BR112020011620A2

BR112020011620A2 - Vacinas de câncer com alvo lemd1 e usos das mesmas

Info

Publication number: BR112020011620A2
Application number: BR112020011620-3A
Authority: BR
Inventors: Jian Yan; Anna SLAGER; Bradley GARMAN; Neil COOCH
Original assignee: Inovio Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-12-08
Also published as: KR20240096711A; MX2024005404A; JP2023111915A; MX2020006305A; RU2760984C1; JP2021506264A; CA3084137A1; EP3724217A1; AU2022263546A1; AU2018384824A1; EP3724217A4; AU2018384824A8; KR102673699B1; AU2018384824B2; US11338028B2; US20220265800A1; WO2019118771A1; CN111479822A; JP7314139B2; US20190175712A1

Abstract

a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam um antígeno de lemdi de consenso mutado. são divulgados vetores, composições e vacinas compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam um antígeno de lemdi de consenso mutado. são divulgados métodos para tratar um indivíduo com um tumor expressando lemdi e métodos para prevenir um tumor expressando lemdi. é divulgado antígeno de lemdi de consenso mutado.

Description

"MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO E SEU USO, VETOR, COMPOSIÇÃO, PROTEÍNA E VACINA". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade e benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos 62/598.329, depositado em 13 de dezembro de 2017 e Pedido de Patente Provisório dos Estados Uni- dos 62/598.612, depositado em 14 de dezembro de 2017, cujas divul- gações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] Este pedido contém uma Listagem de sequências, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada por meio deste a título de referência em sua totalidade. A cópia ASCII, cri- ada em 12 de dezembro de 2018, é denominada 104409 000449 se- quence listing.txt e tem 25.040 bytes de tamanho.

CAMPO TÉCNICO

[003] A presente invenção refere-se a antígenos LEMD1 e moléculas de ácido nucleico que codificam os mesmos. A presente invenção também se refere a vacinas, incluindo esses imunógenos LEMD1 e/ou moléculas de ácido nucleico. A presente invenção refere-se ainda a métodos de uso de vacinas para indução de respostas imunes e prevenção e/ou trata- mento de indivíduos com células cancerígenas ou tumores que expressam LEMD1.

ANTECEDENTES

[004] O câncer continua sendo uma das principais causas de morte nos EUA e no mundo. O mercado de vacinas contra o câncer está crescendo rapidamente. As vacinas eficazes contra tumores po- dem ser úteis para impedir o crescimento do tumor e/ou podem ser úteis como uma alternativa mais eficaz e menos tóxica aos tratamen- tos padrão para pacientes com câncer avançado. Um antígeno as- sociado ao câncer e, portanto, um alvo para vacinas antitumorais é o

LEMD1.

[005] LEMD1 é uma proteína de 20 kD localizada na membrana nuclear interna (INM). Lá, associa-se à lâmina nuclear, que está envol- vida em funções mecânicas nucleares e organização heterocromática. A LEMD1 é caracterizada por seu domínio LAP2-Emerin-MAN1 (LEM), inicialmente descrito como um módulo globular conservado de aproxi- madamente 40 aminoácidos que confere ligação ao fator de Barreira à Autointegração (BAF), uma proteína de ponte de DNA.

[006] Os complexos de nucleoproteínas de BAF-DNA desempe- nham um papel importante na remontagem nuclear em associação com lâminas e intensificação da descondensação da cromatina no final da mitose. O aumento da expressão de LEMD1 pode estar envolvido na mitose de células cancerígenas de crescimento rápido. Yuki, D. et al, Isolation of LEM Domain-Containing 1, a Novel Testis-specific Gene Expressed in Colorectal Cancers. Oncology reports 12, 275-280 (2004). Seis isoformas LEMD1 foram identificadas como LEMD1A a LEMD1F.

[007] As vacinas para o tratamento e prevenção do câncer são de interesse. No entanto, as vacinas existentes direcionadas a antíge- nos de células tumorais são limitadas por expressão de antígeno defi- ciente in vivo. Por conseguinte, permanece uma necessidade na técni- ca de vacinas seguras e eficazes e métodos de seu uso para prevenir e/ou tratar o câncer e reduzir a mortalidade em indivíduos que sofrem de câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] São aqui divulgadas moléculas de ácido nucleico compre- endendo uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em (a) uma sequência de ácido nucleico que codi- fica os resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica os resíduos de aminoácidos

19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica os resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (d) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína compreendendo os resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (e) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento intei- ro de uma proteína compreendendo os resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (f) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína compreendendo os resíduos de aminoácido 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (g) uma sequência de ácido nu- cleico que codifica uma proteína que é mais que 95,6% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (h) uma sequên- cia de ácido nucleico que codifica uma proteína que é mais que 95,5% idêntica aos resíduos de aminoácido 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo me- nos 95% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (j) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento intei- ro de uma proteína que é mais que 95,6% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (k) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é mais que 95,5% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; e (1) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compre- endendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6.

[009] As moléculas de ácido nucleico são fornecidas que com-

preendem uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em (a) nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (b) nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (c) nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nu- cleico compreendendo os nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreendendo os nucleo- tídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreendendo os nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (g) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (h) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (i) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (])) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de áci- do nucleico que é pelo menos 95% idêntica aos nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; e (1) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um compri- mento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 1,3 ou 5.

[0010] Também são fornecidas moléculas de ácido nucleico, como aqui descrito, em que a molécula de ácido nucleico é incorporada a um plasmídeo ou vetor. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico pode estar operacionalmente ligada a um elemento regulador selecionado a partir de um promotor e um sinal de poliadenilação. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor imediato do citome- galovírus humano (promotor do hcMV). Em ainda outras modalidades, o sinal de poliadenilação pode ser um sinal de poliadenilação do hor- mônio do crescimento bovino (bGH poli A). Em ainda outras modalida- des, a molécula de ácido nucleico pode ser incorporada em um vetor viral.

[0011] Também são divulgadas composições que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico, conforme estabelecido nes- te documento. Em alguns aspectos, essas composições compreendem ainda um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0012] Também são aqui fornecidas proteínas e peptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em (a) resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (c) resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resí- duos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resí- duos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resí- duos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 SEQ ID NO: 6; (g) uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,6% idêntica aos resí- duos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (h) uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,5% idêntica aos resíduos de ami- noácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (])) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoá- cidos que é mais que 95,6% idêntica às sequências de aminoácidos

19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoá- cidos que é mais que 95,5% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; e (1) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoá- cidos que é pelo menos 95% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 e 206 e 271 da SEQ ID NO: 6.

[0013] As vacinas também são fornecidas neste documento que compreendem um antígeno, em que o antígeno compreende a se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em (a) re- síduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (c) resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (d) um fragmento compreen- dendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (e) um fragmento compreen- dendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (f) um fragmento compreen- dendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 SEQ ID NO: 6; (g) uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,6% idêntica aos resíduos de ami- noácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (h) uma sequência de aminoáci- dos que é mais que 95,5% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (])) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,6% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,5% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; e (1) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 e 206 e 271 da SEQ ID NO: 6.

[0014] Em algumas modalidades, o antígeno da vacina é codifica- do pela molécula de ácido nucleico compreendendo uma ou mais se- quências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em (a) nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (b) nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (c) nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro uma molécula de ácido nucleico compreendendo os nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (e) um fragmento compre- endendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécu- la de ácido nucleico compreendendo os nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreen- dendo os nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (g) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (h) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (i) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (])) 5; um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimen- to inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; e (1) um frag- mento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 1.

[0015] Vacinas adicionais são fornecidas compreendendo uma molécula de ácido nucleico em que a molécula de ácido nucleico com- preende uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 95% de identidade através de um comprimento inteiro da sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 1,3 ou 5.

[0016] Também são divulgadas aqui vacinas compreendendo uma molécula de ácido nucleico em que a molécula de ácido nucleico codi- fica um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95% de identidade através de um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2,4 ou 6. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico pode ser um vetor de expressão. Em algumas modalidades, a vacina compre- ende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável ou um adjuvan- te.

[0017] Também são divulgadas vacinas que compreendem um peptídeo, em que o peptídeo compreende uma sequência de aminoá- cidos com pelo menos cerca de 90% de identidade ao longo de um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2,4 ou 6.

[0018] Também são aqui fornecidos métodos de tratamento de um indivíduo com uma célula cancerígena que expressa LEMD1, compre- endendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina aqui descrita.

[0019] Métodos de vacinação de um indivíduo contra uma célula cancerígena que expressa LEMD1, compreendendo administrar uma quantidade de uma vacina, conforme descrito aqui, eficaz para induzir uma resposta imune humoral.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A FIG. 1A é um alinhamento de sequência dos aminoácidos 19-198 do consenso sintético LEMD1A (SEQ ID NO: 1) com LEMD1IA humano nativo (SEQ ID NO: 11). A FIG. 1B apresenta a identidade e divergência de sequência entre o consenso nativo e sintético LEMD1A.

[0021] A FIG. 2 é uma representação esquemática do consenso sintético LEMD1 A.

[0022] A FIG. 3 ilustra a estratégia de clonagem empregada para gerar pGX1431.

[0023] A FIG. 4 A é um alinhamento de sequência dos aminoáci- dos 19-84 do consenso sintético LEMD1IF (SEQ ID NO: 4) com LEMD1F humano nativo (SEQ ID NO: 12). A FIG. 4B apresenta a iden- tidade e divergência de sequência entre o consenso nativo e sintético LEMD1F.

[0024] A FIG. 5 é uma representação esquemática do consenso sintético LEMD1F.

[0025] A FIG. 6 ilustra a estratégia de clonagem empregada para gerar pGX1432.

[0026] A FIG. 7 é uma representação esquemática do consenso sintético LEMD1AF.

[0027] A FIG. 8 ilustra a estratégia de clonagem empregada para gerar pGX1433.

[0028] A FIG. 9 mostra um Western blot para determinar a expres- são do consenso sintético LEMD1A, LEMD1F e LEMD1AF gerado a partir dos construtos pGX1431, pGX1432 e pGX1433, respectivamen- te, em células de rabdomiossarcoma.

[0029] A FIG. 10 representa a estratégia de bloqueio da citometria de fluxo usada para caracterizar as respostas imunes celulares.

[0030] A FIG. 11A, a FIG. 11B e FIG. 11C ilustram graficamente a imunogenicidade do consenso sintético LEMD1A, consenso sintético LEMD1F e consenso sintético LEMD1AF, respectivamente.

[0031] A FIG. 12A, a FIG. 12B e FIG. 12C ilustram graficamente a frequência relativa de células T CD4+ induzidas por consenso sintético

LEMD1A, consenso sintético LEMD1F e consenso sintético LEMD1AF, respectivamente. A FIG. 12D compara as frequências relativas de cé- lulas T CD4+ induzidas por consenso sintético LEMD1A e consenso sintético LEMD1F. A FIG. 12E ilustra o perfil de citocinas induzido pelo consenso sintético LEMD1A, LEMD1F e LEMD1AF no compartimento de células T CD4+.

[0032] A FIG. 13A, FIG. 13B e FIG. 13C ilustra graficamente o po- tencial citolítico de células T CD4+ CD107a+ específicas de antígeno induzidas pelo consenso sintético LEMD1A, consenso sintético LEMD1F e consenso sintético LEMD1AF, respectivamente. A FIG. 13D compara as frequências relativas de células T CD4+ CD107a+ induzidas por consenso sintético LEMD1A e consenso sintético LEMD1F. A FIG. 13E ilustra o perfil de citocinas induzido em CD4 + CD107a+ por pGX1431, pGX1432 e pGX1433.

[0033] A FIG. 14A, a FIG. 14B e FIG. 14C ilustram graficamente as frequências relativas de células T CD8+ induzidas por LEMD1A (con- senso sintético pPGX1431), LEMD1F (consenso sintético pGX1432) e LEMD1AF (consenso sintético PpGX1433). A FIG. 14D compara as fre- quências relativas de células T CD8+ induzidas por consenso sintético LEMD1A e consenso sintético LEMD1F. A FIG. 14E ilustra o perfil de citocinas induzido pelo consenso sintético LEMD1A, LEMD1F e LEMD1AF no compartimento de células T CD8+.

[0034] A FIG. 15A, FIG. 15B e FIG. 15C ilustra graficamente o po- tencial citolítico de células T CD8+ CD107a+ específicas de antígeno induzidas pelo consenso sintético LEMD1A, consenso sintético LEMD1F e consenso sintético LEMD1AF, respectivamente. A FIG. 15D compara as frequências relativas de células T CD8+ CD107a+ induzidas por consenso sintético LEMD1A e consenso sintético LEMD1F. A FIG. 15E ilustra o perfil de citocinas induzido em CD8+ CD107a+ por LEMD1A (consenso sintético PpGX1431), LEMD1F (con-

senso sintético pPGX 1432) e LEMD1AF (consenso sintético PpGX1433).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0035] A presente invenção refere-se a uma vacina compreenden- do um antígeno LEMD1. O LEMD1 é expresso em muitos tumores. Por conseguinte, a vacina fornece tratamento para um câncer ou tumor baseado em câncer que expressa LEMD1. A vacina da invenção pode proporcionar qualquer combinação de antígenos de câncer particula- res para a prevenção ou tratamento particular do câncer de um indiví- duo que necessite de tratamento.

[0036] Uma maneira de projetar o ácido nucleico e sua sequência de aminoácidos codificada do antígeno de câncer recombinante é através da introdução de mutações que alteram aminoácidos particula- res na sequência geral de aminoácidos do antígeno de câncer nativo. A introdução de mutações não altera tanto o antígeno do câncer que ele não possa ser universalmente aplicado em um mamífero e, de pre- ferência, em humanos ou cães, mas altera o suficiente para que a se- quência de aminoácidos resultante quebre a tolerância ou seja consi- derada um antígeno estranho para gerar uma resposta imune. Outra maneira pode ser criar um antígeno de câncer recombinante de con- senso que tenha pelo menos 85% e até 99% de identidade de se- quência de aminoácidos em relação ao seu antígeno de câncer nativo correspondente; preferencialmente pelo menos 90% e até 98% de identidade de sequência; mais preferencialmente pelo menos 93% e até 98% de identidade de sequência; ou ainda mais preferencialmente pelo menos 95% e até 98% de identidade de sequência. Em alguns casos, o antígeno de câncer recombinante tem identidade de sequên- cia de aminoácidos de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de seu antígeno de câncer nativo correspondente. O antígeno de câncer nativo é o an- tígeno normalmente associado ao tumor específico de câncer ou cân- cer. Dependendo do antígeno de câncer, a sequência de consenso do antígeno de câncer pode ser através de espécies de mamíferos ou dentro de subtipos de uma espécie ou através de cepas virais ou soro- tipos. Alguns antígenos de câncer não variam muito da sequência de aminoácidos do tipo selvagem do antígeno de câncer. Alguns antíge- nos de câncer têm sequências de ácidos nucleicos/aminoácidos que são tão divergentes entre as espécies, que uma sequência de consen- so não pode ser gerada. Nesses casos, é gerado um antígeno recom- binante do câncer que rompe a tolerância e gera uma resposta imune que possui pelo menos 85% e até 99% de identidade de sequência de aminoácidos ao seu antígeno de câncer nativo correspondente; prefe- rencialmente pelo menos 90% e até 98% de identidade de sequência; mais preferencialmente pelo menos 93% e até 98% de identidade de sequência; ou ainda mais preferencialmente pelo menos 95% e até 98% de identidade de sequência. Em alguns casos, o antígeno de câncer recombinante tem identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de seu antígeno de câncer nativo cor- respondente. As abordagens acima mencionadas podem ser combi- nadas de modo a que o antígeno de câncer recombinante final tenha uma porcentagem de similaridade com a sequência de aminoácidos de antígeno de câncer nativo, como discutido acima.

[0037] O antígeno LEMD1 pode ser um antígeno consensual LEMD1 derivado das sequências de LEMD1 de diferentes espécies ou de diferentes isoformas dentro de uma espécie e, portanto, o antígeno consensual LEMD1 não é nativo. O LEMD1 recombinante pode induzir respostas de anticorpos de células T específicas de antígeno e/ou de altos níveis, induzindo ou provocando assim uma resposta imune que é dirigida ou reativa contra o câncer ou tumor que expressa o antíge- no. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida ou provoca- da pode ser uma resposta imune celular, humoral ou tanto celular quanto humoral. Em algumas modalidades, a resposta imune celular induzida ou provocada pode incluir indução ou secreção de interferon gama (IFN-y) e/ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-a). Em outras modalidades, a resposta imune induzida ou provocada pode reduzir ou inibir um ou mais fatores de imunossupressão que promovem o cres- cimento do tumor ou câncer que expressa o antígeno, por exemplo, mas não limitados a fatores que suprarregulam a apresentação de MHC, fatores que suprarregulam as células T reguladoras específicas de antígeno (Tregs), PD-L1, FasL,citocinas, como I1L-10 e TFG-b, ma- crófagos associados a tumores, fibroblastos associados a tumores, fatores solúveis produzidos por células imunossupressoras, CTLA-A4, PD-1, MDSCs, MCP-1 e uma molécula de ponto de verificação imuno- lógico

[0038] A vacina pode ser combinada ainda mais com anticorpos para inibidores do ponto de verificação, como PD-1 e PDL-1, para au- mentar a estimulação das respostas imunes celular e humoral. O uso de anticorpos anti-PD-1 ou anti-PDL-1 impede que PD-1 ou PDL-1 su- primam as respostas das células T e/ou das células B. Em geral, ao projetar os antígenos do câncer a serem reconhecidos pelo sistema imunológico, ajuda a superar outras formas de supressão imunológica pelas células tumorais, e essas vacinas podem ser usadas em combi- nação com terapias de supressão ou inibição (como terapias de anti- corpo anti-PD-1 e anti-PDL-1) para aumentar ainda mais as respostas das células T e/ou das células B. Definições

[0039] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado compreendido comumente por versados na técnica. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo as definições, controlará. Métodos e materiais preferidos são descritos a seguir, embora métodos e materiais seme- lhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção. Todas as publica- ções, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas por referência em suas totalida- des. Os materiais, métodos e exemplos descritos neste documento são ilustrativos apenas e não se destinam a ser um fator limitante. À terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitante da invenção.

[0040] Os termos "compreende(m)", "incluilem)", "ter", "tem", "po- de", "contém(êm)", e as variantes destes, conforme usado neste do- cumento, destinam-se a ser frases de transição em aberto, termos ou palavras que não excluem a possibilidade de atos ou estruturas adici- onais. As formas singulares "uma", "um" e "a/o" incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. À presente divulgação também contempla outras modalidades "compre- endendo", "consistindo nas" e "consistindo essencialmente nas" moda- lidades ou elementos apresentados neste documento, se explicitamen- te estabelecido ou não.

[0041] Para a recitação de faixas numéricas neste documento, ca- da valor intermediário tendo o mesmo grau de precisão que a faixa re- citada mínima e máxima é explicitamente contemplado. Por exemplo, para a faixa de 6-9, os números 7 e 8 são contemplados além de 6 e 9, e para a faixa de 6,0-7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0 são contemplados explicitamente.

[0042] "Adjuvante", como utilizado neste documento, significa qualquer molécula adicionada às vacinas de DNA de plasmídeo des- critas neste documento para aumentar a imunogenicidade dos antíge- nos codificados pelos plasmídeos de DNA e das sequências de ácidos nucleicos de codificação descritas adiante.

[0043] "Anticorpo", como utilizado neste documento, significa um anticorpo das classes IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, ou fragmentos ou de- rivativos dos mesmos, includindo Fab, F(ab')2, Fd, e anticorpos de ca- deia única, bivalentes, anticorpos biespeciíficos, anticorpos bifuncionais e derivados dos mesmos. O anticorpo pode ser um anticorpo isolado da amostra de soro de um mamífero, um anticorpo policlonal, um anti- corpo purificado de afinidade ou qualquer mistura dos mesmos, que apresenta especificidade suficiente de ligação a um epítopo desejado ou a uma sequência derivada destes.

[0044] "Antígeno" refere-se a proteínas com sequências de ami- noácidos LEMD1 mutadas, incluindo a SEQ ID NO: 2 e fragmentos dos mesmos de comprimentos estabelecidos aqui, como os resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; variantes, isto é, proteínas com sequências que têm identidade com a SEQ ID NO: 2, como esta- belecido aqui e fragmentos de variantes com comprimentos estabele- cidos aqui, e combinações dos mesmos. "Antígeno" também se refere a proteínas com sequências de aminoácidos LEMD1 mutadas, incluin- do a SEQ ID NO: 4 e fragmentos dos mesmos de comprimentos esta- belecidos aqui, como os resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; variantes, isto é, proteínas com sequências que têm identidade com a SEQ ID NO: 4, conforme estabelecido aqui e fragmentos de va- riantes com comprimentos estabelecidos aqui, e combinações dos mesmos. "Antígeno" também refere-se a proteínas com sequências de aminoácidos LEMD1 mutadas, incluindo a SEQ ID NO: 6 e fragmentos dos mesmos de comprimentos estabelecidos aqui, como os resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; variantes, isto é, proteínas com sequências que têm identidade com a SEQ ID NO: 6, como estabelecido aqui e fragmentos de variantes com comprimentos estabelecidos aqui, SEQ ID NO:6 e combinações dos mesmos. Os an- tígenos podem opcionalmente incluir peptídeos de sinal, como os de outras proteínas.

[0045] "Sequência codificante" ou "ácido nucleico codificador", como usado aqui, significa os ácidos nucleicos (molécula de RNA ou de DNA) que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codi- fica uma proteína. A sequência codificante pode ainda incluir sinais de iniciação e terminação operacionalmente ligados a elementos regulató- rios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de di- recionar a expressão nas células de um indivíduo ou mamífero ao qual o ácido nucleico é administrado.

[0046] "Complemento" ou "complementar", como utilizado neste documento, significa que um ácido nucleico pode significar uma base de Watson-Crick (por exemplo, A-T/U e C-G) ou de Hoogsteen pare- ando entre os nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos das molécu- las de ácido nucleico.

[0047] "Consenso" ou "sequência de consenso", como utilizado neste documento, significa uma sequência polipeptídica que é basea- da na análise de um alinhamento de múltiplas sequências para o mesmo gene de diferentes organismos. As sequências de ácidos nu- cleicos que codificam uma sequência consenso polipeptídica podem ser preparadas. As vacinas compreendendo as proteínas que compre- endem as sequências consenso e/ou as moléculas de ácido nucleico que codificam tais proteínas podem ser usadas para induzir ampla imunidade contra um antígeno.

