CN102335189B

CN102335189B - 包含针对miR-214的反义多核苷酸的药物组合物

Info

Publication number: CN102335189B
Application number: CN 201110200394
Authority: CN
Inventors: 李英贤; 王晓刚; 李琦; 李莹辉; 白延强; 陈善广
Original assignee: China Astronaut Research and Training Center
Current assignee: China Astronaut Research and Training Center
Priority date: 2011-07-18
Filing date: 2011-07-18
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-07-18
Also published as: CN102335189A

Abstract

本发明涉及包含针对miR-214的反义多核苷酸的药物组合物以及该反义多核苷酸的制药用途。一种药物组合物，其包含针对miR-214的反义多核苷酸作为活性成分，并且包含药物可接受的载体。

Description

包含针对miR-214的反义多核苷酸的药物组合物

技术领域

本发明属于分子生物学和医学领域，尤其涉及反义核酸药物组合物、反义核酸的制药用途。

背景技术

成骨细胞是一种间充质来源的细胞类型，在骨骼发育及骨形成过程中发挥着重要的作用。深入理解成骨细胞功能的调节机制是对抗骨丢失如骨质疏松症的前提条件。在最近的二十年里，分子与遗传学的研究进展揭示了成骨细胞分化过程中的各种调控过程。这些调控的中心是转录因子。RunX2、Osterix和β-catenine是成骨细胞分化过程中必需的转录因子。其他的一些转录因子C/EBPβ、Smad1和Smad5与RunX2相结合增强其转录活性。然而，Twist1可以抑制RunX2的转录活性。然而，在脊椎动物和没有骨骼的无脊椎动物中，编码基因的数目是相当的，因此必然存在除基因的转录调节之外的其余的控制骨骼发育的调节机制。

近来，人们越来越认识到miRNA是在发育、病理与生理条件下发挥重要作用的调控因子，参与肿瘤的发生、病毒的感染、细胞的分化与功能的发挥等一系列的生命过程中。miRNA是单链的小RNA分子，大约21或22个核苷酸长。这些小RNA分子不编码蛋白，但是它们通过降低mRNA的水平或与mRNA 3’UTR相结合抑制翻译，从而降低体内的蛋白水平。令人意想不到的是非编码RNA分子占人类基因组总量的98％，非编码RNA与蛋白编码RNA的比例与发育的复杂性密切相关。

miR-214最早发现在斑马鱼的慢肌发育过程中发挥着重要的作用。后来证实，miR-214可以与Ezh2的3’UTR相结合，降低细胞内Ezh2的水平，从而促进骨骼肌细胞的分化和胚胎干细胞中发育调控因子的转录。在未分化的骨胳肌细胞中，PcG蛋白抑制miR-214的转录，随着发育的进行，伴随着PcG的解离和MyoD以及myogenin的募集，从而激活miR-214的转录。

还有研究表明，miR-214参与神经母细胞瘤的分化、皮层的发育以及胚胎干细胞的分化从而控制神经突的过度生长。在人的前列腺癌细胞中，miR-214表达失调，过表达miR-214降低了对药物的敏感性。在乳腺上皮细胞中，miR-214抑制乳铁蛋白的表达。在T细胞中，CD3与CD28共刺激可以上调miR-214的表达，miR-214通过靶向Pten，增加了T细胞的增殖能力。在C2C12细胞中，通过下调原癌基因N-ras的表达，促进了肌向分化。

Twist1是miR-199a/214这一miRNA转录簇的转录调节因子，参与IKKβ/NF-κB和PTEN/AKT途径的调控，与癌症干细胞的分化密切相关。上皮卵巢癌干细胞(Type I/CD44+)表达较低水平的miR-199a和miR-214，然而较为成熟的卵巢癌细胞(Type II/CD44-)内miR-199a和miR-214的水平较高。

Dnm3os基因敲除的小鼠表现骨发育异常。在C2C12细胞中，miR-214过表达，细胞内发生改变的基因中，5％的基因参与骨的重塑过程。上述的研究结果表明，miR-214在骨发育调控中发挥着重要的作用，但是目前还没有文献报道miR-214在成骨细胞功能调控中的作用。

