CN105435247A - miR-378在预防和/或治疗肥胖症中的用途 - Google Patents

miR-378在预防和/或治疗肥胖症中的用途 Download PDF

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CN105435247A CN201511026393.4A CN201511026393A CN105435247A CN 105435247 A CN105435247 A CN 105435247A CN 201511026393 A CN201511026393 A CN 201511026393A CN 105435247 A CN105435247 A CN 105435247A
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张勇
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Abstract

本发明涉及miR-378在预防和/或治疗肥胖症中的用途。具体地，本发明涉及miR-378在制备预防和/或治疗肥胖症药物中的用途。本发明还涉及用于制备治疗和/或预防肥胖症药物的组合物，其包含miR-378。本发明发现miR-378对于肥胖症特别是获得性肥胖症有很好的治疗效果。

Description

miR-378在预防和/或治疗肥胖症中的用途
技术领域
本发明涉及miR-378在预防和/或治疗肥胖症，特别是获得性肥胖症中的用途。
背景技术
肥胖症是一种常见的代谢疾病。据报道，2008年全世界共有2亿成年男性、3亿成年女性患有肥胖症[1]。估计到2030年，全球肥胖人数将会高达10亿[2]。正常男性成人脂肪组织重量约占体重的15％～18％，女性约占20％～25％。随年龄增长，体脂所占比例相应增加。体重指数[BMI＝体重(Kg)/(身高)2(m2)]大于28者称为肥胖症[3]。
无明显病因的肥胖症称单纯性肥胖症；具有明确病因者称为继发性肥胖症。单纯性肥胖是各种肥胖最常见的一种，全身脂肪分布比较均匀，没有内分泌混乱现象，也无代谢障碍性疾病，其家族往往有肥胖病史。单纯性肥胖又分为体质性肥胖和过食性肥胖两种。体质性肥胖即双亲肥胖，是由于遗传和机体脂肪细胞数目增多而造成的，还与25岁以前的营养过度有关系。这类人的物质代谢过程比较慢，比较低，合成代谢超过分解代谢。过食性肥胖也称为获得性肥胖，是由于人成年后有意识或无意识地过度饮食，使摄入的热量大大超过身体生长和活动的需要，多余的热量转化为脂肪，促进脂肪细胞肥大与细胞数目增加，脂肪大量堆积而导致肥胖。
与单纯性肥胖不同，继发性肥胖是于疾病引起的肥胖。继发性肥胖是由内分泌混乱或代谢障碍引起的一类疾病，虽然同样具有体内脂肪沉积过多的特征，但仍然以原发性疾病的临床症状为主要表现，肥胖只是这类患者的重要症状之一。这类患者同时还会出现其他各种各样的临床表现，多表现为皮质酵增多、甲状腺功能减退人群、性腺功能减退等多种疾病中。
肥胖症会使高血压、糖尿病和心脑血管疾病等的发病率及死亡率显著增加[3]，已成为危害全球人类健康的重要问题之一,成为社会广泛关注的焦点。肥胖的预防和治疗已成为现代医学面临的一项挑战。2008年，仅美国用于肥胖的医疗费用就高达1470亿美元[4]。据博思数据统计，2012年全球减肥药市场规模为15.6亿美元,我国减肥药零售市场规模30.5亿元，其中减肥药(处方药)市场规模为16.8亿元[5]。按现在的市场预测未来可能全球将达到700亿，其中中国将近100亿元。
microRNA是一类非编码小RNA分子，在基因转录后水平通过对靶mRNA的翻译抑制或降解，继而调控基因的表达。最近的研究表明，miR-378参与调控糖脂代谢，与脂类的合成与分解密切相关[6-7]。
发明内容
