CN109868280A

CN109868280A - 一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒、相应基因载体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109868280A
Application number: CN201910117363.6A
Authority: CN
Inventors: 褚茂平; 郭晓令; 李超; 陈显武
Original assignee: Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
Current assignee: Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2019-02-15
Publication date: 2019-06-11

Abstract

本发明涉及一种人源一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体、NOS2基因过表达慢病毒及其构建方法和应用。本发明通过分子克隆技术，将普通质粒上的人源NOS2基因利用PCR扩增技术加上XhoI和BamHI酶切位点，并经酶切后连接到空载的过表达慢病毒载体上，得到NOS2基因过表达的慢病毒载体。再使用慢病毒包装质粒对NOS2基因过表达慢病毒载体进行包装，通过转染293T细胞，得到相应的慢病毒。本发明构建的NOS2基因过表达慢病毒对宿主细胞转染效率高，能特异性、持续、高效的促进人源NOS2基因在宿主细胞中稳定表达。同时，本发明构建的NOS2基因过表达慢病毒载体能特异性合成可诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，并带有绿色荧光蛋白标签，为进一步研究人源一氧化氮合酶2(NOS2)的功能和潜在作用机理提供了实验基础。

Description

一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒、相应基因载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒载体、一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒及其构建方法和应用。

背景技术

NO是一种新型生物信使分子，广泛存在于多种细胞中。其结构简单、可快速透过生物膜进行扩散；NO分子中有一未配对电子，可形成自由基,从而可与超氧自由基、氧分子或过渡金属反应；此外，NO作为第二信使普遍存在于脊椎动物中，对血管的流速、流量及血管阻力起调节作用。人体的免疫功能、血小板凝集反应、记忆和神经传递等内环境稳定都与其有关。因此，NO受到人们的普遍重视。

NO是活性氮簇(RNS)的一员，由一氧化氮合酶(NOS)产生，可诱导型NOS (iNOS)是NOS的一种亚型，由NOS2基因编码。研究表明，iNOS在慢性神经变性疾病、炎症、梗阻性病变、肿瘤、移植/植入等行为中发挥重要作用。iNOS 的表达与信号通路中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、核因子(NF-kB)通路、蛋白激酶(PK)C通路、环腺营酸(cAMP)依赖PKA通路、核激素受体过氧化物酶体增生激活受体(PPAR)通路、磷脂酰肌醇兰羟基激酶(P13K)-蛋白激酶 B(Akt通路)、JAK/信号转导及转录活化因子(STAT)通路、血红素加氧酶(HO)-1/ 一氧化碳(CO)通路均密切相关。构建NOS2基因过表达慢病毒载体从而具有重要意义。

为实现NOS2基因在目的细胞中过表达，目前普遍采用将整合有NOS2基因的普通过表达质粒通过脂质体对宿主细胞进行转染，但是对大多数细胞脂质体转染效率较低。因此，如何提高NOS2基因过表达载体的转染效率是目前亟需解决的问题。

发明内容

未解决上述技术问题，本发明提供了一种一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体、一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒及其构建方法和应用。

本发明提供一种一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体及其制备方法。制备方法包括以下步骤：

①以普通质粒pDoubleEx-EGFP-NOS2为基因模板，通过上游引物NOS2-F 和下游引物NOS2-R对该模板进行PCR扩增，预先在上下游引物两端分别设计加入XhoI和BamHI酶切位点序列以获取一氧化氮合酶2(NOS2)基因，所述 NOS2-F的上游引物序列为 CACCTCGAGATGGCCTGTCCTTGGAAATTTCTGT，NOS2-R的下游引物序列为GCGAGATCTTCAGAGCGCTGACATCTCCAG。

②确认步骤①在中的PCR产物大小为3462bp后回收纯化的一氧化氮合酶2 (NOS2)基因。

③用XhoI限制性内切酶和BamHI限制性内切酶分别对所述纯化的一氧化氮合酶2(NOS2)基因和空载过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1进行双酶切后，回收纯化带有酶切粘性末端的NOS2基因和pLVX-IRES-ZsGreen1。

④采用T4 DNA连接酶将一氧化氮合酶2(NOS2)基因连接到 pLVX-IRES-ZsGreen1上，得到NOS2基因过表达的慢病毒载体 pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2。