发明内容

本发明人长期从事miRNA相关的研究工作，在深入的研究中，我们通过大量的实验发现：

miR-214(5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’)(SEQ ID NO：1)在细胞内过表达能显著降低前成骨细胞MC3T3合成碱性磷酸酶(ALP)及骨钙素(OCN)，同时实时PCR的结果显示：MC3T3细胞内ALP及OCNmRNA的水平显著降低，而参与成骨细胞功能调控的转录因子Col1A、ATF4、Runx2及Osx mRNA的水平保持不变。而miR-214的反义寡核苷酸能增强MC3T3细胞合成ALP及OCN的能力，促进ALP及OCN的转录。miR-214的反义寡核苷酸中，有13个核苷酸(5’-CUGUGCCUGCUGU-3’，SEQ IDNO：2)是必需的，其与miR-214中的5’-ACAGCAGGCACAG-3’(SEQ ID NO：3)互补，SEQ ID NO：2中的突变导致其抑制miR-214水平的明显降低。在与miR-214互补的反义核苷酸序列中，单个核苷酸的突变仍具有降低细胞内miR-214水平的效果，但上述单个核苷酸的突变优选存在于SEQ ID NO：2以外的部分。

BMP2诱导的成肌干细胞C2C12在骨向分化的过程中，miR-214的水平明显下降。C2C12细胞转染miR-214后，BMP2诱导C2C12骨向分化的能力明显降低，和对照相比，细胞分泌OCN、ALP的能力明显降低，而转染miR-214的反义核酸后，同样浓度的BMP2诱导同样的时间，OCN的分泌水平明显高于对照组。说明miR-214在骨向诱导分化的过程中发挥着重要的调控作用。

小鼠后肢尾吊、大鼠去卵巢模型诱导的骨丢失、以及骨质疏松病人的骨组织中miR-214的表达水平明显升高，这意味着miR-214可作为骨质疏松早期诊断及预防的生物标志物。

基于上述实验发现，本发明人完成了本发明。即本发明提供：

1.一种药物组合物(以下也称为本发明的药物组合物)，其包含针对SEQID NO：1(miR-214)的多核苷酸的反义多核苷酸作为活性成分，并且包含药物可接受的载体。

2.根据项1所述的药物组合物，其中，所述反义多核苷酸是经化学修饰的。

3.根据项2所述的药物组合物，其中，所述化学修饰是选自低级烷基膦酸酯修饰、硫代磷酸酯修饰、氨基磷酸酯修饰和胆固醇修饰中的至少一种。

4.根据项1所述的药物组合物，其中，所述反义多核苷酸与SEQ ID NO：1的多核苷酸中的至少13个连续的核苷酸互补，所述至少13个连续的核苷酸包含SEQ ID NO：3的多核苷酸。

5.根据项1所述的药物组合物，其中，所述反义多核苷酸可以允许单个核苷酸突变的存在。

6.根据项1所述的药物组合物，其中，所述反义多核苷酸与SEQ ID NO：1的多核苷酸中的22个连续的核苷酸互补。

此外，本发明还提供：

7.针对SEQ ID NO：1的多核苷酸的反义多核苷酸在制备治疗下述疾病的药物中的用途(以下也称为本发明的制药用途)，所述疾病选自成骨细胞功能降低相关的疾病。

8.根据项7所述的用途，其中，所述反义多核苷酸是经化学修饰的。

9.根据项8所述的用途，其中，所述化学修饰是选自低级烷基膦酸酯修饰、硫代磷酸酯修饰、氨基磷酸酯修饰和胆固醇修饰中的至少一种。

10.根据项7所述的用途，其中，所述反义多核苷酸与SEQ ID NO：1的多核苷酸中的至少13个连续的核苷酸互补，所述至少13个连续的核苷酸包含SEQ ID NO：3的多核苷酸。

