KR102154225B1 - Ａａｖ ｓｆｌｔ-1을 사용한 ａｍｄ의 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가용성 Fms-관련 티로신 키나제-1(sFlt-1) 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 유효량의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 인간 대상체에게 망막하 투여함으로써 인간 대상체에서 AMD 등의 안구 신혈관형성을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

ＡＡＶ ＳＦＬＴ-1을 사용한 ＡＭＤ의 치료 {TREATMENT OF AMD USING AAV SFLT-1}
서열 목록
본 출원은 EFS-Web를 통해 ASCII 포맷으로 제출되고 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입되는 서열 목록을 함유한다. 2013년 5월 1일자로 작성된 상기 ASCII 카피는 43016-702.201_SL.txt로 명명되고, 크기는 84,779 바이트이다.
노화-관련 황반 변성(AMD)은 50세 이상의 인간에서 시력 비가역적 손상의 주요 원인 중의 하나이다. AMD는 임상적으로 "건성" 및 "습성"과 같은 2종류로 구분된다. 습성 형태의 AMD는 급속하게 발달하고 종종 실명을 일으킨다. 당해 질환의 병리학적 변화는 몇몇 시력 장해를 유발할 수 있다. AMD의 증상은, 이로써 제한되지 않지만, 황반 영역에서 망막 색소 상피 세포(RPE) 장애 및 맥락막 신혈관형성(CNV)을 포함할 수 있다. 파괴된 혈관으로부터 유체 누출, RPE 또는 신경 상피 박리 및 출현이 몇몇 경우에 발생할 수 있다. 다수의 세포 인자가 CNV 생성의 조절에 중요한 역활을 하는 것으로 밝혀졌고, 이들 중에는, 이로써 제한되지 않지만, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF 수용체(VEGFR), 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 저산소증 유도 인자(HIF), 안지오포이에틴(Ang) 및 기타 사이토킨, 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK) 등을 포함할 수 있다.
습성 AMD를 위한 현재 승인된 하나의 치료제는 루센티스(LucentisR)이다. 루센티스R은 항-혈관형성제이고, 모든 이소 형태의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 표적화한다. 임상 연구는, 위약 치료를 제공한 환자의 약 60%와 비교하여, 루센티스R 투여된 환자의 약 95%에서 개선된 또는 안정한 시력을 나타냈다. 루센티스R은 시력을 개선시키기 위해 최초 승인된 제제이지만, 이는 최적의 시각적 잇점을 위해 4주마다 유리체내 투여를 필요로 한다. 에일레아(EyleaR)는 습성 AMD를 치료하도록 승인된 또 다른 VEGF 억제제이다. 에일레아R은 또한 최적의 시각적 잇점을 위해 4 내지 8주마다 유리체내 주사를 필요로 한다. 유리체내 투여 경로는 감염성 안내염 및 망막 박리 등의 심각한 합병증의 위험을 증가시킬 수 있고, 이러한 누적 위험은 반복된 투여로 증가한다. 증가된 안내압, 외상성 백내장 및 망막 파열이 또한 보고되었다. 마지막으로, 안과의에 의해 전달되는 치료에 있어서, 치료 빈도는 일반적으로 환자, 의사 및 의료 시스템에 부담을 결정하고, 가능한 정도로 감소되어야 한다. AMD에 2차적인 CNV의 현재 이용가능한 치료의 제한은 요구된 고도의 치료 빈도 및 치료 과정의 침습성을 해소하는 대체 방법에 대한 당해 기술의 필요성을 생성했다. VEGF 상승을 수반하는 신혈관형성은 다른 안구 병변, 예를 들면, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 황반 부종(DME) 및 망막 정맥 폐색(RVO)을 또한 유도할 수 있다. 이들 질환은 망막 신혈관형성 및 시력 상실을 유도한다. VEGF 억제제, 예를 들면, 루센티스R은 습성 AMD과 마찬가지로 DME 및 RVO에서의 효능을 입증했고, 잇점을 유지하기 위해 빈번한 유리체내 투여를 필요로 한다.
미국 특허출원공개 제2006/0193830(2006.8.31. 공개)
본 발명은 인간 대상체에서 AMD의 습성 형태로 발견되는 것과 같은 CNV를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
한 가지 실시양태에서, 본 발명은, 약제학적 유효량의 VEGF 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 AMD의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 AMD를 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. 한 가지 실시양태에서, 약제학적 조성물은 재조합 바이러스를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, VEGF 억제제는 가용성 Fms-관련 티로신 키나제-1(sFLT-1) 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 본 발명은, 가용성 Fms-관련 티로신 키나제-1(sFLT-1) 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 유효량의 재조합 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물을 AMD의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 망막하 투여하는 것을 포함하는, AMD를 갖는 인간 대상체에서 CNV를 예방하는 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 바이러스는 아데노-관련 바이러스(AAV), 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 일본-리포좀 헤마글루티나틴 바이러스(HVJ) 복합체, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 및 HIV-기반 바이러스로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 또는 역방향 말단 반복체(ITR)은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 및 이의 하이브리드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로부터 선택된 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 인핸서를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 인트론 또는 키메라 인트론을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 SV40 폴리 A 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 인간 sFlt-1 단백질 또는 이의 작용성 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 암피실린 내성 마커 또는 비-암피실린 내성 마커를 포함하는 플라스미드로부터 생성된다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 등의 세균 조절 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 T7 DNA 폴리머라제 프로모터 등의 세균 조절 서열을 결여한다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 눈 세포에서 sFlt-1 단백질 또는 이의 작용성 단편의 선택적 발현을 유도할 수 있는 조절 핵산 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 약 1×106 내지 약 1×1015 재조합 바이러스 벡터 게놈, 약 1×107 내지 약 1×1014 재조합 바이러스 벡터 게놈, 약 1×108 내지 약 1×1013 재조합 바이러스 벡터 게놈, 약 1×109 내지 약 3×1012 재조합 바이러스 게놈 벡터, 약 1×1010 내지 약 3×1012 재조합 바이러스 벡터 게놈을 포함한다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 망막하 주사를 통해 투여된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 약제학적 유효량의 VEGF 억제제를 인간 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 VEGF에 대한 항체 또는 이의 작용성 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 라니비주맵을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 VEGF 억제제의 투여후 적어도 5, 6, 7 또는 8일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 VEGF 억제제를 투여하는 30, 60 또는 90일 이내에 투여된다.
일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 재조합 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물의 투여 전에 1회, 및 투여 후에 1 내지 2회 투여된다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 약제학적 조성물의 투여 전에 적어도 2회, 및 투여 후에 1 내지 2회 투여된다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 6 내지 7주 기간에 걸쳐 투여된다.
일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 예를 들면, 베바시주맵 또는 라니비주맵이다. 다른 실시양태에서, VEGF 억제제는 가용성 수용체, 융합 단백질 또는 이의 단편, 예를 들면, 아플리베르셉트 또는 sFLT01이다.
일부 실시양태에서, AMD는 습성 AMD이다.
일부 실시양태에서, AMD는 건성 AMD이다.
일부 실시양태에서, 인간 대상체는 습성 AMD의 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 인간 대상체는 초기 단계 습성 AMD의 증상을 나타낸다.
일부 실시양태에서, AMD의 치료를 위한 상이한 VEGF 억제제의 적어도 3, 5, 10, 15 또는 20회 치료가 상기 인간 대상체에게 사전 투여된다.
일부 실시양태에서, 최고 교정 시력(BCVA)는 라니비주맵을 사용한 상기 치료 후에 개선하지 않는다.
일부 실시양태에서, ETDRS(조기 치료 당뇨병성 망막증 연구) 문자에 의해 측정된 최고 교정 시력(BCVA)는 라니비주맵을 사용한 상기 치료 후에 1 라인 이상까지 개선한다.
일부 실시양태에서, 인간 대상체는 초기 단계 건성 AMD의 증상을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 치료는 적어도 반년마다의 빈도로 투여된다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는, 대상체가 연령 20, 40, 50, 55 또는 65세 이상인 경우, 상기 인간 대상체에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 투여는 중심와 외부의 부위에 대해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 투여는 중심 망막의 망막하 공간의 하나 이상의 세포에 대해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 투여는 외부 황반의 하나 이상의 세포에 대해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 투여는 내부 황반의 하나 이상의 세포에 대해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 투여는 망막 색소 상피 세포에 대해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 투여는 중심 망막 작용 또는 중심 망막 구조에 악영향을 미치지 않는다.
일부 실시양태에서, 투여는 인간 대상체에서 VEGF 억제제의 전신 수준을 증가시키지 않는다.
일부 실시양태에서, 투여는 인간 대상체에서 sFlt-1의 전신 수준을 증가시키지 않는다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 양쪽 눈에서 동시에 또는 순차로 수행된다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 한쪽 눈에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는, 다른쪽 눈이 AMD의 증상을 나타내는 경우, 한쪽 눈에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 페니실린에 내성이 있는 인간 대상체에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 페니실린에 감수성이 있는 인간 대상체에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 페니실린에 알레르기가 있는 인간 대상체에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 페니실린에 알레르기가 없는 인간 대상체에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는, 유리체의 염증이 투여 단계 후에 생체현미경검사(BE) 및 간접 검안경검사(IOE)에 의해 관찰되지 않도록 한다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 세포독성 T 세포를 유발하지 않는다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 기준선 범위보다 10% 미만 더 큰 세포독성 T 세포의 증가에 의해 세포독성 T 세포 반응 측정치를 유발하지 않는다.
일부 실시양태에서, T 세포는 투여 단계 후에 활성화된 작동체 표현형을 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, ETDRS(조기 치료 당뇨병성 망막증 연구) 문자에 의해 측정된 최고 교정 시력(BCVA)은 투여 단계 후에 1, 2, 3, 4 또는 5 라인 이상 개선된다.
일부 실시양태에서, 신혈관형성의 감소는 투여 단계 후에 형광안전 혈관조영(FA)을 사용하여 관찰된다.
일부 실시양태에서, 라니비주맵의 투여 빈도는 연간 12회 미만의 투여량으로 감소된다. 일부 실시양태에서, 아플리베르셉트의 투여 빈도는 연간 6회 미만의 투여량으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 라니비주맵 또는 아플리베르셉트 또는 기타 VEGF 억제제는 감소된 빈도로 투여되거나 더이상 투여되지 않는다.
일부 실시양태에서, 바이러스는 인간 sFLT-1 유전자 서열에 대하여 >90% 서열 상동성을 갖는 sFLT-1 유전자 또는 이의 작용성 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 투여된 바이러스는 sFLT-1 유전자, 유전자 변이체 또는 유전자 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 약제학적 조성물의 투여후 7, 14, 21 또는 30일에 인간 대상체의 눈물, 혈액, 타액 또는 뇨 샘플에서 검출되지 않는다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터의 존재는 qPC 또는 ELISA에 의해 검출된다.
일부 실시양태에서, 인간 대상체의 유리체 중의 sFLT-1 단백질 수준은 약제학적 조성물의 투여후 7, 14, 21 또는 30일에 약 500 내지 5,000 pg/ml, 약 600 내지 4,000 pg/ml, 약 800 내지 3,000 pg/ml, 약 900 내지 2,000 pg/ml 또는 약 1,000 내지 1,800 pg/ml이다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체의 유리체 중의 sFlt-1 단백질 수준(이는 또한 sFlt-1 단백질 농도로 불릴 수 있음)은 약제학적 조성물의 투여 후에 7, 14, 31, 30, 60, 90, 180, 270 및 365일에서 상승된다.
일부 실시양태에서, 인간 대상체는 적어도 2개월에 걸쳐 연속 안과 검사에 의해 평가된 임상적으로 유의한 망막 독성을 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, 표면상, 전방 세그먼트 또는 유리체 염증 징후는 적어도 2개월의 기간에 걸쳐 인간 대상체에서 존재하지 않는다.
일부 실시양태에서, 인간 대상체는 재조합 바이러스의 투여후 적어도 120일 동안 VEGF 억제제를 사용한 구제 치료를 필요로 하지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체는 재조합 바이러스의 투여후 적어도 180일 또는 적어도 210일 동안 VEGF 억제제를 사용한 구제 치료를 필요로 하지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체는 재조합 바이러스의 투여후 적어도 270일 동안 VEGF 억제제를 사용한 구제 치료를 필요로 하지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체는 재조합 바이러스의 투여후 적어도 365일 동안 VEGF 억제제를 사용한 구제 치료를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스의 상기 투여후 적어도 180일 또는 적어도 210일 동안 상기 인간 대상체에서 시력 상실, IOP 상승, 망막 박리 또는 임의의 안내 또는 전신 면역 반응의 증거는 없다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스의 투여후 적어도 365일 동안 상기 인간 대상체에서 시력 상실, IOP 상승, 망막 박리 또는 임의의 안내 또는 전신 면역 반응의 증거는 없다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 약 1×106 내지 약 1×1015 재조합 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물로서, 각각의 재조합 바이러스가 가용성 Fms-관련 티로신 키나제-1(sFlt-1) 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 치료를 필요로 인간 대상체에게 sFLT-1을 코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 유효량의 약제학적 조성물을 하나 이상의 망막하 부위에 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 안구 신혈관형성을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 노화-관련 황반 변성(AMD), 습성-AMD, 건성-AMD, 망막 신혈관형성, 맥락막 신혈관형성 및 당뇨병성 망막증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 상태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 인간 대상체를 제공한다. 일부 경우에, 인간 대상체는 증식성 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색증, 중심 망망 정맥 폐색증, 분지상 망막 정맥 폐색증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막 허혈, 허혈성 망막증 및 당뇨병성 망막 부종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 상태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 재조합 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 바이러스가 아데노-관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 일본-리포좀 헤마글루티나틴 바이러스(HVJ) 복합체, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 및 HIV-기반 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터에 작동적으로 연결되는 sFLT-1을 코딩하는 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, sFLT-1이 적어도 하나의 이량체화 도메인을 코딩하는 sFLT-1 핵산을 제공한다. 일부 경우에, sFLT-1 핵산은 원핵생물 조절 서열을 함유하지 않는다. 일부 경우에, sFLT-1 핵산은 원핵생물 조절 서열을 함유한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 플라스미드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 대상체에게 VEGF 억제제의 하나 이상의 치료의 투여를 제공한다. 일부 경우에서, VEGF 억제제는 약제학적 조성물의 투여의 30, 90 또는 180일 이내에 투여된다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물 및 VEGF 억제제는 적어도 24시간 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 55세 이상의 인간 대상체에게 투여된 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 중심와 외부에 약제학적 조성물을 투여하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물의 투여후 ETDRS(조기 치료 당뇨병성 망막증 연구) 문자에 의해 측정된 인간 대상체의 최고 교정 시력(BCVA)를 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 라인 개선시키는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물의 투여후 ETDRS(조기 치료 당뇨병성 망막증 연구) 문자에 의해 측정된 최고 교정 시력(BCVA)를 15 문자 미만 감소시키는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 한쪽 눈에 약제학적 조성물의 투여, 양쪽 눈에 순차로 약제학적 조성물의 투여 및 양쪽 눈에 동시에 약제학적 조성물의 투여로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상태하에 약제학적 조성물을 투여하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물의 투여후 형광안전 혈관조영(FA)에 의해 관찰된 신혈관형성의 감소를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 표면상, 전방 세그먼트 또는 유리체 염증 징후가 주사후 적어도 1주 동안 인간 대상체에서 존재하지 않는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 표면상, 전방 세그먼트 또는 유리체 염증 징후가 약제학적 조성물의 투여후 1주 또는 3, 6, 9 또는 12개월에 인간 대상체에서 존재하지 않는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 대상체가 약제학적 조성물의 투여후 적어도 30, 60, 90, 120, 180, 270 또는 365일 동안 구제 치료를 필요로 하지 않는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 대상체가 약제학적 조성물의 투여후 시력 상실, IOP 상승, 망막 박리, 안내 또는 전신 면역 반응을 경험하지 않는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 증가된 항-AAV 세포독성 T 세포 반응이 투여 단계 후에 측정되지 않는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물의 투여후 3, 7, 14, 21 또는 30일 동안 인간 대상체의 혈액, 타액 또는 뇨 샘플에서 바이러스가 검출되지 않는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 대상체에서 약제학적 조성물의 투여후 7, 14, 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270 또는 365일에서 인간 대상체의 유리체 중의 sFLT-1 단백질 수준이 약 500 내지 5,000 pg/ml인 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 대상체가 약제학적 조성물의 투여 전에 VEGF 억제제를 사용한 하나 이상의 치료를 제공받는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 VEGF 억제제를 사용한 치료에 내성이 있는 인간 대상체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물의 투여 전에 VEGF 억제제를 사전 제공받지 않은 인간 대상체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 대상체에서 3회 미만의 빈도로 약제학적 조성물을 투여하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 대상체에서 추가의 VEGF 억제제 치료의 투여 빈도를 감소시키기 위해 약제학적 조성물을 투여하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 약제학적 조성물의 투여후 7, 14, 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270 또는 365일에서 측정하는 경우, 인간 대상체의 유리체 중의 sFLT-1 단백질의 농도가 상승하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 약제학적 조성물의 투여의 1일 또는 1주 전 또는 이내에 제거된 유리체 겔을 갖는 인간 대상체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 20 게이지보다 작은 유리체절제 시스템을 사용하여 투여된 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 봉합을 필요로 하지 않는 유리체절제 시스템을 사용하여 투여된 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 39 게이지보다 작은 캐뉼라 팁을 사용하여 투여된 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 유리체 챔버 중의 기체/유체 교환을 수반하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체의 중심 망막 두께가 상기 약제를 사용한 치료 후에 12개월 이내에 50 마이크론, 100 마이크론 또는 250 마이크론 이상 증가하지 않는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 무처리 인간 대상체의 발병된 눈과 비교하여 인간 대상체의 발병된 눈에서 지형학적 위축이 진행하지 않는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 sFLT-1 도입유저자 서열에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 경우에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 300개 염기쌍 초과의 서열에 의해 분리된 프로모터 서열 및 sFLT-1 도입유전자 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 UTR 서열에 의해 분리된 프로모터 서열 및 sFLT-1 도입유전자 서열을 포함한다. 일부 경우에, UTR 서열은 적어도 10개 염기쌍을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 적어도 50개 염기쌍을 각각 포함하는 적어도 3개의 링커 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 sFLT-1 핵산이 적어도 하나의 이량체화 도메인을 코딩하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 340, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46 및 서열번호 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터 서열; 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107 및 서열번호 108로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VEGF 억제제를 코딩하는 서열; 서열번호 48, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118 및 서열번호 119로 이루어진 인트론 서열; 서열번호 91, 서열번호 2, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호100 및 서열번호 101로 이루어진 그룹으로부터 선택된 UTR 서열; 및 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종결 서열을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 1×106 내지 1×1015 벡터 게놈의 재조합 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물의 단위 용량으로서, 상기 재조합 바이러스가 프로모터에 작동적으로 연결된 sFLT-1을 코딩하는 핵산을 포함하는, 약제학적 조성물의 단위 용량을 제공한다. 일부 경우에, 약제학적 조성물의 단위 용량은 1×1010 내지 3×1012 벡터 게놈을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 세포에서 재조합 바이러스를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 sFLT-1 도입유전자 서열, ITR 사열 및 UTR 서열에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터 서열을 포함하는 핵산을 세포 내로 도입하는 단계; 및 재조합 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 일부 경우에, UTR 서열은 인간 UTR 서열이다. 일부 경우에, 핵산 서열은 베타-락탐 항생물질 내성 서열을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 재조합 바이러스는, 1×106의 감염 다중도(MOI)에서 HEK293 세포의 형질도입후 72시간에서 측정하는 경우, sFLT-1 단백질을 100 내지 10,000 pg/ml 범위로 생성한다. 일부 경우에, 재조합 바이러스는 인간 제대 혈관 내피(HUVEC) 세포의 증식을 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 재조합 바이러스 벡터를 생성하기 위한 세포로서, 상기 세포가 sFLT-1 도입유전자 서열, ITR 폴리뉴클레오티드 서열 및 UTR 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터 서열을 포함하는 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 인간에서 안구 신혈관형성의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 sFLT-1을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 사용이 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 상기 인간 대상체의 하나 이상의 망막하 부위에 유효량의 약제학적 조성물을 직접 투여하는 것을 포함하고, 상기 약제학적 조성물이 상기 핵산을 포함하는, 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 상기 sFLT-1이 VEGF의 억제제이고 안구 신혈관형성의 가능성의 상기 치료 또는 감소가 VEGF 억제의 결과로서 발생하는, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 약제학적 조성물이, 상기 투여 전에 상기 인간의 유리체 중의 sFLT-1 단백질 수준과 비교하여, 상기 인간 대상체에게 상기 약제학적 조성물의 투여후 적어도 72시간 후에 인간 대상체의 유리체 중의 sFLT-1 단백질 수준을 상승시킬 수 있는, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 상기 sFLT-1을 포함하는 핵산이 재조합 바이러스를 포함하고, 상기 바이러스가 아데노-관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 일본-리포좀의 헤마글루티나틴(HVJ) 복합체, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 및 HIV-기반 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, sFLT-1을 코딩하는 핵산이 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터에 작동적으로 연결되는, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 핵산이 바이러스에 의해 팩키징되거나 플라스미드 DNA인, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 상기 사용이 치료 또는 감소를 필요로 하는 인간 대상체에게 하나 이상의 추가의 VEGF 억제제의 투여를 추가로 포함하고, 임의로 상기 추가의 VEGF 억제제가 라니비주맵 또는 베바시주맵인, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 상기 사용이 적어도 50, 55 또는 65세 이상의 인간 대상체에게 상기 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 상기 사용이 상기 약제학적 조성물을 중시와 외부에 투여하는 것을 포함하는, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 치료를 필요로 하는 인간 대상체의 최고 교정 시력(BCVA)이 유효량의 약제학적 조성물의 투여후 ETDRS(조기 치료 당뇨병성 망막증 연구) 문자에 의해 측정된 바와 같이 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 라인 개선되는, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 약제학적 조성물의 투여가 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 3, 6, 9, 12, 18 또는 24개월에 적어도 1회의 빈도로 수행되는, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 약제학적 조성물의 투여가 인간 대상체에서 연간 3회 미만의 빈도로 수행되거나 인간 대상체에서 추가의 VEGF 억제제 치료의 투여 빈도를 감소시키는 빈도로 수행되는, 사용을 위한 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 약 1×106 내지 1×1015 또는 1×1010 내지 3×1012 벡터 게놈을 포함하는 약제학적 조성물의 단위 용량을 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 프로모터에 작동적으로 연결된 sFLT-1을 코딩하는 핵산, 이의 작용성 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 VEGF 억제제를 코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 유효량의 약제학적 조성물을 하나 이상의 망막하 부위에 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 안구 신혈관형성을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 항-VEGF 항체 또는 이의 작용성 단편이다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 가용성 수용체, 융합 단백질 또는 이의 작용성 단편이다.
참고에 의한 원용
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허원은 본 명세서에 각각의 개개 간행물, 특허 또는 특허원이 구체적이고 개별적으로 참조에 의해 도입되는 것으로 지시된 것과 동일한 정도로 참조로 본원에 도입된다.
본 바명의 신규한 특징은 첨부된 특허청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 잇점의 보다 양호한 이해는, 본 발명의 원리가 이용되는 예시적 실시양태을 기재하는 하기 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조함으로써 수득될 것이다.
도 1은 예시적 플라스미드의 개략도를 나타낸다.
도 2는 rAAV.sflt-1-형질도입된 세포로부터 sFLT-1의 발현, 분비 및 생물학적 활성을 나타낸다. (a) Ad.sFlt-1-형질도입된 293 세포(레인 1), rAAV.sFlt-1-형질도입된 D407 세포(레인 2), rAAV.sFlt-1-형질도입된 293 세포(레인 3) 및 AAV.gfp-형질도입된 D407 세포(레인 4)로부터 조절된 배지의 웨스턴 블롯 분석. (b) rAAV.sFlt-1-형질도입된 세포로부터 조절된 배지에 의한 VEGF-유도된 HUVEC 증식의 억제. HUVEC는 기아 배지(컬럼 1), 재조합 VEGF를 함유하는 배지(컬럼 2), VEGF 및 rAAV.sFlt-1-형질도입된 293 세포로부터 40 ㎕ 조절된 배지를 함유하는 배지(컬럼 3), VEGF 및 rAAV.sFlt-1-형질도입된 293 세포로부터 80 ㎕ 조절된 배지를 함유하는 배지(컬럼 4), 및 VEGF 및 rAAV.gfp-형질도입된 293 세포로부터 80 ㎕ 조절된 배지를 함유하는 배지(컬럼 5)에서 배양했다. (rAAV.sFlt-1 + VEGF 및 VEGF 단독 사이의 차이에 대한 *P < 0.02, **P <0.005).
도 3a는 rAAV.sFlt-1(Monkey 8514, 8530, 8523, 8524 및 999), rAAV.gfp(Monkey 8297 및 8532)을 갖슨 좌측 눈, 재조합 sFLT-1 단백질(Monkey 8294)을 갖는 양쪽 눈에 주사된 원숭이 및 대조군 비주사된 원숭이(대조군)의 유리체에서 인간 sFlt-1(hsFLT-1) 발현을 나타내는 그래프를 나타낸다. 대조군 및 원숭이 8294 및 999는 주사후 3개월에 안락사시키고, 원숭이 8524는 주사후 9개월에 안락사시키고, 원숭이 8297, 8532, 8514, 8530 및 8523은 주사후 12개월에 안락사시켰다. *는 rAAV.sFlt-1 주사된 눈에서 유의적으로 높은 sFLT-1 단백질 수준을 나타낸다(p < 0.05). 도 3b는 주사후 상이한 시간에서 rAAV.sFlt-1-주사된(999, 8524, 8523, 8530 및 8514), rAAV.gfp-주사된(8297 및 8532), 재조합 sFlt-1 단백질-주사된(8294) 및 비주사된(대조군) 원숭이에서 hsFLT-1 수준을 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 4는 마우스 눈에서 면역 세포 서브세트 모집단이다. 그래프는 주사후 상이한 시간에서 면역 세포 서브세트 모집단을 나타낸다.
도 5는 마우스 비장에서 면역 세포 서브세트 모집단이다. 그래프는 주사후 상이한 시간에서 면역 세포 서브세트 모집단을 나타낸다.
도 6은 주사후 상이한 시간에서 상이한 마우스의 CD4+ T 세포에서 Ki67 반응을 비교하는 도식을 나타낸다.
도 7a 내지 7d는 다양한 예시적 복제 기원 서열을 나타낸다.
도 8a 내지 8f는 다양한 예시적 프로모터의 서열을 나타낸다.
도 9a 내지 9c는 다양한 예시적 인트론, 폴리 A 서열 및 ITR 영역의 서열을 나타낸다.
도 9d 내지 9f는 다양한 예시적 링커 서열의 서열을 나타낸다.
도 9G 내지 9f는 다양한 예시적 UTR 서열의 서열을 나타낸다.
도 10a 내지 10c는 다양한 예시적 항-VEGF 단백질을 코딩하는 서열을 나타낸다.
도 11a는 sFLT-1의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 11b는 sFLT-1 도메인 2의 아미노산 서열, sFLT-1의 작용성 단편을 나타낸다. 도 11c는 sFLT-1 도메인 2를 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.
도 12a 내지 12b는 다양한 예시적 항생물질 내성 유전자의 서열을 나타낸다.
도 13은 하나의 예시적 조성물(rAAV.sFlt-1)의 PK를 나타내고, 여기서, 6 내지 8주에서 최적 항-VEGF 발현에 도달한다. RBZ는 라니비주맵 등과 같은 항-VEGF의 표준 치료이다. "RBZ 구제"는 구제 치료를 의미한다.
도 14는 환자의 안과적 평가를 나타낸다. 염증은 생체현미경검사(BE) 및 간접 검안경검사(IOE)에 의해 평가했다. Rnrem: 평범.
도 15a 및 15b는 시력 결과를 나타낸다.
도 16은 24시간 사전 루센티스 주사를 제공한 환자의 망막 두께의 측정치를 나타낸다.
도 17은 생체내분포: sFLT-1 서열에 대한 qPCR(검출된 카피 수)를 나타낸다.
도 18은 생체내분포: ELISA, 캡시드/mL의 AAV 역가로 측정한 AAV 캡시드를 나탄내다.
도 19는 ELISA로 측정한 sFLT-1의 생체내분포를 나타낸다. 인간 sFLT-1 농도(pg/mL)가 제시되어 있다.
도 20a 및 20b는 저용량 rAAV.sFlt-1(R1, R2, R4) 또는 고용량의 rAAV.sFlt-1(R5, R6 및 R8)로 투여된 환자의 OCT 평가치를 나타낸다.
도 21a 및 21b는 치료후 180일에서 rAAV.sFlt-1로 치료한 인간 대상체 대 무처리 대조군 환자의 시력 결과를 나타낸다.
도 22a 및 22b는 치료후 1년에서 rAAV.sFlt-1으로 치료한 인간 대상체 대 무처리 대조군 환자의 시력 결과를 나타낸다.
도 23은 rAAV.sFlt-1의 임상 연구에서 매주 루센티스 구제 주사(VEGF 억제제 재투여)를 제공한 인간 대상체의 표를 나타낸다.
도 24는 rAAV.sFlt-1의 임상 연구에서 rAAV.sFlt-1로 치료한 인간 대상체에 대한 매주 시력 및 SD-OCT 영상을 나타낸다.
도 25a 및 25b는 ELISA에 의해 검출된 바와 같이 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포에서 인간 sFlt-1 단백질의 생성에 대한 데이터를 나타낸다. rAAV.sFlt-1은 HEK293 세포 중의 플라스미드 형질감염을 사용하여 생성했다. 제2 작제물, rAAV(bv).sFlt-1은 Sf9 곤충 세포에서 재조합 바쿨로바이러스를 사용하여 생성했다. sFlt-1 단백질 농도는 다양한 MOI에서 72시간 후에 ELISA에 의해 측정했다.
본 발명은, 가용성 Fms-관련 티로신 키나제-1(sFlt-1) 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 유효량의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 인간 대상체에게 망막하 투여함으로써 인간 대상체에서 AMD 등의 안과 신혈관형성을 예방 또는 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 몇몇 실시양태은 설명을 위한 예시적 적용예를 참조로 하여 하기에 기재되어 있다. 다수의 특정의 상세, 관계 및 방법이 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 기재되어 있는 것으로 이해되어야 한다. 그러나, 관련 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 개시가 하나 이상의 특정의 상세 및 기타 방법 없이 실시될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 본 발명의 개시는, 몇몇 실행이 상이한 순서로 일어날 수 있고/있거나 다른 실행 또는 사건과 동시에 일어날 수 있기 때문에, 실행 또는 사건의 예시된 순서에 의해 제한되지 않는다. 추가로, 모든 예시된 실행 또는 사건이 본 개시에 따르는 방법을 실시하는데 요구되는 것은 아니다.
본 개시의 용어는 단지 특정 경우를 기재하기 위한 것이며, 본 개시의 조성물, 방법 및 조성물을 한정하는 것을 의도하는 것은 아니다.
본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 조성물 및 방법은, 달리 명시하지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학, 면역화학 및 안과 기술의 통상의 기술 및 기재를 사용할 수 있고, 이는 당해 기술분야에서 실시하는 숙련가의 기술내에 있다. 이러한 통상의 기술은 대상체에서 망막을 관찰 및 분석하는 방법 또는 시력, 재조합 바이러스의 클로닝 및 증식, 약제학적 조성물의 제형화 및 생화학적 정제 및 면역화학을 위한 방법을 포함한다. 적합한 기술의 구체적 예시는 본원에서 실시예를 참조로 하여 수득될 수 있다. 그러나, 동등한 통상의 공정은이 물론 또한 사용될 수 있다. 이러한 통상의 기술 및 기재는 표준 실험실 매뉴얼[참조: Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999); Weiner, et al, Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); and Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" IRL Press, London (1984); Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2000); and Berg et al, Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2002)]에서 발견할 수 있고, 이들 모두는 모든 목적을 위해 이의 전체가 참조로서 본원에 도입된다. 본 발명의 조성물, 연구 도구 및 방법을 기재하기에 앞서, 본 발명은 기재된 특정 방법, 조성물, 목적 및 용도로 한정되지 않고, 물론 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태을 기재하기 위한 것으로 이해되어야 하며, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의도하는 것은 아님을 이해해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나" (a, an) 및 "상기" (the)는, 당해 문맥이 달리 명시하지 않는 경우, 또한 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 용어 "포함하는", "포함한다", "갖는", "갖는다", "갖고" 또는 이의 변형어가 상세한 설명 및/또는 특허청구범위에 사용되는 정도로, 이러한 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
범위는 "약" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지로 본원에서 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 또 다른 경우는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 또 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게는, 값들이 선행구 "약"을 사용하여 근사치로서 표현되는 경우, 이는 특정 값이 또 다른 경우를 형성하는 것을 이해할 것이다. 또한, 각각의 당해 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여 및 다른 종점과 독립적으로 중요한 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 용어 "약"은 특정 사용의 문맥 내에서 언급된 수치로부터 15% ±인 범위를 지칭한다. 예를 들면, 약 10은 8.5 내지 11.5의 범위를 포함할 것이다. 용어 "약"은 또한 값 측정에서 통상의 오차 또는 부정확을 설명한다.
I. AMD
AMD는 50세 이상의 환자에서 실명의 주요 원인이고, 이는 황반에서 광수용체의 진행성 변성, 외부 망막 및 망막 색소 상피를 특징으로 한다. 고도 "습성" 형태(신혈관 또는 삼출성)의 AMD는 보다 덜 일반적이지만, 환자에서 중심 시력의 신속한 및 종종 실질적 상실을 빈번히 유발할 수 있다. 습성 형태의 AMD에서, 맥락막 신혈관형성은 망막 색소 상피항 및 이를 통해 성장할 수 있는 혈관의 네트워크 내로 형성 및 발달한다. 이는 망막하 공간으로 혈장 및/또는 출혈의 누출에 의해 달성되기 때문에, 이것이 황반에서 발생하는 경우에 중심 시력의 심각한 돌연의 상실이 있을 수 있다.
용어 "AMD"는, 달리 특정하지 않는 한, 건성 AMD 또는 습성 AMD일 수 있다. 본 발명은 AMD, 습성 AMD 및/또는 건성 AMD의 치료 또는 예방을 의도한다.
당해 기술분야에서 이미 공지된 바와 같이, AMD는 단일 원인이 없는 것으로 밝혀졌다. 이러한 고도의 복잡한 질환은, 이로써 제한되지 않지만, 연령, 유전적 요소, 환경 및 이들의 조합을 포함하는 변수의 기여로부터 발생할 수 있다. 인간에서, 예를 들면, 확립된 역학적 위험 인자는, 이로써 제한되지 않지만, 흡연, 식이, 여성, 백인 인종 및 AMD의 가족력을 포함할 수 있다. AMD는 50세 미만의 개체에서 희귀하기 때문에, 유일의 필요한 위험 인자는 AMD의 병인에서 정상 노화를 수반하는 세포 변화의 다수를 암시하는 연령이다.
