CN113474458A - 靶向癌症抗原的dna编码的双特异性t细胞连接子以及在癌症治疗中的使用方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了组合物，其包括编码双特异性免疫细胞接合抗体(DICE)的重组核酸序列、编码双特异性T细胞接合(DBiTE)抗体的重组核酸序列、其片段、其变体或其组合。

Description

靶向癌症抗原的DNA编码的双特异性T细胞连接子以及在癌症 治疗中的使用方法

相关申请的交叉引用

本申请主张2019年1月30日提出申请的美国临时申请号62/798,626和2019年4月1日提出申请的美国临时申请号62/827,265的优先权，其中每一者通过引用方式全文并入本文中。

技术领域

本发明涉及包括用于在体内产生一种或多种合成DNA编码的双特异性T细胞连接子(bispecific T cell engager)(BiTE)及其功能性片段的重组核酸序列的组合物，和通过施用所述组合物预防和/或治疗受试者中的癌症的方法。

背景技术

单克隆抗体疗法已经成为癌症治疗中的一个游戏规则改变者，然而，这种治疗有几个限制，包含需要重复施用，更有限的稳定性和成本。单克隆技术的进一步进展是双特异性T细胞连接子(BiTE)的开发，所述连接子结合单克隆抗体的特异性和T细胞的细胞毒性。BiTE在白血病临床试验(Viardot等人2016年《血液(Blood)》，127(11):1410-6；Goebeler等人2016年《临床肿瘤学杂志》，34(10):1104-11)中显示出有希望的结果，然而，这种疗法的适用性有限，因为它需要每个循环持续静脉输注4-8周(Zhu等人2016年《临床药代动力学》，55(10):1271-88)，并且其生产可能有限制。基于抗体的产品的更长寿命的更简单的生产方法将可能是癌症免疫疗法的重要新工具。

因此，在本领域中需要用于癌症免疫疗法的寿命更长、生产更简单的基于抗体的产品。本发明满足了这一需求。

发明内容

在一个实施例中，本发明涉及一种核酸分子，其编码一个或多个合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子，其中所述合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子包括至少一个抗原结合结构域和至少一个免疫细胞接合结构域。

在一个实施例中，抗原结合结构域靶向CD19、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD33、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、卵泡刺激素受体(FSHR)、表皮生长因子受体(EGFR)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD123或Her2。

在一个实施例中，免疫细胞结合结构域靶向T细胞、抗原呈递细胞、自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞或巨噬细胞。

在一个实施例中，免疫细胞结合结构域靶向CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、CD40、FcgRs、FceRs、FcaRs或CD95。在一个实施例中，免疫细胞接合结构域靶向CD3。

在一个实施例中，所述核酸分子包括编码选自以下的一个或多个序列的核苷酸序列：a)在氨基酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列；b)在氨基酸序列的至少65％上与选自SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:74或SEQ ID No:76的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列的片段；c)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和d)包括选自SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:74或SEQ ID No:76的氨基酸序列的至少65％的氨基酸序列的片段。

在一个实施例中，所述核酸分子包括：a)在核酸序列的整个长度上与选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:75的核苷酸序列具有至少约90％同一性的核苷酸序列；b)在核酸序列的至少65％上与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:73和SEQ ID NO:75的核苷酸序列具有至少约90％同一性的核苷酸序列的片段；c)SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:75的核苷酸序列；或d)包括选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:75的核苷酸序列的至少65％的核苷酸序列的片段。

在一个实施例中，所述核苷酸序列与编码IgE前导序列的核酸序列可操作地连接。

在一个实施例中，核酸分子包括表达载体。

在一个实施例中，本发明涉及一种组合物，其包括一种核酸分子，其编码一个或多个合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子，其中所述合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子包括至少一个抗原结合结构域和至少一个免疫细胞接合结构域。在一个实施例中，所述组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

在一个实施例中，本发明涉及一种预防或治疗受试者中的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用编码一种或多种合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子的核酸分子或包括编码一种或多种合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子的核酸分子的组合物，其中所述合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子包括至少一个抗原结合结构域和至少一个免疫细胞接合结构域。在一个实施例中，所述疾病是良性肿瘤、癌症或癌症相关疾病。

在一个实施例中，本发明涉及一种编码一种或多种合成抗体的核酸分子，其中所述核酸分子包括编码抗人表皮生长因子受体2(HER2)合成抗体的核苷酸序列；编码抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列；编码ScFv抗HER2合成抗体的核苷酸序列；或编码ScFv抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列。

在一个实施例中，所述核苷酸序列编码在氨基酸序列的整个长度上与SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:66具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，所述核苷酸序列编码在氨基酸序列的至少65％上与SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ IDNO:66的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，核苷酸序列编码SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一个实施例中，核苷酸序列编码包括SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:66的至少65％的氨基酸序列的片段。

在一个实施例中，核酸分子包括在SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:65的整个长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列。在一个实施例中，核酸分子包括在氨基酸序列的至少65％上与SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:65的核苷酸序列具有至少约90％同一性的核苷酸序列的片段。在一个实施例中，核酸分子包括选自SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:65的核苷酸序列。在一个实施例中，核酸分子包括包括有SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:65的核苷酸序列的至少65％的核苷酸序列的片段。

在一个实施例中，所述核苷酸序列与编码IgE前导序列的核酸序列可操作地连接。

在一个实施例中，核酸分子包括表达载体。

在一个实施例中，本发明涉及一种组合物，其包括编码一种或多种合成抗体的核酸分子，其中所述核酸分子包括编码抗人表皮生长因子受体2(HER2)合成抗体的核苷酸序列；编码抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列；编码ScFv抗HER2合成抗体的核苷酸序列；或编码ScFv抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列。在一个实施例中，所述组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

在一个实施例中，本发明涉及一种预防或治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用编码一种或多种合成抗体的核酸分子，其中所述核酸分子包括编码抗人表皮生长因子受体2(HER2)合成抗体的核苷酸序列；编码抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列；编码ScFv抗HER2合成抗体的核苷酸序列；或编码ScFv抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列。

在一个实施例中，本发明涉及一种预防或治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用编码一种或多种合成抗体的核酸分子，其中所述核酸分子包括编码抗人表皮生长因子受体2(HER2)合成抗体的核苷酸序列；编码抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列；编码ScFv抗HER2合成抗体的核苷酸序列；或编码ScFv抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列。在一个实施例中，所述疾病是与HER2表达相关的癌症。在一个实施例中，所述疾病是卵巢癌或乳腺癌。

在一个实施例中，本发明涉及一种预防或治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，其包括编码一种或多种合成抗体的核酸分子，其中所述核酸分子包括编码抗人表皮生长因子受体2(HER2)合成抗体的核苷酸序列；编码抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列；编码ScFv抗HER2合成抗体的核苷酸序列；或编码ScFv抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列。在一个实施例中，所述疾病是与HER2表达相关的癌症。在一个实施例中，所述疾病是卵巢癌或乳腺癌。

附图说明

图1描绘用BCMADBiTE、CD33DBiTE和CD123DBiTE转染的293T细胞上清液的示例性蛋白质印迹。

图2描绘用EGFRvIIIDBiTE、FSHRDBiTE、PSMADBiTE和CD19DBiTE转染的293T细胞上清液的示例性蛋白质印迹。

图3描绘实验设计的图。来自3个独立供体的PBMC在5μl CD19DBiTE或对照DBiTE(EGFRvIIIDBiTE)上清液存在的情况下一式三份培养5小时。孵育后，对细胞进行B细胞和T细胞标记物染色，以确定针对B细胞(CD19+细胞)和T细胞早期活化的潜在溶细胞活性。

图4描绘示例性实验结果，证明在CD19DBiTE存在但对照DBiTE不存在的情况下，所有三个供体的B细胞(在PBMC混合液中的CD19+细胞)均呈现出耗尽。

图5描绘示例性实验结果，证明在CD19DBiTE存在但对照DBiTE不存在的情况下，所有三个供体的T细胞中的早期活化标记物CD69均增加。

图6(包括图6A至图6F)描绘HER2 DNA编码的单克隆抗体(DMAb)的设计、表达和结合。图6A描绘编码HER2DMAb的DNA构建体的示意图。图6B描绘在293T细胞中表达的HER2DMAb或FSHR构建体的蛋白质印迹。图6C描绘DNA注射和电穿孔64天后，来自仅用HER2DMAb或pVax电穿孔的小鼠血清的人IgG的蛋白质印迹(n＝每组5只小鼠)。图6D描绘通过ELISA从用HER2DMAb电穿孔的裸小鼠血清量化的人IgG的表达水平(n＝每组5只小鼠，2个独立实验)。图6E描绘用人HER2蛋白涂覆板后，来自表达HER2DMAb或pVax的小鼠血清的结合ELISA。图6F描绘显示HER2DMAb结合具有和无人HER2表达的小鼠乳腺癌细胞系的流式细胞术图。

图7(包括图7A至图7F)描绘HER2 DNA编码的单克隆抗体(DMAb)的体外表达和抗肿瘤活性。图7A描绘DNA转染48h后从293T或RD细胞上清液中量化的HER2DMAb的表达水平(n＝3/组)。图7B描绘在HER2DMAb或pVax血清或Hu4D5抗体作为阳性对照(三份)存在的情况下，通过培养人PBMC(50万)和OVCAR3-荧光素酶(10,000)细胞所产生的体外细胞毒性。图7C描绘在来自HER2DMAb或pVax注射小鼠的血清(三份)存在的情况下，通过将人PBMC(50万)与HER2阴性细胞系MDA-MD-231(10,000)共培养所产生的体外细胞毒性。图7D描绘在HER3DMAb、pVax血清存在或未添加血清的情况下，被巨噬细胞吞噬的OVCAR3细胞的百分比，以及代表性的流式细胞术图(三份)。图7E描绘在来自HER2DMAb或pVax注射小鼠的血清(三份)存在的情况下，通过将来自Nu/J小鼠的脾细胞(50万)与OVCAR3(10,000)细胞共培养所产生的体外细胞毒性。图7F描绘在Nu/J血清(三份)中第0天和第252天的小鼠抗HER2DMAbIgG。ANOVA。T检验。***p<0.001。ns：不显著。

图8(包括图8A至图8C)显示卵巢癌中HER2DMAb结合HER2。8A描绘通过使用抗HER2抗体24D2的流式细胞术在卵巢癌细胞系OVCAR3、SKOV3、CAOV3、TOV-21G和RNG1中的HER2表达。图8B描绘来自表达HER2DMAb的小鼠的血清中的HER2表达。图8C描绘用来自HER2DMAb表达小鼠的血清染色的OVCAR3肿瘤的免疫荧光成像。比例尺10μm。

图9(包括图9A至图9F)显示HER2DMAb阻断HER2信号传导，诱导ADCC并延缓体内癌症进展。图9A描绘蛋白质印迹，显示在HER2DMAb或对照血清存在的情况下，用HER2-HER3激动剂HRG处理的OVCAR3细胞中的总计和磷酸化的Akt和β-肌动蛋白。图9B描绘直方图，显示HER2DMAb或与OVCAR3不相关的IgG的ADCC测定。图9C描绘移植到用HER2DMAb或空载体处理的裸小鼠中的OVCAR3肿瘤的生长曲线(每组n＝5只小鼠的2个独立实验)。图9D描绘用HER2DMAb或空载体处理的OVCAR3荷瘤小鼠血清中的HER2DMAb水平(代表每组n＝5只小鼠的2个独立实验)。图9E描绘显示OVCAR3、Brpkp110和Brpkp110-hHER2肿瘤细胞表达HER2的流式细胞术图。图9F描绘移植到用HER2DMAb或空pVax质粒处理的C57Bl/6小鼠中的Brpkp110-hHER2肿瘤的生长曲线(代表每组n＝5只小鼠的2个独立实验)。双向ANOVA，t检验，对数秩。*p<0.05，***p<0.001。

图10(包括图10A至图10J)显示HER2DBiTE的结合、细胞毒性、活化和体内有效性。图10A描绘结合通过结合ELISA测得的重组HER2蛋白的HER2DBiTE(三份)。图10B描绘结合通过结合ELISA测得的重组CD3蛋白的HER2DBiTE(三份)。图10C描绘在HER2DBiTE或pVax血清存在的情况下T细胞与OVCAR3共孵育24小时后孔中存在的T细胞数量(三份)。图10D描绘在OVCAR3细胞存在的情况下，用HER2DBIiTE或pVax血清活化T细胞5天后出现的凋亡(膜联蛋白V+)细胞。使用抗CD3/抗CD28珠作为阳性对照(三份)。图10E描绘在HER2DBIiTE或pVax血清和OVCAR3细胞存在的情况下培养24小时的T细胞上清液中以IFNγ测量的T细胞活化。使用抗CD3/抗CD28珠作为阳性对照，单独使用T细胞作为阴性对照(三份)。图10F描绘在HER2DBIiTE或pVax血清和OVCAR3细胞存在的情况下培养72小时的T细胞中以CD69的表达测量的T细胞活化。使用抗CD3/抗CD28珠作为阳性对照，单独使用T细胞作为阴性对照(三份)。图10G描绘在HER2DBIiTE或pVax血清和OVCAR3细胞存在的情况下培养72小时的T细胞中以PD-1的表达测量的T细胞活化。使用抗CD3/抗CD28珠作为阳性对照，单独使用T细胞作为阴性对照(三份)。图10H描绘在HER2DBiTE或pVax小鼠血清存在的情况下，通过将T细胞与OVCAR3细胞以不同比率共培养产生的体外细胞毒性(2个独立实验，一式三份)。图10I描绘Nu/J血清中第0天和第64天小鼠抗HER2DBiTE IgG(三份)。图10J描绘移植到用HER2DBiTE或无PBMC的空载体和具有PBMC的HER2DBiTE处理的NSG小鼠中的OVCAR3肿瘤的平均生长曲线以及肿瘤的图像(每组n＝5只小鼠；X表示无肿瘤(完全排斥))。T检验，ANOVA，双向ANOVA。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。ns：不显著。

图11(包括图11A至图11F)显示HER2DBiTE的产生、表达和抗肿瘤活性。图11A描绘编码HER2DMAb的DNA构建体示意图，以及接合HER2和TCR的BiTE卡通图。图11B描绘DNA注射和电穿孔21天和28天后，来自仅用HER2DBiTE或pVax空载体电穿孔的1μl小鼠血清的人IgG的蛋白质印迹(代表性n＝每组5只小鼠)。图11C描绘在HER2DBiTE或pVax小鼠血清存在的情况下，通过将T细胞与OVCAR3细胞以不同比率共培养产生的体外细胞毒性(2个独立实验，一式三份)。图11D描绘在使用OVCAR3作为靶以5:1的效应子：靶比注射和电穿孔100μg之前和之后的不同时间点，来自用HER2DBiTE处理的小鼠的血清的体外细胞毒性(三份)。图11E描绘移植到用HER2DBiTE或空载体处理的NSG小鼠中的OVCAR3肿瘤的平均生长曲线(n＝每组10只小鼠)。图11F描绘移植到用HER2DBiTE或空载体处理的NSG小鼠中的OVCAR3肿瘤的个体生长曲线(n＝每组10只小鼠)。双向ANOVA。***p<0.001。

具体实施方式

本发明涉及组合物，其包括编码双特异性免疫细胞结合抗体(DICE)的重组核酸序列、编码双特异性T细胞结合(DBiTE)抗体的重组核酸序列、其片段、其变体或其组合。所述组合物可对有需要的受试者施用，以促进DICE或DBiTE的体内表达和形成。

在一个实施例中，DICE或DBiTE包括至少一个抗原结合结构域和至少一个免疫细胞结合结构域。在一个实施例中，免疫细胞接合结构域对免疫细胞表面上表达的抗原具有特异性。免疫细胞包含但不限于T细胞、抗原呈递细胞、NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。

在各个实施例中，免疫细胞接合结构域包括编码对结合免疫细胞特异性受体分子具有特异性的抗体、其片段或其变体的核苷酸序列。在一个实施例中，免疫细胞特异性受体分子是T细胞表面抗原。在一个实施例中，T细胞特异性受体分子是CD3、TCR、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、CD40、FcgRs、FceRs、FcaRs和CD95中的一种。

在各个实施例中，抗原结合结构域包括编码对结合抗原具有特异性的抗体、其片段或其变体的核苷酸序列。在一个实施例中，抗体或其片段是DNA编码的单克隆抗体(DMAb)或其片段或变体。

在一个实施例中，DICE或DBiTE的抗原结合结构域对结合靶抗原具有特异性，并募集T细胞至靶抗原。在一个实施例中，靶抗原是肿瘤抗原。在一个实施例中，所述抗原是CD19、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD33、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、卵泡刺激素受体(FSHR)、表皮生长因子受体(EGFR)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD123和人表皮生长因子受体2(Her2)。因此，在一个实施例中，本发明提供包括一种或多种DICE或DBiTE的组合物和用于治疗或预防受试者中的癌症或与癌症相关的疾病或障碍的方法。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如有冲突，以本文件(包含定义)为准。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明，但优选的方法和材料如下所述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。本文公开的材料、方法和示例仅是说明性的而非意图限制。

如本文所使用的术语“包括”、“包含”、“具有(having、has)”、“可以”、“含有”和其变体旨在是不排除附加动作或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或单词。单数形式“一”、“一个”和“所述”包含复数指代物，除非上下文另有明确指示。本公开还设想其他实施例“包括”本文提出的实施例或元素、“由其组成”和“基本上由其组成”，无论是否明确阐述。

“抗体”可指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类抗体或片段、其片段或衍生物，包含Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样本中分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，其对所需表位或由其衍生的序列表现出足够的结合特异性。

本文可互换使用的抗体的“抗体片段”或“抗体的片段”是指包括抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。所述部分不包含完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即，CH2、CH3或CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的示例包含但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双体、单链Fv(scFv)分子、仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅含有一个重链可变区的单链多肽和含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。

“抗原”是指在宿主中具有产生免疫应答能力的蛋白质。抗原可以被抗体识别和结合。抗原可能来自体内，也可能来自外部环境。

本文所用的“编码序列”或“编码核酸”可指包括编码本文所述抗体的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可进一步包含与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调控元件包含启动子和能够指导在施用所述核酸的个体或哺乳动物的细胞中表达的聚腺苷酸化信号。编码序列可以进一步包含编码信号肽的序列。

本文所用的“互补”或“互补的”可以指核酸可以指Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Hoogsteen碱基配对。

如本文所用的“恒定电流”定义在递送到相同组织的电脉冲的持续时间内由组织或定义所述组织的细胞接收或经历的电流。电脉冲由本文所述的电穿孔装置递送。此电流在电脉冲的寿命期间在所述组织中保持恒定的安培数，因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。反馈元件可以在整个脉冲持续期间测量组织(或细胞)的电阻，并使电穿孔装置改变其电能输出(例如，增加电压)，使得相同组织中的电流在整个电脉冲期间(微秒量级)以及从一个脉冲到另一个脉冲保持恒定。在一些实施例中，反馈元件包括控制器。

本文所用的“电流反馈”或“反馈”可互换使用，且可意指所提供的电穿孔装置的主动响应，其包括测量电极之间的组织中的电流并相应地改变由EP装置递送的能量输出以将电流维持在恒定水平。此恒定水平由用户在起始脉冲序列或电治疗之前预设。反馈可以通过电穿孔装置的电穿孔部件例如控制器来完成，因为其中的电路能够连续地监测电极之间的组织中的电流，并将所述监测的电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较，并且连续地进行能量输出调节以将监测的电流保持在预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为它是模拟闭环反馈。

如本文所用，“分散电流”可指从本文所述电穿孔装置的各种针电极阵列递送的电流模式，其中所述模式最小化或优选消除在被电穿孔的组织的任何区域上发生与电穿孔相关的热应力。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电通透”或“动电增强”(“EP”)可指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧传递到另一侧。

本文所用的“内源性抗体”可以指在受试者中产生的抗体，所述受试者被施用有效剂量的抗原以诱导体液免疫应答。

本文使用的“反馈机制”可以指由软件或硬件(或固件)执行的过程，所述过程接收期望的组织的阻抗(在能量脉冲递送之前、期间和/或之后)并将其与当前值、优选为电流进行比较，并且调节递送的能量脉冲以实现预设值。反馈机制可以由模拟闭环电路来执行。

“片段”可以指具有功能，即可结合期望靶并具有与全长抗体相同的预期效果的抗体的多肽片段。除N和/或C末端缺失至少一个氨基酸外，抗体的片段的全长可以100％相同，在每种情况下，1位都有或没有信号肽和/或甲硫氨酸。片段可以包括特定全长抗体长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比，排除添加的任何异源信号肽。所述片段可包括与所述抗体95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多相同的多肽的片段，并且另外包括在计算同一性百分比时不包含的N末端甲硫氨酸或异源信号肽。片段可以进一步包括N末端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N末端甲硫氨酸和/或信号肽可以连接到抗体的片段。

编码抗体的核酸序列的片段可以与全长100％相同，除了从5'和/或3'末端缺失至少一个核苷酸，在每种情况下在1位具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可以包括特定全长编码序列长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比，排除添加的任何异源信号肽。所述片段可包括编码与所述抗体95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多相同的多肽的片段，并且另外任选地包括编码在计算同一性百分比时不包含的N末端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段可以进一步包括N末端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N末端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以连接到编码序列的片段。

本文所用的“基因构建体”是指包括编码蛋白质诸如抗体的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包含与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调控元件包含启动子和能够指导在施用所述核酸分子的个体的细胞中表达的聚腺苷酸化信号。如本文所用，术语“可表达形式”是指含有必要的调控元件的基因构建体，所述调控元件与编码蛋白质的编码序列可操作地连接，使得当存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。

如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所使用的“相同的”或“同一性”可以指所述序列具有在指定区域上相同的指定百分比的残基。百分比可通过以下方式来计算：将所述两个序列最佳比对，在指定区域上比较所述两个序列，确定这两个序列中相同残基出现的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中的位置总数，且将结果乘以100，以得到序列同一性的百分比。如果所述两个序列具有不同的长度，或者比对产生一个或多个交错的末端，并且比较的指定区域仅包含一个序列，则计算的分母中包含单个序列的残基，但分子中不包含。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可视为等效。可手动或通过使用计算机序列算法(诸如BLAST或BLAST 2.0)来执行同一性。

当讨论反馈机制时，可以使用如本文所用的“阻抗”，并且可以根据欧姆定律将其转换为电流值，从而可以与预设电流进行比较。

本文所用的“免疫应答”可以指响应于引入一种或多种核酸和/或肽，宿主免疫系统的活化，例如哺乳动物的活化。免疫应答可以是细胞或体液应答的形式，或两者兼有。

本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸还包含所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还包含基本上相同的核酸及其互补序列。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包含在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂交体，其中核酸可以含有脱氧核糖和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包含尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸可以通过化学合成方法或重组方法获得。

本文所用的“可操作地连接”可以指基因的表达受与其空间连接的启动子的控制。启动子可以位于受其控制的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离可以近似相同于所述启动子和在所述启动子来源的基因中其所控制的基因之间的距离。如本领域所知，此距离的变化可以在不损失启动子功能的情况下调节。

如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的或天然和合成的修饰或组合。

本文所用的“启动子”可以指能够赋予、活化或增强细胞中核酸表达的合成或天然衍生的分子。启动子可以包括一个或多个特异性转录调控序列，以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包括远端增强子或阻遏子元件，它们可以位于距转录起始位点几千个碱基对的位置。启动子可以来自包含病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以组成性地或相对于发生表达的细胞、组织或器官，或相对于发生表达的发育阶段，或响应于外部刺激诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂而差异地调节基因组分的表达。启动子的代表性示例包含噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操作子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV 40晚期启动子和CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用，且指可在本文所述蛋白质的氨基末端连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从其产生的细胞中分泌。信号肽/前导序列通常在从细胞分泌时从蛋白质(通常称为成熟蛋白质)的剩余部分裂解。信号肽/前导序列在蛋白质的N末端连接。

本文所用的“严格杂交条件”可以指这样的条件，在所述条件下第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶)，诸如在核酸的复杂混合物中杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会有所不同。严格条件可选择为在规定离子强度pH下比特定序列的热熔点(T_m)低约5-10℃。T_m可以是50％与靶互补的探针在平衡时与靶序列杂交的温度(在规定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为靶序列过量存在，在T_m下，50％的探针在平衡时被占据)。严格条件可以是下述条件：其中盐浓度小于约1.0M钠离子，诸如在pH 7.0至8.3下约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)，温度为至少约30℃，以及对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)，温度为至少约60℃。加入诸如甲酰胺等去稳定剂也可以实现严格的条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格杂交条件包含以下：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS，在42℃下孵育，或5xSSC、1％SDS，在65℃下孵育，在0.2x SSC中洗涤，和在65℃下的0.1％SDS。

本文中可互换使用的“受试者”和“患者”是指任何脊椎动物，包含但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、大羊驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如，猴，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人)。在一些实施例中，受试者可以是人或非人。受试者或患者可能正在接受其他形式的治疗。

本文所用的“基本上互补”可以指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上与第二序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或者这两个序列在严格的杂交条件下杂交。

本文所用的“基本上相同”可以指第一和第二序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20,21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补序列基本上互补。

如本文所用，“合成抗体”是指由本文所述的重组核酸序列编码并在受试者中产生的抗体。

如本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”可以指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病的方式保护受试者免于疾病。预防疾病包含在疾病发作之前向受试者施用本发明的抗体。抑制疾病包含在疾病诱导后但在其临床出现前向受试者施用本发明的抗体。压制疾病包含在所述疾病的临床出现之后对受试者施用本发明的抗体。

本文关于核酸使用的“变体”可以指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列基本相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其基本相同的序列杂交的核酸。

“变体”是指氨基酸序列因氨基酸的插入、缺失或保守取代而不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可以指氨基酸序列与氨基酸序列保留至少一种生物活性的参考蛋白基本上相同的蛋白。氨基酸的保守取代，即，用相似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸在本领域中被认为通常涉及微小的变化。如本领域所理解的，这些微小的变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水性指数来识别。Kyte等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》157:105-132(1982年)。氨基酸的亲水性指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，具有相似亲水性指数的氨基酸可以被取代并且仍然保持蛋白质功能。一方面，亲水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示将会导致蛋白质保留生物功能的取代。在肽的上下文中考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，这是一个有用的测量，已被报道与抗原性和免疫原性良好相关。美国专利号4,554,101通过引用全文并入本文。如本领域所理解的，取代具有相似亲水性值的氨基酸可导致肽保留生物活性，例如免疫原性。可以用亲水性值彼此在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受到所述氨基酸特定侧链的影响。与所述观察一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对相似性，且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性质所揭示的。

变体可以是在整个基因序列或其片段的全长上基本上相同的核酸序列。核酸序列在基因序列或其片段的全长上可以是80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列在氨基酸序列或其片段的全长上可以是80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的。