本发明人通过一系列实验发现内源性微小核糖核酸microRNA-378(miR-378)对肥胖症有明显的预防和/或治疗作用。miR-378可以调节糖脂代谢，促进脂类氧化分解，miR-378转基因小鼠体脂显著低于对照小鼠。给小鼠注射miR-378对高脂饮食诱导的肥胖具有显著的预防和治疗作用，尤其可降低肥胖症中白色脂肪积累。进一步研究发现miR-378在骨骼肌中可以通过抑制Akt1而促进FoxO1活性，从而促进PEPCK表达，激活丙酮酸-PEP无效循环。无效循环导致小鼠能量缺陷，从而促进脂肪分解。在脂肪组织中，miR-378通过靶向调节Scd1而促进脂解作用。以上研究表明微小核糖核酸miR-378可以参与整体代谢调控，促进脂肪氧化分解，减少脂肪积累，从而预防和治疗肥胖。
因此，本发明的目的是提供miR-378在制备预防和/或治疗肥胖症的药物中的用途。
进一步地，肥胖症选自单纯性肥胖症和继发性肥胖症，所述单纯性肥胖症选自体质性肥胖症和获得性肥胖症，优选获得性肥胖症。
进一步地，miR-378的序列如SEQIDNo.1所示。
进一步地，预防和/或治疗是指降低肥胖症中白色脂肪积累。
进一步地，肥胖症是指由白色脂肪积累引起的肥胖症。
进一步地，miR-378可由胆固醇修饰。
进一步地，胆固醇修饰的miR-378可降低肥胖症中白色脂肪积累。
进一步地，胆固醇修饰的miR-378可预防和/或治疗由白色脂肪积累引起的肥胖症。
进一步地，miR-378的靶标是Scd1。
此外，本发明还提供了一种制备用于治疗和/或预防肥胖症的组合物，其包含miR-378。
进一步地，组合物还包含一种或更多药学上可接受的载体。
进一步地，miR-378可由胆固醇修饰。
进一步地，肥胖症选自单纯性肥胖症和继发性肥胖症。所述单纯性肥胖症选自体质性肥胖症和获得性肥胖症，优选获得性肥胖症。
进一步地，miR-378的序列如SEQIDNo.1所示。
进一步地，预防和/或治疗是指降低肥胖症中白色脂肪积累。
进一步地，肥胖症是指由白色脂肪积累引起的肥胖症。
进一步地，胆固醇修饰的miR-378可降低肥胖症中白色脂肪积累。
进一步地，胆固醇修饰的miR-378可预防和/或治疗由白色脂肪积累引起的肥胖症。
进一步地，miR-378的靶标是Scd1。
术语“肥胖症”是指体重指数[BMI＝体重(Kg)/(身高)2(m2)]大于28者。
附图说明
图1A-图1K：miR-378转基因小鼠脂肪积累减少。图中Wt代表野生型对照小鼠，Tg代表转基因小鼠。图1A显示转基因小鼠体型小于野生型对照小鼠。图1B显示在转基因小鼠的骨骼肌、棕色脂肪、白色脂肪和肝脏中miR-378均高表达，其中Mus:骨骼肌，BAT：棕色脂肪，WAT：白色脂肪。图1C显示转基因小鼠的体重减轻。图1D显示转基因小鼠的骨骼肌重量减少，其中TA:胫骨前肌，EDL：趾长伸肌，Gastro：腓肠肌，Qu:股四头肌。图1E-图1F显示转基因小鼠的脂肪积累少，图1G显示转基因小鼠的脂肪细胞数量没有显著变化，其中iWAT:腹股沟皮下白色脂肪，gWAT:性腺旁腹腔白色脂肪。图1H显示miR-378对脂肪细胞的分化无显著影响，其中Pparγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ，aP2：脂肪细胞脂结合蛋白，也称为FABP4，Agt:血管紧张肽原。图1I-图1J显示转基因小鼠的脂肪细胞体积明显减小。图1K显示转基因小鼠棕色脂肪中脂肪分解相关基因表达显著增加，其中Ucp1：解偶联蛋白1，Pgc-1α：过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α，Pgc-1β：过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1β，Prdm16：含PR结构域的蛋白16，Cox7a1:细胞色素C氧化酶蛋白7A1。
