CN111479822A

CN111479822A - 靶向lemd1的癌症疫苗和其用途

Info

Publication number: CN111479822A
Application number: CN201880080531.2A
Authority: CN
Inventors: 严健; 安娜·斯莱格; 布拉德利·加曼; 尼尔·库奇
Original assignee: Ainuo Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Ainuo Pharmaceutical Co ltd; Inovio Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-07-31
Also published as: KR102673699B1; JP2023111915A; JP2021506264A; WO2019118771A1; KR20240096711A; JP7314139B2; US20190175712A1; US11338028B2; AU2018384824A1; EP3724217A1; KR20200096959A; CA3084137A1; AU2022263546A1; RU2760984C1; US20220265800A1; AU2018384824A8; AU2018384824B2; BR112020011620A2; EP3724217A4; MX2020006305A

Abstract

本文公开了核酸分子，其包含一或多种编码突变的共同LEMD1抗原的核酸序列。公开了载体、组合物和疫苗，其包含一或多种编码突变的共同LEMD1抗原的核酸序列。公开了治疗患有表达LEMD1的肿瘤的受试者的方法和预防表达LEMD1的肿瘤的方法。公开了突变的共同LEMD1抗原。

Description

靶向LEMD1的癌症疫苗和其用途

相关申请的交叉参照

本申请要求2017年12月13日所提交的美国临时专利申请第62/598,329号和2017年12月14日所提交的美国临时专利申请第62/598,612号的优先权和权益，所述临时专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交且以全文引用的方式并入本文。所述ASCII副本于2018年12月12日创建，命名为104409_000449_sequence_listing.txt并且大小为25,040个字节。

技术领域

本发明涉及LEMD1抗原和编码所述抗原的核酸分子。本发明还涉及包括此类LEMD1免疫原和/或核酸分子的疫苗。本发明进一步涉及使用疫苗来诱导免疫响应和预防和/或治疗患有表达LEMD1的癌细胞或肿瘤的受试者的方法。

背景技术

癌症在美国和全世界仍然是死亡的主要原因。癌症疫苗市场正在快速增长。有效的肿瘤疫苗可以适用于预防肿瘤生长和/或可以适用作晚期癌症患者的更有效、毒性更小的标准疗法替代方案。与癌症有关的抗原是LEMD1，因此，抗肿瘤疫苗的靶标是LEMD1。

LEMD1是位于内核膜(INM)的20kD蛋白质。在内核膜中，所述蛋白质与核纤层缔合，所述核纤层涉及核机械功能和异染色质组织。LEMD1的特征是其LAP2-伊默菌素-MAN1(LAP2-Emerin-MAN1，LEM)结构域，所述结构域最初被描述为约40个氨基酸的保守型球形模块，其赋予针对屏障自整合因子(Barrier-to-Autointegration Factor，BAF)(一种DNA桥接蛋白质)的结合。

BAF-DNA核蛋白复合物在与核纤层蛋白相关的核重新组装中起重要作用，并且增强了染色质在有丝分裂末期的解凝聚。增强的LEMD1表达可能涉及快速生长中的癌细胞的有丝分裂。Yuki,D.等人，含有LEM结构域的蛋白质1(结肠直肠癌所表达的一种新睾丸特异性基因)的分离(Isolation of LEM Domain-Containing 1,a Novel Testis-specificGene Expressed in Colorectal Cancers)，《肿瘤学报道(Oncology reports)》12,275-280(2004)。已经鉴定出六种LEMD1同功异型物：LEMD1A到LEMD1F。

用于治疗和预防癌症的疫苗受到关注。然而，靶向肿瘤细胞抗原的现有疫苗受到体内不良抗原表达的限制。因此，本领域中仍需要用于预防和/或治疗癌症以及降低罹患癌症的受试者的死亡率的安全有效疫苗以及其使用方法。

发明内容

本文中公开了包含一或多种核酸序列的核酸分子，所述一或多种核酸序列选自由以下组成的组：(a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198的核酸序列；(b)编码SEQ IDNO:4的氨基酸残基19到84的核酸序列；(c)编码SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271的核酸序列；(d)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198的蛋白质的整个长度中占至少90％；(e)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ IDNO:4的氨基酸残基19到84的蛋白质的整个长度中占至少90％；(f)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271的蛋白质的整个长度中占至少90％；(g)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于95.6％一致；(h)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于95.5％一致；(i)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质与SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271至少95％一致；(j)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于95.6％一致的蛋白质的整个长度中占至少90％；(k)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于95.5％一致的蛋白质的整个长度中占至少90％；以及(l)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271至少95％一致的蛋白质的整个长度中占至少90％。

提供的核酸分子包含一或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:1的核苷酸55到600；(b)SEQ ID NO:3的核苷酸55到258；(c)SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819；(d)在包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到600的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(e)在包含SEQ ID NO:3的核苷酸55到258的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(f)在包含SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的片段；(h)与SEQ IDNO:3的核苷酸55到258至少95％一致的片段；(i)与SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的片段；(j)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段；(k)在与SEQ ID NO:3的核苷酸55到258至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及(l)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:1、3或5中所示的核酸序列。

还提供如本文所述的核酸分子，其中所述核酸分子并入质粒或载体中。在一些实施例中，核酸分子可以可操作地连接到调控元件，所述调控元件选自启动子和聚腺苷酸化信号。在一些实施例中，启动子是人巨细胞病毒即刻早期启动子(hCMV启动子)。在仍其它实施例中，聚腺苷酸化信号可以是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH polyA)。在仍另外的实施例中，可以将核酸分子并入病毒载体中。

还公开了包含如本文中所述的一或多种核酸分子的组合物。在一些方面中，这些组合物进一步包含药学上可接受的载剂。

本文还提供包含氨基酸序列的蛋白质和肽，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198；(b)SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84；(c)SEQID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271；(d)在SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198的整个长度中占至少90％的片段；(e)在SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84的整个长度中占至少90％的片段；(f)在SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271的整个长度中占至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于95.6％一致的氨基酸序列；(h)与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于95.5％一致的氨基酸序列；(i)与SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271至少95％一致的氨基酸序列；(j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸序列19到198大于95.6％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；(k)在与SEQ ID NO:4的氨基酸序列19到84大于95.5％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及(l)在与SEQ ID NO:6的氨基酸序列19到198和206和271至少95％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段。

本文还提供了包含抗原的疫苗，其中所述抗原包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198；(b)SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84；(c)SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271；(d)在SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198的整个长度中占至少90％的片段；(e)在SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84的整个长度中占至少90％的片段；(f)在SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271的整个长度中占至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于95.6％一致的氨基酸序列；(h)与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于95.5％一致的氨基酸序列；(i)与SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271至少95％一致的氨基酸序列；(j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸序列19到198大于95.6％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；(k)在与SEQ ID NO:4的氨基酸序列19到84大于95.5％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及(l)在与SEQ ID NO:6的氨基酸序列19到198和206和271至少95％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段。

在一些实施例中，疫苗抗原由包含一或多种核酸序列的核酸分子编码，所述一或多种核酸序列选自由以下组成的组：(a)SEQ ID NO:1的核苷酸55到600；(b)SEQ ID NO:3的核苷酸55到258；(c)SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819；(d)在包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到600的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(e)在包含SEQ ID NO:3的核苷酸55到258的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(f)在包含SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的片段；(h)与SEQ ID NO:3的核苷酸55到258至少95％一致的片段；(i)与SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的片段；(j)在与SEQID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段；(k)在与SEQ ID NO:3的核苷酸55到258至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及(l)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段。

提供了包含核酸分子的其它疫苗，其中所述核酸分子包含相对于SEQ ID NO:1、3或5中所示的核酸序列的整个长度至少约95％一致的核酸序列。

本文中还公开了包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码的肽包含相对于SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列的整个长度至少约95％一致的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子可以是表达载体。在一些实施例中，疫苗进一步包含药学上可接受的赋形剂或佐剂。

还公开了包含肽的疫苗，其中所述肽包含相对于SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列的整个长度至少约90％一致的氨基酸序列。

本文还提供了治疗具有表达LEMD1的癌细胞的受试者的方法，其包含施用治疗有效量的本文所述疫苗。

向受试者接种针对表达LEMD1的癌细胞的疫苗的方法包含施用有效诱导体液免疫响应的量的本文所述疫苗。

附图说明

图1A是合成共同LEMD1A(SEQ ID NO:1)与人原生LEMD1A(SEQ ID NO:11)的氨基酸19-198的序列比对。图1B展示原生与合成共同LEMD1A之间的序列一致性和趋异度。

图2是合成共同LEMD1A的示意图。

图3说明用于产生pGX1431的克隆策略。

图4A是合成共同LEMD1F(SEQ ID NO:4)与人原生LEMD1F(SEQ ID NO:12)的氨基酸19-84的序列比对。图4B展示原生与合成共同LEMD1F之间的序列一致性和分歧。

图5是合成共同LEMD1F的示意图。

图6绘示了用于产生pGX1432的克隆策略。

图7是合成共同LEMD1AF的示意图。

图8绘示了用于产生pGX1433的克隆策略。

图9显示了蛋白质印迹，其测定分别由构建体pGX1431、pGX1432和pGX1433产生的合成共同LEMD1A、LEMD1F和LEMD1AF在横纹肌肉瘤细胞中的表达。

图10描绘了用于表征细胞免疫响应的流式细胞术设门策略。

图11A、图11B和图11C以图形方式分别绘示了合成共同LEMD1A、合成共同LEMD1F和合成共同LEMD1AF的免疫原性。

图12A、图12B和图12C以图形方式分别绘示了合成共同LEMD1A、合成共同LEMD1F和合成共同LEMD1AF所诱导的CD4+T细胞的相对频率。图12D比较了合成共同LEMD1A和合成共同LEMD1F所诱导的CD4+T细胞的相对频率。图12E绘示了合成共同LEMD1A、LEMD1F和LEMD1AF在CD4+T细胞代谢区中所诱导的细胞因子分布。

图13A、图13B和图13C以图形方式分别绘示了合成共同LEMD1A、合成共同LEMD1F和合成共同LEMD1AF所诱导的抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的溶胞潜力。图13D比较了合成共同LEMD1A和合成共同LEMD1F所诱导的CD4+CD107a+T细胞的相对频率。图13E绘示了pGX1431、pGX1432和pGX1433在CD4+CD107a+中所诱导的细胞因子分布。

图14A、图14B和图14C以图形方式绘示了LEMD1A(合成共同pGX1431)、LEMD1F(合成共同pGX1432)和LEMD1AF(合成共同pGX1433)所诱导的CD8+T细胞的相对频率。图14D比较了合成共同LEMD1A和合成共同LEMD1F所诱导的CD8+T细胞的相对频率。图14E绘示了合成共同LEMD1A、LEMD1F和LEMD1AF在CD8+T细胞代谢区中所诱导的细胞因子分布。

图15A、图15B和图15C以图形方式分别绘示了合成共同LEMD1A、合成共同LEMD1F和合成共同LEMD1AF所诱导的抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的溶胞潜力。图15D比较了合成共同LEMD1A和合成共同LEMD1F所诱导的CD8+CD107a+T细胞的相对频率。图15E绘示了LEMD1A(合成共同pGX1431)、LEMD1F(合成共同pGX1432)和LEMD1AF(合成共同pGX1433)在CD8+CD107a+中诱导的细胞因子分布。

具体实施方式

本发明涉及一种包含LEMD1抗原的疫苗。LEMD1在许多肿瘤中受到表达。因此，疫苗提供的治疗针对表达LEMD1的癌症或基于癌症的肿瘤。本发明的疫苗能够针对需要治疗的受试者的癌症的特定预防或治疗来提供特定癌症抗原的任何组合。

一种用于设计重组癌症抗原的核酸和其编码的氨基酸序列的方式是引入突变，从而改变原生癌症抗原的整体氨基酸序列中的特定氨基酸。突变的引入不是使癌症抗原发生太多的改变以致其无法普遍地在哺乳动物受试者(优选人或犬受试者)中施用，而是其变化足以使得所得氨基酸序列中断耐受性或被视为外来抗原以便产生免疫响应。另一种方式可以是产生一种共同重组癌症抗原，其与其对应的原生癌症抗原具有至少85％并且至多99％氨基酸序列一致性；优选至少90％并且至多98％序列一致性；更优选至少93％并且至多98％序列一致性；或甚至更优选至少95％并且至多98％序列一致性。在一些情况下，重组癌症抗原与其对应的原生癌症抗原具有95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性。原生癌症抗原是通常与特定癌症或癌症肿瘤相关的抗原。视癌症抗原而定，癌症抗原的共同序列能够是跨哺乳动物物种的或属于物种亚型内或是跨病毒株或血清型的。一些癌症抗原相对于癌症抗原的野生型氨基酸序列并无太大变化。一些癌症抗原的核酸/氨基酸序列所跨物种如此趋异，以致无法产生共同序列。在这些情况下，产生了将中断耐受性并且产生免疫响应的重组癌症抗原，所述重组癌症抗原与其对应的原生癌症抗原具有至少85％并且至多99％氨基酸序列一致性；优选至少90％并且至多98％序列一致性；更优选至少93％并且至多98％序列一致性；或甚至更优选至少95％并且至多98％序列一致性。在一些情况下，重组癌症抗原与其对应的原生癌症抗原具有95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性。前述方案能够组合，以便最终重组癌症抗原与原生癌症抗原氨基酸序列具有一定百分比的相似性，如上文所论述。

LEMD1抗原可以是来源于不同物种或物种内的不同同功异型物的LEMD1序列的共同LEMD1抗原，并且因此，共同LEMD1抗原不是原生的。重组LEMD1能够诱导抗原特异性T细胞和/或高效价抗体反应，从而诱导或诱发针对表达所述抗原的癌症或肿瘤或对表达所述抗原的癌症或肿瘤具有反应性的免疫响应。在一些实施例中，诱导或诱发的免疫响应可以是细胞、体液免疫响应，或细胞与体液免疫响应。在一些实施例中，诱导或诱发的细胞免疫响应可以包括诱导或分泌干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。在其它实施例中，诱导或诱发的免疫响应能够减少或抑制一或多种促进表达所述抗原的肿瘤或癌症生长的免疫抑制因子，例如(但不限于)下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调控T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子(例如IL-10和TFG-β)、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关纤维母细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子。

所述疫苗可以进一步与抗体组合，直至与检查点抑制剂(例如PD-1和PDL-1)组合，以增加细胞与体液免疫响应的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体阻止PD-1或PDL-1抑制T细胞和/或B细胞响应。总的来说，设计被免疫系统识别的癌症抗原有助于克服肿瘤细胞的其它免疫抑制形式，并且这些疫苗能够与抑制或遏制疗法(例如抗PD-1和抗PDL-1抗体疗法)组合使用以进一步增加T细胞和/或B细胞响应。