AMD의 병인 복잡성은 유효한 치료, 예방 전략, 및 이를 연구하기 위한 양호한 동물 모델의 상대적 부족에 의해 반영된다. 당해 질환의 복잡성 및 불완전한 특성화에 기인하여, AMD는 동물에서 불완전하게 모델화되어 있다. 이는 동물 및 영장류 망막에서 해부학적 차이, 또한 질환 발달에 필요한 장기간 시간에 부분적으로 기인한다. 인간 분자 유전적 및 동물 연구로부터의 증거는, 정상 광수용체-RPE 생리학에 기여할 수 있는 메카니즘의 다수의 변화된 항상성이 당해 질환을 침전시킬 수 있는 개념을 뒷받침한다. 적어도 분자 수준에서, 당해 질환은 동물 모델에서 및, 일부 경우에, 유전자 결함이 인간에서 AMD의 주요 원인이 아닌 것에서 검토될 수 있다.
깊은 병리학적 분석 뿐만 아니라 이전의 유전학적 연구는, AMD를 위한 단순한 유전 패턴 및 하나의 병상이 다양한 AMD 동물 모델에 통상적이지 않음을 나타낸다. 비인간 영장류 모델은 마우스 또는 랫트 모델보다 인간에서 보다 유사한 CNV로 당해 기술분야에 공지되어 있지만, 망막의 해부학, 조직학 및 비인간 영장류의 유전학에서 기본적 차이는 상이한 종의 특이적 병태를 가져왔다.
추가로, 본원에서 기재된 바와 같이, 레이저 광응고는 동물 모델에서 CNV, 하나의 AMD 유사 증상을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 경우에, 레이저 치료는 브루쉬 막을 파괴하고, 맥락막에서 기원하는 섬유혈관 증식 반응을 유발한다. 이 반응은 후기 AMD에서 맥락막 신혈관형성을 모델링하는 기초이고, 레수스 및 사이노몰구스 마카쿠에서 개발되었다.
아르곤 레이저를 사용하여, 스폿을 작게 유지하고, 브루쉬 막을 파괴하기에 충분한 전력으로 유도했다. 이는 광응고의 시간에 버블로서 안저검사에 의해 가시화한다. 광응고는 맥락막 혈관의 혈전증을 유도하고, 이어서 48시간후 재내피화 및 매주 망막하 공간 내로 새로운 혈관의 성장을 수반한다. 새롭게 형성된 혈관은 보다 투과성이기 때문에, 신혈관 발달은 혈관 누출을 평가하기 위해 플루오레세인 혈관조영법으로 모니터링할 수 있다.
자발적 신혈관 퇴축(플루오레세인 누출 감소에 의해 나타남)은 대략 3 내지 7주에서 개시하고, 이어서 누출이 당해 부위에서 더이상 명백하지 않을 때까지 서서히 진행한다(대약 2 내지 13개월의 기간에 걸쳐).
불충분하게 신혈관형성된 반흔과 비교하여 새로운 혈관 성장의 정도는 모든 모델에서 변화할 수 있고, 종, 망막 중의 손상 위치 및 레이저 빔의 강도에 의해 영향을 받는다. 종마다의 치료의 차이에서 고유한 변동성은 하나의 동물 모델이 인간에서 AMD를 완전하게 재현하지 않는다는 사상을 추가로 뒷받침한다.
AMD를 위한 치료는 단백질 VEGF에 결합하는 앱타머, 항체 및 가용성 수용체 데코이의 이용성과 함께 과거 수년 동안 변경되었다. VEGF 단백질 또는 VEGF 리간드는 VEGF 수용체를 포함하는 세포 수용체에 대한 결합을 통해 새로운 혈관의 형성(즉, 신혈관형성)을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 항-VEGF 제제는 습성 AMD에서 발생하는 신혈관형성 및 혈관신생을 어느 정도 방지할 수 있다. 마쿠겐(MacugenR) 또는 루센티스(LucentisR) 또는 에일레아(EyleaR)(항-VEGF 제제)의 안내 주사는 고가이고, 대부분의 경우에, 치료는 에일레아R의 경우에 4 내지 6주 또는 8주마다 반복되어야 한다. 예를 들면, 루센티스는 약 1950달러/주사의 비용이 드는 VEGF 항체 단편이다. 매월, 아바스틴(VEGF 항체)는 승인 없이 사용되고, 에일레아(VEGF 트랩)은 약 1850달러/주사의 비용이 들고 격월로 투여된다. 이들 의약 모두는 약물동태 프로파일을 감소시키는 일반적 문제를 공유하고, 따라서 반복된 안구 주사를 필요로 한다.
실용상 경제적으로 실행가능한 보다 장기간 치료 전략이 당해 기술분야에서 요구되고 있다. 본 발명은 이들 필요성의 일부를 해소하기 위한 신규한 치료를 제공한다.
본 발명은 AMD 또는 관련된 신혈관 망막 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 인간 대상체의 망막에 임의의 적합한 벡터(예: 재조합 바이러스 시스템)에 의해 전달된 sFLT-1 등의 항-VEGF 분자를 제공한다. 일부 경우에, sFLT-1은 VEGF의 강력한 직접 결합 단백질일 수 있다. 일부 경우에, sFLT-1은 또한 VEGF 활성을 차단 또는 억제할 수 있다.
예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, sFLT-1(본원에서 추가로 기재된 바와 같이)은 Kd=10 pM으로 VEGF 단백질 이량체에 결합하는 것으로 관찰되었다.
본 발명은 또한 눈에의 rAAV 매개된 유전자 전달과 관련된 조성물 및 방법을 제공한다. 개 눈(>8세)에서 장기간 유전자 발현은 AAV 기반 시스템으로 관찰되었다. 망막에서 sFLT-1 mRNA 발현은 적어도 18개월 동안 유지된다. 레버 선천성 아마로수시스에 대한 3명의 인간 시험을 수행했고, LCA 등의 망막 변성 질환의 맥락에서 AAV 기반 전달 시스템의 안전성을 입증했다.
II. VEGF 및 Fms-관련 티로신 키나제-1(sFLT-1) 단백질
A. VEGF
혈관 내피 성장 인자(본원에서 "VEGF" 또는 "VEGF 리간드"로서 지칭됨)는 생리학적 혈관 형형성에서 중요한 역할을 하는 강력한 내피 세포 특이적 미토겐이다. 일부 경우에서, VEGF 활성은 세포에서 하나 이상의 VEGF 수용체에 대한 VEGF 리간드 결합의 결과이다. VEGF 수용체에 대한 VEGF 리간드의 결합은, 이로써 제한되지 않지만, 조직에서 혈관신생을 포함하는, 다수의 하류 세포 및 생화학적 효과를 가질 수 있다. VEGF는, 암, 허혈 및 염증과 관련된 것들을 포함하는, 혈관신생 또는 신혈관 질환의 실질적으로 모든 종류에 연관되어 있다. 추가로, VEGF는, 이로써 제한되지 않지만, 허혈성 망막증, 안내 신혈관형성, 노화-관련 황반 변성(AMD), 습성-AMD, 건성-AMD, 망막 신혈관형성, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막 허열증, 당뇨병성 망막 부종, 증식성 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색증, 중심 망막 정맥 폐색증, 분지상 망막 정맥 폐색증을 포함하는 안 질환에 연관되어 있다. 추가로, 본원에 기재된 본 발명의 조성물 및 방법을 포함하는 항-VEGF 치료는 본원에 기재된 하나 이상의 이들 질환의 치료에 사용될 수 있다.
최근의 데이터는 VEGF가 습성 형태의 AMD의 병인에서 주요 혈관신생 성장 인자인 것을 시사한다.
VEGF, 46-kDa 호모이량체성 글리코펩티드는, 이로써 제한되지 않지만, 색소 상피 세포, 주피 세포, 혈관 내피 세포, 신경교 세포 및 신경절 세포를 포함하는 몇몇 상이한 안구 세포형에 의해 발현된다. 몇몇 경우에, VEGF는 망막 발달 동안에 특이적 공간 및 일시적 패턴으로 발현된다. 몇몇 경우에, 인간 이소형의 VEGF는 단량체당 206, 189, 183, 165, 148, 145 및 121개 아미노산의 단백질을 포함할 수 있지만, 우세한 인간 VEGF 이소형은, 이로써 제한되지 않지만, VEGF121, VEGF 165, VEGF189 및 VEGF206을 포함한다. 이들 단백질은 VEGF mRNA의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되고, 헤파린 및 특이적 VEGF 수용체 또는 공수용체(뉴로필린)에 결합하는 이들의 능력이 상이하다. VEGF 유전자의 엑손 1 내지 5에 의해 코딩된 도메인은 공지된 VEGF 수용체 KDR/FLK-1 및 FLT-1의 인식에 요구되는 정보를 하유한다. 이러한 도메인은 모든 VEGF 이소형에 존재한다. VEGF는 고친화성 수용체 티로신 키나제인 이들 수용체를 통해 작용하여, 내피 세포 증식, 이동 및 증가된 혈관투과성을 유도한다.
VEGF는 혈관신생의 복잡한 과정에 관여하는 몇몇 인자 중의 하나이고, 혈관 내피 세포에 대한 매우 높은 특이성을 갖는다. VEGF는 배 생성, 골격 성장 및 생식 기능 등의 공정 동안 생리학적 혈관신생의 조절인자이지만, 이는 또한 암, 태반 장애 및 기타 상태 등의 질환과 연관된 병리학적 혈관신생에 관여되어 있다. VEGF의 장재적 생리학적 효과는 특정한 fms-유사 막 관통 수용체, FLT-1 및 FLK-1/KDR에 의해 매개될 수 있다. 일부 경우에, VEGF의 이들 천연 발생 결합 파트너는 VEGF 수용체에 대한 VEGF의 결합에 영향을 미치고, 이에 의해 VEGF 수용체의 활성화 및 후속의 하류 경로를 조절할 수 있다.
암과 관련된 바와 같이, VEGF에 대한 인간화된 모노클로날 항체(rhuMab VEGF), 항-VEGFR-2 항체, 소분자 억제 VEGFR-2 신호 전달 및 가용성 VEGF 수용체를 포함하는 몇명 VEGF 억제제는 몇몇 치료학적 특성을 나타냈다.
당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색 또는 노화 관련 황반 변성 등의 안내 신혈관 질환과 관련된 바와 같이, 일부 VEGF 길항제는 빈번한 투여 필요성에도 불구하고 치료 효과를 나타냈다.
B. 항-VEGF
본 발명의 재조합 바이러스는, 이로써 제한되지 않지만, 미국 특허 제5,712,380호, 제5,861,484호 및 제7,071,159호에 개시된 VEGF-결합 단백질 또는 이의 작용성 단편, 및 미국 특허 제7,635,474호에 개시된 VEGF-결합 융합 단백질을 포함하는 항-VEGF 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 항-VEGF 단백질은 또한 본원에 기재된 sFLT-1 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 바이러스 또는 플라스미드는 미국 특허 제5,861,484호에 기재된 천연 발생 단백질 sFlt-1을 포함하는 항-VEGF 단백질을 코딩하는 서열 및 서열번호 109에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이로써 제한되지 않지만, sFlt-1 도메인 2의 서열 또는 서열번호 121에 기재된 것들 뿐만 아니라, 관련 작제물, 예를 들면, 미국 특허 제7,635,474호에 개시된 VEGF-결합 융합 단백질을 포함하는 이의 작용성 단편을 포함한다. 항-VEGF 단백질은 또한 본원에 기재된 sFLT-1 단백질을 포함할 수 있다. 이들 서열은 유전자 코드, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 이해되는 표준 기술을 사용하여 이러한 서열을 코딩하는 DNA로부터 발현될 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 항-VEGF 단백질 서열은 다수의 상이한 DNA 서열로부터 용이하게 발현될 수 있다.
본원에서 "sFlt-1 단백질"은, sFlt-1 단백질 또는 폴리펩티드가 VEGF 및/또는 VEGF 수용체에 결합하도록, 천연 발생 인간 sFLT-1 서열과 적어도 90% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열 또는 이의 작용성 단편을 지칭한다. 상동성은 2개 서열 사이의 정렬 잔기의 % 보존을 지칭하고, 예를 들면, 천연 발생 인간 sFLT-1 단백질은, 이로써 제한되지 않지만, 작용성 단편, 삽입체, 결실체, 치환체, 슈도단편, 슈도유전자, 스플라이스 변이체 또는 인위적으로 최적화된 서열을 포함하는 서열을 포함하는 sFLT-1의 임의의 적합한 변이체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, "sFLT-1 단백질"은 천연 발생 인간 sFLT-1 단백질 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 상동성일 수 있다. 일부 경우에, "sFLT-1 단백질"은 천연 발생 인간 sFLT-1 단백질 서열과 최대 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 상동성일 수 있다. 일부 경우에, "sFLT-1 단백질"은 천연 발생 sFLT-1 단백질 배열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 공간적 상동성일 수 있다. 일부 경우에, "sFLT-1 단백질"은 천연 발생 인간 sFLT-1 단백질 배열과 최대 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 공간적 상동성일 수 있다.
추가로, 가용성 절단된 형태의 VEGF 수용체 FLT-1, sFLT-1은 VEGF의 유일하게 공지된 내인성 특이적 억제제이다. 사실상, 이는 선택적 mRNA 스플라이싱에 의해 생성되고, 막-근위 면역글로불린-유사 도메인, 막관통 영역 및 세포내 티로신-키나제 도메인을 결여한다. 구조적으로, FLT-1 및 sFLT-1 단백질은 둘 다 복수의 작용성 도메인을 포함할 수 있다. 일부 변이체에서, FLT 및 sFLT 단백질은 일반적으로 6개의 상호연결된 도메인; 단백질의 이량체화에 관여하는 3개 도메인 및 VEGF 등의 리간드의 결합에 관여하는 3개 도메인을 공유한다.
sFLT-1은 FLT-1의 가용성 절단된 형태이고, 내인적으로 발현된다. 본원에 기재된 바와 같이, "가용성" FLT-1 또는 sFLT-1은 세포 막으로 한정되지 않는 FLT-1을 지칭한다. 비결합된 sFLT-1은 세포외 공간 또는 용액에서 자유롭게 확산할 수 있다.
sFLT-1은 VEGF의 유일하게 공지된 내인성 특이적 억제제이다. 이 상호작용은 특이적이고, 100배 초과의 비표지된 VEGF와 경쟁할 수 있다. 일부 경우에, sFLT-1의 혈관신생 억제 활성은 2개 메카니즘: i) 고친화성으로 결합하는 VEGF의 격리 및 ii) VEGF 수용체 FLTt-1 및 FLK-1/KDR의 막-관통 이소형을 사용한 불활성 헤테로이량체의 형성에 의한 VEGF의 억제의 결과일 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 시험관내 결합 분석은 sFLT-1이 고친화성으로 VEGF에 결합하고 또한 인간 제대 정맥 내피 세포의 VEGF 유래된 증식을 억제할 수 있음을 나타낸다. 암에 대한 동물 모델에서, sFLT-1 억제제는 종양 성장을 억제한다. 일부 경우에, sFLT-1은, 세포외 공간에서 과다한 VEGF가 VEGF 수용체에 대한 결합 및 후속의 불활성화를 방지할 수 있기 때문에, 반화학양론적 또는 우세한 네가티브 방식으로 작용할 수 있다. sFLT-1의 이들 특성은 본원에서 이의 전체가 참조로서 도입되는 문헌[참조: Kendall and Thomas, 1993; Proc Natl Acad Sci. 90: 10705-10709]에 기재되어 있다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, sFLT-1의 작용성 단편은 전장 단백질 대신에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, VEGF 결합 도메인(도메인 2), 또는 대안적으로 sFLT-1의 도메인 2 + sFLT1, KDR 또는 또 다른 계열 구성원으로부터의 도메인 3을 사용하여 VEGF를 결합시키고 불활성화시킬 수 있다. 이러한 작용성 단편은 본원에서 이의 전체로 참조로서 도입되는 문헌[참조: Wiesmann et al., 1997; Cell, 91: 695-704]에 기재되어 있다. 용어 "sFLT-1" 및 "sFLT-1의 작용성 단편"은 동등하고 상호 교환적으로 사용된다.
III. 벡터 및 재조합 바이러스
본 발명의 조성물 및 방법은 이를 필요로 하는 인간 대상체 또는 환자의 세포에 항-VEGF를 코딩하는 핵산(예: sFLT-1 단백질)의 전달을 제공한다. 일부 경우에, 핵산의 전달은 유전자 치료로서 지칭될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 항-VEGF 핵산(예: sFLT-1)의 전달를 위한 임의의 적합한 방법을 제공한다. 일부 경우에, 핵산의 전달은 적합한 "벡터"를 사용하여 수행할 수 있다(종종 "유전자 전달" 또는 "유전자 전이 비이클"로서 지칭됨). 벡터, 전달 비히클, 유전자 전달 비히클 또는 유전자 전이 비히클은 표적 세포로 전달되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 적접한 거대분자 또는 분자 복합체를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 표적 세포는 핵산 또는 유전자가 전달되는 임의의 세포일 수 있다. 전달되는 폴리뉴클레오티드는 sFLT-1 유전자 등과 같이 유전자 치료에서 목적하는 코딩 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, 적합한 벡터는, 이로써 제한되지 않지만, 표적 세포로 폴리뉴클레오티드의 전달을 매개할 수 있는 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 레트로바이러스, 리포좀, 기타 지질-함유 복합체 및 기타 거대분자 복합체를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 벡터는 유기 또는 무기 분자일 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 소분자(즉, <5 kD) 또는 거대분자(즉, >5 kD)일 수 있다. 예를 들면, 벡터는, 이로써 제한되지 않지만, 불활성의 비생물학적 활성 분자, 예를 들면, 금속 입자를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 금 입자일 수 있다.
일부 경우에, 벡터는 생물학적 활성 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 벡터는 덴드리머 등의 중합된 거대분자를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 벡터는 하나 이상의 핵산을 도입한 재조합 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 핵산은 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 sFLT-1의 발현을 위한 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 일부 경우에, RNA 핵산은, 이로써 제한되지 않지만, 목적하는 유전자의 전사체(예: sFLT-1), 인트론, 비해독된 영역, 종결 서열 등을 포함한다. 일부 경우에, DNA 핵산은, 이로써 제한되지 않지만, 하이브리드 프로모터 유전자 서열, 강력한 구조 프로모터 서열, 목적하는 유전자(예: sFLT-1), 비해독된 영역, 종결 서열 등의 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, DNA 및 RNA의 조합이 사용될 수 있다.
본원의 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "발현 작제물"은, 핵산 코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 임의 형태의 유전자 작제물을 포함하는 것을 의미한다. 전사물은 단백질로 해독될 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현은 유전자의 전사 및 유전자 생성물로의 mRNA의 해독 둘 다를 포함한다. 다른 실시양태에서, 발현은 단지 목적하는 유전자를 코딩하는 핵산의 전사를 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 본 발명은 sFLT-1의 발현을 매개하는 벡터로서 아데노-관련 바이러스(rAAV) 등의 재조합 바이러스를 제공한다.
일부 경우에, 본 발명의 바이러스 벡터는 pfu(플라크 형성 단위)로서 측정될 수 있다. 일부 경우에, 재조합 바이러스 또는 본 발명의 조성물 및 방법의 바이러스 벡터의 pfu는 약 108 내지 약 5×1010 pfu일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 적어도 약 1×108, 2×108, 3×108, 4×l08, 5×l08, 6×l08, 7×l08, 8×l08, 9×l08, 1×109, 2×l09, 3×l09, 4×l09, 5×l09, 6×l09, 7×l09, 8×l09, 9×l09, 1×1010, 2×l010, 3×l010, 4×l010 및 5×l010 pfu이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 최대 약 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×l08, 6×xl08, 7×l08, 8×l08, 9×l08, 1×109, 2×l09, 3×l09, 4×l09, 5×l09, 6×l09, 7×l09, 8×l09, 9×l09, 1×1010, 2×l010, 3×l010, 4×l010 및 5×l010 pfu이다.
일부 경우에, 본 발명의 바이러스 벡터는 벡터 게놈으로서 측정될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 1×l010 내지 3×l012 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 1×l08 내지 3×1014 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 적어도 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×1O4, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 1×108 내지 3×1014 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 최대 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 벡터 게놈이다.
일부 경우에, 본 발명의 바이러스 벡터는 감염 다중도(MOI)를 사용하여 측정할 수 있다. 일부 경우에, MOI는, 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비율 또는 배수를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×106일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×105 내지 1×107일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×104 내지 1×108일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 적어도 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 1×108 내지 3×1014 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 최대 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 MOI이다.
일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스의 사용 없이(즉, 비바이러스 벡터) 전달될 수 있고, 핵산의 양으로서 측정될 수 있다. 일반적으로, 핵산의 임의의 적합한 양은 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 적어도 약 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍, 200 ㎍, 300 ㎍, 400 ㎍, 500 ㎍, 600 ㎍, 700 ㎍, 800 ㎍, 900 ㎍, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g 또는 5g일 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 최대 약 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍, 200 ㎍, 300 ㎍, 400 ㎍, 500 ㎍, 600 ㎍, 700 ㎍, 800 ㎍, 900 ㎍, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g 또는 5 g일 수 있다.
일부 실시양태에서, 자가-상보성 벡터(sc)가 사용될 수 있다. 자가-상보성 AAV 벡터의 사용은 바이러스 제2-쇄 DNA 합성의 필요성을 회피할 수 있고, 본원에서 참조로서 도입된 문헌[참조:Wu, Hum Gene Ther. 2007, 18(2): 171-82]에 의해 제공된 바와 같이 도입유전자 단백질의 보다 큰 발현 속도를 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 몇몇 AAV 벡터는 가장 최적 혈청형, 프로모터 및 도입유전자의 선택을 가능하게 하기 위해 생성될 수 있다.
일부 경우에, 벡터는 표적화된 벡터, 특히 암 세포 또는 종양 세포 또는 눈 세포 등의 특정한 세포에 선택적으로 결합하는 표적화 벡터일 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 바이러스 벡터는 표적 세포에 저독성을 나타내고 세포 특이적 방식으로 치료학적으로 유용한 양의 항-VEGF 단백질의 생성을 유도하는 것들을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은, 이로써 제한되지 않지만, 아데노-관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 일본-리포좀 헤마글루티나틴 바이러스(HVJ) 복합체, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 및 HIV-기반 바이러스 중의 적어도 하나의 사용을 포함하는 임의의 적합한 바이러스 핵산 전달 시스템을 제공한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 강력한 진핵생물 프로모터, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 포함한다.
일반적으로, 임의의 적합한 바이러스 벡터는 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 최적화되도록 조작될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스(Ad) 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 인간 및 비인간 바이러스 벡터 둘 다를 사용할 수 있고, 재조합 바이러스 벡터는 인간에서 복제-결함일 수 있도록 변경될 수 있다. 벡터가 아데노바이러스인 경우, 당해 벡터는 항-VEGF 단백질을 코딩하는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 인간에서 복제-결함이다.
2개 바이러스 벡터 시스템의 유리한 특성을 조합하기 위해, 하이브리드 바이러스 벡터를 사용하여, sFLT-1 단백질을 코딩하는 핵산을 표적 세포 또는 조직에 전달할 수 있다. 하이브리드 벡터를 작제하는 표준 기술은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이러한 기술은, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook, et al., In Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y] 또는 재조합 DNA 기술을 언급하는 임의 수의 실험실 매뉴얼에서 발견할 수 있다. AAV 및 아데노바이러스 ITR의 조합을 함유하는 아데노바이러스 캡시드 중의 이본쇄 AAV 게놈은 세포를 형질도입하기 위해 사용할 수 있다. 또 다른 변형태에서, AAV 벡터는 "거트레스(gutless)", "헬퍼-의존성" 또는 "고-성능" 아데노바이러스 벡터 내로 위치시킬 수 있다. 아데노바이러스/AAV 하이브리드 벡터는 문헌[참조: Lieber et al, J. Virol. 73:9314-9324, 1999]에 논의되어 있다. 레트로바이러스/아데노바이러스 하이브리드 벡터는 문헌[참조: Zheng et al, Nature Biotechnol. 18: 176-186, 2000]에 논의되어 있다.
아데노바이러스에 함유된 레트로바이러스 게놈은 표적 세포 게놈 내에서 통합되어 안정한 유전자 발현을 수행할 수 있다.
복제-결함 재조합 아데노바이러스 벡터는 공지된 기술에 따라 생성될 수 있다[참조: Quantin, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet, et al. , J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992); and Rosenfeld, et al, Cell, 68: 143-155 (1992)].
추가의 바람직한 벡터는, 이로써 제한되지 않지만, 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 접합체를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 및 HIV-기반 바이러스를 포함한다. 일부 경우에, HIV-기반 바이러스 벡터가 사용될 수 있고, 여기서 HIV-기반 바이러스 벡터는 적어도 2개의 벡터를 포함하고, 여기서 gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈으로부터 유래하고, env 유전자는 또 다른 바이러스로부터 유래한다. DNA 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이들 벡터는, 본원에 참조로서 도입된, 폭스 벡터, 예를 들면, 오르토폭스 또는 아비폭스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 예를 들면, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스(HSV) 벡터[참조: Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al, in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al, Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603 (1993); Geller, A.I., et al, Proc Natl. Acad. Sci USA: 87: 1149 (1990)], 아데노바이러스 벡터[참조: LeGal LaSalle et al, Science, 259:988 (1993); Davidson, et al, Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)] 및 아데노-관련 바이러스 벡터[참조: Kaplitt, M.G., et al, Nat. Genet. 8:148 (1994)]를 포함한다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 기타 바이러스 벡터는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)-기반 벡터를 포함한다. 하나 이상의 즉시 초기 유전자(IE)가 결실된 HSV 벡터는, 이들이 일반적으로 비-세포독성이고 표적 세포에서 잠복성과 유사한 상태로 지속하고 효율적 표적 세포 형질도입을 제공하기 때문에 유리하다. 재조합 HSV 벡터는 대략 30 kb의 이종성 핵산을 도입할 수 있다.
레트로바이러스, 예를 들면, C-형태 레트로바이러스 및 렌티바이러스는 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터는 본원에서 참조로서 도입된 문헌[참조: Hu and Pathak, Pharmacol. Rev. 52:493511, 2000 and Fong et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17: 1-60, 2000]에 의해 제공된 마우스 백혈병 바이러스(MLV)에 기반할 수 있다. MLV-기반 벡터는 바이러스 유전자 대신에 최대 8 kb의 이종성(치료) DNA를 함유할 수 있다. 이종성 DNA는 조직-특이적 프로모터 및 항-VEGF 단백질 핵산을 포함할 수 있다. 신생물 세포로의 전달 방법에서, 이는 또한 조직 특이적 수용체에 대한 리간드를 코딩할 수 있다.
추가의 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있고, 이는, 이로써 제한되지 않지만, 본원에서 참조로서 도입된 문헌[참조: Vigna and Naldini, J. Gene Med. 5:308-316, 2000 and Miyoshi et al., J. Virol. 72:8150-8157, 1998]에 의해 제공된 바와 같이 인간 면역결핍(HIV)-기반 벡터를 포함하는 복제-결함 렌티바이러스-기반 벡터를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 이들이 활성적으로 분화 및 미분화 세포 둘 다를 감염시킬 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 이들은 또한 인간 상피 세포의 형질도입에 고도로 효율적일 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 렌티바이러스 벡터는 인간 및 비-인간(SIV 포함) 렌티바이러스로부터 유래할 수 있다. 렌티바이러스 벡터의 예는 항-VEGF 단백질 유전자에 작동적으로 연결된 조직-특이적 프로모터 뿐만 아니라 벡터 증식에 필요한 핵산 서열을 포함한다. 핵산 서열은 바이러스 LTR, 프라이머 결합 부위, 폴리퓨린 트랙, att 부위 및 캡신화 부위를 포함할 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 임의의 적합한 렌티바이러스 캡시드에 팩키징될 수 있다. 상이한 바이러스로부터 한 입자의 또 다른 입자로의 치환은 "슈도타이핑"으로 지칭된다. 벡터 캡시드는, 마우스 백혈병 바이러스(MLV) 또는 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 포함하는 다른 바이러스로부터 바이러스 외피 단백질을 함유할 수 있다. VSV G-단백질의 사용은 높은 벡터 역가를 생성하고, 벡터 바이러스 입자의 보다 큰 안정성을 제공한다.
알파바이러스-기반 벡터, 예를 들면, 셈리키 삼림 바이러스(SFV) 및 신드비스 바이러스(SIN)으로부터 제조된 것들이 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 알파바이러스의 사용은 본원에서 참조로서 도입된 문헌[참조: Lundstrom, K., Intervirology 43:247-257, 2000 and Perri et al, Journal of Virology 74:9802-9807, 2000]에 기재되어 있다.
재조합 복제-결함 알파바이러스 벡터는, 이들이 고도의 이종성(치료) 유전자 발현을 가능하게 하고 광범위한 표적 세포 범위를 감염시킬 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 알파바이러스 리플리콘은, 동족의 결합 파트너를 발현하는 표적 세포에 대한 선택적 결합을 가능하게 하는 작용성 이종성 리간드 또는 결합 도메인을 이들의 비리온 표면 상에서 발현시킴으로써 특이적 세포 유형으로 표적화될 수 있다. 알파바이러스 리플리콘은 잠복성 및 따라서 표적 세포에서 장기간 이종성 핵산 발현을 확립할 수 있다. 리플리콘은 또한 표적 세포에서 일시적 이종성 핵산 발현을 나타낼 수 있다.
폭스 바이러스 벡터는 유전자를 세포의 세포질에 도입할 수 있다. 아비폭스 바이러스 벡터는 유전자 또는 핵산의 단기간 발현만을 제공할 수 있다. 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 방러스 벡터 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 벡터는 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스보다 단기간 발현(예: 약 1개월 미만)을 제공할 수 있고, 일부 실시양태에서, 보다 긴 발현을 나타낼 수 있다. 선택된 특정한 벡터는 표적 세포 및 치료되는 상태에 의존적일 수 있다.
아데노-관련 바이러스(AAV)는 소형의 비-외피성 일본쇄 DNA 바이러스이다. 이들은 비-병원성 인간 파르보바이러스이고, 복제를 위해, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스 및 DMV를 포함하는 헬퍼 바이러스에 의존적일 수 있다. 야생형(wt) AAV에 대한 노출은 임의의 인간 병태와 관련이 없거나 이를 유발하는 것으로 알려져 있지 않고, 아데노바이러스 감염과 관련하여 인생의 최초 10년에서 통상 발생하는 일반적 모집단에서 일반적이다.
본원에 기재된 바와 같이, "AAV"는 아데노-관련 바이러스를 지칭하고, "rAAV"는 재조합 아데노-관련 바이러스를 지칭한다.
일부 경우에, 야생형 AAV는 rep 및 cap 유전자를 코딩한다. rep 유전자는 바이러스 복제에 요구되고, cap 유전자를 캡시드 단백질의 합성에 요구된다. 대체 번역 개시 및 스플라이싱 부위의 조합을 통해, 작은 게놈은 4개의 rep 및 3개의 cap 유전자 생성물을 발현시킬 수 있다. 역방향 말단 반복체(게놈에 인접하는 145 bp ITR)에서 rep 유전자 생성물 및 서열은 이러한 공정에 중요할 수 있다. 현재까지, AAV의 11개 혈청형이 단리되어 있다. AAV2는 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 적합한 AAV 혈청형의 사용을 제공한다. 일부 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV2.5, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 및 이의 하이브리드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, rAAV.sFlt-1으로 명명되는 인간 형태의 절단된 가용성 VEGF 수용체 1(sFLT-1)을 추가로 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다. 상기 벡터는 혈청형 2의 재조합, 복제-결함 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 벡터는 rAAV.sFlt-1으로 명명된 혈청형 2의 재조합 복제-결함 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이다.
AAV2는 최고로 특성화된 것이다. rAAV2는 동물의 다수 종의 눈에서 장기간 도입유전자 발현을 매개할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 랫트에서, rAAV 매개된 리포터 유전자(녹색 형광 단백질)은 주사후 18개월에서 여전히 존재했다. 원숭이에서, 동일한 보고된 유전자는 주사후 17개월에서 존재했다. 유사하게는, 고도의 sFLT-1 단백질 수준은 주사하 15개월에서 rAAV.sFlt-1 주사된 원숭이의 유리체에 존재했다.
rAAV.sFlt-1은 안내 신혈관 질환을 위한 동물 모델에서 시험되었다. rAAV.sFlt-1은 각막 신혈관형성 및 망막 신혈관형성의 동물 모데에서 신혈관형성의 진행을 지연시키는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, rAAV-매개된 sFlt-1은 맥락막 신혈관형성의 원숭이 모델에서 신혈관형성의 약간의 억제를 나타냈다(노화 관련된 황반 변성 또는 AMD의 습성 형태를 위한 모델). 이러한 연구에서, rAAV.sFlt-1 작제물의 존재는 원숭이 눈에서 sFLT-1의 낮은 발현 수준을 나타냈고, 원숭이의 웰빙 또는 망막 기능에 영향을 미치지 않았다. rAAv.sFlt-1에 대한 전신 노출과 관련된 임의의 안전성 문제를 시사하는 증거는 없다. 이들 연구에서 rAAV 벡터의 전체적 포지티브 발견 및 독성 결여 뿐만 아니라 맥락막 신혈관형성/AMD의 포유동물 모델에서 rAAV.sFlt-1을 사용한 발견은, 상기 벡터가 눈에 투여될 때에 양호한 안전성 프로파일을 갖는 광범위하게 뒷받침 데이터를 제공한다.
원숭이 모델에서 AMD의 특정 증상을 완화시키는 rAAV.sFlt-1의 능력에도 불구하고, sFLT-1 단백질 수준은 망막에서 예상치 않게 낮다. 구조적 활성 활성 포유동물 프로모터에 의해 유도된 sFLT-1의 발현 수준은 다수의 세포 유형에서 고도의 단백질 발현 수준을 제공하는 것으로 당해 기술분야에 밝혀졌다. 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 다수의 가능성은 예상된 발현 수준보다 낮은 발현 수준을 위해 존재할 수 있다. 거대한 멀티-도메인 단백질로서, sFLT-1은 조기 단백질분해 열화, 불량한 발현 동태 또는 비최적 선별에 감수성일 수 있다. 후자와 관련하여, 분비된 단백질로서, 세포에서 재조합에 의해 발현된 sFLT-1은 분비 경로에 유입된다. RPE 세포를 포함하는 망막 세포에서, sFLT-1은 단백질의 ER 또는 골지 어파르티스 선별에 의존하여 정단 또는 기저외측으로 분비될 수 있다. 일부 경우에, 비-최적 선별은 바람직하지 않은 기저외측 막으로 분자를 분비하고, 따라서 RPE 세포 층의 정단 표면 상에서 VEGF 신호전달 및 신혈관 혈관신생을 억제하는데 이용가능한 sFLT-1 분자의 농도를 감소시킬 수 있다.