人源一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体即为上述制备方法制备获得。

此外还提供一种一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒及其制备方法，制备方法为：使用慢病毒包装质粒psPAX2和慢病毒包装质粒pMD2.G对所述 pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2进行包装并通过转染293T细胞，得到NOS2基因过表达慢病毒。

进一步，所述制备方法具体包括以下步骤：

S1：用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞并培养消化后的293T细胞，待倒置光学显微镜下观察细胞达到70-90％汇合度时准备转染。

S2：用所述NOS2基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2、慢病毒包装质粒psPAX2及慢病毒包装质粒pMD2.G转染步骤S1中得到的293T 细胞，NOS2基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2、慢病毒包装质粒psPAX2及慢病毒包装质粒pMD2.G的比率为2:1:1。

S3：对转染后的293T细胞进行细胞培养12h后，弃细胞上清液后再用PBS 轻轻洗3次。重新加入新鲜的完全培养基后继续培养48h，然后回收细胞上清液、低速离心、过滤、超速离心、吸弃上清后留沉淀，用冰上预冷的PBS重悬沉淀后得到人源一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒。

一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒即为上述制备方法制备所获得。

此外，还提供一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒在感染人源心肌细胞HMC中的应用。

本发明提供的人源一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体、一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒以及他们的构建方法。本发明构建的人源一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒对宿主细胞转染效率高，能特异性、持续、高效的促进一氧化氮合酶基因在宿主细胞中稳定表达。同时，本发明构建的NOS2基因过表达慢病毒载体能特异性合成可诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，并带有绿色荧光蛋白标签，为进一步研究一氧化氮合酶2(NOS2)的功能和潜在作用机理提供了实验基础。

以下结合附图对本发明进行更进一步详细的说明。

附图说明

图1为pDoubleEx-EGFP-NOS2普通质粒图谱。

图2为pLVX-IRES-ZsGreen1空载过表达慢病毒载体图谱。

图3为psPAX2慢病包装质粒图谱。

图4为pMD2.G慢病包装质粒图谱。

图5为PCR扩增NOS2基因。

图6为菌落PCR鉴定(随机挑选1-20号菌落)，其中A为PCR鉴定电泳图，B为200bpDNA marker图。

图7为2号阳性克隆测序报告图。

图8为人源NOS2基因过表达慢病毒感染的293T细胞，其中A表示明场， B表示荧光场，C表示明场和荧光场叠加。

图9为人源NOS2基因过表达慢病毒感染人源心肌细胞HCM，其中A表示明场，B表示荧光场，C表示明场和荧光场叠加。

图10为qPCR定量检测比较NOS2基因过表达慢病毒感染或未感染的HCM 细胞NOS2基因表达水平。^*P<0.05表示有统计学意义。

图11为WB定量检测比较NOS2基因过表达慢病毒感染或未感染的HCM 细胞可诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平，其中A为WB蛋白条带，B为蛋白条带定量图。^*P<0.05表示有统计学意义。

具体实施方式

本文所称NOS2基因过表达慢病毒载体、慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2均为一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体，所称NOS2基因过表达慢病毒为一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒。所称Tryptone为胰蛋白胨，所称Yeast Extract为酵母粉，所称NaCl为氯化钠。下面，通过示例性的实施例本发明具体描述。

实施例1

实验材料包括有：DH5a感受态细胞(Invitrogen)；293T细胞(ATCC)；人源心肌细胞HCM(ATCC)。

LB培养基(Sigma)；普通过表达质粒pDoubleEx-EGFP-NOS2(长沙赢润生物)；慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1(南京麦田生物)；慢病毒包装质粒psPAX2 和pMD2.G；胎牛血清FBS(Invitrogen)；胰蛋白酶(Gibco)；DEMEM-F12基础培养基(Gibco)；PBS缓冲液(Gibco)；100U/mL青霉素(Gibco)；100ug/mL 链霉素(Gibco)；XhoI和BamHI限制性内切酶(Takara)；去内毒素质粒提取试剂盒(TIANGEN)；切胶回收试剂盒(TIANGEN)；T4 DNA连接酶(NEB)；Amp抗生素(上海宁杭生物)；DNA marker(Invitrogen)；Q5超保真DNA聚合酶 (NEB)；DNA聚合酶(NEB)；引物合成(上海生工)；基因测序(天擎生物)；逆转录试剂盒(TOYOBO)；qPCR试剂盒(NEB)；LTX脂质体转染试剂盒 (Invitrogen)。