本文所用的“载体”可以指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体或整合入宿主基因组的载体。

对于本文的数字范围的叙述，明确设想到其间具有相同精确度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外还考虑了数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0被明确地设想到。

组合物

在一个实施例中，本发明涉及包括编码DICE或DBiTE、其片段、其变体或其组合的重组核酸序列的组合物。当将所述组合物施用于有需要的受试者时，可导致在受试者中产生合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子。

在一个实施例中，DICE或DBiTE包括至少一个抗原结合结构域和至少一个免疫细胞结合结构域。在一个实施例中，免疫细胞接合结构域对免疫细胞表面上表达的抗原具有特异性。免疫细胞包含但不限于T细胞、抗原呈递细胞、NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。

在各个实施例中，免疫细胞接合结构域包括编码对结合免疫细胞特异性受体分子具有特异性的抗体、其片段或其变体的核苷酸序列。在一个实施例中，免疫细胞特异性受体分子是T细胞表面抗原。在一个实施例中，T细胞特异性受体分子是CD3、TCR、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、CD40、FcgRs、FceRs、FcaRs和CD95中的一种。

在各个实施例中，抗原结合结构域包括对结合抗原具有特异性的抗体、其片段或其变体。在一个实施例中，抗原是肿瘤抗原。在一个实施例中，所述抗原是CD19、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD33、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、卵泡刺激素受体(FSHR)、表皮生长因子受体(EGFR)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD123或人表皮生长因子受体2(Her2)。

在一个实施例中，编码CD19DBiTE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码CD19DBiTE的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，编码BCMADBiTE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码BCMADBiTE的核苷酸序列包括SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，编码CD33DBiTE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码CD33DBiTE的核苷酸序列包括SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，编码FAPBiTE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码FAPDBiTE的核苷酸序列包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，编码FSHRDBiTE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码FSHRDBiTE的核苷酸序列包括SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，编码EGFRDBiTE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码EGFRDBiTE的核苷酸序列包括SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，编码PSMADBiTE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:42或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码PSMADBiTE的核苷酸序列包括SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:43或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，编码CD123DBiTE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:48或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码CD123DBiTE的核苷酸序列包括SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，编码HER2DBiTE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:60或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码HER2DBiTE的核苷酸序列包括SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:67或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，编码EGFRvIII2DICE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:70或SEQ IDNO:72或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码EGFRvIII2DICE的核苷酸序列包括SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:71或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，编码HER2DICE的核苷酸序列编码SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:76或其片段或变体的氨基酸序列。在一个实施例中，编码HER2DICE的核苷酸序列包括SEQ IDNO:73或SEQ ID NO:75或其片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施例中，所述组合物包括编码抗Her2抗体(HER2DMAb)的核苷酸序列。在一个实施例中，编码HER2DMAb的核苷酸序列包括编码SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或其片段或变体的核苷酸序列。在一个实施例中，编码HER2DMAb的核苷酸序列包括SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63或其片段或变体。

在一个实施例中，所述组合物包括scFv抗Her2抗体。在一个实施例中，编码scFv抗Her2抗体的核苷酸序列包括编码SEQ ID NO:66或其片段或变体的核苷酸序列。在一个实施例中，编码scFv抗Her2抗体的核苷酸序列包括SEQ ID NO:65或其片段或变体。

表1：合成抗体序列

在某些实施例中，所述组合物可以治疗、预防和/或保护免受与本发明的合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)所结合抗原相关的疾病或障碍。在一个实施例中，本发明的组合物可以治疗、预防和/或保护免受与靶抗原表达相关的任何疾病、障碍或病症。在某些实施例中，所述组合物可治疗、预防和/或保护免受癌症。

合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)可治疗、预防和/或保护免受施用所述组合物的受试者中的疾病。合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)可促进施用所述组合物的受试者中的疾病存活。合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)可提供在施用所述组合物的受试者中疾病的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％存活。在其他实施例中，合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)可提供在施用所述组合物的受试者中疾病的至少约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％存活。

所述组合物可导致在对受试者施用所述组合物的至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时或60小时内在受试者中产生合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)。所述组合物可导致在对受试者施用所述组合物至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天内在受试者中产生合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)。所述组合物可导致在对受试者施用所述组合物约1小时至约6天、约1小时至约5天、约1小时至约4天、约1小时至约3天、约1小时至约2天、约1小时至约1天、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约1小时至约12小时或约1小时至约6小时内在受试者中产生合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)。

当将所述组合物施用于有需要的受试者时，可导致比在施用抗原诱导体液免疫应答的受试者中产生内源性抗体更快地在受试者中产生合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)。所述组合物可以导致在施用抗原诱导体液免疫应答的受试者中产生内源性抗体之前至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天产生合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)。

本发明的组合物可以具有有效组合物所需的特征，诸如安全，使得组合物不引起疾病或死亡；保护免受疾病；并且提供施用容易、副作用少、生物稳定性和每剂量低的成本。

重组核酸序列

如上所述，组合物可以包括重组核酸序列。重组核酸序列可以编码合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)、其片段、其变体或其组合。下文将更详细地描述所述抗体。

重组核酸序列可以是异源核酸序列。重组核酸序列可以包含至少一个异源核酸序列或一个或多个异源核酸序列。

重组核酸序列可以是优化的核酸序列。这种优化可以增加或改变抗体的免疫原性。优化还可以改善转录和/或翻译。优化可包含以下中的一项或多项：低GC含量前导序列，以增加转录；mRNA的稳定性和密码子优化；添加kozak序列(例如，GCC ACC)用于增加翻译；添加编码信号肽的免疫球蛋白(Ig)前导序列；并且尽可能消除顺式作用序列基序(即，内部TATA盒)。

重组核酸序列可以包含一个或多个重组核酸序列构建体。重组核酸序列构建体可以包含一种或多种组分，下面将更详细地描述。

重组核酸序列构建体可包含编码重链多肽、其片段、其变体或其组合的异源核酸序列。重组核酸序列构建体可包含编码轻链多肽、其片段、其变体或其组合的异源核酸序列。重组核酸序列构建体还可以包含编码蛋白酶或肽酶裂解位点的异源核酸序列。重组核酸序列构建体还可以包含编码内部核糖体进入位点(IRES)的异源核酸序列。IRES可能是病毒IRES或真核生物IRES。重组核酸序列构建体可以包含一个或多个前导序列，其中每个前导序列编码信号肽。重组核酸序列构建体可以包含一个或多个启动子、一个或多个内含子、一个或多个转录终止区、一个或多个起始密码子、一个或多个终止或停止密码子和/或一个或多个聚腺苷酸化信号。重组核酸序列构建体还可以包含一个或多个接头或标签序列。标签序列可以编码血凝素(HA)标签。

重链多肽

重组核酸序列构建体可包含编码重链多肽、其片段、其变体或其组合的异源核酸。重链多肽可以包含可变重链(VH)区和/或至少一个恒定重链(CH)区。所述至少一个恒定重链区可以包含恒定重链区1(CH1)、恒定重链区2(CH2)和恒定重链区3(CH3)和/或铰链区。

在一些实施例中，重链多肽可以包含VH区和CH1区。在其他实施例中，重链多肽可以包含VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。

重链多肽可以包含互补决定区(“CDR”)集。CDR集可以含有VH区的三个高变区。从重链多肽的N末端开始，这些CDR分别被表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3有助于抗原的结合或识别。

轻链多肽

重组核酸序列构建体可包含编码轻链多肽、其片段、其变体或其组合的异源核酸序列。轻链多肽可以包含可变轻链(VL)区和/或恒定轻链(CL)区。

轻链多肽可以包含互补决定区(“CDR”)集。CDR集可以含有VL区的三个高变区。从轻链多肽的N末端开始，这些CDR分别被表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可有助于抗原的结合或识别。

蛋白酶裂解位点

重组核酸序列构建体可以包含编码蛋白酶裂解位点的异源核酸序列。蛋白酶裂解位点可被蛋白酶或肽酶识别。蛋白酶可以是内肽酶或内蛋白酶，例如但不限于，弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、HtrA、钙蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。蛋白酶可以是弗林蛋白酶。在其他实施例中，蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或任何裂解内部肽键(即，不裂解N末端或C-末端肽键)的蛋白酶。

蛋白酶裂解位点可以包含促进或提高裂解效率的一个或多个氨基酸序列。所述一个或多个氨基酸序列可以促进或增加形成或产生离散多肽的效率。所述一个或多个氨基酸序列可以包含2A肽序列。

接头序列

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个接头序列。接头序列可以在空间上分离或连接本文所述的一种或多种组分。在其他实施例中，接头序列可以编码在空间上分离或连接两种或更多种多肽的氨基酸序列。在一个实施例中，接头序列是G4S接头序列，具有GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:68)的氨基酸序列。

启动子

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个启动子。所述一个或多个启动子可以是能够驱动基因表达和调节基因表达的任何启动子。这种启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列元件。用于指导基因表达的启动子的选择取决于具体的应用。在重组核酸序列构建体中，启动子可以定位在与它在其自然环境中距转录起始位点的距离大致相同的距转录起始位点的距离。然而，此距离的变化可以在不损失启动子功能的情况下调节。

启动子可以与编码重链多肽和/或轻链多肽的异源核酸序列可操作地连接。启动子可以是显示在真核细胞中有效表达的启动子。与编码序列可操作地连接的启动子可以是CMV启动子、来自猿猴病毒40(SV40)的启动子(诸如SV40早期启动子和SV40晚期启动子)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子(诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV立即早期启动子)、Epstein Barr病毒(EBV)启动子或Rous肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子也可以是来自人基因的启动子，诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肌酸、人多角体蛋白或人金属硫蛋白。

启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，其仅在宿主细胞暴露于某些特定的外部刺激时启动转录。在多细胞生物的情况下，启动子也可以对特定的组织或器官或发育阶段具有特异性。启动子也可以是组织特异性启动子，诸如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。这种启动子的示例描述于美国专利申请公开号US20040175727中，其内容通过引用整体并入本文。

启动子可以与增强子结合。增强子可以位于编码序列的上游。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肌酸或病毒增强子，诸如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的病毒增强子。多核苷酸功能增强描述于美国专利号5,593,972、5,962,428和W094/016737中，其内容全部通过引用并入。

转录终止区

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个转录终止区。转录终止区可以位于编码序列的下游，以提供有效的终止。转录终止区可以从与上述启动子相同的基因获得，或者可以从一个或多个不同的基因获得。

起始密码子

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个起始密码子。起始密码子可以位于编码序列的上游。起始密码子可以与编码序列在同一框架内。起始密码子可以与有效翻译起始所需的一个或多个信号相关，例如但不限于核糖体结合位点。

终止密码子

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个终止或停止密码子。终止密码子可以在编码序列的下游。终止密码子可以与编码序列在同一框架内。终止密码子可以与有效翻译终止所需的一个或多个信号相关联。

聚腺苷酸化信号

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号可以包含转录物有效聚腺苷酸化所需的一个或多个信号。聚腺苷酸化信号可以位于编码序列的下游。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号或人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号可能是来自pCEP4质粒(Invitrogen,San Diego,CA)的聚腺苷酸化信号。

前导序列

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个前导序列。前导序列可以编码信号肽。信号肽可以是免疫球蛋白(Ig)信号肽，例如但不限于IgG信号肽和IgE信号肽。

重组核酸序列构建体的表达

如上所述，重组核酸序列构建体可以在所述一种或多种组分中包含编码重链多肽的异源核酸序列和/或编码轻链多肽的异源核酸序列。因此，重组核酸序列构建体可以促进重链多肽和/或轻链多肽的表达。

当使用如上所述的排列1时，第一重组核酸序列构建体可以促进重链多肽的表达，且第二重组核酸序列构建体可以促进轻链多肽的表达。当使用如上所述的排列2时，重组核酸序列构建体可以促进重链多肽和轻链多肽的表达。

当在例如但不限于细胞、生物体或哺乳动物中表达时，重链多肽和轻链多肽可以组装到合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)中。特别地，重链多肽和轻链多肽可以相互作用，使得组装产生能够结合抗原的合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)。在其他实施例中，重链多肽和轻链多肽可以相互作用，使得组装产生与未如本文所述组装的抗体相比更具免疫原性的合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)。在另一些实施例中，重链多肽和轻链多肽可以相互作用，使得组装产生能够引发或诱导针对抗原的免疫应答的合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)。

载体

上述重组核酸序列构建体可置于一个或多个载体中。所述一个或多个载体可以含有复制起点。所述一个或多个载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。所述一个或多个载体可以是自复制染色体外载体，或整合入宿主基因组的载体。

所述一个或多个载体可以是异源表达构建体，其通常是用于将特定基因导入靶细胞的质粒。一旦表达载体位于细胞内，由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽就由细胞-转录和翻译机制核糖体络合物产生。所述一个或多个载体可以表达大量稳定的信使RNA，从而表达蛋白质。

表达载体

所述一个或多个载体可以是圆形质粒或线性核酸。圆形质粒和线性核酸能够指导特定核苷酸序列在合适的受试者细胞中的表达。包括重组核酸序列构建体的所述一个或多个载体可以是嵌合的，意味着其至少一种组分相对于其至少一种其他组分是异源的。

质粒

所述一个或多个载体可以是质粒。质粒可用于用重组核酸序列构建体转染细胞。质粒可用于将重组核酸序列构建体导入受试者。质粒还可包括调控序列，所述调控序列可非常适合于在施用所述质粒的细胞中的基因表达。

质粒还可以包括哺乳动物复制起点，以便在染色体外保持质粒并在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是来自Invitrogen(San Diego,CA)的pVAX1、pCEP4或pREP4，其可以包括Epstein Barr病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其可以产生高拷贝游离体复制而不整合。质粒的主链可以是pAV0242。质粒可能是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)质粒。

质粒可以是pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于大肠杆菌(E.coli)中的蛋白质生产。质粒也可以是p YES2(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株中的蛋白质生产。质粒也可以具有MAXBAC^TM完整杆状病毒表达系统(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于昆虫细胞中的蛋白质生产。质粒也可以是pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的蛋白质生产。

RNA

在一个实施例中，核酸分子是RNA分子。在一个实施例中，RNA分子由DNA序列转录。因此，在一个实施例中，本发明提供编码本发明的一种或多种合成抗体的RNA分子。RNA可能是正链的。因此，在一些实施例中，RNA分子可以被细胞翻译，而不需要任何中间的复制步骤，诸如逆转录。可用于本发明的RNA分子可以具有5'帽(例如，7-甲基鸟苷)。此帽可增强RNA的体内翻译。可用于本发明的RNA分子的5'核苷酸可以具有5'三磷酸基团。在加帽的RNA中，它可能通过5'-至-5'桥与7-甲基鸟苷连接。RNA分子可能有一个3'聚-A尾。它还可以包含接近其3'端的聚-A聚合酶识别序列(例如，AAUAAA)。可用于本发明的RNA分子可以是单链的。可用于本发明的RNA分子可包括合成RNA。在一些实施例中，RNA分子是裸RNA分子。在一个实施例中，RNA分子包括在载体中。

在一个实施例中，RNA具有5'和3'UTR。在一个实施例中，5'UTR的长度在零至3000个核苷酸之间。5'和3'UTR序列被添加到编码区的长度可以通过不同的方法进行改变，包含但不限于，设计退火至该UTR的不同区域的PCR的引物。使用这种方法，一个本领域的普通技术人员可以修改要在转染转录的RNA后达到最佳的翻译效率所需的5'和3'UTR的长度。

5'和3'UTR可以是天然存在的目标基因的内源性5'和3'UTR。另选地，目标基因的非内源UTR的序列可通过将UTR序列插入正向和反向引物或通过该模板的任何其他修改来添加。使用目标基因的非内源UTR序列对于改变RNA的稳定性和/或翻译效率是有用的。例如，已知3'UTR序列中富含AU的元素可降低RNA的稳定性。因此，3'UTR可以选择或设计为根据本领域中公知的UTR性质来增加转录的RNA的稳定性。

在一个实施例中，该5'UTR可以含有内源基因的Kozak序列。另选地，当目标基因的非内源5'UTR通过如上所述的PCR被加入时，一个共有Kozak序列可以通过添加5'UTR被重新设计。Kozak序列可以增加一些RNA转录物的翻译效率，但似乎并不是所有的RNA都需其来进行高效的翻译。许多RNA对Kozak序列的要求是本领域已知的。在其他实施例中，该5'UTR可以衍生自一个RNA病毒，其RNA基因组在细胞中稳定存在。在其他实施例中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止RNA的外切核酸酶降解。

在一个实施例中，RNA在5'端和3'poly(A)尾处均具有帽，其确定核糖体结合、翻译的起始和RNA在细胞中的稳定性。

在一个实施例中，RNA是核苷修饰的RNA。核苷修饰的RNA与非修饰的RNA相比具有特殊的优势，包含例如增加的稳定性、低的或不存在的先天免疫原性以及增强的翻译。

圆形和线性载体

所述一个或多个载体可以是圆形质粒，其可以通过整合到细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其他表达载体。

本文还提供线性核酸或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效地递送至受试者并表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。LEC可以是没有任何磷酸盐主链的任何线性DNA。LEC可能不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸盐主链。LEC可能不含与所需基因表达无关的其他核酸序列。

LEC可以来自能够线性化的任何质粒。质粒可以能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。质粒可以是pNP(波多黎各/34)或pM2(新喀里多尼亚/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其他表达载体。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别来自pNP(波多黎各/34)和pM2(新喀里多尼亚/99)。

制备载体的方法

本文提供一种制备所述一个或多个载体的方法，重组核酸序列构建体已置于所述载体中。在最后的亚克隆步骤之后，可以使用本领域已知的方法，将载体用于孵育大规模发酵罐中的细胞培养物。

在其他实施例中，在最终亚克隆步骤之后，载体可以与一个或多个电穿孔(EP)装置一起使用。下文将对EP装置进行更详细的描述。

所述一个或多个载体可以使用已知装置和技术的组合来配制或制造，但优选地，它们使用质粒制造技术来制造，所述质粒制造技术描述于许可的、共同未决的2007年5月23日提交的美国临时申请美国序列号60/939,792中。在一些示例中，本文所述的DNA质粒可以以大于或等于10mg/mL的浓度配制。制造技术还包含或结合除了在美国序列号60/939792中所述的那些，包含在发布于2007年7月3日的许可专利，美国专利号7,238,522中所述的那些之外的本领域普通技术人员公知的各种装置和协议。上述引用的申请和专利，美国序列号60/939,792和美国专利号7,238,522分别全文并入本文。

抗体

在一些实施例中，本发明涉及编码抗体、其片段、其变体或其组合的重组核酸序列。抗体可以与抗原结合或反应，这将在下面更详细地描述。在一些实施例中，抗体是DNA编码的单克隆抗体(DMAb)、其片段或其变体。在一些实施例中，所述片段是ScFv片段。在一些实施例中，所述抗体是DNA编码的双特异性T细胞连接子(BiTE)、其片段或其变体。

在一些实施例中，抗体可包括重链和轻链互补决定区(“CDR”)集，分别插入重链和轻链框架(“FR”)集之间，其为CDR提供支持并定义CDR相对于彼此的空间关系。CDR集可能含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区分别被表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可能包含六个CDR，包括来自重链和轻链V区中每一者的CDR集。

蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先裂解IgG分子，产生几个片段，其中两个(F(ab)片段)各包括一个共价异二聚体，共价异二聚体包含完整的抗原结合位点。胃蛋白酶能够裂解IgG分子，提供几个片段，包含F(ab')₂片段，它包括两个抗原结合位点。因此，抗体可以是Fab或F(ab')₂。Fab可以包含重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可以包含VH区和CH1区。Fab的轻链可以包含VL区和CL区。

抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。例如，Ig可以是IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可以包含重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包含VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包含VL区和CL区。

抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的抗体，其结合具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。

抗体可以是如下更详细描述的双特异性抗体。也是如下文更详细描述的，抗体可以是双功能抗体。

如上所述，在将组合物施用于受试者时，可在受试者中产生抗体。抗体在受试者体内可能有半衰期。在一些实施例中，可以修饰抗体以延长或缩短其在受试者体内的半衰期。下面将更详细地描述这些修饰。

如下文更详细描述的，抗体可被脱岩藻糖基化。

ScFv抗体

在一个实施例中，本发明的DMAb是ScFv DMAb。在一个实施例中，ScFv DMAb涉及不含CH1和CL区的Fab片段。因此，在一个实施例中，ScFv DMAb涉及包括VH和VL的Fab片段DMAb。在一个实施例中，ScFv DMAb包括VH和VL之间的接头。在一个实施例中，ScFv DMAb是ScFv-Fc DMAb。在一个实施例中，ScFv-Fc DMAb包括VH、VL以及CH2和CH3区。在一个实施例中，ScFv-Fc DMAb包括VH和VL之间的接头。在一个实施例中，与亲本DMAb相比，本发明的ScFv DMAb具有修饰的表达、稳定性、半衰期、抗原结合、重链-轻链配对、组织穿透或其组合。

在一个实施例中，本发明的ScFv DMAb具有比亲本DMAb高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍的表达。

在一个实施例中，本发明的ScFv DMAb具有比亲本DMAb高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍的抗原结合。

在一个实施例中，本发明的ScFv DMAb具有比亲本DMAb长至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍的半衰期。

在一个实施例中，本发明的ScFv DMAb具有比亲本DMAb高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍的稳定性。

在一个实施例中，本发明的ScFv DMAb具有比亲本DMAb大至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍的组织穿透性。

在一个实施例中，本发明的ScFv DMAb具有比亲本DMAb大至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍的重链-轻链配对。

在一个实施例中，抗HER2 scFv抗体包括与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗HER2 scFv抗体包括SEQ ID NO:66的氨基酸，或SEQ ID NO:66的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗HER2 scFv抗体包括与SEQ ID NO:65编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:65之一编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗HER2scFv抗体包括由SEQ ID NO:65编码的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:65编码的氨基酸序列的片段。

单克隆抗体

在一个实施例中，本发明提供抗HER2抗体。抗体可以是完整的单克隆抗体，以及免疫活性片段(例如，Fab或(Fab)₂片段)、单克隆抗体重链或单克隆抗体轻链。

抗体可包括重链和轻链互补决定区(“CDR”)集，分别插入重链和轻链框架(“FR”)集之间，其为CDR提供支持并定义CDR相对于彼此的空间关系。CDR集可能含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区分别被表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可能包含六个CDR，包括来自重链和轻链V区中每一者的CDR集。

抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。例如，Ig可以是IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可以包含重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包含VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包含VL区和CL区。

在一个实施例中，针对在人中的表达优化抗HER2抗体。在一个实施例中，抗HER2抗体包括与SEQ ID NO:62的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:62的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗HER2抗体包括SEQ IDNO:62的氨基酸，或SEQ ID NO:62的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗HER2抗体包括与SEQ ID NO:61编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:61之一编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗HER2抗体包括由SEQ ID NO:61编码的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:61编码的氨基酸序列的片段。

在一个实施例中，针对在小鼠中的表达优化抗HER2抗体。在一个实施例中，抗HER2抗体包括与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗HER2抗体包括SEQ IDNO:64的氨基酸，或SEQ ID NO:64的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗HER2抗体包括与SEQ ID NO:61编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:63之一编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗HER2抗体包括由SEQ ID NO:63编码的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:63编码的氨基酸序列的片段。

双特异性T细胞连接子

如上所述，重组核酸序列可以编码双特异性T细胞连接子(BiTE)、其片段、其变体或其组合。BiTE的抗原靶向结构域可与抗原结合或反应，下文将对此进行更详细的描述。

BiTE的抗原靶向结构域可以包括抗体、其片段、其变体或其组合。BiTE的抗原靶向结构域可包括重链和轻链互补决定区(“CDR”)集，分别插入重链和轻链框架(“FR”)集之间，其为CDR提供支持并定义CDR相对于彼此的空间关系。CDR集可能含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区分别被表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合结构域可能包含六个CDR，包括来自重链和轻链V区中每一者的CDR集。

蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先裂解IgG分子，产生几个片段，其中两个(F(ab)片段)各包括一个共价异二聚体，共价异二聚体包含完整的抗原结合位点。胃蛋白酶能够裂解IgG分子，提供几个片段，包含F(ab')₂片段，它包括两个抗原结合位点。因此，BiTE的抗原靶向结构域可以是Fab或F(ab')₂。Fab可以包含重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可以包含VH区和CH1区。Fab的轻链可以包含VL区和CL区。

BiTE的抗原靶向结构域可以是免疫球蛋白(Ig)。例如，Ig可以是IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可以包含重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包含VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包含VL区和CL区。

BiTE的抗原靶向结构域可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的抗体，其结合具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。

在一个实施例中，本发明的DBiTE的抗原结合结构域和免疫细胞结合结构域中的至少一个是如上详细描述的ScFv DNA编码的单克隆抗体(ScFv DMAb)。

双特异性抗体

重组核酸序列可以编码双特异性抗体、其片段、其变体或其组合。双特异性抗体可以结合两种抗原或与两种抗原反应，例如下面更详细描述的两种抗原。双特异性抗体可以由本文所述的两种抗体的片段构成，从而允许双特异性抗体与两种期望的靶分子、配体(包含受体的配体)、受体(包含受体上的配体结合位点)、配体-受体络合物和标记物结合或反应，所述靶分子可以包含下文更详细描述的抗原。

本发明提供新颖的双特异性抗体，其包括特异性结合第一靶的第一抗原结合位点和特异性结合第二靶的第二抗原结合位点，具有特别有利的性质，诸如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、某些T细胞的特异性靶向、靶向效率和降低的毒性。在一些情况下，存在双特异性抗体，其中双特异性抗体以高亲和力结合第一靶，并以低亲和力结合第二靶。在其他情况下，存在双特异性抗体，其中双特异性抗体以低亲和力结合第一靶，并以高亲和力结合第二靶。在其他情况下，存在双特异性抗体，其中双特异性抗体以期望的亲和力结合第一靶，并以期望的亲和力结合第二靶。

在一个实施例中，双特异性抗体是二价抗体，其包括a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链。

根据本发明的双特异性抗体分子可以具有任何所需特异性的两个结合位点。在一些实施例中，结合位点之一能够肿瘤抗原。在一些实施例中，包含在Fab片段中的结合位点是对肿瘤抗原具有特异性的结合位点。在一些实施例中，包含在单链Fv片段中的结合位点是对肿瘤抗原诸如CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA、CD123或Her2具有特异性的结合位点。

