KR20220147684A - 최적화된 핵산 항체 작제물 - Google Patents

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Abstract

구조적으로 변형된 DNA 코딩된 항체(DMAb)를 포함하는 조성물, DMAb를 구조적으로 변형시키는 방법 및 구조적으로 변형된 DMAb를 사용하는 방법이 본 명세서에 개시된다.

Description

최적화된 핵산 항체 작제물 {Optimized nucleic acid antibody constructs}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 5월 10일자로 출원된 미국 가출원 제62/504,448호, 2017년 5월 10일자로 출원된 미국 가출원 제62/504,460호, 2018년 1월 31일자로 출원된 미국 가출원 제62/624,320호 및 2018년 1월 31일자로 출원된 미국 가출원 제62/624,367호(이들의 각각은 본 명세서에 의해 그 전문이 본 명세서에서 참고로 원용됨)에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 핵산 항체 작제물을 최적화하는 방법 및 최적화된 구조적으로 변형된 핵산 항체 작제물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 면역 반응을 유도하기 위한 그리고 항원에 대해 개체를 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 면역화하기 위한 개선된 방법을 제공한다.
면역글로불린 분자는 시스테인 잔기 사이에 (S-S로 표시된) 다이설파이드 결합에 의해 공유로 연결된 경쇄(L) 및 중쇄(H)의 각각의 유형의 2개를 포함한다. 중쇄(heavy chain: VH) 및 경쇄(light chain: VL)의 가변 도메인은 항체 분자의 결합 부위에 기여한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3) 및 (가요성) 힌지 영역으로 이루어진다. 경쇄는 또한 불변 도메인(constant domain: CL)을 갖는다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 4개의 프레임워크 영역(FR(framework region); FR1, FR2, FR3 및 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(CDR(complementarity-determining region); CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다. 따라서, 이들은 생체내 어셈블링하기에 어려운 매우 복잡한 유전자 시스템을 갖는다.
표적화된 단일클론 항체(monoclonal antibody: mAb)는 최근 25년의 가장 중요한 의학적 치료 진보 중 하나를 나타낸다. 면역 기반 치료의 이 유형은 이제 자가면역 질환의 숙주, 암, 및 감염성 질환의 치료에 일상적으로 사용된다. 악성종양에 대해, 현재 사용되는 많은 면역글로불린(Ig) 기반 치료는 종양에 지향된 세포독성 화학요법제 요법과 조합된다. 이 조합 접근법은 유의미하게 개선된 전체 생존율을 갖는다. 다수의 mAb 제제는 비호지킨 림프종의 치료를 위한 키메라 mAb 표적화 CD20인 리툭산(Rituxan)(리툭시맙) 및 CTLA-4를 차단하고 흑색종 및 다른 악성종양의 치료에 사용되는 인간 mAb인 이플리무맙(Yervoy)을 포함하여 특정한 암에 대한 사용에 허가되었다. 추가적으로, 베바시주맙(Avastin)은 VEGF 및 종양 혈관신생을 표적화하고 결장직장암의 치료에 사용되는 또 다른 중요한 인간화된 mAb이다. 아마도, 악성종양의 치료에 대한 가장 높은 프로필 mAb는 환자의 하위집단에서 유방암에 대한 상당한 효율을 갖는 것으로 나타난 Her2/neu를 표적화하는 인간화된 제제인 트라스투주맙(Herceptin)이다. 게다가, mAb의 숙주는 자가면역 및 특정한 혈액 장애의 치료에 사용 중에 있다.
암 치료 이외에, 다중클론 Ig의 수동 이동은 디프테리아, A형 및 B형 간염, 광견병, 파상풍, 수두 및 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus: RSV)를 포함하는 다수의 감염성 질환에 대한 보호 효율을 매개한다. 사실, 몇몇 다중클론 Ig 제제는, 보호성 Ig가 활성 백신접종을 통해 생성되기에 불충분한 시간이 있을 때, 질환 풍토성 지역으로 이동하는 개체에서 특정한 감염성 물질에 대한 일시적인 보호를 제공한다. 게다가, 면역 결핍을 갖는 어린이에서, RSV 감염을 표적화하는 mAb인 팔리비주맙(Synagis)은 RSV에 대해 임상적으로 보호한다고 나타났다.
시장에 존재하는 현재 구입 가능한 치료학적 항체는 인간 IgG1 아이소타입이다. 이 항체는 항체 불변 영역(Fc)에 결합된 2개의 N 연결된 바이안테나(biantennary) 복합체-유형 올리고사카라이드를 보유하는 당단백질을 포함하고, 여기서 대부분의 올리고사카라이드는 코어-푸코실화된다. 이것은 Fc와 백혈구 수용체(FcγR) 또는 보체의 상호작용을 통해 항체 의존적 세포 독성(antibody-dependent cellular toxicity: ADCC) 및 보체 의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC)의 효과기 기능을 발휘한다. (시험관내에 대한) 치료학적 항체의 감소된 생체내 효율의 현상이 있어서, 치료학적 항체의 높은 용량(때때로 수백 밀리그램의 주마다의 용량)의 수요를 생성시킨다. 이는 주로 천연 살해(natural killer: NK) 세포에서 FcγRIIIa에 대한 결합에 대한 혈청 IgG와 치료학적 항체 사이의 경쟁으로 인한다. 내인성 인간 혈청 IgG는 치료학적 항체에 의해 유도된 ADCC를 저해한다. 따라서, 인간에서 비푸코실화된 치료학적 항체의 증대된 효율이 있을 수 있다. 비푸코실화된 치료학적 항체는 푸코실화된 인간 혈청 IgG보다 FcγRIIIa에 대해 훨씬 더 높은 결합 친화도를 갖고, 이는 인간 혈장 IgG에 의한 방해를 극복하는 바람직한 특질이다.
항체 기반 치료는 위험이 없지 않다. 하나의 이러한 위험은 항체 의존적 증대(antibody-dependent enhancement: ADE)이며, 이는 비중화 항바이러스 단백질이 숙주 세포로 바이러스가 진입하는 것을 수월하게 하여서, 세포에서 감염성을 증가시킬 때 발생한다. 몇몇 세포는 바이러스가 진입을 얻도록 사용하는 이의 표면에서의 보통의 수용체를 갖지 않는다. 항바이러스 단백질(즉, 항체)은 이들 세포 중 일부가 혈장 막에서 갖는 항체 Fc 수용체에 결합한다. 바이러스는 항체의 다른 말단에서 항원 결합 부위에 결합한다. 이 바이러스는 인간 대식세포를 감염시키는 이 기전을 사용할 수 있어서, 보통의 약한 바이러스 감염이 삶을 위협하게 한다. ADE의 가장 널리 공지된 예는 뎅기 바이러스(dengue virus: DENV)에 의한 감염의 환경에서 발생한다. DENV의 하나의 혈청형에 의해 이전에 감염된 사람이 상이한 혈청형에 의해 차후에 여러 달 또는 년에 감염될 때 이것이 관찰된다. 이러한 경우, 질환의 임상 과정은 더 심각하고, 이 사람들은 ADE가 발생하지 않은 사람들과 비교하여 더 높은 바이러스혈증을 갖는다. 이는 1차(제1) 감염이 어린이에서 주로 심각하지 않은 질환(DF)을 발생시키는 한편, 2차 감염(나중의 재감염)이 어린이 및 성인 둘 다에서 심각한 질환(DHF 및/또는 DSS)과 더 연관될 것 같다는 관찰을 설명한다. DENV의 4개의 항원상 상이한 혈청형(DENV-1 내지 DENV-4)이 존재한다. DENV에 의한 감염은 감염 혈청형에 대한 일생의 면역력을 제공하는 중화하는 동형성 면역글로불린 G(IgG) 항체의 생성을 유도한다. DENV에 의한 감염은 또한 다른 3개의 혈청형에 대한 상호 보호 면역력의 약간의 정도를 생성한다. 중화하는 이형성 항체를 유도하는 것 이외에, DENV에 의한 감염은 또한 바이러스를 오직 부분적으로 중화시키거나 결코 중화시키지 않는 이형성 항체를 유도할 수 있다. 이러한 교차 반응성이지만 비중화인 항체의 생성은 더 심각한 2차 감염에 대한 이유일 수 있다. 백혈구 내에 있으면, 바이러스는 비검출된 채 복제하여서, 결국 심각한 질환을 초래하는 매우 높은 바이러스 역가를 생성시킨다.
mAb 치료의 임상 영향은 인상적이다. 그러나, 이 치료학적 접근법의 사용 및 보급을 제한하는 논의가 여전하다. 이들 중 일부는 더 넓은 집단에서, 특히 이들이 큰 영향을 가질 수 있는 개발도상국에서 이의 사용을 제한할 수 있는 이 복잡한 생물물질의 높은 제조 비용을 포함한다. 예를 들어, 에볼라 바이러스 당단백질(glycoprotein: GP)을 표적화하는 mAb는 에볼라 바이러스 질환(Ebola virus disease: EVD)에 대한 중요한 치료 접근법을 대표한다. 개별 mAb 및 mAb 칵테일이 치사 에볼라 바이러스 감염에 대해 작은 동물 및 비인간 영장류를 성공적으로 보호할 수 있다고 나타났다. EVD에 대한 MAb 기반 치료는 ZMapp인 항-GP mAb 칵테일을 받는 확인된 인간 EVD 사례에서 양호한 회복에 의해 더욱 지지된다. 그러나, 극적인 비용, 느린 개발 및 수회 고용량 투여(㎎/㎏)에 대한 요건은 특히 가능한 발병 동안 단백질 mAb 전달에 대한 상당한 도전을 나타낸다.
게다가, 효율을 획득하고 유지시키는 mAb의 반복 투여를 위한 빈번한 요건은 로지스틱 및 환자 순응도의 면에서 장애물일 수 있다. 혈청 IgG와의 경쟁으로 인해 치료학적 항체의 낮은 생체내 효율을 감소시키거나 제거하는 새로운 항체가 필요하다. EVD, 뎅기, HIV, RSV 및 기타와 같은 바이러스에서 항체 의존적 증대를 제거할 수 있는 새로운 항체가 필요하다. 이중특이적 항체, 이작용성 항체 및 항체 칵테일은 치료학적 또는 예방학적인 것으로 입증된 몇몇 기능을 수행하도록 필요하다. DNA 기반 백신을 포함하는 백신에 의한 면역화를 통해 숙주 시스템을 면역자극하는 것과 함께 본 명세서에 기재된 합성 항체를 사용할 수 있는 조합 치료가 또한 필요하다. 추가적으로, 이들 항체 제형의 장기간 안정성은 흔히 짧고 최적이 아니다.
따라서, 안전하고 비용 효과적인 방식으로 대상체에게 전달될 수 있는 최적화된 합성 항체 분자에 대한 수요가 당해 분야에 존재한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DNA 코딩된 항체(DNA encoded antibody: DMAb)를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 제1 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역을 확인하는(identifying) 단계, 제2 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역을 확인하는 단계, 제2 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역의 아미노산 서열을 제1 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역의 아미노산 서열로 치환하여서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계 및 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 DMAb 서열로부터의 것과 제1 DMAb의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열의 단편의 서열 정렬을 수행하는 단계, 제1 DMAb의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 하나 이상의 추가적인 DMAb 서열의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환하여서(여기서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 CDR 영역에서의 잔기가 아님), 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계 및 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인의 접점에서 상호작용에 참여하는 것으로 예측된 DMAb의 아미노산 잔기를 확인하는 단계, 확인된 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 치환을 만들어서(여기서, 하나 이상의 치환은 접점에서 등전점 및 표면 전하 중 적어도 하나를 변경하는 것으로 예측됨), 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계 및 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 DMAb의 아미노산 서열로부터 CH 및 CL 도메인에 대한 아미노산 서열을 제거하는 단계, VH 및 VL 도메인에 대한 아미노산 서열 사이의 링커의 아미노산 서열을 DMAb의 아미노산 서열에 첨가하여서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계, 생성된 아미노산 서열에서 적어도 1회차의 모델링을 수행하는 단계 및 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 모델링의 방법은 링커 모델링, 힌지 변형 모델링, 프레임워크 모델링 및 CDR 루프 개선 중 적어도 하나를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 VH 도메인에 C 말단으로 연결되고, VL 도메인에 N 말단으로 연결된다. 일 실시형태에서, 링커는 VH 도메인에 N 말단으로 연결되고, VL 도메인에 C 말단으로 연결된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 제1 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역을 확인하는 단계, 제2 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역을 확인하는 단계, 제2 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역의 아미노산 서열을 제1 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역의 아미노산 서열로 치환하여서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계, DMAb의 아미노산 서열로부터 CH 및 CL 도메인에 대한 아미노산 서열을 제거하는 단계, VH 및 VL 도메인에 대한 아미노산 서열 사이의 링커의 아미노산 서열을 DMAb의 아미노산 서열에 첨가하여서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계, 생성된 아미노산 서열에서 적어도 1회차의 모델링을 수행하는 단계 및 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 DMAb 서열로부터의 것과 제1 DMAb의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열의 단편의 서열 정렬을 수행하는 단계, 제1 DMAb의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 하나 이상의 추가적인 DMAb 서열의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환하여서(여기서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 CDR 영역에서의 잔기가 아님), 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계, DMAb의 아미노산 서열로부터 CH 및 CL 도메인에 대한 아미노산 서열을 제거하는 단계, VH 및 VL 도메인에 대한 아미노산 서열 사이의 링커의 아미노산 서열을 DMAb의 아미노산 서열에 첨가하여서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계, 생성된 아미노산 서열에서 적어도 1회차의 모델링을 수행하는 단계 및 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인의 접점에서 상호작용에 참여하는 것으로 예측된 DMAb의 아미노산 잔기를 확인하는 단계, 확인된 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 치환을 만들어서(여기서, 하나 이상의 치환은 접점에서 등전점 및 표면 전하 중 적어도 하나를 변경하는 것으로 예측됨), 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계, DMAb의 아미노산 서열로부터 CH 및 CL 도메인에 대한 아미노산 서열을 제거하는 단계, VH 및 VL 도메인에 대한 아미노산 서열 사이의 링커의 아미노산 서열을 DMAb의 아미노산 서열에 첨가하여서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계, 생성된 아미노산 서열에서 적어도 1회차의 모델링을 수행하는 단계 및 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 생성된 핵산 분자에 의해 코딩된 구조적으로 변형된 DMAb에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 제1 DMAb로부터의 하나 이상의 CDR 영역 및 제2 DMAb로부터의 하나 이상의 불변 영역을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb에 관한 것이고, 여기서 구조적으로 변형된 DMAb는 이렇게 변형되지 않은 상응하는 DMAb와 비교하여 더 높은 생체내 발현 및 더 높은 결합 중 적어도 하나를 나타낸다.
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 이렇게 변형되기 전의 구조적으로 변형된 DMAb의 특이성과 비교하여 적어도 동일하거나 더 높은 항원 결합 특이성을 나타낸다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb에 관한 것이고, 여기서 구조적으로 변형된 DMAb는 이렇게 변형되지 않은 상응하는 DMAb와 비교하여 더 높은 생체내 발현 및 더 높은 결합 중 적어도 하나를 나타낸다.
일 실시형태에서, 본 발명은 CH1, CH2, 힌지, VH, 링커 및 VL 도메인을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb에 관한 것이고, 여기서 구조적으로 변형된 DMAb는 이렇게 변형되지 않은 상응하는 DMAb와 비교하여 더 높은 생체내 발현 및 더 높은 결합 중 적어도 하나를 나타낸다.
일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 구조적으로 변형된 DMAb는 a) 코딩된 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115 또는 서열 번호 119의 아미노산 서열과 적어도 90%를 갖는 아미노산 서열; 또는 b) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115 또는 서열 번호 119의 아미노산 서열의 적어도 60%를 포함하는 단편으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 적어도 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 각각의 뉴클레오타이드 서열은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, 적어도 2개의 뉴클레오타이드 서열의 각각은 a) 코딩된 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115 또는 서열 번호 119의 아미노산 서열과 적어도 90%를 갖는 아미노산 서열; 또는 b) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115 또는 서열 번호 119의 아미노산 서열의 적어도 60%를 포함하는 단편으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104 또는 서열 번호 106으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열 번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1a 내지 도 1d를 포함하는, 도 1은 생성될 수 있는 다양한 구조적으로 변형된 DMAb의 예시적인 모델을 도시한다. 도 1a는 풀 그래프트 DMAb의 다이어그램을 도시한다. 도 1b는 부분 그래프팅의 다이어그램을 도시한다. 모 DMAb(서열 번호 47)와 비교하여 변형된 DMAb(서열 번호 48)의 FR1 및 FR4 영역에서의 아미노산의 다수의 변형은 모델링된 DMAb의 오른쪽에 표시된다. 도 1c는 스캐폴드 변형의 다이어그램을 도시한다. VH VL 접점에 참여하는 잔기의 측쇄가 표시된다. 경쇄(상부) 및 중쇄(하부)(각각 서열 번호 50 및 서열 번호 52)의 스캐폴드 변형이 표시되고, 변형된 잔기는 강조된다. 모 DMAb 서열은 서열 번호 49 및 서열 번호 51이다. 도 1d는 풀 및 부분 DMAb 프레임워크 그래프팅을 보여주는 단백질 리본 이미지를 도시한다. 고발현 DMAb의 VH-VL(황색/청색)은 상부 왼쪽에 표시된다. 저발현 DMAb의 VH-VL(녹색/적색)은 상부 오른쪽에 표시된다. 하부 왼쪽에서의 새로운 DMAb 분자는 낮은 발현자로부터의 CDR을 높은 발현자의 프레임워크에 그래프팅함으로써 생성된다. 하부 오른쪽에 높은 발현자로부터의 것에 의해 불량하게 발현하는 DMAb의 VL에서의 처음의 22개의 아미노산을 대체하는, 부분 그래프트에 의해 생성된 새로운 DMAb가 있다.
도 2A 내지 도 2B를 포함하는, 도 2는 BDBV223의 풀 및 부분 그래프팅을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 2A는 BDBV223 항체 및 풀 및 부분 그래프트의 발현을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 2B는 BDBV223 항체 및 풀 및 부분 그래프트의 EBOV 항원 결합을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다.
도 3A 내지 도 3B를 포함하는, 도 3은 풀 및 부분 그래프팅 및 Z5D2의 구조 변형의 효과를 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 3A는 Z5D2 항체의 발현 및 풀 및 부분 그래프트를 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 3B는 Z5D2 항체의 EBOV 항원 결합 및 풀 및 부분 그래프트를 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다.
도 4는 2개의 검증된 고발현 DMAb로부터의 경쇄(서열 번호 58 및 서열 번호 59)에 의한 저발현 DMAb로부터의 다수의 경쇄(서열 번호 54 내지 서열 번호 57)의 정렬을 도시한다.
도 5는 도 5의 각각의 모 경쇄에 대한 풀 VL, CDR 영역을 배제한 VL, FR1 및 FR4를 각각의 검증된 고발현 DMAb와 비교하는 동일성 매트릭스를 도시한다.
도 6은 전장과 scFv-Fc 변형된 IgG DMAb 사이의 구조 차이를 나타내는 다이어그램을 도시한다.
도 7A 내지 도 7C를 포함하는, 도 7은 scFv-Fc 링커가 CDR을 방해하지 않는다는 것을 나타내는 단백질 모델링 이미지를 도시한다. 도 7A는 scFv-Fc 항체의 예측된 폴딩의 막대기 및 리본 이미지를 도시한다. VL(적색), VL CDR(핑크색), VH(녹색), VH CDR(자주색) 및 링커(CPK)가 나타난다. 도 7B 및 도 7C는 ScFv-Fc DMAb의 공간 충전된 모델의 2개의 회전 도면을 도시한다.
도 8A 내지 도 8D를 포함하는, 도 8은 DMAb BDBV223의 scFv-Fc 전환의 효과를 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 8A는 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 발현 수준을 도시한다. 도 8B는 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 혈청 발현 수준을 도시한다. 도 8C는 1976 에볼라 바이러스 발생 균주로부터의 당단백질 항원에 대한 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 항원 결합을 도시한다. 도 8D는 2014 에볼라 바이러스 발생 균주로부터의 당단백질 항원에 대한 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 항원 결합을 도시한다.
도 9A 내지 도 9F를 포함하는, 도 9는 DMAb Z5D2의 scFv-Fc 전환의 효과를 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 9A는 21일에 걸친 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 발현 수준을 도시한다. 도 9B는 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 혈청 발현 수준을 도시한다. 도 9C는 1976 에볼라 바이러스 발생 균주로부터의 당단백질 항원에 대한 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 항원 결합을 도시한다. 도 9D는 2014 에볼라 바이러스 발생 균주로부터의 당단백질 항원에 대한 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 항원 결합을 도시한다. 도 9E는 35일에 걸친 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 발현 수준을 도시한다. 도 9F는 35일에 걸친 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 정규화된 발현 수준을 도시한다.
도 10A 내지 도 10E를 포함하는, 도 10은 DMAb Z1H3의 scFv-Fc 전환의 효과를 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 10A는 21일에 걸친 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 발현 수준을 도시한다. 도 10B는 1976 에볼라 바이러스 발생 균주로부터의 당단백질 항원에 대한 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 항원 결합을 도시한다. 도 10C는 2014 에볼라 바이러스 발생 균주로부터의 당단백질 항원에 대한 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 항원 결합을 도시한다. 도 10D는 35일에 걸친 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 발현 수준을 도시한다. 도 10E는 35일에 걸친 모 및 ScFv-Fc 변형된 DMAb의 정규화된 발현 수준을 도시한다.
도 11은 ScFv-Fc 모델링 과정에서의 상이한 단계로부터의 예시적인 아웃풋을 도시한다.
도 12는 pGX9256의 Fv, VH-VL 및 VL-VH 모델링의 예시적인 이미지를 도시한다.
도 13은 pGX9290의 Fv, VH-VL 및 VL-VH 모델링의 예시적인 이미지를 도시한다.
도 14는 조작된 DMAb가 DNA 플라스미드로서 합성되고 이후 항원 결합 및 발현에 대해 시험관내 및 생체내 평가된다는 것을 나타내는 흐름 다이어그램을 도시한다.
도 15A 내지 도 15B를 포함하는, 도 15는 구조적으로 리포맷팅된 DMAb의 중화 활성을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 15A는 1군 EBOMAb-10에 대한 퍼센트 중화를 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 15B는 에볼라 자이르 당단백질(EBOV-GP)에 의한 렌비타이러스 위형화를 이용한 2군(EBOMAb-14)에 대한 퍼센트 중화를 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다.
도 16은 1군 및 2군의 구조적으로 변형된 DMAb의 중화 활성, IC50 및 IC90의 정량화를 도시한다.
도 17A 내지 도 17F를 포함하는, 도 17은 1군 및 2군의 구조적으로 변형된 DMAb의 발현 및 항원 결합을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 17A는 1군 DMAb의 생체내 시간 과정 발현을 도시한다. 면역억제된 BALB/c 마우스는 근육내 전달을 통해 170㎍의 DMAb를 코딩하는 DNA-플라스미드가 투여된 후, 전기천공(IM-EP)이 되었다. DMAb의 혈청 수준은 35일에 걸쳐 평가되었다. 도 17B는 1군 DMAb에 대한 항원 결합 곡선을 도시한다. 혈청에서의 DMAb는 에볼라 항원에 대한 반응성에 대해 평가되었다. 도 17C는 EBOV-GP 위형화 렌비타이러스 벡터를 사용하여 평가된 바와 같은 1군 DMAb 중화 곡선을 도시한다. 도 17D는 2군 DMAb의 생체내 시간 과정 발현을 도시한다. 면역억제된 BALB/c 마우스는 근육내 전달을 통해 200㎍의 DMAb를 코딩하는 DNA-플라스미드가 투여된 후, 전기천공(IM-EP)이 되었다. DMAb의 혈청 수준은 35일에 걸쳐 평가되었다. 도 17E는 2군 DMAb에 대한 항원 결합 곡선을 도시한다. 혈청에서의 DMAb는 에볼라 항원에 대한 반응성에 대해 평가되었다. 도 17F는 EBOV-GP 위형화 렌비타이러스 벡터를 사용하여 평가된 바와 같은 2군 DMAb 중화 곡선을 도시한다.
도 19A 및 도 19B를 포함하는, 도 19는 코돈 최적화된 마우스 지카 DMAb ZK190G1M3LALA의 유전자 최적화의 분석을 도시한다. 도 19A는 각각의 유전자 최적화된 DMAb에 대한 발현 데이터를 도시한다. 도 19B는 각각의 유전자 최적화된 DMAb에 대한 항원 결합을 도시한다. 이 실험은 HEK293 세포에서 시험관내 수행되었다.
도 20A 및 도 20B를 포함하는, 도 20은 유전자 최적화된 마우스 지카 DMAb ZK190G1M3LALA의 발현 및 결합의 생체내 분석을 도시한다. 도 20A는 각각의 유전자 최적화된 DMAb에 대한 생체내 7일 발현 데이터를 도시한다. 도 20B는 각각의 유전자 최적화된 DMAb에 대한 항원 결합을 도시한다.
도 21A 및 도 21B를 포함하는, 도 21은 유전자 최적화된 ZK185LALA FP2A 코돈 최적화된 작제물의 발현의 분석을 도시한다. 도 21A는 각각의 유전자 최적화된 DMAb에 대한 생체내 7일 발현 데이터를 도시한다. 도 21B는 HEK293 세포에서 각각의 유전자 최적화된 DMAb에 대한 시험관내 발현 데이터를 도시한다.
도 22A 및 도 22B를 포함하는, 도 22는 유전자 최적화된 ZK185LALA FP2A 코돈 최적화된 작제물의 결합 역량의 분석을 도시한다. 도 22A는 각각의 유전자 최적화된 DMAb에 대한 생체내 7일 결합 역량을 도시한다. 도 5B는 HEK293 세포에서 각각의 유전자 최적화된 DMAb에 대한 시험관내 결합 활성을 도시한다.
도 23A 및 도 23B를 포함하는, 도 23은 코돈 최적화된 마우스 지카 DMAb ZK190G1M3LALA의 ScFv-Fc 전환의 분석을 도시한다. 도 23A는 각각의 ScFv-Fc DMAb에 대한 발현 데이터를 도시한다. 도 23B는 각각의 ScFv-Fc DMAb에 대한 항원 결합을 도시한다. 이 실험은 생체내 수행되었다.
도 24는 ZK185LALA FP2A 코돈 최적화된 DMAb의 ScFv-Fc 전환 작제물의 생체내 발현의 분석을 도시한다.
도 25는 DMAb 생체내 전달 및 단백질 조작의 개관의 도식적 다이어그램을 도시한다. 도 25A는 DMAb가 CELLECTRA-3P(등록상표) 장치를 사용하여 촉진된 전기천공에 의해 생체내 전달된다는 것을 나타내는 도식적 다이어그램을 도시한다. 형질주입된 근세포는 단백질 MAb를 발현하고 분비한다. 단백질-MAb는 혈액 순환에 들어간다. 도 25A는 항-RSV 항체가 scFv-Fc 발현을 위해 조작된다는 것을 나타내는 도식적 다이어그램을 도시한다.
도 26A 내지 도 26D를 포함하는, 도 26은 scFv-Fc 항-RSV DMAb의 발현을 도시한다. 도 26A는 RSV DMAb의 발현 동역학을 나타내는 실험 결과를 도시한다. 도 26B는 RSV-DMAb의 피크 발현을 나타내는 실험 결과를 도시한다. 도 26C는 기관지폐포 세척(Bronchoalveolar lavage: BAL) 샘플에서 DMAb의 양을 나타내는 실험 결과를 도시한다. 도 26D는 RSV-F 결합을 나타내는 실험 결과를 도시한다.
도 27은 항-RSV DMAb의 중화를 나타내는 실험 결과를 도시한다.
도 28은 목화나무 래트(cotton rat)에서 항-RSV-DMAb를 나타내는 실험 결과를 도시한다.
도 29A 내지 도 29D를 포함하는, 도 29는 면역유능 마우스에서 인간 sc-Fv 항-RSV의 피크 발현 및 기능을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 마우스에 balb/c 마우스의 다리 근육으로 전달되는 200㎍의 인간 sc-Fv 항-RSV dMAb를 투약하였다. 전달은 CELLECTRA-3P(등록상표)에 의해 보조되었다. 도 29A는 13200ng/㎖의 단백질 인간 sc-Fv의 평균 혈청-수준 발현이 치료 후 7일에 달성된다는 것을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 29B는 생체내 발현된 인간 sc-Fv가 RSV-F 항원에 결합한다는 것을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 29C는 치료된 마우스의 혈청이 시험관내 플라크 감소 검정에 의해 입증된 바대로 살아 있는 RSV-A 바이러스 중화 활성을 나타내고 6.9 로그 역수 중화 역가를 발생시킨다는 것을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 29D는 인간 sc-Fv가 기관지폐포 세척(BAL)에서 전체 단백질의 1㎍당 1.1ng의 인간 sc-Fv의 평균 농도로 치료된 마우스의 폐에 존재한다는 것을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다.
도 30은 목화나무 래트에서 인간 sc-Fv의 유지된 발현을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 100㎍ 및 800㎍의 인간 sc-Fv는 목화나무 래트의 TA 근육에 전달되었다. 전달은 CELLECTRA-3P(등록상표)에 의해 보조되었다. 혈청에서의 피크 발현은 7일 후 도달되었다(각각 226ng/㎖ 및 1353ng/㎖).
도 31A 및 도 31B를 포함하는, 도 31은 목화나무 래트에서 인간 sc-Fv의 피크 발현 및 기능을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 31A는 목화나무 랫트의 다리 근육에서의 2.4㎎의 인간 sc-Fv의 CELLECTRA-3P(등록상표) 보조된 전달이 7일에 7030ng/㎖의 평균 혈청 발현을 발생시킨다는 것을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 31B는 치료된 목화나무 래트의 혈청이 시험관내 플라크 감소 검정에서 중화되어서 5.4 로그 역수 중화 역가의 평균을 발생시킨다는 것을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다.
도 32A 내지 도 32C를 포함하는, 도 32는 분자상 및 실험상 설계 뎅기 및 지카 scFv-Fc가 구조적으로 리포맷팅된다는 것의 도식적 다이어그램을 도시한다. 도 32A는 이용된 설계 접근법의 도식적 표시를 도시한다. ScFv-Fc에 대한 인간 dMAb 설계 전략. VH 및 VL 영역은 (G4S)3 링커에 의해 연결되고, 프로토타입 인간 IgG1 힌지 및 Fc에 융합된다. 도 32B는 scFv-Fc 지카 및 뎅기 dMAb 코딩 플라스미드(Z-dMAb1-sc 및 D-dMAb1-sc), 및 다가 이방향성 촉진자 작제물(Z/D-dMAb1-sc)의 분자 체계화의 다이어그램을 도시한다. 도 32C는 실험 설계의 흐름 차트를 도시하고, 조합된 또는 다가 카세트 내의 다양한 dMAb 작제물은 C57BL/6 마우스의 각각의 전경골근(TA) 근육에서 전달된 후, 전기천공이 되고, dMAb 발현 및 항원 결합은 DNA 전달 후 7일에 평가되었다.
도 33은 지카와 뎅기 바이러스 사이의 교차 반응성의 평가를 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 지카 dMAb는 지카 항원과 특이적으로 반응한다. 뎅기 dMAb는 DENV1 및 DENV2 항원과 특이적으로 반응한다. scFv-FC-dMAb를 코딩하는 플라스미드는 293 T 세포에서 형질주입되었다. 형질주입 후 2일에 scFv-Fc 단백질을 함유하는 상청액은 항원 결합에 처리되었다. 96월 플레이트는 지카 또는 뎅기 항원(DENV1-4)의 1㎖당 1㎍의 웰당 100㎕로 코팅되었다. 역수 혈청 희석 3분의 1(⅓) 연속 희석은 96월 플레이트에서 예비 희석된 혈청 샘플로 수행되었다. 항원 결합은 ELISA에 의해 평가되었다. 데이터는 평균 OD450±SEM으로 표시된다.