[0048] "Corrente constante", como aqui utilizado descreve uma corrente que é recebida ou experimentada por um tecido, ou células que definem o referido tecido, durante a duração de um pulso elétrico administrado ao mesmo tecido. O pulso elétrico é administrado a partir dos dispositivos de eletroporação aqui descritos. Esta corrente perma- nece com uma amperagem constante no referido tecido durante a vida de um pulso elétrico, porque o dispositivo de eletroporação aqui forne- cido possui um elemento de realimentação, preferivelmente tendo rea-

limentação instantânea. O elemento de feedback pode medir a resis- tência do tecido (ou células) durante toda a duração do pulso e fazer com que o dispositivo de eletroporação altere sua produção de energia elétrica (por exemplo, aumente a tensão), de modo que a corrente no mesmo tecido permaneça constante durante todo o pulso elétrico (li- gado a ordem dos microssegundos) e de pulso para pulso. Em algu- mas modalidades, o elemento de feedback compreende um controla- dor.

[0049] "Feedback de corrente" ou "feedback", conforme usado neste documento, pode ser usado de forma intercambiável e pode sig- nificar a resposta ativa dos dispositivos de eletroporação fornecidos, que compreendem medir a corrente no tecido entre os eletrodos e alte- rar a saída de energia fornecida pelo dispositivo EP de acordo, para manter a corrente em um nível constante. Esse nível constante é pre- definido pelo usuário antes do início de uma sequência de pulsos ou tratamento elétrico. O feedback pode ser realizado pelo componente de eletroporação, por exemplo, controlador, do dispositivo de eletropo- ração, pois o circuito elétrico nele é capaz de monitorar continuamente a corrente no tecido entre os eletrodos e comparar essa corrente moni- torada (ou corrente no tecido) com uma corrente predefinida e conti- nuamente faz ajustes na produção de energia para manter a corrente monitorada em níveis predefinidos. O loop de feedback pode ser ins- tantâneo, pois é um feedback de loop fechado analógico.

[0050] "Corrente descentralizada", como utilizado neste documen- to, pode significar o padrão de correntes elétricas entregues dos vários arranjos de eletrodos de agulha dos dispositivos de eletroporação aqui descritos, em que os padrões minimizam, ou preferivelmente eliminam, a ocorrência de estresse térmico relacionado à eletroporação em qual- quer área do tecido eletroporado.

[0051] "Eletroporação", "eletropermeabilização," ou "potenciamen-

to eletrocinético" ("EP"), tal como utilizado permutavelmente aqui, sig- nifica a utilização de um pulso de campo elétrico transmembrana para induzir caminhos microscópicos (poros) em uma biomembrana; sua presença permite que biomoléculas como plasmídeos, oligonucleotí- deos, siRNA, drogas, íons e água passem de um lado da membrana celular para o outro.

[0052] "Fragmento", como utilizado neste documento com relação às sequências de ácidos nucleicos, significa uma sequência de ácido nucleico ou uma porção do mesmo, que codifica um polipeptídeo ca- paz de provocar uma resposta imune em um mamífero que reage cru- zadamente com um antígeno divulgado aqui. Os fragmentos podem ser fragmentos de DNA selecionados de, pelo menos, uma das diver- sas sequências de nucleotídeos que codificam os fragmentos de prote- ína definidos abaixo. Os fragmentos podem compreender pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo me- nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos menos 95% de uma ou mais das sequên- cias de ácido nucleico apresentadas abaixo, excluindo um peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender pelo me- nos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de uma ou mais das sequências de ácidos nucleicos es- tabelecidas abaixo e adicionalmente opcionalmente compreendem a sequência que codifica um peptídeo sinal heterólogo que não é incluí- do quando se calcula a porcentagem de identidade. Os fragmentos podem ainda compreender sequências de codificação para um peptí- deo sinal, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal IgE ou IgG. A sequência de codificação que codifica uma metionina e/ou peptídeo de sinal do terminal N pode ser ligada a um fragmento da sequência de codificação.

[0053] Em algumas modalidades, os fragmentos podem compre-

ender pelo menos 20 nucleotídeos ou mais, pelo menos 30 nucleotí- deos ou mais, pelo menos 40 nucleotídeos ou mais, pelo menos 50 nucleotídeos ou mais, pelo menos 60 nucleotídeos ou mais, pelo me- nos 70 nucleotídeos ou mais, pelo menos 80 nucleotídeos ou mais, pelo menos 90 nucleotídeos ou mais, pelo menos 100 nucleotídeos ou mais, pelo menos 150 nucleotídeos ou mais, pelo menos 200 nucleotí- deos ou mais, pelo menos 250 nucleotídeos ou mais, pelo menos 300 nucleotídeos ou mais , pelo menos 350 nucleotídeos ou mais, pelo menos 400 nucleotídeos ou mais, pelo menos 450 nucleotídeos ou mais, pelo menos 500 nucleotídeos ou mais, pelo menos 550 nucleotí- deos ou mais, pelo menos 600 nucleotídeos ou mais, pelo menos 650 nucleotídeos ou mais, pelo menos 700 nucleotídeos ou mais, pelo me- nos 750 nucleotídeos ou mais de pelo menos uma das sequências de ácidos nucleicos estabelecidas abaixo.

[0054] "Fragmento" ou "fragmento imunogênico" com relação às sequências polipeptídicas significa um polipeptídeo capaz de provocar uma resposta imune em um mamífero que reage cruzadamente com um antígeno divulgado aqui. Os fragmentos podem ser fragmentos po- lipeptídicos selecionados de pelo menos uma das várias sequências de aminoácidos. Os fragmentos de proteínas consenso podem com- preender pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pe- lo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de uma proteína consenso, excluindo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de uma ou mais das sequências amino estabelecidas abaixo e adicionalmente opcio- nalmente compreendem um peptídeo sinal heterólogo que não é inclu- ído quando se calcula a porcentagem de identidade. Os fragmentos podem ainda compreender um peptídeo sinal, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal IgE ou IgG.

[0055] Em algumas modalidades, fragmentos de proteínas de con- senso podem compreender pelo menos 20 aminoácidos ou mais, pelo menos 30 aminoácidos ou mais, pelo menos 40 aminoácidos ou mais, pelo menos 50 aminoácidos ou mais, pelo menos 60 aminoácidos ou mais, pelo menos 70 aminoácidos ou mais, pelo menos 80 aminoáci- dos ou mais, pelo menos 90 aminoácidos ou mais, pelo menos 100 aminoácidos ou mais, pelo menos 110 aminoácidos ou mais, pelo me- nos 120 aminoácidos ou mais , pelo menos 130 aminoácidos ou mais, pelo menos 140 aminoácidos ou mais, pelo menos 150 aminoácidos ou mais, pelo menos 160 aminoácidos ou mais, pelo menos 170 ami- noácidos ou mais, pelo menos 180 aminoácidos ou mais, em pelo me- nos 190 aminoácidos ou mais, pelo menos 200 aminoácidos ou mais, pelo menos 210 aminoácidos ou mais, pelo menos 220 aminoácidos ou mais, pelo menos 230 aminoácidos ou mais, pelo menos 240 ami- noácidos ou mais, pelo menos 250 aminoácidos ou mais, ou pelo me- nos 260 aminoácidos ou mais de uma sequência de proteínas aqui di- vulgada.

[0056] Como utilizado neste documento, o termo "construto gené- tico" refere-se às moléculas de DNA ou RNA que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codificam uma proteína. A sequência de codificação inclui sinais de iniciação e de terminação ligados de forma operável a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células do indivíduo ao qual a molécula de ácido nucleico é administrada. Como utilizado neste documento, o termo "forma expressável" se refere a um construto de gene que contêm os elementos regulatórios necessários operavelmente ligados a uma sequência de codificação que codifica uma proteína, de tal modo que quando presente na célula de um indi- víduo, a sequência de codificação será expressa.

[0057] O termo "homólogo", tal como aqui utilizado, refere-se ao grau de complementaridade. Pode haver uma homologia parcial ou uma homologia completa (i.e., identidade). Uma sequência parcial- mente complementar que inibe pelo menos parcialmente uma sequên- cia completamente complementar da hibridação com um ácido nuclei- co alvo é referida usando o termo funcional “substancialmente homó- logo". Quando usado em referência a uma sequência de ácido nuclei- co de fita dupla, como um cDNA ou clone genômico, o termo substan- cialmente homólogo”, tal como aqui utilizado, refere-se a uma sonda que pode hibridar com uma fita da sequência de ácido nucleico de fita dupla sob condições de baixa estringência. Quando usado em referên- cia a uma sequência de ácidos nucleicos de fita única, o termo "subs- tancialmente homólogo”, como utilizado neste documento, refere-se a uma sonda que pode hibridizar para (i.e., é o complemento de) uma sequência modelo de ácido nucleico de fita simples sob condições de baixa estringência.

[0058] "Idêntico" ou "identidade", tal como aqui utilizado no contex- to de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, po- dem significar que as sequências têm uma porcentagem especificada de resíduos que são as mesmas ao longo de uma região especificada. A porcentagem pode ser calculada por alinhamento ótimo das duas sequências, comparando as duas sequências sobre a região especifi- cada, determinando o número de posições em que o resíduo idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na região especificada, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade da se- quência. Em casos em que as duas sequências são de comprimentos diferentes ou em que o alinhamento produz uma ou mais extremidades espaçadas e a região especificada de comparação inclui apenas uma única sequência, os resíduos da sequência única são incluídos no de- nominador, mas não no numerador do cálculo. Ao comparar o DNA e o RNA, timina (T) e uracil (U) podem ser considerados equivalentes. À identidade pode ser executada manualmente ou usando um algoritmo de sequência de computador, como o BLAST ou BLAST 2.0.

[0059] "Impedância", conforme usada neste documento, pode ser usada ao discutir o mecanismo de feedback e pode ser convertida em um valor atual de acordo com a lei de Ohm, permitindo comparações com a corrente predefinida.

[0060] "Resposta imune", tal como aqui utilizado, significa a ativa- ção de um sistema imunológico do hospedeiro, por exemplo, o de um mamífero, em resposta à introdução de antígeno. A resposta imune pode estar na forma de uma resposta celular ou humoral, ou ambas.

[0061] "Ácido nucleico" ou "oligonucleotídeo" ou "polinucleotídeo", como usado neste documento, significa pelo menos dois nucleotídeos covalentemente ligados entre si. A representação de uma fita simples também define a sequência da fita complementar. Assim, um ácido nucleico também engloba a fita complementar de uma fita simples re- presentada. Muitas variantes de um ácido nucleico podem ser usadas para a mesma finalidade que um determinado ácido nucleico. Assim, um ácido nucleico também engloba substancialmente ácidos nucleicos idênticos e complementos dos mesmos. Uma fita única fornece uma sonda que pode hibridizar a uma sequência-alvo sob condições restri- tivas de hibridização. Assim, um ácido nucleico também engloba uma sonda que se hibridiza sob condições de hibridização rigorosas.

[0062] Os ácidos nucleicos podem ser de fita única ou de fita du- pla, ou podem conter porções das sequências de fita dupla ou de fita única. O ácido nucleico pode ser o DNA, genômico e cDNA, RNA ou um híbrido, onde o ácido nucleico pode conter combinações de deoxir- ribo- e ribo-nucleotídeos e combinações de bases incluindo uracila,

adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isoci- tosina e isoguanina. Os ácidos nucleicos podem ser obtidos por méto- dos de síntese química ou por métodos recombinantes.

[0063] "Operacionalmente ligado", como usado aqui, significa que a expressão de um gene está sob o controle de um promotor com o qual ele está espacialmente conectado. Um promotor pode ser posici- onado 5' (a montante) ou 3' (a jusante) de um gene sob seu controle. À distância entre o promotor e um gene pode ser aproximadamente a mesma que a distância entre aquele promotor e o gene que ele contro- la no gene do qual o promotor é derivado. Como é conhecido na técni- ca, a variação desta distância pode ser ajustada sem perda da função do promotor.

[0064] Um "peptídeo", "proteína" ou "polipeptídeo", como utilizado neste documento, pode significar uma sequência de aminoácidos liga- dos e pode ser natural, sintético ou uma modificação ou combinação de natural e sintético.

[0065] "Promotor", como utilizado neste documento, significa uma molécula sintética ou naturalmente derivada que é capaz de conferir, ativar ou potencializar a expressão de um ácido nucleico em uma célu- la. Um promotor pode compreender uma ou mais sequências regulató- rias transcricionais específicas para potencializar ainda mais a expres- são e/ou para alterar a expressão espacial e/ou expressão temporal de um ácido nucleico em uma célula. Um promotor também pode com- preender elementos acentuadores distais ou repressores, que podem ser localizados, tanto quanto milhares de pares de base, a partir do local de início da transcrição. Um promotor pode ser derivado de fon- tes que incluem vírus, bactérias, fungos, plantas, insetos e animais. Um promotor pode regular a expressão de um componente de gene constitutivamente, ou diferencialmente em relação à célula, ao tecido ou ao órgão em que a expressão ocorre ou, em relação ao estágio de desenvolvimento em que a expressão ocorre, ou em resposta a estí- mulos externos, tais como estresses fisiológicos, patogênicos, íons metálicos, ou agentes de indução. Exemplos representativos de pro- motores incluem o promotor do bacteriófago T7, promotor do bacterió- fago T3, promotor SP6, promotor operador lac, promotor tac, promotor SVA40 tardio, promotor SV40 precoce, promotor RSV-LTR, promotor IE de CMV, promotor SV40 precoce ou promotor SV40 tardio e promotor IE de CMV.

[0066] "Peptídeo sinal" e "sequência líder" são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a uma sequência de aminoácido que pode ser ligada no amino terminal de uma proteína estabelecida neste documento. Peptídeos sinal/sequências líderes normalmente direcionam a localização de uma proteína. Peptídeos si- nal/sequências principais usados neste documento preferencialmente facilitam a secreção da proteína a partir da célula em que são produzi- dos. Peptídeos sinal/sequências líderes são frequentemente clivados do restante da proteína, frequentemente referidos como a proteína madura, mediante a secreção da célula. Os peptídeos sinal/sequên- cias líderes estão ligados no terminal amino (isto é, terminal N) da pro- teína.

[0067] "Condições restritivas de hibridização", tal como aqui utili- zado, significa que as condições sob as quais uma primeira sequência de ácido nucleico (por exemplo, sonda) irá hibridizar para uma segun- da sequência de ácido nucleico (por exemplo, alvo), tal como em uma mistura complexa de ácidos nucleicos. Condições restritivas são de- pendentes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstân- cias. As condições restritivas podem ser selecionadas para ser de cer- ca de 5 a 10 ºC menor que o ponto de fusão térmica (Tm) para a se- quência específica a um pH de força iônica definido. A Tm pode ser a temperatura (força iônica, pH e concentração nucleica definidos) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam para a se- quência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, a Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). Condições restritivas podem ser aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de íon de sódio, tal como uma concen- tração de aproximadamente 0,01-1,0 M de íons de sódio (ou outros sais) a um pH de 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30ºC para sondas curtas (por exemplo, aproximadamente 10-50 nu- cleotídeos) e pelo menos cerca de 60ºC para sondas longas (por exemplo, maior do que cerca de 50 nucleotídeos). As condições restri- tivas também podem ser alcançadas com a adição de agentes deses- tabilizantes, como a formamida. Para a hibridização seletiva ou especí- fica, um sinal positivo pode ser hibridização de fundo pelo menos que 2 a 10 vezes. Exemplos de condições restritivas de hibridização inclu- em o seguinte: formamida a 50%, SSC 5x e SDS a 1%, incubando a 42ºC, ou SSC 5x, SDS a 1%, incubando a 65ºC, com lavagem em SSC 0,2x e 0,1 % De SDS a 65ºC.

[0068] "Indivíduo", tal como aqui utilizado pode significar um ma- mífero que deseja ou que possui necessidade de ser imunizado com a vacina descrita aqui. O mamífero pode ser um humano, chipanzé, ca- chorro, gato, cavalo, vaca, camundongo ou rato.

[0069] "Substancialmente complementar", tal como aqui utilizado, pode significar que a primeira sequência é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao complemento de uma segunda sequência ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou que as duas se- quências hibridizam sob condições de hibridação estritas.

[0070] "Substancialmente idêntico(a)", tal como aqui utilizado, sig- nifica que a primeira e a segunda sequências são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- ticas a uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou em relação a ácidos nucleicos, se a primeira sequência for subs- tancialmente complementar ao complemento da segunda sequência.

[0071] "Tratar", "tratamento" ou "tratando", como aqui utilizado, pode significar proteger um animal de uma doença através de meios de prevenir, suprimir, reprimir ou eliminar completamente a doença. Prevenir a doença envolve administrar uma vacina da presente inven- ção a um animal antes da aparição da doença. Suprimir a doença en- volve administrar uma vacina da presente invenção a um indivíduo após a indução da doença, mas antes de seu aparecimento clínico. Reprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente inven- ção a um animal após aparecimento clínico da doença.

[0072] "Variante", como utilizado neste documento com relação a um ácido nucleico, significa (i) uma porção ou fragmento de uma se- quência de nucleotídeos referenciada; (ii) o complemento de uma se- quência de nucleotídeos referenciada ou parte da mesma; (iii) um áci- do nucleico que é substancialmente idêntico a um ácido nucleico refe- renciado ou ao complemento deste; ou (iv) um ácido nucleico que hi- bridiza sob condições restritivas para o ácido nucleico referenciado, seu complemento ou uma sequência substancialmente idêntica ao mesmo.

[0073] "Variante", como aqui utilizado em relação a um peptídeo ou polipeptídeo, significa um peptídeo ou polipeptídeo que difere na sequência de aminoácidos pela inserção, exclusão ou substituição conservadora de aminoácidos, mas retém pelo menos uma atividade biológica.

Variante também pode significar uma proteína com uma se- quência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a uma prote- íÍna referenciada com uma sequência de aminoácidos que retém pelo menos uma atividade biológica.

Uma substituição conservativa de um aminoácido, isto é, a substituição de um aminoácido por um aminoáci- do diferente de propriedades semelhantes (por exemplo, hidrofilicida- de, grau e distribuição das regiões carregadas) é reconhecida na téc- nica como normalmente envolvendo uma pequena alteração.

Estas pequenas alterações podem ser identificadas, em parte, considerando o Índice hidropático de aminoácidos, como entendido na técnica.

Kyte et al, J.

Mol.

Biol. 157: 105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é baseado em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga.

É conhecido na técnica que os aminoácidos de índices hidropá- ticos semelhantes podem ser substituídos e ainda manter a função proteica.

Em um aspecto, os aminoácidos tendo índices hidropáticos de +2 são substituídos.

A hidrofilia dos aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas que mantêm a função biológica.

Uma consideração da hidrofilia dos ami- noácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior hidro- filia média local desse peptídeo, uma medida útil que foi relatada por se correlacionar bem com a antigenicidade e imunogenicidade.

Paten- te U.S. 4.554.101, incorporada aqui integralmente por referência.

À substituição de aminoácidos com valores de hidrofilicidade semelhan- tes pode resultar em peptídeos que retêm a atividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, como é entendido na técnica.

As substitui- ções podem ser realizadas com aminoácidos com valores de hidrofili- cidade dentro de + 2 um do outro.

O índice do hidrofobicidade e o valor de hidrofilicidade dos aminoácidos são influenciados pela cadeia late- ral particular desse aminoácido.

Consistente com essa observação, as substituições de aminoácidos que são compatíveis com a função bio- lógica são compreendidas como dependentes da semelhança relativa dos aminoácidos e, particularmente, das cadeias laterais desses ami- noácidos, conforme revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, car- ga, tamanho e outras propriedades.

[0074] Uma variante pode ser uma sequência de ácido nucleico que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da se- quência de gene total ou um fragmento do mesmo. A sequência de ácido nucleico pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene ou um fragmento do mesmo. Uma variante pode ser uma se- quência de aminoácido que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento do mesmo. A sequência de ácidos nucleicos pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimen- to total da sequência de aminoácido ou um fragmento do mesmo.

[0075] "Vetor", tal como aqui utilizado, significa uma sequência de ácido nucleico, que contém uma origem de replicação. Um vetor pode ser um vetor viral, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou RNA. Um vetor pode ser um vetor extracromossômico autor- replicante e, de preferência, é um plasmídeo de DNA. O vetor pode conter ou incluir uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólo- gas. Vacina

[0076] São fornecidas aqui vacinas compreendendo um antígeno LEMD1 ou um ácido nucleico que codifica um antígeno LEMD1, como aqui descrito. Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam um antígeno LEMD1 como descrito aqui.

Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico que compre- endem uma sequência de ácido nucleico que codifica aminoácidos.

Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico codifica um antígeno.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em (a) nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (b) nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (c) nucleo- tídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (d) um fragmento com- preendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma mo- lécula de ácido nucleico compreendendo os nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro uma molécula de ácido nucleico compreen- dendo os nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreendendo os nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (g) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (h) um fra- gmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (i) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (])) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico aos nu- cleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (k) um fragmento compreen- dendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; e (1) um fragmento compreendendo pelo me- nos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nu- cleico que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades da presente inven- ção, a molécula de ácido nucleico codifica proteínas e peptídeos com- preendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em (a) resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (c) resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resí- duos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resí- duos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resí- duos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 SEQ ID NO: 6; (g) uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,6% idêntica aos resí- duos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (h) uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,5% idêntica aos resíduos de ami- noácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (]) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoá- cidos que é mais que 95,6% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoá- cidos que é mais que 95,5% idêntico às sequências de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; e (1) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoá- cidos que é pelo menos 95% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 e 206 e 271 da SEQ ID NO: 6.

[0077] Em alguns aspectos da presente divulgação, a vacina com- preende um antígeno, em que o antígeno compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em (a) resíduos de aminoácido 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (c) resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (d) um fragmento compreendendo pelo me- nos 90% de um comprimento inteiro dos resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 SEQ ID NO: 6; (g) uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,6% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (h) uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,5% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; ()) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,6% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (k) um frag- mento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,5% idêntica às se- quências de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; e (1) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às sequên- cias de aminoácidos 19 a 198 e 206 e 271 da SEQID NO: 6.

[0078] Em alguns aspectos da presente divulgação, a vacina com- preende uma molécula de ácido nucleico, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo me- nos cerca de 95% de identidade ao longo de todo o comprimento da sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO : 1,3 ou 5. Em alguns aspectos, a vacina compreende uma molécula de ácido nu- cleico, em que a molécula de ácido nucleico codifica um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cer- ca de 95,6%, 95,5% ou 95% de identidade através de um comprimento inteiro da sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 2, 4 ou 6, respectivamente.

