ES2928167T3

ES2928167T3 - Composiciones y métodos para reducir las respuestas inmunitarias contra receptores de antígenos quiméricos

Info

Publication number: ES2928167T3
Application number: ES16825929T
Authority: ES
Inventors: Mark L Bonyhadi
Original assignee: Juno Therapeutics Inc
Current assignee: Juno Therapeutics Inc
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2036-12-02
Also published as: MA43378A; EP3383419B1; WO2017096327A2; EP4212166A1; US20200297760A1; EP3383419A2; CA3007258A1; WO2017096327A3

Abstract

Se proporcionan métodos para administrar péptidos que contienen porciones de o correspondientes a un agente a administrar, como una célula o molécula expresada por dicha célula, como una proteína recombinante, como un receptor quimérico. En algunas realizaciones, la administración se realiza junto con métodos de tratamiento que emplean el agente, por ejemplo, receptor celular o quimérico, tales como métodos de terapia celular adoptiva. El receptor quimérico puede ser un receptor de antígeno quimérico (CAR). Los péptidos contienen un epítopo del receptor recombinante y, en algunas realizaciones, son capaces de regular a la baja o reducir las respuestas inmunitarias contra el receptor quimérico, como CAR. También se proporcionan dichos péptidos y composiciones que pueden inducir tolerancia a un agente tal como un receptor quimérico, tal como un CAR. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para reducir las respuestas inmunitarias contra receptores de antígenos quiméricos Campo

La presente invención se refiere a péptidos para su uso en métodos de tratamiento que comprenden administrar tales péptidos junto con la administración de células que expresan un receptor quimérico recombinante, específicamente un receptor de antígeno quimérico (CAR). Los péptidos aislados contienen uno o más epítopos del receptor quimérico y, en algunas realizaciones, los péptidos para su uso en los métodos son capaces de regular por disminución o reducir las respuestas inmunitarias contra el CAR expresado por las células. Los péptidos proporcionados pueden inducir tolerancia al CAR, y/o a células manipuladas genéticamente con el CAR, en un sujeto al que se administran posteriormente las células o el CAR. Las características de los métodos proporcionan varias ventajas para las terapias celulares adoptivas, como una eficacia mejorada y, en algunos aspectos, la posibilidad de evitar o reducir el uso de enfoques inmunosupresores más tóxicos, como la quimioterapia. Por ejemplo, los péptidos para su uso en los métodos pueden minimizar el riesgo de una exposición reducida a las células que expresan los CAR, que de lo contrario puede ser el resultado de respuestas inmunitarias específicas al CAR en el sujeto.

Antecedentes

Hay varios métodos disponibles para la terapia celular adoptiva que usan células manipuladas genéticamente que expresan receptores recombinantes, como receptores de antígenos quiméricos (CAR). Se necesitan métodos mejorados, por ejemplo, para mejorar la eficacia de tales terapias, por ejemplo, aumentando la exposición del sujeto a las células administradas. Son necesarios tales métodos, por ejemplo, que puedan mejorar la expansión y/o la persistencia de las células administradas, reducir la respuesta inmunitaria a los receptores expresados en las células o reducir otros resultados no deseados. Se proporcionan péptidos y/o células para su uso en métodos que satisfagan dichas necesidades.

La WO 2014/153270 A1 describe moléculas de CAR que comprenden un scFv anti-CD19 humanizado y células T que expresan dichos CAR.

Shaffer et al. (2014) (2014) "Foreign or Domestic CARs: Receptor Ligands as Antigen-Binding Domains", Medical Sciences, 2(1):23-36, describe estrategias que pueden reducir la inmunogenicidad de las células CAR T, como la humanización del scFv y el uso de ligandos de receptores de origen natural como dominios de unión a antígenos.

Sumario

La presente invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La presente invención proporciona por lo menos un péptido que comprende una porción de una región inmunogénica de un receptor de antígeno quimérico (CAR) y células que expresan el CAR para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto humano, en donde el CAR comprende: a) un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente a un antígeno objetivo asociado con la enfermedad en el sujeto humano, b) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización citoplasmático activador y que comprende además un dominio de señalización coestimulador intracelular de una molécula coestimuladora de células T, en donde el dominio de señalización coestimulador es un dominio de señalización 4-1BB humano y un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular, en donde el dominio transmembrana es un dominio transmembrana CD28 humano, de tal manera que se forma una región de unión mediante la unión de la porción transmembrana humana de CD28 y el dominio de señalización 4-1BB humano, em donde la región de unión comprende la SEQ ID NO: 137, en donde el CAR se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad en el sujeto humano, en donde el método comprende administrar las células que expresan el CAR para tratar la enfermedad y administrar por lo menos un péptido para inducir tolerancia al CAR, en donde la región inmunogénica comprende la SEQ ID NO: 137, y en donde el péptido tiene entre 10 y 30 aminoácidos, y el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO 7-12, 16-22, 163 o 165, y en donde dicho método comprende administrar el péptido antes de la administración del CAR, y dicho método comprende administrar al sujeto el por lo menos un péptido en condiciones que inducen tolerancia en el sujeto al CAR y administrar al sujeto las células que expresan el CAR.

La presente invención también proporciona por lo menos un péptido que comprende una porción de una región inmunogénica de un receptor de antígeno quimérico (CAR) para su uso con células que expresan el CAR, en un método para tratar una enfermedad en un sujeto humano, en donde el CAR comprende: a) un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente a un antígeno objetivo asociado con la enfermedad en el sujeto humano, b) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización citoplasmático activador y que comprende además un dominio de señalización coestimulador intracelular de una molécula coestimuladora de células T, en donde el dominio de señalización coestimulador es un dominio de señalización de 4-1BB humano, y c) un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular, en donde el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 humano, de tal manera que se forma una región de unión mediante la unión de la porción transmembrana humana de CD28 y el dominio de señalización 4-1BB humano, en donde la región de unión comprende la SEQ ID NO: 137, en donde el CAR se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad en el sujeto humano, en donde el método comprende administrar las células que expresan el CAR para tratar la enfermedad y administrar por lo menos un péptido para inducir tolerancia al CAR, en donde la región inmunogénica comprende la SEQ ID NO: 137, y en donde el péptido tiene entre 10 y 30 aminoácidos, y el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO 7-12, 16-22, 163 o 165, y en donde dicho método comprende administrar el péptido antes de la administración de CAR, y dicho método comprende administrar al sujeto el por lo menos un péptido en condiciones que inducen tolerancia en el sujeto al CAR y administrar al sujeto las células que expresan el CAR.

La presente invención también proporciona células que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) para su uso con por lo menos un péptido que comprende una porción de una región inmunogénica del CAR, en un método para tratar una enfermedad en un sujeto humano, en donde el CAR comprende:

a) un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente a un antígeno objetivo asociado con la enfermedad en el sujeto humano, b) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización citoplasmático activador y que comprende además un dominio de señalización coestimulador intracelular de una molécula coestimuladora de células T, en donde el dominio de señalización coestimulador es un dominio de señalización de 4-1BB humano, y c) un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular, en donde el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 humano, de tal manera que se forma una región de unión por la unión de la porción transmembrana humana de CD28 y el dominio de señalización 4-1BB humano, en donde la región de unión comprende la SEQ ID NO: 137, en donde el CAR se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad en el sujeto humano, en donde el método comprende administrar las células que expresan el CAR para tratar la enfermedad y administrar por lo menos un péptido para inducir tolerancia al CAR, en donde la región inmunogénica comprende la SEQ ID NO: 137, y en donde el péptido tiene entre 10 y 30 aminoácidos, y el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 7-12, 16-22, 163 o 165, y en donde dicho método comprende administrar el péptido antes de la administración del CAR, y dicho método comprende administrar al sujeto el por lo menos un péptido en condiciones que inducen tolerancia en el sujeto al CAR y administrar al sujeto las células que expresan el CAR.

En algunas realizaciones, la enfermedad es un cáncer, una enfermedad o trastorno autoinmune o una enfermedad infecciosa.

En algunas realizaciones, el método comprende administrar una pluralidad de péptidos, cada uno de dichos péptidos comprendiendo la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 7-12, 16-22, 163 o 165.

En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular comprende un scFv. En algunas realizaciones, el péptido o uno o más péptidos de la pluralidad de péptidos consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 7-12, 16-22, 163 o 165.

En la presente se describe, como parte de la divulgación, un método para prevenir, reducir o reducir el riesgo de una respuesta inmunitaria contra un agente, o para inducir tolerancia al agente, como un agente terapéutico como una célula o molécula manipulada expresada en el mismo sobre el mismo o de este modo como una molécula recombinante, por ejemplo, un receptor, por ejemplo, un antígeno y/o un receptor quimérico. Los métodos generalmente incluyen administrar a un sujeto por lo menos un péptido que contiene todo o una parte del agente o molécula, como una región inmunogénica del mismo, como el receptor quimérico. En algunos casos, se administra una pluralidad de péptidos, cada uno de ellos conteniendo la totalidad o una porción del agente o molécula. El péptido o la pluralidad de péptidos generalmente se administra en condiciones que inducen tolerancia al agente en el sujeto, por ejemplo, a la molécula como el receptor quimérico o las células que lo expresan. En algunos casos, la molécula, como el receptor quimérico, se expresa mediante células manipuladas genéticamente con ácido nucleico que codifica el receptor quimérico.

En algunos casos, el método incluye además administrar al sujeto el agente, por ejemplo, el receptor quimérico, y/o administrar células que expresan el mismo, por ejemplo, que expresan el receptor quimérico, para tratar una enfermedad o afección en el sujeto. En algunos casos, el receptor quimérico es un receptor de antígeno quimérico.

También se describe aquí como parte de la divulgación un método de tratamiento que incluye administrar a un sujeto un péptido que contiene la totalidad o una parte de una región inmunogénica del agente o una porción del mismo, como el receptor de antígeno quimérico, dicho péptido o péptidos administrándose en condiciones que inducen tolerancia en el sujeto al agente o porción del mismo, por ejemplo, receptor de antígeno quimérico; y administrar al sujeto células que expresan el receptor del antígeno quimérico, en donde el receptor del antígeno quimérico se une específicamente a un antígeno asociado con una enfermedad o afección en el sujeto. En algunos casos, el péptido o péptidos se administran antes, posteriormente o de manera intermitente desde la administración del receptor quimérico. En la invención, el péptido o péptidos se administran antes de la administración del receptor quimérico, específicamente CAR. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran desde o desde aproximadamente 7 a 28 días antes de la administración del receptor quimérico, específicamente CAR.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran en ausencia de un adyuvante.

En algunas realizaciones, el método incluye además la administración de un agente tolerogénico. En algunas realizaciones, el agente tolerogénico se dirige y/o se une específicamente a, y opcionalmente induce o reduce o agoniza o antagoniza la señalización por, o mediada por, una o más moléculas que se expresan en células T u otras células inmunitarias, como una molécula seleccionada de entre moléculas de CD4, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD26, CD44, CD28, PD1, BTLA, B7-1, ICOS, CTLA-4, familia B7-2, CD99, CD137 (4-1BBL), CD2, LFA3, CD27, CD70, CD3, CD8, ICAM1, LFA1, MHC clase II y MHC clase I. En algunas realizaciones, el agente tolerogénico se dirige y/o se une específicamente a una o más moléculas que se expresan en una célula que no es T, como una célula presentadora de antígeno (APC), por ejemplo, un macrófago o una célula dendrítica, por ejemplo una célula que sirve como la pareja ligando/receptor para cualquiera de las moléculas mencionadas anteriormente identificadas anteriormente expresadas en células T como PD-L1, PD-L2 y miembros de la familia B7.

En algunas realizaciones, el agente tolerogénico es un anticuerpo o un fragmento del mismo o es una proteína de fusión soluble. En algunas realizaciones, por ejemplo, en las que también se administra el agente tolerogénico, el péptido o péptidos se administran en presencia de un adyuvante. En algunas realizaciones, no se administra en presencia de un adyuvante. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran mediante administración intravenosa, intraperitoneal, intranasal, oral o intratímica. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran mediante inyección intraperitoneal. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran mediante la implantación de una bomba subcutánea o similar (como una bomba Alzet) o mediante un parche tópico. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran en una cantidad que es de o de aproximadamente 0,1 mg y 1000 mg. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administra en una cantidad que es de o de aproximadamente 100 mg a 1000 mg. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran en una cantidad que es de o de aproximadamente 0,1 mg a 5 mg.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran varias veces mediante administración repetida. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran por lo menos dos veces, por lo menos tres veces, por lo menos cuatro veces, por lo menos cinco veces, por lo menos seis veces o por lo menos siete veces. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran por lo menos una vez al día durante dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días o siete días. En algunas realizaciones, cada administración de los péptidos se produce antes de la administración del agente, por ejemplo, la célula manipulada o el receptor quimérico.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos incluyen una pluralidad de péptidos, cada uno de dichos péptidos incluyendo la totalidad o una parte de una región inmunogénica de la molécula o célula manipulada o molécula expresada en el mismo o sobre el mismo o por lo tanto como una molécula recombinante, por ejemplo, un receptor, por ejemplo, un antígeno y/o un receptor quimérico. En algunas realizaciones, la pluralidad de péptidos son péptidos de dos o más regiones inmunogénicas diferentes de dicho receptor quimérico. En algunas realizaciones, la pluralidad de péptidos son péptidos de la misma región inmunogénica de dicho receptor quimérico, cada uno de dichos péptidos superponiéndose en secuencia e incluyendo una porción de dicha región inmunogénica. En algunas realizaciones, la pluralidad de péptidos incluye por lo menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez péptidos diferentes.

En la invención según se reivindica, la región inmunogénica comprende la SEQ ID NO: 137. En algunas realizaciones, la región inmunogénica incluye un epítopo de células T. En algunas realizaciones, el epítopo de células T es un epítopo de MHC de clase I o MHC de clase II. En algunas realizaciones, el epítopo de células T es un epítopo de MHC de clase I. En algunas realizaciones, el sujeto es positivo para un alelo de HLA que se une específicamente al péptido administrado. En algunas realizaciones, el método incluye, antes de administrar el péptido, seleccionar un sujeto que sea positivo para un alelo de HLA que se una específicamente o se sabe que se une bien al péptido administrado. En algunas realizaciones, el alelo de HLA se selecciona entre HLA-A* 02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01 y HLA-B*08:01. En algunos casos, la región inmunogénica incluye una región dentro de una o más porciones seleccionadas del grupo que consiste de una porción scFv, una porción conectora, una secuencia de aminoácidos no endógena al sujeto, una secuencia derivada de una especie diferente a la del sujeto, y/o unión entre dos dominios CAR; y/o donde la región del receptor quimérico es una región de unión que incluye aminoácidos en cada lado de una unión entre dos dominios.

En algunos casos, la región incluye una región marco (FR) dentro de la porción scFv, la región incluye una secuencia de FR de cadena pesada, la región incluye una secuencia de CDR de cadena pesada, la región incluye una secuencia de FR de cadena ligera y/o la región incluye una secuencia de CDR de cadena ligera.

En la invención según se reivindica, la región inmunogénica incluye una secuencia contigua de aminoácidos de una región de unión del receptor quimérico, en donde la región de unión incluye hasta 15 aminoácidos contiguos directamente C-terminales de una unión que une un primer dominio y un segundo dominio del receptor quimérico y/o hasta 15 aminoácidos contiguos directamente N-terminales de la unión, y además incluye la unión. En algunos casos, el primer dominio y el segundo dominio están enlazados directamente o están enlazados indirectamente a través de un conector o conectores. En la invención según se reivindica, cada uno del primer y del segundo dominio incluye secuencias de dominio de una proteína derivada de la misma especie que el sujeto y/o secuencias de dominio de una proteína endógena al sujeto.

En la invención según se reivindica, el sujeto es un humano.

En la invención según se reivindica, el péptido tiene entre 10 y 30 aminoácidos, y comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 7-12, 16-22, 163 o 165. En la invención según se reivindica, el péptido o cada uno de los péptidos incluye una secuencia contigua de aminoácidos de la región de unión. El péptido o cada uno de los péptidos individualmente puede tener entre 7 y 30 aminoácidos, 8 y 20 aminoácidos, 8 y 15 aminoácidos, 10 y 17 aminoácidos, 7 y 13 aminoácidos u 8 y 10 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido tiene entre 10 y 17 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido o cada uno de los péptidos individualmente tiene aproximadamente 10 aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos, 15 aminoácidos, 16 aminoácidos o 17 aminoácidos.

En la invención según se reivindica, el CAR comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente a un antígeno objetivo asociado con la enfermedad en el sujeto humano, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización citoplasmático activador y que comprende además un dominio de señalización coestimulador intracelular de una molécula coestimuladora de células T, en donde el dominio de señalización coestimulador es un dominio de señalización 4-1BB humano, y un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular, en donde el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 humano. En la invención según se reivindica, el receptor quimérico es un CAR y el CAR incluye un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente a un antígeno objetivo y un dominio de señalización intracelular que incluye un dominio de señalización citoplasmático activador. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular incluye un scFv.

En algunas realizaciones, el dominio de señalización citoplasmático activador incluye un componente de receptor de células T (TCR) y/o incluye un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM); y/o el dominio de señalización citoplasmático activador incluye un dominio intracelular de una cadena CD3-zeta (CD3Z). En algunas realizaciones, el CAR incluye además un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. En la invención según se reivindica, el dominio transmembrana incluye una porción transmembrana de CD28. En la invención según se reivindica, el dominio de señalización intracelular incluye además un dominio de señalización coestimulador intracelular de una molécula coestimuladora de células T. La molécula coestimuladora de células T puede seleccionarse del grupo que consiste de CD28 y 41BB.

El primer dominio y el segundo dominio pueden ser, respectivamente, un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio bisagra, un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio transmembrana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimuladora intracelular, y un dominio de señalización coestimuladora intracelular y un dominio de señalización de ITAM. En la invención según se reivindica, el primer dominio es un dominio transmembrana de CD28 humano y el segundo dominio es un dominio de señalización de 4 1 BB humano.

En la invención según se reivindica, el primer dominio es un dominio transmembrana o una porción funcional del mismo y el segundo dominio es un dominio de señalización coestimulador o una porción funcional del mismo. En la invención según se reivindica, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 o una porción funcional o variante del mismo y el dominio de señalización coestimulador es un dominio de señalización de 4-1BB o una porción funcional o variante del mismo. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana de CD28 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, 103 o 104 o una porción funcional o variante de la misma que incluye una secuencia que muestra por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, 103 o 104; y el dominio de señalización coestimulador de 4-1 BB incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o una porción funcional o variante de la misma incluyendo una secuencia que muestra por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3.

En algunas realizaciones, el primer dominio y el segundo dominio juntos incluyen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o una porción funcional o variante de la misma que incluye una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el primer dominio y el segundo dominio juntos incluyen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5.

En algunos casos, el péptido o uno o más péptidos de la pluralidad de péptidos incluyen i) una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 7, 8-12, 16-22, 137, 160, 163, 165, 166, 167 o 168 o una variante de la misma que conserva la actividad para inducir tolerancia; o ii) un epítopo peptídico de una secuencia de i) que se une a una molécula de HLA. En la invención según se reivindica, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 7-12, 16-22, 163 o 165.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos tienen una afinidad de unión por una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA) que es inferior a 1000 nM, inferior a 500 nM o inferior a 50 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es una IC50. En algunas realizaciones, el péptido se une a un MHC de clase I y el alelo de HLA se selecciona entre HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01 y HLA-B*08:01. En algunas realizaciones, el péptido se une a un MHC de clase II y el alelo de HLA comprende una cadena alfa y/o beta seleccionada de HLA-DPA1*0103, HLA-DPA1*0201, HLA-DPB1*0101, HLA-DPB1*0301, HLA-DPB1*0401, HLA-DPB*0402, HLA-DPB1*1501, HLA-DRA*0101, HLA-DRB1*1101.

En algunas realizaciones, los péptidos se administran no más de una semana antes de administrar el receptor quimérico. En algunas realizaciones, el método incluye además la administración de un compuesto inmunosupresor. En la invención según se reivindica, el receptor de antígeno quimérico se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un cáncer y una enfermedad o trastorno autoinmune, o una enfermedad infecciosa.

También se describe en la presente como parte de la divulgación el uso de un péptido o péptidos para la formulación de un medicamento para reducir una respuesta inmunitaria asociada con el tratamiento con un receptor quimérico, en donde dicho o dichos péptidos se formulan para administrarlos para inducir tolerancia en un sujeto al receptor quimérico. También se describe en la presente como parte de la divulgación una composición farmacéutica que incluye un péptido o péptidos para su uso en la reducción de una respuesta inmunitaria asociada con el tratamiento con un receptor quimérico, en donde dicho péptido o péptidos se formulan para su administración para inducir tolerancia en un sujeto al receptor quimérico. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se formulan para su administración en ausencia de un adyuvante.

También se describe en la presente como parte de la divulgación el uso de un receptor quiméri formulación de un medicamento para tratar una enfermedad o afección en un sujeto que ha recibido el péptido o una pluralidad de péptidos para inducir tolerancia al receptor quimérico. También se describe en la presente como parte de la divulgación una composición farmacéutica que incluye una célula, como una célula manipulada que expresa la molécula expresada en la misma o sobre la misma o, por lo tanto, como una molécula recombinante, por ejemplo, un receptor, por ejemplo, un antígeno y/o un receptor quimérico para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto que ha recibido el péptido o una pluralidad de péptidos para reducir la tolerancia al receptor quimérico. En la invención según se reivindica, el receptor quimérico es un receptor de antígeno quimérico. En algunas realizaciones, el receptor quimérico (específicamente CAR) es expresado por células manipuladas genéticamente con ácido nucleico que codifica el receptor quimérico. En la invención según se reivindica, el receptor quimérico (específicamente CAR) se une a un antígeno asociado con la enfermedad o afección. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un cáncer y una enfermedad o trastorno autoinmune, o una enfermedad infecciosa.

En algunos casos, se describe en la presente un péptido aislado que incluye una secuencia contigua de aminoácidos de una región de unión de un receptor quimérico, en donde la región de unión incluye hasta 15 aminoácidos contiguos directamente C-terminales de una unión que une un primer dominio del receptor quimérico y un segundo dominio del receptor quimérico y/o hasta 15 aminoácidos contiguos directamente N-terminales de la unión, y opcionalmente incluye además la unión. En algunos casos, el primer dominio y el segundo dominio están enlazados directamente o están enlazados indirectamente a través de un conector o conectores. En la invención según se reivindica, cada uno del primer y del segundo dominio incluye secuencias de dominio de una proteína derivada de la misma especie que el sujeto y/o secuencias de dominio de una proteína endógena al sujeto. En ciertas ocasiones, el primer dominio y el segundo dominio son, respectivamente, un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio bisagra, un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio transmembrana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimuladora intracelular, y un dominio de señalización coestimuladora intracelular y un dominio de señalización de ITAM. En la invención según se reivindica, el primer dominio es un dominio transmembrana o una porción funcional del mismo y el segundo dominio es un dominio de señalización coestimulador o una porción funcional del mismo.

En la invención según se reivindica, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 o una porción funcional o variante del mismo y el dominio de señalización coestimulador es un dominio de señalización de 4-1BB o una porción funcional o variante del mismo. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana de CD28 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, 103 o 104 o una porción funcional o variante de la misma, incluyendo una secuencia que muestra por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, 103 o 104; y el dominio de señalización coestimulador de 4-1BB incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o una porción funcional o variante de la misma, incluyendo una secuencia que muestra por lo menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el primer dominio y el segundo dominio juntos incluyen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o una porción funcional o variante de la misma, incluyendo una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el primer dominio y el segundo dominio juntos incluyen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5.

El péptido o cada uno de los péptidos individualmente puede tener entre 7 y 30 aminoácidos, 8 y 20 aminoácidos, 8 y 15 aminoácidos, 10 y 17 aminoácidos, 7 y 13 aminoácidos u 8 y 10 aminoácidos; o el péptido o cada uno de los péptidos individualmente es o tiene aproximadamente 10 aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos, 15 aminoácidos, 16 aminoácidos o 17 aminoácidos.

En algunos casos, el péptido o péptidos aislados incluyen i) una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOS: 6, 7, 8-12, 16-22 y 137 o una variante de la misma que retiene la actividad para inducir tolerancia; o ii) una secuencia de aminoácidos de un epítopo peptídico de una secuencia de i) que se une a una molécula de HLA.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos tienen una afinidad de unión por una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA) que es inferior a 1000 nM, inferior a 500 nM o inferior a 50 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es una IC50. En algunas realizaciones, el alelo de HLA se selecciona entre HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01 y HLA-B*08:01. En algunos casos, el péptido contiene o es la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, 7, 8-12, 16-22 o 137 o un péptidomimético, análogo o variante del mismo.

También se describe aquí como parte de la divulgación una composición que incluye cualquiera de los péptidos descritos o una pluralidad de péptidos, incluyendo una pluralidad de cualquiera de los péptidos descritos. En algunos casos, se describe una composición que incluye una pluralidad de péptidos, en donde cada uno de dichos péptidos se superpone en secuencia e incluye la totalidad o una parte de una región inmunogénica de un receptor quimérico. En algunos casos, la composición incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, se describe una combinación que incluye cualquiera de los péptidos descritos o una pluralidad de péptidos que incluye cualquiera de los péptidos descritos y un receptor quimérico. En algunos casos, se describe en la presente un kit que incluye cualquiera de las composiciones o combinaciones descritas en la presente y, opcionalmente, instrucciones de uso. En ciertas ocasiones, el receptor quimérico se expresa mediante células manipuladas genéticamente con ácido nucleico que codifica el receptor quimérico. En algunos casos, el receptor quimérico es un receptor de antígeno quimérico.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra los resultados de un ensayo de liberación de cromo ejemplar que detecta la presencia de una respuesta inmunitaria citolítica específica para células que expresan CAR después de la administración de células que expresan CAR anti-CD19 en un sujeto humano. Se muestran los resultados de cultivos de linfocitos mixtos que contienen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) derivadas de la infusión previa (panel izquierdo) y la infusión posterior (panel derecho) del sujeto con las células que expresan CAR, en presencia de células que expresan CAR ("CD19-CAR") y que no expresan CAR ("Simulado"). "E/T" = proporción de células efectoras a objetivo.

La Fig. 2 muestra los resultados de un análisis ELISpot ejemplar que confirma las respuestas inmunitarias a ciertos péptidos superpuestos que representan regiones particulares de un CAR en un sujeto humano ejemplar. Los números etiquetados con "pep" representan varios péptidos superpuestos a lo largo de la secuencia de CAR, con las regiones correspondientes indicadas encima del gráfico.

La Fig. 3 muestra un mapa de afinidad de epítopos para las afinidades de unión previstas de péptidos de una región ejemplar de un receptor quimérico para unirse a HLA-A2:01, incluyendo una serie de péptidos superpuestos de 8 mer a 14 mer de una región de unión ejemplar que tiene una secuencia de aminoácidos CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPF (SEQ ID NO: 6) donde los residuos 1-15 corresponden a un dominio transmembrana de CD28 ejemplar y los residuos 16-30 corresponden a un dominio coestimulador de 4-1BB ejemplar. La figura también representa las afinidades de unión previstas de una serie de péptidos de 8 mer a 14 mer superpuestos de una región de unión variante que tiene una secuencia de aminoácidos CYSLLTVVAFIIFWVNNKRGRKKLLYIFKQPF (SEQ ID NO: 13), que contiene residuos de asparagina insertados entre el dominio transmembrana de CD28 y el dominio coestimulador de 4-1BB.

La Fig. 4A y la Fig. 4B representan predicciones de epítopos de células T basadas en algoritmos para los alelos de HLA de clase I y HLA de clase II, respectivamente, que muestran el número total de secuencias en el conjunto de datos, incluyendo cada posición a lo largo de la secuencia con una IC50 prevista de menos de 50 nm ponderada de acuerdo con la frecuencia de los alelos de HLA individuales en la población.

La Fig. 5 representa predicciones de epítopos de células T basadas en algoritmos para alelos de HLA de clase I y HLA de clase II de una serie de péptidos variantes. Las puntuaciones se determinaron y ponderaron como se describe en el Ejemplo 2. Los triángulos y una línea de puntos indican puntuaciones ponderadas de clase I. Los círculos y una línea sólida indican puntuaciones ponderadas de clase II.

La Fig. 6 representa la secuencia de aminoácidos de una secuencia ejemplar de CD28-4-1BB de la SEQ ID NO: 5. Los aminoácidos correspondientes al dominio transmembrana de CD28 se indican mediante una línea continua con flechas que indican las posiciones inicial y final; los aminoácidos del dominio coestimulador de 4-1BB ejemplar se indican mediante una línea discontinua con flechas que indican las posiciones inicial y final; los aminoácidos de la región de unión ejemplar se indican mediante una línea discontinua y punteada con flechas que indican las posiciones inicial y final y en cursiva. Los dos aminoácidos que flanquean inmediatamente el sitio de unión se indican mediante un recuadro. Los aminoácidos ejemplares que en algunas realizaciones son objetivo de modificación, incluyendo K28, R31 y L34, están en negrita y subrayados. Las regiones de residuos ácidos que pueden estar implicadas en la unión y señalización de TRAF mediada por 4-1BB están indicados por un subrayado doble.

La Fig. 7 muestra la unión relativa a varias moléculas de MHC Clase II de péptidos de 15 mer superpuestos dentro de una porción de la región que abarca la unión entre CD28 y la secuencia derivada de 4-1BB (expuesta en la SEQ ID NO: 160; la secuencia canónica o "nativa") o dentro de una porción correspondiente que contiene una sustitución de R31H, R31N o L34A (con referencia a la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 5). Se muestra la puntuación REVEAL® para la unión. La puntuación de los alelos de HLA clase II individuales están etiquetados individualmente con una letra correspondiente de la siguiente manera: A: DPA1*01:03; DPB1 *04:01; B: DRA*01:01; DRB1*03:01; C: DRA*01:01; DRB1*15:01; D: DRA*01:01; DRB1 *11:01; E: DPA1 *01:03; DPB1 *04:02; F: DPA1 *01:03; DPB1 *03:01; G: DPA1 *01:03; DPB1 *01:01; H: DPA1 *02:01; DPB1 *01:01; I: DPA1 *02:01; DPB1 *04:02; J: DRA*01:01; DRB1 *11:04; K: DRA*01:01; DRB1 *01:02; y L: DPA1 *02:01; DPB1 *15:01.

La Fig. 8 muestra una comparación de la unión predicha in silico frente a la determinada in vitro de un péptido de 15 mer de la unión CD28-4-1BB a una molécula de MHC de clase II.

Descripción detallada

A continuación se describen realizaciones de la invención en algunos de los casos y aspectos.

A menos que se defina de otra manera, se pretende que todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología técnica y científica usados en la presente tengan el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente para mayor claridad y/o para facilitar la referencia, y no debe interpretarse necesariamente la inclusión de tales definiciones en la presente como una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la técnica.

Los encabezados de las secciones usados en la presente tienen únicamente propósitos organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.

I. Métodos que emplean péptidos junto con terapia celular adoptiva

En la presente, como parte de la divulgación, se describen métodos, composiciones y artículos de fabricación para su uso junto con la terapia celular adoptiva, por ejemplo, para el tratamiento de varias enfermedades y afecciones. La invención está definida por las reivindicaciones y se refiere a péptidos que comprenden una porción de una región inmunogénica de un CAR y/o células que expresan el CAR para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto humano. En algunos casos, los métodos implican administrar al sujeto uno o más péptidos, como un péptido aislado o una combinación de péptidos, capaces de prevenir, reducir o regular por disminución de otro modo una respuesta inmunitaria a un receptor quimérico, como un receptor de antígeno quimérico (CAR), expresado en células manipuladas. En algunos casos, las células, como las células T, que expresan una molécula recombinante, como un receptor como un receptor quimérico manipulado y/o un receptor de antígeno, como un CAR, se administran en relación con métodos de terapia celular adoptiva. En algunos casos, los péptidos coadministrados inducen tolerancia en un sujeto a células que expresan un receptor quimérico manipulado genéticamente. En algunos casos, el péptido o péptidos se administran antes o simultáneamente con la administración del agente, por ejemplo, las células, por ejemplo, que expresa la molécula como el receptor quimérico manipulado genéticamente, como un CAR, al sujeto.

En algunos aspectos, las realizaciones proporcionadas se basan en observaciones de que la eficacia de la terapia celular adoptiva puede estar limitada por el desarrollo de una respuesta inmunitaria en el sujeto a las células y/o al constructo administrado. Por ejemplo, en algunos casos, la exposición a células manipuladas, como las que expresan una proteína recombinante como un receptor quimérico, puede verse limitada por las respuestas inmunitarias del huésped contra las proteínas recombinantes, por ejemplo, los receptores expresados por las células administradas, que pueden eliminar prematuramente el células. Se observa que incluso en ciertos sujetos que tienen enfermedades malignas de células B, que a menudo están inmunocomprometidos, pueden detectarse respuestas inmunitarias que son específicas para regiones de receptores expresados por células administradas en terapia celular adoptiva. Por ejemplo, como se muestra en la presente, los sujetos a los que se les administraron células manipuladas genéticamente con un CAR desarrollaron una respuesta inmunitaria específica a una región inmunogénica de la región quimérica que contiene la unión entre el dominio transmembrana y coestimulador del CAR.

En algunos aspectos, el desarrollo de una respuesta inmunitaria puede reducir la exposición o la persistencia de células manipuladas, como las células T que expresan la molécula, por ejemplo, el receptor quimérico, por ejemplo, en el curso de métodos de terapia adoptiva, que a su vez puede reducir su eficacia a largo plazo. Las observaciones indican que, en algunos casos, una mayor exposición del sujeto a las células administradas que expresan los receptores recombinantes (por ejemplo, número de células o duración en el tiempo aumentados) puede mejorar la eficacia y los resultados terapéuticos en la terapia celular adoptiva. El análisis preliminar realizado después de la administración de diferentes células T que expresan CAR dirigidas a CD19 a sujetos con varios tipos de cáncer que expresan CD19 en múltiples ensayos clínicos reveló una correlación entre un grado de exposición mayor y/o más prolongado a las células que expresan CAR y los resultados del tratamiento. Tales resultados incluyeron la supervivencia y la remisión del paciente, incluso en individuos con una carga tumoral grave o significativa.

