CN105102067B - 结合tl1a的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合TL1A的抗体或其片段。更具体而言，本发明涉及结合人TL1A的抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包括包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链CDR3。

Description

结合TL1A的抗体及其用途
发明领域
本发明涉及结合TL1A的抗体或其片段。更具体而言，本发明涉及结合TL1A的抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包括包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链CDR3。
发明背景
TNF样配体1A(TL1A)是肿瘤坏死因子(配体)超家族的成员，成员15。TL1A也被称为TNFSF15和VEGI并于1999年被鉴定为一种血管新生抑制剂，其抑制体内结肠癌生长(Zhai Yet al(1999)FASEB J,13(1):181-9)。该蛋白质大量表达在内皮细胞和造血谱系的活化细胞中，包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、固有层单核细胞、树突细胞和浆细胞，但不表达在B或T细胞中(Tan KB et al(1997)Gene,204:35-46；Prehn JL et al(2007)J Immunol,178:4033-4038)。它也表达在肾、肺、前列腺和胸腺中(Tan KB等人(1997)，见上文)。它是TNFRSF25/DR3和诱饵受体TR6/DcR3的配体，并且它的表达由TNF和IL-1α诱导。TNFRSF25/DR3是在T细胞活化时被上调的含死亡结构域的受体。TL1A诱导NF-κB的活化和TNFRSF25/DR3表达细胞系的细胞凋亡，而且在T细胞中，TL1A可以作为在体外和体内增加IL-2反应性和促炎细胞因子的分泌的共刺激因子。TL1A与DR3的相互作用可以在免疫应答时促进T细胞扩增(Migone TS et al(2002)Immunity,16(3):479-92)。分泌的诱饵受体(DcR3蛋白)，即肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的可溶性蛋白阻止TL1A的作用。(Kim S&Zhang L(2005)JImmunol Methods,298:1-8)。TL1A已经牵涉多种疾病和病症的潜在治疗目标。
过敏和哮喘中的肺部炎症的主要原因是伴有IgE水平升高和NKT细胞产生IL-13的CD4 T细胞的Th2极化。TL1A通过共刺激NKT细胞中产生IL-4和IL-13而在过敏性肺部炎症中起主要作用。通过TL1A抗体或显性负TL1A突变体阻断TL1A和DR3相互作用废除肺部炎症(Fang L等人，(2008)J Exp Med,205(5):1037-48)。DcR3，即TL1A的诱饵受体表达在若干肺和结肠癌和一些正常组织中，因此表明TL1A在肺癌和结肠癌中的作用。此外，也已报道TL1A是血管生成抑制的并且诱导金属蛋白酶和IL-8基因表达(Su WB等人，(2006)Exp CellRes,312:266-277；Kang YJ等人，(2005)Cytokine,29:229-235)。通过增加促炎症性细胞因子和趋化因子的产生以及通过诱导细胞外基质降解酶降低斑块稳定性，TL1A和DR3也可能参与动脉粥样硬化的发病机制(Kang YJ等人，(2005)见上文)。也有证据表明，TL1A/DR3参与类风湿性关节炎的病因学(Bossen C等人，(2006)J Biol Chem,281(20):13964-13971)。
TL1A的表达和炎症性肠道疾病之间的关联已经由研究员确定(Prehn JL等人，(2004)Clin Immunol,112:66-77；Bamias G等人，(2003)J Immunol,171:4868-4874)。克罗恩病，其是一种严重的炎症性肠紊乱，被认为由导致效应器(促炎)和调节性T细胞应答的不平衡，从而导致胃肠粘膜的炎症和疾病的易感基因和环境因素引起。TL1A/DR3途径已经显示在肠道疾病中发挥了重要作用，如克罗恩病(Papadakis KA等人，(2005)J.Immunol,174:4985-4990；Bamias G等人，(2003)见上文)，因此，阻断TL1A/DR3途径可以提供这种疾病的治疗机会。
死亡受体和它们的配体在维持组织稳态和生理调节程序性细胞死亡方面起关键作用。死亡配体的结合引起受体的寡聚化，经由被称为死亡结构域的保守胞质信号元素募集衔接蛋白，半胱天冬酶的活化和细胞凋亡的诱导(Young HA等人，(2006)Proc Natl AcadSci USA,103(22):8303-8304)。尽管如Fas/APO-1/CD95、TNF-R1、TRAIL-R1、TRAIL-R2或DR3的死亡受体最初表征为细胞凋亡的诱导剂，有越来越多的证据表明，这些受体也有非凋亡功能，包括调节适应性免疫应答。Bamias等人报告说TL1A通过固有层树突细胞表达以及TL1A通过增加记忆细胞而不是新生CD4+T细胞的增殖发挥功能，并且与IL-12和/或T细胞受体的低剂量刺激协同作用来强烈提高IFN-γ基因表达(Bamias G等人，(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:8441-8446)。肠道中的IFN-γ表达已被认为是炎症的标记，而且用于治疗克罗恩病的许多策略依靠广泛尝试抑制免疫激活状态。然而，这种方法(类固醇治疗和免疫抑制药物)不特异性地集中于肠道，因此具有其自身的复杂性。20世纪90年代成功地引入了基于TNF-α的使用的靶向治疗，而且结果表明，特异性地针对TL1A或其受体的治疗可对这种令人衰弱的病症提供另一种靶向治疗。
目前用于克罗恩病的治疗包括抗TNF-α单克隆抗体英夫利昔单抗(
Figure BDA0000795281120000031
Centocor)和阿达木单抗(
Figure BDA0000795281120000032
Abbott)，以及抗炎剂(例如，柳氮磺吡啶)，可的松或类固醇(例如，泼尼松)，免疫系统抑制剂(例如，6-巯基嘌呤)和抗生素。然而，相比于其他可用的治疗，英夫利昔单抗是唯一一种具有高度特异性的治疗选择(Young HA等人，(2006)见上文)。虽然英夫利昔单抗一般耐受良好；它可以引起结核感染复发、心脏衰竭恶化、脱髓鞘病和淋巴瘤的发生率增加。
因此，本领域仍然需要可以用于治疗和诊断多种炎症和免疫性疾病和病症的组合物。
发明概述
本公开大体上涉及结合TL1A的抗体或其片段，它们的制备方法和用途，包括用于治疗TL1A介导的病症的方法。结合TL1A的本发明的抗体或其片段表现出许多所需特性，并且可以用于治疗各种疾病，包括但不限于炎症性疾病和/或自身免疫疾病，尤其包括炎症性肠道疾病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)、类风湿关节炎、多发性硬化症(MS)、动脉粥样硬化、移植排斥、中枢神经系统损伤、牛皮癣、白血病或淋巴瘤(例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL))、动脉粥样硬化、以及肺和结肠癌。结合TL1A的本发明的抗体或其片段表现出许多所需特性，并且可以用于治疗各种疾病，包括但不限于炎症性疾病和/或自身免疫疾病，尤其包括炎症性肠道疾病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)、类风湿关节炎、多发性硬化症(MS)、动脉粥样硬化、移植排斥、中枢神经系统损伤、牛皮癣、白血病或淋巴瘤(例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL))、动脉粥样硬化、以及肺和结肠癌、慢性阻塞性肺疾病COPD、视神经炎、年龄相关性黄斑变性、系统性红斑狼疮(SLE)、sjogen综合征、硬皮病、系统性硬化症、慢性肾病、肝纤维化、结核病、特发性肺纤维化、肺结核引起的肺纤维化、腹膜后纤维化、肺纤维化、囊性纤维化、心内膜心肌纤维化、心房纤维变性、纵隔纤维变性、骨髓纤维变性(骨髓)、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统性纤维化(pephrogenic systemicfibrosis)、关节纤维化。
在一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包括包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区序列。在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括这样的重链可变框架区，所述重链可变框架区是选自IGHV1-2*02(SEQ ID NO:3)、IGHV1-2*04(SEQ ID NO:4)、IGHV1-2*05(SEQ ID NO:5)、IGHV1-2*01(SEQ ID NO:6)、和IGHV1-46*01(SEQ ID NO:7)的人基因的产物或源自所述人基因。
在另一个方面，本发明提供了抗体或其片段，其包括这样的重链可变框架区，所述重链可变框架区是人基因IGHV1-2*02(SEQ ID NO:3)的产物或源自所述人基因，并且其中所述重链可变框架区包括相对于相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。
在另一个方面，本发明提供了抗体或其片段，其包括这样的重链序列，该重链序列包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，并且其中所述重链可变框架区包括相对于相应鼠抗体的相应重链可变框架区的至少一个氨基酸修饰。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区序列。在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括这样的轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是选自IGKV1-33*01(SEQ ID NO:8)、IGKV1D-33*01(SEQ ID NO:9)、IGKV1D-12*02(SEQ ID NO:10)、IGKV1D-12*01(SEQ ID NO:11)和IGKV1-12*02(SEQ ID NO:12)的人基因的产物或源自所述人基因。
在另一个方面，本发明提供了抗体或其片段，其包括这样的轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是人基因IGKV1-33*01(SEQ ID NO:8)的产物或源自所述人基因，并且其中所述轻链可变框架区包括相对于相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO:16、21、22、23和24的重链序列。在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO:17和25的轻链序列。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括：
(a)包含SEQ ID NO:22或24的氨基酸序列的重链序列；和
(b)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链序列。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括包含选自SEQ IDNO:13、26、27、28和29的氨基酸序列的重链可变区。在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括包含选自SEQ ID NO:14和30的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括：
(a)包含SEQ ID NO:27或29的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其中所述抗体包含人IgG4Fc区，其中所述抗体不具有Fc介导的细胞毒性活性。在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其中抗体包含人IGHG1Fc区，其中抗体具有细胞毒性机制，例如抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。在优选的方面，结合TL1A的抗体或其片段具有未岩藻糖基化的IGHG1Fc区，并表现出增强的Fc介导的细胞毒性机制，如ADCC。
在另一个方面，本发明提供结合人TL1A的交叉反应性抗体或其片段，并且其还结合小鼠、大鼠和食蟹猴(cynomologous)TL1A。“交叉反应性抗体”是指结合来自一种物种(例如人类)的抗原并且还结合不同物种(例如大鼠)中的相应抗原的抗体。
在另一个方面，本发明还描述了以与相应嵌合抗体类似的亲和力结合TL1A的人源化抗体或其片段，例如保留了相应嵌合抗体的至少85％的TL1A结合亲和力(KD)，或与相应嵌合抗体比较时，具有至少等价的或更高的TL1A结合亲和力(KD)。在一个优选的方面，当与相应嵌合抗体比较时，人源化抗体或其片段具有大约三倍高的TL1A结合亲和力。
在另一个方面，本发明还描述了结合hTL1A并抑制hTL1A与DR3和DcR3的相互作用的人源化抗体或其片段。
本发明的公开内容还提供了编码结合TL1A的抗体及其片段的分离的核酸、载体，和包含所述核酸或载体的宿主细胞。还提供了包含抗TL1A抗体或其片段以及可药用载体的组合物，和包括与治疗剂连接的所述抗体或其片段的免疫缀合物。
本发明还提供了治疗TL1A介导的病症的方法。在一个方面，在引发的CD4T细胞引起的TL1A诱导的IFNγ分泌的体外模型中，抗TL1A抗体或其片段高效地抑制由免疫复合物刺激的单核细胞诱导的IFNγ的产生。在另一个方面，在过敏性哮喘的体内模型中，抗TL1A抗体使哮喘小鼠的支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞的数目减少约4倍。在另一个方面，在由葡聚糖硫酸钠(DSS)在小鼠中和由三硝基苯磺酸(TNBS)在大鼠中诱导的急性结肠炎的体内模型中，抗TL1A抗体有效地减少疾病的症状。
本发明还提供了药物组合物，其包含抗TL1A抗体或其片段和载体，如稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了试剂盒和制品，其包括所述抗体或其片段、用于治疗TL1A介导的病症的组合物或免疫缀合物。
附图简介
图1：该图显示了杂交瘤抗体与人TL1A-his(图1A)或者无关的蛋白-his(图1B)的结合，利用HRP标记的抗小鼠IgG二抗和TMB底物进行检测。图1A显示对人TL1A-his的ELISA的450nm吸光度以及图1B显示对无关的蛋白-his的ELISA的450nm吸光度。
图2：该图显示在阻断ELISA中纯化的三种不同浓度的杂交瘤抗TL1A抗体的效果，在图2示出的抗体的存在下评价人TNFRSF25与TL1A的结合。读取450nm吸光度。mIgG：小鼠IgG同种型对照。
图3：亲本5G6候选物阻断由活化的单核细胞产生的可溶和膜结合的TL1A的效果：图3A：用免疫复合物刺激来自健康供体的PBMC，然后用荧光抗体染色。基于大的前向光散射和高的侧向散射参数圈门单核细胞。直方图显示单核细胞圈门种群的PE荧光。灰色阴影直方图表示同种型对照和空白直方图表示用抗TL1A的染色。图3B：采集来自用免疫复合物刺激的健康供体PBMC的纯化的人单核细胞的上清液并且通过ELISA对sTL1A蛋白的存在进行测试。该图显示了在指示条件的上清液中测得的内插TL1A浓度。“IC Stim”是指免疫复合物刺激。“NS”表示不刺激。图3C：用IL-12，IL-18和IC刺激的自体单核细胞培养从健康供体PBMC纯化的新生CD4 T细胞。以表中指示的浓度与单核细胞同时地添加亲本嵌合5G6抗体。NA表示不加入IL-12和IL-18。通过ELISA定量培养物的上清液。该图显示了每个指示的条件下的内插IFN-γ浓度。
图4：亲本5G6候选物结合小鼠，大鼠，食蟹猴和人TL1A：通过免疫测定确定5G6与对应于人(智人)，大鼠(大家鼠)，小鼠(小家鼠)和食蟹猴(长尾猴)序列的TL1A蛋白的胞外部分的结合。该图显示根据所使用的5G6的浓度的对数的450nm吸光度。
图5：人源化5G6抗体阻断由新生CD4 T细胞引起的TL1A诱导的IFN-γ分泌：用IL-12，IL-18和重组可溶性人TL1A培养新生CD4 T细胞并且以表中指示的浓度添加人源化5G6候选物(VH3/VL1，VH4/VL1，VH5/VL1和VH2/VL2)。NA表示不添加IL-12和IL-18。通过ELISA定量培养上清的IFN-γ浓度。图5A-5D示出了每个培养条件的IFN-γ浓度。每个图形显示一个人源化5G6候选物的结果。
图6：人源化5G6抗体减少过敏性哮喘的小鼠模型中的支气管肺泡灌洗(BAL)液的细胞数。在卵白蛋白挑战诱导的免疫应答的诱导之后，在第28，30和33天，用50mg/kg的人源化5G6候选物(VH5/VL1；格式IgG4铰链稳定的)或者相当量的对照人IgG，或者5mg/kg的地塞米松(阳性对照)处理小鼠。该图显示了每只小鼠的BAL液中的嗜酸性粒细胞的数目并且计算每组的嗜酸性粒细胞的平均数量。使用单向ANOVA计算标准偏差，*表示P<0.05，以及**表示P<0.01。
图7：用人源化5G6抗体处理改善DSS诱导的急性结肠炎模型中的结肠缩短。用50mg/kg的人源化5G6抗体(VH5/VL1；装配IgG4铰链稳定的)或者相当量的同种型对照，或者5mg/kg的地塞米松(阳性对照)处理小鼠3周。该图显示每只小鼠的整个结肠长度和每组的平均长度。使用单向ANOVA计算标准偏差，*表示P<0.05，**表示P<0.01和***表示P<0.001。
图8：用人源化5G6抗体处理可改善TNBS诱导的急性结肠炎模型中的疾病严重程度。在TNBS给药后两小时，用单次剂量的人源化5G6抗体(50mg/kg)和等量的同种型对照处理大鼠。给药泼尼松龙作为阳性对照。使用粘连、狭窄、溃疡和壁厚的结肠分数评估疾病严重程度，并且平均得分显示在直方图中。使用学生t检验计算标准偏差，而且*表示P<0.05。
图9：hDcR3-Fc和hDR3-Fc都阻断5G6与hTL1A的结合。组氨酸标记的人TL1A以2μg/ml涂布在ELISA板上并且在人DcR3(白柱)、DR3(黑柱)或者无关的受体(Ctrl-Fc，阴影线柱)的胞外域的10μg/ml Fc融合的存在下用20μg/ml 5G6培养，然后用过氧化物酶缀合的抗人IgG(Fab特异性的)检测。
发明详述
本发明涉及结合TL1A的抗体及其片段。
本文中使用的术语“TL1A”包括TL1A的变体、同种型和物种同源物。因此，本发明的抗体可以结合人TL1A并且可与人以外的物种的TL1A交叉反应，例如，小鼠，大鼠和食蟹猴。在某些实施方案中，抗体可以完全对一种或多种人TL1A蛋白特异并且可以不表现出物种或其它类型的非人交叉反应。示例性的人TL1A的完整氨基酸序列具有Swiss-Prot登录号O95150(TNFSF15 HUMAN；SEQ ID NO:38)。TL1A也被称为TNFSF15；TNF-类蛋白1A；VEGI；TNFγβ。人TL1A被Entrez Gene称为GeneID：9966，被HGNC称为HGNC:11931。TL1A可以被称为TNFSF15/TL1A的基因编码。示例性小鼠TL1A的完整氨基酸序列具有Swiss-Prot登录号Q5UBV8(TNFSF15_MOUSE；SEQ ID NO：39)。小鼠TL1A被Entrez Gene称为GeneID:326623。示例性大鼠TL1A的完整氨基酸序列具有Swiss-Prot登录号Q8K3Y7(TNFSF15_RAT；SEQ ID NO:40)。大鼠TL1A被Entrez Gene称为GeneID:252878。示例性食蟹猴TL1A(长尾猴)的完整氨基酸序列具有SEQ ID NO:41。
本文中“TL1A”的使用涵盖了TL1A的所有已知的或仍未被发现的等位基因和多态形式，优选人TL1A。
本文中使用的术语“结合TL1A的抗体或其片段”包括结合TL1A(例如分离形式的人TL1A)的抗体或其片段，其亲和力(KD)为850pM或更低，优选700nM或更低，更优选300nM或更低，更优选260nM或更低，甚至更优选250nM或更低。
术语“结合TL1A的抗体或其片段”包括抗体或其抗原结合片段。
本文中使用的术语“抗体”包括完整的抗体和其任何抗原结合片段或单链。“抗体”指包括通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白，或其抗原结合片段。每条重链都由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链都由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的超变区，其序列超变和/或参与抗原识别和/或通常形成结构性限定的环，分散在被称为框架区(FR或FW)的较保守的区域中。每个VH和VL都由3个CDR和4个FW组成，按下列顺序从氨基端向羧基端排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列都构成本文所述VH或VL的“非CDR区”或“未延伸的CDR区”。
本文中使用的术语“重链可变框架区”可包括一个或多个(例如，1、2、3和/或4个)重链框架区序列(例如，框架1(FW1)、框架2(FW2)、框架3(FW3)和/或框架4(FW4))。优选的，重链可变框架区包括FW1、FW2和/或FW3，更优选FW1、FW2和FW3。本文中使用的术语“轻链可变框架区“可包括一个或多个(例如，1、2、3和/或4个)轻链框架区序列(例如，框架1(FW1)、框架2(FW2)、框架3(FW3)和/或框架4(FW4))。优选的，轻链可变框架区包括FW1、FW2和/或FW3，更优选FW1、FW2和FW3。
重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
根据恒定区遗传确定，将抗体分类，也被称为同种型。人的恒定轻链分为κ(CK)和λ(Cλ)轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。因此，本文中使用的“同种型”意指通过其恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何类别和/或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是IgG1(IGHG1)、IgG2(IGHG2)、IgG3(IGHG3)、IgG4(IGHG4)、IgA1(IGHA1)、IgA2(IGHA2)、IgM(IGHM)、IgD(IGHD)和IgE(IGHE)。所谓的人免疫球蛋白假γIGHGP基因代表了额外的人免疫球蛋白重链恒定区基因，该额外的基因已被测序，但由于改变的转换区而不编码蛋白质(Bensmana M等人，(1988)Nucleic AcidsRes.16(7):3108)。尽管具有改变的转换区，人免疫球蛋白假γIGHGP基因具有所有的重链恒定结构域(CH1-CH3)和铰链区的开放阅读框。其重链恒定结构域的所有的开放阅读框编码与具有预测的结构特征的所有人免疫球蛋白恒定结构域良好比对的蛋白质结构域。该额外的假γ同种型在本文中被称为IgGP或IGHGP。已报道了其他的假免疫球蛋白基因，例如人免疫球蛋白重链恒定结构域εP1和P2假基因(IGHEP1和IGHEP2)。IgG类是最常用于治疗目的的。在人中，该类别包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类。在小鼠中，该类别包括亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3。
本文中使用的术语“鼠抗体”包括其中可变区序列和恒定区序列来源于小鼠的抗体。
本文中使用的术语“嵌合抗体”包括这样的抗体，其中可变区序列源自一种物种，而恒定区序列源自另一种物种，例如可变区序列源自鼠抗体，而恒定区序列源自人抗体的抗体。
