CN102421800A - 结合cd19的人源化抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合人CD19的人源化抗体或其片段。更具体而言，本发明涉及结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包括包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。

Description

结合CD19的人源化抗体及其用途
发明领域
本发明涉及结合人CD19的人源化抗体或其片段。更具体而言，本发明涉及结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包括包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ IDNO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。
发明背景
B细胞表面标志物一般被建议作为治疗B细胞病症或疾病、自身免疫病和移植排斥的靶。B细胞表面标志物的实例包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85和CD86白细胞表面标志物。已开发了特异性结合某些这类标志物的抗体，且测试了其中一些用于治疗疾病和病症。
例如，针对成熟B细胞及其恶性对应物的特异性CD20细胞表面分子的嵌合或放射性标记的单克隆抗体(mAb)疗法，表现出在体内有效治疗非霍奇金淋巴瘤(Tedder等人，Immunol.Today 15：450-454(1994)；Press等人，Hematology，221-240(2001)；Kaminski等人，N.Engl.J.Med.，329：459-465(1993)；Weiner，Semin.Oncol，26：43-51(1999)；Onrust等人，Drugs，58：79-88(1999)；McLaughlin等人，Oncology，12：1763-1769(1998)；Reff等人，Blood，83：435-445(1994)；Maloney等人，Blood，90：2188-2195(1997)；Maloney等人，J.Clin.Oncol，15：3266-3274(1997)；Anderson等人，Biochem.Soc.Transac，25：705-708(1997))。还发现抗CD20单克隆抗体疗法缓解了类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血，以及其他免疫介导性疾病的表现(Silverman等人，Arthritis Rheum.，48：1484-1492(2002)；Edwards等人，Rheumatology，40：1-7(2001)；De Vita等人，Arthritis Rheumatism，46：2029-2033(2002)；Leandro等人，Ann.Rheum.Dis.，61：883-888(2002)；Leandro等人，Arthritis Rheum.，46：2673-2677(2001))。抗CD20单克隆抗体LL-2表现出有效治疗经历化疗治疗的进行性和复发性淋巴瘤患者(Goldenberg美国专利号6,134,982和6,306,393)。抗CD20(IgGl)抗体RITUXAN(TM)成功的用于治疗某些疾病，例如成人免疫血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎和自身免疫性溶血性贫血(Cured等人，WO 00/67796)。尽管该疗法有效，但大部分的急性淋巴细胞白血病(ALL)和许多其他的B细胞恶性肿瘤不表达CD20，或者以低水平表达CD20，或者在CD20免疫疗法后丢失了CD20表达(Smith等人，Oncogene，22：7359-7368(2003))。此外，CD20的表达不能预测对抗CD20疗法的响应，因为仅一半的非霍奇金淋巴瘤患者响应针对CD20的免疫疗法。
人CD19分子是在人B细胞的表面上表达的结构上不同的细胞表面受体，所述B细胞包括但不限于前B细胞、处于早期发育中的B细胞(即，未成熟B细胞)、经过终末分化为浆细胞的成熟B细胞，和恶性B细胞。大部分的前B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、原淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、普通急性淋巴细胞白血病和一些Null-急性淋巴细胞白血病都表达CD19(Nadler等人，J.Immunol.，131：244-250(1983)；Loken等人，Blood，70：1316-1324(1987)；Uckun等人，Blood，71：13-29(1988)；Anderson等人，1984.Blood，63：1424-1433(1984)；Scheuermann，Leuk.Lymphoma，18：385-397(1995))。CD19在浆细胞上的表达进一步提示，它可能在分化的B细胞肿瘤上表达，例如多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、Waldenstrom肿瘤(Grossbard等人，Br.J.Haematol，102：509-15(1998)；Treon等人，Semin.Oncol，30：248-52(2003))。
CD19抗原也是免疫疗法的多个假定靶之一。CLB-CD 19抗体(抗CD19鼠IgG2a mAb)表现出抑制移植到无胸腺小鼠中的人肿瘤的生长(Hooijberg等人，Cancer Research，55：840-846(1995))。在另一项研究中，使用人IgG1Fc区嵌合单克隆鼠抗体FMC63(IgG2a)(Zola等人，Immunol Cell Biol 69：411-22(1991))。该抗体不在体外诱导补体介导的细胞毒性或ADCC，其施用到有人B细胞淋巴瘤的SCID小鼠(异种移植模型)中导致中等但非特异性的杀伤所移植的肿瘤细胞(Pietersz等人，Cancer Immunol.Immunother.，41：53-60(1995))。
使用植入肿瘤的异种移植小鼠模型获得的结果导致在人类患者中使用鼠抗CD19抗体的研究。将鼠CLB-CD 19抗体施用到6位诊断为进行性非霍奇金淋巴瘤的患者中，上述患者未能在之前用常规疗法(化疗或放疗)成功治疗。给予这些患者的总抗体剂量是从225至1000mg(Hekman等人，Cancer Immunol.Immunotherapy，32：364-372(1991))。虽然在抗体注入后，两名患者的循环肿瘤细胞暂时降低了，但是在两个阶段的抗体治疗后，仅1名患者实现了部分减轻。从该小组复发型患者中不能得出关于治功效果的任何结论。
之后，这些研究人员展示了在移植模型中，未缀合的CD20mAb的抗肿瘤效应远高于CD 19mAb的(Hooijberg等人，Cancer Res.，55：840-846(1995)；和Hooijberg等人，Cancer Res.，55：2627-2634(1995))。此外，他们未观察到当组合使用CD19和CD20mAb时的增益或协同效应(Hooijberg等人，Cancer Res.，55：840-846(1995))。虽然异种移植动物模型被视为是对人类对象的功效的不充分的预后指示物，但是在上述动物研究中获得的消极结果打消了对裸露的抗CD19抗体疗法的兴趣。
基于抗CD19抗体的免疫毒素的应用产生了同样令人失望的结果。在早期临床试验中，将B4抗CD19抗体(鼠IgG1mAb)与植物毒素蓖麻毒蛋白缀合，施用给之前在常规疗法中失败的患多发性骨髓瘤(Grossbard等人，British Journal of Haematology，102：509-515(1998))、高等非霍奇金淋巴瘤(advanced non-Hodgkin’s lymphoma)(Grossbard等人，ClinicalCancer Research，5：2392-2398(1999))，和复发性B细胞恶性肿瘤(Grossbard等人，Blood，79：576-585(1992))的人类患者。这些试验一般性的证实了向人类施用B4-蓖麻毒蛋白缀合物的安全性；然而，相比RITUXAN(TM)的临床试验(Grossbard等人，Clinical Cancer Research，5：2392-2398(1999))，结果是混杂的，而响应速率则令人失望。此外，显著一部分的患者出现了人抗小鼠抗体(HAMA)响应或人抗蓖麻毒蛋白抗体(HARA)响应。
考虑到使用裸露的抗CD19抗体或基于抗CD19抗体的免疫毒素的现有疗法产生同样令人失望的结果，需要开发更有效地治疗CD19介导的病症的抗CD19抗体，例如，通过触发凋亡和阻断B细胞增殖，以及介导通过ADCC的杀伤，能够有效诱导肿瘤细胞死亡的抗CD19抗体。
发明概述
本发明一般涉及结合人CD19的人源化抗体或其片段，其制备和使用的方法，包括治疗CD19介导的病症的方法。本发明的结合人CD19的人源化抗体或其片段表现出多种理想的特性，包括例如ADCC活性、诱导凋亡和抑制B细胞增殖。
在一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ IDNO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3。在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ IDNO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ IDNO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ IDNO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO：19、20、21、22和42的重链可变区序列。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括这样的重链可变框架区，所述重链可变框架区是选自V3-33＊01(SEQ ID NO：11)、V3-11＊01(SEQ ID NO：12)、V3-30＊-18(SEQ IDNO：13)和V3-48＊01(SEQ ID NO：14)的人基因的产物或源自所述人基因。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO：23、24、25、26和41的轻链可变区序列。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括这样的轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是选自V1-5＊03(SEQID NO：3)、V1-27＊01(SEQ ID NO：4)、V1-39＊-01(SEQ ID NO：5)和V1-12＊01(SEQ ID NO：6)的人基因的产物或源自所述人基因。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO：33、34、35、36、37、43、44、45、46、47、54和55的重链可变区。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO：25、38、39、40、48、49、50、51、52、53、56、57、58、59、60、61、62和63的轻链可变区。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括：
(a)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的重链序列；和
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括：
(a)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链序列；和
(b)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的轻链序列。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括：
(a)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链序列；和
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括人重(链)和/或轻(链)恒定区，其中所述人重(链)恒定区包括同种型变体，所述变体包含人IgG1的CH1、人IgG1的铰链区和人IgG3的Fc区。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的包含变体人IgG Fc区的人源化抗体或其片段，其中所述变体人IgG Fc区包括相对于亲本抗体的人IgG Fc区的至少一个氨基酸修饰，而包含变体人IgG Fc区的抗体表现出相比亲本抗体改变的效应子功能。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中所述抗体包括变体人IgG Fc区，所述变体人IgG Fc区包含用天冬酰胺替换亲本抗体的氨基酸324位的丝氨酸的氨基酸取代S324N，而包括所述变体人IgG Fc区的抗体相比亲本抗体表现出改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，所述抗体具有各种理想的特性，例如与Raji肿瘤细胞结合、与人CD19结合(具有的亲和力(Kd)为50nM或更低)、保留了相应嵌合抗体的至少20％的CD19结合亲和力(Kd)、竞争结合Raji肿瘤细胞(具有的亲和力(Ki)为50nM或更低)、在Raji肿瘤细胞中诱导凋亡、在Raji肿瘤细胞中的ADCC活性、抑制恶性B细胞的增殖、抑制Raji肿瘤细胞的克隆发生、导致血液中的B细胞耗尽、在Raji肿瘤细胞中内化和FAB片段热稳定温度大于65℃。
本发明还提供了编码结合人CD19的人源化抗体及其片段的分离的核酸、载体，和包含所述核酸或载体的宿主细胞。还提供了包含所述人源化抗体或其片段以及药学可接受的载体的组合物，和包括与治疗剂连接的所述人源化抗体或其片段的免疫缀合物。
本发明还提供了治疗CD19介导的病症的方法、抑制表达CD19的肿瘤细胞生长的方法，和在需要此类治疗的对象中耗尽B细胞的方法。
本发明还提供了药盒和制品，其包括所述人源化抗体或其片段、用于治疗CD19介导的病症的组合物或免疫缀合物。
附图简介
图1A和1B显示了流式细胞仪分析，确定移植到人受体抗体框架上的FMC63-CDR在Raji肿瘤细胞上的结合活性。
图2A和2B显示了FMC63的轻链(A)或重链(B)可变区与选定的VBASE2的种系框架和CDR移植供体扩增框架的比对。使用Kabat编号，并显示在编号行下。
图3显示了由流式细胞仪所确定的人源化抗体在SU-DHL-6人B细胞淋巴瘤细胞上的结合活性。
图4A和4B显示了人源化抗CD19抗体的Scatchard分析曲线。使用铕标记的抗体在Raji肿瘤细胞上实施分析。
图5A和5B显示了人源化抗CD19抗体对Raji肿瘤细胞的ADCC活性。
图6显示了人源化抗CD19抗体对Raji肿瘤细胞诱导的凋亡。
图7A显示了人源化抗CD19抗体抑制SU-DHL-6人B细胞淋巴瘤细胞增殖。图7B显示了用人源化抗CD19抗体治疗后的Raji肿瘤细胞的克隆发生。
图8显示了抗CD19抗体在Raji肿瘤细胞中的内化。内化受肥皂草毒蛋白缀合的二抗(Hum-ZAP)的细胞毒性监控。
图9显示了与野生型VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A比较，S324位的抗CD19抗体突变体的补体依赖性细胞毒性(CDC)：(1)IgG1对照抗体；
(2)VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(3)VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(4)VH16R94K/S324G-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(5)VH16R94K/S324A-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(6)VH16R94K/S324V-VL433Q/T7S/P44I/N92A；(7)VH16R94K/S324L-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(8)VH16R94K/S324I-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(9)VH16R94K/S324P-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(10)VH16R94K/S324T-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(11)VH16R94K/S324C-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(12)VH16R94K/S324M-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(13)VH16R94K/S324Q-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(14)VH16R94K/S324F-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(15)VH16R94K/S324Y-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(16)VH16R94K/S324W-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(17)VH16R94K/S324R-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(18)VH16R94K/S324D-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(19)仅血清。
图10显示了在E269、S298和S324位上具有取代的抗CD19抗体变体的CDC测定：(1)阴性对照——无抗体；(2)IgG1对照抗体；(3)VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(4)VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(5)VH16R94K/S298A/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(6)VH16R94K/E269D/S298A/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A.
图11显示了选定的抗CD19抗体变体的基于细胞的ADCC测定：(1)阴性对照——无抗体；(2)IgG1对照抗体；(3)VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(4)VH16R94K/S298A-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(5)VH16R94K/E269D/S298A-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A。
图12显示了选定的抗CD19抗体变体的基于细胞的ADCC测定：(1)IgG1对照抗体；
(2)VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(3)VH16R94K(1133)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(4)VH16R94K/K274Q-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(5)VH16R94K/N276K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(6)VH16R94K/K334R-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(7)VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(8)VH16R94K/K274Q/N276K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(9)VH16R94K/K274Q/N276K/K334R-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(10)阴性对照——无抗体——无血清；(11)阴性对照——仅血清。
图13显示了去岩藻糖基化的抗CD19抗体变体的基于细胞的ADCC测定：(1)阴性对照——无抗体；(2)IgG1对照抗体；(3)VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(4)VH16R94K(shRNA)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(5)VH16R94K(GNTIII)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(6)VH16R94K/E269D/S298A(shRNA)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(7)VH16R94K/E269D/S298A(GNTIII)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A.
图14显示了在SCID小鼠的脾脏中检测到的抗CD19抗体变体的B细胞耗尽(总B细胞的ACN)：(1)阴性对照——无人PBMC；(2)人PBMC——(3)人PBMC——
Figure BDA0000100909380000092
(4)人PBMC——VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(5)人PBMC——VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A。
图15显示了在SCID小鼠的脾脏中检测到的抗CD19抗体变体的B细胞耗尽(总B细胞的百分数)：(1)阴性对照——无人PBMC；(2)人PBMC——
Figure BDA0000100909380000093
(3)人PBMC——
Figure BDA0000100909380000094
(4)人PBMC——VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A；(5)人PBMC——VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A。
发明详述
本发明涉及结合人CD19的人源化抗体及其片段。
本文中使用的术语“人CD19”包括人CD19的变体、同种型和物种同源物。因此，在某些情况下，本发明的人源化抗体可与人以外的物种的CD19交叉反应。在某些情况下，抗体可以完全对一种或多种人CD19蛋白特异并且可以不表现出物种或其它类型的非人交叉反应。示例性的人CD19的完整氨基酸序列具有SwissProt登录号P 15391(SEQ ID NO：125)。CD19也被称为B细胞表面抗原B4、B细胞抗原CD19、CD19抗原和Leu-12。人CD19被Entrez Gene称为GeneID：930，被HGNC称为HGNC：1633。CD19可以被称为CD19的基因编码。本文中“人CD19”的使用涵盖了人CD19的所有已知的或仍未被发现的等位基因和多态形式。如未另外具体指出，则本文中使用的术语“CD19”指“人CD19”。
本文中使用的术语“结合人CD19的抗体”包括结合人CD19的亲和力(Kd)为500nM或更低，优选100nM或更低，更优选50nM或更低的抗体，优选IgG抗体，所述人CD19例如在Raji肿瘤细胞的表面表达的人CD19，所述细胞如Raji肿瘤细胞DSMZ ACC319。
本文中使用的“B细胞”或“B淋巴细胞”意指在骨髓中发育的淋巴细胞类型，其在血液和淋巴液中循环，并提供体液免疫。B细胞识别游离的抗原分子，并分化或成熟为分泌使抗原失活的免疫球蛋白(抗体)的浆细胞。还产生记忆细胞，所述细胞在之后遇到此类抗原时制造特定的免疫球蛋白(抗体)。在胰岛(islet of Langerhans)中，B细胞也被称为“β细胞”。
本文中使用的术语“抗体”包括完整的抗体和任何抗原结合片段或其单链。“抗体”指包括通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白，或其抗原结合片段。每条重链都包括重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链都包括轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的超变区，其分散在被称为框架区(FR或FW)的更保守的区域中。每个VH和VL都包括3个CDR和4个FR，按下列顺序从氨基端向羧基端排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应子细胞)和经典补体系统的第一补体(CIq)。
本文中使用的术语“嵌合抗体”包括这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，而恒定区序列源自另一个物种，例如可变区序列源自小鼠抗体，而恒定区序列源自人抗体的抗体。
本文中使用的术语“人源化抗体”包括这样的抗体，其中源自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人的框架序列上。在人的框架序列和源自另一种哺乳动物物种的种系的CDR序列中也可以进行额外的框架区修饰。
本文中使用的术语“人抗体”包括这样的抗体，所述抗体具有框架和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。此外，如果所述抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不是人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或定点诱变或者通过体内的体细胞突变导入的突变)。然而，本文中使用的术语“人抗体”并非意在包括这样的抗体，所述抗体中源自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人的框架序列上。
如果抗体的可变框架区获得自使用人种系免疫球蛋白基因的系统，则本文中使用的人源化抗体包括这样的重链或轻链可变框架区，所述可变框架区是特定的人种系序列(人基因)的“产物”或“源自”所述特定的人种系序列。此类系统包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。可以通过比较人源化抗体的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列，来鉴别包括这样的重链或轻链可变框架区的人源化抗体，所述可变框架区是人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”所述人种系免疫球蛋白序列。包括是特定的人种系免疫球蛋白序列的“产物”的重链或轻链可变框架区的人源化抗体具有氨基酸序列与特定的人种系免疫球蛋白序列的重链或轻链可变框架区100％相同的重链或轻链可变框架区。由于例如天然存在的体细胞突变或有意导入的定点突变，相比特定种系序列的重链或轻链可变框架区，包括“源自”所述特定的人种系免疫球蛋白序列的重链或轻链可变框架区的人源化抗体可含有氨基酸差异。然而，通常选定的人源化抗体的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因的重链或轻链可变框架区编码的氨基酸序列至少90％相同，并且，当相比其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)时，含有鉴别所述人源化抗体是源自人的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列与由种系免疫球蛋白基因编码的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列可优选至少95％，更优选至少96％，最优选至少97％，特别是至少98％，最特别是至少99％相同。通常，源自特定的人种系序列的人源化抗体的重链或轻链可变框架区将展现出与由人种系免疫球蛋白基因编码的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列不超过10个、优选不超过5个、或者甚至更优选不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
本文中使用的术语“Fab”或“Fab区”包括包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离的该区域，或者位于全长抗体或抗体片段环境中的该区域。
本文中使用的术语“Fc”或“Fc区”包括包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体恒定区的多肽。因而，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(C[γ]2和C[γ]3)，和在Cγ1(C[γ]1)和Cγ2(C[γ]2)之间的铰链。虽然Fc区的边界可以改变，但人IgG重链Fc区通常定义为在其羧基端包含残基C226或P230，其中编号是根据Kabat的EU索引。对于人IgG1，Fc在本文定义为包含残基P232至其羧基端，其中编号是根据Kabat中的EU索引。Fc可以指分离的该区域，或者位于Fc多肽，例如抗体，环境中的该区域。
本文中的术语“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”包括包含在抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。结构上，IgG CH1结构域终止于EU 220位，IgG CH2结构域始于残基EU 237位。因而，对于IgG，本文中抗体铰链定义为包括221(IgGI的D221)至231(IgGI的A231)位，其中编号是根据Kabat的EU索引。
本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括未修饰的抗体，所述抗体之后经修饰产生变体。所述亲本抗体可以是天然存在的抗体，或者天然存在的抗体的变体或改造版本。亲本抗体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物，或其编码氨基酸序列。本文中使用的“亲本抗CD19抗体”意指结合人CD19的抗体或免疫球蛋白，并经修饰产生变体。
本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括之后经修饰产生人源化抗体的鼠抗体或嵌合抗体。
本文中使用的术语“变体抗体”或“抗体变体”包括由于相比亲本的至少一个氨基酸修饰，而不同于亲本抗体序列的抗体序列。本文中的变体抗体序列优选的具有与亲本抗体序列至少约80％，最优选至少约90％，更优选至少约95％的氨基酸序列同一性。抗体变体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物，或编码其的氨基酸序列。
本文中的术语“氨基酸修饰”包括在多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用另一种氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代R94K指这样的变体多肽，其中94位的精氨酸被赖氨酸替换，此情况为重链可变框架区变体。对于前例，94K表示用赖氨酸取代94位。出于本文的目的，通常通过斜杠分隔多个取代。例如，R94K/L78V指包含取代R94K和L78V的双变体。本文中使用的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置添加氨基酸。例如，插入-94表示在94位的插入。本文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如R94-表示删除94位的精氨酸。
本文中使用的术语“保守修饰”或“保守序列修饰”意指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、插入和缺失。可通过本领域已知的标准技术将修饰导入本发明的抗体中，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守的氨基酸取代是用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括含碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如、天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，可以用其他相同侧链家族的氨基酸残基替换本发明抗体的CDR区中或框架区中的一个或多个氨基酸残基，并可以测试所改变的抗体(变体抗体)保留的功能。
本发明中讨论的所有免疫球蛋白重链恒定区位置，都根据Kabat的EU索引编号(Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，United States Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，通过引用全文整合)。“Kabat的EU索引”指人IgGlEU抗体的残基编号，如Edelman等人，1969，Biochemistry 63：78-85所述。
本文中使用的术语“全长抗体”包括构成抗体的天然生物学形态的结构，包括可变区和恒定区。例如，在大部分哺乳动物包括人和小鼠中，IgG类的全长抗体是四聚体，由两对相同的成对免疫球蛋白链组成，每对都具有一条轻链和一条重链，每条轻链都包含免疫球蛋白结构域VL和CL，每条重链都包含免疫球蛋白结构域VH、CH1(C[γ]1)、CH2(C[γ]2)和CH3(C[γ]3)。在一些哺乳动物中，例如骆驼和美洲驼，IgG抗体可以只由两条重链组成，每条重链都包含与Fc区连接的可变结构域。
抗体片段包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，包括Fab’和Fab’-SH，(ii)VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由单个可变区组成的dAb片段(Ward等人，1989，Nature 341：544-546)；(v)F(ab′)2片段，包含2个连接的Fab片段的二价片段；(vi)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述接头允许两个结构域关联形成抗原结合位点(Bird等人，1988，Science 242：423-426；Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883)；(vii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；(viii)“二体”或“三体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Tomlinson等人，2000，MethodsEnzymol.326：461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448)；和(ix)与相同或不同抗体遗传融合的scFv(Coloma&Morrison，1997，Nature Biotechnology 15，159-163)。