추가로, 이러한 예상치 않게 낮은 수준의 sFLT-1이 인간에서 실제 AMD 감소의 치료에 대한 약물의 효능에 어떻게 영향을 미칠 수 있는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있지 않다. 원숭이 모델에서 희귀하게 상승된 수준은 AMD의 완화 증상의 유망한 징후를 나타냈지만, AMD를 위한 원숭이 동물 모델은 단지 AMD 질환을 위한 대리를 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, AMD 증상은 망막에서 인위적으로 유도된다(레이저를 통해). 이러한 모델은 다양한 분석에 적합하지만, 원숭이 모델에서 증상의 치료에서 약물의 실제 효능은 인간에서 질환 치료로 외삽하는 것은 곤란하다. rAAV.sFlt-1에 의해 생성된 예상치 않게 보다 낮은 단백질 수준은 추가로 인간에서 실험 없이 이러한 평가의 곤란성을 증가시킨다.
또한, 레버 콘제니탈 아마우로시스(Lebers Congenital Amaurosis; LCA)에 대한 3개 임상 실험은 rAAV2 골격을 사용하여 UK 및 USA에서 수행되고 있다. LCA는 출생시 또는 생후 수개월에서 나타나는 희귀 유전된 눈 질환이고, 안진, 느린 또는 동공 무반응 및 중증의 시력 저하 또는 실명을 특징으로 한다. 현재까지, 안전성 문제는 이들 2개 실험에서 6명 참가자의 망막하 공간 내로 rAAV2 작제물의 주사 후에 보고되지 않았다. 임상 실험에 관련되는 양 팀은 이들의 발견이 LCA 환자에서 추가의 유전자 치료를 뒷받침하는 것으로 결론지었다.
원숭이에서 실질적으로 또는 지속적으로 상승 수준의 sFLT-1의 생성에서 명백한 기술적 문제를 고려하면, 다수의 최적화 전략은 rAAV.sFlt-1의 도입 후에 망막에서 sFlt-1의 보다 낮은 단백질 수준의 근저에 있는 하나 이상의 기술적 문제를 해소하기 위해 취할 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 제공된 바와 같은 것을 포함하는 최적화 전략은 sFlt-1 단백질 서열 또는 도메인의 최적화, 또는 망막 세포에서 발현후 정확한 선별을 유도하기 위한 조절 요소의 도입, 또는 임의의 이들 가능한 인자를 보상하기 위한 sFlt-1 단백질의 수준 상승을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 조성물 및 방법은 후자에 대해 유도된 특정한 전략을 제공하고, 원숭이 연구에서 이미 관찰된 sFlt-1 수준과 비교하여 인간 망막에서 단백질 수준 상승의 개선에 대해 유도된 특이적 핵산 서열의 도입을 수반한다. 본원에 기재된 바와 같이, 다수의 서열, 링커, UTR, 인트론, sFLT-1 변이체 또는 이의 조합을 사용하여, rAAV.sFlt-1에 대한 노출후 망막에서 sFlt-1 단백질의 단백질 수준을 상승시킬 수 있다.
벡터는 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나 달리는 표적화된 세포에 유리한 특성을 제공하는 성분 또는 기능을 포함할 수 있다. 이러한 기타 성분은, 예를 들면, 게포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분(세포형 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 성분 포함); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수후 세포 내에 폴리뉴클레오티드의 국지화에 영향을 미치는 성분(예를 들면, 핵 국지화를 매개하는 제제); 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 이러한 성분은 또한 마커, 예를 들면, 상기 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하거나 발현하는 세포를 검출 또는 선택하기 위해 사용될 수 있는 검출가능한 및/또는 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 이러한 성분은 벡터의 천연 특징(예를 들면, 결합 및 흡수를 매개하는 성분 또는 기능을 갖는 특정 바이러스 벡터의 사용)으로 제공될 수 있거나, 벡터는 이러한 기능을 제공하기 위해 변형될 수 있다.
선택가능한 마커는 포지티브, 네가티브 또는 이작용성일 수 있다. 포지티브 선택가능한 마커는 마커를 갖는 세포의 선택을 가능하게 하고, 네가티브 선택가능한 마커는 선택적으로 제거되는 마커를 갖는 세포를 가능하게 한다. 이작용성(즉, 포지티브/네가티브) 마커를 포함하는 다양한 이러한 마커 유전자는 기재되어 있다[참조: Lupton, S., WO 92/08796, published May 29, 1992; and Lupton, S., WO 94/28143, published Dec. 8, 1994]. 네가티브 선택가능한 마커의 예는 암피실린 또는 카나마이신 등의 항생물질에 내성 유전자의 포함할 수 있다. 이러한 마커 유전자는 유전자 치료 상황에서 유리할 수 있는 조절의 추가 측정을 제공할 수 있다. 다종 다양한 이러한 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 일반적으로 이용가능하다.
일부 경우에, 항생물질 내성 마커를 코딩하는 핵산은, 이로써 제한되지 않지만, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113 또는 서열번호 114 등의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 적합한 다수의 바이러스 벡터에서, 하나 이상의 프로모터가 벡터에 포함되어, 하나 이상의 이종성 유전자가 당해 벡터에 의해 발현되도록 한다. 추가로, 벡터는, 표적 세포로부터 항-VEGF 단백질의 발현을 촉진시키는 단일 펩타이드 또는 기타 잔기를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
유전자 생성물을 코딩하는 핵산은 프로모터에 의해 전사 조절하에 존재할 수 있다. 본원에 제공된 "프로모터"는 유전자의 전사를 개시하는데 필요한 적합한 DNA 서열을 지칭한다. 문구 "전사 조절하"는 프로모터가 유전자의 RNA 폴리머라제 개시 및 발현을 조절하기 위해 핵산과 관련하여 정확한 위치 및 배향으로 존재하는 것을 의미한다. 일부 경우에, 프로모터는 "강력한" 또는 구조적 활성 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들면, CMV 프로모터는 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 구조적 활성 프로모터로서 사용될 수 있다. 일부 경우에, CMV 프로모터는 발현을 촉진시키는 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다. 일부 경우에, CMV 프로모터는 초기-초기 CMV 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 프로모터는 "약한" 프로모터, 또는 강력한 프로모터보다 낮은 수준의 sFLT-1 단백질을 제공하는 서열을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 프로모터는 당해 프로모터가 sFLT-1의 선택적 발현을 유도하도록 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 다른 서열과 조합하여 사용된 프로모터 또는 기타 조절 요소는 눈 세포 또는 눈 조직에서 sFLT-1의 선택적 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
추가로, "프로모터"(104)는 또한 RNA 폴리머라제를 위한 개시 부위 주위에 존재할 수 있는 임의의 추가의 적합한 전사 조절 모듈을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 본원에서 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 도입유전자(106)의 발현을 위한 임의의 적합한 프로모터 및 전사 조절 모듈을 사용할 수 있다. 추가의 전사 조절 모듈은, 이로써 제한되지 않지만, HSV 티미딘 키나제(tk) 및 SV40 초기 전사 유닛 등의 요소를 포함할 수 있다. 일반적으로, 프로모터는 각각이 약 7 내지 20 bp의 DNA 또는 20 내지 5000 bp의 DNA로 이루어진 개별 작용성 모듈로 구성될 수 있고, 전사 활성화제 또는 리프레서 단백질을 위한 하나 이상의 인식 부위를 함유한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 적합한 조절 서열 또는 이의 조합을 제공한다. 일부 경우에, 이들 전자 조절 모듈 서열은 인핸서 또는 리프레서 서열로서 지칭되거나 동정될 수 있다.
각각의 프로모터에서 적어도 하나의 모듈은 RNA 합성을 위한 개시 부위를 위치하도록 기능한다. 한 가지 예는 TATA 박스이다. 다른 예는 TATA 박스를 결여하는 일부 프로모터, 예를 들면, 포유동물 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자를 위한 프로모터 및 SV40 후기 유전자를 위한 프로모터를 포함할 수 있고, 개시 부위 자체 위에 있는 개별 요소는 개시 위치를 고정하는 것을 돕는다.
추가의 프로모터 요소는 전사 개시 빈도를 조절한다. 일반적으로, 이들은 개수 부위의 상류에 있는 영역 30 내지 110 bp에 위치하지만, 다수의 프로모터는 또한 개시 부위의 하류에 있는 작용성 요소를 함유할 수 있다. 요소가 서로에 대해 반전 또는 이동되는 경우에 당해 프로모터 기능이 보존되도록, 프로모터 사이의 간격은 빈번히 가요성일 수 있다. 예를 들면, tk 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 저하되기 시작하기 전에 50 bp까지 떨어져 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개개 요소는 전사를 활성화하기 위해 협조적으로 또는 독립적으로 기능하도록 위치할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 표적화된 세포에서 목적하는 핵산 서열의 발현을 조절하기 위한 임의의 적합한 서열을 제공한다. 따라서, 인간 세포가 표적화되는 경우, 서열은 핵산일 수 있고, 코딩 영역은 인간 세포에서 발현될 수 있는 프로모터의 조절하에 인접하도록 조작될 수 있다. 일반적으로, 이러한 프로모터는 인간 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시양태에서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 프로모터(ie-CMV), SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복체, β-액틴, 랫트 인슐린 프로모터 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 사용하여, 목적하는 코딩 서열의 고도의 발현을 수득할 수 있다(예: sFLT-1). 목적하는 코딩 서열의 발현을 달성하기 위해 당해 기술분야에 공지되어 있는 기타 바이러스 또는 포유동물 세포 또는 세균 파지 프로모터의 사용이 또한 고려되며, 단 발현 수준은 소정 목적에 충분해야 한다. 일부 실시양태에서, 원핵생물 조절 서열, 예를 들면, T7 DNA 폴리머라제 프로모터 서열이 벡터에 존재할 수 있다. 다른 실시양태에서, 벡터는 이러한 조절 서열을 포함하지 않는다. 공지된 특성을 갖는 프로모터를 사용함으로써, 형질감염 또는 형질전환 후에 목적하는 단백질의 발현 수준 및 패턴을 최적화할 수 있다.
특정한 생리학적 또는 합성 신호에 반응하여 조절되는 프로모터의 선택은 유전자 생성물의 유도 발현을 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 도입유전자, 또는 다시스트론 벡터가 이용되는 도입유전자의 발현이 당해 벡터가 생성되는 세포에 독성인 경우에, 하나 이상의 도입유전자의 발현을 금지 또는 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 생산자 세포주에 독성일 수 있는 도입유전자의 예는 프로-아폽토시스 및 사이토킨 유전자이다. 몇몇 유도 프로모터 시스템은 도입유전자 생성물이 독성일 수 있는 바이러스 벡터의 생성에 이용가능하다. 본 발명의 조성물 및 방법은 프로모터 서열, 조절 서열 및 도입유전자의 임의의 적합한 조합을 제공한다. 일부 경우에, 서열의 조합은 세포에 무독성을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 서열의 조합은 세포에 고도 독성을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 서열의 조합은 세포에서 적절한 수준의 독성을 제공할 수 있다.
엑디손 시스템(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)은 도입유전자를 위한 이러한 한 가지 시스템이다. 이 시스템은 포유동물 세포에서 목적하는 유전자의 조절된 발현을 가능하게 하도록 설계된다. 이는 도입유전자의 기저 수준의 발현을 가능하게 하지만 200배 이상의 유도성을 가능하게 하는 매우 조절된 발현 메카니즘으로 이루어진다. 이 시스템은 드로소필라의 헤테로이량체성 엑디손 수용체에 기반하고, 엑디손 또는 무리스테론 A 등의 동족체가 수용체에 결합하는 경우, 당해 수용체는 고도의 mRNA 전사물이 수득되는 하류 도입유전자의 발현을 개시하도록 프로모터를 활성화한다. 이 시스템에서, 헤테로이량체성 수용체의 두 단량체는 하나의 벡터로부터 구조적으로 발현되지만, 목적하는 유전자의 발현을 유도하는 엑디손-반응성 프로모터는 또 다른 플라스미드 상에 존재한다. 목적하는 유전자 전이 벡터 내로 이러한 유형의 시스템의 조작은 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 이어서, 생산자 세포주에 목적하는 유전자 및 수용체 단량체를 함유하는 플라스키드의 공형질감염은 잠재적 독성 도입유전자의 발현 없이 유전자 전이 벡터의 생성을 가능하게 한다. 적절한 시간에서, 도입유전자의 발현은 엑디손 또는 무리스테론 A로 활성화시킬 수 있다.
일부 상황하에서, 유전자 치료 벡터에서 도입유전자의 발현을 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 상이한 강도의 활성을 갖는 상이한 바이러스 프로모터는 요구되는 발현 수준에 따라 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서, CMV 즉시 초기 프로모터는 강력한 전사 활성화를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 덜 강력한 CMV 프로모터의 변형된 버젼은 도입유전자의 감소된 발현 수준이 요구되는 경우에 사용될 수 있다. 조혈세포에서 도입유전자의 발현이 요구되는 경우, MLV 또는 MMTV로부터 LTR(긴 말단 반복체) 등의 레트로바이러스 프로모터가 종종 사용된다. 목적하는 효과에 따라 사용될 수 있는 기타 바이러스 프로모터는 SV40, RSV LTR, HIV-1 및 HIV-2 LTR, 아데노바이러스 프로모터, 예를 들면, ElA, E2A, 또는 MLP 영역, AAV LTR, 칼리플라워 모자인 바이러스, HSV-TK, 및 유인원 육종 바이러스로부터의 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조직 특이적 프로모터는 비-표적화된 조직에 대한 잠재적 독성 또는 바람직하지 않은 효과를 감소시키도록 특정한 조직 또는 세포에서 전사를 수행하기 위해 사용된다. 예를 들면, PSA, 프로바신, 전립선 산 포스파타제 또는 전립선-특이적 선성 칼리크레인(hK2) 등의 프로모터를 사용하여 전립선에서 유전자 발현을 표적화할 수 있다.
일부 경우에, 프로모터 또는 조절 서열 요소는 눈 세포 또는 눈 조직에서 선택적 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 망막 색소 상피 세포 등의 특정한 눈 세포형에서 발견되는 프로모터, 서열 요소 또는 조절 서열은 적합한 발현 작제물에서 사용될 수 있다(예: RPE65 또는 VMD2 프로모터).
적절한 프로모터의 선택은 용이하게 달성될 수 있다. 일부 경우에, 고도 발현 또는 강력한 프로모터가 사용될 수 있다. 적합한 프로모터의 예는 763-염기쌍 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터이다. 라우스 육종 바이러스(RSV)(Davis, et ah, Hum Gene Ther 4: 151 (1993)) 및 MMT 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 특정한 단백질은 이들의 천연 프로모터를 사용하여 발현시킬 수 있다. 발현을 증강시킬 수 있는 다른 요소는 인핸서 또는 고도의 발현을 제공하는 시스템, 예를 들면, tat 유전자 및 tar 요소 등을 포함할 수 있다. 이어서, 이들 카세트를 벡터, 예를 들면, pUC19, pUC118, pBR322 또는, 예를 들면, 이. 콜라이 복제 기원을 포함하는 기타 공지된 플라스미드 벡터에 삽입할 수 있다[참조: Sambrook, et al., Molecular C10ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, (1989)]. 프로모터는 하기에 논의되어 있다. 플라스미드 벡터는 또한 적합한 마커, 예를 들면, 암피실린 내성을 위한 β-락타마제 유전자를 포함할 수 있고, 단 마커 폴리펩티드는 치료되는 생물의 대사에 악영향을 미치지 않아야 한다. 카세트는 또한 합성 전달 시스템, 예를 들면, 본원에서 참조로서 도입된 국제공개공보 제WO 95/22618호에 개시된 시스템 중의 핵산 결합 잔기에 결합할 수 있다. 일반적으로, 프로모터 서열 및/또는 임의의 관련된 조절 서열은 약 적어도 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp,5000 bp 또는 10000 bp를 포함할 수 있다. 프로모터 서열 및 임의의 관련된 조절 서열은 약 최대 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp,5000 bp 또는 10000 bp를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스 또는 플라스미드는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터 및 MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로부터 선택된 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공된 프로모터 서열 및 프로모터/인핸서 서열은, 이로써 제한되지 않지만, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 340, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46 및 서열번호 47로부터 선택된 임의의 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항생물질 마커는 재조합 바이러스를 생성을 위한 공정에서 사용된다. 항생물질 내성 마커는 재조합 바이러스의 생성시에 포지티브 도입유전자 세포를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항생물질 마커는 항생물질 내성 유전자를 코딩하는 서열, 예를 들면, 이로써 제한되지 않지만, 도 8a 및 도 8b에 제시된 서열을 포함하는 본원에 제공된 것들을 포함한다. 예를 들면, 내성을 부여하는 마커는, 이로써 제한되지 않지만, 카나마이신, 젠타마이신, 암피실린, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 독소사이클린 또는 하이드로마이신을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항생물질 내성 유전자는 카나마이신 등의 비-베타-락탐 항생물질 내성 유전자이다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스를 생성하기 위해 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 복제 기원 서열을 코딩하는 서열, 예를 들면, 본원에 기재된 것들을 포함한다. 복제 기원 서열은 일반적으로 플라스미드의 전파에 유용한 서열을 제공한다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공된 복제 기원 서열은, 이로써 제한되지 않지만, 도 7a, 도 7b, 도 7c 및 도 7d에 제공된 서열로부터 선택된 임의의 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기원 또는 복제 기원 서열은, 이로써 제한되지 않지만, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 또는 서열번호 17 등의 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 인핸서, 예를 들면, 본원에 제공된 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 키메라 인트론 또는 인트론(105), 예를 들면 본원에서 제공되고 참조로서 본원에 도입된 미국 특허 제7635474호에 개시된 것들을 포함한다. 인트론 또는 키메라 인트론은 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일부 경우에, 인트론은 전사되지만 해독되지 않는 임의의 서열을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 인트론은 전사되고 세포에서 성숙 RNA 전사물로부터 제거되는 임의의 서열을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 인트론은 약 적어도 1 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp 또는 5000 bp를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 인트론은 약 적어도 1 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp 또는 5000 bp를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 인트론은 약 300 bp를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 인트론은 약 200 내지 400 bp일 수 있다. 일부 경우에, 키메라 인트론은 약 100 내지 500 bp일 수 있다. 일부 경우에, 인트론은 약 50 내지 200 bp일 수 있다. 일부 경우에, 인트론은 순수한 천연 발생 인트론 또는 키메라 인트론일 수 있다.
일부 실시양태에서, 인트론은, 이로써 제한되지 않지만, 서열번호 48, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119 또는 서열번호 120 등의 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 폴리 A(폴리아데닐화) 서열(107), 예를 들면, 본원에서 제공된 것들(예: SV40 폴리 A 서열)을 포함한다. 일반적으로, 임의의 적합한 폴리A 서열은 도입유전자(즉, sFLT-1)의 목적하는발현에 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에, 본 발명은 SV40 폴리A 서열 또는 SV40 폴리A 서열의 일부분을 포함하는 서열을 제공한다. 일부 경우에, 인간 게놈 서열에서 발견된 인간 sFLT-1 유전자의 하류(3'UTR)에서 발견되는 천연 폴리A 서열이 사용될 수 있다. 다른 경우에, sFLT-1 이외의 유전자의 하류에서 발견되는 폴리A 서열이 사용될 수 있다. 다른 경우에, 본 발명은 하나 이상의 폴리A 서열 또는 서열 요소의 조합을 포함하는 폴리A 서열을 제공한다. 일부 경우에, 폴리A 서열은 사용되지 않는다. 일부 경우에, 하나 이상의 폴리A 서열은 비해독된 영역(UTR), 3' UTR 또는 종결 서열로서 지칭될 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 내부 리보솜 도입 부위(IRES) 또는 족구병 바이러스(FMDV) 요소의 사용은 다중유전자 또는 폴리시스트론, 메세지를 작성하기 위해 사용될 수 있다. IRES 요소는 5' 메틸화된 Cap 의존성 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 해독을 개시할 수 있다. 피코마바이러스 부류(폴리오바이러스 및 엔세팔로마이오카디티스)의 2개 구성원으로부터의 IRES 요소, 및 포유동물 메시지로부터의 IRES는 기재되어 있다. IRES 요소는 이종성 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 다중 개방 판독 프레임은 함께 전사될 수 있고, 각각은 IRES에 의해 분리되어 폴리시스트론 메시지를 생성할 수 있다. IRES 요소와 관련하여, 각각의 개방 판독 프레임은 효율적인 해독을 위한 리보솜에 접근할 수 있다. 복수의 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다. 유전자 치료 전달 벡터에서 2개 단백질의 동시 발현을 위한 대체 시스템은 FMDV 2A 시스템이다. FMDV 2A 시스템은, 2개의 유전자가 피코마바이러스 족구 질환 바이러스로부터의 2A 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있는 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 사용한다. 전사 및 해독은 바이시스트론성 mRNA 및 2개 독립적 단백질 생성물을 제공한다.
이종성 개방 판독 프레임은 IRES 요소에 연결될 수 있다. 이는 독립적 유전자에 의해 코딩된 분비된 단백질, 다중 서브유닛 단백질, 세포내 또는 막-결합된 단백질 및 선택가능한 마커를 위한 유전자를 포함할 수 있다. 이와 같이, 몇몇 단백질의 발현은 단일 작제물 및 단일 선택가능한 마커를 갖는 세포 내로 동시에 유전자 조작될 수 있다.
폴리A 서열은 길이 1 내지 10 bp, 10 내지 20 bp, 20 내지 50 bp, 50 내지 100 bp, 100 내지 500 bp, 500 bp 내지 1Kb, 1Kb 내지 2 Kb, 2Kb 내지 3 Kb, 3Kb 내지 4 Kb, 4Kb 내지 5 Kb, 5Kb 내지 6 Kb, 6Kb 내지 7 Kb, 7Kb 내지 8 Kb, 8Kb 내지 9 Kb 및 9Kb 내지 10 Kb의 길이를 포함할 수 있다. 폴리 A 서열은 길이가 적어도 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb 및 10 Kb의 길이를 포함할 수 있다. 폴리A 서열은 길이가 최대 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb 및 10 Kb의 길이를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 폴리A 또는 종결 서열은, 이로써 제한되지 않지만, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55 등의 서열을 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 의해 제공된 폴리A 서열은, 이로써 제한되지 않지만, 도 9a 및 9B에서 제공된 폴리A 영역 1 내지 10으로부터 선택된 임의의 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 폴리A 서열은, 이로써 제한되지 않지만, 세포에서 도입유전자의 mRNA 반감기, 도입유전자의 mRNA의 안정성 또는 전사 조절을 포함하는 단백질 발현에 영향을 미치는 다양한 파라미터를 위해 최적화될 수 있다. 예를 들면, 폴리A 서열은, 증가된 단백질 발현을 제공할 수 있는 도입유전자의 mRNA 전사물을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 일부 경우에, 폴리A 서열은, 감소된 단백질 발현을 제공할 수 있는 도입유전자의 mRNA 전사물의 반감기를 감소시키기 위해 변경될 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 인간 sFLT-1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 작용성 단편을 포함한다. 일부 경우에, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 또 다른 항-VEGF 단백질 또는 VEGF 억제제를 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 경우에, VEGF 억제제는, 이로써 제한되지 않지만, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108 또는 서열번호 122 등의 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, VEGF 억제제의 핵산은, 이로써 제한되지 않지만, 서열번호 109 또는 서열번호 121 등의 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있는 폴리펩티드 서열을 코딩할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는, 눈 세포에서 sFLT-1 단백질의 선택적 발현을 유도할 수 있는 조절 핵산 단편을 포함한다. 일부 경우에, 눈 세포는 망막 색소 상피 세포(RPE)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 하나 이상의 비해독된 영역(UTR) 또는 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 임의의 적합한 UTR 서열은 도입유전자(즉, sFLT-1)의 목적하는 최적 발현을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에, UTR 영역 또는 서열은 천연 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, UTR 서열은 인간 게놈 서열 또는 이의 부분에서 발견되는 인간 sFLT-1 유전자의 상류(5' UTR) 또는 하류(3' UTR)에서 발견되는 서열일 수 있다. 다른 경우에, UTR 서열은 sFLT-1 이외의 유전자의 상류 또는 하류에서 발견되는 것과 같은 비-천연 서열을 포함할 수 있거나, 본원에서 추가로 기재된 바와 같은 하나 이상의 UTR 서열 요소의 조합을 추가로 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 5' UTR 서열만이 사용된다. 일부 경우에, 3' UTR 서열만이 사용된다. 일부 경우에, UTR 서열은 사용되지 않는다.
UTR 서열은 길이 1 내지 10 bp, 10 내지 20 bp, 20 내지 50 bp, 50 내지 100 bp, 100 내지 500 bp, 500 bp 내지 1 Kb, 1 Kb 내지 2 Kb, 2 Kb 내지 3 Kb, 3 Kb 내지 4 Kb, 4 Kb 내지 5 Kb, 5 Kb 내지 6 Kb, 6 Kb 내지 7 Kb, 7 Kb 내지 8 Kb, 8 Kb 내지 9 Kb 및 9 Kb 내지 10 Kb의 길이를 포함할 수 있다. UTR 서열은 길이가 적어도 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb 및 10 Kb의 길이를 포함할 수 있다. UTR 서열은 길이가 최대 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb 및 10 Kb의 길이를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 의해 제공된 UTR 서열은, 이로써 제한되지 않지만, 서열번호 91, 서열번호 2, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호100 및 서열번호 101을 포함하는 임의의 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 5' UTR 및/또는 3' UTR의 변형은 목적하는 단백질 발현 수준을 위해 최적화될 수 있다. 일부 경우에, 3' UTR 서열은, 이로써 제한되지 않지만, 세포에서 도입유전자의 mRNA 반감기, 도입유전자의 mRNA의 안정성 또는 2차 구조 또는 조건적 조절(예를 들면, 해독을 조절하기 위한 다양한 인자의 결합)을 포함하는 단백질 발현에 영향을 미치는 다양한 파라미터를 위해 최적화될 수 있다. 예를 들면, 3' UTR 서열은, 증가된 단백질 발현을 제공할 수 있는 도입유전자의 mRNA 전사물의 반감기를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 일부 경우에, 3' UTR 서열은, 감소된 단백질 발현을 제공할 수 있는 도입유전자의 mRNA 전사물의 반감기를 감소시키기 위해 변경될 수 있다.
일반적으로, 3' UTR 서열은 다양한 서열 요소를 포함할 수 있다. 본 발명은, 이로써 제한되지 않지만, 하나 이상의 폴리아데닐화 신호, 링커 서열, 스페이서 서열, SECIS 요소, AU-풍부 또는 ARE 서열 또는 miRNA 또는 RNAi 결합 서열, 전사 종결 서열, 3' 종결 서열 또는 이의 변이체 및/또는 조합 등의 서열 요소를 포함할 수 있는 3' UTR 서열을 제공한다.
일부 경우에, 5' UTR 서열은, 이로써 제한되지 않지만, 세포에서 도입유전자의 mRNA 반감기, 도입유전자의 mRNA의 안정성 또는 2차 구조 또는 전사 조절을 포함하는 단백질 발현에 영향을 미치는 다양한 파라미터를 위해 최적화될 수 있다. 예를 들면, 5' UTR 서열은, 증가된 단백질 발현을 제공할 수 있는 도입유전자의 mRNA 전사물의 해독 효율을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 일부 경우에, 5' UTR 서열은, 감소된 단백질 발현을 제공할 수 있는 도입유전자의 mRNA 전사물의 해독 효율을 감소시키기 위해 변경될 수 있다.
일반적으로 5' UTR은 다양한 서열 요소를 포함할 수 있다. 본 발명은, 이로써 제한되지 않지만, 하나 이상의 리보솜 결합 부위(RBS), 링커 서열, 스페이서 서열, 조절 서열, 조절 반응 요소, 리보스위치, 해독 개시를 촉진하거나 억제하는 서열, mRNA 수송을 위한 조절 서열 또는 이의 변이체 및/또는 조합 등의 서열 요소를 포함하는 5' UTR 서열을 제공한다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 하나 이상의 링커 또는 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 링커 서열 또는 스페이서 서열은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 링커 서열 또는 스페이서 서열은 적어도 2개의 서열 요소 사이의 비연속적 서열을 생성하기 위해 사용된 임의의 적합한 서열일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 실시양태에서, 링커 서열은 도 1A에서 반영된 바와 같이 ITR-1(108) 서열 또는 ITR-2(103) 및 항생물질 내성 유전자 서열(106) 사이에 삽입된 것을 발견할 수 있다. 또 다른 예에서, 링커 서열은 ITR 서열, 프로모터 또는 프로모터/인핸서 서열, 인트론 서열, 도입유전자 서열 및 폴리A 영역 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 코딩하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드의 임의의 서열 요소에 인접하여 삽입될 수 있다. 일반적으로, 임의의 적합한 링커 또는 스페이서 서열이 비-연속 서열의 생성에 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에, 링커 서열은 랜덤으로 생성된 서열일 수 있다. 일부 경우에, 링커 서열은, 단백질 발현에 악영향을 미칠 수 있는 2차 구조의 형성 또는 분자내 상호작용을 방지하기 위해 최적화된 비-특이적 서열일 수 있다. 일부 경우에, 링커 서열은, 이로써 제한되지 않지만, 인트론, 조절 서열, 인핸서 등을 포함하는 임의의 추가 작용성 서열 요소를 포함할 수 있다. 링커 서열 중의 작용성 요소는 바이러스의 목적하는 최적 생성 및/또는 도입유전자 발현의 발현을 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 링커 서열은 클로닝 부위, 선행 클로닝 부위의 나머지 또는 기타 비-유의한 서열이고, 임의의 2개 서열 사이의 이러한 링커의 삽입은 임의적이다.
일반적으로, 본 발명에 의해 제공된 링커 서열은, 이로써 한정되지 않지만, 도 9d, 도 9e 및 도 9f에서 제공된 바와 같은 서열로부터 선택된 임의의 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 링커 서열의 길이는 바이러스의 목적하는 최적 생성 및/또는 도입유전자 발현의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 게놈 또는 플라스미드 중의 하나 이상의 부위에 위치된 하나 이상의 링커 서열의 길이는 목적하는 최적 단백질 발현을 생성하기 위해 달라질 수 있다. 예를 들면, 링커 서열은 본원에 기재된 바와 같은 인트론 및 도입유전자(즉, sFLT-1) 사이에서 발견될 수 있다. 링커 서열의 길이는, 전사 및 후속적으로 세포에서 도입유전자의 해독에 대한 상이한 효과를 생성하기 위해 달라질 수 있다.
링커 서열은 실이 1 내지 10 bp, 10 내지 20 bp, 20 내지 50 bp, 50 내지 100 bp, 100 내지 500 bp, 500 bp 내지 1 Kb, 1 Kb 내지 2 Kb, 2 Kb 내지 3 Kb, 3 Kb 내지 4 Kb, 4 Kb 내지 5 Kb, 5 Kb 내지 6 Kb, 6 Kb 내지 7 Kb, 7 Kb 내지 8 Kb, 8 Kb 내지 9 Kb 및 9 Kb 내지 10 Kb의 길이를 포함할 수 있다. 링커 서열은 길이가 적어도 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb 및 10 Kb의 길이를 포함할 수 있다. 링커 서열은 길이가 최대 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb 및 10 Kb의 길이를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 링커 또는 스페이서 서열은, 이로써 한정되지 않지만, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89 및 서열번호 90을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는, 바이러스 벡터의 비리온 내로 재조합 유전자 발현 카세트의 팩키징에 사용된 역방향 말단 반복체(ITR) 서열을 포함한다. 일부 경우에, ITR은 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래한다. 일부 경우에, ITR은 AAV 혈청형 2로부터 유래한다. 일부 경우에, ITR은, 이로써 제한되지 않지만, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58 또는 서열번호 59를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스이 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 하기 순서로 핵산 요소를 포함한다: a) 제1 ITR 서열; b) 프로모터 서열; c) 인트론 서열; d) 제1 UTR 서열; e) VEGF 억제제를 코딩하는 서열; f) 제2 UTR 서열; g) 폴리A 서열 및 h) 제2 ITR 서열. 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드의 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 프로모터/인핸서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제를 코딩하는 서열은 인간 sFLT-1 단백질을 코딩하는 서열 또는 이의 작용성 단편을 포함한다. 다른 실시양태에서, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 플라스미드는 복제 기원 서열(102)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 본원에 제공된 바와 같은 항생물질 내성 유전자를 위한 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 하기 순서로 핵산 요소를 포함한다: a) 제1 ITR 서열; b) 제1 링커 서열; c) 프로모터 서열; d) 제2 링커 서열; e) 인트론 서열; f) 제3 링커 서열; g) 제1 UTR 서열; h) VEGF 억제제를 코딩하는 서열; i) 제2 UTR 서열; j) 제4 링커 서열; k) 폴리A 서열; l) 제5 링커 서열 및 m) 제2 ITR 서열. 재조합 바이러스의 생성에 사용된 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드의 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 프로모터/인핸서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제를 코딩하는 서열은 인간 sFLT-1 단백질을 코딩하는 서열 또는 이의 작용성 단편을 포함한다. 다른 실시양태에서, 재조합 바이러스의 생성에 사용된 플라스미드는 복제 기원 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 본원에 제공된 바와 같은 항생물질 내성 유전자를 위한 서열을 추가로 포함한다.
IV. 약제학적 조성물
약제학적 조성물은, 목적하는 진단학적 결과 또는 치료학적 또는 예방학적 효과를 달성하기 위해 인간 환자에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 부형제, 담체, 안정화제 또는 증량제 뿐만 아니라 하나 이상의 활성 성분을 함유하는 제형이다. 저장 안정성 및 취급 용이성을 위해, 약제학적 조성물은 동결건조물(즉, 동결 건조), 또는 환자에게 투여 전에 염수 또는 물로 재구성할 수 있는 진공 건조된 분말로서 제형화될 수 있다. 대안적으로, 약제학적 조성물은 수용액으로서 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 단백질성 활성 성분을 함유할 수 있다. 불운하게도, 단백질은 안정화시키기에 곤란하여, 제형화, 재구성(필요한 경우) 동안 및 단백질 함유 약제학적 조성물의 사용전 저장 동안 단백질의 소실 및/또는 단백질 활성의 소실을 제공할 수 있다. 안정성 문제는 단백질 변성, 분해, 이량체화 및/또는 중합 때문에 발생할 수 있다. 다양한 부형제, 예를 들면, 알부민 및 젤라틴은 약제학적 조성물에 존재하는 단백질 활성 성분을 시험 및 안정화시키기 위해 상이한 정도의 성공과 함께 사용되어 왔다. 추가로, 알콜 등의 동결보호제는 동결건조의 냉동 조건하에서 단백질 변성을 감소시키기 위해 사용되어 왔다.