实验过程如下所示：

LB培养基包括有10克Tryptone，5克Yeast Extract和10克NaCl。将这些内容物用去离子水溶解，调节PH至7.0，再定容至1000mL，分装到LB管中，每管5mL，高压灭菌，4℃保存。

如果配置LB固体培养基，需加入2％(质量/体积)琼脂粉。

人源NOS2基因过表达的慢病毒载体构建

步骤①、利用长片段高保真性DNA聚合酶，以购买普通质粒 pDoubleEx-EGFP-NOS2为基因模板，通过如表1所示引物进行PCR扩增获取 NOS2基因，在上下游引物两端分别预先设计加入XhoI和BamHI酶切位点序列。

表1 NOS2-F与NOS2-R的引物情况

引物名称	引物序列	PCR产物
			NOS2-F	CACCTCGAGATGGCCTGTCCTTGGAAATTTCTGT	3462bp
NOS2-R	GCGAGATCTTCAGAGCGCTGACATCTCCAG	3462bp

PCR反应体系与条件如表2所示。

表2 PCR反应体系与条件

成分	体积
		模板(pDoubleEx-EGFP-NOS2质粒)	1μL
NOS2-F(10μM)	1.25μL
		NOS2-R(10μM)	1.25μL
5×Q5反应缓冲液	5μL
		5×Q5 High GC Enhancer	5μL
dNTPs(10mM)	0.5μL
		Q5超保真DNA聚合酶	0.3μL
ddH<sub>2</sub>O	10.7μL
		总体积	20μL

PCR反应程序如表3所示。

表3 PCR反应程序

NOS2基因CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤②、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小是否为3462bp，如果吻合，切割在琼脂糖凝胶电泳中的目的片段，采用切胶回收试剂盒回收纯化NOS2基因。

步骤③、用XhoI和BamHI限制性内切酶分别对NOS2基因和慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1进行双酶切(37℃酶切4h)，反应体系如表4所示：

表4限制性内切酶的酶切反应体系

试剂	体积
		pLVX-IRES-ZsGreen1或NOS2基因	2μL(1μg)
10×H Buffer	6μL
		10×K Buffer	6μL
XhoI	3μL
		BamHI	3μL
ddH<sub>2</sub>O	30μL
		总体积	50μL

应用琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳中的NOS2基因和慢病毒载体，采用切胶回收试剂盒回收纯化带有酶切粘性末端的NOS2基因和慢病毒载体。

步骤④、采用T4 DNA连接酶于16℃水浴锅中，将NOS2基因和慢病毒载体的粘性末端进行连接过夜(12h)。反应体系如表5所示。

表5连接酶连接的反应体系

为证实确实建构了可应用的NOS2基因慢病毒载体，进行以下实验过程：

实验例1：

转化感受态细胞：从-80℃冰箱取出1管100μL DH5a感受态细胞，放4℃冰箱解冻，吸取50μL DH5a感受态细胞转移到新的EP管中。然后取上述连接产物10μL 加入到其中一管感受态细胞中混匀，另外一管加入10μL的ddH₂O作为对照组。冰浴吸附30min，42℃水浴锅总热激90s，冰上静止5min。接着加入400μL LB液体培养基，37℃恒温摇床(转速150转/min)恢复培养45min，同时将LB固态培养板(带Amp抗生素)放入37℃恒温箱中预热。然后将其混匀后涂布到预热后的 LB固态培养板上，然后37℃培养箱静止培养1h，最后37℃倒置培养过夜(10h)。

菌落PCR鉴定：观察培养过夜后对照组LB平板是否有菌落长出，如果没有，证明没有杂菌污染。接着采用200μL灭菌的枪头随机挑取实验组中数个菌落划痕到新的LB固态培养板对应方格中上继续培养12h(该培养板提前在反面画均匀的方格并标上序号)。把划痕后的枪头置于装有LB液体培养基(带Amp抗生素) 的EP管中(管盖提前对应平板上方格做好编号)，并用移液器吹打几次，使菌液混匀到培养基中。将EP管置于管架上，用报纸包裹，转移到37℃摇床培养12h，要倾斜放置。培养12h后，固体培养板用封口膜封住，4℃保存，EP管菌液进行菌液PCR鉴定。鉴定引物如表6，反应体系如表7，反应条件如表8：