根据恒定区基因测定，将抗体分类，也称为同种型。人的恒定轻链分为κ(CK)和λ(C[λ])轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并分别定义抗体的同种型IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG类是最常用于治疗目的的。在人中，该类别包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类别包括亚类IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA具有若干亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。因而，本文中使用的“同种型”意指通过恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何类或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。
本文中使用的术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”包括细胞介导的反应，其中表达Fc[γ]R的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，之后导致靶细胞的裂解。在各个方面，增强的ADCC效应子功能可以意指增强的效价或增强的功效。实验背景中使用的“效价”意指当观察特定的治功效应EC50时抗体的浓度(半最大有效浓度)。实验背景中使用的“功效”意指饱和水平的抗体的最大可能的效应子功能。
本文中使用的术语“ADCP”或“抗体依赖性细胞介导的吞噬作用”包括细胞介导的反应，其中表达Fc[γ]R的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，之后导致靶细胞的吞噬作用。
本文中使用的术语“CDC”或“补体依赖性细胞毒性”包括这样的反应，其中一种或多种补体蛋白质组分识别靶细胞上结合的抗体，之后导致靶细胞的裂解。
本文中使用的术语“效应子功能”包括由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用导致的生物化学事件。效应子功能包括Fc[γ]R-介导的效应子功能，例如ADCC和ADCP，和补体介导的效应子功能，例如CDC。
本文中使用的术语“对象”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类、爬行类等。优选的对象是人。
本文中使用的术语“同种型变体”包括这样的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰将一种同种型的至少一个氨基酸，优选将一种同种型的重链恒定区的至少一个氨基酸，转化为不同的、匹配的同种型中的相应氨基酸。氨基酸修饰可包括整个恒定区免疫球蛋白结构域的转化，或者优选一种同种型的Fc区转化为不同的同种型，例如人IgG1重链恒定区的Fc区转化为人IgG3的Fc区导致同种型变体包含人IgG1的CH1、人IgG1的铰链和人IgG3的Fc区。
本文中使用的术语“同种型修饰”包括将一种同种型的一个氨基酸转化为不同的、匹配的同种型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为IgG1在Kabat的296位具有酪氨酸，而IgG2具有苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被认为是同种型修饰。
本文中使用的术语“成熟的核心糖类结构”包括与Fc区连接的加工的核心糖类结构，所述结构一般包括糖类结构GlcNAc(岩藻糖)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2，即，如下示意性呈现的典型二触角(biantennary)寡糖：
Figure BDA0000100909380000171
该术语具体包括缺少β1，2GlcNAc残基的G-1型核心成熟糖类结构。然而优选的，核心糖类结构包括两种β1，2GlcNAc残基。本文中的成熟核心糖类结构一般不是高甘露糖基化的。成熟核心糖类结构与糖蛋白的Fc区连接，一般通过N连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。
抗CD19抗体
在第一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ IDNO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3。在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ IDNO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包括包含SEQID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。优选的，所述结合人CD19的人源化抗体或其片段包括包含SEQ IDNO：27的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3，和/或包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。更优选的，所述结合人CD19的人源化抗体或其片段包括包含SEQID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3；和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。
本领域普遍已知CDR3结构域不依赖于CDR1和/或CDR2结构域，单独就可以确定抗体对同族抗原的结合特异性，基于共同的CDR3序列可以可预测的产生具有相同结合特异性的多种抗体。参见例如Klimka等人，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)(描述了仅使用鼠抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3生产人源化抗CD30抗体)；Beiboer等人，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)(描述了仅使用亲本鼠MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列生产重组的上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader等人，Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.95：8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整联蛋白[α]v[β]3抗体LM609的重链和轻链可变CDR3结构域的一组人源化抗整联蛋白[α]v[β]3抗体，其中每个抗体成员在CDR3结构域之外都包括不同的序列，并能够以与亲本鼠抗体同样高或更高的亲和力结合与亲本鼠抗体相同的表位)；Barbas等人，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)(描述了CDR3结构域为抗原结合提供了最重要的贡献)。
因此，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体及其片段，其包括来自非人动物抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，例如来自鼠抗体(如FMC63)的，特别是包括包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3，和/或包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链CDR3，其中所述抗体能够结合CD19。在一些实施方案中，本发明的抗体包括来自非人动物抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，所述抗体与相应的亲本非人(例如鼠)抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特征；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO：19、20、21、22和42的重链可变区序列，优选选自SEQ ID NO：21、22和42的重链可变区序列，更优选包含SEQ ID NO：21的重链可变区序列。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO：23、24、25、26和41的轻链可变区序列，优选选自SEQ ID NO：25和41的轻链可变区序列，更优选包含SEQ ID NO：41的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，结合人CD19的人源化抗体或其片段包括选自SEQ ID NO：19、20、21、22和42的重链可变区序列和选自SEQ ID NO：23、24、25、26和41的轻链可变区序列，优选选自SEQ ID NO：21、22和42的重链可变区序列和选自SEQ ID NO：23、24、25、26和41的轻链可变区序列，更优选选自SEQ ID NO：21、22和42的重链可变区序列和选自SEQID NO：25和41的轻链可变区序列，最优选包含SEQ ID NO：21的重链可变区序列和包含SEQ ID NO：41的轻链可变区序列。
考虑到这些重链和轻链可变区序列各自可以结合人CD19，可以“混合和匹配”重链和轻链可变区序列来产生本发明的抗CD19结合分子。可以使用例如实施例中描述的结合测定，来测试此类“混合和匹配”的抗体的CD19结合。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段的变体。因而，本发明提供了人源化抗体或其片段，具有与重链或轻链的(例如分别如SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：41的重链和轻链可变区序列的)亲本人源化抗体的重链和/或轻链可变框架区的氨基酸序列至少80％相同的重链和/或轻链可变框架区的氨基酸序列(具有至少80％氨基酸序列同一性)。优选的，重链和/或轻链可变框架区的氨基酸序列同一性是至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，特别是96％，更特别97％，甚至更特别98％，最特别99％，包括例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。本文中关于氨基酸序列的同一性或同源性定义为在比对序列和为了实现最大百分比序列同一性，在必要时导入空位后，候选序列中与结合人CD19的人源化抗体或其片段相同的氨基酸残基的百分比。因而，可以通过通常用于比较两条多肽的氨基酸位置相似性的标准方法，来确定序列同一性。使用计算机程序例如BLAST或FASTA，比对两条多肽各自氨基酸的最佳匹配(沿一条或两条序列的全长或者沿一条或两条序列预定的部分)。程序提供了默认的开放罚分和默认的空位罚分，评分矩阵例如PAM250(标准评分矩阵；参见Dayhoff等人，in Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，第3期增补(1978))可与计算机程序结合使用。例如，百分比同一性可计算为：相同匹配的总数乘以100，再除以匹配跨度中较长序列的总长度和为了比对两条序列向较长序列中导入的空位数。
在一些实施方案中，本发明因而提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括与SEQ ID NO：19、20、21、22或42的框架区序列至少80％相同的重链可变框架区序列，和/或与SEQID NO：：23、24、25、26和41的框架区序列至少80％相同的轻链可变框架区序列。
在一些实施方案中，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括与SEQ ID NO：21、22或42的框架区序列至少80％相同的重链可变框架区序列，和/或与SEQ ID NO：：25或41的框架区序列至少80％相同的轻链可变框架区序列。在一些实施方案中，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括与SEQ ID NO：21的框架区序列至少80％相同的重链可变框架区序列，和/或与SEQ ID NO：41的框架区序列至少80％相同的轻链可变框架区序列。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括如上文所述的重链和/或轻链CDR，并还包括这样的重链可变框架区，所述重链可变框架区是选自V3-33＊01(SEQ ID NO：11)、V3-11＊01(SEQ ID NO：12)、V3-30＊-18(SEQ ID NO：13)和V3-48＊01(SEQ IDNO：14)的人基因的产物或源自所述人基因；优选这样的重链可变框架区，所述重链可变框架区是V3-30＊-18(SEQ ID NO：13)或V3-48＊01(SEQ IDNO：14)的人基因的产物或源自所述人基因；更优选这样的重链可变框架区，所述重链可变框架区是V3-30＊-18(SEQ ID NO：13)的人基因的产物或源自所述人基因。重链可变框架区可包括一个或多个(例如，1、2、3和/或4个)重链框架区序列(例如，框架1(FW1)、框架2(FW2)、框架3(FW3)和/或框架4(FW4))，其存在于这些人基因的产物中或源自这些人基因。优选的，重链可变区框架包括FW1、FW2和/或FW3，更优选FW1、FW2和/或FW3，存在于选自V3-33＊01(SEQ ID NO：11)、V3-11＊01(SEQ ID NO：12)、V3-30＊-18(SEQ ID NO：13)和V3-48＊01(SEQ ID NO：14)的人基因的产物中或源自所述人基因。本文使用的重链框架区序列包括FW1(位置1至位置25)、FW2(位置36至位置49)、FW3(位置66至位置94)和FW4(位置103至位置113)，其中利用Kabat中提出的编号系统表示所述氨基酸位置。
在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括这样的轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是选自V1-5＊03(SEQID NO：3)、V1-27＊01(SEQ ID NO：4)、V1-39＊-01(SEQ ID NO：5)和V1-12＊01(SEQ ID NO：6)的人基因的产物或源自所述人基因；优选这样的轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是V1-39＊-01(SEQ ID NO：5)的人基因的产物或源自所述人基因。轻链可变区框架区可包括一个或多个(例如，1、2、3和/或4个)轻链框架区序列(例如，框架1(FW1)、框架2(FW2)、框架3(FW3)和/或框架4(FW4))，其存在于这些人基因的产物中或源自这些人基因。优选的，轻链可变区框架包括FW1、FW2和/或FW3，更优选FW1、FW2和FW3，其存在于选自V1-5＊03(SEQ IDNO：3)、V1-27＊01(SEQ ID NO：4)、V1-39＊-01(SEQ ID NO：5)和V1-12＊01(SEQ ID NO：6)的人基因的产物中或源自所述人基因。本文使用的轻链框架区序列包括FW1(位置1至位置23)、FW2(位置35至位置49)、FW3(位置57至位置88)和FW4(位置98至位置108)，其中利用Kabat中提出的编号系统表示所述氨基酸位置。
在一些实施方案中，结合人CD19的人源化抗体或其片段包括这样的重链可变框架区和这样的轻链可变框架区，所述重链可变框架区是选自V3-33＊01(SEQ ID NO：11)、V3-11＊01(SEQ ID NO：12)、V3-30＊-18(SEQ ID NO：13)和V3-48＊01(SEQ ID NO：14)的人基因的产物或源自所述人基因，所述轻链可变框架区是选自V1-5＊03(SEQ ID NO：3)、V1-27＊01(SEQ ID NO：4)、V1-39＊-01(SEQ ID NO：5)和V1-12＊01(SEQ IDNO：6)的人基因的产物或源自所述人基因；优选这样的重链可变框架区和这样的轻链可变框架区，所述重链可变框架区是V3-30＊-18(SEQ ID NO：13)或V3-48＊01(SEQ ID NO：14)的人基因的产物或源自所述人基因，所述轻链可变框架区是V1-39＊-01(SEQ ID NO：5)的人基因的产物或源自所述人基因；更优选这样的重链可变框架区和这样的轻链可变框架区，所述重链可变框架区是V3-30＊-18(SEQ ID NO：13)的人基因的产物或源自所述人基因，所述轻链可变框架区是V1-39＊-01(SEQ ID NO：5)的人基因的产物或源自所述人基因。
本发明还涵盖了存在于不同的人基因的产物中或源自所述人基因的重链可变区框架区，和/或存在于不同的人基因的产物中或源自所述人基因的轻链可变区框架区的组合，例如，存在于V3-30＊-18(SEQ ID NO：13)的产物或源自V3-30＊-18(SEQ ID NO：13)的FW1和FW2，与存在于V3-48＊01(SEQ ID NO：14)的产物中或源自V3-48＊01(SEQ ID NO：14)的FW3组合，和/或存在于V1-39＊-01(SEQ ID NO：5)的产物中或源自V1-39＊-01(SEQ ID NO：5)的FW1和FW2，与存在于V1-12＊01(SEQ ID NO：6)的产物中或源自V1-12＊01(SEQ ID NO：6)的FW3组合。
人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“VBase”人种系序列数据库中(可获得自因特网的www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242；Tomlinson，I.M.等人，(1992)″The Repertoireof Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VHSegments with Different Hypervariable Loops″J.MoI.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L等人，(1994)″A Directory of HumanGermline VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage″Eur.J.Immunol.24：827-836。如另一个实例，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于Genbank数据库。
在另一个方面，本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR包括至少一个氨基酸修饰。可以实施定点诱变或PCR介导的诱变，来导入修饰，并可以在如本文所述的和实施例中提供的体外或体内测定中评估对抗体结合的影响或者其他的目标功能特性。优选的导入保守修饰。修饰可以是氨基酸取代、添加或缺失，但优选是取代。通常，在CDR区中实施不超过5个，优选不超过4个，更优选不超过3个，甚至更优选不超过2个，最优选不超过1个的氨基酸修饰。
因而，本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含重链CDR1中的氨基酸取代Y32F的氨基酸修饰，和/或包括包含重链CDR2中的氨基酸取代Y58F或Y59F的氨基酸修饰，和/或包括包含重链CDR3中的一个或多个选自Y96F、Y97F、Y98F和Y100BF的氨基酸取代的氨基酸修饰。人源化抗体或其片段的优选的氨基酸修饰是重链CDR1中的氨基酸取代Y32F，和重链CDR3中的选自Y96F、Y97F、Y98F和Y100BF的氨基酸取代。人源化抗体或其片段的更优选的氨基酸修饰是重链CDR1中的氨基酸取代Y32F，和/或重链CDR3中的氨基酸取代Y100BF。
本发明还提供了人源化抗体或其片段，其包括包含轻链CDR1中的氨基酸取代Y32F的氨基酸修饰，和/或包括包含轻链CDR3中的选自N92A、T93A和T93V的氨基酸取代的氨基酸修饰。人源化抗体或其片段的优选的氨基酸修饰是轻链CDR1中的氨基酸取代Y32F，和/或轻链CDR3中的氨基酸取代N92A。
在一些实施方案中，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含重链CDR1中的氨基酸取代Y32F的氨基酸修饰，和/或包括包含重链CDR2中的氨基酸取代Y58F或Y59F的氨基酸修饰，和/或包括包含重链CDR3中的一个或多个选自Y96F、Y97F、Y98F和Y100BF的氨基酸取代的氨基酸修饰，且包括包含轻链CDR1中的氨基酸取代Y32F的氨基酸修饰，和/或包括包含轻链CDR3中的选自N92A、T93A和T93V的氨基酸取代的氨基酸修饰。
在某些实施方案中，框架序列可用于改造可变区，产生变体抗体。本发明的变体抗体包括对VH和/或VK中的框架区残基进行了修饰的变体，例如改善抗体的特性。通常，进行此类框架区修饰来减少抗体的免疫原性。例如，一种方法是“回复突变”一个或多个框架区残基为相应的鼠序列，或者“回复突变”一个或多个框架区残基为相应的种系序列。
因而在另一个方面，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段的至少一个重链可变区的框架区包括来自相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。优选的，所述氨基酸修饰是氨基酸取代。通常，在框架区内实施不超过5个，优选不超过4个，更优选不超过3个，甚至更优选不超过2个，最优选不超过1个的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中重链可变区的框架区的氨基酸修饰包括在选自37、42、48、49、67、71、78和94的氨基酸位置上的氨基酸取代。优选的重链可变区的框架区的氨基酸取代是在选自42、67、71、78和94的氨基酸位置上的。更优选的重链可变区的框架区的氨基酸取代是选自G42R、F67L、R71K、L78V和R94K，其条件是如果氨基酸修饰是R94K，则重链可变区序列不是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20，而R94K是重链可变区的框架区的最优选的氨基酸取代。
本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段的至少一个轻链可变区的框架区包括来自相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。优选的，所述氨基酸修饰是氨基酸取代。通常，在框架区内实施不超过5个，优选不超过4个，更优选不超过3个，甚至更优选不超过2个，最优选不超过1个的氨基酸修饰。在一些实施方案中，本发明提供了人源化抗体或其片段，其中轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰包括在选自44、71和87的氨基酸位置上的氨基酸取代。更优选的轻链可变区序列的框架区的氨基酸取代是选自P44V、P44I、P44L、F71Y、F71H、F71S、F71T和Y87F。最优选的轻链可变区序列的框架区的氨基酸取代是选自P44V、P44I、F71Y和Y87F，而P44I是特别优选的。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗体或其片段可包括如上文所述的重链可变区序列的框架区的氨基酸修饰，和如上文所述的轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰。
本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO：33、34、35、36、37、43、44、45、46、47、54和55的重链可变区，优选选自SEQ ID NO：37、43和47，更优选选自SEQ ID NO：37和47的重链可变区。
本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO：25、38、39、40、48、49、50、51、52、53、56、57、58、59、60、61、62和63的轻链可变区，优选选自SEQ ID NO：25、59和60，更优选选自SEQ ID NO：59和60的轻链可变区。
在一些实施方案中，结合人CD19的人源化抗体或其片段包括选自SEQ ID NO：33、34、35、36、37、43、44、45、46、47、54和55的重链可变区，和选自SEQ ID NO：25、38、39、40、48、49、50、51、52、53、56、57、58、59、60、61、62和63的轻链可变区。
在一些实施方案中，结合人CD19的人源化抗体或其片段包括选自SEQ ID NO：37、43和47的重链可变区，和选自SEQ ID NO：25、59和60的轻链可变区。在更优选的实施方案中，结合人CD19的人源化抗体或其片段包括选自SEQ ID NO：37和47的重链可变区，和选自SEQ ID NO：59和60的轻链可变区。最优选的是结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ IDNO：59的氨基酸序列的轻链可变区；结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ IDNO：60的氨基酸序列的轻链可变区；结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ IDNO：59的氨基酸序列的轻链可变区；结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ IDNO：25的氨基酸序列的轻链可变区；结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ IDNO：49的氨基酸序列的轻链可变区；结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ IDNO：49的氨基酸序列的轻链可变区；结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ IDNO：59的氨基酸序列的轻链可变区；特别是结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的轻链可变区；结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的轻链可变区；结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的轻链可变区。
考虑到每种上述重链和轻链可变区序列都可以结合人CD19，可以“混合和匹配”重链和轻链可变区序列，来产生本发明的抗CD19结合分子。可以使用例如实施例中描述的结合测定，来测试此类“混合和匹配”的抗体的CD19结合。
在一些实施方案中，结合人CD19的人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
在一些实施方案中，结合人CD19的人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的轻链序列。
在一些实施方案中，结合人CD19的人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其还包括人重链和/或轻链恒定结构域。人重链恒定区可选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE构成的人免疫球蛋白的组，而人重链恒定区IgG，特别是IgG1是优选的。人轻链恒定区可选自κ或λ恒定区构成的人免疫球蛋白的组，而人κ恒定区是优选的。在一些优选的实施方案中，所述人源化抗体或其片段包括人IgG1重链恒定结构域和人轻链κ恒定结构域。本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括人重链和/或轻链恒定区，其中人重链恒定区包括包含人IgG1的CH1、人IgG1的铰链区和人IgG3的Fc区的同种型变体。优选的包含同种型变体的人源化抗体是全长抗体。对于包括包含人IgG1的CH1、人IgG1的铰链区和人IgG3的Fc区的同种型变体的结合人CD19的人源化抗体或其片段，特别优选的是包括包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。已发现同种型变体表现出改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)，这是相比下述结合人CD19的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段包括人IgG1的人重链恒定区(通常是天然的人IgG1)，即相比只有涉及修饰的重链恒定区时不同于同种型变体的结合人CD19的人源化抗体或其片段。
本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体片段，所述片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab′)2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双抗体、三链抗体和与相同或不同抗体遗传融合的scFv。优选的片段是scFv、双特异性单链Fv二聚体和双抗体。本发明还提供了结合人CD19的全长人源化抗体。
除了在框架区或CDR区进行修饰外，或作为其备选，还可以改造本发明的抗体以包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fx受体结合，和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。此外，可以化学修饰(例如，可以在抗体上连接一个或多个化学部分)或修饰本发明的抗体，改变它的糖基化。下文进一步详细描述了每种这类实施方案。如下概述的Fc区内的修饰是根据Kabat的EU索引的Fc区内的残基编号。在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得改变铰链区内的半胱氨酸残基数，例如增加或减少。该方法进一步描述在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中。改变CH1的铰链区内的半胱氨酸残基数，以例如促进轻链和重链装配，或增加或减少抗体的稳定性。在另一个实施方案中，突变抗体的Fc铰链区，以减少抗体的生物学半衰期。更具体而言，在Fc铰链片段的CH2-CH3结构域交界区中导入一个或多个氨基酸突变，使得抗体相比天然的Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌A蛋白(SpA)结合。该方法进一步描述在Ward等人的美国专利号6,165,745中。在另一个实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。多种方法都是可以的。例如，可以导入一种或多种下列突变：T252L、T254S、T256F，如Ward等人的美国专利号6,277,375所述。可选的，为了增加生物学半衰期，可以在CH1或CL区中改变抗体，以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的2个环中的补救受体(salvage receptor)结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022所述。在其他实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸，使得抗体具有与效应子配体改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法进一步描述在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中。在另一个实例中，可以用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法进一步描述在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中。在另一个实例中，改变CH2结构域的N端区域中氨基酸位置231至238中的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法进一步描述在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中。在另一个实例中，修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力，和/或增加抗体对Fc[γ]受体的亲和力，通过修饰下列位置上的一个或多个氨基酸：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法进一步描述在Presta的PCT公开WO 00/42072中。
因而，在优选的实施方案中，本发明提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括相对于亲本抗体的人IgG Fc区，包含至少一个氨基酸修饰的变体人IgG Fc区，而所述包含变体人IgG Fc区的抗体表现出相比亲本抗体改变的效应子功能。优选的，所述抗体包括变体人IgG1Fc区。更优选的是包括变体人IgG1Fc区的全长抗体。亲本抗体是结合人CD19的人源化抗体或其片段，并且除了在人IgG Fc区中的氨基酸修饰外，与包含变体人IgG Fc区的结合人CD19的人源化抗体相同，通常是具有天然的人IgG Fc区的抗体。氨基酸修饰优选是非同种型的。
改变的效应子功能通常是补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或C1q结合和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体对Fc[γ]受体的结合亲和力，优选补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。通过标准的体外测定测量CDC、C1q结合、ADCC和抗体对Fc[γ]受体的结合亲和力，所述测定是本领域已知的和可商购的。通常，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定测量ADCC，例如本申请实施例4中所述，通过基于细胞的测定测量CDC，例如本申请实施例10中所述。
