KR20230041028A - SARS-CoV-2 면역원성 조성물, 백신 및 방법 - Google Patents

SARS-CoV-2 면역원성 조성물, 백신 및 방법 Download PDF

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삐에르 오띠
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Abstract

본 발명은 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 이는 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 작용제를 상기 대상체의 상기도에 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자를 상기도에 투여하기 위한 제형에 관한 것이다.

Description

SARS-CoV-2 면역원성 조성물, 백신 및 방법
2019년 말 중국 우한에서 출현한 새로운 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 매우 전염성이 강하고 전 세계적으로 빠르게 확산되고 있다(Guo 등, 2020). 이전에 출현한 SARS 또는 중동 호흡기 증후군(MERS) 코로나바이러스와 비교할 때 SARS-CoV-2는 전 세계 보건에 전례 없는 위협 및 엄청난 사회 경제적 결과를 초래한다. 따라서, SARS-CoV-2에 대한 효과적인 예방 백신의 개발은 유해한 염증 및 진행성 호흡 부전과 같이, 전염병의 확산을 억제하고 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 발병을 약화시키기 위해 절대적으로 필요하다(Amanat 및 Krammer, 2020). 폐가 SARS-CoV-2가 선호하는 기관이지만, SARS-CoV 및 중동 호흡기 증후군(MERS)-CoV의 것(Glass 등, 2004; Li 등, 2016; Netland 등, 2008)과 같은 그의 향신경성(neurotropism) (Glass 등, 2004; Li 등, 2016; Netland 등, 2008)도 보고되어 왔다(Aghagoli 등, 2020; Fotuhi 등, 2020; Hu 등, 2020; Liu 등, 2020; Politi 등, 2020; Roman 등, 2020; von Weyhern 등, 2020; Whittaker 등, 2020). 또한, 신경세포 및 신경아교세포에서 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)의 발현이 기술되어 왔다(Chen 등, 2020; Xu 및 Lazartigues, 2020). 따라서 COVID-19 인간 환자는 두통, 근육통, 후각 상실, 미각 이상, 의식 장애 및 급성 뇌혈관 질환과 같은 증상을 나타낼 수 있다(Bourgonje 등, 2020; Hu 등, 2020; Mao 등, 2020). 바이러스는 신경 전파 또는 혈행 경로를 통해 뇌에 접근할 수 있다(Desforges 등, 2014). COVID-19 사망 환자의 부검 분석 결과, 비인두에 SARS-CoV-2가 존재하고 후각 점막의 신경-점막 경계면을 통해 뇌와 중추신경계(CNS)로 바이러스가 유입되는 것으로 확인되었다(Meinhardt 등, 2020). 따라서 이후에는 호흡기뿐만 아니라 뇌에서의 COVID-19 백신 후보의 보호 특성에 초점을 맞추는 것이 중요하다.
코로나바이러스는 외피가 있는 비분절 양성 가닥 RNA 바이러스로, 외피에 고정된 스파이크(S) 당단백질이 특징이다(Walls 등, 2020). SARS-CoV-2 S(SCoV-2)는 숙주 세포에서 발현되는 카르복시펩티다아제 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)와 결합하는 (180kDa)3 동종삼량체 클래스 I 바이러스 융합 단백질이다. SCoV-2 단백질의 단량체는 외부 도메인, 막관통 앵커 도메인 및 짧은 내부 꼬리를 가지고 있다. SCoV-2는 2단계 순차적 단백질 분해 절단에 의해 활성화되어 숙주 세포막과의 융합을 시작한다. 형태 재구성을 유도하는 SCoV-2-ACE2 상호작용에 이어, SCoV-2의 세포외 도메인은, 유비쿼터스 푸린과 연결된(Wang 등, 2020) 바이러스의 병리학적 특징을 결정하는 핵심 요소인 고도로 특이적인 푸린 682RRAR685(서열번호 99) 부위에서 먼저 절단된다(Guo 등, 2020; Walls 등, 2020). 생성된 서브유닛은 다음의 것들로 구성되어 있다: (i) ACE2 프로테아제 도메인으로 제한된 원자 접촉이 있는 ACE2 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하고 NAb를 표적으로 하는 주요 B 세포 에피토프를 또한 포함하는 S1(Walls 등, 2020), 및 (ii) 막 융합 요소를 포함하는 S2. SCoV-1과 마찬가지로, S1의 쉐딩(shedding)은 S2에서 두 번째 단백질 분해 절단 부위인 797R, 즉 S2'에 접근할 수 있게 한다(Belouzard 등, 2009). 세포 또는 조직 유형에 따라, 푸린, 트립신, 카텝신 또는 TMPRSS(TransMembrane Protease Serine Protease)-2 또는 -4를 포함한 하나 또는 여러 개의 숙주 프로테아제가 이러한 두 번째 절단 단계에 관여할 수 있다(Coutard 등, 2020). 결과적으로 S의 "융합(fusogenic)" 구조적 변화는, 숙주 세포막과의 융합 반응을 시작하고(Sternberg alc Naujokat, 2020) S2'에 인접한 융합 펩티드(FP)의 노출로 이어지는 SCoV-2의 매우 안정적인 융합 후 형태를 초래한다. 숙주 세포/소낭 막에 FP를 삽입하면 융합 반응이 시작되어 바이러스 RNA가 숙주 세포질로 방출된다(Lai 등, 2017). SCoV-2-ACE2 상호작용이 지금까지 SARS-CoV-2에 의한 숙주 세포 감염에 대해 확인된 유일한 메커니즘이라는 사실 및 RBD가 수많은 구조적 B 세포 에피토프를 포함하고 있다는 사실(Walls 등, 2020)은 이러한 바이러스 외피 당단백질을 중화 항체(nAbs)의 주요 표적으로 지정한다. 호흡기 세포융합 바이러스, HIV, 에볼라 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 및 라사 바이러스(Bos 등, 2020)를 포함한 여러 다른 바이러스의 외피 당단백질과 마찬가지로, SCoV-2를 조작하여, S1 B 세포 에피토프의 노출을 더 잘 유지하고 면역원 가용성을 개선할 수 있는 융합전 형태 하에서 그의 안정화 및 형태적 역학(conformational dynamics)을 피할 수 있다(McCallum 등, 2020).
몇 가지 백신 대안물은 상당한 단점이 있다. 구체적으로: (i) 약독화 또는 불활성화 바이러스 백신 후보는 광범위한 안전성 테스트를 필요로 하고, (ii) S를 암호화하는 핵산은 장기간 보호에 대한 효능이 입증되지 않았고, (iii) 단백질 백신은 아쥬반트의 사용 및 부스팅을 필요로 하고, (iv) 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에 대해 이미 존재하는 면역은, 강력한 항-벡터 면역 반응을 생성하여 이는 면역원성을 크게 감소시킨다 (Rosenberg 등, 1998; Schirmbeck 등, 2008). 바이러스 벡터 중에서 렌티바이러스 벡터는 통합(ILV) 및 비통합(NILV) 형태로 존재하며, 이들 형태는 백신 관심 대상(vaccinal interest)의 최대 8kb 길이의 이식유전자의 삽입을 허용하고 숙주 세포의 핵으로의 우수한 유전자 전달 가능성을 가지고 있다(Di Nunzio 등, 2012; Hu 등, 2011; Ku 등, 2020; Zennou 등, 2000). 렌티벡터는 면역 세포, 특히 수지상 세포에 대해 생체 내 친화성(tropism)을 나타내고, 비복제성, 비세포 변성이고 및 거의 염증이 없으며, 오래 지속되는 B 및 T 세포 면역을 유도한다(Di Nunzio 등, 2012; Hu 등, 2011; Ku 등, 2020; Zennou 등, 2000). 인간 개체군이 거의 노출되지 않은 수포성 구내염 바이러스의 표면 당단백질로 둘러싸이는 유사 유형인 LV는 아데노바이러스 벡터와 달리 인간에서 특정 기존 면역의 표적이 아니다(Rosenberg 등, 1998; Schirmbeck 등, 2008). 또한, 인간에 대한 LV의 안전성은 I/II상 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-1 백신 시험(2011-006260-52 EN)에서 확립되었다.
SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 조성물 및 방법에 대한 필요성이 존재한다. 본 개시는 이러한 요구 및 기타 요구를 충족한다.
COVID-19를 예방하거나 그 중증도를 감소시킬 수 있는 백신 후보를 개발하기 위해, 하기의 것들을 암호화하는 LV를 생성하였다: (i) S의 전장의 막 고정 형태(LV::SFL / LV::SFL), (ii) 막횡단 및 내부 꼬리 도메인이 없는 S1-S2 엑토-도메인(LV::S1-S2), (iii) S1 단독(LV::S1), (iv) 푸린 부위를 포함하는 서열이 결실되고 잔기 K986P 및 V987P에서 치환되어 S2(2P 돌연변이)에 연속적인 프롤린 잔기를 도입하여 안정화된(2P) 및 융합전(△F) 형태의 단백질을 제공하는 돌연변이된 S(LV::S△F2P). 또한, 하기의 것들을 암호화하는 LV를 포함하는 추가의 백신 후보를 생성하였다: (i) 변이체 B1.351(소위 남아프리카 또는 β 변이체)의 스파이크 단백질, (ii) 변이체 B1.1.7(소위 UK 또는 알파 변이체)의 스파이크 단백질, (iii) 잔기 K986P 및 V987P에서 치환된 변이체 B1.351의 스파이크 단백질, (iv) D614G 치환과 조합된 S의 전장 막 고정 형태(LV::SFL-D614G), 및 (v) 변이체 P.1(소위 Manaus 또는 감마 변이체)의 스파이크 단백질. 특히 실시예에서 제시된 데이터는 벡터의 통합 또는 비통합 버전의 LV::SFL 및 LV::S△F2P가 (i) SARS-CoV-2 환자 코호트에서 발견되는 것과 유사한 중화 활성을 갖는 COVID-19의 병인체(etiologic agent)인 SARS-CoV-2의 스파이크 당단백질(S)에 특이적인 중화 항체를 유도하고, (ii) 스파이크-특이적 CD8+ T 세포를 유도하였다는 것을 확인시켜준다. 또한, SARS-CoV-2 복제에 매우 취약한 골든 햄스터를 사용하여, SARS-CoV-2 임상 분리주의 복제에 대한 LV::SFL 또는 LV::S△F2P 면역의 강력한 예방 효과가 입증되었다. 아데노바이러스 벡터 혈청형 5(Ad5)에 의해 호흡기에서 인간 ACE2(hACE2)의 발현이 유도된 마우스 모델에서도 유사한 결과가 얻어졌다. 게다가, 뇌를 포함하여 SARS-CoV-2 복제에 대한 전례 없는 허용 가능성을 보여주는 전임상 모델로 생성된 형질전환(transgenic) 마우스에서, 본 발명자들은 LV::S△F2P와 같은 SARS-CoV-2 스파이크 당단백질의 융합전 형태를 암호화하는 LV는 SARS-CoV-2에 대하여 호흡기 및 CNS의 실질적인 보호를 유도한다는 것을 입증할 수 있었다. 예기치 않게, 생성된 형질전환 마우스는 하기 제공되고 실험예에 예시된 정의에 따라 스파이크 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 개발된 LV가 CNS를 보호하는 능력을 다룰 수 있게 하였다. 또한, 본 발명자들은 SARS-CoV-2의 스파이크 당단백질의 융합전 형태를 암호화하는 LV의 단일 비강내 투여가 호흡기의 실질적인 보호를 유도하고 감수성 햄스터 모델에서 폐 염증을 완전히 방지한다는 것을 입증했다. 또한 중요하게도, LV::SFL 또는 LV::S△F2P를 사용한 상기도 점막 부스트/표적 면역화는 생성된 형질전환 마우스로 구성된 엄격한 전임상 모델에서 보호 효능에 중요한 역할을 했다. 제시된 바이러스학적, 면역학적 및 조직병리학적 데이터는 다음을 입증한다: (i) SARS-CoV-2에 대한 LV 기반 백신 접종 전략의 현저한 예방 효과, (ii) LV 기반 면역이 코로나바이러스에 대한 백신 후보를 개발하기 위한 유망한 전략을 나타낸다는 사실, 및 (iii) 점막 면역화는 활발한 보호 폐 면역 및 보호 CNS 면역을 가능하게 한다. 감염된 숙주의 여러 기관에 대해 향성(tropism)을 나타내는 SARS-CoV-2의 특정 맥락에서, 숙주 세포를 표적하는데 필수적인 렌티바이러스 서열을 포함하고 예를 들어 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 또는 B 에피토프 및 T 에피토프를 포함하는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 이식유전자의 발현을 가능하게 하는 모든 형태의 렌티바이러스 벡터는 이식유전자 항원에 대한 면역 반응을 유도 및/또는 활성화하는 능력을 보여주었다. 본 발명자들은 특히 숙주의 면역계에의 에피토프, 특히 B-에피토프의 효과적인 제시를 가능하게 하는 S 항원(야생형이든 또는 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이이든)의 형태를 유지하거나 지지하는 렌티바이러스 벡터의 능력을 입증했다. 또한, 본원에 개시된 실험 데이터는 숙주의 상기도에 투여하는 단계를 포함하는 투여 경로가 바이러스에 의해 표적화된 몇몇 조직 또는 기관에서 면역 반응을 개선할 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는 놀랍고 예상치 못한 것이다.
또한, 실시예의 데이터는 다음을 입증한다: (i) 전신 수준에서 NILV::SCoV-2 Wuhan에 의해 유도된 강력한 CD8+ T-세포 반응, (ii) 여러 SCoV-2 에피토프에 특이적인 IFN-g 생성 폐 CD8+ T 세포의 주목할만한 비율, (iii) 이펙터 메모리(Tem) 및 상주 메모리(Trm) 표현형을 갖는 폐 CD8+ T 세포의 높은 비율, (iv) 백신을 접종하고 SARS-CoV-2 우한 또는 SARS-CoV-2 P.1 변종으로 공격접종한 마우스에서 감지할 수 있는, 후각 망울에의 CD8+ T 세포의 동원. 놀랍게도, SCoV-2 Wuhan 서열에서 확인된 모든 뮤린 및 인간 CD8+ T 세포 에피토프는 돌연변이된SCoV-2 Manaus P.1에서 보존된다. 이러한 관찰은 현저한 B 및 T 세포 반응을 유도함으로써 조상 및 신종 SARS-CoV-2 변종에 대한 폐와 뇌의 완전한 보호를 유도하는데 있어서의 NILV의 강력한 잠재력을 나타낸다. NAb의 표적인 B 세포 에피토프와 달리, 지금까지 확인된 T 세포 에피토프는 새로운 변종의 SCoV-2에 축적된 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 놀랍고 예상치 못한 것이다.
실시예의 데이터는 다음을 추가로 입증한다: (i) LV::SCoV-2 B1.1.7로 면역화된 마우스의 혈청은 SCoV-2 Wuhan 및 LV::S SCoV-2 B1.1.7를 포함하는 슈도 바이러스를 높은 EC50에서 중화하지만, SCoV-2 B1.351 및 LV::S SCoV-2 P.1를 포함하는 슈도 바이러스를 빈약하게 중화했고,
(ii) LV::S SCoV-2 P.1로 면역화된 마우스의 혈청은 SCoV-2 P.1 및 LV:: SCoV-2 B1.351를 포함하는 슈도 바이러스를 높은 EC50에서 중화하지만, SCoV-2 Wuhan 및 LV:: SCoV-2 B1.1.7를 포함하는 슈도 바이러스를 빈약하게 중화했고,
(iii) LV:: SCoV-2 B1.351로 면역화된 마우스의 혈청은 SCoV-2 P.1 및 LV:: SCoV-2 B1.351 를 포함하는 슈도 바이러스뿐만 아니라 SCoV-2 Wuhan 및 LV:: SCoV-2 B1.1.7를 포함하는 슈도 바이러스를 높은 EC50에서 중화했다.
이러한 결과는 B1.351(남아프리카 또는 β) 변종의 스파이크 서열을 중화 항체 측면에서 가장 교차 반응성인 면역원으로 지정한다.
또한, 데이터는 LV와 관련하여 K986P - V987P 치환(2P)에 의한 스파이크 안정화가 (교차) 중화 항체 활성을 상당히 향상시킨다는 것을 보여주었다.
종합하면 데이터는 놀랍고 예상외로, 하나의 특히 효과적인 항원은 2P를 갖는 B1.351(남아프리카 또는 β) 변이체 유래의 전장 스파이크라는 것을 보여준다.
따라서, 제1 측면에서 본 발명은 대상체에서 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 대상체의 상기도에 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 작용제(agent)를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 작용제는 SARS-CoV-2 스파이크(S) 당단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타입 LV 벡터 입자이다. 몇몇 구현예에서 작용제는 에어로졸 흡입에 의해 투여된다. 몇몇 구현예에서 작용제는 비강 점적에 의해 투여된다. 몇몇 구현예에서 작용제는 비강 흡입에 의해 투여된다. 몇몇 구현예에서 치료 과정은 상기도에의 단일 투여로 구성된다. 몇몇 구현예에서 치료 과정은 기도 외부에 적어도 1회 프라이밍 투여한 후 상기도에 적어도 1회 부스팅 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서 보호 면역 반응은 대상체에서 SARS-CoV-2 중화 항체의 생성을 포함한다. 몇몇 구현예에서 중화 항체는 IgG 항체를 포함한다. 몇몇 구현예에서 중화 항체는 IgA 항체를 포함한다. 몇몇 구현예에서 보호 면역 반응은 대상체에서 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포의 생성을 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두를 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 폐 CD8+ T 세포를 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 IFN-γ 생산 T-세포를 포함한다. 몇몇 구현예에서 CD8+ T 세포는 이펙터 메모리(Tem) 및/또는 상주 메모리(Trm) 표현형을 갖는 T 세포를 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 후각 망울로 동원된다. 몇몇 구현예에서 보호 면역 반응은 대상체에서 SARS-CoV-2 감염 관련 염증이 발생할 가능성을 감소시킨다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열로부터 발현된다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 단편은 펩티드 61-75(NVTWFHAIHVSGTNG(서열번호 15)), 펩티드 536-550(NKCVNFNFNGLTGTG(서열번호 16)) 및 펩티드 576-590(VRDPQTLEILDITPC(서열번호 17))로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 유도체 또는 이의 단편은 서열번호 1에 대한 아미노산 변형을 포함하며, 상기 변형은 (i) 986K→P 및 987V→P, (ii) 681PRRARS686(서열번호 22) → 681PGSAGS686(서열번호 23), 및 (iii) 986K→P, 987V→P, 및 675QTQTNSPRRAR685(서열번호 24) 결실로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 1, 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 및 120로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 1을 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 1로 구성된다.
몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 5를 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 5로 구성된다.
몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 8을 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 8로 구성된다.
몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 11을 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 11로 구성된다.
몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 14를 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 14로 구성된다.
몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 108을 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 108로 구성된다.
몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 111을 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 111로 구성된다.
몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 114를 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 114로 구성된다.
몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 117을 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 117로 구성된다.
몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 120을 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 120으로 구성된다.
몇몇 구현예에서, 투여된 LV 벡터 입자는 통합적(ILV)이다. 몇몇 구현예에서, 투여된 렌티바이러스 벡터 입자는 결손 인테그라제 단백질(NILV)과 비통합적이다. 몇몇 구현예에서, 투여된 NILV는 인테그라제 코딩 서열에서 D64V 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 투여된 LV 벡터 입자는 수포성 구내염 바이러스 외피 당단백질(VSV-G)로 슈도타이핑된다. 몇몇 구현예에서, LV 벡터 입자는 LV 벡터 입자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신 제제로서 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 LV 벡터 입자를 대상체의 상기도에 투여하기 위한 제형(dosage form)에 관한 것이다. 몇몇 구현예에서 제형은 에어로졸 흡입에 의한 투여를 위한 것이다. 몇몇 구현예에서 제형은 비강 점적에 의한 투여를 위한 것이다. 몇몇 구현예에서 제형은 비강 흡입에 의한 투여를 위한 것이다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열로부터 발현된다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 단편은 펩티드 61-75(NVTWFHAIHVSGTNG(서열번호 15)), 펩티드 536-550(NKCVNFNFNGLTGTG(서열번호 16)) 및 펩티드 576-590(VRDPQTLEILDITPC(서열번호 17))로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 유도체 또는 이의 단편은 서열번호 1에 대한 아미노산 변형을 포함하며, 상기 변형은 (i) 986K→P 및 987V→P, (ii) 681PRRARS686(서열번호 22) → 681PGSAGS686(서열번호 23), 및 (iii) 986K→P, 987V→P, 및 675QTQTNSPRRAR685(서열번호 24) 결실로부터 선택된다. S 단백질의 추가 유도체 및 단편은 본 발명의 다양한 측면과 함께 아래에 개시되어 있다.
몇몇 구현예에서, 투여된 LV 벡터 입자는 통합적(ILV)이다. 몇몇 구현예에서, 투여된 LV 벡터 입자는 비통합적이다(NILV). 몇몇 구현예에서, NILV 입자는 인테그라제 암호화 서열에서 D64V 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 수포성 구내염 바이러스 외피 당단백질(VSV-G)로 슈도타이핑된다.
또 다른 측면에서, 키트가 제공된다. 키트는 본원에 개시된 방법을 실행하는데 사용하기에 적합할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 키트는 본 개시에 따른 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 LV 벡터 입자를 대상체의 상기도에 투여하기 위한 제형을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 투여용 어플리케이터(applicator)는 에어로졸 흡입용 어플리케이터이다. 몇몇 구현예에서, 대상체의 상기도에 투여하기 위한 어플리케이터는 비강 점적을 위한 어플리케이터이다. 몇몇 구현예에서, 대상체의 상기도에 투여하기 위한 어플리케이터는 비강 흡입용 어플리케이터이다.
또한 SARS-CoV-2 Spike(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 신규하고 자명하지 않은 슈도타이핑된 LV 벡터 입자가 제공된다. 몇몇 구현예에서, 슈도타이핑된 LV 벡터 입자는 대상체의 상기도에 투여된다. 몇몇 구현예에서, 슈도타이핑된 LV 벡터 입자는 대상체의 상기도에 투여 후 SARS-CoV-2 감염 관련 염증이 발생할 가능성을 감소시키는 보호 면역 반응을 유도한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열로부터 발현된다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 단편은 펩티드 61-75(NVTWFHAIHVSGTNG(서열번호 15)), 펩티드 536-550(NKCVNFNFNGLTGTG(서열번호 16)) 및 펩티드 576-590(VRDPQTLEILDITPC(서열번호 17))로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 유도체 또는 이의 단편은 서열번호 1에 대한 아미노산 변형을 포함하며, 상기 변형은 (i) 986K→P 및 987V→P, (ii) 681PRRARS686(서열번호 22) → 681PGSAGS686(서열번호 23), 및 (iii) 986K→P, 987V→P, 및 675QTQTNSPRRAR685(서열번호 24) 결실로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서 LV 벡터 입자는 통합적(ILV)이다. 몇몇 구현예에서 렌티바이러스 벡터 입자는 비통합적이다(NILV). 몇몇 구현예에서 NILV 입자는 인테그라제 암호화 서열에서 D64V 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구현예에서 LV 벡터 입자는 수포성 구내염 바이러스 외피 당단백질(VSV-G)로 슈도타이핑된다. 몇몇 구현예에서, 슈도타이핑된 LV 벡터 입자는 하기의 것들로부터 선택된 벡터에 의해 암호화되는 스파이크 단백질, 또는 이의 단편 또는 유도체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 스파이크 당단백질, 또는 이의 단편 또는 유도체를 암호화한다:
pFlap-ieCMV-S2P△F-WPREm(pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm이라고도 함)(CNCM I-5537), pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538), pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCM I-5539), pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCM I-5540), pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708), pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709), pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710), pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711), 및 pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712).
또한 하기의 것들로부터 선택된 벡터가 제공된다: pFlap-ieCMV-S2P△F-WPREm(pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm이라고도 함)(CNCM I-5537), pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538), pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCM I-5539), pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCM I-5540), pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708), pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709), pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710), pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711), 및 pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712).
또한 하기의 것들로부터 선택된 벡터를 포함하는 숙주세포가 제공된다: pFlap-ieCMV-S2P△F-WPREm(CNCM I-5537), pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538), pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCM I-5539), pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCM I-5540), pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708), pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709), pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710), pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711), pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712). 몇몇 구현예에서 벡터는 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되는 반면, 다른 구현예에서는 그렇지 않다.
또한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 당단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 LV 벡터 입자가 제공되고, 여기사의 슈도타이핑된 LV 벡터 입자는 하기의 것들로부터 선택된 벡터로 숙주 세포를 공동-형질감염하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다: pFlap-ieCMV-S2P△F-WPREm(CNCM I-5537), pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538), pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCM I-5539), pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCM I-5540), pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708), pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709), pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710), pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711), 및 pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712).
도면은 컬러 도면으로 제출된다.
도 1. LV에 의한 항-S CoV-2 Ab 반응의 유도. (A) 마우스에 주입된 LV에 의해 암호화된 3가지 형태의 SCoV-2 단백질(SFL, S1-S2 및 S1)의 개략도. RBD, S1/S2 및 S2' 절단 부위, 융합 펩티드(FP), 막관통(TM) 및 짧은 내부 꼬리(T)가 표시되어 있다. (B) LV 면역화 후 항-SCoV-2 Ab 반응의 역학. C57BL/6 마우스(n = 4/그룹)에게 음성 대조군으로서 LV::GFP, LV::S1, LV::S1-S2 또는 LV::SFL를 1 x 107 TU로 복강내 주사했다. 면역화 후 2, 3, 4 및 6주에 혈청을 수집하였다. 항-SCoV-2 IgG 반응을 ELISA로 평가하고 평균 종점 희석 역가로 표현했다. (C) LV::SFL 면역화에 의해 유도된 항-SCoV-2 Ab의 중화 능력. 50% 유효 농도(EC50) 중화 역가를 측정하기 위해 혈청 중화 분석에서 마우스 혈청을 평가하였다. (D) 다양한 실험 그룹에서 Ab 역가와 중화 활성 사이의 상관관계. 통계적 유의성은 양방향 Spearman 순위 상관 검정에 의해 결정되었다. NS: 유의하지 않음. (E) 면역화후 후 3주 또는 4주에 채취한 마우스 혈청과 프랑스, Ile de, Crepy-en-Valois에 거주하는 경미한 증상이 있는 코호트 사이의 1:40 희석에서 일대일 비교. 이 환자들은 치료를 받지 않고 COVID-19에서 회복되었다. 결과는 루시페라제 활성 억제의 평균 ± SEM 백분율로 표시된다.
도 2. LV::S FL 에 의한 T-세포 반응의 유도. C57BL/6 마우스(n = 3)에게 1 x 107 TU의 LV::SFL 또는 음성 대조군 LV를 복강내 주사했다. (A) 면역화 2주 후에 수집된 비장 세포는 전체 SCoV-2(1-1273 a.a.)에 걸쳐 있고 10 a.a. 잔기만큼 서로 겹치는 15-mer 펩티드의 16개의 개별 풀을 사용하여 IFN-γ ELISPOT에 적용되었다. SFU = 스팟 형성 세포. (B) 3마리의 LV::SFL-또는 Ctrl LV-면역 마우스로부터 풀링된 비장 세포에 적용된 ELISPOT에 의한 16개의 양성 펩티드 풀의 디콘볼루션. (C) 면역우성 에피토프를 포함하는 개별 펩티드로 자극한 후 CD4+ 또는 CD8+ T 비장세포의 세포내 IFN-γ 대 IL-2 염색.
도 3. 호흡기에서 hACE2를 발현하는 뮤린 모델 설정. (A) 형질도입 2일 후, Ad5::hACE2로 형질도입된 HEK293 T 세포에서 RT-PCR에 의한 hACE2 발현의 검출. NT: 형질도입되지 않음. (B) C57BL/6 마우스(n = 2/그룹)에게 Ad5::hACE2 또는 빈 Ad5의 비강내 점적 후 4일에 회수된 폐 세포 추출물에서 웨스턴 블롯에 의한 hACE2 단백질 검출. (C) CD45+ 조혈 세포 또는 EpCam+ 상피 세포에서 유세포 분석법으로 평가한 것으로, C57BL/6 마우스에게 Ad5::GFP 또는 PBS의 비강내 점적 후 4일째에 제조한 폐 세포에서의 GFP 발현. (D) Ad5::hACE2의 2.5 x109 IGU, 대조군 빈 Ad5 또는 PBS로 전처리한 후 4일 후 1 x105 TCID50의 SARS-CoV-2로 비강내 접종한 마우스의 폐 바이러스 부하. 한 그룹에서, Ad5::hACE2-전처리된 마우스는 바이러스 복제가 없는 상태에서 입력 바이러스 RNA를 측정하기 위해 동량의 열 사멸(HK) 바이러스로 접종하였다. 2, 4 또는 7 dpi에서 폐 균질물에서 qRT-PCR에 의한 바이러스 부하 정량화. 빨간색 선은 검출 한계를 나타낸다. (E) 다양한 투여량의 Ad5::hACE2로 전처리한 후 4일째에 측정한 폐 내 CD45+ 세포의 백분율. (F) 다양한 용량의 Ad5::hACE2로 전처리한 후 4일 후 SARS-CoV-2의 1 x105 TCID50으로 접종한 마우스에서 폐 바이러스 부하. 바이러스 부하은 3dpi에서 측정하였다.
도 4. 마우스에서 SARS-CoV-2에 대한 LV::S FL 을 사용한 전신 면역화의 보호 가능성. (A) LV의 단일 복강내 주사 후 Ad5::hACE2 전처리 및 비강내 SARS-CoV-2 공격접종에 의한 백신 접종 일정. (B) 백신 접종되지 않은 마우스(PBS), LV::SFL- 또는 샴(sham)-백신 접종 마우스의 폐 바이러스 부하, 3dpi. 바이러스 부하의 차이의 통계적 유의성은 양측 독립표본 t 검정(two tailed unpaired)로 평가되었다. * = p<0.0139.
도 5. LV::S FL 을 사용한 비강 내 부스트는 마우스에서 SARS-CoV-2에 대한 강력한 보호를 제공한다. (A) LV 기반 프라임 부스트 전략 후 Ad5::hACE2 전처리 및 SARS-CoV-2 공격접종의 일정. (B) 0주째에 복강내 프라이밍되고 3주째에 복강내 또는 비강내 부스트된 C57BL/6 마우스의 혈청에서 ELISA에 의해 정량화된 항-SCoV-2 IgG의 역가(왼쪽). 역가는 부스트(3주째) 및 공격접종(4주째) 전에 평균 종료점 희석으로 결정되었다. *** p <0.001, **** p <0.0001; 양방향 ANOVA에 이어 Sidak의 다중 비교 검정. NS, 유의적이지 않음. EC50으로 표시된 이들 혈청의 중화 능력(오른쪽). (C). LV::SFL로 프라이밍(복강내) 및 부스트(복강내 또는 비강내)된 마우스에서 3dpi에서의 폐 바이러스 부하. 샴 백신 접종은 빈(empty) LV를 받았다. 빨간색 선은 검출 한계를 나타낸다. 바이러스 부하의 차이의 통계적 유의성은 양측 독립표본 t 검정으로 평가되었다. * = p<0.0139, *** = p<0.0088. (D) 코팅을 위해 Foldon-trimerized SCoV-2를 사용하여 ELISA에 의해 정화된 폐 균질액에서 측정된 항-SCoV-2 IgG 및 IgA Ab의 역가. (E) 1/5 희석의 경우에 측정된 정화된 폐 균질물의 중화 활성. 차이의 통계적 유의성은 Mann-Whitney U 검정에 의해 평가되었다(*= p<0.0159).
