KR20150117259A - Tl1a에 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 더욱 특정적으로, 본 발명은 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.

Description

TL1A에 결합하는 항체 및 이의 용도{ANTIBODIES THAT BIND TO TL1A AND THEIR USES}
본 발명은 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 더욱 특정적으로, 본 발명은 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
TNF-like 리간드 1A(TL1A)는 종양괴사인자(tumor necrosis factor)(리간드) 수퍼페밀리의 구성원, 구성원 15이다. 또한, TL1A는 TNFSF15 및 VEGI로서 알려져있고 생체 내 결장 암(colon carcinomas)의 성장을 억제하는 혈관신생(angiogenesis) 억제제로서 1999년에 확인되었다(Zhai Y et al (1999) FASEB J, 13(1): 181-9). 단백질은 내피세포 및 단핵백혈구(monoctes), 대식세포(macrophages), 림프구(lymphocytes), 고유판 단핵세포(lamina propria mononuclear cells), 수상돌기가지(dendritic cells) 및 형질세포(plasma cells)을 포함하는, 조혈계통의 활성화된 세포에서 풍부하게 발현되나, B 또는 T 세포에서는 발현되지 않는다(Tan KB et al (1997) 유전자, 204: 35-46; Prehn JL et al (2007) J Immunol, 178: 4033-4038). 이것은 또한 신장, 폐, 전립선 및 가슴샘(thymus)에서 발현된다(Tan KB et al (1997), supra). 이것은 TNFRSF25/DR3 및 디코이 수용체(decoy receptor) TR6/DcR3를 위한 리간드이고 자체의 발현은 TNF 및 IL-1α에 의해 유도된다. TNFRSF25/DR3은 T 세포 활성 동안에 상향조절되는 사멸 도메인(death domain)-포함하는 수용체이다. TL1A는 NFRSF25/DR3-발현 세포주, 및 T 세포에서, NF-카파((kappa)B 활성 및 세포사멸(apoptosis)을 유도하고 TL1A는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 IL-2 반응성 및 전염증성(proinflammatory) 사이토카인의 배출을 증가시키는 공동자극자(costimulator)로서 행동할 수 있다. TL1A와 DR3의 상호작용은 면역반응 동안에 T 세포 확장은 촉진할 수 있다(Migone TS et al (2002) Immunity, 16(3): 479-92). 배출된 디코이 수용체 (DcR3), 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 수용체 (TNFR) 수퍼페밀리의 수용성 단백질은 TL1A의 작용을 차단한다(Kim S & Zhang L (2005) J Immunol 방법, 298: 1-8). TL1A는 질병 및 장애의 구성원에서 잠재적 치료 표적으로서 연루된다.
알레르기 및 천식(asthma)에서 폐 염증의 주요 원인은 상승된 IgE 수준 및 NKT 세포에 의한 IL-13의 생성을 가지는 CD4 T 세포의 h2 분극(polarization)이다. TL1A는 NKT 세포에서 공동-자극 IL-4 및 IL-13 생성에 의해 알레르기 폐 염증에서 주요 역할을 한다. TL1A 항체 또는 우성음성(dominant negative) TL1A 돌연변이체에 의한 TL1A 및 DR3 상호작용 차단은 폐 염증을 없앤다(Fang L 외 다수, (2008) J Exp Med, 205(5): 1037-48). DcR3, TL1A를 위한 디코이 수용체는 몇가지 폐 및 결장 암 및 일부정상 조직에서 발현되고, 따라서 폐 및 결장 암에서 TL1A를 위한 역할을 제시한다. 추가적으로, TL1A는 지혈(Angiostatic)되고 금속단백분해효소 (metalloproteinase) 및 IL-8 유전자 발현을 유도하는 것으로 보고되어 왔다(Su WB 외 다수, (2006) Exp 세포 Res, 312: 266-277; Kang YJ 외 다수, (2005) 사이토카인, 29: 229-235). 또한 TL1A 및 DR3는 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 및 케모카인(chemokines)의 생성을 증가시키고 세포외 매트릭스-분해효소(matrix-degrading 효소)에 의해 플라크(plaque) 안정성을 감소시켜 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 발병기전(pathogenesis)에 포함될 수 있다(Kang YJ 외 다수, (2005) supra). 또한 TL1A/DR3는 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis)의 병인(etiology)에 포함된다는 것을 제시하는 증거가 있다 (Bossen C 외 다수, (2006) J Biol Chem, 281(20): 13964-13971).
TL1A의 발현과 염증성 창자병(inflammatory bowel disease)사이의 연합은 연구자에 의해 확인되어 왔다(Prehn JL 외 다수, (2004) Clin Immunol, 112: 66-77; Bamias G 외 다수, (2003) J Immunol, 171: 4868-4874). 심각한 염증성 창자병인 크론병(Crohn’s disease)은 위장관 점막 및 질병의 염증을 초래하는, 작용인자 (전염증성(proinflammatory)) 및 조절 T 세포 반응의 불균형을 원인이 되는 선행 유전적 및 환경 요인으로부터 기원되는 것으로 생각된다. TL1A/DR3 경로는 장의 질병, 예를 들면 크론병(Crohn’s disease)에 중요한 역할을 하는 것으로 나타나고(Papadakis KA 외 다수, (2005) J. Immunol, 174: 4985-4990; Bamias G 외 다수, (2003) supra), 따라서, TL1A/DR3 경로의 봉쇄는 상기 질병에서 치료 기회를 제공할 수 있다.
사멸 수용체(Death receptors) 및 이의 리간드는 조직 항상성 유지 및 프로그램된 세포 사멸의 생리학적 조절에서 핵심 역할을 한다. 사멸 리간드의 결합은 사멸 도메인(death domain), 캐스페아제(caspases)의 활성 및 세포사멸의 유도라고 불리는 보존된 세포질 신호 요소를 경유하여 적응 단백질(adapter protein)의 보충, 수용체의 올리고머화(oligomerization)를 유도한다(Young HA 외 다수, (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 103(22): 8303-8304). 비록 Fas/Apo-1/CD95, TNF-R1, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 또는 DR3과 같은 사멸 수용체가 세포사멸의 유도체로서 초기에 특징되었지만, 또한 상기 수용체는 적응면역반응(adaptive immune response)의 조절을 포함하는, 비-세포사멸 기능을 가진다는 증거가 계속 나오고 있다. 비마스 외 다수(Bamias 외 다수)는 TL1A가 고유판 수상돌기가지(lamina propia dendritic cells)에 의해 발현되고 이것은 순수(naive) CD4+ T 세포거 아니라 기억 세포의 증식을 증가시켜 기능하고 IL-12 및/또는 저-용량 자극의 T 세포 수용체를 협력작용하여 IFN-γ 유전자 발현을 강하게 증강시킨다는 것을 보고하였다(Bamias G 외 다수, (2006) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 103: 8441-8446). 장에서 IFN-γ 발현은 염증 마커로 간주되었고 크론병(Crohn’s disease)을 치료하기 위한 많은 전략은 면역-활성화된 상태를 억제하기 위한 다양한 시도에 의존된다. 그러나, 이러한 접근(스테로이드 치료 및 면역억제 약물)은 특정적으로 장에 집중하지 않고 따라서 자체의 합병증을 가진다. TNF-α의 길항제(antagonists) 사용에 기반하는 표적화된 치료는 1990년대에 성공적으로 도입되었고 그 결과는 TL1A 또는 자체의 수용체에 대한 특정적으로 직접 작용하는 치료가 장애를 쇠약하게 하는데 대안적 표적화된 치료를 제공할 수 있다.
크론병(Crohn’s disease)에 대한 현재 치료는 항-염증 (예를 들면, 설파살라진(sulfasalazine)), 코르티손(cortisone) 또는 스테로이드(steroids) (예를 들면, 프레드니손(prednisone)), 면역 시스템 억제제(예를 들면, 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine)) 및 항생제 뿐만 아니라, 항- TNF-α 단클론 항체 인플릭시맵(Infliximab)(Remicade®; Centocor) 및 아달리무맙(Adalimumab)(Humira®; Abbott)을 포함한다. 그러나, 인플릭시맵(Infliximab)은 다른 활용가능한 치료와 비교하여 높은 정도의 특정성을 가지는 단지 치료 선택이다. 비록 인플릭시맵(Infliximab)은 일반적으로 잘 견디지만 이것은 결핵(tuberculosis) 감염의 재발, 심장마비 악화, 말이집탈락(demyelinating) 질병 및 증가된 림프종(lymphoma)의 발생률을 일으킬 수 있다.
따라서 다양한 염증 및 면역 질병 및 장애의 치료 및 진단에 사용될 수 있는 조성물에 대한 당업계에 필요성이 있다.
도 1: 상기 도는 HRP-표지된 항-마우스 IgG 2차 항체 및 TMB 기질을 사용하여 검출되는, 인간 TL1A-his (도 1A) 또는 관계없는 단백질-his (도 1B)에 하이브리도마 항체의 결합을 니타낸다. 도 1A는 인간 TL1A-his에 대해 코팅된 450nm ELISA에서 흡광도를 나타내고 도 1B는 무관한 단백질-his에 대한 450nm의 ELISA에서 흡광도를 나타낸다.
도 2: 상기 도는 ELISA 차단에서 세가지 상이한 농도에서 정제된 하이브리도마 항-TL1A 항체의 효과를 나타내고, TL1A에 대해 인간 TNFRSF25의 결합은 도 2에 나타낸 바와 같이 항체의 존재에서 평가된다. 흡광도를 450nm에서 읽는다. mIgG: 마우스 IgG 동형(isotype) 대조군.
도 3: 부모 5G6 후보는 활성화된 단핵백혈구에 생성된 수용 및 멤브린 결합 TL1A이 효과를 차단한다. 도 3A: 건강한 기증자로부터 PBMCs를 면역 복합체로 자극한 후 형광항체(fluorescent antibody)로 염색하였다. 단핵백혈구는 빛산란(light scatter) 및 높은 측면 산란 파라미터를 향한 기반하여 통로다. 히스토그램 플롯은 단핵백혈구로 모인 집단(monocytes gated population)의 PE 형광을 나타낸다. 회색 빗금친 히스토그램은 동형(isotype) 대조군을 나타내고 빈 공간 히스토그램은 항 TL1A으로 염색을 나타낸다. 도 3B: 면역 복합체로 자극된 건강한 기증자 PBMCs로부터 정제되 인간 단핵백혈구(monocytes)의 상등액을 수확하고 sTL1A 단백질의 존재를 위하여 ELISA로 테스트하였다. 그래프는 지시된 조건의 상등액에서 측정된 삽입된 TL1A 농도를 나타낸다. ‘IC stim’은 자극된 면역 복합체를 의미한다. ‘NS’은 자극되지 않는 것을 나타낸다. 도 3C: 건강한 기증자 PBMCs로부터 정제된 순수(naive) CD4 T 세포는 자가의(autologous) 단핵백혈구로 자극된 IL-12, IL-18 및 IC와 같이 배양하였다. 부모 키메라 5G6 항체는 단핵백혈구(monocytes)로서 동일한 시간에 표에 나타낸 지적된 농도에서 첨가되었다. NA는 IL-12 및 IL-18가 첨가되지 않은 것을 나타낸다. 배양의 상등액은 ELISA에 의해 정량화된다. 그래프는 각각의 지시된 조건에 대한 삽입된 IFN-γ 농도를 나타낸다.
도 4: 부모 5G6 후보는 마우스, 래트, 게잡이원숭이(cynomologus monkey) 및 인간 TL1A에 결합한다: 인간 (homo sapiens), 래트 (ratus norvegicus), 마우스 (mus musculus) 및 게잡이원숭이(cynomologus monkey) (macaca fascicularis) 서열에 해당하는 TL1A 단백질의 세포외 부분의 5G6의 결합은 면역형광에 의해 결정된다. 그래프는 사용되는 5G6의 농도의 log에 따른 450nm에서 흡광도를 나타낸다.
도 5: 인간화 5G6 항체는 주된 CD4 T 세포에 의해 TL1A유도된 IFN-γ 배출을 차단한다: 순수(naive) CD4 T 세포는 IL-12과 같이 배양하고, IL-18 및 재조합 수용 인간 TL1A 및 인간화 5G6 후보 (VH3/VL1, VH4/VL1, VH5/VL1 및 VH2/VL2)는 표에 나타낸 농도에서 첨가된다. NA는 IL-12 및 IL-18가 첨가되지 않은 것을 나타낸다. 배양 상등액은 IFN-γ의 농도를 위해서 ELISA에 의해 정량화된다. 그래프 5A-5D는 각각의 배양 조건의 IFN-γ 농도를 나타낸다. 각각의 그래프 디스플레이는 하나의 인간화 5G6 후보의 결과를 나타낸다.
도 6: 인간화 5G6 항체는 알레르기 천식(asthma)이 있는 마우스 모델에서 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage(BAL) fluid)에서 세포의 수를 감소시킨다. 마우스는 28, 30 및 33일에, 50mg/kg의 인간화 5G6 후보 (VH5/VL1; 안정화된 IgG4 힌지(hinge) 포맷) 또는 동등한 양의 대조군 인간 IgG, 또는 5mg/kg의 덱사메타존(dexamethasone)(양성 대조군)을 처리하고, 이어서 난알부민(ovalbumin) 시험으로 유도된 면역 반응을 유도한다. 그래프는 각각의 마우스를 위해 BAL 용액에 있는 호산구(eosinophils)의 수를 나타낸다. 각각의 군을 위한 호산구(eosinophils)의 평균 수를 계산하였다. 표준 편차는 하나의 방식 ANOVA를 사용하여 계산하였고 * 는 p<0.05를 나타내고, ** 는 p<0.01를 나타낸다.
도 7: 인간화 5G6 항체에 의한 치료는 급성 결장염(colitis)의 DSS 유도된 모델에서 결장의 짧아짐을 완화시킨다. 마우스는 인간화 5G6 항체 (VH5/VL1; 형태at IgG4 힌지(hinge) stabilised)의 50mg/kg 또는 동등한 양의 동형(isotype) 대조군, 5mg/kg의 사이클로스포린(cyclosporine)(양성 대조군)으로 3 x 주 처리하였다. 그래프는 각각의 마우스의 전체 결장 길이 및 군 당 평균 길이를 나타낸다. 표준 편차는 하나의 방식 ANOVA를 사용하여 계신하였고 *는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01를 나타내고 ***는 p<0.001를 나타낸다.
도 8: 인간화 5G6 항체에 의한 치료는 급성 결장염의 TNBS 유도된 모델에서 질병 심각도를 완화시킨다. 래트는 TNBS 투여 후 2 시간에, 인간화 5G6 항체 (50mg/kg)의 단일 용량 또는 동형(isotype) 대조군의 동등한 양으로 i.p 처리하였다. 프레드니솔론(Prednisolone)은 양성 대조군으로서 투여되었다. 질병 심각도는 부착(adhesions), 협착(strictures), 궤양(ulcers) 및 벽 두께 및 평균 점수는 히스토그램에 나타냈다. 표준 편차는 Student’s t-test를 사용하여 계산하였고 *는 p<0.05를 나타낸다.
도 9: hTL1A에 대한 5G6의 결합은 hDcR3-Fc 및 hDR3-Fc 모두에 의해 차단된다. 히스티딘(Histidine)- 태그된 인간 TL1A는 ELISA 플레이트 상에 2 ㎍/ml 코팅되었고 인간 DcR3 (흰색 바(white bar)), DR3 (검은색 바(black bar)) 또는 관계없는 수용체 (Ctrl-Fc, 빗금친 바(hatched bar)) 중 하나의 엑토도메인의 10 ㎍/ml Fc 융합의 존재에서 20 ㎍/ml 5G6으로 배양하였고 이어서 퍼옥시다제(peroxidase)-결합된 항-인간 IgG (Fab 특정)으로 검출하였다.
본 발명의 요약
본 개시는 L1A 매개된 장애를 치료하기 위한 방법을 포함하여, 이의 제조 및 사용을 위한 방법, TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편에 대하여 일반적으로 관련된다. TL1A에 결합하는 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 다수의 바람직한 성질을 나타내고 그중에서도 염증성창자병(Inflammatory Bowel Disease)(예를 들면, 궤양성대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn’s disease)), 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성경화증(multiple sclerosis)(MS), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 이식거부반응(transplant rejection), 중추신경계부상(central nervous system injury), 건선(psoriasis), 백혈병(leukaemia) 또는 림프종(lymphoma) (예를 들면, 만성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia) (CLL)), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 및 폐 및 결장 암을 포함하는, 염증 질병 및/또는 자가 면역 질병을 포함하나 제한하지 않는 다양한 질병의 치료에 유용할 수 있다. TL1A에 결합하는 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 다수의 바람직한 성질을 나타내고 그중에서도 염증성창자병(Inflammatory Bowel Disease)(예를 들면, 궤양성대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn’s disease)), 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성경화증(multiple sclerosis) (MS), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 이식거부반응(transplant rejection), 중추신경계부상(central nervous 시스템 injury), 건선(psoriasis), 백혈병(leukaemia) 또는 림프종(lymphoma) (예를 들면, 만성백혈병(chronic lymphocytic leukaemia(CLL))), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 및 폐 및 결장 암, 만성폐쇄폐병(chronic obstructive pulmonary disease COPD), 시신경염(optic neuritis), 노년기황반변성(age related macular degeneration), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus)(SLE), 스조젠 증후군(sjogen’s syndrome), 경피증(scleroderma), 전신피부경화증(systemic sclerosis), 만성신장 질병, 간경변(liver fibrosis), 결핵(tuberculosis), 특발성폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)), 결핵(tuberculosis) 유도된 폐 섬유증, 후복막섬유증식증(retroperitoneal Fibrosis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis) , 낭성섬유증(cystic fibrosis), 심내막심근섬유증(endomyocardial fibrosis), 심방섬유증(atrial fibrosis), 종격섬유증(medistinal fibrosis), 골섬유증(myelofibrosis(bone marrow)), 후복막섬유증식증(retroperitoneal Fibrosis), 진행성 거대섬유화증(progressive massive fibrosis), 전신성 섬유증(pephrogenic systemic fibrosis), 관절섬유증(arthrofibrosis)을 포함하는, 염증 질병 및/또는 자가 면역 질병을 포함하나 제한하지 않는 다양한 질병 치료에 유용할 수 있다.
일측면에서, 본 개시는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
추가적 측면에서 본 발명은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 추가적 측면에서 본 발명은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물인 중쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다: IGHV1-2*02 (서열번호: 3), IGHV1-2*04 (서열번호: 4), IGHV1-2*05 (서열번호: 5), IGHV1-2*01 (서열번호: 6), 및 IGHV1-46*01 (서열번호: 7).
추가적 측면에서 본 발명은 인간 유전자 IGHV1-2*02 (서열번호: 3)의 또는 로부터 유래된 생성물인 중쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고 상기 중쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 경쇄 가변영역의 해당 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함한다.
추가적 측면에서 본 발명은 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고 상기 중쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 해당 중쇄 가변 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함한다.
추가적 측면에서 본 발명은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 추가적 측면에서 본 발명은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물인 경쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다: IGKV1-33*01 (서열번호: 8), IGKV1D-33*01 (서열번호: 9), IGKV1D-12*02 (서열번호: 10), IGKV1D-12*01 (서열번호: 11) 및 IGKV1-12*02 (서열번호: 12).
추가적 측면에서 본 발명은 인간 유전자 IGKV1-33*01 (서열번호: 8)의 또는 로부터 유래된 생성물인 경쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고 상기 경쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 경쇄 가변영역의 해당 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함한다.
추가적 측면에서 본 발명은 서열번호: 16, 21, 22, 23 및 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 추가적 측면에서 본 발명은 서열번호: 17 및 25로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
추가적 측면에서 본 발명은 하기를 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다:
(a) 서열번호: 22 또는 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열; 및
(b) 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열.
추가적 측면에서 본 발명은 서열번호: 13, 26, 27, 28 및 29로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 추가적 측면에서 본 발명은 서열번호: 14 및 30으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
추가적 측면에서 본 발명은 하기를 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다:
(a) 서열번호: 27 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
(b) 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역.
추가적 측면에서 본 발명은 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 항체는 인간 IgG4 Fc 영역을 포함하고, 상기 항체는 Fc-매개된 세포독성 활성을 가지지 않는다. 추가적 측면에서 본 발명은 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 항체는 인간 IGHG1 Fc 영역을 포함하고, 상기 항체는 세포독성 기전, 예를 들면 항체 의존적 세포내 세포독성 (ADCC)에 능숙히다. 바람직한 측면에서, TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 비 푸코실화된(fucosylated) IGHG1 Fc 영역을 가지고 ADCC와 같은 증강된 Fc-매개된 세포독성 기전을 나타낸다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 TL1A에 결합하고 또한 마우스, 래트 및 게잡이원숭이 TL1A에 결합하는 이의 단편의 교차반응 항체("cross reactive antibody")를 제공한다. “교차반응 항체”는 하나의 종(species), 예를 들면 인간으로부터의 항원에 결합하는 항체를 의미하고, 이는 또한 상이한 종(species), 예를 들면 래트에서 해당 항원에 결합한다.
다른 측면에서, 또한 본 발명의 개시는 해당 키메라 항체로서 TL1A에 유사한 친화도, 예를 들면 해당 키메라 항체의 TL1A 결합 친화도 (KD)의 적어도 85%를 유지 또는 해당 키메라 항체와 비교하였을 때 적어도 동등하거나 또는 높은 TL1A 결합 친화도 (KD)를 가지는 친화도로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 설명한다.
추가적 측면에서, 또한 본 발명은 hTL1A에 결합하고 hTL1A와 DR3 및 DcR3 모두의 상호작용을 억제하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 설명한다.
또한 본 발명의 개시는 TL1A에 결합하는 항체 및 이의 단편을 암호화하는 분리된 핵산, 벡터 및 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 항-TL1A 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체 및 치료제에 연결된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합체(immunoconjugates)를 포함하는 조성물을 또한 제공한다.
또한 본 개시는 TL1A 매개된 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일측면에서, 중요한 CD4 T 세포에 의해 TL1A 유도된 IFNγ 배출의 시험관 내 모델에서, 항-TL1A 항체 또는 이의 단편은 면역 복합체-자극된 단핵백혈구에 의해 유도된 IFNγ의 생성을 효과적으로 억제한다. 다른 측면에서, 알레르기 천식(asthma)의 생체 내 모드에서, 항-TL1A 항체는 천식 마우스의 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid)에 있는 호산구(eosinophils)의 구성원을 대략 4배 정도 감소시켰다. 추가 측면에서, 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulphate sodium (DSS))로 급성대장염(acute colitis)유도된 마우스에서 및 트리니트로벤젠설포닉 산(trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS))으로 급성대장염(acute colitis)유도된 래트의 생체 내 모델에서, 항-TL1A 항체는 질병의 증상을 감소시키는데 효과적이었다.
또한 본 개시는 항-TL1A 항체 또는 이의 단편 및 희석제(diluent) 또는 부형제(excipient)와 같은 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 개시는 키트 및 TL1A 매개된 장애를 치료하기 위한 항체 또는 이의 단편, 조성물 또는 면역접합체를 포함하는 제작 물품(article)을 제공한다.
본 발명의 상세한 설명
본 개시는 TL1A에 결합하는 항체 및 이의 단편에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “TL1A”는 TL1A의 변이(variants), 동종(isoform), 및 종 상동(species homologs)을 포함한다. 따라서, 본 개시의 항체는 인간 TLA1에 결합할 수 있고 인간보다 다른 종, 예를 들면, 마우스, 래트 또는 게잡이원숭이로부터 TL1A과 교차-반응일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 하나 이상의 인간 TL1A 단백질에 대하여 완전하게 특이적(specific)일 수 있고 비-인간 교차반응의 종(species) 또는 다른 유형을 나타내지 않을 수 있다. 전형적 인간 TL1A의 완전한 아미노산 서열은 Swiss-Prot 식별번호(acession number) O95150 (TNFSF15_인간; 서열번호:38)이다. 또한 TL1A는 TNFSF15; TNF-like 단백질 1A; VEGI; TNFγβ로서 알려져 있다. 인간 TL1A는 Entrez 유전자에 의해 유전자 ID(GeneID): 9966, HGNC에 의해 HGNC: 11931로 지정된다. TL1A는 TNFSF15 /TL1A로 지정된 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 전형적 마우스 TL1A의 완전한 아미노산 서열은 Swiss-Prot 식별번호(acession number) Q5UBV8 (TNFSF15_마우스; 서열번호: 39)를 가진다. 마우스 TL1A는 Entrez 유전자에 의해서 유전자ID: 326623으로 지정된다. 전형적 래트 TL1A의 완전한 아미노산 서열은 Swiss-Prot 식별번호(acession number) Q8K3Y7 (TNFSF15_RAT; 서열번호: 40)를 가진다. 래트 TL1A는 Entrez 유전자에 의해 유전자ID: 252878로 지정된다. 전형적 cyno TL1A (macaca fascicularis)의 완전한 아미노산 서열은 서열번호: 41을 가진다.
본 명세서에서 “TL1A”사용은 모두 알려져 있거나 또는 아직 발견되지 않은 TL1A의 대립형질(alleles)및 다형(polymorphic) 형태, 바람직하게는 인간 TL1A를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 것처럼 용어 "TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편"은 850 pM 또는 미만, 바람직하게는 700nM 또는 미만, 더욱 바람직하게는 300 nM 또는 미만, 더욱 바람직하게는 260 nM 또는 미만, 더욱 더 바람직하게는 250 nM 또는 미만의 친화도(KD)를 가지고, TL1A 예를 들면 분리되 형태의 인간 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다.
용어 “TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편”은 항체 또는 항원에 결합하는 이의 단편을 포함한다.
본 명세서에서 언급된 용어 “항체”는 전체 항체 및 이의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬을 포함한다. “항체”는 디설피드 결합(disulfide bonds)에 의해 내부-연결된(inter-connected) 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 글리코단백질, 또는 이의 항원 결합 단편을 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변영역 (VH로서 본 명세서에서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변영역 (VL로서 본 명세서에서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 서열에서 고가변성인 상보결정부위(complementarity determining region)(CDR)로 불리고 및/또는 항원 인식에 포함되고 및/또는 항상 구조적으로 정의된 루프(loops) 형태인 고가변성(hypervariability)의 영역, 더 보존되고 프레임워크 영역(FR 또는 FW)으로 불리는 영역을 가지는 인터스프레드(interspersed)로 추가적으로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기의 순서로 아미노- 말단부터 카르복시-말단으로 배열된, 3개의 CDRs 및 4개의 FWs로 구성된다: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. FW1, FW2, FW3, 및 FW4 모두의 아미노산 서열은 본 명세서에서 언급된 바와 같이 VH 또는 VL의 “비-CDR 영역” 또는 “비-확장된 CDR 영역”을 구성한다.
본 명세서에서 언급된 바와 같이 용어 “중쇄 가변 프레임워크 영역”은 하나 이상의(예를 들면, 1개, 2개, 3개 및/또는 4개) 중쇄 프레임워크 영역 서열 (예를 들면, 프레임워크 1 (FW1), 프레임워크 2 (FW2), 프레임워크 3 (FW3) 및/또는 프레임워크 4 (FW4))를 포함할 수 있다. 바람직하게는 중쇄 가변영역 프레임워크는 FW1, FW2 및/또는 FW3, 더욱 바람직하게는 FW1, FW2 및 FW3을 포함한다. 본 명세서에서 언급된 용어 “경쇄 가변 프레임워크 영역(light chain variable framework region)”는 하나 이상의(예를 들면, 1개, 2개, 3개 및/또는 4개) 경쇄 프레임워크 영역 서열 (예를 들면, 프레임워크 1 (FW1), 프레임워크 2 (FW2), 프레임워크 3 (FW3) 및/또는 프레임워크 4 (FW4))를 포함한다. 바람직하게는 경쇄 가변영역 프레임워크는 FW1, FW2 및/또는 FW3, 더욱 바람직하게는 FW1, FW2 및 FW3를 포함한다.
