CN109641064A - 非整合病毒递送系统及其相关方法 - Google Patents
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Abstract
公开了一种非整合病毒递送系统。该系统包括病毒运载体,其中所述病毒运载体包含缺陷型整合酶基因;异源性病毒附加型复制起点;编码至少一个起始蛋白的序列,所述至少一个起始蛋白对异源性病毒附加型复制起点具有特异性,其中表达编码至少一个起始蛋白的序列是诱导型的,所述至少一个起始蛋白对异源性病毒附加型复制起点具有特异性;以及至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求下述的优先权:2016年6月8日提交的题为“非整合病毒递送系统和其使用方法”的美国临时专利申请号62/347,552、2016年12月8日提交的题为“非整合病毒递送系统及其相关方法”的美国临时专利申请号62/431,760和2016年12月12日提交的题为“非整合病毒递送系统及其相关方法”的PCT/US16/66185,其公开通过引用纳入本文。
技术领域
本公开一般涉及病毒载体和用于递送基因的系统,和其他治疗、诊断或研究用途的领域。更具体地,本公开的实施方式涉及非整合病毒载体和用于递送基因的系统,和其他治疗、诊断或研究用途。
背景
由于病毒载体特定的病毒包膜-宿主细胞受体相互作用和病毒的基因表达机制,病毒载体已经用于将基因和其他治疗性核酸构建体转导到靶细胞中。结果,病毒载体已被用作将基因转移到许多不同细胞类型中的载剂,包括但不限于分离的组织样品、原位组织靶标和培养的细胞系。在细胞中导入和表达外源基因的能力可用于基因表达的研究以及细胞系和途径的阐明,以及提供治疗干预的潜力,如基因疗法和各类免疫疗法。
已经提出包括慢病毒鼠逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒的一些病毒系统作为潜在的治疗性基因传递载体。然而,许多障碍阻碍了将它们作为批准的治疗剂的有效利用。研究和开发障碍包括但不限于,表达的稳定性和控制,基因组包装能力和构建体依赖性载体稳定性。另外,病毒载体的体内应用可受到针对病毒结构蛋白和/或转导的基因产物的宿主免疫应答的限制,这可导致有害的抗载体免疫学效应。
研究人员已经试图找到稳定的表达系统,以此作为克服这些障碍中的一些的方法。一种途径在这类表达系统中利用重组多肽或基因调节分子,包括小RNA。这些系统采用将转导的逆转录病毒基因组或其至少一部分染色体整合到宿主细胞的基因组中。对于这些途径的一个重要限制是基因整合的位点通常是随机的,并且在任何特定位点整合的基因数量和比例通常是不可预测的。因此,依赖于染色体整合的载体导致可能超过治疗间隔的重组基因的永久维持,并且不良控制质粒或其他非复制DNA并且可能在完成所需治疗间隔之前衰退。
另一种方法是使用瞬时表达系统。在瞬时表达系统下,感兴趣基因的表达基于非整合的质粒,并且因此表达通常会丢失,因为细胞后来经历分裂或质粒载体被内源性核酸酶破坏。因此,瞬时基因表达系统通常不会随时间导致充分的表达,并且通常需要重复治疗,这通常被理解为不期望的特征。
发明内容
提供了稳定的病毒递送系统和方法。在各方面,递送系统包括瞬时表达系统。根据一个方面,递送系统是非整合的。在另一方面,递送系统是非整合的和瞬时的。
在各方面和实施方式中,系统不同地包括一个或所有病毒运载体,其中,病毒运载体包含缺陷型整合酶基因;异源性病毒附加型DNA复制起点;编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白(initiator protein)的序列,其中,表达编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列是诱导型的;以及至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。病毒运载体可以是慢病毒。异源性病毒附加型DNA复制起点可以来自乳头瘤病毒。异源性病毒附加型DNA复制起点可以来自人乳头瘤病毒或牛乳头瘤病毒。
异源性病毒附加型DNA复制起点可以来自人乳头瘤病毒16型(HPV16)。异源性病毒附加型DNA复制起点可以来自HPV16的长控制区(LCR)。异源性病毒附加型DNA复制起点可以包括SEQ ID NO:1。任选地,异源性病毒附加型DNA复制起点可以包括SEQ ID NO:1的5′短截。异源性病毒附加型DNA复制起点可以包含SEQ ID NO:1的至少约200个核苷酸、或至少约300个核苷酸、或至少约400个核苷酸、或至少约500个核苷酸、或至少约600个核苷酸或至少约700个核苷酸的5′短截。异源性病毒附加型DNA复制起点可以包含与HPV16的LCR的Frag 1(SEQ ID NO:2)(本文也称之为片段1)或Frag 2(SEQ ID NO:3)(本文也称之为片段2)或Frag 3(SEQ ID NO:4)(本文也称之为片段3)或Frag 4(SEQ ID NO:5)(本文也称之为片段4)至少约80%的序列相同性、或至少约85%的序列相同性、或至少约90%的序列相同性、或至少约95%的序列相同性、或至少约98%的序列相同性。异源性病毒附加型DNA复制起点包含HPV16的LCR的Frag 1(SEQ ID NO:2)、或Frag 2(SEQ ID NO:3)、或Frag 3(SEQ ID NO:4)、或Frag 4(SEQ ID NO:5)。
对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白可以包括E1或其操作性片段(operative fragment)。对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白可以包括E2或其操作性片段。对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白可以包括EBNA-1或其操作性片段。任选地,系统可以包括对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白。对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白可以包括单独或组合的E1或E1或其操作性片段。编码至少一个起始蛋白的序列可以存在于单个离散质粒或非整合病毒载体。任选地,系统可以包括对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白,其中编码所述至少两个起始蛋白的序列存在于单个离散质粒或非整合病毒载体。任选地,系统可以包括对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白,其中第一起始蛋白的序列和第二起始蛋白的序列可以存在于非同一离散质粒或非整合病毒载体。
关于公开的非整合病毒递送系统,至少一个基因产物可包括抗体、抗体片段或生长因子。抗体可以包括抗-HER2抗体或其片段。生长因子可以包括血管内皮生长因子(VEGF)或其变体。miRNA可以包括CCR5 miRNA。
在另一方面,公开了药物组合物。药物组合物包括本文所公开的非整合病毒递送系统和至少一种药学上可接受的运载体。
在另一方面,提供了一种在细胞中表达至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的方法。该方法包括使细胞与有效量的非整合病毒递送系统接触,其中所述系统包括病毒运载体,其中,病毒运载体包含一个或所有缺陷型整合酶基因;异源性病毒附加型DNA复制起点;编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列,其中,表达编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列是诱导型的;以及至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。
在另一方面,提供了一种在有此需要的对象中表达至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的方法。该方法包括向有此需要的对象给予有效量的非整合病毒递送系统,其中所述系统包括病毒运载体,其中,病毒运载体包含一个或所有缺陷型整合酶基因;异源性病毒附加型DNA复制起点;编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列,其中,表达编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列是诱导型的;以及至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。编码至少一个起始蛋白的序列可以存在于单个分离质粒,而该至少一个起始蛋白可以包括单独或组合的E1或E2或其操作性片段。该方法还包括向有此需要的对象给予第一量的所述单个离散质粒,以引起所述至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA第一水平的表达。该方法还包括向有此需要的对象给予第二量的所述单个离散质粒,以引起所述至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA第二水平的表达。在当所述第二量低于所述第一量的情况中,至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的表达的水平可能降低。在当所述第二量高于所述第一量的情况中,至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的表达的水平可能增加。
在另一方面,本文所公开的非整合病毒递送系统经优化以产生至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的低水平的表达。异源性病毒附加型DNA复制起点可包含与HPV16的LCR的Frag 1(SEQ ID NO:2)或SEQ ID NO:1至少约80%的序列相同性、或至少约85%的序列相同性、或至少约90%的序列相同性、或至少约95%的序列相同性、或至少约98%的序列相同性。
在另一方面,本文所公开的非整合病毒递送系统经优化以产生至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的低水平的基础表达,并且异源性病毒附加型DNA复制起点可包含HPV16的LCR的Frag 1(SEQ ID NO:2)或SEQ ID NO:1。
在另一方面,本文所公开的非整合病毒递送系统经优化以产生至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的中等水平的基础表达,并且其中所述异源性病毒附加型DNA复制起点可以包括与HPV16的LCR的Frag 2(SEQ ID NO:3)、Frag 3(SEQID NO:4)或Frag 4(SEQ ID NO:5)至少约80%的序列相同性,或至少约85%的序列相同性,或至少约90%的序列相同性,或至少约95%的序列相同性,或至少约98%的序列相同性。该系统可以经优化以产生至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的中等水平的基础表达,并且所述异源性病毒附加型DNA复制起点可以包括HPV16的LCR的Frag 2(SEQ ID NO:3)、Frag 3(SEQ ID NO:4)或Frag 4(SEQ ID NO:5)。
在另一方面,公开了一种选择经优化的非整合病毒递送系统的方法。该方法涉及选择基础表达的水平。因此,当选择水平X时,选择对应的Y,其中Y对应于选来纳入所述非整合病毒递送系统的异源性病毒附加型DNA复制起点,其中当X=载物(cargo)的第一限定基础表达水平时;Y包含LCR(SEQ ID NO:1)或Frag 1(SEQ ID NO:2);和当X=载物的第二限定基础表达水平时;Y包含HPV16的LCR的Frag 2(SEQ ID NO:3)、Frag 3(SEQ ID NO:4)或Frag4(SEQ ID NO:5)。在实施方式中,第一限定水平包括小于0.020载物的附加型(episomal)拷贝/细胞。在实施方式中,第二限定水平包括0.020或更多的载物的附加型拷贝/细胞。
其他方面包括治疗例如感染性疾病的方法。其他方面包括预防感染性疾病的方法。在另一方面,公开了增强伤口愈合的方法。在另一方面,公开了治疗骨损伤的方法。其他方面包括使用本文详述的系统治疗遗传性疾病的方法。
前面的一般描述和下面的详细描述都是示例性的和解释性的,并且旨在提供对所要求保护的发明的进一步解释。从以下对附图的简要描述和本发明的详述,其他目的、优点和特征对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
图1描述了示例性的载体包载体(vector-in-vector)(VIV)实施方式。图1(A)描述了载体的线性形式,图1(B)描绘了载体的环化形式。
图2描述了包含E1起始蛋白的示例性载体包载体(VIV)实施方式(本文也称之为载体1)。
图3描述了使用载体1的来自三(3)个单独实验的293 T细胞的转导结果。
图4描述了包含E1和E2起始蛋白的示例性载体包载体(VIV)实施方式(本文也称之为载体19)。
图5描述了分别表达(A)mCherry和(B)VEGF的示例性载体包载体(VIV)实施方式。
图6描述了当分别通过质粒(A)或以慢病毒(B)提供E1和E2时,用于各种描述的构建体的mCherry阳性细胞的表达。
图7描述了与本文详述的实施例联用的示例性载体包载体(VIV)实施方式。
图8描绘了包含HPV16长控制区(LCR)的片段1的各种所述构建体的VEGF的表达水平。
图9描述了与本文详述的实施例联用的示例性载体包载体(VIV)实施方式。
图10描述了非整合慢病毒载体的附加型形式的示例性图。
图11描述了HPV16的LCR的Frag 1、Frag 2、Frag 3和Frag 4之间的基因组关系。
图12描述了本文所述的整合酶缺陷型慢病毒载体中HPV16 ori的附加型拷贝数的分析。
图13描述了(A)来自含有HPV LCR和3′片段的整合酶缺陷型慢病毒载体的mCherry表达的分析;(B)来自整合酶缺陷型载体的mCherry表达的分析,所述载体表达或不表达来自单个载体的HPV16 E1-T2A-E2。
图14描述了在添加E1、E1-C和E2-11后,来自包含HPV LCR的整合酶缺陷型慢病毒载体的mCherry表达的分析。
图15描述了通过(A)免疫印迹和(B)IgG浓度确定的使用包含HPV LCR的整合酶缺陷型慢病毒载体的抗-HER2抗体表达。
图16描述了使用包含HPV ori序列的整合酶缺陷型慢病毒载体的抗-EGFR抗体表达。
图17描述了使用包含HPV16的全长LCR的慢病毒载体的CCR5表达敲减。
图18描述了使用包含HPV16的LCR的Frag 2的慢病毒载体的CCR5表达敲减。
图19描述了使用EB(Epstein-Barr)病毒(EBV)oriP序列以D64V整合酶缺陷型慢病毒载体转导的细胞中GFP表达。
图20描述了这样的示意图,其显示了HPV16的全长LCR、片段1、片段2、片段3和片段4的基础和E1-E2诱导的附加型拷贝数。
图21描述了这样的实施方式,其用于基于本文实施例中进一步详述的相对结构-功能活性的LCR片段选择。
具体实施方式
本文公开了稳定的病毒递送系统和方法。在各方面,递送系统包括瞬时表达系统。根据一个方面,递送系统是非整合的。在另一方面,递送系统是非整合的和瞬时的。
在其他方面,提供了非整合的、附加型复制病毒载体(例如,慢病毒载体)及其使用方法。本公开的附加型复制载体可以包含来自病毒如乳多空病毒科(例如牛乳头瘤病毒或BPV)或疱疹病毒科(例如EB(Epstein Barr)病毒或EBV)或肝脱氧核糖核酸病毒(例如乙型肝炎病毒或HBV)体的病毒成分。源自这些病毒的附加型复制载体可以包含复制起点和至少一个病毒反式作用因子,例如,起始蛋白,如BPV的E1和EBV或HBV聚合酶的EBNA-1或腺病毒的末端结合蛋白。附加型复制过程通常包括宿主细胞复制机制和病毒反式作用因子。
通过使用异源性病毒复制起点,可以用“关闭”开关工程改造新型载体,用于表达识别复制起点所需的病毒蛋白。关闭DNA复制将导致治疗性DNA水平随着时间急剧下降。不受任何具体理论或机理限制,据信非复制DNA简单地降解,例如通过核酸酶活性降解,并且随着宿主细胞随时间经历自然凋亡(细胞死亡)事件。最终,这类非复制的DNA可能是不可检测的,并且随着时间的推移完全或几乎从患者中清除。