定义

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术和科学术语具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在有冲突的情况下，将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选方法和材料，但与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文所提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献以全文引用的方式并入。本文所公开的材料、方法和实例仅具说明性而非旨在限制。本文所用的术语仅为了描述特定实施例的目的，而非旨在限制。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“能够”、“含有”以及其变化形式旨在是开放端过渡短语、术语或词语，其不排除其它行为或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一”、“和”以及“所述”包括多个提及物。本公开还涵盖其它实施例，“包含”、“组成为”和“基本上组成为”本文中所展示的实施例或元件，不论是否明确阐述。

本文中叙述数值范围时，明确涵盖每个中间值，所述中间值的精确度与所述范围(最小值和最大值)相同。举例来说，当范围为6-9时，除了6和9外，还涵盖数字7和8；并且当范围为6.0-7.0时，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

如本文所用，“佐剂”是指添加到本文所述的DNA质粒疫苗中的任何分子，以增强由本文所述的DNA质粒和编码核酸序列编码的抗原的免疫原性。

如本文所用，“抗体”是指如下类别的抗体：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，或片段，或其衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体和其衍生物。抗体可以是从哺乳动物血清样品中分离出来的抗体、多克隆抗体、亲和力提纯的抗体，或其任何混合物，其对所期望的抗原决定基或由其衍生的序列展现充分的结合特异性。

“抗原”是指具有突变的LEMD1氨基酸序列的蛋白质，包括SEQ ID NO:2和本文中所述长度的其片段，例如SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198；变异体，即，序列与SEQ ID NO:2具有一致性的如本文所述蛋白质和具有本文所述长度的变异体片段，和其组合。“抗原”还指具有突变的LEMD1氨基酸序列的蛋白质，包括SEQ ID NO:4和本文中所述长度的其片段，例如SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84；变异体，即，序列与SEQ ID NO:4具有一致性的如本文所述蛋白质和具有本文所述长度的变异体片段，和其组合。“抗原”还指具有突变的LEMD1氨基酸序列的蛋白质，包括SEQ ID NO:6和本文中所述长度的其片段，例如SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271；变异体，即，序列与SEQ ID NO:6具有一致性的如本文所述蛋白质和具有本文所述长度的SEQ ID NO:6变异体片段，和其组合。抗原可以任选地包括信号肽，例如来自其它蛋白质的那些肽。

如本文所用，“编码序列”或“编码核酸”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号，能够引导核酸所施用的受试者或哺乳动物的细胞表达。

如本文所用，“补体”或“互补”是指核酸能够可以指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对(例如A-T/U和C G)或胡斯廷(Hoogsteen)碱基对。

如本文所用，“共同”或“共同序列”是指一种多肽序列，其基于不同生物体的相同基因的多个序列的比对分析。能够制备编码共同多肽序列的核酸序列。包含含有共同序列的蛋白质和/或编码此类蛋白质的核酸分子的疫苗能够用于诱导针对抗原的广泛免疫性。

如本文所用，“恒定电流”描述组织或界定所述组织的细胞在电脉冲持续递送到同一组织期间所接收或经历的电流。电脉冲是从本文所述的电穿孔装置中递送。由于本文提供的电穿孔装置具有反馈元件(优选具有瞬时反馈)，因此这种电流在所述组织中以恒定安培数、在电脉冲的寿命期保持。反馈元件能够在脉冲的整个持续期间测量组织(或细胞)的电阻并且促使电穿孔装置改变其电能输出(例如增加电压)，因此，同一组织中的电流在整个电脉冲期间(微秒数量级)以及脉冲间保持恒定。在一些实施例中，反馈元件包括控制器。

如本文所用，“电流反馈”或“反馈”可以互换使用并且可以指所提供的电穿孔装置的主动响应，包含测量电极之间的组织中的电流以及相应地改变EP装置所递送的能量输出以便将电流维持在恒定水平。这种恒定水平是由用户在起始脉冲序列或电治疗之前预设。反馈可以利用电穿孔装置的电穿孔组件(例如控制器)完成，因为其中的电路能够连续地监测电极之间的组织中的电流并且将监测到的那个电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较并且连续地进行能量输出调节以将所监测的电流维持在预设水平。反馈回路因其是模拟闭环反馈而可以是瞬时的。

如本文所用，“分散电流”可以指本文所述的电穿孔装置的多个针电极阵列所递送的电流模式，其中所述模式使正被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关热应激的发生最小化或优选消除。

如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“EP”)是指利用跨膜电场脉冲诱导生物膜中产生微观路径(孔隙)；其存在允许生物分子(例如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水)从细胞膜的一侧传送到另一侧。

如本文关于核酸序列所用的“片段”是指编码多肽的核酸序列或其一部分，所述多肽能够在哺乳动物中诱发与本文公开的抗原交叉反应的免疫响应。所述片段可以是DNA片段，其选自编码下述蛋白质片段的多种核苷酸序列中的至少一种。片段可以包含下述一种或多种核酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，不包括所添加的异源信号肽。所述片段可以包含下述一种或多种核酸序列的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％并且另外任选地包含编码异源信号肽的序列，当计算一致性百分比时，编码异源信号肽的所述序列不包括在内。片段可以进一步包含信号肽(例如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽)的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以连接到编码序列的片段。

在一些实施例中，片段可以包含下述至少一种核酸序列中的至少20个核苷酸或更多、至少30个核苷酸或更多、至少40个核苷酸或更多、至少50个核苷酸或更多、至少60个核苷酸或更多、至少70个核苷酸或更多、至少80个核苷酸或更多、至少90个核苷酸或更多、至少100个核苷酸或更多、至少150个核苷酸或更多、至少200个核苷酸或更多、至少250个核苷酸或更多、至少300个核苷酸或更多、至少350个核苷酸或更多、至少400个核苷酸或更多、至少450个核苷酸或更多、至少500个核苷酸或更多、至少550个核苷酸或更多、至少600个核苷酸或更多、至少650个核苷酸或更多、至少700个核苷酸或更多、至少750个核苷酸或更多。

关于多肽序列的“片段”或“免疫原性片段”是指一种多肽，其能够在哺乳动物中诱发与本文公开的抗原交叉反应的免疫响应。片段可以是选自以下多种氨基酸序列中的至少一种的多肽片段。共同蛋白质的片段能够包含共同蛋白质的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，不包括所添加的任何异源信号肽。所述片段可以包含下述一种或多种氨基序列的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％并且另外任选地包含异源信号肽，当计算一致性百分比时，异源信号肽不包括在内。片段可以进一步包含信号肽，例如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。

在一些实施例中，共同蛋白质的片段可以包含本文所公开的蛋白质序列中的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多、至少240个氨基酸或更多、至少250个氨基酸或更多，或至少260个氨基酸或更多。

如本文所用，术语“基因构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号，能够引导核酸分子所施用的受试者的细胞表达。如本文所用，术语“可表达形式”是指一种基因构建体，其含有可操作地连接到编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，以便当存在于受试者的细胞时，编码序列受到表达。

如本文所用，术语“同源性”是指互补程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即，一致性)。使用功能术语“基本上同源”提及部分互补序列，其至少部分地抑制完全互补序列与靶核酸杂交。当结合双链核酸序列(例如cDNA或基因组克隆)使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针能够与双链核酸序列的链在低严格度的条件下杂交。当结合单链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针能够与单链核酸模板序列在低严格度的条件下杂交(即，补体)。

如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的上下文中所用，“一致”或“一致性”是指序列中的指定百分比的残基在指定区域内相同。所述百分比能够如下计算：将两个序列最优地对齐，在指定区域内比较两个序列，测定两个序列中存在相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中的位置总数，并且将结果乘以100而产生序列一致性百分比。在两个序列具有不同长度或对齐产生一或多个交错末端并且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，将单个序列的残基纳入计算的分母而非分子中。比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)与尿嘧啶(U)能视为等效的。一致性能够以人工方式或通过使用计算机序列算法(例如BLAST或BLAST 2.0)执行。

当论述反馈机理时，可以使用如本文所用的“阻抗”并且能够根据欧姆定律(Ohm'slaw)换算成电流值，从而能够与预设电流比较。

如本文所用，“免疫响应”是指宿主免疫系统(例如哺乳动物的免疫系统)响应于抗原的引入而激活。免疫响应可以呈细胞或体液响应的形式，或两者。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“聚核苷酸”是指至少两个核苷酸共价连接在一起。单链的描绘还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘单链的互补链。核酸的许多变异体能够用于与指定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖基本上一致的核酸和其补体。单链提供了能够与靶序列在严格杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或能够含有双链和单链序列的一部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA或杂合体，其中核酸能够含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸能够通过化学合成方法或重组方法获得。

如本文所用的“可操作地连接”是指基因在与其空间连接的启动子控制下表达。启动子能够定位于处于其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离能够与所述启动子和产生启动子的基因中由其控制的基因之间的距离大致相同。如所属领域中已知，能够适应这个距离的变化而不损失启动子功能。

如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以指所连接的氨基酸序列并且可以是天然的、合成的，或天然的与合成的变型或组合。

如本文所用的“启动子”是指一种合成或天然来源的分子，其能够赋予、激活或增强细胞中的核酸表达。启动子能够包含一或多个特定转录调控序列以进一步增强表达和/或改变核酸在细胞中的空间表达和/或暂时表达。启动子还能够包含远端增强或抑制元件，其定位相对于转录起始位点多达数千个碱基对。启动子能够来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。就其中发生表达的细胞、组织或器官而言，或就表达发生的发育阶段而言，或响应于外部刺激(例如生理性应激、病原体、金属离子或诱导剂)，启动子能够在组成上或以不同方式调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括细菌噬菌体T7启动子、细菌噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMVIE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换地使用并且是指能够在本文所述蛋白质的氨基端连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列典型地引导蛋白质定域。本文所用的信号肽/前导序列优先促进蛋白质从产生其的细胞中分泌出来。所述蛋白质(通常称为成熟蛋白质)从细胞中分泌出来后，信号肽/前导序列通常与蛋白质的其余部分裂解。信号肽/前导序列连接于蛋白质的氨基端(即，N端)。

如本文所用，“严格杂交条件”是指第一核酸序列(例如探针)与第二核酸序列(例如靶标)杂交的条件，例如在核酸的复杂混合物中。严格条件与序列相关且在不同情况下是不同的。可以选择比特定序列在所限定的离子强度pH下的热熔点(Tm)低约5-10℃的严格条件。Tm可以是50％的与靶标互补的探针与靶序列杂交处于平衡(当靶序列过量存在时，在Tm下，50％探针在平衡时被占据)时的温度(在限定的离子强度、pH和核浓度下)。严格条件可以是如下条件，其中盐浓度小于约1.0M钠离子，例如在pH 7.0到8.3时为约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度就短探针(例如约10-50个核苷酸)而言是至少约30℃并且就长探针(例如超过约50个核苷酸)而言为至少约60℃。严格条件还能够通过添加去稳定化剂(例如甲酰胺)来实现。就选择性或特异性杂交而言，正信号可以是背景杂交的至少2到10倍。示例性的严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS、在42℃培育，或5xSSC、1％SDS、在65℃培育，在65℃、在0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤。

如本文所用，“受试者”可以指想要或需要用本文所述的疫苗免疫的哺乳动物。哺乳动物可以是人、黑猩猩、犬、猫、马、奶牛、小鼠或大鼠。

如本文所用，“基本上互补”是指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或所述两个序列在严格杂交条件下杂交。

如本文所用，“基本上一致”是指第一序列与第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或就核酸而言，第一序列与第二序列的补体基本上互补。

如本文所用，“治疗(Treat/treatment/treating)”可以指通过预防、抑制、遏制或完全消除疾病的方式保护动物以免患病。预防疾病涉及在疾病发作之前将本发明的疫苗施用于动物。抑制疾病涉及在诱发疾病之后但在其临床表现之前将本发明的疫苗施用于动物。遏制疾病涉及在疾病存在临床表现后将本发明的疫苗施用于动物。

如本文关于核酸使用的“变异体”是指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其一部分的补体；(iii)与参考核酸或其补体基本上一致的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上一致的序列杂交的核酸。

如本文关于肽或多肽所用的“变异体”是指氨基酸序列因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而不同、但保持至少一种生物活性的肽或多肽。变异体还能指氨基酸序列与参考蛋白质基本上一致、但氨基酸序列保持至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守取代(即，氨基酸被具有类似特性(例如带电荷区域的亲水性、程度和分布)的不同氨基酸置换)在所属领域中被认为是典型地涉及微小变化。这些微小变化能够部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如所属领域中所了解。Kyte等人,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。所属领域中已知亲水指数类似的氨基酸能够被取代并且仍保持蛋白质功能。在一个方面中，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还能用于揭露使蛋白质保持生物功能的取代。在肽的情况下考虑氨基酸的亲水性容许计算所述肽的最大局部平均亲水性，这是一种有用的量度，据报道与抗原性和免疫原性紧密相关。美国专利第4,554,101号，其以引用的方式完整并入本文中。亲水值类似的氨基酸的取代能够使肽保持生物活性，例如免疫原性，如所属领域中所了解。取代能够用亲水值在彼此±2内的氨基酸进行。氨基酸的疏水性指数和亲水值受所述氨基酸的特定侧链影响。与观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代应理解为依赖于氨基酸的相对相似性，具体地说，那些氨基酸的侧链的相对相似性，如根据疏水性、亲水性、电荷、尺寸和其它特性所揭露。

变异体可以是在全基因序列或其片段的全长上基本上一致的核酸序列。核酸序列在基因序列或其片段的全长上可以80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。变异体可以是氨基酸序列或其片段的全长上基本上一致的氨基酸序列。氨基酸序列在氨基酸序列或其片段的全长上可以80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。

如本文所用，“载体”是指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自复制染色体外载体，并且优选DNA质粒。载体能够含有或包括一或多种异源核酸序列。

疫苗

本文提供了包含如本文所述的LEMD1抗原或编码LEMD1抗原的核酸的疫苗。在一些实施例中，疫苗包含一或多种编码如本文所述的LEMD1抗原的核酸分子。在一些实施例中，疫苗包含一或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码氨基酸的核酸序列。在一些实施例中，一或多种核酸分子编码抗原。在一些实施例中，核酸分子包含一或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:1的核苷酸55到600；(b)SEQ ID NO:3的核苷酸55到258；(c)SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819；(d)在包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到600的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(e)在包含SEQ ID NO:3的核苷酸55到258的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(f)在包含SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的片段；(h)与SEQ ID NO:3的核苷酸55到258至少95％一致的片段；(i)与SEQ IDNO:5的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的片段；(j)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段；(k)在与SEQ ID NO:3的核苷酸55到258至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及(l)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段。在本发明的一些实施例中，核酸分子编码包含氨基酸序列的蛋白质和肽，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198；(b)SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84；(c)SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271；(d)在SEQ IDNO:2的氨基酸残基19到198的整个长度中占至少90％的片段；(e)在SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84的整个长度中占至少90％的片段；(f)在SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271的整个长度中占至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于95.6％一致的氨基酸序列；(h)与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于95.5％一致的氨基酸序列；(i)与SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271至少95％一致的氨基酸序列；(j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸序列19到198大于95.6％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；(k)在与SEQ ID NO:4的氨基酸序列19到84大于95.5％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及(l)在与SEQ ID NO:6的氨基酸序列19到198和206和271至少95％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段。