도 34A 내지 도 34C를 포함하는, 도 34는 scFV-Fc dMAb의 시험관내 발현 및 항원 결합을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. scFv-FC-dMAb를 코딩하는 플라스미드는 293 T 세포에 의해 형질주입되었다. 도 34A는 형질주입 후 2일에 scFv-Fc dMAb의 발현, 및 동시형질주입 및 다가 Z/D-dMAb1-sc 작제물에서의 이들의 각각의 기여가 평가된다는 것을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 34B는 뎅기(DENV1)에 결합하는 scFv-Fc dMAb의 능력을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 34C는 지카 항원에 결합하는 scFv-Fc dMAb의 능력을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다.
도 35A 내지 도 35C를 포함하는, 도 35는 scFv-Fc dMAb의 생체내 발현 및 항원 결합을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 35A는 전기천공(EP) 매개된 dMAb 형질주입 후 7일에 scFv-Fc dMAb 발현을 나타내는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 데이터는 Z-dMAb1-sc 및 D-dMAb1-sc에 대한 개별 dMAb 발현, 및 동일한 동물에서 칵테일로 전달될 때 또는 동일한 동물에서 2개의 구별되는 근육내 부위에서 개별적으로 전달될 때 이들의 각각의 기여를 나타낸다. 데이터는 또한 단일 다가 플라스미드 작제물에서 발현될 때 뎅기 및 지카 scFv-Fc dMAb의 기여를 나타낸다. 전체 100㎍의 dMAb 코딩 플라스미드는 Z-dMAb1-sc, D-dMAb1-sc 및 Z/D-dMAb1-sc 군에 대해 전달되고, 200㎍은 칵테일 전달 및 개별 전달 군에 대해 전달된 후, EP가 되었다. 혈청은 C57BL/6 마우스에서 scFv-Fc dMAb 발현을 평가하는 정량적 ELISA에 대해 치료 후 7일에 수집되었다. 도 35B는 지카 항원을 인식하는 다양한 작제물에 대한 능력을 평가하는 ab 예시적인 항원 결합 검정을 도시한다. 도 35C는 뎅기 항원을 인식하는 다양한 작제물에 대한 능력을 평가하는 예시적인 항원 결합 검정을 도시한다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 문헌이 지배할 것이다. 바람직한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있지만, 본 명세서 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 이들의 전문이 참고로 원용된다. 본 명세서 개시된 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적이고, 제한인 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "포함한다", "포함된다", "갖는", "갖는다", "수 있다", "함유한다" 및 이들의 파생어는 추가적인 작용 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 전이 어구, 용어 또는 단어인 것으로 의도된다. 문맥상 명백하게 달리 기술하지 않는 한, 단수 형태의 표현은 복수 지시대상을 포함한다. 본 개시내용은 또한 명시적으로 기술하는지 또는 아닌지와 관계없이, 본 명세서 제시된 실시형태 또는 요소를 "포함하는", "이것으로 이루어진" 및 "본질적으로 이것으로 이루어진" 다른 실시형태를 고려한다.
"항체"는 Fab, F(ab')2, Fd, 및 단쇄 항체, 및 이들의 유도체를 포함하는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 항체, 또는 단편, 이들의 단편 또는 유도체를 의미할 수 있다. 항체는 원하는 에피토프 또는 이로부터 유래된 서열에 충분한 결합 특이성을 나타내는 포유류의 혈청 샘플로부터 단리된 항체, 다중클론 항체, 친화도 정제된 항체, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 명세서에서 상호 교환되어 사용되는 바와 같은, "항체 단편" 또는 "항체의 단편"은 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 의미한다. 이 일부는 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, 항체 아이소타입에 따라 CH2, CH3, 또는 CH4)을 포함하지 않는다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 디아바디(diabody), 단쇄 Fv(scFv) 분자, 오직 하나의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 단쇄 폴리펩타이드, 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 함유하는 단쇄 폴리펩타이드, 오직 하나의 중쇄 가변 영역을 함유하는 단쇄 폴리펩타이드, 및 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 함유하는 단쇄 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"항원"은 숙주에서 면역 반응을 생성하는 능력을 갖는 단백질을 나타낸다. 항원은 항체에 의해 인식되고 이에 결합될 수 있다. 항원은 체내에서 또는 외부 환경에서 유래될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "코딩 서열" 또는 "코딩 핵산"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산(RNA 또는 DNA 분자)을 의미할 수 있다. 코딩 서열은 핵산이 투여되는 개체 또는 포유류의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 촉진자 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다. 코딩 서열은 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "보체" 또는 "상보성"은 핵산이 핵산 분자의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 사이의 왓슨-클릭(Watson-Crick)(예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기 짝짓기를 의미할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "정전류"는 조직 또는 상기 조직을 한정하는 세포가 동일한 조직에 전달되는 전기 펄스의 기간에 걸쳐 수신하거나 경험하는 전류를 정의하기 위한 것이다. 전기 펄스는 본 명세서에 기재된 전기천공 장치로부터 전달된다. 이 전류는 본 명세서에 제공된 전기천공 장치가 피드백 요소, 바람직하게는 즉각적인 피드백을 가지므로, 전기 펄스의 수명에 걸쳐 상기 조직에서 정전류량으로 있는다. 피드백 요소는 펄스의 기간에 걸쳐 조직(또는 세포)의 저항을 측정하고, 전기천공 장치가 그 전기 에너지 출력을 변경하도록(예컨대, 전압을 증가하도록) 하여서 동일한 조직에서의 전류가 전기 펄스에 걸쳐(마이크로초의 차수로) 그리고 펄스로부터 펄스로 일정하게 있는다. 몇몇 실시형태에서, 피드백 요소는 컨트롤러를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "전류 피드백" 또는 "피드백"은 상호 교환되어 사용될 수 있고, 제공된 전기천공 장치의 능동 반응을 의미할 수 있으며, 이는 전극 간에 조직에서 전류를 측정하는 것 및 전류를 불변 수준으로 유지하기 위해 이에 따라 EP 장치에 의해 전달되는 에너지 출력을 변경하는 것을 포함한다. 이 불변 수준은 펄스 순서 또는 전기 처리의 개시 전에 사용자에 의해 사전 설정된다. 내부에서의 전기 회로가 전극 간에 조직에서의 전류를 연속적으로 모니터링하고 이 모니터링된 전류(또는 조직 내 전류)를 사전 설정된 전류와 비교하고 모니터링된 전류를 사전 설정된 수준으로 유지하기 위해 연속적으로 에너지-출력 조정을 할 수 있으므로, 피드백은 전기천공 장치의 전기천공 부품, 예를 들어, 컨트롤러에 의해 달성될 수 있다. 피드백 루프는 이것이 아날로그 폐쇄 루프 피드백이므로, 즉각적일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "분산된 전류(decentralized current)"는 본 명세서 기재된 전기천공 장치의 다양한 바늘 전극 어레이로부터 전달되는 전기 전류의 패턴을 의미할 수 있고, 여기서 이 패턴은 전기천공되는 조직의 임의의 영역 상에서 전기천공 관련된 열 스트레스의 발생을 최소화하거나 바람직하게 제거한다.
본 명세서에서 상호 교환되어 사용되는 "전기천공", "전기-투과화" 또는 "전기-역학 증강"("EP")은 생체막에서 미시적 경로(기공)를 유도하기 위한 막관통 전기장 펄스의 이용을 의미할 수 있다; 이들의 존재는 생체분자, 예를 들어, 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 약물, 이온, 및 물이 세포막의 한 쪽에서 다른 쪽으로 통과하게 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "내인성 항체"는 체액성 면역 반응의 유도를 위해 유효 용량의 항원이 투여되는 대상체에서 생성되는 항체를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "피드백 메커니즘"은 소프트웨어 또는 하드웨어(또는 펌웨어)에 의해 수행되는 공정을 의미할 수 있고, 이 공정은 원하는 조직의 임피던스를 수신하고 (에너지의 펄스의 전달 전에, 동안에, 및/또는 후에) 사전 설정된 값, 바람직하게는 전류와 비교하고, 사전 설정된 값을 달성하기 위해 전달된 에너지의 펄스를 조정한다. 피드백 메커니즘은 아날로그 폐쇄 루프 회로에 의해 수행될 수 있다.
"단편"은 기능하고, 즉 원하는 표적에 결합할 수 있고, 전장 항체와 동일한 의도된 효과를 갖는 항체의 폴리펩타이드 단편을 의미할 수 있다. 항체의 단편은 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산이 없는 것을 제외하고는 전장과 100% 동일할 수 있고, 각각의 경우에 1번 위치에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 갖거나 갖지 않는다. 단편은, 부가된 임의의 비상동성 신호 펩타이드를 배제하여, 특정한 전장 항체의 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 백분율을 포함할 수 있다. 단편은 항체와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드의 단편을 포함하고, 추가적으로 동일성 백분율을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 비상동성 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 단편은 추가로 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예컨대, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 항체의 단편에 연결될 수 있다.
항체를 코딩하는 핵산 서열의 단편은 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 없는 것을 제외하고는 전장과 100% 동일할 수 있고, 각각의 경우에 1번 위치에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 코딩하는 서열을 갖거나 갖지 않는다. 단편은, 부가된 임의의 비상동성 신호 펩타이드를 배제하여, 특정한 전장 코딩 서열 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 백분율을 포함할 수 있다. 단편은 항체와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드를 코딩하는 단편을 포함하고, 추가적으로 선택적으로 동일성 백분율을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 비상동성 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 단편은 추가로 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예컨대, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 코딩하는 코딩 서열은 항체 서열의 단편에 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "유전적 작제물"은 단백질, 예컨대, 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 코딩 서열은 핵산 분자가 투여되는 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 촉진자 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "발현 가능한 형태"는 개체의 세포에 존재하는 경우, 코딩 서열이 발현되도록 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 작제물을 의미한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 본 명세서에 사용된 바와 같은 "동일한" 또는 "동일성"은 서열이 기재된 영역에 걸쳐 동일한 기재된 잔기 백분율을 가진다는 것을 의미할 수 있다. 백분율은 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 기재된 영역에 걸쳐 2개의 서열을 비교하고, 서열 둘 다에서 동일한 잔기가 생기는 위치의 수를 결정하여서, 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 기재된 영역에서의 위치의 전체 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱해서 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열이 상이한 길이이거나 정렬이 하나 이상의 엇갈린 말단을 생성하고 비교의 기재된 영역이 오로지 단일 서열을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에는 포함되지만 분자에는 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교하는 경우, 타이민(T) 및 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 이용함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "임피던스"는 피드백 메커니즘을 논의할 때 이용될 수 있고, 옴의 법칙에 따라 전류 값으로 전환되어 사전 설정된 전류와의 비교를 가능하게 할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "면역 반응"은 하나 이상의 핵산 및/또는 펩타이드의 도입에 반응하는 숙주의 면역계, 예를 들어, 포유류의 면역계의 활성화를 의미할 수 있다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응의 형태, 또는 둘 다일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 단일 가닥의 도시는 또한 상보성 가닥의 서열을 한정한다. 따라서 핵산은 또한 도시된 단일 가닥의 상보성 가닥을 포함한다. 핵산의 많은 변이체가 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이들의 보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘 다, RNA, 또는 하이브리드일 수 있고, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합 및 우라실, 아데닌, 타이민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 아이소사이토신 및 아이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 이것이 공간적으로 연결된 촉진자의 제어 하에 있다는 것을 의미할 수 있다. 촉진자는 그 제어 하에 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 배치될 수 있다. 촉진자와 유전자 사이의 거리는 촉진자와, 촉진자가 유래된 유전자에서 이것이 제어하는 유전자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 이 거리의 변동은 촉진자 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "펩타이드", "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있고, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "촉진자"는 세포에서의 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화하거나, 증대시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 의미할 수 있다. 촉진자는 발현을 추가로 증대시키고/시키거나, 이의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특정한 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 촉진자는 또한 원위 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함할 수 있고, 이들은 전사의 시작 부위에서 수천 개의 염기쌍만큼 떨어져 배치될 수 있다. 촉진자는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 소스로부터 유래될 수 있다. 촉진자는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 발현이 일어나는 발생 단계에 대해, 또는 외부 자극, 예컨대, 생리학적 스트레스, 병원균, 금속 이온 또는 유도제에 반응하여 구성적으로 또는 차별적으로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 촉진자의 대표적인 예는 박테리오파지 T7 촉진자, 박테리오파지 T3 촉진자, SP6 촉진자, lac 오퍼레이터-촉진자, tac 촉진자, SV40 후기 촉진자, SV40 조기 촉진자, RSV-LTR 촉진자, CMV 촉진자, EF1알파 촉진자, ACTA1 촉진자, SV40 초기 촉진자 또는 SV 40 후기 촉진자 및 CMV IE 촉진자를 포함한다.
"신호 펩타이드" 및 "리더 서열"은 본 명세서에서 상호 교환되어 사용되며, 본 명세서에 기재된 단백질의 아미노 말단에 연결될 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. 신호 펩타이드/리더 서열은 통상적으로 단백질의 국재화를 지시한다. 본 명세서에 사용된 신호 펩타이드/리더 서열은 바람직하게는 이것이 생산되는 세포로부터 단백질의 분비를 촉진한다. 신호 펩타이드/리더 서열은 대개 세포로부터의 분비 시, 종종 성숙 단백질로 불리는 단백질의 나머지로부터 절단된다. 신호 펩타이드/리더 서열은 단백질의 N 말단에서 연결된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "엄격한 혼성화 조건"은 제1 핵산 서열(예를 들어, 프로브)이 제2 핵산 서열(예를 들어, 표적)에, 예컨대, 핵산의 복합 혼합물로 혼성화하는 조건을 의미할 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 한정된 이온 농도 pH에서 특정한 서열에 대한 열 용점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 낮도록 선택될 수 있다. Tm은 표적에 상보성인 프로브의 50%가 평형 시(표적 서열이 과량으로 존재하므로, Tm에서 프로브의 50%가 평형 시 점유됨) 표적 서열에 혼성화하는 온도(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에)일 수 있다. 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 예컨대, pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예를 들어, 약 10 내지 50개의 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예를 들어, 약 50개 초과의 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 60℃인 것일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예를 들어, 폼아마이드의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기를 포함한다: 50% 폼아마이드, 5×SSC 및 1% SDS, 42℃에서 항온처리하거나, 또는 5×SSC, 1% SDS, 65℃에서 항온처리하고, 65℃에서 0.2×SSC, 및 0.1% SDS 중에 세척.
본 명세서에 상호 교환되어 사용된 바와 같은, "대상체" 및 "환자"는 포유류(예를 들어, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니아 피그, 고양이, 개, 래트 및 마우스, 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 예컨대, 사이노몰구스 또는 레서스 원숭이, 침팬지 등) 및 인간)(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 임의의 척추동물을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비인간일 수 있다. 대상체 또는 환자는 다른 형태의 치료를 받고 있을 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "실질적으로 상보성"은 제1 서열이 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 영역의 영역에 걸쳐 제2 서열의 보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 2개의 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화한다는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "실질적으로 동일한"은 제1 서열이 제2 서열의 보체에 실질적으로 상보적인 경우, 제1 서열 및 제2 서열이 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 또는 핵산에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%라는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "합성 항체"는 본 명세서에서 기재된 재조합 핵산 서열에 의해 코딩되고 대상체에서 생성되는 항체를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 예방, 억제, 진압 또는 완전 제거의 수단을 통해 질환으로부터 대상체를 보호하는 것을 의미할 수 있다. 질환의 예방은 질환의 발병 전에 대상체에 대한 본 발명의 백신의 투여를 수반한다. 질환의 억는 질환의 유도 후 그러나 이의 임상 출현 전에 대상체에 대한 본 발명의 백신 투여를 수반한다. 질환의 진압은 질환의 임상 출현 후 대상체에 대한 본 발명의 백신 투여를 수반한다.
핵산에 대해 본 명세서에 사용된 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이의 보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 이의 상보체, 또는 이들과 실질적으로 동일한 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성(예를 들어, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산에 의한 아미노산의 대체는 당해 분야에서 통상적으로 작은 변화가 관여되는 것으로 인식된다. 이러한 작은 변화는, 부분적으로 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)를 고려하여 확인될 수 있다[Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)]. 아미노산의 수치 지수는 그 소수성 및 전하에 기초한다. 유사한 수치 지수의 아미노산은 치환되고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 일 양상에서, ±2의 수치 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 생성하는 치환을 드러내기 위해 이용될 수 있다. 펩타이드의 맥락에서 아미노산의 친수성 고려는 항원성 및 면역원성과 훌륭히 상관되는 것으로 보고된 유용한 척도인 그 펩타이드의 가장 높은 국소 평균 친수성의 계산을 허용한다(미국 특허 제4,554,101호(본 명세서에 완전히 참고로 원용됨)). 당해 분야에서 이해되는 바와 같은, 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들어, 면역원성을 보유하는 펩타이드를 생성할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 둘 다는 아미노산의 특정한 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이 관찰과 일치하게, 생물학적 기능에 맞는 아미노산 치환은 아미노산의 상대적 유사성, 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성으로 드러나는 바와 같은 이들 아미노산의 측쇄에 따라 달라진다고 이해된다.
변이체는 전체 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "벡터"는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 벡터는 나노플라스미드 또는 미니-서클 플라스미드를 포함하는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다.
본 명세서에서 숫자 범위의 기재에 있어서, 동일한 정도의 정확도를 갖는 이들 사이의 각각의 개재하는 숫자가 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위에 대해, 숫자 7 및 8은 6 및 9에 부가하여 고려되며, 6.0 내지 7.0의 범위에 대해, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명시적으로 고려된다.
2. 구조적으로 변형된 DMAb
본 발명은 구조적으로 변형된 DNA 코딩된 합성 항체(DMAb)를 포함하는 조성물, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물, 구조적으로 변형된 DMAb를 생성하는 방법 및 구조적으로 변형된 DMAb를 사용하는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 생체내 발현, 항원 결합, 안정성, 또는 이들의 조합을 증가시키는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 변형은 낮은 발현하는 DMab로 지정된 DMAb의 생체내 발현을 증가시키는 것에 기초하여 이루어진다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 변형은 DMAb의 생체내 항원 결합을 증가시키는 것에 기초하여 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따라 구조적으로 변형되기 위한 후보 DMAb는 생체내 원해지는 항원 결합을 나타내지만, 낮은 발현을 나타내는 DMAb이다. 따라서, 원해지는 DMAb를 생성하기 위한 구조 변형은 생체내 원해지는 항원 결합 및 더 높은 발현 수준 둘 다를 나타내는 DMAb를 생성하도록 그 DMAb의 발현을 증가시키는 것이다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 비변형된 DMAb의 발현 수준에 비해 발현을 증가시키는 적어도 하나의 변형을 포함한다.
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 이렇게 변형되지 않은 상응하는 DMAb의 발현을 증가시키는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 변형은 풀 그래프트, 부분 그래프트, 스캐폴드 변형, ScFv-Fc 전환 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 그러나, 본 발명은 이들 유형의 변형으로 제한되지 않아야 한다. 오히려, 본 발명은 DMAb의 생체내 발현 또는 항원 결합을 증가시킬 수 있는 임의의 유형의 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
풀 그래프트
일 실시형태에서, 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb는 풀 그래프트 DMAb이다. 일 실시형태에서, 풀 그래프팅은 상이한 DMAb의 골격으로 DMAb의 적어도 하나의 CDR 영역을 코딩하는 서열을 이동시키는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 풀 그래프팅은 낮은 생체내 발현을 갖는 DMAb의 적어도 하나의 CDR 영역을 확인하는 것 및 낮은 발현하는 DMAb의 적어도 하나의 CDR 서열을 갖도록 높은 생체내 발현 수준을 갖는 DMAb의 적어도 하나의 CDR 영역을 변형시키는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 풀 그래프트 DMAb는 하나의 DMAb의 가변 중쇄로부터의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 CDR이 제2 DMAb의 가변 중쇄로부터의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 CDR과 동일하도록 변형된 DMAb를 포함한다. 일 실시형태에서, 풀 그래프트 DMAb는 하나의 DMAb의 가변 중쇄로부터의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 CDR이 제2 DMAb의 가변 중쇄로부터의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 CDR과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하도록 변형된 DMAb를 포함한다. 일 실시형태에서, 풀 그래프트 DMAb는 하나의 DMAb의 가변 경쇄로부터의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 CDR이 제2 DMAb의 가변 경쇄로부터의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 CDR과 동일하도록 변형된 DMAb를 포함한다.
본 발명의 풀 그래프트 DMAb를 생성하기 위해 사용하기 위한 면역글로불린 스캐폴드는 임의의 면역글로불린 아이소타입 유래일 수 있다. 중쇄 면역글로불린 아이소타입은 IgA, 예를 들어, IgA1 및 IgA2, IgD, IgE, IgG, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 IgM을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 경쇄 면역글로불린 아이소타입은 카파 및 람다를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 풀 그래프트 DMAb의 생성에 대한 기초로서 작용하는 DMAb는 동일한 면역글로불린 아이소타입을 갖는다. 일 실시형태에서, 풀 그래프트 DMAb의 생성에 대한 기초로서 작용하는 DMAb는 상이한 면역글로불린 아이소타입 유래이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 풀 그래프트 DMAb는 모 DMAb와 비교하여 변형된 발현, 안정성, 반감기, 항원 결합, 중쇄-경쇄 짝짓기, 조직 침투 또는 이들의 조합을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 풀 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 발현을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 풀 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 항원 결합을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 풀 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 긴 반감기를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 풀 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 안정성을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 풀 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 큰 조직 침투를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 풀 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 중쇄-경쇄 짝짓기를 갖는다.
부분 그래프트
일 실시형태에서, 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb는 부분 그래프트 DMAb이다. 일 실시형태에서, 부분 그래프팅은, 상이한 DMAb의, 하나 이상의 FR 영역, 또는 이의 단편을 함유하도록 DMAb의 하나 이상의 FR 영역, 또는 이의 단편을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 부분 그래프팅은 높은 생체내 발현을 갖는 제2 DMAb의 것과 유사한 낮은 생체내 발현을 갖는 DMAb의 FR 영역, 또는 이의 단편을 변형시키는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 FR 영역의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개 또는 50개 초과의 잔기는 변경된다. 일 실시형태에서, 다수의 FR 영역의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개 또는 50개 초과의 잔기는 변경된다. 일 실시형태에서, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 20개 초과의 잔기는 서로에 가까운 근접성 내에 변경된다(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 20개 초과의 잔기는 연속 30개의 잔기 영역 내에 변경된다.) 일 실시형태에서, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 20개 초과의 잔기는 단일 FR 내에(즉, FR1, FR2, FR3 또는 FR4 내에) 변경된다. 일 실시형태에서, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 20개 초과의 잔기는 다수의 FR 내에(예를 들어, FR1 및 FR4 내에) 변경된다. 예시적인 실시형태에서, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 잔기는 가변 경쇄의 N 말단에서 변경된다.
본 발명의 부분 그래프트 DMAb의 생성을 위한 기본으로서 작용하는 DMAb의 면역글로불린 스캐폴드는 임의의 면역글로불린 아이소타입, 예를 들어, IgA, 예를 들어, IgA1 및 IgA2, IgD, IgE, IgG, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgM, 카파 및 람다(이들로 제한되지는 않음) 유래일 수 있다. 일 실시형태에서, 부분 그래프트 DMAb의 생성을 위한 기본으로서 작용하는 DMAb는 동일한 면역글로불린 아이소타입이다. 일 실시형태에서, 부분 그래프트 DMAb의 생성을 위한 기본으로서 작용하는 DMAb는 상이한 면역글로불린 아이소타입이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 부분 그래프트 DMAb는 모 DMAb와 비교하여 변형된 발현, 안정성, 반감기, 항원 결합, 중쇄-경쇄 짝짓기, 조직 침투 또는 이들의 조합을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 부분 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 발현을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 부분 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 항원 결합을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 부분 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 긴 반감기를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 부분 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 안정성을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 부분 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 조직 침투를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 부분 그래프트 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 중쇄-경쇄 짝짓기를 갖는다.
스캐폴드 변형
일 실시형태에서, 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb는 스캐폴드 변형된 DMAb이다. 일 실시형태에서, 스캐폴드 변형은 VH-VL 접점에서 안정화 상호작용을 증가시키거나, 등전점을 양호하게 변경하기 위해 DMAb의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 변형될 수 있는 잔기는 VH-VL 상호작용에 관여된 잔기를 예측하기 위해 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여(예를 들어, 문헌[Abhinandan et al., 2010, Protein Eng Des Sel, 23(9):689-697]에 기재된 바대로 VH-VL 접점에 관여된 잔기를 예측하기 위한 생물정보 방법을 이용하여) 확인될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 스캐폴드 변형된 DMAb는 비방향족 측쇄 잔기를 방향족 측쇄 잔기로 변경시키는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 스캐폴드 변형된 DMAb는 전기적으로 하전된 측쇄를 갖는 VH-VL 접점 아미노산을 비하전된 측쇄를 갖는 아미노산으로 변경시키는 하나 이상의 변형(예를 들어, 글루타민(Q)으로의 라이신(K) 변형)을 포함한다. 일 실시형태에서, 스캐폴드 변형된 DMAb는 비하전된 측쇄를 갖는 VH-VL 접점 아미노산을 소수성 측쇄를 갖는 아미노산으로 변경시키는 하나 이상의 변형(예를 들어, 타이로신(Y)으로의 Q 변형)을 포함한다. 일 실시형태에서, 스캐폴드 변형된 DMAb는 VH-VL 접점 아미노산을 방향족 측쇄를 갖는 아미노산으로 변경시키는 하나 이상의 변형(예를 들어, 타이로신(Y)으로의 Q 변형)을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 스캐폴드 변형된 DMAb는 FR2 또는 FR3 내의 하나 이상의 변형을 포함한다.
본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb의 면역글로불린 스캐폴드는 임의의 면역글로불린 아이소타입, 예를 들어, IgA, 예를 들어, IgA1 및 IgA2, IgD, IgE, IgG, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgM, 카파 및 람다(이들로 제한되지는 않음) 유래일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스캐폴드 변형된 DMAb는 모 DMAb와 비교하여 변형된 발현, 안정성, 반감기, 항원 결합, 중쇄-경쇄 짝짓기, 조직 침투 또는 이들의 조합을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스캐폴드 변형된 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 발현을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스캐폴드 변형된 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 항원 결합을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스캐폴드 변형된 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 긴 반감기를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스캐폴드 변형된 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 안정성을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스캐폴드 변형된 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 큰 조직 침투를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스캐폴드 변형된 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 큰 중쇄-경쇄 짝짓기를 갖는다.
단쇄 Fv-Fc(ScFv-Fc) 전환
일 실시형태에서, 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb는 ScFv-Fc DMAb이다. 일 실시형태에서, ScFv-Fc 전환은 CH1 및 CL 영역의 제거, 및 VH와 VL 사이의 링커의 첨가에 관한 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb는 CH1 및 CL 도메인에 대한 코딩 서열이 결여되고 VH 도메인을 코딩하는 서열과 VL 도메인을 코딩하는 서열 사이의 링커에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩된 DMAb를 포함한다. 일 실시형태에서, ScFv-Fc DMAb는 VH 영역의 C 말단을 VL 영역의 N 말단에 부착시키는 링커를 포함하는 VH-VL 배향에 있다. 일 실시형태에서, ScFv-Fc DMAb는 VL 영역의 C 말단을 VH 영역의 N 말단에 부착시키는 링커를 포함하는 VL-VH 배향에 있다. 일 실시형태에서, 링커는 적어도 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 20개 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS에 따른 서열(서열 번호 53)을 갖는 (G4S)3 링커를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 아미노산 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열 번호 109)를 갖는 위틀로우(Whitlow) 링커이다.
본 발명의 ScFv-Fc DMAb의 면역글로불린 스캐폴드는 임의의 면역글로불린 아이소타입, 예를 들어, IgA, 예를 들어, IgA1 및 IgA2, IgD, IgE, IgG, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgM, 카파 및 람다(이들로 제한되지는 않음) 유래일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 ScFv-Fc 전환된 항체는 모 DMAb와 비교하여 변형된 발현, 안정성, 반감기, 항원 결합, 중쇄-경쇄 짝짓기, 조직 침투 또는 이들의 조합을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 ScFv-Fc DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 발현을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 ScFv-Fc DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 항원 결합을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 ScFv-Fc DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 긴 반감기를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 ScFv-Fc DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 안정성을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 ScFv-Fc DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 큰 조직 침투를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 ScFv-Fc DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 큰 중쇄-경쇄 짝짓기를 갖는다.
유전자 최적화
일 실시형태에서, 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb는 유전자 최적화된(gene optimized: GO) DMAb이다. 일 실시형태에서, 유전자 최적화는 모 DMAb와 비교하여 변형된 발현, 안정성, 반감기, 항원 결합, 또는 이들의 조합을 갖는 서열을 생성하도록 전사 및 번역에 영향을 미치는 다수의 매개변수, 예컨대, 코돈 용법, GC 함량, 은성 스플라이스 부위 및 mRNA 2차 구조가 다변량 회귀 알고리즘에서 가중되는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 유전자 최적화된 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 발현을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 유전자 최적화된 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 항원 결합을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 유전자 최적화된 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 긴 반감기를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 유전자 최적화된 DMAb는 모 DMAb보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 50배 초과로 더 높은 안정성을 갖는다.
구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자
일 실시형태에서, 본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 핵산 서열은 모 DMAb에 비해 증가된 발현, 안정성, 반감기, 항원 결합, 또는 이들의 조합을 갖도록 설계된 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, 핵산 서열은 풀 그래프트 DMAb, 부분 그래프트 DMA, 스캐폴드 변형된 DMAb, 유전자 최적화된 DMAb 또는 ScFv-Fc 전환 DMAb를 코딩한다.
항-에볼라 DMAb
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 항-에볼라 DMAb이다. 일 실시형태에서, 풀 그래프트의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 16 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, 풀 그래프트의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 15 또는 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 부분 그래프트의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 4, 서열 번호 14, 서열 번호 30 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, 부분 그래프트의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 3, 서열 번호 13, 서열 번호 29 또는 서열 번호 33의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 스캐폴드 변형된 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 2 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, 스캐폴드 변형된 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 2 또는 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, ScFv-Fc 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 32 또는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, ScFv-Fc 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 32 또는 서열 번호 36의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb의 단편을 코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자의 단편은 구조적으로 변형된 DMAb의 가변 경쇄 영역 또는 가변 중쇄 영역을 코딩한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 코딩된 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44 또는 서열 번호 46의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43 또는 서열 번호 45의 핵산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb의 단편을 코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자의 단편은 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb의 가변 경쇄 영역 또는 가변 중쇄 영역을 코딩한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44 또는 서열 번호 46의 아미노산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함하는 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43 또는 서열 번호 45의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함하는 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44 또는 서열 번호 46의 아미노산 서열과 코딩된 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%에 걸쳐 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43 또는 서열 번호 45의 핵산 서열과 핵산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%에 걸쳐 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44 또는 서열 번호 46과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열 또는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44 또는 서열 번호 46과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44 또는 서열 번호 46에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44 또는 서열 번호 46에 기재된 바와 같은 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43 또는 서열 번호 45와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43 또는 서열 번호 45와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 DNA 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-에볼라 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43 또는 서열 번호 45에 기재된 바와 같은 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43 또는 서열 번호 45에 기재된 바와 같은 DNA 서열의 단편을 포함한다.
본 발명의 조성물은 에볼라 바이러스 감염과 연관된 임의의 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 바이러스 감염에 대해 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 에볼라 바이러스 감염과 연관된 병태를 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다.
항-지카 DMAb
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 항-ZIKV DMAb이다.
