BR112021004451A2 - método para produção de um arenavírus antitumoral, bem como mutantes de arenavírus - Google Patents

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Abstract

“método para produção de um arenavírus antitumoral, bem como mutantes de arenavírus”. a presente invenção refere-se a um mutante de um arenavírus apresentando propriedades antitumorais aperfeiçoadas. a invenção também refere-se a um método de geração de tal mutante de arenavírus, composições farmacêuticas correlacionadas, utilizações médicas, métodos de tratamento, e proteínas e ácidos nucleicos isolados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM ARENAVÍRUS ANTITUMORAL, BEM COMO MUTANTES DE ARENAVÍRUS”.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] A presente invenção reivindica o benefício de prioridade de Pedido de Patente Alemã DE 10 2018 215 551.8 depositado em 12 de setembro de 2018, cujo conteúdo é aqui incorporado como referência em sua totalidade para todos os propósitos.
CAMPO E ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a um método para a prepara- ção de um arenavírus antitumoral, mutantes de arenavírus, proteínas ou peptídeos isolados, em particular, glicoproteínas isoladas, um arenaví- rus e ácidos nucleicos que codificam proteínas ou peptídeos correspon- dentes.
[003] Arenavírus pertence à família de vírus de ARN pleomórfico patogênico humano. Doenças com esses vírus pertencem às zoonoses devido a seu reservatório natural em animais, predominantemente roe- dores. Zoonoses são doenças que podem ser transmitidas de animais para humanos e vice-versa, de humanos para animais.
[004] Pelo menos oito arenavírus são conhecidos por causar uma doença em humanos, tipicamente, meningite asséptica e febre hemor- rágica. Vírus conhecidos que podem causar uma doença em humanos são os vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), vírus guanarito (GTOV), vírus junin (JUNV), vírus de lassa (LASV), vírus lujo (LUJV), vírus machupo (MACV), vírus sabia (SABV) e vírus do arroio de águas brancas (WWAV).
[005] Arenavírus com o gênero mamarenavírus são divididos em dois grupos, os Arenavírus do Velho Mundo e os Arenavírus do Novo Mundo. Esses grupos diferem geográfica e geneticamente. Os Arenaví-
rus do Velho Mundo, tais como o vírus da coriomeningite linfocítica, fo- ram encontrados principalmente em países do Hemisfério Oriental, tais como países europeus, asiáticos e africanos. Em contraste, os Arenaví- rus do Novo Mundo foram encontrados em países do Hemisfério Oci- dental, tais como Argentina, Bolívia, Venezuela, Brasil e Estados Unidos da América.
[006] Arenavírus se replicam na célula e entram no espaço extra- celular como vírions (partículas infecciosas). Os vírions apresentam uma forma pleomórfica, geralmente redonda, com um diâmetro de 110 nm a 130 nm até 50 nm a 300 nm. O capsídeo do vírion é circundado por uma proteína do envelope que consiste de uma membrana lipídica dupla e homotrímeros de glicoproteínas (GP1 e GP2) que se projetam em forma de pontas. GP1 é direcionado para fora e se liga ao receptor celular durante a infecção. GP2 é direcionado na direção oposta e me- deia fusão com a célula. As proteínas Z ficam como um anel abaixo da camada lipídica, localizada dentro do nucleocapsídeo. Os complexos de ribonucleoproteína (RNP) consistem, cada um do segmento de ARN mais curto (segmento S de 3,5 kb), respectivamente, o segmento de ARN mais longo (segmento L de 7,2 kb) e as nucleoproteínas. A prote- ína L, a polimerase viral, está associada aos complexos de RNP. Os segmentos L e S carregam a informação genética e codificam para duas proteínas cada. Os ARNs de fita simples apresentam uma mistura (ou seja, polaridade ambissentido), em suas extremidades 3’ não traduzidas as sequências (aproximadamente 19-30 pb) são conservadas, também dentro da família do vírus. Primeiro, os ARNsm de nucleoproteína e da proteína L são transcritos, seguidos por replicação e transcrição do ARNm da proteína Z e do precursor da glicoproteína e, finalmente, se- guido por tradução e modificação das proteínas virais.
[007] O uso de arenavírus como vetores de vacinação é bem co- nhecido. Um exemplo proeminente é o vírus da vacinação Candid no. 1 usado contra a febre hemorrágica argentina. Esta é uma variante da vacinação do vírus Junin.
[008] A partir de WO 2009/083210 A1, conhece-se o uso de partí- culas defeituosas de replicação, ou seja, partículas de arenavírus gene- ticamente modificadas (vírions), entre outros, para o tratamento de do- enças neoplásicas, tais como melanoma, carcinoma de próstata, carci- noma de mama e carcinoma de pulmão. A publicação “Desenvolvimento de vetores de vírus de coriomeningite linfocítica com defeito de replica- ção para a indução de imunidade potente de células T CD8 +” (Nature Medicine, vol. 16, no. 3, março de 2010, p. 339-345; doi:
10.1038/nm.2104) menciona como uma área de aplicação potencial para tal imunoterapia contra câncer com partículas de vírus.
[009] Ainda, a partir de WO 2006/008074 A1, conhece-se o uso de células de empacotamento que produzem tanto vírions pseudotipados com glicoproteína retroviral quanto com arenavírus para terapia gênica de tumores sólidos.
[010] Métodos do estado da técnica descritos acima para o trata- mento de tumores são baseados no uso de partículas de vírus que são muito complicadas de se gerar por meio de engenharia genética. Além disso, no caso de métodos de tratamento de terapia genética, uma transdução suficiente e terapeuticamente eficaz do tecido tumoral com vírions geneticamente modificados ou células de empacotamento que produzem vírions muitas vezes não é alcançável.
[011] A partir de WO 2016/166285 A1, contudo, são conhecidos arenavírus para o tratamento e/ou prevenção de tumores, em que os arenavírus são livres de ARN genômico estranho. Ainda, a partir de WO 2016/166285 A1 conhece-se um método para a produção de arenavírus com propriedades regressivas do tumor.
[012] Entretanto, existe ainda a necessidade de arenavírus espe-
cíficos e em particular terapeuticamente eficazes para uso no trata- mento e/ou prevenção de tumores.
OBJETIVO E SOLUÇÃO
[013] O objetivo subjacente da presente invenção é produzir are- navírus com propriedades antitumorais e/ou propriedades antitumorais melhoradas. Além disso, o objetivo subjacente da invenção é proporci- onar mutantes de arenavírus correspondentes, proteínas ou peptídeos isolados, em particular, glicoproteínas e/ou proteínas L de arenavírus, bem como ácidos nucleicos que os codificam.
[014] Os objetivos acima são resolvidos por um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica de acordo com a reivindicação indepen- dente 1, um método de acordo com a reivindicação independente 15, um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica de acordo com a rei- vindicação 22, um medicamento ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, uma proteína ou peptídeo isolado de acordo com a reivindicação 28, bem como um ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 29. Modalidades preferidas do método e o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica são objetivos das reivindicações dependentes e da presente descrição. Aspectos adicionais da presente invenção são descritos na invenção. O texto de todas as reivindicações é aqui incorporado por referência explícita ao conteúdo da presente des- crição.
[015] A presente invenção baseia-se no achado surpreendente de que certos mutantes de um arenavírus, em particular, vírus da coriome- ningite linfocítica (LCMV) podem apresentar atividades antitumorais aperfeiçoadas quando comparadas com um vírus do tipo selvagem.
[016] Consequentemente, a presente invenção refere-se geral- mente a um mutante de vírus da coriomeningite linfocítiva, preferencial- mente, um mutante de cepa WE.
[017] O mutante pode ser capaz de sofrer uma propagação mais forte em uma célula tumoral, tal como uma célula H1975, uma célula HCC1954, uma célula cancerosa pancreática murina ou uma célula de melanoma humano, em comparação com a cepa do vírus de coriome- ningite linfocítica de tipo selvagem WE. O mutante pode também ser capaz de induzir uma ativação imune inata mais forte do que LCMV-WE de tipo selvagem in vivo. O mutante também pode ser capaz de apre- sentar um efeito antitumoral mais forte in vivo do que LCMV-WE do tipo selvagem. O mutante também pode ser capaz de aumentar a expansão de células T CD8+ específicas de tumor em comparação com LCMV- WE de tipo selvagem. O mutante também pode ser capaz de aumentar a função de células T CD8+ específicas de tumor. O mutante também pode ter uma capacidade maior para estimular células T específicas de tumor em comparação com o tipo selvagem de LCMV-WE.
[018] O mutante de um vírus da coriomeningite linfocítica da inven- ção compreende preferencialmente um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína, em que a glicoproteína compreende pelo menos uma mu- tação nas posições correspondentes às posições 181 e 185 da sequên- cia da glicoproteína de tipo selvagem apresentada em ID SEQ NO: 10. As mutações preferidas são Arg 185 → Trp e/ou Ile 181 → Met (tal como Arg 185 → Trp apenas, Ile 181 → Met apenas, ou Arg 185 → Trp e Ile 181 → Met) em comparação com a sequência de glicoproteína do tipo selvagem apresentada em ID SEQ NO: 10 e/ou (a)s respectiva(s) pro- teína(s) codificada(s) pelo ácido nucleico. Embora os exemplos do pre- sente pedido demonstrem que a presença de qualquer uma das muta- ções possa já ser suficiente para proporcionar uma função melhorada em relação a um vírus da coriomeningite linfocítica do tipo selvagem, a presença de ambas as mutações recitadas aperfeiçoará ainda a função do LCMV, a qual pode ser aditiva ou mesmo sinergicamente. Conse- quentemente, em uma modalidade preferida, ambas as mutações estão presentes no LCMV da invenção.
[019] Sem desejar ser limitado por teoria, acredita-se ainda que a presença de uma ou duas mutações acima mencionadas na glicoprote- ína pode melhorar a função do LCMV (por exemplo, replicação ou pro- pagação em uma célula tumoral, atividades antitumorais e/ou estimula- ção do sistema imunológico como descrito acima), independente da pre- sença de outras mutações, em particular, de outras mutações em outros genes ou proteínas de LCMV. A suposição baseia-se no achado de que as mutações Arg 185 → Trp e Ile 181 → Met na glicoproteína permane- cem conservadas enquanto algumas outras mutações aparecem e de- saparecem durante as passagens em série e/ou não são conservadas entre as diferentes cepas mutantes. A suposição baseia-se ainda no fato de que a(s) glicoproteína(s) de LCMV formam os picos no envelope do vírion e, portanto, acredita-se que desempenham um papel predomi- nante na capacidade do vírus de infectar uma célula tumoral.
[020] O mutante de LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína, em que a glicoproteína apresenta pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência pelo menos cerca de 98%, de preferência pelo menos cerca de 99%, prefe- rencialmente, pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente, pelo me- nos cerca de 99,2%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7% de identidade de se- quência, para a sequência da glicoproteína de tipo selvagem apresen- tada em ID SEQ NO: 10, e/ou pode compreender (a)s respectiva(s) pro- teína(s) codificada(s) pelo ácido nucleico.
[021] O mutante do LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína, em que a glicoproteína compreende as mutações Arg 185 → Trp e Ile 181 → Met em compara- ção com a glicoproteína de tipo selvagem apresentada em ID SEQ NO:
10.
[022] O mutante do LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína, em que a glicoproteína apresenta pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, prefe- rencialmente, pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente, pelo me- nos cerca de 99,2%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7% de identidade de se- quência, ou é preferencialmente, idêntica a uma sequência apresentada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 18, 26, 34, 42, 50 e 58, e/ou pode compreender (a)s respectiva(s) proteína(s) codificada(s) pelo ácido nu- cleico.
[023] O mutante do LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína, em que o ácido nucleico compreende uma sequência que apresenta pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferên- cia, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, de preferência, pelo menos cerca de 99,5%, de preferência, pelo menos cerca de 99,6%, de preferência, pelo menos cerca de 99,7% de identi- dade de sequência, ou é preferencialmente idêntica, a uma sequência apresentada em ID SEQ Nos: 17, 25, 33, 41, 49 e 57, e/ou pode com-
preender (a)s respectiva(s) proteína(s) codificada(s) pelo ácido nu- cleico.
[024] Como já indicado acima, acredita-se que a(s) glicoprote- ína(s) de LCMV, que formam as pontas no envelope do vírion, desem- penham um papel predominante na capacidade do vírus de infectar cé- lulas tumorais. Entretanto, outras proteínas estão preferencialmente presentes em um LCMV.
[025] O mutante do LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma proteína L que apresenta pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferên- cia, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,2%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7% de identidade de sequência para a sequência da proteína L de tipo selvagem apresentada em ID SEQ NO: 16 e/ou pode compreender uma respectiva proteína codificada pelo ácido nucleico.
[026] O mutante do LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma proteína L, em que a proteína L apre- senta pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de prefe- rência, pelo menos cerca de 99,4%, de preferência, pelo menos cerca de 99,5%, de preferência, pelo menos cerca de 99,6%, de preferência, pelo menos cerca de 99,7%, de preferência, pelo menos cerca de 99,8%, de preferência, pelo menos cerca de 99,9% de identidade de sequência, ou é preferencialmente idêntica a uma sequência apresen- tada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 24, 32, 40, 48, 56 e 64 e/ou podem compreender uma respectiva proteína codificada pelo ácido nu- cleico.
[027] O mutante do LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma proteína L, em que a proteína L com- preende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações nas posições correspon- dentes às posições 253, 1512, 1513, 1758, 1995, 2094, 2115, 2141, 2175 e 2185 da sequência da proteína L de tipo selvagem apresentada em ID SEQ NO: 16. Modalidades preferidas de mutações nessas posi- ções são: Lys 253 → Arg; Lys 1512 → Met; Lys 1513 → Glu; Ser 1758 → Phe; Phe 1995 → Ser; Ile 2094 → Val; Lys 2115 → Glu; Thr 2141> Ala; Arg 2175 → Lys; Thr 2185 → Ala em comparação com a sequência da proteína L de tipo selvagem apresentada em ID SEQ NO: 16 e/ou pode compreender uma respectiva proteína codificada pelo ácido nu- cleico. Preferencialmente, a muteína de LCMV compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 das mutações acima mencionadas.
[028] O mutante de LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma proteína L, em que a proteína L com- preende, em comparação com a sequência de proteína L de tipo selva- gem apresentada em ID SEQ NO: 16, um dos seguintes conjuntos de mutações: Ser 1758 → Phe (correspondendo às mutações da cepa mu- tante P42); Phe 1995 → Ser, opcionalmente, Ile 2094 → Val, e opcio- nalmente, Thr 2141 → Ala (correspondendo às mutações da cepa mu- tante P52, a qual é oligoclonal para as posições 2094 e 2141); Lys 1513 → Glu, Phe 1995 → Ser, e opcionalmente, Arg 2175 → Lys (correspon- dendo às mutações da cepa mutante P91, a qual é oligoclonal para a posição 2175); Lys 253 → Arg; Lys 1512 → Met; Lys 2115 → Glu; Thr 2185 → Ala (correspondendo às mutações da cepa mutante P52-1); Phe 1995 → Ser (correspondendo às mutações da cepa mutante P52-
1.3); ou Lys 2115 → Glu (correspondendo às mutações da cepa mutante P52-2.1), e/ou pode compreender uma respectiva proteína codificada pelo ácido nucleico.
[029] O mutante de LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma proteína L, em que o ácido nucleico apresenta ou é de preferência complementar a uma sequência que apresenta pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de prefe- rência, pelo menos cerca de 99,4%, de preferência, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,6%, preferencial- mente, pelo menos cerca de 99,7%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,8%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,9% de identidade de sequência, ou é preferencialmente idêntica, a uma se- quência apresentada em ID SEQ Nos: 17, 25, 33, 41, 49 e 57, e/ou po- dem compreender uma respectiva proteína codificada pelo ácido nu- cleico.
[030] O mutante de LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma nucleoproteína, em que a nucleoprote- ína apresenta pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferên- cia, pelo menos cerca de 98%, de preferência, de pelo menos cerca de 99%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,2%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,4%, preferencial- mente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência, ou é idêntica a uma nucleoproteína apresen- tada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 12, 20, 28, 36, 44, 52 e 60, e/ou pode compreender uma respectiva proteína codificada pelo ácido nu- cleico.
[031] O mutante de LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma nucleoproteína, em que o ácido nu- cleico apresenta ou - é de preferência complementar a uma sequência que apresenta pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferên- cia, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, de preferência, pelo menos cerca de 99,5%, de preferência, pelo menos cerca de 99,6%, de prefe- rência, pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência ou é idêntica a uma nucleoproteína apresentada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 11, 19, 27, 35, 43, 51 e 59, e/ou pode compreender uma res- pectiva proteína codificada pelo ácido nucleico.
[032] O mutante de LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma proteína Z, em que a proteína Z apre- senta pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98% de preferência, pelo menos cerca de 99%, de pre- ferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, de preferência, pelo menos cerca de 99,5%, de preferência, pelo menos cerca de 99,6%, de preferência, pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência, ou é idêntica, a uma sequência apresentada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 14, 22, 30, 38, 46, 54 e 62, e/ou pode compreender uma respectiva proteína codificada pelo ácido nucleico.
[033] O mutante de LCMV da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma proteína Z, em que o ácido nucleico compreende uma sequência que apresenta pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferên- cia, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, de preferência, pelo menos cerca de 99,5%, de preferência, pelo menos cerca de 99,6%, de preferência, pelo menos cerca de 99,7%, de identi- dade de sequência ou é idêntica a uma sequência apresentada em qual- quer uma das ID SEQ Nos: 13, 21, 29, 37, 45, 53 e 61, e/ou pode com- preender uma respectiva proteína codificada pelo ácido nucleico.
