CN100478689C - 多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种多肽及其在检测和诊断结肠直肠癌的客观方法中的用途。本发明还提供了筛选用于治疗结肠癌的治疗剂的方法以及对个体进行疫苗接种以防止结肠癌的方法。

Description

多肽及其用途
本申请涉及提交于2002年8月30日提交的USSN 60/407.338，此处将其引入作为参考。
发明领域
本发明涉及结肠癌或胃癌的诊断方法。
发明背景
在世界范围内，结肠直肠癌和胃癌是癌症造成的死亡的主要原因。尽管近来在诊断和治疗策略上取得进展，但晚期癌患者的预后仍非常差。虽然分子研究已揭示出肿瘤抑制基因和/或癌基因的改变与其致癌作用有关，但精确机制仍需要详细阐明。
cDNA微阵列技术已使得可获得正常和恶性细胞中基因表达的广泛表达分布图，以及恶性和相应正常细胞中基因表达的比较(Okabe等，CancerRes 61：2129-37(2001)；Kitahara等，Cancer Res 61：3544-9(2001)；Lin等，Oncogene 21：4120-8(2002)；Hasegawa等，Cancer Res 62：7012-7(2002))。该方法能够揭示癌细胞的复杂性质，并能帮助理解致癌机理。鉴定在肿瘤中去调节(deregulate)的基因能导致对个体癌症更为精准的诊断，并能发展新的治疗靶(Bienz和Clevers，Cell 103：311-20(2000))。为了从基因组的角度揭示肿瘤的潜在机制，并发现用于诊断和发展新的治疗药的靶分子，本发明人采用23040个基因的cDNA微阵列分析了肿瘤细胞的表达分布图(Okabe等，Cancer Res 61：2129-37(2001)；Kitahara等，Cancer Res 61：3544-9(2001)；Lin等，Oncogene 21：4120-8(2002)；Hasegawa等，Cancer Res62：7012-7(2002))。
意在揭示致癌机理的研究已促进了对抗肿瘤剂分子靶的鉴定。例如，法尼酰转移酶(farnexyltransferase)(FTI)的抑制剂已被有效用于在动物模型中治疗Ras依赖性肿瘤，所述抑制剂最初被发展用于抑制与Ras相关的生长信号通路，Ras的激活依赖翻译后法尼基化(posttranslational farnesylation)(He等，Cell 99：335-45(1999))。已联合利用抗癌药及抗HER2单克隆抗体trastuzumab对人类进行了临床试验，用以拮抗原癌基因受体HER2/neu；并已获得乳癌患者的临床反应和总生存率的改善(Lin等，Cancer Res61：6345-9(2001))。选择性灭活bcr-abl融合蛋白质的酪氨酸激酶抑制剂(STI-571)已被发展用于治疗慢性髓细胞性白血病，在该疾病中，bcr-abl酪氨酸激酶的组成性激活(constitutive activation)在白细胞转化中发挥决定性作用。这类药剂意在抑制特定基因产物的致癌活性(Fujita等，Cancer Res61：7722-6(2001))。因此，在癌性细胞中通常被上调的基因产物可作为发展新抗癌剂的潜在靶点。
已经证实，CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)能识别在MHC I类分子上呈递的来源于肿瘤相关抗原(TAAs)的表位肽，并溶解肿瘤细胞。自从MAGE家族作为第一例TAA被发现以来，已经采用免疫学方法发现了许多其它TAA(Boon，Int J Cancer 54：177-80(1993)；Boon和van der Bruggen，J Exp Med183：725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 254：1643-7(1991)；Brichard等，J Exp Med 178：489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180：347-52(1994))。所发现的某些TAA现已作为免疫治疗靶点而处于临床开发阶段。到目前为止发现的TAA包括MAGE(van der Bruggen等，Science 254：1643-7(1991))，gp100(Kawakami等，J Exp Med 180：347-52(1994))，SART(Shichijo等，J Exp Med 187：277-88(1998))，和NY-ESO-1(Chen等，Proc Natl Acad Sci USA 94：1914-8(1997))。另一方面，已被证实在肿瘤细胞中特异性过表达的基因产物已显示出可被识别为诱导细胞免疫反应的靶点。所述基因产物包括p53(Umano等，Brit J Cancer 84：1052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka等，Brit J Cancer 84：94-9(2001))，CEA(Nukaya等，Int JCancer 80：92-7(1999))，等。
尽管关于TAA的基础和临床研究已取得显著进展(Rosenbeg等，NatureMed 4：321-7(1998)；Mukherji等，Proc Natl Acad Sci USA 92：8078-82(1995)；Hu等，Cancer Res 56：2479-83(1996))，但用于治疗腺癌(包括结肠直肠癌)的可用候补(candidate)TAA的数量是有限的。在癌细胞中大量表达，同时其表达限于癌细胞的TAA应该是免疫治疗靶的有希望的候补物(candidate)。此外，对诱导有效且特异性抗肿瘤免疫反应的新型TAA的鉴定被预期能够促进肽接种策略在多种类型癌中的临床使用(Boon和can der Bruggen，J ExpMed 183：725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 254：1643-7(1991)；Brichard等，J Exp Med 178：489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180：347-52(1994)；Shichijo等，J Exp Med 187：277-88(1998)；Chen等，Proc NatlAcad Sci USA 94：1914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 88：1442-5(1996)；Butterfield等，Cancer Res 59：3134-42(1999)；Vissers等，Cancer Res 59：5554-9(1999)；van der Burg等，J Immunol 156：3308-14(1996)；Tanaka等，Cancer Res 57：4465-8(1997)；Fujie等，Int J Cancer 80：169-72(1999)；Kikuchi等，Int J Cancer 81：459-66(1999)；Oiso等，Int J Cancer 81：387-94(1999))。
已有报道重复指出，来自具体健康供体的肽刺激的外周血单核细胞(PBMC)对该肽产生响应而产生显著水平的IFN-γ，但在铬-51释放试验中几乎不以HLA-A24或-A0201限制性图谱发挥针对肿瘤细胞的细胞毒性作用(Kawano等，Cance Res 60：3550-8(2000)；Nishizaka等，Cancer Res 60：4830-7(2000)；Tamura等，Jpn J Cancer Res 92：762-7(2001))。但是，HLA-A24和HLA-A0201均为一种在日本人以及高加索人中常见的HLA等位基因(Date等，Tissue Antigens 47：93-101(1996)；Kondo等，J Immunol 155：4307-12(1995)；Kubo等，J Immunol 152：3913-24(1994)；Imanishi等，Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop andConference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams等，TissueAntigen 49：129(1997))。因此，由这些HLA所呈递的癌抗原肽特别适用于治疗日本人和高加索人中的癌症。此外，已知在体外诱导低亲和力CTL通常是使用高浓度肽的结果，所述高浓度肽的使用在抗原呈递细胞(APC)上生成高水平特异性肽/MHC复合物，所述复合物将有效激活这些CTL(Alexander-Miller等，Proc Natl Acad Sci USA 93：4102-7(1996))。
发明概述
本发明基于如下发现，即基因的表达图谱与癌性状态，例如，结肠癌或胃癌相关。在结肠癌或胃癌中差异性表达的基因在本文中被统称为“CGX核酸”或“CGX多核苷酸”，而编码的相应多肽被称为“CGX多肽”或“CGX蛋白质”。
由此，本发明描述了诊断或测定个体中患结肠癌或胃癌倾向性的方法的特征，所述方法通过测定来源于患者的生物样品诸如组织样品中的结肠癌或胃癌关联基因(colon and gastric cancer associated gene)的表达水平而进行。结肠癌或胃癌关联基因是指特征在于在结肠癌或胃癌细胞中的表达水平与正常(或非结肠癌或胃癌)细胞不同的基因。例如，结肠癌或胃癌关联基因包括例如CGX 1-8。基因表达水平相对于基因正常对照水平的改变(例如增加或降低)提示该个体患有或易患结肠癌或胃癌。
正常对照水平是指在正常、健康个体或已知未患结肠癌或胃癌的个体的群体中检测到的基因表达水平。对照水平是从单一对照群或多个表达图谱中得到的单一表达图谱。例如，对照水平可以是来自以前检测的细胞的表达图谱数据库。
被验样品中所检测的CGX1-8水平相对于正常对照水平的增加表明所述个体(从该个体中获得样品)患有或易患结肠癌或胃癌。
或者，将样品中各种结肠癌或胃癌关联基因的表达与相同基因种类的结肠癌或胃癌对照水平进行比较。结肠癌或胃癌对照水平是指在患有结肠癌或胃癌的群体中发现的结肠癌或胃癌关联基因的表达分布图。
基因表达比对照水平增加了10％、25％、50％。或者，基因表达比对照水平增加了1、2、5或更多倍。表达可通过在例如阵列上检测结肠癌或胃癌关联基因探针与来源于患者的组织样品的基因转录物的杂交进行测定。
来源于患者的组织样品是来自试验个体，例如，已知患有或疑似患有结肠癌或胃癌的患者的任何组织。例如，该组织包含肿瘤细胞。例如，该组织是来自结肠或胃的肿瘤细胞。
本发明还提供了两种或多种CGX 1-8的基因表达水平的结肠癌或胃癌对照表达分布图。或者，本发明提供了两种或多种CGX 1-8表达水平的结肠癌或胃癌对照表达分布图。
本发明进一步提供了鉴定抑制结肠癌或胃癌关联基因的表达或活性的药剂的方法，其通过将表达结肠癌或胃癌关联基因的被验细胞与被验药剂接触以及测定结肠癌或胃癌关联基因的表达水平而实施。所述被验细胞是上皮细胞诸如来自结肠或胃的上皮细胞。所述水平相对于基因正常对照水平的降低表明该被验药剂是结肠癌或胃癌关联基因的抑制剂。此外，酵母双杂交筛选实验(yeast two hybrid screening assay)揭示出分别与Zyxin、MGC10334或CENPC1、BRD8和nCLU相关的ARHCL1、NFXL1、C20orf20，和CCPUCC1蛋白质。结肠癌可经由对蛋白质相关性的抑制可被治疗。由此，本发明提供了筛选用于治疗结肠癌的化合物的方法，其中该方法包括在存在被验化合物的情况下与所述蛋白质接触，并选择抑制所述蛋白质结合的被验化合物。
本发明还提供了含有检测试剂的试剂盒，该检测试剂与两种或多种CGX核酸序列结合或与该核酸序列编码的基因产物结合。还提供了与两种或多种CGX核酸结合的核酸的阵列。
治疗方法包括通过对个体施用反义组合物而治疗或预防个体中结肠癌或胃癌的方法。该反义组合物降低特异性靶基因的表达，例如，该反义组合物包含核苷酸，所述核酸与选自CGX 1-8的序列互补。其它方法包括对个体施用短干扰RNA(siRNA)组合物的步骤。siRNA组合物降低选自CGX1-8的核酸的表达。而在另一方法中，治疗或预防个体中结肠癌或胃癌通过对个体施用核酶组合物来实施。核酸特异性核酶组合物降低选自CGX1-8的核酸的表达。
本发明还包括疫苗和疫苗接种方法。例如，治疗或预防个体中结肠癌或胃癌的方法通过对个体施用疫苗来实施，所述疫苗包含由选自CGX 1-8的核酸编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段。免疫活性片段是长度短于全长天然存在的蛋白质并能诱导免疫反应的多肽。例如，免疫活性片段的长度至少为8个残基，且能刺激免疫细胞诸如T细胞或B细胞。通过检测细胞增殖、细胞因子(例如，IL-2)的加工(elaboration)，或抗体的生成可检测免疫细胞的刺激。
此外，本发明提供了分离的新基因，ARHCL1，NFXL1，C20orf20，LEMD1，和CCPUCC1，其是用于结肠直肠癌诊断标记的候补物和发展诊断新策略和有效抗癌剂的有希望的潜在靶点。此外，本发明提供了这些基因所编码的多肽，及其制备和用途。更具体地，本发明提供了以下内容：
本申请提供了新型人类多肽，ARHCL1，NFXL1，C20orf20，LEMD1，和CCPUCC1，或其功能等价物，所述多肽或其功能等价物能促进细胞增殖，且在结肠直肠癌中被上调。
在优选的实施方案中，ARHCL1多肽包括推定的514个氨基酸的蛋白质，其与人类假定蛋白质DKFZp434P1514.1具有约68.7％的同一性，与小鼠RIKEN cDNA 2310008J22具有61.45％的同一性。采用Simple ModularArchitecture Research Tool(SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)对蛋白质基序的研究揭示出该预测的蛋白质包含丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(2C家族)催化区(密码子68-506)(图3b)。ARHCL1多肽优选包括SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列。本申请还提供了分离的蛋白质，其由至少部分ARHCL1多核苷酸序列，或由与SEQ ID NO：1所示序列至少70％，和更优选至少80％互补的多核苷酸序列所编码。ARHCL1与Zyxin相结合。Zyxin是包含N末端富脯氨酸区(proline-rich region)和C末端区中的三个LIM区域的磷蛋白(Macalma，T.等J.Biol.Chem.271：31470-31478，1996)。通过Northern印迹分析发现Zyxin是遍在表达的，且该蛋白质在具有肌动蛋白丝束的局部粘着斑(focal adhesion plaque)浓聚，Zyxin在有丝分裂细胞中有丝分裂细胞器集中的细胞质中广泛地分布，(Hirota，T.等J.Cell Biol.149：1073-1086，2000)。Zyxin被CDC2激酶磷酸化，并与LATS1肿瘤抑制物相互作用。因此，Zyxin可通过与LATS1的相互作用而调节肌动蛋白丝和靶有丝分裂细胞器的组装。
在优选的实施方案中，C20orf20多肽包括推定的204个氨基酸的蛋白质，其与小鼠RIKEN cDNA 1600027N09(XM_110403)具有约96.6％的同一性。采用Simple Modular Architecture Research Tool对蛋白质基序的研究未预测出任何已知的保守结构域(图16b)。C20orf20多肽优选包括SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列。本申请还提供了分离的蛋白质，其由至少部分C20orf20多核苷酸序列编码，或由与SEQ ID NO：3所示序列至少97％，和更优选至少99％互补的多核苷酸序列所编码。C20orf20与BRD8相结合。BRD8蛋白质包含位于其C末端的溴结构域(bromodomain)，许多酸性残基，和一些富脯氨酸区段(Nielsen，M.S.等Biochim.Biophys.Acta 1306：14-16，1996)。BRD8是细胞核受体激动剂，其与甲状腺激素受体和雄激素受体相互作用并激活其转录活性(Monden，T.等J.Biol.Chem.272：29834-29841，1997)。
在优选的实施方案中，CCPUCC1多肽包括推定的413个氨基酸的蛋白质，其具有与小鼠RIKEN cDNA 2610111M03(AK011846)约89％的同一性。由于采用Simple Modular Architecture Research Tool对蛋白质基序的研究揭示了该预测的蛋白质包含卷曲螺旋区(coiled-coil region)(密码子195-267)，我们将其基因命名为CCPUCC1(在结肠癌中被上调的卷曲螺旋蛋白质)。CCPUCC1多肽优选包括SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列。本申请还提供了分离的蛋白质，其由至少部分CCPUCC1多核苷酸序列编码，或由与SEQID NO：5中所示序列至少90％，和更优选至少95％互补的多核苷酸序列所编码。CCPUCC1与nCLU相结合。核丛生蛋白(nCLU)是CLU基因的选择性剪接转录物的产物。外显子I和III通过外显子II遗漏(skipping)(其产生外显子III中AUG的第一个可得的翻译起始位点)而被剪接在一起。该较短mRNA产生49-kDa前体nCLU蛋白质(Leskov K.S.等J.Biol.Chem.278：11590-11600，2003)。核丛生蛋白(nCLU)是与Ku70结合的蛋白质。电离辐射(IR)诱导nCLU，其过表达在MCF-7细胞中触发凋亡。
在优选的实施方案中，LEMD1多肽包括推定的29个氨基酸的蛋白质(LEMD1S)。采用Simple Modular Architecture Research Tool对蛋白质基序的研究揭示了该预测的蛋白质包含LEM基序(密码子1-27)，我们将其基因命名为LEMD1(包含1的LEM域)(图38a)。LEMD1多肽优选包括SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列。此外，在优选的实施方案中，LEMD1多肽包括其选择性剪接形式。因此，LEMD1多肽包括推定的67个氨基酸的蛋白质(LEMD1L)。LEMD1多肽优选包括SEQ ID NO：10中所列氨基酸序列。预测的LEMD1蛋白质的氨基酸序列显示出与人类假定蛋白质的62％的同一性，所述人类假定蛋白质与GenBank登录号XM_050184的胸腺生成素(thymopoietin)相似。
本申请还提供了分离的蛋白质，其由至少部分LEMD1多核苷酸序列编码，或由与SEQ ID NO：7或9所示序列至少70％，和更优选至少80％互补的多核苷酸序列所编码。
在优选的实施方案中，NFXL1多肽包括推定的911个氨基酸的蛋白质，其具有与人类NFX1(核转录因子，X-盒结合1)的约36.5％的同一性。采用简单模块结构研究工具(Simple Modular Architecture Research Tool)对蛋白质基序的研究揭示了该预测的蛋白质包含环指结构域(密码子160-219)，12NFX型Zn指域(密码子265-794)，卷曲螺旋区(密码子822-873)，和跨膜区(密码子889-906)(图9b)。NFXL1多肽优选包括SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列。本申请还提供了分离的蛋白质，其由至少部分NFXL1多核苷酸序列或与SEQ ID NO：11所示序列至少40％，和更优选至少50％互补的多核苷酸序列所编码。NFXL1与MGC10334或CENPC1相结合。免疫电子显微术将CENPC1定位于内动粒板(inner kinetochore plate)(Saitoh，H.等Cell 70：115-125，1992)。
除非另有所述，本文所使用的所有技术术语和科技术语的含义与本发明所属技术领域技术人员所公知的相同。虽然与本文所述相似或相等的方法和材料均可用于本发明的实施或试验中，但下面描述了适宜的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利，和其它参考文件均为全文引入作为参考。假使冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法，和实施例仅为说明性的，而并非意在进行限制。
从以下详述的说明中，以及从权利要求中可显而易见地得出本发明的其它特征和优势。
附图简述
图1(a-g)是柱形图，显示在cDNA微阵列上，结肠癌组织中B6647，D7610，C4821，A8108，B9223，C3703，和D9092的相对表达率(癌/非癌)，其中的Cy3或Cy5信号强度高于各选择基准强度(cut-off intensity)。图1(a)：B6647；图1(b)：D7610；图1(c)：C4821；图1(d)：A8108；图1(e)：B9223；图1(f)：C3703；图1(g)：D9092。
图2(a-g)是凝胶，显示采用另外的结肠癌病例，通过半定量RT-PCR对(a)B6647，(b)D7610，(c)C4821，(d)A8108(e)B9223，(f)Ly6E，和(g)Nkd1的表达进行分析。T，肿瘤组织；N，正常组织。将GAPDH的表达作为内部对照。
图3(a-b)显示了ARHCL1的结构。图3(a)显示了ARHCL1的多组织Northern印迹分析；图3(b)是ARHCL1的基因组结构和预测的ARHCL1蛋白质结构的示意图。在上部图形中，用具有ARHCL1 cDNA序列的核苷酸序号的空心方框来表示外显子。
图4(a-b)描述了标记的ARHCL1蛋白质的亚细胞定位。图4(a)显示了cMyc标记的或Flag标记的ARHCL1蛋白质；图4(b)描述了HCT15细胞中标记的蛋白质的免疫组织化学染色，通过FITC使之显示，核用DAPI复染。
图5(a-b)描述了ARHCL1(AS1)的反义S-寡核苷酸在SNU-C4或LoVo细胞中的生长抑制作用。图5(a)显示了通过半定量RT-PCR进行检测，与对照ARHCL1-R1(R1)相比，ARHCL1-AS1(AS1)降低ARHCL1表达的凝胶图；图5(b)是ARHCL1-AS1(AS1)或ARHCL1-R1(R1)转染的存活SNU-C4和LoVo细胞的图，用姬姆萨氏溶液进行染色。
图6显示了在大肠杆菌细胞中制备与GST融合的ARHCL1蛋白质。图6(A)显示了ARHCL1的结构，以及表达与GST融合的N末端(ARHCL1-N)或C末端ARHCL1(ARHCL1-C)蛋白质的质粒的构建。图6(B)显示了与GST融合的ARHCL1-N或ARHCL1-C蛋白质的表达。上部图形：CBB染色。下部图形：采用抗GST抗体的免疫印迹分析。
图7描述了通过酵母双杂交系统鉴定与ARHCL1相互作用的蛋白质。图7(A)和(B)显示了在酵母细胞中ARHCL1蛋白质的N末端区和C末端区的相互作用以及鉴定的克隆。
图8描述了体内ARHCL1和Zyxin间的相互作用。图8(A)显示了Flag标记的ARHCL1与HA标记的Zyxin的免疫共沉淀结果。将从用pFlag或pFLAG-ARHCL1与pCMV-HA或pCMV-HA-Zyxin一起转染的细胞中提取的蛋白质用抗Flag M2抗体进行免疫沉淀。随后，采用抗HA抗体进行免疫印迹。图8(B)显示了ARHCL1和Zyxin在细胞中的亚细胞定位。细胞核用DAPI染色。
图9(a-b)描述了NFXL1的结构。图9(a)显示了NFXL1的多组织Northern印迹；图9(b)描述了NFXL1基因组结构和预测的NFXL1蛋白质结构的示意图。在上部图形中用空心方框表示外显子。
图10显示了用NFXL1-AS(AS)或NFXL1-R(R)转染的存活SW480和SNU-C4细胞，采用姬姆萨氏溶液染色。
图11(A)描述了NFXL1-siRNA对NFXL1在SNU-C4细胞中表达的影响。(B)上部图形：经对照-siRNA或NFXL1-siRNA处理的存活HCT116、SW480，或SNU-C4细胞的姬姆萨染色。下部图形：通过一式三份的MMT试验检测对EGFP-siRNA或NFXL1-siRNAs有响应的存活细胞。
图12描述了HA标记的NFXL1蛋白质在HCT116、SW480和COS7细胞中的亚细胞定位。
图13描述了在大肠杆菌细胞中制备His标记的NFXL1蛋白质。图13(A)描述了NFXL1的结构，构建表达His标记的N末端(NFXL1-N)或C末端(NFXL1-C2)NFXL1的质粒。图13(B)和(C)描述了His标记的NFXL1-N或NFXL1-C2蛋白质的表达。左侧图形：CBB染色。右侧图形：用抗His-tag抗体免疫印迹。
图14显示了通过酵母双杂交系统鉴定与NFXL1相互作用的蛋白质。14(A)和(B)显示，在酵母细胞中通过共转化而证实NFXL1的N末端区或C末端区与所鉴定的克隆的相互作用。
图15显示了Flag标记的NFXL1与HA标记的MGC10334或CENPC1在体内的免疫共沉淀结果。将从用pFlag或pFLAG-NFXL1与pCMV-HA-FLJ25348、pCMV-HA-MGC10334、pCMV-HA-CENPC1、pCMV-HA-SOX30或pCMV-HA-DKFZp564J047一起转染的细胞中提取的蛋白质用抗Flag M2抗体进行免疫沉淀。随后，采用抗HA抗体进行免疫印迹(1：pCMV-HA-FLJ25348，2：pCMV-HA-MGC10334，3：pCMV-HA-CENPC1，4：pCMV-HA-SOX30和5：pCMV-HA-DKFZp564J047)。
图16(a-b)描述了C20orf20的结构。图16(a)多种人类组织中C20orf20多组织Northern印迹；图16(b)是描述C20orf20基因组结构和预测的C20orf20蛋白质结构的示意图。在上部图形中用空心方框表示外显子。
图17(a-b)描述了标记的C20orf20蛋白质的亚细胞定位。图17(a)显示了cMyc-或Flag标记的C20orf20蛋白质的免疫印迹；图17(b)描述了COS7细胞中标记的蛋白质的免疫组织化学染色，通过FITC使之显示，细胞核用DAPI复染。
图18是用C20orf20-AS1(AS1)、C20orf20-AS2(AS2)、C20orf20-R1(R1)，或C20orf20-R1(R2)转染的存活SNU-C4细胞用姬姆萨氏溶液染色的图像。
图19(A)显示了C20orf20-siRNA对C20orf20的表达的影响结果。图19(B)显示了C20orf20-siRNA对HCT116和SW480细胞的存活力的影响结果。
图20描述了在酵母双杂交系统中C20orf20和BRD8间的相互作用。图20(A)显示了保守溴结构域(Bromo domain)和BRD8的相互作用区。用条带(bar)显示负责相互作用的区域。图20(B)显示了在酵母细胞中C20orf20与BRD8的相互作用。图20(C)显示了C20orf20和BRD8在体内的相互作用。来自用单独的Flag-C20orf20或与Flag-C20orf20以及pCMV-HA-BRD8一起转染的细胞的提取物用抗FLAG M2抗体进行免疫沉淀。用抗HA抗体进行Western印迹分析。
图21(a-b)描述了CCPUCC1的亚细胞定位。图21(a)显示了cMyc-或Flag标记的CCPUCC1蛋白质的免疫印迹；图21(b)描述了COS7细胞中标记的蛋白质的免疫组织化学染色，通过FITC使之显示，细胞核用DAPI复染。
图22(a-c)显示了CCPUCC1的反义S-寡核苷酸(CCPUCC1-AS3)在LoVo细胞中的生长抑制作用。图22(a)是凝胶，显示通过半定量RT-PCR检测，CCPUCC1-AS3(AS3)与对照CCPUCC1-S3(S3)相比降低CCPUCC1的表达；图22(b)是用CCPUCC1-AS3(AS3)或-S3(S3)转染的存活LoVo细胞和未经处理的细胞(模拟)，用姬姆萨氏溶液染色的图像；图22(c)是柱形图，显示通过MTT测定法检测，用CCPUCC1-AS3(AS3)或CCPUCC1-S3(S3)转染的LoVo细胞的存活力。
图23(A)CCPUCC1-siRNA对CCPUCC1在SNU-C4细胞中表达的影响。(B)CCPUCC1-siRNA对SNU-C4细胞存活力的影响。
图24(A)CCPUCC1-siRNA对CCPUCC1在HCT116细胞中表达的影响。(B)CCPUCC1-siRNA对HCT116细胞存活力的影响。
图25显示了结肠癌细胞中CCPUCC1的western印迹分析。
图26显示了HCT116细胞中CCPUCC1蛋白质的亚细胞定位。
图27(A)显示了结肠癌组织中CCPUCC1的免疫组织化学染色图。图27(B)显示了结肠腺瘤中CCPUCC1的免疫组织化学染色图。
图28显示了通过酵母双杂交系统将核丛生蛋白(nuclearclusterin)(nCLU)鉴定为与CCPUCC1相互作用的蛋白质的结果。图28(A)显示了在酵母细胞中CCPUCC1与核丛生蛋白的相互作用。图28(B)显示了CCPUCC1和nCLU之间在体内的相互作用。用CCPUCC1-myc和/或pFlag-丛生蛋白转染COS7细胞。采用抗FLAG M2抗体或抗myc小鼠抗体进行免疫沉淀。采用抗myc(上部图形)或抗FLAG(下部图形)抗体进行Western印迹分析。CCPUCC1和C端CLU的条带仅在经共转染细胞的裂解物的泳道内发现，这提示CCPUCC1(上部图形)与nCLU(下部图形)蛋白质在体内发生相互作用。
图29显示了CCPUCC1和nCLU蛋白质的亚细胞定位。图29(A)是用pcDNA-myc-CCPUCC1和pFlag-丛生蛋白转染并用小鼠抗myc抗体染色的COS7细胞的图像。用FITC标记的抗小鼠IgG抗体使转染细胞显像。图29(B)显示了用兔抗FLAG抗体染色并用与罗丹明偶联的抗兔抗体IgG使之显像的细胞的图像。图29(C)显示了A，B和D的合并图像。图29(D)显示了用DAPI复染细胞核的图。
图30(a-b)描述了Ly6E的亚细胞定位。图30(a)是cMyc标记的Ly6E蛋白质的免疫印迹；图30(b)描述了SW480细胞中标记的Ly6E蛋白质的免疫组织化学染色，通过FITC是指显像。细胞核用DAPI复染。
图31(a-c)显示了Ly6E的反义S-寡核苷酸(Ly6E-AS1，或-AS5)在LoVo细胞中的生长抑制作用。图31(a)是凝胶，显示通过半定量RT-PCR检测，Ly6E-AS1(AS1)或-AS5(AS5)与对照Ly6E-S1(S1)或S5(S5)相比降低Ly6E的表达；图31(b)是用Ly6E-AS1(AS1)，-S1(S1)，-AS5(AS5)或-S5(S5)转染的存活结肠癌细胞和未转染的细胞(模拟)用姬姆萨氏溶液染色的图像；图31(c)是柱形图，其显示通过MTT测定法检测的，用Ly6E-AS1(AS1)，-S1(S1)，-AS5(AS5)或-S5(S5)转染的结肠癌细胞的存活力。
图32显示了Nkd1的多组织Northern印迹。
图33(a-c)显示了Nkd1的反义S-寡核苷酸(Nkd1-AS4，或-AS5)在LoVo和Sw480细胞中的生长抑制作用。图33(a)是凝胶，其显示通过半定量RT-PCR检测，Nkd1-AS4(AS4)或-AS5(AS5)与对照Nkd1-S4(S4)或-S5(S5)相比降低Nkd1的表达；图33(b)是用Nkd1-AS4(AS4)，-S4(S4)，-AS5(AS5)或-S5(S5)转染的存活结肠癌细胞以及未转染的细胞(模拟)用姬姆萨氏溶液染色的图像；图33(c)是柱形图，显示通过MTT检测，用Nkd1-AS4(AS4)，-S4(S4)，-AS5(AS5)或-S5(S5)转染的结肠癌细胞的存活力。