도 6. LV::S FL 백신접종은 마우스에서 SARS-Co-2 매개 폐 염증을 감소시킨다. (A) 뚜렷한 폐 선천성 면역 세포 하위 집합을 식별하고 정량화하기 위한 유세포 분석 전략. 폐 조혈 CD45+ 세포는 표면 마커 또는 표면 마커의 조합에 특이적인 항체를 사용하여 분석하여 선천성 면역 세포 집단을 3가지 고유한 경로와 순차적 게이팅을 통해 특성 규명할 수 있었다. 세포 집단은 회색으로 강조 표시되어 있다. (B) PBS만 받은 비감염(NI) 대조군과 비교하여 다양한 프라임-부스트 요법에 따라 샴 백신 접종 또는 LV::SFL로 백신 접종된 마우스에서 3dpi에서 각 선천성 면역 하위 집합 대 총 폐 CD45+ 세포의 백분율. 모든 마우스는 SARS-CoV-2 접종 4일 전에 Ad5::hACE-2로 전처리되었다. (C) 3 dpi에서 다양한 프라임-부스트 요법에 따라 샴 백신접종 또는 LV::SFL로 백신접종된 마우스에서 사이토카인 및 케모카인 mRNA 발현의 상대적 log2 배수 변화. 데이터는 PBS-처리된 공격접종되지 않은 대조군에 대해 정규화되었다. 통계적 유의성은 양측 독립표본 t 검정에 의해 평가되었다. * = p<0.05, ** = p<0.01, *** = p<0.001 및 **** = p<0.0001.
도 7. LV::S FL 을 사용한 비강내 백신 접종은 골든 햄스터에서 SARS-CoV-2에 대한 강력한 보호를 제공한다. (A) 햄스터의 LV::SFL 프라임-부스트/표적 면역 요법 및 SARS-CoV-2 공격접종의 일정. 샴 백신 접종은 빈 LV를 받았다. (B) LV 면역화 후 항-SCoV-2 Ab 반응의 역학. 혈청은 프라임 주사 후 3주, 5주(전-부스트) 및 6주(후-부스트)에 샴 또는 LV 백신접종 햄스터로부터 수집되었다. 항-SCoV-2 IgG 반응은 ELISA로 평가하고 평균 종점 희석 역가로 표시했다. (C) 무증상(AS), 소수 증상(PS), 증상이 있는 COVID-19 사례(S) 또는 입원(H) 인간의 코호트의 혈청과 비교하여, 부스트 후 햄스터의 혈청에서 확인된 후 부스트/표적 EC50 중화 역가. (D) 다양한 요법으로 샴 또는 LV::SFL 백신접종한 햄스터의 체중 추적. 명확성을 더하기 위해, 4dpi에 도달하는 개체만이 도시되어 있다. 2dpi에서 희생된 것들은 0에서 2dpi 사이의 동일한 그룹의 상대(counterpart)와 동일한 평균 체중을 가졌다. (E) LV::SFL 백신 접종 햄스터에서 SARS-CoV-2로서 2dpi 또는 4dpi에서 폐 바이러스 부하. 바이러스 부하의 차이의 통계적 유의성은 양측 독립표본 t 검정에 의해 평가되었다. * = p<0.0402, **** = p<0.0001. 도 S4C도 참조한다. (F) 전체 폐 균질액에서 qRT-PCR에 의해 4 dpi에서 측정하고 무처리 대조군에 정규화한 바와 같이, LV::SFL-백신접종 개체 및 보호된 햄스터 대 보호되지 않은 샴-백신접종 개체에서의 사이토카인 및 케모카인 발현의 상대적 log2 배수 변화. 사이토카인 및 케모카인 수준의 차이의 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 의해 평가되었다. * = p<0.05, ** = p<0.01.
도 8. LV::S FL 백신접종은 골든 햄스터에서 SARS-Co-2-매개 조직병리를 감소시킨다. 동물은 도 6에 도시된 것들이다. (A) 다양한 프라임-부스트 요법에 따라 샴 백신접종 또는 LV::SFL로 백신접종된 마우스에서 사이토카인 및 케모카인 mRNA 발현의 log2 배수 변화의 측정. 각 작제물(construct) 및 요법에 대해 동일한 출현 순서가 각 측정에 적용된다. (B) 2dpi 및 4dpi에 대하여 확인된 조직학적 분석 HE&S 폐. 최초 배율: x10, 눈금 막대: 100㎛. Br: 기관지 또는 세기관지. Bv: 혈관. 화살표: 단핵 염증 세포 침윤. 별표: 호흡기 상피의 퇴행성 변화. (C) 각각의 정의된 매개변수에 대해 조직학적 점수의 평균을 요약하고 2 또는 4dpi에서 동일한 그룹의 개체에 대해 측정된 히트맵.
도 9. 골든 햄스터에 대한 전신 프라임 및 비강내 부스트 요법에서 NILV::S FL 의 보호 효능. (A) 햄스터에서 NILV::SFL 프라임-부스트/표적 면역 요법 및 SARS-CoV-2 공격접종의 일정. (B) 단일(근육내) 주사 또는 NILV::SFL로 프라임(근육내) - 부스트(비강내) 면역화 후 혈청 항-SCoV-2 IgG 반응의 프로파일. 항-SCoV-2 IgG 반응은 평균 종점 희석 역가로 표시되었다. (C) 대조군 또는 NILV::SFL 백신접종 햄스터에서 SARS-CoV-2로서 4dpi에서 폐 바이러스 부하. 바이러스 부하의 차이의 통계적 유의성은 양측 독립표본 t 검정에 의해 평가되었다. ** = p <0.01. (D) 햄스터의 혈청에서 측정된, 부스트 후/표적 EC50 중화 역가. (E) 폐 조직학적 분석은 H&E에 의해 수행되었다. 각 매개변수에 대해 조직학적 점수를 요약하고 4dpi에서 다양한 그룹의 개체에 대해 측정된 히트맵. (F, G) 4 dpi에서 NILV::SFL 근육내 - NILV::SFL 비강내(F) 또는 샴 근육내 - 샴 비강내 (G) 햄스터의 대표적인 전체 폐 단면.
도 10. SFL, S1-S2 또는 S1 항원을 암호화하는 LV의 생성에 사용되는 플라스미드의 맵.
도 11. LV에 의해 암호화된 S FL 및 S△F2P의 개략도. RBD, S1/S2 및 S2' 절단 부위, 융합 펩티드(FP), 막횡단 도메인(TM) 및 짧은 내부 꼬리(T), RRAR(서열번호 99) 푸린 절단 부위를 포함하는 675QTQTNSPRRAR685(서열번호 24) 서열, 및 K986P 및 V987P 연속 치환이 표시되어 있다.
도 12. 단일 비강내 LV::S△F2P 주사는 SARS-CoV-2로부터 골든 햄스터를 완전히 보호한다. (A) 햄스터에서 LV::S△F2P 프라임-부스트 백신접종 요법 및 SARS-CoV-2 공격접종의 일정. (B) ELISA에 의해 측정된, 평균 종점 희석 역가로 표현된 혈청 항-SCoV-2 IgG 반응. (C) LV::S△F2P-면역화 햄스터의 혈청 및 폐 균질물에서 측정된 EC50 중화 역가로 표시되는 항-SCoV-2 Ab의 중화 능력. (D) 4dpi에서 LV::S△F2P- 또는 샴-백신접종 햄스터에서 체중 감소의 백분율. (E) 4 dpi에서 총 E 또는 Esg qRT-PCR로 정량화된 폐 바이러스 부하. 차이의 통계적 유의성은 양측 독립표본 t 검정에 의해 평가되었다. * = p<0.0402, **** = p<0.0001. 빨간색 선은 각 분석의 검출 한계를 나타낸다.
도 13. LV::S△F2P 백신접종 햄스터에서 감염 유발 폐 염증이 크게 감소했다. (A) 총 폐 균질액에서 추출한 RNA를 사용하여 4dpi에서 분석하고 무처리 대조군의 샘플에 정규화된 것으로, S△F2P- 또는 샴-백신접종 개체에서 염증 관련 매개체의 발현의 상대적인 log2 배수 변화를 요약한 히트맵. 그룹당 6마리의 개별 햄스터가 히트맵에 표시되어 있다. (B) 4dpi에서 연구된 폐 조직학적 H&E 분석,
도 14. SARS-CoV-2 복제에 대한 K18-hACE2 IP-THV 형질전환 마우스의 폐와 뇌의 큰 허용성. (A) 게놈당 hACE2 유전자 카피 수를 측정하기 위해 qPCR에 의해 수행된, 15마리의 N1 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스의 대표적인 유전형 분석 결과. (B) 5-7주령에서 0.3 x105 TCID50으로 비강내 접종된 동일한 마우스의 표현형, 및 통상적인 E-특이적 qRT-PCR에 의해 3dpi에서 다양한 기관의 바이러스 부하 측정. (C) K18-hACE2IP-THV 및 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 형질전환 마우스의 다양한 장기의 SARS-CoV-2 복제에 대한 비교 허용성(통상적인 E-특이적 또는 하위 게놈 Esg-특이적 qRT-PCR에 의해 3dpi에서 측정됨). 빨간색 선은 qRT-PCR 검출 한계를 나타낸다. 차이의 통계적 유의성은 Mann-Whitney 검정에 의해 평가되었다(*= p < 0.01, **= p < 0.00). (D) B6.K18-hACE2IP-THV 및 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 형질전환 마우스의 폐 및 뇌에서 hACE-2 mRNA의 비교 정량. (E) 3dpi에서 B6.K18-hACE2IP-THV 및 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 형질전환 마우스의 폐 또는 뇌에서 사이토카인 및 케모카인 mRNA 발현의 log2 배수 변화를 요약한 히트맵. 데이터는 무처리 대조군에 대해 정규화되었다.
도 15. LV::S△F2P를 사용한 백신접종은 K18-hACE2IP-THV 형질전환 마우스에서 SARS-CoV-2 감염으로부터 폐와 중추신경계를 모두 보호한다. (A) K18-hACE2IP-THV 마우스에서 프라임-부스트 LV::S△F2P 백신접종 및 SARS-CoV-2 공격접종의 일정. (B) LV::S△F2P 백신접종 마우스에서 항-SCoV-2 항체의 혈청 중화 능력. (C) 통상의 E-특이적 또는 하위-게놈 Esg-특이적 qRT-PCR을 사용하여 3dpi에서 다양한 장기에서 측정된 바이러스 부하. 빨간색 선은 qRT-PCR 검출 한계를 나타낸다. 차이의 통계적 유의성은 Mann-Whitney 검정에 의해 평가되었다(*= p < 0.01, **= p < 0.001). (D) 3dpi에서 LV::S△F2P- 또는 샴-백신접종 및 SARS-CoV-2 공격접종 K18-hACE2IP-THV 형질전환 마우스의 폐에서 폐 NK 세포 및 호중구를 식별하고 정량화하기 위해 결정된 세포분석(cytometric) 게이팅 전략. NK 및 호중구 하위 집합의 백분율을 전체 폐 CD45+ 세포에 대해 계산했다. (E) 3dpi에서 LV::S△F2P- 또는 샴-면역화 및 SARS-CoV-2-공격접종 K18-hACE2IP-THV 형질전환 마우스의 뇌에서 사이토카인 및 케모카인 mRNA 발현의 상대적 log2 배수 변화. 데이터는 무처리 대조군에 대해 정규화되었다. 통계적 유의성은 양측 독립표본 t 검정에 의해 평가되었다.(* = p<0.05, ** = p<0.01).
도 16. 비강내 경로를 통한 LV::S △F2P 백신접종은 SARS-CoV-2 감염으로부터 CNS의 완전한 보호를 유도한다. (A) B6.K18-hACE2IP-THV 마우스에서 다양한 LV::S△F2P 백신접종 요법 및 SARS-CoV-2 공격접종의 일정. (B) 통상적인 E-특이적 또는 하위-게놈 Esg-특이적 qRT-PCR에 의해 측정된 3dpi에서 뇌의 바이러스 부하. 빨간색 선은 qRT-PCR 검출 한계를 나타낸다. 차이의 통계적 유의성은 Mann-Whitney 검정에 이해 평가되었다(*= p < 0.01). (C-D) 샴-백신접종 및 미보호 마우스와 비교한, LV::S△F2P 근육내-비강내 백신접종 및 보호된 마우스의 풀링된 후각 망울 또는 뇌로부터 추출한 세포에 대하여 수행된 3 dpi에서의 세포분석. 후각 망울에서 (C) 적응 및 (D) 선천 면역 세포. (E) 뇌의 선천 면역 세포.
도 17: SFL ,S1-S2, S1, S2P, S2P3F S△F2P를 암호화하는 렌티바이러스 플라스미드의 맵.
도 18: Ad5::hACE2로 전처리하고 SARS-CoV-2로 공격접종한 C57BL/6 마우스에서 ILV::SFL 또는 ILV::S△F2P의 보호 가능성에 대한 일대일 비교. C57BL/6 마우스는 실시예 1에서 기재된 바와 같이 근육내 프라이밍 및 비강내 부스트되었다. 동물들은 SARS-CoV-2로 비강내 공격접종되었고 바이러스 부하는 3dpi에서 측정되었다. 결과는, 유의하지 않은 것으로 간주되고 복제 바이러스를 측정하는 하위 게놈 qRT-PCR에 의해 평가될 때 사라져야 하는 2개의 비교된 LV 함유 작제물 사이에 약간의 차이를 보여준다.
도 19: pFLAP K18-hACE2 WPRE에 대한 플라스미드 지도.
도 20 내지 도 24: pFlap-CMV-S-2019-nCoV-WPREm, pFlap-ieCMV-S2P-WPREm, pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm, pFlap-ieCMV-S2P-DF-WPREm, pFLAP K18-hACE2 WPRE의 서열 및 이식유전자 서열.
도 25. Manaus P.1 SARS-CoV-2 변종에 대한 NILV::SCoV-2의 완전한 보호 능력. A) B6.K18-hACE2IP-THV 마우스(n = 5/그룹)에서 NILV::SCoV-2 근육내-비강내 면역화 및 Manaus P.1 SARS-CoV-2 공격접종의 일정. (B) 3dpi에서 통상적인 E-특이적 또는 하위-게놈 Esg-특이적 qRT-PCR에 의해 측정된 뇌 또는 폐 바이러스 RNA 함량. 5마리의 샴-백신접종한 마우스 중 2마리는 동일 그룹의 다른 마우스와 비슷한 수준의 hACE2 mRNA 발현 수준과 뇌에서의 높은 바이러스 수치에도 불구하고 폐에서 검출가능한 바이러스 부하가 없었다. (C) 조상 우한(Wuhan) 균주 또는 D614G, B1.117, B1.351 또는 P.1 변이체의 SCoV-2를 포함하는 슈도-바이러스에 대한 개별 NILV::SCoV-2 백신접종 마우스의 혈청의 중화 활성(EC50). 통계적 유의성은 Mann-Whitney 검정에 의해 평가하였다 (*= p < 0.05, **= p < 0.01). 빨간색 별표(아래)는 조상 우한의 유의성을 나타내고, 파란색 별표(가운데)는 D614G 변이체의 유의성을 나타내며, 주황색 별표(위)는 B1.117 변이체의 유의성을 나타낸다. 각각의 부스팅 시점에서 통계적 비교가 이루어졌다.
도 26. T 세포 반응은 SARS-CoV-2에 대한 NILV::SCoV-2 매개 보호에서 중요한 역할을 한다. (A) 야생형 또는 μMT KO 마우스(n= 5-9/그룹)을 도 1A에 도시된 일정에 따라 LV::SCoV-2 또는 샴으로 주사한 다음, Ad5::hACE2으로 전처리하고 4일 후 SARS-CoV-2 Wuhan 변종으로 공격접종했다. 폐 바이러스 RNA 함량은 3dpi에서 측정되었다. 차이의 통계적 유의성은 Mann-Whitney 검정으로 평가되었다(**= p < 0.01, ****= p < 0.0001). (B) SCoV-2 MHC-I-제한 에피토프를 포함하는 15-mer 펩티드를 사용하여 IFN-γ ELISPOT에 의해 평가된 NILV::SCoV-2-프라이밍 및 부스트된 C57BL/6 WT 마우스 또는 샴 대조군에서의 T-비장세포 반응. (B) SCoV-2 MHC-I 제한 에피토프를 포함하는 15-mer 펩티드를 사용하여 IFN-γ ELISPOT에 의해 평가된, NILV::SCoV-2-프라이밍 및 부스트된 C57BL/6 WT 마우스 또는 샴 대조군에서의 T-비장세포 반응. (C) 표시된 SCoV-2 유래 펩티드로 시험관 내 자극 후 폐 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 반응의 대표적인 도트 플롯. (D) 폐 CD8+ T 중앙 기억(Tcm, CD44+CD62L+CD69-), T 이펙터 기억(Tem, CD44+CD62L-CD69-) 및 T 상주 기억(Trm, CD44+CD62L-CD69+CD103+)을 검출하기 위한 세포측정 전략(상단) 및 LV::S 근육내-비강내-백신 접종 또는 샴 마우스에서 이러한 하위 집합의 대표적인 백분율.
도 27. 보호된 NILV::SCoV-2- 또는 보호되지 않은 샴-백신접종 K18-hACE2IP-THV 마우스의 후각 망울의 특징. 마우스는 도 2에 도시된 것들이다. (A-B) NILV::SCoV-2 i근육내-비강내 백신접종 및 보호된 마우스 또는 보호되지 않은 샴-백신접종 마우스의 후각 망울의 CD3 면역조직화학 분석 및 SARS-CoV-2 우한을 이용한 3dpi에서 이들 그룹의 대표적인 결과. (C) 동일한 그룹의 풀링된 후각 망울에서 추출한 세포의 세포 측정 분석. (D-E) NILV::SCoV-2 근육내-비강내 백신접종 및 보호된 마우스 또는 보호되지 않은 샴-백신접종 마우스의 후각 망울의 면역조직화학에 의해 측정된 CD3 T 세포의 밀도, 및 SARS-CoV-2 Manaus P.1을 이용한 3dpi에서 이들 그룹의 대표적인 결과. (E) 동일한 그룹의 풀링된 후각 망울에서 추출한 세포의 세포 측정 분석.
도 28. 우려되는 각 스파이크를 암호화하는 LV로 프라이밍 및 부스트된 마우스에서의 교차 혈청 중화 가능성. (A) C57BL/6 마우스(n = 5/그룹)에서 복강내-복강내 면역화의 일정. (B) 사용된 혈청 중화 테스트를 보여주는 개략도. (C) 조상 우한 변종 또는 D614G, B1.1.7, B1.351 또는 P.1 변이체의 SCoV-2를 포함하는 슈도 바이러스에 대한 개별 백신접종된 마우스의 혈청 중화 활성(EC50).
도 29. (교차) 중화 항체 활성에 미치는 K986P - V987P 치환(2P)에 의한 스파이크 안정화의 영향. (A) C57BL/6 마우스(n = 5/그룹)에서 복강내-복강내 면역화의 일정. (B) 조상 우한 변종 또는 D614G, B1.1.7, B1.351 또는 P.1 변이체의 SCoV-2를 포함하는 슈도 바이러스에 대한 개별 백신접종된 마우스의 혈청의 중화 활성(EC50).
도 30 내지 도 34: pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm, pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm, pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm, pFlap-ieCMV--SFL-D614G-WPREm, pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm의 서열 및 이식유전자 서열.
이식유전자 작제물과 관련된 본원에 개시된 서열은 다음과 같이 그들의 서열번호에 의해 지정된다:
Figure pct00001
본원에 기재된 발명은 실시예에서 입증된 강력한 백신접종 전략에 부분적으로 기초한다. 실시예는 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 병인체인 SARS-CoV-2의 스파이크 당단백질(S)에 특이적인 중화 항체를 유도할 수 있는 렌티바이러스 벡터(LV)에 대한 특정 실시예를 기반으로 하는 백신 전략의 유용성을 입증한다. S의 여러 변이체를 암호화하는 여러 LV 중, 전체 길이의 막 고정 S를 암호화하는 것(LV::SFL) 및 LV::S△F2P(LV::S2P△F 또는 LV::S2PDF or LV::S2PdeltaF로도 지정됨)과 같은 돌연변이된 prefusion(선택적으로 안정화된) 형태를 암호화하는 것은 SARS-CoV-2 유입 수용체인 인간 안지오텐신 전환 효소 2(hACE2)를 발현하는 숙주 세포의 시험관 내 및 생체 내 바이러스 침입을 억제하는 상당한 능력과 함께 마우스와 햄스터에서 높은 항체 역가를 유발했다. S-특이적 T 세포는 LV::SFL- 또는 LV::S△F2P 백신접종 개체에서도 풍부하게 유도되었다. 아데노바이러스 5형(Ad5) 벡터에 의한 기도 세포의 형질도입 또는 LV 벡터(B6.K18-hACE2IP-THV 마우스)에 의해 벡터화된 hACE2로 형질전환에 의해 hACE2의 발현이 유도된 마우스에서 뿐만 아니라 햄스터에서, 폐 SARS-CoV-2 복제에 대한 실질적 또는 완전한 보호 효과는 LV::SFL 또는 LV::S△F2P가 전신 프라임 면역화(systemic prime immunization)에 사용된 후 비강 점막내 부스트/표적에 사용되었을 때 제공되었다. 부여된 보호는 폐 염증을 피하고 조직 손상을 예방했다. 게다가, SARS-CoV-2 복제에 대한 상당한 뇌 허용성이 있는 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스에서, 보호가 뇌와 CNS로 확장되는 것으로 확인되었다. 제시된 결과는 전임상 동물 모델에서 SARS-CoV-2에 대한 LV 기반 백신접종 전략의 현저한 예방 효과를 입증하고, 특히 비강 내 LV::SFL 기반 면역화를 COVID-19에 대한 강력하고 유망한 백신 접근 방식으로 지정한다. SARS-CoV-2 복제에 대한 뇌의 특히 높은 허용성을 가진 SARS-CoV-2 감염의 엄격한 모델인 개발된 형질전환 모델에서 CNS의 완전한 보호에 도달하려면 LV 기반 백신으로 전신 프라임 후 비강내 부스트가 필요하다.
A. 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2 스파이크 단백질
본 개시의 다양한 측면은 SARS-CoV-2 S 단백질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 다음 아미노산 서열(Genbank: YP_009724390.1; 서열번호 1)을 포함한다:
1 mfvflvllpl vssqcvnltt rtqlppaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs
61 nvtwfhaihv sgtngtkrfd npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv
121 nnatnvvikv cefqfcndpf lgvyyhknnk swmesefrvy ssannctfey vsqpflmdle
181 gkqgnfknlr efvfknidgy fkiyskhtpi nlvrdlpqgf saleplvdlp iginitrfqt
241 llalhrsylt pgdsssgwta gaaayyvgyl qprtfllkyn engtitdavd caldplsetk
301 ctlksftvek giyqtsnfrv qptesivrfp nitnlcpfge vfnatrfasv yawnrkrisn
361 cvadysvlyn sasfstfkcy gvsptklndl cftnvyadsf virgdevrqi apgqtgkiad
421 ynyklpddft gcviawnsnn ldskvggnyn ylyrlfrksn lkpferdist eiyqagstpc
481 ngvegfncyf plqsygfqpt ngvgyqpyrv vvlsfellha patvcgpkks tnlvknkcvn
541 fnfngltgtg vltesnkkfl pfqqfgrdia dttdavrdpq tleilditpc sfggvsvitp
601 gtntsnqvav lyqdvnctev pvaihadqlt ptwrvystgs nvfqtragcl igaehvnnsy
661 ecdipigagi casyqtqtns prrarsvasq siiaytmslg aensvaysnn siaiptnfti
721 svtteilpvs mtktsvdctm yicgdstecs nlllqygsfc tqlnraltgi aveqdkntqe
781 vfaqvkqiyk tppikdfggf nfsqilpdps kpskrsfied llfnkvtlad agfikqygdc
841 lgdiaardli caqkfngltv lpplltdemi aqytsallag titsgwtfga gaalqipfam
901 qmayrfngig vtqnvlyenq klianqfnsa igkiqdslss tasalgklqd vvnqnaqaln
961 tlvkqlssnf gaissvlndi lsrldkveae vqidrlitgr lqslqtyvtq qliraaeira
1021 sanlaatkms ecvlgqskrv dfcgkgyhlm sfpqsaphgv vflhvtyvpa qeknfttapa
1081 ichdgkahfp regvfvsngt hwfvtqrnfy epqiittdnt fvsgncdvvi givnntvydp
1141 lqpeldsfke eldkyfknht spdvdlgdis ginasvvniq keidrlneva knlneslidl
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다른 바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 아미노산 서열(Genbank: YP_009724390.1; 서열번호 1)을 포함한다.
기술적으로 당업자에게 적용할 수 없는 것으로 보이지 않는 한, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 SARS-CoV-2 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 본원에 제공된 정의는 각각 서열번호 또는 서열번호 2의 서열과 관련하여 정의된 SARS-CoV-2 S 단백질의 유도체 또는 단편에 유사하게 적용된다는 점을 유의하여야 한다.
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 SARS-CoV-2 S 단백질은 얻어진 서열이 서열번호 1보다 짧은 경우 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체 및/또는 SARS-CoV-2 S 단백질 단편의 자격이 있을 수 있다. 또한, 최초에 확인된 분리주인 Wuhan-Hu-1(기탁 번호 MN908947)과는 다른 바이러스 균주에 의해 발현된 SARS-CoV-2 S 단백질의 서열일 수도 있다.
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열로 구성된다. 이러한 SARS-CoV-2 S 단백질은 얻어진 서열이 서열번호 1보다 짧은 경우 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체 및/또는 SARS-CoV-2 S 단백질 단편의 자격이 있을 수 있다. 또한, 이는 최초로 확인된 분리주인 Wuhan-Hu-1(기탁번호 MN908947)과는 다른 바이러스 변종에 의해 발현된 SARS-CoV-2 S 단백질의 서열일 수도 있다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 1과 적어도 95% 동일하거나 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 유도체 또는 단편은 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 108, 서열번호 111, 서열번호 114, 서열번호 117 또는 서열번호 120의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 108, 서열번호 111, 서열번호 114, 서열번호 117 또는 서열번호 120과 적어도 95% 동일하거나 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 단편은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 14와 적어도 95% 동일하거나 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1에 비해 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 이러한 SARS-CoV-2 S 단백질은 얻어진 서열이 서열번호 1보다 짧은 경우 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체 및/또는 SARS-CoV-2 S 단백질 단편의 자격이 있을 수 있다. 또한, 이는 최초 분리주인 Wuhan-Hu-1(기탁번호 MN908947)과 다른 바이러스 변이체에 의해 발현된 SARS-CoV-2 S 단백질의 서열일 수도 있다.
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1에 비해 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하, 특히 단백질의 단일 위치에서 10개 이하의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 S2P△F 또는 S2P3F를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이와 같은 돌연변이(들)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 단백질의 수용체 결합 도메인에서 돌연변이(들)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 D614G와 같은 잔기 614에서 치환을 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 소위 변이체 SARS-CoV-2 VUI 2020 12/01 S 단백질에서 확인된 돌연변이(들), 즉 스파이크 단백질의 아미노산 잔기의 치환 또는 결실에 의한 돌연변이, 예를 들어, 결실 69-70, 결실 144, N501Y, 치환 A570D, D614G, P681H, T716I, S982A 및 D1118H을 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 서열번호 108, 서열번호 111, 서열번호 114, 서열번호 117 또는 서열번호 120에 존재하는 돌연변이(들)를 포함한다.
바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 Genbank: NC_045512.2의 뉴클레오티드 21563 내지 25384를 포함하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)에 의해 암호화된다:
21541 atgtttgt ttttcttgtt ttattgccac tagtctctag
21601 tcagtgtgtt aatcttacaa ccagaactca attaccccct gcatacacta attctttcac
21661 acgtggtgtt tattaccctg acaaagtttt cagatcctca gttttacatt caactcagga
21721 cttgttctta cctttctttt ccaatgttac ttggttccat gctatacatg tctctgggac
21781 caatggtact aagaggtttg ataaccctgt cctaccattt aatgatggtg tttattttgc
21841 ttccactgag aagtctaaca taataagagg ctggattttt ggtactactt tagattcgaa
21901 gacccagtcc ctacttattg ttaataacgc tactaatgtt gttattaaag tctgtgaatt
21961 tcaattttgt aatgatccat ttttgggtgt ttattaccac aaaaacaaca aaagttggat
22021 ggaaagtgag ttcagagttt attctagtgc gaataattgc acttttgaat atgtctctca
22081 gccttttctt atggaccttg aaggaaaaca gggtaatttc aaaaatctta gggaatttgt
22141 gtttaagaat attgatggtt attttaaaat atattctaag cacacgccta ttaatttagt
22201 gcgtgatctc cctcagggtt tttcggcttt agaaccattg gtagatttgc caataggtat
22261 taacatcact aggtttcaaa ctttacttgc tttacataga agttatttga ctcctggtga
22321 ttcttcttca ggttggacag ctggtgctgc agcttattat gtgggttatc ttcaacctag
22381 gacttttcta ttaaaatata atgaaaatgg aaccattaca gatgctgtag actgtgcact
22441 tgaccctctc tcagaaacaa agtgtacgtt gaaatccttc actgtagaaa aaggaatcta
22501 tcaaacttct aactttagag tccaaccaac agaatctatt gttagatttc ctaatattac
22561 aaacttgtgc ccttttggtg aagtttttaa cgccaccaga tttgcatctg tttatgcttg
22621 gaacaggaag agaatcagca actgtgttgc tgattattct gtcctatata attccgcatc
22681 attttccact tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac
22741 taatgtctat gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa gtcagacaaa tcgctccagg
22801 gcaaactgga aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt
22861 tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta
22921 tagattgttt aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta
22981 tcaggccggt agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca
23041 atcatatggt ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact
23101 ttcttttgaa cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt
23161 ggttaaaaac aaatgtgtca atttcaactt caatggttta acaggcacag gtgttcttac
23221 tgagtctaac aaaaagtttc tgcctttcca acaatttggc agagacattg ctgacactac
23281 tgatgctgtc cgtgatccac agacacttga gattcttgac attacaccat gttcttttgg
23341 tggtgtcagt gttataacac caggaacaaa tacttctaac caggttgctg ttctttatca
23401 ggatgttaac tgcacagaag tccctgttgc tattcatgca gatcaactta ctcctacttg
23461 gcgtgtttat tctacaggtt ctaatgtttt tcaaacacgt gcaggctgtt taataggggc
23521 tgaacatgtc aacaactcat atgagtgtga catacccatt ggtgcaggta tatgcgctag
23581 ttatcagact cagactaatt ctcctcggcg ggcacgtagt gtagctagtc aatccatcat
23641 tgcctacact atgtcacttg gtgcagaaaa ttcagttgct tactctaata actctattgc
23701 catacccaca aattttacta ttagtgttac cacagaaatt ctaccagtgt ctatgaccaa
23761 gacatcagta gattgtacaa tgtacatttg tggtgattca actgaatgca gcaatctttt
23821 gttgcaatat ggcagttttt gtacacaatt aaaccgtgct ttaactggaa tagctgttga
23881 acaagacaaa aacacccaag aagtttttgc acaagtcaaa caaatttaca aaacaccacc
23941 aattaaagat tttggtggtt ttaatttttc acaaatatta ccagatccat caaaaccaag
24001 caagaggtca tttattgaag atctactttt caacaaagtg acacttgcag atgctggctt
24061 catcaaacaa tatggtgatt gccttggtga tattgctgct agagacctca tttgtgcaca
24121 aaagtttaac ggccttactg ttttgccacc tttgctcaca gatgaaatga ttgctcaata
24181 cacttctgca ctgttagcgg gtacaatcac ttctggttgg acctttggtg caggtgctgc
24241 attacaaata ccatttgcta tgcaaatggc ttataggttt aatggtattg gagttacaca
24301 gaatgttctc tatgagaacc aaaaattgat tgccaaccaa tttaatagtg ctattggcaa
24361 aattcaagac tcactttctt ccacagcaag tgcacttgga aaacttcaag atgtggtcaa
24421 ccaaaatgca caagctttaa acacgcttgt taaacaactt agctccaatt ttggtgcaat
24481 ttcaagtgtt ttaaatgata tcctttcacg tcttgacaaa gttgaggctg aagtgcaaat
24541 tgataggttg atcacaggca gacttcaaag tttgcagaca tatgtgactc aacaattaat
24601 tagagctgca gaaatcagag cttctgctaa tcttgctgct actaaaatgt cagagtgtgt
24661 acttggacaa tcaaaaagag ttgatttttg tggaaagggc tatcatctta tgtccttccc
24721 tcagtcagca cctcatggtg tagtcttctt gcatgtgact tatgtccctg cacaagaaaa
24781 gaacttcaca actgctcctg ccatttgtca tgatggaaaa gcacactttc ctcgtgaagg
24841 tgtctttgtt tcaaatggca cacactggtt tgtaacacaa aggaattttt atgaaccaca
24901 aatcattact acagacaaca catttgtgtc tggtaactgt gatgttgtaa taggaattgt
24961 caacaacaca gtttatgatc ctttgcaacc tgaattagac tcattcaagg aggagttaga
25021 taaatatttt aagaatcata catcaccaga tgttgattta ggtgacatct ctggcattaa
25081 tgcttcagtt gtaaacattc aaaaagaaat tgaccgcctc aatgaggttg ccaagaattt
25141 aaatgaatct ctcatcgatc tccaagaact tggaaagtat gagcagtata taaaatggcc
25201 atggtacatt tggctaggtt ttatagctgg cttgattgcc atagtaatgg tgacaattat
25261 gctttgctgt atgaccagtt gctgtagttg tctcaagggc tgttgttctt gtggatcctg
25321 ctgcaaattt gatgaagacg actctgagcc agtgctcaaa ggagtcaaat tacattacac
25381 ataa
바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 Genbank: NC_045512.2의 뉴클레오티드 21563 내지 25384를 포함하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)에 의해 암호화된다:
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 2와 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 이러한 SARS-CoV-2 S 단백질은, 이와 같이 정의된 동일성%를 갖는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 2보다 짧은 경우 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체 및/또는 SARS-CoV-2 S 단백질 단편의 자격이 있을 수 있다. 또한, 이는 최초 확인된 분리주인 Wuhan-Hu-1(기탁번호 MN908947)과는 다른 바이러스 변종에서 유래한 SARS-CoV-2 S 단백질을 암호화하는 서열일 수도 있다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 비동의(non-synonymous) 돌연변이를 포함하는 돌연변이(들)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 S2P△F 또는 S2P3F를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 것과 같은 돌연변이(들)를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2의 서열에서 위치 23403에서 돌연변이를 포함하고, 여기서의 코돈 GGT는 돌연변이되어 있고, 특히 코돈 GAT(위치 614에서의 돌연변이, 특히 암호화된 단백질에서의 D614G 치환에 해당)로 치환되어 있다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 소위 변이체 SARS-CoV-2 VUI 2020 12/01의 스파이크 단백질을 암호화하는 서열이고, 여기서의 스파이크 단백질은 뉴클레오티드의 치환 또는 결실에 의한 다중 돌연변이를 포함하고, 여기서의 돌연변이는 암호화된 스파이크 단백질의 아미노산 잔기에서 다음과 같은 변화로 이어진다: 결실 69-70, 결실 144, 치환 N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A 및 D1118H.