[034] Um mutante de LCMV da invenção pode compreender (a) glicoproteína(s) preferencialmente como aqui definida, uma proteína L de preferência como definida neste relatório, uma proteína Z de prefe- rência como definida neste relatório, e uma nucleoproteína de preferên- cia como aqui definida. Um mutante de LCMV da invenção pode com- preender (a) ácido(s) nucleico(s) que codificam a) glicoproteína(s) de preferência como aqui definidas, uma proteína L de preferência como aqui definida, uma proteína Z de preferência como aqui definida, e uma nucleoproteína de preferência como aqui definida.
[035] Um mutante de LCMV da invenção pode compreender (a) ácido(s) nucleico(s) que codificam as proteínas de ID SEQ Nos: 18, 20, 22 e 24, ou proteínas apresentando pelo menos cerca de 95%, de pre- ferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, preferen- cialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência para essas sequências. A glicoproteína pode compreender uma mutação Ile 181 → Met. A proteína L pode compre- ender uma mutação Ser 1758 → Phe. Um mutante de LCMV da inven- ção pode compreender (a) ácido(s) nucleico(s) que compreende(com- preendem) uma sequência apresentada em ID SEQ Nos: 17 e 21 e que compreende(compreendem) uma sequência que é complementar à se- quência apresentada em ID SEQ Nos: 19 e 23.
[036] Um mutante de LCMV da invenção pode compreender (a) ácido(s) nucleico(s) que codificam as proteínas de ID SEQ Nos: 26, 28, 30 e 32, ou proteínas apresentando pelo menos cerca de 95%, de pre- ferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, preferen- cialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência para essas sequências. A glicoproteína pode compreender uma mutação Ile 181 → Met e uma mutação Arg 185 → Trp. A proteína L pode compreender as seguintes mutações Phe 1995 → Ser, opcionalmente, Ile 2094 → Val e, opcionalmente, Thr 2141> Ala. Um mutante de LCMV da invenção pode compreender (a) ácido(s) nu- cleico(s) que compreende(compreendem) uma sequência apresentada em ID SEQ Nos: 25 e 29 e que compreende(compreendem) uma se- quência que é complementar à sequência apresentada em ID SEQ Nos: 27 e 31.
[037] Um mutante de LCMV da invenção pode compreender (a)
ácido(s) nucleico(s) que codificam as proteínas de ID SEQ Nos: 34, 36, 38 e 40, ou proteínas apresentando pelo menos cerca de 95%, de pre- ferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, preferen- cialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência para essas sequências. A glicoproteína pode compreender uma mutação Ile 181 → Met e Arg 185 → Trp. A proteína L pode compreender as seguintes mutações Lys 1513 → Glu, Phe 1995 → Ser e, opcionalmente, Arg 2175 → Lys. Um mutante de LCMV da invenção pode compreender (a) ácido(s) nucleico(s) que compreende (compreendem) uma sequência apresentada em ID SEQ Nos: 33 e 37 e que compreende (compreendem) uma sequência que é complementar à sequência apresentada em ID SEQ Nos: 35 e 39.
[038] Um mutante de LCMV da invenção pode compreender (a) ácido(s) nucleico(s) que codificam as proteínas de ID SEQ Nos: 50, 52, 54 e 56, ou proteínas apresentando pelo menos cerca de 95%, de pre- ferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, preferen- cialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência para essas sequências. A glicoproteína pode compreender uma mutação Ile 181 → Met e mutação Arg 185 → Trp. A proteína L pode compreender as seguintes mutações Lys 253 → Arg;
Lys 1512 → Met; Lys 2115 → Glu; Thr 2185 → Ala. Um mutante de LCMV da invenção pode compreender (a) ácido(s) nucleico(s) que com- preende(compreendem) uma sequência apresentada em ID SEQ Nos: 41 e 45 e que compreende(compreendem) uma sequência que é com- plementar à sequência apresentada em ID SEQ Nos: 43 e 47.
[039] Um mutante de LCMV da invenção pode compreender (a) ácido(s) nucleico(s) que codificam as proteínas de ID SEQ Nos: 58, 60, 62 e 64, ou proteínas apresentando pelo menos cerca de 95%, de pre- ferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, preferen- cialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência para essas sequências. A glicoproteína pode compreender uma mutação Arg 185 → Trp. A proteína L pode compre- ender uma mutação Phe 1995 → Ser. Um mutante de LCMV da inven- ção pode compreender (a) ácido(s) nucleico(s) que compreende(com- preendem) uma sequência apresentada em ID SEQ Nos: 49 e 53 e que compreende(compreendem) uma sequência que é complementar à se- quência apresentada em ID SEQ Nos: 51 e 55.
[040] Um mutante de LCMV da invenção pode compreender (a) ácido(s) nucleico(s) que codificam as proteínas de ID SEQ Nos: 66, 68, 70 e 72, ou proteínas apresentando pelo menos cerca de 95%, de pre- ferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferência, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, preferen- cialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência para essas sequências. A glicoproteína pode compreender uma mutação Ile 181 → Met. A proteína L pode compre- ender uma mutação Lys 2115 → Glu. Um mutante de LCMV da inven- ção pode compreender (a) ácido(s) nucleico(s) que compreende(com- preendem) uma sequência apresentada em ID SEQ Nos: 57 e 61 e que compreende(compreendem) uma sequência que é complementar à se- quência apresentada em ID SEQ Nos: 59 e 63.
[041] Um LCMV da invenção pode compreender (a) ácido(s) nu- cleico(s) que codificam as proteínas de ID SEQ Nos: 10, 12, 14 e 18, ou proteínas apresentando pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo menos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de preferência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, de preferên- cia, pelo menos cerca de 99,2%, de preferência, pelo menos cerca de 99,3%, de preferência, pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente, pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência para essas sequências. Um LCMV da invenção pode com- preender (a) ácido(s) nucleico(s) que compreende(compreendem) uma sequência apresentada em ID SEQ Nos: 10 e 14 e que compreende (compreendem) uma sequência que é complementar à sequência apre- sentada em ID SEQ Nos: 12 e 16.
[042] A presente invenção também refere-se geralmente a um ví- rus LCMV da descrição, em particular, do mutante de LCMV da inven- ção, para uso em terapia.
[043] Em particular, quando um mutante de LCMV da invenção é usado, tal uso pode compreender uma propagação mais forte do mu- tante de LCMV em um tumor (célula), em comparação com o uso da cepa WE do vírus da coriomeningite linfocítica do tipo selvagem. Tal uso também pode compreender a indução de uma ativação imune inata mais forte em comparação com o uso de LCMV-WE de tipo selvagem in vivo. Tal uso também pode compreender promoção de um efeito an- titumoral mais forte in vivo em comparação com o uso de LCMV-WE do tipo selvagem. Tal uso também pode compreender o aumento da ex- pansão de células T CD8+ específicas de tumor em comparação com o uso de LCMV-WE de tipo selvagem. A utilização também pode compre- ender o aumento da função de células T CD8+ específica de tumor. O uso também pode compreender a estimulação de células T específica de tumor em uma extensão maior em comparação com o tipo selvagem LCMV-WE.
[044] O LCMV (mutante) da invenção pode ser para uso no trata- mento e/ou prevenção de um tumor. O tumor pode ser qualquer tumor descrito neste relatório. O tumor é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em carcinoma, melanoma, blastoma, linfoma e sar- coma.
[045] De acordo com um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um método para a produção de um arenavírus antitumoral, isto é, um arenavírus de combate ou repulsivo a tumor (chamado arenavírus re- gressivo de tumor), em particular, um arenavírus que apresenta, em comparação com um arenavírus original, propriedades antitumorais aperfeiçoadas, isto é, propriedades de combate ou repulsivas a tumores aperfeiçoadas.
[046] O método compreende as seguintes etapas: a) plaqueamento de células tumorais primárias em um meio nu- triente, preferencialmente meio nutriente líquido, ou plaqueamento de células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 para e/ou em um meio nutriente, de preferência, meio nutriente líquido, b) inoculação das células tumorais primárias plaqueadas com um arenavírus original ou inoculação das células plaqueadas da linha- gem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 com um arenavírus original, c) incubação das células tumorais primárias inoculadas ou in- cubação das células inoculadas da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2, ou seja, incubação das células tumorais primárias e o are- navírus original ou incubação das células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 e o arenavírus original sob condições adequadas para causar pelo menos uma porção das células tumorais primárias ino- culadas ou pelo menos uma porção das células inoculadas da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2, em particular, apenas parte das cé- lulas tumorais primárias inoculadas ou apenas parte das células inocu- ladas da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 ou todas as célu- las tumorais primárias inoculadas ou todas as células inoculadas da li- nhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2, para serem infectadas com o arenavírus original, d) extração de um sobrenadante de cultura de células contendo arenavírus a partir de uma cultura de células tumorais primárias incuba- das, ou extração de um sobrenadante de cultura de células contendo arenavírus das células incubadas da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 contendo cultura de células, em que a sequência da etapa a) a d) é repetida uma pluralidade de ve- zes, em que as células tumorais primárias ou as células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 ao realizar a primeira repetição da sequência da etapa a) a d), para realizar a etapa b) é inoculada com o sobrenadante de cultura de células contendo arenavírus ou uma parte deste extraída ao realizar a etapa d) antes da primeira repetição da se- quência da etapa a) a d, e em que as células tumorais primárias ou as células da linhagem celular H1975 , C643 ou Tramp-C2 ao realizar cada repetição adicional da sequência da etapa a) a d), para realizar a etapa b) é inoculada com o sobrenadante de cultura de células contendo are- navírus ou uma parte deste extraída ao realizar a etapa d) de uma re- petição precedente da sequência de etapas a) a d).
[047] A primeira conduta da sequência de etapas a) a d) também pode ser referida como a “primeira passagem” no significado da pre- sente invenção. A primeira passagem é, portanto, realizada com o are- navírus original como inóculo. Cada passagem adicional é então reali- zada com um sobrenadante de cultura de células contendo arenavírus ou parte deste extraído na etapa d) de uma passagem precedente, de preferência, imediatamente precedente. A partir da realização de uma segunda passagem em diante, a passagem pode ser referida como “passagem repetida”, dentro do significado da presente invenção.
[048] O termo “arenavírus original” no contexto da presente inven- ção pode ser entendido como significando um arenavírus que é usado antes da primeira repetição da sequência da etapa a) a d), ou seja, antes da primeira passagem para inoculação das células do tumor primário ou as células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 (etapa b)). O “arenavírus original” pode referir-se ao que é descrito em mais detalhes abaixo, um arenavírus do tipo selvagem ou um mutante do mesmo. Em particular, o termo pode referir-se a um arenavírus original sem proprie- dades antitumorais ou com propriedades antitumorais.
[049] O termo “arenavírus do tipo selvagem” no contexto da pre- sente invenção deve ser entendido como significando um arenavírus com um genoma que ocorre na natureza em sua forma geneticamente normal.
[050] O termo “células tumorais primárias” no contexto da presente invenção deve ser entendido como significando células tumorais não passadas ou não, isto é, células tumorais isoladas diretamente de um tecido tumoral ou células tumorais isoladas diretamente de um tecido tumoral, que foram passadas antes da realização da etapa a) um má- ximo de 1.000 vezes, em particular, um máximo de 100 vezes, de pre- ferência, um máximo de 10 vezes, ou células tumorais primárias que são caracterizadas por apresentar clones celulares diferentes. No caso deste último, heterogeneidade pode ser demonstrada por diferentes ex- pressões de proteínas e por diferentes sequências de ADN (impressão digital genética).
[051] O termo “linhagem celular H1975” no contexto da presente invenção deve ser entendido como significando uma linhagem celular que foi isolada a partir de um adenocarcinoma humano e é depositada em ATCC (American Type Culture Collection) sob a designação NCI- H1975 (ATCC® CRL-5908®) e sob o número de acesso ou depósito CVCL-1511.
[052] O termo “linhagem celular C643” no contexto da presente in- venção deve ser entendido como significando uma linhagem celular que foi isolada a partir de carcinoma anaplásico da tireoide humana deposi- tado sob a designação C643 e sob o número de acesso ou depósito CVCL-5969 (ExPASy Cellosaurus).
[053] O termo “linhagem celular Tramp-C2” no contexto da pre- sente invenção deve ser entendido como significando uma linhagem ce- lular isolada a partir de um adenocarcinoma murino e depositada sob a designação Tramp-C2 e sob o número de acesso ou depósito CVCL- 3615 (ExPASy Cellosaurus).
[054] O termo “plaqueamento” no contexto da presente invenção deve ser entendido como significando a semeadura ou introdução de células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 para e/ou em um meio de cultura, preferencialmente, um meio de cultura líquido. Em outras palavras, o termo “plaqueamento” no sentido desta invenção deve ser entendido como significando o cultivo, em particular o cultivo inicial, de células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 em e/ou em um meio de cultura, de preferência, meio de cultura líquido.
[055] O termo “cepa WE do vírus da coriomeningite linfocítica” pode referir-se à cepa LCMV-WE que foi descrita por Seiler, P., e outros, J. Immunol. 162 (8), 4536-4541 (1999). O termo “cepa WE do vírus da coriomeningite linfocítica”, como aqui utilizado, refere-se preferencial- mente a um LCMV que compreende glicoproteínas apresentando a se- quência das posições 59-265 e 266-498 da ID SEQ NO: 10, uma nucle- oproteína apresentando a sequência da ID SEQ NO: 12; uma proteína Z apresentando a sequência de ID SEQ NO: 14; e/ou uma proteína L apresentando a sequência de ID SEQ NO: 16. O termo “cepa WE do vírus da coriomeningite linfocítica”, como utilizado neste relatório, tam- bém refere-se preferencialmente a um LCMV que compreende um ou mais, de preferência, duas moléculas de ácido nucleico, que compreen- dem sequências que são complementares às sequências de ID SEQ Nos: 9, 11, 13 e/ou 15.
[056] O termo “arenavírus mutante” ou “mutante de um arenavírus” no contexto da presente invenção deve ser entendido como significando um arenavírus cujo genoma e/ou proteoma apresenta pelo menos uma mutação, em particular, pelo menos uma mutação pontual, com relação ao genoma e/ou proteoma de seu tipo selvagem. Preferencialmente, o termo “mutante de arenavírus” ou “mutante de um arenavírus” deve ser entendido como um arenavírus com uma proteína, em particular, glico- proteína e/ou proteína L, que tem em relação a uma proteína correspon- dente, em particular, glicoproteína e/ou proteína L de um arenavírus de tipo selvagem correspondente, pelo menos uma mutação, de preferên- cia, na forma de uma substituição de aminoácido.
[057] Consequentemente, o termo “mutante do vírus da coriome- ningite linfocítica” deve ser entendido como um mutante do vírus da co-
riomeningite linfocítica, cujo genoma e/ou proteoma apresenta em rela- ção ao genoma e/ou proteoma do vírus da coriomeningite linfocítica de tipo selvagem em pelo menos uma mutação, em particular, pelo menos uma mutação pontual. De preferência, o termo “mutante do vírus da co- riomeningite linfocítica” deve ser entendido como significando um are- navírus com uma proteína, em particular, glicoproteína e/ou proteína L, que apresenta, em relação a uma proteína correspondente, em particu- lar, glicoproteína e/ou proteína L, do vírus da coriomeningite linfocítica de tipo selvagem pelo menos uma mutação, preferencialmente, na forma de uma substituição de aminoácido.
[058] O termo “glicoproteína” no contexto da presente invenção deve ser entendido como significando uma macromolécula que consiste de uma proteína, a qual em um determinado contexto também pode ser referida como uma porção de proteína, ou componente de proteína e um ou mais grupos de carboidratos ligados covalentemente (grupos de açúcar), em particular, grupos monossacarídeo e/ou oligo e/ou polissa- carídeo.
[059] O termo “passagem repetida” ou “passando repetido” no con- texto da presente invenção, a não ser que estabelecido de outro modo, deve-se entender como um processo único ou repetido em que células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 são tratadas com arenavírus produzido a partir de células tu- morais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp- C2. Portanto, um meio de cultura para células tumorais primárias ou cé- lulas da linhagem celular H1975 C643 ou Tramp-C2, tal como DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) com soro fetal de bezerro a 10% (FKS) e penicilina/estreptomicina/glutamina a 1% (equivalente a 1 unidade/ml de penicilina, 100 micrograma/ml de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina), devem ser utilizados. Células tumorais primárias não infectadas ou células não infectadas da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 são plaqueadas preferencialmente 0 a 7 dias, em particu- lar 1 a 7 dias, antes da etapa de inoculação (etapa b). De preferência, um meio de cultura utilizado para o plaqueamento celular é substituído antes da etapa de inoculação por um meio de cultura fresco. Em alguns casos, o meio de cultura pode ser extraído 1, 10 ou 100 minutos após a etapa de inoculação (etapa b) e substituído por um meio de cultura fresco. Após um período de incubação de 24, 48, 72 ou 96 horas, um sobrenadante de cultura de células contendo um acúmulo de arenavírus mutados é extraído. Parte desse sobrenadante é adicionado a novas células tumorais primárias não infectadas ou células das linhagens ce- lulares H1975, C643 ou Tramp-C2.
[060] O termo “ácido nucleico”, tal como utilizado neste relatório, pode referir-se geralmente a ADN ou ARN. ADN e ARN diferem - entre outros - em suas nucleobases. A base complementar para adenina em ADN é timina, enquanto no ARN é uracila. Para fins de simplificação, a base correspondente à adenina é denotada como “t” em todo o pedido, a qual - dependendo de seu contexto - pode se referir a timina (no ADN) ou uracila (no ARN).