本文中使用的术语“人源化抗体”或“人源化抗TL1A抗体”包括这样的抗体，其中源自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人的框架序列上。在人的框架序列和源自另一种哺乳动物物种的种系的CDR序列中也可以进行额外的框架区修饰。
术语“中和抗体”包括这样的抗体，其能够抑制和/或中和TL1A的生物活性，例如通过阻断结合或者大幅减少TL1A与其受体TNFRSF25/DR3或诱饵受体TNFRSF21/DR6的结合从而抑制或减少由TL1A触发的信号通路和/或抑制或减少TL1A介导的细胞应答，如淋巴细胞增殖、细胞因子表达、或淋巴细胞生存。
术语“拮抗性抗体”或“拮抗剂抗体”在本文中等同地使用并且包括能够抑制和/或中和TL1A的生物信号传递活性的抗体，如上文关于中和抗体所述。
术语“激动性抗体”或“激动剂抗体”在本文中等同地使用并且包括能够激活和/或增强TL1A的生物信号传递活性的抗体，例如通过增加TL1A与其受体TNFRSF25/DR3或诱饵受体TNFRSF21/DR6的结合从而激活或增强由TL1A触发的信号通路和/或激活或增强TL1A介导的细胞应答，如淋巴细胞增殖、细胞因子表达、或淋巴细胞生存。
本文中使用的术语“Fab”或“Fab区”包括包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离的该区域，或者位于全长抗体或抗体片段环境中的该区域。
本文中使用的术语“Fc”或“Fc区”包括包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体恒定区的多肽。因而，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)，和在Cγ1(Cγ1)和Cγ2(Cγ2)之间的铰链。虽然Fc区的边界可以改变，但人IgG重链Fc区通常定义为包含残基C226或P230至其羧基端，其中编号是根据EU编号系统。对于人IgG1，Fc区在本文定义为包含残基P232至其羧基端，其中编号是根据EU编号系统(Edelman GM等人，(1969)ProcNatl Acad Sci USA,63(1):78-85)。Fc可以指分离的该区域，或者位于Fc多肽(例如抗体)环境中的该区域。
本文中的术语“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”包括包含在抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。本文所述的“铰链区”是长度为6-62个氨基酸的序列区，仅存在于IgA、IgD和IgG中，涵盖了桥接两条重链的半胱氨酸残基。结构上，IgG CH1结构域终止于EU220位，IgG CH2结构域始于残基EU237位。因而，对于IgG，本文中抗体铰链定义为包括221(IgG1的D221)至231(IgG1的A231)位，其中编号是根据EU编号系统(Edelman GM等人，见上文)。
本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括未修饰的抗体，所述抗体之后经修饰产生变体。所述亲本抗体可以是天然存在的抗体，或者天然存在的抗体的变体或改造版本。亲本抗体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物，或编码其的氨基酸序列。本文中使用的“亲本抗TL1A抗体”意指结合TL1A的抗体或免疫球蛋白，并经修饰产生变体。本文中使用的“相应鼠抗体”意指结合TL1A的鼠抗体或免疫球蛋白，可以经修饰生成变体，尤其是本文公开的鼠抗体5G6。本文中使用的“相应的嵌合抗体”是指结合TL1A并且可以经修饰产生变体的嵌合抗体或免疫球蛋白。
本文中使用的术语“变体抗体”或“抗体变体”包括由于相比亲本的至少一个氨基酸修饰，而不同于亲本抗体序列的抗体序列。本文中的变体抗体序列优选地具有与亲本抗体序列至少约80％，最优选至少约90％，更优选至少约95％的氨基酸序列同一性。抗体变体可以指抗体本身，包含所述抗体变体的组合物，或编码其的氨基酸序列。
当提及核酸或其片段时，术语“同一性”或“实质的同一性”或“基本相同”表示当与另一核酸(或其互补链)最佳比对适当的核苷酸插入或缺失时，核苷酸碱基存在至少约80％，更优选至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性，通过序列同一性的任何已知算法测量，如FASTA、BLAST或GAP，下文将详述。
对于多肽，术语“实质相似”或“基本上相似”是指两个肽序列最佳比对时，诸如通过使用默认的空位权重的GAP或BESTFIT程序，共有至少80％的序列同一性，甚至更优选至少90％、95％、98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置相差保守的氨基酸取代。
本文中的术语“氨基酸修饰”包括多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用另一种氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代R94K指这样的变体多肽，其中94位的精氨酸被赖氨酸替换，此情况为重链可变框架区变体。对于前例，94K表示用赖氨酸取代94位。出于本文的目的，通常通过斜杠分隔多个取代。例如，R94K/L78V指包含取代R94K和L78V的双变体。本文中使用的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置添加氨基酸。例如，插入-94表示在94位的插入。本文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如R94-表示缺失94位的精氨酸。
本文中使用的术语“保守修饰”或“保守序列修饰”意指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、插入和缺失。可通过本领域已知的标准技术将修饰导入本发明的抗体中，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守的氨基酸取代是用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括含碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如、天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，可以用其他相同侧链家族的氨基酸残基替换本发明抗体的CDR区中或框架区中的一个或多个氨基酸残基，并可以测试所改变的抗体(变体抗体)保留的功能。
术语“表位”是指由抗体结合的抗原的区域。一个表位可以被定义为结构或功能。功能表位通常是结构表位的一个子集，并且具有那些直接有助于相互作用的亲和力的残基。表位还可以是构象，即，由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可以包括决定因素，所述决定因素是化学分子(如氨基酸，糖侧链，磷酰基，或磺酰基)的活性表面基团，并且，在某些实施方案中，可以具有特异性三维结构特征，和/或特异性电荷特征。
对于所有的人免疫球蛋白重链恒定结构域，都是根据“EU编号系统”编号(EdelmanGM等人，(1969)Proc Natl Acad Sci USA,63(1):78-85)。对于人κ免疫球蛋白轻链恒定结构域(IGKC)，根据“EU编号系统”编号(Edelman等人，见上文)。
对于人λ免疫球蛋白轻链恒定结构域(IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6和IGLC7)，根据“Kabat编号系统”编号(Kabat EA等人，(1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest.，第5版，US Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242)，如Dariavach P等人，(1987)Proc Natl Acad Sci USA,84(24):9074-8和Frangione B等人，(1985)Proc Natl Acad Sci USA,82(10):3415-9所述。
术语“可变结构域”指介导抗原结合和定义特定抗体对特定抗原的特异性的结构域。在天然存在的抗体中，抗原结合位点由2个定义特异性的可变结构域组成：一个位于重链(VH)，另一个位于轻链(VL)。在一些情况下，特异性可专门位于2个结构域中的1个结构域中，如可见于骆驼科的重链抗体中的单结构域抗体。V区长度通常是约110个氨基酸，由15-30个氨基酸的、被称为框架区(FR)的相对不变的氨基酸序列区段和分割该区段的长度为9-12个氨基酸的、被称为“超变区”的非常易变的较短区域组成。天然重链和轻链的可变结构域包括4个大部分采用β片层构象的FR，通过3个超变区连接，这形成环。由FR将每条链中的超变区紧密的保持在一起，并且与其他链的超变区保持在一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat EA等人，见上文)。本文中使用的术语“超变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区一般包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。根据Kabat(Kabat EA等人，见上文)对所有的可变结构域编号。
本文使用和涵盖了多个CDR定义。Kabat定义是基于序列可变性的并是最常用的定义(Kabat EA等人，见上文)。Chothia相反指结构环的位置(Chothia C&Lesk AM(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。AbM定义是Kabat和Chothia定义之间的妥协，由OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用(Martin ACR等人，(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA,86:9268–72；Martin ACR等人，(1991)Methods Enzymol.203:121–153；Pedersen JT等人，(1992)Immunomethods,1:126–136；Rees AR等人，(1996)In Sternberg M.J.E.(编著)，Protein Structure Prediction.Oxford University Press,Oxford,141–172)。接触定义是最近引入的(MacCallum RM等人，(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)，基于对ProteinDatabank中可利用的复杂结构的分析。
Figure BDA0000795281120000161
(the international ImMunoGeneTicsinformation)对CDR的定义(http://www.imgt.org)是基于对所有种类的所有免疫球蛋白和T细胞受体V区的IMGT编号的(
Figure BDA0000795281120000162
the international ImMunoGeneTicsinformation
Figure BDA0000795281120000163
Lefranc MP等人，(1991)Nucleic Acids Res.27(1):209-12；RuizM等人，(2000)Nucleic Acids Res.28(1):219-21；Lefranc MP(2001)Nucleic AcidsRes.29(1):207-9；Lefranc MP(2003)Nucleic Acids Res.31(1):307-10；Lefranc MP等人，(2005)Dev.Comp.Immunol.29(3):185-203；Kaas Q等人，(2007)Briefings inFunctional Genomics&Proteomics,6(4):253-64)。
本发明中讨论的所有互补决定区(CDR)优选是根据
Figure BDA0000795281120000164
定义的。上述CDR中每一个的可变结构域残基如下(根据Kabat EA等人编号，见上文)：LCDR1：27-32；LCDR2：50-52；LCDR3：89-97；HCDR1：26-35；HCDR2：51-57和HCDR3：93-102。本文中使用的VL区的“非CDR区”包括氨基酸序列：1-26(FR1)、33-49(FR2)、53-88(FR3)和98-约107(FR4)。本文中使用的VH区的“非CDR区”包括氨基酸序列：1-25(FR1)、36-50(FR2)、58-92(FR3)和103-约113(FR4)。
本发明的CDR可包括基于上述定义的“延伸的CDR”，并具有如下的可变结构域：LCDR1：24-36、LCDR2：46-56、LCDR3：89-97、HCDR1：26-36、HCDR2：47-65、HCDR3：93-102。这些延伸的CDR是根据Kabat等人，见上文编号的。本文使用的VL区的“非延伸CDR区”包括氨基酸序列：1-23(FR1)、37-45(FR2)、57-88(FR3)和98-约107(FR4)。本文使用的VH区的“非延伸CDR区”包括氨基酸序列：1-25(FR1)、37-46(FR2)、66-92(FR3)和103-约113(FR4)。
本文使用的术语“全长抗体”包括构建天然生物学形态的抗体的结构，包括可变区和恒定区。例如，在大部分哺乳动物中，包括人和小鼠，IgG类的全长抗体是四聚体，并由2对相同的两条免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL，每条重链包括免疫球蛋白结构域VH、CH1(Cγ1)、CH2(Cγ2)和CH3(Cγ3)。在一些哺乳动物中，例如骆驼和羊驼(llama)，IgG抗体可以仅由两条重链组成，每条重链包含与Fc区连接的可变结构域。
抗体片段包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，包括Fab′和Fab′-SH，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由单个可变区组成的dAb片段(Ward等人，1989,Nature，341:544-546)；(v)F(ab')2片段，包含2个连接的Fab片段的二价片段；(vi)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述接头允许两个结构域关联形成抗原结合位点(Bird等人，(1988),Science 242:423-426；Huston JS等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883)；(vii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；(viii)”双抗体”或”三链抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Tomlinson I&Hollinger P(2000)MethodsEnzymol.326:461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448)；和(ix)与相同或不同抗体遗传融合的scFv(Coloma MJ&Morrison SL(1997)Nature Biotechnology,15(2),159-163)。
本文中使用的术语“效应子功能”包括由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用导致的生物化学事件。效应子功能包括FcγR-介导的效应子功能，例如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用)和ADCP(抗体依赖性细胞介导的吞噬作用)，和补体介导的效应子功能，例如CDC(补体依赖性细胞毒性作用)。可以通过改变(即，增强或降低)，优选增强抗体与效应子分子(例如Fc受体或补体组分)的亲和力，改变抗体的效应子功能。效应子功能可以通过使用基于一个或多个细胞或体内测定法来确定。此类测定通常涉及监测细胞对抗体的应答，例如细胞存活，细胞死亡，改变细胞形态或转录激活，如天然基因或报告基因的细胞表达。例如，这样的测定法可以测量抗体引发ADCC，ADCP或CDC的能力。对于一些测定法，额外的细胞或组分，即除了靶细胞，可能需要加入，例如血清补体或效应细胞，如外周血单核细胞(PBMCs)，NK细胞，巨噬细胞，和类似物。可以通过比较改变的抗体和对照抗体的效应子功能，和检测例如由一种或者多种上述测定法测量的ADCC，ADCP或CDC的增加来确定增强的效应子功能。
一般通过修饰效应子分子结合位点来改变结合亲和力，在此情况下，恰当的是以合适的方式定位目标位点和修饰至少一部分位点。还可以设想抗体与效应子分子的结合位点中的改变不必显著改变整体的结合亲和力，可以改变相互作用的几何形状，使效应子机制在非生产性结合中无效。还可以设想通过修饰不直接参与效应子分子结合而参与效应子功能实施的位点来改变效应子功能。通过改变抗体的效应子功能，可以控制免疫应答的多个方面，例如增强或抑制免疫系统的多种反应，对诊断和治疗具有潜在的有益效果。
本文中使用的术语“TL1A介导的病症”包括这样的病况，例如炎症性疾病和/或自身免疫疾病，尤其包括炎症性肠道疾病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)，类风湿关节炎，多发性硬化症(MS)，动脉粥样硬化，移植排斥，中枢神经系统损伤，牛皮癣，白血病或淋巴瘤(例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL))，动脉粥样硬化，以及肺和结肠癌，慢性阻塞性肺疾病COPD，视神经炎，年龄相关性黄斑变性，系统性红斑狼疮(SLE)，sjogen综合征，硬皮病，系统性硬化症，慢性肾病，肝纤维化，结核病，特发性肺纤维化，肺结核引起的肺纤维化，腹膜后纤维化，肺纤维化，囊性纤维化，心内膜心肌纤维化，心房纤维变性，纵隔纤维变性，骨髓纤维变性(骨髓)，腹膜后纤维化，进行性大块纤维化，肾源性系统性纤维化，关节纤维化。
本文中使用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类、爬行类等。优选的受试者是人。
抗TL1A抗体
在第一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包括包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，结合TL1A的抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的延伸的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的延伸的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的延伸的重链CDR3；和/或包括包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的延伸的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的延伸的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的延伸的轻链CDR3。
优选的，结合TL1A的抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链CDR3。更优选地，结合TL1A的抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链CDR2，包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链CDR3；和包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链CDR2，和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链CDR3。优选地，抗体或其片段结合人TL1A并且与小鼠、大鼠和食蟹猴TL1A交叉反应。
本领域普遍已知CDR3结构域不依赖于CDR1和/或CDR2结构域，单独就可以确定抗体对同族抗原的结合特异性，基于共同的CDR3序列可以可预测地产生具有相同结合特异性的多种抗体。参见例如KlimkaA等人，(2000)Br.J.Cancer,83(2):252-260(描述了仅使用小鼠抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3生产人源化抗CD30抗体)；Beiboer SH等人，(2000)J.Mol.Biol.296:833-849(描述了仅使用亲本小鼠MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列生产重组的上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader C等人，(1998)Proc.Natl Acad.SciUSA，95:8910-8915(描述了使用小鼠抗整联蛋白αvβ3抗体LM609的重链和轻链可变CDR3结构域的一组人源化抗整联蛋白αvβ3抗体，其中每个抗体成员在CDR3结构域之外都包括不同的序列，并能够以与亲本鼠抗体同样高或更高的亲和力结合与亲本鼠抗体相同的表位)；Barbas等人，(1994)J.Am.Chem.Soc.116:2161-2162(公开了CDR3结构域为抗原结合提供了最重要的贡献)。
因此，本发明提供了结合TL1A的抗体及其片段，其包括一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，特别是包括包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链CDR3，和/或包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列的轻链CDR3，其中所述抗体能够结合TL1A。在一些实施方案中，本发明的抗体包括来自非人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，所述抗体(a)能够与相应的亲本非人(例如小鼠)抗体竞争结合；(b)保留相应的亲本非人(例如鼠)抗体的功能特征；(c)结合与相应的亲本非人(例如鼠)抗体结合的表位相同的表位；和/或(d)具有与相应的亲本非人(例如鼠)抗体相似的结合亲和力。