图2A-图2Q：miR-378转基因小鼠分解代谢活跃。图中Wt代表野生型对照小鼠，Tg代表转基因小鼠。图2A显示转基因小鼠氧消耗显著高于野生型对照小鼠，图2B显示转基因小鼠二氧化碳产生高于野生型对照小鼠，图2C显示转基因小鼠食物摄取高于野生型对照小鼠，图2D显示转基因小鼠饮水量高于野生型对照小鼠，图2E显示转基因小鼠产热高于野生型对照小鼠。图2F显示转基因小鼠棕色脂肪中解偶联蛋白1(Ucp1)表达高于野生型对照小鼠。图2G显示转基因小鼠白色脂肪中脂肪分解的关键酶表达高于野生型对照小鼠，其中ATGL:脂肪甘油三酯脂肪酶，HSL:激素敏感的脂肪酶，CGI-58(Comparativegeneidentification-58)：比较文库方法鉴定的第58号蛋白。图2H显示转基因小鼠白色脂肪中甘油浓度高于野生型对照小鼠。图2I-图2J显示转基因小鼠棕色脂肪(图2I)及骨骼肌(图2J)中脂肪分解及脂肪酸利用的关键酶表达高于野生型对照小鼠，其中LPL:脂蛋白脂酶，CD36:细胞分化蛋白36，CPT1b：肉碱脂酰基转移酶，UCP3：解偶联蛋白3。图2K显示转基因小鼠血清中游离脂肪酸(FFA)浓度明显降低。图2L显示转基因小鼠在饥饿条件下血糖高于野生型对照小鼠。图2M显示转基因小鼠糖耐量(GTT)异常，图2N显示转基因小鼠胰岛素耐量(ITT)正常。图2O显示转基因小鼠血清胰岛素水平正常。图2P显示转基因小鼠丙酮酸耐量(PTT)显著高于野生型对照小鼠。图2Q显示转基因小鼠肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)表达上调。
图3A-图3H：miR-378转基因小鼠抵抗饮食诱导的肥胖。图中Wt-HFD代表高脂饲料喂养的野生型对照小鼠，Tg-HFD代表高脂饲料喂养的转基因小鼠，Wt-SD代表标准饲料喂养的野生型对照小鼠，Tg-SD代表标准饲料喂养的转基因小鼠，NS表示无显著性差异。图3A显示转基因小鼠体重显著低于同样高脂饲料喂养的野生型对照小鼠。图3B显示转基因小鼠高脂饮食的食物摄取量与野生型对照小鼠食物摄取量无区别，其中Wt代表野生型对照小鼠，Tg代表转基因小鼠，SD:标准饲料喂养；HFD:高脂饲料喂养。图3C显示转基因小鼠脂肪重量的增加显著低于野生型对照小鼠。图3D显示转基因小鼠脂肪细胞数量显著低于野生型对照小鼠。图3E显示高脂饲料喂养的转基因小鼠的白色脂肪细胞直径明显小于野生型小鼠。图3F显示高脂饲料喂养的转基因小鼠棕色脂肪细胞直径明显小于野生型对照小鼠。图3G显示转基因小鼠的葡萄糖耐量(GTT)明显改善。图3H显示转基因小鼠的胰岛素耐量(ITT)得到改善。
图4A-图4J：miR-378预防和治疗小鼠的肥胖。图4A-图4E中SD代表标准饲料喂养且未注射任何RNA的小鼠，HFD代表高脂饲料喂养且未注射任何RNA的小鼠，HFD-Con代表高脂饲料喂养并注射agomiR-378的阴性对照序列RNA的对照组小鼠，HFD-378代表高脂饲料喂养并注射agomiR-378RNA的肥胖干预组小鼠，NS表示无显著性差异。图4F-图4J中SD代表标准饲料喂养且未注射任何RNA的小鼠，HFD-Con代表高脂饲料喂养诱导肥胖后注射agomiR-378的阴性对照序列RNA的对照组小鼠，HFD-378代表高脂饲料喂养诱导肥胖后注射agomiR-378RNA的治疗组小鼠，NS表示无显著性差异。图4A显示注射胆固醇修饰的miR-378(也称为agomiR-378)的肥胖干预组小鼠在体重和体重增长方面都显著小于对照组小鼠。图4B显示注射agomiR-378的肥胖干预组小鼠棕色脂肪重量并未减少，而白色脂肪(包括iWAT和gWAT)的增重都明显减少。图4C显示注射agomiR-378的肥胖干预组小鼠脂肪细胞体积显著减小。图4D显示注射agomiR-378的肥胖干预组小鼠表现出显著改善的GTT。图4E显示注射agomiR-378的肥胖干预组小鼠表现出显著改善的ITT。图4F显示注射agomiR-378的治疗组小鼠体重显著低于对照组小鼠，体重增长也显著降低。图4G显示注射agomiR-378的治疗组小鼠白色脂肪重量比对照组小鼠降低，而棕色脂肪重量无显著变化。图4H显示注射agomiR-378的治疗组小鼠脂肪细胞体积和脂肪重量都减小。图4I显示注射agomiR-378的治疗组小鼠的GTT明显改善。图4J显示注射agomiR-378的治疗组小鼠的ITT明显改善。