[061] O termo “codificação” ou “codifica(codificam)”, tal como utili- zado neste relatório no contexto de um ácido nucleico, refere-se a um ácido nucleico apresentando uma sequência que pode ser traduzida em uma sequência de aminoácidos particular que é codificada pelo ácido nucleico. A sequência de ácido nucleico pode abranger a sequência de uma fita de codificação e também pode abranger a sequência de uma fita que é complementar à fita de codificação.
[062] “Porcentagem (%) de identidade de sequência” em relação às sequências descritas neste relatório defina-se como a porcentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em uma sequência candi- data que são idênticas em pares aos resíduos de aminoácidos ou nu- cleotídeos em uma sequência de referência, após o alinhamento das sequências e a introdução de lacunas, se necessário, para atingir a por- centagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de se- quência. O alinhamento para fins de determinação da identidade de se- quência de aminoácidos percentual pode ser alcançado de várias ma- neiras que estão dentro do estado da técnica, por exemplo, usando sof- tware de computador disponível publicamente, tais como software BLAST, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados no estado da técnica podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo, quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo sobre o comprimento total das sequências que são comparadas. O mesmo é verdadeiro para as sequências de nucleotí- deos descritas neste relatório. Para determinar identidade de sequên- cia, uracila (por exemplo, em ARN) pode ser considerada idêntica à ti- mina (por exemplo, em ADN).
[063] A invenção também se baseia no achado surpreendente de que através da passagem de células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 infectadas com um arena- vírus, pode ser produzido um arenavírus com propriedades antitumo- rais, em particular um arenavírus com propriedades antitumorais aper- feiçoadas comparadas com o arenavírus que foi utilizado. A produção de tal arenavírus baseia-se no fato de que o arenavírus original, geral- mente, um arenavírus do tipo selvagem, é dificilmente capaz de se pro- liferar nas células tumorais primárias ou nas células da linhagem celular H1975. Uma proliferação igualmente limitada foi observada nas linha- gens celulares C643 e Tramp-C2. A proliferação limitada desencadeia um aumento da pressão de seleção ou adaptação no arenavírus durante a infecção e replicação nas células tumorais primárias ou nas células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2. Mutantes de vírus emergi-
dos aleatoriamente, que foram capazes de se proliferar nas células tu- morais primárias ou nas células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2, supercrescem o arenavírus original, geralmente, o arenaví- rus do tipo selvagem. Através da passagem, em particular, uma passa- gem repetida (repetição múltipla da sequência da etapa a) para d)), re- sulta preferencialmente em um enriquecimento de um arenavírus, que apresenta um efeito antitumoral em relação às células tumorais primá- rias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 ou que apresenta propriedades antitumorais aperfeiçoadas em comparação com o arenavírus original. O efeito antitumoral do mutante de arenavírus baseia-se no fato de que este pode infectar melhor as células e se re- plicar melhor dentro das células. Ao fazer isso, o mutante de arenavírus pode se espalhar com mais sucesso nas células usadas em compara- ção com o arenavírus original e, em particular, promover a ativação imu- nológica intensificada. Uma vez que muitas células tumorais não apre- sentam quaisquer fatores antivirais e, portanto, mostram uma resistên- cia viral limitada, o método de acordo com a invenção pode ser particu- larmente vantajoso não apenas para a produção de um arenavírus an- titumoral, mas também para a produção de um arenavírus específico de tumor, isto é, para a produção de um arenavírus antitumoral e específico de tumor.
[064] As células tumorais primárias, bem como as células das li- nhagens celulares H1975, C643 e Tramp-C2 foram identificadas pelos inventores como células que surpreendentemente permitem apenas uma replicação reduzida de arenavírus e que no decurso de passagem desencadeiam uma pressão de seleção particularmente elevada ou compulsão de adaptação em arenavírus.
[065] Em uma modalidade da invenção, as células tumorais primá- rias são passadas antes de realização da etapa a) no máximo 1.000 vezes, em particular, no máximo 100 vezes, de preferência, no máximo
10 vezes. O termo “passagem” deve, neste contexto, ser entendido como a diluição das células em uma cultura de células, desse modo, a absorção das células em uma suspensão e plaqueamento de uma parte das células (por exemplo, 50%, 10% ou 1%) em um novo meio nutriente. Quanto menos as células tumorais primárias são passadas antes de etapa a), maior quantidade das células corresponde às propriedades das células tumorais de um paciente. Em particular, grandes diferenças (heterogeneidade) entre células tumorais primárias individuais na mor- fologia, padrão de expressão de ARN, expressão de proteína e células tumorais de mapa de sequência de ADN in vivo. Desse modo, um are- navírus pode ser produzido de forma vantajosa, o qual é particularmente adequado para um tratamento terapêutico de respectivos pacientes com tumores, em determinados grupos de pacientes.
[066] Em particular, as células tumorais primárias podem antes de etapa a) ser submetidas a nenhuma passagem. Em outras palavras, para realizar a etapa a) não passadas, isto é, podem ser utilizadas cé- lulas tumorais primárias não passadas. Desse modo, o arenavírus origi- nal ou o arenavírus contido no sobrenadante da cultura de células ex- traídas ou uma parte do mesmo é forçada a se adaptar às células que representam as células tumorais de um paciente particularmente bem. Ao fazer isso, é possível gerar arenavírus particularmente adequados para o tratamento terapêutico de respectivos pacientes com tumores, em particular grupos de pacientes dos mesmos.
[067] As células já frequentemente passadas das linhagens celu- lares H1975, C643 e Tramp-C2, foram identificadas pelos inventores como células igualmente adequadas, embora já foram passadas in vitro por anos.
[068] Em uma modalidade adicional da invenção, a etapa c) é re- alizada durante um período de 1 hora a 1.000 horas, em particular, 3 horas a 300 horas, de preferência, 12 horas a 96 horas. Os períodos de tempo descritos neste parágrafo mostraram ser particularmente benéfi- cos para incubação eficiente e, consequentemente, a infecção das cé- lulas tumorais primárias inoculadas ou das células inoculadas da linha- gem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 com o arenavírus original ou o arenavírus contido no sobrenadante de cultura de células extraído ou parte deste.
[069] Em uma outra modalidade da invenção, a etapa (b) e/ou a etapa (c) é realizada sob uma temperatura de 4°C a 50°C, em particular, de 20°C a 42°C, preferencialmente, de 34°C a 39°C. As faixas de tem- peratura descritas neste parágrafo foram verificadas particularmente vantajosas para inoculação e/ou incubação eficiente (e, consequente- mente, infecção) das células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 com o arenavírus original ou o are- navírus contido no sobrenadante de cultura de células extraído ou parte do mesmo.
[070] Em uma modalidade adicional da invenção, a etapa a) e/ou a etapa b) e/ou a etapa c) e/ou etapa d) são realizadas em um meio nutriente preferencialmente selecionado do grupo que consiste em RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute), DMEM (Dulbecco's Modi- fied Eagle's Medium) e IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium). O meio nutriente pode conter ainda soro (0,1 - 20%), tal como soro fetal de bezerro e/ou soro humano, e/ou aminoácidos, tais como glutamato e/ou glutamina e/ou antibióticos. Um meio de cultura permite o cultivo das células tumorais primárias ou das células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2. Em particular, um meio de cultura favorece com particular vantagem o crescimento e/ou divisão celular das células tumorais primárias ou das células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2. Os meios de cultura mencionados neste parágrafo são par- ticularmente adequados para o cultivo de células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2.
[071] Em uma modalidade adicional da invenção, a etapa a) e/ou a etapa b) e/ou etapa c) são realizadas sob uma atmosfera de dióxido de carbono (atmosfera de CO2) de 0% a 20%, em particular, de 0,1% a 20%, preferencialmente, de 2% a 10%, mais preferencialmente, de 4% a 6%. Isso permite que o pH de um meio nutriente usado para a etapa a) e/ou a etapa b) e/ou etapa c) seja mantido constante. Isso permite o plaqueamento e/ou inoculação e/ou incubação (e, consequentemente, infecção) eficientes das células tumorais primárias ou das células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 com o arenavírus original, respectivamente, o arenavírus contido no sobrenadante da cultura celu- lar extraída ou parte deste.
[072] Preferencialmente, a etapa a) e/ou a etapa b) e/ou etapa c) são realizadas em uma incubadora, por meio da qual as condições ex- ternas controladas para crescimento e/ou divisão celular das células tu- morais primárias ou das células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 podem ser criadas.
[073] Em uma modalidade adicional da invenção, a sequência de etapas a) a d) é repetida 3 vezes a 1.000 vezes, em particular, 10 vezes a 100 vezes, de preferência, 20 vezes a 50 vezes. Uma repetição múl- tipla da sequência de etapas a) para d), em particular, como descrita neste parágrafo, mostrou ser particularmente benéfica em vista do de- senvolvimento de mutações benéficas no que diz respeito às proprieda- des antitumorais, em particular, mutações pontuais e, consequente- mente, à produção de um arenavírus antitumoral.
[074] Na modalidade adicional da invenção, o meio nutriente é substituído por um meio nutriente fresco ou novo antes de realização da etapa b). Através desta etapa, as condições de infecção podem ser van- tajosamente padronizadas.
[075] Em uma modalidade adicional da invenção, o meio de cultura é substituído por um meio de cultura novo ou fresco dentro de um perí- odo de 0,1 minuto a 600 minutos, em particular 1 minuto a 30 minutos, de preferência, de 5 minutos a 15 minutos após a etapa b). Essa etapa aumenta vantajosamente a pressão de seleção da infecção, visto que o tempo de infecção é limitado.
[076] Em uma modalidade adicional da invenção, múltiplas mu- danças do meio nutriente são realizadas. Por exemplo, o meio nutriente pode ser substituído por um meio nutriente novo ou fresco antes da etapa b) e o último pode ser substituído por um meio nutriente novo ou fresco dentro de um período de 0,1 minuto a 600 minutos, em particular de 1 minuto a 30 minutos, de preferência, de 5 minutos a 15 minutos após realização da etapa b).
[077] Em uma outra modalidade da invenção, as células tumorais primárias ou as células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 e/ou o arenavírus original e/ou o arenavírus contido no sobrenadante de cultura de células extraído ou parte deste são tratadas com pelo menos um agente quimioterapêutico antes de realização da etapa d), em parti- cular, antes de realização da etapa c), em particular, antes de realização da etapa b), em particular antes de realização da etapa a). Desse modo, podem ser simuladas células tumorais que já foram tratadas quimiote- rapeuticamente. Isto permite vantajosamente a produção de um arena- vírus que é particularmente adequado para o tratamento de pacientes com tumor que já foram tratados com quimioterapia e/ou que são con- siderados já submetidos a todas as opções de terapia.
[078] Na modalidade adicional da invenção, o arenavírus original e/ou o arenavírus contido no sobrenadante de cultura de células extra- ído ou uma parte deste é antes de realização da etapa b) tratado com pelo menos um agente quimioterapêutico. Desse modo, a taxa de mu- tação natural no arenavírus pode ser vantajosamente aumentada e, as- sim, acelerar sua adaptação às células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2.
[079] Pelo menos um agente quimioterapêutico pode, em particu- lar, ser selecionado do grupo que consiste em alquilantes, inibidores de topoisomerase, inibidores mitóticos, antimetabólitos, antibióticos, inibi- dores de quinase, derivados de talidomida, indutores de apoptose celu- lar, terapêuticos biológicos, tais como citostáticos biológicos, compostos contendo isótopos, hormônios, antagonistas de hormônios, inibidores de histona desacetilase e outros agentes citostáticos.
[080] Os agentes alquilantes podem ser selecionados do grupo que consiste em oxazafosforinas, derivados perdidos N, sulfonatos de alquila, hidrazinas, substâncias contendo platina, antraciclinas e mistu- ras de pelo menos dois dos agentes alquilantes acima.
[081] As oxazafosforinas podem, por exemplo, ser selecionadas do grupo que consiste em ciclofosfamida, ifosfamida e misturas dos mesmos.
[082] Os derivados perdidos em N podem ser selecionados do grupo que consiste em clorambucila, melfalano e misturas dos mesmos.
[083] Os sulfonatos de alquila podem, por exemplo, ser husulfano.
[084] As hidrazinas podem, por exemplo, ser selecionadas do grupo que consiste em temozolomida, dacarbazina, procarbazina e mis- turas de pelo menos duas das hidrazinas acima.
[085] As substâncias contendo platina podem, por exemplo, ser selecionadas do grupo que consiste em cisplatina, carboplatina, oxali- platina e misturas de pelo menos duas das substâncias contendo pla- tina.
[086] As antraciclinas podem, por exemplo, ser selecionadas do grupo que consiste em doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, elir- rubicina e misturas de pelo menos duas das antraciclinas.
[087] Os inibidores de topoisomerase acima mencionados podem ser selecionados do grupo que consiste em inibidores de topoisomerase
I, inibidores de topoisomerase II (etoposídeo) e misturas dos mesmos.
[088] Por exemplo, os inibidores de topoisomerase I podem ser selecionados do grupo que consiste em irinotecano, topotecano e mis- turas dos mesmos.
[089] Inibidores de topoisomerase II podem ser etoposídeo, por exemplo.
[090] Os inibidores de mitose ou antimetabólitos mencionados acima podem ser selecionados do grupo que consiste em alcaloides de vinca, taxanos, antagonistas de ácido fólico, antagonistas de pirimidina, antagonistas de purina, inibidores de ribonucleotídeo reductase e mis- turas de pelo menos dois dos inibidores de mitose ou antimetabólitos mencionados acima.
[091] Por exemplo, os alcaloides de vinca podem ser selecionados do grupo que consiste em vincristina, vimblastina e misturas dos mes- mos.
[092] Taxanos podem ser selecionados do grupo que consiste em docetaxel, paclitaxel e misturas dos mesmos.
[093] Por exemplo, os antagonistas de ácido fólico podem ser se- lecionados do grupo que consiste em metotrexato, pemetrexed e mistu- ras dos mesmos.
[094] Os antagonistas de pirimidina podem, por exemplo, ser sele- cionados do grupo que consiste em citarabina, 5-fluorouracila, gencita- bina, capecitabina e misturas de pelo menos dois dos antagonistas de pirimidina.
[095] Os antagonistas de purina podem, por exemplo, ser selecio- nados do grupo que consiste em 5-azacitidina, azatioprina, 6-mercapto- purina, fludarabina e misturas de pelo menos dois dos antagonistas de purina.
[096] Por exemplo, o inibidor de ribonucleotídeo reductase pode ser hidroxiuréia.
[097] Os antibióticos acima podem ser selecionados do grupo que consiste em bleomicina, actinomicina D, mitomicina e misturas de pelo menos dois dos antibióticos acima.
[098] Os inibidores de quinase mencionados acima podem ser se- lecionados do grupo que consiste em afatinib, alectinib, axitinib, crizoti- nib, cobimetinib, dasatinib, dabrafenib, erlotinib, gefitinib, imatinib, ixa- zomib, lenvatinib, nilotinib, osimertinib, palbociclib, pazopanib, ponati- nib, regorafenib, sunitinib, vemurafenib, trametinib, everolimus e mistu- ras de pelo menos dois dos inibidores de quinase.
[099] Os derivados da talidomida mencionados acima podem ser selecionados do grupo que consiste em lenalidomida, pomalidomida e misturas dos mesmos.
[100] Os indutores de apoptose celular mencionados acima podem ser selecionados do grupo que consiste em metoxais, venetoclax e mis- turas dos mesmos.
[101] A terapêutica biológica mencionada acima pode ser selecio- nada do grupo que consiste em rituximab, trastuzumab, cetuximab, pa- nitumumab, ipilimumab, pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, ave- lumab, nivolumab, olaratumab, ramucirumab e misturas de pelo menos dois dos terapêuticos biológicos mencionados acima.
[102] Os hormônios e/ou antagonistas hormonais mencionados acima podem ser selecionados do grupo que consiste em buserelina, goserelina, leuprorelina, triptorelina, estramustina, tamoxifeno, inibido- res de aromatase, tal como anastrozol, antiandrógenos, tais como en- zalutamida, flutamida, bicalutamida progestinas, tais como acetato de megestrol e acetato de medroxiprogesterona, glucocorticoides e mistu- ras de pelo menos dois dos hormônios e/ou antagonistas hormonais acima mencionados.
[103] Os outros agentes citostáticos mencionados acima podem ser selecionados do grupo que consiste em bexaroteno, afatinib, crizo- tinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, dasatinib, imatinib, nilotinib, ponatinib, regorafenib, sonidegib, hidroxicarbamida, trametinib, tretininoína, isotre- tinoína, alitretinoína, MAOP (éster metílico do ácido 5-amino-4-oxopen- tanóico) e misturas de pelo menos dois dos outros agentes citostáticos precedentes.
[104] Além disso, as células tumorais primárias ou as células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 e/ou o arenavírus original e/ou o arenavírus contido no sobrenadante de cultura de células extra- ído ou uma parte do mesmo, antes de realização da etapa d), em parti- cular, antes de realização da etapa c), em particular, antes de realização da etapa b), em particular, antes de realização da etapa a), podem ser tratadas com radiação, em particular, selecionada do grupo que consiste em raios ultravioleta (UV), em particular, raios UVA e/ou raios UVB, raios alfa, raios beta, raios gama e raios-X. Desse modo, as células tu- morais podem ser vantajosamente simuladas, as quais já foram subme- tidas à radiação terapêutica. Isso permite vantajosamente a produção de um arenavírus, que pode ser usado especialmente para o tratamento de pacientes com tumor que já foram tratados com radioterapia.
[105] Além disso, o arenavírus original e/ou o arenavírus contido no sobrenadante de cultura de células extraído ou parte dele antes de realizar a etapa b) ser tratado com radiação, em particular selecionado do grupo que consiste em raios ultravioleta (UV), em particular UVA raios e/ou raios UVB, raios-alfa, raios-beta, raios gama e raios-X. Desse modo, a taxa de mutação natural no arenavírus e, portanto, sua adap- tação às células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 pode ser vantajosamente aumentada.