일 실시형태에서, 유전자 최적화된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84 또는 서열 번호 86의 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, 유전자 최적화된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83 또는 서열 번호 85의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, ScFv-Fc 변형된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104 또는 서열 번호 106의 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, ScFv-Fc 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103 또는 서열 번호 105의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 코딩된 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104 또는 서열 번호 106의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103 또는 서열 번호 105의 핵산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 구조적으로 변형된 항-ZIKV DMAb의 단편을 코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 핵산 분자의 단편은 구조적으로 변형된 항-ZIKV DMAb의 가변 경쇄 영역 또는 가변 중쇄 영역을 코딩한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104 또는 서열 번호 106의 아미노산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함하는 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103 또는 서열 번호 105의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함하는 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104 또는 서열 번호 106의 아미노산 서열과 코딩된 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%에 걸쳐 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103 또는 서열 번호 105의 핵산 서열과 핵산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%에 걸쳐 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104 또는 서열 번호 106과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104 또는 서열 번호 106과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104 또는 서열 번호 106에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104 또는 서열 번호 106에 기재된 바와 같은 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103 또는 서열 번호 105와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103 또는 서열 번호 105와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 DNA 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-ZIKV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103 또는 서열 번호 105에 기재된 바와 같은 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103 또는 서열 번호 105에 기재된 바와 같은 DNA 서열의 단편을 포함한다.
본 발명의 조성물은 지카 바이러스 감염과 연관된 임의의 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 바이러스 감염에 대해 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 지카 바이러스 감염과 연관된 병태를 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다.
항-DENV DMAb
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 항-DENV DMAb이다.
일 실시형태에서, ScFv-Fc 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 108의 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, ScFv-Fc 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 107의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 코딩된 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 108의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 107의 핵산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb의 단편을 코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb를 코딩하는 핵산 분자의 단편은 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb의 가변 경쇄 영역 또는 가변 중쇄 영역을 코딩한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 108의 아미노산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함하는 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 107의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함하는 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 108의 아미노산 서열과 코딩된 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%에 걸쳐 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 107의 핵산 서열과 핵산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%에 걸쳐 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-DENV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 108과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 108과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-DENV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 108에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 108에 기재된 바와 같은 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-DENV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 107과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 107과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 DNA 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-DENV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 107에 기재된 바와 같은 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 107에 기재된 바와 같은 DNA 서열의 단편을 포함한다.
본 발명의 조성물은 DENV 바이러스 감염과 연관된 임의의 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 바이러스 감염에 대해 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 DENV 바이러스 감염과 연관된 병태를 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다.
항-RSV DMAb
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 항-RSV DMAb이다.
일 실시형태에서, ScFv-Fc 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 113 또는 서열 번호 117의 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, ScFv-Fc 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 112 또는 서열 번호 116의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 유전자 최적화된 항-RSV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 111, 서열 번호 115 또는 서열 번호 119의 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다. 일 실시형태에서, 유전자 최적화된 항-RSV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 110, 서열 번호 114 또는 서열 번호 118의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 코딩된 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117 또는 서열 번호 119의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 DMAb를 코딩한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116 또는 서열 번호 118의 핵산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb의 단편을 코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb를 코딩하는 핵산 분자의 단편은 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb의 가변 경쇄 영역 또는 가변 중쇄 영역을 코딩한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117 또는 서열 번호 119의 아미노산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함하는 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116 또는 서열 번호 118의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함하는 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117 또는 서열 번호 119의 아미노산 서열과 코딩된 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%에 걸쳐 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116 또는 서열 번호 118의 핵산 서열과 핵산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%에 걸쳐 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 구조적으로 변형된 항-RSV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117 또는 서열 번호 119와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117 또는 서열 번호 119와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-RSV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117 또는 서열 번호 119에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117 또는 서열 번호 119에 기재된 바와 같은 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-RSV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116 또는 서열 번호 118과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116 또는 서열 번호 118과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 DNA 서열의 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-RSV DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116 또는 서열 번호 118에 기재된 바와 같은 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열, 또는 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116 또는 서열 번호 118에 기재된 바와 같은 DNA 서열의 단편을 포함한다.
본 발명의 조성물은 RSV 바이러스 감염과 연관된 임의의 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 바이러스 감염에 대해 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 RSV 바이러스 감염과 연관된 병태를 치료, 예방 및/또는 보호할 수 있다.
3. DNA 코딩된 항체
상기 기재된 바대로, 조성물은 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열은 구조적으로 변형된 DMAb, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 코딩할 수 있다. 항체는 하기에 더 자세히 기재된다.
재조합 핵산 서열은 비상동성 핵산 서열일 수 있다. 재조합 핵산 서열은 적어도 하나의 비상동성 핵산 서열 또는 하나 이상의 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있다.
재조합 핵산 서열은 최적화된 핵산 서열일 수 있다. 이러한 최적화는 항체의 면역원성을 증가시키거나 변경할 수 있다. 최적화는 또한 전사 및/또는 번역을 개선할 수 있다. 최적화는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 전사를 증가시키기 위한 낮은 GC 함량의 리더 서열; mRNA 안정성 및 코돈 최적화; 증가된 번역을 위한 코작 서열(예를 들어, GCC ACC)의 부가; 신호 펩타이드를 코딩하는 면역글로불린(Ig) 리더 서열의 부가; 및 시스-작용(cis-acting) 서열 모티프(즉, 내부 TATA 박스)가 작용한 범위까지의 제거.
a. 재조합 핵산 서열 작제물
재조합 핵산 서열은 하나 이상의 재조합 핵산 서열 작제물을 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 성분을 포함할 수 있고, 이는 하기에 더 자세히 기재된다.
재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 코딩하는 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물은 경쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 코딩하는 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물은 또한 프로테아제 또는 펩티다제 절단 부위를 코딩하는 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 리더 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 각각의 리더 서열은 신호 펩타이드를 코딩한다. 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 촉진자, 하나 이상의 인트론, 하나 이상의 전사 종결 영역, 하나 이상의 개시 코돈, 하나 이상의 종결 또는 정지 코돈, 및/또는 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물은 또한 하나 이상의 링커 또는 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열은 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 태그를 코딩할 수 있다.
(1) 중쇄 폴리펩타이드
재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 코딩하는 비상동성 핵산을 포함할 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드는 가변 중쇄(VH) 영역 및/또는 적어도 하나의 불변 중쇄(CH) 영역을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 불변 중쇄 영역은 불변 중쇄 영역 1(CH1), 불변 중쇄 영역 2(CH2), 및 불변 중쇄 영역 3(CH3), 및/또는 힌지 영역을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역 및 CH1 영역을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함할 수 있다.
중쇄 폴리펩타이드는 상보성 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 VH 영역의 3개의 초가변 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드의 N 말단에서 시작하여, 이들 CDR은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 표시된다. 중쇄 폴리펩타이드의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 항원의 결합 또는 인식에 기여할 수 있다.
(2) 경쇄 폴리펩타이드
재조합 핵산 서열 작제물은 경쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 코딩하는 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 경쇄 폴리펩타이드는 가변 경쇄(VL) 영역 및/또는 불변 경쇄(CL) 영역을 포함할 수 있다.
경쇄 폴리펩타이드는 상보성 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 VL 영역의 3개의 초가변 영역을 함유할 수 있다. 경쇄 폴리펩타이드의 N 말단에서 시작하여, 이들 CDR은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 표시된다. 경쇄 폴리펩타이드의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 항원의 결합 또는 인식에 기여할 수 있다.
(3) 프로테아제 절단 부위
재조합 핵산 서열 작제물은 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 프로테아제 또는 펩티다제에 의해 인식될 수 있다. 프로테아제는 엔도펩티다제 또는 엔도 프로테아제, 예를 들어, 퓨린, 엘라스타제, HtrA, 칼파인, 트립신, 키모트립신, 트립신 및 펩신일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 프로테아제는 퓨린일 수 있다. 다른 실시형태에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제, 글루탐산 프로테아제 또는 내부 펩타이드 결합을 절단하는(즉, N 말단 또는 C 말단 펩타이드 결합을 절단하지 않는) 임의의 프로테아제일 수 있다.
프로테아제 절단 부위는 절단 효율을 촉진시키거나 증가시키는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 서열은 별개의 폴리펩타이드를 형성하거나 생성하는 효율을 촉진하거나 증가시킬 수 있다. 하나 이상의 아미노산 서열은 2A 펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
(4) 링커 서열
재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 링커 서열을 포함할 수 있다. 링커 서열은 본 명세서 기재된 하나 이상의 성분을 공간적으로 분리하거나 연결할 수 있다. 다른 실시형태에서, 링커 서열은 2개 이상의 폴리펩타이드를 공간적으로 분리하거나 연결하는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 일 실시형태에서, 링커 서열은 (G4S)n 링커, 예를 들어, 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 53)을 갖는 (G4S)3 링커(이들로 제한되지는 않음)이다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 아미노산 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열 번호 109)를 갖는 위틀로우 링커이다.
(5) 촉진자
재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 촉진자를 포함할 수 있다. 하나 이상의 촉진자는 유전자 발현을 유도하고 유전자 발현을 조절할 수 있는 임의의 촉진자일 수 있다. 이러한 촉진자는 DNA 의존적 RNA 폴리머라제를 통해 전사에 필요한 시스-작용 서열 요소이다. 유전자 발현을 지시하기 위해 사용된 촉진자의 선택은 특정한 용도에 따라 달라진다. 촉진자는, 이것이 그 천연 환경에서 전사 시작 부위로부터 유래되므로, 재조합 핵산 서열 작제물에서 전사 시작으로부터 대략 동일한 거리에 배치될 수 있다. 그러나, 이 거리의 변동이 촉진자의 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
촉진자는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 촉진자는 진핵 세포에서 발현에 효과적인 것으로 나타난 촉진자일 수 있다. 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 촉진자는 CMV 촉진자, 유인원 바이러스 40(SV40)에서 유래된 촉진자, 예컨대, SV40 초기 촉진자 및 SV40 후기 촉진자, 마우스 유선 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus: MMTV) 촉진자, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV) 촉진자, 예컨대, 소 면역결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus: BIV) 긴 말단 반복부(long terminal repeat: LTR) 촉진자, 몰로니 바이러스 촉진자, 조류 백혈증 바이러스(avian leukosis virus: ALV) 촉진자, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus: CMV) 촉진자, 예컨대, CMV 즉시 초기 촉진자, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus: EBV) 촉진자 또는 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus: RSV) 촉진자일 수 있다. 촉진자는 또한 인간 유전자, 예컨대, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아티닌, 인간 폴리헤드린 또는 인간 메탈로티오네인에서 유래된 촉진자일 수 있다.
촉진자는 구성적 촉진자 또는 숙주 세포가 일부 특정한 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도성 촉진자일 수 있다. 다세포 유기체의 경우, 촉진자는 또한 특정한 조직 또는 기관 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다. 촉진자는 또한 천연 또는 합성의 조직 특이적 촉진자, 예컨대, 근육 또는 피부 특이적 촉진자일 수 있다. 이러한 촉진자의 예는 US 특허 출원 공보 제US20040175727호(이의 내용은 그 전문이 본 명세서에 원용됨)에 기재되어 있다.
촉진자는 인핸서와 연관될 수 있다. 인핸서는 코딩 서열의 상류에 배치될 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아티닌 또는 바이러스 인핸서, 예를 들어, CMV, FMDV, RSV 또는 EBV 유래의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 기능 증대는 미국 특허 제5,593,972호, 제5,962,428호 및 W0 제94/016737호(이들의 내용은 그 전문이 본 명세서에 원용됨)에 기재되어 있다.
(6) 인트론
재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 각각의 인트론은 기능적 스플라이스 도너 및 억셉터 부위를 포함할 수 있다. 인트론은 스플라이싱의 인핸서를 포함할 수 있다. 인트론은 효율적인 스플라이싱을 위해 필요한 하나 이상의 신호를 포함할 수 있다.
(7) 전사 종결 영역
재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 전사 종결 영역을 포함할 수 있다. 전사 종결 영역은 효율적인 종결을 제공하기 위해 코딩 서열의 하류일 수 있다. 전사 종결 영역은 상기 기재된 촉진자와 동일한 유전자에서 얻어질 수 있거나, 하나 이상의 상이한 유전자에서 얻어질 수 있다.
(8) 개시 코돈
재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 개시 코돈을 포함할 수 있다. 개시 코돈은 코딩 서열의 상류에 배치될 수 있다. 개시 코돈은 코딩 서열과 같은 틀에 있을 수 있다. 개시 코돈은 효율적인 번역 개시를 위해 필요한 하나 이상의 신호, 예를 들어, 리보솜 결합 부위(이들로 제한되지는 않음)와 연관될 수 있다.
(9) 종결 코돈
재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 종결 또는 정지 코돈을 포함할 수 있다. 종결 코돈은 코딩 서열의 하류일 수 있다. 종결 코돈은 코딩 서열과 같은 틀에 있을 수 있다. 종결 코돈은 효율적인 번역 종결을 위해 필요한 하나 이상의 신호에 연관될 수 있다.
(10) 폴리아데닐화 신호
재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 전사체의 효율적인 폴리아데닐화를 위해 필요한 하나 이상의 신호를 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 코딩 서열의 하류에 배치될 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(bovine growth hormone: bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬(human growth hormone: hGH) 폴리아데닐화 신호 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 플라스미드(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))로부터의 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
(11) 리더 서열
재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 리더 서열을 포함할 수 있다. 리더 서열은 신호 펩타이드를 코딩할 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린(Ig) 신호 펩타이드, 예를 들어, IgG 신호 펩타이드 및 IgE 신호 펩타이드(이들로 제한되지는 않음)일 수 있다.
b. 재조합 핵산 서열 작제물의 배열
상기 기재된 바대로, 재조합 핵산 서열은 하나 이상의 재조합 핵산 서열 작제물을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 하나 이상의 성분이 상기에 자세히 기재된다. 하나 이상의 성분은, 재조합 핵산 서열 작제물에 포함될 때, 서로에 대해 임의의 순서로 배열될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 성분은 하기에 기재된 바와 같이 재조합 핵산 서열 작제물에 배열될 수 있다.
(1) 배열 1
하나의 배열에서, 제1 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있고, 제2 재조합 핵산 서열 작제물은 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있다.
제1 재조합 핵산 서열 작제물은 벡터에 배치될 수 있다. 제2 재조합 핵산 서열 작제물은 제2 또는 별도의 벡터에 배치될 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물의 벡터로의 배치는 하기에 더 자세히 기재된다.
제1 재조합 핵산 서열 작제물은 또한 촉진자, 인트론, 전사 종결 영역, 개시 코돈, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 제1 재조합 핵산 서열 작제물은 추가로 리더 서열을 포함할 수 있고, 여기서 리더 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열의 상류(또는 5')에 배치된다. 따라서, 리더 서열에 의해 코딩된 신호 펩타이드는 중쇄 폴리펩타이드에 대한 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
제2 재조합 핵산 서열 작제물은 또한 촉진자, 개시 코돈, 종결 코돈 및 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 제2 재조합 핵산 서열 작제물은 추가로 리더 서열을 포함할 수 있고, 여기서 리더 서열은 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열의 상류(또는 5')에 배치된다. 따라서, 리더 서열에 의해 코딩된 신호 펩타이드는 경쇄 폴리펩타이드에 대한 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
따라서, 배열 1의 하나의 예는 VH 및 CH1을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 벡터(및 이에 따른 제1 재조합 핵산 서열 작제물), 및 VL 및 CL을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 벡터(및 이에 따른 제2 재조합 핵산 서열 작제물)를 포함할 수 있다. 배열 1의 제2 예는 VH, CH1, 힌지 영역, CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 벡터(및 이에 따른 제1 재조합 핵산 서열 작제물), 및 VL 및 CL을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 벡터(및 이에 따른 제2 재조합 핵산 서열 작제물)를 포함할 수 있다.
(2) 배열 2
제2 배열에서, 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열은 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열의 상류(또는 5')에 배치될 수 있다. 대안적으로, 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열의 상류(또는 5')에 배치될 수 있다.
재조합 핵산 서열 작제물은 하기 더 자세히 기재된 바대로 벡터에 위치할 수 있다.
재조합 핵산 서열 작제물은 프로테아제 절단 부위 및/또는 링커 서열을 코딩하는 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물에 포함되는 경우, 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 비상동성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열과 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 사이에 배치될 수 있다. 따라서, 프로테아제 절단 부위는 발현 시 구별되는 폴리펩타이드로의 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드의 분리를 허용한다. 다른 실시형태에서, 링커 서열이 재조합 핵산 서열 작제물에 포함되는 경우, 링커 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열과 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 사이에 배치될 수 있다.
재조합 핵산 서열 작제물은 또한 촉진자, 인트론, 전사 종결 영역, 개시 코돈, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 촉진자를 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물은 2개의 촉진자를 포함할 수 있어서, 하나의 촉진자는 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열과 연관될 수 있고, 제2 촉진자는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열과 연관될 수 있다. 더욱 다른 실시형태에서, 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열과 연관된 촉진자를 포함할 수 있다.
재조합 핵산 서열 작제물은 추가로 2개의 리더 서열을 포함할 수 있고, 여기서 제1 리더 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열의 상류(또는 5')에 배치되고, 제2 리더 서열은 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열의 상류(또는 5')에 배치된다. 따라서, 제1 리더 서열에 의해 코딩된 제1 신호 펩타이드는 중쇄 폴리펩타이드에 대한 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있고, 제2 리더 서열에 의해 코딩된 제2 신호 펩타이드는 경쇄 폴리펩타이드에 대한 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
따라서, 배열 2의 하나의 예는 VH 및 CH1을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터(및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)를 포함할 수 있고, 여기서 링커 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 사이에 배치된다.
배열 2의 제2 예는 VH 및 CH1을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터(및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)를 포함할 수 있고, 여기서 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 비상동성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 사이에 배치된다.
배열 2의 제3 예는 VH, CH1, 힌지 영역, CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터(및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)를 포함할 수 있고, 여기서 링커 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 사이에 배치된다.
배열 2의 제4 예는 VH, CH1, 힌지 영역, CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터(및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)를 포함할 수 있고, 여기서 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 비상동성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 사이에 배치된다.
(3) ScFv-Fc 배열
ScFv-Fc 배열에서, 재조합 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드의 VH 도메인 및 경쇄 폴리펩타이드의 VL 도메인을 코딩하는 서열 및 추가로 VH 도메인 및 VL 도메인을 코딩하는 비상동성 핵산 서열 사이에 배치된 링커 서열을 포함할 수 있다.
ScFv-Fc 배열의 예는 VH, 링커, VL, 힌지 영역, CH2 및 CH3을 코딩하는 벡터(및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)을 포함할 수 있다. VH 영역은 링커를 VL 영역에 N 말단에서 또는 C 말단에서 연결될 수 있다.
c. 재조합 핵산 서열 작제물로부터의 발현
상기 기재된 바대로, 재조합 핵산 서열 작제물은, 하나 이상의 성분 중에서, 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 비상동성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 배열 1을 이용할 때, 제1 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있고, 제2 재조합 핵산 서열 작제물은 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 배열 2를 이용할 때, 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있다.
예를 들어, 세포, 유기체 또는 포유류(이들로 제한되지는 않음)에서의 발현 시, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 합성 항체로 어셈블링될 수 있다. 특히, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 어셈블링으로 항원에 결합할 수 있는 합성 항체를 생성하도록 서로 상호작용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 어셈블링으로 본 명세서에 기재된 바와 같이 어셈블링되지 않은 항체와 비교하여 더 면역원성인 합성 항체를 생성하도록 서로 상호작용할 수 있다. 더욱 다른 실시형태에서, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 어셈블링으로 항원에 대해 면역 반응을 야기하거나 유도할 수 있는 합성 항체를 생성하도록 서로 상호작용할 수 있다.
d. 벡터
상기 기재된 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 벡터에 배치될 수 있다. 하나 이상의 벡터는 복제 기원을 함유할 수 있다. 하나 이상의 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 하나 이상의 벡터는 자가 복제 염색체외 벡터, 또는 숙주 게놈으로 통합되는 벡터일 수 있다.
벡터는 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 임의의 형태의 재조합 "네이키드 DNA" 벡터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. "벡터"는 세포를 감염시키거나, 형질주입하거나, 일시적으로 또는 영구적으로 형질도입할 수 있는 핵산을 포함한다. 벡터가 네이키드 핵산, 또는 단백질 또는 지질과 복합화된 핵산일 수 있고 인식될 것이다. 벡터는 선택적으로 바이러스 또는 박테리아 핵산 및/또는 단백질, 및/또는 막(예를 들어, 세포막, 바이러스 지질 엔벨로프 등)을 포함한다. 벡터는 레플리콘(예를 들어, RNA 레플리콘, 박테리오파지)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않으며, 이것에 DNA의 단편이 부착되고 복제될 수 있다. 이에 따라 벡터는 RNA, 자율 자가-복제 원형 또는 선형 DNA 또는 RNA(예를 들어, 플라스미드, 바이러스 등, 미국 특허 제5,217,879호 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 발현 및 비발현 플라스미드 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 선형 DNA, 효소 DNA 또는 합성 DNA를 포함한다. 재조합 미생물 또는 세포 배양물이 "발현 벡터"를 숙주화하는 것으로 기재되는 경우, 이는 염색체외 원형 및 선형 DNA 및 숙주 염색체(들)로 도입된 DNA 둘 다를 포함한다. 벡터가 숙주 세포에 의해 유지되는 경우, 벡터는 자율 구조(autonomous structure)로서 유사분열 동안 세포에 의해 안정적으로 복제될 수 있거나, 숙주 게놈 내로 도입된다.
하나 이상의 벡터는 비상동성 발현 작제물일 수 있고, 이는 일반적으로 표적 세포로 특정 유전자를 도입하기 위해 사용되는 플라스미드이다. 일단 발현 벡터가 세포 내이면, 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 코딩되는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드는 세포 전사 및 번역 기전 리보솜 복합체에 의해 생성된다. 하나 이상의 벡터는 다량의 안정한 메신저 RNA, 및 이에 따라 단백질을 발현할 수 있다.
(1) 발현 벡터
하나 이상의 벡터는 원형 플라스미드 또는 선행 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정한 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물을 포함하는 하나 이상의 벡터는 키메라일 수 있고, 이는 그 성분의 적어도 하나가 그 다른 성분의 적어도 하나에 대해 비상동성이라는 것을 의미한다.
(2) 플라스미드
하나 이상의 벡터는 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 재조합 핵산 서열 작제물로 세포를 형질주입하기 위해 유용할 수 있다. 플라스미드는 대상체로 재조합 핵산 서열 작제물을 도입하기 위해 유용할 수 있다. 플라스미드는 또한 조절 서열을 포함할 수 있고, 이는 플라스미드가 투여되는 세포에서 유전자 발현에 매우 적합할 수 있다.
플라스미드는 또한 염색체외로 플라스미드를 유지하고 세포에서 복수의 플라스미드 사본을 생산하기 위해 포유류 복제 기원을 포함할 수 있다. 플라스미드는 Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고)으로부터의 pVAXI, pCEP4 또는 pREP4일 수 있고, 이는 엡스타인 바 바이러스 복제 기원 및 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 포함할 수 있고, 이는 통합 없이 고사본 에피솜 복제를 생성할 수 있다. 플라스미드 골격은 pAV0242일 수 있다. 플라스미드는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5(Ad5) 플라스미드일 수 있다.
플라스미드는 pSE420(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있고, 이는 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli)(이. 콜라이)에서 단백질 생성을 위해 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 pYES2(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있으며, 이는 효모의 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 균주에서 단백질 생성을 위해 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 MAXBAC(상표명) 완전 바큘로바이러스(baculovirus) 발현 시스템(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)일 수 있고, 이는 곤충 세포에서 단백질 생산을 위해 이용될 수 있다. 플라스미드는 또한 pcDNAI 또는 pcDNA3(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있고, 이는 포유류 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 단백질 생성을 위해 사용될 수 있다.
(3) RNA
하나 이상의 벡터는 RNA 분자일 수 있다. 일 실시형태에서, RNA 분자는 본 명세서에 기재된 DNA 서열로부터 전사된다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, RNA 분자는 구조적으로 변형된 DMAb 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 코딩한다. 일 실시형태에서, RNA 분자는 구조적으로 변형된 DMAb 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA 분자로부터 생성된 전사체이다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 DMAb를 코딩하는 RNA 분자를 제공한다. RNA는 펄스-가닥일 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, RNA 분자는 임의의 개재하는 복제 단계, 예컨대, 역전사를 필요로 하지 않으면서 세포에 의해 번역될 수 있다. 본 발명에서 유용한 RNA 분자는 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아노신)을 가질 수 있다. 이러한 캡은 RNA의 생체내 번역을 증대시킬 수 있다. 본 발명에서 유용한 RNA 분자의 5' 뉴클레오타이드는 5' 트리포스페이트기를 가질 수 있다. 캡핑된 RNA에서, 이것은 5'-대-5' 브리지를 통해 7-메틸구아노신에 연결될 수 있다. RNA 분자는 3' 폴리-A 꼬리를 가질 수 있다. 이것은 또한, 이의 3' 말단 부근에, 폴리-A 폴리머라제 인식 서열(예를 들어, AAUAAA)을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 RNA 분자는 단일 가닥일 수 있다. 본 발명에서 유용한 RNA 분자는 합성 RNA를 포함할 수 있다.
(4) 원형 및 선형 벡터
하나 이상의 벡터는 원형 플라스미드일 수 있고, 이는 세포 게놈으로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체외(예를 들어, 복제 기원을 갖는 자가 복제 플라스미드)로 존재할 수 있다. 벡터는 pVAX, pcDNA3.0 또는 provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 코딩된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
선형 핵산, 또는 선형 발현 카세트(linear expression cassette: "LEC")가 본 명세서에 또한 제공되고, 이는 전기천공을 통해 대상체로 효율적으로 전달되고, 핵산 서열 작제물에 의해 코딩된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. LEC는 어떠한 포스페이트 골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 포스페이트 골격을 함유하지 않을 수 있다. LEC는 원하는 유전자 발현과 관련되지 않은 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수 있다.
LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 플라스미드는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 코딩된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 플라스미드는 pNP(푸에르토 리코(Puerto Rico)/34) 또는 pM2(뉴 칼레도니아(New Caledonia)/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0 또는 provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 코딩된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 각각 pNP(푸에르토 리코/34) 및 pM2(뉴 칼레도니아/99)로부터 유래될 수 있다.
(5) 이방향성 발현 벡터
하나 이상의 벡터는 이방향성 발현 벡터일 수 있다. 이방향성 벡터는 관심 대상의 단백질 또는 폴리펩타이드 및 리포터 단백질을 발현하거나, 대안적으로 단일 촉진자로부터의 관심 대상의 2개의 단백질 또는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계될 수 있다. 발현은 구성적으로 활성인 이방향성 인간 사이토메갈로바이러스 촉진자(PminCMV)에 의해 추진될 수 있다. 일 실시형태에서, 관심 대상의 제1 폴리펩타이드는 DMAb이고, 관심 대상의 제2 폴리펩타이드는 항원이다. 일 실시형태에서, 관심 대상의 제1 폴리펩타이드는 제1 DMAb이고, 관심 대상의 제2 폴리펩타이드는 제2 DMAb이다. 일 실시형태에서, 제1 및 제2 DMAb 중 하나 이상은 구조적으로 변형된 DMAb일 수 있다. 제2 DMAb는 제1 DMAb와 동일한 항원, 제1 DMAb와 동일한 바이러스로부터의 상이한 항원 또는 상이한 바이러스의 항원을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명은 항-ZIKV 구조적으로 변형된 DMAb 및 항-DENV 구조적으로 변형된 DMAb의 조합을 코딩하는 다가 이방향성 발현 벡터를 제공한다. 일 실시형태에서, 이방향성 발현 벡터는 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104 또는 서열 번호 106으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열 번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
(6) 바이러스 벡터
세포에 본 발명의 핵산을 전달할 수 있는 바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된다. 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001) 및 Ausubel et al. (1997)]에 그리고 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스(herpes virus) 및 렌티바이러스(lentivirus)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기능, 촉진자 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유한다(예를 들어, WO 제01/96584호; WO 제01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호 참조). 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 포유류, 예를 들어, 인간 세포로 유전자를 삽입하기 위한 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유도될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호 참조).
(7) 벡터를 제조하는 방법
재조합 핵산 서열 작제물이 배치된 하나 이상의 벡터의 제조 방법이 본 명세서에 제공된다. 최종 서브클로닝 단계 후, 벡터는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 대규모 발효 탱크에서 세포 배양물을 접종하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 최종 서브클로닝 단계 후, 벡터는 하나 이상의 전기천공(EP) 장치와 함께 사용될 수 있다. EP 장치는 하기에 더 자세히 기재된다.
하나 이상의 벡터는 공지된 장치 및 기법의 조합을 이용하여 제형화되거나 제조될 수 있지만, 바람직하게는 2008년 12월 4일자로 공개된 제WO/2008/148010호에 기재된 플라스미드 제조 기법을 이용하여 제조된다. 몇몇 예에서, 본 명세서에 기재된 DNA 플라스미드는 10㎎/㎖ 이상의 농도로 제형화될 수 있다. 제조 기법은 또한, 미국 출원 제60/939792호에 기재된 것에 이외에, 2007년 7월 3일자로 허여된 허가받은 특허인 미국 특허 제7,238,522호에 기재된 것들을 포함하여 당업자에게 흔히 공지된 다양한 장치 및 프로토콜을 포함하거나 도입한다. 상기 기재된 출원 및 특허인 미국 출원 제60/939,792호 및 미국 특허 제7,238,522호는 각각 이들의 전문이 본 명세서에 원용된다.
4. 항체
상기 기재된 바대로, 재조합 핵산 서열은 구조적으로 변형된 DMAb, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 코딩할 수 있다. 구조적으로 변형된 DMAb는 항원에 결합하거나 이와 반응할 수 있고, 이는 하기에 더 자세히 기재된다.
구조적으로 변형된 DMAb는 CDR에 대한 지지를 제공하고 서로에 대해 CDR의 공간 관계를 정의하는 중쇄 및 경쇄 프레임워크("FR") 세트 사이에 각각 개입된 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3개의 초가변 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 N 말단에서 시작하여, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 표시된다. 따라서, 항원 결합 부위는 각각의 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.
단백분해 효소 파파인은 우선적으로 IgG 분자를 절단하여서 몇몇 단편을 생성시키고, 이들 중 2개(F(ab) 단편)는 각각 온전한 항원 결합 부위를 포함하는 공유 이종이합체를 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 절단하여서 F(ab')2 단편을 포함하는 몇몇 단편을 제공할 수 있고, 이는 둘 다 항원 결합 부위를 포함한다. 따라서, 항체는 Fab 또는 F(ab')2일 수 있다. Fab는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. Fab의 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역 및 CH1 영역을 포함할 수 있다. Fab의 경쇄는 VL 영역 및 CL 영역을 포함할 수 있다.
구조적으로 변형된 DMAb는 면역글로불린(Ig)일 수 있다. Ig는, 예를 들어, IgA, IgM, IgD, IgE 및 IgG일 수 있다. 면역글로불린은 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 경쇄 폴리펩타이드는 VL 영역 및 CL 영역을 포함할 수 있다.
구조적으로 변형된 DMAb는 각각 중쇄 및 경쇄의 CH1 및 CL 영역이 결여될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 단쇄 DMAb일 수 있고, VL 영역을 VH 영역에 테터링하도록 작용하는 가요성 아미노산 링커 서열을 포함한다. 구조적으로 변형된 DMAb는 VL 영역, 링커, VH 영역, 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 단쇄를 포함할 수 있다. VH 영역은 링커를 통해 VL 영역에 N 말단에서 또는 C 말단에서 연결될 수 있다.
구조적으로 변형된 DMAb는 다중클론 또는 단일클론 항체일 수 있다. 항체는 키메라 항체, 단쇄 항체, 친화도 성숙된 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 인간화된 항체는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 원하는 항원에 결합하는 비인간 종으로부터의 항체일 수 있다.
구조적으로 변형된 DMAb는 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, IgA1 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, 또는 IgM 항체일 수 있다. 구조적으로 변형된 DMAb는 임의의 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, IgA1 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, 또는 IgM 항체의 키메라일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체 힌지 도메인은 변형된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 힌지 도메인에서의 프롤린으로의 세린의 아미노산 치환을 포함한다.
구조적으로 변형된 DMAb는 하기에 더 자세히 기재된 바와 같은 이중특이적 항체일 수 있다. 항체는 또한 하기에 더 자세히 기재된 바와 같은 이작용성 항체일 수 있다.