在一些实施例中，根据本发明的抗体分子的结合位点之一能够结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤细胞(NK细胞)特异性受体分子。T细胞特异性受体是所谓的“T细胞受体”(TCR)，它允许T细胞与另一细胞(称为抗原呈递细胞或APC)呈递的表位/抗原结合，并在存在额外信号时被其活化和并作出应答。已知T细胞受体类似于天然免疫球蛋白的Fab片段。它通常是单价的，包含α-和β-链，在一些实施例中，它包含γ-链和δ-链条(如上)。因此，在一些实施例中，TCR是TCR(α/β)，且在一些实施例中，它是TCR(γ/δ)。T细胞受体与CD3 T细胞共受体形成络合物。CD3是一种蛋白质络合物，且由四条不同的链构成。在哺乳动物中，所述络合物含有一条CD3γ链、一条CD36链和两条CD3E链。这些链与称为T细胞受体(TCR)和ζ-链的分子结合，在T淋巴细胞中产生活化信号。因此，在一些实施例中，T细胞特异性受体是CD3 T细胞共受体。在一些实施例中，T细胞特异性受体是CD28，也在T细胞上表达的蛋白。CD28可提供T细胞活化所需的共刺激信号。CD28在T细胞增殖和存活、细胞因子产生以及T辅助细胞2型发育中起重要作用。T细胞特异性受体的再一个示例是CD134，也称为Ox40。CD134/OX40在活化24至72小时后表达，且可用于定义次级共刺激分子。T细胞受体的另一个示例是4-1BB，其能够结合抗原呈递细胞(APC)上的4-1BB-配体，由此产生T细胞的共刺激信号。另一个主要在T细胞上发现的受体的示例是CD5，它也以低水平在B细胞上发现。修改T细胞功能的受体的另一个示例是CD95，也称为Fas受体，它通过在其他细胞表面上表达的Fas配体介导凋亡信号传导。据报道，CD95可调节静息T淋巴细胞中由TCR/CD3驱动的信号传导通路。

NK细胞特异性受体分子的一个示例是CD16，低亲和力Fc受体和NKG2D。T细胞和自然杀伤(NK)细胞表面上都存在的受体分子的示例是CD2和CD2-超家族的其他成员。CD2能够作为共刺激分子作用于T细胞和NK细胞。

在一些实施例中，抗体分子的第一结合位点结合肿瘤抗原，且第二结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子。

在一些实施例中，抗体分子的第一结合位点结合CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA、CD123或Her2，且第二结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子。在一些实施例中，抗体分子的第一结合位点结合CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA、CD123或Her2，且第二结合位点结合CD3、TCR、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、CD40、FcgRs、FceRs、FcaRs和CD95中的一种。在一些实施例中，抗体分子的第一结合位点结合CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA、CD123或Her2，且第二结合位点结合CD3。

在一些实施例中，抗体分子的第一结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子，且第二结合位点结合肿瘤抗原。在一些实施例中，抗体的第一结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子，且第二结合位点结合CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA、CD123或Her2。在一些实施例中，抗体的第一结合位点结合CD3、TCR、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、CD40、FcgRs、FceRs、FcaRs和CD95中的一者，且第二结合位点结合CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA、CD123或Her2。在一些实施例中，抗体的第一结合位点结合CD3，且第二结合位点结合CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA、CD123或Her2。

在一个实施例中，本发明的双特异性抗体包括DBiTE，其包括本文所述的一种或多种scFv抗体片段，从而允许DBiTE与所需靶分子结合或反应。

在一个实施例中，DBiTE包括编码特异性结合与特异性结合T细胞特异性受体分子的第二scFv连接的靶疾病特异性抗原的第一scFv的核酸分子。连接可以以任何顺序放置第一和第二结构域，例如，在一个实施例中，编码特异性结合靶疾病特异性抗原的scFv的核苷酸序列被取向在编码特异性结合T细胞特异性受体分子的scFv的核苷酸序列的5'(或上游)。在另一个实施例中，编码特异性结合靶疾病特异性抗原的scFv的核苷酸序列被取向在编码特异性结合T细胞特异性受体分子的scFv的核苷酸序列的3'(或下游)。

双功能抗体

重组核酸序列可以编码双功能抗体、其片段、其变体或其组合。双功能抗体可与下述抗原结合或反应。还可以修饰双功能抗体，以赋予抗体除识别和结合抗原之外的额外功能。这种修饰可以包含但不限于与因子H或其片段偶联。因子H是补体活化的可溶性调节因子，且因此可能通过补体介导的裂解(CML)促进免疫应答。

延长抗体半衰期

如上所述，合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)可进行修饰，以延长或缩短抗体在受试者中的半衰期。修饰可延长或缩短抗体在受试者血清中的半衰期。

修饰可以存在于抗体的恒定区。修饰可以是抗体恒定区中的一个或多个氨基酸取代，与不含所述一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期相比，其延长抗体的半衰期。修饰可以是抗体的CH2结构域中的一个或多个氨基酸取代，与不含所述一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期相比，其延长抗体的半衰期。

在一些实施例中，恒定区中的一个或多个氨基酸取代可以包含用酪氨酸残基取代恒定区中的甲硫氨酸残基，用苏氨酸残基取代恒定区中的丝氨酸残基，用谷氨酸残基取代恒定区中的苏氨酸残基，或其任意组合，从而延长抗体的半衰期。

在其他实施例中，恒定区中的一个或多个氨基酸取代可以包含用酪氨酸残基取代CH2结构域中的甲硫氨酸残基，用苏氨酸残基取代CH2结构域中的丝氨酸残基，用谷氨酸残基取代CH2结构域中的苏氨酸残基，或其任意组合，从而延长抗体的半衰期。

脱岩藻糖基化

重组核酸序列可以编码未岩藻糖基化的抗体(即脱岩藻糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体)、其片段、其变体或其组合。岩藻糖基化包含将岩藻糖添加到分子中，例如，将岩藻糖附着到N-聚糖、O-聚糖和糖脂。因此，在脱岩藻糖基化抗体中，岩藻糖不附着到恒定区的碳水化合物链。反过来，与岩藻糖基化抗体相比，这种岩藻糖基化的缺乏可通过抗体改善FcγRIIIa结合和抗体定向细胞毒性(ADCC)活性。因此，在一些实施例中，与岩藻糖基化抗体相比，非岩藻糖基化抗体可以表现出增加的ADCC活性。

可以修饰抗体以防止或抑制抗体的岩藻糖基化。在一些实施例中，与未修饰的抗体相比，这种修饰的抗体可以表现出增加的ADCC活性。修饰可以在重链、轻链或其组合中。修饰可以是重链中的一个或多个氨基酸取代，轻链中的一个或多个氨基酸取代，或其组合。

抗原

在一个实施例中，合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)针对抗原或其片段或变体。抗原可以是核酸序列、氨基酸序列、多糖或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。多糖可以是核酸编码的多糖。

抗原可以是肿瘤抗原。抗原可能与癌症发生或进展的风险增加有关。在一个实施例中，抗原可以是CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA、CD123或Her2。

在一个实施例中，本发明的合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子靶向两种或更多种抗原。在一个实施例中，双特异性抗体的至少一种抗原是肿瘤抗原。在一个实施例中，双特异性抗体的至少一种抗原是T细胞活化抗原。

肿瘤抗原

本发明的合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)的抗原结合结构域可与肿瘤抗原相互作用。在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性障碍抗原”或“与过度增殖性障碍相关的抗原”指的是特定过度增殖性障碍诸如癌症所共有的抗原。

本发明中涉及的肿瘤抗原的类型可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对于肿瘤细胞是独特的，并且不会发生在机体内的其他细胞上。TAA抗原并非肿瘤细胞所独有，相反，在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下，所述抗原也在正常细胞上表达。肿瘤上的抗原的表达可在使得免疫系统能够对抗原产生响应的条件下发生。TAA可能是在胎儿发育期间免疫系统不成熟且无法应答时在正常细胞上表达的抗原，它们也可能是在正常细胞上以极低水平正常存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。

所讨论的抗原仅是示例中包含的抗原。该列表并非意在排他，并且进一步的示例对本领域的技术人员将是显而易见的。

肿瘤抗原是由引起免疫应答，特别是T细胞介导的免疫反应的肿瘤细胞所产生的蛋白质。本发明抗原结合部分的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原是本领域熟知的，且包含例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、前列腺标志物、PSMA、Her2、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。

肿瘤相关表面抗原的说明性示例是CD10、CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、B细胞成熟抗原(BCMA)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、表皮生长因子受体(EGFR)、Her2、Her3、IGFR、CD133、IL3R、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CDCP1、Derlin1、腱生蛋白、卷曲蛋白1-10、血管抗原VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4，CD309)、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)内皮素、CLEC14、Tem1-8和Tie2。进一步的示例可包含A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐酶IX(MN/CAIX)、CD21、CD25、CD30、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、de2-7EGFR、EGFRvIII、EpCAM、Ep-CAM、叶酸结合蛋白、G250、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、卵泡刺激素受体(FSHR)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑色素瘤相关细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)和TAG-72。在肿瘤细胞外基质上表达的抗原的示例是腱生蛋白和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

在一个实施例中，肿瘤抗原是可用于靶向特定受体的激素或其片段。示例包含但不限于FSH激素、LH激素、TSH激素或其片段。

非限制性的TSA或TAA抗原示例包含以下：分化抗原(诸如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2)和肿瘤特异性多系抗原诸如(MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15)；过表达的胚胎抗原诸如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因诸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他较大的基于蛋白质的抗原包含TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

本发明的方面包含用于增强有需要的受试者中针对抗原的免疫应答的组合物，其包括能够在受试者中产生免疫应答的合成抗体(例如，DMAb、ScFv抗体片段、DICE或DBiTE)或其生物学功能性片段或变体。在一些实施例中，抗原是CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA、CD123或Her2。在一些实施例中，本发明的合成抗体是包括靶向CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA、CD123或Her2的scFv的DBiTE。

T细胞特异性受体

在一个实施例中，本发明的DBiTE或DICE包括T细胞特异性受体的scFv。T细胞特异性受体包含但不限于CD3、TCR、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、CD40、FcgRs、FceRs、FcaRs和CD95。

赋形剂和组合物的其他组分

所述组合物可以进一步包括药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子诸如介体、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包含表面活性剂，诸如免疫刺激络合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物，包含单磷酰基脂质A、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。

转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包含聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，且聚-L-谷氨酸盐可以低于6mg/ml的浓度存在于组合物中。转染促进剂还可包含表面活性剂诸如免疫刺激络合物(ISCOMS)、费氏不完全佐剂、LPS类似物，包含单磷酰基脂质A、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯，且透明质酸也可与组合物联合施用。所述组合物还可以包括转染促进剂诸如脂质、脂质体(包含卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，作为DNA-脂质体混合物)(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包含聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。转染剂在组合物中的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

该组合物可以进一步包括基因促进剂，如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所述，其通过引用完全并入。

所述组合物可以包括约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；或优选约0.1微克至约10毫克；或更优选约1毫克至约2毫克的量的DNA。在一些优选的实施例中，根据本发明的组合物包括约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选的实施例中，组合物可以含有约10纳克至约800微克的DNA。在一些优选的实施例中，组合物可以含有约0.1至约500微克的DNA。在一些优选的实施例中，组合物可以含有约1至约350微克的DNA。在一些优选的实施例中，组合物可以含有约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；约0.1微克至约10毫克；约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0.1至约500微克、约1至约350微克、约25至约250微克、约100至约200微克的DNA。

所述组合物可根据所用的施用方式进行配制。可注射的药物组合物可以是无菌的、无热原的和无微粒的。可以使用等渗制剂或溶液。等渗性添加剂可包含氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。所述组合物可以包括血管收缩剂。等渗溶液可以包含磷酸盐缓冲盐水。所述组合物可以进一步包括稳定剂，包含明胶和白蛋白。稳定剂(包含LGS或聚阳离子或聚阴离子)可使制剂在室温或环境温度下长时间保持稳定。

产生合成抗体的方法

本发明还涉及产生合成抗体的方法。所述方法可包含通过使用下文更详细描述的递送方法将所述组合物施用给有需要的受试者。因此，向受试者施用组合物后，在受试者中或体内产生合成抗体。

所述方法还可以包含将组合物引入一个或多个细胞中，且因此，可以在所述一个或多个细胞中产生或生产合成抗体。所述方法可以进一步包含将组合物引入一个或多个组织，例如但不限于皮肤和肌肉，且因此，可以在所述一个或多个组织中产生或生产合成抗体。

组合物的递送方法

本发明还涉及将所述组合物递送至有需要的受试者的方法。递送方法可以包含向受试者施用组合物。施用可包含但不限于DNA注射(有或无体内电穿孔)、脂质体介导的递送和纳米颗粒促进的递送。

接受组合物递送的哺乳动物可以是人、灵长类动物、非人灵长类动物、母牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、大羊驼、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。

组合物可以通过不同途径施用，包含口服、肠胃外、舌下、经皮、直肠、经粘膜、局部、通过吸入、通过经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、鞘内和关节内或其组合。对于兽医用途，根据正常的兽医实践，组合物可以作为合适的可接受的制剂施用。兽医可以很容易地确定最适合特定动物的给药方案和施用途径。组合物可以通过传统的注射器、无针注射装置、“微喷射轰击枪”或其他物理方法诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声来施用。

电穿孔

通过电穿孔施用所述组合物可使用电穿孔装置来完成，所述电穿孔装置可经配置以将有效引起细胞膜中形成可逆孔的能量脉冲递送到哺乳动物的所需组织，且优选所述能量脉冲是类似于由用户输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置可以包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔部件可以包含并结合电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包含：控制器、电流波形产生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器部件、电源和电源开关。电穿孔可以使用体内电穿孔装置完成，例如CELLECTRAEP系统(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)或Elgen电穿孔器(InovioPharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)以促进质粒转染细胞。

电穿孔部件可用作电穿孔装置的一个元件，而其他元件是与电穿孔部件通信的单独元件(或部件)。电穿孔部件可用作电穿孔装置的多于一个元件，其可与电穿孔装置的与电穿孔部件分离的另一些元件通信。作为一个机电或机械装置的一部分而存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为这些元件可以用作一个装置或用作彼此通信的单独元件。电穿孔部件可以能够递送在期望的组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包含反馈机制。电极组件可以包含具有空间排列的多个电极的电极阵列，其中电极组件接收来自电穿孔部件的能量脉冲，并通过电极将其递送到期望的组织。所述多个电极中的至少一个在能量脉冲的递送期间是中性的，并且测量期望的组织中的阻抗，并且将阻抗传送到电穿孔部件。反馈机制可以接收测量的阻抗并且可以调节由电穿孔部件递送的能量脉冲以保持恒定的电流。

多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。所述多个电极可以通过在编程序列下控制电极以分散模式递送能量脉冲，并且用户将编程序列输入到电穿孔部件。编程序列可包括按顺序递送的多个脉冲，其中所述多个脉冲中的每个脉冲由具有测量阻抗的一个中性电极的至少两个有源电极递送，且其中所述多个脉冲中的后续脉冲由具有测量阻抗的一个中性电极的至少两个有源电极中的不同一个递送。

反馈机制可以由硬件或软件来执行。反馈机制可以由模拟闭环电路来执行。反馈每50μs、20μs、10μs或1μs出现，但优选地是实时反馈或瞬时的(即，如用于确定响应时间的可用技术所确定的，基本上是瞬时的)。中性电极可以测量期望的组织中的阻抗，并将阻抗传送到反馈机制，并且反馈机制响应于所述阻抗并且调节能量脉冲以将恒定电流保持在与预设电流类似的值。反馈机制可以在能量脉冲的递送期间连续且瞬时地保持恒定电流。

可有助于递送本发明组合物的电穿孔装置和电穿孔方法的示例包含在Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963、Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630中描述的那些，其内容通过引用整体并入本文。可用于促进组合物递送的其他电穿孔装置和电穿孔方法包含在2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的那些，其根据35USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149以及2007年10月10日提交的60/978,982的权益，所有这些专利整体并入本文。

Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963描述模块化电极系统及其用于促进将生物分子引入身体或植物中的选定组织的细胞中的用途。模块化电极系统可以包括多个针电极；皮下注射针；电连接器，提供从可编程恒定电流脉冲控制器到所述多个针电极的导电链路；和电源。操作者可以抓住安装在支撑结构上的所述多个针电极，并将它们牢固地插入身体或植物中的选定组织中。然后通过皮下注射针将生物分子递送到选定组织中。可编程恒定电流脉冲控制器被活化，并且恒定电流电脉冲被施加到所述多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲有助于将生物分子引入所述多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的全部内容通过引用并入本文。

Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630描述一种电穿孔装置，其可用于有效地促进将生物分子引入身体或植物中的选定组织的细胞中。电穿孔装置包括动电装置(“EKD装置”)，其操作由软件或固件规定。EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输入，在阵列中的电极之间产生一系列可编程恒定电流脉冲图案，并允许存储和采集电流波形数据。电穿孔装置还包括具有针电极阵列的可更换电极盘、用于注射针的中心注射通道和可移除引导盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容通过引入并入本文。

在美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法可适于不仅深入到诸如肌肉等组织中，而且深入到其他组织或器官中。由于电极阵列的配置，注射针(以递送所选择的生物分子)也完全插入到靶器官中，并且在由电极预先描绘的区域中垂直于靶组织进行注射。在美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/005263中描述的电极优选为20毫米长和21号规格。

此外，在结合电穿孔装置及其用途的一些实施例中，设想电穿孔装置，这些电穿孔装置是在以下专利中描述的那些：1993年12月28日发布的美国专利5,273,525、2000年8月29日发布的美国专利6,110,161、2001年7月17日发布的6,261,281和2005年10月25日发布的6,958,060，以及2005年9月6日发布的美国专利6,939,862。此外，涵盖2004年2月24日发布的美国专利6,697,669(其涉及使用多种装置中的任一种递送DNA)和2008年2月5日发布的美国专利7,328,064(其涉及注射DNA的方法)中所提供的主题的专利在本文中设想到。上述专利通过引用整体并入本文。

治疗方法

本文还提供通过在有需要的受试者中产生合成抗体(例如，DMAb、ScFv片段或DBiTE)来治疗、保护免受和/或预防受试者中的疾病的方法。所述方法可以包含向受试者施用组合物。向受试者施用组合物可以使用上述递送方法来进行。

在某些实施例中，本发明提供一种治疗、保护免受和/或预防癌症的方法。在一个实施例中，所述方法治疗、保护免受和/或预防肿瘤生长。在一个实施例中，所述方法治疗、保护免受和/或预防癌症进展。在一个实施例中，所述方法治疗、保护免受和/或预防癌症转移。

在一个实施例中，本发明提供预防良性肿瘤(诸如但不限于子宫肌瘤)生长的方法。所述方法包括将有效量的一种或多种本发明的组合物施用于被诊断患有良性肿瘤的受试者。

在受试者中产生合成抗体(例如，DMAb、ScFv片段或DBiTE)时，合成抗体(例如，DMAb、ScFv片段或DBiTE)可以与抗原结合或反应。这种结合可中和抗原，阻断另一分子(例如，蛋白质或核酸)对抗原的识别，并引发或诱导针对抗原的免疫应答，从而治疗、保护免受和/或预防受试者中与抗原相关的疾病。

组合物的剂量可以在1μg至10mg活性组分/kg体重/时间之间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。组合物可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用一次。有效治疗的组合物剂量的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

癌症疗法

本发明提供治疗或预防癌症，或治疗和预防肿瘤生长或转移的方法。本发明的相关方面提供预防、辅助预防和/或减少个体中增值性细胞或肿瘤细胞转移的方法。

本发明的一个方面提供一种在有需要的个体中抑制转移的方法，所述方法包括对个体施用有效量的本发明组合物。本发明进一步提供一种抑制有需要的个体中的转移的方法，所述方法包括对个体施用有效转移抑制量的本文所述的任何一种组合物。

在治疗或预防癌症，或治疗和预防有需要的个体中的肿瘤转移的一些实施例中，对所述个体施用第二药剂，诸如抗肿瘤剂。在一些实施例中，第二药剂包括第二转移抑制剂，诸如纤溶酶原拮抗剂或腺苷脱氨酶拮抗剂。其他实施例中，第二药剂是血管生成抑制剂。

本发明的组合物可用于预防、减轻、最小化、控制和/或减少人和动物中的癌症。本发明的组合物还可用于减缓原发性肿瘤生长的速率。本发明的组合物在施用于需要治疗的受试者时可用于阻止癌细胞的扩散。因此，本发明的组合物可以作为与一种或多种药物或其他药剂的联合疗法的一部分施用。当用作联合疗法的一部分时，由本发明的组合物提供的转移的减少和原发性肿瘤生长的减少允许更有效和高效地使用用于治疗患者的任何药物或药物疗法。此外，通过本发明的组合物对转移的控制赋予受试者将疾病集中在一个位置的更大能力。

在一个实施例中，本发明提供预防恶性肿瘤或其他癌细胞转移以及降低肿瘤生长速率的方法。所述方法包括将有效量的一种或多种本发明的组合物施用于被诊断患有恶性肿瘤或癌细胞的受试者或具有肿瘤或癌细胞的受试者。

以下是可通过本发明的方法和组合物治疗的癌症的非限制性示例：急性成淋巴细胞癌；急性髓性白血病；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，儿童期；阑尾癌；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤，儿童期；脑肿瘤，成人；脑肿瘤，脑干胶质瘤，儿童期；脑肿瘤，中枢神经系统非典型畸胎样/横纹肌样瘤，儿童期；中枢神经系统胚胎性肿瘤；小脑星形细胞瘤；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；颅咽管瘤；室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；中间分化的松果体实质肿瘤；幕上原始神经外胚层肿瘤与松果体细胞瘤；视觉通路与下丘脑胶质瘤；脑和脊髓肿瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；类癌瘤，胃肠道；中枢神经系统非典型畸胎样/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童期；宫颈癌；脊索瘤，儿童期；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增殖性障碍；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；食道癌；肿瘤尤因家族；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑色素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃部)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；生殖细胞肿瘤，颅外；生殖细胞肿瘤，性腺外；生殖细胞肿瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；胶质瘤；胶质瘤，儿童脑干；胶质瘤，儿童脑星形细胞瘤；胶质瘤、儿童视觉通路与下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；组织细胞增生症，朗格汉斯细胞；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑-视觉通路胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；肾(肾细胞)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；白血病，急性淋巴细胞性；白血病，急性髓性；白血病，慢性淋巴细胞性；白血病，慢性髓性；白血病，毛细胞；唇、口腔癌；肝癌；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤，艾滋病相关；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，霍奇金；淋巴瘤，非霍奇金；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，登斯透姆；骨恶性纤维组织瘤与骨肉瘤；髓母细胞瘤；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内(眼)；默克尔细胞癌；间皮瘤；转移性鳞状颈癌伴隐匿性原发灶；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征，(儿童期)；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤；霉菌病；蕈样肉芽肿；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增值性疾病；髓性白血病，慢性；髓性白血病，成人急性；髓性白血病，儿童急性；骨髓瘤，多发性；骨髓增殖性疾病，慢性；鼻腔鼻窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤及骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜能肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，胰岛细胞瘤；乳头状瘤病；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；中间分化的松果体实质肿瘤；松果体细胞瘤与幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体肿瘤；浆细胞瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂、输尿管、移行细胞癌；涉及15号染色体NUT基因的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤，尤因肿瘤家族；肉瘤，卡波西；肉瘤，软组织；肉瘤，子宫；塞扎里综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，默克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌，鳞状颈癌伴隐匿性原发性、转移性；胃(胃部)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；喉癌；胸腺瘤与胸腺癌；甲状腺癌；肾盂输尿管移行细胞癌；滋养细胞肿瘤，妊娠；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；登斯透姆巨球蛋白血症；和威尔姆斯肿瘤。

在一个实施例中，本发明提供一种治疗癌症转移的方法，所述方法包括在用本发明的组合物治疗之前、同时或之后用针对癌症的补充疗法诸如手术、化疗、化疗剂、放射疗法或激素疗法或其组合来治疗受试者。

化疗剂包含细胞毒性剂(例如，5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、氧代柔比星、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、阿糖胞苷USP、环磷酰胺、雌莫司汀磷酸钠、六甲蜜胺、羟基脲、异环磷酰胺、丙卡巴肼、丝裂霉素、白消安、环磷酰胺、米托蒽醌、卡铂、顺铂、干扰素α-2a重组体、紫杉醇、替尼泊苷和链脲佐菌素)、细胞毒性烷基化剂(例如，白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑或乙基磺酸)、烷基化剂(例如，亮氨酸溶肉瘤素、AZQ、BCNU、白消安、亚硫酸氢盐、羧基邻苯二甲酸铂、CBDCA、CCNU、CHIP、苯丁酸氮芥、氯脲霉素、顺铂、氯乙矾、氰基吗啉代多柔比星、环迪松、环磷酰胺、二羟半乳糖醇、氟多巴、庚苏泛、羟胺硫蒽酮、异环磷酰胺、美法仑、甲基CCNU、丝裂霉素C、米托唑酰胺、氮芥、PCNU、哌嗪、哌嗪二酮、哌泊溴烷、泊非霉素、螺乙内酰脲芥剂、链脲霉素、替罗昔隆、四铂、噻替派、曲他胺、尿嘧啶氮芥和Yoshi-864)、抗有丝分裂剂(例如，别秋水仙碱、软海绵素M、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、尾海兔素10、美登木碱、根霉素、紫杉醇衍生物、紫杉醇、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春碱和硫酸长春新碱)、植物生物碱(例如，放线菌素D、博来霉素、L-天冬酰胺酶、伊达比星、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、光辉霉素、丝裂霉素、柔红霉素、VP-16-213、VM-26、长春瑞滨和泰索帝)、生物制剂(例如，α干扰素、BCG、G-CSF、GM-CSF和白细胞介素-2)、拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱、喜树碱衍生物和吗啉代多柔比星)、拓扑异构酶II抑制剂(例如，米托蒽醌、氨萘非特、m-AMSA、蒽吡唑衍生物、吡唑并吖啶、比生群HCL、柔红霉素、脱氧多柔比星、美诺立尔、N,N-二苄基柔红霉素、噁蒽唑、正定苯酰肼、VM-26和VP-16)和合成药物(例如，羟基脲、丙卡巴嗪、o,p'-DDD、达卡巴嗪、CCNU、BCNU、顺式二胺二氯铂、米托蒽醌、CBDCA、左旋咪唑、六甲基三聚氰胺、全反式视黄酸、卡氮芥和卟吩姆钠)。

抗增殖剂是降低细胞增殖的化合物。抗增殖剂包含烷基化剂、抗代谢物、酶、生物响应调节剂、各种药剂、激素和拮抗剂、雄激素抑制剂(例如，氟他胺和醋酸亮丙瑞林)、抗雌激素(例如，枸橼酸他莫昔芬及其类似物、托瑞米芬、屈洛昔芬和雷洛昔芬)。具体抗增殖剂的其他示例包含但不限于左旋咪唑、硝酸镓、格拉司琼、沙格司亭锶-89氯化物、非格司亭、匹鲁卡品、右丙亚胺和昂丹司琼。