表6鉴定引物情况表

引物名称	引物序列	PCR产物
			NOS2-JD-F	CAGGGTGGAAGCGGTAACAA	495bp
NOS2-JD-R	ACCTCAAGCACAAGGTCAGG	495bp

表7 PCR反应体系与条件

表8 PCR反应程序

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小是否为495bp，如果吻合，则证明该编号下菌液为阳性克隆。再将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行进一步测序验证，测序引物选用CMV启动子。

实验结果：如图1所示，商业化带人源NOS2基因的模板，该基因CDS序列已经克隆到普通过表达质粒pDoubleEx-EGFP-NOS2上。

如图5所示，利用PCR扩增技术获取两端分别带XhoI和BamHI酶切位点序列的NOS2基因，分子量3500bp左右。如图2所示，通过酶切和酶连操作将NOS2基因克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体上。如图6所示，通过菌液PCR鉴定，成功筛选除19个(总共挑选20个克隆)阳性克隆，除5号外均成功PCR获得500bp 左右的目的条带。随机挑选部分阳性克隆测序，其中2号菌液测序结果如图7所示，经过核酸序列Blast在线软件比对，成功将NOS2基因整合到pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体上，获得NOS2基因过表达慢病毒载体 pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2。

以下提供实施例2，以阐述NOS2慢病毒的包装和建构。

实施例2

步骤S1：取对数生长期的293T细胞，用胰蛋白酶消化细胞，然后用细胞计数板进行计数，按细胞浓度1×10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板中。每孔加入2mL 完全培养基(DEMEM-F12+10％FBS+100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)，转移至37℃二氧化碳培养箱继续培养2-3天，待倒置光学显微镜下观察细胞达到 70-90％汇合度时准备转染。

步骤S2：按商业化LTX脂质体转染试剂盒说明书进行共转染重组慢病毒过表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2和慢病毒包装质粒psPAX2及pMD2.G。针对6孔板每个孔，三种质粒DNA比率按2:1:1，具体量如表9所示。

表9三种质粒DNA具体量

质粒	质量
		pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2	2μg
psPAX2	1μg
		pMD2.G	1μg

步骤S3：转染后的细胞转移至37℃二氧化碳培养箱培养12h，然后弃去培养基，细胞用PBS轻轻洗3次。向每孔细胞中重新加入2mL完全培养基继续培养48h。然后回收此时的上清，采用低速离心机2000转/min离心，吸取上清液，弃沉淀从而除去死细胞及细胞碎片。此上清液采用0.45μm的滤器进行过滤一次。然后将所有的过滤后的上清液进行4℃，离心力55200g超速离心2h，缓慢吸弃上清(50mL 超离管底预留200μL左右液体不要吸，以免造成病毒损失)。然后加入500μL冰上预冷的PBS重悬，4℃放置过夜，即得到浓缩的NOS2基因过表达慢病毒。如果需长期保持，转移至-80℃冰箱。

实验结果：通过脂质体转染，成功将pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2，psPAX2 和pMD2.G三种质粒转运至293T细胞中。由于pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2带绿色荧光蛋白标签，因此，如图8所示，倒置显微镜下我们能观察到大部分293T细胞发绿色荧光，说明成功实现NOS2慢病毒包装。

以下，提供实验例2至实验例4，以阐述NOS2慢病毒的实际作用。

实验例2：NOS2慢病毒感染人源心肌细胞HCM

实验过程：取对数生长期的HCM细胞，用胰蛋白酶消化细胞，然后用细胞计数板进行计数，按细胞浓度1×10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板中。每孔加入2mL 完全培养基(DEMEM-F12+10％FBS+100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)，转移至37℃二氧化碳培养箱继续培养2天，待倒置光学显微镜下观察细胞达到 60-80％汇合度时准备NOS2慢病毒感染。

吸弃培养基上清，PBS洗1遍。吸取2mL完全培养基到5mL EP管中，加入20μL 上述NOS2慢病毒浓缩液，充分混匀后，将混合液加入到细胞中。转移至37℃二氧化碳培养箱继续培养2天。pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2带绿色荧光蛋白标签，可倒置荧光显微镜下观察间接观察NOS2过表达情况。同时可以提取细胞mRNA 和总蛋白进行定量评估NOS2过表达水平。进而作为很好工具进一步研究NO和 NOS2对宿主细胞影响及作用机理。