중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템 (예를 들면, 작용인자 세포)의 다양한 세포 및 전통적 완전 시스템(classical complement system)의 첫번째 구성요소(C1q)를 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
항체는 분류(classes)로 그룹화되고, 또한 불변 영역에 의해 유전적으로 결정된 바와 같은, 동형(isotype)으로서 언급된다. 인간 불변 경쇄는 카파(kappa) (CK) 및 람다(lambda)(Cλ) 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 mu (μ), delta (δ), 감마 (γ), alpha (α), 또는 epsilon (ε)으로 분류되고 항체의 동형(isotype)을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 정의한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 "동형(isotype)" 은 이의 불변 영역의 화학적 및 항원 특정적에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 분류 및/또는 하위분류이다. 알려진 인간 면역글로불린 동형(isotype)은 IgG1 (IGHG1), IgG2 (IGHG2), IgG3 (IGHG3), IgG4 (IGHG4), IgA1 (IGHA1), IgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD), 및 IgE (IGHE)이다. 소위 인간 면역글로불린 모조의(pseudo)-감마 IGHGP 유전자는 변형된 스윗치 영역에 기인한 단백질을 암호화하지 않으나 서열되는 추가 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자를 나타낸다(Bensmana M 외 다수, (1988) Nucleic Acids Res. 16(7): 3108). 변형된 스윗치 영역에도 불구하고, 인간 면역글로불린 모조의-감마 IGHGP 유전자는 모든 중쇄 불변 도메인 (CH1-CH3) 및 힌지(hinge)를 위한 해독틀(open reading frames)을 가진다. 자체의 중쇄 불변 도메인을 위한 모든 해독틀(open reading frames)은 예상된 구조적 특성을 가지는 모든 인간 면역글로불린 불변 도메인으로 잘 정렬된 단백질 도메인을 암호화한다. 상기 추가 모조의-감마 동형(isotype)은 IgGP 또는 IGHGP로서 본 명세서에서 언급된다. 다른 모조(pseudo) 면역글로불린 유전자는 예를 들면 인간 면역글로불린 ?쇄 불변 도메인 엡실론(epsilon) P1 및 P2 모조-유전자 (IGHEP1 및 IGHEP2)로 보고되었다. IgG 분류는 치료 목적을 위하여 가장 일반적으로 사용된다. 인간에서, 상기 분류는 하위분류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4을 포함한다. 마우스에서 상기 분류는 하위분류 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “마우스 항체(murine antibody)”는 가변영역 서열 및 불변 영역 서열이 마우스로부터 유래된 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 “키메라 항체(chimeric antibody)”는 가변영역 서열이 하나의 종(species)으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 다른 종으로부터 유래된 항체, 예를 들면 가변영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래된 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것처럼 용어 “인간화 항체(humanized antibody)” 또는 “인간화 항-TL1A 항체(humanized anti-TL1A antibody)”는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식세포계열(germline)로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열상으로 이식되었던 항체를 포함한다. 추가 프레임워크 영역 수정은 다른 포유류 종의 생식세포계열(germline)로부터 유래된 CDR 서열 내 뿐만 아니라 인간 프레임워크 내에서 만들어질 수 있다.
용어 “중화 항체(neutralising antibody)”는 TL1A의 생물학적 활성을 억제 및/또는 중화할 수 있는, 예를 들면 자체의 수용체 TNFRSF25/DR3 또는 디코이 수용체 TNFRSF21/ DR6에 TL1A의 결합을 차단 또는 실질적으로 감소시켜 따라서 TL1A에 의해 유발되는 신호 경로를 억제 또는 감소 및/또는 림프구 증식, 사이토카인 발현, 또는 림프구 생존과 같은 TL1A-매개된 세포 반응을 억제 또는 감소시킬 수 있는 항체를 포함한다.
용어“길항 항체(antagonistic antibody)” 또는 “길항 항체(antagonist antibody)”는 본 명세서에서 동등하게 사용되고 앞에 중화 항체에 대하여 설명된 바와 같이, TL1A의 생물학적 신호 활성을 억제 및/또는 중화할 수 있는 항체를 포함한다.
용어 “길항 항체(antagonistic antibody)” 또는 “길항 항체(antagonist antibody)”는 본 명세서에서 동등하게 사용되고 TL1A의 생물학적 신호 활성을 활성 및/또는 증강시킬 수 있는, 예를 들면 자체의 수용체 TNFRSF25/DR3 또는 디코이 수용체 TNFRSF21/ DR6에 TL1A의 결합을 증가시켜서 TL1A에 의해 유발되는 신호 경로를 활성화 또는 증강 및/또는 림프구증식, 사이토카인 발현, 또는 림프구 생존과 같은 TL1A-매개된 세포 반응을 활성화 또는 증강시킬 수 있는 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것처럼 용어 “Fab” 또는 “Fab 영역”은 VH, CH1, VL, 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. Fab는 분리에서 상기 영역을 의미하거나, 또는 전장 항체 또는 항체 단편의 문맥에서 상기 영역을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것처럼 용어 “Fc” 또는 “Fc 영역”은 첫번째 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서 Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 상기 도메인에 유연한 힌지(hinge) N-말단을 의미한다. IgA 및 IgM에 대하여, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG에 대하여, Fc는 면역글로불린 도메인 C 감마(gamma) 2 및 C 감마 3 (Cγ2 및 Cγ3) 및 C 감마 l(Cγl)와 C 감마 2(Cγ2) 사이의 힌지(hinge)를 포함한다. 비록 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 자체의 카르복실-말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 항상 정의되고 상기 숫자는 EU 숫자 시스템에 따른다. 인간 IgG1에 대하여 Fc 영역은 자체의 카르복실-말단에 잔기 P232를 포함하는 것으로 본 명세서에서 정의되고, 상기 숫자는 EU 숫자 시스템에 따른다(Edelman GM 외 다수, (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85). Fc는 분리에서 상기 영역 또는 Fc 폴리펩타이드, 예를 들면 항체의 문맥에서 상기 영역을 의미할 수 있다.
본 명세서의 용어 “힌지(hinge)” 또는 “힌지 영역(hinge region)” 또는 “항체 힌지 영역”은 항체의 첫번째와 두번째 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 유연한 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 언급된 “힌지 영역”은 단지 IgA, IgD 및 IgG에 존재하는, 길이에서 6-62 아미노산의 서열 영역이고, 이는 2개의 중쇄를 브릿지(bridge)하는 시스테인 잔기를 포함한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 220에서 끝나고 IgG CH2 도메인은 잔기 EU 위치 237에서 시작한다. 따라서 IgG에 대하여 항체 힌지는 위치 221(IgG1의 D221) 내지 231(IgG1의 A231)를 포함하는 것으로 본 명세서에서 정의되고, 상기 숫자는 EU 숫자 시스템에 따른다(이전에 Edelman GM 외 다수).
본 명세서에서 사용되는 것처럼 용어 “부모 항체” 또는 “부모 면역글로불린”은 변이를 생성하기 위하여 이어서 수정된 비수정된 항체를 포함한다. 상기 부모 항체는 자연적으로 발생하는 항체, 또는 자연적으로 발생하는 항체의 변이 또는 조작된 버젼일 수 있다. 부모 항체는 항체 자체, 부모 항체를 포함하는 조성물, 또는 이를 암호화하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것처럼 “부모 항-TL1A 항체”는 TL1A에 결합하는 항체 또는 면역글로불린을 의미하고 변이를 생성하기 위하여 수정된다. 본 명세서에서 사용된 것처럼 “해당 마우스 항체”는 변이, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 특정적으로 마우스 항체 5G6를 생성하기 위하여 수정될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 “해당 키메라 항체”는 TL1A에 결합하는 키메라 항체 또는 면역글로불린을 의미하고 변이를 생성하기 위하여 수정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 “변이 항체” 또는 “항체 변이” 는 부모와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 수정때문에 부모 항체 서열의 것으로부터 상이한 항체 서열을 포함한다. 본 명세서에서 변이 항체 서열은 부모 항체 서열과 바람직하게는 적어도 약80%, 가장 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%로 일치를 내포할 것이다. 항체 변이는 항체 자체, 항체 변이를 포함하는 조성물, 또는 이것을 암호화하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 언급할 때, 용어 “일치(identity)” 또는 “실질적 일치(substantial identity)” 또는 “실질적으로 일치(substantially identical)"는 최적으로 다른 핵산 (또는 자체의 상보성 가닥(complementary strand))으로 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 최적으로 정렬될 때, 하기에 논의된 바와 같이, 임의의 잘 알려져 있는 서열 일치의 알고리듬, 예를 들면 FASTA, BLAST 또는 GAP에 의해 측정된 바와 같이, 뉴클레오티드 베이스(nucleotide bases)의 적어도 약 80%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%로 뉴클레오티드 서열 일치를 나타낸다.
폴리펩타이드에 적용된 바와 같이, 용어 “실질적 유사(substantial similarity)” 또는 “실질적으로 유사한(substantial similarity)”는 예를 들면 디폴트 갭 무게(default gap weights)를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 2개의 펩타이드 서열이 적어도 80% 서열 일치, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 일치를 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존 아미노산 대체에 의해 상이하다.
본 명세서의 용어 “아미노산 수정”은 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 대체(substitution), 삽입(insertion), 및/또는 결실(deletion)을 포함한다. 본 명세서의 “아미노산 대체(amino acid substitution)” 또는 “대체(substitution)”는 다른 아미노산으로 부모 폴리펩타이드 서열에 있는 특정 위치의 아미노산의 교체(replacement)를 위미한다. 예를 들면, 대체 R94K는 중쇄 가변 프레임워크 영역 변이인 경우에, 위치 94의 아르기닌(arginine)이 라이신(lysine)으로 교체되는 변이 폴리펩타이드를 의미한다. 선행하는 실시예에 대하여, 94K는 라이신(lysine)으로 위치 94의 대체를 나타낸다. 본 명세서의 목적에 대하여 다수의 대체는 통상적으로 슬래쉬(slash)에 의해 분리된다. 예를 들면, R94K/L78V는 대체R94K 및 L78V를 포함하는 이중변이를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 “아미노산 삽입(insertion)” 또는 “삽입(insertion)”은 부모 폴리펩타이드 서열에서 특정 위치의 아미노산의 첨가(addition)을 의미한다. 예를 들면, 삽입 -94는 위치 94의 삽입(insertion)을 지정한다. 본 명세서에서 사용된 “아미노산 결실(deletion)” 또는 “결실(deletion)”은 부모 폴리펩타이드 서열에서 특정 위치의 아미노산의 제거(removal)을 의미한다. 예를 들면, R94-는 위치 94의 아르기닌(arginine)의 결실(deletion)을 지정한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “보존적 수정(conservative modifications)” 또는 “보존적 서열 수정(conservative sequence modifications)"은 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성을 현저하게 변경하지 않거나 또는 변경하는 아미노산 수정을 의미하고자 하는 의도이다. 상기 보존적 수정은 아미노산 대체, 삽입(insertions) 및 결실(deletions)을 포함한다. 수정은 당업계에서 알려져 있는 표준 기술, 예를 들면 부위-지정 돌연변이생성(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개된 돌연변이생성에 의해 발명의 항체로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 대체는 아미노산 잔기가 유사한 곁사슬(side chian)을 가지는 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 유사한 곁사슬을 가지는 아미노산 잔기의 페밀리는 당업계에서 정의되었다. 상기 페밀리는 염기성 곁사슬(basic side chain)(예를 들면, 라이신(lysine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine)), 산성 곁사슬(acidic side chain)(예를 들면, 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid)), 무전하 극성 곁사슬(uncharged polar side chain)(예를 들면, 글라이신, 아스파라진(asparagine), 글루타민, 세린(serine), 쓰레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 시스테인(cysteine), 트립토판(tryptophan)), 비극성 곁사슬(예를 들면, 알라닌(alanine), 발린(valine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 메티오닌(methionine)), 베타-브랜치드(beta-branched) 곁사슬예를 들면, 쓰레오닌(threonine), 발린(valine), 이소루신(isoleucine)) 및 방향족(aromatic) 곁사슬(예를 들면, 타이로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 히스티딘(histidine))으로 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내 또는 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 곁사슬 페밀리로부터 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있고 변형된 항체 (variant antibody)는 보유하고 있는 기능을 위하여 테스트될 수 있다.
용어 “항원결정기(epitope)”는 항체에 의해 결합된 항원 영역이다. 항원결정기(epitope)는 구조적으로 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 항원결정기(epitopes)는 일반적으로 구조적 항원결정기의 서브셋(subset)이고 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 상기 잔기를 가진다. 항원결정기는 또한 형태(conformational)일 수 있고, 즉, 비-직선(non-linear) 아미노산으로 구성된다. 특정 실시형태에서, 항원결정기는 아미노산, 슈가(sugar) 곁사슬, 인산화기(phosphoryl group), 또는 설포닐기(sulfonyl group)과 같은 분자의 화학적으로 활성 표면 군인 결정기(determinants)를 포함할 수 있고, 특정 실시형태에서 특정 3차원 구조 특성(three-dimensional structural characteristics), 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다.
모든 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 숫자는 “EU 숫자 시스템” (Edelman GM 외 다수, (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85)에 따른다. 인간 카파 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(IGKC)에 대하여, 숫자는 “EU 숫자 시스템”(Edelman GM 외 다수, 이전에)에 따른다.
인간 람다(lambda) 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6, 및 IGLC7)에 대하여, 숫자는 Dariavach P 외 다수, (1987) Proc Natl Acad Sci USA, 84(24): 9074-8 및 Frangione B 외 다수, (1985) Proc Natl Acad Sci USA, 82(10): 3415-9에 의해 설명된 바와 같이, “카밧(Kabat) 숫자 시스템” (Kabat EA 외 다수, (1991) Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health 및 Human Services, NIH publication no 91-3242)에 따른다.
용어 “가변 도메인(variable domain)”은 항원-결합을 매개하고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특정성을 정의하는 도메인을 의미한다. 자연적으로 발생하는 항체에서, 항원-결합 부위는 특정성을 정의하는 2개의 가변 도메인으로 구성된다: 하나는 중쇄 (VH)에 위치하고 다른 것은 경쇄 (VL)에 위치한다. 일부 경우에서, 특정성은 독점적으로 카멜리드(camelids)에서 발견된 중쇄 항체로부터 단일-도메인 항체로서 2개의 도메인의 단지 하나인 잔기일 수 있다. V 영역은 항상 약 110 아미노산 길이이고, 9-12 아미노산 길이인“고가변영역(hypervariable regions)”으로 불리는 극도의 가변성(variability)의 짧은 영역에 의해 분리된 15-30 아미노산의 프레임워크 영역(FRs)으로 불리는 아미노산 서열의 상대적으로 불변 스트레치로 구성된다. 선천적 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프(loops)를 형성하는, 3개의 고가변영역에 의해 연결된, 비트-시트 구성(beat-sheet configuration)을 크게 적용하는, 4개의 FRs를 포함한다. 각각의 사슬에서 고가변영역(hypervariable regions)은 FRs에 의해 가까운 근접에 있고, 다른 사슬로부터 고가변영역(hypervariable regions)으로 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(이전의 Kabat EA 외 다수,을 참조하시오). 본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어 “고가변영역(hypervariable region)”은 항원 결합에 대해 주된 원인이 되는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 고가변영역(hypervariable region)은 일반적으로 “상보적 결정 영역(complementary determining region)” 또는 “CDR”로부터 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 가장높은 서열 가변성이되고 및/또는 항원 인식에 포함된다. 모든 가변 도메인에 대하여 숫자는 카밧(Kabat)에 따른다(이전에 Kabat EA 외 다수).
CDR 정의의 숫자는 본 명세서에서 사용되고 포함된다. 카밧 정의는 서열 가변성에 기반하고 대부분 통상적으로 사용된다(Kabat EA 외 다수, 앞에). 초티아(Chothia)는 대신에 구조적 루프의 위치를 언급한다(Chothia C & Lesk AM (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). AbM 정의는 카밧과 초티아 정의(Chothia definitions) 사이의 절충(compromise)이고 옥스포드 분자의 AbM 항체 모델 소프트웨어(Martin ACR 외 다수, (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86: 9268-72; Martin ACR 외 다수, (1991) Method Enzymol. 203: 121-153; Pedersen JT 외 다수, (1992) Immunomethods, 1: 126-136; Rees AR 외 다수, (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), 단백질 구조 Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172)에 의해 사용된다. 접촉 정의는 최근에 도입되었고(MacCallum RM 외 다수, (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745) 및 단백질 데이타뱅크에서 이용할수 있는 이용가능한 복합체 구조 분석에 기반한다. IMGT®에 의한 CDR의 정의, 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템® (http://www.imgt.org)은 모든 종(species)의 모든 면역글로불린 및 T 세포 수용체 V-영역에 대하여 IMGT 숫자에 기반된다(IMGT®, the international ImMunoGeneTics in Formation System®; Lefranc MP 외 다수, (1991) Nucleic Acids Res. 27(1): 209-12; Ruiz M 외 다수, (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res. 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res. 31(1): 307-10; Lefranc MP 외 다수, (2005) Dev. Comp. Immunol. 29(3): 185-203; Kaas Q 외 다수, (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64).
본 발명에서 논의되는 모든 상보결정부위(complementarity determining region)(CDRs)는 바람직하게는 IMGT®에 따라 정의된다. 상기 CDRs의 각각에 대한 가변 도메인 잔기는 하기와 같다(이전에 Kabat EA, 외 다수, 따른 숫자): LCDR1: 27-32, LCDR2: 50-52, LCDR3: 89-97, HCDR1: 26-35, HCDR2: 51-57 및 HCDR3: 93-102. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 VL 영역의 “비-CDR 영역”은 1-26 (FR1), 33-49 (FR2), 53-88 (FR3), 및 98- 대략 107 (FR4)를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 비와 같이 “비-CDR 영역”은 아미노산 서열: 1-25 (FR1), 36-50 (FR2), 58-92 (FR3), 및 103- 대략 113 (FR4)을 포함한다.
본 발명의 CDRs는 앞서 말한 정의에 기반하는 “확장된 CDRs(extended CDRs)”를 포함할 수 있고 하기와 같이 가변 도메인 잔기를 가진다: LCDR1: 24-36, LCDR2: 46-56, LCDR3:89-97, HCDR1: 26-36, HCDR2:47-65, HCDR3: 93-102. 상기 확장된 CDRs는 이전의 Kabat 외 다수,에 따라 역시 숫자화된다. 본 명세서에서 사용된 VL 영역의 “비-확장된 CDR 영역”은 아미노산 서열: 1-23 (FR1), 37-45 (FR2), 57-88 (FR3), 및 98- 대략 107 (FR4)을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 VH 영역의 “비-확장된 CDR 영역”은 아미노산 서열: 1-25 (FR1), 37-46 (FR2), 66-92 (FR3), 및 103- 대략 113 (FR4)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 “전장 항체”는 가변 및 불변 영역을 포함하는, 항체의 천연 생물학적 형태를 구성하는 구조를 포함한다. 예를 들면, 인간 및 마우스를 포함하는 대부분의 포유류에서, IgG 분류의 전장 항체는 테트라머(tetramer)이고 2개의 면역글로불린 사슬의 2개의 동일한 쌍, 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 가지는 각각의 쌍, 면역글로불린 도메인 VL 및 CL을 포함하는 각각의 경쇄, 및 면역글로불린 도메인 VH, CH1 (Cγ1), CH2 (Cγ2), 및 CH3 (Cγ3)을 포함하는 각각의 중쇄로 구성된다. 카멜(camels) 및 라마(llamas)와 같은 일부 포유류에서, IgG 항체는 Fc 영역에 부착된 가변 도메인을 포함하는 각각의 중쇄, 단지 2개의 중쇄로 구성될 수 있다.
항체 단편은 (i) Fab′및 Fab′-SH를 포함하는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (iv) 단일 가변으로 구성된 dAb 단편 (Ward ES 외 다수, (1989) Nature, 341: 544-546), (v) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 이가(bivalent) 단편, (vi) 단일 사슬 Fv 분자 (scFv), 상기 VH 도메인 및 VL 도메인은 2개의 도메인을 항원 결합 부위를 형성하기 위하여 연합되도록 허가하는 펩타이드 링커에 연결된다(Bird RE 외 다수, (1988) Science 242: 423-426; Huston JS 외 다수, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83), (vii) 이중특이 단일 사슬 Fv 2분자체(dimers) (PCT/US92/09965), (viii) “이중체(diabodies)” 또는 “삼중체(triabodies)”, 유전자 융합에 의해 구성된 다가(multivalent) 또는 다특이 단편(Tomlinson I & Hollinger P (2000) Methods Enzymol. 326: 461-79; WO94/13804; Holliger P 외 다수, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-48) 및 (ix) 동일하거나 또는 상이한 항체에 유전적으로 융합된 scF(Coloma MJ & Morrison SL (1997) Nature Biotechnology, 15(2): 159-163)을 포함하나, 제한하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 “작용인자 기능(effector function)”은 Fc 수용체 또는 리간드로 항체 Fc 영역의 상호작용으로부터 원인이 되는 생물화학적 사건을 포함한다. 작용인자 기능은 ADCC(항체 의존적 세포-매개된 세포독성) 및 ADCP (항체 의존적 세포-매개된 phagocytosis)와 같은 FcγR-매개된 작용인자 기능, 및 CDC (상보적 의존적 세포독성)과 같은 상보적-매개된 작용인자 기능을 포함한다. 항체의 작용인자 기능은 예를 들면 Fc 수용체 또는 상보적 구성요소와 같은 작용인자 분자를 위한 항체의 친화도를 변경, 예를 들면 증강 또는 감소, 바람직하게는 증강에 의해 변형될 수 있다. 작용인자 기능은 하나 이상의 세포 기반 또는 생체 내 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 상기 분석은 항체에 대한 세포의 반응, 예를 들면 세포 생존, 세포 사멸, 고유 유전자 또는 리포터 유전자의 세포 내 발현과 같은 세포내 형태의 변화 또는 전사 활성을 모니터링을 종종 포함한다. 예를 들면, 분석은 ADCC, ADCP, 또는 CDC를 끌어내기 위하여 항체능을 측정 할 수 있다. 추가 세포 또는 구성요소 표적 세포에 추가적으로 일부 분석을 위하여, 말초혈액단핵백혈구(PBMCs), NK 세포, 대식세포, 등과 같은 혈청 구성요소 또는 작용인자 세포를 첨가할 필요가 있다. 증강된 작용인자 기능은 변형된 항체의 작용인자 기능과 대조군 항체를 비교하고 하나 이상의 앞서말한 분석에 의해 측정된 ADCC, ADCP 또는 CDC에서 증가를 검출하여 결정될 수 있다.
결합 친화도는 작용인자 분자결합 부위를 수정하여 일반적으로 다양하게 될 것이고 상기 경우에 관심있는 부위를 위치정하고 적합한 경로에서 적어도 부위의 일부를 수정하는 것이 적절하다. 작용인자 분자를 위한 항체 상의 결합 부위의 변경(alteration)은 모든 결합 친화도를 현저하게 변경하지 않으나 비-생성물 결합으로서 비효과적인 작용인자 기전을 만드는 상호작용의 기하학적 구조(geometry)를 변경할 수 있다. 작용인자 기능은 작용인자 분자결합에 직접적으로 포함되지 않는 부위를 수정하여 변형될 수도 있지만, 그렇지 않으면 작용인자 기능의 수행에 포함된다는 것을 추가적으로 예상된다. 항체의 작용인자 기능을 변형하여 면역 반응의 다양한 측면을 조절, 예를 들면 진단 및 치료에서 가능한 혜택적 효과로, 면역 시스템의 다양한 반응을 증강 또는 억제하는 것이 가능할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “TL1A-매개된 장애”는 그중에서도염증성창자병(Inflammatory Bowel Disease)(예를 들면, 궤양성대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn’s disease)), 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성경화증(multiple sclerosis)(MS), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 이식거부반응(transplant rejection), 중추신경계부상(central nervous system injury), 건선(psoriasis), 백혈병(leukemia) 또는 림프종(lymphoma) (예를 들면, 만성림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia) (CLL)), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 및 폐 및 결장 암, 만성폐쇄폐병(chronic obstructive pulmonary disease) COPD, 시신경염(optic neuritis), 노년기황반변성(age related macular degeneration), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus) (SLE), 스조젠 증후군(sjogen’s syndrome), 경피증(scleroderma), 전신피부경화증(systemic sclerosis), 만성신장 질병, 간경변(liver fibrosis), 결핵(tuberculosis), 특발성폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 결핵(tuberculosis) 유도된 폐섬유증, 후복막섬유증식증(retroperitoneal Fibrosis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis) , 낭성섬유증(cystic fibrosis), 심내막심근섬유증(endomyocardial fibrosis), 심방섬유증(atrial fibrosis), 종격섬유증(medistinal fibrosis), 골섬유증(myelofibrosis(bone marrow)), 후복막섬유증식증(retroperitoneal Fibrosis), 진행성 거대섬유화증(progressive massive fibrosis), 전신성 섬유증(pephrogenic systemic fibrosis), 관절섬유증(arthrofibrosis)을 포함하는, 염증 질병 및/또는 자가 면역 질병과 같은 증상을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “개체”는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물" 은 모든 척추동물, 예를 들면, 포유류 및 비-포유류, 예를 들면 비인간 영장류, 양(sheep), 개(dogs), 고양이(cats), 말(horses), 소(cows), 닭(chickens), 양서류(amphibianss), 파충류(reptiles), 등을 포함한다. 바람직하게는 개체는 인간이다.
항- TL1A 항체
첫번째 측면에서 본 발명은 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
일부 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 중쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 경쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 경쇄 CDR3을 포함한다.
바람직하게는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 및/또는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함한다. 더욱 바람직하게는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 및 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 단편은 인간 TL1A에 결합하고 마우스, 래트 및 cyno TL1A와 교차반응이다.
CDR1 및/또는 CDR2 도메인으로부터 비의존적으로, CDR3 도메인 단독은 동족 항원을 위한 항체의 결합 특정성을 결정할 수 있고 다항체(multiple antibody)는 일반 CDR3 서열에 기반한 동일한 결합 특정성을 가지도록 예측적으로 생성될 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 예를 들면, Klimka A 외 다수, (2000) Br. J. Cancer, 83(2): 252-260(단지 마우스 항-CD30 항체 Ki-4의 중쇄 가변 도메인 CDR3를 사용하여 인간화 항-CD30 항체의 생성을 설명); Beiboer SH 외 다수, (2000) J. Mol. Biol. 296: 833-849 (단지 부모 마우스 Moc-31 항-EGP-2 항체의 중쇄 CDR3 서열을 사용하여 재조합 상피 글리코단백질-2 (EGP-2) 항체를 설명); Rader C 외 다수, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95: 8910-8915 (마우스 항-인테그린 αvβ3 항체 LM609의 중쇄 및 경쇄 가변 CDR3 도메인을 사용하여 인간화 항-인테그린 αvβ3 항체의 패늘(panel)을 설명, 여기서 각각의 구성원 항체는 CDR3 도메인 외부의 뚜렷한 서열을 포함하고 부모 마우스 항체보다 높거나 또는 만큼 높은 친화도를 가지는 부모 마우스 항체로서 동일한 항원결정기에 결합할 수 있다); Barbas C 외 다수, (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 2161-62 (CDR3 도메인은 항원 결합에 가장 현저한 기여를 제공하는 것을 개시).
따라서, 본 발명은 하나 이상의중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인, 특히 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 및/또는 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 및 이의 단편을 제공하고, 상기 항체는 TL1A에 결합할 수 있다. 일부 실시형태 내에서, 비-인간 항체로부 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 상기 발명적인 항체는 (a) 결합에 대하여 경쟁할 수 있고; (b) 기능적 특성을 보유할 수 있고; (c) 동일한 항원결정기(epitope)에 결합하고; 및/또는 (d) 해당 부모 비-인간 예를 들면 마우스 항체와 같은 유사한 결합 친화도를 가진다.
추가적 측면에서 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 포함한다. 추가적 측면에서 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 1의 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역을 포함한다.
추가적 측면에서 본 발명은 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28 및 서열번호: 29로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
추가적 측면에서 본 발명은 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 다른 측면에서 본 발명은 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열 및 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열을 포함한다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 단편은 인간 TL1A에 결합하고 마우스, 래트 및 cyno TL1A와 교차반응(cross reavtive)이다.