图34(a-b)显示了B0338在胃癌中的表达。图34(a)是柱形图，显示在16例胃癌组织中B0338在cDNA微阵列上的相对表达率(癌/非癌)，其中Cy3或Cy5信号强度大于选择基准值；图34(b)是凝胶，显示通过半定量RT-PCR分析的LAPTM4β的表达：T，肿瘤组织；N，正常组织。将GAPDH的表达作为内部对照。
图35(a-b)显示了LAPTM4β的结构。图35(a)显示了LAPTM4β的多组织Northern印迹；图35(b)是四个LAPTM4β蛋白质跨膜区的示意图。
图36显示了NIH3T3细胞中cMyc-或Flag标记的LAPTM4β蛋白质的免疫组织化学染色，通过FITC使之显像。细胞核用DAPI复染。
图37(a-c)显示了LAPTM4β的反义S-寡核苷酸(LAPTM4β-AS)在MKN1和MKN7胃癌细胞中的生长抑制作用。图37(a)是凝胶，显示了通过半定量RT-PCR检测，LAPTM4β-AS(AS)与对照LAPTM4β-S(S)、-SCR(SCR)或-REV(REV)相比降低LAPTM4β表达的；图37(b)用LAPTM4β-反义(AS)、-REV(REV)，-SCR(SCR)或-S(S)转染的存活胃癌细胞以及未转染的细胞(模拟)用姬姆萨氏溶液染色的图像；图37(c)是柱形图，显示了通过MTT测定法检测，用LAPTM4β-AS(AS)或对照(S、SCR或REV)S-寡核苷酸转染的胃癌细胞的存活力。显示了相对未转化的细胞的值。
图38(a-b)描述了LEMD1的结构。图38(a)是LEMD1的基因组结构的示意图；在上部图形中用空心方框表示外显子。图38(b)显示了多种成年人类组织中LEMD1的多组织Northern印迹。
图39是LEMD1-AS1(AS1)、LEMD1-AS2(AS2)、LEMD1-AS3(AS3)、LEMD1-AS4(AS4)、LEMD1-AS5(AS5)、LEMD1-REV1(REV1)、LEMD1-REV2(REV2)、LEMD1-REV3(REV3)、LEMD1-REV4(REV4)或LEMD1-REV5(REV5)转染的存活HCT116细胞用姬姆萨氏溶液染色的图。
发明详述
本发明部分基于如下发现，在来自结肠癌或胃癌患者的结肠和胃的细胞中存在多个核酸序列表达的图谱改变。采用综合(comprehensive)cDNA微阵列系统可以鉴定基因表达的差异。
表达水平在结肠癌或胃癌患者中被调节(即，增高)的基因在本文中被统称为“CGX核酸”或“CGX多核苷酸”，而相应编码的多肽被称为“CGX多肽”或“CGX蛋白质”。除非另有说明，“CGX”意指本文所述的任何序列(例如，CGX 1-8)。
表达水平在结肠直肠癌中增高的7种基因已被鉴定。这7种基因在本文中被称为结肠癌关联基因。其中5种是新的，而2种是先前已知的、但其与结肠癌的相关性未知的基因。所述5种新型基因包括ARHCL1(“CGX1”)，NFXL1(“CGX2”)，C20orf20(“CGX3”)，LEMD1(“CGX4”)，和CCPUCC1(“CGX5”)。下述表1中总结了该新的结肠癌关联基因，而序列表中给出了其核酸和多肽序列。所述已知基因包括Ly6E(“CGX6”)和Nkd1(“CGX7”)。已鉴定在胃癌中表达水平增加的一种已知基因LAPTM4β(“CGX8”)。该基因在本文中被称为胃癌相关基因。
通过检测细胞样品中多种基因的表达，可在细胞或细胞群中确定结肠癌或胃癌。相似地，通过检测这些基因在对多种药剂响应下的表达，可以鉴定出治疗结肠癌或胃癌的药剂。
表1
  基因名称  GenBank登录号   核苷酸长度(SEQ ID NO：)   ORF   氨基酸长度(SEQ ID NO：)
  ARHCL1  AB084258   6462bp(1)   415-1956   514aa(2)
  C20orf20  AB085682   1634bp(3)   72-683   204aa(4)
  CCPUCC1  AB089691   1681bp(5)   106-1347   413aa(6)
  LEMD1S  AB084765   733bp(7)   103-192   29aa(8)
  LEMD1L  AB084764   656bp(9)   103-306   67aa(10)
  NFXL1  AB085695   3707bp(11)   54-2786   911aa(12)
本发明涉及测定(例如，测量)至少一种，以及直至全部CGX序列的表达。采用GeneBank数据库条目所提供的已知序列的序列信息，利用本领域技术人员众所周知的的技术来检测和测定结肠癌或胃癌关联基因。例如，与CGX序列相应的序列数据库条目中的序列可被用于构建在例如，Northern印迹杂交分析中检测CGX RNA序列的探针。作为另一实例，该序列可用于构建引物，所述引物特异性地用于在例如基于扩增的检测方法(诸如基于反转录的多聚酶链式反应等)中扩增CGX序列。
然后将被验细胞群(例如，来源于患者的组织样品)中的一种或多种CGX序列的表达水平与参照群中一些序列的表达水平进行比较。对照细胞群包括其对照参数已知的一种或多种细胞，即，该细胞是癌性或非癌性的。
被验细胞群中基因表达水平与参照细胞群相比较是否能够揭示出被检测参数的存在有赖于参照细胞群的组成。例如，如果参照细胞群由非癌性细胞组成，被验细胞群和参照细胞群中相似的基因表达水平表明该被验细胞群是非癌性的。相反地，如果参照细胞群由癌性细胞组成，被验细胞群和参照细胞群间相似的基因表达分布图表明该被验细胞群包括癌性细胞。
如果被验细胞群中CGX序列的表达水平相对于参照细胞群的改变是该参照细胞群中相应CGX序列的表达水平的1.0、1.5、2.0、5.0、10.0倍或以上或者更多倍，则可认为被验细胞群中CGX序列的表达水平上改变。
如有需要，可利用对照核酸来比较被验细胞群和参照细胞群的差异性表达序列，所述对照核酸的表达不依赖于检测的参数或疾病。例如，对照核酸是已知不依赖于细胞的癌性或非癌性状态而改变的核酸。对照核酸在被验核酸以及参照核酸中的表达水平可用于对所比较的群体中的信号水平进行标准化。对照基因可以是，例如，β-肌动蛋白，甘油醛3-磷酸脱氢酶或核糖体蛋白P1。
将被验细胞群与多个参照细胞群进行比较。多个参照群中的每个群在已知参数上可存在差异。因此，可将被验细胞群与已知包含例如结肠癌或胃癌细胞的第二参照细胞群以及已知包含例如非结肠癌或胃癌细胞的第二对照群进行比较。被验细胞包含在来自已知包含，或疑似包含结肠癌或胃癌细胞的个体的组织类型或细胞样品中。
被验细胞获自身体组织或体液(诸如尿液、粪便、胃分泌液或血液)，例如，身体组织(诸如结肠，或胃)。例如，被验细胞从结肠或胃组织中纯化。
参照细胞群中的细胞来自于与被验细胞相似的组织类型，例如，结肠或胃的粘膜组织。在一些实施方案中，对照细胞所来源的个体与被验细胞的相同，例如，来自于被验细胞的起源区域的邻近区域。或者，参照细胞群来自于分子信息数据库，所述分子信息数据库来源于测定参数或条件均已知的细胞。
所述个体优选是哺乳动物。所述哺乳动物可以是，例如，人类、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马，或母牛。
测定CGX 1-8所示1、2、3、4、5或更多个序列的表达，如有需要，这些序列的表达可与其它序列一起测定，所述其它序列的表达水平已知根据本文所述的一种参数或疾病，例如，结肠癌或胃癌或者非结肠癌或胃癌而改变。
采用本领域任何已知的方法对本文所述基因的表达在RNA水平进行测定。例如，采用特异性识别一种或多种这些序列的探针的Northern杂交分析可被用于测定基因表达。或者，采用基于反转录的PCR测定法，例如采用针对差异性表达序列的特异性引物可对表达进行检测。
表达还可在蛋白质水平进行测定，即，通过检测本文所述基因产物所编码的多肽的水平或其生物活性。所述方法是本领域众所周知的，其包括，例如，基于抗所述基因所编码蛋白质的抗体的免疫测定法。所述基因所编码蛋白质的生物活性也是众所周知的。
当基因表达的改变与基因扩增或缺失相关时，可通过比较试验和参照细胞群中所检测的DNA序列的相对量而对试验和对照群中的序列进行比较。
诊断结肠癌或胃癌
通过检测来自包含或疑似包含结肠癌或胃癌细胞的被验细胞群(即，来源于患者的生物样品)的一种或多种CGX核酸序列的表达可诊断结肠癌或胃癌。优选地，该被验细胞群包括上皮细胞。最优选地，该细胞群包括来自结肠或胃的粘膜细胞。其它生物样品可用于检测蛋白质水平。例如，通过免疫测定法或生物分析法可测定来自待诊断的个体的血液或血清中的蛋白质水平。
在被验细胞或生物样品中测定一种或多种结肠癌或胃癌关联基因例如CGX 1-8的表达，并将其与正常对照水平的表达进行比较。正常对照水平是指通常见于未患结肠癌或胃癌的群体中的结肠癌或胃癌关联基因的表达分布图。来源于患者的组织样品中结肠癌或胃癌关联基因表达水平的增加或降低表明该个体患有或易患结肠癌或胃癌。例如，试验群中CGX 1-8的表达与正常对照水平相比的增加表明该个体患有或易患结肠癌或胃癌。
当与正常对照水平相比，试验群中50％、60％、80％、90％或更高的结肠癌或胃癌关联基因发生改变时，这表明该个体患有或易患结肠癌或胃癌。
或者，如果将试验群中结肠癌或胃癌关联基因的表达与患有结肠癌或胃癌的群体的表达分布图相比较，CGX 1-8表达的降低表明该个体不患有结肠癌或胃癌。
具体样品中CGX 1-8的表达水平可通过对与其相应的mRNA或由CGX1-8编码的蛋白质的定量来进行评估。mRNA的定量方法是本领域技术人员已知的。例如，CGX 1-8的相应mRNA水平可通过Northern印迹或RT-PCR进行评估。因此SEQ ID NO：1、3、5、7、9，或11中显示了CGX 1-5的全长核苷酸序列。或者，CGX 6-8的核苷酸序列已被报道。任何本领域技术人员均可设计出用于定量CGX 1-8的探针或引物的核苷酸序列。
CGX 1-8的表达水平还可根据所述基因编码的蛋白质的活性或量进行分析。用于测定CGX 1-8蛋白质的量的方法如下所示。例如，免疫测定法可用于测定生物材料中的蛋白质。任何生物材料均可用于测定蛋白质或其活性。例如，分析血液样品可以估计血清标记物所编码的蛋白质。另一方面，可选择适宜的方法从而根据要分析的每种蛋白质的活性来测定由CGX1-8所编码蛋白质的活性。
评估样品(被验样品)中CGX 1-8的表达水平，并将其与正常样品进行比较。当所述比较显示出靶基因的表达水平高于正常样品时，可判断该个体患有结肠癌或胃癌。可同时测定来自正常样品和个体的样品中CGX 1-8的表达水平。或者，通过统计学方法可确定表达水平的正常范围，所述统计学方法基于这样的结果，该结果通过分析预先从对照组中收集的样品中基因的表达水平而获得。将通过比较个体样品所得到的结果与所述正常范围进行比较；当该结果不在该正常范围中时，则判断该个体患有结肠癌或胃癌。在本发明中，评估CGX 1-7的表达水平，并将其与正常样品进行比较，从而用以诊断结肠癌；评估CGX 8用以诊断胃癌。
在本发明中，还提供了用于诊断结肠癌或胃癌的诊断剂。本发明的诊断剂包括与本发明的多核苷酸或多肽结合的化合物。优选地，可将与CGX1-8的多核苷酸杂交的寡核苷酸，或与CGX 1-8的多肽结合的抗体用作所述化合物。
鉴定抑制结肠癌或胃癌关联基因表达的药剂
抑制结肠癌或胃癌关联基因的表达或活性的药剂可通过如下方法进行鉴定，即通过将表达结肠癌或胃癌关联基因的被验细胞群与被验药剂接触，并测定结肠癌或胃癌关联基因的表达水平。与正常对照水平相比，表达的降低表明该药剂是结肠癌或胃癌关联基因的抑制剂。
被验细胞群是表达结肠癌或胃癌关联基因的任何细胞。例如，所述被验细胞群包括粘膜细胞。优选地，所述上皮细胞来源于结肠或胃。
评估对个体中结肠癌或胃癌的治疗有效性
本文所鉴定的差异性表达的CGX序列还可使结肠癌或胃癌的疗程得以监测。在该方法中，正在接受结肠癌或胃癌治疗的个体提供被验细胞群。如有需要，可在治疗之前、期间或之后的多个时间点从个体取得被验细胞群。然后所述测定细胞群中一种或多种CGX序列的表达，并将其与参照细胞群进行比较，所述参照细胞群包括结肠癌或胃癌状态已知的细胞。优选地，所述参照细胞未暴露于治疗。
如果所述参照细胞群不包含结肠癌或胃癌细胞，所述被验细胞群和参照细胞群中CGX序列之间表达的相似性表明该治疗是有效的。但是，所述试验群和该参照细胞群中CGX序列之间表达的差异表明该治疗是无效的。
“有效的”是指治疗导致个体中结肠癌或胃癌肿瘤的大小、患病数，或转移可能性降低。当治疗用于预防时，“有效的”是指治疗延缓或阻止结肠癌或胃癌肿瘤形成。
当参照细胞群包含结肠癌或胃癌细胞时，例如，当所述参照细胞群包括在诊断时但治疗开始前取自个体的结肠癌或胃癌细胞时，被验细胞群和该参照细胞群之间表达图谱的相似性表明治疗是无效的。相反地，试验群和该参照细胞群的CGX序列表达的差异表明治疗是有效的。
当参照细胞群包含非结肠癌或胃癌细胞，一种或多种CGX 1-8序列的表达降低表明治疗是有效的。
联合用于诊断或治疗结肠癌或胃癌的任何已知方法可对有效性进行测定。结肠癌可通过例如，鉴别症状性异常如肠习惯(bowel habit)改变，大便中的血液(blood in the stool)，比正常狭窄的大便，无原因的体重减轻，和持续性疲劳，以及直肠检查时的身体触诊，直肠镜检查术，和钡灌肠或其它显像方式，诸如测定大便潜血或血液中的肿瘤抗原等试验进行诊断。胃癌可通过例如，鉴定症状性异常如溃疡症状，以及大便潜血试验，胃镜检查术，钡餐，计算机控制的轴向断层(CT)扫描术，和超声进行诊断。
选择适于具体个体的治疗结肠癌或胃癌的治疗剂
个体基因构成的差异可导致其代谢多种药物的相对能力有差异。在个体中被代谢从而作为抗结肠癌或胃癌剂的药剂可通过如下方式使其自身得以显现，即诱导个体细胞中基因表达图谱的变化，即将所述图谱从结肠癌或胃癌状态的特征性图谱改变为非结肠癌或胃癌的特征性基因表达图谱。由此，本文公开的差异性表达的CGX序列使可在来自所选择个体的被验细胞群中检验推定的治疗性或预防性抗结肠癌或胃癌剂，以便确定该药剂是否是适于该个体的抗结肠癌或胃癌剂。
为鉴定适于特定个体的抗结肠癌或抗胃癌药剂，将来自该个体的被验细胞群暴露于治疗剂，然后测定一种或多种CGX 1-8序列的表达。
被验细胞群包含表达结肠癌或胃癌关联基因的结肠癌或胃癌细胞。优选地，所述被验细胞是来自结肠或胃的上皮细胞。例如，将被验细胞群在存在候补药剂的情况下进行保温，然后检测被验样品的基因表达图谱并将其与一种或多种参照分布图(例如结肠癌或胃癌参照表达分布图或者非结肠癌或胃癌参照表达分布图)进行比较。或者，首先将该药剂与细胞提取物例如肝细胞提取物(其包含使药物代谢为活性形式的酶)混合。然后将药剂的活化形式与被验细胞群混合，并检测基因表达。优选地，在离体条件下将所述细胞群与药剂或该药剂的活化形式接触。
然后将被验细胞群中核酸序列的表达与参照细胞群中核酸序列的表达进行比较。该参照细胞群包括至少一种结肠癌或胃癌状态已知的细胞。如果该参照细胞是非结肠癌或胃癌，被验细胞群和参照细胞群之间相似的基因表达分布图表明该药剂适于治疗该个体中的结肠癌或胃癌。序列在被验细胞群中表达和参照细胞群中表达的差异表明该药剂不适于治疗该个体中的结肠癌或胃癌。
如果参照细胞是结肠癌或胃癌细胞，被验细胞群和参照细胞群之间基因表达图谱的相似性表明该药剂不适于治疗个体中的结肠癌或胃癌。
被验细胞群中一种或多种序列CGX 1-8的表达相对于包含结肠癌或胃癌的参照细胞群的降低表明该药剂具有治疗性。
被验药剂可以是任何化合物或组合物。在一些实施方案中，被验药剂是已知为抗癌剂的化合物和组合物。
鉴定用于治疗或预防结肠癌或胃癌的候补治疗剂的筛选试验
本文所述差异性表达的序列还可用于鉴定用于治疗或预防结肠癌或胃癌的候补治疗剂。该方法基于如下方式，即筛选候补治疗剂以便确定其是否将结肠癌或胃癌状态的CGX 1-8序列的特征表达分布图转变为指示非结肠癌或胃癌状态的图谱。
在该方法中，将细胞暴露于被验药剂或被验药剂的组合(依序地或相应地)，然后检测一种或多种CGX 1-8序列在细胞中的表达。将试验群中CGX序列的表达与未暴露于该被验药剂的参照细胞群中CGX序列的表达水平进行比较。被验药剂将增加在一些结肠癌或胃癌细胞中被下调的CGX序列的表达，和/或将降低在结肠癌或胃癌细胞中未被调节的那些CGX序列的表达。
在一些实施方案中，参照细胞群包括结肠癌或胃癌细胞。当使用该细胞群时，存在所述药剂时核酸序列的表达相对于不存在该药剂时细胞群表达分布图的变化表明该药剂是治疗结肠癌或胃癌的候补治疗剂。
该被验药剂可以是先前未述及的化合物或可以是先前已知、但不知道其是抗结肠癌或胃癌剂的化合物。
可进一步检测有效抑制过表达的基因的表达的药剂抑制结肠癌或胃癌肿瘤生长的能力，并且其可潜在地用于治疗结肠癌或胃癌。可采用评估抗癌剂的毒性和临床有效性的标准方法进一步评估所述化合物的临床有用性。
在其它实施方案中，本发明提供了筛选候补药剂的方法，所述候补药剂是结肠癌或胃癌治疗中的潜在靶点。如上面所详述的，通过控制标记基因的表达水平或活性，可以控制结肠癌或胃癌的发病和进展。因此，候补药剂(结肠癌或胃癌治疗中的潜在靶点)可通过采用标记基因的表达水平和活性作为指示的筛选方法进行鉴定。在本发明中，所述筛选方法可包括，例如，以下步骤：
a)将被验化合物与多肽接触，所述多肽由选自CGX 1-8的核酸编码；
b)检测所述多肽和被验化合物之间的结合活性；和
c)选择与所述多肽结合的化合物。
或者，本发明的筛选方法可包括以下步骤：
a)将候补化合物与表达一种或多种标记基因的细胞接触，其中一种或多种标记基因选自CGX 1-8；和
b)选择降低选自CGX1-8的一种或多种标记基因的表达水平的化合物。
表达标记基因的细胞包括，例如，由结肠癌或胃癌建立的细胞系；所述细胞可用于本发明的上述筛选中。
或者，本发明的筛选方法可包括以下步骤：
a)将被验化合物与多肽接触，所述多肽由选自CGX 1-8的核酸编码；
b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和
c)选择化合物，其中与不存在该被验化合物时检测到的生物活性相比，所述化合物抑制选自CGX 1-8的核酸所编码多肽的生物活性。
筛选所需要的蛋白质可采用标记基因的核苷酸序列作为重组蛋白质而获得。根据该标记基因的信息，本领域技术人员可选择该蛋白质的任何生物活性作为基于所选生物活性的筛选和检测方法的指标。
或者，本发明的筛选方法可包括以下步骤：
a)将候补化合物与细胞接触，所述细胞中已导入载体，所述载体包含一种或多种标记基因的转录调节区以及在该转录调节区控制下表达的报道基因，其中的一种或多种标记基因选自CGX1-8，
b)检测所述报道基因的活性；和
c)选择化合物，其与对照相比降低所述报道基因的表达水平。
适宜的报道基因和宿主细胞是本领域中所众所周知的。筛选所需要的报告物构建体可通过使用标记基因的转录调节区来制备。当标记基因的转录调节区是本领域技术人员所已知时，报告物构建体可通过使用已知序列信息来制备。如果标记基因的转录调节区未被鉴定，包含转录调节区的核苷酸片段可从基于该标记基因的核苷酸序列信息的基因组文库中分离。
在筛选用于治疗或预防结肠癌的本发明化合物的方法的其它实施方案中，该方法使用了ARHCL1与Zyxin，NFXL1与MGC10334或CENPC1，C20orf20与BRD8，以及CCPUCC1与nCLU的结合能力。显示本发明的蛋白质与Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU相结合。这些发现提示本发明的蛋白质经由其与分子，诸如Zyxin，MGC10334，CENPC1，BRD8和nCLU等的结合而发挥细胞增殖的功能。因此，预期抑制本发明的蛋白质与Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之间的结合会导致细胞增殖的抑制，且抑制所述结合的化合物可作为治疗或预防结肠癌的药物。
所述筛选方法包括以下步骤：(a)在存在被验化合物条件下，将本发明的多肽与Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU接触；(b)检测该多肽与Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之间的结合；和(c)选择抑制该多肽与Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之间结合的化合物。
用于筛选方法的本发明的多肽，以及Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU可以是重组多肽或天然来源的蛋白质，或还可以是其部分肽，只要其保持相互结合的能力即可。用于筛选方法的本发明的多肽，Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU可以是，例如，纯化的多肽、可溶性蛋白质、与载体结合的形式，或与其它多肽融合的融合蛋白质。
可以使用任何被验化合物，例如，细胞提取物，细胞培养上清，微生物发酵产物，海洋生物提取物，植物提取物，纯化的或粗制蛋白质，肽，非肽化合物，合成小分子化合物和天然化合物。
作为筛选抑制本发明的蛋白质与Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之间结合的化合物的方法，可使用本领域技术人员众所周知的许多方法。所述筛选方法可作为体外实验系统，例如在无细胞系统中实施。更具体地，首先，将本发明的多肽，或Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU与支持物结合，然后将另一种蛋白质与被验样品一起加至其上。随后，对该混合物进行保温、洗涤并检测和/或测定与该支持物结合的其它蛋白质。
可用于结合蛋白质的支持物的实例包括不溶性多糖，诸如琼脂糖，纤维素，和葡聚糖；和合成树脂，诸如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，和硅；优选由上述材料制备的商业上可获得的珠和板(例如，多孔板，生物传感器芯片等)。当使用珠时，所述珠可被填入柱中。
可根据常规方法，诸如化学结合和物理吸附法实施蛋白质与支持物的结合。或者，蛋白质可经由特异性识别该蛋白质的抗体而与支持物结合。而且，还可通过抗生物素蛋白和生物素结合的方式实施蛋白质与支持物的结合。
蛋白质间的结合在缓冲液，例如(但不限于)磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液中实施，条件是所述缓冲液不会抑制蛋白质间结合。
在本发明中，使用表面等离子共振现象的生物传感器可用作对结合的蛋白质进行检测或定量的方法。当使用所述生物传感器(例如，BIAcore，Pharmacia)时，可仅使用微量多肽且无需标记，即可将蛋白质间的相互作用作为表面等离子共振信号进行实时观测。因此，采用生物传感器诸如BIAcore就可以评估本发明的多肽与Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之间的结合。
或者，可对本发明的多肽，或Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU进行标记，而结合的蛋白质的标记可被用于检测或测定结合的蛋白质。具体地说，在预标记一种蛋白质之后，将该标记的蛋白质与其它蛋白质在存在被验化合物的条件下接触，洗涤后根据该标记检测或测定结合的蛋白质。
标记性物质诸如放射性同位素(例如，3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)，酶(例如，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖苷酶)，荧光物质(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明)，以及生物素/抗生物素蛋白可用于标记本方法中的蛋白质。当用放射性同位素标记蛋白质时，可通过液体闪烁实施检测或测定。或者，可使用光度计对用酶标记的蛋白质实施检测或测定，所述检测或测定可通过加入酶的底物以便来检测底物的酶性改变(enzymic change)诸如颜色生成来进行。此外，在荧光物质被用作标记的情况下，结合的蛋白质可采用荧光光度计进行检测或测定。
此外，本发明的多肽与Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU的结合还可采用针对本发明的多肽以及Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU的抗体进行检测或测定。例如，将固定在支持物上的本发明的多肽与被验化合物以及Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU接触后，对混合物进行保温并洗涤，然后采用抗Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU的抗体实施检测或测定。或者，可将Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU固定在支持物上，而将针对本发明的多肽的抗体用作抗体。
在本发明的筛选方法中使用抗体时，该抗体优选用一种上述标记物进行标记，并根据该标记物进行检测或测定。或者，针对本发明的多肽，Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU的抗体可用作第一抗体，该抗体通过以标记物标记的第二抗体而被检测出。此外，在本发明的筛选方法中，与所述蛋白质结合的抗体可采用蛋白质G或蛋白质A柱进行检测或测定。
或者，在本发明的筛选方法的其它实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER双杂交系统”，“哺乳动物MATCHMAKER双杂交检测试剂盒”，“MATCHMAKER单杂交系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体系统”(Stratagene)；参照“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。
在双杂交系统中，将本发明的多肽融合至SRF-结合区或GAL4-结合区，并在酵母细胞中表达。与本发明的多肽结合的Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU被融合至VP16或GAL4转录激活区，并且在存在被验化合物的情况下也可在酵母细胞中表达。当被验化合物不能抑制本发明的多肽与Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之间的结合时，二者间的结合即激活报道基因，从而可检测到阳性克隆。
作为报道基因，除HIS3基因外，还可使用例如Ade2基因，lacZ基因，CAT基因，萤光素酶基因等。
通过筛选而分离的化合物是药物的候补物，所述药物抑制标记基因编码的蛋白质的活性，且可用于治疗或预防结肠癌或胃癌。
此外，可通过本发明的筛选方法获得的化合物中还包括其中部分结构通过添加、缺失和/或置换而改变的化合物，该化合物能够抑制由标记基因编码的蛋白质的活性。
当通过本发明的方法分离的化合物作为药物而施用于人类和其它哺乳动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒以及猩猩时，该分离的化合物可被直接施用或可采用已知的药物制备方法而被制成剂型。例如，根据需要，该药物可作为糖衣片剂，胶囊剂，酏剂和微囊剂而口服，或以水或任何其它可药用的液体的无菌溶液或悬浮液的注射液形式以非口服施用。例如，该化合物可与可药用的载体或介质，具体而言为无菌水，生理盐水，植物油，乳化剂，悬浮剂，表面活性剂，稳定剂，调味剂，赋形剂，载体，防腐剂，粘合剂，等，在通常可接受的药物制备方法所需的单位剂型中混合。这些制剂中活性成分的量可以得到所述范围内的适宜剂量。
可混合至片剂和胶囊的添加剂的实例是，粘合剂诸如明胶，玉米淀粉，黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂诸如微晶纤维素；溶胀剂诸如玉米淀粉，明胶和海藻酸；润滑剂诸如硬脂酸镁；增甜剂诸如蔗糖，乳糖或糖精；以及调味剂诸如薄荷，Gaultheria adenothrix油和樱桃红(cherry)。当单位剂型是胶囊时，液体载体诸如油，也可进一步包括在上述成份中。用于注射的无菌组合物可按照标准的药物制备方法采用载体诸如用于注射的蒸馏水进行制备。
生理盐水，葡萄糖，和包含佐剂诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的其它等张液可被用作注射用含水溶液。其可与适宜的增溶剂，诸如醇，特别是乙醇，多元醇诸如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，诸如Polysorbate 80(TM)和HCO-50联合使用。
麻油或大豆油可用作油性液体，其可与用作增溶剂的苯甲酸苄酯或苯甲醇联合使用，且可采用缓冲液诸如磷酸盐缓冲液和醋酸钠缓冲液进行配制；止痛药，诸如盐酸普鲁卡因；稳定剂，诸如苯甲醇和苯酚；和抗氧化剂。可将制备的注射剂装于适宜的安瓿中。
可采用本领域技术人员众所周知的方法将本发明的药物组合物投药患者，例如以动脉内，静脉内，或经皮注射的方式，也可以经鼻内，经支气管，肌内或口服投药。施用的剂量和方法根据患者的体重和年龄以及施用方法而改变；然而，本领域技术人员可常规地选择适宜的施用方法。如果所述化合物可由DNA编码，可将该DNA插入用于基因治疗的载体中，将该载体施用于患者从而实施治疗。施用的剂量和方法根据患者的体重，年龄和症状而改变但本领域技术人员能适当地对其进行选择。
例如，虽然与本发明的蛋白质结合并调节其活性的化合物的剂量依赖于症状，但经口服施用于正常成年个体(体重60kg)时，所述化合物的剂量为约0.1mg-约100mg/日，优选约1.0mg-约50mg/日且更优选约1.0mg-约20mg/日。
当以胃肠外方式(注射剂方式)施用于正常成年个体(体重60kg)时，虽然根据患者、靶器官、症状和施用方法而存在一些差异，适于静脉内注射的剂量是约0.01mg-约30mg/日，优选约0.1-约20mg/日且更优选约0.1-约10mg/日。而且，当用于其它动物的情况下，可以施用按60kg体重转换的量。
评估患结肠癌或胃癌个体的预后
还提供了评估患结肠癌或胃癌个体的预后的方法，该方法通过在疾病阶段谱期间比较被验细胞群中一种或多种CGX序列的表达与来自患者的参照细胞群中所述序列的表达进行。通过比较被验细胞群和参照细胞群中一种或多种CGX序列的基因表达，或通过比较来自所述个体的被验细胞群在不同时间的(overtime)基因表达图谱，可对个体的预后进行评估。
参照细胞群主要包括非结肠癌或胃癌细胞，或者结肠癌或胃癌细胞。可选地，所述参照是结肠癌或胃癌或者非结肠癌或胃癌表达分布图。当参照细胞群主要包括非结肠癌或胃癌细胞时，一种或多种序列CGX 1-8的表达增加表明预后良好程度较低。序列CGX 1-8的表达降低表明个体预后良好程度较高。
或者，当参照细胞群主要包括非结肠癌或胃癌细胞时，一种或多种序列CGX 1-8的表达增加表明个体预后良好程度较低，而表达降低或相似则表明个体预后良好程度较高。
试剂盒
本发明还提供了以试剂盒的形式包装在一起的CGX-检测试剂，例如，通过具有与部分CGX核酸互补的同源性核酸序列，诸如寡核苷酸序列而特异性识别一种或多种CGX核酸的核酸，或针对CGX核酸所编码的蛋白质的抗体。该试剂盒可在分开的容器中包含核酸或抗体(已结合于固体基质或与将其结合于所述基质的试剂分开包装)，对照制剂(阳性和/或阴性)，和/或可检测的标记。该试剂盒中可包含实施所述实验的说明书(例如，书面的，磁带，VCR，CD-ROM等)。该实验可以是，例如本领域已知的Northern杂交或夹心ELISA的形式。