在一个实施方案中，相比亲本抗体改变效应子功能的氨基酸修饰包括在选自269、274、276、298、324和334的氨基酸位置上的氨基酸取代，优选选自269、298和324，更优选298和/或324，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每一组成员的氨基酸位置。
在另一实施方案中，相比亲本抗体改变效应子功能的氨基酸修饰包括选自E269D、K274Q、N276K、S298A、S324N和K334R的氨基酸取代，优选选自E269D、S298A和S324N，更优选S298A和/或S324N，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每一组成员的氨基酸位置。
在另一实施方案中，相比亲本抗体改变效应子功能的氨基酸修饰包括在选自以下的氨基酸位置上的氨基酸取代的组合：269/274、269/276、269/298、269/324、269/334、274/276、274/298、274/324、274/334、276/298、276/324、276/334、298/324、298/334、324/334、269/274/276、269/274/298、269/274/324、269/274/334、269/276/298、269/276/324、269/276/334、269/298/324、269/298/334、274/276/298、274/276/324、274/276/334、274/298/324、274/298/334、276/298/324和276/298/334，优选选自274/276、269/298、298/324、274/276/334和269/298/324，更优选选自298/324和269/298/324，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每一组成员的氨基酸位置。
在另一实施方案中，相比亲本抗体改变效应子功能的氨基酸修饰包括选自以下的氨基酸取代的组合：E269D/K274Q、E269D/N276K、E269D/S298A、E269D/S324N、E269D/K334R、K274Q/N276K、K274Q/S298A、K274Q/S324N、K274Q/K334R、N276K/S298A、N276K/S324N、N276K/K334R、S298A/S324N、S298A/K334R、S324N/K334R、E269D/K274Q/N276K、E269D/K274Q/S298A、E269D/K274Q/S324N、E269D/K274Q/K334R、E269D/N276K/S298A、E269D/N276K/S324N、E269D/N276K/K334R、E269D/S298A/S324N、E269D/S298A/K334R、K274Q/N276K/S298A、K274Q/N276K/S324N、K274Q/N276K/K334R、K274Q/S298A/S324N、K274Q/S298A/K334R、N276K/S298A/S324N和N276K/S298A/K334R，优选选自K274Q/N276K、E269D/S298A、S298A/S324N、K274Q/N276K/K334R和E269D/S298A/S324N，更优选选自S298A/S324N和E269D/S298A/S324N，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每一组成员的氨基酸位置。
优选的，包含变体人IgG Fc区的本发明的人源化抗CD19抗体在如上所述的体外测定中表现出相比亲本抗体改善的CDC。本文中使用的表现出的改善的CDC包括a)相比亲本抗体表现出增强的CDC，即，亲本抗体已表现出CDC，所述CDC通过人IgG Fc区的氨基酸修饰而增强，和b)相比亲本抗体重新表现出CDC，即，亲本抗体没有表现出CDC，因而通过人IgG Fc区的氨基酸修饰重新导入CDC。
在其他实施方案中，相比亲本抗体在体外测定中表现出改善的CDC的本发明的人源化抗CD19抗体的人IgG Fc区变体包括在选自以下的氨基酸位置上的氨基酸取代或氨基酸取代的组合：324、334、274/276、298/324、274/276/334和269/298/324，所述位置优选选自324、334、298/324、274/276/334和269/298/324，更优选选自324、298/324和269/298/324，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每一组成员的氨基酸位置。
在其他实施方案中，本发明的人源化抗CD19抗体的人IgG Fc区变体包括选自以下的氨基酸位置上的氨基酸取代或氨基酸取代的组合：S324N、K334R、K274Q/N276K、S298A/S324N、K274Q/N276K/K334R和E269D/S298A/S324N，优选选自S324N、K334R、S298A/S324N、K274Q/N276K/K334R和E269D/S298A/S324N，更优选选自S324N、S298A/S324N和E269D/S298A/S324N，所述人IgG Fc区变体相比亲本抗体在体外测定中表现出改善的CDC，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每一组成员的氨基酸位置。
在其他实施方案中，本发明的人源化抗CD19抗体的人IgG Fc区变体包括在选自以下的氨基酸位置上的氨基酸取代或氨基酸取代的组合：269、298、269/298、269/324、298/324和269/298/324，所述位置优选选自298、269/298、269/298/324，所述人IgG Fc区变体相比亲本抗体在体外测定中表现出改善的ADCC，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每一组成员的氨基酸位置。
在其他实施方案中，本发明的人源化抗CD19抗体的人IgG Fc区变体包括在选自以下的氨基酸位置上的氨基酸取代或氨基酸取代的组合：E269D、S298A、E269D/S298A、E269D/S324N、S298A/S324N和E269D/S298A/S324N，优选选自S298A、E269D/S298A和E269D/S298A/S324N，所述人IgG Fc区变体相比亲本抗体在体外测定中表现出改善的ADCC，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每一组成员的氨基酸位置。
本发明提供的结合人CD19并相比亲本人源化抗体表现出改变的效应子功能的特别优选的人源化抗体或其片段是这样的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：114(VH16R94K/S298A)的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ ID NO：65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的轻链序列；包含SEQ ID NO：115(VH16R94K/E269D/S298A)的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ ID NO：65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的轻链序列；包含SEQ ID NO：116(VH16R94K/S298A/S324N)的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ ID NO：65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的轻链序列；包含SEQ ID NO：117(VH16R94K/E269D/S298A/S324N)的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ ID NO：65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的轻链序列；包含SEQ ID NO：118(VH16R94K/S324N)的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ ID NO：65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的轻链序列；包含SEQ ID NO：119(VH16R94K/K274Q)的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ ID NO：65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的轻链序列；包含SEQ ID NO：120(VH16R94K/N276K)的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ ID NO：65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的轻链序列；包含SEQ ID NO：121(VH16R94K/K334R)的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ ID NO：65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的轻链序列；包含SEQ ID NO：122(VH16R94K/K274Q/N276K)的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ ID NO：65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的轻链序列；或者包含SEQ ID NO：123(VH16R94K/K274Q/N276K/K334R)的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ ID NO：65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的轻链序列。
本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中所述抗体包括变体人IgG Fc区，所述变体人IgG Fc区包括用天冬酰胺替换亲本抗体的氨基酸324位的丝氨酸的氨基酸取代S324N，而包括所述变体人IgGFc区的抗体相比亲本抗体表现出改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)。优选的所述抗体包括变体人IgG1Fc区。更优选的是包括变体人IgG1Fc区的全长抗体。令人惊讶的发现，如实施例10所述，在氨基酸324位的16种不同的氨基酸取代中，相比亲本抗体，取代S324N显著地改善了CDC，而其他的取代相比亲本抗体没有改善CDC。在不受理论约束的条件下，S324N取代对CDC的这一预料不到的选择性影响似乎是由于与人补体组分C1q的增强的结合。
本发明还提供了包括人IgG Fc区的结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中与所述人IgG Fc区连接的成熟核心糖类结构缺乏岩藻糖。优选的，所述抗体包括人IgG1Fc区，其中与所述人IgG1Fc区连接的成熟核心糖类结构缺乏岩藻糖。更优选的是包括人IgG1Fc区的全长抗体，其中与所述人IgG1Fc区连接的成熟核心糖类结构缺乏岩藻糖。从WO 2003/035835已知，与人IgG Fc区连接的成熟核心糖类结构缺乏岩藻糖可增强ADCC。因而，在其它实施方案中，本发明的人源化抗体或其片段包括这样的人IgGFc区，其中与所述人IgG Fc区连接的成熟核心糖类结构缺乏岩藻糖，而所述缺乏岩藻糖的抗体相比不缺乏岩藻糖的亲本人源化抗体或其片段表现出增强的ADCC。包括这样的人IgG Fc区的结合人CD19的优选抗体或其片段是包括包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的重链序列和包含SEQ IDNO：65的氨基酸序列的轻链序列的抗体，其中与所述人IgG Fc区连接的成熟核心糖类结构缺乏岩藻糖，而所述缺乏岩藻糖的抗体相比不缺乏岩藻糖的亲本人源化抗体或其片段表现出增强的ADCC。产生缺乏岩藻糖的抗体的方法是例如(a)使用改造或突变的宿主细胞，所述宿主细胞是岩藻糖代谢缺陷的，使得其对其中表达的蛋白质岩藻糖基化能力降低(或不能岩藻糖基化)；(b)在阻止或降低岩藻糖基化的条件下培养细胞；(c)翻译后去除岩藻糖(例如，使用岩藻糖苷酶)；(d)翻译后添加理想的糖类，例如，在重组表达未糖基化的糖蛋白之后；或者(e)纯化糖蛋白，选择没有岩藻糖基化的产物。优选使用的是实施例14描述的方法，例如Longmore等人(1982)Carbohydr.Res.365-92或Imai-Nishiya等人，(2007)，BMCBiotechnol.7，84中描述的方法。
抗CD19抗体特性
评估抗体例如人CD19的抗体的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、Western印迹、RIA和流式细胞仪分析。合适的测定详细描述在实施例中。也可以通过本领域已知的标准测定来评估抗体的结合动力学(例如，结合亲和力如Kd)，例如Scatchard或Biacore<(R)>系统分析，并可如例如实施例3所述实施和计算。可以通过本领域已知的标准竞争性测定来评估相对结合亲和力Ki，并可如例如实施例3所述实施和计算。为了评估结合，可以使用Raji肿瘤细胞(人伯基特淋巴瘤，DSMZACC319)、NALM-6(人B细胞前体白血病，DSMZ AC128)或SU-DHL-6(人B细胞淋巴瘤，DSMZ ACC572)，优选使用Raji肿瘤细胞，例如人伯基特淋巴瘤，DSMZ ACC319或SU-DHL-6(人B细胞淋巴瘤，DSMZACC572)，更优选使用Raji肿瘤细胞，例如人伯基特淋巴瘤，DSMZACC319。可以从公众可获得的来源获得这些细胞，例如DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，德国，并可用于标准测定例如流式细胞分析。可用于本发明测定中的相应嵌合抗体通常是鼠抗体FMC63的嵌合版，其由与人IgG1重链恒定结构域融合的FMC63鼠重链可变结构域，和与κ恒定结构域融合的鼠轻链可变结构域组成。优选用于本发明测定中的相应嵌合抗体是抗体FMC63的嵌合版，其包括包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的重链序列，与包含SEQID NO：69的氨基酸序列的轻链序列。亲本非人源化抗体或可用于本发明测定中的相应亲本非人源化抗体通常是鼠抗体，特别是鼠抗体FMC63。
本发明还提供了结合Raji肿瘤细胞的人源化抗体或其片段，其相对于相应嵌合抗体的结合的中点荧光(MPF)为至少10％。Raji肿瘤细胞在表面上表达人源化抗体或其片段可以结合的CD19。可以使用流式细胞仪根据测量染色细胞的平均荧光强度(MFI)对比抗体浓度来获得中点荧光值。优选的，相对于相应嵌合抗体的结合，人源化抗体或其片段结合Raji肿瘤细胞的MPF为至少30％，更优选至少50％，最优选至少70％，特别是至少80％，更特别是至少90％，最特别是至少95％。如上文所述的Raji肿瘤细胞可用于评估与CD19的结合。
本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，其亲和力(Kd)为50nM或更低，特别是40nM或更低，更特别是30nM或更低，甚至更特别是20nM或更低，最特别是15nM或更低。如上文所述的Raji肿瘤细胞可用于评估与人CD19的结合。
本发明还提供了保留了相应嵌合抗体的至少20％的CD19结合亲和力(Kd)的人源化抗体或其片段。优选的所述人源化抗体或其片段保留了相应嵌合抗体的至少40％，更优选至少60％，最优选至少80％，特别是至少90％，更特别是至少95％的CD19结合亲和力(Kd)。如上文所述的Raii肿瘤细胞或SU-DHL-6细胞可用于评估与人CD19的结合。
本发明还提供了这样的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段结合人CD19，且竞争结合Raji肿瘤细胞，所述结合的亲和力(Ki)为50nM或更低，优选20nM或更低，更优选10nM或更低，最优选5nM或更低，特别是4nM或更低，更特别是3nM或更低，最特别是至少约1.5nM至约5.0nM(例如，1.9；1.6或2.9至约2.6或4.9nM)。通常针对相应的嵌合抗体测量结合竞争，而如上文所述的Raji肿瘤细胞可用于评估Ki。
本发明还提供了这样的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段结合人CD19，且在Raji肿瘤细胞中诱导凋亡。可以通过膜联蛋白-V和碘化丙碇染色测量Raji肿瘤细胞中的凋亡诱导(Vermes等人，1995，J.Immunol.Methods.184：39-51)。根据相应的嵌合抗体对凋亡没有影响的事实，诱导凋亡是本发明的人源化抗体展现出的非常令人惊讶的特性。如上文所述的Raji肿瘤细胞可用于评估凋亡。因而，本发明还提供了这样的人源化抗体或其片段，其中在至少10％，优选至少15％，更优选至少20％，最优选至少25％的Raji肿瘤细胞中诱导凋亡。
本发明还提供了这样的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段结合人CD19，且在Raji肿瘤细胞中诱导ADCC。可以使用例如乳酸脱氢酶释放测定(CytoTox 96非放射性测定，Promega，Madison，USA)，来评估如上文所述的靶细胞，例如Raji肿瘤细胞的ADCC相关性特异性裂解。令人惊讶的是，结合人CD19的人源化抗体或其片段在Raji肿瘤细胞中诱导的ADCC活性等于，甚至大于相应的嵌合抗体诱导的ADCC活性。优选的，结合CD19的人源化抗体或其片段具有相应的嵌合抗体至少80％，更优选至少100％，最优选至少120％的ADCC活性。
本发明还提供了这样的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段结合人CD19，且抑制恶性B细胞的增殖。优选的，所述人源化抗体或其片段保留了相应嵌合抗体的至少60％，更优选至少80％，最优选至少90％，特别是95％，更特别是100％的对恶性B细胞增殖的抑制。为了测量抗体对细胞增殖的抑制，可以使用如上文所述的Raji肿瘤细胞或SU-DHL-6细胞评估恶性B细胞增殖。
本发明还提供了这样的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段结合人CD19，且抑制Raji肿瘤细胞的克隆发生。通过在用抗体处理后计数克隆数，测量对克隆发生的抑制，可根据例如Nahimana等人，2009，Blood.0：blood-2008-08-173369v1”(Blood，2009，卷113，No.14，pp.3276-3286)进行。可以使用如上文所述的Raji肿瘤细胞评估克隆发生。在用本发明的人源化抗体处理后计数的克隆数比用相应嵌合抗体处理后计数的克隆数少至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，最优选至少60％。对Raji肿瘤细胞的克隆发生的抑制验证了本发明的人源化抗体对恶性B细胞增殖的强抑制功能。
本发明还提供了这样的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段结合人CD19，且导致血液中的B细胞耗尽。优选的，所导致的B细胞耗尽与相应嵌合抗体导致的B细胞耗尽至少相同，优选是其至少1.5倍，更优选是其至少2倍。可以如实施例所述，通过用抗体孵育后，确定全血中的％阳性B细胞，来评估B细胞耗尽。
本发明还提供了这样的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段结合人CD19，且在Raji肿瘤细胞中内化。本发明的人源化抗体或其片段的内化程度可与相应嵌合抗体的内化程度相比。优选的，以0.01μg/ml使用的本发明的人源化抗体的内化程度是相应嵌合抗体的内化程度的50％和150％之间，更优选60％和140％之间，最优选70％和130％之间。可以使用例如与毒素肥皂草毒蛋白缀合的次级抗人抗体，在如上文所述的Raji肿瘤细胞上评估抗体内化(Hum-Zap，Advanced Targeting Systems，San Diego，CA，USA)。
本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段具有热稳定温度大于65℃，优选大于70℃，更优选大于75℃，最优选大于80℃的FAB片段。为了分析FAB片段的热稳定性，使用差示扫描量热法，而鉴别在全长IgG背景中的FAB片段的中点熔融温度。这类量热法测量是技术人员已知的，可根据例如Garber和Demarest(2007)，BBRC 355：751-7进行。令人惊讶的是，已发现本发明的人源化抗体具有等于相应嵌合抗体的FAB片段热稳定温度。因而，本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段具有等于相应嵌合抗体的FAB片段热稳定温度的FAB片段热稳定温度。
核酸、载体和宿主细胞
本发明还提供了编码结合人CD19的人源化抗体和其片段分离的核酸、载体以及包含所述核酸或载体的宿主细胞。核酸可位于完整细胞中、细胞裂解液中或者以部分纯化的或基本纯化的形式。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域普遍已知的技术，与其他细胞组分或其他污染物(例如，其他的细胞核酸或蛋白质)纯化分离时，核酸是“分离的”或“使得基本纯的”，参见例如F.Ausubel，等人编著，(1987)Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，可以含有或不含内含子序列。在优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸，例如可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术，获得编码抗体的轻链和重链或者编码VH和VL区段的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从文库回收编码抗体的一种或多种核酸。向宿主细胞中导入外源核酸的方法是本领域普遍已知的，并可随所使用的宿主细胞而变化。技术包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、氯化钙处理、聚凝胺(polybrene)介导的转染，原生质体融合、电穿孔、病毒或噬菌体感染、在脂质体中封装多核苷酸和直接显微注射DNA到核中。在哺乳动物细胞的情况下，转染可以是瞬时或稳定的。
优选的本发明核酸分子是编码选自SEQ ID NO：25，38，39，40，48，49，50，51，52，53，56，57，58，59，60，61，62和63的轻链可变区，和/或选自SEQID NO：33，34，35，36，37，43，44，45，46，47，54和55的重链可变区的那些。更优选的是这样的核酸分子，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；编码包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQID NO：116的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：118的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ IDNO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列；或编码包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
本发明还提供了分离的核酸，其包括结合人CD19的人源化FMC63变体的重链编码核酸序列，于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物中，具有登录号DSM 23302。由保藏的结合人CD19的人源化FMC63变体的核酸序列编码的重链包括包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和包含SEQ IDNO：29的氨基酸序列的重链CDR3。
本发明还提供了分离的核酸，其包括结合人CD19的人源化FMC63变体的轻链编码核酸序列，于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物中，具有登录号DSM 23303。由保藏的结合人CD19的人源化FMC63变体的核酸序列编码的轻链包括包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和包含SEQ IDNO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。
因而，本发明还提供了这样的结合人CD19的人源化抗体或其片段，其由包含结合人CD19的人源化FMC63变体的重链编码核酸序列的分离的核酸和包括结合人CD19的人源化FMC63变体的轻链编码核酸序列的分离的核酸所编码，所述重链编码核酸序列于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物中，具有登录号DSM 23302，所述轻链编码核酸序列于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物中，具有登录号DSM 23303。
在一个实施方案中，由分离的核酸编码的结合人CD19的人源化抗体或其片段包括变体人IgG Fc区，优选变体人IgG1Fc区，其中所述分离的核酸包括结合人CD19的人源化FMC63变体的重链编码核酸序列，所述重链编码核酸序列于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物中，具有登录号DSM 23302，所述变体人IgG Fc区包括在选自269，274，276，298，324和334，优选选自269，298和324，更优选298和/或324的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每一组成员的氨基酸位置。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，则可以通过标准的重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因，或转化为对应于上文所述片段的片段基因，如Fab片段或转化为scFv基因。在这些操作中，将VL或VH编码DNA片段有效的连接至编码另一种蛋白质的另一种DNA片段上，例如抗体恒定区或柔性接头。该上下文中使用的术语“有效连接”意指连接两个DNA片段，使得所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框内。通过将VH编码DNA与另一种编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子有效连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。这些人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)，可以通过标准PCR扩增获得涵盖了这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将V[pi]-编码DNA与另一种只编码重链CH1恒定区的DNA分子有效连接。通过将VL编码DNA与另一种编码轻链恒定区CL的DNA分子有效连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。这些人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences ofProteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and HumanServices.NIH Publication No.91-3242)，可以通过标准PCR扩增获得涵盖了这些区域的DNA片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，优选κ恒定区。为了产生scFv基因，可以将VH和VL-编码DNA片段与另一种编码柔性接头的片段有效连接，例如，编码氨基酸序列(GIy4-Ser)3的片段，使得VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白质表达，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如，Bird等人，(1988)Science242：423-426；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.ScL USA85：5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554)。已开发了各种技术生产人源化抗体的抗体片段。传统上，这些片段源自完整抗体的蛋白质水解消化(参见例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical andBiophysical Methods，24：107-117(1992)；和Brennan等人，Science，229：81(1985))。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接生产这些片段。例如，可以从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。可选的，可以从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，并将其化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology，10：163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab′)2片段。生产抗体片段的其他技术对熟练的技术人员而言是显而易见的。在其他实施方案中，选定的抗体是单链Fv片段(scFv)，参见例如WO 1993/16185；美国专利号5,571,894和美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利号5,641,870所述。
为了表达蛋白质，可以将编码本发明抗体的核酸整合到表达载体中。多种表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可包括自我复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。构建的表达载体与宿主细胞类型是可相容的。因而，可用于本发明的表达载体包括但不限于使蛋白质能够在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外系统中表达的那些。如本领域已知的，多种表达载体是可商业或其他方式获得的，可用于本发明中来表达抗体。
表达载体通常包括与控制或调控序列、可选择的标志物、任何融合伙伴和/或其他元件有效连接的蛋白质。本文中，“有效连接”意指核酸置于与另一种核酸序列的功能性关联中。术语“调控序列”意在包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology，Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中。一般而言，这些表达载体包括与编码抗体的核酸有效连接的转录和翻译调控核酸，且通常对用于表达所述蛋白质的宿主细胞是恰当的。一般而言，转录和翻译调控序列可包括启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，和增强子或激活子序列。还如本领域已知的，表达载体通常含有选择基因或标志物，允许选择含有表达载体的转化的宿主细胞。选择基因是本领域普遍已知的，可随使用的宿主细胞而变化。例如，通常可选择的标志物基因赋予已导入载体的宿主细胞对药物的抗性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤。优选的可选择的标志物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用氨甲喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中)和neo基因(用于G418选择)。
用于在克隆或表达本文载体中的DNA的合适的宿主细胞是原核细胞、酵母或更高等的真核细胞。用于该目的的合适的原核细胞包括真细菌，包括革兰氏阴性生物或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷菌属(Serratia)例如粘质沙雷菌(Serratia marcescans)，和志贺菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。合适的大肠杆菌克隆宿主包括大肠杆菌294(ATCC 31，446)、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)。
除原核细胞外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是合适的克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通的贝克酵母是最常用的。然而，多种其他属、种和菌株通常是可获得且有效的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharoriyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，包括乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16，045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24，178)、K.WaItH(AJCC 56，500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosopmarum)(ATCC 36，906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)或K.marxianusyarrowia(EP 402226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183，070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia(EP244234))；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，包括链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium或曲霉属(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)。