在另一个方面，抗体或其片段包含重链可变区序列，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在另一个方面，抗体或其片段包含重链可变区序列的非CDR区，其与SEQ ID NO：1的重链可变区序列的非CDR区至少80％相同。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括包含选自SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链可变区序列。在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区序列。在一些实施方案中，结合TL1A的抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区序列，和包含SEQID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区序列。优选地，抗体或其片段结合人TL1A并且与小鼠、大鼠和食蟹猴TL1A交叉反应。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段的变体。因此，本发明提供了这样的抗体或其片段，具有重链和/或轻链可变区序列的非CDR区的氨基酸序列，所述氨基酸序列与亲本抗体的重链或轻链之重链和/或轻链可变区序列(例如分别如SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:14的重链和轻链可变区序列)的非CDR区的氨基酸序列至少80％相同(具有至少80％氨基酸序列同一性)。本发明还提供了这样的抗体或其片段，具有重链和/或轻链可变区序列的非延伸CDR区的氨基酸序列，所述氨基酸序列与亲本抗体的重链或轻链之重链和/或轻链可变区序列的非延伸CDR区的氨基酸序列至少80％相同。优选的，重链和/或轻链可变区序列的非CDR区或非延伸CDR区的氨基酸序列同一性是至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，特别是96％，更特别97％，甚至更特别98％，最特别99％，包括例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。本文中关于氨基酸序列的同一性或同源性定义为在比对序列和为了实现最大百分比序列同一性，在必要时导入空位后，候选序列中与结合TL1A的抗体或其片段相同的氨基酸残基的百分比。因而，可以通过通常用于比较两条多肽的氨基酸位置相似性的标准方法，来确定序列同一性。使用计算机程序例如BLAST或FASTA，比对两条多肽各自氨基酸的最佳匹配(沿一条或两条序列的全长或者沿一条或两条序列预定的部分)。程序提供了默认的开放罚分和默认的空位罚分，评分矩阵例如PAM250(标准评分矩阵；参见Dayhoff MO等人，(1978),in Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，第3期增补)可与计算机程序结合使用。例如，百分比同一性可计算为：相同匹配的总数乘以100，再除以匹配跨度中较长序列的长度和为了比对两条序列向较长序列中导入的空位数之和。
在一些实施方案中，本发明因而提供了结合TL1A的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括与SEQ ID NO:3，4，5，6或者7的框架区序列至少65％相同的重链可变框架区序列，和/或与SEQ ID NO:8，9，10，11和12的框架区序列至少75％相同的轻链可变框架区序列。在一些实施方案中，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括与SEQ ID NO:3的框架区序列至少69％相同的重链可变框架区序列，和/或与SEQ ID NO:8的框架区序列至少80％相同的轻链可变框架区序列。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括如上文所述的重链和/或轻链CDR，并还包括这样的重链可变框架区，所述重链可变框架区是选自IGHV1-2*02(SEQ ID NO:3)、IGHV1-2*04(SEQ ID NO:4)、IGHV1-2*05(SEQ ID NO:5)、IGHV1-2*01(SEQ ID NO:6)和IGHV1-46*01(SEQ ID NO:7)的人基因的产物或源自所述人基因；优选这样的重链可变框架区，所述重链可变框架区是IGHV1-2*01(SEQ ID NO:3)的人基因的产物或源自所述人基因。重链可变框架区可包括一个或多个(例如，1、2、3和/或4个)重链框架区序列(例如，框架1(FW1)、框架2(FW2)、框架3(FW3)和/或框架4(FW4))，其存在于这些人基因的产物中或源自这些人基因。优选的，重链可变区框架包括FW1、FW2和/或FW3，更优选FW1、FW2和/或FW3，其存在于选自IGHV1-2*02(SEQ ID NO:3)、IGHV1-2*04(SEQ ID NO:4)、IGHV1-2*05(SEQ ID NO:5)、IGHV1-2*01(SEQ ID NO:6)和IGHV1-46*01(SEQ ID NO:7)的人基因的产物中或源自所述人基因。本文使用的重链框架区序列包括FW1(位置1至位置25)、FW2(位置36至位置49)、FW3(位置66至位置94)和FW4(位置103至位置113)，其中利用Kabat中提出的编号系统表示所述氨基酸位置。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，其中抗体或其片段包括这样的重链可变框架区，所述重链可变框架区是IGHV1-2*01(SEQ ID NO:3)的人基因的产物或源自所述人基因，其中重链可变框架区包括相对于相应鼠抗体的相应重链可变框架区的至少一个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链序列，其中重链可变框架区包括相对于相应鼠抗体的相应重链可变框架区的至少一个氨基酸修饰。
优选的，氨基酸修饰包括在选自37、48、50、67，69，71和75的氨基酸位置上的氨基酸取代，更优选在选自37、38、50、67和71的氨基酸位置上的氨基酸取代，最优选在氨基酸位置37的氨基酸取代，其中每个氨基酸位置根据Kabat编号表示。具体而言，氨基酸修饰包括选自37A，48I，50E，67A，69L，71V和75S的氨基酸取代，优选选自V37A，M48I，W50E，V67A，M69L，R71V和I75S的氨基酸取代，而V37A是最优选的氨基酸取代，其中每个氨基酸位置根据Kabat编号表示。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括这样的轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是选自IGKV1-33*01(SEQ ID NO:8)、IGKV1D-33*01(SEQ IDNO:9)、IGKV1D-12*02(SEQ ID NO:10)、IGKV1D-12*01(SEQ ID NO:11)和IGKV1-12*02(SEQID NO:12)的人基因的产物或源自所述人基因；优选是IGKV1-33*01(SEQ ID NO:8)的人基因的产物或源自所述人基因的轻链可变框架区。轻链可变框架区可包括一个或多个(例如，1、2、3和/或4个)轻链框架区序列(例如，框架1(FW1)、框架2(FW2)、框架3(FW3)和/或框架4(FW4))，其存在于这些人基因的产物中或源自这些人基因。优选的，轻链可变区框架包括FW1、FW2和/或FW3，更优选FW1、FW2和/或FW3，其存在于选自IGKV1-33*01(SEQ ID NO:8)、IGKV1D-33*01(SEQ ID NO:9)、IGKV1D-12*02(SEQ ID NO:10)、IGKV1D-12*01(SEQ ID NO:11)和IGKV1-12*02(SEQ ID NO:12)的人基因的产物中或源自所述人基因。本文使用的轻链框架区序列包括FW1(位置1至位置23)、FW2(位置35至位置49)、FW3(位置57至位置88)和FW4(位置98至位置108)，其中所述氨基酸位置利用Kabat中提出的编号系统表示。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，其中抗体或其片段包括是人基因IGKV1-33*01(SEQ ID NO:8)的产物或源自所述人基因的轻链可变框架区，其中轻链可变框架区包括相对于相应鼠抗体的相应轻链可变框架区的至少一个氨基酸修饰。
在另一个方面，抗体或其片段包含轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一个方面，抗体或其片段包含轻链可变区序列的非CDR区，其至少80％相同于SEQID NO：2的重链可变区序列的非CDR区。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，其包括包含选自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链序列。可选地，轻链序列的轻链可变框架区包括相对于相应鼠抗体的相应轻链可变框架区的至少一个氨基酸修饰。
氨基酸修饰包括在5和34的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中每个氨基酸位置根据Kabat编号表示。具体而言，氨基酸修饰包括选自5N和34S的氨基酸取代，优选T5N和N34S，其中每个氨基酸位置根据Kabat编号表示。特别优选的是轻链序列包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，而没有任何氨基酸修饰。
在一些实施方案中，结合TL1A的抗体或其片段包括这样的重链可变框架区和轻链可变框架区，所述重链可变框架区是选自IGHV1-2*02(SEQ ID NO:3)、IGHV1-2*04(SEQ IDNO:4)、IGHV1-2*05(SEQ ID NO:5)、IGHV1-2*01(SEQ ID NO：6)和IGHV1-46*01(SEQ IDNO:7)的人基因的产物或源自所述人基因，所述轻链可变框架区是选自IGKV1-33*01(SEQ IDNO:8)、IGKV1D-33*01(SEQ ID NO:9)、IGKV1D-12*02(SEQ ID NO:10)、IGKV1D-12*01(SEQID NO:11)和IGKV1-12*02(SEQ ID NO:12)的人基因的产物或源自所述人基因；优选的重链可变框架区是IGHV1-2*02(SEQ ID NO:3)的人基因的产物或源自所述人基因，轻链可变框架区是IGKV1-33*01(SEQ ID NO:8)的人基因的产物或源自所述人基因。本发明还涵盖了存在于上述不同的人基因的产物中或源自所述人基因的重链可变区框架区，和/或存在于上述不同的人基因的产物中或源自所述人基因的轻链可变区框架区的组合。
人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“VBase”人种系序列数据库中(可获自因特网的www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase)，以及Kabat EA等人，见上文；Tomlinson IM等人，(1992)J.MoI.Biol.227:776-798和Cox JPL等人，(1994)Eur.J.Immunol.24:827-836。如另一个实例，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于Genbank数据库。
在另一个方面，本发明还提供了结合TL1A的抗体或其片段，其中至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR包括至少一个氨基酸修饰。可以实施定点诱变或PCR介导的诱变，来导入(多个)修饰，并可以在体外或体内测定中评估对抗体结合的影响或者其他的目标功能特性。优选地导入保守修饰。(多个)修饰可以是氨基酸取代、添加或缺失，但优选是取代。通常，在CDR区中实施不超过5个，优选不超过4个，更优选不超过3个，甚至更优选不超过2个，最优选不超过1个的氨基酸修饰。
在某些实施方案中，框架序列可用于改造可变区，产生变体抗体。本发明的变体抗体包括对VH和/或VK中的框架区残基进行了修饰的变体，例如改善抗体的特性。通常，进行此类框架区修饰来减少抗体的免疫原性。例如，一种方法是“回复突变”一个或多个框架区残基为相应的小鼠序列，或者“回复突变”一个或多个框架区残基为相应的种系序列。
因而在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的重链可变区的至少一个框架区序列包括相对于相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。优选的，所述氨基酸修饰是氨基酸取代。通常，在框架区内实施不超过7个，优选不超过6个，优选不超过5个，优选不超过4个，更优选不超过3个，甚至更优选不超过2个，最优选不超过1个的氨基酸修饰。在一些实施方案中，本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其中重链可变区的框架区的氨基酸修饰包括在选自37，48，50，67，69，71和75的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中每个氨基酸位置根据Kabat编号表示。重链可变区的框架区的优选的氨基酸取代位于选自37，48，50，67和71的氨基酸位置上。重链可变区的框架区的更优选的氨基酸取代是选自V37A，M48I，W50E,V67A，M69L，R71V和I75S的氨基酸取代，而V37A是重链可变区的框架区的最优选的氨基酸取代。
本发明提供了结合TL1A的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的轻链可变区的至少一个框架区序列包括相对于相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。优选的，所述氨基酸修饰是氨基酸取代和/或氨基酸缺失。通常，在框架区内实施不超过2个，更优选不超过1个的氨基酸修饰，并且最优选在框架区内不实施氨基酸修饰。在一些实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，其中轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰包括在选自5和34的氨基酸位置上的氨基酸取代。轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰包括选自5N和34S，优选T5N和N34S的取代，其中每个氨基酸位置根据Kabat编号表示。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段可包括上述重链可变区序列的框架区的氨基酸修饰，和上述轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰。
本发明还提供了结合TL1A的拮抗型抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO:13，26，27，28和29的重链可变区，优选选自SEQ ID NO:26，27，28和29，更优选选自SEQ ID NO:27，28和29，甚至更优选选自SEQ ID NO:27和29。本发明还提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO:14和30的轻链可变区，更优选SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，结合TL1A的抗体或其片段包括选自SEQ ID NO:26，27，28和29的重链可变区，和选自SEQ ID NO:14和30的轻链可变区。考虑到每种上述重链和轻链可变区序列都可以结合TL1A，可以“混合和匹配”重链和轻链可变区序列，来产生本发明的抗TL1A结合分子。可以使用例如实施例中描述的结合测定来测试此类“混合和匹配”的抗体的TL1A结合。
在一些实施方案中，结合TL1A的抗体或其片段包括选自SEQ ID NO:27和29的重链可变区，和选自SEQ ID NO:14和30的轻链可变区。在更优选的实施方案中，结合TL1A的抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区；或者包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的轻链可变区。更优选的是这样的结合TL1A的抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO:27和29的重链可变区，和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明还提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO:16，21，22，23和24的重链序列，优选选自SEQID NO:22，23和24，更优选选自SEQ ID NO:22和24。本发明还提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO:17和25的轻链序列，更优选选自SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，结合TL1A的抗体或其片段包括选自SEQ ID NO:21，22，23和24的重链序列，和选自SEQ ID NO:17和25的轻链序列。考虑到每种上述重链和轻链可变区序列都可以结合TL1A，可以“混合和匹配”重链和轻链可变区序列，来产生本发明的抗TL1A结合分子。可以使用例如实施例中描述的结合测定来测试此类“混合和匹配”的抗体的TL1A结合。
在一些实施方案中，结合TL1A的抗体或其片段包括选自SEQ ID NO:22和24的重链序列，和选自SEQ ID NO:17和25的轻链序列。在更优选的实施方案中，结合TL1A的抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链序列或包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链序列，和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链序列。更优选的是这样的结合TL1A的抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO:22和24的重链序列，和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链序列。
在本发明的一个实施方案中，抗体或其片段是人源化抗体。优选地，抗体或其片段是单克隆人源化抗体。
本发明还提供了结合TL1A的单价抗体或其片段，即，由单抗原结合臂组成的抗体。本发明还提供了结合TL1A的抗体的片段，所述片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab')2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双抗体、三链抗体和与相同或不同抗体遗传融合的scFv。优选的片段是scFv、双特异性单链Fv二聚体和双抗体。本发明还提供了结合TL1A的全长抗体。
本发明还提供了结合TL1A的抗体或其片段，其还包括重链和/或轻链恒定区，特别是人重链和/或人轻链恒定区。人重链恒定区可选自IgG1(IGHG1)、IgG2(IGHG2)、IgG3(IGHG3)、IgG4(IGHG4)、IgA1(IGHA1)、IgA2(IGHA2)、IgM(IGHM)、IgD(IGHD)或IgE(IGHE)构成的人免疫球蛋白的组，而人重链恒定区IgG，特别是IgG1(IGHG1)是优选的。人轻链恒定区可选自κ或λ恒定区构成的人免疫球蛋白的组，而人κ恒定区是优选的。在一些优选的实施方案中，所述结合TL1A的抗体或其片段包括人IgG1(IGHG1)重链恒定结构域和人轻链κ恒定结构域。
除了在框架区或CDR区进行修饰外，或作为其备选，还可以改造本发明的抗体以包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合，和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性作用。此外，可以化学修饰(例如，可以在抗体上连接一个或多个化学部分)或修饰本发明的抗体，改变它的糖基化。这些实施方案中的每一种如下详细描述。如下概述的Fc区内的修饰是根据Fc区内的残基的EU编号。在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得改变铰链区内的半胱氨酸残基数，例如增加或减少。该方法进一步描述在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中。改变CH1的铰链区内的半胱氨酸残基数，以例如促进轻链和重链装配，或增加或减少抗体的稳定性。在另一个实施方案中，突变抗体的Fc铰链区，以减少抗体的生物学半衰期。更具体而言，在Fc铰链片段的CH2-CH3结构域交界区中导入一个或多个氨基酸突变，使得抗体相比天然的Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌A蛋白(SpA)结合。该方法进一步描述在Ward等人的美国专利号6,165,745中。在另一个实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。多种方法都是可以的。例如，可以导入一种或多种下列突变：T252L、T254S、T256F，如Ward等人的美国专利号6,277,375所述。可选的，为了增加生物学半衰期，可以在CH1或CL区中改变抗体，以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的2个环中的补救受体(salvage receptor)结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022所述。在其他实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的(多个)效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸，使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法进一步描述在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中。在另一个实施例中，可以用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性作用(CDC)。该方法进一步描述在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中。在另一个实例中，改变CH2结构域的N端区域中氨基酸位置231至238中的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法进一步描述在Bodmer等人的PCT公开WO94/29351中。在另一个实施例中，修饰Fc区以增加抗体介导的抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)的能力，和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力，通过修饰下列位置上的一个或多个氨基酸：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法进一步描述在Presta的PCT公开WO00/42072中。
本发明还提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括人重链和/或轻链恒定区，其中人重链恒定区包括包含来自人IgG4(IGHG4)的CH1区、铰链区、CH2区和CH3区的同种型变体，其中所述铰链区包括第228位丝氨酸取代为脯氨酸。优选的，包含同种型变体的抗体是全长抗体。特别优选的结合TL1A的抗体或其片段包括包含来自人IgG4(IGHG4)的CH1、具有S228P取代的人IgG4(IGHG4)的铰链区和人IgG4(IGHG4)的CH2和CH3的同种型变体。已发现相比包含来自人IgG1(IGHG1，通常是天然的人IgG1)的人重链恒定区的结合TL1A的抗体或其片段(即，相比仅在修饰的重链恒定区不同于同种型变体的结合TL1A的抗体或其片段)，同种型变体没有表现出Fc介导的细胞毒性作用机制，如ADCC。
本发明还提供了结合TL1A的抗体或其片段，其包括人IgG Fc区，其中与人IgG Fc区连接的成熟核心碳水化合物结构缺少岩藻糖(在本文中被可选地称为“未岩藻糖基化”)。本文使用的术语“成熟核心碳水化合物结构”包括与Fc区连接的经处理的核心碳水化合物结构，其一般由碳水化合物结构GlcNAc(岩藻糖)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2组成，通常具有示意性地表示如下的二天线寡糖：
Figure BDA0000795281120000301
该术语具体包括缺乏β1,2 GlcNAc残基的核心成熟碳水化合物结构的G-1形态。然而，优选的是，所述核心碳水化合物结构包括β1,2 GlcNAc残基。本文中的成熟核心碳水化合物结构通常不是高甘露糖化的。所述成熟核心碳水化合物结构与糖蛋白的Fc区连接，通常经由与Fc区的CH2结构域的Asn297的N-连接。