本发明的化合物可以单独施用或与其他抗肿瘤剂，包含细胞毒性/抗肿瘤剂和抗血管生成剂联合施用。细胞毒性/抗肿瘤剂被定义为攻击和杀伤癌细胞的药剂。一些细胞毒性/抗肿瘤剂是烷基化剂，其将肿瘤细胞中的遗传物质烷基化，例如顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、贝鲁司汀、尿嘧啶氮芥、氯苯匹嗪和达卡巴嗪。其他细胞毒性/抗肿瘤剂是肿瘤细胞的抗代谢物，例如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴嗪。其他细胞毒性/抗肿瘤剂是抗生素，例如，多柔比星、博来霉素、更生霉素、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、自力霉素C和柔红霉素。这些化合物有多种市售脂质体制剂。另一些细胞毒性/抗肿瘤剂是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些药剂包含长春新碱、长春碱和依托泊甙。各种细胞毒性/抗肿瘤剂包含紫杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。

抗血管生成剂是本领域技术人员熟知的。用于本发明的方法和组合物中的合适的抗血管生成剂包含抗VEGF抗体，包含人源化和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其他已知的血管生成抑制剂包含血管抑素、内皮抑素、干扰素、白细胞介素1(包含α和β)、白细胞介素12、维甲酸以及金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂(TIMP-1和-2)。也可以使用小分子，包含拓扑异构酶，诸如雷佐生，具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。

可与本发明组合物联合使用的其他抗癌剂包含但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；二霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；蒽霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；氮杂胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博莱霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克雷斯托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；枸橼酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；偶氮霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊甙；磷酸依托泊甙；艾托卜宁；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟卡他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白细胞介素II(包含重组白细胞介素II或rIL2)、干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司丁；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登木碱；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美乌替派；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培加帕加司；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟菲尔钠；泊菲霉素；泼尼氮芥；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；稀疏霉素；锗螺胺盐酸盐；螺莫司汀；螺铂；链霉黑素；链脲佐菌素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；喃氟啶；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替派；噻唑呋林；替拉扎明；枸橼酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其他抗癌药物包含但不限于：20-epi-l,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；艾美多；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背化形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗肿瘤药；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节因子；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；阿苏拉科林；阿他美坦；阿莫司汀；阿奇他汀1；阿奇他汀2；阿奇他汀3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；巴拉诺；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚；苯甲酰星形孢菌素；β-内酰胺衍生物；β-阿立辛；β可来霉素B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶基精胺；双奈法德；比特迪尼A；比折来新；布里菲特；溴匹立明；布多替坦；丁硫氨酸磺基肟；钙泊三醇；卡弗他丁C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；羧酰胺-氨基-三唑；羧基氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨源性抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；粟树精胺；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克；绿素类；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；克林霉素A；克林霉素B；康普瑞汀A4；康普瑞汀类似物；康纳京尼；甘蓝海绵素816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；库拉欣A；环戊烯蒽醌；环普拉坦；塞普霉素；阿糖胞苷烷磷酯；细胞溶解因子；细胞抑制素；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；德舍瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右丙亚胺；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；迪朵克斯；二乙基降精胺；二氢-5-氮杂胞苷；二氢紫杉醇，9-；二氧霉素；二苯基螺莫司汀；多西他赛；廿二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡米星SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表阿霉素；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊甙；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯汀；氟斯特酮；氟达拉滨；盐酸氟柔红霉素；福酚美克；福美斯坦；福司曲星；福莫司汀；钆德卟啉；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；庚磺胺；调蛋白；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激剂肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘多柔比星；甘薯苦醇，4-；伊罗普拉；依索拉定；异本格唑；异高软海绵素B；伊他司琼；结丝立得；卡哈拉得F；片螺素-N-三乙酸酯；兰瑞肽；雷纳霉素；来格司亭；硫酸磨茹多糖；莱托斯汀；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；利索纳得7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立滨；勒托替康；镥德克萨卟啉；溶血叶碱；裂解肽；美坦辛；制甘糖酶素A；马马司他；马索罗酚；丝抑蛋白；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素成纤维细胞生长因子-皂苷；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰基脂质A+肌细菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制物1的疗法；芥末抗癌剂；印度洋海绵B；分枝杆菌细胞壁提取物；迈泼龙；N-乙酰地那林；N-取代的苯甲酰胺类；那法瑞林；那瑞替喷；纳洛酮+潘他唑新；纳帕英；那非特平；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；尼萨霉素；一氧化氮调节剂；氮氧化物抗氧化剂；里挫林；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥琪森酮；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥拉素；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；奥沙霉素；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕劳胺；棕榈酰利索新；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；副肌动蛋白；帕折普汀；培门冬酶；培得星；戊聚糖多硫酸钠；喷司他丁；喷唑；潘氟隆；培磷酰胺；紫苏醇；苯那霉素；苯基乙酸酯；磷酸酶抑制剂；毕西巴尼；盐酸匹鲁卡品；吡柔比星；匹利垂克辛；普雷斯汀A；普雷斯汀B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂三胺络合物；卟菲尔钠；泊菲霉素；强的松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑并吖啶；吡哆酸化血红蛋白聚氧乙烯共轭物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras过法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化的瑞替普汀；铼Re 186依替膦酸盐；利索新；核酶；RII维甲酰酚胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；卢比格酮B1；卢伯西；沙芬戈；伞托平；SarCNU；肌肉叶绿醇A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼氢化钠；苯乙酸钠；索尔醇；生长激素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；穗霉素D；螺莫司汀；斯耐潘定；海绵生长抑制素1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；斯蒂哌胺；基质分解素抑制剂；亚硫甙；超活性血管活性肠肽拮抗剂；素拉迪塔；苏拉明；苦马豆素；合成糖胺聚糖；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；喃氟啶；碲杂吡喃鎓；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物；四佐胺；泰立拉汀；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；初乙基卟啉锡；替拉扎明；二氯化茂钛；托普森廷；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；瓦立奥林B；载体系统，红细胞基因疗法；维拉雷琐；藜芦胺；维尔丁斯；维替泊芬；长春瑞滨；维萨汀；维他欣；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维；和净司他丁斯酯。在一个实施例中，抗癌药物是5-氟尿嘧啶、紫杉醇或亚叶酸。

体外和离体合成抗体的产生

在一个实施例中，合成抗体(例如，DMAb、ScFv片段或DBiTE)是在体外或离体产生的。例如，在一个实施例中，编码合成抗体(例如，DMAb、ScFv片段或DBiTE)的核酸可在体外或离体细胞中导入和表达。在细胞引入和表达基因的方法是本领域公知的。在一个表达载体的情况下，该载体可容易地通过本领域的任何方法引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，该表达载体可通过物理、化学或生物方法转移到宿主细胞中。

将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包含磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如Sambrook等人(2012年《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》，Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。向宿主细胞中引入多核苷酸的一个优选方法是磷酸钙转染法。

用于向宿主细胞引入目标多核苷酸的生物学方法包含DNA和RNA载体的使用。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物(例如人类)细胞最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将多核苷酸导入宿主细胞的化学方法包含胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统，包含水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。一个用作体外和体内递送介体的示例性胶体体系是脂质体(例如，一个人造膜囊泡)。

在使用一个非病毒递送系统的情况下，一个示例性递送介体是脂质体。考虑使用脂质制剂把核酸引入到宿主细胞(在体外、离体或体内)。在另一个方面，该核酸可以与脂质相关联。与脂质相关的核酸可以包封在脂质体的水性内部，穿插在脂质体的脂质双层中，经由与脂质体和寡核苷酸两者相关的连接分子附着于脂质体，包埋在脂质体中，与一种脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，包含在脂质中作为悬浮液，包含于或混合于一种胶束中，或以其他方式与脂质相关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限制在溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于一个双层结构，如胶束/或具有“折叠”结构胶束。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是可以天然存在或合成的脂质脂肪物质。例如，脂质包含天然存在于细胞质中的脂肪小滴以及含有长链脂族烃和它们的衍生物(诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛类)的化合物类。

示例

在以下示例中进一步说明本发明。应该理解的是，这些示例虽然指出了本发明的优选示例，但仅作为说明给出。通过以上讨论和这些示例，本领域中的技术人员可确知本发明的大体特征，且在不脱离其精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文示出和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说从前面的描述中将是显而易见的。这些修改也旨在落入所附权利要求的范围内。

示例1

本文介绍的研究证明靶向CD19、BCMA、CD33、FAP、FSHR、EGFR、PSMA或CD123的DNA编码的双特异性T细胞连接子(DBiTE)的开发。DBiTE构建体在体内以高水平表达。图1显示BCMADBiTE、CD33DBiTE和CD123DBiTE的表达。图2显示EGFRvIIIDBiTE、FSHRDBiTE、PSMADBiTE和CD19DBiTE的表达。这些新颖的DBiTE代表癌症免疫疗法的新工具。

图3至图5提供的数据表明，CD19DBiTE对B细胞耗尽和T细胞活化都有作用。来自3个独立供体的PBMC在5μl CD19DBiTE或对照DBiTE(EGFRvIIIDBiTE)上清液存在的情况下一式三份培养5小时。孵育后，对细胞进行B细胞和T细胞标记物染色，以确定针对B细胞(CD19+细胞)和T细胞早期活化的潜在溶细胞活性。图4提供的数据显示在CD19DBiTE存在但对照DBiTE不存在的情况下，所有三个供体的B细胞(在PBMC混合液中的CD19+细胞)均呈现出耗尽。图5提供的数据显示在CD19DBiTE存在但对照DBiTE不存在的情况下，所有三个供体的T细胞中的早期活化标记物CD69均增加。

此外，还进行了实验以证明BCMADBiTE的细胞毒性。将BCMADBiTE上清液或CD33DBiTE上清液与RPMI8226细胞系孵育5小时，并以1:0、1:1、1:3和1:7肿瘤与T细胞比(每孔10,000个肿瘤细胞)从一个供体获得T细胞。孵育5小时后，BCMAdBiTE能够以1:1、1:3和1:7的比率裂解细胞，但在T细胞不存在的情况下未裂解，且在任何条件下在CD33DBiTE存在的情况下下均未发生杀伤。

示例2

本文介绍的研究证明靶向HER2的DNA单克隆抗体和BiTE(HER2DMAb和HER2DBiTE)的开发及其作为治疗剂在卵巢癌和乳腺癌治疗中的用途。DMAb和DBiTE构建体在体外和体内均以高水平表达约4个月。HER2DMAb与HER2结合，并诱导HER2信号传导阻断和抗体依赖性细胞毒性。HER2DBiTE有效诱导T细胞对HER2+肿瘤细胞的细胞毒性。这些新颖的DNA技术代表癌症免疫疗法进一步研究的新工具。

现在描述材料和方法。

动物和细胞系

C57Bl/6和Nu/J小鼠购自Jackson实验室。NSG小鼠购自Wistar Institute AnimalFacility。

OVCAR3、SKOV3和Brpkp110细胞由J.R.Conejo-Garcia(Department ofImmunology,Moffitt Cancer Center,FL)提供。TOV-21G和RNG1由R.Zhang(The WistarInstitute)提供。通过如前所述在PBS/Matrigel(50/50)中的侧面注射300万个细胞产生OVCAR3肿瘤(Perales-Puchalt等人2017年《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》，23(2):441-53)。RD和293T细胞购自ATCC。

通过用200IU/ml的透明质酸酶(Sigma)将100ug重悬于80ul水中的DNA注射到胫骨前肌(每条腿40ul)中，然后在注射一分钟后用CELLECTRA装置进行电穿孔对小鼠进行处理。

HER2DMAb和HER2DBiTE的设计

设计并产生了HER2DMAb，其编码抗HER2单克隆抗体帕妥珠单抗的重链和轻链密码子优化序列。两个抗体链均按序列定位，由P2A和弗林蛋白酶裂解位点分开。IgE前导序列被替换为原始前导序列。通过编码密码子优化的HER2DMAb的scFv，然后编码OKT3抗人CD3抗体的scFv，并添加IgE前导序列，设计了HER2DBiTE。将两种构建体亚克隆到修饰的pVAX1表达载体中(图6A和图11A)。

使用空的修饰的pVAX1质粒作为阴性对照。

体外DMAb表达

将100万个293T细胞置于6孔板的每个室中。第二天用1μg含Lipofectamin2000(Invitrogen)的HER2DMAb质粒转染。转染48小时后收集上清液。

流式细胞术

使用的抗人抗体是直接荧光染料共轭的。HER2(24D2)、CD45(HI30)、CD3(HIT3A)、CD69(FN50)、PD-1(EH12.2H7)和二次抗人IgG APC(多克隆)来自Biolegend。使用7AAD(Invitrogen)和膜联蛋白V(Biolegend)进行存活/死亡排除。

免疫印迹

蛋白质提取、变性和蛋白质印迹如前所述进行(Perales-Puchalt等人2017《临床癌症研究》，23(2):441-53)。用多克隆抗人IgG(H+L)(Bethyl)和抗β-肌动蛋白(a5441，Sigma-Aldrich)印迹膜。使用ImageQuantLAS 4000(GE Healthcare Life Sciences)捕获图像。

对于信号传导阻断实验，将200,000个OVCAR3细胞置于6孔板，并用无血清培养基饥饿过夜。第二天，将10μg纯化的HER2DMAb或PBS加入适当的孔中进行1h，然后加入10ng/ml的HRG(Peprotech)30分钟。

HER2结合ELISA

将ELISA板在4℃下用1ug/ml的人HER2重组蛋白(abcam)涂覆过夜。使用PBST-10％FBS进行阻断1小时。将来自不同稀释度的HER2DMAb表达小鼠或对照(用空pVax质粒电穿孔)的血清用作一次抗体，并在室温下孵育1小时。二次抗体是山羊抗人IgG Fc HRP共轭物(Bethyl)。孵育1小时后，使用SIGMAFAST OPD(Sigma Aldrich)进行显影，并在450nm下读取。

DMAb量化ELISA

将ELISA板在4℃下用1μg/ml的山羊抗人IgG-Fc片段抗体(Bethyl)涂覆过夜。第二天，用PBST-10％FBS在室温下将其阻断1小时，洗涤，与在PBST-1％FBS中稀释的样本在室温下孵育1小时，洗涤，并在室温下与HRP共轭的山羊抗人κ轻链抗体(Bethyl)孵育。孵育1小时后，使用SIGMAFAST OPD(Sigma Aldrich)将其显影，并在450nm下读取。使用纯化的人IgG/κ(Bethyl)产生标准曲线。

CD3和HER2结合ELISA(DBiTE)

将ELISA板在4℃下用1μg/ml的人HER2重组蛋白(abcam)或人CD3ε(Acrobiosystems)涂覆过夜。用PBST-10％FBS将其阻断1小时。使用来自HER2DBiTE表达小鼠或对照(用空pVax质粒电穿孔)的血清作为一次抗体。将它们在室温下孵育1小时。二次抗体是山羊抗人IgG H+L HRP共轭物(Bethyl)。孵育1小时后，使用SIGMAFAST OPD(SigmaAldrich)将板显影，并在450nm下读取。

抗HER2DMAb和HER2DBiTE抗体的检测

将ELISA板在4℃下用1μg/ml纯化的HER2DMAb或HER2DBiTE涂覆过夜。第二天，用PBST-10％FBS在室温下将板阻断1小时，洗涤，与在PBST-1％FBS中稀释的样本在室温下孵育1小时，洗涤，并在室温下与HRP共轭的山羊抗小鼠IgG抗体(Abcam)孵育。孵育1小时后，使用SIGMAFAST OPD(Sigma Aldrich)将板显影。

HER2DBiTE检测T细胞活化和凋亡

在4℃下，将5,000个OVCAR3放置在96孔板平板中过夜。第二天，加入来自HER2DBiTE表达小鼠或pVax对照(PBS中1:20稀释度，100ul)和50,000个T细胞的血清，并将板在37℃下孵育。24小时后，取上清液用于IFNγELISA，并加入新鲜上清液。72小时后，使用流式细胞术测量T细胞凋亡和活化(CD3、CD69、PD-1、膜联蛋白V)。对于细胞计数，将5,000个OVCAR3与100,000个T细胞平板培养，并使用死细胞排斥染料锥虫蓝(ThermoFisher)和Countess II自动细胞计数器(ThermoFisher)对活T细胞数进行计数。

干扰素γELISA

根据制造商的说明，使用人IFNg ELISA MAX(Biolegend)从上清液中确定人干扰素γ。

体外细胞毒性

将每孔10,000个OVCAR3细胞置于96孔板中，且18小时后与来自健康供体(由University of Pennsylvania Human Immunology Core提供)的500,000人PBMC或来自裸小鼠的500,000脾细胞在HER2DMAb存在或不存在的情况下共孵育4小时。4小时后收集上清液，使细胞胰蛋白酶化并对7AAD(Invitrogen)、膜联蛋白V(Biolegend)和抗人CD45(Biolegend)进行染色，并且如前所述进行基于流式细胞术的细胞毒性测定(Perales-Puchalt等人2017年《临床癌症研究》，23(2):441-53)。另选地，我们使用表达荧光素酶的OVCAR3或MDA-MB-231，并在共培养后测量荧光素酶表达。对于BiTE杀伤测定，将10,000个OVCAR3-荧光素酶细胞与不同比率的T细胞孵育5小时，用PBS洗涤，裂解并测量荧光素酶表达。

抗体依赖性细胞吞噬作用

通过用50ng/ml人M-CSF(Peprotech)每T25平板培养100万个单核细胞，从人单核细胞分化出巨噬细胞。在第3天和第6天更换含有细胞因子的培养基。第6天，对巨噬细胞进行胰蛋白酶化，根据制造商的说明用cell trace violet(Invitrogen)对其进行染色，并在96孔板中以50,000/孔的比率平板培养，然后用20ng/ml M-CSF静置过夜。第7天，用CFSE(Invitrogen)对OVCAR3细胞进行染色，并将10,000个OVCAR3细胞在含有HER2DMAb或pVax血清的巨噬细胞孔上平板培养。24小时后，将细胞胰蛋白酶化，并进行流式细胞术。吞噬作用被测量为双阳性染色细胞。

免疫荧光

将小鼠肿瘤冷冻在OCT(TissueTek)中，并切割冷冻切片。然后用4％多聚甲醛固定载玻片，并在PBS中用0.5％Triton X-100透化。使用5％正常山羊血清阻断切片，然后用HER2DMAb抗体和抗人AF488共轭二次抗体(Invitrogen)染色。

使用Leica TCS SP5 II共焦显微镜和LAS软件(Leica)观察载玻片。

统计

使用双尾不成对学生t检验或单向ANOVA(测量两个分类变量)计算实验组平均值之间的差异。使用2向ANOVA分析重复的测量值。误差线表示平均值的标准误差。使用对数秩检验比较存活率。所有统计分析均使用Graph Pad Prism 7.0进行。p<0.05被认为具有统计学意义。

现在说明实验结果

HER2 DNA编码的单克隆抗体(DMAb)的设计与表达。

DNA编码的抗体(DMAb)相对于传统蛋白质抗体有一系列的优势。首先，DNA比蛋白质更稳定。这种更高的稳定性使得不必保持抗体的严格的冷链，这增加治疗成本并限制产品的半衰期(Hernandez等人2018年《美国护理管理杂志(Am J Manag Care)》，24(2):109-12)。此外，这些编码抗体的DNA质粒的细胞内递送在相当长的时间内实现了稳定的血浆抗体浓度，限制多次施用的需要，并为癌症的免疫疗法提供新的工具。

通过将帕妥珠单抗的重链和轻链的密码子和RNA优化序列编码到pVAX1质粒表达载体中，产生HER2DMAb(图6A)。这些序列之前有IgE信号肽，且重链和轻链由P2A和弗林蛋白酶裂解位点分开。通过用编码HER2DMAb或无关蛋白的DNA转染293T细胞，在体外检测抗体表达。48小时后，收集上清液并进行蛋白质印迹。在HER2DMAb转染的293T上清液中鉴定出对应于重抗体链和轻抗体链的条带，但在无关蛋白对照中未鉴定出(图6B)。使用ELISA确定人IgG的量，且观察到HER2DMAb在5-6μg/ml下以293T表达，使用RD细胞进行验证(图7A)。

在确认体外表达后，确认HER2DMAb在体内的表达。注射200μg的HER2DMAb或空载体，随后使用CELLECTRA 3P系统(Tebas等人2017年《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》，电子版早于纸质版)适应性电穿孔到小鼠的胫骨前肌中。与在体外系统中一样，在注射HER2DMAb的小鼠血清中鉴定出人IgG的存在，但在对照组中未鉴定出(图6C)，小鼠血清中的表达水平高达50ug/ml，平均约为25μg/ml(图6D)。

接下来，检查DNA编码的人IgG结合人HER2的能力。用人HER2蛋白涂覆板，并与来自HER2DMAb处理小鼠的血清或对照血清一起孵育。小鼠血清中的HER2DMAb与人HER2以剂量依赖性方式结合(图6E)。为了在细胞表面上存在蛋白时确认HER2结合，人HER2在鼠细胞系Brpkp110中过表达。HER2DMAb仅在异位表达时通过流式细胞术与人HER2结合(图6F)。

HER2在人卵巢癌细胞系中表达。

帕妥珠单抗与曲妥珠单抗不同，其抗肿瘤活性不需要肿瘤细胞中HER2过表达(Agus等人2002年《癌细胞(Cancer Cell)》，2(2):127-37)。在卵巢癌中，帕妥珠单抗在与吉西他滨和紫杉醇联合治疗中显示出无进展生存期增加的趋势(Kurzeder等人2016年《临床肿瘤学杂志》，34(21):2516-25)。HER2在约11.4％的卵巢癌中过表达(组织学评分2+/3+)(Bookman等人2003年《临床肿瘤学杂志》，21(2):283-90)。为了确定HER2是否也在卵巢癌细胞系中表达，使用商业24D2抗体进行流式细胞术(图8A)。通过对这些相同细胞进行流式细胞术，验证了HER2DMAb的结合(图8B)。为了进一步验证使用HER2DMAb的卵巢癌细胞系的体内表达和潜在靶向，在小鼠中产生OVCAR3肿瘤，并在肿瘤冷冻切片上进行免疫荧光。使用来自HER2DMAb转染小鼠的血清发现阳性结合，但利用对照血清未发现阳性结合，确认HER2体内表达和HER2DMAb的结合(图8C)。

HER2DMAb介导HER2信号传导阻断和抗体依赖性细胞毒性

抗癌抗体的抗肿瘤效应导致了不同的机制。帕妥珠单抗通过防止HER2异二聚化和激动剂介导的信号传导发挥作用(Franklin等人2004年《癌细胞》，5(4):317-28)。如预期，HER2DMAb防止OVCAR3细胞中HER2-HER3激动剂调蛋白诱导的(HRG诱导的)信号传导，如与介体对照相比Akt磷酸化减少所证明的(图9A)。

MAb具有抗肿瘤活性的另一个机制是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。为了研究HER2DMAb的ADCC电位，在来自HER2DMAb的血清存在或使用来自空载体处理小鼠的血清的情况下，将OVCAR3细胞与或不与外周血单核细胞(PBMC)共孵育。在PBMC存在时，HER2DMAb血清有效杀伤卵巢癌细胞，但在它们不存在时则不能。此外，在对照血清条件下(图9B和图7B)或针对HER2细胞系(诸如MDA-MB-231)(图7C)未观察到杀伤。类似地，HER2dMAb表现出抗体依赖性吞噬活性(图7D)。

HER2DMAb延缓体内癌症进展。

为了确定HER2DMAb的体内抗肿瘤作用，用OVCAR-3卵巢癌细胞系攻击小鼠。裸小鼠无T细胞，但NK和巨噬细胞活性增强，并且其脾细胞可在HER2dMAb存在的情况下体外裂解OVCAR3(图7E)。当肿瘤达到平均50mm3时，通过EP将100μg HER2DMAb或空载体递送至肌肉。注射HER2DMAb的动物表现出肿瘤生长显著延迟，从而提高了存活率(图9C)。HER2DMAb抗体水平在DMAb注射2周后达到峰值，水平约为20ug/ml，并在一个月内维持在约5-10ug/ml，直至实验结束(图9D)。为了验证在免疫活性宿主中的抗肿瘤作用(这将更好地模拟临床施用)，使用鼠人HER2乳腺癌细胞系Brkpk110产生肿瘤。对此细胞系进行了工程改造，以表达与OVCAR3相似的HER2水平(图9E)。肿瘤攻击后5天，用HER2DMAb或空载体处理小鼠。在这种积极乳腺癌模型中，HER2DMAb也会延缓肿瘤进展(图9F)。

在研究HER2dMAb的动力学时，注意到抗体表达在近300天内下降。为了研究这种现象，评估了在小鼠中表达的针对这种人构建体的抗体的诱导。使用HER2dMAb处理后，在血清中观察到抗HER2dMAb的形成(图7F)，这可能是导致其随时间下降的原因。

HER2BiTE的产生、表达及细胞毒性

双特异性T细胞连接子(BiTE)有2个结合抗体片段(scFv)，因此其中一个片段与肿瘤抗原接合，且另一个片段通过与T细胞结合而活化，从而驱动CD3活化。尽管具有较高的抗肿瘤活性，但BiTE疗法进展缓慢，因为这些新工具的体内消除半衰期约为2.1小时，因此存在重大局限性。这种短半衰期要求在每个循环使用输注泵进行4-8周的连续静脉输注时进行BiTE疗法。最近用表达BiTE的RNA进行的实验显示，在IV输注后表达长达6天，这是一个相当大的进步(Stadler等人2017年《自然医学》，23(7):815-7)。

通过将HER2DMAb的scFv与刺激抗体抗CD3(OKT3)的scFv融合，产生优化的HER2BiTE(图11A)。在小鼠胫骨前肌注射和电穿孔后，HER2BiTE在体内高效表达(图11B)。新的HER2DBiTE保留了与HER2的结合和与CD3的结合(图10A和图10B)。重要的是，尽管已报道UCHT1提供的刺激能够杀伤T细胞，但与仅对照在HER2+细胞存在的情况下相比，当OKT3细胞与HER2DBiTE共培养时，未观察到凋亡比例增加或T细胞数量差异(图10C和图10D)。为了确定体内表达的HER2DBiTE的功能，我们将注射了HER2DBiTE或空载体的小鼠血清与HER2+卵巢癌细胞和T细胞培养。HER2DBiTE处理后的小鼠血清显示T细胞活化(图10E至图10G)以及OVCAR3和CAOV3细胞的高效剂量依赖性细胞毒性。与空载体处理小鼠的血清孵育时未发现细胞毒性，或在T细胞不存在情况下观察到细胞毒性(图11C和图10H)。T细胞与OVCAR3以1:5的比率与5％处理小鼠的血清(在100μl中为5μl)孵育显示DBiTE表现出约4个月的强效活性(图11D)。与在HER2DBiTE中一样，观察到抗HER2DBiTE抗体的产生，这可能是随着时间推移循环水平的部分原因(图10I)。为了确定DBiTE体内抗肿瘤活性，用OVCAR3攻击NOD/SCID-γ(NSG)小鼠。肿瘤植入一天后，用200μg HER2DBiTE或空载体单次施用来处理小鼠。肿瘤接种两周后，当肿瘤为约50mm³时，向每只小鼠腹腔注射10,000,000PBMC。HER2DBiTE处理显著影响肿瘤进展(图11E)，在10个肿瘤中的8个中观察到肿瘤消退或肿瘤消除，而在对照组中未观察到肿瘤影响(图11F)。