Además, en algunos casos, una vez que se desarrolla tal respuesta inmunitaria del huésped, ya sea adquirida o innata, puede que no sea factible o eficaz intentar aumentar la exposición o proporcionar un nuevo tratamiento de los sujetos administrando una dosis posterior de células que expresan el mismo receptor recombinante. Una vez que se ha desarrollado dicha respuesta inmunitaria contra el receptor, la administración de una segunda o posterior dosis de células que expresan el mismo receptor o una con epítopos inmunogénicos similares puede dar como resultado la eliminación rápida de las células antes de que hayan tenido la oportunidad de expandirse y/o persistir en un grado eficaz o sustancial. Por tanto, sería ventajoso minimizar las respuestas inmunitarias no deseadas que puedan destruir o interferir con la actividad de las células manipuladas usadas en los métodos de terapia celular adoptiva, disminuyendo de este modo la eficacia del tratamiento.

En algunos casos, los métodos descritos ofrecen una eficacia mejorada en uno o más de tales contextos. En algunos casos, los métodos y las composiciones incluyen características que dan como resultado una respuesta inmunitaria disminuida a las células manipuladas administradas que expresan una proteína recombinante, como un receptor recombinante, como un receptor quimérico y/o una exposición o persistencia aumentadas de tales células, como en relación con inmunoterapia adoptiva. En algunos casos, mediante la coadministración (que puede incluir la administración antes, simultáneamente o después de y/o intermitentemente) a un sujeto de un péptido o péptidos que comprenden un epítopo o epítopos dentro de la proteína recombinante, como el de un receptor quimérico, como un CAR, los métodos proporcionados pueden dar como resultado la generación o producción de un población de células T manipuladas genéticamente que tienen la capacidad de mostrar una exposición y/o persistencia aumentadas o prolongadas cuando se administran a un sujeto, por ejemplo, en comparación con un método que no implica la administración del antígeno del péptido o péptidos.

En particular, los métodos descritos se refieren a la inducción de tolerancia inmunológica hacia un receptor quimérico antigénico (por ejemplo, CAR) expresado en células manipuladas administrando a un sujeto un antígeno peptídico o antígenos peptídicos del receptor quimérico (por ejemplo, CAR). La tolerancia inmunológica (o "tolerancia inmunitaria") es un proceso que forma parte del funcionamiento normal del sistema inmunitario. La tolerancia inmunitaria específica de antígeno se caracteriza por una disminución en la capacidad de respuesta a un antígeno, que está inducida por una exposición previa a ese antígeno. Cuando linfocitos específicos se encuentran con antígenos, los linfocitos pueden activarse, lo que da lugar a una respuesta inmunitaria específica de antígeno, o las células pueden inactivarse o eliminarse lo que lleva, en cambio, a una tolerancia inmunitaria específica del antígeno. El mismo antígeno puede inducir una respuesta o tolerancia inmunitaria específica del antígeno, dependiendo de las circunstancias de la presentación del antígeno al sistema inmunitario.

En algunos aspectos, la tolerancia puede estar provocada por anergia clonal, deleción clonal periférica, supresión de células T y/u otras formas de tolerancia específica de antígeno. En algunas realizaciones, la tolerancia puede ser el resultado de o estar caracterizada por la inducción de anergia. En algunos aspectos, la anergia puede ser resultado de la exposición de las células T CD4+ a un antígeno en ausencia de coestimulación y/o los factores inmunitarios innatos pueden hacer que las células sean incapaces de responder a ese antígeno. Como la activación completa de las células T requiere generalmente el reconocimiento del antígeno por parte del TCR (señal uno), así como el reconocimiento de los coestimuladores (señal dos), el reconocimiento prolongado del antígeno solo, en ausencia de la segunda señal, puede llevar a anergia (es decir, falta de respuesta funcional). Las células T anérgicas pueden ser refractarias a desafío antigénico posterior, y pueden ser capaces de suprimir otras respuestas inmunitarias. En algunas realizaciones, administrar péptido o péptidos e inducir tolerancia en ausencia de adyuvante es ventajoso porque promueve la presentación de antígenos por ciertas células inhibidoras como las células presentadoras de antígenos inhibidoras (como DC inmaduras o supresoras o células mieloides, por ejemplo, IDO+ DC, pDC, iDC o DC inductoras de Treg (tDC) La ausencia de adyuvante puede favorecer la presentación por una APC inmunosupresora en lugar de una DC estimuladora o APC equivalente.

Generalmente, en el entorno natural, la tolerancia está implicada en la no reactividad o la reactividad no productiva a los antígenos propios. En algunos casos, sin embargo, puede inducirse la tolerancia a un antígeno no propio. Por tanto, en algunos aspectos, los mismos mecanismos por los que las células T maduras que reconocen antígenos propios en tejidos periféricos se vuelven incapaces de responder posteriormente a estos antígenos también pueden regular la falta de respuesta a antígenos extraños. En algunos aspectos, el péptido o péptidos pueden inducir tolerancia al inducir anergia clonal, deleción clonal, por ejemplo, deleción clonal periférica, supresión de células T y/u otras formas de tolerancia específica de antígeno. En algunas realizaciones, la tolerancia puede inducirse mediante la administración de un componente antigénico a un sujeto que, bajo ciertas condiciones, puede ser capaz de reducir o minimizar una respuesta inmunitaria a ese componente. Por tanto, mientras que el péptido o péptidos que son inmunogénicos pueden provocar una respuesta inmunitaria, pueden administrarse para inducir la tolerancia cuando se administran en condiciones particulares, como a dosis tolerogénicas particulares o bajo diferentes vías de administración.

En algunos aspectos, el péptido o péptidos s uno que es o incluye una región inmunogénica de la proteína recombinante como el receptor quimérico, como un CAR, que generalmente es una proteína manipulada genéticamente, como el receptor quimérico, expresada sobre o en o codificado por células para administrar al sujeto al que se administra el péptido. El péptido o péptidos pueden ser una combinación o una pluralidad de péptidos. En algunos casos, el péptido o péptidos se derivan o contienen una secuencia contigua de aminoácidos contenida en la proteína recombinante, por ejemplo, un receptor quimérico, como un CAR. En algunos casos, el péptido o péptidos incluyen la totalidad o parte de la secuencia no propia o no nativa (con referencia al sujeto o la especie a la que se administra el péptido) presente en la proteína recombinante, como el receptor quimérico (por ejemplo, CAR). En ciertas ocasiones, la secuencia no propia o no nativa es una secuencia que contiene residuos de aminoácidos que abarcan una región de unión entre dos dominios de la molécula. En algunos casos, la secuencia no propia o no nativa es una secuencia que contiene residuos de aminoácidos con orígenes en especies diferentes a las del sujeto a tratar. En algunos casos, los dominios del receptor quimérico (como los dominios de unión a antígeno, por ejemplo, sFvs y/u otros dominios de receptores quiméricos, por ejemplo, otros dominios de CAR) tienen secuencias con orígenes en la misma especie que el sujeto a tratar y/o tienen secuencias con orígenes en especies diferentes a las del sujeto a tratar. Por ejemplo, en algunos casos, el receptor quimérico puede contener un dominio de unión que se deriva de una secuencia murina. En otros casos, el receptor quimérico puede contener un dominio de unión que se deriva de una secuencia humana o que es una secuencia humanizada. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar es un humano y la secuencia no propia o no nativa es o incluye una secuencia no humana. En algunas realizaciones, incluso si todos los dominios del receptor quimérico son humanos o se derivan por lo demás de la misma especie a tratar, la región de unión que incluye residuos de aminoácidos que abarcan los dos dominios puede, no obstante, ser reconocida por el sistema inmunitario como no propia.

En algunos casos, el péptido o péptidos incluyen una secuencia de aminoácidos de una molécula en o sobre un agente terapéutico, como una célula manipulada, como un receptor quimérico (por ejemplo, un CAR), que es o contiene por lo menos un epítopo de célula inmunitaria como un epítopo de células T (o epítopo peptídico) o por lo menos un epítopo de células B que es reconocido por el sistema inmunitario. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos son o contienen por lo menos un epítopo de células T. En algunas realizaciones, un epítopo de células T es un antígeno peptídico que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un animal por sus características de unión a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). En algunas realizaciones, el péptido es capaz de unirse a una molécula de MHC (molécula de HLA en humanos). En algunas realizaciones, la molécula de MHC es una molécula de MHC de clase I (por ejemplo, HLA clase I) o MHC de clase II (por ejemplo, HLA clase II). En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se unen a un alelo de una molécula de MHC que se expresa o está presente en el sujeto al que se administra el péptido.

En algunos casos, los métodos y composiciones descritos son ventajosos porque los péptidos pueden usarse independientemente del tipo o subtipo de HLA del sujeto. Por ejemplo, generalmente no se requiere conocer o predeterminar el tipo o subtipo de HLA del sujeto para seleccionar el péptido o grupo (combinación o pluralidad) correcto del mismo. En algunas realizaciones, del grupo de péptidos que representan inmunogénicos o neoantígenos o epítopos en el agente que se va a administrar, solo aquellos que se unen a las moléculas de HLA del sujeto inducirán tolerancia, por lo que se autoseleccionarán y tolerarán específicamente al sujeto a los péptidos que se unen de manera natural con cierta afinidad a sus moléculas de HLA, y por tanto tolerarán específicamente al sujeto contra los epítopos inmunitarios que se presenten con mayor probabilidad en una respuesta inmunitaria potencial tras la administración del agente.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos tienen una afinidad de unión para unirse a un antígeno leucocitario humano (HLA) con una afinidad de unión de menos de 1000 nM, menos de 500 nM o menos de 50 nM. En algunos casos, la afinidad de unión puede ser una IC50 para la unión, por ejemplo, la concentración capaz de llevar a una inhibición del 50% de un péptido estándar. En algunas realizaciones, la molécula de HLA es una molécula de HLA de clase I o una molécula de HLA de clase II, como cualquiera de las expuestas en la Tabla 1A o la Tabla 1B. En algunas realizaciones, HLA es HLA-A*02:01, HlA-A*03:01, HLA-A*11:01 y HlA-B*08:01.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se unen a un alelo de HLA-A2, que en algunas poblaciones se expresa en aproximadamente el 50% de la población. En algunas realizaciones, el alelo de HLA-A2 puede ser un producto génico de HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206 o *0207. En algunos casos, puede haber diferencias en la frecuencia de subtipos entre diferentes poblaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, más del 95% de la población caucásica positiva para HLA-A2 es HLA-A0201, mientras que en la población china se ha informado que la frecuencia es aproximadamente del 23% de HLA-A*0201,45% de HLA-A*0207, 8% de HLA-A*0206 y 23% de HLA-A*0203. En algunas realizaciones, el epítopo restringido por MHC es HLA-A*0201, que se expresa en aproximadamente el 39-46% de todos los caucásicos.

En algunos casos, el péptido o péptidos típicamente tienen una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 aminoácidos, como una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 15 aminoácidos. En algunos casos, un péptido o una pluralidad de péptidos individualmente tiene una longitud de o de aproximadamente 9 a 22 aminoácidos para el reconocimiento en el complejo de MHC de Clase II, como por ejemplo aproximadamente 15 aminoácidos. En algunos casos, un péptido o una pluralidad de péptidos individualmente tiene una longitud de o de aproximadamente 7 a 15 aminoácidos, como de 8 a 13 aminoácidos, para reconocimiento en el complejo de MHC Clase I. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos son un péptido aislado.

En algunos casos de los métodos descritos en la presente, un péptido o péptidos que es un antígeno peptídico o un epítopo o epítopos o una porción o porciones de los mismos, se administra de una manera que inhibe, reduce o previene el potencial de una respuesta inmunitaria (como tras la administración posterior de las células manipuladas o la proteína recombinante, como CAR, que contiene el epítopo). En algunos aspectos, esta inhibición o reducción o prevención se lleva a cabo mediante la inducción de tolerancia específica del antígeno (o epítopo) a proteínas o células que contienen un epítopo presente en la proteína, por ejemplo, en linfocitos. La inducción de tolerancia puede depender de factores, como la forma física o la naturaleza del antígeno, la vía de administración y/o la dosis de péptido (ver, por ejemplo, Hochweller et al. (2006) Curr. Mol. Med., 6:631-43; Parija (2014) Immune Response In Textbook of Microbiology and Immunology (pp. 134-142)). Por ejemplo, los péptidos administrados en forma soluble, por ejemplo, no agregada, pueden ser más tolerogénicos que los antígenos agregados. En algunas realizaciones, las dosis bajas repetidas pueden, en algunos aspectos, inducir la tolerancia. En algunos casos, la administración de una dosis alta de un antígeno peptídico puede inducir tolerancia. Los estudios han demostrado que, en algunos casos, el péptido, cuando se administra en forma soluble por vía intraperitoneal (i.p.), intravenosa (i.v.), intranasal (i.n.) u oral, puede inducir la tolerancia de las células T (Anderton and Wraith, Eur. J. Immunol.

28:1251-1261 (1998); Liu and Wraith, Int. Immunol. 7:1255-1263 (1995); Metzler and Wraith (1999) Immunology 97:257-263; Aichele et al. (1995) J. Exp. Med., 182:261-266). En algunas realizaciones, se emplean una o más de las condiciones anteriores cuando se administra un péptido o una combinación de péptidos en el contexto de los péptidos y/o células proporcionados para su uso en los métodos.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran en una forma soluble en agua pero en ausencia de una señal proinflamatoria, como en ausencia de adyuvante. Por ejemplo, en algunos casos, se sabe que los adyuvantes pueden facilitar la activación de los linfocitos y la promoción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran en presencia de un adyuvante, pero junto con un agente tolerogénico para reducir o atenuar una respuesta inmunitaria. En algunos aspectos, un agente tolerogénico puede interferir con la activación de células T, como interferir con la coestimulación de una célula T requerida para la activación de células T. En general, los linfocitos T que reconocen antígenos extraños sin coestimulación, pero en presencia de un adyuvante, pueden hacer que las células T mueran (deleción) por muerte celular inducida por activación (AICD).

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos pueden administrarse mediante la administración repetida del péptido una pluralidad de veces, lo que puede promover la tolerancia. En algunas realizaciones, la administración repetida es con una dosis baja de péptido. En algunas realizaciones, la administración repetida del péptido o péptidos se produce durante un período de tiempo prolongado, como hasta tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas o un mes. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos pueden administrarse en una cantidad de dosis alta. En algunas realizaciones, se emplean uno o más de los modos de administración, programas o frecuencia de administración anteriores.

En algunos casos, el péptido o péptidos se coadministran con células manipuladas genéticamente con una proteína o molécula recombinante, como un receptor recombinante, como un receptor quimérico (por ejemplo, CAR) y, en general, un receptor quimérico correspondiente (por ejemplo, CAR) que contiene una región inmunogénica que es la misma o está relacionada con la secuencia presente en el péptido, por ejemplo, una región que contiene un epítopo peptídico que muestra una afinidad de unión por una molécula de HLA de menos de 1000 nM, menos de 500 nM o menos de 50 nM. En algunos casos, la administración del receptor quimérico (por ejemplo, CAR) se realiza mediante métodos de terapia celular adoptiva usando células, como células T, manipuladas con un CAR. En algunos aspectos, las células se aíslan de un sujeto, se manipulan y se administran al mismo sujeto. En otros aspectos, se aíslan de un sujeto, se manipulan y se administran a otro sujeto.

En algunas realizaciones, el receptor quimérico es un CAR que generalmente se une específicamente a uno o más antígenos expresados por, asociados con y/o específicos para una enfermedad o afección en el sujeto y/o células o tejidos del mismo. En algunos casos, el receptor quimérico es un receptor que no es un receptor de antígeno, como uno de una pareja de socios de compañeros y/o una variante de la misma, el otro compañero de la cual se expresa específicamente en el contexto de una enfermedad o afección o células o tejidos de las mismas, y/o cuya expresión está asociada con la enfermedad o afección. En algunos casos, tales receptores quiméricos contienen porciones de unión extracelulares que interactúan específicamente con dicho compañero de unión y contienen, por ejemplo, dominio o dominios de señalización transmembrana y/o intracelular capaces de potenciar una señal o señales inmunoestimuladoras, como dominios activadores y/o coestimuladores como los presentes en ciertos receptores de antígenos quiméricos. De manera similar, en algunas formas de receptores quiméricos, el receptor puede mediar una función supresora, como las demostradas en las células T reguladoras. Para mantener el entorno supresor deseado, tales células también necesitan persistir y resistir el rechazo inmunológico debido a la inmunogenicidad de sus neoepítopos formados por fusión génica. En estos casos, la tolerancia al rechazo inmunitario también es valiosa y puede mediarse a través de péptidos derivados de "neoepítopos" apropiados. En algunos casos, el antígeno o compañero de unión está asociado y/o es específico de una enfermedad o afección que puede incluir tumores, cánceres, otras enfermedades proliferativas, enfermedades o trastornos autoinmunes, y/o agentes infecciosos o enfermedad.

En algunos casos, el péptido o péptidos pueden administrarse antes, simultáneamente, intermitente o posteriormente a la administración de la terapia o el agente, por ejemplo, células manipuladas, que se expresan en o incluyen la proteína u otra molécula que contiene el epítopo o los epítopos presentes en el péptido, por ejemplo, un receptor recombinante o manipulado genéticamente como un receptor quimérico (por ejemplo, CAR). En general, el péptido o péptidos se administran antes de la administración de las células que expresan el receptor quimérico, como antes de la administración del agente como las células.

En algunas realizaciones, los métodos también incluyen el tratamiento con un fármaco inmunosupresor. En algunas realizaciones, el fármaco inmunosupresor se administra antes, simultáneamente, posteriormente o intermitente con la administración del péptido. En algunos casos, el fármaco inmunosupresor se administra antes, simultáneamente, posteriormente o intermitente con la administración del agente, por ejemplo, células y/o receptor quimérico, como CAR.

En algunos casos, los métodos descritos reducen, disminuyen o previenen una respuesta inmunitaria en un sujeto al que se le administran células que expresan el receptor quimérico, como CAR, en comparación con la respuesta inmunitaria generada en el sujeto al que se administran células que expresan el receptor quimérico, como CAR, en ausencia de péptido o péptidos. En algunos casos, el sujeto no muestra una respuesta inmunitaria o un tipo o grado particular de respuesta inmunitaria contra el receptor quimérico, como después de la administración de las células que expresan el receptor. El tipo de respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria detectable, una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria mediada por células.

En algunos casos, los métodos proporcionados logran una persistencia aumentada de células T manipuladas genéticamente que expresan el receptor quimérico, como el CAR, cuando se administran a un sujeto. En algunos casos, una célula manipulada genéticamente con una persistencia aumentada muestra una mejor potencia en un sujeto al que se le administra. En algunos casos, la persistencia de las células manipuladas genéticamente, como las células T que expresan CAR, en el sujeto tras la administración es mayor en comparación con la que se lograría mediante métodos alternativos, como los que implican la administración de células manipuladas genéticamente en los que el péptido o péptidos no se coadministran con las células manipuladas genéticamente. En algunos aspectos, la persistencia de las células administradas aumenta por lo menos o aproximadamente por lo menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o más.

En algunos casos, el grado o extensión de la persistencia de las células administradas puede detectarse o cuantificarse después de la administración a un sujeto. Por ejemplo, en algunos aspectos, se usa PCR cuantitativa (qPCR) para evaluar la cantidad de células que expresan el receptor quimérico (por ejemplo, células que expresan CAR) en la sangre, el suero, el órgano o el tejido (por ejemplo, el sitio de la enfermedad) del sujeto. En algunos aspectos, la persistencia se cuantifica como copias de ADN o plásmido que codifica el receptor, por ejemplo, CAR, por microgramo de ADN, o como el número de células que expresan el receptor, por ejemplo, CAR, por microlitro de la muestra, por ejemplo, de sangre o suero, o por número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o glóbulos blancos o células T por microlitro de la muestra. En ciertos casos, también pueden realizarse ensayos de citometría de flujo que detectan células que expresan el receptor generalmente usando anticuerpos específicos para los receptores. También pueden usarse ensayos basados en células para detectar el número o porcentaje de células funcionales, como células capaces de unirse y/o neutralizar y/o inducir respuestas, por ejemplo, respuestas citotóxicas, contra células de la enfermedad o afección o que expresan el antígeno reconocido por el receptor. En cualquiera de tales casos, puede usarse la extensión o nivel de expresión de otro marcador asociado con el receptor recombinante (por ejemplo, células que expresan CAR) para distinguir las células administradas de las células endógenas en un sujeto.

También se describen composiciones que contienen el péptido o péptidos y/o células manipuladas. También se describen artículos de fabricación, como kits y dispositivos, para administrar los péptidos, células y composiciones a sujetos, como para terapia celular adoptiva.

II. Péptidos, composiciones y métodos de administración de péptidos

A. Péptidos

En la presente se describen péptidos que corresponden a, como basados en o derivados de, una secuencia de aminoácidos presentes en una terapia o agente, como una célula manipulada, como una proteína recombinante, por ejemplo, un receptor recombinante, por ejemplo, un receptor recombinante, por ejemplo, un receptor quimérico, como un CAR. También se describen métodos para administrar tales péptidos a un sujeto, por ejemplo, para reducir o prevenir una respuesta inmunitaria al agente o terapia, por ejemplo, para inducir tolerancia en el sujeto a un antígeno que está o está dentro de la terapia o agente, por ejemplo, que se expresa en o es expresado por la célula o sobre la célula o está incluido dentro de la proteína recombinante como el receptor quimérico, por ejemplo un CAR. La invención está definida por las reivindicaciones y se refiere a péptidos que comprenden una porción de una región inmunogénica de un CAR y/o células que expresan el CAR para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto humano. En algunos casos, los receptores quiméricos y otras proteínas administradas, y las células que los expresan, como las CAR, pueden ser antigénicas. Por ejemplo, pueden contener uno o más epítopos de células T y/o epítopos de células B reconocidos por el sistema inmunitario de una manera que provoca una respuesta inmunitaria productiva y específica contra dicho agente, que por ejemplo puede dar como resultado la depuración o reducción de las células. En algunas realizaciones, dicha inmunogenicidad puede desarrollarse debido a que los péptidos contienen secuencias que no se producen de manera natural en el cuerpo del sujeto y que se reconocen como ajenas al sujeto. En algunos casos, el péptido o péptidos administrados en los métodos proporcionados y/o el péptido o péptidos proporcionados es o contiene un epítopo, como un epítopo peptídico (o epítopo de células T), presente dentro del agente que se va a administrar, como la proteína recombinante, como el receptor quimérico.

En algunas realizaciones, el péptido y/o el epítopo son reconocidos por la respuesta inmunitaria para iniciar una respuesta inmunitaria o activación o señal primaria de una célula inmunitaria del mismo, como iniciar la activación humoral o mediada por células, contra dicha secuencia peptídica. En algunas realizaciones, el epítopo peptídico puede asociarse o unirse a una molécula de MHC expresada en una célula para su reconocimiento por un receptor de células T (TCR). En algunas realizaciones, el péptido o péptidos, bajo ciertas condiciones, pueden provocar una respuesta inmunitaria en un animal, como una respuesta de células T. Por ejemplo, en algunos casos, las células T que expresan un TCR que reconoce un epítopo de células T en el contexto de una molécula de MHC pueden estimularse, por ejemplo, con una señal primaria y secundaria, lo que lleva a respuestas de células T, como la proliferación de células T, secreción de linfoquinas, respuestas citotóxicas, reacciones inflamatorias locales, reclutamiento de células inmunitarias adicionales y/o activación de células B que lleva a la producción de anticuerpos contra la proteína que contiene el epítopo peptídico, como un receptor quimérico. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica identificar un epítopo peptídico de cualquier receptor quimérico.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos, bajo ciertas condiciones, son capaces de inducir tolerancia, por ejemplo, tolerar a un sujeto a un antígeno que contiene el epítopo, por ejemplo, el epítopo peptídico, por ejemplo, previniendo, reduciendo o regulando por disminución de otro modo una respuesta inmunitaria específica a un receptor quimérico que contiene el antígeno. En algunos casos, el péptido o péptidos son, incluyen o están relacionados con una región inmunogénica del agente que se va a administrar, como la célula manipulada y/o proteína o molécula expresada por la misma, como un receptor recombinante, por ejemplo, un receptor quimérico, como un CAR, que contiene el epítopo peptídico. En algunas realizaciones, esta capacidad se debe a la capacidad del péptido o péptidos para inducir la activación de células inmunitarias en ciertos contextos y/o para inducir la activación parcial o transitoria o de corta duración de las células inmunitarias, por ejemplo, sin un adyuvante. En algunos casos, el péptido o péptidos son, incluyen o tienen una secuencia relacionada con una secuencia de aminoácidos no nativa del agente o molécula recombinante, como el receptor, por ejemplo, un receptor quimérico, como una secuencia no humana, presente. en el receptor quimérico (por ejemplo, CAR). En algunos aspectos, la tolerancia puede ser inducida por el péptido o péptidos cuando se administra en forma soluble, a una dosis baja (incluyendo una pluralidad de veces) o a una dosis alta, en ausencia de adyuvante y/o en presencia de adyuvante con la coadministración de un agente tolerogénico. En algunas realizaciones, la tolerancia puede inducirse mediante la administración de péptidos por vía intraperitoneal (i.p.), intravenosa (i.v.), intranasal (i.n.), u oral o subcutánea (s.c.).

Un péptido es generalmente una porción de un polipéptido menor que la longitud total pero que tiene una longitud mayor o igual a 2 aminoácidos, como uno que tiene una longitud mayor o igual a 2 y menor o igual a 50 o 40 aminoácidos. En algunos casos, el péptido tiene entre 7 y 40 aminoácidos, 8 y 20 aminoácidos, 10 y 17 aminoácidos, 7 y 13 aminoácidos u 8 y 10 aminoácidos. En algunos casos, el péptido tiene una longitud de entre 7 y 20 aminoácidos. En algunos casos, el péptido tiene una longitud de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos.

En algunos casos, el péptido o péptidos es un péptido que comprende un epítopo dentro de una región inmunogénica del agente, por ejemplo, el receptor quimérico. En algunos casos, la región inmunogénica es o incluye o está contenida en una porción de scFv, una porción conectora, una secuencia de aminoácidos del receptor quimérico no endógena al sujeto, una secuencia del receptor quimérico derivada de una especie diferente a la del sujeto, y/o una unión entre dos dominios de un receptor quimérico.

En algunos casos, el receptor quimérico es un receptor de antígeno quimérico (CAR) que contiene un dominio de unión a ligando extracelular. En algunos casos, el dominio de unión al ligando extracelular es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es o incluye una secuencia derivada de una especie distinta del sujeto al que se administra el receptor quimérico. En algunas realizaciones, la especie es un ratón u otro roedor. En algunos casos, el receptor quimérico como, en la invención, un CAR, incluye un dominio de unión a antígeno extracelular, como una porción de una molécula de anticuerpo, generalmente una región de cadena pesada variable (V^h) y/o región de cadena ligera variable (V^l) del anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo scFv. En algunas realizaciones, el epítopo peptídico es una secuencia presente en una región inmunogénica que es o incluye o está contenida en una región marco (FR) dentro de la porción scFv, una secuencia de FR de cadena pesada, una secuencia de CDR de cadena pesada, una secuencia de FR de cadena ligera, y/o una secuencia CDR de cadena ligera.

En algunos casos, el receptor quimérico contiene por lo menos un primer dominio y un segundo dominio, y la región inmunogénica del receptor quimérico es una región de unión que comprende aminoácidos a cada lado de una unión entre dichos dos dominios. En algunos casos, el péptido tiene una secuencia de aminoácidos que es, contiene o está relacionada con una secuencia de aminoácidos que abarca una región de unión de un receptor quimérico, como un CAR, entre dos dominios. Generalmente, los receptores quiméricos incluyen una pluralidad de dominios diferentes, como una pluralidad de dominios endógenos o de origen natural. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un CAR incluye un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente a un antígeno objetivo y un dominio de señalización intracelular que comprende un ITA^m(por ejemplo, dominio de señalización intracelular de CD3-zeta). En algunos casos, el receptor quimérico incluye (en lugar o además de un dominio que contiene ITAM) otros dominios de señalización que pueden ser coestimuladores y/o inhibidores. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv). Un CAR en algunas realizaciones también puede contener un dominio transmembrana y/o un endodominio entre el dominio de reconocimiento extracelular y el dominio de señalización, que puede incluir dominios de señalización transmembrana y/o intracelulares de una molécula coestimuladora, como una molécula coestimuladora de CD28 o 4-1BB. En algunos casos, tales dominios pueden conectarse mediante conectores.

En algunos casos, la pluralidad de dominios normalmente no están presentes adyacentes entre sí en secuencia en una molécula endógena en un sujeto. Por ejemplo, en algunos casos, un primer dominio y un segundo dominio de un receptor quimérico que se unen en una unión pueden crear una secuencia contigua de aminoácidos que pueden no estar presentes en un sujeto, particularmente cuando estos dos dominios no se encuentran de manera natural adyacentes en la misma proteína y/o están separados por un conector sintético. En algunos casos, esto puede dar como resultado la presencia de una secuencia no nativa que no es idéntica a una secuencia presente en una molécula endógena del huésped en la porción de la secuencia de un receptor quimérico, como un CAR, que contiene la unión entre dos dominios.

En algunos casos, una región de unión que contiene epítopos peptídicos potenciales que abarcan la unión de los dos dominios puede ser inmunogénica y dar como resultado la generación de una respuesta inmunitaria tras la administración a un sujeto de un receptor quimérico que contiene la región de unión. En algunos casos, la región de unión puede incluir, como tras el procesamiento del antígeno para su visualización en un HLA, una pluralidad de fragmentos peptídicos superpuestos individuales de secuencia contigua de aproximadamente 8 a 24 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 15 aminoácidos o de 8 a 13 aminoácidos), como aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos) directamente C-terminales de la unión que une un primer dominio y un segundo dominio del receptor quimérico y/o de aproximadamente 8 a 24 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 15 aminoácidos o de 8 a 13 aminoácidos, como aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos) directamente N-terminales de la unión, cada uno de cuyos fragmentos peptídicos puede incluir o abarcar la unión de los dos dominios. Por tanto, en algunos casos, la región de unión puede contener una pluralidad de epítopos peptídicos potenciales que pueden mostrar una afinidad de unión por una molécula de HLA y/o ser capaces de inducir una respuesta inmunitaria.

En algunos casos, el péptido o péptidos contienen una secuencia contigua de aminoácidos de la región de unión. En algunos casos, el primer dominio y el segundo dominio son, respectivamente, un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio bisagra, un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio transmembrana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimulador intracelular, y un dominio de señalización coestimulador intracelular y un dominio de señalización de ITAM. En algunos casos, el primer dominio es un dominio transmembrana o una parte funcional del mismo y el segundo dominio es un dominio de señalización coestimulador o una parte funcional del mismo. En algunos casos, el receptor quimérico es un CAR y el péptido o péptidos tienen una secuencia de aminoácidos que es, contiene o está relacionada con una secuencia de aminoácidos que contiene una región de unión entre cualquiera de los siguientes dominios: un scFv, un dominio transmembrana de CD28, un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, un dominio de señalización intracelular de CD3-zeta, un dominio de T2A, un porción truncada de EGFR (EGFRt), un dominio de señalización de CD8a, un dominio bisagra de IgG4 y/o un conector, incluyendo, por ejemplo, un conector (GGGGS)x.

En algunos casos, una región de unión de un receptor quimérico (por ejemplo, CAR) contiene una porción contigua de un dominio transmembrana y una porción contigua de un dominio coestimulador unidos en una unión. En la invención, el dominio transmembrana incluye una porción transmembrana de CD28. En la invención, el dominio de señalización coestimulador incluye el dominio de señalización coestimulador intracelular de una molécula coestimuladora de células T. En algunos casos, la molécula coestimuladora es CD28. En la invención, el dominio coestimulador es 41BB. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, 103 o 104 o una porción funcional o variante de la misma que comprende una secuencia que muestra por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, 103 o 104. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador de 4-1BB comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o una porción funcional o variante de la misma que comprende una secuencia que muestra por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana de CD28 y el dominio coestimulador de 4-1BB juntos tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o una porción funcional o variante funcional del mismo que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5.

En algunos casos, la región de unión contiene una porción de la SEQ ID NO:5 que es o incluye la unión de los dos dominios. En algunas realizaciones, la región de unión es o incluye la secuencia de aminoácidos CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPF (SEQ ID NO: 6). En la invención, la región de unión es o incluye la secuencia de aminoácidos SLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQ (SEQ ID NO: 137). En algunas realizaciones, la región de unión es o incluye la secuencia de aminoácidos CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQT (SEQ ID NO: 160).

En algunos casos, el péptido o péptidos tienen una secuencia de aminoácidos que es o está contenida dentro de una porción de la región de unión de la SEQ ID NO:5. En algunos casos, el péptido o péptidos tienen una secuencia de aminoácidos que es o está contenida dentro de una región de unión expuesta en la SEQ ID NO:6. En algunos casos, el péptido o péptidos tienen una secuencia de aminoácidos que es o está contenida dentro de una región de unión expuesta en la SEQ ID NO:137. En algunos casos, el péptido o péptidos tienen una secuencia de aminoácidos que está contenida dentro de una región de unión expuesta en la SEQ ID NO: 160. En algunos casos, el péptido o péptidos tienen una secuencia contigua de aproximadamente 8 a 24 aminoácidos. (por ejemplo, de 8 a 15 aminoácidos o de 8 a 13 aminoácidos, como de aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos) contenidos dentro de una región de unión de la SEQ ID NO: 5 o contenidos dentro de SEQ ID NO: 6 o contenidos dentro de la SEQ ID NO: 137 o contenidos dentro de la SEQ ID NO: 160.

En algunos casos, puede administrarse al sujeto una pluralidad de péptidos, en la que los péptidos representan dos o más péptidos presentes en una región de unión o región inmunogénica de un receptor quimérico. En algunos casos, la pluralidad puede representar una serie de fragmentos peptídicos superpuestos de la misma región de unión o región inmunogénica. En algunos casos, la pluralidad de péptidos representa fragmentos de péptidos presentes en dos o más regiones de unión o regiones inmunogénicas diferentes del receptor quimérico. En algunos casos, la pluralidad de péptidos pueden ser péptidos superpuestos de, por ejemplo, 8 a 24 aminoácidos (por ejemplo, 8 a 15 aminoácidos u 8 a 13 aminoácidos, como aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos), de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5, 6, 137 o 160. La pluralidad de péptidos puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más péptidos.