用于表达本发明的人源化抗体的合适的宿主细胞源自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括plaril和昆虫细胞。已鉴别了多种杆状病毒菌株和变体，与相应的许可昆虫宿主细胞，所述细胞来自宿主例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes augypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的多种病毒菌株是公众可获得的，例如苜蓿尺蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，此类病毒可特别用于转染草地贪夜蛾细胞。还可以利用棉花、玉米、土豆、大豆、牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
用于表达本发明的重组抗体的宿主细胞优选的是哺乳动物宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr<->CHO细胞，描述在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.ScL USA 77：4216-4220中，与DHFR可选择标志物一起使用，例如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)J.MoI.Biol 159：601-621所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别的，为了与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统是GS基因表达系统，公开在WO 87/04462(Wilson)、WO 89/01036(Bebbington)和EP 338841(Bebbington)中。当将重组的抗体基因导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一定时间来生产抗体，所述时间足以允许抗体在所述宿主细胞中的表达，或更优选的，允许抗体分泌到所述宿主细胞生长的培养基中。可以在多种培养基中培养用于生产结合人CD19的抗体的宿主细胞。可商购的培养基例如Ham′s F10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma或Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium((DMEM)，Sigma))适合培养宿主细胞。可以使用标准的蛋白质纯化方法，从培养基中回收抗体。
抗体可与融合伙伴有效连接，使得能够进行表达的蛋白质的靶向、纯化、筛选、展示等。融合伙伴可通过接头序列与抗体序列连接。接头序列一般包括少量氨基酸，通常少于10个，但也可以使用更长的接头。通常，选择柔性且抗降解的接头序列。对本领域技术人员显而易见的是，任一种多样的序列都可用作接头。例如，普通的接头序列包括氨基酸序列GGGGS。融合伙伴(parterner)可以是靶向序列或信号序列，指导抗体和任何相关的融合伙伴到达理想的细胞位置或胞外基质中。如本领域已知的，某些信号序列可以将蛋白质靶向分泌到生长基质中，或位于细胞的内膜和外膜之间的周质空间中。融合伙伴还可以是编码使得能够纯化和/或筛选的肽或蛋白质的序列。此类融合伙伴包括但不限于多聚组氨酸标签(His-tag)(例如H6和H10或其它与固定化金属亲和层析(IMAC)系统一起使用的标签(例如，Ni<+2>亲和柱))、GST融合物、MBP融合物、Strep-标签、细菌酶BirA的BSP生物素化靶序列，和由抗体靶向的表位标签(例如c-myc标签、flag标签等)。对本领域技术人员显而易见的是，此类标签可用于纯化、筛选或两者。
构建和生产抗体
通过技术人员已知的重组DNA技术生产抗体。此外，可以通过酶促或化学切割天然存在的抗体，来生产抗体。可以通过将来自非人动物(例如小鼠)的VH和/或VL区的一个或多个CDR或其部分转移至人VH和/或VL区的一个或多个框架区上，来构建本发明的人源化抗体。任选的，当减少抗体的免疫原性和/或维持结合亲和力需要或理想时，可以通过相应的非人(例如小鼠)残基替换位于VH和/或VL区中的人框架残基。任选的，可以用人残基替换位于CDR中的非人氨基酸残基。可以基于如上所述制备的非人单克隆抗体的序列，来制备本发明的嵌合或人源化抗体。可以从目的非人杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准的分子生物学技术将其改造为含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区与人恒定区连接(参见例如，Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入到人框架中(参见例如，Winter等人的美国专利号5,225,539，和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
可以构建本发明的人源化抗体，其中基于在潜在的受体分子可变区和鼠抗体重链可变区之间的同源性的考虑，来选择重链可变区的人受体分子。种系候选人受体分子优选是降低潜在的免疫原性的。种系数据库由读取时穿过重链FW3区的末端且部分至CDR3序列的抗体序列构成。为了选择FW4区，可以搜索源自选定的种系分子的成熟抗体序列数据库，或使用源自人类供体的选定的种系分子的抗体序列。人受体分子优选选自与鼠供体分子相同的重链类型，而且是与鼠供体分子的可变区相同的经典结构类型。针对重链可变区选择人受体分子的次要考虑是规避鼠供体分子和人受体分子之间在CDR长度上的同源性。优选通过搜索V-BASE数据库的同源性，来选择人受体抗体分子，但也可以使用其他数据库如Kabat和公开的NCBI数据库。
可以构建本发明的人源化抗体，其中基于在潜在的受体分子可变区和鼠抗体轻链可变区之间的同源性的考虑，来选择轻链可变区的人受体分子。种系候选人受体分子优选是降低潜在的免疫原性的。种系数据库由读取时穿过重链FW3区的末端且部分至CDR3序列的抗体序列构成。为了选择FW4区，可以搜索源自选定的种系分子的成熟抗体数据库，或使用源自人类供体的选定的种系分子的抗体序列。人受体分子优选选自与鼠供体分子相同的轻链类型，且是与小鼠供体分子的可变区相同的经典结构类型。针对轻链可变区选择人受体分子的次要考虑包括鼠供体分子和人受体分子之间在CDR长度上的同源性。优选通过V-BASE数据库的同源性搜索，来选择人受体抗体分子，但也可以使用其他数据库如Kabat和公开的NCBI数据库。人源化非人抗体的方法如本文所述，包括下文实施例。
本发明提供了生产结合人CD19的人源化抗体或其片段的方法，包括培养包含分离的核酸(编码结合人CD19的人源化抗体或其片段)或包含含有分离的核酸(编码结合人CD19的人源化抗体或其片段)的载体的宿主细胞，使得核酸表达并生产抗体。优选分离所述抗体。
可以使用上文所述作为宿主细胞、核酸和载体。可以通过例如本领域普遍已知的(例如，Morrison，S.(1985)Science 229：1202)和上文进一步概述的重组DNA技术和基因转染方法的组合，获得核酸表达。例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如PCR扩增或使用表达目标抗体的杂交瘤的cDNA克隆)获得编码部分或全长的轻链和重链DNA，并可将所述DNA插入到载体中，例如表达载体。选择的表达载体和表达控制序列与所使用的表达宿主细胞是可相容的。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到分离的载体中，或更通常的，两种基因都插入到同一表达载体中。通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上互补的限制性位点，或者如果不存在限制性位点时平端连接)将抗体基因插入到表达载体中。通过将本文所述的抗体轻链和重链可变区插入到已编码理想同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段与载体内的CH区段有效连接，VK区段与载体内的CL区段有效连接，将其用来产生任何抗体同种型的全长抗体基因。
抗CD19抗体的表征和纯化
可以测试本发明的抗体与人CD19的结合，通过例如标准的ELISA或与Raji肿瘤细胞的结合。可以以本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化本发明的抗体。标准的纯化方法包括层析技术，包括在大气压下进行的离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析、尺寸层析或凝胶过滤层析，和反相层析，或使用系统例如FPLC和HPLC在高压下进行。纯化方法还包括电泳的、免疫学的、沉淀、透析和层析聚焦技术。超滤和透析过滤技术也可与蛋白质浓缩结合使用。为了纯化抗CD19抗体，可以在例如用于单克隆抗体纯化的转瓶中生长选定的宿主细胞。在用蛋白A琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)的亲和层析之前，可以过滤和浓缩上清液。可以通过凝胶电泳和高效液相层析检测洗脱的IgG，以保证纯度。
免疫缀合物
在另一个方面，本发明提供了与治疗剂连接的结合人CD19的人源化抗CD19抗体或其片段，所述治疗剂例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素。此类缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞致命(例如杀死细胞)的任何活性剂。实例包括紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-脱氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)，和嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同源物。治疗剂还包括例如抗代谢剂(例如，氨甲蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracil decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥(mechlorethamine、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycinC)和顺式-二氯二胺铂(II)(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)顺铂(cisplatin)、蒽环类(anthracyclines)(例如，柔红霉素(daunorubicin)(原道诺霉素(daunomycin)和多柔比星(doxorubicin)、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(原放线菌素(actinomycin))、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin)(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))。可以与本发明抗体连接的治疗性细胞毒素的其他实例包括多卡米星(duocarmycins)、加利车霉素(calicheamicins)、美坦辛(maytansines)和auristatins，及其衍生物。加利车霉素抗体缀合物的实例是可商购的(
Figure BDA0000100909380000481
American Home Products)。可以使用本领域可获得的接头技术连接本发明的抗体与细胞毒素。用于缀合细胞毒素与抗体的接头类型的实例包括但不限于腙硫醚、酯、二硫化物和含肽接头。可以选择例如对溶酶体区室内的低pH切割敏感的或对蛋白酶切割敏感的接头，所述蛋白酶例如在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D)。关于细胞毒素、接头类型和将治疗剂与抗体缀合的方法的进一步讨论，还参见Saito，G等人，(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A等人，(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，CJ.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。本发明的抗体还可与放射性同位素连接，产生细胞毒性的放射药物，也被称为放射性免疫缀合物。可与用于诊断或治疗性抗体缀合的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域已建立了制备放射性免疫缀合物的方法。放射性免疫缀合物的实例是可商购的，包括
Figure BDA0000100909380000491
(EDEC Pharmaceuticals)和
Figure BDA0000100909380000492
(Corixa Pharmaceuticals)，相似的方法可用于制备使用本发明抗体的放射性免疫缀合物。本发明的抗体免疫缀合物可用于修饰给定的生物学应答，而药物部分不被视为限制于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有理想生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括例如酶促活性毒素，或其活性片段，例如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白A(ricinA)、假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)；蛋白质例如肿瘤坏死因子或干扰素-[γ]；或生物学应答修饰剂，例如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其它生长因子。
连接此类治疗剂与抗体的技术是普遍已知的，参见例如Arnon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编著)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(编著)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(编著)，第475-506页(1985)；″Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy，Baldwin等人(编著)，第303-16页(Academic Press 1985)和Thorpe等人，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包括本发明的人源化抗体或其片段和药学可接受的载体。此类组合物可包括一种本发明的抗体或免疫缀合物，或其组合(例如，两种或多种不同的抗体或免疫缀合物)。例如，本发明的药物组合物包括结合靶抗原的不同表位，或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物)的组合。本发明的药物组合物还可以在组合疗法中施用，即与其它活性剂组合。例如，组合疗法可包括与至少一种其它的抗炎剂或免疫抑制剂组合的本发明的抗CD19抗体。
本文中使用的“药学可接受的载体”包括任意的和所有的溶剂、分散基质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗的和延迟吸附的活性剂，以及诸如此类生理学相容的。优选的，载体是适合静脉内、肌内、皮下、不经肠道的、脊柱的或表皮施用的(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物(即，抗体或免疫缀合物)可包被在材料中，保护所述化合物免受可能灭活所述化合物的酸和其它天然条件的作用。药学可接受的载体包括无菌的含水溶液或分散液，和用于即时制备的无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类基质和活性剂用于药学活性物质的用途是本领域已知的。除非是与所述活性化合物不相容的任何常规基质或活性剂，否则可考虑其在本发明的药物组合物中的用途。补充的活性化合物也可被掺入到所述组合物中。
在另一个方面，本发明提供了包含免疫缀合物和药学可接受的载体的组合物，所述免疫缀合物包括与治疗剂连接的结合人CD19的人源化抗体或其片段。可如上文所述使用免疫缀合物和治疗剂。
本发明的药物组合物还可包括药学可接受的抗氧化剂。药学可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酰抗坏血酸酯(ascorbyl palmitate)、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可用于本发明的药物组合物中的合适的含水和不含水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油例如橄榄油，和可注射的有机酯例如油酸乙酯。例如通过使用包被材料(如卵磷脂)，通过维持所需的颗粒大小(分散体的情形下)和通过使用表面活性剂，可以维持恰当的流动性。这些组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的灭菌程序和通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂来确保防止存在微生物，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、山梨酸苯酚(phenol sorbic acid)等。组合物中包括等渗剂也是理想的，例如糖、氯化钠等。此外，通过包括延迟吸附的后星级，例如单硬脂酸铝和明胶，可以产生可注射的药物形式的延长吸附。
治疗和其他用途
本发明的人源化抗体具有多种体外和体内的诊断和治疗性用途，涉及CD19介导的病症的诊断和治疗。例如，可以在体外或离体条件下，将这些分子施用给培养的细胞，或例如在体内条件下，施用给人类对象，来治疗、预防和诊断多种CD19介导的病症。优选的对象是人，包括患CD19活性介导的病症(CD19介导的病症)的患者。方法特别适合治疗患与异常B细胞群体相关的CD19介导的病症的人类患者。
出于本发明的目的，“患者”包括人和其他动物，优选哺乳动物和最优选人。因而，本发明的抗体同时具有人类治疗和兽医应用。本发明中的术语“治疗”意在包括治疗性治疗，以及对疾病或病症的预防性或抑制性的手段。因而，例如，在疾病发动前成功的施用抗体，导致疾病的治疗。作为另一个实例，在疾病的临床表征后成功的施用抗体，来抗争疾病的症状，包括疾病的治疗。“治疗”还涵盖了在疾病出现后，为了消除所述疾病而施用抗体。在发动后或出现临床症状后成功的施用抗体，伴随临床症状的可能的减轻以及也许疾病的缓解，包括了疾病的治疗。上述“需要治疗的”包括已患所述疾病或病症的，以及倾向于患所述疾病或病症的哺乳动物，包括要被预防疾病或病症的那些。
在特定的实施方案中，人源化抗体在体内用于治疗、预防或诊断多种CD19介导的疾病。因而，本发明提供了在对象中治疗CD19介导的病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的人源化抗体或其片段。示例性的CD19介导的病症包括包含类风湿性关节炎的自身免疫病症，癌症、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、急性淋巴细胞白血病(acutelymphocytic leukemia)(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocyticleukemia)(CLL)、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large-cell lymphomas)(ALCL)、皮肤T-细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphomas)、结节性小裂细胞淋巴瘤(nodular small cleaved-cell lymphomas)、外周T-细胞性淋巴瘤(peripheral T-cell lymphomas)、伦纳特淋巴瘤(Lennert′s lymphomas)、免疫母细胞性淋巴瘤(immunoblastic lymphomas)、T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)(T-cell leukemia/lymphomas)、成人T-细胞白血病(adult T-cellleukemia)(T-ALL)、内分芽型/中心细胞性(cb/cc)滤泡型淋巴瘤癌症(entroblastic/centrocytic(cb/cc)follicular lymphomas cancers)、B系弥漫性大细胞淋巴瘤(diffuse large cell lymphomas of B lineage)、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)-样T细胞性淋巴瘤(angioimmunoblasticlymphadenopathy(AILD)-like T cell lymphoma)、HIV相关性体腔淋巴瘤(HIV associated body cavity based lymphomas)、胚性癌(EmbryonalCarcinomas)、鼻咽部的未分化癌(undifferentiated carcinomas of therhino-pharynx)(例如，施明克瘤(Schmincke′s tumor))、卡斯尔曼病(Castleman′s disease)、卡波氏肉瘤(Kaposi′s Sarcoma)、多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma)、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′smacroglobulinemia)、抗CD20抗体耐受性B细胞癌症和其他的B细胞淋巴瘤和白血病。抗CD20抗体耐受性B细胞癌症是例如利妥昔单抗
Figure BDA0000100909380000531
耐受性B细胞癌症，这是优选的抗CD20抗体耐受性B细胞癌症。优选的癌症是血液癌症，尤其是涉及表达CD19的淋巴瘤和白血病的癌症，特别是非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多毛细胞白血病。用本发明的抗体治疗的优选的CD19介导的病症选自非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多毛细胞白血病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)和抗CD20抗体耐受性B细胞癌症。用本发明的抗体治疗的更优选的CD19介导的病症是类风湿性关节炎、非霍奇金淋巴瘤或抗CD20抗体耐受性B细胞癌症。
“自身免疫病症”包括同种异体胰岛移植排斥(allogenic islet graftrejection)、斑秃(alopecia areata)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome)、自身免疫性艾迪生病(autoimmune Addison′s disease)、抗嗜中性粒细胞细胞质自身抗体(antineutrophil cytoplasmic autoantibodies)(ANCA)、肾上腺的自身免疫病(autoimmune diseases of the adrenal gland)、自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、自身免疫性心肌炎(autoimmune myocarditis)、自身免疫性嗜中性白血球减少症(autoimmune neutropenia)、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎(autoimmuneoophoritis and orchitis)、自身免疫性血小板减少症(autoimmunethrombocytopenia)、自身免疫性风疹(autoimmune urticaria)、白塞氏病(Behcet′s disease)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、心肌病(cardiomyopathy)、Castleman氏综合征(Castleman′s syndrome)、celiacspruce-dermatitis、慢性疲劳免疫机能失常综合征(chronic fatigue immunedisfunction syndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(chronic inflammatorydemyelinating polyneuropathy)、丘斯综合征(Churg-Strauss syndrome)、疤痕性类天疱疮(cicatrical pemphigoid)、CREST综合征(CRESTsyndrome)、冷凝集素疾病(cold agglutinin disease)、克罗恩氏病(Crohn′sdisease)、皮肌炎(dermatomyositis)、盘状狼疮(discoid lupus)、特发性混合性冷球蛋白血症(essential mixed cryoglobulinemia)、因子VIII缺陷(factor  VIII deficiency)、纤维肌痛-纤维肌炎(fibromyalgia-fibromyositis)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、格雷夫斯氏病(Grave′s disease)、Guillain-Barre，古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′s syndrome)、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease(GVHD))、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、血友病A(hemophilia A)、特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis)、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenia purpura)(ITP)、IgA神经病(IgA neuropathy)、IgM多发性神经病(IgM polyneuropathies)、免疫介导的血小板减少症(immune mediated thrombocytopenia)、青春期关节炎(juvenile arthritis)、川崎病(Kawasaki′s disease)、lichen planrus、红斑狼疮(lupus erthematosis)、美尼尔氏病(Meniere′s disease)、混合型结缔组织病(mixed connective tissue disease)、多发性硬化(multiplesclerosis(MS))、I型糖尿病(type 1diabetes mellitus)、重症肌无力(myasthenia gravis)、寻常天疱疮(pemphigus vulgaris)、恶性贫血(pernicious anemia)、结节性多发性动脉炎(polyarteritis nodosa)、多软骨炎(polychondritis)、多腺体综合征(polyglandular syndromes)、风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatica)、多肌炎(polymyositis)和皮肌炎(dermatomyositis)、原发性无丙种球蛋白血症(primaryagammaglobinulinemia)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、银屑病(psoriasis)、牛皮癣关节炎(psoriatic arthritis)、Reynauld氏现象(Reynauld′s phenomenon)、莱特尔综合征(Reiter′s syndrome)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)(RA)、肉状瘤病(sarcoidosis)、硬皮病(scleroderma)、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、实体器官移植排斥(solid organ transplant rejection)、僵人综合征(stiff-man syndrome)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)(SLE)、大动脉炎(takayasuarteritis)、暂时性动脉炎/巨细胞动脉炎(temporal arteristis/giant cellarteritis)、血栓性血小减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenia purpura)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、眼色素层炎(uveitis)、血管炎病(vasculitides)例如疱疹样皮炎脉管炎(dermatitis herpetiformis vasculitis)、白癜风(vitiligo)、与抗中性白细胞胞质抗体相关的脉管炎(anti-neutrophilcytoplasmic antibody associated vasculitis)、移植物抗宿主病(graft vs.hostdisease)、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、IgM介导的神经病(IgMmediated neuropathy)、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy)、斜视性眼阵挛(opsoclonusmyoclonus)和韦格纳氏肉芽肿病(Wegner′s granulomatosis)。
此外，考虑CD19在多种肿瘤细胞上的表达，并考虑如上所述本发明的人源化抗体或其片段抑制表达CD19的恶性B细胞增殖的事实，CD19介导的疾病优选是肿瘤发生性病症，如癌症，例如特征是存在表达CD19的肿瘤细胞的病症，包括例如非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多毛细胞白血病、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、结节性小裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞白血病(lymphocytic lymphomas)外周T-细胞性淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T-细胞白血病(T-ALL)、内分芽型/中心细胞性(cb/cc)滤泡型淋巴瘤癌症、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)-样T细胞性淋巴瘤、HIV相关性体腔淋巴瘤、胚性癌、鼻咽部的未分化癌(例如，施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波氏肉瘤、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、抗CD20抗体耐受性B细胞癌症和其他的B细胞淋巴瘤和白血病。
因而在其他方面，本发明提供了抑制表达CD19的肿瘤细胞生长的方法，包括将细胞与本发明的人源化抗体或其片段接触，其量有效的抑制肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞通常选自人伯基特淋巴瘤细胞、人B细胞前体白血病细胞、人B细胞白血病细胞或人B细胞淋巴瘤细胞，优选人伯基特淋巴瘤细胞或人B细胞淋巴瘤细胞。
考虑本发明的人源化抗体或其片段导致血液中的B细胞耗尽的事实，本发明还提供了耗尽对象中的B细胞的方法，包括向对象施用一定量的本发明的人源化抗体或其片段，所述量有效的耗尽对象中的B细胞。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于检测CD19的水平，或在其膜表面含有CD19的细胞的水平，所述水平之后可与某些疾病症状关联。可选的，抗体可用于抑制或阻断CD19功能，反过来可与某些疾病症状的预防或缓解相关，从而提示CD19作为疾病的介质。这可以通过在允许抗体和CD19之间形成复合体的条件下，将样品和对照样品与抗CD19抗体接触来实现。检测在抗体和CD19之间形成的任何复合体，并比较样品和对照。根据本发明抗体与CD19的特异性结合，本发明抗体可用于特异性检测细胞表面表达的CD19表达，进而可用于通过免疫亲和纯化来纯化CD19。
在另一个实施方案中，可以初步测试本发明抗体与治疗或体外诊断用途相关的结合活性。例如，可以使用下文实施例所述的流式细胞仪测定，来测试本发明的组合物。
本发明还提供了使用人源化抗体或其片段作为药物的用途，和人源化抗体或其片段在制备用于治疗CD19介导的病症的药物中的用途。在其他实施方案中，本发明提供了人源化抗体或其片段，其用作为药物。本发明还提供了人源化抗体或其片段，用在治疗CD19介导的病症的方法中。CD19介导的病症如上文所述。
如前所述，本发明的人抗CD19抗体可以和一种或其它多种治疗剂共同施用，例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂。抗体可以与活性剂连接(作为免疫复合物)或者可以与活性剂分别施用。在后一种情况下(分别施用)，可以在活性剂之前、之后或同时施用抗体，或者可以与其它已知的疗法共同施用抗体，所述疗法例如抗癌疗法，例如放射。
对于施用抗体，剂量范围从约0.0001至100mg/kg，更常见从0.01至10mg/kg的宿主体重。示例性的治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次或每3至6个月一次施用。通常在多种情况施用所述抗体。单次剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三月或每年。间隔还可以是不规律的，通过测量血液的抗体水平与患者中的靶抗原提示。在一些方法中，调节剂量获得约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，而在一些方法中，约25-300μg/ml。可选的，可以以持续释放的配方施用抗体，在此情况下需要较低的施用频率。剂量和频率根据患者中的抗体的半衰期而变化。施用的剂量和频率可以根据所述治疗是预防性还是治疗性而改变。在预防性应用中，在较长时间段中，以相对较不频繁的间隔，施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直到降低或终止疾病的进展。
活性成分的实际剂量(即，本发明的药物组合物中的抗体)是可以改变的，从而获得活性成分的这样的量，对于特定的患者、组合物和施用模式，所述量有效的实现理想的治疗响应，而对患者没有毒性。选定的剂量水平取决于多种药物动力学因子，包括所使用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定抗体的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、年龄、性别、体重、病况、健康状态和受治患者之前的药物史等本领域普遍已知的因素。