公开的系统和方法包括减少或预防来自转导的基因的过表达或延长表达的毒性和毒性作用。一旦DNA复制停止及消除基因将防止将来不需要的基因表达或宿主基因表达的敲减。同样,将附加型复制的益处结合到异质性病毒系统中提供了一种平台,该平台可以安全高效地将感兴趣的基因转导到多种细胞类型中。
乳头瘤病毒
乳头瘤病毒在哺乳动物细胞中主要以附加体复制。取决于感染的上皮细胞的分化状态,病毒E1蛋白(其作为DNA解旋酶)对DNA复制的病毒起点(ori)的作用驱动产生数百至数千个DNA拷贝/细胞。已经尝试使用所谓的“穿梭质粒”来开发基于乳头瘤病毒的基因递送系统。藉由细菌DNA复制起点以允许在大肠杆菌中产生DNA,以及乳头瘤病毒ori以允许哺乳动物细胞中的附加型复制,已经进行了许多研究以证明基因表达的安全性和持久性。在大多数的情况中,ori来自牛乳头瘤病毒。
乳头瘤病毒已进化为感染表皮和上皮细胞。当受感染的细胞从基底分化到腔表面时,乳头瘤病毒增加DNA复制,并且拷贝数变得非常高,直到腔表面释放出大剂量的病毒。这使得乳头瘤病毒具有高度传染性,如从人乳头瘤病毒中显而易见的。拷贝数激增主要是由于宿主因素。然而,乳头瘤病毒的这种特征可以开发成靶向表皮和上皮表面的瞬时基因疗法。
根据本公开内容的各个方面和实施方式,使用乳头瘤病毒的某些特征来驱动附加型载体的表达和复制,以及将载体的表达靶向特定细胞类型。
EB病毒(EBV)
EB病毒(EBV)也称之为人疱疹病毒4,其是疱疹病毒科的成员。它是最常见的人类病毒之一,并且大多数人在其生命的某个阶段感染EBV。
EBV是一种含有大约85个基因的双链DNA病毒;已知EBV感染B细胞和上皮细胞。EBV能够进行裂解和潜伏复制,后者导致EBV基因组的环化形式易位至宿主细胞核,其中其可以通过宿主细胞DNA聚合酶复制。
EBV可以经由至少三种不同的途径进行潜伏复制,但每一种都涉及EB病毒核抗原1(EBNA-1)的表达,所述EBNA-1是一种结合附加型复制起点并在宿主细胞分裂过程中介导附加体划分的蛋白质。EBNA-1在EBV基因调节、复制和附加型维持中起着不可或缺的作用。
根据本公开的各个方面和实施方式使用EBV的某些特征。
乙型肝炎病毒(HBV)
乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科的成员。它是与进行性肝纤维化、肝炎和肝细胞癌相关的常见人类病毒。
HBV是一种双链DNA病毒,其通过RNA中间体复制并依赖于病毒聚合酶。肝细胞中HBV的稳定维持是由于存在难以根除的共价闭合的病毒DNA环形。
因此,根据本公开的各个方面和实施方式使用HBV的某些特征。
逆转录病毒
逆转录病毒是一种病毒科,其特征在于编码能够从RNA模板产生DNA拷贝并将前病毒整合到宿主细胞染色体中的逆转录酶。慢病毒是可以将大量的病毒核酸传递到宿主细胞中的逆转录病毒属。慢病毒的特征在于具有感染/转导非分裂细胞的独特能力,并且在转导后,慢病毒将它们的核酸整合到宿主细胞的染色体中。
感染性慢病毒有编码毒力蛋白的三个主要基因gag,pol和env,以及两个调控基因,包括tat和rev。取决于特定血清型和病毒,可能存在编码参与调节、合成和/或加工病毒核酸和其他复制功能的蛋白质的其他辅助基因,包括抵消针对慢病毒感染的先天细胞防御。
慢病毒包含长末端重复(LTR)区域,其可以是约600nt长。LTR可以分段为U3、R和U5区域。LTR可以通过整合酶的作用介导逆转录病毒DNA整合到宿主染色体中。或者,在没有功能性整合酶的情况下,LTR可用于使病毒核酸环化。
参与慢病毒复制早期阶段的病毒蛋白包括逆转录酶和整合酶。逆转录酶是病毒编码的RNA依赖性DNA聚合酶。该酶使用病毒RNA基因组作为合成互补DNA拷贝的模板。逆转录酶还具有RNA酶H活性,用于破坏RNA模板,所述RNA模板是DNA第二链合成以完成可供整合的双链DNA的产生所必需的。整合酶结合宿主DNA和逆转录酶产生的病毒cDNA。整合酶在将病毒基因组插入宿主DNA之前加工LTR。Tat在转录过程中充当反式激活剂以增强来自病毒DNA的RNA拷贝的起始和延伸。rev反应元件在转录后起作用,调节mRNA剪接并转运至细胞质。
根据本公开的各个方面和实施方式使用包括慢病毒的逆转录病毒的某些特征。
载体包载体(Vector-in-Vector)系统
提供了新型载体包载体(VIV)系统,其可以通过组合来自各种病毒物种的所需特征来精确地调节基因的表达和递送。可以使用许多病毒载体,包括慢病毒(LV)平台。与稳定转导的大多数其他形式一样,慢病毒转导导致LV有效荷载(例如,感兴趣的基因)的染色体整合。根据各个方面,通过使病毒整合酶基因失活的选择性突变废除染色体整合。本文使用了乳头瘤病毒ori加上E1蛋白,或EBV ori加上EBNA-1或嗜肝DNA病毒末端加上病毒聚合酶,作为通常不能附加型维持的异源性病毒的遗传载物的一部分。将这种异质性病毒复制机制纳入慢病毒载体留下了大约5kb额外的载物空间,以容纳感兴趣的治疗性基因。
在其他方面,其他控制元件可以纳入本公开的VIV系统。作为非限制性的示例,E1或E2或EBNA-1或HBV聚合酶的表达可由诱导型启动子驱动。此外,作为非限制性的示例,可以使用质粒或非整合病毒载体表达E1和/或E2或其变体。许多类型的诱导型启动子是本领域已知的,并且出于本公开的目的,诱导型启动子可包括但不限于响应抗生素(即,四环素,氨基糖苷类抗生素,青霉素,头孢菌素,多粘菌素等)或其他药物,铜和其他金属,乙醇,类固醇,光,氧,热,冷或其他物理或化学刺激的启动子。例如,使用公开的病毒系统的方法包括使用四环素诱导型基因表达,其取决于用于表达载物基因的药物的恒定供应。用于诱导诱导型启动子的化合物可以一次或多次添加,这取决于附加型复制的持续时间和所需的载物递送时间。附加体的DNA复制和维持不同地取决于E1、E2和/或EBNA-1诱导,而其反过来取决于基因表达的诱导物(即,四环素)。
示例性的VIV系统示于图1。公开的VIV包括至少一个感兴趣的基因或核苷酸序列(例如,如图1A中所示的载物)。纳入VIV的基因或序列将取决于VIV的目的。通常参见图1,慢病毒与整合酶缺陷型系统一起包装,或者在用于阻断整合酶活性的临床药物(例如,度鲁特韦(Dolutegravir)或雷特格韦(Raltegravir))存在下进行转导。如果不能整合,线性双链载体DNA通常会使用宿主酶促机制进行环化(例如,图1B)。任选地,如果需要,可以激活药物诱导型启动子以表达E1和/或E2蛋白,其将反过来驱动DNA复制。治疗性载物将由整合的盒表达。在各种实施方式中,撤回或终止诱导诱导型启动子的化合物(在本文中也称为“诱导物”)。诱导物的终止将下调E1和/或E2合成。在进一步的实施方式中,有效地终止E1和/或E2产生。在任何一种情况下,这将导致附加型DNA的水平下降并最终消除载体构建体。
VIV系统进一步的示意图如图2所示。存在E1起始蛋白,并且载物是EF1-HTLV启动子下的GFP。虽然图1和2描述了含有E1的VIV系统,但如本文所述,图4描绘了在单个病毒载体上含有E1和E2的VIV系统。在进一步的实施方式中,为了从相同的mRNA表达E1和E2,添加了内部核糖体进入位点(IRES)以允许重新启动蛋白质翻译。起始蛋白如E1和E2也可以在分开的质粒或非整合的慢病毒载体上表达。
VIV系统进一步的示意图如图4所示。遗传载物由CMV/GFP盒表示。载物基因序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增。例如,可以使用合成的寡核苷酸引物,例如与载物基因的5′末端相同和/或与载物基因的3′末端互补的引物。5吲物可以从其具有内切核酸酶的识别位点的5′末端延伸。3吲物还可以在其具有内切核酸酶识别的互补物的3’末端处延伸。获得的扩增的载物基因序列可以经退火成合适的载体,如慢病毒载体。遗传载物的非限制性的示例包括,CMV/VEGF,CMV/抗表皮生长因子受体(EGFR),抗-HER2抗体,或miRNA抑制性C-C趋化因子受体5型(CCR5)。
载物的适当表达可以通过适当的试验来确定。例如,DNA拷贝数可以通过定量PCR测量。由非限制性的示例如载体1或载体19(如本文所述)翻译的蛋白质产物可以例如通过分析流式细胞术测量。ELISA试验可用于检测某些载物的存在,如分泌的蛋白质,如VEGF。Western印迹技术也可用于检测某些载物,如抗体,如抗-EGFR。此外,还可以采用监测载物蛋白质细胞表面表达的降低,如趋化因子受体如CCR5。
关于载物,并且作为非限制性实例,编码血小板衍生生长因子(PDGF)的基因可以作为基因与shRNA、siRNA、miRNA和/或感兴趣的其他基因沉默RNA一起纳入用于促进伤口愈合的VIV。公开的VIV系统不限于可以表达的特定类型的基因或序列。
所公开的VIV可以包含许多治疗或预防性基因或序列,包括例如,编码这样抗体的序列,所述抗体针对与感染性疾病或癌症相关的抗原(包括复制病原体上的抗原和是外源性毒素的抗原和肿瘤细胞上的抗原),血小板衍生生长因子,血管内皮生长因子,脑源性生长因子,神经生长因子,人生长因子,人绒毛膜促性腺激素,囊性纤维组织跨膜传导调节因子(CFTR),肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白相关复合物,苯丙氨酸羟化酶,脂蛋白脂酶,α-和/或β-地中海贫血,VIII因子,骨形态发生蛋白1-4,环氧合酶2,血管内皮细胞生长因子,趋化因子受体CCR5,趋化因子受体CXCR4,趋化因子受体CXCR5,针对涉及结肠炎、炎症性肠病或克罗恩病的自身免疫抗原的反义DNA或RNA,涉及成瘾的小干扰RNA,包括调节鸦片制剂或酒精的神经衰弱的miRNA,肿瘤抑制基因,调节细胞存活的基因,包括促凋亡或抗凋亡基因和促自噬或抗自噬基因,编码辐射抗性因子的基因,编码用于追踪肿瘤细胞转移或其他细胞运输现象的发光蛋白的基因,或各种其他治疗上有用的序列,其可用于使身体适应辐射、手术或化疗的最大影响,或保护组织免受辐射、手术或化疗,修饰宿主或移植组织以改善器官移植或抑制低活性,尤其是在气道中。
在不限制任何前述内容的情况下,载物可包括诊断蛋白质,如GFP和mCherry,以及cDNA、micoRNA、shRNA和抗体。此外,载物可包括特定载物,例如VEGF和BMP,如本文所述。
在其他方面,期望将基因以VIV系统中的附加型形式保持作为“安全开关”。例如,当特定基因产物有毒时,撤回诱导分子将减少或终止DNA复制。附加体数量将随后下降,而基因和载体将最终消失。与传统受调控的基因表达不同,公开的表达构建体通过内源性核酸酶降解并通过细胞分裂稀释直至其有效地消失,从而防止任何短期或长期突破表达。
根据另一方面,将基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA和/或其他感兴趣的基因沉默RNA维持在附加型形式还允许在宽范围内和比传统慢病毒转导所实现的高得多的水平调控拷贝数。
公开的VIV系统具有许多益处。例如,附加型DNA不易受染色体修饰的影响,所述染色体修饰可导致传统转导载体的基因沉默。同样地,VIV附加型DNA载体至少在短至中等范围的时间间隔内支持活性基因递送,所述时间间隔为约1至约4个月,并且可能更长。在其他实施方式中,附加型DNA载体在约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、或约12周的时间段内支持活性基因递送。在其他实施方式中,附加型DNA载体在约1个月,2个月,3个月,4个月,5个月,6个月,7个月,8个月,9个月,10个月,11个月,12个月或更长的时间段内支持活性基因递送。这些时间段的任何组合也可用于本文所公开的方法,例如1个月和1周,或3个月和2个星期。
尽管存在与使用慢病毒运载体来纳入公开的VIV系统特别相关的益处,但所公开的系统不限于单一类型的病毒载体。使用DNA中间体的一个或多个任何DNA病毒可以用作用于纳入本文VIV系统的运载体,包括但不限于慢病毒,腺相关病毒(AAV),腺病毒,牛痘病毒,疱疹病毒,麻疹病毒,嗜肝DNA病毒,细小病毒和鼠病毒。
在不限制前述任何内容的情况下,在本公开的一个方面,公开了非整合病毒递送系统。该系统包括病毒运载体,其中所述病毒运载体包含一个或多个缺陷型整合酶基因;异源性病毒附加型复制起点;编码至少一个起始蛋白的序列,所述至少一个起始蛋白对异源性病毒附加型复制起点具有特异性,其中表达编码至少一个起始蛋白的序列是诱导型的,所述至少一个起始蛋白对异源性病毒附加型复制起点具有特异性;以及至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。病毒运载体可以是慢病毒。异源性病毒附加型DNA复制起点可以来自乳头瘤病毒。异源性病毒附加型DNA复制起点可以来自人乳头瘤病毒或牛乳头瘤病毒。
异源性病毒附加型DNA复制起点可以来自人乳头瘤病毒16型(HPV16)。异源性病毒附加型DNA复制起点可以来自HPV16的长控制区(LCR)。异源性病毒附加型DNA复制起点可以包括SEQ ID NO:1。任选地,异源性病毒附加型DNA复制起点可以包括SEQ ID NO:1的5′短截。异源性病毒附加型DNA复制起点可以包含SEQ ID NO:1的至少约200个核苷酸、或至少约300个核苷酸、或至少约400个核苷酸、或至少约500个核苷酸、或至少约600个核苷酸或至少约700个核苷酸的5′短截。异源性病毒附加型DNA复制起点可以包含与HPV16的LCR的Frag 1(SEQ ID NO:2)、Frag 2(SEQ ID NO:3)、Frag 3(SEQ ID NO:4)或Frag 4(SEQ ID NO:5)至少约80%的序列相同性、或至少约85%的序列相同性、或至少约90%的序列相同性、或至少约95%的序列相同性、或至少约98%的序列相同性。异源性病毒附加型DNA复制起点包含HPV16的LCR的Frag 1(SEQ ID NO:2)、Frag 2(SEQ ID NO:3)、Frag 3(SEQ ID NO:4)或Frag4(SEQ ID NO:5)。在不限制任何前述内容或本文详述的实施例的情况下,LCR的基因组组织述于图11中。除了本文详述的片段之外,可通过缺失LCR的5′和3′区域产生额外的片段。此外,可以对全长LCR或相关片段进行突变、取代、添加和/或缺失。此外,并且在不限制前述内容或本文详述的实施例的情况下,应理解并且在本公开实施方式的范围内的是,本文所详述的载体组分可互换使用以开发新的和/或修饰的载体。
载体包载体系统的可调节性
在本公开的一方面,通过修饰下述一个或多个来调节或优化病毒载体系统:病毒运载体;异源性病毒附加型DNA复制起点;编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列,其中,调节编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列的表达;或至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。对下述进行修饰以:控制至少一个基因产物的最大剂量,影响靶细胞或组织中表达的持久性,并且当相同的生物分子以错误的剂量递送并且在不再需要这类生物分子或其可能有毒后继续表达时,用瞬时需要的生物分子治疗疾病或损伤以防止毒性或副作用。
在实施方式中,公开的系统中的修饰允许调节生物分子的表达水平并控制表达的持续时间以实现不可检测或几乎检测不到的载物表达,如基因疗法研究中安慰剂对照可能需要的。在实施方式中,这导致这样的低水平表达,所述低水平表达在统计学上不同于不可检测,但是不符合诱导或高水平表达的标准,如当以低水平给予短暂的间隔以便去除或纠正缺陷型基因时递送更安全的基因编辑蛋白和RNA可能需要的。在实施方式中,产生了载物表达的高或诱导水平,相较于相同载物的可检测但低基础水平,其包括大约大于5倍的峰值表达水平。在实施方式中,当表达包括这样肿瘤靶向生物药物的治疗性抗体时这可能是最佳的,所述肿瘤靶向生物药物在肿瘤位点处或其附近产生时更有效,必须以高水平存在但也必须衰退,并从血液中去除以避免对正常组织的脱靶影响或防止引发自身免疫。
在实施方式中,公开的系统是可调节的,从而治疗癌症。所公开的系统经调节以:允许在肿瘤位点处或附近表达肿瘤靶向抗体,如西妥昔单抗、利妥昔单抗或曲妥珠单抗,通过复制附加型DNA产生对于有效肿瘤靶向足够水平的抗体,以增加靶细胞中的基因剂量,并且当E1/E2蛋白停止产生时,随后终止附加型DNA复制,产生伴随下降抗体表达的附加型转基因分子的衰变,其与治疗性抗体的预期衰减曲线相匹配,所述治疗性抗体已知将改善它们和类似的生物药物的安全性和功效。