图5A-图5I：骨骼肌中的丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸无效循环导致转基因小鼠能量缺陷。图中Wt代表野生型对照小鼠，Tg代表转基因小鼠，NS表示无显著性差异。图5A显示转基因小鼠骨骼肌中糖代谢关键酶表达显著升高，其中Hk2:已糖激酶2，Pfk1:磷酸果糖激酶1，Pk:丙酮酸激酶。图5B显示转基因小鼠骨骼肌中α-磷酸甘油脱氢酶(α-GPDH)活性显著增强，琥珀酸脱氢酶(SDH)活性显著减弱。图5C显示转基因小鼠骨骼肌中丙酮酸水平下降。图5D显示转基因小鼠骨骼肌中丙酮酸脱氢酶(PDH)活性不变。图5E显示转基因小鼠的骨骼肌中丙酮酸羧化酶(PC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)的mRNA显著升高。图5F显示转基因小鼠骨骼肌中Pfk1和PEPCK的酶活性显著升高。图5G显示转基因小鼠骨骼肌中乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)浓度显著下降。图5H显示转基因小鼠骨骼肌中ATP/ADP水平显著降低。图5I显示转基因小鼠在高脂饲料喂养后骨骼肌组织中PEPCK的表达恢复到了野生型对照小鼠的水平，其中SD:标准饲料喂养；HFD:高脂饲料喂养。
图6A-图6G：miR-378通过Akt-FoxO1-PEPCK途径激活丙酮酸-PEP无效循环。图中Wt代表野生型对照小鼠，Tg代表转基因小鼠，Wt-Con代表感染对照腺病毒的野生型对照组小鼠，Tg-Con代表感染对照腺病毒的转基因小鼠，Wt-Akt代表感染组成型激活的Akt1(ca-Akt1)腺病毒的野生型小鼠，Tg-Akt代表感染组成型激活的Akt1腺病毒的转基因小鼠，NS表示无显著性差异。图6A显示转基因小鼠骨骼肌组织中Akt1蛋白水平明显降低，其中t-Akt1：总Akt1，p-Akt1：磷酸化Akt1，p-FoxO1：磷酸化FoxO1，t-FoxO1：总FoxO1。图6B显示转基因和野生型对照小鼠成功转染组成型激活的Akt1(ca-Akt1)。图6C显示感染ca-Akt1腺病毒的转基因小鼠骨骼肌中PEPCK的表达恢复到了对照组小鼠(Wt-Con)水平。图6D-图6F显示感染ca-Akt1腺病毒的转基因小鼠白色脂肪中脂解相关基因(图6D)，棕色脂肪中(图6E)和骨骼肌组织中(图6F)脂肪酸利用相关基因的表达也都恢复到对照组小鼠(Wt-Con)水平，其中PEPCK:磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，Hsl:激素敏感的脂肪酶，Lpl:脂蛋白脂酶，Cpt1b：肉碱脂酰基转移酶，Atgl:脂肪甘油三酯脂肪酶，Cgi58:差异蛋白58，Cd36：细胞分化蛋白36。图6G显示感染ca-Akt1腺病毒的转基因小鼠血清中的FFA水平与对照组小鼠(Wt-Con)也不再有显著性差异。
图7A-图7H：图7A显示Scd1基因是miR-378的潜在靶基因。图7B显示萤光素酶报告基因检测验证了Scd1的表达受miR-378的直接抑制，图7C显示3T3诱导分化的脂肪细胞中转染miR-378以后Scd1基因表达水平降低，图7D显示3T3诱导分化的脂肪细胞中转染miR-378以后脂分解相关的基因表达水平升高，其中Con代表转染对照核酸，miR-378代表转染了miR-378的RNA，pGL3代表空质粒，wt-utr代表野生型的3’非翻译区，m-utr代表miR-378种子序列突变的3’非翻译区，ATGL:脂肪甘油三酯脂肪酶，HSL:激素敏感的脂肪酶。图7E显示转基因小鼠棕色脂肪组织中Scd1表达水平低于野生型对照小鼠，图7F显示转基因小鼠棕色脂肪和白色脂肪组织中C16:1/C16:0均显著低于野生型对照小鼠，图7G显示转基因小鼠棕色脂肪和白色脂肪组织中C18:1/C18:0均显著低于野生型对照小鼠，其中Wt代表野生型对照小鼠，Tg代表转基因小鼠。图7H显示高脂饲料喂养诱导肥胖后注射agomiR-378的治疗组小鼠棕色和白色脂肪中Scd1表达显著降低，其中SD代表标准饲料喂养且未注射任何RNA的小鼠，HFD-Con代表高脂饲料喂养诱导肥胖后注射agomiR-378的阴性对照序列RNA的对照组小鼠，HFD-378代表高脂饲料喂养诱导肥胖后注射agomiR-378的治疗组小鼠。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明，这些实施例仅是用于阐明本发明而不以任何方式限制本发明。