내부 사용에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉시조제용 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여에 있어서, 적합한 담체는 생리학적 염수, 정균수 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고, 용이하게 주사가능할 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하고, 세균 및 진균 등의 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴 등의 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 폴리솔베이트(Tween™), 나트륨 도데실 설페이트(나트륨 라우릴 설페이트), 라우릴 디메틸 아민 옥사이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 폴리에톡실화 알콜, 폴리옥시에틸렌 솔비탄, 옥토시놀(Triton XI 00™), N,N-디메틸도데실아민-N-옥사이드, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(HTAB), 폴리옥실 10 라우릴 에테르, Brij 721™, 담즙 염(나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 콜레이트), 플루론산(F-68, F-127), 폴리옥실 피마자유(Cremophor™), 노닐페놀 에톡실레이트(Tergitol™), 사이클로덱스트린 및 에틸벤즈에토늄 클로라이드(Hyamine™) 등의 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균 제제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성할 수 있다. 다수의 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예를 들면, 만니톨, 솔비톨, 염화 나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 내부 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 수득할 수 있다.
멸균 용액은 활성 화합물을 필요한 양으로, 필요에 따라, 상기 열거된 성분의 하나 또는 조합과 함께, 적절한 용매에 도입한 다음, 멸균 여과시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들의 필요하 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은, 활성 성분의 분말 + 상기 이의 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가 목적 성분을 제공하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
한 가지 실시양태에서, 활성 화합물은, 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절된 방출 제형 등과 같이, 신체로부터 신속한 제거에 대해 화합물을 보호할 수 있는 담체로 제조된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등이 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 재조는 또한 상업적으로 입수할 수 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 감염 세포로 표적화된 리포좀 포함)은 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면, 본원에서 참조로서 도입된 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
투여 용이성 및 용량의 균일성을 위해 경구 또는 비경구 조성물을 용량 단위로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 용량 단위형은 치료되는 인간 대상체를 위한 단위 용량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다; 필요한 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 소정량을 함유하는 각각의 단위. 본 발명의 용량 단위형을 위한 상세는 활성 화합물의 독특한 특성 및 치료되는 특정 치료 효과, 및 개체 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 당해 기술에 고유한 제한에 따라 직접 결정된다.
약제학적 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩 또는 분배기에 포함될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 인간을 포함하는 동물에게 투여할 때에 생물학적 활성 대사물 또는 이의 잔사를 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 기타 화합물을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 본 발명은 본 발명의 화합물의 프로드러그 및 약제학적으로 허용되는 염, 이러한 프로드러그의 약제학적으로 허용되는 염 및 기타 생체등가물에 관한 것이다.
용어 "프로드러그"는, 내인성 효소 또는 기타 화학물질 및/또는 조건의 작용에 의해 신체 또는 이의 세포 내에서 활성 형태(즉, 약물)로 전환되는 불활성 형태로 제조되는 치료제를 나타낸다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적으로 및 약제학적으로 허용되는 염을 지칭한다: 즉, 상기 염은 친(parent) 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고, 이에 대한 바람직하지 않는 독성학적 영향을 제공하지 않는다.
약제학적으로 허용되는 염기 부가 염은 금속 또는 아민, 예를 들면, 알칼리 및 알카리토 금속 또는 유기 아민으로 형성된다. 양이온으로 사용된 금속은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등을 포함한다. 아민은 N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 디사이클로헥실아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 및 프로카인[참조: Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharma Sci., 1977, 66, 119]을 포함한다. 상기 산성 화합물의 염기 부가 염은 유리 산 형태를 충분한 양의 목적하는 염기와 접촉시켜 통상의 방식으로 염을 생성함으로써 제조된다. 유리 산 형태는 염 형태를 산과 접촉시키고 유리 산을 통상의 방식으로 단리하여 생성할 수 있다. 유리 산 형태는, 극성 용매 중의 가용성 등의 특정 물성이 이들의 각각의 염 형태와 상이하지만, 당해 염은 본 발명의 목적을 위해 이들의 각각의 유리 산과 등가이다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적 부가 염"은 본 발명의 조성물의 하나의 산 형태의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 이들은 아민의 유기 또는 무기 산 염을 포함한다. 바람직한 산 염은 하이드로클로라이드, 아세테이트, 살리실레이트, 니트레이트 및 포스페이트이다. 다른 적합한 약제학적으로 허용되는 염은 당업자에게 공지되어 있고, 다양한 무기 및 유기 산의 염기성 염, 예를 들면, 무기 산, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 황산 또는 인산; 유기 카복실산, 설폰산, 설포 또는 포스포산 또는 N-치환된 설팜산, 예를 들면, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 석신산, 말레산, 하이드록시말레산, 메틸말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 락트산, 옥살산, 글루콘산, 글루카산, 글루쿠론산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 2-페녹시벤조산, 2-아세톡시벤조산, 엠본산, 니코틴산 또는 이소니코틴산; 및 아미노산, 예를 들면, 자연적으로 단백질의 합성에 관여하는 20 알파-아미노산, 예를 들면, 글루탐산 또는 아스파르트산, 및 또한 페닐아세트산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 에탄-1,2-디설폰산, 벤젠설폰산, 4-메틸벤젠설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 2- 또는 3-포스포글리세레이트, 글루코즈-6-포스페이트, N-사이클로헥실설팜산(사이클라메이트의 형성과 함께), 또는 기타 산 유기 화합물, 예를 들면, 아스코르브산과의 염기성 염을 포함한다. 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 또한 약제학적으로 허용되는 양이온으로 제조할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 양이온은 당업자에게 공지되어 있고, 알칼리, 알칼리토, 암모늄 및 4급 암모늄 양이온을 포함한다. 카보네이트 또는 탄산수소가 또한 가능한다. 올리고뉴클레오티드와 관련하여, 약제학적으로 허용되는 염의 바람직한 예는, 이로써 제한되지 않지만, (I) 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예를 들면, 스퍼민 및 수퍼미딘 등의 양이온으로 형성된 형; (II) 무기 산, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등으로 형성된 산 부가 염; (III) 유기 산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌디설폰산, 폴리갈락투론산 등으로 형성된 염; 및 (IV) 원소 음이온, 예를 들면, 염소, 브롬 및 요오드로부터 형성된 염을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 이로써 제한되지 않지만, 용액, 에멀젼 및 리포좀-함유 제형을 포함한다. 이들 조성물은, 이로써 제한되지 않지만, 예비형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하는 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다.
본 발명의 특정 조성물은 또한 당해 제형에 담체 화합물을 도입한다. 본원에 사용된 바와 같이, "담체 화합물" 또는 "담체"는, 불활성(즉, 자체로 생물학적 활성을 보유하지 않음)이지만, 예를 들면, 생물학적 활성 핵산을 분해 또는 순환으로부터 이의 제거를 촉진시킴으로써 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생체이용성을 감소시키는 생체내 공정에 의해 핵산으로 인식되는, 핵산 또는 이의 동족체를 지칭한다. 핵산 및 담체 화합물의 동시 투여(일반적으로 후자의 물질을 과량으로)는, 아마도 공통 수용체에 대한 담체 화합물 및 핵산 사이의 경쟁으로 인해, 간, 신장 또는 기타 추가의 순환 저장소에서 회수된 핵산 양의 실질적 감소를 제공할 수 있다. 예를 들면, 간 조직에서 부분적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 회수는, 폴리이노신산, 덱스트란 설페이트, 폴리시티딜산 또는 4-아세트아미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2'디설폰산과 동시 투여되는 경우에 감소될 수 있다[참조: Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183].
벡터 또는 재조합 벡터(비리온)는 포유동물 환자, 특히 인간에게 투여하기 위해 약제학적 조성물 내로 도입될 수 있다. 벡터 또는 비리온은, 바람직하게는 pH 3 내지 8 범위, 보다 바람직하게는 pH 6 내지 8 범위로 무독성의 불활성 약제학적으로 허용되는 수성 담체에서 제형화될 수 있다. 이러한 멸균 조성물은, 재구성시에 허용되는 pH를 갖는 수성 완충제에 용해된 치료학적 분자를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터 또는 비리온을 포함할 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 벡터 또는 비리온을 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제, 예를 들면, 염수, 인산염 완충 염수, 포스페이트 및 아미노산, 중합체, 폴리올, 당, 완충제, 방부제 및 기타 단백질과 혼합하여 포함한다. 예시적 아미노산, 중합체 및 당 등은 옥틸페녹시 폴리에톡시 에탄올 화합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 화합물, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르, 슈크로즈, 프럭토즈, 덱스트로즈, 말토즈, 글루코즈, 만니톨, 덱스트란, 솔비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 크실리톨, 락토즈, 트레할로즈, 소 또는 인간 혈청 알부민, 시트레이트, 아세테이트, 링거액 및 행크액, 시스테인, 아르기닌, 카니틴, 알라닌, 글리신, 리신, 발린, 류신, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 및 글리콜이다. 바람직하게는, 이러한 제형은 4℃에서 적어도 6개월 동안 안정하다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 완충제, 예를 들면, 인산염 완충 염수(PBS) 또는 인산나트륨/황산나트륨, 트리스 완충제, 글리신 완충제, 멸균수 및 문헌[참조: Good et al. (1966) Biochemistry 5:467]에 기재된 것들과 같은 당업자에게 공지된 기타 완충제를 포함한다. 아데노바이러스 벡터 전달 시스템에 함유된 항-VEGF를 포함하는 약제학적 조성물 중의 완충제의 pH는 6.5 내지 7.75, 7 내지 7.5 또는 7.2 내지 7.4 범위일 수 있다. 제형의 pH는 약 3.0 내지 약 12.0의 범위일 수 있다. 면역원성 조성물의 pH는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 pH 단위일 수 있다. 면역원성 조성물의 pH는 최대 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 pH 단위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란을 약 1 내지 10%의 양, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%의 양으로 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태는 하나 이상의 재조합 바이러스 및 하나 이상의 기타 화학치료제를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
이러한 화학치료제의 예는, 이로써 제한되지 않지만, 항암 약물, 예를 들면, 다우노루비신, 닥티노마이신, 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신, 질소 머스타드, 클로람부실, 멜팔란, 사이클로포스파미드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈(CA), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록스우리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MIX), 콜히친, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드, 테니포사이드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤(DES)를 포함한다[일반 참조: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pages 1206-1228].
이로써 제한되지 않지만, 비스테로이드 항염증 약물 및 코르티코스테로이드를 포함하는 항-염증 약물 및, 이로써 제한되지 않지만, 리비비린, 비다라빈, 아사이클로비르 및 간시클로비르를 포함하는 항바이러스 약물은 또한 본 발명의 조성물에 배합될 수 있다[참조: 각각 The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pages 2499-2506 and 46-49]. 기타 비-안티센스 화학치료제가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 2종 이상의 배합된 화합물은 함께 또는 순차로 사용될 수 있다.
또 다른 관련 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 재조합 바이러스, 특히, 상이한 서열을 갖는 sFLT-1을 함유할 수 있다. 2종 이상의 배합된 바이러스는 함께 또는 순차로 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 약 1×106 내지 약 1×1015 바이러스 게놈을 포함하는 약제학적 조성물의 단위 용량을 제공하고, 여기서 바이러스는 sFLT-1을 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량은 pfu(플라크 형성 단위)로 측정될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량의 pfu는 약 1×108 내지 약 5×1010 pfu일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량의 pfu는 적어도 약 1×108, 2×l08, 3×l08, 4×l08, 5×l08, 6×l08, 7×l08, 8×l08, 9×l08, 1×109, 2×l09, 3×l09, 4×l09, 5×l09, 6×l09, 7×l09, 8×l09, 9×l09, 1×1010, 2×l010, 3×l010, 4×l010 및 5×l010 pfu이다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량의 pfu는 최저 약 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×l010, 3×l010, 4×l010 및 5×l010 pfu이다.
일부 경우에, 본 발명의 바이러스 벡터는 벡터 게놈으로 측정될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량은 1×1010 내지 3×l012 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량은 1×10 내지 3×1013 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량은 1×1010 내지 1×1011 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량은 1×108 내지 3×1014 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량은 적어도 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량은 1×108 내지 3×1014 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량은 최저 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 벡터 게놈이다.
일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량은 감염 중목도(MOI)를 사용하여 측정할 수 있다. 일부 경우에 MOI는 핵산이 전달되는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비 또는 배수를 지칭한다. 일부 경우에, MOI는 1×106일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×105 내지 1×107일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×104 내지 1×108일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 적어도 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×l018 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 1×108 내지 3×1014 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 최대 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 MOI이다.
일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스의 사용 없이 (즉, 비-바이러스 벡터) 전달될 수 있고, 핵산의 양으로 측정될 수 있다. 일반적으로, 핵산의 임의의 적합한 양이 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 양은 적어도 약 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍, 200 ㎍, 300 ㎍, 400 ㎍, 500 ㎍, 600 ㎍, 700 ㎍, 800 ㎍, 900 μ& 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g 또는 5 g일 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 최대 약 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍, 200 ㎍, 300 ㎍, 400 ㎍, 500 ㎍, 600 ㎍, 700 ㎍, 800 ㎍, 900 μg, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g 또는 5 g일 수 있다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 약 1×106 내지 1×1015 재조합 바이러스, 약 1×107 내지 1×1014 재조합 바이러스, 약 1×108 내지 약 1×1013 재조합 바이러스, 약 1×109 내지 약 3×1012 재조합 바이러스 또는 약 1×1010 내지 약 3×1012 재조합 바이러스를 포함한다.
키트
본 발명에 유용한 조성물 및 시약은 본 발명의 적용을 용이하게 하기 위해 키트에 팩키징될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 바이러스를 포함하는 키트를 제공한다. 지침은 임의의 형태로 존재할 수 있고, 이로써 제한되지 않지만, 키트 삽입물에 인쇄된 것, 하나 이상의 용기에 인쇄된 것 뿐만 아니라, 전자 기억 매체에 제공된 전자적 기억 지침, 예를 들면, 컴퓨터 판독가능한 기억 매체를 포함한다. 또한, 정보를 통합하고 조절 용량을 계산하는 것을 사용자에게 허용하는 컴퓨터 판독가능한 기억 매체에 소프트웨어 팩키지가 필요에 따라 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 예를 들면, AMD, DME, RVO, 혈관신생 관련 질환, 암, 자가면역 질환, 감염성 질환 생물 등과 같은 질환의 치료에서 키트를 제공한다.
한 가지 실시양태에서, 키트는 (a) 본원에 제공된 재조합 바이러스 및 (b) 치료학적 유효량의 재조합 바이러스를 세포 또는 개체에게 투여하기 위한 지침을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 재조합 바이러스를 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 염 또는 용액을 포함할 수 있다. 임의로, 키트는 라벨 또는 별개의 삽입물 형태로 적합한 작동 파라미터를 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 재조합 바이러스의 용량을 제조하기 위해 의사 또는 실험실 기술자에게 통지하는 표준 지침을 가질 수 있다.
임의로, 키트는, 시험 양의 재조합 바이러스가 예를 들면, 종양의 수축과 일치하는 치료량인지를 결정하기 위해, 환자 샘플이 대조 정보 표준과 비교될 수 있도록 하는 표준 또는 대조 정보를 추가로 포함할 수 있다. 임의로 키트는, 시린지, 필터 바늘, 연장 튜브, 캐뉼라 및 망막하 주사기 등의 투여 장치를 추가로 포함할 수 있다.
재조합 바이러스는 임의의 적합한 수단에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은, 포유동물 세포, 곤충 세포, 동물 세포 또는 진균 세포를 포함할 수 있는 도입유전자 세포의 사용을 포함하여, 다양한 수단을 통한 재조합 바이러스의 생성을 제공한다.
예를 들면, 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 재조합 바쿨로바이러스에 의한 곤충 세포의 형질감염을 통해 생성될 수 있다. 일부 경우에, 재조합 바쿨로바이러스는 중간체로서 생성될 수 있고, 이에 의해 바쿨로바이러스는 AAV 또는 rAAV2 바이러스 등의 기타 바이러스의 생성에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 바쿨로바이러스는 본 발명의 조성물 및 치료 방법에 사용된 재조합 바이러스의 생성에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 곤충 세포, 예를 들면, Sf9, High-Five 또는 Sf21 세포주가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 세포주는 일시적 방법을 사용하여 생성될 수 있다(즉, 안정하게 통합되지 않는 도입유전자를 사용한 감염). 다른 경우에, 세포주는 안정한 세포주의 생성을 통해 생성될 수 있다(즉, 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합된 도입유전자를 사용한 감염). 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 부착 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포를 사용하여 제조된다. 대체 실시양태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 현탁액-적용된 HEK293 세포를 사용하여 제조된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 곤충 세포에서 바쿨로바이러스 발현 시스템(BVES)를 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 헤르페스-헬퍼 바이러스를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 생산자-클론 방법을 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 Ad-AAV를 사용하여 생성된다.
일반적으로, 임의의 적합한 방법은 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물에 사용하기 위한 재조합 바이러스의 생화학적 정제에 사용될 수 있다. 재조합 바이러스는 세포로부터 또는 숙주 세포 주변의 배양 매지로부터 직접 회수할 수 있다. 바이러스는 다양한 생화학적 수단, 예를 들면, 겔 여과, 여과, 크로마토그래피, 친화성 정제, 구배 초원심분리 또는 크기 배제 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 재조합 바이러스는 약제학적 조성물로 제형화하기 전에 임의의 적합한 수단을 사용하여 함량(즉, 동일성), 순도 또는 효능(즉, 활성)에 대해 시험할 수 있다. 방법은, 이로써 제한되지 않지만, 면역분석, ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯팅, 서던 블롯팅 또는 PCR, HUVEC 분석 등을 포함할 수 있다.
V. 치료 방법
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 본원에 제공된 약제학적 유효량의 약제학적 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 병리학적 혈관신생 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 노화 관련 황반 변성(AMD), 습성-AMD, 건성-AMD, 망막 신혈관형성, 맥락막 신혈관형성 당뇨병성 망막증, 증식성 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색증, 중심 망막 정맥 폐색증, 분지상 망막 정맥 폐색증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막 허혈, 허혈성 망막증 및 당뇨병성 망막 부종으로 이루어진 안과 신혈관 질환 그룹으로부터 선택된다.
일부 경우에, 건성 AMD가 치료될 수 있다. 일부 경우에, 건성 AMD는 중심 지형학적 위축으로 지칭될 수 있고, 이후에 망막 하부에서 망막 색소 상피의 위축 및 눈의 중심부에서 광수용체의 후속적 손실을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 및 모든 형태의 AMD의 치료를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 본원에 제공된 약제학적 유효량의 약제학적 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 AMD 또는 안과 신혈관 질환의 예방학적 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 AMD가 발병하거나 당해 질환의 초기 증상을 나타내는 위험에 있는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이는 동시에 또는 순차로 눈의 치료를 포함할 수 있다. 동시 치료는 당해 치료가 동시에 각각의 눈에 투여되거나, 양쪽 눈이 치료 의사 또는 기타 의료 제공자의 동일한 방문 동안에 치료되는 것을 의미할 수 있다. 환자는 AMD의 증상을 나타내는 눈의 건강한 다른쪽 눈에서 AMD의 발병 위험이 높거나 환자는 AMD의 발병을 향해 유전적 요소를 갖는 것으로 보고되어 있다. 본 발명은 다른쪽 눈에서 AMD의 예방에 있어서 예방학적 치료로서 사용될 수 있다.
다른쪽 눈에서 안관 신혈관 질환의 진행에 대한 증가된 위험의 기초가 되는 메카니즘은 알려져 있지 않지만, 이러한 상승된 위험을 상술하는 당업계의 다수의 연구가 있다. 예를 들면, 한 가지 이러한 대규모 연구에서, 110개의 다른쪽 눈에서는 고도 AMD로 진행했고, 98개의 눈에서는 맥락막 신혈관형성(CNV)가 발병했고, 15개의 눈에서는 중심와 지형학적 위축(GA)이 발병한 것으로 관찰되었다[참조: Ophthalmologics. 2011;226(3): 110-8. doi: 10.1159/000329473. Curr Opin Ophthalmol. 1998 Jun;9(3):38-46]. 비-안과 특성(연령, 성별, 고혈압 병력 또는 흡연) 또는 기준선(병변 조성, 병변 크기 또는 시력)에서 연구 눈의 안과 특징은 이러한 코호트에서 고도 AMD로의 진행을 예측했다. 그러나, 통계학적 분석은, 드루센 크기, 초점 고색소 침착 및 비중심와 지형학적 위축을 포함하는 제1 눈의 AMD 증상이 다른쪽 눈에서 AMD의 발병 위험을 평가하는데 있어서 유의한 독립적 관계를 갖는 것을 나타낸다. 최근의 연구는 안과 특성 중에서 유전적 요인 및 특정한 환경적 요인이 다른쪽 눈에서 AMD의 발병 위험의 증가에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타냈다[참조: JAMA Ophthalmol. 2013 Apr l;131(4):448-55. doi: 10.1001/jamaophthalmol.2013.2578]. 미처리 다른쪽 눈에서 잘 특성화된 AMD 발달 위험 증가를 고려하면, 당해 질환에 기인하는 발병 및 후속의 시력 상실을 예방하기 위한 방법이 당해 기술분야에서 요구되고 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "환자"는 질환 또는 장애를 갖거나 질환 또는 장애 등을 갖는 것으로 의심되는 개체를 지칭한다. 대상체, 개체 또는 환자는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다. 포유동물의 예는, 이로써 제한되지 않지만, 포유동물 부류의 임의의 구성원: 인간, 비-인간 영장류, 예를 들면, 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예를 들면, 소, 말, 양, 염소, 돼지; 가축 동물, 예를 들면, 래빗, 개 및 고양이; 설치류를 포함하는 실험 동물, 예를 들면, 랫트, 마우스 및 기니아 피그 등을 포함한다. 비-포유동물의 예는, 이로써 제한되지 않지만, 조류, 어류 등을 포함한다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
용어 "대상체" 또는 "개체"는 또한 연령 20세 이상의 당해 질환 또는 장애를 앓고 있는 인간을 포함한다. 예상치 않게, 본 발명은 광범위한 환자 연령에서 사용될 수 있다. 이는, 보다 빈번하게는 연령 65세 이상의 환자에서 나타나는 AMD와 일반적으로 관련되지 않는 보다 어린 환자를 포함한다. 본 발명의 인간 대상체 또는 환자는 적어도 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100세의 연령을 포함할 수 있다. 본 발명의 인간 대상체 또는 환자는 최대 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100세의 연령을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 용어 "대상체" 또는 "개체"는 페니실린에 대해 상이한 반응을 갖는, 예를 들면, 이의 효과에 대해 내성 또는 감수성을 갖는 환자, 또는 약물에 대해 알레르기 반응의 증상을 나타내거나 결여하는 환자를 포함한다.
A. 전달 방법
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 임의의 유도 방법을 사용하여 망막하 부위에 투여된다. 일부 경우에, 전달 방법은 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입되는 미국 공개특허공보 제2010008170호에 기재된 것들과 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 망막하 부위에 대한 직접 투여는 시린지를 통한 액체 약제학적 조성물의 주사를 포함한다. 또 다른 예에서, 직접 투여는 벡터 또는 재조합 바이러스의 전달을 위한 캐뉼라 또는 기타 적합한 장치에 의한 주사를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 직접 투여는 sFLT-1 등의 도입유전자의 전달에 적합한 벡터를 추가로 포함하는 임플란트를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 임플란트는 망막 내에 또는 망막 주위에 직접 이식될 수 있다.
중심 망막, 황반, 및 망막의 중심와 영역은 포유동물 중에서 영장류에 독특하다. 추가로, 영장류 및 인간 사이에 AMD의 해부학적 및 후속의 발병에서 명확한 차이가 있다. 중심 망막은 중심와, 황반 및 주위 부분을 포함하는 영장류 눈의 혈관 아케이드 사이의 후극 주변의 망막 영역이다. 황반은 망막의 중심 부근이고, 대략 1.5 mm의 직경을 갖는다. 이러한 부분은 최고 농도의 막대 및 원추 광수용체를 함유한다. 황반의 중심에는 중심와, 최대 농도의 원추 광수용체를 함유하는 작은 피트(pit)이다. 망막의 황반 및 중심와 영역은 또한 주요 RPE 세포를 함유한다. 망막의 이들 영역은 미세 디테일(시력) 및 색의 인식에 관여한다. 이 영영은 인간 시력(미세 시력)에 관여하기 때문에, 황반 및 중심와의 망막하 공간에 대한 벡터의 안전한 및 효과적 표적화가 바람직하다. 일부 경우에, 본 발명의 약제학적 조성물은 중심 망막에 투여된다. 일부 경우에, 이는 중심와 외부의 중심 망막에 투여된다.
요약하면, 황반 및 중심와의 망막하 공간에 벡터를 전달하는 일반적 방법은 하기 간단한 개요에 의해 설명될 수 있다. 이러한 실시예는 당해 방법의 특정 특징을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
일반적으로, 벡터는 수술용 현미경을 사용하여 직접 관찰하에 안내(망막하) 주사된 현탁액의 형태로 전달될 수 있다. 이러한 과정은 하나 이상의 작은 망막절개에 의한 미세 캐뉼라를 사용하여 망막하 공간 내로 벡터 현탁액의 주사에 의해 수행된 유리체절제를 포함할 수 있다.
요약하면, 주입 캐뉼라는 조작 전체에 걸쳐 주입(예: 염수)에 의해 정상 지구 용적을 유지하기 위해 소정 위치에 봉합될 수 있다. 유리체절제는 적절한 구경 크기(예: 20 내지 27게이지)의 캐뉼라를 사용하여 수행하고, 여기서 제거되는 유리체 겔의 용적은 주입 캐뉼라로부터 염수 또는 기타 등장성 용액의 주입에 의해 치환된다. 유리체절제는 (1) 이의 피질(후부 유리체 막)의 제거가 캐뉼라에 의한 망막의 투과를 용이하게 하고; (2) 이의 제거 및 유체(예: 염수)에 의한 치환이 벡터의 안내 주사를 수용하기 위해 공간을 생성하고, (3) 이의 조절된 제거가 망막 파열 및 계획 외의 망막 박리의 가능성을 감소시키기 때문에 유리하게 수행된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 적절한 구경 크기(예: 27 내지 45 게이지)의 캐뉼라를 사용하여 망막하 공간에 블레브(bleb)를 생성함으로써 중심 망막 내의 망막하 공간 내로 직접 주사된다. 다른 실시양태에서, 벡터 현탁액의 망막하 주사는 중심 망막 중의 망막하 공간 내로 소용적(예: 약 0.1 내지 약 0.5 ml)의 적절한 유체(예: 염수 또는 링거액)의 망막하 주사에 의해 선행된다. 망막하 공간 내로 이러한 초기 주사는 망막하 공간 내에 초기 유체 블레브를 확립하여, 초기 블레브의 위치에서 국지화된 망막 박리를 유발한다. 이러한 초기 유체 블레브는 (벡터 전달 전에 주사면을 정의함으로써) 망막하 공간으로 표적화된 전달을 촉진시키고, 맥락막 내로 가능한 벡터 투여 및 유리체 강 내로 벡터 주사 또는 역류의 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 초기 유체 블레브는 동일한 또는 추가의 미세 구경 캐뉼라를 사용하여 초기 유체 블레브에 직접 이들 유체의 투여에 의해 하나 이상의 벡터 현탁액 및/또는 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는 유체로 추가 주사될 수 있다.
벡터 현탁액 및/또는 초기 소용적의 유체의 안내 투여는 시린지에 부착된 미세 구경 캐뉼라(예: 27 내지 45 게이지)를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 시린지의 플런저는 풋 페달의 압하에 의한 것과 같은 기계 장치에 의해 구동될 수 있다. 미세 구경 캐뉼라는 강막절개를 통해, 유리체 공간을 횡단하여, 치료되는 망막 부분(중심 망막 내)에 따라 각각의 대상체에서 미리 결정된 부위의 망막 내로 진행한다. 한 가지 실시양태에서, 투여는 중심와의 외부 부위에 수행된다. 직접 가시화 하에서, 벡터 현탁액은 자가-밀봉 비-팽창 망막절개로 국지화된 망막 박리를 유발하는 신경감각 망막하에서 기계적으로 주사된다. 상술한 바와 같이, 벡터는 중심 망막 내에 블레브를 생성하는 망막하 공간 내로 직접 주사될 수 있거나, 벡터는 팽창(및 망막 박리 부분의 팽창)을 유발하는 중심 망막 내의 초기 블레브에 주사될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터 현탁액의 주사는 블레브 내로 또 다른 유체의 주사가 계속된다.
이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 망막하 주사(들)의 속도 및 위치는 황반, 중심와 및/또는 주요 RPE 세포를 손상시킬 수 있는 국지화된 전단력을 제공할 수 있다. 망막하 주사는 전단력을 최소화하거나 억제하는 속도로 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 15 내지 17분에 걸쳐 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 17 내지 20분에 걸쳐 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 20 내지 22분에 걸쳐 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 1분에 걸쳐 또는 약 1 내지 3분에 걸쳐 또는 1분 이내에 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 35 내지 약 65 ㎕/분 또는 65 ㎕/분 내지 약 150 ㎕/분의 속도로 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 35 ㎕/분의 속도로 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 40 ㎕/분의 속도로 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 45 ㎕/분의 속도로 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 50 ㎕/분의 속도로 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 55 ㎕/분의 속도로 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 60 ㎕/분의 속도로 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 65 ㎕/분의 속도로 주사된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 약 100 ㎕/분의 속도로 주사된다. 당업자는 블레브의 주사 속도 및 시간이, 예를 들면, 중심 망막의 세포에 접근하기에 충분한 망막 박리를 제공하는데 필요한 벡터의 용적 또는 블레브의 크기, 벡터의 전달에 사용된 캐뉼라의 크기, 및 본 발명의 캐뉼라의 위치를 안전하게 유지하는 능력에 의해 유도될 수 있음을 인지할 것이다.
하나 또는 복수(예: 2, 3 또는 그 이상)의 블레브가 생성될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법 및 시스템에 의해 생성된 블레브 또는 블레브들의 전체 용적은 눈의 유체 용적, 예를 들면, 통상의 인간 대상체에서 약 4 ml를 초과할 수 없다. 각 개개 블레브의 전체 용적은 바람직하게는 약 0.1 내지 0.2 ml이다. 당업자는 본 발명의 방법 및 시스템에 따르는 블레브의 생성에 있어서 안과 구조의 손상을 회피하기 위해 적절한 안압이 유지되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 각각의 개개 블레브의 크기는, 예를 들면, 약 50 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 50 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 0.1 내지 약 0.2 ml, 약 0.1 내지 약 0.3 ml 또는 > 0.3 ml일 수 있다.
블레브의 원래 위치의 엣지 외부의 표적 망막(예: 중심 망막)의 부분을 안전하고 효율적으로 형질도입하기 위해, 일부 경우에서, 블레브를 조작하여 블레브를 형질도입용 표적 부분에 재배치시키는 것이 바람직할 수 있다. 블레브의 조작은 블레브 용적에 의해 생성되는 블레브의 의존성, 블레브를 함유하는 눈의 재배치, 하나 이상의 블레브를 함유하는 눈 또는 눈들을 갖는 인간 머리의 재배치 및/또는 유체-공기 교환에 의해 수행할 수 있다. 이러한 부분은 일반적으로 망막하 주사에 의해 박리에 내성이 있기 때문에, 이는 특히 중심 망막과 관련된다.
일부 실시양태에서, 유체-공기 교환은 망막하 주사 후에 사용된다; 주입 캐뉼라로부터의 유체는, 예를 들면, 공기를 망막 표면으로 분출하는 것으로부터 공기에 의해 일시적으로 치환된다. 공기의 용적은 유리체 강으로부터의 염수 유체를 치환하기 때문에, 블레브는 유리체 강으로의 유출 없이 소정 위치에 유지된다. 눈 지형을 적절하게 배치함으로써, 일부 경우에 망막하 벡터의 블레브는 인접한 부분(예: 황반 및/또는 중심와)을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, 블레브의 질량은 유체-공기 교환의 사용 없이도 이를 끌어들이기에 충분하다. 블레브의 이동은 눈에서 목적하는 위치로 블레브를 끌어들이도록 인간 대상체의 머리 위치를 변경함으로써 추가로 촉진될 수 있다. 블레브의 목적하는 형상이 달성되면, 유체는 유리체 강으로 복귀한다. 유체는 적절한 유체, 예를 들면, 신선한 염수이다. 일반적으로, 망막하 벡터는 망막절개로의 망막복귀 없이 및 안내 탐폰삽입 없이 제자리에 잔류할 수 있고, 망막은 약 48시간 이내에 자연적으로 재접속할 것이다.
안구 질환의 치료를 위한 AAV-2의 망막하 투여는 희귀 유전병, 레버 선천성 흑내장("LCA")의 치료에서 입증되었다. LCA의 병리 및 LCA 환자 모집단은 습성-AMD의 것들과 상이하고, 따라서 유전자 치료 및 특히 AAV-2를 사용한 습성 AMD의 치료는 rAAV.sFLT 임상 연구 전에 안전하고 효과적일 수 있음은 예상되지 않았다. 구체적으로, LCA는 망막 단백질 RPE-65의 불충분한 발현에 의해 유발된 변성 유전성 질환이다. 이는, 청소년, 일반적으로 연령 25 내지 30세까지 전체 실명을 유도하는 영아 및 유아에서 시력 열화를 서서히 유발한다. 대조적으로, 이전에 기재된 바와 같이, 습성 AMD는 일반적으로 연령 65 내지 75세에서 개시되는 인생 후기에서 망막의 새로운 혈관의 성장에 의해 유발된다. 새로운 혈관의 존재는 AAV 입자, 도입유전자 또는 도입유전자 생성물이 LCA 연구에서 밝혀진 것보다 많은 양으로 눈 외부로 전송된다는 관심을 제기한다. 추가로, 외래 물질에 대한 면역 시스템 및 면역 반응은, rAAV.sFLT-1 등의 바이러스 벡터를 사용한 습성 AMD의 치료가 안전하고 효과적이라는 실시예 12에 기재된 연구 결과 전에 불확실하게 작성한 환자 연령에 따라 변화한다.
B. 치료 효과
일부 실시양태에서, 발병된 눈에 본 발명의 약제학적 조성물의 단일 주사는 루센티스R 치료의 잇점을 가질 뿐만 아니라, 하나의 단일 주사만을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 기존의 혈관에서의 누출을 정지시킬 수 있고, 적어도 18개월 동안 AMD에 2차적인 DNV을 앓고 있는 환자의 망막하 공간에서 새로운 혈관 형성을 추가로 억제할 수 있고, 일부 실시양태에서 활성은 3 내지 5년 동안 지속한다. 누출 및 새로운 혈관 형성의 억제는 발병된 환자에서 실명의 발달을 예방한다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 대상체의 유리체 중의 sFLT-1 단백질 수준은 약 500 내지 5,000 pg/ml, 약 600 내지 4,000 pg/ml, 약 800 내지 3,000 pg/ml, 약 900 내지 2,000 pg/ml, 또는 약 1,000 내지 1,800 pg/ml, 500 내지 700 pg/ml, 700 내지 1,000 pg/ml, 1,000 내지 1200 pg/ml, 1200 내지 1,500 pg/ml, 1,800 내지 2000 pg/ml이다. 일부 경우에, 인간 대상체의 유리체 중의 단백질 수준은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700. 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 또는 2400 pg/ml이다. 일부 경우에, 인간 대상체의 유리체 중의 단백질 수준은 최대 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 또는 2400 pg/ml이다.