11.根据项7所述的用途，其中，所述反义多核苷酸可以允许单个核苷酸突变的存在。

12.根据项7所述的用途，其中，所述反义多核苷酸与SEQ ID NO：1的多核苷酸中的22个连续的核苷酸互补。

13.根据项7所述的用途，其中，所述疾病是成骨细胞功能降低相关的疾病如：由于失重或长期卧床导致的废用性骨丢失、老年性骨质疏松或绝经后妇女的骨质疏松。

此外，本发明还提供：

14.治疗下述疾病的方法(以下也称为本发明的疾病治疗方法)，所述疾病选自成骨细胞功能降低相关的疾病；该方法包括对患者施用针对SEQ IDNO：1的多核苷酸的反义多核苷酸的步骤。

15.针对下述疾病的诊断方法(以下也称为本发明的疾病诊断方法)，所述疾病选自成骨细胞功能下降相关的疾病如由于失重或长期卧床导致的废用性骨丢失以及老年性或妇女绝经后导致的骨丢失；该方法包括测定来自患者的样品中SEQ ID NO：1的多核苷酸的量的步骤。

此外，本发明还提供：

1.一种药物组合物，其包含针对SEQ ID NO：1的多核苷酸的反义多核苷酸作为活性成分，并且包含药物可接受的载体。

7.针对SEQ ID NO：1的多核苷酸的反义多核苷酸在制备治疗下述疾病的药物中的用途，所述疾病是成骨细胞功能降低相关的疾病如：长期失重或卧床引起的废用性骨丢失、老年性骨质疏松症等。

11.根据项7所述的用途，上述反义多核苷酸可以允许单个核苷酸突变的存在。

13.根据项7所述的用途，其中，所述疾病是成骨细胞功能降低相关的疾病。

14.根据项13所述的用途，其中，所述成骨细胞功能降低相关的疾病是骨质疏松或废用性骨丢失相关的疾病。

15.根据项7所述的用途，其中，所述疾病是骨丢失。

16.根据项7所述的用途，其中，所述疾病是骨质疏松。

根据本发明，可以提供可用于骨丢失或骨质疏松治疗的药物组合物。此外，本发明针对miR-214的反义多核苷酸可以用于治疗由于成骨细胞功能降低导致的骨丢失或骨质疏松等相关疾病，还可以用于制备治疗由于成骨细胞功能降低而导致的骨丢失或骨质疏松的相关药物。

附图说明

图1MC3T3-E1细胞转染与miR-214不同互补程度的反义核酸后，对细胞内miR-214的抑制效率。1#与miR-214完全互补的寡核苷酸；2#反义核酸的3’端有1个碱基的突变；3#反义核酸的3’端有13个碱基的突变；4#反义核酸的3’端有6个碱基的突变；5#反义核酸的3’端有5个碱基的突变；6#反义核酸的5’端有1个碱基的突变；7#反义核酸的5’端有另外1个碱基的突变；

图2MC3T3-E1细胞转染miR-214及其反义核酸后，细胞内碱性磷酸酶染色的结果。1.Mock；2.miR-214-NC；3.miR-214；4.Mock；5.Anti-miR-214-NC；6.Anti-miR-214。

图3MC3T3-E1细胞转染miR-214及其反义核酸后，细胞内OCN水平的变化结果。

图4MC3T3-E1细胞转染miR-214后，与成骨细胞功能相关的基因OCN，ALP，COL1A，ATF4，RUNX2和OSX在细胞内的表达变化(n＝3)。

图5MC3T3-E1细胞转染miR-214的反义核酸后，与成骨细胞功能相关的基因OCN，ALP，COL1A，ATF4，RUNX2和OSX在细胞内的表达变化(n＝3)。

图6C2C12进行下述转染后，在BMP2的诱导下，48小时内细胞OCN表达的变化曲线。1.Mock；2.miR-214-NC；3.miR-214；4.Mock；5.Anti-miR-214-NC；6.Anti-miR-214。