在实施方式中,公开的系统可经调节以治疗或预防感染性疾病。所公开的系统经调节以:表达这样的治疗性抗体,其能够破坏或中和病原体复制,在感染位点处或附近指导局部产生抗体或将抗体释放到血液和淋巴循环中,产生对于有效病原体预防或消灭足够水平的抗体,所述有效病原体预防或消灭通过复制附加型DNA以增加靶细胞中的基因剂量,并且当E1/E2蛋白停止产生时,随后终止附加型DNA复制,产生伴随下降抗体表达的附加型转基因分子的衰变,其与治疗性抗体的预期衰减曲线相匹配,所述治疗性抗体已知将改善它们和类似的生物药物的安全性和功效。
在实施方式中,公开的系统可经调节以治疗创伤性损伤或再生性疾病。在一些实施方式中,所公开的系统可经调节以表达具有治疗潜力的生物活性分子,在损伤或疾病位点处或附近指导抗体的局部产生,通过复制附加型DNA以增加靶细胞中的基因剂量来产生对于有效治疗足够水平的抗体,并且当E1/E2蛋白停止产生时,终止附加型DNA复制,产生伴随下降生物治疗剂表达的附加型转基因分子的衰变,其在峰值转基因剂量实现了高水平给药,但是避免了短暂治疗窗口期间期所需的生物治疗剂长期或非常长期的表达所导致的不良反应或毒性。
在实施方式中,根据所需的治疗过程或结果,可选择和使用LCR片段。如图20-21、表1和实施例16-20中提供的非限制性实施例所示,根据所需的治疗过程或结果,病毒递送系统可调节或经优化。
表1-疾病靶标和相关描述的总结
在本公开的方面中,基于所期望的治疗过程或结果,病毒递送系统可根据象限(Quadrant)1、象限2、象限3或象限4因子进行调节或优化。
在实施方式中,象限1因子包括病毒递送系统,其中LCR选自全长Frag 2、Frag 3、Frag 4或其变体。象限1因子使用所述载体系统提供遗传载物的瞬时基础表达。在大多数情况下,DNA拷贝数比该系统可达到的最高水平低大约20倍。仔细选择驱动载物表达的启动子将进一步增加该系统的灵活性和组织特异性。
在实施方式中,象限2因子包括病毒递送系统,其中LCR选自Frag 2、Frag 3、Frag4或其变体。象限2因子还包括E1和/或E2起始蛋白。在实施方式中,E1和/或E2起始蛋白通过质粒提供。在实施方式中,F1和/或E2起始蛋白通过慢病毒载体提供。象限2因子提供了高附加型DNA拷贝数,具有可能非常高的基因表达水平,同样这取决于启动子选择。此外,使用较短的LCR片段增加了可以作为载物纳入的DNA插入物的大小。
在实施方式中,象限3因子包括病毒递送系统,其中LCR选自LCR、Frag 1或其变体。象限3因子还包括E1和/或E2起始蛋白。在实施方式中,E1和/或E2起始蛋白通过质粒提供。在实施方式中,F1和/或E2起始蛋白通过慢病毒载体提供。象限3因子提供了高附加型拷贝数,但略低于象限2中可获得的值。象限3的一个优点是附加型DNA非常低的基础水平,这使得系统可以通过E1/E2蛋白的导入或不导入而高度可控。
在实施方式中,象限4因子包括病毒递送系统,其中LCR选自全长LCR、Frag 1或其变体。象限4因子的选择导致非常低的表达,例如下述可能需要:安慰剂对照或剂量递增临床试验中初始剂量或剂量测试以建立所需适应症的最大耐受或最佳水平。
在本公开的方面中,当需要非常低的基础水平的载物表达时,将象限4因子导入病毒递送系统。在实施方式中,象限4因子包括Frag 1或全长LCR或其变体。在实施方式,当需要略微高的基础水平的载物表达时,将象限1因子导入病毒递送系统。在实施方式中,象限1因子包括Frag 2、Frag 3、Frag 4或其变体。
在实施方式,当需要高诱导水平的载物表达时,将象限2因子或象限3因子导入病毒递送系统。在实施方式中,象限2因子包括Frag 2、Frag 3、Frag 4或其变体。在实施方式中,象限2因子包括E1和/或E2起始蛋白。在实施方式中,象限3因子包括LCR、Frag 1或其变体。在实施方式中,象限3因子包括E1和/或E2起始蛋白。在实施方式,当需要高诱导水平的载物表达并且考虑较大的载物大小时,将象限2因子导入病毒递送系统。在实施方式,当需要高诱导水平的载物表达并且考虑较小的载物大小时,将象限3因子导入病毒递送系统。因此,当前系统的可调节性或优化允许基于载物大小的可调节性或优化。
在实施方式,当载物表达的基础水平和诱导水平之间需要大倍数变化增加时,将象限3因子导入病毒递送系统。在实施方式中,象限3因子包括LCR、Frag 1或其变体。在实施方式中,象限3因子包括E1和/或E2起始蛋白。
在实施方式,当载物表达的基础水平和诱导水平之间需要较小倍数变化增加时,将象限2因子导入病毒递送系统。在其他实施方式,相较于图12和20中所示的象限3概况,当载物表达的基础水平和诱导水平之间需要较小倍数变化增加时,将象限2因子导入病毒递送系统。在实施方式中,象限2因子包括Frag 2、Frag 3、Frag 4或其变体。在实施方式中,象限2因子包括E1和/或E2起始蛋白。
在另一方面,提供了象限1疗程治疗对象的方法。该方法包括向对象给予包括象限1因子的病毒递送系统。在实施方式中,象限1因子包括病毒递送系统,其中LCR选自全长Frag 2、Frag 3、Frag 4或其变体。
在另一方面,提供了象限2疗程治疗对象的方法。该方法包括向对象给予包括象限2因子的病毒递送系统。在实施方式中,象限2因子包括Frag 2、Frag 3、Frag 4或其变体。在实施方式中,象限2因子包括E1和/或E2起始蛋白。
在另一方面,提供了象限3疗程治疗对象的方法。该方法包括向对象给予包括象限3因子的病毒递送系统。在实施方式中,象限3因子包括LCR、Frag1或其变体。在实施方式中,象限3因子包括E1和/或E2起始蛋白。
在另一方面,提供了象限4疗程治疗对象的方法。该方法包括向对象给予包括象限4因子的病毒递送系统。在实施方式中,象限4因子包括LCR、Frag1或其变体。
在另一方面,对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白存在于病毒系统中。在实施方式中,对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白包括E1或其操作性片段。在实施方式中,对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白包括E2或其操作性片段。在实施方式中,对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白包括EBNA-1或其操作性片段。在实施方式中,系统包括对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白。在实施方式中,对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白是E1和E2或其操作性片段。在实施方式中,编码至少一个起始蛋白的序列存在于单个离散质粒。在实施方式中,系统包括对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白,其中编码至少两个起始蛋白的序列可以存在于单个离散质粒。在实施方式中,系统包括对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白,其中第一起始蛋白的序列和第二起始序列的蛋白可以存在于非同一离散的质粒。
在本公开的方面,存在至少一个基因产物。在实施方式中,至少一个基因产物包括抗体、抗体片段、生长因子或小RNA。在实施方式中,抗体包括抗-HER2抗体或其片段。在实施方式中,生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)或其变体。在实施方式中,小RNA包括shRNA、siRNA或miRNA。在实施方式中,miRNA包括CCR5 miRNA。
方法
本公开的方面包括向有此需要患者给予VIV系统的方法,其中VIV系统编码至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个感兴趣的基因。鉴于多功能性和治疗潜力以及所公开的VIV系统,根据本公开方面的VIV系统可以编码这样的基因或核酸序列,所述基因或核酸序列包括但不限于,针对与感染性疾病或由感染性病原体产生的毒性相关的抗原的抗体,血小板衍生生长因子,血管内皮生长因子,脑源性生长因子,神经生长因子,人生长因子,人绒毛膜促性腺激素,囊性纤维组织跨膜传导调节因子(CFTR),肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白相关复合物,脂蛋白脂酶,α-和/或β-地中海贫血,VIII因子,骨形态发生蛋白1-4,环氧合酶2,血管内皮细胞生长因子,趋化因子受体CCR5,趋化因子受体CXCR4,趋化因子受体CXCR5,针对涉及结肠炎、炎症性肠病或克罗恩病的自身免疫抗原的反义DNA或RNA,涉及成瘾的小干扰RNA,包括调节鸦片制剂或酒精的神经衰弱的miRNA,肿瘤抑制基因,调节细胞存活的基因,包括促凋亡或抗凋亡基因和促自噬或抗自噬基因,编码辐射抗性因子的基因,编码用于追踪肿瘤细胞转移或其他细胞运输现象的发光蛋白的基因,或各种其他治疗上有用的序列,其可用于使身体适应辐射、手术或化疗的最大影响,或保护组织免受辐射、手术或化疗,修饰宿主或移植组织以改善器官移植或抑制低活性,尤其是在气道中。
此外,并且不限制任何前述内容,在另一方面,提供了一种在细胞中表达至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的方法。该方法包括使细胞与有效量的非整合病毒递送系统接触,其中所述系统包括病毒运载体,其中,病毒运载体包含缺陷型整合酶基因;异源性病毒附加型DNA复制起点;编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列,其中,表达编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列是诱导型的;以及至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。
在另一方面,提供了一种在有此需要的对象中表达至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的方法。该方法包括向有此需要的对象给予有效量的非整合病毒系统接触,其中所述系统包括病毒运载体,其中,病毒运载体包含一缺陷型整合酶基因;异源性病毒附加型复制起点;编码对异源性病毒附加型复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列,其中,表达编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少一个起始蛋白的序列是诱导型的;以及至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。编码至少一个起始蛋白的序列可以存在于单个离散质粒,而该至少一个起始蛋白可以单独或组合是E1或E2或其操作性片段。任选地,该方法包括向有此需要的对象给予第一量的所述单个离散质粒,以引起所述至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA第一水平的表达。任选地,该方法包括向有此需要的对象给予第二量的所述单个离散质粒,以引起所述至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA第二水平的表达。在当所述第二量低于所述第一量的情况中,至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的表达的水平可能降低。在当所述第二量高于所述第一量的情况中,至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的表达的水平可能增加。
感染性疾病
提供了治疗或预防感染性疾病的方法。目前已经实施了向高风险个体预防性递送单克隆抗体,例如由于健康状况或地理位置处于感染感染性疾病的高风险个体。预防性递送包括递送针对致死病毒剂的保护性抗体,例如以保护移动通过流行区域的个体(例如,军队和援助人员进入埃博拉病毒感染地区)。疫苗很大程度上未经过疾病的检测,如埃博拉病毒或拉沙热病毒或登革热或基孔肯雅病毒或疟原虫病引起的疟疾,通过使用整合的载体长期表达预防性抗体基因带来未知的健康风险。因此,对于必须是高但是短暂的有效抗体表达存在显著的医学需求。
公开的VIV系统和在有限时间内递送高拷贝数的基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA和/或感兴趣的其他基因沉默RNA的方法满足该医学需要。可以递送用于治疗感染性疾病的基因产物的非限制性的示例是对讨论中的感染性疾病具有特异性的抗体。
在一个方面,本公开涉及治疗、预防或最小化与感染性疾病相关的病症、症状或副作用的方法。在某些实施方式中,感染性疾病可以是人免疫缺陷病毒(HIV),人T细胞白血病病毒,埃博拉病毒,拉沙热病毒,登革热,寨卡病毒,疟疾,结核病,狂犬病,牛痘病毒或其他感染性疾病。在一些实施方式中,VIV系统可以预防性地给予或在感染感染性疾病后给予。
在另一方面,VIV系统可用于预防感染性疾病。怀疑患有特定感染性疾病风险增加的对象可以接受预防有效量的VIV给予,所述VIV编码特异性靶向所讨论的感染性疾病的抗体。
在某些实施方式中,感染性疾病可以是人免疫缺陷病毒(HIV),人T细胞白血病病毒,埃博拉病毒,拉沙热病毒,登革热,寨卡病毒,疟疾,结核病,狂犬病,牛痘病毒或其他感染性疾病。在某些实施方式中,VIV载体可以预防性地给予或在感染感染性疾病后给予。
伤口愈合
在另一实施方式中,本公开涉及治疗、预防或最小化与伤口愈合相关的病症、症状或副作用的方法。所公开的组合物可以在事故、损伤或手术后全身或直接给予伤口。在手术的情况下,可以预防性地给予VIV系统以加速愈合。在由事故、损伤或手术引起的伤口的情况下,可以在伤口形成后的某个时间给予VIV系统。例如,可以在形成伤口的约1、约2、约3、约4、约5、约10、约12、约24、约36、约48、约60、约72、约84、约96、约108,约120或约168小时内给予VIV系统。
本公开的方法和组合物的另一个应用是瞬时递送能够表达血小板生长因子的VIV构建体,所述血小板生长因子将加速伤口愈合。高剂量的血小板衍生生长因子(PDGF),相关生长因子,其片段和与其相关的核苷酸突变体非常快速但瞬时地需要。公开的系统和方法对于这类应用是理想的。
其他短期应用包括用于酒精滥用间歇性治疗的脑源性生长因子的表达,用于脊髓再生的神经生长因子和用于皮肤病症的局部应用。
骨疾病或损伤
在一实施方式中,本公开涉及增强骨愈合的方法,包括鉴定具有骨损伤的对象和向对象给予治疗有效量的如本文公开的病毒递送系统。病毒递送系统包括病毒运载体,异源性病毒附加型复制起点,编码对异源性病毒附加型复制起点具有特异性的起始蛋白的序列,以及至少一个基因,基因产物,shRNA,siRNA,miRNA和/或感兴趣的其它基因沉默RNA,其中病毒运载体具有缺陷型整合酶基因,并且其中这样序列的表达处于诱导型启动子的控制之下,所述序列编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的起始蛋白。例如,骨损伤可以是由事故、损伤或手术引起的,并且可能是骨不连接,或急性骨折或需要脊柱融合。在一些实施方式中,基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA和/或感兴趣的其他基因沉默RNA编码骨形态发生蛋白1-4或环氧酶-2或血管内皮生长因子或其片段。此外,在某些实施方式中,前述突变体是优选的并且在本发明的范围内,用于治疗骨损伤或相关疾病。
在一实施方式中,本公开涉及增强骨愈合的方法,包括鉴定具有骨疾病的对象和向对象给予治疗有效量的根据本文公开的病毒递送系统。病毒递送系统包括病毒运载体,异源性病毒附加型复制起点,编码对异源性病毒附加型复制起点具有特异性的起始蛋白的序列,以及至少一个基因,基因产物,shRNA,siRNA,miRNA和/或感兴趣的其它基因沉默RNA,其中病毒运载体具有缺陷型整合酶基因,并且其中这样序列的表达处于诱导型启动子的控制之下,所述序列编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的起始蛋白。例如,骨疾病可以是由事故、损伤或手术引起的,并且可能是骨不连接,或急性骨折或需要脊柱融合。另外,骨疾病可以来自低骨密度,低血流到骨,衰老,遗传病症等。在一些实施方式中,基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA和/或感兴趣的其他基因沉默RNA编码骨形态发生蛋白1-4或环氧酶-2或血管内皮生长因子。
遗传性遗传疾病