在本公开的一些方面中，疫苗包含抗原，其中所述抗原包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198；(b)SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84；(c)SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271；(d)在SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198的整个长度中占至少90％的片段；(e)在SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84的整个长度中占至少90％的片段；(f)在SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271的整个长度中占至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于95.6％一致的氨基酸序列；(h)与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于95.5％一致的氨基酸序列；(i)与SEQ IDNO:6的氨基酸残基19到198和206到271至少95％一致的氨基酸序列；(j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸序列19到198大于95.6％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；(k)在与SEQ ID NO:4的氨基酸序列19到84大于95.5％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及(l)在与SEQ ID NO:6的氨基酸序列19到198和206和271至少95％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段。

在本公开的一些方面中，疫苗包含核酸分子，其中所述核酸分子包含在SEQ IDNO:1、3或5所示的核酸序列的整个长度上具有至少约95％一致性的核酸序列。在一些方面中，疫苗包含核酸分子，其中所述核酸分子编码肽，所述肽包含在SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列的整个长度上分别具有至少约95.6％、95.5％或95％一致性的氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，存在于疫苗中的核酸分子包含表达载体。在一些实施例中，疫苗进一步包含药学上可接受的赋形剂，并且在一些实施例中，疫苗进一步包含佐剂，所述佐剂在实施例的一些方面中可以是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES

在一些实施例中，疫苗包含肽，其中所述肽包含在SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列的整个长度上分别具有至少约95.6％、95.5％或95％一致性的氨基酸序列。在其它实施例中，疫苗包含肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列。

疫苗能够在受试者中产生针对抗原的免疫响应。免疫响应可以是治疗性或预防性免疫响应。

疫苗可以用于预防癌症，例如表达LEMD1的癌症或肿瘤。疫苗能够用于预防和/或治疗有需要的受试者的表达LEMD1的肿瘤。疫苗能够诱导针对LEMD1和针对表达LEMD1的肿瘤的细胞和/或抗体响应。

如本文所述的癌症疫苗的研发包含鉴定免疫系统不能识别并且是自身抗原的癌症抗原，例如LEMD1。为了被免疫系统识别，将所鉴定的癌症抗原从自身抗原变为外来抗原。重组癌症抗原的核酸和氨基酸序列从自身抗原到外来抗原的再设计破坏了免疫系统对抗原的耐受性。为了破坏耐受性，能够将若干种再设计措施应用于癌症抗原，如下文所述。

疫苗中的重组癌症抗原不能作为自身抗原被识别，借此破坏耐受性。破坏耐受性能够诱导抗原特异性T细胞和/或高效价抗体响应，借此诱导或诱发针对表达抗原的癌症或肿瘤或对表达抗原的癌症或肿瘤具有反应性的免疫响应。在一些实施例中，诱导或诱发的免疫响应可以是细胞、体液免疫响应，或细胞与体液免疫响应。在一些实施例中，诱导或诱发的细胞免疫响应可以包括诱导或分泌干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。在其它实施例中，诱导或诱发的免疫响应能够减少或抑制一或多种促进表达所述抗原的肿瘤或癌症生长的免疫抑制因子，例如(但不限于)下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调控T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子(例如IL-10和TFG-β)、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关纤维母细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子。

疫苗能够使无肿瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％和45％。疫苗在免疫接种之后，能够使肿瘤质量减少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。疫苗能够预防和阻止单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(一种由骨髓源抑制细胞分泌的细胞因子)增加。疫苗能够使肿瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。

相较于未施用疫苗的受试者的细胞免疫响应，疫苗能够使施用疫苗的受试者的细胞免疫响应增加约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍，或约300倍至约6000倍。在一些实施例中，相较于未施用疫苗的受试者的细胞免疫响应，疫苗能够使施用疫苗的受试者的细胞免疫响应增加约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

相较于未施用疫苗的受试者中的干扰素γ(IFN-γ)水平，疫苗能够使施用疫苗的受试者中的IFN-γ水平增加约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍，或约300倍至约6000倍。在一些实施例中，相较于未施用疫苗的受试者中的IFN-γ水平，疫苗能够使施用疫苗的受试者中的IFN-γ水平增加约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

所述疫苗可以是DNA疫苗。美国专利第5,593,972号、第5,739,118号、第5,817,637号、第5,830,876号、第5,962,428号、第5,981,505号、第5,580,859号、第5,703,055号和第5,676,594号公开了DNA疫苗，所述美国专利以引用的方式完整并入本文中。DNA疫苗可以进一步包含抑制其整合到染色体中的元件或试剂。

疫苗可以是一或多种癌症抗原的RNA。RNA疫苗能够引入细胞中。

疫苗可以是减毒的活疫苗、使用重组载体递送抗原的疫苗、亚单元疫苗和糖蛋白疫苗，例如(但不限于)以下美国专利号中所述的疫苗：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319和6,589,529所述专利各自以引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，疫苗可以进一步包含分子佐剂；在一些情况下，分子佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES，并且在一些情况下，分子佐剂是检查点抑制剂，包括抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、抗程序性死亡受体-1(PD-1)和抗淋巴细胞激活基因(LAG-3)。在一些实施例中，核酸疫苗可以进一步包含分子佐剂的编码序列；在一些情况下，分子佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES，并且在一些情况下，分子佐剂是检查点抑制剂，包括抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、抗程序性死亡受体-1(PD-1)和抗淋巴细胞激活基因(LAG-3)。IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码序列可以包括于一或多种核酸分子上，所述一或多种核酸分子包含一或多种抗原的编码序列。IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码序列可以包括于单独的核酸分子上，例如单独的质粒。

本发明的疫苗能够具有有效疫苗所需的特征，例如安全，使得疫苗自身不引起疾病或死亡；预防疾病；诱导中和抗体；诱导保护T细胞响应；以及易施用、几乎没有副作用、生物学稳定性和单位剂量成本低。疫苗通过含有如下文所论述的癌症抗原而能够完成这些特征中的一些或全部。

疫苗能够进一步包含一或多种免疫检查点分子的一或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子更详细地描述于下文。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分(例如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、任何细胞因子、趋化因子或用于免疫细胞增殖和/或分化的信号传导)被抑制的任何核酸或蛋白质。还如下文更详细地描述，疫苗可以进一步与抗体组合，直至与检查点抑制剂(例如PD-1和PDL-1)组合，以增加细胞与体液免疫响应的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体阻止PD-1或PDL-1抑制T细胞和/或B细胞响应。

抗原

如上文所述，疫苗能够包含LEMD1抗原或编码LEMD1抗原的核酸分子。抗原可以是LEMD1、其片段、其变异体或其组合。

疫苗能够用于治疗罹患表达LEMD1的癌症的受试者。疫苗还能够用于治疗患有表达LEMD1的癌症或肿瘤的受试者或用于预防受试者中的此类肿瘤的发展。LEMD1抗原能够不同于原生“正常”LEMD1基因，并且因此提供针对表达LEMD1抗原的肿瘤的治疗或预防。相应地，本文提供了不同于原生LEMD1基因的LEMD1抗原序列(即，突变的LEMD1基因或序列)。举例来说，本公开的一些方面提供了包含核酸分子的疫苗，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1、3或5中所示的核酸序列，并且一些方面提供了包含核酸分子的疫苗，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列的核酸序列。在包含核酸分子的疫苗的一些方面中，所述核酸分子包含一或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:1的核苷酸55到600；(b)SEQ ID NO:3的核苷酸55到258；(c)SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819；(d)在包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到600的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(e)在包含SEQ ID NO:3的核苷酸55到258的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(f)在包含SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的片段；(h)与SEQ ID NO:3的核苷酸55到258至少95％一致的片段；(i)与SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的片段；(j)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段；(k)在与SEQ ID NO:3的核苷酸55到258至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及(l)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段。

提供了经分离的核酸分子，其包含上述异源序列。提供了经分离的核酸分子，其由上述异源序列组成。可以将包含上述异源序列的经分离的核酸分子并入载体中，例如质粒、病毒载体和如下文所述的其它形式的核酸分子中。本文提供了编码LEMD1抗原的核酸序列。编码LEMD1抗原的编码序列具有如上文所述的序列。

提供了包含上述异源氨基酸序列的蛋白质分子。提供了由上述异源氨基酸序列组成的蛋白质分子。本文提供了具有上述序列的蛋白质和多肽。本公开的一些实施例提供了一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198；(b)SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84；(c)SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271；(d)在SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198的整个长度中占至少90％的片段；(e)在SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84的整个长度中占至少90％的片段；(f)在SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271的整个长度中占至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于95.6％一致的氨基酸序列；(h)与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于95.5％一致的氨基酸序列；(i)与SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271至少95％一致的氨基酸序列；(j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸序列19到198大于95.6％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；(k)在与SEQ ID NO:4的氨基酸序列19到84大于95.5％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及(l)在与SEQ ID NO:6的氨基酸序列19到198和206和271至少95％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段。

所述蛋白质和多肽可以称为LEMD1抗原和LEMD1免疫原。LEMD1抗原能够诱发针对表达LEMD1抗原的癌细胞和肿瘤的免疫响应。

在本发明的一个方面中，希望共同抗原提供改善的转录和翻译，包括具有以下中的一种或多种：低GC含量前导序列以增加转录；mRNA稳定性和密码子优化以及尽可能地排除顺式作用序列基序(即，内部TATA盒)。

在本发明的一些方面中，希望产生共同抗原，所述共同抗原产生跨越多个株系的广泛免疫响应，包括具有以下中的一种或多种：合并所有可获得的全长序列；计算机产生的序列，其利用在每个位置最常出现的氨基酸；以及增强株系之间的交叉反应性。

LEMD1抗原可以是来源于两种或更多种物种的共同抗原(或免疫原)序列。LEMD1抗原能够包含用于改善表达的共同序列和/或修饰。修饰能够包括密码子优化、RNA优化、添加Kozak序列(例如GCC ACC)以便增加翻译起始，和/或添加免疫球蛋白前导序列以增加LEMD1抗原的免疫原性。LEMD1抗原能够包含信号肽，例如免疫球蛋白信号肽，例如(但不限于)免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。在一些实施例中，LEMD1共同抗原能够包含血球凝集素(HA)标签。LEMD1共同抗原能够设计成诱发比相应密码子优化LEMD1抗原更强和更宽的细胞和/或体液免疫响应。

LEMD1共同抗原能够包含一或多个突变，借此诱发比相应密码子优化LEMD1抗原更强且更宽的细胞和/或体液免疫响应。

LEMD1共同抗原可以是核酸SEQ ID NO:1的核苷酸55到600，其编码SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198。在一些实施例中，LEMD1共同抗原可以是在SEQ ID NO:1所示的核酸序列的整个长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在其它实施例中，LEMD1共同抗原可以是核酸序列，其编码在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的整个长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。

LEMD1共同抗原可以是核酸SEQ ID NO:3的核苷酸55到258，其编码SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84。在一些实施例中，LEMD1共同抗原可以是在SEQ ID NO:3所示的核酸序列的整个长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在其它实施例中，LEMD1共同抗原可以是核酸序列，其编码在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的整个长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。

LEMD1共同抗原可以是核酸SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819，其编码SEQID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271。在一些实施例中，LEMD1共同抗原可以是在SEQID NO:5所示的核酸序列的整个长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。在其它实施例中，LEMD1共同抗原可以是核酸序列，其编码在SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的整个长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。

LEMD1抗原能够包含用于改善表达的修饰。修饰能够包括密码子优化、RNA优化、添加Kozak序列(例如GCC ACC)以便增加翻译起始，和/或添加免疫球蛋白前导序列以增加抗原的免疫原性。LEMD1抗原能够包含信号肽，例如免疫球蛋白信号肽，例如(但不限于)免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。

LEMD1抗原能够包含用于抗原决定基优化的修饰。在一些实施例中，可以将此类裂解位点插入多个LEMD1抗原序列之间。裂解位点可以是弗林蛋白酶裂解位点。

疫苗与免疫检查点抑制剂的组合

疫苗能够进一步包含一或多种免疫检查点分子的一或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子更详细地描述于下文。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分(例如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、任何细胞因子、趋化因子或用于免疫细胞增殖和/或分化的信号传导)被抑制的任何核酸或蛋白质。

此类抑制剂可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变异体、其片段或其组合。核酸还能够包括编码接头或标签序列的其它序列，所述接头或标签序列通过肽键连接到免疫检查点抑制剂。小分子可以是低分子量(例如小于800道尔顿)有机或无机化合物，其能够充当酶底物、蛋白质或核酸所结合的配体(或其类似物)，或生物过程的调节因子。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变异体、其片段，或其组合。

在一些实施例中，免疫检查点抑制剂可以是一或多种核酸序列，其编码抗体、其变异体、其片段或其组合。在其它实施例中，免疫检查点抑制剂可以是抗体、其变异体、其片段或其组合。

1.免疫检查点分子

免疫检查点分子可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变异体、其片段或其组合。核酸还能够包括编码接头或标签序列的其它序列，所述接头或标签序列通过肽键连接到免疫检查点抑制剂。小分子可以是低分子量(例如小于800道尔顿)有机或无机化合物，其能够充当酶底物、蛋白质或核酸所结合的配体(或其类似物)，或生物过程的调节因子。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变异体、其片段，或其组合。

a.PD-1和PD-L1

免疫检查点分子可以是程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序化细胞死亡配体1(PD-L1)、其片段、其变异体，或其组合。PD-1是由PDCD1基因编码的细胞表面蛋白质。PD1是免疫球蛋白超家族的成员并且在T细胞和前B细胞上表达，并且因此影响这些细胞的命运和/或分化。确切地说，PD1是T细胞调控因子的CD28/CTLA-4家族的1型膜蛋白并且负向调控T细胞受体(TCR)信号，借此负向调控免疫响应。PD-1能够负向调控CD8+T细胞响应，并且从而抑制CD8介导的细胞毒性且增强肿瘤生长。

PD-1具有两种配体：PD-L1和PD-L2，其是B7家族成员。响应于LPS和GM-CSF治疗，PD-L1在巨噬细胞和树突状细胞(DC)上受到上调，并且在TCR和B细胞受体信号传导后，在T细胞和B细胞上受到上调。PD-L1由多种肿瘤细胞株表达，包括骨髓瘤、肥大细胞瘤和黑色素瘤。

2.抗免疫检查点分子抗体

如上文所述，免疫检查点抑制剂可以是抗体。抗体能够结合或与抗原(即，上述免疫检查点分子)反应。因此，抗体可以被视为抗免疫检查点分子抗体或免疫检查点分子抗体。抗体能够由所含的核酸序列编码。

