CN111904974B - miR-574-5p在糖尿病及其相关疾病中的医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及miR‑574‑5p的医药用途，具体涉及miR‑574‑5p在制备糖尿病及其相关疾病预防或治疗药物中的用途。本发明提供了miR‑574‑5p、表达miR‑574‑5p核酸分子的重组载体或重组细胞在制备糖尿病及其相关疾病预防或治疗药物中的用途。还提供了检测血清或血浆中miR‑574‑5p或其活性表达水平的试剂在制备糖尿病及其相关疾病的预测和/或治疗效果、预后的评估的试剂盒中的用途。经本发明实验证明miR‑574‑5p在人的脂肪组织中高表达，并且随着脂肪细胞分化表达量显著升高；增加miR‑574‑5p促进脂肪细胞分化，对抗肥胖引起的胰岛素抵抗；抑制miR‑574‑5p表达会加重肥胖及胰岛素抵抗现象；在BMI相似的人群中，糖耐量异常和糖尿病人群血清中miR‑574‑5p表达会明显减少。miR‑574‑5p可以用于检测、预防或治疗糖尿病及相关疾病。

Description

miR-574-5p在糖尿病及其相关疾病中的医药用途
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及miR-574-5p的医药用途，具体涉及miR-574-5p在制备糖尿病及其相关疾病预防或治疗药物中的用途。
背景技术
糖尿病是一种以慢性血糖升高为特征的代谢性疾病，主要分为1型和2型，其中2型糖尿病尤为常见。2型糖尿病主要表现为胰岛素抵抗伴或不伴有β细胞功能障碍。糖尿病在全球呈广泛流行趋势，世界卫生组织报道，到2035年，全球糖尿病人数将超过6亿，2 型糖尿病全球发病率为5.4％。中华医学会糖尿病学分会的糖尿病流行病学调查结果显示，2013年我国2型糖尿病患者超过1.39亿，居世界首位。其中30岁以上人群中，2型糖尿病患病率达11.6％。每年有490万人死于糖尿病，其中约50％死于心血管并发症。
肥胖是引起2型糖尿病的一个重要因素，特别是腹部脂肪堆积产生的中心性肥胖是代谢综合征的表现之一。这种中心性肥胖引起脂肪细胞膜上胰岛素受体数目减少，近而发生胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是指人体内胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降。由于细胞膜上胰岛素受体数目减少而导致胰岛素作用下降，因此机体会代偿性分泌更多的胰岛素来发挥降低血糖作用，最终导致胰岛细胞功能的衰竭和胰岛素抵抗，在肥胖的人群中胰岛素抵抗是要比非肥胖的人群明显增加，也就是说肥胖患者体内胰岛素降低血糖的能力是受损的，因此肥胖的人群和非肥胖的人群相比，糖尿病发生的比例明显增高。如果能减少中心性肥胖发生，糖尿病的发生率也会相应下降。
(microRNA，miR)是进化中具有高度保守性的含有22个核苷酸的短链非编码 RNA，具有广泛生物学功能。近年研究表明，microRNA参与肥胖相关的多种生物过程，包括脂肪分化、脂质代谢和改善胰岛素敏感性等。miRNA参与脂肪分化调控报道很多，包括 miR-17-92，miR-210，miR-30，miR-193b通过靶向Rb2/p130，SHIP1，RUNX2和FAK的 3'UTR促进脂肪形成。而miR-130，miR-93，miR-155，miR-26，miR-149-3p通过抑制 PPARγ，Sirt7和FTO(12-16)具有抗脂肪形成活性。目前已有研究证实，miR-574-5p通过介导Wnt/β-catenin信号通路参与肿瘤细胞增殖、迁移和凋亡。但是，它在肥胖和糖尿病发生中的作用及机制尚不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供miR-574-5p在制备糖尿病及其相关疾病预防或治疗药物中的用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
活性成分在制备糖尿病及其相关疾病预防和/或治疗药物及药物组合物中的用途；其中，所述的活性成分选自下组。
(1)miR-574-5p。
(2)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-574-5p。
(3)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录成(2)中所述的前体miRNA，并加工形成miR-574-5p，或能在宿主内加工成miR-574-5p。
(4)表达构建物，所述的表达构建物含有(1)中所述的miR-574-5p、或(2)中所述的前体miRNA、或(3)中所述的多核苷酸。