本申请实施方案所用实验材料如下：C57BL/6小鼠品系的miR-378转基因小鼠，繁殖miR-378转基因小鼠产生的同窝野生型小鼠作为野生型对照小鼠进行研究。在胆固醇修饰的miR-378(简称AgomiR-378)预防和/或治疗高脂饮食诱导的肥胖症实验中采用的小鼠也都是C57BL/6小鼠品系。
实施例1：miR-378全身转基因小鼠分解代谢增强导致脂肪重量减少。
骨骼肌和脂肪组织是两个重要的代谢器官，它们之间的相互作用对于整体代谢稳态的调节起着重要作用。miR-378在骨骼肌和棕色脂肪组织(BAT)中大量表达，起着调节二者能量代谢的功能。因此我们推测miR-378通过系统调节骨骼肌和脂肪组织的相互作用来调控整体的能量稳态。为检验这个假设，我们制备了两个miR-378转基因小鼠品系(C系和D系)，通过β-肌动蛋白启动子(pCAGGS)全身过表达miR-378(图1A)。定量RT-PCR结果显示，在转基因小鼠的骨骼肌和棕色脂肪中，miR-378过表达约8倍，而在白色脂肪中过表达约25倍(图1B)。前两周转基因小鼠体重与野生型对照小鼠无显著差别，两周后转基因小鼠的体重显著低于野生型对照小鼠(图1C)，提示转基因小鼠出生后生长缺陷。转基因小鼠的骨骼肌重量减少(图1D)。转基因小鼠的脂肪重量明显降低，棕色脂肪和白色脂肪(包括皮下脂肪和腹腔脂肪)都显著低于对照小鼠(图1E-图1F)。心、肝、肺、胃、胰腺、脑等器官重量无显著改变。因此，转基因小鼠体重减轻主要是骨骼肌和脂肪重量减轻导致的。因为两个品系表型相似，所以我们详细研究了D品系。
转基因小鼠脂肪重量减少的原因可能是脂肪发育障碍，也可能是脂代谢障碍。我们首先检测了棕色和白色脂肪组织的DNA含量，并未发现显著差异(图1G)。与此一致，白色脂肪组织中脂肪分化相关分子标记的检测也无明显变化，说明miR-378过表达对脂肪分化没有显著影响(图1H)。接着我们检测了脂代谢情况。HE染色结果显示转基因小鼠的白色和棕色脂肪中核密度明显升高(图1I-图1J)，棕色脂肪中解偶联蛋白1(Ucp1)、过氧化物酶体增殖物激活受体(Pparγ)、Pgc-1α、Pgc-1β表达也都明显上调(图1K)。以上数据表明，转基因小鼠脂肪重量减少主要由于脂肪组织中脂类分解代谢增强。
实施例2：miR-378转基因小鼠显示能量缺乏
为进一步确定转基因小鼠脂肪重量减少是由于能量需求导致的分解代谢增强引起，我们用代谢笼实验测定了转基因小鼠和野生型对照小鼠的代谢状况。转基因小鼠的氧消耗和二氧化碳产生都显著高于野生型对照小鼠(图2A-图2B)，食物摄取和饮水也显著升高(图2C-图2D)。另外，转基因小鼠的热量产生也高于野生型对照小鼠(图2E)，这与其Ucp1的高表达是一致的(图2F)。这表明转基因小鼠能量代谢受损，在正常生理条件下需要增强分解代谢来供应机体需求。
糖脂代谢在调节能量稳态方面具有重要作用。我们随后直接测定了脂肪和骨骼肌组织的糖脂代谢情况。我们首先测定了脂肪组织的脂代谢，发现在转基因小鼠的白色脂肪中，脂解基因ATGL、HSL、CGI-58的表达均显著升高(图2G)，提示其脂解增强。我们还发现其甘油水平升高(图2H)，进一步证明转基因小鼠白色脂肪中脂肪分解加快，支持脂解增强。另外，我们还观察到在棕色脂肪和骨骼肌中，脂解和脂肪酸利用的相关基因表达都上调(图2I-图2J)，而相应地，血清中游离脂肪酸(FFA)水平下降(图2K)。以上数据说明转基因小鼠脂肪分解代谢显著增强。总之，这些证据表明，转基因小鼠脂解增强，代谢活跃，分解产生的脂肪酸被利用导致血清中游离脂肪酸水平下降。