[0079] Em algumas modalidades da presente invenção, a molécu- la de ácido nucleico presente na vacina compreende um vetor de ex- pressão. Em algumas modalidades, a vacina compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável e, em algumas modalidades, a vacina compreende ainda um adjuvante, que em alguns aspectos da modalidade pode ser IL-12, IL-15, I1L-28 ou RANTES.

[0080] Em algumas modalidades, a vacina compreende um peptí- deo, em que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 95,6%, 95,5% ou 95% de identidade através de um comprimento inteiro da sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NO: 2,4 ou 6, respectivamente. Em outras modalidades, a vaci- na compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2, 4 ou 6.

[0081] As vacinas podem ser capazes de gerar em um indivíduo uma resposta imune contra o antígeno. A resposta imune pode ser uma resposta imune terapêutica ou profilática.

[0082] As vacinas podem ser usadas para proteger contra o cân- cer, por exemplo, um câncer ou tumor expressando LEMD1. As vaci- nas podem ser usadas para prevenir e/ou tratar um tumor que expres- sa LEMD1 em um indivíduo em necessidade do mesmo. As vacinas podem induzir respostas celulares e/ou anticorpos contra LEMD1 e contra tumores que expressam LEMD1.

[0083] O desenvolvimento de uma vacina contra o câncer, como descrito aqui, compreende identificar um antígeno do câncer, por exemplo, LEMD1, que não é reconhecido pelo sistema imunológico e é um autoantígeno. O antígeno de câncer é alterado de um autoantígeno para um antígeno estrangeiro, a fim de ser reconhecido pelo sistema imunológico. O redesenho do ácido nucleico e da sequência de ami- noácidos do antígeno de câncer recombinante de um antígeno para um antígeno estrangeiro, quebra a tolerância do antígeno pelo sistema imunológico. Para quebrar a tolerância, várias medidas de redesenho podem ser aplicadas ao antígeno de câncer como descrito abaixo.

[0084] O antígeno de câncer recombinante da vacina não é reco- nhecido como auto, quebrando, portanto, a tolerância. A quebra da tolerância pode induzir respostas de anticorpos de células T específi- cas de antígeno e/ou de altos níveis, induzindo ou provocando assim uma resposta imune que é dirigida ou reativa contra o câncer ou tumor que expressa o antígeno. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida ou provocada pode ser uma resposta imune celular, humoral ou tanto celular quanto humoral. Em algumas modalidades, a resposta imune celular induzida ou provocada pode incluir indução ou secreção de interferon gama (IFN-y) e/ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-a). Em outras modalidades, a resposta imune induzida ou provocada pode reduzir ou inibir um ou mais fatores de imunossupressão que promo- vem o crescimento do tumor ou câncer que expressa o antígeno, por exemplo, mas não limitados a fatores que suprarregulam a apresenta- ção de MHC, fatores que suprarregulam as células T reguladoras es- pecíficas de antígeno (Tregs), PD-L1, FasL,citocinas, como IL-10 e TFG-b, macrófagos associados a tumores, fibroblastos associados a tumores, fatores solúveis produzidos por células imunossupressoras, CTLAHA, PD-1, MDSCs, MCP-1 e uma molécula de ponto de verifica- ção imunológico.

[0085] A vacina pode aumentar a sobrevida livre de tumor em 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43% , 44% e 45%. A vacina pode reduzir a massa tumoral em 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%,

42%, 43%, 44 %, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% e 60% após a imunização. A vacina pode prevenir e bloquear o aumento da proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP-1), uma citocina secretada por células supressoras mieloides. A vacina pode aumentar a sobrevida do tumor em 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44 %, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% e 60%.

[0086] A vacina pode aumentar uma resposta imune celular num indivíduo administrado com a vacina em cerca de 50 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5500 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5000 vezes, cerca de 50 vezes cerca de 4500 vezes, cerca de 100 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 150 vezes a cer- ca de 6000 vezes, cerca de 200 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 250 vezes a cerca de 6000 vezes, ou cerca de 300 vezes a cerca de 6000 vezes, em comparação com uma resposta imune celular em um indivíduo não administrado com a vacina. Em algumas modalida- des, a vacina pode aumentar a resposta imune celular no indivíduo administrado com a vacina em cerca de 50 vezes, 100 vezes, 150 ve- zes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, 450 ve- zes, 500 vezes, 550 vezes, 600 vezes, 650 vezes, 700 vezes, 750 ve- zes, 800 vezes, 850 vezes, 900 vezes, 950 vezes, 1000 vezes, 1100 vezes, 1200 vezes, 1300 vezes, 1400 vezes, 1500 vezes, 1600 vezes, 1700 vezes, 1800 vezes, 1900 vezes, 2000 vezes, 2100 vezes, 2200 vezes, 2300 vezes, 2400 vezes, 2500 vezes, 2600 vezes, 2700 vezes, 2800 vezes, 2900 vezes, 3000 vezes, 3100 vezes, 3200 vezes, 3300 vezes, 3400 vezes, 3500 vezes, 3600 vezes, 3700 vezes, 3800 vezes, 3900 vezes, 4000 vezes, 4100 vezes, 4200 vezes, 4300 vezes, 4400 vezes, 4500 vezes, 4600 vezes, 4700 vezes, 4800 vezes , 4900 vezes, 5000 vezes, 5100 vezes, 5200 vezes, 5300 vezes, 5400 vezes, 5500 vezes, 5600 vezes, 5700 vezes, 5800 vezes, 5900 vezes ou 6000 ve- zes em comparação com a resposta imune celular em um indivíduo não administrado com a vacina.

[0087] A vacina pode aumentar os níveis de interferon gama (IFN- y) num indivíduo administrado com a vacina em cerca de 50 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5500 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5000 vezes 50 vezes cerca de 4500 vezes, cerca de 100 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 150 vezes a cer- ca de 6000 vezes, cerca de 200 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 250 vezes a cerca de 6000 vezes, ou cerca de 300 vezes a cerca de 6000 vezes, em comparação com os níveis de IFN-y em um indiví- duo não administrado com a vacina. Em algumas modalidades, a vaci- na pode aumentar os níveis de IFN-y no indivíduo administrado com a vacina em cerca de 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, 450 vezes, 500 vezes, 550 vezes, 600 vezes, 650 vezes, 700 vezes, 750 vezes, 800 vezes, 850 vezes, 900 vezes, 950 vezes, 1000 vezes, 1100 vezes, 1200 vezes, 1300 vezes, 1400 vezes, 1500 vezes, 1600 vezes, 1700 vezes, 1800 vezes, 1900 vezes, 2000 vezes, 2100 vezes, 2200 vezes, 2300 vezes, 2400 vezes, 2500 vezes, 2600 vezes, 2700 vezes, 2800 vezes, 2900 vezes, 3000 vezes, 3100 vezes, 3200 vezes, 3300 vezes, 3400 vezes, 3500 vezes, 3600 vezes, 3700 vezes, 3800 vezes, 3900 vezes, 4000 vezes, 4100 vezes, 4200 vezes, 4300 vezes, 4400 vezes, 4500 vezes, 4600 vezes, 4700 vezes, 4800 vezes, 4900 vezes, 5000 vezes, 5100 vezes, 5200 vezes, 5300 vezes 5400 vezes, 5500 vezes, 5600 vezes, 5700 vezes, 5800 vezes, 5900 vezes ou 6000 vezes em comparação com os níveis de IFN-y em um indivíduo não administrado com a vaci- na.

[0088] A vacina pode ser uma vacina de DNA. As vacinas de DNA são divulgadas nas Patentes U.S. 5.593.972, 5.739.118, 5.817.637,

5.830.876, 5.962.428, 5.981.505, 5.580.859, 5.703.055 e 5.676.594, que são aqui incorporadas totalmente por referência. A vacina de DNA pode compreender adicionalmente elementos ou reagentes que a ini- bem de integrar o cromossomo.

[0089] A vacina pode ser um RNA de um ou mais antígenos de câncer. A vacina de RNA pode ser introduzida na célula.

[0090] A vacina pode ser uma vacina viva atenuada, uma vacina que usa vetores recombinantes para administrar vacinas de antígeno, subunidades e glicoproteínas, por exemplo, mas não limitadas, às va- cinas descritas nas Patentes U.S.: 4.510.245; 4.797.368; 4.722.848;

4.790.987; 4.920.209; 5.017.487; 5.077.044; 5.110.587; 5.112.749;

5.174.993; 5.223.424; 5.225.336; 5.240.703; 5.242.829; 5.294.441;

5.294.548; 5.310.668; 5.387.744; 5.389.368; 5.424.065; 5.451.499;

5.453.364; 5.462.734; 5,470,734; 5.474.935; 5.482.713; 5.591.439;

5.643.579; 5.650.309; 5.698.202; 5.955.088; 6.034.298; 6.042.836;

6.156.319 e 6.589.529, que são aqui incorporadas por referência.

[0091] Em algumas modalidades, a vacina pode ainda compreen- der um adjuvante molecular; em alguns casos, o adjuvante molecular pode ser IL-12, I1L-15, 11-28, 11-28, 11-31, 11-33 e/ou RANTES, e em alguns casos, o adjuvante molecular é um inibidor do ponto de verifi- cação, incluindo antígeno linfocitário T anti-citotóxico 4 (CTLAH), anti- receptor de morte programada 1 (PD-1) e gene de ativação anti- linfócito (LAG-3) . Em algumas modalidades, a vacina de ácido nuclei- co pode ainda compreender a sequência de codificação para um adju- vante molecular, em alguns casos o adjuvante molecular pode ser IL- 12, 11-15, 11-28, 11-31, 11-33 e/ou RANTES e, em alguns casos, o ad- juvante molecular é um inibidor do ponto de verificação, incluindo o antígeno linfocitário T anti-citotóxico 4 (CTLA-4), o receptor de morte anti-programado-1 (PD-l) e o gene de ativação anti-linfócito (LAG-3). A sequência de codificação para IL-12, I1L-15, I1L-28, 11-31, 11-33 e/ou

RANTES pode ser incluída em uma ou mais moléculas de ácido nu- cleico que compreendem a sequência de codificação para um ou mais antígenos. A sequência de codificação para I1L-12, IL-15, 11-28, 11-31, I1L-33 e/ou RANTES pode ser incluída em moléculas de ácido nucleico separadas, como um plasmídeo separado.

[0092] A vacina da presente invenção pode ter características re- queridas das vacinas eficazes, tais como sendo seguras, de forma que a própria vacina não causa doença ou morte; sendo protetora contra doença; induzindo o anticorpo de neutralização; induzindo respostas de célula T de proteção; e fornecendo facilitação da administração, poucos efeitos colaterais, estabilidade biológica e baixo custo por do- se. A vacina pode realizar algumas ou todas essas características, contendo o antígeno de câncer, como discutido abaixo.

[0093] A vacina pode ainda compreender um ou mais inibidores de uma ou mais moléculas de ponto de verificação imune (isto é, um ini- bidor de ponto de verificação imune). As moléculas do ponto de verifi- cação imune são descritas abaixo em mais detalhes. O inibidor de ponto de verificação imune é qualquer ácido nucleico ou proteína que impeça a supressão de qualquer componente no sistema imunológico, tais como apresentação de classe de MHC, apresentação e/ou dife- renciação de células T, apresentação e/ou diferenciação de células B e citocina, quimiocina ou sinalização para proliferação e/ou diferencia- ção de células imunes. Como também descrito abaixo em mais deta- lhes, a vacina pode ser combinada ainda mais com anticorpos para inibidores do ponto de verificação, como PD-1 e PDL-1, para aumentar a estimulação das respostas imunes celulares e humorais. O uso de anticorpos anti-PD-1 ou anti-PDL-1 impede que PD-1 ou PDL-1 supri- mam as respostas das células T e/ou das células B. Antígeno

[0094] Como descrito acima, a vacina pode compreender um antí-

geno LEMD1 ou uma molécula de ácido nucleico que codifica um antí- geno LEMD1. O antígeno pode ser LEMD1, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos.

[0095] A vacina pode ser usada para tratar indivíduos que sofrem de câncer que expressa LEMD1. A vacina também pode ser usada para tratar indivíduos com câncer ou tumores que expressam LEMD1 para impedir o desenvolvimento de tais tumores em indivíduos. O antí- geno LEMD1 pode diferir do gene LEMD1 "normal" nativo e, portanto, fornecer terapia ou profilaxia contra um tumor que expressa o antígeno LEMD1. Por conseguinte, as sequências de antígeno LEMD1 que dife- rem do gene LEMD1 nativo (isto é, genes ou sequências LEMD1 mu- tadas) são fornecidas aqui. Por exemplo, alguns aspectos da presente divulgação fornecem vacina compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 1, 3 ou 5, e alguns aspectos fornecem uma vacina compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2, 4 ou 6. Em alguns aspectos da vacina compreendendo uma molécula de ácido nucleico, a molécula de ácido nucleico compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em (a) nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (b) nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (c) nucleo- tídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (d) um fragmento com- preendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma mo- lécula de ácido nucleico compreendendo os nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compre- endendo os nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreendendo os nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (g) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (h) um fra- gmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; (i) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 5; (])) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica aos nu- cleotídeos 55 a 600 da SEQ ID NO: 1; (k) um fragmento compreen- dendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica aos nucleotídeos 55 a 258 da SEQ ID NO: 3; e (1) um fragmento compreendendo pelo me- nos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nu- cleico que é pelo menos 95% idêntica aos nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 da SEQ ID NO: 1.

[0096] Moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo as sequências heterólogas descritas acima são fornecidas. São forneci- das moléculas de ácido nucleico isoladas que consistem nas sequên- cias heterólogas descritas acima. Moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo as sequências heterólogas descritas acima podem ser incorporadas em vetores como plasmídeos, vetores virais e outras formas de moléculas de ácido nucleico, como descrito abaixo. Aqui são fornecidas sequências de ácidos nucleicos que codificam antíge- nos LEMD1. As sequências de codificação que codificam antígenos LEMD1 têm as sequências como descrito acima.

[0097] Moléculas de proteína compreendendo as sequências de aminoácidos heterólogos descritas acima são fornecidas. São forneci- das moléculas de proteína que consistem nas sequências de aminoá- cidos heterólogos descritas acima. São aqui fornecidas proteínas e polipeptídeos que possuem as sequências descritas acima. Algumas modalidades da presente divulgação fornecem uma proteína compre-

endendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que con- siste em (a) resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (c) resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resí- duos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resí- duos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos resí- duos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 SEQ ID NO: 6; (g) uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,6% idêntica aos resí- duos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (h) uma sequência de aminoácidos que é mais que 95,5% idêntica aos resíduos de ami- noácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6; (])) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoá- cidos que é mais que 95,6% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoá- cidos que é mais que 95,5% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4; e (1) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoá- cidos que é pelo menos 95% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 e 206 e 271 da SEQ ID NO: 6.

[0098] As proteínas e polipeptídeos podem ser referidos como an- tígenos LEMD1 e imunógenos LEMD1. Os antígenos LEMD1 são ca- pazes de provocar uma resposta imune contra células cancerígenas e tumores que expressam um antígeno LEMD1.

[0099] Em um aspecto da invenção, é desejável que o antígeno de consenso forneça transcrição e tradução aprimoradas, incluindo um ou mais dos seguintes itens: sequência líder de baixo teor de GC para aumentar a transcrição; estabilidade do mMRNA e otimização do códon e eliminação na medida do possível dos motivos de sequência de ação cis (isto é, caixas-TATA internas).

[00100] Em alguns aspectos da invenção, é desejável gerar um an- tígeno de consenso que gere uma ampla resposta imune em várias cepas, incluindo as seguintes: incorporar todas as sequências comple- tas disponíveis; sequências geradas por computador que utilizam o aminoácido mais comum em cada posição; e aumentar a reatividade cruzada entre as cepas.

[00101] O antígeno LEMD1 pode ser uma sequência de antígeno de consenso (ou imunógeno) derivada de duas ou mais espécies. O antígeno LEMD1 pode compreender uma sequência de consenso e/ou modificação(s) para melhorar a expressão. A modificação pode incluir otimização de códon, otimização de RNA, adição de uma sequência kKozak (por exemplo, GCC ACC) para aumentar a iniciação da tradução e/ou a adição de uma sequência líder de imunoglobulina para aumen- tar a imunogenicidade do antígeno LEMD1. O antígeno LEMD1 pode compreender um peptídeo sinal, como um peptídeo sinal de imunoglo- bulina, por exemplo, mas não limitado a, um peptídeo sinal imunoglo- bulina E (I9E) ou imunoglobulina G (IgG). Em algumas modalidades, o antígeno de consenso LEMD1 pode compreender uma etiqueta de hemaglutinina (HA). O antígeno de consenso LEMD1 pode ser proje- tado para obter respostas imunes celulares e/ou humorais mais fortes e mais amplas do que um antígeno LEMD1 otimizado por códon cor- respondente.

[00102] O antígeno de consenso LEMD1 pode compreender uma ou mais mutações, provocando assim respostas imunes celulares e/ou humorais mais fortes e mais amplas do que um antígeno LEMD1 oti-

mizado por códon correspondente.

[00103] O antígeno de consenso LEMD1 pode ser nucleotídeos 55 a 600 do ácido nucleico SEQ ID NO: 1, que codifica os resíduos de aminoácidos 19 a 198 da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o antígeno de consenso LEMD1 pode ser a sequência de ácido nucleico que possui pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao longo de um comprimento inteiro da se- quência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, o antígeno de consenso LEMD1 pode ser a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao longo de um comprimento inteiro da sequência de ami- noácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2.

[00104] O antígeno de consenso LEMD1 pode ser nucleotídeos 55 a 258 do ácido nucleico SEQ ID NO: 3, que codifica os resíduos de aminoácidos 19 a 84 da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o antígeno de consenso LEMD1 pode ser a sequência de ácido nucleico que possui pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao longo de um comprimento inteiro da se- quência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 3. Em outras modalidades, o antígeno de consenso LEMD1 pode ser a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao longo de um comprimento inteiro da sequência de ami- noácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4.

[00105] O antígeno de consenso LEMD1 pode ser os nucleotídeos

55 a 594 e 616 a 819 do ácido nucleico SEQ ID NO: 5, que codifica os resíduos de aminoácido 19 a 198 e 206 a 271 da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o antígeno de consenso LEMD1 pode ser a se- quência de ácido nucleico que possui pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao longo de um comprimento inteiro da sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 5. Em outras modalidades, o antígeno de consenso LEMD1 pode ser a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoáci- dos com pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao longo de um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6.

[00106] O antígeno LEMD1 pode compreender modificações para expressão melhorada. A modificação pode incluir otimização de códon, otimização de RNA, adição de uma sequência kozak (por exemplo, GCC ACC) para aumentar a iniciação da tradução e/ou a adição de uma sequência líder de imunoglobulina para aumentar a imunogenici- dade do antígeno. O antígeno LEMD1 pode compreender um peptídeo sinal, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, mas não limitado a, um peptídeo sinal imunoglobulina E (IgE) ou imunoglo- bulina G (IgG).

[00107] O antígeno LEMD1 pode compreender modificações para otimização do epítopo. Em algumas modalidades, um local de cliva- gem tal pode ser inserido entre várias sequências de antígeno LEMD1. O local de clivagem pode ser um local de clivagem de furina. Vacina Combinada com o Inibidor do Ponto de Verificação Imune

[00108] A vacina pode ainda compreender um ou mais inibidores de uma ou mais moléculas de ponto de verificação imune (isto é, um ini- bidor de ponto de verificação imune). As moléculas do ponto de verifi-

cação imune são descritas abaixo em mais detalhes. O inibidor de ponto de verificação imune é qualquer ácido nucleico ou proteína que impeça a supressão de qualquer componente no sistema imunológico, tais como apresentação de classe de MHC, apresentação e/ou dife- renciação de células T, apresentação e/ou diferenciação de células B e citocina, quimiocina ou sinalização para proliferação e/ou diferencia- ção de células imunes.

[00109] Um tal inibidor pode ser uma sequência de ácido nucleico, uma sequência de aminoácidos, uma molécula pequena ou uma com- binação das mesmas. A sequência de ácido nucleico pode ser DNA, RNA, cDNA, uma variante destes, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. O ácido nucleico também pode incluir se- quências adicionais que codificam sequências de ligantes ou de eti- quetas que estão ligadas ao inibidor do ponto de verificação imune por uma ligação peptídica. A molécula pequena pode ter um baixo peso molecular, por exemplo, menos que 800 Daltons, composto orgânico ou inorgânico que pode servir como substrato enzimático, ligando (ou análogo do mesmo) ligado por uma proteína ou ácido nucleico, ou re- gulador de um processo biológico. A sequência de aminoácido pode ser uma proteína, um peptídeo, uma variante dos mesmos, um frag- mento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos.

[00110] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verifica- ção imune pode ser uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam um anticorpo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. Em outras modalidades, o inibidor de ponto de verificação imune pode ser um anticorpo, uma va- riante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos.

1. Molécula do Ponto de Verificação Imune

[00111] O inibidor de uma molécula de ponto de verificação imune pode ser uma sequência de ácido nucleico, uma sequência de amino- ácidos, uma molécula pequena ou uma combinação dos mesmos. À sequência de ácido nucleico pode ser DNA, RNA, cDNA, uma variante destes, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. O ácido nucleico também pode incluir sequências adicionais que codi- ficam sequências de ligantes ou de etiquetas que estão ligadas ao ini- bidor do ponto de verificação imune por uma ligação peptídica. A mo- lécula pequena pode ter um baixo peso molecular, por exemplo, me- nos que 800 Daltons, composto orgânico ou inorgânico que pode ser- vir como substrato enzimático, ligando (ou análogo do mesmo) ligado por uma proteína ou ácido nucleico, ou regulador de um processo bio- lógico. A sequência de aminoácido pode ser uma proteína, um peptí- deo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. a. PD-l e PD-L1

[00112] A molécula do ponto de verificação imune pode programar a proteína de morte celular 1 (PD-I), ligando de morte celular progra- mada (PD-L1), um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. PD-1 é uma proteína de superfície ce- lular codificada pelo gene PDCDI. PD-1 é um membro da superfamília da imunoglobulina e é expressa em células T e células pró-B e, portan- to, contribui para o destino e/ou diferenciação dessas células. Em par- ticular, PD-1 é uma proteína de membrana tipo 1 da família de regula- dores de células T CD28/CTLA-4 e regula negativamente os sinais do receptor de células T (TCR), regulando negativamente as respostas imunes. PD-1 pode regular negativamente as respostas das células T CD8+ e, assim, inibir a citotoxicidade mediada por CD8 e aumentar o crescimento do tumor.

