CN115485289A - 使用工程化的病毒颗粒进行基因递送的方法和组合物 - Google Patents

使用工程化的病毒颗粒进行基因递送的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于转导细胞(例如T细胞或免疫细胞)的组合物和方法。本文还提供了在有需要的受试者中治疗疾病的方法。

Description

使用工程化的病毒颗粒进行基因递送的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月11日提交的美国临时申请号62/988,195、2020年3月11日提交的美国临时申请号62/988,074和2020年9月18日提交的美国临时申请号63/080,501的优先权，其中的每一个都通过引用以其整体并入本文。
对序列表的参考
同时提交的文本文件名为“046483_7300WO1_Sequence_Listing.txt”(创建于2021年3月9日并且大小为59,132字节)的序列表根据37 C.F.R.§1.52(e)(5)通过引用并入本文。
背景技术
CAR T细胞疗法已经产生了令人兴奋的结果，最近得到了四项FDA批准，并且在美国最近得到了可用的商业产品。然而，目前的个性化细胞产品平台价格昂贵、繁琐且耗时。具体而言，将基因转移到T细胞中用于癌症疗法的现有技术包括多种离体方法，范围从病毒(例如慢病毒转导)到非病毒方法(例如转座子质粒的电穿孔)。患者接受体外制造的CAR T细胞。患者和医生面临的主要临床问题之一是离体制造过程的持续时间，该过程至少持续17天，而且通常要更长得多。限制访问、增加治疗时间和生成成本的其他后勤问题包括单采血液成分法的可用性、制造时的GMP套件可用性以及因此被视为新批次的每个产品的发行测试。随着全球范围内200多项CAR T细胞试验的进行和蓬勃发展的开发管道，制造是一个关键瓶颈。
发明内容
本发明部分地提供了改变CAR T疗法范式并规避离体制造问题的CAR技术。此外，本发明提供了使用工程化的病毒颗粒或病毒载体系统进行体内CAR基因递送的方法和组合物。具体地，本发明考虑了工程化的病毒颗粒或病毒载体系统，其生成针对具体靶细胞的基于细胞的免疫应答。因此，本发明承诺现成的CAR药物产品，在其易用性、可递送性和制造方面更接近于传统药物.。此外，本发明的工程化的病毒颗粒或病毒载体系统可用于递送转基因以治疗癌症以外的遗传疾病。
因此，在某些方面，本公开内容提供了工程化的病毒颗粒，其包含工程化包膜，该包膜含有突变的融合蛋白、嵌合gag蛋白、用于结合靶细胞的工程化靶向部分，其中突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和编码感兴趣的多肽的核酸。
在某些示例性实施方式中，嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
在某些示例性实施方式中，靶向部分与突变的融合蛋白融合。
在某些示例性实施方式中，病毒颗粒是用麻疹病毒(MV)血凝素(HA)蛋白或MV融合(F)蛋白假型化(pseudotyped)的慢病毒，并且与其天然存在的受体相比，MV-HA蛋白或MV-F蛋白包含突变的结合结构域。
在某些示例性实施方式中，靶向部分与MV-HA蛋白或MV-F蛋白融合。
在某些示例性实施方式中，靶向部分是scFv、抗原结合结构域、DARPIN、FN3结构域或其任何组合。在某些示例性实施方式中，靶向部分选自干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子)或结合cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3的部分。
在某些示例性实施方式中，感兴趣的多肽是嵌合抗原受体(CAR)或其部分。在某些示例性实施方式中，嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，细胞外结构域特异性结合在细胞表面上表达的抗原。在其他实施方式中，抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19或CD123。在一个实施方式中，抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过度表达的细胞表面分子。在另一个实施方式中，抗原是在癌细胞上异常表达的细胞表面分子，例如，与在正常细胞上表达的分子相比，包含缺失、添加或突变的分子。在一些实施方式中，抗原将完全或作为片段仅在癌细胞的细胞表面上表达，而不在正常细胞的表面上表达。
在某些示例性实施方式中，细胞外结构域与CD8、CCR7、CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b结合。
在某些示例性实施方式中，感兴趣的多肽是血红蛋白β链。
在某些示例性实施方式中，病毒颗粒是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。在某些示例性实施方式中，假型化的慢病毒载体用副粘病毒假型化，例如麻疹病毒属例如麻疹病毒糖蛋白或亨尼帕病毒属例如尼帕病毒(NiV)糖蛋白。在某些示例性实施方式中，假型化的载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。在一些实施方式中，假型化的载体用尼帕病毒G蛋白假型化。
在另一个方面，本公开内容提供了体内基因递送的方法，其包括将工程化的病毒颗粒施用于需要递送感兴趣的蛋白质或感兴趣的核酸分子的受试者。在一些实施方式中，工程化的病毒颗粒包含工程化的包膜，其含有突变的融合蛋白、嵌合gag蛋白和用于结合靶细胞的工程化的靶向部分，其中突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和编码感兴趣的多肽的核酸。施用工程化的病毒颗粒在与感兴趣的多肽相关的靶细胞中诱导体内活性。
在某些示例性实施方式中，嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
在某些示例性实施方式中，靶细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
在另一个方面，本公开内容提供了细胞，其包含由本文公开的任何工程化的病毒颗粒编码的感兴趣的多肽。在某些示例性实施方式中，细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞或调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
在另一个方面，本公开内容提供了治疗受试者中疾病的方法。该方法包括向受试者施用本文公开的任何工程化的病毒颗粒，其中该工程化的病毒颗粒在细胞中表达感兴趣的多肽。在某些示例性实施方式中，疾病是癌症或镰状细胞病，或骨髓遗传病或血红蛋白病。在某些示例性实施方式中，细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
在另一个方面，本公开内容提供了病毒载体系统，其包含第一病毒颗粒和第二病毒颗粒。第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子。第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子。蛋白质或多肽的第一和第二部分能够在细胞内形成完整的感兴趣的蛋白质或多肽。在某些示例性实施方式中，嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
在某些示例性实施方式中，第一靶标和第二靶标是不同的。
在某些示例性实施方式中，感兴趣的蛋白质或多肽是嵌合抗原受体。在某些示例性实施方式中，嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在某些示例性实施方式中，细胞外结构域与CD8、CCR7、CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b结合。
在某些示例性实施方式中，蛋白质或多肽是血红蛋白β链。
在某些示例性实施方式中，第一靶向部分和第二靶向部分各自独立地选自与第一靶标结合的蛋白质、抗原结合结构域、DARPIN和FN3结构域或其任何组合。在某些示例性实施方式中，第一靶向部分和第二靶向部分各自独立地选自干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子)或与cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3结合的部分。在某些示例性实施方式中，第一靶向部分选自干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子)或与cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14或CD68结合的部分。在某些示例性实施方式中，第二靶向部分与CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7或CXCR3结合。
在某些示例性实施方式中，第一靶标和第二靶标各自独立地选自cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。在某些示例性实施方式中，第一靶标是cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、或CD68。在某些示例性实施方式中，第二靶标是CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7或CXCR3。
在某些示例性实施方式中，第一病毒载体是假型化的病毒载体。在某些示例性实施方式中，第二病毒载体是假型化的病毒载体。
在某些示例性实施方式中，第一和第二病毒载体各自独立地是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。在某些示例性实施方式中，假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属例如麻疹病毒糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。在某些示例性实施方式中，第一和/或第二病毒载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。
在某些示例性实施方式中，细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
在某些示例性实施方式中，蛋白质或多肽是嵌合抗原受体或血红蛋白β链。
在某些示例性实施方式中，蛋白质或多肽的第一和第二部分在二聚剂存在下形成完整的蛋白质。在某些示例性实施方式中，二聚剂是rimiducid((1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[3-({[2-(2-{3-[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羰基氧基]丙基]苯氧基}乙酰氨基)乙基]氨基甲酰基}甲氧基)苯基]丙基(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羧酸酯(AP1903))、促红细胞生成素或二聚剂可以是天然结合同源二聚体或异源二聚体的可溶性药物或激素，例如促红细胞生成素或血小板生成素，或雷帕霉素。
在某些示例性实施方式中，蛋白质或多肽的第一和第二部分可以通过切除内含肽结构域结合在一起。
在某些示例性实施方式中，蛋白质的第一部分包含嵌合抗原受体的细胞外结构域，并且蛋白质的第二部分包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
在另一个方面，本公开内容提供了包含本文公开的任何病毒载体系统的细胞。在某些示例性实施方式中，细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞或调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
在另一个方面，本公开内容提供了体内基因递送的方法，包括向有需要的受试者施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒。第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子。第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子。蛋白质或多肽的第一和第二部分能够在细胞内形成完整的感兴趣的蛋白质或多肽。在某些示例性实施方式中，嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
在某些示例性实施方式中，方法进一步包含施用二聚剂以在受试者中形成蛋白质或多肽。
在某些示例性实施方式中，第一部分和第二部分包含内含肽结构域并且切除内含肽结构域以缀合第一和第二部分以形成蛋白质或多肽。
在某些示例性实施方式中，细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或CD8+幼稚/中央记忆细胞(CD8+CCR7+)和CD4+幼稚/中央记忆细胞(CD4+CCR7+)。
在某些示例性实施方式中，蛋白质或多肽是嵌合抗原受体。在某些示例性实施方式中，蛋白质或多肽是血红蛋白β链。
在某些示例性实施方式中，第一病毒载体是假型化的病毒载体。在某些示例性实施方式中，第二病毒载体是假型化的病毒载体。在某些示例性实施方式中，第一和第二病毒载体各自独立地是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。在某些示例性实施方式中，假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属如麻疹病毒糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。在某些示例性实施方式中，第一和/或第二病毒载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。
在某些示例性实施方式中，提供了工程化的病毒颗粒，其包含工程化的包膜，该包膜包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽；用于结合靶细胞的异源多肽靶向部分；和编码感兴趣的异源多肽的核酸分子。
在另一个方面，本公开内容提供了治疗受试者中疾病的方法。方法包括向受试者施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒。第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子。第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子。蛋白质或多肽的第一和第二部分能够在细胞内形成完整的感兴趣的蛋白质或多肽。
在一些实施方式中，疾病是癌症或遗传疾病，其包括但不限于例如骨髓疾病、血红蛋白病和镰状细胞病。
在某些示例性实施方式中，疾病是癌症或镰状细胞病。
在某些示例性实施方式中，方法进一步包含施用二聚剂以在细胞中形成蛋白质或多肽。
在某些示例性实施方式中，第一部分和第二部分包含内含肽结构域并且切除内含肽结构域以缀合第一和第二部分以形成蛋白质或多肽。
在某些示例性实施方式中，细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
在某些示例性实施方式中，蛋白质或多肽是嵌合抗原受体。在某些示例性实施方式中，蛋白质或多肽是血红蛋白β链。
在某些示例性实施方式中，第一病毒载体是假型化的病毒载体。在某些示例性实施方式中，第二病毒载体是假型化的病毒载体。在某些示例性实施方式中，第一和第二病毒载体各自独立地是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。在某些示例性实施方式中，假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属例如麻疹病毒糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。在某些示例性实施方式中，第一和/或第二病毒载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。
附图说明
通过以下结合附图对说明性实施方式的详细描述，将更充分地理解本文提供的实施方式的前述和其他特征和优点。
图1A-1B是图解麻疹病毒(MV)-假型化的慢病毒载体和病毒载体系统的示意图。图1A说明了包含HIV gag-pol序列的MV假型化的慢病毒载体系统。图1B是说明MV假型化的慢病毒载体系统的非限制性实施方式的示意图，其中HIV gag序列被编码xHIV(SEQ ID NO:5)、来自SIV和HIV的嵌合gag蛋白的序列替换。
图2A-2D描绘了其中用gag-pol NGFR MV(图2A和图2C)或xHIV NGFR MV(图2B和图2D)转导活化的PBMC的实验结果。显示了第4天的结果。
图3A-3D描绘了其中用gag-pol GFP MV(图3A和图3C)或xHIV GFP MV(图3B和图3D)转导活化的PBMC的实验结果。显示了第4天的结果。
图4A-4D描绘了其中用gag-pol CAR-19 MV(图4A和图4C)或xHIV CAR-19 MV(图4B和图4D)转导活化的PBMC的实验结果。显示了第4天的结果。
图5A-5D描绘了其中用gag-pol NGFR MV(图5A和图5C)或xHIV NGFR MV(图5B和图5D)转导活化的PBMC的实验结果。显示了第12天的结果。
图6A-6D描绘了其中用gag-pol GFP MV(图6A和图6C)或xHIV GFP MV(图6B和图6D)转导活化的PBMC的实验结果。显示了第12天的结果。
图7A-7D描绘了其中用gag-pol CAR-19 MV(图7A和图7C)或xHIV CAR-19 MV(图7B和图7D)转导活化的PBMC的实验结果。显示了第12天的结果。
图8A-8B是图解根据本公开内容的一些实施方式的剪接载体应用的示意图。(A)如实施例2中所述，EpoR信号传导(例如，通过来自慢病毒载体1(LV1)的转基因1编码的EpoR4-1BB-CD3ζ(BBz)内域)和EpoR结合(例如，通过来自慢病毒载体2(LV2)的转基因2编码的CAR-EpoR外域)部件在细胞中使用不同的慢病毒载体单独表达。(B)EpoR的二聚化结构域在二聚剂EPO存在下二聚化以提供信号传导活性。
图9描绘了来自实施例2中描述的CAR-EpoR外域的表达实验的结果。
图10描述了来自实施例2中描述的EpoR BBz内域的表达实验的结果。
图11是图解剪接载体应用的另一个实施方式的示意图，其中只有CD8+CCR7+细胞同时包含外域和内域，其可以经由CAR和如实施例2中所述的EPO施用来活化。
图12描绘了在IV施用载体后7天，来自用靶向CD4的MV系统、GFP报道基因在人源化小鼠的血液中特异性转导人CD4细胞的实验的结果。
图13描绘了在IV施用载体后7天，来自用靶向CD4的MV系统、GFP报道基因在人源化小鼠的肝脏中特异性转导人CD4细胞的实验的结果。VSVG对照显示肝库普弗细胞的非特异性转导。
图14描绘了在IV施用载体后7天，来自用靶向CD4的MV系统、NGFR报道基因在人源化小鼠的腹膜中特异性转导人CD4细胞的实验的结果。显示了重复三次的小鼠。
图15描绘了来自静息(未活化)的恒河猴CD4细胞体外特异性转导的实验的结果。NGFR报道基因。VSVG对照显示没有转导，因为细胞没有被活化。MV和NV系统显示出同等高和特异性的转导。
图16描绘了来自用MV假型化的、抗CD8 DARPIN重定向载体刺激、转导的人T细胞的实验的结果，该载体使用xHIV gag制备并用IL7和IL15活化。第11天的流式细胞术显示高效且特异性的转基因表达。单独的FACS图显示病毒载体在3倍稀释度时的表达。
图17描绘了来自用MV-假型化的、抗CD8 DARPIN重定向载体刺激、转导的人T细胞的实验的结果，该载体使用xHIV gag制备并用IL7和IL15活化。第11天的流式细胞术显示高效且特异性的转基因表达。幻灯片1中的示例性FACS图显示为表示形式(representation)。转导效率为20.7/20.7+12.2＝63％。
图18描绘了来自响应于用抗CD20或抗CD19 BBz CAR20(VSVG)或抗CD20或抗CD19KIR MV或NiV系统的两种不同CD19+CD20+淋巴瘤细胞系的脱粒实验的结果。
图19描绘了来自用抗CD20 BBz CAR20(VSVG)或抗CD20 KIR MV杀死CD20+淋巴瘤细胞系的实验的结果。KIR20系统应答(杀死)比标准BBz共刺激CAR系统慢。
图20描绘了来自其中IL15/IL15R表达盒的并入驱动转导细胞增殖的实验的结果。与对照相比，转导以表达细胞因子应答盒的细胞的扩增高10倍。
定义
除非另有定义，本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。术语“包含”以及例如“包括”和“包含的”等的其他形式的使用是非限制性的。
通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学以及杂交结合使用的命名法在本领域中是公知的和常用的。除非另有说明，否则本文提供的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并且如在整个本说明书中引用和讨论的多种一般和更具体的参考文献中所述。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述。本文所述的与分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域公知的和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。
为了更容易理解本公开，选择的术语定义如下。
本文使用冠词“一个”和“一种”，指的是一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意思是一个要素或多于一个要素。
如本文所用，“大约”，当指的是可测量的值比如量、时间期间等时，意思是涵盖从规定值的±20％或±10％、±5％、±1％、±0.1％的变化，只要这样的变化适于进行公开的方法。
如本文所用，关于T细胞的“活化”是指T细胞已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的状态。活化也可能与诱导的细胞因子产生和可检测的效应器功能有关。此外，术语“活化的T细胞”是指正在经历细胞分裂的T细胞。
如本文所用，“减轻”疾病是指降低疾病的一种或多种症状的严重性。
如本文所用，术语“抗原”被定义为激发免疫应答的分子。此免疫应答可以涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或二者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有蛋白质或肽——可以充当抗原。术语“抗原”还可以指抗体或抗体样分子可以结合的或被抗体或抗体样分子识别的分子。
如本文所用的术语，术语“抗体分子”、“抗体”或抗原结合结构域是指多肽，例如免疫球蛋白链或其片段，其包含至少一个功能性免疫球蛋白可变结构域序列。抗体分子包括抗体(例如，全长抗体)和抗体片段。在一些实施方式中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能性片段。例如，全长抗体是天然存在或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(Ig)分子(例如IgG抗体)。在实施方式中，抗体分子是指免疫球蛋白分子，例如抗体片段的免疫学活性抗原结合部分。抗体片段，例如功能性片段，包含抗体的一部分，例如Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)2、可变片段(Fv)、结构域抗体(dAb)或单链可变片段(scFv)。功能性抗体片段与完整(例如，全长)抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”或“功能性片段”还包括由可变区组成的分离片段，例如由重链和轻链的可变区或其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)组成的“Fv”片段。在一些实施方式中，抗体片段不包括没有抗原结合活性的抗体部分，例如Fc片段或单个氨基酸残基。示例性抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如，dAb(结构域抗体)、单链、Fab、Fab'和F(ab')2片段，以及单链可变片段(scFv)。
术语“抗体分子”还包括结构域或单结构域抗体的完整或抗原结合片段，其也可称为“sdAb”或“VHH”。结构域抗体包含可作为独立抗体片段的VH或VL。此外，结构域抗体包括仅重链抗体(HCAb)。结构域抗体还包括IgG的CH2结构域作为CDR环移植到其中的基础支架。它通常也可以定义为包含氨基酸序列的多肽或蛋白质，该氨基酸序列由被三个互补决定区中断的四个框架区组成。这表示为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。sdAb可以在骆驼如美洲驼中产生，但也可以使用本领域公知的技术合成产生。sdAb或多肽的氨基酸残基编号根据Kabat等人("Sequence of proteins of immunological interest,"US PublicHealth Services,NIH Bethesda,MD,出版号91，其通过引用并入本文)给出的VH结构域的通用编号。根据该编号，sdAb的FR1包含位置1-30的氨基酸残基，sdAb的CDR1包含位置31-36的氨基酸残基，sdAb的FR2包含位置36-49的氨基酸，sdAb的CDR2包含位置50-65的氨基酸残基，sdAb的FR3包含位置66-94的氨基酸残基，sdAb的CDR3包含位置95-102的氨基酸残基，并且sdAb的FR4包含位置103-113的氨基酸残基。结构域抗体也在WO2004041862和WO2016065323中描述，其各自通过引用并入本文。结构域抗体可以是如本文所述的靶向部分。
抗体分子可以是单特异性(例如，单价或二价)、双特异性(例如，二价、三价、四价、五价或六价)、三特异性(例如，三价、四价、五价或六价)、或具有更高阶的特异性(例如，四特异性)和/或超过六价的更高阶的化合价。抗体分子可以包含轻链可变区的功能性片段和重链可变区的功能性片段，或者重链和轻链可以融合在一起形成单一多肽。
另外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列——因此编码如本文使用的该术语“抗原”。另外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。而且，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。容易显而易见的是抗原可以被生成、合成或可以源自生物学样品。这样的生物学样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学流体。
如本文使用的，术语“自体的”意思是指源自受试者的任何物质，例如细胞，其随后被再引入同一受试者。
如本文所用，术语“同种异体的”是指源自一个受试者的物质，例如细胞，其随后被引入不同的受试者。
“共刺激分子”或“共刺激受体”是指T细胞上与共刺激配体特异性结合的关联结合配偶体，从而介导T细胞的共刺激应答，例如，但是不限于增殖、活化、分化等。共刺激分子包括但不限于CD27、CD28、CD40或4-1BB。
如本文所用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的关联共刺激受体的抗原呈递细胞(例如人工抗原呈递细胞或“aAPC”、树突状细胞、B细胞等)上的分子，从而提供信号，该信号除了由例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子结合所提供的主要信号外，还介导T细胞应答，包括，但不限于增殖、活化、分化等。
如本文所用，“共刺激信号”是指信号，其与例如TCR/CD3连接的主要信号组合导致T细胞增殖和/或关键分子上调或下调。
“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持稳态，并且其中如果不改善疾病，则动物的健康继续恶化。相比之下，动物的“障碍”是健康状态，其中动物能够维持稳态，但是其中动物的健康状态与它没有该障碍时相比不太有利。保持不治疗，障碍未必引起动物健康状态的进一步降低。
“有效量”或“治疗有效量”在本文可交换地使用，并且指的是对实现具体的生物学结果或提供治疗或预防益处有效的如本文描述的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于如此量：当施用至哺乳动物时与不存在组合物时检测到的免疫细胞活化相比引起可检测水平的免疫细胞活化。免疫应答可以很容易地通过大量本领域公认的方法进行评估。本领域技术人员会理解，本文施用的组合物的量是变化的，并且可以基于许多因素容易地确定，例如所治疗的疾病或病症、所治疗的哺乳动物的年龄和健康状况以及身体状况、疾病的严重程度、所施用的具体化合物等。
“编码”指的是多核苷酸比如基因、cDNA、或mRNA中的核苷酸的特异性序列充当模板来合成生物学过程中的其它多聚体和大分子的固有性质，该多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一种和由其产生的生物学性质。因而，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。其核苷酸序列同一于mRNA序列并且通常在序列表中提供的编码链，和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链二者，可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
如本文所用，术语“表位”定义为抗原上可引发免疫应答、诱导B和/或T细胞应答的小化学分子。抗原可以具有一个或多个表位。大多数抗原有许多表位；即，它们是多价的。通常，表位的大小为约10个氨基酸和/或糖。在一些实施方式中，表位是约4-18个氨基酸、约5-16个氨基酸、约6-14个氨基酸、约7-12或约8-10个氨基酸。本领域技术人员理解通常整体的三维结构，而不是分子的具体线性序列，是抗原特异性的主要标准，因此，来区分一个表位与另一个表位。基于本公开内容，肽可以是表位。
“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，比如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
如本文所用，关于离体被转导、转染或转化的细胞的短语“离体”是指在受试者外部细胞被转导、转染或转化，即在这样的细胞被转导、转染或转化之前将细胞从受试者中移出。
如本文使用的“同一性”指的是两个聚合物分子之间，特别是两个核酸或氨基酸分子之间，比如，两个多核苷酸或多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同的位置处具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子的每个中的位置均被精氨酸占据，则它们在该位置处是同一的。在比对中，两个氨基酸或两个核酸序列在相同的位置处具有相同残基的同一性或程度经常表达为百分数。两个氨基酸或两个核酸序列之间的同一性是匹配或同一位置的数目的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置是同一的，则两个序列是50％同一的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同一的，则两个氨基酸序列是90％同一的。
“基本上同一的”是指多肽或核酸分子与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任何一种氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述的任何一种核酸序列)表现出至少50％的同一性。优选地，这样的序列在氨基酸水平或核酸上与用于比较的序列具有至少60％、更优选80％或85％、更优选90％、95％或甚至99％的同一性。
序列同一性通常使用序列分析软件(例如，the Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705,BLAST,BESTFIT,GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序的序列分析软件包)。此类软件通过将同源性程度分配给多种取代、缺失和/或其他修饰来匹配同一或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e3和e100之间的概率分数指示密切相关的序列。
就本发明包括包含多种蛋白质的组合物来说，这些蛋白质在一些情况下可以包含与本文公开的氨基酸序列具有序列同一性的氨基酸序列。因此，在某些实施方式中，取决于具体序列，相对于本文公开的SEQ ID NO，序列同一性程度优选大于的50％(例如60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。这些蛋白质可能包括同源物、直系同源物、等位基因变体和功能性突变体。通常，两个多肽序列之间50％或更高的同一性被认为是功能等同性的指示。多肽之间的同一性优选通过如在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中实施的，使用具有参数空位开放罚分-12和空位延伸罚分＝1的仿射空位搜索的Smith-Waterman同源性搜索算法确定。
与所公开的蛋白质相比，这些蛋白质可以包括一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守氨基酸置换，即用一种氨基酸置换另一个具有相关侧链的氨基酸。遗传编码的氨基酸一般分为四个家族：(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电荷的极性，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香族氨基酸。一般来说，这些家族中单个氨基酸的取代对生物活性没有重大影响。相对于所公开的蛋白质序列，蛋白质可以具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单个氨基酸缺失。相对于所公开的蛋白质序列，蛋白质还可以包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入(例如1、2、3、4或5个氨基酸中的每一个)。
如本文使用的术语“免疫应答”被定义为当淋巴细胞将抗原分子鉴定为异物并诱发形成抗体和/或活化淋巴细胞以去除抗原时发生的对抗原的细胞应答。在一些实施方式中，免疫应答可以针对表达抗原的肿瘤细胞。在一些实施方式中，免疫应答由表达嵌合抗原受体的T细胞促进，该嵌合抗原受体例如但不限于本文提供的那些。
本文使用的术语“免疫抑制”是指降低整体免疫应答。
如本文所用，关于在体内被转导、转染或转化的细胞的短语“体内”是指细胞在受试者中被转导、转染或转化，而在这种细胞被转导、转染或转化之前没有将细胞从受试者中移出。
“分离的”意思是从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是部分或完全与它的自然状态的共存物质分开的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非自然环境，比如，例如，宿主细胞。
如本文使用的“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属，其能够感染非分裂细胞。慢病毒可以递送显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因递送载体的最有效的方法之一。HIV、SIV、和FIV是慢病毒的所有实例。源自慢病毒的载体提供了实现基因体内转移的能力。
如本文使用的术语“修饰的”是指如本文提供的分子或细胞的改变的状态或结构。分子可以以许多方式被修饰，包括化学地、结构地和功能地。细胞可以通过引入核酸或表达异源蛋白质被修饰。
如本文使用的术语“调节”意思是与不存在治疗或化合物的受试者中的应答水平相比，和/或与在其它方面相同但未治疗的受试者中的应答水平相比，介导受试者中的应答水平中的增加或减少。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或应答，从而介导受试者(例如，人)中的有益的治疗性应答。
如本文所用，使用常见核酸碱基的下列缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
“尼帕病毒”(NiV)是副粘病毒科亨尼帕病毒属的成员。尼帕病毒是有包膜的病毒，具有负链极性和由螺旋状核衣壳组成的非分段RNA基因组。两种尼帕病毒株包括但不限于马来西亚(MY)和孟加拉国(BD)株。
除非另外规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并形式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在一些形式中包含内含子(一个或多个)。
术语“寡核苷酸”通常是指短多核苷酸。应理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、C、G)表示时，这也提供了相应的RNA序列(即A、U、C、G)，其中“U”替换“T”。
组合物的“肠胃外”施用包括例如，皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射，或输注技术。
如本文所用，术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方法获得的所有核酸序列，包括但不限于重组方法，即从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列，使用克隆技术和PCR等，以及通过合成手段。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的多个氨基酸残基组成的化合物。如本文使用，该术语指的是短链，其在本领域中也通常被称为例如肽、寡肽和寡聚物；和较长链二者，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有许多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用，术语“假型化的”或“假型化的病毒颗粒”是指带有来源于具有包膜的其他病毒的包膜糖蛋白的病毒颗粒，或编码来自不同于亲本病毒的病毒的包膜糖蛋白的病毒载体。载体颗粒的宿主范围因此可以根据糖蛋白使用的细胞表面受体的类型而扩大或改变。例如，HIV慢病毒载体可以将HIV包膜糖蛋白替换为VSV包膜糖蛋白。这只是一个非限制性实例，并且可以使用其他包膜糖蛋白，例如尼帕病毒的包膜糖蛋白。因此，在一些实施方式中，病毒颗粒由编码尼帕病毒包膜糖蛋白的慢病毒编码。在一些实施方式中，尼帕病毒包膜糖蛋白是糖蛋白F。在一些实施方式中，尼帕病毒包膜糖蛋白是糖蛋白G。在一些实施方式中，假型化的病毒载体编码尼帕病毒糖蛋白F和糖蛋白G。在一些实施方式中，假型化的病毒颗粒表达尼帕病毒糖蛋白F和糖蛋白G的之一或两者。
如本文使用的关于抗体的术语“特异性地结合”意思是识别特异性抗原但是基本上不识别或结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性地结合至来自一个物种的抗原的抗体也可以结合至来自一个或多个物种的该抗原。但是，这样的跨物种反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在另一个实例中，特异性地结合至抗原的抗体也可以结合至抗原的不同等位基因形式。然而，这样的交叉反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可以关于抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，以指相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合至特异性蛋白质结构，而不是一般地识别和结合至蛋白质。如果抗体特异于表位“A”，则在包含标示的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标示的A)的分子，将降低结合至抗体的标示的A的量。
术语“刺激”意思是通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其关联配体，从而介导信号转导事件——比如，但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导——诱导的初次应答。刺激可以介导某些分子的改变的表达，比如TGF-β的下调、和/或细胞骨架结构的重组织等。
如本文所用的术语“刺激分子”是指T细胞上与抗原呈递细胞上存在的关联刺激配体特异性结合的分子。
如本文所用，“刺激配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞等)上时可以与在T细胞上的关联结合配偶体(在本文中称为“刺激分子”)特异性结合的配体，从而介导T细胞的初次应答，其包括但不限于活化、启动免疫应答、增殖等。刺激配体是本领域公知的并且尤其包括负载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。
术语“受试者”包括活的生物体，其包括其中可以引发免疫应答的那些(例如，哺乳动物)。如本文使用的“受试者”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括，例如，家畜和宠物，比如羊、牛、猪、狗、非人灵长类、猫和鼠哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。
如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指响应抗原呈递而参与T细胞活化的膜蛋白复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合物分子结合的抗原。TCR由α(α)和β(β)链的异二聚体组成，尽管在一些细胞中TCR由γ和δ(γ/δ)链组成。TCR可能以α/β和γ/δ形式存在，它们在结构上相似，但具有不同的解剖位置和功能。每条链由两种细胞外结构域(可变结构域和恒定结构域)组成。在一些实施方式中，TCR可以在包含TCR的任何细胞上被修饰，包括例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞.