例如，将CGX检测试剂固定在固体基质诸如多孔带上从而形成至少一个CGX检测位点。多孔带的测定或检测区可包括多个包含核酸的位点。试验带还可包含阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点位于与试验带分开的带上。任选地，不同检测位点可包含不同量的固定的核酸，即，第一检测位点上的量较高而随后的位点上的量较低。加入被验样品后，显示可检测信号的位点的数量提供了对样品中存在的CGX量的定量指示。检测位点可被设定为任何适宜的可检测形状，通常为跨越试验带宽度的条或点的形状。
或者，该试剂盒包含核酸基质阵列，该阵列包含一种或多种核酸序列。该阵列上的核酸可特异性鉴定CGX 1-8所表示的一种或多种核酸序列。在多种实施方案中，CGX 1-8所表示的2、3、4、5、6、7或更多序列的表达在与阵列结合的情况下则可被有效地鉴定。所述基质阵列可位于，例如固体基质(例如，美国专利5,744,305中所述的“芯片”)上。
阵列和复数状态(pluralities)
本发明还包括包含一种或多种核酸序列的核酸基质阵列。该阵列上的核酸特异性鉴定CGX 1-8所表示的一种或多种核酸序列。在多种实施方案中，CGX 1-8所表示的2、3、4、5、6、7或更多序列的表达可被鉴定。
例如，所述阵列中的核酸可通过具有与上文列举核酸的一部分互补的同源性核酸序列(诸如寡核苷酸序列等)而鉴定所述列举的核酸。该基质阵列可位于，例如固体基质(例如，美国专利5,744,305中所述“芯片”)上。
本发明还包括核酸序列的分离的复数状态(即，若两种或两种以上核酸的混合物)。该核酸序列可以为液相或固相，例如固定在固体支持物诸如硝酸纤维素膜上。该复数状态通常包括CGX 1-8所表示的一种或一种以上核酸序列。在多个实施方案中，该复数状态包括CGX 1-8所表示的2、3、4、5、6、7或更多个序列。
治疗结肠癌或胃癌的方法
本发明提供了治疗个体中结肠癌或胃癌的方法。对易患(或具有易感性)或患有与本文所述差异性表达的序列(例如，CGX 1-8)的表达或活性异常相关的病症患病风险或患有该病症的个体可预防性或治疗性地进行投药。
该方法还包括降低基因的一种或多种基因产物的表达和/或功能，所述基因在结肠癌或胃癌细胞中的表达与在非结肠癌或胃癌细胞中的表达相比增加(“过表达的基因”)。可通过本领域已知的数种方法之一对表达进行抑制。例如，可通过对个体施用抑制或拮抗过表达的一或多种基因的表达的核酸而抑制表达。在一个实施方案中，可以施用破坏一或多种基因表达的反义寡核苷酸或小干扰RNA。
如上述，与CGX 1-8的核苷酸序列对应的反义核酸可用于降低CGX 1-8的表达水平。与在结肠癌或胃癌中被上调的CGX 1-8对应的反义核酸可用于治疗结肠癌或胃癌。具体来说，本发明的反义核酸可通过如下方式发挥作用，即其与CGX 1-8或与CGX1-8相应的mRNA结合，由此抑制所述基因的转录或翻译，促进所述mRNA的降解，和/或抑制由选自CGX 1-8的核酸所编码的蛋白质的表达，最终抑制所述蛋白质的功能。例如，将包含启动子例如组织特异性或肿瘤特异性启动子的DNA可操作性连接于被转录为反义RNA的DNA序列(反义模板)。“可操作性连接于”是指编码序列与调节序列(即，启动子)以在适宜分子(例如，转录激活蛋白质)与该调节序列结合时允许基因表达的方式进行连接。
本文所使用的术语“反义核酸”包括与靶序列完全互补的核苷酸以及具有一个或多个核苷酸错配的那些核苷酸，只要该反义核酸能与所述靶序列特异性杂交即可。例如，本发明的反义核酸包括在至少15个连续核苷酸的长度上具有至少70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高同源性的多核苷酸。可将本领域已知的算法用于测定同源性。
反义治疗可通过经由标准载体和/或基因递送系统对患者施以反义核酸而实施。适宜的基因递送系统可包括脂质体，受体介导的递送系统，裸露DNA和病毒载体诸如疱疹病毒，反转录病毒，腺病毒以及腺伴随病毒等。CGX生成的降低导致经由IRS信号转导通路的信号转导减少。可将治疗性核酸组合物配制在可药用的载体中。所述治疗性组合物还可包括上述基因递送系统。可药用的载体是适合施用于动物的生物学相容性载体：例如生理盐水。化合物的治疗有效量是能够在经治疗的动物中产生医学上所需的效果，诸如降低CGX基因产物的生成或降低肿瘤的生长。
本发明的反义核酸衍生物通过以下方式对生成标记基因所编码蛋白质的细胞产生作用：与编码所述蛋白质的DNA或mRNA相结合，抑制其转录或翻译，促进所述mRNA降解，抑制所述蛋白质表达，由此抑制该蛋白质的功能。
本发明的反义核酸衍生物可通过与对衍生物无活性的适宜基质混合而被制成外用制剂，诸如搽剂或泥敷剂。
按照需要，该衍生物也可通过加入赋形剂等张剂增溶剂、稳定剂、防腐剂、止痛剂等而被制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、脂质体胶囊剂、注射剂、溶液、滴鼻剂和冻干剂。这些剂型可通过以下已知方法进行制备。
可通过将所述反义核酸衍生物直接施用于患病位点或注射至血管中以便到达患病位点而给予患者。对核酸或CGX抑制性肽或非肽化合物的递送可采用胃肠外投药，诸如经静脉内、皮下、肌内以及腹膜内递送途径。反义封固的介质也可被用于增加耐久性和膜通透性。实例为脂质体、聚左旋赖氨酸、脂质、胆固醇、脂转染素(lipofectin)或这些物质的衍生物。
本发明的反义核酸衍生物的剂量可根据患者情况进行适当调整并以所需量进行使用，所述患者情况例如，包括患者体型，体表面积，年龄，施用的具体核酸，性别，投药时间和途径，一般健康情况，和同时施用的其它药物。例如，可施用的剂量范围为0.1-100mg/kg，优选0.1-50mg/kg。静脉内施用核酸的可选的剂量为约106-1022拷贝的核酸分子。
本发明的反义核酸抑制本发明的蛋白质的表达，由此可用于抑制本发明的蛋白质的生物活性。而且，由于能够抑制本发明的蛋白质的生物活性，表达抑制剂(包括本发明的反义核酸)是有用的。
本发明的反义核酸包括经过修饰的寡核苷酸。例如，硫代核苷酸(thioated nucleotide)可被用于赋予寡核苷酸对核酸酶的抗性。
根据标准方法，在体外检测与CGX mRNA的多个部分互补的寡核苷酸降低肿瘤细胞中CGX生成的能力。与在缺乏候补组合物的情况下培养的细胞相比，与所述候补反义组合物接触的细胞中CGX基因产物的减少可通过采用CGX特异性抗体或其它检测策略进行检测。然后在大鼠或小鼠中，对在基于细胞或无细胞的体外测定法中降低CGX生成的序列进行体内检测，以证实患有恶性肿瘤的动物中CGX的生成被降低。
适宜的反义S-寡核苷酸具有选自SEQ ID NO：50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76或79的核苷酸序列。适用于结肠直肠癌的反义S-寡核苷酸如下：ARHCL1的反义S-寡核苷酸，其包括具有SEQ IDNO：50的核苷酸序列的那些序列；NFXL1的反义S-寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO：52的核苷酸序列的那些序列；C20orf20的反义S-寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO：54或56的核苷酸序列的那些序列；LEMD1的反义S-寡核苷酸，其包括具有选自SEQ ID NO：58、60、62、64或66的核苷酸序列的那些序列；CCPUCC1的反义S-寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO：68的核苷酸序列的那些序列；Ly6E的反义S-寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO：70或72的核苷酸序列的那些序列；Nkd1的反义S-寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO：74或76的核苷酸序列的那些序列。LAPTM4β的反义S-寡核苷酸适于胃癌，所述反义S-寡核苷酸包含具有SEQ ID NO：79的核苷酸序列的那些序列。
核酶治疗也可被用于抑制癌症患者中CGX基因的表达。核酶与特定的mRNA结合，然后在预定的切割位点进行切割，由此破坏转录物。这些RNA分子可用于根据本领域已知的方法来抑制CGC基因的表达(Sullivan等，1994，J.Invest.Derm.103：85S-89S；Czubayko等，1994，J.Biol.Chem.269：21358-21363；Mahieu等，1994，Blood 84：3758-65；Kobayashi等1994，Cancer Res.54：1271-1275)。
而且，针对标记基因的siRNA可被用于降低该标记基因的表达水平。术语“siRNA”意指可阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可以采用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中DNA是RNA转录模板的那些技术。在本发明中，siRNA包括针对上调的标记基因诸如CGX 1-8的有义核酸序列和反义核酸序列。构建siRNA使其单个转录物具有来自靶基因的有义和互补反义序列例如，发卡结构。
该方法可被用于改变细胞中被上调的表达(例如，作为细胞恶性转化结果)。siRNA与靶细胞中CGX 1-8之一的相应转录物的结合导致细胞产生的蛋白质减少。寡核苷酸的长度为至少10个核苷酸，且可与天然存在的转录物同样长。优选地，所述寡核苷酸的长度为19-25个核苷酸。最优选地，所述寡核苷酸的长度短于75、50、25个核苷酸。
采用可获自Ambion网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)的siRNA设计计算机程序(design computer program)来设计siRNAs的核苷酸序列。该计算机程序根据以下方案选择用于siRNA合成的核苷酸序列。
选择siRNA靶位：
1.从目标转录物的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA二核苷酸序列。将每次AA和邻近3′的19个核苷酸的出现记录为潜在的siRNA靶位。Tuschl等反对针对5′和3′非翻译区(UTRs)和邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为上述区域可能较为富含调节性蛋白质结合位点。UTR结合蛋白质和/或翻译起始复合物可干扰与siRNA内切核酸酶复合物的结合的。
2.将所述潜在靶位与人类基因组数据库进行比较，不考虑与其它编码序列显著同源的任何靶序列。可采用BLAST(可见于NCBI服务器：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行同源性检索
3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion，优选沿基因选择数个靶序列进行评估。
在优选的实施方案中，适宜siRNA靶序列的适宜核苷酸序列可选自SEQ ID NO：126、127、128或129。以下序列可适宜地用于设计治疗结肠直肠癌的siRNA的核苷酸序列：由SEQ ID NO：126的核苷酸序列组成的NFXL1的靶序列；由SEQ ID NO：127的核苷酸序列组成的C20orf20的靶序列；由SEQ ID NO：128或129的核苷酸序列组成的CCPUCC1的靶序列。例如，本发明优选的siRNA包括具有以下核苷酸序列组合的双链RNA。SEQID NO：106-121的核苷酸序列的碱基《t》上包括碱基《u》。
siRNA的靶序列      核苷酸序列组合
SEQ ID NO：126     SEQ ID NO：114/115
SEQ ID NO：127    SEQ ID NO：116/117
SEQ ID NO：128    SEQ ID NO：118/119
SEQ ID NO：129    SEQ ID NO：120/121
本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明的多肽的表达，由此可用于抑制本发明的多肽的生物活性。而且，由于可抑制本发明多肽的生物活性，故此在这一点上，表达抑制剂(包含本发明的反义寡核苷酸或siRNA)是有用的。因此，包含本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗结肠癌或胃癌。
或者，过表达的基因的一种或多种基因产物的功能可通过施用可与所述基因产物结合或抑制其功能的化合物而被抑制。所述化合物可以是，例如，针对过表达的一或多种基因产物的抗体。
本发明涉及抗体、尤其是针对由上调的标记基因所编码的蛋白质的抗体或该抗体的片段的用途。本文术语“抗体”是指具有特定结构的免疫球蛋白分子，所述特定结构仅与用于合成所述抗体的抗原(即，上调的标记基因产物)或与其紧密相关的抗原发生相互作用(即，结合)。此外，所述抗体可以是抗体的片段或修饰的抗体，只要其能结合标记基因所编码的一种或多种蛋白质即可。例如，所述抗体片段可以是Fab，F(ab’)2，Fv，或单链Fv(scFv)，其中来自H和L链的Fv片段通过适宜的接头而连接(Huston J.S.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883(1988))。更具体地，可通过用酶，诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码所述抗体片段的基因，将其插入表达载体中，并在适宜的宿主细胞中表达(参见，例如，Co M.S.等J.Immunol.152：2968-2976(1994)；Better M.和HorwitzA.H.Methods Enzymol.178：476-496(1989)；Pluckthun A.和Skerra A.Methods Enzymol.178：497-515(1989)；Lamoyi E.Methods Enzymol.121：652-663(1986)；Rousseaux J.等Methods Enzymol.121：663-669(1986)；Bird R.E.和Walker B.W.Trends Biotechnol.9：132-137(1991))。
抗体可通过与多种分子，诸如聚乙二醇(PEG)结合而进行修饰。本发明提供了所述修饰的抗体。该修饰的抗体可通过化学方法修饰抗体而获得。这些修饰方法在本领域中是常规的。
或者，抗体可以作为嵌合抗体(源于非人抗体的可变区和源于人抗体的恒定区之间)，或人源化抗体(包含源于非人抗体的互补决定区(CDR)，源于人抗体的框架区(FR)和恒定区)而获得。使用已知技术可制备所述抗体。
针对癌细胞中所发生的具体分子改变的癌症治疗已经过临床研究和抗癌药的调控性批准而被证实是有效的，所述抗癌药诸如用于治疗晚期乳癌的曲妥单抗(Herceptin)，用于治疗慢性髓细胞性白血病(chronic myeloidleukemia)的伊马替尼甲酯(imatinib methylate)(Gleevec)，用于治疗非小细胞性肺癌(NSCLC)的吉非替尼(gefitinib)(Iressa)，和用于治疗B细胞淋巴瘤和外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)的利妥昔单抗(rabimax)(抗CD20mAb)(Ciardiello F，Tortora G.A novel approach in the treatment of cancer：targeting the epidermal growth factor receptor.Clin Cancer Res.2001 Oct；7(10)：2958-70.Review.；Slamon DJ，Leyland-Jones B，Shak S，Fuchs H，PatonV，Bajamonde A，Fleming T，Eiermann W，Wolter J，Pegram M，Baselga J，Norton L.Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 formetastatic breast cancer that overexpresses HER2.N Engl J Med.2001 Mar 15；344(11)：783-92.；Rehwald U，Schulz H，Reiser M，Sieber M，Staak JO，Morschhauser F，Driessen C，Rudiger T，Muller-Hermelink K，Diehl V，EngertA.Treatment of relapsed CD20+Hodgkin lymphoma with the monoclonalantibody rituximab is effective and well tolerated：results of a phase 2 trial of theGerman Hodgkin Lymphoma Study Group.Blood.2003 Jan 15；101(2)：420-424.；Fang G，Kim CN，Perkins CL，Ramadevi N，Winton E，Wittmann S和Bhalla KN.(2000).Blood，96，2246-2253.)。这些药物在临床上是有效的，由于其仅靶向转化的细胞，故其耐受性比传统抗癌剂好。因此，所述药物不仅改善了癌症患者的存活率和生活质量，还验证了分子靶向癌症治疗这一概念。此外，在与标准化学疗法联合使用时，经靶向的药物可增强标准化学疗法的功效(Gianni L.(2002).Oncology，63 Suppl 1，47-56.；Klejman A，Rushen L，Morrione A，Slupianek A和Skorski T.(2002).Oncogene，21，5868-5876.)。因此，未来的癌症治疗可涉及传统药物与靶特异性药剂的联用，后者针对肿瘤细胞不同特性诸如血管发生及侵袭力。
这些调节方法可离体或在体外实施(例如，通过在存在所述药剂的条件下培养细胞)或(可选地)在体内实施(例如，通过将药剂施用于个体)。由此，本发明提供了治疗对患有疾病或病症个体的方法，所述疾病或病症的特征在于差异性表达的蛋白质或核酸分子的表达或活性异常。在一个实施方案中，该方法包括施用调节(例如，上调或下调)一种或多种差异性表达的基因的表达或活性的药剂(例如，由本文所述筛选实验所鉴定的药剂)或所述药剂的组合。在另一实施方案中，该方法包括施用蛋白质或蛋白质的组合或核酸分子或核酸的组合进行治疗以代偿差异性表达的基因的降低或异常的表达或活性。
特征在于基因的水平或生物活性增加(相对于未患有疾病或病症的个体而言)的疾病或病症可用拮抗(即，降低或抑制)过表达一或多种基因的活性的治疗剂来进行治疗。拮抗活性的治疗剂可在治疗上或预防上进行施用。
可使用的治疗剂包括，例如，(i)过表达的一或多种序列的多肽，或其类似物、衍生物、片段或同源物；(ii)针对所述过表达的一或多种序列的抗体；(iii)编码过表达的一或多种序列的核酸；(iv)“功能障碍性(dysfunctional)”反义核酸或核酸(即由于一或多种过表达的序列的编码序列中的异源插入物)；(v)小干扰RNA(siRNA)；或(vi)调节剂(即，改变过表达的多肽与其结合配偶体之间相互作用的抑制剂、激动剂和拮抗剂)。该功能障碍性反义分子可用于通过同源重组而“敲除”多肽的内源功能(参见，例如，Capecchi，Science 244：1288-1292 1989)
通过定量肽和/或RNA可很容易地检测增加的水平，所述定量可通过获取患者组织样品(例如，从活组织检查组织中)，在体外检测其RNA或肽水平、表达的肽的结构和/或活性(或其表达改变的基因的mRNA)来进行。本领域众所周知的方法包括(但不限于)免疫测定法(例如，通过Western印迹分析，免疫沉淀然后进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫细胞化学等)和/或杂交测定法来检测mRNA的表达(例如，Northern测定法，斑点印迹，原位杂交等)。
预防药剂的施用可在异常基因表达的特征症状出现之前进行，由此可防止或(可选地)延迟疾病或病症的进程。根据所检测的异常表达的类型，所述药剂可用于治疗个体。根据本文所述筛选方法可确定适宜的药剂。
本发明另一方面涉及为了治疗性目的而调节本文所述差异性调节的基因之一的表达或活性的方法。该方法包括将细胞与药剂接触，所述药剂调节差异性表达的基因的基因产物的一种或多种活性。调节蛋白质活性的药剂可以是如本文所述的药剂，诸如核酸或蛋白质，这些蛋白质、肽、肽模拟物的天然存在的同源配体，或其它小分子。在一个实施方案中，所述药剂刺激一种或多种差异性表达的基因的一种或多种蛋白质活性。所述刺激性药剂的实例包括活性蛋白质和已被导入细胞的编码所述蛋白质的核酸分子。
本发明还涉及治疗或预防个体中结肠癌或胃癌的方法，其包括对所述个体施用疫苗，所述疫苗包含由选自CGX 1-8的核酸编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码该多肽的多核苷酸或其片段。施用所述多肽在个体中诱导抗肿瘤免疫。为了诱导抗肿瘤免疫，施用选自CGX 1-8的核酸所编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码该多肽的多核苷酸。该多肽或其免疫活性片段可用作对抗结肠癌或胃癌的疫苗。在一些情况下，蛋白质或其片段可以以与T细胞受体(TCR)结合或由抗原呈递细胞(APC)呈递的形式进行施用，所述APC诸如巨噬细胞、树突细胞(DC)或B-细胞。由于DC具有强抗原呈递能力，在所述APC中，使用DC是最适宜的。
在本发明中，针对结肠癌或胃癌的疫苗是指具有经对动物进行免疫接种而诱导抗肿瘤免疫功能的物质。根据本发明，由选自CGX 1-8的核酸或片段编码的多肽被认为是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，所述多肽可诱导针对表达CGX 1-8的结肠癌或胃癌细胞的、有效且特异的免疫反应。因此，本发明还包括使用该多肽诱导抗肿瘤免疫的方法。一般而言，抗肿瘤免疫包括诸如以下的免疫反应：
诱导抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，
诱导识别肿瘤的抗体，和
诱导抗肿瘤细胞因子的产生。
因此，当特定蛋白质通过接种动物而诱导任何一种所述免疫反应时，该蛋白质即可被认为具有抗肿瘤免疫诱导功效。由蛋白质诱导的抗肿瘤免疫可通过在体内或体外观察宿主免疫系统针对该蛋白质的反应而进行检测。
例如，细胞毒性T淋巴细胞的诱导的检测方法是众所周知的。进入活体的外来物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用而被呈递于T细胞和B细胞。响应于APC所呈递抗原的T细胞由于该抗原的刺激而以抗原特异性图谱分化为细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTL)，然后增殖(这被称为T细胞活化)。因此，具体肽对CTL的诱导可通过经由APC将该肽呈递给T细胞，并检测CTL的诱导而进行评估。此外，APC具有激活CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，嗜酸粒细胞，和NK细胞的功效。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤免疫中同等重要，故该肽的抗肿瘤免疫诱导作用可采用这些细胞的激活效应作为指标进行评估。
以树突细胞(DC)作为APC而对CTL诱导作用进行评估的方法在本领域中是众所周知的。在APC中，DC是具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在该方法中，首先将试验多肽与DC接触，然后将该DC与T细胞接触。在与DC接触后，对具有针对兴趣细胞的细胞毒性作用的T细胞的检测显示出该试验多肽具有诱导所述细胞毒性T细胞的活性。CTL抗肿瘤的活性可通过，例如，采用51Cr标记的肿瘤细胞的溶解作为指标进行检测。或者，采用3H-脱氧胸苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指标对肿瘤细胞损伤程度进行评价的方法也是众所周知的。
除DC外，外周血单核细胞(PBMC)也可用作APC。已有报道指出，通过在存在GM-CSF和IL-4的情况下培养PBMC，可增强CTL的诱导。相似地，已经显示出通过在存在钥孔戚血蓝素(KLH)和IL-7的条件下培养PBMC可诱导CTL。
通过这些方法证实具有CTL诱导活性的试验多肽是具有DC激活效应和随后CTL诱导活性的多肽。因此，诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过与所述多肽接触而获得诱导针对肿瘤的CTL能力的APC可用作抗肿瘤的疫苗。此外，由于经APC呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可被用作抗肿瘤的疫苗。采用由APC和CTL产生的抗肿瘤免疫的肿瘤治疗方法被称为细胞免疫治疗。
一般来说，当使用多肽进行细胞免疫治疗时，已知通过联合多种具有不同结构的多肽并将其与DC接触可增加CTL诱导效率。因此，当用蛋白质片段刺激DC时，使用多种类型片段的混合物是有利的。
或者，多肽对抗肿瘤免疫的诱导可通过检测对抗肿瘤抗体生成的诱导而证实。例如，当在用所述多肽免疫的试验动物中诱导抗该多肽的抗体时，以及当这些抗体抑制肿瘤细胞的生长时，该多肽可被确定为具有诱导抗肿瘤免疫的能力。
通过施用本发明的疫苗可诱导抗肿瘤免疫，且这种对该抗肿瘤免疫的诱导能够治疗和预防结肠癌或胃癌。抗癌治疗或对癌症发病的预防包括任何步骤，诸如癌性细胞生长的抑制，癌症的衰退(involution)，以及癌发生的抑制。患有癌症的个体死亡率的降低，血液中肿瘤标记物的降低，癌伴发的可检测症状的缓解等等也包括在癌症的治疗或预防中。所述治疗性和预防性效果优选具有统计学上的显著性。例如，在观察中显著性水平为5％或更低，其中将疫苗抗细胞增殖性疾病的治疗性或预防性效果与未施用疫苗的对照进行比较。例如，可将Student’s t-检验，Mann-Whitney U-检验，或ANOVA用于统计学分析。
上述具有免疫活性的蛋白质或编码该蛋白质的载体可与佐剂联合。佐剂是指当与具有免疫活性的蛋白质一起(或连续)使用时能增强针对该蛋白质的免疫反应的化合物。佐剂的实例包括(但不限于)霍乱毒素，沙门氏菌毒素，明矾，等。此外，本发明的疫苗可适宜地与可药用的载体联用。所述载体的实例是无菌水，生理盐水，磷酸缓冲液，培养液等。此外，疫苗可按需要包含稳定剂，混悬剂，防腐剂，表面活性剂等。疫苗可全身或局部地进行施用。疫苗施用可通过单一投药进行，或经多次投药而强化。
当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可通过，例如离体方法治疗或预防肿瘤。更具体地，收集接受治疗或预防的个体的PBMC，将该细胞与所述多肽在离体条件下接触，诱导APC或CTL后，可将该细胞施用于该个体。APC还可通过将编码所述多肽的载体在离体条件下导入PBMC中来诱导。离体条件下诱导的APC或CTL可在施用前进行克隆。通过克隆并使具有高靶细胞破坏活性的细胞生长，可以更有效地实施细胞免疫治疗。此外，以该方式分离的APC和CTL不仅可用于对所述细胞所来源个体进行细胞免疫治疗，还可用于对来自其它个体的相似肿瘤类型进行细胞免疫治疗。
此外，提供了治疗或预防细胞增殖性疾病，诸如癌症的药物组合物，其包括药学有效量的本发明的多肽。该药物组合物可用于提高抗肿瘤免疫。
治疗结肠癌或胃癌的药物组合物
本发明另一方面包括药学或治疗组合物，其包含一种或多种本文所述的治疗化合物。药物制剂可包括适于经口服，经直肠，经鼻，局部(包括经颊和舌下)，经阴道或胃肠外(包括经肌内，皮下和静脉内)投药，或适于经吸入或吹入投药的那些制剂。所述制剂(在适宜时)可为分散的剂量单位，并可通过药学领域众所周知的任何方法进行制备。所有所述药学方法包括如下步骤，将活性化合物按照需要与液体载体和/或微细分碎的固体载体联用，且然后(如有需要)将所产物塑成所需制剂的形状。
适于经口投药的药物制剂可被合宜地制成分散单位，诸如胶囊剂、扁囊剂或片剂，其各包含预定量的活性成分；散剂或颗粒剂；或溶液、混悬剂或乳剂。活性成分还可制为大丸剂、药糖剂或糊剂，并可以是纯的形式，即无载体。用于经口投药的片剂和胶囊剂可包含常规赋形剂诸如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。片剂可通过压制(compression)或模制(modeling)，任选地用一种或多种配制性成分来制备。压制片剂可通过在适宜的机器中将活性成分压制成非流动形式诸如粉末或颗粒(任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑的，表面活性或分散剂混合)来制备。模制片剂可通过在适宜的机器中，将用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物进行模塑而制备。片剂可根据本领域众所周知的方法进行包衣。口服液体制剂的形式可以是，例如，水性或油性混悬剂、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或可以是在使用前用水或其它适宜的载体溶解的干燥产品。所述液体制剂可包含常规添加剂诸如悬浮剂、乳化剂、非水性载体(可包括食用油)，或防腐剂。片剂可任选地进行制备，只要其能缓慢或有控制地释放其中的活性成分即可。
用于胃肠外道投药的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可包含抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和溶质，所述成份可使该制剂与目的受体的血液等张；以及包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌混悬剂。所述制剂可被置于单位剂量或多剂量容器，例如密封安瓿和玻璃瓶中，并可以冷冻干燥(冻干)状态保存，在使用前仅需要加入无菌液体载体例如盐水、注射用水。或者，所述制剂可以是连续输注剂。临时注射剂溶液和混悬剂可用先前所述类型的无菌散剂，颗粒剂和片剂进行制备。
用于直肠投药的制剂可以是采用常用载体诸如可可脂或聚乙二醇的栓剂。用于在口中局部投药(例如经颊或舌下)的制剂包括在调味基质诸如蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶中的、包含活性成分的锭剂，以及在基质诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的、包含活性成分的芳香重剂(pastill)。对于经鼻内施用，本发明的化合物可以作为液体喷雾剂或分散性粉剂或以滴剂的形式进行使用。滴剂可用水性或非水性基质制备，所述基质中还包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。液体喷雾剂可适宜地从压力包中递送。
对于通过吸入的投药，化合物可适宜地通过喷雾器(insufflator)、雾化器(nebulizer)、压力包或其它适宜递送喷雾剂的方式进行递送。压力包可包含适宜的推进剂诸如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜的气体。在增压气雾剂的情况下，剂量单位可通过阀瓣来递送经计量的量来确定。