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 2의 코돈-최적화된 변이체와 같은 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 K986P 및 V987P 아미노산 치환을 포함한다.
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 아미노산 681-686이 PRRARS(서열번호 22)에서 PGSAGS(서열번호 23)로 변경된 변형을 포함한다.
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 아미노산 675-685(QTQTNSPRRAR(서열번호 24))가 결실된 변형을 포함한다.
B. 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질을 암호화하는 렌티바이러스 벡터 및 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입
본 발명의 맥락에서, "렌티바이러스 벡터"는 cis-작용 렌티바이러스 RNA 또는 DNA 서열을 포함하고 트랜스로 제공되는 렌티바이러스 단백질(예를 들어, Gag, Pol 및/또는 Env)을 필요로 하는 이식유전자를 숙주세포에 형질도입하기 위한 비복제 벡터를 의미한다. 렌티바이러스 벡터는 기능적 Gag, Pol 및 Env 단백질의 발현이 부족하다. 렌티바이러스 벡터는 상기 레트로바이러스 벡터의 생성 또는 발생 단계에 따라 RNA 또는 DNA 분자의 형태로 존재할 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 플라스미드와 같은 재조합 DNA 분자의 형태일 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스의 다른 단백질의 복합체 내의 RNA 분자(들)와 같은 렌티바이러스 벡터 입자의 형태일 수 있다. 일반적으로, 변형된 또는 재조합 렌티바이러스 입자에 상응하는 렌티바이러스 입자 벡터는 단일 가닥 RNA의 2개 카피로 구성된 게놈을 포함한다. 이들 RNA 서열은 숙주 세포 게놈(프로바이러스 벡터 DNA)에 삽입된 이중 가닥 DNA 서열로부터 전사에 의해 얻을 수 있거나 형질전환된 숙주 세포에서 플라스미드 DNA(플라스미드 벡터 DNA)의 일시적인 발현으로부터 얻을 수 있다.
렌티바이러스 벡터 입자는 통합 능력을 가질 수 있다. 따라서, 이들은 기능적 인테그라제 단백질을 함유하고 있다. 대안적으로, 렌티바이러스 벡터 입자는 통합 능력이 손상되었거나 없을 수 있다. 비통합 벡터 입자는 렌티바이러스 벡터 입자의 통합 능력의 대부분 또는 전부를 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 가지고 있다. 예를 들어, 통합되지 않는 벡터 입자는 통합 능력을 감소시키는 렌티바이러스 pol 유전자에 의해 암호화된 인테그라제에서 돌연변이(들)를 포함할 수 있다. 대조적으로, 통합 벡터 입자는 렌티바이러스 벡터 입자의 통합 능력의 대부분 또는 전부를 제거하는 돌연변이를 포함하지 않는 기능적 인테그라제 단백질을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 통합적(ILV)이다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 비통합적(NILV)이다.
렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스, 특히 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 또는 HIV-2), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 말 전염성 뇌염 바이러스(EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 소 면역결핍 바이러스(BIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)에서 유래하고, 이들은 병원성과 관련된 유전적 결정인자를 제거하고 치료 효과를 얻는데 유용한 새로운 결정인자를 도입하도록 변형된다. 바람직하게는 렌티바이러스 벡터는 HIV-1에서 유래한다.
이러한 벡터는 시스- 및 트랜스-작용 서열의 분리를 기반으로 한다. 복제-결함 벡터를 생성하기 위해, 트랜스-작용 서열(예를 들어, gag, pol, tat, rev 및 env 유전자)을 결실시키고 이식유전자를 암호화하는 발현 카세트로 대체할 수 있다.
비분열 세포에서의 효율적인 통합 및 복제는 일반적으로 렌티바이러스 게놈의 중심에서 두 개의 cis-작용 서열, 중심 폴리퓨린 트랙(cPPT) 및 중심 종결 서열(CTS)의 존재를 필요로 한다. 이들은 핵공(nuclear pore)에서 사전 통합 복합체의 코팅 해제(uncoating) 및 수지상 세포와 같은 비분열 세포의 핵으로의 발현 카세트의 효율적인 도입을 위한 신호로서 작용하는 중앙 DNA "플랩"이라고 하는 삼중 가닥 DNA 구조의 형성으로 이어진다.
한 구현예에서, 본 발명은 특히 유럽 특허 출원 EP 2 169 073호에 기재된 바와 같이 cPPT/CTS 서열로 지칭되는 중심 폴리퓨린 트랙 및 중심 종결 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
벡터 프로바이러스 DNA 서열을 숙주 세포 게놈으로 통합하는데 관여하는 긴 말단 반복(LTR)과 같은 추가 서열은 일반적으로 시스로 존재한다. 예를 들어, 상기 LTR의 도메인 U3(△U3)에서 LTR 서열을 돌연변이시킴으로써 벡터가 얻어질 수 있다(Miyoshi H 등, 1998, J Virol. 72(10):8150-7; Zufferey 등, 1998, J Virol 72(12):9873-80).
몇몇 구현예에서, 벡터는 인핸서를 함유하지 않는다. 몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 바람직하게는 3' LTR에서 프로모터 및 인핸서 서열을 제거하는 돌연변이된 U3 영역(△U3)을 갖는 LTR 서열을 포함한다.
또한, 패키징 서열 ψ(psi)는 벡터 입자로의 폴리뉴클레오티드 서열의 캡슐화를 돕기 위해 통합될 수도 있다(Kessler 등, 2007, Leukemia, 21(9):1859-74; Paschen 등, 2004, Cancer Immunol Immunother 12(6):196-203).
몇몇 구현예에서, 본 발명은 렌티바이러스 패키징 서열 ψ(psi)를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
또한, 수송 RNA 결합 부위 또는 프라이머 결합 부위(PBS) 또는 Woodchuck PostTranscriptional Regulatory Element(WPRE) 야생형 또는 돌연변이형(WPREm)(X 단백질 펩티드의 발현을 피하기 위해 WPRE에서 단백질 X의 시작 코돈에 돌연변이가 도입되어 있는)도 렌티바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열에 포함될 수 있으며, 이는 몇몇 구현예에서 생체 내에서 이식유전자의 보다 안정한 발현을 가능하게 한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 PBS를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 WPRE 및/또는 IRES를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 적어도 하나의 cPPT/CTS 서열, 하나의 ψ 서열, 하나(바람직하게는 2개)의 LTR 서열, 및 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시-초기 프로모터, β2m 프로모터 또는 클래스 I MHC 프로모터의 전사 제어 하에 이식유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
또한, 렌티바이러스 벡터 입자를 제조하는 방법 및 렌티바이러스 벡터 입자가 제공된다. 렌티바이러스 벡터 입자(또는 렌티바이러스 입자 벡터)는 바이러스 단백질과 관련된 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 벡터는 통합 벡터(IL)(특히 하기에 예시된 바와 같은 형질전환 마우스 제조용)이거나 특히 인간 대상체에 투여하기 위한 비통합 벡터(NIL)일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 본원에 개시된 임의의 구현예에 따라 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 1, 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 및 120로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 아미노산 서열 Genbank: YP_009724390.1(서열번호 1)로 구성된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다. 이러한 단백질 S 유도체 또는 단편의 특정 구현예 또한 렌티바이러스 벡터 입자의 이러한 구현예 내에 포함된다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 또는 120과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다. 이러한 단백질 S 유도체 또는 단편의 특정 구현예 또한 렌티바이러스 벡터 입자의 이러한 구현예 내에 포함된다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다. 여기에 개시된 이러한 단백질 S 유도체 또는 단편의 특정 구현예 또한 렌티바이러스 벡터 입자의 이러한 구현예 내에 포함된다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 또는 120과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다. 이러한 단백질 S 유도체 또는 단편의 특정 구현예 또한 렌티바이러스 벡터 입자의 이러한 구현예 내에 포함된다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 1과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1에 비해 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하 또는 10개 이하의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 또는 120과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1에 비해 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하 또는 10개 이하의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 1과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1에 비해 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하 또는 10개 이하의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 또는 120과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1에 비해 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하 또는 10개 이하의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 S2P△F(S2PdeltaF) 또는 S2P3F 단백질 유도체에 포함된 것과 같은 돌연변이(들)를 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 D614G와 같은 잔기 614에서 치환을 갖거나 이러한 치환을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화한다. 몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 소위 변이체 SARS-CoV-2 VUI 2020 12/01 S 단백질에서 확인된 돌연변이(들), 즉 결실 69-70, 결실 144, N501Y, 치환 A570D, D614G, P681H, T716I, S982A 및 D1118H와 같은 스파이크 단백질의 아미노산 잔기의 치환 또는 결실에 의한 돌연변이를 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 2를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 SARS-CoV-2 S 단백질을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 Genbank: NC_045512.2의 뉴클레오티드 21563 내지 25384로 구성된 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)에 의해 암호화되는 SARS-CoV-2 S 단백질을 암호화한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 2와 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 2의 서열과 관련하여 돌연변이(들)를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 SARS-CoV-2 S 단백질을 암호화하며, 여기서의 돌연변이(들)는 적어도 하나의 비동의 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 그의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 2의 서열에서 위치 23403에서 돌연변이를 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하고, 여기서의 코돈 GGT는 돌연변이되어 있고, 특히 코돈 GAT(위치 614에서의 돌연변이, 특히 서열번호 1의 암호화된 S 단백질에서의 D614G 치환에 해당)로 치환되어 있다. 몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 소위 변이체 SARS-CoV-2 VUI 2020 12/01의 스파이크 단백질을 암호화하며, 여기서의 스파이크 단백질은 서열번호 2의 서열을 기준으로 뉴클레오티드의 치환 또는 결실에 의한 다중 돌연변이를 갖고, 뉴클레오티드 돌연변이는 암호화된 스파이크 단백질의 아미노산 잔기에서 다음과 같은 변화로 이어진다: 결실 69-70, 결실 144, 치환 N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A 및 D1118H.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서열번호 2의 코돈 최적화 변이체 또는 S2P△F(S2PdeltaF) 또는 S2P3F 유도체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화 변이체와 같은 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 K986P 및 V987P 아미노산 치환을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 아미노산 681-686 PRRARS(서열번호 22)가 LV::S2P3F에서와 같은 PGSAGS(서열번호 23)로 변경된 변형을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 아미노산 675-685(QTQTNSPRRAR)(서열번호 24)가 LV::S2P△F(LV::S2PdeltaF)에서와 같이 결실되는 변형을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자는 하기의 것들로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
- 서열번호 13의 S2P△F(S2PdeltaF) 또는 서열번호 13과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열, 특히 RBD에서 돌연변이, 특히 결실을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ,
- 서열번호 10의 S2P3F 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 10과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로, 특히 여기서 서열번호 10과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열은 돌연변이 986K→P and 987V→P를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 서열번호 7의 S2P 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 7과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 2의 SFL 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 107의 S-B1.1.7 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 107과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 110의 S-B351 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 110과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 113의 S-B1.1.7 S-B351-2P 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 113과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 116의 SFL-D614G 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 116과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및
- 서열번호 119의 S-P1 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 119와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 HIV-1 Gag 및 Pol 단백질을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 서브타입 D, 특히 HIV-1NDK, Gag 및 Pol 단백질을 포함한다.
몇몇 구현예에 따르면, 렌티벡터 입자는 DNA 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포에서 얻어진다.
이러한 DNA 플라스미드는 다음을 포함할 수 있다:
- 박테리아 복제 기점(예: pUC ori);
- 선택을 위한 항생제 내성 유전자(예: KanR); 및 더욱 특히:
- CMV 프로모터에 전사적으로 연결된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 렌티바이러스 벡터.
이러한 방법은 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 벡터 입자의 생산을 가능하게 한다:
i) 적절한 숙주 세포를 렌티바이러스 벡터로 형질감염시키는 단계;
ii) 레트로바이러스(바람직하게는 렌티바이러스)의 적어도 구조적 및 중합효소(+ 인테그라제) 활성을 암호화하는 바이러스 DNA 서열을 함유하는 패키징 플라스미드 벡터로 상기 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; 이러한 패키징 플라스미드는 문헌[Dull 등, 1998, J Virol, 72(11):8463-71; Zufferey 등, 1998, J Virol 72(12):9873-80)]에 기재되어 있다.
iii) 상기 렌티바이러스 벡터의 발현 및 렌티바이러스 벡터 입자로의 패키징을 달성하기 위해 상기 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
iv) 상기 배양된 숙주 세포에서 단계 iii)의 발현 및 패키징으로부터 얻어지는 렌티바이러스 벡터 입자를 수확하는 단계.
다른 이유로, 특히 인간 대상체에게 투여를 위해, 얻어진 레트로바이러스 입자를 슈도타이핑하는 것, 즉, 특정 입자 외피 단백질을 추가하거나 교체하는 것이 도움이 될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 슈도타이핑은 인간 집단에서 이미 존재하는 면역의 표적이 되는 것을 피하면서 형질도입될 수 있는 세포 유형의 범위를 확장한다.
본 발명의 레트로바이러스 입자를 슈도타이핑하기 위해, 숙주 세포는 바이러스 외피 단백질(들), 바람직하게는 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 하나 또는 여러 외피 DNA 플라스미드(들)로 추가로 형질감염될 수 있다.
적절한 숙주 세포는 바람직하게는 인간 배양 세포주, 예를 들어 HEK293T 세포주와 같은 HEK 세포주이다.
대안적으로, 벡터 입자를 생산하는 방법은 게놈이 하기의 성분 중 하나 이상으로 안정적으로 형질전환된 숙주 세포에서 수행된다: 렌티바이러스 벡터 DNA 서열, 패키징 유전자, 및 외피 유전자. 이러한 DNA 서열은 벡터 서열의 전사를 허용하고 입자 생산 속도를 향상시키기 위한 추가 프로모터를 포함하는, 본 발명에 따른 프로바이러스 벡터와 유사한 것으로 간주될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 전체 세포가 부풀어 오르거나 죽지 않고 연속적인 방식으로 배양 배지에서 바이러스 입자를 생산할 수 있도록 추가로 변형된다. 바이러스 입자 생산을 위한 기법에 관하여는 문헌[Strang 등, 2005, J Virol 79(3):1165-71; Relander 등, 2005, Mol Ther 11(3):452-9; Stewart 등, 2009, Gene Ther, 16(6):805-14; 및 Stuart 등, 2011, Hum gene Ther]을 참조할 수 있다.
본 발명의 목적은 렌티바이러스 입자 벡터로 형질전환된 숙주세포로 구성된다.
렌티바이러스 입자 벡터는 이전에 정의된 바와 같이 하기 성분을 포함할 수 있다:
- cPPT/CTS 폴리뉴클레오티드 서열; 및
- β2m 또는 MHCI 프로모터의 제어 하에 CAR을 암호화하는 핵산, 및 선택적으로 상기 기재된 추가 성분 중 하나.
바람직하게는, 렌티벡터 입자는 106, 2 x 106, 5x 106, 107, 2 x 107, 5 x 107, 108, 2 x 108, 5 x 108, 또는 109 TU의 용량으로 존재한다.
본 개시는 본 개시에 따른 SARS-CoV-2 S 단백질을 포함하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자를 제공한다. 렌티벡터는 통합적이거나 비통합적일 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 SARS-CoV-2 S 단백질을 포함하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터(즉, "렌티바이러스 벡터 입자")이다.
본 개시는 또한 본 개시에 따른 SARS-CoV-2 S 단백질을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 렌티바이러스 입자와 관련하여 본원에 개시된 모든 구현예는 면역원성 조성물의 정의에 적용된다.
몇몇 구현예에서, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 의한 인간 대상체의 감염을 예방하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 몇몇 구현예에서, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 노출되거나 SARS-CoV-2에 의해 감염될 위험이 있는 인간 대상체에서 SARS-CoV-2 복제로부터 보호하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 몇몇 구현예에서, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 노출되거나 SARS-CoV-2에 감염될 위험이 있는 인간 대상체에서 COVID-19와 같은, SARS-CoV-2에 의한 감염과 관련된 질병의 발병 또는 증상의 발병을 예방하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 몇몇 구현예에서, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 노출되거나 SARS-CoV-2에 감염될 위험이 있는 인간 대상체에서 SARS-CoV-2에 의한 감염과 관련된 신경학적 예후의 개시(onset)를 예방하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 몇몇 구현예에서, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 노출되거나 SARS-CoV-2에 의해 감염될 위험이 있는 인간 대상체의 중추신경계(CNS)를 보호하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 몇몇 구현예에서, 개시된 방법에 사용하기 위한 이들 적용 중 임의의 적용에서, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로 예방제로서 대상체에게 투여될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2 감염에 대해 또는 SARS-CoV-2 감염과 관련된 증상 또는 질병(COVID-19)의 발병으로부터 인간 대상체를 보호하는 방법에 사용하기 위한 것이고, 여기서 대상체는 폐 및/또는 CNS 병리가 발생할 위험이 있는 대상체이다. 특히 인간 대상체는 동반이환 상태, 특히 CNS에 영향을 미치는 동반이환 상태에 영향을 받기 때문에 SARS-CoV-2 복제로부터 CNS의 면역 보호가 필요한 대상체이다.
본 개시는 또한 본 개시에 따른 SARS-CoV-2 S 단백질을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자 및 담체를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 백신은 백신 접종 대상체, 특히 인간 대상체가 COVID-19에 걸릴 가능성을 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 감소는 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다. 몇몇 구현예에서, 백신은 대상체의 COVID-19 질병 중증도를 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 감소는 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다.
몇몇 구현예에서, 백신은 SARS-Cov-2에 의한 감염에 대한 보호, 특히 멸균 보호를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 백신은 면역원성 조성물과 관련하여 본원에 개시된 바와 같은 방법에 사용하기 위한 것이다.
본원에 개시된 면역원성 조성물 및 백신은 본원에 개시된 투여 경로 및 투여 요법에 따라, 특히 하기 C.에 개시된 특정 실시양태에 따라, 특히 예시된 구현예에 따라 투여될 수 있다.
C. 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 보호 면역 반응을 유도 및/또는 활성화하는 방법
또한 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 보호 면역 반응을 유도하거나 활성화하는 방법으로서, SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 작용제를 대상체의 상기도에 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 작용제는 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자이다. 본원의 방법의 개시내용은 본 개시에 개시된 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물 또는 본 개시에 개시된 방법에 사용하기 위한 백신에 유사하게 적용가능하다.
몇몇 구현예에서, 작용제는 비강 흡입에 의해 투여된다.
본원에서 사용되는 "상기도에 투여되는"은 상기도의 점막 내층으로 전달되는 임의의 유형의 투여를 포함하고 특히 비강 투여를 포함한다. 상기도에의 투여는 에어로졸 흡입, 비강 점적, 비강 흡입 및 이들의 모든 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 몇몇 구현예에서, 투여는 에어로졸 흡입에 의한 것이다. 몇몇 구현예에서, 투여는 비강 점적에 의한 것이다. 몇몇 구현예에서, 투여는 비강 흡입에 의한 것이다.
몇몇 구현예에서, 치료 과정은 상기도에의 단일 투여로 구성된다. 몇몇 구현예에서, 치료 과정은 상기도에의 복수의 투여를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 치료 과정은 상기도에의 적어도 하나의 투여 및 기도 외부에의 적어도 하나의 투여를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 치료 과정은 기도 외부의 경로를 통한 적어도 1회의 프라이밍 투여 후 상기도에의 적어도 1회의 부스팅 투여를 포함한다. 기도 외부에의 투여는 근육내, 피내 또는 피하 투여일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 치료 과정은 적어도 프라임/부스트 또는 프라임/표적 투여를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 투여 요법은 전신(특히 근육내) 투여와 같은 상기도 외부에의 프라임 투여 및 상기도에의 부스트 또는 표적 투여를 포함하거나 이로 구성된다. 작용제의 투여량은 프라임 및 부스트/표적 투여 단계에서 동일할 수 있거나 상이할 수 있고, 특히 상기도에의 투여의 경우에 더 높을 수 있다. 상기도에의 투여에 대한 세부사항은 하기에 제공된다.
특정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 LV::SFL, 특히 NILV::SFL이고 투여 요법은 전신 투여, 특히 상기도에의 근육내(i.m.) 프라임 및 부스트 투여, 특히 비강내 부스트 투여로 구성된다.
특정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 LV::Sprefusion, 특히 NILV::Sprefusion, 예컨대 LV::S2P△F 또는 NILV::S2P△F, 또는 LV::S2P3F 또는 NI LV::S2P3F이고, 투여 요법은 전신 투여, 특히 상기도에의 근육내(i.m.) 프라임 및 부스트 투여, 특히 비강내 부스트 투여로 구성된다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 하기의 것들로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
- 서열번호 13의 S2P△F(S2PdeltaF) 또는 서열번호 13과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열, 특히 RBD에서 돌연변이, 특히 결실을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 10의 S2P3F 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 10과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로, 특히 여기서 서열번호 10과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열은 돌연변이 986K→P and 987V→P를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 서열번호 7의 S2P 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 7과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 2의 SFL 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 107의 S-B1.1.7 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 107과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 110의 S-B351 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 110과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 113의 S-B1.1.7 S-B351-2P 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 113과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
- 서열번호 116의 SFL-D614G 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 116과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및
- 서열번호 119의 S-P1 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 119와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
몇몇 구현예에서, 보호 면역 반응은 대상체에서 SARS-CoV-2 중화 항체의 생성을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 중화 항체는 IgG 항체를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 보호 면역 반응은 대상체에서 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포의 생성을 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 CD4+ T 세포를 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 CD8+ T 세포를 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 폐 CD8+ T 세포를 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 IFN-α 생성 T-세포를 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 이펙터 메모리(Tem) 및/또는 상주 메모리(Trm) 표현형을 갖는 T 세포를 포함한다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 후각 망울로 동원된다. 몇몇 구현예에서, 보호 면역 반응은 SARS-CoV-2 감염의 적어도 하나의 증상의 발생을 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 보호 면역 반응은 감염된 대상체가 SARS-CoV-2 감염의 적어도 하나의 증상을 겪는 기간을 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 보호 면역 반응은 대상체에서 SARS-CoV-2 감염 관련 염증이 발생할 가능성을 감소시킨다.
다양한 구현예에서, 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 벡터 입자의 설명에 관한 구현예에서 개시되어 있는 임의의 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화할 수 있다.
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열로부터 발현된다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 단편은 펩티드 61-75(NVTWFHAIHVSGTNG(서열번호 15)), 펩티드 536-550(NKCVNFNFNGLTGTG(서열번호 16)) 및 펩티드 576-576-590(VRDPQTLEILDITPC(서열번호 17))로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 몇몇 구현예에서 SARS-CoV-2 S 유도체 또는 이의 단편은 서열번호 1에 대한 아미노산 변형을 포함하며, 상기 변형은 (i) 986K→P 및 987V→P, (ii) 681PRRARS686(서열번호 22) → 681PGSAGS686(서열번호 23), 및 (iii) 986K→P, 987V→P, 및 675QTQTNSPRRAR685(서열번호 24) 결실로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 1, 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 및 120로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
몇몇 구현예에서, 투여된 렌티바이러스 벡터 입자는 통합적이다. 몇몇 구현예에서, 투여된 렌티바이러스 벡터 입자는 비통합적이다. 몇몇 구현예에서, 투여된 비통합 렌티바이러스 입자는 인테그라제 코딩 서열에서 D64V 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 투여된 렌티바이러스 벡터 입자는 수포성 구내염 바이러스 외피 당단백질(VSV-G)로 슈도타이핑된다. 몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 벡터 입자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신 제제로서 투여된다.
몇몇 구현예에서, 렌티벡터는 중증급성호흡기증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편의 고발현을 유도하고 유도된 면역 반응에 의한 제거에 충분한 양으로 발현을 유도하는 프로모터를 함유한다. 몇몇 구현예에서, 프로모터는 삽입 효과를 피하기 위해 인핸서 요소가 결여되어 있다.
몇몇 구현예에서, 투여 후 4일째에 마우스 또는 햄스터 동물 모델의 세포에 통합된 렌티바이러스 DNA의 적어도 95%, 99%, 99.9% 또는 99.99%가 투여 후 21일까지 제거된다.
몇몇 구현예에서, 렌티벡터 입자는 106, 2 x 106, 5x 106, 107, 2 x 107, 5 x 107, 108, 2 x 108, 5 x 108, 또는 109 TU의 용량으로 존재한다.
렌티바이러스 벡터에 의해 유도된 면역 반응은 B 세포 반응, CD4+ T 세포 반응 및/또는 CD8+ T 세포 반응일 수 있다.
따라서 본 발명은 특히 상기도에 투여하기 위한 약제 또는 백신으로서 유용한 벡터를 제공한다.
개시된 렌티바이러스 벡터는 기억 CTL 반응을 포함하는 B 세포 반응, CD4+ T 세포 반응, 및/또는 CD8+ T 세포 반응의 발생을 유도, 개선 또는 일반적으로 연관시키는 능력을 갖는다.
몇몇 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 아쥬반트, 다른 면역원성 조성물 및/또는 임의의 다른 치료적 치료와 함께 사용된다.
몇몇 구현예에 따르면, 본원에서 정의되거나 예시된 면역원성 조성물은 대상체의 상기도 및/또는 뇌에서 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 사용하기 위한 것이다.
몇몇 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 B 및 T 세포 반응을 유도함으로써 SARS-CoV-2 Wuhan 균주, SARS-CoV-2 D614G 균주 및 SARS-CoV-2 B1.117 균주의 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2를 포함하는 조상 및 SARS-CoV-2 P.1 변종과 같은 새로운 SARS-CoV-2 변종에 대해 폐 및 뇌의 교차 보호 면역 반응을 유도하기 위해 사용하기 위한 것이다.
몇몇 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 본원에 정의된 바와 같이 사용하기 위한 것이며, 투여 형태 또는 슈도타이핑된 렌티바이러스 입자가 본원에 정의된 바와 같은 슈도타이핑된 렌티바이러스 입자를 포함하고 여기서 슈도타이핑된 렌티바이러스 입자는 비통합적임을 특징으로 한다.
몇몇 구현예에서, 이들 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 사용하기 위한 것이며, 여기서의 반응은 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포, 특히 폐 CD8+ T 세포 및/또는 IFN-γ 생산 T 세포를 포함하는 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포를 유도한다.
몇몇 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 사용되며, 여기서의 반응은 이펙터 메모리(Tem) 및/또는 상주 메모리(Trm) 표현형을 갖는 T 세포를 포함하는 CD8+ T 세포를 유도한다.
몇몇 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 본원에 정의된 바와 같이 사용하기 위한 것이며, SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 후각 망울로 동원된다.
몇몇 구현예에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물은 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편이 서열번호 1, 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 및 120으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
몇몇 구현예에 따르면, 면역원성 조성물은 대상체에서 SARS-CoV-2 감염 관련 염증을 예방하거나 완화하기 위해 사용하기 위한 것이다.
D. 상기도에의 투여를 위한 제형
본 개시의 면역원성 조성물은 대상체의 상기도에 투여하기에 적합한 제형(dosage form)으로 제공될 수 있다. 적절한 제형은 당업계에 공지되어 있다. 몇몇 구현예에서, 제형은 에어로졸 흡입에 적합하다. 몇몇 구현예에서, 제형은 비강 점적에 적합하다. 몇몇 구현예에서, 비강 투여 형태는 비강 흡입에 적합하다. 몇몇 구현예에서, 제형은 단일 투여량으로 분주된다. 몇몇 구현예에서, 제형은 단일 용량으로 포장된다.
E. 키트
또한 본원에 개시된 방법을 실시하는데 사용하기에 적합한 키트가 제공된다. 몇몇 구현예에서 키트는 본 개시에 따른 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자를 대상체의 상기도에 투여하기 위한 제형 및 어플리케이터를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 어플리케이터는 에어로졸 흡입용 어플리케이터이다. 몇몇 구현예에서, 어플리케이터는 비강 점적을 위한 어플리케이터이다. 몇몇 구현예에서, 어플리케이터는 비강 흡입용 어플리케이터이다. 각각의 적합한 예는 당업계에 공지되어 있고 사용될 수 있다.
F. 렌티바이러스 벡터
또한 이를 생성하기 위한 신규하고 자명하지 않은 렌티바이러스 벡터 및 플라스미드가 제공된다. LV 및 플라스미드는 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
본 발명의 여러 구현예를 설명하였지만, 본원의 개시 내용은 단지 예시일 뿐이며 다양한 다른 대안, 적용 및 수정이 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다는 것이 당업자에 의해 주목되어야 한다. 따라서, 본 발명은 본원에 예시된 특정 구현예에 제한되지 않는다.
G. 실시예
실시예 1: 인간 ACE2를 발현하도록 처리된 골든 햄스터 및 마우스의 전임상 동물 모델에서 SARS-Cov-2에 대한 LV를 이용한 비강 백신접종
실시예 1.1: 물질 및 방법
1. 1.1 SCoV-2에서 유래된 SFL, S1-S2 또는 S1을 암호화하는 전달 pFLAP 플라스미드의 제작.