在PBMC不存在的情况下，未观察到HER2DBiTE的体内效应(图10J)。通过持续仅数秒的简单注射递送在体内表达约4个月的HER2DBiTE，并表现出显著的抗肿瘤活性。BiTE的合成DNA递送可以减轻BiTE疗法半衰期短带来的负担，且为此工具提供在癌症免疫疗法中新的应用。

总之，数据表明DMAb可以编码HER2DMAb和HER2DBiTE，使它们能够在体内以高水平持续表达，并驱动强效抗肿瘤活性。这种方法为卵巢癌以及潜在的其他癌症的治疗提供了有价值的新工具。

示例3

在GBM小鼠模型中，EGFRvIII靶向DNA编码的免疫细胞接合子(DICE)产生双特异性 抗体的体内表达，所述双特异性抗体诱导针对EGFRvIII阳性肿瘤的T细胞介导的细胞溶解 活性并控制肿瘤生长。

近年来，在临床前和临床环境中，靶向T细胞和肿瘤相关抗原(TAA)的双特异性抗体的开发呈指数级扩展。2017年，一种双特异性抗体被批准用于治疗急性淋巴细胞白血病。然而，由于其分子量低，抗体的血清半衰期仅为约4小时。因此，治疗需要持续IV注射抗体数天，可能长达数周。较差的药代动力学特征给双特异性抗体的开发带来了巨大挑战，同时也带来了与制造和分子稳定性相关的其他困难。为了解决这些问题，开发了优化的合成DNA编码的免疫细胞接合子(DICE)，其旨在体内表达双特异性抗体。单次施用HER2-DICE的小鼠表现出双特异性抗体的长期体内表达和针对表达HER2的卵巢细胞系的T细胞介导的细胞溶解活性超过120天。在同一研究中，在卵巢癌小鼠模型中，HER2-DICE不仅控制了肿瘤进展，还促进了许多动物的肿瘤清除。采用类似策略，开发了靶向EGFRvIII的DICE，在30-50％的多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者中表达的TAA。来自体外转染EGFRvIII-DICE的细胞的上清液样本显示出对EGFRvIII和CD3的强效靶特异性结合亲和力，并诱导了针对过表达EGFRvIII的GBM细胞系的T细胞介导的细胞溶解活性。在EGFRvIII-DICE上清液存在的情况下，靶细胞和原代人T细胞共培养刺激了稳健的T细胞应答，并在细胞毒性T细胞群中显示出显著水平的IFNγ、TNFα和CD107a。最后，在GBM小鼠攻击模型中，对重新植入人T细胞的NSG小鼠进行EGFRvIII-DICE处理使得肿瘤生长得到控制，这在空载体对照组中未观察到。这些研究支持双特异性抗体的合成DNA递送产生能够激发细胞毒性T细胞功能的强效和功能性抗体，并且可以作为开发用于癌症免疫疗法的双特异性抗体的替代方法进行研究。

应当理解，前面的详细描述和所附的示例仅仅是说明性的，而不是对本发明的范围的限制，本发明的范围仅由所附的权利要求及其等同物限定。

对所公开的实施例的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行这些改变和修改，包含但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法有关的改变和修改。

序列表

<110> 威斯塔解剖学和生物学研究所

卡尔·穆图马尼

大卫·韦纳

阿尔弗雷多·佩拉莱斯·普查尔特

伊丽莎白·迪佩雷

<120> 靶向癌症抗原的DNA编码的双特异性T细胞接合物以及在癌症治疗中的使用方法

<130> 206194-0033-00WO

<150> US 62/798,626

<151> 2019-01-30

<150> US 62/827,265

<151> 2019-04-01

<160> 76

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD19DBiTE，无开始或IgE前导序列

<400> 1

gatattcagc tgactcagag ccctgcttcc ctggccgtgt ccctgggaca gagggcaacc 60

atctcttgca aggcctccca gtctgtggac tacgatggcg actcctatct gaactggtac 120

cagcagatcc caggccagcc ccctaagctg ctgatctatg acgcctctaa tctggtgagc 180

ggcatcccac ccagattcag cggctccggc tctggcacag acttcaccct gaacatccac 240

ccagtggaga aggtggacgc agcaacctac cactgccagc agtccacaga ggatccttgg 300

accttcggcg gcggcacaaa gctggagatc aagggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 360

agcggcggcg gcggcagcca ggtgcagctg cagcagagcg gcgccgagct ggtgcggccc 420

ggcagctccg tgaagatctc ctgtaaggcc tctggctatg ccttttctag ctactggatg 480

aattgggtga agcagcgccc cggacagggc ctggagtgga tcggccagat ctggcctggc 540

gatggcgaca caaactacaa tggcaagttc aagggcaagg ccacactgac cgccgacgag 600

tcctctagca ccgcctacat gcagctgtcc tctctggcct ccgaggattc tgccgtgtat 660

ttttgcgcca ggagagagac aacaaccgtg ggcaggtact attacgccat ggactactgg 720

ggccagggca caaccgtgac agtgagcagc ggcggcggcg gctctgatat caagctgcag 780

cagagcggag cagagctggc cagacctgga gccagcgtga agatgtcctg taagacctct 840

ggctatacat tcacccggta cacaatgcac tgggtgaagc agcgcccagg ccagggcctg 900

gaatggatcg gctacatcaa ccccagccgg ggctatacca actacaatca gaagtttaag 960

gataaggcca ccctgacaac cgacaagtct agctccacag cctatatgca gctgtctagc 1020

ctgaccagcg aggactccgc cgtgtattac tgcgcccgct attacgacga tcactattgt 1080

ctggattatt ggggacaggg cacaaccctg acagtgtcct ctgtggaggg cggctctggc 1140

ggcagcggcg gctccggcgg ctctggcggc gtggacgata tccagctgac ccagtcccct 1200

gcaatcatga gcgcctcccc aggagagaag gtgacaatga cctgcagggc cagctcctct 1260

gtgagctata tgaattggta ccagcagaag agcggcacat cccctaagag gtggatctat 1320

gacaccagca aggtggcctc cggcgtgcca tacagattct ctggcagcgg ctccggcacc 1380

tcttatagcc tgacaatcag ctccatggag gccgaggatg ccgccaccta ttactgtcag 1440

cagtggtcta gcaatcctct gactttcggg gctgggacaa aactggaact gaag 1494

<210> 2

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD19DBiTE，无开始或IgE前导序列

<400> 2

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

115 120 125

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val

130 135 140

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met

145 150 155 160

Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln

165 170 175

Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

210 215 220

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

260 265 270

Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

275 280 285

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

290 295 300

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

305 310 315 320

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

325 330 335

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

355 360 365

Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro

385 390 395 400

Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg

405 410 415

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly

420 425 430

Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly

435 440 445

Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

450 455 460

Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

465 470 475 480

Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

485 490 495

Leu Lys

<210> 3

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD19DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 3

atggactgga cttggatcct gttcctggtc gccgccgcca cacgggtgca ttccgatatt 60

cagctgactc agagccctgc ttccctggcc gtgtccctgg gacagagggc aaccatctct 120

tgcaaggcct cccagtctgt ggactacgat ggcgactcct atctgaactg gtaccagcag 180

atcccaggcc agccccctaa gctgctgatc tatgacgcct ctaatctggt gagcggcatc 240

ccacccagat tcagcggctc cggctctggc acagacttca ccctgaacat ccacccagtg 300

gagaaggtgg acgcagcaac ctaccactgc cagcagtcca cagaggatcc ttggaccttc 360

ggcggcggca caaagctgga gatcaagggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 420

ggcggcggca gccaggtgca gctgcagcag agcggcgccg agctggtgcg gcccggcagc 480

tccgtgaaga tctcctgtaa ggcctctggc tatgcctttt ctagctactg gatgaattgg 540

gtgaagcagc gccccggaca gggcctggag tggatcggcc agatctggcc tggcgatggc 600

gacacaaact acaatggcaa gttcaagggc aaggccacac tgaccgccga cgagtcctct 660

agcaccgcct acatgcagct gtcctctctg gcctccgagg attctgccgt gtatttttgc 720

gccaggagag agacaacaac cgtgggcagg tactattacg ccatggacta ctggggccag 780

ggcacaaccg tgacagtgag cagcggcggc ggcggctctg atatcaagct gcagcagagc 840

ggagcagagc tggccagacc tggagccagc gtgaagatgt cctgtaagac ctctggctat 900

acattcaccc ggtacacaat gcactgggtg aagcagcgcc caggccaggg cctggaatgg 960

atcggctaca tcaaccccag ccggggctat accaactaca atcagaagtt taaggataag 1020

gccaccctga caaccgacaa gtctagctcc acagcctata tgcagctgtc tagcctgacc 1080

agcgaggact ccgccgtgta ttactgcgcc cgctattacg acgatcacta ttgtctggat 1140

tattggggac agggcacaac cctgacagtg tcctctgtgg agggcggctc tggcggcagc 1200

ggcggctccg gcggctctgg cggcgtggac gatatccagc tgacccagtc ccctgcaatc 1260

atgagcgcct ccccaggaga gaaggtgaca atgacctgca gggccagctc ctctgtgagc 1320

tatatgaatt ggtaccagca gaagagcggc acatccccta agaggtggat ctatgacacc 1380

agcaaggtgg cctccggcgt gccatacaga ttctctggca gcggctccgg cacctcttat 1440

agcctgacaa tcagctccat ggaggccgag gatgccgcca cctattactg tcagcagtgg 1500

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<210> 4

<211> 516

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD19DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 4

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser

20 25 30

Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp

35 40 45

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln

50 55 60

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile

65 70 75 80

Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn

85 90 95

Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln

100 105 110

Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

145 150 155 160

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

165 170 175

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

180 185 190

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

195 200 205

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

210 215 220

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

225 230 235 240

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

245 250 255

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly

275 280 285

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg

290 295 300

Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

305 310 315 320

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys

325 330 335

Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

340 345 350

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr

355 360 365

Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

370 375 380

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln

405 410 415

Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr

420 425 430

Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

435 440 445

Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala

450 455 460

Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

465 470 475 480

Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

485 490 495

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

500 505 510

Leu Glu Leu Lys

515

<210> 5

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD19DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 5

atggactgga cttggatcct gttcctggtc gccgccgcca cacgggtgca ttccgatatt 60

cagctgactc agagccctgc ttccctggcc gtgtccctgg gacagagggc aaccatctct 120

tgcaaggcct cccagtctgt ggactacgat ggcgactcct atctgaactg gtaccagcag 180

atcccaggcc agccccctaa gctgctgatc tatgacgcct ctaatctggt gagcggcatc 240

ccacccagat tcagcggctc cggctctggc acagacttca ccctgaacat ccacccagtg 300

gagaaggtgg acgcagcaac ctaccactgc cagcagtcca cagaggatcc ttggaccttc 360

ggcggcggca caaagctgga gatcaagggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 420

ggcggcggca gccaggtgca gctgcagcag agcggcgccg agctggtgcg gcccggcagc 480

tccgtgaaga tctcctgtaa ggcctctggc tatgcctttt ctagctactg gatgaattgg 540

gtgaagcagc gccccggaca gggcctggag tggatcggcc agatctggcc tggcgatggc 600

gacacaaact acaatggcaa gttcaagggc aaggccacac tgaccgccga cgagtcctct 660

agcaccgcct acatgcagct gtcctctctg gcctccgagg attctgccgt gtatttttgc 720

gccaggagag agacaacaac cgtgggcagg tactattacg ccatggacta ctggggccag 780

ggcacaaccg tgacagtgag cagcggcggc ggcggctctg atatcaagct gcagcagagc 840

ggagcagagc tggccagacc tggagccagc gtgaagatgt cctgtaagac ctctggctat 900

acattcaccc ggtacacaat gcactgggtg aagcagcgcc caggccaggg cctggaatgg 960

atcggctaca tcaaccccag ccggggctat accaactaca atcagaagtt taaggataag 1020

gccaccctga caaccgacaa gtctagctcc acagcctata tgcagctgtc tagcctgacc 1080

agcgaggact ccgccgtgta ttactgcgcc cgctattacg acgatcacta ttgtctggat 1140

tattggggac agggcacaac cctgacagtg tcctctgtgg agggcggctc tggcggcagc 1200

ggcggctccg gcggctctgg cggcgtggac gatatccagc tgacccagtc ccctgcaatc 1260

atgagcgcct ccccaggaga gaaggtgaca atgacctgca gggccagctc ctctgtgagc 1320

tatatgaatt ggtaccagca gaagagcggc acatccccta agaggtggat ctatgacacc 1380

agcaaggtgg cctccggcgt gccatacaga ttctctggca gcggctccgg cacctcttat 1440

agcctgacaa tcagctccat ggaggccgag gatgccgcca cctattactg tcagcagtgg 1500

tctagcaatc ctctgacttt cggggctggg acaaaactgg aactgaagca ccaccaccac 1560

caccattgat aa 1572

<210> 6

<211> 522

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD19DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 6

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser

20 25 30

Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp

35 40 45

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln

50 55 60

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile

65 70 75 80

Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn

85 90 95

Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln

100 105 110

Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

145 150 155 160

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

165 170 175

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

180 185 190

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

195 200 205

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

210 215 220

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

225 230 235 240

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

245 250 255

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly

275 280 285

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg

290 295 300

Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

305 310 315 320

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys

325 330 335

Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

340 345 350

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr

355 360 365

Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

370 375 380

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln

405 410 415

Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr

420 425 430

Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

435 440 445

Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala

450 455 460

Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

465 470 475 480

Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

485 490 495

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

500 505 510

Leu Glu Leu Lys His His His His His His

515 520

<210> 7

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成BCMADBiTE，无开始、终止或IgE

前导序列

<400> 7

caggtgcagc tggtgcagtc aggagccgag gtcaagaagc ccggcgcctc cgtgaaggtg 60

tcttgcaagg cctccggcta ttctttccct gattactata tcaactgggt gcggcaggca 120

ccaggacagg gcctggagtg gatgggctgg atctatttcg ccagcggcaa ctccgagtac 180

aatcagaagt ttacaggccg ggtgaccatg acacgcgaca caagctcctc taccgcctac 240

atggagctga gctccctgcg ctccgaggat accgccgtgt atttctgcgc ctctctgtac 300

gactatgatt ggtactttga cgtgtggggc cagggcacaa tggtgaccgt gtctagcggc 360

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggct ccgatatcgt gatgacccag 420

acacctctgt ccctgtctgt gacacccggc gagcctgcca gcatctcctg taagtcctct 480

cagagcctgg tgcactccaa cggcaatacc tatctgcact ggtacctgca gaagcctggc 540

cagtccccac agctgctgat ctacaaggtg tctaaccggt tcagcggcgt gccagaccgc 600

ttttctggaa gcggatccgg agcagatttc acactgaaga tctctagggt ggaggccgag 660

gacgtgggcg tgtactattg cgccgagaca agccacgtgc cctggacatt tggccagggc 720

accaagctgg agatcaagag cggcggcggc ggctctgagg tgcagctggt ggagagcggc 780

ggcggcctgg tgcagcccgg cggctccctg aagctgtctt gtgccgccag cggcttcacc 840

ttcaacaagt atgccatgaa ttgggtgagg caggcacctg gcaagggcct ggagtgggtg 900

gccaggatca gaagcaagta caacaattat gccacctact atgccgactc cgtgaaggat 960

aggttcacaa tctccagaga cgattctaag aataccgcct acctgcagat gaacaatctg 1020

aagacagagg ataccgccgt gtactattgc gtgagacacg gcaactttgg caattcttac 1080

atcagctatt gggcctactg gggccagggc acactggtga ccgtgagcag cggcggcggc 1140

ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagccaga cagtggtgac ccaggagcca 1200

agcctgaccg tgtcccctgg cggcaccgtg acactgacct gtggatctag cacaggagca 1260

gtgacctccg gaaactaccc taattgggtg cagcagaagc caggacaggc ccctaggggc 1320

ctgatcggcg gaacaaagtt cctggcccca ggcacccccg ccagattttc tggcagcctg 1380

ctgggcggca aggccgccct gaccctgtcc ggagtgcagc cagaggacga ggccgagtac 1440

tattgcgtgc tgtggtacag caatcgctgg gtcttcggag ggggaaccaa actgactgtc 1500

ctg 1503

<210> 8

<211> 501

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成BCMADBiTE，无开始或IgE前导序列

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser

130 135 140

Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser

145 150 155 160

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

245 250 255

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu

260 265 270

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp

275 280 285

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg

290 295 300

Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp

305 310 315 320

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

325 330 335

Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg

340 345 350

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly

355 360 365

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

370 375 380

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro

385 390 395 400

Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser

405 410 415

Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln

420 425 430

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu

435 440 445

Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys

450 455 460

Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr

465 470 475 480

Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr

485 490 495

Lys Leu Thr Val Leu

500

<210> 9

<211> 1563

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成BCMADBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 9

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cccgcgtgca tagtcaggtg 60

cagctggtgc agtcaggagc cgaggtcaag aagcccggcg cctccgtgaa ggtgtcttgc 120

aaggcctccg gctattcttt ccctgattac tatatcaact gggtgcggca ggcaccagga 180

cagggcctgg agtggatggg ctggatctat ttcgccagcg gcaactccga gtacaatcag 240

aagtttacag gccgggtgac catgacacgc gacacaagct cctctaccgc ctacatggag 300

ctgagctccc tgcgctccga ggataccgcc gtgtatttct gcgcctctct gtacgactat 360

gattggtact ttgacgtgtg gggccagggc acaatggtga ccgtgtctag cggcggcggc 420

ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggctccgata tcgtgatgac ccagacacct 480

ctgtccctgt ctgtgacacc cggcgagcct gccagcatct cctgtaagtc ctctcagagc 540

ctggtgcact ccaacggcaa tacctatctg cactggtacc tgcagaagcc tggccagtcc 600

ccacagctgc tgatctacaa ggtgtctaac cggttcagcg gcgtgccaga ccgcttttct 660

ggaagcggat ccggagcaga tttcacactg aagatctcta gggtggaggc cgaggacgtg 720

ggcgtgtact attgcgccga gacaagccac gtgccctgga catttggcca gggcaccaag 780

ctggagatca agagcggcgg cggcggctct gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc 840

ctggtgcagc ccggcggctc cctgaagctg tcttgtgccg ccagcggctt caccttcaac 900

aagtatgcca tgaattgggt gaggcaggca cctggcaagg gcctggagtg ggtggccagg 960

atcagaagca agtacaacaa ttatgccacc tactatgccg actccgtgaa ggataggttc 1020

acaatctcca gagacgattc taagaatacc gcctacctgc agatgaacaa tctgaagaca 1080

gaggataccg ccgtgtacta ttgcgtgaga cacggcaact ttggcaattc ttacatcagc 1140

tattgggcct actggggcca gggcacactg gtgaccgtga gcagcggcgg cggcggcagc 1200

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc cagacagtgg tgacccagga gccaagcctg 1260

accgtgtccc ctggcggcac cgtgacactg acctgtggat ctagcacagg agcagtgacc 1320

tccggaaact accctaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcccctag gggcctgatc 1380

ggcggaacaa agttcctggc cccaggcacc cccgccagat tttctggcag cctgctgggc 1440

ggcaaggccg ccctgaccct gtccggagtg cagccagagg acgaggccga gtactattgc 1500

gtgctgtggt acagcaatcg ctgggtcttc ggagggggaa ccaaactgac tgtcctgtga 1560

taa 1563

<210> 10

<211> 519

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成BCMADBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 10

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

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Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro

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Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln

65 70 75 80

Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr

85 90 95

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro

145 150 155 160

Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys

165 170 175

Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp

180 185 190

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val

195 200 205

Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

225 230 235 240

Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

260 265 270

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

275 280 285

Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met

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Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg

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Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

325 330 335

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

340 345 350

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

355 360 365

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr

370 375 380

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln

405 410 415

Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys

420 425 430

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val

435 440 445

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys

450 455 460

Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly

465 470 475 480

Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala

485 490 495

Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly

500 505 510

Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

515

<210> 11

<211> 1587

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成BCMADBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 11

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cccgcgtgca tagtcaggtg 60

cagctggtgc agtcaggagc cgaggtcaag aagcccggcg cctccgtgaa ggtgtcttgc 120

aaggcctccg gctattcttt ccctgattac tatatcaact gggtgcggca ggcaccagga 180

cagggcctgg agtggatggg ctggatctat ttcgccagcg gcaactccga gtacaatcag 240

aagtttacag gccgggtgac catgacacgc gacacaagct cctctaccgc ctacatggag 300

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gattggtact ttgacgtgtg gggccagggc acaatggtga ccgtgtctag cggcggcggc 420

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ggaagcggat ccggagcaga tttcacactg aagatctcta gggtggaggc cgaggacgtg 720

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acaatctcca gagacgattc taagaatacc gcctacctgc agatgaacaa tctgaagaca 1080

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ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc cagacagtgg tgacccagga gccaagcctg 1260

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tccggaaact accctaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcccctag gggcctgatc 1380

ggcggaacaa agttcctggc cccaggcacc cccgccagat tttctggcag cctgctgggc 1440

ggcaaggccg ccctgaccct gtccggagtg cagccagagg acgaggccga gtactattgc 1500

gtgctgtggt acagcaatcg ctgggtcttc ggagggggaa ccaaactgac tgtcctgtga 1560

taacaccacc accaccacca ttgataa 1587

<210> 12

<211> 525

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成BCMADBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 12

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

20 25 30

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro

35 40 45

Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln

65 70 75 80

Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr

85 90 95

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro

145 150 155 160

Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys

165 170 175

Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp

180 185 190

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val

195 200 205

Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

225 230 235 240

Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

260 265 270

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

275 280 285

Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met

290 295 300

Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg

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Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

325 330 335

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

340 345 350

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

355 360 365

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr

370 375 380

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln

405 410 415

Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys

420 425 430

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val

435 440 445

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys

450 455 460

Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly

465 470 475 480

Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala

485 490 495

Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly

500 505 510

Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His His His His

515 520 525

<210> 13

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD33BiTE，无终止、开始或IgE

前导序列

<400> 13

caggtgcagc tggtgcagtc aggggctgaa gtcaagaagc ccggcgagtc cgtgaaggtg 60

tcttgcaagg ccagcggcta taccttcaca aactacggca tgaattgggt gaagcaggcc 120

cctggccagt gtctggagtg gatgggctgg atcaacacct atacaggcga gccaacctac 180

gccgataagt ttcagggcag ggtgacaatg accacagaca cctccacatc taccgcctac 240

atggagatcc ggaatctggg cggcgacgat accgccgtgt actattgcgc ccgctggagc 300

tggtccgatg gctactacgt gtacttcgac tattggggcc agggcacctc cgtgacagtg 360

agcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg 420

atgacccagt cccccgactc tctgacagtg agcctgggcg agagaaccac aatcaactgt 480

aagtctagcc agagcgtgct ggattcctct accaacaaga acagcctggc atggtaccag 540

cagaagccag gacagccccc taagctgctg ctgagctggg catccaccag ggagtccggc 600

atccctgaca gattctctgg cagcggctcc ggcacagact ttacactgac catcgattcc 660

ccacagcccg aggactctgc cacctactat tgccagcagt ccgcccactt ccctatcacc 720

tttggctgtg gcacacggct ggagatcaag agcggcggcg gcggctctga ggtgcagctg 780

gtggagagcg gcggcggcct ggtgcagcca ggcggctccc tgaagctgtc ttgcgcagca 840

agcggcttca ccttcaacaa gtatgcaatg aattgggtgc gccaggcacc aggcaagggc 900

ctggagtggg tggccaggat cagatctaag tacaacaatt atgccaccta ctatgccgac 960

agcgtgaagg atcggttcac catctcccgc gacgattcta agaatacagc ctacctgcag 1020

atgaacaatc tgaagaccga ggatacagcc gtgtactatt gcgtgaggca cggcaacttt 1080

ggcaattctt acatcagcta ttgggcatac tggggacagg gcaccctggt cacagtgagc 1140

agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcca gaccgtggtg 1200

acacaggagc caagcctgac cgtgtcccct ggcggcacag tgaccctgac atgtggatct 1260

agcaccggag cagtgacaag cggaaactat cctaattggg tgcagcagaa acctggacag 1320

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tctggcagcc tgctgggcgg caaggccgcc ctgaccctgt ccggagtgca gccagaggac 1440

gaggccgagt actattgcgt gctgtggtac tctaatcgct gggtcttcgg gggagggaca 1500

aaactgactg tgctg 1515

<210> 14

<211> 505

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD33BiTE，无开始或IgE前导序列

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr Thr Ile Asn Cys

145 150 155 160

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys Asn Ser Leu

165 170 175

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu Ser

180 185 190

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Pro Gln Pro Glu

210 215 220

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His Phe Pro Ile Thr

225 230 235 240

Phe Gly Cys Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr

275 280 285

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

290 295 300

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

305 310 315 320

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

325 330 335

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

340 345 350

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp

355 360 365

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val

385 390 395 400

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

405 410 415

Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn

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Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly

435 440 445

Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

450 455 460

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp

465 470 475 480

Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe

485 490 495

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

500 505

<210> 15

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD33DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 15

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcaa ctcgcgtcca ctcacaggtg 60

cagctggtgc agtcaggggc tgaagtcaag aagcccggcg agtccgtgaa ggtgtcttgc 120

aaggccagcg gctatacctt cacaaactac ggcatgaatt gggtgaagca ggcccctggc 180

cagtgtctgg agtggatggg ctggatcaac acctatacag gcgagccaac ctacgccgat 240

aagtttcagg gcagggtgac aatgaccaca gacacctcca catctaccgc ctacatggag 300

atccggaatc tgggcggcga cgataccgcc gtgtactatt gcgcccgctg gagctggtcc 360

gatggctact acgtgtactt cgactattgg ggccagggca cctccgtgac agtgagcagc 420

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gctccgatat cgtgatgacc 480

cagtcccccg actctctgac agtgagcctg ggcgagagaa ccacaatcaa ctgtaagtct 540

agccagagcg tgctggattc ctctaccaac aagaacagcc tggcatggta ccagcagaag 600

ccaggacagc cccctaagct gctgctgagc tgggcatcca ccagggagtc cggcatccct 660

gacagattct ctggcagcgg ctccggcaca gactttacac tgaccatcga ttccccacag 720

cccgaggact ctgccaccta ctattgccag cagtccgccc acttccctat cacctttggc 780

tgtggcacac ggctggagat caagagcggc ggcggcggct ctgaggtgca gctggtggag 840

agcggcggcg gcctggtgca gccaggcggc tccctgaagc tgtcttgcgc agcaagcggc 900

ttcaccttca acaagtatgc aatgaattgg gtgcgccagg caccaggcaa gggcctggag 960

tgggtggcca ggatcagatc taagtacaac aattatgcca cctactatgc cgacagcgtg 1020

aaggatcggt tcaccatctc ccgcgacgat tctaagaata cagcctacct gcagatgaac 1080

aatctgaaga ccgaggatac agccgtgtac tattgcgtga ggcacggcaa ctttggcaat 1140

tcttacatca gctattgggc atactgggga cagggcaccc tggtcacagt gagcagcggc 1200

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gccagaccgt ggtgacacag 1260

gagccaagcc tgaccgtgtc ccctggcggc acagtgaccc tgacatgtgg atctagcacc 1320

ggagcagtga caagcggaaa ctatcctaat tgggtgcagc agaaacctgg acaggcccct 1380

aggggcctga tcggcggaac caagttcctg gcccctggca caccagccag attttctggc 1440

agcctgctgg gcggcaaggc cgccctgacc ctgtccggag tgcagccaga ggacgaggcc 1500

gagtactatt gcgtgctgtg gtactctaat cgctgggtct tcgggggagg gacaaaactg 1560

actgtgctgt gataa 1575

<210> 16

<211> 523

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD33DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 16