(5)(1)中所述的miR-574-5p的激动剂。
(6)miR-574-5p的核酸分子或其核酸分子的重组载体或重组细胞。
(7)能够上调miR-574-5p或其活性表达的试剂。
进一步地，糖尿病及其相关疾病为胰岛素抵抗、糖耐量异常、糖尿病和脂肪肝及相关疾病。
一种药物组合物，所述的药物组合包括药学上可接受的载体和选自下组的一种或多种活性成分。
(1)miR-574-5p，或经修饰的miR-574-5p衍生物，或miR-574-5p类似物。
(2)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-574-5p。
(3)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录成(2)中所述的前体miRNA，并加工形成miR-574-5p，或能在宿主内加工成miR-574-5p。
(4)表达构建物，所述的表达构建物含有(1)中所述的miR-574-5p、或(2)中所述的前体miRNA、或(3)中所述的多核苷酸。
(5)(1)中所述的miR-574-5p的激动剂。
(6)miR-574-5p的核酸分子或其核酸分子的重组载体或重组细胞。
(7)能够上调miR-574-5p或其活性表达的试剂。
进一步地，所述药物组合物在制备糖尿病及其相关疾病预防和/或治疗药物中的用途。
检测血清或血浆中miR-574-5p或其活性表达水平的试剂和/或含有检测miR-574-5p 核酸分子表达水平的试剂在制备糖尿病及其相关疾病的预测和/或治疗效果、预后的评估的试剂盒中的用途。
用于筛选预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病的药物的用途。
片段可以作为靶点用于筛选预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病的药物。
一种筛选预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病的潜在药物的方法，所述方法包括。
步骤1、用候选物质处理表达miR-574-5p的体系；和。
步骤2、检测所述体系中miR-574-5p的表达情况。
其中，若所述候选物质可提高miR-574-5p的表达，则表明该候选物质是预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病的潜在物质。
进一步地，步骤1包括：在测试组中，将候选物质加入到表达miR-574-5p的体系中；和/或。
步骤2包括：检测测试组的体系中miR-574-5p的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miR-574-5p的体系。
如果测试组中miR-574-5p的表达在统计学上高于对照组，就表明该候选物是预防和/ 或治疗糖尿病及其相关疾病的潜在物质。
能够调控miR-574-5p片段表达的试剂在制备糖尿病及其相关疾病预防和/或治疗药物中的用途。
本发明中所述的糖尿病及其相关疾病为胰岛素抵抗、糖耐量异常、糖尿病和脂肪肝及相关疾病。
在本发明的实施方案中，其中所述的重组载体为重组腺病毒载体。
在本发明中，所述细胞可以为真核细胞。所述真核细胞例如为哺乳动物细胞。
在本发明中，所述真核细胞例如可以为小鼠脂肪前体细胞等，所述哺乳动物例如可以为大鼠、小鼠、犬、小型猪、猴、人等。
在本发明中，可以利用本领域所知的任何种类的转染方法获得转染有特定核酸或载体的宿主细胞，例如可通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中；或者，可使用脂转染试剂如FuGENE 6、X-tremeGENE和LipofectAmine；或者，可通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的适当病毒病毒载体将核酸引入细胞中。
在本发明中，所述miR-574-5p来源于人。
在本发明的实施方案中，所述miR-574-5p的GenBank号为NC_000004.12。
在本发明中，所述糖尿病具有本领域公知的含义，糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖耐量异常(IGT)是指口服一定量(75g无水或82.5&g含水)葡萄糖后，血糖超过正常水平但是未达到糖尿病诊断标准，是介于糖尿病与正常人之间的一种中间状态。1999年WHO的诊断糖耐量异常标准定义为空腹血糖小于7.0mmol大于等于6.1mmol/l，口服75g葡萄糖液后2h 血糖大于等于7.8mmol小于等于11.1mmol。因此，糖耐量异常是糖尿病的前奏，也称为“糖尿病前期状态”。胰岛素抵抗是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗易导致代谢综合征和2型糖尿病。脂肪肝是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，是一种常见的肝脏病理改变，而非一种独立的疾病。