En algunos casos, el péptido o la pluralidad de péptidos individualmente es o contiene la secuencia de aminoácidos AFIIFWVKRGRKKLL (SEQ ID NO: 8), FWVKRGRKKLLYIFK (SEQ ID NO: 9, también expuesta en la SEQ ID NO: 165), FIIFWVKRGRKKLL (SEQ ID NO: 165), FIIFWVKRGRKKLL (SEQ ID NO: 8), ID NO: 10), FIIFWVKRGRKKL (SEQ ID NO: 11), IIFWVKRGRKKLL (SEQ ID NO: 12), VAFIIFWVK (SEQ ID NO: 16), AFIIFWVKR (SEQ ID NO: 17), FIIFWVKRG (SEQ ID NO: 18), IIFWVKRGR (SEQ ID NO: 19), IFWVKRGRK (SEQ ID NO: 20), FWVKRGRKK (SEQ ID NO: 21) o WVKRGRKKL (SEQ ID NO: 22), TVAFIIFWVKRGRKK (SEQ ID NO: 163), KRGRKKLLYIFKQPF (SEQ ID NO: 166), RKKLLYIFKQPFMRP (SEQ ID NO: 167), LLYIFKQPFMRPVQT (SEQ ID NO: 168), una porción de la misma, o es un peptidomimético, un análogo o una variante del mismo. En algunos casos, la porción es un péptido que comprende por lo menos 7 aminoácidos, se une específicamente a una molécula de MHC y es capaz de inducir tolerancia, es decir, prevenir, reducir o regular por disminución de otro modo una respuesta inmunitaria a un receptor quimérico coadministrados, como un CAR.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos pueden unirse a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), como una proteína de clase I o clase II, que son moléculas que contienen un sitio de unión de péptido polimórfico o una ranura de unión que puede, en algunos casos, formar complejos con fragmentos peptídicos de polipéptidos, incluyendo péptidos procesados por la maquinaria celular. En algunos casos, las moléculas de MHC pueden presentarse o expresarse en la superficie celular, incluyendo un complejo con un péptido, es decir, un complejo MHC-péptido, para la presentación de un antígeno en una conformación reconocible por los TCR en las células T. Generalmente, las moléculas de MHC de clase I son heterodímeros que tienen una cadena a que abarca la membrana, en algunos casos con tres dominios a, y una microglobulina p2 asociada no covalentemente. Generalmente, las moléculas de MHC de clase II están compuestas por dos glicoproteínas transmembrana, a y p, ambas de las cuales típicamente abarcan la membrana. Una molécula de MHC puede incluir una porción eficaz de un MHC que contiene un sitio o sitios de unión a antígeno para unir un péptido y las secuencias necesarias para el reconocimiento por la molécula de unión apropiada, como TCR. En algunas realizaciones, las moléculas de MHC de clase I suministran péptidos que se originan en el citosol a la superficie celular, donde las células T reconocen un complejo péptido:MHC, como generalmente células T CD8+, pero en algunos casos células T CD4+. En algunas realizaciones, las moléculas de MHC de clase II suministran péptidos que se originan en el sistema vesicular a la superficie celular, donde típicamente son reconocidos por las células T CD4+. En general, las moléculas de MHC están codificadas por un grupo de loci enlazados, que se denominan colectivamente H-2 en el ratón y antígeno leucocitario humano (HLA) en humanos. Por lo tanto, al MHC típicamente humano también puede hacerse referencia como antígeno leucocitario humano (HLA). Las secuencias de los alelos del MHC son conocidas y pueden encontrarse, por ejemplo, en la base de datos IMGT/HLA disponible en www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos pueden unirse a una molécula de MHC que es una molécula de MHC humana. En algunas realizaciones, la molécula de MHC es una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA).

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos requieren procesamiento adicional. Por ejemplo, en algunas realizaciones, algunos epítopos se unen a MHC de una manera dependiente de la carga de MHC en los endosomas y, por lo tanto, requieren procesamiento (Viner et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 2214-2218). En algunas realizaciones, el péptido o péptidos pueden presentarse en moléculas de MHC sin procesamiento.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos (o una forma procesada de los mismos) muestran afinidad de unión por un alelo de MHC del sujeto al que se administrará. En algunas realizaciones, la afinidad de unión puede variar de 0,1 nM a 25.000 nM, de 0,1 nM a 5000 nM, de 0,1 nM a 1000 nM, de 0,1 nM a 500 nM, de 0,1 nM a 250 nM, de 0,1 nM a 100 nM, de 0,1 nM a 50 nM, de 0,1 nM a 25 nM, o de 0,1 nM a 10 nM. Está dentro de la capacidad del experto en la técnica determinar la afinidad de unión del péptido. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos muestran una afinidad de unión (por ejemplo, IC50) que es menor de 1000 nM, menor de 500 nM o menor de 50 nM.

En algunas realizaciones, la afinidad de unión puede determinarse experimental o algorítmicamente. En algunas realizaciones, la afinidad de unión de un péptido por un MHC puede determinarse computacionalmente, como mediante el uso de algoritmos basados en modelos de afinidad de unión cuantitativa (Lafuente y Reche (2009) Current Pharmaceutical Design, 15:3209-3220).

En algunas realizaciones, determinar la afinidad de unión de un péptido a una molécula de MHC implica ensayos de unión de competición de radiactividad o fluorescencia. Ver, por ejemplo, Ettinger et al., J. Immunol.

160:2365 (1998). En algunas realizaciones, el ensayo de competición produce una comparación de las afinidades de unión de diferentes péptidos. Algunos estudios de unión al MHC utilizan moléculas de clase I solubilizadas con detergente de líneas celulares transformadas con EBV (ver, por ejemplo, Sette, A., et al., Mol Immunol, 31 (11) :813-22 (1994). En algunas realizaciones, el ensayo competitivo implica MHC cargado naturalmente, y la molécula de MHC de interés puede purificarse de otras moléculas de MHC en el lisado de detergente o usarse en una mezcla con otras moléculas de MHC. En algunas realizaciones, pueden identificarse péptidos radiomarcados que tienen una alta afinidad por la molécula de MHC en cuestión. En algunas realizaciones, se determina luego la afinidad de péptidos de "prueba" adicionales por la molécula de MHC en cuestión por su capacidad para competir con el péptido radiomarcado de alta afinidad.

En algunas realizaciones, determinar la afinidad del péptido puede implicar un ensayo de reconstitución, por ejemplo, usando células "T2", en las que las células que expresan un alelo de MHC apropiado se "desprenden" de un péptido de unión nativo mediante incubación a pH 2-3 durante un período corto de tiempo. En algunas realizaciones, para determinar la afinidad de unión de un péptido de unión a MHC putativo por el mismo alelo de MHC, el monómero de MHC desprendido puede combinarse en solución con el péptido de unión a MHC putativo, beta2-microglobulina y un anticuerpo monoclonal dependiente de la conformación. En algunas realizaciones, puede usarse la diferencia en la intensidad de la fluorescencia determinada entre células incubadas con y sin el péptido de unión de prueba después del marcado, por ejemplo, ya sea directamente con el anticuerpo monoclonal marcado o un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, para determinar la unión del péptido de prueba.

En algunas realizaciones, la afinidad de unión puede predecirse usando métodos in silico. A continuación se describen ejemplos de métodos in silico para predecir la afinidad de unión.

En algunas realizaciones, la afinidad de unión de un péptido por una molécula de MHC (por ejemplo, HLA) está representada por una IC50, que es la concentración de péptido en un ensayo de unión en el que se observa una inhibición del 50% de la unión de un péptido de referencia. En algunos casos, tales ensayos pueden realizarse en condiciones en las que los valores de IC50 se aproximan a los valores de K^d(es decir, limitando las concentraciones de proteínas HLA y péptidos marcados). En algunas realizaciones, la unión puede expresarse con respecto a un péptido de referencia.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos son un epítopo del MHC de clase II. En algunos casos, los péptidos que se unen a las moléculas del MHC de clase II pueden tener una longitud de entre 8 y 20 aminoácidos, incluyendo realizaciones de entre 10 y 17 aminoácidos de longitud, como o por lo menos aproximadamente o por lo menos o aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 aminoácidos de longitud, por ejemplo, aproximadamente 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los péptidos que se unen a las moléculas del MHC de clase II pueden tener más de 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se encuentran en una conformación extendida a lo largo de la ranura de unión al péptido de MHC II. En algunas realizaciones, la ranura de unión al péptido de MHC II está abierta en ambos extremos. En algunas realizaciones, el péptido se mantiene en su lugar por lo menos en parte mediante contactos del átomo de la cadena principal con residuos conservados que recubren la ranura de unión del péptido. En algunas realizaciones, el MHC de clase II es un dímero ap que puede ser o incluir cualquier proteína alélica del MHC de clase II que se sepa que está presente en un sujeto, como un sujeto humano. En algunas realizaciones, el alelo de MHC puede ser, pero no se limita a, DR1, DR3, DR4, DR7, DR52, DQ1, DQ2, DQ4, DQ8 y DP1. En algunas realizaciones, el alelo del MHC de clase II puede ser cualquiera de los expuestos en las Tablas 1B, incluyendo las asociaciones alfa y beta de isotipos coincidentes o heterodímeros de isotipos mixtos que combinan cadenas alfa y beta de diferentes alelos. En algunas realizaciones, el MHC de clase II puede ser un dímero que es o incluye un alelo alfa y/o beta de entre HLA-DPA1*0103, HLA-DPA1*0201, HLADPB1 *0101, HLA-DPB1 *0301, HLA-DPB1 *0401, HLA-DPB*0402, HLA-DPB1 *1501, HLA-DRA*0101, HLA-DRB1 *0101, HLA-DRB1 *0102, HLA-DRB*0301, HLA-DRB*0701, HLA-DRB*0401, HLA-DRB1 *1101, HLA-DRB1 *1104, HLADRB*1501, y/o HLA-DQB1*0201.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos son o contienen un epítopo de MHC de clase I. En algunos casos, los péptidos que se unen a moléculas de MHC de clase I pueden tener entre 7 y 15 aminoácidos de longitud. En algunos casos, los péptidos que se unen a la molécula de MHC de clase I pueden tener entre 8 y 13 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la unión del péptido se estabiliza en sus dos extremos mediante contactos entre átomos en la cadena principal del péptido y sitios invariables en la ranura de unión del péptido de todas las moléculas de MHC de clase I. En algunas realizaciones, hay sitios invariables en ambos extremos de la ranura que se unen a los extremos terminales amino y carboxi del péptido. En algunas realizaciones, las variaciones en la longitud del péptido pueden acomodarse mediante una torcedura en la estructura principal del péptido. En algunas realizaciones, la torcedura incluye residuos de prolina o glicina, que pueden permitir flexibilidad. En algunas realizaciones, el alelo de MHC de clase I puede ser cualquiera que se sepa que está presente en un sujeto, como un sujeto humano. En algunas realizaciones, el alelo de MHC de clase I es un alelo de HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 o HLA-Cw8. En algunas realizaciones, el alelo de MHC de clase I puede ser cualquiera de los expuestos en las Tablas 1A, que se encuentran entre los alelos de MHC de clase I más frecuentes (Solberg et al., (2008) Hum Immunol. 2008 julio; 69(7):443-6).

En algunas realizaciones, el alelo de MHC de clase I es un alelo de HLA-A2, que en algunas poblaciones es expresado aproximadamente por el 50% de la población. En algunas realizaciones, el alelo de HLA-A2 puede ser un producto génico de HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206 o *0207. En algunos casos, puede haber diferencias en la frecuencia de subtipos entre diferentes poblaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, más del 95% de la población caucásica positiva para HLA-A2 es HLA-A*0201, mientras que en la población china se ha informado que la frecuencia es de aproximadamente el 23% de HLA-A*0201, 45% de HLA -A*0207, 8% de HLA-A*0206 y 23% de HLA-A* 0203. En algunas realizaciones, la molécula de MHC es HLA-A*0201.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos pueden producirse sintéticamente mediante síntesis química usando técnicas estándar (Peptide Chemistry, A Practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin). Por ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse mediante técnicas de fase sólida (Roberge J Y et al (1995) Science 269: 202-204). En algunas de tales realizaciones, los péptidos sintetizados pueden escindirse de la resina y purificarse, por ejemplo mediante cromatografía líquida preparativa de alto rendimiento (por ejemplo, Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY). En algunas realizaciones, los péptidos pueden generarse mediante métodos de síntesis automatizados, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos ABI 431A (Perkin Elmer).

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos pueden elaborase mediante métodos recombinantes. En algunas realizaciones, los péptidos pueden producirse en una célula huésped transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho péptido. En algunos casos, tales células huésped pueden cultivarse en un medio adecuado para las células y los péptidos aislados pueden purificarse usando técnicas conocidas en la técnica para purificar péptidos. Los ejemplos de tales métodos incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, ultrafiltración, electroforesis o inmunopurificación con anticuerpos específicos para un péptido deseado. En algunas realizaciones, los péptidos pueden generarse por escisión a partir de un polipéptido más largo, como por escisión química o enzimática. Por ejemplo, el péptido puede obtenerse por escisión del antígeno objetivo, como un receptor quimérico particular (por ejemplo, CAR).

En algunas realizaciones, los péptidos se purifican y aíslan sustancialmente libres de cualquier otro polipéptido o contaminante, como purificados a partir de materiales celulares, otros polipéptidos o péptidos, medio de cultivo, productos químicos u otros contaminantes. En algunas realizaciones, los péptidos se purifican hasta una pureza de por lo menos el 90%, 95%, 97% o más. En algunas realizaciones, los péptidos se purifican hasta la homogeneidad.

En algunas realizaciones, la composición de un péptido puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman).

B. Modificaciones a los péptidos

En algunos casos, los péptidos descritos incluyen una secuencia de aminoácidos que está relacionada con una región inmunogénica de un receptor quimérico, como un CAR, es decir, el péptido es un péptido modificado, como un peptidomimético, un análogo de péptido u otra variante de péptido, que tiene una estructura química que está alterada en comparación con la región inmunogénica del receptor quimérico, como un CAR, pero que, sin embargo, es capaz de prevenir, reducir o regular por disminución de otro modo una respuesta inmunitaria específica de antígeno al receptor quimérico. En algunos casos, un péptido modificado tiene una secuencia de aminoácidos alterada en comparación con la secuencia de la proteína nativa de la que se deriva (por ejemplo, un receptor quimérico, como un CAR), como por sustitución, deleción o adición de aminoácidos o por sustitución de en0aces o ligamientos químicos.

En algunos casos, el péptido o péptidos pueden ser un peptidomimético que imita la actividad inmunogénica de un péptido derivado de un receptor quimérico, como un CAR. En algunos casos, un peptidomimético puede basarse en cualquier región inmunogénica de un receptor quimérico (por ejemplo, CAR), como cualquiera de los péptidos descritos en la presente. En algunos casos, el peptidomimético puede incluir un compuesto no unido completamente de subunidades unidas por enlaces peptídicos, pero unidas por otros ligamientos, como enlaces tioléster, análogos de enlaces reducidos o isosterasas de enlaces aminida. En algunos casos, el enlace amida normal puede reemplazarse por enlaces de la estructura principal de éster o alquilo, pueden incluirse sustituyentes N- o C-alquilo, modificaciones de la cadena lateral y restricciones como puentes disulfuro y ligamientos amida o éster de la cadena lateral.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos pueden modificarse para aumentar la solubilidad o la estabilidad, lo que puede dar como resultado una mayor eficacia, estabilidad in vivo del péptido o una vida biológica más larga. En algunas realizaciones, el péptido se modifica con un polímero, como polietilenglicol (PEG), monometoxipolietilenglicol (mPEG) o alcohol polivinílico (PVA).

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se modifican para mejorar su eficacia in vivo, por ejemplo, mejorando la capacidad de regular por disminución la respuesta inmunitaria a un receptor quimérico (por ejemplo, CAR). En algunos casos, pueden determinarse los residuos implicados en el reconocimiento de TCR usando técnicas conocidas, por ejemplo, sustitución de cada residuo y determinación de la presencia o ausencia de unión al MHC y/o reactividad de células T. Los residuos que se muestran necesarios o implicados en la interacción con el TCR pueden modificarse reemplazando dicho aminoácido o aminoácidos con otro aminoácido, como un residuo de aminoácido similar, por ejemplo, una sustitución conservadora, y puede evaluarse el péptido modificado para determinar la unión al MHC, la reactividad de las células T y/o la capacidad de regular por disminución la respuesta inmunitaria a un receptor quimérico (por ejemplo, CAR). En algunos casos, la modificación de epítopos puede realizarse en base a predicciones para una inducción de células T más eficiente derivadas usando el programa "Peptide Binding Predictions" (ver Parker, K. C et al. 1994. J. Immunol. 152:163).

En algunos casos, los péptidos pueden modificarse para incorporar uno o más polimorfismos en base a la secuencia de aminoácidos del antígeno proteico resultante de la variación alélica natural. En algunos casos, pueden sustituirse o añadirse D-aminoácidos, aminoácidos no naturales o análogos de no aminoácidos para producir un péptido modificado. En algunos casos, las modificaciones de los péptidos pueden incluir reducción/alquilación, acilación, acoplamiento químico a un portador apropiado o tratamiento suave con formalina.

En algunas realizaciones, un péptido o péptidos pueden modificarse añadiendo un grupo o grupos informadores a la estructura principal del péptido. Por ejemplo, en algunos casos, la adición de un grupo informador puede facilitar la purificación o aumentar la solubilidad de los péptidos. En algunas realizaciones, puede añadirse polihistidina a un péptido, por ejemplo, para purificar el péptido en cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados. En algunas realizaciones, puede introducirse un sitio de escisión de endoproteasas específico entre un grupo informador y una secuencia de aminoácidos para facilitar el aislamiento de péptidos libres de dichos grupos informadores. En algunas realizaciones, para garantizar el procesamiento de antígenos apropiado de los epítopos de células T dentro de un péptido, pueden manipularse los sitios sensibles a la proteasa canónica de manera recombinante o sintética antes o después de un epítopo de células T para que no se altere. En una realización ejemplar, pueden introducirse parejas de aminoácidos cargados, como KK o RR, entre regiones dentro de un péptido durante la construcción de recombinación o la síntesis del péptido. En tal ejemplo, el péptido resultante puede volverse sensible a la escisión por catepsina y/u otras enzimas similares a la tripsina para generar porciones del péptido que contiene un epítopo de células T.

En algunos casos, un péptido o péptidos pueden modificarse mediante la sustitución de residuos de cisteína, como serina, treonina, leucina o ácido glutámico, lo que puede minimizar la dimerización a través de enlaces disulfuro. En algunos casos, los péptidos pueden modificarse añadiendo un grupo o grupos funcionales al péptido, por ejemplo, para aumentar la solubilidad del péptido en una solución acuosa tamponada como un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, en algunos aspectos, pueden añadirse aminoácidos cargados o parejas o tripletes de aminoácidos cargados al extremo terminal carboxi o al extremo terminal amino o ambos del péptido. Los aminoácidos cargados ejemplares incluyen, por ejemplo, arginina (R), lisina (K), histidina (H), ácido glutámico (E) y ácido aspártico. En algunos casos, pueden eliminarse o sustituirse del extremo N- o C-terminal un aminoácido o aminoácidos, por ejemplo, para aumentar la eficiencia de la síntesis de péptidos. Por ejemplo, en algunos aspectos, el aminoácido N-terminal o C-terminal del péptido puede ser capaz de ciclación, o puede estar sujeto a degradación durante o después de la síntesis del péptido. En tal ejemplo, pueden añadirse uno o más aminoácidos adicionales para "bloquear" el aminoácido amino o carboxi-terminal menos deseable. Dichos aminoácidos añadidos pueden derivar de la secuencia de proteína nativa o pueden ser un residuo de aminoácido no nativo.

En algunos casos, un péptido modificado tiene una secuencia que muestra por lo menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 8-12, 16-22, 137, 160, 163, 165, 166, 167 o 168, siempre que el péptido modificado conserve la actividad para unirse a un MHC y/o para prevenir, reducir o regular por disminución de otro modo una respuesta inmunitaria a un receptor quimérico correspondiente. En algunos casos, un péptido modificado es un análogo de péptido o un peptidomimético de un péptido expuesto en cualquiera de las s Eq ID NO: 6, 8-12, 16-22, 137, 160, 163, 165, 166, 167 o 168, siempre que el péptido modificado se una a un MHC y/o retenga la actividad para prevenir, reducir o regular por disminución de otro modo una respuesta inmunitaria a un receptor quimérico correspondiente. Los métodos para evaluar la actividad de un péptido son conocidos en la técnica y a continuación los ensayos ejemplares se describen. En algunas realizaciones, el péptido modificado conserva su capacidad para unirse a una molécula de MHC o su capacidad para provocar una respuesta inmunitaria en determinadas condiciones en comparación con el péptido no modificado correspondiente. En algunas realizaciones, el péptido modificado conserva la actividad para regular por disminución la respuesta inmunitaria a un receptor quimérico (por ejemplo, CAR), como se determina en un modelo de ratón humanizado. Generalmente, un péptido conserva una actividad indicada si muestra por lo menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de la actividad indicada del péptido no modificado.

C. Métodos de identificación de péptidos

En algunos casos, los péptidos pueden identificarse determinando las regiones inmunogénicas de una proteína incluyendo, por ejemplo, las regiones inmunogénicas de un receptor quimérico. En algunos casos, el péptido es o incluye la región inmunogénica identificada. El receptor quimérico puede incluir cualquiera de los descritos en la presente o conocidos en la técnica, incluyendo los receptores de antígenos, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR) o los receptores quiméricos que no se unen a antígenos.

En algunos casos, la región inmunogénica puede identificarse por su capacidad para unirse a una molécula de MHC o por su capacidad para provocar una respuesta inmunitaria bajo ciertas condiciones.

En algunos casos, predecir si un péptido de interés se une a una molécula de MHC dada incluye analizar el péptido en busca de motivos de unión que probablemente se unan a una molécula de MHC particular. En algunos casos, pueden evaluarse los péptidos superpuestos de un receptor quimérico, como los péptidos superpuestos de 8 mer a 20 mer, como 9mers, 10mers, 11mers, 12mers, 13mers, 14mers o 15mers para determinar la unión al MHC usando métodos algorítmicos u otros métodos computacionales. Ver, por ejemplo, Marsh, et al., The HLA Factsbook (Academic Press, 2000). En algunos casos, puede usarse un algoritmo para predecir si un péptido de interés debe unirse a una molécula MHC determinada. Ver, por ejemplo, Southwood, et al., J. Immunol. 160:3363 (1998); Honeyman, et al., Nat. Biotechnol. 16:966-969 (1998); Breisie, et al., Bioinformatics 14:121-131 (1998), así como el algoritmo "S^yF^pEⁱTHI" (Hans-Georg Rammensee, et al., Immunogenetics (1999) 50: 213-219), Zhang et al., PLoS ONE 7(2): e30483. doi: 10.1371/journal.pone.0030483, the Immune Epitope and Analysis Resource (IEDB) (Peters B, et al. PLoS Biology 3: 379 (2005)), and the "BIMAS" algorithm (Parker, K. C., M. A. Bednarek, and J. E. Coligan. J. Immunol. 152:163 (1994).

En algunos casos, las herramientas de predicción de algoritmos, incluyendo las disponibles en IEDB, usan una o más predicciones usando ANN (Nielsen et al. (2003) Protein Sci., 12:1007-1017 and Lundegaard et al. (2008) NAR, 36:W509-512), SMM (Peters and Sette (2005) BMC Bioinformatics, 6:132) y comblib (Sidney et al. (2008) Immunome Res. 4:2), o la herramienta Consensus (ver Kim, et al. (2012) Immune epitope database analysis resource, NAR, que combina predicciones de cualquiera de los anteriores).

En algunos casos, la predicción del procesamiento de antígenos puede lograrse usando un algoritmo para la escisión proteosomal (PaProC). Ver Kuttler et al., J. Mol. Biol. 298 (2000), 417-429 y Nussbaum et al., Immunogenetics 53 (2001), 87-94.

En algunas realizaciones, puede evaluarse un receptor quimérico, específicamente un CAR, para determinar si es inmunogénico evaluando una respuesta inmunitaria para la molécula. En algunos casos, un sujeto puede ser tratado con un receptor quimérico, como un CAR, por ejemplo, administrando células manipuladas genéticamente con el receptor quimérico o CAR. Puede evaluarse la presencia de una respuesta humana humoral o mediada por células. En algunas realizaciones, la presencia de anticuerpos que se unen específicamente y/o neutralizan los epítopos de unión del receptor quimérico (específicamente CAR) puede identificarse mediante métodos como ELISpot, tinción de citoquinas intracelulares, ELISA (por ejemplo, para citoquinas) o métodos de detección de anticuerpos basados en células, por ejemplo, por citometría de flujo, en suero del sujeto. En algunas realizaciones, una respuesta inmunitaria mediada por células al receptor quimérico, específicamente un receptor quimérico expresado en células modificadas, puede evaluarse usando un ensayo de linfocitos T citotóxicos (CTL) para la detección de células T CD8+ que se unen específicamente e inducen citotoxicidad y/o una reacción de linfocitos mixta, usando células, por ejemplo, células irradiadas, que expresan el receptor quimérico, como células estimuladoras.

En algunos casos, la región inmunogénica particular puede identificarse en un ensayo in vitro mediante la estimulación de células inmunitarias aisladas (por ejemplo, PBMC) de un sujeto al que se le administró un receptor quimérico (por ejemplo, CAR) con una biblioteca sintética de péptidos que se superponen y abarcan la longitud del antígeno particular. La respuesta inmunitaria en células estimuladas puede evaluarse usando métodos que incluyen, pero no se limitan a, ELISpot, tinción de citoquinas intracelulares, ensayos de linfocitos T citotóxicos y/o reacciones mixtas de linfocitos.

En algunos casos, los estudios de péptidos superpuestos pueden indicar el área del antígeno en la que está localizado un epítopo. A continuación, puede evaluarse el epítopo mínimo para una célula T particular midiendo la respuesta a los péptidos truncados. Por ejemplo, si se obtiene una respuesta al péptido que comprende los residuos 1-15 en la biblioteca superpuesta, pueden usarse los conjuntos que se truncan en ambos extremos (es decir, 1-14, 1-13, 1-12, etc. y 2-15, 3- 15, 4-15, etc.) para identificar el epítopo mínimo.

En algunos casos, una región inmunogénica puede identificarse mediante análisis de espectrometría de masas de péptidos eluidos de APC cargada con antígeno. En algunos casos, se ha estimulado a estas APC para que absorban el antígeno (por ejemplo, un receptor quimérico) o se las ha forzado para que produzcan la proteína intracelularmente mediante transformación con el gen apropiado. En algunos casos, la APC puede incubarse con proteína en solución o de manera adecuada dirigida a la superficie celular de APC. Después de la incubación a 37° C, las células pueden lisarse en detergente y la proteína de MHC puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad. El tratamiento del MHC purificado con un medio químico adecuado (por ejemplo, condiciones ácidas) puede dar como resultado la elución de péptidos del MHC. Este conjunto de péptidos puede separarse y el perfil compararse con el péptido de APC de control tratado de la misma manera. Los picos únicos de las células alimentadas/que expresan proteínas pueden analizarse (por ejemplo, mediante espectrometría de masas, incluyendo la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) o cromatografía líquida de alto rendimiento espectrometría de masas de ionización por electropulverización (HPLC ESI MS)) e identificarse los fragmentos peptídicos. Este procedimiento puede generar información sobre la gama de péptidos (que a veces se encuentran en "conjuntos anidados") generados a partir de un antígeno particular mediante el procesamiento de antígenos.

En algunos casos, la región inmunogénica se identifica examinando una biblioteca sintética de péptidos que se superponen y abarcan la longitud del antígeno en un ensayo in vitro. Por ejemplo, pueden usarse péptidos que tienen una longitud de 15 aminoácidos y que se superponen en 5 o 10 aminoácidos. Los péptidos pueden probarse en un sistema de presentación de antígenos que comprende células presentadoras de antígenos y células T. Por ejemplo, el sistema de presentación de antígenos puede ser una preparación de esplenocitos murinos o una preparación de células humanas de amígdalas o PBMC. Alternativamente, el sistema de presentación de antígenos puede comprender una línea/clon de células T particular y/o un tipo de célula presentadora de antígeno particular.

En algunos casos, la activación de las células T se mide a través de la proliferación de células T (por ejemplo, usando la incorporación de 3H-timidina) o la producción de citoquinas. La activación de células T CD4+ de tipo TH1 puede, por ejemplo, detectarse a través de la producción de IFN^yque puede detectarse mediante técnicas estándar, como un ensayo ELISPOT.

En algunos casos, puede evaluarse la capacidad de un péptido que es o incluye una región inmunogénica de un antígeno receptor quimérico para inducir tolerancia en un sujeto in vivo. En algunos casos, se emplea un modelo de ratón humanizado. Un ejemplo de tales modelos de ratón incluye el modelo de ratón transgénico HLA-A*0201 (ver, por ejemplo, Tey, et al. Immunology and Cell Biology. 84:281 (2006)). En algunos casos, el modelo de ratón expresa tanto moléculas HLA-A*0201 clase I como HLA-DR1 clase II (vér, por ejemplo, BenMohamed L, et al. Immunol. Agosto de 2000;61 (8):764-79). Otros modelos de ratones transgénicos son bien conocidos por un experto en la técnica.

En algunos casos, al ratón transgénico se le coadministra (por ejemplo, antes, posteriormente o intermitentemente) un péptido potencial o candidato y un receptor quimérico (por ejemplo, CAR), como células manipuladas genéticamente con el receptor quimérico. Generalmente, el péptido se administra bajo una o más condiciones que pueden o es probable que induzcan tolerancia. Por ejemplo, el péptido se administra en ausencia de adyuvante. Las células inmunitarias de los ratones, como los esplenocitos, pueden aislarse y analizarse para determinar una respuesta inmunitaria humoral o mediada por células como se describe, por ejemplo, para determinar si la administración conjunta con el péptido previene, reduce o regula por disminución la respuesta inmunitaria en comparación con ratones a los que se les administró el receptor quimérico pero sin coadministración con el péptido. Por ejemplo, en algunos casos, los esplenocitos de ratones cebados se aíslan y se vuelven a exponer en cultivo con el mismo péptido o péptidos candidatos, u opcionalmente con células irradiadas con rayos gamma transducidas con un CAR que contiene la secuencia peptídica. La nueva exposición puede producirse en cualquier momento después de la exposición inicial incluyendo, por ejemplo, 7 días, 10 días, 14 días, 21 días, 28 días, 35 días o 42 días después de la administración. En algunos casos, las células pueden derivarse de ratones expuestos y evaluarse para determinar una respuesta inmunitaria a la nueva exposición mediante un ensayo de liberación de cromo, tinción de citoquinas intracelulares, ensayo ELISpot y/o secuenciación de TCR clonal. En algunos casos, pueden administrarse péptidos a un subconjunto de ratones de control en presencia de adyuvante y/o se administran péptidos de control que no se unen al MHC.

Por ejemplo, puede emplearse un ensayo de inmunospot ligado a enzimas (ELISpot) para evaluar una respuesta inmunitaria al receptor quimérico, como en presencia o ausencia de coadministración con el péptido. En algunos aspectos, un ELISpot puede adaptarse para la detección de células individuales que secretan citoquinas específicas u otras moléculas efectoras mediante la unión de un anticuerpo monoclonal específico para una citoquina o molécula efectora en una microplaca. Las células estimuladas por un antígeno pueden ponerse en contacto con el anticuerpo inmovilizado. Después de lavar las células y cualquier sustancia no unida, puede añadirse a los pocillos un anticuerpo policlonal marcado o, más a menudo, un anticuerpo monoclonal, específico para la misma citoquina u otra molécula efectora. Después de un lavado, puede añadirse un colorante que se une al anticuerpo marcado de tal manera que se forma un precipitado (o punto) de color negro azulado en los sitios de localización de las citoquinas. Los puntos pueden contarse manualmente o con el sistema de lectura ELISpot automatizado para cuantificar la respuesta.

En algunos casos, puede evaluarse la actividad citotóxica mediada por células T CD8+ para evaluar la presencia o ausencia o el nivel o grado de una respuesta inmunitaria a la proteína o célula recombinante, por ejemplo, al receptor quimérico, como en presencia o ausencia de coadministración con el péptido. En algunos casos, pueden analizarse las células estimuladas con un antígeno (por ejemplo, esplenocitos) mediante un ensayo de liberación de cromo para determinar la citotoxicidad frente a células marcadas con 51Cr. Este ensayo puede medir la liberación de cromo radiactivo (biológico) de las células como resultado de la actividad de las células asesinas. Las células pueden volver a estimularse con un antígeno in vitro, por ejemplo, células manipuladas genéticamente con un receptor quimérico (por ejemplo, células que expresan CAR), incluyendo células T, células T cargadas con péptidos y/o células T no transducidas ("simuladas") (objetivos) a varias proporciones de efector a objetivo (E/T). Después de la incubación conjunta, puede cuantificarse la liberación de cromo y determinar el porcentaje de lisis máxima alcanzable en cada muestra. Las condiciones en las que no se detecta actividad citolítica específica indican que no se desarrolló una respuesta inmunitaria específica al agente, por ejemplo, el receptor quimérico después de la coadministración con el péptido. Este resultado puede indicar un blanco potencial para la administración de un péptido específico en condiciones capaces de inducir tolerancia inmunogénica al receptor quimérico.

En algunos casos, se emplea la tinción de citoquinas intracelulares para evaluar una respuesta inmunitaria al receptor quimérico, como en presencia o ausencia de coadministración con el péptido. Las células inmunitarias, como los esplenocitos, pueden aislarse de los ratones y teñirse con anticuerpos para detectar la expresión superficial de CD8 y CD4 y la expresión intracelular de citoquinas incluyendo, por ejemplo, IFNy. Las condiciones en las que la tinción de citoquinas intracelulares indica que las células T no generaron una respuesta inmunitaria específica al receptor quimérico pueden indicar un blanco potencial para la administración de un péptido específico en condiciones capaces de inducir tolerancia inmunogénica al receptor quimérico.

En algunos casos, se emplea la secuenciación clonal para evaluar una respuesta inmunitaria al agente, por ejemplo, el receptor quimérico, como en presencia o ausencia de coadministración con el péptido. Los receptores de células T de células T aisladas de ratones expuestos o pacientes pueden secuenciarse (ver Arstila et al. (1999) Science 286, 958-961; WO 2012/083069). La ausencia de expansión clonal de TCR indica que las células T no generaron una respuesta inmunitaria específica para el receptor quimérico. Esto puede indicar un blanco potencial para la administración de un péptido específico en condiciones capaces de inducir tolerancia inmunogénica al receptor quimérico.

D. Composiciones

También se describen composiciones que contienen un péptido o péptidos, como los descritos y/o usados en los métodos descritos, incluyendo las composiciones y formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas generalmente incluyen uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables opcionales.

En algunos aspectos, la elección del portador está determinada en parte por el péptido y/o por el método de administración particulares. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas. Los portadores se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como polietilenglicol (PEG).