在实施方式,本公开涉及治疗、预防或最小化与遗传性遗传疾病相关的病症、症状或副作用的方法。本文表2中公开了这类遗传性遗传疾病的几个示例,使用下面的命名法涉及的因果类型的突变和染色体:
P-点突变,或完全在一个基因内的任何插入/缺失
D-一个或多个基因缺失
C-全染色体额外、缺失或两者兼而有(参见染色体异常)
T-三核苷酸重复紊乱:基因长度延长
目前的基因疗法包括试图通过基因缺失、置换或重新测序来编辑基因组DNA。本领域已知的各种基因疗法系统,包括Talen,CRISPR-Cas9,锌指核酸内切酶,TALEN等,依赖于通过慢病毒转导递送遗传物质。但是,不同于本公开,如果在细胞中长时间保持活性,这些系统可能具有意想不到的后果,因为活性染色体修饰系统可能改变意料之外的位点,导致包括癌症的新遗传疾病。修饰宿主DNA真正实用的系统需要通过诸如本文公开的方法的方法进行瞬时、良好调节的表达。
在一实施方式中,本公开涉及治疗遗传性遗传疾病的方法,包括鉴定具有遗传性遗传疾病的对象和向对象给予治疗有效量的根据本文公开的病毒递送系统。病毒递送系统包括一个或多个病毒运载体,异源性病毒附加型复制起点,编码对异源性病毒附加型复制起点具有特异性的起始蛋白的序列,以及至少一个基因,基因产物,shRNA,siRNA,miRNA和/或感兴趣的其它基因沉默RNA,其中病毒运载体具有缺陷型整合酶基因,并且其中这样序列的表达处于诱导型启动子的控制之下,所述序列编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的起始蛋白。遗传性遗传疾病可以是,例如,表2中所列疾病,并且在一些实施方式中,基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA和/或感兴趣的其他基因沉默RNA编码表2所示列基因的非突变形式。在不限制前述内容的情况下,特定遗传性遗传疾病可以是CF,并且可以通过表达如本文详述的非突变形式的CFTR来进行治疗。
在另一实施方式中,将引导RNA靶序列纳入本公开的VIV系统中。引导RNA序列是用于将基因编辑机制靶向宿主基因组内突变或需要校正的特定位点的序列。在VIV系统的载物中包含引导RNA允许修饰需要校正的染色体部分,并且在VIV内将发生相同的修饰以加速宿主的降解和/或稀释。在实施方式中,公开的病毒递送系统包括一个或多个病毒运载体,异源性病毒附加型复制起点,编码对异源性病毒附加型复制起点具有特异性的起始蛋白的序列,至少一个基因,shRNA,siRNA,miRNA和/或感兴趣的其它基因沉默RNA,以及至少一个引导RNA,其中病毒运载体具有缺陷型整合酶基因,并且其中这样序列的表达处于诱导型启动子的控制之下,所述序列编码对异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的起始蛋白。
细胞或组织的离体修饰
在另一方面,VIV系统可用于修饰用于疾病疗法的细胞或组织。细胞可以包括但不限于原代细胞,如淋巴细胞,干细胞,上皮细胞,神经细胞等。例如,VIV系统可用于修饰重定向至特定疾病的淋巴细胞,包括癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病,并且其中遗传修饰细胞的长期存在造成健康风险。例如,VIV系统也可以用于编程多能干细胞,所述多能干细胞在限定的间隔内需要高水平的转录因子,并且其中整合的病毒载体长期存在是不希望的。合适的上皮细胞包括用于合成皮肤或其他应用的细胞。这些可能需要在初始治疗期间表达营养因子或生长因子,所述营养因子或生长因子在治疗后对正常组织的功能是有害的,并且最好通过本文公开的VIV系统递送。
剂量和剂型
所公开的VIV系统允许感兴趣的基因或序列的短期、中期或长期表达以及所公开载体的附加型维持。因此,给药方案可以根据所治疗的病症和给药方法而变化。
在一实施方式中,可以以不同剂量向需要的对象给予VIV。具体地,可以向对象给予≥106个感染剂量(其中平均需要1剂量以转导1个靶细胞)。更具体地,给予对象≥107、≥108、≥109或≥1010个感染剂量。VIV剂量的上限将针对每种疾病指征来确定,并且将取决于每个单独产品或产品批次的毒性/安全性概况。
此外,可以每天一次或每天两次给予VIV。或者,VIV可以每周一次,每隔一周一次,每三周一次,每月一次,每隔一个月,每三个月,每六个月,每九个月,每年一次,每十八个月,每两年,每36个月或每三年一次给予有需要的对象。
在各方面和实施方式中,VIV作为药物组合物给予。在实施方式中,包含VIV的药物组合物可以配制成多种鼻、肺、口服、局部或肠胃外剂型用于临床应用。各剂型可包含各种崩解剂,表面活性剂,填充剂,增稠剂,粘合剂,稀释剂如润湿剂或其它药学上可接受的赋形剂。包含VIV的药物组合物也可以配制用于注射。
VIV组合物可以使用任何药学上可接受的方法给予,例如鼻内,口腔,舌下,口服,直肠,眼,肠胃外(静脉内,皮内,肌肉内,皮下,脑池内(intracisternally)腹膜内),经肺,阴道内,局部(locally)给予,局部(topically)给予,在划痕后局部给予,经粘膜给予,通过气溶胶,或通过口腔或鼻腔喷雾制剂。
此外,VIV组合物可以配制成任何药学上可接受的剂型,例如固体剂型,片剂,丸剂,锭剂,胶囊,液体分散体,凝胶,气溶胶,肺气雾剂,鼻气雾剂,软膏,乳膏,半-固体剂型和悬浮液。此外,组合物可以是控释制剂,持续释放制剂,速释制剂或其任何组合。此外,组合物可以是透皮递送系统。
在另一实施方式中,包含VIV的药物组合物可以配制成用于口服给药的固体剂型,并且固体剂型可以是粉末,颗粒,胶囊,片剂或丸剂。在另一实施方式中,固体剂型可包括一种或多种赋形剂,例如碳酸钙,淀粉,蔗糖,乳糖,微晶纤维素或明胶。此外,除赋形剂外,固体剂型还可包括润滑剂,例如滑石或硬脂酸镁。在实施方式中,口服剂型可以是立即释放或调节释放形式。调节释放剂型包括控释或延长释放,肠释放等。调节释放剂型中使用的赋形剂是本领域普通技术人员公知的。
在一实施方式中,包含VIV的药物组合物可以配制成舌下或口含剂型。这样的剂型包括经舌下给予的舌下片剂或溶液组合物,和放置在脸颊和牙龈之间口腔片剂。
在另一实施方式中,包含VIV的药物组合物可以配制成鼻剂型。本公开的该剂型包含用于鼻腔递送的溶液,悬浮液和凝胶组合物。
在一实施方式中,药物组合物可以配制成用于口服给药的液体剂型,例如悬浮液,乳液或糖浆。在实施方式中,除常用的简单稀释剂如水和液体石蜡外,液体剂型还可包括各种赋形剂,如保湿剂,甜味剂,芳香剂或防腐剂。在实施方式中,可以将包含VIV或药学上可接受的盐的组合物配制成适合给予儿科患者。
在实施方式中,药物组合物可以配制成用于肠胃外给药的剂型,例如无菌水溶液、悬浮液、乳液、非水溶液或栓剂。在实施方式中,非水性溶液或悬浮液可包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油或可注射的酯如油酸乙酯。对于栓剂的基质,可以使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、月桂油或甘油处理的明胶等。
药物组合物的剂量可以根据患者的体重、年龄、性别、给药时间和方式,排泄率和疾病的严重程度而变化。
定义
本文未具体定义的词语将被理解为具有与本领域普通技术人员所理解的含义一致的含义。
如本文所用,术语“约”将为本领域普通技术人员所理解,并且在某种程度上取决于其使用的上下文而变化。如果在使用该术语的文中该术语对于本领域普通技术人员来说是不明确的,则“约”将意味着高达特定术语的正负10%。
术语“给予”或“施用”活性剂表示为向此需要治疗的对象提供本公开的活性剂,其形式为可以治疗有用形式和治疗有效量导入该个体的形式。
术语“基础水平”是指当没有添加至少一种起始蛋白质时载物的表达。
术语“BMP”是指骨形态发生蛋白。
术语“载物”是指使用本文公开的病毒递送系统表达的基因或基因产物。
术语“CF”是指囊性纤维化,术语“CFTR”是指囊性纤维化跨膜传导调节蛋白。
术语“表达”、“表达的”或“编码”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽,多肽或蛋白质的过程。表达可以包括在真核细胞中剪接mRNA或其他形式的转录后修饰或翻译后修饰。
术语“片段1”与“F1”和“Frag 1”同义,并且是指如本文详述的LCR的片段1截短。术语“片段2”与“F2”和“Frag 2”同义,并且是指如本文详述的LCR的片段2截短。术语“片段3”与“F3”和“Frag 3”同义,并且是指如本文详述的LCR的片段3截短。术语“片段4”与“F4”和“Frag 4”同义,并且是指如本文详述的LCR的片段1构建体。
术语“个体”、“宿主”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用。
术语“诱导水平”是指在添加至少一种起始蛋白质后载物的表达。
术语“LCR”是指例如HPV16的长控制区。
术语“PDGF”是指血小板衍生生长因子。
术语“象限1疗程”包括图21的象限1中包括的疗程。作为非限制性的示例,象限1疗程包括基因编辑,安全性研究和实施例17中概述的目的。术语“象限2疗程”包括图21的象限2中包括的疗程。作为非限制性的示例,象限2疗程包括细胞重编程,检查点抑制和实施例18中概述的目的。术语“象限3疗程”包括图21的象限3中包括的疗程。作为非限制性的示例,象限3疗程包括被动免疫,免疫刺激和实施例19中概述的目的。术语“象限4疗程”包括图21的象限4中包括的疗程。作为非限制性的示例,象限4疗程包括安慰剂对照和实施例20中概述的目的。
术语“象限1因子”是指促进基础附加型拷贝数概况的任何生物因子,如图20的象限1中所示。作为非限制性的示例,象限1因子包括Frag 2、Frag 3和Frag 4序列。术语“象限2因子”是指促进诱导附加型拷贝数概况的任何生物因子,如图20的象限2中所示。作为非限制性的示例,象限2因子包括与E1和/或E2起始蛋白组合的Frag 2、Frag 3和Frag 4序列。术语“象限3因子”是指促进诱导附加型拷贝数概况的任何生物因子,如图20的象限3中所示。作为非限制性的示例,象限3因子包括与E1和/或E2起始蛋白组合的LCR和Frag 1序列。术语“象限4因子”是指促进基础附加型拷贝数概况的任何生物因子,如图20的象限4中所示。作为非限制性的示例,象限4因子包括LCR和Frag 1序列。
术语“shRNA”指短发夹RNA;术语“siRNA”是指小(或短)干扰RNA;术语“miRNA”是指微小RNA。
术语“治疗有效量”是指足够量的本公开的活性剂,以合适的组合物和合适的剂型来治疗或预防患有给定轻病、损伤、疾病或病症的患者中出现的症状、进展或并发症发作。“治疗有效量”取决于患者病症状态或其严重程度、所治疗对象的年龄、体重等。治疗有效量可以根据许多因素中的任何一种而变化,包括例如给药途径,对象的状况,以及本领域技术人员理解的其他因素。
术语“治疗”或“处理”通常是指试图改变所治疗的对象的自然进程的干预,并且可以用于预防进行或在临床病理学过程中进行。理想的效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,遏制,减少或抑制疾病的任何直接或间接病理后果,改善或缓解疾病状态,以及引起缓解或改善预后。
当在基础表达水平上下文中使用时,术语“非常低”是指非常低水平的表达和/或附加型拷贝数(视情况而定)并且可以包括没有可检测的表达和/或附加型拷贝数。作为非限制性的示例,非常低水平的表达包括少于0.020个附加型拷贝/细胞。当在基础表达水平上下文中使用时,术语“非常低”在本文中也称之为“第一限定水平”。当在基础表达水平上下文中使用时,术语“略微高”是指相较于“非常低”的标准,比其略微高的低水平的表达和/或附加型拷贝数。作为非限制性的示例,略微高的表达水平包括这样的各细胞附加型拷贝值,其等于或大于0.020个附加型拷贝/细胞,但小于0.2个拷贝/细胞。当在基础表达水平上下文中使用时,术语“略微高”在本文中也称之为“第二限定水平”。
如本文所用,术语“VIV”是指用于表达至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的载体包载体系统。当用于本文时,术语“VIV”与病毒递送系统和瞬时载体同义。
给出以下实施例以说明本发明的方面。然而,应该理解的是,本发明不限于这些实施例中描述的具体病症或细节。本文引用的所有印刷出版物均通过引用具体纳入。
实施例
实施例1-用于治疗感染性疾病的VIV
该实施例证明了用于治疗感染性疾病的示例性VIV构建体。
在该实施例中,图1A表示用于治疗埃博拉病毒(一种感染性疾病)的示例性线性VIV构建体。本文中,图1A中所描述的至少一个“载物”部分编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体。示例性VIV构建体的长末端重复(LTR)部分可用于使病毒核酸环化,如图1B所示。
怀疑患有或经诊断患有埃博拉病毒的对象可以接收治疗有效量的VIV的给药,所述VIV编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体,给药可以是单独的或与一个或多个其他试剂组合,用于治疗或预防埃博拉。编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体的VIV和/或其他试剂根据本领域已知或本文所述的方法口服,鼻内,鞘内,眼内,皮内,经粘膜,离子电渗,局部,全身,静脉内,皮下,腹膜内或肌肉内给予。然后,每天评估对象与埃博拉病毒相关的体征和症状的存在和/或严重程度,包括但不限于例如,发烧,疲劳,不适,虚弱,眼睛发红,关节和肌肉疼痛,头痛,恶心,呕吐,出血和死亡。维持治疗直至改善或消除埃博拉病毒感染的一种或多种体征或症状。
合理地预测是,怀疑患有或经诊断已经感染埃博拉病毒并且接受治疗有效量的编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体的VIV的对象将显示出严重性降低或消除与埃博拉病毒感染相关的一种或多种症状。进一步合理地预测的是,给予与一个或多个其他试剂组合的编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体的VIV将具有协同效应。
这些结果表明,编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体的VIV可用于治疗埃博拉病毒。
实施例2-用于预防感染性疾病的的VIV
该实施例证明了用于预防感染性疾病的示例性VIV构建体。在该实施例中,图1A表示用于预防埃博拉病毒的感染(一种感染性疾病)的示例性线性VIV构建体。本文中,图1A中所描述的至少一个“载物”部分编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体。示例性VIV构建体的长末端重复(LTR)部分可用于使病毒核酸环化,如图1B所示。
怀疑具有增加风险接触埃博拉病毒的对象可以接收预防有效量的VIV的给药,所述VIV编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体,给药可以是单独的或与一个或多个其他试剂组合,用于在进入接触埃博拉风险增加的区域之前治疗或预防埃博拉。编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体的VIV和/或其他试剂根据本领域已知的方法口服,鼻内,鞘内,眼内,皮内,经粘膜,离子电渗,局部,全身,静脉内,皮下,腹膜内或肌肉内给予。然后,每天评估对象与埃博拉病毒相关的体征和症状的存在和/或严重程度,包括但不限于例如,发烧,疲劳,不适,虚弱,眼睛发红,关节和肌肉疼痛,头痛,恶心,呕吐,出血和死亡。维持治疗直至预防埃博拉病毒感染的一种或多种体征或症状。
合理地预测是,怀疑患有或经诊断已经暴露于埃博拉病毒并且接受预防有效量的编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体的VIV的对象接触埃博拉的风险将降低。进一步合理地预测的是,给予与一个或多个其他试剂组合的编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体的VIV将具有协同效应。这些结果表明,编码特异性靶向埃博拉病毒的抗体的VIV可用于预防埃博拉病毒。
实施例3-用于增强伤口愈合的VIV
该实施例证明了用于增强伤口愈合的示例性VIV构建体。在该实施例中,图1A表示了用于增强伤口愈合的示例性线性VIV构建体。本文中,图1A中所描述的至少一个“载物”部分编码血小板衍生生长因子(PDGF)(SEQ ID NO:17)。示例性VIV构建体的长末端重复(LTR)部分可用于使病毒核酸环化,如图1B所示。