或者，对于通过吸入或吹入的投药，所述化合物可采用干粉组合物的形式，例如所述化合物与适宜的粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以是单位剂量形式，例如，胶囊，药筒，明胶或发泡包，其中借助吸入器或吹入器来施用所述粉末。
需要时，可使用上述制剂(适于持续释放活性成分)。该药物组合物还可包含其它活性成分诸如抗微生物剂、免疫抑制剂或防腐剂。
应当理解除上面具体描述的成分外，根据需要的制剂类型，本发明的制剂可包括本领域常规的其它药剂，例如，适于经口服投药的药剂可包括调味剂。
优选的单位剂量制剂是包含有效剂量的活性成分的那些制剂(如下述)，或其适宜部分。
对于上述各种情况来说，组合物以约0.1-约250mg/kg/日的剂量经口服或经注射进行施用。用于成年人的剂量范围一般是约5mg-约17.5g/日，优选约5mg-约10g/日，最优选约100mg-约3g/日。分散单位剂量形式的片剂或其它单位剂型可合宜地包含有效剂量或其多剂量形式，例如，包含约5mg-约500mg，通常约100mg-约500mg的单位剂量。
所述药物组合物优选经口服或经注射(静脉内或皮下)进行施用，主治医师将能确定施用于个体的精确量。但是，施用剂量要依赖多种因素，包括个体的年龄和性别，要进行治疗的具体疾病及其严重度。投药途径也可根据病症及其严重度而改变。
CGX核酸
本发明还提供了新的核酸，其包括选自CGX：1-5(SEQ ID NO：1，3，5，7，9和11)的核酸序列或其互补序列，以及包含这些核酸的载体和细胞。还提供了由CGX核酸或其生物活性部分编码的多肽。
本发明还包括能足以用作鉴别CGX编码核酸(例如，CGX mRNA)的杂交探针的核酸片段以及可用于CGX核酸分子的扩增或突变的聚合酶链式反应(PCR)引物的片段。如本文所使用的，术语“核酸分子”意指包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，用核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物，和其衍生物、片段及其同源物。所述核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链DNA。
“探针”是指长度可变的核酸序列，根据用途，优选为至少约10个核苷酸(nt)或多至约例如6,000nt。探针用于检测相同、相似或互补的核酸序列。通常由天然或重组来源获得的较长探针具有高度特异性，且杂交比寡聚体慢很多。探针是单链或双链的，并设计为在PCR，基于膜的杂交技术，或类似ELISA的技术中具有高度特异性。
“分离的”核酸分子是与存在于核酸天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子的实例包括(但不限于)包含在载体中的重组DNA分子，保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子，部分或基本上纯化的核酸分子，以及合成的DNA或RNA分子。优选地，“分离的”核酸不含与核酸天然侧接的序列(即，位于该核酸5′和3′末端的序列)，该序列存在于核酸所来源的生物体的基因组DNA中。例如，在多种实施方案中，分离的CGX核酸分子可包含低于约50kb、25kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，该核苷酸序列在该核酸来源的细胞的基因组DNA中与所述核酸分子天然侧接。而且，“分离的”核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术制备时，可基本上不含其它细胞性物质或培养基，或当通过化学方法合成时，可基本上不含化学前体物质或其它化学物质。
本发明的核酸分子，例如，具有CGX：1-5之一的核苷酸序列(SEQ IDNO：1、3、5、7、9或11)的核酸分子，或这些核苷酸序列之一的互补序列，可采用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息进行分离。采用这些核酸序列的全部或部分作为杂交探针，采用标准杂交和克隆技术可分离CGX核酸序列(例如，按照Sambrook等，eds.，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL 2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989；和Ausubel，等，eds.，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，NY，1993.中所述)
本发明的核酸可采用cDNA，mRNA或可选为基因组DNA作为模板和适宜的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术进行扩增。如此扩增的核酸可被克隆至适宜的载体中，并可通过DNA序列分析表征。此外，与CGX核苷酸序列相应的寡核苷酸可通过标准合成技术，例如，使用DNA自动合成仪进行制备。
如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指一系列相连接的核苷酸残基，该寡核苷酸具有的核苷酸碱基数目足以用于PCR反应。短寡核苷酸序列可根据，或从基因组或cDNA序列设计，并可被用于在具体细胞或组织中扩增、验证相同、相似或互补DNA或RNA或揭示所述DNA或RNA的存在。寡核苷酸包含具有至少约10nt-多达50nt，优选约15nt-30nt的核酸序列的部分。它们可通过化学方法合成，并可被用作探针。
在另一实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括与CGX：1-5(SEQ IDNO：1、3、5、7、9或11)所示核苷酸序列互补的核酸分子。在另一实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括与任何这些序列或任何这些核苷酸序列的一部分所示的核苷酸序列互补的核酸分子。与CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11)中所示核苷酸序列互补的核酸分子是与所示核苷酸序列充分互补的核酸分子，由此所述核酸分子可与所示核苷酸序列通过氢键结合，而形成少量或无错配，由此形成稳定的双链体。
本文术语“互补”是指核酸分子的核苷酸单位间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基对，而术语“结合”是指两种多肽或化合物和/或其相关多肽或化合物间的物理或化学的相互作用。结合包括离子性，非离子性，范德华力，疏水作用等。物理相互作用可以是直接或间接的。间接相互作用可通过或由于其它多肽或化合物的作用。直接结合指不通过或由于其它多肽或化合物的作用而发生的相互作用，其无需其它化学介质。
而且，本发明的核酸分子可仅包括CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11)的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物的片段或编码CGX的生物活性部分的片段。本文所提供的片段的定义是至少6个(连续)核酸或至少4个(连续)氨基酸的序列，其长度对于核酸而言足以允许特异性杂交，或对于氨基酸而言足以允许特异性识别表位，且最多是少于全长序列的一些部分。片段可来自所选核酸或氨基酸序列的任何连续的部分。衍生物是从天然化合物直接或通过修饰或部分置换而形成的核酸序列或氨基酸序列。类似物是具有与天然化合物相似的(但不相同的)结构、但具体部分或侧链不同的核酸序列或氨基酸序列。类似物可以是合成的或来自不同进化起源的，且可具有与野生型相似或相反的代谢活性。
若衍生物或类似物包含修饰的核酸或氨基酸(如下述)，则衍生物和类似物可以是全长或非全长的。在多个实施方案中，本发明的核酸或蛋白质的衍生物或类似物包括(但不限于)含有与本发明的核酸或蛋白基本同源的区的分子，所述区的相同核酸或氨基酸序列长度上或当与经过比对的序列(其通过本领域已知的计算机同源性程序进行比对)进行比较时与本发明的核酸或蛋白具有至少约45％、50％、70％、80％、95％、98％或甚至99％的同一性(优选80-99％的同一性)，或编码它的核酸能够与编码上述蛋白质的序列的互补序列在严谨、中度严谨，或低严谨条件下杂交的分子。例如参见Ausubel，等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley&Sons，New York，NY，1993，以及下述。示例性程序是采用缺省设定的Gap程序(Wisconsin序列分析包，针对UNIX的版本8，GeneticsComputer Group，University Research Park，Madison，WI)，其采用的是Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.，1981，2：482-489，其全文引入此处作为参考)。
“同源核酸序列”或“同源氨基酸序列”或其变体是指这样的序列，其特征在于在核苷酸水平或氨基酸水平上具有上述同源性。同源核苷酸序列编码那些编码CGX多肽同种型的序列。同种型作为例如，RNA的选择性剪接的结果而可以在相同生物体的不同组织中表达。或者，异构体可由不同基因所编码。在本发明中，同源核苷酸序列包括编码除人之外物种的CGX多肽的核苷酸序列，所述物种包括(但不限于)哺乳动物，由此可包括，例如，小鼠，大鼠，兔，犬，猫、牛，马以及其它生物体。同源核苷酸序列还包括(但不限于)本文所述核苷酸序列的天然存在的等位基因变异和突变。但是，同源核苷酸序列不包括编码人CGX蛋白质的核苷酸序列。同源核酸序列包括编码在CGX多肽中编码保守氨基酸置换(如下)以及具有CGX活性的多肽的核酸序列。同源氨基酸序列不编码人CGX多肽的氨基酸序列。
通过克隆人CGX基因而确定的核苷酸序列可用于生成探针和引物，该探针和引物设计为用于鉴定和/或克隆其它细胞类型(例如来自其它组织)中的CGX同源物，以及来自其它哺乳动物的CGX同源物。探针/引物典型地包括基本上纯化的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包括这样的核苷酸序列区域，其与包含CGX序列的核酸的至少约12，25，50，100，150，200，250，300，350或400连续有义链核苷酸序列，或包含CGX序列的核酸的反义链核苷酸序列，或这些序列的天然存在的突变体在严谨条件下杂交。
基于人CGX核苷酸序列的探针可用于检测编码相同的或同源性蛋白质的转录物或基因组序列。在多个实施方案中，所述探针还包括与其结合的标记基团，例如，所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。所述探针可被用作诊断检测试剂盒的一部分，所述试剂盒用于鉴定错误表达(misexpress)CGX蛋白质的细胞或组织，诸如通过在来自个体的细胞样品中检测编码CGX的核酸的水平，例如，检测CGX mRNA水平或测定基因组CGX基因是否已经发生突变或缺失。
“具有CGX的生物活性部分的多肽”是指通过具体生物测定法的检测(具有或不具有剂量依赖性)，显示与本发明的多肽(包括成熟形式)的活性相似(但无须相同)活性的多肽。编码“CGX的生物活性部分”的核酸片段可通过分离部分CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11)(该部分编码具有CGX生物活性的多肽)，表达CGX蛋白质的编码部分(例如，通过体外重组表达)并评估CGX的编码部分的活性来制备。例如，编码CGX多肽的生物活性部分的核酸片段可任选地包括ATP结合域。在其它实施方案中，编码CGX的生物活性部分的核酸片段包括一或多个区域。
CGX变体
本发明进一步包括由于遗传密码简并性而与所公开的或所参照的CGX核苷酸序列不同的核酸分子。由此，这些核酸编码的CGX蛋白质与包含例如CGX1、3、5、7、9或11所示CGX核酸的核苷酸序列所编码的相同。
除CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11)中所示大鼠CGX核苷酸序列外，本领域技术人员应能理解群体(例如，人类群体)中可存在导致CGX多肽的氨基酸序列改变的DNA序列多态性。由于天然等位基因变异，CGX基因中所述遗传多态性可存在于群体中的个体中。如本文所使用的，术语“基因”和“重组基因”是指包含编码CGX蛋白质，优选哺乳动物CGX蛋白质的开放阅读框的核酸分子。所述天然等位基因变异通常可导致CGX基因的核苷酸序列中1-5％的变化。任何和全部所述核苷酸变体以及导致的氨基酸多态性也意在包含于本发明的范围中，所述变异及氨基酸多态性是天然等位基因变异的结果、且不会改变CGX功能活性的CGX中。
而且，编码来自其它物种的CGX蛋白质，并由此具有与CGX1、3、5、7、9或11人类序列不同的核苷酸序列的核酸分子也意在包含于本发明的范围之内。与本发明CGX DNA的天然等位变体和同源物相应的核酸分子可根据其与本文所公开的人CGX核酸的同源性，采用人cDNA或其部分作为杂交探针，在严谨杂交条件下按照标准杂交技术进行分离。例如，可溶性人CGX DNA可根据其与膜结合的人CGX的同源性而被分离。而且，膜结合的人CGX DNA可根据其与可溶性人CGX的同源性而被分离。
由此，在其它实施方案中，本发明的分离的核酸分子的长度为至少6个核苷酸，并在严谨条件下与包含CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11)的核苷酸序列的核酸分子杂交。在其它实施方案中，该核酸的长度为至少10、25、50、100、250或500个核苷酸。在其它实施方案中，本发明的分离的核酸分子与编码区杂交。如本文所使用的，术语“在严谨条件下杂交”意在描述这样一种杂交和洗涤条件，在该条件下彼此具有至少60％同源性的核苷酸序列通常保持彼此的杂交。
同源物(即，编码来自人类之外物种的CGX蛋白质的核酸)或其它相关序列(例如，旁系同源物(paralog))可利用全部或部分具体人类序列作为探针通过低、中等或高严谨杂交，采用本领域已知用于核酸杂交和克隆的方法而获得。
在本发明中，术语“功能等同物(functional equivalent)”是指受试多肽具有这样的活性，其与CGX 1-7蛋白质相似可促进细胞增殖、并赋予癌细胞致癌活性。受试多肽是否具有细胞增殖活性可通过将编码该受试多肽的DNA导入表达各多肽的细胞中，并检测对细胞增殖的促进或集落形成活性的增加来进行判断。或者，该受试多肽是否在功能上等同于ARHCL1，NFXL1，C20orf20及CCPUCC1可通过分别检测其与Zyxin，MGC10334或CENPC1，BRD8及nCLU结合的能力来判断。此外，该受试多肽是否在功能上等同于所述蛋白质可通过其与Zyxin，MGC10334或CENPC1，BRD8，或nCLU的结合能力来判断。
本文术语“严谨杂交条件”是指这样的条件，在该条件下探针、引物或寡核苷酸将与其靶序列杂交，而不与其它序列杂交。严谨条件是序列依赖性的，在不同的环境下存在差异。较长的序列发生特异性杂交的温度比较短序列的高。通常，所选择的严谨条件为在规定的离子强度和pH条件下比特异性序列的热融点(Tm)低约5℃。Tm是平衡时，与靶序列互补的50％的探针与该靶序列杂交(在规定的离子强度，pH和核酸浓度下)的温度。由于靶序列通常是过量的，故在Tm、平衡时，50％的探针被占据。通常，严谨条件是：盐浓度为低于约1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH 7.0-8.3，温度对于短探针、引物或寡核苷酸(例如，10nt-50nt)为至少约30℃而对于较长探针、引物或寡核苷酸为至少约60℃。严谨杂交还可通过加入去稳定剂诸如甲酰胺等而获得。
严谨条件是本领域技术人员已知的，并可见于CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。优选地，该条件是这样的条件，即相互之间具有至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％，或99％同源性的序列通常保持杂交。严谨杂交条件的非限制性实例是，于65℃、在包含6×SSC，50mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA，和500mg/ml变性鲑精DNA的高盐缓冲液中进行杂交。所述杂交后，于50℃、0.2×SSC，0.01％BSA中洗涤一次或多次。在严谨条件下与CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9，或11)的序列杂交的本发明的分离的核酸分子与天然存在的核酸分子相对应。本文中“天然存在的”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，编码天然蛋白质)。
在第二个实施方案中提供了核酸序列，其能够在中等严谨的条件下，与包含CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9，或11)的核苷酸序列或其片段、类似物或衍生物的核酸分子杂交。中等严谨杂交条件的非限制性实例是在55℃、6×SSC，5×Denhardt氏溶液，0.5％SDS和100mg/ml变性鲑精DNA中进行杂交，随后在37℃、1×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。可使用的其它中等严谨条件是本领域所众所周知的。参见，例如，Ausubel等(eds.)，1993，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，NY，和Kriegler，1990，GENE TRANSFER AND EXPRESSION，ALABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY。
在第三个实施方案中提供了核酸，所述核酸能够在低严谨的条件下，与包含CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9，或11)的核苷酸序列或其片段、类似物或衍生物的核酸分子杂交。低严谨杂交条件的非限制性实例是在40℃、35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100mg/ml变性鲑精DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖中进行杂交，随后在50℃、2×SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA、和0.1％SDS中洗涤一次或多次。可使用的其它中等严谨条件是本领域所众所周知的(例如，用于交叉物种杂交的)。参见，例如，Ausubel等(eds.)，1993，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，NY，和Kriegler，1990，GENE TRANSFER AND EXPRESSION，ALABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY；Shilo等，1981，Proc NatlAcad Sci USA 78：6789-6792。
保守性突变
除可存在于群体中的CGX序列的天然存在的等位变体外，本领域技术人员还将理解所述改变可被引入CGX核酸或直接引入CGX多肽序列中而不会改变CGX蛋白质的功能。在一些实施方案中，CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11)的核苷酸序列将被改变，由此导致所编码CGX蛋白质的氨基酸序列中的改变。例如，可在CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11)的序列中在多种“非必要”氨基酸残基处进行会导致氨基酸置换的核苷酸置换。“非必要”氨基酸残基是可相对于CGX的野生型序列发生改变，而不会改变生物活性的残基，然而“必要”氨基酸残基是生物活性所需要的。例如，预期本发明的CGX蛋白质中保守的氨基酸残基尤其不易于改变。
此外，预测在本发明的CGX蛋白质家族成员中保守的氨基酸残基，也特别不易于改变。如此，这些保守性区域可能不易于突变。然而，其它氨基酸残基(例如，在CGX蛋白质成员中非保守的或仅为半保守的的那些残基)可能对活性不重要，因此很可能易于改变。
本发明另一方面涉及编码CGX蛋白质的核酸分子，所述CGX蛋白质包含对活性非必要的氨基酸残基中的改变。所述CGX蛋白质在氨基酸序列上与包含CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11)的核酸所编码多肽的氨基酸序列不同，但保持了生物活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包括编码蛋白质的核苷酸序列，其中该蛋白质包含与由包含CGX：1-5(SEQID NO：1、3、5、7、9，或11)的核酸编码的多肽的氨基酸序列至少约45％同源性，更优选60％，且更优选至少约70％，80％，90％，95％，98％，且最优选至少约99％的同源性的氨基酸序列。
编码同源CGX蛋白质的分离的核酸分子可通过如下方法生成，通过将一种或多种核苷酸置换、添加或缺失引入包含CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11)的核酸的核苷酸序列，从而将一或多种氨基酸置换、添加或缺失引入所编码的蛋白质中。
通过标准技术，，诸如定点诱变和PCR介导的诱变可将突变引入包含CGX：1-5(SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11)的核酸中。优选地，在一个或多个预测的非必要氨基酸残基上实施保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”是这样一种置换，其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。在本领域中已经对具有相似侧链的氨基酸残基家族给出详细说明。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，门冬氨酸，谷氨酸)，具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，丝氨酸，丝氨酸，半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，CGX中预测的非必要氨基酸残基被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基置换。或者，在其它实施方案中，突变可沿全部或部分CGX编码序列而被随机引入诸如通过饱和诱变，并可筛选所得突变体的CGX生物活性以便鉴定保持所述活性的突变体。在核酸诱变后，通过本领域已知的任何重组技术表达所编码的蛋白质并测定该蛋白质的活性。
在其它实施方案中，与第一序列杂交的互补多核苷酸序列的片段是CGX 1、3、5、7、9或11的互补多核苷酸序列的片段。
在其它具体实施方案中，核酸是RNA或DNA。长度为约10至约100个核苷酸，例如，长度为约10至约90个核苷酸，或长度为约10至约75个核苷酸，长度为约10至约50碱基，长度为约10至约40个碱基，或长度为约15至约30个碱基的片段是CGX 1、3、5、7、9或11的互补多核苷酸序列的片段。
CGX多肽
本发明的一个方面涉及分离的CGX蛋白质，(SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12)及其生物活性部分，或其衍生物、片段、类似物或同源物。还提供了适于用作产生抗CGX抗体的免疫原的多肽片段。在一个实施方案中，通过适宜的纯化方案，采用标准蛋白质纯化技术可从细胞或组织来源中分离天然CGX蛋白质。在其它实施方案中，CGX蛋白质通过重组DNA技术制备。作为重组表达的可选方法，CGX蛋白质或多肽可采用标准肽合成技术通过化学方法合成。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自CGX蛋白所来源的细胞或组织源的细胞性物质或其它污染性蛋白质，或如果是通过化学方法合成则基本上不含化学前体物质或其它化学物质。术语“基本上不含细胞物质”包括这样的CGX蛋白质制剂，其中所述蛋白质与该从中分离或重组制备蛋白质的细胞的细胞成分相分离。在一个实施方案中，术语“基本上不含细胞性物质”包括这样的CGX蛋白质制剂，其含有低于约30％(以干重计)的非CGX蛋白质(本文中也称为“污染蛋白质”)，更优选低于约20％的非CGX蛋白质，更优选低于约10％的非CGX蛋白质，最优选低于约5％的非CGX蛋白质。当CGX蛋白质或其生物活性部分经重组制备时，还优选基本上不含培养基，即，培养基占所述蛋白质制剂体积的低于约20％，更优选低于约10％，最优选低于约5％。
术语“基本上不含化学前体物质或其它化学物质”包括这样的CGX蛋白质制剂，其中所述蛋白质与该蛋白质合成所涉及的化学前体物质或其它化学物质相分离。在一个实施方案中，术语“基本上不含化学前体物质或其它化学物质”包括这样的CGX蛋白质制剂，其含有低于约30％(以干重计)的化学前体物质或非CGX化学物质，更优选低于约20％的化学前体物质或非CGX化学物质，更优选低于约10％的化学前体物质或非CGX化学物质，最优选低于约5％的化学前体物质或非CGX化学物质。
CGX蛋白质的生物活性部分包括肽，所述肽含有与CGX蛋白质的氨基酸序列充分同源的或来自所述氨基酸序列的氨基酸序列，例如包含CGX1-20的核酸所编码的氨基酸序列，其包括的氨基酸少于全长CGX蛋白质，并表现出至少一种CGX蛋白质的活性。通常，生物活性部分包括具有至少一种CGX蛋白质活性的结构域或基序。CGX蛋白质的生物活性部分可以是长度为例如，10个、25个、50个、100个或更多个氨基酸的多肽。
本发明CGX蛋白质的生物活性部分可包含在CGX蛋白质间保守的至少一种上文所鉴定的区域。CGX蛋白质的可选择的生物活性部分可包含至少两种上文所鉴定的区域。CGX蛋白质的另一生物活性部分可包含至少三种上文所鉴定的区域。而本发明的CGX蛋白质的另一生物活性部分可包含至少四种上文所鉴定的区域。
而且，其它生物活性部分(其中蛋白质的其它区域被缺失)可通过重组技术制备，并评估其天然CGX蛋白质的一种或多种功能活性。
在一些实施方案中，CGX蛋白质与这些CGX蛋白质中的一种基本上同源并保持其功能活性，但由于天然等位变异或诱变而在氨基酸序列中存在差异，如下文详述。
在具体的实施方案中，本发明包括分离的多肽，其包含与多肽的序列具有80％或更高同一性的氨基酸序列，所述多肽在施用了PPAR配体的哺乳动物中的表达受到调节。
本发明将通过以下实施例做进一步描述，其并不限制权利要求中所述本发明的范围。下述实施例描述了对在结肠癌或胃癌细胞中差异性表达的基因的鉴定和表征。
实施例1：一般方法
患者和组织样品。在征得患者同意的情况下，所有结肠直肠和胃癌组织以及相应非癌性组织均取自接受手术的患者的外科标品。
全基因组cDNA微阵列。采用具有23040个基因的全基因组cDNA微阵列。用DNAe I处理从显微解剖的组织中提取的总RNA，采用AmpliscribeT7转录试剂盒(Epicentre Technologies)对所述总RNA进行扩增，随后在反转录期间用Cy染料(Amersham)进行标记。用Cy5标记来自非癌性组织的RNA，而用Cy3标记来自肿瘤的RNA。如前面(4)所述实施杂交、洗涤和检测，每个靶点的Cy5和Cy3荧光强度采用Array Vision软件(AmershamPharmacia)生成。在减去本底信号后，将每个点的双值平均化。然后，将载玻片上的所有荧光强度标准化，以便校正每个载玻片的52个看家基因的平均Cy5和Cy3强度。当基因的Cy3和Cy5的强度均低于25,000荧光单位时，从进一步的试验中排除该基因，在剩余的基因中，我们选取Cy3/Cy5信号比值＞2.0的那些做进一步的评估。
细胞系。COS7细胞，和人结肠癌细胞系，LoVo，HCT15，以及SW480获自美国典型培养物中心(ATCC，Rockville，MD)，人类结肠癌SNU-C4细胞获自韩国细胞系库(korea cell-line bank)。人胃癌细胞系MKN-1，MKN-28，MKN45和MKN74获自研究生物资源日本保藏中心(Japanese Collection ofResearch Bioresources(JCRB))。人胃癌MKN7细胞获自RIKEN，而人胃癌St-4细胞由Tsuruo博士(癌症研究所，日本(Institute of cancer Researth，Japan))惠赠。所有细胞均在适宜的培养基(Sigma)中单层生长，Dulbecco改良的Eagle培养基用于COS7；RPMI1640用于SNUC4，HCT15；MKN-1，MKN-7，MKN-28，MKN45，MKN74，St-4，Leibovitz氏L-15培养基(Leibovitz’s L-15)用于SW480，以及HAM氏F-12培养基(HAM’s F-12)用于LoVo。所有培养基中均添加10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma)。
RNA制备和RT-PCR。采用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen)或Trizol试剂(Life Technologies公司)，根据厂商提供的方案提取总RNA。采用多聚dT12-18引物(Amersham Pharmacia Biotech)和Superscript II逆转录酶(LifeTechnologies)将总RNA的10微克等分试样逆转录为单链cDNA。将各个单链cDNA制品稀释以便进行随后的PCR扩增，所述PCR通过标准RT-PCR试验在12μl体积的PCR缓冲液(TAKARA)中进行。扩增过程：在GeneAmpPCR系统9700(Perkin-Elmer，Foster City，CA)中，94℃变性4分钟，随后94℃、30秒，60℃、30秒，和72℃、60秒进行21个(对于GAPDH)，36个(对于ARHCL1)，32个(对于NFXL1)，32个(对于C20orf20)，40个(对于LEMD1)，30个(对于CCPUCC1，Ly6E和Nkd1)，以及28个(对于LAPTM4β)循环。引物序列为：
对于GAPDH：正向，5’-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3’(SEQ ID NO：13)和
反向，5’-GGTCCACCACTGACACGTTG-3’(SEQ ID NO：14)；
对于ARHCL1：正向，5’-TTTCTTCCTAACTGTGATCCAGAT-3’(SEQ IDNO：15)和
反向：5’-ACAACACTTGGTAGCAGCCTT-3’(SEQ ID NO：16)；
对于NFXL1正向：5’-CTCTAACAGACCTCTTAAATTGTG-3’(SEQ IDNO：17)
反向：5’-CATAGACCCATAAGCCCTGTTG-3’(SEQ ID NO：18)；
对于C20orf20：正向，5’-GTGTGCCTCTTCCACGCCAT-3’(SEQ ID NO：19)和
反向：5’-CCTGGTCTTTCAGGTCCATCA-3’(SEQ ID NO：20)；
对于LEMD1：正向，5’-TGTGGTGTTTGTCTACCTGACTG-3’(SEQ ID NO：21)和