在本发明中所述预防和/或治疗胰岛素抵抗、糖耐量异常、糖尿病和脂肪肝及相关疾病的发生。
在本发明中所述通过检测miR-574-5p片段表达水平用于预测和/或评估是指当血液、组织或细胞中的miR-574-5p片段表达水平低于参考值时，即可以预测糖尿病及相关疾病发生，或者评估其治疗效果或预后。
在本发明中所述哺乳动物例如可以为小鼠和人等。
在本发明中可以通过本领域公知的方法检测miR-574-5p片段的表达水平，例如通过聚合酶链式反应扩增并进行定量反应。
在本发明中所述上调/下调组织/细胞中miR-574-5p的表达是指提高或降低组织/细胞中mRNA水平至少50％、60％、70％、80％、90％、100％，或者提高大于50％。其中所述的上调或下调是与未干预的组织/细胞(例如转染对照载体组的组织/细胞)进行比较。
与现有技术比，本发明的有益效果如下。
本发明通过大量实验发现，miR-574-5p在人的脂肪组织中高表达，并且随着脂肪细胞分化表达量显著升高。进一步研究发现，增加miR-574-5p促进脂肪细胞分化，对抗肥胖引起的胰岛素抵抗。相反，抑制miR-574-5p表达会加重肥胖及胰岛素抵抗现象。临床研究发现，在BMI相似的人群中，糖耐量异常和糖尿病人群血清中miR-574-5p表达会明显减少。以上结果表明，miR-574-5p可以用于检测、预防或治疗胰岛素抵抗、糖尿病及相关疾病。
附图说明
图1A-1C是miR-574-5p在脂肪组织中高表达。其中，A为miR-574-5p在脂肪组织中高表达(n＝4，**p<0.01与WT-ND相比)；B为miR-574-5p在分化的脂肪细胞中表达增高 (*p<0.05与0day相比，miR-574-5p；&p<0.05与0day相比，Adipoq#p<0.05与0day相比)。
图2是miR-574-5p表达减少与脂肪组织损伤有关。其中，A为PA诱导的脂肪细胞损伤伴随miR-574-5p表达减少(*p<0.05，与Control组相比)；B为HFD喂养小鼠12周后miR-574-5p在脂肪组织中表达显著减少。(n＝4，**p<0.01，与ND相比)；C为糖尿病病人血液中miR-574-5p较对照组显著减少(n＝20,*p<0.05，与Control组相比)。
图3A-3D是增加miR-574-5p改善脂肪前体细胞向脂肪细胞分化。其中A为WesternBlot方法检测增加或者抑制miR-574-5p表达改变脂肪分化基因表达；B为定量分析检测增加或者抑制miR-574-5p表达改变脂肪分化基因表达；C为油红染色检测增加或者抑制miR-574-5p表达改变脂肪细胞分化；D为定量分析显示增加或者抑制miR-574-5p表达增加油红染色阳性细胞比例。
图4A-4L是miR-574-5p过表达改善HFD小鼠脂肪组织分化。其中A-C为HE染色显示过表达miR-574-5p(agomiR-574-5p)改善减少HFD小鼠皮下脂肪细胞体积(B)，抑制炎性巨噬细胞浸润(C)，改善肝脏脂肪变性(n＝4，**p<0.01，与HFD-agomiR-NC组相比)；D-G)Western Blot检测(D)和定量分析(E-G)证实过表达mir-574-5p(agomiR-574- 5p)促进HFD诱导的皮下脂肪组织分化标志蛋白adiponectin和PPARgamma表达(n＝4，**p<0.01，与HFD-agomiR-NC组相比)；H-I为miR-574-5p过表达HFD小鼠糖耐量(H)和胰岛素耐量(I)；J-L为miR-574-5p过表达HFD小鼠血清TG(J)、FFA(K)和 adiponectin(L)水平。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的实验数据均为百分数。两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用 SPSS 24.0软件包处理。P<0.05为有统计学差异。
实施例1miR-574-5p在肥胖并且伴随胰岛素抵抗人群及小鼠血清中表达降低。
(1)小鼠各组织总RNA提取。
异氟烷麻醉断颈处死正常C57BL/6小鼠，提取各组织100mg，使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取总RNA。使用带有gDNA Eraser的PrimeScriptTMRT试剂盒(TakaRa)和特定的RT引物(广州锐博生物公司)，将2μg总RNA反转录为cDNA。在CFX96TouchTM实时PCR检测系统(Hercules)上，使用