일부 경우에, 단백질 "수준"은 단백질의 임의 양 또는 상대량을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 수준은 농도(예: pM, nM, μM 등), 몰농도(예: m)으로서, 질량(예: pg, ug, ng 등) 또는 임의의 적합한 측정치로서 측정될 수 있다. 일부 경우에, 단위가 없는 측정치가 수준을 나타낼 수 있다.
일부 경우에, 단백질 수준은 상기 약제학적 조성물의 투여후 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 0.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 또는 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 또는 365일에 측정될 수 있다. 일부 경우에, 단백질 수준은 상기 약제학적 조성물의 투여후 최대 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 0.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 or 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 또는 365일에 측정될 수 있다. 일부 경우에, 단백질 수준은 상기 약제학적 조성물의 투여후 적어도 72시간에 측정된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여는 일반적으로 부작용 또는 역효과를 유도하지 않는다.
일부 경우에, 벡터는 상기 약제학적 조성물의 투여후 7, 14, 21 또는 30일에 인간 대상체의 눈물, 혈액, 타액 또는 뇨 샘플에서 검출되지 않는다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터의 존재는 당해 기술분야에 공지된 qPCI 또는 ELISA에 의해 검출된다.
일부 경우에, 벡터는 상기 약제학적 조성물의 투여후 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 0.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 또는 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 또는 365일에 인간 대상체의 눈물, 혈액, 타액 또는 뇨 샘플에서 검출되지 않는다. 일부 경우에, 벡터는 상기 조성물의 투여후 최대 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 0.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 또는 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 또는 365일에 인간 대상체의 눈물, 혈액, 타액 또는 뇨 샘플에서 검출되지 않는다. 일부 경우에, 벡터는 상기 약제학적 조성물의 투여후 적어도 72시간에서 측정되는 인간 대상체의 눈물, 혈액, 타액 또는 뇨 샘플에서 검출되지 않는다.
일부 실시양태에서, 인간 대상체는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 기간에 걸쳐 연속 안과 검사에 의해 평가된 임상적으로 유의한 망막 독성을 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체는 최대 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 기간에 걸쳐 연속 안과 검사에 의해 평가된 임상적으로 유의한 망막 독성을 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, 표면상, 전방 세그먼트 또는 유리체 염증 징후는 적어도 2개월 기간에 걸쳐 인간 대상체에서 존재하지 않는다. 일부 경우에, 표면상, 전방 세그먼트 또는 유리체 염증 징후는 약제학적 조성물의 투여후 1주 또는 3, 6, 9 또는 12개월에 인간 대상체에서 존재하지 않는다.
일부 실시양태에서, 투여 단계후 정상 범위의 약 10% 이내의 세포독성 T 세포 반응을 포함하는 염증 징후는 관찰되지 않는다. 일부 실시양태에서, ELISpot에 의해 측정한 T-세포 반응은 증가하지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포는 HLA-DR 또는 Ki67을 발현하지 않고, 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입되는 문헌[참조: Lai et al. 2011; Gene Therapy]에 기재된 바와 같은 활성화된 작동체 표현형을 발생하지 않는다. 일부 실시양태에서, 유리체의 염증은 투여 단계 후에 생체현미경검사(BE) 및 간접 검안경검사(IOE)에 의해 관찰되지 않는다. 일부 실시양태에서, 10일 이내에 해결된 유리체의 염증 흔적은 투여 단계 후에 생체현미경검사(BE) 및 간접 검안경검사(IOE)에 의해 관찰되지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체는 투여후 적어도 120일 동안 구제 치료를 필요로 하지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체는 투여후 적어도 30일, 적어도 60일, 적어도 90일, 적어도 120일, 적어도 180일, 적어도 270일 또는 적어도 365일 동안 구제 치료를 필요로 하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 구제 치료는 본 발명에 기재된 약제학적 조성물의 초기 투여후 VEGF 억제제의 소정 용량의 투여를 지칭한다. 구제 치료는 질환 질환의 징후 및 증상을 방지 또는 역전시키기 위해 눈 환자에서 VEGF 억제의 양을 강화하기 위해 투여된다. 구제 치료를 투여하는 결정은 실시예 12에 기재된 임상 연구에서와 같은 소정의 진단학적 기준, 또는 활성 질환의 징후가 환자에서 존재하는 의사의 임상적 판단에 기초할 수 있다.
일부 실시양태에서, 투여후 적어도 120일 동안 상기 인간 대상체에서 시력 상실, IOS 상승, 망막 박리 또는 임의의 안내 또는 전신 면역 반응의 증거는 없다. 일부 실시양태에서, 투여후 적어도 30일, 적어도 60일, 적어도 90일, 적어도 120일, 적어도 180일, 적어도 270일 또는 적어도 365일 동안 상기 인간 대상체에서 시력 상실, IOP 상승, 망막 박리 또는 임의의 안내 또는 전신 면역 반응의 증거는 없다. 일부 실시양태에서, 투여후 최대 30일, 적어도 60일, 적어도 90일, 적어도 120일, 적어도 180일, 적어도 270일 또는 적어도 365일 동안 상기 인간 대상체에서 시력 상실, IOP 상승, 망막 박리 또는 임의의 안내 또는 전신 면역 반응의 증거는 없다.
일부 실시양태에서, 환자의 최고 교정 시력(BCVA)는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 라인까지 개선된다.
일부 실시양태에서, 형광안전 혈관조영(FA)에 의해 평가된 신혈관형성의 감소는 투여 단계를 따른다.
일부 경우에, 망막 두께는 치료 효과를 조사하기 위해 측정할 수 있다. 일부 경우에, 인간 대상체의 중심 망막 두께는 본 발명의 약제학적 조성물을 사용한 치료후 12개월 이내에 50 마이크론, 100 마이크론 또는 250 마이크론 이상 증가하지 않는다. 일부 경우에, 인간 대상체의 중심 망막 두께는 본 발명의 약제학적 조성물을 사용한 치료후 3개월, 6개월 또는 9개월 또는 12개월 이내에 적어도 50 마이크론, 100 마이크론, 200 마이크론, 250 마이크론, 300 마이크론, 400 마이크론, 500 마이크론, 600 마이크론까지 감소한다. 인간 대상체의 중삼 망막 두께의 감소는 본 발명의 약제학적 조성물의 투여후 1, 3, 7 또는 10일에 또는 이내에 취한 시간점에서의 중심 망막 두께를 기준선 측정치와 비교하여 측정할 수 있다.
C. VEGF 억제제를 사용한 병용 치료
일부 실시양태에서, 방법은 약제학적 유효량의 VEGF 억제제를 인간 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 VEGF에 대한 항체 또는 이의 작용성 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 라니비주맵을 포함한다. 다른 실시양태에서, VEGF 억제제는 가용성 수용체, 융합 단백질 또는 이의 단편, 예를 들면, 아플리베르셉트 또는 sFLT01을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 상기 VEGF 억제제의 투여후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 상기 VEGF 억제제의 투여후 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 상기 VEGF 억제제의 투여후 90일 이내에 투여된다.
일부 실시양태에서, 환자는 도 13에 개략된 바와 같은 프로토콜하에 치료된다. 재조합 바이러스에 의해 발현된 단백질이 적합한 수준으로 발현된 후(또는 "on"), 환자는 기준-기반 재치료에 따른다:
a. 질환이 재발한 경우, 라니비주맵 재치료를 허용한다.
b. 대조군에서는 연간 5 내지 8회 재치료를 기대한다.
c. 치료 그룹에서, 재치료 수의 실질적 감소와 함께 동등의 시력을 기대한다.
환자는, 활성 CNV의 징후가 존재하는 경우, 재치료에 적합하다:
a. 차단된 개인(기술자 및 안과의)에 의해 평가된 객관적 기준에 기초하여
b. 재치료 기준은 항-VEGF 제제를 사용한 이전 실험에서 "필요에 따라"(PRN) 치료와 함께 실질적 경험에 기초한다.
재치료는 활성 질환의 징후에 기반하여 다음과 같이 정당화된다:
a. > 10 인간 대상체의 이전 방문(망막 원인에 기인)으로부터 조기 치료 당뇨병성 망막증 연구(ETDRS) 문자 소실, 또는 기능 상실의 환자 인식과 함께 이전 방문으로부터 > 5 ETDRS 문자의 감소;
b. 임의의 증가된, 새로운 또는 지속적 감각, 망막하 색소 상피(RPE) 또는 OCT 상의 망막내 유체;
c. FA를 통한 증가된 CNV 누출의 징후.
일부 실시양태에서, VEGF 억제제는, 단백질 발현을 적합한 수준으로 증가시키면서 질환 질행을 방지하기 위해, 상기 약제학적 조성물의 투여전 적어도 1회 및 상기 투여후 약 30일 간격으로 추가 1 또는 2회 투여된다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 상기 약제학적 조성물의 투여전 적어도 2회 투여된다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 상기 약제학적 조성물의 투여후 6 내지 7주에 걸쳐 투여된다.
일부 실시양태에서, VEGF의 투여 빈도는 연간보다 감소되거나 완전히 정지된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 VEGF 억제제의 3회 이상 치료 후에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 AMD 환자가 다른 VEGF 억제제의 사용후에 BCVA의 개선을 나타내지 않는다는 관찰 후에 사용된다.
D. 기타 병용 치료
또 다른 바람직한 실시양태에서, 환자의 치료는 다른 치료제, 예를 들면, 화학치료, 방사선, 수술, 항-염증제, 선택된 비타민 등과 조합하여 본원에 제공된 하나 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 다른 제제는 약제학적 조성물의 투여 전후에 투여되거나 동시 투여될 수 있다.
본 발명의 실시양태는 제시된 이론적 실시양태 없이 실시할 수 있다. 또한, 이론적 실시양태는 본 출원인이 제시된 이론에 구속되지 않는다는 것을 이해하는 것으로 제시된다.
본 발명의 바람직한 양태가 제시되고 본원에 기재되었으나, 이러한 실시양태가 단지 예로서 제공된 것임은 당업자에게 명백하다. 본 발명으로부터 벗어나지 않고도 다수의 변형, 변화 및 치환이 당업자에게 발생할 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대체는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 것이 이해되어야 한다. 하기 특허청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이들 특허청구범위 및 이들의 등가물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
핵산의 유효량은 특정한 발현된 단백질, 표적화되는 특정 질환, 환자 및 그 또는 그녀의 임상 상태, 체중, 연령, 성별 등의 함수일 것이다.
실시예
본 발명의 정신을 벗어나지 않고 실질적으로 유사한 결과를 생성시킬 수 있는 많은 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 참조는 기술된 주제에 관한 그 전문이 참조로서 포함된다. 하기 실시예는 단지 예시적 목적으로 포함되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
구체적으로 특정되지 않은 경우, 하기 실시예의 백분율이 총 중량 퍼센트 함량 wt%라는 것이 설명되어야 한다.
실시예
본 발명의 정신을 벗어나지 않고 실질적으로 유사한 결과를 생성시킬 수 있는 많은 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 참조는 기술된 주제에 관한 그 전문이 참조로서 포함된다. 하기 실시예는 단지 예시적 목적으로 포함되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
구체적으로 특정되지 않은 경우, 하기 실시예의 백분율이 총 중량 퍼센트 함량 wt%라는 것이 설명되어야 한다.
실시예 1
rAAV.sFlt-1
일례의 재조합 바이러스는 rAAV.sFlt-1이다. 이는 벡터 및 절단된 가용성 VEGF 수용체 1(sFLT-1)의 인간 형태를 코딩한다. 벡터는 혈청형 2의 재조합 복제-결함 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이다.
rAAV.sFlt-1은 적정 제조 기준(cGMP)하에 제조했다. 제조 현장에서, 최종 생성물은 프로토콜 요건(즉, 200□l의 1 × 1010 또는 1 × 1011 바이러스 게놈)에 따라서 무균 저-바이러스 결합 마이크로원심분리 튜브(개별적으로 팩키징됨, 저유지, 무균된 평평한 캡 바이알)에 등분화하고, 최종 생성물 방출을 기다리기 위해 -80℃에서 저장했다. 각 바이알은 단일 환자에 사용하기에 충분한 벡터(투여되는 100□l)를 함유했다.
재조합 바이러스, rAAV.sFlt-1은 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 유도되는 가용성 VEGFR 수용체 1(VEGFR1) 또는 sFLT-1을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 2(rAAV2) 벡터이다. rAAV.sFlt-1 벡터 및 골격으로서 사용되는 손상되지 않은 AAV2 게놈은 문헌[참조: Lai et. al. Gene Therapy 2002 vol. 9 (12) 804-813]에 기재되어 있는 바와 같이 제조했다. rAAV2 벡터는 바이러스 코딩 서열이 결여되고, 즉 rep 및 cap은 치료 유전자를 위한 발현 카세트로 치환되어 있다. rAAV.sFlt-1의 활성 잔기는 sFlt-1이다. sFLT-1은 자연적으로 발생하는 혈관 내피 증식 인자 수용체 1(VEGFR1 또는 Fit-1)의 가용성 절단 형태이다. sFLT-1은 VEGF의 유일하게 공지된 내인성 특이적 억제제이다. sFLT-1은 선택적 스플라이싱에 의해 생성되고, 이는 막 근위 면역글로불린형 도메인, 막관통 영역 및 세포내 티로신-키나제 도메인이 결여된다. 따라서, 이는 단지 최초 6개의 세포외 면역글로불린형 루프, 이어서 31개의 독특한 아미노산 잔기를 함유한다. sFLT-1은 최초로 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 확인되었지만, 이는 이후 태반에서 자연적으로 발생하고, 임신한 여성에서 전신적으로 순환하는 것으로 확인되었다. rAAV.sFlt-1을 생성하는데 사용된 sFLT-1은 전장 막 관통 FLT-1의 최초 6개의 세포외 면역글로불린형 도메인을 코딩하는 개방 판독 프레임, 이어서 독특한 31-아미노산의 긴 C-말단 확장을 함유하여 대안적으로 상술된 분비 가용성 FLT-1 이소형인 스플라이싱을 나타낸다.
ITR은 최대 수준의 도입유전자 발현에 대한 완만한 프로모터 활성을 갖는 것으로 나타났지만, 카세트는 일반적으로 프로모터/인핸서 조합, 작은 인트론 서열, 치료 유전자의 cDNA 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. rAAV.sFlt-1에서, 인간 CMV 주요 전방 초기 유전자 인핸서/프로모터 및 키메라 인트론은 sFLT-1 cDNA의 상류에 배치하였다. 원숭이 바이러스 40 폴리아데닐화(SV40 폴리 A) 신호는 sFLT-1 cDNA의 하류에 배치하였다.
시험관내 VEGF에 대한 sFLT-1의 결합이 광범위하게 입증되었다. VEGF-유도된 혈관신생을 억제하는 sFLT-1의 능력은 이의 잠재적인 임상 응용을 위해 상당한 주목을 받았지만, 인간에서의 효능 또는 적합성의 증거는 실시예 12에서 기재된 rAAV.sFlt-1의 임상 연구 이전에는 제시되지 않았다. sFLT-1의 지혈 활성은 2개 메카니즘; i) 높은 친화성으로 결합하는 VEGF의 격리 및 ii) VEGF 수용체 Flt-1 및 KDR/Flk-1의 막관통 이소형에 의한 불활성 헤테로이량체의 형성에 의한 VEGF의 억제로부터 생성된다.
뉴클레오티드 서열 및 rAAV.sFlt-1을 생성하기 위해 사용된 플라스미드 벡터의 다이아그램
rAAV.sFlt-1은 당해 기술 분야[참조: Xiao et al, 1998. J Virololgy, 72(3): 2224-2232]에 공지된 바와 같이, pSSV.CI.hsFlt-1 플라스미드 벡터 및 헬퍼 플라스미드로부터 DNA를 사용하여 인간 배아 신장 293 세포의 삼중 형질감염에 의해 생성되었다. rAAV.sFlt-1은 핵 분리, 밀도 구배 원심분리 및 헤파린 설페이트 친화성 컬럼 크로마토그래피의 순차적 공정을 사용하여 정제하였다. sFLT-1 플라스미드 벡터의 개략도를 도 1에 제시한다.
제형
rAAV.sFlt-1은 무균 저-대-결합 마이크로원심분리 튜브에서 1 × 1010 벡터 게놈/100uL(저용량) 및 1 × 1011 벡터 게놈/100uL(고용량)의 2개 농도로 무균 인산염 완충된 생리식염수(pH7)에서 제형화했다. 제형은 방부제를 함유하지 않고, 단지 망막하 주사에 의한 1회-해동 단일 사용하기 위한 것이다.
rAAV(bv).sFlt-l
제2 예의 재조합 바이러스는 rAAV(bv).sFlt-l이다. rAAV(bv).sFlt-l은 Sf9 곤충 세포 중의 바쿨로바이러스 발현 시스템(BEVS)을 사용하여 생성된 혈청형 2의 재조합 복제 결함 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이고, 절단된 가용성 VEGF 수용체 1(sFLT-1)의 인간 형태를 코딩한다. 상기 벡터는 Sf9 세포에서 2개의 재조합 바쿨로바이러스인 Bac-inRep-inCap 및 Bac-sFlt-1을 사용하는 감염을 사용하여 생성하였다. Bac-sFlt-1은 문헌[참조: Maniatis et al.]에 기재된 바와 같고 이하 추가로 기술되는 바와 같이, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 FragOOlm-BHKan으로부터 클로닝된 8.7kb 플라스미드, AVA01-pFB-CMV-sFlt, 및 플라스미드 골격 V109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kan에 의한 전기천공적격 세포의 형질전환으로부터 생성된 백미드 DNA로부터 유래되었다. FragOOlm은 블루에론 바이오테크, 엘엘씨(Blue Heron Biotech, LLC; Bothell, WA)에 의해 화학적으로 합성되어 BHKan 골격으로 클로닝된 다음, 순차적 핵산 요소로부터 형성되었다: ITR (AAV 혈청형 2), CMV-IE 프로모터, 키메라 인트론, 5' 비해독된 영역(UTR), sFlt-1 코딩 서열, SV40 폴리A 영역, ITR(AAV 혈청형 2). 플라스미드 V109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kan은 비로벡, 인코포레이티드(Virovek, Inc.; Hayward, CA)로부터 수득하였다. 플라스미드는 카나마이신 항생물질 내성 유전자, ColEl 기원 및 재조합 AAV 카세트를 함유하고, 이는 CMV-IE 프로모터, 인트론, 다중 클로닝 서열 및 AAV 혈청형 2로부터 역방향 말단 반복체(ITR)가 인접한 SV40 폴리A 영역을 함유한다. 이 rAAV 카세트는 젠타마이신 내성 유전자 및 Tn7L 부착 부위가 인접한다. AVAOl-pFB-CMV-sFlt는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 또는 기타 원핵생물 조절 서열을 함유하지 않는다. Bac-inRep-inCap은 AAV 혈청형 2로부터 rep 및 cap 유전자를 위한 발현 카세트를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스이다.
바쿨로바이러스에서 rAAV(bv).sFlt-l 생산
rAAV(bv).sFlt-l은 미국 특허원 제12/297,958호에 기재된 방법에 따라, 보다 구체적으로는 다음과 같이 바쿨로바이러스에서 생산하였다: Sf9 세포를 28℃에서 100units/ml의 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 SF900 II SFM 배지 중에서 약 107세포/ml로 증식시키고, 감염 전에 약 5×106 세포/ml로 희석시켰다. Bac-inRep-inCap 및 Bac-sFlt-1은 각각 하나의 m.o.i에서 AAV 유형 2 벡터를 생성하기 위해 세포를 28℃에서 3일 동안 감염시키는데 사용하였다. 3일 감염 후, 세포 펠릿을 탁상원심분리기 중에서 2,000rpm으로 15분 동안 원심분리로 수집하였다. 세포 펠릿을 문헌[참조: Urabe et al, Hum Gene Ther. 1; 13(16): 1935-43 (2002)]에 기재된 바와 같이 용해 완충제에 용해시키고, 세포상 핵산(DNA 및 RNA)을 벤조나제(Sigma, St. Louis, Mo.)로 소화시켰다. 세포 용해물은 아반티 J-25 원심분리기(Beckman, Fullerton, Calif.) 중에서 8,000rpm으로 30분 동안 원심분리로 투명하게 한 다음, 5ml의 1.55 g/cc 및 10ml의 1.32g/cc의 CsCl 용액을 함유하는 SW28 원심분리기에 부하시켰다. 28,000rpm에서 15℃에서 약 16시간 동안 원심분리후, rAAV-함유 분획은 원심분리 튜브를 주사기 바늘을 사용하여 천공시켜 수집하고, CsCl 초원심분리의 제2 라운드에 적용하였다. rAAV-함유 분획은 원심분리 튜브를 주사기 바늘을 사용하여 천공시켜 다시 수집하고, 염 및 세정제를 제거하기 위해 PBS 완충제로 투석시켰다. 벡터 역가는 제조업자의 프로토콜(Applied Biosystems, Foster City, Calif)에 따라서 정량적 실시간 PCR 분석에 의해 결정하였다.
실시예 2
VEGF-유도 내피 세포 증식의 시험관내 억제
연구를 수행하여 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 증식의 VEGF-유도를 평가하고 VEGF-유도된 HUVEC 증식이 rAAV-매개된 sFLT-1로 억제되는지를 결정하였다. 형질도입된 세포 중의 sFLT-1의 존재는 최초 조절된 배지의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다(도 2, 패널 a). rAAV.sFlt-l-형질도입된 및 rAAV.gfp-형질도입된 293 세포로부터 조절된 배지를 희석의 증가에 있어서 VEGF-처리된 HUVEC에 첨가하였다. 대조군 기아 배지(소 내피 성장 인자가 없는 정상 HUVEC 증식 배지)만이 또한 포함되었다. 헤파린을 각 웰에 100 ㎍/mL로 첨가하였다. VEGF 및 상이한 조절 배지로 처리된 HUVECS의 상대적 VEGF-유도 증식은 25 μL의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트로졸륨 브로마이드(MTT, 5 mg/mL, Sigma)를 4시간 동안 37℃에서 각 웰에 첨가하여 분석하였다. rAAV.sFlt-1-형질도입된 293 세포로부터 40 μL의 조절 배지 중의 rAAV 벡터로 코딩된 분비된 sFLT-1은 HUVECS의 VEGF-유도된 증식을 32%까지 억제하기 위해 확인하였다. 조절 배지의 용적의 배가하면, 기아 배지에서의 배양과 유사한 기저 수준과 동등한 세포 증식을 갖는 완전한 억제가 유도되었다(도 2, 패널 b).
rAAV.sFt-1 벡터 효력의 시험관내 평가
연구를 수행하여 ELISA에 의해 형질도입된 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포의 인간 sFlt-1 단백질 발현을 정량화하여 재조합 인간 sFlt-1 유전자를 코딩하는 AAV 벡터의 효력을 평가하였다. 인간 배아 신장 293 세포를 아메리칸 타입 배양물 저장소(Rockville, MD, USA)로부터 수득하고, 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM; Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 10% 태아 소 혈청(FBS, GIBCO) 및 1× 페니실린-스트렙토마이신-글루타민으로 배양시켰다. 모든 배양물을 가습 대기 중에서 37℃ 및 5% C02에서 유지시켰다.
HEK293 세포를 8E4 또는 1.5E5 세포/24웰에서 씨딩시키고, 2% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 1×103 내지 1×106 범위의 감염 다중도(MOI)에서 재조합 AAV 벡터로 60-90% 밀집도로 형질도입하였다. 72시간 후, 형질도입후, 조절 배지를 수집하였다. 조절 배지의 분량은 시약을 사용하고 R&D 시스템즈 SVR100B Quantikine ELISA 인간 sVEGF Rl/sFlt-1 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)로부터의 표준 지침에 따라 ELISA를 위해 제조하였다. 샘플, 표준 및 대조군은 R&D 시스템즈 ELISA 시약을 사용하여 ELISA 키트 지침에 따라 제조한 다음, sVEGF Rl/sFlt-1에 대한 항체로 예비-코팅된 ELISA 플레이트로 옮기고, 실온에서 2시간 동안 수평 오르비탈 마이크로플레이트 진탕기 상에서 배양시켰다. 배양 후, 항-sVEGF Rl 접합체(2시간), 기질 용액(30분) 및 정지 용액을 표준 ELISA 분석 절차에 따라 각각 사이에 흡인 및 세척 단계로 각 웰에 순차적으로 적용하였다. 샘플, 표준 및 대조군의 광학 밀도(OD)는 ELISA 플레이트 판독기로 기질 반응의 중지 30분 이내에 측정하였다. pg/mL의 sFlt-1 농도는 ELISA 플레이트 판독기로부터 OD 측정을 사용하는 SoftmaxPro 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
rAAV.sFlt-1 및 rAAV(bv).sFlt-l의 연구 결과는 도 25a 및 도 25b에 제시한다. rAAV.sFlt-1 및 rAAV(bv).sFlt-l로 형질도입후 72시간에서 HEK293 세포로 발현된 sFlt-1 단백질의 농도는 1×104의 MOI에서 100 내지 1,000 pg/mL, 1×105의 MOI에서 100 내지 10,000 pg/mL 및 1×106의 MOI에서 1,000 내지 10,000 pg/mL이다.
실시예 3
마우스에서 rAAV.sFlt-1 연구
광수용체 세포로부터 인간 VEGF의 도입유전자 발현에 의해 유도된 느리지만 안정한 망막 신혈관형성을 갖는 유전자도입 마우스(trVEGF029)를 망막 혈관신생 모델로서 사용하였다. 이러한 마우스를 사용하는 2개의 별도의 연구를 수행하였다.
제1 마우스 연구에서, 13마리 유전자도입 마우스를 하나의 눈에 rAAV.sFlt-1 벡터(1 × 1011 벡터 입자) 및 다른쪽 눈에 대조군 벡터의 투여 전후의 눈의 신혈관형성 변화에 대해 평가하였다. 눈은, 주사 후 1, 3 및 8개월 후에 플루오레세인 혈관조영법을 사용하여 신혈관형성 변화에 대해 평가하였다. 혈관신생 정도, 세기 및 단계를 3명의 관찰자에 의해 등급화하고(0-4), 시험된 눈에 수용된 치료에 마킹하였다. 중앙값 등급 '3'(주사전)으로부터 주사 1개월의 중앙값 등급 '1'(P= 0.012)로의 신혈관형성 등급화에서 통계적으로 유의한 전반적인 감소가 존재하였다. 이 감소는 rAAV.sFlt-1 주사 후 3개월(중앙값 = 1; P = 0.001) 및 8개월(중앙값 = 1; P = 0.001)에서 유지되었다. rAAV.sFlt-1 벡터의 주사는 대조군 벡터-처리된 눈에서 8%(13마리 중 1마리)와 비교하여 처리된 눈이 85%(13마리 중 11마리)에서 장기간(적어도 8개월) 혈관신생 혈관의 퇴화를 유도했다.
이 임상 연구에서 눈의 조직학적 검사는, 광수용체의 방해 또는 손실이 rAAV.sFlt-1로 주사된 눈에 비해 대조군 벡터 주사된 눈에서 유의적으로(P < 0.01) 더욱 현저했다는 것을 나타낸다. sFLT-1의 발현은 또한 조직 샘플의 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응 분석에 의해 확인하였고, sFLT-1을 위한 mRNA를 시험된 모든 4개의 눈에서 검출하였다. 대조군(rAAV.gfp) 벡터로 주사된 눈과 비교할 때, rAAV.sFlt-1로 주사된 눈에서는 어떠한 rAAV.sFlt1 벡터-특이적 부작용도 주목되지 않았다.
trVEGF02 유전자도입 마우스에서 수행된 제2 연구에서, 연구 목적은 rAAV.sFlt-1의 망막하 주사가 sFLT-1의 장기간 발현에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 임의의 세포 매개된 면역 반응을 유도하였는지 또는 망막에 면역 반응 관련 손상을 일으키는지를 결정하는 것이었다. 이 연구에서, 50마리의 trVEGF02 유전자도입 마우스는 한쪽 눈에 rAAV.sFlt-1(8 × 109 바이러스 입자) 또는 인산염-완충된 염수(PBS)를 망막하 주사하였다. 이어서, rAAV.sFlt-1 또는 대조군 처리 그룹으로부터 30마리 마우스의 망막은 면역 세포(백혈구, 마크로파지 및 B- 및 T-림프구)의 존재에 대해 주사후 1주 및 1개월에 평가하였다. 후방 아이 컵의 유동 세포측정 검사는 주사후 1주에 CD45+ 백혈구(대조군에 비해 6.6-배 증가; P < 0.05) 및 CD1lb+ 마크로파지(대조군에 비해 5.7-배 증가; P < 0.036)에서 통계학적으로 유의한 증가가 존재하였음을 나타냈다. 그러나, 이 시점에 CD19+, CD8+ 및 CD4+(B- 및 T-림프구)에서는 차이가 없었다. 주사후 1개월에서, rAAV.sFlt-1 또는 PBS로 처리된 마우스 눈에서 백혈구 서브세트(즉, CD45+, CD19+, CD1lb+, CD8+ 또는 CD4+ 세포) 사이의 세포수에는 차이가 없으므로 백혈구 및 마크로파지의 침윤이 일과성이었음을 시사했다. 1주 및 1개월 시점에서 이러한 마우스로부터 비장의 림프구 서브세트의 유도 세포측정 평가는 림프구 수에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 이 발견은 비록 일과성 국지화 면역 반응이 망막에서 나타났지만, 관찰된 전신 면역 반응은 존재하지 않았음을 시사한다.
이 제2 연구에서, rAAV.sFlt-1 또는 PBS 주사된 마우스 중 5마리의 눈의 조직학적 검사는 검사된 임의의 마우스의 망막에서 어떠한 관찰가능한 면역-반응 관련 파괴 또는 후유증도 존재하지 않음을 나타냈다.
망막 신혈관형성의 이 유전자도입 마우스 모델(trVEGF02)에서 신혈관형성 수준에 대한 rAAV.sFlt-1의 영향을 평가하기 위해, rAAV.sFlt-1 또는 PBS 주사된 마우스의 망막을 또한 처리후 2개월에 2명의 상이한 평가자에 의해 독립적으로 등급화하였다. 전체적으로, rAAV.sFlt-l-주사된 눈에서 평균 신혈관형성 등급에서 유의한 감소가 존재한(주사전: 1.46 ± 0.58; 주사후: 0.81 ± 0.57; P < 0.00015) 반면, PBS 대조군 주사된 눈에서 평균 신혈관형성 등급에서는 유의한 증가가 존재하였다(주사전: 1.08 ± 0.56; 주사후: 1.63 ± 0.96; P < 0.018).
이 제2 마우스 연구로부터의 발견은 명백하게 rAAV.sFlt-1에 의한 치료가 망막 신혈관형성 및 AMD의 이 마우스 모델에서 관찰된 신혈관형성의 점진적인 증가를 역전시키는 것으로 나타났음을 지시한다. 더욱이, 단지 제한된 국지화와 염증 반응이 rAAV.sFlt-1의 망막하 주사후 1주일에 관찰되었고, 1개월에 해결되었다. 이 면역 반응은 망막에서 rAAV.sFlt-1의 장기간 치료 효과를 손상시키는 것으로 나타나지 않았다.
이 실시예 3에서 기재된 유전자도입 마우스 모델은 본원에 기재된 약제학적 조성물이 VEGF 억제가 관여하는 기타 망막 혈관 질환의 치료 및/또는 예방용으로 사용될 수 있음을 증명한다. 이들은 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막 허혈, 당뇨병성 망막 부종, 증식성 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색증, 망막 중심 정맥 폐색증 및 분지상 망막 정맥 폐색증을 포함한다. 임상 연구에서, 일부 VEGF 억제제, 예를 들면, 루센티스는 당뇨병성 황반 부종 및 망막 정맥 폐색증을 포함하는 특정의 이러한 질환을 효과적으로 치료하는 것으로 나타났다. 이러한 마우스 모델에서 입증된 rAAV.sFlt-1의 효능은 rAAV.sFlt-1이 또한 이러한 VEGF 매개된 질환을 치료하는데 효과적이다는 것을 나타낸다.
실시예 4
랫트에서 rAAV . sFlt -1 연구
랫트 rAAV.sFlt-1 연구에서, 눈의 신혈관형성의 두 모델: 소작-유도된 각막 신혈관형성 및 레이저 광응고-유도된 맥락막 신혈관형성(CNV)이 사용되었다. 각막 신혈관형성 모델에서, 22마리 랫트에게 한쪽 눈의 전방 챔버에 rAAV.sFlt-1 벡터(8 X 108 바이러스 입자)를, 다른쪽 눈에 대조군 벡터(rAAV.gfp)를 주사한 후, 각막 소작시켰다. 이어서, 눈을 소작후 4일에 신혈관형성에 대해 세극등 사진촬영을 사용하여 조사했다. 유의하게 낮은 비율의 각막 신혈관형성이 대조군-처리된 눈과 비교하여 rAAV.sFlt-1-처리된 눈에서 발견되었다(각각 27% 및 63%; P = 0.009). 눈의 조직학적 조사는 각막 혈관이 대부분의 소작된 rAAV.sFlt-l-처리된 눈에서는 관찰되지 않았음을 나타냈다. 조직학적 검사는 또한 각막 간질성 층의 세포 침윤이 rAAV.sFlt-1-처리된 눈에 비해 대조군 벡터-주사된 눈에서 더욱 현저했음을 나타냈다. 또한, 대조군 벡터 처리된 눈에서 명백한 부종 및 각막 간질 팽윤이 존재한 반면, rAAV.sFlt-1-처리된 눈에서는 중요한 조직 팽윤의 증거가 존재하지 않았다.
레이저 광응고 유도된 CNV 모델에서, 10마리 랫트는 한쪽 눈에 rAAV.sFlt-1 벡터(8 × 108 바이러스 입자) 및 다른쪽 눈에 대조군 벡터(rAAV.gfp)를 망막하 주사하였다. 레이저 광응고를 사용하여 주사후 1개월에 CNV를 유도하였다. 레이저 광응고후 5주에, 눈을 플루오레세인 혈관조영법을 사용하여 CNV에 대해 조사하였다. 레이저-처리된 영역의 41%만이 대조군 벡터 처리된 눈에서 60%(P = 0.002)에 비해 rAAV.sFlt-1 처리된 눈에서 누출을 나타낸다. 레이저-유도된 CNV 후 16주에, rAAV.sFlt-1-처리된 눈은 대조군 눈보다 유의적으로 낮은 신혈관형성을 나타냈다.