[106] Em outra modalidade da invenção, células tumorais primá- rias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 são usa- das, as quais são resistentes a pelo menos um agente quimioterápico.
Por exemplo, podem ser utilizadas células tumorais primárias resisten- tes a paclitaxel e/ou trametinib. Desse modo, as células tumorais de um paciente podem ser vantajosamente simuladas, as quais são resisten- tes a pelo menos um agente quimioterápico durante o tratamento do tumor. As modalidades da invenção descritas neste parágrafo represen- tam, portanto, outras possibilidades para a produção de um poderoso arenavírus antitumoral.
[107] Em uma modalidade adicional da invenção, as células tumo- rais primárias ou as células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp- C2 e/ou o arenavírus original e/ou o arenavírus contido no sobrenadante de cultura de células extraído ou uma parte deste são antes de realiza- ção da etapa d), em particular, antes de realização da etapa c), em par- ticular antes de realização da etapa b), em particular antes de realização da etapa a) tratados com pelo menos um composto antiviral, em parti- cular com alfa-interferon e/ou gama-interferon. Desse modo, o arenaví- rus original ou o arenavírus contido no sobrenadante da cultura celular extraído ou em uma parte do mesmo pode ser vantajosamente forçado a se adaptar em um ambiente antiviral, em que um arenavírus antitumo- ral exibindo resistência ao mesmo tempo pode ser produzido. Tal are- navírus é particularmente eficaz do ponto de vista terapêutico, como também pode ser usado para combater o tecido tumoral que pode exibir resistência viral.
[108] Além disso, o método pode compreender uma etapa adicio- nal e) isolar e/ou identificar um arenavírus antitumoral, em particular, um arenavírus, o qual apresenta propriedades antitumorais aperfeiçoadas em relação ao arenavírus original, a partir do sobrenadante de cultura de células extraído ou uma parte deste por meio de clonagem e/ou RCP (reação em cadeia da polimerase) e/ou sequenciamento.
[109] As células tumorais primárias utilizadas preferencialmente são células tumorais malignas primárias, em particular, células de car- cinoma primário, células de melanoma primário, células de blastoma pri- márias, células de linfoma primário ou células de sarcoma primárias.
[110] Em uma modalidade adicional da invenção, as células tumo- rais primárias são células de melanoma coroidal primárias, células de carcinoma anal primárias, células de angiossarcoma primárias, células de astrocitoma primárias, células de carcinoma basocelular primárias, células de carcinoma cervical primárias, células de condrossarcoma pri- márias, células de carcinoma coriônico primárias, células de carcinoma de células escamosas dérmicas primárias, células de carcinoma de in- testino delgado primárias, células de carcinoma endometrial primárias, células de sarcoma de Ewing primárias, células de fibrossarcoma pri- márias, células de carcinoma de vesícula biliar primárias, células de car- cinoma de ducto biliar primárias, células de glioblastoma primárias, cé- lulas de carcinoma de bexiga primárias, células de carcinoma de uretra primárias, células de carcinoma uretral primárias, células de carcinoma hepatocelular primárias, células tumorais testiculares primárias, células de carcinoma hipofaríngeo primárias, células de carcinoma pituitário pri- márias, células de sarcoma de Kaposi primárias, células de carcinoma brônquico de pequenas células primárias, células de carcinoma de có- lon primárias, células de carcinoma colorretal primárias, células de car- cinoma laríngeo primárias, células de leiomiossarcoma primárias, célu- las de lipossarcoma primárias, células de carcinoma gástrico primárias, células de histiocitoma fibroso maligno primárias, células de carcinoma de mama primárias, células de meduloblastoma primárias, células de melanoma primárias, células de carcinoma do assoalho oral primárias, células de carcinoma sinusal primárias, células de carcinoma nasofarín- geo primárias, células de carcinoma do córtex adrenal primárias, células de carcinoma da paratireoide primárias, células de sarcoma neurogê-
nico primárias, células de carcinoma brônquico de células não peque- nas primárias, células de carcinoma renal primárias, células de carci- noma orofaríngeo primárias, células de osteossarcoma primárias, célu- las de carcinoma ovariano primárias, células de tumor pancreático pri- márias, células de carcinoma peniano primárias, células de feocromoci- toma primárias, células de mesotelioma pleural primárias, células de carcinoma da próstata primárias, células de carcinoma retal primárias, células de retinoblastoma primárias, células de rabdomiossarcoma pri- márias, células de carcinoma tireoidiano primárias, células de carci- noma da glândula salivar primárias, células de carcinoma de esôfago primárias, células de carcinoma de amígdala primárias, células de car- cinoma vaginal primárias, células de carcinoma vulvar primárias, células tumorais de Wilms primárias, células de tumores neuroendócrinos pri- márias ou células de carcinoma da língua primárias.
[111] Particularmente preferidas são células de melanoma primá- rias, células de carcinoma pulmonar primárias, células de carcinoma pancreático primárias, células de carcinoma de cólon primárias, células de carcinoma gástrico primárias, células de carcinoma de faringe primá- rias, células de carcinoma de laringe primárias, células de carcinoma de células renais primárias são particularmente preferidas como células tu- morais primárias, células de carcinoma ovariano primárias, células de carcinoma endometrial primárias, células de carcinoma de tireoide pri- márias, células de carcinoma de próstata primárias, células de carci- noma hepático primárias ou células de sarcoma primárias, tais como células primárias de sarcoma neurogênico, células primárias de osteos- sarcoma ou células primárias de rabdomiossarcoma.
[112] Em uma modalidade adicional da invenção, utiliza-se um arenavírus do tipo selvagem, isto é, um arenavírus chamado tipo selva- gem, como o arenavírus original.
[113] Em uma modalidade adicional da invenção, um arenavírus do velho mundo é utilizado como o arenavírus original. O arenavírus do velho mundo é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em Vírus Catarina, Vírus Danfenong, Vírus Ippy (IP-PYV), Vírus Kodoko, Vírus Lassa (LASV), Vírus da Coriomeningite Linfocítica (LCMV), Vírus Morogoro, Vírus Mobala (MOBV), Vírus Gairo e Vírus Mopeia (MOPV), Vírus Pinhal e Vírus Skinner Tank.
[114] Prefere-se como arenavírus original o vírus da coriomenin- gite linfocítica, em particular um tipo selvagem do vírus da coriomenin- gite linfocítica. Por exemplo, uma cepa do vírus da coriomeningite linfo- cítica, em particular, selecionada do grupo que consiste em WE, Arms- trong, Clone 13 (Clone 13) e Docile, pode ser usada como o arenavírus original.
[115] Particularmente preferido é o vírus da coriomeningite linfocí- tica de tipo selvagem, isto é, um vírus da coriomeningite linfocítica de tipo selvagem compreendendo uma proteína L que compreende ou con- siste de uma sequência de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 7, e/ou um ácido nucleico, em particular, ácido ribonucleico, preferencial- mente, ácido ribonucleico L, compreendendo ou consistindo em uma sequência de ácido nucleico, em particular, sequência de ácido ribonu- cleico, de preferência, sequência de ácido ribonucleico L, a qual é com- plementar a uma sequência de ácido nucleico de acordo com ID SEQ NO: 8.
[116] Além disso, um arenavírus do novo mundo pode ser usado como arenavírus original. O arenavírus do novo mundo é preferencial- mente selecionado do grupo que consiste em Vírus Allpahuayo (ALLV), Vírus Amapari (AMAV), Vírus Bear Canyon (BCNV), Vírus Chapare, Ví- rus Cupixi (CPXV), Vírus Flexal (FLEV), Vírus Guanarito (GTOV), Vírus Junin (JUNV), Candid no. 1 (Candid No.1).), Vírus Latino (LATV), vírus Machupo (MACV), vírus Oliveros (OLVV), vírus Parana (PARV), vírus
Picinídeo (PICV), Vírus Pirital (PIRV), vírus Sabiá (SABV), vírus Taca- ribe (TCRV), vírus Tamiami (TAMV) e vírus arroyo Whitewater (WWAV).
[117] Além disso, um arenavírus sem propriedades antitumorais pode ser utilizado como o arenavírus original.
[118] Alternativamente, um arenavírus original com propriedades antitumorais pode ser utilizado.
[119] De acordo com um segundo aspecto, a invenção refere-se a um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica, isto é, um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica.
[120] O mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreende uma proteína ou peptídeo, em particular, uma glicoproteína. A proteína ou peptídeo compreende uma mutação, em particular, uma mutação pontual. A mutação, em particular a mutação pontual, é preferencial- mente diferente das sequências AJ297484, AJ233196 e da sequência de referência LCMV, (cepa WE-Essen).
[121] Preferencialmente, o mutante do vírus da coriomeningite lin- focítica apresenta uma glicoproteína, em particular, um componente de proteína ou uma porção de proteína de uma glicoproteína, com pelo me- nos uma mutação, em que pelo menos uma mutação é uma substituição de aminoácido da isoleucina na posição 181 da glicoproteína por outro aminoácido, preferencialmente metionina, e/ou uma substituição de aminoácido da arginina na posição 185 da glicoproteína por outro ami- noácido, preferencialmente triptofano.
[122] Alternativamente ou em combinação, o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreende preferencialmente uma proteína L com pelo menos uma mutação, em que pelo menos uma mutação é uma substituição de aminoácido da lisina na posição 1513 da proteína L por outro amino ácido, de preferência, glutamato, e/ou uma substitui- ção de aminoácido da fenilalanina na posição 1995 da proteína L por outro aminoácido, preferencialmente, serina, e/ou uma substituição de aminoácido de isoleucina na posição 2094 da proteína L por outro ami- noácido, preferencialmente valina, e/ou uma substituição de aminoácido de treonina na posição 2141 da proteína L por outro aminoácido, de preferência, alanina, e/ou uma substituição de aminoácido de arginina na posição 2175 da proteína L por outro aminoácido, preferencialmente lisina.
[123] Alternativamente ou em combinação, o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreende preferencialmente uma proteína ou peptídeo, em particular uma glicoproteína, em particular, um compo- nente de proteína ou uma porção de proteína de uma glicoproteína, ou uma proteína L, compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 18, ID SEQ NO: 26, ID SEQ NO: 34, ID SEQ NO: 42, ID SEQ NO: 50, ID SEQ NO: 58, ID SEQ NO: 24, ID SEQ NO: 32, ID SEQ NO: 40, ID SEQ NO: 48, ID SEQ NO: 56, e ID SEQ NO: 64. As sequên- cias de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 18, ID SEQ NO: 26, ID SEQ NO: 34, ID SEQ NO: 42, ID SEQ NO: 50 e ID SEQ NO: 58 são preferencialmente sequências de amino- ácidos de uma glicoproteína do mutante do vírus da coriomeningite lin- focítica. A sequência de aminoácidos de ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 24, ID SEQ NO: 32, ID SEQ NO: 40, ID SEQ NO: 48, ID SEQ NO: 56 e ID SEQ NO: 64 são preferencialmente a sequência de aminoácidos de uma proteína L do mutante do vírus da coriomeningite linfocítica.
[124] Alternativamente ou em combinação, o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreende preferencialmente um ácido nu- cleico, em particular ácido ribonucleico, o qual codifica uma proteína ou peptídeo, em particular, uma glicoproteína ou proteína L, compreen- dendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 18, ID SEQ NO: 26, ID SEQ NO: 34, ID SEQ NO: 42, ID SEQ NO: 50, ID SEQ
NO: 58, ID SEQ NO: 24, ID SEQ NO: 32, ID SEQ NO: 40, ID SEQ NO: 48, ID SEQ NO: 56 ou ID SEQ NO: 64.
[125] Alternativamente ou em combinação, o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreende preferencialmente um ácido nu- cleico, em particular ácido ribonucleico, o qual compreende uma se- quência de ácido nucleico, em particular sequência de ácido ribonu- cleico, ou consiste de uma sequência de ácido nucleico, em particular sequência de ácido ribonucleico, a qual é complementar a uma sequên- cia de ácido nucleico de acordo com ID SEQ NO. 2, ID SEQ NO. 4, ID SEQ NO. 6, ID SEQ NO: 17, ID SEQ NO: 25, ID SEQ NO: 33, ID SEQ NO: 41, ID SEQ NO: 49, ID SEQ NO: 57, ID SEQ NO: 23, ID SEQ NO: 31, ID SEQ NO: 39, ID SEQ NO: 47, ID SEQ NO: 55 ou ID SEQ NO: 63.
[126] Verificou-se surpreendentemente que um respectivo mu- tante/respectivos mutantes do vírus da coriomeningite linfocítica - con- forme descrito nos parágrafos precedentes - apresenta/apresentam competência de replicação aperfeiçoada em células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, bem como propriedades antitu- morais ou propriedades antitumorais aperfeiçoadas, em particular, em relação ao tipo selvagem do vírus da coriomeningite linfocítica.
[127] Além disso, prefere-se que o códon para isoleucina na posi- ção 181 da glicoproteína seja substituído por outro códon, preferencial- mente por um códon para metionina.
[128] Além disso, prefere-se que o códon para arginina na posição 185 da glicoproteína seja substituído por outro códon, preferencialmente por um códon para triptofano.
[129] Além disso, prefere-se que o códon para histidina na posição 155 da glicoproteína seja substituído por outro códon, preferencialmente um códon para tirosina.
[130] Além disso, prefere-se que o códon para arginina na posição
358 da glicoproteína seja substituído por outro códon, preferencial- mente, por um códon para lisina.
[131] Além disso, prefere-se também que o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreenda um ácido nucleico, em particular ácido ribonucleico, preferencialmente, ácido ribonucleico L, compreen- dendo uma mutação, em que a mutação é uma substituição de nucleo- tídeo de adenina na posição 4537 do ácido nucleico, em particular, ácido ribonucleico, preferencialmente, ácido ribonucleico L, por guanina.
[132] Além disso, prefere-se que o mutante do vírus da coriome- ningite linfocítica compreenda um ácido nucleico, em particular, ácido ribonucleico, de preferência, ácido ribonucleico L, o qual codifica uma proteína L compreendendo uma mutação, em que a mutação é uma substituição de aminoácido da lisina na posição 1513 da proteína L, por outro aminoácido, preferencialmente por glutamato.
[133] Além disso, prefere-se que o mutante do vírus da coriome- ningite linfocítica compreenda um ácido nucleico, em particular, um ácido ribonucleico, de preferência ácido ribonucleico L, o qual codifica uma proteína L compreendendo uma mutação, em que a mutação é uma substituição de aminoácido do fenilalanina na posição 1995 da pro- teína L, por outro aminoácido, preferencialmente por uma serina.
[134] Além disso, prefere-se também que o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreenda um ácido nucleico, em particular ácido ribonucleico, de preferência, ácido ribonucleico L, compreen- dendo uma mutação, em que a mutação é uma substituição de nucleo- tídeo de timina na posição 5984 do ácido nucleico, em particular, ácido ribonucleico, preferencialmente, ácido ribonucleico L, preferencial- mente, pelo nucleotídeo citosina.
[135] Além disso, prefere-se também que o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreenda um ácido nucleico, em particular,
ácido ribonucleico, preferencialmente, ácido ribonucleico L, o qual codi- fica uma proteína L compreendendo uma mutação, em que a mutação é uma substituição de aminoácido da isoleucina na posição 2094 da proteína L, por outro aminoácido, preferencialmente por valina.
[136] Além disso, prefere-se que o mutante do vírus da coriome- ningite linfocítica compreenda um ácido nucleico, em particular, ácido ribonucleico, preferencialmente, ácido L-ribonucleico, compreendendo uma mutação, em que a mutação é uma substituição de nucleotídeo de adenina na posição de nucleotídeo 6280 do ácido nucleico, em particu- lar, ácido ribonucleico, preferencialmente, ácido ribonucleico L, por ou- tro nucleotídeo, preferencialmente guanina.
[137] Além disso, prefere-se que o mutante do vírus da coriome- ningite linfocítica compreenda um ácido nucleico, em particular, ácido ribonucleico, preferencialmente, ácido ribonucleico L, que codifica uma proteína L compreendendo uma mutação, em que a mutação é uma substituição de aminoácido da treonina na posição 2141 da proteína L, por outro aminoácido, de preferência por alanina.
[138] Além disso, prefere-se também que o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreenda um ácido nucleico, em particular, ácido ribonucleico, de preferência, ácido ribonucleico L, compreen- dendo uma mutação, em que a mutação é uma substituição de nucleo- tídeo de adenina na posição 6421 do ácido nucleico, em particular, ácido ribonucleico, preferencialmente, ácido ribonucleico L, preferencialmente por outro nucleotídeo, preferencialmente guanina.
[139] Além disso, prefere-se também que o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreenda um ácido nucleico, em particular ácido ribonucleico, de preferência, ácido ribonucleico L, o qual codifica uma proteína L compreendendo uma mutação, em que a mutação é uma substituição de aminoácido de arginina na posição 2175 da prote- ína L, preferencialmente por lisina.
[140] Além disso, prefere-se também que o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreenda um ácido nucleico, em particular ácido ribonucleico, de preferência, ácido ribonucleico L, compreen- dendo uma mutação, em que a mutação é uma substituição de nucleo- tídeo de guanina na posição 6524 do ácido nucleico, em particular ácido ribonucleico, de preferência, ácido ribonucleico L, pelo nucleotídeo ade- nina.
[141] Em outra modalidade da invenção, o mutante do vírus da co- riomeningite linfocítica é um mutante do vírus da coriomeningite linfocí- tica, incluindo, qualquer mutante do vírus da coriomeningite linfocítica da invenção, para aplicação ou uso em medicina.