다른 측면에서 본 발명은 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 변이(variants)를 제공한다. 따라서 본 발명은 각각 서열번호: 13, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29 또는 서열번호: 14로서 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열 중 하나인 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나의 부모 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역의 아미노산 서열에 적어도 80% 일치하는(적어도 80% 아미노산 서열 일치를 가지는) 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역의 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 또한 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나의 부모 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 서열의 비-확장된 CDR 영역의 아미노산 서열에 적어도 80% 일치하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 서열의 비-확장된 CDR 영역의 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 이의 단편은 본 발명에 의해 제공된다. 바람직하게는 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역 또는 비-확장된 CDR 영역의 아미노산 서열 일치는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 100%를 포함하는 특히 96%, 더욱 특히 97%, 더욱 더 특히 98%, 가장 특히 99%이다. 아미노산 서열에 대하여 일치 또는 상동(homology)은, 필요한 경우에 최대 퍼센트 서열 일치를 얻기위하여 서열 및 도입 갭(introducing gaps)을 정렬한 후에, TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편에 일치하는 후보 서열에서 아미노산 잔기의 퍼센트로서 본 명세서에서 확인되었다. 따라서 서열 일치는 2개의 폴리펩타이드의 아미노산의 위치에서 유사성을 비교하기 위하여 주로 사용되는 표준 방법으로 결정될 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 2개의 폴리펩타이드는 자체의 각각의 아미노산의 최적 매칭에 대하여 정렬된다(하나의 또는 모든 서열의 전장을 따라서 또는 하나의 또는 모든 서열의 미리-결정된 일부를 따라서). 프로그램은 디폴트 개방 페널티(default opening penalty) 및 디폴트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하고, PAM250 (표준 점수 매트릭스; Dayhoff MO 외 다수, (1978) in Atlas of 단백질 서열 및 구조, vol 5, supp. 3를 참조하시오)와 같은 점수 매트릭스는 컴퓨터 프로그램과 결합(conjunction)으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 퍼센트 일치는 하기로서 계산될 수 있다: 일치하는 매치의 총 구성원을 100으로 곱한 후 매치된 스팬(matched span) 내에 있는 긴 서열의 길이의 합으로 나누고 갭의 수를 긴 서열로 도입하여 2개의 서열을 정렬한다.
따라서 일부 실시형태에서 본 개시는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 3, 4, 5, 6 또는 7의 프레임워크 영역 서열에 적어도 65 % 일치하는 중쇄 가변 프레임워크 영역 서열 및/또는 서열번호: 8, 9, 10, 11 및 12의 프레임워크 영역 서열에 적어도 75 % 일치하는 경쇄 가변 프레임워크 영역 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서 본 개시는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 3의 프레임워크 영역 서열에 적어도 69% 일치하는 중쇄 가변 프레임워크 영역 서열 및/또는 서열번호: 8의 프레임워크 영역 서열에 적어도 80 % 일치하는 경쇄 가변 프레임워크 영역 서열을 제공한다.
다른 측면에서 본 발명은 앞에 설명된 바와 같이 중쇄 및 또는 경쇄 CDRs를 포함하고 IGHV1-2*02 (서열번호: 3), IGHV1-2*04 (서열번호: 4), IGHV1-2*05 (서열번호: 5), IGHV1-2*01 (서열번호: 6), 및 IGHV1-46*01 (서열번호: 7)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 생성물 또는 로부터 유래된 생성물인 중쇄 가변 프레임워크 영역, 바람직하게는 인간 유전자 IGHV1-2*01 (서열번호: 3)의 생성물 또는 로부터 유래된 생성물인 중쇄 가변 프레임워크 영역을 추가적으로 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 중쇄 가변 프레임워크 영역은 상기 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물에 존재하는 하나 이상의(예를 들면, 1개, 2개, 3개 및/또는 4개) 중쇄 프레임워크 영역 서열 (예를 들면, 프레임워크 1 (FW1), 프레임워크 2 (FW2), 프레임워크 3 (FW3) 및/또는 프레임워크 4 (FW4))를 포함할 수 있다. 바람직하게는 중쇄 가변영역 프레임워크는 IGHV1-2*02 (서열번호: 3), IGHV1-2*04 (서열번호: 4), IGHV1-2*05 (서열번호: 5), IGHV1-2*01 (서열번호: 6), 및 IGHV1-46*01 (서열번호: 7)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물에 존재하는 FW1, FW2 및/또는 FW3, 더욱 바람직하게는 FW1, FW2 및 FW3을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 중쇄 프레임워크 영역 서열은 FW1 (위치 1 내지 위치 25), FW2 (위치 36 내지 위치 49), FW3 (위치 66 내지 위치 94) 및 FW 4 (위치 103 내지 위치 113)을 포함하고, 상기 아미노산 위치는 카밧(Kabat)에 제시한 바와 같이 숫자 시스템을 사용하는 것을 지시한다.
일부 실시형태에서 본 개시는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간 유전자 IGHV1-2*01 (서열번호: 3)의 또는 로부터 유래된 생성물인 중쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하고 상기 중쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 해당 중쇄 가변 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함한다.
일부 실시형태에서 본 개시는 서열번호: 16을 포함하는 중쇄 서열 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고 상기 중쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 해당 중쇄 가변 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정은 포함한다.
바람직하게는 아미노산 수정은 37, 48, 50, 67, 69, 71 및 75로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치, 더욱 바람직하게는 37, 48, 50, 67 및 71로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치, 가장 바람직하게는 아미노산 위치 37에서 아미노산 대체를 포함하고, 상기 각각의 군 구성원의 아미노산 위치는 카밧 숫자에 따라 지시된다. 특정적으로 아미노산 수정은 37A, 48I, 50E, 67A, 69L, 71V 및 75S로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 대체, 바람직하게는 V37A, M48I, W50E, V67A, M69L, R71V 및 I75S로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 대체, 반면에 V37A는 가장 바람직하게는 아미노산 대체이고 상기 각각의 군 구성원의 아미노산 위치는 카밧 숫자에 따라 지시된다.
다른 측면에서 본 발명은 IGKV1-33*01 (서열번호: 8), IGKV1D-33*01 (서열번호: 9), IGKV1D-12*02 (서열번호: 10), IGKV1D-12*01 (서열번호: 11) 및 IGKV1-12*02 (서열번호: 12)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물인 경쇄 가변 프레임워크 영역, 바람직하게는 인간 유전자 IGKV1-33*01 (서열번호: 8)의 또는 로부터 유래된 생성물인 경쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 경쇄 가변영역 프레임워크 영역은 상기 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물에 존재하는 하나 이상의(예를 들면, 1개, 2개의, 3개의 및/또는 4개)의 경쇄 프레임워크 영역 서열 (예를 들면, 프레임워크 1 (FW1), 프레임워크 2 (FW2), 프레임워크 3 (FW3) 및/또는 프레임워크 4 (FW4))을 포함할 수 있다. 바람직하게는 경쇄 가변영역 프레임워크는 IGKV1-33*01 (서열번호: 8), IGKV1D-33*01 (서열번호: 9), IGKV1D-12*02 (서열번호: 10), IGKV1D-12*01 (서열번호: 11), 및 IGKV1-12*02 (서열번호: 12)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물에 존재하는 FW1, FW2 및/또는 FW3, 더욱 바람직하게는 FW1, FW2 및 FW3을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 경쇄 프레임워크 영역 서열은 FW1 (위치 1 내지 위치 23), FW2 (위치 35 내지 위치 49), FW3 (위치 57 내지 위치 88) 및 FW 4 (의치 98 내지 위치 108)를 포함하고, 상기 아미노산 위치는 카밧에 따른 숫자 시스템을 사용하여 지시한다.
일부 실시형태에서 본 개시는 인간 유전자 IGKV1-33*01 (서열번호: 8)의 또는 로부터 유래된 생성물인 경쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고 상기 경쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 경쇄 가변영역의 해당 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함한다. 추가 측면에서 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 2를 포함하는 경쇄 가변영역 서열 아미노산 서열을 포함한다. 추가 측면에서 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 2의 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80 % 일치하는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서 본 개시는 서열번호: 17 및 서열번호: 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
일부 실시형태에서 본 개시는 서열번호: 17을 포함하는 경쇄 서열 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 대안적으로, 경쇄 서열의 경쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 해당 경쇄 가변 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함한다.
아미노산 수정은 5 및 34로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치의 아미노산 대체를 포함할 수 있고, 상기 각각의 군 구성원의 아미노산 위치는 카밧 숫자에 따라 지시된다. 특정적으로 아미노산 수정은 5N, 및 34S, 바람직하게는 T5N 및 N34S으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 대체를 포함하고, 상기 각각의 군 구성원의 아미노산 위치는 카밧 숫자에 따라 지시된다. 특정적으로 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열은 임의의 아미노산 수정이없는 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 IGHV1-2*02 (서열번호: 3), IGHV1-2*04 (서열번호: 4), IGHV1-2*05 (서열번호: 5), IGHV1-2*01 (서열번호: 6), 및 IGHV1-46*01 (서열번호: 7)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물인 중쇄 가변 프레임워크 영역 및 IGKV1-33*01 (서열번호: 8), IGKV1D-33*01 (서열번호: 9), IGKV1D-12*02 (서열번호: 10), IGKV1D-12*01 (서열번호: 11), 및 IGKV1-12*02 (서열번호: 12)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물인 경쇄 가변 프레임워크 영역, 바람직하게는 인간 유전자 IGHV1-2*02 (서열번호: 3)의 또는 로부터 유래된 생성물 중쇄 가변 프레임워크 영역 및 인간 유전자 IGKV1-33*01 (서열번호: 8)의 또는 로부터 유래된 생성물인 경쇄 가변 프레임워크 영역을 포함한다. 또한 앞에 언급된 상이한 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물에 존재하는 중쇄 가변 프레임워크 영역의 조합 및/또는 앞에 언급된 상이한 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물에 존재하는 경쇄 가변영역 프레임워크 영역은 본 발명에 의해 포함된다.
인간 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자에 대한 생식세포계열(germline) DNA 서열은 앞의 Kabat EA 외 다수,; Tomlinson IM 외 다수, (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798 및 Cox JPL 외 다수, (1994) Eur. J. Immunol. 24: 827-836에서 뿐만 아니라 “VBase” 인간 생식세포계열(germline) 서열 데이타베이스(www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase의 인터넷에서 이용할수 있는)에서 발견될 수 있다.
다른 실시예에서와 같이, 인간 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자에 대한 생식세포계열(germline) DNA 서열은 유전자뱅크 데이타베이스(Genbank database).
또한 다른 측면에서, 본 개시는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 적어도 하나의 중쇄 CDRs 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDRs는 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함한다. 부위-지정 돌연변이생성 또는 PCR-매개된 돌연변이생성은 항체 결합의 수정 및 효과를 도입하기 위하여 수행될 수 있고, 또는 관심있는 다른 기능적 성질은, 시험관내 또는 생체 내 분석에서 평가될 수 있다. 바람직하게는 보존적 수정(conservative mosification)은 도입된다. 수정은 아미노산 대체, 첨가 또는 결실(deletion)일 수 있으나, 바람직하게는 대체(substitution)이다. 통상적으로, 겨우 5개(no more than five), 바람직하게는 겨우 4개, 더욱 바람직하게는 겨우 3개, 더욱 더 바람직하게는 겨우 2개, 가장 바람직하게는 겨우 1개가 CDR 영역 내에서 수행될 수 있다.
특정 실시형태에서, 프레임워크 서열은 변이 항체를 생성하기 위하여 가변영역을 조작하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 변이 항체는 수정이 VH 및/또는 VK 내 프레임워크 잔기, 예를 들면 항체의 성질을 개선하는데 만들어진 것을 포함한다. 통상적으로 상기 프레임워크 수정은 항체의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키는것으로 만들어진다. 예를 들면, 하나의 접근은 해당 마우스 서열에 하나 이상의 프레임워크 잔기를 “복귀돌연변이(backmutate)”이거나 또는 해당 생식세포계열(germline) 서열에 하나 이상의 프레임워크 잔기 “복귀돌연변이(backmutate)”하는 것이다.
따라서 추가적 측면에서 본 개시는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변영역의 적어도 하나의 프레임워크 영역 서열은 해당 마우스 항체의 중쇄 가변영역의 해당 프레임워크 영역로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함한다. 바람직하게는 아미노산 수정는 아미노산 대체이다. 통상적으로, 겨우 7개, 바람직하게는 겨우 6개, 바람직하게는 겨우 5개, 바람직하게는 겨우 4개, 더욱 바람직하게는 겨우 3개, 더욱 더 바람직하게는 겨우 2개의, 가장 바람직하게는 겨우 하나의 아미노산 수정은 프레임워크 영역 내에 수행된다. 일부 실시형태에서 본 개시는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산 수정은 37, 48, 50, 67, 69, 71, 및 75로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치의 아미노산 대체를 포함하고 상기 각각의 군 구성원의 아미노산 위치는 카밧 숫자에 따라 지시된다. 바람직하게는 중쇄 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산 대체는 37, 48, 50, 67 및 71로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치이다. 더욱 바람직하게는 중쇄 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산 대체는 V37A, M48I, W50E, V67A, M69L, R71V 및 I75S로 구성되는 군으로부터 선택되고, 반면에 가장 바람직하게는 V37A는 중쇄 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산 대체이다.
또한 본 개시는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 이의 단편의 경쇄 가변영역의 적어도 하나의 프레임워크 영역 서열은 해당 마우스 항체의 경쇄 가변영역의 해당 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함할 수 있다. 바람직하게는 아미노산 수정은 아미노산 대체이다. 통상적으로, 겨우 2개, 더욱 바람직하게는 겨우 하나 및 가장 바람직하게는, 아미노산 수정은 프레임워크 영역 내에서 수행되지 않는다. 일부 실시형태에서 본 개시는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 경쇄 가변영역 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 수정은 5 및 34로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치의 아미노산 대체를 포함한다. 경쇄 가변영역 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 수정은 5N 및 34S, 바람직하게는 T5N 및 N34S으로 구성되는 군으로부터 선택되는 대체를 포함하고, 상기 각각의 군 구성원의 아미노산 위치는 카밧 숫자에 따라 지시된다. 일부 실시형태에서 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 상기에서 준비된 중쇄 가변영역 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 수정 및 상기에서 준비된 경쇄 가변영역 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 수정을 포함할 수 있다.
또한 본 개시는 서열번호: 13, 26, 27, 28 및 29로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역, 바람직하게는 서열번호: 26, 27, 28 및 29로 구성되는 군으로부터, 더욱 바람직하게는 서열번호: 27, 28 및 29로 구성되는 군으로부터 및 더욱 더바람직하게는 서열번호: 27 및 29로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 또한 본 개시는 서열번호: 14 및 30, 더욱 바람직하게는 서열번호: 14로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 26, 27, 28 및 29로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 14 및 30로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열의 각각은 TL1A에 결합할 수 있다는 것을 고려하면, 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 발명의 항-TL1A 결합 분자를 만들기 위하여 “혼합(mixed) 및 매치된(matched)”일 수 있다. 상기 “혼합(mixed) 및 매치된(matched)” 항체의 TL1A 결합은 예를 들면 실시예에서 설명된 바와 같이 결합 분석을 사용하여 테스트될 수 있다.
일부 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 27 및 29로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역, 및 서열번호: 14 및 30로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 또는 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 아미노산을 포함한다. 가장 바람직하게는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 27 및 29로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역, 및 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.
또한 본 개시는 서열번호: 16, 21, 22, 23 및 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열, 바람직하게는 서열번호: 22, 23 및 24로 구성되는 군으로부터 및 더욱 바람직하게는 서열번호: 22 및 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 또한 본 개시는 서열번호: 17 및 25, 더욱 바람직하게는 서열번호: 17로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 21, 22, 23 및 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열, 및 서열번호: 17 및 25로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열의 각각이 TL1A에 결합할 수 있다는 것을 고려하면, 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 본 발명의 항-TL1A 결합 분자를 만들기 위하여 "혼합(mixed) 및 매치(matched)"될 수 있다. 상기 "혼합(mixed) 및 매치(matched)" 항체의 TL1A 결합은 예를 들면 실시예에서 설명된 결합 분석을 사용하여 테스트될 수 있다.
일부 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 22 및 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열, 및 서열번호: 17 및 25로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 또는 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 서열번호: 22 및 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열, 및 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편이 가장 바람직하다.
본 개시의 하나의 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 인간화 항체이다. 바람직하게는 항체 또는 이의 단편은 인간화 단클론 항체이다.
또한 본 개시는 TL1A에 결합하는 1가(monovalent) 항체 또는 이의 단편, 예를 들면 단일 항원 결합 암(arm)으로 구성되는 항체를 제공한다. 또한 본 개시는 동일하거나 또는 상이한 항체에 유전적으로 융합된 Fab, Fab′, Fab′-SH, Fd, Fv, dAb , F(ab')2, scFv, 이중특이 단일 사슬 Fv 2분자체(dimers), 이중체(diabodies), 삼중체(triabodies) 및 scFv로 구성되는 군으로부터 선택되는 TL1A에 결합하는 항체의 단편을 제공한다. 바람직한 단편은 scFv, 이중특이 단일 사슬 Fv 2분자체(dimers) 및 이중체(diabodies)이다. 또한 본 개시는 TL1A에 결합하는 전장 항체를 제공한다.
또한 본 개시는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역 특히 인간 중쇄 및/또는 인간 경쇄 불변 영역을 추가적으로 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 인간 중쇄 불변 영역은 IgG1 (IGHG1), IgG2 (IGHG2), IgG3 (IGHG3), IgG4 (IGHG4), IgA1 (IGHA1), IgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD), 또는 IgE (IGHE)로 구성되는 인간 면역글로불린의 군으로부터 선택될 수 있는 반면, 인간 중쇄 불변 영역 IgG, 특히 IgG1 (IGHG1)가 바람직하다. 인간 경쇄 불변 영역은 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 불변 영역으로 구성되는 인간 면역글로불린의 군으로부터 선택될 수 있고, 반면에 인간 카파(kappa) 불변 영역이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 인간 IgG1 (IGHG1) 중쇄 불변 도메인 및 인간 경쇄 카파(kappa) 불변 도메인을 포함한다.
프레임워크 영역 또는 CDR 영역 내에 만들어진 수정에 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 통상적으로 항체의 하나 이상의 기능적 성질, 예를 들면 혈청 반감기, 보완 고정(complement fixation), Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포내 세포독성을 변경하는, Fc 영역 내에 수정을 포함하도록 조작(engineered)될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 항체는 화학적적으로 수정될 수 있고(예를 들면, 하나 이상의 화학적 일부분(moieties)은 항체에 부착될 수 있다) 또는 자체의 글리코실레이션(glycosylation)을 변경하도록 수정될 수 있다. 상기 실시형태의 각각은 하기에 추가적으로 상세히 설명된다. 하기에 개략된 바와 같이 Fc 영역 내의 수정은 Fc 영역에 있는 잔기의 EU 숫자에 따른다. 하나의 실시형태에서, CH1의 힌지(hinge) 영역은 힌지(hinge) 영역에 있는 시스테인(cysteine)잔기의 구성원이 증가된 또는 감소되는 것과 같이 변형된다. 상기 접근은 Bodmer 외 다수에 의하여 미국 특허 제 5,677,425호에 추가적으로 설명된다. CH1의 힌지(hinge) 영역에 있는 시스테인 잔기의 수는 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키는 것과 같이 변형된다. 다른 실시형태에서, 항체의 Fc 힌지(hinge) 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 더욱 특정적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 항체가 선천적 Fc-힌지(hinge) 도메인 SpA 결합에 대하여 손상된 스타필로코컬(Staphyloccal) 단백질 A (SpA) 결합을 가지는 것과 같은 Fc-힌지(hinge) 단편의 CH2-CH3 도메인 경계 영역으로 도입된다. 상기 접근은 Ward 외 디수에 의해 미국 특허 제 6,165,745호에서 추가적으로 상세히 설명된다. 다른 실시형태에서, 항체는 자체의 생물학적 반감기를 증가시키도록 수정된다. 다양한 접근이 가능하다. 예를 들면, 하기의 돌연변이의 하나 이상을 Ward에 도입될 수 있다: 미국 특허 제6,277,375호에 설명된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위하여, 항체는 Presta 외 디수에 의해 미국 특허 제 5,869,046 및 6,121,022에서 설명된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 얻은 구조(salvage) 수용체 결합 항원결정기를 포함하는 CH1 또는 CL 영역 내에 변형될 수 있다. 추가 실시형태에서 Fc 영역은 항체의 작용인자 기능을 변경하기 위하여 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 교체하여 변형된다. 예를 들면, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산은 항체가 작용인자 리간드에 대하여 변형된 친화도를 가지나 부모 항체의 항원- 결합 능력을 보유하는 상이한 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 친화도가 변형된 작용인자 리간드는, 예를 들면, Fc 수용체 또는 보체(complement)의 C1 구성요소일 수 있다. 상기 접근은 Winter 외 다수에 의해, 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에서 추가 상세부분에 설명되어 있다. 다른 실시예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산은 항체가 변형된 C1q 결합을 가지고 및/또는 보체(complement) 의존적 세포독성(CDC)을 감소시키거나 없앤다. 상기 접근은 Idusogie 외 다수에 의해 미국 특허 제 6,194,551호에서 추가 상세 부분에서 설명된다. 다른 실시예에서, CH2 도메인의 N-말단 영역에 있는 아미노산 위치 231 내지 238내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 보체(complement)를 고정하기 위하여 항체 능력을 변경하도록 변형된다. 상기 접근은 Bodmer 외 다수에 의해 PCT 출원 WO94/29351에서 추가적으로 설명된다. 그러나 다른 실시예에서, Fc 영역은 하기의 위치에서 하나 이상의 아미노산 수정에 의한 Fcγ 수용체에 대하여 항체 의존적 세포내 세포독성 (ADCC)을 매개하고 및/또는 항체의 친화도를 증가하여 항체의 능력을 증가시키기 위하여 수정된다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 상기 접근은 프레스타(Presta)에 의해 PCT 출원 WO00/42072에서 추가적으로 설명된다.
또한 본 개시는 인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 인간 중쇄 불변 영역은 인간 IgG4 (IGHG4)로부터 CH1 영역, 힌지(hinge) 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 동형의(isotypic)변이를 포함하고 상기 힌지(hinge) 영역은 위치 228의 세린(serine)을 프롤린(proline)으로 대체를 포함한다. 바람직하게는 동형의(isotypic)변이를 포함하는 항체는 전장 항체이다. 인간 IgG4 (IGHG4)로부터 CH1, 인간 IgG4 (IGHG4)로부터 S228P 대체를 가지는 힌지(hinge) 및 인간 IgG4 (IGHG4)로부터 CH2 및 CH3를 포함하는 동형의(isotypic) 변이를 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 특정적으로 바람직하다. 동형의(isotypic) 변이는 인간 IgG1 (IGHG1) (항상 선천적 인간 IgG1)로부터 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편과 비교하여, 예를 들면 수정된 중쇄 불변 영역에 대하여 동형의(isotypic) 변이로부터 단지 상이한 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편과 비교하여, ADCC와 같은 Fc-매개된 세포독성을 나타내지 않는다는 것을 발견하였다.
또한 본 개시는 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 인간 IgG Fc 영역에 부착된 성숙 핵심 탄수화물(mature core carbohydrate) 구조는 푸코오스(fucose)가 부족하다(“비 푸코실화된”으로서 본 명세서에서 대안적으로 언급됨). 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 “성숙 핵심 탄수화물 구조(mature core carbohydrate structure)”는 하기에 도식적으로 나타낸 통상적 바이안테너리 올리고당(biantennary oligosaccharides) 탄수화물 구조 GlcNAc (Fucose)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2로 일반적으로 구성되는 Fc 영역에 부착된 진행된 핵심 탄수화물 구조를 포함한다:
Figure pct00001

상기 용어는 β1,2 GlcNAc 잔기가 부족한 핵심 성숙 탄수화물 구조(core mature carbohydrate structure) G-1 형태를 특정적으로 포함한다. 그러나, 바람직하게는, 핵심 탄수화물 구조는 β1,2 GlcNAc 잔기 모두를 포함한다. 본 명세서의 성숙 핵심탄수화물 구조(mature core carbohydrate structure)는 일반적으로 고만노실화(hypermannosylated) 되지않는다. 성숙 핵심 탄수화물 구조는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-링키지를 일반적으로 경유하여, 글리코단백질의 Fc 영역에 부착된다.
바람직하게는 항체는 인간 IgG1 (IGHG1) Fc 영역을 포함하고, 상기 인간 IgG1 (IGHG1) Fc 영역에 부착된 성숙 핵심탄수화물 구조는 푸코오스(fucose)가 부족하다. 인간 IgG1 (IGHG1) Fc 영역을 포함하는 전장 항체가 더욱 바람직하고, 상기 인간 IgG1 (IGHG1) Fc 영역에 부착된 성숙 핵심탄수화물 구조는 푸코오스가 부족하다. 인간 IgG Fc 영역에 부착된 성숙 핵심탄수화물 구조에서 푸코오스의 부족이 ADCC를 증강할 수 있다는 것은 WO03/035835로부터 알려져 있다. 따라서 본 개시의 추가 실시형태 항체 또는 이의 단편은 인간 IgG1 (IGHG1) Fc 영역을 포함하고, 상기 인간 IgG1 (IGHG1) Fc 영역에 부착된 성숙 핵심탄수화물 구조는 푸코오스(fucose)가 부족하고, 상기 푸코오스(fucose)가 부족한 항체는 푸코오스가 부족하지 않은 부모 항체 또는 이의 단편과 비교하여 증강된 ADCC를 나타낸다. 푸코오스가 부족한 항체를 생성하기 위한 방법은, 예를 들면 (a) 거기에 발현된 푸코실화 단백질을 감소된 능력(또는 할 수 없는)을 가지는 것과 같은 푸코오스 대사에 결핍된 조작되거나 또는 돌연변이체 숙주 세포의 사용; (b) 푸코실화(fucosylation)을 차단하거나 또는 감소시키는 조건하의 배양 세포; (c) 푸코오스(예를 들면 푸코오시다제 효소(fucosidase enzyme)로)의 번역 후 제거(post-translational removal); (d) 원하는 탄수화물의 번역 후 추가, 예를 들면 비-글리코시화된 글리코단백질(non-glycosylated glycoprotein)의 재조합 발현 후; 또는 (e) 푸코실레이티드가 아닌 생성물을 선별하기 위하여 글리코단백질의 정제이다. 바람직하게는 WO10/095031의 실시예 14에서 설명된 방법, 예를 들면, Longmore 외 다수, (1982) Carbohydr. Res. 365-92 또는 Imai-Nishiya 외 다수, (2007), BMC Biotechnol. 7: 84에서 설명된 방법이 사용된다.
또한 TL1A에 결합하고 서열번호 27 또는 29를 포함하는 중쇄 가변 서열 아미노산 서열 및 서열번호 14를 포함하는 경쇄 가변 서열 아미노산 서열을 포함하는 항체로서 동일한 항원결정기에 결합하는 항체 또는 이의 단편이 본 발명에 의해 제공된다. 또한 본 발명에 의해 제공되는 항체에 의해, 특히 서열번호 27 또는 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 서열 아미노산 서열 및 서열번호 14를 포함하는 경쇄 가변 서열 아미노산 서열을 포함하는 항체에 의해 결합되는, TL1A의 특정 영역 또는 항원결정기는 본 발명에 의해 제공된다. TL1A 폴리펩타이드의 상기 특정 영역 또는 항원결정기는 본 발명에 의해 제공된 임의의 하나의 항체와 결합하여 당업계에 알려져 있는 임의의 적합한 항원결정기 맵핑 방법에 의해 확인될 수 있다. 상기 방법의 실시예는 항체에 의해 인식되는 항원결정기의 서열을 포함하는 항체에 특정적으로 결합할 수 있는 가장 작은 단편을 가지는 본 발명의 항체에 결합을 위하여 TL1A로부터 유래된 다양한 길이의 스크리닝 펩타이드를 포함한다. TL1A 펩타이드는 합성적으로 또는 TL1A 폴리펩타이드의 단백질 가수분해(proteolytic digestion)에 의해 생성될 수 있다. 항체에 결합하는 펩타이드는, 예를 들면 질량분광계 분석(mass spectrometric analysis)에 의해 확인될 수 있다. 다른 실시예에서, 핵자기공명분광학(NMR spectroscopy) 또는 엑스-선 결정학(X-ray crystallography)는 본 발명의 항체에 의해 결합된 항원결정기를 식별하도록 사용될 수 있다. 일단 확인되면, 본 발명의 항체에 결합하는 항원결정기 단편은, 만약 요구된다면, 동일한 항원결정기에 결합하는 추가 항체를 얻기 위하여 면역원(immunogen)으로서 사용될 수 있다.