抗体能够包括重链多肽和轻链多肽。重链多肽能够包括重链可变(VH)区和/或至少一个重链恒定(CH)区。至少一个重链恒定区能够包括重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)和/或铰链区。

在一些实施例中，多肽重链能够包括VH区和CH1区。在其它实施例中，多肽重链能够包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。

多肽重链能够包括互补决定区(“CDR”)集合。CDR集合能够含有VH区的三个高变区。从多肽重链的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。多肽重链的CDR1、CDR2和CDR3能够促成抗原的结合或识别。

多肽轻链能够包括轻链可变(VL)区和/或轻链恒定(CL)区。多肽轻链能够包括互补决定区(“CDR”)集合。CDR集合能够含有VL区的三个高变区。从多肽轻链的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。多肽轻链的CDR1、CDR2和CDR3能够促成抗原的结合或识别。

抗体可以包含分别置入重链与轻链构架(“FR”)集合之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)集合，所述构架集合向CDR提供支撑并且界定CDR相对于彼此的空间关系。CDR集合可以含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可以包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR集合。

抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白能够包括多肽重链和多肽轻链。免疫球蛋白的多肽重链能够包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的多肽轻链能够包括VL区和CL区。

另外，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先使IgG分子裂解以产生若干片段，其中两者(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。酶胃蛋白酶能够使IgG分子裂解以提供若干片段，包括F(ab')₂片段，其包含两个抗原结合位点。因此，抗体可以是Fab或F(ab')₂。Fab能够包括多肽重链和多肽轻链。Fab的多肽重链能够包括VH区和CH1区。Fab的轻链能够包括VL区和CL区。

抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的抗体，其结合具有来自非人物种的一或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的所期望抗原。

a.PD-1抗体

抗免疫检查点分子抗体可以是抗PD-1抗体(在本文中也称为“PD-1抗体”)、其变异体、其片段，或其组合。PD-1抗体可以是尼沃单抗(Nivolumab)。抗PD-1抗体能够抑制PD-1活性，借此诱导、诱发或增强针对肿瘤或癌症的免疫响应和减少肿瘤生长。

b.PD-L1抗体

抗免疫检查点分子抗体可以是抗PD-L1抗体(在本文中也称为“PD-L1抗体”)、其变异体、其片段，或其组合。抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1活性，借此诱导、诱发或增强针对肿瘤或癌症的免疫响应和减少肿瘤生长。

载体

疫苗能够包含一或多种载体，所述载体包括编码LEMD1抗原的异源核酸。一或多种载体能够以有效诱发哺乳动物的免疫响应的数量表达抗原。载体可以包含编码抗原的异源核酸。载体能够具有含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是自复制染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。

一或多种载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体进入细胞内部，则通过细胞转录和翻译机制核糖体复合物产生由基因编码的蛋白质。质粒频繁地被工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区域并且使表达载体上所携带的基因有效转录。本发明的载体表达大量的稳定信使RNA，且因此表达大量的蛋白质。

载体可以具有表达信号，例如强启动子、强终止密码子，调整启动子与克隆基因之间的距离，以及插入转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列)。

载体可以包含可操作地连接到调控元件的核酸序列，所述调控元件选自启动子和聚腺苷酸化信号。在一些实施例中，启动子是人巨细胞病毒即刻早期启动子(hCMV启动子)。在一些实施例中，聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH polyA)。

载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒或线性核酸能够引导特定核苷酸序列在适当的受试者细胞中的表达。载体能够具有可操作地连接到抗原编码核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接到终止信号。载体还能够含有核苷酸序列正确翻译所必需的序列。包含所关注核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着载体组分中的至少一种相对于载体其它组分中的至少一种组分是异源的。核苷酸序列在表达盒中的表达可以处于组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述组成型启动子或诱导型启动子仅当宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时起始转录。在多细胞生物体的情况下，启动子还能够对特定组织或器官或发育阶段具有特异性。载体可以是质粒。质粒可以适用于与编码抗原的核酸一起转染细胞，将已转化的宿主细胞在发生抗原表达的条件下培养且维持。

质粒可以包含编码上文公开的多种抗原中的一种或多种的核酸序列，包括编码合成共同抗原的编码序列，所述共同抗原能够诱发针对抗原、此类蛋白质的片段、此类蛋白质的变异体、变异体片段或融合蛋白的免疫响应，所述融合蛋白由共同蛋白质和/或共同蛋白质的片段和/或共同蛋白质的变异体和/或共同蛋白质变异体的片段的组合构成。

单一质粒可以含有单一抗原的编码序列、两种抗原的编码序列、三种抗原的编码序列或四种抗原的编码序列。在一些实施例中，质粒可以进一步包含单独或作为这些质粒之一的一部分的编码CCR20的编码序列。类似地，质粒可以进一步包含IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列。

质粒可以进一步包含可以位于编码序列上游的起始密码子，和可以位于编码序列下游的终止密码子。起始和终止密码子可以与编码序列同框。

质粒还可以包含可操作地连接到编码序列的启动子。可操作地连接到编码序列的启动子可以是猴病毒40(SV40)启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子(例如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、细胞巨大病毒(CMV)启动子(例如CMV即刻早期启动子)、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)启动子，或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因(例如人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白)的启动子。启动子还可以是天然或合成的组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例描述于美国专利申请公开号US20040175727中，所述美国专利申请公开的内容全部并入本文中。

质粒还可以包含可以位于编码序列下游的聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号，或人β-球蛋白聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒的聚腺苷酸化信号(英杰公司(Invitrogen)，加州圣地亚哥(San Diego,CA))。

质粒还可以包含编码序列上游的增强子。增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，例如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。聚核苷酸功能增强子描述于美国专利第5,593,972号、第5,962,428号和W094/016737中，其各自的内容以引用的方式完全并入。

质粒还可以包含哺乳动物复制起点，以便在染色体外维持质粒且在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是得自英杰公司(加州圣地亚哥)的p V AXI、pCEP4或pREP4，其可以包含埃-巴二氏病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，从而可以在不整合的情况下产生高拷贝游离型复制。质粒的主链可以是pA V0242。质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)质粒。

质粒还可以包含调控序列，其可以较好地适用于其中施用质粒的细胞中的基因表达。编码序列可以包含可以使得编码序列在宿主细胞中更有效转录的密码子。

编码序列还可以包含Ig前导序列。前导序列可以位于编码序列的5'。由这个序列编码的共同抗原可以包含N端Ig前导序列，继之为共同抗原蛋白质。N端Ig前导序列可以是IgE或IgG。

质粒可以是pSE420(英杰公司，加州圣地亚哥)，其可以用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白质。质粒还可以是p YES2(英杰公司，加州圣地亚哥)，其可以用于在酵母的酿酒酵母株中产生蛋白质。质粒还可以是MAXBACTM完整杆状病毒表达系统(英杰公司，加州圣地亚哥)的质粒，其可以用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒还可以是pcDNA I或pcDNA3(英杰公司，加州圣地亚哥)，其可以用于在哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中产生蛋白质。载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中来转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。

载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。

本文还提供了一种线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效递送到受试者中并且表达一或多种所期望抗原。LEC可以是缺乏任何磷酸酯主链的任何线性DNA。DNA可以编码一或多种抗原。LEC可以含有启动子、内含子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。抗原表达可以通过启动子控制。LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸酯主链。LEC可以不含有与所期望的抗原基因表达无关的其它核酸序列。LEC可以来源于能够线性化的任何质粒。质粒能够表达抗原。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(NewCaledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能够将序列翻译成被免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别来源于pNP(Puerto Rico/34)和pM2(NewCaledonia/99)。

载体可以具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达和调控经分离的核酸表达的任何启动子。此类启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶转录所必需的顺式作用序列元件，其转录本文所述的抗原序列。用于引导异源核酸表达的启动子的选择视具体应用而定。启动子可以定位于载体中的距转录起点一定距离处，所述距离与其天然背景下距转录起点的距离大约距离。然而，在启动子功能无损失的情况下，可以允许这种距离的变化。

启动子可以可操作地连接到编码抗原的核酸序列以及转录物有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。

启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或显示在真核细胞中有效表达的其它启动子。

载体可以包括具有功能剪接供体和受体位点的增强子和内含子。载体可以含有结构基因下游的转录终止区以实现有效终止。终止区可以获自与启动子序列相同的基因或可以获自不同基因。

制备载体的方法

本文提供了制备载体的方法，所述载体包含编码本文所论述的LEMD1抗原的核酸分子。使用所属领域中已知的方法能够将最终亚克隆到哺乳动物表达质粒的步骤之后的载体接种到大型发酵槽的细胞培养液中。

使用已知装置和技术的组合能够配制或制造下文更详细所述的EP装置所用的载体，但其优选使用同在申请中的已许可美国临时申请美国U.S.第60/939,792号(2007年5月23日提交)中所述的优化质粒制造技术制造。在一些实例中，这些研究中所用的DNA质粒能够以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除U.S.第60/939792号所述的那些之外，制造技术还包括或合并所属领域的技术人员通常已知的各种装置和方案，包括已许可的专利美国专利第7,238,522号(2007年7月3日授权)中所述的那些。以上提及的申请和专利、US第60/939,792号和美国专利第7,238,522号分别完整并入本文中。

疫苗的赋形剂和其它组分

疫苗可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，例如媒剂、载剂或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freunds incompleteadjuvant)、LPS模拟物(包括单磷酰脂质A、胞壁酰基肽)、醌类似物、囊泡(例如角鲨烯和角鲨烯)、玻糖醛酸、脂质、脂质粒、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)，或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且所述聚-L-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS模拟物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰基肽、醌类似物和囊泡，例如角鲨烯和角鲨烯，并且玻糖醛酸也可以联合基因构建体施用。DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂，例如脂质、脂质粒，包括卵磷脂脂质粒或所属领域中已知的其它脂质粒作为DNA-脂质粒混合物(参见例如W09324640)；钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)，或脂质。转染剂在疫苗中的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可以是一或多种佐剂。佐剂可以是替代质粒中表达或作为蛋白质与上述质粒的组合在疫苗中递送的其它基因。一或多种佐剂可以选自由以下组成的组：CCL20、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、胸腺上皮表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1～、IL-8、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、纤维母细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、凋亡蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2、IL-15，其已缺失信号序列或编码信号序列的编码序列并且任选地包括不同信号肽，例如来自IgE的信号肽，或编码不同信号肽(例如来自IgE的信号肽)的编码序列，和其功能片段，或其组合。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

在一些实施例中，佐剂可以是一或多种蛋白质和/或编码蛋白质的核酸分子，其选自由以下组成的组：CCL-20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC或RANTES。IL-12构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1997/019502号和对应的美国申请第08/956,865号和美国临时申请第61/569600号(2011年12月12日提交)中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。IL-15构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US04/18962号和对应的美国申请第10/560,650号，以及PCT申请第PCT/US07/00886号和对应的美国申请第12/160,766号，以及PCT申请第PCT/USI0/048827号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US09/039648号和对应的美国申请第12/936,192号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。RANTES和其它构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1999/004332和对应的美国申请第09/622452号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请第PCT/US11/024098号中，所述申请以引用的方式并入本文中。RANTES和其它构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1999/004332和对应的美国申请第09/622452号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请第PCT/US11/024098号中，所述申请以引用的方式并入本文中。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US2005/042231号和对应的美国申请第11/719,646号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。OX40和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请第10/560,653号中，所述申请以引用的方式并入本文中。DR5和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请第09/622452号中，所述申请以引用的方式并入本文中。

能够适用作佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、纤维母细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、凋亡蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2和其功能片段。

疫苗可以进一步包含如U.S.第021,579号(1994年4月1日提交)中所述的基因疫苗促进剂，所述文献以引用的方式全部并入。

疫苗可以约1纳克到100毫克、约1微克到约10毫克或优选约0.1微克到约10毫克或更优选约1毫克到约2毫克的数量包含抗原和质粒。在一些优选实施例中，根据本发明的疫苗包含约5纳克到约1000微克DNA。在一些优选实施例中，疫苗能够含有约10纳克到约800微克DNA。在一些优选实施例中，疫苗能够含有约0.1到约500微克DNA。在一些优选实施例中，疫苗能够含有约1到约350微克DNA。在一些优选实施例中，疫苗能够含有约25到约250微克、约100到约200微克、约1纳克到100毫克、约1微克到约10毫克、约0.1微克到约10毫克、约1毫克到约2毫克、约5纳克到约1000微克、约10纳克到约800微克、约0.1到约500微克、约1到约350微克、约25到约250微克、约100到约200微克的抗原或其质粒。

疫苗能够根据待使用的施药方式配制。可注射的疫苗医药组合物可以是无菌的、不含热原质的以及不含微粒的。能够使用等张性配制物或溶液。等张性添加剂能够包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。疫苗能够包含血管收缩剂。等张性溶液能够包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗能够进一步包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂能使配制物在室温或环境温度下稳定延长的时间段，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

疫苗的医药组合物

疫苗能够呈医药组合物的形式。医药组合物能够包含疫苗。医药组合物能够包含约5纳克(ng)到约10毫克(mg)的疫苗DNA。在一些实施例中，根据本发明的医药组合物包含约25ng到约5mg的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约50ng到约1mg的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约0.1到约500微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约1至约350微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约5到约250微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约10到约200微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约15到约150微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约20到约100微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约25到约75微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约30到约50微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约35到约40微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物含有约100到约200微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物包含约10微克到约100微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物包含约20微克到约80微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物包含约25微克到约60微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物包含约30ng到约50微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物包含约35ng到约45微克的疫苗DNA。在一些优选实施例中，医药组合物含有约0.1到约500微克的疫苗DNA。在一些优选实施例中，医药组合物含有约1到约350微克的疫苗DNA。在一些优选实施例中，医药组合物含有约25到约250微克的疫苗DNA。在一些优选实施例中，医药组合物含有约100到约200微克的疫苗DNA。

在一些实施例中，根据本发明的医药组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物能够包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物能够包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗DNA。

在其它实施例中，医药组合物能够包含至多且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物能够包含至多且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物能够包含至多且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg的疫苗DNA。

根据待使用的施药方式，医药组合物能进一步包含用于配制目的的其它药剂。在医药组合物是可注射医药组合物的情况下，它们是无菌的、不含热原质的以及不含微粒的。优选使用等张性配制物。一般来说，等张性添加剂能够包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。在一些情况下，优选等张溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施例中，将血管收缩剂添加到配制物中。

疫苗能够进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，例如载剂、佐剂、载剂或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂。

在一些实施例中，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)，或脂质。在一个实施例中，转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且更优选地，所述聚-L-谷氨酸盐以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还能够包括表面活性剂，例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS模拟物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰基肽、醌类似物和囊泡，例如角鲨烯和角鲨烯，并且玻糖醛酸也可以联合基因构建体施用。在一些实施例中，转染促进剂能够包含脂质、脂质粒，包括卵磷脂脂质粒或所属领域中已知的其它脂质粒作为DNA-脂质粒混合物(参见例如W09324640)；钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。转染剂在疫苗中的浓度可以小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。佐剂可以是在一或多种替代质粒中表达或作为蛋白质与上述质粒的组合在疫苗中递送的其它基因。佐剂能选自由以下组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、胸腺上皮表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括信号序列已缺失并且任选地包括来自IgE的信号肽的IL-15。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。在一个示例性实施例中，佐剂是IL-12。