Figure RE-GDA0002711979120000061
Fast qPCR混合物(TakaRa)和特定引物(广州锐博生物公司)进行实时定量PCR。U6小核RNA被用作 miRNA的内标。每个反应重复三次，并通过2-ΔΔCt方法进行分析。
(2)检测发现miR-574-5p在小鼠的脂肪组织中具有特定的高表达，这表明miR-574-5p在脂肪组织中可能具有重要的功能如图1A所示。
(3)脂肪前体细胞3T3L1培养和诱导分化。脂肪前体细胞3T3L1购自于中科院细胞库。将3T3-L1细胞在补充有10％新生牛血清(NBS)(Life Technologies Corporation)，1％谷胺酰氨(Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Life TechnologiesCorporation)中培养，1％非必需氨基酸(Invitrogen)和1％丙酮酸钠(Invitrogen)。前脂肪细胞分化培养基(PADM)(ScienCell研究实验室)用于诱导3T3-L1细胞分化为成熟的脂肪细胞。
(4)脂肪细胞分化是其功能的重要方面。为了阐明miR-574-5p在脂肪细胞分化过程中的表达变化，收集了在不同分化时间的3T3-L1。RT-PCR和Western Blot检测发现miR-574-5p表达随着3T3-L1分化时间逐渐增加，表达趋势与脂肪分化蛋白PPARγ和脂联素一致如图1B-1C所示。
(5)Western Blot方法检测蛋白表达。
具体操作如下：将50μg蛋白在95℃煮沸5min后，经12％分离胶行SDS-PAGE 电泳，判断电泳终止时间。以350mA的电流将样品转到纤维素膜上，时间为45min；在 TBS-T稀释的5％脱脂奶粉中常温封闭2h后加入一抗4℃孵育过夜。分别以抗PPARγ (1:1000，美国Abcam公司)\脂联素抗体(1:1000，美国Abcam公司)和抗GAPDH抗体 (1：1 000，美国Abcam公司)作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(美国Cell signalling公司)作为二抗，行Western Blot检测，用ECL试剂盒(美国Amersham公司) 发光显影。
实施例2脂肪损伤引起miR-574-5p表达减少。
(1)棕榈酸(Palmitic acid，PA)处理分化的3T3L1细胞。
将PA(400mM)加入体外分化7天的3T3L1细胞上清中培养24小时后，收集细胞，提取RNA，检测miR-574-5p表达。结果发现，PA处理显著减少miR-574-5p表达，如图2A所示。
(2)HFD处理C57小鼠的肥胖模型。
从南京模型动物中心(中国南京)购买雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄)。本研究得到了北部战区司令部总医院机构动物护理和使用委员会的批准。所有动物实验方案均符合美国国立卫生研究院出版的《实验动物的护理和使用指南》。给小鼠喂食高脂饮食(HFD)12周，然后将其分为两组(每组n＝8)。在异氟烷麻醉条件下处死小鼠，分离脂肪组织并提取mRNA。检测脂肪组织中miR-574-5p的变化，发现在由HFD诱导的肥胖小鼠的脂肪组织中，miR-574-5p的表达显着降低，如图2B所示。
(3)糖尿病病人血清中miR-574-5p表达检测。
收集对照组及糖尿病患者血清及基本信息、既往史、影像学等相关资料；使用Tirzol 法(Invitrogen)提取血清(200μL)中miRNA，逆转录成cDNA后行RT-PCR分析检测miR-574- 5p表达情况。结果证实，糖尿病患者血清中miR-574-5p表达显著低于对照组人群，如图 2C所示。
实施例3miR-574-5p启动脂肪前体细胞分化为脂肪细胞。
为明确miR-574-5p是否参与脂肪细胞分化。在分化的3T3L1细胞中转染过表达miR- 574-5p载体(miR-574-5p mimic)或者miR-574-5p抑制子(inhibitor)，检测其对3T3L1细胞分化的效应。
(1)细胞转染。
使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(invitrogen)将miRNA mimic(100nM)， miRNAinhibitor(100nM)及其对照(广州锐博生物公司)转染到3T3-L1细胞中。培养 48小时后，收集细胞，提取蛋白，行Western blot检测脂肪细胞分化标志蛋白。