항- TL1A 항체 성질
예를 들면 TL1A를 향하여 항체의 결합 능력을 평가하는, 예를 들면, ELISAs, BIAcore®, Western blots, RIAs, 및 유동세포분석(flow cytometry 분석)을 포함하는, 표준 분석은 당업계에서 알려져 있다. 적합한 분석은 실시예의 상세 부분에 설명되어 있다. 또한 항체의 결합 키네틱스(Kinetics) (예를 들면, KD와 같은 결합 친화도)는 당업계에서 알려져 있는 표준 분석에 의해, 예를 들면 Scatchard 또는 BIAcore® 시스템 분석에 의해, 평가될 수 있다. 상대적 결합 친화도 Ki는 당업계에서 알려져 있는 표준 경쟁 분석(standard competition assay)에 의해 평가될 수 있다.
추가적 측면에서 본 발명은 ELISA 또는 BIAcore® 방법에 의해 시각화되는 바와 같이 인간, 마우스, 래트 및 게잡이원숭이(cynomologus monkey) TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
추가적 측면에서 본 발명은 재조합 또는 자연적으로 생성된 인간 TL1A에 결합하고 CD4 T 림프구에 의한 활성 및 사이토카인 배출을 차단하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 면역 복합체로 자극된 단핵백혈구에 의해 유도된 INFγ생성을 억제할 수 있다. CD4 T 림프구에 의해 TL1A-매개된 사이토카인 배출을 결정하는 분석은 실시예 3 및 6에 따라 수행되고 측정될 수 있다.
추가적 측면에서 본 발명은 850 pM 또는 미만, 바람직하게는 700nM 또는 미만, 더욱 바람직하게는 300 nM 또는 미만, 더욱 바람직하게는 260 nM 또는 미만, 더욱 더 바람직하게는 250 nM 또는 미만의 친화도 (KD)로, 예를 들면, 실시예 5에서 상세 부분에서와 같이 사용된 인간 수용 TL1A 폴리펩타이드 (서열번호: 116에 의해 암호화되는)으로 단백질-A 결합된 CM5 연구등급 센서칩(research grade sensor chip) (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland; BR-1000-14)에 있는 항체를 포착하여 BIAcore® 기구(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland) 상의 표면 플라즈마 공명(surface Plasmon Resonance (SPR))에 의해 측정된, TL1A, 특히 분리된 형태의 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 바람직한 측면에서, 본 발명은 해당 키메라 항체의 TL1A 결합 친화도 (KD)의 적어도 85%를 유지하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 바람직하게는 인간화 항체 또는 이의 단편은 해당 키메라 항체의 TL1A 결합 친화도(KD)의 적어도 90% , 더욱 바람직하게는 해당 키메라 항체의 결합 친화도(KD)의 적어도 95%을 유지한다. 바람직하게는, 인간화 항체 또는 이의 단편은 해당 키메라 항체에 동등 한 친화도를 가지는 인간 TL1A에 결합한다. “동등한 친화도(equivalent affinity)”는 해당 키메라 항체의 TL1A 결합 친화도의 ±10%의 범위 내에 있는 친화도 값을 의미한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 해당 키메라 항체보다 높은 친화도을 가지는 인간 TL1A에 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 바람직하게는 인간화 항체 또는 이의 단편은 해당 키메라 항체보다 2-배 높은 친화도, 더욱 바람직하게는 해당 키메라 항체보다 3-배 높은 친화도를 가지는 인간 TL1A에 결합한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, TL1A에 결합하는 인간화 항체 또는 이의 단편은 예를 들면, 실시예 5에서 상세 부분에서와 같이 분석체로서 사용된 인간 수용 TL1A 폴리펩타이드 (서열번호: 116에 의해 암호화되는)으로 단백질-A 결합된 CM5 연구등급 센서칩(research grade sensor chip) (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland; BR-1000-14)에 있는 항체를 포착하여 BIAcore® 기구(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland) 상의 표면 플라즈마 공명(surface Plasmon Resonance (SPR))에 의해 측정된, 900 pM 또는 미만, 700 pM 또는 미만, 바람직하게는 500 pM 또는 미만, 더욱 바람직하게는 300 nM 또는 미만, 더욱 바람직하게는 260 pM 또는 미만, 더욱 더 바람직하게는 250 pM 또는 미만의 결합 친화도 (KD)를 가지는 것을 제공한다.
본 발명의 추가 측면은 좋은 열 안정성을 가지고 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 바람직한 실시형태에서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 70℃보다 큰, 바람직하게는 75℃보다 큰, 더욱 더 바람직하게는 80℃보다 큰 FAB 단편 열 안정성 온도를 가진다. FAB 단편 열 안정성 분석을 위하여 시차주사 열량측정법(differential scanning calorimetry measurements)이 사용되고, 반면에 전장 IgG의 문맥에서 Fab 단편의 중간지점-녹는점이 확인된다. 열량측정법(calorimetric measurements)의 종류는 당업자에게 알려져 있고 실시예 5에서 추가적으로 설명된 바와 같이, 예를 들면 Garber E & Demarest SJ (2007) Biohem Biophys Res Commun, 355: 751-7에 따라 수행될 수 있다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포
또한 본 개시는 핵산 또는 벡터를 포함하는 TL1A, 벡터 및 숙주 세포에 결합하는 항체 및 이의 단편을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제되 또는 실질적으로 순수 형태에서 존재될 수 있다. 핵산은 당업계에서 잘 알려져 있는, 예를 들면 F. Ausubel, 외 다수, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing 및 Wiley Interscience, New York를 참조하고, 알칼린/SDS 치료, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로우즈 젤전기영동 및 다른 것들을 포함하는, 다른 세포내 구성요소 또는 다른 오염물질로부터 떨어져 정제될 때 "분리된(isolated)” 또는 “실질적으로 순수가 되게 만들다(rendered substantially pure)”이다. 본 발명의 핵산은 예를 들면, DNA 또는 RNA일 수 있고 인트론(intron) 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술, 예를 들면 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하거나 또는 VH 및 VL 부분을 암호화하는 cDNAs를 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리(예를 들면, 파지(phage) 디스플레이 기술을 사용하여)로부터 얻은 항체를 위하여, 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산은 라이브러리로부터 회수될 수 있다. 숙주 세포로 외부 핵산을 도입하는 방법은 당업계에서 잘 알려져 있고, 사용되는 숙주 세포와 같이 다양할 것이다. 기술은 댁스트란-매개된 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전(calcium phosphate precipitation), 칼슘 클로이드(calcium chloride) 치료, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine) 매개된 형질감염, 폴리브렌(polybrene) 매개된 형질감염, 프로토플라스트(protoplast) 융합, 전기영동, 바이러스 또는 파지(phage) 감염, 리포좀에서 폴리뉴클레오티드의 피막형성(encapsulation), 및 핵으로 DNA의 직접 마이크로주사(microinjection)을 포함하나 제한하지 않는다. 포유류 세포의 경우에는, 형질감염(transfection)은 일시적(transient) 또는 안정적(stable)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 서열번호: 42, 43, 44, 45 및 46로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열 및/또는 서열번호: 47 및 48로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 암호화하는 것이다. 본 발명의 바람직한 핵산 분자는 서열번호: 31, 32, 33, 34 및 35로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호: 36 및 37로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 암호화하는 것이다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 서열번호: 1의 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호: 2의 경쇄 가변영역을 암호화하는 것, 예를 들면 서열번호: 63의 핵산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호: 64의 핵산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 암호화하는 DNA이다. 본 발명의 더욱 바람직한 핵산 분자는 서열번호: 27 또는 29의 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호: 14의 경쇄 가변영역, 예를 들면 가장 바람직하게는 서열번호: 33 또는 35의 핵산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호: 36의 핵산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 암호화하는 DNA이다.
일단 VH 및 VL 부분을 암호화하는 DNA 단편이 얻어지면, 상기 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술, 예를 들면 가변영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, 또는 Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자같은 앞에 설명된 단편에 해당하는 단편 유전자로 전환하는 기술에 의해 추가적으로 조종할 수 있다. 상기 조정(manipulations)에서, VL- 또는 VH-암호화하는 DNA 단편은 다른 단백질, 예를 들면 항체 불변 영역 또는 유연한(flexible) 링커를 암호화하는 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 상기 문맥에서 사용된, 용어 “작동가능하게 연결된(작동가능하게 linked)”은 2개의 DNA 단편이 2개의 DNA 단편에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 인-프레임(in-frame)에 남아있는 것을 연결시키는 것을 의미하고자 한다. VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH-암호화하는 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자로 작동가능하게 연결하여 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있고(예를 들면, 앞에 Kabat EA 외 다수를 참조), 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1 (IGHG1), IgG2 (IGHG2), IgG3 (IGHG3), IgG4 (IGHG4), IgA1 (IGHA1), IgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD), 또는 IgE (IGHE) 불변 영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG1 (IGHG1) 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자를 위하여, VH-암호화하는 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변 영역을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 경쇄 불변 영역, CL을 암호화하는 다른 DNA 분자에 VL-암호화하는 DNA를 작동가능하게 연결하여 전장 경쇄 유전자(Fab 경쇄 유전자뿐만 아니라)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있고(앞에 예를 들면, Kabat EA 외 다수를 참조) 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 경쇄 불변 영역은 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 불변 영역, 바람직하게는 카파(kappa) 불변 영역일 수 있다. scFv 유전자를 만들기 위하여, VH- 및 VL-암호화하는 DNA 단편은 예를 들면, VH 및 VL 서열은 유연한 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 서열과 같이, 인접한 단일-사슬 단백질로서 발현될 수 있는 것과 같이, 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)3를 암호화하는 유연한(flexible) 링커를 암호화하는 다른 단편에 작동가능하게 연결된다(예를 들면, Bird RE 외 다수, (1988) Science, 242: 423-426; Huston JS 외 다수, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83; McCafferty J 외 다수, (1990) Nature, 348: 552-554를 참조). 다양한 기술은 항체의 항체 단편의 생성에 대하여 발달된다. 전통적으로, 상기 단편은 온전한 항체의 단백질 가수분해를 경유하여 유래된다(see, 예를 들면, Morimoto K 외 다수, (1992) J. Biochem. & Biophysical Methods, 24: 107-117 및 Brennan M 외 다수, (1985) Science, 229: 81-3을 참조). 그러나, 상기 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성된다. 예를 들면, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지(phage) 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab′-SH 단편은 E. coli로부터 직접적으로 F(ab′)2 단편 형성에 화학적으로 연결될 수 있다(Carter P 외 다수, (1992) Bio/ Technology, 10: 163-167). 다른 접근에 따라, F(ab′)2 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 분리될 수 있다. 항체 단편의 생성에 대한 다른 기술은 숙련자에게 명백할 것이다. 다른 실시형태에서, 항체 선택은 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)이고, 예를 들면 WO 1993/16185; 미국 특허 제5,571,894호 및 미국 특허 제 5,587,458호를 참조하시오. 또한 항체 단편은 예를 들면 미국 특허 제5,641,870호에 설명된 바와 같이, “직선 항체(linear antibody)”일 수 있다.
본 발명의 항체를 암호화하는 핵산은 벡터, 바람직하게는 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터로 혼합될 수 있다. 발현 벡터의 다양성은 단백질 발현에 대하여 활용화될 수 있다. 발현 벡터는 자가-복제 추가-크로모좀 벡터 또는 숙주 게놈으로 통합되는 벡터를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 숙주 세포 유형으로 양립할 수 있도록 구성된다. 따라서 벡터, 바람직하게는 본 발명에서 사용이 발견된 발현 벡터는 포유류 세포, 박테리아, 곤충 세포, 효모, 및 시험관 내 시스템에서 단백질 발현을 할 수 있는 것을 포함하나 제한하지 않는다. 당업계에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 발현 벡터의 다양성은 상업적으로 이용할수 있거나 또는, 그렇지 않으면 항체를 발현하는 본 발명에서 사용을 찾을 수 있다.
발현 벡터는 통상적으로 조정(control) 또는 조절(regulatory) 서열로 작동가능하게 연결된 단백질, 선별마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 추가적 요소를 포함한다. 본 명세서에서 “작동가능하게 연결된(operably linked)”은 핵산이 다른 핵산 서열과 같이 기능적 상호관계로 위치되는 것을 의미한다. 용어 “조절 서열(regulatory sequence)”은 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer) 및 항체 사슬 유전자의 형질감염(transcription) 또는 형질전환(translation)을 조절하는 다른 발현 조절 요소(예를 들면, 폴리아데닐레이션 신호)를 포함하는 것을 의도한다. 상기 조절 서열은 예를 들면, Goeddel(Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))에서 설명된다. 일반적으로, 상기 발현 벡터는 항체를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 전사 및 번역 조절 핵산을 포함하고 단백질을 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포에 통상적으로 적절하다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열은 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 시작 및 멈춤 서열, 번역 시작 및 멈춤 서열, 및 인핸서 또는 증강자(activator) 서열을 포함할 수 있다. 당업계에 또한 알려져 있기 때문에, 발현 벡터는 발현 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주를 선별을 허용하기 위한 선별 유전자 또는 마커를 통상적으로 포함한다. 선별 유전자는 당업계에 잘 알려져 있고 사용되는 숙주 세포와 같이 다양할 것이다. 예를 들면, 통상적으로 선별마커 유전자는 G418, 하이그로마이신(hygromycin) 또는 메토트렉에이트(methotrexate)와 같은 약물에 대한 내성을 벡터가 도입된 숙주 세포에 수여한다. 바람직한 선별마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dihydrofolate reductase (DHFR)) 유전자 (메토트렉에이트 선별/증폭을 가지는 dhfr- 숙주 세포에서 사용을 위하여) 및 네오유전자(G418 선별을 위하여)를 포함한다.
본 명세서에서 클로닝 또는 벡터의 DNA를 나타내는 적합한 숙주 세포는 원핵생물(prokaryote), 효모, 또는 고등 진핵 세포(higher eukaryote cells). 상기 목적을 위한 적합한 원핵은 B . subtilis 및 B. licheniformis와 같은 Bacilli, P. aeruginosa, 및 Streptomyces와 같은 Pseudomonas뿐만 아니라 Escherichia와 같은 Enterobacteriaceae, 예를 들면, E. coli , Enterobacter , Klebsiella , Proteus , Salmonella, 예를 들면, Salmonella typhimurium , Serratia, 예를 들면, Serratia marcescans, 및 Shigella와 같은 그램-음성 또는 그램-양성생물체를 포함하는 eubacteria를 포함한다. 적합한 E. coli 클로닝 숙주는 E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), 및 E. coli W3110 (ATCC 27,325)를 포함한다. 원핵생물 이외에, 필라멘터스 균(filamentous fungi) 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 클로닝 또는 발현 숙주에 적합하다. Saccharomyces cerevisiae, 또는 일반 제빵사의 효모는 저등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 다른 속(genera), 종(species), 및 균주(strain)의 수는 Schizosaccharoriyces pombe; 예를 들면 Schizosaccharoriyces pombe; K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. WaItH (AJCC 56,500), K. drosopmarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, 또는 K. marxianusyarrowia (EP402226)을 포함하는 Kluyveromyces 숙주; Pichia pastoris (EP183070); Candida; Trichoderma reesia (EP244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces occidentalis와 같은 Schwanniomyces; 및 Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, 또는 A. nidulans 또는 A. niger와 같은 Aspergillus 숙주를 포함하는 필라멘터스 균(filamentous fungi)을 일반적으로 이용할 수 있고 사용한다.
본 발명의 항체의 발현에 대한 적합한 숙주 세포는 다수 세포 내 생물체로부터 유래된다. 무척추 동물(invertebrate) 세포의 실시예는 plaril 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 배큘로바이러스 균주(strains) 및 변이 및 예를 들면 Spodoptera frugiperda(caterpillar), Aedes augypti(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster(fruitfly) 및 Bombyx mori와 같은 숙주로부터 해당 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염에 대한 다양한 바이러스 균주는 공개적으로 이용할 수 있고, 예를 들면, 자가그래프 칼리포니카(californica) NPV 및 Bombyx mori NPV의 Bm-5 균주, 및 상기 바이러스는 Spodoptera frugiperda 세포의 형질감염에 특정적으로 사용될 수 있다. 면(cotton), 콘(corn), 감자(potato), 대두(soybean), 페튜니아(petunia), 토마토(tomato), 및 담배(tobacco)를 위한 식물 세포 배양이 숙주로서 활용화 될 수 있다.
본 발명의 재조합 항체를 나타내는 숙주세포는 Chinese Hamster Ovary (CHO cells) (Urlaub G & Chasin LA (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 77: 4216-4220에서 설명된 바와 같이 dhfr- CHO 세포를 포함하는, 예를 들면, Kaufman RJ & Sharp PA (1982) J. Mol. Biol, 159: 601-621에서 설명된 바와 같이 DHFR 선별마커와 같이 사용되는), NSO 골수종(myeloma) 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함하는 바람직하게는 포유류 숙주 세포이다. 특히, NSO 골수종(myeloma) 세포에 대하여, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462 (Wilson에), WO 89/01036 (Bebbington에) 및 EP338841 (Bebbington에)에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 재조합 항체 유전자가 포유류 숙주 세포로 도입되었을 때, 항체가 숙주 세포에서 항체의 발현 또는 더욱 바람직하게는, 숙주 세포가 자라는 배양배지로 항체의 배출을 허용하기에 충분한 시간의 기간 동안, 숙주 세포를 배양하여 생성된다. TL1A에 결합하는 생성 항체를 위해 유용한 숙주 세포는 배지의 다양성에서 배양될 수 있다. 예를 들면 Ham's F10 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland), 분imal Essential 배지 (MEM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Basel, Switzerland), 및 Dulbecco's Modified Eagle's 배지 ((DMEM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH)와 같은 상업적으로 이용할수 있는 배지는 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 항체는 표준 단백질정제 방법을 사용하여 배양배지로부터 회수될 수 있다.
항체는 발현되는 단백질,정제, 스크리닝, 디스플레이, 등의 표적할 수 있게 융합 파트너에 작동가능하게 연결될 수 있다. 융합 파트너는 링커 서열을 경유하여 항체 서열에 연결될 수 있다. 비록 긴 링커가 사용될 수 있지만, 링커 서열은 아미노산의 적은 구성원을 통상적으로 10개 미만 일반적으로 포함할 것이다. 통상적으로, 링커 서열은 분해하는데 유연하고 저항적인 것이 선택된다. 숙련자에 의해 평가되는 것과 같이, 임의의 넓은 다양성의 서열은 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 일반 링커서열은 아미노산 서열 GGGGS을 포함한다. 융합 파트너는 원하는 세포내 위치 또는 세포외 배지에 항체 및 임의로 연합된 융합 파트너와 직접적인 표적 또는 신호 서열일 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 특정 신호 서열은 성장 배지 또는 세포의 내부 및 외부 멤브린 사이에 위치된, 주변세포질 공간으로 배출되기 위해서 단백질을 표적할 수 있다. 또한 융합 파트너는 정제 및/또는 스크리닝할 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 서열일 수 있다. 상기 융합 파트너는 폴리히스티딘 태그(히스-태그(his-tags) (예를 들면 고정 금속(Immobilized Metal) 친화도 크로마토그래프 (IMAC) 시스템으로 사용을 위한 예를 들면 H6 및 H10 또는 다른 태그(예를 들면 Ni+2 친화도 컬럼)), GST 융합, MBP 융합, 스트렙-태그(Strep-tag), 박테리아 효소 BirA의 BSP 바이오틴일화(biotinylation) 표적 서열, 및 항체에 의해 표적화된 항원결정기(epitope) 태그(예를 들면 c-myc 태그, flag-태그, 등)을 포함하나, 제한하지 않는다. 당업계의 숙련자에게 감사하는 바와 같이, 상기 태그는 정제, 스크리닝, 또는 모두에 유용할 수 있다.
항체를 위한 구성(construction) 및 생성
TL1A 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체는 잘 알려져 있고 일상적 프로토콜을 사용하여 동물의 면역 예를 들면 동물, 바람직하게는 비-인간 동물에게 폴리펩타이드를 투여하여 얻을 수 있으머, 예를 들면 Handbook of Experimental Immunology (Weir DM (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986)을 참조하시오. 많은 온혈 동물, 예를 들면 래빗, 마우스, 래트, 양(sheep), 소(cows), 카멜(camels) 또는 돼지는 면역접종될 수 있다. 그러나, 마우스, 래빗, 돼지 및 래트 특히 마우스는 일반적으로 가장 적합하다. 항체는 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA 기술로 또한 생성될 수 있다. 추가적으로 항체는 자연적으로 발생하는 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 인간화 항체는 비-인간 동물(예를 들면, 마우스)로부터 VH 및/또는 VL 영역으로부터 하나 이상의 CDRs 또는 이의 일부를 인간 VH 및/또는 VL 영역으로부터 하나 이상의 프레임워크 영역에 운반하여 구성될 수 있다. 선택적으로, 따라서 VH 및/또는 VL 영역에 존재하는 인간 프레임워크 잔기는 항체의 면역원성(immunogenicity)을 감소 및/또는 결합 친화도를 유지하기 위하여 필요하거나 또는 원할 때 해당 비-인간 (예를 들면, 마우스) 잔기에 의해 교체될 수 있다. 선택적으로, CDRs에 존재하는 비-인간 아미노산 잔기는 인간 잔기로 교체될 수 있다. 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기에서 설명된 바와 같이 제조된 비-인간 단클론 항체의 서열에 기반하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA는 관심있는 비- 인간 하이브리도마로부터 얻을 수 있고 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-마우스 (예를 들면, 인간) 면역글로불린 서열을 조작될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 만들기 위하여, 마우스 가변영역은 당업계에 알려져 있는 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 Cabilly 외 다수를 참조하시오). 인간화 항체를 만들기 위하여, 마우스 CDR 영역은 당업계에 알려져 있는 방법을 사용하여 인간 프레임워크로 삽입될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,225,539호 Winter, 및 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; Queen 외 다수에 대한 제5,693,762호 및 제6,180,370호를 참조).
본 발명의 인간화 항체는 구성될 수 있고 상기 중쇄 가변영역에 대한 인간 수용체(acceptor) 분자는 마우스 항체의 잠재적 수용체(acceptor) 분자 가변영역과 중쇄 가변영역 사이의 상동(homology) 고려에 기반하여 선택된다. 생식세포계열(germline) 후보 인간 수용체(acceptor) 분자는 잠재적 면역원성(immunogenicity)을 감소하기 위하여 바람직하다. 생식세포계열(germline) 데이타베이스는 중쇄 FW3 영역의 말단을 통하여 부분적으로 CDR3 서열로 읽는 항체 서열로 구성된다. FW4 영역의 선별을 위하여, 선택된 생식세포계열(germline) 분자로부터 유래된 성숙 항체 서열의 데이타베이스는 조사될 수 있거나 또는 인간 기증자로부터 선택된 생식세포계열(germline) 분자로부터 유래된 항체 서열이 사용될 수 있다. 바람직하게는 인간 수용체(acceptor) 분자는 마우스 기증 분자로서, 및 마우스 기증 분자의 가변영역의 동일한 기본형 구성 분류(canonical structural class)의 동일한 중쇄 분류로부터 선택된다. 중쇄 가변영역에 대한 인간 수용체(acceptor) 분자의 선별을 위한 두번째 고려는 마우스 기증 분자와 인간 수용체(acceptor)분자 사이의 CDR 길이에서 상동(homology)을 피하는 것이다. 비록 다른 데이타베이스 예를 들면 카밧(Kabat) 및 공용 NCBI 데이타베이스는 또한 사용될 수 있지만, 바람직하게는 인간 수용체(acceptor) 항체 분자는 V-BASE 데이타베이스에 대하여 상동조사하여 선택된다.
본 발명의 인간화 항체는 구성될 수 있고 경쇄 가변영역에 대한 상기 인간 수용체(acceptor) 분자는 마우스 항체의 잠재적 수용체(acceptor)는 분자 가변영역과 경쇄 가변영역 사이의 상동 고려(homology considerations)에 기반하여 선택된다. 생식세포계열(germline) 후보 인간 수용체(acceptor) 분자는 잠재적 면역원성(immunogenicity)을 감소시키는데 바람직하다. 생식세포계열(germline) 데이타베이스는 CDR3 서열으로 중쇄 FW3 영역의 말단 및 부분을 통하여 읽는 항체 서열로 구성된다. FW4 영역의 선별을 위하여, 선택된 생식세포계열(germline) 분자로부터 유래된 성숙 항체 서열의 데이타베이스는 조사되거나 또는 인간 기증자로부터 선택되는 생식세포계열(germline) 분자로부터 유래된 항체 서열을 사용할 수 있다. 바람직하게는 인간 수용체(acceptor) 분자는 마우스 기증 분자로서 동일한 경쇄 분류, 및 마우스 기증 분자의 가변영역의 동일한 기본형 구성 분류(canonical structural class)로부터 선택된다. 경쇄 가변영역에 대한 인간 수용체(acceptor) 분자의 선별을 위한 두번째 고려는 마우스 기증 분자와 인간 수용체(acceptor) 분자사이의 CDR 길이에서 상동(homology)을 포함한다. 인간 수용체(acceptor) 항체 분자는 바람직하게는 V-BASE 데이타베이스에 대한 상동(homology) 조사되고, 및 다른 데이타베이스 예를 들면, 카밧(Kabat) 및 공중 NCBI 데이타베이스가 도한 사용될 수 있다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 하기의, 실시예 5를 포함하여, 본 명세서에서 설명된다.
본 발명은 핵산이 발현시키고 항체를 생성시키기 위해서 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 TL1A 또는 벡터에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 생성 방법을 제공한다. 숙주 세포, 핵산 및 벡터를 위하여, 상기에서 설명된 하나가 사용될 수 있다. 핵산의 발현은, 예를 들면 상기에서 추가적으로 요약되고 당업계에서 (예를 들면, Morrison S (1985) Science 229: 1202)에사 잘 알려진 만큼의 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체, 또는 항체 이의 단편을 발현하기 위해서, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNAs는 표준 분자 생물학 기술 (예를 들면, 관심있는 항체를 발현시키는 하이브리도마를 사용하여 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 얻을 수 있고 DNAs는 벡터 예를 들면 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 대조군 서열은 사용되는 숙주 세포 발현을 양립할 수 있도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 분리된 벡터로 삽입될 수 있거나 또는 더욱 통상적으로, 모두 유전자는 동일한 발현 벡터로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법에 의해 발현 벡터로 삽입된다(예를 들면, 만약 제한부위가 존재된다면 항체 유전자 단편 및 벡터, 또는 블런트 앤드 결찰(blunt end ligation)상의 상보적 제한부위의 결찰(ligation)). 본 명세서에서 설명된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역은 원하는 동형(isotype)의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 암호화하는 발현 벡터로 그들을 삽입하여 임의의 항체 동형(isotype)의 전장 항체 유전자를 만들기 위해 사용될 수 있고 VH 부분은 벡터 내에 CH1 부분에 작동가능하게 연결되고 VK 부분은 벡터 내에 CK 부분에 작동가능하게 연결된다.