反向：5’-ACCATCATGCTCTTAACACAGGT-3’(SEQ ID NO：22)；
对于CCPUCC1：正向，5’-GAGTGGAAGTAACGATGACTC-3’(SEQ IDNO：23)和
反向：5’-GTCATTGTCACTCTCATCCAG-3’(SEQ ID NO：24)；
对于Ly6E正向：5’-GAAGATCTTCTTGCCAGTG-3’(SEQ ID NO：25)和
反向：5’-GCAGCAGGCTCAGCTGC-3’(SEQ ID NO：26)；
对于Nkd1：正向，5’-CTTGTTGATGTGGGTCACACG-3’(SEQ ID NO：27)和
反向：5’-TGTGGAGCTTAGGGAGGCAG-3’(SEQ ID NO：28)，
LAPTM4β：正向，5’-CTATGGCTACTTACGGAGCG-3’(SEQ ID NO：29)和
反向：5’-TCCTTGGCAGCACCATTCAC-3’(SEQ ID NO：30)。
Northern印迹分析。将人多组织印迹(Clontech，Palo Alto，CA)与ARHCL1、NFXL1、C20orf20、LEMD1、Nkd1或LAPTM4β的32P标记的PCR产物进行杂交。根据供应商推荐的方法实施预杂交，杂交和洗涤。在-80℃用增感屏(intensifying screen)对印迹进行放射自显影24-72小时。
构建表达ARHCL1、NFXL1、C20orf20、LEMD1、CCPUCC1、Ly6E、Nkd1，或LAPTM4β的质粒。采用下列基因特异性引物组，通过RT-PCR扩增ARHCL1、NFXL1、C20orf20、LEMD1、CCPUCC1、Ly6E、Nkd1，或LAPTM4β的完整编码区：
对于ARHCL1使用5’-GGCGAATTCGTAATATGCTCACTCGAGTG-3’(SEQ ID NO：31)，
5’-CCAGGATCCTGACAGCTTGTTTCCA-3’(SEQ ID NO：32)和
5’-TCTCCGGCCGCTTTCATGACAGCTTG-3’(SEQ ID NO：33)，
对于NFXL1使用5’-TGCGAATTCGGGATGGAAGCTTCCT-3’(SEQ IDNO：34)，
5’-GATAATTCTTTTTTTAATTGACATC-3’(SEQ ID NO：35)，和
5’-CTTGTACCATTGACATCATGGGTGAT-3’(SEQ ID NO：36)；
对于C20orf20使用5’-TGTGAATTCGCCATGGGAGAGGC-3’(SEQ IDNO：37)，
5’-TAACTCGAGCGTGCGGCGCCGCTT-3’(SEQ ID NO：38)，和
5’-TAAGGATCCCGTGCGGCGCCGCTT-3’(SEQ ID NO：39)，
对于LEMD1使用，5’-TCTGAATTCAGAAAAGAGGCCAAACTTCTATC-3’(SEQ ID NO：40)和
5’-TCCGATATCAGGTAGACAAACACCACAATGATG-3’(SEQ IDNO：41)；
对于CCPUCC1使用，5’-GAGGAATTCCGACCCTGGGCTCCTGGGGAC
-3’(SEQ ID NO：42)，和
5’-AAGCTCGAGAAGTCATTGTCACTCTCATCCAG-3’(SEQ IDNO：43)；
对于Ly6使用5’-ACGGAATTCCTCTCCAGAATGAAGATCTTC-3’(SEQ ID NO：44)，和
5’-TCTCTCGAGTCAGGGGCCAAACCGCAGC-3’(SEQ ID NO：45)；
对于Nkd1使用，5’-CGGCTCGAGCGCATGGCTTAGGGACGCTC-3’(SEQ ID NO：46)和
5’-TGGGGATCCGCTCTATGTCTGGTAGAAGTG-3’(SEQ ID NO：47)；
对于LAPTM4β使用，5’-CTGAATTCGGAGCGATGAAGATGGTCGC-3’(SEQ ID NO：48)，和
5’-AAGCTCGAGGCAGACACGTAAGGTGGCG-3’(SEQ ID NO：49)。
将PCR产物克隆至pcDNA3.1(Invitrogen)、pFLAG-CMV-5(Sigma)或pcDNA3.1 myc/His(Invitrogen)载体的适宜克隆位点。
免疫印迹。pcDNA3.1myc/His-ARHCL1、pFLAG-ARHCL1、pcDNA3.1myc/His-C20orf20、pFLAG-C20orf20、pcDNA3.1myc/His-CCPUCC1、pcDNA3.1myc/His-Ly6E，pcDNA3.1myc/His-LAPTM4β或pFLAG-LAPTM4β转染的细胞用PBS洗涤两次，然后在裂解缓冲液(150mM NaCl，1％Triton X-100，50mM Tris-HCl pH7.4，1mM DTT，和1×完全蛋白酶抑制剂Cocktail(Boehringer))中进行收集。将细胞均质化并以10,000×g离心30分钟后，通过Bradford测定(Bio-Rad)对上清进行蛋白质浓度标准化。采用10％SDS-PAGE分离蛋白质，用小鼠抗myc(SANTA CRUZ)，或抗Flag(SIGMA)抗体进行免疫印迹。HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(Amersham)用作ECL Detection System(Amersham)的第二抗体。
免疫组织化学染色。pcDNA3.1myc/His-ARHCL1、pFLAG-ARHCL1、pcDNA3.1myc/His-C20orf20、pFLAG-C20orf20、pcDNA3.1myc/His-CCPUCC1、pcDNA3.1myc/His-Ly6E、pcDNA3.1myc/His-LAPTM4β或pFLAG-LAPTM4β转染的细胞，及pFlag-ARHCL1和pCMV-HA-Zyxin，或pCMV-HA-NFXL1转染的HCT16，SW480和COS7细胞以及pcDNA-myc-CCPUCC1和pFlag-丛生蛋白转染的COS7细胞用包含4％的低聚甲醛的PBS固定15分钟，然后在室温，用包含0.1％Triton X-100的PBS处理2.5分钟使其具有可透过性。随后，4℃，用PBS中的2或3％BSA覆盖(cover)细胞12-24小时以阻断非特异性杂交。将1∶1000稀释度的大鼠抗HA单克隆抗体(Roche)，1∶1000稀释度的兔抗FLAG抗体(Sigma)，1∶1000稀释度的小鼠抗myc单克隆抗体(Sigma)或1∶2000稀释度的小鼠抗FLAG抗体(Sigma)用作第一抗体，在与FITC偶联的抗小鼠和荧光素偶联的抗小鼠IgG第二抗体(Leinco和ICN)一起保温后，显示该反应。细胞核用4′，6′二脒基-2′-苯吲哚二盐酸盐(phenylindoledihydrochloride)(DAPI)复染。在ECLIPSE E800显微镜下得到荧光图像。
反义(anti-sense)寡核苷酸对细胞生长的影响。采用LIPOFECTIN试剂(GIBCO BRL)，用质粒或ARHCL1、NFXL1、C20orf20、LEMD1、CCPUCC1、Ly6E、Nkd1或LAPTM4β的合成S-寡核苷酸对细胞进行转染，将所述细胞铺于10厘米皿(2×105细胞/皿)上，然后培养3-7日。然后用100％甲醇固定所述细胞，并用姬姆萨溶液进行染色。S-寡核苷酸的序列如下：
ARHCL1-AS1，5’-GTGAGCATATTACTCC-3’(SEQ ID NO：50)；
ARHCL1-R1，5’-CCTCATTATACGAGTG-3’(SEQ ID NO：51)；
NFXL1-AS，5’-GGCCAGGGACAATCTTTC-3’(SEQ ID NO：52)；
NFXL1-R，5’-CTTTCTAACAGGGACCGG-3’(SEQ ID NO：53)；
C20orf20-AS1，5’-GCCCACCTCGGCCTCTCC-3’(SEQ ID NO：54)；
C20orf20-R1，5’-CCTCTCCGGCTCCACCCG-3’(SEQ ID NO：55)；
C20orf20-AS2，5’-CACCTCGGCCTCTCCCAT-3’(SEQ ID NO：56)；
C20orf20-R2，5’-TACCCTCTCCGGCTCCAC-3’(SEQ ID NO：57)；
LEMD1-AS1，5’-ATCCACCATGATGATAGA-3’(SEQ ID NO：58)；
LEMD1-REV1，5’-AGATAGTAGTACCACCTA-3’(SEQ ID NO：59)；
LEMD1-AS2，5’-ACACTTCACATCCACCAT-3’(SEQ ID NO：60)；
LEMD1-REV2，5’-TACCACCTACACTTCACA-3’(SEQ ID NO：61)；
LEMD1-AS3，5’-CAGACACTTCACATCCAC-3’(SEQ ID NO：62)；
LEMD1-REV3，5’-CACCTACACTTCACAGAC-3’(SEQ ID NO：63)；
LEMD1-AS4，5’-CATGATGATAGAAGTTTG-3’(SEQ ID NO：64)；和
LEMD1-REV4，5’-GTTTGAAGATAGTAGTAC-3’(SEQ ID NO：65)；
LEMD1-AS5，5’-ACATCCACCATGATGATA-3’(SEQ ID NO：66)；和
LEMD1-REV5，5’-ATAGTAGTACCACCTACA-3’(SEQ ID NO：67)；
CCPUCC1-AS3，5’-CGGAGGTCGCGGAAAG-3’(SEQ ID NO：68)；
CCPUCC1-S3，5’-CTTTCCGCGACCTCCG-3’(SEQ ID NO：69)；
Ly6E-AS1，5’-ATCTTCATTCTGGAGA-3’(SEQ ID NO：70)；
Ly6E-S1，5’-TCTCCAGAATGAAGAT-3’(SEQ ID NO：71)，
Ly6E-AS5，5’-GAAGATCTTCATTCTG-3’(SEQ ID NO：72)；
Ly6E-S5，5’-CAGAATGAAGATCTTC-3’(SEQ ID NO：73)，
Nkd1-AS4，5’-GCGGCCGGCTTGGAGT-3’(SEQ ID NO：74)；
Nkd1-S4，5’-ACTCCAAGCCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：75)；
Nkd1-AS5，5’-GTAGAAGTGGTGGTAA-3’(SEQ ID NO：76)；
Nkd1-S5，5’-TTACCACCACTTCTAC-3’(SEQ ID NO：77)；
LAPTM4β-S，5’-GTGAGCGCGGCGCGCC-3’(SEQ ID NO：78)；
LAPTM4β-AS，5’-GGCGCGCCGCGCTCAC-3’(SEQ ID NO：79)；
LAPTM4β-SCR，5’-GCGCGGCCGCGCTCAC-3’(SEQ ID NO：80)；
LAPTM4β-REV，5’-CACTCGCGCCGCGCGG-3’(SEQ ID NO：81)。
溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯四唑(3-(4，5-dimethythiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)(MTT)试验。用反义或参照(有义、反转和混合)S-寡核苷酸转染一式三份的细胞。转染72小时后，用包含500μg/ml MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯四唑)(Sigma)的新鲜培养基置换培养基，然后将该板在37℃保温4小时。随后，加入1ml 0.01 N HCl/10％SDS将细胞溶解，然后用ELISA读板器检测溶胞产物在570nm检测波长(参照，630nm)的吸光度。细胞的存活力通过将所得吸光度与对照细胞的吸光度进行比较来表示。
制备重组ARHCL1和NFXL1蛋白质。为了生成针对ARHCL1或NFXL1的特异性抗体，我们制备了重组ARHCL1和NFXL1蛋白质。其部分编码序列通过RT-PCR采用如下引物组进行扩增：用于ARHCL1的N末端区(ARHCL1-N)：5’-GGCGAATTCGTAATATGCTCACTCGAGTGAAAT-3’(SEQ ID NO：82)和5’-GTTGAATTCCGTGTTCTCAGGCT-3’(SEQ ID NO：83)，用于ARHCL1的C末端区(ARHCL1-C)：5’-GCGGAATTCC TGCTGCAGCA CCACAT-3’(SEQID NO：84)和5’-ACAGCGGCCGCTTTCATGACAGCTTG-3’(SEQ ID NO：85)，用于NFXL1的N末端区(NFXL1-N)5’-ACAGAATTCGGGATGGAAGCTTC-3’(SEQ ID NO：86)和5’-ATACTCGAGAGGAGGTTTAAATTCACGCTC-3’(SEQ ID NO：87)，而用于NFXL1的C末端区(NFXL1-C2)：5’-CACGAATTCA AGGTAAAACTTAGATGTCCT-3’(SEQ ID NO：88)和5’-GAGCTCGAGT TTATGTTTTTGCCATAGTGA TAG-3’(SEQ ID NO：89)。纯化所述产物，用EcoRl(ARHCL1-N)，EcoRl和NotI(ARHCL1-C)，或EcoRl和Xhol(NFXL1-N和NFXL1-C2)进行消化，然后克隆至pGEX6P-1(pGEX-ARHCL1-N或pGEX-ARHCL1-C)或pET28a(pET-NFXL1-N或pET-NFXL1-C2)载体适宜的克隆位点。将质粒pGEX-ARHCL1-N，pGEX-ARHCL1-C，pET-NFXL1-N，或pET-NFXL1-C2转化至大肠杆菌DH10B(Life Technologies，Inc.)或BL21密码子+(codon plus)(Novagen)细胞中。通过加入IPTG来诱导重组蛋白质，然后根据厂商提供的步骤从提取物中进行纯化。
酵母双杂交试验。采用MATCHMAKER GAL4双杂交系统(BDBioscience)，按照厂商提供的步骤实施酵母双杂交测定。我们将ARHCL1或NFXL1的部分编码序列克隆至pAS2-1载体的EcoRl-Xhol位点(pAS2-ARHCL1-N，-ARHCL1-C，-NFXL1-N，和-NFXL1-C2)。我们还采用下列引物组：5’-TGTGAATTCGCCATGGGAGAGGC-3’(SEQ ID NO：90)和5’-TAAGGATCCCGTGCGGCGCCGCTT-3’(SEQ ID NO：91)，以pcDNA3.1-C20orf20作为模板，通过PCR扩增了C20orf20的完整编码区，然后产物克隆至pAS2-1载体(pAS2-C20orf20)的EcoRI-BamHI位点。我们还将CCPUCC1的完整编码序列克隆至pAS2-1载体(pAS2-CCPUCC1)的EcoRI位点。我们用pAS2-ARHCL1-N、pAS2-ARHCL1-C、pAS2-NFXL1-N、或pAS2-NFXL1-C2做饵(bait)从人睾丸MATCHMAKER cDNA文库中筛选出5×105个克隆，以pAS2-C20orf20做饵从文库中筛选出1.9×106个克隆，而以pAS2-CCPUCC1做饵从文库中筛选出1.1×106个克隆(BD Bioscience)。
免疫沉淀测定。通过RT-PCR，采用一组引物5’-CATGAATTCCGGCCATGGCG-3’(SEQ ID NO：92)和5’-CATCTCGAGTCAGGTCTGGGCTC-3’(SEQ ID NO：93)来扩增Zyxin的全部编码区。纯化PCR产物，用EcoRl和Xhol消化，然后克隆至pCMV-HA载体中。将MGC10334或CEMPC1的完整编码区以及BRD8的C末端区从cDNA文库中分离的阳性克隆亚克隆至pCMV-HA载体(pCMV-HA-MGC10334，pCMV-HA-CEMPC1，和pCMV-HA-BRD8)中。将来自分离的阳性克隆的核丛生蛋白的C末端区亚克隆至pFlag载体。我们用pFlag-CMV，pFlag-ARHCL1，pCMV-HA，pCMV-HA-Zyxin或其组合转染HeLa细胞，用pFlag-CMV，pFlag-NFXL1，pCMV-HA，pCMV-HA-MGC10334，pCMV-HA-CEMPC1或其组合转染COS7细胞，用pFlag-CMV，pFlag-C20orf20，pCMV-HA，pCMV-HA-BRD8或其组合转染COST细胞，用pcDNA-myc，表达myc标记的(tagged)CCPUCC1的pcDNA-CCPUCC1-myc，pFlag-CMV，pFlag-丛生蛋白，或其组合转染COST细胞。细胞用PBS洗涤，然后在包含150mM NaCl，0.5％NP-40，10mMTris-HCl pH7.8，和无EDTA的1×完全蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche)的TNE缓冲液中裂解。在通常的免疫沉淀反应中，300μg完全细胞提取物与1μg抗FLAG M2(SIGMA)或抗HA抗体，20μl蛋白质G琼脂糖(Sepharose)珠(Zymed)于4℃保温2小时。将所述珠在1ml TNE缓冲液中洗涤四次，然后通过在Laemmli Sample Buffer中煮沸来洗脱与该珠结合的蛋白质。通过SDS-PAGE分离沉淀的蛋白质，然后用抗myc抗体、抗-HA抗体或兔抗FLAG抗体实施免疫印迹分析。
表达NFXL1-siRNA，C20orf20-siRNA，和CCPUCC1-siRNA的质粒的构建及其效果。为了制备表达短干扰RNA(siRNA)的质粒载体，我们采用引物组，并以人胎盘DNA作为引物，通过PCR扩增H1RNA或U6snRNA基因的包含其启动子区的基因组片段，所述引物组为：对于H1RNA，5’-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3’(SEQ ID NO：94)和5’-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3’(SEQ ID NO：95)，对于U6snRNA，5’-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’(SEQ ID NO：96)和5’-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3’(SEQ ID NO：97)。纯化产物，然后采用TA克隆试剂盒(Invitrogen)，根据厂商提供的方案将其克隆至pCR2.0质粒载体中。将包含H1RNA或U6snRNA的BamHI和XhoI片段置于pcDNA3.1(+)中的核苷酸56和1257之间，所述片段已用5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQ ID NO：98)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ ID NO：99)通过PCR进行扩增。连接的DNA成为PCR扩增的模板，所述PCR扩增使用如下引物：对于H1RNA为5’-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAC-3’(SEQ ID NO：100)和5’-TTTAAGCTTGAA
GACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3’(SEQ ID NO：101)，或对于U6snRNA：5’-TTTAAGCTTG AAGACTATTT TTACATCAGGTTGTTTTTCT-3’(SEQ ID NO：102)和5’-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQ ID NO：103)。用HindIII消化产物，然后自我连接(selfligate)从而生成psiH1BX3.0或psiU6BX3.0载体质粒。参照质粒，psiH1BX-EGFP和psiU6BX-EGFP通过将5’-CACCGAAGCAGCACGACTTC TTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCG
TGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO：104)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTT
CTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO：105)的双链寡核苷酸分别克隆至psiH1BX3.0或psiU6BX载体中的BbsI位点来制备。通过将双链寡核苷酸克隆至psiU6BX3.0载体中制备表达NFXL1-siRNA的质粒。用于NFXL1-siRNA的寡核苷酸是：对于psiU6BX-NFXL1D，使用5’-CACCAGAAAGATTGTCCCTG GCCTTCAAGA GAGGCCAGGGACAATCTTTC T-3’(SEQ ID NO：106)和5’-AAAAAGAAAG ATTGTCCCTGGCCTCTCTTG AAGGCCAGGG ACAATCTTTC T-3’(SEQ IDNO：107)(siRNA的靶序列是SEQ ID NO：122)；
对于psiU6BX-NFXL1E，使用5’-CACCGGAGAT GAAGATTTTGAAGTTCAAGA GACTTCAAAA TCTTCATCTCC-3’(SEQ ID NO：108)和5’-AAAAGGAGAT GAAGATTTTG AAGTCTCTTG AACTTCAAAATCTTCATCTCC-3’(SEQ ID NO：109)(使用siRNA的靶序列是SEQ IDNO：123)；
对于psiU6BX-NFXL1F，使用5’-CACCGAAGAA CAGGAAAAGAGATTTCAAGA GAATCTCTTT TCCTGTTCTT C-3’(SEQ ID NO：110)和5’-AAAAGAAGAA CAGGAAAAGA GATTCTCTTG AAATCTCTTTTCCTGTTCTT C-3’(SEQ ID NO：111)(siRNA的靶序列是SEQ ID NO：124)，和
对于psiU6BX-NFXL1G，使用5’-CACCCCAGAAGGTAAAACTTAGATTCAAGAGATCTAAGTTTTACCTTCTGG-3’(SEQ ID NO：112)和5’-AAAACCAGAA GGTAAAACTT AGATCTCTTG AATCTAAGTTTTACCTTCTG G-3’(SEQ ID NO：113)(所述siRNA的靶序列是SEQ IDNO：125)，和
对于psiU6BX-NFXL1H，使用5’-CACCGTATGTGAGCGTGAATTTATTCAAGAGATAAATTCACGCTCACATAC-3’(SEQ ID NO：114)和5’-AAAAGTATGTGAGCGTGAAT TTATCTCTTG AATAAATTCA CGCTCACATA C-3’(SEQ IDNO：115)(siRNA的靶序列是SEQ ID NO：126)。
通过将双链寡核苷酸克隆至psiH1BX3.0载体中来制备表达C20orf20-siRNA的质粒。用于C20orf20-siRNA的寡核苷酸是：5’-TCCCCCGACA CTTCCACATG ATTTTCAAGA GAAATCATGTGGAAGTGTCG G-3’(SEQ ID NO：116)和5’-AAAACCGACA CTTCCACATGATTTCTCTTG AAAATCATGT GGAAGTGTCG G-3’(SEQ IDNO：117)(psiH1BX-C20orf20，(siRNA的靶序列是SEQ ID NO：127)。
通过将双链寡核苷酸克隆至psiU6BX3.0载体来制备表达CCPUCC1-siRNAs的质粒。用于CCPUCC1-siRNA的寡核苷酸是：对于siRNA-2，使用5’-TCCCGCGACT AGAGACTCTG CAGTTCAAGAGACTGCAGAG TCTCTAGTCG C-3’(SEQ ID NO：118)和5’-TTTTGCGACTAGAGACTCTG CAGTCTCTTG AACTGCAGAG TCTCTAGTCG C-3’(SEQID NO：119)(siRNA的靶序列是SEQ ID NO：128)；
对于siRNA-3，使用5’-TCCCGACCAT CATAGGATGG AGCTTCAAGAGAGCTCCATC CTATGATGGT C-3’(SEQ ID NO：120)和5’-TTTTGACCATCATAGGATGG AGCTCTCTTG AAGCTCCATC CTATGATGGT C-3’(SEQ IDNO：121)(siRNA的靶序列是SEQ ID NO：129)。
采用FuGENE6试剂(Roche)或Nucleofector试剂(Alexa)，按照供应商推荐的方法，将质粒psiU6BX-NFXL1、psiU6BX-EGFP、psiH1BX-C20orf20、psiH1BX-EGFP或psiH1BX-模拟转染至SNU-C4细胞中，并将psiU6BX-CCPUCC1-2、psiU6BX-CCPUCC1-3，或psiU6BX-模拟质粒转染至HCT116和SNUC4细胞中。转染后48小时，从细胞中提取总RNA。将细胞在400-800μm/ml遗传霉素(genetiein)(G418)存在下培养14日，然后如其它部分所述用姬姆萨氏溶液(MERCK，德国)染色。
制备CCPUCC1的多克隆抗体。在大肠杆菌中制备重组标记的CCPUCC1蛋白质，然后采用Pro BondTM组氨酸树脂，按照厂商推荐的方法(Invitrogen)将所述蛋白质从细胞中纯化。用所述重组蛋白质接种兔以进行免疫。从血清中纯化抗CCPUCC1的多克隆抗体。将用pcDNA-myc-CCPUCC1转染的细胞的提取物和来自结肠癌细胞系的提取物通过10％SDS-PAGE进行分离并用所述抗体进行免疫印迹。将HRP偶联的山羊抗兔IgG(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)用作ECL检测系统的(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)的第二抗体。采用抗CCPUCC1抗体进行的免疫印迹显示myc标记的CCPUCC1的55kD条带，其与用抗myc抗体检测到的图谱相同。
免疫组织化学。采用抗CCPUCC1抗体进行免疫组织化学染色。根据厂商推荐的方法，用SAB-PO过氧化物酶免疫染色系统(Nichirei，Tokyo，日本)处理石蜡包埋的组织切片。通过将所述载片在枸橼酸盐缓冲液中于微波炉内以700W预加热10分钟，从脱石蜡的和再水合的组织中收集抗原。
统计分析。对数据进行方差分析(ANOVA)和Scheffé’s F检验。
实施例2：鉴定与结肠癌或胃癌相关联的基因
采用包含23040个基因的cDNA微阵列对11个结肠癌组织和其相应结肠非癌性粘膜组织的表达分布图进行分析。该分析可鉴别大量基因表达水平，所述基因表达水平在癌组织中与在相应非癌性组织中相比通常是升高的。其中，在通过选择基准的所有七个病例中，与EST(KIAA1157)、UniGene群中的Hs.21894(http://www.ncbi.blm.noh.gov/UniGene)对应、内部登录号为B6647的基因在癌组织中与在相应非癌性粘膜中相比，在2.60-8.03的上升率范围内上调(图1a)。在通过选择基准(cut-off filter)的所有四个病例中，与EST(IMAGE4286524)，UniGene群中的Hs.351839对应、内部登录号为D7610的第二新基因在癌组织中的表达水平与在相应非癌性粘膜中相比，在1.25-2.44的上升率范围内上升(图1b)。通过选择基准的十个病例中的九个当中，与推定的ORF、UniGene群中的Hs.143954对应的内部登录号为C4821的第三新基因在癌组织中与在相应非癌性粘膜中相比，在1.31-3.83的上升率范围内上调(图1c)。通过选择基准的三个病例中的两个当中，与EST、XM_050184对应、内部登录号为A8108的第四新基因在癌组织中与在相应非癌性粘膜中相比，在1.19-5.90的上升率范围内上调(图1d)。此外，在通过选择基准的所有七个病例中，与ETS、UniGene群中的Hs.155995对应。内部登录号为B9223的第五新基因在癌组织中与其相应非癌性粘膜相比，在1.49-3.5的上升率范围内上调(图1e)。在通过选择基准的单个病例中，与Ly6E对应、内部登录号为C3703的命名过的基因在癌组织中的表达水平与在相应非癌性粘膜中相比，以2.6的上升率升高(图1f)，而在通过选择基准的四个病例的两个中，与Nkd1对应、内部登录号为D9092的另一经过命名的基因在癌组织中的表达水平与在相应非癌性粘膜中相比在1.24-2.63的上升率范围内升高(图1g)。为说明微阵列的结果，实施了半定量RT-PCR，其揭示了B6647在另外20个结肠癌的19个中的表达与相应正常粘膜相比升高(图2a)，20个肿瘤的12个中D7610的表达升高(图2b)，在20个肿瘤的15个中C4821的表达升高(图.2c)，而在所有8个检测的肿瘤中A8108的表达增加(图2d)，在28个检测的肿瘤的15个肿瘤中B9223的表达增加(图2e)，在13个检测的肿瘤的11个中Ly6E的表达升高(图2f)，而在所有检测的肿瘤中Nkd1的表达均升高(图2g)。
实施例3：通过降低ARHCL1的表达抑制结肠癌细胞的生长
ARHCL1的鉴定，表达和结构。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)用B6647的序列在公共数据库中进行的同源性检索鉴定了EST包括XM_051093以及具有染色体带12q13.13(GenBank登录号NT-009711)的基因组序列。为了测定该基因的编码序列，采用GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)和Gene Recognition和Assembly Internet Link(GLAIL，http://compbio.ornl.gov/Grail-1.3/)程序来预测基因组序列中的候补外显子序列，并实施外显子联结试验(exon-connection experiments)。结果，获得6462个核苷酸的组装序列，其包含编码推定514个氨基酸蛋白质的1535个核苷酸的开放阅读框(GenBank登录号AB084258)，将该基因命名为ARHCL1(Ras同源物基因家族，成员C样1)。第一ATG与以下序列侧接：与在真核生物中用于启始翻译的共有序列一致的序列(ATTATGC)，以及上游框内终止密码子(in-frame stop codon upstream)。ARHCL1 cDNA与该基因组序列的比较显示出该基因由11个外显子组成。此外，以ARHCL1的PCR产物作为探针实施多组织northern-印迹分析，检测到在前列腺、脑和胰中表达的6.5kb转录物(图3a)。预测的ARHCL1蛋白质的氨基酸序列显示出与人类假定(hypothetical)蛋白质DKFZp434P1514.1具有68.7％的同一性，且与小鼠RIKEN cDNA 2310008J22具有61.45％的同一性。采用简单模块结构研究工具(SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)对蛋白质基序的研究揭示了预测的蛋白质包含丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，家族2C，催化区(密码子68-506)(图3b)。