코돈-최적화 전장 S(1-1273) 서열을 pMK-RQ_S-2019-nCoV로부터 증폭하고 pFlap-ieCMV-WPREm의 BamHI 및 XhoI 부위 사이에 삽입하였다. S1-S2(1-1211) 또는 S1(1-681)을 암호화하는 서열을 pFlap-ieCMV-SFL-WPREm 플라스미드로부터 PCR로 증폭하고 BamHI 및 XhoI 제한 부위 사이의 pFlap-ieCMV-WPREm으로 서브클로닝했다. 각각의 PCR 산물은 천연 인간 ieCMV 프로모터와 돌연변이된 WPRE(Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element) 서열 사이에 삽입하였으며, 여기서 X 단백질 펩티드의 발현을 피하기 위해 WPRE의 단백질 X의 시작 코돈에 돌연변이를 도입하였다. 플라스미드를 50μg/ml의 카나마이신이 보충된 Lysogeny Broth(LB)에서 대장균 DH5a에서 증폭하고, NucleoBond Xtra Maxi EF 키트(Macherey Nagel)를 사용하여 정제하고 Tris-EDTA 내독소가 없는(TE-EF) 완충액에 밤새 재현탁했다. 플라스미드를 NanoDrop 2000c 분광광도계(Thermo Scientific)로 정량하고, TE-EF 버퍼에서 1 μg/μl로 조정하고, 분취하고 -20℃에서 보관하였다. 플라스미드 DNA는 (i) 제한 절단을 이용한 진단 검사 및 (ii) 이식유전자 삽입 부위에 근접한 영역의 시퀀싱에 의해 검증하였다.
1. 1.2 LV 벡터의 생성 및 적정
비복제적 통합 LV 벡터는 이전에 설명한 바와 같이 HEK(Human Embryonic Kidney)-293T 세포에서 생성하였다(Zennou 등, 2000). 페트리 접시당 6 x 106 세포를 DMEM에서 배양하고 하기의 것들의 혼합물 1 ml로 삼자(tripartite) 방식으로 동시 형질감염했다: (i) 코돈 최적화된 gag-pol-tat-rre-rev를 암호화하는 2.5 ㎍/ml의 pSD-GP-NDK 패키징 플라스미드, (ii) 10 ㎍/ml의 VSV-G 인디애나 외피 플라스미드, 및 (iii) 125mM Ca(ClO3)2를 포함하는 Hepes 1X에서 10 ㎍/ml의 전달 pFLAP 플라스미드. 형질감염 48시간 후 상층액을 수확하고, 4℃에서 2500rpm으로 6분 원심분리하여 정화한 다음, 잔류 DNA를 제거하기 위해 최종적으로 MgCl2(2mM)를 함유하는 Hepes-완충 용액에서 37℃에서 벤조나제 10U/ml 최종 농도로 30분 동안 처리하였다. LV 벡터를 분주하고 -80℃에서 보존하였다. LV 제제의 역가를 측정하기 위해, HEK-293T를 세포 증식을 차단하는 8 μM 아피디콜린(Sigma)의 존재 하에 완전한 DMEM에서 편평 바닥 6-웰 플레이트에서 4 x 105세포/웰로 분포시켰다. 그런 다음 세포에 LV 제제의 연속 희석액을 형질도입했다. 핵 유전자 전달의 효능에 비례하는 역가는 다른 곳에서 기재된 바와 같이(Iglesias 등, 2006), pFLAP 플라스미드에 특이적인 정방향 5'-TGG AGG AGG AGA TAT GAG GG-3'(서열번호 100) 및 역방향 5'-CTG CTG CAC TAT ACC AGA CA-3'(서열번호 101) 프라이머 및 숙주 하우스키핑 유전자 gadph에 특이적인 정방향 5'-TCT CCT CTG ACT TCA ACA GC-3'(서열번호 102) 및 역방향 5'-CCC TGC ACT TTT TAA GAG CC-3'(서열번호 103) 프라이머를 이용하여 형질도입 후 3일째에 총 용해물에 대한 qPCR에 의해 형질도입 단위(TU)/ml로 측정한다.
1. 1.3 마우스 연구
암컷 C57BL/6J 마우스(Janvier, Le Genest Saint Isle, France)는 생후 6주에서 10주 사이에 사용하였다. 수컷 Mesocricetus auratus 골든 햄스터(Janvier, Le Genest Saint Isle, France)는 성숙한 상태, 즉 80-90 그램 무게로 구입했다. 면역화 요법의 시작 시 체중은 100 내지 120g이었다. 동물에 대한 실험은 지역 윤리 위원회(CETEA #DAP20007)와 고등 교육 연구부 APAFIS#24627-2020031117362508 v1에서 전달한 프로토콜 동의에 따라, 파스퇴르 연구소 안전성(Institut Pasteur Safety)의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인 후 유럽 및 프랑스 지침(Directive 86/609/CEE 및 1987년 10월 19일 법령 87-848)에 따라 수행되었다. 복강내(i.p.) 주사를 통해 지시된 TU의 LV로 마우스를 백신접종하였다. 결합 및 중화 활성을 모니터링하기 위해 면역화 후 다양한 시점에서 혈청을 수집하였다.
1. 1.4 SARS-CoV-2 접종
Ad5::hACE2-전처리된 마우스 또는 햄스터는 케타민 및 자일라진 혼합물의 복막 주사로 마취하였고, PSM-III로 옮겨 VeroE6 세포(프랑스 국립 바이러스 참조 센터(Centre National de Reference des Virus Respiratoires)에 의해 제공됨)에서 증폭된 SARS-CoV-2 임상 분리주 1 x 105 TCID50으로 접종하였다. 바이러스 접종물은 마우스의 경우 20 ㎕, 햄스터의 경우 50 ㎕로 함유되었다. 그런 다음 동물을 파스퇴르 연구소의 BSL3 동물 시설에 있는 격리 장치에 보관했다. 살아있는 SARS-CoV-2와 함께 감염된 마우스에서 회수한 장기 및 체액은 BioSafety Level BSL3 시설의 승인된 표준 운영 절차에 따라 조작하였다.
1. 1.5 재조합 SCoV-2 단백질 변이체
SARS-CoV-2 S 엑토도메인(a.a. 1 내지 1208), S1 모노머(a.a. 16 내지 681) 및 RBD 하위 도메인(아미노산 331 내지 519)(둘 모두 뮤린 IgK 리더 펩타이드가 앞에 있고 8xHis Tag(서열번호 104)가 뒤따름)의 안정화된 삼량체 버전을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 단편을 합성하고 pcDNATM3.1/Zeo(+) 발현 벡터(Thermo Fisher Scientific사)에 클로닝했다. 단백질은 이전에 기술된 폴리에틸렌이민(PEI)-침전 방법(Lorin 및 Mouquet, 2015)을 사용하여 기하급수적으로 성장하는 FreestyleTM 293-F 현탁 세포(Thermo Fisher Scientific사, Waltham, MA)의 일시적 동시 형질감염에 의해 생성하였다. 재조합 SCoV-2 단백질은 제조사의 지침(Thermo Fisher Scientific사)에 따라 Ni Sepharose® Excel Resin을 사용하여 친화성 크로마토그래피로 정제했다. 단백질 순도는 NuPAGETM 3-8% Tris-Acetate 겔(Life Technologies사)을 사용하여 환원 및 비환원 조건에서 SDS-PAGE 후 Pierce Silver Stain 키트(Thermo Fisher Scientific사)를 사용하여 인겔(in-gel) 단백질 은염색으로 평가했다. 정제된 단백질을 Slide-A-Lyzer® 투석 카세트(10kDa MW 컷오프, Thermo Fisher Scientific사)를 사용하여 PBS에 대해 밤새 투석했다. 단백질 농도는 NanoDrop™ One 장비(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정하였다.
1. 1.6 ELISA
96-웰 Nunc Polysorp 플레이트(Nunc, Thermo Scientific)를 4℃에서 밤새 탄산염 완충액 (pH 9.6)에서 100ng/웰의 정제된 tri-S 단백질로 코팅했다. 0.1% Tween 20(PBST)이 포함된 PBS로 세척한 후, 플레이트 웰을 1% Tween20 및 10% FBS가 포함된 PBS로 실온에서 2시간 동안 블로킹했다. PBST 세척 후, 10% FBS를 함유하는 PBST에서 1:100 희석된 혈청 및 4개의 연속적 1:10 희석액을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBST 세척 후, 플레이트를 1,000배 희석된 퍼옥시다제-접합 염소 항-마우스 IgG/IgM(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd사, Cambridgeshire, United Kingdom)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트는 PBST 세척 후 100 μl의 TMB 발색 기질(TMB, Eurobio Scientific사)을 첨가하여 노출(reveal)시켰다. 광학 밀도는 30분 인큐베이션 후 PR3100 판독기에서 450nm/620nm에서 측정하였다.
1. 1.7 nAb 검출
안정적으로 인간 ACE2를 발현하도록 형질도입된 HEK(Human Embryonic Kidney) 293-T 세포와 리포터 루시퍼라제 반딧불이 유전자를 포함하는 안전한 비복제 SCoV-2 슈도타이핑된 LV 입자를 사용하는 억제 분석을 통해 혈장의 연속 희석액을 nAb에 대해 평가하여, 천연 SARS-CoV-2 바이러스의 융합 단계를 모방함으로써 숙주 세포 침입의 정량화를 가능하게 했다(Sterlin 등). 먼저, SCoV-2 슈도타이핑된 LV의 1.5 x 102 TU를 실온에서 30분 동안 U-바닥 플레이트에서 DMEM(10% 열 불활성화된 FCS 및 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 함유)에서 최종 부피 50 μl로 각 혈청을 연속적 희석액과 함께 전배양했다. 그런 다음 샘플을 투명하고 평평한-바닥 96-웰 블랙 플레이트로 옮기고 각 웰에 50 μl에 포함된 2 x 104 hACE2+ HEK293-T 세포를 수용했다. 37℃, 5% CO2에서 2일 배양 후, 리포터 용해 완충액(Promega)이 있는 루시퍼라제 분석 시스템 키트를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 슈도타이핑된 LV 입자에 의한 hACE2+ HEK293-T 세포의 형질도입 효율을 측정하였다. 이를 위해, 배양 웰의 상등액을 완전히 제거하고, 각 배양 웰에 40 ㎕의 리포터 용해 완충액 1X와 50 ㎕의 루시퍼라제 분석 시약(Luciferase FireFly)를 순차적으로 첨가하였다. 생물발광 신호는 LB 960 플레이트 판독기(Berthold사)를 사용하여 정량하였다.
1. 1.8 SFL T-세포 에피토프 매핑
면역우성 에피토프를 매핑하기 위해, 전체 스파이크 단백질에 걸쳐 있는 펩티드를 10개의 풀에 모았으며, 각각은 10개의 아미노산이 겹치는 15개의 아미노산 잔기를 포함했다. 합성 펩티드는 Mimotopes(호주)에서 구입했다. IFN-g ELISpot 분석은 이전에 설명한 대로 수행하였다(Dion 등, 2013). 풀링된 펩티드의 이러한 상이한 세트는 매트릭스 분석에서 사용되어 각 작제물에 의해 유도된 에피토프 반응을 ICS에 의해 매핑했다. 펩티드는 2mg/ml의 농도로 DMSO에 용해하였고 ELISpot 및 ICS 분석에서 각각 사용하기 전에 배양 배지로 1μg/ml 및 2-5μg/mL로 사용 전에 희석하였다. ELISpot에서의 반응은 3중 웰에서 반점-형성 세포의 중간 수가 대조군 웰에서 관찰된 것의 2배 이상이고 배경을 뺀 후 백만 개의 비장 세포당 적어도 50개의 반점-형성 세포가 검출된 경우 양성으로 간주하였다.
1. 1.9 Ad5 유전자 전달 벡터의 생성 및 마우스의 비강내 전처리
ViraPower Adenoviral Promoterless Gateway Expression Kit(Thermo Fisher Scientific사, 프랑스)를 사용하여 Ad5 유전자 전달 벡터를 생성하였다. pCMV-BamH1-Xho1-WPRE 서열은 하기의 것들을 사용하여 pTRIP-3CMV 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다: (i) 5' 말단에서 attB1을 암호화하는 정방향 프라이머, 및 (ii) 5' 말단에서 attB2 및 SV40 polyA 신호 서열 모두를 암호화하는 역방향 프라이머. pDORN207-CMV-BamH1-Xho1-WPRE-SV40 polyA를 형성하기 위해 attb-PCR 산물을 BP 클로나제 반응을 통해 게이트웨이 pDORN207 공여 벡터에 클로닝했다. hACE2는 hACE2를 발현하는 pcDNA3.11(Nicolas Escriou로부터 얻음)의 플라스미드 유도체로부터 증폭하였으며, egfp는 pTRIP-ieCMV-eGFP-WPRE2로부터 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 BamH1 및 Xho1 제한 부위를 통해 pDORN207-CMV-BamH1-Xho1-WPRE-SV40 polyA 플라스미드에 클로닝했다. 최종 Ad5 플라스미드를 얻기 위해, hACE2 또는 gfp 유전자를 포함하는 pDORN207 벡터를 LR Clonase 반응을 통해 pAd/PL-DESTTM 벡터에 추가로 삽입했다.
Ad5 비리온은 제조사의 프로토콜(ViraPower Adenoviral Promoterless Gateway Expression Kit, Thermo Fisher Scientific사)에 따라. E3-형질전환(transcomplementing) HEK-293A 세포주를 pAd CMV-GFP-WPRE-SV40 polyA 또는 pAd CMV-hACE2-WPRE-SV40 polyA 플라스미드로 형질감염시킨 후 후속 벡터 증폭에 의해 생성하였다. Ad5 입자는 Adeno-X Rapid Maxi 정제 키트를 사용하여 정제하고 Amicon Ultra-4 10k 원심 필터 장치로 농축했다. 벡터를 재현탁하고 2.5% 글루코스가 보충된 PIPES 완충액(pH 7.5)에서 -80℃로 보관하였다. Ad5는 HEK-293T 세포에 적합한, Gallaher 등3에 의해 설명된 qRT-PCR 프로토콜을 사용하여 적정하였다.
공격접종(challenge) 4일 전에, 마우스에게 케타민(Imalgene, 100 mg/kg)과 실라진(Rompun, 10 mg/kg)의 혼합물의 복강내 주사하여 얻은 전신 마취하에서, 15 ㎕의 PBS에 재현탁된 2.4 x 109 IGU의 Ad5::hACE2, Ad5::GFP 또는 대조군 빈 벡터를 비강내 주입하였다.
1. 1.10 웨스턴 블롯
Ad5::hACE2-형질도입 마우스의 폐에서 hACE2의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 폐 균질액의 1 x 106 세포를 4 내지 12% NuPAGE Bis-Tris 단백질 겔(Thermo Fisher Scientific사, 프랑스) 상에서 분리한 다음 니트로셀룰로스 막(Biorad사, 프랑스)으로 옮겼다. 니트로셀룰로오스 막을 실온에서 2시간 동안 0.5% Tween PBS(PBS-T) 중 5% 무지방 우유에서 블로킹하고 1mg/mL(AF933, R&D systems사)에서 염소 항-hACE2 1차 Ab와 밤새 반응시켰다. PBS-T로 10분씩 3회 세척한 후, 막을 HRP-접합 항-염소 2차 Ab 및 HRP-접합 항-β-액틴(ab197277, Abcam사)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 막을 PBS-T로 세 번 세척한 후 ChemiDoc XRS+(Biorad사, 프랑스)에서 슈퍼 시그널 웨스트 펨토 최대 감도 기질(ThermoFisher사, 프랑스)를 통해 강화된 화학발광으로 시각화하였다. PageRuler Plus 전염색(prestained) 단백질 래더(ladder)를 크기 기준으로 사용하였다.
1. 1.11 폐의 SARS-CoV-2 바이러스 부하의 측정
각 폐엽의 절반을 무균적으로 제거하고 -80℃에서 동결시켰다. 장기를 해동하고 500μl의 얼음 냉각 PBS에서 용해 매트릭스 D(MP Biomedical사)를 사용하여 4.0m/s에서 20초 동안 두 번 균질화했다. 균질화는 MP Biomedical Fastprep 24 Tissue Homogenizer에서 수행하였다. 미립자 바이러스 RNA는 제조사의 절차에 따라 QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen사)을 사용하여 폐 균질액 70μl로부터 추출했다. 바이러스 부하는 SuperScriptTM III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR 시스템(Invitrogen사) 및 하기 표 1에 나열된 SARS-CoV-2 외피(E) 유전자를 표적하는 프라이머 및 프로브(Eurofins사)를 사용하여, 본질적으로 Corman 등(Corman 등, 2020)에 기재된 역전사 및 실시간 TaqManTM PCR에 따라 측정하였다. 플라스미드 pCI/SARS-CoV E 유래의 시험관내 전사된 RNA는 T7 RiboMAX Express Large Scale RNA 생성 시스템(Promega사)을 사용하여 합성한 다음 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올을 사용한 2회 연속 침전으로 정제했다. 광학 밀도 측정으로 RNA 농도를 측정한 다음, RNA를 100μg/mL tRNA 담체를 함유하는 RNAse가 없는 물에 109 게놈 당량/μL로 희석하고 -80℃에서 일회용 분취량으로 보관했다. 시험관 내에서 전사된 이러한 RNA의 일련의 희석액은 10μg/ml tRNA 담체를 포함하는 RNAse가 없는 물에서 준비하였고 각 분석에서 표준 곡선을 설정하는데 사용하였다. 열 사이클링 조건은 다음과 같았다: (i) 55℃에서 10분 동안 역전사, (ii) 95℃에서 3분 동안 효소 불활성화, 및 (iii) 95℃에서 15초 동안, 58℃에서 30초 동안 변성/증폭의 45 사이클. 산물은 ABI 7500 Fast 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems사)에서 분석하였다.
1. 1.12 폐 선천성 면역 세포의 세포 계측 분석
개별 마우스의 폐를 콜라게나아제-DNAse-I로 처리하고 370℃에서 30분간 인큐베이션하고 GentleMacs를 사용하여 균질화했다. 세포를 100 μm 기공 필터를 통해 여과하고 8분 동안 1200 rpm에서 원심분리했다. 그런 다음 세포를 적혈구 용해 완충액(Sigma사)으로 처리하고 PBS로 2회 세척했다. 그런 다음 세포를 다음과 같이 염색했다. (i) DC, 단핵구, 폐포 및 간질 대식세포를 검출하기 위해: Near IR Live/Dead(Invitrogen사), FcγII/III 수용체 차단 항-CD16/CD32(BD Biosciences사), BV605-항-CD45(BD Biosciences사), PE-항-CD11b(eBioscience사), PE-Cy7-항-CD11c(eBioscience사), BV450-항-CD64(BD Biosciences사), FITC-항-CD24(BD Biosciences사), BV711-항-CD103(BioLegend사), AF700-항-MHC-II(BioLegend사), PerCP-Cy5.5-항-Ly6C(eBioscience사) 및 APC 항-Ly-6G(Miltenyi사) mAbs, (ii) 호중구 또는 호산구를 검출하기 위해: Near IR DL(Invitrogen사), FcγII/III 수용체 차단 항-CD16/CD32(BD Biosciences사), PerCP-Vio700-항-CD45(Miltenyi사), APC-anti-CD11b(BD Biosciences사), PE-Cy7-항-CD11c(eBioscience사), FITC-항-CD24(BD Biosciences사), AF700-항-MHC-II(BioLegend사), PE-항-Ly6G(BioLegend사), BV421-항-Siglec-F(BD Biosciences사), (iii) 비만 세포, 호염기구, NK를 검출하기 위해: Near IR DL(Invitrogen사), BV605-항-CD45(BD Biosciences사), PE-항-CD11b(eBioscience사), eF450-항-CD11c(eBioscience사), PE-Cy7-항-CD117(BD Biosciences사), APC-항-FcER1(BioLegend사), AF700-항-NKp46(BD Biosciences사), FITC-항-CCR3(BioLegend사), FcγII/III 수용체 차단 항-CD16/CD32는 없음. 세포를 4℃에서 25분 동안 적절한 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 3% FCS를 함유하는 PBS로 2회 세척한 다음 PFA 4%에서 고정하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. Attune NxT cytometer 시스템(Invitrogen사)에서 세포를 획득하고 데이터를 FlowJo 소프트웨어(Treestar사, 미국 OR)로 분석했다.
1.1.13 qRT-PCR 폐에서 염증성 사이토카인 및 케모카인의 검출
폐 샘플을 TRIzol 시약 1mL를 함유하는 용해 기질 D(MP Biomedical사)에 첨가하고 MP Biomedical Fastprep 24 Tissue Homogenizer를 사용하여 6.0m/s에서 30초 동안 2회 균질화했다. 제조사의 절차에 따라 TRIzol 시약(ThermoFisher Scientifc사, 프랑스)을 사용하여 총 RNA를 추출했다. cDNA는 20μl 반응에서 2.5mM의 올리고(dT) 18 프라이머(서열번호 105), 0.5mM의 데옥시리보뉴클레오티드, 2.0U의 RNase 억제제 및 SuperScript IV 역전사 효소(ThermoFisher Scientific사, 프랑스)의 존재하에 4mg의 RNA로부터 합성하였다. 실시간 PCR은 QuantStudio® 7 Flex Real-Time PCR System(ThermoFisher Scientifc사, 프랑스)에서 수행하였다. iQTM SYBR® Green Supermix(Biorad사, 프랑스) 5ml, DEPC-물에 1:15로 희석된 cDNA 4ml, 0.5mM의 최종 농도에서 각 정방향 및 역방향 프라이머 0.5ml를 포함하는 10ml의 최종 반응 부피에서 3회 반응을 수행했다(표 2). 하기 열적 프로파일이 사용되었다: 95℃에서 3분 동안 폴리머라제 활성화의 단일 사이클, 이어서 95℃에서 15초 및 60℃에서 30초의 40회 증폭 사이클(어닐링-연장 단계). 평균 CT 값은 표적 사이토카인/케모카인의 상대적 정량화를 위해 기술적 복제물로부터 계산하였다. 사이토카인/케모카인 앰플리콘의 CT와 기준 β-글로빈의 CT의 차이(△CT)를 계산하고 핵산의 양의 차이에 대해 정규화하였다. 비교 △△CT 방법을 사용하여 실험 조건의 △CT를 PBS 처리된 마우스와 상대적으로 비교하였다. 유전자 발현의 배수 변화는 2-△△CT를 사용하여 추가로 계산하였다.
실시예 1.2: SARS-CoV-2 스파이크 단백질 변이체를 암호화하는 LV에 의한 항체 반응의 유도
SCoV-2에 특이적인 nAbs를 유도할 수 있는 백신 후보를 개발하기 위해, 본 발명자들은 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시-초기 프로모터의 전사 제어하에 하기의 코돈 최적화된 서열을 암호화하는 LV를 생성했다: (i) S의 전장 막 고정 형태(LV::SFL), (ii) 막관통 및 C-말단 짧은 내부 꼬리가 없는 S1-S2 엑토-도메인(LV::S1-S2), 또는 ( iii) S1 단독(LV::S1), 모두 RBD(도 1A)를 갖고 있으며, 전향적 구조적 이질성(prospective conformational heterogeneity)이 있다. 이들 벡터에 의해 유도된 체액성 반응을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스(n = 4/그룹)를 마우스당 1 x 107 TU의 LV, 또는 음성 대조군으로서 GFP를 암호화하는 LV의 단일 복강내 주사에 의해 면역화시켰다. SCoV-2 특이적 Ab 반응은 면역화 후 1, 2, 3, 4 및 6주에 혈청에서 조사하였니다. LV::SFL 또는 LV::S1-S2-면역화 마우스에서, SCoV-2-특이성 면역글로불린 G(IgG)는 면역화 후 1주부터 검출할 수 있었고 그의 양은 면역화 후 6주까지 점진적인 증가를 보였다. 평균 역가 ± SEM = (4.5 ± 2.9) x 106 또는 (1.5 ± 1) x 106. 비교로서, SCoV-2-특이적 IgG 역가는 그의 LV::S1-면역화 대응물에서 100x 이하, 즉, (7.1 ± 6.1) x 104이었다(도 1B).
그런 다음 혈청은 SCoV-2로 슈도타이핑된 비복제 LV 입자 대용물(surrogate)에 의한 hACE2+ 세포 침입의 nAb-매개 억제를 기반으로 하는 신뢰할 수 있는 중화 분석을 사용하여 SARS-CoV-2를 중화하는 능력에 대해 평가하였다(Sterlin 등). 이러한 SCoV-2 슈도타이핑된 LV 입자는 생물학적 유체에 함유될 수 있는 nAb의 중화 효율에 반비례하는 hACE2+ 숙주 세포 침입의 정량화를 가능하게 하는 리포터 루시퍼라제 유전자를 갖고 있다. LV::SFL-, LV::S1-S2- 또는 LV::S1-면역화 마우스에서 얻은 혈청의 50% 유효 농도(EC50)의 분석 결과, LV::SFL이 SCoV-특이적 nAbs 를 유도하는데 가장 강력한 벡터라는 것이 명확하게 확립되었다(도 1C). 더욱이, nAb 역가는 LV::SFL-면역화 마우스의 혈청에서만 SCoV-2-특이적 IgG 역가와 상관관계가 있었다(p < 0.0001, R2 = 0.645, 양방향 Spearman 순위 상관 검정)(도 1E). 이러한 결과는 S1-S2 또는 S1 폴리펩티드에서, 관련 B 세포 에피토프의 형태가 천연 SFL의 형태와 구별되며, 후자는 SCoV-2-hACE2 상호 작용 및 숙주 세포 침입을 억제할 수 있는 nAb를 유도하는 유일한 변이체를 나타냄을 강력하게 시사한다. LV::SFL로 면역화된 마우스와 프랑스 최초의 전염병 지역 중 하나인 Crepy en Valois에 거주하는 경미한 증상을 보이는 감염자 코호트의 혈청 중화능을 비교한 결과 동등한 중화 활성 평균을 보였다(도 1D ). 이러한 데이터는 LV::SFL에 의해 유도된 체액 반응의 보호 가능성을 예측했다.
중화 Ab를 유도할 때 LV::S 벡터의 면역원성을 잠재적으로 증가시키기 위해, 본 발명자들은 다음과 같이 조작된 안정화된 전융합(pre-fusion) SCoV-2를 암호화하는 LV 벡터를 생성했다:
(i) 두 개의 986K―>P 및 987V―>P 연속적 a.a 치환을 포함하는 안정성이 향상된 SCoV-2. 견고한 프롤린 잔기로의 a.a 치환은 구조적 엔트로피를 감소시켜 단백질 안정성을 증가시킨다는 것이 실제로 입증되었다.
(ii) 푸린 절단 부위에서 681PRRARS686(서열번호 22)―>681PGSAGS686(서열번호 23) a.a. 치환을 갖는 SCoV-2. 이로써 이러한 단백질 분해 효소에 의해 인식되지 않는다.
(iii) 986K―>P 및 987V―>P 연속적 a.a. 치환을 갖고 퓨린 절단 부위를 포함하는 675 QTQTNSPRRAR 685(서열번호 24)가 결실된 SCoV-2.
도 17A는 pFlap-ieCMV-SFL-WPREm의 플라스미드 맵을 도시한다.
pFlap-ieCMV-SFL-WPREm의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3으로 확인되는 도 20A에 도시되어 있다. 이러한 벡터에 존재하는 S 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4로 확인되는 도 20B에 도시되어 있다. 이러한 벡터에 존재하는 S 단백질을 암호화하는 아미노산 서열은 서열번호 5로 확인되는 도 20C에 도시되어 있다.
도 17B는 pFlap-ieCMV-S2P-WPREm의 플라스미드 맵을 도시한다.
pFlap-ieCMV-S2P-WPREm의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6으로 확인되는 도 21A에 도시되어 있다. 이러한 벡터에 존재하는 S 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7로 확인되는 도 21B에 도시되어 있다. 이러한 벡터에 존재하는 S 단백질을 암호화하는 아미노산 서열은 서열번호 8로 확인되는 도 21C에 도시되어 있다.
도 17C는 pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm의 플라스미드 맵을 도시한다.
pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 9으로 확인되는 도 22A에 도시되어 있다. 이러한 벡터에 존재하는 S 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7로 확인되는 도 22B에 도시되어 있다. 이러한 벡터에 존재하는 S 단백질을 암호화하는 아미노산 서열은 서열번호 11로 확인되는 도 22C에 도시되어 있다.
도 17D는 pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm의 플라스미드 맵을 도시한다.
pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12으로 확인되는 도 23A에 도시되어 있다. 이러한 벡터에 존재하는 S 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7로 확인되는 도 23B에 도시되어 있다. 이러한 벡터에 존재하는 S 단백질을 암호화하는 아미노산 서열은 서열번호 14로 확인되는 도 23C에 도시되어 있다.
COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES(CNCM)는 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라 국제 기탁 기관의 지위를 갖는다. CNCM은 프랑스, 75724 파리 세덱스 15, 닥터 루 거리 25-28, 파스테르 연구소에 위치하여 있다.
하기의 물질들을 2020년 7월 15일 기탁하였다: pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm (CNCM I-5537), pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm (CNCM I-5538), pFlap-ieCMV-S2P-WPREm (CNCM I-5539), and pFlap-ieCMV-SFL-WPREm (CNCM I-5540). 기탁 접수증이 함께 제출된다.
하기의 물질들을 2021년 7월 6일 CNCM에 기탁하였다: pFlap-ieCMV-S-B1.1.7 -WPREm(CNCM I-5708), pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709), pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710), pFlap-ieCMV--SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711), pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712). 기탁 접수증이 함께 제출된다.
LV::SFL로 면역화된 C57BL/6 마우스(n = 3)는 면역화 후 2주차에 IFNγ ELISPOT 기반 에피토프 매핑에 의해 검출된 바와 같이 강한 항-SCoV-2 T 세포 반응을 나타냈으며, 이는 전장 SCoV-2에 걸친 15-mer 펩타이드의 뚜렷한 풀로 자극된 비장 세포에 적용되었다(도 2A). 상당한 양의 반응 T 세포가 16개 펩타이드 풀 중 6개에서 검출되었다. 이들 양성 풀의 디콘볼루션은 S:256-275(SGWTAGAAAYYVGYLQPRTF - 서열번호 32), S:536-550(NKCVNFNFNGLTGTG - 서열번호 16) 및 S:576:590(VRDPQTLEILDITPC - 서열번호 17) 면역우성 에피토프의 확인을 가능하게 하였고, 이들 에피토프는 > 2000 SFU(Spot Forming Unit) / 1 x 106 비장 세포를 생성했다(도 2B). 이들 에피토프는 세포내 사이토카인 염색으로 평가한 바와 같이 CD4+가 아닌 CD8+ T 세포를 유도했다(도 2C). 이들 T 세포의 우세한 CD8+ 표현형은 MHC-I 제시 경로에의 LV-암호화 항원의 선호되는 방향에 따른 것이다(Hu 등, 2011). 본 발명자들은 또한 S:441-455(LDSKVGGNYNYLYRL - 서열번호 18), S:671-685(CASYQTQTNSPRRAR 서열번호 19) 및 S:991-1005(VQIDRLITGRLQSLQ - 서열번호 20) 하위 우성 에피토프를 확인했고, 이들 에피토프는 ELISPOT 분석에서 < 2000 SFU / 1 x 106 비장 세포를 생성했다(도 2B).
실시예 1.3: Ad5 유전자 전달 벡터를 사용하여, 기도에서 인간 ACE2를 발현하는 뮤린 모델의 설정.