En algunos casos, un portador farmacéutico puede incluir por lo menos un excipiente, como agua estéril, fosfato de sodio, manitol, sorbitol, cloruro de sodio o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, otros portadores farmacéuticamente aceptables pueden incluir solventes o medios de dispersión que contengan, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y aceites vegetales. En algunos casos, la prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y timerosol.

En algunos casos, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 2% en peso de la composición total.

En algunos aspectos se incluyen en las composiciones agentes tampón. Los agentes tampón adecuados incluyen, por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato de potasio y varios otros ácidos y sales. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más agentes tampón. El agente tampón o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a edición. (1 de mayo de 2005).

En algunos casos, las composiciones se describen como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunos aspectos pueden tamponarse a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas normalmente son más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y las composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente mediante inyección. Las composiciones viscosas, por otro lado, pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar períodos de contacto más prolongados con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender portadores, que pueden ser un solvente o un medio dispersante que contiene, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando las células en un solvente, mezcladas con un portador, diluyente o excipiente adecuado, como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ejemplo, metilcelulosa), agentes tamponadores del pH, gelificantes o aditivos que mejoran la viscosidad, conservantes, aromatizantes y/o colorantes, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseadas. En algunos aspectos pueden consultarse textos estándar para preparar preparaciones adecuadas.

Pueden añadirse varios aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol y ácido sórbico. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante el uso de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las formulaciones para usar para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Las formulaciones pueden incluir soluciones acuosas. En algunos casos, el péptido se formula como una composición liofilizada, que puede reconstituirse como una composición acuosa o líquida en un portador farmacéuticamente aceptable, como agua esterilizada, antes de su uso. En algunos casos, puede prepararse un polvo estéril mediante secado al vacío, secado por congelación o secado por centrifugado.

La formulación o composición también puede contener más de un ingrediente activo útil para la indicación, enfermedad o condición particular que se está tratando con el péptido, preferiblemente aquellos con actividades complementarias al péptido, donde las actividades respectivas no se ven afectadas adversamente entre sí. Tales ingredientes activos están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

En algunos casos la composición farmacéutica se formula para contener una cantidad tolerante de péptido para la administración. La composición puede formularse para que contenga una dosificación individual o dosificaciones múltiples del péptido. En algunas realizaciones, el péptido se formula para que sea soluble a una concentración que permita su uso in vivo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el péptido es soluble a concentraciones de hasta 0,5 mg/ml, concentraciones de hasta 1 mg/ml y/o concentraciones de hasta 5 mg/ml. E. Métodos de administración de péptidos

También se describen métodos que generalmente implican la administración a un sujeto de un péptido o péptidos, incluyendo cualquiera de los descritos anteriormente. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos incluyen administrar un péptido o péptidos expuestos en cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 8-12, 16-22, 137, 160, 163, 165, 166, 167 o 168 o un peptidomimético, análogo o variante del mismo que retiene la actividad, es decir, actividad para prevenir, reducir o regular por disminución de otro modo una respuesta inmunitaria a células coadministradas manipuladas con un receptor quimérico. Generalmente, el péptido o péptidos se coadministran con células que expresan un receptor quimérico (por ejemplo, CAR) en relación con la terapia celular adoptiva, por ejemplo, para tratar una enfermedad o afección, como un cáncer. El péptido o péptidos pueden coadministrarse a un sujeto antes, simultáneamente o intermitente con, o posteriormente a la administración de las células que expresan el receptor quimérico (por ejemplo, CAR). Típicamente, el péptido o péptidos se administran antes de administrar las células que expresan el receptor quimérico (por ejemplo, CAR). Por tanto, en algunos casos, los métodos mejoran la eficacia del tratamiento con el receptor quimérico (por ejemplo, CAR) aumentando la exposición del sujeto a las células administradas previniendo o reduciendo las respuestas inmunitarias del huésped que de otro modo depurarían o evitarían la expansión de las células administradas.

Como se usa en la presente, un "sujeto" es un mamífero, como un humano u otro animal, y típicamente es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es uno que, en el momento del tratamiento, no ha sido tratado con el antígeno, por ejemplo, al sujeto no se le han administrado previamente células que expresan el receptor quimérico, como un CAR. En algunas realizaciones, el sujeto recibe o recibirá terapia con un antígeno quimérico, como un CAR, que puede ser inmunogénico, como en el contexto de células manipuladas con el receptor quimérico (por ejemplo, CAR) en relación con la terapia celular adoptiva.

En algunos casos, los péptidos que se administran al sujeto corresponden a una región inmunogénica presente en el receptor quimérico (por ejemplo, CAR) que se coadministrará al sujeto, por ejemplo, en el contexto de células manipuladas genéticamente para que expresen el receptor quimérico. El término "corresponde a" significa que el péptido contiene una región inmunogénica que se deriva o se basa en, es decir, que es o incluye o está relacionada con una secuencia inmunogénica de aminoácidos presente en el receptor quimérico que se administrará al sujeto. En algunos casos, no es necesario que el péptido contenga una estructura química, incluyendo una secuencia de aminoácidos, que sea idéntica a las presentes en una región inmunogénica del receptor quimérico, como un CAR, siempre que el péptido esté suficientemente relacionado o sea similar a dicha región para poder prevenir, reducir o regular por disminución una respuesta inmunitaria a dicho receptor quimérico cuando se administre conjuntamente. Por ejemplo, un péptido que se modifica en comparación con una región inmunogénica presente en un receptor quimérico, por ejemplo, el péptido es un peptidomimético, análogo o variante de aminoácido que contiene una o más mutaciones de aminoácidos (es decir, deleciones, sustituciones/reemplazos o inserciones), puede no obstante, corresponder a un receptor quimérico particular si el péptido puede prevenir, reducir o regular por disminución una respuesta inmunitaria a dicho receptor quimérico cuando se coadministra.

La referencia a un receptor quimérico "correspondiente", como un CAR, se refiere a un receptor quimérico que contiene una secuencia inmunogénica de aminoácidos en la que se basa o se deriva el péptido y/o para la cual el péptido es capaz de prevenir, reducir o regular por disminución de otro modo una respuesta inmunitaria para el receptor quimérico, como un CAR, cuando se coadministra a un sujeto.

En algunas realizaciones, al sujeto se le administra un péptido o péptidos con eficacia conocida específica para el alelo o grupo de alelos del MHC del sujeto, como cuando se sabe que el péptido se une o se presenta particularmente bien a, o por, o para inducir una señal particularmente buena cuando se une al alelo o grupo de MHC, por ejemplo, en comparación con otros. En algunas realizaciones, antes de administrar un péptido a un sujeto, se selecciona un sujeto para la expresión de un alelo de MHC en base a la eficacia conocida para un MHC particular por el péptido. En algunas realizaciones, los alelos de MHC del sujeto pueden determinarse usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando ensayos de haplotipos moleculares (BioTest ABC SSPtray, BioTest Diagnostics Corp., Denville, NJ; SeCore Kits, Life Technologies, Grand Island, NY). Por ejemplo, en el caso en el qu el péptido es específico o ventajoso en el contexto de un alelo de HLA-A*0201 (por ejemplo, un péptido expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11), se selecciona un sujeto que expresa el alelo de HLA-A*0201.

En algunas realizaciones, al sujeto se le administran el péptido o péptidos en condiciones que son capaces de inducir tolerancia al agente, por ejemplo, una célula o una proteína como un receptor quimérico (por ejemplo, CAR), por ejemplo, cualquier condición de administración de péptidos, formulación de péptidos y/o o forma peptídica que prevenga, reduzca o regule por disminución de otro modo una respuesta inmunitaria específica de antígeno a un receptor quimérico coadministrado (por ejemplo, CAR) en comparación con una respuesta inmunitaria del huésped al receptor quimérico (por ejemplo, CAR) en ausencia del péptido Las condiciones que se sabe que inducen tolerancia incluyen, pero no se limitan a, la administración del péptido en forma soluble, la administración en ausencia de adyuvante, la administración en presencia de adyuvante con un agente tolerogénico, la administración en una dosis baja (que, en algunos casos, puede repetirse), administración de una cantidad de dosis alta, o administración por vía intraperitoneal (i.p.), intravenosa (i.v.), intranasal (i.n.) u oral, y combinaciones de cualquiera de los anteriores. También se contemplan otras vías de administración dependiendo de una o más condiciones empleadas para inducir la tolerancia. En algunas realizaciones, el péptido no se administra por vía subcutánea o intradérmica.

En algunos casos, la prevención, reducción o regulación por disminución de una respuesta inmunitaria específica del huésped a un antígeno específico, por ejemplo, un receptor quimérico, puede determinarse clínicamente o puede determinarse subjetivamente, como en base a la eficacia o la respuesta al CAR, es decir, el paciente siente como si algunos o todos los síntomas relacionados con la enfermedad o afección que se está tratando se hubieran aliviado sin ningún efecto secundario inmunomediado. En algunas realizaciones, los signos o síntomas de una respuesta inmunitaria pueden incluir cualquier indicador detectable de una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral o mediada por células, como la generación de anticuerpos neutralizantes o no neutralizantes contra el receptor quimérico (por ejemplo, CAR) o presencia de células T CD8+ que inducen citotoxicidad. Otros indicadores de una respuesta inmunitaria pueden incluir reacciones a la infusión o reacciones agudas, como la anafilaxia o el síndrome de liberación de citoquinas. Por ejemplo, en algunos casos, no se observa respuesta inmunitaria del huésped al agente, por ejemplo, receptor quimérico (por ejemplo, CAR) en casos en los que se coadministra un péptido.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran al sujeto en forma soluble en una solución acuosa.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran en ausencia de adyuvante. En general, los antígenos proteicos administrados con adyuvantes, como los adyuvantes proinflamatorios, favorecen una respuesta inmunitaria robusta al antígeno. Por ejemplo, en algunos casos, los adyuvantes pueden estimular la liberación de citoquinas y la expresión de coestimuladores en las células presentadoras de antígenos (APC), teniendo en cuenta por tanto su actividad inmunoestimuladora. En algunos casos, se ha demostrado que la administración de un antígeno peptídico en ausencia de adyuvante induce la tolerancia de las células T. Por ejemplo, se ha demostrado que ratones expuestos a un péptido antigénico en forma inmunogénica (con adyuvante) mostraron una gran expansión de células T, pero no los ratones expuestos al mismo péptido administrado en forma tolerogénica (dosis grandes de péptido acuoso sin adyuvante) (Pape KA et al., Immunological Reviews 156:67-78, 1997).

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran en presencia de un adyuvante y un agente tolerogénico (o un agente tolerogénico y ningún antígeno) (ver, por ejemplo, la solicitud internacional publicada WO2010/056143). El término "agente tolerogénico" se refiere a cualquier agente que interfiera con la respuesta inmunitaria adaptativa, por ejemplo, con la activación, proliferación, expansión, supervivencia o diferenciación de las células T a un estado de memoria o de larga duración, por ejemplo, dirigiéndose a moléculas que están implicadas en la activación de células T y/o interfieran con la interacción entre una célula T y una célula presentadora de antígeno (APC). En algunas realizaciones, el agente tolerogénico es un agente que bloquea una señal de coestimulación. En algunas realizaciones, el agente tolerogénico es un agente que se une a una molécula de la superficie celular expresada en una célula T o una célula presentadora de antígeno. En algunas realizaciones, el agente tolerizante se dirige a una o más moléculas que se expresan en las células T y están implicadas en la activación de las células T u otra señal estimuladora, o inhibición de las mismas, que pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas de CD4, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD26, CD44, CD28, PD1, BTLA, B7-1, ICOS, CTLA-4, familia B7-2, CD99, CD137 (4-1BBL), CD2, LFA3, CD27, CD70, CD3, CD8, ICAM1, LFA1, MHC de clase II o MHC de clase I. En algunas realizaciones, el agente tolerogénico puede ser un anticuerpo, como un anticuerpo monoclonal, que se une y bloquea la acción de una o más moléculas implicadas en la activación de células T, como las enumeradas anteriormente. En algunas realizaciones, el agente tolerogénico puede ser una proteína de fusión soluble derivada de una proteína que se une específicamente a la molécula implicada en la activación de las células T, como las enumeradas anteriormente. Los agentes tolerogénicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, antagonistas o bloqueantes anti-CD4, antagonistas o bloqueantes anti-CD3, antagonistas o bloqueantes anti-CD25, antagonistas o bloqueantes anti-CD28, antagonistas o inductores de señal anti-PDl, anti-BTLA, bloqueante anti-B7 (anti-B7-1 o anti-B7-2), bloqueante o antagonista anti-ICOS, anti-CTLA, anti-CD40, anti-CD40L, anti-CD99, anti-CD2, anti-LFA3, anti-CD27, anti-CD70, anti-DC8, anti-OX40, anti-OX40L, anti-LFA-1, anti-CDlla, anti-ICAM1, anti-CD26, anti-CD44, anti-CD137 (anti-4-IBBL), CTLA4-Ig, anti-MHC clase II y anti-MHC clase I, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, el agente tolerogénico se administra en una cantidad que es de o de aproximadamente 1 mg a 1000 mg, como de 25 mg a 600 mg. El agente tolerogénico puede administrarse mediante inyección, como inyección intravenosa o subcutánea.

En algunas realizaciones, el agente tolerogénico es un anticuerpo anti-CD3, como Muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), que es un anticuerpo monoclonal anti-CD3 que se usa comúnmente para suprimir o prevenir el rechazo de trasplantes. En algunas realizaciones, el agente tolerogénico se dirige y/o se une específicamente a, y opcionalmente induce la señalización o está mediada por, una o más moléculas que se expresan en una célula que no es una célula T, como una célula presentadora de antígeno (APC), por ejemplo un macrófago o una célula dendrítica, por ejemplo, una célula que sirve como pareja de ligando/receptor para cualquiera de las moléculas mencionadas con anterioridad identificadas anteriormente expresadas en las células T, como PD-L1, PD-L2 y miembros de la familia B7.

En general, no se coadministra un adyuvante. En algunos casos, el adyuvante puede administrarse con un péptido o péptidos, como en presencia de un agente tolerogénico. El adyuvante en algunas realizaciones puede ser o incluir una toxina derivada de organismos microbiológicos, como productos bacterianos, incluyendo los derivados de Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetella pertussis y Mycobacterium bovis. En algunos casos, los adyuvantes pueden incluir compuestos inorgánicos, compuestos orgánicos, saponinas vegetales y citoquinas. Los compuestos inorgánicos usados en adyuvantes pueden incluir alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, hidróxido de fosfato de calcio. Los compuestos orgánicos usados en adyuvantes pueden incluir escualeno y timerosal. Las saponinas vegetales incluyen las de Quillaja, Soybean y Polygala senega. Las citoquinas usadas en adyuvantes pueden incluir IL-1, IL-2 e IL-12. Ejemplos adicionales de adyuvantes incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante incompleto de Freund. En algunas realizaciones, el adyuvante es alumbre (hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio); aceite mineral, aceite no mineral, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, serie Seppic ISA de adyuvantes de Montanide (por ejemplo, Montanide ISA 720, AirLiquide, París, Francia); MF-59 (una emulsión de escualeno en agua estabilizada con Span 85 y Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, California); PROVAX (una emulsión de aceite en agua que contiene un detergente estabilizador y un agente formador de micelas; IDEC, Pharmaceuticals Corporation, San Diego, California); saponinas, incluyendo las saponinas purificadas de la corteza del árbol Q. saponaria, como QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, Mass,); poli[di(carboxilatofenoxi)fosfaceno (PCPP; Virus Research Institute, USA); derivados de lipopolisacáridos como lípido monofosforililo (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.), dipéptido muramilo (MDP; Ribi) y dipéptido treonil muramilo (tMDP; Ribi); OM-174 (un disacárido de glucosamina relacionado con el lípido A; OM Pharma SA, Meyrin, Suiza); y factor de elongación de Leishmania (una proteína de Leishmania purificada; Corixa Corporation, Seattle, Wash.); ISCOMS (complejos inmunoestimulantes que contienen saponinas mixtas, lípidos y forman partículas del tamaño de un virus con poros que pueden contener antígenos; CSL, Melbourne, Australia); SB-AS2 (sistema adyuvante N° 2 de SmithKline Beecham que es una emulsión de aceite en agua que contiene MPL y QS21: SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Bélgica); SB-AS4 (sistema adyuvante N° 4 de SmithKline Beecham que contiene alumbre y MPL; SBB, Bélgica); copolímeros de bloques no iónicos que forman micelas como CRL 1005 (éstos contienen una cadena lineal de polioxpropileno hidrófobo flanqueada por cadenas de polioxietileno; Vaxcel, Inc., Norcross, Ga.); Formulación adyuvante de Syntex (SAF, una emulsión de aceite en agua que contiene Tween 80 y un copolímero de bloque no iónico; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, Colo.) o una molécula de ácido nucleico inmunoestimuladora. En algunas realizaciones, el adyuvante es un adyuvante proinflamatorio. En algunos casos, puede mezclarse un adyuvante con un antígeno.

Si se usa un adyuvante, el adyuvante generalmente se administra al mismo tiempo que el péptido o péptidos y en el mismo lugar de tal manera que los efectos del adyuvante estén presentes cuando el sistema inmunitario ve el péptido. Generalmente, el adyuvante y el péptido se administran juntos como una única formulación. En tales aspectos, generalmente se administra un agente tolerogénico junto con el péptido y el adyuvante. El agente tolerogénico puede administrarse antes, simultáneamente, intermitente o posteriormente a la administración del péptido y el adyuvante. En algunas realizaciones, el agente tolerogénico puede formularse en la misma preparación con el péptido/adyuvante o en una formulación separada.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran por vía oral, sublingual por vía bucal, intranasal, intravenosa, intramuscular, intratecal, intraperitoneal o subcutánea. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran por vía oral, intraperitoneal, intranasal o intravenosa. El péptido o péptidos y las composiciones pueden administrarse usando técnicas, formulaciones y/o dispositivos de administración estándar.

El péptido o péptidos se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz, que es una cantidad que, bajo ciertas condiciones de administración, es adecuada y capaz de inducir tolerancia, es decir, prevenir, reducir o regular por disminución una respuesta inmunitaria, a un coreceptor quimérico administrado (por ejemplo, CAR). La cantidad de dosificación particular puede determinarse empíricamente y puede depender del receptor quimérico particular (por ejemplo, CAR), el péptido particular, la edad y condición física del sujeto que se está tratando, el estado inmunológico del sujeto, la duración del tratamiento, la naturaleza de cualquier tratamiento concurrente (si lo hay), la vía específica de administración, la presencia o ausencia de adyuvante y, opcionalmente, un agente tolerogénico y otros factores dentro de la capacidad de un experto en la técnica.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran a una dosis alta (por ejemplo, de 100 mg a 1000 mg, como de 200 mg a 600 mg, por ejemplo, de aproximadamente 500 mg). En algunos casos, la administración de dosis altas puede inducir la falta de respuesta de las células T, como por anergia y/o deleción. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran a una dosis baja (por ejemplo, de 0,1 mg a 5 mg, como de 0,2 mg a 2 mg). En algunos casos, la administración de dosis bajas puede provocar la supresión inespecífica debido a la activación de las células T reguladoras que pueden secretar citoquinas supresoras, como TGF-p, IL-4 o IL-10.

En algunas realizaciones, la administración del péptido o péptidos incluye la administración de una dosis de entre 0,1 mg y 1000 mg de péptido a un sujeto, como por lo menos 0,1 mg, 0,25 mg, 0,5 mg, 0,75 mg, 1 mg, 2 mg, 1,5 mg, 2 mg, 2,5 mg, 3 mg y 4 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg o más por sujeto. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran en una cantidad de 0,005 mg/kg del sujeto a aproximadamente 500 mg/kg del sujeto, como de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran como una dosis individual. En algunas realizaciones, la dosis se administra en dosis múltiples, como dosis repetidas. Los estudios en ratones han demostrado que, en algunos casos, pueden requerirse dosis repetidas de péptido para inducir la tolerancia (Burkhart et al. (1999)). La dosis exacta y el número de dosis de péptido o péptidos pueden depender del individuo o de la vía de administración. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran varias veces, incluyendo, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran por lo menos una vez al día durante dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días o siete días. En algunas realizaciones, se administran cantidades repetidas de dosis bajas del péptido.

En algunos casos, se administra una pluralidad de péptidos, cada uno de los cuales incluye un epítopo de una célula o una proteína recombinante, como un receptor quimérico (por ejemplo, CAR). En algunos casos, cada uno de los péptidos contiene la totalidad o una porción de una región inmunogénica del receptor quimérico (por ejemplo, CAR). En algunas realizaciones, cada uno de la pluralidad de péptidos se une al mismo alelo de MHC. En algunas realizaciones, la pluralidad de péptidos se une a uno o más alelos de MHC diferentes. En algunas realizaciones, dichas combinaciones de péptidos pueden administrarse simultáneamente o secuencialmente. En algunas realizaciones, cuando se administran simultáneamente, los péptidos pueden administrarse como una mezcla en una única composición. En algunas realizaciones, cuando se administran simultáneamente, uno o más de los péptidos se administran en composiciones separadas.

En algunos casos, el péptido o péptidos se administran antes, simultáneamente, posteriormente o intermitente de la administración de células manipuladas genéticamente para expresar un receptor quimérico correspondiente (por ejemplo, un CAR). En general, el péptido o péptidos se administran por separado de las células que expresan el receptor quimérico, como las células que expresan CAR, pero en algunos casos, se administran junto con tales células. Generalmente, el péptido o péptidos se administran antes de administrar las células que expresan el receptor quimérico, como antes de administrar los agentes a administrar, como las células que expresan la molécula recombinante, por ejemplo, las células que expresan CAR.

En algunos casos, el péptido o péptidos se administran antes de administrar las células manipuladas genéticamente con la molécula. En algunas realizaciones, el péptido o péptidos se administran un tiempo suficiente antes de efectuar la tolerancia de las células inmunitarias o la respuesta contra el agente que se va a administrar. En algunas realizaciones, el tiempo entre la administración del péptido o péptidos y la administración de la molécula, específicamente el receptor quimérico, específicamente CAR, como células manipuladas genéticamente con el receptor quimérico, es de 1 a 60 días, como de 7 a 28 días. por ejemplo de 14 a 21 días. En algunas realizaciones, el tiempo es a los 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 o 27 días.

En algunos casos, el péptido o péptidos se administran por separado y se administran desde aproximadamente 1 hora hasta 96 horas antes o después de la administración de células manipuladas genéticamente para expresar el receptor quimérico correspondiente, como desde o desde aproximadamente 2 horas hasta 48 horas, 6 horas a 36 horas o 12 horas a 24 horas, cada una inclusive, antes o después de administrar células manipuladas genéticamente para expresar el receptor quimérico correspondiente.

En algunas realizaciones, al sujeto se le puede administrar además un agente inmunosupresor. Los ejemplos no limitativos de agentes inmunosupresores incluyen, pero no se limitan a, suero antilinfocítico o ciclosporina, o agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina y/o vincristina. El agente inmunosupresor puede administrarse antes, simultáneamente, intermitentemente o posteriormente a la administración del péptido y/o las células, por ejemplo, manipuladas genéticamente con el receptor quimérico, como las células que expresan CAR.

III. Células manipuladas genéticamente para expresar receptores quiméricos, composiciones, dosificaciones y métodos de administración

Se describen células para terapia celular adoptiva, por ejemplo, inmunoterapia adoptiva, y un método para producir o generar las células. La invención está definida por las reivindicaciones y se refiere a péptidos que comprenden una porción de una región inmunogénica de un CAR y/o células que expresan el CAR para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto humano. Las células incluyen células inmunitarias como las células T. Las células generalmente se manipulan para expresar un receptor recombinante, como un receptor quimérico. Los receptores pueden incluir receptores de antígenos, como receptores de antígenos no TCR funcionales, incluyendo receptores de antígenos quiméricos (CAR) y otros receptores de unión a antígenos quiméricos como, en algunos casos, receptores de células T transgénicas (TCR). Los receptores también pueden incluir otros receptores quiméricos, como receptores que se unen a ligandos particulares y que tienen dominios de señalización transmembrana y/o intracelulares similares a los presentes en un CAR.

Al poner en práctica los métodos descritos, las células que expresan un receptor quimérico pueden coadministrarse con uno o más péptidos, como la administración previa, simultánea, posterior o intermitente con el péptido. Generalmente, las células se administran después o posteriormente a la administración del agente, por ejemplo, célula o receptor. En algunos casos, los métodos previenen, reducen o regulan por disminución una respuesta inmunitaria en el sujeto al agente, por ejemplo, células o moléculas expresadas en las mismas, por ejemplo, receptor quimérico expresado en las células administradas. En algunos casos, esto mejora la exposición al agente, por ejemplo, mejorando la persistencia o expansión de las células.

A. Receptores quiméricos manipulados genéticamente

En algunas realizaciones, las células comprenden uno o más ácidos nucleicos introducidos mediante ingeniería genética y productos manipulados genéticamente de dichos ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos son heterólogos, es decir, normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como la obtenida de otro organismo o célula, que por ejemplo, no se encuentra normalmente en la célula que se está manipulando y/o o un organismo del que se deriva dicha célula. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos no son de origen natural, como un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo uno que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes. Por ejemplo, las células generalmente expresan receptores recombinantes, como receptores de antígenos que incluyen receptores de antígenos no TCR funcionales, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos (CAR), y otros receptores quiméricos.

1. Células

En algunas realizaciones, las células, por ejemplo, células manipuladas, son células eucariotas, como células de mamífero, por ejemplo, células humanas. En algunas realizaciones, las células se derivan de la sangre, la médula ósea, la linfa o los órganos linfoides, son células del sistema inmunitario, como células de la inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo, células mieloides o linfoides, incluyendo linfocitos, típicamente T células y/o células NK. Otros ejemplos de células incluyen células madre, como células madre multipotentes y pluripotentes, incluyendo células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos aspectos, las células son células humanas. Las células suelen ser células primarias, como las que se aíslan directamente de un sujeto y/o se aíslan de un sujeto y se congelan. En algunas realizaciones, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos de células, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+, y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o capacidades de persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento particular, marcador o perfil de secreción de citoquinas, y/o grado de diferenciación. Con referencia al sujeto a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se incluyen métodos ya existentes. En algunos aspectos, como en el caso de las tecnologías ya existentes, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como las células madre, como las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunas realizaciones, los métodos incluyen aislar células del sujeto, prepararlas, procesarlas, cultivarlas y/o manipularlas, como se describe en la presente, y volverlas a introducir en el mismo paciente, antes o después de la crioconservación.

Entre los subtipos y subpoblaciones de células T y/o de células T CD4+ y/o de células T CD8+ se encuentran las células T vírgenes (Tⁿ), células T efectoras (T^eff), células T de memoria y subtipos de las mismas, como células T de memoria de células (T^scm), T de memoria central (T^cm), T de memoria efectora (T^em), o T de memoria efectoras diferenciadas terminalmente, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células T inmaduras, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), células T reguladoras adaptativas y de origen natural (T reg), células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta y células T delta/gamma. En algunas realizaciones, se usan Treg en el contexto del trasplante alogénico.

En algunas realizaciones, una o más de las poblaciones de células T se enriquecen o se agotan de células que son positivas para (marcador+) o expresan altos niveles (marcadoralto) de uno o más marcadores particulares, como marcadores de superficie, o que son negativas para (marcador-) o expresan niveles relativamente bajos (marcadorbajo) de uno o más marcadores. En algunos casos, tales marcadores son aquellos que están ausentes o se expresan a niveles relativamente bajos en ciertas poblaciones de células T (como las células no de memoria), pero están presentes o se expresan en niveles relativamente más altos en otras poblaciones de células T (como células de memoria). En una realización, las células (como las células CD8+ o las células T, por ejemplo, células CD3+) están enriquecidas (es decir, seleccionadas positivamente para) células que son positivas o que expresan niveles de superficie altos de CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127 y/o CD62L y/o están empobrecidas (por ejemplo, seleccionadas negativamente para) células que son positivas o expresan niveles de superficie altos de CD45RA. En algunas realizaciones, las células se enriquecen o se empobrecen en células positivas o que expresan niveles superficiales altos de CD122, CD95, CD25, CD27 y/o IL7-Ra (CD127). En algunos ejemplos, las células T CD8+ se enriquecen con células positivas para CD45RO (o negativas para CD45RA) y para CD62L.

En algunas realizaciones, una población de células T CD4+ y una subpoblación de células T CD8+, por ejemplo, una subpoblación enriquecida para células de memoria central (T^cm).

En algunas realizaciones, las células son células asesinas naturales (NK). En algunas realizaciones, las células son monocitos o granulocitos, por ejemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos.

2. Receptores de antígenos quiméricos (CAR)

En la invención, las células expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR). El CAR es generalmente un receptor manipulado genéticamente con un dominio de unión a ligando extracelular, como una porción extracelular que contiene un anticuerpo o fragmento del mismo, enlazado a uno o más componentes de señalización intracelular. En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio transmembrana y/o un dominio intracelular que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. Tales moléculas típicamente imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural y/o una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador.

Los receptores de antígenos ejemplares, incluyendo los CAR, y los métodos para manipular e introducir dichos receptores en las células incluyen los descritos, por ejemplo, en los números de publicación de solicitud de patente internacional WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 Números de publicación de solicitudes de patentes de Estados Unidos US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes de Estados Unidos N2: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592,, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7.446.191, 8,324,353, y 8,479,118, y número de solicitud de patente europea EP2537416, y/o los descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. abril de 2013; 3(4): 388-398; Dávila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., octubre 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, de marzo de 2012 18(2): 160-75. En algunos aspectos, los receptores de antígenos incluyen un CAR como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7,446,190, y los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N°: WO/2014055668 A1. Los ejemplos de CAR incluyen los CAR divulgados en cualquiera de las publicaciones mencionadas anteriormente, como la WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, Patente de Estados Unidos N2: 7,446,190, Patente de Estados Unidos N°: 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; y Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177). Ver también WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, Patente de Estados Unidos N2: 7,446,190, y Patente de Estados Unidos N°: 8,389,282 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° US 2013/0149337. Entre los receptores quiméricos se encuentran los receptores de antígenos quiméricos (CAR). Los receptores quiméricos, como los CAR, generalmente incluyen un dominio de unión a antígeno extracelular, como una porción de una molécula de anticuerpo, generalmente una región de cadena pesada variable (VH) y/o región de cadena ligera variable (VL) del anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo scFv.

En algunas realizaciones, los CAR se construyen con una especificidad para un antígeno o marcador particular, como un antígeno o marcador expresado en un tipo de célula particular para ser el objetivo de la terapia adoptiva, por ejemplo, un marcador de cáncer y/o cualquiera de los antígenos descritos. Por tanto, el CAR típicamente incluye uno o más dominios de unión a ligandos. En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligandos es un TCR o un no TCR funcional. En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligandos es un fragmento, dominio o porción de unión a antígeno de un anticuerpo, o uno o más dominios variables de anticuerpo y/o moléculas de anticuerpo. En algunas realizaciones, el CAR incluye una porción o porciones de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo, como una cadena pesada variable (VH) o una porción de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) derivado de las cadenas variable pesada (VH) y variable ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal (mAb). A continuación se describen ejemplos de tales dominios de unión a ligandos.

En algunas realizaciones, la porción extracelular del CAR, como una porción de anticuerpo del mismo, incluye además un espaciador, como una región espaciadora entre el componente de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, scFv, y un dominio transmembrana. El espaciador puede ser o incluir por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina o una variante o versión modificada de la misma, como una región bisagra, por ejemplo, una región bisagra de IgG4 y/o una región de CH1/CL y/o Fc. En algunas realizaciones, la porción o región constante es una IgG humana, como IgG4 o IgG1. El espaciador puede tener una longitud que proporcione una capacidad de respuesta aumentada de la célula después de la unión al antígeno, en comparación con la ausencia del espaciador. En algunos ejemplos, el espaciador tiene una longitud de aproximadamente 12 aminoácidos o no tiene más de 12 aminoácidos de longitud. Los espaciadores ejemplares incluyen aquellos que tienen por lo menos aproximadamente de 10 a 229 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 200 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 175 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 150 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 125 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 100 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 75 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 50 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 40 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 30 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 20 aminoácidos, o aproximadamente de 10 a 15 aminoácidos, e incluyendo cualquier número entero entre los puntos finales de cualquiera de los intervalos enumerados. En algunas realizaciones, una región espaciadora tiene aproximadamente 12 aminoácidos o menos, aproximadamente 119 aminoácidos o menos, o aproximadamente 229 aminoácidos o menos. Los espaciadores ejemplares incluyen la bisagra de IgG4 sola, la bisagra de IgG4 enlazada a los dominios CH2 y CH3, o la bisagra de IgG4 enlazada al dominio CH3. Los espaciadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, publicación de solicitud de patente internacional número WO2014031687, o Patente de Estados Unidos N° 8,822,647 o solicitud publicada. N2 US2014/0271635.

En algunas realizaciones, la porción o región constante es una IgG humana, como IgG4 o IgG 1. En algunas realizaciones, el espaciador tiene la secuencia ESKYGPPCPPCP (expuesta en la SEQ ID NO: 1) y está codificado por la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 158. En algunas realizaciones, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 107. En algunas realizaciones, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 108. En algunas realizaciones, la región o porción constante es de IgD. En algunas realizaciones, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el espaciador tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 107, 108 o 109.

La unión del ligando extracelular, como el dominio de reconocimiento de antígeno, generalmente está enlazado a uno o más componentes de señalización intracelular, como componentes de señalización que imitan la activación a través de un complejo receptor de antígeno, como un complejo TCR, en el caso de un CAR, y/ o señal a través de otro receptor de superficie celular. En la invención, el dominio transmembrana enlaza los dominios de señalización intracelular y de unión al ligando extracelular. En algunas realizaciones, CAR incluye un dominio transmembrana fusionado con el dominio extracelular. En una realización, se usa un dominio transmembrana que está asociado de manera natural con uno de los dominios en el receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica por sustitución de aminoácidos para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de la membrana superficial o unas diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

El dominio transmembrana en algunas realizaciones se deriva o de una fuente natural o de una sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos se deriva de cualquier proteína transmembrana o unida a la membrana. Las regiones transmembrana incluyen aquellas derivadas de (es decir, comprenden por lo menos la región o regiones transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154 y/o regiones transmembrana que contienen variantes funcionales de las mismas como aquellas que conservan una parte sustancial de sus propiedades estructurales, por ejemplo, transmembrana. En algunos casos, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana derivado de CD4, CD28 o CD8, por ejemplo, CD8 alfa, o una variante funcional del mismo. Alternativamente, el dominio transmembrana en algunas realizaciones es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembrana sintético comprende residuos predominantemente hidrófobos como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. En algunas realizaciones, el enlace es mediante conectores, espaciadores y/o dominios transmembrana.