주사 부위에 바로 인접한 영역에서 눈의 조직학적 검사는 정상적인 망막 색소 상피 및 정상적인 외측 세그먼트 및 외핵층을 나타냈다. 이러한 발견은 sFLT-1 발현과 관련된 명백한 독성이 없었음을 시사했다. 망막전위도는 또한 rAAV.sFlt-1-처리된 눈의 정상적인 기능을 나타냈다. 대부분의 rAAV.sFlt-1 및 대조군 벡터-처리된 레이저 병변은 망막하 세포막을 발달시켰다. 그러나, rAAV.sFlt-1로 처리된 눈에서 병변은 일반적으로 덜 증식성 내피 세포를 가져 플루오레세인 혈관조영법 발견을 반영하고, 혈관형성(즉, 신혈관형성) 비율이 rAAV.sFlt-1-처리된 눈에서 감소되었음을 나타낸다.
당뇨병 랫트 모델에서 rAAV.sFlt-1 및 rAAV(bv).sFlt-1 연구
당뇨병성 망막증(DR) 및 당뇨병성 황반 부종(DMF)의 치료를 위한 rAAV.sFlt-1 및 rAAV(bv).sFlt-l의 안전성 및 효능을 추가로 평가하기 위해, 당뇨병 랫트 모델에서 실험을 수행한다.
당뇨병 환자의 실명은 혈액-망막-장벽의 최종적 파괴 및 후속적인 혈관 누출을 유도하고 황반 부종을 유도하는 염증에 의해 매개된다. 스트렙토조토신(STZ)-당뇨병 랫트 모델은 충분히 특성화된 혈관 누출 패턴을 나타내고, 여기서 VEGF는 2주 빨리 강력하게 상향조절된다[참조: Miyamoto, K., et al. Proc Natl Acad Sci USA 96, 10836-10841 (1999)]. DR 동물 모델을 치료하기 위한 현재 접근법은 단지 혈관 누출의 부분적 해결만을 입증한다.
당뇨병은 스트렙토조토신(50mg/kg)의 복강내 주사로 브라운 노르웨이 랫트에서 유도시켰다. 당뇨병은 혈중 글루코즈 측정에 의해 확인하고 모니터링했다. 혈당치 > 350mg/dl의 랫트는 당뇨병으로 간주한다. 당뇨병 발병 후 8일에, 랫트를 문헌[참조: Chalberg, T.W. et al, Invest Ophthalmol Vis Sci 46, 2140-2146 (2005)]에 기재된 확립된 기술을 사용하여 1×1010 또는 5×l010 vg의 rAAV.sFlt-1 또는 rAAV(bv).sFlt-l을 함유하는 5μL로 망막하 주사(그룹당 n= 12개 눈)로 처리했다. AAV2.GFP(5×l010 vg) 및 비히클을 대조군으로서 주사하였다. 비-당뇨병성 및 당뇨병성 비처리 그룹은 또한 대조군으로서 사용된다.
혈관 누출에 대한 rAAV(bv).sFlt-l 발현 sFLT-1의 효과는 60일에서의 측정치이다. 망막 혈관 누출은 트레이서로서 FITC-접합된 알부민을 사용하는 주사 후 FITC-알부민 누출 방법으로 측정한다. FITC-알부민 누출 방법은 직접 순환으로부터 망막으로 누출하는 FITC-알부민 누출량을 측정하고, 망막 혈관 투과성을 측정하기 위해 통상적으로 사용되는 방법이다. 주사된 눈에서 망막 혈관 누출은 비-당뇨병성 대조군, 비처리된 및 비히클 처리된 당뇨병성 눈, 및 야생형 AAV 혈청형 2 및 8과 비교한다.
결과: rAAV(bv).sFlt-l 발현 sFLT-1은 STZ-당뇨병 랫트에서 혈관 누출을 감소시키는 반면, AAV2.GFP 및 기타 대조군의 주사는 그렇지 않다.
실시예 5
원숭이에서 rAAV.sFlt-1 연구
rAAV.sFlt-1의 효능 및 안전성은 또한 CNV를 유도하기 위해 레이저 광응고를 사용하여 AMD의 비인간 영장류(마카쿠)에서 시험하였다. 인간에서 AMD의 치료법을 개발하는데 있어서 하나의 과제는 비인간 영장류가 AMD를 발달하지 않는다는 것이다. 레이저 광응고 유도된 CNV는 AMD의 일부 증상을 시뮬레이팅하지만, 기본적인 생물학적 과정은 만성 질환의 진행보다는 오히려 급성 손상의 치유이고, 따라서 AMD 또는 기타 CNV계 질환을 갖는 인간에서 CNV에 대한 임의의 특별한 치료법의 성능은 예측되지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 인간 눈은 비영장류 눈보다 비인간 영장류 눈과 해부학적으로 더 유사하기 때문에, 비인간 영장류는 빈번히 잠재적인 치료 또는 기타 개입에 대한 독성 및 조직학적 반응을 평가하기 위해 연구된다.
비인간 영장류에 대한 제1 연구에서, 5마리 마카쿠 원숭이는 한쪽 눈에 rAAV.sFlt-1(4 × 1012 바이러스 입자)를, 다른쪽 눈에 대조군 벡터(rAAV.gfp)를 망막하 주사하였다. 원숭이의 눈 건강은 망막하 주사 후 주기적으로 평가하였다. 대조군 또는 rAAVsFlt-1 벡터의 망막하 주사에 직접적으로 관련된 명백한 합병증은 없었다. 일과성 결막 자극 및 유리체 흐림이 주간 주사후 관찰되었고, 이는 2주까지 투명화된다. 망막하 주사는 원숭이 중의 하나의 오른쪽 눈에서는 성공하지 않았고, 따라서 이 동물은 추가의 평가를 수행하지 않았다.
40-100uL의 rAAV 현탁액의 망막하 주사는 망막을 들어올려 색소 상피와 광수용체 층 사이에 국지화 방식으로 벡터가 수용된 블레브를 생성한다. 이 블레브는 24 내지 48시간 이내에 자가 치유된다. 침상 침투 시점에서 망막 색소 상피에서 최소한의 방해를 제외하고, 어떤 기타 망막 이상도 추적 치료 기간(주사후 3 내지 17개월)에 관찰되지 않았다. 어떤 기타 이상 또는 부작용도 관찰되지 않았고, 시간이 없을 때 수술과 관련된 망막 박리였다.
rAAVsFlt-1의 장기간 치료 효과를 평가하기 위해, 이어서 4마리 주사된 원숭이를 벡터에 의한 치료 후 16개월에 강력한 레이저 광응고에 적용하였다. 8개의 병변을 각 눈에서 레이저를 사용하여 유도한 다음, 레이저 치료 후 2주 및 4주에 CNV에 대해 모니터링했다. 레이저 광응고 후, 4마리 원숭이 중 3마리만이 분석가능하였고, 따라서 효능 데이터는 3마리 동물에 대해 수집하였다. rAAVsFlt-1로 처리된 3마리 원숭이 눈 중 어떤 것도 CNV-관련 병변을 발달하지 않았고, 단지 약한 플루오레세인 염색은 관찰되어, 최소 누출/신혈관형성을 나타내었다. 대조군 벡터로 처리된 모든 다른쪽 눈들은 CNV-관련 병변을 발달하였다.
망막하 공간으로 주사된 rAAV.sFlt-1의 안전성 및 독성을 평가하는 것을 목적으로 하는 추적 치료 연구에서, 8마리 원숭이를 사용하였고, 5마리는 그들의 왼쪽 눈에 rAAV.sFlt-1을 주사하였고, 두 마리는 그들의 왼쪽 눈에 rAAV.gfp를 주사하였고, 한 마리는 양쪽 눈에 재조합 Flt-1 단백질을 주사하였고, 한 마리는 주사되지 않은 대조군으로서 유지시켰다. 원숭이를 컬러 안저 촬영, 플루오레세인 혈관조영법 및 망막전위도검사법에 의해 주사전 및 주사후 시험하였다. 혈액은 sFLT-1 수준을 평가하기 위해 정기적으로 수집하였고, 말초 혈액 림프구는 면역 세포 서브세트 반응을 평가하기 위한 유동 세포측정법을 위해 단리시켰다. 희생시(주사후 3, 9 및 12개월), 조직은 i) 추출된 게놈 DNA 상의 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하는 rAAV.sFlt-1 벡터 상의 생체내 분포 연구; ii) ELISA에 의한 hsFlt-1 단백질 및 AAV2 캡시드 단백질 수준 정량화; 및 iii) 눈의 조직학을 위해 수집하였다.
컬러 안저 촬영, 플루오레세인 혈관조영법 및 망막전위도검사법은 주사후 눈에 대한 어떤 부작용도 검출하지 않았다. 혈장 sFLT-1 수준은 임의의 수컷 또는 암컷 원숭이 시험에서 임의의 rAAV.sFlt-1 주사 관련된 수준의 상승은 나타내지 않았다. 시신경 샘플을 제외하고, rAAV.sFlt-1 서열은 샘플링된 임의의 기타 조직(림프절, 비장, 간장, 뇌, 뇌, 심장, 비장, 각막)의 게놈 DNA에서 검출되지 않았다. 눈의 헤마톡실린 및 에오신 염색된 파라핀-매립 단편은 정상으로 나타났다.
비-인간 영장류 해부는 마우스와 같은 작은 포유류의 해부보다 인간 해부학에 보다 유사하지만, 비-인간 영장류에서 연구를 매력적이도록 하는 제한이 존재하지만, 인간에서 임상 결과는 예측되지 않는다. 상기한 바와 같이, 이 실시예에서 연구는 동물이 달리는 건강한 망막 조직을 갖는 레이저 손상 모델을 사용한다. 망막 조직은 질환 망막 조직에서 처럼 경시적으로 열화되지 않고, 질환 특이적 병원 인자도 존재하지 않는다. 비-인간 영장류는 빈번히 생체내 분포, 약물동태 및 용량 의존성, 항체 역가, 면역 반응 및 예측할 수 없는 방식의 염증 반응과 관련하여 인간과 상이하다. 추가의 차이는 ILM(내부 제한 막) 및 이 연구에 사용되는 비인간 영장류보다 인간에서 대략 4배 더 큰 유리체 챔버의 용적을 포함한다. 망막과 유리체 사이의 수송을 제한하는 작용을 하는 인간 내부 제한 막인 장벽은 원숭이의 ILM보다 더욱 더 깊고 효과적인 장벽이다.
실시예 6
안전성 연구
이러한 연구에서, sFLT-1 단백질은 sFLT-1 단백질 검출을 위한 효소 결합된 면역흡착성 분석 키트를 사용하여 동물의 유리체 및 혈장에서 측정하였다. sFLT-1 단백질 수준은 rAAV.sFlt-1이 주사된 동물의 유리체 및 눈에서 상향조절되었다. 도 3a는 rAAV.sFlt-1이 주사된 원숭이 눈(왼쪽 눈) 및 rAAV.gfp가 주사된 대조군 눈 및 주사되지 않은 눈(우측 눈)에서 유리체 sFLT-1 단백질 수준을 도시한다. sFLT-1 단백질 수준은 5개의 rAAV.sFlt-1 주사된 눈 중의 4개에서 유의하게 높았다. 표 5.3.1은 주사되지 않은 및 rAAV.sFlt-1이 주사되고 주사후 1개월에 적출된 마우스 눈에서 sFLT-1 단백질 수준을 나타낸다. 마우스의 눈 및 원숭이의 유리체에서 sFLT-1의 과발현은 그들의 전반적인 행복에 대해 어떠한 부작용을 갖지 않았다. 원숭이에서, 유리체에서 sFLT-1 과발현은 그들의 망막 기능에 대해 어떠한 효과도 갖지 않았고, 눈에 대한 임의의 임상적으로 또는 조직학적으로 명백한 독성 효과를 갖지 않았다. rAAV.sFlt-1 주사된 눈에서 유의하게 높은 FLT-1 단백질 수준은 장기간 rAAV-매개된 hsFLT-1 발현을 시사하고, 주사후 17개월에 원숭이 망막에서 바이러스 mRNA 서열의 검출 및 rAAV-매개된 gfp 발현의 존재에 대한 이전 데이터를 지지한다.
주사후 1개월에 rAAV.sFlt-l-주사된 마우스 눈 및 주사되지 않은 마우스 눈의 hsFLT-1 단백질 수준의 요약
동물 종류 및 눈의 수 처리 주사후 시간(주) sFLT-1 단백질 수준(pg/mL)
마우스(n=1) 주사되지 않음 NA 101.4±4.8
마우스(n=1) 주사되지 않음 NA 91.0±10.9
마우스(n=1) 주사되지 않음 NA 113.4±6.3
마우스(n=1) 주사되지 않음 NA 160.2±8.9
마우스(n=1) rAAV.sFlt-1 주사됨 4 1034.7±44.3
마우스(n=1) rAAV.sFlt-1 주사됨 4 610.3±16.3
마우스(n=1) rAAV.sFlt-1 주사됨 4 1417.2±50
마우스(n=1) rAAV.sFlt-1 주사됨 4 >최대
원숭이에서 혈장 hsFLT-1 수준은 상이한 샘플링 시간에서 어떠한 경향도 나타내지 않았다(도 3b). 이는 rAAV.sFlt-1의 주사가 혈장 hsFLT-1 수준에 대한 명백한 효과를 갖지 않는다고 시사한다. 변동 수준은 원숭이의 행복에 어떤 효과도 갖지 않았다.
면역원성 연구
종/균주 투여 방법 투여 기간 투여량 GLP 컴플라이언스
C57b1/6 마우스 망막하 1, 2 및 4주 8 X 109 벡터 게놈 없음
원숭이 망막하 12개월 8 X 1011 벡터 게놈 없음
표 2: 면역원성 연구에 사용된 동물 균주, 주사 경로, 지속기간 및 rAAV.sFlt-1의 투여량의 요약
실시예 7
마우스에 대한 면역원성 연구
rAAV.sFlt-1 요법에 대한 세포상 면역 반응은 유동 세포측정법을 사용하여 주사후 1, 2 및 4주에 마우스 눈에서 평가하였다. 침윤 백혈구는 CD45 발현에 기초하여 동정되었고, CD11b, CD19, CD4 및 CD8 발현에 기초하여 단구/과립구, B 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포로서 분류된다. 후방 아이 컵은 각 그룹에서 5마리 마우스(rAAV.sFlt-1-주사됨, PBS-주사됨, 주사되지 않은 대조군)로부터 수집하고, 분석을 위해 풀링하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, 이 실험 과정 동안 마우스의 각 그룹으로부터 회수된 세포수에서는 차이가 없었다. 그러나, 주사후 1 및 2주에 CD45+ 세포수는 상당히 증가하였고, 이는 4주까지 사라졌다(두 4b). 1주에 나타난 증가의 거의 모두는, CD4+, CD8+, 및 CD19+ 세포 수의 차이가 없었기 때문에(도 4d-f), CD11b+ 세포의 증가에 기인할 수 있다(도 4c). 그러나, 2주에서, AAV.sFlt-1 주사된 마우스의 눈에 존재하는 CD11b+ 수에서 더 이상 유의한 차이가 없었고, 대신 CD4+ 및 CD8+ T 세포수의 상당한 증가 및 B 세포의 증가를 향한 가능한 경향이 존재했다. 4주에 급격하게 떨어진 CD4+ 및 CD8+ 세포의 수는 PBS-주사된 마우스 및 주사되지 않은 마우스에 비해 아직 유의하게 증가된 상태로 남아 있었다. 대조적으로, 이 실험 과정 동안 비장에서 CD11b+, CD4+, CD8+ 및 CD19+ 세포 수의 변화는 없었다(도 5a-e).
망막을 침윤하는 T 세포의 기능은 이들을 PMA/이노마이신 또는 항-CD3로 자극하고, 유동 세포측정법에 의해 세포내 IFN-감마 생산을 측정함으로써 보다 밀접하게 조사하였다. 도 6은 주사되지 않은 대조군에 비해, 두 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 작은 비율을 rAAV.sFlt-1의 주사후 IFN-감마를 생산하기 위해 프라이밍하였다. IFN-감마 생산 세포의 빈도는 3일째 CD8+ T 세포 사이의 명백한 증가에도 불구하고 실험 과정 동안 유의하게 변화하지 않았다(도 6b). 보다 낮은 수준의 IFN-감마는 T 세포가 rAAV 캡시드 단백질의 부류 I MHC-제한된 에피토프로 재자극될 때 측정되었고, 일부 IFN-감마는 또한 임의의 자극 부재하에 검출되었다(데이터는 도시되지 않음). 종합하면, 이러한 결과는 rAAV.sFlt-1-주사된 마우스의 눈을 침윤하는 T 세포의 작은 비율이 최근에 IFN-감마를 생산하기 위해 활성화되었지만, 이는 이 실험 과정 동안 T 세포 사이에서 변화하지 않았음을 나타낸다.
AAV-sFLT-1 주사된 마우스의 눈에서 면역 세포의 침윤에 대한 이러한 실험을 위해 제시된 데이터는 명백하게 세포 침윤의 2개의 파를 나타낸다. 1주에 CD11b+ 세포의 초기 파, 이어서 2주에 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 파가 존재했다. 중요하게는, 어떤 침윤 파도 4주에는 존재하지 않아 침윤이 자체로 해결되었음을 시사했다. 중요하게는, sFLT-1 단백질 생산성은 이 시점에서 감퇴되지 않았고, 사실 매우 고수준으로 계속 발현되었다.
IFN-감마 생산에 대한 데이터는 약 5%의 CD4+ 및 CD8+ T가 최근에 프라이밍되었고, 이 빈도는 실험 과정 동안 변화하지 않았음을 나타냈다. 후 등(Hu. et al)은 최초로 활성화 T 세포에 의한 혈액-망막 장벽의 파괴를 기재하였고, 여기에 제시된 데이터는 활성화된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 침윤과 일치한다. 그러나, 특이적 펩타이드에 의한 재자극이 단지 실험 과정 동안 변화하지 않는 낮은 수준의 IFN-감마 생산을 나타내기 때문에 이 집단 사이의 캡시드-특이적 T 세포수의 증가의 증거는 없었다. 종합하면, 이러한 관찰은 rAAV.sFlt-1의 주사로 발생하는 최초 상해가 4주 이내에 자체 해결되는 면역 세포 침윤의 단명 파를 생성하지만, 눈의 조직을 상하게 하거나 sFLT-1 발현에 영향을 미칠 수 있는 진행성 면역 반응을 유도하는 것은 실패하였음을 시사한다.
실시예 8
원숭이에서 면역원성 연구
rAAV.sFlt-1 또는 rAAV.gfp의 망막하 주사후 면역 반응은 면역 세포 서브세트 집단에서 변화를 동정하는 항체의 패널을 사용하여 분석하였다. 결과는 도 4에 요약한다. 일부 원숭이에서, 면역 세포 서브세트 집단에서 매우 작은 변화가 관찰되었지만, 그들은 통계적으로 유의하지 않았다. 이에 불구하고, 이는 순환 세포의 보다 상세한 연구를 수행하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 벡터(rAAV) 또는 삽입된 유전자 생성물(sFLT-1)이 면역 활성화를 유발할 수 있는 가능성을 평가했다. B 세포 및 T 세포의 활성화를 조사하였다(도 5 및 도 6). 기타 림프구 집단을 또한 분석하여 치료가 직접 활성화 또는 활성화에 대한 반응을 나타낼 수 있는 임의의 관찰가능한 차이를 유발하는지의 여부를 결정하였다. 분석은 고전적인 마커(Pitcher, 2002 #129) 뿐만 아니라, 최근에 발표된 보고서에 기재된 신규한 표현형 분석(Miller, 2008 #126)의 조합을 사용하여 수행하였다. 표현형 마커의 작은 서브세트(HLA-DR, Ki-67 및 Bcl-2)를 사용하여, 본 발명자들은 rAAV-sFLT-1의 투여후 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 및/또는 B 세포가 활성화 신호를 나타냈는지의 여부를 조사하였다. 밀러(Miller) 및 동료들에 의해 발표된 연구에서, 활성화된 T 세포는 분화 마커 HLA-DR 및 증식용 마커로서 사용되는 세포 주기 관련 핵 항원 Ki-67의 발현을 특징으로 하는 활성화 작동체 표현형을 나타낸다. 휴지 T 세포는 Ki-67을 발현시키지 않는 반면, 사이클링 또는 최근 분할된 T 세포는 Ki-67 발현을 상향조절한다. Ki-67 발현 수준은 통상적으로 항상적 세포 주기의 일부로서 검출된다.
실시예 9
rAAV.sFlt-1의 생체내분포
게놈 DNA는 원숭이 안락사 직후에 수집된 조직(시신경, 림프절, 뇌, 심장, 폐, 비장, 간장, 각막)으로부터 추출하였다. 망막하 공간에 주사된 rAAV.sFlt-1 벡터 작제물이 다른 곳에 존재하는지의 여부를 결정하기 위해, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 게놈 DNA 상에서 수행하였다. 공지된 양의 대조군 플라스미드 pssv.Cl.sflt-1 DNA 사이의 Ct 값의 비교에 기초하여, rAAV.sFlt-1 작제물은 임의의 기타 조직 샘플에서가 아니라, 하나의 주사된 눈의 시신경에서 낮은 유전자 복제수로 발견되었다. 이는, 망막하 공간에 주사된 rAAV.sFlt-1이 주로 눈 내에 잔류한다는 것을 시사한다. 표 4는 주사되지 않았거나 rAAV.sFlt-1 및 rAAV.gfp 주사된 원숭이로부터 추출된 게놈 DNA로부터의 Ct 값의 요약이다.
분석된 상이한 게놈 DNA 및 대조군 플라스미드 DNA에 대한 Ct 값 및 Ct 표준편차 값
샘플 ID Ct 평균 Ct 표준편차
DNA 0 복제 없음 40.83970125 0.08415232
pssv.C 1.hsFlt-1 (0.045ng) 6000000 복제 18.17500393 0.522299978
pssv.C 1.hsFlt-1 (0.009ng) 1000000 복제 22.5311632 0.318372962
pssv.C 1.hsFlt-1 (0.0009ng) 100000 복제 26.23701276 0.183232131
pssv.C 1.hsFlt-1 (0.00009ng) 10000 복제 25.2483849 0.164140658
pssv.C 1.hsFlt-1 (0.000009ng) 1000 복제 29.4265616 0.415926721
대조군 주사되지 않은 원숭이
1 LE 시신경 42.11 0.573
2 RE 시신경 43.58 0.323
3 겨드랑이 LN 45.86 1.319
4 자궁경 LN N/A N/A
5 비장 40.71 0.093
6 간장 44.16 0.604
원숭이 999: rAAV.sFlt-l 주사됨, 3 mo p.i. 안락사시킴
7 LE 시신경 39.13 0.137
8 RE 시신경 42.25 0.153
9 겨드랑이 LN 40.87 0.728
10 아래턱아래 LN 40.54 0.453
11 비장 N/A N/A
12 간장 41.23 0.388
원숭이 8294: sFLT-l 단백질 주사됨, 3 mo p.i. 안락사시킴
13 LE 시신경 42.15 0.545
14 RE 시신경 42.67 0.411
15 겨드랑이 LN 43.92 0.304
16 아래턱아래 LN N/A N/A
17 비장 N/A N/A
18 간장 40.45 0.981
원숭이 8524: rAAV.sFlt-l 주사됨, 9 mo p.i. 안락사시킴
19 왼쪽 각막 39.72 0.975
20 오른쪽 각막 N/A N/A
21 겨드랑이 LN 44.12 0.216
22 자궁경 LN N/A N/A
23 비장 37.91 0.668
24 간장 41.8 0.648
원숭이 8514: rAAV.sFlt-l 주사됨, 12 mo p.i. 안락사시킴
25 오른쪽 시신경 39.96 0.609
26 왼쪽 시신경 28.9 0.057
27 겨드랑이 LN 40.08 0.221
28 자궁경 LN 41.27 0.063
29 비장 39.22 0.196
30 간장 40.79 0.367
31 뇌 41.14 0.798
32 심장 42.19 0.265
33 폐 40.11 2.093
원숭이 8523: rAAV.sFlt-l 주사됨, 12 mo p.i. 안락사시킴
34 왼쪽 시신경 37.27 0.838
35 오른쪽 시신경 37.92 1.181
36 겨드랑이 LN 38.55 0.895
37 자궁경 LN 39.68 0.583
샘플 ID Ct 평균 Ct 표준편차
39 비장 36.44 0.519
40 간장 39.94 0.768
41 8523 뇌 40.29 0.397
42 8523 심장 41.28 0.877
43 8523 폐 41.71 1.186
원숭이 8530: rAAV.sFlt-l 주사됨, 12 mo p.i. 안락사시킴
44 왼쪽 시신경 38.52 0.777
45 오른쪽 시신경 40.67 1.354
46 겨드랑이 LN 42.49 0.841
47 자궁경 LN 38.55 0.895
48 비장 36.44 0.519
49 간장 39.94 0.768
50 뇌 40.29 0.397
51 심장 41.67 1.787
52 폐 39.29 1.474
원숭이 8532: rAAV.sFlt-l 주사됨, 12 mo p.i. 안락사시킴
53 왼쪽 시신경 35.07 1.06
54 오른쪽 시신경 38.14 0.665
55 겨드랑이 LN 40.23 1.171
56 자궁경 LN 40.82 0.496
57 비장 40.09 0.195
58 간장 40.63 1.1052
59 뇌 38.68 0.295
60 심장 40.04 0.685
원숭이 8297: rAAV.sFlt-l 주사됨, 12 mo p.i. 안락사시킴
61 왼쪽 시신경 39.84 1.034
62 오른쪽 시신경 42.17 1.247
63 겨드랑이 LN 41.19 2.174
64 자궁경 LN 41.38 2.040
65 비장 39.09 1.273
66 간장 41.36 0.683
67 뇌 37.84 1.243
68 심장 40.74 0.868
69 폐 42.60 0.276
실시예 10
망막 신혈관형성의 마우스 모델에 대한 효능 연구
광수용체 세포에서 VEGF 상향조절을 통해 생성된 유전자도입 마우스를 연구에 사용하였다. 한쪽 눈에 rAAV.sFlt-1을 주사하였고, 다른쪽 눈에 rAAV.gfp를 주사하였다. 신혈관형성 정도, 강도 및 단계는 합의된 스케일에 기초하여 가장된 관찰자에 의해 등급화했다. 결과는 주사후 1개월에 중앙값 3(심함)으로부터 중앙값 1(완만함)의 신혈관형성 등급에서 통계적으로 유의한 전체적인 감소가 존재하였음(P = 0.012)을 나타냈다. 이 낮은 수준의 플루오레세인 누출은 rAAV.sFlt-1 주사후 3개월(중앙값 = 1; P = 0.001) 및 8개월(중앙값 1; P = 0.001)에서 유지되어 장기간 지속된 rAAV.sFlt-1의 치료 효과를 시사했다.
AAV.sFlt-1 및 AAV.gfp 주사 전후이 눈의 등급 및 주사후 8개월에 광수용체 수/열
동물 ID 주사후 시간(개월)에서 등급 광수용체 수 광수용체의 열 회귀
a0 1 3 8
243 L 1 0 0 0 68.8±14.1b 4-8 적당함
243 R 1 3 3 3 0 0 없음
244 L 2 1 1 1 72.8±18.8b 3-7 적당함
244 R 1 3 2 1 5.8±3.1 0-1 없음
247 L 2 2 0 0 80.8±31.0b 3-8 상당함
247 R 1 1 1 1 28.3±33.3 0-4 없음
249 L 3 1 1 1 0 0 상당함
249 R 3 3 3 4 7.2±13.1 0-1 없음
250 L 3 1 1 1 65.1±24.4b 3-8 상당함
250 R 3 3 3 3 0 0 없음
251 L 3 2 1 1 0 0 상당함
251 R 3 3 3 4 0 0 없음
253 L 3 2 1 1 73.8±20.39b 5-7 상당함
253 R 3 2 3 2 20±30.3 0-2 적당함
254 L 3 1 0 0 61.8±14.3b 4-6 상당함
254 R 2 2 2 2 8.8±9.6 0-1 없음
324 L 1 1 1 1 ND ND 없음
324 R 1 1 1 1 ND ND 없음
326 L 2 1 1 1 ND ND 적당함
326 R 2 2 2 2 ND ND 없음
327 L 2 2 0 0 ND ND 상당함
327 R 2 3 2 2 ND ND 없음
329 L 3 2 2 2 ND ND 적당함
329 R 2 2 2 2 ND ND 없음
330 L 3 3 2 3 ND ND 없음
330 R 3 3 3 3 ND ND 없음
L= AAV.sFlt-1이 주사된 왼쪽 눈, R= AAV.GFP가 주사된 오른쪽 눈, ND= 수행되지 않음
a AAV 벡터 주사전 3일
b 광수용체 수의 통계적으로 유의한 차이(p<0.01)
실시예 11
레이저 유도된 맥락막 신혈관형성의 원숭기 모델 상의 효능 연구
5마리 원숭이는 한쪽 눈에 rAAV.sFlt-1을, 다른 쪽에 rAAV.gfp를 주사하였다. 망막하 주사는 원숭이 중의 하나의 오른쪽 눈에서는 성공하지 않았고; 따라서 이 동물은 추가의 평가를 수행하지 않았다. 40-100㎕의 rAAV 현탁액의 망막하 주사는 망막을 들어올려 색소 상피와 광수용체 층 사이에 국지화된 방식으로 벡터를 수용하는 블레브를 생성한다. 이 블레브는 24 내지 48시간 내에 자체 치료되었다. 침상 관통 시점에 망막 색소 상피에 대한 최소 방해를 제외하고, 어떤 기타 망막 이상도 추적 치료 기간 동안(주사후 3 내지 17개월) 관찰되지 않았다. 어떠한 기타 이상 또는 부작용도 관찰되지 않았고, 시간이 없을 때 수술과 관련된 망막 박리였다.
rAAVsFlt-1의 장기간 치료 효과를 평가하기 위해, 이어서 4마리 주사된 원숭이에게 벡터로 처리후 강력한 레이저 항응고에 적용하였다. 8개 병변은 각 눈에서 레이저를 사용하여 유도하였고, 이어서, 눈을 레이저 처리 후 2 및 4주에 맥락막 신혈관형성에 모니터링하였다. 레이저 광응고 후, 4마리 원숭이 중 3마리만 분석가능하였고, 따라서, 효능 데이터를 3마리 동물에 대해 수집하였다. rAAVsFlt-1로 처리된 3마리 원숭이 눈 중의 어떤 것도 맥락막 신혈관형성-관련 병변을 개발하지 않았고, 단지 약한 플루오레세인 염색이 관찰되어 최소 누출/신혈관형성을 나타낸다. 대조군 벡터로 처리된 모든 다른쪽 눈은 맥락막 신혈관형성-관련 병변을 개발했다. 세마리 동물에 대한 효능 데이터를 표 5에 제시한다.
마카쿠 원숭이에서 레이저 유도된 CNV에 대한 rAAV.sFlt-1 또는 대조군(rAAV.gfp) 벡터의 망막하 투여 효과
원숭이 레이저 유도된 CNV의 시간 플루오레세인 안저 혈관조영법 후 CNV 병변†
번호 (개월)* 오른쪽 눈(rAA V.sFlt-1) 왼쪽 눈(rAA V.gfp)
2주 4주 2주 4주
1 16 0/8 0/8 1/8 6/8
2 16 0/8 0/8 0/8 3/8
4 16 0/8 0/8 0/8 2/8
*CNV는 rAAVs의 망막하 주사후 16개월에 유도되었다.
†레이저 광응고후 신혈관형성(플루오레세인 누출)을 갖는 황반 병변의 수
원숭이의 망막 기능은 망막전위도검사법으로 평가하였다. 주사된 눈 및 주사되지 않은 다른쪽 눈의 반응으로부터 진폭 및 암흑 시간을 계산하여 주사 전 및 주사후 상이한 시간에 비교했다. 결과는 rAAV.sFlt-1, 재조합 sFLT-1 단백질 또는 rAAV.gfp의 주사가 원숭이 망막 기능에 대한 어떠한 부작용도 갖지 않았다는 것을 나타냈다.
실시예 12
습성 AMD를 치료하는데 있어서 치료의 표준은 4-8주마다 재조합 항-VEGF 단백질의 빈번한 안내 주사를 포함한다. rAAV 작제물은 습성 AMD의 치료를 위한 강력한(Kd 약 10pM) 자연 발생적 항-VEGF 단백질, 가용성 Fms-관련 티로신 키나제-1(sFlt-1)을 위해 개발되었다. rAAV.sFlt-1은 UNC 벡터 코어 인간 응용 연구소에서 FDA 및 ICH 가이드라인에 따라 생성하였다. rAAV.sFlt-1의 안전성 및 효능에 대한 8명 환자 조절 연구를 수행하였다. 연구에 대한 자격, 포함 및 제외 기준은 다음과 같다:
자격 기준
연구에 적격인 연령: 65세 이상
연구에 적격인 성별: 둘 다
건강한 지원자 수용: 없음
포함 기준:
· 65세 이상 연령;
· AMD에 부차적이고, 다른 눈에 최대 교정 시력 20/80 - 20/400 이상을 갖는 황반하 CNV;
· 연구 눈의 플루오레세인 혈관조영이 누출성 황반하 맥락막 신혈관형성 병변의 증거를 나타내야 하고;
· 항-VEGF 유리체내 주사에 대한 지원자여야 하고;
· 병변의 전체 치수는 12 황반 광응고 연구 디스크 영역을 초과하지 않아야 하고;
· 광역학적 치료 또는 레이저의 사전 망막 치료가 없고;
· 고지에 입각한 동의를 제공할 수 있고;
· 참가자는 등록시에 임상적으로 허용되는 실험실 및 ECG를 갖고;
· 추적 치료 방문을 포함하는 프로토콜 요건에 적합할 수 있다.
제외 기준:
· 간 효소 > 2 × 정상 상한치;
· 아데노바이러스, A, B 또는 C형 간염, 또는 HIV 바이러스를 포함하는 임의 형태의 활성 감염의 임상적 증거;
· 항-VEGF 주사를 제외한 연구/대조군 눈에서 AMD에 대한 임의의 사전 치료;
· 망막 색상 상피에서 눈물;
· 광범위한 황반하 반흔 조직;
· 당뇨병성 망막증 또는 망막 혈관 폐색과 같은 황반하 CNV AMD 이외의 중요한 망막 질환;
· 눈 위축 또는 백내장과 같은 중요한 비-망막 질환;
· 플루오레세인에 대한 공지된 알레르기
· 프레드니솔론, 기타 항-염증성 스테로이드 또는 면역 억제 약물의 현행 사용. 비스테로이드성 약물, 예를 들면, 아스피린은 허용된다;
· 연구자의 의견에서, 연구에의 참여 때문에 참여자를 위험에 처하게 할 수 있거나 연구 결과 또는 연구에 참여하는 참여자의 능력에 영향을 미칠 수 있는 임의의 기타 중요한 질환 또는 장애;
· 과거 12주간 조사 제품과 관련되는 또 다른 조사 연구에 참여했던 참여자; 및
· 페니실린 민감성.