[142] Preferencialmente, o mutante do vírus da coriomeningite lin- focítica é um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica para aplica- ção ou uso no tratamento e/ou prevenção de um tumor.
[143] O tumor é preferencialmente selecionado do grupo que con- siste em carcinoma, melanoma, blastoma, linfoma e sarcoma.
[144] O termo “carcinoma” no contexto da presente invenção deve- se entender significar uma neoplasia maligna de origem epitelial.
[145] O termo “sarcoma” no contexto da presente invenção deve- se entender significar uma neoplasia maligna de origem mesodérmica.
[146] O termo “melanoma” no contexto da presente invenção deve-se entender significar uma neoplasia maligna de origem melano- cítica.
[147] O termo “linfoma” no contexto da presente invenção deve-se entender significar uma neoplasia maligna de origem linfocítica.
[148] O termo “blastoma” no contexto da presente invenção deve- se entender significar uma neoplasia maligna de origem embriônica.
[149] O carcinoma é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em carcinoma anal, carcinoma brônquico, carcinoma pulmo- nar, carcinoma endometrial, carcinoma da vesícula biliar, carcinoma da bexiga, carcinoma hepatocelular, carcinoma testicular, carcinoma do có- lon, carcinoma colorretal, carcinoma retal, carcinoma da laringe, carci- noma do esôfago, carcinoma gástrico, carcinoma da mama, carcinoma renal, carcinoma ovariano, carcinoma pancreático, carcinoma da fa- ringe, carcinoma da orofaringe, carcinoma da próstata, carcinoma da tiroide e carcinoma cervical.
[150] O sarcoma pode ser selecionado do grupo que consiste em angiossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, fibrossarcoma, sarcoma de Kaposi, lipossarcoma, leiomiossarcoma, histiocitoma fi- broso maligno, sarcoma neurogênico, osteossarcoma e rabdomiossar- coma.
[151] Ainda, o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica pode ser preparado ou usado para administração local, em particular intra- muscular, intraperitoneal ou subcutânea.
[152] Alternativamente, o mutante do vírus da coriomeningite linfo- cítica pode ser preparado ou usado para administração sistêmica, em particular intravenosa.
[153] Para características e benefícios adicionais do mutante do vírus da coriomeningite linfocítica, faz-se referência completa à descri- ção precedente e à seguinte.
[154] De acordo com um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreendendo ou consistindo em uma proteína ou peptídeo, em particular, glicoproteína ou proteína L, compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 18, ID SEQ NO: 26, ID SEQ NO: 34, ID SEQ NO: 42, ID SEQ NO: 50, ID SEQ NO: 58, ID SEQ NO: 66, ID SEQ NO: 24, ID SEQ NO: 32, ID SEQ NO: 40, ID SEQ NO: 48, ID SEQ NO: 56 ou ID SEQ NO: 64.
[155] Alternativamente ou em combinação, o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreende um ácido nucleico, em particular ácido ribonucleico, em que o ácido nucleico, em particular o ácido ribo- nucleico, compreende uma sequência de ácido nucleico, em particular uma sequência de ácido ribonucleico, ou consiste de uma sequência de ácido nucleico, em particular sequência de ácido ribonucleico, a qual é complementar a uma sequência de ácido nucleico de acordo com ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 17, ID SEQ NO: 25, ID SEQ NO: 33, ID SEQ NO: 41, ID SEQ NO: 49, ID SEQ NO: 57, ID SEQ NO: 65, ID SEQ NO: 23, ID SEQ NO: 31, ID SEQ NO: 39, ID SEQ NO: 47, ID SEQ NO: 55 ou ID SEQ NO: 63.
[156] Preferencialmente, o mutante do vírus da coriomeningite lin- focítica é um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica para aplica- ção ou uso em medicina.
[157] O mutante do vírus da coriomeningite linfocítica é particular e preferencialmente um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica para uso ou aplicação no tratamento e/ou prevenção de um tumor.
[158] O tumor é preferencialmente selecionado do grupo que con- siste em carcinoma, melanoma, blastoma, linfoma e sarcoma.
[159] O termo “carcinoma” no contexto da presente invenção deve- se entender significar uma neoplasia maligna de origem epitelial.
[160] O termo “sarcoma” no contexto da presente invenção deve- se entender significar uma neoplasia maligna de origem mesodérmica.
[161] O termo “melanoma” no contexto da presente invenção deve-se entender significar uma neoplasia maligna de origem melano- cítica.
[162] O termo “linfoma” no contexto da presente invenção deve-se entender significar uma neoplasia maligna de origem linfocítica.
[163] O termo “blastoma” no contexto da presente invenção deve- se entender significar uma neoplasia maligna de origem embriônica.
[164] O carcinoma é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em carcinoma anal, carcinoma brônquico, carcinoma pulmo- nar, carcinoma endometrial, carcinoma da vesícula biliar, carcinoma da bexiga, carcinoma hepatocelular, carcinoma testicular, carcinoma do có- lon, carcinoma colorretal, carcinoma retal, carcinoma da laringe, carci- noma do esôfago, carcinoma gástrico, carcinoma da mama, carcinoma renal, carcinoma ovariano, carcinoma pancreático, carcinoma da fa- ringe, carcinoma da orofaringe, carcinoma da próstata, carcinoma da tiroide e carcinoma cervical.
[165] O sarcoma pode ser selecionado do grupo que consiste em angiossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, fibrossarcoma, sarcoma de Kaposi, lipossarcoma, leiomiossarcoma, histiocitoma fi- broso maligno, sarcoma neurogênico, osteossarcoma e rabdomiossar- coma.
[166] Ainda, o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica pode ser preparado ou usado para administração local, em particular intra- muscular, intraperitoneal ou subcutânea.
[167] Alternativamente, o mutante do vírus da coriomeningite linfo- cítica pode ser preparado ou usado para administração sistêmica, em particular intravenosa.
[168] Com relação a outras características e vantagens do mu- tante do vírus da coriomeningite linfocítica, a fim de evitar repetições, faz-se também referência completa à descrição precedente, em particu- lar às declarações feitas no contexto do segundo aspecto da invenção. As características e vantagens aqui descritas, em particular em relação ao mutante do vírus da coriomeningite linfocítica, a proteína ou peptí- deo, em particular, glicoproteína, e o ácido nucleico, em particular ácido ribonucleico, também se aplicam mutatis mutandis ao mutante do vírus da coriomeningite linfocítica de acordo com o terceiro aspecto da inven- ção.
[169] De acordo com um quarto aspecto, a invenção refere-se a um fármaco ou medicamento que compreende um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica de acordo com o segundo ou terceiro aspecto da invenção.
[170] O fármaco ou medicamento pode compreender ainda um bloqueador de ponto de controle (checkpoint), tal como PD-1 (Program- med Cell Death Protein 1) (Proteína 1 de morte celular programada) e/ou um modulador de apoptose, em particular um inibidor de apoptose, tal como SMAC-mimético (LCL-161).
[171] O fármaco ou medicamento compreende de preferência e ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo pode ser se- lecionado do grupo que consiste em água, solução salina aquosa, solu- ção tamponada aquosa, meio de cultura de células e combinações de pelo menos dois dos veículos precedentes.
[172] Com relação às características e vantagens adicionais do fármaco ou medicamento, a fim de evitar repetições, faz-se referência completa à descrição precedente, em particular às declarações feitas no contexto do segundo e terceiro aspectos da invenção. As caracterís- ticas e vantagens aqui descritas, em particular, em relação ao mutante do vírus da coriomeningite linfocítica, também se aplicam mutatis mu- tandis ao fármaco ou medicamento referido no quarto aspecto da inven- ção.
[173] De acordo com um quinto aspecto, a invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo, que é preferencialmente uma proteína ou peptídeo isolado, em particular uma glicoproteína ou uma proteína L, compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 7, ID SEQ NO: 10, ID SEQ NO: 18, ID SEQ NO: 26, ID SEQ NO: 34, ID SEQ NO: 42, ID SEQ NO: 50, ID SEQ NO: 58, ID SEQ NO: 24, ID SEQ NO: 32, ID SEQ NO: 40, ID SEQ NO: 48, ID SEQ NO: 56 ou ID SEQ
NO: 64. A invenção também refere-se a uma proteína ou peptídeo iso- lado apresentando pelo menos cerca de 95%, de preferência, pelo me- nos cerca de 96%, de preferência, pelo menos cerca de 97%, de prefe- rência, pelo menos cerca de 98%, de preferência, pelo menos cerca de 99%, de preferência, pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,2%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,4%, preferencial- mente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,7% de identidade de sequência para ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 7, ID SEQ NO: 10, ID SEQ NO: 18, ID SEQ NO: 26, ID SEQ NO: 34, ID SEQ NO: 42, ID SEQ NO: 50, ID SEQ NO: 58, ID SEQ NO: 24, ID SEQ NO: 32, ID SEQ NO: 40, ID SEQ NO: 48, ID SEQ NO: 56 ou ID SEQ NO: 64.
[174] As sequências de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 1 e ID SEQ NO: 3 são preferencialmente a sequência de aminoácidos de uma glicoproteína, em particular um componente de proteína ou uma porção de proteína de uma glicoproteína, de um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica. A sequência de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 5 é de preferência a sequência de aminoácidos de uma proteína L de um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica. A se- quência de aminoácidos de ID SEQ NO: 7 é preferencialmente a se- quência de aminoácidos de uma proteína L de um vírus da coriomenin- gite linfocítica de tipo selvagem.
[175] A invenção também refere-se a uma proteína ou peptídeo, que é preferencialmente uma proteína ou peptídeo isolado, em particu- lar uma nucleoproteína ou uma proteína Z, compreendendo ou consis- tindo em uma sequência de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 12, ID SEQ NO: 20, ID SEQ NO: 28, ID SEQ NO: 36, ID SEQ NO: 44, ID SEQ NO: 52, ID SEQ NO: 60, ID SEQ NO: 14, ID SEQ NO: 22, ID
SEQ NO: 30, ID SEQ NO: 38, ID SEQ NO: 46, ID SEQ NO: 54 ou ID SEQ NO: 62. A invenção também refere-se a uma proteína ou peptídeo isolado apresentando pelo menos cerca de 95%, de preferência pelo menos cerca de 96%, de preferência pelo menos cerca de 97%, de pre- ferência pelo menos cerca de 98%, de preferência pelo menos cerca de 99%, de preferência pelo menos cerca de 99,1%, de preferência pelo menos cerca de 99,2%, de preferência pelo menos cerca de 99,3%, de preferência pelo menos cerca de 99,4%, de preferência pelo menos cerca de 99,5%, de preferência pelo menos cerca de 99,6%, de prefe- rência pelo menos cerca de 99,7% de identidade de sequência com ID SEQ NO: 12, ID SEQ NO: 20, ID SEQ NO: 28, ID SEQ NO: 36, ID SEQ NO: 44, ID SEQ NO: 52, ID SEQ NO: 60, ID SEQ NO: 14, ID SEQ NO: 22, ID SEQ NO: 30, ID SEQ NO: 38, ID SEQ NO: 46, ID SEQ NO: 54 ou ID SEQ NO: 62.
[176] Com relação a outras características e vantagens da prote- ína ou peptídeo, a fim de evitar repetições, faz-se também referência completa à descrição precedente, em particular às declarações feitas no segundo e terceiro aspectos da invenção. As vantagens e caracte- rísticas aqui descritas, em particular em relação a proteína ou peptídeo, em particular glicoproteína, também se aplicam mutatis mutandis à pro- teína ou peptídeo isolado de acordo com o quinto aspecto da invenção.
[177] De acordo com um sexto aspecto, a invenção refere-se a um ácido nucleico, o qual é preferencialmente um ácido nucleico isolado, em particular ácido ribonucleico, compreendendo ou consistindo em uma sequência de ácido nucleico, em particular sequência de ácido ri- bonucleico, de acordo com ou complementar a ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 8, ID SEQ NO: 9, ID SEQ NO: 17, ID SEQ NO: 25, ID SEQ NO: 33, ID SEQ NO: 41, ID SEQ NO: 49, ID SEQ NO: 57, ID SEQ NO: 23, ID SEQ NO: 31, ID SEQ NO: 39, ID SEQ NO: 47, ID SEQ NO: 55 ou ID SEQ NO: 63. A invenção também refere-
se a uma proteína ou peptídeo isolado apresentando pelo menos cerca de 95%, de preferência pelo menos cerca de 96%, de preferência pelo menos cerca de 97%, de preferência pelo menos cerca de 98%, de pre- ferência pelo menos cerca de 99%, de preferência pelo menos pelo me- nos cerca de 99,1%, de preferência pelo menos cerca de 99,2%, de preferência pelo menos cerca de 99,3%, de preferência pelo menos cerca de 99,4%, de preferência pelo menos cerca de 99,5%, de prefe- rência pelo menos cerca de 99,6%, de preferência pelo menos cerca de 99,7% de identidade da sequência para ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 8, ID SEQ NO: 9, ID SEQ NO: 17, ID SEQ NO: 25, ID SEQ NO: 33, ID SEQ NO: 41, ID SEQ NO: 49, ID SEQ NO: 57, ID SEQ NO: 23, ID SEQ NO: 31, ID SEQ NO: 39, ID SEQ NO: 47, ID SEQ NO: 55 ou ID SEQ NO: 63 ou uma respectiva sequência com- plementar.
[178] A invenção também refere-se a um ácido nucleico, que é pre- ferencialmente um ácido nucleico isolado, em particular, ácido ribonu- cleico, compreendendo ou consistindo em uma sequência de ácido nu- cleico, em particular sequência de ácido ribonucleico, de acordo com, ou complementar a ID SEQ NO: 11, ID SEQ NO: 19, ID SEQ NO: 27, ID SEQ NO: 35, ID SEQ NO: 43, ID SEQ NO: 51, ID SEQ NO: 59, ID SEQ NO: 13, ID SEQ NO: 21, ID SEQ NO: 29, ID SEQ NO: 37, ID SEQ NO: 45, ID SEQ NO: 53 ou ID SEQ NO: 61. A invenção também refere-se a uma proteína ou peptídeo isolado apresentando pelo menos cerca de 95%, de preferência pelo menos cerca de 96%, de preferência pelo me- nos cerca de 97%, de preferência pelo menos cerca de 98%, de prefe- rência pelo menos cerca de 99%, de preferência pelo menos cerca de 99,1%, de preferência pelo menos cerca de 99,2%, de preferência pelo menos cerca de 99,3%, de preferência pelo menos cerca de 99,4%, de preferência pelo menos SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59,
SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 61 ou uma respectiva se- quência complementar.
[179] As sequências de ácido nucleico de acordo com ID SEQ NO: 2 e ID SEQ NO: 4, cada uma codifica preferencialmente para uma gli- coproteína, em particular para um componente de proteína ou uma por- ção de proteína de uma glicoproteína, de um mutante do vírus da corio- meningite linfocítica.
[180] A sequência de ácido nucleico de acordo com ID SEQ NO: 6 codifica preferencialmente uma proteína L de um mutante do vírus da coriomeningite linfocítica.
[181] A sequência de ácido nucleico de ID SEQ NO: 8 codifica pre- ferencialmente uma proteína L de um vírus da coriomeningite linfocítica do tipo selvagem.
[182] Com relação às características e vantagens adicionais do ácido nucleico isolado, a fim de evitar repetições, faz-se também refe- rência completa à descrição precedente, em particular às declarações feitas no contexto do segundo e terceiro aspectos da invenção. As ca- racterísticas e vantagens aqui descritas, em particular em relação ao ácido nucleico, em particular ácido ribonucleico, também se aplicam mu- tatis mutandis ao ácido nucleico isolado de acordo com o sexto aspecto da invenção.
[183] De acordo com um sétimo aspecto, a invenção refere-se a um agrupamento de genes ou óperon isolado contendo pelo menos um ácido nucleico, em particular, ácido ribonucleico, de acordo com o quinto aspecto da invenção.
[184] Com relação às características e vantagens adicionais do agrupamento de genes ou óperon, a fim de evitar repetições, faz-se tam- bém referência completa à descrição precedente, em particular às de-
clarações feitas no contexto do sexto aspecto da invenção. As caracte- rísticas e vantagens aqui descritas, em particular no que diz respeito ao ácido nucleico, em particular ácido ribonucleico, também se aplicam mu- tatis mutandis ao agrupamento de genes ou óperon isolado de acordo com o sétimo aspecto da invenção.
[185] De acordo com um oitavo aspecto, a invenção refere-se a um vetor de expressão contendo pelo menos um ácido nucleico de acordo com o sexto aspecto da invenção ou um agrupamento de genes ou óperon de acordo com o sétimo aspecto da invenção.
[186] Em relação às características e vantagens adicionais do ve- tor de expressão, a fim de evitar repetições, faz-se também referência completa à descrição, em particular às declarações feitas sob o sexto e o sétimo aspectos da invenção. As características e vantagens aqui des- critas, em particular no que diz respeito ao ácido nucleico e agrupa- mento de genes ou óperon, também se aplicam mutatis mutandis ao vetor de expressão de acordo com o oitavo aspecto da invenção.
[187] De acordo com um nono aspecto, a invenção refere-se a um organismo, um vírus, um vetor ou um plasmídeo que expressa ou con- tém uma proteína ou peptídeo de acordo com o quinto aspecto da in- venção e/ou que contém um ácido nucleico, em ácido ribonucleico par- ticular, de acordo com o sexto aspecto da invenção.
[188] O organismo pode ser uma célula hospedeira, um fungo ou uma bactéria.
[189] A célula hospedeira pode, por exemplo, ser uma célula eu- cariótica ou procariótica. Além disso, a célula hospedeira pode ser uma célula que pode ser utilizada para a produção de organismos e/ou veto- res e/ou plasmídeos.