항- TL1A 항체의 특성 및 정제
항체에 대한 스크리닝은 TL1A에 대한 결합을 측정하는 분석 및/또는 자체의 수용체 TNFRSF25에 대한 TL1A의 결합을 차단하는 능력을 측정하는 분석을 사용하여 수행될 수 있다. 결합 분석의 실시예는, 특히, 플레이트 상에 고정된, TL1A 및 인간 Fc의 융합 단백질을 사용하고, 융합 단백질에 결합된 항-TL1A 항체를 검출하기 위하여 결합된 2차 항체를 사용하여 ELISA이다. 차단 분석의 실시예는 인간 CD4 세포 상의 TNFRSF25에 결합하는 TL1A 융합 단백질의 차단을 측정하는 유동 세포(flow cytometry) 기반한 분석이다. 형광적으로 표지된 2차 항체는 세포에 결합하는 TL1A 융합 단백질의 양을 검출하기 위하여 사용된다. 상기 분석은 상등액의 항체가TNFRSF25에 대해 리간드 융합 단백질의 결합을 차단하는 것처럼 신호에서 감소를 찾는다. 차단 분석의 추가 실시예는 플레이트에 코팅된 TL1A 융합 단백질에 의해 매개된 순수 인간 T 세포의 공동자극의 차단을 티미딘 포함(thymidine incorporation)을 측정하여 측정한 분석이다. 항-TL1A 항체의 기능적 활성 예를 들면 실시예 3 및 6에 설명된 바와 같이 CD4 T 림프구에 의한 사이토카인 배출의 감소를 평가하는 분석이 시용될 수 있다.
본 발명의 항체는 당업자에게 알려진 다양한 방식으로 분리되거나 또는 정제될 수 있다. 표준정제 방법은 이온교환(ion exchange), 소수성(hydrophobic) 상호작용, 친화도, 크기(sizing) 또는 젤 여과(gel filtration)을 포함하는 크로마토그래프 기술, 및 시스템 예를 들면 FPLC 및 HPLC를 사용하여 기압(atmospheric pressure) 또는 고압(high pressure)에서 수행되는 역상(reversed-phase)을 포함한다. 또한 정제 방법은 전기영동(electrophoretic), 면역(immunological), 침전(precipitation), 투석(dialysis), 및 크로마토포커싱(chromatofocusing) 기술을 포함한다. 단백질 농도와 함께 초미세여과법(Ultrafiltration) 및 여과작용(diafiltration) 기술은 또한 유용하다. TL1A 항체를 정제하기 위하여, 선택된 숙주 세포는 단클론 항체 정제를 위하여 예를 들면 회전-플라스크에서 자라게 할 수 있다. 상등액은 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, NJ)로 친화도 크로마토그래프하기 전에 여과하고 농축될 수 있다. 용축된 항체는 순수도를 확실히 하기 위하여 젤 전기영동 및 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography)에 의해 체크될 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체는 TL1A에 결합하는 분리된 및/또는 정제된 항체이다.
면역접합체( Immunoconjugates )
다른 측면에서, 본 발명은 세포독소, 약물(예를 들면, 면역억제제(immunosuppressant)) 또는 방사선독소와 같은 치료제에 연결된, TL1A에 결합하는 TL1A 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 상기 접합체는 본 명세서에서 "면역접합체"로서 언급된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소(immunotoxins)."로서 언급된다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운(예를 들면, 죽이는)임의의 제제를 포함한다. 실시예는 탁솔(taxol), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그래미시딘 D(gramicidin D), 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide),
테노포사이드(tenoposide), 빈크리시딘(vincristine), 빈블라시티딘(vinblastine), 콜치신(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디원(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 액티노마이신 D(actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라신(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀올(propranolol), 및 퓨로마이신(puromycin) 및 이의 유사체 또는 상동(homologs)을 포함한다. 또한 치료제는 예를 들면, 항대사성물질(antimetabolites) (예를 들면, 메토트렉에이트(methotrexate), 6-머캅토퓨린(6- mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 사이타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 데카르바진(5-fluorouracil decarbazine)), 알킬레이팅제(alkylating agents) (예를 들면, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine (BSNU)) 및 로무스틴(lomustine(CCNU)), 사이클로토스파미드(cyclothosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모마니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신 C(mitomycin C), 및 시스-디클로로디아민 플라티늄 (II) (DDP) 시스플라틴(cis-dichlorodiamine platinum (II) (DDP) cisplatin), 안트라사이클린(anthracyclines)(예를 들면, 다우노루비신(daunorubicin) (이전에 다우노마이신(daunomycin) 및 독소루비신(doxorubicin))), 항생제 (예를 들면, 닥티오마이신(dactinomycin) (이전에 악티노마이신(actinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin), 및 안트라마이신(anthramycin (AMC))), 및 항-미토틱제(anti-mitotic agents) (예를 들면, 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine))을 포함한다. 본 발명의 항체에 연결될 수 있는 치료 세포독소으이 다른 실시예는 듀오카르마이신(duocarmycins), 칼리케미신(calicheamicins), 메이탄신(maytansines) 및 아우리스타틴(auristatins), 및 이의 유도체(derivatives)를 포함한다. 칼리케미신 항체 접합체(conjugate)의 실시예는 상업적으로 이용할수 있다(Mylotarg(R); American Home Products). 세포독소는 당업계에서 이용할수 있는 링커기술을 사용하여 본 발명의 항체에 연결될 수 있다. 항체에 세포독소를 접합하기 위해 사용되는 링커 유형의 실시예는 하이드라존(hydrazones), 티오에테르(thioethers), 에스테르(esters), 디설피드(disulfides) 및 펩타이드-포함하는 링커를 포함하나, 제한하지 않는다. 링커는 리소좀 구획(lysosomal compartment)내의 낮은 pH에 의해 절단되기 쉽거나 또는 프로테아제, 예를 들면 카테프신(cathepsins)(예를 들면, 카테프신 B, C, D)과 같은 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제에 의해 절단되기 쉬운것으로 선택될 수 있다. 항체에 대한 치료제를 접합하기 위한 세포독소의 유형, 링커 및 방법의 추가 논의에 대하여, Saito G 외 다수, (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail PA 외 다수, (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne G (2003) Cancer 세포, 3: 207-212; Allen TM (2002) Nat. Rev. Cancer, 2: 750-763; Pastan I & Kreitman RJ (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs, 3: 1089-1091; Senter PD & Springer CJ, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264를 참조하시오. 또한 본 발명의 항체는 방사선면역접합체(radioimmunoconjugates)로서 언급된, 세포독성 방사성 의약품(radiopharmaceuticals)을 생성하기 위하여 방사선활성 동위원소에 연결될 수 있다. 진단적으로 또는 치료적으로 사용을 위해 항체에 접헙될 수 있는 방사선활성 동위원소의 실시예는 아이오딘131(iodine131), 인디움111(indium111), 이티리움90(yttrium90) 및 루테티움177(lutetium177)을 포함하나, 제한하지 않는다. 방사선-면역접합체를 제조하는 방법은 당업계에서 구축된다. 방사선면역접합체의 실시예는 Zevalin® (EDEC Pharmaceuticals) 및 Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals)을 포함하여, 상업적으로 이용할수 있고, 유사한 방법은 본 발명의 항체를 사용하여 방사선면역접합체를 제조하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 면역접합체는 주어진 생물학적 반응을 수정하기 위해 사용될 수 있고, 약물 일부분(drug moiety)은 전통적 화학적 치료제에 제한하는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들면, 약물 일부분(drug moiety)은 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, 효소적 활성 독소, 또는 이의 활성 단편, 예를 들면 아브린(abrin), 리신 A(ricin A), 슈도노마스(pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아 독소(diphtheria toxin); 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 또는 인터페론-γ(interferon-γ)과 같은 단백질; 또는 림포카인(lymphokines), 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-6 (IL-6), 과립성 백혈구 매크로파지 결장 촉진인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF)), 과립성 결장 촉진인자(G-CSF), 또는 다른 성장 인자와 같은 생물학적 반응 조절물질을 포함할 수 있다.
항체에 대한 상기 치료제 연결을 위한 기술은 잘 알려져 있다, 예를 들면, Arnon 외 다수, 단클론 항체 및 암 치료, Reisfeld 외 다수, (eds.), pp. 243- 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)에 있는 “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”; Hellstrom 외 다수, Controlled Drug Delivery (2nd Ed.)에 있는 “Antibodies For Drug Delivery”, Robinson 외 다수, (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Monoclonal Antibodies '84: 생물학적 및 Clinical Applications, Pinchera 외 다수, (eds.), pp. 475-506 (1985)에 있는 Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”; Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin 외 다수 (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe PE & Ross WC (1982) Immunol. Rev. 62: 119-58에 있는 “AAnalysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy”를 참조하시오.
다른 측면에서, 본 발명은 세포독소, 약물(예를 들면, 면역억제제( immunosuppressant)) 또는 방사선독소와 같은, 치료제와 같이 투여되는, TL1A에 결합하는 TL1A 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 조성물, 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 제공한다. 상기 조성물은 하나 또는 조합(예를 들면, 2개 이상의 상이한)의 항체, 및/또는 본 발명의 면역접합체 및/또는 상기에서 언급된 바와 같이 세포독소, 약물(예를 들면, 면역억제제) 또는 방사선독소와 같은 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 표적 항원 상에 상이한 항원결정기에 결합하거나 또는 상보적 활성을 가지는 항체(또는 면역접합체)의 조합을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 치료와 결합하여, 예를 들면, 다른 제제와 결합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 조합 치료는 적어도 하나의 다른 항-염증 또는 면역억제제와 조합된 본 발명의 TL1A 항체를포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “약학적으로 허용가능한 담체”는 생리학적으로 호환되는 임의의 및 모든 용매, 분산 배지, 코팅, 항박테리아 및 항균제, 등장(isotonic) 및 흡수지연제, 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체(carrier)는 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 피하의(subcutaneous), 비경구(parenteral), 척추(spinal) 또는 표피 투여 (예를 들면, 주사(injection) 또는 주입(infusion)에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 예를 들면, 항체 또는 면역접합은 화합물을 비활성화시킬수 있는 산(acids) 및 다른 자연(natural) 조건으로부터 화합물을 보호할 수 있는 물질로 코팅될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 살균 주사가능한 용액 또는 분산의 즉석 제조를 위한 살균 수용성 용액 또는 분산 및 살균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성 물질을 위한 상기 배지 및 제제의 사용은 당업계에 알려져 있다. 임의의 관습적 배지 또는 제제로서에 있어서를 제외하고, 본 발명의 약학적 조성물에서 이의 사용은 고려된다. 또한 보충 활성 화합물을 조성물로 혼합될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료제 및 약학적으로 허용가능한 담체에 연결된 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 사용될 수 있는 면역접합체 및 치료제는 이전에 설명된 바와 같다.
다른 측면에서, 본 발명은 다른 약학적으로 활성제(ctive agent)를 추가적으로 포함하는 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는 다른 약학적 활성제는 하나 이상의: a) TL1A에 대한 다른 길항제, b) 항-염증제, c) 면역 억제제 예를 들면, TNFα 길항제, 코르티손(cortisone) 또는 스테로이드(steroids) 등) 및/또는 d) 항-알레르기제이다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 항산화제의 실시예를 하기를 포함한다: (1) 물 수용 항산화제, 예를 들면 아스코르브산(ascorbic acid), 시스테인 하이드로클로라이드(cysteine hydrocloride), 소듐 비설페이트(sodium bisulfate), 소듐 메타비설페이트(sodium metabisulfite), 소듐 설피트(sodium sulfite) 등; (2) 오일- 수용 항산화제, 예를 들면 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 부틸화된 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole (BHA)), 부틸화된 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene(BHT)), 렉틴(lecithin), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 알파-토코페롤(alpha-tocopherol), 등; 및 (3) 시트산(citric acid), 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic-acid (EDTA)), 소르비톨(sorbitol), 타르타르산(tartaric acid), 인산(phosphoric acid), 등과 같은 금속 킬레이트제(metal chelating agents)을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물로 수행될 수 있는 적합한 수용성 및 비수용성담체의 실시예는 물, 에탄올, 폴리올스(polyols) (예를 들면 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 등), 및 이의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 야채 오일, 및 에틸 올레이트(ethyl oleate)과 같은 주사가능한 유기 에스테르(injec표 organic esters)을 포함한다. 적절한 유동질(fluidity)은 렉틴과 같은 코팅 물질로, 분산인 경우에 요구되는 입자 크기의 유지로, 및 계면활성제(surfactants)의 사용으로 유지될 수 있다. 상기 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 에멀젼제 및 분산제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 보존은 이전의 멸균 절차 및 파라벤(paraben), 클로로부탄올(chlorobutanol), 페놀 소르브산(phenol sorbic acid), 등과 같은 다양한 항박테리아 및 항균제의 포함에 의해 모두 지속될 수 있다. 또한 슈가(sugar), 소듐 클로라이드, 등과 같은 등장제(isotonic agent)를 조성물로 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 추가적으로, 주사가능한 약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate)및 젤라틴과 같은 흡수를 지연하는 제제의 포함에 의해 초래될 수 있다.
치료 및 다른 용도
본 발명의 항체는 다수의 시험관내 및 생체 내 진단 및 TL1A 매개된 장애의 진단 및 치료를 포함하는 치료 지원프로그램을 가진다. 예를 들면, 상기 분자는 TL1A-매개된 장애의 다양성을 치료, 방지 및 진단하기 위해서, 배양에 있는 세포, 시험관 내 또는 생체 외, 또는 인간 개체, 예를 들면, 생체 내에 투여될 수 있다. 바람직한 개체는 인간이고 TL1A 활성(TL1A 매개된 장애)에 의해 매개된 장애를 가지는 환자를 포함한다. 본 발명의 중화(neutralizing) 항체는 그들의 TL1A 공동자극자(costimulatory) 상태에 비의존적 환자를 치료하는데 효과적일 수 있다. 더욱 바람직하게는 개체는 인간이고 TL1A의 높은 수준을 나타내는 환자를 포함한다.
본 발명의 목적을 위한 “환자”는 인간 및 다른 동물 모두, 바람직하게는 포유류 및 가장 바람직하게는 인간을 포함한다. 따라서 본 발명의 항체는 인간 치료 및 가축 적용(veterinary applications)을 가진다. 본 발명의 용어 “치료(treatment)” 또는 “치료(treating)”는 질병 또는 장애를 위한 예방(prophylactic), 또는 억제 측정뿐만 아니라, 치료(therapeutic treatment)를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들면, 질병 개시 전에 항체의 성공적 투여는 질병치료를 초래한다. 다른 실시예와 같이, 질병 증상을 싸우기 위한 질병의 임상적 명시(manifestation) 후에 항체의 성공적 투여는 질병의 치료를 포함한다. “치료(treatment)” 또는 “치료(treating)”는 질병을 근절하기 위하여 질병 출현 후에 항체 투여를 포함한다. 개시 후 및 임상 증상 후에 항체의 성공적 투여는 질병 치료를 포함하는, 임상 증상의 가능한 감퇴 및 아마도 질병의 완화로, 발달되었다. 상기 “치료의 필요(in need of treatment)”는 질병 또는 장애가 차단되는 것을 포함하는, 질병 또는 장애를 가지기 쉬운 것뿐만 아니라, 질병 또는 장애를 이미 가지는 포유류를 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체는 다양한 TL1A-매개된 장애를 치료, 차단 또는 진단하기 위하여 생체 내에서 사용된다. 따라서 본 발명은 항체 또는 이의 단편의 효과적 양을 치료적으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 TL1A 매개된 장애를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 전형적 TL1A 매개된 장애는 염증 질병 및/또는 자가면역 질병, 예를 들면, 궤양성대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn’s disease)을 포함하는 염증성 창자병(inflammatory bowel disease) (IBD), 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), MS, 제1형 및 제2형 당뇨병, 건선(psoriasis), 건선 관절염(psoriatic arthritis), 강직척추염(ankylosing spondylitis), 아토피피부염(atopic dermatitis); 예를 들면, 천식(asthma) 및 알레르기 폐 염증을 포함하는 알레르기 반응 또는 증상; 암, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 감염, 신경퇴행병(neurodegenerative disease), 이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD) 및 심혈관(cardiovascular) 장애/ 질병을 포함하나 제한하지 않는다. 본 발명은 항체 또는 이의 단편의 효과적 양을 치료적으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 TL1A 매개된 장애를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 전형적 TL1A 매개된 장애는 염증 질병 및/또는 자가면역 질병, 예를 들면, 궤양성대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn’s disease)을 포함하는 염증성 창자병(염증 bowel disease) (IBD), 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), MS, 제1형 및 제2형 당뇨병, 건선(psoriasis), 건선 관절염(psoriatic arthritis), 강직척추염(ankylosing spondylitis), 아토피피부염(atopic dermatitis); 예를 들면, 천식(asthma) 및 알레르기 폐 염증을 포함하는 알레르기 반응 또는 증상; 암, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 감염, 신경퇴행병(neurodegenerative disease), 이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD) 및 심혈관(cardiovascular) 장애/질병, 만성폐쇄폐병(chronic obstructive pulmonary disease) COPD, 시신경염(optic neuritis), 노년기황반변성(age related macular degeneration), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus) (SLE), 스조젠 증후군(sjogen’s syndrome), 경피증(scleroderma), 전신피부경화증(systemic sclerosis), 만성신장 질병, 간경변(liver fibrosis), 결핵(tuberculosis), 특발성폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 결핵(tuberculosis) 유도된 폐 섬유증, 후복막섬유증식증(retroperitoneal Fibrosis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis) , 낭성섬유증(cystic fibrosis), 심내막심장근육섬유화(endomyocardial fibrosis), 심방 섬유증(atrial fibrosis), 종격섬유증(mediastinal fibrosis), 골섬유증(myelofibrosis) (bone marrow), 후복막섬유증식증(retroperitoneal Fibrosis), 진행성 거대섬유화증(progressive massive fibrosis), 페프로제닉 시스테믹 섬유증(pheprogenic systemic fibrosis), 관절섬유증(arthrofibrosis)을 포함하나 제한하지 않는다. 바람직하게는, TL1A 매개된 장애는 그중에서도 염증성창자병(Inflammatory Bowel Disease)(예를 들면, 궤양성대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn’s disease)), 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), MS 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 포함하는, 염증 질병 및/또는 자가 면역 질병을 포함한다.
본 발명의 항체로 치료되는 바람직한 TL1A 매개된 장애는 염증성 창자병(염증 bowel disease), 다발성경화증(multiple sclerosis), 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis) 및 천식(asthma)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 항체로 치료되는 특정적으로 바람직한 TL1A 매개된 장애는 염증성 창자병(inflammatory bowel disease).
TL1A-매개된 장애에서 항-TL1A 항체의 기능적 활성을 평가하는 동물 모델은 천식(asthma)에 대해 실시예 7에서 설명되고 IBD에 대해서 실시예 8 및 9에서 설명된다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 항체는 TL1A의 수준, 또는 멤브린 표면 상에 TL1A를 포함하는 세포의 수준을 검출하는데 사용할 수 있고, 상기 수준은 특정 질병 증상에 연결될 수 있다. 대안적으로, 항체는 TL1A 기능을 억제 또는 차단하기 위해 사용될 수 있고, 결국, 특정 질병 증상의 차단 또는 완화에 연결될 수 있어서, 질병의 매개체로서 TL1A을 관련시킨다. 상기는 항체와 TL1A 사이의 복합체의 형성을 위하여 허가하는 조건하에서 TL1A 항체로 샘플을 접촉하는 것(contacting a sample) 및 대조군 샘플에 의해 얻을 수 있다. 항체와 TL1A 사이에 형성된 임의의 복합체는 검출되고 샘플 및 대조군에서 비교된다. TL1A에 대한 본 발명의 항체의 특정 결합을 고려하여, 본 발명의 항체는 세포의 표면 상에 TL1A 발현을 특정적으로 검출하는데, 예를 들면 TL1A의 낮거나 또는 높은 발현 수준을 가지는 환자를 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 면역친화도정제를 경유하여 TL1A을 정제하는데 또한 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 시험관 내 치료 또는 진단 사용과 관련된 결합 활성에 대해 초기에 테스트될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물 은 유동세포 분석(flow cytometric assays)을 사용하여 테스트될 수 있다.
본 개시는 의약으로서 항체 또는 이의 단편의 사용 및 TL1A 매개된 장애의 치료를 위한 의약 제조에서 항체 또는 이의 단편의 사용을 추가적으로 제공한다. 추가 실시형태에서 본 개시는 의약으로서 사용을 위한 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 또한 TL1A 매개된 장애를 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 항체 또는 이의 단편은 본 개시에 의해 제공된다. TL1A 매개된 장애는 이전에 설명된 바와 같이 하나이다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 환자의 DR3 공동자극자(costimulatory) 상태의 비의존적으로 TL1A 매개된 장애 치료를 위하여 특정적으로 유용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 TL1A 매개된 장애를 치료하는데 사용될 수 있고 상기 환자는 높은 수준의 TL1A을 나타낸다.
이전에 설명된 바와 같이, 본 발명의 항-TL1A 항체는 하나 또는 다른 치료제, 예를 들면, 세포독성제, 방사선독소제 또는 면역억제제로 공동-투여될 수 있다. 항체는 제제에 연결될 수 있고(이전에 설명된 것과 같이 면역접합체로서) 또는 제제로부터 분리 투여될 수 있다. 후지인 경우(분리 투여)에, 항체는 제제와 같이 전, 후 또는 동시에 투여될 수 있거나 또는 알려진 치료 예를 들면, 항-암 치료, 예를 들면, 방사성으로 공동-투여될 수 있다.
항체의 투여를 위하여, 용량은 숙주 체중의, 약 0.0001부터 100 mg/kg까지, 및 더욱 항상 0.01 내지 10 mg/kg로부터 용량 범위이다. 전형적 치료 구역은 주 당 한번, 매 2주 당 한번, 매 3주 당 한번, 매 4주 당 한번, 1달에 한번, 매 3개월 당 한번, 또는 매 3개월 내지 6개월 당 한번 투여를 수반한다. 항체는 다수의 경우에 항상 투여된다. 단일 용량 사이의 간격은, 예를 들면, 주(weekly), 개월(monthly), 매 3개월씩 또는 년으로(yearly) 일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정하여 지적되는 것처럼 불규칙할 수 있다. 일부 방법에서, 용량은 약 1-1000 ㎍/ml 및 일부 방법에서 약 25-300 ㎍/ml의 플라즈마 항체 농도를 얻을 수 있도록 조정된다. 대안적으로 항체는 지연되는 배출 제제로서 투여될 수 있고, 상기 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 용량 및 빈번도는 환자에서 항체의 반감기에 의존하여 다양하다. 상기 투여의 용량 및 빈번도는 치료가 예방 또는 치료인가에 의존하여 다양할 수 있다. 예방 적용에서, 상대적으로 낮은 용량은 시간의 길이 기간 상에 상대적으로 빈번한 간격에서 투여된다. 일부 환자는 그들의 생명의 나머지를 치료받는 것을 지속한다. 치료 적용에서, 상대적 짧은 간격에서 상대적 고용량은 질병의 진행이 감소되거나 끝날때까지 때때로 요구된다.
활성 성분의 실제 용량 수준, 예를 들면 본 발명의 약학적 조성물에서 항체는 환자에게 독성없이, 특정 환자, 조성물, 및 투여 모드를 위하여 원하는 치료 반응을 효과적으로 얻는 활성 성분의 양을 얻기 위해서 다양할 수 있다. 선택되는 용량 수준은 수용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 수용되는 특정 항체의 배출 비율, 치료 기간, 다른 약물, 수용되는 특정 조성물과 결합하여 사용되는 화합물 및/또는 물질, 연령, 성별, 체중, 증상, 일반건강 및 치료되고자 하는 환자의 이전의 의약 히스토리 및 의약계에 잘 알려진 요인을 포함하는 다양한 약물 동력(pharmacokinetic) 인자에 의존할 것이다.
바람직하게는 본 발명의 TL1A 항체의 “치료적으로 효과적 양”은 질병 증상의 심각도의 감소, 질병 증상이 없는 시기의 비번도 및 기간의 증가, 및/또는 질병 고통에 기인한 손상(impairment) 또는 장애(disability)의 증가를 초래한다. TL1A 매개된 장애의 치료를 위한 화합물의 능력은 인간에서 동물 모델 시스템 예상되는 효험에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 상기 소유물은 세포 성장을 억제하기 위한 화합물의 능력을 시험하여 평가될 수 있고, 상기 억제는 숙련자에게 알려져 있는 분석에 의해 시험관 내 측정될 수 있다. 하나의 당업계의 보통 기술은 개체의 크기, 개체의 증상의 심각도, 및 선택되는 투여의 특정 조성물 또는 경로와 같은 상기 요인에 기반된 상기 양을 결정할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 조성물은 당업계에서 알려져 있는 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 경유하여 투여될 수 있다. 숙련자에 의해 평가되는 비와 같이, 투여의 경로 및/또는 모드는 원하는 결과에 의존하여 다양할 것이다. 투여의 바람직한 경로는 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 진피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 피하(subcutaneous), 예를 들면 주사(injection) 또는 주입(infusion)에 의한, 척추(spinal) 또는 투여의 다른 비경구(parenteral)) 경로를 포함한다. 투여의 더욱 바람직한 경로는 정맥내(intravenous) 또는 피하(subcutaneous)이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 문구 "비경구(parenteral) 투여" 는 항상 주사(injection)에의한, 중심(centeral) 및 국소투여 보다 다른 투여의 모드를 의미하고, 제한없이, 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 동맥내(intraarterial), 경막내(ntrathecal), 관절낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내(intracardiac), 진피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 경기관(transtracheal), 피하의(subcutaneous), 피하(subcuticular), 관절내(intraarticular), 피막하(subcapsular), 거미막밑(subarachnoid), 척추내(spinal), 경막외 및 흉골 주사(intrasternal injection) 및 주입(infusion)을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 국소, 표피 또는 투여의 점막 경로와 같은 비- 비경구 경로, 예를 들면, 비강내의, 경구, 질의(vaginally), 직장의(rectally), 혀아래(sublingually) 또는 국소적을 경유하여 투여될 수 있다.
제작 및 키트의 물품
본 개시의 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편을 포함하는 제작 물품, TL1A 매개된 장애의 치료를 위한 본 발명의 조성물 또는 면역접합체를 제공한다. 제작 물품은 용기 및 용기(container)와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알(vials) 또는 시린지(syringes)를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 증상을 치료하는데 효과적일 수 있는 조성물을 지탱하고 살균 접근 포트(port)(예를 들면, 용기는 피하 주사바늘에 의해 마개 찌르기(stopper pierceable)를 가지는 정맥내(intravenous) 용액 백 또는 바이알일 수 있다. 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 명세서에서 설명된 항체일 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입은 조성물은 암과 같은, 선택 증상을 치료하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 라벨 또는 패키지 삽입은 항체를 포함하는 조성물은 TL1A -매개된 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
추가적으로, 제작 물품은 (a) 거기에 포함된 조성물을 가지는 첫번째 용기, 상기 조성물은 본 명세서에서 항체를 포함한다, 및 (b) 거기에 포함된 조성물을 가지는 두번째 용기, 상기 조성물은 항체보다 다른 치료제를 포함을 포함할 수 있다. 본 개시의 상기 실시형태에서 제작 물품은 패키지 삽입을 추가적으로 포함할 수 있고 첫번째 및 두번째 조성물은 TL1A 매개된 질병 또는 장애를 치료하는데 결합하여 사용될 수 있다. 상기 치료제는 선행하는 섹션(예를 들면, 혈전용해제(thrombolytic agent), 항-혈소판제(anti-platelet agent), 화학치료제, 항-혈관신생제, 항-호르몬 화합물, 심장보호제(cardioprotectant), 및/또는 사이토카인을 포함하는, 포유류의 면역 기능 조절자)에서 설명되는 임의의 부가치료(adjunct therapies)일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제작 물품은 정균 물 for 주사(injection) (BWFI), 인산염완충식염수, 링거 용액 및 덱스트로오스 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 버퍼를 포함하는 두번째 (또는 세번째) 용기를 추가적으로 포함할 수 있다. 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 시린지(syringes)를 포함하는, 상업적 및 사용자의 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 항체, 조성물 또는 면역접합체 및 사용을 위한 지침을 를 포함하는 키트는 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 예를 들면 면역억제 시약, 세포독성제 또는 방사선독성제와 같은 하나 이상의 추가 시약, 또는 본 발명의 하나 이상의 추가 항체(예를 들면, 첫번째 항체로부터 떨어진 TL1A 항원의 항원결정기(epitope)에 결합하는 상호 보완적인 활성을 가지는 항체)를 추가적으로 포함할 수 있다.
