CN117867030A - 小鼠肺癌细胞系cmt167荧光素酶稳转细胞株的构建与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体公开了一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建、筛选以及体内建模的方法。本发明利用慢病毒载体将荧光素酶LUC转染入CMT167小鼠肺癌细胞，经单克隆筛选后获得稳定表达LUC的CMT167细胞株，同时利用原位接种技术构建小鼠体内模型。利用本方法建立的稳转细胞株通过原位移植至小鼠体内，可以实时监测和评估CMT167小鼠肺癌的发生、发展、浸润、转移及相应治疗措施的治疗效果，并达到活体动物体内示踪的目的，应用该细胞株制备的小鼠原位模型在肺癌的发生发展机制研究、治疗药物筛选及不同治疗方案筛选中具有极佳的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体公开了一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建、筛选以及体内建模的方法。
背景技术
肺癌是我国最常见的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌约占80％～85％，其余为小细胞肺癌。由于早期肺癌多无明显症状，临床上多数患者出现症状就诊时已属晚期，而晚期肺癌患者整体5年生存率不高。
小鼠肺癌细胞CMT167同种移植模型是一个广泛应用于临床前药理药效研究的小鼠动物模型，通常人们都是通过建立皮下模型对其进行研究，但随着近年来免疫治疗相关药物研发的火热开展，肿瘤免疫微环境受到越来越多研究人员的重视，因此开发一种能实时监测的小鼠肺癌原位模型显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开了一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建、筛选以及体内建模的方法，本发明利用慢病毒载体将荧光素酶LUC转染入CMT167小鼠肺癌细胞，经单克隆筛选后获得稳定表达LUC的CMT167细胞株，同时利用原位接种技术构建小鼠体内模型。
本发明的技术方案如下：
一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，包括以下步骤：
S1.构建含有荧光素酶的慢病毒载体：合成萤光素酶编码区的序列，然后将其克隆到慢病毒载体中；
S2.将含有荧光素酶的慢病毒载体和包装质粒，共同转染入病毒宿主细胞，扩增病毒，并收集病毒毒液；
S3.将收集的慢病毒毒液转染CMT167小鼠肺癌细胞，并通过连续稀释分离单个克隆细胞，加入荧光素酶底物D-luciferin进行荧光素酶活性检测，筛选出稳定表达LUC的CMT167荧光素酶稳转细胞株CMT167-LUC。
进一步的，上述一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，还包括验证步骤S4：
将CMT167-LUC细胞原位接种于C57BL/6小鼠肺部，接种后一周两次进行小动物活体成像，若结果显示小鼠肺部光子信号随着时间的推移逐渐增大，则肿瘤模型构建成功，即CMT167荧光素酶稳转细胞株具有实用价值。
进一步的，上述一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，所述步骤S1中的萤光素酶编码区的DNA序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，上述一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，所述步骤S1中的慢病毒载体为pLVX-IRES-ZsGreen1。
进一步的，上述一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，所述步骤S2中的包装质粒包括psPAX2和pMD2.G。
进一步的，上述一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，所述步骤S2中的病毒宿主细胞为293T细胞。
进一步的，上述一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，所述步骤S3中荧光素酶底物D-luciferin的加入量为150μg/mL。
本发明还公开了一株小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株，由上述任一项所述的构建方法制备。
本发明还公开了上述细胞株或者构建方法在研制治疗肺癌的药物中的用途。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明通过慢病毒表达载体将荧光素酶稳定转入CMT167小鼠肺癌细胞中，从而获得CMT167-LUC稳转细胞株，利用本方法建立的稳转细胞株通过原位移植至小鼠体内，可以实时监测和评估CMT167小鼠肺癌的发生、发展、浸润、转移及相应治疗措施的治疗效果，并达到活体动物体内示踪的目的。应用该细胞株制备的小鼠原位模型在肺癌的发生发展机制研究、治疗药物筛选及不同治疗方案筛选中具有极佳的应用前景。
附图说明
图1为pLVX-LUC-IRES-ZsGreen1载体图谱；
图2为荧光素酶活性检测比较；
图3为小鼠活体成像图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