SCoV-2는 뮤린 ACE2와 효율적으로 상호 작용하지 않기 때문에, 야생형 실험실 마우스는 SARS-CoV-2 임상 분리주의 복제를 허용하지 않는다. 본 연구가 진행되는 동안 유럽에서 hACE2 형질전환 마우스를 사용할 수 없기 때문에, LV::SFL 백신 효능을 평가하기 위해 본 발명자들은 hACE2 발현이 호흡기 및 폐 점막에서 유도되는 뮤린 모델을 정교하게 만들려고 했다. 이를 위해, 본 발명자들은 CMV 프로모터의 전사 제어하에서 hACE2를 암호화하는 유전자를 비통합 에피좀에서 전달할 수 있는 Ad5 유전자 전달 벡터를 생성했다(Ad5::hACE2). 먼저 본 발명자들은 Ad5::hACE2 벡터가 RT-PCR에 의해 HEK293T 세포에 형질도입될 수 있는 가능성을 시험관 내에서 확인했다(도 3A). 호흡기 세포의 생체내 형질 도입을 달성하기 위해, 마우스당 2.5 x 109 IGU의 Ad5::hACE2를 C57BL/6 마우스에 비강내 주입했다. 4일 후, 웨스턴 블롯에 의해 폐 세포 균질액에서 hACE2 단백질 발현이 검출할 수 있었다(도 3B). 이러한 조건에서 투여된 이식유전자의 생체내 발현 프로파일에 대한 더 많은 통찰력을 얻기 위해, 본 발명자들은 동일한 용량의 Ad5::GFP 리포터 벡터를 C57BL/6 마우스에 비강내로 주입했다. 점적 4일 후 세포 계측법으로 평가한 바와 같이, GFP 리포터는 폐 상피 EpCam+ 세포에서 발현될 뿐만 아니라, CD45 범조혈 마커에 의해 추적된 바와 같이 폐 면역 세포에서도 발현되었으며(도 3C), 이는 이러한 접근법이 상피세포의 효율적인 형질도입을 가능하게 한다는 것을 나타내지만, 이들 세포에 제한되지 않는다.
이러한 hACE2-형질도입 마우스의 SARS-CoV-2 감염에 대한 허용성을 평가하기 위해, Ad5::hACE2 또는 빈 대조군 Ad5 벡터로 비강내 전처리한 지 4일 후, C57BL/6 마우스에 2020년 2월에 국립 호흡기 바이러스 기준 센터(프랑스 파스퇴르 연구소)에서 COVID-19 환자로부터 분리한 SARS-CoV-2 임상 분리주를 1 x 105 TCID50로 접종하였다. 접종후(dpi) 2일에 측정된 폐 바이러스 부하는 Ad5::hACE2-전처리된 마우스에서는 마우스당 SARS-CoV-2 RNA의 (4.4 ± 1.8) x 109 카피만큼 높았으며, 빈 Ad5-전처리된 마우스에서는 마우스당 단지 (6.2 ± 0.5) x 105개 카피였고, 또는 무처리 마우스에서는 마우스당 (4.0 ± 2.9) x 105 카피였다(도 3D). 4 dpi에서, Ad5::hACE2-전처리된 마우스(2.8 ± 1.3 x 109 카피/mouse)에서 폐 바이러스 부하는 유지되었지만, 마우스당 (1.7 ± 2.3) x 104 카피 또는 (3.9 ± 5.1) x 103 카피로의 저하가 빈 Ad5-전처리된 마우스 또는 무처리된 마우스에서 각각 관찰되었다. 7 dpi에서, Ad5::hACE2-전처리된 마우스에서 바이러스 부하는 상당히 감소했지만 여전히 대부분 검출 가능했다((1.33 ± 0.9) x 106 카피/마우스).
Ad5::hACE-2 비강내 주입은 폐로의 CD45+ 세포 동원을 유도했지만, 이러한 효과는 주입 후 4일째에 측정된 바와 같이 벡터 용량이 감소함에 따라 감소했다. 마우스당 4 x 108 IGU의 용량은 PBS-처리 대조군과 비교하여 CD45+ 세포 동원을 일으키지 않았지만(도 3E), 여전히 SARS-CoV-2 복제에 대한 완전한 허용성을 부여했다(도 3F). SARS-CoV-2 복제에 대한 Ad5-hACE2 전처리 마우스의 허용성과 이러한 모델의 설정은 마우스에서 SARS-CoV-2에 대한 백신 또는 약물 효능의 생체 내 평가를 위한 길을 열어주었다.
실시예 1.4: 마우스에서 SARS-CoV-2에 대한 LV::SFL의 보호 가능성의 평가
SARS-CoV-2에 대한 LV::SFL의 예방 가능성을 조사하기 위해, C57BL/6 마우스(n = 4/그룹)에 LV::SFL 또는 음성 대조군 LV(샴)을 1 x 107 TU/마우스의 단일 용량으로 복강내 주사하였다. 면역화 후 6주째에, 마우스를 Ad5::hACE2로 전처리하고, 4일 후에 1 x 105 TCID50의 SARS-CoV-2를 비강내 접종했다(도 4A). 3dpi에서, LV::SFL 백신접종 마우스의 폐 바이러스 부하는 ~1 log10까지 감소했다. 즉, 평균 ± SEM은 (3.2 ± 2.2) x 108 SARS-CoV-2 RNA 카피/아무스인 반면, 백신접종되지 않거나 샴-백신접종된 마우스에서는 (1.7 ± 0.9) x 109 또는 (2.4 ± 1.6) x 109 카피/마우스였다(도 4B). 따라서, 단일 LV::SFL 주입은 폐에서 바이러스 복제를 ~90% 억제하는데 효과적이었다. 예방 효과를 더욱 향상시키기 위해, 본 발명자들은 프라임 부스트 또는 프라임 표적 접근법을 평가했다. C57BL/6 마우스(n = 4-5/그룹)를 0주차에 1 x 107 TU의 LV::SFL 또는 대조군 LV로 복강내 프라임 접종한 다음, 3주차에 하기의 것으로 부스트 접종하였다: (i) 복강내 경로를 통한 1 x 107 TU의 동일 LV("LV::SFL 복강내-복강내" 프라임-부스트), 또는 (ii) 폐 점막으로 전신 면역 매개체를 끌어들이기 위해 비강내 경로를 통한 3 x 107 TU("LV::SFL 복강내-비강내" 프라임-표적)(도 5A). 복강내 경로를 통한 LV::SFL의 전신 부스트 접종은 항-SCoV-2 IgG 역가의 상당한 증가를 가져왔다(도 5B, 왼쪽). 대조적으로, 비강내 경로를 통해 LV::SFL을 사용한 점막 표적화는 전신 수준에서 항-SCoV-2 IgG 역가의 통계적으로 유의미한 개선으로 이어지지 않았다(도 5B 왼쪽). 혈청 중화능의 경우, 복강내 또는 비강내 부스트 후에 증가하는 경향이 관찰되었으나, 그 차이는 통계적 유의성에 도달하지 않았다(도 5B 우측). 그런 다음 모든 마우스를 Ad5::hACE2로 전처리하고 프라임 후 4주차에 0.3 x 105 TCID50의 SARS-CoV-2을 비강내로 공격접종했다. 3dpi에서, 폐 바이러스 부하는 샴-백신접종된 마우스(SARS-CoV-2 RNA의 (13.7 ± 7.5) x 108 카피)에서보다 LV::SFL 복강내-복강내 면역화된 마우스에서 상당히 낮았다(즉, 평균 ± SD(2.3 ± 3.2) x 108)(도 5C). 이러한 바이러스 부하 감소는 단일 LV::SFL 투여로 얻은 것과 유사했다(도 5C). 가장 중요하게는, 비강내 LV::SFL 표적 면역화 후, qRT-PCR 분석에 의해 확인된 바와 같이 바이러스 부하의 > 3 log10 감소가 관찰되었고 5마리의 마우스 중 2마리가 검출할 수 없는 폐 바이러스 부하를 가졌다. 항-SCoV-2 IgG는 실제로 부분적으로(LV::SFL 복강내-복강내) 또는 완전히(LV::SFL 복강내-비강내) 보호된 마우스의 정화된 폐 균질액에서 검출되었다. 대조적으로 항-SCoV-2 IgA는 완전히 보호된 LV::SFL 복강내-비강내 마우스에서만 검출 가능했다(도 5D). LV::SFL 복강내-복강내 대응물보다 LV::SFL 복강내-비강내의 정화된 폐 균질물에서 더 높은 중화 활성이 검출되었다(도 5E). 따라서, 전신 수준에서 IgG 이소형의 NAb 역가를 증가시켜도 SARS-CoV-2에 대한 보호가 개선되지 않았다. 그러나, 점막 비강내 표적 면역화는 바이러스의 숙주 유기체에 대한 진입점으로 면역 이펙터를 유인할 수 있는 잠재력을 갖고, SARS-CoV-2 복제 억제와 상관관계가 있는 국소 IgA Abs를 유도할 수 있었다.
COVID-19의 급성 폐 손상에서 선천성 면역 과잉 활성의 강력한 증거를 기반으로(Vabret 등, 2020), 본 발명자들은 감염되지 않은 대조군에서, 샴-백신접종 또는 LV::SFL 백신접종 마우스(SARS-CoV-2로 접종됨)에서 폐 선천성 면역 세포 하위 집합의 가능한 변형을 조사했다(도 6A). 3 dpi에서, 본 발명자들은 다양한 실험 그룹 중에서 호염구 또는 NK 세포 대 총 폐 CD45+ 세포의 비율에 차이가 없음을 확인했다(도 6B). 대조적으로, 본 발명자들은 폐 바이러스 부하가 가장 높은 샴-백신접종 마우스에서 전체 폐 CD45+ 세포에 대한 폐포 대식세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, Ly6C+ 또는 Ly6C- 단핵구/대식세포 또는 호중구의 증가된 비율을 확인했다. 이러한 관찰 결과는 이러한 마우스 모델에서 증가된 폐 SARS-CoV-2 부하가 여러 염증-관련 선천 면역 세포의 동원과 상관관계가 있으며 백신-매개 항바이러스 보호가 그러한 염증을 약화시키거나 방지한다는 것을 보여준다. 이는 총 폐 균질물로부터 추출된 RNA에 적용된 qRT-PCR에 의해 평가된 바와 같이 LV::SFL을 사용한 프라임-부스트/표적에 의해 백신접종된 마우스의 폐에서 감소된 사이토카인 및 케모카인 함량으로 확증되었다(도 6C). 따라서 부여된 보호는 SARS-CoV-2 감염과 관련된 폐 염증도 방지했다.
실시예 1.5: 골든 햄스터에서 SARS-CoV-2에 대한 LV::SFL의 보호 가능성의 평가
소위 골든 햄스터라고 불리는 근교종 메소크리세투스 아우라투스(Mesocricetus auratus)는 COVID-19 병리학 연구에 적합한 전임상 모델을 제공한다. 이러한 종의 ACE2 오르토로그는 SCoV-2와 효율적으로 상호 작용하여 숙주 세포 침습 및 바이러스 복제를 나타낸다(Sia 등, 2020). 따라서, 본 발명자들은 이러한 관련 모델에서 SARS-CoV-2 감염에 대한 LV::SFL 백신접종의 예방 효과를 조사했다. 통합적인 LV::SFL 외에도, 통합적인 LV 벡터는 대체로 안전하고 1상 임상 시험(2011-006260-52 EN)을 성공적으로 통과했지만, 본 발명자들은 또한 향후 임상 시험에 적용할 가능성이 있는 LV::SFL의 인테그라제 결핍 비통합 버전을 평가했다.
프라임-부스트/표적 요법에 따른 백신접종의 예방 효과를 평가하기 위해, 메소크리세투스 아우라투스 햄스터(n = 6/그룹)를 (i) 저용량(1 x 106 TU)의 통합적 LV::SFL로 복강내 프라임 접종하고 4주차에 3 x 107 TU의 통합적 LV::SFL로 비강내 부스트 접종하거나("int LV::SFL i.p. - i.n. Low"), (ii) 고용량(1 x 107 TU)의 통합적 LV::SFL로 복강내 프라임 접종하고 4주차에 3 x 107 TU의 통합적 LV::SFL로 비강내 부스트 접종하거나("int LV::SFL i.p. - i.n. High"), 또는 (iii) 1 x 108 TU의 비통합적 LV::SFL로 근육내 프라임 접종하고 4주차에 3 x 107 TU의 비통합적 LV::SFL로 비강내 부스트 접종하였다("non int LV::SFL i.m. - i.n.")(도 7A). 샴-백신접종 대조군은 복강내 및 비강내 경로를 통해 동일한 양의 빈 통합적 LV를 받았다. 유사한 SCoV-2-특이적 IgG 항체가 비강내 부스트 접종 전후에 다양한 백신접종 그룹의 햄스터 혈청에서 ELISA에 의해 검출되었다(도 7B). 사후 부스트/표적 혈청학은 모든 그룹에서 중화 활성을 검출했으며, 가장 높은 EC50 평균이 "int LV::SFL i.p. - i.n. High" 그룹에서 관찰되었다. 이러한 수준은 인간의 무증상, 소수 증상, 유증상 또는 건강한 COVID-19 접촉자에서 검출된 수준과 비슷했다(도 7C). 모든 햄스터는 5주차에 0.3 x 105 TCID50의 SARS-CoV-2로 비강내 공격접종하였다. 모든 LV::SFL 백신접종 그룹에서의 유의하지 않은 손실과 비교하여, 샴-백신접종 개체의 경우 4dpi에서 최대 16%의 체중 감소에 점진적으로 도달했다(도 7D). 2 dpi에서, 샴-백신접종 햄스터와 비교하여, 폐 바이러스 부하의 ~1.5-to-3 log10의 감소가 "int LV::SFL i.p. - i.n. Low", "int LV::SFL i.p. - i.n. High" 및 "non int LV::SFL i.m. - i.n." 그룹에서 관찰되었다(도 7E, 7F). 4dpi에서, 백신접종 그룹의 바이러스 부하 감소의 정도는 샴-백신접종 개체에 비해 여전히 더 높았고 >4 log10에 도달했다. 추가의 면역학적 및 조직병리학적 연구는 햄스터 모델에서 LV 백신접종에 의한 상당한 폐 보호를 확인시켜 주었다(도 8).
추가의 실험에서(도 9A), 본 발명자들은 하기의 사실을 확인했다: (i) NILV::SFL의 단일 근육내 주사는 높은 역가의 혈청 항-S Ab를 유도했고(도 9B), 폐에서 유의하지만 부분적인 수준의 보호를 시작했고(도 9C), (ii) 혈청 NAb 활성을 개선하지 않은(도 9D)의 NILV::SFL의 비강내 부스트 접종은 qRT-PCR을 기반으로 폐 바이러스 부하에 의해 확인된 바와 같이, SARS-CoV-2에 대한 상당히 개선된 보호를 유도했다(도 9C), 4 dpi에서, 샴-백신접종 및 공격접종된 햄스터에서, 실질적인 폐 병변, 심각한 실질 염증, 폐 실질의 통합, 세기관지 상피의 현저한 변경 및 세기관지 상피의 중등도 소실이 검출되었다(도 9E). 이들의 NILV::SFL-백신접종 대응물에서, 부스팅 여부에 관계없이, 폐 병변은 분명히 더 낮은 중증도였다(도 9E, 9F, 9G).
단일 비강내 NILV::S△F2P 투여에 의한 햄스터 모델의 멸균 보호
본 발명자들은 사이토메갈로바이러스 프로모터의 전사 조절하에 SCoV-2의 융합전(prefusion) 형태를 암호화하는 LV를 생성했다. 이러한 융합전 SCoV-2 변이체(S△F2P)는 S1/S2 서브유닛의 경계면에서, 다염기성 RRAR(서열번호 99) 푸린 절단 부위를 포함하는 675QTQTNSPRRAR685(서열번호 24) 서열의 결실을 갖고, heptad repeat 1과 중앙 나선 사이의 힌지 루프 내에서, S2에서 K986P 및 V987P 연속적 프롤린 치환을 포함한다(도 11).
또한, 본 발명자들은 햄스터 모델에서 NILV::S△F2P의 단일 비강내 투여에 의한 백신접종의 예방 효과를 평가했다.
햄스터(n = 6/그룹)에게 (i) 양성 보호 대조군으로서, 0주차에 1 x 108 TU의 NILV::S△F2P으로 근육내 프라임 접종하고 5주차에 동일 량의 벡터로 비강내 부스트 접종하거나, (ii) 0주차에 1 x 108 TU의 NILV::S△F2P의 단일 주사로 비강내 면역화하거나, 또는 (iii) 5주차에 면역화하였다(도 12A). 샴-백신접종 대조군은 0주 및 5주에 비강내 경로를 통해 동일한 양의 빈 NILV를 받았다. 항-SCoV-2 IgG Ab의 유사하고 높은 역가가 5주에 처음 두 그룹의 혈청에서 검출되었다(도 12B). 7주째에, 혈청 Ab 역가는 NILV::S△F2P i.m.-i.n 그룹에서 높게 유지되었는데, "NILV::S△F2P i.n. wk 0" 그룹의 몇몇 개체에서는 약간 감소했다. 이 시점에서, "NILV::S△F2P i.n. wk 5" 그룹에서 더 낮은 혈청 Ab 역가가 검출되었다(도 12B). 바이러스 중화 활성은 다른 2개의 백신접종된 그룹과 비교하여 "NILV::S△F2P i.n. wk 5" 햄스터의 혈청에서 상당히 낮았지만, 이들 개체는 이들의 폐 균질물에서 동등한 중화 능력을 가졌다(도 12C).
7주차에, 모든 동물에게 0.3 x 105 TCID50의 SARS-CoV-2를 비강내로 공격접종했다. 접종후(dpi) 4일에, NILV::S△F2P-백신접종 그룹에서는 단지 2-3%의 체중 감소가 검출된 반면, 샴-백신접종 햄스터에서는 12%의체중 감소가 검출되었다(도 12D). 이 시점에서, SARS-CoV-2 외피(ECoV-2) RNA를 검출하는 qRT-PCR에 의해 확인된 바와 같이, 샴-백신접종 그룹과 비교하여 근육내-비강내 또는 단일 비강내 그룹의 NILV::S△F2P 백신접종 개체에서 ~2 내지 -3 log10 감소가 관찰되었다(도 12E).
활성 바이러스 복제의 지표인 서브게놈 ECoV-2 RNA(Esg)를 검출하는 qRT-PCR에 의한 폐 바이러스 부하 평가 결과(Chandrashekar 등, 2020; Tostanoski 등, 2020; Wolfel 등, 2020), 샴-백신접종 그룹에서 SARS-CoV-2/폐의 Esg RNA의 (1.24 ± 0.99) x 109 카피의 평균 ± SD에 비해 3개의 백신접종 그룹에서 복제 바이러스의 부재가 확인되었다(도 12E).
4dpi에서, 전체 폐 균질액에서 qRT-PCR로 평가한 바와 같이, 면역화 용법에 상관없이, 즉, 0주 또는 5주에 제공되는 근육내-비강내 프라임-부스트 또는 단일 비강내 주사에 상관없이, 샴-백신접종 대응물에 비해 NILV::S△F2P 백신접종 햄스터에서 실질적으로 감소된 염증이 관찰되었다(도 13A). 조직병리학적 폐 분석 결과, NILV::S△F2P-면역화 햄스터에서는 폐 병변이 드물거나 검출할 수 없었던 반면, 샴-백신접종 대조군에서는 상당한 실질 침윤 및 경화, 세기관지 상피의 현저한 변화 및 소실이 검출된 것으로 확인되었다(도 13B, 13C).
이러한 데이터로부터, NILV::S△F2P의 단일 비강내 투여는 전신 프라임 및 비강내 부스트 요법 만큼이나 보호적이었고, SARS-CoV-2에 대한 멸균 폐 면역을 부여했고, 민감한 햄스터 모델에서 폐 염증 및 병원성 조직 손상을 쉽게 예방한 것으로 확인되었다.
종합하면, 바이러스학적, 면역학적 및 예상되는 조직병리학적 데이터(후자는 진행 중)의 완전한 세트를 기반으로, LV::SFL 벡터는 2개의 관련 동물 모델에서 특히 점막 비강내 투여시 SARS-CoV-2 감염에 대한 실질적인 보호 수준과 상관관계가 있는 SCoV-2-특이적 nAbs 및 T 세포 반응을 유도한다.
실시예 1.6: 고찰
SARS-CoV-2 감염을 통제하기 위해서는 예방 전략이 필요하다. SARS-CoV-2 감염은 대유행이 발생한 지 6개월이 지났지만 여전히 둔화될 기미 없이 기하급수적으로 계속 확산되고 있다. 이제 붉은털원숭이의 SARS-CoV-2 1차 감염이 재노출에 대한 보호 면역으로 이어진다는 것이 입증되었다(Chandrashekar 등, 2020). 네이키드 DNA(Yu 등, 2020) 또는 mRNA, 재조합 단백질, 아데노바이러스 Ad5 벡터(Zhu 등, 2020)를 포함한 복제 또는 비복제 바이러스 벡터, 또는 명반 아주반트 비활성화 바이러스(Gao 등, 2020)에 기반한 다수의 백신 후보물이 코로나19 예방을 위해 활발한 개발 중에 있다. SCoV-2 항원을 암호화하는 유전자를 전달하기 위해 LV 벡터를 선택하는 본 발명의 면역학적 근거는 이러한 면역화 플랫폼에 의해 유도된 체액 및 세포 매개 면역의 장수(longevity) 및 복합 특성뿐만 아니라 인 시튜에서(in situ) 이종 유전자 발현의 효능에 대해 얻은 통찰력을 기반으로 한다. LV의 고유한 기능은 증식 및 휴지기 세포를 형질도입하는 능력(Esslinger 등, 2002; He 등, 2005)이며, 이에 따라 LV는 강력한 백신접종 전략으로 이용되어(Beignon 등, 2009; Buffa 등, 2006); Coutant 등, 2012; Gallinaro 등, 2018; Iglesias 등, 2006) 강력하고 오래 지속되는 적응 반응을 유발한다. 특히, 많은 다른 바이러스 벡터와 대조적으로, LV 벡터는 인간이 거의 노출되지 않는 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 외피와의 슈도타이핑과 관련이 있는, 집단에서의 기존 면역을 겪지 않는다. 본 발명자들은 최근에 Zika 외피를 발현하는 LV의 단일 주사가 Zika 감염으로부터 신속하고 지속적인 보호를 제공한다는 것을 입증했다(Ku 등, 2020). 또한, 본 발명자들에 의한 LV와 금 본위 Ad5 면역화 벡터의 최근의 포괄적인 체계적 비교 결과, 마우스 모델에서 다기능 및 중앙 기억 T 세포를 유도하는 LV의 우수한 능력 및 외계 교배 쥐에서 더 강한 면역원성을 확인했고(Ku 등, 2021(PMID: 33357418), 이는 백신 적용을 위한 LV의 크게 적합한 특성을 강조한다.
본 발명자들은 S의 변이체들, 즉 전장의 막 고정(LV::SFL), 막관통 및 C-말단 짧은 내부 꼬리가 없는 S1-S2 엑토-도메인(LV ::S1-S2), 또는 S1 단독(LV::S1) 중 하나를 암호화하는 LV의 효능을 평가했다. 이러한 각각의 LV의 단일 투여가 높은 항-SCoV-2 Ab 역가를 유도할 수 있었지만, LV::SFL만이 고기능성 nAbs를 유도할 수 있었다. LV 기반 백신의 이러한 단일 주사는 중화 활성을 유도했으며, 이러한 활성은 평균적으로 가벼운 증상을 나타내는 SARS-CoV-2 환자 코호트에서 발견된 것과 비슷했다. 이러한 확인은 LV::SFL 벡터에 의해 유도된 체액 반응의 보호 가능성을 예측했다. 동시에, S-특이적 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응은 단일 LV::SFL 주입 후 빠르면 2주 만에 마우스의 비장에서 관찰되었으며, C57BL/6(H-2b) 마우스에서 확인한 수많은 MHC-I- 또는 -II-제한 면역원성 영역에 대하여 검출될 수 있었다.
실험용 마우스가 SARS-CoV-2 복제를 허용하지 않는 것 및 현재 유럽에서 hACE2 형질전환 마우스를 사용할 수 없는 것과 관련하여, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 접종 전 비강내 Ad5::hACE2 전처리에 의해 호흡기에서 hACE2 발현이 유도되는 생체내 감염 뮤린 모델을 설정했다. 이러한 접근법은 마우스가 폐에서 SARS-CoV-2 복제를 대체로 허용하도록 하고 이러한 바이러스에 대한 백신 또는 약물 효능의 평가를 가능하게 한다. 또한, 이러한 방법은 MERS-CoV에 의한 마우스 감염의 연구를 위한 인간 DPP4의 발현을 확립하는데 성공적으로 사용되었다(Zhao 등, 2014). Ad5::hACE2 모델이 생리학적 ACE2 발현 프로파일을 완전히 모방하지 못하여 SARS-CoV-2 감염의 병태생리학의 모든 측면을 반영하지 않을 수 있지만, SARS-CoV-2 복제에 대한 항바이러스 약물, 백신 후보, 다양한 돌연변이 또는 유전적 배경의 효과를 생체내에서 평가하기 위한 적절한 모델을 제공한다. 저용량의 Ad5::hACE2/마우스를 사용하면, 점적 후 4일째에 특정 CD45+ 세포 동원이 검출되지 않으므로, SARS-CoV-2 접종 전에 Ad5 관련 염증이 없음을 알 수 있다.
SARS-CoV-2 복제율이 높은 형질도입 마우스 모델에서, 바이러스 접종 6주 전에 1 x 107 TU의 LV::SFL의 단일 복강내 투여에 의한 백신접종은 ~1 log10까지 바이러스 복제를 억제하기에 충분했다. 전신 경로를 통한 추가 부스트 접종은 단일 투여와 비교할 때 개선된 보호율을 제공하지 못했다. 그러나, 전신 경로에 의한 프라이밍 접종과 점막 경로를 통한 부스트 접종은 바이러스 복제를 효율적으로 억제하고 폐 염증을 회피했다. 이러한 보호는 항-SCoV-2 IgG의 높은 역가 및 혈청에서의 강력한 중화 활성과 상관관계가 있었다. 또한, ELISPOT에 의해 평가된 후 겹치는 15-mer 펩티드의 풀로 비장 세포를 자극한 바와 같이, S-특이적 T-세포 반응이 LV::SFL-면역화 마우스의 비장에서 검출되었다. SARS-CoV-2에 대한 질병 중증도 또는 보호에 기여하는 면역학적 경로를 확인하기 위해서는 적절한 KO 마우스에 대한 훨씬 더 장기적인 실험 또는 입양(adoptive) 면역 세포 전달 접근법에 필요하다. LV 기반 백신 후보에 의해 매우 효과적으로 유도된 nAb 및 세포 매개 면역은 감염 및 바이러스 복제를 억제하기 위해 시너지 효과를 낸다.
점막 염증 및 폐 조직 손상의 급격한 감소와 함께 SARS-CoV-2 감염에 대한 상당한 수준의 보호가 통합 또는 비통합 LV::SFL을 사용한 프라임-부스트/표적 요법에 따라 면역화된 Mesocricetus auratus 골든 햄스터에서 관찰되었다. 이러한 매우 민감한 종에서 보호 결과의 확인은 향후 임상 시험에 도입하기 위해 특히 비통합 변이체 상태에서 LV::SFL 백신 후보를 더욱 선호한다.
숙주 세포로의 코로나바이러스 진입의 Ab-의존적 강화(ADE)는 코로나바이러스에 대한 백신 접종에 장애물이 될 수 있는 메커니즘으로 유발되었다. 짧은꼬리원숭이에 DNA(Yu 등, 2020) 또는 비활성화 SARS-CoV-2 바이러스(Gao 등, 2020) 백신을 접종하면, 면역병리학적 악화가 관찰되지 않았지만 배제될 수는 없었다. 이러한 가설을 배제하기 위해서는 Ab 역가가 감소한 후에도 장기간 관찰이 필요할 수 있다. MERS-CoV의 경우, 바이러스 수용체 인간 DPP4를 모방하고 SMERS의 구조적 재배열을 유도함으로써 하나의 특정 RBD-특이적 중화 단일클론 Ab(Mersmab1)가 숙주 세포내로 MERS-CoV의 시험관내 ADE를 매개할 수 있다는 것이 보고되었다(Wan 등, 2020). 본 발명자들은 백신에 의해 유도된 다클론 반응을 대표할 수 없는 단클론 Ab의 단일 특성과 파라토프 레퍼토리 복잡성을 가진 다클론 Ab 반응을 비교하는 것은 어렵다고 생각한다. 또한, 동일한 팀의 매우 모순적인 결과는 Mersmab1의 인간화 버전을 사용한 단일 용량 치료가 치명적인 MERS 공격접종으로부터 인간 형질전환 마우스 모델을 완전히 보호할 수 있다고 보고했다(Qiu 등, 2016). 따라서, 몇몇 조건에서 시험관내에서 세포 숙주 침입을 촉진할 수 있는 Ab를 사용하더라도, 생체내 감염의 악화가 없을 뿐만 아니라 현저한 보호가 있다. 실제로, Ab가 생체 내에서 ADE를 유발할 수 있음을 확인하기 위해서는, 대규모 B 세포 융합에 의해 그러한 Ab의 생성 확률을 추정하는 것이 필요하다.
예방 백신접종은 전염병, 특히 신종 코로나바이러스에 대한 가장 비용 효과적이고 효율적인 전략이다. 본 발명의 결과는 백신접종의 점막 경로를 통해 사용되는 SARS-CoV-2의 SFL 단백질을 암호화하는 LV 벡터가 COVID-19에 대한 유망한 백신 후보임을 나타내는 강력한 증거를 제공한다.