myc-或Flag标记的ARHCL1蛋白质的亚细胞定位。为了研究ARHCL1蛋白质的亚细胞定位，将表达myc标记的ARHCL1蛋白质(pDNAmyc/His-ARHCL1)或Flag标记的ARHCL1蛋白质(pFLAG-ARHCL1)的质粒被瞬时转染至HCT15细胞中。采用细胞提取物以及抗myc或抗Flag抗体的Western印迹分析揭示了分别与标记的蛋白质对应的56-和60-KDa的条带(图4a)。随后用这些抗体对细胞进行的免疫组织化学染色表明该蛋白质主要存在于细胞质中(图4b)。
目的在于降低ARHCL1表达的反义S-寡核苷酸对结肠癌细胞的生长抑制。为了检测抑制ARHCL1是否能导致结肠癌细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成与ARHCL1相应的五对对照及反义S-寡核苷酸，然后将其转染至SNU-C4结肠癌细胞中，该结肠癌细胞在所检测的11个结肠癌细胞系中表达大量的ARHCL1。在这五个反义S-寡核苷酸中，ARHCL1-AS1在转染12小时后与对照S-寡核苷酸(ARHCL1-R1)相比显著抑制了ARHCL1的表达(图5a)。转染后5日，转染了ARHCL1-AS1的存活细胞数显著低于用ARHCL1-R1转染的情况，这提示抑制ARHCL1降低了转染细胞的生长和/或存活力(图5b)。在三个独立试验中得到一致的结果。在LoVo人结肠癌细胞中观察到ARHCL1-R1的相似的生长抑制(图5b)。
重组ARHCL1蛋白质的制备。为了生成ARHCL1的特异性抗体，我们构建了表达GST融合的N末端ARHCL1(ARHCL1-N)和C末端ARHCL1(ARHCL1-C)蛋白质的质粒(图6A)。当把这些质粒转化至大肠杆菌细胞中时，我们发现产生了重组蛋白质，其在SDS-PAGE上表现出预期大小，并通过免疫印迹得到证实(图6B)。
通过酵母双杂交系统筛选与ARHCL1相互作用的蛋白质。为了分析ARHCL1的功能，我们采用酵母双杂交筛选系统搜索了与ARHCL1相互作用的蛋白质。在显示可与ARHCL1的N末端区(ARHCL1-N)发生相互作用的75个阳性克隆中，有15、8、7、7和3个克隆分别是Zyxin、DTNB、MAGE-A12、PA28岷偷鞍酌柑
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28亚单位3。此外，在显示可与ARHCL1的C末端区(ARHCL1-C)相互作用的52个阳性克隆中，有2个克隆是FLJ25348。用pAS2-ARHCL1-N或pAS2-ARHCL1-C同时进行转化，6个克隆证实了其在酵母中的相互作用(图7)。
Zyxin与ARHCL1的N末端区在体内的相互作用。为了证实ARHCL1和Zyxin之间在体内的结合，我们在HeLa细胞中进行了免疫沉淀测定(图8A)。我们用pFlag-ARHCL1、pCMV-HA-Zyxin，或其组合来转染HeLa细胞，然后从所述细胞中提取蛋白质。用抗Flag抗体进行免疫沉淀，然后用抗HA抗体进行蛋白质印迹分析，证实了Zyxin和ARHCL1之间在体内的相互作用。
Flag标记的ARHCL1和HA标记的Zyxin在细胞中的共定位。为了检测ARHCL1和Zyxin是否在细胞中共定位，我们将pFlag-ARHCL1和pCMV-HA-Zyxin共转染至SW480细胞中，然后通过免疫组织化学染色检测其亚细胞定位(图8B)。用抗Flag抗体的染色显示出Flag标记的ARHCL1定位于细胞核和细胞质中。此外，用抗FLAG和抗HA抗体的染色显示出HA标记的Zyxin与ARHCL1共定位在细胞核和细胞质中(图8B)。该数据支持ARHCL1和Zyxin在细胞核和细胞质中相互作用的观点。
实施例4：通过降低NFXL1的表达抑制结肠癌细胞的生长
NFXL1的鉴定，表达，和结构。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序用D7610的序列在公共数据库中进行的同源性搜索鉴定了EST，其包含BC018019以及具有染色体带4p12(GenBank登录号AC107068)的基因组序列。为了测定D7610 cDNA的5’部分的序列，采用所述序列在Gene Recognition和Assembly Internet Link程序中预测候补外显子序列。结果，获得3,707个核苷酸的组装序列，其包含编码推定的911个氨基酸蛋白质的2,736个核苷酸的开放阅读框(GenBank登录号AB085695)，将其命名为NFXL1(核转录因子，X-盒结合样1)。第一ATG侧接于与真核生物中用于启始翻译的共有序列一致的序列(GGGATGG)。NFXL1 cDNA与所述基因组序列的比较显示出该基因由23个外显子组成。此外，以NFXL1的PCR产物作为探针实施多组织northern-印迹分析，检测到在睾丸和甲状腺中表达的3.8kb转录物(图9a)。预测的NFXL1蛋白质的氨基酸序列显示出与人NFX1(核转录因子，X-盒结合1)具有35.3％的同一性。采用简单模块结构研究工具对蛋白质基序的研究揭示了预测的蛋白质包含环指结构域(密码子160-219)，12NFX型Zn-指结构域(密码子265-794)，卷曲螺旋区(密码子822-873)，以及跨膜区(密码子889-906)(图9b)。
目的在于降低NFXL1表达的反义S-寡核苷酸对结肠癌细胞生长的抑制。为了检测抑制NFXL1是否可导致结肠癌细胞的生长停滞和/或细胞死亡，根据NFXL1合成四对对照及反义S-寡核苷酸，然后将其转染至SW480和SNU-C4结肠癌细胞中，所述细胞在检测的11个结肠癌细胞系中表达大量的NFXL1。转染后五天，用NFXL1-AS转染的存活细胞的数量显著低于用NFX-R转染的细胞，这提示抑制NFXL1可降低转染的细胞的生长和/或存活(图10)。在三个独立试验中得到一致的结果。
表达NFXL1-siRNA的质粒对结肠癌细胞生长的影响。最近发现，在哺乳动物细胞中，由20或21-聚(mer)双链RNA(dsRNA)与19个互补性核苷酸以及胸苷或尿苷3’端互补二聚体组成的短干扰RNA(siRNA)已经显示出具有基因特异性基因沉默效应(gene silencing effect)，而不会诱导基因表达的总体改变。因此，我们构建了表达多种NFXL1-siRNA的质粒，并检测了其对NFXL1表达的影响。其中，psiU6BX-NFXL1H而非psiU6BX-NFXL1D、psiU6BX-NFXL1E、psiU6BX-NFXL1F或psiU6BX-NFXL1G显著抑制NFXL1在SNUC4细胞中的表达(图11A)。为了检测抑制NFXL1是否可以导致结肠癌细胞的生长抑制，我们用psiU6BX-NFXL1H或psiU6BX-EGFP转染了HCT116、SW480或SNUC4细胞。转染了psiU6BX-NFXL1H的存活细胞与转染了psiU6BX-EGFP的存活细胞相比显著减少，这提示NFXL1表达的降低抑制了结肠癌细胞的生长(图11B)。
NFXL1在哺乳动物细胞中的亚细胞定位。为了研究NFXL1蛋白质的亚细胞定位，在HCT116，SW480或COS7细胞中对HA标记的NFXL1实施荧光免疫组织化学染色。细胞用pCMV-HA-NFXL1转染，固定，用抗HA染色，并用罗丹明偶联的第二抗体进行显示。在细胞质中观察的信号显示出NFXL1在细胞质中的亚细胞定位(图12)。
制备重组NFXL1蛋白质为了生成NFXL1特异性抗体，我们构建了表达His标记的N末端NFXL1(NFXL1-N)和C末端NFXL1(NFXL1-C2)蛋白质的质粒(图13A)。当把这些质粒转化至大肠杆菌细胞中时，我们发现产生了重组蛋白质，其在SDS-PAGE上表现出预期大小，并通过免疫印迹得到证实(图13B和13C)。
通过酵母双杂交系统筛选与NFXL1相互作用的蛋白质。为了分析NFXL1的功能，我们采用酵母双杂交筛选系统搜索与NFXL1相互作用的蛋白质。在显示与NFXL1的N末端区(NFXL1-N)相互作用的145个阳性克隆中，9、7、6、3和3个克隆分别是DKFZp564J047、DKFZp434A1319、MGC10334、SOX30、CENPC1和FLJ25348。此外，在显示与NFXL1的C末端区(NFXL1-C2)相互作用的32个克隆中，8和5个克隆分别是FLJ36990和GBP2。同时用pAS2-NFXL1-N或pAS2-NFXL1-C进行转化，这8个鉴定的克隆证实了所述蛋白质与NFXL1在酵母中的结合(图14A，和14B)。
鉴定MGC10334和CENPC1为与NFXL1相互作用的蛋白质。为了证实NFXL1和MGC10334或CENPC1蛋白质之间在体内的结合，我们在COS7细胞中进行了免疫沉淀测定(图15)。我们用pFlag-NFXL1和pCMV-HA-MGC10334，pCMV-HA-CEMPC1或其组合来转染细胞，并从所述细胞提取蛋白质。用抗Flag抗体进行免疫沉淀，然后用抗HA抗体进行蛋白质印迹分析，证实了NFXL1与MGC10334或CENPC1在体内的相互作用。
实施例5：通过降低C20ORF20的表达抑制结肠癌细胞的生长
C20orf20的分离，构建和表达。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序用C4821的序列在公共数据库中进行的同源性搜索鉴定了EST，其包含BM922576以及具有染色体带20q13.3(GenBank登录号AL035669)的基因组序列。为了测定C4821 cDNA的5’部分的序列，在所述基因组序列中预测候补外显子序列，并采用GENSCAN以及基因识别和组装因特网链接(Gene Recognition and Assembly Internet Link)程序利用所述序列实施外显子联结。结果，获得1,634个核苷酸的组装序列，其包含编码推定的204个氨基酸蛋白质的615个核苷酸的开放阅读框，并将其命名为C20orf20(GenBank登录号AB085682)。将第一ATG侧接于与真核生物中翻译起始的共有序列一致的序列(GCCATGG)。C20orf20 cDNA与所述基因组序列的比较显示出该基因由5个外显子组成。此外，以C20orf20的PCR产物作为探针实施多组织northern-印迹分析，并检测到在睾丸和甲状腺中表达的1.8kb的转录物(图16a)。预测的C20orf20蛋白质的氨基酸序列显示出与小鼠RIKEN cDNA 1600027N09(XM_110403)具有96.6％的同一性。采用简单模块结构研究工具对蛋白质基序进行的搜索没有预测出任何已知的保守区(图16b)。
myc-或Flag标记的C20orf20蛋白质的亚细胞定位。为了研究C20orf20蛋白质的亚细胞定位，将表达myc标记的(pDNAmyc/His-C20orf20)C20orf20蛋白质或Flag标记的C20orf20蛋白质(pFLAG-C20orf20)的质粒瞬时转染至COS7细胞中。利用细胞提取物、用抗myc抗体进行的Western印迹分析揭示了分别与myc标记的蛋白质对应的主要30-kDa和次要25-Kda的条带，而用抗Flag抗体的所述分析揭示了与Flag标记的蛋白质相应的主要28-kDa和次要23-Kda的条带(图17a)。这些数据提示所标记蛋白质可能有翻译后的修饰。随后用这些抗体的细胞免疫组织化学染色表明标记的蛋白质主要存在于细胞核中(图17b)。
目的在于降低C20orf20表达的反义S-寡核苷酸对结肠癌细胞的生长抑制。为了检测抑制C20orf20是否能导致结肠癌细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成与C20orf20相应的四对对照和反义S-寡核苷酸，然后将其转染至SNU-C4结肠癌细胞中，该结肠癌细胞在所检测的11个结肠癌细胞系中表达大量的C20orf20。转染后5日，转染了C20orf20-A1或C20orf20-A2的存活细胞数显著低于转染了C20orf20-R1或C20orf20-R2的存活细胞数，这提示抑制C20orf20降低了转染的细胞的生长和/或存活力(图18)。在三个独立试验中得到一致的结果。
表达C20orf20-siRNA的质粒对结肠癌细胞生长的影响。为了研究C20orf20在癌细胞中的功能，我们构建了表达C20orf20-siRNA的质粒，并检测了其对C20orf20表达的影响。psiH1BX-C20orf20，psiH1BX-EGFP或psiH1BX-模拟对SNU-C4细胞的转染揭示出psiH1BX-C20orf20与psiH1BX-EGFP或psiH1BX-模拟相比显著抑制C20orf20在细胞中的表达(图19A)。为了检测抑制C20orf20是否能导致结肠癌细胞的生长抑制，我们用psiH1BX-C20orf20或psiH1BX-EGFP转染HCT116和SW480细胞。转染了psiH1BX-C20orf20的存活细胞与转染了psiH1BX-EGFP的那些相比显著减少，这提示C20orf20表达降低抑制了结肠癌细胞的生长(图19B)。
通过酵母双杂交筛选鉴定与C20orf20相互作用的蛋白质。为了阐明C20orf20的功能，我们采用酵母双杂交筛选系统搜索了与C20orf20相互作用的蛋白质。我们用表达C20orf20完整编码区的pAS2-C20orf20作饵筛选了来自人睾丸cDNA文库的1.9×106个克隆。通过随后的DNA测序，发现在175个阳性克隆中，发现有32个为编码溴结构域含有8(BRD8)的基因。此外，BRD8克隆均包含C端588个氨基酸区域，表明负责所述结合的区位于该区域内(图20A)。将表达BRD8的C端区的pAS2-C20orf20和pACT2-BRD8同时转染至酵母细胞在体外证明了C20orf20和BRD8的相互作用(图20B)。为在体内检测C20orf20和BRD8的结合，我们用表达Flag标记的C20orf20蛋白质的质粒(pFlag-C20orf20)单独或与表达HA标记的C端BRD8蛋白质的那些质粒(pCMV-HA-BRD8)一起转染COS7细胞，并实施例免疫沉淀试验。采用抗FLAG抗体的免疫沉淀和随后采用抗HA抗体的western印迹分析检测到与Flag标记的C20orf20相应的单个条带，这在体内确证了C20orf20和BRD8之间的相互作用(图20C)。
实施例6：通过降低CCPUCC1的表达抑制结肠癌细胞的生长
CCPUCC1的鉴定，表达和结构。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序利用B9223的序列在公共数据库中实施的同源性检索鉴定了新人类基因(该基因已被注释为与KIAA0643蛋白质、克隆MGC：9638(GenBank登录号BC017070)相似)，以及具有染色体带16p12(GenBank登录号NT_010552.9)的基因组序列。为了测定该基因的编码序列，采用GENSCAN和基因识别和组装互联网链接在该基因组序列中预测候补外显子序列，并实施外显子联结试验。结果获得1681个核苷酸的组装序列，其包含编码推定413个氨基酸蛋白质的1239个核苷酸的开放阅读框。第一ATG与以下序列侧接：与真核生物中翻译起始的共有序列一致的序列(GTTATGT)以及上游的框内终止密码子。cDNA与该基因组序列的比较显示出该基因由11个外显子组成。预测的蛋白质的氨基酸序列显示出与小鼠RIKEN cDNA 2610111M03(AK011846)89％的同一性。由于采用简单模块结构研究工具对蛋白质基序的搜索揭示了预测的蛋白质包含卷曲螺旋区(密码子195-267)，我们将该基因命名为CCPUCC1(在结肠癌中上调的卷曲螺旋蛋白质)。
myc标记的CCPUCC1蛋白质的亚细胞定位。为了研究CCPUCC1蛋白质的亚细胞定位，将表达myc标记的(pDNAmyc/His-CCPUCC1)CCPUCC1蛋白质的质粒瞬时转染至COS7细胞中。采用细胞提取物和抗myc抗体的Western印迹分析显示了与标记的蛋白质相对应的60-KDa条带(图21a)。随后用所述抗体对细胞进行免疫组织化学染色，表明该蛋白质主要存在于细胞质中(图21b)。
目的在于降低CCPUCC1表达的反义S-寡核苷酸对结肠癌细胞的生长抑制。为了检测抑制CCPUCC1是否能够导致结肠癌细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成与CCPUCC1相应的五对对照和反义S-寡核苷酸，然后将其转染至LoVo结肠癌细胞中，该结肠癌细胞在所检测的11个结肠癌细胞系中表达大量的CCPUCC1。在所述五种反义S-寡核苷酸中，转染12小时后，CCPUCC1-AS3与对照S-寡核苷酸(CCPUCC1-S3)相比显著抑制了CCPUCC1的表达(图22a)。转染后5日，转染了CCPUCC1-AS3的存活细胞数量显著低于转染了CCPUCC1-S3的存活细胞数，这提示抑制CCPUCC1降低了转染细胞的生长和/或存活力(图22b)。在三个独立试验中得到一致的结果。在SW480人结肠癌细胞中观察到相似的CCPUCC1-AS3的生长抑制。我们还采用LoVo细胞以CCPUCC1-AS3或CCPUCC1-S3实施了MTT试验，其证实了相对于CCPUCC1-S3，对CCPUCC1-AS3的响应降低了细胞生存力(图22c)。
表达CCPUCC1-siRNA的质粒对结肠癌细胞生长的影响。为了研究CCPUCC1在癌细胞中的功能，我们构建了表达CCPUCC1-siRNA的质粒并检测了其对CCPUCC1表达的影响。与psiU6BX-CCPUCC1-2或psiU6BX-模拟相比，用psiU6BX-CCPUCC1-2，psiU6BX-CCPUCC1-3或psiU6BX-模拟转染SNU-C4或HCT116结肠癌细胞的显示了psiU6BX-CCPUCC1-3显著抑制CCPUCC1在细胞中的表达(图23A，24A)。为了检测抑制CCPUCC1是否可导致结肠癌细胞的生长抑制，我们用psiU6BX-CCPUCC1-3或psiU6BX-模拟转染这些细胞。转染了psiU6BX-CCPUCC1-3的存活细胞数与转染了psiU6BX-CCPUCC1-2的相比显著减少，这提示CCPUCC1表达的降低抑制SNU-C4细胞的生长(图23B)以及HCT116细胞的生长(图24B)。
CCPUCC1在结肠癌细胞系中的表达。为了检测CCPUCC1的表达并研究其功能，我们制备了抗CCPUCC1的多克隆抗体。采用结肠癌细胞(包括HCT116，SNUC4，和SW480)的全部提取物的Western印迹分析显示出与CCPUCC1对应的53kDa条带(图25)。内源CCPUCC1蛋白质的大小与用抗myc抗体检测的myc标记的CCPUCC1的大小非常相似(图25)。
CCPUCC1在结肠癌细胞和组织中的亚细胞定位。为了研究其亚细胞定位，在HCT116细胞中实施CCPUCC1的荧光免疫组织化学染色。细胞用抗CCPUCC1染色并用与第二抗体偶联的荧光素显示。信号主要在细胞核中观察到(图26)。
CCPUCC1在结肠的正常上皮，腺癌和腺瘤中的表达。为了比较CCPUCC1蛋白质在非癌性上皮细胞和肿瘤细胞的表达水平，对石蜡包埋的临床组织进行免疫组织化学染色。癌细胞用抗CCPUCC1抗体的染色比非癌性上皮细胞强(图27A)。我们还研究了其在腺瘤中的表达，显示在腺瘤细胞中为弱信号(图27B)。
通过酵母双杂交筛选系统鉴定与CCPUCC1相互作用的蛋白质。为了阐明CCPUCC1的致癌机理，我们采用酵母双杂交筛选系统研究了与CCPUCC1相互作用的蛋白质。在鉴定的阳性克隆中，核丛生蛋白(nCLU)的C端区通过在酵母细胞中同时采用pAS2-CCPUCC1和pACT2-丛生蛋白进行转化(图28A)而与CCPUCC1发生相互作用。阳性克隆包含密码子252-449，这表明nCLU中负责相互作用的区域位于该区内。
为了证实CCPUCC1和nCLU在体内的结合，我们用表达myc标记的CCPUCC1的质粒(pcDNA-CCPUCC1-myc)单独或与表达FLAG标记的C端nCLU的质粒(pFlag-丛生蛋白)一起用转染COS7细胞，并实施免疫沉淀试验。采用抗FLAG抗体的免疫沉淀和采用抗myc抗体的western印迹显示了与CCPUCC1对应的单个条带，而采用抗myc抗体的免疫沉淀和采用抗FLAG抗体的western印迹显示了与nCLU对应的条带，这表明CCPUCC1与nCLU在体内的结合(图28B，28C)。
myc标记的CCPUCC1和FLAG标记的丛生蛋白在细胞中的共定位。为了检测CCPUCC1和nCLU是否在细胞中共定位，我们用pcDNA-CCPUCC1-myc和pFlag-丛生蛋白共转染COS7细胞，然后通过免疫组织化学染色检测其亚细胞定位。用抗myc抗体的染色显示出标记的CCPUCC1蛋白质定位于细胞核中，而用抗FLAG抗体的染色表明标记的nCLU定位于细胞核中(图29A，29B，29D)。用pcDNA-CCPUCC1-myc和pFlag-丛生蛋白的共转染以及用所述抗体的二重染色揭示了这些蛋白质定位于细胞核中，这支持CCPUCC1和nCLU在细胞中相互作用的观点(图29C)。
实施例7：通过降低LY6E的表达抑制结肠癌细胞的生长
Ly6E的鉴定和结构。采用National Center for Biotechnology Information中的BLAST程序用C3703的序列在公共数据库中实施的同源性检索鉴定了人基因Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E)(GenBank登录号U66711)，以及具有染色体带8q24.3(GenBank登录号NT_008127)的基因组序列。Ly6EcDNA与该基因组序列的比较揭示出该基因由四个外显子组成。
myc标记的Ly6E蛋白质的亚细胞定位。为了研究Ly6E蛋白质的亚细胞定位，将表达myc标记的Ly6E蛋白质的质粒(pDNAmyc/His-Ly6E)瞬时转染至SW480细胞中。采用细胞提取物和抗myc抗体的Western印迹分析显示了与标记的蛋白质对应的30-KDa条带(图30a)。随后用所述抗体进行细胞免疫组织化学染色，表明该蛋白质主要存在于细胞质中(图30b)。
目的在于降低Ly6E表达的反义S-寡核苷酸对结肠癌细胞的生长抑制。为了检测抑制Ly6E是否能导致结肠癌细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成与Ly6E相应的五对对照和反义S-寡核苷酸，然后将其转染至LoVo或SNU-C4结肠癌细胞中，该结肠癌细胞在所检测的11个结肠癌细胞系中表达大量的Ly6E。转染12小时后，在所述五种反义S-寡核苷酸中，Ly6E-AS1或-AS5与对照S-寡核苷酸(Ly6E-S1或-S5)相比，显著抑制Ly6E在LoVo细胞中的表达(图31a)。转染后5日，转染了Ly6E-AS1或Ly6E-AS5的存活细胞数显著低于转染了Ly6E-S1或Ly6E-S5的存活细胞数，这提示抑制Ly6E降低了转染的LoVo细胞的生长和/或存活力(图31b)。在三个独立试验中得到一致的结果。此外，我们采用LoVo细胞用S-寡核苷酸(Ly6E-AS1，AS5，-S1或-S5)实施了MTT试验，其证实了相对于Ly6E-S1或-S5，对Ly6E-AS1或-AS5的响应降低了细胞生存力(图31c)。在SNU-C4细胞中获得相似结果。
实施例8：通过降低NKD1的表达抑制结肠癌细胞的生长
Nkd1的鉴定，结构和表达。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序用D9092的序列在公共数据库中实施的同源性检索鉴定了人类基因Nkd1(Naked1)(GenBank登录号AB062886)，染色体带16p12(GenBank登录号NT_010493)的基因组序列。采用Nkd1的PCR产物作为探针实施多组织northern印迹分析，并检测到在脾，睾丸和卵巢中表达的4.0kb转录物(图32)。
目的在于降低Nkd1表达的反义S-寡核苷酸对结肠癌细胞的生长抑制。为了检测抑制Nkd1是否可以导致结肠癌细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成与Nkd1相应的四对对照和反义S-寡核苷酸，然后将其转染至所检测的11个结肠癌细胞系中表达大量Nkd1的LoVo或SW480结肠癌细胞中。转染12小时后，在所述五种反义S-寡核苷酸中，Nkd1-AS4或-AS5与对照S-寡核苷酸Nks1-S4或-S5相比显著抑制了Nkd1的表达(图33a)。转染后5日，转染了Nkd1-AS4和Nkd1-AS5的存活细胞数量显著低于分别转染了Nkd1-S4或Nkd1-S5的存活细胞数，这提示抑制Nkd1降低了转染的细胞的生长和/或存活力(图33b)。在三个独立试验中得到一致的结果。我们还采用LoVo细胞和SW480细胞用S-寡核苷酸(Nkd1-AS4，-AS5，-S4或-S5)实施了MTT试验，其证实了相对于Nkd1-S4或-S5，对Nkd1-AS4或-AS5的响应降低了细胞生存力(图33c)。
实施例10：通过降低LAPTM4β的表达抑制胃癌细胞的生长
鉴定其表达在人类胃癌中通常发生上调的基因B0338。采用包含23040个基因的cDNA微阵列分析20种胃癌组织及其相应非癌性胃粘膜组织的表达分布图。该分析可鉴定大量基因表达水平，癌组织中的所述基因表达水平通常高于相应非癌性组织中的所述水平。其中，在通过选择基准的十六例中，与LAPTM4β相对应的内部登录号为B0338的基因在癌组织中与在相应非癌性粘膜中相比，在1.03-16的上升率范围内上调(图34a)。
为说明所述微阵列的结果，实施了半定量RT-PCR，显示与相应正常粘膜相比，LAPTM4β的表达在另外12个胃癌的8个中增加(图34b)。
LAPTM4β的表达和结构。采用LAPTM4β的PCR产物作为探针实施多组织northern印迹分析，并检测到在脾，卵巢，心脏和骨骼肌中相对高表达的2.4kb转录物(图35a)。LAPTM4β蛋白质的氨基酸序列显示出与人类LAPTM4A的47％的同一性且与小鼠Laptm4b97％的同一性。采用简单模块结构研究工具对蛋白质基序进行搜索，显示预测的蛋白质包含四个跨膜区(图35b)。
myc-或Flag标记的LAPTM4β蛋白质的亚细胞定位。为了研究LAPTM4β蛋白质的亚细胞定位，将表达myc标记的(pDNAmyc/His-LAPTM4β)或Flag标记的LAPTM4β蛋白质(pFLAG-LAPTM4β)的质粒瞬时转染至NIH3T3细胞中。采用细胞提取物以及抗myc或抗Flag抗体的Western印迹分析显示与所述标记的蛋白质相对应的26-KDa条带。随后用这些抗体进行细胞免疫组织化学染色，表明所述标记的蛋白质主要存在于高尔基体中(图36)。
目的在于降低LAPTM4β表达的反义S-寡核苷酸对胃癌细胞的生长抑制。为了检测抑制LAPTM4β是否能导致胃癌细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成与LAPTM4β相应的对照和反义S-寡核苷酸，然后将其转染至所检测的6个胃癌细胞系中表达大量LAPTM4β的MKN1或MKN7胃癌细胞中，转染12小时后，反义S-寡核苷酸LAPTM4β-AS与对照S-寡核苷酸(LAPTM4β-S，-SCR或-REV)相比显著抑制了LAPTM4β的表达(图37a)。转染后6日，转染了LAPTM4β-AS的存活细胞数显著低于转染了对照S-寡核苷酸(LAPTM4β-S，-SCR，-REV)的存活细胞数，这提示抑制LAPTM4β降低了转染的细胞的生长和/或存活力(图37b)。在三个独立试验中得到一致的结果。我们还采用MKN1和MKN7细胞以及S-寡核苷酸(LAPTM4β-AS，-S，-SCR，或-REV)实施了MTT试验，其证实了与LAPTM4β-S，-SCR，或-REV相比，对LAPTM4β-AS的响应降低了细胞生存力(图37c)。在MKN28，-74和St-4人胃癌细胞中观察到由LAPTM4β-AS产生的相似的生长抑制。
实施例11：通过降低LEMD1的表达对结肠癌细胞的生长抑制
LEMD1的鉴定，表达和结构。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序用A8108的序列在公共数据库中的同源性检索鉴定了EST，其包含XM_050184及具有染色体带1q31(GenBank登录号NT_02190)的基因组序列。为了测定该基因的编码序列，采用GENSCAN和基因识别和组装因特网链接在基因组序列中预测候补外显子序列，并实施外显子联结试验。结果，获得733个核苷酸的组装序列，该序列包含编码29个氨基酸蛋白质的90个核苷酸的开放阅读框(GenBank登录号：AB084765)。由于采用Simple Modular Architecture Research Tool对蛋白质基序的搜索显示了该预测的蛋白质包含LEM基序(密码子1-27)，我们将该基因命名为LEMD1(包含1的LEM结构域)(图38a)。第一ATG与以下序列侧接：与真核生物中起始翻译的共有序列一致的序列(ATCATGG)，以及上游的框内终止密码子。LEMD1 cDNA与基因组序列的比较显示出该基因由4个外显子组成。最终鉴定了由外显子1，2和4组成的选择性剪接体(alternatiolspliaing)。该转录物包含编码67个氨基酸蛋白质的204个核苷酸的开放阅读框(GenBank登录号：AB084764)。
此外，我们以LEMD1的PCR产物作为探针实施多组织northern-印迹分析，检测到在睾丸而不在其它组织中表达的0.9kb转录物(图38b)。预测的LEMD1蛋白质的氨基酸序列显示出与GenBank登录号XM_050184的胸腺生成素相似的人类假定蛋白质具有62％的同一性。
目的在于降低LEMD1表达的反义S-寡核苷酸对结肠癌细胞的生长抑制。为了检测抑制LEMD1是否能导致结肠癌细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成与LEMD1相应的五对对照和反义S-寡核苷酸，然后将其转染至所检测的7个结肠癌细胞系中表达大量LEMD1的HCT116结肠癌细胞。转染后5日，转染了反义S-寡核苷酸LEMD1-AS1、2、3、4，或5的存活细胞数显著低于转染了对照S-寡核苷酸LEMD1-REV1、2、3、4，或5的存活细胞数，这提示抑制LEMD1降低了转染的细胞的生长和/或存活力。在三个独立试验中得到一致的结果(图39)。
工业实用性
如本文所述，通过激光俘获切割和全基因组cDNA微阵列的组合得到的结肠癌或胃癌的基因-表达分析，鉴定了可作为癌症预防和治疗靶的具体基因。根据这些差异性表达的基因的亚组的表达，本发明提供了用于鉴定或检测结肠癌或胃癌的分子诊断标记。
本文所述方法还可用于鉴定预防，诊断和治疗结肠癌或胃癌的其它分子靶。本文所报道的数据增加了对结肠癌或胃癌的综合性理解，促进了新的诊断策略的发展，并提供了鉴定治疗药和预防药的分子靶的线索。所述信息促成对结肠直肠或胃肿瘤发生更为深入的理解，并提供了发展诊断，治疗新策略的指标，以及对结肠癌或胃癌的最终预防。
本文所引用的全部专利，专利申请，和出版物均为全文引入作为参考。此外，虽然已对照本发明的具体实施方案对本发明进行了详细描述，对本领域技术人员来说，在不背离本发明的精神和范围的情况下可对其进行多种改变和修饰是显而易见的。
对比文件
1 Kitahara，O.，Furukawa，Y.，Tanaka，T.，Kihara，C.，Ono，K.，Yanagawa，R.，Nita，M.，Takagi，T.，Nakamura，Y and Tsunoda，T.Alterations of gene expressionduring colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays afterlaser-capture microdissection of tumor tissues and normal epithelia.Cancer Res.，61：3544-3549，2001.