图7NIH3T3与C2C12两种细胞分别用300ng/ml的BMP2进行诱导，诱导前后细胞内miR-214水平的变化。

图8A～E C2C12细胞在BMP2的诱导下，细胞内OCN、ALP、RunX2、ATF4、Osx mRNA水平的变化。

图9A～C miR-214在小鼠后肢尾吊诱导的骨丢失中的变化。采用小鼠后肢尾吊诱导去负荷导致的骨质丢失，小鼠后肢胫骨与体重的比值在3天、28天及56天的变化规律(A)；尾吊28天组(S28)、对照组(C28)、假尾吊组(Cs28)以及尾吊后每天恢复15分钟(S28+R)，小鼠后肢胫骨与体重的比值变化(B)(^*P＜0.05，^**P＜0.01，n＝10)；尾吊28天组、尾吊组、假尾吊组及尾吊加恢复组，骨组织miR-214水平的变化(R)(^***P＜0.001，n＝10)。

图10去卵巢大鼠的骨组织中miR-214的表达变化。采用大鼠去卵巢诱导骨质疏松模型，大鼠去卵巢及假手术28天后，后肢胫骨miR-214的表达变化(N＝3，P＜0.001)。

图11骨质疏松病人与正常人相比骨组织中miR-214的表达变化。

图12miR-214的反义核酸可以对抗尾吊诱导的骨组织miR-214水平的升高。尾吊前3天，每天通过尾静脉注射80mg/kg/d的经过修饰的miR-214的反义核酸或阴性对照，尾吊28后，取后肢胫骨，提取RNA，通过Q-PCR检测对照组、尾吊组、以及尾吊加核酸干预组骨组织中miR-214的变化。C：对照组；S：尾吊组；S+NC：尾吊+miR-214反义核酸的阴性对照；S+AMO：尾吊+miR-214反义核酸。

图13miR-214的反义核酸在体内对尾吊引起的骨丢失能起到部分对抗作用。对尾吊的小鼠来说，能增加后肢骨重与体重的比例以及ALP与OCN的水平。

图14A～F反义miR-214在体内能对由于尾吊引起的骨小梁结构的改变起到部分恢复的作用。BV/TV：骨小梁相对体积，单位(％)；Conn.Dens：骨小梁连接密度，单位(1/mm³)；Apparent Density：(表观)骨密度，单位(mg/cm³)；Tb.N：骨小梁数量，单位(1/mm)；Tb.Th：骨小梁厚度，单位(um)；Tb.Sp：骨小梁间隙，单位(um)。

具体实施方式

本发明的药物组合物

本发明提供一种药物组合物(本发明的药物组合物)，其包含针对SEQ IDNO：1(miR-214)的多核苷酸的反义多核苷酸作为活性成分，并且包含药物可接受的载体。

在本说明书中，寡核苷酸、多核苷酸与核酸三者可以互换使用，构成上述三者的基本单元均是核苷酸(包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)。

在本说明书中，反义多核苷酸是指反义的核苷酸多聚物。通常，反义多核苷酸通过碱基互补配对与单链核酸(称为靶标核酸优选是单链RNA)形成杂交双链来抑制(优选完全抑制)所述单链核酸的功能。

本发明的反义多核苷酸的靶标核酸是所述的miR-214(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，因此，针对miR-214的多核苷酸，优选是特异性针对miR-214的多核苷酸。对于本发明的反义多核苷酸除13个必需核苷酸外没有特殊限制。反义核酸并非必须与靶标核酸的核苷酸序列完全互补(当然，完全互补是优选的)，本发明的反义多核苷酸除13个必需互补的核苷酸外，单个碱基的突变并不影响结合的效率。

所述反义多核苷酸可以是经化学修饰的，反义多核苷酸的修饰产物也可以用作反义寡核苷酸。所述化学修饰可以包括但不限于，低级烷基膦酸酯(lower alkyl phosphonate)修饰如膦酸甲酯型(methyl-phosphonate type)(甲氧基修饰)或膦酸乙酯型(ethyl-phosphonate-type)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰、氨基磷酸酯(phosphoroamidate)修饰以及胆固醇修饰。本发明的经化学修饰的反义多核苷酸的优选实例是例如AMO-214：5′mA(s)mC(s)mUmGmCmCmUmGmUmCmUmGmUmGmCmCmUmGmC(s)mU(s)mG(s)mU(s)-Chol 3′(SEQ ID NO：4)(前置m表示2’OMe修饰；chol表示3’胆固醇连接；s表示硫代磷酸酯修饰)，其在体内能显著降低miR-214的水平，增加骨的质量、密度以及骨小梁的体积，增强成骨细胞的功能，对抗由于去负荷导致的骨丢失的发生。化学修饰可以增加反义多核苷酸的稳定性或生物利用度，可以采用常规方法对反义寡核苷酸进行化学修饰。