“治疗有效量”的本发明的抗CD19抗体优选导致疾病症状严重程度的减少、疾病无症状期的频率和持续期的增加，和/或预防由于病痛导致的损伤或残疾。例如，对于治疗肿瘤发生性病症(CD19<+>肿瘤)，相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，仍然更优选至少约80％。可以在预测人类肿瘤功效的动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。可选的，可以通过检验化合物抑制细胞生长的能力，来评估组合物的该特性，可以通过熟练的技术人员已知的测定在体外测量此类抑制作用。治疗有效量的治疗性化合物可以减小肿瘤尺寸，或者减轻对象的症状。本领域的普通技术人员将能够基于如下因素确定所述量，例如对象的尺寸、对象症状的严重程度，和所选定的特定组合物或施用途径。
可以利用本领域已知的各种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径，来施用本发明的抗体或组合物。如熟练的技术人员所理解的，施用的途径和/或方式将根据所需的结果而改变。优选的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱的或其它不经肠道的施用途径，例如通过注射或输注。更优选的施用途径是静脉内或皮下的。本文中使用的词组“不经肠道的施用”意指除肠和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、硬膜内、囊内、眶内(intraorbital)、心内(intracardiac)、皮内(intradermal)、腹膜内(intraperitoneaD、经气管的(transtracheal)、皮下、表皮下(subcuticular)、关节内(intraarticular)、囊下(subcapsular)、蛛网膜下(subarachnoid)、脊柱内(intraspinal)、硬膜外(epidural)和胸骨内(intrasternal)的注射和输注。可选的，可以通过非不经肠道的途径施用本发明的抗体，例如局部的、表皮的或粘膜的施用途径，例如鼻内、口服、阴道的、经直肠的、舌下的或局部的。
制品和药盒
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于治疗CD19介导的病症的、包括本发明的人源化抗体或其片段、组合物或免疫缀合物的制品。制品可包括容器，和与容器相关联或在其上的标签或包装内置物。合适的容器包括例如瓶、管状瓶或注射器。可以用多种材料形成容器，例如玻璃或塑料。容器保留对治疗疾病有效的的组合物，可具有无菌的入口(例如，容器可以是静脉内用溶液包或管状瓶，具有可被皮下注射针头穿刺的瓶塞)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的人源化抗体。标签或包装内置物可指示所述组合物可用于治疗的选择的疾病，例如癌症。在一个实施方案中，标签或包装内置物可指示包括人源化抗体的所述组合物可用于治疗CD19介导的病症。
此外，制品可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包括本文的人源化抗体，和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包括人源化抗体以外的治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品可进一步包括包装内置物，其指示第一和第二组合物可组合的用于治疗CD19介导的疾病或病症。此类治疗剂可以是上述章节中描述的任何附属疗法(例如，血栓溶解剂、抗血小板剂、化疗剂、抗血管发生剂、抗激素化合物、保心药和/或哺乳动物免疫功能的调节剂，包括细胞因子)。可选的或额外的，制品可还包括包含药学可接受的缓冲液的第二(或第三)容器，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格液(Ringer′s solution)和葡萄糖溶液。还可包括其他对商业和用户观点而言理想的材料，包括其他的缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
还落入本发明范围内的包括包含本发明的抗体、组合物或免疫缀合物和使用说明的药盒。药盒可进一步含有一种或多种其他试剂，例如免疫抑制剂、细胞毒性剂或放射毒性剂，或一种或多种其他的本发明的人源化抗体(例如，结合CD19中不同于第一人源化抗体的表位的人源化抗体，其具有补充活性)。
材料的保藏
下列材料保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)，Inhoffenstr.7B，38124Braunschweig，Germany中：
于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物(大肠杆菌)，具有登录号DSM 23303，其包含分离的核酸，所述核酸包含如实施例1所述结合人CD19的人源化FMC63变体的轻链编码核酸序列。于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物(大肠杆菌)，具有登录号DSM 23302，其包含分离的核酸，所述核酸包含如实施例1所述结合人CD19的人源化FMC63变体的重链编码核酸序列。这些保藏都是根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约及其规程中的布达佩斯条约的条款进行的(布达佩斯条约)。
不需进一步描述，可以相信本领域的普通技术人员可以利用上述说明和下列示例性实施例，制造和利用本发明的物质和实施要求保护的方法。下列工作实施例供促进本发明的实践所用，并非被视为对本发明其余内容的任何方式的限制。
实施例
实施例1：抗人CD19的小鼠单克隆FMC63抗体的人源化
本文描述了人源化抗人CD19的鼠抗体FMC63，包括人受体框架的选择、回复突变和基本保留和/或改善人CDR移植受体框架结合特性的突变。
FMC63是鼠IgG2a，从用人幼淋巴细胞白血病细胞系JVM3免疫的小鼠中分离的κ抗体(Zola H.等人，(1991)，Immunol Cell Biol.，69：411-22)，其可变区是已知的且公众可获得的(重链NCBI登录号：CAA74659(SEQ ID NO：1)；轻链NCBI登录号：CAA74660(SEQ ID NO：2))。测定抗原结合亲和力的方法是本领域普遍已知的，包括半最大结合测定、竞争测定和Scatchard印迹分析。
设计改造的可变区
选择人受体框架：使用同源性匹配来选择移植FMC63CDR的人受体框架。可使用数据库(例如，人和小鼠免疫球蛋白基因座的种系可变基因的数据库，VBASE2(Retter I.等人，2005，Nucleic Acids Res.，33，Databaseissue D671-D674)或Kabat数据库(Johnson G.等人，2000，Nucleic AcidsRes.，28，第214-218页))或出版物(例如，Kabat等人，Sequences ofProteins ofImmunologicalInterest，1992)鉴别鼠重链和轻链V区所属的人亚族，并确定用作受体分子的最适人种系框架。在这些用作受体的亚族中选择VH和VL序列可基于序列同源性和/或CDR1和CDR2区的结构匹配，来帮助在移植后保留六个CDR的恰当的相对呈现。
例如，VBASE2数据库的使用提示FMC63的κ轻链是κ1亚族，因为在FMC63VL框架和人κ亚族I的成员之间鉴别了良好的同源性。对四种种系序列观察到了CDR和框架序列的最高同源性和同一性：IGKV1-5＊03(VBASE2ID humIGKV087)(SEQ ID NO：3)，IGKV1-27＊01(VBASE2ID humIGKV106)(SEQ ID NO：4)，IGKV1-39＊01(VBASE2ID humIGKV115)(SEQ ID NO：5)，和IGKV1-12＊01(VBASE2IDhumIGKV094)(SEQ ID NO：6)；其在达到CDR3的整个序列分别具有70.4％、75％、76.1％和72.7％的序列同一性，而在框架区分别具有74.3％、78.6％、78.6％和77.1％的序列同一性。因为VBASE2中不包括完整的LCDR3和框架4区，所以通过分析从健康的供体B细胞mRNA制备的互补DNA(cDNA)，来鉴别与人受体框架最匹配的JK区段序列，之后使用简并引物扩增，表1显示了κ同种型的免疫球蛋白轻链第一恒定结构域。利用该方法，扩增的与IGKV1-5＊03(SEQ ID NO：3)、IGKV1-27＊01(SEQ ID NO：4)、IGKV1-39＊01(SEQ ID NO：5)和IGKV1-12＊01(SEQID NO：6)最匹配序列分别是：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10。
表1：
Figure BDA0000100909380000611
Figure BDA0000100909380000621
相似的，VBASE2数据库的使用提示FMC63直到框架3的VH序列落入人VH亚族III中。在人VH亚族III中，FMC63表现出与IGHV3-33＊01(VBASE2-ID：humIGHV199)(SEQ ID NO：11)、IGHV3-11＊01(VBASE2-ID：humIGHV175)(SEQ ID NO：12)、IGHV3-30＊18(VBASE2-ID：humIGHV195)(SEQ ID NO：13)和IGHV3-48＊01(VBASE2-ID：humIGHV031)(SEQ ID NO：14)的最高同源性；其在框架区和CDR区表现出高于70.4％的序列同源性。就轻链而言，鉴别相容的JH区段的资源是用简并引物扩增的从健康的供体B细胞mRNA制备的cDNA，和IgM重链第一恒定结构域(表2)。下列序列：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18分别与IGHV3-33＊01(VBASE2-ID：humIGHV199)(SEQ ID NO：11)、IGHV3-11＊01(VBASE2-ID：humIGHV175)(SEQ ID NO：12)、IGHV3-30＊03(VBASE2-ID：humIGHV195)(SEQ ID NO：13)和IGHV3-48＊01(VBASE2-ID：humIGHV031)(SEQ ID NO：14)最接近。
表2：
Figure BDA0000100909380000631
Figure BDA0000100909380000632
制备移植到人可变区上的初始CDR
将上文制备的人VH和VL片段用于开始人源化程序。cDNA用作CDR移植的模板，使用重叠PCR装配提供基于下列重链和轻链的第一人源化候选物：VH2(SEQ ID NO：19)、VH5(SEQ ID NO：20)、VH16(SEQ IDNO：21)、VH20(SEQ ID NO：22)、VL39(SEQ ID NO：23)、VL40(SEQ ID NO：24)、VL43(SEQ ID NO：25)和VL44(SEQ ID NO：26)，其中用表3显示的FMC63CDR替换最初的CDR。
表3：FMC63CDR区
Figure BDA0000100909380000641
VH2、VH5、VH16和VH20重链分别基于编码SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的cDNA，使用如表4和5所述的四片段装配PCR策略将CDR替换为FMC63CDR。如表6和7所示，类似的策略也用于VL39、VL40、VL43和VL44。
对于重链，通过运行二次PCR，亚克隆表4描述的PCR扩增产物，使用衔接子引物(正义引物HindIII VJ2C(SEQ ID NO：93)；和反义引物SalI衔接子(SEQ ID NO：92))在可变结构域cDNA的3’端添加SalI位点(见下文)。表6所述的扩增允许指导κ链克隆到哺乳动物细胞表达载体中(描述如下)。在该例子中，使用BamHI和NotI位点策略，产物含有可变区以及全长恒定区κ结构域，并被克隆到哺乳动物细胞表达载体中。
表4：概述用于构建移植第1CDR的重链可变区的模板和引物
Figure BDA0000100909380000661
表5：用于构建移植选定的人重链第1CDR的可变区的引物序列
Figure BDA0000100909380000662
Figure BDA0000100909380000671
Figure BDA0000100909380000681
Figure BDA0000100909380000691
表6：概述用于构建移植第1CDR的轻链可变区的模板和引物
Figure BDA0000100909380000701
表7：用于构建移植选定的人轻链第1CDR的可变区的引物序列
Figure BDA0000100909380000702
Figure BDA0000100909380000711
Figure BDA0000100909380000721
将改造的重链和轻链编码DNA序列连接到独立的载体中，所述载体是基于携带CMV启动子和牛生长激素多聚腺苷酸信号的修饰的pREP4(Invitrogen，CA，USA)载体的。通过使用BamHI和BsiWI限制性位点，在κ轻链恒定结构域eDNA之前连接可变κ轻链eDNA片段，轻链特异性载体允许κ同种型轻链的表达；同时，改造了重链特异性载体，使用BamHI和SalI限制性位点，在编码γ1、铰链、γ2和γ3恒定结构域的eDNA之前，连接可变重链eDNA片段。在重链和轻链表达载体中，分泌是由含BamHI位点的鼠VJ2C前导肽驱使的。应注意，BsiWI位点位于κ恒定结构域中；同时，SalI位点位于Cγ1结构域中。
为了瞬时表达免疫球蛋白候选物，使用聚乙烯亚胺(PEI)，将等量的重链和轻链载体共转染到适应悬浮的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)中。通常，用含有50μg编码重链的表达载体和50μg编码轻链的表达载体的DNA-PEI混合物，转染100ml密度为0.8-1.2百万细胞/ml的细胞悬浮液。当编码抗体基因的重组表达载体被导入宿主细胞中时，进一步培养细胞为期4至5天来生产抗体，以允许分泌到培养基(EX-CELL 293，HEK293-无血清培养基，Sigma，Buchs，Switzerland)中，所述培养基补充了0.1％pluronic acid、4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml遗传霉素。然后，使用重组的蛋白A streamline基质(GE，Switzerland)，从无细胞上清液中纯化抗体，并在测定前缓冲液交换为磷酸缓冲盐溶液。
人源化对策是基于初始的4种移植的重链和轻链(上文)的，其以成对的方式组合，衍生出16种初始的全长免疫球蛋白候选物。通过在B细胞淋巴瘤细胞系(FACS)上的半最大结合测定，和与嵌合版本的FMC63相比较(这是为了标准化抗人Fc PE标记的检测抗体的染色水平，如实施例2所述)，来评估这些免疫球蛋白的抗原结合亲和力。根据该初步工作，含有VH16(SEQ ID NO：21)或VH20(SEQ ID NO：22)的免疫球蛋白候选物在FACS实验中表现出与Raji细胞的最佳结合，如图1A和1B所示。由VH16重链和轻链VL43配对组成的抗体在瞬时转染中具有最优的表达水平，它的FAB片段具有最优的解链温度，因此被选为用于进一步回复突变和合理改造，如表8所示。
表8：移植第1CDR的抗体的IgG瞬时表达水平和FAB稳定性
  抗体   表达(mg/L)   TmFab(℃)
  嵌合FMC63   48   84.27
  VH2/VL39   11   78.78
  VH2/VL40   23   76.55
  VH2/VL43   13   73.17
  VH2/VL44   21   78.27
  VH5/VL39   5   76.08
  VH5/VL40   9   ND
  VH5/VL43   19   76.76
  VH5/VL44   12   74.81
  VH16/VL39   8   71.67
  VH16/VL40   11   71.81
  VH16/VL43   20   83.54
  VH16/VL44   7   85.16
  VH20/VL39   11   82.41
  VH20/VL40   24   79.46
  VH20/VL43   37   79.67
  VH20/VL44   26   82.00
人框架的回复突变
由于直接移植FMC63小鼠抗体的CDR导致人受体具有低的结合特性，所以理想的是在一些位置上将框架内的某些残基突变回鼠残基。被称为回复突变的该过程是单克隆抗体人源化中最不可预测的程序，必需鉴别亲本抗体中需要保留的关键框架残基，从而基本保留亲本抗体的结合特性与此同时最小化所获得抗体的潜在免疫原性。表9和10和图2A和2B显示了可影响CDR构象的残基(Kabat编号)，其被选为回复突变为鼠残基的潜在候选。
表9：比较FMC63和人受体轻链框架区
Figure BDA0000100909380000751
表10：比较FMC63和人受体重链框架区
Figure BDA0000100909380000752
在重链的8个可能的回复突变中，由于其保守的性质，放弃了位置37、48和49的改变。因此制造了4种改造版的VH16，并以成对的方式与VL43的所有3种回复突变组合。此外，将改造的变体与亲本VH16和VL43配对，研究每种单回复突变的影响。研究了共计24种全长免疫球蛋白候选物。相比VH16序列，5种重链变体具有下列单点突变：G42R、F67L、R71K、L78V和R94K；同时，相比VL43，3种轻链变体具有P44V、F71Y和Y87F。
根据FACS实验(如实施例2所述)、瞬时表达水平和FAB稳定性测量，可知回复突变重链R94K和/或轻链P44V大幅度的增加与Raji细胞或NALM-6细胞的结合，同时改善了表达水平，并维持良好的FAB稳定性，如表11和12所示。仅这两个位置就恢复了亲本FMC63抗体约一半的结合力。
表11：人源化回复突变的抗CD19抗体在Raji和NALM-6肿瘤细胞系上的FACS染色。流式细胞仪测量的与抗体中点荧光(MPF)对应的值(在Raji和NALM-6细胞上的测量分别表示为Raji和NALM-6)表示为针对FMC63嵌合抗体观察到的值的百分比。
Figure BDA0000100909380000761
表12：人源化回复突变的抗CD19抗体的IgG瞬时表达水平和FAB稳定性
Figure BDA0000100909380000762
种系化
作为人源化抗体的受体框架，种系框架一般优于个体的成熟抗体框架，因为它们缺少可能降低免疫原性程度的体细胞突变。利用根据VBASE2种系序列设计的简并引物，从健康供体B细胞mRNA中获得VH16，该程序提供了尚未遭遇过任何抗原的抗体。然而，由于真正首次用于实验的抗体的频率严重取决于B细胞来源，使用上述程序也可以观察到突变(Klein U.等人，1997，Blood 89，第1288-1298页)。VH16和VL43具有低含量的被回复突变为种系的非种系残基，这些改变是VH16-Q6E、VL43-V3Q和VL43-T7S，如表13所示。
表13：人源化回复突变/种系化的抗CD19抗体在Raji肿瘤细胞系上的FACS染色。流式细胞仪测量的与抗体中点荧光(MPF)对应的值(表示为Raji)表示为针对FMC63嵌合抗体观察到的值的百分比。还表示了人源化回复突变/种系化的抗CD19抗体的IgG瞬时表达水平和FAB稳定性。
Figure BDA0000100909380000771
发现所有的种系改变都对VH16-VL43抗体没有影响，不论是其亲和性还是其FAB稳定性，并且仅显著增加了其瞬时的表达水平。之后，将在位置VL43-V3Q和VL43-T7S具有种系残基的VH16-VL43变体用于理性设计的亲和力改善(下文)。
通过理性设计和CDR改造的回复突变的人受体的亲和力改善
酪氨酸突变体：FMC63CDR具有高酪氨酸含量：重链CDR1(位置32)、重链CDR2(位置58和59)、重链CDR3(位置96、97、98和100b)、轻链CDR1(位置32)，和轻链CDR3(位置96)。特别是重链CDR3中的4个酪氨酸残基(Y96、Y97、Y98和Y100b)，和在重链CDR1和轻链CDR1中可见的两个其他的酪氨酸残基，都在位置32。这些残基可能定义了与人CD19分子假设的相互作用结合位点，因为除了它们的疏水性质外，事实上大部分这类残基都是重链CDR3的部分，所述CDR3是最重要的CDR，通常决定特异性，所述残基还在VH16-R94K/VL433D模型中显著的突出在抗体结合位点平面的外侧。综合考虑，这些观察结果允许鉴别重链CDR3残基96、97、98、100b和轻链CDR1残基32作为理性的亲和力改善的候选物。酪氨酸残基是独特的，因为分别通过其芳香环和羟基，它们具有双重的疏水和极性性质。因此，将上述残基突变为苯丙氨酸，增加疏水性，探测在这些位置上极性对比疏水性含量的重要性。在重链R94K突变环境下的苯丙氨酸突变体测量显示，重链突变体32、97、98以及轻链突变体32优于亲本分子VH16-R94K/VL43，其中重链突变体Y97F具有嵌合FMC63的72.8％的亲和力，如表14所示。
表14：人源化回复突变/亲和力成熟的抗CD19抗体在Raji肿瘤细胞系上的FACS染色。流式细胞仪测量的与抗体中点荧光(MPF)对应的值(表示为Raji)表示为针对FMC63嵌合抗体观察到的值的百分比。还表示了人源化回复突变/亲和力成熟的抗CD19抗体的IgG瞬时表达水平和FAB稳定性。
Figure BDA0000100909380000781
轻链——Pro 44突变体：轻链P44位于重链和轻链交界处的底部，该位置可以解释当回复突变为缬氨酸时极大的亲和力改善。在位置44探讨了2种其他的疏水性氨基酸以可能协调(或更好地调节)轻链和重链之间的交界：在VH16-R94K变体背景中构建了异亮氨酸和亮氨酸变体，如表15所示。亲和力和稳定性测量揭示，在位置44，异亮氨酸优于缬氨酸回复突变，而变为亮氨酸仅提供了轻微的改善，尽管亮氨酸是更合乎逻辑的选择。
表15：人源化回复突变/亲和力成熟的抗CD19抗体在Raji肿瘤细胞系上的FACS染色。流式细胞仪测量的与抗体中点荧光(MPF)对应的值(表示为Raji)表示为针对FMC63嵌合抗体观察到的值的百分比。还表示了人源化回复突变/亲和力成熟的抗CD19抗体的IgG瞬时表达水平和FAB稳定性。
抗体 相对Raji FACS染色 瞬时表达(mg/L)   FABTm(℃)
  VH16R94K VL43P44I   69.44   17   81.37
  VH16R94K VL43P44L   37.50   18   80.10
去除潜在的脱酰胺作用位点：脱酰胺作用是抗体降解的主要途径。Asn脱酰胺作用为Asp是高度序列依赖性的，发生在CDR中已知或预测是柔性的蛋白质区域(Bischoff和Kolbe(Journal of Chromatography B，662(1994)，261-278)；这通常涉及位于CDR中的Asn残基。在FMC63轻链的CDR3中，鉴别出位置91至93(GNT)的天冬酰胺脱酰胺作用的高可能性。因此，为了阻止假设的脱酰胺作用，在VH16-R94K重链背景中探讨下列改变：VL43-N92A、VL43-T93V和VL-43-T93A，如表16所示。发现，N92A和T93A都维持了结合亲和力。还发现N92A变体具有改善的FAB稳定性。
表16：人源化回复突变/去除脱酰胺作用位点的抗CD19抗体在Raji肿瘤细胞系上的FACS染色。流式细胞仪测量的与抗体中点荧光(MPF)对应的值(表示为Raji)表示为针对FMC63嵌合抗体观察到的值的百分比。还表示了人源化回复突变/去除脱酰胺作用位点的抗CD19抗体的IgG瞬时表达水平和FAB稳定性。
Figure BDA0000100909380000801
在位置F71进行了VL43人受体的其他改良。VH16R94K VL43F71H(SEQ ID NO：61)、VH16R94K VL43F71S(SEQ ID NO：62)和VH16R94K VL43F71T(SEQ ID NO：63)与Raji的结合活性与VH16R94KVL43的结合活性相似。
组合回复突变和理性设计的突变
为了进一步增加与Raji细胞的结合，在系统性方法中组合回复突变和理性设计的突变，其中测试了有限数量的组合。将在重链和轻链中从酪氨酸转变为苯丙氨酸中鉴别的最改良的突变(上文)与轻链的改变P44I和N92A，以及种系改变V3Q和T7S组合。
虽然CDR改变通常对亲和力具有附加的影响，当这些CDR改变与影响框架的突变组合时，其结果是不可预测的。表17显示了组合种系、框架、回复和CDR突变的VH16/VL43变体的相对FACS染色。发现将重链CDR改变Y32F和Y97F与回复突变R94K组合，导致结合的丧失，而Y32F与重链回复突变R94K和轻链改变P44I和N92A组合，极大的改善了结合，按照我们的测量手段，这获得了染色优于FMC63嵌合体的相对中点滴度。另一种有利的组合是在重链回复突变R94K条件下的重链CDR突变Y100BF和Y32F，和轻链改变V3Q、T7S、Y32F、P44I和N92A。
表17：人源化回复突变/种系化/亲和力成熟/去除脱酰胺作用位点的抗CD19抗体在Raji肿瘤细胞系上的FACS染色。流式细胞仪测量的与抗体中点荧光(MPF)对应的值(表示为Raji)表示为针对FMC63嵌合抗体观察到的值的百分比。
Figure BDA0000100909380000811
展现出高结合活性的组合还保留了高的瞬时表达水平(表18)和高的FAB片段热稳定性(表19)。
表18：人源化回复突变/种系化/亲和力成熟/去除脱酰胺作用位点的抗CD19抗体的IgG瞬时表达水平。
Figure BDA0000100909380000812
表19：人源化回复突变/种系化/亲和力成熟/去除脱酰胺作用位点的抗CD19抗体的FAB稳定性(℃)。
Figure BDA0000100909380000813
实施例2：CD19抗体与B细胞来源的肿瘤细胞系的结合：流式细胞仪分析
通过流式细胞仪评估CD19人源化单克隆抗体与Raji肿瘤细胞(人伯基特淋巴瘤，DSMZ ACC319)、NALM-6(人B细胞前体白血病，DSMZACC128)和SU-DHL-6(人B细胞淋巴瘤，DSMZ ACC572)(所有的细胞系都来自DSMZ Braunschweig，Deutschland)的结合。用系列稀释的各种人源化单克隆抗体孵育细胞。使用不相关的人IgG1作为阴性对照。洗涤细胞，并用藻红蛋白标记的(PE)抗人二抗(eBioscience，CA，USA)检测和用流式细胞仪分析。为了确保在人源化候选物和亲本鼠抗体之间可比较的染色水平，使用嵌合的FMC63作为标准，即，由如SEQ ID NO：68所示与人IgG1重链恒定结构域融合的FMC63鼠重链可变结构域，和如SEQ ID NO：69所示与κ恒定结构域融合的鼠轻链可变结构域组成的抗体。表11、13-17显示了与Raji或NALM-6结合的结果，图3显示了与SU-DHL-6细胞系结合的结果。图3中的所有结果是通过细胞染色的平均荧光强度(MFI)测量的。根据MFI对抗体浓度的曲线，使用软件GraphPadPrism 5(CA，USA)计算每种抗CD19人源化抗体的中点荧光(MPF)值。剂量响应曲线的MPF表示了观察到50％最大染色时的抗体浓度(μg/ml)。因而，具有与细胞更好的结合活性的抗体具有更低的MPF(μg/ml)。在表11、13-17中，值表示嵌合FMC63和抗CD19人源化变体之间的相对MPF，如下计算：[1/(MPF嵌合FMC63/MPF抗CD19人源化抗体)]x 100。百分比越高，抗体的结合活性越好。
图3显示，随着VH16/VL43抗体经过不同的人源化步骤成为VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A抗体，对SU-DHL-6细胞的亲和力大幅度改善。后者达到了与FMC63嵌合体相似的和B细胞的强亲和力。FMC63人源化抗体与细胞的亲和力改善是突变的直接结果，所述突变基本保留和/或改善了如上所述移植人CDR的受体框架的结合特性。
实施例3：抗CD19人抗体与Raji肿瘤细胞的SCATCHARD结合分析
人源化抗体与Raji-B肿瘤细胞的Scatchard结合分析
可以用饱和结合曲线确定抗体与它的靶的恒定的结合亲和力。在平衡时，与其结合位点结合和游离的抗体的量是解离结合常数Kd的指标。通常，对于一个单结合位点，结合/游离比结合抗体的比例具有线性相关，斜率对应于结合常数Kd的倒数。
用荧光染料铕(Eu3+)(PerkinElmer，MA，USA)标记测试的抗体。Eu3+提供了定量与细胞结合的抗体分子以及游离的抗体分子的量的可能。使用时间分辨荧光，通过Eu3+进行选择的人源化候选物对Raji细胞结合的饱和。为了证实在没有Eu3+染料与细胞表面非特异性行为的条件下，Eu3+标记的候选物的结合特异性，还用Eu3+标记了阴性的同种型人IgG1。
如实施例2所述，将Raji细胞生长在补充了10％胎牛血清(FBS，Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)、2mM UltraGlutamine1(Lonza，Verviers，Belgium)和1％青霉素/链霉素(Chemie BrunschwigAG，PAA，Basel，Switzerland)的RPMI-1640培养基(Chemie BrunschwigAG，PAA，Basel，Switzerland)中。用相同的培养基洗涤细胞，并调节至1x106细胞/mi的终浓度。在U形底的96孔板中种植100μl体积的Raji细胞。将系列稀释的Eu3+标记抗体制备成PBS-2.5％FBS-0.05％叠氮化钠(NaN3)，放入分离的96孔板中，冷却至4℃。然后，将100μl体积各种Eu3+标记抗体的稀释液转移到Raji细胞中，对应13.3nM至6.5pM的Eu3+标记抗体的最终稀释范围。在冰上，用Eu3+抗体孵育细胞15分钟，达到平衡。通过将等分试样的无细胞上清液(根据抗体浓度经验的调节体积；在1300RPM离心细胞2min)转移至含100μl的Delfia溶液(PerkinElmer，MA，USA；Eu3+荧光的增强剂)的新鲜平板中，来测量游离的Eu3+标记抗体的量。为了确保完全去除上清液，在1300RPM离心细胞2min。在第二次离心后，抛弃上清液，用200μl冷的结合缓冲液(PBS-2.5％FBS-0.05％NaN3)洗涤细胞2次。将细胞沉淀重悬在100μl的Delfia溶液中。用分光光度计(Bio-Tek，synergy2，VT，USA；激发波长为340nm，发射波长为615nm，时间延迟为400μs，捕获时间为1000μs)测量两块平板的时间分辨荧光(游离或结合的Eu3+抗体)。通过Scatchard分析确定解离常数Kd，其中线性呈现的结合比结合/游离的斜率代表了1/Kd。对每种抗体重复两次确定Kd，每种荧光测量实施重复3次。根据上述结合测定，图4A和4B显示了随着抗体VH16-R94K/VL43(Kd＝47nM)成为抗体VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A(Kd＝10.9nM)的不同突变阶段的明显的Kd改善。后一种抗体相比亲本嵌合FMC63(11.8nM)具有改善的Kd。
铕标记的FMC63嵌合体和未标记的抗CD19人源化抗体之间的结合竞争或Ki确定
另一种评估每种人源化抗体的结合亲和力的方法是测量相比亲本嵌合FMC63抗体与Raji细胞的结合竞争。为了抑制铕标记的嵌合FMC63(Eu3+-FMC63)与Raji细胞上表达的CD19抗原的结合，与增加浓度的未标记抗体一起添加恒量的Eu3+-FMC63。出于该目的，将100μl体积的Raji细胞种植到U形底的96孔板中，所述细胞在补充了10％胎牛血清(FBS，Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)、2mMUltraGlutamine 1(Lonza，Verviers，Belgium)和1％青霉素/链霉素(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)的RPMI-1640培养基(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)中，制备的浓度为1x106细胞/ml。将系列稀释的竞争抗体在PBS-2.5％FBS-0.05％NaN3中制备到分离的96孔板中，之后与恒量的Eu3+-FMC63混合。在采集100μl前，将抗体稀释液冷却至4℃，并添加到Raji细胞中。未标记的人源化抗体的最终稀释度范围是从100nM至4.2pM，而Eu3+-FMC63的浓度维持在0.2nM。细胞在冰上用抗体孵育15分钟。在达到平衡后，在1300RPM离心细胞2min，抛弃上清液。用200μl冷的结合缓冲液PBS-2.5％FBS-0.05％NaN3洗涤细胞沉淀2次，重悬在100μl的Delfia溶液中。如上所述，用时间分辨荧光测量结合Eu3+-FMC63的细胞。确定每个孔的Eu3+-FMC63的量(fmole)，并相对于未标记抗体的总量绘图。用GraphPadPrism 5软件(CA，USA)进一步分析Eu3+-FMC63的抑制结合曲线，使用单位点竞争模型，总配体固定浓度为0.2nM；抑制结合常数在纳摩尔范围内。如表20所示和根据上文所示实验，不包括突变的框架VH16VL43展示出与Raji细胞极低的亲和力(72.8nM)，而人源化变体VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A表现出非常高的亲和力，等于FMC63嵌合体(1.9nM对比1.4nM)。含标准偏差的结果被确定至少3次。
表20：人源化抗CD19抗体的Ki确定。
  抗体   Ki(nM)
  FMC63嵌合体   1.4±0.32
  同种型对照IgG1   No Competition
  VH16/VL43   72.8
  VH16-R94K/VL43   7.6
  VH16-R94K/VL43-V3Q-T7S-P441-N92A   3.9±1.02
  VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-Y32F-P44I-N92A   2.1±0.5
  VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A   1.9
  VH16-Y32F-R94K-Y97F/VL43-V3Q-T7S-N92A   49.9
实施例4：评估抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性
使用CytoTox 96非放射活性的细胞毒性测定试剂盒(Promega，Madison，USA)，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定测量人源化抗CD19抗体的ADCC活性。通过标准的Ficoll-paque分离，从柠檬酸化的全血中纯化人外周血单核细胞(PBMC)，重悬在补充了10％胎牛血清(FBS，Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)、2mM UltraGlutamine1(Lonza，Verviers，Belgium)、1％青霉素/链霉素(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)和100U/ml人IL-2(Sigma，Missouri，USA)的完全培养基(RPMI-1640培养基(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland))中，37℃下孵育过夜。第二天，通过离心收集PBMC，洗涤两次，重悬在培养基中，密度为8x106细胞/ml。使用实施例2中描述的CD19+细胞系Raji作为靶细胞。洗涤Raji细胞两次，重悬在完全培养基中，密度为0.2x 106细胞/ml。将稀释为1.5μg/ml的50微升抗体(终浓度为0.5μg/ml)与50μl靶细胞混合，添加至U形底的96孔板中的等体积PBMC中。在整个实验中使用1∶40的靶比效应子比例。在37℃孵育4小时后，离心细胞，收集50μl无细胞上清液样品，转移到平底的96孔板中，并测定。如下计算裂解的百分比：(样品释放-靶自发释放-效应子自发释放)/(最大释放-靶自发释放)＊100；其中靶自发释放是仅含有靶细胞的孔中的荧光，效应子自发释放是仅含有效应子细胞的孔中的荧光，而最大释放是含有已用裂解缓冲液处理的靶细胞的孔中的荧光。从样品裂解的百分比中减去在缺少抗体(靶+效应子细胞)的条件下获得的裂解的背景百分比。