我们接下来检测了转基因小鼠的糖代谢状况。实验表明，转基因小鼠在饥饿条件下血糖显著高于野生型对照小鼠(图2L)，提示转基因小鼠糖代谢异常。对10周龄小鼠的糖耐量检测表明，转基因小鼠糖耐量受损(图2M)。而接下来的胰岛素耐量检验表明转基因小鼠未发生胰岛素抵抗(图2N)，并且其血清胰岛素水平也无异常(图2O)。丙酮酸耐量测试表明转基因小鼠糖异生明显增加(图2P)，而磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶表达水平也升高(图2Q)。以上数据表明，转基因小鼠糖代谢紊乱，导致整体能量耗竭。血糖升高是由于糖代谢平衡失调，而不是因为胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗。
结论：转基因小鼠的代谢紊乱引起能量缺陷。
实施例3：miR-378转基因小鼠抵抗饮食诱导的肥胖
接下来我们检测了转基因小鼠是否因为能量缺陷而抵抗饮食诱导的肥胖。6周龄雄性转基因小鼠采用高脂饲料喂养8周，称重。我们发现转基因小鼠体重显著低于同样高脂饲料喂养的野生型对照小鼠(图3A)，转基因和野生型对照小鼠高脂饲料喂养时的食物摄取量没有区别(图3B)。高脂饲料喂养的野生型对照小鼠脂肪重量明显增加，而转基因小鼠脂肪重量的增加显著低于野生型对照小鼠(图3C)，脂肪细胞数量也显著低于野生型对照小鼠(图3D)。转基因小鼠的棕色脂肪和白色脂肪细胞直径明显小于野生型对照小鼠，脂肪细胞内的脂滴大小明显小于野生型对照小鼠(图3E和3F)。高脂饲料喂养后，野生型对照小鼠会出现明显的GTT和ITT异常，我们观察到转基因小鼠的GTT(图3G)和ITT(图3H)得到显著改善。
结论：转基因小鼠对饮食诱导的肥胖有抵抗作用。
实施例4：miR-378可以预防和改善小鼠的肥胖
转基因小鼠对肥胖的抵抗提示我们miR-378可以预防小鼠的肥胖。为此，通过尾静脉给高脂饲料喂养的小鼠注射agomiR-378，每周一次，持续8周。结果发现，注射agomiR-378的肥胖干预组小鼠在体重和体重增长方面都显著小于对照组小鼠(图4A)。有趣的是，过表达miR-378的小鼠棕色脂肪重量并未减少，而白色脂肪(包括iWAT和gWAT)的增重都明显减少(图4B)。这与其脂肪细胞体积显著缩小是一致的(图4C)。肝脏和骨骼肌重量无明显变化。接下来我们检测了miR-378对糖耐量和胰岛素抵抗的影响。注射agomiR-378的肥胖干预组小鼠表现出显著改善的GTT(图4D)和接近正常的ITT(图4E)。这些结果说明miR-378可以预防高脂饮食诱导的肥胖。
接下来我们每周通过尾静脉给高脂饮食诱导的肥胖小鼠注射agomiR-378进行治疗，持续4周。实验结束时，注射agomiR-378的治疗组小鼠体重显著低于对照组，体重增长也显著降低(图4F)。特别是白色脂肪重量比对照组降低了31％，而棕色脂肪重量无显著变化(图4G)，脂肪细胞体积和脂肪重量也都减小(图4H)。与此一致，治疗组小鼠的GTT(图4I)和ITT(图4J)也都明显改善。
结论：通过转基因或药物过表达miR-378可以预防和治疗小鼠的肥胖。
实施例5：骨骼肌中的丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸无效循环导致小鼠能量缺陷
骨骼肌的糖代谢对于维持代谢稳态,调节机体能量平衡非常重要。我们发现，转基因小鼠骨骼肌中糖代谢的缺陷很可能是其整体代谢失调的根本原因。为此，我们直接测定了小鼠骨骼肌中糖酵解活性，发现转基因小鼠糖酵解显著增强。转基因小鼠的糖酵解关键酶基因：己糖激酶2(Hk2)、磷酸果糖激酶1(Pfk1)和丙酮酸激酶(Pk)表达显著升高(图5A)，α-磷酸甘油脱氢酶活性也显著增强，相比之下，氧化代谢相关的琥珀酸脱氢酶(SDH)活性显著降低(图5B)。由于转基因小鼠糖酵解代谢活跃，我们进一步检测了糖酵解的产物丙酮酸。有趣的是，我们没有发现转基因小鼠骨骼肌组织中丙酮酸积累增加，反而发现其丙酮酸水平下降(图5C)。我们检测了丙酮酸脱氢酶(PDH)活性，进一步排除了PDH异常的可能(图5D)。