能够作为适用佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、纤维母细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、凋亡蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2和其功能片段。

疫苗接种方法

本文提供了使用上述医药配制物治疗和/或预防表达LEMD1的癌症的方法。本文还描述使用上述医药配制物治疗和/或预防受试者的癌症的方法。本文还描述了受试者接种疫苗的方法。本文还描述了向有需要的受试者施用本文所述的医药配制物的方法。本文所述的方法(统称为使用本文所述的医药配制物治疗的方法)能够包含向有需要的受试者施用一或多种如本文所述的疫苗以诱导治疗性和/或预防性免疫响应。能够将疫苗施用于受试者以调节受试者免疫系统的活性且增强免疫响应。疫苗的施用可以是将如本文所公开的癌症抗原以核酸分子形式转染，使其在细胞中表达并且递送到细胞表面，之后，免疫系统识别且诱导细胞、体液响应，或细胞与体液响应。疫苗的施用通过将如本文所论述的疫苗施用于受试者而能够用于诱导或诱发受试者产生针对如本文所公开的一或多种癌症抗原的免疫响应。

能够将疫苗施用于受试者以调节受试者免疫系统的活性，借此增强免疫响应。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。疫苗施用于哺乳动物且借此将载体引入哺乳动物细胞内之后，经转染的细胞将表达且分泌如本文所公开的一或多种癌症抗原。所分泌的这些蛋白质或合成抗原将作为外来物质被免疫系统识别，从而建立免疫响应，所述免疫响应能够包括：针对一或多种癌症抗原所产生的抗体，和特异性针对一或多种癌症抗原的T细胞响应。在一些实例中，接种本文所论述的疫苗的哺乳动物将具有预致敏的免疫系统并且当用一或多种如本文所公开的癌症抗原攻击时，预致敏的免疫系统将允许随后快速清除如本文所公开的癌症抗原，不论通过体液、细胞免疫响应，或细胞与体液免疫响应。

施用疫苗DNA的方法描述于美国专利第4,945,050号和第5,036,006号，所述两个专利均以全文引用的方式并入本文中。

疫苗能够施用于哺乳动物以诱发哺乳动物产生免疫响应。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、奶牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、大羊驼、羊驼、小鼠、大鼠，并且优选人、奶牛或猪。疫苗能够类似地施用于非哺乳动物受试者，例如鸡，以诱发免疫响应。

疫苗剂量可以在1微克与10mg活性组分/公斤(kg)体重/时间(组分/kg体重/时间)之间，并且可以是20微克到10mg组分/kg体重/时间。能够每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。疫苗剂量用于有效治疗的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次剂量。

通过疫苗产生免疫响应的方法

所述疫苗能够在哺乳动物或非哺乳动物受试者中用于产生免疫响应，包括治疗性或预防性免疫响应。免疫响应能够产生针对一或多种如本文所公开的癌症抗原的抗体和/或杀手T细胞。此类抗体和T细胞能够分离出来。

一些实施例提供了产生针对一种或多种如本文所公开的癌症抗原的免疫响应的方法，所述实施例包含向受试者施用疫苗。一些实施例提供了向受试者预防性接种针对癌症或肿瘤的疫苗的方法，所述癌症或肿瘤表达一或多种如上文所述的癌症抗原，所述实施例包含施用疫苗。一些实施例提供了在治疗上向受试者接种疫苗的方法，所述受试者已经罹患表达一或多种癌症抗原的癌症或肿瘤，所述实施例包含施用疫苗。在施用疫苗之前，能够常规地诊断表达一或多种如本文所公开的癌症抗原的癌症或肿瘤。

通过疫苗进行癌症治疗的方法

所述疫苗能够用于在哺乳动物中产生或诱发免疫响应，所述免疫响应对有需要的哺乳动物或受试者的癌症或肿瘤(例如HPV介导的癌症、上皮卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、子宫颈癌、肝癌、前列腺癌、血液癌症、食道鳞状细胞癌、胃癌)具有反应性或针对所述癌症或肿瘤。所诱发的免疫响应能够防止癌症或肿瘤生长。

所诱发的免疫响应能够防止和/或减少癌症或肿瘤细胞转移。因此，所述疫苗能够用于治疗和/或预防施用疫苗的哺乳动物或受试者的癌症或肿瘤的方法。基于所治疗的癌症或肿瘤的生长可以是任何类型的癌症，例如(但不限于)结肠直肠癌。

在一些实施例中，所施用的疫苗能够如下介导肿瘤细胞的清除或防止肿瘤细胞生长：(1)通过B细胞响应来诱导体液免疫性以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生的抗体，借此阻滞骨髓源抑制性细胞(MDSC)且抑制肿瘤生长；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞(例如CD8⁺(CTL))攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞响应；和(4)通过IFN-γ和TFN-α增加炎症响应，或优选全部前述内容。

在一些实施例中，免疫响应能够产生体液免疫响应和/或抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)响应，所述响应对施用疫苗的受试者中的各种组织或系统(例如脑或神经系统等)不产生损伤或发炎。

在一些实施例中，所施用的疫苗能够增加受试者的存活率，减少受试者的肿瘤质量，或其组合。所施用的疫苗能够使受试者的无肿瘤存活率增加20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。所施用的疫苗在免疫接种之后能够使受试者的肿瘤质量减小20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％。相较于未施用疫苗的受试者的细胞免疫响应，所施用的疫苗能够防止和阻断LEMD1介导的肿瘤发生和/或肿瘤进展。所述疫苗能够防止和阻断单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(由骨髓源抑制性细胞分泌的细胞因子)增加。疫苗能够使肿瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。

在一些实施例中，能够将疫苗施用于外周(如下文更详细地描述)以建立靶向癌症或肿瘤细胞或组织的抗原特异性免疫响应，从而清除或消除表达一或多种癌症抗原的癌症或肿瘤而不损伤或引起施用疫苗的受试者出现疾病或死亡。

相较于未施用疫苗的受试者的细胞免疫响应，所施用的疫苗能够使受试者的细胞免疫响应增加约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍，或约300倍至约6000倍。在一些实施例中，所施用的疫苗能够使受试者的细胞免疫响应增加约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

相较于未施用疫苗的受试者的细胞免疫响应，所施用的疫苗能够使受试者中的干扰素γ(IFN-γ)水平增加约50倍到约6000倍、约50倍到约5500倍、约50倍到约5000倍、约50倍到约4500倍、约100倍到约6000倍、约150倍到约6000倍、约200倍到约6000倍、约250倍到约6000倍，或约300倍到约6000倍。在一些实施例中，相较于未施用疫苗的受试者的细胞免疫响应，所施用的疫苗能够使受试者中的IFN-γ水平增加约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

施药途径

疫苗或医药组合物能够通过不同途径施用，包括口服、肠胃外、舌下、透皮、直肠、经粘膜、体表、经由吸入、经由颊内施药、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内和/或关节内，或其组合。对于兽用而言，组合物能够根据正常兽医学实务、作为可接受的适合配制物施用。兽医能够容易地确定最适于特定动物的给药方案和施药途径。能够通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪”或其它物理方法(例如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波)施用疫苗。

疫苗的载体能够通过众所周知的若干技术施用于哺乳动物，包括DNA注射(也称为DNA疫苗接种)联合和不联合体内电穿孔、脂质粒介导的转染、纳米粒子促进的转染，以及使用重组载体，例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。疫苗的一或多种癌症抗原能够通过DNA注射以及体内电穿孔施用。

电穿孔

疫苗或医药组合物能够通过电穿孔施用。通过电穿孔施用疫苗能够使用电穿孔装置完成，所述电穿孔装置能够被配置成向所期望的哺乳动物组织递送在细胞膜中有效引起可逆孔隙形成的能量脉冲，并且优选地，所述能量脉冲是类似于用户输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置能够包含电穿孔组件和电极组合件或手柄组合件。电穿孔组件能够包括且合并电穿孔装置的多个元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形产生器、阻抗测试仪、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通讯端口、存储器组件、电源和电源开关。电穿孔能够使用体内电穿孔装置完成，例如

EP系统(Inovio制药有限公司，宾夕法尼亚州蓝铃市(Blue Bell,PA))或Elgen电穿孔器(Inovio制药有限公司)，以促进质粒转染细胞。

能够促进本发明DNA疫苗施用的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号、Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630中所述的那些，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。能够用于促进DNA疫苗施用的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括同在申请中且共同拥有的美国专利申请第11/874072号(2007年10月17日提交)中所提供的那些，所述专利申请根据35USC 119(e)要求美国临时申请第60/852,149号(2006年10月17日提交)和第60/978,982号(2007年10月10日提交)的权益，所述美国申请都全部并入。

Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号描述了模块化电极系统及其用于促进将生物分子引入身体或植物中选定组织的细胞的用途。所述模块化电极系统能够包含多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；和电源。操作人员能够握住安装在支撑结构上的多个针电极并且将其牢固地插入身体或植物中的选定组织中。然后通过皮下注射针将生物分子施用于选定的组织中。将可编程恒流脉冲控制器激活并且将恒流电脉冲施加到多个针电极。施加的恒流电脉冲有助于将生物分子引入多个电极之间的细胞中。美国专利第7,245,963号的完整内容以全文引用的方式并入本文。

Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630描述了能够用于有效地促进将生物分子引入身体或植物中选定组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包含电动装置(“EKD装置”)，其操作通过软件或固件来指定。所述EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输入、在阵列中的电极之间产生一系列可编程恒流脉冲图案，并且能够存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包含具有针电极阵列的可更换电极盘、用于注射针的中心注射通道，以及可拆卸式导引盘。美国专利公开2005/0052630的完整内容以引用的方式完全并入本文。

美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/0052630中所述的电极阵列和方法不仅能够适于深度穿入组织(例如肌肉)，而且适于深度穿入其它组织或器官。由于电极阵列的配置，因此还将注射针(将所选生物分子递送到神经变性的系统中)完全插入靶器官中，并且在与电极预先界定的区域中垂直于靶组织施用注射。美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/005263中所述的电极优选20mm长和21号规格。

另外，合并电穿孔装置和其用途的一些实施例中涵盖作为以下专利中所述的那些电穿孔装置的电穿孔装置：1993年12月28日授权的美国专利5,273,525、2000年8月29日授权的美国专利6,110,161、2001年7月17日授权的美国专利6,261,281和2005年10月25日授权的美国专利6,958,060，以及2005年9月6日授权的美国专利6,939,862。另外，本文涵盖的专利覆盖2004年2月24日授权的美国专利6,697,669中所提供的标的，其涉及使用多种装置中的任一种施用DNA；以及2008年2月5日授权的美国专利7,328,064，其涉及DNA注射方法。以上专利以全文引用的方式并入。

制备疫苗的方法

本文提供了制备DNA质粒的方法，所述DNA质粒包含本文所论述的疫苗。使用所属领域中已知的方法能够将最终亚克隆到哺乳动物表达质粒的步骤之后的DNA质粒接种到大型发酵槽的细胞培养液中。

使用已知装置和技术的组合能够配制或制造结合本发明EP装置使用的DNA质粒，但它们优选使用美国公开申请第20090004716号(2007年5月23日)中所述的优化质粒制造技术制造。在一些实例中，这些研究中所用的DNA质粒能够以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除U.S.第60/939792号所述的那些之外，制造技术还包括或合并所属领域的技术人员通常已知的各种装置和方案，包括已许可的专利美国专利第7,238,522号(2007年7月3日授权)中所述的那些。以上提及的申请和专利、US第60/939,792号和美国专利第7,238,522号分别完整并入本文中。

本发明具有多个方面，通过以下非限制性实例说明。

实例

本发明在以下实例中进一步说明。应了解，这些实例虽然指出本发明的优选实施例，但是仅为了说明而提供。从以上论述和这些实例中，所属领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，能够对本发明进行不同变更和修改以使其适于不同用途和条件。因此，所属领域的技术人员根据以上描述将显而易知除本文所示和所述之外的本发明的不同修改。也希望此类修改属于所附权利要求书的范围内。

实例1

共同LEMD1

共同LEMD1A

为了产生人共同LEMD1A，从基因库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中收集八种LEMD1A序列。所选序列的基因库寄存编号是：NP_001185979.1；XP_003938379.1；XP_012314760.1；XP_002760754.2；XP_012513307.1；XP_011371293.1；XP_011221935.1；以及XP_007086602.1。

共同序列是使用

Lasergene套装软体(13.0.0.357版)产生。将上文所列的八种序列输入MegAlign且使用ClustalW多序列比对程序比对。所得LEMD1A序列与人原生LEMD1A共享97.2％一致性。

共同LEMD1F

为了产生人共同LEMD1F，从基因库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中收集六种LEMD1F序列。所选序列的基因库寄存编号是：NP_001185981.1；XP_011845800.1；XP_011813129.1；XP_010347273.1；XP_012314764.1；以及XP_012513311.1。

共同序列是使用

Lasergene套装软体(13.0.0.357版)产生。将上文所列的六种序列输入MegAlign且使用ClustalW多序列比对程序比对。所得LEMD1F序列与人原生LEMD1F共享98.5％一致性。

实例2

合成共同LEMD1A

消除LEMD1A的生物功能

为了消除所得共同LEMD1A的潜在生物功能，在LEM结构域中引入三个突变(G20A、P25A和Y34A)以破坏BAF结合。结果，合成共同LEMD1A蛋白质与人原生LEMD1A蛋白质共享95.6％一致性，如图1A和1B所示。

优化表达

获得合成共同LEMD1A DNA序列之后，为了达到较高表达水平，去除合成共同LEMD1A的N端甲硫氨酸并且将上游Kozak序列和IgE前导序列添加到N端。另外，这种基因的密码子使用适于智人基因的密码子偏好，并且还对GC含量极高(>80％)或极低(<30％)的区域执行RNA优化，避免顺式作用序列基序，例如内部TATA盒、χ位点和核糖体进入位点。合成共同LEMD1A的示意图展现于图2中。合成共同LEMD1A的特征提供于表1中。

表1：合成共同LEMD1A的特征

特征	合成共同LEMD1A
		与人原生LEMD1A的一致性	95.6％
与恒河猴原生LEMD1A的一致性	56.2-92.8％
		与小鼠原生LEMD1A的一致性	32.2-60.6％
氨基酸突变的数量(相对于人原生)	8
		插入突变的数量(非共同序列来源的)	3
分子量	200aa(22kDa)
		编码序列长度(bp)	600

参看图3，合成共同LEMD1A使用BamHI和XhoI消化，并且克隆到表达载体pGX0001(Inovio制药)中。pGX0001主链是经修饰的pVAX1表达载体，其处于人巨细胞病毒即刻早期启动子(hCMV启动子)的控制下。将修饰引入pVAX1中以建立pGX0001并且基于获自赛默飞世尔科学(ThermoFisher Scientific)的pVAX1的所报道序列鉴定。这些修饰列举于表2中。