图5A和图5B显示了由于IgG1对照造成的极低的特异性Raji裂解。然而，对于VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-Y32F-P44I-N92A抗体或VH16-R94K/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A抗体或VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A或嵌合FMC63而言，人源化抗体诱导的裂解增加至少3倍(图5A显示3种不同的供体的平均值±标准偏差，图5B显示1种供体重复实施3次的结果±标准偏差)。该数据证实，选定的人源化抗CD19抗体导致的表达CD19+细胞的细胞性细胞毒性与亲本嵌合FMC63的相似。
实施例5：抗CD19抗体的凋亡诱导
为了测量抗体诱导的细胞死亡，在补充了10％胎牛血清(FBS，ChemieBrunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)、2mM UltraGlutamine 1(Lonza，Verviers，Belgium)和1％青霉素/链霉素(Chemie BrunschwigAG，PAA，Basel，Switzerland))的RPMI-1640培养基((ChemieBrunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)中制备1x106细胞/ml的如实施例2所述的Raji细胞，在96孔板中种植100μl/孔，在24孔板中种植1ml/孔。37℃和5％CO2下孵育细胞15min至24h，抗体浓度为0.0016至1μg/ml(0.01μM至6.6μM)。孵育后，1300RPM离心U形底平板中的细胞3min，用200μl的PBS洗涤。每个孔中加入100μl的1x结合缓冲液(BD Pharmingen，Allschwil，Switzerland)，再加入2.5μl的膜联蛋白V-FITC和2.5μl碘化丙锭(PI；BD Pharmingen，Allschwil，Switzerland)。在流式细胞仪分析前，室温下用膜联蛋白V和PI孵育细胞。用膜联蛋白V和PI双重染色表征死亡的细胞群体，而活细胞既不被膜联蛋白V也不被PI染色。
图6显示了用1μg/ml抗体孵育Raji细胞2.5h的膜联蛋白V和PI染色。令人惊讶的是，VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A和VH16-R94K/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A人源化抗CD19抗体诱导强烈的膜联蛋白V染色和细胞死亡，同时亲本嵌合FMC63对凋亡没有影响。值得注意的是，在图6中观察到的嵌合FMC63处理后轻微增加的膜联蛋白V染色是不可重复且不显著的。令人惊讶的，在添加人源化抗CD19抗体后15min，就可用膜联蛋白V染色细胞，两种染色(膜联蛋白V和PI)都在用人源化抗CD19抗体孵育4h后达到平台期(未显示)。抗CD19抗体造成的凋亡机制不同于抗FasL诱导的Raji细胞的凋亡。实际上，FasL不诱导膜联蛋白V对Raji细胞染色(未显示)。该结果证实人源化作用使抗CD19抗体产生了新的特征。相比亲本嵌合FMC63，人源化抗CD19抗体除触发同型细胞附着的能力(未显示)之外产生的新的凋亡特征是预料不到的，对抗CD20抗体的研究具有极大的重要性。实际上，Beers等人已显示，具有强的凋亡和同型附着特性的抗CD20抗体在动物中具有更好的B细胞耗尽能力(Beers S.A.等人，2008，Blood 112，第4170-4177页)。此外，在添加抗CD19抗体后15min，就可用膜联蛋白V染色Raji细胞。染色在4h孵育后达到平台期。该快速的凋亡事件优于抗CD20抗体，后者的凋亡效应一般在24h后观察到(Chan H.T.C.等人，Cancer Research，63：5480-5489)。
实施例6：在体外抑制恶性B细胞增殖
增殖——alamarBlue
为了测量抗体对细胞增殖的抑制，以2x105细胞/孔的密度种植细胞(Raji或SU-DHL-6，如实施例2所述)，每孔100μl。用预先消毒的100μl抗体孵育细胞，并在补充了10％胎牛血清(FBS，Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)、2mM UltraGlutamine 1(Lonza，Verviers，Belgium)和1％青霉素/链霉素(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland))的RPMI-1640培养基(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)中稀释至终浓度为0.0016至1μg/ml(0.01μM至6.6μM)。在37℃和5％CO2下孵育平板72小时。然后将20μl的alamarBlue(AbDSerotec，Düsseldorf，Germany)加入到细胞中4至8小时。生长的细胞导致化学降低alamarBlue荧光，在540nm的激发光和620nm的发射光对其进行监控。根据重复3次实施的实验，计算在处理和未处理细胞(仅用载体)之间的百分比差异。图7A显示了用抗体孵育72h后的SU-DHL-6的增殖水平。使用不相关的IgG1和强烈结合SU-DHL-6的抗HLA-DR抗体分别作为阴性和阳性对照。人源化抗体VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-Y32F-P44I-N92A、VH16-R94K/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A和VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A(未显示)即使在低至0.01μg/ml的浓度下对细胞增殖也具有强烈的抑制作用。因此，除了早期诱导凋亡外，抗CD19抗体在72h内阻断B细胞增殖。
克隆发生
克隆发生测定是另一种评估人源化抗CD19抗体造成肿瘤细胞死亡的方法。方法通常被用于评估抗体的抗增殖作用(Chan HTC，CancerResearch 2003)。我们使用集落形成性细胞测定和完全的MethoCult培养基(StemCell Technologies，Grenoble，France)来实施克隆发生测定。以1x106细胞/ml制备Raji细胞(如实施例2所述)，以100μL/孔种植在96孔板中。然后，用100μL预先消毒，并在补充了10％胎牛血清(FBS，ChemieBrunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)、2mM UltraGlutamine 1(Lonza，Verviers，Belgium)和1％青霉素/链霉素(Chemie BrunschwigAG，PAA，Basel，Switzerland)的RPMI-1640培养基((Chemie BrunschwigAG，PAA，Basel，Switzerland)中稀释的抗体(抗体浓度为0.2μg/ml)孵育细胞90分钟。然后，在Iscove’s培养基中稀释Raji细胞和抗体，达到100μl中500个细胞的计数，最终与1.1ml的MethoCult培养基混合。使用结核菌素注射器，将0.8ml该制品分散在35mm x 10mm皿中。细胞在37℃(5％CO2)孵育9天，用显微镜(50x放大)计数集落。结果显示在图7B中，与之前在实施例5中观察到人源化抗体具有令人惊讶的凋亡特性(膜联蛋白-V加PI染色)相关，在此相似的，人源化抗体表现出令人惊讶的良好的抗增殖特性，同时亲本嵌合FMC63对克隆发生只有非常低的影响或没有影响。人源化抗CD19抗体通过在孵育的前90min内诱导凋亡和杀伤作用，或者通过抑制细胞分裂，或者上述二者，强烈的减少了Raji克隆的数量。该实验对一些实验是代表性的，重复两次实施。结果验证了人源化抗CD19抗体对B细胞杀伤和抑制增殖的效应。
实施例7：抗CD19单克隆抗体的内化作用
使用Hum-Zap测定的内化作用
为了评估抗体内化作用，使用与毒素肥皂草毒蛋白缀合的次级抗人抗体(Hum-Zap，Advanced Targeting Systems，San Diego，CA，USA)。当核糖体失活蛋白——肥皂草毒蛋白内化时，诱导细胞死亡，之后可以使用alamarBlue测定监控。如实施例2所述以1x105细胞/ml种植Raji细胞，每孔100μl，在补充了10％胎牛血清(FBS，Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)、2mM UltraGlutamine 1(Lonza，Verviers，Belgium)和1％青霉素/链霉素(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)的RPMI-1640培养基(Chemie Brunsehwig AG，PAA，Basel，Switzerland)中。在RPMI-1640完全的细胞培养基中以100ng/10μl在预先制备的Hum-Zap中稀释抗体(上文)。在Raji细胞上添加10μl抗体和Hum-Zap的混合物。抗体的最终浓度范围从0.5至0.005μg/ml。然后，在使用alamarBlue测量细胞毒性前，用抗体孵育细胞48h。如下计算细胞增殖的百分比：抗体处理的细胞的荧光(发射590nm)/对照细胞(仅用Hum-Zap)的荧光(发射光590nm)x 100。也实施含抗体和不含Hum-Zap的对照，在48h后未表现出对细胞增殖任何显著的效应。我们观察到人源化抗CD19抗体的内化作用(图8)。之前的研究已描述过CD19在与抗体相互作用之后的内化作用，但在Raji细胞中，6h后仍不明显，24h后仍极低，在外周血的新鲜B细胞中也是如此(Ingle G.S.等人，BJH，2007，140，第46-58页)。使用Hum-Zap，人源化抗CD19VH16-R94K/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A抗体的内化与亲本嵌合FMC63非常相似。然而，抗体VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-Y32F-P44I-N92A展现出低得多的内化作用，在10ng/ml没有内化。只有当设计治疗性抗体作为与细胞毒性净荷(payload)或毒素的缀合物使用时，高水平的内化作用才是理想的。
实施例8：通过差示扫描量热法的抗CD19单克隆抗体的热稳定性
如表8、12-16和19所示，使用量热法测量来比较人源化抗CD19单克隆抗体和嵌合FMC63的热稳定性。单克隆抗体解链曲线图形是其同种型的特征(Garber和Demarest(2007)，BBRC 355：751-7)，然而，即使在全长IgG背景中，也可以方便的鉴别FAB片段的中点解链温度。FAB部分的此类中点解链温度用于监控人源化候选物的单克隆稳定性。
在VP-DSC差示扫描微量热计(MicroCal，Northampton，UK)上进行量热法测量。细胞体积是0.128ml，加热速率是1℃/min，超压保持在64p.s.i。使用的所有蛋白质片段浓度都是在PBS(pH 7.4)中1-0.5mg/ml。通过比较重复两次的、含有省略了蛋白质的相同缓冲液的样品，来估计每种蛋白质的摩尔热容。使用标准程序分析部分摩尔热容和解链曲线。在使用软件Origin v7.0中的Non-Two State模型进一步分析前，将热谱图进行基线校正和浓度归一化。
实施例9：B细胞耗尽研究
在人的全血中B细胞耗尽
为了评估人源化抗CD19抗体耗尽人全血中的B细胞的能力，实施B细胞耗尽测定。通过静脉穿刺获得外周血，在补充了10％胎牛血清(FBS，Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)、2mM UltraGlutamine1(Lonza，Verviers，Belgium)和1％青霉素/链霉素(Chemie BrunschwigAG，PAA，Basel，Switzerland)的RPMI-1640培养基(Chemie BrunschwigAG，PAA，Basel，Switzerland)中稀释2倍。将稀释的全血种植在24孔板(1-2mL/孔)中，加入10μg/ml抗体或PBS(未处理的)，并在37℃和5％CO2孵育平板24h。用RBS裂解缓冲液(eBiosciences，THP MedicalProducts，Vienna，Austria)室温下裂解血液5min(进行两次)，并以1100RPM离心3min。用2ml结合缓冲液(PBS，2.5％FCS，100mg/l MgCl2，0.5mM CaCl2，0.05％NaN3和10％Versene(v/v))洗涤细胞沉淀。然后，将细胞重悬在0.5ml结合缓冲液中，用抗CD19-PE-Cy5或抗CD20-PE、或抗CD22-FITC抗体染色。在冰上孵育20分钟后，用结合缓冲液洗涤细胞一次，通过流式细胞仪分析。确定B细胞的百分比，并如下计算百分比改变：(未处理的(PBS)细胞中的B细胞％-抗体处理的细胞中的B细胞％)/(未处理的(PBS)细胞中的B细胞％)x 100。
如表21所示，将10μg/ml抗体用于四个血液供体上，在用人源化抗CD19抗体处理后观察全血中的B细胞耗尽。在对照IgG1处理后没有观察到B细胞数量的改变。通常，当用对照IgG1孵育时，CD19+或CD20+或CD22+B  细胞代表了9至10％的白细胞群体。抗体VH16-R94K-Y100BF/VL43-V3Q-T7S-P44I-N92A对B细胞耗尽具有最高的影响(均值＝15.25％)，而亲本嵌合FMC63是最无效的(均值＝7.25％)。
表21：全血的B细胞耗尽
Figure BDA0000100909380000921
实施例10：具有增强的补体介导的效应子功能的VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A变体
出于增强补体依赖性细胞毒性(CDC)的目的，设计多个变体。以相同的方式，Fc与Fcγ受体相互作用结合介导ADCC，Fc与补体组分C1q相互作用介导CDC。虽然目前没有可获得的关于Fc/C1q复合物的结构，但一些研究已将人IgG上与C1q的结合位点定位于集中在残基D270、K322、P329和P331之上的区域(Idusogie等人，The Journal ofImmunology，2000，164：4178-4184)。在CH2结构域的D269-K334区中设计氨基酸修饰，探索可介导增强的VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A的CDC的变体。
研究显示，在位置E269、S298和S324上的残基取代导致变体具有至少约1.6倍(图9)至最大5.5倍(图10)的CDC增加。
为了产生这些变体cDNA编码序列，通过标准诱变，将编码VH16R94K重链(SEQ ID NO：64)cDNA的cDNA转化为重链VH16R94K/324(NNK)、VH16R94K/S298A  (SEQ ID NO：114)、VH16R94K/E269D/S298A(SEQ ID NO：115)、VH16R94K/S298A/S324N(SEQ ID NO：116)、VH16R94K/E269D/S298A/S324N(SEQ ID NO：117)。324位的NNK描述了用NNK密码子取代野生型丝氨酸编码密码子，所述密码子提供了所有20种氨基酸的取代(硬性随机化)。
将这些变体编码DNA序列连接到基于修饰的pREP4(Invitrogen，CA，USA)载体的载体中，所述载体携带CMV启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号。在该表达载体中，分泌受鼠VJ2C前导肽的驱动。
为了瞬时表达，使用聚乙烯亚胺(PEI)，将等量的各种重链和轻链载体共转染到适应悬浮的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)中。通常，用含有50μg编码变体重链的表达载体和50μg编码VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)轻链的表达载体的DNA-PEI混合物，转染100ml密度为0.8-1.2百万细胞/ml的细胞悬浮液。当编码各种改造的链基因的重组表达载体被导入宿主细胞中时，进一步培养细胞为期4至5天来生产构建体，以允许分泌到培养基(EX-CELL 293，HEK293-无血清培养基，Sigma，Buchs，Switzerland)中，所述培养基补充了0.1％pluronic acid、4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml遗传霉素。然后，使用重组的Streamline rProtein A基质(GE，Switzerland)，从无细胞上清液中纯化构建体，并用于进一步分析。
表22中列举了这些变体的表达水平。
表22：VH16R94K/VL43V3Q-T7S-P44I-N92A重链变体的IgG瞬时表达水平。
Figure BDA0000100909380000941
补体介导的对Raji细胞的毒性
使用基于细胞的测定来测量变体介导CDC的能力。
通过幼兔补体(Harlan Laboratories，C-0099F，AN VENRAY，TheNetherlands)，使用乳酸脱氢酶(LDH)的释放，监控变体调理Raji细胞的裂解作用，来测量裂解。通过离心和重悬，用完全培养基(补充了10％胎牛血清(FBS，Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)和1％UltraGlutamine 1(Lonza，Verviers，Belgium)的RPMI-1640培养基(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland))洗涤靶细胞2次。添加的变体抗体的标示最终浓度为1μg/ml。用完全培养基稀释幼兔血清至7.5％，加入到抗体调理的靶细胞中。37℃下孵育平板3小时。使用CytoTox 96非放射活性细胞毒性测定试剂盒(Promega，Madison，USA)测量细胞的细胞毒性。
该测定的代表性数据显示在图9和图10中。
图9和图10显示了由于IgG1对照抗体(
Figure BDA0000100909380000951
Roche PharmaA.G.，Reinach，Switzerland)造成的极低的特异性裂解；然而，对于VH16R94K/S324N(SEQ ID NO：118)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)抗体，补体诱导的裂解增加至少1.6倍(图9)至最大5.5倍(图10)，这取决于由于Raji细胞活力的改变造成的测定的变化性；VH16R94K/S298A/S324N(SEQ ID NO：116)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQID NO：65)抗体和VH16R94K/E269D/S298A/S324N(SEQ ID NO：117)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)抗体也表现出比亲本抗体改善的CDC(至少4.4倍)。图9和图10显示了重复3次的结果±标准偏差。
实施例11：具有增强的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A变体
评估了实施例10所述研究中探讨的抗CD19抗体变体引发ADCC的能力，所述变体具有位置E269、S298的残基取代。
使用CytoTox 96非放射活性的细胞毒性测定试剂盒(Promega，Madison，USA)，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定测量抗体的ADCC活性。通过标准的Ficoll-paque分离，从柠檬酸化的全血中纯化人外周血单核细胞(PBMC)，重悬在完全培养基(补充了10％胎牛血清(FBS，Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)、2mM UltraGlutamine1(Lonza，Verviers，Belgium)、1％青霉素/链霉素(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)和100U/ml人IL-2(Sigma，Missouri，USA)的RPMI-1640培养基(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland))中，37℃下孵育过夜。第二天，通过离心收集PBMC，洗涤两次，重悬在培养基中，密度为8x106细胞/ml。使用实施例2中描述的CD19+细胞系Raji作为靶细胞。洗涤Raji细胞两次，重悬在完全培养基中，密度为0.2x106细胞/ml。将稀释为1.5μg/ml的50微升抗体(终浓度为0.5μg/ml)与50μl靶细胞混合，添加到U形底的96孔板中的等体积PBMC中。在整个实验中使用1∶40的靶比效应子比例。在37℃孵育4小时后，离心细胞，收集50μl无细胞上清液样品，转移到平底的96孔板中，并测定。如下计算裂解的百分比：(样品释放-靶自发释放-效应子自发释放)/(最大释放-靶自发释放)＊100；其中靶自发释放是仅含有靶细胞的孔中的荧光，效应子自发释放是仅含有效应子细胞的孔中的荧光，而最大释放是含有已用裂解缓冲液处理的靶细胞的孔中的荧光。从样品裂解的百分比中减去在缺少抗体(靶+效应子细胞)的条件下获得的裂解的背景百分比。
图11显示IgG对照抗体(
Figure BDA0000100909380000961
Roche Pharma A.G.，Reinach，Switzerland)不导致任何特异性Raji裂解，亲本抗体导致一些细胞毒性；所示数据是使用分离自一个供体的PBMC重复三次的孔的平均细胞毒性百分比±SD。然而，VH16-R94K/S298A(SEQ ID NO：114)-VL43-V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)抗体的抗体诱导的裂解增加至少5倍，而VH16-R94K/E269D/S298A(SEQ ID NO：115)-VL43-V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)抗体为至少6.8倍。该数据证实，选定的抗CD19抗体变体对表达CD19+的细胞具有增强的细胞性细胞毒性。
实施例12：基于源自人Ig-γ3和人Ig-γ1/Ig-γ3铰链-Fc结构域改组的氨基酸取代，而具有增强的补体介导的效应子功能的VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A变体
人IgG3抗体一般具有比人IgG1抗体增强的CDC，这部分是由于IgG3Fc具有比IgG1Fc更高的C1q结合亲和力(Schumaker VN等人，Biochemistry，1976，15：5175-81)。
基于在人IgG3和人IgG1Fc部分之间的序列差异，进行VH16R94K的Fc区的氨基酸修饰。在互补的方法中，实施人IgG1铰链区和恒定结构域与人IgG3铰链区和恒定结构域的改组，产生具有增强的CDC的嵌合的抗CD19抗体同种型。
研究显示，位置K274和N276的残基的取代，以及由各来自IgG1的CH1和铰链与来自IgG3的Fc组成的嵌合变体(由1133suffix设计)，导致CDC分别增加1.7和2.2倍。
为了产生在位置K274和N276具有残基取代的变体cDNA编码序列，通过标准诱变技术，将编码VH16R94K重链(SEQ ID NO：64)cDNA的cDNA转化为重链VH16R94K/K274Q(SEQ ID NO：119)、VH16R94K/N276K(SEQ ID NO：120)、VH16R94K/K334R(SEQ ID NO：121)、VH16R94K/K274Q/N276K(SEQ ID NO：122)和VH16R94K/K274Q/N276K/K334R(SEQ ID NO：123)。
此外，通过用人IgG3重链基因(NCBI GenBank登录号X03604.1，残基161至377)的相应部分取代VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92AIgG1表达载体中的部分重链基因(编码Kabat残基231至其羧基端)，产生了人抗CD19VH16R94K(1133)(SEQ ID NO：124)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)嵌合同种型。
将这些变体编码DNA序列连接到基于修饰的pREP4(Invitrogen，CA，USA)载体的载体中，所述载体携带CMV启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号。在该表达载体中，分泌受鼠VJ2C前导肽的驱动。
为了瞬时表达这些变体，使用聚乙烯亚胺(PEI)，将等量的各种重链和轻链载体共转染到适应悬浮的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)中。通常，用含有50μg编码变体重链的表达载体和50μg编码VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)轻链的表达载体的DNA-PEI混合物，转染100ml密度为0.8-1.2百万细胞/ml的细胞悬浮液。当编码各种改造的链基因的重组表达载体被导入宿主细胞中时，进一步培养细胞为期4至5天来生产构建体，以允许分泌到培养基(EX-CELL 293，HEK293-无血清培养基，Sigma，Buchs，Switzerland)中，所述培养基补充了0.1％pluronic acid、4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml遗传霉素。然后，使用重组的Streamline rProtein A基质(GE，Switzerland)，从无细胞上清液中纯化构建体，并用于进一步分析。
表23中列举了这些变体的表达水平。
表23：VH16R94K/VL43V3Q-T7S-P44I-N92A重链变体的IgG瞬时表达水平。
补体介导的对Raji细胞的毒性
根据实施例10，使用基于细胞的测定来测量变体介导CDC的能力。通过幼兔补体(Harlan Laboratories，C-0099F，AN VENRAY，TheNetherlands)，使用乳酸脱氢酶(LDH)的释放，监控变体调理的Raji细胞的裂解作用，来测量裂解。通过离心和重悬，用完全培养基(补充了10％胎牛血清(FBS，Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland)和1％UltraGlutamine 1(Lonza，Verviers，Belgium)的RPMI-1640培养基(Chemie Brunschwig AG，PAA，Basel，Switzerland))洗涤靶细胞2次。添加的变体抗体的标示最终浓度为1μg/ml。用完全培养基稀释幼兔血清至5％，加入到抗体调理的靶细胞中。37℃下孵育平板3小时。
使用Cyto Tox 96非放射活性细胞毒性测定试剂盒(Promega，Madison，USA)测量细胞的细胞毒性。该测定的代表性数据显示在图12中。
图12显示了由于IgG1对照造成的极低的特异性裂解。相比亲本抗体时，对于VH16R94K/K274Q/N276K(SEQ ID NO：122)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)抗体，补体诱导的裂解增加至少1.7倍，对于VH16R94K/K274Q/N276K/K334R(SEQ ID NO：123)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)抗体，增加至少2倍，对于VH16R94K(1133)(SEQ ID NO：124)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)抗体，增加至少2.2倍。图12显示了实施重复3次的结果±标准偏差。
实施例13：建立表达抗CD19抗体的细胞系
开发了高产的哺乳动物蛋白质表达系统。所述系统是基于充分公开的CHO细胞系(CHO-S，Invitrogen，Basel，Switzerland)，q其被改造以适应在化学定义的无血清培养基中悬浮生长，和鉴别高产细胞系的克隆群体的高度有效的转染方法和筛选对策。该哺乳动物蛋白质表达系统用于稳定表达抗CD19抗体的人源化变体。
将用于实施例1的携带VL43V3Q/T7S/P44I/N92A轻链(SEQ ID NO：65)的cDNA序列的质粒，和携带VH16R94K重链(SEQ ID NO：64)的cDNA序列的质粒pAE18_VH16_R94K都用XbaI和HindIII消化，以释放轻链和重链插入物。通过凝胶电泳分离这些插入物，凝胶提取、纯化和进一步克隆到基于Promega的pGL3(Madison，WI，USA)的表达载体的多克隆位点中，所述载体已预先用相同的限制性酶消化，并使用相同的凝胶电泳和纯化方法制备。这产生2种表达质粒：pGL41[18_HC]质粒和pGL41[18_LC]质粒，分别携带VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A抗CD19抗体的重链和轻链。
从Clontech (Mountain View，CA，USA)购买表达遗传霉素抗性基因neo的载体pSV2neo，和通过克隆SV40启动子和pBABE-Puro(Addgene，Camebridge，MA，USA)的嘌呤霉素抗性基因(pac)到Promega的pGL3载体中，获得嘌呤霉素抗性载体pSV-Puro。使用氨苄青霉素抗性基因(ampR)中的单个限制性位点，将这4种质粒线性化，并通过乙醇沉淀从剩余的盐纯化。相似的，使用与上述相同的限制性酶，切割用于其他人源化变体(VH16R94K/Y100BF(SEQ ID NO：66)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)和VH16R94K/Y100RF(SEQ ID NO：66)-VL43V3Q/T7S/Y32F/P44I/N92A(SEQ ID NO：67))的表达载体，并克隆到pGL41骨架中。
为了稳定的整合到宿主细胞系CHO-S(Invitrogen)中，将10ml细胞以1×106细胞/ml的密度种植在50ml生物反应器过滤管(TPP，Trasadingen，Switzerland)中，培养过夜。在转染前，用转染培养基(Opti-MEM，Invitrogen)替换化学定义的细胞培养基(PowerCHO2，Lonza，Basel，Switzerland)。根据生产商的说明，使用polykationic转染剂JetPEI(Polyplus-transfections，Illkirch，France)，用12.5μg线性化载体混合物转染细胞，所述混合物含有重链和轻链表达质粒pSV-Puro和pSV2neo的混合物。在转染4-5小时后，用1体积的生长培养基稀释细胞。在含有5.0μg/ml嘌呤霉素和500ug/ml遗传霉素的生长培养基中，按1∶10、1∶20或1∶30的比例，稀释下列天数的细胞，并分布在96孔板中。在选择14天后，使用抗体特异性ELISA测定药物抗性集落，并扩增阳性单个克隆进行抗体生产分析。为了获得克隆群体，在细胞培养基(PowerCHO2，Lonza)中，将表现最好的克隆按浓度1、10和100细胞/ml稀释。最后，生产最好的克隆产生的滴度范围是：在12天的振荡分批测定中，VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A抗体400-600mg/L，VH16R94K/Y100BF-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A和VH16R94K/Y100aF-VL43V3Q/T7S/Y32F/P44I/N92A抗体200-300mg/L，使用补充了谷氨酰胺的PowerCHO2细胞培养基。
实施例14：生产去岩藻糖基化的抗CD19抗体的变体
在哺乳动物中，岩藻糖残基通过α-1，6-键连接在几乎所有复杂类型的Asn连接寡糖的最内部的GlcNAc残基上。制备表达大鼠β-1，4-甘露糖-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺转移酶(GNTIII)的稳定细胞系。该酶在糖蛋白(例如抗体)的N连接寡糖中导入了二分支的N-乙酰葡糖胺。此类修饰将抗体的Fc寡糖转变为酶Fut8不可接近的底物，所述酶将岩藻糖残基转移至聚糖树的还原型N-乙酰葡糖胺上(Longmore和Schachter，1982，Carbohydr Res 365-92)，从而抑制岩藻糖基化。大鼠gntIII购自Imagenes(Berlin，Germany)，并使用特异性引物扩增。然后，使用酶BamHI和HindIII消化扩增子，凝胶纯化和克隆到表达载体pGLEX33的BamHI、HindIII开放的多克隆位点中；pGLEX33是基于Invitrogen的pcDNA3.1质粒(Basel，Switzerland)的哺乳动物表达载体，处于小鼠CMV启动子的控制下。所获得的载体被称为pGNTIII。
通过克隆SV40启动子和pBABE-Puro(Addgene，Camebridge，MA，USA)的嘌呤霉素抗性基因(pac)到Promega(Madison，WI，USA)的pGL3中，获得嘌呤霉素抗性载体pSV-Puro。使用氨苄青霉素抗性基因(ampR)中的单个限制性位点，将这2种质粒线性化，并通过乙醇沉淀从剩余的盐纯化。
为了稳定的整合到宿主细胞系CHO-S(Invitrogen)中，将10ml细胞以1×106细胞/ml的密度种植在50ml生物反应器过滤管(TPP，Trasadingen，Switzerland)中，培养过夜。在转染前，用转染培养基(Opti-MEM，Invitrogen)替换化学定义的细胞培养基(PowerCHO2，Lonza，Basel，Switzerland)。根据生产商的说明，使用polykationic转染剂JetPEI(Polyplus-transfections，Illkirch，France)，用12.5μg线性化载体混合物转染细胞，所述混合物含有pGNTIII和pSV-Puro的混合物。在转染4-5小时后，用1体积的生长培养基稀释细胞。在含有5.0μg/ml嘌呤霉素的生长培养基中，按1∶10、1∶20或1∶30的比例，稀释下列天数的细胞，并分布在96孔板中。在选择14天后，分离表达大鼠GNTIII基因的药物抗性集落。
使用Invitrogen的CHO-S细胞系制备第二个稳定的细胞系。使用以前描述的shRNA序列(Imai-Nishiya等人，2007，BMC Biotechnol.，7：84)，用表达敲低酶Fut8(α-1，6-岩藻糖基转移酶)和GMD(GDP-甘露糖-4，6-脱水酶)的小发夹RNA(shRNA)的载体转染细胞，所述shRNA处于人U6启动子和tRNAVal启动子的控制下。构建体购自GeneArt A.G.(Regensburg，Germany)。详细而言，tRNATVal启动子控制Fut8特异性shRNA的表达，而U6启动子控制GMD特异性shRNA的表达。构建体的侧翼是NheI和NruI位点，而这些限制性位点用于将被消化且凝胶纯化的片段克隆到用相同的酶以前消化过的pGLEX1(pcDNA3.1(Invitrogen)的修饰版本)载体骨架中。