상기 기재된 바대로, 항체는 대상체에 대한 조성물의 투여 시 대상체에서 생성될 수 있다. 항체는 대상체 내에 반감기를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 대상체 내에 이의 반감기를 연장하거나 단축시키기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 하기에 더 자세히 기재된다.
항체는 하기에 더 자세히 기재된 바와 같이 탈푸코실화될 수 있다.
항체는 하기에 더 자세히 기재된 바와 같이 항원과 관련된 질환의 항체 의존적 증대(ADE)를 감소하거나 예방하기 위해 변형될 수 있다.
a. 이중특이적 항체
재조합 핵산 서열은 이중특이적 구조적으로 변형된 DMAb, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 코딩할 수 있다. 이중특이적 항체는 2개의 항원, 예를 들어, 하기에 더 자세히 기재된 항원 중 2개와 결합하거나 반응할 수 있다. 이중특이적 항체는 본 명세서에 기재된 항체 중 2개의 단편으로 이루어질 수 있고, 이로써 이중특이적 항체가 2개의 원하는 표적 분자와 결합하거나 반응하게 할 수 있으며, 이는 하기에 더 자세히 기재되어 있는 항원, 수용체를 위한 리간드를 포함하는 리간드, 수용체 상의 리간드 결합 부위를 포함하는 수용체, 리간드-수용체 복합체, 및 마커, 예를 들어, 암 마커를 포함할 수 있다.
본 발명은, 생산성, 안정성, 결합 친화도, 생물학적 활성, 소정의 T 세포의 특이적 표적화, 표적화 효율 및 감소된 독성과 같은 특히 유리한 특성을 갖는, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 제2 표적에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 신규한 이중특이적 항체를 제공한다. 몇몇 경우에, 이중특이적 항체가 있고, 여기서 이중특이적 항체는 높은 친화도로 제1 표적에 결합하고, 낮은 친화도로 제2 표적에 결합한다. 다른 경우에, 이중특이적 항체가 있고, 여기서 이중특이적 항체는 낮은 친화도로 제1 표적에 결합하고, 높은 친화도로 제2 표적에 결합한다. 다른 경우에, 이중특이적 항체가 있고, 여기서 이중특이적 항체는 원하는 친화도로 제1 표적에 결합하고, 원하는 친화도로 제2 표적에 결합한다.
일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및 b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄를 포함하는 2가 항체이다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체 분자는 임의의 원하는 특이성의 2개의 결합 부위를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 분자의 결합 부위 중 하나는 T 세포 특이적 수용체 분자 및/또는 천연 살해 세포(NK 세포) 특이적 수용체 분자에 결합할 수 있다. T 세포 특이적 수용체는 소위 "T 세포 수용체"(T-cell receptor: TCR)이고, 이것은 T 세포가 항원 제시 세포 또는 APC라 불리는 또 다른 세포에 의해 제시된 에피토프/항원에 결합하고, 추가적인 신호가 존재하는 경우, 이에 의해 활성화되고 이에 반응하게 한다. T 세포 수용체는 천연 발생 면역글로불린의 Fab 단편을 닮은 것으로 공지되어 있다. 이것은 일반적으로 .알파. 및 .베타. 사슬을 포함하는 1가이고, 몇몇 실시형태에서 이것은 .감마. 사슬 및 .델타. 사슬을 포함한다(상기). 따라서, 몇몇 실시형태에서, TCR은 TCR(알파/베타)이고, 몇몇 실시형태에서 이것은 TCR(감마/델타)이다. T 세포 수용체는 CD3 T 세포 동시수용체와 복합체를 형성한다. CD3은 단백질 복합체이고, 4개의 구별되는 사슬로 이루어진다. 포유류에서, 복합체는 CD3γ 사슬, CD36 사슬 및 2개의 CD3E 사슬을 함유한다. 이들 사슬은 T 림프구에서 활성화 신호를 생성하도록 T 세포 수용체(TCR)로서 공지된 분자 및 ζ-사슬과 회합한다. 그러므로, 몇몇 실시형태에서, T 세포 특이적 수용체는 CD3 T 세포 동시수용체이다. 몇몇 실시형태에서, T 세포 특이적 수용체는 T 세포에서 또한 발현되는 단백질인 CD28이다. CD28은 T 세포 활성화에 필요한 동시자극 신호를 제공할 수 있다. CD28은 T 세포 증식 및 생존, 사이토카인 생성 및 T 헬퍼 2형 발생에서 중요한 역할을 한다. T 세포 특이적 수용체의 더욱 추가의 예는 Ox40이라고도 불리는 CD134이다. CD134/OX40은 활성화 이후의 24 내지 72시간 후에 발현되고, 2차 동시자극 분자를 한정하도록 취해질 수 있다. T 세포 수용체의 또 다른 예는 항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC)에서 4-1BB-리간드에 결합하는 4-1BB이고, 이로써 T 세포에 대한 동시자극 신호가 생성된다. T 세포에서 주로 발견되는 수용체의 또 다른 예는 B 세포에서 또한 낮은 수준으로 발견되는 CD5이다. T 세포 기능을 변형시키는 수용체의 추가의 예는 다른 세포의 표면에서 발현된 Fas-리간드에 의한 아폽토시스 신호전달을 매개하는 Fas 수용체로도 공지된 CD95이다. CD95는 휴지 T 림프구에서 TCR/CD3 추진 신호전달 경로를 조절한다고 보고되어 있다.
NK 세포 특이적 수용체 분자의 예는 CD16, 저친화도 Fc 수용체 및 NKG2D이다. T 세포 및 천연 살해(NK) 세포 둘 다의 표면에 존재하는 수용체 분자의 예는 CD2 및 CD2-슈퍼패밀리의 추가의 구성원이다. CD2는 T 및 NK 세포에서 동시자극 분자로서 작용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체 분자의 제1 결합 부위는 표적 항원에 결합하고, 제2 결합 부위는 T 세포 특이적 수용체 분자 및/또는 천연 살해(NK) 세포 특이적 수용체 분자에 결합한다.
몇몇 실시형태에서, 항체 분자의 제1 결합 부위는 바이러스 항원(예를 들어, 에볼라바이러스 GP 글라이칸 캡, 에볼라바이러스 GP 융합 루프 또는 에볼라바이러스 GP 챌리스 염기) 또는 자가 항원(예를 들어, 종양 항원)(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 표적 항원에 결합하고, 제2 결합 부위는 T 세포 특이적 수용체 분자 및/또는 천연 살해(NK) 세포 특이적 수용체 분자에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 분자의 제1 결합 부위는 표적 항원에 결합하고, 제2 결합 부위는 CD3, T 세포 수용체(TCR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 및 CD95 중 하나에 결합한다.
몇몇 실시형태에서, 항체 분자의 제1 결합 부위는 T 세포 특이적 수용체 분자 및/또는 천연 살해(NK) 세포 특이적 수용체 분자에 결합하고, 제2 결합 부위는 바이러스 항원(예를 들어, 에볼라바이러스 GP 글라이칸 캡, 에볼라바이러스 GP 융합 루프 또는 에볼라바이러스 GP 챌리스 염기) 및 자가 항원(예를 들어, 종양 항원)(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 표적 항원에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체의 제1 결합 부위는 T 세포 특이적 수용체 분자 및/또는 천연 살해(NK) 세포 특이적 수용체 분자에 결합하고, 제2 결합 부위는 표적 항원에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체의 제1 결합 부위는 CD3, T 세포 수용체(TCR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 및 CD95 중 하나에 결합하고, 제2 결합 부위는 표적 항원에 결합한다.
b. 이작용성 항체
재조합 핵산 서열은 이작용성 구조적으로 변형된 DMAb, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 코딩할 수 있다. 이작용성 항체는 하기에 기재된 항체와 결합하거나 반응할 수 있다. 이작용성 항체는 또한, 항원의 인식 및 항원에 대한 결합을 넘어서, 항체에 대한 추가적인 기능성을 부여하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 H 인자 또는 이의 단편에 대한 커플링을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. H 인자는 보체 활성화의 가용성 조절자이고, 이에 따라 보체 매개된 용해(complement-mediated lysis: CML)를 통해 면역 반응에 기여할 수 있다.
c. 항체 반감기의 연장
상기 기재된 바대로, 구조적으로 변형된 DMAb는 대상체에서 항체의 반감기를 연장하거나 단축시키기 위해 변형될 수 있다. 변형은 대상체의 혈청에서 항체의 반감기를 연장하거나 단축시킬 수 있다.
변형은 항체의 불변 영역에 존재할 수 있다. 변형은 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하지 않는 항체의 반감기와 비교하여 항체의 반감기를 연장시키는 항체의 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환일 수 있다. 변형은 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하지 않는 항체의 반감기와 비교하여 항체의 반감기를 연장시키는 항체의 CH2 도메인에서의 하나 이상의 아미노산 치환일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 불변 영역에서의 메티오닌 잔기를 타이로신 잔기로, 불변 영역에서의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 불변 영역에서의 트레오닌 잔기를 글루타메이트 잔기로, 또는 이들의 임의의 조합으로 대체하는 것을 포함할 수 있고, 이로써 항체의 반감기를 연장시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 CH2 도메인에서의 메티오닌 잔기를 타이로신 잔기로, CH2 도메인에서의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, CH2 도메인에서의 트레오닌 잔기를 글루타메이트 잔부로, 또는 이들의 임의의 조합으로 대체하는 것을 포함할 수 있고, 이로써 항체의 반감기를 연장시킬 수 있다.
d. 탈푸코실화
재조합 핵산 서열은 푸코실화되지 않은 구조적으로 변형된 DMAb(즉, 탈푸코실화 항체 또는 비푸코실화 항체), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 코딩할 수 있다. 푸코실화는 분자에 당 푸코스의 첨가, 예를 들어, N-글라이칸, O-글라이칸 및 당지질에 대한 푸코스의 부착을 포함한다. 따라서, 탈푸코실화된 항체에서, 푸코스는 불변 영역의 탄수화물 사슬에 부착되지 않는다. 결국, 이러한 푸코실화의 결여는 푸코실화된 항체와 비교하여 항체에 의해 FcγRIIIa 결합 및 항체 지향된 세포독성(ADCC) 활성을 개선할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 비푸코실화된 항체는 푸코실화된 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성을 나타낼 수 있다.
구조적으로 변형된 DMAb는 항체의 푸코실화를 방지하거나 저해하기 위해 변형될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 변형된 항체는 비변형된 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성을 나타낼 수 있다. 변형은 중쇄, 경쇄, 또는 이들의 조합에서 있을 수 있다. 변형은 중쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 경쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 또는 이들의 조합일 수 있다.
e. 감소된 ADE 반응
구조적으로 변형된 DMAb는 항원과 관련된 질환의 항체 의존적 증대(ADE)를 감소시키거나 방지하기 위해 변형될 수 있지만, 여전히 항원을 중화시킨다. 예를 들어, 항체는 DENV와 연관된 질환을 감소시키거나 방지하기 위해 변형될 수 있고, 이는 하기에 더 자세히 기재되어 있고, 여전히 DENV를 중화시킨다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 FcγR1a에 대한 항체의 결합을 감소시키거나 방지하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 하나 이상의 아미노산 치환은 항체의 불변 영역에 있을 수 있다. 하나 이상의 아미노산 치환은 항체의 불변 영역에서 류신 잔기를 알라닌 잔기로 대체하는 것을 포함할 수 있고, 즉 또한 본 명세서에서 LA, LA 돌연변이 또는 LA 치환으로서 공지되어 있다. 하나 이상의 아미노산 치환은 항체의 불변 영역에서, 2개의 류신 잔기를 각각 알라닌 잔기로 대체하는 것을 포함할 수 있고, 이는 또한 본 명세서에서 LALA, LALA 돌연변이 또는 LALA 치환으로서 공지되어 있다. LALA 치환의 존재는 FcγR1a에 대한 결합으로부터 항체를 방지하거나 차단할 수 있고, 이에 따라, 변형된 항체는 항원과 관련된 질환의 ADE를 증대시키거나 야기하지 않고, 여전히 항원을 중화시킨다.
5. 항원
본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb는 항원, 또는 이의 단편 또는 변이체에 대한 것이다. 항원은 핵산 서열, 아미노산 서열, 다당류 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩타이드, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 다당류는 핵산 코딩된 다당류일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 합성 항체는 2개 이상의 항원을 표적화한다. 일 실시형태에서, 이중특이적 항체의 적어도 하나의 항원은 본 명세서에 기재된 항원 으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 2개 이상의 항원은 본 명세서에 기재된 항원으로부터 선택된다.
항원은 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 바이러스, 기생충, 박테리아, 진균 또는 포유류 유래일 수 있다. 항원은 자가면역 질환, 알레르기 또는 천식과 연관된다. 다른 실시형태에서, 항원은 암, 헤르페스, 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 인간 유두종 바이러스(human papilloma virus: HPV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV)와 연관될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항원은 외래이다. 몇몇 실시형태에서, 항원은 자가 항원이다.
a. 외래 항원
몇몇 실시형태에서, 항원은 외래이다. 외래 항원은 신체로 도입될 때 면역 반응을 자극할 수 있는 임의의 비자가 물질(즉, 대상체의 외래에 기원)이다.
(1) 바이러스 항원
외래 항원은 바이러스 항원, 또는 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 바이러스 항원은 아데노비리다에(Adenoviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae), 분야비리다에(Bunyaviridae), 칼리시비리다에(Caliciviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae), 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 파포바비리다에(Papovaviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 파르보비리다에(Parvoviridae), 피코르나비리다에(Picornaviridae), 폭스비리다에(Poxviridae), 폴리오마비리다에(Polyomaviridae), 레오비리다에(Reoviridae), 레트로비리다에(Retroviridae), 랍도비리다에(Rhabdoviridae) 또는 토가비리다에(Togaviridae)의 과 중 하나로부터의 바이러스일 수 있다. 바이러스 항원은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 치쿤구니야 바이러스(CHIKV), 뎅기 열 바이러스, 유두종 바이러스, 예를 들어, 인간 유두종 바이러스(HPV), 폴리오 바이러스, 간염 바이러스, 예를 들어, A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV) 및 E형 간염 바이러스(HEV), 두창 바이러스(대두창 및 소두창), 백시니아 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노바이러스, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스, 황열 바이러스, 노르워크 바이러스(Norwalk virus), A형 간염 바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV-I), 털 세포 백혈병 바이러스(HTLV-II), 캘리포니아 뇌염 바이러스, 한타 바이러스(Hanta virus)(출혈 열), 광견병 바이러스, 에볼라 열 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 단순 포진 1(구강 헤르페스), 단순 포진 2(성기 헤르페스), 헤르페스 조스터(수두로도 공지된 바리셀라-조스터), 사이토메갈로바이러스(CMV), 예를 들어, 인간 CMV, 엡스타인 바 바이러스(EBV), 플라비바이러스, 구제역 바이러스, 라싸 바이러스(lassa virus), 아레나바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(Merkel cell polyoma virus: MCV) 또는 암 야기 바이러스 유래일 수 있다.
(a) 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원
바이러스 항원은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 바이러스 유래일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, HIV 항원은 아형 A 엔벨로프 단백질, 아형 B 엔벨로프 단백질, 아형 C 엔벨로프 단백질, 아형 D 엔벨로프 단백질, 아형 B Nef-Rev 단백질, Gag 아형 A, B, C 또는 D 단백질, MPol 단백질, Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag의 핵산 또는 아미노산 서열, 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다.
(b) 치쿤구니야 바이러스
바이러스 항원은 치쿤구니야 바이러스 유래일 수 있다. 치쿤구니야 바이러스는 토가비리다에 패밀리의 알파바이러스 속에 속한다. 치쿤구니야 바이러스는 아에데스(Aedes) 속과 같은 감염된 모기의 교상에 의해 인간에게 전파된다.
(c) 뎅기 바이러스
바이러스 항원은 뎅기 바이러스 유래일 수 있다. 뎅기 바이러스 항원은 바이러스 입자를 형성하는 3개의 단백질 또는 폴리펩타이드(C, prM 및 E) 중 하나일 수 있다. 뎅기 바이러스 항원은 바이러스의 복제에 관여하는 7개의 다른 단백질 또는 폴리펩타이드(NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5) 중 하나일 수 있다. 뎅기 바이러스는 DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4를 포함하는 바이러스의 5개의 균주 또는 혈청형 중 하나일 수 있다. 항원은 복수의 뎅기 바이러스 항원의 임의의 조합일 수 있다.
뎅기 바이러스에 특이적인 예시적인 구조적으로 변형된 DMAb는 서열 번호 108을 코딩하는 서열 번호 107에 기재된 구조적으로 변형된 DMAb를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
(d) 간염 항원
바이러스 항원은 간염 바이러스 항원(즉, 간염 항원), 또는 이의 단편 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 간염 항원은 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), 및/또는 E형 간염 바이러스(HEV) 중 하나 이상으로부터의 항원 또는 면역원일 수 있다.
간염 항원은 HAV로부터의 항원일 수 있다. 간염 항원은 HAV 캡시드 단백질, HAV 비구조 단백질, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
간염 항원은 HCV로부터의 항원일 수 있다. 간염 항원은 HCV 뉴클레오캡시드 단백질(즉, 코어 단백질), HCV 엔벨로프 단백질(예를 들어, E1 및 E2), HCV 비구조 단백질(예를 들어, NS1, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a 및 NS5b), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
간염 항원은 HDV로부터의 항원일 수 있다. 간염 항원은 HDV 델타 항원, 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다.
간염 항원은 HEV로부터의 항원일 수 있다. 간염 항원은 HEV 캡시드 단백질, 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다.
간염 항원은 HBV로부터의 항원일 수 있다. 간염 항원은 HBV 코어 단백질, HBV 표면 단백질, HBV DNA 폴리머라제, X 유전자에 의해 코딩된 HBV 단백질, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 간염 항원은 HBV 유전자형 A 코어 단백질, HBV 유전자형 B 코어 단백질, HBV 유전자형 C 코어 단백질, HBV 유전자형 D 코어 단백질, HBV 유전자형 E 코어 단백질, HBV 유전자형 F 코어 단백질, HBV 유전자형 G 코어 단백질, HBV 유전자형 H 코어 단백질, HBV 유전자형 A 표면 단백질, HBV 유전자형 B 표면 단백질, HBV 유전자형 C 표면 단백질, HBV 유전자형 D 표면 단백질, HBV 유전자형 E 표면 단백질, HBV 유전자형 F 표면 단백질, HBV 유전자형 G 표면 단백질, HBV 유전자형 H 표면 단백질, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 A, HBV 유전자형 B, HBV 유전자형 C, HBV 유전자형 D, HBV 유전자형 E, HBV 유전자형 F, HBV 유전자형 G, 또는 HBV 유전자형 H로부터의 항원일 수 있다.
(e) 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원
바이러스 항원은 HPV로부터의 항원을 포함할 수 있다. HPV 항원은 자궁경부암, 직장암, 및/또는 다른 암을 야기하는 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 및 58 유래일 수 있다. HPV 항원은 성기 사마귀를 야기하고, 두경부암을 야기하는 것으로 공지된 HPV 유형 6 및 11 유래일 수 있다.
HPV 항원은 각각의 HPV 유형으로부터의 HPV E6 또는 E7 도메인일 수 있다. 예를 들어, HPV 유형 16(HPV16)에 대해, HPV16 항원은 HPV16 E6 항원, HPV16 E7 항원, 이들의 단편, 변이체 또는 조합을 포함할 수 있다. 유사하게, HPV 항원은 HPV 6 E6 및/또는 E7, HPV 11 E6 및/또는 E7, HPV 18 E6 및/또는 E7, HPV 31 E6 및/또는 E7, HPV 33 E6 및/또는 E7, HPV 52 E6 및/또는 E7, or HPV 58 E6 및/또는 E7, 이들의 단편, 변이체 또는 조합일 수 있다.
(f) RSV 항원
바이러스 항원은 RSV 항원을 포함할 수 있다. RSV 항원은 인간 RSV 융합 단백질(본 명세서에서 "RSV F", "RSV F 단백질" 및 "F 단백질"이라고도 칭함), 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 인간 RSV 융합 단백질은 RSV 아형 A와 B 사이에 보존될 수 있다. RSV 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23994.1)로부터의 RSV F 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 RSV A2 균주(유전자은행 AAB59858.1)로부터의 RSV F 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 RSV F 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체의 단량체, 이합체 또는 삼합체일 수 있다.
RSV F 단백질은 융합전 형태 또는 융합후 형태일 수 있다. RSV F의 융합후 형태는 면역화된 동물에서 고역가 중화 항체를 유발하고, RSV 시험감염으로부터 동물을 보호한다.
RSV 항원은 또한 인간 RSV 부착 당단백질(본 명세서에서 "RSV G", "RSV G 단백질" 및 "G 단백질"이라고도 칭함), 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 인간 RSV G 단백질은 RSV 아형 A와 B 사이에 상이하다. 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23993)로부터의 RSV G 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 RSV 아형 B 단리물 H5601, RSV 아형 B 단리물 H1068, RSV 아형 B 단리물 H5598, RSV 아형 B 단리물 H1123, 또는 이의 단편 또는 변이체로부터의 RSV G 단백질일 수 있다.
다른 실시형태에서, RSV 항원은 인간 RSV 비구조 단백질 1("NS1 단백질"), 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23987.1)로부터의 RSV NS1 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원 인간은 또한 RSV 비구조 단백질 2("NS2 단백질"), 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23988.1)로부터의 RSV NS2 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 추가로 인간 RSV 뉴클레오캡시드("N") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23989.1)로부터의 RSV N 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 인간 RSV 포스포단백질("P") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23990.1)로부터의 RSV P 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 또한 인간 RSV 매트릭스 단백질("M") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23991.1)로부터의 RSV M 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
더욱 다른 실시형태에서, RSV 항원은 인간 RSV 작은 소수성("SH") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23992.1)로부터의 RSV SH 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 또한 인간 RSV 매트릭스 단백질 2-1("M2-1") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23995.1)로부터의 RSV M2-1 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 추가로 인간 RSV 매트릭스 단백질 2-2("M2-2") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23997.1)로부터의 RSV M2-2 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원 인간은 RSV 폴리머라제 L("L") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주(유전자은행 AAX23996.1)로부터의 RSV L 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
추가의 실시형태에서, RSV 항원은 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2-1, M2-2 또는 L 단백질의 최적화된 아미노산 서열을 가질 수 있다. RSV 항원은 인간 RSV 단백질 또는 재조합 항원, 예컨대, 인간 RSV 게놈에 의해 코딩된 단백질 중 임의의 하나일 수 있다.
다른 실시형태에서, RSV 항원은 RSV 긴 균주로부터의 RSV F 단백질, RSV 긴 균주로부터의 RSV G 단백질, 최적화된 아미노산 RSV G 아미노산 서열, RSV 긴 균주의 인간 RSV 게놈, 최적화된 아미노산 RSV F 아미노산 서열, RSV 긴 균주로부터의 RSV NS1 단백질, RSV 긴 균주로부터의 RSV NS2 단백질, RSV 긴 균주로부터의 RSV N 단백질, RSV 긴 균주로부터의 RSV P 단백질, RSV 긴 균주로부터의 RSV M 단백질, RSV 긴 균주로부터의 RSV SH 단백질, RSV 긴 균주로부터의 RSV M2-1 단백질, RSV 긴 균주로부터의 RSV M2-2 단백질, RSV 긴 균주로부터의 RSV L 단백질, RSV 아형 B 단리물 H5601로부터의 RSV G 단백질, RSV 아형 B 단리물 H1068로부터의 RSV G 단백질, RSV 아형 B 단리물 H5598로부터의 RSV G 단백질, RSV 아형 B 단리물 H1123으로부터의 RSV G 단백질, 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
RSV에 특이적인 예시적인 구조적으로 변형된 DMAb는 서열 번호 110 내지 서열 번호 119에 기재된 구조적으로 변형된 DMAb를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
(g) 인플루엔자 항원
바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 포함할 수 있다. 인플루엔자 항원은 포유류에서 하나 이상의 인플루엔자 혈청형에 대해 면역 반응을 유발할 수 있는 것이다. 항원은 전장 번역 산물 HA0, 아단위 HA1, 아단위 HA2, 이들의 변이체, 이들의 단편 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 인플루엔자 혈구응집소 항원은 인플루엔자 A 혈청형 H1, 혈청형 H2의 다수의 균주, 인플루엔자 A 혈청형 H1의 다수의 균주의 상이한 세트로부터 유래된 하이브리드 서열로부터 유래되거나, 인플루엔자 B의 다수의 균주로부터 유래될 수 있다. 인플루엔자 혈구응집소 항원은 인플루엔자 B 유래일 수 있다.
인플루엔자 항원은 또한 면역 반응이 유도될 수 있는 특정한 인플루엔자 면역원에 대해 효과적일 수 있는 적어도 하나의 항원 에피토프를 함유할 수 있다. 항원은 온전한 인플루엔자 바이러스에 존재하는 면역원성 부위 및 에피토프의 전체 레퍼토리를 제공할 수 있다. 항원은 하나의 혈청형의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주, 예컨대, 혈청형 H1 또는 혈청형 H2의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주로부터의 혈구응집소 항원 서열로부터 유래될 수 있다. 항원은 2개의 상이한 혈구응집소 항원 서열 또는 이의 일부를 조합하여 유래된 하이브리드 혈구응집소 항원 서열일 수 있다. 2개의 상이한 혈구응집소 항원 서열의 각각은 하나의 혈청형의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주, 예컨대, 혈청형 H1의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주의 상이한 세트로부터 유래될 수 있다. 항원은 복수의 인플루엔자 B 바이러스 균주로부터의 혈구응집소 항원 서열로부터 유래된 혈구응집소 항원 서열일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 인플루엔자 항원은 H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, 또는 BHA 항원일 수 있다.
(h) 에볼라 바이러스
바이러스 항원은 에볼라 바이러스 유래일 수 있다. 에볼라 바이러스 질환(EVD) 또는 에볼라 출혈 열(EHF)은 분디부교 바이러스(Bundibugyo virus: BDBV), 에볼라 바이러스(Ebola virus: EBOV), 수단 바이러스(Sudan virus: SUDV) 및 타이 포레스트 바이러스(Tai Forest virus)(TAFV, 코트디부아르 에볼라 바이러스(아이보리 코스트 에볼라바이러스, CIEBOV)라고도 칭함)를 포함하는 5개의 공지된 에볼라 바이러스 중 임의의 4개를 포함한다.
구조적으로 변형된 DMAb는 에볼라 바이러스 항원에 특이적일 수 있다. 에볼라 바이러스에 특이적인 예시적인 구조적으로 변형된 DMAb는 서열 번호 1 내지 서열 번호 46에 기재된 구조적으로 변형된 DMAb를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
(i) 마르부르그 마르부르그바이러스
바이러스 항원은 마르부르그 마르부르그바이러스 유래일 수 있다. 마르부르그 바이러스 질환(MVD) 또는 마르부르그 출혈 열(EHF)은 마르부르그 바이러스(Marburg virus: MARV) 및 레이븐 바이러스(Ravn virus: RAW)를 포함하는 5개의 공지된 마르부르그 마르부르그바이러스 중 임의의 4개를 포함한다.
사용될 수 있는 마르부르그바이러스 면역원은 마르부르그바이러스의 다수의 아형 또는 혈청형에 대해 넓은 면역력을 유도한다. 항원은 마르부르그 바이러스 엔벨로프 당단백질 유래일 수 있다.
(j) 지카 바이러스
바이러스 항원은 지카 바이러스 유래일 수 있다. 지카 질환은 지카 바이러스에 의한 감염에 의해 생기고, 감염된 모기의 교상을 통해 인간에게 전파되거나 인간 간에 성으로 전파될 수 있다. 지카 항원은 지카 바이러스 엔벨로프 단백질, 지카 바이러스 NS1 단백질 또는 지카 바이러스 캡시드 단백질을 포함할 수 있다.
구조적으로 변형된 DMAb는 지카 바이러스 항원에 특이적일 수 있다. 지카 바이러스에 특이적인 예시적인 구조적으로 변형된 DMAb는 서열 번호 63 내지 서열 번호 106에 기재된 구조적으로 변형된 DMAb를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
(2) 박테리아 항원
외래 항원은 박테리아 항원, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 박테리아는 하기 문 중 임의의 하나로부터 유래할 수 있다: 액시도박테리아(Acidobacteria), 악티노박테리아(Actinobacteria), 아퀴피카에(Aquificae), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 칼디세리카(Caldiserica), 클라마이디아에(Chlamydiae), 클로로비(Chlorobi), 클로로플렉시(Chloroflexi), 크리시오게네테스(Chrysiogenetes), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 데페리박테레스(Deferribacteres), 데이노코쿠스-테르무스(Deinococcus-Thermus), 딕티오글로미(Dictyoglomi), 엘루시미크로비아(Elusimicrobia), 피브로박테레스(Fibrobacteres), 피르미큐테스(Firmicutes), 푸소박테리아(Fusobacteria), 겜마티모나데테스(Gemmatimonadetes), 렌티스파에라에(Lentisphaerae), 나이트로스피라(Nitrospira), 플랑크토마이세테스(Planctomycetes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로헤타(Spirochaetes), 시네르기스테테스(Synergistetes), 테네리큐테스(Tenericutes), 테르모데설포박테리아(Thermodesulfobacteria), 테르모토가에(Thermotogae) 및 베루코미크로비아(Verrucomicrobia).
박테리아는 그램 양성 박테리아 또는 그램 음성 박테리아일 수 있다. 박테리아는 호기성 박테리아 또는 혐기성 박테리아일 수 있다. 박테리아는 자가영양 박테리아 또는 종속영양 박테리아일 수 있다. 박테리아는 중온성 생물, 호중구성 생물, 극한생물, 호산성 생물, 호염기성 생물, 고온성 생물, 저온성 생물, 호염성 생물 또는 호삼투성 생물일 수 있다.
박테리아는 탄저병 박테리아, 항생제 내성 박테리아, 질환 야기 박테리아, 식품 중독 박테리아, 감염성 박테리아, 살모넬라 박테리아, 스타필로코커스 박테리아, 스트렙토코커스 박테리아 또는 파상풍 박테리아일 수 있다. 박테리아는 마이코박테리아(mycobacteria), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA) 또는 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)일 수 있다. 박테리아는 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)일 수 있다.
(a) 슈도모나스 항원
박테리아 항원은 슈도모나스 항원일 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 항원은 슈도모나스 아에루기노사 항원, 또는 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 슈도모나스 아에루기노사 항원은 병독성 인자 유래일 수 있다. 슈도모나스 아에루기노사와 연관된 병독성 인자는 구조 성분, 효소 및 독소를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 슈도모나스 아에루기노사 병독성 인자는 엑소다당류, 부착소(Adhesin), 지질다당류, 파이오시아닌, 외독소 A, 외독소 S, 세포독소, 엘라스타아제(Elastase), 알칼리 프로테아제, 포스포리파아제 C, 람노리피드 및 박테리아 분비 시스템의 성분 중 하나일 수 있다.
일 실시형태에서, 슈도모나스 항원은 세포외 다당류(예를 들어, 알기네이트, Pel 및 Psl)이다. 일 실시형태에서, 항원은 다당류 합성 유전좌위(psl), 여기에 함유된 유전자(예를 들어, pslA, pslB, pslC, pslD, pslE, pslF, pslG, pslH, pslI, pslJ, pslK, pslL, pslM, pslN 및 pslO), 단백질 또는 여기에 함유된 효소(예를 들어, 글라이코실 전환효소, 포스포만노스 아이소머라제/GDP-D-만노스 피로포스포릴라제, 수송체, 가수분해효소, 폴리머라제, 아세틸라제, 탈수소효소 및 토포아이소머라제) 또는 이로부터 생성된 생성물(예를 들어, "Psl"이라 칭하는 Psl 엑소다당류) 중 하나이다.