具有伤口(例如,来自事故、损伤或手术)的对象可以接收治疗有效量的VIV的给药,所述VIV编码血小板衍生生长因子(PDGF),给药可单独的或与一种或多种其他试剂组合,用于治疗或消毒伤口。VIV PDGF和/或其他试剂根据本领域已知或本文所述的方法口服,鼻内,鞘内,眼内,皮内,经粘膜,离子电渗,局部,全身,静脉内,皮下,腹膜内或肌肉内给予。然后每天评估对象以确定伤口的状态。维持治疗,直至伤口愈合并且瘢痕最小化。
合理地预测是,具有伤口并接受治疗有效量的VIV PDGF的对象将显示出伤口愈合增强。进一步合理地预测的是,给予与一个或多个其他试剂组合的编码PDGF的VIV将具有协同效应。这些结果表明编码PDGF的VIV能够用于增强伤口愈合。
实施例4-用于治疗骨损伤的VIV
该实施例证明了用于治疗骨损伤的示例性VIV构建体。在该实施例中,图1A表示了用于治疗骨损伤的示例性线性VIV构建体。本文中,图1A中所示的至少一个“载物”部分编码骨形态生成蛋白(BMP)(SEQ ID NO:18)。示例性VIV构建体的长末端重复(LTR)部分可用于使病毒核酸环化,如图1B所示。
怀疑患有或经诊断患有骨损伤的对象可以接收治疗有效量的VIV的给药,所述VIV编码骨形态生成蛋白(BMP),给药可以是单独的或与一个或多个其他试剂组合,用于治疗骨损伤。编码BMP的VIV和/或其他试剂根据本领域已知或本文所述的方法口服,鼻内,鞘内,眼内,皮内,经粘膜,离子电渗,局部,全身,静脉内,皮下,腹膜内或肌肉内给予。然后,每周评估对象与骨损伤相关的体征和症状的存在和/或严重程度,以确定愈合的速率和强度。维持治疗,直至骨骼已愈合时。
合理地预测是,怀疑患有或经诊断患有骨损伤并且接受治疗有效量的编码BMP的VIV的对象将显示出损伤严重性降低和愈合增强。进一步合理地预测的是,给予与一个或多个其他试剂组合的编码BMP的VIV将具有协同效应。这些结果表明,编码BMP的VIV能够用于治疗骨损伤或疾病。
实施例5-用于治疗遗传性疾病的VIV
该实施例证明了用于治疗囊性纤维化(CF)的示例性VIV构建体。在该实施例中,图1A表示了用于治疗CF(一种遗传性疾病)的示例性线性VIV构建体。本文中,图1A中所描述的至少一个“载物”部分编码囊性纤维组织跨膜传导调节因子(CFTR)(NM_000492)。示例性VIV构建体的长末端重复(LTR)部分可用于使病毒核酸环化,如图1B所示。
怀疑患有或经诊断患有(CF)的对象可以接收治疗有效量的VIV的给药,所述VIV编码囊性纤维组织跨膜传导调节因子(CFTR),给药可以是单独的或与一个或多个其他试剂组合,用于治疗CF。编码CFTR的VIV和/或其他试剂根据本领域已知或本文所述的方法口服,鼻内,鞘内,眼内,皮内,经粘膜,离子电渗,局部,全身,静脉内,皮下,腹膜内或肌肉内给予。然后,每周评估对象与CF相关的体征和症状的存在和/或严重程度,包括但不限于例如,生长不良,持续咳嗽,痰液粘稠,哮喘,呼吸困难,运动能力下降,反复肺部感染,鼻腔发炎,大便腻,肠梗阻,体重增加不良。维持治疗直至改善或消除CF的一种或多种体征或症状。
合理地预测是,怀疑患有或经诊断患有CF并且接受治疗有效量的编码CFTR的VIV的对象将显示出严重性降低或与CF相关的一种或多种症状消除。进一步合理地预测的是,给予与一个或多个其他试剂组合的编码CFTR的VIV将具有协同效应。这些结果表明,编码CFTR的VIV能够用于治疗CF。
实施例6-包含E1以表达载物的VIV
产生根据图2的载体,其包含绿色荧光蛋白基因(GFP)作为载物。化学合成这样的DNA,其包含来自人乳头瘤病毒16型的E1蛋白(NCBI登录号U89348;SEQ ID NO:19)和完整基因座控制区。最初合成各个区段和/或编码序列。使用与绿色荧光蛋白基因5′末端相同并与绿色荧光蛋白的3′末端互补的合成寡核苷酸引物通过聚合酶链反应(PCR)扩增这些。5’引物(SEQ ID NO:20)从其具有BamHI或EcoRI内切核酸酶的识别位点的5’端延伸。3’引物(SEQID NO:21)在其具有BamHI的互补物或EcoRI内切核酸酶识别位点的3’端延伸。然后,用BamHI和EcoRI限制性内切核酸酶消化所得扩增的绿色荧光蛋白基因序列。
慢病毒载体获自系统生物科学有限公司(System Biosciences,Inc.)。用BamHI和EcoRI酶切割质粒,并与过量扩增的绿色荧光蛋白基因序列以1∶3比例的插入物与载体混合。
然后通过在70摄氏度下加热灭活20分钟来终止酶活性。将上述混合物冷却至室温以进行退火。
用噬菌体T4DNA连接酶在室温下进行30分钟退火反应。将2.5微升获得的连接混合物添加到25微升STBL3感受态细菌细胞中。
然后通过在42摄氏度下短暂的(1分钟)热休克进行转染。
将细菌细胞划线到含有氨苄青霉素的琼脂平板上以获得细菌培养物。这些培养物在Luria肉汤中扩增。
为了检查扩增的绿色荧光蛋白基因序列是否插入慢病毒载体包装质粒中,从上述细菌培养物中提取DNA并通过标准方法纯化。用与制备构建体相同的内切核酸酶消化纯化的DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析片段长度,并使用获自Eurofins MWG操纵子有限责任公司(Eurofins MWG Operon LLC)特异性引物通过DNA测序验证扩增的绿色荧光蛋白基因序列。
慢病毒载体储液如下产生。将至少两个慢病毒包装质粒加上载物质粒共转染到HEK细胞中,其中表达病毒基因和基因组RNA,组装成整合酶缺陷型慢病毒颗粒,并释放到培养基中。在转染后3-10天的间隔期间内产生并收集无细胞上清液。慢病毒颗粒通过标准程序纯化,包括方法的组合,所述方法可以包括离心,瞬时流动过滤,尺寸排阻色谱,尺寸排阻过滤或离子交换色谱。测定各储液的浓度和生物活性(转导单位/ml)。
将哺乳动物细胞,包括293T细胞,用于测试慢病毒衍生的附加体形成、拷贝数和表达。在聚凝胺存在的情况下,用以从1至10范围的感染复数的整合酶缺陷型慢病毒颗粒转导293T细胞。施用后3小时通过洗涤细胞除去未吸收的病毒,并将细胞培养3天。在荧光显微镜下观察细胞,计数表达GFP的细胞。未转导的293T细胞用作阴性对照。数据以培养物中每100个活细胞的GFP阳性细胞报告。每个显微镜视野计数最少300个细胞,各重复实验计数5-10个视野。进行四个独立的转导实验,包括1个阴性对照(最左边的数据列)和3个重复实验(即,指定为实验1、实验2和实验3的数据列),以确定转导细胞的频率。数据在图3中描述,并显示了三次重复实验中GFP的表达。
实施例7-包含E1和E2以表达载物的VIV
参照图4,可以构建载体19以包含E1(SEQ ID NO:6)和E2(SEQ ID NO:7)起始蛋白。此处,遗传载物是在诱导型启动子控制下的CMV/GFP表达盒。
293T细胞可以用载体19转导,感染复数范围为1至20个转导单位/细胞。3小时后,用培养基洗涤细胞以除去未吸附的病毒粒子并返回培养。转导后12-24小时,用至少一剂可以诱导诱导型启动子的化合物处理细胞。在添加可诱导诱导型启动子的化合物后,E1和E2mRNA由附加体转录并在基因座控制区片段2(LCR/F2)(SEQ ID NO:3)上组合和组装以触发DNA复制。慢病毒衍生的附加体在启动子诱导的停止后约24-36小时开始衰变。通过分析流式细胞术测量来自载体19中的载物的蛋白质产物。
实施例8-导入E1和E2用于表达载物
为了确定E1和E2在表达载物中的作用,用D64V整合酶缺陷型慢病毒载体(即,图5A中的载体)转导293T细胞,所述D64V整合酶缺陷型慢病毒载体表达mCherry和全长HPV16(SEQ ID NO.1)长控制区(LCR)或3’片段,如本文片段1(SEQ ID NO:2)、片段2(SEQ ID NO:3)、片段3(SEQ ID NO:4)和片段4(SEQ ID NO:5)所述。
值得注意的是,参照图5A,在图5A中所述LCR区域中使用全长LCR或3′片段。更具体地,设计的构建体的描述如本文图7中载体9-13示范。图7中所示其他元件指:psi包装元件(SEQ ID NO:22);rev元件(SEQ ID NO:23);cPPT(中心聚嘌呤区)元件(SEQ ID NO:24);和土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调控元件(SEQ ID NO:25)。
24小时后,用包含HPV16E1(SEQ ID NO:6)和E2(SEQ ID NO:7)的质粒以Lipofectamine 2000转染细胞。2天后,通过FACS分析mCherry表达。这些实验的结果如本文图6A所示。
为了与上述其中通过质粒导入E1和E2的试验相对照,进行如下所述的第二组实验。简言之,基于本文图5A中所示广义的载体,用D64V整合酶缺陷型慢病毒载体转导293T细胞,所述D64V整合酶缺陷型慢病毒载体表达mCherry和全长HPV16长控制区(LCR)(SEQ IDNO:1)或较短片段(SEQ ID NO:2)。与此同时,用表达HPV16 E1(SEQ ID NO:6)和E2(SEQ IDNO:7)的慢病毒转导细胞。2天后,通过FACS分析mCherry表达,如本文图6B所示。如本文图6B所示,当用D64V整合酶缺陷型慢病毒载体导入E1和E2时实现了较大百分比的mCherry细胞,所述D64V整合酶缺陷型慢病毒载体表达mCherry和全长LCR(SEQ ID NO:1)或较短片段1(本文也称之为片段1,并且本文也称之为SEQ ID NO:2)。
该实施例中详述的数据表明,当E1和E2经由慢病毒介导的表达表达时,存在更强的表达并因此HPV ori(LCR)全长和片段更多的活化。
其次,来自该实施例的数据表明,取决于LCR区域的大小,HPV ori激活存在差异。例如,参照图6,相较于片段2(SEQ ID NO:3)、3(SEQ ID NO:4)和4(SEQ ID NO:5),当使用全长LCR(SEQ ID NO:1)和片段1(SEQ ID NO:2)时,mCherry表达中存在显著的表达。
实施例9-表达VEGF
如本文所述,VEGF可经选择成为“载物”区域,用于治疗骨损伤等。为了进一步分析VEGF表达的水平,用D64V整合酶缺陷型慢病毒载体转导293T细胞,所述64V整合酶缺陷型慢病毒载体包含VEGF的人cDNA(SEQ ID NO:26)和HPV16长控制区(LCR)的片段1(SEQ ID NO:2)(参见:图5B关于包含VEGF的载体的一般描述)。与此同时,用包含HPV16 E1(SEQ ID NO:6)和E2(SEQ ID NO:7)的慢病毒载体转导细胞。2天后,收集细胞培养基并用VEGF的ELISA试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))分析。如图8所示,VEGF表达载体的VEGF水平(3,594pg/ml)增加,而其与E1和E2一起时进一步增加(11,856pg/ml)。
以类似于上述实施例8的mCherry结果的方式,结果表明取决于LCR区域的大小,HPV ori活化中存在差异。如图8所示,添加E1/E2后,VEGF水平发生了约3倍的变化。因此,全长LCR(SEQ ID NO:1)或片段1(SEQ ID NO:2)以低水平表达感兴趣的基因(即,VEGF),但是当导入E1/E2时,存在强烈的表达诱导。相反,测试的其他片段在较高的初始水平表达,因此在导入E1/2时差异减小。
实施例10-开发包含E1和E2的载体
使用标准分子生物学技术(例如,Sambrook;《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratory Manual),第4版)以及本文所述的技术,开发了一系列含有HPV LCR和E1和E2的慢病毒载体,如下述更细致的描述。这些载体还示于图9中。
参照图9,开发了载体20,其是用于表达cDNA、微小RNA或shRNA的一般慢病毒载体。参照载体20,并且从左到右,所开发载体的关键组分是:长末端重复部分(SEQ ID NO:27);psi包装元件(SEQ ID NO:22);rev响应元件(RRE)(SEQ ID NO:23);启动子;cDNA、微小RNA、shRNA或其他载物元件;土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件(SEQ ID NO:25),LCR部分,其可以包含如本文所示的LCR片段;以及长末端重复部分(SEQ ID NO:28)。
参照图9,开发了载体21,并且其是用于表达E1的慢病毒载体。参照载体21,并且从左到右,所开发载体的关键组分是:长末端重复部分(SEQ ID NO:27);psi包装元件(SEQ IDNO:22);rev响应元件(RRE)(SEQ ID NO:23);CMV启动子(SEQ ID NO:29);E1(SEQ ID NO:6);土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件(SEQ ID NO:25);和长末端重复部分(SEQ IDNO:28)。
参照图9,开发了载体22,并且其是用于表达E1-C(羧基末端)(SEQ ID NO:8)的慢病毒载体。参照载体22,并且从左到右,所开发载体的关键组分是:长末端重复部分(SEQ IDNO:27);psi包装元件(SEQ ID NO:22);rev响应元件(RRE)(SEQ ID NO:23);CMV启动子(SEQID NO:29);E1-C(SEQ ID NO:8);土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件(SEQ ID NO:25);和长末端重复部分(SEQ ID NO:28)。
参照图9,开发了载体23,并且其是用于表达E2(HPV 16)(SEQ ID NO:7)的慢病毒载体。参照载体23,并且从左到右,所开发载体的关键组分是:长末端重复部分(SEQ ID NO:27);psi包装元件(SEQ ID NO:22);rev响应元件(RRE)(SEQ ID NO:23);UbiC启动子(SEQID NO:30);E2(SEQ ID NO:7);土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件(SEQ ID NO:25);和长末端重复部分(SEQ ID NO:28)。
参照图9,开发了载体24,并且其是用于表达E2-11(HPV11)(SEQ ID NO:9)的慢病毒载体。参照载体24,并且从左到右,所开发载体的关键组分是:长末端重复部分(SEQ IDNO:27);psi包装元件(SEQ ID NO:22);rev响应元件(RRE)(SEQ ID NO:23);UbiC启动子(SEQ ID NO:30);E2-11(HPV11)(SEQ ID NO:9);土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件(SEQ ID NO:25);和长末端重复元件(SEQ ID NO:28)。
参照图9,开发了载体25,并且其是用于表达E1-T2A-E2(SEQ ID NO:10)的慢病毒载体。参照载体25,并且从左到右,所开发载体的关键组分是:长末端重复部分(SEQ ID NO:27);psi包装元件(SEQ ID NO:22);rev响应元件(RRE)(SEQ ID NO:23);CMV启动子(SEQ IDNO:29);E1-T2A-E2(SEQ ID NO:10);土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件(SEQ IDNO:25);和长末端重复部分(SEQ ID NO:28)。
参照图9,开发了载体26,并且其是慢病毒载体用于表达E1-T2A-E2(SEQ ID NO:10)和全长LCR(SEQ ID NO:1)或其片段(例如,SEQ ID NO:2-5)。参照载体26,并且从左到右,所开发载体的关键组分是:长末端重复部分(SEQ ID NO:27);psi包装元件(SEQ ID NO:22);rev响应元件(RRE)(SEQ ID NO:23);CMV启动子(SEQ ID NO:29);E1-T2A-E2(SEQ IDNO:10);土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件(SEQ ID NO:25);LCR部分;和长末端重复部分(SEQ ID NO:28)。