[00113] PD-1tem dois ligandos, PD-L1 e PD-L2, que são membros da família B7. PD-L1 é regulada em excesso em macrófagos e células dendríticas (DCs) em resposta ao tratamento com LPS e GM-CSF e em células T e células B mediante sinalização de receptores de célu- las B e TOR. PD-L1 é expressa por muitas linhagens de células tumo- rais, incluindo mielomas, mastocitomas e melanomas.

2. Anticorpo da Molécula do Ponto de Verificação Anti-Imune

[00114] Como descrito acima, o inibidor do ponto de verificação imune pode ser um anticorpo. O anticorpo pode se ligar ou reagir com um antígeno (isto é, a molécula do ponto de verificação imune descrita acima). Por conseguinte, o anticorpo pode ser considerado um anti- corpo da molécula de ponto de verificação anti-imune ou um anticorpo da molécula de ponto de verificação imune. O anticorpo pode ser codi- ficado por uma sequência de ácido nucleico contida nele

[00115] O anticorpo pode incluir um polipeptídeo de cadeia pesada e um polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou pelo me- nos uma região constante de cadeia pesada (CH). A pelo menos uma região constante da cadeia pesada pode incluir uma região constante da cadeia pesada 1 (CH1), uma região constante da cadeia pesada 2 (CH2) e uma região constante da cadeia pesada 3 (CH3) e/ou uma região de dobradiça.

[00116] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH e uma região CH1. Em outras modalida- des, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região cH3.

[00117] O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir um conjunto de regiões determinantes de complementaridade ("CDR"). O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VH. Proce- dendo do terminal N do polipeptídeo da cadeia pesada, essas CDRs são denotadas "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. CDR1,

CDR?2 e CDR3 do polipeptídeo da cadeia pesada podem contribuir pa- ra a ligação ou reconhecimento do antígeno.

[00118] O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir uma região de cadeia leve variável (VL) e/ou uma região de cadeia leve constante (CL). O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir um conjunto de regi- ões determinantes de complementaridade ("CDR"). O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VL. Continuan- do do terminal N do polipeptídeo da cadeia leve, essas CDRs são de- notadas "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. CDR1, CDR2 e CDRS3 do polipeptídeo da cadeia leve podem contribuir para a ligação ou reconhecimento do antígeno.

[00119] O anticorpo pode compreender um conjunto de regiões de- terminantes de complementaridade de cadeia pesada e cadeia leve ("CDR"), interposto respectivamente entre um conjunto de cadeia pe- sada e uma estrutura de cadeia leve ("FR") que fornece suporte às CDRs e define a relação espacial das CDRs uma em relação à outra. O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. Continuando do terminal N de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são indicadas como "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. Um local de ligação ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada região V de cadeia pesada e leve.

[00120] O anticorpo pode ser uma imunoglobulina (Ig). A lg pode ser, por exemplo, IgA, IgM, IgD, IgE e IgG. A imunoglobulina pode in- cluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3. O polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobu- lina pode incluir uma região VL e uma região CL.

[00121] Adicionalmente, a enzima proteolítica papaína cliva preferi-

velmente as moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F (ab)) compreendem cada um heterodímero covalente que inclui um local de ligação ao antígeno intacto. A enzima pepsina é capaz de clivar moléculas de IgG para fornecer vários frag- mentos, incluindo o fragmento F (ab')2, que compreende os dois locais de ligação ao antígeno. Por conseguinte, o anticorpo pode ser o Fab ou F(ab')2. O Fab pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o po- lipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada do Fab pode incluir a região VH e a região CH1. A cadeia leve do Fab pode incluir a região VL e a região CL.

[00122] O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou monoclo- nal. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo de ca- deia única, um anticorpo amadurecido por afinidade, um anticorpo hu- mano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano. O anticorpo humanizado pode ser um anticorpo de uma espécie não humana que se liga ao antígeno desejado com uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana. a. Anticorpo PD-1

[00123] O anticorpo da molécula de ponto de verificação anti-imune pode ser um anticorpo anti-PD-1 (também aqui referido como "anticor- po PD-1"), uma variante do mesmo, um fragmento do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo PD-1 pode ser o Nivolumabe. O anticorpo anti-PD-1 pode inibir a atividade de PD-1, induzindo, provo- cando ou aumentando uma resposta imune contra um tumor ou câncer e diminuindo o crescimento do tumor. b. Anticorpo PD-L1

[00124] O anticorpo da molécula de ponto de verificação anti-imune pode ser um anticorpo anti-PD-L1 (também aqui referido como "anti- corpo PD-L1"), uma variante do mesmo, um fragmento do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo anti-PD-L1 pode inibir a atividade de PD-L1, desse modo induzir, provocar ou aumentar uma resposta imune contra um tumor ou câncer e diminuir o crescimento do tumor. Vetor

[00125] A vacina pode compreender um ou mais vetores que inclu- em um ácido nucleico heterólogo que codifica o antígeno LEMD1. Os um ou mais vetores podem ser capazes de expressar o antígeno em uma quantidade eficaz para provocar uma resposta imune no mamiífe- ro. O vetor pode compreender ácido nucleico heterólogo que codifica o antígeno. O vetor pode ter uma sequência de ácido nucleico contendo uma origem de replicação. O vetor pode ser um plasmídeo, bacteriófa- go, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de leve- dura. O vetor pode ser um vetor cromossômico extra de autorreplica- ção ou um vetor que se integra ao genoma do hospedeiro.

[00126] Os um ou mais vetores podem ser um construto de expres- são, que geralmente é um plasmídeo usado para introduzir um gene específico em uma célula alvo. Uma vez que o vetor de expressão es- teja dentro da célula, a proteína que é codificada pelo gene é produzi- da pelos complexos ribossômicos das máquinas de transcrição e tra- dução celulares. O plasmídeo é frequentemente engenheirado para conter sequências reguladoras que atuam como regiões intensificado- ras e promotoras e levam à transcrição eficiente do gene transportado no vetor de expressão. Os vetores da presente invenção expressam grandes quantidades de RNA mensageiro estável e, portanto, proteí- nas.

[00127] Os vetores podem ter sinais de expressão como um promo- tor forte, um códon de terminação forte, ajuste da distância entre o promotor e o gene clonado e a inserção de uma sequência de termi- nação de transcrição e uma PTIS (sequência de iniciação de tradução portátil).

[00128] Os vetores podem compreender sequências de ácidos nu- cleicos operacionalmente ligadas a um elemento regulador seleciona- do de um promotor e um sinal de poliadenilação. Em algumas modali- dades, o promotor é um promotor imediato do citomegalovírus humano (promotor do hocMV). Em algumas modalidades, o sinal de poliadenila- ção é um sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino (bGH poli A).

[00129] O vetor pode ser um plasmídeo circular ou um ácido nuclei- co linear. O plasmídeo circular e o ácido nucleico linear são capazes de direcionar a expressão de uma sequência nucleotídica específica em uma célula em questão apropriada. O vetor pode ter um promotor operacionalmente ligado à sequência nucleotídica que codifica o antí- geno, que pode estar operacionalmente ligada aos sinais de termina- ção. O vetor também pode conter sequências necessárias para a tra- dução adequada da sequência nucleotídica. O vetor compreendendo a sequência nucleotídica de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um de seus componentes é heterólogo em relação a pelo menos um de seus outros componentes. A expressão da sequên- cia nucleotídica na cassete de expressão pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível, que inicia a transcrição apenas quando a célula hospedeira é exposta a algum es- tímulo externo específico. No caso de um organismo multicelular, o promotor também pode ser específico para um tecido ou órgão ou es- tágio de desenvolvimento específico. O vetor pode ser um plasmídeo. O plasmídeo pode ser útil para transfectar células com ácido nucleico que codifica o antígeno, no qual as células hospedeiras transformadas são cultivadas e mantidas sob condições em que a expressão do antí- geno ocorre.

[00130] O plasmídeo pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um ou mais dos vários antígenos divulgados acima, incluindo sequências de codificação que codificam antígeno de consenso sintético capaz de provocar uma resposta imune contra um antígeno, fragmentos dessas proteínas, variantes dessas proteínas, fragmentos de variantes ou proteínas de fusão que são constituídos por combinações de proteínas de consenso e/ou fragmentos de prote- íÍna de consenso e/ou variantes de proteína de consenso e/ou frag- mentos de proteínas de consenso de variantes.

[00131] Um único plasmídeo pode conter sequência de codificação para um único antígeno, sequência de codificação para dois antíge- nos, sequência de codificação para três antígenos ou sequência de codificação para quatro antígenos. Em algumas modalidades, um plasmídeo pode ainda compreender a sequência de codificação que codifica o CCR20 sozinho ou como parte de um desses plasmídeos. Da mesma forma, os plasmídeos podem ainda compreender sequên- cias de codificação para IL-12, IL-15 e/ou 1L-28.

[00132] O plasmídeo pode ainda compreender um códon de inicia- ção, que pode estar a montante da sequência de codificação, e um códon de parada, que pode estar a jusante da sequência de codifica- ção. O códon de iniciação e terminação pode estar in frame com a se- quência de codificação.

[00133] O plasmídeo também pode compreender um promotor que está operacionalmente ligado à sequência de codificação. O promotor operacionalmente ligado à sequência de codificação pode ser um promotor do vírus símio 40 (SV40), um promotor do vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV), um vírus da imunodeficiência hu- mana (HIV), como o promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus da imunodeficiência bovina (BIV), um promotor do vírus Moloney, um promotor do vírus da leucose aviária (ALV), um promotor do cito- megalovírus (CMV), como o promotor imediato do CMV, vírus Epstein

Barr (EBV) ou um promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV). O promotor também pode ser um promotor de um gene humano, como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina mus- cular humana ou metalotioneína humana. O promotor também pode ser um promotor específico de tecido, tal como um promotor específico de músculo ou pele, natural ou sintético. Exemplos de tais promotores são descritos na publicação do pedido de patente US20040175727, cujo conteúdo é aqui incorporado na sua totalidade.

[00134] O plasmídeo também pode compreender um sinal de polia- denilação, que pode estar a jusante da sequência de codificação. O sinal de poliadenilação pode ser um sinal de poliadenilação SV40, si- nal de poliadenilação LTR, sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (bGH), sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento humano (hGH) ou sinal de poliadenilação de B-globina humana. O sinal de poliadenilação SV40 pode ser um sinal de polia- denilação de um plasmídeo pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).

[00135] O plasmídeo também pode compreender um potenciador a montante da sequência de codificação. O intensificador pode ser acti- na humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana ou um intensificador viral como um de CMV, FMDV, RSV ou EBV. Os intensificadores da função de polinucleotídeo são descritos nas Patentes U.S. 5.593.972, 5.962.428 e WOS94/016737, cujos conte- údos está totalmente incorporado por referência.

[00136] O plasmídeo também pode compreender uma origem de replicação em mamíferos, a fim de manter o plasmídeo extracromos- sômica e produzir várias cópias do plasmídeo em uma célula. O plas- mídeo pode ser p V AXI, pCEP4 ou pREP4 da Invitrogen (San Diego, CA), que pode compreender a origem de replicação do vírus Epstein- Barr e da região de codificação EBNA-1 do antígeno nuclear, que pode produzir replicação epissômica de alta cópia sem integração. A espi-

nha dorsal do plasmídeo pode ser pA V0242. O plasmídeo pode ser um plasmídeo de adenovírus do tipo 5 (Ad5) com defeito de replica- ção.

[00137] O plasmídeo também pode compreender uma sequência reguladora, que pode ser bem adequada para a expressão genética em uma célula na qual o plasmídeo é administrado. A sequência de codificação pode compreender um códon que pode permitir a transcri- ção mais eficiente da sequência de codificação na célula hospedeira.

[00138] A sequência de codificação também pode compreender uma sequência líder de Ig. A sequência líder pode estar 5" da sequên- cia de codificação. Os antígenos de consenso codificados por esta se- quência podem compreender um líder de Ig do terminal N seguido por uma proteína de antígeno de consenso. O líder de lg do terminal N pode ser IgE ou IgG.

[00139] O plasmídeo pode ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Cali- fórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em Escherichia coli (E.coli). O plasmídeo também pode ser p YES?2 (Invitrogen, San Die- go, Calif.), que pode ser utilizado para produção de proteínas em cepas de levedura de Saccharomyces cerevisiae. O plasmídeo também pode ser o sistema de expressão baculovírus completo MAXBACY (Invitro- gen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em células de insetos. O plasmídeo também pode ser pc/DNA | ou pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em células de mamíferos, tais como célu- las de ovário de hamster chinês (CHO). O vetor pode ser circular, o que pode transformar uma célula alvo por integração no genoma celu- lar ou existir extracromossômica (por exemplo, plasmídeo replicador autônomo com origem de replicação).

[00140] O vetor pode ser pVAX, pcDNA3.0 ou provax ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar DNA que codifica o antí-

geno e permitir que uma célula traduza a sequência em um antígeno que seja reconhecido pelo sistema imunológico.

[00141] Também é aqui fornecida uma vacina linear de ácido nu- cleico, ou cassete de expressão linear ("LEC"), que é capaz de ser dis- tribuída de maneira eficiente a um indivíduo por eletroporação e ex- pressar um ou mais antígenos desejados. O LEC pode ser qualquer DNA linear desprovido de qualquer espinha dorsal de fosfato. O DNA pode codificar um ou mais antígenos. O LEC pode conter um promo- tor, um íntron, um códon de parada e/ou um sinal de poliadenilação. À expressão do antígeno pode ser controlada pelo promotor. O LEC não pode conter nenhum gene de resistência a antibióticos e/ou um espi- nha dorsal de fosfato. O LEC pode não conter outras sequências de ácidos nucleicos não relacionadas à expressão genética de antígeno desejada. O LEC pode ser derivado de qualquer plasmídeo capaz de ser linearizado. O plasmídeo pode ser capaz de expressar o antígeno. O plasmídeo pode ser pNP (Puerto Rico/34) ou pM2 (New Caledo- nia/99). O plasmídeo pode ser WLVOO9, pVAX, pcDNA3.0 ou provax ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar DNA que codifica o antígeno e permitir que uma célula traduza a sequência em um antígeno que seja reconhecido pelo sistema imunológico. O LEC pode ser pcrM2. O LEC pode ser pcerNP. O perNP e o perMR podem ser derivados de pNP (Puerto Rico/34) e pM2 (New Caledonia/99), respectivamente.

[00142] O vetor pode ter um promotor. Um promotor pode ser qual- quer promotor que seja capaz de dirigir a expressão genética e regular a expressão do ácido nucleico isolado. Esse promotor é um elemento de sequência de ação cis necessário para a transcrição via RNA poli- merase dependente de DNA, que transcreve a sequência de antígeno aqui descrita. A seleção do promotor usado para direcionar a expres- são de um ácido nucleico heterólogo depende da aplicação particular.

O promotor pode ser posicionado aproximadamente na mesma distân- cia do início da transcrição no vetor, uma vez que é a partir do local de início da transcrição em seu cenário natural. No entanto, a variação nessa distância pode ser acomodada sem perda da função do promo- tor.

[00143] O promotor pode ser operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica o antígeno e os sinais necessários para a poliadenilação eficiente do transcrito, dos locais de ligação ao ribos- somo e da terminação da tradução.

[00144] O promotor pode ser um promotor de CMV, promotor pre- coce de SV40, promotor posterior de SV40, promotor de metalotioneí- na, promotor de vírus de tumor mamário murino, promotor de vírus de sarcoma Rous, promotor de poliedrina ou outro promotor mostrado efi- caz para expressão em células eucarióticas.

[00145] O vetor pode incluir um intensificador e um íntron com lo- cais funcionais de doador e aceitador de emenda. O vetor pode conter uma região de terminação de transcrição a jusante do gene estrutural para proporcionar uma terminação eficiente. A região de terminação pode ser obtida do mesmo gene que a sequência do promotor ou pode ser obtida de genes diferentes. Métodos de preparação do vetor

[00146] São aqui fornecidos métodos para preparar o vetor que compreende a molécula de ácido nucleico que codifica o antígeno LEMD1 discutido aqui. O vetor, após a etapa final de subclonagem no plasmídeo de expressão de mamíferos, podem ser usados para inocu- lar uma cultura de células em um tanque de fermentação em larga es- cala, usando métodos conhecidos na técnica.

[00147] O vetor para uso com os dispositivos EP, que são descritos abaixo em mais detalhes, pode ser formulado ou fabricado usando uma combinação de dispositivos e técnicas conhecidas, mas de prefe-

rência eles são fabricados usando uma técnica otimizada de fabrica- ção de plasmídeo, descrita em uma pedido provisório U.S. licenciado e copendente, U.S. 60/939.792, depositado em 23 de maio de 2007. Em alguns exemplos, os plasmídeos de DNA usados nestes estudos po- dem ser formulados em concentrações maiores ou iguais a 10 mg/mL. As técnicas de fabricação também incluem ou incorporam vários dis- positivos e protocolos que são comumente conhecidos pelos versados na técnica, além dos descritos em U.S. 60/939792, incluindo os descri- tos em uma patente licenciada Patente U.S. 7.238.522, emitida em 3 de julho de 2007. O pedido e a patente mencionados anteriormente, U.S. 60/939.792 e a Patente U.S. 7.238.522, respectivamente, são in- corporados na sua totalidade. Excipientes e outros componentes da vacina

[00148] A vacina pode ainda compreender um excipiente farmaceu- ticamente aceitável. O transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser moléculas funcionais, tais como veículos, transpor- tadores, ou diluentes. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um agente facilitador de transfecção, que pode incluir agentes ati- vos de superfície, tais como complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freund, análogo de LPS incluindo lipídeo À de monofosforil, peptídeos muramil, análogos de quinona, vesículas, tais como esqualeno e esqualeno, ácido hialurônico, lipídeos, liposso- mas, íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nano- partículas, ou outros agentes facilitadores de transfecção conhecidos.

[00149] O agente facilitador da transfecção é um poliânion, um cá- tion, incluindo o poli-L-glutamato (LGS) ou lipídeo. O agente facilitador da transfecção é o poli-L-glutamato, e o poli-L-glutamato pode estar presente na vacina a uma concentração inferior a 6 mg/ml. O agente facilitador de transfecção também pode incluir agentes ativos de su- perfície, tais como os complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adju-

vante incompleto de Freunds, análogos de LPS incluindo o lipídeo À de monofosforil, peptídeos muramil, análogos da quinona e vesículas, tais como esqualeno e esqualeno, e o ácido hialurônico pode ser ad- ministrado em conjunto com o construto genético. As vacinas de plas- mídeo de DNA também pode incluir um agente facilitador da transfec- ção, como lipídios, lipossomos, incluindo lipossomos de lecitina ou ou- tros lipossomos conhecidos na técnica, como uma mistura DNA- lipossomo (ver, por exemplo, WO09324640), íons cálcio, proteínas vi- rais, poliânions, policátions ou nanopartículas ou outros agentes facili- tadores da transfecção conhecidos. O agente facilitador da transfecção é um poliânion, um cátion, incluindo o poli-L-glutamato (LGS) ou lipí- deo. A concentração do agente de transfecção na vacina é de menos que 4 mg/ml, menos que 2 mg/ml, menos que 1 mg/ml, menos que 0,750 mg/ml, menos que 0,500 mg/ml, menos que 0,250 mg/ml, me- nos que 0,100 mg/ml, menos que 0,050 mg/ml, ou menos que 0,010 mg/ml.

[00150] O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes podem ser outros genes que são ex- pressos em um plasmídeo alternativo ou são distribuídos como proteí- nas em combinação com o plasmídeo acima na vacina. Os um ou mais adjuvantes podem ser selecionados do grupo que consiste em: CCL?20, interferon a (IFN-a), interferon b (IFN-b), interferon g, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNRb, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), quimiocina cutânea que atrai células T (CTACK), quimiocina epitelial expressa em timo (TECK), quimiocina epitelial associada a mucosas (MEC), IL-12, I1L-15, 11-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, I1L-2, IL-4, IL-5, IL-6, 11-10, 11-18, MCP-1, MIP-1a, MIP-1--, IL -8, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GIyYCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM- 1, ICAM-2 , ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, formas mutantes de

I1L-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de cresci- mento de fibroblastos, IL-7, fator de crescimento de nervos, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, FIt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DRA4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAFG6, IkB, NIK inativo, SAP K, SAP-I, JNK, genes de resposta a interferon, NFKB, Bax, TRAIL, TRAlLrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2B, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2, IL-15 tendo a sequência de sinal ou se- quência de codificação que codifica a sequência de sinal excluída e, opcionalmente, incluindo um peptídeo de sinal diferente, como o IgE, ou a sequência de codificação que codifica um peptídeo de sinal dife- rente, como o de IgE, e fragmentos funcionais dos mesmos, ou uma combinação dos mesmos. O adjuvante pode ser 11-12, 11-15, 11-28, CTACK, TECK, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNRb, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, I1L-6, 11-10, 11-12, I1L-18 ou uma combinação dos mes- mos.

[00151] Em algumas modalidades, o adjuvante pode ser uma ou mais proteínas e/ou moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas selecionadas do grupo que consiste em: CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC ou RANTES. Exemplos de construtos e sequên- cias de I|L-12 são divulgados no pedido PCT PCT/US 1997/019502 e Pedido US 08/956.865, e Pedido Provisório U.S. 61/569600 deposita- do em 12 de dezembro de 2011, cada um aqui incorporado por refe- rência. Exemplos de construtos e sequências de IL-15 são divulgados no pedido PCT PCT/US04/18962 e Pedido U.S. correspondente 10/

560.650 e no pedido PCT PCT/US07/00886 e Pedido U.S. correspon- dente 12/160.766, e no pedido PCT PCT/USI0/048827, que são cada um aqui incorporados por referência. Exemplos de construtos e se- quências de I|L-28 são divulgados no pedido PCT PCT/US09/039648 e Pedido U.S. correspondente 12/936.192, que são aqui incorporados por referência. Exemplos de RANTES e outros construtos e sequên- cias são divulgados no pedido PCT No. PCT/US1999/004332 e Pedido U.S. correspondente 09/622.452, que são aqui incorporados por refe- rência. Outros exemplos de construtos e sequências RANTES são di- vulgados no pedido PCT PCT/US11/024098, que é aqui incorporado por referência. Exemplos de RANTES e outros construtos e sequên- cias são divulgados no pedido PCT No. PCT/US1999/004332 e Pedido U.S. correspondente 09/622.452, que são aqui incorporados por refe- rência. Outros exemplos de construtos e sequências RANTES são di- vulgados no pedido PCT PCT/US11/024098, que é aqui incorporado por referência. Exemplos de quimiocinas construtos e sequências CTACK, TECK e MEC são divulgados no pedido PCT PCT/US2005/ 042231 e Pedido U.S. correspondente 11/719.646, que são aqui incorpo- rados por referência. Exemplos de OX40 e outros imunomoduladores são divulgados no Pedido U.S. 10/560.653, que é aqui incorporado por referência. Exemplos de DR5 e outros imunomoduladores são divulga- dos no Pedido U.S. 09/622.452, que é aqui incorporado por referência.