SARS-CoV-2 바이러스 부하 측정을 위한 프라이머 및 프로브의 서열
프라이머/프로브 명칭 및 서열번호 DNA 서열
"E-Sarbeco" Fw - 서열번호 34 5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3'
"E-Sarbeco" Rv - 서열번호 35 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3'
"E-Sarbeco" 프로브 - 서열번호 36 5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ-1-3'
qRT-PCR에 의해 마우스 사이토카인 및 케모카인을 정량화하는데 사용되는 프라이머의 서열
유전자 및 서열번호 서열
β-글로빈 - 서열번호37 F　: 5'- ATGGGAAGCCGAACATACTG -3'
- 서열번호 38 R　: 5'- CAGTCTCAGTGGGGGTGAAT -3'
GAPDH - 서열번호 39 F　: 5'- TTCACCACCATGGAGAAGGC -3'
- 서열번호 40 R　: 5'- GGCATGGACTGTGGTCATGA -3'
IFNα - 서열번호 41 F　: 5'- GGATGTGACCTTCCTCAGACTC -3'
- 서열번호 42 R　: 5'- ACCTTCTCCTGCGGGAATCCAA -3'
IFNγ - 서열번호 43 F　: 5'- TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA -3'
- 서열번호 44 R　: 5'- TGGCTCTGCAGGATTTTCATG -3'
TNFα - 서열번호 45 F　: 5'- CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA -3'
- 서열번호 46 R　: 5'- TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC -3'
TGFβ - 서열번호 47 F　: 5'- TGACGTCACTGGAGTTGTACGG -3'
- 서열번호 48 R　: 5'- GGTTCATGTCATGGATGGTGC -3'
IL1β - 서열번호 49 F　: 5'- TGGACCTTCCAGGATGAGGACA -3'
- 서열번호 50 R　: 5'- GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG -3'
IL2 - 서열번호 51 F　: 5'- CCTGAGCAGGATGGAGAATTACA -3'
- 서열번호 52 R　: 5'- TCCAGAACATGCCGCAGAG -3'
IL4 - 서열번호 53 F　: 5'- CGAGGTCACAGGAGAAGGGA -3'
- 서열번호 54 R　: 5'- AAGCCCTACAGACGAGCTCACT -3'
IL5 - 서열번호 55 F　: 5'- GATGAGGCTTCCTGTCCCTACT -3'
- 서열번호 56 R　: 5'- TGACAGGTTTTGGAATAGCATTTCC -3'
IL6 - 서열번호 57 F　: 5'- CTGCAAGTGCATCATCGTTGTTC -3'
- 서열번호 58 R　: 5'- TACCACTTCACAAGTCGGAGGC -3'
IL10 - 서열번호 59 F　: 5'- GGTTGCCAAGCCTTATCGGA -3'
- 서열번호 60 R　: 5'- ACCTGCTCCACTGCCTTGCT -3'
IL12p40 - 서열번호 61 F　: 5'- GGAAGCACGGCAGCAGAATA -3'
- 서열번호 62 R　: 5'- AACTTGAGGGAGAAGTAGGAATGG -3'
IL17A - 서열번호 63 F　: 5'- GAAGCTCAGTGCCGCCA -3'
- 서열번호 64 R　: 5'- TTCATGTGGTGGTCCAGCTTT -3'
IL18 - 서열번호 65 F　: 5'- GACAGCCTGTGTTCGAGGATATG -3'
- 서열번호 66 R　: 5'- TGTTCTTACAGGAGAGGGTAGAC -3'
IL33 - 서열번호 67 F　: 5'- CTACTGCATGAGACTCCGTTCTG -3'
- 서열번호 68 R　: 5'- AGAATCCCGTGGATAGGCAGAG -3'
CCL2 - 서열번호 69 F　: 5'- AGGTCCCTGTCATGCTTCTG -3'
- 서열번호 70 R　: 5'- TCTGGACCCATTCCTTCTTG -3'
CCL3 - 서열번호 71 F　: 5'- CCTCTGTCACCTGCTCAACA -3'
- 서열번호 72 R　: 5'- GATGAATTGGCGTGGAATCT -3'
CCL5 - 서열번호 73 F　: 5'- GTGCCCACGTCAAGGAGTAT -3'
- 서열번호 74 R　: 5'- GGGAAGCGTATACAGGGTCA -3'
CXCL5 - 서열번호 75 F　: 5'- GCATTTCTGTTGCTGTTCACGCTG -3'
- ID No.76 R　: 5'- CCTCCTTCTGGTTTTTCAGTTTAGC -3'
CXCL9 - 서열번호 77 F　: 5'- AAAATTTCATCACGCCCTTG -3'
- 서열번호 78 R　: 5'- TCTCCAGCTTGGTGAGGTCT -3'
CXCL10 - 서열번호 79 F　: 5'- GGATGGCTGTCCTAGCTCTG -3'
- 서열번호 80 R　: 5'- ATAACCCCTTGG GAAGATGG -3'
실시예 2: 인간 ACE2 유전자를 보유하는 형질전환 마우스의 생성
현재까지 별개의 전사 및 발현 제어 서열 하에서 hACE2 유전자를 발현하는 다양한 계통의 여러 형질전환(Tg) 마우스가 제공되었으며, 이들 중 일부는 2003년 SARS-CoV 전염병이 출현했을 때 발생한 요구를 충족시키기 위해 수행된 개발에서 비롯되었다. 이러한 이전에 개발된 Tg 마우스 및 추가 모델은 SARS-CoV의 병인에 대한 연구 및 이해를 위해 평가되었으며 바이러스 복제 및 때로는 어느 정도의 질병 증상 또는 임상 질환에 대해 허용되는 것으로 확인되었지만, SARS-CoV-2를 접종한 Tg 마우스에서 관찰된 다양한 임상 프로필은 아직 감염 결과의 모든 측면을 재현하는데 적합하다고 입증되지 않았으며, 특히 인간 환자에서 관찰된 바이러스 확산, 특히 기도와 폐를 넘어서 뇌로의 확산을 충분히 나타내지 않았다. 또한 사용 가능한 Tg 마우스는 인간 환자에서 관찰되는 증상을 재현하는 모든 일관된 질병 증상을 나타내지 않았다.
B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스 변종은 이전에 JAX 연구소(Jackson Laboratories사, Bar Harbor, ME)에 기탁되었다. 그러나, 본 발명에 따라 본 발명자들이 생성한 새로운 B6.K18-hACE2IP-THV 형질전환 마우스는 SARS-CoV-2 비강내(i.n.) 접종 후 확인된 독특한 특성을 나타낸다. 실제로, SARS-CoV-2 복제 및 말초 기관에의 바이러스 전파에 대한 폐의 큰 허용성 외에도, B6.K18-hACE2IP-THV 마우스는 놀랍게도 뇌에서 상당한 바이러스 복제를 허용하는데, 이는 이전에 이용가능한 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 변종에서 관찰된 복제 범위보다 약 4 log10 더 높다(McCray 등, 2007). 이러한 새로운 마우스 모델은 COVID-19 백신 또는 COVID-19 치료 효능 연구에 광범위하게 적용될 뿐만 아니라 COVID-19 면역/신경 생리 병리학을 설명하기 위한 실험 모델을 제공한다. SARS-CoV-2의 신경친화성이 입증되었으며 일부 COVID-19 인간 환자는 두통, 혼란, 무감각증, 미각 이상, 메스꺼움 및 구토와 같은 증상을 나타낸다(Bourgonje 등, 2020). 또한, 후각 경점막 SARS-CoV-2 침입은 최근에 COVID-19에 걸린 인간 개인에서의 중추신경계 진입 포트로 설명되었다(https://doi.org/10.1038/s41593-020-00758-5). 코로나바이러스는 중추 신경계를 감염시킬 수 있기 때문에(Bergmann 등, 2006), B6.K18-hACE2IP-THV 소형 설치류 실험 모델은 다음과 같은 주요 관심사에 대한 귀중한 전임상 또는 공동 임상 동물 모델을 나타낸다: (i) 뇌의 면역 보호의 조사 및 (ii) COVID-19 유래 신경 병리학의 탐구.
1. 인간 케라틴 18 프로모터의 제작
인간 K18 프로모터(GenBank: AF179904.1 뉴클레오티드 90 내지 2579)는 이전에 기술된 바와 같이(Chow 등, 1997; Koehler 등, 2000), A549 세포 용해물로부터 네스티드(nested) PCR에 의해 증폭하였다. "i6x7" 인트론(GenBank: AF179904.1 뉴클레오티드 2988에서 3740)은 Genscript에 의해 합성하였다. 이전에 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 균주를 생성하는데 사용된 "K18i6x7PA" 프로모터는 K18 프로모터, hACE2 유전자의 5'에서 "i6x7" 인트론 및 3'에서 인핸서/폴리A 서열 (PA)를 포함한다. 여기에서 사용된 K18 IP-ThV 프로모터는 PA 대신 hACE2 유전자의 3'에서 더 강력한 야생형 Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)를 포함한다. polyA 서열을 포함하는 3' 조절 영역을 포함하는 K18i6x7PA 작제물과 달리, K18IP-ThV 작제물은 형질전환에 사용되는 pFLAP LV 플라스미드의 3' LTR(Long Terminal Repeats) 내에 이미 존재하는 polyA 서열의 이점을 취한다. i6x7 인트론 부분은 컨센서스 5' 스플라이싱 공여 및 3' 공여 부위 서열을 도입하도록 변형하였다. AAGGGG(서열번호 97) 공여 부위는 AAGTGG(서열번호 95) 컨센서스 부위에 대해 추가로 변형하였다. 컨센서스 서열 로고(Dogan 등, 2007)에 기초하여, 최초 서열 GenBank AF179904.1의 스플라이싱 수용 부위(TACAATCCCTC(서열번호 82) 및 K18JAX의 TTTTTTTTTTT(서열번호 83) 앞의 폴리피리미딘 트랙트는 형질도입 동안 역전사 단계와의 비호환성을 제한하기 위해 CTTTTTCCTTCC(서열번호 96)로 대체하였다. 더욱이, 최초 스플라이싱 수용 부위 CAGAT는 컨센서스 서열 CAGGT(서열번호 84)에 상응하도록 변형하였다. 제작 설비로서, 프로모터와 인트론 사이에 ClaI 제한 부위를 도입하였다. 작제물을 MluI 및 BamHI 부위 사이의 pFLAP 플라스미드에 삽입하였다. 제한/라이게이션에 의해 hACE2 cDNA를 BamHI 및 XhoI 부위 사이에 도입하였다. 통합적 LV::K18-hACE2IP-THV는 다른 곳(Sayes 등, 2018)에 기재된 바와 같이 생성되었고 4℃에서 1시간 동안 22,000rpm에서 2 사이클의 초원심분리에 의해 농축하였다.
2. 형질전환(Transgenesis)
높은 역가(8.32 x 109 TU/ml)의 통합 LV::K18-hACE2IP-THV를 수정란의 투명 영역에 미세 주입하고 이를 유사 임신 B6CBAF1 암컷(Charles Rivers)에 이식했다. N0 마우스를 꼬리 생검에서 준비한 게놈 DNA에 적용된 PCR에서 hACE2-정방향: 5'-TCC TAA CCA GCC CCC TGT T-3'(서열번호 85) 및 hACE2-역방향: 5'-TGA CAA TGC CAA CCA CTA TCA CT-3'(서열번호 86) 프라이머를 사용하여 게놈당 hACE2 유전자의 통합 및 복제수에 대해 조사하였다. 자손의 안정화를 위해, 이식유전자 양성 수컷을 WT C57BL/6 암컷(Charles Rivers)과 교배시켰다. 통합 LV::K18-hACE2IP-THV의 수정란 핵으로의 미세 주입에 의한 이식유전자 전달이 특히 효율적이었다. N0 세대에서, 획득된 마우스의 약 11%, 즉 139마리 중 15마리는 게놈당 적어도 하나의 이식유전자 카피를 가졌다. 이식유전자를 보유한 8마리의 N0 수컷을 암컷 C57BL/6 WT 마우스(Janvier, Le Genest Saint Isle, 프랑스)와 교배시켰다. N1 세대에서 얻은 마우스의 약 62%, 즉 147마리 중 91마리는 게놈당 적어도 하나의 이식유전자 카피를 가지고 있었다. 이식유전자를 보유하고 있는 10마리의 N1 수컷을 암컷 C57BL/6 WT 마우스와 추가로 교배시켰다.
면역화 기간 동안 암컷 또는 수컷 형질전환 마우스를 특정 병원균이 없는 조건 하에서 개별적으로 환기되는 케이지에 수용하였다. 마우스는 파스퇴르 연구소 동물 시설에서 SARS-CoV-2 접종을 위해 격리 장치의 개별적으로 여과된 케이지로 옮겼다. 이전 i.n. 비강내 주입전, 마우스를 케타민(Imalgene, 80 mg/kg) 및 실라진(Rompun, 5 mg/kg)의 복강내 주사를 통해 마취시켰다.
3. 게노타이핑 및 형질전환 마우스에서 hACE2 유전자 카피 수/게놈의 정량화
형질전환 마우스의 게놈 DNA(gDNA)는 페놀-클로로포름 추출에 의해 꼬리 생검으로부터 준비하였다. 60ng의 gDNA를 하기 표 3에 나열된 특정 프라이머를 사용하여 SyBr Green을 사용한 qPCR의 주형으로 사용했다. 동일한 주형을 사용하여 유사한 반응 플레이트에서 마우스 PKD1(다낭성 신장 질환 1) 및 GAPDH를 또한 정량화했다. 모든 샘플은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초 및 60℃에서 30초의 40 사이클 동안 10 μl 반응을 4회 실시하였다. 이식유전자 카피 수를 계산하기 위해, PKD1을 캘리브레이터로 사용하고 GAPDH를 내인성 컨트롤로 사용하여 2-△△Ct 방법을 적용했다. 2-△△Ct는 PKD1 유전자에 대한 hACE2 유전자의 복제 수의 변화 배수를 제공한다.
B6.K18-hACE2IP-THV 형질전환 마우스를 게노타이핑하기 위해 사용된 프라이머의 서열.
프라이머 및 서열번호
hACE2 Fw - 서열번호 85 TCCTAACCAGCCCCCTGTT
hACE2 Rv- 서열번호 86 TGACAATGCCAACCA CTATCACT
PKD1 Fw- 서열번호 87 GGCTGCTGAGCGTCTGGTA
PKD1 Rv- 서열번호 88 CCAGGTCCTGCGTGTCTGA
GAPDH-ACE2 Fw- 서열번호 89 GCCCAGAACATCATCCCTGC
GAPDH-ACE2 Rv- 서열번호 90 CCGTTCAGCTCTGGGATGACC
4. SARS-CoV-2 복제에 대한 K18-hACE2 IP-THV 허용성
SARS-CoV-2 복제에 대한 N1 마우스의 허용성(permissibility)은 자손의 표본 개체에서 평가하였다. 게놈당 다양한 수의 이식유전자 카피를 가진 N1 암컷을 샘플링하고(도 14A) SARS-CoV-2 복제에 대한 그의 허용성을 평가했다(도 14B). 이를 위하여, 선정된 마우스에 전신 마취 하에, 파스퇴르 연구소(프랑스 파리) 산하 국립 호흡기 바이러스 기준 센터(National Reference Centre for Respiratory Viruses)에 의해 공급된 0.3 x 105 TCID50의BetaCoV/France/IDF0372/2020 SARS-CoV-2 임상 분리주(Lescure 등, 2020)를 비강내 접종했다. 마우스용 바이러스 접종물은 20 ㎕로 함유되었다. 그런 다음 동물을 파스퇴르 연구소의 BioSafety Level 3 동물 시설의 격리 장치에 보관했다.
살아있는 SARS-CoV-2에 감염된 동물에서 회수한 장기는 이러한 시설의 승인된 표준 조작 절차에 따라 조작되었다.
접종후(dpi) 3일에서 폐 바이러스 부하의 평균 ± SD는 허용(permissive) 마우스에서 마우스당 SARS-CoV-2 RNA의 (3.3 ± 1.6) x 1010 카피만큼 높았다(도 14B). 게놈당 이식유전자 카피 수(도 14A)는 폐에서 SARS-CoV-2 복제율에 비례하지 않았으며(도 14B) 따라서 이러한 표현형에 영향을 미치지 않았다. 폐 바이러스 부하량은 백신 효능 분석을 가능하게 하는 적합한 모델로 이전에 설명된 hCAE2(Ad5::hACE2)를 암호화하는 아데노바이러스 벡터 혈청형 5로 비강내 전처리한 양성 대조군 마우스에서 검출된 것보다 더 높았다. 놀랍게도, 마우스당 SARS-CoV-2 RNA의 상당한 바이러스 부하, 즉 (5.7 ± 7.1) x 1010 카피가 허용 마우스의 뇌에서도 검출되었다(도 14B). 또한, 바이러스 전파는 바이러스 접종 후 이 시점에서 심장과 신장에서도 비록 정도는 덜하지만 관찰되었다.
5. SARS-CoV-2 복제에 대한 허용성의 측면에서 B6.K18-ACE2 2Prlmn/JAX 및 K18-hACE2 IP-THV 변종의 비교
본 발명자들은 폐 및 뇌에서 SARS-CoV-2 복제와 B6.K18-hACE2IP-THV 및 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스에서 다양한 장기로의 전파를 비교 평가했다(도 14C). 폐 바이러스 부하는 K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스에서는 마우스당 SARS-CoV-2 RNA의 (18.3 ± 13.3) x 1010인 반면 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스에서는 마우스당 (2.1 ± 2.2) x 1010 카피로 더 낮았다. 그러나, B6.K18-hACE2IP-THV 마우스의 뇌에서 바이러스 복제, 즉 마우스당 (7.4 ± 7.9) x 1010 카피수는 그들의 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 대응물의 (1.9 ± 74.3) x 108 카피수에 비해 상당히 높았다. 서브게놈 ECoV-2 mRNA(Esg)에 특이적인 qRT-PCR에 의한 뇌 바이러스 부하 측정 결과, B6.K18-hACE2IP-THV 마우스에서는 SARS-CoV-2 RNA의 (7.55 ± 7.74) x 109 카피의 평균 ± 표준 편차를 검출하였고 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스의 경우 5마리 중 4마리에서 바이러스 복제가 없었다. 서브게놈 ECoV-2 mRNA(Esg)에 특이적인 qRT-PCR에 의한 바이러스 부하의 측정은 복제/감염성 SARS-CoV-2 바이러스 입자만을 특성규명한다는 점에 유의한다. 따라서, 높은 SARS-CoV-2 복제율과 뇌의 높은 감염성 바이러스 입자 부하가 새로운 B6.K18-hACE2IP-THV 변종의 주요한 특징적인 표현형이다. 뇌에서 qRT-PCR에 의해 수행된 hACE2 mRNA 발현의 비교는 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스와 비교하여 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스의 뇌에서 훨씬 더 높은 양의 이식유전자 발현을 보여주었다(도 14C). 형질전환 변종에서 자궁경부 SARS-CoV-2 복제 사이의 이러한 실질적인 차이는 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스의 뇌에서 상당히 더 높은 hACE2 mRNA 발현으로 확증되었다(도 14D). 그러나, B6.K18-hACE2IP-THV 마우스의 폐에서 hACE2 mRNA 발현은 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스에서보다 높았으며, 이는 전자에서 더 낮은 바이러스 복제를 설명할 수 없다. B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스와 비교하여 B6.K18-hACE2IP-ThV의 신장 및 심장에서 더 높은 바이러스 부하 경향이 또한 관찰되었지만, 그 차이가 통계적 유의성에 도달하지 않았다(도 14C). B6.K18-hACE2IP-ThV의 신장과 심장에서 더 높은 바이러스 부하 경향이 관찰되었지만, 그 차이는 통계적 유의성에 도달하지 않았다.
뇌 바이러스 부하와 관련하여, 3dpi에서 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스와 비교하여 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스의 뇌에서 qRT-PCR에 의해 훨씬 더 높은 염증이 검출되었으며, 이는 후자의 경우가 아니라 전자의 경우의 중추 신경계에서 면역/염증 증상을 나타낸다(도 14C). 폐 바이러스 부하와 일치하게, 총 폐 균질물에 적용된 qRT-PCR에 의해 평가된 바와 같이, B6.K18-hACE2IP-THV 마우스는 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스보다 폐 염증이 더 적었다(도 14E). 놀랍게도, 총 뇌 균질액에 적용된 이 분석은 B6.K18-hACE2IP-THV에서 상당한 수준의 염증을 검출했지만 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스에서는 그렇지 않았다(도 14E). 또한, B6.K18-hACE2IP-THV 마우스는 3 내지 4dpi 사이에서 인도적 종점에 도달했으며 따라서 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 대응 마우스보다 더 빠르게 치명적인 SARS-CoV-2 매개 질병을 나타낸다{Winkler, 2020 # 102}.
따라서 폐와 CNS 모두에서 SARS-CoV-2 복제에 대한 큰 허용성, 현저한 뇌 염증 및 급속한 치명적인 질병은 이러한 새로운 B6.K18-hACE2IP-THV 형질전환 모델의 주요 특징이다.
동물 연구의 윤리적 승인
모든 실시예에서, 마우스 및 햄스터에 대한 실험은 지역 윤리 위원회(CETEA #DAP20007, CETEA #DAP200058)와 고등 교육 연구부 APAFIS#24627-2020031117362508 v1에서 전달한 프로토콜 동의에 따라, 파스퇴르 연구소 안전성(Institut Pasteur Safety)의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인 후 유럽 및 프랑스 지침(Directive 86/609/CEE 및 1987년 10월 19일 법령 87-848)에 따라 수행되었다.
실시예 3: 비강내 렌티벡터 백신접종에 의한 SARS-CoV-2에 대한 전체 CNS 및 폐 예방
여기에서, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 복제에 대한 뇌의 전례 없는 허용성을 가진 새로운 hACE2 형질전환 마우스 변종을 생성했다. 이러한 독특한 전임상 동물 모델을 사용하여 본 발명자들은 SARS-CoV-2로부터 폐뿐만 아니라 CNS를 완전히 보호하기 위해 이러한 LV 기반 백신 후보를 이용한 비강 내 부스터 면역화의 중요성을 입증했다. 본 발명의 결과는 비세포 변성 및 비염증 LV를 사용한 비강내 백신접종 단계는 COVID-19의 영향을 받는 주요 해부학적 부위에서 멸균 면역을 유도하는 성능 있고 안전한 전략이라는 것을 나타낸다.
방법
LV::S △F2P 의 제작 및 생성
코돈 최적화된 S△F2P 서열(1-1262)(서열번호 14)을 MK-RQ_S-2019-nCoV로부터 증폭하였고 천연 인간 ieCMV 프로모터와 돌연변이된 WPRE(Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element) 서열 사이에 BamHI와 XhoI 사이트 사이의 제한/라이게이션에 의해 pFlap에 삽입하였다. WPRE의 atg 개시 코돈은 안전성 문제를 위해 Woodchuck 간염 바이러스의 다운스트림 절단된 "X" 단백질의 전사를 피하기 위해 돌연변이(mWPRE)시켰다(도 17). 플라스미드를 증폭하고 실시예 1에 이미 기재된 바와 같이 LV를 생산하는데 사용하였다.
마우스
형질전환 마우스는 실시예 2에 상세히 개시된 바와 같이 생성하였다.
체액 및 T 세포 면역, 염증
최근 다른 곳(Ku 등, 2021)에서 자세히 설명한 바와 같이, T-비장세포 반응을 IFN-g ELISPOT으로 정량화하였고 항-S IgG 또는 IgA Ab는 재조합 안정화 SCoV-2를 사용하여 ELISA로 검출하였다. NAb 정량은 최근에 기술된 바와 같이(Anna 등, 2020; Sterlin 등, 2020), SCoV-2 슈도타이핑된 LV를 사용하여 수행하였다. 햄스터 및 마우스의 폐 및 뇌에서 염증 매개체의 qRT-PCR 정량화는 실시예 1에 상세히 기술된 바와 같이, TRIzol 시약에 의해 추출된 전체 RNA에서 수행하였다.
SARS-CoV-2 접종
햄스터 또는 형질전환 B6.K18-hACE2IP-THV 또는 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX를 케타민과 자일라진 혼합물의 복강내 주사를 통해 마취시키고, 바이오안전 캐비닛 3으로 옮기고, BetaCoV/France/IDF0372/2020 SARS-CoV-2 임상 분리주 0.3 x 105 TCID50을 비강 내로 접종했다(Lescure 등, 2020). 이러한 임상 분리주는 파스퇴르 연구소(프랑스 파리) 산하 국제 호흡기 바이러스 기준 연구소(대표자: Pr. van der Werf)에 의해 제공되었다. 이러한 균주가 분리된 인간 샘플은 프랑스 파리 Bichat 병원의 Dr. Lescure와 Pr. Yazdanpanah에 의해 제공되었다. 바이러스 접종물은 마우스의 경우 20 ㎕, 햄스터의 경우 50 ㎕로 함유되었다. 동물은 파스퇴르 연구소의 BioSafety Level 3 동물 시설의 격리 정치에 수용시켰다. 감염된 동물로부터 회수된 장기는 이들 시설의 승인된 표준 절차에 따라 조작되었다.
장기에서 바이러스 부하의 측정
마우스 또는 햄스터로부터 장기를 무균적으로 적출하고 즉시 -80℃에서 동결시켰다. 순환하는 SARS-CoV-2의 RNA는 최근에 기술된 바와 같이 폐로부터 준비하였다(Ku 등). 간단히 말해서, MP Biomedical Fastprep 24 Tissue Homogenizer에서 500 μl의 얼음 냉각 PBS에서 용해 매트릭스 M(MP Biomedical)을 사용하여 장기를 해동 및 균질화하여 폐 균질물을 준비했다. RNA는 2000g에서 10분 동안 원심분리된 폐 균질물의 상층액에서 추출하였다. 대안적으로, TRIzol 시약 1mL를 함유하는 용해 매트릭스 D(MP Biomedical)를 첨가하고 MP Biomedical Fastprep 24 Tissue Homogenizer를 사용하여 6.0m/s에서 30초에 두 번 균질화하여 폐 또는 기타 장기로부터 총 RNA를 준비했다. TRIzol 시약(ThermoFisher사)을 사용하여 총 RNA를 추출했다. SARS-CoV-2 E 유전자(Corman 등, 2020) 또는 E 서브게놈mRNA(sgmRNA)(Wolfel 등, 2020)는 SuperScriptTM III Platinum One-Step qRT-PCR 시스템(Invitrogen사) 및 특정 프라이머 및 프로브(Eurofins사)를 사용하여 역전사 및 실시간 정량적 TaqMan® PCR에 따라 정량화했다(표 4). EsgmRNA 분석의 표준 곡선은 "T7 SARS-CoV-2 E-sgmRNA"의 PCR 단편에서 유래된 시험관내 전사된 RNA를 사용하여 수행하였다. 시험관내에서 전사된 RNA는 T7 RiboMAX Express Large Scale RNA 생산 시스템(Promega)을 사용하여 합성하였고 페놀/클로로포름 추출 및 이소프로판올 및 에탄올을 사용한 2회 연속 침전에 의해 정제하였다. 광학 밀도 측정으로 RNA 농도를 측정한 다음, RNA를 100μg/mL tRNA 담체를 함유하는 RNAse가 없는 물에 109 게놈 당량/μL로 희석하고 -80℃에서 보관했다. 시험관 내에서 전사된 이러한 RNA의 일련의 희석액은 10μg/ml tRNA 담체를 포함하는 RNAse가 없는 물에서 준비하였고 각 분석에서 표준 곡선을 설정하는데 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: (i) 55℃에서 10분 동안 역전사, (ii) 95℃에서 3분 동안 효소 불활성화, 및 (iii) 95℃에서 15초 동안, 58℃에서 30초 동안 변성/증폭의 45 사이클. PCR 산물은 ABI 7500 Fast 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems사)에서 분석하였다.
qRT-PCR에의해 SARS-CoV-2 부하를 정량화하는데 사용된 프라이머의 서열
프라이머/프로브 서열번호 DNA 서열
"E-Sarbeco" Fw 서열번호 91 5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3'
"E-Sarbeco" Rv 서열번호 92 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3'
"E-Sarbeco" 서열번호 93 5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ-1-3'
"E-sgmRNA" Fw
서열번호 94		 5'-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3'
면역 폐 및 뇌 세포의 세포 계측 분석
폐 선천성 면역 세포의 분리 및 염색은 실시예 1에 상세히 설명되어 있다. 각 그룹의 마우스의 경부 림프절, 후각 망울 및 뇌를 풀링하고 400U/ml 타입 IV 콜라게나제 및 DNase I(Roche사)로 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 그런 다음 경부 림프절과 후각 망울을 유리 균질기로 균질화하는 한편 뇌는 GentleMacs(Miltenyi Biotech사)를 사용하여 균질화했다. 세포 현탁액을 100 μm 기공 필터를 통해 여과하고, 세척하고, 8분 동안 1200rpm에서 원심분리하였다. 뇌의 세포 현탁액은 RT에서 1360g에서 25분 원심분리 후 Percoll 구배에서 면역 세포가 풍부했다. 폐에서 회수된 세포는 최근 다른 곳에서 설명한 바와 같이 염색하였다(Ku 등, 2021). 뇌에서 회수한 세포를 다음과 같이 적절한 mAb 혼합물로 염색했다. (i) 선천 면역 세포를 검출하기 위해: Near IR Live/Dead(Invitrogen사), FcγII/III 수용체 차단 항-CD16/CD32(BD Biosciences사), BV605-항-CD45(BD Biosciences사), PE-항-CD11b(eBioscience사), PE-Cy7-항-CD11c(eBioscience사), (ii) NK, 호중구, Ly-6C+/- 단핵구 및 대식세포를 검출하기 위하여: Near IR DL(Invitrogen사), FcγII/III 수용체 차단 항-CD16/CD32(BD Biosciences사), BV605-항-CD45(BD Biosciences사), PE-항-CD11b(eBioscience사), PE-Cy7-항-CD11c(eBioscience사), APC-항-Ly6G(Miltenyi사), BV711-항-Siglec-F(BD사), AF700-항-NKp46(BD Biosciences사), FITC-항-Ly6C(Abcam사), (iii) 적응 면역 세포를 검출하기 위해: Near IR Live/Dead(Invitrogen사), FcγII/III 수용체 차단 항-CD16/CD32(BD Biosciences사), APC-항-CD45(BD사), PerCP-Cy5.5-항-CD3(eBioscience사), FITC-항-CD4(BD Pharmingen사), BV711-항-CD8(BD Horizon사), BV605-항-CD69(Biolegend사), PE-항-CCR7(eBioscience사) 및 VioBlue-항-B220(Miltenyi사). 세포를 적절한 혼합물과 함께 4℃에서 25분 동안 인큐베이션하고, 3% FCS를 함유하는 PBS로 세척하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 파라포름알데히드 4%로 고정시켰다. 샘플은 Attune NxT cytometer(Invitrogen사)에서 획득하고 데이터는 FlowJo 소프트웨어(Treestar, OR, 미국)로 분석했다.
결과
SARS-CoV-2 복제에 대한 뇌의 상당한 허용성을 가진 새로운 hACE2 형질전환 마우스
B6.K18-hACE2IP-THV 마우스는 실시예 2에 개시된 바와 같이 생성하였다. SARS-CoV-2 복제에 대한 이들 마우스의 허용성을 평가했고, 폐 및 CNS 모두에서 SARS-CoV-2 복제에 대한 큰 허용성, 현저한 뇌 염증 및 급속한 치명적인 질병은 이러한 새로운 B6.K18-hACE2IP-THV 형질전환 모델의 주요 특징인 것으로 확인되었다.
LV::S △F2P -면역화된 B6.K18-hACE2 IP-THV 마우스에서 폐와 뇌의 완전한 보호
다음으로, 본 발명자들은 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스에서 LV::S△F2P의 백신 효능을 평가했다. 개체(n = 6/그룹)를 0주차에 마우스당 1 x 107 TU의 LV::S△F2P 또는 빈 LV(샴)로 근육내로 프라이밍 접종한 다음 3주차에 동일한 용량의 동일한 벡터로 비강내 부스트 접종하였다(도 15A). 이어서, 마우스를 5주차에 SARS-CoV-2로 공격접종하였다. 높은 혈청 중화 활성, 즉 5466 ± 6792의 EC50 평균 ± SD가 LV::S△F2P-백신접종된 마우스에서 검출되었다(도 15B). 이러한 백신접종은 폐뿐만 아니라 뇌에서도 SARS-CoV-2 복제에 대한 상당한 수준의 보호를 부여했다(도 15C). 특히, Esg qRT-PCR에 의한 뇌 바이러스 부하의 정량화는 LV::S△F2P 백신 접종 마우스에서 이러한 복제 관련 SARS-CoV-2 RNA의 카피를 검출하지 못한 반면 샴-백신접종 대조군의 뇌에서 (7.55 ± 7.84) x 109 카피를 검출했다.
3 dpi에서, 폐 선천성 면역 세포 서브세트의 세포계측 조사(도 15D)는 샴-백신접종 대조군과 비교하여 LV::S△F2P-백신접종된 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스에서 폐 CD45+ 세포 내부의 NK 세포 및 호중구 비율의 유의한 감소를 검출하였다(도 15D). 3dpi에서, 뇌 균질액에 적용된 qRT-PCR에 의해 평가된 바와 같이, NILV::S△F2P-백신접종된 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스는 샴 그룹과 비교하여 IFN-, NF-, L-5, L-6, L-10, L-12p40, CL2, CL3, XCL9 및 XCL10의 발현 수준이 상당히 감소했다(도 15E), 두 그룹 사이에 폐 염증의 눈에 띄는 변화는 기록되지 않았다(도시되지 않음).
따라서 NILV::S△F2P를 사용한 근육내-비강내 프라임-부스트 접종은 폐 및 CNS 해부학적 영역 모두에서 SARS-CoV-2 복제를 예방하고 바이러스-매개 폐 병리 및 신경 염증을 억제한다.
B6.K18-hACE2 IP-THV 마우스에서 뇌의 완전한 보호를 위한 비강내 부스트 접종의 요건
햄스터 모델과 유사한 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스의 하기 실험에서 LV의 보호 특성을 특성규명하기 위해, 본 발명자들은 LV의 비통합 버전을 사용했다. SARS-CoV-2로부터 뇌의 관찰된 보호는 이러한 호흡기 및 향신경성 바이러스에 대한 LV 투여의 비강내 경로의 이점을 반영할 수 있다. 이러한 가설을 다루기 위해, B6.K18-hACE2IP-THV 마우스를 다음과 같이 NILV::S△F2P로 백신접종하였다: (i) 양성 대조군으로서 0주차에 근육내 및 5주차에 비강내, (ii) 0주차에 비강내, 또는 (iii) 5주차에 근육내. 샴-백신접종 대조군은 0주 및 5주에서 빈 NILV를 비강내 접종받았다(도 16A). 이어서, 마우스를 7주차에 SARS-CoV-2로 공격접종하고 바이러스 부하는 3dpi에서 E 또는 Esg 특이적 qRT-PCR에 의해 뇌에서 측정하였다(도 16B). 이러한 매우 엄격한 전임상 모델에서, NILV::S△F2P의 단일 비강내 또는 근육내 주사는 각 그룹의 모든 동물에서 완전한 보호를 유도하지 못했다. 근육내 프라임 접종 후 비강내 부스트 접종만이 모든 동물에서 완전한 보호를 부여하였고, 이는 뇌의 완전한 보호에 도달하기 위한 비강내 부스트 접종의 필요성을 나타낸다.