如果将细胞培养在缺少岩藻糖的条件下，组合敲低从头通路的这两种酶已表现出对促进IgG1的N连接寡糖结构中的岩藻糖缺失具有协同效应(Imai-Nishiya等人，2007，BMC Biotechnol.7：84)。因为GMD酶不是拯救通路的一部分，因此在存在岩藻糖的条件下，岩藻糖基化的降低将依赖于敲低Fut8酶。用双重敲低表达盒转染的细胞之前表现出丧失了N连接寡糖中90-98％的岩藻糖基化(Imai-Nishiya等人，2007，BMCBiotechnol.，7：84)。为了稳定的整合到宿主细胞系CHO-S(Invitrogen)中，使用氨苄青霉素抗性基因中的单个限制性位点，将siRNA载体线性化。用选择质粒共转染细胞，并如上所述进行选择。
用编码分别如实施例1和11所述VH16R94K(SEQ ID NO：64)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)抗体和VHl6R94K/E269D/S298A(SEQ ID NO：115)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)抗体的质粒，瞬时转染两种细胞系。
为了瞬时转染，将200ml细胞以1×106细胞/ml的密度种植在1000ml圆形Schott瓶中，培养过夜。在转染前，用100ml转染培养基(Opti-MEM，Invitrogen)替换化学定义的细胞培养基(PowerCHO2，Lonza)。根据生产商的说明，使用polykationic转染剂JetPEI(Polyplus-transfections)，用250μg载体混合物转染细胞，所述混合物含有50％重链和50％轻链DNA的混合物。在转染4-5小时后，用1体积的生长培养基稀释细胞。在第5天收获培养基。在离心后，过滤(0.2μm)上清液，在Akta纯化系统(GE healthcare)上通过蛋白A亲和层析(Hitrap，GE healthcare，Zurich，Switzerland)纯化。如实施例11所述实施ADCC测定。
以shRNA生产的抗体变体和上述GNTIII细胞系分别由shRNA或GNTIII suffix设计。图13显示，去岩藻糖基化变体具有比其岩藻糖基化的亲本抗体增加至少2倍的ADCC。
实施例15：在人源化SCID小鼠中，抗CD19抗体对B细胞移植物移入的效应。
该研究设计为评估抗CD19处理huPBL SCID小鼠的体内效应。在开始处理前，将30只5-6周龄且称重为16-20g、健康的雌性严重联合免疫缺陷病(SCID，HARLAN)小鼠基于体重随机化为1组2只动物，另外4组7只动物。每组的平均体重是可比较的，与其他组没有统计学差异(方差分析)。然后，在D0天使用γ-源(1.8Gy，60Co，INRA BRETENIERE，Dijon，France)，将所有的小鼠进行全身辐射。在D1和D8天，小鼠接受20mg/kg的NK细胞耗尽的Ab(mCD122抗原，大鼠IgG2b同种型，TM-Beta 1，BioXCell，USA)的单次SC注射。
获得健康自愿者供体的4种新鲜收集的暗黄覆盖层样品，在收集全血后的48h内，根据Ficoll-
Figure BDA0000100909380001031
plus程序(Ref 07907，StemCellTechnologies)，使用梯度离心纯化外周血单核细胞(PBMC)。在体内注射前，通过0.25％台盼蓝排出评估PBMC的活力。在D3，用来自供体#1、#2和#3的3x107hPBMC(组2至5，2-3只小鼠/供体)或PBS(组1)IP注射小鼠(通过IP途径注射PBS中的500μL)。在D14，组2、3、4和5的小鼠分别以10mg/kg/inj接受(阴性对照，21.0mg/ml，Batch N°B1492)、(阳性对照，10.0mg/ml，Batch N°B2136)、抗CD19抗体变体VH16R94K(SEQ ID NO：64)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)或抗CD19抗体变体VH16R94K/S324N(SEQ ID NO：118)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A(SEQ ID NO：65)的单次IV注射。下表24概括了处理规程：
表24：处理规程
Figure BDA0000100909380001041
通过4色流式细胞仪分析检测脾脏中的人B淋巴细胞。对于每个样品，使用hCD45(+)、mCD45(-)、hCD20(+)和hCD19(+)和PKH26参照微珠(RefP7458，Sigma)的细胞表面表达定量人B淋巴细胞。使用下表25中描述的抗体。
表25：检测人B淋巴细胞的抗体
Figure BDA0000100909380001042
″BD：Becton Dickinson Biosciences，Le Pont de Claix，France
对于CD标志物表达分析，将100000个脾脏细胞在200μL染色缓冲液(PBS(Ref 17-516F，Lonza)、0.2％BSA(RefA7030，Sigma)、0.02％NaN3(Ref S2002，Sigma))中室温下黑暗孵育20分钟，其具有hCD19PerCP、hCD20FITC、hCD45APC和mCD45APC-Cy7抗体的混合溶液，或mIgG 1-FITC、rIgG2b-APC-Cy7、mIgG 1-APC和mIgG 1-PerCP抗体的混合溶液。在每种情况下使用同种型对照抗体作为阴性对照。
使用“固定和裂解”程序裂解红血细胞。简而言之，通过在1mL的VersaLyse(Ref A09777，Beckman Coulter)添加25μL的IOTest 310X固定溶液(Ref A07800，Beckman Coulter)，来制备“固定和裂解”缓冲液，并向染色的细胞中添加1ml所述混合物。在振荡和室温下黑暗孵育10min后，离心细胞，并用3mL染色缓冲液洗涤1次，重悬在0.5mL参照微珠溶液(PKH26，Ref P7458，Sigma，在染色缓冲液中1/2稀释)中。将样品保藏在冰上，直到FACS分析为止免受曝光。用
Figure BDA0000100909380001051
space流式细胞仪(Partec S.A.R.L.)分析染色的细胞，使用488nm波长激光激发。对每个样品，在收集共计10,000个hCD45(+)(如果可实现的话)后停止获取。保存获取过程中的所有事件。
用显示FSC比SSC参数(正向和侧向散射探测器)的点印迹(为了使细胞尺寸和复杂性可视化)和显示hCD45(FITC)荧光强度的点印迹表示FACS结果。
通过使用下列公式实现对绝对细胞计数的计算：
Figure BDA0000100909380001052
其中：
-ACN是每L的绝对细胞数，
-CN是细胞数，
-BN是珠数。
-根据生产商提供的批次，稍后说明珠子浓度。
-Vf(以mL表示)是用于重悬细胞沉淀的微珠溶液的体积。
-Vi(以μL表示)是用于FACS分析的初始血液体积。
图14显示了D18时，移植SCID小鼠的脾脏中的总B细胞的单个ACN。图15显示了D18时，移植SCID小鼠的脾脏中的总B细胞的单个百分比。
除了hPBMC&抗-CD 19变体V18组的一只小鼠(小鼠N°3817)外，所有的小鼠都成功的移植了hPBMC，导致在小鼠的血液中检测到循环的人CD45+白细胞。在大部分移植hPBMC的小鼠中，人CD45+白细胞的水平超过了15％的血细胞。此外，在52％的移植小鼠中，观察到高水平的人细胞重建(在血细胞中达到31-73％hCD45+白细胞)。在实验过程中，hCD45+白细胞的水平没有改变或是增加的。在移植后第18天，在脾脏中也检测到人CD45+白细胞，脾脏细胞中的平均移植水平是约45％hCD45+细胞。
当在给药后第4天杀死小鼠时，分析脾脏中的人B细胞群体；换言之这是移植后的第18天。在阴性对照组的所有移植小鼠中，脾脏在hCD45+白细胞中含有5至11％B细胞。脾脏中的人B细胞由hCD19+或hCD20+单阳性细胞以及hCD19+hCD20+双阳性B细胞构成。在用
Figure BDA0000100909380001061
抗CD 19抗体变体VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A或抗CD 19抗体变体VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A处理的小鼠脾脏中，只检测到低水平(＜3％)的人B细胞，相比组，人B细胞群体的减少是统计学显著的。另一方面，在抗CD 19变体抗体VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A或抗CD 19抗体变体VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A和
Figure BDA0000100909380001063
处理之间，对脾脏的B细胞耗尽没有观察到统计学差异。
结果证实，单次IV注射10mg/kg的抗CD 19抗体变体VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A或抗CD 19抗体变体VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A导致被处理小鼠的脾脏中B细胞耗尽，对GBR抗体的响应与对
Figure BDA0000100909380001064
的强度相当。
Figure IDA0000100909470000011
Figure IDA0000100909470000021
Figure IDA0000100909470000031
Figure IDA0000100909470000041
Figure IDA0000100909470000061
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Figure IDA0000100909470000081
Figure IDA0000100909470000091
Figure IDA0000100909470000101
Figure IDA0000100909470000121
Figure IDA0000100909470000131
Figure IDA0000100909470000151
Figure IDA0000100909470000161
Figure IDA0000100909470000171
Figure IDA0000100909470000181
Figure IDA0000100909470000191
Figure IDA0000100909470000211
Figure IDA0000100909470000231
Figure IDA0000100909470000241
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Figure IDA0000100909470000301
Figure IDA0000100909470000311
Figure IDA0000100909470000321
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Claims (110)

1.结合人CD19的人源化抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包括包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ IDNO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。
2.权利要求1的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3。
3.权利要求1的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。。
4.权利要求1的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ IDNO：28的氨基酸序列的重链CDR2，和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR3；以及包括包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链CDR2，和包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链CDR3。
5.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括选自SEQ ID NO：19、20、21、22和42的重链可变区序列。
6.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括与SEQ ID NO：19、20、21、22或42的框架区序列至少80％相同的重链可变框架区序列。
7.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括SEQ ID NO：21的重链可变区序列。
8.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括与SEQ ID NO：21的框架区序列至少80％相同的重链可变框架区序列。
9.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括这样的重链可变框架区，所述重链可变框架区是选自V3-33＊01(SEQ ID NO：11)、V3-11＊01(SEQ ID NO：12)、V3-30＊-18(SEQ ID NO：13)和V3-48＊01(SEQ ID NO：14)的人基因的产物或源自所述人基因。
10.权利要求1至9的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段的至少一个重链CDR包含至少一种氨基酸修饰。
11.权利要求10的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括在重链CDR1内的氨基酸取代Y32F，其中利用Kabat中提出的编号系统表示氨基酸位置。
12.权利要求10的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括在重链CDR2内的氨基酸取代Y58F或Y59F，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
13.权利要求10的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括在重链CDR3内的选自Y96F、Y97F、Y98F和Y100BF的一个或多个氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
14.权利要求5至13的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段的重链可变区的至少一个框架区包含至少一种氨基酸修饰，所述氨基酸修饰来自相应的鼠抗体的重链可变区的相应的框架区。
15.权利要求14的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括在选自37、42、48、49、67、71、78和94的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
16.权利要求14的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括在选自42、67、71、78和94的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
17.权利要求14的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括选自G42R、F67L、R71K、L78V和R94K的氨基酸取代，条件是如果氨基酸修饰是R94K，则重链可变区序列不是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
18.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括选自SEQ ID NO：23、24、25、26和41的轻链可变区序列。
19.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括与SEQ ID NO：23、24、25、26和41的框架区序列至少80％相同的轻链可变框架区序列。
20.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括SEQ ID NO：41的轻链可变区序列。
21.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括与SEQ ID NO：41的框架区序列至少80％相同的轻链可变框架区序列。
22.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括这样的轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是选自V1-5＊03(SEQ ID NO：3)、V1-27＊01(SEQ ID NO：4)、V1-39＊-01(SEQID NO：5)和V1-12＊01(SEQ ID NO：6)的人基因的产物或源自所述人基因。
23.权利要求1至4或18至22的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段的至少一个轻链CDR包括至少一种氨基酸修饰。
24.权利要求23的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括在轻链CDR1中的氨基酸取代Y32F，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
25.权利要求23的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括选自轻链CDR3内的N92A、T93A和T93V的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
26.权利要求18至25的任一项的人源化抗体或其片段，其中人源化抗体或其片段的轻链可变区的至少一个框架区包括至少一种氨基酸修饰，所述氨基酸修饰来自相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区。
27.权利要求26的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括在选自44、71和87的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
28.权利要求26的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括选自P44V、P44I、P44L、F71Y、F71H、F71S、F71T和Y87F的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
29.权利要求26的人源化抗体或其片段，其中氨基酸修饰包括选自P44V、P44I、F71Y和Y87F的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
30.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)选自SEQ ID NO：19、20、21、22和42的重链可变区序列；和
(b)选自SEQ ID NO：23、24、25、26和41的轻链可变区序列。
31.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区序列；和
(b)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的轻链可变区序列。
32.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括选自SEQ ID NO：33、34、35、36、37、43、44、45、46、47、54和55的重链可变区。
33.权利要求1至4的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括选自SEQ ID NO：25、38、39、40、48、49、50、51、52、53、56、57、58、59、60、61、62和63的轻链可变区。
34.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的轻链可变区。
35.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括包括包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ IDNO：60的氨基酸序列的轻链可变区。
36.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的轻链可变区。
37.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的轻链可变区。
38.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的轻链可变区。
39.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的轻链可变区。
40.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的轻链可变区。
41.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的重链序列；和
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
42.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链序列；和
(b)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的轻链序列。
43.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链序列；和
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
44.权利要求1至40的任一项的人源化抗体或其片段，其还包括人重链和/或轻链恒定区。
45.权利要求44的人源化抗体或其片段，其中所述人重链恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE组成的人免疫球蛋白的组。
46.权利要求44的人源化抗体或其片段，其中所述人重链恒定区是人IgG。
47.权利要求44的人源化抗体或其片段，其中所述人重链恒定区是人IgG1。
48.权利要求44的人源化抗体或其片段，其中所述人重链恒定区包括包含来自人IgG1的CH1、来自人IgG1的铰链区和来自人IgG3的Fc区的同种型变体。
49.权利要求48的人源化抗体或其片段，其包括：
(a)包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的重链序列；和
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
50.权利要求48的人源化抗体或其片段，其中所述同种型变体相比权利要求47的人源化抗体或其片段表现出改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
51.权利要求44的人源化抗体或其片段，其中所述人轻链恒定区选自由人κ和人λ组成的人免疫球蛋白的组。
52.权利要求51的人源化抗体或其片段，其中所述人轻链恒定区是人κ。
53.权利要求1至52的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述抗体是全长抗体。
54.权利要求1至52的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述抗体是抗体片段，其选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab′)2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双抗体、三链抗体和与相同或不同抗体遗传融合的scFv。
55.权利要求1至53的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述抗体包括相对于亲本抗体的人IgG Fc区含有至少一种氨基酸修饰的变体人IgG Fc区，而包含变体人IgG Fc区的抗体表现出相比亲本抗体改变的效应子功能。
56.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述效应子功能是补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
57.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述氨基酸修饰包括在选自269、274、276、298、324和334的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
58.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述氨基酸修饰包括选自E269D、K274Q、N276K、S298A、S324N和K334R的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
59.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述氨基酸修饰包括在选自269/274，269/276，269/298，269/324，269/334，274/276，274/298，274/324，274/334，276/298，276/324，276/334，298/324，298/334，324/334，269/274/276，269/274/298，269/274/324，269/274/334，269/276/298，269/276/324，269/276/334，269/298/324，269/298/334，274/276/298，274/276/324，274/276/334，274/298/324，274/298/334，276/298/324，和276/298/334的氨基酸位置上的氨基酸取代的组合，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
60.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述氨基酸修饰包括选自E269D/K274Q，E269D/N276K，E269D/S298A，E269D/S324N，E269D/K334R，K274Q/N276K，K274Q/S298A，K274Q/S324N，K274Q/K334R，N276K/S298A，N276K/S324N，N276K/K334R，S298A/S324N，S298A/K334R，S324N/K334R，E269D/K274Q/N276K，E269D/K274Q/S298A，E269D/K274Q/S324N，E269D/K274Q/K334R，E269D/N276K/S298A，E269D/N276K/S324N，E269D/N276K/K334R，E269D/S298A/S324N，E269D/S298A/K334R，K274Q/N276K/S298A，K274Q/N276K/S324N，K274Q/N276K/K334R，K274Q/S298A/S324N，K274Q/S298A/K334R，N276K/S298A/S324N，和N276K/S298A/K334R的氨基酸取代的组合，其中利用Kabat中提出的编号系统表示每组成员的氨基酸位置。
61.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列的重链序列；
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
62.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列的重链序列；
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
63.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：116的氨基酸序列的重链序列；
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
64.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的重链序列；
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
65.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：118的氨基酸序列的重链序列；
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
66.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列的重链序列；
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
67.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的重链序列；
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
68.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的重链序列；
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
69.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的重链序列；
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
70.权利要求55的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段包括
(a)包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的重链序列；
(b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链序列。
71.权利要求46的人源化抗体或其片段，其中所述与人IgG Fc区连接的成熟的核心糖类结构缺少岩藻糖。
72.结合人CD19的人源化抗体或其片段，其中所述抗体包括变体人IgG Fc区，所述变体人IgG Fc区包含用天冬酰胺替换亲本抗体的氨基酸324位的丝氨酸的氨基酸取代S324N，而包括所述变体人IgG Fc区的抗体相比亲本抗体表现出改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
73.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段结合Raji肿瘤细胞，其具有的中点荧光(MPF)相对于相应嵌合抗体的结合为至少10％。
74.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段结合人CD19，其具有的亲和力(Kd)为50nM或更低。
75.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段保留了相应嵌合抗体的至少20％的CD19结合亲和力(Kd)。
76.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体竞争结合Raji肿瘤细胞，其具有的亲和力(Ki)为50nM或更低。
77.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段在Raji肿瘤细胞中诱导凋亡。
78.权利要求77的人源化抗体或其片段，其中在至少10％的Raji肿瘤细胞中诱导凋亡。
79.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段在Raji肿瘤细胞中诱导ADCC活性。
80.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段抑制恶性B细胞的增殖。
81.权利要求80的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段保留了相应嵌合抗体的至少60％的对恶性B细胞增殖的抑制。
82.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段抑制Raji肿瘤细胞的克隆发生。
83.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段导致血液中的B细胞耗尽。
84.权利要求83的人源化抗体或其片段，其中所导致的B细胞耗尽至少与相应嵌合抗体导致的B细胞耗尽相同。
85.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段在Raji肿瘤细胞中内化。
86.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体具有大于65℃的FAB片段热稳定温度。
87.权利要求86的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体的FAB片段的热稳定温度等于亲本鼠抗体的FAB片段的热稳定温度。
88.编码权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段的分离的核酸。
89.分离的核酸，其包括结合人CD19的人源化FMC63变体的重链编码核酸序列，所述重链编码核酸序列保藏在DSMZ的具有登录号DSM 23302的微生物中。
90.分离的核酸，其包括结合人CD19的人源化FMC63变体的轻链编码核酸序列，所述轻链编码核酸序列保藏在DSMZ的具有登录号DSM 23303的微生物中。
91.载体，其包括权利要求88的分离的核酸或权利要求89和90的分离的核酸。
92.宿主细胞，其包括权利要求88的分离的核酸或权利要求89和90的分离的核酸或权利要求91的载体。
93.生产结合人CD19的人源化抗体或其片段的方法，其包括培养权利要求92的宿主细胞，使得表达核酸和生产抗体。
94.权利要求89和90的分离的核酸编码的结合人CD19的人源化抗体或其片段。
95.组合物，其包括权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，和药学可接受的载体。