추가 설명없이, 당업계에서 보통 기술의 하나는, 선행하는 설명 및 하기의 설명하는 실시예를 사용하여, 본 개시의 제제 및 청구된 방법의 실행을 만들고 활용할 수 있다. 하기의 작용 실시예는 본 개시의 실행을 제공하고, 본 개시의 나머지를 임의의 방식으로 제한하는 것으로서 해석해서는 안된다.
실시예
실시예 1:
마우스 항-인간 TL1A 항체의 생성 및 스크리닝
재조합 인간 TL1A-Fc 단백질을 생성하기 위하여, 인간 TL1A 유전자에 대한 cDNA를 Source BioScience (Nottingham, UK; clone number: IRATp970G02115D)로부터 구입하였다. 상기 cDNA는 PCR을 사용하여 인간 TL1A(서열번호: 116)의 진행된 배출된 버젼의 코딩 영역을 증폭하기 위해 템플레이트로서 사용되었다. 상기 PCR은 프라이머 GlnPr994 및 GlnPr995 (각각 서열번호: 119 및 120)을 사용하여 수행되었다. 프라이머 GlnPr994는 세포외 영역의 BamHI 제한부위(restriction site) 5’를 첨가하고 선천적 신호 펩타이드를 절단하였다. 프라이머 GlnPr995는 세포외 영역의 HindIII 제한부위(restriction site) 3’를 첨가하였다. 엠플리콘을 플랭킹 제한부위(flanking restriction site) BamHI 및 HindIII를 사용하여 절단하였고 Fc-융합 구성체(construct)를 나타내는, Invitrogen (Invitrogen AG, Basel, Switzerland)으로부터 pcDNA3.1(-) 플라스미드르 기반하는 수정된 포유류 발현 벡터로 클론되었다. 발현 벡터는 미국특허 제5,924,939호, the OriP sequence (Koons MD 외 다수, (2001) J Virol. 75(22): 10582-92)에 설명된 Ig 기증 수용체(acceptor) 단편 (first intron)을 가지는 인간 CMV 프로모터, SV40 인핸서(enhancer), 및 Kim D, 외 다수, (2003) Biotechnol. Prog. 19(5): 1620-2에 설명된 바와 같이 가스트린 터미네이터(gastrin terminator)에 융합된 SV40 polyA를 포함한다. 발현 카세트는 Fc 융합 단백질의 해독틀(open reading frame)의 코작(kozak) 영역 상류(upstream)에 이어서 편리한 클로닝을 위하여 BamHI 제한부위(restriction site)에 의해 종료되는, 신호 펩타이드를 포함한다. 편리한 클로닝을 위하여 융합 단백질의 Fc 영역은 HindIII 제한부위(restriction site), 이어서 작은 글라이신-세린 링커에 의해 시작된다. Fc 영역의 이전의 구성체(construct) 상류(upstream)를 배출하기 위하여, 벡터를 BamHI (NEB, Ipswich, MA, USA) 및 HindIII (NEB, Ipswich, MA, USA)을 사용하여 절단하였고, CIP (NEB, Ipswich, MA, USA) 및 정제된 젤을 사용하여 처리하였다. 인간 TL1A의 세포외 영역의 삽입 코딩은 백본에서 결찰되고 Fc 융합 발현 구성체(construct) (서열번호: 117)로 이끄는 E.coli Top 10 세포 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)에서 형질전환된다. 서열번호: 117의 첫번째 20개의 아미노산은 신호 서열에 해당하고, 이는 최종 Fc 융합 발현 구성체(construct)에 존재하지 않는다.
상기 재조합 플라스미드는 신호 펩타이드에 의해 이끌려 세포 배양배지로 배출을 가지는 포유류 세포의 인간 TL1A-Fc 융합 단백질의 발현을 허가한다. 재조합 단백질 생성을 위하여, 앞서 말한 재조합 벡터는 jetPEITM 형질감염 시약 (Polyplus-transfection S.A., Strasbourg, France; Distributor: Brunschwig, Basel, Switzerland)을 사용하여 현탁-적응된 HEK 293 EBNA 세포 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)로 형질감염된다. 세포 배양 상등액은 5일 후에 수득되고 AKTA FPLC 시스템 (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)에 작동되는 단백질 A 친화도 정제 컬럼 (HiTrap 단백질 A sepharose column; GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)을 사용하여 추가 로 정제된다.
히스-태그(his-tag)를 가지는 배출된 재조합 인간 TL1A 단백질을 생성하기 위하여, 배출된 인간 TL1A의 진행된 버젼을 위한 DNA 서열 코딩은 N-말단 6xHis 링커를 첨가하는 프라이머 GlnPr1542 및 GlnPr1543 (각각, 서열번호: 121 및 122)을 사용하여 PCR에 의해 증폭된다. 프라이머 GlnPr1544 (서열번호: 123) 및 GlnPR1543을 사용하여 PCR의 두번째 라운드는 클로닝 (5’: NheI; 3’: XhoI)을 위하여 신호 펩타이드 및 편리한 플랭킹 제한부위(flanking restriction sites)를ㄹ 첨가한다. PCR 생성물은 NheI 및 XhoI (NEB, Ipswich, MA, USA)을 사용하여 절단하고 및 이어서 동일한 효소 및 CIPed를 사용하여 절단된, 상기에서 설명된 수정된 pcDNA3.1(-) 플라스미드에서 클론된다. 상기 제한 분해는 발현 벡터에 존재하는 이전의 전체 Fc-융합 단백질의 해독틀(open reading frame)을 배출한다. Top 10 E. coli 세포에서 결찰(ligation) 및 형질전환 후에, 최종 플라스미드는 N-말단 히스-태그(his-tag) (서열번호: 118)를 가지는 배출된 TL1A를 위하여 발현 구성체(construct)의 제한분해 및 시퀀싱에 기반하여 선택된다. 서열번호: 118의 첫번째 20개 아미노산은 최종 N-말단 히스-태그(his-tag) 발현 구성체에 존재하지 않는, 신호 서열에 해당한다.
상기 재조합 플라스미드는 배출을 가지는 포유류 세포의 인간 TL1A-his 단백질의 발현을 세포 배양 배지로 허용한다. 단백질 생성을 위하여, 재조합 벡터는 jetPEITM 형질감염 시약(Polyplus-형질감염 S.A., Strasbourg, France; Distributor: Brunschwig, Basel, Switzerland)을 사용하여 현탁-적응된 HEK 293 EBNA 세포 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)로 형질감염된다. 세포 배양 상등액은 AKTA FPLC 시스템(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)에 작동되는 Ni2+-NTA 친화도 정제 컬럼 (HiTrap Ni2+-NTA sepharose column; GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)을 사용하여 형질감염 및 정제힌 후 5일에 수득한다. 재조합 인간 TL1A-Fc 및 TL1A-his 단백질의 버퍼는 인산염완충식염수 (PBS)로 바꾼다. PBS에 용해된 재조합 인간 TL1A-Fc 단백질은 동등한 부피의 Stimune 보조제 (Prionics, Switzerland)와 혼합되고 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼을 0.5 mL 인슐린 시린지(syringes) (BD Pharmingen, Allschwil, Switzerland)로 옮기고 BALB/c 동물 (Harlan, Netherlands)을 에멀젼화된 단백질의 50 ㎍으로 꼬리 및 목의 맨 아래부분, 백 풋패드(back footpads)에서 피하(sub-cutaneously) 면역접종하였다. 면역접종은 동일한 양의 항원 및 동일한 경로의 주사로 2주 후에 재반복하였다.
면역접종된 마우스 혈청에서 순환하는 항-인간 TL1A 항체의 존재는 재조합 인간 TL1A-his 단백질을 가지는 코팅된 플레이트를 사용하여 직접 ELISA에 의해 평가된다. 상이한 마우스 혈청의 연속의 희석 (1:100부터 1:109까지)은 플레이트에 첨가되고 결합된 항체는 고우트(goat) 항-마우스 H+L 전체 분자-HRP (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland)를 사용하여 검출되었다. 보조제 없이 50 ㎍의 항원을 가지는 최종 피하 추진(boost)는 희생 전에 3일에 최상의 항-인간 TL1A IgG 혈청 역가(titer)를 나타내는 동물에서 수행되었다.
동물을 안락사시키고 사타구니(inguinal), 겨드랑이(axillary), 팔(brachial), 오금(popliteal) 및 좌골림프절(sciatic lymph nodes)를 DNAse(Roche Diagnostics (Schweiz) AG, Rotkreuz, Switzerland) 및 콜라게나제(collagenase)(Roche Diagnostics (Schweiz) AG, Rotkreuz, Switzerland) 용액으로 2개의 25G 주사바늘로 림프절(lymph node) 건축을 방해하여 단일 세포 현탁을 제조하도록 수득되었다. 단일 세포 현탁은 폴리에틸렌글리콜 1500 (Roche Diagnostics (Schweiz) AG, Rotkreuz, Switzerland)을 가지는 7:1의 비율(수확된 림프절 세포에 대한 융합 파트너)로 골수종(myeloma) 세포주 X63AG8.653 (마우스 BALB/c 골수종(myeloma) 세포주; ATCC accession number: CRL 1580; Kearney JF 외 다수, (1979) J. Immunol. 123(4): 1548-1550)에 융합된다. 융합된 세포는 10% 소태아 혈청 (FBS, PAA Laboratories, Pasching, Austria), 2mM L-글루타민, 100U/ml (Biochrom AG, Germany) 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Biochrom AG, Germany), 10mM HEPES (Invitrogen AG, Basel, Switzerland), 50 μM β-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland), HAT (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland) 및 1% 성장 인자 (Hybridokine, Interchim/Uptima, Montlucon, France)로 보충된 DMEM-10 배지 (Invitrogen AG, Basel, Switzerland)에 있는 마우스 대식세포를 포함하는 96 웰 편평한 바닥 플레이트로 분주되었다.
융합으로부터 대략 800 웰은 인간 TL1A을 확인하고 자체의 수용체로 인간 TL1A의 결합을 차단하는 마우스 IgG의 존재를 위한 ELISA에 의해 스크린되었다. 양성 웰은 서브클로닝의 2개의 라운드로 확장되고 받았다. 세포를 수득하고 경쇄는 클론되고 시퀀싱되었다.
실시예 2:
하이브리도마 세포로부터 항-TL1A 항체의 VH 및 VL 사슬의 클로닝 및 시퀀싱
각각의 양성적으로 선택되는 하이브리도마를 위하여, 총 RNA가 제조되고, cDNA로 역전사되고, VH 및 VL 유전자는 PCR에 의해 각각 증폭되었다. 상기 PCR 생성물은 구조-벡터(rescue-vector) (pDrive 벡터; QIAGEN AG, Hombrechtikon, Switzerland)로 결찰되었고, 각각의 PCR 생성물의 DNA 시퀀싱 및 선택되는 하이브리도마의 모노(mono)- 또는 폴리(poly)-클론형성능(clonality)의 결정을 허용한다. 상기 벡터는 IPTG 및 X-gal(삽입없는 콜로니는 LacZ α -펩타이드에 의해 X-gal을 분해하기 때문에 블루(blue)의 원인이 된다)을 포함하는 LB-아가 플레이트 상의 블루/화이트 선별을 허용한다. 양성(white) 박테리아 클론로부터 재조합 플라스미드가 제조되고 벡터 백본 (M13rev, M13fwd, T7 또는 SP6)에 특정적으로 표준 DNA 시퀀싱 프라이머를 사용하여 시퀀싱된다. DNA 서열은 포유류 세포에서 관심있는 항체의 재조합 발현을 위해 발현 벡터로 최종적으로 서브클론된다.
RNA 분리
총 RNA는 제작사의 프로토콜에 따라 QIAGEN (QIAGEN AG, Hombrechtikon, Switzerland)으로부터 RNeasy 미니 키트를 사용하여 2-10x106 세포로부터 분리된다; 샘플은 NanoDrop ND-1000 분광강도계(pectrophotometer) (WITEC AG, Littau, Switzerland)를 사용하여 정량화하였다.
1 단계 RT- PCR
상기에서 설명된 총 RNA 제조는 cDNA로 추가적으로 역전사되었고, VH 및 VL 단편은 2개의 상이한 혼합물의 퇴화된(degenerated) 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었고, 각각의 하나는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 단편 및 가변 중쇄 결합(junction) 영역의 모든 상이한 서브페밀리의 회수 또는 모든 마우스 면역글로불린 경쇄 카파(kappa) 가변 단편 및 가변 경쇄 카파(kappa) 결합 영역의 모든 상이한 서브페밀리의 회수를 허용한다. 역전사 및 증폭에 사용되는 프라이머는 Microsynth (Balgach, Switzerland)에 의해 합성되고, HPLC 정제었다(표 1-4). 모든 역전사 및 PCR 증폭은 QIAGEN 1 단계 RT-PCR 키트 (QIAGEN AG, Hombrechtikon, Switzerland)을 사용하여 동시에 수행된다. 상기 기술은 특정 프라이머를 사용하였기 때문에, 각각의 mRNA 샘플은 VH 또는 VL 단편 중 어느 하나의 각각의 역전사 및 증폭을 하용하는 복제(duplicate)로 처리되었다. 최종 부피 30㎕가 되도록 RNase-없는 물로 용해된 총 RNA의 2㎍은 하기와 같이 혼합된다: QIAGEN 1단계 RT-PCR 버퍼의 5x 재고(stock) 용액의 10㎕, 10mM 농도의 dNTPs 혼합의 2㎕, 10μM 농도의 프라이머 혼합의 3㎕ 및 QIAGEN 1단계 RT-PCR 효소 혼합의 2㎕. 최종 혼합은 PCR 튜브로 옮기고, 하기의 세팅을 사용하여 PCR-열순환기(thermal cycler) (BioRad iCycler version 4.006, Bio-Rad Laboratories AG, Reinach, Switzerland)으로 사이클하였다:
50 ℃에서 30 분
95 ℃에서 15 분
40 사이클: 94 ℃에서 30 초
55 ℃에서 30 초
72 ℃에서 1 분
72 ℃에서 10 분
4 ℃에서 유지.
pDrive 클로닝
PCR 생성물을 2% 아가로우즈 젤 상에서 수행한다. DNA 전기영동 후, 관심있는 단편을 아가로우즈 젤로부터 절단하고, Macherey-Nagel NucloSpin Extract II 키트 250 (Macherey-Nagel, Oensingen, Switzerland)을 사용하여 추가적으로 추출하였다. DNA 시퀀싱을 위하여, 추출된 PCR 생성물을 상기에서 설명된 구조-벡터(rescue-vector)로 클론하였고 E. coli TOP10 균주(strain) (Invitrogen AG, Basel, Switzerland)으로 형질전환되었다.
미니프랩 추출
양성 콜로니를 Macherey-Nagel Square-well Block plate(Macherey-Nagel, Oensingen, Switzerland)에 분주된 100㎍/ml 앰피실린으로 보충된 1.5ml의 Luria Bertani (LB) 배지에서 37 ℃(250 RPM에서 진탕)에서 밤사이 배양하였다. 다음 날 DNA 미니프랩 추출물을 NucleoSpin Multi-8 플라스미드 키트(Macherey-Nagel, Oensingen, Switzerland)를 사용하여 수행하였다.
시퀀싱 및 서열 분석
DNA 시퀀싱을 위해서 샘플을 DNA 시퀀싱 서비스 회사 Fasteris (Plan-les-Ouates, Switzerland)로 보냈다. 표준 프라이머: M13rev, M13fwd, T7, SP6을 사용하였다(표 5). DNA 서열 분석을 위하여, Clone Manager 9 Professional Edition (Scientific & Educational 소프트웨어, NC, USA) 및 BioEdit 서열 Alignment Editor (Hall TA (1999) Nucl Acids Symp Ser 41: 95-98)을 사용하였다.
재조합 키메라 항체 발현을 위한 발현 벡터의 클로닝
포유류 세포에서 재조합 발현을 위하여, 분리된 마우스 VH 및 VL 단편을 어셈블리-기반 PCR 방법을 사용하여 키메라 면역글로불린으로서 포맷되었다. 상기 키메라 항체는 마우스 중쇄 가변 도메인이 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 (γ1, 힌지(hinge), γ2, 및 γ3 영역) 및 마우스 경쇄 가변 도메인이 인간 카파(kappa) 불변 도메인 (Cκ)에 융합된 경쇄에 융합된 중쇄로 구성된다. PCR- 어셈블된 마우스 가변 및 인간 불변 부분은 인간 면역글로불린 경쇄 카파(kappa) 리더 펩타이드가 단백질 배출을 조절하기 위해 수용되는 차이를 가지는 실시예 1에 언급된 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 수정된 pcDNA3.1(-) 벡터에 기반하는 수정된 포유류 발현 벡터로 이어서 클론된다. 면역글로불린 후보의 단백질 생성을 위하여, 동등한 양의 중쇄 및 경쇄 벡터 DNA를 현탁-적응된 HEK-293 (ATCC number: CRL-1573)로 공동-형질감염하였다. 세포 배양 상등액을 5일 후에 수득하고 AKTA FPLC 시스템 (모두 GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland로부터) 상에 작동되는 단백질 A 친화도 정제 컬럼 (HiTrap Protein A sepharose column)을 사용하여 정제하였다.
표 1: 프라이머 혼합 VH - 역방향(back)
1 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAK GTR MAG CTT CAG GAG TC 서열번호: 65
2 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC 서열번호: 66
3 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTG CAG CTG AAG SAR TC 서열번호: 67
4 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC 서열번호: 68
5 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTY CAG CTB CAG CAR TC 서열번호: 69
6 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTY CAR CTG CAG CAR TC 서열번호: 70
7 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTC CAC GTG AAG CAR TC 서열번호: 71
8 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG AAS STG GTG GAR TC 서열번호: 72
9 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAV GTG AWG STG GTG GAG TC 서열번호: 73
10 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG CAG STG GTG GAR TC 서열번호: 74
11 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAK GTG CAM CTG GTG GAR TC 서열번호: 75
12 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC 서열번호: 76
13 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG CAR CTT GTT GAR TC 서열번호: 77
14 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAR GTR AAG CTT CTC GAR TC 서열번호: 78
15 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAA GTG AAR STT GAG GAR TC 서열번호: 79
16 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTT ACT CTR AAA SAR TC 서열번호: 80
17 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTC CAA CTV CAG CAR CC 서열번호: 81
18 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAT GTG AAC TTG GAA SAR TC 서열번호: 82
19 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG AAG GTC ATC GAR TC 서열번호: 83
표 2: 프라이머 혼합 VH - 정방향(forward)
1 CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA AAC GGT GAC CGT GGT 서열번호: 84
2 CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT 서열번호: 85
3 CCTCCACCACTCGAGCC CGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT 서열번호: 86
4 CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT 서열번호: 87
표 3: 프라이머 혼합 VH - 역방향(back)
1 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATC CAG CTG ACT CAG CC 서열번호: 88
2 GGCGGTGGC GCT AGC CAA ATT GTT CTC ACC CAG TC 서열번호: 89
3 GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT GTG MTM ACT CAG TC 서열번호: 90
4 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG YTR ACA CAG TC 서열번호: 91
5 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTR ATG ACM CAG TC 서열번호: 92
6 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT MAG ATR AMC CAG TC 서열번호: 93
7 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT CAG ATG AYD CAG TC 서열번호: 94
8 GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATY CAG ATG ACA CAG AC 서열번호: 95
9 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTT CTC AWC CAG TC 서열번호: 96
10 GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT GWG CTS ACC CAA TC 서열번호: 97
11 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT STR ATG ACC CAR TC 서열번호: 98
12 GGCGGTGGC GCT AGC GAY RTT KTG ATG ACC CAR AC 서열번호: 99
13 GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT GTG ATG ACB CAG KC 서열번호: 100
14 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATA ACY CAG GA 서열번호: 101
15 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATG ACC CAG WT 서열번호: 102
16 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATG ACA CAA CC 서열번호: 103
17 GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT TTG CTG ACT CAG TC 서열번호: 104
18 GGCGGTGGC GCT AGC GAA ACA ACT GTG ACC CAG TC 서열번호: 105
19 GGCGGTGGCGCT AGC GAA AAT GTK CTS ACC CAG TC 서열번호: 106
20 GGCGGTGGCGCT AGC CAG GCT GTT GTG ACT CAG GAA TC 서열번호: 107
표 4: 프라이머 혼합 VL - 정방향(forward)
1 ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT KAT TTC CAG CTT GG 서열번호: 108
2 ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT TAT TTC CAA CTT TG 서열번호: 109
3 ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT CAG CTC CAG CTT GG 서열번호: 110
4 ATGCTGAC GC GGC CGC ACC TAG GAC AGT CAG TTT GG 서열번호: 111
표 5: 시퀀싱 프라이머
M13-Fwd GTAAAACGACGGCCAGT 서열번호: 112
M13-Rev AACAGCTATGACCATG 서열번호: 113
T7 TAATACGACTCACTATAGG 서열번호: 114
SP6 GATTTAGGTGACACTATAG 서열번호: 115
실시예 3:
항-인간 TL1A 항체의 생물학적 특성
TL1A -특정 항체 검출 ELISA
하이브리도마 및 재조합 항체 후보에 의해 항체 역가(titers), 특정성 및 생성은 직접적 ELISA에 의해 결정된다. 간단히, 96 웰-마이크로타이터 플레이트(Costar USA, distributor VWR AG, Nyon, Switzerland)를 PBS에 있는 2 ㎍/ml의 재조합 인간 TL1A-his의 100 ㎕로 코팅하였다(TL1A-his 단백질의 생성을 위하여 실시예 1을 참조하시오). 플레이트를 4℃에서 밤사이 배양하고 상온(RT)에서 1시간 동안 PBS 2% BSA (Bovine Serum Albumin, PAA Laboratories, Pasching, Austria)로 차단하였다. 차단 용액(blocking solution)을 제거하고 하이브리도마 상등액 또는 정제된 항체를 처가하였다. 플레이트를 RT에서 30 분동안 배양한 후, PBS 0.01% 트윈-20(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland)으로 9회 세척하고 Horseradish Peroxidase (HRP) 표지된-고우트(Goat) 항-마우스 H+L-검출 항체 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland)을 1:1000 희석 농도로 첨가하였다. 인간 Fc를 포함하는 재조합 키메라 항체 (실시예 2 참조)를 검출하기 위하여, 1:1000 희석의 HRP-표지된 래빗 항인간 IgG 항체 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland)를 검출 항체로서 사용하였다. 플레이트를 상온 (RT)에서 30 분 동안 배양하고, PBS 0.01% 트윈-20으로 9회 세척하고 TMB 기질 (Bio-rad Laboratories AG, Reinach, Switzerland)을 플레이트에 첨가하고 상기 반응을 H2SO4를 첨가하여 2 내지 6 분후에 멈췄다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더(a microplate reader)(Biotek, USA; distributor: WITTEC AG, Littau, Switzerland)로 450 nm에서 읽었다. 도 1은 다양한 클론의 부모 하이브리도마 상등액이 인간 TL1A-his 코팅된 단백질을 인식하고 관계없는 히스-태그된(irrelevant his-tagged) 단백질이 아닌 것을 나타낸다.
TNFRSF25 차단하는 ELISA
재조합 인간 TNFRSF25 수용체 단백질 (TNFRSF25)은 하기와 같이 생성되었다: 인간 TNFRSF25 (clone name: IRCMp5012F0812D)에 대한 cDNA를 Source Biosystems(Nottingham, UK)으로부터 구입하고 인간 TNFRSF25(Uniprot Q93038 서열에 따른 숫자)의 세포외 부분(아미노산 25-199)을 플랭킹 제한부위(restriction sites)로 증폭하였다. 이어서 N-말단 8-His 태그 서열을 포함하는 얻어진 PCR 생성물을 CMV 프로모터, 소 성장 호르몬 폴리(poly)-아데닐레이션, 및 재조합 단백질의 배출을 유도하기 위한 마우스 VJ2C 리더 펩타이드를 수반하는 Invitrogen (Invitrogen AG, Basel, Switzerland)으로부터 pcDNA3.1 벡터의 수정된 버젼으로 클론하였다. 재조합 단백질 생성을 위하여, 재조합 벡터는 jetPEITM 형질감염 시약 (Polyplus-transfection S.A., Strasbourg, France; Distributor: Brunschwig, Basel, Switzerland)dmf 사용하여 현탁-적응된 HEK 293 세포(ATCC number CRL 1573)로 형질감염되었다. 세포 배양 상등액을 5일 후에 수득하고 AKTA FPLC 시스템 (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)에 작동되는 단백질 A 친화도 정제 컬럼 (HiTrap 단백질 A sepharose column; GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)을 사용하여 정제하였다.
생성된 항-TL1A 항체가 TNFRSF25 수용체에 대하여 TL1A의 결합을 차단할수 있는지를 결정하기 위하여, 차단 ELISA를 발달하였다. 96 웰-마이크로타이터 플레이트(Costar, USA; distributor VWR AG, Nyon, Switzerland)를 PBS에 있는 2 ㎍/ml의 재조합 인간 TL1A-Fc(실시예 1 참조)의 100 ㎕ 또는 재조합 비태그된 TL1A (R&D Systems, Minineapolis, USA)로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤사이 배양하였고 1시간 동안 RT에서 PBS 2% BSA로 차단하였다. 차단 용액을 제거하였고 하이브리도마 상등액 또는 정제된 항체를 플레이트에 첨가하였다. 5분 후, 4 ㎍/ml의 재조합 인간 TNFRSF25-Fc-his(R&D Systems)의 50 ㎕을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 60 분동안 RT에서 배양한 후, PBS 0.01% 트윈-20로 9회 세척하고 마우스 항-폴리 히스티딘-HRP (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland)을 1:2000의 희석으로 첨가하였다. 플레이트를 RT에서 30 분동안 배양하였고, PBS 0.01% 트윈-20으로 9 회 세척하였고 MB 기질 (Bio-rad Laboratories AG, Reinach, Switzerland)을 플레이트에 첨가하였고 H2SO4를 첨가하여 6 분 후에 반응을 멈추게 하였다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더(a microplate reader)(Biotek, USA; distributor: WITTEC AG, Littau, Switzerland)로 450 nm에서 읽었다. 도 2는 정제된 항체가 용량 의존적 방식으로 TL1A와 TNFRSF25사이의 상호작용을 차단할 수 있다는 것을 나타낸다.
중요한 CD4 T 세포에 의해 TL1A 유도된 IFN-γ 배출의 억제
IL-12 및 IL-18 사이토카인에 의한 주된 CD4 T 세포는 TH1 표현형을 향하여 편광시키고 IFN-γ을 배출한다. TL1A는 중요한 CD4 T 세포에 의해 IFN-γ 생성을 증강시켰다. 따라서 키메라 5G6 항체가 IFN-γ 생성에서 상기 TL1A-의존적 증가를 차다하는지 안하는지를 테스트하였다.
말초혈액단핵 세포(PMBC)로부터 인간 CD4 T 세포를 정제하기 위해서, 인간 백혈구를 포함하는 필터를 La Chaux-de-Fonds, Switzerland (Centre de Trans융합 Sanguine et Laboratoire de Serologie, rue Sophie-Mairet 29, CH-2300)로부터 혈액 수집 센터(Blood Collection Centre)로부터 수득하였다. 세포는 10U/mL의 리퀘민(liquemin)(Drossapharm AG, Lucern, Switzerland)을 포함하는 60 mL PBS을 가지는 백 수세식 세정(back flushing)에 의해 필터로부터 제거되었다. 이후 PBMCs는 하기의 제작사의 지시에 따라 50mL Blood-Sep-Filter 튜브(분배자: Brunschwig, Basel, Switzerland)로 정제되었다. 세포를 인산완충요액(PBS)으로 3회 세척하고 제조사의 지시에 따라 Miltenyi(Gladbach, Germany)로부터의 순수(naive) CD4 T 세포정제 키트를 사용하여 CD4정제를 위하여 사용되었다.