表2

pGX0001主链包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUC ori)用于产生目的。那些元件在真核细胞中不具有功能。存在于2998碱基对pGX0001中的元件包括以下：

CMV启动子：碱基137-724

T7启动子/预致敏位点：碱基664-683

多克隆位点：碱基696-811

牛GH聚腺苷酸化信号：碱基829-1053

卡那霉素抗性基因：碱基1226-2020

pUC起点：碱基2319-2992

将LEMD1A克隆到pGX0001主链而得到的质粒称为pGX1431，并且全长序列经验证是正确的。pGX1431是编码合成共同LEMD1A蛋白质的DNA质粒。相关mRNA产生是由人CMV启动子(hCMV启动子)驱动并且通过牛生长激素3'末端聚腺苷酸化信号(bGH polyA)终止。pGX1431的特征展现于表3中。

表3

pGX1431的氨基酸插入序列(SEQ ID NO:2)

N端前导序列由插入序列的氨基酸残基1到18组成，并且氨基酸残基19到198是合成共同LEMD1A抗原。

pGX1431的单链DNA序列(SEQ ID NO:7)：

N端前导序列由上述序列的核苷酸1到54组成，且剩余核苷酸编码LEMD1A抗原。

实例3

合成共同LEMD1F

为了消除所得共同LEMD1F的潜在生物功能，在LEM结构域中引入两个突变(G20A和P25A)以破坏BAF结合。因此，合成共同LEMD1F蛋白质与人原生LEMD1F蛋白质共享95.5％一致性，如图4A和4B所示。

获得合成共同LEMD1F DNA序列之后，为了达到较高表达水平，去除合成共同LEMD1F的N端甲硫氨酸并且将上游Kozak序列和IgE前导序列添加到N端。另外，这种基因的密码子使用适于智人基因的密码子偏好。另外，还执行RNA优化：GC含量极高(>80％)或极低(<30％)的区域，并且避免顺式作用序列基序，例如内部TATA盒、χ位点和核糖体进入位点。合成共同蛋白质的示意图展现于图5中。表4展现了合成共同LEMD1F的一些特征。

表4：LEMD1F的特征

特征	合成共同LEMD1F
		与人原生LEMD1F的一致性	95.5％
与恒河猴原生LEMD1F的一致性	55.2-61.2％
		与小鼠原生LEMD1F的一致性	11.9-43.3％
氨基酸突变的数量(相对于人原生)	3
		插入突变的数量(非共同序列来源的)	2
分子量	86aa(9.5kDa)
		编码序列长度(bp)	258

使用与构建pGX1431所用相同的pGX0001主链构建表达载体pGX1432。参看图6，已合成的合成共同LEMD1F使用BamHI和XhoI消化，并且通过将表达盒置于细胞巨大病毒即刻早期启动子的转录控制下来克隆到表达载体pGX0001(Inovio制药)中。所得质粒称为pGX1432且验证全长序列。pGX1432特征提供于表5中。

表5

pGX1432的氨基酸插入序列(SEQ ID NO:4)：

N端前导序列由插入序列的氨基酸残基1到18组成，并且氨基酸残基19到84是合成共同LEMD1F抗原。

pGX1432的单链DNA序列(SEQ ID NO:8)：

N端前导序列由上述序列的核苷酸1到54组成，且剩余核苷酸编码LEMD1F抗原。

实例3

合成共同LEMD1AF

通过将弗林蛋白酶裂解位点(RGRKRRS，SEQ ID NO:10)插入合成共同LEMD1A与合成共同LEMD1F的氨基酸序列之间来建立多抗原构建体：合成共同LEMD1AF。获得合成共同LEMD1AF DNA序列之后，为了达到较高表达水平，去除合成共同LEMD1AF的N端甲硫氨酸并且将上游Kozak序列和IgE前导序列添加到N端。另外，这种基因的密码子使用适于智人基因的密码子偏好。另外，还执行RNA优化：GC含量极高(>80％)或极低(<30％)的区域，并且避免顺式作用序列基序，例如内部TATA盒、χ位点和核糖体进入位点。由于共同LEMD1A与共同LEMD1F蛋白质中的N端域(氨基酸2-27)一致，因此编码合成共同LEMD1A的氨基酸2-27区域的DNA序列和合成共同LEMD1F的氨基酸2-27区域以不同程度优化(64.1％序列一致性)，从而增加质粒稳定性。合成共同LEMD1AF构建体的示意图显示于图7中。

参看图8，已合成的合成共同LEMD1AF使用BamHI和XhoI消化，并且如前面的实例中所述克隆到表达载体pGX0001(Inovio制药)中。表达盒置于细胞巨大病毒即刻早期启动子的转录控制下。所得质粒称为pGX1433且验证全长序列。

pGX1433是编码合成共同LEMD1AF蛋白质的DNA质粒。相关mRNA产生是由人CMV启动子(hCMV启动子)驱动并且通过牛生长激素3'末端聚腺苷酸化信号(bGH polyA)终止。pGX0001主链包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUC ori)用于产生目的。那些元件在真核细胞中不具有功能。表6提供了关于pGX1433的其它信息。

表6

pGX1433的氨基酸插入序列(SEQ ID NO:6)

N端前导序列由插入序列的氨基酸残基1到18组成，并且氨基酸残基19到198和206-271是合成共同LEMD1A和F抗原。弗林蛋白酶裂解位点氨基酸残基199到205存在于LEMD1序列之间。

pGX1433的单链DNA序列(SEQ ID NO:9)：

N端前导序列由上述序列的核苷酸1到54组成，并且核苷酸55到594和616到819编码LEMD1AF抗原构建体。核苷酸595到615编码弗林蛋白酶结合位点。

实例4

试管内抗原表达

通过蛋白质印迹法证实pGX1431、pGX1432和pGX1433对抗原蛋白质的表达。使用Turbofectin 8(Origene)，用pGX1431、pGX1432、pGX1433或pGX0001(6μg/10cm²培养皿)转染人横纹肌肉瘤(RD)细胞(ATCC，CCL-136)，所述细胞在含有10％FBS的DMEM培养基(赛默飞世尔)中维持。转染之后的四十八小时，使用RIPA细胞溶解缓冲液(赛默飞世尔)溶解细胞且收集细胞溶解物。BCA分析(赛默飞世尔)测定总蛋白质浓度之后，使15μg细胞溶解物在4-12％SDS-PAGE凝胶上电泳并且用抗LEMD1单克隆抗体(Abcam，克隆ab201206)执行检测，然后使用ECL蛋白质印迹分析系统(GE Amersham)，使用辣根过氧化酶(HRP)偶联的抗兔IgG(Santa Cruz Biotech，SC-2004)可视化。作为内参照，使用抗β-肌动蛋白单克隆抗体(Santa Cruz Biotech，克隆C4)再探测印迹中的肌动蛋白表达。

针对合成的共同LEMD1A(pGX1431)和合成共同LEMD1AF(pGX1433)构建体检测预期分子量的蛋白质色带，但合成的共同LEMD1F(pGX1432)构建体的色带未检测到(图9)。能够推断出LEMD1F抗原是作为LEMD1AF抗原的一部分表达，原因是其是在AF抗原的预期分子量下被检测到。pGX0001泳道中未检测到蛋白质色带。检测到抗β-肌动蛋白色带的强度相似，表明每个泳道中装载的蛋白质的量相等。总之，发现pGX1431和pGX1433表达其相应抗原蛋白质。

实例5

合成共同LEMD1疫苗构建体的免疫原性

材料与方法

动物和免疫接种

8周龄雌性CB6F1小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)。所有动物圈养于BTS研究所(加州圣地亚哥)的温度可控的光循环机构中。根据美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)指导原则以及动物照护和使用提案(ACUP)(BTS ACUP#15-091)进行动物照护。将小鼠分成十组，如表1中详述。

表7

组	n	构建体	构建体剂量(μg)	注射体积(μL)
					1	4	pGX0001	30	30
2	8	pGX1431	10	30
					3	8	pGX1431	30	30
4	8	pGX1431	50	30
					5	8	pGX1432	10	30
6	8	pGX1432	30	30
					7	8	pGX1432	50	30
8	8	pGX1433	10	30
					9	8	pGX1433	30	30
10	8	pGX1433	50	30

免疫组的小鼠接种指定剂量的pGX0001、pGX1431、pGX1432或pGX1433。简单地说，在无菌注射用水(VetOne)中配制质粒，以便以30μL注射体积通过肌肉内注射将指定的剂量递送到胫骨前肌肌肉中。每次肌肉内注射之后立即使用具有3P阵列的

2000适应性恒定电流电穿孔装置(Inovio制药)进行电穿孔(EP)。装置被配置成递送两个0.1Amp脉冲，52ms脉冲宽度，间隔1秒延迟。小鼠隔3周接收3次免疫接种。最后一次免疫接种之后的一周处死小鼠且收获脾脏用于细胞免疫读数。不收集其它组织。

脾脏淋巴细胞分离

以无菌方式分离出脾细胞并且置于5mL R10培养基(罗斯韦尔帕克纪念研究所(Rosewell Park Memorial Institute)，补充有10％胎牛血清和1％抗生素-抗霉菌素的培养基1640)中。通过使用Stomacher机器(Seward实验室系统有限公司)机械破碎脾脏来分离脾细胞，并且使用40μm细胞过滤器(BD Falcon)过滤所得产物。将所得产物离心并且集结粒使用ACK溶解缓冲液(Lonza)处理5分钟以便溶解RBC。然后将脾细胞离心，用PBS洗涤，并且然后再悬浮于R10培养基中且立即用于进一步的分析。

IFNγELISpot

执行小鼠IFNγELISpot分析(MabTech)以评估抗原特异性细胞响应。简单来说，经抗小鼠IFNγ抗体预涂布的96孔板用PBS洗涤且在室温下用完全培养基(补充有10％FBS和抗生素的RPMI 1640)阻断2小时。将脾脏淋巴细胞再悬浮于R10培养基中并且然后以每孔2×10⁵个细胞的输入细胞数量添加，一式三份。合成一组肽(GenScript)，每种肽含有15个氨基酸残基，有9个氨基酸重叠，代表着完整的合成共同LEMD1蛋白质序列。将这些组的肽再悬浮于DMSO(Sigma)中并且以约2μg/ml肽的浓度合并成两个肽池。一个肽池含有与合成共同LEMD1A抗原蛋白质对应的肽并且第二个肽池含有与合成共同LEMD1F抗原蛋白质对应的肽。5μg/ml的刀豆蛋白A(Concavalin A)(Sigma)用作阳性对照并且完全培养基用作阴性对照。培养板在5％CO2气氛的培育箱中、在37℃下培育18小时。然后，添加生物素化抗小鼠IFNγ检测抗体(MabTech)，并且培养板在室温下培育2小时。洗涤培养板，并且添加抗生蛋白链菌素-ALP抗体(MabTech)并且培养板在室温下培育1小时。根据试剂盒制造商的说明书(MabTech)完成斑点检测。培养板上的斑点使用自动化ELISPOT读取器(细胞技术(CellularTechnology))计数。将斑点形成单元(SFU)的平均数调整到1×10⁶个脾细胞用于数据显示。

IFNγELISpot中的抗原特异性响应作为每1×10⁶个脾细胞的IFNγ斑点形成单元(SFU)的数量报道，其大于单独培养基对照组中的SFU。

流式细胞术

由合成共同LEMD1诱导的细胞免疫响应通过流式细胞术进一步表征。简单来说，每组在适当时，来自接种疫苗和未处理小鼠的2×10⁶个脾细胞在分离之后，立即在布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(BD Biosciences)、莫能菌素(Monensin)(BD Biosciences)和FITC抗小鼠CD107a抗体(BD Biosciences)的存在下用合成共同LEMD1肽刺激6小时。肽刺激之后，将脾细胞离心并且再悬浮于每孔20μL的小鼠BD Fc阻断(BD Biosciences)溶液中。Fc阻断溶液在PBS中以1:40的初始稀释度使用并且在4℃下培育5分钟。培育之后，每孔添加30μL剩余细胞外抗体(于PBS中)并且在4℃培育30分钟。添加细胞外染色剂之后，每个孔中的最终体积是50μL，由最终稀释度为1:100的Fc阻断溶液和其适当工作稀释度的细胞外抗体组成。细胞然后用活力染料(Vivid V450，Thermo-Fisher)和以下细胞外抗体染色：PerCP-Cy5.5抗小鼠CD4(BD Biosciences，克隆RM4-5)和APC抗小鼠CD8a(BD Biosciences，克隆63-6.7)。将细胞固定且在4℃下渗透(BD Biosciences，#554714)20分钟。细胞内染色随后使用以下抗体完成：APC-Cy7抗小鼠CD3e(BD Biosciences，克隆145-2C11)、BV605抗小鼠IFNγ(BD Biosciences，克隆XMG1.2)、APC-R700抗小鼠IL-2(BD Biosciences，克隆JEs6-5H4)，和PE抗小鼠TNF-α(BD Biosciences，克隆MP6-XT22)。在10色FACS CANTO(BD Biosciences)上收集ICS数据且使用FlowJo软件完成分析。流式细胞术设门策略显示在下述图10中。

对于称为抗原特异性(根据流式细胞术)的细胞而言，所报道参数的频率必须超过单独培养基对照的频率。对于经鉴定产生抗原特异性CD107a的细胞来说，必须还鉴定出细胞就IFNγ和/或IL-2和/或TNFα的抗原特异性产生而言呈阳性，如通过布尔设门(Booleangating)所鉴定。

统计分析

使用IBM SPSS Statistics 22(IBM公司)完成统计分析。使用ANOVA联合事后杜凯氏诚实显著差异(post-hoc Tukey's Honest Significant Difference，HSD)执行各组之间的分析，以针对多重比较进行调整。多重比较之前，使用F统计证实方差均一性。对于所有统计分析而言，0.050的p值被视为显著。