优选地，抗体包括人IgG1(IGHG1)Fc区，其中与人IgG1(IGHG1)Fc区连接的成熟核心碳水化合物结构缺少岩藻糖。更优选是包括人IgG1(IGHG1)Fc区的全长抗体，其中与人IgG1(IGHG1)Fc区连接的成熟核心碳水化合物结构缺少岩藻糖。从WO03/035835已知，与人IgG Fc区连接的成熟核心碳水化合物结构缺乏岩藻糖可增强ADCC。因而，在其它实施方案中，本发明的抗体或其片段包括这样的人IgG1(IGHG1)Fc区，其中与所述人IgG1(IGHG1)Fc区连接的成熟核心碳水化合物结构缺乏岩藻糖，而所述缺乏岩藻糖的抗体相比不缺乏岩藻糖的亲本抗体或其片段表现出增强的ADCC。产生缺乏岩藻糖的抗体的方法是例如(a)使用改造或突变的宿主细胞，所述宿主细胞是岩藻糖代谢缺陷的，使得其对其中表达的蛋白质岩藻糖基化能力降低(或不能岩藻糖基化)；(b)在阻止或降低岩藻糖基化的条件下培养细胞；(c)翻译后去除岩藻糖(例如，使用岩藻糖苷酶)；(d)翻译后添加理想的糖类，例如，在重组表达未糖基化的糖蛋白之后；或者(e)纯化糖蛋白，选择没有岩藻糖基化的产物。优选使用的是WO10/095031的实施例14描述的方法，例如Longmore等人(1982)Carbohydr.Res.365-92或Imai-Nishiya等人，(2007)，BMC Biotechnol.7:84中描述的方法。
本发明还提供了结合TL1A的抗体或其片段，其结合与包括包含SEQ ID NO:27或29的氨基酸序列的重链可变序列和/或包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变序列的抗体相同的表位。本发明还提供了TL1A的特定区域或表位，其被本发明提供的抗体结合，特别是被包括包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO 29的氨基酸序列的重链可变序列和/或包含SEQID NO:14的氨基酸序列的轻链可变序列的抗体结合。可以通过本领域已知的任何合适的表位定位方法，与本发明提供的任一种抗体结合，来鉴别TL1A多肽的这一特定区域或表位。这类方法的例子包括在源自TL1A的具有不同长度的肽中筛选结合本发明抗体的最小片段，所述片段可以特异性结合含有被抗体识别的表位序列的抗体。可以合成或通过蛋白质水解消化TL1A多肽，来生产TL1A肽。可以通过例如质谱分析鉴别结合抗体的肽。在另一个实例中，可以使用NMR光谱或X射线晶体衍射鉴别被本发明的抗体结合的表位。在需要时，一经鉴别，可以使用结合本发明抗体的表位片段作为免疫原，获得结合相同表位的其他抗体。
抗TL1A抗体特性
评估抗体针对例如TL1A的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、
Figure BDA0000795281120000321
Western印迹、RIA和流式细胞仪分析。合适的测定详细描述在实施例中。也可以通过本领域已知的标准测定来评估抗体的结合动力学(例如，结合亲和力，如KD)，例如通过Scatchard或
Figure BDA0000795281120000322
系统分析。可以通过本领域已知的标准竞争性测定来评估相对结合亲和力Ki。
在另一个方面，通过ELISA或
Figure BDA0000795281120000323
方法可视，本发明提供了结合人、小鼠、大鼠和食蟹猴TL1A的抗体或其片段。根据实施例3可以进行和测量结合ELISA。
在另一个方面，本发明提供了结合重组的或天然产生的人TL1A并且防止CD4 T淋巴细胞引起的活化和细胞因子分泌的抗体或其片段。例如，本发明的抗体或其片段可以抑制免疫复合物刺激的单核细胞诱导产生INFγ。根据实施例3和6可以进行和测量确定这种由CD4 T淋巴细胞引起的TL1A介导的细胞因子的分泌的测定。
在另一方面，本发明提供了结合TL1A，特别是分离形式的TL1A的抗体或其片段，如实施例5中详述的，其与被用作分析物的可溶人TL1A多肽(由SEQ ID NO:116编码)的亲和力(KD)为850pM或更低，优选700nM或更低，更优选300nM或更低，更优选260nM或更低，甚至更优选250nM或更低，例如通过
Figure BDA0000795281120000324
仪器(GE Healthcare Europe GmbH，Glattbrugg，瑞士)对偶联蛋白A的CM5研究级传感芯片(GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士；BR-1000-14)上捕获的抗体进行表面等离振子共振(SPR)测量。在优选的方面，本发明提供了保留相应嵌合抗体的至少85％的TL1A结合亲和力(KD)的人源化抗体或其片段。优选地，人源化抗体或其片段保留相应嵌合抗体的至少90％的TL1A结合亲和力(KD)，更优选地，相应嵌合抗体的至少95％的结合亲和力(KD)。优选的，结合TL1A的人源化抗体或其片段与相应的嵌合抗体具有等价的亲和力。“等价的亲和力”意指在相应嵌合抗体的TL1A结合亲和力的±10％范围内的亲和力值。更优选地，本发明提供了具有比相应嵌合抗体更高的亲和力的结合人TL1A的人源化抗体或其片段。优选地，人源化抗体或其片段结合人TL1A的亲和力是相应嵌合抗体的亲和力的两倍，更优选地是相应嵌合抗体的亲和力的三倍。在本发明的优选的方面，提供了结合人TL1A的人源化抗体或其片段，如实施例5中详述的，其与被用作分析物的可溶人TL1A多肽(由SEQ ID NO:116编码)的结合亲和力(KD)为900pM或更低，700pM或更低，优选500pM或更低，更优选300nM或更低，更优选260nM或更低，甚至更优选250pM或更低，例如通过仪器(GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)对偶联蛋白A的CM5研究级传感芯片(GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士；BR-1000-14)上捕获的抗体进行表面等离振子共振(SPR)测量。
本发明的另一方面提供了具有良好热稳定性的结合TL1A的抗体或其片段。在优选的实施方案中，结合TL1A的抗体或其片段，具有热稳定温度大于70℃，优选大于75℃，甚至更优选大于80℃的FAB片段。为了分析FAB片段热稳定性，使用差异扫描量热法，在全长IgG中鉴别FAB片段的中点融解温度。这类量热测量法是本领域技术人员已知的，并可根据例如Garber E&Demarest SJ(2007),BBRC,355:751-7进行，如实施例5中进一步描述的。
核酸、载体和宿主细胞
本发明还提供了编码结合TL1A的抗体及其片段的分离的核酸、载体以及包含所述核酸或载体的宿主细胞。核酸可位于完整细胞中、细胞裂解液中或者以部分纯化的或基本纯化的形式。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域普遍已知的技术，与其他细胞组分或其他污染物(例如，其他的细胞核酸或蛋白质)纯化分离时，核酸是“分离的”或“使得基本纯的”，参见例如F.Ausubel等人编著，(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and WileyInterscience,New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，可以含有或不含内含子序列。在优选的实施方案中，所述核酸是cDNA分子。
可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸，例如可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术，获得编码抗体的轻链和重链或者编码VH和VL区段的cDNA。对于从免疫球蛋白基因库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从库还原编码抗体的一种或多种核酸。向宿主细胞中导入外源核酸的方法是本领域普遍已知的，并可随所使用的宿主细胞而变化。技术包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、氯化钙处理、聚乙烯亚胺介导的转染、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、病毒或噬菌体感染、在脂质体中封装(多个)多核苷酸和直接显微注射DNA到核中。在哺乳动物细胞的情况下，转染可以是瞬时或稳定的。
本发明的优选的核酸分子是编码选自SEQ ID NO:42，43，44，45和46的重链序列，和/或选自SEQ ID NO:47和48的轻链序列的那些核酸分子。本发明的优选的核酸分子是编码选自SEQ ID NO:31，32，33，34和35的重链可变区，和/或选自SEQ ID NO:36和37的轻链可变区的那些核酸分子。
本发明的优选的核酸分子是编码SEQ ID NO:1的重链可变区，和/或SEQ ID NO:2的轻链可变区的那些核酸分子；例如，包含SEQ ID NO:63的核酸序列的重链可变区编码DNA，和/或包含SEQ ID NO:64的核酸序列的轻链可变区编码DNA。本发明的更优选的核酸分子是编码SEQ ID NO:27或29的重链可变区，和/或SEQ ID NO:14的轻链可变区的那些核酸分子；例如，包含SEQ ID NO:33或35的核酸序列的重链可变区编码DNA，和/或包含SEQ IDNO:36的核酸序列的轻链可变区编码DNA是最优选的。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，则可以通过标准的重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因，或转化为对应于上文所述片段的片段基因，如Fab片段基因或转化为scFv基因。在这些操作中，将VL或VH编码DNA片段有效地连接至编码另一种蛋白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一种DNA片段上。该上下文中使用的术语“有效连接”意指连接两个DNA片段，使得所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持读码框连续。通过将VH编码DNA与另一种编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子有效连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。这些人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.等人，见上文)，可以通过标准PCR扩增获得涵盖了这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1(IGHG1)、IgG2(IGHG2)、IgG3(IGHG3)、IgG4(IGHG4)、IgA1(IGHA1)、IgA2(IGHA2)、IgM(IGHM)、IgD(IGHD)或IgE(IGHE)恒定区，但最优选是IgG1(IGHG1)恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将VH编码DNA与另一种只编码重链CH1恒定区的DNA分子有效连接。通过将VL编码DNA与另一种编码轻链恒定区CL的DNA分子有效连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。这些人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat E.A.等人，见上文)，可以通过标准PCR扩增获得涵盖了这些区域的DNA片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，优选κ恒定区。为了产生scFv基因，可以将VH和VL编码DNA片段与另一种编码柔性接头的片段有效连接，例如，编码氨基酸序列(GIy4-Ser)3的片段，使得VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白质表达，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如，Bird等人，(1988)Science242:423-426；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.ScL.USA,85:5879-83；McCafferty等人，(1990)Nature348:552-554)。已开发了各种技术生产抗体的抗体片段。传统上，这些片段源自完整抗体的蛋白质水解消化(参见例如，MorimotoK等人,(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods,24:107-117；和Brennan等人，(1985)Science,229:81-3)。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接生产这些片段。例如，可以从上文讨论的抗体噬菌体库中分离抗体片段。可选的，可以从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，并将其化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter P等人，(1992)Bio/Technology,10:163-167)。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab′)2片段。生产抗体片段的其他技术对熟练的技术人员而言是显而易见的。在其他实施方案中，选定的抗体是单链Fv片段(scFv)，参见例如WO1993/16185；美国专利号5,571,894和美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利号5,641,870所述。
为了表达蛋白质，可以将编码本发明抗体的核酸整合到载体中，优选表达载体。多种表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可包括自我复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。构建的表达载体与宿主细胞类型是可相容的。因而，可用于本发明的载体(优选表达载体)包括但不限于使蛋白质能够在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外系统中表达的那些载体。如本领域已知的，多种表达载体是可商业或其他方式获得的，可用于本发明中来表达抗体。
表达载体通常包括与控制或调控序列、可选择的标志物、任何融合配偶体和/或其他元件有效连接的蛋白质。本文中，“有效连接”意指核酸置于与另一种核酸序列的功能性关联中。术语“调控序列”意在包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology,Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。一般而言，这些表达载体包括与编码抗体的核酸有效连接的转录和翻译调控核酸，且通常对用于表达所述蛋白质的宿主细胞是恰当的。一般而言，转录和翻译调控序列可包括启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，和增强子或激活子序列。还如本领域已知的，表达载体通常含有选择基因或标志物，允许选择含有表达载体的转化的宿主细胞。选择基因是本领域普遍已知的，可随使用的宿主细胞而变化。例如，通常可选择的标志物基因赋予已导入载体的宿主细胞对药物的抗性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤。优选的可选择的标志物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用氨甲喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中)和neo基因(用于G418选择)。
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适的宿主细胞是原核细胞、酵母或更高等的真核细胞。用于该目的的合适的原核细胞包括真细菌，包括革兰氏阴性生物或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷菌属(Serratia)例如粘质沙雷菌(Serratia marcescans)，和志贺菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。合适的大肠杆菌克隆宿主包括大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)。除原核细胞外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是合适的克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物中，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通的贝克酵母是最常用的。然而，多种其他属、种和菌株通常是可获得且有效的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharoriyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，包括乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、K.WaItH(AJCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosopmarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)或K.marxianusyarrowia(EP402226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia(EP244234))；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，包括链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium或曲霉属(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)。
用于表达本发明的抗体的合适的宿主细胞源自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括plaril和昆虫细胞。已鉴别了多种杆状病毒菌株和变体，与相应的许可昆虫宿主细胞，所述细胞来自宿主例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaugypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的多种病毒菌株是公众可获得的，例如苜蓿尺蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，此类病毒可特别用于转染草地贪夜蛾细胞。还可以利用棉花、谷物、土豆、大豆、碧冬茄属、西红柿和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
用于表达本发明的重组抗体的宿主细胞优选的是哺乳动物宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述在Urlaub和Chasin LA(1980)Proc.Natl.Acad.ScL USA，77:4216-4220中，与DHFR可选择标志物一起使用，例如KaufmanRJ和Sharp PA(1982)J.MoI.Biol，159:601-621所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别的，为了与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统是GS基因表达系统，公开在WO87/04462(Wilson)、WO89/01036(Bebbington)和EP338841(Bebbington)中。当将重组的抗体基因导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一定时间来生产抗体，所述时间足以允许抗体在所述宿主细胞中的表达，或更优选的，允许抗体分泌到所述宿主细胞生长的培养基中。可以在多种培养基中培养用于生产结合TL1A的抗体的宿主细胞。可商购的培养基例如Ham's F10(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)、最低必需培养基(MEM；Sigma-Aldrich Chemie GmbH)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Basel,瑞士)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM；Sigma-Aldrich Chemie GmbH)适合培养宿主细胞。可以使用标准的蛋白质纯化方法，从培养基中回收抗体。
抗体可与融合配偶体有效连接，使得能够进行表达的蛋白质的靶向、纯化、筛选、展示等。融合配偶体可通过接头序列与抗体序列连接。接头序列一般包括少量氨基酸，通常少于10个，但也可以使用更长的接头。通常，选择柔性且抗降解的接头序列。对本领域技术人员显而易见的是，多种序列的任一种都可用作接头。例如，普通的接头序列包括氨基酸序列GGGGS。融合配偶体可以是靶向序列或信号序列，指导抗体和任何相关的融合配偶体到达所需要的细胞位置或胞外基质中。如本领域已知的，某些信号序列可以将蛋白质靶向分泌到生长基质中，或位于细胞的内膜和外膜之间的周质空间中。融合配偶体还可以是编码使得能够纯化和/或筛选的肽或蛋白质的序列。此类融合配偶体包括但不限于多组氨酸标签(His-tag)(例如H6和H10或其它与固定化金属亲和层析(IMAC)系统一起使用的标签(例如，Ni+2亲和柱))、GST融合物、MBP融合物、Strep-标签、细菌酶BirA的BSP生物素化靶序列，和由抗体靶向的表位标签(例如c-myc标签、flag标签等)。对本领域技术人员显而易见的是，此类标签可用于纯化、筛选或两者。
构建和生产抗体
通过使用普遍已知的和常规的操作规程免疫动物，获得针对TL1A多肽生成的抗体，即，向动物，优选非人动物施用多肽，参见例如实验免疫学手册(Weir DM(编著)，第4卷，Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986)。可以免疫多种暖血动物，如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最合适的，特别是小鼠。可以通过技术人员已知的重组DNA技术生产抗体。此外，可以通过酶促或化学切割天然存在的抗体，来生产抗体。可以通过将来自非人动物(例如小鼠)的VH和/或VL区的一个或多个CDR或其部分转移至人VH和/或VL区的一个或多个框架区上，来构建本发明的人源化抗体。任选的，当需要或期望减少抗体的免疫原性和/或维持结合亲和力时，可以用相应的非人(例如小鼠)残基替换位于VH和/或VL区中的人框架残基。任选的，可以用人残基替换位于CDR中的非人氨基酸残基。可以基于如上所述制备的非人单克隆抗体的序列，来制备本发明的嵌合或人源化抗体。可以从目的非人杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准的分子生物学技术将其改造为含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区与人恒定区连接(参见例如，Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入到人框架中(参见例如，Winter的美国专利号5,225,539，和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