如本文使用的术语“治疗的”意思是治疗和/或预防。治疗效果通过疾病状态的阻抑、缓解或根除获得。
如本文使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如下过程：通过该过程外源性核酸被转移或引入细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经被转染、转化或转导外源性核酸的细胞。细胞包括原代对象细胞和其子代。在一些实施方式中，转染、转化或转导在体内进行或发生。
如本文使用的术语“治疗”疾病，意思是降低受试者经历的疾病或障碍的至少一种迹象或症状的频率或严重度。
如本文所用，术语“变体”在与氨基酸序列结合使用时是指与参考序列至少或大约为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，变体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。在一些实施方式中，取代是保守取代。
“载体”是包含编码蛋白质或肽的分离的核酸的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、质粒、DNA和RNA。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
“运载体”或“递送介质”包括病毒颗粒、病毒、聚赖氨酸化合物和脂质体，其促进核酸转移到细胞中。运载体或递送介质也可用于将蛋白质或肽递送至细胞。
如本文所用，xHIV和χHIV(即，希腊符号χ(chi)HIV)作为同义词使用，以避免源自本说明书的电子或其他成像的任何混淆。
范围：遍及本公开内容，本实施方式的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解范围格式的描述仅仅出于方便和简洁，并且不应当解释为僵硬限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体地公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。例如，比如1至6的范围的描述应当被认为已经具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这均适用。除非另有明确相反的说明，所公开的范围还包括范围的端点。
具体实施方式
此外，本发明提供了用于体内转导细胞(例如T细胞)的组合物和方法。在一些实施方式中，这些组合物和方法在没有离体培养或转导细胞的情况下进行或使用。在一些实施方式中，患有需要CAR T细胞疗法的恶性肿瘤的患者可以用现成的组合物治疗，该组合物在体内转导他们的T细胞，原位产生CAR T细胞。这些方法和组合物，例如病毒颗粒中的基因转移载体(例如慢病毒载体)，与离体转导细胞相反，可用于例如将患者自身的淋巴器官转变为生物反应器以产生CAR T细胞。在一些实施方式中，可以使用的载体是用慢病毒转导CD4+CD8+ T细胞的那些载体，例如CD4-特异性慢病毒和/或CD8-特异性慢病毒，使得只有表达CD4和CD8两者的靶细胞基于从用于体内转导细胞的多种慢病毒表达的表达产物的组合来表达感兴趣的转基因。
应当理解，本公开内容中描述的方法不限于本文公开的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，而不是限制性的。
此外，除非另有说明，本文所述的实验使用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。这样的技术对于熟练的技术人员来说是公知的，并且在文献中有充分的解释。参见例如Ausubel等人编辑的Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，包括所有增补材料；MRGreen和J.Sambrook的Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Fourth Edition)；Harlow等人，Antibodies:ALaboratory Manual,Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013,2nd edition)。
工程化的病毒颗粒
此外，本发明提供了组合物，其可用于例如使用病毒颗粒选择性地转导表达特异性细胞表面标志物的细胞。在一些实施方式中，病毒颗粒用于在体内转导细胞。在一些实施方式中，病毒颗粒用于离体转导细胞。通过利用病毒颗粒来转导相同的细胞类型，病毒颗粒可以增加特异性，通过将整个感兴趣的分子的表达限制在具体细胞类型来提高安全性，并且在某些实施方式中，通过利用需要施用外源性试剂的二聚化结构域提供额外的控制层，使得感兴趣的分子将由病毒颗粒表达的第一和第二部分形成。
病毒载体系统
此外，本发明还提供组合物，其可用于例如使用多种病毒颗粒在体内或离体选择性地转导表达特异性细胞表面标志物的细胞。通过利用多种病毒颗粒来转导相同的细胞类型，病毒颗粒可以增加特异性，通过将整个感兴趣的分子的表达限制在具体细胞类型来提高安全性，并且在某些实施方式中，通过利用需要施用外源性试剂的二聚化结构域提供额外的控制层，使得感兴趣的分子将由多个载体表达的第一和第二部分形成。
感兴趣的蛋白质或多肽
在一些实施方式中，病毒颗粒编码感兴趣的多肽，其也可以称为感兴趣的分子。在一些实施方式中，一种病毒颗粒提供编码感兴趣的分子的第一部分的病毒载体，而另一种病毒颗粒提供编码感兴趣分子的第二部分的第二病毒载体。如本文所提供，在一些实施方式中，感兴趣的分子是嵌合抗原受体。
在一些实施方式中，病毒颗粒递送感兴趣的核酸分子。在一些实施方式中，感兴趣的核酸分子编码感兴趣的多肽。
在一些实施方式中，提供组合物，其包含工程化的病毒颗粒，该工程化的病毒颗粒包含工程化包膜，该工程化包膜含有突变的融合蛋白和用于结合靶细胞的工程化靶向部分，其中该突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和编码感兴趣的多肽的核酸。
在一些实施方式中，gag蛋白不是嵌合gag而是野生型gag。
在一些实施方式中，提供组合物，其包含工程化的病毒颗粒，该工程化的病毒颗粒包含工程化包膜，该工程化包膜含有突变的融合蛋白、嵌合gag蛋白和用于结合靶细胞的工程化靶向部分，其中突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和编码感兴趣的多肽的核酸。
在一些实施方式中，提供了包含第一病毒颗粒和第二病毒颗粒的组合物。在一些实施方式中，第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码蛋白质或多肽的第一部分的核酸分子。在一些实施方式中，第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码蛋白或多肽的第二部分的核酸分子。一旦在细胞中表达，蛋白质或多肽的第一和第二部分可以结合在一起或彼此相互作用以形成完整的或功能性的蛋白质或多肽。
在某些实施方式中，嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。在Uchida等人J.Virol,Oct.2009,p.9854–9862中描述了嵌合gag蛋白xHIV，其内容通过引用并入本文。
在某些实施方式中，如本文所述的嵌合gag蛋白包含SIV和HIV序列。在某些实施方式中，嵌合gag蛋白被称为xHIV gag蛋白。在某些实施方式中，xHIV包含HIV长末端重复(LTR)、HIV gag蛋白(gag)、SIV元件、HIV Pol蛋白(Pol)和HIV包膜(Env)蛋白。在一些实施方式中，gag、Pol和/或Env蛋白是多蛋白。在某些实施方式中，xHIV的gag蛋白、SIV元件和Pol蛋白由如SEQ ID NO:5中叙述的核酸序列编码。
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在某些实施方式中，gag蛋白由如SEQ ID NO:6中叙述的核酸序列编码。
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在某些实施方式中，SIV元件由如SEQ ID NO:7中叙述的核酸序列编码。在某些实施方式中，编码SIV元件的核酸序列位于如SEQ ID NO:6中叙述的编码gag蛋白的核酸序列内。
aaaattacccagtacaacaaataggtggtaactatgtccacctgccattaagcccgagaacattaaatgcctgggtaaaattgatagaggaaaagaaatttggagcagaagtagtgccaggatttcaggcactgtcagaaggttgcaccccctatgacattaatcagatgttaaattgtgtgggagaccatcaagcggctatgcagattatcagagatattataaacgaggaggttgcagattgggacttgcagcacccacaaccagctccacaacaaggacaacttagggagccgtcaggatcagatattgcaggaacaactagttcagtagatgaacaaatccagtggatgtacagacaacagaaccccataccagtaggcaacatttacaggagatggatccaactggggttgcaaaaatgtgtcagaatgtataacccaacaaacattctagatgtaaaacaagggccaaaagagccatttcagagctatgtagacaggttctacaaaagtttaagagcagaacagacagatgcagcagtaaagaattggatgactcaaacactgctgattcaaaatgctaacccagattgcaagctagtgctgaaggggttggg(5’-3’xHIV SIV元件，SEQ ID NO:7)
在某些实施方式中，Pol蛋白由如SEQ ID NO:8中叙述的核酸序列编码。
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在某些实施方式中，编码gag蛋白的核苷酸序列编码包含如SEQ ID NO:9中叙述的序列的蛋白质。
MGARASVLSGGELDKWEKIRLRPGGKKQYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTIAVLYCVHQRIDVKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGNNSQVSQNYPVQQIGGNYVHLPLSPRTLNAWVKLIEEKKFGAEVVPGFQALSEGCTPYDINQMLNCVGDHQAAMQIIRDIINEEVADWDLQHPQPAPQQGQLREPSGSDIAGTTSSVDEQIQWMYRQQNPIPVGNIYRRWIQLGLQKCVRMYNPTNILDVKQGPKEPFQSYVDRFYKSLRAEQTDAAVKNWMTQTLLIQNANPDCKLVLKGLGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIMIQKGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIAKNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQSRPEPTAPPEESFRFGEETTTPSQKQEPIDKELYPLASLRSLFGSDPSSQ(SEQ ID NO:9)
在某些实施方式中，编码Pol蛋白的核苷酸序列编码包含如SEQ ID NO:10中叙述的序列的蛋白质。
MNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKQKKSVTVLDVGDAYFSVPLDKDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQCSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYAGIKVRQLCKLLRGTKALTEVVPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMKGAHTNDVKQLTEAVQKIATESIVIWGKTPKFKLPIQKETWEAWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIIGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTDRGRQKVVPLTDTTNQKTELQAIHLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVSQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKVLFLDGIDKAQEEHEKYHSNWRAMASDFNLPPVVAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVIESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRDPVWKGPAKLLWKGEGAVVIQDNSDIKVVPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED(SEQ ID NO:10)
“完整的蛋白质或多肽”是指完整的或功能性的蛋白质或多肽。例如，它们本身没有功能性的蛋白质的两个分开部分可以结合在一起或彼此相互作用，形成完整的功能性的蛋白质。该术语应广义地解释为包括本领域已知的任何类型的蛋白质或多肽。“完整的”蛋白质不必具有具体结构域的完整序列。例如，如本文所提供的，可由第一和第二部分形成的蛋白质可以是嵌合抗原受体。在一些实施方式中，CAR的细胞外结构域可以是与靶细胞上的抗原结合的抗原结合结构域。抗原结合结构域可以是例如重链和轻链抗体分子或可以是scFv结构域，但这些可以不同于独立于CAR起作用的天然序列。
在某些实施方式中，感兴趣的多肽是嵌合抗原受体(CAR)。感兴趣的多肽可以包含本文公开的任何CAR。在某些实施方式中，CAR包含细胞外(抗原结合)结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，细胞外/抗原结合结构域是结合肿瘤抗原(例如抗CD19 scFv、抗CD19抗体、抗CD33 scFv等)的结构域。在一些实施方式中，感兴趣的多肽包含跨膜结构域和CD3ζ结构域。在一些实施方式中，CAR包含细胞内4-1BB结构域。
在一些实施方式中，细胞外/抗原结合结构域是结合CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b的结构。
在某些实施方式中，蛋白质的第一部分包含结合肿瘤抗原(例如抗-CD19 scFv、抗-CD19抗体、抗-CD33 scFv等)的细胞外/抗原结合结构域，并且蛋白质的第二部分包含跨膜结构域和CD3ζ结构域。在某些实施方式中，蛋白质的第一部分包含结合肿瘤抗原的细胞外结构域，并且蛋白质的第二部分包含跨膜结构域、CD3ζ结构域和4-1BB结构域。在某些实施方式中，蛋白质的第一部分包含结合肿瘤抗原的细胞外结构域和跨膜结构域，并且蛋白质的第二部分包含CD3ζ结构域。在某些实施方式中，蛋白质的第一部分包含结合肿瘤抗原的细胞外结构域和跨膜结构域，并且蛋白质的第二部分包含CD3ζ结构域和4-1BB结构域。在某些实施方式中，蛋白质的第一部分包含结合肿瘤抗原的细胞外结构域、跨膜结构域和CD3ζ结构域，并且蛋白质的第二部分包含4-1BB结构域。在某些实施方式中，蛋白质的第一部分包含结合肿瘤抗原的细胞外结构域、跨膜结构域和4-1BB结构域，并且蛋白质的第二部分包含CD3ζ结构域。
在某些实施方式中，感兴趣的多肽是血红蛋白β链。感兴趣的蛋白质或多肽的这些实例是非限制性的，并且任何感兴趣的多肽可以由本文提供的组合物编码。
病毒
在某些实施方式中，病毒颗粒是腺病毒。腺病毒颗粒基于腺病毒，其整合到基因组DNA的能力低，但转染宿主细胞的效率高。腺病毒颗粒含有足以：(a)支持表达载体的包装和(b)最终在宿主细胞中表达蛋白质的腺病毒序列。在一些实施方式中，腺病毒基因组是36kb、线性、双链DNA，其中可以插入外源DNA序列(例如，编码CAR的核酸)以取代大块的腺病毒DNA以便制备表达载体(参见，例如，Danthinne和Imperiale，Gene Therapy(2000)7(20):1707-1714)。
在某些实施方式中，病毒颗粒是依赖病毒(dependovirus)，例如细小病毒。依赖病毒的非限制性实例是腺伴随病毒(AAV)，它利用了腺病毒偶联系统。这种AAV表达载体高频率的整合到宿主基因组中。它可以感染非分裂细胞，因此可用于将基因递送到哺乳动物细胞中，例如在组织培养物中或体内。AAV具有广泛的宿主传染范围。关于AAV的生成和使用的细节在美国专利号5,139,941和4,797,368中进行了描述，每一篇都通过引用整体并入。在一些实施方式中，AAV颗粒是AAV9颗粒。美国专利号7,906,111中提供了AAV9颗粒的实例，其通过引用整体并入本文。
逆转录病毒表达载体能够整合到宿主基因组中，递送大量外源遗传物质，感染广泛的物种和细胞类型，并被包装在特定的细胞系中。逆转录病毒颗粒是通过在某些位置将核酸(例如，编码CAR的核酸)插入病毒基因组中以产生复制缺陷的病毒来构建的。尽管逆转录病毒颗粒能够感染多种细胞类型，但CAR的整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂。
在某些实施方式中，病毒颗粒是慢病毒颗粒。慢病毒颗粒源自慢病毒，慢病毒是逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外还含有其他具有调节或结构功能的基因(参见，例如，美国专利号6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒颗粒通过多重减弱HIV毒力基因生成，例如基因env、vif、vpr、vpu和nef被缺失，使载体在生物学上是安全的。慢病毒颗粒能够感染非分裂细胞并且可以用于例如编码CAR的核酸的体内和离体基因转移和表达(参见例如美国专利号5,994,136)。
假型化的病毒颗粒/靶向部分
为了赋予病毒颗粒对靶细胞的特异性，病毒颗粒可以是假型化的。衣壳蛋白和包膜糖蛋白参与病毒附着以及与细胞受体的相互作用，这决定细胞嗜性(tropism)。因此，对这些病毒表面蛋白的操作可以提高这些载体的转导能力，这扩大或限制它们的嗜性。此外，载体假型化的实验表明，假型化的载体可以实现更高的转导滴度并增加转导效率。
在一些实施方式中，提供了病毒颗粒，其包含与细胞上的靶标结合的靶向部分和编码感兴趣的多肽的核酸分子。
在一些实施方式中，提供了病毒颗粒，其包含与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码蛋白质或多肽的第一部分的核酸分子。在一些实施方式中，提供了病毒颗粒，其包含与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码蛋白质或多肽的第二部分的核酸分子。
在一些实施方式中，提供了组合物，其包含第一病毒颗粒和第二病毒颗粒，该第一病毒颗粒具有与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分，该第二病毒颗粒具有与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分。在某些实施方式中，第一靶标和第二靶标是不同的。
靶向部分可以是任何类型的靶向部分，其包括但不限于抗原结合结构域、DARPIN、FN3结构域、抗体、Centryn、干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子)。在某些实施方式中，靶标是cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。在某些实施方式中，靶标是cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14或CD68。
在某些实施方式中，第一靶标和第二靶标各自独立地选自cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。在某些实施方式中，第一靶标是cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14或CD68。在某些实施方式中，第二靶标是CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7或CXCR3。
在某些实施方式中，靶向部分(第一和/或第二)是与靶标、抗原结合结构域、抗体、scFv、DARPIN和FN3结构域或其任何组合结合的蛋白质。
在某些实施方式中，靶向部分(第一和/或第二)是干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子)或与cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7或CXCR3结合的部分。在一些实施方式中，靶向部分与CD4和/或CD8结合。在一些实施方式中，靶向部分与CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b结合。
在某些实施方式中，工程化的病毒颗粒是假型化的病毒颗粒。在某些实施方式中，工程化的病毒颗粒是假型化的慢病毒颗粒、腺病毒或腺伴随病毒。在某些实施方式中，假型化的慢病毒颗粒用麻疹病毒属例如麻疹病毒糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。在某些实施方式中，工程化的病毒颗粒用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。在一些实施方式中，麻疹F蛋白或H蛋白是突变的。突变可用于已暴露于麻疹病毒或麻疹疫苗的受试者，其可避免可能存在于已暴露于麻疹病毒或麻疹疫苗的受试者中的抗MV抗体的中和。在一些实施方式中，工程化的病毒颗粒用尼帕病毒F蛋白或G蛋白假型化。
F、G或H蛋白的实例可以在美国专利号10,415,057中找到，该专利通过引用以其整体并入本文。在一些实施方式中，假型化的病毒颗粒包含麻疹病毒属的融合(F)蛋白和血凝素(H)蛋白，其中F和H蛋白的细胞质部是截短的，并且其中F蛋白的截短的细胞质部至少包含1个带正电荷的氨基酸残基并且H蛋白的截短的细胞质部被截短以允许有效的假型化并具有融合支持功能。在一些实施方式中，麻疹病毒属是麻疹病毒或麻疹病毒的埃德蒙斯顿株(Edmonston strain)。在一些实施方式中，H蛋白的截短的细胞质部包含H蛋白的C末端细胞质部的至少9个连续氨基酸残基加上在N末端的额外的甲硫氨酸。在一些实施方式中，F蛋白的截短的细胞质部包含F蛋白的N末端细胞质部的至少3个连续氨基酸残基，并且H蛋白的截短的细胞质部包含H蛋白的C末端细胞质部的至少13个连续氨基酸残基加上在N末端的额外的甲硫氨酸，其中所述H蛋白的C末端细胞质部的至少13个连续氨基酸残基的N末端氨基酸残基中的1至4个可以被丙氨酸残基取代。在一些实施方式中，截短的F蛋白是FcΔ24或FcΔ30和/或截短的H蛋白选自HcΔ14、HcΔ15、HcΔ16、HcΔ17、HcΔ18、Hc.Δ.19、HcΔ20、HcΔ21+A和HcΔ24+4A。这些蛋白质也在美国专利号10,415,057中描述，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方式中，病毒颗粒包含麻疹病毒F蛋白，其可称为Δ30，具有以下氨基酸序列：
MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTGQIHWGNLSKIGVVGIGSASYKVMTRSSHQSLVIKLMPNITLLNNCTRVEIAEYRRLLRTVLEPIRDALNAMTQNIRPVQSVASSRRHKRFAGVVLAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDYINNELIPSMNQLSCDLIGQKLGLKLLRYYTEILSLFGPSLRDPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRGIKARITHVDTESYLIVLSIAYPTLSEIKGVIVHRLEGVSYNIGSQEWYTTVPKYVATQGYLISNFDESSCTFMPEGTVCSQNALYPMSPLLQECLRGSTKSCARTLVSGSFGNRFILSQGNLIANCASILCKCYTTGTIINQDPDKILTYIAADHCPVVEVNGVTIQVGSRRYPDAVYLHRIDLGPPILLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILRSMKGLSSTCIVYILIAVCLGGLIGIPALICCCRGR(SEQID NO:11).