实验结果：如图9所示，回收的NOS2慢病毒浓缩液感染HCM细胞，感染2 天后，荧光显微镜下观察到大部分HCM细胞发绿色荧光，说明NOS2慢病毒可成功感染HCM。

实验例3：蛋白印迹检测

将上述感染NOS2慢病毒后的HCM，吸掉上清，PBS洗1遍，放置冰上操作，加入细胞裂解液(RIPA)裂解30分钟，收集裂解液，4℃冷冻离心(16000转/min, 15min)收集上清，BCA定量试剂盒测定蛋白浓度后，-20℃冰箱保存。跑胶前解冻后与溴酚兰(4:1)混混合，加入β巯基乙醇后煮沸制样。各组分别用微量注射器取50μg蛋白样进行12％十二烷基硫酸钠凝胶电泳，电泳后进行电转(按“滤纸-PVDF膜-胶-滤纸”的顺序叠好，电流恒流180mA，电压120V，湿转2.5h)，将蛋白样转移到PDVF膜上。然后用5％脱脂奶粉对PDVF膜进行4℃封闭处理 1h，接着加入一抗：兔多克隆iNOS抗体(1:500)和鼠单克隆β-Actin抗体(1:5000)， 4℃孵育过夜。然后TBST洗5遍，每次10min，接着加入二抗：HRP标记羊抗兔 IgG和HRP标记羊抗鼠IgG抗体(1:5000)室温孵育2h。之后TBST洗5遍，每次 10min，加入ECL发光液后在蛋白荧光成像系统下曝光并拍照。

实验结果：图11所示，通过蛋白免疫印迹进行蛋白定量分析，感染NOS2慢病毒的HCM表达NOS2蛋白水平显著高于对照组未感染NOS2慢病毒。从而说明，本发明构建的NOS2基因过表达慢病毒对宿主细胞HCM实现高效转染，能特异性、持续、高效的促进NOS2基因在宿主细胞中稳定表达。

实验例4：定量PCR(qPCR)检测

利用Trizol(Invitrogen)提取各组细胞总的RNA，并测定OD，保证提取各组的RNAOD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.8和2.1之间，以保证其纯度。然后总RNA利用逆转录试剂盒进行反转录成cDNA，反应体系和反应程序参照产品说明书。cDNA用来做qPCR，引物如表10所示：

表10引物情况

反应体系参考qPCR试剂盒说明书，瞬离后上机,反应程序如表11所示：

表11 PCR反应程序

反应后根据Ct值统计分析，绘制标准曲线，使用基于Ct(2^-△△Ct)方法进行定量分析。

实验结果：如图10所示，通过基因定量分析，感染NOS2基因过表达慢病毒的HCM表达NOS2基因表达水平显著高于对照组未感染NOS2慢病毒。从而说明，本发明构建的NOS2慢病毒对宿主细胞HCM实现高效转染，能特异性、持续、高效的促进NOS2基因在宿主细胞中稳定表达。

以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

<110> 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院

<120> 一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒、相应基因载体及其制备方法和应用

<140> 2019101173636

<141> 2019-02-15

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3462

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atggcctgtc cttggaaatt tctgttcaag accaaattcc accagtatgc aatgaatggg 60

gaaaaagaca tcaacaacaa tgtggagaaa gccccctgtg ccacctccag tccagtgaca 120

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aatggagaga aactgaagaa atcgctcttc atgctgaaag agctcaacaa caaattcagg 1860

tacgctgtgt ttggcctcgg ctccagcatg taccctcggt tctgcgcctt tgctcatgac 1920

attgatcaga agctgtccca cctgggggcc tctcagctca ccccgatggg agaaggggat 1980

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tgtgagacgt ttgatgtccg aggcaaacag cacattcaga tccccaagct ctacacctcc 2100