可以构建本发明的人源化抗体，其中基于在潜在的受体分子可变区和鼠抗体重链可变区之间的同源性的考虑，来选择重链可变区的人受体分子。种系候选人受体分子优选是降低潜在的免疫原性的。种系数据库由读取时穿过重链FW3区的末端且部分至CDR3序列的抗体序列构成。为了选择FW4区，可以搜索源自选定的种系分子的成熟抗体序列的数据库，或使用源自人类供体的选定的种系分子的抗体序列。人受体分子优选选自与鼠供体分子相同的重链类型，而且是与鼠供体分子的可变区相同的规范结构类型。针对重链可变区选择人受体分子的次要考虑是规避鼠供体分子和人受体分子之间在CDR长度上的同源性。优选通过V-BASE数据库的同源性搜索，来选择人受体抗体分子，但也可以使用其他数据库如Kabat和公开的NCBI数据库。
可以构建本发明的人源化抗体，其中基于在潜在的受体分子可变区和鼠抗体轻链可变区之间的同源性的考虑，来选择轻链可变区的人受体分子。种系候选人受体分子优选是降低潜在的免疫原性的。种系数据库由读取时穿过重链FW3区的末端且部分至CDR3序列的抗体序列构成。为了选择FW4区，可以搜索源自选定的种系分子的成熟抗体序列数据库，或使用源自人类供体的选定的种系分子的抗体序列。人受体分子优选选自与鼠供体分子相同的轻链类型，且是与小鼠供体分子的可变区相同的规范结构类型。针对轻链可变区选择人受体分子的次要考虑包括鼠供体分子和人受体分子之间在CDR长度上的同源性。优选通过V-BASE数据库的同源性搜索，来选择人受体抗体分子，但也可以使用其他数据库如Kabat和公开的NCBI数据库。人源化非人抗体的方法如本文所述，包括下文实施例5。
本发明提供了生产结合TL1A的抗体或其片段的方法，包括培养包含分离的核酸(编码结合TL1A的抗体或其片段)或包含含有分离的核酸(编码结合TL1A的抗体或其片段)的载体的宿主细胞，使得核酸表达并生产抗体。优选分离所述抗体。可以使用上文所述的宿主细胞、核酸和载体。可以通过例如本领域普遍已知的(例如，Morrison S(1985)Science229:1202)和上文进一步概述的重组DNA技术和基因转染方法的组合，获得核酸表达。例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如使用表达目标抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长的轻链和重链DNA，并可将所述DNA插入到载体中，例如表达载体。选择的表达载体和表达控制序列与所使用的表达宿主细胞是可相容的。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到分离的载体中，或更通常的，两种基因都插入到同一表达载体中。通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上互补的限制性位点，或者如果不存在限制性位点时平端连接)将抗体基因插入到表达载体中。通过将本文所述的抗体轻链和重链可变区插入到已编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段与载体内的(多个)CH1区段有效连接，VK区段与载体内的CK区段有效连接，将其用来产生任何抗体同种型的全长抗体基因。
抗TL1A抗体的表征和纯化
可以使用测量与TL1A的结合的测定，和/或测量阻断TL1A与其受体TNFRSF25结合的能力的测定，实施抗体筛选。结合测定的实例是ELISA，特别是使用固定在平板上的TL1A和人Fc的融合蛋白，和应用缀合的二抗检测与融合蛋白结合的抗TL1A抗体。阻断测定的例子是基于流式细胞的测定，测量与人CD4细胞上的TNFRSF25结合的TL1A融合蛋白的阻断。使用荧光标记的二抗检测与细胞结合的TL1A融合蛋白的量。该测定搜索由于上清液中的抗体阻断配体融合蛋白与TNFRSF25结合的信号降低。阻断测定的另一例子是通过测量胸苷整合，测量由包被在平板上的TL1A融合蛋白介导的新生人T细胞共刺激的阻断。作为评估抗TL1A抗体的功能活性的测定，可以使用如实施例3和6所述的CD4 T淋巴细胞引起的细胞因子分泌减少。
可以以本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化本发明的抗体。标准的纯化方法包括层析技术，包括在大气压下进行的离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析、大小排阻层析或凝胶过滤层析，和反相层析，或使用系统例如FPLC和HPLC在高压下进行。纯化方法还包括电泳的、免疫学的、沉淀、透析和层析聚焦技术。超滤和透析过滤技术也可与蛋白质浓缩结合使用。为了纯化TL1A抗体，可以在例如用于单克隆抗体纯化的转瓶中生长选定的宿主细胞。在用蛋白A琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,NJ)的亲和层析之前，可以过滤和浓缩上清液。可以通过凝胶电泳和高效液相层析检测洗脱的抗体，以保证纯度。因而本发明的优选的抗体是结合TL1A的分离的和/或纯化的抗体。
免疫缀合物
在另一个方面，本发明提供了与治疗剂连接的结合TL1A的TL1A抗体或其片段，所述治疗剂例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素。此类缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞致命(例如杀死细胞)的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔，和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂还包括例如抗代谢剂(例如，氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracil decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)顺铂(cisplatin)、蒽环类(anthracyclines)(例如，柔红霉素(原道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(原放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。可以与本发明抗体连接的治疗性细胞毒素的其他实例包括多卡米星(duocarmycins)、加利车霉素(calicheamicins)、美坦辛(maytansines)和auristatins，及其衍生物。加利车霉素抗体缀合物的实例是可商购的(Mylotarg(R)；American Home Products)。可以使用本领域可获得的接头技术连接本发明的抗体与细胞毒素。用于缀合细胞毒素与抗体的接头类型的实例包括但不限于腙类、硫醚、酯、二硫化物和含肽接头。可以选择例如对溶酶体区室内的低pH切割敏感的或对蛋白酶切割敏感的接头，所述蛋白酶例如在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D)。关于细胞毒素类型、接头类型和将治疗剂与抗体缀合的方法的进一步讨论，还参见Saito,G等人，(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail P.A等人，(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne G(2003)Cancer Cell，3:207-212；Allen TM(2002)Nat.Rev.Cancer,2:750-763；Pastan I和Kreitman,RJ(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs,3:1089-1091；Senter PD和Springer CJ,(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。本发明的抗体还可与放射性同位素连接，产生细胞毒性的放射药物，也被称为放射性免疫缀合物。可与用于诊断或治疗性抗体缀合的放射性同位素的实例包括但不限于：碘131、铟111、钇90和镥177。本领域已建立了制备放射性免疫缀合物的方法。放射性免疫缀合物的实例是可商购的，包括
Figure BDA0000795281120000431
(EDECPharmaceuticals)和
Figure BDA0000795281120000432
(Corixa Pharmaceuticals)，相似的方法可用于制备使用本发明抗体的放射性免疫缀合物。本发明的抗体免疫缀合物可用于修饰给定的生物学应答，而药物部分不被视为限制于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有理想生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括例如酶促活性毒素，或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学应答修饰剂，例如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其它生长因子。
连接此类治疗剂与抗体的技术是普遍已知的，参见例如Arnon等人，"MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",in MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编著)，第243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery",in Controlled DrugDelivery(第2版)，Robinson等人(编著)，第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",inMonoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编著)，第475-506页(1985)；"Analysis,Results,and Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy",in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(编著)，第303-16页(Academic Press 1985)和Thorpe PE&Ross WC(1982)，Immunol.Rev.62:119-58。
在另一个方面，本发明提供了结合TL1A的TL1A抗体或其片段，与治疗剂共同施用，例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包括本发明的抗体或其片段和可药用载体。此类组合物可包括一种本发明的抗体和/或免疫缀合物或其组合(例如，两种或多种不同的抗体或免疫缀合物)，和/或治疗剂，例如上述细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素。例如，本发明的药物组合物包括结合靶抗原的不同表位，或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物)的组合。本发明的药物组合物还可以在组合疗法中施用，即与其它试剂组合。例如，组合疗法可包括与至少一种其它的抗炎剂或免疫抑制剂组合的本发明的TL1A抗体。
本文中使用的“可药用载体”包括任意的和所有的溶剂、分散基质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗的和延迟吸附的以及诸如此类生理学相容的介质。优选的，载体是适合静脉内、肌内、皮下、不经肠道的、脊柱的或表皮施用的(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物(即，抗体或免疫缀合物)可包被在材料中，保护所述化合物免受可能灭活所述化合物的酸和其它天然条件的作用。可药用载体包括无菌的含水溶液或分散液，和用于即时制备的无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类基质和介质用于药学活性物质的用途是本领域已知的。除非是与所述活性化合物不相容的任何常规基质或介质，否则可考虑其在本发明的药物组合物中的用途。补充的活性化合物也可被掺入到所述组合物中。
在另一个方面，本发明提供了包含免疫缀合物和可药用载体的组合物，所述免疫缀合物包括与治疗剂连接的结合TL1A的抗体或其片段。可如上文所述使用免疫缀合物和治疗剂。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的抗体或其片段的组合物，所述抗体或其片段还包括另一种药学活性剂。优选的，另一种药学活性剂是：a)TL1A的另一种拮抗剂，b)抗炎剂和c)免疫抑制剂，例如TNFα拮抗剂、可的松或类固醇等，和/或d)抗过敏剂。
本发明的药物组合物还可包括可药用抗氧化剂。可药用抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酰抗坏血酸酯(ascorbyl palmitate)、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可用于本发明的药物组合物中的合适的含水和不含水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油例如橄榄油，和可注射的有机酯例如油酸乙酯。例如通过使用包被材料(如卵磷脂)，通过维持所需的颗粒大小(分散体的情形下)和通过使用表面活性剂，可以维持恰当的流动性。这些组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的灭菌程序和通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂来确保防止存在微生物，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、山梨酸苯酚(phenol sorbic acid)等。组合物中包括等渗剂也是理想的，例如糖、氯化钠等。此外，通过包括延迟吸附的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以产生可注射的药物形式的延长吸附。
治疗和其他用途
本发明的抗体具有多种体外和体内的诊断和治疗性用途，涉及TL1A介导的病症的诊断和治疗。例如，可以在体外或离体条件下，将这些分子施用给培养的细胞，或例如在体内条件下，施用给人类受试者，来治疗、预防和诊断多种TL1A介导的病症。优选的受试者是人，包括患TL1A活性介导的病症(TL1A介导的病症)的患者。本发明的中和抗体可有效用于治疗不依赖于其TL1A共刺激状态的患者。更优选的受试者是人类，包括表达高TL1A水平的患者。
出于本发明的目的，“患者”包括人和其他动物，优选哺乳动物和最优选人。因而，本发明的抗体同时具有人类治疗和兽医应用。本发明中的术语“治疗”意在包括对疾病或病症的治疗性治疗，以及预防性或抑制性的手段。因而，例如，在疾病发作前成功地施用抗体导致疾病的治疗。作为另一个实例，在疾病的临床表征后成功地施用抗体来抗争疾病的症状，包括疾病的治疗。“治疗”还涵盖了在疾病出现后，为了消除所述疾病而施用抗体。在发作后或出现临床症状后成功地施用抗体，伴随临床症状的可能的减轻以及也许疾病的缓解，包括疾病的治疗。上述“需要治疗的”包括已患所述疾病或病症的，以及倾向于患所述疾病或病症的哺乳动物，包括要被预防疾病或病症的那些。
在特定的实施方案中，抗体在体内用于治疗、预防或诊断多种TL1A介导的疾病。因而，本发明提供了在受试者中治疗TL1A介导的病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体或其片段。示例性的TL1A介导的病症包括但不限于，炎症性疾病和/或自身免疫性疾病，例如炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，类风湿性关节炎，MS，1型和2型糖尿病，牛皮癣，牛皮癣关节炎，强直性脊柱炎，特应性皮炎；过敏反应或病况，包括例如，哮喘和过敏性肺部炎症；癌症，动脉粥样硬化，感染，神经退行性疾病，移植排斥，移植物抗宿主疾病(GVHD)和心血管病症/疾病。本发明还提供了用于治疗受试者中的TL1A介导的病症的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的抗体或其片段。示例性TL1A介导的病症包括，但不限于，炎症性疾病和/或自身免疫性疾病，例如炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，类风湿性关节炎，MS，1型和2型糖尿病，牛皮癣，银屑病关节炎，强直性脊柱炎，特应性皮炎；过敏反应或病况，包括例如，哮喘和过敏性肺部炎症；癌症，动脉粥样硬化，感染，神经退行性疾病，移植排斥，移植物抗宿主疾病(GVHD)和心血管病症/疾病，慢性阻塞性肺疾病COPD，视神经炎，年龄相关性黄斑变性，系统性红斑狼疮(SLE)，sjogen综合征，硬皮病，全身性硬化症，慢性肾病，肝纤维化，结核病，特发性肺纤维化，肺结核引起的肺纤维化，腹膜后纤维化，肺纤维化，囊性纤维化，心内膜心肌纤维化，心房纤维变性，纵隔纤维变性，骨髓纤维变性(骨髓)，腹膜后纤维化，进行性大块纤维化，系统性肾源性纤维化，关节纤维化。优选的是，TL1A介导的病症包括炎症性疾病和/或自身免疫疾病，尤其包括炎症性肠道疾病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)，类风湿关节炎，MS和动脉粥样硬化。
用本发明的抗体治疗的优选的TL1A介导的病症选自炎症性肠道疾病，多发性硬化症，类风湿关节炎和哮喘。用本发明的抗体治疗的特别优选的TL1A介导的病症是炎症性肠道疾病。
实施例7描述了用于评估抗TL1A抗体在TL1A介导的病症中的功能活性的哮喘动物模型，实施例8和9描述了IBD动物模型。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于检测TL1A的水平，或在其膜表面含有TL1A的细胞的水平，所述水平之后可与某些疾病症状关联。可选地，所述抗体可用于抑制或阻断TL1A功能，其反过来可与某些疾病症状的预防或缓解相关，从而提示TL1A作为疾病的介质。这可以通过在允许抗体和TL1A之间形成复合体的条件下，将样品和对照样品与TL1A抗体接触来实现。在样品和对照中检测在抗体和TL1A之间形成的任何复合体并比较。根据本发明抗体与TL1A的特异性结合，本发明抗体可用于特异性检测细胞表面表达的TL1A表达，例如可用于检测具有低或者高TL1A表达水平的患者。本发明的抗体还可用于通过免疫亲和纯化来纯化TL1A。
在另一个实施方案中，可以初步测试本发明抗体与治疗或体外诊断用途相关的结合活性。例如，可以使用流式细胞仪测定来测试本发明的组合物。
本发明还提供了使用抗体或其片段作为药物的用途，和抗体或其片段在制备用于治疗TL1A介导的病症的药物中的用途。在其他实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，其用作为药物。本发明还提供了抗体或其片段，用在治疗TL1A介导的病症的方法中。TL1A介导的病症如上文所述。本发明的抗体特别可用于治疗不依赖于患者的DR3共刺激状态的TL1A介导的病症。在优选的实施方案中，抗体或其片段可用于在表达高水平TL1A的患者中治疗TL1A介导的病症。
如前所述，本发明的抗TL1A抗体可以和一种或其它多种治疗剂共同施用，例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂。所述抗体可以与药剂连接(作为如上所述免疫复合物)或者可以与药剂分别施用。在后一种情况下(分别施用)，可以在药剂之前、之后或同时施用抗体，或者可以与其它已知的疗法共同施用抗体，所述疗法例如抗癌疗法，例如放射。
对于施用抗体，剂量范围为宿主体重的从约0.0001至100mg/kg，更常见从0.01至10mg/kg。示例性的治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次或每3至6个月一次施用。通常在多种情况施用所述抗体。单次剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三月或每年。间隔还可以是不规律的，通过测量血液的抗体水平与患者中的靶抗原指示。在一些方法中，调节剂量获得约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，而在一些方法中，约25-300μg/ml。可选地，可以以持续释放的制剂施用抗体，在此情况下需要较低的施用频率。剂量和频率根据患者中的抗体的半衰期而变化。施用的剂量和频率可以根据所述治疗是预防性还是治疗性而改变。在预防性应用中，在较长时间段中，以相对较不频繁的间隔，施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直到降低或终止疾病的进展。
活性成分的实际剂量(即，本发明的药物组合物中的抗体)是可以改变的，从而获得活性成分的这样的量，对于特定的患者、组合物和施用模式，所述量有效地实现理想的治疗响应，而对患者没有毒性。选定的剂量水平取决于多种药物动力学因子，包括所使用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定抗体的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、年龄、性别、体重、病况、健康状态和受治患者之前的药物史等本领域普遍已知的因素。
“治疗有效量”的本发明的TL1A抗体优选导致疾病症状严重程度的减少、疾病无症状期的频率和持续期的增加，和/或预防由于病痛导致的损伤或残疾。可以在预测人类功效的动物模型系统中评估化合物治疗TL1A介导的病症的能力。可选地，可以通过检验化合物抑制细胞生长的能力，来评估组合物的该特性，可以通过熟练的技术人员已知的测定在体外测量此类抑制作用。本领域的普通技术人员将能够基于如下因素确定所述量，例如受试者的尺寸、受试者症状的严重程度，和所选定的特定组合物或施用途径。
可以利用本领域已知的各种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径，来施用本发明的抗体或组合物。如熟练的技术人员所理解的，施用的途径和/或方式将根据所需的结果而改变。优选的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱的或其它不经肠道的施用途径，例如通过注射或输注。更优选的施用途径是静脉内或皮下的。本文中使用的词组“不经肠道的施用”意指除肠和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、硬膜内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管的、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内的注射和输注。可选地，可以通过非不经肠道的途径施用本发明的抗体，例如局部的、表皮的或粘膜的施用途径，例如鼻内、口服、阴道的、经直肠的、舌下的或局部的。
制品和试剂盒
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于治疗TL1A介导的病症的、包括本发明的抗体或其片段、组合物或免疫缀合物的制品。制品可包括容器，和与容器相关联或在其上的标签或包装内置物。合适的容器包括例如瓶、管状瓶或注射器。可以用多种材料形成容器，例如玻璃或塑料。容器保留对治疗病况有效的组合物，可具有无菌的入口(例如，容器可以是静脉内用溶液包或管状瓶，具有可被皮下注射针头穿刺的瓶塞)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的抗体。标签或包装内置物可指示所述组合物可用于治疗选择的病况，例如癌症。在一个实施方案中，标签或包装内置物可指示包括抗体的所述组合物可用于治疗TL1A介导的病症。