일 실시형태에서, 슈도모나스 항원은 박테리아 분비 시스템의 성분이다. 분비 시스템의 6개의 상이한 종류(I형 내지 VI형)는 박테리아에 기재되어 있고, 이들 중 5개(I형, II형, II형, V형 및 VI형)는 슈도모나스 아에루기노사를 포함하는 그램 음성 박테리아에서 발견된다. 일 실시형태에서, 항원은 I형 분비 시스템의 유전자(예를 들어, apr 또는 has 유전자) 또는 단백질(예를 들어, AprD, AprE, AprF, HasD, HasE, HasF 및 HasR) 또는 분비된 단백질(예를 들어, AprA, AprX 및 HasAp) 중 하나이다. 일 실시형태에서, 항원은 II형 분비 시스템의 유전자(예를 들어, xcpA/pilD, xphA, xqhA, xcpP 내지 Q 및 xcpR 내지 Z) 또는 단백질(예를 들어, GspC 내지 M, GspAB, GspN, GspO, GspS, XcpT 내지 XcpX, FppA) 또는 분비된 단백질(예를 들어, LasB, LasA, PlcH, PlcN, PlcB, CbpD, ToxA, PmpA, PrpL, LipA, LipC, PhoA, PsAP, LapA) 중 하나이다. 일 실시형태에서, 항원은 III형 분비 시스템의 유전자(예를 들어, psc, pcr, pop 또는 exs 유전자) 또는 단백질(예를 들어, PscC, PscE 내지 PscF, PscJ, PscN, PscP, PscW, PopB, PopD, PcrH 및 PcrV) 또는 분비된 단백질(예를 들어, ExoS, ExoT, ExoU 및 ExoY) 중 하나이다. 일 실시형태에서, 항원은 III형 분비 시스템의 조절자(예를 들어, ExsA 및 ExsC)이다. 일 실시형태에서, 항원은 V형 분비 시스템의 유전자(예를 들어, estA) 또는 단백질(예를 들어, EstA, CupB3, CupB5 및 LepB) 또는 분비된 단백질(예를 들어, EstA, LepA 및 CupB5) 중 하나이다. 일 실시형태에서, 항원은 VI형 분비 시스템의 유전자(예를 들어, HSI-I, HSI-II 및 HSI-III 유전자) 또는 단백질(예를 들어, Fha1, ClpV1, VgrG 단백질 또는 Hcp 단백질) 또는 분비된 단백질(예를 들어, Hcp1) 중 하나이다.
(b) 보렐리아 항원
박테리아 항원은 보렐리아 종(Borrelia spp) 항원, 또는 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 보렐리아 종 항원은 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 루시타니아에(Borrelia lusitaniae), 보렐리아 아프젤리(Borrelia afzelii), 보렐리아 비세티(Borrelia bissettii), 보렐리아 바바리엔시스(Borreliella bavariensis), 보렐리아 킬렌시스(Borrelia chilensis), 보렐리아 가리니(Borrelia garinii), 보렐리아 발라이시아나(Borrelia valaisiana), 보렐리아 스피엘마니(Borrelia spielmanii) 및 보렐리아 핀란덴시스(Borrelia finlandensis) 중 임의의 하나 유래일 수 있다.
박테리아 항원은 보렐리아 종 항원, 또는 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 보렐리아 종 항원은 보렐리아 종이 복제하거나 생존하게 하는 박테리아 생성물 유래일 수 있다. 보렐리아 종이 복제하거나 생존하게 하는 박테리아 생성물은 구조 성분, 효소 및 독소를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 생성물은 지질단백질, 외부 표면 단백질, 척추동물 숙주 내에 감염성 또는 지속성에 필요한 생성물, 및 운동성 및 주화성에 관여된 생성물 중 하나일 수 있다.
일 실시형태에서, 항원은 지질단백질(예를 들어, BptA)이다. 일 실시형태에서, 항원은 외부 표면 단백질(예를 들어, OspA, OspB 및 OspC)이다. 일 실시형태에서, 항원은 척추동물 숙주 내에 감염성 또는 지속성에 필요한 생성물(예를 들어, PncA, DbpA, DbpB, Bgp, P66 및 VlsE)이다.
(c) 마이코박테륨 투베르쿨로시스 항원
박테리아 항원은 마이코박테륨 투베르쿨로시스 항원(즉, TB 항원 또는 TB 면역원), 또는 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. TB 항원은 TB 항원의 Ag85 패밀리, 예를 들어, Ag85A 및 Ag85B 유래일 수 있다. TB 항원은 TB 항원의 Esx 패밀리, 예를 들어, EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsxE, EsxF, EsxH, EsxO, EsxQ, EsxR, EsxS, EsxT, EsxU, EsxV 및 EsxW 유래일 수 있다.
(3) 기생충 항원
외래 항원은 기생충 항원, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 기생충은 원생동물, 연충 또는 체외기생충일 수 있다. 연충(즉, 벌레)은 편형동물(예를 들어, 흡충 및 촌충), 구두충 또는 회충(예를 들어, 요충)일 수 있다. 체외기생충은 이, 벼룩, 참진드기 및 진드기일 수 있다.
기생충은 하기 질환 중 임의의 하나를 야기하는 임의의 기생충일 수 있다: 가시아메바 각막염, 아베마증, 회충증, 바베시아증, 바란티디움증, 아메리카너구리회충증, 샤가스병, 간흡충증, 코클리오미아, 크립토스포리듐증, 열두조충증, 매디나충증, 포충증, 상피병, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 필라리아증, 편모충증, 악구충증, 왜소조충증, 포자충증, 카타야마 열, 리슈만편모충증, 라임병, 말라리아, 요코가와흡충증, 구더기증, 회선사상충증, 몸니감염증, 옴, 주혈흡충병, 수면병, 분선충증, 조충증, 개회충증, 톡소플라스마증, 선모충증 및 편충증.
기생충은 아칸타모에바(Acanthamoeba), 아니사키스(Anisakis), 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides), 말파리(Botfly), 발란티듐 콜라이(Balantidium coli), 베드버그, 세스토다(Cestoda)(촌충), 양충(Chiggers), 코클리오미아 호미니보락스(Cochliomyia hominivorax), 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 파시올라 헤파티카(Fasciola hepatica), 지아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 구충(Hookworm), 리슈마니아(Leishmania), 링구아툴라 세라타(Linguatula serrata), 간질증(Liver fluke), 로아사상충(Loa loa), 파라고니무스(Paragonimus) - 폐흡충(lung fluke), 요충(Pinworm), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 주혈흡충(Schistosoma), 스트롱랄로데스 스텔라랄리스(Strongyloides stercoralis), 진드기, 촌충, 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 트리파노소마(Trypanosoma), 편충(Whipworm) 또는 부케레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti)일 수 있다.
(a) 라임 항원
외래 항원은 라임병 항원일 수 있다. 항원은 외부-표면 단백질 A 항원(OspA 항원), 또는 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 항원은 말라리아를 야기하는 기생충 유래일 수 있다. 라임병은 박테리아 보렐리아 부르그도르페리에 의해 생기고, 감염된 익소데스 스카폴라리스(Ixodes scapularis)(라임 진드기 또는 사슴 진드기)의 교상을 통해 인간에게 전파된다.
(b) 말라리아 항원
외래 항원은 말라리아 항원(즉, PF 항원 또는 PF 면역원), 또는 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 항원은 말라리아를 야기하는 기생충 유래일 수 있다. 말라리아 야기 기생충은 플라스모듐 팔시파룸일 수 있다. 플라스모듐 팔시파룸 항원은 포자소체단백질(circumsporozoite: CS) 항원을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 말라리아 항원은 피. 팔시파룸 면역원 CS 중 하나일 수 있다; LSA1; TRAP; CelTOS; 및 Ama1. 면역원은 전장 단백질의 전장 또는 면역원성 단편일 수 있다.
다른 실시형태에서, 말라리아 항원은 SSP2라고도 칭하는 TRAP일 수 있다. 더욱 다른 실시형태에서, 말라리아 항원은 Ag2라고도 칭하고 고도로 보존된 플라스모듐 항원인 CelTOS일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 말라리아 항원은 고도로 보존된 플라스모듐 항원인 Ama1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 말라리아 항원은 CS 항원일 수 있다.
다른 실시형태에서, 말라리아 항원은 본 명세서에 기재된 2개 이상의 PF 단백질의 조합을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 서로에 인접하여 직접 연결되거나 스페이서 또는 이들 사이의 하나 이상의 아미노산에 의해 연결된 CS 면역원, ConLSA1 면역원, ConTRAP 면역원, ConCelTOS 면역원 및 ConAma1 면역원 중 2개 이상을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 융합 단백질은 2개의 PF 면역원을 포함하고; 몇몇 실시형태에서, 융합 단백질은 3개의 PF 면역원을 포함하고, 몇몇 실시형태에서, 융합 단백질은 4개의 PF 면역원을 포함하고, 몇몇 실시형태에서, 융합 단백질은 5개의 PF 면역원을 포함한다. 2개의 PF 면역원과의 융합 단백질은 CS 및 LSA1; CS 및 TRAP; CS 및 CelTOS; CS 및 Ama1; LSA1 및 TRAP; LSA1 및 CelTOS; LSA1 및 Ama1; TRAP 및 CelTOS; TRAP 및 Ama1; 또는 CelTOS 및 Ama1을 포함할 수 있다. 3개의 PF 면역원과의 융합 단백질은 CS, LSA1 및 TRAP; CS, LSA1 및 CelTOS; CS, LSA1 및 Ama1; LSA1, TRAP 및 CelTOS; LSA1, TRAP 및 Ama1; 또는 TRAP, CelTOS 및 Ama1을 포함할 수 있다. 4개의 PF 면역원과의 융합 단백질은 CS, LSA1, TRAP 및 CelTOS; CS, LSA1, TRAP 및 Ama1; CS, LSA1, CelTOS 및 Ama1; CS, TRAP, CelTOS 및 Ama1; 또는 LSA1, TRAP, CelTOS 및 Ama1을 포함할 수 있다. 5개의 PF 면역원과의 융합 단백질은 CS or CS-alt, LSA1, TRAP, CelTOS 및 Ama1을 포함할 수 있다.
(4) 진균 항원
외래 항원은 진균 항원, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 진균은 아스페르길루스 종(Aspergillus species), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 효모(예를 들어, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)), 콕시디오이데스(Coccidioides), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티(Cryptococcus gattii), 데르마토피테(dermatophyte), 푸사륨 종(Fusarium species), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 무코로미코티나(Mucoromycotina), 뉴모시스티스 지로베시(Pneumocystis jirovecii), 스포로트릭스 첸키아이(Sporothrix schenckii), 엑세로힐룸(Exserohilum) 또는 클라도스포륨(Cladosporium)일 수 있다.
b. 자가 항원
몇몇 실시형태에서, 항원은 자가 항원이다. 자가 항원은 면역 반응을 자극할 수 있는 대상체의 자체의 신체의 구성성분일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 자가 항원은, 대상체가 질환 상태, 예를 들어, 자가면역 질환에 있지 않는 한, 면역 반응을 유발하지 않는다.
자가 항원은 사이토카인, HIV 및 뎅기를 포함하여 상기 기재된 것과 같은 바이러스에 대한 항체, 암 진행 또는 발생에 영향을 미치는 항원, 및 세포 표면 수용체 또는 막관통 단백질을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
(1) WT-1
자가 항원 항원은 윌름스 종양 억제자 유전자 1(WT1), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합일 수 있다. WT1은 N 말단에서 프롤린/글루타민 농후 DNA 결합 도메인 및 C 말단에서 4개의 아연 핑거 모티프를 함유하는 전사 인자이다. WT1은 비뇨생식계의 일반 발생에서 역할을 하고, 다수의 인자, 예를 들어, 공지된 종양 억제자인 p53 및 세포독성 약물에 의한 치료 후 다수의 부위에서 WT1을 절단시키는 세린 프로테아제 HtrA2와 상호작용한다. WT1의 돌연변이는 종양 또는 암 형성, 예를 들어, 윌름스 종양 또는 WT1을 발현하는 종양을 발생시킬 수 있다.
(2) EGFR
자가 항원은 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. EGFR(ErbB-1 및 HER1이라고도 칭함)은 세포외 단백질 리간드의 표피 성장 인자 패밀리(EGF-패밀리)의 구성원을 위한 세포 표면 수용체이다. EGFR은 EGFR(ErbB-1), HER2/c-neu(ErbB-2), Her 3(ErbB-3) 및 Her 4 (ErbB-4)인 4개의 밀접하게 관련된 수용체 타이로신 키나제를 포함하는 수용체의 ErbB 패밀리의 구성원이다. EGFR 발현 또는 활성에 영향을 미치는 돌연변이는 암을 발생시킨다.
항원은 ErbB-2 항원을 포함할 수 있다. Erb-2(인간 표피 성장 인자 수용체 2)는 Neu, HER2, CD340(분화의 클러스터 340) 또는 p185로도 공지되어 있고, ERBB2 유전자에 의해 코딩된다. 이 유전자의 증폭 또는 과발현은 유방암의 소정의 공격적인 유형의 발생 및 진행에서 역할을 하는 것으로 나타났다. 유방암을 갖는 여성의 대략 25% 내지 30%에서, ERBB2 유전자에서 유전자 변경이 발생해서, 종양 세포의 표면에서 HER2의 증가된 양을 생성시킨다. HER2의 이 과발현은 신속한 세포 분열을 촉진하고, 이에 따라 HER2는 종양 세포를 마킹한다.
(3) 코카인
자가 항원은 코카인 수용체 항원일 수 있다. 코카인 수용체는 도파민 수송체를 포함한다.
(4) PD-1
자가 항원은 예정 사멸 1(PD-1)을 포함할 수 있다. 예정 사멸 1(PD-1) 및 이의 리간드, PD-L1 및 PD-L2는 T 세포 활성화, 관용성, 및 면역병리학 사이의 균형을 조절하는 저해 신호를 전달한다. PD-1은 세포외 IgV 도메인, 이어서 막관통 영역 및 세포내 꼬리를 포함하는 288개의 아미노산 세포 표면 단백질 분자이다.
(5) LAG-3
자가 항원은 림프구 활성화 유전자 3(CD223으로도 공지된 Lag-3)을 포함할 수 있다. LAG-3은 MHC-II 분자에 결합하고 저해 신호를 전달하는 것으로 공지된 활성화된 및 관용유도된(tolerized) T 세포에서 오직 발현되는 Ig 슈퍼패밀리의 구성원이다. LAG-3은 효과기 또는 기억 T 세포와 비교하여 탈진된 T 세포에서 현저히 상향조절된다. LAG-3은 T 세포 수용체 유도된 칼슘 플럭스를 저해하여서, 암의 맥락에서 T 세포 메모리 풀의 크기를 제어함으로써 T 세포 증식을 부정적으로 조절하고, LAG3은 TIL에서 상향조절되고, LAG-3의 봉쇄는 항종양 T 세포 면역 반응을 증대시킬 수 있다. CD8 T 세포 탈진을 촉발하는 바이러스 만성 모델에서의 LAG-3의 봉쇄는 CD8 T 세포 반응을 활성화할 수 있다.
(6) GITR
자가 항원은 TNF 수용체 슈퍼패밀리 18(TNFRSF 18)이라고도 칭하는 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질(glucocorticoid-induced TNFR-related protein: GITR)을 포함할 수 있다. GITR 활성화는 공동활성화 신호를 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 전송하고, 조절 T 세포에 의한 면역 반응의 억제를 방지한다. 추가적으로, GITR 발현 효과기 T 세포 및 조절 T 세포는 다수의 종양 유형을 침윤시키지만, 비조혈 세포에서 GITR의 아주 적은 발현이 있거나 발현이 없다. 이 분포 프로필은 GITR 발현 세포가 종양에서 집중된다는 것을 의미한다. 활성 및 분포의 이 조합은 총체적으로 GITR 활성화를 다양한 암을 치료하기 위한 매력적인 접근법으로 만든다. 항원 결합 단백질은 고형 종양, 및 백혈병을 포함하는 혈액암 둘 다를 치료하기 위해 사용될 수 있다, 암의 치료에서의 사용 이외에, 또 다른 실시형태에서, 제공된 항원 결합 단백질은 다양한 감염성 물질에 존재하는 것과 같은 외래 항원에 대해 면역 반응을 유도하거나 증대시키도록 사용될 수 있다. 면역 반응이 생성될 수 있는 감염성 물질에 존재하는 항원의 예는 바이러스, 기생충, 박테리아 및 다른 미생물에 존재하는 단백질, 당단백질, 지질단백질 및 당지질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
(7) CD40
자가 항원은 CD40을 포함할 수 있다. CD40은 정상 및 신생물 인간 B 세포, 수지상 세포, 다른 항원 제시 세포(APC), 내피 세포, 단핵구 세포, CD8+ T 세포, 상피 세포, 몇몇 상피 암종, 및 많은 고형 종양, 예를 들어, 폐암, 유방암, 난소암 및 결장암의 표면에 존재하는 55kDa 세포 표면 항원이다. B 세포 계통의 몇몇 종양으로부터의 악성 B 세포는 CD40의 높은 수준을 발현하고, 생존 및 증식을 위해 CD40 신호전달에 따라 달라지는 것으로 보인다. 따라서, 저등급 및 고등급 B 세포 림프종, B 세포 급성 림프아구성 백혈병, 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병, 및 호지킨 질환을 갖는 환자로부터의 형질전환된 세포는 CD40을 발현한다. CD40 발현은 또한 급성 골수아구성 백혈병 사례의 ⅔에서 및 AIDS 관련 림프종의 50%에서 검출된다.
(8) OX40
자가 항원은 OX40을 포함할 수 있다. OX40(CD134라고도 칭함)은 50킬로달톤(KDa) 당단백질 및 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(tumor necrosis factor receptor superfamily: TNFRSF)의 구성원이다. OX40L(TNFSF4, CD252라고도 칭함)인 OX40에 대한 리간드는 내피 세포, 활성화된 항원 제시 세포, 예를 들어, 대식세포, 수지상 세포, B 세포 및 천연 살해 세포에서 발현되는 것으로 보고되었다. 이론에 구속되도록 원하지 않지만, 항원 제시 세포 상의 CD40 사이의 결합이 지질다당류(LPS)처럼 OX40L 발현을 증가시킨다. T 세포 상의 OX40의 발현은 T 세포 항원 수용체를 통해 신호전달 이후에 유도될 수 있다. 예를 들어, OX40은 염증의 부위에서 최근에 활성화된 T 세포에서 발현된다. CD4 및 CD8 T 세포는 염증성 조건 하에 OX40을 상향조절할 수 있다.
(9) TIM-3
자가 항원은 TIM-3을 포함할 수 있다. TIM-3은 IFN-.감마.를 분비하는 Th1(T 헬퍼 1) CD4-T 세포 및 세포독성 CD8-T 세포에서 발현된 막관통 수용체이다. TIM-3은 일반적으로 미경험 T 세포에서 발현되지 않고, 오히려 활성화된 효과기 T 세포에서 상향조절된다. TIM-3은 생체내 면역력 및 관용성을 조절하는 데 역할을 한다.
(10) 4-1BB
자가 항원은 4-1BB 리간드를 포함할 수 있다. 4-1BB 리간드는 TNF 슈퍼패밀리에 속하는 2형 막관통 당단백질이다. 4-1BB 리간드는 활성화된 T 림프구에서 발현될 수 있다. 4-1BB는 활성화 유도된 T 세포 동시자극 분자이다. 4-1BB를 통한 신호전달은 생존 유전자를 상향조절하고, 세포 분열을 증대시키고, 사이토카인 생성을 유도하고, T 세포에서 활성화 유도된 세포 사멸을 방지한다.
(11) CTLA4
자가 항원은 CD152(분화의 클러스터 152)로도 공지된 CTLA-4(세포독성 T-림프구 항원 4)를 포함할 수 있다. CTLA-4는 항원에서 세포 면역 공격을 발생시키는 T 세포의 표면에서 발견되는 단백질 수용체이다. 항원은 CTLA-4의 단편, 예컨대, 세포외 V 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리, 또는 이들의 조합일 수 있다.
(12) IL-6
자가 항원은 인터류킨 6(IL-6)을 포함할 수 있다. IL-6은 많은 질환, 예를 들어, 당뇨병, 죽상동맥경화증, 우울증, 알츠하이머병, 전신 홍반 루푸스, 다발성 골수종, 암, 베체트병, 류마티스성 관절염, 패혈증, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염 등(이들로 제한되지는 않음)에서 염증성 및 자가면역 과정을 자극한다.
(13) CD126
자가 항원은 CD126을 포함할 수 있다. CD126은 IL-6에 대한 수용체이고, 많은 질환, 예를 들어, 당뇨병, 죽상동맥경화증, 우울증, 알츠하이머병, 전신 홍반 루푸스, 다발성 골수종, 암, 베체트병, 류마티스성 관절염, 패혈증, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염 등(이들로 제한되지는 않음)에서 염증성 및 자가면역 과정을 자극한다.
(14) MCP-1
자가 항원은 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP-1)을 포함할 수 있다. MCP-1은 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2(CCL2) 또는 소형 유도성 사이토카인 A2라고도 칭해진다. MCP-1은 CC 케모카인 패밀리에 속하는 사이토카인이다. MCP-1은 단핵구, 기억 T 세포 및 수지상 세포를 조직 손상 또는 감염에 의해 생긴 염증의 부위로 동원시킨다.
(15) 아밀로이드 베타
자가 항원은 아밀로이드 베타(Aβ), 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. Aβ 항원은 Aβ(X-Y) 펩타이드를 포함할 수 있고, 여기서 X 및 Y 둘 다를 포함하는 인간 서열 Aβ 단백질의 아미노산 위치 X로부터 아미노산 위치 Y로의 아미노산 서열, 특히 아미노산 위치 1 내지 47에 상응하는 아미노산 서열의 아미노산 위치 X로부터 아미노산 위치 Y로의 아미노산 서열; 인간 쿼리 서열(서열 번호 62), 또는 이의 변이체. Aβ 항원은 Aβ(X-Y) 폴리펩타이드의 Aβ 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 여기서 X는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32일 수 있고, Y는 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16 또는 15일 수 있다. Aβ 폴리펩타이드는 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 36개, 적어도 37개, 적어도 38개, 적어도 39개, 적어도 40개, 적어도 41개, 적어도 42개, 적어도 43개, 적어도 44개, 적어도 45개 또는 적어도 46개의 아미노산인 단편을 포함할 수 있다.
(16) IP-10
자가 항원은 인터페론(IFN)-감마-유도된 단백질 10(IP-10)을 포함할 수 있다. IP-10은 소형 유도성 사이토카인 B10 또는 C-X-C 모티프 케모카인 10(CXCL10)으로도 공지되어 있다. CXCL10은 IFN-γ에 반응하여 몇몇 세포 유형, 예컨대, 단핵구, 내피 세포 및 섬유아세포에 의해 분비된다.
(17) TERT
자가 항원은 TERT(텔로머라제 역전사효소)를 포함할 수 있다. TERT는 염색체 짧아짐으로 인한 세포 사멸을 방지하도록 말단소체의 말단에서 TTAGGG 태그를 합성하는 텔로머라제 역전사효소이다. TERT의 비정상적으로 높은 발현을 갖는 과증식성 세포는 면역요법에 의해 표적화될 수 있다. 최근의 연구는 TERT 유전자에 의해 형질주입된 수지상 세포에서의 TERT 발현이 CD8+ 세포독성 T 세포를 유도하고 항원 특이적 방식으로 CD4+ T 세포를 유발할 수 있다는 것을 입증한다.
(18) 타이로시나제
자가 항원은 타이로시나제(Tyr)를 포함할 수 있다. Tyr은 (1) 단핵구 화학주성인자 단백질-1(MCP-1) 생성을 차단하여서, 골수성 유래된 억제자 세포(MDSC)를 지연시키고 종양 성장을 억제하는 항체를 생성하도록 B 세포 반응을 통해 체액 면역력을 유도하고; (2) 종양 세포를 공격하고 사멸시키는 세포독성 T 림프구, 예컨대, CD8+(CTL)를 증가시키고; (3) T 헬퍼 세포 반응을 증가시키고; (4) IFN-γ 및 TFN-α를 통해 염증성 반응을 증가시킴으로써 또는 상기 언급된 모두에 의해 면역 매개된 청소를 위한 중요한 표적이다.
타이로시나제는 식물 및 동물 조직에서 발견될 수 있는 구리 함유 효소이다. 타이로시나제는 타이로신과 같은 페놀의 산화에 의해 멜라닌 및 다른 안료의 생성을 촉매화한다. 흑색종에서, 타이로시나제는 비조절될 수 있어서, 멜라닌 합성을 증가시킨다. 타이로시나제는 또한 흑색종을 겪는 대상체에서 세포독성 T 세포 인식의 표적이다. 따라서, 타이로시나제는 흑색종과 연관된 항원일 수 있다.
항원은 이것이 항-Tyr 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이게 만드는 단백질 에피토프를 포함할 수 있다. Tyr 항원은 전장 번역 산물, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
Tyr 항원은 공통 단백질을 포함할 수 있다. Tyr 항원은 모든 암 및 종양 관련 세포에 대해 전신으로 항원 특이적 T 세포 및 고역가 항체 반응 둘 다를 유도한다. 그러므로, 보호성 면역 반응은 Tyr 공통 항원을 포함하는 백신에 의해 종양 형성에 대해 제공된다. 따라서, 임의의 사용자는 종양 형성, 종양 전이 및 종양 성장에 대해 넓은 면역력을 제공하도록 Tyr 항원을 포함하도록 본 발명의 면역원성 조성물을 설계할 수 있다. 단백질은 Tyr 항원에 상동성인 서열, Tyr 항원의 단편 및 Tyr 항원의 단편에 상동성인 서열을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
(19) NY-ESO-1
자가 항원은 NY-ESO-1을 포함할 수 있다. NY-ESO-1은 다양한 암에서 발현되는 암-고환 항원이고, 여기서 이것은 세포 및 체액 면역력 둘 다를 유도할 수 있다. 유전자 발현 연구는 정액모양 및 원형 세포 지방육종에서 CTAG1B인 NY-ESO-1에 대한 유전자의 상향조절을 나타냈다.
(20) MAGE
자가 항원은 MAGE(흑색종 연관된 항원)를 포함할 수 있다. MAGE 항원은 MAGE-A4(흑색종 연관된 항원 4)를 포함할 수 있다. NY-ESO-1은 다양한 암에서 발현되는 암-고환 항원이고, 여기서 이것은 세포 및 체액 면역력 둘 다를 유도할 수 있다. 유전자 발현 연구는 정액모양 및 원형 세포 지방육종에서 CTAG1B인 NY-ESO-1에 대한 유전자의 상향조절을 나타냈다.
MAGE-A4는 남성 생식 세포 및 다양한 조직학적 유형의 종양 세포, 예컨대, 위장, 식도 및 폐 암종에서 발현된다. MAGE-A4는 갠키린인 종양단백질에 결합한다. 이 MAGE-A4 특이적 결합은 이의 C 말단에 의해 매개된다. 연구는 외인성 MAGE-A4가 시험관내 갠키린 과발현 세포의 부착 독립적 성장을 부분적으로 저해하고, 누드 마우스에서 이 세포로부터의 이동된 종양의 형성을 억제할 수 있다는 것을 나타냈다. 이 저해는 MAGE-A4와 갠키린 사이의 결합에 의존적이어서, 갠키린과 MAGE-A4 사이의 상호작용이 갠키린 매개된 발암을 저해한다는 것을 제안한다. 종양 조직에서의 MAGE 발현이 원인이 아니고, 종양생성의 결과이고, MAGE 유전자가 파괴를 위해 초기 종양 세포를 표적화함으로써 면역 과정에 참여할 것이다.
흑색종 연관된 항원 4 단백질(MAGEA4)은 배아 발생 및 종양 전환 및/또는 진행에 관여될 수 있다. MAGEA4는 고환 및 태반에서 보통 발현된다. 그러나, MAGEA4는 종양의 많은 상이한 유형, 예를 들어, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종, 폐 암종 및 유방 암종에서 발현될 수 있다. 따라서, MAGEA4는 다양한 종양과 연관된 항원일 수 있다.
MAGEA4 항원은 항원 특이적 T 세포 및/또는 고역가 항체 반응을 유도하여서, 항원을 발현하는 암 또는 종양에 지향되거나 이에 반응성인 면역 반응을 유도하거나 유발할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 유도된 또는 유발된 면역 반응은 세포, 체액, 또는 세포 및 체액 면역 반응 둘 다일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 유도된 또는 유발된 세포 면역 반응은 인터페론-감마(IFN-γ) 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 유도 또는 분비를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 유도된 또는 유발된 면역 반응은 항원을 발현하는 종양 또는 암의 성장을 촉진하는 하나 이상의 면역 억제 인자, 예를 들어, MHC 제시를 하향조절하는 인자, 항원 특이적 조절 T 세포(Treg), PD-L1, FasL, 사이토카인, 예컨대, IL-10 및 TFG-β, 종양 연관된 대식세포, 종양 연관된 섬유아세포를 상향조절하는 인자(이들로 제한되지는 않음)를 감소시키거나 저해할 수 있다.
MAGEA4 항원은 이것이 항-MAGEA4 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이게 만드는 단백질 에피토프를 포함할 수 있다. MAGEA4 항원은 전장 번역 산물, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
(21) FSHR
자가 항원은 FSHR(난포 자극 호르몬 수용체)을 포함할 수 있다. FSHR은 여성에서 선택적으로 난소 과립막 세포에서(Simoni et al., Endocr Rev. 1997, 18:739-773) 그리고 난소 내피에서 낮은 수준으로(Vannier et al., Biochemistry, 1996, 35:1358-1366) 발현되는 항원이다. 가장 중요하게는, 이 표면 항원은 난소 암종의 50% 내지 70%에서 발현된다.
(22) 종양 미세환경 항원
자가 항원은 종양 미세환경 항원을 포함할 수 있다. 몇몇 단백질, 예를 들어, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 혈소판 유래된 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-β) 및 글리피칸-1(GPC1)(이들로 제한되지는 않음)은 종양 미세환경에서 과발현된다. FAP는 인간 암종의 90% 초과에서 암 연관된 섬유아세포에서 상향 조절되는 젤라티나제 및 펩티다제 활성을 갖는 막 결합된 효소이다. PDGFR-β는 배아 발생, 혈관신생, 세포 증식 및 분화를 포함하는 많은 생물학적 과정의 조절에서 역할을 하는 세포 표면 타이로신 키나제 수용체이다. GPC1은 암 세포에서 농후화된 세포 표면 프로테오글라이칸이다.
(23) PRAME
자가 항원은 PRAME(종양에서 우선적으로 발현된 흑색종 항원)를 포함할 수 있다. PRAME는 인간에서 PRAME 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 이 유전자는 인간 흑색종에서 주로 발현되고 세포용해 T 림프구에 의해 인식되는 항원을 코딩한다. 이것은 고환을 제외한 정상 조직에서 발현되지 않는다. 유전자는 또한 급성 백혈병에서 발현된다. 동일한 단백질을 코딩하는 5개의 대안적으로 스플라이싱된 전사체 변이체는 이 유전자에 대해 관찰되었다. 단백질은 PRAME 항원에 상동성인 서열, PRAME 항원의 단편 및 PRAME 항원의 단편에 상동성인 서열을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
(24) 전립선 항원
자가 항원은 전립선 항원, 예컨대, 전립선 특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen: PSMA), PSA 항원, STEAP 항원, PSCA 항원, 전립선 산 포스파타제(PAP) 항원 및 다른 공지된 전립선 종양 항원을 포함할 수 있다. PSMA는 글루타메이트 카복시펩티다제 II(GCPII), N-아세틸-L-아스파르틸-L-글루타메이트 펩티다제 I(NAALADase I), NAAG 펩티다제 또는 엽산 가수분해효소(FOLH)로도 공지되어 있다. PMSA는 전립선암 세포에서 고도로 발현되는 통합 막 단백질이다.
몇몇 실시형태에서, PSMA에 지향된 항체(항-PSMA 항체)를 코딩하는 재조합 핵산 서열은 배열 2에서 재조합 핵산 서열 작제물을 포함하는 재조합 핵산 서열일 수 있다.
더욱 다른 실시형태에서, 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된 항-PSMA 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 하나의 이러한 변형은, 실시예에 입증된 바대로, 상업용 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성을 나타내는 탈푸코실화된 항체이다. 변형은 중쇄, 경쇄, 또는 이들의 조합에 있을 수 있다. 변형은 중쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 경쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 또는 이들의 조합일 수 있다.