对本发明的药物组合物中包含的所述反义多核苷酸的量没有特殊限制，优选其为药物有效量。药物有效量是指能够使所述反义多核苷酸发挥抑制所述miR-214的功能的作用的量。本领域技术人员可以根据施用对象的情况、药物组合物的剂型等适宜地确定反义多核苷酸的药物有效量。

本发明中，作为药物可接受的载体，可使用常用的各种有机或无机载体物质。本发明的药物组合物可以口服或非口服给药，其剂型可以是例如，粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂等固体制剂，糖浆剂、乳剂、注射剂(包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、点滴剂)等液体制剂，舌下药片、颊含片、含片、微胶囊或经过缓释性包覆处理的制剂、栓剂等。当为固体制剂时，可以适当使用赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等；当为液体制剂时，可以适当使用溶剂、助溶剂、悬浊剂、等渗剂、缓冲剂、去痛剂等。另外，根据需要，还可以加入防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、香料等添加物。

本发明的制药用途

此外，本发明还提供针对SEQ ID NO：1的反义多核苷酸在制备治疗选自成骨细胞功能降低相关的疾病如失重、长期卧床导致的废用性骨丢失、在老年性骨质疏松或绝经后妇女中等人群中发生的骨质疏松病。

例如，可以将所述反义多核苷酸与药物可接受的载体混合来制备治疗上述疾病的药物。关于可以使用的药物可接受的载体以及药物的剂型，可以参照前述。

此外，本发明提供的反义多核苷酸可用于治疗老年性骨质疏松或由于去负荷如长期卧床、失重等因素而导致的骨丢失疾病。例如以其单独或混合形式为有效组分配制成非肠道给药制剂，依据给药模式、受者年龄、体重、疾病程度以适当剂量给药，也可采用基因治疗的方法，以质粒或腺病毒为表达载体，对其进行包装后，使其靶向骨组织发挥作用。

实施例

以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。

1.MC3T3-E1细胞转染与miR-214不同互补程度的反义核酸后，对细胞内miR-214的抑制效率。1#与miR-214完全互补的寡核苷酸；2#反义核酸的3’端有1个碱基的突变；3#反义核酸的3’端有13个碱基的突变；4#反义核酸的3’端有6个碱基的突变；5#反义核酸的3’端有5个碱基的突变；6#反义核酸的5’端有1个碱基的突变；7#反义核酸的5’端有另外1个碱基的突变；上述寡核苷酸中的核糖进行2-甲氧修饰(2’-OMe)，来提高siRNA的稳定性。上述寡核苷酸用Lipofectamin2000(Invitrogen)转染24小时后，通过Q-PCR检测细胞内miR-214的水平。

2.前成骨细胞MC3T3-E1转染miR-214及其反义核酸对细胞内碱性磷酸酶活性的影响。

甲氧基寡核苷酸miR-214由上海吉玛公司化学合成，转染共设1.空白对照组(1)，2.miR-214碱基错配序列组，3.miR-214组，4.空白对照组(2)，5.miR-214反义核酸的碱基错配序列组，6.miR-214的反义核酸序列组。细胞于铺板18-24h后至70-80％融合开始转染，所用试剂为Lipofectamin2000(Invitrogen)。寡核苷酸的工作浓度为50nmol/L。ALP活性的染色测定：细胞用95％乙醇固定10min，晾干，底片孵育，37℃，4h，1％硝酸钴作用2min，冲洗1-2min，1％硫酸铵作用1min，水洗5min，晾干后镜下观察。

3.前成骨细胞MC3T3-E1转染miR-214及其反义核酸后对细胞内骨钙素水平的影响。细胞的转染方法同上，OCN的测定采用放免法，从六孔板中取培养上清100μl检测OCN的含量，采用骨钙素放免试剂盒。根据放射免疫竞争结合的原理，¹²⁵I标记OCN和样品所含OCN与OCN抗体竞争结合，使用分离剂使结合抗体沉淀，4℃离心后，γ计数器测定沉淀物cpm数，根据标准曲线得到样品OCN含量。