此外，制品可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包括本文的抗体，和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包括抗体以外的治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品可进一步包括包装内置物，其指示第一和第二组合物可组合地用于治疗TL1A介导的疾病或病症。此类治疗剂可以是上述章节中描述的任何附属疗法(例如，血栓溶解剂、抗血小板剂、化疗剂、抗血管发生剂、抗激素化合物、保心药和/或哺乳动物免疫功能的调节剂，包括细胞因子)。可选地或额外地，制品可还包括包含可药用缓冲液的第二(或第三)容器，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格液(Ringer'ssolution)和葡萄糖溶液。还可包括其他对商业和用户观点而言理想的材料，包括其他的缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
还落入本发明范围内的是包含本发明的抗体、组合物或免疫缀合物和使用说明的试剂盒。试剂盒可进一步含有一种或多种其他试剂，例如免疫抑制剂、细胞毒性剂或放射毒性剂，或一种或多种其他的本发明的抗体(例如，结合TL1A抗原中不同于第一抗体的表位的抗体，其具有补充活性)。
不需进一步描述，可以相信本领域的普通技术人员可以利用上述说明和下列示例性实施例，制造和利用本发明的药剂和实施要求保护的方法。下列工作实施例供促进本发明的实践所用，并非被视为对本发明其余内容的任何方式的限制。
实施例
实施例1：生成和筛选小鼠抗人TL1A抗体
为了生产重组TL1A-Fc蛋白，从Source BioScience购买了人TL1A基因的cDNA(Nottingham，UK；克隆编号：IRATp970G02115D)。使用该cDNA作为模板，利用PCR扩增经处理的分泌版本的人TL1A的编码区(SEQ ID NO:116)。使用引物GlnPr994和GlnPr995(分别为SEQ ID NO:119和120)进行该PCR。引物GlnPr994添加胞外区的BamHI限制性位点5'并切割天然信号肽。引物GlnPr995添加胞外区的HindIII限制性位点3'。使用侧翼限制性位点BamHI和HindIII切割扩增子并克隆到基于Invitrogen(Invitrogen AG，Basel，瑞士)的pcDNA3.1(-)质粒的经修饰哺乳动物表达载体中，表达Fc融合构建体。表达载体含有人CMV启动子和美国专利5,924,939所述的Ig供体受体片段(第一内含子)、OriP序列(Koons MD等人，(2001)J Virol.75(22):10582-92)、SV40增强子和与胃泌素终止子融合的SV40polyA，如Kim D等人，(2003)Biotechnol.Prog.19(5):1620-2所述。该表达盒包含Fc融合蛋白的开放阅读框的上游kozak区，接着是信号肽，通过BamHI限制性位点终止以方便克隆。融合蛋白的Fc区由HindIII限制性位点开始以方便克隆，接着是小甘氨酸-丝氨酸接头。为了释放Fc区的上游构建体，使用BamHI(NEB,Ipswich,MA,USA)和HindIII(NEB,Ipswich,MA,USA)切割，使用CIP(NEB,Ipswich,MA,USA)处理和凝胶纯化所述载体。人TL1A的胞外区的插入编码在骨架中连接并在大肠杆菌Top 10细胞(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)中转化，导致Fc融合表达构建体(SEQ ID NO：117)。SEQ ID NO:117的前20个氨基酸对应于信号序列，其不存在于最终的Fc融合表达构建体中。
该重组质粒允许在哺乳动物细胞中表达人TL1A-Fc融合蛋白，并通过信号肽驱动分泌到细胞培养基中。为了生产重组蛋白质，使用jetPEITM转染试剂(Polyplus-transfection S.A.,Strasbourg,France；供应商:Brunschwig,Basel,瑞士)，将上述重组载体转染到适应悬浮的HEK 293细胞(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)中。在5天后收集细胞培养上清液，并使用在
Figure BDA0000795281120000521
FPLC系统(GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)上操作的蛋白A亲和纯化柱(HiTrap Protein A琼脂糖柱；GEHealthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)进一步纯化。
为了产生具有his-标签的分泌的重组人TL1A蛋白，利用引物GlnPr1542和GlnPr1543(分别为SEQ ID NO:121和122)添加N-末端6xHis接头，通过PCR扩增经处理版本的分泌人TL1A的DNA序列编码。使用引物GlnPr1544(SEQ ID NO：123)和GlnPR1543的第二轮PCR添加信号肽和方便的侧翼限制性位点用于克隆(5'：NheI；3'：XhoI)。用NheI和XhoI(NEB,Ipswich,MA,USA)切割PCR产物，并随后在上述经修饰pcDNA3.1(-)质粒中克隆，使用相同的酶和CIPed切割。此限制性消化释放先前存在于表达载体中的整个Fc-融合蛋白的开放阅读框。在Top 10大肠杆菌细胞中连接和转化之后，基于限制性消化和带有N-端his-标签的分泌TL1A的表达构建体(SEQ ID No:118)的测序选择最终的质粒。SEQ ID NO:118的前20个氨基酸对应于信号序列，其不存在于最终的N端his-标签表达构建体中。
该重组质粒允许在哺乳动物细胞中表达人TL1A-Fc融合蛋白，并分泌到细胞培养基中。为了生产重组蛋白质，使用jetPEITM转染试剂(Polyplus-transfection S.A.,Strasbourg,France；供应商:Brunschwig,Basel,瑞士)，将上述重组载体转染到适应悬浮的HEK 293EBNA细胞(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)中。在5天后收集细胞培养上清液，并使用在FPLC系统(GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)上操作的Ni2+-NTA亲和纯化柱(HiTrap Ni2+-NTA琼脂糖柱；GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)纯化。将重组人TL1A-Fc和TL1A-his蛋白的缓冲液改变为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。将溶解在PBS中的重组TL1A-Fc蛋白与等体积的Stimune佐剂(Prionics,瑞士)混合，并制备乳状液。将乳状液转移到0.5mL胰岛素注射器(BD Pharmingen,Allschwil,瑞士)中，并用50μg乳化蛋白在后足垫、尾基部和颈部皮下免疫BALB/c动物(Harlan,Netherlands)。2周后，用相同的抗原量和相同的注射途径重复免疫。
使用包被了重组TL1A-his蛋白的平板，通过直接ELISA评估在免疫的小鼠血清中存在的循环型抗TL1A抗体。将一系列稀释度(1:100至1:109)的不同小鼠血清添加到平板中，并使用山羊抗小鼠H+L完整分子-HRP(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)检测结合的抗体。在处死前3天，在表现出最佳抗TL1A-IgG血清滴度的动物中，用50μg不含佐剂的抗原进行最后一次皮下加强。
使动物安乐死，收集腹股沟、腋下、手臂、腘和髋部的淋巴结，用2个25G针头，在DNA酶(Roche Diagnostics(Schweiz)AG,Rotkreuz,瑞士)和胶原酶(Roche Diagnostics(Schweiz)AG,Rotkreuz,瑞士)溶液中分散淋巴结结构，制备单细胞悬浮液。用聚乙二醇1500(Roche Diagnostics(Schweiz)AG,Rotkreuz,瑞士)，以比例7:1(融合配偶体与收获的淋巴结细胞)融合单细胞悬浮液与骨髓瘤细胞系X63AG8.653(小鼠BALB/c骨髓瘤细胞系；ATCC登录号：CRL 1580；Kearney JF等人，(1979)J.Immunol.123(4):1548-1550)。将融合的细胞种植到含有小鼠巨噬细胞的96孔平底平板中，所述平板含有补充了10％胎牛血清(FBS,PAA Laboratories,Pasching,Austria)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml(Biochrom AG,德国)青霉素、100μg/ml链霉素(Biochrom AG,德国)、10mM HEPES(Invitrogen AG,Basel,瑞士)、50μMβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)、HAT(Sigma-AldrichChemie GmbH,Buchs,瑞士)和1％生长因子(Hybridokine,Interchim/Uptima,France)的DMEM-10培养基(Invitrogen AG,Basel,瑞士)。
通过ELISA从融合物中筛选约800个孔，寻找所存在的识别TL1A和阻断TL1AL与其受体结合的小鼠IgG。扩展阳性细胞，并进行2轮亚克隆。收集细胞，克隆和测序重链和轻链。
实施例2：
从杂交瘤细胞中克隆和测序抗TL1A抗体的VH和VL链
对于每个阳性的选定杂交瘤，制备总RNA，逆转录成cDNA，通过PCR分别扩增VH和VL基因。将这些PCR产物连接到拯救载体(pDrive载体；QIAGEN AG,Hombrechtikon,瑞士)中，允许对单个PCR产物DNA测序，确定选定杂交瘤的单克隆性或多克隆性。该载体允许在含有IPTG和X-gal的LB琼脂平板上进行蓝白选择(由于LacZα–肽对X-gal的降解，没有插入物的克隆是蓝色的)。从阳性(白色)细菌克隆制备重组质粒，并使用载体骨架特异性的标准DNA测序引物(M13rev、M13fwd、T7或SP6)测序。最终将DNA序列亚克隆到用于在哺乳动物细胞中重组表达目标抗体的表达载体中。
分离RNA
根据生产商的操作规程，使用QIAGEN的RNeasy Mini Kit(QIAGEN AG,Hombrechtikon,瑞士)，从2-10x106细胞中分离总RNA；使用NanoDrop ND-1000分光光度计(WITEC AG,Littau,瑞士)定量样品。
一步RT-PCR
将上述总RNA制品进一步逆转录成cDNA，使用2个不同的简并引物的混合物，通过PCR扩增VH和VL片段，每种简并引物的混合物都允许回收小鼠免疫球蛋白重链可变片段和可变重链连接区的所有不同亚类，或回收所有的小鼠免疫球蛋白轻链κ可变片段和可变轻链κ连接区。用于逆转录和扩增的引物通过Microsynth(Balgach,瑞士)合成，并HPLC纯化(表1-4)。使用QIAGEN一步RT-PCR试剂盒(QIAGEN AG,Hombrechtikon,瑞士)同时实施逆转录和PCR扩增。由于技术使用特定的引物，将每种mRNA样品重复处理2份，允许分别逆转录和扩增VH或VL片段。将2μg总RNA溶解在不含RNA酶的水中，至终体积30μl，与10μl的QIAGENOneStep RT-PCR缓冲液的5x储液、2μl浓度为10mM的dNTP混合物，3μl浓度为10μM的引物混合物和2μl的QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix混合。然后将最终混合物放在PCR管中，并在PCR热循环仪(BioRad iCycler version4.006,Bio-Rad Laboratories AG,Reinach,瑞士)中循环，循环使用下列设置：
50℃，30min
95℃，15min
40个循环：94℃，30sec
55℃，30sec
72℃，1min
72℃，10min
保持在4℃
pDrive克隆
在2％琼脂糖凝胶上运行PCR产物。在DNA电泳后，从琼脂糖凝胶上切下目标片段(～450bp)，并使用Macherey-Nagel NucloSpin Extract II试剂盒250(Macherey-Nagel,Oensingen,瑞士)进一步抽提。为了DNA测序，将抽提的PCR产物克隆到上述拯救载体(pDrive载体,QIAGEN AG,Hombrechtikon,瑞士)中，并转化到E.coli TOP10菌株(Invitrogen AG,Basel,瑞士)中。
Miniprep抽提
在1.5ml补充了100μg/ml青霉素的Luria Bertani(LB)培养基中，37℃(振荡250RPM)培养阳性克隆过夜，接种在Macherey-Nagel Square-well Block平板(Macherey-Nagel,Oensingen,瑞士)上。第二天，使用NucleoSpin Multi-8Plasmid试剂盒(Macherey-Nagel,Oensingen,瑞士)，实施DNA miniprep抽提。
测序和序列分析
将样品送去DNA测序服务公司Fasteris(Plan-les-Ouates,瑞士)，进行DNA测序。使用标准引物：M13rev、M13fwd、T7、SP6(表5)。为了分析DNA序列，使用Clone Manager 9专业版(Scientific&Educational Software,NC,USA)和BioEdit Sequence AlignmentEditor(Hall,TA(1999)Nucl Acids Symp Ser 41:95-98)。
克隆表达载体用于重组嵌合抗体表达
为了在哺乳动物细胞中重组表达，使用基于装配的PCR方法，将分离的鼠VH和VL片段装配成嵌合免疫球蛋白。这些嵌合抗体由重链和轻链组成，在所述重链中，鼠重链可变结构域与人IgG1重链恒定结构域(γ1、铰链区、γ2和γ3区)融合，在所述轻链中，鼠轻链可变结构域与人κ恒定结构域(Cκ)融合。将PCR装配的鼠可变部分和人恒定部分克隆到修饰型哺乳动物表达载体中，所述载体是基于实施例1提及的Invitrogen的修饰型pcDNA3.1(-)载体，差别在于使用人免疫球蛋白轻链κ前导肽驱动蛋白质分泌。为了免疫球蛋白候选物的蛋白质生产，将等量的重链和轻链载体DNA共转染到适应悬浮的HEK293细胞(ATCC编号CRL1573)中。在转染5天后收集细胞培养上清液，并使用在FPLC系统上操作的蛋白A亲和纯化柱(HiTrap蛋白A琼脂糖柱)(都来自GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)纯化。
表1：引物Mix VH–反向
1 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAK GTR MAG CTT CAG GAG TC SEQ ID NO:65
2 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC SEQ ID NO:66
3 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTG CAG CTG AAG SAR TC SEQ ID NO:67
4 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC SEQ ID NO:68
5 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTY CAG CTB CAG CAR TC SEQ ID NO:69
6 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTY CAR CTG CAG CAR TC SEQ ID NO:70
7 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTC CAC GTG AAG CAR TC SEQ ID NO:71
8 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG AAS STG GTG GAR TC SEQ ID NO:72
9 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAV GTG AWG STG GTG GAG TC SEQ ID NO:73
10 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG CAG STG GTG GAR TC SEQ ID NO:74
11 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAK GTG CAM CTG GTG GAR TC SEQ ID NO:75
12 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC SEQ ID NO:76
13 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG CAR CTT GTT GAR TC SEQ ID NO:77
14 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAR GTR AAG CTT CTC GAR TC SEQ ID NO:78
15 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAA GTG AAR STT GAG GAR TC SEQ ID NO:79
16 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTT ACT CTR AAA SAR TC SEQ ID NO:80
17 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTC CAA CTV CAG CAR CC SEQ ID NO:81
18 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAT GTG AAC TTG GAA SAR TC SEQ ID NO:82
19 GTG ATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG AAG GTC ATC GAR TC SEQ ID NO:83
表2：引物Mix VH–正向
1 CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA AAC GGT GAC CGT GGT SEQ ID NO:84
2 CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT SEQ ID NO:85
3 CCTCCACCACTCGAGCC CGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT SEQ ID NO:86
4 CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT SEQ ID NO:87
表3：引物Mix VL–反向
1 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATC CAG CTG ACT CAG CC SEQ ID NO:88
2 GGCGGTGGC GCT AGC CAA ATT GTT CTC ACC CAG TC SEQ ID NO:89
3 GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT GTG MTM ACT CAG TC SEQ ID NO:90
4 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG YTR ACA CAG TC SEQ ID NO:91
5 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTR ATG ACM CAG TC SEQ ID NO:92
6 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT MAG ATR AMC CAG TC SEQ ID NO:93
7 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT CAG ATG AYD CAG TC SEQ ID NO:94
8 GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATY CAG ATG ACA CAG AC SEQ ID NO:95
9 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTT CTC AWC CAG TC SEQ ID NO:96
10 GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT GWG CTS ACC CAA TC SEQ ID NO:97
11 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT STR ATG ACC CAR TC SEQ ID NO:98
12 GGCGGTGGC GCT AGC GAY RTT KTG ATG ACC CAR AC SEQ ID NO:99
13 GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT GTG ATG ACB CAG KC SEQ ID NO:100
14 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATA ACY CAG GA SEQ ID NO:101
15 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATG ACC CAG WT SEQ ID NO:102
16 GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATG ACA CAA CC SEQ ID NO:103
17 GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT TTG CTG ACT CAG TC SEQ ID NO:104
18 GGCGGTGGC GCT AGC GAA ACA ACT GTG ACC CAG TC SEQ ID NO:105
19 GGCGGTGGCGCT AGC GAA AAT GTK CTS ACC CAG TC SEQ ID NO:106
20 GGCGGTGGCGCT AGC CAG GCT GTT GTG ACT CAG GAA TC SEQ ID NO:107
表4：引物Mix VL–正向
1 ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT KAT TTC CAG CTT GG SEQ ID NO:108
2 ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT TAT TTC CAA CTT TG SEQ ID NO:109
3 ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT CAG CTC CAG CTT GG SEQ ID NO:110
4 ATGCTGAC GC GGC CGC ACC TAG GAC AGT CAG TTT GG SEQ ID NO:111
表5：测序引物
M13-Fwd GTAAAACGACGGCCAGT SEQ ID NO:112
M13-Rev AACAGCTATGACCATG SEQ ID NO:113
T7 TAATACGACTCACTATAGG SEQ ID NO:114