(25) 종양 항원
자가 항원은 종양 항원을 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "종양 항원" 또는 "과증식성 장애 항원" 또는 "과증식성 장애와 연관된 항원"은 암과 같은 특정한 과증식성 장애에 흔한 항원을 의미한다. 본 명세서에 기재된 항원은 단순히 예로서 포함된다. 목록은 배타적이도록 의도되지 않고, 추가의 예는 당업자에게 용이하게 명확할 것이다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T 세포 매개된 면역 반응을 유발하는 종양 세포에 의해 생성된 단백질이다. 본 발명의 항원 결합 모이어티의 선택은 치료되는 암의 특정한 유형에 따라 달라질 것이다. 종양 항원은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 신경교종 연관된 항원, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), β-인간 융모성 고나도트로핀, 알파태아단백질(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 타이로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선 특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타아제, ephrinB2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다.
일 실시형태에서, 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격에 대한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이 분자는 조직 특이적 항원, 예컨대, 흑색종에서 MART-1, 타이로시나제 및 GP 100 및 전립선암에서 전립선 산성 포스파타제(PAP) 및 전립선 특이적 항원(PSA)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 표적 분자는 형질전환 관련된 분자, 예컨대, 종양유전자 HER-2/Neu/ErbB-2의 군에 속한다. 표적 항원의 더 또 다른 군은 태아 종양 항원, 예컨대, 암배아 항원(CEA)이다. B 세포 림프종에서, 종양 특이적 이디오타입 면역글로불린은 개별 종양에 고유한 진정한 종양 특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. B 세포 분화 항원, 예컨대, CD19, CD20 및 CD37은 B 세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보이다. 이들 항원(CEA, HER-2, CD19, CD20, 이디오타입) 중 몇몇은 제한된 성공으로 단일클론 항체에 의한 수동 면역요법에 대한 표적으로서 사용된다.
본 발명에서 칭해지는 종양 항원의 유형은 또한 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 연관된 항원(tumor-associated antigen: TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 고유하고, 신체에서 다른 세포에서 발생하지 않는다. TAA 연관된 항원은 종양 세포에 고유하지 않고, 대신에 항원에 대한 면역학적 관용성의 상태를 유도하지 못하는 조건 하에 정상 세포에서 또한 발현된다. 종양에서의 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응하게 하는 조건 하에 발생할 수 있다. TAA는 면역계가 미성숙할 때 태아 발생 동안 정상 세포에서 발현되고 반응할 수 없는 항원일 수 있거나, 이들은 정상 세포에서 극도로 낮은 수준으로 보통 존재하지만, 종양 세포에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 분화 항원, 예컨대, MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 타이로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양 특이적 다계통 항원, 예컨대, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; 과발현된 배아 항원, 예컨대, CEA; 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제자 유전자, 예컨대, p53, Ras, HER-2/neu; 염색체 전좌로부터 생긴 고유한 종양 항원; 예컨대 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대, 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 큰 단백질 기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90/Mac-2 결합 단백질/사이클로필린 C 연관된 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS를 포함한다.
c. 다른 항원
몇몇 실시형태에서, 항원은 외래 항원 및/또는 자가 항원 이외의 항원이다. 예시적인 다른 항원은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다:
(a) HIV-1 VRC01
다른 항원은 HIV-1 VRC01일 수 있다. HIV-1 VCR01은 HIV에 대한 중화 CD4 결합 부위-항체이다. HIV-1 VCR01은 gp120 루프 D 내에, CD4 결합 루프 및 HIV-1의 V5 영역을 포함하는 HIV-1의 일부를 접촉시킨다.
(b) HIV-1 PG9
다른 항원은 HIV-1 PG9일 수 있다. HIV-1 PG9는 HIV(HIV-1) 엔벨로프(Env) 당단백질(gp) 삼합체에 우선적으로 결합하고 바이러스를 광범위하게 중화시키는 글라이칸 의존적 인간 항체의 확장 패밀리의 창립자 구성원이다.
(c) HIV-1 4E10
다른 항원은 HIV-1 4E10일 수 있다. HIV-1 4E10은 중화 항-HIV 항체이다. HIV-1 4E10은 gp41 엑토도메인의 C 말단에 위치한 HIV-1의 막 근위 외부 영역(membrane-proximal external region: MPER)에 맵핑된 선형 에피토프에 대해 지향된다.
(d) DV-SF1
다른 항원은 DV-SF1일 수 있다. DV-SF1은 4개의 뎅기 바이러스 혈청형의 엔벨로프 단백질에 결합하는 중화 항체이다.
(e) DV-SF2
다른 항원은 DV-SF2일 수 있다. DV-SF2는 뎅기 바이러스의 에피토프에 결합하는 중화 항체이다. DV-SF2는 DENV4 혈청형에 특이적일 수 있다.
(f) DV-SF3
다른 항원은 DV-SF3일 수 있다. DV-SF3은 뎅기 바이러스 엔벨로프 단백질의 EDIII A 가닥에 결합하는 중화 항체이다.
6. 핵산 백신
구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물은 조작된 DNA 코딩된 합성 항체의 생체내 발현 및 형성을 수월하게 하도록 이를 필요로 하는 대상체에게 단독으로 또는 조합되어 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 포유류에서 항원에 대한 면역 반응을 유발하는 조성물과 조합되어 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 항원을 코딩하는 핵산과 조합되어 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 조성물은 DNA 백신을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조합물은 적어도 2개의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 적어도 2개의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 각각의 dMAb는 상이한 항원을 표적화한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 각각의 dMAb는 단일 바이러스의 상이한 바이러스 항원을 표적화한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 dMAb는 상이한 바이러스의 바이러스 항원을 표적화한다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 각각의 dMAb는 상이한 자가 항원을 표적화한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조합 백신은 적어도 2개의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 6개 초과의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 각각의 dMAb는 상이한 항원을 표적화한다. 항원은 핵산 서열, 아미노산 서열, 다당류 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩타이드, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 다당류는 핵산 코딩된 다당류일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 적어도 2개의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 적어도 2개의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 각각의 dMAb는 상이한 항원을 표적화하고, 여기서 각각의 항원은 상이한 바이러스의 항원이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 조합 백신은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 6개 초과의 dMAb를 코딩하는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 6개 초과의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 코딩된 dMAB는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 6개 초과의 상이한 바이러스로부터의 항원을 표적화한다.
본 발명은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 재조합 핵산 서열, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때, 대상체에서 구조적으로 변형된 DMAb를 생성시킬 수 있다. 합성 항체는 대상체에 존재하는 표적 분자(즉, 항원)에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 항원을 중화시키거나, 다른 분자, 예를 들어, 단백질 또는 핵산에 의한 항원의 인식을 차단하거나, 항원에 대한 면역 반응을 야기하거나 유도할 수 있다.
구조적으로 변형된 DMAb는 조성물이 투여된 대상체에서 질환을 치료, 보호 및/또는 예방할 수 있다. 구조적으로 변형된 DMAb는, 항원에 결합함으로써, 조성물이 투여된 대상체에서 질환을 치료, 보호 및/또는 예방할 수 있다. 구조적으로 변형된 DMAb는 조성물이 투여된 대상체에서 질환의 생존율을 증대시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 구조적으로 변형된 DMAb가 투여되지 않은 질환을 갖는 대상체의 기대 생존율에 비해 대상체에서의 질환의 증가된 생존율을 제공할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 조성물의 부재 하의 기대 생존율에 비해 조성물이 투여된 대상체에서 질환의 생존율의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 100% 초과의 증가를 제공할 수 있다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 구조적으로 변형된 DMAb가 투여되지 않은 대상체의 기대 보호에 비해 대상체에서의 질환에 대한 증가된 보호를 제공할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 조성물의 부재 하의 기대 보호에 비해 조성물이 투여된 대상체의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로 질환에 대해 보호할 수 있다.
조성물은 대상체에 대한 조성물의 투여의 적어도 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 45시간, 50시간 또는 60시간 내에 대상체에서 구조적으로 변형된 DMAb를 생성시킬 수 있다. 조성물은 대상체에 대한 조성물의 투여의 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 내에 대상체에서 합성 항체를 생성시킬 수 있다. 조성물은 대상체에 대한 조성물의 투여의 약 1시간 내지 약 6일, 약 1시간 내지 약 5일, 약 1시간 내지 약 4일, 약 1시간 내지 약 3일, 약 1시간 내지 약 2일, 약 1시간 내지 약 1일, 약 1시간 내지 약 72시간, 약 1시간 내지 약 60시간, 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 또는 약 1시간 내지 약 6시간 내에 대상체에서 구조적으로 변형된 DMAb를 생성시킬 수 있다.
조성물은, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때, 체액 면역 반응을 유도하도록 항원이 투여된 대상체에서 내인성 항체의 생성보다 더 빨리 대상체에서 구조적으로 변형된 DMAb를 생성시킬 수 있다. 조성물은 체액 면역 반응을 유도하도록 항원이 투여된 대상체에서 내인성 항체의 생성 전에 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일에 구조적으로 변형된 DMAb를 생성시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 제2의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제2 조성물과 조합된 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제1 조성물의 투여에 관한 것이다. 제1 조성물 및 제2 조성물은 동시에 또는 임의의 순서로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 상이한 주사 부위에서 동시에 투여된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 2개 이상의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 단일 조성물의 투여에 관한 것이다. 이러한 실시형태에서, 2개 이상의 DMAb는 단일 핵산 분자에서 또는 투여를 위해 단일 조성물로 조합되는 별도의 핵산 분자에서 코딩될 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 포유류에서 항원에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 핵산 백신과 조합된 하나 이상의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자의 투여에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 핵산 백신은 포유류에서 공통 항원을 발현할 수 있는 적어도 하나의 핵산 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 공통 항원을 코딩하는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 촉진자를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 항원을 코딩하는 암호화 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 코딩 서열의 N 말단 단부에서 IgE 리더 서열에 작동 가능하게 연결된 항원을 코딩하는 암호화 서열을 포함한다.
핵산 분자는 코딩 서열의 C 말단 단부에 부착된 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 코돈 최적화된다.
몇몇 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 애쥬번트이다. 일 실시형태에서, 애쥬번트는 IL-12 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 형질주입 촉진제이다. 일 실시형태에서, 형질주입 촉진제는 다중음이온, 다중양이온 또는 지질, 및 더 바람직하게는 폴리-L-글루타메이트이다. 일 실시형태에서, 폴리-L-글루타메이트는 6㎎/㎖ 미만의 농도이다. 일 실시형태에서, 핵산 백신은 1㎎/㎖ 이상의 전체 핵산의 농도를 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 핵산 백신은 복수의 고유한 DNA 플라스미드를 포함하고, 여기서 각각의 복수의 고유한 DNA 플라스미드는 공통 항원을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
본 발명의 몇몇 실시형태에서, 핵산 백신은 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 애쥬번트는 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유리 성장 인자(platelet derived growth factor: PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF), 피부 T 세포 유인 케모카인(cutaneous T cell-attracting chemokine: CTACK), 상피 흉선 발현된 케모카인(epithelial thymus-expressed chemokine: TECK), 점막 연관된 상피 케모카인(mucosae-associated epithelial chemokine: MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, 신호 서열이 결실되고 선택적으로 IgE로부터의 신호 펩타이드를 포함하는 IL-15를 포함하는 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 유용한 애쥬번트일 수 있는 다른 유전자는 하기를 코딩하는 것을 포함한다: MCP-1, MIP-l-알파, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴(selectin), P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제(Caspase) ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능적 단편. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 애쥬번트는 IL-12, IL-15, CTACK, TECK 또는 MEC로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 포유류에서 공통 항원에 대해 면역 반응을 유발하는 방법은 점막 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 상기 기재된 공통 항원을 포함하는 DNA 플라스미드와 조합하여 CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 이의 기능적 단편 또는 이의 발현 가능한 코딩 서열 중 하나 이상을 포유류에게 투여하는 것을 포함한다. CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 이의 기능적 단편 중 하나 이상은 본 명세서에 제공된 핵산 백신의 투여 전에, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, CTACK, TECK, MEC 및 이의 기능적 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 포유류에게 투여된다.
본 발명의 조성물은 안전성(그래서 조성물은 질병 또는 사망을 야기하지 않음); 질병에 대한 보호; 및 투여 용이성, 아주 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 용량당 낮은 비용의 제공과 같은 효과적인 조성물의 필요한 특징을 가질 수 있다.
상기 기재된 바대로, 조성물은 하나 이상의 항원을 포함하는 백신과 같은 면역원성 조성물을 포함할 수 있다. 백신은 임의의 수의 항원에 대해 보호하여서, 항원 기반 병리학에 대해 치료, 예방 및/또는 보호하도록 사용될 수 있다. 백신은 백신이 투여된 대상체의 면역 반응을 유의미하게 유도하여서, 항원에 의한 감염을 보호하고 치료할 수 있다.
백신은 DNA 백신, 펩타이드 백신, 또는 조합 DNA 및 펩타이드 백신일 수 있다. DNA 백신은 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 펩타이드 결합에 의해 항원에 연결된 링커, 리더 또는 태그 서열을 코딩하는 추가적인 서열을 또한 포함할 수 있다. 펩타이드 백신은 항원 펩타이드, 항원 단백질, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 조합 DNA 및 펩타이드 백신은 항원 및 항원 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 상기 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 항원 펩타이드 또는 단백질 및 코딩된 항원은 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
백신은 백신이 투여된 대상체에서 체액 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 체액 면역 반응은 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 체액 면역 반응은 항원과 반응성일 수 있다. 체액 면역 반응은 백신이 투여된 대상체에서 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배 또는 약 3배 내지 약 10배 유도될 수 있다. 체액 면역 반응은 백신이 투여된 대상체에서 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 15.5배 또는 적어도 약 16.0배 유도될 수 있다.
백신에 의해 유도된 체액 면역 반응은 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 백신이 투여된 대상체와 연관된 중화 항체의 증가된 수준을 포함할 수 있다. 중화 항체는 항원에 특이적일 수 있다. 중화 항체는 항원과 반응성일 수 있다. 중화 항체는 백신이 투여된 대상체에서 감염 및 이의 연관된 병리학의 보호 및/또는 치료를 제공할 수 있다.
백신에 의해 유도된 체액 면역 반응은 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 백신이 투여된 대상체와 연관된 IgG 항체의 증가된 수준을 포함할 수 있다. 이 IgG 항체는 항원에 특이적일 수 있다. 이 IgG 항체는 항원에 반응성일 수 있다. 바람직하게는, 체액 반응은 항원의 2개 이상의 균주에 대해 교차 반응성이다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 IgG 항체의 수준은 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배, 또는 약 3배 내지 약 10배만큼 증가할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 IgG 항체의 수준은 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 15.5배 또는 적어도 약 16.0배만큼 증가할 수 있다.
백신은 백신이 투여된 대상체에서 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 항원에 반응성일 수 있다. 바람직하게는, 세포 반응은 항원의 2개 이상의 균주에 대해 교차 반응성이다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있다. 유발된 CD8+ T 세포 반응은 항원에 반응성일 수 있다. 유발된 CD8+ T 세포 반응은 다작용성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 CD8+ T 세포는 인터페론-감마(IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터류킨-2(IL-2), 또는 IFN-γ 및 TNF-α의 조합을 생성한다.
유도된 세포 면역 반응은 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 백신이 투여된 대상체와 연관된 증가된 CD8+ T 세포 반응을 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 CD8+ T 세포 반응은 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 약 2배 내지 약 30배, 약 3배 내지 약 25배, 또는 약 4배 내지 약 20배만큼 증가할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 CD8+ T 세포 반응은 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 16.0배, 적어도 약 17.0배, 적어도 약 18.0배, 적어도 약 19.0배, 적어도 약 20.0배, 적어도 약 21.0배, 적어도 약 22.0배, 적어도 약 23.0배, 적어도 약 24.0배, 적어도 약 25.0배, 적어도 약 26.0배, 적어도 약 27.0배, 적어도 약 28.0배, 적어도 약 29.0배 또는 적어도 약 30.0배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ를 생성하는 CD3+CD8+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 CD3+CD8+IFN-γ+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 TNF-α를 생성하는 CD3+CD8+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 CD3+CD8+TNF-α+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배 또는 14배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IL-2를 생성하는 CD3+CD8+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 CD3+CD8+IL-2+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 0.5배, 1.0배, 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배 또는 5.0배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ 및 TNF-α 둘 다를 생성하는 CD3+CD8+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 CD3+CD8+IFN-γ+TNF-α+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 100배, 110배, 120배, 130배, 140배, 150배, 160배, 170배 또는 180배만큼 증가할 수 있다.
백신에 의해 유도된 세포 면역 반응은 CD4+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있다. 유발된 CD4+ T 세포 반응은 원하는 항원에 반응성일 수 있다. 유발된 CD4+ T 세포 반응은 다작용성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD4+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 CD4+ T 세포는 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ 및 TNF-α의 조합을 생성한다.
유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ를 생성하는 CD3+CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 CD3+CD4+IFN-γ+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 TNF-α를 생성하는 CD3+CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 CD3+CD4+TNF-α+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배 또는 22배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IL-2를 생성하는 CD3+CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 CD3+CD4+IL-2+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배, 35배, 36배, 37배, 38배, 39배, 40배, 45배, 50배, 55배 또는 60배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ 및 TNF-α 둘 다를 생성하는 CD3+CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 연관된 CD3+CD4+IFN-γ+TNF-α+의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 10.0배, 10.5배, 11.0배, 11.5배, 12.0배, 12.5배, 13.0배, 13.5배, 14.0배, 14.5배, 15.0배, 15.5배, 16.0배, 16.5배, 17.0배, 17.5배, 18.0배, 18.5배, 19.0배, 19.5배, 20.0배, 21배, 22배, 23배 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배 또는 35배만큼 증가할 수 있다.
본 발명의 백신은 안전성(그래서 백신 자체는 질병 또는 사망을 야기하지 않음); 살아 있는 병원균, 예컨대, 바이러스 또는 박테리아에 대한 노출로부터 생긴 질병에 대한 보호; 세포를 예방하기 위한 중화 항체의 유도; 세포내 병원균에 대한 보호성 T 세포의 유도; 및 투여 용이성, 아주 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 용량당 낮은 비용의 제공과 같은 효과적인 백신의 필요한 특징을 가질 수 있다.
백신은 상이한 조직, 예컨대, 근육 또는 피부에 투여될 때 면역 반응을 추가로 유도할 수 있다. 백신은 전기천공 또는 주사를 통해, 또는 피하로 또는 근육내로 투여될 때 면역 반응을 추가로 유도할 수 있다.
백신 작제물 및 플라스미드
백신은 하나 이상의 항원을 코딩하는 핵산 작제물 또는 플라스미드를 포함할 수 있다. 핵산 작제물 또는 플라스미드는 하나 이상의 비상동성 핵산 서열을 포함하거나 함유할 수 있다. 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있는 유전적 작제물이 본 명세서에 제공된다. 유전적 작제물은 기능하는 염색체외 분자로서 세포에 존재할 수 있다. 유전적 작제물은 선형 미니염색체, 예를 들어, 동원체, 말단소체 또는 플라스미드 또는 코스미드일 수 있다. 유전적 작제물은 하나 이상의 비상동성 핵산 서열을 포함하거나 함유할 수 있다.
유전적 작제물은 임의의 순서로 항원을 발현하는 플라스미드의 형태일 수 있다.
유전적 작제물은 또한 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관된 바이러스 및 재조합 백시니아를 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 게놈의 일부일 수 있다. 유전적 작제물은 세포에서 사는 약독화된 살아 있는 미생물 또는 재조합 미생물 벡터에서 유전자 재료의 일부일 수 있다.
유전적 작제물은 핵산의 코딩 서열의 유전자 발현을 위한 조절 요소를 포함할 수 있다. 조절 요소는 촉진자, 인핸서 개시 코돈, 중지 코돈 또는 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
핵산 서열은 벡터일 수 있는 유전적 작제물을 구성할 수 있다. 벡터는 포유류에서 면역 반응을 유발하기에 효과적인 분량으로 포유류의 세포에서 항원을 발현할 수 있다. 벡터는 재조합일 수 있다. 벡터는 항원을 코딩하는 비상동성 핵산을 포함할 수 있다. 벡터는 플라스미드일 수 있다. 벡터는 세포를 항원을 코딩하는 핵산에 의해 형질주입하기에 유용할 수 있고, 여기서 형질전환된 숙주 세포가 항원의 발현이 발생하는 조건 하에 배양되고 유지된다.
코딩 서열은 안정성 및 높은 발현 수준을 위해 최적화될 수 있다. 몇몇 경우에, 코돈은 분자내 결합으로 인해 형성되는 것과 같은 RNA의 2차 구조 형성을 감소시키도록 선택된다.
벡터는 항원을 코딩하는 비상동성 핵산을 포함할 수 있고, 하나 이상의 암 항원 코딩 서열(들)의 상류일 수 있는 개시 코돈 및 항원의 코딩 서열(들)의 하류일 수 있는 중지 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 개시 및 종결 코돈은 항원의 코딩 서열(들)과 같은 틀에 있을 수 있다. 벡터는 항원의 코딩 서열(들)에 작동 가능하게 연결된 촉진자를 또한 포함할 수 있다. 항원의 코딩 서열(들)에 작동 가능하게 연결된 촉진자는 유인원 바이러스 40(SV40)에서 유래된 촉진자, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 촉진자, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 촉진자, 예컨대, 소 면역결핍 바이러스(BIV) 긴 말단 반복부(LTR) 촉진자, 몰로니 바이러스 촉진자, 조류 백혈증 바이러스(ALV) 촉진자, 사이토메갈로바이러스(CMV) 촉진자, 예컨대, CMV 즉시 초기 촉진자, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 촉진자 또는 라우스 육종 바이러스(RSV) 촉진자일 수 있다. 촉진자는 또한 인간 유전자, 예컨대, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아티닌 또는 인간 메탈로티오네인에서 유래된 촉진자일 수 있다. 촉진자는 또한 조직 특이적 촉진자, 예컨대, 근육 또는 피부 특이적 촉진자(천연 또는 합성)일 수 있다. 이러한 촉진자의 예는 US 특허 출원 공보 제US20040175727호(이의 내용은 본 명세서에서 그 전문이 원용됨)에 기재되어 있다.
벡터는 또한 항원의 코딩 서열(들)의 하류일 수 있는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 신호 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 벡터(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))로부터의 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
벡터는 또한 항원의 상류에 인핸서를 포함할 수 있다. 인핸서는 DNA 발현에 필요할 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아티닌 또는 바이러스 인핸서, 예컨대, CMV, HA, RSV 또는 EBV 유래의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 기능 증대는 미국 특허 제5,593,972호, 제5,962,428호 및 WO 제94/016737호(이들의 각각의 내용은 완전히 참고로 원용됨)에 기재되어 있다.
벡터는, 세포에서 벡터를 염색체외로 유지시키고 벡터의 다수의 카피를 생성하도록, 포유류 복제 기원을 또한 포함할 수 있다. 벡터는 엡스타인 바 바이러스 복제 기원 및 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역(통합 없이 고카피 에피솜 복제를 생성할 수 있음)을 포함할 수 있는 Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고)으로부터의 pVAX1, pCEP4 또는 pREP4일 수 있다. 벡터는 변화를 갖는 pVAX1 또는 pVAX1 변이체, 예컨대, 본 명세서에 기재된 변이체 플라스미드일 수 있다. 변이체 pVAX1 플라스미드는 골격 벡터 플라스미드 pVAX1(Invitrogen(캘리포니아주 칼스바드))의 2998개의 염기쌍 변이체이다. CMV 촉진자는 137 내지 724 염기에 위치한다. T7 촉진자/프라이밍 부위는 664 내지 683 염기에 있다. 다수의 클로닝 부위는 696 내지 811 염기에 있다. 소 GH 폴리아데닐화 신호는 829 내지 1053 염기에 있다. 카나마이신 내성 유전자는 1226 내지 2020 염기에 있다. pUC 복제 기원은 2320 내지 2993 염기에 있다.
Invitrogen으로부터 구입 가능한 pVAX1의 서열에 기초하여, 하기 돌연변이는 본 명세서에 기재된 플라스미드 1-6에 대해 골격으로서 사용된 pVAX1의 서열에서 발견되었다:
CMV 촉진자에서의 C>G241
소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(bGHpolyA)의 하류인 C>T1942 골격
카나마이신 유전자의 하류인 A>-2876 골격
pUC 복제 기원(Ori) 고카피수 돌연변이에서의 C>T3277(문헌[Nucleic Acid Research 1985] 참조)
RNASeH 부위의 pUC Ori 상류의 매우 말단에서의 G>C3753
염기 쌍 2, 3 및 4는 CMV 촉진자의 상류에서 골격에서 ACT로부터 CTG로 변한다.
벡터의 골격은 pAV0242일 수 있다. 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5(Ad5) 벡터일 수 있다.
벡터는 또한 벡터가 투여된 포유류 또는 인간 세포에서 유전자 발현에 매우 적합할 수 있는 조절 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 하나 이상의 암 항원 서열은 숙주 세포에서 코딩 서열의 더 효율적인 전사를 허용할 수 있는 코돈을 포함할 수 있다.
벡터는 에스체리치아 콜라이(이. 콜라이)에서 단백질 생성에 사용될 수 있는 pSE420(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있다. 벡터는 또한 효모의 사카로마이세스 세레비시아에 균주에서 단백질 생성에 사용될 수 있는 pYES2(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있다. 벡터는 또한 곤충 세포에서 단백질 생성에 사용될 수 있는 MAXBAC(상표명) 완전한 바큘로바이러스 발현 시스템(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있다. 벡터는 또한 포유류 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 단백질 생성에 사용될 수 있는 pcDNA I 또는 pcDNA3(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있다. 벡터는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)](완전히 참고로 원용됨)을 포함하여 일상적인 기법 및 용이하게 구입 가능한 출발 재료에 의해 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터 또는 시스템일 수 있다.
7. 조성물의 부형제 및 다른 성분
조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 기능적 분자, 예컨대, 비히클, 담체 또는 희석제일 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 형질주입 촉진제일 수 있고, 이것은 표면 활성제, 예컨대, 면역 자극 복합체(immune-stimulating complexes: ISCOMS), 프로인트 불완전 애쥬번트, LPS 유사체, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체, 소포체, 예컨대, 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중음이온, 다중양이온 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질주입 촉진제를 포함할 수 있다.
형질주입 촉진제는 다중음이온, 다중양이온, 예를 들어, 폴리-L-글루타메이트(LGS) 또는 지질이다. 형질주입 촉진제는 폴리-L-글루타메이트이고, 폴리-L-글루타메이트는 6㎎/㎖ 미만의 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 형질주입 촉진제는 또한 표면 활성제, 예컨대, 면역-자극 복합체(ISCOMS), 프로인트 불완전 애쥬번트, LPS 유사체, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 소포체, 예를 들어, 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 포함할 수 있고, 히알루론산은 또한 조성물과 함께 투여되어 사용될 수 있다. 조성물은 또한 형질주입 촉진제, 예컨대, 지질, 리포좀, 예를 들어, 레시틴 리포좀 또는 당해 분야에 공지된 다른 리포솜, 예를 들어, DNA-리포솜 혼합물(예를 들어, W0 제9324640호 참조), 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중음이온, 다중양이온 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질주입 촉진제를 포함할 수 있다. 형질주입 촉진제는 다중음이온, 다중양이온, 예를 들어, 폴리-L-글루타메이트(LGS) 또는 지질이다. 백신 내 형질주입 제제의 농도는 4㎎/㎖ 미만, 2㎎/㎖ 미만, 1㎎/㎖ 미만, 0.750㎎/㎖ 미만, 0.500㎎/㎖ 미만, 0.250㎎/㎖ 미만, 0.100㎎/㎖ 미만, 0.050㎎/㎖ 미만, 또는 0.010㎎/㎖ 미만이다.
조성물은 유전적 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.
조성물은 약 1나노그램 내지 100밀리그램; 약 1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 또는 바람직하게는 약 0.1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 또는 더 바람직하게는 약 1밀리그램 내지 약 2밀리그램의 분량으로 DNA를 포함할 수 있다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 약 5나노그램 내지 약 1000마이크로그램의 DNA를 포함한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약 10나노그램 내지 약 800마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약 0.1 내지 약 500마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약 1 내지 약 350마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약 25 내지 약 250마이크로그램, 약 100 내지 약 200마이크로그램, 약 1나노그램 내지 100밀리그램; 약 1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 약 0.1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 약 1밀리그램 내지 약 2밀리그램, 약 5나노그램 내지 약 1000마이크로그램, 약 10나노그램 내지 약 800마이크로그램, 약 0.1 내지 약 500마이크로그램, 약 1 내지 약 350마이크로그램, 약 25 내지 약 250마이크로그램, 약 100 내지 약 200마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다.
조성물은 사용되는 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사 가능한 약학 조성물은 무균이고, 발열원을 함유하지 않고, 입자가 없을 수 있다. 등장성 제형 또는 용액을 사용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 조성물은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 등장성 용액은 인산염 완충 식염수를 포함할 수 있다. 조성물은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. LGS 또는 다중양이온 또는 다중음이온을 포함하는 안정화제는 제형이 연장된 시간 기간 동안 실온 또는 상온에서 안정하도록 할 수 있다.
8. 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 생산하는 방법
본 발명의 조작된 DMAb에서 도달하도록 사용될 수 있는 다수의 조작 전략이 있다.
DMAb의 풀 그래프팅
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 풀 그래프팅에 의해 생성된다. 일 실시형태에서, 풀 그래프팅의 방법은 더 높은 발현 DMAb의 프레임워크로 모 DMAb의 가변 경쇄 및 가변 중쇄의 CDR 영역을 전위시키는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열은 풀 그래프트 DMAb의 아미노산 서열로부터 생성된다.
일 실시형태에서, 핵산 서열은 최적화된다. 최적화는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 전사를 증가시키기 위한 낮은 GC 함량의 리더 서열의 부가; mRNA 안정성 및 코돈 최적화; 증가된 번역을 위한 코작 서열(예를 들어, GCC ACC)의 부가; 증가된 번역을 위한 IRES 서열의 부가; 증가된 전사를 위한 WPRE 서열의 부가; 신호 펩타이드를 코딩하는 면역글로불린(Ig) 리더 서열의 부가; 및 시스-작용 서열 모티프(즉, 내부 TATA 박스)가 작용한 범위까지의 제거.
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 최적화된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 생성된다. 핵산 분자를 생성하기 위한 임의의 방법은 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 생성하도록 이용될 수 있다. 특이적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 생성하는 방법은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다.
DMAb의 부분 그래프팅
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 부분 그래프팅에 의해 생성된다. 일 실시형태에서, 부분 그래프팅의 방법은 구조적 정렬 및 가능한 변형의 필적하는 모델링 중 하나 이상을 포함한다. 일 실시형태에서, 모 DMAb VL 도메인 서열은 하나 이상의 검증된 고도로 발현된 스캐폴드 VL 서열의 VL 도메인에 정렬되다. 일 실시형태에서, 필적하는 모델링은 VL 도메인의 구조적 슈퍼-배치를 통해 예측된 돌연변이를 포함하는 다수의 가능한 부분 그래프트 서열에서 수행된다. 일 실시형태에서, 필적하는 모델링의 방법은 에너지 최소화 분석, 접점 분석, 서열 특성 예측 및 라마찬드란(Ramachandran) 분석 중 적어도 하나를 포함한다. 후보 부분 그래프트 DMAb는 양호한 예측된 특징(예를 들어, 개선된 안정성)을 갖는 것이다.
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열은 예측된 부분 그래프트 DMAb 아미노산 서열로부터 생성된다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열은 추가로 최적화되고, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 최적화된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 생성된다.
