CN105368834B - miRNA-199a在抑制成肌细胞的成脂分化试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种miRNA‑199a在抑制肌细胞的成脂分化试剂中的应用。本发明中用于抑制成肌细胞转分化为脂肪细胞的试剂盒包括：miRNA‑199a模拟物；药学上可接受的miRNA‑199a的载体。本发明中miRNA‑199a的靶基因为Fatp1基因，试剂盒使用中Fatp1基因低表达提示成功抑制成肌细胞的成脂分化，miRNA‑199a和本发明该试剂盒可应用在遗传标记辅助育种、改善肉用品质试剂中，具有重要的科研应用价值。

Description

miRNA-199a在抑制成肌细胞的成脂分化试剂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种miRNA-199a在抑制成肌细胞转分化为脂肪细胞的试剂中的应用。

背景技术

microRNA(miRNA)是一种广泛存在于动物、植物、细菌和病毒体内的非编码小RNA(non-coding RNA)，通过序列互补的方式引导沉默复合体降解靶mRNA或者抑制翻译。一个miRNA可以调控多个甚至影响数百个靶基因，而一个基因也可能同时受到多个miRNA的调节。通过对靶基因的特异性/系统性调控，miRNA广泛参与并调控了细胞增殖、分化、代谢、衰老和凋亡的各种转录激活和信号传导。

肌肉和脂肪组织是人和动物体内极为重要的两大器官，特别是它们都受到胰岛素等激素调控，分别服务于能量消耗和能量储存，对于体内能量平衡具有重要影响。肌肉和脂肪的发育失调会造成能量代谢紊乱，产生肌肉萎缩或者肥胖症、2型糖尿病等代谢综合征。miRNA一经发现以来，其于脂肪和肌肉的生长、发育和代谢的调节作用就成为生命科学研究的热点。近10年来，陆续有多个脂肪或肌肉特异性的miRNA被发现和确认。例如，let-7和miR-143被认为是脂肪细胞分化的关键调控分子，而miR-27的高表达则能够显著抑制脂肪细胞分化。miR-1和miR-26对于肌细胞的形成具有重要的调节作用。随着分析技术手段的日益进步，越来越多的miRNA分子被认为同脂肪和肌肉的生长发育和功能发挥具有密切联系。然而肌细胞的生脂是一个明显不同的分化代谢过程，在这个过程中miRNA的表达变化和功能发挥扮演怎样的角色还不清楚，有待深入研究。

近年来，国内外一些研究表明肌细胞在一定条件下能够分化为脂肪细胞或脂肪样细胞，包括细胞内产生大量脂滴以及脂肪特异性基因的表达上调。C2C12鼠源肌前体细胞系是常用于研究肌肉生发和发育的肌细胞模型。正常情况下C2C12细胞通过生肌分化成为肌管，最终形成肌纤维。

专利号为CN104152567A的专利公布了一种与人类肝癌相关的血液miRNA标志物及其应用，该标志物为exosome来源的miRNA-199a，标志物及其检测试剂可用于制备诊断试剂盒，用于肝癌的早期诊断。

但目前miRNA-199a与肌细胞的成脂分化的关系和应用还未有研究和专利公布。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种miRNA-199a的新用途，即miRNA-199a在抑制成肌细胞转分化为脂肪细胞的试剂中的应用。miRNA-199a序列(NCBI GI：262206106)。

本发明通过药物刺激C2C12肌细胞系成脂分化，通过基因芯片筛选成脂分化的C2C12细胞和正常成肌分化的C2C12细胞中miRNA表达差异，筛选出数个主要差异表达的miRNA，然后通过生物信息学分析和分子生物学试验验证差异表达miRNA在肌细胞成脂分化中的调控作用及其靶基因。得到抑制成肌细胞的成脂分化的分子标记物miRNA-199a及其靶基因。

进一步，所述miRNA-199a包括其pri-miRNA，pre-miRNA，成熟miRNA，dsmiRNA及其片段或变体中的一种或几种。

miRNA侧翼序列是指包括miRNA加工元件的核苷酸序列。miRNA加工元件是促成从前体miRNA产生成熟miRNA的最小限度核酸序列。称为pri-miRNAs的前体miRNA在细胞核中被加工成大约15-70个核苷酸的pre-miRNAs，其折叠成不完全的茎环结构。在前体miRNA分子内的miRNA侧翼序列可以处于包含miRNA RNA序列的茎环结构的一侧或两侧的侧翼。优选的结构在茎环结构的两个末端处具有侧翼序列。侧翼序列可以与茎环结构的一个或两个末端直接相邻，或者可以通过接头、额外的核苷酸或其他分子与茎环结构相连接。

茎环结构是指具有二级结构的核酸，所述二级结构包括已知或预知形成双链的核苷酸的区域(茎部分)，所述双链在一侧通过主要地单链的核苷酸的区域(环部分)相连接。在茎-环结构内的核苷酸的实际一级序列不是关键的，只要存在二级结构。如本领域中已知的，二级结构不需要精确的碱基配对。因此，茎可以包含一个或多个碱基错配。作为一种优选，碱基配对可以不包括任何错配。