Entre los dominios de señalización intracelular se encuentran aquellos que imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador y/o una señal a través de un receptor coestimulador solo. En algunos casos, está presente un conector oligo- o polipeptídico corto, por ejemplo, un conector de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, como uno que contiene glicinas y serinas, por ejemplo, el doblete de glicina-serina, y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplasmática del CAR.

El receptor, por ejemplo, el CAR, generalmente incluye por lo menos un componente o componentes de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el receptor incluye un componente intracelular de un complejo TCR, como una cadena CD3 de TCR que media en la activación y citotoxicidad de las células T, por ejemplo, la cadena zeta CD3. Por tanto, en algunos aspectos, la porción de unión a antígeno está enlazada a uno o más módulos de señalización celular. En algunas realizaciones, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana de CD3, los dominios de señalización intracelular de CD3 y/u otros dominios transmembrana de CD. En algunas realizaciones, el receptor, por ejemplo CAR, incluye además una porción de una o más moléculas adicionales, como el receptor Fc y, CD8, CD4, CD25 o CD16. Por ejemplo, en algunos aspectos, el CAR u otro receptor quimérico incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-Z) o receptor Fc y y CD8, CD4, CD25 o CD16.

En algunas realizaciones, tras el ligamiento del CAR o, en algunos casos, otro receptor quimérico, el dominio citoplasmático o el dominio de señalización intracelular del receptor activa por lo menos una de las funciones o respuestas efectoras normales de la célula inmunitaria, por ejemplo, célula T manipulada para expresar el CAR. Por ejemplo, en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad T-auxiliar, como la secreción de citoquinas u otros factores. En algunas realizaciones, se usa una porción truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente receptor de antígeno o molécula coestimuladora en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, por ejemplo, si transduce la señal de función efectora. En algunas realizaciones, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR), y en algunos aspectos también la de los correceptores que en el contexto natural actúan en combinación con tales receptores para iniciar la transducción de señales después del acoplamiento del receptor de antígenos.

En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no solo la señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Por tanto, en algunas realizaciones, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. En otros casos, el CAR no incluye un componente para generar una señal coestimuladora. En algunos aspectos, se expresa un CAR adicional en la misma célula y proporciona el componente para generar la señal secundaria o coestimuladora.

En algunos aspectos, la activación de las células T se describe como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmática primaria) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplasmáticas secundarias). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos de tales componentes de señalización.

En algunos aspectos, el CAR incluye una secuencia de señalización citoplasmática primaria que regula la activación primaria del complejo TCR. Las secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o ITAM. Los ejemplos de secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que contienen ITAM incluyen las derivadas de la cadena zeta de CD3, FcR gamma, CD3 gamma, CD3 delta y CD3 épsilon. En algunas realizaciones, la molécula o moléculas de señalización citoplasmática en el CAR contienen un dominio de señalización citoplasmática, una parte del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta.

En algunos casos, el CAR incluye un dominio de señalización y/o una porción transmembrana de un receptor coestimulador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. En algunos aspectos, el mismo CAR incluye tanto el componente activador como el coestimulador.

En algunos casos, el dominio activador se incluye dentro de un CAR, mientras que el componente coestimulador es proporcionado por otro CAR que reconoce otro antígeno. En algunos casos, los CAR incluyen CAR activadores o estimuladores, CAR coestimuladores, ambos expresados en la misma célula (ver WO2014/055668). En algunos aspectos, las células incluyen uno o más CAR estimuladores o activadores y/o un CAR coestimulador. En algunas realizaciones, las células incluyen además CAR inhibidores (iCAR, ver Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (diciembre de 2013), como un CAR que reconoce un antígeno distinto del asociado con y/o específico para la enfermedad o afección mediante el cual una señal de activación suministrada a través del CAR dirigido a la enfermedad se reduce o inhibe mediante la unión del CAR inhibidor a su ligando, por ejemplo, para reducir los efectos fuera del objetivo.

En algunas realizaciones, el componente de señalización intracelular del receptor recombinante, específicamente CAR, comprende un dominio intracelular de CD3 zeta y una región de señalización coestimuladora. En ciertas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización y transmembrana de CD28 unido a un dominio intracelular de CD3 (por ejemplo, CD3-zeta). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende dominios coestimuladores quiméricos de CD28 y CD137 (4-1BB, TNFRSF9), enlazados a un dominio intracelular de CD3 zeta.

En algunas realizaciones, el CAR abarca uno o más, por ejemplo, dos o más, dominios coestimuladores y un dominio de activación, por ejemplo, el dominio de activación primario, en la porción citoplásmica. Los CAR ejemplares incluyen componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 y 4-1BB.

En algunas realizaciones, el CAR u otro receptor de antígeno incluye además un marcador, como un marcador de superficie celular, que puede usarse para confirmar la transducción o manipulación de la célula para expresar el receptor, como una versión truncada de un receptor de superficie celular, como EGFR truncado (tEGFR). En algunos aspectos, el marcador incluye todo o parte (por ejemplo, forma truncada) de CD34, un NGFR o receptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, tEGFR). En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el marcador está enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible, por ejemplo, T2A. Por ejemplo, un marcador, y opcionalmente una secuencia conectora, puede ser cualquiera de los divulgados en la solicitud de patente publicada N° WO2014031687. Por ejemplo, el marcador puede ser un EGFR truncado (tEGFR) que está, opcionalmente, enlazado a una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible de T2A. Un polipéptido ejemplar para un EGFR truncado (por ejemplo, tEGFR) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la ^sE^qID NO: 111 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 111. Una secuencia conectora de T2A ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 110 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 110.

En algunas realizaciones, el marcador es una molécula, por ejemplo, una proteína de la superficie celular, que no se encuentra de manera natural en las células T o que no se encuentra de manera natural en la superficie de las células T, o una porción de la misma.

En algunas realizaciones, la molécula es una molécula no propia, por ejemplo, una proteína no propia, es decir, una que no es reconocida como "propia" por el sistema inmunitario del huésped al que se transferirán adoptivamente las células.

En algunas realizaciones, el marcador no cumple ninguna función terapéutica y/o no produce ningún otro efecto que no sea el de ser usado como marcador para ingeniería genética, por ejemplo, para seleccionar células manipuladas con éxito. En otras realizaciones, el marcador puede ser una molécula terapéutica o una molécula que ejerza de otro modo algún efecto deseado, como un ligando para que una célula se encuentre in vivo, como una molécula coestimuladora o de punto de control inmunitario para mejorar y/o amortiguar las respuestas de las células tras la transferencia adoptiva y el encuentro con el ligando.

En algunos casos, a los CAR se hace referencia como CAR de primera, segunda y/o tercera generación. En algunos aspectos, un CAR de primera generación es uno que únicamente proporciona una señal inducida por la cadena de CD3 tras la unión al antígeno; en algunos aspectos, un CAR de segunda generación es uno que proporciona dicha señal y una señal coestimuladora, como una que incluye un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador como CD28 o CD137; en algunos aspectos, un CAR de tercera generación es uno que incluye múltiples dominios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.

Dominio de unión al ligando

En algunos casos, el receptor quimérico se construye con una especificidad para un antígeno (o marcador o ligando) en particular, como un antígeno expresado en un tipo de célula particular para ser el objetivo de una terapia adoptiva, por ejemplo, un marcador de cáncer y/o un antígeno destinado a inducir una respuesta amortiguadora, como un antígeno expresado en un tipo de célula normal o no enferma. Por tanto, el receptor quimérico típicamente incluye en su porción extracelular uno o más dominios de unión a ligandos.

En la invención, el receptor quimérico es un CAR. En la invención, el CAR incluye típicamente en su porción extracelular una o más moléculas de unión a antígeno, como uno o más fragmentos, dominios o porciones de unión a antígeno, o uno o más dominios variables de anticuerpos y/o moléculas de anticuerpos. En algunas realizaciones, el CAR incluye una porción o porciones de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo, como un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) derivado de las cadenas variable pesada (VH) y variable ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal (mAb).

El término "anticuerpo" en la presente se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos funcionales (de unión a antígeno), incluyendo fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), regiones de cadena pesada variable (V^h) capaces de unirse específicamente al antígeno, fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, incluyendo fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) y fragmentos de anticuerpos de dominio único (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanocuerpo). El término abarca formas de inmunoglobulinas manipuladas genéticamente y/o modificadas de otro modo, como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, tándem di-scFv, tri-scFv en tándem. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "anticuerpo" abarca fragmentos de anticuerpos funcionales del mismo. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluyendo anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluyendo IgG y subclases de las mismas, IgM, IgE, IgA e IgD.

En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos reconocen específicamente un antígeno de un anticuerpo de longitud completa. En algunas realizaciones, las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo pueden ser de longitud completa o pueden ser una porción de unión a antígeno (un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv)). En otras realizaciones, la región constante de la cadena pesada del anticuerpo se elige de, por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE, particularmente de, por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. más particularmente, IgG1 (por ejemplo, IgG1 humana). En otra realización, la región constante de la cadena ligera del anticuerpo se elige de, por ejemplo, kappa o lambda, particularmente kappa.

Entre los anticuerpos proporcionados se encuentran fragmentos de anticuerpos. Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; regiones de cadena pesada variable (V^h), moléculas de anticuerpo de cadena sencilla como scFv y anticuerpos únicos V^hde dominio único; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En realizaciones particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una región de cadena ligera variable, como scFv.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (V^hy V^l, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) conservadas y tres CDR. (Ver, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un único dominio de V^ho V^lpuede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse usando un dominio de V^ho V^lde un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominios V^lo V^hcomplementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol.

150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpos que comprenden la totalidad o una parte del dominio variable de la cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano. En algunas realizaciones, el CAR comprende un dominio de cadena pesada de anticuerpo que se une específicamente al antígeno, como un marcador de cáncer o antígeno de superficie celular de una célula o enfermedad a la que se dirige, como una célula tumoral o una célula cancerosa, como cualquiera de los antígenos objetivo descritos en la presente o que se conocen en la técnica.

Los fragmentos de anticuerpos pueden elaborarse mediante varias técnicas, incluyendo pero no limitadas a, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción mediante células huésped recombinantes. En algunas realizaciones, los anticuerpos son fragmentos producidos de manera recombinante, como fragmentos que comprenden disposiciones que no se producen de manera natural, como aquellos con dos o más regiones o cadenas de anticuerpos unidas por conectores sintéticos, por ejemplo, conectores peptídicos, y/o que pueden no ser producido por la digestión enzimática de un anticuerpo intacto natural. En algunas realizaciones, los fragmentos de anticuerpos son scFv.

Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo en el que todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos de la CDR derivan de CDR no humanas y todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos de la FR derivan de FR humanas. Un anticuerpo humanizado puede incluir opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo no humano se refiere a una variante del anticuerpo no humano que se ha humanizado, típicamente para reducir la inmunogenicidad para los humanos, a la vez que conserva la especificidad y la afinidad del anticuerpo original no humano. En algunas realizaciones, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de CDR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

En algunas realizaciones, el CAR contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) que reconoce específicamente un antígeno, como un antígeno intacto, expresado en la superficie de una célula.

En algunas realizaciones, el CAR contiene un anticuerpo similar a TCR, como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) que reconoce específicamente un antígeno intracelular, como un antígeno asociado a un tumor, presentado en la superficie celular como un complejo MHC-péptido. En algunas realizaciones, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que reconoce un complejo MHC-péptido puede expresarse en células como parte de un receptor recombinante, como un receptor de antígeno. Entre los receptores de antígenos se encuentran los receptores de antígenos no TCR funcionales, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR). En general, a un CAR que contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que muestra una especificidad similar a la de TCR dirigida contra complejos de péptido-MHC también puede hacerse referencia como CAR similar a TCR.

En algunas realizaciones, puede producirse un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un complejo MHC-péptido inmunizando a un huésped con una cantidad eficaz de un inmunógeno que contiene un complejo MHC-péptido específico. En algunos casos, el péptido del complejo MHC-péptido es un epítopo de antígeno capaz de unirse al MHC, como un antígeno tumoral, por ejemplo, un antígeno tumoral universal, antígeno de mieloma u otro antígeno como se describe a continuación. En algunas realizaciones, luego se administra una cantidad eficaz del inmunógeno a un huésped para provocar una respuesta inmunitaria, en donde el inmunógeno retiene una forma tridimensional del mismo durante un período de tiempo suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra la presentación tridimensional del péptido en la ranura de unión de la molécula de MHC. Luego, se analiza el suero recogido del huésped para determinar si se están produciendo los anticuerpos deseados que reconocen una presentación tridimensional del péptido en la ranura de unión de la molécula de MHC. En algunas realizaciones, los anticuerpos producidos pueden evaluarse para confirmar que el anticuerpo puede diferenciar el complejo MHC-péptido de la molécula de MHC sola, el péptido de interés solo y un complejo de MHC y péptido irrelevante. A continuación, pueden aislarse los anticuerpos deseados.

En algunas realizaciones, puede producirse un anticuerpo o una porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un complejo MHC-péptido empleando métodos de presentación de bibliotecas de anticuerpos, como bibliotecas de anticuerpos de fagos. En algunas realizaciones, pueden generarse bibliotecas de presentación de fagos de Fab, scFV u otras formas de anticuerpos mutantes, por ejemplo, en las que los miembros de la biblioteca están mutados en uno o más residuos de una CDR o varias CDR. En la técnica se conocen ejemplos de tales métodos (ver, por ejemplo, la solicitud publicada de Estados Unidos N° US20020150914, US2014/0294841; y Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332).

Receptores quiméricos ejemplares

En algunas realizaciones, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunos aspectos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene el anticuerpo o fragmento y un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento incluye un scFv y el dominio intracelular contiene un ITAM. En algunos aspectos, el dominio de señalización intracelular incluye un dominio de señalización de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z). En la invención, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, el dominio transmembrana contiene una porción transmembrana de CD28. En la invención, el dominio transmembrana del receptor, específicamente, el CAR es un dominio transmembrana de CD28 humano o una variante del mismo, por ejemplo, un dominio transmembrana de 27 aminoácidos de un CD28 humano (N° de registro: P10747.1). En la invención, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T. El dominio extracelular y el dominio transmembrana pueden enlazarse directa o indirectamente. En algunas realizaciones, el dominio extracelular y la transmembrana están enlazados por un espaciador, como cualquiera descrito en la presente. En algunas realizaciones, el receptor contiene una porción extracelular de la molécula de la que se deriva el dominio transmembrana, como una porción extracelular de CD28. En la invención, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular derivado de una molécula coestimuladora de células T o una variante funcional de la misma, como entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 41BB.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, CAR contiene un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de CD28 o funcional variante del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o variante funcional del mismo. En algunas realizaciones, el CAR contiene un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de un 4-1 BB o una variante funcional. del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o variante funcional del mismo. En algunas de tales realizaciones, el receptor incluye además un espaciador que contiene una porción de una molécula de Ig, como una molécula de Ig humana, como una bisagra de Ig, por ejemplo una bisagra de IgG4, como un espaciador solo bisagra.

En algunas realizaciones, el dominio transmembrana del receptor recombinante, específicamente, el CAR, es o incluye un dominio transmembrana de CD28 humano (por ejemplo, N° de registro P01747.1) o una variante del mismo, como un dominio transmembrana que comprende la secuencia de amino ácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2; en algunas realizaciones, la porción que contiene el dominio transmembrana del receptor recombinante comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 104 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos o aproximadamente un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la misma.

En la invención, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 41 BB.

En algunas realizaciones, el componente o componentes de señalización intracelular del receptor recombinante, específicamente el CAR, contienen un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD28 humano o una variante funcional o una porción del mismo, como un dominio con una sustitución de LL por GG en las posiciones 186-187 de una proteína CD28 nativa. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 112 o 113 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 112 o 113. En la invención, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador intracelular de 4-1BB (por ejemplo, N° de registro Q07011.1) o variante funcional o porción del mismo, como la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3.

En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular del receptor recombinante, específicamente el CAR, comprende un dominio de señalización estimulador de CD3 zeta humano o una variante funcional del mismo, como un dominio citoplasmático de 112 AA de la isoforma 3 de CD3Z humano (N° de registro: P20963. 2) o un dominio de señalización de CD3 zeta como se describe en la patente de Estados Unidos N° 7,446,190 o la Patente de Estados Unidos N° 8,911,993. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 4, 105 o 159 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la S^eQ ID NO: 4, 105 o 159.

En algunos aspectos, el espaciador contiene solo una región bisagra de una IgG, como solo una bisagra de IgG4 o IgG 1, como el espaciador solo bisagra expuesto en la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, el espaciador es o contiene un Bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra derivada de IgG4, opcionalmente enlazada a dominios de CH2 y/o CH3. En algunas realizaciones, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, enlazada a los dominios de CH2 y CH3, como la expuesta en la SEQ ID NO: 108. En algunas realizaciones, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4 enlazada a un dominio CH3 solamente, como la expuesta en la SEQ ID NO: 107. En algunas realizaciones, el espaciador es o comprende una secuencia rica en glicina-serina u otro conector flexible como los conectores flexibles conocidos.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, el CAR incluye un anticuerpo como un fragmento de anticuerpo, incluyendo scFvs, un espaciador, como un espaciador que contiene una porción de una molécula de inmunoglobulina, como una región bisagra y/o una o más regiones constantes de una molécula de cadena pesada, como un espaciador que contiene una bisagra de Ig, un dominio transmembrana que contiene todo o una porción de un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de CD28 y un dominio de señalización zeta de CD3. En algunas realizaciones, el CAR incluye: una porción de unión a ligando extracelular, como una porción de unión a antígeno, como un anticuerpo o fragmento del mismo, incluyendo sdAbs y scFvs, que se une específicamente a un antígeno, por ejemplo, un antígeno descrito en la presente; un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagras de Ig; un dominio transmembrana que es una porción de CD28 o una variante del mismo; un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de 4-1BB o variante funcional del mismo; y una porción de señalización del dominio de señalización Cde D3 zeta o una variante funcional del mismo.

En algunos casos, las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos constructos de CAR incluyen además una secuencia que codifica un elemento de salto ribosómico T2A y/o una secuencia de tEGFR, por ejemplo, en sentido descendente de la secuencia que codifica el CAR. En algunos casos, la secuencia codifica un elemento de salto ribosómico T2A y/o una secuencia de tEGFR expuesta en la SEQ ID NO: 110 y/o 111, respectivamente, o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SeQ ID NO: 110 y/o 111. En algunas realizaciones, también pueden generarse células T que expresan un receptor de antígeno (específicamente CAR) para expresar un EGFR truncado (EGFRt) como un epítopo de selección no inmunogénico (por ejemplo, mediante al introducción de un constructo que codifica el CAR y EGFRt separados por un salto ribosómico de T2A para expresar las dos proteínas del mismo constructo), que luego pueden usarse como un marcador para detectar tales células (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 8,802,374).

En la invención, el CAR incluye una región de unión que está formada por la unión de una porción transmembrana de CD28 y una segunda porción coestimuladora de 41BB. En la invención, CAR comprende la secuencia de aminoácidos SLLVTVAFIIF^wV^kRGRKKLLYIFKQ (SEQ ID NO: 137). En algunas realizaciones, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPF (SEQ ID NO: 6), o la secuencia de aminoácidos CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQT (SEQ ID NO: 160).

3. Vectores y métodos para ingeniería genética

También se describen métodos, ácidos nucleicos, composiciones y kits para producir células manipuladas genéticamente. En algunos aspectos, la ingeniería genética implica la introducción de un ácido nucleico que codifica el componente manipulado genéticamente u otro componente para la introducción en la célula, como un componente que codifica una proteína o ácido nucleico de alteración génica.

En algunos casos, la transferencia génica se logra estimulando primero el crecimiento celular, por ejemplo, crecimiento, proliferación y/o activación de células T, seguido de la transducción de las células activadas y la expansión en cultivo a cantidades suficientes para aplicaciones clínicas.

En algunos contextos, la sobreexpresión de un factor estimulador (por ejemplo, una linfoquina o una citoquina) puede ser tóxica para un sujeto. Por tanto, en algunos contextos, las células manipuladas incluyen segmentos de genes que hacen que las células sean susceptibles a la selección negativa in vivo, como tras la administración en inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células se manipulan para que puedan eliminarse como resultado de un cambio en la condición in vivo del paciente al que se administran. El fenotipo seleccionable negativo puede resultar de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes seleccionables negativos incluyen el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple tipo I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II: 223, 1977).) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosforribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforribosiltransferasa celular (APRT), la citosina desaminasa bacteriana (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

89:33 (1992)).

En algunos aspectos, las células se manipulan adicionalmente para promover la expresión de citoquinas u otros factores. Varios métodos para la introducción de componentes manipulados genéticamente, por ejemplo, receptores de antígenos, por ejemplo, CAR, son bien conocidos y pueden usarse con los métodos y composiciones descritos. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los receptores, incluyendo a través de transducción viral, por ejemplo, retroviral o lentiviral, transposones y electroporación.

En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células usando partículas virales infecciosas recombinantes, como, por ejemplo, vectores derivados del virus simio 40 (SV40), adenovirus, virus adenoasociados (AAV). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T usando vectores lentivirales recombinantes o vectores retrovirales, como vectores gamma-retrovirales (ver, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 3 abril de 2014. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. noviembre 2011; 29(11): 550-557.

En algunos casos, el vector retroviral tiene una secuencia de repetición terminal larga (LTR), por ejemplo, un vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), virus de células madre embrionarias murinas (MESV), virus de células madre (MSCV), virus formador de focos de bazo (SFFV) o virus adenoasociados (AAV). La mayoría de los vectores retrovirales se derivan de retrovirus murinos. En algunos casos, los retrovirus incluyen los derivados de cualquier fuente de células de aves o mamíferos. Los retrovirus típicamente son anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar células huésped de varias especies, incluyendo los humanos. En un caso, el gen a expresar reemplaza las secuencias retrovirales gag, pol y/o env. Se han descrito una serie de sistemas retrovirales ilustrativos (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.219.740; 6,207,453; 5,219,740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

Se conocen métodos de transducción lentiviral. Los métodos ejemplares se describen, por ejemplo, en Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.

En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante electroporación (ver, por ejemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante transposición (ver, por ejemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74 y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Otros métodos para introducir y expresar material genético en células inmunitarias incluyen la transfección con fosfato de calcio (por ejemplo, como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York. N.Y.), fusión de protoplastos, transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

Otros enfoques y vectores para la transferencia de los ácidos nucleicos manipulados genéticamente que codifican los productos manipulados genéticamente son los descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional, N° de Publicación: WO2014055668, y la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190.

Entre los ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo, los genes para la introducción son los que mejoran la eficacia de la terapia, como promoviendo la viabilidad y/o la función de las células transferidas; genes para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, como para evaluar la supervivencia o localización in vivo; genes para mejorar la seguridad, por ejemplo, haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo como se describen por Lupton S.D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); y Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); ver también las publicaciones de PCT/LTS91/08442 y PCT/US94/05601 por Lupton et al. que describen el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo. Ver, por ejemplo, Riddell et al., Patente de Estados Unidos N° 6,040,177, en las columnas 14-17.

4. Preparación de células para manipulación

En algunos casos, la preparación de las células manipuladas incluye uno o más pasos de cultivo y/o preparación. Las células para la introducción del ácido nucleico que codifica el receptor quimérico como el CAR, pueden aislarse de una muestra, como una muestra biológica, por ejemplo, una obtenida o derivada de un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto del que se aísla la célula es uno que tiene la enfermedad o afección o que necesita una terapia celular o al que se le administrará la terapia celular. El sujeto en algunas realizaciones es un humano con necesidad de una intervención terapéutica particular, como la terapia celular adoptiva para la cual las células se aíslan, procesan y/o manipulan.

Por consiguiente, las células en algunas realizaciones son células primarias, por ejemplo, células humanas primarias. Las muestras incluyen tejidos, fluidos y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de uno o más pasos de procesamiento, como separación, centrifugación, ingeniería genética (por ejemplo, transducción con vector viral), lavado y/o incubación. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra que está procesada. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, fluidos corporales, como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluyendo las muestras procesadas derivadas de los mismos.

En algunos aspectos, la muestra de la que se derivan o aíslan las células es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de aféresis o leucoféresis. Las muestras ejemplares incluyen sangre completa, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado al intestino, tejido linfoide asociado a la mucosa, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdala u otro órgano y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, por ejemplo, terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.

En algunas realizaciones, las células se derivan de líneas celulares, por ejemplo, líneas de células T. Las células en algunas realizaciones se obtienen de una fuente xenogénica, por ejemplo, de ratón, rata, primate no humano y cerdo.

En algunos casos, el aislamiento de las células incluye uno o más pasos de preparación y/o separación de células basados en la no afinidad. En algunos ejemplos, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer los componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos, las células se separan en base a una o más propiedades, como densidad, propiedades adherentes, tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares.

En algunos ejemplos, se obtienen células de la sangre circulante de un sujeto, por ejemplo, por aféresis o leucoféresis. Las muestras, en algunos aspectos, contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunos aspectos contienen células distintas de glóbulos rojos y plaquetas.

En algunos casos, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan, por ejemplo, para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En algunos casos, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunos aspectos, se lleva a cabo un paso de lavado en una centrífuga de "flujo continuo" semiautomática (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos aspectos, se logra un paso de lavado mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se vuelven a suspender en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, como, por ejemplo, PBS libre de Ca++/Mg++. En ciertos casos, se eliminan componentes de la muestra de célula sanguínea y las células se vuelven a suspender directamente en medio de cultivo.

En algunos casos, los métodos incluyen métodos de separación de células basados en la densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica mediante la lisis de los glóbulos rojos y la centrifugación a través de un gradiente de Percoll o Ficoll.

En algunos casos, los métodos de aislamiento incluyen la separación de diferentes tipos de células en base a la expresión o presencia en la célula de una o más moléculas específicas, como marcadores de superficie, por ejemplo, proteínas de superficie, marcadores intracelulares o ácido nucleico. En algunos casos, puede usarse cualquier método conocido para la separación en base a tales marcadores. En algunos casos, la separación es una separación basada en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, el aislamiento en algunos aspectos incluye la separación de células y poblaciones celulares en base a la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo, mediante incubación con un anticuerpo o compañero de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguido generalmente por pasos de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o a al compañero de unión, de las células que no se han unido al anticuerpo o compañero de unión.

Tales pasos de separación pueden basarse en la selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos se conservan para su uso posterior, y/o la selección negativa, en la que se conservan las células que no se han unido al anticuerpo o al compañero de unión. En algunos ejemplos, ambas fracciones se conservan para su uso posterior. En algunos aspectos, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no hay ningún anticuerpo disponible que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de tal manera que la separación se lleve a cabo mejor en base a marcadores expresados por células distintas de la población deseada.

No es necesario que la separación dé como resultado un enriquecimiento o eliminación del 100% de una población celular particular o células que expresan un marcador particular. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a aumentar el número o porcentaje de dichas células, pero no es necesario que dé como resultado una ausencia total de células que no expresan el marcador. De igual manera, la selección negativa, la eliminación o el agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a disminuir el número o porcentaje de tales células, pero no tiene por qué dar como resultado una eliminación completa de todas esas células.

En algunos ejemplos, se llevan a cabo múltiples rondas de pasos de separación, donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de separación, como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos, un solo paso de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, como incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión, cada uno específico para un marcador objetivo de selección negativa. De igual manera, pueden seleccionarse positivamente múltiples tipos de células simultáneamente incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión expresados en los varios tipos de células.

P or e je m p lo , en a lgu nos asp ec tos , se a ís lan s u b p o b la c io n e s e sp e c ífica s de cé lu la s T, co m o cé lu la s p o s itiva s o que exp re sa n a ltos n ive le s de uno o m ás m arca d o re s de sup e rfic ie , p o r e jem p lo , cé lu la s T C D 28+ , C D 62L , C C R 7+ , C D 27+ , C D 127+ , C D 4+ , C D 8+ , C D 45R A y /o C D 45 R O m ed ia n te té c n ic a s de se lecc ió n po s itiva o nega tiva .

P or e je m p lo , las cé lu la s T C D 3+ , C D 28+ pu ed en se le cc io n a rse p o s itiva m e n te u sa n d o pe rla s m ag né ticas co n ju g a d a s C D 3 /C D 28 (po r e jem p lo , e x p a n s o r de cé lu la s T C D 3 /C D 28 D^yN ^aBEADS ® M -450).

En a lg u n o s ca so s , e l a is la m ie n to se lleva a ca b o m ed ia n te e l e n r iq u e c im ie n to de u n a p o b lac ió n c e lu la r p a rtic u la r m ed ia n te se lecc ió n p o s itiva , o el ag o ta m ie n to de un a p o b lac ió n c e lu la r p a rtic u la r m ed ia n te se lecc ión nega tiva . En a lg u n o s caso s , la se le cc ió n po s itiva o ne g a tiva se lo g ra in cub and o cé lu la s con uno o m ás a n ticu e rp o s u o tro a g en te de un ión q u e se u n a e s p e c ífic a m e n te a uno o m ás m arca d o re s de su p e rfic ie e xp re sa d o s o e xp re sa d o s (m a rca d o r+ ) a un n ive l re la tiva m e n te m ás a lto (m a rca d o r a lto ) en las cé lu la s s e le cc io n a d a s po s itiva o n e g a tiva m e n te , resp ec tiva m en te .

En a lg u n o s caso s , las cé lu la s T se sep a ra n de u n a m u e s tra de P B M C m ed ia n te se lecc ió n n e g a tiva de m a rca d o re s e xp re sa d o s en cé lu la s q u e no son T, co m o cé lu la s B, m o n o c ito s u o tro s g ló b u lo s b lancos , co m o C D 14. En a lg u n o s a sp ec tos , se u sa un pa so de se lecc ió n de C D 4+ o C D 8+ pa ra se p a ra r las cé lu la s T au x ilia re s C D 4+ y las cé lu la s T c ito tó x ica s C D 8+ . T a le s p o b la c io n e s de C D 4+ y C D 8+ p u ed en c la s ifica rse a d ic io n a lm e n te en su b p o b la c io n e s m ed ia n te se lecc ió n po s itiva o ne ga tiva pa ra m a rca d o re s e xp re sa d o s o e x p re s a d o s en un g ra d o re la tiva m e n te m ás a lto en un a o m ás su b p o b la c io n e s de cé lu la s T v írg e n e s , de m e m o ria y /o e fe c to ras .

En a lg u n o s caso s , las cé lu la s C D 8+ se e n riq u e ce n o se ago tan a d ic io n a lm e n te en cé lu la s m ad re de v írg e n e s , m e m o ria cen tra l, m e m o ria e fe c to ra y /o m e m o ria cen tra l, co m o p o r e je m p lo m ed ia n te se lecc ió n po s itiva o ne g a tiva b a sa d a en an tíg eno s de sup e rfic ie aso c ia d o s con la su b p o b la c ió n respec tiva . En a lg u n o s caso s , el e n r iq u e c im ie n to de cé lu la s T de m e m o ria cen tra l (M T C ) se lle va a ca b o pa ra a u m e n ta r la e fica c ia , co m o m e jo ra r la s u p e rv ive n c ia a la rgo p lazo , la exp a n s ió n y /o el in je rto d e sp u é s de la ad m in is tra c ió n , q u e en a lg u n o s a sp e c to s es p a rticu la rm e n te rob us to en ta le s s u b p o b la c io n e s . V e r T e ra ku ra e t al. (2012 ) B lo o d .1 :72 -82 ; W ang et al. (2012 ) J Inm un o the r. 35 (9 ):689 -701. En a lgu nos caso s , la co m b in a c ió n de cé lu la s T C D 8+ e n riq u e c id a s con TC M y cé lu la s T C D 4+ m e jo ra la e fica c ia aún m ás.

En a lgu nos caso s , las cé lu la s T de m e m o ria es tá n p re se n te s ta n to en los s u b co n ju n to s C D 62 L com o C D 62 L - de lin foc ito s de san g re p e rifé rica C D 8+ . Las P B M C p u ed en e n riq u e ce rse o e m p o b re ce rse en fra cc io n e s de C D 62 L -C D 8 y /o C D 62 L C D 8 , co m o p o r e je m p lo u sa nd o a n ticu e rp o s a n ti-C D 8 y a n ti-C D 62L .

En a lg u n o s caso s , e l e n riq u e c im ie n to de las cé lu la s T de m e m o ria cen tra l (T C M ) se ba sa en la exp res ión su p e rfic ia l a lta o p o s itiva de C D 45 R ^o, C D 62L , C C R 7, C D 28, C D 3 y /o C D 127; en a lgu nos asp ec tos , se b a sa en la se lecc ió n n e g a tiva de cé lu la s qu e e xp re sa n o e xp re sa n en g ran m e d id a C D 45 R A y /o g ra n z im a B. En a lgunos a sp ec tos , el a is la m ie n to de u n a pob lac ió n C D 8+ e n riq u e c id a pa ra cé lu la s de T C M se lle va a ca b o m ed ia n te el e m p o b re c im ie n to de cé lu la s que exp re sa n C D 4, C D 14 , C D 45R A , y se lecc ió n po s itiva o e n r iq u e c im ie n to de cé lu la s q u e exp re sa n C D 62L . En un asp ec to , e l e n r iq u e c im ie n to pa ra cé lu la s T de m e m o ria cen tra l (TC M ) se lleva a cab o p a rtie n d o de u n a fra cc ió n ne g a tiva de cé lu la s s e le cc io n a d a s en ba se a la e xp res ión de C D 4, q u e se som e te n a una se le cc ió n ne g a tiva b a sa d a en la e xp re s ió n de C D 14 y C D 45R A , y u n a se lecc ió n po s itiva b a sa d a en C D 62L . T a le s se le cc io n e s en a lg u n o s asp e c to s se llevan a cab o s im u ltá n e a m e n te y en o tro s a sp e c to s se llevan a cab o s e cu e n c ia lm e n te , en c u a lq u ie r o rd en . En a lg u n o s asp ec tos , ta m b ié n se u sa el m ism o paso de se lecc ió n b a sa d o en la e xp re s ió n de C D 4 usa d o en la p re p a ra c ió n de la p o b lac ió n o su b p o b la c ió n de cé lu la s C D 8+ , p a ra g e n e ra r la p o b lac ió n o su b p o b la c ió n de cé lu la s C D 4+ , de ta l m an e ra que ta n to las fra cc io n e s po s itiva s co m o las nega tivas de la se p a ra c ió n b a sa d a en C D 4 se c o n se rva n y usan en pa sos p o s te rio re s de los m é tod os , o p c io n a lm e n te de sp u é s de uno o m ás pa sos de se lecc ió n p o s itivo s o ne ga tivos ad ic io na le s .