在一些实施方式中，病毒颗粒包含麻疹病毒H蛋白，其可称为Δ18+4Α，具有以下氨基酸序列：
MGSRIVINREHLMIDRPYVLLAVLFVMFLSLIGLLAIAGIRLHRAAIYTAEIHKSLSTNLDVTNSIEHQVKDVLTPLFKIIGDEVGLRTPQRFTDLVKFISDKIKFLNPDREYDFRDLTWCINPPERIKLDYDQYCADVAAEELMNALVNSTLLETRTTNQFLAVSKGNCSGPTTIRGQFSNMSLSLLDLYLGRGYNVSSIVTMTSQGMYGGTYLVEKPNLSSKRSELSQLSMYRVFEVGVIRNPGLGAPVFHMTNYLEQPVSNDLSNCMVALGELKLAALCHGEDSITIPYQGSGKGVSFQLVKLGVWKSPTDMQSWVPLSTDDPVIDRLYLSSHRGVIADNQAKWAVPTTRTDDKLRMETCFQQACKGKIQALCENPEWAPLKDNRIPSYGVLSVDLSLTVELKIKIASGFGPLITHGSGMDLYKSNHNNVYWLTIPPMKNLALGVINTLEWIPRFKVSPALFNVPIKEAGEDCHAPTYLPAEVDGDVKLSSNLVILPGQDLQYVLATYDTSAVEHAVVYYVYSPSRLSSYFYPFRLPIKGVPIELQVECFTWDQKLWCRHFCVLADSESGGHITHSGMVGMGVSCTVTREDGTNRRGG(SEQ ID NO:12).
不受任何理论束缚，4个氨基酸变化用于失活CD46的天然嗜性。
在一些实施方式中，病毒颗粒包含麻疹Δ30(SEQ ID NO:11)和麻疹Δ18+4A(SEQID NO:12)氨基酸序列。
在一些实施方式中，病毒颗粒包含尼帕病毒F蛋白，其可称为Δ30，具有以下氨基酸序列：
MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT(SEQ ID NO:13)。
在一些实施方式中，病毒颗粒包含可称为Δ34+4A的尼帕病毒G蛋白，具有以下氨基酸序列：
MKKINEGLLDSKILSAFNTVIALLGSIVIIVMNIMIIQNYTRSTDNQAVIKDALQGIQQQIKGLADKIGTEIGPKVSLIDTSSTITIPANIGLLGSKISQSTASINENVNEKCKFTLPPLKIHECNISCPNPLPFREYRPQTEGVSNLVGLPNNICLQKTSNQILKPKLISYTLPVVGQSGTCITDPLLAMDEGYFAYSHLERIGSCSRGVSKQRIIGVGEVLDRGDEVPSLFMTNVWTPPNPNTVYHCSAVYNNEFYYVLCAVSTVGDPILNSTYWSGSLMMTRLAVKPKSNGGGYNQHQLALRSIEKGRYDKVMPYGPSGIKQGDTLYFPAVGFLVRTEFKYNDSNCPITKCQYSKPENCRLSMGIRPNSHYILRSGLLKYNLSDGENPKVVFIEISDQRLSIGSPSKIYDSLGQPVFYQASFSWDTMIKFGDVLTVNPLVVNWRNNTVISRPGQSQCPRFNTCPAICAEGVYNDAFLIDRINWISAGVFLDSNATAANPVFTVFKDNEILYRAQLASEDTNAQKTITNCFLLKNKIWCISLVEIYDTGDNVIRPKLFAVKIPEQCT(SEQ ID NO:14).
不受任何理论束缚，4个氨基酸变化用于失活Ephrin的天然嗜性。
在一些实施方式中，病毒颗粒包含尼帕Δ30(SEQ ID NO:13)和尼帕Δ18+4A(SEQID NO:14)氨基酸序列。
在一些实施方式中，H蛋白是HmutΔ18、HmutΔ19或HmutΔ24+4A与在其胞外域的细胞表面标志物的单链抗体或配体的融合物。在一些实施方式中，单链抗体针对本文提供的细胞表面蛋白，其包括但不限于CD20(scFvCD20)、CD34(scFvCD34)、VEGFR-2(scFvA7)、CD133(scFvCD133)，或配体是EGF(EGF受体的配体)。在一些实施方式中，H蛋白是与scFvCD20、scFvCD34、scFvA7、EGF或scFvCD133融合的HmutΔ18、HmutΔ19或HmutΔ24+4A的融合物，并且F蛋白是FcΔ30或FcΔ24。在一些实施方式中，截短的H蛋白是由美国专利号10,415,057的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中叙述的氨基酸序列定义的融合物，该专利通过引用以其整体并入本文，即本公开内容的SEQ ID NO:15和16，分别为：
MGSRIVINREHLMIDRPYVLLAVLFVMFLSLIGLLAIAGIRLHRAAIYTAEIHKSLSTNLDVTNSIEHQVKDVLTPLFKIIGDEVGLRTPQRFTDLVKFISDKIKFLNPDREYDFRDLTWCINPPERIKLDYDQYCADVAAEELMNALVNSTLLETRTTNQFLAVSKGNCSGPTTIRGQFSNMSLSLLDLYLGRGYNVSSIVTMTSQGMYGGTYLVEKPNLSSKRSELSQLSMYRVFEVGVIRNPGLGAPVFHMTNYLEQPVSNDLSNCMVALGELKLAALCHGEDSITIPYQGSGKGVSFQLVKLGVWKSPTDMQSWVPLSTDDPVIDRLYLSSHRGVIADNQAKWAVPTTRTDDKLRMETCFQQACKGKIQALCENPEWAPLKDNRIPSYGVLSVDLSLTVELKIKIASGFGPLITHGSGMDLYKSNHNNVYWLTIPPMKNLALGVINTLEWIPRFKVSPALFTVPIKEAGGDCHAPTYLPAEVDGDVKLSSNLVILPGQDLQYVLATYDTSAVEHAVVYYVYSPSRLSSYFYPFRLPIKGVPIELQVECFTWDQKLWCRHFCVLADSESGGHITHSGMVGMGVSCTVTREDGTNAAQPAIEGRMAQVQLVQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAQLRPNYWYFDVWGAGTTVTVSKISGGGGSGGGGSGGGGSGGSSDIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWISNPPTFGAGTKLELKAAARGSHHHHHH(SEQ ID NO:15)。
MGSRIVINREHLMIDRPYVLLAVLFVMFLSLIGLLAIAGIRLHRAAIYTAEIHKSLSTNLDVTNSIEHQVKDVLTPLFKIIGDEVGLRTPQRFTDLVKFISDKIKFLNPDREYDFRDLTWCINPPERIKLDYDQYCADVAAEELMNALVNSTLLETRTTNQFLAVSKGNCSGPTTIRGQFSNMSLSLLDLYLGRGYNVSSIVTMTSQGMYGGTYLVEKPNLSSKRSELSQLSMYRVFEVGVIRNPGLGAPVFHMTNYLEQPVSNDLSNCMVALGELKLAALCHGEDSITIPYQGSGKGVSFQLVKLGVWKSPTDMQSWVPLSTDDPVIDRLYLSSHRGVIADNQAKWAVPTTRTDDKLRMETCFQQACKGKIQALCENPEWAPLKDNRIPSYGVLSVDLSLTVELKIKIASGFGPLITHGSGMDLYKSNHNNVYWLTIPPMKNLALGVINTLEWIPRFKVSPALFTVPIKEAGGDCHAPTYLPAEVDGDVKLSSNLVILPGQDLQYVLATYDTSAVEHAVVYYVYSPSRLSSYFYPFRLPIKGVPIELQVECFTWDQKLWCRHFCVLADSESGGHITHSGMVGMGVSCTVTREDGTNAAQPAMANSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRAAARGSHHHHHH(SEQ IDNO:16)。
在一些实施方式中，第一病毒颗粒和第二病毒颗粒用相同的包膜蛋白假型化。在一些实施方式中，第一病毒载体和第二病毒颗粒用不同的包膜蛋白假型化。在一些实施方式中，本文提供组合物包含工程化的病毒颗粒，该病毒颗粒包含结合细胞的靶向部分。在一些实施方式中，本文提供的组合物包含第一和第二病毒颗粒，该第一和第二病毒颗粒包含结合细胞上的第一和第二靶标的靶向部分。细胞可以是任何类型的细胞，其包括但不限于T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。在一些实施方式中，细胞是CD4+CD8+ T细胞。
因此，在一些实施方式中，提供了工程化的病毒颗粒，该病毒颗粒包含工程化包膜，该包膜包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，工程化的病毒颗粒包含用于结合靶细胞的异源多肽靶向部分。在一些实施方式中，病毒颗粒包含编码感兴趣的异源多肽的核酸分子。在一些实施方式中，靶向部分与工程化的病毒颗粒表面上存在的突变的融合蛋白融合。在一些实施方式中，病毒颗粒是用a)麻疹病毒(MV)血凝素(HA)蛋白和/或MV融合(F)蛋白(MV-F蛋白)假型化的慢病毒，并且其中MV-HA蛋白或MV-F蛋白质与其天然存在的蛋白质相比，包含突变或突变的结合结构域；或b)尼帕病毒F蛋白和/或尼帕病毒G蛋白假型化的慢病毒，并且其中尼帕病毒F蛋白和/或尼帕病毒G蛋白与其天然存在的蛋白质相比，包含突变或突变的结合结构域。在一些实施方式中，靶向部分与MV-HA蛋白和/或MV-F蛋白融合。在一些实施方式中，靶向部分与尼帕病毒F蛋白和/或尼帕病毒G蛋白融合。在一些实施方式中，靶向部分是scFv、抗原结合结构域、DARPIN、VHH或FN3结构域。在一些实施方式中，靶向部分与选自以下的蛋白质结合：干细胞因子蛋白(SCF、KIT配体、KL或钢因子)或与cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD3D、CD3E、CD3G、CD3Z、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3结合的部分。在一些实施方式中，感兴趣的异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞外结构域与CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b结合。在一些实施方式中，感兴趣的异源多肽是血红蛋白β链。
细胞
在一些实施方式中，所提供的实施方式包括细胞，该细胞包含如本文提供的一个或多个工程化的病毒颗粒。在一些实施方式中，细胞包含由工程化的病毒颗粒编码的感兴趣的多肽。
在某些实施方式中，感兴趣的多肽是血红蛋白β链。在某些实施方式中，感兴趣的多肽是异源嵌合抗原受体(CAR)。
在某些实施方式中，细胞是T细胞，例如CD8+ T细胞(例如CD8+幼稚T细胞、中央记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+ T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、调节T细胞(Treg)、α-βT细胞、γ-δT细胞、干细胞记忆T细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、T-细胞CD8+CCR7+、淋巴祖细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)或树突状细胞。在一些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如髓样细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。在一个实施方式中，靶细胞是诱导多能干(iPS)细胞或源自iPS细胞的细胞，例如，从受试者生成的iPS细胞，其被操纵以改变(例如，在其中诱导突变)或操纵一种或多种靶基因的表达，并分化成例如T细胞，例如CD8+ T细胞(例如CD8+幼稚T细胞、中央记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+ T细胞、干细胞记忆T细胞、淋巴祖细胞或造血干细胞。在一些实施方式中，细胞是CD4+CD8+ T细胞。
在一些实施方式中，细胞包括一种或多种T细胞子集或其他细胞类型，例如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，例如由功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久性能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在具体器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱和/或分化程度限定的那些。在T细胞和/或CD4+和/或CD8+ T细胞的亚型和亚群中，有幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，例如干细胞记忆T(TSCM)细胞、中央记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关性不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。在某些实施方式中，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。
病毒载体
本文提供了可用于例如使用病毒载体体内选择性地转导表达特异性细胞表面标志物的细胞的组合物。在一些实施方式中，载体编码感兴趣的多肽。在一些实施方式中，病毒载体是假型化的载体。
在一些实施方式中，假型化的病毒载体包含嵌合gag蛋白，如本文所述。在一些实施方式中，嵌合gag蛋白被称为xHIV gag蛋白。在一些实施方式中，gag蛋白包含如SEQ IDNO:9中叙述的序列。在一些实施方式中，病毒载体包含编码嵌合gag蛋白的多核苷酸分子。在一些实施方式中，编码嵌合gag蛋白的多核苷酸分子包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列。在一些实施方式中，核苷酸序列进一步包含长末端重复(LTR)、SIV元件、编码Pol蛋白的序列，和/或编码包膜(Env)多聚蛋白的序列。在一些实施方式中，xHIV的gag蛋白、SIV元件和Pol蛋白由如SEQ ID NO:5中叙述的核酸序列编码。在一些实施方式中，gag蛋白由如SEQ ID NO:6中叙述的核酸序列编码。在一些实施方式中，SIV元件由如SEQ ID NO:7中叙述的核酸序列编码。在一些实施方式中，编码SIV元件的核酸序列位于如SEQ ID NO:6中叙述的编码gag蛋白的核酸序列内。在一些实施方式中，Pol蛋白由如SEQ ID NO:8中叙述的核酸序列编码。在一些实施方式中，编码Pol蛋白的多核酸分子编码包含如SEQ ID NO:10中叙述的序列的蛋白。
在一些实施方式中，提供了包含嵌合gag蛋白的病毒颗粒，如本文所述。在一些实施方式中，嵌合gag蛋白包含如SEQ ID NO:9中叙述的氨基酸序列。在一些实施方式中，包含嵌合gag蛋白的病毒颗粒包含感兴趣的异源转基因，例如嵌合抗原受体。本文提供了嵌合抗原受体的非限制性实例。
本文还提供了可用于例如使用多种病毒载体体内选择性地转导表达特异性细胞表面标志物的细胞的组合物，该多种病毒载体可称为剪接病毒载体系统。在一些实施方式中，一个载体编码感兴趣分子的第一部分，而另一个载体编码感兴趣分子的第二部分。在某些实施方式中，蛋白质(或编码所述蛋白质的核酸)的第一部分和第二部分由多种载体表达或编码。在一些实施方式中，第一部分和第二部分由2、3或4个不同的载体表达或编码。为避免疑问，如果载体编码具有不同序列或目标分子的不同部分，则认为该载体是不同的，即使分子的序列或结构相似或重叠。
在一些实施方式中，一种病毒颗粒提供编码感兴趣分子的第一部分的病毒载体，而另一种病毒颗粒提供编码感兴趣分子的第二部分的第二病毒载体。如本文所提供的，在一些实施方式中，感兴趣的分子是嵌合抗原受体。
在一些实施方式中，提供了包含第一病毒颗粒和第二病毒颗粒的组合物。在一些实施方式中，第一病毒颗粒包含与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码蛋白质或多肽的第一部分的核酸分子。在一些实施方式中，第二病毒颗粒包含与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码蛋白质或多肽的第二部分的核酸分子。一旦在细胞中表达，蛋白质或多肽的第一和第二部分可以结合在一起或彼此相互作用以形成完整的或功能性的蛋白质或多肽。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法或组合物将包含本公开内容的核酸的表达载体引入宿主细胞。如果需要，表达载体可以包括用于转染的病毒序列。可选地，可以通过融合、电穿孔、基因枪法、转染、脂质转染等引入表达载体。尽管可以在体内转导或转染细胞，但在一些实施方式中，转导的细胞然后可以从受试者中分离，然后在一些实施方式中，可以在培养物中离体生长和扩增。然后可以通过载体中存在的标志物筛选扩增的细胞。然后可以将扩增的细胞重新引入同一受试者或不同的受试者进行治疗。可以使用的多种标志物是本领域已知的，并且可以包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。在一些实施方式中，宿主细胞是免疫细胞或其前体，例如，T细胞、NK细胞或NKT细胞。
本文提供的实施方式还包括编码本文公开的在任何实施方式中的任何病毒颗粒的核酸。
在一些实施方式中，本公开内容的核酸被提供用于产生如本文所述的蛋白质(例如，CAR)，例如，在细胞中或在受试者体内。
在一些实施方式中，本公开内容的核酸可以可操作地连接至转录控制元件，例如启动子和增强子等。合适的启动子和增强子元件是本领域技术人员已知的。在某些实施方式中，编码CAR的核酸与启动子可操作的连接。在某些实施方式中，启动子是磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子。
对于在真核细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒即时早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于逆转录病毒的长末端重复中的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；和多种本领域已知的组织特异性启动子。合适的可逆启动子(包括可逆诱导型启动子)是本领域已知的。这种可逆启动子可以分离自和源自许多生物体例如真核生物和原核生物。修饰源自第一生物体的可逆启动子以用于第二生物体，例如第一原核生物和第二真核生物、第一真核生物和第二原核生物等，在本领域中是公知的。此类可逆启动子和基于此类可逆启动子但还包含额外的控制蛋白的系统包括但不限于醇调节的启动子(例如乙醇脱氢酶I(alcA)基因启动子、对乙醇反式激活蛋白(A1cR)反应的启动子等)、四环素调节启动子(例如，启动子系统，其包括TetActivators、TetON、TetOFF等)、类固醇调节启动子(例如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人雌激素受体启动子系统、类视黄醇启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调节启动子(例如，金属硫蛋白启动子系统等)、发病机制相关的调节启动子(例如，水杨酸调节启动子、乙烯调节启动子、苯并噻二唑调节启动子等)、温度调节启动子(例如，热休克诱导型启动子(例如，HSP-70、HSP-90、大豆热休克启动子等)、光调节启动子、合成诱导型启动子等。
在一些实施方式中，启动子是CD8细胞特异性启动子、CD4细胞特异性启动子、嗜中性粒细胞特异性启动子或NK特异性启动子。例如，可以使用CD4基因启动子；参见例如Salmon等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:7739；和Marodon等人.(2003)Blood 101:3416。作为另一个实例，可以使用CD8基因启动子。NK细胞特异性表达可以通过使用NcrI(p46)启动子来实现；参见，例如，Eckelhart等人.Blood(2011)117:1565。
合适的启动子的其他实例包括即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。也可以使用其他组成型启动子序列，其包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)或人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒即时早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、EF-1α启动子以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，载体不应限于使用组成型启动子。也可以使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在需要这种表达时打开与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施方式中，含有合适启动子的基因座或构建体或转基因通过诱导型系统的诱导被不可逆地转换。用于诱导不可逆转换的合适系统是本领域公知的，例如，不可逆转换的诱导可以利用Cre-lox介导的重组(参见例如，Fuhrmann-Benzakein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)28:e99，其公开内容通过引用并入本文)。本领域已知的重组酶、内切核酸酶、连接酶、重组位点等的任何合适组合可用于生成不可逆地可转换启动子。本文其他地方描述的进行位点特异性重组的方法、机制和要求可用于生成不可逆地转换的启动子并且是本领域公知的，参见例如Grindley等人Annual Review ofBiochemistry(2006)567-605；和Tropp Molecular Biology(2012)(Jones&BartlettPublishers,Sudbury,Mass.)，其公开内容通过引用并入本文。
本公开内容的核酸可以存在于表达载体和/或克隆载体中。表达载体可以包括可选择的标志物、复制起点和提供载体复制和/或维持的其他特征。合适的表达载体包括例如质粒、病毒载体等。本领域技术人员已知大量合适的载体和启动子；许多可商购用于生成对象重组构建体。以下载体作为实例提供，并且无论如何不应被解释为限制性的：细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,LaJolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、Psg(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。可以在表达宿主中存在可操作的可选择的标志物。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒的病毒载体(参见，例如，Li等人,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35:2543-2549；Borras等人,Gene Ther.(1999)6:515-524；Li和Davidson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:7700-7704；Sakamoto等人,H.Gene Ther.(1999)5:1088-1097；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺伴随病毒(参见，例如，Ali等人,Hum.Gene Ther.(1998)9:81-86,Flannery等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:6916-6921；Bennett等人,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38:2857-2863；Jomary等人,GeneTher.(1997)4:683 690,Rolling等人,Hum.Gene Ther.(1999)10:641-648；Ali等人,Hum.Mol.Genet.(1996)5:591-594；Srivastava的WO 93/09239,Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(参见，例如，Miyoshi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:10319-23；Takahashi等人，J.Virol.(1999)73:7812-7816)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾脏坏死病毒和源自逆转录病毒(例如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)的载体)；等等。
适合使用的额外的表达载体是例如但不限于慢病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺伴随病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、工程化的杂合病毒载体、转座子介导的载体等。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
在一些实施方式中，表达载体(例如，慢病毒载体)可用于将感兴趣的多肽(例如，CAR或其一部分)引入细胞(例如，T细胞)中。因此，表达载体(例如，慢病毒载体)可以包含编码感兴趣的多肽(例如，CAR或其一部分)的核酸。如本文所提供的，可以通过使用表达载体将感兴趣的多肽引入细胞中。在一些实施方式中，表达载体(例如，慢病毒载体)将包含有助于其中编码的蛋白质或多肽(例如，CAR或其一部分)的功能性表达的额外元件。在一些实施方式中，包含编码感兴趣的多肽(例如，CAR或其一部分)的核酸的表达载体进一步包含哺乳动物启动子。在一些实施方式中，载体进一步包含延伸因子-1-α启动子(EF-1α启动子)。EF-1α启动子的使用可以增加下游转基因(例如，编码蛋白质或多肽(例如，CAR或其一部分)的核酸序列)的表达效率。生理启动子(例如，EF-1α启动子)可能不太可能诱导整合介导的基因毒性，并可能消除逆转录病毒载体转化干细胞的能力。适用于载体(例如，慢病毒载体)的其他生理启动子是本领域技术人员已知的并且可以并入本发明的载体中。在一些实施方式中，载体(例如，慢病毒载体)进一步包含可以提高滴度和基因表达的非必需的顺式作用序列。非必需的顺式作用序列的一个非限制性实例是中央多聚嘌呤序列(polypurine tract)和中央终止序列(cPPT/CTS)，其对于有效的逆转录和核输入很重要。其他非必需的顺式作用序列是本领域技术人员已知的并且可以并入本发明的载体(例如，慢病毒载体)中。在一些实施方式中，载体进一步包含转录后调节元件。转录后调节元件可以提高RNA翻译、提高转基因表达和稳定RNA转录物。转录后调节元件的一个实例是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。因此，在一些实施方式中，用于本发明的载体进一步包含WPRE序列。多种转录后调节元件是本领域技术人员已知的并且可以并入本发明的载体(例如慢病毒载体)中。本发明的载体可以进一步包含额外的元件，例如用于RNA转运的rev应答元件(RRE)、包装序列和5'和3'长末端重复(LTR)。术语“长末端重复”或“LTR”是指位于逆转录病毒DNA末端的碱基对的结构域，其包括U3、R和U5区。LTR通常提供逆转录病毒基因表达(例如，基因转录物的促进、起始和多聚腺苷酸化)和病毒复制所需的功能。在一些实施方式中，本发明的载体(例如，慢病毒载体)包括3'U3缺失的LTR。因此，本发明的载体(例如，慢病毒载体)可包含本文所述元件的任何组合以增强转基因功能性表达的效率。例如，本发明的载体(例如，慢病毒载体)除了编码蛋白质或多肽(例如，CAR)的核酸之外，还可以包含WPRE序列、cPPT序列、RRE序列。
在一些实施方式中，载体是自失活载体。如本文所用，术语“自失活载体”是指其中3'LTR增强子启动子区(U3区)已被修饰(例如，通过缺失或取代)的载体。自失活载体可以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。因此，自失活载体可能只能感染一次，然后整合到宿主基因组(例如哺乳动物基因组)中，并且不能进一步传代。因此，自失活载体可以大大降低产生具有复制能力的病毒的风险。
为了评估多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以包含可选择的标志物基因或报道基因，或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在一些实施方式中，可选择的标志物可以在单独的DNA段上携带并用于共转染或共转导程序中。可选择的标志物和报道基因二者的侧翼可以具有适当的调节序列，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的可选择的标志物包括但不限于抗生素抗性基因。报道基因用于鉴定可能转染的细胞和用于评估调节序列的功能性。一般而言，报道基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，并且其编码的多肽的表达通过一些容易可检测的性质，例如酶活性来证明。在将DNA引入受体细胞后的适当时间评估报道基因的表达。合适的报道基因可以包括但不限于编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBSLetters 479:79-82)。
二聚剂
在某些实施方式中，蛋白质或多肽的第一和第二部分在二聚剂存在下形成完整的蛋白质。可以使用本领域普通技术人员已知的任何二聚剂，其包括但不限于，rimiducid((1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[3-({[2-(2-{3-[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羰基氧基]丙基]苯氧基}乙酰氨基)乙基]氨基甲酰基}甲氧基)苯基]丙基(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羧酸酯(AP1903))、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素或雷帕霉素或其类似物。例如，被剪接为单独部分然后可以二聚化的感兴趣的蛋白质将包含促红细胞生成素结合结构域、血小板生成素结合结构域或雷帕霉素或其类似物结合结构域，使得当给予化合物时化合物将促进蛋白质的单独部分的连结以形成完整的蛋白质。在一些实施方式中，施用用于诱导红细胞生成素或血小板生成素的化合物，而不是红细胞生成素或血小板生成素本身，以诱导体内红细胞生成素或血小板生成素的产生，其将连结蛋白质的部分以形成完整的蛋白质。
在某些实施方式中，蛋白质或多肽的第一和第二部分可以通过切除内含肽结构域结合在一起。内含肽是蛋白质结构域，它可以自发地将其侧翼的N末端和C末端结构域剪接为成熟的蛋白质并从序列中切除自身。与mRNA水平的内含子相似，该蛋白质是内含子样蛋白质，因此被命名为内含肽。内含肽的实施方式可以在文献中找到，参见例如美国专利号10,407,742和美国专利号10,087,213，它们的全部内容通过引用并入本文。
嵌合抗原受体(CAR)
此外，本发明提供了用于体内转导细胞(例如T细胞)的组合物和方法。在一些实施方式中，这些组合物和方法在没有离体培养或转导细胞的情况下进行或使用。在一些实施方式中，患有需要CAR T细胞疗法的恶性肿瘤的患者可以用现成的组合物治疗，该组合物在体内转导他们的T细胞，原位产生CAR T细胞。此外，本发明的组合物和方法(i)能够特异性转导感兴趣的靶细胞，(ii)具有高转导效率以在体内施用后导致足够数量的携带转基因的T细胞，和(iii)导致转导的细胞具有功能。
本发明的某些实施方式包括包含作为嵌合抗原受体(CAR)的感兴趣的多肽的组合物。本发明的CAR包含细胞外(抗原结合)结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域包含刺激结构域，并且任选地包含共刺激结构域。
抗原结合结构域可以可操作地连接至CAR的另一个结构域，例如跨膜结构域或细胞内结构域(两者均在本文别处描述)，以在细胞中表达。在一个实施方式中，编码抗原结合结构域的第一核酸序列与编码跨膜结构域的第二核酸可操作地连接，并且进一步与编码细胞内信号传导结构域的第三核酸序列可操作地连接。
本文所述的抗原结合结构域可与本文所述的任何跨膜结构域、本文所述的任何细胞内信号传导结构域或细胞质结构域或本文所述的可包含在由载体表达的CAR中的任何其他结构域组合。在一些实施方式中，CAR包含铰链结构域，例如但不限于，本文描述的那些。在一些实施方式中，CAR包含间隔结构域，例如但不限于本文所述的那些。在一些实施方式中，抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域中的一个或多个由接头分开。
细胞外/抗原结合结构域
CAR的抗原结合结构域是CAR的细胞外区，用于结合具体的靶抗原，其包括蛋白质、碳水化合物和糖脂。在一些实施方式中，CAR包含对靶细胞上的靶抗原的亲和力。靶抗原可以包括与靶细胞相关的任何类型的蛋白质或其表位。例如，CAR可以包括对靶细胞上的靶抗原的亲和力，其指示靶细胞的具体疾病状态。
在一个实施方式中，靶细胞抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。肿瘤相关抗原(TAA)的实例包括但不限于分化抗原，例如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多系抗原，例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原，如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，例如爱泼斯坦-巴尔病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。在一些实施方式中，CAR的抗原结合结构域靶向抗原，其包括但不限于CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、PSCA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3 TCR、CD19、BCMA、CD33或CD79b等。
在一些实施方式中，细胞外结构域结合CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33、CD8、CCR7或CD79b。
根据待靶向的期望抗原，CAR可以被工程化为包括对所期望抗原靶标特异性的适当抗原结合结构域。例如，如果CD19是待靶向的期望抗原，则CD19的抗体可用作抗原结合部分以并入CAR。
在一些实施方式中，靶细胞抗原是CD19。因此，在一些实施方式中，CAR对靶细胞上的CD19具有亲和力。这不应以任何方式解释为限制性的，因为对任何靶抗原具有亲和力的CAR适用于本文提供的任何组合物或方法。
如本文所述，对靶细胞上的特定靶抗原具有亲和力的本公开的CAR可以包含靶特异性结合结构域。在一些实施方式中，靶特异性结合结构域是鼠靶特异性结合结构域，例如，靶特异性结合结构域是鼠源的。在一些实施方式中，靶特异性结合结构域是人靶特异性结合结构域，例如，靶特异性结合结构域是人源的。
在一些实施方式中，本公开内容的CAR可以对一种或多种靶细胞上的一种或多种靶抗原具有亲和力。在一些实施方式中，CAR可以对靶细胞上的一种或多种靶抗原具有亲和力。在这样的实施方式中，CAR是双特异性CAR或多特异性CAR。在一些实施方式中，CAR包含一种或多种靶特异性结合结构域，其赋予对一种或多种靶抗原的亲和力。在一些实施方式中，CAR包含一个或多个靶特异性结合结构域，其赋予对相同靶抗原的亲和力。例如，包含对相同靶抗原具有亲和力的一个或多个靶特异性结合结构域的CAR可以结合靶抗原的不同表位。当CAR中存在多个靶特异性结合结构域时，结合结构域可以串联排列并且可以被接头肽分开。例如，在包含两个靶特异性结合结构域的CAR中，结合结构域通过寡核苷酸或多肽接头、Fc铰链区或膜铰链区在单一多肽链上彼此共价连接。
在一些实施方式中，抗原结合结构域如本文所提供。在一些实施方式中，抗原结合结构域选自抗体、抗原结合片段(Fab)和单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，抗原结合结构域是VHH。在一些实施方式中，抗原结合结构域是FN3结构域。在一些实施方式中，抗原结合结构域是DARPIN。在一些实施方式中，CD19结合结构域选自CD19特异性抗体、CD19特异性Fab和CD19特异性scFv。在一个实施方式中，CD19结合结构域是CD19特异性抗体。在一些实施方式中，CD19结合结构域是CD19特异性Fab。在一些实施方式中，CD19结合结构域是CD19特异性scFv。CD19只是一个实例，任何其他靶抗原都可以取代抗体或抗体类型分子。在一些实施方式中，靶抗原是CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33、CD8、CCR7或CD79b。
抗原结合结构域可以包括与抗原结合的任何结构域，并且可以包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体和其任何片段。在一些实施方式中，抗原结合结构域部分包含哺乳动物抗体或其片段。抗原结合结构域的选择可能取决于在靶细胞表面上存在的抗原的类型和数量。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是共价连接以形成VH::VL异二聚体的免疫球蛋白(例如小鼠或人)的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接连结或通过肽编码接头连结，该接头将VH的N末端与VL的C末端或将VH的C末端与VL的N末端连接起来。在一些实施方式中，抗原结合结构域(例如，CD19结合结构域)包含具有从N末端到C末端，VH-接头-VL的构型的scFv。在一些实施方式中，抗原结合结构域包含具有从N末端到C末端，VL-接头-VH的构型的scFv。
在一些实施方式中，接头富含甘氨酸(为了柔性)，以及丝氨酸或苏氨酸(为了溶解度)。接头可以连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。在Shen等人,Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)和WO 2014/087010中公开了接头的非限制性实例，其内容通过引用以其整体并入本文。本领域已知多种接头序列，其包括但不限于甘氨酸丝氨酸(GS)接头，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:1)、(GGGS)n(SEQ ID NO:2)、(GGGGS)n(SEQID NO:3)、(GGSGG)n(SEQ ID NO:4)，其中每个n独立地是至少1或1-5的整数。在一些实施方式中，接头的丝氨酸被丙氨酸替换。