스캐폴드 변형
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb는 스캐폴드 변형에 의해 생성된다. 일 실시형태에서, 스캐폴드 변형의 방법은 모 DMAb의 아미노산 서열에 하나 이상의 특정한 아미노산 변화를 만들어서 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb를 생성하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 특정한 아미노산 변화는 모 DMAb와 비교하여 안정성, 중쇄 및 경쇄 접점, 및 구조적으로 변형된 DMAb의 분비 중 적어도 하나를 개선한다. 일 실시형태에서, 특정한 아미노산 변화는 모 DMAb와 비교하여 구조적으로 변형된 DMAb의 가변 사슬 접점, Pi 상호작용, 등전점 및 라마찬드란 분석에 기초하여 DMAb의 응집을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 특정한 아미노산 변화는 등전점 변형, VH-VL 접점 상호작용의 변경 또는 이들의 조합을 발생시키도록 만들어진다.
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열은 변형된 아미노산 서열로부터 생성된다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열은 추가로 최적화되고, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 최적화된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 생성된다.
ScFv-Fc 구조적으로 변형된 DMAb
일 실시형태에서, 낮은 발현을 나타내는 모 DMAb는 1회 이상의 scFv 모델링을 겪는다. 다양한 실시형태에서, ScFv 모델링은 링커 모델링, 힌지 변형 모델링, 프레임워크 모델링 및 CDR 루프 개선 중 적어도 하나를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 모델링은 VH-링커-VL 및 VL-링커-VH 포맷 중 적어도 하나에서 DMAb 서열에서 수행된다. 일 실시형태에서, 여러 회차의 모델링은 링커가 CDR을 모호하게 하지 않거나 최소로 영향을 미치는 경우 변이체가 예측될 때까지 다양한 인풋 서열로 수행된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 예측된 변이체의 링커는 CDR 중 하나 이상을 모호하게 하는 것으로 예측되고, 따라서 또 다른 회차의 ScFv 모델링은 새로운 링커 서열을 사용하여 수행된다. 일 실시형태에서, 새로운 링커는 더 길거나, 더 짧을 수 있거나, 이전에 모델링된 링커와 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 1회 이상의 ScFv 모델링 이후에, 분석은 예측된 DMAb가 추가의 개발을 위한 후보인지를 결정하기 위해 예측된 구조에서 수행된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 링커 융합 부위 근처의 영역의 RMSD 분석은 수행된다. 일 실시형태에서, 링커에 의한 CDR의 최소의 모호성을 갖는 예측된 DMAb는 후보 DMAb에 대해서 선택된다. 일 실시형태에서, 링커 융합 부위 근처의 낮은 예측된 RMSD를 갖는 예측된 DMAb는 후보 DMAb로서 선택된다.
일 실시형태에서, 후보 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 최적화된다. 일 실시형태에서, 최적화는 개별적으로 VH, 링커 및 VL 서열의 각각을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서 수행된다(즉, 뉴클레오타이드 서열의 모듈식 최적화). 일 실시형태에서, 최적화는 단일 뉴클레오타이드 서열로서 VH-링커-VL을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서 수행된다. 일 실시형태에서, 최적화는 단일 뉴클레오타이드 서열로서 VL-링커-VH를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서 수행된다.
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 생성된다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 최적화된 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb의 발현 수준 및 항원 결합은 이후 모 DMAb의 것과 비교된다. 일 실시형태에서, 모 DMAb보다 높은 발현을 갖고 항원 결합을 여전히 나타내는 구조적으로 변형된 DMAb는 이후 생체내 발현 및 대상체에서 면역 반응을 생성하는 능력에 대해 추가로 시험된다.
9. 합성 항체를 생산하는 방법
본 발명은 또한 합성 항체를 생성하는 방법에 대한 것이다. 상기 방법은 하기에 더 자세히 기재된 전달 방법을 이용함으로써 이를 필요로 하는 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 합성 항체는 대상체에 대한 조성물의 투여 시 생체 내 또는 대상체에서 생성된다.
상기 방법은 또한 하나 이상의 세포로 조성물을 도입하는 단계를 포함할 수 있고, 따라서 합성 항체는 하나 이상의 세포에서 생성되거나 생산될 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 조직, 예를 들어, 피부 및 근육(이들로 제한되지는 않음)으로 조성물을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있고, 따라서 합성 항체는 하나 이상의 조직에서 생성되거나 생산될 수 있다.
10. 항체에 대한 확인 또는 스크리닝 방법
본 발명은 추가로 상기 기재된 항원에 반응성이거나 이에 결합하는 상기 기재된 항체를 확인하거나 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 항체를 확인하거나 스크리닝 방법은 항체를 확인하거나 스크리닝하기 위해 당업자에게 공지된 방법론에서 항원을 사용할 수 있다. 이러한 방법론은 라이브러리(예를 들어, 파지 디스플레이)로부터의 항체의 선택 및 동물의 면역화 이후 항체의 단리 및/또는 정제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
11. 조성물의 전달 방법
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 조성물을 전달하는 방법에 관한 것이다. 전달 방법은 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 투여는 생체 내 전기천공을 포함하는 및 포함하지 않는 DNA 주입, 리포솜 매개된 전달 및 나노입자 촉진된 전달을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
조성물의 전달을 받는 포유류는 인간, 영장류, 비인간 영장류, 젖소, 육우, 양, 염소, 영양, 유럽들소, 물소, 유럽들소, 소과, 사슴, 고슴도치, 코끼리, 라마, 알파카, 마우스, 래트 및 닭일 수 있다.
조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입을 통해, 협측 투여를 통해, 흉막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내 경막내, 및 관절내 또는 이들의 조합을 포함하는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 수의학적 용도를 위해, 조성물은 정상적인 수의학적 관례에 따라 적합하게 허용 가능한 제형으로 투여될 수 있다. 수의사는 특정한 동물에 가장 적절한 투약 요법 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 조성물은 전통적인 주사기, 무바늘 주사 장치, "미세입자투사 곤 건(microprojectile bombardment gone gun)" 또는 다른 물리적 방법, 예컨대, 전기천공("EP"), "수력학적 방법" 또는 초음파에 의해 투여될 수 있다.
a. 전기천공
전기천공을 통한 조성물의 투여는 가역적인 기공이 세포막에서 형성하게 하도록 효과적인 에너지의 펄스를 원하는 포유류 조직으로 전달하도록 구성될 수 있는 전기천공 장치를 사용해서 달성될 수 있고, 바람직하게는 에너지의 펄스는 사용자에 의해 입력된 사전 설정된 전류와 유사한 정전류이다. 전기천공 장치는 전기천공 부품 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함할 수 있다. 전기천공 부품은 하기를 포함하는 전기천공 장치의 다양한 요소의 하나 이상을 포함하고 통합할 수 있다: 컨트롤러, 전류 파형 생성기, 임피던스 테스터, 파형 로거, 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 부품, 전원 및 전력 스위치. 전기천공은, 플라스미드에 의한 세포의 형질주입을 수월하게 하도록, 생체 내 전기천공 장치, 예를 들어, CELLECTRA EP 시스템(Inovio Pharmaceuticals(펜실베니아주 플리머스 미팅)) 또는 Elgen 전기천공기(Inovio Pharmaceuticals(펜실베니아주 플리머스 미팅))를 이용해서 달성될 수 있다.
전기천공 부품은 전기천공 장치의 하나의 요소로서 작용할 수 있고, 다른 요소는 전기천공 성분과 통신하는 별도의 요소(또는 부품)이다. 전기천공 부품은 전기천공 장치의 하나 초과의 요소로서 작용할 수 있고, 이는 전기천공 부품과 별도의 전기천공 장치의 더 다른 요소와 통신할 수 있다. 요소가 하나의 장치로서 또는 서로 통신하는 별도의 요소로서 작용할 수 있으므로, 하나의 전기기계적 또는 기계적 장치의 일부로 존재하는 전기천공 장치의 요소는 제한되지 않을 수 있다. 전기천공 부품은 원하는 조직에서 정전류를 생성하고 피드백 메커니즘을 포함하는 에너지의 펄스를 전달할 수 있다. 전극 어셈블리는 복수의 전극을 공간적 배열로 갖는 전극 어레이를 포함할 수 있고, 여기서 전극 어셈블리는 전기천공 부품으로부터 에너지의 펄스를 수신하고, 전극을 통해 이를 원하는 조직으로 전달한다. 복수의 전극 중 적어도 하나는 에너지의 펄스의 전달 동안 중성이고, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 전기천공 부품으로 임피던스와 통신한다. 피드백 메커니즘은 측정된 임피던스를 수신할 수 있고, 정전류를 유지하기 위해 전기천공 부품에 의해 전달된 에너지의 펄스를 조정할 수 있다.
복수의 전극은 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있다. 복수의 전극은 프로그래밍된 순서로 전극의 제어를 통해 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있고, 프로그래밍된 순서는 전기천공 부품에 사용자에 의해 입력된다. 프로그래밍된 순서는 순서대로 전달된 복수의 펄스를 포함할 수 있고, 여기서 복수의 펄스의 각각의 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해 전달되고, 복수의 펄스의 후속하는 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중 다른 것에 의해 전달된다.
피드백 메커니즘은 하드웨어 또는 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 피드백 메커니즘은 아날로그 폐쇄-루프 회로에 의해 수행될 수 있다. 피드백은 50㎲, 20㎲, 10㎲ 또는 1㎲마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백이거나 순간적이다(즉, 반응 시간을 결정하기 위해 이용 가능한 기법에 의해 결정되는 바에 따라 실질적으로 순간적임). 중성 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 피드백 메커니즘으로 임피던스를 통신시킬 수 있고, 피드백 메커니즘은 임피던스에 반응하여 정전류를 사전 설정된 전류와 유사한 값에서 유지하기 위해 에너지의 펄스를 조정한다. 피드백 메커니즘은 에너지의 펄스의 전달 동안 연속적으로 및 순간적으로 정전류를 유지시킬 수 있다.
본 발명의 조성물의 전달을 수월하게 할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는 미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli 등), 미국 특허 공보 제2005/0052630호(Smith 등)(이들의 내용은 본 명세서에 의해 그 전문이 참고로 원용됨)에 기재된 것을 포함한다. 조성물의 전달을 수월하게 하도록 사용될 수 있는 다른 전기천공 장치 및 전기천공 방법은 2006년 10월 17일자로 출원된 미국 가출원 제60/852,149호 및 2007년 10월 10일자로 출원된 제60/978,982호에 대해 35 USC 119(e) 하에 이익을 청구하는, 2007년 10월 17일자로 출원된 공동 계류 중이고 공동 소유된 미국 특허 출원 제11/874072호(이들은 모두 본 명세서에 의해 그 전문이 원용됨)에 제공된 것을 포함한다.
미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli 등)는 체내 또는 식물에서 선택된 조직의 세포로의 생체분자의 도입을 수월하게 하기 위한 모듈식 전극 시스템 및 이의 용도를 기재한다. 모듈식 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극으로 전도성 링크를 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 운영자는 지지 구조 상에 실장된 복수의 바늘 전극을 쥐고 이들을 체내 또는 식물에서 선택된 조직으로 단단히 삽입할 수 있다. 이후, 생체분자는 피하 바늘을 통해 선택된 조직 내로 전달된다. 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고, 정전류 전기 펄스는 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이에 세포로의 생체분자의 도입을 수월하게 한다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용은 본 명세서에 의해 참고로 원용된다.
미국 특허 공보 제2005/0052630호(Smith 등)는 체내 또는 식물에서 선택된 조직의 세포로의 생체분자의 도입을 효과적으로 수월하게 하도록 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기재한다. 전기천공 장치는 그 작동이 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 특정되는 전기-역학 장치("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 펄스 파라미터의 입력 및 사용자 제어에 기초하여 어레이에서의 전극 사이의 일련의 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하고, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 바늘 전극의 어레이, 주사 바늘을 위한 중심 주사 채널 및 제거 가능한 가이드 디스크를 갖는 대체 가능한 전극 디스크를 포함한다. 미국 특허 공보 제2005/0052630호의 전체 내용은 본 명세서에 의해 참고로 원용된다.
미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공보 제2005/0052630호에 기재된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직뿐만 아니라 다른 조직 또는 기관으로의 심부 침투를 위해 채택될 수 있다. 전극 어레이의 구성 때문에, (선택된 생체분자의 전달을 위한) 주사 바늘은 또한 표적 기관 내로 완전히 삽입되고, 주사는 전극에 의해 사전-서술된 영역에서 해당 표적에 수직으로 투여된다. 미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공보 제2005/005263호에 기재된 전극은 바람직하게는 20㎜ 길이 및 21 게이지이다.
추가적으로, 전기천공 장치 및 이의 용도를 도입하는 몇몇 실시형태에, 하기 특허에 기재된 것인 전기천공 장치가 고려된다: 1993년 12월 28일자로 허여된 미국 특허 제5,273,525호, 2000년 8월 29일자로 허여된 미국 특허 제6,110,161호, 2001년 7월 17일자로 허여된 제6,261,281호 및 2005년 10월 25일자로 허여된 제6,958,060호, 및 2005년 9월 6일자로 허여된 미국 특허 제6,939,862호. 게다가, 임의의 다양한 장치를 이용한 DNA의 전달에 관한 2004년 2월 24일자로 허여된 미국 특허 제6,697,669호, 및 DNA의 주입의 방법에 대한 2008년 2월 5일자로 허여된 미국 특허 제7,328,064호에서 제공된 대상을 포함하는 특허는 본 명세서에서 고려된다. 상기 특허는 그 전문이 참고로 포함된다.
12. 치료의 방법
대상체에서 구조적으로 변형된 DMAb를 생성함으로써 이를 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료, 보호 및/또는 예방 방법이 본 명세서에 또한 제공된다. 상기 방법은 대상체에 대한 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 대상체에 대한 조성물의 투여는 상기 기재된 전달의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
대상체에서 구조적으로 변형된 DMAb의 생성 시, 합성 항체는 항원에 결합하거나 이와 반응할 수 있다. 이러한 결합은 항원을 중화시키거나, 다른 분자, 예를 들어, 단백질 또는 핵산에 의한 항원의 인식을 차단하거나, 항원에 대한 면역 반응을 야기하거나 유도하여서, 대상체에서 항원과 연관된 질환을 치료, 보호 및/또는 예방할 수 있다.
백신을 전달하는 방법 또는 백신접종은 치료학적 및 예방학적 면역 반응을 유도하도록 제공될 수 있다. 백신접종 과정은 항원에 대한 포유류 면역 반응에서 생성할 수 있다. 백신은 포유류의 면역계의 활성을 조절하고 면역 반응을 증대시키도록 개체에게 전달될 수 있다. 백신의 전달은 세포에서 발현되고 면역계가 인식하는 세포의 표면으로 전달되고 세포, 체액, 또는 세포 및 체액 반응을 유도하는 핵산 분자로서의 공통 항원의 형질주입일 수 있다. 백신의 전달은 상기 기재된 바와 같은 백신을 포유류에게 투여함으로써 항원에 대해 포유류에서 면역 반응을 유도하거나 유발하도록 사용될 수 있다.
조성물 용량은 1㎍ 내지 10㎎의 활성 성분/㎏ 체중/시간일 수 있고, 20㎍ 내지 10㎎ 성분/㎏ 체중/시간일 수 있다. 조성물은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일 또는 31일마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 조성물 용량의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다.
조성물은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 항원을 코딩하는 DNA 백신을 포함할 수 있다. 조성물은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 구조적으로 변형된 DMAb 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
DNA 백신 및 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 동일한 시간에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, DNA 백신 및 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 동시에 투여된다. 일 실시형태에서, DNA 백신은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자 전에 투여된다. 일 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 DNA 백신 전에 투여된다.
소정의 실시형태에서, DNA 백신은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자가 투여된 후 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상 또는 14일 이상에 투여된다. 소정의 실시형태에서, DNA 백신은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자가 투여된 후 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상 또는 10주 이상에 투여된다. 소정의 실시형태에서, DNA 백신은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자가 투여된 후 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상 또는 12개월 이상에 투여된다.
소정의 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 DNA 백신이 투여된 후 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상 또는 14일 이상에 투여된다. 소정의 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 DNA 백신이 투여된 후 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상 또는 10주 이상에 투여된다. 소정의 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자는 DNA 백신이 투여된 후 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상 또는 12개월 이상에 투여된다.
소정의 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자 및 DNA 백신은 1회 투여된다. 소정의 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자 및/또는 DNA 백신은 1회 초과로 투여된다. 소정의 실시형태에서, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자 및 DNA 백신의 투여는 지속적이고 전신인 면역 반응을 제공한다.
13. 항생제와 조합된 사용
본 발명은 또한 구조적으로 변형된 DMAb 및 치료학적 항생제의 조합물을 투여함으로써 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료, 보호 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
구조적으로 변형된 DMAb 및 항생제는 임의의 적합한 방법을 이용하여 투여될 수 있어서, 구조적으로 변형된 DMAb 및 항생제의 조합물은 둘 다 대상체에서 존재한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 상기 자세히 기재된 임의의 방법에 의한 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제1 조성물의 투여 및 합성 항체의 투여 이후의 1일 미만, 2일 미만, 3일 미만, 4일 미만, 5일 미만, 6일 미만, 7일 미만, 8일 미만, 9일 미만 또는 10일 미만에 항생제를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 상기 자세히 기재된 임의의 방법에 의한 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제1 조성물의 투여 및 합성 항체의 투여 이후의 1일 초과, 2일 초과, 3일 초과, 4일 초과, 5일 초과, 6일 초과, 7일 초과, 8일 초과, 9일 초과 또는 10일 초과에 항생제를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 항생제를 포함하는 제1 조성물의 투여 및 항생제의 투여 이후의 1일 미만, 2일 미만, 3일 미만, 4일 미만, 5일 미만, 6일 미만, 7일 미만, 8일 미만, 9일 미만 또는 10일 미만에서의 상기 자세히 기재된 임의의 방법에 의한 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 항생제를 포함하는 제1 조성물의 투여 및 항생제의 투여 이후의 1일 초과, 2일 초과, 3일 초과, 4일 초과, 5일 초과, 6일 초과, 7일 초과, 8일 초과, 9일 초과 또는 10일 초과에서의 상기 자세히 기재된 임의의 방법에 의한 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 동시에 상기 자세히 기재된 임의의 방법에 의한 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제1 조성물 및 항생제를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 본 발명의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 분자 및 항생제를 포함하는 단일 조성물의 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 합성 항체와 조합되어 사용될 수 있는 항생제의 비제한적인 예는 아미노글라이코사이드(예를 들어, 젠타마이신, 아미카신, 토브라마이신), 퀴놀론(예를 들어, 시프로플록사신, 레보플록사신), 세팔로스포린(예를 들어, 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 세프피롬, 세프토비프롤), 항슈도모나스 페니실린: 카복시페니실린(예를 들어, 카르베니실린 및 티카르실린) 및 우레이도페니실린(예를 들어, 메즐로실린, 아즐로실린 및 피페라실린), 카바페넴(예를 들어, 메로페넴, 이미페넴, 도리페넴), 폴리믹신(예를 들어, 폴리믹신 B 및 콜리스틴) 및 모노박탐(예를 들어, 아즈트레오남)을 포함한다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 예시되는 다수의 양상을 갖는다.
14. 실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 예시된다. 이러한 실시예가 본 발명의 바람직한 실시형태를 표시하지만, 단지 예시로서 주어진다고 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 이들의 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 용법 및 조건에 이를 채택하기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 본 명세서에 도시되고 기재된 것들에 이외에 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명으로부터 당업자에게 명확할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
실시예 1: 그래프팅 및 스캐폴드 변형
DNA 벡터 코딩된 단일클론 항체(DMAb)는 골격근을 형질주입시키도록 전기천공(EP)을 이용함으로써 생체내 mAb를 생성하는 수단을 제공한다. 이전의 연구에서, 독감 및 슈도모나스 쥣과 시험감염 모델에서 DMAb가 높은 혈청 수준을 달성하고 정제된 mAb에 필적하는 밝혀진 보호를 달성할 수 있는 것으로 입증되었다. 임상 분야에 작업하여서, 제형화, 투여, 뉴클레오타이드 및 아미노산 최적화를 통해 DMAb의 생체내 발현 수준을 추가로 증가시키는 것에 노력이 집중되었다. 다수의 DMAb 항체 변형 전략은 원래의 mAb 클론의 생물학을 희생시키지 않으면서 DMAb의 생체내 발현 수준을 증가시키도록 프레임워크 그래프팅을 이용하여 개발되었다.
도 1은 최적화된 DMAB를 생성하도록 이용된 다수의 전략의 개관을 제공한다. 전략은 풀 스캐폴드 그래프팅, 부분 스캐폴드 그래프팅 및 스캐폴드 변형(다수의 점 돌연변이)을 포함한다.
풀 스캐폴드 그래프팅은 원하는 특성을 갖는 제2 Fv의 프레임워크에 바람직하지 않은 특성을 갖는 하나의 Fv 영역으로부터의 CDR(VH 또는 VL)을 이동시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 항체 인간화에 이용된 것과 다소 유사하다. Fv의 제한된 선택이 이용 가능하여서, 이상적인 CDR 배치 도전을 만든다. 발현은 긍정적으로 영향을 받을 수 있지만, 스캐폴드가 완전히 상용성이 아닌 경우 결합은 부정적으로 영향을 받을 수 있다.
부분 스캐폴드 그래프팅은 배수 안정성을 증가시키는 목표로 스캐폴드의 선택된 영역의 변경을 포함한다. CDR에 너무 가까운 영역은 CDR 교란을 최소화하도록 회피된다. 일반적으로, 높은 발현을 갖는 DMAb의 서열을 모방하도록 가변 경쇄의 N 말단에서 처음의 20개의 잔기 내에 변화가 이루어진다.
스캐폴드 변형은 VH-VL 접점에서 안정화 상호작용을 증가시키도록 또는 양호하게 등전점을 변경하도록 다수의 돌연변이의 예측된 시리즈를 만드는 것을 포함한다. 일반적으로 약 3개 내지 4개의 개별 아미노산 변화는 안정성을 증가시키도록 이루어진다.
방법이 이제 기재된다.
BALB/c 마우스(n=8)는 근육내 전달을 통해 하나의 치료 부위에서 100㎍의 DMAb를 코딩하는 DNA-플라스미드가 투여된 후, 전기천공(IM-EP)이 되었다. DMAb의 혈청 수준은 7일에 ELISA에 의해 정량화되었다. 혈청 DMAb의 결합은 7일에 ELISA에 의해 평가되었다.
부분 그래프트, 풀 그래프트 및 스캐폴드 변형은 표 1에 기재된 바대로 BDBV223 및 Z5D2 항체에서 수행되었다.
Figure pat00001
결과가 이제 기재된다.
다수의 작제물은 생성되고 ELISA에 의해 생체내 발현에 대해 스크리닝되었다. 부분 그래프트 방법은 불량한 발현자로부터의 가변 경쇄 프레임워크 영역의 일부를 더 높은 발현 DMAb의 것에 의해 대체하는 것으로 이루어진다. 새로운 부분 그래프트 작제물은 결합을 유지시키면서 원래의 DMAb보다 대략 더 높은 로그 증가를 나타냈다.
BDBV223의 부분 그래프팅은 증대된 발현을 갖는 최적화된 항체를 생성시키고 결합을 유지시켰다(도 2). 반대로, V2L2로의 BDBV223의 풀 그래프트는 발현을 증대시키지만, 항원 결합을 소실시켰다(도 2). 유사한 결과가 Z5D2 항체에 의해 나타났다. Z5D2의 부분 그래프팅은 증대된 발현을 갖는 최적화된 항체를 생성시키고 결합을 유지시키는 한편, Z5D2의 풀 그래프팅은 항원 결합을 소실시켰다(도 3). 도 4는 3개의 상이한 모 DMAb 서열로부터 변형된 구조적으로 변형된 DMAb의 발현 및 항원 결합에 대한 풀 그래프팅, 부분 그래프팅 및 스캐폴드 변형의 효과의 요약을 제공한다.
실시예 2: 부분 그래프트 설계
2개의 고발현 DMAB(pGX9232 및 pGX9214)는 pGX9256(1A2) 및 pGX9290(EBV114)의 DMAB 경쇄로 정렬되었다(도 4).
CDR을 갖고 갖지 않는 동일성 매트릭스를 계산하였다. 결과는 도 5에 제공된다. 정렬 매트릭스는 또한 오직 FR1(처음의 Cys 잔기까지) 및 FR4를 사용하여 생성되었다. FR1 매트릭스 패턴으로부터의 패턴은 VL 및 무 CDR 매트릭스와 동일하다. 오직 10개의 잔기(말단 R 배제)에 기초한 FR4 매트릭스는 상이한 패턴을 생성하지만, 전체적으로 고도로 유사하다. 어떤 특정한 이론에 구속되도록 원하지 않지만, 더 높은 유사한 점수가 더 양호하다고 가정된다. 조작된 부분 그래프트에 대한 서열은 하기와 같다:
>pGX9256_(232)_L(서열 번호 58)
>pGX9290_(232)_L(서열 번호 59)
>pGX9256_(214)_L(서열 번호 60)
>pGX9290_(214)_L(서열 번호 61)
실시예 3: scFv-Fc 전환
단쇄 Fv-Fc(scFv-Fc) 전환은 CH1 및 CL 영역의 제거 및 VH와 VL 사이의 링커의 부가이다. 전환은 중쇄-경쇄 짝짓기 및 조직 침투를 촉진한다. DMAb는 (도 6 및 도 7에 도시된 바대로) 링커의 부가를 통해 scFv-Fc의 전장 항체로부터 전환된다.
방법이 이제 기재된다.
BALB/c 마우스(n=5)는 근육내 전달을 통해 하나의 치료 부위에서 100㎍의 scFv-Fc DMAb를 코딩하는 DNA-플라스미드가 투여된 후, 전기천공(IM-EP)이 되었다. 투여 후 35일의 과정에 걸쳐 혈청을 수집하였다.
293T 세포를 scFv-Fc DMAb를 코딩하는 DNA-플라스미드에 의해 형질주입하였다. 단백질 A를 사용하여 세포 상청액으로부터 scFv-Fc DMAb를 정제하고, 1976 마인가(Mayinga) 균주 또는 2014 기니(Guinea) 균주로부터의 자이르 에볼라바이러스 당단백질(GP)인 2개의 상이한 에볼라 바이러스 발생 균주로부터의 동일한 항원을 사용하여 ELISA에 의해 이의 정규화된 결합 친화도를 분석하였다.
Figure pat00002
결과가 이제 기재되어 있다.
BDBV223의 scFv-Fc 전환은 증가된 항원 결합을 발생시켰다(도 8). Z5D2의 scFv-Fc 전환은 증가된 발현 및 증가된 항원 결합을 발생시켰다(도 9). Z1H3의 scFv-Fc 전환은 증가된 발현을 발생시키지만, 항원 결합에 대한 효과를 갖지 않았다(도 10).
실시예 4: scFv-Fc 설계
몇몇 가능한 조작 접근법이 존재하지만, 지역에서 많은 발표는 달리 클레임에도 불구하고 매우 시스템 특이적인 경향이 있다. 설계에 사용되고 dMAb 공간에서 현재 시험되는 몇몇 새로운 접근법은 scFv-Fc 공간에 대한 아이디어에 잠재적으로 기여할 수 있다.
모델링 및 분석은 증가된 결합 및/또는 발현과 연관된 scFv DMAb의 구조 특징을 확인하도록 수행되었다. 모델링은 (G4S)3 링커를 사용하여 형태 둘 다(VH-VL 및 VL-VH)에서 Fv 및 scFv에서 수행되었다. 모델의 15개의 세트가, 각각의 세트에서 다수의 모델로, 생성되었다. 스코어링 방법, 및 구조 검사는 각각의 단계에서 모델 빌딩을 평가하도록 이용된다. 도 11은 프레임워크 모델링 및 CDR 루프 개선을 포함하는 모델링 과정에서 상이한 단계로부터의 예시적인 아웃풋을 도시한다. 상위 20개의 링커 구성은 평가되었다. 평균 제곱근 편차(RMSD)는 링커 근처의 영역에 주의하여 골격으로부터 생성되었다.
링커
GGGGSGGGGSGGGGS의 서열(서열 번호 53)을 갖는 (G4S)3 링커는 연구에서 포함을 위해 선택되었다.
결과가 이제 기재된다.
예측적인 ScFv-Fc 모델링은 5개의 상이한 모 DMAb에서 수행되었다. 각각의 DMAb는 2개의 배열에서 모델링되었다: VH-링커-VL 및 VL-링커-VH. 도 12 및 도 13은 링커가 CDR을 모호하게 하거나 이것을 방해할 것인지를 예측하기 위해 사용되는 ScFv-Fc DMAb의 공간 충전된 모델을 나타낸다.
표 3은 추가의 개발을 위한 후보 DMAb를 확인하기 위한 결정 트리(decision tree)의 요약을 제공한다.
Figure pat00003
이 결과에 기초한 추천은 표 3에 있다. 몇몇 경우에, RMSD는 독립적으로 최소화된 모델에 대한 일반 오류 내에 있다. 몇몇 경우에, 특히 구성 사이에 강한 신호가 존재하지 않는 경우, 또 다른 구성(VH-VL 및 VL-VH)에 비해 하나의 구성을 선택하는 데 있어서의 이익이 있을 수 없다. 다른 경우에, 모델링은 하나의 구성이 또 다른 구성보다 더 양호한 후보가 있을 수 있다는 것을 나타낸다. RMSD는 추천을 형성하기 위한 단순한 일관된 측정이지만, RMSD 이외의 다른 기준은 또한 정보적일 수 있다.
여기서 사용되는 것과 같은 링커 평가는 왜곡 쟁점을 검출할 수 있지만, 이것은 연관의 중간체 또는 유연성에 따라 달라지는 V 도메인 연관과 관련된 쟁점을 쉽게 검출할 수 없고, 연관하는 더 큰 이동성을 요한다(예를 들어, '엔트로피 고려사항').
실시예 5: 에볼라 바이러스 질환(EVD)에 대해 항체를 코딩하는 합성 DNA-플라스미드의 치료학적 유전자 전달을 위한 구조 리포맷팅 및 단백질 조작 전략의 기능적 평가
에볼라 바이러스 질환(EVD)은 인간에서 심각한 출혈 열을 야기하고, 높은 사망률과 연관된다. 서아프리카에서의 2013년 내지 2015년의 에볼라 유행병은 훨씬 가장 치명적이고 출현 질환의 최근의 역사에서 가장 오래 지속되었다. 이러한 큰 발병의 도전은 효과적인 EVD 항바이러스 치료 및 백신에 대한 수요를 하위평가하였다. EVD에 대한 백신이 인간에서 최근에 효과적인 것으로 발견되었지만, 백신 보호는 EVD의 급성 사례에 대해 치료학적 환경에서 대개 즉각적이지 않고 유리하지 않다. 즉각적인 보호성 면역력을 부여하도록 단일클론 항체(mAb)의 전달을 요하는 수동 면역화 전략은 EVD를 포함하는 감염성 질환 환경에서 성공적으로 사용되었다. 그러나, 항체 투여와 연관된 개념적 및 방법론적 장애가 있다. 이것은 시험관내 이의 제조 및 최적화, 생체내 이의 투약 및 마지막으로 제조 공정 동안 초래되는 비용을 포함한다. 이 견지로부터, 항체를 코딩하는 DNA-플라스미드의 생체내 전달은 단일클론 항체(mAb) 투여에 대한 혁신적이고 안전하고 비용 효과적인 접근법을 제공한다.
다양한 병원균에 대해 지향된 단일클론 항체(DMAb)를 코딩하는 DNA의 마우스에서의 생체내 전기천공(EP) 매개된 유전자 전달은 이전에 입증되었다. 현재의 연구는 EBOMAb-10 및 EBOMAb-14인 에볼라 바이러스 당단백질(EBOV-GP)을 표적화하는 2개의 DMAb를 기재하고; 이것은 또한 단쇄 항체(scFv-Fc)에 대한 면역글로불린(Ig)의 리포맷팅 및 상기 언급된 DMAb 구조 프레임 내의 스캐폴드 그래프팅으로 이루어진 조작된 변형의 기능적 영향을 기재한다. 이의 비변형된 및 변형된 포맷에서의 EBOMAb-10 및 EBOMAb-14의 EP 매개된 유전자 전달은 ELISA에 의한 EBOV-GP 항원 결합에 의해 평가된 바와 같은 마우스 혈청에서의 기능적 항체의 분비 및 EBOV-GP 위형화 바이러스 검정에서의 바이러스 중화를 발생시킨다. 이 구조 변화는 표면 당단백질을 발현하는 살아 있는 세포에서 및 시험관내 EBOV-GP 결합 및 바이러스 중화에 대한 이질적인 효과를 갖는다. 종합하면, 여기에 기재된 데이터는 EVD와 같은 출현하는 질환에 대한 증대된 치료학적 효력을 갖는 단일클론 항체(DMAb)를 코딩하는 합성-DNA 플라스미드의 개발에 대한 개념적 프레임워크를 제공한다. 연구는 또한 DMAb의 구조 조작을 평가하기 위한 기능적 패러다임을 제공하고, 대체로 안전하고 비용 효율적인 방식으로 클리닉으로 DNA 기반 수동 면역화 접근법을 번역하기 위한 생체내 추가의 동물 시험을 지지한다.