本发明的目的之二在于提供一种用于抑制成肌细胞转分化为脂肪细胞的试剂盒，包括以下物质：

1)miRNA-199a模拟物；

2)药学上可接受的miRNA-199a的载体。

miRNA-199a可以用市场现有产品，也可以合成获得，例如通过经由技术人员已知的任何合成方法来化学合成核酸。然后，所合成的miRNA-199a可以通过本领域已知的任何方法进行纯化。用于化学合成核酸的方法包括但不限于：体外化学合成，其使用磷酸三酯、磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术或者经由脱氧核苷氢膦酸酯中间体。

载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒和人工染色体，本领域技术人员可以容易地采用本领域已知的其他载体。作为一种优选，载体选自质粒、噬菌粒和人工染色体中的一种或几种。

进一步，步骤1)所述miRNA-199a模拟物为经合成和修饰的miRNA，所述修饰包括糖基修饰，磷酸链修饰，碱基修饰，突出和末端修饰，双螺旋结构修饰中的一种或几种；miRNA-199a的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。(NCBI:NR_029585.1)

进一步，所述miRNA-199a的靶基因为Fatp1基因(NCBI GI：NM_011977.3)所述Fatp1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明的目的之三在于提供一种所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)制备miRNA-199a模拟物；

2)将步骤1)所述miRNA-199a模拟物整合到所述载体中，得重组质粒；

3)将步骤2)所述重组质粒施用到C2C12细胞或含有C2C12细胞的组织中；

4)检测步骤3)中过表达miR-199后对C2C12细胞生脂转分化情况和Fatp1基因表达水平变化。

进一步，步骤4)所述检测方法包括组织免疫染色和/或基因芯片和/或WesternBlot和/或实时荧光定量PCR检测。

miRNA模拟物(miRNA mimics)已经成为研究基因调控的工具之一。miRNA mimics是一种RNA分子，可以通过载体导入细胞内，上调miRNA在细胞内或者活体内miRNA浓度，从而调控基因表达。开发的miRNA mimics有两种，一种是前体分子60碱基以上的前体；一种是双链的成熟体分子。这两种分子都已经证实，能够很好的上调miRNA在细胞内的丰度。

进一步，步骤4)中检测结果为所述Fatp1基因低表达提示成功抑制成肌细胞的成脂分化，所述检测结果中Fatp1基因表达数据为基准数据的0.5倍以下可视为成功抑制成肌细胞的成脂分化。

miR-199对于肌细胞成脂分化有负调控作用，过表达miR-199a显著抑制C2C12细胞的成脂分化，Fatp1基因是miR-199a的靶基因，过表达miR-199a显著下调C2C12细胞内Fatp1基因的表达，所以通过使用siRNA转染沉默细胞内源性Fatp1基因，C2C12细胞的成脂分化同样受到明显抑制。

本发明的目的还在于提供一种所述的试剂盒在遗传标记辅助育种、改善肉用品质试剂中的应用。

本发明的目的还在于提供一种miRNA-199a在遗传标记辅助育种、改善及鉴定肉用品质试剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种miRNA-199a在抑制成肌细胞的成脂分化试剂中的应用。miRNA-199a的靶基因为Fatp1基因，试剂盒使用中Fatp1基因低表达提示成功抑制成肌细胞的成脂分化，本发明的方法简捷，具有较高的特异性和敏感性，可应用在遗传标记辅助育种、改善肉用品质试剂中，具有重要的临床和科研应用价值。

附图说明

图1为本中发明C2C12肌细胞的成脂分化示意图。A.油红O染色显示成脂转分化的C2C12细胞随着分化时间增长，细胞内脂滴逐渐增多，变大。吉姆萨染色显示成肌分化的C2C12细胞逐渐拉长，形成多核肌管，且数量逐渐增加。B和D是通过western blotting对脂肪生成调控因子和肌细胞分化调控因子蛋白水平表达检测。C.是通过定量PCR对调控因子的mRNA水平的检测结果。

图2为本中发明成脂分化细胞，成肌分化细胞和未分化细胞三者之间miRNA表达差异示意图。A.三组细胞之间差异表达miRNA聚类图；B.三组细胞之间差异表达miRNA个数；C.基因芯片检测miR-199a和miR-199b信号值；D.定量PCR结果显示只有miR-199a表达显著下调。

图3为本中发明中过表达miR-199a抑制C2C12细胞生脂转分化的示意图。A.mimics和inhibitor过表达和沉默细胞内的miR-199a；B和C显示过表达miR-199a显著减少细胞内脂滴的积累；D过表达miR-199后生脂调控因子的的表达水平变化。

图4为本中发明中miR-199a的靶基因Fatp1示意图。A.生物信息学分析显示miR-199a和Fatp1基因的3’UTR区存在结合位点；B.Fatp1和miR-199a在C2C12细胞生脂转分化过程中呈现表达负相关性；C和D过表达miR-199a显著降低细胞内Fatp1表达水平；E.荧光素酶分析显示miR-199a能够和Fatp1的3’UTR区直接结合，在生肌分化中miR-199a表达水平没有显著变化。