[00152] Outros genes que podem ser úteis como adjuvantes incluem os que codificam: MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GIÕYCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M- CSF, G-CSF, I1L-4, formas mutantes de 11-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento do fibroblasto, IL- 7, 11-22, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento endotelial vascu- lar, Fas, receptor do TNF, FIt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo- 3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyDB88,

IRAK, TRAFS6, IKB, NIK inativa, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respos- ta interferon, NFKB, Bax, TRAIL, TRAlLrec, TRAILrecDRC 5, TRAIL- R3, TRAIL-R4, RANK, Ligante RANK, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 e fragmentos funcionais dos mesmos.

[00153] A vacina pode ainda compreender um agente facilitador de vacina genético como descrito em U.S. 021.579 depositado em 1 de abril de 1994, o qual é totalmente incorporado por referência.

[00154] A vacina pode compreender o antígeno e plasmídeos em quantidades de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou preferivelmente cerca de 0,1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou mais preferivelmente cerca de 1 miligrama a cerca de 2 miligramas. Em algumas modalidades pre- feridas, a vacina de acordo com a presente invenção compreende cer- ca de 5 nanogramas a cerca de 1.000 microgramas de DNA. Em al- gumas modalidades preferidas, a vacina pode conter cerca de 10 na- nogramas a cerca de 800 microgramas de DNA. Em algumas modali- dades preferidas, a vacina pode conter cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a vacina pode conter cerca de 1 a cerca de 350 microgramas de DNA. Em al- gumas modalidades preferidas, a vacina pode conter cerca de 25 a cerca de 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgra- mas, de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; de cerca de 1 mi- crograma a cerca de 10 miligramas; de cerca de 0,1 micrograma a cerca de 10 miligramas; de cerca de 1 miligrama a 2 miligramas, de cerca de 5 nanogramas a cerca de 1.000 microgramas, de cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas, de cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas, de cerca de 1 a 350 microgramas, de 25 a 250 mi- crogramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas do antígeno ou plasmídeo dos mesmos.

[00155] A vacina pode ser formulada de acordo com o modo de administração a ser utilizado. Uma vacina injetável pode ser estéril, livre de pirogênio e livre de partículas. Uma formulação ou solução iso- tônica pode ser usada. Os aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. A vacina pode compreender um agente de vasoconstrição. As soluções isotônicas podem incluir solução salina tamponada com fosfato. A vacina pode ainda compreender estabilizantes, incluindo gelatina e albumina. Os estabilizantes podem permitir que a formulação seja estável à tempe- ratura da sala ou ambiente por longos períodos de tempo, incluindo LGS ou policátions ou poliânions.

Composições farmacêuticas da vacina

[00156] A vacina pode estar na forma de uma composição farma- cêutica. A composição farmacêutica pode compreender a vacina. As composições farmacêuticas podem compreender cerca de 5 nanogra- mas (ng) até cerca de 10 miligramas (mg) do DNA da vacina. Em al- gumas modalidades, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem cerca de 25 ng a cerca de 5 mg de DNA. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas con- têm cerca de 50 ng para cerca de 1 mg de DNA da vacina. Em algu- mas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modali- dades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 1 a cerca de 350 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 5 a cerca de 250 micro- gramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 10 a cerca de 200 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêu- ticas contêm cerca de 15 a cerca de 150 microgramas de DNA da va- cina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas con-

têm cerca de 20 a cerca de 100 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 25 a cerca de 75 microgramas de DNA da vacina. Em algumas mo- dalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 30 a cerca de 50 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 35 a cerca de 40 micro- gramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 100 a cerca de 200 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêu- ticas compreendem cerca de 10 microgramas a cerca de 100 micro- gramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 20 microgramas a cerca de 80 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as compo- sições farmacêuticas compreendem cerca de 25 microgramas a cerca de 60 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 30 ng para cerca de 50 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 35 ng para cerca de 45 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades pre- feridas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades prefe- ridas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 1 a cerca de 350 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades prefe- ridas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 25 a cerca de 250 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades prefe- ridas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 100 a cerca de 200 microgramas de DNA da vacina.

[00157] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 , 95 ou 100 ng de DNA da vacina. Em algumas modalidades, as composições farma- cêuticas podem compreender pelo menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95.100 , 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 , 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 ou 1000 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalida- des, a composição farmacêutica pode compreender pelo menos 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ou 10 mg ou mais de DNA da vacina.

[00158] Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode compreender até e incluindo 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 ng de DNA da vacina. Em algumas mo- dalidades, a composição farmacêutica pode compreender até e inclu- indo 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675,

680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 ou 1000 microgramas de DNA da vacina. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode compreender até e incluindo 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ou 10 mg de DNA da vacina.

[00159] A composição farmacêutica pode compreender adicionalmen- te outros agentes para fins de formulação, de acordo com o modo de administração a ser usado. Nos casos em que composições farmacêuti- cas são composições farmacêuticas injetáveis, elas são estéreis, livres de pirogênio e livres de material particulado. Uma formulação isotônica é preferencialmente usada. Em geral, aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. Em alguns casos, soluções isotônicas, tal como tampão fosfato-salino, são preferen- ciais. Estabilizadores incluem gelatina e albumina. Em algumas modali- dades, um agente de vasoconstrição é adicionado à formulação.

[00160] A vacina pode ainda compreender um excipiente farmaceu- ticamente aceitável. O transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser moléculas funcionais, tais como veículos, adjuvan- tes, transportadores, ou diluentes. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um agente facilitador da transfecção.

[00161] O agente facilitador da transfecção é um poliânion, um cá- tion, incluindo o poli-L-glutamato (LGS) ou lipídeo. Em uma modalida- de, o agente facilitador de transfecção é poli-L-glutamato, e mais pre- ferencialmente, o poli-L-glutamato está presente na vacina em uma concentração de menos que 6 mg/ml. O agente facilitador de transfec- ção também pode incluir agentes ativos de superfície, tais como os complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de

Freunds, análogos de LPS incluindo o lipídeo A de monofosforil, peptí- deos muramil, análogos da quinona e vesículas, tais como esqualeno e esqualeno, e o ácido hialurônico pode ser administrado em conjunto com o construto genético. Em algumas modalidades, o agente facilita- dor da transfecção pode compreender lipídeos, lipossomos, incluindo lipossomos de lecitina ou outros lipossomos conhecidos na técnica, como uma mistura DNA-lipossomo (ver, por exemplo, W09324640), íons cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions ou nanopartículas ou outros agentes facilitadores da transfecção conhecidos. A concen- tração do agente de transfecção na vacina pode ser de menos que 4 mg/ml, menos que 2 mg/ml, menos que 1 mg/ml, menos que 0,750 mg/ml, menos que 0,500 mg/ml, menos que 0,250 mg/ml, menos que 0,100 mg/ml, menos que 0,050 mg/ml, ou menos que 0,010 mg/ml.

[00162] O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um ad- juvante. Os adjuvantes podem ser outros genes que são expressos em um ou mais plasmídeos alternativos ou são distribuídos como proteí- nas em combinação com o plasmídeo acima na vacina. O adjuvante pode ser selecionado do grupo que consiste em: a-interferon (IFN-a), B-interferon (IFN-B), y-interferon, fator de crescimento derivado de pla- quetas (PDGF), TNFa, TNFB, GM-CSF, fator de crescimento epidérmi- co (EGF), quimiocina de atração de célula T cutânea (CTACK), quimi- ocina expressa por timo epitelial (TECK), quimiocina epitelial associa- da à mucosa (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80,CD86 incluindo IL-15 tendo a sequência sinal deletada e opcionalmente incluindo o peptídeo sinal de IgE. O adjuvante pode ser 11-12, 11-15, 11-28, CTACK, TECK, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNRB, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, I1L-10, 11-12, 11-18 ou uma combinação dos mesmos. Numa mo- dalidade exemplificativa, o adjuvante é IL-2.

[00163] Outros genes que podem ser adjuvantes úteis incluem os que codificam: MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectina, P- selectina, E-selectina, CD34, GIÕYCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M- CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de 11-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento do fibroblasto, IL- 7, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor do TNF, FIt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DRA4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAFS6, IkB, NIK inativa, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respos- ta interferon, NFKB, Bax, TRAIL, TRAlLrec, TRAILrecDRC 5, TRAIL- R3, TRAIL-R4, RANK, Ligante RANK, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 e fragmentos funcionais dos mesmos.

Métodos de Vacinação

[00164] São aqui fornecidos métodos para o tratamento e/ou pre- venção do câncer que expressa LEMD1 usando as formulações far- macêuticas descritas acima. Também aqui descritos são métodos de utilização das formulações farmacêuticas descritas acima no tratamen- to e/ou prevenção de câncer em um indivíduo. Também são aqui des- critos métodos de vacinar um indivíduo. Também são aqui descritos métodos de administração das formulações farmacêuticas aqui descri- tas a um indivíduo em necessidade das mesmas. Os métodos aqui descritos coletivamente referidos como métodos de tratamento utili- zando as formulações farmacêuticas aqui descritas podem compreen- der administrar uma ou mais vacinas como aqui descritas a um indiví- duo em necessidade das mesmas para induzir uma resposta imune terapêutica e/ou profilática. A vacina pode ser administrada a um indi- víduo para modular a atividade do sistema imune do indivíduo e inten- sificar a resposta imune. A administração da vacina pode ser a trans-

fecção dos antígenos de câncer como divulgado aqui como uma molé- cula de ácido nucleico que é expressa na célula e distribuída à super- fície da célula, em que o sistema imunológico reconhece e induz uma resposta celular, humoral, ou celular e humoral. A administração da vacina pode ser usada para induzir ou desencadear uma resposta imune em indivíduos contra um ou mais dos antígenos de câncer co- mo divulgados aqui por administração aos indivíduos da vacina tal co- mo aqui discutida.

[00165] A vacina pode ser administrada a um indivíduo para modu- lar a atividade do sistema imunológico do indivíduo, aumentando as- sim a resposta imune. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Após a administração da vacina ao mamífero e, portanto, a introdução do vetor para as células do mamífero, as células transfec- tadas expressam e segregam um ou mais dos antígenos de câncer como aqui divulgados. Estas proteínas secretadas, ou antígenos sinté- ticos, serão reconhecidos como estrangeiros pelo sistema imune, que ajustarão uma resposta imune que pode incluir: anticorpos produzidos contra um ou mais antígenos de câncer e uma resposta de célula T especificamente contra um ou mais antígenos de câncer. Em alguns exemplos, um mamífero vacinado com as vacinas aqui discutidas terá um sistema imunológico iniciado e quando desafiado com um ou mais antígenos de câncer como divulgado aqui, o sistema imunológico imu- nizado permitirá a limpeza rápida de antígenos de câncer subsequen- tes, conforme divulgado aqui, seja através das respostas imunes hu- moral, celular, ou ambas celular e humoral.

[00166] Os métodos de administração do DNA de uma vacina são descritos nas Patentes U.S. 4.945.050 e 5.036.006, ambas as quais são aqui incorporadas na sua totalidade por referência.

[00167] A vacina pode ser administrada a um mamífero para provo- car uma resposta imune em um mamífero. O mamífero pode ser hu-

mano, primata não humano, vaca, porco, ovelha, cabra, antílope, bi- sonte, búfalo de água, bovídeos, veados, ouriços, elefantes, lhama, alpaca, camundongos, ratos e, de preferência humano, vaca ou porco. A vacina também pode ser administrada a um indivíduo não mamífero, por exemplo, um frango, para provocar uma resposta imune.

[00168] A dose da vacina pode estar entre 1 micrograma e 10 mg de componente ativo por quilograma (kg) de peso corporal ao longo do tempo (componente/kg de peso corporal/tempo) e pode ser de 20 mi- crogramas a 10 mg de componente/kg de peso corporal/tempo. A va- cina pode ser administrada a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou 31 dias. O número de doses da vacina para tratamento eficaz pode ser 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ou mais doses. Método de Geração de uma Resposta Imune com a Vacina

[00169] A vacina fornecida pode ser usada para gerar uma resposta imune em um indivíduo mamífero ou não mamífero, incluindo respos- tas imunes terapêuticas e profiláticas. A resposta imune pode gerar anticorpos e/ou células T assassinas que são dirigidas para um ou mais antígenos de câncer, como aqui divulgado. Esses anticorpos e as células T podem ser isolados.

[00170] Algumas modalidades fornecem métodos para gerar res- postas imunes contra um ou mais dos antígenos do câncer, conforme divulgado neste documento, modalidades que compreendem adminis- trar a vacina a um indivíduo. Algumas modalidades proporcionam mé- todos de vacinação profilática de um indivíduo contra um câncer ou tumor expressando um ou mais dos antígenos de câncer, como des- crito acima, cujas modalidades compreendem administrar a vacina. Algumas modalidades proporcionam métodos de vacinação terapêuti- ca de um indivíduo que vem sofrendo de câncer ou tumor expressando um ou mais dos antígenos de câncer, cujas modalidades compreen-

dem administrar a vacina. O diagnóstico do câncer ou tumor que ex- pressa um ou mais antígenos do câncer, como divulgado aqui antes da administração da vacina, pode ser feito rotineiramente. Métodos de Tratamento do Câncer com a Vacina

[00171] A vacina pode ser usada para gerar ou obter uma resposta imune em um mamífero que seja reativo ou direcionado a um câncer ou tumor (por exemplo, câncer mediado por HPV, câncer epitelial de ovário, melanoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer cervical, cân- cer de fígado, câncer de próstata, cânceres de sangue, carcinomas de células escamosas do esôfago, câncer gástrico) do mamífero ou indi- víduo em necessidade do mesmo. A resposta imune provocada pode prevenir o câncer ou o crescimento do tumor.

[00172] A resposta imune provocada pode prevenir e/ou reduzir a metástase de células cancerígenas ou tumorais. Por conseguinte, a vacina pode ser utilizada num método que trata e/ou previne o câncer ou tumores no mamífero ou indivíduo administrado com a vacina. O câncer tratado ou o crescimento baseado em tumor pode ser qualquer tipo de câncer, como, mas não limitado a, câncer colorretal.

[00173] Em algumas modalidades, a vacina administrada pode me- diar a eliminação ou impedir o crescimento de células tumorais indu- zindo (1) a imunidade humoral por meio de respostas de células B pa- ra gerar anticorpos que bloqueiam a produção de proteína-1 quimiotá- tica de monócitos (MCP-1), assim retardando as células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) e suprimindo o crescimento do tu- mor; (2) aumentar o linfócito T citotóxico, como CD8* (CTL) para ata- car e matar células tumorais; (3)aumentar as respostas das células T auxiliares; (4) e aumentar as respostas inflamatórias via IFN-y e TFN-a ou, preferencialmente, todas as anteriormente mencionadas..

[00174] Em algumas modalidades, a resposta imune pode gerar uma resposta imune humoral e/ou uma resposta de linfócito T citotóxi-

co específico (CTL) que não causa danos ou inflamação de vários te- cidos ou sistemas (por exemplo, sistema cerebral ou neurológico, etc.) no indivíduo administrado com a vacina.

[00175] Em algumas modalidades, a vacina administrada pode au- mentar a sobrevida, reduzir a massa tumoral, ou uma combinação dos mesmos no indivíduo. A vacina administrada pode aumentar a sobre- vida livre de tumor em 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33% , 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50 %, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% e 60% no indivíduo. A vaci- na administrada pode reduzir a massa tumoral em 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67 %, 68%, 69% e 70% no indivíduo após a imunização. A vacina administrada pode impedir e bloquear a tumorigênese mediada por LEMD1 e/ou a progressão do tumor em comparação com uma resposta imune celular em um indivíduo não administrado com a vacina. A vacina pode prevenir e bloquear o au- mento da proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP-1), uma citocina secretada por células supressoras mieloides. A vacina pode aumentar a sobrevida do tumor em 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44 %, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% e 60% .

[00176] Em algumas modalidades, a vacina pode ser administrada na periferia (conforme descrito em mais detalhes abaixo) para estabe- lecer uma resposta imune específica de antígeno que as células ou tecidos cancerígenos ou tumorais para liberar ou eliminar o câncer ou tumor que expressa um ou mais antígenos de câncer sem danificar ou causar doença ou morte no indivíduo administrado com a vacina.

[00177] A vacina administrada pode aumentar uma resposta imune celular no indivíduo em cerca de 50 vezes a cerca de 6000 vezes, cer- ca de 50 vezes a cerca de 5500 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5000 vezes, cerca de 50 vezes cerca de 4500 vezes, cerca de 100 ve- zes a cerca de 6000 vezes, cerca de 150 vezes a cerca de 6000 ve- zes, cerca de 200 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 250 vezes a cerca de 6000 vezes, ou cerca de 300 vezes a cerca de 6000 vezes, em comparação com uma resposta imune celular em um indivíduo não administrado com a vacina. Em algumas modalidades, a vacina admi- nistrada pode aumentar a resposta imune celular no indivíduo em cer- ca de 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 ve- zes, 350 vezes, 400 vezes, 450 vezes, 500 vezes, 550 vezes, 600 ve- zes, 650 vezes, 700 vezes, 750 vezes, 800 vezes, 850 vezes, 900 ve- zes, 950 vezes, 1000 vezes, 1100 vezes, 1200 vezes, 1300 vezes, 1400 vezes, 1500 vezes, 1600 vezes, 1700 vezes, 1800 vezes, 1900 vezes, 2000 vezes, 2100 vezes, 2200 vezes, 2300 vezes, 2400 vezes, 2500 vezes, 2600 vezes, 2700 vezes, 2800 vezes, 2900 vezes, 3000 vezes, 3100 vezes, 3200 vezes, 3300 vezes, 3400 vezes, 3500 vezes, 3600 vezes, 3700 vezes, 3800 vezes, 3900 vezes, 4000 vezes, 4100 vezes, 4200 vezes, 4300 vezes, 4400 vezes, 4500 vezes, 4600 vezes, 4700 vezes, 4800 vezes , 4900 vezes, 5000 vezes, 5100 vezes, 5200 vezes, 5300 vezes, 5400 vezes, 5500 vezes, 5600 vezes, 5700 vezes, 5800 vezes, 5900 vezes ou 6000 vezes em comparação com uma res- posta imune celular em um indivíduo não administrado com a vacina.

[00178] A vacina administrada pode aumentar os níveis de interfe- ron gama (IFN-y) no indivíduo em cerca de 50 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5500 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5000 vezes 50 vezes cerca de 4500 vezes, cerca de 100 ve- zes a cerca de 6000 vezes, cerca de 150 vezes a cerca de 6000 ve- zes, cerca de 200 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 250 vezes a cerca de 6000 vezes, ou cerca de 300 vezes a cerca de 6000 vezes, em comparação com uma resposta imune celular g em um indivíduo não administrado com a vacina. Em algumas modalidades, a vacina administrada pode aumentar os níveis de IFN-y no indivíduo em cerca de 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, 450 vezes, 500 vezes, 550 vezes, 600 vezes, 650 vezes, 700 vezes, 750 vezes, 800 vezes, 850 vezes, 900 vezes, 950 vezes, 1000 vezes, 1100 vezes, 1200 vezes, 1300 vezes, 1400 vezes, 1500 vezes, 1600 vezes, 1700 vezes, 1800 vezes, 1900 vezes, 2000 vezes, 2100 vezes, 2200 vezes, 2300 vezes, 2400 vezes, 2500 vezes, 2600 vezes, 2700 vezes, 2800 vezes, 2900 vezes, 3000 vezes, 3100 vezes, 3200 vezes, 3300 vezes, 3400 vezes, 3500 vezes, 3600 vezes, 3700 vezes, 3800 vezes, 3900 vezes, 4000 vezes, 4100 vezes, 4200 vezes, 4300 vezes, 4400 vezes, 4500 vezes, 4600 vezes, 4700 vezes, 4800 vezes, 4900 vezes, 5000 vezes, 5100 vezes, 5200 vezes, 5300 vezes 5400 vezes, 5500 vezes, 5600 vezes, 5700 vezes, 5800 vezes, 5900 vezes ou 6000 vezes em comparação com uma resposta imune celular em um indivíduo não administrado com a vacina.

[00179] A dose da vacina pode estar entre 1 micrograma e 10 mg de componente ativo por quilograma (kg) de peso corporal ao longo do tempo (componente/kg de peso corporal/tempo) e pode ser de 20 mi- crogramas a 10 mg de componente/kg de peso corporal/tempo. A va- cina pode ser administrada a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou 31 dias. O número de doses da vacina para tratamento eficaz pode ser 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10 ou mais doses. Vias de administração

[00180] A vacina ou composição farmacêutica pode ser administra- da por diferentes vias, incluindo via oral, parenteral, sublingual, trans- dérmica, retal, transmucosa, tópica, via inalação, via administração bucal, intrapleural, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutã- nea, intramuscular, intranasal intratecal e/ou intra-articularmente, ou combinações dos mesmos. Para uso veterinário, a composição pode ser administrada como uma formulação devidamente aceitável em conformidade com a prática veterinária normal. O veterinário pode prontamente determinar o regime de dosagem e a via de administra- ção que é a mais apropriada para um animal particular. A vacina pode ser administrada por seringas tradicionais, dispositivos de injeção sem agulha, biobalística ("microprojectile bombardment gene guns") ou ou- tros métodos físicos, tal como eletroporação ("EP"), "método hidrodi- nâmico", ou ultrassom.