SP6 GATTTAGGTGACACTATAG SEQ ID NO:115
实施例3：
抗人TL1A抗体的生物学表征
TL1A-特异性抗体检测ELISA
通过直接ELISA确定杂交瘤和重组抗体候选物的抗体滴度、特异性和生产。简而言之，用100μl在PBS中2μg/ml的重组人TL1A-his包被96孔微滴度板(Costar USA,供应商VWRAG,Nyon,瑞士)。在4℃孵育平板过夜，然后用PBS 2％BSA(牛血清白蛋白，PAALaboratories,Pasching,Austria)在室温(RT)封闭1小时。去除封闭溶液，加入杂交瘤上清液或纯化的抗体。在RT孵育平板30分钟，然后用PBS 0.01％Tween-20(Sigma-AldrichChemie GmbH,Buchs,瑞士)洗涤9次，加入1:1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠H+L-检测抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)。为了检测具有人Fc的重组嵌合抗体(参见实施例2)，使用1:1000稀释的HRP标记的兔抗人IgG抗体(Sigma-AldrichChemie GmbH,Buchs,瑞士)作为检测抗体。在室温(RT)孵育平板30分钟，用PBS 0.01％Tween-20洗涤9次，向平板加入TMB底物(Bio-rad Laboratories AG,Reinach,瑞士)，通过2至6分钟后添加H2SO4终止反应。然后通过显微平板读板器读取450nm吸光值(Biotek,USA；供应商:WITTEC AG,Littau,瑞士)。图1A显示了各种克隆的亲本杂交瘤上清液识别人TL1A-his包被的蛋白而不识别无关的带his-标签的蛋白。
TNFRSF25阻断ELISA
如下生成重组人TNFRSF25受体蛋白(TNFRSF25)：从Source Biosystems(Nottingham,UK)购买人TNFRSF25的cDNA(克隆名称：IRCMp5012F0812D)，用侧翼的限制性位点扩增人TNFRSF25的胞外部分(氨基酸25-199)(根据Uniprot Q93038序列编号)。之后，将得到的包括N-端8-His标签序列的PCR产物克隆到Invitrogen的修饰型pcDNA3.1载体版本(Invitrogen AG,Basel,瑞士)中，该载体携带了CMV启动子、牛生长激素聚腺苷酸化，和驱动重组蛋白分泌的鼠VJ2C前导肽。为了生产重组蛋白质，使用jetPEITM转染试剂(Polyplus-transfectionS.A.,Strasbourg,France；供应商:Brunschwig,Basel,瑞士)，将重组载体转染到适应悬浮的HEK293细胞(ATCC编号CRL1573)中。在5天后收集细胞培养上清液，并使用在FPLC系统(GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)上操作的蛋白A亲和纯化柱(HiTrap蛋白A琼脂糖柱；GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)纯化。
为了确定生成的抗TL1A抗体是否可以阻断TL1AL与TNFRSF25受体的结合，研发了阻断ELISA。用100μl在PBS中2μg/ml的重组人TL1A-Fc(参见实施例1)或者重组的未加标签的TL1A(R&D Systems,Minneapolis,USA)，包被96孔微滴度板(Costar,USA；供应商VWR AG,Nyon,瑞士)。在4℃孵育平板过夜，然后用PBS 2％BSA在RT封闭1小时。去除封闭溶液，向平板加入杂交瘤上清液或纯化的抗体。5分钟后，向每个孔加入50μl的4μg/ml的重组人TNFRSF25-Fc-his(R&D Systems)。在RT孵育平板60分钟，然后用PBS 0.01％Tween-20洗涤9次，加入1:2000稀释的小鼠抗聚组氨酸HRP(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)。在RT孵育平板30分钟，用PBS 0.01％Tween-20洗涤9次，向平板加入TMB底物(Bio-radLaboratories AG,Reinach,瑞士)，6分钟后添加H2SO4终止反应。然后通过显微平板读板器读取450nm吸光值(Biotek,USA；供应商:WITTEC AG,Littau,瑞士)。图2显示了纯化的抗体能够以剂量依赖性的方式阻断TL1A和TNFRSF25之间的相互作用。
引发的CD4 T细胞抑制TL1A诱导的IFN-γ分泌
IL-12和IL-18细胞因子引发的CD4 T细胞向TH1表型和分泌的IFN-γ极化。TL1A已经显示了引发的CD4 T细胞增强IFN-γ的生产。因此，我们测试是否嵌合5G6抗体可以阻断IFN-γ生产的这种TL1A依赖性增加。
为了纯化外周血单核细胞的人CD4 T细胞(PMBC)，从La Chaux-de-Fonds,瑞士的血液收集中心(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Sérologie,rueSophie-Mairet29,CH-2300)，收集含有人白细胞的过滤器。通过用60mL含有10U/mLliquemin(Drossapharm AG,Lucern,瑞士)的PBS反冲洗，从过滤器移出细胞。然后，按生产商的说明，用50mL Blood-Sep-Filter管(供应商：Brunschwig,Basel,瑞士)纯化PBMC。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞3次，然后根据制造商的说明，使用Miltenyi(Gladbach,德国)的新生CD4 T细胞纯化试剂盒，用于CD4纯化。
测试5G6抗体以确定其是否能抑制天然产生的TL1A的效果。用已经通过免疫复合物(IC)预活化的单核细胞孵育IL-12和IL-18引发的CD4 T细胞，并且测定产生的IFN-γ。根据制造商的说明，使用Miltenyi的单核细胞分离试剂盒II(Gladbach,德国)，从PBMCs分离单核细胞(见上文)。单核细胞IC刺激如下进行：在PBS中，在室温下，将50μg/mL的chrompure人IgG(Jackson Immuno Research Europe Ltd,Newmarket,UK)包被在12孔细胞培养板(TPP，Trasadingen，瑞士)上2小时。然后板用PBS洗涤，并在室温下用小鼠抗人IgG(JacksonImmunoResearch)孵育1小时。在镀纯化的单核细胞之前用PBS洗涤包被的板一次。在5％CO2培养箱中，在37℃下孵育48-72小时后，收集IC-刺激的单核细胞。
为了流式细胞术分析，在V底96孔微量滴定板(TPP，Trasadingen，瑞士)中，在4℃下，用10μg/mL的抗TL1A-PE抗体(GeneTex,由Lucerna Chem.AG供应，Lucerna,瑞士)或者兔同种型对照(BD Pharmingen,Allschwil,瑞士)染色IC-刺激的单核细胞30分钟。稀释缓冲液(FACS缓冲液)是补充有2％胎牛血清(FCS，由Bioconcept供应的Amimed，Allschwil，瑞士)和10％Versene(Gibco Life Technologies)的PBS。孵育后，将100μL的FACS缓冲液加入到各孔中，将板以300g离心3分钟。丢弃上清液，并将在FACS缓冲液中0.2μg/mL的样品再悬浮于100μL的PE-抗兔二抗溶液中。在4℃下孵育样品20分钟。如上所述地洗涤该板并且在300μL的FACS缓冲液中再悬浮样品并且立即在FACSCyan流式细胞仪(Beckman CoulterInternational S.A.,Nyon,瑞士)上获取。对于可溶性TL1A定量，根据制造商的建议，在不同的时间点(20，48和72小时)收集IC-刺激的单核细胞培养物的上清液并且利用人TL1A开发ELISA试剂盒(Peprotech)定量sTL1A。
对于单核细胞-T细胞共培养，在CO2培养箱中，在37℃下，用8ng/mL的IL-12(Peprotech)和200ng/mL的IL-18(MBL International，由LabForce AG供应，Nunningen，瑞士)在平底-96孔板(TPP)中接种IC-刺激的单核细胞(104)和CD4纯化的T细胞(105)。72小时后收集培养上清并且如上所述地定量IFN-γ。
IC-刺激的单核细胞在其膜上表达TL1A(mTL1A)(图3A)，但是更基本上作为可溶性因子(sTL1A)(图3B)并且通过共培养的CD4 T细胞诱导IFN-γ的强烈产生(图3C)。完全抑制由IC-刺激单核细胞诱导的IFN-γ的产生的5G6抗体显示强力阻断mTL1A和sTL1A介导作用。
实施例4：
结合小鼠、大鼠、食蟹猴和人TL1A的亲本5G6候选物
用ELISA测试亲本5G6抗体(产生为带有人Fc的嵌合抗体)对来自不同物种的TL1A的胞外部分的反应性。在PBS中，在4℃下，以2μg/mL的浓度在高结合96孔板(Costar,USA；供应商VWR AG,Nyon,瑞士)上固定对应于人(智人)、大鼠(褐家鼠)、小鼠(小家鼠)和食蟹猴(长尾猴)序列(分别为SEQ ID NO：38，39，40和41)的TL1A蛋白的胞外部分过夜。在RT下，用2％BSA白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich Chemie，Buchs，瑞士)封闭板一小时。移除封闭溶液并且对板施用剂量稀释的5G6抗体。在RT下孵育板60分钟，用PBS 0.01％Tween-20洗涤6次并且对板加入TMB底物(Bio-rad Laboratories AG,Reinach,瑞士)。6分钟后加入H2SO4停止反应并且使用以稀释度1：1000加入的HRP标记的抗人IgG二抗(Sigma-Aldrich Chemie，Buchs，瑞士)揭示5G6对不同TL1A蛋白的结合。通过酶标仪(Biotek,USA；供应商：WITTECAG，Littau，瑞士)读取板的450nm吸光度。图4显示5G6以剂量依赖的方式识别所有测试的物种的TL1A蛋白。
实施例5
小鼠单克隆抗体5G6的人源化
本文描述了人源化抗TL1A鼠抗体5G6，包括人受体框架的选择、回复突变和基本保留和/或改善人CDR移植受体框架结合特性的突变。
设计改造的可变区
使用同源性匹配来选择移植5G6CDR的人受体框架。可使用数据库(例如，人和小鼠免疫球蛋白基因座的种系可变基因的数据库(IMGT数据库，见上文)或VBASE2(Retter I.等人，(2005)Nucleic Acids Res.33,Database issue D671-D674)或Kabat数据库(JohnsonG.等人，(2000),Nucleic Acids Res.,28，第214-218页))或出版物(例如，Kabat等人，见上文))鉴别鼠重链和轻链V区(分别为SEQ ID NO:1和2)所属的人亚族，并确定用作受体分子的最适人种系框架。在这些用作受体的亚族中选择重链和轻链可变序列(VH和VL)可基于序列同源性和/或CDR1和CDR2区的结构匹配，来帮助在移植后保留六个CDR的恰当的相对呈现。
例如，IMGT数据库的使用提示在5G6重链可变结构域框架和人重链可变结构域亚类1的成员之间的良好的同源性。对种系序列观察到了CDR和框架序列的最高同源性和同一性：IGHV1-2*02(SEQ ID NO:3)，IGHV1-2*04(SEQ ID NO:4)，IGHV1-2*05(SEQ ID NO:5)，IGHV1-2*01(SEQ ID NO:6)，和IGHV1-46*01(SEQ ID NO:7)；其在达到CDR3的整个序列都具有高于67％的序列同一性，IGHV1-2*02和IGHV1-2*04具有69.4％序列同一性；而IGHV1-2*01和IGHV1-46*01分别具有68.4％和67.3％的序列同一性。
使用同一方法，5G6轻链可变结构域序列表现出与人轻链可变结构域κ亚类1的成员的良好同源性。对种系序列观察到了CDR和框架序列的最高同源性和同一性：IGKV1-33*01(SEQ ID NO:8)和IGKV1D-33*01(SEQ ID NO:9)表现出最高同一性(均具有80.0％同一性)，然后是由IGKV1D-12*02(SEQ ID NO:10)，IGKV1D-12*01(SEQ ID NO:11)和IGKV1-12*02(SEQ ID NO:12)组成的组，都表现出相同程度的序列同一性(75.8％)。
作为人源化过程的起点，选择人IGHV1-2*01(SEQ ID NO:3)和IGKV1-33*01(SEQID NO:8)可变结构域作为5G6CDR的受体。制备第一个人γ1同种型的人源化抗体(见下文)。抗体涵盖了人-小鼠杂交重链可变结构域和人-小鼠杂交轻链可变结构域。杂交重链可变结构域是基于人重链可变结构域IGHV1-2*01的，其中种系CDR1和2分别被5G6重链CDR1和2替换。从上述IMGT检索中鉴别出与人受体框架最匹配的JH片段序列。得到的人-小鼠杂交重链可变序列(具有人IGHV1-2*01框架区、5G6小鼠CDR和与人受体最佳匹配的JH)在本文中被称为重链可变结构域VH1，具有SEQ ID NO:13。类似的，用于该第一个人源化抗体候选物的人-小鼠杂交轻链可变结构域具有人IGKV1-33*01框架区、5G6小鼠CDR和与人受体最佳匹配的JK，在本文中被称为轻链可变结构域VL1，具有SEQ ID NO:14。所述涵盖VH1和VL1的第一个人源化抗体在本文中被缩写为VH1/VL1抗体。
生产第一人源化抗体原型
由GENEART AG(Regensburg，德国)以scFv模式合成VH1和VL1的编码DNA序列(cDNA)，从而允许单个cDNA序列涵盖两个可变结构域(SEQ ID NO:15)。通过PCR从该scFv构建体重新得到单个可变结构域cDNA，并使用PCR装配技术进一步在上游装配其相应的(多个)恒定结构域cDNA序列。最后，将完整的重链和轻链cDNA连接到独立的载体中，所述载体基于携带CMV启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号的修饰型pcDNA3.1载体(Invitrogen,CA,USA)。轻链特异性载体通过使用BamHI和BsiWI限制性酶位点，将目标轻链可变结构域cDNA连接到κ轻链恒定结构域cDNA之前，允许表达人κ同种型轻链；同时使用BamHI和SalI限制性酶位点改造重链特异性载体，允许将目标重链可变结构域cDNA连接到编码人IGHG1CH1、IGHG1铰链区、IGHG1 CH2和IGHG1CH3恒定结构域的cDNA序列之前。在重链和轻链表达载体中，分泌是由含有BamHI位点的小鼠VJ2C前导肽驱动的。BsiWI限制性酶位点位于κ恒定结构域中；而SalI限制性酶位点则可见于IGHG1 CH1结构域中。
通过使用聚乙稀亚胺(PEI,Sigma,Buchs,瑞士)，共转染等量的重链和轻链载体到适应悬浮的HEK293-EBNA1细胞(
Figure BDA0000795281120000661
目录编号:CRL-10852)中，瞬时生产VH1/VL1抗体(具有重链SEQ ID NO:16和轻链SEQ ID NO:17)。通常，用含有50μg编码重链的表达载体和50μg编码轻链的表达载体的DNA-PEI混合物，转染100ml密度为0.8-1.2百万细胞/ml的细胞悬浮液。当编码抗体基因的重组表达载体被导入宿主细胞中时，进一步培养细胞为期4至5天来生产抗体，以允许分泌到培养基(EX-CELL 293,HEK293-无血清培养基，Sigma,Buchs,瑞士)中，所述培养基补充了0.1％普流罗尼酸(pluronic acid)、4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml遗传霉素。
使用重组的蛋白A层流基质(GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)，从无细胞上清液中纯化VH1/VL1抗体，并在测定前缓冲液交换为磷酸缓冲盐溶液。
通过表面等离子共振的动力学结合亲和性常数(SPR)
利用重组组氨酸标记的TL1A作为分析物测定蛋白质-A捕获的抗体的动力学结合亲和常数(KD)。在室温下在BIAcore 2000(GE Healthcare-BIAcore,GE HealthcareEurope GmbH,Glattbrugg,瑞士)上进行测定，并用BiaEvaluation软件(BIAcore；v4.1，GEHealthcare Europe GmbH)分析。
通过注入35μl的1:1N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)/1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(v/v；5μl/min流速；在流路1和2)活化CM5研究级传感器芯片(GEHealthcare Europe GmbH；ref.BR-1000-14)。将蛋白A(ref.P7837；Sigma-Aldrich ChemieGmbH,Buchs,瑞士)在pH 4.5的乙酸盐缓冲液(GE Healthcare Europe GmbH,BR-1003-50；比pI低一个pH单位)中稀释为50μg/ml的最终浓度并且随后通过在两个流路1和2(5μl/min)上注入35μl而在先前活化的CM5传感芯片上固定。这对应于大约1500个应答单位(RU)。然后通过注入35μl的乙醇胺溶液(5μl/min)去活该蛋白质-A-CM5传感芯片。最后，实施两次注入10μl的甘氨酸溶液(GE Healthcare Europe GmbH,ref.BR-1003-54；10mM；pH 1.5)以释放非交联的蛋白A分子。
对于亲和力测定，将储存在1×PBS缓冲液中的嵌合和人源化抗体在HBS-EP缓冲液(GE Healthcare Europe GmbH，ref.BR-1001-8；0.01M HEPES，0.15M NaCl，EDTA 3mM，0.005％表面活性剂P20，pH值7.4)中稀释，并随后在蛋白-A CM5芯片的流路2上注入(30μl/min)以达到约180个RU。按照该捕获步骤，以30μl/min的流速对流路1和2(流路1用作参比)注入不同浓度的重组组氨酸标记的人TL1A。在每个结合事件之后，用注入20秒(30μl/min)的pH 1.5的甘氨酸缓冲液再生表面。
测量值(传感图(sensorgram)：fc2-fc1)与不具有质量传递的1:1分析物模型最佳拟合。为了说明在每次开始测量时蛋白A捕获抗体的实验误差的原因，在所有拟合中将Rmax值设为局部。解离时间是至少300-600秒。实施重复测量2次，包括0浓度样品作为参照。Chi2值表示每个点的实验数据和参照数据之间的方差总和；而剩余的点表示在拟合的每个点的实验数据和参照数据之间的差异。Chi2值和剩余值都用于评估实验数据和每个结合模型之间的拟合质量。
经移植的人框架的回复突变
由于从5G6鼠抗体直接移植的CDR导致不与TL1A结合的候选物(表6)，所以开始其中用鼠残基替换人残基的诱变。被称为回复突变的该过程是单克隆抗体人源化中最不可预测的程序。必需鉴别和选择鼠抗体中需要保留的关键框架残基，从而在保留亲和力的同时使人源化抗体的潜在免疫原性最小化。
为了鉴别可影响大部分CDR构象和/或可变结构域间包装的残基，使用设为自动模式的结构同源性-建模服务器SWISS-MODEL(Arnold K等人，(2006)Bioinformatics,22(2):195-201；http://swissmodel.expasy.org)，计算可变结构域的VH1-VL1对的3D模型。模型分析允许基于位置对CDR区和/或重链-轻链可变结构域包装的推定影响，选择一小组位置。该小组位置由以下可变重链位置和下列可变轻链位置组成，可变重链位置：37，48，50，67，69，71和75；下列可变轻链位置：5和34(Kabat编号)。
使用基因合成和标准诱变方法，制备在上述选定的位置具有回复突变的其他人源化候选物。合成涵盖VH2和VL2可变结构域的单个cDNA序列(SEQ ID NO：18)并用作进一步诱变的起始点。抗体表达和纯化按照上面描述的方法。如前所述，通过SPR测定人源化抗体候选物的结合亲和力。
表6显示了基于上述单取代或取代组合的选定人源化抗体的结合特性(KD)。在人源化变体中，VH3/VL1抗体具有对TL1A抗原的最高亲和力，表现出比5G6嵌合抗体低的KD。
通过差异扫描量热法分析选定的人源化抗TL1A抗体的热稳定性
使用差异扫描量热法(DSC)测量人源化抗体的热稳定性。单克隆抗体融解曲线是其同种型的特征(Garber E&Demarest SJ(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.355:751-7)，然而，即使在全长IgG中，也可以轻易地鉴别FAB片段的中点融解温度。使用这类FAB部分的中点融解监控人源化候选物的单克隆稳定性。
在VP-DSC差异扫描量热仪(MicroCal,Northampton,UK)上进行量热法测量。细胞体积是0.128ml，加热速率是200℃/h，过压保持在65p.s.i.。所有抗体都使用PBS(pH7.4)中1mg/ml的浓度。通过与含有相同缓冲液但省略了抗体的重复2次的样品比较，估计抗体的摩尔热容。使用标准的方法分析部分摩尔热容和融解曲线。在使用软件Origin v7.0中的Non-Two State模型进一步分析前，将热图进行基线校正和浓度归一化。
人源化变体VH5/VL1FAB片段83.8℃表现出单相变(single transition)，形状和幅度与协作解折叠一致，这一般是在紧密折叠的FAB片段中观察到的，表示改造过程对于保留FAB稳定性是成功的。总而言之，人源化变体表现出良好的热稳定性。
表6:人源化抗TL1A抗体
Figure BDA0000795281120000701
实施例6：
5G6人源化候选物可通过引发的CD4 T细胞阻断TL1A诱导的IFN-γ分泌
测试5G6抗体的人源化候选物以确定它们是否能抑制IFN-γ生产的TL1A依赖性增加。
如上述实施例3中所述，从外周血单核细胞(PMBC)纯化人CD4 T细胞。在补充有10％热灭活胎牛血清(FCS,Amimed distributed by Bioconcept,Allschwil,瑞士)、非必需氨基酸(PAA,distributed by Chemie Brunschwig AG,Basel,瑞士)、超谷氨酰胺(Lonza,Basel,瑞士)、丙酮酸钠(PAA)和青霉素/链霉素混合物(Gibco Lifetechnologies)的Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI-1640,PAALaboratories,Pasching,Austria)中进行所有的细胞培养。在同时以浓度100、10、1和0.1μg/mL(参见图5中的表格)加入的阻断5G6人源化抗体候选物(VH3/VL1–SEQ ID NOS:22和17，VH4/VL1–SEQ ID NOS:23和17，VH5/VL1–SEQ ID NOS:24和17和VH2/VL2–SEQ ID NO:21和25)的存在下，以8ng/mL的IL-12(Peprotech,Hamburg德国)，200ng/mL的IL-18(MBLInternational,由LabForce AG供应,Nunningen,瑞士)和带有N-端his-标签的可溶性人TL1A(由SEQ ID NO：118编码)孵育CD4纯化的T细胞(105个细胞/孔)72小时。在平底96孔细胞培养板(TPP AG，Trasadingen，瑞士)中加入100μg/mL的同种型对照。72小时后收集上清并且根据制造商的说明，利用OptEIA试剂盒(BD Pharmingen，Allschwil，瑞士)，通过ELISA定量IFN-γ。图5显示了人源化抗TL1A抗体能够实质上抑制产生IFN-γ。
实施例7：
5G6人源化抗体在过敏性哮喘的小鼠模型中有效
哮喘不会自发地在小鼠中发生，因此调查小鼠的这一疾病需要在气道中诱导哮喘样反应。已经开发了各种急性过敏原攻击模型，而且在本实施例中，使用BALB/c小鼠，因为它们发展良好的T辅助细胞2(Th2)-偏向的免疫反应(Boyce JA&Austin KF(2005)J ExpMed,201:1869-73)。源自鸡蛋的卵清蛋白是诱导小鼠顽固、过敏性肺部炎症的过敏原，因此通常用于过敏性哮喘的小鼠模型(Kumar RK et al.,(2008)Curr Drug Targets,9:485-94)。