En un e je m p lo pa rticu la r, un a m u e s tra de P B M C u o tra m u e s tra de g ló b u lo s b lan cos se som e te a se lecc ió n de cé lu la s C D 4+, do n d e se co n se rva n ta n to las fra c c io n e s ne ga tivas co m o las p o s itiva s . Luego, la fra cc ió n ne ga tiva se so m e te a se lecc ió n ne ga tiva en base a la e xp re s ió n de C D 14 y C D 45 R A o C D 19, y se le cc ió n p o s itiva b a sa d a en un m a rca d o r c a ra c te rís tico de las cé lu la s T de m e m o ria cen tra l, co m o C D 62L o C C R 7, do nd e las se le cc io n e s p o s itiva s y nega tivas se llevan a ca b o en c u a lq u ie r o rden .

Las cé lu la s a u x ilia re s C D 4+ T se c la s ifica n en cé lu la s v írg e n e s , de m em o ria c e n tra l y e fe c to ra s m ed ia n te la id e n tifica c ió n de p o b la c io n e s c e lu la re s q u e tie n e n a n tíg e n o s de sup e rfic ie ce lu la r. Los lin foc ito s C D 4+ pueden o b te n e rs e m ed ia n te m é tod os e s tá n d a r. En a lgu nos caso s , los lin foc ito s T C D 4+ v írg e n e s son cé lu la s T C D 45R O -, C D 45R A , C D 62L , C D 4+ . En a lg u n o s caso s , las cé lu la s C D 4+ de m e m o ria ce n tra l son C D 62 L y C D 45R O . En a lg u n o s caso s , las cé lu la s e fe c to ra s C D 4+ son C D 62 L - y C D 45R O .

En un e jem p lo , pa ra e n riq u e c e r las cé lu la s C D 4+ po r se le cc ió n nega tiva , un cóc te l de an ticu e rp o s m o n o c lo n a le s in c luye típ ic a m e n te a n ticu e rp o s co n tra C D 14, C D 20, C D 11b , C D 16, H L A -D R y C D 8. En a lgu nos ca so s , e l an ticu e rp o o e l co m p a ñ e ro de un ión se une a un sop o rte só lido o m a triz , co m o un a pe rla m a g n é tica o una perla paramagnética, para permitir la separación de células para selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunos casos, las células y las poblaciones celulares se separan o aíslan usando técnicas de separación inmunomagnéticas (o magnéticas por afinidad) (revisadas en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 editado por: S.A. Brooks y U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).

En algunos aspectos, la muestra o composición de células a separar se incuba con material pequeño, magnetizable o magnéticamente sensible, como partículas o micropartículas magnéticamente sensibles, como perlas paramagnéticas (por ejemplo, perlas Dynalbeads o MACS). El material magnéticamente sensible, por ejemplo, una partícula, generalmente se une directa o indirectamente a un compañero de unión, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, por ejemplo, un marcador de superficie, presente en la célula, las células o la población de células que se desea separar, por ejemplo, que se desea seleccionar negativa o positivamente.

En algunos casos, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un elemento de unión específico, como un anticuerpo u otro compañero de unión. Hay muchos materiales magnéticamente sensibles bien conocidos que se usan en los métodos de separación magnética. Las partículas magnéticas adecuadas incluyen las descritas en Molday, Patente de Estados Unidos N° 4.452.773, y en la memoria de la patente europea EP 452342B. Partículas de tamaño coloidal, como las descritas en Owen Patente de Estados Unidos N° 4.795.698, y Liberti et al., Patente de Estados Unidos N° 5.200.084 son otros ejemplos.

La incubación generalmente se lleva a cabo en condiciones en las que los anticuerpos o compañeros de unión, o moléculas, como anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a tales anticuerpos o compañeros de unión, que están unidos a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células dentro de la muestra.

En algunos aspectos, la muestra se coloca en un campo magnético, y aquellas células que tienen partículas magnéticamente sensibles o magnetizables unidas a ellas serán atraídas por el imán y separadas de las células no marcadas. Para la selección positiva, se conservan las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se conservan las células que no son atraídas (células sin marcar). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, donde se conservan las fracciones positivas y negativas y se procesan adicionalmente o se someten a pasos de separación adicionales.

En ciertos casos, las partículas magnéticamente sensibles están recubiertas en anticuerpos primarios u otros compañeros de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertos casos, las partículas magnéticas se unen a las células a través de un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En ciertos casos, se marcan las células, en lugar de las perlas, con un anticuerpo primario o un compañero de unión y luego se añaden partículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo secundario específico de tipo celular u otro compañero de unión (por ejemplo, estreptavidina). En ciertos casos, se usan partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.

En algunos casos, las partículas magnéticamente sensibles se dejan unidas a las células que se van a incubar, cultivar y/o manipular posteriormente; en algunos aspectos, las partículas se dejan unidas a las células para su administración a un paciente. En algunos casos, las partículas magnetizables o magnéticamente sensibles se eliminan de las células. Se conocen métodos para eliminar partículas magnetizables de las células e incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos competitivos no marcados y partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con conectores escindibles. En algunos casos, las partículas magnetizables son biodegradables.

En algunos casos, la selección basada en la afinidad se realiza a través de la Clasificación de Células Activadas Magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Los sistemas de Clasificación de Células Activadas Magnéticamente (MACS) son capaces de una selección de alta pureza de células que tienen partículas magnetizadas unidas a ellas. En ciertos casos, la MACS funciona en un modo en el que las especies objetivo y no objetivo se eluyen secuencialmente después de la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células unidas a las partículas magnetizadas se mantienen en su sitio mientras se eluyen las especies no unidas. Luego, después de que se completa este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y se les impidió eluir se liberan de alguna manera para que puedan eluirse y recuperarse. En ciertos casos, las células no objetivo se marcan y empobrecen de la población heteróloga de células.

En ciertos casos, el aislamiento o separación se lleva a cabo usando un sistema, dispositivo o aparato que lleva a cabo uno o más de los pasos de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación de los métodos. En algunos aspectos, el sistema se usa para llevar a cabo cada uno de estos pasos en un ambiente cerrado o estéril, por ejemplo, para minimizar el error, la manipulación por parte del usuario y/o la contaminación. En un ejemplo, el sistema es un sistema como se describe en la Solicitud de Patente Internacional, Número de Publicación W02009/072003, o la US 20110003380 A1.

En algunos casos, el sistema o aparato lleva a cabo uno o más, por ejemplo, todos los pasos de aislamiento, procesamiento, manipulación y formulación en un sistema integrado o independiente, y/o de manera automatizada o programable. En algunos aspectos, el sistema o aparato incluye un ordenador y/o programa de ordenador en comunicación con el sistema o aparato, que permite al usuario programar, controlar, evaluar el resultado y/o ajustar varios aspectos de los pasos de procesamiento, aislamiento, manipulación y formulación.

En algunos aspectos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec), por ejemplo, para la separación automatizada de células a nivel de escala clínica en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de pinza. El ordenador integrado en algunos aspectos controla todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para realizar procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. La unidad de separación magnética en algunos aspectos incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla el caudal en todo el conjunto de tubos y, junto con las válvulas de pinza, asegura el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.

El sistema CliniMACS en algunos aspectos usa partículas magnetizables acopladas a anticuerpos que se suministran en una solución estéril no pirógena. En algunos casos, después de marcar las células con partículas magnéticas, las células se lavan para eliminar el exceso de partículas. Luego, se conecta una bolsa de preparación de células al conjunto de tubos, que a su vez se conecta a una bolsa que contiene tampón y una bolsa de recogida de células. El conjunto de tubos consiste de tubos estériles preensamblados, que incluyen una precolumna y una columna de separación, y son de un solo uso. Después de iniciar el programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra de células en la columna de separación. Las células marcadas se retienen dentro de la columna, mientras que las células no marcadas se eliminan mediante una serie de pasos de lavado. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente no están marcadas y no se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente están marcadas y se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente se eluyen de la columna después de eliminar el campo magnético y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.

En ciertos casos, la separación y/u otros pasos se realizan mediante el sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). El sistema CliniMACS Prodigy en algunos aspectos está equipado con una unidad de procesamiento celular que permite el lavado y fraccionamiento automatizado de células por centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara integrada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el punto final de fraccionamiento celular óptimo al discernir las capas macroscópicas del producto celular de origen. Por ejemplo, la sangre periférica se separa automáticamente en eritrocitos, glóbulos blancos y capas de plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que lleva a cabo protocolos de cultivo celular como, por ejemplo, diferenciación y expansión celular, carga de antígenos y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada pueden permitir la extracción estéril y la reposición de medios y las células pueden monitorizarse usando un microscopio integrado. Ver, por ejemplo, Klebanoff et al. (2012) J Inmunotro. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, y Wang et al. (2012) J Inmunotro. 35(9):689-701.

En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o empobrece) mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluida. En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o empobrece) mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En ciertos casos, una población de células descrita en la presente se recolecta y enriquece (o empobrece) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (ver, por ejemplo, la WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; y Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. En ambos casos, las células pueden marcarse con múltiples marcadores, lo que permite el aislamiento de subconjuntos de células T bien definidos con alta pureza.

En algunos casos, los anticuerpos o compañeros de unión se marcan con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, la separación puede basarse en la unión a anticuerpos marcados con fluorescencia. En algunos ejemplos, la separación de células basada en la unión de anticuerpos u otros compañeros de unión específicos para uno o más marcadores de superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), incluyendo la escala preparativa (FACS) y/o chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS), por ejemplo, en combinación con un sistema de detección de citometría de flujo. Tales métodos permiten la selección positiva y negativa en base a múltiples marcadores simultáneamente.

En algunos casos, los métodos de preparación incluyen pasos para congelar, por ejemplo, crioconservar, las células, ya sea antes o después del aislamiento, la incubación y/o la manipulación. En algunos casos, el paso de congelación y posterior descongelación elimina los granulocitos y, hasta cierto punto, los monocitos en la población celular. En algunos casos, las células se suspenden en una solución de congelación, por ejemplo, después de un paso de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. En algunos aspectos puede usarse cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos. Un ejemplo implica el uso de PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano (HSA), u otro medio de congelación celular adecuado. A continuación, se diluye 1:1 con medio de tal manera que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10% y el 4%, respectivamente. A continuación, las células se congelan generalmente a -80 °C a una tasa de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.

En algunos casos, los métodos descritos incluyen pasos de cultivo, incubación, cultivo y/o ingeniería genética. La incubación y/o la ingeniería genética pueden llevarse a cabo en un recipiente de cultivo, como una unidad, cámara, pocillo, columna, tubo, conjunto de tubos, válvula, vial, placa de cultivo, bolsa u otro recipiente para cultivo o cultivar células. En algunos casos, las células se incuban y/o cultivan antes o en conexión con la ingeniería genética. Los pasos de incubación pueden incluir cultivo, estimulación, activación y/o propagación. En algunos casos, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones estimulantes o un agente estimulador. Tales condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de las células en la población, para imitar la exposición al antígeno, y/o para cebar las células para ingeniería genética, como para la introducción de un receptor de antígenos recombinante.

Las condiciones pueden incluir uno o más medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimuladores, como citoquinas, quimiocinas, antígenos, compañeros de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células.

En algunos casos, las condiciones o agentes de estimulación incluyen uno o más agentes, por ejemplo, un ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo de TCR. En algunos aspectos, el agente activa o inicia la cascada de señalización intracelular de TCR/CD3 en una célula T. Tales agentes pueden incluir anticuerpos, como los específicos para un componente de TCR y/o un receptor coestimulador, por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28, unidos a un soporte sólido como una perla y/o una o más citoquinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además el paso de añadir anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de por lo menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunos casos, los agentes estimuladores incluyen IL-2 y/o IL-15, por ejemplo, una concentración de IL-2 de por lo menos aproximadamente 10 unidades/ml.

En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.177 de Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J Inmunother.. 35(9):689-701.

En algunos casos, las células T se expanden añadiendo a la composición iniciadora de cultivo células alimentadoras, como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que no se dividen (por ejemplo, de tal manera que la población de células resultante contenga por lo menos aproximadamente 5,10, 20, o 40 o más células alimentadoras de PBMC para cada linfocito T en la población inicial que se va a expandir); e incubar el cultivo (por ejemplo, durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunos casos, las PBMC se irradian con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de añadir las poblaciones de células T.

En algunos casos, las condiciones de estimulación incluyen una temperatura adecuada para el crecimiento de los linfocitos T humanos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente por lo menos aproximadamente 30 grados y generalmente de o aproximadamente 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides (LCL) transformadas por EBV que no se dividen como células alimentadoras. Las LCL pueden irradiarse con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 6000 a 10.000 rads. En algunos aspectos las células alimentadoras LCL se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras LCL a linfocitos T iniciales de por lo menos aproximadamente 10:1.

B. Composiciones y formulaciones farmacéuticas

También se describen composiciones que incluyen las células, incluyendo composiciones y formulaciones farmacéuticas, como composiciones en forma de dosis unitaria que incluyen el número de células para administración en una dosis dada o fracción de la misma. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas generalmente incluyen uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables opcionales. En algunos casos, la composición incluye por lo menos un agente terapéutico adicional.

En algunos aspectos, la elección del portador está determinada en parte por la célula y/o por el método de administración particulares. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 2% en peso de la composición total. Los portadores se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como polietilenglicol (PEG).

En algunos aspectos se incluyen en las composiciones agentes tampón. Los agentes tampón adecuados incluyen, por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato de potasio y varios otros ácidos y sales. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más agentes tampón. El agente tampón o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a edición (1 de mayo de 2005).

Las formulaciones pueden incluir soluciones acuosas. La formulación o composición también puede contener más de un ingrediente activo útil para la indicación, enfermedad o afección particular que se esté tratando con las células, preferiblemente aquellas con actividades complementarias a las células, donde las actividades respectivas no se afectan negativamente entre sí. Tales ingredientes activos están adecuadamente presentes combinados en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Por tanto, en algunos casos, la composición farmacéutica incluye además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina y/o vincristina.

Las formulaciones incluyen aquellas para administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorios. En algunas realizaciones, las poblaciones celulares se administran por vía parenteral. Las infusiones parenterales pueden incluir administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratorácica, intracraneal y/o subcutánea. En algunas realizaciones, se administra una dosis dada mediante una única administración en bolo de las células. En algunas realizaciones, las células se administran al sujeto usando administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

En algunos casos, las composiciones se proporcionan como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunos aspectos pueden tamponarse a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas normalmente son más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y las composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más convenientes de administrar, especialmente mediante inyección. Las composiciones viscosas, por otro lado, pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar períodos de contacto más prolongados con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender portadores, que pueden ser un solvente o un medio dispersante que contiene, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando las células en un solvente, mezcladas con un portador, diluyente o excipiente adecuado, como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ejemplo, metilcelulosa), agentes tamponadores del pH, gelificantes o aditivos que mejoran la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes y/o colorantes, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. En algunos aspectos pueden consultarse textos estándar para preparar preparaciones adecuadas.

Pueden añadirse varios aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol y ácido sórbico. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante el uso de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las formulaciones para su uso para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

La composición farmacéutica en algunos casos contiene las células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz.

La administración de las células puede ser autóloga o alogénica. Por ejemplo, las células o progenitores inmunosensibles pueden obtenerse de un sujeto y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto compatible diferente. Las células inmunosensibles derivadas de sangre periférica o su progenie (por ejemplo, derivadas in vivo, ex vivo o in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluyendo la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica (por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene una célula inmunosensible manipulada genéticamente), generalmente se formulará en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión).

C. Métodos de administración y usos de las células en terapia celular adoptiva

Se describen métodos, como los que abarcan la administración de péptidos como los péptidos descritos, por ejemplo, para inducir tolerancia o reducir o prevenir una respuesta inmunitaria. La invención está definida por las reivindicaciones y se refiere a péptidos que comprenden una porción de una región inmunogénica de un CAR y/o células que expresan el CAR para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto humano. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además administrar células, poblaciones y composiciones, y usos de tales células, poblaciones y composiciones para tratar o prevenir enfermedades, afecciones y trastornos, incluyendo cánceres, enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas. En casos de los métodos descritos, las células, poblaciones y composiciones de células, incluyendo cualquiera que contenga células que expresen una molécula recombinante, como un receptor, como un antígeno y/o un receptor quimérico, como un CAR, se coadministran con (generalmente, se administran después) de un péptido o péptidos que contienen un epítopo o secuencia presente en o codificado o expresado por el agente, como la célula o molécula en el mismo o sobre el mismo. En algunos casos, el epítopo o secuencia corresponde al receptor quimérico particular, como un CAR, expresado en las células manipuladas genéticamente.

En algunas realizaciones, las células, poblaciones y composiciones se administran a un sujeto o paciente que tiene la enfermedad o afección particular que se va a tratar, por ejemplo, a través de terapia celular adoptiva, como terapia de células T adoptivas. En algunas realizaciones, las células y las composiciones preparadas mediante los métodos descritos, como las composiciones manipuladas y las composiciones de final de producción después de la incubación y/u otros pasos de procesamiento, se administran a un sujeto, como un sujeto que tiene o está en riesgo de tener la enfermedad. o condición. En algunos aspectos, los métodos tratan, por ejemplo, mejoran uno o más síntomas de la enfermedad o afección, como por ejemplo, disminuyendo la carga tumoral en un cáncer que expresa un antígeno reconocido por una célula T manipulada.

Los métodos para la administración de células para la terapia celular adoptiva son conocidos y pueden usarse en relación con los métodos y composiciones descritos. Por ejemplo, los métodos de terapia de células T adoptiva se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/0170238 de Gruenberg et al.; Patente de Estados Unidos N° 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol.

8(10):577-85). Ver, por ejemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Dávila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.

Como se usa en la presente, "retrasar el desarrollo de una enfermedad" significa diferir, dificultar, ralentizar, retardar, estabilizar, suprimir y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (como el cáncer). Este retraso puede variar en la duración del tiempo, dependiendo del historial de la enfermedad y/o del individuo que se está tratando. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolle la enfermedad. Por ejemplo, puede retrasarse un cáncer en etapa tardía, como el desarrollo de metástasis.

"Prevenir", como se usa en la presente, incluye proporcionar profilaxis con respecto a la aparición o recurrencia de una enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero al que aún no se la ha diagnosticado la enfermedad. En algunas realizaciones, las células y composiciones proporcionadas se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

Como se usa en la presente, "suprimir" una función o actividad es reducir la función o actividad en comparación con las mismas condiciones excepto por una condición o parámetro de interés, o alternativamente, en comparación con otra condición. Por ejemplo, las células que suprimen el crecimiento del tumor reducen la tasa de crecimiento del tumor en comparación con la tasa de crecimiento del tumor en ausencia de células.

En algunas realizaciones, la terapia celular, por ejemplo, la terapia de células T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia autóloga, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir del sujeto que va a recibir la terapia celular, o de una muestra derivada de tal sujeto. Por tanto, en algunos aspectos, las células se derivan de un sujeto, por ejemplo, un paciente, que necesita un tratamiento y las células, tras el aislamiento y el procesamiento, se administran al mismo sujeto.

En algunas realizaciones, la terapia celular, por ejemplo, la terapia de células T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia alogénica, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir de un sujeto distinto del sujeto que va a recibir o que finalmente recibe la terapia celular, por ejemplo, un primer sujeto. En tales realizaciones, las células se administran luego a un sujeto diferente, por ejemplo, un segundo sujeto, de la misma especie. En algunas realizaciones, el primer y el segundo sujeto son genéticamente idénticos. En algunas realizaciones, el primer y el segundo sujeto genéticamente similares. En algunas realizaciones, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo de ^hL^aque el primer sujeto.

En algunas realizaciones, el sujeto ha sido tratado con un agente terapéutico dirigido a la enfermedad o afección, por ejemplo, el tumor, antes de la administración de las células o la composición que contiene las células. En algunos aspectos, el sujeto es refractario o no responde al otro agente terapéutico. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad persistente o recidivante, por ejemplo, después del tratamiento con otra intervención terapéutica, que incluye quimioterapia, radiación y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), por ejemplo, HSCT alogénico. En algunas realizaciones, la administración trata eficazmente al sujeto a pesar de que el sujeto se haya vuelto resistente a otra terapia.

En algunas realizaciones, el sujeto responde al otro agente terapéutico y el tratamiento con el agente terapéutico reduce la carga de la enfermedad. En algunos aspectos, el sujeto responde inicialmente al agente terapéutico, pero muestra una recaída de la enfermedad o afección a lo largo del tiempo. En algunas realizaciones, el sujeto no ha recaído. En algunas de tales realizaciones, se determina que el sujeto está en riesgo de recaída, como en riesgo alto de recaída, y por lo tanto las células se administran profilácticamente, por ejemplo, para reducir la probabilidad de recaída o prevenirla.

En algunos aspectos, el sujeto no ha recibido tratamiento previo con otro agente terapéutico.

Entre las enfermedades, afecciones y trastornos para el tratamiento con las composiciones, células, métodos y usos descritos están los tumores, incluyendo los tumores sólidos, las enfermedades malignas hematológicas y los melanomas, y las enfermedades infecciosas, como la infección por un virus u otro patógeno, por ejemplo, el VIH., VHC, VHB, CMV y enfermedades parasitarias. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un tumor, cáncer, enfermedad maligna, neoplasia u otra enfermedad o trastorno proliferativo. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, leucemia, linfoma, por ejemplo, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma no Hodgkin, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiple, linfoma folicular refractario, linfoma de células del manto, linfoma de células B indolente, enfermedades malignas de células B, cánceres de colon, pulmón, hígado, mama, próstata, ovario, piel, melanoma, hueso, y cáncer de cerebro, cáncer de ovario, cánceres epiteliales, carcinoma de células renales, adenocarcinoma pancreático, linfoma de Hodgkin, carcinoma cervical, cáncer colorrectal, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de Ewing, meduloblastoma, osteosarcoma, sarcoma sinovial y/o mesotelioma.

En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección infecciosa, como pero no limitada a, infecciones virales, retrovirales, bacterianas y protozoarias, inmunodeficiencia, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, poliomavirus BK. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria como artritis, por ejemplo, artritis reumatoide (RA), diabetes tipo I, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, esclerodermia, enfermedad de tiroides autoinmune, enfermedad de Grave, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, asma y/o una enfermedad o afección asociada con el trasplante.

En algunas realizaciones, el antígeno asociado con la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de receptor de tirosina quinasa huérfano ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA y antígeno de superficie de hepatitis B, receptor anti-folato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 o 4, FBP, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos NKG2D, N^y-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno específico de la próstata, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, y MAGE A3 y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por el VIH, VHC, VHB u otros patógenos.

En algunas realizaciones, las células se administran a una dosificación deseada, que en algunos aspectos incluye una dosis deseada o número de células o tipos de células y/o una proporción deseada de tipos de células.

Por tanto, la dosificación de células en algunas realizaciones se basa en un número total de células (o número por kg de peso corporal) y una proporción deseada de las poblaciones individuales o subtipos, como la proporción de CD4+ a CD8+. En algunas realizaciones, la dosificación de células se basa en un número total deseado (o número por kg de peso corporal) de células en las poblaciones individuales o de tipos de células individuales. En algunas realizaciones, la dosificación se basa en una combinación de dichas características, como el número deseado de células totales, la proporción deseada y el número total deseado de células en las poblaciones individuales.

En algunas realizaciones, las poblaciones o subtipos de células, como las células T CD8+ y CD4+, se administran en o dentro de una diferencia tolerada de una dosis deseada de células totales, como una dosis deseada de células T. En algunos aspectos, la dosis deseada es un número deseado de células o un número deseado de células por unidad de peso corporal del sujeto al que se administran las células, por ejemplo, células/kg. En algunos aspectos, la dosis deseada es igual o superior a un número mínimo de células o un número mínimo de células por unidad de peso corporal. En algunos aspectos, entre las células totales, administradas a la dosis deseada, las poblaciones o subtipos individuales están presentes en o cerca de una proporción de salida deseada (como proporción de CD4+ a CD8+), por ejemplo, dentro de una cierta diferencia tolerada o error de dicha proporción.

En algunas realizaciones, las células se administran en o dentro de una diferencia tolerada de una dosis deseada de una o más de las poblaciones individuales o subtipos de células, como una dosis deseada de células CD4+ y/o una dosis deseada de células CD8+. En algunos aspectos, la dosis deseada es un número deseado de células del subtipo o población, o un número deseado de tales células por unidad de peso corporal del sujeto al que se administran las células, por ejemplo, células/kg. En algunos aspectos, la dosis deseada es igual o superior a un número mínimo de células de la población o subtipo, o un número mínimo de células de la población o subtipo por unidad de peso corporal.

Por tanto, en algunas realizaciones, la dosificación se basa en una dosis fija deseada de células totales y una proporción deseada, y/o en una dosis fija deseada de uno o más, por ejemplo de cada uno, de los subtipos o subpoblaciones individuales. Por tanto, en algunas realizaciones, la dosificación se basa en una dosis mínima o fija deseada de células T y una proporción deseada de células CD4+ a CD8+, y/o se basa en una dosis mínima o fija deseada de CD4+ y/o células CD8+.

En ciertas realizaciones, las células, o poblaciones individuales de subtipos de células, se administran al sujeto en un intervalo de aproximadamente un millón a aproximadamente 100 mil millones de células, como, por ejemplo, de 1 millón a aproximadamente 50 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1 billón de células, aproximadamente 5 mil millones de células, aproximadamente 20 mil millones de células, aproximadamente 30 mil millones de células, aproximadamente 40 mil millones de células, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores), como de aproximadamente 10 millones a aproximadamente 100 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 30 millones de células, aproximadamente 40 millones de células, aproximadamente 60 millones de células, aproximadamente 70 millones de células, aproximadamente 80 millones de células, aproximadamente 90 millones de células, aproximadamente 10 mil millones de células, aproximadamente 25 mil millones de células, aproximadamente 50 mil millones de células, aproximadamente 75 mil millones de células, aproximadamente 90 mil millones de células, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores), y en algunos casos aproximadamente 100 millones de células a aproximadamente 50 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 120 millones de células, aproximadamente 250 millones de células, aproximadamente 350 millones de células, aproximadamente 450 millones de células, aproximadamente 650 millones de células, aproximadamente 800 millones de células, aproximadamente 900 millones de células, aproximadamente 3 mil millones de células, aproximadamente 30 mil millones de células, aproximadamente 45 mil millones de células) o cualquier valor entre estos intervalos.

En algunas realizaciones, la dosis de células totales y/o la dosis de subpoblaciones individuales de células está dentro de un intervalo de entre aproximadamente 104 y aproximadamente 109 células/kilogramo (kg) de peso corporal, como entre 105 y 106 células/kg de peso corporal, por ejemplo, aproximadamente 1 x 105 células/kg, 1,5 x 105 células/kg, 2 x 105 células/kg o 1 x 106 células/kg de peso corporal. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células se administran a, o dentro de un cierto intervalo de error, entre o entre aproximadamente 104 y aproximadamente 109 células T/kilogramo (kg) de peso corporal, como entre 105 y 106 células T/kg de peso corporal, por ejemplo, aproximadamente 1 x 105 células T/kg, 1,5 x 105 células T/kg, 2 x 105 células T/kg o 1 x 106 células T/kg de peso corporal.

En algunas realizaciones, las células se administran en o dentro de un cierto intervalo de error de entre o entre aproximadamente 104 y de o aproximadamente 109 células CD4+ y/o CD8+/kilogramos (kg) de peso corporal, como entre 105 y 106 células CD4+ y/o CD8+/kg de peso corporal, por ejemplo, a o aproximadamente 1 x 105 células CD4+ y/o CD8+/kg, 1,5 x 105 células CD4+ y/o CD8+/kg, 2 x 105 células CD4+ y/o CD8+/kg, o 1 x 106 células CD4+ y/o CD8+ /kg de peso corporal.

En algunas realizaciones, las células se administran en o dentro de un cierto intervalo de error de, más de y/o por lo menos aproximadamente 1 x 106, aproximadamente 2,5 x 106, aproximadamente 5 x 106, aproximadamente 7,5 x 106, o aproximadamente 9 x 106 células CD4+, y/o por lo menos aproximadamente 1 x 106, aproximadamente 2,5 x 106, aproximadamente 5 x 106, aproximadamente 7,5 x 106 o aproximadamente 9 x 106 células CD8+, y/ o por lo menos aproximadamente 1 x 106, aproximadamente 2,5 x 106, aproximadamente 5 x 106, aproximadamente 7,5 x 106, o aproximadamente 9 x 106 células T. En algunas realizaciones, las células se administran en o dentro de un cierto intervalo de error de entre aproximadamente 108 y 1012 o entre aproximadamente 1010 y 1011 células T, entre aproximadamente 108 y 1012 o entre aproximadamente 1010 y 1011 células CD4+, y/o entre aproximadamente 108 y 1012 o entre aproximadamente 1010 y 1011 células CD8+.

Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosificación adecuada puede depender del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de células o receptores quiméricos, la gravedad y evolución de la enfermedad, si las células se administran con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del sujeto y la respuesta a las células, y el criterio del médico tratante. En algunas realizaciones, las composiciones y las células se administran adecuadamente al sujeto de una vez o durante una serie de tratamientos.

Las células pueden administrarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por infusión en bolo, por inyección, por ejemplo, inyecciones intravenosas o subcutáneas, inyección intraocular, inyección periocular, inyección subretiniana, inyección intravítrea, inyección transseptal, inyección subescleral, inyección intracoroidea, inyección intracameral, inyección subconjetval, inyección subconjuntival, inyección sub-Tenon, inyección retrobulbar, inyección peribulbar o administración yuxtaescleral posterior. En algunas realizaciones, se administran por vía parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. En algunas realizaciones, una dosis dada se administra mediante una única administración en bolo de las células. En algunas realizaciones, se administra mediante múltiples bolos de las células, por ejemplo, durante un período de no más de 3 días, o mediante la administración por infusión continua de las células.

En algunas realizaciones, las células se administran como parte de un tratamiento de combinación, como simultáneamente o secuencialmente con, en cualquier orden, otra intervención terapéutica, como un anticuerpo o una célula o receptor o agente manipulados, como un agente citotóxico o terapéutico. Las células en algunas realizaciones se coadministran con uno o más agentes terapéuticos adicionales o en relación con otra intervención terapéutica, ya sea simultánea o secuencialmente en cualquier orden. En algunos contextos, las células se coadministran con otra terapia lo suficientemente próxima en el tiempo como para que las poblaciones de células potencien el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunas realizaciones, las células se administran antes de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones, las células se administran después de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones, uno o más agentes adicionales incluyen una citoquina, como IL-2, por ejemplo, para mejorar la persistencia. En algunas realizaciones, los métodos comprenden la administración de un agente quimioterapéutico.

Después de la administración de las células, en algunas realizaciones se mide la actividad biológica de las poblaciones de células manipuladas, por ejemplo, mediante cualquiera de varios métodos conocidos. Los parámetros a evaluar incluyen la unión específica de una célula T manipulada o natural u otra célula inmunitaria al antígeno, in vivo, por ejemplo, mediante imagenología, o ex vivo, por ejemplo, mediante ELISA o citometría de flujo. En ciertas realizaciones, la capacidad de las células manipuladas para destruir las células objetivo puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, como los ensayos de citotoxicidad descritos, por ejemplo, en Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), y Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). En ciertas realizaciones, la actividad biológica de las células se mide analizando la expresión y/o secreción de una o más citoquinas, como CD 107a, IFNy, IL-2 y TNF. En algunos aspectos, la actividad biológica se mide evaluando el resultado clínico, como la reducción del volumen o carga tumoral.

IV. Monitorización de una respuesta inmunitaria del huésped

En algunas realizaciones, puede monitorizarse la respuesta inmunitaria de un sujeto a un receptor quimérico, como un CAR, administrado a un sujeto, incluyendo en el contexto de la administración de células manipuladas genéticamente con la respuesta quimérica. En algunas realizaciones, las medidas de la respuesta inmunitaria pueden realizarse en sujetos sin tratamiento previo con el antígeno o sensibilizados previamente al antígeno, es decir, sujetos que nunca han sido tratados con células manipuladas genéticamente que expresan el receptor quimérico o sujetos que han sido tratados previamente con células manipuladas genéticamente que expresan el receptor quimérico, respectivamente. En algunos casos, tales medidas de una respuesta inmunitaria también pueden realizarse en sujetos antes y/o después de recibir el tratamiento con péptido, como de acuerdo con los métodos descritos. Puede medirse cualquier respuesta inmunitaria detectable, como una respuesta inmunitaria humoral o mediada por células detectable. En algunos aspectos, se detecta o mide la presencia o ausencia de dicha respuesta inmunitaria del huésped y/o la cantidad, el grado o el alcance de la misma, por ejemplo, tras la administración de células que expresan el receptor quimérico (por ejemplo, CAR) en presencia o ausencia de coadministración, como una administración previa, del péptido.

Después de la administración de uno o más péptidos pueden monitorizarse periódicamente las respuestas inmunitarias específicas del antígeno. La inducción de tolerancia puede confirmarse cuando la respuesta inmunitaria se previene, reduce o se regula por disminución de otro modo de una manera específica del antígeno. Por ejemplo, en algunos aspectos, la inducción de la tolerancia puede confirmarse al mostrar una disminución en los niveles de anticuerpos específicos del antígeno o los niveles de linfocitos específicos del antígeno para el antígeno administrado en un sujeto sensibilizado cuando se administra junto con un péptido de acuerdo con los métodos proporcionados, donde el individuo tiene niveles preexistentes de anticuerpos o linfocitos contra el antígeno. En algunos aspectos, cuando un sujeto no ha sido tratado con el antígeno (es decir, no ha sido tratado previamente con células que expresan el receptor quimérico (por ejemplo, CAR), la inducción de tolerancia puede confirmarse mostrando niveles de anticuerpos específicos del antígeno o niveles de linfocitos específicos del antígeno después del tratamiento que son consistentes con los niveles de control de una respuesta inmunitaria esperada en un sujeto con tolerancia inmunitaria. En otros casos, cuando un sujeto no ha recibido tratamiento previo con el antígeno (es decir, no ha sido tratado previamente con células que expresan el receptor quimérico (por ejemplo, CAR), la inducción de tolerancia puede confirmarse mostrando niveles de anticuerpos específicos del antígeno o niveles de linfocitos específicos del antígeno después del tratamiento que son consistentes con los niveles de control presentes en el sujeto antes del tratamiento con las células que expresan el receptor quimérico. Los niveles de control pueden establecerse usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede medirse la proliferación de células T en respuesta al antígeno en cuestión. También pueden medirse los niveles de inmunoglobulina para evaluar una respuesta inmunitaria.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria del huésped es o comprende una respuesta inmunitaria humoral. La respuesta inmunitaria humoral puede estar indicada por la presencia de anticuerpos específicos para las células o receptores expresados de este modo en el suero, otros fluidos corporales y/u órganos o tejidos del sujeto. En algunas realizaciones, están presentes tales anticuerpos de un isotipo particular, como IgM o IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4; en algunas realizaciones incluyen IgE.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria es o comprende un componente mediado por células. Una respuesta mediada por células puede estar indicada por la presencia de células, por ejemplo, células T, por ejemplo, células T auxiliares o citotóxicas, que reconocen específicamente uno o más epítopos del receptor o células recombinantes a través de un receptor de células T.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria primaria; en algunos aspectos, la respuesta inmunitaria es una respuesta de memoria.