SEQ ID No.1= TCTAGAATGGAGGATGCCAAGAATATTAAGAAAGGCCCTGCCCCATTCTACCCTCTGGAAGATGGCACTGCTGGTGAGCAACTGCACAAGGCCATGAAGAGGTATGCCCTGGTCCCTGGCACCATTGCCTTCACTGATGCTCACATTGAGGTGGACATCACCTATGCTGAATACTTTGAGATGTCTGTGAGGCTGGCAGAAGCCATGAAAAGATATGGACTGAACACCAACCACAGGATTGTGGTGTGCTCTGAGAACTCTCTCCAGTTCTTCATGCCTGTGTTAGGAGCCCTGTTCATTGGAGTGGCTGTGGCCCCTGCCAATGACATCTACAATGAGAGAGAGCTCCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCAACTGTGGTCTTTGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAAAAGATCCTGAATGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAAGACTGACTACCAGGGCTTCCAGAGCATGTATACCTTTGTGACCAGCCACTTACCCCCTGGCTTCAATGAGTATGACTTTGTGCCTGAGAGCTTTGACAGGGACAAGACCATTGCTCTGATTATGAACAGCTCTGGCTCCACTGGACTGCCCAAAGGTGTGGCTCTGCCCCACAGAACTGCTTGTGTGAGATTCAGCCATGCCAGAGACCCCATCTTTGGCAACCAGATCATCCCTGACACTGCCATCCTGTCTGTGGTTCCATTCCATCATGGCTTTGGCATGTTCACAACACTGGGGTACCTGATCTGTGGCTTCAGAGTGGTGCTGATGTATAGGTTTGAGGAGGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTACAAGACTACAAGATCCAGTCTGCCCTGCTGGTGCCCACTCTGTTCAGCTTCTTTGCCAAGAGCACCCTCATTGACAAGTATGACCTGAGCAACCTGCATGAGATTGCCTCTGGAGGAGCACCCCTGAGCAAGGAGGTGGGTGAGGCTGTGGCAAAGAGGTTCCATCTCCCAGGAATCAGACAGGGCTATGGCCTGACTGAGACCACCTCTGCCATCCTCATCACCCCTGAAGGAGATGACAAGCCTGGTGCTGTGGGCAAGGTGGTTCCCTTTTTTGAGGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACTGGCAAGACCCTGGGAGTGAACCAGAGGGGTGAGCTGTGTGTGAGGGGTCCCATGATCATGTCTGGCTATGTGAACAACCCTGAGGCCACCAATGCCCTGATTGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCTGGTGACATTGCCTACTGGGATGAGGATGAGCACTTTTTCATTGTGGACAGGCTGAAGAGCCTCATCAAGTACAAAGGCTACCAAGTGGCACCTGCTGAGCTAGAGAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTTGATGCTGGTGTGGCTGGCCTGCCTGATGATGATGCTGGAGAGCTGCCTGCTGCTGTTGTGGTTCTGGAGCATGGAAAGACCATGACTGAGAAGGAGATTGTGGACTATGTGGCCAGTCAGGTGACCACTGCCAAGAAGCTGAGGGGAGGTGTGGTGTTTGTGGATGAGGTGCCAAAGGGTCTGACTGGCAAGCTGGATGCCAGAAAGATCAGAGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGTGGCAAAGGATCC。
实施例1
构建含有荧光素酶的慢病毒载体
利用XbaI限制性内切酶和BamHI限制性内切酶对pLVX-IRES-ZsGreen1载体进行酶切，通过凝胶回收试剂盒回收并纯化慢病毒表达载体。同时根据DNA序列（KM099238）合成萤火虫萤光素酶编码区的序列如SEQ ID No.1所示 ，随后分别取慢病毒表达载体4μl及萤光素酶编码区片段6μl，于16℃温育30min进行连接、转化，获得携带萤光素酶基因的慢病毒表达载体pLVX-LUC-IRES-ZsGreen1，载体图谱件图1所示。
实施例2
在293T细胞中产生慢病毒
1） 转染前一天，将293T细胞接种在10cm的组织培养板中，使它们在转染当天融合率达到90-95%。
2） 在转染当天，用生长培养基替换来自293T细胞的培养基。
3） 对于每个转染样品，制备Lipofectamine复合物。使用Lipofectamine 3000，pLVX-LUC-IRES-ZsGreen1慢病毒载体以及包装质粒psPAX2和pMD2.G进行转染。
4） 将DNA-Lipofectamine复合物逐滴加入每个孔中，并通过来回摇动平板轻轻混合。然后将细胞在37°C的湿度为5%CO2的培养箱中培养过夜。
5） 第二天，用2ml不含抗生素的完全培养基代替含有DNA-Lipofectamine复合物的培养基。将细胞在37°C的湿度为5%CO2的培养箱中培养。
6） 转染后48–72小时，通过将培养基移到无菌、带帽的锥形管中，收获含有病毒的上清液。
7） 将病毒上清液在4°C下以3000rpm离心15分钟以沉淀碎片，然后通过Millex HV0.45μm过滤器过滤病毒上清液。
8） 然后将病毒上清液直接用于随后的感染实验，或以1 ml等分试样保存在冷冻瓶中，并作为病毒储备在-80°C下储存。