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

20 25 30

Gly Glu Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

35 40 45

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu

50 55 60

Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr

85 90 95

Ala Tyr Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr Thr Ile

165 170 175

Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys Asn

180 185 190

Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

195 200 205

Leu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Pro Gln

225 230 235 240

Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His Phe Pro

245 250 255

Ile Thr Phe Gly Cys Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

275 280 285

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

290 295 300

Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

305 310 315 320

Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr

325 330 335

Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys

340 345 350

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

355 360 365

Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser

370 375 380

Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

385 390 395 400

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr

405 410 415

Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val

420 425 430

Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr

435 440 445

Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile

450 455 460

Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly

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Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro

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Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp

500 505 510

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

515 520

<210> 17

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD33DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 17

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcaa ctcgcgtcca ctcacaggtg 60

cagctggtgc agtcaggggc tgaagtcaag aagcccggcg agtccgtgaa ggtgtcttgc 120

aaggccagcg gctatacctt cacaaactac ggcatgaatt gggtgaagca ggcccctggc 180

cagtgtctgg agtggatggg ctggatcaac acctatacag gcgagccaac ctacgccgat 240

aagtttcagg gcagggtgac aatgaccaca gacacctcca catctaccgc ctacatggag 300

atccggaatc tgggcggcga cgataccgcc gtgtactatt gcgcccgctg gagctggtcc 360

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cagtcccccg actctctgac agtgagcctg ggcgagagaa ccacaatcaa ctgtaagtct 540

agccagagcg tgctggattc ctctaccaac aagaacagcc tggcatggta ccagcagaag 600

ccaggacagc cccctaagct gctgctgagc tgggcatcca ccagggagtc cggcatccct 660

gacagattct ctggcagcgg ctccggcaca gactttacac tgaccatcga ttccccacag 720

cccgaggact ctgccaccta ctattgccag cagtccgccc acttccctat cacctttggc 780

tgtggcacac ggctggagat caagagcggc ggcggcggct ctgaggtgca gctggtggag 840

agcggcggcg gcctggtgca gccaggcggc tccctgaagc tgtcttgcgc agcaagcggc 900

ttcaccttca acaagtatgc aatgaattgg gtgcgccagg caccaggcaa gggcctggag 960

tgggtggcca ggatcagatc taagtacaac aattatgcca cctactatgc cgacagcgtg 1020

aaggatcggt tcaccatctc ccgcgacgat tctaagaata cagcctacct gcagatgaac 1080

aatctgaaga ccgaggatac agccgtgtac tattgcgtga ggcacggcaa ctttggcaat 1140

tcttacatca gctattgggc atactgggga cagggcaccc tggtcacagt gagcagcggc 1200

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gccagaccgt ggtgacacag 1260

gagccaagcc tgaccgtgtc ccctggcggc acagtgaccc tgacatgtgg atctagcacc 1320

ggagcagtga caagcggaaa ctatcctaat tgggtgcagc agaaacctgg acaggcccct 1380

aggggcctga tcggcggaac caagttcctg gcccctggca caccagccag attttctggc 1440

agcctgctgg gcggcaaggc cgccctgacc ctgtccggag tgcagccaga ggacgaggcc 1500

gagtactatt gcgtgctgtg gtactctaat cgctgggtct tcgggggagg gacaaaactg 1560

actgtgctgc atcaccacca ccaccattga taa 1593

<210> 18

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD33DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 18

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

20 25 30

Gly Glu Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

35 40 45

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu

50 55 60

Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr

85 90 95

Ala Tyr Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr Thr Ile

165 170 175

Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys Asn

180 185 190

Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

195 200 205

Leu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Pro Gln

225 230 235 240

Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His Phe Pro

245 250 255

Ile Thr Phe Gly Cys Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

275 280 285

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

290 295 300

Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

305 310 315 320

Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr

325 330 335

Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys

340 345 350

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

355 360 365

Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser

370 375 380

Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

385 390 395 400

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr

405 410 415

Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val

420 425 430

Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr

435 440 445

Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile

450 455 460

Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly

465 470 475 480

Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro

485 490 495

Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp

500 505 510

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His His His

515 520 525

His

<210> 19

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FAPBiTE，无开始、终止或IgE

前导序列

<400> 19

gaagtgcagc tgctggaaag tggcgggggc ctggtccagc ctggcgggtc cctgagactg 60

agttgtgctg cctccgggtt tacatttagc tcctacgcaa tgtcctgggt gaggcaggca 120

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ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcgc caagggctgg 300

ctgggcaatt ttgattattg gggccagggc accctggtga cagtgtctag cggcggcggc 360

ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggctccgaga tcgtgctgac ccagagccca 420

ggcacactga gcctgtcccc aggagagagg gccaccctgt cctgtcgcgc ctctcagagc 480

gtgtcccggt cttacctggc ctggtatcag cagaagccag gacaggcccc tcgcctgctg 540

atcatcggag catctaccag ggcaacaggc atccctgaca gattcagcgg ctccggctct 600

ggcacagact tcaccctgac aatctccaga ctggagccag aggacttcgc cgtgtactat 660

tgtcagcagg ggcaggtcat tccacccaca ttcgggcagg gcactaaagt cgagatcaaa 720

ggcggcggcg gctctgaggt gcagctggtg gagagcggcg gcggcctggt gcagcccggc 780

ggctccctga agctgtcttg tgccgccagc ggcttcacct tcaacaagta tgccatgaat 840

tgggtgaggc aggcacctgg caagggcctg gagtgggtgg ccaggatcag aagcaagtac 900

aacaattatg ccacctacta tgccgactcc gtgaaggata ggttcacaat ctccagagac 960

gattctaaga ataccgccta cctgcagatg aacaatctga agacagagga taccgccgtg 1020

tactattgcg tgagacacgg caactttggc aattcttaca tcagctattg ggcctactgg 1080

ggccagggca cactggtgac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1140

ggcggcggcg gcagccagac agtggtgacc caggagccaa gcctgaccgt gtcccctggc 1200

ggcaccgtga cactgacctg tggatctagc acaggagcag tgacctccgg aaactaccct 1260

aattgggtgc agcagaagcc aggacaggcc cctaggggcc tgatcggcgg aacaaagttc 1320

ctggccccag gcacccccgc cagattttct ggcagcctgc tgggcggcaa ggccgccctg 1380

accctgtccg gagtgcagcc agaggacgag gccgagtact attgcgtgct gtggtacagc 1440

aatcgctggg tcttcggagg gggaaccaaa ctgactgtcc tg 1482

<210> 20

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FAPBiTE，无开始或IgE前导序列

<400> 20

Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

35 40 45

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

130 135 140

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

145 150 155 160

Ser Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

165 170 175

Arg Leu Leu Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln

210 215 220

Val Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

245 250 255

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

260 265 270

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275 280 285

Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr

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Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp

305 310 315 320

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp

325 330 335

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr

340 345 350

Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

355 360 365

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

385 390 395 400

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly

405 410 415

Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

420 425 430

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

435 440 445

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

450 455 460

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn

465 470 475 480

Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

485 490

<210> 21

<211> 1542

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FAPDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 21

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cccgcgtgca tagtgaagtg 60

cagctgctgg aaagtggcgg gggcctggtc cagcctggcg ggtccctgag actgagttgt 120

gctgcctccg ggtttacatt tagctcctac gcaatgtcct gggtgaggca ggcaccaggc 180

aagggcctgg agtgggtgtc tgccatctcc ggctctggcg gctctaccta ctatgccgac 240

agcgtgaagg gcaggttcac catcagcaga gataactcca agaatacact gtacctgcag 300

atgaacagcc tgagggccga ggacacagcc gtgtactatt gcgccaaggg ctggctgggc 360

aattttgatt attggggcca gggcaccctg gtgacagtgt ctagcggcgg cggcggcagc 420

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggctcc gagatcgtgc tgacccagag cccaggcaca 480

ctgagcctgt ccccaggaga gagggccacc ctgtcctgtc gcgcctctca gagcgtgtcc 540

cggtcttacc tggcctggta tcagcagaag ccaggacagg cccctcgcct gctgatcatc 600

ggagcatcta ccagggcaac aggcatccct gacagattca gcggctccgg ctctggcaca 660

gacttcaccc tgacaatctc cagactggag ccagaggact tcgccgtgta ctattgtcag 720

caggggcagg tcattccacc cacattcggg cagggcacta aagtcgagat caaaggcggc 780

ggcggctctg aggtgcagct ggtggagagc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggctcc 840

ctgaagctgt cttgtgccgc cagcggcttc accttcaaca agtatgccat gaattgggtg 900

aggcaggcac ctggcaaggg cctggagtgg gtggccagga tcagaagcaa gtacaacaat 960

tatgccacct actatgccga ctccgtgaag gataggttca caatctccag agacgattct 1020

aagaataccg cctacctgca gatgaacaat ctgaagacag aggataccgc cgtgtactat 1080

tgcgtgagac acggcaactt tggcaattct tacatcagct attgggccta ctggggccag 1140

ggcacactgg tgaccgtgag cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 1200

ggcggcagcc agacagtggt gacccaggag ccaagcctga ccgtgtcccc tggcggcacc 1260

gtgacactga cctgtggatc tagcacagga gcagtgacct ccggaaacta ccctaattgg 1320

gtgcagcaga agccaggaca ggcccctagg ggcctgatcg gcggaacaaa gttcctggcc 1380

ccaggcaccc ccgccagatt ttctggcagc ctgctgggcg gcaaggccgc cctgaccctg 1440

tccggagtgc agccagagga cgaggccgag tactattgcg tgctgtggta cagcaatcgc 1500

tgggtcttcg gagggggaac caaactgact gtcctgtgat aa 1542

<210> 22

<211> 512

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FAPDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 22

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

35 40 45

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr

145 150 155 160

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

165 170 175

Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

180 185 190

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly

195 200 205

Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

210 215 220

Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

225 230 235 240

Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

245 250 255

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser

275 280 285

Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro

290 295 300

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn

305 310 315 320

Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser

325 330 335

Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys

340 345 350

Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly

355 360 365

Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

370 375 380

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser

405 410 415

Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val

420 425 430

Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

435 440 445

Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro

450 455 460

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465 470 475 480

Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp

485 490 495

Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

500 505 510

<210> 23

<211> 1560

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FAPDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 23

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cccgcgtgca tagtgaagtg 60

cagctgctgg aaagtggcgg gggcctggtc cagcctggcg ggtccctgag actgagttgt 120

gctgcctccg ggtttacatt tagctcctac gcaatgtcct gggtgaggca ggcaccaggc 180

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agcgtgaagg gcaggttcac catcagcaga gataactcca agaatacact gtacctgcag 300

atgaacagcc tgagggccga ggacacagcc gtgtactatt gcgccaaggg ctggctgggc 360

aattttgatt attggggcca gggcaccctg gtgacagtgt ctagcggcgg cggcggcagc 420

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggctcc gagatcgtgc tgacccagag cccaggcaca 480

ctgagcctgt ccccaggaga gagggccacc ctgtcctgtc gcgcctctca gagcgtgtcc 540

cggtcttacc tggcctggta tcagcagaag ccaggacagg cccctcgcct gctgatcatc 600

ggagcatcta ccagggcaac aggcatccct gacagattca gcggctccgg ctctggcaca 660

gacttcaccc tgacaatctc cagactggag ccagaggact tcgccgtgta ctattgtcag 720

caggggcagg tcattccacc cacattcggg cagggcacta aagtcgagat caaaggcggc 780

ggcggctctg aggtgcagct ggtggagagc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggctcc 840

ctgaagctgt cttgtgccgc cagcggcttc accttcaaca agtatgccat gaattgggtg 900

aggcaggcac ctggcaaggg cctggagtgg gtggccagga tcagaagcaa gtacaacaat 960

tatgccacct actatgccga ctccgtgaag gataggttca caatctccag agacgattct 1020

aagaataccg cctacctgca gatgaacaat ctgaagacag aggataccgc cgtgtactat 1080

tgcgtgagac acggcaactt tggcaattct tacatcagct attgggccta ctggggccag 1140

ggcacactgg tgaccgtgag cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 1200

ggcggcagcc agacagtggt gacccaggag ccaagcctga ccgtgtcccc tggcggcacc 1260

gtgacactga cctgtggatc tagcacagga gcagtgacct ccggaaacta ccctaattgg 1320

gtgcagcaga agccaggaca ggcccctagg ggcctgatcg gcggaacaaa gttcctggcc 1380

ccaggcaccc ccgccagatt ttctggcagc ctgctgggcg gcaaggccgc cctgaccctg 1440

tccggagtgc agccagagga cgaggccgag tactattgcg tgctgtggta cagcaatcgc 1500

tgggtcttcg gagggggaac caaactgact gtcctgcacc accaccacca ccattgataa 1560

<210> 24

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FAPDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 24

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

35 40 45

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

85 90 95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr

145 150 155 160

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

165 170 175

Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

180 185 190

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly

195 200 205

Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

210 215 220

Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

225 230 235 240

Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

245 250 255

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser

275 280 285

Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro

290 295 300

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn

305 310 315 320

Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser

325 330 335

Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys

340 345 350

Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly

355 360 365

Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

370 375 380

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser

405 410 415

Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val

420 425 430

Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

435 440 445

Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro

450 455 460

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu

465 470 475 480

Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp

485 490 495

Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

500 505 510

His His His His His His

515

<210> 25

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FSHRDBiTE，无开始或终止密码子

或IgE前导序列

<400> 25

tacaccaggg acctggtgta taaggatccc gccagaccta agatccagaa gacctgcaca 60

ttcggcggcg gcggctctga ggtgcagctg gtggagagcg gcggcggcct ggtgcagccc 120

ggcggctccc tgaagctgtc ttgtgccgcc agcggcttca ccttcaacaa gtatgccatg 180

aattgggtga ggcaggcacc tggcaagggc ctggagtggg tggccaggat cagaagcaag 240

tacaacaatt atgccaccta ctatgccgac tccgtgaagg ataggttcac aatctccaga 300

gacgattcta agaataccgc ctacctgcag atgaacaatc tgaagacaga ggataccgcc 360

gtgtactatt gcgtgagaca cggcaacttt ggcaattctt acatcagcta ttgggcctac 420

tggggccagg gcacactggt gaccgtgagc agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 480

agcggcggcg gcggcagcca gacagtggtg acccaggagc caagcctgac cgtgtcccct 540

ggcggcaccg tgacactgac ctgtggatct agcacaggag cagtgacctc cggaaactac 600

cctaattggg tgcagcagaa gccaggacag gcccctaggg gcctgatcgg cggaacaaag 660

ttcctggccc caggcacccc cgccagattt tctggcagcc tgctgggcgg caaggccgcc 720

ctgaccctgt ccggagtgca gccagaggac gaggccgagt actattgcgt gctgtggtac 780

agcaatcgct gggtcttcgg agggggaacc aaactgactg tcctg 825

<210> 26

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FSHRDBiTE，无开始或IgE前导

序列

<400> 26

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln

1 5 10 15

Lys Thr Cys Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys

35 40 45

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg

50 55 60

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe

85 90 95

Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn

100 105 110

Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly

115 120 125

Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

130 135 140

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu

165 170 175

Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr

180 185 190

Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro

195 200 205

Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro

210 215 220

Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala

225 230 235 240

Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys

245 250 255

Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

260 265 270

Thr Val Leu

275

<210> 27

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FSHRDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 27

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cccgcgtgca tagttacacc 60

agggacctgg tgtataagga tcccgccaga cctaagatcc agaagacctg cacattcggc 120

ggcggcggct ctgaggtgca gctggtggag agcggcggcg gcctggtgca gcccggcggc 180

tccctgaagc tgtcttgtgc cgccagcggc ttcaccttca acaagtatgc catgaattgg 240

gtgaggcagg cacctggcaa gggcctggag tgggtggcca ggatcagaag caagtacaac 300

aattatgcca cctactatgc cgactccgtg aaggataggt tcacaatctc cagagacgat 360

tctaagaata ccgcctacct gcagatgaac aatctgaaga cagaggatac cgccgtgtac 420

tattgcgtga gacacggcaa ctttggcaat tcttacatca gctattgggc ctactggggc 480

cagggcacac tggtgaccgt gagcagcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 540

ggcggcggca gccagacagt ggtgacccag gagccaagcc tgaccgtgtc ccctggcggc 600

accgtgacac tgacctgtgg atctagcaca ggagcagtga cctccggaaa ctaccctaat 660

tgggtgcagc agaagccagg acaggcccct aggggcctga tcggcggaac aaagttcctg 720

gccccaggca cccccgccag attttctggc agcctgctgg gcggcaaggc cgccctgacc 780

ctgtccggag tgcagccaga ggacgaggcc gagtactatt gcgtgctgtg gtacagcaat 840

cgctgggtct tcggaggggg aaccaaactg actgtcctgt gataa 885

<210> 28

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FSHRDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 28

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys

20 25 30

Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

35 40 45

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp

65 70 75 80

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg

85 90 95

Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp

100 105 110

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

115 120 125

Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg

130 135 140

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly

145 150 155 160

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

165 170 175

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro

180 185 190

Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser

195 200 205

Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln

210 215 220

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu

225 230 235 240

Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys

245 250 255

Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr

260 265 270

Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr

275 280 285

Lys Leu Thr Val Leu

290

<210> 29

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FSHRDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 29

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cccgcgtgca tagttacacc 60

agggacctgg tgtataagga tcccgccaga cctaagatcc agaagacctg cacattcggc 120

ggcggcggct ctgaggtgca gctggtggag agcggcggcg gcctggtgca gcccggcggc 180

tccctgaagc tgtcttgtgc cgccagcggc ttcaccttca acaagtatgc catgaattgg 240

gtgaggcagg cacctggcaa gggcctggag tgggtggcca ggatcagaag caagtacaac 300

aattatgcca cctactatgc cgactccgtg aaggataggt tcacaatctc cagagacgat 360

tctaagaata ccgcctacct gcagatgaac aatctgaaga cagaggatac cgccgtgtac 420

tattgcgtga gacacggcaa ctttggcaat tcttacatca gctattgggc ctactggggc 480

cagggcacac tggtgaccgt gagcagcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 540

ggcggcggca gccagacagt ggtgacccag gagccaagcc tgaccgtgtc ccctggcggc 600

accgtgacac tgacctgtgg atctagcaca ggagcagtga cctccggaaa ctaccctaat 660

tgggtgcagc agaagccagg acaggcccct aggggcctga tcggcggaac aaagttcctg 720

gccccaggca cccccgccag attttctggc agcctgctgg gcggcaaggc cgccctgacc 780

ctgtccggag tgcagccaga ggacgaggcc gagtactatt gcgtgctgtg gtacagcaat 840

cgctgggtct tcggaggggg aaccaaactg actgtcctgc accaccacca ccaccattga 900

taa 903

<210> 30

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成FSHRDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 30

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys

20 25 30

Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

35 40 45

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp

65 70 75 80

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg

85 90 95

Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp

100 105 110

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

115 120 125

Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg

130 135 140

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly

145 150 155 160

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

165 170 175

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro

180 185 190

Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser

195 200 205

Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln

210 215 220

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu

225 230 235 240

Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys

245 250 255

Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr

260 265 270

Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr

275 280 285

Lys Leu Thr Val Leu His His His His His His

290 295

<210> 31

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成EGFRBiTE，无开始、终止或IgE

前导序列

<400> 31

gagatccagc tggtgcagag cggagccgag gtcaagaagc ctggggagag cctgagaatt 60

tcctgtaagg ggagcgggtt caacattgag gactactata tccactgggt gaggcagatg 120

ccaggcaagg gcctggagtg gatgggaaga atcgacccag agaacgatga gacaaagtac 180

ggccccatct tccagggcca cgtgacaatc agcgccgaca cctccatcaa tacagtgtat 240

ctgcagtgga gctccctgaa ggcctccgat accgccatgt actattgcgc ctttaggggc 300

ggcgtgtact ggggacaggg aaccacagtg acagtgtcta gcggcggcgg cggcagcggc 360

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggct ccgacgtggt catgacccag 420

tctcctgata gcctggccgt gtctctggga gagagggcaa caatcaactg taagtcctct 480

cagtctctgc tggacagcga tggcaagacc tatctgaatt ggctgcagca gaagcctggc 540

cagcccccta agcggctgat ctccctggtg tctaagctgg acagcggcgt gccagatcgc 600

ttctctggca gcggctccgg cacagacttt accctgacaa tcagctccct gcaggccgag 660

gatgtggccg tgtactattg ttggcagggg actcattttc cagggacatt cggaggaggg 720

acaaaggtcg agatcaaggg cggcggcggc tctgaggtgc agctggtgga gagcggcggc 780

ggcctggtgc agcccggcgg ctccctgaag ctgtcttgtg ccgccagcgg cttcaccttc 840

aacaagtatg ccatgaattg ggtgaggcag gcacctggca agggcctgga gtgggtggcc 900

aggatcagaa gcaagtacaa caattatgcc acctactatg ccgactccgt gaaggatagg 960

ttcacaatct ccagagacga ttctaagaat accgcctacc tgcagatgaa caatctgaag 1020

acagaggata ccgccgtgta ctattgcgtg agacacggca actttggcaa ttcttacatc 1080

agctattggg cctactgggg ccagggcaca ctggtgaccg tgagcagcgg cggcggcggc 1140

agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agccagacag tggtgaccca ggagccaagc 1200

ctgaccgtgt cccctggcgg caccgtgaca ctgacctgtg gatctagcac aggagcagtg 1260

acctccggaa actaccctaa ttgggtgcag cagaagccag gacaggcccc taggggcctg 1320

atcggcggaa caaagttcct ggccccaggc acccccgcca gattttctgg cagcctgctg 1380

ggcggcaagg ccgccctgac cctgtccgga gtgcagccag aggacgaggc cgagtactat 1440

tgcgtgctgt ggtacagcaa tcgctgggtc ttcggagggg gaaccaaact gactgtcctg 1500

<210> 32

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成EGFRBiTE，无开始或IgE前导序列

<400> 32

Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser

130 135 140

Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser

145 150 155 160

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys

180 185 190

Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

245 250 255

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser

260 265 270

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val

275 280 285

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser

290 295 300

Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg

305 310 315 320

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

325 330 335

Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His

340 345 350

Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln

355 360 365

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

385 390 395 400

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

405 410 415

Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys

420 425 430

Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala

435 440 445

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

450 455 460

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

465 470 475 480

Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

485 490 495

Leu Thr Val Leu

500

<210> 33

<211> 1560

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成EGFRDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 33

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cccgcgtgca tagtgagatc 60

cagctggtgc agagcggagc cgaggtcaag aagcctgggg agagcctgag aatttcctgt 120

aaggggagcg ggttcaacat tgaggactac tatatccact gggtgaggca gatgccaggc 180

aagggcctgg agtggatggg aagaatcgac ccagagaacg atgagacaaa gtacggcccc 240

atcttccagg gccacgtgac aatcagcgcc gacacctcca tcaatacagt gtatctgcag 300

tggagctccc tgaaggcctc cgataccgcc atgtactatt gcgcctttag gggcggcgtg 360

tactggggac agggaaccac agtgacagtg tctagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 420

ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggctccgacg tggtcatgac ccagtctcct 480

gatagcctgg ccgtgtctct gggagagagg gcaacaatca actgtaagtc ctctcagtct 540

ctgctggaca gcgatggcaa gacctatctg aattggctgc agcagaagcc tggccagccc 600

cctaagcggc tgatctccct ggtgtctaag ctggacagcg gcgtgccaga tcgcttctct 660

ggcagcggct ccggcacaga ctttaccctg acaatcagct ccctgcaggc cgaggatgtg 720

gccgtgtact attgttggca ggggactcat tttccaggga cattcggagg agggacaaag 780

gtcgagatca agggcggcgg cggctctgag gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg 840

gtgcagcccg gcggctccct gaagctgtct tgtgccgcca gcggcttcac cttcaacaag 900

tatgccatga attgggtgag gcaggcacct ggcaagggcc tggagtgggt ggccaggatc 960

agaagcaagt acaacaatta tgccacctac tatgccgact ccgtgaagga taggttcaca 1020

atctccagag acgattctaa gaataccgcc tacctgcaga tgaacaatct gaagacagag 1080

gataccgccg tgtactattg cgtgagacac ggcaactttg gcaattctta catcagctat 1140

tgggcctact ggggccaggg cacactggtg accgtgagca gcggcggcgg cggcagcggc 1200

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccag acagtggtga cccaggagcc aagcctgacc 1260

gtgtcccctg gcggcaccgt gacactgacc tgtggatcta gcacaggagc agtgacctcc 1320

ggaaactacc ctaattgggt gcagcagaag ccaggacagg cccctagggg cctgatcggc 1380

ggaacaaagt tcctggcccc aggcaccccc gccagatttt ctggcagcct gctgggcggc 1440

aaggccgccc tgaccctgtc cggagtgcag ccagaggacg aggccgagta ctattgcgtg 1500

ctgtggtaca gcaatcgctg ggtcttcgga gggggaacca aactgactgt cctgtgataa 1560

<210> 34

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成EGFRDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 34

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

20 25 30

Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu

35 40 45

Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro

65 70 75 80

Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr

85 90 95

Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro

145 150 155 160

Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys

165 170 175

Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp

180 185 190

Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val

195 200 205

Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

260 265 270

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys

275 280 285

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn

290 295 300

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

305 310 315 320

Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

325 330 335

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

340 345 350

Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

355 360 365

Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp

370 375 380

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

385 390 395 400

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu

405 410 415

Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly

420 425 430

Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln

435 440 445

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe

450 455 460

Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly

465 470 475 480

Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu

485 490 495

Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly

500 505 510

Thr Lys Leu Thr Val Leu

515

<210> 35

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成EGFRDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 35