尽管去除了恒定区并引入了接头，但scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。如Huston等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)所述，单链Fv多肽抗体可以由包含VH和VL编码序列的核酸表达。另见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；和美国专利公开号20050196754和20050196754。已经描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(参见，例如，Zhao等人,Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6):455-51；Peter等人,JCachexia Sarcopenia Muscle 2012August 12；Shieh等人,J Imunol 2009 183(4):2277-85；Giomarelli等人,Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fife等人,J Clin Invst 2006116(8):2252-61；Brocks等人,Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayer等人,Ther Immunol 1995 2(10:31-40))。已经描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见，例如，Peter等人,J Bioi Chem 2003 25278(38):36740-7；Xie等人,Nat Biotech 1997 15(8):768-71；Ledbetter等人,Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55；Ho等人,BioChimBiophys Acta 2003 1638(3):257-66)。
如本文所用，“Fab”是指与抗原结合但为单价且不具有Fc部分的抗体结构的片段，例如，被木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个Fab片段和一个Fc片段(例如，重(H)链恒定区；不与抗原结合的Fc区)。
如本文所用，“F(ab')2”是指通过胃蛋白酶消化完整IgG抗体生成的抗体片段，其中该片段具有两个抗原结合(ab')(二价)区，其中每个(ab')区包含两条单独的氨基酸链，通过S-S键连接的一部分H链和一条轻(L)链以结合抗原，其中剩余的H链部分连接在一起。“F(ab')2”片段可以剪接成两个单独的Fab'片段。
本文提供了抗体或抗原结合结构域的其他实例，并且也可用于CAR构建体。
在一些实施方式中，抗原结合结构域可源自其中最终使用CAR的相同物种。例如，对于用于人类，CAR的抗原结合结构域可以包含人抗体或其片段。在一些实施方式中，抗原结合结构域可以源自其中最终将使用CAR的不同物种。例如，对于用于人类，CAR的抗原结合结构域可以包含鼠抗体或其片段。
跨膜结构域
CAR包含跨膜结构域。对象CAR的跨膜结构域是能够跨越细胞(例如，免疫细胞或其前体)的质膜的区域。跨膜结构域用于插入细胞膜，例如真核细胞膜。在一些实施方式中，跨膜结构域连接CAR的细胞外/抗原结合结构域和细胞内结构域。
在一些实施方式中，跨膜结构域与CAR中的一个或多个结构域天然相关。在一些实施方式中，可以通过一个或多个氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可以源自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白，例如I型跨膜蛋白。在来源是合成的情况下，跨膜结构域可以是促进CAR插入细胞膜的任何人工序列，例如人工疏水序列。跨膜结构域的实例包括但不限于源自以下的跨膜结构域(即，至少包含以下的一个或多个跨膜结构域)：T细胞受体的α或β链、CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9。在一些实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方式中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体位于合成跨膜结构域的每一端。
本文所述的跨膜结构域可与本文所述的任何抗原结合结构域、本文所述的任何细胞内结构域或本文所述的可包括在对象CAR中的任何其他结构域组合。
在一些实施方式中，跨膜结构域进一步包含铰链区。因此，在一些实施方式中，对象CAR还可以包括铰链区。CAR的铰链区是位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区。铰链区可以包括选自抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工铰链序列或其组合的结构域。铰链区的实例包括但不限于CD8a铰链、由可以小至三个甘氨酸(Gly)的多肽制成的人工铰链以及IgG(例如人IgG4)的CH1和CH3结构域。
在一些实施方式中，本公开内容的对象CAR包括连接抗原结合结构域和跨膜结构域的铰链区，而跨膜结构域又连接到细胞内结构域。铰链区可能够支持抗原结合结构域以识别和结合靶细胞上的靶抗原(参见，例如，Hudecek等人,Cancer Immunol.Res.(2015)3(2):125-135)。在一些实施方式中，铰链区是柔性结构域。不受任何特定理论的束缚，铰链区可以允许抗原结合结构域具有最佳识别细胞如肿瘤细胞上靶抗原的具体结构和密度的结构(Hudecek等人，同上)。铰链区的柔性可以允许铰链区采用许多不同的构象。
在一些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。在一些实施方式中，铰链区是源自受体的铰链区多肽(例如，源自CD8的铰链区)。
铰链区可具有约4个氨基酸至约50个氨基酸的长度，例如约4个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约25个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸约40个氨基酸至约50个氨基酸。在一些实施方式中，铰链区的长度可以具有大于5个氨基酸、大于10个氨基酸、大于15个氨基酸、大于20个氨基酸、大于25个氨基酸、大于30个氨基酸、大于35个氨基酸、大于40个氨基酸、大于45个氨基酸、大于50个氨基酸、大于55个氨基酸或更多。
合适的铰链区可以容易地选择并且可以是许多合适长度中的任何一种，例如从1个氨基酸(例如，Gly)到20个氨基酸、从2个氨基酸到15个氨基酸、从3个氨基酸到12个氨基酸氨基酸，包括4个氨基酸到10个氨基酸、5个氨基酸到9个氨基酸、6个氨基酸到8个氨基酸或7个氨基酸到8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。合适的铰链区可以具有大于20个氨基酸(例如，30、40、50、60或更多个氨基酸)的长度。
例如，铰链区可以包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:1)和(GGGS)n(SEQ ID NO:2)，其中每个n独立地是至少1或1-5的整数、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物。也可以使用甘氨酸聚合物。
在一些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。免疫球蛋白铰链区氨基酸序列是本领域已知的；参见，例如，Tan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87(1):162-166；和Huck等人,Nucleic Acids Res.(1986)14(4):1779-1789。铰链区可以包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区的氨基酸序列。在一些实施方式中，与野生型(天然存在的)铰链区相比，该铰链区可以包括一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。
在一些实施方式中，铰链区可包含源自人CD8的氨基酸序列或其变体。
细胞内信号域
对象CAR还包括细胞内信号传导结构域。术语“细胞内信号传导结构域”和“细胞内结构域”在本文中可互换使用。CAR的细胞内信号传导结构域负责激活其中表达CAR的细胞(例如免疫细胞)的至少一种效应器功能。细胞内信号传导结构域转导效应器功能信号并指导细胞(例如免疫细胞)执行其特化功能，例如伤害和/或破坏靶细胞。
细胞内结构域的实例包括但不限于表面受体的胞质部分、共刺激分子和协同作用以启动T细胞中的信号转导的任何分子，以及这些元件的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
细胞内信号传导结构域的实例包括但不限于T细胞受体复合物的ζ链或其任何同源物(例如η链、FcsRIγ和β链、MB1(Iga)链、B29(Ig)链等)、人CD3ζ链、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和参与T细胞转导的其他分子，例如CD2、CD5和CD28。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ链、FcγRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾、带有胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)及其组合。
在一些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包括一种或多种共刺激分子的任何部分，例如来自CD2、CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1的至少一个信号传导结构域，其任何衍生物或变体，其具有相同功能能力的任何合成序列及其任何组合。
细胞内结构域的其他实例包括来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，该分子或受体包括但不限于TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、普通FcRγ、FcRβ(FcεRIb)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12、T细胞受体(TCR)、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CDlib、ITGAX、CD11c、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其他共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段、具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列能力及其任何组合。
细胞内结构域的额外的实例包括但不限于几种类型的各种其他免疫信号传导受体的细胞内信号传导结构域，包括但不限于第一代、第二代和第三代T细胞信号传导蛋白，包括CD3、B7家族共刺激和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族受体(参见，例如，Park和Brentjens,J.Clin.Oncol.(2015)33(6):651-653)。此外，细胞内信号传导结构域可以包括由NK和NKT细胞使用的信号传导结构域(参见例如Hermanson和Kaufman,Front.Immunol.(2015)6:195)，例如NKp30(B7-H6)的信号传导结构域(参见例如，Zhang等人,J.Immunol.(2012)189(5):2290-2299)和DAP 12(参见，例如，Topfer等人,J.Immunol.(2015)194(7):3201-3212)、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10和CD3z。
CAR的细胞内信号传导结构域可以包括响应于CAR的激活(即，由抗原和二聚剂激活)提供不同信号(例如，细胞产生一种或多种细胞因子的增加；靶基因转录的变化；蛋白质活性的变化；细胞行为的变化，例如，细胞死亡；细胞增殖；细胞分化；细胞存活；细胞信号传导应答的调节等)的任何所需信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括至少一个(例如，一、二、三、四、五、六等)如下所述的ITAM基序。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域不共价附接至膜结合的CAR，而是散布在细胞质中。
细胞内信号传导结构域还可以包括含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的细胞内信号传导多肽。在一些实施方式中，ITAM基序在细胞内信号传导结构域中重复两次，其中ITAM基序的第一和第二实体彼此分开6至8个氨基酸。在一些实施方式中，对象CAR的细胞内信号传导结构域包含3个ITAM基序。
在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括人免疫球蛋白受体的信号传导结构域，其含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，例如但不限于FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5(参见，例如，Gillis等人,Front.Immunol.(2014)5:254)。
合适的细胞内信号传导结构域也可以是源自含有ITAM基序的多肽的含ITAM基序的部分。例如，合适的细胞内信号传导结构域可以是来自任何含ITAM基序的蛋白质的含ITAM基序的结构域。因此，合适的细胞内信号传导结构域不需要包含它所来源的整个蛋白质的整个序列。合适的含ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：DAP12、FCER1G(Fcε受体Iγ链)、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD3Z(CD3ζ)和CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。
在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域源自DAP12(也称为TYROBP；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX激活蛋白12；KAR相关蛋白；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；杀伤激活受体相关蛋白；杀伤激活受体-相关蛋白等)。在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域源自FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRlγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ；免疫球蛋白E受体、高亲和力、γ链等)。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原，δ亚基；CD3δ；CD3d抗原，δ多肽(TiT3复合物)；OKT3，δ链；T细胞受体T3δ链；T细胞表面糖蛋白CD3δ链等)。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G、T细胞受体T3γ链、CD3-GAMMA、T3G、γ多肽(TiT3复合物)等)。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域源自CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；ig-α；膜结合免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM相关蛋白等)。在一些实施方式中，适用于本公开内容的CAR的细胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一些实施方式中，适用于本公开内容的CAR的细胞内信号传导结构域包括ZAP70多肽。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞质信号传导结构域。在一些实施方式中，CAR中的细胞内信号传导结构域包括人CD3ζ的细胞质信号传导结构域。
虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不需要使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，该截短部分可用于替换完整链，只要它转导效应器功能信号即可。细胞内信号传导结构域包括足以转导效应器功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
本文所述的细胞内信号传导结构域可以与本文所述的任何抗原结合结构域、本文所述的任何跨膜结构域或本文所述的可包括在CAR中的任何其他结构域组合。
体内CAR T
本公开内容提供了用于在受试者体内产生或生成包含蛋白质或多肽或感兴趣的多肽的细胞的方法。在一些实施方式中，方法包括施用一种或多种工程化的病毒颗粒，例如本文提供的那些。在一些实施方式中，工程化的病毒颗粒包含工程化的包膜，其含有突变的融合蛋白、嵌合gag蛋白和用于结合靶细胞的工程化的靶向部分，其中突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和编码感兴趣的多肽的核酸。在一些实施方式中，工程化的病毒颗粒包含工程化的包膜，其含有突变的融合蛋白和用于结合靶细胞的工程化的靶向部分，其中突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和编码感兴趣的多肽的核酸分子。
在一些实施方式中，方法包括施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒。第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子。第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子。当在细胞中表达时，蛋白质或多肽的第一和第二部分结合在一起，或彼此相互作用，以在受试者的细胞中形成完整的蛋白质或多肽。
在某些实施方式中，方法进一步包含向受试者施用二聚剂以在受试者中形成蛋白质或多肽。可以使用如本文别处详细讨论的任何二聚剂。在某些实施方式中，需要施用二聚剂以形成完整的蛋白质，例如CAR。二聚剂的使用可以为体内蛋白质的方法和功能提供额外的控制层。
在某些实施方式中，蛋白质或多肽的第一部分和第二部分包含内含肽结构域并且切除内含肽结构域以连接第一和第二部分以形成完整的蛋白质或多肽。
在某些实施方式中，细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或CD8+幼稚/中央记忆细胞(CD8+CCR7+)和CD4+幼稚/中央记忆细胞(CD4+CCR7+)。在一些实施方式中，细胞是CD4+CD8+细胞。这些细胞类型不是限制性的，因为可以使用本文提供的方法和组合物生成任何类型的细胞。
在某些实施方式中，感兴趣的多肽是嵌合抗原受体(CAR)。本文提供了CAR的非限制性示例，但这些仅用于说明目的，任何类型的CAR都可以使用本文提供的组合物和方法在体内表达。
在某些实施方式中，感兴趣的多肽是血红蛋白β链。
在某些实施方式中，通过将载体注射到受试者的外周血中，将病毒载体或颗粒施用于受试者。在某些实施方式中，通过将载体注射到受试者的淋巴结中，将病毒载体或颗粒施用于受试者。
在一些实施方式中，提供了在受试者中直接产生CAR T细胞的方法，在一些实施方式中，该方法不涉及或使用T细胞的离体产生、扩增或活化。在一些实施方式中，该方法包括使用利用(a)突变的麻疹和/或(b)尼帕病毒糖蛋白假型化的慢病毒颗粒。在一些实施方式中，修饰慢病毒颗粒以使其不能感染靶细胞，而颗粒表面上也不存在特异性靶向结构域。以这种方式，转导了CD4 T细胞(使用抗CD4靶向结构域)或CD8 T细胞(使用抗CD8靶向结构域)。载体携带的转基因编码CAR。通过将载体注射到外周血中，可以在循环中转导T细胞。可选地，驻留在淋巴器官中的T细胞可以通过例如将载体直接注射到富含T细胞的器官如淋巴结中来转导。
治疗方法
本文还提供了在有需要的受试者中治疗疾病的方法。
在一些实施方式中，提供的方法包括但不限于在有需要的受试者中治疗疾病的方法，包括向受试者施用本文提供的一种或多种病毒颗粒以治疗疾病。
在某些实施方式中，疾病是癌症。此外，本文提供的组合物可用于治疗与癌症相关的任何病症的方法中，例如针对一种或多种肿瘤细胞的细胞介导的免疫应答，其中期望治疗或减轻疾病。待治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤、肉瘤、某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、恶性肿瘤例如肉瘤、癌和黑素瘤。其他示例性癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲状腺癌等等。癌症可以是非实体瘤(例如血液肿瘤)或实体瘤。成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包括在内。在一个实施方式中，癌症是血液肿瘤。在一个实施方式中，癌症是癌。在一个实施方式中，癌症是肉瘤。在一个实施方式中，癌症是白血病。在一个实施方式中，癌症是实体瘤。
实体瘤是组织的异常肿块，通常不包含囊肿或液体区域。实体瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤例如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆氏瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤、CNS肿瘤(如胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、恶性胶质瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤))、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
可以通过本文公开的方法治疗的癌包括但不限于食管癌、肝细胞癌、基底细胞癌(一种形式的皮肤癌)、鳞状细胞癌(多种组织)、膀胱癌(包括移行癌细胞癌(膀胱恶性肿瘤))、支气管癌、结肠癌、结直肠癌腺癌、胃癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肾细胞癌、导管原位癌或胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆氏瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、成骨癌、上皮癌和鼻咽癌。
在某些示例性实施方式中，本文提供的组合物可用于治疗骨髓瘤或与骨髓瘤相关的病症的方法。骨髓瘤或与其相关的病症的实例包括但不限于轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、意义不明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)、浆细胞瘤(例如，孤立性、多发性孤立性、髓外浆细胞瘤)、淀粉样变性和多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，提供了治疗多发性骨髓瘤的方法。在一些实施方式中，多发性骨髓瘤是难治性骨髓瘤。在一些实施方式中，多发性骨髓瘤是复发性骨髓瘤。
在某些示例性实施方式中，使用本文提供的载体和组合物产生的体内修饰的免疫细胞用于治疗黑素瘤或与黑素瘤相关的病症。黑素瘤或与其相关的病症的实例包括但不限于浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性雀斑样黑素瘤、肢端雀斑样黑素瘤、无黑色素型黑素瘤或皮肤黑素瘤(例如，皮肤、眼、外阴、阴道、直肠黑素瘤)。在一些实施方式中，黑素瘤是皮肤黑素瘤。在一些实施方式中，黑素瘤是难治性黑素瘤。在一些实施方式中，黑素瘤是复发性黑素瘤。
在一些实施方式中，本文提供的载体和组合物用于治疗肉瘤或与肉瘤相关的病症。肉瘤或其相关病症的实例包括但不限于血管肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、尤文氏肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、恶性外周神经鞘瘤、粘液肉瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、多形性肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤和其他软组织肉瘤。在一些实施方式中，肉瘤是滑膜肉瘤。在一些实施方式中，肉瘤是脂肪肉瘤，例如粘液样/圆形细胞脂肪肉瘤、分化/去分化脂肪肉瘤或多形性脂肪肉瘤。在一些实施方式中，肉瘤是粘液样/圆形细胞脂肪肉瘤。在一些实施方式中，肉瘤是难治性肉瘤。在一些实施方式中，肉瘤是复发性肉瘤。
在某些实施方式中，组合物和载体用于治疗镰状细胞病的方法。在一些实施方式中，将病毒载体或颗粒施用于患有镰状细胞病的受试者，其中颗粒编码血红蛋白β链。当在细胞中表达时，表达血红蛋白β链并减轻镰状细胞病的症状以治疗疾病。
在某些实施方式中，方法包括施用二聚剂以在细胞中从由多个载体编码的完整蛋白质的部分形成完整蛋白质或多肽。
在一些实施方式中，受试者在施用组合物或多种病毒载体之前已经用靶向疾病或病症，例如肿瘤的治疗剂治疗。在一些方面，受试者对其他治疗剂是难治的或无反应的。在一些实施方式中，受试者患有持续性或复发性疾病，例如，在用另一种治疗干预治疗后，所述另一种治疗干预包括化学疗法、放射疗法和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如同种异体HSCT。在一些实施方式中，尽管受试者已经对另一种疗法产生抗性，但该施用有效地治疗受试者。
在一些实施方式中，受试者对其他治疗剂有反应，并且使用治疗剂的治疗减轻了疾病负担。在一些方面，受试者最初对治疗剂有反应，但随着时间的推移表现出疾病或病症的复发。在一些实施方式中，受试者没有复发。在一些这样的实施方式中，确定受试者处于复发风险中，例如处于高复发风险中，因此预防性地施用细胞，例如以降低复发的可能性或防止复发。在一些方面，受试者之前没有接受过另一种治疗剂的治疗。
组合物的施用可以以本领域技术人员已知的任何方便的方式进行。例如，可以通过气溶胶吸入、注射、吞咽、输血、植入或移植将组合物施用于受试者。本文所述的组合物可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。在其他情况下，将组合物直接注射到受试者的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等部位。
对于疾病的防止或治疗，合适的剂量可能取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、组合物是用于预防还是治疗目的施用、先前的疗法、受试者的临床病史和对治疗的应答、以及主治医师的判断。在一些实施方式中，该组合物在一次或在一系列治疗中适当地施用于受试者。
在一些实施方式中，组合物作为联合治疗的一部分施用，例如与另一种治疗干预，例如抗体或工程化的细胞或受体或试剂，例如细胞毒剂或治疗剂，同时或以任何顺序依次施用。在一些实施方式中，一种或多种组合物与一种或多种额外的治疗剂共施用或与另一种治疗干预组合，同时或以任何顺序依次共施用。在一些情况下，组合物与另一种疗法在时间上足够接近的共施用以使组合物增强一种或多种额外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方式中，组合物在一种或多种额外的治疗剂之前施用。在一些实施方式中，组合物在一种或多种额外的治疗剂之后施用。在一些实施方式中，一种或多种额外的试剂包括细胞因子，例如IL-2，例如以增强持久性。在一些实施方式中，方法包括施用化疗剂。在一些实施方式中，方法不包括施用化疗剂。
在某些实施方式中，组合物可以与免疫检查点抗体(例如抗PDl、抗CTLA-4或抗PDLl抗体)组合施用至受试者。例如，病毒载体可以与靶向例如PD-1(程序性死亡1蛋白)的抗体或抗体片段组合施用。抗PD-1抗体的实例包括但不限于派姆单抗(pembrolizumab)(
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之前的lambrolizumab，也称为MK-3475)和纳武单抗(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、
Figure BDA0003916974310000402
)或其抗原结合片段。在某些实施方式中，组合物可以与抗PD-L1抗体或其抗原结合片段组合施用。抗PD-L1抗体的实例包括但不限于BMS-936559、MPDL3280A(
Figure BDA0003916974310000403
阿替利珠单抗)和MEDI4736(德瓦鲁单抗，Imfinzi)。在某些实施方式中，组合物可以与抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段组合施用。抗CTLA-4抗体的实例包括但不限于伊匹单抗(Ipilimumab)(商品名Yervoy)。也可以使用其他类型的免疫检查点调节剂，包括但不限于小分子、siRNA、miRNA和CRISPR系统。免疫检查点调节剂可以在病毒载体之前、之后或同时施用。在某些实施方式中，包含免疫检查点调节剂的组合治疗可以提高包含本文提供的组合物的疗法的疗效。其他治疗剂可以与本文提供的载体同时、在之前或之后施用至受试者。
在某些实施方式中，向受试者提供二次治疗。二次治疗包括但不限于化疗、放疗、手术和药物治疗。在一些实施方式中，不向受试者提供二次治疗。
在一些实施方式中，方法在没有淋巴清除步骤(例如施用环磷酰胺和/或氟达拉滨)的情况下进行。
在一些实施方式中，可以在施用载体后对受试者施用调理疗法以杀死某些未被多种载体编码的CAR转导的免疫细胞。这可以通过包括由多个载体编码的选择标志物来完成，例如在美国专利公开号201909261223中描述的。在一些实施方式中，调理疗法包括向受试者施用有效量的环磷酰胺。在一些实施方式中，调理疗法包括向受试者施用有效量的氟达拉滨。在一些实施方式中，调理疗法包括向受试者施用有效量的环磷酰胺和氟达拉滨的组合。
在一些实施方式中，本公开内容的具体给药方案包括在施用组合物后的淋巴清除步骤。在一个示例性实施方式中，淋巴清除步骤包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。
在一些实施方式中，淋巴清除步骤包括以约200mg/m2/天和约2000mg/m2/天之间的剂量(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)施用环磷酰胺。在一个示例性实施方式中，环磷酰胺的剂量为约300mg/m2/天。在一些实施方式中，淋巴清除步骤包括以约20mg/m2/天和约900mg/m2/天之间的剂量(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)施用氟达拉滨。在一个示例性实施方式中，氟达拉滨的剂量为约30mg/m2/天。
在一些实施方式中，淋巴清除步骤包括以约200mg/m2/天至约2000mg/m2/天之间的剂量(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)施用环磷酰胺，和以约20mg/m2/天和约900mg/m2/天之间的剂量(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天，或60mg/m2/天)施用氟达拉滨。在一个示例性实施方式中，淋巴清除步骤包括以约300mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺和以约30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨。
在一个示例性的实施方式中，环磷酰胺的剂量是在三天内300mg/m2/天，氟达拉滨的剂量是在三天内30mg/m2/天。
本领域已知使用CAR T细胞的不利影响之一可能是免疫激活的发作，称为细胞因子释放综合征(CRS)。CRS是导致炎症细胞因子升高的免疫激活。CRS是一种已知的中靶(on-target)毒性，其发展可能与疗效相关。临床和实验室测量范围从轻度CRS(全身症状和/或2级器官毒性)到严重CRS(sCRS；≥3级器官毒性、积极的临床干预和/或可能危及生命)。临床特征包括：高热、不适、疲劳、肌痛、恶心、厌食、心动过速/低血压、毛细血管渗漏、心功能不全、肾损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。在CAR T细胞输注后，包括干扰素-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-10和IL-6在内的细胞因子显著升高。一种CRS特征是包括IL-6(严重升高)、IFN-γ、TNF-α(中度)和IL-2(轻度)的细胞因子升高。还观察到包括铁蛋白和C反应蛋白(CRP)在内的临床可用炎症标志物的升高与CRS综合征相关。CRS的存在通常与过继转移细胞的扩增和进行性免疫激活相关。已经证明，CRS的严重程度由输注时的疾病负担规定，因为肿瘤负担高的患者会经历更多的sCRS。
因此，在一些实施方式中，方法包括在诊断出CRS之后，适当的CRS管理策略以减轻不受控制的炎症的生理症状而不削弱体内工程化的细胞(例如，CAR T细胞)的抗肿瘤功效。CRS管理策略在本领域中是已知的。例如，可以施用全身性皮质类固醇以快速逆转sCRS的症状(例如3级CRS)，而不会影响初始抗肿瘤应答。
在一些实施方式中，可以施用抗IL-6R抗体。抗IL-6R抗体的实例是美国食品药品管理局批准的单克隆抗体托珠单抗(tocilizumab)，也称为atlizumab(作为Actemra或RoActemra销售)。托珠单抗是针对白细胞介素6受体(IL-6R)的人源化单克隆抗体。托珠单抗的施用已证明CRS几乎立即逆转。
CRS通常根据观察到的综合征的严重程度进行管理，并为此量身定制干预。CRS管理决策可能基于临床体征和症状以及对干预的应答，而不仅仅基于实验室值。
轻度至中度病例通常采用利用流体疗法、非甾体抗炎药(NSAID)和抗组胺药(在需要时)的症状管理进行治疗，以充分缓解症状。更严重的病例包括有任何程度的血流动力学不稳定的患者；对于任何血流动力学不稳定性，推荐施用托珠单抗。CRS的一线管理可以是托珠单抗，在一些实施方式中，标示剂量为60分钟内8mg/kg的IV(不超过800mg/剂)；托珠单抗可重复Q8小时。如果对第一剂量的托珠单抗的应答不佳，可以考虑额外剂量的托珠单抗。托珠单抗可以单独施用或与皮质类固醇疗法联合施用。具有持续或进行性CRS症状、12-18小时内临床改善不足或对托珠单抗应答不佳的患者，可以接受大剂量皮质类固醇治疗，一般为氢化可的松100mg的IV或甲基强的松龙1-2mg/kg。在具有更严重的血流动力学不稳定或更严重的呼吸系统症状重的患者中，可在CRS病程早期向患者施用大剂量皮质类固醇疗法。CRS管理指南可能基于已发布的标准(Lee等人(2019)Biol Blood Marrow Transplant,doi.org/10.1016/j.bbmt.2018.12.758；Neelapu等人(2018)Nat Rev Clin Oncology,15:47；Teachey等人(2016)Cancer Discov,6(6):664-679)。
在利用CAR-T疗法治疗的患者中观察到与巨噬细胞激活综合征(MAS)或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)一致的特征(Henter,2007)，与CRS的临床表现一致。MAS似乎是对由CRS发生的免疫激活的反应，因此应被视为CRS的表现。MAS类似于HLH(也是对免疫刺激的反应)。MAS的临床综合征的特征在于高级别不缓解发热、影响三个谱系中至少两个谱系的血细胞减少和肝脾肿大。它与高血清铁蛋白、可溶性白介素2受体和甘油三酯以及循环自然杀伤(NK)活性降低有关。
在一些实施方式中，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文提供的任何组合物，例如一种或多种病毒颗粒。在一些实施方式中，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用由本文公开的任何一种方法生成的组合物。
药物组合物和制剂
本文公开的组合物可以包含药物组合物，例如包括药学上可接受的运载体和/或药物制剂。
术语“药物制剂”是指这样的制品，其形式使得其中所含的活性成分的生物活性是有效的，并且不包含对制剂可能施用至的受试者具有不可接受毒性的额外组分。“药学上可接受的运载体”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的运载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在一些方面，运载体的选择部分地由具体细胞和/或由施用方法决定。因此，有多种合适的制剂。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。运载体描述于例如Remington's PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.Ed.(1980年)。药学上可接受的运载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，例如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，组合物中包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及多种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Lippincott Williams&Wilkins第21版(2005年5月1日)中有更详细的描述。