세포 계측법으로 분석한 결과, NILV::S△F2P 근육내-비강내 보호 그룹, 샴 근육내-비강내 보호되지 않은 그룹 및 무처리 대조군에서 경부 림프절의 선천성 및 후천성 면역 세포의 구성은 변하지 않았다(데이터는 도시되지 않음). 특히, 본 발명자들은 보호되지 않은 그룹과 비교하여 NILV::S△F2P 근육내-비강내 보호 그룹의 후각 망울에서 CD8+ T 세포의 증가된 비율을 검출했다(도 16C). 후각 망울의 CD4+ T 세포는 각각 CD69 또는 CCR7의 발현에 따라 뚜렷한 활성화 또는 이동성 표현형이 없었다. 본 발명자들은 염증의 바이오마커 및/또는 활성 바이러스 복제와 상관 관계가 있는 것으로서, NILV::S△F2P 근육내-비강내 보호 그룹과 비교하여 보호되지 않은 마우스의 뇌에서 증가된 양의 CD11b+ Ly6G- Ly6C+ 염증성 단핵구(도 16E)와 후각 망울에서 증가된 양의 호중구(도 16D)를 검출했다.
종합하면, 매우 엄격한 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스 모델에서 생성된 본 발명의 데이터는 SARS-CoV-2 복제 및 이에 따른 침윤 및 신경- 염증으로부터 CNS의 면역 보호에서 NILV::S△F2P 비강내 부스트 접종의 이점을 뒷받침한다. 비강 및 후각 망울, 즉 바이러스의 진입점에서 점막 면역 반응의 국소 유도 및/또는 활성화는 성능 기준에 맞는 전략이다.
고찰
LV 기반 플랫폼은 특히 전임상 동물 모델에서 폐 SARS-CoV-2 감염에 대한 멸균 면역을 유도할 수 있는 전신 프라임 접종에 이어 점막 비강 부스트 접종에 사용될 때 COVID-19에 대한 강력한 백신 접종 접근법을 제공한다. 우선, 본 발명자들은 바이러스학적, 면역학적 및 조직병리학적 매개변수에 의해 평가된 바와 같이, SCoV-2의 S△F2P 전융합 형태를 암호화하는 LV의 단일 비강내 투여가 매우 민감한 햄스터 모델에서 근육내-비강내 프라임-부스트 요법만큼 효율적으로 호흡기를 완전히 보호한다는 것을 입증한다. 햄스터 ACE2 오르토로그는 SCoV-2와 효율적으로 상호 작용하여 SARS-CoV-2의 숙주 세포 침입과 이의 높은 복제 속도를 쉽게 허용한다. SARS-CoV-2 접종 후 급속한 체중 감소와 심각한 폐 병리 현상이 발생하는 이러한 종은 예를 들어 경증 COVID-19 병리 현상만 발생하는 붉은털원숭이와 비교하여 약물 또는 백신 후보의 효능을 평가하기 위한 민감한 모델을 제공한다(Munoz-Fontela 등, 2020; Sia 등, 2020). SARS-CoV-2 공격접종 7주 또는 2주 전에 1회 비강내 LV 투여가 이러한 감수성 모델에서 살균 보호를 이끌어낸다는 사실은 이러한 LV 기반 백신을 이용하여 향후 임상 시험을 설정하는데 값어치가 있으며 대량 백신접종에 현저한 사회 경제적 이점을 제공한다. 백신 후보의 효능을 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 LV 기반 형질전환 접근법을 사용하여 새로운 형질전환 마우스 모델을 생성했다(Nakagawa 및 Hoogenraad, 2011). 이러한 전략에 사용된 ILV는 사이토케라틴 K18 프로모터, 즉 렌티바이러스 FLAP 전달 플라스미드에 약간의 적응이 있는, B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스(McCray 등, 2007)를 생성하기 위해 Perlman 팀이 이전에 사용한 것과 동일한 프로모터에 의해 제어되는 hACE2를 암호화한다. 그러나, 새로운 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스는 뇌에서 훨씬 더 높은 수준의 hACE2 mRNA를 발현하고 감염후 4일 이내에 상당한 뇌 염증 및 치명적인 질병의 발생과 병행하여 SARS-CoV-2 복제에 대한 현저하게 증가된 뇌 허용성을 나타내기 때문에 특정한 특징을 가지고 있다. 이러한 뚜렷한 특징은 다음과 같은 이유로 차등 hACE2 발현 프로필의 결과일 수 있다: (i) 네이키드 DNA와 비교하여 염색체에의 ILV의 대체 삽입 부위, 및/또는 (ii) B6.K18-hACE2IP-THV 및 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 동물에서, 알팔파(alfalfa) 바이러스 번역 인핸서(McCray 등, 2007)에 대한 Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)의 상이한 효과. 다른 보고된 hACE2 인간화 마우스는 하기 하에서 이식유전자를 발현한다: (i) 뇌에서 보고된 hACE2 mRNA 발현이 없는 뮤린 ACE2 프로모터(Yang 등, 2007), (ii) "hepatocyte nuclear factor-3/forkhead homologue 4"(HFH4) 프로모터, 즉 폐가 감염 및 병리학의 주요 부위인 "HFH4-hACE2" C3B6 마우스(Jiang 등, 2020; Menachery 등, 2016), 및 (iii) "CAG" 혼합 프로모터, 즉 hACE2 mRNA가 폐 및 뇌를 비롯한 다양한 기관에서 발현되는 "AC70" C3H x C57BL/6 마우스(Tseng 등, 2007). AC70 및 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스의 비교는 이 두 모델의 유사성과 차이점을 평가하는데 유용할 수 있다. 그러나, 여기서 본 발명자들은 B6.K18-ACE22Prlmn/JAX 마우스와 비교하여 SARS-CoV-2 복제에 대한 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스의 훨씬 더 높은 뇌 허용성을 보고한다. B6.K18-hACE2IP-THV 뮤린 모델은 COVID-19 백신 연구에 광범위하게 적용할 수 있을 뿐만 아니라 COVID-19 유래 신경 병리학 탐구를 위한 고유한 설치류 모델을 제공한다. SARS-CoV-2 복제에 대한 뇌의 실질적인 허용성과 이러한 형질전환 마우스에 의한 치명적인 질병의 발생에 기반하여, 이러한 전임상 모델은 골든 햄스터 모델보다 더 엄격한 것으로 간주될 수 있다.
본 연구에서, 매우 엄격한 B6.K18-hACE2IP-THV 마우스의 사용은 SARS-CoV-2에 대해 개발된 LV 기반 백신 후보에 의한 CNS의 멸균 보호 유도를 위한 비강내 부스터 면역화의 중요성을 입증했다. 후각 망울은 국소적 선천 및 적응 면역의 작용을 통해 바이러스 CNS 감염을 제어할 수 있으며(Durrant 등, 2016), 본 발명자들은 근육내-비강내 백신접종되고 보호된 마우스의 이러한 해부학적 전략 영역에서 CD8+ T 세포의 빈도가 증가하는 것을 관찰했다. 염증 매개체의 상당한 감소는 후각 망울 및 뇌에서 각각 호중구와 염증성 단핵구의 감소와 함께 이러한 백신을 접종하고 보호된 마우스의 뇌에서도 입증되었다.
동반 질환(comorbid condition)이 있는 환자의 COVID-19와 관련된 신경학적 징후의 원인은 다음과 같을 수 있다: (i) CNS에 미치는 SARS-CoV-2의 직접적인 영향, (ii) 뇌 혈관 내피의 감염, 및 (iii) CNS 내부의 제어되지 않는 항바이러스 면역 반응. ACE2는 인간 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포(중간 측두이랑과 후측 대뇌 피질에 위치함)에서 발현되며, 이는 환자에서 SARS-CoV-2에 대한 뇌의 허용성을 설명할 수 있다(Song 등, 2020; Hu 등, 2020). 바이러스는 신경 전파 또는 혈행 경로를 통해 뇌에 침입할 수 있다(Bohmwald 등, 2018; Desforges 등, 2019, 2014). 후각 시스템은 전두엽 피질을 통해 CNS에 직접 연결되어 있다(Mori 등, 2005). CNS로의 바이러스의 신경 전달은 후각 점막에서 축삭 수송을 통한 직접적인 뉴런 침범의 결과로 발생할 수 있다. 신경내 복제 후, 바이러스는 시냅스로 퍼지고 후각로 투사(olfactory tract projection)를 받는 해부학적 CNS 영역으로 퍼진다(Koyuncu 등, 2013; Zubair 등, 2020; Berth, 2009; Koyuncu 등, 2013; Roman 등, 2020). 그러나, 후각 점막과 연결되지 않은 CNS 영역에서 바이러스 RNA의 검출은 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 SARS-CoV-2-감염 면역 세포의 이동 또는 CNS 혈관 내피를 통한 직접적인 바이러스 진입 경로를 포함하여, CNS로의 또 다른 바이러스 유입의 존재를 시사한다(Meinhardt 등, 2020). 정상 상태에서는 바이러스가 무손상 혈액-뇌 장벽을 통해 뇌에 침투할 수 없지만(Berth, 2009), 사이토카인/케모카인 폭풍(storm) 동안 대량으로 생성되는 염증 매개체, 특히 TNF-α 및 CCL2는 혈액-뇌 장벽의 무결성을 저해하거나 그의 투과성을 증가시켜서, 바이러스 또는 바이러스에 감염된 백혈구의 세포주위 혈액에서 뇌로의 수송을 가능하게 한다{Aghagoli, 2020 #77;Hu, 2011 #15}. SARS-CoV-2가 뇌로 들어가는 메커니즘과 관계없이, 본 발명자들은 NILV::S△F2P를 이용한 비강내 부스터 면역화를 통해 SARS-CoV-2에 대한 CNS의 완전한 보호에 대한 증거를 제공한다.
본 발명자들은 SARS-CoV-2 감염으로부터 폐에서 멸균 보호를 유도할 때 LV::SFL의 강력한 예방 능력을 입증하는 실시예 1의 결과를 보고했다. 본 연구에서, 임상 분석으로 이동하면서 본 발명자들은 백신 관심을 나타내는 S 단백질의 추가 형태로 SCov-2의 안정화된 전융합 S△F2P 형태를 암호화하는 LV를 사용했다. 이러한 선택은 융합전 형태에서 바이러스 외피 당단백질의 안정화가 서브유닛 백신의 산업적 제조에서 재조합 단백질로서의 생산 수율을 개선하고, 그의 최적 면역원성 형태하에 항원의 이용성을 향상시켜서 핵산 기반 백신의 효능을 개선한다(Hsieh 등, 2020). 융합전 안정화 접근법은 지금까지 HKU1-CoV, SARS-CoV 및 MERS-CoV를 포함한 여러 코로나바이러스의 S 단백질에 적용되었다. 안정화된 SMERS-CoV는 전임상 동물 모델에서 훨씬 더 높은 NAb 반응과 보호를 이끌어내는 것으로 확인되었다(Hsieh 등, 2020).
단일 비강내 투여에 의해 부여되는 폐의 멸균 보호 및 비강내 부스트에 의해 부여되는 CNS의 완전한 보호는 가장 중요한 자산이다. SARS-CoV-2의 조상 또는 신흥 변이체로부터 SCoV-2의 전체 길이 또는 안정화된 형태를 암호화하는 비세포변성 및 비염증성 LV는 유망한 2세대 COVID-19 백신 후보를 제공한다. 지금까지 다른 백신 전략에 의해 직접적으로 다루어지지 않은 뇌 보호는 COVID-19와 관련된 다중적이고 때로는 중증인 신경 병리학적 징후를 고려해야 한다.
실시예 4: 유전적으로 먼 P.1(소위 Manaus, Brazil 또는 g) 변이체에 대한 NILV::S CoV-2 Wuhan 에 의해 유도된 완전한 교차 보호
현재 사용 중인 COVID-19 백신과 관련된 중요한 문제는 새로운 변종에 대한 방어 능력이다. NILV::SCoV-2 Wuhan 백신 후보로 이러한 질문을 평가하기 위해, B6.K18-hACE2IP-THV 형질전환 마우스에게 NILV::SCoV-2 또는 샴(sham)을 0주차에 근육내 프라임 접종 및 5주차에 비강내 부스트 접종했다(도 25A). 그런 다음, 7주째에 마우스에게 지금까지 설명한 가장 유전적으로 먼 변종인 P.1(소위 Manaus, Brazil 또는 γ) SARS-CoV-2를 마우스당 0.3 × 105 TCID50으로 비강내 공격접종했다(Buss 등, 2021).
3dpi에서 뇌 및 폐 바이러스 부하를 측정한 결과, NILV::SCoV-2 Wuhan을 이용한 근육내-비강내 프라임-부스트 접종은 이러한 유전적으로 먼 P.1 변종으로부터 뇌와 폐의 완전한 교차 보호를 유도한 것으로 확인되었다(도 25B). 본 발명자들은 SWuhan, SD614G 또는 SB1.117 슈도-바이러스와 비교하여 SB1.351 또는 SManaus P.1 슈도-바이러스를 중화시키는 NILV::SCoV-2 Wuhan-백신접종된 마우스의 혈청의 현저하게 감소된 능력을 관찰하였다(도 25C).
이것은 현저한 보호에도 불구하고 보호 B 세포 반응을 크게 감소시켰고, 이러한 NILV::SCoV-2 Wuhan 매개 완전 보호에 T 세포가 관여할 가능성을 높였다. 이러한 가능성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 동일한 프로토콜(도 25A)에 따라 C57BL/6 WT 또는 μMT KO 마우스를 백신접종했다. μMT KO 마우스는 성숙한 B 세포 구획이 부족하므로 Ig/항체 반응이 부족하다(Kitamura 등, 1991). 이러한 비형질전환 마우스가 SARS-CoV-2 복제를 허용하도록 만들기 위해, SARS-CoV-2 공격접종 4일 전에 이전에 설명한 바와 같이(Ku 등, 2021), hACE2(Ad5::hACE2)를 암호화하는 아데노바이러스 벡터 혈청형 5의 3 × 108 IGU로 전처리했다. 3dpi에서 폐 바이러스 부하의 측정은 백신접종된 WT 마우스에서 폐의 완전한 보호뿐만 아니라 백신접종된 μMT KO 마우스에서 매우 유의미한 보호를 보여주었다(도 26A). 이러한 관찰 결과는 B 세포 독립적이고 항원 특이적인 세포 면역, 즉 T 세포 반응이 SARS-CoV-2에 대한 NILV::SCoV-2 매개 보호에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
이는 다음과 일치한다: (i) 전신 수준에서 NILV::SCoV-2 Wuhan에 의해 유도된 강한 CD8+ T-세포 반응(도 26B), (ii) 몇몇의 SCoV-2 에피토프에 특이적인 IFN-γ-생성 폐 CD8+ T 세포의 현저한 비율(도 26C), (iii) 이펙터 기억(Tem) 및 상주 기억(Trm) 표현형을 갖는 폐 CD8+ T 세포의 높은 비율(도 26D), (iv) 백신접종되고 SARS-CoV-2 Wuhan(도 27A-27C) 또는 SARS-CoV-2 P.1 변종(도 27D, 27E)으로 공격접종된 마우스에서 검출가능한, 후각 망울에서 CD8+ T 세포의 동원.
놀랍게도, SCoV-2 Wuhan 서열에서 확인된 모든 뮤린 및 인간 CD8+ T 세포 에피토프는 돌연변이된 SCoV-2 Manaus P.1에서 보존된다(표 5). 이러한 관찰 결과는 현저한 B 및 T 세포 반응을 이끌어냄으로써 조상 및 신종 SARS-CoV-2 변종으로부터 폐와 뇌의 완전한 보호를 유도하는 NILV의 강력한 잠재력을 나타낸다. NAb의 표적인 B 세포 에피토프와 달리(Hoffmann 등, 2021), 지금까지 확인된 T 세포 에피토프는 새로운 변이체의 SCoV-2에 축적된 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았다.
S CoV-2 -유래 뮤린 및 인간 T-세포 에피토프
뮤린 서열 아미노산 서열번호 아미노산 치환 / 결실
H-2Db LDS KVGGNYNYL YRL 18
H-2Db NK CVNFNFNGL TGTG 16
H-2Db V RDPQTLEIL DITPC 17
H-2Db CASY QTQTNSPRRA R 19 B1.1.7에서 P ―> H
H-2Db VQID RLITGRLQSL Q 20
인간 확인됨(Immundex 데이터베이스) 관찰
A*0101 LTDEMIAQY 121
A*0201 FLHVTYVPA 122
A*0201 KIYSKHTPI 123
A*0201 KLPDDFTGCV 124
A*0201 LLFNKVTLA 125
A*0201 RLDKVEAEV 126
A*0201 RLITGRLQSL 127
A*0201 RLQSLQTYV 128
A*0201 TLDSKTQSL 129
A*0201 VLNDILSRL 130 B1.1.7에서 S ―>A
A*0201 YLQPRTFLL 131
A*0201 RLNEVAKNL 132
A*0201 VVFLHVTYV 133
A*0201 NLNESLIDL 134
A*0201 FIAGLIAIV 135
A*0301 KCYGVSPTK 136
A*0301 GVYFASTEK 137
A*1101 RLFRKSNLK 138
A*1101 GTHWFVTQR 139
A*1101 GVYFASTEK 137
A*2402 KWPWYIWLGF 140
A*2402 QYIKWPWYI 141
A*2402 NYNYLYRLF 142
A*2402 RFDNPVLPF 143 B1.351에서 D ―> A
B*0702 SPRRARSVA 144 B1.1.7에서 P ―> H
B*0702 APHGVVFL 145
B*3501 QPTESIVRF 146
B*3501 LPFNDGVYF 147
B*3501 IPFAMQMAY 148
B*4403 YEQYIKWPW 149
DR ITRFQTLLALHRSYL 150 B1.351에서 LAL 결실
DR FNGLTVLPPLLTDEM 151
DRB1*0101 DRB1*0401 DRB1*0701 DRB1*1501 QLIRAAEIRASANLAATK 152 P.1에서 A ―> I
실시예 5: 광범위한 보호 LV 백신에 가장 적합한 항원으로서 SARS-CoV-2 B1.351(소위 남아프리카 또는 β) 변이체로부터 스파이크의 확인
실시예 4에서 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 NILV::SCoV-2 Wuhan이 조상 Wuhan 및 유전적으로 가장 먼 마나우스(Manaus) P.1 SARS-CoV-2 변종 모두로부터 매우 민감한 B6.K18-hACE2IP-THV 형질전환 마우스를 크게 보호한다는 것을 확인하였다. 치료제의 확립을 위해, 항원을 더욱 개량하기 위해, 알려진 변이체의 바이러스 증식 역학을 가장 잘 고려할 수 있는 가장 적합한 스파이크 변이체의 사용을 고려하였다.
가장 교차 방어적인 Spike 변이체를 확인하기 위해, 본 발명자들은 각각의 관심 스파이크를 암호화하는 LV로 C57BL/6 마우스를 프라이밍 및 부스트 접종했으며(도 28A), 각 스파이크를 보유하는 슈도 바이러스를 사용하여 교차 혈청 중화 가능성을 평가했다(도 28B). 도 28C에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 다음을 관찰하였다:
(i) LV::SCoV-2 B1.1.7로 면역화된 마우스의 혈청은 SCoV-2 Wuhan 및 LV::S SCoV-2 B1.1.7를 포함하는 슈도 바이러스를 높은 EC50에서 중화하지만, SCoV-2 B1.351 및 LV::S SCoV-2 P.1를 포함하는 슈도 바이러스를 빈약하게 중화했고,
(ii) LV::S SCoV-2 P.1로 면역화된 마우스의 혈청은 SCoV-2 P.1 및 LV:: SCoV-2 B1.351를 포함하는 슈도 바이러스를 높은 EC50에서 중화하지만, SCoV-2 Wuhan 및 LV:: SCoV-2 B1.1.7를 포함하는 슈도 바이러스를 빈약하게 중화했고,
(iii) LV:: SCoV-2 B1.351로 면역화된 마우스의 혈청은 SCoV-2 P.1 및 LV:: SCoV-2 B1.351 를 포함하는 슈도 바이러스뿐만 아니라 SCoV-2 Wuhan 및 LV:: SCoV-2 B1.1.7를 포함하는 슈도 바이러스를 높은 EC50에서 중화했다.
이러한 결과는 B1.351(남아프리카 또는 β) 변종의 스파이크 서열을 중화 항체 측면에서 가장 교차 반응성인 면역원으로 지정한다.
또한, 본 발명자들은 LV와 관련하여, K986P - V987P 치환(2P)에 의한 스파이크 안정화가 (교차) 중화 항체 활성을 상당히 향상시킨다는 것을 확인하였다(도 29A-29C).
따라서, 본 발명의 향후 선도 항원 후보는 2P가 있는 B1.351(남아프리카 또는 β) 변종의 전장 스파이크이다.
실시예 1에서 인용된 참고문헌
Amanat, F., and F. Krammer. 2020. SARS-CoV-2 Vaccines: Status Report. Immunity 52:583-589.
Beignon, A.S., K. Mollier, C. Liard, F. Coutant, S. Munier, J. Riviere, P. Souque, and P. Charneau. 2009. Lentiviral vector-based prime/boost vaccination against AIDS: pilot study shows protection against Simian immunodeficiency virus SIVmac251 challenge in macaques. J Virol 83:10963-10974.
Belouzard, S., V.C. Chu, and G.R. Whittaker. 2009. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci U S A 106:5871-5876.
Bourgine, M., S. Crabe, Y. Lobaina, G. Guillen, J.C. Aguilar, and M.L. Michel. 2018. Nasal route favors the induction of CD4(+) T cell responses in the liver of HBV-carrier mice immunized with a recombinant hepatitis B surface- and core-based therapeutic vaccine. Antiviral Res 153:23-32.
Buffa, V., D.R. Negri, P. Leone, M. Borghi, R. Bona, Z. Michelini, D. Compagnoni, C. Sgadari, B. Ensoli, and A. Cara. 2006. Evaluation of a self-inactivating lentiviral vector expressing simian immunodeficiency virus gag for induction of specific immune responses in vitro and in vivo. Viral Immunol 19:690-701.
Chandrashekar, A., J. Liu, A.J. Martinot, K. McMahan, N.B. Mercado, L. Peter, L.H. Tostanoski, J. Yu, Z. Maliga, M. Nekorchuk, K. Busman-Sahay, M. Terry, L.M. Wrijil, S. Ducat, D.R. Martinez, C. Atyeo, S. Fischinger, J.S. Burke, M.D. Slein, L. Pessaint, A. Van Ry, J. Greenhouse, T. Taylor, K. Blade, A. Cook, B. Finneyfrock, R. Brown, E. Teow, J. Velasco, R. Zahn, F. Wegmann, P. Abbink, E.A. Bondzie, G. Dagotto, M.S. Gebre, X. He, C. Jacob-Dolan, N. Kordana, Z. Li, M.A. Lifton, S.H. Mahrokhian, L.F. Maxfield, R. Nityanandam, J.P. Nkolola, A.G. Schmidt, A.D. Miller, R.S. Baric, G. Alter, P.K. Sorger, J.D. Estes, H. Andersen, M.G. Lewis, and D.H. Barouch. 2020. SARS-CoV-2 infection protects against rechallenge in rhesus macaques. Science, May 2020:eabc4776. doi: 10.1126/science.abc4776. Online ahead of print. PMID:　32434946　.
Corman, V., T. Bleicker, S. Brunink, and C. Drosten. 2020. Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR. https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf
Cousin, C., M. Oberkampf, T. Felix, P. Rosenbaum, R. Weil, S. Fabrega, V. Morante, D. Negri, A. Cara, G. Dadaglio, and C. Leclerc. 2019. Persistence of Integrase-Deficient Lentiviral Vectors Correlates with the Induction of STING-Independent CD8(+) T Cell Responses. Cell Rep 26:1242-1257 e1247.
Coutant, F., R.Y. Sanchez David, T. Felix, A. Boulay, L. Caleechurn, P. Souque, C. Thouvenot, C. Bourgouin, A.S. Beignon, and P. Charneau. 2012. A nonintegrative lentiviral vector-based vaccine provides long-term sterile protection against malaria. PLoS One 7:e48644.
Coutard, B., C. Valle, X. de Lamballerie, B. Canard, N.G. Seidah, and E. Decroly. 2020. The spike glycoprotein of the new coronavirus 2019-nCoV contains a furin-like cleavage site absent in CoV of the same clade. Antiviral Res 176:104742.
Di Nunzio, F., T. Felix, N.J. Arhel, S. Nisole, P. Charneau, and A.S. Beignon. 2012. HIV-derived vectors for therapy and vaccination against HIV. Vaccine 30:2499-2509.
Esslinger, C., P. Romero, and H.R. MacDonald. 2002. Efficient transduction of dendritic cells and induction of a T-cell response by third-generation lentivectors. Hum Gene Ther 13:1091-1100.
Gallinaro, A., M. Borghi, R. Bona, F. Grasso, L. Calzoletti, L. Palladino, S. Cecchetti, M.F. Vescio, D. Macchia, V. Morante, A. Canitano, N. Temperton, M.R. Castrucci, M. Salvatore, Z. Michelini, A. Cara, and D. Negri. 2018. Integrase Defective Lentiviral Vector as a Vaccine Platform for Delivering Influenza Antigens. Front Immunol 9:171.
Gao, Q., L. Bao, H. Mao, L. Wang, K. Xu, M. Yang, Y. Li, L. Zhu, N. Wang, Z. Lv, H. Gao, X. Ge, B. Kan, Y. Hu, J. Liu, F. Cai, D. Jiang, Y. Yin, C. Qin, J. Li, X. Gong, X. Lou, W. Shi, D. Wu, H. Zhang, L. Zhu, W. Deng, Y. Li, J. Lu, C. Li, X. Wang, W. Yin, Y. Zhang, and C. Qin. 2020. Rapid development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science 2020 Jul 3;369(6499):77-81. doi: 10.1126/science.abc1932. Epub 2020 May 6.PMID:　32376603.
Guo, Y.R., Q.D. Cao, Z.S. Hong, Y.Y. Tan, S.D. Chen, H.J. Jin, K.S. Tan, D.Y. Wang, and Y. Yan. 2020. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Mil Med Res 7:11.
He, Y., J. Zhang, Z. Mi, P. Robbins, and L.D. Falo, Jr. 2005. Immunization with lentiviral vector-transduced dendritic cells induces strong and long-lasting T cell responses and therapeutic immunity. J Immunol 174:3808-3817.
Hu, B., A. Tai, and P. Wang. 2011. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunol Rev 239:45-61.
Iglesias, M.C., M.P. Frenkiel, K. Mollier, P. Souque, P. Despres, and P. Charneau. 2006. A single immunization with a minute dose of a lentiviral vector-based vaccine is highly effective at eliciting protective humoral immunity against West Nile virus. J Gene Med 8:265-274.
Ku, M.W., F. Anna, F. Souque, S. Petres, M. Prot, E. Simon-Loriere, P. Charneau, and M. Bourgine. 2020. A Single Dose of NILV-Based Vaccine Provides Rapid and Durable Protection against Zika Virus. Mol Ther 2020 May 20;S1525-0016(20)30250-1.　doi: 10.1016/j.ymthe.2020.05.016.
Ku, M.W., P. Authie P. Souque, M. Bourgine, M. Romano, P. Charneau, and L. Majlessi. Submitted. High-Quality Memory T Cells by Programmed Antigen Expression in Dendritic Cells Induced by Lentiviral Vector. (In revision)
Lai, A.L., J.K. Millet, S. Daniel, J.H. Freed, and G.R. Whittaker. 2017. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. J Mol Biol 429:3875-3892.
Lorin, V., and H. Mouquet. 2015. Efficient generation of human IgA monoclonal antibodies. J Immunol Methods 422:102-110.
Qiu, H., S. Sun, H. Xiao, J. Feng, Y. Guo, W. Tai, Y. Wang, L. Du, G. Zhao, and Y. Zhou. 2016. Single-dose treatment with a humanized neutralizing antibody affords full protection of a human transgenic mouse model from lethal Middle East respiratory syndrome (MERS)-coronavirus infection. Antiviral Res 132:141-148.
Rosenberg, S.A., Y. Zhai, J.C. Yang, D.J. Schwartzentruber, P. Hwu, F.M. Marincola, S.L. Topalian, N.P. Restifo, C.A. Seipp, J.H. Einhorn, B. Roberts, and D.E. White. 1998. Immunizing patients with metastatic melanoma using recombinant adenoviruses encoding MART-1 or gp100 melanoma antigens. J Natl Cancer Inst 90:1894-1900.
Schirmbeck, R., J. Reimann, S. Kochanek, and F. Kreppel. 2008. The immunogenicity of adenovirus vectors limits the multispecificity of CD8 T-cell responses to vector-encoded transgenic antigens. Mol Ther 16:1609-1616.
Sia, S.F., L.M. Yan, A.W.H. Chin, K. Fung, K.T. Choy, A.Y.L. Wong, P. Kaewpreedee, R. Perera, L.L.M. Poon, J.M. Nicholls, M. Peiris, and H.L. Yen. 2020. Pathogenesis and transmission of SARS-CoV-2 in golden hamsters. Nature 2020 May 14. doi: 10.1038/s41586-020-2342-5. Online ahead of print.PMID:　32408338.
Sterlin, D., A. Mathian, M. Miyara, A. Mohr, F. Anna, L. Claer, P. Quentric, J. Fadlallah, P. Ghillani, C. Gunn, R. Hockett, S. Mudumba, A. Guihot, C. Luyt, J. Mayaux, A. Beurton, S. Fourati, J. Lacorte, H. Yssel, C. Parizot, K. Dorgham, P. Charneau, Z. Amoura, and G. Gorochov. IgA dominates the early neutralizing antibody response to SARS-CoV-2. (in preparation).
Vabret, N., G.J. Britton, C. Gruber, S. Hegde, J. Kim, M. Kuksin, R. Levantovsky, L. Malle, A. Moreira, M.D. Park, L. Pia, E. Risson, M. Saffern, B. Salome, M. Esai Selvan, M.P. Spindler, J. Tan, V. van der Heide, J.K. Gregory, K. Alexandropoulos, N. Bhardwaj, B.D. Brown, B. Greenbaum, Z.H. Gumus, D. Homann, A. Horowitz, A.O. Kamphorst, M.A. Curotto de Lafaille, S. Mehandru, M. Merad, R.M. Samstein, and P. Sinai Immunology Review. 2020. Immunology of COVID-19: Current State of the Science. Immunity 52:910-941.
Walls, A.C., Y.J. Park, M.A. Tortorici, A. Wall, A.T. McGuire, and D. Veesler. 2020. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell 181:281-292 e286.
Wan, Y., J. Shang, S. Sun, W. Tai, J. Chen, Q. Geng, L. He, Y. Chen, J. Wu, Z. Shi, Y. Zhou, L. Du, and F. Li. 2020. Molecular Mechanism for Antibody-Dependent Enhancement of Coronavirus Entry. J Virol 94:
Wang, Q., Y. Qiu, J.Y. Li, Z.J. Zhou, C.H. Liao, and X.Y. Ge. 2020. A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility. Virol Sin 2020 Jun;35(3):337-339. doi: 10.1007/s12250-020-00212-7.　Epub 2020 Mar 20.