96.免疫缀合物，其包括与治疗剂连接的权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段。
97.组合物，其包括权利要求96的免疫缀合物，和药学可接受的载体。
98.抑制表达CD19的肿瘤细胞生长的方法，其包括将细胞与一定量的权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段接触，所述量有效的抑制肿瘤细胞的生长。
99.权利要求98的方法，其中所述肿瘤细胞选自人伯基特淋巴瘤细胞、人B细胞前体型白血病细胞、人B细胞白血病细胞或人B细胞型淋巴瘤细胞。
100.耗尽对象中的B细胞的方法，其包括向对象施用一定量的权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，所述量有效的耗尽对象中的B细胞。
101.治疗对象中CD19介导的病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段。
102.权利要求101的方法，其中所述CD19介导的病症选自包含类风湿性关节炎的自身免疫病症，癌症、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多毛细胞白血病、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T-细胞淋巴瘤、结节性小裂细胞淋巴瘤、外周T-细胞性淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T-细胞白血病(T-ALL)、内分芽型/中心细胞性(cb/cc)滤泡型淋巴瘤癌症、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)-样T细胞性淋巴瘤、HIV相关性体腔淋巴瘤、胚性癌、鼻咽部的未分化癌(例如，施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波氏肉瘤、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、抗CD20抗体耐受性B细胞癌症和其他的B细胞淋巴瘤和白血病。
103.权利要求101的方法，其中所述CD19介导的病症选自非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多毛细胞白血病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)和抗CD20抗体耐受性B细胞癌症。
104.权利要求101的方法，其中所述CD19介导的病症是肿瘤发生性病症。
105.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段作为药物的用途。
106.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段在制备用于治疗CD19介导的病症的药物中的用途。
107.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其用作为药物。
108.权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段，其用于治疗CD19介导的病症的方法中。
109.制品，其包括权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段、权利要求95或97的组合物或权利要求96的免疫缀合物，用于治疗CD19介导的病症。
110.药盒，其包括权利要求1至72的任一项的人源化抗体或其片段、权利要求95或97的组合物或权利要求96的免疫缀合物，用于治疗CD19介导的病症。
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SG (1) SG173654A1 (zh)
WO (1) WO2010095031A2 (zh)
ZA (1) ZA201106369B (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105050661A (zh) * 2012-10-12 2015-11-11 Adc疗法责任有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓-抗体结合物
CN106922147A (zh) * 2014-08-28 2017-07-04 朱诺治疗学股份有限公司 Cd19特异性抗体和嵌合抗原受体
CN107406517A (zh) * 2015-03-05 2017-11-28 Ucl商务股份有限公司 包含cd19结合域的嵌合抗原受体(car)
CN108137696A (zh) * 2015-10-01 2018-06-08 豪夫迈·罗氏有限公司 人源化抗人cd19抗体和使用方法
CN109293774A (zh) * 2018-10-16 2019-02-01 南京医科大学 特异性结合cd19的全人源化抗体及应用
WO2019137518A1 (zh) * 2018-01-15 2019-07-18 李华顺 以cd19为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备方法和应用
CN110248677A (zh) * 2017-01-05 2019-09-17 上海斯丹赛生物技术有限公司 人源化抗cd19抗体及其与嵌合抗原受体的用途
CN110396129A (zh) * 2019-07-10 2019-11-01 武汉思安医疗技术有限公司 人源化cd19抗原结合单链抗体及其嵌合抗原受体、免疫细胞和应用
CN112679612A (zh) * 2021-01-29 2021-04-20 武汉华美生物工程有限公司 抗cd19人源化抗体及其制备方法与应用
WO2022105811A1 (zh) * 2020-11-20 2022-05-27 江苏先声药业有限公司 Cd19人源化抗体及其应用
TWI768034B (zh) * 2017-04-24 2022-06-21 美商凱特製藥公司 人類化抗原-結合域及使用方法
TWI835141B (zh) 2017-04-24 2024-03-11 美商凱特製藥公司 人類化抗原-結合域及使用方法

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112012021261A2 (pt) * 2010-02-23 2020-01-07 Sanofi Anticorpo de integrina anti-alfa2 humanizada, uso do mesmo, ácido nucleico isolado codificando um anticorpo de integrina anti-alfa2beta1, vetor, célula hospedeira, composição, kit e anticorpo
UY33578A (es) 2010-08-31 2012-03-30 Sanofi Sa PÉPTIDO O COMPLEJO PEPTÍDICO QUE SE UNE A INTEGRINA a(ALFA) Y MÉTODOS Y USOS QUE IMPLICAN A LOS MISMOS
US9605320B2 (en) * 2011-01-13 2017-03-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of predicting responsiveness of B cell lineage malignancies to active immunotherapy
SG188638A1 (en) 2011-03-25 2013-05-31 Glenmark Pharmaceuticals Sa Hetero-dimeric immunoglobulins
CN107915775B (zh) 2011-07-11 2022-07-12 伊克诺斯科学公司 结合ox40的抗体及其用途
EP2744515B1 (en) 2011-08-16 2022-02-09 MorphoSys AG Combination therapy with an anti-cd19 antibody and a nitrogen mustard
LT2744826T (lt) 2011-08-16 2022-04-25 Morphosys Ag Kombinuota terapija su anti-cd19 antikūnu ir purino analogu
EP3401337A1 (en) 2012-09-25 2018-11-14 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Purification of hetero-dimeric immunoglobulins
RS58921B1 (sr) 2012-10-12 2019-08-30 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepini i njihovi konjugati
MX364328B (es) 2012-10-12 2019-04-23 Medimmune Ltd Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina.
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
JP2016503818A (ja) 2013-01-02 2016-02-08 グレンマーク ファーマシューティカルズ， エセ．アー． Ｔｌ１ａと結合する抗体およびその使用
JP6493692B2 (ja) 2013-03-15 2019-04-10 セルジーン コーポレイション 修飾されたｔリンパ球
UY35468A (es) * 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
EP3013856A2 (en) 2013-06-27 2016-05-04 AbbVie Biotherapeutics Inc. Fc variants with improved complement activation
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
AU2014342020C1 (en) * 2013-10-31 2019-09-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-T effector cells, and uses thereof
AP2016009222A0 (en) 2013-11-04 2016-05-31 Glenmark Pharmaceuticals Sa Production of t cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
WO2015090230A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
IL280215B (en) 2014-04-07 2022-07-01 Novartis Ag Cancer treatment using a chimeric receptor antigen (car) against cd19
EP2990416B1 (en) 2014-08-29 2018-06-20 GEMoaB Monoclonals GmbH Universal chimeric antigen receptor expressing immune cells for targeting of diverse multiple antigens and method of manufacturing the same and use of the same for treatment of cancer, infections and autoimmune disorders
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2016061368A1 (en) * 2014-10-15 2016-04-21 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating b-lymphoid malignancies
MA41480A (fr) 2014-10-17 2017-12-19 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anticorps qui se lient au ccr6 et leurs utilisations
US11773166B2 (en) 2014-11-04 2023-10-03 Ichnos Sciences SA CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production
JP7068820B2 (ja) 2014-12-03 2022-05-17 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 養子細胞療法のための方法および組成物
US10253086B2 (en) 2015-04-08 2019-04-09 Novartis Ag CD20 therapies, CD22 therapies, and combination therapies with a CD19 chimeric antigen receptor (CAR)-expressing cell
WO2016168769A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 The California Institute For Biomedical Research Chimeric receptor t cell switches for her2
JP6985934B2 (ja) * 2015-04-29 2021-12-22 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 操作された造血幹細胞／前駆細胞及び非ｔエフェクター細胞、ならびにその使用
SG10201914069SA (en) 2015-05-18 2020-03-30 Tcr2 Therapeutics Inc Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
RS59605B1 (sr) 2015-05-26 2020-01-31 Morphosys Ag Kombinacija anti-cd19 antitela i inhibitora brutonove tirozin kinaze i njene upotrebe
US10493139B2 (en) 2015-07-24 2019-12-03 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Humanized anti-CD19 antibody and use thereof with chimeric antigen receptor
EP3149046B1 (en) * 2015-07-24 2020-02-26 Innovative Cellular Therapeutics Co., Ltd. Humanized anti-cd19 antibody and use thereof
EP3337506B1 (en) 2015-08-21 2021-07-21 MorphoSys AG Combinations and uses thereof
MA44909A (fr) 2015-09-15 2018-07-25 Acerta Pharma Bv Association thérapeutique d'un inhibiteur du cd19 et d'un inhibiteur de la btk
EP3913000A1 (en) * 2015-10-02 2021-11-24 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
ES2928167T3 (es) * 2015-12-03 2022-11-15 Juno Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reducir las respuestas inmunitarias contra receptores de antígenos quiméricos
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
RS62155B1 (sr) 2016-05-30 2021-08-31 Morphosys Ag Postupci predviđanja terapijske koristi anti-cd19 terapije kod pacijenata
KR102533875B1 (ko) 2016-06-27 2023-05-18 모르포시스 아게 항-cd19 항체 제제
EP3523331A1 (en) 2016-10-07 2019-08-14 Novartis AG Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
WO2018075820A2 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Celgene Corporation Cereblon-based heterodimerizable chimeric antigen receptors
MX2019004942A (es) 2016-10-28 2019-08-12 Morphosys Ag Combinacion de anticuerpo anti cd19 con un inhibidor de bcl-2 y usos de la misma.
AU2017363311A1 (en) 2016-11-22 2019-06-13 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2871001T3 (es) 2017-02-08 2021-10-28 Adc Therapeutics Sa Conjugados de pirrolobenzodiazepinas y anticuerpos
CN106967171B (zh) * 2017-02-23 2021-04-27 郑州大学 一种全人源重组CD40L单抗Fab片段及其制备方法
PT3612537T (pt) 2017-04-18 2022-08-29 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
CN110753555A (zh) 2017-04-19 2020-02-04 得克萨斯州大学系统董事会 表达工程化抗原受体的免疫细胞
KR102455340B1 (ko) * 2017-05-10 2022-10-18 더 위스타 인스티튜트 오브 아나토미 앤드 바이올로지 최적화된 핵산 항체 작제물
SI3630177T1 (sl) 2017-05-31 2023-12-29 Morphosys Ag Paradigma zdravljenja za protitelo proti cd19 in kombinirano zdravljenje z venetoklaksom
WO2018229222A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-cd19 adc
US11634488B2 (en) 2017-07-10 2023-04-25 International—Drug—Development—Biotech Treatment of B cell malignancies using afucosylated pro-apoptotic anti-CD19 antibodies in combination with anti CD20 antibodies or chemotherapeutics
CA3099487A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 Nbe-Therapeutics Ag Human antibodies binding to ror2
MY194477A (en) 2017-08-18 2022-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
WO2019057100A1 (en) 2017-09-21 2019-03-28 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. NEW ANTI-CD19 ANTIBODIES
JP7277473B2 (ja) 2017-10-30 2023-05-19 ニューロポア セラピーズ インコーポレイテッド 置換フェニルスルホニルフェニルトリアゾールチオンおよびその使用法
WO2019112347A2 (ko) * 2017-12-06 2019-06-13 앱클론(주) 악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
CN109053899B (zh) * 2017-12-22 2021-11-16 湖南远泰生物技术有限公司 一种含人转铁蛋白抗原表位序列的嵌合体抗原受体
JP7080514B2 (ja) * 2017-12-22 2022-06-06 アブクロン・インコーポレイテッド 悪性ｂ細胞を特異的に認知する抗体またはその抗原結合断片、これを含むキメラ抗原受容体及びその用途
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
MX2020013443A (es) 2018-06-13 2021-02-26 Novartis Ag Receptores de antigeno quimerico de bcma y usos de los mismos.
CN116726362A (zh) 2018-11-19 2023-09-12 比奥拉治疗股份有限公司 用生物治疗剂治疗疾病的方法和装置
SG11202106302WA (en) 2018-12-12 2021-07-29 Kite Pharma Inc Chimeric antigen receptors and car-t cells and methods of use
JP2021528048A (ja) * 2019-03-05 2021-10-21 ンカルタ・インコーポレイテッドＮｋａｒｔａ， Ｉｎｃ． Ｃｄ１９指向性キメラ抗原受容体および免疫療法におけるその使用
EP3953385A4 (en) * 2019-04-08 2022-12-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center CD19 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
BR112021021542A2 (pt) * 2019-04-30 2022-04-19 Crispr Therapeutics Ag Terapia celular alogênica de malignidades de células b com o uso de células t geneticamente modificadas que têm como alvo cd19
WO2020225196A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Morphosys Ag Anti-cd19 therapy in patients having a limited number of nk cells
WO2020261219A1 (en) * 2019-06-27 2020-12-30 Crispr Therapeutics Ag Use of chimeric antigen receptor t cells and nk cell inhibitors for treating cancer
JP2022550435A (ja) 2019-10-04 2022-12-01 ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド 組換えａａｖの改善された治療的使用のための方法
JP2022554324A (ja) 2019-10-31 2022-12-28 モルフォシス・アーゲー 抗ｃｄ１９抗体及びガンマデルタｔ細胞を含む抗腫瘍併用療法
AU2020376305A1 (en) 2019-10-31 2022-05-12 Incyte Corporation Anti-CD19 therapy in combination with lenalidomide for the treatment of leukemia or lymphoma
CN115666704A (zh) 2019-12-13 2023-01-31 比奥拉治疗股份有限公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
WO2021255155A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cd19
AU2021298106A1 (en) 2020-06-22 2023-01-19 Gilead Sciences, Inc. Anti-tumor combination therapy comprising anti-CD19 antibody and polypeptides blocking the SIRPalpha-CD47 innate immune checkpoint
TW202229349A (zh) 2020-10-06 2022-08-01 美商山可爾股份有限公司 用於治療包括全身性紅斑性狼瘡(sle)的自體免疫疾病之生物標記、方法及組合物
KR20230131464A (ko) 2020-12-04 2023-09-13 모르포시스 아게 항-cd19 병용 요법
WO2022155375A2 (en) * 2021-01-13 2022-07-21 Washington University MHC-INDEPENDENT TCRs AND METHODS OF MAKING AND USING SAME
CA3217586A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Eliezer Katz Use of an anti-cd19 antibody to treat myasthenia gravis
WO2023073645A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Therapy comprising anti-cd19 antibody and sumo-activating enzyme inhibitor
WO2024038115A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Morphosys Ag Therapy comprising anti-cd19 antibody and ezh2 modulators

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3883899T3 (de) * 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5677425A (en) * 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5571894A (en) * 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5587458A (en) * 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
ATE419355T1 (de) 1992-02-06 2009-01-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
EP0640094A1 (en) * 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5641870A (en) * 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6121022A (en) * 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) * 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6194551B1 (en) * 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2386574A3 (en) 1999-01-15 2012-06-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ATE338124T1 (de) * 2000-11-07 2006-09-15 Hope City Cd19-spezifische umgezielte immunzellen
WO2002097395A2 (en) * 2001-05-31 2002-12-05 Chiron Corporation P-cadherin as a target for anti-cancer therapy
KR100988949B1 (ko) * 2001-10-25 2010-10-20 제넨테크, 인크. 당단백질 조성물
US20040002587A1 (en) * 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
KR20050089151A (ko) * 2002-11-26 2005-09-07 프로테인 디자인 랩스 인코포레이티드 혈관형성을 조절하는 α5β1 인테그린에 대한 키메라성 및인간화 항체
EP2216342B1 (en) * 2003-07-31 2015-04-22 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
WO2005047324A2 (en) * 2003-11-10 2005-05-26 Schering Corp ANTI-INTERLEUKIN ANTIBODY-10
EP2548575A1 (en) * 2005-02-15 2013-01-23 Duke University Anti-CD19 antibodies that mediate ADCC for use in treating autoimmune diseases
WO2006121852A2 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 Duke University Anti-cd19 antibody therapy for autoimmune disease
EP1899379B1 (en) * 2005-06-20 2018-04-11 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Cd19 antibodies and their uses
US20090068110A1 (en) * 2006-12-22 2009-03-12 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105050661B (zh) * 2012-10-12 2018-03-30 Adc疗法责任有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓‑抗体结合物
CN105050661A (zh) * 2012-10-12 2015-11-11 Adc疗法责任有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓-抗体结合物
CN106922147A (zh) * 2014-08-28 2017-07-04 朱诺治疗学股份有限公司 Cd19特异性抗体和嵌合抗原受体
CN114106181A (zh) * 2014-08-28 2022-03-01 朱诺治疗学股份有限公司 Cd19特异性抗体和嵌合抗原受体
CN106922147B (zh) * 2014-08-28 2021-12-21 朱诺治疗学股份有限公司 Cd19特异性抗体和嵌合抗原受体
CN107406517B (zh) * 2015-03-05 2020-05-12 Ucl商务有限公司 包含cd19结合域的嵌合抗原受体(car)
CN107406517A (zh) * 2015-03-05 2017-11-28 Ucl商务股份有限公司 包含cd19结合域的嵌合抗原受体(car)
US11578126B2 (en) 2015-03-05 2023-02-14 Autolus Limited Chimeric antigen receptor (CAR) comprising a CD19-binding domain
CN108137696B (zh) * 2015-10-01 2022-01-11 豪夫迈·罗氏有限公司 人源化抗人cd19抗体和使用方法
CN108137696A (zh) * 2015-10-01 2018-06-08 豪夫迈·罗氏有限公司 人源化抗人cd19抗体和使用方法
CN110248677A (zh) * 2017-01-05 2019-09-17 上海斯丹赛生物技术有限公司 人源化抗cd19抗体及其与嵌合抗原受体的用途
TWI768034B (zh) * 2017-04-24 2022-06-21 美商凱特製藥公司 人類化抗原-結合域及使用方法
TWI835141B (zh) 2017-04-24 2024-03-11 美商凱特製藥公司 人類化抗原-結合域及使用方法
WO2019137518A1 (zh) * 2018-01-15 2019-07-18 李华顺 以cd19为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备方法和应用
CN109293774A (zh) * 2018-10-16 2019-02-01 南京医科大学 特异性结合cd19的全人源化抗体及应用
CN110396129A (zh) * 2019-07-10 2019-11-01 武汉思安医疗技术有限公司 人源化cd19抗原结合单链抗体及其嵌合抗原受体、免疫细胞和应用
WO2022105811A1 (zh) * 2020-11-20 2022-05-27 江苏先声药业有限公司 Cd19人源化抗体及其应用
CN112679612A (zh) * 2021-01-29 2021-04-20 武汉华美生物工程有限公司 抗cd19人源化抗体及其制备方法与应用
CN112679612B (zh) * 2021-01-29 2022-07-01 武汉华美生物工程有限公司 抗cd19人源化抗体及其制备方法与应用

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