En algunas de cualquiera de las realizaciones anteriores, una respuesta inmunitaria detectable se refiere a una cantidad detectable por cualquiera de una serie de métodos conocidos para evaluar respuestas inmunitarias específicas a antígenos y células particulares. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria del tipo especificado es detectable realizando ELISpot, ELISA o métodos de detección de anticuerpos basados en células, por ejemplo, mediante citometría de flujo, en suero del sujeto para detectar la presencia de anticuerpos que se unen específicamente y/o neutralizan antígenos presentes en las células, por ejemplo, uniéndose a epítopos del receptor recombinante, por ejemplo, CAR. En algunos de estos ensayos, se determina el isotipo del anticuerpo detectado y puede indicar el tipo de respuesta y/o si la respuesta es una respuesta de memoria.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria especificada es detectable mediante ensayos de linfocitos T citotóxicos (CTL) para la detección de células T CD8+ que se unen específicamente e inducen citotoxicidad en respuesta a epítopos en el receptor recombinante y/o una reacción mixta de linfocitos usando células, por ejemplo, células irradiadas, que expresan el receptor recombinante, como células estimuladoras.

En algunos aspectos, la respuesta inmunitaria detectable es aquella que se detecta mediante dicho método por encima o significativamente por encima del nivel de una muestra de control, como un pocillo no recubierto o un pocillo recubierto con un péptido de control o células que no expresan el receptor quimérico y /o niveles detectados en base al suero de pretratamiento o muestra de sangre del sujeto antes del tratamiento con las células que expresan el receptor quimérico.

Las respuestas inmunitarias humorales pueden detectarse mediante cualquiera de una serie de ensayos bien conocidos para la detección de anticuerpos específicos para antígenos o células particulares, incluyendo ensayos de unión, inmunoensayos e incluyendo ensayos basados en células. Los ensayos pueden incluir aquellos diseñados para evaluar la presencia o ausencia de funciones particulares de los anticuerpos, como su capacidad para llevar a cabo una función efectora particular tras unirse al antígeno, como los ensayos de anticuerpos neutralizantes. En algunas realizaciones, se detectan los resultados de las respuestas inmunitarias humorales, como anticuerpos específicos de antígeno, por ejemplo, anticuerpos neutralizantes, usando ensayos basados en células, por ejemplo, incubando células del sujeto antes y después del tratamiento con células que expresan el receptor recombinante (y células de control) y detectando la unión específica de antígeno y/u otros resultados, como resultados neutralizantes, por ejemplo, mediante citometría de flujo o ensayos enzimáticos. En algunas realizaciones, se usan ensayos ELISA y/o ELISpot para detectar y cuantificar anticuerpos específicos para los receptores recombinantes, como CAR, y epítopos mapeados usando técnicas conocidas, como aquellas que usan péptidos individuales que representan porciones del receptor. Ver, por ejemplo, Berger et al. Blood. marzo 2006; 107(6): 2294-2302, Berger et al. J Virol. enero 2001 75(2): 799-808, Riddell et al. Nature Medicine. febrero 19962(2): 216-223, Berger et al. Blood. febrero 2005 105(4): 1640-1647, Jensen et al. Biol Blood Marrow Transplant. septiembre 2010; 16(9): 1245-1256. En algunas realizaciones, se evalúa el isotipo de los anticuerpos detectados, por ejemplo, usando anticuerpos de detección específicos para isotipos particulares, por ejemplo, isotipos humanos.

La respuesta inmunitaria celular o basada en células a las células y/o receptores puede detectarse y/o medirse usando cualquiera de varias técnicas bien conocidas. Tales técnicas pueden incluir ensayos de linfocitos T citotóxicos (CTL) para la detección de células T CD8+ que se unen específicamente e inducen citotoxicidad en respuesta a epítopos en el receptor recombinante, por ejemplo, CAR, y/o células administradas. En algunas realizaciones, el ensayo es una reacción de linfocitos mixta, como aquellos que usan PBMC u otras células derivadas del huésped de la sangre u otro órgano o tejido como células respondedoras, y células inducidas para que expresen el receptor recombinante, por ejemplo, células T irradiadas que expresan el CAR, como células estimuladoras. Las células estimuladoras generalmente son autólogas y pueden ser las mismas células administradas al sujeto, y pueden irradiarse. Pueden usarse células no transducidas o las células que no expresan el transgén de interés como controles negativos en lugar de las células estimuladoras en las muestras de control. De igual manera, pueden usarse muestras de células respondedoras de puntos temporales pretratados u otros sujetos en muestras de control. En algunos aspectos, tales ensayos evalúan la capacidad de las células huésped para llevar a cabo una o más funciones efectoras, por ejemplo, lisis celular específica del antígeno, por ejemplo, usando un ensayo de liberación de cromo para detectar células T citotóxicas presentes en el sujeto que reconocen específicamente y antígenos presentes sobre o en las células administradas e inducen una respuesta citotóxica. En algunas realizaciones, las células de sangre periférica, por ejemplo, PBMC, se obtienen de un sujeto antes y después de la administración de las células, y cada una se usa en un ensayo, como un ensayo de lisis celular, usando células T autólogas modificadas para expresar el receptor recombinante, que generalmente están irradiadas. La lisis específica indica la presencia de una respuesta inmunitaria mediada por células específica del receptor. El mapeo de epítopos puede realizarse usando paneles de péptidos que representan porciones del receptor recombinante. Ver, por ejemplo, Berger et al. Blood. marzo 2006; 107(6): 2294-2302, Berger et al. J Virol. 2001 enero 75(2): 799-808, Riddell et al. Medicina de la Naturaleza. 2 de febrero de 1996 (2): 216-223, Berger et al. Blood. febrero 2005105(4): 1640-1647, Lamers, Blood 2011 117: 72-82. Pueden usarse ensayos de unión de tetrámeros de HLA para la enumeración de células T específicas del antígeno. En algunos aspectos, se usan ensayos linfoproliferativos (LPA) y/o ensayos para evaluar citoquinas secretadas, como ELISA y/o tinción intracelular y evaluación por citometría de flujo, para la detección de células T CD4+ específicas de transgén.

En algunas realizaciones, después de la administración del receptor quimérico (específicamente CAR) a un sujeto al que también se le administraron uno o más péptidos, el sujeto no presenta una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células detectable específica para el receptor quimérico (específicamente CAR). La presencia o grado de una respuesta inmunitaria específica al receptor quimérico puede estar relacionada con las propiedades inmunogénicas del receptor, específicamente el CAR, expresado por las células, y/o el tiempo durante el cual el sujeto ha estado expuesto al mismo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células específica contra el receptor, a o aproximadamente a los 28 días o a o aproximadamente a los 35 días, o a o aproximadamente a los 42 días después de la exposición del sujeto a las células que expresan el receptor. En algunas realizaciones, el sujeto no presenta una respuesta inmunitaria humoral o mediada por células detectable contra el receptor quimérico (específicamente CAR) en el plazo de aproximadamente 30 días, en el plazo de aproximadamente 60 días o en el plazo de aproximadamente 90 días después de la administración de células que expresan el receptor quimérico (específicamente CAR) .

Los métodos pueden implicar la detección de la presencia o ausencia o nivel de tal respuesta inmunitaria o indicador de la misma, por ejemplo, después de la administración del receptor quimérico (por ejemplo, CAR) junto con la administración de un péptido de acuerdo con los métodos descritos en la presente.

En algunas realizaciones, los métodos mejoran o previenen la inducción o reducen el nivel de anticuerpos contra el receptor quimérico (específicamente CAR), como un receptor quimérico (específicamente CAR) expresado por las células administradas en el curso de la terapia celular adoptiva. Por ejemplo, los títulos de anticuerpos de anticuerpos anti-receptor, específicamente anti-CAR, por ejemplo, medidos en el suero del sujeto mediante ELISA, disminuyen después de la administración del péptido (específicamente mediante la administración previa del péptido), en comparación con los métodos en los que el receptor quimérico (por ejemplo, CAR), como las células que expresan el receptor quimérico, se administra en ausencia de un péptido.

V. Artículos de fabricación

También se describen artículos de fabricación, como kits y dispositivos, para su uso en relación con métodos para inducir tolerancia inmunitaria a un receptor quimérico, como en combinación con métodos de tratamiento que emplean el receptor quimérico, como métodos de terapia celular adoptiva.

Los artículos de fabricación incluyen uno o más recipientes, típicamente una pluralidad de recipientes, material de envasado y una etiqueta o prospecto en o asociado al recipiente o recipientes y/o envase, que generalmente incluye instrucciones para la administración del péptido tolerorgénico y/o administración de las células a un sujeto.

En algunos casos, el artículo de fabricación, como un kit, incluye un recipiente que contiene el péptido o péptidos que se usarán para inducir tolerancia inmunitaria y, opcionalmente, uno o más recipientes que contienen agentes para administrar el péptido o péptidos. Por ejemplo, en algunos aspectos, el uno o más recipientes adicionales contienen un adyuvante y un agente. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para tratar a un sujeto con una cantidad efectiva del péptido o péptidos y, opcionalmente, uno o más de cada uno de los otros componentes. Por ejemplo, en algunos casos, las instrucciones incluyen instrucciones para administrar el péptido o péptidos por una vía particular de administración y/o en una cantidad de dosificación para inducir tolerancia. En algunos casos, la instrucción puede incluir instrucciones para administrar el péptido o péptidos en ausencia de adyuvante u otro agente. En algunos casos, las instrucciones pueden incluir instrucciones para administrar el péptido o péptidos en presencia de adyuvante y con un agente. En algunos casos, las instrucciones pueden proporcionar instrucciones relacionadas con el régimen de dosificación y la frecuencia de administración del péptido y, opcionalmente, el uno o más de los otros agentes.

En algunos aspectos, el artículo de fabricación, como un kit, puede incluir además un recipiente de preparación farmacéutica y un diluyente de preparación farmacéutica y una preparación concentrada o liofilizada del antígeno peptídico aislado. En algunos casos, el recipiente que contiene el diluyente contiene un diluyente, como un tampón farmacéuticamente aceptable, para diluir lo que podría ser una solución concentrada o un polvo liofilizado del antígeno, y en algunos aspectos, opcionalmente, el adyuvante y/o el agente tolerogénico. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para mezclar una cantidad particular del diluyente con una cantidad particular de la preparación farmacéutica concentrada, mediante lo cual se prepara una formulación final para inyección o infusión.

En algunos casos, los artículos de fabricación, como los kits, son para la administración de las células, como las composiciones que contienen las células, a sujetos de acuerdo con los métodos descritos para la terapia celular adoptiva y para el almacenamiento y la administración de las células y las composiciones. En algunos casos, los recipientes contienen las células que se van a administrar para la administración de dosificaciones únicas o múltiples. Por ejemplo, los recipientes pueden contener una o más dosis unitarias de las mismas. En general, el artículo de fabricación, como un kit, incluye células diseñadas para expresar un receptor quimérico, por ejemplo, un CAR, que corresponde a los péptidos también contenidos en un recipiente del artículo de fabricación, es decir, el receptor quimérico es uno en el que puede inducirse inmunotolerancia mediante la coadministración del péptido.

Además del uno o más recipientes anteriores, el artículo de fabricación en algunos casos incluye uno o más recipientes adicionales con una composición contenida en el mismo que incluye un agente adicional, como un agente inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente terapéutico, por ejemplo, que debe administrarse en combinación, por ejemplo, simultánea o secuencialmente en cualquier orden, con las células. Alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede incluir además otro o el mismo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable. Puede incluir además otros materiales como otros tampones, diluyentes, filtros, tubos, agujas y/o jeringuillas.

Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y bolsas flexibles, como bolsas de infusión. En casos particulares, los recipientes incluyen bolsas, por ejemplo, bolsas flexibles, como las adecuadas para la infusión de células a sujetos, por ejemplo, bolsas de plástico o PVC flexibles y/o bolsas de solución IV. Las bolsas en algunos casos pueden sellarse y/o pueden esterilizarse, para proporcionar una solución estéril y la administración de las células y composiciones. En algunos casos, los recipientes, por ejemplo, bolsas, tienen una capacidad de o de aproximadamente o de por lo menos o de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 o 1000 ml de capacidad, como entre o aproximadamente 10 y o aproximadamente 100 o entre o aproximadamente 10 y o aproximadamente 500 ml de capacidad. En algunos casos, los recipientes, por ejemplo, bolsas, son y/o están hechos de un material que es estable y/o proporciona un almacenamiento y/o mantenimiento estables de las células a una o más de varias temperaturas, como en temperaturas frías, por ejemplo, por debajo de o aproximadamente de o de o aproximadamente -20° C, -80° C, -120° C, 135° C y/o temperaturas adecuadas para la crioconservación, y/u otras temperaturas, como temperaturas adecuadas para descongelar las células y temperatura corporal como de o de aproximadamente 37° C, por ejemplo, para permitir la descongelación, por ejemplo, en la localización del sujeto o en la localización del tratamiento, por ejemplo, en la cabecera del paciente, inmediatamente antes del tratamiento.

Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales como vidrio o plástico. En algunos casos, el recipiente tiene uno o más puertos, por ejemplo, puertos de acceso estériles, por ejemplo, para la conexión de tubos o canulación a uno o más tubos, por ejemplo, para infusión intravenosa o de otro tipo y/o para conexión con propósitos de transferencia hacia y desde otros recipientes, como cultivos celulares y/o bolsas de almacenamiento u otros recipientes. Los recipientes ejemplares incluyen bolsas de infusión, bolsas de solución intravenosa, viales, incluyendo aquellos con tapones perforables por una aguja para inyección.

El artículo de fabricación puede incluir además un prospecto o etiqueta en el paquete con una o más piezas de información de identificación y/o instrucciones de uso. En algunos casos, la información o las instrucciones indican que los contenidos pueden o deben usarse para administrar el péptido y la población celular y/o proporcionar instrucciones para ello.

En algunos casos, la información o las instrucciones indican que los contenidos pueden o deben usarse para tratar una afección o enfermedad en particular y/o proporcionan instrucciones para ello. La etiqueta o prospecto puede indicar que el contenido del artículo de fabricación debe usarse para tratar la enfermedad o afección. En algunos casos, la etiqueta o el prospecto proporciona instrucciones para tratar a un sujeto, por ejemplo, el sujeto del que se derivaron las células, a través de un método que implica la administración de una dosis apropiada para tratar una enfermedad o afección.

En algunos casos, la etiqueta o prospecto o envase comprende un identificador para indicar la identidad específica del sujeto del que se derivan las células y/o al que se van a administrar. En el caso de transferencia autóloga, la identidad del sujeto del que se derivan las células es la misma que la identidad del sujeto al que se van a administrar las células. Por tanto, la información de identificación puede especificar que las células se van a administrar a un paciente particular, como aquel del que se derivaron originalmente las células. Dicha información puede estar presente en el material de envasado y/o la etiqueta en forma de un código de barras u otro identificador codificado, o puede indicar el nombre y/u otras características de identificación del sujeto.

El término "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones que habitualmente se incluyen en los paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de dichos productos terapéuticos.

VI. Definiciones

Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "uno" significa "por lo menos uno" o "uno o más". Se entiende que los aspectos y variaciones descritos en la presente incluyen aspectos y variaciones "que consisten" y/o "que consisten esencialmente de".

A lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la materia reivindicada se presentan en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de la materia reivindicada. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor expuesto o intermedio en ese intervalo expuesto está incluido dentro de la materia reivindicada. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están incluidos dentro de la materia reivindicada, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo expuesto. Cuando el intervalo expuesto incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la materia reivindicada los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Como se usa en la presente, el término "recombinante" se refiere a una célula, microorganismo, molécula de ácido nucleico o vector que ha sido modificado mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico exógena, como heteróloga, o se refiere a una célula o microorganismo que ha sido alterado de tal manera que la expresión de un gen o molécula de ácido nucleico endógeno es controlada, desregulada o constitutiva, donde tales alteraciones o modificaciones pueden ser introducidas por ingeniería genética. Las alteraciones genéticas pueden incluir, por ejemplo, modificaciones que introducen moléculas de ácidos nucleicos (que pueden incluir un elemento de control de la expresión, como un promotor) que codifican una o más proteínas o enzimas, u otras adiciones, deleciones, sustituciones u otra alteración o adición funcionales al material genético de una célula. Las modificaciones ejemplares incluyen aquellas en las regiones codificantes o fragmentos funcionales de las mismas de polipéptidos heterólogos u homólogos de una referencia o molécula original.

El término "aproximadamente" como se usa en la presente se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro incluye (y describe) en la presente realizaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Como se usa en la presente, "empobrecer" cuando se refiere a uno o más tipos de células o poblaciones de células particulares, se refiere a disminuir el número o porcentaje del tipo o población de células, por ejemplo, en comparación con el número total de células o el volumen de la composición, o con respecto a otros tipos de células, como por selección negativa basada en marcadores expresados por la población o célula, o por selección positiva basada en un marcador no presente en la población celular o célula que se va a empobrecer. El término no requiere la eliminación completa de la célula, tipo de célula o población de la composición.

Como se usa en la presente, "enriquecer" cuando se refiere a uno o más tipos de células o poblaciones de células particulares, se refiere a aumentar el número o porcentaje del tipo o población de células, por ejemplo, en comparación con el número total de células o el volumen de la composición o con respecto a otros tipos de células, como por selección positiva basada en marcadores expresados por la población o célula, o por selección negativa basada en un marcador no presente en la población celular o célula que se va a empobrecer. El término no requiere la eliminación completa de otras células, tipos de células o poblaciones de la composición y no requiere que las células así enriquecidas estén presentes al 100% o incluso cerca del 100% en la composición enriquecida.

Como se usa en la presente, una afirmación de que una célula o población de células es "positiva" o "+" para un marcador particular se refiere a la presencia detectable sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la presencia de expresión superficial detectada, en algunas realizaciones, por citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectando dicho anticuerpo, en donde la tinción es detectable por citometría de flujo a un nivel sustancialmente superior al de la tinción detectada realizando el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas y/o a un nivel sustancialmente similar al de las células que se sabe que son positivas para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente más alto que el de para una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

Como se usa en la presente, una afirmación de que una célula o población de células es "negativa" para un marcador particular se refiere a la ausencia de una presencia detectable sustancial sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la ausencia de expresión superficial detectada, en algunas realizaciones, por citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectando dicho anticuerpo, en donde la tinción no se detecta por citometría de flujo a un nivel sustancialmente superior al de la tinción detectada mediante el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas, y/o a un nivel sustancialmente inferior al de las células que se sabe que son positivas para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente similar en comparación con el de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

Como se usa en la presente, "aislado" o "purificado" con referencia a un péptido se refiere a un péptido que está sustancialmente libre de todos los demás polipéptidos, contaminantes, reactivos de partida u otros materiales, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Puede determinar que las preparaciones están sustancialmente libres si parecen libres de impurezas fácilmente detectables según se determina por métodos estándar de análisis, como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la cromatografía en capa fina (TLC) o la electroforesis capilar (CE), usados por aquellos expertos en la técnica para evaluar dicha pureza, o suficientemente puros de tal manera que una purificación adicional no altere de manera detectable las propiedades físicas y químicas de la sustancia.

Como se usa en la presente, "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" y "porcentaje de identidad" cuando se usan con respecto a una secuencia de aminoácidos (secuencia polipeptídica de referencia) se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata (por ejemplo, un proteína Vpx o Vpr) que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia y no considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que están dentro de la capacidad en la técnica, por ejemplo, usando software disponible públicamente como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr el alineamiento máximo sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando.

Una sustitución de aminoácidos puede incluir la sustitución de un aminoácido en un polipéptido por otro aminoácido. Los aminoácidos generalmente pueden agruparse de acuerdo con las siguientes propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones de aminoácidos no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Una sustitución de aminoácido conservadora se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera la carga relativa o las características de tamaño de la proteína en la que se realiza la sustitución de aminoácidos, y generalmente incluye sustituciones que implican el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro diferente de la misma clase.

Como se usa en la presente, un control se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con un parámetro de prueba o, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado por la condición de interés. Un control también puede ser un control interno.

El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está enlazado. El término incluye el vector como estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. A tales vectores se hace referencia en la presente como "vectores de expresión". Los vectores incluyen vectores virales, como vectores retrovirales, por ejemplo, vectores lentivirales o gammaretrovirales, que tienen un genoma que porta otro ácido nucleico y son capaces de insertarse en un genoma huésped para la propagación del mismo.

Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo las células. Puede ser una solución, suspensión, líquido, polvo, pasta, acuoso, no acuoso o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en la presente, "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en ella sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.

Como se usa en la presente, un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, un excipiente, un estabilizador o un conservante.

Como se usa en la presente, un "sujeto" es un mamífero, como un humano u otro animal, y típicamente es un humano. En la invención, el sujeto, por ejemplo, el paciente, al que se administran las células, las poblaciones celulares o las composiciones es un mamífero, específicamente un primate, más específicamente un humano. En algunos casos, el primate es un mono o un simio. El sujeto puede ser hombre o mujer y puede tener cualquier edad adecuada, incluyendo sujetos lactantes, juveniles, adolescentes, adultos y geriátricos. En algunos casos, el sujeto es un mamífero no primate, como un roedor.

Como se usa en la presente, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, como "tratar" o "que trata") se refiere a la mejora o reducción completa o parcial de una enfermedad, afección o trastorno, o un síntoma, efecto adverso o resultado, o fenotipo asociado con ella. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión o un pronóstico mejorado. Los términos no implican la curación completa de una enfermedad o la eliminación completa de cualquier síntoma o efectos en todos los síntomas o resultados. En ciertas realizaciones, el efecto es terapéutico, de tal manera que cura parcial o completamente una enfermedad o afección o síntoma adverso atribuible a la misma.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, células o composición, en el contexto de la administración, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones/cantidades y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado deseado, como un resultado terapéutico o profiláctico.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, un compuesto, una composición, una formulación farmacéutica o células, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado, como para el tratamiento de una enfermedad, afección o trastorno, y/o un efecto farmacocinético o farmacodinámico del tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto y las poblaciones de células administradas. En algunas realizaciones, los métodos implican administrar las células y/o las composiciones en cantidades eficaces, por ejemplo, cantidades terapéuticamente eficaces.

Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, como se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz. En el contexto de una menor carga tumoral, la cantidad profilácticamente eficaz en algunos aspectos será mayor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

En algunas de cualquiera de las realizaciones anteriores, el receptor es un receptor quimérico que se une a un antígeno distinto del asociado con la enfermedad o afección, como en el contexto de un receptor expresado en una célula T reguladora o un iCAR, por ejemplo, donde se desea suprimir la célula tras la unión al receptor, como para evitar efectos secundarios como los inducidos por la unión no dirigida a la enfermedad. Aunque el receptor en sí mismo es inhibidor, generalmente aún se desea la persistencia de las células para maximizar o aumentar la exposición, como en el contexto de una célula que también expresa un receptor que se dirige y activa la enfermedad. Por tanto, en algunas realizaciones, los péptidos que se administran incluyen aquellos que tienen identidad de secuencia o similitud con un receptor no activador o no dirigido a una enfermedad/afección.

En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones, el péptido puede ser una pluralidad de péptidos.

VIII. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen solamente con propósitos ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Análisis de las respuestas inmunitarias del huésped específicas de productos transgénicos Se obtuvieron muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) antes y después del tratamiento de cuatro (4) sujetos con enfermedades malignas de células B tratados con células T autólogas que expresan un CAR específico de CD19. El CAR incluía un scFv anti-CD 19 derivado de un anticuerpo murino, un dominio bisagra, un dominio transmembrana de CD28, un dominio de señalización intracelular de 4-1BB y un dominio de señalización intracelular de CD3-zeta. Las células T que expresan CAR también expresaron un EGFR truncado (EGFRt) como marcador sustituto mediante la transducción de células con un vector lentiviral que contiene un ácido nucleico que codifica el CAR y un ácido nucleico que codifica el marcador sustituto EGFRt, separados por un dominio de cambio de ribosoma T2A.

Se evaluaron las PBMC obtenidas de los sujetos antes y después de la infusión (día 42) para detectar la presencia o ausencia de respuestas inmunitarias anti-CAR específicas esencialmente como se describe en Berger et al. Blood. marzo 2006; 107(6): 2294-2302, Berger et al. J Virol. enero 2001 75(2): 799-808, Riddell et al. Nature Medicine. febrero 19962(2): 216-223, Berger et al. Blood. febrero 2005 105(4): 1640-1647. Brevemente, las PBMC (respondedoras) se estimularon in vitro con células irradiadas con rayos gamma autólogas transducidas con el CAR expresado por las células administradas (estimuladoras en una proporción de respondedora a estimuladora de 1:1 o 2:1). Luego, los cultivos se evaluaron en un ensayo de liberación de cromo para determinar la citotoxicidad frente a células T transducidas con CAR ("CD19 CAR") y no transducidas ("simuladas") marcadas con 51Cr autólogas (objetivos) a varias proporciones de efector-objetivo (E/T). Después de la coincubación, se cuantificó la liberación de cromo y se determinó el porcentaje de lisis máxima alcanzable en cada muestra.

En la Figura 1 se muestran los resultados de las muestras derivadas de un paciente ejemplar, que representa la actividad citolítica de las PBMC antes y después de la infusión en el día 42. Mientras que no se detectó actividad citolítica específica para las células objetivo transducidas con CAR en ningún cultivo derivado de PBMC antes de la infusión, en dos de los cuatro sujetos evaluados, se detectó actividad lítica específica de CAR en cultivos derivados de muestras de PBMC posteriores a la infusión. Estos resultados indican que las respuestas inmunitarias específicas de CAR pueden desarrollarse después de una única infusión de células T que expresan CAR.

Se llevó a cabo un mapeo de epítopos para evaluar la región o regiones del CAR reconocidas por las respuestas inmunitarias específicas. Las muestras de PBMC antes y después de la infusión se estimularon en presencia de grupos individuales de múltiples péptidos de 15 mer, con secuencias que representan porciones superpuestas (superposición de 11 aminoácidos) de la longitud total de una secuencia de aproximadamente 500 aminoácidos del CAR expresado por las células administradas. Las células se tiñeron con anticuerpos para detectar la expresión superficial de CD8 y CD4 y la expresión intracelular de citoquinas. Se evaluaron veintitrés (23) grupos, cada uno de los cuales contenía diez (10) péptidos y colectivamente incluían 125 péptidos superpuestos individuales, con cada péptido representado en por lo menos dos de los grupos.

Este diseño permitió la generación de una cuadrícula analítica para evaluar respuestas específicas para péptidos individuales, por lo que un péptido presente en más de un grupo detectado como aciertos en este ensayo se consideró un acierto de péptido potencialmente inmunogénico. Para los dos pacientes en los que se había detectado una respuesta inmunitaria específica de CAR, se identificaron seis y tres aciertos de péptidos, respectivamente.

Se realizaron ensayos ELISpot individuales usando un anticuerpo de captura anticitoquinas para evaluar la presencia o ausencia de una respuesta inmunitaria específica para cada uno de estos aciertos individuales (ver Berger et al. (2006); Berger et al. (2001); Riddell et al. (1996) y Berger et al. (2005), supra). En la FIG. 2 se muestran los resultados de un ensayo ejemplar para un paciente. Se detectaron respuestas inmunitarias específicas contra péptidos con secuencias dentro de la porción V^hdel scFv de CAR en ambos pacientes evaluados (incluyendo regiones dentro de las regiones FR1, CDR1 y FR2 para un paciente y dentro de la FR3 para el otro). Para el primer paciente, también se detectaron respuestas inmunitarias específicas contra dos péptidos de 15 mer superpuestos, cada uno de los cuales contenía la unión entre el dominio transmembrana y el dominio coestimulador del CAR (etiquetado como "sitio de fusión" en la FIG. 2). Estos dos péptidos de 15 mer superpuestos tenían las secuencias de aminoácidos AFIIFWVKRGRKKLL (SEQ ID NO: 8) y FWVKRGRKKLLYIFK (SEQ ID NO: 9, también expuestas en la SEQ ID NO: 165), respectivamente. En otro estudio, después de la administración con un CAR diferente que tiene un scFv murino, dominios transmembrana y coestimuladores de CD28 y un dominio zeta de CD3, usando métodos similares, también se detectó una respuesta inmunitaria para un sujeto contra un grupo que contenía porciones de V^hde un scFv anti-CD19 y para otro sujeto en un grupo que contiene porciones de unión.

No se detectaron respuestas inmunitarias específicas en los pacientes mediante este ensayo contra péptidos dentro de otras regiones. Por ejemplo, en este ensayo, no se detectaron respuestas específicas contra péptidos que tienen secuencias dentro de otras CDR o regiones marco del scFv, péptidos dentro de regiones del dominio coestimulador o transmembrana pero que no abarcan la unión entre los dos, o péptidos dentro de la región de EGFRt o CD3-Z del CAR. No se detectaron respuestas inmunitarias específicas frente a secuencias endógenas.

Ejemplo 2: Análisis in ^síI^íco de péptidos derivados de regiones de unión de un CAR para unirse a HLA Clase I y HLA Clase II

Se usaron herramientas de predicción de epítopos de células T, disponibles en la base de datos de epítopos inmunes y recursos de análisis (IEDB), para análisis in silico para predecir las afinidades de unión al MHC y otras propiedades relacionadas con la inmunogenicidad potencial para cada una de una serie de secuencias peptídicas superpuestas dentro de una porción de una secuencia de CAR ejemplar. La porción incluía un espaciador que tenía un dominio bisagra derivado de inmunoglobulina, un dominio transmembrana de CD28 humano, un dominio coestimulador de 4-1BB humano y un dominio de señalización de CD3zeta humano. En la porción evaluada, el dominio bisagra era un dominio bisagra de IgG4 humana, el dominio transmembrana de CD28 comprendía una secuencia expuesta en la SEQ ID NO:2 y el dominio coestimulador de 4-1BB contenía la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:3. Por tanto, esta porción contenía tres uniones entre diferentes dominios derivados de secuencias humanas (cuyas uniones pueden haber representado sitios de inmunogenicidad potencial contra un CAR tras la administración a un sujeto humano): la unión entre la región espaciadora y el dominio transmembrana, la unión entre el dominio transmembrana y el dominio coestimulador, y la unión entre el dominio coestimulador y el dominio de señalización intracelular (ver las Figuras 3A y 3B).

Para identificar porciones de la secuencia que pueden tener propiedades particulares que hacen que sea más probable que se presenten a las células T, se predijeron afinidades para unirse a 27 alelos de HLA clase I individuales y 56 alelos de HLA clase II individuales para péptidos superpuestos a lo largo de la porción, de 8-14 aminoácidos de longitud y de 15 aminoácidos de longitud (que contienen un núcleo de unión 9-mer), respectivamente. En las Tablas 1A y 1B se enumeran estos alelos, que representan colectivamente los alelos de HLA presentes en más del 99% de la población mundial, y su frecuencia aproximada en la población de los Estados Unidos.

continuación

Se usaron herramientas de predicción de epítopos de células T basadas en algoritmos disponibles de IEDB para predecir los valores de IC50 para la unión a moléculas de HLA de clase I para cada péptido de 8-14 aminoácidos en el conjunto de datos usando ANN (Nielsen et al. (2003) Protein Sci., 12:1007-1017 y Lundegaard et al. (2008) NAR, 36:W509-512) y, en algunos casos, una o más predicciones adicionales usando SMM (Peters y Sette (2005) ^bM^cBioinformatics, 6:132) y comblib (Sidney et al. (2008) Immunome Res. 4:2, o la herramienta de consenso (ver Kim, et al. (2012) Immune epitope database analysis resource, NAR (que combina predicciones de cualquiera de los anteriores). Las predicciones de los valores de IC50 para la unión a HLA clase II para cada péptido de 15 aminoácidos en el conjunto de datos se realizaron mediante el método NetMHCIIpan (Karosiene et al. (2013) Immunogenetics 65(10):711; Nielsen et al. (2008) PLoS Comput Biol.4(7)e1000107). Para cada posición individual dentro de la porción de la secuencia de aminoácidos del CAR, se determinó el número total de secuencias en el conjunto de datos que incluía la posición y se predijo que se uniría a cualquiera de los alelos de clase I o clase II con una IC50 prevista de menos de 50 nm. Las FIGS. 4A (HLA clase I) y 4B (HLA clase II), representan los resultados para los alelos de clase I y clase II, respectivamente, mostrando la cobertura posicional a lo largo de la longitud de la secuencia, en base al número total determinado, ponderado según la frecuencia de alelos de HLA individuales en la población. El área bajo la curva (AUC) en toda la región evaluada fue de aproximadamente 1321 para la unión de HLA de clase I y de 2943 para la unión de HLA de clase II. La AUC para la región del dominio coestimulador transmembrana fue de aproximadamente 931 para la unión de HLA de clase I y de 2212 para la unión de HLA de clase II.