4.miR-214对成骨细胞内OCN，ALP，COL1A，ATF4，RUNX2和OSX基因表达的影响。MC3T3-E1细胞转染miR-214后，通过Q-PCR的方法检测上述基因的表达变化。用invitrogen的Trizol抽提总RNA，定量并质检。取3μg总RNA为模板，以随机寡核苷酸为引物，使用invitrogen的SuperScript IIIFirst-Strand Synthesis System试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，使用针对目标基因的特异引物及Takara的SYBR Green荧光定量PCR体系，在Eppendorf mastercycler realplex²定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的Ct值。同时测定待测样品中的看家基因GADPH的Ct值，以此来校正各组样品之间上样量差别，将所得数据标准化后进行比较各组之间目的基因的变化。

用于Q-PCR分析的成骨细胞相关基因的引物序列：

基因	正向引物	反向引物
			GAPDH	TCACCACCATGGAGAAGGC	GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA
ALP	CCAGGGAAGAAGAGATGTTG	GCTCCTATTTGGAGAGCCCCT
			ATF4	AGTGGCATCTGTATGAGCCCA	GCTCCTATTTGGAGAGCCCCT
Runx2	GTTCAACGATCTGAGATTTGTG	GGGAGGATTTGTGAAGACTG
			Osx	AGCGACCACTTGAGCAAACAT	GCGGCTGATTGGCTTCTTCT
Ocn	GCAATAAGGTAGTGAACAGACTCC	GTTTGTAGGCGGTCTTCAAGC
			Col Ia	GCAACAGTCGCTTCACCTACA	CAATGTCCAAGGGAGCCACAT

5.miR-214的反义核酸对成骨细胞内OCN，ALP，COL1A，ATF4，RUNX2和OSX基因表达的影响。实验方法同上。

6.miR-214及其反义核酸对BMP2诱导的C2C12细胞骨向诱导分化的影响。

C2C12细胞均培养于DMEM培养基，10％胎牛血清，5％CO₂37℃培养，C2C12进行下述转染后，在BMP2的诱导下，48小时内细胞OCN表达的变化曲线。1.Mock；2.miR-214-NC；3.miR-214；4.Mock；5.Anti-miR-214-NC；6.Anti-miR-214。

7.C2C12细胞在骨向诱导分化的过程中，细胞内miR-214水平的变化。

NIH3T3与C2C12两种细胞分别用300ng/ml的BMP2进行诱导，诱导前后细胞内miR-214水平的变化。使用Trizol提取细胞或组织中的总RNA，定量并质检。取50-100ng总RNA为模板，使用针对特定miRNA的逆转录引物及invitrogen的SuperScript III First-Strand Synthesis System试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，使用针对目标miRNA的PCR引物及Takara的SYBRGreen荧光定量PCR体系，在Eppendorf mastercycler realplex²定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的Ct值。将所得Ct值通过代入测定标准曲线得出的公式，采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标miRNA的含量。U6基因作为内照对miRNA qPCR检测结果进行标准化校正。mmu-miR-214的反转录引物：

5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTGCC 3’

用于Q-PCR分析的miR-214引物序列：

基因	正向引物	反向引物
			mmu-miR-214	GACAGCAGGCACAGACA	GTGCAGGGTCCGAGGT
U6	CTCGCTTCGGCAGCACA	AACGCTTCACGAATTTGCGT

8.miR-214对C2C12细胞在骨向诱导分化的过程中，细胞内OCN、ALP、RunX2、ATF4、Osx mRNA水平的影响。C2C12细胞分别转染miR-214及其阴性对照，在BMP2的诱导下，在24小时和48小时两个时间点检测细胞内OCN、ALP、RunX2、ATF4、Osx mRNA水平的变化。