[00181] O vetor da vacina pode ser administrado ao mamífero por várias tecnologias conhecidas, incluindo injeção de DNA (também co- nhecida como vacinação de DNA) com e sem eletroporação in vivo, transfecção mediada por lipossomas, transfecção facilitada por nano- partículas e uso de vetores recombinantes, como adenovírus recombi- nantes, vírus associado a adenovírus recombinante e vaccinia recom- binante. O um ou mais antígenos de câncer da vacina podem ser ad- ministrados via injeção de DNA junto com eletroporação in vivo. Eletroporação

[00182] A vacina ou composição farmacêutica pode ser administra- da por eletroporação. A administração da vacina através de eletropo- ração pode ser realizada usando os dispositivos de eletroporação que podem ser configurados para distribuir a um tecido desejado de um mamífero um pulso de energia eficaz para fazer com que poros rever- síveis se tornem em membranas de célula, e preferivelmente o pulso de energia é um similar atual constante a uma entrada corrente prede- terminada por um usuário. O aparelho de eletroporação pode compre- ender um componente de eletroporação e um conjunto de eletrodo ou conjunto de manuseio. O componente de eletroporação pode incluir e incorporar um ou mais dos diversos elementos dos dispositivos de ele- troporação, incluindo: controlador, gerador de forma de onda de cor- rente, testador de impedância, registrador de forma de onda, elemento de entrada, elemento de relatório de status, porta de comunicação, componente de memória, fonte de energia e interruptor. A eletropora- ção pode ser realizada usando um dispositivo de eletroporação in vivo, por exemplo, sistema CELLECTRAG EP (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA) ou eletroporador Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Inc.) para facilitar a transfecção de células pelo plasmídeo.

[00183] Exemplos de dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem facilitar a administração das vacinas de DNA da presente invenção incluem aqueles descritos na Patente U.S.

7.245.963 por Draghia-Akli, et al, Pub. de Patente U.S. 2005/0052630 apresentado por Smith, et al., cujos conteúdos estão aqui incorporados por referência na sua totalidade. Outros dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem ser utilizados para facilitar a administração das vacinas de DNA incluem os fornecidos no Pedido de Patente U.S. copendente e coproprietário, 11/874072, depositado em 17 de outubro de 2007, que reivindica o benefício em 35 USC 119 (e) a Pedidos Provisórios U.S. 60/852.149, depositado em 17 de outu- bro de 2006, e 60/978.982, depositado em 10 de outubro de 2007, to- dos incorporados neste documento em sua totalidade.

[00184] A Patente U.S.7.245.963 de Draghia-Akli, et al. descreve sistemas de eletrodo modulares e seu uso para facilitar a introdução de uma biomolécula em células de um tecido selecionado em um cor- po ou uma planta. Os sistemas de eletrodo modular podem compreen- der uma pluralidade de eletrodos de agulha; uma agulha hipodérmica; um conector elétrico que fornece uma ligação condutora de um contro- lador de pulso de corrente constante programável para a pluralidade de eletrodos de agulha; e uma fonte de energia. Um operador pode segurar a pluralidade de eletrodos de agulha que são montados em uma estrutura de suporte e firmemente inseri-los no tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Em seguida, as biomoléculas são admi- nistradas por meio de agulha hipodérmica no tecido selecionado. O controlador de pulso de corrente constante programável é ativado e pulso elétrico de corrente constante é aplicada à pluralidade de eletro- dos de agulha. O pulso elétrico de corrente constante aplicado facilita a introdução da biomolécula na célula, entre a pluralidade de eletro- dos. Todo o conteúdo da Patente U.S. 7.245.963 é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[00185] A Publicação de Patente U.S. 2005/0052630 apresentada por Smith, et al. descreve um dispositivo de eletroporação que pode ser usado para facilitar efetivamente a introdução de uma biomolécula nas células de um tecido selecionado em um corpo ou planta. O apa- relho de eletroporação compreende um dispositivo eletro-cinético ("dispositivo EKD"), cuja operação é especificada pelo software ou fir- mware. O dispositivo EKD produz uma série de padrões de pulso de corrente constante programáveis entre eletrodos em uma disposição com base no controle de usuário e na entrada dos parâmetros de pul- so e permite o armazenamento e a aquisição de dados de forma de onda corrente. O aparelho de eletroporação também compreende um disco de eletrodo substituível tendo uma disposição de eletrodos de agulha, um canal de injeção central para uma agulha de injeção e um disco de guia removível. Todo o conteúdo da Pub. de Patente U.S. 2005/0052630 é totalmente aqui incorporado por referência.

[00186] Os arranjos e métodos de eletrodo descritos na Patente U.S.7.245.963 e Pub. de Patente U.S. 2005/0052630 podem ser adap- tados para penetração profunda não apenas nos tecidos tal como o músculo, mas também outros tecidos ou órgãos. Devido à configura- ção da matriz de eletrodos, a agulha de injeção (ao sistema deseneu-

rológico a biomolécula de escolha) também é inserida completamente no órgão-alvo, e a injeção é administrada perpendicularmente ao pro- blema-alvo, na área pré-delimitada pelos eletrodos. Os eletrodos des- critos na Patente U.S. 7.245.963 e Pub. de Patente U.S. 2005/005263 têm preferivelmente 20 mm de comprimento e calibre 21.

[00187] Além disso, contemplado em algumas modalidades que in- corporam dispositivos de eletroporação e usos dos mesmos, existem dispositivos de eletroporação descritos nas seguintes patentes: Paten- te U.S. 5.273.525 emitida em 28 de dezembro de 1993, Patentes U.S.

6.110.161 emitidas em 29 de agosto de 2000, 6.261.281 emitida em 17 de julho de 2001 e 6.958.060, emitida em 25 de outubro de 2005, e patente U.S. 6.939.862, emitida em 6 de setembro de 2005. Além dis- So, as patentes que cobrem o assunto em questão fornecido na paten- te U.S. 6.697.669, emitida em 24 de fevereiro de 2004, que diz respei- to à administração de DNA usando qualquer um de uma variedade de dispositivos, e a Patente U.S. 7.328.064, emitida em 5 de fevereiro de 2008, desenhada para o método de injeção de DNA, são contempla- das aqui. As patentes anteriores são incorporadas por referência na sua totalidade. Método de Preparação da Vacina

[00188] São descritos neste documento os métodos para prepara- ção de plasmídeos de DNA que compreendem as vacinas discutidas aqui. Os plasmídeos de DNA, após a etapa final de subclonagem no plasmídeo de expressão de mamíferos, podem ser usados para inocu- lar uma cultura de células em um tanque de fermentação em larga es- cala, usando os métodos conhecidos na técnica.

[00189] Os plasmídeos de DNA para uso com os dispositivos EP da presente invenção podem ser formulados ou fabricados usando uma combinação de dispositivos e técnicas conhecidas, mas preferencial- mente são fabricados usando uma técnica de fabricação de plasmídeo otimizada descrita em um pedido publicado US no. 20090004716, de- positado em 23 de maio de 2007. Em alguns exemplos, os plasmídeos de DNA usados nestes estudos podem ser formulados em concentra- ções maiores ou iguais a 10 mg/mL. As técnicas de fabricação tam- bém incluem ou incorporam vários dispositivos e protocolos que são comumente conhecidos pelos versados na técnica, além dos descritos em U.S. 60/939792, incluindo os descritos em uma patente licenciada Patente U.S. 7.238.522, emitida em 3 de julho de 2007. O pedido e a patente mencionados anteriormente, U.S. 60/939.792 e a Patente U.S.

7.238.522, respectivamente, são incorporados na sua totalidade.

[00190] A presente invenção tem múltiplos aspectos, ilustrados pe- los seguintes exemplos não limitativos. Exemplos

[00191] A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos se- guintes exemplos. Deve ser entendido que estes exemplos, enquanto indicando modalidades preferenciais da invenção, são providos a título de ilustração apenas. A partir da discussão anterior e nestes exem- plos, um versado na técnica pode avaliar as características essenciais da presente invenção e, sem fugir de seu espírito e escopo, pode fazer várias alterações e modificações da invenção para adaptá-la para vá- rios usos e condições. Assim, várias modificações da invenção, além das mostradas e descritas no presente documento, serão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição anteriormente men- cionada. Tais modificações pretendem ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1 LEMD1 de consenso LEMD1A de consenso

[00192] Para gerar um consenso humano LEMD1A, oito sequências de LEMD1A foram coletadas no GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/

genbank). Os números de acessão do GenBank para as sequências se- lecionadas são: NP 001 185979.1; XP 003938379.1; XP 012314760.1; XP 002760754.2; CR 012513307.1; CR 011371293.1; XP 011221935.1; e XP 007086602.1.

[00193] Uma sequência de consenso foi gerada usando o pacote de software DNASTARO Lasergene (versão 13.0.0.357). As oito sequên- cias listadas acima foram importadas para o MegAlign e alinhadas usando o programa de alinhamento de múltiplas sequências ClustalW. A sequência LEMD1 A resultante compartilha 97,2% de identidade com LEMD1 A nativo humano. LEMD1F de consenso

[00194] Para gerar um LEMD1F de consenso humano, seis sequên- cias de LEMD1F foram coletadas no GenBank (www .ncbi.nlm.nih.gov/ gen- bank). Os números de acessão do GenBank para as sequências selecio- nadas são: NP 001 185981. |; XP 01 1845800.1; CR 011813129.1; CR 010347273.1; XP 012314764.1; e CR 012513311.1.

[00195] “Uma sequência de consenso foi gerada usando o pacote de software DNASTARG Lasergene (versão 13.0.0.357). As seis sequên- cias listadas acima foram importadas para o MegAlign e alinhadas usando o programa de alinhamento de múltiplas sequências ClustalW. A sequência LEMD1F resultante compartilha 98,5% de identidade com LEMD1F nativo humano. Exemplo 2 LEMD1A de consenso sintético Abolindo a função biológica de LEMD1A

[00196] Afim de abolir a função biológica potencial do LEMD1A de consenso resultante, três mutações no domínio LEM (G20A, P25A e Y34A) foram introduzidas para interromper a ligação ao BAF. Como resultado, a proteína LEMD1A de consenso sintético compartilha 95,6% de identidade com a proteína LEMD1A humana nativa, como mostrado nas FIGs. 1h e 1B.

Otimizando a expressão

[00197] Uma vez obtida a sequência de DNA do consenso sintético LEMD1 A, para obter um nível de expressão mais alto, a metionina do N terminal do consenso sintético LEMD1 A foi removida e uma se- quência Kozak a montante e o líder IgE foram adicionados ao terminal N. Além disso, o uso de códons desse gene foi adaptado ao viés de códons dos genes do Homo sapiens, e a otimização do RNA também foi realizada com regiões com teor de GC muito alto (> 80%) ou muito baixo (<30%), motivos de sequência de ação como caixas TATA inter- nas, locais chi e locais ribossômicos sendo evitados. Uma representa- ção esquemática do LEMD1 A de consenso sintético é apresentada na FIG. 2. As características do LEMD1A de consenso sintético são for- necidas na Tabela 1. Tabela 1: Características do LEMD1A de consenso sintético Identidade para LEMD1A humana nativa | Identidade para LEMD1A de rhesus nativa Número de mutações de aminoácidos (vs hu- manas nativas) Po Número de mutações inseridas (não derivadas | 3 Peso molecular [comprimento de sequencia de codifeação (99) Jo

[00198] Com referência à FIG. 3, o LEMD1 de consenso sintética sintetizado A foi digerido com BamHlI e Xhol e clonado no vetor de ex- pressão pGX0001 (Inovio Pharmaceuticals). A espinha dorsal pGX0001 é um vetor de expressão pvAX1 modificado sob o controle do promotor imediato-precoce do citomegalovírus humano (promotor hocMV). Fo- ram introduzidas modificações no pvVAX1 para criar o pPGX0001 e são identificadas com base na sequência relatada do pvAX1 disponível na

ThermoFisher Scientific. Essas modificações estão listadas na Tabela 2. Tabela 2 Variante Nucleotídeo Descrição ACT>CTG 2,3,4 a montante do promotor CMV Cc>G 241 no promotor CMV Cc>T 1158 espinha dorsal, a jusante do sinal de polia- denilação de hormônio de crescimento bo- vino (bGH poli A) A>- 2092 espinha dorsal, a jusante do gene de resis- tência à Canamicina Cc>T 2493 na origem de replicação de pUC (pUC ori) G>C 2969 na extremidade de pUC Ori a montante do local de RNASeH

[00199] A espinha dorsal pGX0001 inclui o gene de resistência à canamicina (KanR) e a origem da replicação do plasmídeo (pUC ori) para fins de produção. Esses elementos não são funcionais nas célu- las eucarióticas. Os elementos presentes no pGX0001 do par de ba- ses 2998 incluem o seguinte: Promotor CMV: bases 137-724 Promotor T7/local de iniciação: bases 664-683 Local de clonagem múltipla: bases 696-811 Sinal de poliadenilação de GH bovino: bases 829-1053 Gene de resistência à canamicina: bases 1226-2020 origem pUC: bases 2319-2992

[00200] O plasmídeo resultante da clonagem de LEMD1A na espi- nha dorsal pGX0001 foi designado pGX1431, e a sequência completa foi confirmada como correta. O pGX1431 é um plasmídeo de DNA que codifica a proteina LEMD1A de consenso sintético. A produção de MRNA relacionada é conduzida por um promotor de CMV humano (promotor de hCMV) e terminada pelo sinal de poli-adenilação da ex- tremidade 3' do hormônio de crescimento bovino (bGH polyA). Os re-

cursos do pGX1431 são apresentados na Tabela 3. Tabela 3 fementos TpresdeBase | Sequência de Codificação de LEMD1A de 742-1341 Smam êma

[00201] Sequência de inserção de aminoácido de pGX1431 (SEQ ID NO: 2) 1 MDWTWILFLV AAATRVHSVD VKCLSDCKLO NOLEKLAFSP GAILPSTRKL 51 AEKKLVOLLV SPPCAPPVMN GPRELDGAOD SDDSEELNII LOGNIILSTE 101 KSKKLKKRPE ASTTKPKAVD TYCLDYKPSK GRRWAARAPS TRITYGTITK 151 ERDYCTEDOT AESWREEGFP VGLKLAVLGI FIIVVFVYLT VENKPLFG

[00202] A sequência líder do terminal N consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 18 da sequência de inserção e os resíduos de amino- ácidos 19 a 198 são o antígeno LEMD1A de consenso sintético.

[00203] “Sequência de DNA de cadeia simples de pGX1431 (SEQ ID NO: 7): 1 GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGAÇAT TGATTATTGA 51 CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT 101 ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC 151 GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG 201 TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG 251 TAMACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC 301 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT 351 ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC 401 ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG 451 ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC ATTGACGTCA 501 ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAMATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT

551 AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA 601 GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT 651 GGCTTATCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG 701 CGTTTAAACT TAAGCTTGGT ACCGAGCTCG GATCCGCCAC CATGGACTGG 751 ACCTGGATTC TGTTCCTGGT GGCAGCAGCA ACACGGGTGC ACTCCGTGGA 801 CGTGAAGTGC CTGTCTGATT GTAAGCTGCA GAACCAGCTG GAGAAGCTGG B51 CCTTTAGCCC TGGCGCCATC CTGCCATCCA CCAGGAAGCT GGCCGAGAAG 901 AAGCTGGTGC AGCTGCTGGT GTCCCCACCT TGCGCACCAC CCGTGATGAA 951 TGGACCCCGC GAGCTGGACG GAGCACAGGA TAGCGACGAT TCCGAGGAGC 1001 TGAACATCAT CCTGCAGGGC AATATCATCC TGTCTACCGA GAAGAGCAAG 1051 AAGCTGAAGA AGCGGCCCGA GGCCTCTACC ACAMAGCCTA AGGCCGTGGA 1101 CACATACTGC CTGGATTATA AGCCATCTAA GGGCCGGAGA TGGGCAGCCA 1151 GGGCCCCAAG CACCCGCATC ACATACGGCA CCATCACAAA GGAGCGGGAC 1201 TATTGTACCG AGGATCAGAC AGCCGAGAGC TGGAGAGAGG AGGGCTTCCC 1251 TGTGGGCCTG AAGCTGGCCG TGCTGGGÇAT CTTCATCATC GTGGTGTTCG 1301 TGTACCTGAC AGTGGAGAAC AAGCCACTGT TTGGCTGATA ACTCGAGTCT 1351 AGAGGGCCCG TTTAAMACCCG CTGATCAGCC TCGACTGTGC CTTCTAGTTG 1401 CCAGCCATCT GTTGTTTGCC CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG 1451 GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA ATGAGGAAMAT TGCATCGCAT 1501 TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG GGCAGGACAG 1551 CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG 1601 GCTCTATGGC TTCTACTGGG CGGTTTTATG GACAGCAAGC GAACCGGAAT 1651 TGCCAGCTGG GGCGCCCTCT GGTAAGGTTG GGAAGCCCTG CAAAGTAAMAC 1701 TGGATGGCTT TCTTGCCGCC AAGGATCTGA TGGCGCAGGG GATCAAGCTC 1751 TGATCAAGAG ACAGGATGAG GATCGTTTCG CATGATTGAA CAAGATGGAT 1801 TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC 1851 TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTGTC 1901 AGCGCAGGGG CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTECCC 1951 TGAATGAACT GCAAGACGAG GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG 2001 GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT GTCACTGAAG CGGGAAGGGA 2051 CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG TCATCTCACC 2101 TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG

2151 CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG 2201 CATCGAGCGA GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG 2251 ATCTGGACGA AGAGCATCAG GGGCTCGCGC CAGCCGAMACT GTTCGCCAGG 2301 CTCAAGGCGA GCATGCCCGA CGGCGAGGAT CTCGTCGTGA CCCATGGCGA 2351 TGCCTGCTTG CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT TCTGGATTCA 2401 TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG 2451 GCTACCCGTG ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG CTGACCGCTT 2501 CCTCGTGCTT TACGGTATCG CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT 2551 ATCGCCTTCT TGACGAGTTC TTCTGAATTA TTAACGCTTA CAATTTCCTG 2601 ATGCGGTATT TTCTCCTTAC GCATCTGTGC GGTATTTCAC ACCGCATCAG 2651 GTGGCACTTT TCGGGGAAMAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC 2701 TAAMATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT 2751 GCTTCAATAA TAGCACGTGC TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT 2801 AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG 2651 TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC 2901 TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC 2951 CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT 3001 TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTTCT 3051 TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC 3101 CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC 3151 GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATARA 3201 GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG 3251 AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCTATGAGAA 3301 AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG 3351 CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT 3401 GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA 3451 TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA 3501 CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT 3551 TCTT

[00204] A sequência líder do terminal N consiste nos nucleotídeos 1 a 54 da sequência acima, e os nucleotídeos restantes codificam o an- tígeno LEMD1 A. Exemplo 3 LEMD1F de consenso sintética

[00205] Afim de abolir a função biológica potencial do LEMD1F de consenso resultante, duas mutações no domínio LEM (G20A e P25A) foram introduzidas para interromper a ligação ao BAF. Como resulta- do, a proteína LEMD1F de consenso sintética compartilha 95,5% de identidade com a proteína LEMD1F humana nativa, como mostrado nas FIGs. 4A e 4B.

[00206] Uma vez obtida a sequência de DNA do consenso sintético LEMD1F, para obter um nível de expressão mais alto, a metionina do N terminal do consenso sintético LEMDF foi removida e uma sequên- cia Kozak a montante e o líder IgE foram adicionados ao terminal N. Além disso, o uso de códons desse gene foi adaptado ao viés de có- dons dos genes do Homo sapiens. Além disso, a otimização do RNA também foi realizada: regiões com teor de GC muito alto (> 80%) ou muito baixo (<30%) e os motivos de sequência de ação cis como cai- xas TATA internas, locais chi e locais de entrada ribossômicos foram evitadas. Um esquema da proteína de consenso sintético é apresenta- do na FIG. 5. A Tabela 4 apresenta algumas características do con- senso sintético LEMD1F. Tabela 4: Características de LEMD1IF Características LEMD1F de Consenso Sintética Identidade para LEMD1F humana nativa 95,5% Identidade para LEMD1F de camundongo nativa 11,9-43,3% Número de mutações de aminoácidos (vs humanas | 3 Número de mutações inseridas (não derivadas de |2 consenso) Peso molecular 86 aa (9,5 kDa)

[00207] Um vetor de expressão, pGX1432 foi construído usando a mesma esínha dorsal pGX0001 usado para a construção de pGX1431. Com referência à FIG. 6, a LEMD1F de consenso sintética sintetizado foi digerido com BamHI e Xhol e clonado no vetor de expressão pGX0001 (Inovio Pharmaceuticals) com o cassete de expressão colo-

cado sob o controle transcricional do promotor imediato-precoce do citomegalovírus. O plasmídeo resultante foi designado pGX1432 e a sequência completa foi confirmada. Características de pGX1432 são fornecidas na Tabela 5. Tabela 5 Promotor hcMV: 1387-724 Sequência de Codificação de LEMD1F de Consenso Sin- | 742-999 tética bGH PoliA: 1043-1267 Resistência à Canamicina (KanR): 1440-2234 pUuc Ori: 2533-3206

[00208] Sequência de inserção de aminoácido de pGX1432 (SEQ ID NO: 4):

LT MDWTWILFLV AAATRVHSVD VKCLSDCKLO NOLEKLAFSP GAILRGLOEH 51 QAPESHMGLS PKRETTARKT RLLRAGEKKV SQOWA

[00209] A sequência líder do terminal N consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 18 da sequência de inserção e os resíduos de amino- ácidos 19 a 84 são o antígeno LEMD1F de consenso sintética.