在本实施例中，下面的免疫操作规程用于诱导过敏性哮喘：通过在第0天与第14天i.p.注射100μg在1mg的氢氧化铝和氢氧化镁的悬浮液(Imject Alum,Thermo Scientific,瑞士)上吸附的卵清蛋白(源自鸡蛋白的卵清蛋白，V级，Sigma Aldrich，瑞士)敏化BALB/c小鼠。在第28，30和33天，用50mg/kg的人源化5G6抗体(VH5/VL1；格式化的IgG4铰链稳定；SEQ ID NO：124和17)或相当量的对照人IgG i.p.处理小鼠。作为阳性对照，以5mg/kg使用地塞米松(Sigma,瑞士)。处理四小时后，用30mg/kg的甲苯噻嗪和150mg/kg氯胺酮(来自Graeub Veterinary products的Xylazol和Ketasol,瑞士)麻醉小鼠并且用10μg的卵清蛋白鼻内注入。三天后，处死小鼠，在它们的气管插管后，通过向肺部注入2ml的冷PBS进行支气管肺泡灌洗(BAL)。对BAL液中的细胞进行计数并通过流式细胞仪，使用CD11c和Siglec F细胞表面标记物检测嗜酸性粒细胞。
结果示于图6中，从中可以观察到，用人源化抗体5G6治疗导致哮喘小鼠的BAL液中的嗜酸性粒细胞的数目减少大约4倍。
实施例8：
5G6人源化抗体在小鼠的DSS诱导的急性结肠炎的治疗中有效
已经开发了炎症性肠病(IBD)的许多不同的动物模型，并且存在用于研究介入到IBD的发病机制中的各种因素和评估治疗方案的有价值的工具。葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型是一种广泛使用的炎症性肠道疾病模型，因为其简单并且与人IBD具有许多相似之处，尤其是溃疡性结肠炎(
Figure BDA0000795281120000721
M&Cerar A(2012)J Biomed Biotechnol,2012；718617；Wirtz S et al.,(2007)Nat.Protoc,2:541-6)。
为了评价人源化5G6抗体(VH5/VL1；装配的IgG4铰链稳定；SEQ ID NO：SEQ ID NO：124和17)在IBD中的潜在作用，通过在测试组的饮用水中施用2％的DSS(MW 36-50kDa；MPBiomedicals)5天，在C57Bl/6小鼠中诱导急性结肠炎的病况。给予对照组未经处理的自来水。施用DSS之后，给予试验组小鼠自来水7天。用50mg/kg人源化5G6抗体或等量的同种型对照i.p处理小鼠3x/周。作为阳性对照，以5mg/kg使用环孢菌素(Sandimmune，NovartisPharma，瑞士)。每日监测小鼠的体重减轻和粪便一致性。在第12天，处死所有小鼠，并测量其整个结肠长度。如图7所示，可以观察到，用人源化抗体5G6治疗小鼠导致由DSS诱导的大肠缩短的减少。
实施例9
5G6人源化抗体在小鼠的TNBS结肠炎的治疗中有效
通过三硝基苯磺酸(TNBS)的直肠内给药诱导大鼠肠炎症。所得局部溃疡和炎症炎症被认为涉及针对半抗原修饰的自身蛋白或管腔抗原的T细胞介导的应答(Wirtz S等人，见上文)。症状包括腹泻、潜血和体重减轻。
为了评价人源化5G6抗体(VH5/VL1；格式化IgG4铰链稳定的；SEQ ID NO：SEQ IDNO：124和17)在IBD中的潜在作用，通过向治疗组的麻醉大鼠的结肠内直肠内施用TNBS溶液(50％TNBS：50％200标准乙醇；16mg/ml TNBS(Sigma，目录#92822)64mg/kg(4ml/kg)而诱导Sprague-Dawley大鼠中的结肠炎。不给予对照组TNBS溶液。施用TNBS两小时后，用单剂量的人源化5G6抗体(50mg/kg)或者等量的同种型对照i.p处理大鼠。作为阳性对照，每天在施用TNBS两小时后以10mg/kg的剂量口服施用泼尼松龙(Sigma)并每日这样随后持续5天。第7天处死大鼠，并且利用以下评分系统以结肠得分判定疾病严重程度：
1)粘连：无＝0，最小＝1，涉及几个肠袢＝2
2)狭窄：无＝0，轻度＝2，严重的，近端扩张＝3
3)溃疡：无＝0，线性溃疡<1cm＝1，两个线性溃疡<1cm＝2，更多的溃疡位点或一个大的溃疡＝3
4)壁厚：小于1mm＝0，1-3mm＝1，>3mm＝2
如图8所示，可以观察到，用人源化抗体5G6治疗大鼠导致由TNBS诱导的疾病参数减少。
实施例10：
hDcR3-Fc和hDR3-Fc阻断5G6人源化抗体与hTL1A的结合
如上所述，TL1A是TNFRSF25/DR3和诱饵受体DcR3的配体。DR3是在T细胞激活期间上调的含死亡结构域受体，而且TL1A与DR3的相互作用可以在免疫应答期间促进T细胞扩增(Migone TS等人，见上文)。分泌的诱饵受体(DcR3)、肿瘤坏死因子受体的可溶性蛋白(TNFR)超家族、阻断TL1A的作用。(Kim S&Zhang L见上文)。
为了评估5G6人源化抗体是否可能干扰hTL1A与受体DR3和/或与诱饵受体DcR3的相互作用，在10μg/ml的人DcR3、DR3的胞外域的Fc融合(R&D系统)或者相关受体(Ctrl-Fc)的存在下，2μg/ml的his-标记的人TL1A在ELISA板上包被并且用20μg/ml的5G6人源化抗体(VH5/VL1；格式化的IgG4铰链稳定化的；SEQ ID NO:SEQ ID NO:124和17)孵育，然后用过氧化物酶缀合的抗人IgG(Fab特异性)检测。如在图9中可以观察到的，5G6人源化抗体与hTL1A的结合被hDcR3-Fc和hDR3-Fc阻断。这证实5G6人源化抗体与hTL1A的结合抑制hTL1A与DR3和DcR3的相互作用。
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Claims (29)

1.结合TL1A的抗体或其片段，其包括由SEQ ID NO:51的氨基酸序列组成的重链CDR1，由SEQ ID NO:52的氨基酸序列组成的重链CDR2，和由SEQ ID NO:53的氨基酸序列组成的重链CDR3；和包括由SEQ ID NO:54的氨基酸序列组成的轻链CDR1，由SEQ ID NO:55的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和由SEQ ID NO:56的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
3.权利要求1或2的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括这样的重链可变区序列，所述重链可变区序列包含选自SEQ ID NO:1、26、27、28和29的氨基酸序列或者包含与选自SEQ ID NO:1、26、27、28和29的重链可变区序列的非CDR区至少80％相同的重链可变区序列的非CDR区。
4.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括这样的重链序列，所述重链序列包含选自SEQ ID NO:21、22、23和24的氨基酸序列或者包含与选自SEQ ID NO:21、22、23和24的重链序列的非CDR区至少80％相同的重链可变区序列的非CDR区。
5.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括重链可变框架区，所述重链可变框架区是选自序列为SEQ ID NO:3的IGHV1-2*02、序列为SEQ ID NO:4的IGHV1-2*04、序列为SEQ ID NO:5的IGHV1-2*05、序列为SEQ ID NO:6的IGHV1-2*01和序列为SEQ ID NO:7的IGHV1-46*01的人基因的产物的框架区。
6.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链序列，并且其中重链可变框架区包括相对于相应鼠抗体的相应重链可变框架区的至少一个氨基酸修饰。
7.权利要求6的抗体或其片段，其中所述氨基酸修饰包括选自37、48、50、67、69、71和75的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中每个氨基酸位置根据Kabat编号表示。
8.权利要求1或2的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括这样的轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含选自SEQ ID NO:2、14和30的氨基酸序列或者包含与选自SEQID NO:2、14和30的轻链可变区序列的非CDR区至少80％相同的轻链可变区序列的非CDR区。
9.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括这样的序列，所述序列包含选自SEQ ID NO:17和25的氨基酸序列或者包含与选自SEQ ID NO:17和25的序列的轻链可变区序列的非CDR区至少80％相同的非CDR区。
10.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是选自序列为SEQ ID NO:8的IGKV1-33*01、序列为SEQ ID NO:9的IGKV1D-33*01、序列为SEQ ID NO:10的IGKV1D-12*02、序列为SEQ ID NO:11的IGKV1D-12*01和序列为SEQ ID NO:12的IGKV1-12*02的人基因的产物的框架区。
11.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链序列，其中所述轻链可变框架区包括相对于相应鼠抗体的相应轻链可变框架区的至少一个氨基酸修饰。
12.权利要求11的抗体或其片段，其中所述氨基酸修饰包括选自5和34的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中每个氨基酸位置根据Kabat编号表示。
13.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括：
(a)包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链序列；和
(b)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链序列；
或者包括：
(c)包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区序列；和
(d)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区序列。
14.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含选自IGHG1和IGHG4人免疫球蛋白的人重链恒定区。
15.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体具有未岩藻糖基化IGHG1 Fc区。
16.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体包括包含来自人IgG4(IGHG4)的CH1、具有S228P取代的来自人IgG4(IGHG4)的铰链和来自人IgG4(IGHG4)的CH2和CH3的同种型变体。
17.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合人TL1A并与小鼠、大鼠和食蟹猴TL1A交叉反应。
18.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是拮抗抗体。
19.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体是选自以下的抗体片段：Fab、Fab′、Fab′-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab')2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双抗体和三链抗体。
20.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段以700pM或更少的亲和力(KD)结合人TL1A。
21.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段保留了相应嵌合抗体的至少85％的TL1A结合亲和力(KD)。
22.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体具有大于80℃的Fab片段热稳定温度。
23.分离的核酸，其编码权利要求1至22的任一项的抗体或其片段。
24.组合物，其包含权利要求1至22的任一项的抗体或其片段，和可药用的载体。
25.权利要求1至22的任一项的抗体或其片段，用于治疗TL1A介导的病症的方法中。
26.权利要求25的抗体或其片段，用于治疗炎症性肠道疾病(IBD)、类风湿性关节炎、MS、1型和2型糖尿病、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、特应性皮炎；过敏反应或病症；癌症、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、移植排斥、心血管病症/疾病。
27.权利要求26的抗体或其片段，其中所述炎症性肠道疾病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
28.权利要求26的抗体或其片段，其中所述过敏反应或病症包括哮喘和过敏性肺部炎症。
29.用于治疗TL1A介导的病症的制品，其包含权利要求1的抗体或其片段。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110229471A1 (en) 2008-11-26 2011-09-22 Cedars-Sinai Medical Center Methods of determining responsiveness to anti-tnf alpha therapy in inflammatory bowel disease
WO2013044298A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Cephalon Australia Pty Ltd Antibodies against tl1a and uses thereof
EP4285988A3 (en) 2013-03-27 2024-03-06 Cedars-Sinai Medical Center Treating fibrosis by inhibiting tl1a
WO2015010108A1 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Cedars-Sinai Medical Center Signature of tl1a (tnfsf15) signaling pathway
AU2014343636A1 (en) * 2013-11-04 2016-06-02 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
RU2714157C2 (ru) * 2015-02-06 2020-02-12 Хит Байолоджикс, Инк. Вектор, коэкспрессирующий молекулы для вакцинации и костимулирующие молекулы
TWI703158B (zh) 2015-09-18 2020-09-01 美商希佛隆公司 特異性結合tl1a之抗體
JP7002446B2 (ja) 2015-09-21 2022-03-04 アプティーボ リサーチ アンド デベロップメント エルエルシー Ｃｄ３結合ポリペプチド
WO2017077715A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 La Jolla Institute For Allergy & Immunology Method and medicament for treating airway and/or lung diseases
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
CN109462996A (zh) 2016-03-17 2019-03-12 西达-赛奈医疗中心 通过rnaset2诊断炎性肠病的方法
CN109476742B (zh) * 2016-05-09 2023-04-14 百时美施贵宝公司 Tl1a抗体及其用途
US10322174B2 (en) * 2016-10-26 2019-06-18 Cedars-Sinai Medical Center Neutralizing anti-TL1A monoclonal antibodies
CA3098374A1 (en) 2018-04-25 2019-10-31 Prometheus Biosciences, Inc. Optimized anti-tl1a antibodies
CA3158638A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Prometheus Biosciences, Inc. Humanized antibodies to tnf-like ligand 1a (tl1a) and uses thereof
WO2021081365A1 (en) * 2019-10-24 2021-04-29 Prometheus Biosciences, Inc. Humanized antibodies to tnf-like ligand 1a (tl1a) and uses thereof
JP7449390B2 (ja) * 2020-01-24 2024-03-13 ファイザー・インク 抗ｅ－セレクチン抗体、組成物および使用の方法
CN111793135A (zh) * 2020-05-11 2020-10-20 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中rankl含量的抗体对及其用途
WO2023244089A1 (ko) * 2022-06-17 2023-12-21 주식회사 셀렉신 인간 dr3에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101253199A (zh) * 2005-08-30 2008-08-27 迈阿密大学 免疫调节肿瘤坏死因子受体25(tnfr25)的激动剂、拮抗剂和免疫毒素
WO2008106451A3 (en) * 2007-02-26 2008-11-06 Cedars Sinai Medical Center Methods of using single nucleotide polymorphisms in the tl1a gene to predict or diagnose inflammatory bowel disease
CN101903402A (zh) * 2007-11-13 2010-12-01 泰华生物制药美国公司 抗tl1a的人源化抗体
WO2012064682A1 (en) * 2010-11-08 2012-05-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human tnf-like ligand 1a (tl1a)
WO2012161856A1 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Government Of The United States, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Blockade of tl1a-dr3 interactions to ameliorate t cell mediated disease pathology and antibodies thereof

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5024939A (en) 1987-07-09 1991-06-18 Genentech, Inc. Transient expression system for producing recombinant protein
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
ATE295420T1 (de) 1992-02-06 2005-05-15 Chiron Corp Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5924939A (en) 1996-09-10 1999-07-20 Cobra Golf Incorporated Golf club head with a strike face having a first insert within a second insert
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
NZ539776A (en) 1999-01-15 2006-12-22 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
AU2010215239A1 (en) 2009-02-23 2011-09-15 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Humanized antibodies that bind to CD19 and their uses
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101253199A (zh) * 2005-08-30 2008-08-27 迈阿密大学 免疫调节肿瘤坏死因子受体25(tnfr25)的激动剂、拮抗剂和免疫毒素
WO2008106451A3 (en) * 2007-02-26 2008-11-06 Cedars Sinai Medical Center Methods of using single nucleotide polymorphisms in the tl1a gene to predict or diagnose inflammatory bowel disease
CN101903402A (zh) * 2007-11-13 2010-12-01 泰华生物制药美国公司 抗tl1a的人源化抗体
WO2012064682A1 (en) * 2010-11-08 2012-05-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human tnf-like ligand 1a (tl1a)
WO2012161856A1 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Government Of The United States, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Blockade of tl1a-dr3 interactions to ameliorate t cell mediated disease pathology and antibodies thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TL1A(TNFSF15) regulates the development of chronic colitis by modulating both T-helper and T-helper 17 activation;Hidetoshi Takedatsu等;《Gastroenterology》;20080801;第135卷(第2期);第555页左栏第16-19行，图4-6 *

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