9.miR-214在小鼠后肢尾吊诱导的骨丢失中的变化。取8周龄的成年小鼠C57BL/6分为4组：正常对照组、尾吊组、尾吊后miR-214的反义核酸对抗组、miR-214的阴性对照组。尾吊的小鼠尾部悬挂于悬吊笼横梁，使躯干与地面成30°角，小鼠前肢可自由活动，获取水和食物，身体可以360°自由旋转。(A)小鼠后肢胫骨与体重的比值在3天、28天及56天的变化规律；(B)尾吊28天组(S28)、对照组(C28)、假尾吊组(Cs28)以及尾吊后每天恢复15分钟(S28+R)，小鼠后肢胫骨与体重的比值变化(^*P＜0.05，^**P＜0.01，n＝10)；(C)尾吊28天组、尾吊组、假尾吊组及尾吊加恢复组，骨组织miR-214水平的变化(R)(^***P＜0.001，n＝10)。

10.去卵巢大鼠的骨组织中miR-214的表达变化。选取3月龄未经产雌性SD大鼠，分为对照组及去势组。3％的戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉。对照组行单纯开腹，去势组行双侧卵巢切除术，术后于室温下分笼饲养，自由摄水，每天每只给予标准饲料饲养。大鼠去卵巢及假手术28天后，分析后肢胫骨miR-214的表达变化(N＝3，P＜0.001)。

11.骨质疏松病人与正常人相比骨组织中miR-214的表达变化。

12.miR-214的反义核酸对尾吊诱导的骨组织miR-214水平升高的对抗作用。尾吊前3天，每天通过尾静脉注射80mg/kg/d的经过修饰的miR-214的反义核酸或阴性对照，尾吊28后，取后肢胫骨，提取RNA，通过Q-PCR检测对照组、尾吊组、以及尾吊加核酸干预组骨组织中miR-214的变化。C：对照组；S：尾吊组；S+NC：尾吊+miR-214反义核酸的阴性对照；S+AMO：尾吊+miR-214反义核酸。

13.miR-214的反义核酸对尾吊过程中ALP及OCN的表达及后肢骨重与体重的比例变化的影响。小鼠的处理同上，去胫骨，提取RNA，采用Q-PCR分析ALP及OCN mRNA水平的变化。

14.miR-214的反义核酸在体内对由于尾吊引起的骨小梁结构改变的影响。

小鼠的处理同上，取股骨甲醛固定，采用uCT分析骨小梁结构的变化。BV/TV：骨小梁相对体积，单位(％)；Conn.Dens：骨小梁连接密度，单位(1/mm³)；Apparent Density：(表观)骨密度，单位(mg/cm³)；Tb.N：骨小梁数量，单位(1/mm)；Tb.Th：骨小梁厚度，单位(um)；Tb.Sp：骨小梁间隙，单位(um)。

Claims

1.一种药物组合物，其包含针对SEQ ID NO:1的多核苷酸的反义多核苷酸作为活性成分，并且包含药物可接受的载体；其中，所述反义多核苷酸与SEQ ID NO:1的多核苷酸中的至少13个连续的核苷酸互补，所述至少13个连续的核苷酸包含SEQ ID NO:3的多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述反义多核苷酸是经化学修饰的。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，所述化学修饰是选自低级烷基膦酸酯修饰、硫代磷酸酯修饰、氨基磷酸酯修饰和胆固醇修饰中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述反义多核苷酸可以允许单个核苷酸突变的存在。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述反义多核苷酸与SEQID NO:1的多核苷酸中的22个连续的核苷酸互补。

6.针对SEQ ID NO:1的多核苷酸的反义多核苷酸在制备治疗下述疾病的药物中的用途，所述疾病是选自长期失重或卧床引起的废用性骨丢失、老年性骨质疏松症的成骨细胞功能降低相关的疾病；其中，所述反义多核苷酸与SEQ ID NO:1的多核苷酸中的至少13个连续的核苷酸互补，所述至少13个连续的核苷酸包含SEQ ID NO:3的多核苷酸。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述反义多核苷酸是经化学修饰的。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述化学修饰是选自低级烷基膦酸酯修饰、硫代磷酸酯修饰、氨基磷酸酯修饰和胆固醇修饰中的至少一种。