图5为本发明中siRNA沉默细胞内Fatp1基因抑制C2C12生脂转分化示意图。A.siRNA沉默细胞内源Fatp1；B和C沉默Fatp1显著减少细胞内脂肪生成；D.Fatp1沉默对于生脂基因表达的影响；E.沉默Fatp1对于miR-199a的表达没有影响。

具体实施方式

以下将结合附图，对本发明作详细的说明。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以，熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中，采用的主要材料与方法：

MiRNA:miR-199a成熟体，miR-199a前体

肌细胞模型：C2C12肌细胞系，鼠原代肌细胞

实施例一药物刺激C2C12肌细胞系成脂分化

通过“鸡尾酒成脂诱导法”可以使C2C12细胞逐渐转分化为典型的脂肪细胞，并失去肌细胞的特性(图1)。这些变化包括细胞形状变为梭状，并逐渐变圆，细胞内出现大量脂滴，细胞内脂肪生成基因FASn，C/EBPα，PPARγ，Fabp4的mRNA和蛋白水平明显升高，而肌细胞分化因子Myog,MyoD,MYF5表达水平下调。

通过药物刺激C2C12肌细胞系成脂分化，通过基因芯片筛选成脂分化的C2C12细胞和正常成肌分化的C2C12细胞中miRNA表达差异，筛选出数个主要差异表达的miRNA，然后通过生物信息学分析和分子生物学试验验证差异表达miRNA在肌细胞成脂分化中的调控作用及其靶基因。得到肉用性能分子标记物miRNA-199a及其靶基因。

实施例二通过基因芯片技术和定量PCR试验筛选验证成脂分化相关的miRNA

材料：成脂分化的C2C12细胞，正常成肌分化的C2C12细胞和未分化的C2C12细胞。

方法：通过基因芯片筛选成脂分化的C2C12细胞和正常成肌分化的C2C12细胞中差异表达的miRNA，使用定量PCR试验验证结果。

使用高通量基因芯片检测分析不同分化途径下细胞内miRNA的表达变化。基因芯片结果显示成脂转分化细胞，成肌分化细胞和未分化细胞，三组之间有60个miRNA的表达水平明显不同(图2，单因素方差分析，P<0.05)

使用定量PCR试验进行验证，结果显示成脂分化的细胞中10个表达上调miRNA和8个表达下调miRNA，检测结果与芯片检测结果基本一致，但只有miR-199a表达显著下调。

实施例三验证miR-199a抑制__成肌细胞转分化为脂肪细胞

使用合成的mimic和inhibitor转染细胞，过表达和沉默细胞内的miR-199a，结果发现过表达miR-199a显著抑制C2C12细胞的成脂分化(图3，包括细胞内脂滴减少，脂合成基因表达下调)，但是沉默miR-199a对于细胞分化并没有显著影响。

说明miR-199a对于肌细胞成脂分化有负调控作用。

实施例四分析预测miR-199a的靶基因及该基因与生脂分化的关系

结合已有文献使用多种靶基因预测软件分析预测得出Fatp1基因是miR-199a的靶基因，在Fatp1的3’UTR区有一个miR-199a的结合位点。过表达miR-199a显著下调了细胞内的Fatp1的表达，随着C2C12细胞生脂分化，两者的表达水平呈现明显的负相关性(图4)。我们进一步使用siRNA转染沉默细胞内源性Fatp1基因，模拟miR-199a对其沉默作用，结果显示Fatp1沉默以后，C2C12细胞的成脂分化同样受到明显抑制(图5)。

这些结果表明miR-199a能够靶向Fatp1，调控肌细胞的成脂转分化。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.用于抑制成肌细胞转分化为脂肪细胞的试剂盒，其特征在于，包括以下物质：

1)miRNA-199a序列；

2)药学上可接受的miRNA-199a的载体；

miRNA-199a的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；

所述成肌细胞为C2C12细胞；所述miRNA-199a的靶基因为Fatp1基因，所述Fatp1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

2.权利要求1所述的试剂盒的体外使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备miRNA-199a序列；

2)将步骤1)所述miRNA-199a序列整合到所述载体中，得重组质粒；

3)将步骤2)所述重组质粒施用到C2C12细胞或含有C2C12细胞的组织中；

4)检测步骤3)中过表达miR-199后对C2C12细胞生脂转分化情况和Fatp1基因表达水平变化。

3.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于，步骤4)所述检测方法包括组织免疫染色和/或基因芯片和/或Western Blot和/或实时荧光定量PCR检测。

4.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于，步骤4)中检测结果为所述Fatp1基因低表达提示成功抑制成肌细胞的成脂分化，所述检测结果中Fatp1基因表达数据为基准数据的0.5倍以下可视为成功抑制成肌细胞的成脂分化。

5.权利要求1所述的试剂盒在制备遗传标记辅助育种、改善及鉴定肉用品质试剂中的应用。

6.miRNA-199a在制备遗传标记辅助育种、改善及鉴定肉用品质试剂中的应用，其特征在于，所述miRNA-199a的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。