结果

IFNγELISpot

用IFNγELISpot和流式细胞术(n＝8/组)评估三种合成共同LEMD1构建体在三种剂量(10μg、30μg和50μg)下的免疫原性。使用空质粒主链(pGX0001)作为阴性对照(n＝4/组)将小鼠免疫。相较于接种疫苗的阴性对照小鼠，接种合成共同LEMD1A引起显著的IFNγ响应。证据表明合成共同LEMD1A所诱导的IFNγ产生存在剂量依赖性增加(图11A)，其中在30μg剂量下达成最大的平均响应。具体地说，合成的共同LEMD1A IFNγSFU在10μg、30μg和50μg下分别是646±373、1,683±1248和1,645±1002。合成的共同LEMD1A IFNγ响应在30μg(p＝0.024)和50μg(p＝0.028)的pGX1431剂量下显著大于未处理组(3±4)，而在10μg剂量(p＝0.642)下则不然。接种合成共同LEMD1F引起了最小的IFNγ响应，但无证据表明IFNγ响应在剂量增加的情况下存在剂量依赖性增强(图11B)。LEMD1F IFNγSFU在10μg、30μg和50μg下分别是163±382、88±109和140±246。在pGX1432的任一种剂量下，合成共同LEMD1FIFNγ响应不显著大于未处理组(3±4)。相较于接种疫苗的阴性对照小鼠，接种合成共同LEMD1AF引起显著的IFNγ响应。存在证据表明由合成共同LEMD1AF诱导的IFNγ产生存在剂量依赖性增强(图11C)，其中在50μg剂量下达成最大平均响应。具体地说，合成的共同LEMD1AF IFNγSFU在10μg、30μg和50μg下分别是478±269、779±392和879±552。在30μg(p＝0.018)和50μg(p＝0.007)的pGX1433剂量下，合成的共同LEMD1AF IFNγ响应显著大于未处理组(3±4)，但在10μg剂量(p＝0.227)下则不然。IFNγ响应概述于表8中。

表8：pGX1431、pGX1432和pGX1433诱导的IFNγ响应

所报道的p值是相对于未处理组(pGX0001免疫的小鼠)。显著性假定为p≤0.05。

在50μg剂量(1.34％±0.58％)(p<0.005)下，合成共同LEMD1A诱导的抗原特异性CD4+T细胞响应的频率显著稳健于未处理组(0.04％±0.03％)，但10μg(0.50％±0.170％)(p<0.004)或30μg(1.02％±0.57％)(p<0.122)剂量组则不然(图12A)。合成共同LEMD1A特异性CD4+T细胞响应具有剂量依赖性并且主要由产生IFNγ+IL-2+TNFα+IFNγ+IL-2-TNFα+或IFNγ+IL-2-TNFα-的CD4+T细胞组成(图12E)。

合成共同LEMD1F诱导的抗原特异性CD4+T细胞响应的频率最低限度地大于未处理组(0.06％±0.02％)。具体地说，pGX1432在10μg剂量(0.27％±0.34％)、30μg(0.24％±0.10％)和50μg(0.20％±0.20％)剂量组中诱导的响应不显著(图12B)。合成的共同LEMD1F特异性CD4+T细胞响应具有剂量依赖性并且主要由以下组成：产生IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2+TNFα-、IFNγ+IL-2-TNFα+、IFNγ-IL-2-TNFα+或IFNγ+IL-2-TNFα-的CD4+T细胞(图12E)。

在50μg剂量(0.80％±0.51％)(p<0.006)下，合成共同的LEMD1AF诱导的抗原特异性CD4+T细胞响应的频率显著稳健于未处理组(0.09％±0.03％)，但10μg(0.53％±0.19％)(p<0.135)或30μg(0.50％±0.20％)(p<0.176)剂量组则不然(图12C)。合成共同LEMD1AF特异性CD4+T细胞响应不具有剂量依赖性并且主要由以下组成：产生IFNγ+IL-2+TNFα+IFNγ+IL-2-TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα-或IFNγ-IL-2-TNFα+的CD4+T细胞(图12E)。

抗原特异性CD4+T细胞的频率进一步详述于表9中。

所有剂量的合成共同LEMD1构建体诱导的CD4+CD107a+T细胞频率稍微大于未处理组，而pGX1431构建体只在最高剂量下具有显著的较强稳健性。

具体地说，在10μg(p＝0.532)、30μg(p＝0.314)和50μg(p＝0.002)剂量组中，pGX1431抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的频率分别是0.17％±0.09％、0.34％±0.19％，和0.50％±0.30％(图13A)。pGX1431特异性CD4+CD107a+T细胞的细胞因子分布在各剂量组间是类似的并且主要包含IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα+和IFNγ+IL-2-TNFα-细胞(图13E)。

在10μg、30μg和50μg剂量组中，pGX1432抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的频率分别是0.10％±0.14％、0.11％±0.08％和0.04％±0.03％(图13B)。在10μg和30μg剂量组中，pGX1432特异性CD4+CD107a+T细胞的细胞因子分布是类似的并且主要包含IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2+TNFα-和IFNγ+IL-2-TNFα-细胞；而在50μg剂量下，细胞因子分布主要由IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα+和IFNγ+IL-2-TNFα-细胞构成(图13E)。

在10μg(p＝0.365)、30μg(p＝0.992)和50μg(p＝0.109)剂量组中，pGX1433抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的频率分别是0.20％±0.10％、0.17％±0.10％和0.39％±0.31％(图13C)。在10μg和30μg剂量组中，pGX1433特异性CD4+CD107a+T细胞的细胞因子分布是类似的并且主要包含IFNγ+IL-2+TNFα+和一些IFNγ+IL-2-TNFα+和IFNγ+IL-2-TNFα-细胞；而50μg剂量组主要包含IFNγ+IL-2-TNFα-和IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2+TNFα-以及IFNγ+IL-2-TNFα+(图13E)。

抗原特异性CD4+CD107+T细胞的频率进一步详述于表9中。

表9：

合成共同LEMD1A诱导的抗原特异性CD8+T细胞响应的频率更稳健于未处理组(0.08％±0.01％)，但在10μg(1.46％±0.79％)、30μg(2.34％±1.47％)和50μg(2.12％±1.897％)剂量组中不显著(图14A)。合成共同LEMD1A特异性CD8+T细胞响应不具有剂量依赖性并且主要由产生IFNγ+IL-2-TNFα-和一些IFNγ+IL-2-TNFα+的CD8+T细胞组成(图14E)。

合成共同LEMD1F诱导的抗原特异性CD8+T细胞响应的频率不大于未处理组(0.09％±0.05％)。具体地说，在10μg剂量(0.09％±0.04％)、30μg(0.07％±0.05％)和50μg(0.17％±0.07％)剂量组中，pGX1432未诱导显著响应(图14B)。合成共同LEMD1F特异性CD8+T细胞响应不具有剂量依赖性并且主要由产生IFNγ-IL-2+-TNFα-、IFNγ-IL-2-TNFα+和IFNγ+IL-2-TNFα-的CD8+T细胞组成(图14E)。

在50μg剂量(1.73％±1.40％)(p＝0.046)下，合成共同LEMD1AF诱导的抗原特异性CD8+T细胞响应的频率显著地稳健于未处理组(0.17％±0.043％)，但在10μg(0.72％±0.36％)(p＝0.061)或30μg(1.65％±0.86％)(p＝0.061)剂量组中则不然(图14C)。合成共同LEMD1AF特异性CD8+T细胞响应具有剂量依赖性并且主要由产生IFNγ+IL-2-TNFα-和一些IFNγ+IL-2-TNFα+和IFNγ-IL-2+-TNFα-的CD8+T细胞组成(图14E)。

抗原特异性CD8+T细胞的频率进一步详述于表10中。

表10

合成共同LEMD1构建体pGX1431和pGX1433而非pGX1432诱导的CD8+CD107a+T细胞的频率大于未处理组，但在任何剂量下均不显著。

具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量组中，pGX1431抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的频率分别是1.37％±0.78％、2.23％±1.45％和1.97％±1.84％(图15A)。pGX1431特异性CD8+CD107a+T细胞的细胞因子分布在各剂量组间是类似的并且主要包含IFNγ+IL-2-TNFα-和一些IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图15E)。

在10μg、30μg和50μg剂量组中，pGX1432抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的频率分别是0.02％±0.02％、0.05％±0.04％和0.04％±0.03％(图15B)。pGX1432特异性CD8+CD107a+T细胞的细胞因子分布主要包含IFNγ+IL-2-TNFα-、IFNγ-IL-2+TNFα-和IFNγ+IL-2+TNFα-细胞(图15E)。

在10μg(p＝0.897)、30μg(p＝0.089)和50μg(p＝0.053)剂量组中，pGX1433抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的频率分别是0.54％±0.39％、1.43％±1.39％和1.57％±1.39％(图15C)。pGX1433特异性CD8+CD107a+T细胞的细胞因子分布主要包含IFNγ+IL-2-TNFα-和一些IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图15E)。

应了解，以上详细描述和随附实例仅具说明性而非视为对本发明范围的限制，本发明的范围仅由随附权利要求书以及其等效物限定。

对所公开实施例的各种变更和修改对于所属领域的技术人员来说是显而易见的。可以对所公开的实施例进行此类变更和修改，包括(但不限于)与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、配制物或使用方法有关的那些变更和修改，而此类变更和修改不背离其精神和范围。

序列表

<110> 艾诺奥医药品有限公司

<120> 靶向LEMD1的癌症疫苗和其用途

<130> 104409.000449 / INO-1006 WO

<150> 62/598,329

<151> 2017-12-13

<150> 62/598,612

<151> 2017-12-14

<160> 12

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共同LEMD1A DNA序列

<400> 1

atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa cacgggtgca ctccgtggac 60

gtgaagtgcc tgtctgattg taagctgcag aaccagctgg agaagctggc ctttagccct 120

ggcgccatcc tgccatccac caggaagctg gccgagaaga agctggtgca gctgctggtg 180

tccccacctt gcgcaccacc cgtgatgaat ggaccccgcg agctggacgg agcacaggat 240

agcgacgatt ccgaggagct gaacatcatc ctgcagggca atatcatcct gtctaccgag 300

aagagcaaga agctgaagaa gcggcccgag gcctctacca caaagcctaa ggccgtggac 360

acatactgcc tggattataa gccatctaag ggccggagat gggcagccag ggccccaagc 420

acccgcatca catacggcac catcacaaag gagcgggact attgtaccga ggatcagaca 480

gccgagagct ggagagagga gggcttccct gtgggcctga agctggccgt gctgggcatc 540

ttcatcatcg tggtgttcgt gtacctgaca gtggagaaca agccactgtt tggctgataa 600

<210> 2

<211> 198

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共同LEMD1A蛋白质序列

<400> 2

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln

20 25 30

Leu Glu Lys Leu Ala Phe Ser Pro Gly Ala Ile Leu Pro Ser Thr Arg

35 40 45

Lys Leu Ala Glu Lys Lys Leu Val Gln Leu Leu Val Ser Pro Pro Cys

50 55 60

Ala Pro Pro Val Met Asn Gly Pro Arg Glu Leu Asp Gly Ala Gln Asp

65 70 75 80

Ser Asp Asp Ser Glu Glu Leu Asn Ile Ile Leu Gln Gly Asn Ile Ile

85 90 95

Leu Ser Thr Glu Lys Ser Lys Lys Leu Lys Lys Arg Pro Glu Ala Ser

100 105 110

Thr Thr Lys Pro Lys Ala Val Asp Thr Tyr Cys Leu Asp Tyr Lys Pro

115 120 125

Ser Lys Gly Arg Arg Trp Ala Ala Arg Ala Pro Ser Thr Arg Ile Thr

130 135 140

Tyr Gly Thr Ile Thr Lys Glu Arg Asp Tyr Cys Thr Glu Asp Gln Thr

145 150 155 160

Ala Glu Ser Trp Arg Glu Glu Gly Phe Pro Val Gly Leu Lys Leu Ala

165 170 175

Val Leu Gly Ile Phe Ile Ile Val Val Phe Val Tyr Leu Thr Val Glu

180 185 190

Asn Lys Pro Leu Phe Gly

195

<210> 3

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共同LEMD1F DNA序列

<400> 3

atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa caagggtgca ctctgtggac 60

gtgaagtgcc tgagcgattg taagctgcag aaccagctgg agaagctggc cttttcccca 120

ggagcaatcc tgaggggact gcaggagcac caggcaccag agagccacat gggactgtcc 180

cctaagcggg agaccacagc aaggaagacc agactgctga gggcaggaga gaagaaggtg 240

tctcagtggg cctgataa 258

<210> 4

<211> 84

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共同LEMD1F蛋白质序列

<400> 4

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln

20 25 30

Leu Glu Lys Leu Ala Phe Ser Pro Gly Ala Ile Leu Arg Gly Leu Gln

35 40 45

Glu His Gln Ala Pro Glu Ser His Met Gly Leu Ser Pro Lys Arg Glu

50 55 60

Thr Thr Ala Arg Lys Thr Arg Leu Leu Arg Ala Gly Glu Lys Lys Val

65 70 75 80

Ser Gln Trp Ala

<210> 5

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共同LEMD1AF DNA序列

<400> 5

atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa cccgcgtgca ttccgtcgat 60

gtgaagtgtc tgagtgattg taaactgcag aaccagctgg agaagctggc ctttagccct 120

ggagcaatcc tgccatccac caggaagctg gccgagaaga agctggtgca gctgctggtg 180

agcccacctt gcgcaccacc cgtgatgaat ggcccaagag agctggacgg cgcccaggat 240

agcgacgatt ccgaggagct gaacatcatc ctgcagggca atatcatcct gtctaccgag 300

aagagcaaga agctgaagaa gcggcccgag gcctccacca caaagcctaa ggccgtggac 360

acatactgcc tggattataa gccttccaag ggccggagat gggcagccag ggccccatct 420

accaggatca catacggcac catcacaaag gagcgggact attgtaccga ggatcagaca 480

gccgagtctt ggagagagga gggattccca gtgggcctga agctggccgt gctgggcatc 540

ttcatcatcg tggtgttcgt gtacctgaca gtggagaaca agcctctgtt tggccggggc 600

agaaagaggc gctctgtgga tgtaaaatgc ctatcggact gcaagttgca aaatcaatta 660

gaaaaattgg ccttctcccc aggggcgata ttgaggggcc tgcaggagca ccaggcacca 720

gagtcccaca tgggcctgtc tcccaagcgc gagacaaccg caagaaaaac aaggctgctg 780

agggctgggg aaaagaaagt gtcacagtgg gcatgataa 819

<210> 6

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共同LEMD1AF蛋白质序列

<400> 6

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln

20 25 30

Leu Glu Lys Leu Ala Phe Ser Pro Gly Ala Ile Leu Pro Ser Thr Arg

35 40 45

Lys Leu Ala Glu Lys Lys Leu Val Gln Leu Leu Val Ser Pro Pro Cys

50 55 60

Ala Pro Pro Val Met Asn Gly Pro Arg Glu Leu Asp Gly Ala Gln Asp

65 70 75 80

Ser Asp Asp Ser Glu Glu Leu Asn Ile Ile Leu Gln Gly Asn Ile Ile

85 90 95

Leu Ser Thr Glu Lys Ser Lys Lys Leu Lys Lys Arg Pro Glu Ala Ser

100 105 110

Thr Thr Lys Pro Lys Ala Val Asp Thr Tyr Cys Leu Asp Tyr Lys Pro

115 120 125

Ser Lys Gly Arg Arg Trp Ala Ala Arg Ala Pro Ser Thr Arg Ile Thr

130 135 140

Tyr Gly Thr Ile Thr Lys Glu Arg Asp Tyr Cys Thr Glu Asp Gln Thr

145 150 155 160

Ala Glu Ser Trp Arg Glu Glu Gly Phe Pro Val Gly Leu Lys Leu Ala

165 170 175

Val Leu Gly Ile Phe Ile Ile Val Val Phe Val Tyr Leu Thr Val Glu

180 185 190

Asn Lys Pro Leu Phe Gly Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Val Asp Val