투여 절차: rAAV.sFlt-1을 함유하는 약제학적 조성물은 다음 절차에 따르는 망막하 주사에 적합한 셋팅에서 연구 대상에게 투여하였다:
1. 대상체의 눈 주위 피부 및 눈꺼풀 가장자리 및 속눈썹을 드레이핑 전에 5% 포비돈 요오드로 세정하였다.
2. 무균 전신 드레이프를 배치하고, 추가의 눈 드레이프를 배치한다.
3. 검안경을 삽입하여, 그것이 눈꺼풀 아래에 잘 배치되어 필드로부터 속눈썹이 떨어지도록 지시하고, 눈 드레이프로 보호된다는 것을 확인한다.
4. 3 x 23G 또는 25G 유리체절제 포트를 삽입하고;
5. 제1 포트에 생리식염수 주입을 연결하고;
6. 제2 포트에 광학 섬유를 삽입하고;
7. 36G-41G 망막하 캐뉼라를 데3 포트에 있는 마이크로커넥터를 통해 약물 주사기에 연결하고;
8. 현미경 제어하에, 100㎕를 망막하에 주사하고;
9. 주사후, 기구 및 포트를 철회하였고;
10. 클로람페니콜 연고를 적용하였고;
11. 무균 사용 용기로부터 아트로핀 1% 방울을 주입하였고;
12. 눈 패드 및 눈 실드를 적용하였다.
rAAV.sFlt-1 연구 결과는 본원에서 요약한다. 8명의 등록된 대상(평균 연령 77세) 모두는 20/40 내지 20/400의 시력으로 활성 황반하 맥락막 신혈관형성을 가졌고, 라니비주맵의 1 및 25 유리체내 주사를 이미 수용하였다. 환자들을 3개의 그룹, 대조군 그룹 및 두 개의 실험 그룹으로 무작위로 분배하였다. 모든 환자들은 연구 1일째 및 30일째에 라니비주맵의 유리체내 주사를 수용했다. 7일째에, 100㎕ 용적 중의 rAAV.sFlt-1의 1 x 1010 벡터 게놈을 망막하 주사를 통해 제1 실험 그룹에 투여하였고, 100㎕ 용적 중의 rAAV.sFlt-1의 1 x 1011 벡터 게놈을 망막하 주사를 통해 제2 실험 그룹에 투여하였다. 실험 그룹 중의 환자에 대한 모두 6가지 경우에, 망막하 유체의 블레브는 4시간 내에 해결되었다. 24시간 후, 유리체 중의 대부분의 공기가 흡수되고, 단지 망막 주사 부위만 가시화되어 잔류했다. 한 환자는 시력에 영향을 미치지 않은 절차와 관련된 최소 출혈을 개발하였다. 유리체절제 후 예상되는 바와 같이, 주사후 14일까지 정상으로 반환되는 호중구수의 일시적 증가가 있었다. 벡터 서열은 주사후 1일에 한 대상의 눈물에서 발견되고 30일까지 명백해졌다. 이 단일 발생 이외에, AAV2는 지금까지 임의의 대상체 혈액, 타액 또는 뇨 샘플에서 qPCR 또는 ELISA로 검출되지 않았다. 자연 발생적 sFLT-1 단백질의 배경 수준은 처리후 증가 없이 뇨, 혈청 및 타액에서 높은 기준 변화를 나타냈다. 유리체 중의 sFLT-1 수준은 또한 대상들 사이에서 변하였다(975-2085pg/ml). 혈액 생화학, 전혈구수 및 T-세포 반응은 기준과 비교하여 임의의 유의한 변화 없이 유지되었다. rAAV.sFlt-1의 망막하 주사는 2개월 동안 일련의 안과 검사로 평가한 바와 같이 임상적으로 유의한 망막 독성은 전혀 나타내지 않았다. 어떤 표면적인 전방 단편 또는 유리체 염증 신호도 임의의 대상에서 존재하지 않았다. 임의의 환자에게서 시력 상실, IOP 상승, 망막 박리 또는 임의의 안내 또는 전신 면역 반응의 증거는 존재하지 않았다. 초기 또는 구제 둘 다의 항-VEGF 치료의 개요는 표 6에서 각 환자에 대해 요약된다.
환자에 의한 라니비주맵 주사의 요약
대상 0일 30일 60일 90일 120일 150일 180일 210일 224일 252일 280일 308일 336일 364일
R1001 X X 0 0 0 0 0 방문 없음 방문 없음 0 0 0 0 0
R1002 X X 0 0 0 0 0 0 0 방문 없음 0 0 0 0
R1003
(대조군)		 X X 0 X X 0 0 X 0 X 0 0 X 0
R1004 X X 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 X
R1005 X X 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
R1006 X X 0 X 방문 없음 0 0 0 0 0 0 0 0 0
R1007
(대조군)		 X X 0 0 0 X 0 0 0 0 0 0 0 0
R1008 X X 0 X 0 0 방문 없음 0 0 0 0 0 0 0
주: 프로토콜에 따라, 0일 및 30일에 주사는 연구에서 모든 환자에 대해 필수적이었다.
특히, 실험 그룹의 어떤 환자도 60일에 구제 치료를 필요로 하지 않았고, 저용량 실험 그룹의 환자 대부분은 90일, 120일, 150일, 180일 또는 210일 또는 270일 또는 365일(1년)에 0 구제 치료를 필요로 했다. 대조군 환자는 다중 구제 치료를 필요로 했다. 이러한 결과는 예상외였고, 습성 AMD로 고통받는 고령 환자의 대규모 코호트를 위한 유전자 치료 가능성을 확장한다. 일반적으로, VEGF 억제제 단백질 또는 기타 항-VEGF 제제의 유리체내 주사와 같은 현재 항-VEGF 요법으로 처리된 환자는 30, 60 또는 90일에 추가의 주사를 필요로 한다.
연구 대상체 또는 환자에서 sFLT-1의 최대 발현 수준은 rAAV.sFLT-1의 망막하 투여후 6 내지 8주에 도달한다. 이러한 소위 "램프-업" 기간 동안, 항-VEGF 제제의 적어도 1, 2 또는 3개의 유리체내 주사는 15 내지 45일 간격으로, 바람직하게는 약 30일 간격으로 주사하여 질환 진행을 예방한다. 유리체내로 주사된 항-VEGF 제제(루센티스 또는 아바스틴 또는 에일리아 또는 기타 비 sFLT 제제)의 흡수를 허용하기 위해 항-VEGF 제제의 제1 유리체내 주사를 rAAV.sFlt-1 투여전 1 내지 30일, 바람직하게는 5 내지 10일에 투여하는 것이 바람직하다. 이 제1 유리체내 주사가 rAAV.sFLT의 망막하 투여전 24시간 미만에 투여되면, 망막하 주사 절차 동안 유리체로부터 세척하여 부치료 항-VEGF 제제 농도 및 질환 진행을 유도할 수 있다.
램프 기간 완료 후, 그들의 AMD를 치료하거나 진행을 예방하기에 충분한 sFLT-1을 발현시키는 환자는, 그들이 의사의 보호하에 유지될 것으로 기대되지만, 추가의 유리체내 항-VEGF 주사가 필요하지 않을 수 있다. 환자를 모니터링하고, 객관적인 기준, 예를 들면, 광 간섭 단층 촬영에 의한 증가된 중심점 망막 두께 측정에 기초하는 필요한 기준에 따라 처리한다.
이 연구에서, 대조군 및 두 실험 그룹의 환자를 대략 매월 기준으로 활성 맥락막 신혈관형성의 신호에 대해 평가하고, 임의의 다음 기준이 충족될 경우, 유리체내 라니비주맵으로 재처리하였다:
- 대상체 이전 방문으로부터 > 10 조기 치료 당뇨병성 망막증 연구 (ETDRS) 문자 손실(망막 원인에 기인하는) 또는 기능 상실의 환자의 인식과 함께 이전 방문으로부터 >5 ETDRS 문자의 감소;
- OCT 상의 임의의 증가된 새로운 또는 영속적인 서브감각 전달성 서브-망막 색소 상피(RPE), 또는 망막내 유체;
- FA를 경유하는 증가된 CNV 누출 신호.
실시예 13
광 간섭 단층 촬영(OCT)
스펙트럼 도메인 광 간섭 단층 촬영(SD-OCT)은 환자의 망막에서 중심점 망막 두께 및 유체 누출을 모니터링하기 위해 승인된 장치(Heidelberg Spectralis® SD-OCT) 및 표준 기술을 사용하여 수행하였다.
광 간섭 단층 촬영(OCT)은 초음파 및 MRI와 유사한 비접촉 의료 화상 기술이다. OCT와 함께, 반사광을 사용하여 눈의 상세한 단면 및 3D 화상을 생성한다. SPECTRALIS® SD-OCT는 동시에 스펙트럼을 교차하는 반사광의 다중 파장, 따라서 그 이름의 스펙트럼 도메인을 측정한다. 스캔의 증가된 속도 및 수는 보다 높은 해상도 및 질환을 관찰하는 보다 우수한 기회로 해석한다. 습성 AMD 환자에서, 새로운 망막 유체의 검출 또는 망막 두께의 임상적으로 유의한 증가는 SD-OCT로 검출될 수 있다[참조: Adhi et al, Curr Opin Ophthalmol. 2013 May; 24(3):213-21; Malamos et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009 Oct; 50(10):4926-33]. AMD 환자에서 이러한 증상의 검출은 루센티스 또는 에일리아와 같은 항-VEGF 요법에 의한 치료를 보증하는 질환 진행을 나타낸다.
연구에서 각 대상의 망막 건강 및 AMD 진행의 증상은 SD-OCT를 통해 모니터링했다. 각각 길이 약 6mm의 황반을 통해 적어도 6 방사상 스캔을 취했고, OCT 화상/스캔을 각각의 지정된 방문에 수집하였다. SD-OCT 화상은 차단된 판독기로 망막내 유체의 존재에 대해 평가하였고, 중심 망막 두께는 Heidelberg Heyex SD-OCT 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 8명 환자에 대해 각 방문에 대한 중심 망막 두께 결과는 이하 표 7에 제시한다.
투여 그룹에 의한 0일째 기준으로부터 마이크론으로 중심 망막 두께의 평균 변화
연구일 14 28 56 84 112 140 168 196 224 252 280 308 336 364
대조군 -
101		 24 -
194		 -
178		 -
176		 -
199		 -
131		 -
124		 -
186		 -
190		 -
198		 -
172		 -
157		 -
138
저용량 -
140		 -
115		 -
161		 -
189		 -
173		 -
163		 -
157		 -
147		 -
149		 -
155		 -
161		 -
144		 -
127		 -
134
고용량 -
254		 -
245		 -
266		 -
254		 -
245		 -
239		 -
235		 -
209		 -
219		 -
225		 -
215		 -
239		 -
246		 -
245
표 7에 제시된 바와 같이, 모든 투여 코호트에서 대상의 평균 중심 망막 두께는 프로토콜에 의해 필요한 바와 같이, 연구 개시시에 항-VEGF 단백질(루센티스)의 투여후에 감소되었다. 예상한 바와 같이, 대조군 그룹에서 환자의 중심 망막 두께는 증가하기 시작하고, 유체는 항-VEGF 단백질의 투여 30 내지 90일 이내에 SD-OCT 화상에서 나타날 수 있다. 예기치 않게, 저용량 및 고용 그룹에서 대상의 중심 망막 두께는 일반적으로 rAAV.sFlt-1에 의해 충분히 조절되고, 경시적으로 증가하지 않는다. 새로운 망막내 유체는 저용량 그룹 대상체 또는 고용량 그룹 대상의 망막에서 발생하지 않는다. 이는 OCT에 의해, 예를 들면, 도 24에 제시된다. 12개월에, rAAV.sFlt-1로 처리된 대상의 중심 망막 두께는 rAAV.sFlt-1을 포함하는 약제학적 조성물의 투여 12개월 이내에 50㎛ 이상으로, 또는 100㎛ 이상으로 또는 250㎛ 이상으로 증가하지 않았다. 기준과 비교할 때, rAAV.sFlt-1로 처리된 인간 대상체의 중심 망막 두께는 50㎛로 또는 일부 경우에 100㎛로 또는 일부 경우에 200㎛로 감소된다. 이 감소는 sFlt-1 투여 8주 이내에 관찰되어 3개월, 6개월, 9개월 및 12개월 유지되었다. 이 결과는 놀랍고, 인간 대상체에서 AMD 및 눈 신혈관형성의 임상적 치료에서 공지되지 않았다. 보다 일반적으로, 항-VEGF 단백질 또는 기타 VEGF 억제제의 추가의 투여 없이, 망막내 유체 및 중심 망막 두께의 증가가 최초 항-VEGF 치료 30일, 60일, 90일 또는 180일에 관찰된다.
플루오레세인 혈관조영법(FA)
FA는 표준 기술을 사용하여 수행하였다. 일시적 화상은 연구 눈을 촬영한다. 중기 및 후기 단계 화상은 연구 및 비연구 눈을 촬영하고, FA는 각각의 지정된 방문에 수득된다.
생체내분포 연구
벡터의 보급은 눈물, 혈장, 뇨 및 타액의 샘플로부터 단리된 벡터 게놈의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 조사했다. 벡터 및 sFLT-1의 생체내분포는 혈장, 눈물 및 타액 중의 sFLT-1 및 AAV2 캡시드에 대해 ELISA로 조사했다.
DNA의 추출
샘플(100-300㎕)을 샘플 수집 카드(Qiagen, Valencia, CA) 또는 무균 발포체 팁 어플리케이터 상에서 피펫팅했다. DNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 각 샘플로부터 추출하였다. 정제된 DNA를 50㎕의 용출 완충제에 용해시켰다. 존재하는 DNA의 양은 분광광도법으로 결정하였다.
실시간 PCR에 의한 rAAV.sFlt-1의 검출
게놈 DNA 샘플(0.5-1㎍)은 TaqMan® 유전자 발현 분석(Applied Biosystems, U.S.A.)을 사용하여 AAV.sFlt-1 벡터의 존재에 대해 스크리닝했다. 분석은 AAV2 및 sFLT-1 서열 사이의 단편을 증폭시키는 한쌍의 비표지된 PCR 프라이머, 및 5' 말단에 FAM™ 또는 VIC® 염료 표지 및 최소 그루브 결합제 잔기 및 3' 말단에 비-형광성 급냉제 염료를 갖는 TaqMan® 프로브로 이루어진다. 사이클링 조건은 50℃에서 2분 동안 1회 유지 및 95℃에서 20초 동안 또 다른 유지에 이어, 95℃에서 3초 동안 및 60℃에서 30초 동안의 45 주기가 이어졌다.
rAAV.sFlt-1 단편에 대해 포지티브인 샘플은 추가로 시험하였고, 존재하는 rAAV.sFlt-1의 유전자 복제수는 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 정량화하였다. 추출된 DNA 0.5-1.0㎍을 백금 SYBR 그린 qPCR 슈퍼믹스-UDG(Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 및 각 프라이머 0.5 uM를 함유하는 20㎕ 반응 혼합물 중에서 IQ5 Bio-Rad 실시간 PCR 시스템(Bio-Rad, Hercules, California, USA)을 사용하여 증폭시켰다. 표적 서열을 함유하는 플라스미드 DNA로 스파이킹된 유사한 샘플 세트를 스파이킹된 샘플과 평행하게 설정하였다. 사용된 프라이머 쌍(전방향: CACTAGTCCAGTGTGGTGGA; 역방향: AGCCAGGAGACAACCACTTC)은 벡터 cDNA로부터의 영역을 Rotorgene(Corbett)을 사용하여 sFLT-1 유전자로 증폭시키기 위해 프라이머3 출력(Whitehead Institute, MA, USA)의 도움으로 설계되었다. 사용된 사이클링 조건은 다음과 같다: 2분 50.0℃, 2분 95.0℃ 및 95.0℃ 20초, 60.0℃ 20초 및 72.0℃ 20초의 60개의 3-단계 주기. 표준 곡선은 동일한 표적 벡터 서열을 갖는 플라스미드 DNA(pSSV.sFlt-1)의 10배 희석으로부터 각 작동에서 생성되었다. 각 샘플을 3회 분석하였다.
ELISA에 의한 sFlt-1 단백질 농도의 정량화
혈장, 눈물 및 타액에 존재하는 sFLT-1의 농도는 샌드위치 면역분석 기술에 기초하는 퀀티킨 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 ELISA에 의해 정량적으로 측정하였다. 샘플(100㎕)을 VEGF Rl/sFLT-1에 특이적인 모노클로날 항체로 코팅된 96-웰에 첨가하고, 2시간 동안 배양하였다. 임의의 비결합된 sFLT-1은 완충제로 세척하여 제거하였다. VEGF Rl/sFLT-1에 특이적인 효소-결합된 폴리클로날 항체로 배양 후, 과량의 항체-효소 접합체를 세척 제거한 다음, 샘플을 기질 용액으로 배양하였다. 효소-촉매된 색원체 형성은 450nm에서 가시 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 샘플 중의 sFLT-1의 농도(pg/ml)는 재조합 인간 sFLT-1로 플롯팅된 교정 곡선을을 사용하여 흡광도 값으로부터 계산하였다.
ELISA에 의한 AAV2의 검출
혈장, 눈물, 뇨 및 타액 중의 AAV2 캡시드의 존재는 AAV2 적정 ELISA 키트(American Research Products, Inc., Belmont, Massachusetts, USA)를 사용하여 분석하였다. 이 키트는 샌드위치 ELISA 기술에 기초하고, 어셈블리된 AAV 입자 상의 입체구조 에피토프에 특이적인 마우스 모노클로날 항체를 사용한다. 이 모노클로날 항체는 마이크로플레이트 스트립 상에 코팅되고, 시험편으로부터 AAV 입자를 포획하기 위해 사용한다. 포획된 AAV 입자는 두 단계로 검출되었다. 먼저, AAV에 대한 비오틴-접합된 모노클로날 항체를 면역 복합체에 결합시켰다. 제2 단계에서, 스트렙타비딘 퍼옥시다제 접합체를 비오틴 분자와 반응시킨다. 기질 용액의 첨가는 구체적으로 결합된 바이러스 입자에 비례하는 색 반응을 유도한다. 흡광도는 450nm에서 측광적으로 측정하였다. 제공된 키트 대조군은 빈 캡시드의 AAV 입자 제조를 함유하고, 이는 미공지된 입자 역가의 샘플의 정량적 측정을 허용한다. 샘플(100㎕)을 플레이트에 첨가하고, 분석은 제조업자의 프로토콜에 따라서 수행되어졌다.
중화 AAV-2 항체의 검출
혈장은 AAV2.gfp로 HEK293 세포의 형질도입을 차단하는 능력에 대해 분석했다. 환자의 혈장은 다중-웰 플레이트 중의 정상 마우스 혈청으로 연속적으로 희석시켰다. AAV2.gfp를 각 웰에 첨가하였고, 플레이트를 HEK293 세포에 3회 첨가하기 전에 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 중성 항체 역가는 AAV2-gfp에 의한 형질도입의 50% 억제를 유도하는 혈장 희석으로서 발현되었다. 최대 gfp 활성은 정상 마우스 혈청에서 희석된 벡터에 의해 나타났고, 최대 억제는 정상 마우스 혈청 중의 배지만으로 나타났다. 각 대상체로부터 기준 혈장은 각 후-op 샘플과 함께 분석하였다. AAV2.gfp에 의한 293T 세포의 형질도입으로부터 그린 세포를 48시간 후 시험 웰에서 계수하고, 기준 혈청 샘플 중의 그린 세포의 수와 비교하였다.
항-AAV2 항체의 검출
AAV2 캡시드에 대한 혈장 항체를 검출하기 위해, 강화된 단백질-결합 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 109 vg/ml의 AAV2(Vector Core Facility, North Carolina)로 코팅시켰다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 차단한 다음, 4℃에서 밤새 연속 희석된 항-AAV2 모노클로날 항체(Industries International, Concord, MA) 또는 환자 혈장의 1:50, 1:100, 1:200 또는 1:400 희석액으로 배양하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항-인간 Ig로, 이어서 테트라메틸 벤지딘(TMP) 기질 및 과산화수소(H202)로 배양하였다. 반응은 인산(H3P04)으로 중지시키고, 플레이트 판독기 상에서 450nm에서 판독한다. 항-AAV2 항체의 역가는 평행하게 결정된 시판 항체이 표준 곡선에 기초하여 계산하였다. 각 값은 3회 측정하였다.
지형학적 위축
인간 연구 대상체를 표준 기술에 따라 이들의 처리된 및 비처리된 눈에서 지형학적 위축 신호에 대해 시험하였다. 지형학적 위축의 증가는 rAAV.sFlt-1로 처리된 환자에서 3개월, 6개월, 9개월 또는 12개월에 관찰되지 않았다. 치료가 최대 15개월, 18개월, 24개월, 36개월, 5년 및 10년 동안 처리된 눈에서 지형학적 위축의 진행을 정지시킬 수 있다고 가정된다.
실시예 14
습성 AMD 및 맥락막 신혈관형성을 치료하기 위한 rAAV.sFlt-1의 안전성 및 효능을 추가로 시험하기 위해, 40명의 추가 대상체를 조절된 임상 연구에 등록하였다. 실시예 12에서와 같이, rAAV.sFlt-1은 UNC 벡터 코어 인간 응용 연구소에서 FDA 및 ICH 가이드라인에 따라 생성하였다. 연구에 대한 자격, 포함 및 제외 기준은 다음과 같았다:
자격 기준
연구에 적격인 연령: 55세 이상
연구에 적격인 성별: 둘 다
건강한 지원자 수용: 없음
포함 기준:
· 55세 이상 연령;
· AMD에 부차적이고, 연구 눈에서 최대 교정 시력 20/30 - 20/400 및 다른 눈에서 20/200 또는 이상을 갖는 황반하 CNV;
· 연구 눈의 플루오레세인 혈관조영이 누출성 황반하 맥락막 신혈관형성 병변또는 현재 항-VEGF 요법에 의한 활성 처리하의 맥락막 신혈관형성의 증거를 나타내야 하고;
· 항-VEGF 유리체내 주사에 대한 지원자여야 하고;
· 병변의 전체 치수는 12 황반 광응고 연구 디스크 영역을 초과하지 않아야 하고;
· 광역학적 치료 또는 레이저의 사전 망막 치료가 없고;
· 고지에 입각한 동의를 제공할 수 있고;
· 참가자는 등록시에 임상적으로 허용되는 실험실 및 ECG를 갖고;
· 추적 치료 방문을 포함하는 프로토콜 요건에 적합할 수 있다.
제외 기준:
· 간 효소 > 2 X 정상 상한치;
· 아데노바이러스, A, B 또는 C형 간염, 또는 HIV 바이러스를 포함하는 임의 형태의 활성 감염의 임상적 증거; 또는 B형 간염 또는 C형 간염의 문서화된 역사
· 항-VEGF 주사를 제외한 연구/대조군 눈에서 AMD에 대한 임의의 사전 치료;
· 망막 색상 상피에서 눈물;
· 광범위한 황반하 반흔, 광범위한 지형학적 위축, 또는 연구자에 의해 결정된 바와 같은 연구 눈에서 농후한 망막하 혈액;
· 연구 눈에서 시력을 손상시킬 수 있는, 당뇨병성 망막증 또는 망막 혈관 폐색과 같은 황반하 CNV AMD 이외의 중요한 망막 질환;
· 시력에 영향을 미치는 중앙 각막 반흔, 시야 결손을 갖는 녹내장 또는 임의의 측정가능한 포도막염을 포함하는 연구 눈에서 눈 위축 또는 중대한 백내장과 같은 중요한 비-망막 질환;
· 플루오레세인에 대한 공지된 알레르기
· 프레드니솔론, 기타 항-염증성 스테로이드 또는 면역 억제 약물의 현행 사용. 흡인된 스테로이드 및 비스테로이드성 약물, 예를 들면, 아스피린은 허용된다;
· 연구자의 의견에서, 연구에의 참여 때문에 참여자를 위험에 처하게 할 수 있거나 연구 결과 또는 연구에 참여하는 참여자의 능력에 영향을 미칠 수 있는 임의의 기타 중요한 질환 또는 장애;
· 과거 12주간 조사 제품과 관련되는 또 다른 조사 연구에 참여했던 참여자; 및
· 참여자 의료 기록에 의해 확인된 페니실린 민감성.
최초 등록된 대상은 20/30 내지 20/400의 연구 눈의 시력으로 활성 황반하 맥락막 신혈관형성을 가졌고, 라니비주맵의 1 및 25 유리체내 주사를 이미 수용하였다. 환자들을 총 14명의 환자 대조군 환자 및 26명의 실험 환자가 등록될 때까지 대조군 그룹 또는 실험 그룹으로 무작위로 분배하였다. 모든 환자들은 연구 1일째 및 30일째에 라니비주맵의 유리체내 주사를 수용했다. 7일째에, 100㎕ 용적 중의 rAAV.sFlt-1의 1 x 1011 벡터 게놈을 망막하 주사를 통해 실험 그룹에 투여하였다.
실시예 12의 연구에서와 같이, 연구 대상체 또는 환자에서 sFLT-1의 최대 발현 수준은 rAAV.sFLT-1의 망막하 투여후 6 내지 8주에 도달했다. 이러한 소위 "램프-업" 기간 동안, 항-VEGF 제제의 적어도 1, 2 또는 3개의 유리체내 주사는 15 내지 45일 간격으로, 바람직하게는 약 30일 간격으로 주사하여 질환 진행을 예방한다. 유리체내로 주사된 항-VEGF 제제(루센티스 또는 아바스틴 또는 에일리아 또는 기타 비 sFLT 제제)의 흡수를 허용하기 위해 항-VEGF 제제의 제1 유리체내 주사를 rAAV.sFlt-1 투여전 1 내지 30일, 바람직하게는 5 내지 10일에 투여하는 것이 바람직하다. 이 제1 유리체내 주사가 rAAV.sFLT의 망막하 투여전 24시간 미만에 투여되면, 망막하 주사 절차 동안 유리체로부터 세척하여 부치료 항-VEGF 제제 농도 및 질환 진행을 유도할 수 있다.
램프 기간 완료 후, 그들의 AMD 또는 맥락막 신혈관형성의 기타 증상을 치료하거나 진행을 예방하기에 충분한 sFLT-1을 발현시키는 환자는, 그들이 의사의 보호하에 유지될 것으로 기대되지만, 추가의 유리체내 항-VEGF 주사가 필요하지 않을 수 있다.
이 실시예에서 인용된 이 연구에서, 대조군 및 실험 그룹의 환자를 대략 매월 기준으로 활성 맥락막 신혈관형성의 신호에 대해 평가하고, 임의의 다음 기준이 충족될 경우, 유리체내 라니비주맵으로 재처리하였다:
- 대상체 이전 방문으로부터 > 10 조기 치료 당뇨병성 망막증 연구 (ETDRS) 문자 손실(망막 원인에 기인하는) 또는 기능 상실의 환자의 인식과 함께 이전 방문으로부터 >5 ETDRS 문자의 감소;
- OCT 상의 임의의 증가된 새로운 또는 영속적인 서브감각 전달성 서브-망막 색소 상피(RPE), 또는 망막내 유체;
- FA를 경유하는 증가된 CNV 누출 신호.
실시예 15
안구 혈관신생 질환 노화 관련 황반 변성(AMD)의 방지 또는 예방을 위한 rAAV.sFlt-1의 안전성 및 효능을 시험하기 위해, 40명(150) 환자를 사용한 추가 조절된 임상 연구를 수행하였다. rAAV(bv).sFlt-1은 론자 휴스톤, 인코포레이티드(Lonza Houston, Inc.)에서 FDA 및 ICH 가이드라인에 따라 생성하였다. 연구에 대한 자격, 포함 및 제외 기준은 다음과 같았다:
자격:
· 연구에 적격인 연령: 50세 이상
· 연구에 적격인 성별: 둘 다
· 건강한 지원자 수용: 없음
포함 기준:
· 비삼출성 AMD를 갖는 환자(AREDS 기준에 따라 카테고리 2, 3 또는 4; 그룹 4에서 무선행 AMD를 갖는 눈은 포함된다); "습성" 또는 "건성"으로 분류된 AMD를 갖는 환자는 포함된다;
· 50세 및 90세 사이의 연령;
· 이해 가능하고 실험 요건에 부합 가능;
· 시력 > 0.4;
제외 기준:
· 현재 안과 임상 시험에 참가;
· AMD 이외의 부수 황반 또는 맥락막 질환 및 AMD의 명백한 징후를 갖는 눈;
· 활성 망막하 신혈관형성(RSNV) 또는 연구 눈에서 레이저 광응고를 필요로 하는 CNV 병변과 함께 삼출성 AMD의 진단을 갖는 눈;
· 시력 감소를 유발하는 중요한 접안 렌즈 혼탁을 갖는 대상체;
· 약시를 갖는 대상체;
· 시신경증(신경장애, 위축, 유두부종), 25 mmHg 초과의 망막내 압력, 3 이상의 녹내장 약, 0.8 이상의 C/D 및 녹내장과 일치하는 시야에 의해 정의된 불안정한 녹내장; 망막 유리체 수술, 변성 근시, 활성 후방 안내 염증성 질환, 국소 안구 스테로이드 약물의 만성 사용, 혈관증식성 망막증(AMD 이외), 열공 망막 박리 및 유전적 황반 영양실조를 갖는 대상체;
· 요구형 심박조율기 또는 뇌전증;
· 비조절된 고혈압증(90 이상의 확장기 및 150 이상의 수축기로 정의됨)을 갖는 대상체;
· 뇌 혈관 질환의 최근 이력(전년 이내)을 갖는 대상체;
· 일과성 허혈 발작(TIA) 또는 뇌 혈관 사고(CVA)가 명백함;
· AIDS의 이력을 갖는 대상체;
· 시험에 등록하기 전에, 3개월 이내에 시험 눈에서 안구내 수술을 받은 대상체;
· 검사 스케쥴을 방문하기 위해 부착할 용의가 없는 환자;
1차 평가 항목:
MPOD 및 다초점 망막전도[시간 프레임: 1년][안전성 문제로 지정됨: 그렇다]
부차적 평가 항목
고도의 AMD의 발달 위험을 감소시키는데 있어서 rAAV(bv).sFlt-1의 안전성 및 효능[시간 프레임: 1년][안전성 문제로 지정됨: 그렇다]
실험 설계 암즈(Arms)
암즈 지정된 간섭
활성 비교: 그룹 I
100㎕ 용적의 rAAV(bv).sFlt-1의 1×1010 벡터 게놈은 36개월 동안 30 내지 90일 간격으로 실험 그룹에게 망막하 주사에 의해 투여된다.		 약물: rAAV(bv).sFlt-1
100㎕ 용적의 rAAV.sFlt-1의 1×1010 벡터 게놈은 실험 그룹에게 망막하 주사에 의해 투여된다.
활성 비교: 그룹 II
100㎕ 용적의 rAAV(bv).sFlt-1의 1×1011 벡터 게놈은 36개월 동안 180 내지 365일 간격으로 실험 그룹에게 망막하 주사에 의해 투여된다.		 약물: rAAV(bv).sFlt-1
100㎕ 용적의 rAAV.sFlt-1의 1×1011 벡터 게놈은 실험 그룹에게 망막하 주사에 의해 투여된다.
위약 비교: 그룹 위약
약물 위약: 염수 용액		 약물 위약: 염수 용액
약물 위약: 1년까지 염수 용액, AMD의 초기 단계를 나타내는 위약에 대한 환자는 rAAV9bv).sFlt-1을 제공받을 수 있다.
활성 비교: 라니비주맵 0.3 mg
환자는 36개월 동안 매월 유리체내 투여된 라니비주맵 0.3 mg을 제공받는다.		 위약: 라니비주맵
유리체내 주사를 위한 멸균 용액
다른 명칭: 루센티스
실시예 16
안구 혈관신생 질환 당뇨병성 황반 부종(DME)의 치료를 위한 rAAV.sFlt-1의 안전성 및 효능을 시험하기 위해, 40명(40) 환자를 사용한 추가 조절된 임상 연구를 수행하였다. rAAV(bv).sFlt-1은 론자 휴스톤, 인코포레이티드(Lonza Houston, Inc.)에서 FDA 및 ICH 가이드라인에 따라 생성하였다. 연구에 대한 자격, 포함 및 제외 기준은 다음과 같았다:
자격:
· 연구에 적격인 연령: 18세 이상
· 연구에 적격인 성별: 둘 다
· 건강한 지원자 수용: 없음
일반 포함 기준:
· 대상체는 하기 기준에 부합되는 경우에 대상으로 된다:
· 서면 정보제공된 동의서 및, 미국에서 의료 보험 이행 및 책임 법률(HIPAA) 인가 및 다른 국가에서 당해 국내법에 따라 제공할 용의성.
· 당뇨병(타입 1 및 2).
· 광 일관성 단층촬영(OCT)로 평가된 바와 같이 중심 서브필드에서 중심 황반 두께 > 275 ㎛를 갖는 중심와의 중심을 수반하는 당뇨병(DME)에 부차적인 망막 비후.
· 4m의 초기 시험 거리에서 조기 치료 당뇨병성 망막증 연구(ETDRS) 프로토콜을 사용하여 20/40 내지 20/320 대략 스넬렌 등가의 연구 눈에서 최고 보정 시력(BCVA) 스코어.
· 주로 DME의 결과이고 다른 원인이 아닌 것으로 측정된 시력 저하.
· 모든 계획된 방문 및 평가를 위해 복귀할 능력(조사자의 의견) 및 용의성.
제외 기준:
· 연구 눈에서 유리체망막 수술의 이력.
· 스크리닝 3개월 이내에 연구 눈에서 범망막 광응고(PRP) 또는 황반 레이저 광응고.
· 불활성의 퇴행된 PDR을 제외한, 연구 눈에서 증식성 당뇨병성 망막증(PDR).
· 연구 눈에서 홍채 신혈관형성, 유리체 출혈, 색인 망막 박리 또는, 황반을 포함하는 망막전 섬유증.
· 연구 눈에서 황반유리체 견인 또는 망막상 막.
· 연구 눈에서 안구 염증(반흔 또는 상기 포함).
· 어는 하나의 눈에서 즉발성 또는 자가면역 포도막염의 이력.
· 망막 색소 상피증(PRE)의 위축, 망막하 섬유증 또는 조직화 하드-삼출 플라크를 포함하는 황반 부종의 해결 후에 VA의 개선을 배제할 가능성이 있는 연구 눈에서 황반 중심에 대한 구조적 손상.