(2)细胞油红染色。
油红O溶液购自Sigma公司。将4ml油红O溶液和6ml去离子水混合，即可得到 10ml油红O工作溶液。油红色O的工作溶液必须在使用前过滤。细胞用4％多聚甲醛固定 30分钟，用1x PBS洗涤3次，并在37℃下用Oil-Red O工作溶液染色30分钟。然后将细胞用70％异丙醇洗涤一次，并用去离子水洗涤3次。
(3)Western blot和油红染色结果均证实，过表达miR-574-5p促进3T3L1细胞分化，而减少miR-574-5p表达则抑制脂肪细胞分化，如图3所示。
实验例4在体过表达miR-574-5p抑制HFD诱导的C57/BL6小鼠发生胰岛素抵抗。
(1)建立HFD-过表达miR-574-5p喂养小鼠模型。
喂养肥胖小鼠模型同前。在喂养2个月后，1组小鼠每周两次通过尾静脉给予agomiR-574-5p(每次10mg/kg)，持续3周，另1组接受agomiR-NC(每次10mg/kg)。
(2)葡萄糖耐量试验。
在高脂饮食喂养12周时，以2g/kg剂量向小鼠腹腔注射总体积0.1ml的葡萄糖水溶液，测定注射后15min、30min、60min及120min鼠尾静脉血的血糖水平，判断胰岛细胞功能。
结果显示：与HFD+agomiR-NC组小鼠相比，在相同时间点，HFD+agomiR-574-5p 组小鼠血糖水平显著减少，提示agomiR-574-5p干预后引起葡萄糖耐量改善，如图4所示。
(3)胰岛素耐量试验。
在高脂饮食喂养12周时，以0.75U/kg剂量向小鼠腹腔注射人胰岛素，测定注射后15min、30min、60min及120min鼠尾静脉血的血糖水平，判断胰岛素抵抗情况。
结果显示：与HFD+agomiR-NC组小鼠相比，在相同时间点，HFD+agomiR-574-5p 组小鼠血糖水平显著减少，提示agomiR-574-5p干预后引起葡萄糖耐量改善，如图4所示。
(4)HE染色和免疫组化染色评价脂肪分化情况。
染色具体步骤如下。
1)取材肝脏和脂肪组织，经4％甲醛固定后，常规石蜡包埋，5μm切片。
2)切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(II)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。
3)苏木素染色5min，自来水冲洗。
4)盐酸乙醇分化30s。
5)自来水浸泡15min。
6)置伊红液2min。
7)常规脱水，透明，封片：95％乙醇1min→95％乙醇1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(II)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(II)1min→中性树脂封固。
9)显微镜下观察形态并照相保存用于统计分析。
免疫组化染色具体步骤如下。
1)取材肝脏和脂肪组织，经4％甲醛固定后，常规石蜡包埋，5μm切片。
2)切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(II)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。
3)10％BSA封闭10分钟。
4)加入一抗(F4/80)(1：100)，室温2小时。
5)PBS冲洗3次，每次5分钟。
6)加入HRP标记二抗(1：100)，室温2小时。
)PBS冲洗3次，每次5分钟。
8)DAB显色。
9)常规脱水，透明，封片：95％乙醇1min→95％乙醇1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(II)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(II)1min→中性树脂封固。
10)显微镜下观察形态并照相保存用于统计分析。
结果显示：与HFD+agomiR-NC组小鼠相比，在相同时间点，HFD+agomiR-574-5p 组小鼠血糖水平和血清胰岛素水平显著减少，提示agomiR-574-5p干预后引起葡萄糖耐量和胰岛素耐量改善，如图4所示。
同时HE染色显示，与HFD+agomiR-NC组小鼠相比，在相同时间点，HFD+agomiR-574-5p组小鼠内脏脂肪细胞体积明显减小，巨噬细胞浸润减少，肝脏脂肪变性减少。

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1.miR-574-5p在制备预防和/或治疗肥胖引起的胰岛素抵抗的2型糖尿病药物中的用途。
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