[00210] Sequência de DNA de cadeia simples de pGX1432 (SEQ ID NO: 8): 1 GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA 51 CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT 101 ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC 151 GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG 201 TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG 251 TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC 301 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT 351 ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC 401 ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG 451 ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC ATTGACGTCA 501 ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT 551 AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA €01 GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT 651 GGCTTATCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG 701 CGTTTAAACT TAAGCTTGGT ACCGAGCTCG GATCCGCCAC CATGGACTGG 751 ACCTGGATTC TGTTCCTGGT GGCAGCAGCA ACAAGGGTGC ACTCTGTGGA 801 CGTGAAGTGC CTGAGCGATT GTAAGCTGCA GAACCAGCTG GAGAAGCTGG 851 CCTTTTCCCC AGGAGCAATC CTGAGGGGAC TGCAGGAGCA CCAGGCACCA 901 GAGAGCCACA TGGGACTGTC CCCTAAGCGG GAGACCACAG CAAGGAAGAC

951 CAGACTGCTG AGGGCAGGAG AGAAGAAGGT GTCTCAGTGG GCCTGATAAC 1001 TCGAGTCTAG AGGGCCCGTT TAAACCCGCT GATCAGCCTC GACTGTGCCT 1051 TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC 1101 CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG 1151 CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGEG TEGEGTEGES 1201 CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA 1251 TGCGGTGGGC TCTATGGCTT CTACTGGGCG GTTTTATGGA CAGCAAGCGA 1301 ACCGGAATTG CCAGCTGGGG CGCCCTCTGG TAAGGTTGGG AAGCCCTGCA 1351 AAGTAMAACTG GATGGCTTTC TTGCCGCCAA GGATCTGATG GCGCAGGGGA 1401 TCAAGCTCTG ATCAAGAGAC AGGATGAGGA TCGTTTCGCA TGATTGAACA 1451 AGATGGATTG CACGCAGGTT CTCCGGCCGC TTGGGTGGAG AGGCTATTCG 1501 GCTATGACTG GGCACAACAG ACAATCGGCT GCTCTGATGC CGCCGTGTTC 1551 CGGCTGTCAG CGCAGGGGCG CCCGGTTCTT TTTGTCAAGA CCGACCTGTC 1601 CGGTGCCCTG AATGAACTGC AAGACGAGGC AGCGCGGCTA TCGTGGCTGG 1651 CCACGACGGG CGTTCCTTGC GCAGCTGTGC TCGACGTTGT CACTGAAGCG 1701 GGAAGGGACT GGCTGCTATT GGGCGAAGTG CCGGGGCAGG ATCTCCTGTC 1751 ATCTCACCTT GCTCCTGCCG AGAAAGTATC CATCATGGCT GATGCAATGC 1801 GGCGGCTGCA TACGCTTGAT CCGGCTACCT GCCCATTCGA CCACCAAGCG 1851 AAACATCGCA TCGAGCGAGC ACGTACTCGG ATGGAAGCCG GTCTTGTCGA 1901 TCAGGATGAT CTGGACGAAG AGCATCAGGG GCTCGCGCCA GCCGAACTGT 1951 TCGCCAGGCT CAAGGCGAGC ATGCCCGACG GCGAGGATCT CGTCGTGACC 2001 CATGGCGATG CCTGCTTGCC GAATATCATG GTGGAAAATG GCCGCTTTTC 2051 TGGATTCATC GACTGTGGCC GGCTGGGTGT GGCGGACCGC TATCAGGACA 2101 TAGCGTTGGC TACCCGTGAT ATTGCTGAAG AGCTTGGCGG CGAATGGGCT 2151 GACCGCTTCC TCGTGCTTTA CGGTATCGCC GCTCCCGATT CGCAGCGCAT 2201 CGCCTTCTAT CGCCTTCTTG ACGAGTTCTT CTGAATTATT AACGCTTACA 2251 ATTTCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC ATCTGTGCGG TATTTCAÇAC 2301 CGCATCAGGT GGCACTTTTC GGGGAAATGT GCGCGGAACC CCTATTTGTT 2351 TATTTTTCTA AATACATTCA AATATGTATC CGCTCATGAG ACAATAACCC 2401 TGATAAATGC TTCAATAATA GCACGTGCTA AAACTTCATT TTTAATTTAA 2451 AAGGATCTAG GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAMAATCCCTT 2501 AACGTGAGTT TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AMAGATCAAA 2551 GGATCTTCTT GAGATCCTTT TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC 2601 AAAAAAACCA CCGCTACCAG CGGTGGTTTG TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC 2651 CAMACTCTTTT TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA GATACCAAAT 2701 ACTGTTCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT 2751 AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG 2801 CCAGTGGCGA TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA 2851 CCGGATAAGG CGCAGCGGTC GGGCTGAACG GGGGSTTCGT GCACACAGCC 2901 CAGCTTGGAG CGAACGACCT ACACCGAACT GAGATACCTA CAGCGTGAGC 2951 TATGAGARAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA CAGGTATCCG 3001 GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGEG 3051 AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG 3101 AGCGTCGATT TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC 3151 GCCAGCAACG CGGCCTTTTT ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGEC 3201 TCACATGTTC TT

[00211] A sequência líder do terminal N consiste nos nucleotídeos 1 a 54 da sequência acima, e os nucleotídeos restantes codificam o an- tígeno LEMD1F. Exemplo 3 LEMD1AF de consenso sintética

[00212] Um construto de múltiplos antígenos, LEMD1AF de con- senso sintética foi criado através da inserção de um local de clivagem de furina (RGRKRRS, SEQ ID NO: 10) entre as sequências de amino- ácidos da LEMD1A de consenso sintético e do LEMD1F de consenso sintética. Uma vez obtida a sequência de DNA do consenso sintético LEMD1 AF, para obter um nível de expressão mais alto, a metionina do N terminal do consenso sintético LEMD1 AF foi removida e uma sequência Kozak a montante e o líder IgE foram adicionados ao termi- nal N. Além disso, o uso de códons desse gene foi adaptado ao viés de códons dos genes do Homo sapiens. Além disso, a otimização do RNA também foi realizada: regiões com teor de GC muito alto (> 80%) ou muito baixo (<30%) e os motivos de sequência de ação cis como caixas TATA internas, locais chi e locais de entrada ribossômicos fo- ram evitadas. Como os domínios de terminais N (aminoácidos 2-27) nas proteínas LEMD1A de consenso e LEMD1F de consenso são idênticos, as sequências de DNA que codificam a região do aminoáci- do 2-27 do LEMD1A de consenso sintético e a região do aminoácido 2-27 do LEMD1F de consenso sintética foi otimizado de maneira dife- rente (64,1% de identidade de sequência) para aumentar a estabilida- de do plasmídeo. Uma representação esquemática do LEMD1AF de consenso sintética é mostrada na FIG. 7.

[00213] Com referência à FIG. 8, o LEMD1AF de consenso sintética sintetizado foi digerido com BamHI e Xhol e clonado no vetor de ex- pressão pGX0001 (Inovio Pharmaceuticals) como descrito nos exem- plos anteriores. O cassete de expressão foi colocado sob o controle transcricional do promotor imediato-precoce do citomegalovírus. O plasmídeo resultante foi designado pGX1433 e a sequência completa foi confirmada.

[00214] pGX1433 é um plasmídeo de DNA que codifica a proteína LEMD1AF de consenso sintética. A produção de mRNA relacionada é conduzida por um promotor de CMV humano (promotor de hCMV) e terminada pelo sinal de poli-adenilação da extremidade 3' do hormônio de crescimento bovino (bGH polyA). A espinha dorsal pGX0001 inclui o gene de resistência à canamicina (KanR) e a origem da replicação do plasmídeo (pUC ori) para fins de produção. Esses elementos não são funcionais nas células eucarióticas. A Tabela 6 fornece informa- ções adicionais relacionadas ao pGX1433. Tabela 6 [Elementos raesdeBae | Promotor hoMV: 137-724 Sequência de Codificação de LEMD1IF de Consenso | 42-1560 Sintética bGH PoliA: 1604-1828 Resistência à Canamicina (KanR): 2001-2795 pUC Ori 3094-3767

[00215] Sequência de inserção de aminoácido de pGX1433 (SEQ ID NO: 6) 1 MDWTWILFLV AAATRVHSVD VKCLSDCKLO NOLEKLAFSP GAILPSTRKL 51 AEKKLVOLLV SPPCAPPVMN GPRELDGAQD SDDSEELNII LOGNIILSTE 101 KSKKLKKRPE ASTTKPKAVD TYCLDYKPSK GRRWHAARAPS TRITYGTITK 151 ERDYCTEDOT AESWREEGFP VGLKLAVLGI FIIVVFVYLT VENKPLFGRG 201 RKRRSVDVKC LSDCKLONQOL EKLAFSPGAI LRGLÇEHOAP ESHMGLSPKR 251 ETTARKTRLL RAGEKKVSQW A

[00216] A sequência líder do terminal N consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 18 da sequência de inserção e os resíduos de amino- ácidos 19 a 198 e 206-271 são o antígeno LEMD1A e F de consenso sintético. Um local de clivagem de furina, resíduos de aminoácidos 199 a 205, reside entre as sequências de LEMD1.

[00217] Sequência de DNA de cadeia simples de pGX1433 (SEQ ID NO: 9): 1 GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA 51 CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT 101 ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC 151 GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG 201 TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG 251 TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC 301 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT 351 ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC 401 ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGETGEG 451 ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC ATTGACGTCA 501 ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT 851 AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA 601 GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT 651 GGCTTATCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG 701 CGTTTAAACT TAAGCTTGGT ACCGAGCTCG GATCCGCCAC CATGGACTGG 751 ACCTGGATTC TGTTCCTGGT GGCAGCAGCA ACCCGCGTGC ATTCCGTCGA 801 TGTGAAGTGT CTGAGTGATT GTAAACTGCA GAACCAGCTG GAGAAGCTGG 851 CCTTTAGCCC TGGAGCAATC CTGCCATCCA CCAGGAAGCT GGCCGAGAAG 901 AAGCTGGTGC AGCTGCTGGT GAGCCCACCT TGCGCACCAC CCGTGATGAA

951 TGGCCCAAGA GAGCTGGACG GCGCCCAGGA TAGCGACGAT TCCGAGGAGC 1001 TGAACATCAT CCTGCAGGGC AATATCATCC TGTCTACCGA GAAGAGCAAG 1051 AAGCTGAAGA AGCGGCCCGA GGCCTCCACC ACAAAGCCTA AGGCCGTGGA 1101 CACATACTGC CTGGATTATA AGCCTTCCAA GGGCCGGAGA TGGGCAGCCA 1151 GGGCCCCATC TACCAGGATC ACATACGGCA CCATCACAAA GGAGCGGGAC 1201 TATTGTACCG AGGATCAGAC AGCCGAGTCT TGGAGAGAGG AGGGATTCCC 1251 AGTGGGCCTG AAGCTGGCCG TGCTGGGCAT CTTCATCATC GTGGTGTTCG 1301 TGTACCTGAC AGTGGAGAAC AAGCCTCTGT TTGGCCGGGG CAGAAAGAGG 1351 CGCTCTGTGG ATGTAAAATG CCTATCGGAC TGCAAGTTGC AAAATCAATT 1401 AGAMAAATTG GCCTTCTCCC CAGGGGCGAT ATTGAGGGGC CTGCAGGAGC 1451 ACCAGGCACC AGAGTCCCAC ATGGGCCTGT CTCCCAAGCG CGAGACAACC 1501 GCAAGAAAAA CAAGGCTGCT GAGGGCTGGG GAAAAGAMAG TGTCACAGTG 1551 GGCATGATAA CTCGAGTCTA GAGGGCCCGT TTAMACCCGC TGATCAGCCT 1601 CGACTGTGCC TTCTAGTTGC CAGCCATCTG TTGTTTGCCC CTCCCCCGTG 1651 CCTTCCTTGA CCCTGGAAGG TGCCACTCCC ACTGTCCTTT CCTAATAAAA 1701 TGAGGAAATT GCATCGCATT GTCTGAGTAG GTGTCATTCT ATTCTGGGGG 1751 GTGGGGTGGG GCAGGACAGC AAGGGGGAGG ATTGGGAAGA CAATAGCAGG 1801 CATGCTGGGG ATGCGGTGGG CTCTATGGCT TCTACTGGGC GGTTTTATGG 1651 ACAGCAAGCG AACCGGAATT GCCAGCTGGG GCGCCCTCTG GTAAGGTTGG 1901 GAAGCCCTGC AAAGTAAACT GGATGGCTTT CTTGCCGCCA AGGATCTGAT 1951 GGCGCAGGGG ATCAAGCTCT GATCAAGAGA CAGGATGAGG ATCGTTTCGC 2001 ATGATTGAAC AAGATGGATT GCACGCAGGT TCTCCGGCCG CTTGGGTGGA 2051 GAGGCTATTC GGCTATGACT GGGCACAACA GACAATCGGC TGCTCTGATG 2101 CCGCCGTGTT CCGGCTETCA GCGCAGGGGC GCCCGGTTCT TTTTGTCAAG 2151 ACCGACCTGT CCGGTGCCCT GAATGAACTG CAAGACGAGG CAGCGCGGCT 2201 ATCGTGGCTG GCCACGACGG GCGTTCCTTG CGCAGCTGTG CTCGACGTTG 2251 TCACTGAAGC GGGAAGGGAC TGGCTGCTAT TGGGCGAAGT GCCGGGGCAG 2301 GATCTCCTGT CATCTCACCT TGCTCCTGCC GAGAAAGTAT CCATCATGGC 2351 TGATGCAATG CGGCGGCTGC ATACGCTTGA TCCGGCTACC TGCCCATTCG 2401 ACCACCAAGC GAAACATCGC ATCGAGCGAG CACGTACTCG GATGGAAGCC 2451 GGTCTTGTCG ATCAGGATGA TCTGGACGAA GAGCATCAGG GGCTCGCGCC 2501 AGCCGAACTG TTCGCCAGGC TCAAGGCGAG CATGCCCGAC GGCGAGGATC 2551 TCGTCGTGAC CCATGGCGAT GCCTGCTTGC CGAATATCAT GGTGGAAAAT 2601 GGCCGCTTTT CTGGATTCAT CGACTGTGGC CGGCTGGGTG TGGCGGACCG 2651 CTATCAGGAC ATAGCGTTGG CTACCCGTGA TATTGCTGAA GAGCTTGGCG 2701 GCGAATGGGC TGACCGCTTC CTCGTGCTTT ACGGTATCGC CGCTCCCGAT 2751 TCGCAGCGCA TCGCCTTCTA TCGCCTTCTT GACGAGTTCT TCTGAATTAT 2801 TAACGCTTAC AATTTCCTGA TGCGGTATTT TCTCCTTACG CATCTGTGCG 2851 GTATTTCACA CCGCATCAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC 2901 CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA 2951 GACAATAACC CTGATAAATG CTTCAATAAT AGCACGTGCT AAAACTTCAT 3001 TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC 3051 CAMAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 3101 AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC 3151 TGCTTGCÇAAA CAAAAAAAÇC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA 3201 TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC 3251 AGATACCAAA TACTGTTCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC 3301 AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC 3351 AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 3401 GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG 3451 TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT 3501 ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG 3551 ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG 3601 CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA 3651 CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 3701 TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC 3751 TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTT

[00218] A sequência líder do terminal N consiste nos nucleotídeos 1 a 54 da sequência acima e os nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 codi- ficam o construto de antígeno LEMD1AF. Os nucleotídeos 595 a 615 codificam o local de ligação da furina.

Exemplo 4 Expressão de antígeno in vitro

[00219] A expressão da proteína de antígeno por pGX1431, pGX1432 e pGX1433 foi confirmada por Western bloting. As células de rabdomiossarcoma humano (RD) (ATCC, CCL-136) mantidas em meio DMEM com 10% de FBS (ThermoFisher) foram transfectadas com pGX1431, pGX1432, pGX1433 ou pGX0001 (prato de 6 pg/10 cm?) usando Turfofectina 8 (Origene). Quarenta e oito horas após a trans- fecção, as células foram lisadas usando tampão de lise celular RIPA (ThermoFisher) e o lisado celular foi coletado. Após um ensaio de BCA (ThermoFisher) para determinar a concentração total de proteínas, 15 pg de lisado celular foram submetidos a eletroforese em gel de SDS- PAGE 4-12% e a detecção foi realizada com um anticorpo monoclonal anti-LEMDI (Abeam, clone ab20/206) e visualizado com IgG anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Santa Cruz Bio- tech, SC-2004) utilizando um sistema de análise de western blot ECL (GE Amersham). Como controle de carregamento, as transferências fo- ram novamente sondadas quanto à expressão de actina usando um an- ticorpo monoclonal anti-actina (Santa Cruz Biotech, clone, C4).

[00220] Bandas de proteína dos pesos moleculares esperados para os construtos de LEMD1A de consenso sintético (pGX1431) e LEMD1IAF de consenso sintética (pDGX1433) foram detectadas, mas uma banda não foi detectada para o construto de LEMD1F de consenso sintética (PGX1432) (FIG. 9). Pode-se inferir que esse antígeno LEMD1F foi expresso como parte do antígeno LEMD1AF porque foi detectado no peso molecular esperado para o antígeno AF. Não foram detectadas bandas de proteínas na faixa de pGX0001. As bandas anti-actina fo- ram detectadas com intensidades semelhantes, indicando que quanti- dades iguais de proteína foram carregadas em cada faixa. Em resumo, verificou-se que pGX1431 e pGX1433 expressam suas respectivas proteínas antigênicas. Exemplo 5 Imunogenicidade dos construtos sintéticos da vacina LEMD1 Materiais e Métodos Animais e imunizações

[00221] —“Camundongos fêmeas CB6F1 de 8 semanas de idade fo- ram comprados da Jackson Laboratories. Todos os animais foram alojados em uma instalação com ciclo de luz e temperatura controlada na BTS Research (San Die- go, CA). O cuidado com os animais foi realizado de acordo com as di- retrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e a Proposta de Cuidado e Uso de Animais (ACUP) (BTS ACUP %& 15-091). Os camundongos fo- ram divididos em dez grupos, conforme detalhado na Tabela 1. Tabela 7 Dose de Constru- | Volume de injeção Construto to (pg) (UL) LE EB rem o a [a EB em so a [a [BT pe TT RT || pegas | o | 3 | [6 e [rem TT a DT [Or e remar | a 8 || pegdass | o | 3 | [9 e [| rem TT 3 | (10 | 8 | pegas | so | 3 |

[00222] Os camundongos nos grupos imunizados foram vacinados com as doses indicadas de pGX0001, pGX1431, pGX1432 ou pGX1433. Resumidamente, os plasmídeos foram formulados em água estéril pa- ra injeção (VetOne), de modo que a dose indicada fosse administrada por injeção intramuscular no músculo tibial anterior em um volume de injeção de 30 pL. Cada injeção intramuscular foi imediatamente segui- da por eletroporação (EP) usando o dispositivo de eletroporação por corrente constante adaptativa CELLECTRAG 2000 com uma matriz 3P (Inovio Pharmaceuticals). O dispositivo foi configurado para distribuir dois pulsos de 0,1 Amp de 52 ms de largura de pulso espaçados por um 1 segundo de atraso. Os camundongos receberam 3 imunizações, com 3 semanas de intervalo. Os camundongos foram sacrificados uma semana após a última imunização e os baços colhidos para leituras imunes celulares. Nenhum outro tecido foi coletado. Isolamento esplênico de linfócitos

[00223] Os esplenócitos foram isolados assepticamente e coloca- dos em 5 mL de meio R10 (meio 1640 do Rosewell Park Memorial Ins- titute suplementado com soro fetal bovino a 10% e antibiótico-antimi- cótico a 1%). Os esplenócitos foram isolados por interrupção mecânica do baço usando uma máquina Stomacher (Seward Laboratory Sys- tems Inc.), e o produto resultante foi filtrado usando um filtro de células de 40 horas (BD Falcon). O produto resultante foi centrifugado e o se- dimento foi tratado por 5 min com tampão de lise ACK (Lonza) para lise de hemácias. Os esplenócitos foram então centrifugados, lavados em PBS e depois ressuspensos em meio R10 e imediatamente usados para análises posteriores. IFNy ELISpot

[00224] O teste IFNy ELISpot de camundongo (MabTech) foi reali- zado para avaliar respostas celulares específicas do antígeno. Resu- midamente, placas de 96 poços pré-revestidas com anticorpo IFNy an- ticamundongo foram lavadas em PBS e bloqueadas por 2 horas à temperatura ambiente com meio de cultura completo (RPMI 1640 su- plementado com 10% de FBS e antibióticos). Os linfócitos esplênicos foram ressuspensos em meio R10 (e depois adicionados em triplica- dos a um número de células de entrada de 2 x 10º células por poço. Um conjunto de peptídeos foi sintetizado (GenScript), cada um con- tendo 15 resíduos de aminoácidos sobrepostos por 9 aminoácidos re-

presentando toda a sequência de proteínas LEMD1 de consenso sinté- tica. Estes conjuntos de peptídeos foram ressuspensos em DMSO (Sigma) e reunidos a uma concentração de — 2 ug/ml de peptídeo em dois conjuntos de peptídeo. Um grupo de peptídeo continha os peptí- deos correspondentes à proteína de antígeno de LEMD1 A de consen- so sintético e o segundo grupo de peptídeos continha os peptídeos correspondentes à proteína de antígeno LEMD1F de consenso sintéti- ca. A concavalina A (Sigma) a 5pg/ml foi utilizada como controle posi- tivo e o meio de cultura completo foi usado como controle negativo. As placas foram incubadas por 18 horas a 37 º C, em uma incubadora de atmosfera de 5% de CO2. Em seguida, foi adicionado um anticorpo biotinilado de detecção de IFNy anticamundongo (MabTech) e as pla- cas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas e o anticorpo Streptavidin-ALP (MabTech) foi adiciona- do e as placas incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. A de- tecção do ponto foi concluída de acordo com as instruções do fabri- cante do kit (MabTech). As manchas nas placas foram contadas usan- do um leitor ELISPOT automatizado (Cellular Technology). O número médio de unidades formadoras de pontos (SFU) foi ajustado para 1 x 10º esplenócitos para exibição de dados.

[00225] As respostas específicas do antígeno pelo IFNy ELISpot são relatadas como o número de unidades formadoras de mancha IFNy (SFU) por 1 x 10º esplenócitos maiores que a SFU no controle apenas de meio. Citometria de fluxo

[00226] As respostas imunes celulares induzidas por LEMD1 de consenso sintética foram ainda caracterizadas por citometria de fluxo. Resumidamente, 2 x 10º esplenócitos de camundongos vacinados e ingênuos foram imediatamente estimulados após o isolamento com o peptídeo de LEMD1 de consenso sintética, conforme apropriado para cada grupo, por 6 horas na presença de Brefeldin A (BD Biosciences), Monensin (BD Biosciences) e anticorpo anti-CD107a anticamundongo FITC (BD Biosciences). Após estimulação com peptídeos, os esplenó- citos foram centrifugados e ressuspensos em 20 pL por poço da solu- ção de BD Fc Block (BD Biosciences) de camundongo. O bloco Fc é utilizado a uma diluição inicial de 1:40 em PBS e incubado a 4ºC por 5 minutos. Após a incubação, os anticorpos extracelulares restantes (em PBS) são adicionados a 30 pL por poço e deixados a incubar a 4ºC por 30 minutos. Após a adição da mancha extracelular, o volume final em cada poço é de 50 uL, consistindo em Bloco Fc na diluição final de 1:100 e os anticorpos extracelulares nas suas diluições de trabalho apropriadas. As células foram então coradas com corante de viabilida- de (Vivid V450, Thermo-Fisher) e os seguintes anticorpos extracelula- res: CD4 anticamundongo PerCP-Cy5.5 (BD Biosciences, clone RM4- 5) e CD8a anticamundongo APC (BD Biosciences, clone 63-67). As células foram fixadas e permeabilizadas (BD Biosciences, % 554714) por 20 minutos a 4ºC. A coloração intracelular foi subsequentemente concluída com os seguintes anticorpos: CD3e anticamundongo APC- Cy7 (BD Biosciences, clone 145-2C11), IFNy anticamundongo BV605 (BD Biosciences, clone XMG1.2), IL-2 anticamundongo APC-R700 (BD Biosciences, clone JES6-5H4) e PE anticamundongo TNF-a (BD Bios- ciences, clone MP6-XT22). Os dados do ICS foram coletados no FACS CANTO de 10 cores (BD Biosciences) e a análise foi concluída usando o software FlowJo. A estratégia de bloqueio da citometria de fluxo é mostrada abaixo na FIG. 10.