[190] A bactéria pode, por exemplo, ser um vetor de vacina ou ou- tra bactéria terapêutica.
[191] O vírus pode, por exemplo, ser um vetor de vacina ou outro vírus terapêutico.
[192] Com relação às características e vantagens adicionais da cé- lula hospedeira, a fim de evitar repetições, faz-se também referência completa à descrição, em particular às declarações feitas no quinto e no sexto aspectos da invenção. As características e vantagens aqui descri- tas, em particular no que diz respeito à proteína ou peptídeo, em parti- cular, glicoproteína, e o ácido nucleico, em particular, ácido ribonucleico, também se aplicam mutatis mutandis à célula hospedeira de acordo com o nono aspecto da invenção.
[193] Características e vantagens adicionais da invenção resultam da seguinte descrição de modalidades preferidas na forma de exemplos, as figuras correspondentes e as reivindicações. As modalidades descri- tas a seguir destinam-se apenas a fornecer uma descrição adicional e um melhor entendimento da invenção e não devem de forma alguma ser interpretadas como limitantes.
[194] A presente invenção também refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um LCMV da descrição, preferencial- mente um mutante de LCMV da invenção. A composição pode compre- ender ainda excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição far- macêutica pode compreender ainda um bloqueador de ponto de con- trole (checkpoint), tal como PD-1 (Programmed Cell Death Protein 1) (Proteína de Morte Celular Programada 1) e/ou um modulador de apo- ptose, em particular, um inibidor de apoptose, tal como SMAC-mimético (LCL-161). A composição farmacêutica pode compreender ainda um ve- ículo farmaceuticamente aceitável. O veículo pode ser selecionado do grupo que consiste em água, solução salina aquosa, solução tampo- nada aquosa, meio de cultura de células e combinações de pelo menos dois dos veículos precedentes.
[195] A presente invenção também refere-se ao uso de um LCMV da invenção, de preferência um mutante de LCMV da invenção para a produção de um medicamento. O medicamento pode ser para o trata- mento de um tumor. O medicamento pode ser um medicamento de acordo com o quarto aspecto da invenção.
[196] A presente invenção também refere-se a um método de tra- tamento de um tumor, método este que compreende administração a um indivíduo com necessidade de uma quantidade eficaz de um LCMV da invenção, preferencialmente, um mutante de LCMV da invenção, ou um medicamento da invenção ou uma composição farmacêutica da in- venção.
[197] A não ser que indicado de outro modo, o termo “pelo menos” precedendo uma série de elementos deve-se entender referindo-se a todos os elementos da série. Aqueles versados no estado da técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades es- pecíficas da invenção descritas neste relatório. Pretende-se que tais equivalentes sejam abrangidos pela presente invenção.
[198] O termo “e/ou” sempre que utilizado neste relatório inclui o significado de “e”, “ou” e “toda ou qualquer outra combinação dos ele- mentos ligados por esse termo”.
[199] O termo “cerca de” ou “aproximadamente” como utilizado neste relatório significa dentro de 20%, preferencialmente, dentro de 10%, e mais preferencialmente, dentro de 5% de um dado valor ou faixa. Inclui, entretanto, também o número concreto, por exemplo, cerca de 20 inclui 20.
[200] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra “com- preende”, e variações tais como “compreende” e “compreendendo”, se- rão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro ou etapa estabelecida ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de número inteiro ou etapa. Quando utilizado neste relatório, o termo “compreen- dendo” pode ser substituído pelo termo “contendo” ou “incluindo” ou, às vezes, quando usado neste relatório com o termo “apresentando”.
[201] Quando utilizado neste relatório “consistindo em” exclui qual- quer elemento, etapa, ou ingrediente não especificado no elemento da reivindicação. Quando utilizado neste relatório, “consistindo essencial- mente em” não exclui materiais ou etapas que não afetam material- mente as características básicas e novas da reivindicação.
[202] Em cada caso neste relatório, qualquer um dos termos “com- preendendo”, “consistindo essencialmente em” e “consistindo em” pode ser substituído por qualquer um dos outros dois termos. Por exemplo, o termo “compreendendo” significa proporcionar suporte explícito também para “consistindo essencialmente em” e “consistindo em”, o termo “con- sistindo essencialmente em” significa proporcionar suporte explícito também para “compreendendo” e “consistindo em”, o termo “consistindo em” entende-se proporcionar suporte explícito também para “consis- tindo essencialmente em” e “compreendendo”.
[203] Deve-se entender que esta invenção não está limitada à me- todologia, protocolos, materiais, reagentes e substâncias particulares, etc., descritos neste relatório e, como tal, podem variar. A terminologia usada neste relatório tem o propósito de descrever modalidades parti- culares apenas, e não se destina a limitar o escopo da presente inven- ção, o qual é definido apenas pelas reivindicações.
[204] Todas as publicações citadas ao longo do texto deste relató- rio (incluindo, todas as patentes, pedidos de patentes, publicações cien- tíficas, especificações do fabricante, instruções, etc.) são incorporadas por meio deste como referência em sua totalidade. Nada neste relatório deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não é intitulada a anteceder tal descrição em virtude da invenção precedente. À medida em que o material incorporado por referência contradiz ou é inconsistente com este relatório descritivo, o relatório descritivo substi- tuirá qualquer um desses materiais.
EXEMPLOS
1. Métodos e Materiais
1.1 Camundongos
[205] Em relação às análises antitumorais in vivo animais WT (em fundamento C57BL/6) ou camundongos NOD.SCID sem uma cepa imune adaptativa WE foram utilizados. Camundongos OT-1 transportam um receptor de célula T restrita a MHC-I específica a ovalbumina como transgênico.
1.2 Linhagens de Células
[206] MC57 (CVCL_4985) é uma linhagem de células de fi- broblasto murino em que o arenavírus LCMV pode se multiplicar bem. C643 (CVCL_5969) é uma linhagem de células de carcinoma anaplá- sico da tireoide humana. H1975 é uma linhagem celular de carcinoma pulmonar humano (CVCL_1511, ATCC, CRL-5908, adenocarcinoma). TrampC2 é uma linhagem celular de adenocarcinoma murino (CVCL_3615). MOPC é uma linhagem de células orofaríngeas murinas. CMT167 (CVCL_2405) é uma linhagem celular de carcinoma pulmonar murino. B16F10-OVA é uma linhagem celular de melanoma murino (CVCL_0159) que expressa ovalbumina como um antígeno modelo. UKE-Mel-13a são células tumorais primárias isoladas a partir de uma metástase de melanoma humano e foram passadas menos de 100 x. 511950 são células tumorais primárias isoladas a partir de um carci- noma pancreático murino transgênico (Mazur PK e outros, Nat Med. ou- tubro de 2015; 21(10):1163-71) e foram passadas menos de 20 x. 511950R se originam de células 511950 e foram passadas menos de 100 x sob tratamento com o inibidor MEK trametinib.
1.3 Vírus
[207] Obteve-se a cepa WE de LCMV a partir do laboratório de
Prof. Zinkernagel (Experimental Immunology, Zurique, Suíça) e foi pro- pagada em células L929 ou células BHK desde 2008. Os clones de LCMV-P42, LCMV-P52 e LCMV-P91 foram isolados e sequenciados após diferentes passagens.
1.4 Reagentes
[208] LCL161 (Selleckchem) e anti-PD1 (BioXcell) foram testados em combinação com LCMV e LCMV-P52, respectivamente, quanto à sua atividade antitumoral.
1.5 Determinação de células infectadas com LCMV por meio de imunofluorescência
[209] A imunofluorescência foi usada para detectar LCMV nas cé- lulas. As células foram semeadas em placas de 24 poços, cada uma contendo uma tampa de vidro. Após 24 horas, as células foram infecta- das com LCMV e coradas 24 horas posteriormente com um anticorpo anti-LCMV-NP marcado com fluorocromo (clone VL4), visualizado com um microscópio de fluorescência e fotografado com uma câmera CCD integrada.
1.6 Determinação de LCMV em sobrenadante por meio de ensaio em placas
[210] Para determinar a produção de células por LCMV, as células foram semeadas em placas de 24 poços e infectadas com LCMV após 24 horas. O sobrenadante foi extraído após 24 horas. O sobrenadante foi titulado em placas de 24 poços e células MC57 (150.000 células/ori- fício) foram adicionadas. Metilcelulose foi adicionada após 4 horas. Após outras 48 horas, o campo celular foi analisado em relação às pla- cas de LCMV com anticorpos anti-LCMV-NP (clone KL53). As placas foram contadas para determinar o número de partículas infecciosas/ml no sobrenadante.
1.7 Passagens de vírus
[211] A fim de adaptar vírus a tumores, diferentes células tumorais primárias ou linhagens de células tumorais foram infectadas com LCMV- WE. As células foram semeadas em placas de 24 poços (aproximada- mente 100.000 células/poço em 1 mL de meio). Após 24 horas, vírus com uma multiplicidade de infecção (MOI) = 1 em 100 µL foram adicio- nados. Dependendo da configuração, o inóculo inicial foi removido entre 1 - 30 minutos e novo meio foi adicionado. Após 24 ou 48, ou 72 horas, o sobrenadante da cultura celular foi extraído e congelado para análise adicional. As células recentemente plaqueadas foram infectadas com 100 microL do sobrenadante extraído. Esse procedimento foi repetido entre 30 e 100 vezes.
1.8 Sequenciamento
[212] Após a transcrição reversa do ARN viral, o cADN foi amplifi- cado com pares de iniciadores específicos de sequência (oligonucleotí- deos) na reação em cadeia da polimerase (RCP). Os produtos da RCP foram purificados, sequenciados por sequenciamento de ciclo (método singer modificado), os produtos separados por eletroforese capilar e a sequência registrada em eletroferograma. A sequência de ácidos nu- cleicos foi traduzida para obter a sequência da proteína.
1.9 Ativação imune inata
[213] A capacidade de LCMV ativar o sistema imunológico inato foi determinada pelo biomarcador IFN-alfa usando ELISA de IFN-alfa mu- rino (ThermoFisher).
1.10 Ativação imune adaptativa
[214] A capacidade de LCMV ativar o sistema imune adaptativo foi testada por meio de coloração com tetrâmero (NIH, Tetramer Facility) de linfócitos ativados.
1.11 Crescimento Tumoral e Tratamentos
[215] Para medir o efeito antitumoral, camundongos C57BL/6 ou NOD.SCID (6-12 semanas de idade) 5 x 105 células tumorais (em 100 µL) foram injetados por via subcutânea no flanco direito ou esquerdo.
Após formação de um tumor visível, os animais foram tratados e o diâ- metro médio do tumor ou volume do tumor foi determinado. Para um modelo de metástase, células B16F10-OVA foram aplicadas por via in- travenosa.
1.12 Isolamento e transferência de células T CD8+ específicas a ovalbumina (tumor)
[216] Para as análises de células T CD8+ específicas de tumor, células do baço de camundongos OT-1 foram transferidas para camun- dongos C57BL/6 transportando células tumorais que expressam oval- bumina (B16F10-OVA). Os baços foram esmagados mecanicamente. Após filtração, 107 células do baço por camundongo foram injetadas por via intravenosa.
1.13 Medição de células T CD8+ específicas de tumor
[217] Para analisar o número de células T CD8+ específicas de tu- mor, células do sangue foram incubadas com tetrâmeros de ovalbumina fluorescente (quatro moléculas MHC-I H-2 Kb acopladas transportando o peptídeo SIINFEKL, NIH Tetramer Facility) e anticorpos anti-CD8 aco- plados a fluorocromo (eBioscience) e analisadas após lavagem em um citômetro de fluxo. Para a análise de função das células T, as células do baço foram esmagadas mecanicamente e incubadas após filtração com Brefeldin A e com ou sem o peptídeo SIINFEKL. Após seis horas, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com anticorpos fluo- rescentes específicos para CD8 (anti-CD8, eBioscience) e interferon- gama intracelular (anti-interferon-gama, eBioscience). A frequência de células produtoras de IFN-gama foi analisada por citometria de fluxo.
1.14 Análise Estatística
[218] Os valores médios foram comparados usando um teste t de Student de duas amostras não pareadas. Os dados são apresentados como média ± SEM. O nível de significância estatística foi determinado como sendo p <0,05.
1.15 Geração de LCMV-P42:
[219] LCMV-WE foi passado 42 vezes em culturas de células tu- morais primárias (UKE-Mel-13a). Após 42 passagens, uma mutação funcional foi detectada no novo vírus (LCMV-P42). As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de LCMV-WE e P42 mutante são mos- tradas na Figura 25 (A e B).
1.16 Geração de LCMV-P91, LCMV-P52 e seus subclones:
[220] LCMV-WE foi passado 52 vezes nas linhagens de células tumorais H1975. Após 52 passagens, as mutações I181M, R185W fo- ram detectadas na glicoproteína do novo vírus. Além disso, algumas mutações mais provavelmente irrelevantes e/ou oligoclonais (quasispé- cies) foram encontradas. Esse vírus é denominado: “LCMV-P52”. Para determinar a estabilidade e importância das mutações I181M e R185W, o sobrenadante de passagem P52 foi passado mais 39 vezes. O vírus derivado desta passagem é denominado: “LCMV-P91” e ainda continha as mutações I181M e R185W. O vírus LCMV-P52 foi subclonado por diluição limitante. Esse vírus clonal é denominado: “LCMV-P52.1”. As mutações I181M, R185W permaneceram estáveis. As mutações consi- deradas irrelevantes e/ou oligoclonais (quasispécies) apresentaram al- gumas alterações. Para determinar o papel das mutações únicas I181M e R185W, algumas passagens precedentes foram analisadas. A passa- gem P29 continha vírus com mutações individuais I181M e R185W. Os vírus de passagem P29 foram subclonados por meio de diluição limi- tante. Um subclone com a mutação singular R185W foi denominado: “LCMV-P52-1.3”; um subclone com a mutação singular I181M foi deno- minado: “LCMV-P52-2.1”. As sequências de ácidos nucleicos e amino- ácidos de mutantes de LCMV P52, P92, P52-1, P52-1.3 e P52-2.1 são mostradas na Figura 25 (C-G). Os alinhamentos das sequências de áci- dos nucleicos e aminoácidos LCMV-WE e mutantes P42, P52, P92, P52-1, P52-1.3 e P52-2.1 são mostrados na Figura 26 (A-H).
2. Investigações
[221] 2.1 As linhagens de células tumorais MC57, C643, H1975 e culturas de células tumorais primárias (UKE Mel-13a) foram infectadas com LCMV (cepa WE, MOI 1). Replicação foi medida após 24 horas (n = 3).
[222] Desse modo, provou-se que LCMV (cepa WE) se espalhou de forma diferente. Em comparação com a linhagem celular tumoral MC57, a propagação foi reduzida nas linhagens celulares C643 e H1975, bem como em culturas de células tumorais primárias (UKE-Mel- 13a). Os resultados obtidos são mostrados graficamente na Figura 1.
[223] Em branco, as células infectadas com LCMV nas culturas com MC57, C643, H1975 e UKE-Mel-13a podem ser vistas.  = sem infecção, LCMV = LCMV infectado.
[224] 2.2 Linhagem de células tumorais MC57 e culturas de células tumorais primárias 511950 foram infectadas com LCMV (cepa WE, MOI 0,1) (gráfico à esquerda). As linhagens de células tumorais MC57, Tramp-C2 e culturas de células tumorais primárias (511950 e 511950R) foram infectadas com LCMV (cepa WE, MOI 1) (gráfico à direita). O nú- mero de partículas de vírus infecciosas foi medido após 24 horas no sobrenadante.
[225] Desse modo, provou-se que LCMV (cepa WE) prolifera me- nos em comparação com a linhagem de células tumorais MC57 na li- nhagem celular Tramp-C2, bem como nas culturas de células tumorais primárias (511950 e 511950R). Os resultados são mostrados na Figura
2.
[226] Figura 2 apresenta a seguinte legenda:
[227] Ordenada: partículas infecciosas de LCMV no sobrenadante (UFP/mL),
[228] Abscissa: Grupos de tratamento: MC57, Tramp-C2, 511950, 511950R.
[229] 2.3 LCMV-WE foi passado 42 vezes em culturas de células tumorais primárias (UKE-Mel-13a). Após 42 passagens, uma mutação funcional foi detectada no novo vírus (LCMV-P42).
[230] Desse modo, pode-se provar que as células tumorais primá- rias são adequadas para modificar arenavírus por meio de passagem. O procedimento experimental é mostrado na Figura 3.
[231] 2.4 LCMV-WE foi passado 52 vezes em linhagens de células tumorais H1975. Após 52 passagens, mutações funcionais foram detec- tadas no novo vírus LCMV-P52.
[232] Desse modo, usando o exemplo de H1975, provou-se que as linhagens de células tumorais com replicação de LCMV reduzida (em comparação com a linhagem celular MC57) são adequadas para alterar arenavírus por meio de passagem. O procedimento experimental é ilus- trado na Figura 4.
[233] 2.5 LCMV-P52 foi passado 39 vezes em linhagens de células tumorais H1975. Após 39 passagens, outras mutações funcionais foram detectadas no novo vírus LCMV-P91.
[234] Desse modo, provou-se que as células H1975 são capazes de alterar arenavírus por meio de passagem. O procedimento experi- mental é mostrado graficamente na Figura 5.
[235] 2.6 As linhagens celulares H1975 foram infectadas com LCMV-WE e LCMV-P52 (MOI 1). O vírus foi determinado após 12 horas no sobrenadante (n = 6).
[236] Desse modo, provou-se que LCMV-P52 se replica melhor do que LCMV-WE em células H1975. Os resultados obtidos são mostrados graficamente na Figura 6.
[237] Figura 6 apresenta a seguinte legenda:
[238] Ordenada: partículas infecciosas de LCMV no sobrenadante (UFP/mL).