制剂可以包括水溶液。制剂或组合物还可以包含多于一种活性成分，该活性成分可用于用该组合物治疗的具体适应症、疾病或病症，优选具有与组合物互补的活性的那些活性成分，其中各自的活性不会对彼此产生不利影响。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施方式中，药物组合物进一步包含其他药物活性剂或药物，例如化疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。在一些实施方式中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量的组合物，例如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方式中，治疗或预防功效通过对治疗受试者的定期评估来监测。可以通过组合物的单次推注施用、组合物的多次推注施用或组合物的连续输注施用来递送所期望的剂量。在一些实施方式中，药物组合物不包括化疗剂。
制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、经皮、肌肉内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方式中，组合物是肠胃外施用的。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方式中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身性递送将组合物施用至受试者。在一些实施方式中，组合物作为无菌液体制品提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选定的pH。液体制品通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物施用更方便一些，尤其是通过注射施用。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与具体组织的更长接触时期。液体或粘性组合物可以包含运载体，其可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将组合物并入溶剂中来制备，例如与合适的运载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。取决于期望的施用途径和制品，组合物可包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或增粘添加剂、防腐剂、调味剂和/或色素。在一些方面可以参考标准文本以准备适当的制品。
可以添加提高组合物稳定性和无菌性的多种添加剂，其包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂来确保防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸。可通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地实现，例如通过无菌过滤膜进行过滤。
在一些实施方式中，提供了以下实施方式：
1.一种工程化的病毒颗粒，其包括
i.工程化的包膜，其包含突变的融合蛋白、嵌合gag蛋白和用于结合靶细胞的工程化的靶向部分，其中所述突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和
ii.编码感兴趣的多肽的核酸。
2.根据实施方式1所述的工程化的病毒颗粒，其中所述嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
3.根据实施方式1或2所述的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒进一步包含编码SIV元件和/或Pol蛋白的核苷酸序列。
4.根据实施方式2所述的工程化的病毒颗粒，其中所述xHIV gag蛋白由如SEQ IDNO:5中叙述的核酸序列编码。
5.根据实施方式2所述的工程化的病毒颗粒，其中所述xHIV gag蛋白由如SEQ IDNO:6中叙述的核酸序列编码。
6.根据实施方式3所述的工程化的病毒颗粒，其中所述SIV元件由如SEQ ID NO:7中叙述的核酸序列编码。
7.根据实施方式3所述的工程化的病毒颗粒，其中所述Pol蛋白由如SEQ ID NO:8中叙述的核酸序列编码。
8.根据实施方式2所述的工程化的病毒颗粒，其中所述xHIV gag蛋白包含如SEQID NO:9中叙述的氨基酸序列。
9.根据实施方式3所述的工程化的病毒颗粒，其中所述Pol蛋白包含如SEQ ID NO:10中叙述的氨基酸序列。
10.根据实施方式1-9中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与所述突变的融合蛋白融合。
11.根据实施方式1-10所述的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是用麻疹病毒(MV)血凝素(HA)蛋白或MV融合(F)蛋白、尼帕F蛋白或尼帕G蛋白假型化的慢病毒，其中MV-HA蛋白或MV-F蛋白包含与其天然存在的结合结构域相比突变的结合结构域。
12.根据实施方式11所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与MV-HA蛋白、MV-F蛋白、尼帕F蛋白或尼帕G蛋白融合。
13.根据前述实施方式中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分是抗体、scFv抗体、抗原结合结构域、DARPIN、VHH结构域抗体、纳米抗体、单结构域抗体、FN3结构域或其任何组合。
14.根据前述实施方式中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分选自干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子)或结合以下的部分：cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。
15.根据前述实施方式中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述感兴趣的多肽是嵌合抗原受体(CAR)或其一部分。
16.根据实施方式15所述的工程化的病毒颗粒，其中所述嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
17.根据实施方式16所述的工程化的病毒颗粒，其中所述细胞外结构域结合CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b。
18.根据实施方式1所述的工程化的病毒颗粒，其中所述感兴趣的多肽是血红蛋白β链。
19.根据前述实施方式中任一项的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。
20.根据实施方式19所述的工程化的病毒颗粒，其中所述假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属或亨尼帕病毒属例如麻疹病毒糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。
21.根据实施方式19所述的工程化的病毒颗粒，其中所述假型化的载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。
22.一种体内基因递送的方法，其包括向需要递送的受试者施用工程化的病毒颗粒，其中所述工程化的病毒颗粒包括
i.工程化的包膜，其含有突变的融合蛋白、嵌合gag蛋白和用于结合靶细胞的工程化的靶向部分，其中所述突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和
ii.编码感兴趣的多肽的核酸，
iii.其中所述工程化的病毒颗粒的施用在与所述感兴趣的多肽相关的靶细胞中诱导体内活性。
23.根据实施方式22所述的方法，其中所述嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
24.根据实施方式22或23所述的方法，其中所述病毒颗粒进一步包含编码SIV元件和/或Pol蛋白的核苷酸序列。
25.根据实施方式23所述的方法，其中所述xHIV gag蛋白由如SEQ ID NO:5中叙述的核酸序列编码。
26.根据实施方式23所述的方法，其中所述xHIV gag蛋白由如SEQ ID NO:6中叙述的核酸序列编码。
27.根据实施方式24所述的方法，其中所述SIV元件由如SEQ ID NO:7中叙述的核酸序列编码。
28.根据实施方式24所述的方法，其中所述Pol蛋白由如SEQ ID NO:8中叙述的核酸序列编码。
29.根据实施方式23所述的方法，其中所述xHIV gag蛋白包含如SEQ ID NO:9中叙述的氨基酸序列。
30.根据实施方式24所述的方法，其中所述Pol蛋白包含如SEQ ID NO:10中叙述的氨基酸序列。
31.根据实施方式22-30中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
32.一种细胞，其包含由实施方式1-21中任一项所述的工程化的病毒颗粒编码的感兴趣的多肽。
33.根据实施方式32所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞或调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
34.一种治疗受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用实施方式1-21中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述工程化的病毒颗粒在细胞中表达感兴趣的多肽。
35.根据实施方式34所述的方法，其中所述疾病是癌症或镰状细胞病。
36.根据实施方式34或35所述的方法，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
37.一种包含第一病毒颗粒和第二病毒颗粒的病毒载体系统，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
c.)其中蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在细胞内形成完整的目的蛋白质或多肽。
38.根据实施方式23所述的病毒载体系统，其中嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
39.根据实施方式37或38所述的病毒载体系统，其中所述病毒颗粒进一步包含编码SIV元件和/或Pol蛋白的核苷酸序列。
40.根据实施方式38所述的病毒载体系统，其中所述xHIV gag蛋白由如SEQ IDNO:5中叙述的核酸序列编码。
41.根据实施方式38所述的病毒载体系统，其中所述xHIV gag蛋白由如SEQ IDNO:6中叙述的核酸序列编码。
42.根据实施方式39所述的病毒载体系统，其中所述SIV元件由如SEQ ID NO:7中叙述的核酸序列编码。
43.根据实施方式39所述的病毒载体系统，其中所述Pol蛋白由如SEQ ID NO:8中叙述的核酸序列编码。
44.根据实施方式38所述的病毒载体系统，其中所述xHIV gag蛋白包含如SEQ IDNO:9中叙述的氨基酸序列。
45.根据实施方式39所述的病毒载体系统，其中所述Pol蛋白包含如SEQ ID NO:10中叙述的氨基酸序列。
46.根据实施方式37-45中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一靶标和所述第二靶标不同。
47.根据实施方式37-45中任一项所述的病毒载体系统，其中所述感兴趣的蛋白质或多肽是嵌合抗原受体。
48.根据实施方式47所述的病毒载体系统，其中所述嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
49.根据实施方式48所述的病毒载体系统，其中所述细胞外结构域结合CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b。
50.根据实施方式37-45中任一项所述的病毒载体系统，其中所述蛋白质或多肽是血红蛋白β链。
51.根据实施方式37-50中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一靶向部分和所述第二靶向部分各自独立地选自与所述第一靶标结合的蛋白质、抗原结合结构域、DARPIN和FN3结构域，或其任何组合。
52.根据实施方式37-51中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一靶向部分和所述第二靶向部分各自独立地选自干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子))或与以下结合的部分：cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。
53.根据实施方式52所述的病毒载体系统，其中所述第一靶向部分选自干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子)或与以下结合的部分：cKit(CD117)，CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14或CD68。
54.根据实施方式52或53所述的病毒载体系统，其中所述第二靶向部分结合CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7或CXCR3。
55.根据实施方式37-51中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一靶标和所述第二靶标各自独立地选自cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。
56.根据实施方式37-55中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一靶标是cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14或CD68。
57.根据实施方式37-56中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第二靶标是CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7或CXCR3。
58.根据实施方式37-57中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一病毒载体是假型化的病毒载体。
59.根据实施方式37-58中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第二病毒载体是假型化的病毒载体。
60.根据实施方式37-59中任一项的病毒载体系统，其中所述第一病毒载体和第二病毒载体各自独立地是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。
61.根据实施方式60所述的病毒载体系统，其中所述假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属，例如麻疹病毒，糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。
62.根据实施方式60所述的病毒载体系统，其中所述第一和/或第二病毒载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。
63.根据实施方式37-62中任一项所述的病毒载体系统，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
64.根据实施方式37-63中任一项所述的病毒载体系统，其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分在二聚剂的存在下形成完整的蛋白质。
65.根据实施方式37-63中任一项所述的病毒载体系统，其中所述蛋白质或多肽是嵌合抗原受体或血红蛋白β链。
66.根据实施方式64或65所述的病毒载体系统，其中所述二聚剂是rimiducid((1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[3-({[2-(2-{3-[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羰基氧基]丙基]苯氧基}乙酰氨基)乙基]氨基甲酰基}甲氧基)苯基]丙基(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羧酸酯(AP1903))、促红细胞生成素或雷帕霉素。
67.根据实施方式37-63中任一项所述的病毒载体系统，其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分可以通过切除内含肽结构域结合在一起。
68.根据实施方式37-45中任一项所述的病毒载体系统，其中所述蛋白质的第一部分包含嵌合抗原受体的细胞外结构域，并且所述蛋白质的第二部分包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
69.一种细胞，其包含实施方式37-68中任一项所述的病毒载体系统。
70.根据实施方式69中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞或调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
71.一种体内基因递送的方法，其包括向有需要的受试者施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
c.)其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在细胞内形成完整的感兴趣的蛋白质或多肽。
72.根据实施方式71所述的方法，其中所述嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
73.根据实施方式71所述的方法，进一步包括施用二聚剂以在受试者中形成所述蛋白质或多肽。
74.根据实施方式71所述的方法，其中所述第一部分和所述第二部分包含内含肽结构域并且切除所述内含肽结构域以缀合所述第一部分和第二部分以便形成所述蛋白质或多肽。
75.根据实施方式71所述的方法，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或CD8+幼稚/中央记忆细胞(CD8+CCR7+)和CD4+幼稚/中央记忆细胞(CD4+CCR7+)。
76.根据实施方式71-75中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是嵌合抗原受体。
77.根据实施方式71-75中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是血红蛋白β链。
78.根据实施方式71-77中任一项所述的方法，其中所述第一病毒载体是假型化的病毒载体。
79.根据实施方式71-78中任一项所述的方法，其中所述第二病毒载体是假型化的病毒载体。
80.根据实施方式71-79中任一项的方法，其中所述第一病毒和第二病毒载体各自独立地是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。
81.根据实施方式80所述的方法，其中所述假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属或亨尼帕病毒属例如麻疹病毒糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。
82.根据实施方式80所述的方法，其中所述第一病毒和/或第二病毒载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。
83.一种治疗受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
c.)其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在细胞内形成完整的感兴趣的蛋白质或多肽。
84.根据实施方式83所述的方法，其中所述疾病是癌症或镰状细胞病。
85.根据实施方式83或84所述的方法，进一步包含施用二聚剂以在细胞中形成所述蛋白质或多肽。
86.根据实施方式83或84所述的方法，其中所述第一部分和所述第二部分包含内含肽结构域并且切除所述内含肽结构域以缀合所述第一部分和所述第二部分以形成所述蛋白质或多肽。
87.根据实施方式83-86中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
88.根据实施方式83-87中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是嵌合抗原受体。
89.根据实施方式83-87中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是血红蛋白β链。
90.根据实施方式83-89中任一项所述的方法，其中所述第一病毒载体是假型化的病毒载体。
91.根据实施方式83-90中任一项所述的方法，其中所述第二病毒载体是假型化的病毒载体。
92.根据实施方式83-91中任一项所述的方法，其中所述第一病毒载体和所述第二病毒载体各自独立地是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。
93.根据实施方式92所述的方法，其中所述假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属，例如麻疹病毒，糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。
94.根据实施方式93所述的方法，其中第一病毒载体和/或第二病毒载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。
95.一种工程化的病毒颗粒，其包括
工程化的包膜，其包含突变的融合蛋白和用于结合靶细胞的工程化的靶向部分，其中所述突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和编码感兴趣的多肽的核酸分子。
96.根据实施方式95所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与所述突变的融合蛋白融合。
97.根据实施方式95或96所述的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是用麻疹病毒(MV)血凝素(HA)蛋白或MV融合(F)蛋白或尼帕病毒F或G蛋白假型化的慢病毒，
a.)其中所述MV-HA蛋白、所述MV-F蛋白、所述尼帕病毒F或所述尼帕病毒G蛋白包含与其天然存在的受体相比突变的结合结构域。
98.根据实施方式97所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与所述MV-HA蛋白、所述MV-F蛋白、所述尼帕病毒F或所述尼帕病毒G蛋白融合。
99.根据实施方式95-98中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分是scFv、抗原结合结构域、DARPIN、FN3结构域、VHH或其任何组合。
100.根据实施方式95-99中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分选自干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子)或与以下结合的部分：cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。
101.根据实施方式95-100中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述感兴趣的多肽是嵌合抗原受体(CAR)或其一部分。
102.根据实施方式101所述的工程化的病毒颗粒，其中所述嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
103.根据实施方式102所述的工程化的病毒颗粒，其中所述细胞外结构域结合CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b。
104.根据实施方式95所述的工程化的病毒颗粒，其中所述感兴趣的多肽是血红蛋白β链。
105.根据实施方式95-104中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。
106.根据实施方式105所述的工程化的病毒颗粒，其中所述假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属或亨尼帕病毒属例如麻疹病毒糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。
107.根据实施方式106所述的工程化的病毒颗粒，其中所述假型化的载体用麻疹病毒属F蛋白和/或H蛋白或亨尼帕病毒属F蛋白和/或G蛋白假型化。
108.一种体内基因递送的方法，其包括向需要递送的受试者施用工程化的病毒颗粒，其中所述工程化的病毒颗粒是实施方式95-108中任一项所述的颗粒，其中所述工程化的病毒颗粒的施用诱导与感兴趣的多肽相关的靶细胞中的体内活性。
109.根据实施方式108所述的方法，其中所述靶细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞，造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
110.一种细胞，其包含由实施方式95-108中任一项所述的工程化的病毒颗粒编码的感兴趣的多肽。
111.根据实施方式110所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞或调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
112.一种治疗受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用实施方式95-108中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述工程化的病毒颗粒在细胞中表达感兴趣的多肽。
113.根据实施方式112所述的方法，其中所述疾病是癌症或镰状细胞病。
114.根据实施方式112或113所述的方法，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
115.一种工程化的病毒颗粒，其包括：
i.工程化的包膜，其包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽；
ii.用于结合靶细胞的异源多肽靶向部分；和
iii.编码感兴趣的异源多肽的核酸分子。
116.根据实施方式115所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与所述工程化的病毒颗粒表面上存在的突变的融合蛋白融合。
117.根据实施方式115所述的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是用以下假型化的慢病毒：
a)麻疹病毒(MV)血凝素(HA)蛋白和/或MV融合(F)蛋白，并且其中，MV-HA蛋白或MV-F蛋白与其天然存在的蛋白相比包含突变或突变的结合结构域；或
b)尼帕病毒F蛋白和/或尼帕病毒G蛋白，并且其中尼帕病毒F蛋白和/或尼帕病毒G蛋白与其天然存在的蛋白质相比包含突变或突变的结合结构域。
118.根据实施方式115所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与MV-HA蛋白和/或MV-F蛋白或尼帕病毒F蛋白和/或尼帕病毒G蛋白融合。
119.根据实施方式115所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分是scFv、抗原结合结构域、DARPIN、VHH或FN3结构域。
120.根据实施方式115所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分结合选自以下的蛋白质：干细胞因子蛋白(SCF、KIT配体、KL或钢因子)或与以下结合的部分：cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD3D、CD3E、CD3G、CD3Z、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。
121.根据实施方式115所述的工程化的病毒颗粒，其中所述感兴趣的异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)。
122.根据实施方式121所述的工程化的病毒颗粒，其中所述嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
123.根据实施方式122所述的工程化的病毒颗粒，其中所述细胞外结构域结合CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b。
124.根据实施方式115所述的工程化的病毒颗粒，其中所述感兴趣的异源多肽是血红蛋白β链。
125.根据实施方式115所述的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。
126.根据实施方式125所述的工程化的病毒颗粒，其中所述假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属或亨尼帕病毒属假型化。
127.根据实施方式126所述的工程化的病毒颗粒，其中所述麻疹病毒属是麻疹病毒。
128.根据实施方式126所述的工程化的病毒颗粒，其中所述亨尼帕病毒属是尼帕病毒。
129.根据实施方式125所述的工程化的病毒颗粒，其中所述假型化的慢病毒载体包含麻疹病毒属F蛋白和/或H蛋白。
130.根据实施方式129所述的工程化的病毒颗粒，其中所述麻疹病毒属F蛋白和/或H蛋白是麻疹F蛋白和/或H蛋白。
131.根据实施方式130所述的工程化的病毒颗粒，其中所述麻疹F蛋白包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列并且所述麻疹H蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
132.根据实施方式125所述的工程化的病毒颗粒，其中所述假型化的慢病毒载体包含亨尼帕病毒属F蛋白和/或G蛋白。
133.根据实施方式132所述的工程化的病毒颗粒，其中所述亨尼帕病毒属G蛋白是尼帕G蛋白并且所述亨尼帕病毒属F蛋白是尼帕F蛋白。
134.根据实施方式133所述的工程化的病毒颗粒，其中所述尼帕F蛋白包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列并且所述尼帕G蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
135.一种将编码感兴趣的异源蛋白的核酸分子递送至细胞的方法，所述方法包括将实施方式115所述的工程化的病毒颗粒与细胞接触，从而将编码所述感兴趣的异源蛋白的核酸分子递送至细胞。
136.根据实施方式135所述的方法，其中所述接触包括将实施方式1所述的工程化的病毒颗粒施用至受试者以将编码所述感兴趣的异源蛋白质的核酸分子体内递送至细胞。
137.根据实施方式135所述的方法，其中所述细胞与实施方式所述的工程化的病毒颗粒离体接触。
138.一种包含第一病毒颗粒和第二病毒颗粒的病毒载体系统，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
其中所述蛋白质或多肽的第一和第二部分能够在细胞内形成完整的感兴趣的蛋白质或多肽。
139.根据实施方式138所述的病毒载体系统，其中所述第一靶标和所述第二靶标不同。
140.根据实施方式138所述的病毒载体系统，其中所述感兴趣的蛋白质或多肽是嵌合抗原受体。
141.根据实施方式139所述的病毒载体系统，其中所述嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
142.根据实施方式141所述的病毒载体系统，其中所述细胞外结构域结合CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b。
143.根据实施方式138所述的病毒载体系统，其中所述蛋白质或多肽是血红蛋白β链。
144.根据实施方式138-143中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一靶向部分和所述第二靶向部分各自独立地选自与所述第一靶标结合的蛋白质、抗原结合结构域、DARPIN、VHH、scFV和FN3结构域，或其任何组合。
145.根据实施方式138-144中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一靶向部分和所述第二靶向部分各自独立地选自干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子))或与以下结合的部分：cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。
146.根据实施方式145所述的病毒载体系统，其中所述第一靶向部分选自干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子)或与以下结合的部分：cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14或CD68。
147.根据实施方式145或146所述的病毒载体系统，其中所述第二靶向部分结合CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7或CXCR3。
148.根据实施方式138-145中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一靶标和所述第二靶标各自独立地选自以下：cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。
149.根据实施方式138-148中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一靶标是cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14或CD68。
150.根据实施方式138-149中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第二靶标是CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7或CXCR3。
151.根据实施方式138-150中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一病毒载体是假型化的病毒载体。
152.根据实施方式138-151中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第二病毒载体是假型化的病毒载体。
153.根据实施方式138-152中任一项所述的病毒载体系统，其中所述第一病毒载体和第二病毒载体各自独立地为假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。
154.根据实施方式153所述的病毒载体系统，其中所述假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属或亨尼帕病毒属，例如麻疹病毒H蛋白或糖蛋白和/或尼帕病毒F蛋白和/或G蛋白假型化。
155.根据实施方式154所述的病毒载体系统，其中所述第一病毒载体和/或第二病毒载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。
156.根据实施方式138-155中任一项所述的病毒载体系统，其中所述细胞是T细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
157.根据实施方式138-156中任一项所述的病毒载体系统，其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分在二聚剂存在下形成完整的蛋白质。
158.根据实施方式138-157中任一项所述的病毒载体系统，其中所述蛋白质或多肽是嵌合抗原受体或血红蛋白β链。
159.根据实施方式157或158所述的病毒载体系统，其中所述二聚剂是rimiducid((1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[3-({[2-(2-{3-[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羰基氧基]丙基]苯氧基}乙酰氨基)乙基]氨基甲酰基}甲氧基)苯基]丙基(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羧酸酯(AP1903))、促红细胞生成素或雷帕霉素。
160.根据实施方式138-156中任一项所述的病毒载体系统，其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分可以通过切除内含肽结构域结合在一起。
161.根据实施方式138所述的病毒载体系统，其中所述蛋白质的第一部分包含嵌合抗原受体的细胞外结构域，并且所述蛋白质的第二部分包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
162.一种细胞，其包含编码嵌合抗原受体的第一部分的第一核酸分子和编码嵌合抗原受体的第二部分的第二核酸分子，其中在存在二聚剂或二聚化结构域的情况下，所述嵌合抗原受体的第一部分和所述嵌合抗原受体的第二部分能够相互结合以形成完整的嵌合抗原受体。