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gatggccaag gcctgaacta cctgccgggg gagcaccttg gggtttgccc aggcaaccag 2340

ccggccctgg tccaaggtat cctggagcga gtggtggatg gccccacacc ccaccagaca 2400

gtgcgcctgg aggccctgga tgagagtggc agctactggg tcagtgacaa gaggctgccc 2460

ccctgctcac tcagccaggc cctcacctac ttcctggaca tcaccacacc cccaacccag 2520

ctgctgctcc aaaagctggc ccaggtggcc acagaagagc ctgagagaca gaggctggag 2580

gccctgtgcc agccctcaga gtacagcaag tggaagttca ccaacagccc cacattcctg 2640

gaggtgctag aggagttccc gtccctgcgg gtgtctgctg gcttcctgct ttcccagctc 2700

cccattctga agcccaggtt ctactccatc agctcctccc gggatcacac gcccacagag 2760

atccacctga ctgtggccgt ggtcacctac cacacccgag atggccaggg tcccctgcac 2820

cacggcgtct gcagcacatg gctcaacagc ctgaagcccc aagacccagt gccctgcttt 2880

gtgcggaatg ccagcggctt ccacctcccc gaggatccct cccatccttg catcctcatc 2940

gggcctggca caggcatcgc gcccttccgc agtttctggc agcaacggct ccatgactcc 3000

cagcacaagg gagtgcgggg aggccgcatg accttggtgt ttgggtgccg ccgcccagat 3060

gaggaccaca tctaccagga ggagatgctg gagatggccc agaagggggt gctgcatgcg 3120

gtgcacacag cctattcccg cctgcctggc aagcccaagg tctatgttca ggacatcctg 3180

cggcagcagc tggccagcga ggtgctccgt gtgctccaca aggagccagg ccacctctat 3240

gtttgcgggg atgtgcgcat ggcccgggac gtggcccaca ccctgaagca gctggtggct 3300

gccaagctga aattgaatga ggagcaggtc gaggactatt tctttcagct caagagccag 3360

aagcgctatc acgaagatat ctttggtgct gtatttcctt acgaggcgaa gaaggacagg 3420

gtggcggtgc agcccagcag cctggagatg tcagcgctct ga 3462

Claims

1.一种人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述人源一氧化氮合酶2基因为NOS2基因，所述制备方法包括以下步骤：

①以普通质粒pDoubleEx-EGFP-NOS2为基因模板，通过上游引物NOS2-F和下游引物NOS2-R对该模板进行PCR扩增获得NOS2基因，此上下游引物两端分别预先设计加入XhoI和BamHI酶切位点序列，

所述NOS2-F的上游引物序列为：

CACCTCGAGATGGCCTGTCCTTGGAAATTTCTGT，

NOS2-R的下游引物序列为：

GCGAGATCTTCAGAGCGCTGACATCTCCAG；

②确认步骤①中的PCR产物大小为3462bp后回收纯化的NOS2基因；

③用XhoI限制性内切酶和BamHI限制性内切酶分别对所述纯化的NOS2基因和空载的过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1进行双酶切后，回收纯化带有酶切粘性末端的NOS2基因和pLVX-IRES-ZsGreen1；

④采用T4 DNA连接酶将NOS2基因连接到pLVX-IRES-ZsGreen1上，得到NOS2基因过表达的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2。

2.一种如权利要求1所述的制备方法所制备的人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒载体。

3.一种人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒的制备方法，其特征在于，所述人源一氧化氮合酶2基因为NOS2基因，所述制备方法为：使用慢病毒包装质粒psPAX2和慢病毒包装质粒pMD2.G对所述NOS2基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2进行包装并通过转染293T细胞，得到NOS2基因过表达慢病毒。

4.如权利要求3所述的人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：

S1：用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞并培养，待倒置光学显微镜下观察细胞达到70％-90％汇合度时准备转染；

S2：用所述过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2、慢病毒包装质粒psPAX2及慢病毒包装质粒pMD2.G转染步骤S1中得到的293T细胞，过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2、慢病毒包装质粒psPAX2及慢病毒包装质粒pMD2.G的比率为2:1:1；

S3：对转染后的293T细胞进行细胞培养12h后，弃细胞上清液后再用PBS轻轻洗涤3次，重新加入新鲜的完全培养基后继续培养48h后回收细胞上清液，经低速离心、过滤、超速离心、吸弃上清后留沉淀，用冰上预冷的PBS重悬沉淀后得到所述人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒。

5.一种如权利要求3至4中任一所述的制备方法所制备的人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒。

6.人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒在合成可诱导型一氧化氮合酶中的应用。