5G6 항체는 적으로 생성된 TL1A의 효과를 억제할 수 있는지를 결정하기 위하여 테스트하였다. IL-12 및 IL-18가 주된 CD4 T 세포는 면역 복합체 (IC)에 의해 전-활성화된 단핵백혈구로 배양되었고, IFN-γ의 생성을 측정하였다. 단핵백혈구를 제조사의 지시에 따라 Miltenyi (Gladbach, Germany)로부터 단핵구 분리 키트 II를 사용하여 PBMCs(상기를 참조)로부터 분리되었다. 단핵구 IC 자극은 하기와 같이 수행되었다: chrompure 인간 IgG (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd, Newmarket, UK)는 PBS에서 상온에서 2 시간 동안 50㎍/mL에서 12-웰 세포-배양 플레이트(TPP, Trasadingen, Switzerland) 상에 코팅되었다. 상기 플레이트를 PBS로 세척하고 상온에서 1 시간 동안 마우스 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch)으로 배양하였다. 코팅된 플레이트를 정제된 단핵백혈구의 플레이팅하기 전에 PBS로 한번 세적하였다. IC-자극된 단핵백혈구를 5% CO2 배양기에서 37℃에서 48-72 시간 배양 후에 수확하였다.
유동세포분석(flow cytometry analysis)을 위하여, IC-자극된 단핵백혈구를 30분 동안 4℃에서 V-바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트(TPP, Trasadingen, Switzerland)에서 10㎍/mL의 항-TL1A-PE 항체GeneTex, distributed by Lucerna Chem. AG, Lucerna, Switzerland) 또는 래빗 동형(isotype) 대조군 (BD Pharmingen, Allschwil, Switzerland)으로 염색하였다. 희석 버퍼 (FACS 버퍼)를 2% 소태아 혈청(FCS, Amimed distributed by Bioconcept, Allschwil, Switzerland) 및 10% 베르센(Versene)(Gibco Life Technologies)으로 보충된 PBS이다. 배양 후에, 100㎕의 FACS 버퍼를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 3분 동안 300g에서 원심분리하였다. 상등액을 버리고 샘플을 FACS 버퍼에 있는 0.2㎍/mL의 PE-항 래빗 2차 항체 용액의 100㎕에서 재현탁하였다. 샘플을 20분 동안 4℃에서 배양하였다. 상기에서 설명된 바와 같이 플레이트를 세척하고 샘플을 300㎕의 FACS 버퍼에서 재현탁하였고 FACSCyan flow cytometer(Beckman Coulter International S.A., Nyon, Switzerland) 상에서 즉시 획득하였다. 수용성 TL1A 정량을 위하여, IC-자극된 단핵구 배양으로부터 상등액은 상이한 시간 포인트(20, 48 및 72 시간)에서 수확하였고 sTL1A를 제조사의 추천에 따라, 인간 TL1A 발달 ELISA 키트 (Peprotech)을 사용하여 정량화하였다.
단핵구-T 세포 공동-배양을 위하여, IC 자극된 단핵백혈구(monocytes) (104) 및 CD4 정제되 T 세포 (105)를 37℃에서 CO2 배양기에서 8ng/mL의 IL-12 (Peprotech) 및 200ng/mL의 IL-18 (MBL International, distributed by LabForce AG, Nunningen, Switzerland)로 편평 바닥-96 웰 플레이트(TPP)에 분주하였다. 배양의 상등액을 72 시간 후에 수확하고 IFN-γ을 상기에서 설명된 바와 같이 정량화하였다.
IC 자극된 단핵백혈구는 이의 멤브린 (mTL1A) (도 3A) 상에 그러나 실질적으로 수용 인자 (sTL1A) (도 3B)로서 TL1A을 발현하였고 공동-배양된 CD4 T 세포 (도 3C)에 의해 강한 IFN-γ 생성을 유도하였다. 5G6 항체는 mTL1A 및 sTL1A-매개된 효과 모두의 강력한 차단을 나타내는 IC-자극된 단핵백혈구에 의해 유도된 IFN-γ의 생성을 완전히 억제하였다.
실시예 4:
부모 5 G6 후보는 마우스, 래트 , 게잡이원숭이( cynomologus monkey) 및 인간 TL1A에 결합한다
다양한 종(species)으로부터 TL1A의 세포외 부분 상의 부모 5G6 항체 (인간 Fc를 가지는 키메라 항체로서 생성)의 반응을 ELISA로 테스트하였다. 인간(homo sapiens), 래트(ratus norvegicus), 마우스(mus musculus) 및 게잡이원숭이(cynomologus monkey) (macaca fascicularis) 서열 (각각, 서열번호: 38, 39, 40 및 41)에 해당하는 TL1A 단백질의 세포외 부분은 PBS에서 4℃에서 2㎍/mL의 농도로 밤사이 96-웰 플레이트(Costar, USA; distributor VWR AG, Nyon, Switzerland)에 높은 결합으로 고정되었다. 플레이트를 1시간 동안 RT에서 2% BSA 알부민(BSA, Sigma-Aldrich Chemie, Buchs, Switzerland)으로 차단하였다. 차단 용액을 제거하였고 5G6 항체의 용량 희석을 플레이트에 적용하였다. 플레이트를 60 분동안 RT에서 배양하였고, PBS 0.01% 트윈-20으로 6회 세척하였고 TMB 기질 (Bio-rad Laboratories AG, Reinach, Switzerland)를 플레이트에 첨가하였다. 반응을 H2SO4를 첨가하여 6 분 후에 멈추게 하고 상이한 TL1A 단백질 상의 5G6의 결합을 HRP-표지된 항인간 IgG 2차 항체 (Sigma-Aldrich Chemie, Buchs, Switzerland)를 사용하여 드러내고 1:1000의 희석으로 첨가하였다. 플레이트를 마이크로플레이트 리더(a microplate reader)(Biotek, USA; distributor: WITTEC AG, Littau, Switzerland)로 450nm에서 흡광도를 읽었다. 도 4는 용량 의존적 방식으로, 5G6가 모든 테스트된 종(species)으로부터 TL1A 단백질을 인식한다는 것을 나타낸다.
실시예 5:
마우스 단클론 항체 5 G6의 인간화
인간 CDR-이식된 수용체(acceptor) 프레임워크의 결합 성질을 실질적으로 유지 및/또는 개선하는 인간 수용체(acceptor) 프레임워크, 복귀 돌연변이(back mutations), 및 돌연변이의 선별을 포함하는 항-인간 TL1A 마우스 항체 5G6을 인간화히는 것은 본 명세서에서 설명된다.
재모양된 가변영역의 디자인
상동관계 매칭(Homology matching)은 이식 5G6 CDRs에 인간 수용체(acceptor) 프레임워크를 선택하는데 사용한다. 데이타베이스 예를 들면 인간 및 마우스 (IMGT 데이타베이스, 앞에) 또는 VBASE2 (Retter I 외 다수, (2005) Nucleic Acids Res. 33, 데이타베이스 issue D671-D674) 또는 카밧(kabat) 데이타베이스(Johnson G 외 다수, (2000) Nucleic Acids Res. 28: 214-218) 또는 발행 (예를 들면, Kabat EA 외 다수, 앞에)의 면역글로불린 좌(loci)로부터 생식세포계열(germline) 가변 유전자의 데이타베이스는 마우스 중쇄 및 경쇄 V 영역(각각, 서열번호: 1 및 2)가 수용체(acceptor) 분자로서 사용을 위해 베스트-피트(best-fit) 인간 생식세포계열(germline) 프레임워크에 속하고 결정하는 인간 서브페밀리를 확인하는데 사용될 수 있다. 수용체(acceptor)로서 사용되는 상기 서브페밀리 내의 중쇄 및 경쇄 가변 서열 (VH 및 VL)의 선별은 이식 후에 6개의 CDRs의 적절한 상대적 설명을 보전을 돕기 위해서 CDR1 및 CDR2 영역의 구조의 서열상동(homology) 및/또는 매치에 기반할 수 있다.
예를 들면, IMGT 데이타베이스의 사용은 5G6 중쇄 가변 도메인 프레임워크 와 인간 중쇄 가변 도메인 서브페밀리 1의 구성원 사이의 좋은 상동(homology)을 나타낸다. 모든 CDRs 및 프레임워크 서열의 가장 높은 상동(homologies) 및 일치는 생식세포계열(germline) 서열에 대해 관찰되었다: IGHV1-2*02 (서열번호: 3), IGHV1-2*04 (서열번호: 4), IGHV1-2*05 (서열번호: 5), IGHV1-2*01 (서열번호: 6), 및 IGHV1-46*01 (서열번호: 7), 상기 모두는 CDR3까지의 전체 서열에 대해 67% 이상의 서열 일치를 가진다. 각각 IGHV1-2*02 및 IGHV1-2*04는 69.4% 서열 일치를 나타낸 반면 IGHV1-2*01 및 IGHV1-46*01은 68.4 및 67.3%의 서열 일치를 나타냈다.
동일한 접근을 사용하여, 5G6 경쇄 가변 도메인 서열은 인간 경쇄 가변 도메인 카파(kappa) 서브페밀리 1의 구성원에 대해 좋은 상동(homology)을 나타냈다. 모든 CDRs 및 프레임워크 서열의 가장 높은 상동 및 일치는 생식세포계열(germline) 서열을 위해 관찰되었다: IGKV1-33*01 (서열번호: 8) 및 IGKV1D-33*01 (서열번호: 9)는 가장 높은 일치(모두 80.0% 일치를 가지는)를 나타내고, 바로 연이어 IGKV1D-12*02 (서열번호: 10), IGKV1D-12*01 (서열번호: 11), 및 IGKV1-12*02 (서열번호: 12)로 구성되는 다른 군은 동일한 정도의 서열 일치(75.8%)를 나타냈다.
인간화 과정에 대한 시작점으로서, 인간 IGHV1-2*01 (서열번호: 3), 및 IGKV1-33*01 (서열번호: 8) 가변 도메인은 5G6 CDRs에 수용체로서 선택된다. 인간 감마 하나의 동형의 첫번째 인간화 항체를 제조하였다(하기 참조). 항체를 인간-마우스 하이브리드 중쇄 가변 도메인 및 인간-마우스 하이브리드 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 하이브리드 중쇄 가변 도메인은 생식세포계열(germline) CDR1 및 2이 각각 5G6 중쇄 CDR1 및 2에 대하여 각각 치환되는 인간 중쇄 가변 도메인 IGHV1-2*01에 기반한다. 인간 수용체(acceptor) 프레임워크에 대한 최상 매칭 JH 부분 서열은 상기 언급된 IMGT 서치로부터 확인되었다. 인간 IGHV1-2*01 프레임워크 영역, 5G6 마우스 CDRs, 및 인간 수용체에 대한 최상 매칭 JH를 가지는 얻어진 인간-마우스 하이브리드 중쇄 가변 서열은 서열번호: 13을 가지는 중쇄 가변 도메인 VH1로서 본 명세서에서 언급된다. 유사하게, 상기 첫번째 인간화 항체 후보에 대해 사용되는 인간-마우스 하이브리드 경쇄 가변 도메인은 인간 IGKV1-33*01 프레임워크 영역, 5G6 마우스 CDRs, 및 인간 수용체에 대한 최상 매칭 JK를 가지고 서열번호: 14로 경쇄 가변 도메인 VL1으로서 본 명세서에서 언급된다. VH1 및 VL1를 포함하는 첫번째 인간화 항체는 본 명세서에서 VH1/VL1 항체로 약어되었다.
첫번째 인간화 항체 원형(prototype)의 생성
VH1 및 VL1에 대한 코딩 DNA 서열 (cDNAs)은 GENEART AG (Regensburg, Germany)에 의해 scFv 포맷으로 합성하여 모든 가변 도메인 (서열번호: 15)을 포함하는 단일 cDNA 서열을 허용한다. 각각의 가변 도메인 cDNAs는 PCR에 의해 상기 scFv 구성체로부터 회수되었고, PCR 어셈블리 기술을 사용하여 그들 각각의 불변 도메인 cDNA 서열의 상류(upstream)를 추가적으로 어셈블하였다. 최종적으로, 완전한 중쇄 및 경쇄 cDNAs는 CMV 프로모터 및 고(Bovine) 성장 호르몬 폴리(poly)-아데닐레이션 신호를 수반하는 수정된 pcDNA3.1 벡터 (Invitrogen, CA, USA) 에 기반하는 비의존적 벡터로 결찰되었다. 경쇄 특정 벡터는 BamHI 및 BsiWI 제한효소 부위를 사용하여 카파(kappa)경쇄 불변 도메인 cDNA의 앞쪽에 있는 관심있는 경쇄 가변 도메인 cDNA의 결찰하여 인간 카파(kappa) 동형(isotype) 경쇄를 발현시킨다; 반면 중쇄 특정 벡터는 BamHI 및 SalI 제한효소 부위를 사용하여 인간 IGHG1 CH1, IGHG1 힌지(hinge) 영역, IGHG1 CH2, 및 IGHG1 CH3 불변 도메인을 암호화하는 cDNA 서열의 앞쪽에 있는 관심있는 중쇄 가변 도메인 cDNA의 결찰을 허용하도록 조작되었다. 모든 중쇄 및 경쇄 발현 벡터에서, 배출은 BamHI 부위를 포함하는 마우스 VJ2C 리더 펩타이드에 의해 유도되었다. BsiWI 제한효소 부위는 카파(kappa) 불변 도메인에 위치해 있고; 상기 SalI 제한효소 부위는 IGHG1 CH1 도메인에서 발견된다.
VH1/VL1 항체 (중쇄 서열번호: 16 및 경쇄 서열번호: 17을 가지는)는 폴리에틸에니민(polyethylenimine)(PEI, Sigma, Buchs, Switzerland)을 사용하여 현탁-적응된 HEK293-EBNA1 세포(ATCC® 카탈로그 구성원: CRL-10852)로 동등한 양의 중쇄 및 경쇄 벡터를 공동-형질감염하여 일시적으로 생성되었다. 통상적으로, ml 당 0.8-1.2 밀리언(million) 세포의 농도에서 현탁으로 100 ml의 세포는 중쇄를 암호화하는 50 ㎍ of 발현 벡터 및 경쇄를 암호화하는 50 ㎍의 발현 벡터를 포함하는 DNA-PEI로 형질감염된다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 숙주 세포로 도입되었을 때, 항체는 0.1% 플루로닉 산(pluronic acid), 4 mM 글루타민, 및 0.25 ㎍/ml 제네틱신으로 보충된, 배양배지 (EX-CELL 293, HEK293-serum-free medium; Sigma, Buchs, Switzerland)로 배출을 하용하기 위해 4 내지 5 일 기간동안 세포를 추가 배양하여 생성되었다. VH1/VL1 항체는 재조합 단백질-A 스트림라인 배지(streamline media)(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)를 사용하여 세포-없는 상등액으로부터 정제되었고, 분석 이전에 인산염완충식염수로 버퍼 교환되었다.
표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance ( SPR ))에 의한 키네틱(Kinetic) 결합 친화도 상수
키네틱(Kinetic) 결합 친화도 상수(KD)는 분석체로서 재조합 히스티딘 태그된 TL1A을 사용하여 단백질-A 포착된 항체 상에서 측정되었다. 측정은 상온에서 BIAcore 2000 (GE Healthcare - BIAcore, GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland) 상에서 수행되었고 BiaEvaluation 소프트웨어 (BIAcore; v4.1, GE Healthcare Europe GmbH)로 분석되었다. CM5 연구 등급 칩(GE Healthcare Europe GmbH; ref. BR-1000-14)은 1:1 N-하이드록시설포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide (NHS))/ 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드하이클로라이드(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride (EDC) 용액 (v/v; 5 ㎕/분 유동율(flow-rate); 유동경로 1 및 2에서)의 주사 35 ㎕에 의해 활성화된다. 단백질-A (ref. P7837; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland)를 아세테이트 버퍼 pH 4.5 (GE Healthcare Europe GmbH, BR-1003-50; 하나의 pH unit below pI)에서 50 ㎍/ml의 최종 농도로 희석하였고 이어서 모두 우동 경로 1 및 2 (5 ㎕/분) 상에서 주사 35 ㎕로 이전의 활성화된 CM5 센서 칩에 고정화되었다. 단백질-A-CM5 센서 칩은 35 ㎕의 에탄올아민 용액 (5㎕/min) 주사하여 비활성화되었다. 최종적으로, 글라이신 용액 (GE Healthcare Europe GmbH, ref. BR-1003-54; 10 mM; pH 1.5)의 10 ㎕의 2개의 주사는 비-교차연결된 단백질-A 분자를 배출하기 위하여 수행되었다. 친화도 측정을 위하여, 1 x PBS 버퍼에 저장된 키메라 및 인간화 항체를 HBS-EP 버퍼(GE Healthcare Europe GmbH, ref. BR-1001-88; 0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, EDTA 3 mM, 0.005% Surfactant P20, pH 7.4)에서 희석하였고 이어서 약 180 RUs를 도달하기 위하여 단백질-A CM5 칩 (30 ㎕/분)의 유동-경로 2에서 주사되었다. 상기 포착 단계에 따라, 재조합 히스티딘 태그된 인간 TL1A를 30 ㎕/분 유동율에서 유동-경로 1 및 2 (참조로서 사용되는 유동-경로 1) 상에서 상이한 농도(1.25 내지 125 nM)에서 주사하였다. 각각의 결합 사건 후에, 표면을 20 초 (30 ㎕/분)동안 주사된 글라이신 버퍼 pH 1.5로 재생하였다.
측정 (sensorgram: fc2-fc1)은 질량 운반없이 1:1 분석체 모델로 최적으로 맞추었다. 초기 각각의 측정에서 단백질-A 포착된 항체에서 실험적 변이를 설명하기 위하여, Rmax 값은 모든 맞춤에 국소에 세트되었다. 해리(dissociation) 시간은 적어도 300-600 초였다. 측정은 복제(duplicate)로 수행되었고 참조(referencing)로서 제로(zero)-농도 샘플을 포함한다. Chi2 값은 각각의 포인트에서 실험 데이타와 참조 데이타 사이의 제곱차이(squared differences)의 합계를 나타낸다; 반면에 잔여(residual)의 플롯은 맞추기 위한 각각의 포인트에 대한 실험 및 참조 데이타 사이의 차이를 나타낸다. 모두 Chi2 및 잔여 값은 실험 데이타 및 각각의 결합 모델 사이의 맞춤의 품질을 평가하기 위하여 사용되었다.
이식된 인간 프레임워크의 복귀 돌연변이
5G6 마우스 항체로부터 곧바로 이식(straight grafting)은 인간 TL1A에 결합하지 않는 후보를 초래하기 때문에(표 6), 인간 잔기가 마우스 잔기에 대하여 대체된 돌연변이생성(mutagenesis)이 초기화되었다. 상기 과정은 백-돌연변이(back-mutation)라고 불리고 단클론 항체의 인간화에서 가장 예상할 수 없다. 인간화 항체에서 잠재적 면역원성(immunogenicity)을 최소화하는 동일한 시간 동안에 친화도를 보존하기 위하여 유지되는 것이 필요한 마우스 항체로부터 임계 프레임워크 잔기의 확인 및 선별이 필요하게 만든다.
대부분 CDR 형성 및/또는 내부-가변 도메인 패킹을 영향을 줄수 있는 잔기를 확인하기 위하여, 가변 도메인의 VH1-VL1 쌍을 위한 3D 모델은 자동화된 모드에서 세트된 구조 상동(homology) -모델링 서버 SWISS-ㅡMODEL (Arnold K 외 다수, (2006) Bioinformatics, 22(2): 195-201; http://swissmodel.expasy.org)를 사용하여 계산되었다. 모델 분석은 CDR 영역 및/또는 중쇄-경쇄 사슬 가변 도메인 패킹 상에 그들의 추정되는 영향에 기반된 의치의 서브세트의 선별을 하용한다. 상기 위치의 서브셋(subset)은 가변 경쇄 위치: 5 및 34 (Kabat 숫자)뿐만 아니라 가변 중쇄 위치: 37, 48, 50, 67, 69, 71 및 75로 구성된다. 추가적으로 상기 언급된 위치에서 선택되는 복귀 돌연변이(back mutations)를 가지는 인간화 후보는 유전자 합성 및 표준 돌연변이생성 방법을 사용하여 제조된다. VH2 및 VL2 가변 도메인 (서열번호: 18) 모두를 포함하는 단일 cDNA 서열은 추가 돌연변이생성을 위하여 시작점으로서 합성되고 사용된다. 항체 발현 및 정제는 상기에서 설명된 방법에 따른다. 인간화 항체 후보는 이전에 설명된 바와 같이 SPR에 의한 그들의 결합 친화도에 대하여 분석된다.
대체의 단일 또는 조합에 기반한 선택되는 인간화 항체의 결합 성질 (KD)를 표 6에 나타낸다. 인간화 변이 중에서, VH3/VL1 항체는 5G6 키메라 항체보다 낮은 KD를 나타내는, TL1A 항원에 대한 가장 높은 친화도를 가진다.
상이한 스캐닝 열량측정법에 의한 선택되는 인간화 항-TL1A 항체의 열안정성
인간화 항체의 열 안정도는 상이한 스캐닝 열량측정법(scanning calorimetry (DSC))을 사용하여 측정한다. 단클론 항체 녹는 프로파일은 이의 동형(isotype) (Garber E & Demarest SJ (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 355: 751-7)의 특성이고, 그러나 Fab 단편의 중간-지점 녹는점은 전장 IgG의 누맥일지라도 쉽게 확인된다. 상기 FAB 일부의 중간-지점 녹는점은 인간화 후보의 단클론 안정성을 모니터하는데 사용된다.
열량측정법(Calorimetric measurements)은 VP-DSC differential scanning microclorimeter (GE Healthcare Europe GmbH)에서 수행되었다. 세포 부피는 0.128 ml이었고, 가열율(heating rate)은 200℃/시간이었고, 초과압(excess pressure)은 65 p.s.i.에서 유지되었다. 모든 항체는 PBS (pH 7.4)에서 1 mg/ml의 농도로 사용되었다. 항체의 몰라 열용량(molar heat capacity)은 항체가 빠진 것으로부터 동일한 버퍼를 포함하는 복제 샘플과 비교하여 평가된다. 부분적 몰라 열용량(molar heat capacity) 및 녹느점 커브(melting curves)는 표준 절차를 사용하여 분석되었다. 온도 기록도(Thermograms)는 소프트웨어 Origin v7.0에서 Non-Two State 모델을 사용하여 추가 분석하기 전에 수정된 기저선(baseline) 및 표준화된 농도였다.
인간화 변이 VH5/VL1 FAB 단편은 빽빽하게 접혀진 FAB 단편을 위하여 일반적으로 관찰되는 협동적 펼치기(cooperative unfolding)와 일치하는 모양 및 진폭(amplitude)을 가지는 83.8℃에서 단일 전환(single transition)을 나타내고, 조작 과정이 FAB 안정성을 유지하는데 성공적인 것을 나타낸다. 전체적 인간화 변이는 좋은 열 안정성을 나타낸다.
표 6: 인간화 항인간 TL1A 항체
항체 변이 (IGHG1) 서열번호 백-돌연변이(back-mutation)
VH/VL		 KD
(pM)
키메라(Chimera) 19, 20 N.A./N.A. 728
VH1/VL1 16, 17 N.A./N.A. 결합
안함
VH2/VL2 21, 25 VH: V37A-M48I-W50E-V67A-M69L-R71V-I75S
VL: N34S-T5N		 857
VH3/VL1 22, 17 VH: V37A-M48I-W50E-V67A-R71V 249
VH4/VL1 23, 17 VH: V37A-M48I-W50E-R71V 681
VH5/VL1 24, 17 VH: V37A-W50E-R71V 259
실시예 6:
5G6 인간화 후보는 주된 CD4 T 세포에 의해 TL1A 유도된 IFN-γ 배출을 차단할 수 있다.
5G6 항체의 인간화 후보는 그들이 IFN-γ 생성에서 TL1A-의존적 증가를 억제할 수 있는지를 결정하기 위하여 테스트되었다.
인간 CD4 T 세포는 상기 실시예 3에서 설명된 바와 같이 말초혈액단핵 세포 (PMBC)로부터 정제되었다. 모든 세포 배양은 10% 열 비활성화된 소태아 혈청 (FCS, Amimed distributed by Bioconcept, Allschwil, Switzerland), 비필수적 아미노산 (PAA, distributed by Chemie Brunschwig AG, Basel, Switzerland), 울트라글루타민 (Lonza, Basel, Switzerland), 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)(PAA) 및 페니실린/스트렙토마이신 혼합(Gibco Life technologies)으로 보충된 Roswell Park Memorial Institute 배지 (RPMI-1640, PAA Laboratories, Pasching, Austria)에서 수행되었다. CD4 정제되 T 세포(105 세포/웰)를 5G6 인간화 항체 후보 (VH3/VL1- 서열번호: 22 및 17, VH4/VL1-서열번호: 23 및 17, VH5/VL1- 서열번호: 24 및 17 및 VH2/VL2- 서열번호: 21 및 25)를 차단하는 존재에서 72시간동안 8ng/mL의 IL-12 (Peprotech, Hamburg Germany), 200ng/mL의 IL-18 (MBL International, distributed by LabForce AG, Nunningen, Switzerland)(priming factors) 및 N-말단 히스-태그(his-tag)(서열번호: 118에 의해 암호화하는)를 가지는 인간 수용 TL1A로 배양되었고, 동시에 농도 100, 10, 1 및 0.1㎍/mL 에서 첨가되었다(도 5의 표를 참조하시오). 동형(isotype) 대조군을 편평한 바닥 96-웰 세포 배양 플레이트(TPP AG, Trasadingen, Switzerland)에 100㎍/mL로 첨가하였다. 상등액을 72 시간 후에 수확하였고 IFN-γ을 제조사의 지시에 따라 OptEIA 키트 (BD Pharmingen, Allschwil, Switzerland)을 사용하여 ELISA로 정량화하였다. 도 5는 인간화 항-TL1A 항체가 IFN-γ의 생성을 실질적으로 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7:
5G6 인간화 항체는 알레르기 천식(asthma)의 마우스 모델에서 효과적이다
천식(asthma)은 마우스에서 동시에 발달되지 않으므로 마우스에서 상기 질병을 조사하기 위하여 천식(asthma)-같은 반응은 공기방식(airways)으로 유도되는 것이 필요하다. 다양한 급성 알레르기 도전 모델이 개발되었고 상기 실시예에서 BALB/c 마우스는 그들이 좋은 T 헬퍼 세포 2 (Th2)-편향된 면역 반응을 발달시키는것과 같이 사용되었다(Boyce JA & Austin KF (2005) J Exp Med, 201: 1869-73). 치킨 에그로부터 유래된, 난 알부민(Ovalbumin)은 마우스에서 팔팔한, 알레르기 폐 염증을 유도하는 알레르기(allergen)이고, 따라서 알레르기 천식의 마우스 모델에서 빈번히 사용된다(Kumar RK 외 다수, (2008) Curr Drug Targets, 9: 485-94).
상기 실시예에서, 하기의 면역접종 프로토콜은 알레르기 천식을 유도하기 위하여 사용되었다: BALB/c 마우스를 0일 및 14일에 1mg의 현탁 의 알루미늄 하이드록사이드(aluminium hydroxide) 및 마그네슘 하이드록사이드(magnesium hydroxide)(Imject Alum, Thermo Scientific, Switzerland)에 흡수된 100㎍의 난알부민(ovalbumin) (치킨 에그 흰색(chicken egg white)로부터 알부민, Grade V, Sigma Aldrich, Switzerland)를 i.p. 주사(injection)하여 민감하게 만들었다. 28, 30 및 33일에, 마우스를 50mg/kg의 인간화 5G6 항체 (VH5/VL1; 안정화된 IgG4 힌지의 포맷; 서열번호: 124 및 17)또는 동등 양 의 대조군 인간 IgG를 가지는 i.p.를 처리하였다. 양성 대조군으로서, 덱사메타존(dexamethasone)(Sigma, Switzerland)을 5mg/kg에서 사용하였다. 처리 후 4시간째에, 마우스를 30mg/kg의 지라진(xylazine) 및 150mg/kg의 케타민(Ketamin)(Graeub Veterinary 생성물로부터 Xylazol 및 Ketasol, Switzerland)로 마취시키고 및 10㎍의 난알부민(ovalbumin)으로 비강내 주사하였다. 3일 후에, 마우스를 희생시키고 그들의 기도(trachea)의 배관삽입(cannulation)후에 기관지 폐포 세척(bronchoalveolar lavage)(BAL)을 2ml의 찬(cold) PBS 주사하여 폐로 수행하였다. 기관지 폐포 세척 용액에 있는 세포를 세고 호산구(eosinophils)를 CD11c 및 Siglec F 세포 표면 마커를 사용하여 유동세포로 검출하였다.