仍然参照图9,载体27描述了用于表达例如cDNA、抗体、微小RNA或shRNA的一般慢病毒载体。参照载体27,并且从左到右,所开发载体的关键组分是:长末端重复部分(SEQ IDNO:27);psi包装元件(SEQ ID NO:22);rev响应元件(RRE)(SEQ ID NO:23);启动子;cDNA.微小RNA,shRNA或其他载物元件;土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件(SEQ ID NO:25);EBV ori(SEQ ID NO:31);和长末端重复元件(SEQ ID NO:28)。
本文详述的线性载体如所示在细胞内环化,例如图10,其描述了载体20的环化(如图9中所示)。出于详述本文实验的目的,图10以箭头详述了引物组,其位于3′和5′长末端重复序列(LTR)上。该引物组被设计用于扩增慢病毒载体的附加型形式,并且不扩增载体的整合形式。用于检测慢病毒附加体的适当引物包含以下序列:
3’LTR Fwd CTAATTCACTCCCAACGAAG(SEQ ID NO:11);和
5’LTR Rev GCCGAGTCCTGCGTCGAGAG(SEQ ID NO:12)。
在本文详述的实验中,通过利用载体20与载体21或载体22或载体23或载体24的组合来调节整合酶缺陷型慢病毒载体拷贝数。通过利用载体20与载体25或载体26的组合来调节整合酶缺陷型慢病毒载体拷贝数。
实施例11-开发LCR片段和相关的载体
如本文所讨论,本文所详述的载体的LCR部分可以是并且通过使用片段修饰,如片段1(SEQ ID NO:2)、片段2(SEQ ID NO:3)、片段3(SEQ ID NO:4)和片段4(SEQ ID NO:5)。
LCR的基因组组织和本文所述的片段如图11所示。其中,全长LCR(顶部)含有一系列AP1、YY1、E1和E2结合位点。例如,如图11所示,片段1(SEQ ID NO:2)、片段2(SEQ ID NO:3)、片段3(SEQ ID NO:4)和片段4(SEQ ID NO:5)表示藉由增加5′截短而增加LCR,其减少了一系列AP1、YY1和E2结合位点。本文详述了利用LCR片段的慢病毒载体(例如,图7和本文的相关实施例)。
实施例12-测试包含LCR片段和E1/E2变体的载体
为了测试包含本文详述的各种LCR片段的载体,用D64V整合酶缺陷型慢病毒载体转导293T细胞,所述D64V整合酶缺陷型慢病毒载体包含全长HPV16长控制区(LCR)或片段1(SEQ ID NO:2)、片段2(SEQ ID NO:3)、片段3(SEQ ID NO:4)和片段4(SEQ ID NO:5),如本文所述(参见,例如图7和本文的相关实施例)。
24小时后,用包含HPV16 E1(SEQ ID NO:6)和E2(SEQ ID NO:7)的质粒以Lipofectamine 2000转染细胞。2天后,通过qPCR提取DNA用于分析。使用由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所代表的对慢病毒载体附加型形式具有特异性的引物确定附加型拷贝数。值得注意的是,该引物组仅扩增1-和2-LTR附加体。该实施例的数据如图12所示。其中,与LCR及其片段相关的数字反映了添加E1和E2后各种条件的倍数变化增加。
如图12所示,对于全长LCR和Frag 1,基础附加型拷贝数非常低。例如,对于这2种条件(即,全长LCR和Frag 1),基础附加型拷贝数低于0.020个附加型拷贝/细胞。Frag 2、Frag 3和Frag 4构建体的基础附加型拷贝数略高。例如,对于这3种条件(即,Frag 2、Frag3和Frag 4),基础附加型拷贝数为或高于个0.020附加型拷贝/细胞。基础附加型拷贝数数据影响了各测试条件的相对倍数变化。如图12所示,当将E1/E2被导入系统时,全长LCR构建体导致附加型拷贝数增加267倍。当将F1/E2导入系统时,Frag 1构建体导致附加型拷贝数增加362倍。当将E1/E2导入系统时,Frag 2构建体导致附加型拷贝数增加6倍。当将E1/E2导入系统时,Frag 3构建体导致附加型拷贝数增加61倍。当将E1/E2导入系统时,Frag 4构建体导致附加型拷贝数增加7倍。图12中详述的数据也在本文图20中以单独的格式叙述。
在另一组相关实验中,对由包含HPV LCR及其3′片段的整合酶缺陷型慢病毒载体的mCherry表达进行分析。简言之,用D64V整合酶缺陷型慢病毒载体转导293T细胞,所述D64V整合酶缺陷型慢病毒载体表达mCherry和全长HPV16长控制区(LCR)或片段1(SEQ IDNO:2)、片段2(SEQ ID NO:3)、片段3(SEQ ID NO:4)和片段4(SEQ ID NO:5)。与此同时,用表达HPV16E1(SEQ ID NO:6)和E2(SEQ ID NO:7)的慢病毒转导细胞。2天后,通过FACS分析mCherry表达。
如图13A所示,针对各测试条件鉴定mCherry细胞的百分比。与LCR及其片段相关的数字反映了添加E1和E2后各种条件的倍数变化增加。
在另一组相关实验中,用D64V整合酶缺陷型慢病毒载体转导293T细胞,所述D64V整合酶缺陷型慢病毒载体表达mCherry和先前鉴定为SEQ ID NO:1的全长HPV16长控制区。与此同时,用表达HPV16E1-T2A-E2(SEQ ID NO:10)的慢病毒由单个载体(参见,图9的载体25)转导细胞。2天后,通过FACS分析mCherry表达,数据述于图13B中。如其中所示,藉由HPV16E1-T2A-E2(SEQ ID NO:10)转导导致阳性mCherry细胞显著增加。
在另一组相关实验中,在添加E1、E1-C和E2-11后,使用含有HPV LCR的整合酶缺陷型慢病毒载体进行mCherry表达的分析。简言之,藉由表达mCherry和HPV16 LCR(SEQ IDNO:1)或片段1(SEQ ID NO:2)的D64V整合酶缺陷型慢病毒载体转导293T细胞。与此同时,藉由HPV16 E1(即,图9中的载体21;和SEQ ID NO:6)或E1羧基(C)-末端片段(即,图9中的载体22;和SEQ ID NO:8)和HPV16 E2(即,图9中的载体23;和SEQ ID NO:7)或HPV11 E2(即,图9中的载体24;和SEQ ID NO:9)转导细胞。2天后,通过FACS分析mCherry表达。如图14所示,针对各测试条件鉴定mCherry细胞的百分比。与测试的条件相关的数字反映了添加E1和E2后各种条件的倍数变化增加。
实施例13-抗体表达
如本文所述,公开的系统的特征之一是所公开系统表达抗体的有用性。在本文详述的一系列代表性实验中,使用慢病毒载体系统表达抗HER2抗体。简言之,藉由D64V整合酶缺陷型慢病毒载体(即,载体20)感染293T细胞,所述D64V整合酶缺陷型慢病毒载体包含针对HER2(SEQ ID NO:13)的抗体序列和HPV LCR(SEQ ID NO:1)序列。
与此同时,用包含E1(SEQ ID NO:6)和E2(SEQ ID NO:7)的慢病毒载体感染细胞。3天后,收集细胞培养基。使用蛋白A/G琼脂糖珠从培养基中纯化抗体。使用绵羊-抗人抗体(赛默飞世尔科技公司)进行免疫印迹。如图15A所示,藉由添加E1和E2增加抗体产量。此外,如图15B所示,使用EasyTiter IgG试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测定抗HER2 IgG浓度。
此外,如本文图16所示,还可以使用本文公开的系统表达其他抗体。在图16中,示出了显示抗-EGFR抗体(SEQ ID NO:14)表达的免疫印迹。简言之,藉由D64V整合酶缺陷型慢病毒载体感染293T细胞,所述D64V整合酶缺陷型慢病毒载体包含针对EGFR(参加下述SEQID NO:14)的抗体序列和HPV片段2(SEQ ID NO:3)。
24小时后,用包含E1(SEQ ID NO:6)和E2(SEQ ID NO:7)的慢病毒载体感染细胞。3天后,收集细胞裂解物和细胞培养基。使用蛋白A/G琼脂糖珠从培养基中纯化并通过细胞裂解从细胞提取抗体。使用绵羊抗-人抗体(赛默飞世尔科技公司)和抗-肌动蛋白(西格玛公司)抗体作为蛋白质上样对照对细胞裂解物进行免疫印迹。如图16所示,藉由添加E1和E2,细胞裂解物和培养基中抗体产量增加。
实施例14-微小RNA表达和敲减
如本文所述,公开的系统的特征之一是所公开系统表达微小RNA的有用性。作为非限制性的示例,设计构建体基于SEQ ID NO:15表达CCR5的微小RNA。
简言之,藉由D64V整合酶缺陷型慢病毒载体(即,载体20)感染表达CCR5的Hela细胞,所述D64V整合酶缺陷型慢病毒载体包含针对CCR5(SEQ ID NO:15)的微小RNA序列和全长HPV LCR(SEQ ID NO:1)序列。同时,藉由包含E1和E2的慢病毒载体感染细胞。3天后,收集细胞并通过FACS分析以抗-CCR5 APC偶联的抗体分析CCR5表达。如图17所示,CCR5阳性细胞的百分比用LV-LCR miR-CCR5从92.6%降低至70.9%,并且用LV-LCR miR-CCR5加上E1和E2降低至44%。
在相关实验中,利用了这样的D64整合酶缺陷型慢病毒载体,其包含针对CCR5的微小RNA序列和片段2(SEQ ID NO:3)LCR序列。如图18所示,添加miR-CCR5后CCR5表达有类似的降低,当添加E1和E2时更是如此。
更详细地参照图18,上图显示了基于mCherry表达水平的细胞分布,各自由单个点表示。下图显示了CCR5表达中与DNA复制水平和针对CCR5的miRNA产生有关的相应变化。通过用于染色细胞表面的荧光单克隆抗体检测CCR5。没有任何LV载体(左图),没有mCherry的表达(所有细胞都在区段1中)并且CCR5表达均匀地在约200荧光强度单位处高度。通过添加包含miRCCR5的LV-LCR(片段2;SEQ ID NO:3),我们发现这样的细胞产生具有以约30个强度单位为中心的荧光强度(下图、中间图的虚线)的新群体,所述细胞具有mCherry基础表达(55%的细胞位于区段2中)和CCR5表达的一些减少。通过添加LV-LCR miRCCR5和表达E1和E2复制蛋白的非整合型慢病毒载体,我们发现18.8%的细胞具有mCherry表达最高(区段3)并且发现甚至更低的CCR5表达的新群体(曲线3,灰色和虚线),其小于20个荧光强度单位。这些数据证明了包含LCR片段2(SEQ ID NO:3)的VIV表达基础水平的miRCCR5的能力,该miRCCR5在降低CCR5蛋白的细胞表面表达方面具有生物学活性。此外,结果显示了添加E1/E2DNA复制蛋白对载体拷贝数(与mCherry的表达相关)的影响以及增加miRCCR5表达导致细胞表面CCR5表达的进一步降低。
实施例15-基于EBV的起始蛋白
如本文所述,起始蛋白如E1(SEQ ID NO:6)和E2(SEQ ID NO:7)用于增强本文所述系统的有效性。用于当前系统的另一起始蛋白是EBNA-1(SEQ ID NO:32)。因此,在一系列实验中,藉由表达GFP和EB病毒(EBV)OriP序列(SEQ ID NO:31)的D64V整合酶缺陷型慢病毒载体(即,载体27)转导293T细胞。
24小时后,用包含EBV EBNA-1(SEQ ID NO:32)的质粒以Lipofectamine 2000转染细胞。2天后,通过FACS分析GFP表达。如图19中的代表性数据所示,EBV加上EBNA导致GFP表达增强。因此,该数据证明起始蛋白质/ori相互作用不限于E1/E2相互作用,还包括EB病毒组分。
实施例16-LCR片段选择用于配制优化的病毒递送系统
根据细胞中所需的表达水平选择LCR片段长度。图20描述了本文图12中产生的附加型拷贝数数据。更具体地,图20示出了根据本发明的一个方面的选择量规(rubric)。附加体拷贝/细胞(Y轴)针对LCR片段长度(X轴)绘制。如图20所示,通过附加体拷贝/细胞测定的不同表达水平归因于本文测试的各种LCR片段。如图20所示,并从右向左示出具有E1/E2(黑点数据点)和没有E1/E2(浅灰色点数据点)的全长LCR(SEQ ID NO:1)、片段1(SEQ ID NO:2)、片段2(SEQ ID NO:3)、片段3(SEQ ID NO:4)和片段4(SEQ ID NO:5)的数据。如图12所示,通过附加体拷贝/细胞测定的基础表达对于LCR和片段1构建体是最低的。例如,对于这两种条件(即,全长LCR和Frag 1),基础附加型拷贝数低于0.020个附加型拷贝/细胞。Frag2、Frag 3和Frag 4条件的基础表达略微高。例如,对于这3种条件(即,Frag 2、Frag 3和Frag 4),基础附加型拷贝数为或高于0.020个附加型拷贝/细胞。
参考图11和20两者,从LCR的5′末端增加的缺失去除了关键的功能元件。当LCR或LCR片段存在于慢病毒衍生的附加体载体内而没有添加E1/E2蛋白(例如,浅灰色点数据点)时,通过定量PCR试验测量的附加型DNA拷贝数限定基础表达。通过转染含有E1和E2的表达质粒测量诱导活性(例如,黑点数据点),然后在定量PCR试验中测量附加型DNA拷贝数/细胞之前,导入慢病毒衍生的附加体载体。当E1/E2蛋白表达构建体作为非整合慢病毒载体递送时,获得了类似的结果。如本文所详述,LCR的片段2、3和4经确定基础表达最高。这表明基础表达受到YY1转录因子结合位点存在的抑制,所述YY1转录因子结合位点存在于LCR和片段1中,但不存在于片段2-4,如图11所示。在片段2-4内,片段2具有最高的基础表达并且是包括两个AP1转录因子结合位点的唯一片段。因此,当移除YY1位点并且保留两个AP1位点时,基础转录增加。如本文所详述,确定对片段1和3的诱导活性最高,对片段2和4较低,而对完整LCR最低。在LCR中存在未鉴定的元件,其不存在于片段1中,并且其作用是抑制可诱导型DNA复制。当存在YY1和AP1位点时(片段1),相较于去除YY1和所有AP1位点(片段3),附加型DNA水平较低。当AP1位点不存在YY1(片段2)时或当YY1,AP1和4个E2结合位点中的2个被去除时(片段4),诱导型附加型DNA形成是中等的并且类似于LCR。
如图20中所总结,本文详述的数据证明了基础表达水平的可定义差异和诱导这类表达的能力。基于该数据,至少定义了四个象限的活性,如图20所示。
参照图21,4个象限代表可归因于LCR及其相对片段的不同程度的活性。如图21所示,象限1反映了低活性但比象限4高3-4倍,并且具有较小的LCR片段。象限2反映了高活性,同样具有较小的LCR片段。象限3反映了较高的活性,但这次具有相对较长的LCR片段。最后,象限4反映了具有相对较长的LCR片段非常低的活性。
如图21中详述,各象限与特定所需疗程或结果合理地相关联。作为代表性实例,当所需疗程或结果包括基因编辑时,选择选自象限1的LCR。作为代表性实例,当所需疗程或结果包括细胞重编程时,选择来自象限2的LCR。作为代表性实例,当所需疗程或结果是免疫刺激时,选择来自象限3的LCR。作为代表性实例,当所需疗程或结果是安慰剂效应时,选择来自象限4的LCR。因此,基于所需疗程或结果,使用当前系统采用各种LCR片段。
实施例17-以象限1治疗个体
针对镰状细胞贫血症设计了一种治疗方法。在该方法中,去除CD34+骨髓衍生的造血前体干细胞(HPSC),用基因修饰离体处理并作为自体细胞疗法植入。该策略依赖于表达抑制性miRNA,其减少Bcl11A蛋白的表达,所述Bcl11A蛋白是胎儿球蛋白表达的有效抑制因子(Akinsheye,等,Blood 118:19,2011)。当Bcl11A水平降低时,胎儿球蛋白表达增加并且就正常细胞功能而言取代成人球蛋白。
安全性研究引起了关于这样能力的关注,所述能力为表达足够水平的抑制性miRNA,而不显著地增加病毒载体剂量,所述病毒载体剂量反过来会降低转导的CD34+HPSC的活力,降低治疗效率并增加治疗成本。为了克服在不增加慢病毒载体量的情况下增加表达的问题,确定能够增加基因剂量的非整合载体是最佳选择。首先,有必要测试表达Bcl11AmiRNA的低剂量染色体外DNA是否足以抑制Bcl11A表达并提高胎儿球蛋白表达。
使用标准且通常接受的临床级载体主链和包装系统(具有通过突变灭活的整合酶功能)构建慢病毒载体(LVmiRBcl11A),其包含:受合适启动子控制的合成miRNA构建体,所述合成miRNA构建体具有与Bcl11A mRNA内存在的序列匹配的引导序列;长度为200个核苷酸的LCR片段;并且没有E1和/或E2复制蛋白的伴随表达。
LVmiRBcl11A用于以等于5的感染复数转导HPSC,这是使转导的细胞的频率最大化并使HPSC细胞死亡最小化的条件。在适当的细胞减少条件化后,将转导的细胞移植到原始供体的骨髓中。监测试验参与者以确定转导细胞的频率,染色体外DNA拷贝/细胞和胎儿球蛋白表达的水平。合理地预测是,象限1方法产生低染色体外DNA拷贝数/细胞并构成LVmiRBcl11A的低治疗剂量。
实施例18-以象限2治疗个体