[00227] Para que uma célula seja chamada de antígeno específico por citometria de fluxo, a frequência do parâmetro relatado deve exce- der a do controle somente de meio. Para que uma célula seja identifi- cada como produtora de CD107a específico de antígeno, a célula também deve ser identificada como positiva para a produção especiífi-

ca de antígeno de IFNy e/ou IL-2 e/ou TNFa, conforme identificado pe- la porta booleana. Análise estatística

[00228] A análise estatística foi concluída usando o IBM SPSS Sta- tistics 22 (IBM Corporation). A análise entre os grupos foi realizada usando uma ANOVA com Diferença Significativa Honesta post-hoc de Tukey (HSD) para ajustar as comparações múltiplas. A homogeneida- de da variância foi confirmada usando a estatística F antes de compa- rações múltiplas. Para todas as análises estatísticas, um valor de p de 0,050 foi considerado significativo. Resultados IFNy ELISpot

[00229] A imunogenicidade dos três construtos de LEMD1 de con- senso sintética foi avaliada em três doses (10 ug, 30 ug e 50 ug) por IFNy ELISpot e citometria de fluxo (n = 8/grupo). Os camundongos fo- ram imunizados com a espinha dorsal vazia do plasmídeo (pbGX0001) como controle negativo (n = 4/grupo). A vacinação com LEMD1A de consenso sintética resultou em respostas significativas ao IFNy em comparação com camundongos vacinados com controle negativo. Ha- via evidências de um aumento dependente da dose na produção de IFNy induzido pelo LEMD1A de consenso sintético (FIG. 11A) com a resposta média máxima alcançada na quantidade de dose de 30 ug. Especificamente, a LEMD1A de consenso sintético IFNy SFU foi de 646 + 373, 1.683 + 1248 e 1.645 + 1002 a 10 po, 30 ug e 50 ug, res- pectivamente. As respostas de IFNy de LEMD1A de consenso sintético foram significativamente maiores que naive (3 + 4) nas doses de 30 ug (p = 0,024) e 50 ug (p = 0,028) de pGX1431, mas não na dose de 10 Vg (p = 0,642). A vacinação com LEMD1F de consenso sintética resul- tou em respostas IFNy mínimas sem evidência de um aumento depen- dente da dose com o aumento da quantidade da dose (FIG. 11B). SFU de IFNy de LEMD1F eram 163 + 382, 88 + 109 e 140 + 246 a 10 ug, 30 ug e 50 ug, respectivamente.

As respostas de IFNy de LEMD1F de consenso sintética não foram significativamente maiores que naive (3 + 4) em qualquer uma das quantidades de dose de pGX1432. A vaci- nação com LEMD1 AF de consenso sintético resultou em respostas significativas ao IFN em comparação com camundongos vacinados com controle negativo.

Havia evidências de um aumento dependente da dose na produção de IFNy induzido pelo LEMD1 AF de consenso sintético (FIG. 11C) com a resposta média máxima alcançada na quantidade de dose de 50 pg.

Especificamente, a SFU de IFNy de LEMD1AF foi de 478 + 269, 779 +392 e 879 + 552 a 10 ug, 30 ug. e 50 vg, respectivamente.

As respostas de IFNy de LEMD1AF de consenso sintética foram significativamente maiores que naive (3 + 4) nas doses de ug (p=0,018) e 50 ug (p=0,007) de pGX1433, mas não na dose de 10 ug (p=0,227). As respostas de IFNy estão resumidas na Tabela 8. Tabela 8: Respostas de IFNyy induzidas por pGX1431, pGX1432 e pGX1433 LEMD1A de Consenso Sintética LEMD1AF de Consenso Sintética (PGX1431) (PGX1433) SFU média a valor- Construto pose e vRad | Er Leona | oc%0 | soe Dra | Desv Padr Padr p pGX1431 pGX1433 So vg | 1,645+ 1002 | 0,028 1a Valor- Construto | Dose SFU média + p Desv Padr pGX1432 30pg | 88+109

Os valores de p relatados são relativos a naive (camundongos imuni- zados com pGX0001). Significância assumida em p <0,05.

[00230] LEMD1 A de consenso sintética induziu frequências de res- postas de células T CD4+ específicas de antígeno que foram significa- tivamente mais robustas do que naive (0,04% + 0,03%) no grupo de quantidade de dose de 50 ug (1,34% + 0,58%) (p<0,005), mas não nos grupos de quantidade de dose de 10 ug (0,50% + 0,170%) (p<0,004) ou 30 ug (1,02% + 0,57%) (p<0,122) (FIG. 12A). As respostas das cé- lulas T CD4+ específicas de LEMD1A de consenso sintético eram de- pendentes da dose e consistiam principalmente em IFNy+IL-2+TNFa+ IFNy+IL-2-TNFoa+ ou células T CD4+ produtoras de IFNy+IL-2-TNFa- (FIG. 12E).

[00231] LEMDI1F de consenso sintética induziu frequências de res- postas de células T CD4+ específicas de antígeno que eram minima- mente maiores que naive (0,06% + 0,02%). Especificamente, o pGX1432 induziu respostas não significativas nos grupos de quantida- de de dose de 10 ug (0,27% + 0,34%), 30 ug (0,24% + 0,10%) e 50 ug (0,20% + 0,20%) (FIG. 12B). As respostas das células T CD4+ especí- ficas do LEMD1F de consenso sintética eram dependentes da dose e consistiam principalmente em IFNy+IL-2+TNFat, IFNy+IL-2+TNFo-, IFNy+IL-2-TNFa+, IFNy-IL-2-TNFa+t ou células T CD4+ produtoras de IFNy+IL-2-TNFa (FIG. 12E)

[00232] LEMDI1AF de consenso sintética induziu frequências de respostas de células T CD4+ específicas de antígeno que foram signi- ficativamente mais robustas do que naive (0,09% + 0,03%) no grupo de quantidade de dose de 50 ug (0.80% + 0,51%) (p<0,006), mas não nos grupos de quantidade de dose de 10 ug (0,53% + 0,19%) (p<0,135) ou 30 ug (0,50% + 0,20%) (p<0,176) (FIG.12C). As respos- tas das células T CD4+ específicas de LEMD1AF de consenso sintéti- ca eram independentes da dose e consistiam principalmente em

IFNy+IL-2+TNFa+IFNy+IL-2-TNFo+, IFNy + IL-2-TNFo+ ou células T CDA4 + produtoras de IFNy-IL-2-TNFa+t (FIG. 12E).

[00233] A frequência de células T CD4+ específicas de antígeno é mais detalhada na Tabela 9.

[00234] Todas as quantidades de doses de construtos de LEMD1 de consenso sintética induziram uma frequência de células T CD4+ CD107a+ que era ligeiramente maior que naive, mas apenas o cons- truto de pGXI431 na quantidade mais alta de doses foi significativa- mente mais robusto.

[00235] Especificamente, a frequência de células T CD4+CD107a+ específicas para o antígeno pPGX1431 foi de 0,17% + 0,09%, 0,34% + 0,19% e 0,50% + 0,30% nos grupos de quantidade de dose de 10 ug (p = 0,532), 30 ug (p = 0,314) e 50 ug (p = 0,002), respectivamente (Figura 13 A). O perfil de citocina das células T CD4+CD107a+ especí- ficas de pGX1431 foi semelhante nos grupos de quantidade de dose e foi composto principalmente por células IFNy+IL-2+TNFa+t, IFNy+IL-2- TNFart, e IFNy+IL-2-TNFo- (Figura 13E).

[00236] A frequência de células T CD4+CD107a+ específicas para o antígeno pGX1432 foi de 0,10% + 0,14%, 0,11% + 0,08% e 0,04% + 0,03% nos grupos de quantidade de dose de 10 ug, 30 ug e 50 ug, respectivamente (Figura 13B). O perfil de citocinas das células T CD4+CD107a+ específicas para pGX1432 foi semelhante nos grupos de quantidade de dose de 10 ug e 30 ug e era composto principalmen- te por células IFNy+IL-2+TNFat+, IFNy+HIL-2+TNFo-, e IFNy+HlL-2- TNFa- enquanto que na quantidade de dose de 50 ug o perfil de cito- cinas era composto principalmente por células IFNy+IL-2+TNFo+t, IFNy+IL-2-TNFa+ e IFNy+IL-2-TNFaa- (Figura 13E).

[00237] A frequência de células T CD4+CD107a+ específicas para o antígeno pGX1433 foi de 0,20% + 0,10%, 0,17% + 0,10% e 0,39% + 0,31% nos grupos de quantidade de dose de 10 ug (p = 0,365), 30 ug

(p = 0,992) e 50 ug (p = 0,109), respectivamente (Figura 13C). O perfil de citocinas das células T CD4+CD107a+ específicas de pGX1433 foi semelhante nos grupos de quantidade de dose de 10 e 30 pg e era composto principalmente por IFNy+IL-2+TNFa+, com algumas células IFNy+IL-2-TNFa+ e IFNy+IL-2-TNFo-, enquanto que o grupo de quan- tidade de dose de 50 ug era composto principalmente por IFN>+IL-2- TNFa- com IFNy+IL-2+TNFB+. IFNy+IL-2+TNFo- e IFNy+IL-2-TNFo+ (Figura 13E).

[00238] A frequência de células T CD4+CD107+ específicas de an- tígeno é mais detalhada na Tabela 9. Tabela 9: LEMD1A de Consenso Sintética (pGX1431 Construto %ACD4* + Desv | valorp | %SCD4ºCDIO7a* + | valorp Padr Desv Padr pGX0001 0,04 + 0,03 0,00 + 0,00 pg 0,50 + 0,17 0,346 0,17 + 0,09 0,532 pGX1431 30 pq 1,02 + 0,57 0,122 0,34 + 0,19 0,314 50 pg 1,34 + 0,58 0,005 0,50 + 0,30 0,002 LEMD1F de Consenso Sintética (pGX1432 Construto Dose %CD4* + Desv %CD4*CD107a* + Padr valor p Desv Padr valor p pGX0001 30 pq 0,06 + 0,02 0,01 + 0,00 10 pg 0,27 + 0,34 na 0,10 + 0,14 na pGX1432 30 pq 0,24 + 0,10 0,11 + 0,08 50 pq 0,20 + 0,20 0,04 +0,03 LEMD1AF de Consenso Sintética (DGX1433) Construto Y%CDA4* + Desy %CD4*CD107a* + Padr valor p Desv Padr valor p pGX0001 30 pq 0,09 + 0,03 na 0,01 + 0,01 na 10 pq 0,53 + 0,19 0,135 0,20 + 0,10 pGX1433 30 pg 0,50 + 0,20 0,176 0,17 + 0,10 0,992 50 pg 0,80 + 0,51 0,006 0,39 + 0,31 0,109 Os valores de p relatados são relativos a naive (camundongos imunizados com pGX0001). Significância assumida em p < 0,05.

[00239] LEMD1 Ade consenso sintética induziu frequências de respostas de células T CD8+ específicas de antígeno que eram mais robustas que naive (0,08% + 0,01%), mas não significativas nos gru- pos de quantidade de dose de 10 ug (1,46% + 0,79%), 30 ug (2,34% + 1,47%) e 50 ug (2,12% + 1,897%) (FIG. 14A). As respostas de células T CD8+ específicas de LEMD1A de consenso sintético eram indepen- dentes da dose e consistiam principalmente em IFNytIL-2-TNFa- e algumas células T CD8+ produtoras de IFNy+IL-2-TNFa+t (FIG. 14E).

[00240] LEMDI1F de consenso sintética induziu frequências de res- postas de células T CD8+ específicas de antígeno que não eram maio- res que naive (0,09% + 0,05%). Especificamente, o pPGX1432 induziu respostas não significativas nos grupos de quantidade de dose de 10 ug (0,09% + 0,04%), 30 ug (0,07% + 0,05%) e 50 ug (0,17% + 0,07%) (FIG. 14B). As respostas das células T CD8+ específicas de LEMD1IF de consenso sintética eram independentes da dose e consistiam prin- cipalmente em IFNy-IL2+-TNFoa-. IFNy-IL-2-TNFa+ e células T CD8+ produtoas de IFNytIL-2+-TNFa- (FIG. 14E).

[00241] LEMDI1AF de consenso sintética induziu frequências de respostas de células T CD8+ específicas de antígeno que foram signi- ficativamente mais robustas do que naive (0,17% + 0,043%) na quan- tidade de dose de 50 ug (1,73% + 1,40%) (p = 0,046), mas não nos grupos de quantidade de dose de 10 ug (0,72% + 0,36%) (p = 0,061) ou 30 ug (1,65% + 0,86%) (p = 0,061) (p = 0,061) (FIG. 14C). As res- postas de células T CD8+ específicas de LEMD1AF de consenso sin- tética eram dependentes da dose e consistiam principalmente em IFNytIL-2-TNFoa- e algumas células T CD8+ produtoras de IFNy+IL-2- TNFart e IFNy-IL-2+-TNFoa (FIG. 14E).

[00242] A frequência de células T CD8+ específicas de antígeno é mais detalhada na Tabela 10.

Tabela 10 Padr valor p Desv Padr valor p pGX1431 na 2,23 + 1,45 vao [ ESTE pGX1432 na 0,05 + 0,04 Padr valor p Desv Padr valor p pGX1433 0,061 1,43 + 1,39 Os valores de p relatados são relativos a naive (camundongos imunizados com pGX0001). Significância assumida em p <0,05.

[00243] Construtos de LEMD1 de consenso sintética pPGX1431 e pGX1433, mas não pGX1432, induziram uma frequência de células T CD8+CD107a+ que era maior que naive, mas não era significativa em nenhuma quantidade de dose.

[00244] Especificamente, a frequência de células T CD8+CD107a+ específicas para o antígeno pGX1431 foi de 1,37% + 0,78%, 2,23% + 1,45% e 1,97% + 1,84% nos grupos de quantidades de 10 ug, 30 ug e 50 ug, respectivamente (FIG. 15A). O perfil de citocina das células T CD8+CD107a+ específicas de pGX1431 foi semelhante nos grupos de quantidade de dose e foi composto principalmente de IFNy+IL-2-TNFa- e algumas células IFNy+IL-2-TNFa+ (FIG. 15E).

[00245] A frequência das células T CD8+CD107a+ específicas para o antígeno pGX1432 foi de 0,02% + 0,02%, 0,05% + 0,04% e 0,04% + 0,03% nos grupos de quantidades de 10 ug, 30 ug e 50 ug, respecti- vamente (FIG.15B). O perfil de citocinas de células T CD8+CD107a+ específicas de pGX1432 era composto principalmente por células IFNytIL-2-TNFa- e IFNy-IL-2+TNFoa- e IFNytIL-2+TNFo- (FIG. 15E)

[00246] A frequência de células T CD8+CD107a+ específicas para o antígeno pGX1433 foi de 0,54% + 0,39%, 1,43% + 1,39% e 1,57% t+ 1,39% nos grupos de quantidade de dose 10 ug (p = 0,897), 30 ug (p = 0,089) e 50 ug (p = 0,053), respectivamente (FIG.15C). O perfil de ci- tocina das células T CD8+CD107a+ específicas de pGX1433 era com- posto principalmente por IFNytIL-2-TNFa- e algumas células IFNy+IL- 2-TNFa+ (FIG.15E).

[00247] Entende-se que a descrição detalhada anterior e os exem- plos anexos são meramente ilustrativos e não serão considerados co- mo limitações sobre o escopo da invenção, que é exclusivamente defi- nida pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

[00248] Várias mudanças e modificações nas modalidades divulga- das serão evidentes para os especialistas na técnica. Tais mudanças e modificações nas modalidades divulgadas, incluindo, sem limitação, aquelas relacionadas às estruturas químicas, substituintes, derivados, intermediários, sínteses, composições, formulações ou métodos de uso da invenção, podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo das mesmas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica resíduos de aminoácidos 19-198 de SEQ ID NO: 2; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica resíduos de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 de SEQ ID NO: 6; (d) uma sequência de ácido nucleico que codifica um frag- mento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína compreendendo resíduos de aminoácidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (e) uma sequência de ácido nucleico que codifica um frag- mento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína compreendendo resíduos de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4; (f) uma sequência de ácido nucleico que codifica um frag- mento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína compreendendo resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 de SEQ ID NO: 6; (9) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma pro- teína que é maior que 96% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (h) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma pro- teína que é maior que 96% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4; (1) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma prote- íÍna que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a

198 e 206 a 271 de SEQ ID NO: 6; (]) uma sequência de ácido nucleico que codifica um frag- mento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é maior que 95,6% idêntica aos resíduos de aminoá- cidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (k) uma sequência de ácido nucleico que codifica um frag- mento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é maior que 95,5% idêntica aos resíduos de aminoá- cidos 19 a 84 de SEQID NO: 4; e (1) uma sequência de ácido nucleico que codifica um frag- mento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos de aminoá- cidos 19 a 198 e 206 a 271 de SEQ ID NO: 6.

2. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) nucleotídeos 55 a 600 de SEQ ID NO: 1; (b) nucleotídeos 55 a 258 de SEQ ID NO: 3; (c) nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 de SEQ ID NO: 5; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreen- dendo nucleotídeos 55 a 600 de SEQ ID NO: 1; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreen- dendo nucleotídeos 55 a 258 de SEQ ID NO: 3; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreen- dendo nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 de SEQ ID NO: 5; (9) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucle- otídeos 55 a 600 de SEQ ID NO: 1;

(h) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucle- otídeos 55 a 258 de SEQ ID NO: 3; (i) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucle- otídeos 55 a 594 e 616 a 819 de SEQ ID NO: 5; (]) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo me- nos 95% idêntica aos nucleotídeos 55 a 600 de SEQ ID NO: 1; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo me- nos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 258 de SEQ ID NO: 3; e (1) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo me- nos 95% idêntica aos nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 de SEQ ID NO: 1

3. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 1,30ou5.

4, Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molé- cula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1a3.

5. Vetor, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vetor é um plasmídeo ou um vetor viral.

6. Vetor, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligada a um elemento regulatório selecionado de um promotor e um sinal de poliadenilação.

7. Vetor, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor imediato-precoce de citomegalo- vírus humano (promotor de hoMV).

8. Vetor, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (bGH poli A).

9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracte- rizada pelo fato de que compreende ainda um transportador farmaceu- ticamente aceitável.

11. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4; (c) resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 de SEQ ID NO: 6; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de resíduos de aminoácidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de resíduos de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 de SEQ ID NO: 6; (g) uma sequência de aminoácido que é maior que 96% idên- tica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (h) uma sequência de aminoácido que é maior que 96% idên- tica aos resíduos de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4; (i) uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 de SEQ ID

NO: 6; (i) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácido que é maior que 95,6% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (i) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácido que é maior que 95,5% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4;:e (]) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 e 206 e 271 de SEQ ID NO: 6;

12. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NO: 2, 4 ou 6.

13. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um antígeno, em que o antígeno compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4; (c) resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 de SEQ ID NO: 6; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de resíduos de aminoácidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de resíduos de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 de SEQ ID NO: 6; (g) uma sequência de aminoácido que é maior que 95,6% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (h) uma sequência de aminoácido que é maior que 95,5% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4; (i) uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica aos resíduos de aminoácidos 19 a 198 e 206 a 271 de SEQ ID NO: 6; (]) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácido que é maior que 95,6% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 de SEQ ID NO: 2; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácido que é maior que 95,5% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 84 de SEQ ID NO: 4:e (1) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica às sequências de aminoácidos 19 a 198 e 206 e 271 de SEQ ID NO: 6;

14. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o antígeno é codificado pela molécula de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecio- nadas do grupo que consiste em: (a) nucleotídeos 55 a 600 de SEQ ID NO: 1; (b) nucleotídeos 55 a 258 de SEQ ID NO: 3; (c) nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 de SEQ ID NO: 5; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreen- dendo nucleotídeos 55 a 600 de SEQ ID NO: 1;

(e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreen- dendo nucleotídeos 55 a 258 de SEQ ID NO: 3; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma molécula de ácido nucleico compreen- dendo nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 de SEQ ID NO: 5; (g) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucle- otídeos 55 a 600 de SEQ ID NO: 1; (h) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucle- otídeos 55 a 258 de SEQ ID NO: 3; (1) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucle- otídeos 55 a 594 e 616 a 819 de SEQ ID NO: 5; (]) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo me- nos 95% idêntica aos nucleotídeos 55 a 600 de SEQ ID NO: 1; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo me- nos 95% idêntico aos nucleotídeos 55 a 258 de SEQ ID NO: 3; e (1) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo me- nos 95% idêntica aos nucleotídeos 55 a 594 e 616 a 819 de SEQID NO:

1.

15. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico em que a molécula de ácido nucleico com- preende uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 95% de identidade através de um comprimento inteiro da sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO: 1,3 ou 5.

16. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico em que a molécula de ácido nucleico codi- fica um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 95,6%, 95,5% ou 95% de identidade através de um comprimento inteiro da sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 2, 4 ou 6, respectivamente.

17. Vacina, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, carac- terizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende um vetor de expressão.

18. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

19. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adju- vante.

20. Vacina, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é IL-12, I1L-15, 11-28 ou RANTES.

21. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende uma sequência de aminoá- cido tendo pelo menos cerca de 95,6%, 95,5% ou 95% de identidade através de um comprimento inteiro da sequência de aminoácido esta- belecida em SEQ ID NO: 2, 4 ou 6, respectivamente.

22. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo, em que o peptídeo compreende a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 2, 4 ou 6.

23. Uso de molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar um indivíduo com uma célula cancerosa que expressa LEMD1.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado para a administração por eletroporação.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracteri- zado pelo fato de que o medicamento é preparado para administração em um ou mais locais no indivíduo.

26. Uso de molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina contra uma célula cancerígena que expressa LEMD1, em que a vacina deve ser administrada a um indiví- duo em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune humo- ral.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado para administração por eletroporação.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracteri- zado pelo fato de que o medicamento é preparado para administração em um ou mais locais no sujeito.

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