상기 결과는 인간화 항체 5G6로 치료가 천식(asthma) 마우스의 BAL 용액(BAL fluid)에서 호산구(eosinophils)의 수에서 대략 4-배 감소를 초래하는 것을 관찰될 수 있는 도 6에 나타낸다.
실시예 8:
5G6 인간화 항체는 마우스에서 DSS-유도된 급성대장염(colitis)을 치료하는데 효과적이다.
염증성 창자병(inflammatory bowel disease) (IBD)의 많은 상이한 동물 모델은 개발되었고 상기는 IBD의 발병기전(pathogenesis)으로 다양한 인자의 관여를 조사하고 치료 선택을 평가하기 위한 가치있는 도구(valuable tools)이다. 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulphate sodium (DSS))으로 유도된 대장염(colitis)모델은 자체의 단순성때문에 염증성 창자병(inflammatory bowel disease) 질병 모델에 널리 사용되고 인간 IBD에 대하여 많은 유사성을 가진다(Perse M & Cerar A (2012) J Biomed Biotechnol, 2012; 718617; Wirtz S 외 다수, (2007) Nat. Protoc, 2: 541-6).
IBD에서 인간화 5G6 항체 (VH5/VL1; 형태at IgG4 힌지(hinge) stabilised; 서열번호: 서열번호: 124 및 17)의 잠재적 효과를 평가하기 위하여, 급성대장염의 증상을 5 일동안 테스트 군의 음용수에 있는 2%의 DSS(MW 36-50kDa; MP Biomedicals) 투여하여 C57Bl/6 마우스에서 유도된다. 대조군은 비처리된 탭(tap) 물을 주었다. DSS 노출 후에, 탭(tap) 물을 7 일동안 마우스의 테스트 군에 주어졌다. 마우스를 인간화 5G6 항체의 50mg/kg 또는 동형(isotype) 대조군의 동등한 양으로 i.p 3x/주 처리하였다. 양성 대조군으로서, 사이클로스포린(cyclosporine) (Sandimmune, Novartis Pharma, Switzerland)을 5mg/kg에서 사용하였다. 마우스를 매일 체중 감소 및 대변 일관성(stool consistency)을 모티터링하였다. 12일에, 모든 마우스를 희생시켰고 이들의 전체 결장 길이를 측정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 인간화 항체 5G6를 가지는 마우스 치료는 DSS로 유도된 결장 단축(colon shortening)의 감소를 초래한다는 것을 관찰할 수 있다.
실시예 9:
5G6 인간화 항체는 래트에서 TNBS 대장염을 치료하는데 효과적이다
래트에서 장의 염증은 트리니트로벤젠설폰산(trinitrobenzenesulfonic acid) (TNBS) 직장내(intrarectal) 투여로 유도될 수 있다. 얻어진 국소 궤양형성(ulceration) 및 염증은 햅텐(hapten)-수정된 자가 단백질 또는 루미널(luminal) 항원에 대한 T-세포 매개된 반응을 포함하는 것으로 믿어진다(Wirtz S 외 다수, 앞에). 증상은 설사(diarrhoea), 잠혈(occult blood) 및 체중감소(weight loss)를 포함한다.
IBD에서 인간화 5G6 항체(VH5/VL1; 형태at 안정화된 IgG4 힌지(hinge) 의 포맷; 서열번호: 서열번호: 124 및 17)의 잠재적 효과를 평가하기 위하여, 대장염의 증상은 치료 군의 마취시킨 래트의 결장으로 64 mg/kg (4 ml/kg)의 TNBS 용액(50% TNBS: 50% 200 proof 에탄올; 16 mg/ml TNBS (Sigma, Cat# 92822))의 직장내 투여로 Sprague-Dawley 래트에서 유도된다. 대조군은 TNBS 용액을 받지 않는다. TNBS 투여 후 2 시간에, 래트를 단일 용량의 인간화 5G6 항체 (50mg/kg) 또는 동등한 양 의 동형(isotype) 대조군으로 i.p 처리하였다. 양성 대조군으로서, 프레드니솔론(prednisolone) (Sigma)은 TNBS 투여 후 2 시간에 10mg/kg 용량에서 경구투여되고 이어서 5 일동안 매일 투여하였다. 래트를 7일 째에 희생시켰고 질병 심각도를 하기의 점수 시스템을 사용하여 결장 점수(colonic score)로서 평가하였다:
1) 부착(Adhesions): 없음(none) = 0, 최소(minimal) = 1, 몇가지 장 루프(bowel loops)를 포함하는 = 2
2) 협착(Strictures): 없음(none) = 0, 약함(mild) = 2, 심각한, 중심팽창(proximal dilatation)= 3
3) 궤양(Ulcers): 없음(none) = 0, 궤양화선형(linear ulceration) < 1 cm = 1, 2개의 궤양화선형(linear ulcers) < 1 cm = 2, 많은 부위의 궤양 또는 하나의 큰 궤양 = 3
4) 벽 두께: 1 mm 미만 = 0, 1-3 mm = 1, > 3 mm = 2
도 8에 나타낸 바와 같이, 인간화 항체 5G6로 래트의 치료는 TNBS로 유도된 질병 파라미터의 감소를 초래한다.
실시예 10:
hTL1A에 대한 5G6 인간화 항체의 결합은 hDcR3-Fc 및 hDR3-Fc 모두에 의해 차단된다
상기 논의된 바와 같이 TL1A는 TNFRSF25/DR3 및 디코이 수용체 DcR3에 대한 리간드이다. DR3는 T 세포 활성동안에 상향조절되는 사멸 도메인(사멸 도메인)-포함하는 수용체이고 DR3와 같이 TL1A의 상호작용은 면역반응 동안에 T 세포 확장을 촉진할 수 있다(Migone TS 외 다수, 앞에). 배출된 디코이 수용체 (DcR3), 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 수용체 (TNFR) 수퍼페밀리의 수용성 단백질은, TL1A의 작용을 차단한다(Kim S & Zhang L 앞에).
5G6 인간화 항체가 수용체 DR3 및/또는 디코이 수용체 DcR3에 hTL1A의 상호작용으로 간섭할 수 있는지를 평가하기 위해서, 히스-태그된 인간 TL1A을 ELISA 플레이트 상에 2 ㎍/ml로 코팅하였고 인간 DcR3, DR3 (both R&D 시스템) 또는 관계없는 수용체 (Ctrl-Fc) 중 어느 하나의 엑토도메인(ectodomain)의 Fc 융합의 10 ㎍/ml의 존재에서 5G6 인간화 항체 (VH5/VL1; 안정화된 IgG4 힌지(hinge) 포맷; 서열번호: 서열번호: 124 및 17)의 20 ㎍/ml를 배양하였고 이어서 퍼옥시다제(peroxidase)-결합된 항-인간 IgG (Fab 특정)으로 검출하였다. 도 9에서 관찰될 수 있는 바와 같이, hTL1A에 대한 5G6 인간화 항체의 결합은 hDcR3-Fc 및 hDR3-Fc모두에 의해 차단된다. 상기는 hTL1A에 결합하는 5G6 인간화 항체가 DR3 및 DcR3 모두와 hTL1A의 상호작용을 억제한다는 것을 확신한다.
<110> Glenmark Pharmaceuticals S.A. <120> Antibodies that bind to TL1A and their uses <130> 2015fpi-07-006 <150> US US 61/748,201 <151> 2013-01-02 <160> 124 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Val Asp 65 70 75 80 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Gly Asp Tyr Tyr Gly Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Leu 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr 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musculus <400> 52 Ile His Pro Asn Ser Gly Gly Thr 1 5 <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 Gln Asn Ile Asn Val Leu 1 5 <210> 55 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Lys Ala Ser 1 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain extended CDR1 VH5 <400> 57 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp Met His Trp 1 5 10 <210> 58 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain extended CDR2 VH5 <400> 58 Trp Met Gly Glu Ile His Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln 1 5 10 15 Lys Phe Gln Gly 20 <210> 59 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain extended CDR3 VH5 <400> 59 Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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<220> <223> light chain variable domain 5G6 <400> 64 gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60 atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gttttgttaa gctggtacca gcagaaacca 120 ggaaatattc ctaaactctt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180 aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattta ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagacatcg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 65 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 1 <400> 65 gtgatcgcca tggcgtcgac cgakgtrmag cttcaggagt c 41 <210> 66 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 2 <400> 66 gtgatcgcca tggcgtcgac cgaggtbcag ctbcagcagt c 41 <210> 67 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 3 <400> 67 gtgatcgcca tggcgtcgac ccaggtgcag ctgaagsart c 41 <210> 68 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 4 <400> 68 gtgatcgcca tggcgtcgac 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<400> 75 gtgatcgcca tggcgtcgac cgakgtgcam ctggtggart c 41 <210> 76 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 12 <400> 76 gtgatcgcca tggcgtcgac cgaggtgaag ctgatggart c 41 <210> 77 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 13 <400> 77 gtgatcgcca tggcgtcgac cgaggtgcar cttgttgart c 41 <210> 78 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 14 <400> 78 gtgatcgcca tggcgtcgac cgargtraag cttctcgart c 41 <210> 79 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 15 <400> 79 gtgatcgcca tggcgtcgac cgaagtgaar sttgaggart c 41 <210> 80 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 16 <400> 80 gtgatcgcca tggcgtcgac ccaggttact ctraaasart c 41 <210> 81 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 17 <400> 81 gtgatcgcca tggcgtcgac ccaggtccaa ctvcagcarc c 41 <210> 82 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 18 <400> 82 gtgatcgcca tggcgtcgac cgatgtgaac ttggaasart c 41 <210> 83 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - back 19 <400> 83 gtgatcgcca tggcgtcgac cgaggtgaag gtcatcgart c 41 <210> 84 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - forward 1 <400> 84 cctccaccac tcgagcccga ggaaacggtg accgtggt 38 <210> 85 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - forward 2 <400> 85 cctccaccac tcgagcccga ggagactgtg agagtggt 38 <210> 86 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - forward 3 <400> 86 cctccaccac tcgagcccgc agagacagtg accagagt 38 <210> 87 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VH - forward 4 <400> 87 cctccaccac tcgagcccga ggagacggtg actgaggt 38 <210> 88 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 1 <400> 88 ggcggtggcg ctagcgayat ccagctgact cagcc 35 <210> 89 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 2 <400> 89 ggcggtggcg ctagccaaat tgttctcacc cagtc 35 <210> 90 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 3 <400> 90 ggcggtggcg ctagcgayat tgtgmtmact cagtc 35 <210> 91 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 4 <400> 91 ggcggtggcg ctagcgayat tgtgytraca cagtc 35 <210> 92 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 5 <400> 92 ggcggtggcg ctagcgayat tgtratgacm cagtc 35 <210> 93 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 6 <400> 93 ggcggtggcg ctagcgayat tmagatramc cagtc 35 <210> 94 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 7 <400> 94 ggcggtggcg ctagcgayat tcagatgayd cagtc 35 <210> 95 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 8 <400> 95 ggcggtggcg ctagcgayat ycagatgaca cagac 35 <210> 96 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 9 <400> 96 ggcggtggcg ctagcgayat tgttctcawc cagtc 35 <210> 97 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 10 <400> 97 ggcggtggcg ctagcgayat tgwgctsacc caatc 35 <210> 98 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 11 <400> 98 ggcggtggcg ctagcgayat tstratgacc cartc 35 <210> 99 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 12 <400> 99 ggcggtggcg ctagcgayrt tktgatgacc carac 35 <210> 100 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 13 <400> 100 ggcggtggcg ctagcgayat tgtgatgacb cagkc 35 <210> 101 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 14 <400> 101 ggcggtggcg ctagcgayat tgtgataacy cagga 35 <210> 102 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - back 15 <400> 102 ggcggtggcg ctagcgayat tgtgatgacc cagwt 35 <210> 103 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Sequence <220> <223> Primer Mix VL - forward 3 <400> 110 atgctgacgc ggccgcacgt ttcagctcca gcttgg 36 <210> 111 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mix VL - forward 4 <400> 111 atgctgacgc ggccgcacct aggacagtca gtttgg 36 <210> 112 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M13-Fwd <400> 112 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 113 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M13-Rev <400> 113 aacagctatg accatg 16 <210> 114 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer T7 <400> 114 taatacgact cactatagg 19 <210> 115 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SP6 <400> 115 gatttaggtg acactatag 19 <210> 116 <211> 540 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 116 ctaaaaggac aggagtttgc accttcacat cagcaagttt atgcacctct tagagcagac 60 ggagataagc caagggcaca cctgacagtt gtgagacaaa ctcccacaca gcactttaaa 120 aatcagttcc cagctctgca ctgggaacat gaactaggcc tggccttcac caagaaccga 180 atgaactata ccaacaaatt cctgctgatc ccagagtcgg gagactactt catttactcc 240 caggtcacat tccgtgggat gacctctgag tgcagtgaaa tcagacaagc aggccgacca 300 aacaagccag actccatcac tgtggtcatc accaaggtaa cagacagcta ccctgagcca 360 acccagctcc tcatggggac caagtctgta tgcgaagtag gtagcaactg gttccagccc 420 atctacctcg gagccatgtt ctccttgcaa gaaggggaca agctaatggt gaacgtcagt 480 gacatctctt tggtggatta cacaaaagaa gataaaacct tctttggagc cttcttacta 540 540 <210> 117 <211> 1293 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TL1A Fc fusion expression construct <400> 117 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg atccaccggc 60 ctaaaaggac aggagtttgc accttcacat cagcaagttt atgcacctct tagagcagac 120 ggagataagc caagggcaca cctgacagtt gtgagacaaa ctcccacaca gcactttaaa 180 aatcagttcc cagctctgca ctgggaacat gaactaggcc tggccttcac caagaaccga 240 atgaactata ccaacaaatt cctgctgatc ccagagtcgg gagactactt catttactcc 300 caggtcacat tccgtgggat gacctctgag tgcagtgaaa tcagacaagc aggccgacca 360 aacaagccag actccatcac tgtggtcatc accaaggtaa cagacagcta ccctgagcca 420 acccagctcc tcatggggac caagtctgta tgcgaagtag gtagcaactg gttccagccc 480 atctacctcg gagccatgtt ctccttgcaa gaaggggaca agctaatggt gaacgtcagt 540 gacatctctt tggtggatta cacaaaagaa gataaaacct tctttggagc cttcttacta 600 caagcttctg gtggtaccca cacctgcccc ccctgccctg cccctgagct gctgggcgga 660 cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 720 gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ctgaggtgaa gttcaattgg 780 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga gcagtacaac 840 tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 900 gaatacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatcagc 960 aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggag 1020 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1080 gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1140 ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcaggtgg 1200 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1260 cagaagagcc tgagcctgtc ccccggcaag tga 1293 <210> 118 <211> 618 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> secreted TL1A with N-terminal his-tag <400> 118 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg atccaccggc 60 catcaccatc atcaccatct aaaaggacag gagtttgcac cttcacatca gcaagtttat 120 gcacctctta gagcagacgg agataagcca agggcacacc tgacagttgt gagacaaact 180 cccacacagc actttaaaaa tcagttccca gctctgcact gggaacatga actaggcctg 240 gccttcacca agaaccgaat gaactatacc aacaaattcc tgctgatccc agagtcggga 300 gactacttca tttactccca ggtcacattc cgtgggatga cctctgagtg cagtgaaatc 360 agacaagcag gccgaccaaa caagccagac tccatcactg tggtcatcac caaggtaaca 420 gacagctacc ctgagccaac ccagctcctc atggggacca agtctgtatg cgaagtaggt 480 agcaactggt tccagcccat ctacctcgga gccatgttct ccttgcaaga aggggacaag 540 ctaatggtga acgtcagtga catctctttg gtggattaca caaaagaaga taaaaccttc 600 tttggagcct tcttacta 618 <210> 119 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GlnPr994 <400> 119 gttccaggat ccaccggcct aaaaggacag 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Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445

Claims (69)

  1. 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 마우스 항체, 키메라 항체 또는 인간화(humanized) 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 1의 중쇄 가변영역(variable region) 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 26, 27, 28 및 29로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 26, 27, 28 및 29로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 29의 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 21, 22, 23 및 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 21, 22, 23 및 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열의 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 비-CDR 영역을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  12. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 IGHV1-2*02 (서열번호: 3), IGHV1-2*04 (서열번호: 4), IGHV1-2*05 (서열번호: 5), IGHV1-2*01 (서열번호: 6), 및 IGHV1-46*01 (서열번호: 7)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물인 중쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  13. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간 유전자 IGHV1-2*01 (서열번호: 3)의 인간 유전자의 또는 로부터 유래된 생성물인 중쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하고 상기 중쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 해당 중쇄 가변 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  14. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고 상기 중쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 해당 중쇄 가변 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 아미노산 수정은 37, 48, 50, 67, 69, 71 및 75로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에 아미노산 대체(substitution)를 포함하고, 상기 각각의 군 구성원의 아미노산 위치는 카밧 숫자(kabat numbering)에 따라 지시되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 아미노산 수정은 37A, 48I, 50E, 67A, 69L, 71V 및 75S로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 대체를 포함하고, 상기 각각의 군 구성원의 아미노산 위치는 카밧 숫자(kabat numbering)에 따라 지시되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 8의 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  19. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 14 및 30으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  20. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 14 및 30으로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  21. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 17 및 25로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  22. 제1항에 있어서, 상기 경쇄 서열은 서열번호: 17 및 25로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 서열의 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 비-CDR 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  23. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 IGKV1-33*01 (서열번호: 8), IGKV1D-33*01 (서열번호: 9), IGKV1D-12*02 (서열번호: 10), IGKV1D-12*01 (서열번호: 11) 및 IGKV1-12*02 (서열번호: 12)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 생성물 또는 로부터 유래된 생성물인 경쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  24. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간 유전자 IGKV1-33*01 (서열번호: 8)의 생성물 또는 로부터 유래된 생성물인 경쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하고 상기 경쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 경쇄 가변영역의 해당 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  25. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 프레임워크 영역은 해당 마우스 항체의 해당 경쇄 가변 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 아미노산 수정은 5 및 34로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에 아미노산 대체를 포함하고, 상기 각각의 군 구성원의 아미노산 위치는 카밧 숫자에 따라 지시되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 아미노산 수정은 5N 및 34S로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 대체를 포함하고, 상기 각각의 군 구성원의 아미노산 위치는 카밧 숫자에 따라 지시되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  28. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편:
    (a) 서열번호: 22 또는 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열; 및
    (b) 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열.
  29. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편:
    (a) 서열번호: 27 또는 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열; 및
    (b) 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 CDRs의 적어도 하나 및/또는 경쇄 CDRs의 적어도 하나는 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  32. 제31항에 있어서, 상기 인간 중쇄 불변 영역은 IGHG1, 비 푸코실화된(non fucosylated) IGHG1 및 IGHG4로 구성되는 인간 면역글로불린의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  33. 제1항 내지 제31항에 있어서, 상기 항체는 비 푸코실화된 IGHG1 Fc 영역을 가지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  34. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG4(IGHG4)로부터 CH1, S228P 대체를 가지는 인간 IgG4 (IGHG4)로부터 힌지(hinge) 및 인간 IgG4 (IGHG4)로부터 CH2 및 CH3를 포함하는 동형변이(isotypic variant)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간 TL1A에 결합하는 하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간 TL1A에 결합하고 마우스, 래트 및 게먹이원숭이 TL1A와 교차반응(cross reactive)인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  37. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hTL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 DR3 및 DcR3 모두와 hTL1A의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  38. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 길항제 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  39. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 중화(neutralizing) 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  40. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 1가(monovalent) 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  41. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 전장 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  42. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 동일하거나 또는 상이한 항체에 유전적으로 융합된 Fab, Fab′, Fab′-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, 이중특정 단일 사슬 Fv 2분자체(dimers), 이중체(diabodies), 삼중체(triabodies) 및 scFv로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  43. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 부모 항체의 Fc 영역에 대하여 적어도 하나의 아미노산 수정을 포함하는 변이 Fc 영역을 포함하는 반면에, 상기 변이 Fc 영역을 포함하는 항체는 부모 항체와 비교하여 변형된 작용인자(altered sffector) 기능을 나타내는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 700 pM 또는 미만의 친화도 (KD)로 인간 TL1A에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  45. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 해당 키메라 항체의 TL1A 결합 친화도 (KD)의 적어도 85%를 유지하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  46. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 해당 키메라 항체와 비교하였을 때 동등하거나 또는 높은 TL1A 결합 친화도(KD)를 가지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  47. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 해당 키메라 항체보다 3-배 높은 친화도로 인간 TL1A에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  48. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 80℃보다 높은 FAB 단편 열안정성(thermostability) 온도를 가지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  49. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 항체로서 인간 TL1A에 결합하고 동일한 항원결정기(epitope)에 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  50. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 항체에 결합된 수용성 인간 TL1A 상의 항원결정기.
  51. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 분리된 핵산.
  52. 제51항에 있어서, 서열번호: 33 또는 35의 뉴클레오티드 산(nucleotide acid) 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 암호화하는 DNA; 및/또는 서열번호: 36의 뉴클레오티드 산을 포함하는 경쇄 가변영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 분리된 핵산.
  53. 제51항 또는 제52항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  54. 제51항 또는 제52항의 분리된 핵산 또는 제53항의 벡터을 포함하는 숙주세포.
  55. 핵산이 발현되고 항체가 생성되기 위해서 제54항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 생성하는 방법.
  56. 제51항 또는 제52항의 분리된 핵산에 의해 암호화하는 인간 TL1A에 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  57. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  58. 치료제와 연결된 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합(immunoconjugate).
  59. 제58항의 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  60. 제57항 또는 제59항에 있어서, 다른 약학적으로 활성제(active agent)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  61. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편의 치료적으로 효과적 양을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 TL1A 매개된 장애를 치료하기 위한 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 TL1A 매개된 장애는 궤양성대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn’s disease)을 포함하는 염증성 창자병(inflammatory bowel disease)(IBD), 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), MS, 제1형 및 제2형 당뇨병, 건선(psoriasis), 건선 관절염(psoriatic arthritis), 강직척추염(ankylosing spondylitis), 아토피피부염(atopic dermatitis); 예를 들면, 천식(asthma) 및 알레르기 폐 염증을 포함하는 알레르기 반응 또는 조건; 암, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 감염, 신경변성질환(neurodegenerative diseases), 이식편거부반응(graft rejection), 이식편대숙주반응(graft-versus-host disease)(GVHD) 및 심혈관(cardiovascular) 장애/질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 항체는 비 푸코실화된 IGHG1 Fc 영역을 가지고 인간 중쇄 불변 영역 IGHG1을 가지는 항체와 비교하여 증강된 세포독성을 나타내는 방법.
  64. 의약으로서 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편의 용도.
  65. TL1A 매개된 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편의 용도.
  66. 의약으로서 사용을 위한 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편.
  67. TL1A 매개된 장애 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편.
  68. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편, 제57항 또는 제59항의 조성물 또는 TL1A 매개된 장애의 치료를 위한 제58항의 면역접합을 포함하는 제작 물품(article).
  69. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편, 제57항 또는 제59항의 조성물 또는 TL1A 매개된 장애의 치료를 위한 제58항의 면역접합을 포함하는 키트.

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023244089A1 (ko) * 2022-06-17 2023-12-21 주식회사 셀렉신 인간 dr3에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110229471A1 (en) 2008-11-26 2011-09-22 Cedars-Sinai Medical Center Methods of determining responsiveness to anti-tnf alpha therapy in inflammatory bowel disease
BR122020013379B1 (pt) 2011-09-30 2023-01-03 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anticorpos contra tl1a e seus usos
EP2978440B1 (en) 2013-03-27 2019-10-02 Cedars-Sinai Medical Center Treating fibrosis by inhibiting tl1a and diagnosing fibrosis by detecting il31ra
US10316083B2 (en) 2013-07-19 2019-06-11 Cedars-Sinai Medical Center Signature of TL1A (TNFSF15) signaling pathway
AU2014343636A1 (en) * 2013-11-04 2016-06-02 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
RU2714157C2 (ru) * 2015-02-06 2020-02-12 Хит Байолоджикс, Инк. Вектор, коэкспрессирующий молекулы для вакцинации и костимулирующие молекулы
TWI703158B (zh) 2015-09-18 2020-09-01 美商希佛隆公司 特異性結合tl1a之抗體
EP3352760A4 (en) 2015-09-21 2019-03-06 Aptevo Research and Development LLC CD3 BINDING POLYPEPTIDES
WO2017077715A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 La Jolla Institute For Allergy & Immunology Method and medicament for treating airway and/or lung diseases
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
EP3430172A4 (en) 2016-03-17 2019-08-21 Cedars-Sinai Medical Center METHOD FOR DIAGNOSIS OF INFLAMMATORY ENDURANCE THROUGH RNASET2
WO2017196663A1 (en) * 2016-05-09 2017-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Tl1a antibodies and uses thereof
US10322174B2 (en) * 2016-10-26 2019-06-18 Cedars-Sinai Medical Center Neutralizing anti-TL1A monoclonal antibodies
EP3784699A4 (en) 2018-04-25 2022-04-13 Prometheus Biosciences, Inc. OPTIMIZED ANTI-TL1A ANTIBODIES
KR20220103721A (ko) 2019-10-24 2022-07-22 프로메테우스 바이오사이언시즈, 인크. Tnf 유사 리간드 1a(tl1a)에 대한 인간화 항체 및 그의 용도
WO2021081365A1 (en) * 2019-10-24 2021-04-29 Prometheus Biosciences, Inc. Humanized antibodies to tnf-like ligand 1a (tl1a) and uses thereof
AU2021210669A1 (en) * 2020-01-24 2022-08-18 Pfizer Inc. Anti-E-selectin antibodies, compositions and methods of use
CN111793135A (zh) * 2020-05-11 2020-10-20 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中rankl含量的抗体对及其用途

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5024939A (en) 1987-07-09 1991-06-18 Genentech, Inc. Transient expression system for producing recombinant protein
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
WO1994013804A1 (en) 1992-12-04 1994-06-23 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5924939A (en) 1996-09-10 1999-07-20 Cobra Golf Incorporated Golf club head with a strike face having a first insert within a second insert
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CN1237076C (zh) 1999-01-15 2006-01-18 杰南技术公司 具有改变的效应功能的多肽变体
DE60232265D1 (de) 2001-10-25 2009-06-18 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
DK1919954T3 (en) * 2005-08-30 2017-01-30 Univ Miami Immune modulating tumor necrosis factor receptor (TNFR25) - agonists, antagonists and immunotoxins
WO2008106451A2 (en) * 2007-02-26 2008-09-04 Cedars-Sinai Medical Center Methods of using single nucleotide polymorphisms in the tl1a gene to predict or diagnose inflammatory bowel disease
CA2705292C (en) * 2007-11-13 2016-06-21 Teva Biopharmaceuticals Usa, Inc. Humanized antibodies against tl1a
JP2012518404A (ja) 2009-02-23 2012-08-16 グレンマーク・ファーマシューティカルズ・エスエー Ｃｄ１９に結合するヒト化抗体及びその使用
JO3375B1 (ar) * 2010-11-08 2019-03-13 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية للجين a1 الشبيه بعامل النخر الورمي (tl1a)
MX2013013329A (es) * 2011-05-20 2014-04-16 Us Government Bloqueo de interacciones de factor de necrosis tumoral como ligando 1a - receptor de muerte 3 (tl1a-dr3) para mejorar la patologia mediada por las celulas t y los anticuerpos para los mismos.
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023244089A1 (ko) * 2022-06-17 2023-12-21 주식회사 셀렉신 인간 dr3에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

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