针对镰状细胞贫血症相关细胞重编程设计了治疗方法。在该方法中,去除CD34+骨髓衍生的造血前体干细胞(HPSC),用基因修饰离体处理并作为自体细胞疗法植入。该策略依赖于表达抑制性miRNA,其减少Bcl11A蛋白的表达,所述Bcl11A蛋白是胎儿球蛋白表达的有效抑制因子。当Bcl11A水平降低时,胎儿球蛋白表达增加并且就正常细胞功能而言取代成人球蛋白。
引起了关于这样能力的关注,所述能力为表达足够水平的抑制性miRNA,而不显著地增加病毒载体剂量,所述病毒载体剂量反过来会降低转导的CD34+HPSC的活力,降低治疗效率并增加治疗成本。
为了克服在不增加慢病毒载体量的情况下增加表达的问题,确定能够改变基因剂量的非整合载体是最佳选择。在使用象限1条件(不具有E1和/或E2复制蛋白的伴随表达的短LCR片段)的初始测试后(即,实施例17),有必要测试高剂量表达Bcl11A miRNA的染色体外DNA是否足以抑制Bcl11A表达并提高胎儿球蛋白表达。鉴于使用短LCR和E1和/或E2复制蛋白伴随表达的基因剂量的诱导性,可以递送相同剂量的LVmiRBcl11A,以及用于临时表达E1和/或E2蛋白的非整合型慢病毒载体,以在不增加将降低CD34+HPSC活力的慢病毒载体剂量的情况下,将基因剂量增加5倍以上。
使用标准且通常接受的临床级载体主链和包装系统(具有通过突变灭活的整合酶功能)构建慢病毒载体(LVmiRBcl11A),其包含:受合适启动子控制的合成miRNA构建体,所述合成miRNA构建体具有与Bcl11A mRNA内存在的序列匹配的引导序列;长度为200个核苷酸的LCR片段;E1和/或E2复制蛋白在非整合型慢病毒载体上表达,该载体不含有控制DNA复制的LCR。
LVmiRBcl11A用于以等于5的感染复数转导HPSC,这是使转导的细胞的频率最大化并使HPSC细胞死亡最小化的条件。在适当的细胞减少条件化后,将转导的细胞移植到原始供体的骨髓中。监测试验参与者以确定转导细胞的频率,各细胞的染色体外DNA拷贝和胎儿珠蛋白表达的水平。合理地预测是,象限2方法产生高染色体外DNA拷贝数/细胞并构成LVmiRBcl11A的高治疗剂量。
比较实施例17和18中表示的研究以确定用LVmiRBcl11A转导CD34+HPSC的最佳条件,以使治疗效率和效力最大化。
实施例19-以象限3治疗个体
提出的用于HIV疾病的被动免疫治疗涉及使用CRISP-Cas9基因编辑来使细胞表面整联蛋白受体α4β7缺失,其促进病毒附着和易感T细胞穿透。该治疗策略包括从外周血中分离T细胞,然后用携带抗-α4β7 CRISPR-Cas9构建体的慢病毒转导,所述抗-α4β7 CRISPR-Cas9构建体包含对α4β7基因序列具有特异性的引导RNA。用治疗性慢病毒转导分离的T细胞以使α4β7受体缺失。然后经由输注使细胞返回身体。一旦返回循环,这些HIV抗性细胞的数量可能会增加并开始提供正常的免疫功能,包括抵抗HIV复制的能力。预计将需要高剂量的CRISPR-Cas9慢病毒载体以实现α4β7基因的均一缺失。提出的临床试验的一组(即,实施例20)利用具有长形式LCR的非整合慢病毒载体,其表达CRISPR-Cas9α4β7,但不包括将拷贝数增加到高于几乎检测不到的水平所需的E1和/或E2复制蛋白。
在该临床试验的该治疗组中,递送相同的LVCRISPR-Cas9α4β7,并且在这样的构建体中存在伴随递送表达E1和/或E2复制蛋白的非整合慢病毒,所述构建体不含有LCR且不能够进行DNA复制。这将在不该改变有效转导T细胞所需LV-CRISPR-Cas9α4β7的量的情况下增加基因剂量,并且被认为是该试验的高剂量治疗组。
构建慢病毒载体,并在通常使用的病毒载体主链内含有下列元件:长度为720个核苷酸的LCR,当提供E1和/或E2蛋白时其是诱导型的;表达盒,其包含α4β7-互补引导RNA和CRISPR-Cas9蛋白基因转录的合适启动子。载体与整合酶基因中的突变一起包装,以阻断正常的病毒DNA整合。第二非整合慢病毒用于在这样的构建体中提供E1和/或E2 DNA复制蛋白的瞬时表达,所述构建体不含LCR并且不能够进行DNA复制。
藉由这样的非整合慢病毒载体离体修饰T细胞,所述非整合慢病毒载体具有高CRISPR-Cas9和引导RNA表达,因为通过添加E1和/或E2蛋白增加了基因剂量。在研究的治疗组中使细胞返回临床试验对象。评估临床结果,基于在HIV存在下携带α4β7基因缺失的T细胞比例增加,在不存在抗逆转录病毒药物的情况下改善T细胞功能和HIV复制的自然控制。合理地预测是,象限3方法导致在HIV存在下携带α4β7基因缺失的T细胞比例增加,在不存在抗逆转录病毒药物的情况下改善T细胞功能和HIV复制的自然控制。
实施例20-以象限4治疗个体
提出的用于HIV疾病的治疗涉及使用CRISP-Cas9基因编辑来缺失促进病毒附着和易感T细胞穿透的细胞表面整联蛋白受体α4β7。该治疗策略包括从外周血中分离T细胞,然后用携带抗-α4β7 CRISPR-Cas9构建体的慢病毒转导,所述抗-α4β7 CRISPR-Cas9构建体包含对α4β7基因序列具有特异性的引导RNA。用治疗性慢病毒转导分离的T细胞以使α4β7受体缺失,然后经由输注使细胞返回体内。一旦返回循环,这些HIV抗性细胞的数量可能会增加并开始提供正常的免疫功能,包括抵抗HIV复制的能力。
在开始该治疗的临床研究之前,重要地是确认载体安全性和特异性。关键的问题是包含α4β7特异性引导RNA的治疗基因盒是否会整合并引起遗传毒性。存在这种担忧是因为引导RNA在人基因组中具有直接同源性,并且整合能够进行长期CRISPR-Cas9表达的构建体的效果可能具有意想不到的后果,包括细胞转化和癌症。
为了证明载体整合到α4β7基因中不是高概率事件,设计临床对照试验包括这样一个组,其中使用非整合瞬时载体在输注前离体修饰T细胞。体外研究不足以评估风险,因为体内分析的事件数量远大于体外或离体研究所模拟的事件数量。
构建在通常使用的病毒载体主链内含有下列元件的慢病毒载体:长度为720个核苷酸的LCR,没有E1和/或E2的伴随表达;表达盒,其包含CRISPR-Cas9蛋白和α4β7-互补引导RNA基因转录合适的启动子。载体与整合酶基因中的突变一起包装,以阻断正常的病毒DNA整合。
用这样的非整合慢病毒载体离体修饰T细胞,所述非整合慢病毒载体具有最小CRISPR-Cas9或引导RNA表达,因为在没有E1和/或E2蛋白的情况下基因剂量没有增加。在研究对照组中使细胞返回临床试验对象,并这样测量病毒DNA整合的模式,通过提取染色体DNA并进行适当的基于PCR的研究来鉴定已经与染色体DNA重组的病毒DNA。通过高通量DNA测序确定用于重组任何整合DNA的位点,并报告为潜在的基因毒性事件,表明不良事件的可能性。合理地预测是,该象限4方法将用作监测重组事件的效应控制。
序列
本文提及以下序列:
当本文中描述或特别例示了本发明的某些优选实施方式时,这并非旨在将本发明限于这些实施方式。在不脱离本发明的范围和精神的情况下,可以对其进行各种修改。
Claims (38)
1.一种非整合病毒递送系统,所述系统包括:
a.病毒运载体,其中所述病毒运载体包含缺陷型整合酶基因;
b.异源性病毒附加型DNA复制起点;
c.编码至少一个起始蛋白的序列,所述至少一个起始蛋白对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性,其中,表达所述编码至少一个起始蛋白的序列是诱导型的,所述至少一个起始蛋白对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性;和
d.至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。
2.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,所述病毒运载体是慢病毒。
3.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,所述异源性病毒附加型DNA复制起点来自乳头瘤病毒。
4.如权利要求3所述的非整合病毒递送系统,其中,所述异源性病毒附加型DNA复制起点来自人乳头瘤病毒或牛乳头瘤病毒。
5.如权利要求4所述的非整合病毒递送系统,其中,所述异源性病毒附加型DNA复制起点来自人乳头瘤病毒16型(HPV16)。
6.如权利要求5所述的非整合病毒递送系统,其中,所述异源性病毒附加型DNA复制起点来自HPV16的长控制区(LCR)。
7.如权利要求6所述的非整合病毒递送系统,其中,所述异源性病毒附加型DNA复制起点包含SEQ ID NO:1。
8.如权利要求6所述的非整合病毒递送系统,其中,所述异源性病毒附加型DNA复制起点包含SEQ ID NO:1的5′短截。
9.如权利要求6所述的非整合病毒递送系统,其中,所述异源性病毒附加型DNA复制起点包含SEQ ID NO:1的至少约200个核苷酸、或至少约300个核苷酸、或至少约400个核苷酸、或至少约500个核苷酸、或至少约600个核苷酸或至少约700个核苷酸的5′短截。
10.如权利要求6所述的非整合病毒递送系统,其中,所述异源性病毒附加型DNA复制起点包含与HPV16的LCR的Frag 1(SEQ ID NO:2)、Frag 2(SEQ ID NO:3)、Frag 3(SEQ ID NO:4)或Frag 4(SEQ ID NO:5)至少约80%的序列相同性、或至少约85%的序列相同性、或至少约90%的序列相同性、或至少约95%的序列相同性、或至少约98%的序列相同性。
11.如权利要求6所述的非整合病毒递送系统,其中,所述异源性病毒附加型DNA复制起点包含HPV16的LCR的Frag 1(SEQ ID NO:2)、Frag 2(SEQ ID NO:3)、Frag 3(SEQ ID NO:4)或Frag 4(SEQ ID NO:5)。
12.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的所述至少一个起始蛋白包含E1或其操作性片段。
13.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的所述至少一个起始蛋白包含E2或其操作性片段。
14.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的所述至少一个起始蛋白包含EBNA-1或其操作性片段。
15.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,所述系统包括至少两个起始蛋白,所述至少两个起始蛋白对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性。
16.如权利要求15所述的非整合病毒递送系统,其中,对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白是E1和E2或其操作性片段。
17.如权利要求1所述的非整合递送系统,其中,编码所述至少一个起始蛋白的序列存在于单个离散质粒或非整合病毒载体。
18.如权利要求1所述的非整合递送系统,其中,所述系统包括对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白,并且其中编码所述至少两个起始蛋白的序列存在于单个离散质粒或非整合病毒载体。
19.如权利要求1所述的非整合递送系统,其中,所述系统包括对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性的至少两个起始蛋白,其中第一起始蛋白的序列和第二起始蛋白的序列存在于非同一离散的质粒或非整合病毒载体。
20.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,所述至少一个基因产物包括抗体、抗体片段或生长因子。
21.如权利要求20所述的非整合病毒递送系统,其中,所述抗体包含抗-HER2抗体或其片段。
22.如权利要求20所述的非整合病毒递送系统,其中,所述生长因子包含血管内皮生长因子(VEGF)或其变体。
23.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,所述miRNA包含CCR5 miRNA。
24.一种药物组合物,其包含权利要求1所述的非整合病毒递送系统和至少一种药学上可接受的运载体。
25.一种在细胞中表达至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的方法,所述方法包括:
将所述细胞与有效量的非整合病毒递送系统接触,其中所述系统包括:
i.病毒运载体,其中所述病毒运载体包含缺陷型整合酶基因;
ii.异源性病毒附加型DNA复制起点;
iii.编码至少一个起始蛋白的序列,所述至少一个起始蛋白对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性,其中,表达所述编码至少一个起始蛋白的序列是诱导型的,所述至少一个起始蛋白对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性;和
iv.至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。
26.一种在有此需要的对象中表达至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的方法,所述方法包括:
向所述有此需要的对象给予有效量的非整合病毒递送系统,其中所述系统包括:
i.病毒运载体,其中所述病毒运载体包含缺陷型整合酶基因;
ii.异源性病毒附加型复制起点;
iii.编码至少一个起始蛋白的序列,所述至少一个起始蛋白对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性,其中,表达所述编码至少一个起始蛋白的序列是诱导型的,所述至少一个起始蛋白对所述异源性病毒附加型DNA复制起点具有特异性;和
iv.至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA。
27.如权利要求26所述的方法,其中,编码所述至少一个起始蛋白的序列存在于单个离散质粒,并且其中所述至少一个起始蛋白是E1或E2。
28.如权利要求27所述的方法,其还包括向有此需要的对象给予第一量的所述单个离散质粒,以引起所述至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA第一水平的表达。
29.如权利要求28所述的方法,其还包括向有此需要的对象给予第二量的所述单个离散质粒,以引起所述至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA第二水平的表达。
30.如权利要求29所述的方法,其中,当所述第二量低于所述第一量时,所述至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA表达的水平降低。
31.如权利要求29所述的方法,其中,当所述第二量高于所述第一量时,所述至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA表达的水平增加。
32.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,所述系统经优化以产生至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的低水平的基础表达,并且其中所述异源性病毒附加型DNA复制起点包含与HPV16的LCR的Frag 1(SEQ ID NO:2)或SEQ IDNO:1至少约80%的序列相同性,或至少约85%的序列相同性,或至少约90%的序列相同性,或至少约95%的序列相同性,或至少约98%的序列相同性。
33.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,所述系统经优化以产生至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的低水平的基础表达,并且其中所述异源性病毒附加型DNA复制起点包含HPV16的LCR的Frag 1(SEQ ID NO:2)或SEQ ID NO:1。
34.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,所述系统经优化以产生至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的中等水平的基础表达,并且其中所述异源性病毒附加型DNA复制起点包含与HPV16的LCR的Frag 2(SEQ ID NO:3)、Frag 3(SEQ ID NO:4)或Frag 4(SEQ ID NO:5)至少约80%的序列相同性,或至少约85%的序列相同性,或至少约90%的序列相同性,或至少约95%的序列相同性,或至少约98%的序列相同性。