实施例3
用荧光素酶慢病毒转染CMT167细胞
1） CMT167细胞在完全培养基中接种。
2） 在转染当天，将荧光素酶慢病毒原液解冻，并加热至室温，并将1ml用于6孔板一孔中的细胞。
3） 从细胞中吸出培养基，并用含有病毒的培养基代替。轻轻旋转培养基，使细胞和病毒充分混合。
4） 将Polybrene R添加至最终浓度为10μg/ml。将板轻轻旋转以混合，然后在37°C的湿度为5%CO2的培养箱中培养过夜。
5） 第二天，用新鲜、完整的培养基替换含有病毒的培养基，并在37°C下将6孔板在湿度为5%CO2的培养箱中孵育。
6） 之后每3-4天用含有嘌呤霉素的新鲜培养基替换培养基，直到鉴定出抗生素抗性细胞克隆（通常在选择后10-12天）。
实施例4
通过连续稀释分离单个克隆
1） 收集并计数细胞，然后通过将1×106个细胞加入最终体积10mL的培养基中，使细胞悬浮液为1×105个细胞/mL。
2） 通过将1mL以上溶液加入9mL培养基中，使细胞悬浮液为1×104个细胞/mL。
3） 将1mL上述溶液（1×104个细胞/mL）加入9ml培养基中并充分混合以制备1×103个细胞/mL。
4） 然后将1mL上述溶液（1×103个细胞/mL）加入9ml培养基中以制备100个细胞/mL的细胞悬浮液。
5） 将1mL上述溶液（100个细胞/mL）加入39ml培养基中，制成0.5个细胞/200mL的细胞悬浮液。
6） 将200μL上述细胞悬浮液加入96孔板中的每个孔中，培养约3-4周后，单个克隆从孔中生长出来。
实施例5
通过荧光素酶活性测定法验证单个克隆的蛋白质表达。
将单个克隆转移到96孔板中，加入150μg/ml荧光素酶底物D-luciferin进行荧光素酶活性检测（如图2所示），筛选出稳定表达LUC的CMT167单克隆细胞。
实施例6
构建CMT167小鼠肺癌细胞原位移植模型
在原位接种之前，通过腹腔内注射10mg/kg戊巴比妥钠麻醉C57BL/6小鼠并固定在右侧卧位。然后将1ml注射器制备的100μL CMT167-Luc单细胞悬液（1×106/mL）经皮快速接种到右腋前线上第六肋间肋上缘约5mm深度，然后迅速拔针。小鼠在注射后保持在右侧卧位，并观察直至完全恢复。细胞接种后每周两次通过IVIS Lumina III 小鼠活体成像仪（PerkinElmer, USA）对肿瘤生长进行监测。具体的实验步骤如下：
1)成像小鼠通过腹腔注射D-Luciferin 成像底物, 注射剂量为150 mg/kg小鼠体重，注射体积为10 mL/kg小鼠体重。
2)底物注射10分钟后，成像小鼠置于异氟烷麻醉箱中进行麻醉。
3)待成像小鼠进入麻醉状态后，将小鼠转移至成像仪中，通过将小鼠口鼻置于麻醉系统套管中维持动物在成像过程中处于麻醉状态，小鼠按照耳号从小到大，从左到右放置，腹部朝上，小鼠尾巴置于黑色遮光套管中。
4)IVIS Lumina III成像软件中选择生物发光成像，曝光时间设置为自动，进行小鼠成像，结果见图3。
5)成像结束后，将小鼠转移至饲养笼盒内，待全部动物确认苏醒后放回小鼠饲养架中。
结果表明：将CMT167-LUC细胞原位接种于C57BL/6小鼠肺部后，小鼠肺部光子信号随着时间的推移逐渐增大，肿瘤模型构建成功。
以上所述实施例仅表达了本发明的有限几种优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建含有荧光素酶的慢病毒载体：合成萤光素酶编码区的序列，然后将其克隆到慢病毒载体中；
S2.将含有荧光素酶的慢病毒载体和包装质粒，共同转染入病毒宿主细胞，扩增病毒，并收集病毒毒液；
S3.将收集的慢病毒毒液转染CMT167小鼠肺癌细胞，并通过连续稀释分离单个克隆细胞，加入荧光素酶底物D-luciferin进行荧光素酶活性检测，筛选出稳定表达LUC的CMT167荧光素酶稳转细胞株CMT167-LUC。
2.根据权利要求1所述的一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，其特征在于，还包括验证步骤S4：
将CMT167-LUC细胞原位接种于C57BL/6小鼠肺部，接种后一周两次进行小动物活体成像，若结果显示小鼠肺部光子信号随着时间的推移逐渐增大，则肿瘤模型构建成功，即CMT167荧光素酶稳转细胞株具有实用价值。
3.根据权利要求1所述的一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中的萤光素酶编码区的DNA序列如SEQ ID No.1所示。
4.根据权利要求1所述的一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中的慢病毒载体为pLVX-IRES-ZsGreen1。
5.根据权利要求1所述的一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中的包装质粒包括psPAX2和pMD2.G。
6.根据权利要求1所述的一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中的病毒宿主细胞为293T细胞。
7.根据权利要求1所述的一种小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中荧光素酶底物D-luciferin的加入量为150μg/mL。
8.一株小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的构建方法制备。
9.如权利要求8所述的小鼠肺癌细胞系CMT167荧光素酶稳转细胞株在研制治疗肺癌的药物中的用途。
10.如权利要求1-7任一项所述的的构建方法在研制治疗肺癌的药物中的用途。
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