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cccgcgtgca tagtgagatc 60

cagctggtgc agagcggagc cgaggtcaag aagcctgggg agagcctgag aatttcctgt 120

aaggggagcg ggttcaacat tgaggactac tatatccact gggtgaggca gatgccaggc 180

aagggcctgg agtggatggg aagaatcgac ccagagaacg atgagacaaa gtacggcccc 240

atcttccagg gccacgtgac aatcagcgcc gacacctcca tcaatacagt gtatctgcag 300

tggagctccc tgaaggcctc cgataccgcc atgtactatt gcgcctttag gggcggcgtg 360

tactggggac agggaaccac agtgacagtg tctagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 420

ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggctccgacg tggtcatgac ccagtctcct 480

gatagcctgg ccgtgtctct gggagagagg gcaacaatca actgtaagtc ctctcagtct 540

ctgctggaca gcgatggcaa gacctatctg aattggctgc agcagaagcc tggccagccc 600

cctaagcggc tgatctccct ggtgtctaag ctggacagcg gcgtgccaga tcgcttctct 660

ggcagcggct ccggcacaga ctttaccctg acaatcagct ccctgcaggc cgaggatgtg 720

gccgtgtact attgttggca ggggactcat tttccaggga cattcggagg agggacaaag 780

gtcgagatca agggcggcgg cggctctgag gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg 840

gtgcagcccg gcggctccct gaagctgtct tgtgccgcca gcggcttcac cttcaacaag 900

tatgccatga attgggtgag gcaggcacct ggcaagggcc tggagtgggt ggccaggatc 960

agaagcaagt acaacaatta tgccacctac tatgccgact ccgtgaagga taggttcaca 1020

atctccagag acgattctaa gaataccgcc tacctgcaga tgaacaatct gaagacagag 1080

gataccgccg tgtactattg cgtgagacac ggcaactttg gcaattctta catcagctat 1140

tgggcctact ggggccaggg cacactggtg accgtgagca gcggcggcgg cggcagcggc 1200

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aaggccgccc tgaccctgtc cggagtgcag ccagaggacg aggccgagta ctattgcgtg 1500

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<210> 36

<211> 524

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成EGFRDBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 36

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

20 25 30

Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu

35 40 45

Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro

65 70 75 80

Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr

85 90 95

Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro

145 150 155 160

Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys

165 170 175

Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp

180 185 190

Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val

195 200 205

Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

260 265 270

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys

275 280 285

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn

290 295 300

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

305 310 315 320

Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

325 330 335

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

340 345 350

Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

355 360 365

Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp

370 375 380

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

385 390 395 400

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu

405 410 415

Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly

420 425 430

Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln

435 440 445

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe

450 455 460

Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly

465 470 475 480

Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu

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Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly

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Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His His His His

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<210> 37

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成PSMADBiTE，无开始或终止密码子或

IgE前导序列

<400> 37

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acatactatt gccagcagta caactcatac ccttacacct tcggaggagg cacaaaactg 720

gaaatcaagt caggcggcgg cggctctgag gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg 780

gtgcagcccg gcggctccct gaagctgtct tgtgccgcca gcggcttcac cttcaacaag 840

tatgccatga attgggtgag gcaggcacct ggcaagggcc tggagtgggt ggccaggatc 900

agaagcaagt acaacaatta tgccacctac tatgccgact ccgtgaagga taggttcaca 960

atctccagag acgattctaa gaataccgcc tacctgcaga tgaacaatct gaagacagag 1020

gataccgccg tgtactattg cgtgagacac ggcaactttg gcaattctta catcagctat 1080

tgggcctact ggggccaggg cacactggtg accgtgagca gcggcggcgg cggcagcggc 1140

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccag acagtggtga cccaggagcc aagcctgacc 1200

gtgtcccctg gcggcaccgt gacactgacc tgtggatcta gcacaggagc agtgacctcc 1260

ggaaactacc ctaattgggt gcagcagaag ccaggacagg cccctagggg cctgatcggc 1320

ggaacaaagt tcctggcccc aggcaccccc gccagatttt ctggcagcct gctgggcggc 1380

aaggccgccc tgaccctgtc cggagtgcag ccagaggacg aggccgagta ctattgcgtg 1440

ctgtggtaca gcaatcgctg ggtcttcgga gggggaacca aactgactgt cctg 1494

<210> 38

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成PSMADBiTE，无开始或IgE前导序列

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Asp Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Ile Ile

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Phe Pro Leu Leu Arg His Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

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Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

180 185 190

Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

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210 215 220

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Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala

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Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln

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Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr

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Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn

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Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn

340 345 350

Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

355 360 365

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr

385 390 395 400

Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly

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420 425 430

Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly

435 440 445

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Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

485 490 495

Val Leu

<210> 39

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成PSMADBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 39

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cccgcgtgca tagtcaggtg 60

cagctggtcg aatctggcgg cggcctggtc aagcccggag agagcctgag actgagttgt 120

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tattgccagc agtacaactc atacccttac accttcggag gaggcacaaa actggaaatc 780

aagtcaggcg gcggcggctc tgaggtgcag ctggtggaga gcggcggcgg cctggtgcag 840

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atgaattggg tgaggcaggc acctggcaag ggcctggagt gggtggccag gatcagaagc 960

aagtacaaca attatgccac ctactatgcc gactccgtga aggataggtt cacaatctcc 1020

agagacgatt ctaagaatac cgcctacctg cagatgaaca atctgaagac agaggatacc 1080

gccgtgtact attgcgtgag acacggcaac tttggcaatt cttacatcag ctattgggcc 1140

tactggggcc agggcacact ggtgaccgtg agcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 1200

ggcagcggcg gcggcggcag ccagacagtg gtgacccagg agccaagcct gaccgtgtcc 1260

cctggcggca ccgtgacact gacctgtgga tctagcacag gagcagtgac ctccggaaac 1320

taccctaatt gggtgcagca gaagccagga caggccccta ggggcctgat cggcggaaca 1380

aagttcctgg ccccaggcac ccccgccaga ttttctggca gcctgctggg cggcaaggcc 1440

gccctgaccc tgtccggagt gcagccagag gacgaggccg agtactattg cgtgctgtgg 1500

tacagcaatc gctgggtctt cggaggggga accaaactga ctgtcctgtg ataa 1554

<210> 40

<211> 516

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成PSMADBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 40

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

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Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg

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Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp

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225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

260 265 270

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser

275 280 285

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val

290 295 300

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser

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Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg

325 330 335

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

340 345 350

Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His

355 360 365

Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln

370 375 380

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

405 410 415

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

420 425 430

Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys

435 440 445

Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala

450 455 460

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

465 470 475 480

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

485 490 495

Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

500 505 510

Leu Thr Val Leu

515

<210> 41

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成PSMADBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 41

atggattgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cccgcgtgca tagtcaggtg 60

cagctggtcg aatctggcgg cggcctggtc aagcccggag agagcctgag actgagttgt 120

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tattgccagc agtacaactc atacccttac accttcggag gaggcacaaa actggaaatc 780

aagtcaggcg gcggcggctc tgaggtgcag ctggtggaga gcggcggcgg cctggtgcag 840

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atgaattggg tgaggcaggc acctggcaag ggcctggagt gggtggccag gatcagaagc 960

aagtacaaca attatgccac ctactatgcc gactccgtga aggataggtt cacaatctcc 1020

agagacgatt ctaagaatac cgcctacctg cagatgaaca atctgaagac agaggatacc 1080

gccgtgtact attgcgtgag acacggcaac tttggcaatt cttacatcag ctattgggcc 1140

tactggggcc agggcacact ggtgaccgtg agcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 1200

ggcagcggcg gcggcggcag ccagacagtg gtgacccagg agccaagcct gaccgtgtcc 1260

cctggcggca ccgtgacact gacctgtgga tctagcacag gagcagtgac ctccggaaac 1320

taccctaatt gggtgcagca gaagccagga caggccccta ggggcctgat cggcggaaca 1380

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gccctgaccc tgtccggagt gcagccagag gacgaggccg agtactattg cgtgctgtgg 1500

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caccattgat aa 1572

<210> 42

<211> 522

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成PSMADBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 42

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro

20 25 30

Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

35 40 45

Asp Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Val Ala Ser Ile Ser Asp Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Ile Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

85 90 95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Pro Leu Leu Arg His Gly Ala Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

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Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg

195 200 205

Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

260 265 270

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser

275 280 285

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val

290 295 300

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser

305 310 315 320

Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg

325 330 335

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

340 345 350

Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His

355 360 365

Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln

370 375 380

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

405 410 415

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

420 425 430

Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys

435 440 445

Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala

450 455 460

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

465 470 475 480

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

485 490 495

Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

500 505 510

Leu Thr Val Leu His His His His His His

515 520

<210> 43

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD123DBiTE，无开始、终止或前导

序列

<400> 43

gaagtgcagc tggtcgagag tggaggagga ctggtgcagc caggcggctc tctgaggctg 60

agctgcgcag catccggctt caccttcaac acctacgcaa tgaattgggt gcgccaggca 120

ccaggcaagg gcctggagtg ggtggccagg atcagaagca agtacaacaa ttatgccaca 180

tactatgccg cctctgtgaa gggccggttc accatcagcc gcgacgattc caagaactct 240

ctgtatctgc agatgaacag cctgaagaca gaggacaccg ccgtgtacta ttgcgcccgg 300

cacggcaact tcggcaatag ctacgtgtcc tggtttgcct attggggcca gggcacactg 360

gtgaccgtga gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 420

cagacagtgg tgacccagga gccctctctg acagtgagcc ctggcggcac cgtgacactg 480

acctgtcggt ctagcaccgg cgccgtgacc acaagcaact acgccaattg ggtgcagcag 540

aagccaggac aggcccccag gggcctgatc ggcggaacaa acaagagggc accaggaacc 600

cctgcacgct tctccggctc tctgctgggc ggcaaggccg ccctgaccct gtctggagtg 660

cagcccgagg atgaggccga gtactattgc gccctgtggt actccaatct gtgggtgttt 720

ggcggcggaa caaagctgac cgtgctgggc ggcggcggca gcgaggtgca gctggtgcag 780

tccggcgccg aggtgaagaa gcctggcgag tccctgaaga tctcttgtaa gggctctggc 840

tacagcttca catcctattg gatcagctgg gtgaggcaga tgcctggcaa gggcctggaa 900

tggatgggca tcatcgaccc tagcgactcc gataccagat actctccaag ctttcagggc 960

caggtgacaa tctccgccga taagtccatc tctaccgcct atctgcagtg gtcctctctg 1020

aaggcctccg acacagccat gtactattgc gcacgcggcg atggatctac cgacctggat 1080

tactggggac agggcacact ggtcaccgtg agcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 1140

ggcagcggcg gcggcggctc tgagatcgtg ctgacacaga gcccaggcac cctgagcctg 1200

tccccaggag agagggccac cctgtcctgt agagcctctc agagcgtgtc tagctcctac 1260

ctggcctggt atcagcagaa gcctggccag gccccaaggc tgctgatcta cggagcatct 1320

agcagggcaa caggcatccc cgacagattc tccggatctg gaagcggaac cgacttcacc 1380

ctgaccatca gcagactgga gcctgaggac ttcgccgtgt actattgtca gcaggattat 1440

ggctttcctt ggaccttcgg acagggcaca aaagtcgaga ttaagaga 1488

<210> 44

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD123DBiTE，无开始或前导

序列

<400> 44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val

130 135 140

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

165 170 175

Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly

180 185 190

Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

195 200 205

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp

210 215 220

Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe

225 230 235 240

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

245 250 255

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu

260 265 270

Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile

275 280 285

Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile

290 295 300

Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly

305 310 315 320

Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln

325 330 335

Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg

340 345 350

Gly Asp Gly Ser Thr Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

355 360 365

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

370 375 380

Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

385 390 395 400

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

405 410 415

Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

420 425 430

Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

435 440 445

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

450 455 460

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr

465 470 475 480

Gly Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

485 490 495

<210> 45

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD123DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 45

atggattgga cttggattct gtttctggtc gccgccgcaa ctagagtgca ttctgaagtg 60

cagctggtcg agagtggagg aggactggtg cagccaggcg gctctctgag gctgagctgc 120

gcagcatccg gcttcacctt caacacctac gcaatgaatt gggtgcgcca ggcaccaggc 180

aagggcctgg agtgggtggc caggatcaga agcaagtaca acaattatgc cacatactat 240

gccgcctctg tgaagggccg gttcaccatc agccgcgacg attccaagaa ctctctgtat 300

ctgcagatga acagcctgaa gacagaggac accgccgtgt actattgcgc ccggcacggc 360

aacttcggca atagctacgt gtcctggttt gcctattggg gccagggcac actggtgacc 420

gtgagcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagccagaca 480

gtggtgaccc aggagccctc tctgacagtg agccctggcg gcaccgtgac actgacctgt 540

cggtctagca ccggcgccgt gaccacaagc aactacgcca attgggtgca gcagaagcca 600

ggacaggccc ccaggggcct gatcggcgga acaaacaaga gggcaccagg aacccctgca 660

cgcttctccg gctctctgct gggcggcaag gccgccctga ccctgtctgg agtgcagccc 720

gaggatgagg ccgagtacta ttgcgccctg tggtactcca atctgtgggt gtttggcggc 780

ggaacaaagc tgaccgtgct gggcggcggc ggcagcgagg tgcagctggt gcagtccggc 840

gccgaggtga agaagcctgg cgagtccctg aagatctctt gtaagggctc tggctacagc 900

ttcacatcct attggatcag ctgggtgagg cagatgcctg gcaagggcct ggaatggatg 960

ggcatcatcg accctagcga ctccgatacc agatactctc caagctttca gggccaggtg 1020

acaatctccg ccgataagtc catctctacc gcctatctgc agtggtcctc tctgaaggcc 1080

tccgacacag ccatgtacta ttgcgcacgc ggcgatggat ctaccgacct ggattactgg 1140

ggacagggca cactggtcac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1200

ggcggcggcg gctctgagat cgtgctgaca cagagcccag gcaccctgag cctgtcccca 1260

ggagagaggg ccaccctgtc ctgtagagcc tctcagagcg tgtctagctc ctacctggcc 1320

tggtatcagc agaagcctgg ccaggcccca aggctgctga tctacggagc atctagcagg 1380

gcaacaggca tccccgacag attctccgga tctggaagcg gaaccgactt caccctgacc 1440

atcagcagac tggagcctga ggacttcgcc gtgtactatt gtcagcagga ttatggcttt 1500

ccttggacct tcggacaggg cacaaaagtc gagattaaga gatgataa 1548

<210> 46

<211> 514

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD123DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

<400> 46

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

35 40 45

Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys

85 90 95

Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser

115 120 125

Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr

145 150 155 160

Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val

165 170 175

Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr

180 185 190

Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile

195 200 205

Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro

225 230 235 240

Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp

245 250 255

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser

260 265 270

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

275 280 285

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

290 295 300

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

305 310 315 320

Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

325 330 335

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

340 345 350

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

355 360 365

Ala Arg Gly Asp Gly Ser Thr Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

370 375 380

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

405 410 415

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

420 425 430

Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

435 440 445

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

450 455 460

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

465 470 475 480

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

485 490 495

Asp Tyr Gly Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

500 505 510

Lys Arg

<210> 47

<211> 1566

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD123DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 47

atggattgga cttggattct gtttctggtc gccgccgcaa ctagagtgca ttctgaagtg 60

cagctggtcg agagtggagg aggactggtg cagccaggcg gctctctgag gctgagctgc 120

gcagcatccg gcttcacctt caacacctac gcaatgaatt gggtgcgcca ggcaccaggc 180

aagggcctgg agtgggtggc caggatcaga agcaagtaca acaattatgc cacatactat 240

gccgcctctg tgaagggccg gttcaccatc agccgcgacg attccaagaa ctctctgtat 300

ctgcagatga acagcctgaa gacagaggac accgccgtgt actattgcgc ccggcacggc 360

aacttcggca atagctacgt gtcctggttt gcctattggg gccagggcac actggtgacc 420

gtgagcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagccagaca 480

gtggtgaccc aggagccctc tctgacagtg agccctggcg gcaccgtgac actgacctgt 540

cggtctagca ccggcgccgt gaccacaagc aactacgcca attgggtgca gcagaagcca 600

ggacaggccc ccaggggcct gatcggcgga acaaacaaga gggcaccagg aacccctgca 660

cgcttctccg gctctctgct gggcggcaag gccgccctga ccctgtctgg agtgcagccc 720

gaggatgagg ccgagtacta ttgcgccctg tggtactcca atctgtgggt gtttggcggc 780

ggaacaaagc tgaccgtgct gggcggcggc ggcagcgagg tgcagctggt gcagtccggc 840

gccgaggtga agaagcctgg cgagtccctg aagatctctt gtaagggctc tggctacagc 900

ttcacatcct attggatcag ctgggtgagg cagatgcctg gcaagggcct ggaatggatg 960

ggcatcatcg accctagcga ctccgatacc agatactctc caagctttca gggccaggtg 1020

acaatctccg ccgataagtc catctctacc gcctatctgc agtggtcctc tctgaaggcc 1080

tccgacacag ccatgtacta ttgcgcacgc ggcgatggat ctaccgacct ggattactgg 1140

ggacagggca cactggtcac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1200

ggcggcggcg gctctgagat cgtgctgaca cagagcccag gcaccctgag cctgtcccca 1260

ggagagaggg ccaccctgtc ctgtagagcc tctcagagcg tgtctagctc ctacctggcc 1320

tggtatcagc agaagcctgg ccaggcccca aggctgctga tctacggagc atctagcagg 1380

gcaacaggca tccccgacag attctccgga tctggaagcg gaaccgactt caccctgacc 1440

atcagcagac tggagcctga ggacttcgcc gtgtactatt gtcagcagga ttatggcttt 1500

ccttggacct tcggacaggg cacaaaagtc gagattaaga gacaccatca ccaccaccac 1560

tgataa 1566

<210> 48

<211> 520

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD123DBiTE，可操作地连接到IgE前导序列

和His标签

<400> 48

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

35 40 45

Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys

85 90 95

Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser

115 120 125

Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr

145 150 155 160

Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val

165 170 175

Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr

180 185 190

Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile

195 200 205

Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro

225 230 235 240

Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp

245 250 255

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser

260 265 270

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

275 280 285

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

290 295 300

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

305 310 315 320

Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

325 330 335

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

340 345 350

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

355 360 365

Ala Arg Gly Asp Gly Ser Thr Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

370 375 380

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

405 410 415

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

420 425 430

Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

435 440 445

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

450 455 460

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

465 470 475 480

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

485 490 495

Asp Tyr Gly Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

500 505 510

Lys Arg His His His His His His

515 520

<210> 49

<211> 1485

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成HER2DBiTE的核苷酸序列，无

开始或终止密码子或IgE前导序列

<400> 49

gatattcaga tgactcagag cccttcctcc ctgagcgcct ccgtcggcga tcgggtgacc 60

atcacttgta aggcaagcca ggatgtgagc atcggcgtcg catggtacca gcagaagccc 120

ggcaaagccc caaagctgct gatctattcc gcaagttatc ggtacaccgg cgtcccctca 180

cgcttcagtg gatctgggtc tgggacagac ttcactctga ccattagctc cctgcagcca 240

gaagattttg ccacatacta ctgtcagcag tactatatct atccttacac tttcggacag 300

ggaacaaaag tggagatcaa gcgcggcggg ggagggagcg gaggaggggg ctctggaggc 360

ggcgggagcg aggtgcagct ggtcgagtct gggggaggcc tggtgcagcc cggagggtcc 420

ctgaggctgt cctgtgctgc aagcggcttt actttcacag actacaccat ggactgggtc 480

agacaggctc ccgggaaggg gctggaatgg gtggccgatg tgaaccctaa ctctggcggc 540

agtatctaca accagcggtt taaggggaga ttcacactgt cagtggacag gagcaaaaat 600

acactgtacc tgcagatgaa cagcctgagg gcagaagata cagcagtgta ctactgtgcc 660

agaaatctgg gacccagttt ttatttcgat tactgggggc agggaacact ggtgacagtg 720

tcatccggcg gcgggggctc tgaagtccag ctggtggaga gcggaggagg actggtccag 780

cctggcggaa gcctgcggct gtcctgcgct gccagcggat atagttttac cggctacact 840

atgaactggg tgcgccaggc acccggaaaa ggactggagt gggtcgctct gatcaacccc 900

tataagggag tctcaactta caatcagaag tttaaagatc gcttcactat cagtgtggac 960

aagtccaaga atacagccta tctgcagatg aactccctgc gcgccgaaga tactgccgtc 1020

tactattgcg cacggtcagg atattacgga gacagtgact ggtatttcga tgtctgggga 1080

caggggacac tggtgacagt ctcctctggc gggggaggct ccgggggagg aggatcagga 1140

ggcggcggat ctgacattca gatgactcag tcacctagta gcctgtctgc tagcgtggga 1200

gacagggtca ctattacctg cagggccagc caggatatcc gcaattacct gaactggtat 1260

cagcagaaac caggcaaagc ccccaaactg ctgatctact atacctcccg gctggaatca 1320

ggggtccctt caaggttctc aggctccgga agtggcaccg attacactct gacaattagc 1380

tcactgcagc cagaagactt tgctacctac tactgccagc aggggaatac tctgccttgg 1440

accttcggcc agggaactaa agtggagatt aagtcatcct gataa 1485

<210> 50

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成HER2DBiTE，无开始或IgE前导序列

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

115 120 125

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

130 135 140

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val

145 150 155 160

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro

165 170 175

Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr

180 185 190

Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly

210 215 220

Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

260 265 270

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro

275 280 285

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val

290 295 300

Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp

305 310 315 320

Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

325 330 335

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser

340 345 350

Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

355 360 365

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

385 390 395 400

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

405 410 415

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

420 425 430

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

435 440 445

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

450 455 460

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

465 470 475 480

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser

485 490

<210> 51

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成HER2DBiTE，具有IgE前导序列

<400> 51

atggactgga cttggattct gttcctggtc gcagcagcca cacgggtgca ttccgatatt 60

cagatgactc agagcccttc ctccctgagc gcctccgtcg gcgatcgggt gaccatcact 120

tgtaaggcaa gccaggatgt gagcatcggc gtcgcatggt accagcagaa gcccggcaaa 180

gccccaaagc tgctgatcta ttccgcaagt tatcggtaca ccggcgtccc ctcacgcttc 240

agtggatctg ggtctgggac agacttcact ctgaccatta gctccctgca gccagaagat 300

tttgccacat actactgtca gcagtactat atctatcctt acactttcgg acagggaaca 360

aaagtggaga tcaagcgcgg cgggggaggg agcggaggag ggggctctgg aggcggcggg 420

agcgaggtgc agctggtcga gtctggggga ggcctggtgc agcccggagg gtccctgagg 480

ctgtcctgtg ctgcaagcgg ctttactttc acagactaca ccatggactg ggtcagacag 540

gctcccggga aggggctgga atgggtggcc gatgtgaacc ctaactctgg cggcagtatc 600

tacaaccagc ggtttaaggg gagattcaca ctgtcagtgg acaggagcaa aaatacactg 660

tacctgcaga tgaacagcct gagggcagaa gatacagcag tgtactactg tgccagaaat 720

ctgggaccca gtttttattt cgattactgg gggcagggaa cactggtgac agtgtcatcc 780

ggcggcgggg gctctgaagt ccagctggtg gagagcggag gaggactggt ccagcctggc 840

ggaagcctgc ggctgtcctg cgctgccagc ggatatagtt ttaccggcta cactatgaac 900

tgggtgcgcc aggcacccgg aaaaggactg gagtgggtcg ctctgatcaa cccctataag 960

ggagtctcaa cttacaatca gaagtttaaa gatcgcttca ctatcagtgt ggacaagtcc 1020

aagaatacag cctatctgca gatgaactcc ctgcgcgccg aagatactgc cgtctactat 1080

tgcgcacggt caggatatta cggagacagt gactggtatt tcgatgtctg gggacagggg 1140

acactggtga cagtctcctc tggcggggga ggctccgggg gaggaggatc aggaggcggc 1200

ggatctgaca ttcagatgac tcagtcacct agtagcctgt ctgctagcgt gggagacagg 1260

gtcactatta cctgcagggc cagccaggat atccgcaatt acctgaactg gtatcagcag 1320

aaaccaggca aagcccccaa actgctgatc tactatacct cccggctgga atcaggggtc 1380

ccttcaaggt tctcaggctc cggaagtggc accgattaca ctctgacaat tagctcactg 1440

cagccagaag actttgctac ctactactgc cagcagggga atactctgcc ttggaccttc 1500

ggccagggaa ctaaagtgga gattaagtca tcctgataa 1539

<210> 52

<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成HER2DBiTE，具有IgE前导序列

<400> 52

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

20 25 30

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

35 40 45

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

50 55 60

Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

85 90 95

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr

100 105 110

Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

130 135 140

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

145 150 155 160

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp

165 170 175

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Val

180 185 190

Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg

195 200 205

Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

210 215 220

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn

225 230 235 240

Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

275 280 285

Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln

290 295 300

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys

305 310 315 320

Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser

325 330 335

Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

340 345 350

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly

355 360 365

Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

370 375 380

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

405 410 415

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg

420 425 430

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

435 440 445

Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

450 455 460

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

465 470 475 480

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu

485 490 495

Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser

500 505 510

<210> 53

<211> 1560

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD3xHer2 HER2DBiTE，具有His6标签

<400> 53

atggactgga cttggagaat cctgttcctg gtcgctgccg ccactggaac tcacgcccag 60

attgtgctga ctcagagccc tgctattatg tccgcctctc ccggcgagaa ggtgaccatg 120

acctgttctg cctccagctc cgtgtcctat gacggcgata gctacatgaa ctggtaccag 180

cagaagtctg gcacctctcc caagagatgg atctacgata ccagcaagct ggccagcggc 240

gtgcccgccc actttcgggg cagcggctcc ggcaccagct actctctgac aatctccggc 300

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ggcgcctctg tgaagatgtc ttgtaaggcc tccggctaca ccttcaccag atataccatg 540

cactgggtga agcagcgccc aggccagggc ctggagtgga tcggctatat caatccatct 600

agaggctaca ccaattacaa ccagaagttc aaggataagg ccaccctgac cacagacaag 660

tcctcctcta cagcctacat gcagctgtcc tctctgacat ccgaggattc cgccgtgtac 720

tattgtgcca gatattacga cgatcactac tgtctggact attggggcca gggcacaacc 780

ctgacagtgt ccagcggcgg cggcggctct gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcggc 840

ctggtgcagc ccggcggctc tctgagactg tcttgtgccg cctctggctt taccttcaca 900

gattatacca tggattgggt gagacaggcc cctggcaagg gcctggagtg ggtggccgat 960

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cagcagaagc ctggcaaggc cccaaagctg ctgatctact ctgcctccta tagatacacc 1380

ggcgtgccct ctagattctc cggctctggc tctggcaccg acttcacact gaccatctct 1440

tctctgcagc ccgaggactt cgccacctac tattgtcagc agtactacat ctacccttac 1500

accttcggac aggggacaaa agtggaaatc aagagacatc accatcacca tcattgataa 1560

<210> 54

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD3xHer2 HER2DBiTE，具有His6标签

<400> 54

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Thr His Ala Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val