35.如权利要求1所述的非整合病毒递送系统,其中,所述系统经优化以产生至少一个基因、基因产物、shRNA、siRNA、miRNA或感兴趣的其他RNA的中等水平的基础表达,并且其中所述异源性病毒附加型DNA复制起点包含HPV16的LCR的Frag 2(SEQ ID NO:3)、Frag 3(SEQID NO:4)或Frag 4(SEQ ID NO:5)。
36.一种选择经优化的非整合病毒递送系统的方法,所述方法包括:
选择基础表达的水平,其中,当选择水平X时,选择对应的Y,其中Y对应于选来纳入所述非整合病毒递送系统的异源性病毒附加型DNA复制起点,其中:
当X=载物的第一限定基础表达水平时;Y包含LCR(SEQ ID NO:1)或Frag 1(SEQ IDNO:2);和
当X=载物的第二限定基础表达水平时;Y包含HPV16的LCR的Frag 2(SEQ ID NO:3)、Frag 3(SEQ ID NO:4)或Frag 4(SEQ ID NO:5)。
37.如权利要求36所述的方法,其中,所述第一限定水平包括小于0.020个载物的附加型拷贝/细胞。
38.如权利要求36所述的方法,其中,所述第二限定水平包括0.020个或更多的载物的附加型拷贝/细胞。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112029803A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-04 | 西人马联合测控(泉州)科技有限公司 | 一种慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途 |
CN113046330A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-06-29 | 中吉智药(南京)生物技术有限公司 | 携带红系基因编辑系统的慢病毒及药物 |
CN114317610A (zh) * | 2022-01-27 | 2022-04-12 | 上海本导基因技术有限公司 | 一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体 |
CN114395586A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-04-26 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 非整合慢病毒载体系统在基因编辑器递送中的应用 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010045659A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | American Gene Technologies International Inc. | Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules |
US10137144B2 (en) | 2016-01-15 | 2018-11-27 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells |
WO2017123918A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-20 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositons for the activation of gamma-delta t-cells |
EP3413926A4 (en) | 2016-02-08 | 2019-10-09 | American Gene Technologies International, Inc. | HIV VACCINATION AND IMMUNOTHERAPY |
US10767183B2 (en) | 2016-03-09 | 2020-09-08 | American Gene Technologies International Inc. | Combination vectors and methods for treating cancer |
JP7173548B2 (ja) * | 2016-06-08 | 2022-11-16 | アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド | 非組み込みウイルス送達系およびその関連方法 |
WO2018009246A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv pre-immunization and immunotherapy |
EP3487507A4 (en) | 2016-07-21 | 2020-04-08 | American Gene Technologies International, Inc. | VIRAL VECTORS FOR THE TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE |
WO2018187231A2 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-11 | American Gene Technologies International Inc. | Compositions and methods for treating phenylketonuria |
WO2021178571A1 (en) * | 2020-03-03 | 2021-09-10 | American Gene Technologies International Inc. | On demand expression of exogenous factors in lymphocytes to treat hiv |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6635472B1 (en) * | 1997-08-15 | 2003-10-21 | Rubicon Laboratory, Inc. | Retrovirus and viral vectors |
US20040214158A1 (en) * | 2000-05-12 | 2004-10-28 | Neerja Sethi | Treatment of human papillomavirus (hpv)-infected cells |
US20070026521A1 (en) * | 2000-04-28 | 2007-02-01 | Genzyme Corporation | Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production |
WO2011071476A2 (en) * | 2008-11-14 | 2011-06-16 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for engineering cells |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU1124499A (en) * | 1997-10-28 | 1999-05-17 | Maxygen, Inc. | Human papillomavirus vectors |
PT1064393E (pt) | 1998-03-20 | 2005-04-29 | Univ Pennsylvania | Composicoes e metodos para a producao de virus adeno-associados recombinantes sem auxiliar |
DE69940521D1 (de) * | 1998-10-01 | 2009-04-16 | Univ Southern California | Retrovirales genübertragungssystem und entsprechendes verwendungverfahren |
US6156514A (en) * | 1998-12-03 | 2000-12-05 | Sunol Molecular Corporation | Methods for making recombinant cells |
WO2000072886A1 (en) * | 1999-05-26 | 2000-12-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Episomally replicating lentiviral vectors |
US20040161412A1 (en) * | 2002-08-22 | 2004-08-19 | The Cleveland Clinic Foundation | Cell-based VEGF delivery |
WO2005033282A2 (en) * | 2003-10-01 | 2005-04-14 | Pharmacia & Upjohn Company Llc | Polyamide compositions and therapeutic methods for treatment of human papilloma virus |
TWI556829B (zh) * | 2004-04-09 | 2016-11-11 | 艾伯維生物技術有限責任公司 | 用於治療TNFα相關失調症之多重可變劑量療法 |
CA2585523A1 (en) | 2004-11-02 | 2006-05-11 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. | Adenoviral amplicon and producer cells for the production of replication-defective adenoviral vectors, methods of preparation and use thereof |
US7790446B2 (en) * | 2005-02-11 | 2010-09-07 | Kosagen Cell Factory Oü | Vectors, cell lines and their use in obtaining extended episomal maintenance replication of hybrid plasmids and expression of gene products |
US8288094B2 (en) * | 2008-04-09 | 2012-10-16 | Institut Pasteur | APOBEC3 mediated DNA editing |
US8629334B2 (en) * | 2008-07-16 | 2014-01-14 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Viral-based transient-expression vector system for trees |
US8734795B2 (en) * | 2008-10-31 | 2014-05-27 | Biogen Idec Ma Inc. | Light targeting molecules and uses thereof |
JP6348064B2 (ja) * | 2011-11-22 | 2018-06-27 | ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア | 効率の高いトランスジーン送達のためのウイルスベクター |
WO2014016817A2 (en) * | 2012-07-17 | 2014-01-30 | Universite De Geneve | Nucleic acids for down-regulation of gene expression |
EP3307894A4 (en) * | 2015-06-10 | 2019-01-16 | American Gene Technologies International, Inc. | SYSTEM AND METHOD FOR NONINTEGRAL VIRAL OUTPUT AND METHOD FOR USE THEREOF |
JP7173548B2 (ja) * | 2016-06-08 | 2022-11-16 | アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド | 非組み込みウイルス送達系およびその関連方法 |
-
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6635472B1 (en) * | 1997-08-15 | 2003-10-21 | Rubicon Laboratory, Inc. | Retrovirus and viral vectors |
US20070026521A1 (en) * | 2000-04-28 | 2007-02-01 | Genzyme Corporation | Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production |
US20040214158A1 (en) * | 2000-05-12 | 2004-10-28 | Neerja Sethi | Treatment of human papillomavirus (hpv)-infected cells |
WO2011071476A2 (en) * | 2008-11-14 | 2011-06-16 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for engineering cells |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J VARGAS JR,等: "Conditionally replicating lentiviral-hybrid episomal vectors for suicide gene therapy", 《ANTIVIRAL RES》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112029803A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-04 | 西人马联合测控(泉州)科技有限公司 | 一种慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途 |
CN113046330A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-06-29 | 中吉智药(南京)生物技术有限公司 | 携带红系基因编辑系统的慢病毒及药物 |
CN113046330B (zh) * | 2021-03-23 | 2023-03-21 | 中吉智药(南京)生物技术有限公司 | 携带红系基因编辑系统的慢病毒及药物 |
CN114395586A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-04-26 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 非整合慢病毒载体系统在基因编辑器递送中的应用 |
CN114317610A (zh) * | 2022-01-27 | 2022-04-12 | 上海本导基因技术有限公司 | 一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体 |
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