Como se muestra en las FIGS. 4A y 4B, este método predijo que ciertas porciones de la secuencia contenían fragmentos con más probabilidades de unirse bien en los complejos de MHC y, por tanto, presentarse como epítopos para el reconocimiento potencial por parte de las células T. La afinidad de unión por los alelos de HLA por sí sola no predice necesariamente la inmunogenicidad. Dado que los dominios individuales (por ejemplo, transmembrana, coestimulador) en este ejemplo de CAR se derivaban de humanos, tras la administración a un sujeto humano, era menos probable que se desarrollasen respuestas inmunogénicas contra un epítopo dentro de cualquiera de estas regiones individuales solas (a diferencia de un epítopo que abarca múltiples regiones que normalmente no están asociadas entre sí y/o que incluyen una unión entre tales regiones). Por ejemplo, incluso para un péptido que se prevé que se una bien y se presente en el contexto de una molécula de MHC, si el péptido se derivó por completo de una proteína endógena, puede reconocerse como "propio" y por tanto puede fallar en la inducción de una respuesta inmunitaria productiva. Por ejemplo, mientras que ciertas regiones completamente dentro de un único dominio transmembrana o citoplasmático obtuvieron una puntuación alta en la predicción de afinidad de unión a HLA, en los resultados descritos en el Ejemplo 1, no se detectaron respuestas inmunitarias contra secuencias peptídicas únicamente dentro de cualquiera de estos dominios de una secuencia de CAR similar. Por consiguiente, aunque se observaron varios "puntos calientes" con respecto a la afinidad de unión a HLA predicha, la evaluación y alteración posteriores se centraron en aquellas áreas que no solo tenían valores de IC50 predichos más altos, sino que también incluían epítopos potenciales que abarcaban la unión entre diferentes dominios derivados de dos proteínas diferentes.

En particular, se evaluó adicionalmente una región de unión que incluye uno o más epítopos peptídicos potenciales que abarcan la unión del dominio transmembrana de CD28 y el dominio de señalización de 4-1BB del CAR ejemplar. Con respecto a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5, que incluye el dominio transmembrana de CD28 humano ejemplar (SEQ ID NO: 2) y el dominio coestimulador de 4-1BB humano ejemplar (SEQ ID NO: 3), la región de unión evaluada contenía 13 aminoácidos a cada lado de la unión que abarca los dominios transmembrana de CD28 y coestimulador de 4-1BB de la siguiente manera: FWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGC SC RFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 5), en la que una región de unión de 26 aminoácidos está indicada en negrita, y los dos aminoácidos justo C' y N' de la unión entre los dominios se indican en subrayado. La región de unión de 26 aminoácidos evaluada se expone en la SEQ ID NO: 137 y corresponde a los residuos de aminoácidos 15 a 40 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5.

Se llevó a cabo modelado in silico para identificar una o más modificaciones de aminoácidos (mutaciones) dentro de la región de unión de 26 aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 137, lo que dio como resultado fragmentos de péptidos que se predijo que se unirían con valores altos de IC50 a alelos de clase I y clase II y, por tanto, es probable que reduzcan el potencial para inducir inmunogenicidad contra un CAR que contenga esta región. Específicamente, se hicieron predicciones para fragmentos de péptidos variantes de la región de unión que contenían una o más mutaciones en las posiciones de los residuos de aminoácidos correspondientes a las posiciones 14, 17 y 20 con numeración con referencia a la SEQ ID NO: 137 (que corresponden a una o más mutaciones en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 28, 31 y 34 con numeración con referencia a la SEQ ID NO: 5). En este estudio ejemplar, estos residuos se eligieron para análisis adicional después de la mutagénesis in silico y predicciones de unión de todos los epítopos de alta afinidad en los que se evaluaron todos los posibles reemplazos de aminoácidos individuales en ese epítopo por su impacto sobre los valores de IC50 predichos. Se identificaron los residuos que dieron como resultado mayores predicciones de IC50 (disminución de la unión), lo que identificó a los residuos anteriores como sensibles a los reemplazos.

Se evaluaron una serie de diferentes regiones de unión variantes, cada una de las cuales contenía uno o más reemplazos de aminoácidos en la posición o posiciones evaluadas, en comparación con la región de unión no mutada dentro de la secuencia de CAR ejemplar. Se eligió un subconjunto ejemplar de reemplazos de aminoácidos en las posiciones identificadas que pueden ser menos perturbadoras para la estructura o función de la región transmembrana del dominio de señalización coestimulador. Además, se eligieron reemplazos que pueden impactar en más de un epítopo a la vez, ya que los epítopos se superponen. Específicamente, las regiones de unión de variantes individuales contenían las siguientes modificaciones (reemplazos de aminoácidos): K28A, K28H, K28L, K28Q, K28S, R31A, R31H, R31L, R31N, R31S, L34A, L34S, K28Q/R31A, K28Q/R31N, K28Q/R31S, K28Q/L34A, K28Q/L34S, R31N/L34A, R31N/L34S, K28Q/R31N/L34A, K28Q/R31N/L34S, con la numeración con referencia a la SEQ ID NO: 5.

Para las regiones de unión no variante y variante, se obtuvieron puntuaciones de inmunogenicidad ponderadas para los alelos de clase I y clase II, usando las herramientas de predicción de epítopos de células T disponibles en IEDB. Las puntuaciones se derivaron usando los valores IC50 predichos para cada serie de péptidos superpuestos de 8 mer a 14 mer (para cada uno de los 27 alelos de HLA clase I, individualmente) y una serie de péptidos superpuestos de 15 mer (para cada uno de los 56 alelos de HLA clase II, individualmente) dentro de la respectiva región de unión de 26 aminoácidos (variante o no variante), y se ponderaron en base a la frecuencia relativa en la población de los alelos individuales de HLA de clase I y clase II. Una puntuación relativa más alta es indicativa de un grado más alto de unión predicha.

Los resultados se exponen en la FIG. 5. Los resultados demuestran la capacidad de disminuir la puntuación de inmunogenicidad de HLA de clase I predicha general dentro de una región de unión de CAR modificando los aminoácidos dentro de la región. Los resultados también confirman la capacidad de reducir la afinidad de unión predicha de HLA de clase I (y por lo tanto la puntuación de inmunogenicidad predicha reducida) sin dar como resultado un aumento sustancial en la puntuación de inmunogenicidad predicha para la unión de HLA de clase II. Por tanto, en general, los resultados mostraron que podrían realizarse la modificación o modificaciones de aminoácidos dentro de una región que abarca una unión entre un dominio transmembrana de CD28 y un dominio coestimulador de 4-1BB de un CAR y efectuar una reducción general en la afinidad predicha para la unión de HLA humana, que sería consistente con una reducción en el potencial de inmunogenicidad, tras la administración a un sujeto humano, de un receptor quimérico idéntico a un receptor que tiene esta región, pero que contiene la modificación o combinación de modificaciones en esta región.

Ejemplo 3: Comparación del análisis in ^síI^íco y la unión in vitro de péptidos derivados de las regiones de unión de un CAR para la unión a HLA de clase I

Se evaluaron in vitro las afinidades de unión reales para ciertos alelos de HLA de clase I (A*02:01, A*03:01, A*11:01 y B*08:01) para obtener ejemplos de secuencias de péptidos de 9 aminoácidos superpuestas dentro de una porción de la región de unión de 26 aminoácidos que abarca la unión de CD28 y 4-1BB. Específicamente, la evaluación fue de una serie de péptidos de 9 mer superpuestos derivados de la secuencia VAFIIFWVKRGRKKLL (expuesta en la SEQ ID NO: 7), que contiene una porción del dominio transmembrana de CD28 y el dominio coestimulador de 4-1BB que abarca la unión entre los dominios (enlace que une los dos aminoácidos indicados en subrayado). Además, también se evaluaron una serie de péptidos de 9 mer superpuestos de cada una de varias variantes diferentes de esta porción, cada variante conteniendo una mutación o mutaciones en esta región como se describe en el Ejemplo 2.

Los varios péptidos superpuestos de 9-mer se sintetizaron y se probó su pureza mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Luego, se incubaron los péptidos sintéticos con moléculas de MHC recombinantes para evaluar las propiedades de unión usando el sistema REVEAL Epitope Discovery System, que es un ensayo de unión de alto rendimiento que mide el grado en que cada péptido es capaz de estabilizar un complejo ternario de MHC-péptido (ProImmune, Oxford, Reino Unido). Cada péptido se probó por separado para esta capacidad con respecto a cada uno de los alelos de HLA de clase I, normalizados al grado observado para un control positivo (epítopo de células T conocido para el alelo relevante). Los resultados se informan como una puntuación, en la que la unión se normalizó con el péptido de control positivo establecido en 100%. En este análisis, se consideró generalmente que una puntuación de más de 50 representa una afinidad de unión buena o alta.

Los resultados se compararon con los valores de unión previstos (IC50) obtenidos para la unión del mismo complejo péptido: MHC, usando los métodos de predicción in silico como se describe en el Ejemplo 2. Como el valor máximo de IC50 previsto fue de aproximadamente 50.000, los valores de IC50 se transformaron logarítmicamente, se restaron de LOG(50000) y se dividieron por LOG(50000) para obtener una puntuación in silico normalizada ((Log(50000) - logIC50) / Log(50000)). En este análisis, generalmente se consideró que una puntuación de predicción de unión in silico mayor de 2,0 representaba una afinidad de unión prevista buena o alta.

Los resultados se exponen en la Tabla 2A (HLA-A*02:01 y HLA-A*03:01) y la Tabla 2B (HLA-A*11:01 y HLA-B*08:01). En general, las predicciones de unión in silico fueron predictivas de los resultados reales de unión in vitro. En algunos casos, se predijo in silico una unión relativamente mayor, pero no se observó en el ensayo in vitro.

Los resultados también eran consistentes con la afinidad de unión predicha que generalmente predice la afinidad medida en el ensayo in vitro. Además, los resultados demostraron una reducción exitosa de la afinidad de unión a un HLA mediante modificaciones dentro de una región de unión, y que fue posible modificar la secuencia de una manera que dio como resultado una menor afinidad de unión predicha o real o puntuación de uno de los epítopos potenciales superpuestos, sin aumentar (o también reducir) la afinidad de unión o la puntuación por otro de los epítopos superpuestos que contienen el mismo residuo. En algunos casos, dichas mutaciones o modificaciones pueden ser particularmente ventajosas. Como un ejemplo no limitativo de los resultados, las modificaciones K28L, R31H, L34S y/o L34A, con referencia a la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 5, generalmente dieron como resultado una afinidad de unión o puntuación prevista o real reducida para por lo menos un alelo de HLA y/o para por lo menos un péptido dentro de la región evaluada, sin dar como resultado una afinidad de unión más alta para otro alelo de HLA y/o sin dar como resultado una afinidad de unión más alta para otro péptido.

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Ejemplo 4: Análisis de péptidos derivados de la región de unión de un CAR para la unión a HLA-A2:01

Para identificar péptidos derivados de CAR potencialmente capaces de inducir respuestas inmunogénicas, se evaluaron in silico una serie de péptidos superpuestos dentro de la secuencia no variante (referencia) que contiene la unión entre el dominio transmembrana de CD28 y el dominio coestimulador de 4-1BB de un CAR. Se usaron algoritmos para predecir las afinidades de unión por la ranura peptídica de una molécula de MHC de clase I humana común (HLA-A2:01) usando análisis in silico para predecir la afinidad por la unión. Como se expone en la FIG. 3, la porción evaluada del CAR tenía la secuencia ^cY^sLLTVVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPF (expuesta en la SEQ ID NO: 6), que contiene una porción del dominio transmembrana de CD28 (expuesto en la SEQ ID NO: 2) y una porción del dominio coestimulador de 4-1BB (expuesto en la SEQ ID NO: 3), con los residuos que abarcan la unión de los dominios que se muestran subrayados. La afinidad de unión prevista de HLA-A2:01 se evaluó in silico para una serie de 140 péptidos superpuestos de 8-14 aminoácidos de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:6. Treinta y cinco (35) de los péptidos contenían solo la secuencia de la porción del dominio transmembrana; 35 de los péptidos contenían sólo la porción del dominio coestimulador, y 70 de los péptidos tenían una secuencia de unión o región de fusión, que contenía residuos de aminoácidos que unían la unión entre los dominios. Para esta evaluación, se consideró que los fragmentos peptídicos que se predijo que se unirían a HLA-A2:01 con una constante de disociación de 0 nM a 50 nM se unirían con alta afinidad. Se consideró que los fragmentos de péptidos que se predijo que se unirían con una constante de disociación de 51 nM a 1000 nM se unirían con baja afinidad. Se consideró que los fragmentos de péptidos que se predijo que se unirían con una afinidad predicha de 1000 nM a 5000 nM se unirían con una afinidad rara. Los resultados se presentan en la FIG. 3.

Como se muestra en la FIG. 3, se predijo que dos de los péptidos derivados de la secuencia de referencia en esta región, cada uno de los cuales contenía una secuencia con una región superpuesta que abarcaba la unión entre los dominios, mostrarían una baja afinidad de unión por HLA-A2:01. Específicamente, se predijo que un péptido de 14 mer con la secuencia FIIFWVKRGRKKLL (SEQ ID NO: 10) se uniría con una constante de disociación de 294 nM, y se predijo que un péptido de 13 mer con la secuencia FIIFWVKRGRKKL (SEQ ID NO: 11) se uniría con una constante de disociación de 618 nM. Cada uno de estos péptidos incluía una porción del péptido de 15 mer expuesto en la SEQ ID NO: 8 e identificado en el Ejemplo 1. No se predijo que los péptidos de 8 mer a 12 mer más cortos dentro de esta secuencia mostraran unión a HLA-A2:01. Se predijo que otro péptido de 13 mer que contiene la secuencia de aminoácidos IIFWVKRGRKKLL (SEQ ID NO: 12) tenía una afinidad de unión rara con una constante de disociación prevista de aproximadamente 3000 nM. Este ensayo predijo que ninguno de los fragmentos restantes que formaban puentes en la unión entre los dos dominios mostraría afinidad de unión por HLA-A2:01 (todos tenían una constante de disociación predicha mucho mayor de 5000 nM y, en la mayoría de los casos, mayor de 14.000 nm o 20.000 nM o más). En cada uno de los péptidos que se había predicho que se uniría a HLA-A2:01, no se predijo que ninguno de los dos residuos que abarcan la unión (VK) fuera un residuo de anclaje; más bien, dichos péptidos contenían estos residuos en posiciones no flanqueantes.

Se predijo que aproximadamente 15 de los péptidos que contenían secuencias derivadas únicamente del dominio transmembrana tenían una constante de disociación para HLA-A2:01 de menos de 5000 nM. Se predijo que dos péptidos que contenían la secuencia solo del dominio coestimulador tenían una constante de disociación para la unión de HLA-A2:01 de menos de 5000 nM. El dominio coestimulador y el dominio transmembrana en la secuencia evaluada se derivan de secuencias humanas endógenas, que generalmente tienen menos probabilidades de ser inmunogénicas para un sujeto humano. Por ejemplo, en el estudio descrito en el Ejemplo 1, no se detectaron respuestas inmunitarias que fueran específicas para secuencias peptídicas únicamente dentro de cualquiera de estos dominios de CAR. Por consiguiente, se evaluaron variantes de péptidos que contenían secuencias que abarcaban la región de unión.

Para generar péptidos variantes que se había predicho que tenían afinidades de unión reducidas para HLA-A2:01 y/o inmunogenicidad reducida en un sujeto humano que tenía este alelo de HLA, se generó una secuencia variante in silico, que contenía mutaciones en la región de unión en comparación con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6. Como se predijo que los péptidos que contienen los residuos "VK" que abarcan la unión (en posiciones que no son de anclaje) mostrarían altas afinidades de unión por HLA-A2:01, se insertaron dos residuos de asparagina en la unión entre los dominios transmembrana de CD28 y coestimulador de 4-1BB. La variante contenía la secuencia CYSLLTVVAFIIFWVNNKRGRKKLLYIFKQPF (expuesta en la SEQ ID NO: 13, la secuencia que flanquea la unión que se generó mediante la inserción de los residuos de asparagina se muestra subrayada). La secuencia variante ejemplar de la SEQ ID NO: 13 se evaluó mediante los mismos métodos predictivos. Para evaluar las afinidades de unión predichas para esta secuencia variante, se evaluaron una serie de 154 fragmentos superpuestos de 8-14 aminoácidos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 13 mediante análisis in silico como se ha descrito anteriormente, en el que 35 péptidos tenían una secuencia solo en la porción transmembrana, 35 péptidos tenían una secuencia solo en la porción del dominio coestimulador y 84 péptidos contenían una secuencia de la región de unión que contenía aminoácidos que formaban puentes en los dominios, incluyendo uno o ambos residuos de asparagina insertados.

Los resultados se representan en la FIG. 3. Como se muestra, en general, las afinidades de unión a HLA-A2:01 de los péptidos superpuestos dentro de la región variante que contiene la unión, colectivamente, se redujeron sustancialmente en comparación con la secuencia no variante. En particular, la constante de disociación predicha para la unión a HLA-A2:01 de péptidos en la porción de la región de unión previamente predicha como inmunogénica se redujo sustancialmente. Por ejemplo, se predijo que las variantes peptídicas IIFWVNNKRGRKKL (SEQ ID NO: 14) e IIFWVNNKRGRKK (SEQ ID NO: 15), que incluían residuos de asparagina en la región alterada que flanqueaba la unión en comparación con los péptidos identificados como se expone en la SEQ ID NO: 10 y 11, respectivamente, no mostrarían afinidad de unión detectable por HLA-A2:01. Se predijo que dos péptidos de 14 mer, FIIFWVNNKRGRKK (SEQ ID NO: 96) e IFWVNNKRGRKKLL (SEQ ID NO: 97), mostrarían una constante de disociación para unirse a este HLA, lo que indica una afinidad de unión rara, dentro del intervalo de 1000 nM a 5000 nM. Se predijo que todos los demás péptidos que contenían la secuencia de la región de unión modificada mostrarían una constante de disociación superior a 5000 nM y, en la mayoría de los casos, superior a 14.000 nM o 20.000 nM o más, y por lo tanto no se predijo que mostraran afinidad de unión para HLA-A2:01 por esta evaluación. Además, la modificación de la secuencia de la región de unión no creó ningún péptido nuevo que se predijera que tuviese afinidades de unión más altas para HLA-A2:01 dentro de las regiones del dominio coestimulador o transmembrana.

Ejemplo 5: Administración de células que expresan CAR anti-CD22 a sujetos tratados previamente con CAR anti-CD19

A seis sujetos con leucemia linfoblástica aguda (ALL) de células B CD22+ en recaída/refractaria se les administraron células T autólogas que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-CD22. El CAR incluía un anticuerpo scFv anti-CD22 humano, un dominio transmembrana CD8alfa, un dominio de señalización intracelular de 4-1 BB y un dominio de señalización intracelular de CD3zeta.

Todos los sujetos se habían sometido con anterioridad a por lo menos a un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y habían recibido tratamiento con una de varias terapias de células CAR-T dirigidas a CD19. Cinco de los sujetos habían recaído con ALL en la que no se detectó CD19 ("CD19 neg") y un sujeto no respondía a la terapia anterior con CD19 CAR.

Antes de la administración de las células, los pacientes se sometieron a leucaféresis autóloga para recoger células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las células T se aislaron de las PBMC recogidas mediante enriquecimiento basado en inmunoafinidad para la expresión de CD3 y se cultivaron en presencia de perlas anti-CD3/-CD28, seguido de transducción con un vector lentiviral que codifica el CAR anti-CD22. Las células se cultivaron durante 7-10 días. Los sujetos recibieron quimioterapia de inducción con 25 mg/m2 de fludarabina los días -4, -3 y -2 y 900 mg/m2 de ciclofosfamida el día -2 (infusión de células el día 0). Cada paciente recibió una dosis inicial de células T CAR de 3 x 105 células T transducidas/peso del receptor (kg) por infusión intravenosa. El segundo sujeto inscrito desarrolló diarrea de grado 3, cumpliendo los criterios de toxicidad limitante de la dosis (DLT), lo que llevó a la expansión de la dosis en el primer nivel de dosis para tratar a un total de 6 sujetos. No se observaron DLT posteriores con esta dosificación. Dos sujetos desarrollaron síndrome de liberación de citoquinas (CRS) de grado 1, un sujeto desarrolló CRS de grado 2 y en dos sujetos no hubo CRS.

Se determinó el número de células CAR-T en sangre periférica, médula ósea o líquido cefalorraquídeo en ciertos momentos posteriores al tratamiento mediante la incubación de células con CD22-Fc. Para los pacientes en los que se observó expansión, se observó evidencia de expansión de células CAR-T en sangre periférica, médula ósea y líquido cefalorraquídeo, comenzando aproximadamente el día 7. La expansión máxima o pico de células CAR-T se observó generalmente entre aproximadamente el día 12 y aproximadamente el día 15 después de la infusión. La Tabla 7 expone el porcentaje máximo o pico de células CAR-T anti-CD22 observadas en este período de evaluación como porcentaje de las células T totales en cada muestra para los sujetos tratados. Las respuestas clínicas se evaluaron el día 28 (+/- 4 días) después de la infusión.

Como se muestra en la Tabla 4, los resultados fueron consistentes con las respuestas que generalmente se correlacionaron con el grado de expansión de las células CAR-T. Para tres sujetos que mostraron poca o ninguna expansión de células CAR-T también mostraron evidencia de progresión de la enfermedad. Otros dos sujetos tenían enfermedad estable, y uno se observó con remisión completa sin MRD. Se detectó persistencia de CAR por citometría de flujo hasta 47 días después de la infusión en este sujeto, con una remisión mantenida durante 3 meses después de la infusión. Los resultados muestran terapia de células T CAR anti-CD22 segura, factible y clínicamente activa en sujetos que se habían sometido (y que no respondieron, por ejemplo, debido a la pérdida de epítopo/antígeno) a terapia previa con CAR anti-CD19.

Ejemplo 6: Comparación de análisis in ^síI^íco y unión in vitro de péptidos derivados de regiones de unión de un cAr para unión a HLA de clase II

Se evaluaron in vitro las afinidades de unión reales para ciertos alelos de HLA de clase II (DPA1 *01:03;DPB1 *04:01, DRA*01:01;DRB1 *03:01, DRA*01:01, DRB1*15:01, DRA*01:01;DRB1 *11:01, DPA1*01:03;DPB1 *04:02, DPA1 *01:03;DPB1 *03:01, DPA1 *01:03;DPB1 *01:01, DPA1 *02:01;DPB1 *01:01, DPA1*02:01;DPB1 *04:02, DRA*01:01, DRB1 *11:04, DRA*01:01, DRB1 *01:02, y DPA1 *02:01;DPB1 *15:01) para detectar secuencias peptídicas de 15 aminoácidos superpuestas ejemplares dentro de una porción de la región que abarca la unión entre las secuencias derivadas de CD28 y 4-1BB del CAR descritas en el Ejemplo 4. Específicamente, la evaluación fue de una serie de péptidos de 15 mer superpuestos derivados de la secuencia CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQT (expuesta en la SEQ ID NO: 160), que contiene una porción del dominio transmembrana derivado de CD28 y el dominio coestimulador derivado de 4-1BB y abarca la unión entre los dominios (enlace que une los dos aminoácidos indicados en subrayado). Además, también se evaluaron una serie de péptidos de 15 mer superpuestos de cada una de varias variantes diferentes de esta porción, cada variante conteniendo una mutación o mutaciones en esta región como se describe en el Ejemplo 2.

Se sintetizaron los varios péptidos superpuestos de 15 mer y se analizó su pureza mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Luego, los péptidos sintéticos se incubaron con moléculas de MHC recombinantes para evaluar las propiedades de unión usando el sistemaREVEAL Epitope Discovery System como se describe en el Ejemplo 3. Se probó cada péptido por separado para determinar esta capacidad con respecto a cada uno de los alelos de HLA de clase II, normalizados en el grado observado para un control positivo (epítopo de células T conocido para el alelo relevante). Se calculó una puntuación para cada alelo, en la que la unión se normalizó al conjunto de péptidos de control positivo al 100%. Se calculó el impacto potencial en la población en base a estas puntuaciones como la suma de las puntuaciones de los alelos individuales para cada péptido.

Los resultados se exponen en la FIG. 7. Como se muestra, los resultados demostraron que las modificaciones dentro de la región de unión dieron como resultado una reducción con éxito de la unión de HLA de c la se II de p o r lo m en os un p é p tid o d e n tro de la reg ión .

P ara los pé p tid o s 15 -m er s u p e rp u e s to s p re se n te s d e n tro de la reg ión de un ión na tiva , los resu ltad os se co m p a ra ro n con los va lo re s de un ión p re d ich o s (IC 50) o b te n id o s pa ra la un ión de l m ism o c o m p le jo pé p tid o :M H C , ^{u sa n d o los m é tod os de p re d icc ión} in silico ^{co m o se d e sc rib e en el E jem p lo 2. C o m o el v a lo r de IC 50 m áxim o}p re d ich o fu e de a p ro x im a d a m e n te 50000, se tra n s fo rm a ro n lo g a rítm ica m e n te los va lo re s de IC 50, se res ta ron de ^{L O G (50000 ) y se d iv id ie ro n p o r L O G (50000 ) pa ra o b te n e r u n a p u n tua c ió n} in silico ^{n o rm a liza d a ((Lo g (50000 ) -}lo g IC 50 ) / Lo g (50000 )). S e ob tu v ie ro n p u n tu a c io n e s de in m u n o g e n ic id a d (po nd e rad as en ba se a la fre cu e n c ia ^{re la tiva en la p o b lac ió n de los a le lo s de H LA de c la se II in d iv id u a le s ) pa ra las a fin id a d e s de un ión n o rm a liza d a s} in silico ^{y rea les. Los resu ltad os se exp o n e n en la FIG . 8. En ge n e ra l, las p re d icc io n e s de un ión} in silico ^{fu e ro n p re d ic tiva s y, en a lg u n o s caso s , so b re p re d ic tiva s de los resu ltad os rea les de un ión} in vitro.

Ejemplo 7: Comparación de expresión y actividad citolítica de CAR con regiones de unión modificadas

S e g e n e ra ro n cé lu la s T q u e e xp re sa b a n o (1) el re ce p to r de an tíg e n o q u im é rico o rig in a l (C A R ) com o se d e s c rib e en e l E jem p lo 1, q u e c o n te n ía un scF v an ti-C D 19 , un d o m in io b isag ra , la reg ión de un ión e xp u e s ta en la S E Q ID N O : 5 (que in c luye un d o m in io tra n s m e m b ra n a d o m in io d e riva d o de l C D 28 na tivo y un d o m in io de se ñ a liza c ió n in tra c e lu la r d e riva d o de l 4 -1 B B na tivo ) (co n s id e ra d o la reg ión de un ión "n a tiva ") y un d o m in io de se ñ a liza c ió n in tra ce lu la r de C D 3 -ze ta o (2) u n a de u n a se rie de va r ia n te s pa rticu la re s de l m ism o, q u e co n tie n e in d iv id u a lm e n te u n a reg ión de un ión m o d ifica d a en la q u e se in tro du je ro n u n a o m ás m u ta c io n e s en la reg ión de un ió n que a b a rca la un ión e n tre el d o m in io tra n s m e m b ra n a de C D 28 y e l d o m in io de se ñ a liza c ió n c o e s tim u la d o r de 4 -1 B B . C a d a u n a de las va r ia n te s de C A R en p a rtic u la r c o n te n ía u n a reg ión de un ión m o d ifica d a que te n ía una m u tac ión (con re fe re n c ia a la S E Q ID NO : 5) s e le c c io n a d a en tre : K 28 Q /R 31 N /L 34 S , K 28 Q /R 31 N /L 34 A , R 31N /L34S , R 31N /L 34A , K 28 Q /L 34 A , K 28 Q /R 31S , K 28 Q /R 31N , K 28 Q /R 31A , L34S , L34A , R31S, R 31N , R 31A , K 28S , K28Q , K 28L, K 28H , y K28A .

S e a is la ro n cé lu la s T C D 4 y C D 8 hu m a n a s p rim a ria s m ed ia n te se lecc ió n b a sa d a en in m u n o a fin id a d a p a rtir de m ue s tra s de P B M C hu m an as o b te n id a s de d o n a n te s sanos. Las cé lu la s re su lta n te s se es tim u la ro n c u ltiv á n d o la s con un reac tivo a n ti-C D 3 /a n ti-C D 28 an tes de la m an ip u la c ión con el C A R resp ec tivo . Las cé lu la s se tra n sd u je ro n u sa nd o un v e c to r le n tiv ira l q u e c o n te n ía una m o lé cu la de ác ido nu c le ico q u e co d ific a e l C A R y un ác ido nu c le ico q u e c o d ifica un E G FR tru n c a d o (E G F R t), pa ra su uso co m o m a rca d o r sus titu to p a ra la tra n sd u cc ió n , s e p a ra d o s p o r u n a se cu e n c ia q u e co d ific a un c a m b io de rib o so m a T 2A . C o m o con tro l ne ga tivo se usó una tra n sd u cc ió n s im u lad a . Las cé lu la s tra n s d u c id a s se usa ron pa ra an á lis is de e xp res ión y e n sa yo de ac tiv idad c ito lítica .

A. Expresión del CAR

S e e va lu ó la e xp re s ió n de C A R en la su p e rfic ie c e lu la r (com o se in d ica a tra vé s de l m a rc a d o r su s titu to ) el d ía 17 d e sp u é s de la tra n sd u cc ió n con ác ido nu c le ico q u e co d ific a el C A R na tivo o c a d a u n a de los C A R m od ifica dos . Las cé lu la s se t iñ e ro n con an ticu e rp o an ti-E G F R pa ra d e te c ta r E G FR t com o su s titu to pa ra v e r if ic a r la e xp re s ió n de C A R y se e va lu a ro n m ed ia n te c ito m e tría de flu jo . La e xp re s ió n de C A R fue s im ila r en las cé lu la s tra n s d u c id a s pa ra e x p re s a r las va r ia s va r ia n te s de C A R q u e co n te n ía n u n a reg ión de un ión m od ifica da , y fue c o m p a ra b le a la e xp re s ió n de l C A R qu e c o n te n ía la reg ión de un ión na tiva .

B. Actividad citolítica

S e e va lu ó la ac tiv ida d c ito lít ica de las cé lu la s m a n ip u la d a s p a ra e x p re s a r los C A R na tivos o va r ia n te s fren te a las cé lu la s o b je tivo K 562 que exp re sa n el an tíg e n o de C D 19 (K 562 -C D 19 ). Las cé lu la s T se in cub a ron con las cé lu la s o b je tivo (K 562 -C D 19) a va r ia s p ro p o rc io n e s de e fe c to r: o b je tivo (p ro p o rc io n e s de C A R : o b je tivo de 1:1, 2:1 y 4 :1 ) en un po c illo de u n a p la ca de cu ltivo . La ac tiv id a d lítica de las cé lu la s T m an ip u la da s se e va lu ó m id ie n d o el nú m ero de cé lu la s o b je tivo po s itiva s pa ra c a s p a s a p o r poc illo . Los resu ltad os m ostra ro n que, en es te es tu d io , las cé lu la s T que exp re sa n las va r ia s v a r ia n te s de C A R q u e con tien en la reg ión de un ión m o d ifica d a fue ro n ca p a ce s de e lim in a r las cé lu la s o b je tivo q u e e xp re sa n C D 19 de m an e ra e sp e c ífica , en un g ra d o s im ila r al de las cé lu la s T que e xp re sa n la C A R que co n tie n e la reg ión de un ión "na tiva ".

El a lca n ce de la p re se n te in ven c ión no e s tá lim itado p o r las re a liza c io n e s d ivu lg a d a s en la p re sen te , qu e se p re te n d e q u e sean ilu s tra c io n e s ún ica s de a sp e c to s in d iv id u a le s de la in ven c ión . V a rias m od ifica c io n e s a los m o d e lo s y m é tod os de la invenc ión , a d e m á s de los d e sc rito s en la p re sen te , resu lta rá n e v id e n te s pa ra los exp e rto s en la té c n ic a a p a rtir de la d e sc rip c ió n y las e n se ñ a n za s an te rio res , y se p re te n d e de igua l m an e ra q u e en tre n de n tro de l a lcan ce de la invenc ión .

Secuencias

Tabla 5: Secuencias

co n tin u a c ió n

co n tin u a c ió n

co n tin u a c ió n

co n tin u a c ió n

co n tin u a c ió n

Claims

REIVINDICACIONES

1. Por lo menos un péptido que comprende una porción de una región inmunogénica de un receptor de antígeno quimérico (CAR) y células que expresan el CAR para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto humano.

en donde el CAR comprende:

a) un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente a un antígeno objetivo asociado con la enfermedad en el sujeto humano,

b) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización citoplasmático activador y que comprende además un dominio de señalización coestimulador intracelular de una molécula coestimuladora de células T, en donde el dominio de señalización coestimulador es un dominio de señalización de 4-1BB humano, y

c) un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular, en donde el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 humano,

de tal manera que se forma una región de unión mediante la unión de la porción transmembrana humana de CD28 y el dominio de señalización de 4-1BB humano, en donde la región de unión comprende la SEQ ID NO: 137,

en donde el CAR se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad en el sujeto humano, en donde el método comprende administrar las células que expresan el CAR para tratar la enfermedad y administrar por lo menos un péptido para inducir tolerancia al CAR,

en donde la región inmunogénica comprende la SEQ ID NO: 137, y en donde el péptido tiene entre 10 y 30 aminoácidos, y el péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO 7 12, 16-22, 163, o 165, y

en donde dicho método comprende administrar el péptido antes de la administración del CAR, y dicho método comprende administrar al sujeto el por lo menos un péptido en condiciones que inducen tolerancia en el sujeto al CAR y administrar al sujeto las células que expresan el CAR.

2. Por lo menos un péptido que comprende una porción de una región inmunogénica de un receptor de antígeno quimérico (CAR) para su uso con células que expresan el CAR, en un método para tratar una enfermedad en un sujeto humano,

en donde el CAR comprende:

b) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización citoplasmático activador y que comprende además un dominio de señalización coestimulador intracelular de una molécula coestimuladora de células T, en donde el dominio de señalización coestimulador es un dominio de señalización de 4-1 BB humano, y

en donde dicho método comprende administrar el péptido antes de la administración de CAR, y dicho método comprende administrar al sujeto el por lo menos un péptido en condiciones que inducen tolerancia en el sujeto al CAR y administrar al sujeto las células que expresan CAR.

3. Células que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) para su uso con por lo menos un péptido que comprende una porción de una región inmunogénica del CAR, en un método para tratar una enfermedad en un sujeto humano,

en donde el CAR comprende:

a) un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente a un antígeno objetivo asociado con la enfermedad en el sujeto humano,

4. El por lo menos un péptido y células para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, el por lo menos un péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, o las células para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la enfermedad es un cáncer, una enfermedad o trastorno autoinmune o una enfermedad infecciosa.

5. El por lo menos un péptido y células para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4, el por lo menos un péptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 4, o las células para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en donde el método comprende administrar una pluralidad de péptidos, cada uno de dichos péptidos comprendiendo la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 7-12, 16-22, 163 o 165.

6. El por lo menos un péptido y las células para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 5, el por lo menos un péptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 4 a 5, o las células para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular comprende un scFv.

7. El por lo menos un péptido y/o células para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el péptido o uno o más péptidos de la pluralidad de péptidos consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 7 -12, 163 o 165.