35 40 45

Ser Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly

50 55 60

Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Asn Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro

145 150 155 160

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

165 170 175

Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

180 185 190

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln

195 200 205

Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr

210 215 220

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

260 265 270

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

275 280 285

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met

290 295 300

Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp

305 310 315 320

Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly

325 330 335

Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

340 345 350

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

355 360 365

Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

370 375 380

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

385 390 395 400

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

405 410 415

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp

420 425 430

Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

435 440 445

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

450 455 460

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

465 470 475 480

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr

485 490 495

Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

500 505 510

His His His His His His

515

<210> 55

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD3xHer2 HER2DBiTE，具有IgE前导序列

<400> 55

atggattgga cctggattct gtttctggtg gcggcggcga cccgcgtgca tagccagatt 60

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tgttctgcct ccagctccgt gtcctatgac ggcgatagct acatgaactg gtaccagcag 180

aagtctggca cctctcccaa gagatggatc tacgatacca gcaagctggc cagcggcgtg 240

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ggctacacca attacaacca gaagttcaag gataaggcca ccctgaccac agacaagtcc 660

tcctctacag cctacatgca gctgtcctct ctgacatccg aggattccgc cgtgtactat 720

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acagtgtcca gcggcggcgg cggctctgag gtgcagctgg tggagtctgg cggcggcctg 840

gtgcagcccg gcggctctct gagactgtct tgtgccgcct ctggctttac cttcacagat 900

tataccatgg attgggtgag acaggcccct ggcaagggcc tggagtgggt ggccgatgtg 960

aaccccaata gcggcggctc catctacaat cagaggttta agggccgctt tacactgtct 1020

gtggaccggt ctaagaacac cctgtacctg cagatgaatt ctctgagagc cgaggacacc 1080

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ttcggacagg ggacaaaagt ggaaatcaag agatgataa 1539

<210> 56

<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成CD3xHer2 HER2DBiTE，具有IgE前导序列

<400> 56

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser

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Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser

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Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

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Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Asn Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly

145 150 155 160

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg

165 170 175

Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

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Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys

195 200 205

Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

210 215 220

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

260 265 270

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

275 280 285

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp

290 295 300

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Val

305 310 315 320

Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg

325 330 335

Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

340 345 350

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn

355 360 365

Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

370 375 380

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

405 410 415

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val

420 425 430

Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

435 440 445

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg

450 455 460

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

465 470 475 480

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile

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Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

500 505 510

<210> 57

<211> 1542

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成HER2DBiTE-L

<400> 57

atggattgga cctggatcct gtttctggtg gccgctgcca caagagtgca cagcgaagtg 60

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gccgccagcg gcttcacctt caacacctac gccatgaact gggtccgaca ggcccctggc 180

aaaggccttg aatgggtcgc cagaatcaga agcaagtaca acaattacgc cacctactac 240

gccgcctccg tgaagggcag attcaccatc agcagggacg acagcaagaa cagcctgtac 300

ctgcagatga actccctgaa aaccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagacacggc 360

aacttcggca acagctatgt gtcttggttt gcctactggg gccagggcac actggtcaca 420

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gtggtcaccc aagagcctag cctgaccgtt tctcctggcg gaaccgtgac actgacctgt 540

agatcttcta caggcgccgt gaccaccagc aactacgcca attgggtgca gcagaagcca 600

ggccaggctc ctagaggact gatcggaggc accaacaaga gagcccctgg aacaccagcc 660

agattctctg gctctctgct cggaggaaag gccgctctga cactgagcgg agtgcagcct 720

gaagatgagg ccgagtacta ttgcgccctg tggtacagca acctgtgggt tttcggcgga 780

ggcacaaagc tgacagtgct tggaggtggc ggatccgagg ttcagctggt tgaaagtggc 840

ggtggcttgg tgcaaccagg cggaagcctc agacttagct gtgccgcctc tggctttacc 900

tttaccgact acacaatgga ttgggttcga caagctccag gcaagggact cgagtgggtc 960

gccgatgtga atcctaatag cggcggcagc atctacaacc agcggttcaa aggccggttc 1020

accctgagcg tggacagatc caagaatact ctgtatctcc agatgaatag cctgcgcgcc 1080

gaggatacag ctgtgtatta ctgcgcccgg aatctgggcc ccagcttcta ctttgattat 1140

tggggacagg gaaccctcgt gaccgtgtct agtggcggag gtggaagtgg cggaggcggt 1200

tcaggtggcg gaggatctga tatccagatg acacagagcc ccagcagcct gtctgcctct 1260

gtgggagaca gagtgaccat cacatgcaag gccagccagg acgtgtccat tggcgtggca 1320

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tacaccggcg tgccctctag attttccggc agcggcagcg gaaccgactt taccctgaca 1440

atcagctccc tgcagccaga ggacttcgcc acctattact gccagcagta ctacatctac 1500

ccctacacct tcggacaggg caccaaggtg gaaatcaagc gg 1542

<210> 58

<211> 514

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成HER2DBiTE-L

<400> 58

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

35 40 45

Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys

85 90 95

Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser

115 120 125

Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr

145 150 155 160

Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val

165 170 175

Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr

180 185 190

Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile

195 200 205

Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro

225 230 235 240

Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp

245 250 255

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser

260 265 270

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

275 280 285

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

290 295 300

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

305 310 315 320

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

325 330 335

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

340 345 350

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

355 360 365

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

370 375 380

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

385 390 395 400

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

405 410 415

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser

420 425 430

Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

435 440 445

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val

450 455 460

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

465 470 475 480

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

485 490 495

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Lys Arg

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成HER2DBiTE-L具有His标签

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<220>

<223> 化学合成HER2DBiTE-L具有His标签

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<212> DNA

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<400> 64

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ctgcagatga attctctgag agccgaggac accgccgtgt attactgtgc caggaatctg 300

ggcccttctt tctatttcga ctactggggc cagggcacac tggtgaccgt gtcctccggc 360

ggcggcggca gcggcggcgg cggctctggc ggcggcggca gcgacatcca gatgacccag 420

tccccaagct ccctgtctgc ctccgtgggc gatcgcgtga ccatcacatg caaggcctcc 480

caggacgtgt ctatcggcgt ggcctggtac cagcagaagc ctggcaaggc cccaaagctg 540

ctgatctact ctgcctccta tagatacacc ggcgtgccct ctagattctc cggctctggc 600

tctggcaccg acttcacact gaccatctct tctctgcagc ccgaggactt cgccacctac 660

tattgtcagc agtactacat ctacccttac accttcggac aggggacaaa agtggaaatc 720

aagaga 726

<210> 66

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成scFv Her2DMAb

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

130 135 140

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser

145 150 155 160

Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

165 170 175

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val

180 185 190

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

225 230 235 240

Lys

<210> 67

<211> 4493

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成pGX93237全质粒序列

<400> 67

gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accgagctcg gatccgccac catggactgg acttggattc tgttcctggt cgcagcagcc 780

acacgggtgc attccgatat tcagatgact cagagccctt cctccctgag cgcctccgtc 840

ggcgatcggg tgaccatcac ttgtaaggca agccaggatg tgagcatcgg cgtcgcatgg 900

taccagcaga agcccggcaa agccccaaag ctgctgatct attccgcaag ttatcggtac 960

accggcgtcc cctcacgctt cagtggatct gggtctggga cagacttcac tctgaccatt 1020

agctccctgc agccagaaga ttttgccaca tactactgtc agcagtacta tatctatcct 1080

tacactttcg gacagggaac aaaagtggag atcaagcgcg gcgggggagg gagcggagga 1140

gggggctctg gaggcggcgg gagcgaggtg cagctggtcg agtctggggg aggcctggtg 1200

cagcccggag ggtccctgag gctgtcctgt gctgcaagcg gctttacttt cacagactac 1260

accatggact gggtcagaca ggctcccggg aaggggctgg aatgggtggc cgatgtgaac 1320

cctaactctg gcggcagtat ctacaaccag cggtttaagg ggagattcac actgtcagtg 1380

gacaggagca aaaatacact gtacctgcag atgaacagcc tgagggcaga agatacagca 1440

gtgtactact gtgccagaaa tctgggaccc agtttttatt tcgattactg ggggcaggga 1500

acactggtga cagtgtcatc cggcggcggg ggctctgaag tccagctggt ggagagcgga 1560

ggaggactgg tccagcctgg cggaagcctg cggctgtcct gcgctgccag cggatatagt 1620

tttaccggct acactatgaa ctgggtgcgc caggcacccg gaaaaggact ggagtgggtc 1680

gctctgatca acccctataa gggagtctca acttacaatc agaagtttaa agatcgcttc 1740

actatcagtg tggacaagtc caagaataca gcctatctgc agatgaactc cctgcgcgcc 1800

gaagatactg ccgtctacta ttgcgcacgg tcaggatatt acggagacag tgactggtat 1860

ttcgatgtct ggggacaggg gacactggtg acagtctcct ctggcggggg aggctccggg 1920

ggaggaggat caggaggcgg cggatctgac attcagatga ctcagtcacc tagtagcctg 1980

tctgctagcg tgggagacag ggtcactatt acctgcaggg ccagccagga tatccgcaat 2040

tacctgaact ggtatcagca gaaaccaggc aaagccccca aactgctgat ctactatacc 2100

tcccggctgg aatcaggggt cccttcaagg ttctcaggct ccggaagtgg caccgattac 2160

actctgacaa ttagctcact gcagccagaa gactttgcta cctactactg ccagcagggg 2220

aatactctgc cttggacctt cggccaggga actaaagtgg agattaagtc atcctgataa 2280

ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 2340

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 2400

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 2460

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 2520

catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctactgggc ggttttatgg acagcaagcg 2580

aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact 2640

ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagctct gatcaagaga 2700

caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg 2760

cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg 2820

ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt 2880

ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg 2940

gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat 3000

tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat 3060

ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg 3120

accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg 3180

atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc 3240

tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc 3300

cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg 3360

tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg 3420

gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca 3480

tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaattat taacgcttac aatttcctga 3540

tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatcagg tggcactttt 3600

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 3660

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat 3720

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 3780

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 3840

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 3900

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 3960

agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 4020

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 4080

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 4140

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 4200

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 4260

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 4320

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 4380

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 4440

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctt 4493

<210> 68

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成G4S接头

<400> 68

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 69

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成EGFRvIII DNA编码的免疫细胞接合物

<400> 69

gatgtcgtga tgacccagag ccctgatagc ctggccgtga gcctgggaga gagggcaacc 60

atcaactgca agagctccca gagcctgctg gactccgatg gcaagacata cctgaattgg 120

ctgcagcaga agcctggcca gccccctaag aggctgatct ctctggtgag caagctggac 180

tccggagtgc cagatcgctt cagcggctcc ggctctggaa ccgactttac cctgacaatc 240

tctagcctgc aggccgagga tgtggccgtg tactattgct ggcagggcac acacttcccc 300

ggcacctttg gcggcggcac aaaggtggag atcaagggcg gcggcggctc tggaggagga 360

ggcagcggcg gaggaggctc cggaggcggc ggctctgaga tccagctggt gcagagcgga 420

gcagaggtga agaagccagg cgagtctctg agaatcagct gtaagggctc cggcttcaac 480

atcgaggact actatatcca ctgggtgcgg cagatgcctg gcaagggcct ggagtggatg 540

ggcagaatcg acccagagaa cgatgagaca aagtatggcc ccatcttcca gggccacgtg 600

acaatctctg ccgacacaag catcaatacc gtgtacctgc agtggtcctc tctgaaggcc 660

tccgataccg ccatgtacta ttgcgccttt aggggaggcg tgtattgggg acagggaacc 720

acagtgacag tgagctccgg aggaggaggc agcgaggtgc agctggtgga gagcggcggc 780

ggcctggtgc agccaggcgg ctccctgaag ctgtcttgtg ccgccagcgg cttcaccttt 840

aacaagtacg caatgaattg ggtgcgccag gcaccaggca agggcctgga gtgggtggcc 900

cggatcagat ctaagtacaa caattatgcc acatactatg ccgacagcgt gaaggatagg 960

ttcaccatct cccgcgacga ttctaagaac acagcctacc tgcagatgaa caatctgaag 1020

acagaggaca ccgccgtgta ctattgcgtg aggcacggca actttggcaa ttcctacatc 1080

tcttattggg cctactgggg ccagggcaca ctggtgaccg tgtctagcgg cggcggcggc 1140

agcggcggcg gcggctccgg aggaggcggc tctcagacag tggtgaccca ggagccaagc 1200

ctgaccgtgt cccctggagg caccgtgaca ctgacctgtg gctcctctac aggagcagtg 1260

accagcggaa actatcctaa ttgggtgcag cagaagcctg gacaggcacc acggggcctg 1320

atcggaggaa ccaagttcct ggcaccagga acacccgccc ggttcagcgg ctccctgctg 1380

ggaggcaagg ccgccctgac cctgtccggc gtgcagccag aggatgaggc cgagtactat 1440

tgcgtgctgt ggtactctaa tcggtgggtc tttggcgggg gaactaaact gactgtcctg 1500

tgataa 1506

<210> 70

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成EGFRvIII DNA编码的免疫细胞接合物

<400> 70

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

130 135 140

Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn

145 150 155 160

Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr

180 185 190

Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile

195 200 205

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala

210 215 220

Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

245 250 255

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser

260 265 270

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val

275 280 285

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser

290 295 300

Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg

305 310 315 320

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

325 330 335

Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His

340 345 350

Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln

355 360 365

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

385 390 395 400

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

405 410 415

Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys

420 425 430

Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala

435 440 445

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

450 455 460

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

465 470 475 480

Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

485 490 495

Leu Thr Val Leu

500

<210> 71

<211> 1560

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成EGFRvIII DNA编码的免疫细胞接合物，

具有IgE前导序列

<400> 71

atggattgga cttggattct gttcctggtg gcagccgcaa ctagagtgca ttccgatgtc 60

gtgatgaccc agagccctga tagcctggcc gtgagcctgg gagagagggc aaccatcaac 120

tgcaagagct cccagagcct gctggactcc gatggcaaga catacctgaa ttggctgcag 180

cagaagcctg gccagccccc taagaggctg atctctctgg tgagcaagct ggactccgga 240

gtgccagatc gcttcagcgg ctccggctct ggaaccgact ttaccctgac aatctctagc 300

ctgcaggccg aggatgtggc cgtgtactat tgctggcagg gcacacactt ccccggcacc 360

tttggcggcg gcacaaaggt ggagatcaag ggcggcggcg gctctggagg aggaggcagc 420

ggcggaggag gctccggagg cggcggctct gagatccagc tggtgcagag cggagcagag 480

gtgaagaagc caggcgagtc tctgagaatc agctgtaagg gctccggctt caacatcgag 540

gactactata tccactgggt gcggcagatg cctggcaagg gcctggagtg gatgggcaga 600

atcgacccag agaacgatga gacaaagtat ggccccatct tccagggcca cgtgacaatc 660

tctgccgaca caagcatcaa taccgtgtac ctgcagtggt cctctctgaa ggcctccgat 720

accgccatgt actattgcgc ctttagggga ggcgtgtatt ggggacaggg aaccacagtg 780

acagtgagct ccggaggagg aggcagcgag gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg 840

gtgcagccag gcggctccct gaagctgtct tgtgccgcca gcggcttcac ctttaacaag 900

tacgcaatga attgggtgcg ccaggcacca ggcaagggcc tggagtgggt ggcccggatc 960

agatctaagt acaacaatta tgccacatac tatgccgaca gcgtgaagga taggttcacc 1020

atctcccgcg acgattctaa gaacacagcc tacctgcaga tgaacaatct gaagacagag 1080

gacaccgccg tgtactattg cgtgaggcac ggcaactttg gcaattccta catctcttat 1140

tgggcctact ggggccaggg cacactggtg accgtgtcta gcggcggcgg cggcagcggc 1200

ggcggcggct ccggaggagg cggctctcag acagtggtga cccaggagcc aagcctgacc 1260

gtgtcccctg gaggcaccgt gacactgacc tgtggctcct ctacaggagc agtgaccagc 1320

ggaaactatc ctaattgggt gcagcagaag cctggacagg caccacgggg cctgatcgga 1380

ggaaccaagt tcctggcacc aggaacaccc gcccggttca gcggctccct gctgggaggc 1440

aaggccgccc tgaccctgtc cggcgtgcag ccagaggatg aggccgagta ctattgcgtg 1500

ctgtggtact ctaatcggtg ggtctttggc gggggaacta aactgactgt cctgtgataa 1560

<210> 72

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成EGFRvIII DNA编码的免疫细胞接合物，

具有IgE前导序列

<400> 72

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser

20 25 30

Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu

35 40 45

Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp

100 105 110

Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

145 150 155 160

Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly

165 170 175

Phe Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr

195 200 205

Lys Tyr Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr

210 215 220

Ser Ile Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp

225 230 235 240

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

260 265 270

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys

275 280 285

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn

290 295 300

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

305 310 315 320

Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

325 330 335

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

340 345 350

Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

355 360 365

Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp

370 375 380

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

385 390 395 400

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu

405 410 415

Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly

420 425 430

Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln

435 440 445

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe

450 455 460

Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly

465 470 475 480

Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu

485 490 495

Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly

500 505 510

Thr Lys Leu Thr Val Leu

515

<210> 73

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成Her2 DNA编码的免疫细胞接合物

<400> 73

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca aggccagcca ggacgtgagc atcggcgtgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctaca ggtacaccgg cgtgcccagc 180

aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacatct acccctacac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggagatcaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 360

ggcagcgagg tgcagctggt ggagagcggc ggcggcctgg tgcagcccgg cggcagcctg 420

aggctgagct gcgccgccag cggcttcacc ttcaccgact acaccatgga ctgggtgagg 480

caggcccccg gcaagggcct ggagtgggtg gccgacgtga accccaacag cggcggcagc 540

atctacaacc agaggttcaa gggcaggttc accctgagcg tggacaggag caagaacacc 600

ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccagg 660

aacctgggcc ccagcttcta cttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 720

agcggcggcg gcggcagcca ggtgcagctg gtggagagcg gcggcggcgt ggtgcagccc 780

ggcaggagcc tgaggctgag ctgcgccgcc agcggcttca agttcagcgg ctacggcatg 840

cactgggtga ggcaggcccc cggcaagggc ctggagtggg tggccgtgat ctggtacgac 900

ggcagcaaga agtactacgt ggacagcgtg aagggcaggt tcaccatcag cagggacaac 960

agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac agcctgaggg ccgaggacac cgccgtgtac 1020

tactgcgcca ggcagatggg ctactggcac ttcgacctgt ggggcagggg caccctggtg 1080

accgtgagca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcgag 1140

atcgtgctga cccagagccc cgccaccctg agcctgagcc ccggcgagag ggccaccctg 1200

agctgcaggg ccagccagag cgtgagcagc tacctggcct ggtaccagca gaagcccggc 1260

caggccccca ggctgctgat ctacgacgcc agcaacaggg ccaccggcat ccccgccagg 1320

ttcagcggca gcggcagcgg caccgacttc accctgacca tcagcagcct ggagcccgag 1380

gacttcgccg tgtactactg ccagcagagg agcaactggc cccccctgac cttcggcggc 1440

ggcaccaagg tgatcgagaa g 1461

<210> 74

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成Her2 DNA编码的免疫细胞接合物

<400> 74

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

115 120 125

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

130 135 140

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val

145 150 155 160

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro

165 170 175

Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr

180 185 190

Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly

210 215 220

Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

260 265 270

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro

275 280 285

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val

290 295 300

Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp

305 310 315 320

Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

325 330 335

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser

340 345 350

Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

355 360 365

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

385 390 395 400

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

405 410 415

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

420 425 430

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

435 440 445

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

450 455 460

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

465 470 475 480

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser

485 490

<210> 75

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成Her2 DNA编码的免疫细胞接合物，具有

IgE前导序列

<400> 75

atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgccgcca ccagggtgca cagcgacatc 60

cagatgaccc agagccccag cagcctgagc gccagcgtgg gcgacagggt gaccatcacc 120

tgcaaggcca gccaggacgt gagcatcggc gtggcctggt accagcagaa gcccggcaag 180

gcccccaagc tgctgatcta cagcgccagc tacaggtaca ccggcgtgcc cagcaggttc 240

agcggcagcg gcagcggcac cgacttcacc ctgaccatca gcagcctgca gcccgaggac 300

ttcgccacct actactgcca gcagtactac atctacccct acaccttcgg ccagggcacc 360

aaggtggaga tcaagggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 420

gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 480

agctgcgccg ccagcggctt caccttcacc gactacacca tggactgggt gaggcaggcc 540

cccggcaagg gcctggagtg ggtggccgac gtgaacccca acagcggcgg cagcatctac 600

aaccagaggt tcaagggcag gttcaccctg agcgtggaca ggagcaagaa caccctgtac 660

ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggaacctg 720

ggccccagct tctacttcga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcggc 780

ggcggcggca gccaggtgca gctggtggag agcggcggcg gcgtggtgca gcccggcagg 840

agcctgaggc tgagctgcgc cgccagcggc ttcaagttca gcggctacgg catgcactgg 900

gtgaggcagg cccccggcaa gggcctggag tgggtggccg tgatctggta cgacggcagc 960

aagaagtact acgtggacag cgtgaagggc aggttcacca tcagcaggga caacagcaag 1020

aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg agggccgagg acaccgccgt gtactactgc 1080

gccaggcaga tgggctactg gcacttcgac ctgtggggca ggggcaccct ggtgaccgtg 1140

agcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cgagatcgtg 1200

ctgacccaga gccccgccac cctgagcctg agccccggcg agagggccac cctgagctgc 1260

agggccagcc agagcgtgag cagctacctg gcctggtacc agcagaagcc cggccaggcc 1320

cccaggctgc tgatctacga cgccagcaac agggccaccg gcatccccgc caggttcagc 1380

ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg accatcagca gcctggagcc cgaggacttc 1440

gccgtgtact actgccagca gaggagcaac tggccccccc tgaccttcgg cggcggcacc 1500

aaggtgatcg agaag 1515

<210> 76

<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成Her2 DNA编码的免疫细胞接合物，具有

IgE前导序列

<400> 76

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

20 25 30

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

35 40 45

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

50 55 60

Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

85 90 95

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr

100 105 110

Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

130 135 140

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

145 150 155 160

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp

165 170 175

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Val

180 185 190

Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg

195 200 205

Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

210 215 220

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn

225 230 235 240

Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

275 280 285

Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln

290 295 300

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys

305 310 315 320

Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser

325 330 335

Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

340 345 350

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly

355 360 365

Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

370 375 380

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

405 410 415

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg

420 425 430

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

435 440 445

Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

450 455 460

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

465 470 475 480

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu

485 490 495

Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser

500 505 510

Claims (23)

1.一种核酸分子，编码一个或多个合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子，其中所述多个合成DNA编码的双特异性免疫细胞接合子包括至少一个抗原结合结构域和至少一个免疫细胞接合结构域。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述抗原结合结构域靶向选自由CD19、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD33、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、卵泡刺激素受体(FSHR)、表皮生长因子受体(EGFR)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD123和人表皮生长因子受体2(Her2)组成的群组的至少一种抗原。

3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述免疫细胞接合结构域靶向选自由T细胞、抗原呈递细胞、自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞组成的群组的细胞。

4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述免疫细胞接合结构域靶向选自由CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、CD40、FcgRs、FceRs、FcaRs和CD95组成的群组的至少一种T细胞特异性受体分子。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述免疫细胞接合结构域靶向CD3。

6.根据权利要求1所述的核酸分子，包括编码选自由以下组成的群组的一个或多个序列的核苷酸序列：

a)在氨基酸序列的整个长度上与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:76组成的群组的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列；

b)在氨基酸序列的至少65％上与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74或SEQ ID No:76组成的群组的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列的片段；

c)选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:76组成的群组的氨基酸序列；和

d)包括选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:76组成的群组的氨基酸序列的至少65％的氨基酸序列的片段。

7.根据权利要求1所述的核酸分子，选自由以下组成的群组：

a)在核酸序列的整个长度上与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:75组成的群组的核苷酸序列具有至少约90％同一性的核苷酸序列；

b)在核酸序列的至少65％上与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:75组成的群组的核苷酸序列具有至少约90％同一性的核苷酸序列的片段；

c)选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQID NO:59、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:75组成的群组的核苷酸序列；和

d)包括选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:69、SEQ ID N0:71、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:75组成的群组的核苷酸序列的至少65％的核苷酸序列的片段。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列与编码IgE前导序列的核酸序列可操作地连接。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括表达载体。

10.一种组合物，包括根据权利要求1-9中任一项所述的核酸分子。

11.根据权利要求10所述的组合物，进一步包括药学上可接受的赋形剂。

12.一种预防或治疗受试者中的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-9中任一项所述的核酸分子或根据权利要求10-11中任一项所述的组合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述疾病选自由良性肿瘤、癌症和癌症相关疾病组成的群组。

14.一种核酸分子，编码一种或多种合成抗体，其中所述核酸分子包括选自由以下组成的群组的至少一种：

a)编码抗人表皮生长因子受体2(HER2)合成抗体的核苷酸序列；

b)编码抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列；

c)编码ScFv抗HER2合成抗体的核苷酸序列；和

d)编码ScFv抗HER2合成抗体的片段的核苷酸序列。

15.根据权利要求14所述的核酸分子，包括编码选自由以下组成的群组的一个或多个序列的核苷酸序列：

a)在氨基酸序列的整个长度上与选自由SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66组成的群组的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列；

b)在氨基酸序列的至少65％上与选自由SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66组成的群组的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列的片段；

c)选自由SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66组成的群组的氨基酸序列；和

d)包括选自由SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66组成的群组的氨基酸序列的至少65％的氨基酸序列的片段。

16.根据权利要求14所述的核酸分子，选自由以下组成的群组：

a)在核酸序列的整个长度上与选自由SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:65组成的群组的核苷酸序列具有至少约90％同一性的核苷酸序列；

b)在核酸序列的至少65％上与选自由SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:65组成的群组的核苷酸序列具有至少约90％同一性的核苷酸序列的片段；

c)选自由SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:65组成的群组的核苷酸序列；和

d)包括选自由SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:65组成的群组的核苷酸序列的至少65％的核苷酸序列的片段。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列与编码IgE前导序列的核酸序列可操作地连接。

18.根据权利要求14-17中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括表达载体。

19.一种组合物，包括根据权利要求14-18中任一项所述的核酸分子。

20.根据权利要求19所述的组合物，进一步包括药学上可接受的赋形剂。

21.一种预防或治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求14-18中任一项所述的核酸分子或根据权利要求19-20中任一项所述的组合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述疾病是与HER2表达相关的癌症。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述疾病是卵巢癌或乳腺癌。

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