· 망막 혈관 폐색, 망막 박리, 황반 홀, 또는 임의 원인의 맥락막 신혈관형성(CNV)(예: 노화-관련 황반 변성(AMD), 안구 히스토플라스마증 또는 병적 근시)을 포함하는 연구 결과의 해석을 혼란시킬 수 있는 연구 눈의 안과 질환.
· 3개월 이내에 연구 눈에서 백내장 수술, 과거 2개월 이내에 이트륨-알루미늄-가네트(YAG) 레이저 낭절개, 또는 0일 이전 90일 이내에 임의의 기타 안내 수술.
· 연구 눈에서 비조절된 녹내장 또는 이전 여과 수술
· 비조절된 혈압.
· 0일 이전 3개월 이내에 뇌 혈관 장애 또는 심근 경색의 이력.
· 비조절된 당뇨병.
· 투석 또는 신장 이식을 필요로 하는 신부전.
· 기타 질환, 대사 기능부전, 신체 검사 소견, 또는 사용 치료약의 금기 질환 또는 상태의 합리적 의심을 제공하는 임상 검사 소견의 이력은 연구 결과의 해석에 영향을 미칠 가능성이 있거나, 대상체가 합병증 치료로부터 높은 위험에 있게 할 수 있다.
1차 평가 항목:
· 12개월에서 기준선으로부터 이들의 최적 시력(BCVA) 스코어에서 >15 문자를 획득한 환자의 비율[시간 프레임: 기준선 내지 12개월][안전성 문제로 지정됨: 그렇다].
부차적 평가 항목:
· 12, 24 및 36개월에서 최고 보정 시력(BCVA) 스코어에서 기준선으로부터의 평균 변화.
· 12, 24 및 36개월에서 20/40 이상의 시력(VA) 스넬렌 등가를 갖는 환자의 비율.
· 12, 24 및 36개월에서 SD-OCT에 의해 측정된 중심 중심와 두께에서 기준선으로부터의 평균 변화.
· 동시 항-VEGF 치료의 빈도 감소(예: 루센티스, 아바스틴, 마쿠겐 또는 에일레아)[안전성 문제로 지정됨: 아니다]
DME 연구를 위한 실험 설계 암즈(Arms)
암즈 지정된 간섭
실험: I 저용량
100㎕ 용적의 rAAV(bv).sFlt-1의 1×1010 벡터 게놈은 실험 그룹에게 망막하 주사에 의해 투여된다.
후속 상: rAAV.sFlt-1에 대한 참가자는 매월 모니터링되고, 이들이 재치료에 대한 연구 기준을 충족하는 경우에 유리체내 항-VEGF 치료를 사용한 구제 치료를 제공받는다.		 약물: rAAV(bv).sFlt-1
100㎕ 용적의 rAAV.sFlt-1의 1×1010 벡터 게놈은 실험 그룹에게 망막하 주사에 의해 투여된다.
실험: II 고용량
100㎕ 용적의 rAAV(bv).sFlt-1의 1×1011 벡터 게놈은 실험 그룹에게 망막하 주사에 의해 투여된다.
후속 상: rAAV.sFlt-1에 대한 참가자는 매월 모니터링되고, 이들이 재치료에 대한 연구 기준을 충족하는 경우에 유리체내 항-VEGF 치료를 사용한 구제 치료를 제공받는다.		 약물: rAAV(bv).sFlt-1
100㎕ 용적의 rAAV.sFlt-1의 1×1011 벡터 게놈은 실험 그룹에게 망막하 주사에 의해 투여된다.
활성 비교: 라니비주맵 주사 0.3 mg
참가자는 0일 및 30일에 라니비주맵의 2회 초기 주사를 제공받는다.
후속 상: 참가자는 매월 모니터링되고, 이들이 재치료에 대한 연구 기준을 충족하는 경우에 라니비주맵을 사용한 구제 치료를 제공받는다.		 약물: 라니비주맵
유리체내 주사를 위한 멸균 용액
다른 명칭: 루센티스
초기 등록된 대상체는 20/40 내지 20/320의 연구 눈에서 시력과 함께 DME를 갖고, 라니비주맵 또는 아플리베르셉트의 0 내지 25회 유리체내 주사를 사전에 제공받을 것이다. 환자는, 전체 14명의 환자가 환자로 등록하고 13명의 저용량 실험 환자 및 13명의 고용량 실험 환자가 등록될 때까지 대조군 그룹 또는 2개 실험 그룹으로 램덤으로 분포된다. 모든 환자는 연구의 1일 및 30일에 라니비주맵의 유리체내 주사를 제공받는다. 7일에, 100 ㎕ 용적의 rAAV(bv).sFlt-1의 1×1010 또는 1×1011 벡터 게놈을 실험 그룹에게 유리체내 주사를 통해 투여한다.
실시예 12의 연구에서와 같이, 연구 대상체 또는 환자에서 sFLT-1의 최대 발현 수준은 rAAV(bv).sFLT-1의 망막하 투여후 6 내지 8주이다. 소위 "램프-업" 기간 동안, 항-VEGF 제제의 2 또는 3회 유리체내 주사는 15 내지 45일 간격, 바람직하게는 약 30일 간격으로 주사하여 질환 진행을 방지한다. 유리체내 주사된 항-VEGF 제제(루센티스 또는 아바스틴 또는 에일레아 또는 기타 비 sFLT 제제)의 흡수를 가능하게 하기 위해 rAAV(bv).sFLT-1의 투여 전에, 1 내지 30일 및 바람직하게는 5 내지 10일에 항-VEGF 제제의 1차 유리체내 주사를 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 1차 유리체내 주사가 rAAV(bv).sFLT의 망막하 투여전 24시간 이내에 투여되는 경우, 치료하 항-VEGF 제제 농도 및 질환 진행을 유도하는 망막하 주사 공정 동안 유리체를 세척할 수 있다.
램프 기간의 완성 후, 이들의 DME의 진행을 치료 또는 방지하는 충분한 sFLT-1을 발현하는 환자는, 이들이 의사의 관리하에 잔류할 것이 예상되더라도, 추가의 유리체내 항-VEGF 주사를 필요로 하지 않을 것이다.
본 실시예에서 기재된 이러한 연구에서, 대조군 및 실험 그룹의 환자는 활성 또는 새로운 DME의 징후, 및 대략 월간 기준으로 신혈관형성에 대해 평가되고, 하기 기준의 어느 하나를 충족시키는 경우에 유리체내 라니비주맵으로 재치료된다:
- 대상체의 이전 방문으로부터 >10 초기 치료 당뇨병성 망막증 연구(ETDRS) 문자 손실, 또는 기능 상실의 환자 인식과 연동하여 선행 방문으로부터 >5 ETDRS 문자의 감소;
- 임의의 증가된, 새로운 또는 지속성 감각역치하, 망막하 색소 상피(RPE) 또는 OCT 상의 망막내 유체;
- FA를 통한 증가된 CNV 누출 징후.
실시예 17
안구 혈관신생 질환 망막 정맥 폐색(RVO)의 치료를 위한 rAAV.sFlt-1의 안전성 및 효능을 시험하기 위해, 40명(40) 환자를 사용한 추가 조절된 임상 연구를 수행하였다. 임상 연구는 2개 코호트, 중심 망막 정맥 폐색(CRVO)를 갖는 환자를 포함하는 1 코호트 및 분지상 망막 정맥 폐색(BRVO)을 포함하는 1 호코트의 환자에서 수행된다. 실시예 15에서와 같이, rAAV(bv).sFlt-1은 론자 휴스톤, 인코포레이티드(Lonza Houston, Inc.)에서 FDA 및 ICH 가이드라인에 따라 생성하였다. 연구에 대한 자격, 포함 및 제외 기준은 다음과 같았다:
포함 기준:
· 광 일관성 단층촬영(OCT) 상에서 >250 ㎛의 평균 중심 서브필드 두께와 함께 9개월 이하 동안 중심 망막 정맥 폐색(CRBO)에 부차적인 중심-관련 황반 부종 또는 BRVO에 부차적인 분지상-관련 황반 부종;
· 성인 >18세;
· 연구 눈에서 20/40 내지 20/320(73 내지 24 문자)의 조기 치료 당뇨병성 망막증 연구(ETDRS) 최고 보정 시력(BCVA);
제외 기준:
· 연구 눈에서 항-VEGF 제제(페갑타닙 나트륨, 아네코르타브 아세테이트, 베바시주맵, 라니비주맵 등)을 사용한 임의의 선행 치료 또는 전신 항-혈관신생 약제의 선행 투여;
· 연구 눈에서 선행 범망막 레이저 광응고 또는 황반 레이저 광응고;
· 진단일로부터 >9개월 동안 CRVO 질환; 진단일로부터 >9개월 동안 BRVO 질환;
· 연구 눈에서 안내 코르티코스테로이드의 선행 사용 또는 1일전 3개월 이내에 연구 눈에서 안주변 코르티코스테로이드의 사용;
· 홍채 신혈관형성, 유리체 출혈, 견인 망막 박리, 또는 연구 눈 또는 다른쪽 눈에서 황반을 포함하는 망막전 섬유증;
1차 평가 항목:
· 6개월에 최고 보정 시력(BCVA) 스코어에서 기준선으로부터의 평균 변화[시간 프레임: 기준선 및 6개월][안전성 문제로서 지정됨: 아니다]
· 연구 눈에서 73 내지 24(=20/40 내지 20/320의 시력)의 조기 치료 당뇨병성 망막증 연구(ETDRS) 최고 보정 시력(BCVA) 문자의 규정된 연구 기준선 범위; 최고 스코어는 보다 우수한 기능을 나타낸다.
분자 = (시력을 유지한 참가자의 수 ×100); 분모 = 분석된 참가자의 수
부차적 평가 항목:
· 기준선과 비교하여 6개월에 BCVA 스코어에서 >15 문자를 획득한 참가자의 비율.
· 6개월에 중심 망막 두께(CRT)에서 기준선으로부터의 평균 변화[시간 프레임: 기준선 및 6개월][안전성 문제로서 지정됨: 아니다].
· 동시 항-VEGF 치료(예: 루센티스, 아바스틴, 마쿠겐 또는 에일레아)의 빈도 감소[안전성 문제로서 지정됨: 아니다].
BRVO/CRVO 연구를 위한 실험 설계 암즈(Arms)
암즈 지정된 간섭
실험: 100㎕ 용적의 rAAV(bv).sFlt-1의 1×1010 벡터 게놈은 실험 그룹에게 7일에 망막하 주사에 의해 투여된다.
후속 상: rAAV.sFlt-1에 대한 참가자는 매월 모니터링되고, 이들이 재치료에 대한 연구 기준을 충족하는 경우에 유리체내 항-VEGF 치료를 사용한 구제 치료를 제공받는다.		 생물학: rAAV(bv).sFlt-1의 1×1010 벡터 게놈. 망막하 주사.
약물: 재주사 기준을 충족시키는 경우에 라니비주맵 주사 0.3 mg
실험: 100㎕ 용적의 rAAV(bv).sFlt-1의 1×1011 벡터 게놈은 실험 그룹에게 7일에 망막하 주사에 의해 투여된다.
후속 상: rAAV.sFlt-1에 대한 참가자는 매월 모니터링되고, 이들이 재치료에 대한 연구 기준을 충족하는 경우에 유리체내 항-VEGF 치료를 사용한 구제 치료를 제공한다.		 생물학: rAAV(bv).sFlt-1의 1×1010 벡터 게놈. 망막하 주사.
약물: 재주사 기준을 충족시키는 경우에 라니비주맵 주사 0.3 mg
활성 비교: 라니비주맵 주사 0.3 mg
참가자는 0일 및 8일에 라니비주맵의 2회 초기 주사를 제공받는다.
후속 상: 참가자는 매월 모니터링되고, 이들이 재치료에 대한 연구 기준을 충족하는 경우에 라니비주맵을 사용한 구제 치료를 제공받는다.		 약물: 라니비주맵 주사 0.3 mg
0일 30일에 제공된 단일 용량 섭생으로 라니비주맵 주사 0.3 mg
다른 명칭: 루센티스
초기 등록된 대상체는 20/40 내지 20/320의 연구 눈에서 시력과 함께 CRVO 또는 BRVO를 갖고, 라니비주맵 또는 아플리베르셉트의 0 내지 25회 유리체내 주사를 사전에 제공받을 것이다. 환자는, 전체 14명의 환자가 환자로 등록하고 13명의 저용량 실험 환자 및 13명의 고용량 실험 환자가 등록될 때까지 대조군 그룹 또는 2개 실험 그룹으로 램덤으로 분포된다. 모든 환자는 연구의 1일 및 30일에 라니비주맵의 유리체내 주사를 제공받는다. 7일에, 100 ㎕ 용적의 rAAV(bv).sFlt-1의 1×1010 또는 1×1011 벡터 게놈을 실험 그룹에게 유리체내 주사를 통해 투여한다.
실시예 14의 연구에서와 같이, 연구 대상체 또는 환자에서 sFLT-1의 최대 발현 수준은 rAAV(bv).sFLT-1의 망막하 투여후 6 내지 8주이다. 실시예 14에 기재된 바와 같이, 램프 기간의 완성 후, 이들의 BRVO 또는 CRVO의 진행을 치료 또는 예방하기 위해 충분한 sFLT-1을 발현하는 환자는, 이들이 의사의 관리하에 잔류할 것이 예상되더라도, 추가의 유리체내 항-VEGF 주사를 필요로 하지 않을 것이다.
본 실시예에서 기재된 이러한 연구에서, 대조군 및 실험 그룹의 환자는 대략 월간 기준으로 활성 또는 새로운 망막 정맥 폐색 및 신혈관형성의 징후에 대해 평가되고, 하기 기준의 어느 하나를 충족시키는 경우에 유리체내 라니비주맵으로 재치료된다:
- 대상체의 이전 방문으로부터 >10 초기 치료 당뇨병성 망막증 연구(ETDRS) 문자 손실, 또는 기능 상실의 환자 인식과 연동하여 선행 방문으로부터 >5 ETDRS 문자의 감소;
- 임의의 증가된, 새로운 또는 지속성 감각역치하, 망막하 색소 상피(RPE) 또는 OCT 상의 망막내 유체;
- FA를 통한 증가된 CNV 누출 징후.
<110> AVALANCHE AUSTRALIA PTY LTD. <120> TREATMENT OF AMD USING AAV SFLT-1 <130> IPA141250-US <150> 61/647,461 <151> 2012-05-15 <150> 61/670,535 <151> 2012-07-11 <150> 61/678,555 <151> 2012-08-01 <150> 61/691,660 <151> 2012-08-21 <150> 61/775,440 <151> 2013-03-08 <160> 122 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 atggaaaaac gccagcaacg 20 <210> 2 <211> 881 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 60 ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 120 ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 180 tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 240 cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 300 gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 acgcgtggag ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 60 atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 120 ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgtcaat agggactttc 180 cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 240 tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 300 tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 360 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt 420 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttgcacc 480 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 540 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 600 cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc 660 tcc 663 <210> 21 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540 acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatc 589 <210> 22 <211> 670 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 gcggccgcac gcgtggagct agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 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34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 taatacgact cactatagg 19 <210> 35 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 ccgattaatc ataaatatga aaaataattg ttgcatcacc cgccaatgcg tggcttaatg 60 cacatca 67 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 attaaccctc actaaaggg 19 <210> 37 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 ctagacaagg tcgaacgagg ggcatgaccc ggtgcggggc ttcttgcact cggcataggc 60 gagtgctaag aataacgttg gcactcg 87 <210> 38 <211> 1478 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 38 tattaggcga agaggcatct agtagtagtg gcagtggtga gaacgtgggc gctgctatag 60 tgaacaatct ccagtcgatg 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag 60 gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 120 cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 180 ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 240 tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 300 cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg 360 agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctt 419 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 gacgcttttt atcgcaactc tctactgt 28 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 catgacaaaa acgcgtaaca aaagtgtct 29 <210> 46 <211> 1904 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 46 agccgaattc ctcctcattc ttctccaaac ctttattgag tacctactgt gtgctggaat 60 aagacaggca gggccatgcc ctcatgaagc tgacaatcct attggtgtga ccatccccag 120 gtgtgtccca ggtgtgttgc aggtgtgtcc gaggtatgcc ccagctgtcc caggtgtgcc 180 ccagctgtct cagatgtgcc ccagctgtcc caggtgtgtc acagctgcat tgcaggtgtg 240 ccccagttgc attccatgtg tgctccaagt gtgtaccagc tgtcccaggt gtgtctcagg 300 tgtgccccag ctgtatccca ggtgtgcctc agctgtctta ggtgtgtctc aggtgcatcc 360 caggtgtgtc tcagatgtgc cccagctgtc ccaggtgtgc cccagctgtc ccaggtgtgc 420 cccagctgtc tccagtgtgt cccagctgtg ccccaggtgt gtgtcctagg tgtgcctcag 480 ctgtctcagg tgtgccccag gcatatccca ggtgtgcccc agctgtccca ggtgtgtcct 540 acgtgtgcac cagctgtatc ccaggtgtgc cccaggtgtg tctcagatgg gtcccaagtg 600 ttccccaact gcatttcagg tgtctcaggt gtgcccaagc tgtcccaggt gtgtccaaga 660 tgtgccccag gtgtgtctca ggtgggtctc aagtgcccca gctgcatttc aggtgtctca 720 ggtgtgcccc ccagtgcatc ccaggtgtgt cccaggtgtg ccccaggtgc atcccaggtg 780 tgtcccaggt gtgccccagc tgtctcaggt gtctcaggtg tgccccaggc atatcccagg 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 51 ggccgcttcg agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa 60 tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca 120 ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc 180 agggggagat gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatc 239 <210> 52 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 taatcagcat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc 60 cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta 120 taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact 180 gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct ta 222 <210> 53 <211> 142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120 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polynucleotide <400> 59 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag 130 <210> 60 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 ttatgaagat ccctcgacct gcagcccaag cttggcgtaa tcatg 45 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 gataaggatc ttcctagagc atggcta 27 <210> 62 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 62 atgtctgccc gtatttcgcg taaggaaatc cattatgtac tatttaaaaa acacaaactt 60 ttggatgttc ggtttattct ttttctttta cttttttatc atgggagcct acttcccgtt 120 tttcccgatt tggctacatg acatcaacca tatcagcaaa agtgatacgg gtattatttt 180 tgccgctatt tctctgttct cgctattatt ccaaccgctg tttggtctgc tttctgacaa 240 actcggcctc gactctaggc ggccgcgggg atc 273 <210> 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 tagtttccat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta atcattaact aca 53 <210> 68 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctcg atctgaattc 60 ggta 64 <210> 69 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 ggccgcgggg atcc 14 <210> 70 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 ggttcgaaca g 11 <210> 71 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 71 catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg 60 tctcatcatt ttggcaaaga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg gatccaccgg 120 <210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 gcggccgcac gcgtgttact agttattaat 30 <210> 73 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 73 cactagaagc tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt gctaacgcag tcagtgcttc 60 tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg tgaggcactg ggcag 115 <210> 74 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc 60 ctccggac 68 <210> 75 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 75 gtgtccactc ccagttcaat tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat 60 aggctagcct cgagaattca cgcgtggtac cgagctcgga tccactagtc cagtgtggtg 120 gaattcgggc ggg 133 <210> 76 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 60 ggtc 64 <210> 77 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 tagccatgct ctaggaagat cgtacc 26 <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 gaattcgagc ttgcatgcct gcaggt 26 <210> 79 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 gtgtccactc ccagttcaat tacagctctt aaggctagag tacttctagc ctcgag 56 <210> 80 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 aaatcgataa ggatcctaga gcatggctac gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt 60 aactaca 67 <210> 81 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 ggcccgggat cca 13 <210> 82 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 gttgaattcg atatcggatc catcgatacc gtcgacctcg agggggggcc cggtacc 57 <210> 83 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc gcgcagcggc cgac 44 <210> 84 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct agatct 56 <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 agcggccgca ctcctcag 18 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 atcgataccg tcgacccggg c 21 <210> 87 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 87 cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga 60 tccagcctcc ggactctaga ggatccggta ctcgaggaac tgaaaaacca gaaagttaac 120 tg 122 <210> 88 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 ccggaccacg tgcggaccga gcggccgc 28 <210> 89 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 89 gtgtccactc ccagttcaat tacagctctt aaggctagag tacttctagc ctcgagaatt 60 cacgcgtggt accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattcgg gcggg 115 <210> 90 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac 60 aagttaa 67 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 taataataac cgggcaggcc 20 <210> 92 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 92 agccgcgaga cgggcgctca gggcgcgggg ccggcggcgg cgaacgagag gacggactct 60 ggcggccggg tcgttggccg cggggagcgc gggcaccggg cgagcaggcc gcgtcgcgct 120 cacc 124 <210> 93 <211> 194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 93 ggggctcggg tgcagcggcc agcgggcctg gcggcgagga ttacccgggg aagtggttgt 60 ctcctggctg gagccgcgag acgggcgctc agggcgcggg gccggcggcg gcgaacgaga 120 ggacggactc tggcggccgg gtcgttggcc gggggagcgc gggcaccggg cgagcaggcc 180 gcgtcgcgct cacc 194 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 aggactcatt aaaaagtaac 20 <210> 95 <211> 197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 95 ggggctcggg tgcagcggcc agcgggcgcc tggcggcgag gattacccgg ggaagtggtt 60 gtctcctggc tggagccgcg agacgggcgc tcagggcgcg gggccggcgg cggcgaacga 120 gaggacggac tctggcggcc gggtcgttgg ccgcggggag cgcgggcacc gggcgagcag 180 gccgcgtcgc gctcacc 197 <210> 96 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 96 gggcgggtgc atcaatgcgg ccgaaaaaga cacggacacg ctcccctggg acctgagctg 60 gttcgcagtc ttcccaaagg tgccaagcaa gcgtcagttc ccctcaggcg ctccaggttc 120 agtgccttgt gccgagggtc tccggtgcct tcctagactt ctcgggacag tctgaagggg 180 tcaggagcgg cgggacagcg cgggaagagc aggcaagggg agacagccgg actgcgcctc 240 agtcctccgt gccaagaaca ccgtcgcgga ggcgcggcca gcttcccttg gatcggactt 300 tccgccccta gggccaggcg gcggagcttc agccttgtcc cttccccagt ttcgggcggc 360 ccccagagct gagtaagccg ggtggaggga gtctgcaagg atttcctgag cgcgatgggc 420 aggaggaggg gcaagggcaa gagggcgcgg agcaaagacc ctgaacctgc cggggccgcg 480 ctcccgggcc cgcgtcgcca gcacctcccc 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 ccggtcgcca cc 12 <210> 100 <211> 197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 100 ggggctcggg tgcagcggcc agcgggcgcc tggcggcgag gattacccgg ggaagtggtt 60 gtctcctggc tggagccgcg agacgggcgc tcagggcgcg gggccggcgg cggcgaacga 120 gaggacggac tctggcggcc gggtctttgg ccgcggggag cgcgggcacc gggcgagcag 180 gccgcgtcgc gctcacc 197 <210> 101 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 101 ggggtggggg accccttgac gtcaccagaa ggaggtgccg gggtaggaag tgggctgggg 60 aaaggttata aatcgccccc gccctcggct gctcttcatc gaggtccgcg ggaggctcgg 120 agcgcgccag gcggacactc ctctcggctc ctccccggca gcggcggcgg ctcggagcgg 180 gctccggggc tcgggtgcag cggccagcgg gcgcctggcg gcgaggatta cccggggaag 240 tggttgtctc ctggctggag ccgcgagacg ggcgctcagg gcgcggggcc ggcggcggcg 300 aacgagagga cggactctgg cggccgggtc gttggccgcg gggagcgcgg gcaccgggcg 360 agcaggccgc gtcgcgctca cc 382 <210> 102 <211> 2064 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatcta gttcaggttc aaaattaaaa gatcctgaac tgagtttaaa aggcacccag 120 cacatcatgc aagcaggcca gacactgcat ctccaatgca ggggggaagc agcccataaa 180 tggtctttgc ctgaaatggt gagtaaggaa agcgaaaggc tgagcataac taaatctgcc 240 tgtggaagaa atggcaaaca attctgcagt actttaacct tgaacacagc tcaagcaaac 300 cacactggct tctacagctg caaatatcta gctgtaccta cttcaaagaa gaaggaaaca 360 gaatctgcaa tctatatatt tattagtgat acaggtagac ctttcgtaga gatgtacagt 420 gaaatccccg aaattataca catgactgaa ggaagggagc tcgtcattcc ctgccgggtt 480 acgtcaccta acatcactgt tactttaaaa aagtttccac ttgacacttt gatccctgat 540 ggaaaacgca taatctggga cagtagaaag ggcttcatca tatcaaatgc aacgtacaaa 600 gaaatagggc ttctgacctg tgaagcaaca gtcaatgggc atttgtataa gacaaactat 660 ctcacacatc gacaaaccaa tacaatcata gatgtccaaa taagcacacc acgcccagtc 720 aaattactta 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ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac 300 gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag 360 ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac 420 atcgacaaac caatacaatc atagatgtgg ttctgagtcc gtctcatgga attgaactat 480 ctgttggaga aaagcttgtc ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat gtggggattg 540 acttcaactg ggaataccct tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta aaccgagacc 600 taaaaaccca gtctgggagt gagatgaaga aatttttgag caccttaact atagatggtg 660 taacccggag tgaccaagga ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg atgaccaaga 720 agaacagcac atttgtcagg gtccatgaaa agggcccggg cgacaaaact cacacatgcc 780 caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 840 ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 900 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 960 ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1020 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1080 ccctcccagc 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catcgacaaa ccaatacaat catagatgtg gttctgagtc cgtctcatgg aattgaacta 420 tctgttggag aaaagcttgt cttaaattgt acagcaagaa ctgaactaaa tgtggggatt 480 gacttcaact gggaataccc ttcttcgaag catcagcata agaaacttgt aaaccgagac 540 ctaaaaaccc agtctgggag tgagatgaag aaatttttga gcaccttaac tatagatggt 600 gtaacccgga gtgaccaagg attgtacacc tgtgcagcat ccagtgggct gatgaccaag 660 aagaacagca catttgtcag ggtccatgaa aaggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 840 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 900 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 960 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1080 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1140 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1200 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1260 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1320 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1377 <210> 105 <211> 1444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 105 aagcttgggc tgcaggtcga tcgactctag aggatcgatc cccgggcgag ctcgaattcg 60 caaccaccat ggtcagctac tgggacaccg gggtcctgct gtgcgcgctg ctcagctgtc 120 tgcttctcac aggatctagt tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc 180 ccgaaattat acacatgact gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg gttacgtcac 240 ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac 300 gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag 360 ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac 420 atcgacaaac caatacaatc atagatatcc agctgttgcc caggaagtcg ctggagctgc 480 tggtagggga gaagctggtc ctcaactgca ccgtgtgggc tgagtttaac tcaggtgtca 540 cctttgactg ggactaccca gggaagcagg 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 109 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro 20 25 30 Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Ala Gly Gln Thr Leu His 35 40 45 Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala Met Gln His Lys Trp Ser Leu Pro 50 55 60 Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala 65 70 75 80 Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr 85 90 95 Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val 100 105 110 Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile 115 120 125 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 130 135 140 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 145 150 155 160 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 180 185 190 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 195 200 205 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 210 215 220 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val 225 230 235 240 Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr 245 250 255 Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys 260 265 270 Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His 275 280 285 Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys 290 295 300 Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys 305 310 315 320 Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val 325 330 335 Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser 340 345 350 Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val 355 360 365 Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu 370 375 380 Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala 385 390 395 400 Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys 405 410 415 Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu 420 425 430 Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser 435 440 445 Arg Gln 450 <210> 110 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 110 atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 60 gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120 gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180 aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240 gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300 ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360 gaggagcagg actga 375 <210> 111 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 111 atgtctaaat taacctctgc tgttccagtg ttaaccgccc gtgatgttgc cggtgcagtg 60 gaattttgga ctgaccgttt gggtttctca cgtgactttg tcgaagatga ttttgctggc 120 gttgtgcgtg atgacgtcac tttgttcatc tctgctgttc aggatcaggt cgtcccagac 180 aacactttgg cctgggtctg ggttcgtggt ttggacgaat tgtacgctga gtggagtgaa 240 gttgtgtcta caaactttcg tgatgcatca ggtccagcta tgaccgaaat tggcgaacaa 300 ccttggggcc gtgagttcgc tttacgtgat ccagccggta attgcgtgca cttcgttgct 360 gaggagcaag attag 375 <210> 112 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 112 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240 cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480 gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540 cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600 tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660 tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720 cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780 acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840 tcactgatta agcattggta a 861 <210> 113 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 113 atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60 ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120 gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180 caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 114 <211> 2038 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 114 aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 60 ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 120 aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 180 ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 240 gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 300 ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 360 ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 420 gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 480 aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 540 gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 600 aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 660 caccacgatg cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 720 tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 780 acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 840 gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 900 agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 960 gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 1020 ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 1080 taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 1140 agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 1200 aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 1260 ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 1320 gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 1380 aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 1440 aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 1500 gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 1560 aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 1620 aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 1680 cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 1740 cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 1800 tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 1860 tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 1920 ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca 1980 ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtat 2038 <210> 115 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 115 gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60 agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 97 <210> 116 <211> 493 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 116 tcgaatcccg gccgggaacg gtgcattgga acgcggattc cccgtgccaa gagtgacgta 60 agtaccgcct atagagtcta taggcccaca aaaaatgctt tcttctttta atatactttt 120 ttgtttatct tatttctaat actttcccta atctctttct ttcagggcaa taatgataca 180 atgtatcatg cctctttgca ccattctaaa gaataacagt gataatttct gggttaaggc 240 aatagcaata tttctgcata taaatatttc tgcatataaa ttgtaactga tgtaagaggt 300 ttcatattgc taatagcagc tacaatccag ctaccattct gcttttattt tatggttggg 360 ataaggctgg attattctga gtccaagcta ggcccttttg ctaatcatgt tcatacctct 420 tatcttcctc ccacagctcc tgggcaacgt gctggtctgt gtgctggccc atcactttgg 480 caaagaattg gga 493 <210> 117 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 117 gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca g 31 <210> 118 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 118 acttaccata ctttacccgg aaactaatcg tcccactctc acatccttca ttgcag 56 <210> 119 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 119 aaaagttccc cagccagaag cagagaagat gatgtcaaga aatcaagggg gataaatggc 60 catagctgct gcaaatagct tattgcagtc tctagagtgt ggtaaacagg tttccagtgc 120 cagctgtgga ggtgacagcg gcagggaa 148 <210> 120 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 120 aaaagttccc cagccagaag cagagaagat gatgtcaaga aatcaagggg gataaatggc 60 catagctgct gcaaatagct tattgcagtc tctagagtgt ggtaaacagg tttccagtgc 120 cagctgtgga ggtgacagcg gcaggga 147 <210> 121 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 121 Ile Tyr Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr 1 5 10 15 Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val 20 25 30 Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys 35 40 45 Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp 50 55 60 Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly 65 70 75 80 Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn 85 90 95 Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile 100 105 <210> 122 <211> 320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 122 aatctatata tttattagtg atacaggtag acctttcgta gagatgtaca gtgaaatccc 60 cgaaattata cacatgactg aaggaaggga gctcgtcatt ccctgccggg ttacgtcacc 120 taacatcact gttactttaa aaaagtttcc acttgacact ttgatccctg atggaaaacg 180 cataatctgg gacagtagaa agggcttcat catatcaaat gcaacgtaca aagaaatagg 240 gcttctgacc tgtgaagcaa cagtcaatgg gcatttgtat aagacaaact atctcacaca 300 tcgacaaacc aatacaatca 320

Claims (199)

  1. 항-혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 벡터를 함유하는,
    안구 신혈관형성을 가지며, 이전에 VEGF 억제제를 1번 이상 투여받은 적이 있는 인간 대상체에서 안구 신생혈관 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 약제학적 조성물은 최소 1 x 106에서 최대 1 x 1015의 rAAV 벡터 게놈과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 단위 용량으로 인간 대상체의 눈에 투여되는 것을 특징으로 하고,
    상기 rAAV의 단위 용량은 투여 후 적어도 1년 이후에 측정하였을 때 상기 인간 대상체의 눈에서 항-VEGF 단백질의 상승된 수준을 제공하기에 충분하고,
    상기 항-VEGF 단백질은 서열번호: 121과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 인간 sFLT1의 기능성 단편을 포함하고,
    상기 인간 대상체는 상기 단위 용량의 투여 후 약 180일 내지 약 365일의 기간 동안, 안구 신혈관형성의 진행을 막거나 반전시키기 위한, VEGF 억제제를 이용한 구제 (rescue) 치료를 받지 않는 것인, 약제학적 조성물.
  2. 항-VEGF 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV를 함유하는,
    안구 신혈관형성을 가지며, 이전에 VEGF 억제제를 1번 이상 투여 받은 적이 있는 인간 대상체에서 안구 신생혈관 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 약제학적 조성물은 최소 1 x 106에서 최대 1 x 1015의 rAAV 벡터 게놈을 포함하는 단위 용량으로 인간 대상체의 눈에 투여되고, rAAV의 투여 후 30일 간격으로 VEGF 억제제가 1회 또는 2회 투여되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 대상체의 눈은 상기 단위 용량의 투여 후 약 180일 내지 약 365일의 기간 동안, 안구 신혈관형성의 진행을 막거나 반전시키기 위한, VEGF 억제제를 이용한 구제 치료를 필요로 하지 않는 것인, 약제학적 조성물.
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  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 AAV2 및 AAV8으로 이루어진 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단위 용량은 최소 1 x 108에서 최대 1 x 1013의 벡터 게놈을 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단위 용량은 최소 1 x 108에서 최대 1 x 1011의 벡터 게놈을 포함하는, 약제학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 단위 용량은 최소 1 x 109에서 최대 1 x 1013의 벡터 게놈을 포함하는, 약제학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 눈은 상기 단위 용량의 투여 후 약 90일 내지 약 1년의 기간 동안, 안구 신혈관형성의 진행을 막거나 반전시키기 위한, VEGF 억제제를 이용한 구제 치료를 필요로 하지 않는 것인, 약제학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 망막하 주사로 투여되도록 제형화되는, 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 유리체 내 주사로 투여되도록 제형화되는, 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 억제제는 아플리베르셉트 (aflibercept)인, 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 억제제는 라니비주맵 (ranibizumab)인, 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-VEGF 단백질은 sFLT-1인, 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-VEGF 단백질은 아플리베르셉트인, 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안구 신생혈관 질환은, 노화-관련 황반 변성(AMD), 망막 신혈관형성, 맥락막 신혈관형성, 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막 허혈, 허혈성 망막증, 및 당뇨병성 망막 부종으로 이루어진 군에서 선택되는 병증과 관련되어 있고, 상기 병증은 임의로 AMD인, 약제학적 조성물.
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KR1020147035050A 2012-05-15 2013-05-07 Ａａｖ ｓｆｌｔ-1을 사용한 ａｍｄ의 치료 KR102154225B1 (ko)

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