163.根据实施方式162的细胞，其中所述二聚剂是rimiducid((1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[3-({[2-(2-{3-[(1R)-)3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羰基氧基]丙基]苯氧基}乙酰氨基)乙基]氨基甲酰基}甲氧基)苯基]丙基(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羧酸酯(AP1903))、促红细胞生成素或雷帕霉素。
164.根据实施方式163所述的细胞，其中所述二聚化结构域是内含肽结构域。
165.一种细胞，其包含编码蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子和编码蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分可以结合在一起形成完整的蛋白质或多肽。
166.根据实施方式165所述的细胞，其中所述蛋白质或多肽是血红蛋白β链。
167.根据实施方式165所述的细胞，其中所述蛋白质或多肽是异源嵌合抗原受体，其中所述异源嵌合抗原嵌合受体包含所述嵌合抗原受体的第一部分和所述嵌合抗原受体的第二部分，其中所述第一部分和第二部分通过二聚剂或二聚化结构域例如内含肽结构域，彼此结合以形成所述嵌合抗原受体。
168.根据实施方式165-167中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞或调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
169.一种体内或离体基因递送方法，其包括向需要递送的受试者施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在细胞内形成完整的蛋白质或多肽。
170.根据实施方式169所述的方法，其进一步包括施用二聚剂以在所述受试者中形成所述蛋白质或多肽。
171.根据实施方式169所述的方法，其中所述第一部分和第二部分包含内含肽结构域并且切除所述内含肽结构域以缀合所述第一部分和第二部分以形成所述蛋白质或多肽。
172.根据实施方式169所述的方法，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或CD8+幼稚/中央记忆细胞(CD8+CCR7+)和CD4+幼稚/中央记忆细胞(CD4+CCR7+)。
173.根据实施方式169-172中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是嵌合抗原受体。
174.根据实施方式169-172中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是血红蛋白β链。
175.根据实施方式169-174中任一项所述的方法，其中所述第一病毒载体是假型化的病毒载体。
176.根据实施方式169-175中任一项所述的方法，其中所述第二病毒载体是假型化的病毒载体。
177.根据实施方式169-176中任一项所述的方法，其中所述第一病毒载体和第二病毒载体各自独立地是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。
178.根据实施方式177的方法，其中所述假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属或亨尼帕病毒属，例如麻疹病毒糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。
179.根据实施方式178的方法，其中所述第一病毒和/或第二病毒载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白或亨尼帕病毒属F蛋白或G蛋白假型化。
180.一种治疗受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在细胞中形成完整的蛋白质或多肽以治疗疾病。
181.根据实施方式180所述的方法，其中所述疾病是癌症或镰状细胞病。
182.根据实施方式180或181所述的方法，其进一步包含施用二聚剂以在细胞中形成所述蛋白质或多肽。
183.根据实施方式180-182中任一项所述的方法，其中所述第一部分和所述第二部分包含内含肽结构域并且切除所述内含肽结构域以缀合所述第一部分和第二部分以形成所述蛋白质或多肽。
184.根据实施方式180-183中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
185.根据实施方式180-184中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是嵌合抗原受体。
186.根据实施方式180-184中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是血红蛋白β链。
187.根据实施方式180-186中任一项所述的方法，其中所述第一病毒载体是假型化的病毒载体。
188.根据实施方式180-187中任一项所述的方法，其中所述第二病毒载体是假型化的病毒载体。
189.根据实施方式180-188中任一项所述的方法，其中所述第一病毒载体和第二病毒载体各自独立地是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。
190.根据实施方式189所述的方法，其中所述假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属，例如麻疹病毒，糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。
191.根据实施方式190所述的方法，其中所述第一病毒载体和/或第二病毒载体用麻疹病毒属F蛋白和/或H蛋白或亨尼帕病毒属F蛋白和/或G蛋白假型化。
本文提及或引用的文章、专利和专利申请以及所有其他文件和电子可用信息的内容在此通过引用以其整体并入，其程度与每个单独的出版物被具体和单独地表明被通过引用并入的程度相同。申请人保留将来自任何此类文章、专利、专利申请或其他物理和电子文档的任何和所有材料和信息物理上并入到本申请中的权利。
尽管已经参考其具体实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行多种改变并且可以以等效物替换。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本文所公开的实施方式的范围的情况下，可以使用合适的等效物对本文所述的方法进行其他合适的修改和改写。此外，可以进行许多修改以使具体情况、材料、物质组成、工艺、工艺步骤或步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都旨在落入所附权利要求的范围内。现在已经详细描述了某些实施方式，通过参考以下实施例将更清楚地理解相同的实施方式，这些实施方式仅出于说明的目的而被包括在内，并不旨在是限制性的。
实施例
现在参考以下实施例描述实施方式。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且实施方式不限于这些实施例，而是涵盖由于本文提供的教导而显而易见的所有变化。
实施例1
含有嵌合Gag的假型化的病毒载体系统
本公开内容部分基于以下发现：用来自SIV的嵌合gag蛋白xHIV gag蛋白取代在标准假型化的慢病毒载体中发现的HIV gag蛋白，提高了转导效率。
改善的麻疹病毒(MV)-假型化的慢病毒载体和病毒载体系统通过将HIV gag-pol序列(图1A中所示)替换为如SEQ ID NO:5中叙述的编码xHIV的序列而在本文中生成，SEQID NO:5中叙述的序列包含xHIV gag蛋白，其是来自SIV和HIV的嵌合gag蛋白(图1B)(Uchida等人J.Virol,Oct.2009,p.9854-9862；Pavlakis,US8076100B2)(图1A-1B)。由多核苷酸序列编码的xHIV gag蛋白是SEQ ID NO:9的蛋白。
用含有HIV gag-pol和截短的NGFR(gag-pol NGFR MV)(图2A和图2C)的假型化的病毒载体系统或含有嵌合xHIV和截短的NGFR(xHIV NGFR MV)(图2B和图2D)的假型化的病毒载体系统转导活化的PBMC。结果表明，在第4天，与含有HIV gag-pol(gag-pol NGFR MV)(图2A和2B)的载体系统相比，当使用含有嵌合xHIV(xHIV NGFR MV)的假型化的病毒载体系统时，CD4+的转导率更高。此外，xHIV载体表现出更高的转导效率(图2C和2D)。
从其中用gag-pol GFP MV(图3A和图3C)或xHIV GFP MV(图3B和图3D)转导活化的PBMC的实验获得了类似的结果。第4天的结果显示含有嵌合gag的载体的效力增加了3倍(图3A-3D)。
用含有靶向CD19(CAR-19)的嵌合抗原受体的假型化的载体转导活化的PBMC，该嵌合抗原受体使用HIV gag-pol(gag-pol CAR-19 MV)(图4A和图4C)或嵌合gag(xHIV CAR-19MV)(图4B和图4D)包装。同样，使用含有嵌合gag的载体提高了转导效率(图4A-4B)，并且需要的病毒减少了4-5倍(图4C-4D)。
第12天的结果也证明了在含有嵌合gag的载体(图5A-5D、图6A-6D和图7A-7D)中的转导效率增加，其中更高的稀释度显示出更大的差异(图5B、图5D、图6B和图6D)。重要的是，使用含有CAR-19和嵌合gag的假型化的载体证明了第12天转导效率的提高(图7A-7D)，同时需要的体积减少了10倍(图7C和图7D)。
在本发明之前，将基因转移到T细胞中用于癌症疗法的现有技术包括范围从病毒(例如慢病毒转导)到非病毒方法(例如转座子质粒的电穿孔)的多种离体方法。由于CAR T细胞的抗肿瘤作用取决于其增殖的能力，因此转基因的稳定整合至关重要。基因递送中常用的慢病毒(LV)通常(i)缺乏亲代HIV的致病特征；(ii)缺乏生成进一步感染性颗粒的能力，和(iii)稳定感染多种细胞(通过用来自水疱性口炎病毒的G糖蛋白替代HIV包膜蛋白；VSVG)。细胞对VSVG假型化的LV感染的易感性需要LDL受体的表达。虽然活化的T细胞表达LDL受体，但静息淋巴细胞不表达，并因此对用标准VSVG假型化的LV载体的转导具有抗性。因此，迄今为止，已经离体进行了T细胞的遗传修饰，因为(i)只有感兴趣的细胞暴露于病毒，从而提高了安全性并减少了所需的病毒颗粒的数量，以及(ii)T细胞可以使用抗CD3/CD28珠子或类似技术离体激活，以便增强LDL受体的表达并改善转导。
患者和医生面临的主要挑战之一是离体制造过程的持续时间，其至少7天，而且通常要长得多。限制访问、增加治疗时间和生成成本的其他后勤问题包括单采血成分法的可用性、制造时的GMP套件可用性以及因此被视为新批次的每个产品的发行测试。
如本文所公开的，所有这些问题都可以通过在使用具体、有效的病毒系统的患者中全身性施用后体内转导T细胞来规避。考虑到这种病毒系统具有以下特征：(i)病毒颗粒能够特异性转导感兴趣的靶细胞，(ii)转导效率足够高以导致足够数量的T细胞在体内施用后携带转基因，和(iii)转导的细胞是有功能的。
为了促进体内基因转移，病毒颗粒被工程化为结合用于细胞进入选择的细胞表面标志物，而不是它们的天然受体。病毒颗粒表达靶向配体，例如单链可变片段(scFv)，以实现与靶细胞表面的特异性结合。例如，LV用麻疹病毒血凝素(HA)和融合(F)蛋白进行假型化，这些蛋白被突变以防止与其天然受体CD46和SLAM结合。然后为了赋予MV假型化的LV特异性，HA基因被修饰以表达靶向结构域，例如针对CD8或CD4的scFV。此外，在假型化的慢病毒载体中编码HIV gag蛋白的序列被嵌合SIV Gag蛋白xHIV取代。将嵌合gag并入假型化的慢病毒载体中出人意料地导致提高了转导效率而不损失特异性。
实施例2
基于促红细胞生成素受体(EpoR)的结合和信号传导部件
图解本公开内容的信号传导复合物的另一个实施方式的示意图在图8A和8B中示出，其中EpoR信号传导(例如，通过来自慢病毒载体1(LV1)的转基因1编码的EpoR4-1BB-CD3ζ(BBz)内域)和EpoR结合(例如，通过来自慢病毒载体2(LV2)的转基因2编码的CAR-EpoR外域)部件在细胞(例如T细胞)中每个使用不同的慢病毒载体(图8A)单独表达。该示例性的基于EPOR的系统将CAR的抗原识别(例如，scFV CAR 19)和信号传导功能分开成两个不同的多肽，其包含EpoR的二聚化结构域，所述二聚化结构域在二聚剂EPO存在下二聚化以提供信号传导活性(图8B)。CAR-EpoR外域的表达在图9中示出，并且EpoR BBz内域的表达在图10中示出。
这样的裂解载体应用可以被定制，使得外域载体具有与细胞上的第一靶标(例如，CD8)结合的第一靶向部分，而内域载体具有与细胞上第二靶标(例如，CCR7)结合的第二靶向部分，反之亦然。在图11中图解的这种概念的示意图中，只有CD8+CCR7+细胞可以同时包含外域和内域，它们可以经由CAR和施用EPO来活化。
实施例3
人源化小鼠血液或肝脏中人CD4细胞的特异性转导。
人源化小鼠被注射了麻疹病毒(MV-CD4)慢病毒载体(该载体靶向CD4细胞并包含GFP报道基因)、水泡性口炎病毒G蛋白(VSVG)慢病毒载体或PBS。在IV施用后7天，提取血液并使用流式细胞仪进行分析。如图12所提供的数据显示了用MC-CD4载体特异性转导人源化小鼠血液中的人CD4细胞。
在同一实验中，在IV施用MV-CD4、VSVG或PBS后7天提取肝脏，切片并进行免疫组织化学染色。如图13所提供的数据显示了在注射PBS的动物中未显示针对CD4和GFP的阳性染色，在注射VSVG慢病毒载体的动物中库普弗细胞的染色，和在注射MV-CD4的动物的肝实质中的淋巴岛的染色。库普弗细胞是肝脏的常驻巨噬细胞，也是VSVG假型化的慢病毒载体的主要靶标。注射MV-CD4的动物的肝实质中淋巴滤泡的阳性染色显示人源化小鼠肝脏中人CD4细胞的特异性转导。
实施例4
人源化小鼠腹膜中人CD4细胞的特异性转导。
人源化小鼠被注射了包含NGFR报道基因的MV-CD4慢病毒载体、VSVG慢病毒载体或PBS。在IV施用MV-CD4、VSVG或PBS后7天通过灌洗回收腹膜细胞，并进行流式细胞术。如图14所提供的数据显示了来自腹膜腔的人细胞中NGFR的表达。因此，人源化小鼠的CD4+T细胞显示出用MV-CD4的特异性转导。
实施例5
静息(非活化的)恒河猴CD4细胞的体外特异性转导。
用包含NGFR报道基因的MV慢病毒、尼帕慢病毒载体(NV)、VSVG慢病毒载体或PBS转导恒河猴的PBMC。在转导后四天，对静息的NHP T细胞进行流式细胞术。如图15所提供的数据显示了NGFR和CD4在用MV或NV转导的细胞中的表达，而非VSVG或在未转导的细胞中的表达。因此，用MV或NV转导的静息NHP T细胞表达CD4。
实施例6
用MV抗CD8 DARPIN载体转导的受刺激的人类T细胞显示出高效且特异性的转基因表达。
使用抗CD3/CD28珠子刺激，用使用xHIV gag制成的MV假型化的抗CD8 DARPIN重定向载体转导，并用IL7和IL15活化人T细胞。在第11天对细胞进行流式细胞术。如图16所提供的数据显示了在病毒载体的3倍稀释度下的预期蛋白质表达谱，其中示例性图在图17中显示。因此，用MV抗CD8 DARPIN载体转导的受刺激的人T细胞显示出高效且特异性的转基因表达。
实施例7
抗CD19 CAR MV-CD4、抗CD19 CAR NiV-CD4和抗CD20 CAR NiV-CD4载体具有功能。
响应于抗CD20或抗CD19 BBz CAR20(VSVG)或抗CD20或抗CD19 KIR MV或NV系统，在Raji或Ramos CD19+CD20+淋巴瘤细胞系中评估脱粒。使用流式细胞术通过计算CD4+细胞群中CD107a+细胞的百分比来测量脱粒。如图18所提供的数据显示了在暴露于两种细胞系时，用VSVG、抗CD19 CAR MV-CD4、抗CD19 CAR NiV-CD4或抗CD20 CAR NiV-CD4转导的T细胞的特异性脱粒，但未用抗CD20-MV-CD4。因此，抗CD19 CAR MV-CD4、抗CD19 CAR NiV-CD4和抗CD20 CAR NiV-CD4载体增加CD4+细胞的脱粒。
实施例8
抗CD20 KIR CAR MV具有功能，尽管其动力学比抗CD20 BBz CAR20(VSVG)慢。
用KIR CAR20以17％的效率转导的T细胞与表达荧光素酶的Z138淋巴瘤细胞以5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1、0.3125:1、0.15625:1或0.0781:1的E:T比率进行温育。在转导后48小时评估细胞毒性，并将其定义为萤光素酶活性的降低，并在图19中显示。用KIR CAR20系统转导的T细胞需要比标准BBz共刺激的CAR系统更高的E:T比率来诱导特异性裂解。因此，与标准BBz CAR系统相比，用KIRCAR20系统转导的T细胞是有功能的，但诱导的立即杀伤(prompt killing)较弱。
实施例9
用包含IL15/IL15R表达盒的病毒转导的细胞显示出改善的增殖。
通过分析细胞浓度来测量用并入了IL15/IL15R表达盒的病毒转导的静息人T细胞的增殖，并在图20中显示。与对照相比，用并入IL15/IL15R表达的病毒转导的细胞显示出转导以表达细胞因子应答盒的细胞扩增高10倍。因此，用包含细胞因子应答盒的病毒转导的细胞显示出改善的增殖。
实施例10
MV假型化的慢病毒载体转导CD8和CD3e细胞。
人T细胞用珠子激活并暴露于靶向MV假型化的慢病毒载体的CD8或CD3e。流式细胞术数据显示NGFR和CD8或NGFR和CD3e的表达。因此，MV假型化的慢病毒载体靶向CD8和CD3e细胞。
实施例11
基于MV的转导在体内具有高度特异性和有效性。
将人PBMC(10E6)移植到NSG小鼠中，并用2.5×106TU的CD4特异性MV载体或VSVG载体腹膜内注射。在施用病毒后2天或7天处死小鼠。在腹膜、脾脏、血液和骨髓中测量转导。与VSVG对照相比，注射了MV载体的小鼠在所有分析的组织或细胞中都显示出靶标转导。因此，基于MV的转导在体内具有高度特异性和有效性。
实施例12
基本CAR架构的结构修饰显著改善了转导。
CD4+细胞用下列转导：“标准”CAR，其包含scFv、CD8铰链、TM CD8、4-1BB和CD3ζ结构域；“修饰的1”CAR，其包含scFv、NGFR茎、NGFR跨膜、4-1BB和CD3ζ结构域；或“修饰的2”CAR，其包含scFv、NGFR Cys结构域、NGFR茎、NGFR跨膜、4-1BB和CD3ζ结构域。测量转导，并与标准CAR相比，显示用修饰的1和修饰的2的CAR构建体转导的细胞增加。因此，基本CAR架构的结构修饰显著改善了转导。
实施例13
基于尼帕的CAR-T细胞显示出与基于VSVG的CAR-T细胞相似的活性。
用VSVG载体或尼帕CAR载体转导细胞。通过流式细胞术测量CD107、GM-CSF或IFN-γ的表达。与VSVG转导的细胞相比，用尼帕CAR载体转导的细胞显示出所有3种标志物的相似表达模式。因此，基于尼帕的CAR-T细胞显示出与基于VSVG的CAR-T细胞相似的活性。
实施例14
用质粒A加B或质粒C(对照)转染HEK293细胞以产生NiV或VSV-G假型化的病毒。48小时后通过流式细胞术分析GFP、BFP和mScarlet(RFP)的表达。质粒A加质粒B(即剪接载体系统)的共表达通过由表达多肽中存在的内含肽介导的蛋白质剪接重建了mScarlet表达。还显示了细胞表达GFP和BFP。流式细胞术表明产生了mScarlet，这证明了用两种病毒载体转染了相同的细胞，并且内含肽发挥了产生mScarlet的作用。
其他实施方式
本文对变量的任何定义中的要素列举的引用包括将该变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或子组合)。本文对实施方式的叙述包括作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分组合的实施方式。
本文引用的每项专利、专利申请和出版物的公开内容均在此通过引用以其整体并入。虽然本发明已经参照特定实施方式进行了公开，但显然本领域的其他技术人员可以设计出本发明的其他实施方式和变化而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等效变体。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学董事会
S·吉尔
<120> 使用工程化的病毒颗粒进行基因递送的方法和组合物
<130> 046483-7300WO1(02530)
<150> 美国临时申请号 62/988,074
<151> 2020-03-11
<150> 美国临时申请号 62/988,195
<151> 2020-03-11
<150> 美国临时申请号 63/080,501
<151> 2020-09-18
<160> 16
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复n次，其中n=至少1或1-5的整数
<400> 1
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(4)
<223> 重复n次，其中n=至少1或1-5的整数
<400> 2
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复n次，其中n=至少1或1-5的整数
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser
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<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复n次，其中n=至少1或1-5的整数
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 5
<211> 4301
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> xHIV gag-pol
<400> 5
atgggtgcga gagcgtcggt attaagcggg ggagaattag ataaatggga aaaaattcgg 60
ttaaggccag ggggaaagaa acaatataaa ctaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120
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gatgaacaaa tccagtggat gtacagacaa cagaacccca taccagtagg caacatttac 780
aggagatgga tccaactggg gttgcaaaaa tgtgtcagaa tgtataaccc aacaaacatt 840
ctagatgtaa aacaagggcc aaaagagcca tttcagagct atgtagacag gttctacaaa 900
agtttaagag cagaacagac agatgcagca gtaaagaatt ggatgactca aacactgctg 960
attcaaaatg ctaacccaga ttgcaagcta gtgctgaagg ggttgggacc aggagcgaca 1020
ctagaagaaa tgatgacagc atgtcaggga gtggggggac ccggccataa agcaagagtt 1080
ttggctgaag caatgagcca agtaacaaat ccagctacca taatgataca gaaaggcaat 1140
tttaggaacc aaagaaagac tgttaagtgt ttcaattgtg gcaaagaagg gcacatagcc 1200
aaaaattgca gggcccctag gaaaaagggc tgttggaaat gtggaaagga aggacaccaa 1260
atgaaagatt gtactgagag acaggctaat tttttaggga agatctggcc ttcccacaag 1320
ggaaggccag ggaattttct tcagagcaga ccagagccaa cagccccacc agaagagagc 1380
ttcaggtttg gggaagagac aacaactccc tctcagaagc aggagccgat agacaaggaa 1440
ctgtatcctt tagcttccct cagatcactc tttggcagcg acccctcgtc acaataaaga 1500
taggggggca attaaaggaa gctctattag atacaggagc agatgataca gtattagaag 1560
aaatgaattt gccaggaaga tggaaaccaa aaatgatagg gggaattgga ggttttatca 1620
aagtaagaca gtatgatcag atactcatag aaatctgcgg acataaagct ataggtacag 1680
tattagtagg acctacacct gtcaacataa ttggaagaaa tctgttgact cagattggct 1740
gcactttaaa ttttcccatt agtcctattg agactgtacc agtaaaatta aagccaggaa 1800
tggatggccc aaaagttaaa caatggccat tgacagaaga aaaaataaaa gcattagtag 1860
aaatttgtac agaaatggaa aaggaaggaa aaatttcaaa aattgggcct gaaaatccat 1920
acaatactcc agtatttgcc ataaagaaaa aagacagtac taaatggaga aaattagtag 1980
atttcagaga acttaataag agaactcaag atttctggga agttcaatta ggaataccac 2040
atcctgcagg gttaaaacag aaaaaatcag taacagtact ggatgtgggc gatgcatatt 2100
tttcagttcc cttagataaa gacttcagga agtatactgc atttaccata cctagtataa 2160
acaatgagac accagggatt agatatcagt acaatgtgct tccacaggga tggaaaggat 2220
caccagcaat attccagtgt agcatgacaa aaatcttaga gccttttaga aaacaaaatc 2280
cagacatagt catctatcaa tacatggatg atttgtatgt aggatctgac ttagaaatag 2340
ggcagcatag aacaaaaata gaggaactga gacaacatct gttgaggtgg ggatttacca 2400
caccagacaa aaaacatcag aaagaacctc cattcctttg gatgggttat gaactccatc 2460
ctgataaatg gacagtacag cctatagtgc tgccagaaaa ggacagctgg actgtcaatg 2520
acatacagaa attagtggga aaattgaatt gggcaagtca gatttatgca gggattaaag 2580
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cagaagaagc agagctagaa ctggcagaaa acagggagat tctaaaagaa ccggtacatg 2700
gagtgtatta tgacccatca aaagacttaa tagcagaaat acagaagcag gggcaaggcc 2760
aatggacata tcaaatttat caagagccat ttaaaaatct gaaaacagga aagtatgcaa 2820
gaatgaaggg tgcccacact aatgatgtga aacaattaac agaggcagta caaaaaatag 2880
ccacagaaag catagtaata tggggaaaga ctcctaaatt taaattaccc atacaaaagg 2940
aaacatggga agcatggtgg acagagtatt ggcaagccac ctggattcct gagtgggagt 3000
ttgtcaatac ccctccctta gtgaagttat ggtaccagtt agagaaagaa cccataatag 3060
gagcagaaac tttctatgta gatggggcag ccaataggga aactaaatta ggaaaagcag 3120
gatatgtaac tgacagagga agacaaaaag ttgtccccct aacggacaca acaaatcaga 3180
agactgagtt acaagcaatt catctagctt tgcaggattc gggattagaa gtaaacatag 3240
tgacagactc acaatatgca ttgggaatca ttcaagcaca accagataag agtgaatcag 3300
agttagtcag tcaaataata gagcagttaa taaaaaagga aaaagtctac ctggcatggg 3360
taccagcaca caaaggaatt ggaggaaatg aacaagtaga taaattggtc agtgctggaa 3420
tcaggaaagt actattttta gatggaatag ataaggccca agaagaacat gagaaatatc 3480
acagtaattg gagagcaatg gctagtgatt ttaacctacc acctgtagta gcaaaagaaa 3540
tagtagccag ctgtgataaa tgtcagctaa aaggggaagc catgcatgga caagtagact 3600
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cagttcatgt agccagtgga tatatagaag cagaagtaat tccagcagag acagggcaag 3720
aaacagcata cttcctctta aaattagcag gaagatggcc agtaaaaaca gtacatacag 3780
acaatggcag caatttcacc agtactacag ttaaggccgc ctgttggtgg gcggggatca 3840
agcaggaatt tggcattccc tacaatcccc aaagtcaagg agtaatagaa tctatgaata 3900
aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa gagatcaggc tgaacatctt aagacagcag 3960
tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg 4020
caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac 4080
aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttgga 4140
aaggaccagc aaagctcctc tggaaaggtg aaggggcagt agtaatacaa gataatagtg 4200
acataaaagt agtgccaaga agaaaagcaa agatcatcag ggattatgga aaacagatgg 4260
caggtgatga ttgtgtggca agtagacagg atgaggatta a 4301
<210> 6
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-3' xHIV gag 蛋白质 nt
<400> 6
atgggtgcga gagcgtcggt attaagcggg ggagaattag ataaatggga aaaaattcgg 60
ttaaggccag ggggaaagaa acaatataaa ctaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120
ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctt ttagagacat cagaaggctg tagacaaata 180
ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240
acaatagcag tcctctattg tgtgcatcaa aggatagatg taaaagacac taaggaagcc 300
ttagataaga tagaggaaga acaaaacaaa agtaagaaaa aggcacagca agcagcagct 360
gacacaggaa acaacagcca ggtcagccaa aattacccag tacaacaaat aggtggtaac 420
tatgtccacc tgccattaag cccgagaaca ttaaatgcct gggtaaaatt gatagaggaa 480
aagaaatttg gagcagaagt agtgccagga tttcaggcac tgtcagaagg ttgcaccccc 540
tatgacatta atcagatgtt aaattgtgtg ggagaccatc aagcggctat gcagattatc 600
agagatatta taaacgagga ggttgcagat tgggacttgc agcacccaca accagctcca 660
caacaaggac aacttaggga gccgtcagga tcagatattg caggaacaac tagttcagta 720
gatgaacaaa tccagtggat gtacagacaa cagaacccca taccagtagg caacatttac 780
aggagatgga tccaactggg gttgcaaaaa tgtgtcagaa tgtataaccc aacaaacatt 840
ctagatgtaa aacaagggcc aaaagagcca tttcagagct atgtagacag gttctacaaa 900
agtttaagag cagaacagac agatgcagca gtaaagaatt ggatgactca aacactgctg 960
attcaaaatg ctaacccaga ttgcaagcta gtgctgaagg ggttgggacc aggagcgaca 1020
ctagaagaaa tgatgacagc atgtcaggga gtggggggac ccggccataa agcaagagtt 1080
ttggctgaag caatgagcca agtaacaaat ccagctacca taatgataca gaaaggcaat 1140
tttaggaacc aaagaaagac tgttaagtgt ttcaattgtg gcaaagaagg gcacatagcc 1200
aaaaattgca gggcccctag gaaaaagggc tgttggaaat gtggaaagga aggacaccaa 1260
atgaaagatt gtactgagag acaggctaat tttttaggga agatctggcc ttcccacaag 1320
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ttcaggtttg gggaagagac aacaactccc tctcagaagc aggagccgat agacaaggaa 1440
ctgtatcctt tagcttccct cagatcactc tttggcagcg acccctcgtc acaataa 1497
<210> 7
<211> 619
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-3' xHIV SIV 元件 nt
<400> 7
aaaattaccc agtacaacaa ataggtggta actatgtcca cctgccatta agcccgagaa 60
cattaaatgc ctgggtaaaa ttgatagagg aaaagaaatt tggagcagaa gtagtgccag 120
gatttcaggc actgtcagaa ggttgcaccc cctatgacat taatcagatg ttaaattgtg 180
tgggagacca tcaagcggct atgcagatta tcagagatat tataaacgag gaggttgcag 240
attgggactt gcagcaccca caaccagctc cacaacaagg acaacttagg gagccgtcag 300
gatcagatat tgcaggaaca actagttcag tagatgaaca aatccagtgg atgtacagac 360
aacagaaccc cataccagta ggcaacattt acaggagatg gatccaactg gggttgcaaa 420
aatgtgtcag aatgtataac ccaacaaaca ttctagatgt aaaacaaggg ccaaaagagc 480
catttcagag ctatgtagac aggttctaca aaagtttaag agcagaacag acagatgcag 540
cagtaaagaa ttggatgact caaacactgc tgattcaaaa tgctaaccca gattgcaagc 600
tagtgctgaa ggggttggg 619
<210> 8
<211> 3011
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-3' xHIV Pol 蛋白质 nt
<400> 8
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ccagagccaa cagccccacc agaagagagc ttcaggtttg gggaagagac aacaactccc 120
tctcagaagc aggagccgat agacaaggaa ctgtatcctt tagcttccct cagatcactc 180
tttggcagcg acccctcgtc acaataaaga taggggggca attaaaggaa gctctattag 240
atacaggagc agatgataca gtattagaag aaatgaattt gccaggaaga tggaaaccaa 300
aaatgatagg gggaattgga ggttttatca aagtaagaca gtatgatcag atactcatag 360
aaatctgcgg acataaagct ataggtacag tattagtagg acctacacct gtcaacataa 420