生化上的无效循环是由于两个方向相反的代谢反应同时高速进行引起，其结果是消耗能量产热。例如，糖酵解时由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)产生丙酮酸，丙酮酸又经丙酮酸羧化酶(PC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)重新生成PEP，这一循环的结果是净消耗1个ATP。因为转基因小鼠糖酵解增强，而丙酮酸水平没有升高，所以我们推测丙酮酸又生成了PEP。我们在转基因小鼠的骨骼肌中发现PC和PEPCK的mRNA(图5E)和酶活性(图5F)都显著升高，提示转基因小鼠骨骼肌中发生了丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸无效循环。与此相一致，我们还观察到转基因小鼠骨骼肌中乙酰辅酶A浓度显著下降(图5G)。总之，转基因小鼠骨骼肌中丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸无效循环导致小鼠能量相对不足，骨骼肌组织ATP水平下降(图5H)。
我们前面发现转基因小鼠的能量缺陷可以被高脂饮食弥补，并且过表达miR-378可以预防高脂饮食诱导的肥胖。接下来我们检测转基因小鼠骨骼肌中丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸无效循环是否可以被高脂饮食减弱。实验证明，转基因小鼠在高脂饲料喂养后PEPCK的表达几乎恢复到了野生型对照小鼠的水平(图5I)。综上所述，转基因小鼠骨骼肌中丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸无效循环导致的小鼠糖代谢缺陷至少是其能量缺陷的部分原因，它导致了脂肪组织中脂解增强，可能是整体能量缺陷的起因。
实施例6：miR-378通过Akt-FoxO1-PEPCK途径激活丙酮酸-PEP无效循环
有报道miR-378可以调控Akt1。Akt1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在胰岛素通路与其他通路的相互作用上起着重要调控作用。Akt1基因敲除小鼠的表型与miR-378的转基因小鼠相似，如体重和脂肪重量降低，代谢紊乱等。我们观察到转基因小鼠骨骼肌中Akt1蛋白水平明显降低(图6A)。转录因子FoxO1是Akt1的直接底物，被磷酸化后会调控改变代谢平衡。而PEPCK的转录恰好被FoxO1调控。显然，miR-378可以通过Akt-FoxO1-PEPCK途径激活丙酮酸-PEP无效循环。我们检测了转基因小鼠骨骼肌中FoxO1的蛋白水平和磷酸化水平，发现磷酸化的失活FoxO1明显减少(图6A)，即转基因小鼠骨骼肌中去磷酸化的FoxO1更多，就导致转基因小鼠PEPCK表达上调。
为进一步确认miR-378通过Akt-FoxO1-PEPCK途径激活丙酮酸-PEP无效循环，我们用组成型激活的Akt1腺病毒感染转基因和野生型对照小鼠，来恢复骨骼肌中的Akt1水平(图6B)。为直接确定骨骼肌中丙酮酸-PEP无效循环由Akt1-FoxO1-PEPCK途径介导，我们检测了小鼠骨骼肌中参与此无效循环的基因的表达情况。结果发现，Akt1功能恢复后，转基因小鼠骨骼肌中PEPCK的表达也恢复到了对照组小鼠(Wt-Con)水平(图6C)，说明此无效循环已被减弱。与此一致，白色脂肪组织中的脂解(图6D)，以及棕色脂肪(图6E)和骨骼肌组织(图6F)中脂肪酸的利用也都恢复到对照组小鼠(Wt-Con)水平。最后，我们观察到血清中的FFA水平也恢复正常(图6G)。因此，miR-378是通过Akt-FoxO1-PEPCK途径激活丙酮酸-PEP无效循环的。
结论：在转基因小鼠骨骼肌中miR-378通过Akt-FoxO1-PEPCK途径激活丙酮酸-PEP无效循环，通过骨骼肌与脂肪组织的交互作用来调节机体能量平衡。