Yu, J., L.H. Tostanoski, L. Peter, N.B. Mercado, K. McMahan, S.H. Mahrokhian, J.P. Nkolola, J. Liu, Z. Li, A. Chandrashekar, D.R. Martinez, C. Loos, C. Atyeo, S. Fischinger, J.S. Burke, M.D. Slein, Y. Chen, A. Zuiani, N.L. FJ, M. Travers, S. Habibi, L. Pessaint, A. Van Ry, K. Blade, R. Brown, A. Cook, B. Finneyfrock, A. Dodson, E. Teow, J. Velasco, R. Zahn, F. Wegmann, E.A. Bondzie, G. Dagotto, M.S. Gebre, X. He, C. Jacob-Dolan, M. Kirilova, N. Kordana, Z. Lin, L.F. Maxfield, F. Nampanya, R. Nityanandam, J.D. Ventura, H. Wan, Y. Cai, B. Chen, A.G. Schmidt, D.R. Wesemann, R.S. Baric, G. Alter, H. Andersen, M.G. Lewis, and D.H. Barouch. 2020. DNA vaccine protection against SARS-CoV-2 in rhesus macaques. Science 2020 May 20;eabc6284.　doi: 10.1126/science.abc6284.　PMID:　32434945.
Zennou, V., C. Petit, D. Guetard, U. Nerhbass, L. Montagnier, and P. Charneau. 2000. HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap. Cell 101:173-185.
Zhao, J., K. Li, C. Wohlford-Lenane, S.S. Agnihothram, C. Fett, J. Zhao, M.J. Gale, Jr., R.S. Baric, L. Enjuanes, T. Gallagher, P.B. McCray, Jr., and S. Perlman. 2014. Rapid generation of a mouse model for Middle East respiratory syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A 111:4970-4975.
Zhu, F.C., Y.H. Li, X.H. Guan, L.H. Hou, W.J. Wang, J.X. Li, S.P. Wu, B.S. Wang, Z. Wang, L. Wang, S.Y. Jia, H.D. Jiang, L. Wang, T. Jiang, Y. Hu, J.B. Gou, S.B. Xu, J.J. Xu, X.W. Wang, W. Wang, and W. Chen. 2020. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 2020 Jun 13;395(10240):1845-1854. doi: 10.1016/S0140-6736(20)31208-3.　Epub 2020 May 22. P.
실시예 2 및 3에서 인용된 참고문헌
Aghagoli, G., Gallo Marin, B., Katchur, N.J., Chaves-Sell, F., Asaad, W.F., and Murphy, S.A. (2020). Neurological Involvement in COVID-19 and Potential Mechanisms: A Review. Neurocrit Care.
Bergmann, C.C., T.E. Lane, and S.A. Stohlman. 2006. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol 4:121-132.
Anna, F., Goyard, S., Lalanne, A.I., Nevo, F., Gransagne, M., Souque, P., Louis, D., Gillon, V., Turbiez, I., Bidard, F.C., et al. (2020). High seroprevalence but short-lived immune response to SARS-CoV-2 infection in Paris. Eur J Immunol.
Bos, R., Rutten, L., van der Lubbe, J.E.M., Bakkers, M.J.G., Hardenberg, G., Wegmann, F., Zuijdgeest, D., de Wilde, A.H., Koornneef, A., Verwilligen, A., et al. (2020). Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines 5, 91.
Bourgonje, A.R., Abdulle, A.E., Timens, W., Hillebrands, J.L., Navis, G.J., Gordijn, S.J., Bolling, M.C., Dijkstra, G., Voors, A.A., Osterhaus, A.D., et al. (2020). Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease 2019 (COVID-19). J Pathol 251, 228-248.
Chandrashekar, A., Liu, J., Martinot, A.J., McMahan, K., Mercado, N.B., Peter, L., Tostanoski, L.H., Yu, J., Maliga, Z., Nekorchuk, M., et al. (2020). SARS-CoV-2 infection protects against rechallenge in rhesus macaques. Science May 2020:eabc4776 doi: 101126/scienceabc4776 PMID: 32434946.
Chen, R., Wang, K., Yu, J., Howard, D., French, L., Chen, Z., Wen, C., and Xu, Z. (2020). The spatial and cell-type distribution of SARS-CoV-2 receptor ACE2 in human and mouse brain. BioRxiv.
Chow, Y.H., O'Brodovich, H., Plumb, J., Wen, Y., Sohn, K.J., Lu, Z., Zhang, F., Lukacs, G.L., Tanswell, A.K., Hui, C.C., et al. (1997). Development of an epithelium-specific expression cassette with human DNA regulatory elements for transgene expression in lung airways. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 14695-14700.
Corman, V., Bleicker, T., Brunink, S., and Drosten, C. (2020). Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR. https://wwwwhoint/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1pdf.
Cupovic, J., Onder, L., Gil-Cruz, C., Weiler, E., Caviezel-Firner, S., Perez-Shibayama, C., Rulicke, T., Bechmann, I., and Ludewig, B. (2016). Central Nervous System Stromal Cells Control Local CD8(+) T Cell Responses during Virus-Induced Neuroinflammation. Immunity 44, 622-633.
Desforges, M., Le Coupanec, A., Stodola, J.K., Meessen-Pinard, M., and Talbot, P.J. (2014). Human coronaviruses: viral and cellular factors involved in neuroinvasiveness and neuropathogenesis. Virus Res 194, 145-158.
Di Nunzio, F., Felix, T., Arhel, N.J., Nisole, S., Charneau, P., and Beignon, A.S. (2012). HIV-derived vectors for therapy and vaccination against HIV. Vaccine 30, 2499-2509.
Dogan, R.I., Getoor, L., Wilbur, W.J., and Mount, S.M. (2007). Features generated for computational splice-site prediction correspond to functional elements. BMC Bioinformatics 8, 410.
Firat H. et al. The Journal of Gene Medicine 2002; 4: 38-45
Fotuhi, M., Mian, A., Meysami, S., and Raji, C.A. (2020). Neurobiology of COVID-19. J Alzheimers Dis 76, 3-19.
Glass, W.G., Subbarao, K., Murphy, B., and Murphy, P.M. (2004). Mechanisms of host defense following severe acute respiratory syndrome-coronavirus (SARS-CoV) pulmonary infection of mice. J Immunol 173, 4030-4039.
Guo, Y.R., Cao, Q.D., Hong, Z.S., Tan, Y.Y., Chen, S.D., Jin, H.J., Tan, K.S., Wang, D.Y., and Yan, Y. (2020). The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Mil Med Res 7, 11.
Hsieh, C.L., Goldsmith, J.A., Schaub, J.M., DiVenere, A.M., Kuo, H.C., Javanmardi, K., Le, K.C., Wrapp, D., Lee, A.G., Liu, Y., et al. (2020). Structure-based design of prefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes. Science 369, 1501-1505.
Hu, B., Tai, A., and Wang, P. (2011). Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunol Rev 239, 45-61.
Hu, J., Jolkkonen, J., and Zhao, C. (2020). Neurotropism of SARS-CoV-2 and its neuropathological alterations: Similarities with other coronaviruses. Neurosci Biobehav Rev 119, 184-193.
Hoffmann, M., H. Kleine-Weber, S. Schroeder, N. Kruger, T. Herrler, S. Erichsen, T.S. Schiergens, G. Herrler, N.H. Wu, A. Nitsche, M.A. Muller, C. Drosten, and S. Pohlmann. 2020. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell 181:271-280 e278
Jiang, R.D., Liu, M.Q., Chen, Y., Shan, C., Zhou, Y.W., Shen, X.R., Li, Q., Zhang, L., Zhu, Y., Si, H.R., et al. (2020). Pathogenesis of SARS-CoV-2 in Transgenic Mice Expressing Human Angiotensin-Converting Enzyme 2. Cell 182, 50-58 e58.
Koehler, D.R., Chow, Y.H., Plumb, J., Wen, Y., Rafii, B., Belcastro, R., Haardt, M., Lukacs, G.L., Post, M., Tanswell, A.K., et al. (2000). A human epithelium-specific vector optimized in rat pneumocytes for lung gene therapy. Pediatr Res 48, 184-190.
Ku, M.W., Anna, F., Souque, F., Petres, S., Prot, M., Simon-Loriere, E., Charneau, P., and Bourgine, M. (2020). A Single Dose of NILV-Based Vaccine Provides Rapid and Durable Protection against Zika Virus. Mol Ther 2020 May 20;S1525-0016(20)30250-1 doi: 101016/jymthe202005016.
Ku, M.W., Bourgine, M., Authie P., Lopez, J., Nemirov, N., Moncoq, F., Noirat, A., Vesin, B., Nevo, F., Blanc, C., et al. (2021). Intranasal Vaccination with a Lentiviral Vector Protects against SARS-CoV-2 in Preclinical Animal Models
Cell Host and Microbe in press. PMID:　33357418　
Lescure, F.X., Bouadma, L., Nguyen, D., Parisey, M., Wicky, P.H., Behillil, S., Gaymard, A., Bouscambert-Duchamp, M., Donati, F., Le Hingrat, Q., et al. (2020). Clinical and virological data of the first cases of COVID-19 in Europe: a case series. Lancet Infect Dis 20, 697-706.
Li, K., Wohlford-Lenane, C., Perlman, S., Zhao, J., Jewell, A.K., Reznikov, L.R., Gibson-Corley, K.N., Meyerholz, D.K., and McCray, P.B., Jr. (2016). Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus Causes Multiple Organ Damage and Lethal Disease in Mice Transgenic for Human Dipeptidyl Peptidase 4. J Infect Dis 213, 712-722.
Liu, J., Li, S., Liu, J., Liang, B., Wang, X., Wang, H., Li, W., Tong, Q., Yi, J., Zhao, L., et al. (2020). Longitudinal characteristics of lymphocyte responses and cytokine profiles in the peripheral blood of SARS-CoV-2 infected patients. EBioMedicine 55, 102763.
Lopez, J., Anna, F., Authie P., Pawlik, A., Ku, M.W., Blanc, C., Souque, P., Moncoq, F., Noirat, A., Sougakoff, W., et al. (in preparation). An Optimized Poly-antigenic Lentiviral Vector Induces Protective CD4+ T-Cell Immunity and Predicts a Booster Vaccine against Mycobacterium tuberculosis.
Mao, L., Jin, H., Wang, M., Hu, Y., Chen, S., He, Q., Chang, J., Hong, C., Zhou, Y., Wang, D., et al. (2020). Neurologic Manifestations of Hospitalized Patients With Coronavirus Disease 2019 in Wuhan, China. JAMA Neurol 77, 683-690.
McCallum, M., Walls, A.C., Bowen, J.E., Corti, D., and Veesler, D. (2020). Structure-guided covalent stabilization of coronavirus spike glycoprotein trimers in the closed conformation. Nat Struct Mol Biol 27, 942-949.
McCray, P.B., Jr., Pewe, L., Wohlford-Lenane, C., Hickey, M., Manzel, L., Shi, L., Netland, J., Jia, H.P., Halabi, C., Sigmund, C.D., et al. (2007). Lethal infection of K18-hACE2 mice infected with severe acute respiratory syndrome coronavirus. J Virol 81, 813-821.
Meinhardt, J., Radke, J., Dittmayer, C., Franz, J., Thomas, C., Mothes, R., Laue, M., Schneider, J., Brunink, S., Greuel, S., et al. (2020). Olfactory transmucosal SARS-CoV-2 invasion as a port of central nervous system entry in individuals with COVID-19. Nat Neurosci.
Menachery, V.D., Yount, B.L., Jr., Sims, A.C., Debbink, K., Agnihothram, S.S., Gralinski, L.E., Graham, R.L., Scobey, T., Plante, J.A., Royal, S.R., et al. (2016). SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence. Proc Natl Acad Sci U S A 113, 3048-3053.
Munoz-Fontela, C., Dowling, W.E., Funnell, S.G.P., Gsell, P.S., Riveros-Balta, A.X., Albrecht, R.A., Andersen, H., Baric, R.S., Carroll, M.W., Cavaleri, M., et al. (2020). Animal models for COVID-19. Nature 586, 509-515.
Nakagawa, T., and Hoogenraad, C.C. (2011). Lentiviral transgenesis. Methods Mol Biol 693, 117-142.
Netland, J., Meyerholz, D.K., Moore, S., Cassell, M., and Perlman, S. (2008). Severe acute respiratory syndrome coronavirus infection causes neuronal death in the absence of encephalitis in mice transgenic for human ACE2. J Virol 82, 7264-7275.
Park, F. 2007. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis? Physiol Genomics 31:159-173
Politi, L.S., Salsano, E., and Grimaldi, M. (2020). Magnetic Resonance Imaging Alteration of the Brain in a Patient With Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) and Anosmia. JAMA Neurol 77, 1028-1029.
Roman, G.C., Spencer, P.S., Reis, J., Buguet, A., Faris, M.E.A., Katrak, S.M., Lainez, M., Medina, M.T., Meshram, C., Mizusawa, H., et al. (2020). The neurology of COVID-19 revisited: A proposal from the Environmental Neurology Specialty Group of the World Federation of Neurology to implement international neurological registries. J Neurol Sci 414, 116884.
Rosenberg, S.A., Zhai, Y., Yang, J.C., Schwartzentruber, D.J., Hwu, P., Marincola, F.M., Topalian, S.L., Restifo, N.P., Seipp, C.A., Einhorn, J.H., et al. (1998). Immunizing patients with metastatic melanoma using recombinant adenoviruses encoding MART-1 or gp100 melanoma antigens. J Natl Cancer Inst 90, 1894-1900.
Sayes, F., C. Blanc, L.S. Ates, N. Deboosere, M. Orgeur, F. Le Chevalier, M.I. Groschel, W. Frigui, O.R. Song, R. Lo-Man, F. Brossier, W. Sougakoff, D. Bottai, P. Brodin, P. Charneau, R. Brosch, and L. Majlessi. 2018. Multiplexed Quantitation of Intraphagocyte Mycobacterium tuberculosis Secreted Protein Effectors. Cell Rep 23:1072-1084
Schirmbeck, R., Reimann, J., Kochanek, S., and Kreppel, F. (2008). The immunogenicity of adenovirus vectors limits the multispecificity of CD8 T-cell responses to vector-encoded transgenic antigens. Mol Ther 16, 1609-1616.
Sia, S.F., Yan, L.M., Chin, A.W.H., Fung, K., Choy, K.T., Wong, A.Y.L., Kaewpreedee, P., Perera, R., Poon, L.L.M., Nicholls, J.M., et al. (2020). Pathogenesis and transmission of SARS-CoV-2 in golden hamsters. Nature 2020 May 14 doi: 101038/s41586-020-2342-5 Online ahead of printPMID: 32408338.
Song, E., Zhang, C., Israelow, B., Lu-Culligan, A., Prado, A.V., Skriabine, S., Lu, P., Weizman, O.E., Liu, F., Dai, Y., et al. (2020). Neuroinvasion of SARS-CoV-2 in human and mouse brain. bioRxiv.
Sterlin, D., Mathian, A., Miyara, M., Mohr, A., Anna, F., Claer, L., Quentric, P., Fadlallah, J., Devilliers, H., Ghillani, P., et al. (2020). IgA dominates the early neutralizing antibody response to SARS-CoV-2. Sci Transl Med.
Sternberg, A., and Naujokat, C. (2020). Structural features of coronavirus SARS-CoV-2 spike protein: Targets for vaccination. Life Sci 257, 118056.
Tostanoski, L.H., Wegmann, F., Martinot, A.J., Loos, C., McMahan, K., Mercado, N.B., Yu, J., Chan, C.N., Bondoc, S., Starke, C.E., et al. (2020). Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nat Med 26, 1694-1700.
Tseng, C.T., Huang, C., Newman, P., Wang, N., Narayanan, K., Watts, D.M., Makino, S., Packard, M.M., Zaki, S.R., Chan, T.S., et al. (2007). Severe acute respiratory syndrome coronavirus infection of mice transgenic for the human Angiotensin-converting enzyme 2 virus receptor. J Virol 81, 1162-1173. VandenDriessche T. et al. Blood, 1 August 2002- vol. 100, n°3, p. 813-822
von Weyhern, C.H., Kaufmann, I., Neff, F., and Kremer, M. (2020). Early evidence of pronounced brain involvement in fatal COVID-19 outcomes. Lancet 395, e109.
Walls, A.C., Park, Y.J., Tortorici, M.A., Wall, A., McGuire, A.T., and Veesler, D. (2020). Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell 181, 281-292 e286.
Whittaker, A., Anson, M., and Harky, A. (2020). Neurological Manifestations of COVID-19: A systematic review and current update. Acta Neurol Scand 142, 14-22.
Wolfel, R., Corman, V.M., Guggemos, W., Seilmaier, M., Zange, S., Muller, M.A., Niemeyer, D., Jones, T.C., Vollmar, P., Rothe, C., et al. (2020). Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature 581, 465-469.
Xu, J., and Lazartigues, E. (2020). Expression of ACE2 in Human Neurons Supports the Neuro-Invasive Potential of COVID-19 Virus. Cell Mol Neurobiol.
Yang, X.H., Deng, W., Tong, Z., Liu, Y.X., Zhang, L.F., Zhu, H., Gao, H., Huang, L., Liu, Y.L., Ma, C.M., et al. (2007). Mice transgenic for human angiotensin-converting enzyme 2 provide a model for SARS coronavirus infection. Comp Med 57, 450-459.
Zennou, V., Petit, C., Guetard, D., Nerhbass, U., Montagnier, L., and Charneau, P. (2000). HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap. Cell 101, 173-185.
실시예 4 및 5에서 인용된 참고문헌
Buss, L.F., Prete, C.A., Jr., Abrahim, C.M.M., Mendrone, A., Jr., Salomon, T., de Almeida-Neto, C., Franca, R.F.O., Belotti, M.C., Carvalho, M., Costa, A.G., et al. (2021). Three-quarters attack rate of SARS-CoV-2 in the Brazilian Amazon during a largely unmitigated epidemic. Science 371, 288-292.
Hoffmann, M., Arora, P., Gross, R., Seidel, A., Hornich, B.F., Hahn, A.S., Kruger, N., Graichen, L., Hofmann-Winkler, H., Kempf, A., et al. (2021). SARS-CoV-2 variants B.1.351 and P.1 escape from neutralizing antibodies. Cell.
Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., and Rajewsky, K. (1991). A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature 350, 423-426.
Ku, M.W., Bourgine, M., Authie, P., Lopez, J., Nemirov, K., Moncoq, F., Noirat, A., Vesin, B., Nevo, F., Blanc, C., et al. (2021). Intranasal vaccination with a lentiviral vector protects against SARS-CoV-2 in preclinical animal models. Cell Host Microbe 29, 236-249 e236.
SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR THERAVECTYS <120> SARS-COV-2 IMMUNOGENIC COMPOSITIONS, VACCINES, AND METHODS <130> IP20234254FR <150> US 63/052,264 <151> 2020-07-15 <150> US 63/130,202 <151> 2020-12-23 <150> PCT/IB2021/000293 <151> 2021-02-02 <160> 152 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1273 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 1 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe 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<211> 1273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 120 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Phe Thr Asn Arg Thr Gln Leu Pro Ser Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Tyr Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys 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Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Thr Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu Tyr Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn 1010 1015 1020 Leu Ala Ala Ile Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys 1025 1030 1035 Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro 1040 1045 1050 Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val 1055 1060 1065 Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His 1070 1075 1080 Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn 1085 1090 1095 Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln 1100 1105 1110 Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val 1115 1120 1125 Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro 1130 1135 1140 Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn 1145 1150 1155 His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn 1160 1165 1170 Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu 1175 1180 1185 Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu 1190 1195 1200 Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu 1205 1210 1215 Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met 1220 1225 1230 Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro 1250 1255 1260 Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 121 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr 1 5 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 122 Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala 1 5 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 123 Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile 1 5 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 124 Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val 1 5 10 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 125 Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 126 Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val 1 5 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 127 Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu 1 5 10 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 128 Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 129 Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 130 Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu 1 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 131 Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 132 Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 133 Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val 1 5 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 134 Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 135 Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 136 Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 1 5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 137 Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 138 Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 1 5 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 139 Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg 1 5 <210> 140 <211> 10 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 140 Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe 1 5 10 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 141 Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 142 Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe 1 5 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 143 Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe 1 5 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 144 Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 1 5 <210> 145 <211> 8 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 145 Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 146 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 147 Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 148 Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr 1 5 <210> 149 <211> 9 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 149 Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp 1 5 <210> 150 <211> 15 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 150 Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu 1 5 10 15 <210> 151 <211> 15 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 151 Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met 1 5 10 15 <210> 152 <211> 18 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 152 Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala 1 5 10 15 Thr Lys

Claims (64)

  1. 대상체에서 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 보호 면역 반응을 유도하고/하거나 활성화하는 방법으로서, SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 작용제 유효량을 상기 대상체의 상기도에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 작용제는 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    작용제는 에어로졸 흡입에 의해 투여되는, 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    작용제는 비강 점적(nasal instillation)에 의해 투여되는, 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    작용제는 비강 흡입(nasal insufflation)에 의해 투여되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 과정은 상기도에의 단일 투여로 구성되거나, 치료 과정은 상기도에의 1회 초과의 투여, 특히 2회 투여를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 과정은, 근육내, 피내 또는 피하 투여와 같은 기도 외부에 적어도 1회 프라이밍 투여한 후, 상기도에 적어도 1회 부스팅 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    보호 면역 반응은 대상체에서 SARS-CoV-2 중화 항체의 생성을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    중화 항체는 IgG 항체를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    보호 면역 반응은 대상체에서 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포의 생성을 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다를 포함하는, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 폐 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 IFN-γ 생산 T-세포를 포함하는, 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD8+ T 세포는 이펙터 메모리(Tem) 및/또는 상주 메모리(Trm) 표현형을 갖는 T 세포를 포함하는, 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 후각 망울로 동원되는(recruited), 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    보호 면역 반응은 대상체에서 SARS-CoV-2 감염 관련 염증이 발생할 가능성을 감소시키는, 방법.
  17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1과 동일한 아미노산 서열을 가지고, SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열로부터 발현되고, SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열로부터 발현되는, 방법.
  19. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S 단백질 유도체 또는 이의 단편은 펩티드 61-75 (NVTWFHAIHVSGTNG(서열번호 15)), 펩티드 536-550 (NKCVNFNFNGLTGTG(서열번호 16)) 및 펩티드 576-590 (VRDPQTLEILDITPC(서열번호 17))로부터 선택된 펩티드를 포함하는, 방법.
  20. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S 유도체 또는 이의 단편은 서열번호 1에 대한 아미노산 변형을 포함하며, 상기 변형은:
    (i) 986K→P 및 987V→P,
    (ii) 681PRRARS686 (서열번호 22) → 681PGSAGS686 (서열번호 23), 및
    (iii) 986K→P, 987V→P, 및 675QTQTNSPRRAR685(서열번호 24) 결실
    로부터 선택되는, 방법.
  21. 제2항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 1, 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 및 120로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 방법.
  22. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여된 렌티바이러스 벡터 입자는 통합적인(integrative), 방법.
  23. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여된 렌티바이러스 벡터 입자는 비통합적인, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    투여된 비통합 렌티바이러스 입자는 인테그라제 코딩 서열에서 D64V 돌연변이를 포함하는, 방법.
  25. 제2항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여된 렌티바이러스 벡터 입자는 수포성 구내염 바이러스 외피 당단백질(VSV-G)로 슈도타이핑된, 방법.
  26. 제2항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    렌티바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 벡터 입자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신 제제(vaccine formulation)로서 투여되는, 방법.
  27. 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자를 대상체의 상기도에 투여하기 위한 제형(dosage form).
  28. 제27항에 있어서,
    상기 제형은 에어로졸 흡입에 의한 투여를 위한 것인, 제형.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 제형은 비강 점적에 의한 투여를 위한 것인, 제형.
  30. 제27항에 있어서,
    상기 제형은 비강 흡입에 의한 투여를 위한 것인, 제형.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 1과 동일한 아미노산 서열을 가지고, SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 제형.
  32. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열로부터 발현되고, SARS-CoV-2 S 단백질 유도체는 서열번호 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열로부터 발현되는, 제형.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S 단백질 유도체 또는 이의 단편은 펩티드 61-75 (NVTWFHAIHVSGTNG(서열번호 15)), 펩티드 536-550 (NKCVNFNFNGLTGTG(서열번호 16)) 및 펩티드 576-590 (VRDPQTLEILDITPC(서열번호 17))로부터 선택된 펩티드를 포함하는, 제형.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-CoV-2 S 유도체 또는 이의 단편은 서열번호 1에 대한 아미노산 변형을 포함하며, 상기 변형은:
    (i) 986K→P 및 987V→P,
    (ii) 681PRRARS686(서열번호 22) → 681PGSAGS686(서열번호 23), 및
    (iii) 986K→P, 987V→P, 및 675QTQTNSPRRAR685(서열번호 24) 결실
    로부터 선택되는, 제형.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 1, 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 및 120로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 제형.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여된 렌티바이러스 벡터 입자는 통합적인, 제형.
  37. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여된 렌티바이러스 벡터 입자는 비통합적인, 제형.
  38. 제37항에 있어서,
    비통합 렌티바이러스 입자는 인테그라제 코딩 서열에서 D64V 돌연변이를 포함하는, 제형.
  39. 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    렌티바이러스 벡터 입자는 수포성 구내염 바이러스 외피 당단백질(VSV-G)로 슈도타이핑된, 제형.
  40. 제27항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자의 제형, 및 상기도에 투여하기 위한 어플리케이터를 포함하는 키트.
  41. 제40항에 있어서,
    상기도에 투여하기 위한 어플리케이터는 에어로졸 흡입용 어플리케이터인, 키트.
  42. 제40항에 있어서,
    상기도에 투여하기 위한 어플리케이터는 비강 점적을 위한 어플리케이터인, 키트.
  43. 제40항에 있어서,
    상기도에 투여하기 위한 어플리케이터는 비강 흡입용 어플리케이터인, 키트.
  44. 하기로부터 선택되는 벡터:
    pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm (CNCM I-5537),
    pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm (CNCM I-5538),
    pFlap-ieCMV-S2P-WPREm (CNCM I-5539),
    pFlap-ieCMV-SFL-WPREm (CNCM I-5540),
    pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708),
    pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709),
    pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710),
    pFlap-ieCMV--SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711), 및
    pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712).
  45. 제38항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  46. 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자.
  47. 제46항에 있어서,
    암호화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 유도체 또는 이의 단편은 청구항 31 내지 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 것인, 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서,
    SARS-CoV-2 스파이크 단백질은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질; 서열번호 1과 적어도 95% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체; 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 108, 서열번호 111, 서열번호 114, 서열번호 117, 또는 서열번호 120의 아미노산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 유도체; 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 108, 서열번호 111, 서열번호 114, 서열번호 117, 또는 서열번호 120과 적어도 95% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체; 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 단편 또는 서열번호 14과 적어도 95% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 S 단백질 유도체;로부터 선택되는, 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자는 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인, 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자.
  50. 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자로서, 상기 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자는:
    pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm (CNCM I-5537),
    pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm (CNCM I-5538),
    pFlap-ieCMV-S2P-WPREm (CNCM I-5539),
    pFlap-ieCMV-SFL-WPREm (CNCM I-5540),
    pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708),
    pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709),
    pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710),
    pFlap-ieCMV--SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711), 및
    pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712)
    로부터 선택되는 벡터로 숙주 세포를 공동-형질감염하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자.
  51. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    벡터 입자의 게놈이 다음으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터 입자:
    - 서열번호 13의 S2P△F(S2PdeltaF), 또는 서열번호 13과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열, 특히 RBD에서 돌연변이, 특히 결실을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
    - 서열번호 10의 S2P3F, 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 10과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로, 특히 여기서 서열번호 10과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열은 돌연변이 986K→P and 987V→P를 포함하는 코딩 서열인, 폴리뉴클레오티드,
    - 서열번호 7의 S2P, 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 7과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
    - 서열번호 2의 SFL, 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
    - 서열번호 107의 S-B1.1.7, 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 107과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
    - 서열번호 110의 S-B351, 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 110과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
    - 서열번호 113의 S-B1.1.7 S-B351-2P, 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 113과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열를 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
    - 서열번호 116의 SFL-D614G, 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 116과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및
    - 서열번호 119의 S-P1, 또는 RBD에서 돌연변이를 갖는 서열번호 119와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 코딩 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  52. 제27항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 제형 또는 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 슈도타이핑된 렌티바이러스 입자를 포함하는, 면역원성 조성물.
  53. 제52항에 있어서,
    대상체에서 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 보호 면역 반응을 유도하고/하거나 활성화하기 위해 사용하기 위한 것이고, 상기 사용은 상기도 외부에의 프라임 투여, 특히 전신, 특히 근육내 투여 및 상기도에의 부스트 또는 표적 투여를 포함하는, 면역원성 조성물.
  54. 제52항에 있어서,
    제53항에 따라 사용하기 위한 것이고, 투여량 또는 LV 입자는 프라임 및 부스트/표적 투여 단계에서 동일하거나, 또는 투여량 또는 LV 입자는 프라임 및 부스트/표적 투여 단계에서 상이하고, 특히 상기도에의 투여의 경우에 더 높을 수 있는, 면역원성 조성물.
  55. 제52항에 있어서,
    제53항 또는 제54항에 따라 사용하기 위한 것이고, 렌티바이러스 벡터 입자는 LV::SFL, 특히 NILV::SFL이고, 투여 요법은 전신 투여, 특히 상기도에의 i.m. 프라임 및 부스트 투여, 특히 i.n. 부스트 투여로 구성되는, 면역원성 조성물.
  56. 제52항에 있어서,
    제53항 또는 제54항에 따라 사용하기 위한 것이고, 렌티바이러스 벡터 입자는 LV::Sprefusion, 특히 NILV::Sprefusion, 예컨대 LV::S2P△F(LV::S2deltaF) 또는 NILV::S2P△F(NILV::S2deltaF), 또는 LV::S2P3F 또는 NI LV::S2P3F이고, 투여 요법은 전신 투여, 특히 상기도에의 i.m. 프라임 및 부스트 투여, 특히 i.n. 부스트 투여로 구성되는, 면역원성 조성물.
  57. 제52항에 있어서,
    대상체의 상기도 및/또는 뇌에서 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 사용하기 위한 것인, 면역원성 조성물.
  58. 제52항에 있어서,
    B 및 T 세포 반응을 유도함으로써, SARS-CoV-2 Wuhan 균주, SARS-CoV-2 D614G 균주 및 SARS-CoV-2 B1.117 균주의 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2를 포함하는 조상 및 SARS-CoV-2 P.1 변종과 같은 새로운(emerging) SARS-CoV-2 변종에 대해 폐 및 뇌의 교차 보호 면역 반응을 유도하기 위해 사용하기 위한 것인, 면역원성 조성물.
  59. 제52항에 있어서,
    제53항 내지 제58항에 따라 사용하기 위한 것이고, 투여 형태 또는 슈도타이핑된 렌티바이러스 입자는 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 슈도타이핑된 렌티바이러스 입자를 포함하고, 여기서 슈도타이핑된 렌티바이러스 입자는 비통합적인(non-integrative) 것인, 면역원성 조성물.
  60. 제52항에 있어서,
    SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 제53항 또는 제58항에 따라 사용하기 위한 것이고, 여기서 반응은 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포, 특히 폐 CD8+ T 세포 및/또는 IFN-γ 생산 T 세포를 포함하는 SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포를 유도하는, 면역원성 조성물.
  61. 제52항에 있어서,
    SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 것이고, 여기서 반응은 이펙터 메모리(Tem) 및/또는 상주 메모리(Trm) 표현형을 갖는 T 세포를 포함하는 CD8+ T 세포를 유도하는, 면역원성 조성물.
  62. 제52항에 있어서,
    제53항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 것이고, SARS-CoV-2 S-특이적 T 세포는 후각 망울로 동원되는, 면역원성 조성물.
  63. 제52항에 있어서,
    제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 것이고, 중증 급성 호흡기 증후군 베타-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 스파이크(S) 단백질 또는 이의 유도체 또는 단편은 서열번호 1, 5, 8, 11, 14, 108, 111, 114, 117 및 120로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 면역원성 조성물.
  64. 제52항에 있어서,
    대상체에서 SARS-CoV-2 감염 관련 염증을 예방하거나 완화하기 위해 제53항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 것인, 면역원성 조성물.
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