ttggaagaaa tctgttgact cagattggct gcactttaaa ttttcccatt agtcctattg 480
agactgtacc agtaaaatta aagccaggaa tggatggccc aaaagttaaa caatggccat 540
tgacagaaga aaaaataaaa gcattagtag aaatttgtac agaaatggaa aaggaaggaa 600
aaatttcaaa aattgggcct gaaaatccat acaatactcc agtatttgcc ataaagaaaa 660
aagacagtac taaatggaga aaattagtag atttcagaga acttaataag agaactcaag 720
atttctggga agttcaatta ggaataccac atcctgcagg gttaaaacag aaaaaatcag 780
taacagtact ggatgtgggc gatgcatatt tttcagttcc cttagataaa gacttcagga 840
agtatactgc atttaccata cctagtataa acaatgagac accagggatt agatatcagt 900
acaatgtgct tccacaggga tggaaaggat caccagcaat attccagtgt agcatgacaa 960
aaatcttaga gccttttaga aaacaaaatc cagacatagt catctatcaa tacatggatg 1020
atttgtatgt aggatctgac ttagaaatag ggcagcatag aacaaaaata gaggaactga 1080
gacaacatct gttgaggtgg ggatttacca caccagacaa aaaacatcag aaagaacctc 1140
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gggcaagtca gatttatgca gggattaaag taaggcaatt atgtaaactt cttaggggaa 1320
ccaaagcact aacagaagta gtaccactaa cagaagaagc agagctagaa ctggcagaaa 1380
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tagcagaaat acagaagcag gggcaaggcc aatggacata tcaaatttat caagagccat 1500
ttaaaaatct gaaaacagga aagtatgcaa gaatgaaggg tgcccacact aatgatgtga 1560
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aacaagtaga taaattggtc agtgctggaa tcaggaaagt actattttta gatggaatag 2160
ataaggccca agaagaacat gagaaatatc acagtaattg gagagcaatg gctagtgatt 2220
ttaacctacc acctgtagta gcaaaagaaa tagtagccag ctgtgataaa tgtcagctaa 2280
aaggggaagc catgcatgga caagtagact gtagcccagg aatatggcag ctagattgta 2340
cacatttaga aggaaaagtt atcttggtag cagttcatgt agccagtgga tatatagaag 2400
cagaagtaat tccagcagag acagggcaag aaacagcata cttcctctta aaattagcag 2460
gaagatggcc agtaaaaaca gtacatacag acaatggcag caatttcacc agtactacag 2520
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aaagtcaagg agtaatagaa tctatgaata aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa 2640
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aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa 2760
cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt 2820
attacaggga cagcagagat ccagtttgga aaggaccagc aaagctcctc tggaaaggtg 2880
aaggggcagt agtaatacaa gataatagtg acataaaagt agtgccaaga agaaaagcaa 2940
agatcatcag ggattatgga aaacagatgg caggtgatga ttgtgtggca agtagacagg 3000
atgaggatta a 3011
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<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gag 蛋白质
<400> 9
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Lys Trp
1 5 10 15
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Gln Tyr Lys Leu Lys
20 25 30
His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro
35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu
50 55 60
Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Thr Ile Ala Val Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Asp Val Lys Asp
85 90 95
Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys
100 105 110
Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly Asn Asn Ser Gln Val
115 120 125
Ser Gln Asn Tyr Pro Val Gln Gln Ile Gly Gly Asn Tyr Val His Leu
130 135 140
Pro Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu Ile Glu Glu
145 150 155 160
Lys Lys Phe Gly Ala Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser Glu
165 170 175
Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Cys Val Gly Asp
180 185 190
His Gln Ala Ala Met Gln Ile Ile Arg Asp Ile Ile Asn Glu Glu Val
195 200 205
Ala Asp Trp Asp Leu Gln His Pro Gln Pro Ala Pro Gln Gln Gly Gln
210 215 220
Leu Arg Glu Pro Ser Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Ser Val
225 230 235 240
Asp Glu Gln Ile Gln Trp Met Tyr Arg Gln Gln Asn Pro Ile Pro Val
245 250 255
Gly Asn Ile Tyr Arg Arg Trp Ile Gln Leu Gly Leu Gln Lys Cys Val
260 265 270
Arg Met Tyr Asn Pro Thr Asn Ile Leu Asp Val Lys Gln Gly Pro Lys
275 280 285
Glu Pro Phe Gln Ser Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Ser Leu Arg Ala
290 295 300
Glu Gln Thr Asp Ala Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Gln Thr Leu Leu
305 310 315 320
Ile Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu Val Leu Lys Gly Leu Gly
325 330 335
Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly
340 345 350
Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val
355 360 365
Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg Asn Gln
370 375 380
Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala
385 390 395 400
Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys
405 410 415
Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu
420 425 430
Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln
435 440 445
Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg Phe Gly
450 455 460
Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp Lys Glu
465 470 475 480
Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ser Asp Pro Ser
485 490 495
Ser Gln
<210> 10
<211> 912
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pol 蛋白质
<400> 10
Met Asn Leu Pro Gly Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly
1 5 10 15
Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys
20 25 30
Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn
35 40 45
Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr Leu Asn Phe
50 55 60
Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly Met
65 70 75 80
Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys
85 90 95
Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser
100 105 110
Lys Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Val Phe Ala Ile Lys
115 120 125
Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu
130 135 140
Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu Lys Gln Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly
165 170 175
Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Lys Asp Phe Arg Lys Tyr Thr
180 185 190
Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr
195 200 205
Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe
210 215 220
Gln Cys Ser Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln Asn Pro
225 230 235 240
Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp
245 250 255
Leu Glu Ile Gly Gln His Arg Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg Gln His
260 265 270
Leu Leu Arg Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu
275 280 285
Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr
290 295 300
Val Gln Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn Asp
305 310 315 320
Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Ala
325 330 335
Gly Ile Lys Val Arg Gln Leu Cys Lys Leu Leu Arg Gly Thr Lys Ala
340 345 350
Leu Thr Glu Val Val Pro Leu Thr Glu Glu Ala Glu Leu Glu Leu Ala
355 360 365
Glu Asn Arg Glu Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr Tyr Asp
370 375 380
Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly Gln
385 390 395 400
Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Glu Pro Phe Lys Asn Leu Lys Thr Gly
405 410 415
Lys Tyr Ala Arg Met Lys Gly Ala His Thr Asn Asp Val Lys Gln Leu
420 425 430
Thr Glu Ala Val Gln Lys Ile Ala Thr Glu Ser Ile Val Ile Trp Gly
435 440 445
Lys Thr Pro Lys Phe Lys Leu Pro Ile Gln Lys Glu Thr Trp Glu Ala
450 455 460
Trp Trp Thr Glu Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Glu Phe
465 470 475 480
Val Asn Thr Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp Tyr Gln Leu Glu Lys Glu
485 490 495
Pro Ile Ile Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn Arg
500 505 510
Glu Thr Lys Leu Gly Lys Ala Gly Tyr Val Thr Asp Arg Gly Arg Gln
515 520 525
Lys Val Val Pro Leu Thr Asp Thr Thr Asn Gln Lys Thr Glu Leu Gln
530 535 540
Ala Ile His Leu Ala Leu Gln Asp Ser Gly Leu Glu Val Asn Ile Val
545 550 555 560
Thr Asp Ser Gln Tyr Ala Leu Gly Ile Ile Gln Ala Gln Pro Asp Lys
565 570 575
Ser Glu Ser Glu Leu Val Ser Gln Ile Ile Glu Gln Leu Ile Lys Lys
580 585 590
Glu Lys Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile Gly Gly
595 600 605
Asn Glu Gln Val Asp Lys Leu Val Ser Ala Gly Ile Arg Lys Val Leu
610 615 620
Phe Leu Asp Gly Ile Asp Lys Ala Gln Glu Glu His Glu Lys Tyr His
625 630 635 640
Ser Asn Trp Arg Ala Met Ala Ser Asp Phe Asn Leu Pro Pro Val Val
645 650 655
Ala Lys Glu Ile Val Ala Ser Cys Asp Lys Cys Gln Leu Lys Gly Glu
660 665 670
Ala Met His Gly Gln Val Asp Cys Ser Pro Gly Ile Trp Gln Leu Asp
675 680 685
Cys Thr His Leu Glu Gly Lys Val Ile Leu Val Ala Val His Val Ala
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Ser Gly Tyr Ile Glu Ala Glu Val Ile Pro Ala Glu Thr Gly Gln Glu
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Thr Ala Tyr Phe Leu Leu Lys Leu Ala Gly Arg Trp Pro Val Lys Thr
725 730 735
Val His Thr Asp Asn Gly Ser Asn Phe Thr Ser Thr Thr Val Lys Ala
740 745 750
Ala Cys Trp Trp Ala Gly Ile Lys Gln Glu Phe Gly Ile Pro Tyr Asn
755 760 765
Pro Gln Ser Gln Gly Val Ile Glu Ser Met Asn Lys Glu Leu Lys Lys
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Ile Ile Gly Gln Val Arg Asp Gln Ala Glu His Leu Lys Thr Ala Val
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Gln Met Ala Val Phe Ile His Asn Phe Lys Arg Lys Gly Gly Ile Gly
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Gly Tyr Ser Ala Gly Glu Arg Ile Val Asp Ile Ile Ala Thr Asp Ile
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Gln Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg
835 840 845
Val Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asp Pro Val Trp Lys Gly Pro Ala Lys
850 855 860
Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala Val Val Ile Gln Asp Asn Ser Asp
865 870 875 880
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Lys Gln Met Ala Gly Asp Asp Cys Val Ala Ser Arg Gln Asp Glu Asp
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<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 麻疹 d30
<400> 11
Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu
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Ile Gly Val Val Gly Ile Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val Met Thr Arg
35 40 45
Ser Ser His Gln Ser Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn Ile Thr Leu
50 55 60
Leu Asn Asn Cys Thr Arg Val Glu Ile Ala Glu Tyr Arg Arg Leu Leu
65 70 75 80
Arg Thr Val Leu Glu Pro Ile Arg Asp Ala Leu Asn Ala Met Thr Gln
85 90 95
Asn Ile Arg Pro Val Gln Ser Val Ala Ser Ser Arg Arg His Lys Arg
100 105 110
Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala
115 120 125
Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Met Leu Asn Ser
130 135 140
Gln Ala Ile Asp Asn Leu Arg Ala Ser Leu Glu Thr Thr Asn Gln Ala
145 150 155 160
Ile Glu Ala Ile Arg Gln Ala Gly Gln Glu Met Ile Leu Ala Val Gln
165 170 175
Gly Val Gln Asp Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Ile Pro Ser Met Asn Gln
180 185 190
Leu Ser Cys Asp Leu Ile Gly Gln Lys Leu Gly Leu Lys Leu Leu Arg
195 200 205
Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Leu Phe Gly Pro Ser Leu Arg Asp Pro
210 215 220
Ile Ser Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Gly Gly
225 230 235 240
Asp Ile Asn Lys Val Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Leu
245 250 255
Leu Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val
260 265 270
Asp Thr Glu Ser Tyr Leu Ile Val Leu Ser Ile Ala Tyr Pro Thr Leu
275 280 285
Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Ser Tyr
290 295 300
Asn Ile Gly Ser Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Val Pro Lys Tyr Val Ala
305 310 315 320
Thr Gln Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Ser Ser Cys Thr Phe
325 330 335
Met Pro Glu Gly Thr Val Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr Pro Met Ser
340 345 350
Pro Leu Leu Gln Glu Cys Leu Arg Gly Ser Thr Lys Ser Cys Ala Arg
355 360 365
Thr Leu Val Ser Gly Ser Phe Gly Asn Arg Phe Ile Leu Ser Gln Gly
370 375 380
Asn Leu Ile Ala Asn Cys Ala Ser Ile Leu Cys Lys Cys Tyr Thr Thr
385 390 395 400
Gly Thr Ile Ile Asn Gln Asp Pro Asp Lys Ile Leu Thr Tyr Ile Ala
405 410 415
Ala Asp His Cys Pro Val Val Glu Val Asn Gly Val Thr Ile Gln Val
420 425 430
Gly Ser Arg Arg Tyr Pro Asp Ala Val Tyr Leu His Arg Ile Asp Leu
435 440 445
Gly Pro Pro Ile Leu Leu Glu Arg Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly
450 455 460
Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys Glu Leu Leu Glu Ser Ser
465 470 475 480
Asp Gln Ile Leu Arg Ser Met Lys Gly Leu Ser Ser Thr Cys Ile Val
485 490 495
Tyr Ile Leu Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly Ile Pro Ala
500 505 510
Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg
515 520
<210> 12
<211> 601
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 麻疹 d18+4A
<400> 12
Met Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg
1 5 10 15
Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu Ser Leu Ile
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr
35 40 45
Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val Thr Asn
50 55 60
Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr Asp Leu
85 90 95
Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu
100 105 110
Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu Arg Ile
115 120 125
Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu Glu Leu
130 135 140
Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Asn
145 150 155 160
Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr Thr Ile
165 170 175
Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Leu
180 185 190
Gly Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser Gln Gly
195 200 205
Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser Ser Lys
210 215 220
Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu Val Gly
225 230 235 240
Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met Thr Asn
245 250 255
Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met Val Ala
260 265 270
Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp Ser Ile
275 280 285
Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln Leu Val
290 295 300
Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp Val Pro
305 310 315 320
Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His
325 330 335
Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro Thr Thr
340 345 350
Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln Ala Cys
355 360 365
Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu
370 375 380
Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp Leu Ser
385 390 395 400
Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu
405 410 415
Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn
420 425 430
Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Val
435 440 445
Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro Ala Leu
450 455 460
Phe Asn Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Glu Asp Cys His Ala Pro Thr
465 470 475 480
Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser Asn Leu
485 490 495
Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr Tyr Asp
500 505 510
Thr Ser Ala Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser Pro Ser
515 520 525
Arg Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Val
530 535 540
Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys Leu Trp
545 550 555 560
Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly His Ile
565 570 575
Thr His Ser Gly Met Val Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val Thr Arg
580 585 590
Glu Asp Gly Thr Asn Arg Arg Gly Gly
595 600
<210> 13
<211> 524
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 尼帕 d30
<400> 13
Met Val Val Ile Leu Asp Lys Arg Cys Tyr Cys Asn Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ile Leu Met Ile Ser Glu Cys Ser Val Gly Ile Leu His Tyr Glu Lys
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val Thr Arg Lys Tyr Lys Ile
35 40 45
Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val Ile Lys Met Ile Pro Asn
50 55 60
Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser Val Met Glu Asn Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile Lys Gly Ala Leu Glu Ile
85 90 95
Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly Asp Val Arg Leu Ala Gly
100 105 110
Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met Lys Asn Ala Asp Asn Ile
130 135 140
Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr Asn Glu Ala Val Val Lys
145 150 155 160
Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr Val Leu Thr Ala Leu Gln
165 170 175
Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr Ile Asp Lys Ile Ser Cys
180 185 190
Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala Leu Ser Lys Tyr Leu Ser
195 200 205
Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asp Pro Val Ser Asn
210 215 220
Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Glu
225 230 235 240
Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr Glu Asp Phe Asp Asp Leu
245 250 255
Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val Asp Leu Ser
260 265 270
Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe Pro Ile Leu Thr Glu Ile
275 280 285
Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro Val Ser Phe Asn Asn Asp
290 295 300
Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn Phe Ile Leu Val Arg Asn
305 310 315 320
Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe Cys Leu Ile Thr Lys Arg
325 330 335
Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr Pro Met Thr Asn Asn Met
340 345 350
Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys Cys Pro Arg Glu Leu Val
355 360 365
Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Asn Gly Val Leu Phe
370 375 380
Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys Gln Thr Thr Gly Arg Ala
385 390 395 400
Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu Met Ile Asp Asn Thr Thr
405 410 415
Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile Ile Ser Leu Gly Lys Tyr
420 425 430
Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly Ile Ala Ile Gly Pro Pro
435 440 445
Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser Gln Ile Ser Ser Met Asn
450 455 460
Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala Gln Arg Leu
465 470 475 480
Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser Met Ile Ile
485 490 495
Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys Ile Gly Leu Ile Thr Phe
500 505 510
Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg Asn Thr
515 520
<210> 14
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 尼帕 d18+4A
<400> 14
Met Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser Ala
1 5 10 15
Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val Met
20 25 30
Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln Ala
35 40 45
Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly Leu
50 55 60
Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp
65 70 75 80
Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser
85 90 95
Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu Lys
100 105 110
Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser
115 120 125
Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu Gly
130 135 140
Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys Thr
145 150 155 160
Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Val
165 170 175
Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp
180 185 190
Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser
195 200 205
Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp
210 215 220
Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro
225 230 235 240
Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn Glu
245 250 255
Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile Leu
260 265 270
Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala Val
275 280 285
Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro
305 310 315 320
Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe
325 330 335
Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Thr
340 345 350
Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Ile
355 360 365
Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn
370 375 380
Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser Asp
385 390 395 400
Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu Gly
405 410 415
Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys
420 425 430
Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg Asn
435 440 445
Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn
450 455 460
Thr Cys Pro Ala Ile Cys Ala Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe Leu
465 470 475 480
Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser Asn
485 490 495
Ala Thr Ala Ala Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile
500 505 510
Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr
515 520 525
Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser Leu
530 535 540
Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe
545 550 555 560
Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr
565
<210> 15
<211> 868
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> US_10415057_2
<400> 15
Met Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg
1 5 10 15
Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu Ser Leu Ile
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr
35 40 45
Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val Thr Asn
50 55 60
Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr Asp Leu
85 90 95
Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu
100 105 110
Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu Arg Ile
115 120 125
Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu Glu Leu
130 135 140
Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Asn
145 150 155 160
Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr Thr Ile
165 170 175
Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Leu
180 185 190
Gly Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser Gln Gly
195 200 205
Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser Ser Lys
210 215 220
Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu Val Gly
225 230 235 240
Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met Thr Asn
245 250 255
Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met Val Ala
260 265 270
Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp Ser Ile
275 280 285
Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln Leu Val
290 295 300
Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp Val Pro
305 310 315 320
Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His
325 330 335
Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro Thr Thr
340 345 350
Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln Ala Cys
355 360 365
Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu
370 375 380
Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp Leu Ser
385 390 395 400
Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu
405 410 415
Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn
420 425 430
Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Val
435 440 445
Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro Ala Leu
450 455 460
Phe Thr Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Gly Asp Cys His Ala Pro Thr
465 470 475 480
Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser Asn Leu
485 490 495
Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr Tyr Asp
500 505 510
Thr Ser Ala Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser Pro Ser
515 520 525
Arg Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Val
530 535 540
Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys Leu Trp
545 550 555 560
Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly His Ile
565 570 575
Thr His Ser Gly Met Val Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val Thr Arg
580 585 590
Glu Asp Gly Thr Asn Ala Ala Gln Pro Ala Ile Glu Gly Arg Met Ala
595 600 605
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
610 615 620
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
625 630 635 640
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
645 650 655
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
660 665 670
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
675 680 685
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
690 695 700
Ala Arg Ala Gln Leu Arg Pro Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
705 710 715 720
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Lys Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser
725 730 735
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Asp Ile
740 745 750
Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys
755 760 765
Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp
770 775 780
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr
785 790 795 800
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
805 810 815
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala
820 825 830
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly
835 840 845
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ala Ala Ala Arg Gly Ser His His
850 855 860
His His His His
865
<210> 16
<211> 669
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> US_10415057_4
<400> 16
Met Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg
1 5 10 15
Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu Ser Leu Ile
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr
35 40 45
Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val Thr Asn
50 55 60
Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr Asp Leu
85 90 95
Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu
100 105 110
Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu Arg Ile
115 120 125
Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu Glu Leu
130 135 140
Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Asn
145 150 155 160
Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr Thr Ile
165 170 175
Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Leu
180 185 190
Gly Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser Gln Gly
195 200 205
Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser Ser Lys
210 215 220
Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu Val Gly
225 230 235 240
Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met Thr Asn
245 250 255
Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met Val Ala
260 265 270
Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp Ser Ile
275 280 285
Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln Leu Val
290 295 300
Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp Val Pro
305 310 315 320
Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His
325 330 335
Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro Thr Thr
340 345 350
Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln Ala Cys
355 360 365
Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu
370 375 380
Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp Leu Ser
385 390 395 400
Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu
405 410 415
Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn
420 425 430
Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Val
435 440 445
Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro Ala Leu
450 455 460
Phe Thr Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Gly Asp Cys His Ala Pro Thr
465 470 475 480
Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser Asn Leu
485 490 495
Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr Tyr Asp
500 505 510
Thr Ser Ala Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser Pro Ser
515 520 525
Arg Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Val
530 535 540
Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys Leu Trp
545 550 555 560
Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly His Ile
565 570 575
Thr His Ser Gly Met Val Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val Thr Arg
580 585 590
Glu Asp Gly Thr Asn Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Asn Ser Asp Ser
595 600 605
Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys
610 615 620
Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly
625 630 635 640
Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu
645 650 655
Arg Ala Ala Ala Arg Gly Ser His His His His His His
660 665

Claims (65)

1.一种工程化的病毒颗粒，其包括
i.工程化的包膜，其包含突变的融合蛋白、嵌合gag蛋白和用于结合靶细胞的工程化的靶向部分，其中所述突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和
ii.编码感兴趣的多肽的核酸。
2.根据权利要求1所述的工程化的病毒颗粒，其中所述嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒进一步包含编码SIV元件和/或Pol蛋白的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的工程化的病毒颗粒，其中所述xHIV gag蛋白由如SEQ ID NO:5中叙述的核酸序列编码。
5.根据权利要求2所述的工程化的病毒颗粒，其中所述xHIV gag蛋白由如SEQ ID NO:6中叙述的核酸序列编码。
6.根据权利要求3所述的工程化的病毒颗粒，其中所述SIV元件由如SEQ ID NO:7中叙述的核酸序列编码。
7.根据权利要求3所述的工程化的病毒颗粒，其中所述Pol蛋白由如SEQ ID NO:8中叙述的核酸序列编码。
8.根据权利要求2所述的工程化的病毒颗粒，其中所述xHIV gag蛋白包含如SEQ IDNO:9中叙述的氨基酸序列。
9.根据权利要求3所述的工程化的病毒颗粒，其中所述Pol蛋白包含如SEQ ID NO:10中叙述的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与所述突变的融合蛋白融合。
11.根据权利要求1-10所述的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是用麻疹病毒(MV)血凝素(HA)蛋白或MV融合(F)蛋白、尼帕F蛋白或尼帕G蛋白假型化的慢病毒，其中MV-HA蛋白或MV-F蛋白包含与其天然存在的结合结构域相比突变的结合结构域。
12.根据权利要求11所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与所述MV-HA蛋白、所述MV-F蛋白、所述尼帕F蛋白或所述尼帕G蛋白融合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分是抗体、scFv抗体、抗原结合结构域、DARPIN、VHH结构域抗体、纳米抗体、单结构域抗体、FN3结构域或其任何组合。
14.根据前述权利要求中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分选自干细胞因子蛋白(SCF、KIT-配体、KL或钢因子)或结合以下的部分：cKit(CD117)、CD4、CD8、CD3、CD5、CD6、CD7、CD2、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD10、CD34、CD110、CD33、CD14、CD68、CCR7、CD62L、CD25、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR3。
15.根据前述权利要求中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述感兴趣的多肽是嵌合抗原受体(CAR)或其一部分。
16.根据权利要求15所述的工程化的病毒颗粒，其中所述嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
17.根据权利要求16所述的工程化的病毒颗粒，其中所述细胞外结构域结合CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b。
18.根据权利要求1所述的工程化的病毒颗粒，其中所述感兴趣的多肽是血红蛋白β链。
19.根据前述权利要求中任一项的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是假型化的慢病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒。
20.根据权利要求19所述的工程化的病毒颗粒，其中所述假型化的慢病毒载体用麻疹病毒属或亨尼帕病毒属例如麻疹病毒糖蛋白和/或尼帕病毒糖蛋白假型化。
21.根据权利要求19所述的工程化的病毒颗粒，其中所述假型化的载体用麻疹病毒属F蛋白或H蛋白假型化。
22.一种体内基因递送的方法，其包括向需要递送的受试者施用工程化的病毒颗粒，其中所述工程化的病毒颗粒包括
i.工程化的包膜，其含有突变的融合蛋白、嵌合gag蛋白和用于结合靶细胞的工程化的靶向部分，其中所述突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和
ii.编码感兴趣的多肽的核酸，
iii.其中所述工程化的病毒颗粒的施用在与所述感兴趣的多肽相关的靶细胞中诱导体内活性。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述病毒颗粒进一步包含编码SIV元件和/或Pol蛋白的核苷酸序列。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述xHIV gag蛋白由如SEQ ID NO:5中叙述的核酸序列编码。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述xHIV gag蛋白由如SEQ ID NO:6中叙述的核酸序列编码。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述SIV元件由如SEQ ID NO:7中叙述的核酸序列编码。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述Pol蛋白由如SEQ ID NO:8中叙述的核酸序列编码。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述xHIV gag蛋白包含如SEQ ID NO:9中叙述的氨基酸序列。
30.根据权利要求24所述的方法，其中所述Pol蛋白包含如SEQ ID NO:10中叙述的氨基酸序列。
31.根据权利要求22-30中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
32.一种细胞，其包含由权利要求1-21中任一项所述的工程化的病毒颗粒编码的感兴趣的多肽。
33.根据权利要求32所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞或调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
34.一种治疗受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-21中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述工程化的病毒颗粒在细胞中表达感兴趣的多肽。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述疾病是癌症或镰状细胞病。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述细胞是T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中央记忆T细胞、幼稚T细胞、活化T细胞、调节T细胞(Treg)或T-细胞CD8+CCR7+。
37.一种包含第一病毒颗粒和第二病毒颗粒的病毒载体系统，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
c.)其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在所述细胞内形成完整的目的蛋白质或多肽。
38.根据权利要求23所述的病毒载体系统，其中嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
39.一种细胞，其包含权利要求37或38所述的病毒载体系统。
40.一种体内基因递送的方法，其包括向有需要的受试者施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
c.)其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在所述细胞内形成完整的感兴趣的蛋白质或多肽。
41.根据权利要求71所述的方法，其中所述嵌合gag蛋白是xHIV gag蛋白。
42.根据权利要求71所述的方法，进一步包括施用二聚剂以在所述受试者中形成所述蛋白质或多肽。
43.一种治疗受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含嵌合gag蛋白、与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
c.)其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在所述细胞内形成完整的感兴趣的蛋白质或多肽。
44.一种工程化的病毒颗粒，其包括
工程化的包膜，其包含突变的融合蛋白和用于结合靶细胞的工程化的靶向部分，其中所述突变的融合蛋白不与其天然受体结合；和编码感兴趣的多肽的核酸分子。
45.根据权利要求44所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与所述突变的融合蛋白融合。
46.根据权利要求44或45所述的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是用麻疹病毒(MV)血凝素(HA)蛋白或MV融合(F)蛋白或尼帕病毒F或G蛋白假型化的慢病毒，其中所述MV-HA蛋白、所述MV-F蛋白、所述尼帕病毒F或所述尼帕病毒G蛋白包含与其天然存在的受体相比突变的结合结构域。
47.根据权利要求46所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与所述MV-HA蛋白、所述MV-F蛋白、所述尼帕病毒F或所述尼帕病毒G蛋白融合。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分是scFv、抗原结合结构域、DARPIN、FN3结构域、VHH或其任何组合。
49.一种体内基因递送的方法，其包括向需要递送的受试者施用工程化的病毒颗粒，其中所述工程化的病毒颗粒是权利要求44-48中任一项所述的颗粒，其中所述工程化的病毒颗粒的施用诱导与感兴趣的多肽相关的靶细胞中的体内活性。
50.一种细胞，其包含由权利要求44-49中任一项所述的工程化的病毒颗粒编码的感兴趣的多肽。
51.一种治疗受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求44-49中任一项所述的工程化的病毒颗粒，其中所述工程化的病毒颗粒在细胞中表达感兴趣的多肽。
52.一种工程化的病毒颗粒，其包括：
i.工程化的包膜，其包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽；
ii.用于结合靶细胞的异源多肽靶向部分；和
iii.编码感兴趣的异源多肽的核酸分子。
53.根据权利要求52所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与所述工程化的病毒颗粒表面上存在的突变的融合蛋白融合。
54.根据权利要求52所述的工程化的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是用以下假型化的慢病毒：
a)麻疹病毒(MV)血凝素(HA)蛋白和/或MV融合(F)蛋白，并且其中，MV-HA蛋白或MV-F蛋白与其天然存在的蛋白相比包含突变或突变的结合结构域；或
b)尼帕病毒F蛋白和/或尼帕病毒G蛋白，并且其中尼帕病毒F蛋白和/或尼帕病毒G蛋白与其天然存在的蛋白质相比包含突变或突变的结合结构域。
55.根据权利要求52所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分与所述MV-HA蛋白和/或所述MV-F蛋白或所述尼帕病毒F蛋白和/或尼帕病毒G蛋白融合。
56.根据权利要求52所述的工程化的病毒颗粒，其中所述靶向部分是scFv、抗原结合结构域、DARPIN、VHH或FN3结构域。
57.根据权利要求52所述的工程化的病毒颗粒，其中所述感兴趣的异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)。
58.根据权利要求57所述的工程化的病毒颗粒，其中所述嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
59.根据权利要求58所述的工程化的病毒颗粒，其中所述细胞外结构域结合CD20、CD22、CD123、CD38、CD19、BCMA、CD33或CD79b。
60.一种将编码感兴趣的异源蛋白的核酸分子递送至细胞的方法，所述方法包括将权利要求52所述的工程化的病毒颗粒与细胞接触，从而将编码所述感兴趣的异源蛋白的核酸分子递送至所述细胞。
61.一种包含第一病毒颗粒和第二病毒颗粒的病毒载体系统，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在所述细胞内形成完整的感兴趣的蛋白质或多肽。
62.一种细胞，其包含编码嵌合抗原受体的第一部分的第一核酸分子和编码嵌合抗原受体的第二部分的第二核酸分子，其中在存在二聚剂或二聚化结构域的情况下，所述嵌合抗原受体的第一部分和所述嵌合抗原受体的第二部分能够相互结合以形成完整的嵌合抗原受体。
63.一种细胞，其包含编码蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子和编码蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分可以结合在一起形成完整的蛋白质或多肽。
64.一种体内或离体基因递送方法，其包括向需要递送的受试者施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在所述细胞内形成完整的蛋白质或多肽。
65.一种治疗受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一病毒颗粒和第二病毒颗粒，其中：
a.)所述第一病毒颗粒包含与细胞上的第一靶标结合的第一靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第一部分的第一核酸分子；
b.)所述第二病毒颗粒包含与细胞上的第二靶标结合的第二靶向部分和编码感兴趣的蛋白质或多肽的第二部分的第二核酸分子，
其中所述蛋白质或多肽的第一部分和第二部分能够在所述细胞中形成完整的蛋白质或多肽以治疗所述疾病。
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