[239] Abscissa: Grupos de tratamento; LCMV-WE ou LCMV-P52.
[240] 2.7 Células dendríticas derivadas da medula óssea de mu- rino foram infectadas com LCMV-WE e LCMV-P52 (MOI 1). O vírus foi determinado após 24 horas no sobrenadante (n = 3).
[241] Desse modo, provou-se que LCMV-P52 se replica melhor do que LCMV-WE em células apresentadoras de antígeno. Os resultados obtidos são mostrados graficamente na Figura 7.
[242] Figura 7 apresenta a seguinte legenda:
[243] Ordenada: partículas infecciosas de LCMV no sobrenadante (UFP/mL).
[244] Abscissa: grupos de tratamento; LCMV-WE ou LCMV-P52.
[245] 2.8 Linhagem de células tumorais H1975 foi infectada com LCMV-WE ou LCMV-P52 (MOI 1). A propagação do vírus foi medida por meio de imunofluorescência após 24 horas.
[246] Desse modo, provou-se que LCMV-P52 pode se espalhar melhor em linhagens de células tumorais em comparação com LCMV WE usando o exemplo de H1975. Os resultados obtidos são mostrados graficamente na Figura 8.
[247] São mostradas em branco as células infectadas com LCMV para uma cultura infectada com LCMV-WE ou LCMV-P52.
[248] 2.9 Células tumorais primárias (UKE-Mel-13a) foram infecta- das com LCMV-WE ou LCMV-P52 (MOI 1). A propagação desses vírus foi medida por meio de imunofluorescência após 24 horas.
[249] Desse modo, provou-se que LCMV-P52 pode se espalhar melhor em células tumorais primárias em comparação com LCMV-WE. Os resultados obtidos são mostrados graficamente na Figura 9.
[250] As células infectadas com LCMV para culturas infectadas com LCMV-WE ou LCMV-P52 são mostradas em branco.
[251] 2.10 camundongos C57BL/6 foram infectados com LCMV- WE ou LCMV-P52 (2 x 104 UFP por via intravenosa). Um dia após in-
fecção, a ativação do sistema imunológico inato foi determinada me- dindo IFN-alfa em soro.
[252] Desse modo, provou-se que LCMV-P52 causa uma ativação imune inata mais forte do que LCMV-WE. Os resultados obtidos são mostrados graficamente na Figura 10.
[253] Figura 10 apresenta a seguinte legenda:
[254] Ordenada: concentração de IFN-alfa (ng/ml em soro)
[255] Abscissa: grupos de tratamento; animais infectados com LCMV-WE ou LCMV-P52.
[256] 2.11 Camundongos C57BL/6 foram infectados com LCMV- WE ou LCMV-P52 (2 x 104 UFP por via intravenosa). Ativação do sis- tema imune adaptativo foi determinada por meio de citometria de fluxo usando tetrâmero (mede células T CD8+ específicas de vírus).
[257] Desse modo, provou-se que LCMV-P52 induz uma ativação imune adaptativa mais forte do que LCMV-WE. Os resultados obtidos são mostrados graficamente na Figura 11.
[258] Figura 11 apresenta a seguinte legenda:
[259] Ordenada: células T CD8+ específicas de vírus (% de células T CD8+ totais no sangue).
[260] Abscissa: Tempo (dias após infecção).
[261] 2.12 Camundongos NOD.SCID foram tratados por via sub- cutânea com 5 x 105 células H1975 (7 dias). Os camundongos foram infectados ainda com 2 x 104 UFP de LCMV-WE ou LCMV-P52 intratu- moralmente (0 dia). O crescimento do tumor foi analisado.
[262] Desse modo, provou-se que o tratamento com LCMV-P52 teve um efeito antitumoral mais forte do que o tratamento com LCMV- WE. Os resultados obtidos são mostrados graficamente na Figura 12.
[263] Figura 12 apresenta a seguinte legenda:
[264] Ordenada: diâmetro médio do tumor (cm).
[265] Abscissa: Tempo (dias após tratamento com LCMV).
[266] 2.13 Camundongos C57BL/6 foram tratados por via subcu- tânea com 5 x 105 células MOPC (7 dias). Um grupo de camundongos foi infectado ainda com 2 x 104 UFP de LCMV-P52 por via intravenosa (n = 3; 0 dia). O crescimento do tumor foi analisado.
[267] Desse modo, provou-se que o tratamento com LCMV-P52 teve um forte efeito antitumoral. Os resultados são mostrados grafica- mente na Figura 13.
[268] Figura 13 apresenta a seguinte legenda:
[269] Ordenada: volume do tumor (mm3).
[270] Abscissa: Tempo (dias após tratamento com LCMV).
[271] 2.14 Camundongos C57BL/6 foram tratados por via subcu- tânea com 5 x 105 células CMT167 (7 dias). Um grupo de camundongos foi infectado ainda com 2 x 104 UFP de LCMV-P52 por via intravenosa (n = 3; 0 dia). O crescimento do tumor foi analisado.
[272] Desse modo, provou-se que o tratamento com LCMV-P52 teve um forte efeito antitumoral. Os resultados são mostrados na Figura
14.
[273] Figura 14 apresenta a seguinte legenda:
[274] Ordenada: volume do tumor (mm3).
[275] Abscissa: Tempo (dias após tratamento com LCMV).
[276] Desse modo, provou-se que o tratamento com LCMV-P52 teve um forte efeito antitumoral. Os resultados obtidos são mostrados graficamente na Figura 15.
[277] Em preto são mostradas células tumorais no pulmão;  = sem infecção.
[278] 2.15 Camundongos C57BL/6 foram tratados por via intrave- nosa com 5 x 105 células B16F10-OVA (7 dias). Células T CD8+ especí- ficas de tumor isoladas do baço de um camundongo OT-1 foram trans- feridas (4 dias). Um grupo de animais foi tratado ainda com LCMV-P52 por via intravenosa (2 x 104 UFP, n = 4). Em 9 dias, os pulmões foram removidos e fotografados.
[279]  = animais de controle, 4 pulmões cada; LCMV-P52 = tra- tados com LCMV-P52, 4 pulmões cada.
[280] 2.16 Camundongos C57BL/6 foram tratados por via intrave- nosa com 5 x 105 células B16F10-OVA (7 dias). Células T CD8+ espe- cíficas de tumor isoladas do baço de um camundongo OT-1 foram trans- feridas (4 dias). Um grupo de animais foi tratado ainda com LCMV-P52 por via intravenosa (2 x 104 UFP, n = 4). Em 3 dias, foi determinada a frequência de células T CD8+ específicas de tumor no sangue.
[281] Desse modo, provou-se que o tratamento com LCMV-P52 aumenta a expansão de células T CD8+ específicas de tumor. Os resul- tados obtidos são mostrados graficamente na Figura 16.
[282] Figura 16 apresenta a seguinte legenda:
[283] Ordenada: Frequência de células T CD8+ específicas de tu- mor no sangue (% de células T CD8+ totais).
[284] Abscissa: grupos de tratamento  = sem infecção de LCMV- P52 = tratados com LCMV-P52.
[285] 2.17 Camundongos C57BL/6 foram tratados por via intrave- nosa com 5 x 105 células B16F10-OVA (7 dias). Células T CD8+ espe- cíficas de tumor isoladas do baço de um camundongo OT-1 foram trans- feridas (4 dias). Um grupo de animais foi tratado ainda com LCMV-P52 por via intravenosa (2 x 104 UFP, n = 4). Em 9 dias, a função de células T CD8+ específicas de tumor no baço foi determinada por reestimulação in vitro.
[286] Desse modo, provou-se que o tratamento com LCMV-P52 aumenta a função das células T CD8+ específicas de tumor. Os resulta- dos obtidos são mostrados graficamente na Figura 17.
[287] Figura 17 apresenta a seguinte legenda:
[288] Ordenada: Frequência de células T CD8+ específicas de tu- mor produtoras de IFN-gama (% de células T CD8+ totais).
[289] Abscissa: Grupos de tratamento; : Sem tratamento com LCMV-P52; LCMV-P52: Tratamento com LCMV-P52; Legenda: -: Sem antígeno; +: Reestimulação com antígeno (peptídeo SIINFEKL).
[290] 2.18 Camundongos C57BL/6 foram tratados por via subcu- tânea com 5 x 105 células B16F10-OVA (7 dias). Um grupo de animais não foi tratado posteriormente (n = 3). Um grupo de animais foi tratado com o inibidor LCL-161 (oral 50 mg/kg de peso corporal) duas vezes por semana a partir de 0 dia. Um grupo foi tratado intratumoralmente com LCMV-WE em 0 dia (2 x 104 UFP, n = 4). Um grupo foi tratado com LCL- 161 e LCMV. O crescimento do tumor foi analisado.
[291] Desse modo, provou-se que o tratamento com LCMV-WE tem um efeito sinérgico com LCL-161. Os resultados obtidos são mos- trados graficamente na Figura 18.
[292] Figura 18 apresenta a seguinte legenda:
[293] Ordenada: volume do tumor (mm3).
[294] Abscissa: Tempo (dias após administração de LCMV).
[295] 2.19 Camundongos C57BL/6 foram tratados por via subcu- tânea com 5 x 105 células B16F10-OVA (7 dias). Um grupo de animais não foi tratado posteriormente (n = 3). Um grupo de animais foi tratado com o inibidor LCL-161 (oral 50 mg/kg de peso corporal) duas vezes por semana a partir de 0 dia. Um grupo foi tratado intratumoralmente com LCMV-WE em 0 dia (2 x 104 UFP, n = 4). Um grupo foi tratado com LCL- 161 e LCMV. Sobrevivência dos animais foi analisada.
[296] Pode ser mostrado que o tratamento com LCMV-WE tem um efeito sinérgico com LCL-161. Os resultados obtidos são mostrados gra- ficamente na Figura 19.
[297] Figura 19 apresenta a seguinte legenda:
[298] Ordenada: sobrevivência de animais (%).
[299] Abscissa: Tempo (dias após administração de LCMV).
[300] 2.20 Camundongos C57BL/6 foram tratados por via subcu- tânea com 5 x 105 células B16F10-OVA (9 dias). Um grupo de animais não foi tratado posteriormente (n = 3). Um grupo foi tratado intratumo- ralmente com LCMV-P52 em 0 dia (2 x 104 UFP, n = 6-8). Um grupo de animais foi tratado com o bloqueador de ponto de controle (checkpoint) anti-PD-1 (200 µg intraperitoneal) em 1, 5 e 8 dias. Um grupo foi tratado com bloqueador de ponto de controle (checkpoint) anti-PD-1 e LCMV- P52. O crescimento do tumor foi analisado.
[301] Desse modo, provou-se que o tratamento com LCMV-P52 tem um efeito sinérgico com bloqueadores de ponto de controle (check- point) (por exemplo, anti-PD-1). Os resultados obtidos são mostrados graficamente na Figura 20.
[302] Figura 20 apresenta a seguinte legenda:
[303] Ordenada: volume do tumor (mm3).
[304] Abscissa: Tempo (dias após tratamento com LCMV).
[305] As sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos mencio- nadas na presente descrição correspondem às sequências de aminoá- cidos e ácidos nucleicos descritas na seguinte listagem de sequências.
[306] 2.21 Foram semeadas 105 células H1975 em placas de 24 poços. Após 24 horas, as células foram infectadas com os vírus LCMV- WE, LCMV-P52.1 (I181M, R185W), LCMV-P52-1.3 (R185W) e LCMV- P52-2.1 (I181M) com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1. O vírus foi analisado no sobrenadante após 24 horas. Os resultados são mostrados na Figura 21 (média + SEM; n = 6, *p < 0,05, teste t).
[307] Os dados mostram que as mutações I181M e R185W au- mentam a propagação viral em células tumorais separadamente.
[308] Figura 21 apresenta a seguinte legenda:
[309] Eixo X: vírus diferentes
[310] Eixo Y: LCMV no sobrenadante (log10 UFP/ml).
[311] 2.22 Foram semeadas 2,5 x 105 células HCC1954 em placas de 24 poços, seguido por infecção de LCMV-WE, LCMV-P52.1 (I181M, R185W), LCMV-P52-1.3 (R185W) e LCMV-P52-2.1 (I181M) com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,001. O vírus foi analisado no so- brenadante após 48 horas. Os resultados são mostrados na Figura 22 (barras de erro mostram SEM; n = 4, **p < 0,001, n.s. indica não signifi- cativo, utilizou-se ANOVA unilateral com um pós-teste de Tukey adicio- nal).
[312] Os dados mostram que a mutação I181M ou a mutação 185W aumentam a propagação viral em células tumorais HCC1954.
[313] Figura 22 apresenta a seguinte legenda:
[314] Eixo X: vírus diferentes
[315] Eixo Y: LCMV no sobrenadante (log10 UFP/ml).
[316] 2.23 Células de câncer pancreático murino (511950, 4 x 105 células), células de melanoma humano (UKE118b, 4 x 105 células) ou (UKE118c, 4 x 105 células) foram semeadas em placas de 24 poços, seguido por infecção com LCMV-WE (barras brancas) ou LCMV-P42 (I181M, barras pretas) com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1. O vírus foi analisado no sobrenadante após 24 horas. Os resultados são mostrados na Figura 23 (média + SEM; n = 3, *p < 0,05, teste t).
[317] Os dados mostram que a mutação I181M leva ao aumento da propagação viral em células tumorais.
[318] Figura 23 apresenta a seguinte legenda:
[319] Eixo X: Diferentes tipos celulares.
[320] Eixo Y: LCMV no sobrenadante (log10 UFP/ml).
[321] 2.24 Camundongos C57BL/6 foram infectados por via intra- venosa com 2 x 104 UFP de LCMV-WE, LCMV-P52.1 (I181M, R185W), LCMV-P52-1.3 (R185W) e LCMV-P52-2.1 (I181M). Em 8 dias (barras brancas) e 10 dias (barras pretas), o sangue foi analisado em relação às frequências de células T CD8+ específicas de LCMV-GP33 usando tetrâmeros em citometria de fluxo. Os resultados são mostrados na Fi- gura 24 (média + SEM; n = 6-12, agrupados de quatro experimentos separados, *p < 0,05, teste t).
[322] Os dados mostram que as mutações I181M e R185W au- mentam a capacidade do LCMV de estimular células T específicas. A combinação das mutações I181M e R185W pode apresentar proprieda- des sinérgicas em estimulação precoce de células T.
[323] Figura 24 apresenta a seguinte legenda:
[324] Eixo X: vírus diferentes
[325] Eixo Y: Frequência de células T CD8+ de ligação a tetrâmero- GP33 (% de células T CD8+ totais).
[326] A invenção descrita ilustrativamente neste relatório pode ser praticada adequadamente na ausência de qualquer elemento ou ele- mentos, limitação ou limitações, não especificamente, descritas neste relatório. Ainda, os termos e expressões usados neste relatório foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes dos recursos mostrados e descritos ou partes dos mesmos, mas se re- conhece que várias modificações são possíveis dentro do âmbito da in- venção reivindicada. Desse modo, deve-se entender que, embora a pre- sente invenção tenha sido especificamente descrita por modalidades exemplares e características opcionais, modificação e variação das in- venções aqui incorporadas descritas neste relatório podem ser recorri- das por aqueles versados no estado da técnica, e que tais modificações e variações são consideradas estar dentro do âmbito desta invenção.
[327] A invenção foi descrita ampla e genericamente neste relató- rio. Cada uma das espécies mais restritas e agrupamentos subgenéri- cos que se enquadram dentro da descrição genérica também fazem parte da invenção. Isso inclui a descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer assunto do gênero, independentemente de, se o material excisado ser ou não es- pecificamente citado neste relatório.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES
1. Mutante de vírus da coriomeningite linfocítica, caracteri- zado pelo fato de que o mutante é capaz de sofrer uma propagação mais forte em uma célula tumoral quando comparado com a cepa WE do vírus da coriomeningite linfocítica de tipo selvagem, em que o mu- tante compreende um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína, em que a glicoproteína compreende pelo menos uma das mutações Arg 185 → Trp e Ile 181 → Met em comparação com a sequência da glicoprote- ína de tipo selvagem apresentada em ID SEQ NO: 10.
2. Mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma glico- proteína que apresenta pelo menos cerca de 95%, preferencialmente, pelo menos cerca de 96%, preferencialmente pelo menos cerca de 97%, preferencialmente pelo menos cerca de 98%, preferencialmente pelo menos cerca de 99%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,2%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,7% de identidade de sequência, para a sequência de glicoproteína de tipo selvagem apresentada em ID SEQ NO: 10.
3. Mutante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína, em que a glicoproteína compreende as mutações Arg 185 → Trp e Ile 181 → Met em comparação com a glicoproteína de tipo sel- vagem apresentada em ID SEQ NO: 10.
4. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína, em que a glicoproteína apresenta pelo me-
nos cerca de 95%, preferencialmente, pelo menos cerca de 96%, prefe- rencialmente pelo menos cerca de 97%, preferencialmente pelo menos cerca de 98%, preferencialmente pelo menos cerca de 99%, preferenci- almente pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,2%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,3%, prefe- rencialmente pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente pelo me- nos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,7% de identidade de sequên- cia, ou é preferencialmente idêntica, à uma sequência apresentada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 18, 26, 34, 42, 50 e 58.
5. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína, em que o ácido nucleico compreende uma sequência que apresenta pelo menos cerca de 95%, preferencialmente pelo menos cerca de 96%, preferencialmente pelo menos cerca de 97%, preferencialmente pelo menos cerca de 98%, preferencialmente pelo menos cerca de 99%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,2%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,7% de identidade de sequência, ou é preferencialmente idêntica à uma se- quência apresentada em ID SEQ Nos: 17, 25, 33, 41, 49 e 57.
6. Mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma pro- teína L, em que a proteína L apresenta pelo menos cerca de 95%, pre- ferencialmente pelo menos cerca de 96%, preferencialmente pelo me- nos cerca de 97%, preferencialmente pelo menos cerca de 98%, prefe- rencialmente pelo menos cerca de 99%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,2%, prefe- rencialmente pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente pelo me- nos cerca de 99,4%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,7% de identidade de sequência, para a sequência de proteína L de tipo selvagem apresentada em ID SEQ NO: 16.
7. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína L, em que a proteína L apresenta pelo menos cerca de 95%, preferencialmente pelo menos cerca de 96%, preferenci- almente pelo menos cerca de 97%, preferencialmente pelo menos cerca de 98%, preferencialmente pelo menos cerca de 99%, preferencial- mente pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,2%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,3%, preferencial- mente pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,6%, preferencial- mente pelo menos cerca de 99,7%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,8%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,9% de identidade de sequência, ou é preferencialmente idêntica à uma sequência apre- sentada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 24, 32, 40, 48, 56 e 64.
8. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína L, em que a proteína L compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 das seguintes mutações: Lys 253 → Arg; Lys 1512 → Met; Lys 1513 → Glu; Ser 1758 → Phe; Phe 1995 → Ser; Ile 2094 → Val; Lys 2115 → Glu; Thr 2141 → Ala; Arg 2175 → Lys; Thr 2185 → Ala em comparação com a sequência da proteína L de tipo selvagem apre- sentada em ID SEQ NO: 16.
9. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína L, em que a proteína L compreende uma das se- guintes configurações de mutações: (a) Ser 1758 → Phe; (b) Phe 1995 → Ser; opcionalmente Ile 2094 → Val; e opcionalmente Thr 2141 → Ala; (c) Lys 1513 → Glu; Phe 1995 → Ser; e opcional- mente Arg 2175 → Lys; (d) Lys 253 → Arg; Lys 1512 → Met; Lys 2115 → Glu; opcionalmente Thr 2141 → Ala; Thr 2185 → Ala (e) Phe 1995 → Ser; ou (f) Lys 2115 → Glu, em comparação com a sequência de proteína L de tipo selvagem apre- sentada em ID SEQ NO: 16.
10. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nu- cleico que codifica uma proteína L, em que o ácido nucleico é comple- mentar a uma sequência que apresenta pelo menos cerca de 95%, pre- ferencialmente pelo menos cerca de 96%, preferencialmente pelo me- nos cerca de 97%, preferencialmente pelo menos cerca de 98%, prefe- rencialmente pelo menos cerca de 99%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,2%, prefe- rencialmente pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente pelo me- nos cerca de 99,4%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,7%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,8%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,9% de identidade de sequên- cia, ou é preferencialmente idêntica à uma sequência apresentada em ID SEQ Nos: 17, 25, 33, 41, 49 e 57.
11. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nu- cleico que codifica uma nucleoproteína, em que a nucleoproteína apre- senta pelo menos cerca de 95%, preferencialmente pelo menos cerca de 96%, preferencialmente pelo menos cerca de 97%, preferencial- mente pelo menos cerca de 98%, preferencialmente pelo menos cerca de 99%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,1%, preferencial- mente pelo menos cerca de 99,2%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,4%, preferencial- mente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência, ou que é preferencialmente idêntica à uma nucleoprote- ína apresentada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 12, 20, 28, 36, 44, 52 e 60.
12. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nu- cleico que codifica uma nucleoproteína, em que o ácido nucleico é com- plementar à uma sequência que apresenta pelo menos cerca de 95%, preferencialmente pelo menos cerca de 96%, preferencialmente pelo menos cerca de 97%, preferencialmente pelo menos cerca de 98%, pre- ferencialmente pelo menos cerca de 99%, preferencialmente pelo me- nos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,2%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência, ou que é preferen- cialmente idêntica à uma nucleoproteína apresentada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 11, 19, 27, 35, 43, 51 e 59.
13. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nu- cleico que codifica uma proteína Z, em que a proteína Z apresenta pelo menos cerca de 95%, preferencialmente pelo menos cerca de 96%, pre- ferencialmente pelo menos cerca de 97%, preferencialmente pelo me- nos cerca de 98%, preferencialmente pelo menos cerca de 99%, prefe- rencialmente pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo me- nos cerca de 99,2%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,5%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de se- quência, ou que é preferencialmente idêntica à uma sequência apresen- tada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 14, 22, 30, 38, 46, 54 e 62.
14. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nu- cleico que codifica uma proteína Z, em que o ácido nucleico compre- ende uma sequência que apresenta pelo menos cerca de 95%, prefe- rencialmente pelo menos cerca de 96%, preferencialmente pelo menos cerca de 97%, preferencialmente pelo menos cerca de 98%, preferenci- almente pelo menos cerca de 99%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,1%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,2%, preferencial- mente pelo menos cerca de 99,3%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,4%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,5%, preferencial- mente pelo menos cerca de 99,6%, preferencialmente pelo menos cerca de 99,7%, de identidade de sequência, ou que é preferencialmente idên- tica à uma sequência apresentada em qualquer uma das ID SEQ Nos: 13, 21, 29, 37, 45, 53 e 61.
15. Método de produção de um arenavírus antitumoral, em particular, um arenavírus, caracterizado pelo fato de que apresenta pro- priedades antitumorais aperfeiçoadas sobre um arenavírus original, o processo compreendendo as seguintes etapas: a) plaquear células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 para e/ou em um meio nu- triente, b) inocular as células tumorais primárias plaquea- das ou células plaqueadas da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp- C2 com um arenavírus original, c) incubar as células tumorais primárias inoculadas ou células inoculadas da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 sob condições que são adequadas para infectar pelo menos uma por- ção das células tumorais primárias inoculadas ou as células inoculadas da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 com o arenavírus origi- nal, d) extrair um sobrenadante de cultura de células contendo arenavírus a partir de uma cultura de células contendo as cé- lulas tumorais primárias incubadas ou as células incubadas da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2, em que a sequência da etapa a) a d) é repetida uma pluralidade de ve- zes, em que as células tumorais primárias ou as células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 ao realizar a primeira repetição da sequência da etapa a) a d), durante realização da etapa b) é inoculada com o sobrenadante de cultura de células contendo arenavírus ou uma parte deste extraída ao realizar a etapa d) antes da primeira repetição da sequência da etapa a) a d), e em que as células tumorais primárias ou as células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 ao realizar cada repetição adicional da sequência da etapa a) a d), para realização da etapa b) é inoculada com o sobrenadante de cultura de células con- tendo arenavírus ou uma parte deste extraída ao realizar a etapa d) de um repetição da sequência de etapas a) a d).
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que as células tumorais primárias são passadas no máximo
1.000 vezes, em particular, no máximo, 100 vezes, preferencialmente,
no máximo, 10 vezes, antes de realização da etapa a).
17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, carac- terizado pelo fato de que a etapa c) é realizada; - em um período de 1 hora a 1.000 horas, em par- ticular, de 3 horas a 300 horas, de preferência, de 12 horas a 96 horas, e/ou - sob uma temperatura de 4°C a 50°C, em particu- lar de 20°C a 42°C, de preferência, de 34°C a 39°C e/ou - em um meio nutriente selecionado do grupo que consiste em RPMI-1640, DMEM e IMDM, em que o meio nutriente, em particular, compreende adicionalmente soro, tal como soro fetal de be- zerro ou soro humano, e/ou aminoácidos, tal como glutamato e/ou glu- tamina e/ou antibióticos e/ou - sob uma atmosfera de dióxido de carbono de 0% a 20%, em particular, de 2% a 10%, de preferência, de 4% a 6%.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de etapas é repetida 3 a 1.000 vezes, em particular, 10 a 100 vezes, preferencialmente, 20 a 50 vezes.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que: - as células tumorais primárias ou as células da li- nhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 e/ou - o arenavírus original e/ou o arenavírus contido no sobrenadante de cultura de células extraído ou uma parte deste são tra- tados com pelo menos um agente quimioterápico e/ou submetidos a um tratamento de radiação antes de realização da etapa d) e/ou - células tumorais primárias ou células da linhagem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 que são resistentes a pelo menos um agente quimioterápico são utilizadas, e/ou
- células tumorais primárias ou as células da linha- gem celular H1975, C643 ou Tramp-C2 e/ou o arenavírus original e/ou o arenavírus contido no sobrenadante de cultura de células extraído ou uma parte deste antes de realização da etapa d) são tratadas com pelo menos um composto antiviral, em particular com interferon alfa e/ou in- terferon gama.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que as células tumorais primárias são selecionadas do grupo que consiste em células de melanoma co- roidal primárias, células de carcinoma anal primárias, células de angios- sarcoma primárias, células de astrocitoma primárias, células de carci- noma basocelular primárias, células de carcinoma cervical primárias, células de condrossarcoma primárias, células de carcinoma coriônico primárias, células de carcinoma de células escamosas dérmicas primá- rias, células de carcinoma de intestino delgado primárias, células de car- cinoma endometrial primárias, células de sarcoma de Ewing primárias, células de fibrossarcoma primárias, células de carcinoma de vesícula biliar primárias, células de carcinoma de ducto biliar primárias, células de glioblastoma primárias, células de carcinoma de bexiga primárias, células de carcinoma de uretra primárias, células de carcinoma uretral primárias, células de carcinoma hepatocelular primárias, células tumo- rais testiculares primárias, células de carcinoma hipofaríngeo primárias, células de carcinoma pituitário primárias, células de sarcoma de Kaposi primárias, células de carcinoma brônquico de pequenas células primá- rias, células de carcinoma de cólon primárias, células de carcinoma co- lorretal primárias, células de carcinoma laríngeo primárias, células de leiomiossarcoma primárias, células de lipossarcoma primárias, células de carcinoma gástrico primárias, células de histiocitoma fibroso maligno primárias, células de carcinoma de mama primárias, células de medulo-
blastoma primárias, células de melanoma primárias, células de carci- noma do assoalho oral primárias, células de carcinoma sinusal primá- rias, células de carcinoma nasofaríngeo primárias, células de carcinoma do córtex adrenal primárias, células de carcinoma da paratireoide pri- márias, células de sarcoma neurogênico primárias, células de carci- noma brônquico de células não pequenas primárias, células de carci- noma renal primárias, células de carcinoma orofaríngeo primárias, célu- las de osteossarcoma primárias, células de carcinoma ovariano primá- rias, células de tumor pancreático primárias, células de carcinoma peni- ano primárias, células de feocromocitoma primárias, células de mesote- lioma pleural primárias, células de carcinoma da próstata primárias, cé- lulas de carcinoma retal primárias, células de retinoblastoma primárias, células de rabdomiossarcoma primárias, células de carcinoma tireoidi- ano primárias, células de carcinoma da glândula salivar primárias, célu- las de carcinoma de esôfago primárias, células de carcinoma de amíg- dala primárias, células de carcinoma vaginal primárias, células de carci- noma vulvar primárias, células tumorais de Wilms primárias, células de tumores neuroendócrinos primárias ou células de carcinoma da língua primárias.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que como arenavírus original utiliza- se um arenavírus de tipo selvagem, em particular, um vírus da coriome- ningite linfocítica do tipo selvagem.
22. Mutante do vírus da coriomeningite linfocítica, caracteri- zado pelo fato de que compreende: - uma glicoproteína com pelo menos uma mutação, em que pelo menos uma mutação é uma substituição de aminoácido da isoleucina na posição 181 da glicoproteína por outro aminoácido, de preferência metionina, e/ou uma substituição de aminoácido da arginina na posição 185 de a glicoproteína por outro aminoácido, de preferência,
triptofano, e/ou - uma proteína L apresentando pelo menos uma mutação, em que pelo menos uma mutação é uma substituição de ami- noácido da lisina na posição 1513 da proteína L por outro aminoácido, preferencialmente glutamato, e/ou uma substituição de aminoácido da fenilalanina na posição 1995 da proteína L por outro aminoácido, de preferência, serina, e/ou uma substituição de aminoácido de isoleucina na posição 2094 da proteína L por outro aminoácido, preferencialmente valina, e/ou uma substituição de aminoácido de treonina na posição 2141 da proteína L por outro aminoácido, preferencialmente alanina, e/ou uma substituição de aminoácido de arginina na posição 2175 da proteína L por outro aminoácido, preferencialmente lisina.
23. Mutante do vírus da coriomeningite linfocítica, em parti- cular, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o mutante compreende uma proteína ou peptídeo, em particular, uma glicoproteína ou proteína L, apresentando ou consistindo em uma se- quência de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 18, ID SEQ NO: 26, ID SEQ NO: 34, ID SEQ NO: 42, ID SEQ NO: 50, ID SEQ NO: 58, ID SEQ NO: 24, ID SEQ NO: 32, ID SEQ NO: 40, ID SEQ NO: 48, ID SEQ NO: 56 ou ID SEQ NO: 64.
24. Mutante do vírus da coriomeningite linfocítica, em parti- cular, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o mutante compreende um ácido nucleico, o qual é codificação de uma proteína ou peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 18, ID SEQ NO: 26, ID SEQ NO: 34, ID SEQ NO: 42, ID SEQ NO: 50, ID SEQ NO: 58, ID SEQ NO: 24, ID SEQ NO: 32, ID SEQ NO: 40, ID SEQ NO: 48, ID SEQ NO: 56 ou ID SEQ NO: 64, e/ou o mutante do vírus da coriomeningite linfocítica compreendendo um ácido nucleico que apresenta uma sequência de ácido nucleico ou consiste de uma sequência de ácido nucleico que é complementar à uma se- quência de ácido nucleico de acordo com ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 17, ID SEQ NO: 25, ID SEQ NO: 33, ID SEQ NO: 41, ID SEQ NO: 49, ID SEQ NO: 57, ID SEQ NO: 23, ID SEQ NO: 31, ID SEQ NO: 39, ID SEQ NO: 47, ID SEQ NO: 55 ou ID SEQ NO: 63.
25. Mutante do vírus da coriomeningite linfocítica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e 22 a 24, caracterizado pelo fato de que é para uso em medicina, em particular, para uso no tratamento e/ou prevenção de um tumor, preferencialmente, um tumor selecionado do grupo que consiste em carcinoma anal, carcinoma brôn- quico, carcinoma pulmonar, carcinoma endometrial, carcinoma da vesí- cula biliar, carcinoma da bexiga, carcinoma hepatocelular, carcinoma testicular, carcinoma do cólon, carcinoma colorretal, carcinoma colorre- tal, carcinoma hepatocelular, carcinoma testicular, carcinoma do cólon, tumor da bexiga, carcinoma da bexiga, tumor da bexiga, carcinoma he- patocelular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar, carcinoma en- dometrial, carcinoma colorretal, carcinoma retal, carcinoma laríngeo, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma de mama, carci- noma renal, carcinoma ovariano, carcinoma pancreático, carcinoma da faringe, carcinoma ofaríngeo, carcinoma da próstata, carcinoma da tire- oide, câncer cervical, angiossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, fibrossarcoma, sarcoma de Kaposi, lipossarcoma, leiomiossar- coma, histiocitoma de fibrose maligna, linfoma, leucemia, sarcoma neu- rogênico, osteomossarcoma e rabdomiossarcoma.
26. Medicamento ou composição farmacêutica, caracteri- zado pelo fato de que compreende um mutante do vírus da coriomenin- gite linfocítica, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e 22 a 24.
27. Medicamento, de acordo com a reivindicação 26, carac- terizado pelo fato de que compreende ainda um bloqueador de ponto de controle (checkpoint), tal como PD-1 e/ou um modulador de apoptose, em particular um inibidor de apoptose, tal como SMAC mimético.
28. Proteína ou peptídeo isolado, em particular, glicoprote- ína, proteína L, nucleoproteína, ou proteína Z, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 7, ID SEQ NO: 10, ID SEQ NO: 18, ID SEQ NO: 26, ID SEQ NO: 34, ID SEQ NO: 42, ID SEQ NO: 50, ID SEQ NO: 58, ID SEQ NO: 24, ID SEQ NO: 32, ID SEQ NO: 40, ID SEQ NO: 48, ID SEQ NO: 56 ou ID SEQ NO: 64, ID SEQ NO: 12, ID SEQ NO: 20, ID SEQ NO: 28, ID SEQ NO: 36, ID SEQ NO: 44, ID SEQ NO: 52, ID SEQ NO: 60, ID SEQ NO: 14, ID SEQ NO: 22, ID SEQ NO: 30, ID SEQ NO: 38, ID SEQ NO: 46, ID SEQ NO: 54 ou ID SEQ NO: 62.
29. Ácido nucleico isolado, em particular, codificação de uma glicoproteína, proteína L, nucleoproteína ou proteína Z, caracterizado pelo fato de que apresenta uma sequência de ácido nucleico ou consiste em uma sequência de ácido nucleico que é complementar à uma se- quência de ácido nucleico de acordo com ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 6 ou ID SEQ NO: 8, ID SEQ NO: 9, ID SEQ NO: 17, ID SEQ NO: 25, ID SEQ NO: 33, ID SEQ NO: 41, ID SEQ NO: 49, ID SEQ NO: 57, ID SEQ NO: 23, ID SEQ NO: 31, ID SEQ NO: 39, ID SEQ NO: 47, ID SEQ NO: 55, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 11, ID SEQ NO: 19, ID SEQ NO: 27, ID SEQ NO: 35, ID SEQ NO: 43, ID SEQ NO: 51, ID SEQ NO: 59, ID SEQ NO: 13, ID SEQ NO: 21, ID SEQ NO: 29, ID SEQ NO: 37, ID SEQ NO: 45, ID SEQ NO: 53 ou ID SEQ NO: 61.
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