2 Lin，Y-M.，Furukawa，Y.，Tsunoda，T.，Yue，C-T.，Yang，K-C.，andNakamura，Y.Molecular diagnosis of colorectal tumors by expression profilesof 50 genes expressed differentially in adenomas and carcinomas.Oncogene，21：4120-4128，2002.
3 Hasegawa，S.，Furukawa，Y.，Li，M.，Satoh，S.，Kato，T.，Watanabe，W.，Katagiri，T.，Tsunoda，T.，Yamaoka，Y.，and Nakamura，Y.Genome-wide analysisof gene expression in intestinal-type gastric cancer using cDNA microarrayrepresenting 20340 genes.submitted
4 Ono，K.，Tanaka，T.，Tsunoda，T.，Kitahara，O.，Kihara，C.，Okamoto，A.，Ochiai，K.，Takagi，T.，and Nakamura，Y.Identification by cDNA microarray ofgenes involved in ovarian carcinogenesis.Cancer Res.，60：5007-5011，2000.
5 Sun J，Qian Y，Hamilton AD and Sebti SM：Both farnesyltransferase andgeranylgeranyltransferase I inhibitors are required for inhibition of oncogenicK-Ras prenylation but each alone is sufficient to suppress human tumor growthin nude mouse xenografts.Oncogene 16：1467-73，1998.
6 Molina MA，Codony-Servat J，Albanell J，Rojo F，Arribas J and Baselga J：Trastuzumab(herceptin)，a humanized anti-Her2 receptor monoclonal antibody，inhibits basal and activated Her2 ectodomain cleavage in breast cancer cells.Cancer Res 61：4744-9.2001.
7 O′Dwyer ME and Druker BJ：Status of bcr-abl tyrosine kinase inhibitorsin chronic myelogenous leukemia.Curr Opin Oncol 12：594-7，2000.
序列表
<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)
     JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO
<120>诊断结肠癌或胃癌的方法
<130>ONC-A0209P
<150>US 60/407,338
<151>2002-08-30
<160>129
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>6462
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
acatgacccg gcggcagtag ccgtggcagc agccgcggcg gctccgcgag ctcgccgggt     60
gggctcagtt cagcgcacgc cggagccgag cgcagggggc ggggaaggga cctgctgcag    120
ctgcagccgc ctgggcgctc ctggagcgcg cggtgactcc cccggtcggc ccgctccatg    180
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aaaggtgaaa atcgggccag gccaagtact cagctgtctt aataggatga agccttaagc    5040
agtggaaatt tcagttattt tccacagtat tccattttgg aggatttggg gtgtttactt    5100
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tggtggtggg caagaatgag agtcccagga tccagattta gcctcagatc ttccccattc    5280
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gctctttcga atccacagtg ttatctgtgt aaatagcttt aatttttctt ctgtgtctta    5940
ggtgaagttt tgttcatgta gcaaccaggt agacagtgac caaataaggc tgtaaatgtg    6000
ctgtagtttt ctactgtgat gtacttgaag gagaacctgt gtcctctact tttctgatct    6060
cccacaagta ttttgtgttt gtttcctgag tcctgaggtt attattttac tcctgttttg    6120
cccccagttt tctttgtttt ttttctggag acccagggag gcccatggtg gagatcattt    6180
gtaaggaatg gatcatggtc tgggtttcca aaactaccct agtacagtga atgagagaaa    6240
tctgcctgga aattgtttca gaaccatgta cctttatgct ttgtgattgt gaaacattga    6300
cttttttgta accccaaaat gaaaactgtt tagtaaaggg gatctatttt gtgtgttttg    6360
aaacttaggt gcaatgtccc ctggaaaaag ctaaagaaat gtatatgttc aatgacattt    6420
taaaataaaa tattatatat atgtatatac gacatattca gc                       6462
<210>2
<211>514
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Leu Thr Arg Val Lys Ser Ala Val Ala Asn Phe Met Gly Gly Ile
1               5                   10                  15
Met Ala Gly Ser Ser Gly Ser Glu His Gly Gly Gly Ser Cys Gly Gly
            20                  25                  30
Ser Asp Leu Pro Leu Arg Phe Pro Tyr Gly Arg Pro Glu Phe Leu Gly
        35                  40                  45
Leu Ser Gln Asp Glu Val Glu Cys Ser Ala Asp His Ile Ala Arg Pro
    50                  55                  60
Ile Leu Ile Leu Lys Glu Thr Arg Arg Leu Pro Trp Ala Thr Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Ala Glu Val Ile Asn Ala Gly Lys Ser Thr His Asn Glu Asp Gln Ala
                85                  90                  95
Ser Cys Glu Val Leu Thr Val Lys Lys Lys Ala Gly Ala Val Thr Ser
            100                 105                 110
Thr Pro Asn Arg Asn Ser Ser Lys Arg Arg Ser Ser Leu Pro Asn Gly
        115                 120                 125
Glu Gly Leu Gln Leu Lys Glu Asn Ser Glu Ser Glu Gly Val Ser Cys
    130                 135                 140
His Tyr Trp Ser Leu Phe Asp Gly His Ala Gly Ser Gly Ala Ala Val
145                 150                 155                 160
Val Ala Ser Arg Leu Leu Gln His His Ile Thr Glu Gln Leu Gln Asp
                165                 170                 175
Ile Val Asp Ile Leu Lys Asn Ser Ala Val Leu Pro Pro Thr Cys Leu
            180                 185                 190
Gly Glu Glu Pro Glu Asn Thr Pro Ala Asn Ser Arg Thr Leu Thr Arg
        195                 200                 205
Ala Ala Ser Leu Arg Gly Gly Val Gly Ala Pro Gly Ser Pro Ser Thr
    210                 215                 220
Pro Pro Thr Arg Phe Phe Thr Glu Lys Lys Ile Pro His Glu Cys Leu
225                 230                 235                 240
Val Ile Gly Ala Leu Glu Ser Ala Phe Lys Glu Met Asp Leu Gln Ile
                245                 250                 255
Glu Arg Glu Arg Ser Ser Tyr Asn Ile Ser Gly Gly Cys Thr Ala Leu
            260                 265                 270
Ile Val Ile Cys Leu Leu Gly Lys Leu Tyr Val Ala Asn Ala Gly Asp
        275                 280                 285
Ser Arg Ala Ile Ile Ile Arg Asn Gly Glu Ile Ile Pro Met Ser Ser
    290                 295                 300
Glu Phe Thr Pro Glu Thr Glu Arg Gln Arg Leu Gln Tyr Leu Ala Phe
305                 310                 315                 320
Met Gln Pro His Leu Leu Gly Asn Glu Phe Thr His Leu Glu Phe Pro
                325                 330                 335
Arg Arg Val Gln Arg Lys Glu Leu Gly Lys Lys Met Leu Tyr Arg Asp
            340                 345                 350
Phe Asn Met Thr Gly Trp Ala Tyr Lys Thr Ile Glu Asp Glu Asp Leu
        355                 360                 365
Lys Phe Pro Leu Ile Tyr Gly Glu Gly Lys Lys Ala Arg Val Met Ala
    370                 375                 380
Thr Ile Gly Val Thr Arg Gly Leu Gly Asp His Asp Leu Lys Val His
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asn Ile Tyr Ile Lys Pro Phe Leu Ser Ser Ala Pro Glu Val
                405                 410                 415
Arg Ile Tyr Asp Leu Ser Lys Tyr Asp His Gly Ser Asp Asp Val Leu
            420                 425                 430
Ile Leu Ala Thr Asp Gly Leu Trp Asp Val Leu Ser Asn Glu Glu Val
        435                 440                 445
Ala Glu Ala Ile Thr Gln Phe Leu Pro Asn Cys Asp Pro Asp Asp Pro
    450                 455                 460
His Arg Tyr Thr Leu Ala Ala Gln Asp Leu Val Met Arg Ala Arg Gly
465                 470                 475                 480
Val Leu Lys Asp Arg Gly Trp Arg Ile Ser Asn Asp Arg Leu Gly Ser
                485                 490                 495
Gly Asp Asp Ile Ser Val Tyr Val Ile Pro Leu Ile His Gly Asn Lys
            500                 505                 510
Leu Ser
<210>3
<211>1634
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
agtgcgcctg cgcggagctc gtggccgcgc ctgctcccgc cgggggctcc ttgctcggcc     60
gggccgcggc catgggagag gccgaggtgg gcggcggggg cgccgcaggc gacaagggcc    120
cgggggaggc ggccaccagc ccggcggagg agacagtggt gtggagcccc gaggtggagg    180
tgtgcctctt ccacgccatg ctgggccaca agcccgtcgg tgtgaaccga cacttccaca    240
tgatttgtat tcgggacaag ttcagccaga acatcgggcg gcaggtccca tccaaggtca    300
tctgggacca tctgagcacc atgtacgaca tgcaggcgct gcatgagtct gagattcttc    360
cattcccgaa tccagagagg aacttcgtcc ttccagaaga gatcattcag gaggtccgag    420
aaggaaaagt gatgatagaa gaggagatga aagaggagat gaaggaagac gtggaccccc    480
acaatggggc tgacgatgtt ttttcatctt cagggagttt ggggaaagca tcagaaaaat    540
ccagcaaaga caaagagaag aactcctcag acttggggtg caaagaaggc gcagacaagc    600
ggaagcgcag ccgggtcacc gacaaagtcc tgaccgcaaa cagcaaccct tccagtccca    660
gtgctgccaa gcggcgccgc acgtagaccc tcagccctgg tggcggcaga gaagcgggcg    720
aggcactgtg gtcgctgagg gggttggctg ggtctgagtg ccacccccag gccacagtga    780
taccatccca gtgccatgag cccacactgc ccgccctcag gctctcaggt gaacgtggcc    840
gtcagcgggg aaacgtgtgt gtcagttgga ccatgtggga ccctgatgga cctgaaagac    900
caggatcggt ccagctcaga tattgagggc tctgaagcct agttctgtct tctctggagc    960
agctgtggct tccccgtggc tgcttggtga catggattag cgctacgtgg gctgcagcat   1020
ttgggatcca ggctacctag aggggcatcg ggccagggaa aacctcggat tagcaagcaa    1080
taaaaacatg acctcactct tcctcaaagg agcccctggt cttccctgtg tgactcagtt    1140
ctttccatct gtttgtcccg ctgcaagcct ctttctgcgc tgactgtgac attggaacgt    1200
ggccttcctg tcaccccctc cgtgccacgc actgaaggcc acccccaccc acctgggaaa    1260
ctaagaactg gatattttgc ctcattcact tgtactgtaa caatgtatat aatttggttg    1320
gtatttcact atttaatttt taagaagcct attttactag tgttttatat gaacaaagta    1380
ctgcagaagt taaacctgtg ttgtattttt tctgagatgt tttgctttaa gagatacttt    1440
ttgctcagtt tttatatgcc agatacagag aatttgtagc ggttattttt gtatgatcta    1500
gtaacttgca aacagaccaa atggatgaga ggcggggacc gtgcagctgt cggctgatga    1560
ggaggcggcc gccccagtgc tgatggagat gccactttcg tgtgactgcg aacattaaag    1620
cacaaaaaaa atcc                                                      1634
<210>4
<211>204
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Met Gly Glu Ala Glu Val Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Asp Lys Gly
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Ala Ala Thr Ser Pro Ala Glu Glu Thr Val Val Trp Ser
            20                  25                  30
Pro Glu Val Glu Val Cys Leu Phe His Ala Met Leu Gly His Lys Pro
        35                  40                  45
Val Gly Val Asn Arg His Phe His Met Ile Cys Ile Arg Asp Lys Phe
    50                  55                  60
Ser Gln Asn Ile Gly Arg Gln Val Pro Ser Lys Val Ile Trp Asp His
65                  70                  75                  80
Leu Ser Thr Met Tyr Asp Met Gln Ala Leu His Glu Ser Glu Ile Leu
                85                  90                  95
Pro Phe Pro Asn Pro Glu Arg Asn Phe Val Leu Pro Glu Glu Ile Ile
            100                 105                 110
Gln Glu Val Arg Glu Gly Lys Val Met Ile Glu Glu Glu Met Lys Glu
        115                 120                 125
Glu Met Lys Glu Asp Val Asp Pro His Asn Gly Ala Asp Asp Val Phe
    130                 135                 140
Ser Ser Ser Gly Ser Leu Gly Lys Ala Ser Glu Lys Ser Ser Lys Asp
145                 150                 155                 160
Lys Glu Lys Asn Ser Ser Asp Leu Gly Cys Lys Glu Gly Ala Asp Lys
                165                 170                 175
Arg Lys Arg Ser Arg Val Thr Asp Lys Val Leu Thr Ala Asn Ser Asn
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Pro Ser Ala Ala Lys Arg Arg Arg Thr
        195                 200
<210>5
<211>1681
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
gccgtccaag ggtccattgg ttgccataga gatcgtcgag cgctgggcct gtgatcgctg     60
aggggcgagc agttgcgacc ctgggctcct ggggacctga gcgttatgtc tttccgcgac    120
ctccgcaatt tcacagagat gatgagagcc ctgggatacc ctcgacatat ttctatggaa    180
aatttccgta cacccaattt tggacttgta tctgaagtgc ttctctggct tgtgaaaaga    240
tatgagcccc agactgacat cccgcctgac gtggatactg aacaggaccg agttttcttc    300
attaaggcaa ttgcccagtt catggccacc aaggcacata taaaactcaa cactaagaag    360
ctttatcaag cagatgggta tgcggtaaaa gagctgctga agatcacatc tgtcctttat    420
aatgctatga agaccaaggg gatggagggc tctgaaatag tagaggaaga tgtcaacaag    480
ttcaagtttg atcttggctc aaagattgca gatttgaagg cagccaggca gcttgcgtct    540
gaaatcacct ccaaaggagc atctctgtat gacttgctcg gcatggaagt agagttgagg    600
gaaatgagaa cagaagccat tgccagacct ctggaaataa acgagactga aaaagtgatg    660
agaattgcaa taaaagagat tttgacacag gttcagaaga ctaaagacct gctcaataat    720
gtggcctctg atgaagctaa tttagaagcc aaaatcgaaa agagaaaatt agaactggaa    780
agaaatcgga agcgactaga gactctgcag agtgtcaggc catgttttat ggatgagtat    840
gagaagactg aggaagaatt acaaaagcag tatgacactt atctggagaa atttcaaaat    900
ctgacttatc tggaacaaca gcttgaagac catcatagga tggagcaaga aaggtttgag    960
gaagctaaaa acactctctg cctgatacag aacaagctca aggaggaaga gaagcgcctg   1020
ctcaagagtg gaagtaacga tgactcggac atagacatcc aggaggacga tgaatccgac   1080
agtgagttgg aagaaaggcg gctgcccaag ccacagacag ccatggagat gctcatgcaa    1140
ggaagacctg gcaaacgcat tgtgggcacg atgcaaggtg gagactccga tgacaatgag    1200
gactcggagg agagtgaaat tgacatggaa gatgatgatg acgaggatga cgatttggaa    1260
gacgagagca tttctctctc accaaccaag cccaatcgaa gggtccggaa atctgaaccc    1320
ctggatgaga gtgacaatga cttctgaccc ttttgccaag ggaccctggc agattaaaac    1380
cctcagactt gtaggtaaat gggaacttag aaggttagga aggtaacccc tgttttgttt    1440
actaagctgg ctggactcat gatcactgaa gcaatactta tttctgcttt agcctcctat    1500
gtttgcattc catgaagctt aaataagaat tgaagcaaat ccctaagatt tatttttttc    1560
caccttattt atcttctaaa acttgaggaa tgcatgtgtt cttagtgatt cacatccacg    1620
ggacaaaaac tcaagaagaa ataagagctg acgccacaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1680
a                                                                    1681
<210>6
<211>413
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
Met Ser Phe Arg Asp Leu Arg Asn Phe Thr Glu Met Met Arg Ala Leu
1               5                   10                  15
Gly Tyr Pro Arg His Ile Ser Met Glu Asn Phe Arg Thr Pro Asn Phe
            20                  25                  30
Gly Leu Val Ser Glu Val Leu Leu Trp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Pro
        35                  40                  45
Gln Thr Asp Ile Pro Pro Asp Val Asp Thr Glu Gln Asp Arg Val Phe
    50                  55                  60
Phe Ile Lys Ala Ile Ala Gln Phe Met Ala Thr Lys Ala His Ile Lys
65                  70                  75                  80
Leu Asn Thr Lys Lys Leu Tyr Gln Ala Asp Gly Tyr Ala Val Lys Glu
                85                  90                  95
Leu Leu Lys Ile Thr Ser Val Leu Tyr Asn Ala Met Lys Thr Lys Gly
            100                 105                 110
Met Glu Gly Ser Glu Ile Val Glu Glu Asp Val Asn Lys Phe Lys Phe
        115                 120                 125
Asp Leu Gly Ser Lys Ile Ala Asp Leu Lys Ala Ala Arg Gln Leu Ala
    130                 135                 140
Ser Glu Ile Thr Ser Lys Gly Ala Ser Leu Tyr Asp Leu Leu Gly Met
145                 150                 155                 160
Glu Val Glu Leu Arg Glu Met Arg Thr Glu Ala Ile Ala Arg Pro Leu
                165                 170                 175
Glu Ile Asn Glu Thr Glu Lys Val Met Arg Ile Ala Ile Lys Glu Ile
            180                 185                 190
Leu Thr Gln Val Gln Lys Thr Lys Asp Leu Leu Asn Asn Val Ala Ser
        195                 200                 205
Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ala Lys Ile Glu Lys Arg Lys Leu Glu Leu
    210                 215                 220
Glu Arg Asn Arg Lys Arg Leu Glu Thr Leu Gln Ser Val Arg Pro Cys
225                 230                 235                 240
Phe Met Asp Glu Tyr Glu Lys Thr Glu Glu Glu Leu Gln Lys Gln Tyr
                245                 250                 255
Asp Thr Tyr Leu Glu Lys Phe Gln Asn Leu Thr Tyr Leu Glu Gln Gln
            260                 265                 270
Leu Glu Asp His His Arg Met Glu Gln Glu Arg Phe Glu Glu Ala Lys
        275                 280                 285
Asn Thr Leu Cys Leu Ile Gln Asn Lys Leu Lys Glu Glu Glu Lys Arg
    290                 295                 300
Leu Leu Lys Ser Gly Ser Asn Asp Asp Ser Asp Ile Asp Ile Gln Glu
305                 310                 315                 320
Asp Asp Glu Ser Asp Ser Glu Leu Glu Glu Arg Arg Leu Pro Lys Pro
                325                 330                 335
Gln Thr Ala Met Glu Met Leu Met Gln Gly Arg Pro Gly Lys Arg Ile
            340                 345                 350
Val Gly Thr Met Gln Gly Gly Asp Ser Asp Asp Asn Glu Asp Ser Glu
        355                 360                 365
Glu Ser Glu Ile Asp Met Glu Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Asp Leu
    370                 375                 380
Glu Asp Glu Ser Ile Ser Leu Ser Pro Thr Lys Pro Asn Arg Arg Val
385                 390                 395                 400
Arg Lys Ser Glu Pro Leu Asp Glu Ser Asp Asn Asp Phe
                405                 410
<210>7
<211>733
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>7
gtgaaactca cccagcttta gtaaccaact cgattgcata gactttagat aaccatgtga     60
aggggattct accatcagaa aagaggccaa acttctatca tcatggtgga tgtgaagtgt    120
ctgagtgact gtaaattgca gaaccaactt gagaagcttg gattttcacc tggcccaata    180
ctactggcct gaggcttcca ccactaaacg caaagctgta gatacctatt gcttggatta    240
taagccttcc aagggaagaa ggtgggctgc aagagcacca agcaccagaa tcacatatgg    300
gactatcacc aaagagagag actactgcgc ggaagaccag actatcgaga gctggagaga    360
agaaggtttc ccagtgggct tgaagcttgc tgtgcttggt attttcatca ttgtggtgtt    420
tgtctacctg actgtggaaa ataagtcgct gtttggttaa gtaatttagg agcaaagcaa    480
tgctccaagc gaggcctcct gcttcaggaa agaaccaaaa cactaccctg aagggccagc    540
ctagcctgca gccctccctt gcagggagcc ttcccttgca ctgtgctgct ctcacagatc    600
ggtgtctggg ctcagccagg tggaaggaac ctgcctaacc aggcacctgt gttaagagca    660
tgatggttag gaaatccccc aagtcatgtc aactctcatt aaaggtgctt ccatatttga    720
gcaggcgtca aac                                                       733
<210>8
<211>29
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
Met Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln Leu
1               5                   10                  15
Glu Lys Leu Gly Phe Ser Pro Gly Pro Ile Leu Leu Ala
            20                  25
<210>9
<211>656
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
gtgaaactca cccagcttta gtaaccaact cgattgcata gactttagat aaccatgtga     60
aggggattct accatcagaa aagaggccaa acttctatca tcatggtgga tgtgaagtgt    120
ctgagtgact gtaaattgca gaaccaactt gagaagcttg gattttcacc tggcccaata    180
ctacgtgggc tgcaagagca ccaagcacca gaatcacata tgggactatc accaaagaga    240
gagactactg cgcggaagac cagactatcg agagctggag agaagaaggt ttcccagtgg    300
gcttgaagct tgctgtgctt ggtattttca tcattgtggt gtttgtctac ctgactgtgg    360
aaaataagtc gctgtttggt taagtaattt aggagcaaag caatgctcca agcgaggcct    420
cctgcttcag gaaagaacca aaacactacc ctgaagggcc agcctagcct gcagccctcc    480
cttgcaggga gccttccctt gcactgtgct gctctcacag atcggtgtct gggctcagcc    540
aggtggaagg aacctgccta accaggcacc tgtgttaaga gcatgatggt taggaaatcc    600
cccaagtcat gtcaactctc attaaaggtg cttccatatt tgagcaggcg tcaaac        656
<210>10
<211>67
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>10
Met Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln Leu
1               5                   10                  15
Glu Lys Leu Gly Phe Ser Pro Gly Pro Ile Leu Arg Gly Leu Gln Glu
            20                  25                  30
His Gln Ala Pro Glu Ser His Met Gly Leu Ser Pro Lys Arg Glu Thr
        35                  40                  45
Thr Ala Arg Lys Thr Arg Leu Ser Arg Ala Gly Glu Lys Lys Val Ser
    50                  55                  60
Gln Trp Ala
65
<210>11
<211>3707
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>11
cgcgggcggg ggcttctggg agttgtagtc tgttgggggc gtgcgcagtc gggatggaag     60
cttcctggcg ccaggtggcc ggtggccgag gccgatcccg gggacgggcc actgccgccc    120
cctcaggaaa tggagtccat ctccgcggcg ccggaggagg gcgagagaag gggtcggtgg    180
gcgcagttcc ttctggcacc agtcccggag gagtcgcgac cacggcggct gcagggagca    240
ggcacagccc cgcaggatcc caagccctgc agactaccgc agccagcgag ctaatgtctc     300
agaaaaaatt tgaagaaatc aagaaagcta accaagctgc agccagaaaa cttgttgaag     360
aacagtttag ctcttcatct gaagaaggag atgaagattt tgaaggaaaa cagggaaaaa     420
tacttgcaaa tacgtttata acatacacta ctcagacaga tggagataca cgtgaattag     480
agcgaacaaa acaatatgta aatgaagctt ttcaagcagg ggctatgaca tgcctaattt     540
gtattgcttc ggtgaagaga aaccaagcag tttggagctg ttcgggatgt ttctgtatat     600
ttcacatgcc ctgtatccag aagtgggcta aagacagcca gtttcttgta tcttctgtga     660
ctgatgatga ttttggaaag aaagattgtc cctggccttg tccaaaatgt aggtttgaat     720
acaaacgatc tgaaacacct agtaggtact attgctattg tggaaaagta gaagatccac     780
ctttagatcc gtggcttgtg cctcattcat gtggccaagt atgtgagcgt gaatttaaac     840
ctccttgtgg ccataaatgt ttactcctct gtcatccagg tccctgccct ccttgtccaa     900
agatggtcac aactacttgt tactgtaaga aagcaaaacc tatccctcgt aggtgcagtg     960
ccaaggaatg gtcttgtcag ctgccatgtg gacagaagtt gctttgtggg caacataagt    1020
gtgaaaatcc ttgtcatgca ggaagctgtc agccttgtcc aagagttagt agacaaaagt    1080
gtgtctgtgg caaaaaagta gctgaaagaa gttgtgcaag tccactatgg cactgtgatc    1140
aagtatgtgg aaaaacactg ccatgtggta atcacacatg tgagcaagtt tgccatgttg    1200
gtgcttgtgg agaatgtcct cgatctggga aaaggttctg tccatgtcag aaatcaaagt    1260
tttctttgcc ttgtacagaa gatgtaccaa cttgtggaga cagttgtgac aaagtacttg    1320
aatgcggaat ccatagatgt tcacagcgtt gtcaccgagg tccctgtgaa acatgtagac    1380
aagaagtgga aaagcattgt cgctgtggaa agcatacaaa acgaatgcct tgtcataaac    1440
cttatctgtg tgaaactaag tgtgttaaga tgcgtgactg tcagaagcat caatgtagaa    1500
gaaagtgttg ccctggaaac tgtccacctt gtgatcaaaa ctgtggacgg actttaggat    1560
gtagaaacca taagtgtcca tctgtctgtc acagaggcag ttgctatccc tgcccagaaa    1620
ctgtagatgt gaagtgtaat tgtggcaata caaaggtgac agtgccctgt ggccgagaac    1680
gtaccacaag accacccaag tgcaaggagc aatgcagtcg accaccaact tgtcatcata    1740
caagtcaaga aaaacatcgc tgtcactttg gttcttgtcc accatgtcat caaccttgcc    1800
aaaaagtttt ggagaaatgt ggtcacttgt gtcctgctcc gtgtcatgat caagcgttaa    1860
taaagcagac tggcaggcac cagcctacag gcccttggga acagccttct gagccagcat    1920
ttattcagac tgcattaccg tgtcctccat gtcaagttcc tattcctatg gaatgtcttg    1980
ggaaacatga ggtgagtcca ctaccatgcc atgctgtagg accctactct tgtaaaagag    2040
tttgtggaag aatcttggat tgtcagaatc acacatgtat gaaagaatgc cacaaagtaa    2100
ccaaaactga tggctgcact ggaaaaaaca aggctggccc agaatgcctt cattgtgagg    2160
aagggtgctc caagtcacgg ccactaggtt gtcttcaccc atgtattttg cgatgtcacc    2220
ctggagaatg tccaccttgt gttcagatgc ttagaataaa atgtcactgt aagatcacaa    2280
gcctgtatgt ggaatgtaga aaaataacca cagctgatgt aaatgaaaag aacctcctca    2340
gttgttgcaa aaatcagtgc cctaaagagc ttccttgtgg tcatagatgc aaagagatgt    2400
gtcatcctgg tgaatgtccc tttaactgca accagaaggt aaaacttaga tgtccttgta    2460
aaagaataaa aaaggaattg cagtgcaaca aagtacgtga aaatcaggtt tcaatagaat    2520
gtgacacaac gtgcaaggaa atgaagcgga aagcatctga gataaaagaa gcagaagcca    2580
aagctgctct tgaagaagaa aaacgaagac aacaggctga actagaagct tttgaaaaca    2640
gactgaaggg tcgtcggaag aagaacagga aaagagatga agtggcagtt gagctatcac    2700
tatggcaaaa acataaacat tatctcattt cagtgtgtgg agttgtggtt gtagtgtttg    2760
cctggtacat cacccatgat gtcaattaaa aaaagttttg atcttttaat gtaactcaga    2820
ttggttttag ataagttgtt aaatttgaaa tattagaaaa tgtatattat agaacatgat    2880
atatatttac attcatctct gtattctctc agctgttgtt agaaggacag aatgttaaac    2940
tttatcttaa ttagtatact agaaagggca gtataatact gtttaaagtg aaggcatgac    3000
tgaaactaaa atatttcata aggcttagct agaggcagag taacgtgttt ttgttcattg    3060
ggcttccttg tacttagttt tttcatttaa taattcaaac caacactttt aaaaaataat    3120
tcagatgaga ctgagccata tctgcagtaa gagaaatatt tcttaatgtt ttggttactt    3180
atgatagagt acttttcttg ttaccgttaa ctttgtgctt tttaaaaaaa gtgattctct    3240
aacagacctc ttaaattgtg acatgaaggt atgtaattag atttcagaaa ttggtttatt    3300
agtgaggaat ttttatcaat aaatgtcatg gggcgtgttc ttcagaatat atagttattt    3360
tcaacaaatg ccaggctaga ttcctcacat gtggctattt cttatgtaag aagcttttaa    3420
ctgaagttgg catgtttcgt aaaacttgcg tgtcttttaa aaataataaa aggaagatga    3480
gtatttatga agaatatgtg ctgacaacag ggcttatgag gtctatgtac cttaatctcg    3540
tttctcctta ccacaatctt aaatagattt cagctgaaaa taatcagttc ttatgaaaac    3600
aaatagagaa atatcagtaa gtcaaatctg tttgaattat aattcctttc aaatagtttt    3660
gctatttaat ttatatgatt aatgttttca ttaaaatttt tgatacc                  3707
<210>12
<211>911
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>12
Met Glu Ala Ser Trp Arg Gln Val Ala Gly Gly Arg Gly Arg Ser Arg
1               5                   10                  15
Gly Arg Ala Thr Ala Ala Pro Ser Gly Asn Gly Val His Leu Arg Gly
            20                  25                  30
Ala Gly Gly Gly Arg Glu Lys Gly Ser Val Gly Ala Val Pro Ser Gly
        35                  40                  45
Thr Ser Pro Gly Gly Val Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ser Arg His
    50                  55                  60
Ser Pro Ala Gly Ser Gln Ala Leu Gln Thr Thr Ala Ala Ser Glu Leu
65                  70                  75                  80
Met Ser Gln Lys Lys Phe Glu Glu Ile Lys Lys Ala Asn Gln Ala Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Lys Leu Val Glu Glu Gln Phe Ser Ser Ser Ser Glu Glu Gly
            100                 105                 110
Asp Glu Asp Phe Glu Gly Lys Gln Gly Lys Ile Leu Ala Asn Thr Phe
        115                 120                 125
Ile Thr Tyr Thr Thr Gln Thr Asp Gly Asp Thr Arg Glu Leu Glu Arg
    130                 135                 140
Thr Lys Gln Tyr Val Asn Glu Ala Phe Gln Ala Gly Ala Met Thr Cys
145                 150                 155                 160
Leu Ile Cys Ile Ala Ser Val Lys Arg Asn Gln Ala Val Trp Ser Cys
                165                 170                 175
Ser Gly Cys Phe Cys Ile Phe His Met Pro Cys Ile Gln Lys Trp Ala
            180                 185                 190
Lys Asp Ser Gln Phe Leu Val Ser Ser Val Thr Asp Asp Asp Phe Gly
        195                 200                 205
Lys Lys Asp Cys Pro Trp Pro Cys Pro Lys Cys Arg Phe Glu Tyr Lys
    210                 215                 220
Arg Ser Glu Thr Pro Ser Arg Tyr Tyr Cys Tyr Cys Gly Lys Val Glu
225                 230                 235                 240
Asp Pro Pro Leu Asp Pro Trp Leu Val Pro His Ser Cys Gly Gln Val
                245                 250                 255
Cys Glu Arg Glu Phe Lys Pro Pro Cys Gly His Lys Cys Leu Leu Leu
            260                 265                 270
Cys His Pro Gly Pro Cys Pro Pro Cys Pro Lys Met Val Thr Thr Thr
        275                 280                 285
Cys Tyr Cys Lys Lys Ala Lys Pro Ile Pro Arg Arg Cys Ser Ala Lys
    290                 295                 300
Glu Trp Ser Cys Gln Leu Pro Cys Gly Gln Lys Leu Leu Cys Gly Gln
305                 310                 315                 320
His Lys Cys Glu Asn Pro Cys His Ala Gly Ser Cys Gln Pro Cys Pro
                325                 330                 335
Arg Val Ser Arg Gln Lys Cys Val Cys Gly Lys Lys Val Ala Glu Arg
            340                 345                 350
Ser Cys Ala Ser Pro Leu Trp His Cys Asp Gln Val Cys Gly Lys Thr
        355                 360                 365
Leu Pro Cys Gly Asn His Thr Cys Glu Gln Val Cys His Val Gly Ala
    370                 375                 380
Cys Gly Glu Cys Pro Arg Ser Gly Lys Arg Phe Cys Pro Cys Gln Lys
385                 390                 395                 400
Ser Lys Phe Ser Leu Pro Cys Thr Glu Asp Val Pro Thr Cys Gly Asp
                405                 410                 415
Ser Cys Asp Lys Val Leu Glu Cys Gly Ile His Arg Cys Ser Gln Arg
            420                 425                 430
Cys His Arg Gly Pro Cys Glu Thr Cys Arg Gln Glu Val Glu Lys His
        435                 440                 445
Cys Arg Cys Gly Lys His Thr Lys Arg Met Pro Cys His Lys Pro Tyr
    450                 455                 460
Leu Cys Glu Thr Lys Cys Val Lys Met Arg Asp Cys Gln Lys His Gln
465                 470                 475                 480
Cys Arg Arg Lys Cys Cys Pro Gly Asn Cys Pro Pro Cys Asp Gln Asn
                485                 490                 495
Cys Gly Arg Thr Leu Gly Cys Arg Asn His Lys Cys Pro Ser Val Cys
            500                 505                 510
His Arg Gly Ser Cys Tyr Pro Cys Pro Glu Thr Val Asp Val Lys Cys
        515                 520                 525
Asn Cys Gly Asn Thr Lys Val Thr Val Pro Cys Gly Arg Glu Arg Thr