实施例7：miR-378在脂肪组织中通过调节Scd1促进脂解作用
接下来，我们鉴定了miR-378在脂肪组织中的靶基因，从而揭示了miR-378转基因小鼠中脂解增强的分子机制。通过TargetScan和miRanda搜索miR-378的潜在靶基因(图7A)，我们发现，脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd1)mRNA的3’非翻译区(3’untranslatedregion，3’UTR)存在miR-378的结合位点。Scd1对脂类的合成与氧化起着关键的调控作用。Scd1基因敲除小鼠具有与miR-378转基因小鼠相似的消瘦且抵抗肥胖的表型。为确定Scd1基因是miR-378的靶基因，我们构建了萤光素酶报告基因系统。监测结果显示，在HEK293细胞中，miR-378可以显著抑制带有野生型Scd13’UTR的萤光素酶活性(图7B)，而miR-378结合位点突变的质粒则不受抑制(图7B)。进一步，我们在3T3诱导分化的脂肪细胞中转染miR-378，观察到Scd1基因的mRNA显著下调(图7C)，同时脂解相关基因显著上调(图7D)。我们检测了转基因小鼠棕色脂肪中的Scd1表达水平显著低于野生型对照小鼠(图7E)，与此相一致，转基因小鼠棕色脂肪组织中C16:1/C16:0(图7F)和C18:1/C18:0(图7G)均显著低于对照，表明转基因小鼠棕色脂肪组织中Scd1酶活性降低。对于白色脂肪组织，尽管Scd1的表达水平与野生型对照小鼠无显著性差异(图7E)，但是转基因小鼠的白色脂肪组织中C16:1/C16:0(图7F)和C18:1/C18:0(图7G)也显著低于野生型对照小鼠，表明转基因小鼠白色脂肪组织中Scd1酶活性也显著降低。此外，我们发现agomiR-378处理的高脂饲料喂养诱导肥胖的治疗组小鼠棕色和白色脂肪中Scd1表达也显著降低(图7H)。
结论：miR-378在小鼠脂肪组织中通过靶向调节Scd1而促进脂解作用。
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Claims (11)

1.miR-378在制备预防和/或治疗肥胖症药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的miR-378在制备预防和/或治疗肥胖症药物中的用途，其中所述肥胖症选自单纯性肥胖症和继发性肥胖症。
3.根据权利要求2所述的miR-378在制备预防和/或治疗肥胖症药物中的用途，其中所述单纯性肥胖症选自体质性肥胖症和获得性肥胖症，优选获得性肥胖症。
4.根据权利要求1所述的miR-378在制备预防和/或治疗肥胖症药物中的用途，其中所述miR-378的序列如SEQIDNo.1所示。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的miR-378在制备预防和/或治疗肥胖症药物中的用途，其中所述预防和/或治疗是指降低肥胖症中白色脂肪积累。
6.一种用于制备治疗和/或预防肥胖症药物的组合物，其中所述组合物包含miR-378。
7.根据权利要求6所述的用于制备治疗和/或预防肥胖症药物的组合物，其中所述组合物还包含一种或更多药学上可接受的载体。
8.根据权利要求6所述的用于制备治疗和/或预防肥胖症药物的组合物，其中所述miR-378由胆固醇修饰。
9.根据权利要求6或7所述的用于制备治疗和/或预防肥胖症药物的组合物，其中所述肥胖症选自单纯性肥胖症和继发性肥胖症。
10.根据权利要求9所述的用于制备治疗和/或预防肥胖症药物的组合物，其中所述单纯性肥胖症选自体质性肥胖症和获得性肥胖症，优选获得性肥胖症。
11.根据权利要求6或7所述的用于制备治疗和/或预防肥胖症药物的组合物，其中所述miR-378的序列如SEQIDNo.1所示。
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