방법이 이제 기재된다.
도 14는 이 연구에서 이용되는 방법의 흐름 다이어그램을 제공한다. ScFv-Fc DMAb의 생성에 이용되는 DMAb 설계 전략은 1) 링커 설계; 2) VH-VL 배향; 및 3) 힌지-CH2-CH3 선택을 포함한다. 모 DMAb는 부분 그래프팅, ScFv-Fc 전환, 또는 부분 그래프팅 및 ScFv-Fc 전환의 조합을 겪는다.
이 연구에서 DMAb의 2개의 군을 분석하였다. 1군은 EBOMAb-10 DMAb: EBOMAb-10-IgG(대조군), EBOMAb-10-2(ScFv-Fc 변형된 DMAb), EBOMAb-10-3-IgG 부분 그래프트 및 EBOMAb-10-4 ScFv-Fc 부분 그래프트로 이루어진다. 2군은 EBOMAb-14 DMAb: EBOMAb-14-IgG(대조군), EBOMAb-14-2(ScFv-Fc 변형된 DMAb), EBOMAb-14-3-IgG 부분 그래프트 및 EBOMAb-14-4 ScFv-Fc 부분 그래프트로 이루어진다. 이 연구에 사용된 서열은 표 4에 표시된다.
Figure pat00004
결과가 이제 기재된다.
구조적으로 변형된 DMAb의 중화 활성을 평가하였다. 모든 구조적으로 리포맷팅된 DMAb는 이의 모 대조군 DMAb와 필적하였다(도 15). IC50 및 IC90의 평가는 ScFv-Fc DMAb가 대조군 DMAb의 것보다 높은 IC90을 갖는 한편, 부분 그래프팅 변형된 DMAb가 대조군의 것보다 낮은 IC90을 갖는다는 것을 나타냈다(도 16). 2군 DMAb는 대조군 DMAb와 비교하여 증가된 발현을 나타내고, 항원 결합은 약간 증가하거나 대조군과 동등하였다(도 17).
구조적으로 변형된 DMAb는 보통 실질적인 기능 소실(즉, 항원 결합 및 저해 효력) 없이 마우스에서 높은 수준으로 발현될 수 있다. EBOMAb10-3 및 EBOMAb-14-3에 대해 구조 변형은 IC50 및 IC90을 통해 계산된 바대로 마우스에서 증가 발현 및 증가 저해 효력을 발생시킨다.
데이터는 DMAb가 가능하게는 더 높은 발현 및 더 높은 치료학적 효율에 대해 조작될 수 있는 잘 변하는 도구라는 개념 증명을 제공한다.
표 5는 프레임워크 돌연변이, 풀 그래프트, 부분 그래프트 및 scFv-Fc 전환을 이용하는 예시적인 에볼라 DMAb 플라스미드 작제물의 목록을 제공한다.
Figure pat00005
Figure pat00006
실시예 6: 지카 바이러스에 대한 DNA 코딩된 단일클론 항체(DMAb)의 생체내 발현 수준을 증가시키기 위한 전략으로서 유전자 최적화 및 scFv-Fc 리포맷팅의 탐색
지카 바이러스를 표적화하는 변형된 DMAb를 생성하기 위해 2개의 항체 변형 전략을 이용하였다: 유전자 최적화 및 scFv-Fc 리포맷팅(도 1).
유전자 최적화 방법은 2개의 전장 지카 DMAb 서열의 선택 및 6개의 상이한 알고리즘을 통한 최적화로 이루어졌다. 전사 및 번역에 영향을 미치는 다수의 매개변수, 예컨대, 코돈 용법, GC 함량, 은성 스플라이스 부위 및 mRNA 2차 구조는 독점적 다변량 회귀 알고리즘에서 편중된다. 그러나, 언급된 많은 데이터는 시험관내 발현 시스템을 이용하여 생성되었다. 지카 DMAb의 생체내 발현에 가장 맞는 알고리즘을 발견하기 위해, BALB/c 마우스(n=5)는 근육내 전달을 통해 하나의 치료 부위에서 100㎍의 플라스미드 DNA가 투여된 후, 전기천공이 되었다. DMAb의 혈청 수준 및 정규화된 결합은 7일에 ELISA에 의해 정량화되었다. ZKDMAB-1에 대해, 알고리즘 1은 18㎍/㎖에서 가장 높은 발현을 생성하였다(도 19 및 도 20). ZKDMAB-2에 대해, 알고리즘 2는 3.5㎍/㎖의 가장 높은 발현을 생성하였다(도 21). 일관하게, 알고리즘 6에 의해 최적화된 DMAb 둘 다는 생체내 가장 낮은 발현을 나타내거나 나타내지 않았다. 대부분의 경우, ELISA에 의한 결합이 보유되지만, 몇몇 알고리즘은 ZKDMAB-1에 대한 감소를 나타내서, 발현된 DMAb의 단백질 폴딩 또는 구성이 뉴클레오타이드 서열에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 제안한다(도 19, 도 20 및 도 22).
추가적으로, 단쇄 Fv-Fc(scFv-Fc) 전환을 시험하였다. ScFv-Fc 전환은 CH1 및 CL 영역의 제거 및 VH와 VL 사이의 링커의 부가이다. 전환은 중쇄-경쇄 짝짓기 및 조직 침투를 촉진한다. DMAb는 (도 1에 도시된 바대로) 링커의 부가를 통해 scFv-Fc의 전장 항체로부터 전환된다.
2개의 지카 DMAb가 선택되고, 이들로부터 다수의 작제물이 생성되었다. 이들은 링커 분자 및 VH-VL의 배향의 이의 선택에서 달랐다. 전장 항체로부터의 scFv-Fc로의 DMAb의 전환은 원래의 DMAb와 비교하여 6배 이하의 쥣과 발현의 증가를 발생시켰다. ZKDMAB-1에 대해, 시험된 4개의 포맷의 발현은 16㎍/㎖ 내지 8㎍/㎖의 범위이고, VH-VL 배향에서 (G4S)3 링커를 지지하였다. ZKDMAB-2는 VL-VH 배향에서 (G4S)3 링커를 사용하여 12㎍/㎖에 도달하는 가장 높은 발현을 보았다. 중요하게는, 대부분의 DMAb에 이루어진 변형은 항원 결합을 보유하였다. 이 변화를 통해 생체내 발현 수준은 원래의 mAb 클론의 생물학을 희생시키지 않으면서 증가되었다(도 23 및 도 24). 이 데이터는 유전자 치료 분야에 대해 DMAb를 설계할 때 유전자 및 단백질 조절의 분명한 이익을 나타낸다.
Figure pat00007
Figure pat00008
실시예 7: 지카 바이러스(ZIKV) 및 뎅기 바이러스(DENV) 감염에 대한 다가 scFv-Fc DNA 코딩된 단일클론 항체(DMAb) 플랫폼의 평가
이 연구는 각각 ZIKV 및 DENV를 표적화하는 Z-DMAb1-sc 및 D-DMAb1-sc인 2개의 단쇄 단편 가변-Fc(scFv-Fc) DMAb의 조작을 기재한다. 이것은 또한 다가 이방향성 촉진자 포맷(Z/D-DMAb1-sc)에서 Z-DMAb1-sc 및 D-DMAb1-sc 둘 다를 코딩하는 추가적인 DMAb의 조작을 기재한다. 쥣과 모델을 이용하여, CELLECTRA(등록상표)-EP 기술은 다양한 칵테일 조합 Z-DMAb1-sc 및 D-DMAb1-sc, 및 개별적으로 제형화된 다가 Z/D-DMAb1-sc에서 근육내로 전달하도록 이용되었다. 이들 scFv-Fc DMAb의 각각의 EP 매개된 유전자 전달은 ELISA 및 바이러스 항원 결합 검정에 의해 평가된 바대로 마우스 혈청에서 기능적 scFv-Fc의 분비를 발생시켰다. 이 관찰로부터, Z-DMAb1-sc 및 D-DMAb1-sc에 대한 더 높은 scFv-Fc 발현은, 2개의 DNA 플라스미드 작제물이 단일 제제로 동시제형화되거나 2개의 개별 근육 부위에서 별개로 전달될 때보다, 단일 다가 이방향성 촉진자 작제물(Z/D-DMAb1-sc)에서 발현될 때 관찰되었다. 게다가, 중화 표현형의 이 다양한 동시제형화 및 다가 조합의 효과는 분석되었다. 종합하면, 이들 데이터는 겹치는 풍토성 구역에서 유행하는 ZIKV 및 DENV와 같은 다수의 병원균에 의한 감염과 싸우도록 더 다목적인 것으로 증명될 수 있는 다가 scFv-Fc DMAb 플랫폼을 채택하기 위한 증거를 제공한다.
Figure pat00009
실시예 8: 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 생체내 발현된 DNA 기반 단일클론 항체(dMAb)의 기능적 규명
mAb가 많은 감염성 질환에 대해 보호를 제공하는 데 효과적인 것으로 나타났지만, 이의 넓은 사용은 제한된다. 제한된 생체내 반감기는 다수의 용량이 면역력을 유지시키는 데 필요하고, 개발에 관여된 높은 비용 및 복잡함, 제조 및 콜드 체인 분포, 및 분야에서 이용될 수 있는 적합한 투약 방법의 부족이 또한 이의 전반적인 이용을 저해한다는 것을 의미한다. 대응하여, 항체 유전자의 생체내 전달에 기초한 새로운 전략이 개발되었다. 하나의 이러한 플랫폼은 합성 플라스미드 DNA 코딩된 mAb인 dMAb이다. 인간 mAb를 코딩하는 DNA 서열은 플라스미드로 삽입된다. 도 1b에 도시된 바대로, dMAb 플라스미드는 근육 조직으로 직접 전달되고, 생체내 전기천공은 근세포에 의해 세포 흡수를 증대시킨다. 형질주입된 근세포는 mAb를 생성하고 분비한다. mAb는 혈액 순환에 들어가고, 전신으로 작용할 수 있다. 개념 증명 연구에서 dMAb는 전임상 동물 모델에서 인플루엔자, 슈도모나스, 지카 및 에볼라를 포함하는 다양한 감염성 질환에 대한 보호를 제공하였다. 여기서 dMAb 표적화 RSV의 전임상 개발을 기술할 것이다. RSV-dMAb는 계절에 걸쳐 RSV-감염으로부터의 심각한 합병증에 대해 예방학적 보호를 제공하도록 고위험 집단에 전달될 수 있다. 유지된 발현으로 인해 하나의 초기 dMAb 전달은 전체 RSV-계절을 다루고, 재전달은 필요하지 않을 것이다.
항-RSV sc-Fv 코딩 DNA 플라스미드는 전장 인간 IgG와 비교하여 개선된 생체내 발현 프로필로 조작되었다(도 25A). 전신 발현을 추가로 증대시키기 위해, 최적화된 전달 프로토콜을 이용하였다. 최적화된 제형은 표적 조직의 세포외 매트릭스의 변형을 통해 플라스미드 DNA의 분산을 증대시킨다. 전기천공은 표적 세포에 의한 DNA 분자의 세포 흡수를 증가시킨다. 생체내 발현된 인간 sc-Fv의 작용성은 RSV-융합 단백질(RSV-F) 항원에 대한 결합 및 시험관내 살아 있는 RSV-A 바이러스의 중화에 대해 치료된 마우스의 혈청으로부터 확인되었다. 혈청-수준 발현 이외에, 생체내 발현된 인간 sc-Fv는 또한 천연 RSV-감염의 위치인 폐에서 검출되었다. 투약 및 전달 방법은 이후 RSV-예방책 개발에 대한 표준 전임상 모델인 목화나무 래트에 적용되었다.
이 dMAb의 생체내 전달은 마우스의 혈청에서의 항체의 튼튼한 전신 수준을 발생시켰다(도 26 및 도 29A). 재조합 파빌리주맙의 일치된 수준은 RSV 감염 후에 하부 호흡기 질환으로부터 보호를 제공한다. RSV 감염 이후에 인간 질환을 모델링하기 위한 최적 표준인 목화나무 래트에서, dMAb의 지속적인 혈청 발현은 전달 후 60일까지 관찰되었다(도 30). 항체는 또한 폐 세척 샘플에서 검출되어서, 효과적인 생체분포를 나타낸다(도 26C 및 도 29D). 게다가, RSV-F dMAb를 보유하는 동물로부터의 혈청은 항원 결합 및 살아 있는 바이러스의 중화의 면에서 기능적으로 활성이었다(도 27, 도 29B, 도 29C 및 도 31B). 실험은 목화나무 래트의 생체내 살아 있는 바이러스 시험감염을 수행하도록 설계되었다. 목화나무 래트는 비채택된 인간 RSV에 대한 이의 높은 감수성 및 인간에서의 감염의 병리학의 많은 특징의 디스플레이 때문에 RSV 백신의 전임상 개발에 대한 선택의 모델로 생각된다.
이 결과는 항-RSV 인간 sc-Fv dMAb가 RSV-계절 동안에 단백질-mAb의 반복 주사에 대한 효과적인 대안이라는 것을 제안한다. RSV-dMAb는 수동 면역화와 연관된 몇몇 장애를 극복하기 위한 가능성을 갖는다.
Figure pat00010
Figure pat00011
실시예 9: 지카 바이러스(ZIKV) 및 뎅기 바이러스(DENV) 감염에 대한 다가 scFv-Fc DNA 코딩된 단일클론 항체(dMAb(상표명)) 플랫폼
지카(ZIKV) 및 뎅기(DENV) 바이러스는 약간의 발진으로부터 사망을 야기할 수 있는 중증 장기 부전으로 변하는 경증 내지 중증 병리학을 야기하는 모기 매개 플라비바이러스이고, 게다가, 임신 동안 특이적으로 ZIKV에 의한 감염은 자연 유산 또는 개별적으로 및 사회적으로 부담스러운 소두증 및 인지 손상을 포함하는 신생아에서의 중증 발육 결함과 연관된다. 이전에 공개된 전임상 모델은 ZIKV 및 DENV 감염에 대한 치료학적 중재에 대한 기초로서 중화 단일클론 항체(mAb)를 이용하는 것에 대한 이유를 준비한다. mAb 투여가 감염성 질환에 대한 예방학적 및 치유적 접근법 둘 다로서 큰 가능성을 보유하지만, 잠재적으로 ZIKV 및/또는 DENV 감염에 걸릴 위험에 있는 수백만 명의 사람에 대해 특이적으로 단백질 mAb의 대규모 투여와 연관된 개념적 및 방법론적 장애가 있다. 이들 질환의 치료를 위한 대안적인 접근법은 혈청에서 mAb의 생체내 생성 및 분비를 발생시키는 골격근에서의 단일클론 항체(dMAb)를 코딩하는 플라스미드의 발현에 기초한다. 증가된 병원균성 보급률로, 더 다목적인 dMAb 플랫폼을 설계하려는 시도에서, 각각 ZIKV 및 DENV를 표적화하는 Z-DMAb1-sc 및 D-DMAb1-sc인 2개의 단쇄 단편 가변-Fc(scFv-Fc) dMAb를 조작하였다(도 32). 다가 이방향성 촉진자 포맷(Z/D-DMAb1-sc)에서 Z-DMAb1-sc 및 D-DMAb1-sc 둘 다를 코딩하는 추가적인 DMAb를 또한 조작하였다(도 32 및 표 10). CELLECTRA(등록상표)-EP 기술은 Z-DMAb1-sc 및 D-DMAb1-sc를 코딩하는 플라스미드 DNA의 다양한 칵테일 조합, 및 개별적으로 제형화된 Z/D-dMAb1-sc dMAb를 코딩하는 다가 플라스미드 DNA에서 쥣과 모델에서 근육내로 전달하도록 이용되었다. 이들 scFv-Fc DMAb의 각각의 EP 매개된 유전자 전달은 ELISA 및 바이러스 항원 결합 검정에 의해 평가된 바대로 마우스 혈청에서 기능적 scFv-Fc의 분비를 발생시켰다(도 33). 이 관찰로부터, 2개의 DNA 플라스미드 작제물이 단일 제제로 동시제형화되거나 2개의 개별 근육 부위에서 별개로 전달될 때와 비교하여 단일 다가 이방향성 촉진자 작제물(Z/D-DMAb1-sc)에서 발현될 때 Z-DMAb1-sc 및 D-DMAb1-sc에 대해 이질적인 scFv-Fc 발현이 나타났다(도 34). 게다가, 이 다양한 동시제형화 및 다가 조합이 어떻게 중화 표현형에 영향을 미치는지가 분석되었다(도 35). 다가 scFv-Fc dMAb 플랫폼은 2개의 기능적 scFv-Fc dMAb(Z-dMAb1-sc 및 D-dMAb1-sc)의 제조를 허용한다. scFv-Fc 지카/뎅기 dMAb의 칵테일/혼합은 뎅기 dMAb1-sc 발현에 이익인 것으로 보인다. 추가로, 이방향성 촉진자 플랫폼에서의 지카/뎅기 dMAb의 분자 조작은 지카 발현에서 유의미한 차이 없이 뎅기 dMAb의 발현에 유의미하게 이익인 것으로 보인다.
종합하면, 이들 데이터는 겹치는 풍토성 구역에서 유행하는 ZIKV 및 DENV와 같은 다수의 병원균에 의한 감염과 싸우도록 더 적응 가능한 것으로 증명될 수 있는 다가 scFv-Fc dMAb 플랫폼에 대한 지지를 제공한다.
Figure pat00012
상기 상세한 설명 및 수반하는 실시예가 단지 예시적이고, 본 발명의 범위에 대한 한계로서 취해지지 않아야 한다고 이해되고, 이 범위는 오로지 첨부된 청구항 및 이의 균등물에 의해 한정된다.
개시된 실시형태에 대한 다양한 변화 및 변형은 당업자에게 명확할 것이다. 본 발명의 화학 구조, 치환기, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 제형 또는 사용 방법에 관한 것을 제한 없이 포함하는 이러한 변화 및 변형은 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.
<110> THE WISTAR INSTITUTE OF ANATOMY AND BIOLOGY INOVIO PHARMACEUTICALS, INC. <120> OPTIMIZED NUCLEIC ACID ANTIBODY CONSTRUCTS <130> MPI19-032-D1 <150> US 62/504,448 <151> 2017-05-10 <150> US 62/504,460 <151> 2017-05-10 <150> US 62/624,320 <151> 2018-01-31 <150> US 62/624,367 <151> 2018-01-31 <150> PCT/US 2018/032023 <151> 2018-05-10 <160> 128 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized, pGX9291, Ebola Z5D2 modified <400> 1 atggactgga cctggagaat cctgttcctg gtggcagcag caaccggaac acacgcagag 60 gtgcagctgc aggagagcgg accaggcctg gtgcggccca gccagtccct gtctctgacc 120 tgcacagtga ccggctacag catcacatcc gattatgcct ggaactggat caggcagttc 180 cctggctaca agatcgagtg gctgggctat atcacaaaca ccggcagcac cggctttaat 240 ccatctctga agagccggat ctccatcaca agagacacct ccaagaatca gttctttctg 300 cagctgatct ctgtgaccac agaggataca gcaacctacc actgcgccag aggcctggca 360 tattggggac agggcacact ggtgaccgtg agctccgcct ctaccaaggg accaagcgtg 420 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tacaactcca catatagagt ggtgtctgtg 960 ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt ataagtgcaa ggtgtccaat 1020 aaggccctgc cagcccccat cgagaagaca atctctaagg caaagggaca gccacgggag 1080 ccacaggtgt acaccctgcc tccatccaga gacgagctga caaagaacca ggtgtctctg 1140 acctgtctgg tgaagggctt ctatccttct gatatcgccg tggagtggga gagcaatggc 1200 cagccagaga acaattacaa gaccacaccc cctgtgctgg actccgatgg ctctttcttt 1260 ctgtattcca agctgaccgt ggataagtct aggtggcagc agggcaacgt gttttcctgc 1320 tctgtgatgc acgaggccct gcacaatcac tacacccaga agagcctgtc cctgtctcct 1380 ggcaagaggg gaaggaagcg gagaagcggc tccggagcca caaacttcag cctgctgaag 1440 caggcaggcg acgtggagga gaatcctgga ccaatggtgc tgcagaccca ggtgtttatc 1500 agcctgctgc tgtggatctc cggagcatac ggagccatcc agatgacaca gagcccttct 1560 agcctgtctg ccagcgtggg cgatagggtg accatcacat gtcgcgcctc ccagtctctg 1620 ctggactccg atggcaagac ctacctgggc tggtatcagc agaagcctgg caaggcccca 1680 aagctgctga tctacctggt gagcacactg cagtccggag tgccatctcg cttcagcggc 1740 tccggctctg gaaccgactt taccctgaca atctcctctc tgcagccaga ggatttcgcc 1800 acatactatt gctggcaggg cacccactcc cccttcacat ttggccaggg caccaaggtg 1860 gagatcaaga ggaccgtggc agcaccaagc gtgttcatct ttccaccctc cgacgagcag 1920 ctgaagagcg gcacagcctc cgtggtgtgc ctgctgaaca acttctaccc cagagaggcc 1980 aaggtgcagt ggaaggtgga taacgccctg cagagcggca attcccagga gtctgtgaca 2040 gagcaggaca gcaaggattc cacctatagc ctgtccaaca ccctgacact gagcaaggcc 2100 gactacgaga agcacaaggt gtatgcctgc gaggtgacac accagggcct gagctccccc 2160 gtgaccaagt ccttcaatag aggcgagtgt tgataa 2196 <210> 10 <211> 730 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized, pGX9295, Ebola Z5D2 graft on V2L2 <400> 10 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile 35 40 45 Thr Ser Asp Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Asn Thr Gly Ser Thr Gly Tyr Thr 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accgtgccct ctagctccct gggcacacag 660 acctatatct gcaatgtgaa ccacaagccc tctaacacaa aggtggacaa gaaggtggag 720 cctaagagct gtgataagac acacacctgc ccaccctgtc cagcaccaga gctgctgggc 780 ggccctagcg tgttcctgtt tcctccaaag ccaaaggata ccctgatgat ctcccgcacc 840 cctgaggtga catgcgtggt ggtggacgtg tctcacgagg accccgaggt gaagttcaat 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcctaggga ggagcagtac 960 aatagcacct atcgcgtggt gtccgtgctg acagtgctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtata agtgcaaggt gagcaacaag gccctgcctg ccccaatcga gaagaccatc 1080 tccaaggcaa agggacagcc tcgggagcca caggtgtaca cactgccccc tagcagagac 1140 gagctgacca agaatcaggt gtccctgaca tgtctggtga agggcttcta tccatccgat 1200 atcgccgtgg agtgggagtc taacggccag cccgagaaca attacaagac aaccccaccc 1260 gtgctggact ctgatggcag cttctttctg tattccaagc tgaccgtgga taagtctcgg 1320 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1380 acccagaagt ccctgtctct gagcccaggc aagcggggca gaaagcggag atccggctct 1440 ggcgccacaa atttcagcct gctgaagcag gcaggcgacg 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agaatcaggt gtccctgaca tgtctggtga agggcttcta tccatccgat 1200 atcgccgtgg agtgggagtc taacggccag cccgagaaca attacaagac aaccccaccc 1260 gtgctggact ctgatggcag cttctttctg tattccaagc tgaccgtgga caagtctaga 1320 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1380 acccagaagt ccctgtctct gagcccaggc aagcggggca gaaagcggag atccggctct 1440 ggcgccacaa atttcagcct gctgaagcag gcaggcgatg tggaggagaa cccaggacct 1500 atggtgctgc agacccaggt gtttatctct ctgctgctgt ggatcagcgg agcatacgga 1560 gagacaaccc tgacccagag cccaggcaca ctgagcctgt ccccaggaga gagggccacc 1620 ctgtcctgta gggcatctca gagcgtgcca cggaactaca tcggatggtt ccagcagaag 1680 ccaggacagg cccctagact gctgatctat ggagcctcta gccgggccgc aggattccct 1740 gacagatttt ccggctctgg cagcggcacc gatttcacac tgaccatcac aaggctggag 1800 cccgaggact ttgccatgta ctattgccac cagtacgata ggctgcctta taccttcggc 1860 cagggcacaa agctggagat caagaggacc gtggcagcac ctagcgtgtt catctttcct 1920 ccatccgacg agcagctgaa gagcggcaca gcctccgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 1980 tacccacgcg 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tacaagacca caccccctgt gctggactct 1380 gatggcagct tctttctgta ttccaagctg accgtggaca agtctaggtg gcagcagggc 1440 aacgtgtttt cctgctctgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagagc 1500 ctgtccctgt ctcctggcaa gtgataa 1527 <210> 94 <211> 507 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized, pGX93102, 190.scFv_Fc VH.Whitlow.VL <400> 94 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Ser Gly Thr Gln Tyr Tyr Asp Thr Thr Gly Tyr 115 120 125 Glu Tyr Arg Gly Leu Glu Tyr Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 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acactgatga tctctagaac ccccgaggtg 960 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg 1020 gacggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagcccaggg aggagcagta caacagcacc 1080 tatagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtat 1140 aagtgcaagg tgtccaataa ggccctgcca gcccccatcg agaagaccat ctctaaggca 1200 aagggacagc cacgggagcc acaggtgtac acactgcctc catcccgcga ggagatgacc 1260 aagaaccagg tgtctctgac atgtctggtg aagggcttct atccttctga tatcgccgtg 1320 gagtgggaga gcaatggcca gccagagaac aattacaaga ccacaccccc tgtgctggac 1380 tctgatggca gcttctttct gtattccaag ctgaccgtgg acaagtctag gtggcagcag 1440 ggcaacgtgt tttcctgctc tgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cacccagaag 1500 agcctgtccc tgtctcctgg caagtgataa 1530 <210> 96 <211> 508 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized, pGX93103, 190.scFv_Fc.VL.Whitlow.VH <400> 96 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu 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atagcaagct gaccgtggat aagtctagat ggcagcaggg caacgtgttc 2160 tcctgttccg tgatgcacga agcactgcac aaccactaca ctcagaagag cctgtccctg 2220 tcccctggaa aatgataact cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg 2280 actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 2340 ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 2400 ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 2460 tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tactgggcgg 2520 ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga 2580 agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat 2640 caagctctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc 2700 acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga 2760 caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt 2820 ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat 2880 cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg 2940 gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg 3000 ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc 3060 cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga 3120 tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag 3180 ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc 3240 atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg 3300 actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata 3360 ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg 3420 ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgaattatta 3480 acgcttacaa tttcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 3540 gcatcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 3600 atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatag 3660 cacgtgctaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 3720 ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 3780 aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 3840 aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 3900 ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 3960 tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 4020 ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 4080 cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 4140 agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 4200 gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 4260 ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 4320 tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 4380 tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 4440 cacatgttct t 4451

Claims (21)

  1. 구조적으로 변형된 DNA 코딩된 항체(DNA encoded antibody: DMAb)를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법으로서,
    a) 제1 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역을 확인하는(identifying) 단계,
    b) 제2 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역을 확인하는 단계,
    c) 제2 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역의 아미노산 서열을 제1 DMAb의 하나 이상의 CDR 영역의 아미노산 서열로 치환하여서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계, 및
    d) 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 단계를 포함하는, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함하는, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  3. 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법으로서,
    a) 제1 DMAb의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열의 단편;과 하나 이상의 추가적인 DMAb 서열의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열의 단편의 서열 정렬을 수행하는 단계,
    b) 상기 제1 DMAb의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 하나 이상의 추가적인 DMAb 서열의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환하여서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계로서, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기는 CDR 영역에서의 잔기가 아닌, 상기 생성하는 단계, 및
    d) 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 단계를 포함하는, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함하는, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  5. 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법으로서,
    a) 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인의 접점(interface)에서 상호작용에 참여하는 것으로 예측된 DMAb의 아미노산 잔기를 확인하는 단계,
    b) 상기 확인된 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 치환을 만들어서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계로서, 상기 하나 이상의 치환은 상기 접점에서 등전점 및 표면 전하 중 적어도 하나를 변경하는 것으로 예측된, 상기 생성하는 단계, 및
    d) 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 단계를 포함하는, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함하는, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  7. 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법으로서,
    a) DMAb의 아미노산 서열로부터 CH 및 CL 도메인에 대한 아미노산 서열을 제거하는 단계,
    b) VH 및 VL 도메인에 대한 아미노산 서열 사이의 링커의 아미노산 서열을 DMAb의 아미노산 서열에 첨가하여서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계,
    c) 생성된 상기 아미노산 서열에서 적어도 1회차의 모델링을 수행하는 단계, 및
    d) 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계를 포함하는, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 핵산 서열을 최적화하는 단계를 더 포함하는, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 모델링의 방법은 링커 모델링, 힌지 변형 모델링, 프레임워크 모델링 및 CDR 루프 개선 중 적어도 하나를 포함하는, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 링커는 상기 VH 도메인에 C 말단으로 연결되고 상기 VL 도메인에 N 말단으로 연결된, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 링커는 상기 VH 도메인에 N 말단으로 연결되고 상기 VL 도메인에 C 말단으로 연결된, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) DMAb의 아미노산 서열로부터 CH 및 CL 도메인에 대한 아미노산 서열을 제거하는 단계,
    b) VH 및 VL 도메인에 대한 아미노산 서열 사이의 링커의 아미노산 서열을 DMAb의 아미노산 서열에 첨가하여서, 구조적으로 변형된 DMAb의 아미노산 서열을 생성하는 단계, 및
    c) 생성된 상기 아미노산 서열에서 적어도 1회차의 모델링을 수행하는 단계를 더 포함하는, 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법의 핵산 분자에 의해 코딩된 구조적으로 변형된 DMAb.
  14. 제1 DMAb로부터의 하나 이상의 CDR 영역 및 제2 DMAb로부터의 하나 이상의 불변 영역을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb로서, 상기 구조적으로 변형된 DMAb는 변형되지 않은 상응하는 DMAb와 비교하여 더 높은 생체내 발현 및 더 높은 결합 중 적어도 하나를 나타내는, 구조적으로 변형된 DMAb.
  15. 제14항에 있어서, 상기 구조적으로 변형된 DMAb는 변형되기 전의 상기 구조적으로 변형된 DMAb의 특이성과 비교하여 적어도 동일하거나 더 높은 항원 결합 특이성을 나타내는, 구조적으로 변형된 DMAb.
  16. 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb로서, 상기 구조적으로 변형된 DMAb는 변형되지 않은 상응하는 DMAb와 비교하여 더 높은 생체내 발현 및 더 높은 결합 중 적어도 하나를 나타내는, 구조적으로 변형된 DMAb.
  17. CH1, CH2, 힌지, VH, 링커 및 VL 도메인을 포함하는 구조적으로 변형된 DMAb로서, 상기 구조적으로 변형된 DMAb는 변형되지 않은 상응하는 DMAb와 비교하여 더 높은 생체내 발현 및 더 높은 결합 중 적어도 하나를 나타내는, 구조적으로 변형된 DMAb.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 적어도 하나의 구조적으로 변형된 DMAb는,
    a) 상기 코딩된 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115 및 서열 번호 119로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및
    b) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115 및 서열 번호 119로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%를 포함하는 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 핵산 분자는 적어도 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각각의 뉴클레오타이드 서열은 구조적으로 변형된 DMAb를 코딩하는, 조성물.
  21. 적어도 하나의 제18항의 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법.
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