    530                 535                 540
Thr Arg Pro Pro Lys Cys Lys Glu Gln Cys Ser Arg Pro Pro Thr Cys
545                 550                 555                 560
His His Thr Ser Gln Glu Lys His Arg Cys His Phe Gly Ser Cys Pro
                565                 570                 575
Pro Cys His Gln Pro Cys Gln Lys Val Leu Glu Lys Cys Gly His Leu
            580                 585                 590
Cys Pro Ala Pro Cys His Asp Gln Ala Leu Ile Lys Gln Thr Gly Arg
        595                 600                 605
His Gln Pro Thr Gly Pro Trp Glu Gln Pro Ser Glu Pro Ala Phe Ile
    610                 615                 620
Gln Thr Ala Leu Pro Cys Pro Pro Cys Gln Val Pro Ile Pro Met Glu
625                 630                 635                 640
Cys Leu Gly Lys His Glu Val Ser Pro Leu Pro Cys His Ala Val Gly
                645                 650                 655
Pro Tyr Ser Cys Lys Arg Val Cys Gly Arg Ile Leu Asp Cys Gln Asn
            660                 665                 670
His Thr Cys Met Lys Glu Cys His Lys Val Thr Lys Thr Asp Gly Cys
        675                 680                 685
Thr Gly Lys Asn Lys Ala Gly Pro Glu Cys Leu His Cys Glu Glu Gly
    690                 695                 700
Cys Ser Lys Ser Arg Pro Leu Gly Cys Leu His Pro Cys Ile Leu Arg
705                 710                 715                 720
Cys His Pro Gly Glu Cys Pro Pro Cys Val Gln Met Leu Arg Ile Lys
                725                 730                 735
Cys His Cys Lys Ile Thr Ser Leu Tyr Val Glu Cys Arg Lys Ile Thr
            740                 745                 750
Thr Ala Asp Val Asn Glu Lys Asn Leu Leu Ser Cys Cys Lys Asn Gln
        755                 760                 765
Cys Pro Lys Glu Leu Pro Cys Gly His Arg Cys Lys Glu Met Cys His
    770                 775                 780
Pro Gly Glu Cys Pro Phe Asn Cys Asn Gln Lys Val Lys Leu Arg Cys
785                 790                 795                 800
Pro Cys Lys Arg Ile Lys Lys Glu Leu Gln Cys Asn Lys Val Arg Glu
                805                 810                 815
Asn Gln Val Ser Ile Glu Cys Asp Thr Thr Cys Lys Glu Met Lys Arg
            820                 825                 830
Lys Ala Ser Glu Ile Lys Glu Ala Glu Ala Lys Ala Ala Leu Glu Glu
        835                 840                 845
Glu Lys Arg Arg Gln Gln Ala Glu Leu Glu Ala Phe Glu Asn Arg Leu
    850                 855                 860
Lys Gly Arg Arg Lys Lys Asn Arg Lys Arg Asp Glu Val Ala Val Glu
865                 870                 875                 880
Leu Ser Leu Trp Gln Lys His Lys His Tyr Leu Ile Ser Val Cys Gly
                885                 890                 895
Val Val Val Val Val Phe Ala Trp Tyr Ile Thr His Asp Val Asn
            900                 905                 910
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>13
acaacagcct caagatcatc ag                                              22
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>14
ggtccaccac tgacacgttg                                                 20
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>15
tttcttccta actgtgatcc agat                                            24
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>16
acaacacttg gtagcagcct t                                               21
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>17
ctctaacaga cctcttaaat tgtg                                            24
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>18
catagaccca taagccctgt tg                                              22
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>19
gtgtgcctct tccacgccat                                                 20
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>20
cctggtcttt caggtccatc a                                              21
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>21
tgtggtgttt gtctacctga ctg                                            23
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>22
accatcatgc tcttaacaca ggt                                            23
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>23
gagtggaagt aacgatgact c                                              21
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>24
gtcattgtca ctctcatcca g                                              21
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>25
gaagatcttc ttgccagtg                                                  19
<210>26
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>26
gcagcaggct cagctgc                                                    17
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>27
cttgttgatg tgggtcacac g                                               21
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>28
tgtggagctt agggaggcag                                                 20
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>29
ctatggctac ttacggagcg                                                 20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>30
tccttggcag caccattcac                                                 20
<210>31
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>31
ggcgaattcg taatatgctc actcgagtg                                       29
<210>32
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>32
ccaggatcct gacagcttgt ttcca                                           25
<210>33
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>33
tctccggccg ctttcatgac agcttg                                          26
<210>34
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>34
tgcgaattcg ggatggaagc ttcct                                          25
<210>35
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>35
gataattctt tttttaattg acatc                                          25
<210>36
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>36
cttgtaccat tgacatcatg ggtgat                                         26
<210>37
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>37
tgtgaattcg ccatgggaga ggc                                            23
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>38
taactcgagc gtgcggcgcc gctt                                           24
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>39
taaggatccc gtgcggcgcc gctt                                            24
<210>40
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>40
tctgaattca gaaaagaggc caaacttcta tc                                   32
<210>41
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>41
tccgatatca ggtagacaaa caccacaatg atg                                  33
<210>42
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>42
gaggaattcc gaccctgggc tcctggggac                                      30
<210>43
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>43
aagctcgaga agtcattgtc actctcatcc ag                                   32
<210>44
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>44
acggaattcc tctccagaat gaagatcttc                                      30
<210>45
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>45
tctctcgagt caggggccaa accgcagc                                        28
<210>46
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>46
cggctcgagc gcatggctta gggacgctc                                       29
<210>47
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>47
tggggatccg ctctatgtct ggtagaagtg                                      30
<210>48
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>48
ctgaattcgg agcgatgaag atggtcgc                                        28
<210>49
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>49
aagctcgagg cagacacgta aggtggcg                                        28
<210>50
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>50
gtgagcatat tactcc                                                     16
<210>51
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>51
cctcattata cgagtg                                                     16
<210>52
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>52
ggccagggac aatctttc                                                   18
<210>53
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>53
ctttctaaca gggaccgg                                                   18
<210>54
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>54
gcccacctcg gcctctcc                                                   18
<210>55
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>55
cctctccggc tccacccg                                                   18
<210>56
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>56
cacctcggcc tctcccat                                                   18
<210>57
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>57
taccctctcc ggctccac                                                   18
<210>58
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>58
atccaccatg atgataga                                                   18
<210>59
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>59
agatagtagt accaccta                                                   18
<210>60
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>60
acacttcaca tccaccat                                                   18
<210>61
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>61
taccacctac acttcaca                                                   18
<210>62
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>62
cagacacttc acatccac                                                   18
<210>63
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>63
cacctacact tcacagac                                                   18
<210>64
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>64
catgatgata gaagtttg                                                   18
<210>65
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>65
gtttgaagat agtagtac                                                   18
<210>66
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>66
acatccacca tgatgata                                                  18
<210>67
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>67
atagtagtac cacctaca                                                  18
<210>68
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>68
cggaggtcgc ggaaag                                                    16
<210>69
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>69
ctttccgcga cctccg                                                    16
<210>70
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>70
atcttcattc tggaga                                                    16
<210>71
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>71
tctccagaat gaagat                                                     16
<210>72
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>72
gaagatcttc attctg                                                     16
<210>73
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>73
cagaatgaag atcttc                                                     16
<210>74
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>74
gcggccggct tggagt                                                     16
<210>75
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>75
actccaagcc ggccgc                                                     16
<210>76
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>76
gtagaagtgg tggtaa                                                     16
<210>77
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>77
ttaccaccac ttctac                                                     16
<210>78
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>78
gtgagcgcgg cgcgcc                                                     16
<210>79
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>79
ggcgcgccgc gctcac                                                     16
<210>80
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>80
gcgcggccgc gctcac                                                              16
<210>81
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>81
cactcgcgcc gcgcgg                                                              16
<210>82
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>82
ggcgaattcg taatatgctc actcgagtga aat                                           33
<210>83
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>83
gttgaattcc gtgttctcag gct                                                      23
<210>84
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>84
gcggaattcc tgctgcagca ccacat                                          26
<210>85
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>85
acagcggccg ctttcatgac agcttg                                          26
<210>86
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>86
acagaattcg ggatggaagc ttc                                             23
<210>87
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>87
atactcgaga ggaggtttaa attcacgctc                                      30
<210>88
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>88
cacgaattca aggtaaaact tagatgtcct                                      30
<210>89
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>89
gagctcgagt ttatgttttt gccatagtga tag                                  33
<210>90
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>90
tgtgaattcg ccatgggaga ggc                                             23
<210>91
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>91
taaggatccc gtgcggcgcc gctt                                            24
<210>92
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>92
catgaattcc ggccatggcg                                                 20
<210>93
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>93
catctcgagt caggtctggg ctc                                             23
<210>94
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>94
tggtagccaa gtgcaggtta ta                                              22
<210>95
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>95
ccaaagggtt tctgcagttt ca                                              22
<210>96
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>96
ggggatcagc gtttgagtaa                                                 20
<210>97
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>97
taggccccac ctccttctat                                                 20
<210>98
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>98
tgcggatcca gagcagattg tactgagagt                                      30
<210>99
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>99
ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca                                       29
<210>100
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>100
tttaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaac                   47
<210>101
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>101
tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca                                 34
<210>102
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>102
tttaagcttg aagactattt ttacatcagg ttgtttttct                           40
<210>103
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>103
tttaagcttg aagacacggt gtttcgtcct ttccaca                              37
<210>104
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>104
caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c              51
<210>105
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>105
aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c              51
<210>106
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>106
caccagaaag attgtccctg gccttcaaga gaggccaggg acaatctttc t              51
<210>107
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>107
aaaaagaaag attgtccctg gcctctcttg aaggccaggg acaatctttc t              51
<210>108
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>108
caccggagat gaagattttg aagttcaaga gacttcaaaa tcttcatctc c              51
<210>109
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>109
aaaaggagat gaagattttg aagtctcttg aacttcaaaa tcttcatctc c              51
<210>110
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>110
caccgaagaa caggaaaaga gatttcaaga gaatctcttt tcctgttctt c              51
<210>111
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>111
aaaagaagaa caggaaaaga gattctcttg aaatctcttt tcctgttctt c              51
<210>112
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>112
caccccagaa ggtaaaactt agattcaaga gatctaagtt ttaccttctg g              51
<210>113
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>113
aaaaccagaa ggtaaaactt agatctcttg aatctaagtt ttaccttctg g              51
<210>114
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>114
caccgtatgt gagcgtgaat ttattcaaga gataaattca cgctcacata c              51
<210>115
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>115
aaaagtatgt gagcgtgaat ttatctcttg aataaattca cgctcacata c              51
<210>116
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>116
tcccccgaca cttccacatg attttcaaga gaaatcatgt ggaagtgtcg g              51
<210>117
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>117
aaaaccgaca cttccacatg atttctcttg aaaatcatgt ggaagtgtcg g              51
<210>118
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>118
tcccgcgact agagactctg cagttcaaga gactgcagag tctctagtcg c              51
<210>119
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>119
ttttgcgact agagactctg cagtctcttg aactgcagag tctctagtcg c              51
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
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tcccgaccat cataggatgg agcttcaaga gagctccatc ctatgatggt c              51
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<213>人工的
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<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
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<212>DNA
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<223>SiRNA的靶序列
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ccagaaggta aaacttagat                                                 20
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<223>SiRNA的靶序列
<400>129
gaccatcata ggatggagct                                                 20

Claims (39)

1.一种多肽，其选自：
(a)包含SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12的氨基酸序列的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1的多肽。
3.权利要求2的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11之一所示的核苷酸序列。
4.一种载体，其包含权利要求2或3的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其含有权利要求2的多核苷酸或权利要求4的载体。
6.制备权利要求1的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养权利要求5的宿主细胞；
(b)使该宿主细胞表达所述多肽；和
(c)收集所表达的多肽。
7.一种抗体，其与权利要求1的多肽结合。
8.一种多核苷酸，所述多核苷酸与权利要求3的多核苷酸或其互补链互补并包含至少15个核苷酸。
9.权利要求3所述多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA。
10.反义多核苷酸，其为权利要求9所述包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸的反义多核苷酸，其中所述反义多核苷酸包含SEQ ID NO：50的核苷酸序列。
11.反义多核苷酸，其为权利要求9所述包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的多核苷酸的反义多核苷酸，其中所述反义多核苷酸包含SEQ ID NO：54或56的核苷酸序列。
12.反义多核苷酸，其为权利要求9所述包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的反义多核苷酸，其中所述反义多核苷酸包含SEQ ID NO：68的核苷酸序列。
13.反义多核苷酸，其为权利要求9所述包含SEQ ID NO：7或9的核苷酸序列的多核苷酸的反义多核苷酸，其中所述反义多核苷酸包含SEQ IDNO：58、60、62、64或66组成的核苷酸序列组。
14.反义多核苷酸，其为权利要求9所述包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列的多核苷酸的反义多核苷酸，其中所述反义多核苷酸包含SEQ ID NO：52的核苷酸序列。
15.小干扰RNA，其为权利要求9所述包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列的多核苷酸的小干扰RNA，其中所述小干扰RNA的靶序列包含SEQ IDNO：126的核苷酸序列。
16.小干扰RNA，其为权利要求9所述包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的多核苷酸的小干扰RNA，其中所述小干扰RNA的靶序列包含SEQ IDNO：127的核苷酸序列。
17.小干扰RNA，其为权利要求9所述包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的小干扰RNA，其中所述小干扰RNA的靶序列包含SEQ IDNO：128或129的核苷酸序列。
18.筛选治疗或预防结肠癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将被验化合物与选自权利要求1中SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12的氨基酸序列所示多肽接触；
b)检测所述多肽与被验化合物的结合活性；和
c)选择与所述多肽结合的化合物。
19.筛选用于治疗或预防结肠癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将候补化合物与表达一或多种标记基因的细胞接触，其中所述一或多种标记基因由选自权利要求3中SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11的核苷酸序列组成；和
b)选择化合物，所述化合物能降低一或多种由选自权利要求3中SEQID NO：1，3，5，7，9或11的核苷酸序列组成的标记基因的表达水平。
20.权利要求19的方法，其中所述被验细胞包括结肠癌细胞。
21.筛选用于治疗或预防结肠癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将被验化合物与多肽接触，所述多肽由选自权利要求1中SEQ IDNO：2，4，6，8，10或12的氨基酸序列组成；
b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和
c)选择化合物，其中与缺失该被验化合物时检测到的生物活性相比，所述化合物抑制所述多肽的生物活性。
22.筛选用于治疗或预防结肠癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将候补化合物与细胞接触，所述细胞中已导入载体，所述载体包含一或多种标记基因的转录调节区以及在该转录调节区控制下表达的报道基因，其中所述一或多种标记基因由选自权利要求3中SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11的核苷酸序列组成，
b)检测所述报道基因的活性；和
c)选择化合物，所述化合物与对照相比降低所述报道基因的表达水平。
23.筛选用于治疗或预防结肠癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在存在被验化合物的情况下，将由权利要求1中SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽与Zyxin接触；
(b)检测所述多肽与Zyxin之间的结合；和
(c)选择被验化合物，所述被验化合物可抑制所述多肽与Zyxin之间的结合。
24.筛选用于治疗或预防结肠癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在存在被验化合物的情况下，将由权利要求1中SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的多肽与MGC10334或CENPC1接触；
(b)检测所述多肽与MGC10334或CENPC1之间的结合；和
(c)选择被验化合物，所述被验化合物可抑制所述多肽和MGC10334或CENPC1之间的结合。
25.用于筛选治疗或预防结肠癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在存在被验化合物的情况下，将由权利要求1中SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的多肽与BRD8接触；
(b)检测所述多肽与BRD8之间的结合；和
(c)选择被验化合物，所述被验化合物可抑制所述多肽和BRD8之间的结合。
26.筛选用于治疗或预防结肠癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在存在被验化合物的情况下，将由权利要求1中SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的多肽与nCLU接触；
(b)检测所述多肽与nCLU之间的结合；和
(c)选择被验化合物，所述被验化合物可抑制所述多肽和nCLU之间的结合。
27.一种包含检测试剂的试剂盒，所述检测试剂与选自权利要求3中SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11的一或多种核酸序列结合。
28.一种包含检测试剂的试剂盒，所述检测试剂与由选自权利要求1中SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12的氨基酸序列组成的一或多种多肽结合。
29.一种包含核酸的阵列，所述核酸与选自权利要求3中SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11的两种或两种以上的核酸序列结合。
30.反义多核苷酸或小干扰RNA用于制备治疗或预防结肠癌的药物的用途，所述反义多核苷酸或小干扰RNA为权利要求3中核苷酸序列SEQ IDNO：1，3，5，7，9或11组成的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA。
31.权利要求30的方法，其中所述反义多核苷酸的核苷酸序列选自SEQ ID NO：50，52，54，56，58，60，62，64，66或68的核苷酸序列。
32.权利要求30的方法，其中所述小干扰RNA的靶序列包括SEQ IDNO：126-129的核苷酸序列。
33.抗体或其片段用于制备治疗或预防个体中结肠癌的药物的用途，所述抗体或其片段与由权利要求1中SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12的氨基酸序列组成的蛋白质结合。
34.多肽、或所述多肽的免疫活性片段、或编码该多肽的多核苷酸用于制备治疗或预防个体中结肠癌的疫苗的用途，所述多肽由权利要求1中SEQID NO：2，4，6，8，10或12的氨基酸序列组成。
35.化合物用于制备治疗或预防个体中结肠癌的药物的用途，所述化合物由权利要求18-26任一项的方法获得。
36.一种用于治疗或预防结肠癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的反义多核苷酸或小干扰RNA，所述反义多核苷酸或小干扰RNA为权利要求3中SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11的核苷酸序列组成的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA。
37.一种用于治疗或预防结肠癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与由权利要求1中SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12的氨基酸序列组成的蛋白质结合。
38.一种用于治疗或预防结肠癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的由权利要求1中SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12的氨基酸序列组成的多肽、或所述多肽的免疫活性片段、或编码该所述多肽的多核苷酸。
39.一种用于治疗或预防结肠癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的活性成分以及可药用的载体，其中所述活性成分为通过权利要求18-26任一项的方法选出的化合物。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0412301D0 (en) * 2004-06-02 2004-07-07 Diagenic As Product and method
WO2006016696A1 (en) * 2004-08-10 2006-02-16 Oncotherapy Science, Inc. Interaction of colon cancer related gene c20orf20 with p120
US20060246466A1 (en) * 2004-11-11 2006-11-02 Norwegian University Of Science And Technology Identification of biomarkers for detecting gastric carcinoma
JP2006275895A (ja) * 2005-03-30 2006-10-12 Olympus Corp 生体関連物質の測定情報の表示方法
CN1908189A (zh) * 2005-08-02 2007-02-07 博奥生物有限公司 体外辅助鉴定肠型胃癌及其分化程度的方法与专用试剂盒
JP4871630B2 (ja) * 2006-04-12 2012-02-08 第一三共株式会社 脱リン酸化酵素を阻害することを特徴とする細胞増殖阻害方法
WO2007122823A1 (ja) * 2006-04-20 2007-11-01 Jichi Medical University ベクター産生型腫瘍標的細胞
US20100284915A1 (en) * 2006-06-30 2010-11-11 Hongyue Dai Genes associated with chemotherapy response and uses thereof
EP1986010A1 (en) * 2007-04-05 2008-10-29 Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg Methods and tools for discriminating colorectal adenomas and adenocarcinomas
ES2583377T3 (es) * 2007-06-08 2016-09-20 Genentech, Inc. Marcadores de expresión génica de la resistencia tumoral al tratamiento con inhibidor de HER2
US9551033B2 (en) 2007-06-08 2017-01-24 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to HER2 inhibitor treatment
US8562806B2 (en) * 2007-07-31 2013-10-22 Georgia Tech Research Corporation Electrochemical biosensor arrays and instruments and methods of making and using same
SI2350316T1 (sl) * 2008-10-20 2014-09-30 Valipharma Postopki in uporabe, ki vkljuäśujejo genetske aberacije nav3 in aberantno izraĺ˝anje veäś genov
KR100984735B1 (ko) * 2009-05-28 2010-10-01 동국대학교 산학협력단 신개념 신약개발을 위한 타겟 단백질­단백질 상호작용을 저해하는 신약후보물질의 스크리닝 방법
GB201016995D0 (en) * 2010-10-08 2010-11-24 Univ Dundee Cancer targets
CN109793897B (zh) * 2012-10-31 2022-02-01 洛克菲勒大学 结肠癌的治疗和诊断
WO2014117050A2 (en) * 2013-01-26 2014-07-31 Mirimus, Inc. Modified mirna as a scaffold for shrna
MX2020006305A (es) * 2017-12-13 2020-09-17 Inovio Pharmaceuticals Inc Vacunas de cancer dirigidas a lemd1 y sus usos.
CN109609643B (zh) * 2019-01-21 2022-08-02 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种环状rna作为胃癌和结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030148935A1 (en) * 2000-02-23 2003-08-07 Peyman John A. Novel nuclear factor polypeptides and nucleic acids encoding same
AU2001245463A1 (en) * 2000-03-07 2001-09-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 26583, a novel serine/threonine phosphatase and uses therefor
WO2002018565A2 (en) * 2000-08-30 2002-03-07 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human protein phosphatase iic-like enzyme
DE10058596A1 (de) * 2000-11-25 2002-06-06 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zum Screening von chemischen Verbindungen zur Modulierung der Wechselwirkung einer EVH1-Domäne oder eines Proteins mit einer EVH1-Domäne mit einer EVH1-Bindedomäne oder einem Protein mit einer EVH1-Bindedomäne sowie ein Verfahren zum Nachweis besagter Wechselwirkung
WO2002097074A2 (en) * 2001-05-30 2002-12-05 Bayer Aktiengesellschaft Human protein phosphatase 2c-like enzyme

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
alterations of gene expression during colorectalcarcinogenesis revealed by cDNA microarrays afterlaser-capture microdissection of tumor tissues and normalepithelia. kitahara et al.cancer res.,Vol.61 . 2001
alterations of gene expression during colorectalcarcinogenesis revealed by cDNA microarrays afterlaser-capture microdissection of tumor tissues and normalepithelia. kitahara et al.cancer res.,Vol.61. 2001 *
genome-wide cDNA microarray screening to corralate geneexpression profiles with sensitivity of 85 human cancerxenografts to anticancer drugs. hitoshi et al.cancer research,Vol.62 . 2002
genome-wide cDNA microarray screening to corralate geneexpression profiles with sensitivity of 85 human cancerxenografts to anticancer drugs. hitoshi et al.cancer research,Vol.62. 2002 *
molecular diagnosis of colorectal tumors by expression profilesof 50 genes expressed differentially in adenomas andcarcinomas. lin et al.oncogene,Vol.21 . 2002
molecular diagnosis of colorectal tumors by expression profilesof 50 genes expressed differentially in adenomas andcarcinomas. lin et al.oncogene,Vol.21. 2002 *

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