195 200 205

Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln Leu Glu Lys Leu Ala

210 215 220

Phe Ser Pro Gly Ala Ile Leu Arg Gly Leu Gln Glu His Gln Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ser His Met Gly Leu Ser Pro Lys Arg Glu Thr Thr Ala Arg Lys

245 250 255

Thr Arg Leu Leu Arg Ala Gly Glu Lys Lys Val Ser Gln Trp Ala

260 265 270

<210> 7

<211> 3554

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pGX1431

<400> 7

gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accgagctcg gatccgccac catggactgg acctggattc tgttcctggt ggcagcagca 780

acacgggtgc actccgtgga cgtgaagtgc ctgtctgatt gtaagctgca gaaccagctg 840

gagaagctgg cctttagccc tggcgccatc ctgccatcca ccaggaagct ggccgagaag 900

aagctggtgc agctgctggt gtccccacct tgcgcaccac ccgtgatgaa tggaccccgc 960

gagctggacg gagcacagga tagcgacgat tccgaggagc tgaacatcat cctgcagggc 1020

aatatcatcc tgtctaccga gaagagcaag aagctgaaga agcggcccga ggcctctacc 1080

acaaagccta aggccgtgga cacatactgc ctggattata agccatctaa gggccggaga 1140

tgggcagcca gggccccaag cacccgcatc acatacggca ccatcacaaa ggagcgggac 1200

tattgtaccg aggatcagac agccgagagc tggagagagg agggcttccc tgtgggcctg 1260

aagctggccg tgctgggcat cttcatcatc gtggtgttcg tgtacctgac agtggagaac 1320

aagccactgt ttggctgata actcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc 1380

tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg 1440

accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat 1500

tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 1560

gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctactggg 1620

cggttttatg gacagcaagc gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg 1680

ggaagccctg caaagtaaac tggatggctt tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg 1740

gatcaagctc tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat 1800

tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac 1860

agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc 1920

tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc 1980

tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag 2040

cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc 2100

ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg 2160

atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc 2220

ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc 2280

cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga 2340

cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca 2400

tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg 2460

atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg 2520

ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgaatta 2580

ttaacgctta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 2640

accgcatcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 2700

taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 2760

tagcacgtgc taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 2820

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 2880

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 2940

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 3000

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 3060

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 3120

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 3180

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 3240

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 3300

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 3360

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 3420

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 3480

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 3540

gctcacatgt tctt 3554

<210> 8

<211> 3212

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pGX1432

<400> 8

gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accgagctcg gatccgccac catggactgg acctggattc tgttcctggt ggcagcagca 780

acaagggtgc actctgtgga cgtgaagtgc ctgagcgatt gtaagctgca gaaccagctg 840

gagaagctgg ccttttcccc aggagcaatc ctgaggggac tgcaggagca ccaggcacca 900

gagagccaca tgggactgtc ccctaagcgg gagaccacag caaggaagac cagactgctg 960

agggcaggag agaagaaggt gtctcagtgg gcctgataac tcgagtctag agggcccgtt 1020

taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 1080

tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat 1140

gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg 1200

caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc 1260

tctatggctt ctactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg 1320

cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa 1380

ggatctgatg gcgcagggga tcaagctctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca 1440

tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg 1500

gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag 1560

cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc 1620

aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc 1680

tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg 1740

atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc 1800

ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca 1860

tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag 1920

agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg 1980

gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg 2040

gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca 2100

tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc 2160

tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg 2220

acgagttctt ctgaattatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc 2280

atctgtgcgg tatttcacac cgcatcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 2340

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 2400

tgataaatgc ttcaataata gcacgtgcta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 2460

gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 2520

tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 2580

gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 2640

caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 2700

actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 2760

acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 2820

cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 2880

gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 2940

cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 3000

gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 3060

tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 3120

tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 3180

gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tt 3212

<210> 9

<211> 3773

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pGX1433

<400> 9

gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accgagctcg gatccgccac catggactgg acctggattc tgttcctggt ggcagcagca 780

acccgcgtgc attccgtcga tgtgaagtgt ctgagtgatt gtaaactgca gaaccagctg 840

gagaagctgg cctttagccc tggagcaatc ctgccatcca ccaggaagct ggccgagaag 900

aagctggtgc agctgctggt gagcccacct tgcgcaccac ccgtgatgaa tggcccaaga 960

gagctggacg gcgcccagga tagcgacgat tccgaggagc tgaacatcat cctgcagggc 1020

aatatcatcc tgtctaccga gaagagcaag aagctgaaga agcggcccga ggcctccacc 1080

acaaagccta aggccgtgga cacatactgc ctggattata agccttccaa gggccggaga 1140

tgggcagcca gggccccatc taccaggatc acatacggca ccatcacaaa ggagcgggac 1200

tattgtaccg aggatcagac agccgagtct tggagagagg agggattccc agtgggcctg 1260

aagctggccg tgctgggcat cttcatcatc gtggtgttcg tgtacctgac agtggagaac 1320

aagcctctgt ttggccgggg cagaaagagg cgctctgtgg atgtaaaatg cctatcggac 1380

tgcaagttgc aaaatcaatt agaaaaattg gccttctccc caggggcgat attgaggggc 1440

ctgcaggagc accaggcacc agagtcccac atgggcctgt ctcccaagcg cgagacaacc 1500

gcaagaaaaa caaggctgct gagggctggg gaaaagaaag tgtcacagtg ggcatgataa 1560

ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 1620

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 1680

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 1740

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 1800

catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctactgggc ggttttatgg acagcaagcg 1860

aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact 1920

ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagctct gatcaagaga 1980

caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg 2040

cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg 2100

ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt 2160

ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg 2220

gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat 2280

tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat 2340

ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg 2400

accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg 2460

atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc 2520

tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc 2580

cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg 2640

tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg 2700

gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca 2760

tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaattat taacgcttac aatttcctga 2820

tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatcagg tggcactttt 2880

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 2940

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat 3000

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 3060

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 3120

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 3180

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 3240

agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 3300

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 3360

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 3420

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 3480

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 3540

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 3600

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 3660

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 3720

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctt 3773

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 弗林蛋白酶裂解位点

<400> 10

Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser

1 5

<210> 11

<211> 198

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 人原生LEMD1A蛋白质序列

<400> 11

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln

20 25 30

Leu Glu Lys Leu Gly Phe Ser Pro Gly Pro Ile Leu Pro Ser Thr Arg

35 40 45

Lys Leu Tyr Glu Lys Lys Leu Val Gln Leu Leu Val Ser Pro Pro Cys

50 55 60

Ala Pro Pro Val Met Asn Gly Pro Arg Glu Leu Asp Gly Ala Gln Asp

65 70 75 80

Ser Asp Asp Ser Glu Glu Leu Asn Ile Ile Leu Gln Gly Asn Ile Ile

85 90 95

Leu Ser Thr Glu Lys Ser Lys Lys Leu Lys Lys Trp Pro Glu Ala Ser

100 105 110

Thr Thr Lys Arg Lys Ala Val Asp Thr Tyr Cys Leu Asp Tyr Lys Pro

115 120 125

Ser Lys Gly Arg Arg Trp Ala Ala Arg Ala Pro Ser Thr Arg Ile Thr

130 135 140

Tyr Gly Thr Ile Thr Lys Glu Arg Asp Tyr Cys Ala Glu Asp Gln Thr

145 150 155 160

Ile Glu Ser Trp Arg Glu Glu Gly Phe Pro Val Gly Leu Lys Leu Ala

165 170 175

Val Leu Gly Ile Phe Ile Ile Val Val Phe Val Tyr Leu Thr Val Glu

180 185 190

Asn Lys Ser Leu Phe Gly

195

<210> 12

<211> 84

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 人原生LEMD1F蛋白质序列

<400> 12

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln

20 25 30

Leu Glu Lys Leu Gly Phe Ser Pro Gly Pro Ile Leu Arg Gly Leu Gln

35 40 45

Glu His Gln Ala Pro Glu Ser His Met Gly Leu Ser Pro Lys Arg Glu

50 55 60

Thr Thr Ala Arg Lys Thr Arg Leu Ser Arg Ala Gly Glu Lys Lys Val

65 70 75 80

Ser Gln Trp Ala

Claims

1.一种核酸分子，其包含一或多种选自由以下组成的组的核酸序列：

(a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198的核酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84的核酸序列；

(c)编码SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271的核酸序列；

(d)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198的蛋白质的整个长度中占至少90％；

(e)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84的蛋白质的整个长度中占至少90％；

(f)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271的蛋白质的整个长度中占至少90％；

(g)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于96％一致；

(h)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于96％一致；

(i)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质与SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271至少95％一致；

(j)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于95.6％一致的蛋白质的整个长度中占至少90％；

(k)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于95.5％一致的蛋白质的整个长度中占至少90％；以及

(l)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271至少95％一致的蛋白质的整个长度中占至少90％。

2.一种核酸分子，其包含一或多种选自由以下组成的组的核酸序列：

(a)SEQ ID NO:1的核苷酸55到600；

(b)SEQ ID NO:3的核苷酸55到258；

(c)SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819；

(d)在包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到600的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；

(e)在包含SEQ ID NO:3的核苷酸55到258的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；

(f)在包含SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819的核酸分子的整个长度中占至少90％的片段；

(g)与SEQ ID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的片段；

(h)与SEQ ID NO:3的核苷酸55到258至少95％一致的片段；

(i)与SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的片段；

(j)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段；

(k)在与SEQ ID NO:3的核苷酸55到258至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及

(l)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的核酸序列的整个长度中占至少90％的片段。

3.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1、3或5中所示的核酸序列。

4.一种载体，其包含根据权利要求1到3中任一项所述的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的载体，其中所述载体是质粒或病毒载体。

6.根据权利要求4所述的载体，其中所述核酸分子可操作地连接到调控元件，所述调控元件选自启动子和聚腺苷酸化信号。

7.根据权利要求6所述的载体，其中所述启动子是人巨细胞病毒即刻早期启动子(hCMV启动子)。

8.根据权利要求6所述的载体，其中所述聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH polyA)。

9.一种组合物，其包含一种或多种根据权利要求1到4中任一项所述的核酸分子或根据权利要求5到8中任一项所述的载体。

10.根据权利要求9所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。

11.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198；

(b)SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84；

(c)SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271；

(d)在SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198的整个长度中占至少90％的片段；

(e)在SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84的整个长度中占至少90％的片段；

(f)在SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271的整个长度中占至少90％的片段；

(g)与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于96％一致的氨基酸序列；

(h)与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于96％一致的氨基酸序列；

(i)与SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271至少95％一致的氨基酸序列；

(j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸序列19到198大于95.6％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；

(j)在与SEQ ID NO:4的氨基酸序列19到84大于95.5％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及

(j)在与SEQ ID NO:6的氨基酸序列19到198和206和271至少95％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段。

12.一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列。

13.一种包含抗原的疫苗，其中所述抗原包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198；

(b)SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84；

(c)SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271；

(g)与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198大于95.6％一致的氨基酸序列；

(h)与SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84大于95.5％一致的氨基酸序列；

(k)在与SEQ ID NO:4的氨基酸序列19到84大于95.5％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段；以及

(l)在与SEQ ID NO:6的氨基酸序列19到198和206和271至少95％一致的氨基酸序列的整个长度中占至少90％的片段。

14.根据权利要求13所述的疫苗，其中所述抗原由包含一或多种核酸序列的核酸分子编码，所述核酸序列选自由以下组成的组：

(a)SEQ ID NO:1的核苷酸55到600；

(b)SEQ ID NO:3的核苷酸55到258；

(c)SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819；

(g)与SEQ ID NO:1的核苷酸55到600至少95％一致的片段；

(h)与SEQ ID NO:3的核苷酸55到258至少95％一致的片段；

(i)与SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819至少95％一致的片段；

15.一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包含在SEQ ID NO:1、3或5所示的核酸序列的整个长度上具有至少约95％一致性的核酸序列。

16.一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码肽，所述肽包含在SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列的整个长度上分别具有至少约95.6％、95.5％或95％一致性的氨基酸序列。

17.根据权利要求15到16所述的疫苗，其中所述核酸分子包含表达载体。

18.根据权利要求13到17中任一项所述的疫苗，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。

19.根据权利要求13到18中任一项所述的疫苗，其进一步包含佐剂。

20.根据权利要求19所述的疫苗，其中所述佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

21.一种包含肽的疫苗，其中所述肽包含在SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列的整个长度上分别具有至少约95.6％、95.5％或95％一致性的氨基酸序列。

22.一种包含肽的疫苗，其中所述肽包含SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列。

23.一种治疗患有表达LEMD1的癌细胞的受试者的方法，其包含施用治疗有效量的根据权利要求13到22中任一项所述的疫苗。

24.根据权利要求23所述的方法，其中施用包括电穿孔步骤。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中施用发生于所述受试者的一或多个部位。

26.一种向受试者接种针对表达LEMD1的癌细胞的疫苗的方法，其包含施用有效诱导体液免疫响应的量的根据权利要求13到22中任一项所述的疫苗。

27.一种包含SEQ ID NO:1、3或5中所示的核酸序列的核酸分子，其用作药剂。

28.一种包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到600中所示的核酸序列的核酸分子，其用作药剂。

29.一种包含SEQ ID NO:3的核苷酸55到258中所示的核酸序列的核酸分子，其用作药剂。

30.一种包含SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819中所示的核酸序列的核酸分子，其用作药剂。

31.一种包含SEQ ID NO:1、3或5中所示的核酸序列的核酸分子，其用作治疗癌症的药剂。

32.一种包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到600中所示的核酸序列的核酸分子，其用作治疗癌症的药剂。

33.一种包含SEQ ID NO:3的核苷酸55到258中所示的核酸序列的核酸分子，其用作治疗癌症的药剂。

34.一种包含SEQ ID NO:5的核苷酸55到594和616到819中所示的核酸序列的核酸分子，其用作治疗癌症的药剂。

35.一种包含编码SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子，其用于制备药剂。

36.一种包含编码SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198中所示的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子，其用于制备药剂。

37.一种包含编码SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84中所示的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子，其用于制备药剂。

38.一种包含编码SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271中所示的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子，其用于制备药剂。

39.一种包含编码SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子，其用于制备供治疗癌症用的药剂。

40.一种包含编码SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到198中所示的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子，其用于制备供治疗癌症用的药剂。

41.一种包含编码SEQ ID NO:4的氨基酸残基19到84中所示的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子，其用于制备供治疗癌症用的药剂。

42.一种包含编码SEQ ID NO:6的氨基酸残基19到198和206到271中所示的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子，其用于制备供治疗癌症用的药剂。