KR20230156394A - Mhc-ii 경로에 대한 항원을 표적화하고 숙주에서 보호 cd8+ 및 cd4+ t 세포 면역성을 유도하는 렌티바이러스 벡터 - Google Patents

Mhc-ii 경로에 대한 항원을 표적화하고 숙주에서 보호 cd8+ 및 cd4+ t 세포 면역성을 유도하는 렌티바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈에 관한 것으로, 상기 융합 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단으로 정렬된: (i) MHC-II-관련 경불변 쇄(li), 또는 (ii) 트랜스페린 수용체(TfR)의 막관통 도메인, 및 병원체의 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함한다.

Description

MHC-II 경로에 대한 항원을 표적화하고 숙주에서 보호 CD8+ 및 CD4+ T 세포 면역성을 유도하는 렌티바이러스 벡터
본 발명은 MHC-I뿐만 아니라 MHC-II 경로에도 면역원을 전달하고 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 데 활용되는 새로운 세대의 벡터를 제공하도록 설계된 렌티바이러스 벡터에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 숙주, 특히 포유동물 숙주, 특히 이를 필요로 하는 인간 숙주에서 면역 반응을 유발하는 이의 목적을 위해 선택된 항원(들)을 발현하는 이러한 렌티바이러스 벡터에 관한 것이고 여기서 면역 반응은 CD4+ T- 세포 반응을 포함한다. 항원은 단일 항원 또는 다중 항원과 융합된 MHC-II 경로-지정 분자(pathway-addressing molecule)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 암호화(encoding)하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 벡터의 렌티바이러스 골격(backbone)내 삽입물로부터 발현될 수 있다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 면역 조성물, 바람직하게는 백신 후보물, 특히 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에 적합한 백신의 설계에 사용하기 위해 제공된다.
렌티바이러스 벡터(LV)는 특히 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell; APC)를 포함하여 숙주 세포의 핵으로의 유전자 전달의 뛰어난 잠재능에 의존하는, 가장 효율적인 백신 플랫폼(vaccine platform) 중 하나를 제공한다. 이러한 유전자의 핵 전달은 CD8+ T 세포를 추가로 촉발(triggering)하기 위해, 주요 조직적합성 복합체 부류-I(Major Histocompatibility Complex Class-I; MHC-I) 제시 기구(presentation machinery), 즉 프로테아좀에 쉽게 접근하는 항원의 발현을 개시한다. 내인성으로 생성된 항원을 MHC-I 경로로 전달하는데 있어서 이의 실질적인 능력과는 전혀 대조적으로, LV를 포함하는 바이러스 벡터는 분비되지 않은 항원을 엔도솜 MHC-II 구획(MHC-II compartment; MIIC)으로 전달하는 데 거의 효과적이지 않거나 작동하지 않고 CD4+ T 세포를 촉발할 수 없다. CD8+ T 세포는 감염성 질환 또는 종양 성장의 면역 조절에 크게 기여하지만, CD4+ T 세포는 주요 면역 역할인자(major immune player)이다. 이의 긴 수명(lifespan)과 이의 자체의 직접적인 효과기 기능 외에도, CD4+ T 세포는 선천성 면역성을 조절하고 B-세포 반응을 조정하며 CD8+ T 세포 효과기 기능을 지원함으로써 면역계를 조율한다. 따라서 LV의 잠재력을 활용하여 CD4+ T 세포를 유도하는 것은 백신 전략의 성공률을 극대화할 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈에 관한 것이며, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 정렬된:
- (i) 바람직하게는 서열 번호: 11의 MHC-II-관련된 경 불변 쇄(MHC-II-associated light invariant chain)(1i), 또는 (ii) 바람직하게는 서열 번호: 13의 트랜스페린 수용체(transferrins receptor; TfR)의 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 제1의 폴리펩티드, 및
- 병원체의 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터 게놈을 포함하는 DNA 플라스미드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 재조합 렌티바이러스 벡터 입자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 융합 폴리펩티드에 관한 것으로, 이는 N-말단에서 C-말단으로 정렬된:
- (i) 바람직하게는 서열 번호: 11의 MHC-II-관련된 경 불변 쇄(MHC-II-associated light invariant chain)(1i), 또는 (ii) 바람직하게는 서열 번호: 13의 트랜스페린 수용체(transferrins receptor; TfR)의 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 제1의 폴리펩티드, 및
- 병원체의 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA 플라스미드로 형질감염된, 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포, 특히 인간 숙주 세포에 관한 것이며, 특히 여기서 상기 숙주 세포는 HEK-293T 세포주 또는 K562 세포주이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터, 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자, 또는 본 발명의 숙주 세포를 이를 필요로 하는 숙주, 특히 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들)과 함께 포함하는, 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에게 투여하기에 적합한, 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 항원성 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편에 함유된 에피토프에 대해 지시된 T-세포 반응, 및/또는 이를 필요로 하는 숙주, 특히 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에서 체액성 반응을 유발함으로써 보호성, 바람직하게는 예방적, 면역 반응을 유발하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 다음의 단계를 포함하는, 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물의 제조에 적합한 재조합 렌티바이러스 벡터 입자의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터 게놈을 수반하는 재조합 렌티바이러스 전달 벡터 또는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드를 숙주 세포, 예를 들어 HEK-293T 세포주 또는 K562 세포주 내 형질감염시키는 단계;
b) 단계 a)의 세포를 (i) 패키징 작제물(packaging construct)로서 렌티바이러스 GAG 및 POL 또는 돌연변이된 POL 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터; 및 (ii) VSV-G 인디애나(VSV-G indiana) 또는 뉴저지 엔벨로프(New Jersey envelope)를 암호화하는 플라스미드로 공-형질감염(co-transfection)시키는 단계;
c) 본 발명의 융합 폴리펩티드를 발현하는 재조합 렌티바이러스 벡터 입자의 생산에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
d) 본 발명의 융합 폴리펩티드를 발현하는 재조합 렌티바이러스 입자를 회수하는 단계.
본 발명자는 재조합 융합 단백질을 암호화하는 렌티바이러스 벡터의 플랫폼을 설계 및 제조하였고, 여기서 하나 또는 수개의 항원은 단백질 도메인에 융합되어, 엔도솜(endosome)을 통해 이동(traffic)하는 막-결합된 단백질(membrane-bound protein)을 생성함으로써, 항원(들)을 MHC-II 기구에 전달한다. 본 발명자는 MHC-II-경로-전달 단백질 도메인, 특히 MHC-II 복합체와 관련된 경 불변 쇄(light invariant chain)(1i), 및 트랜스페린 수용체의 막관통 도메인(transmembrane domain)이, 병원체의 항원(들)과 융합되는 경우, 항원이 MHC-II 분자를 발현하는 항원 제시 세포로 프로세싱(processing)되는 경우, 상기 항원을 발현하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 사용하여, MHC-II 항원 제시 및 강력한 CD4+ T 세포 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 발견하였다. 기존의 렌티바이러스 플랫폼의 T 세포 면역원성은 대부분 CD8+ T-세포 면역 반응으로 제한되었으므로, 이는 예상치 못한 것이다.
본 발명자는 또한 항원(들)의 MHC-II 제시가 항원(들)의 MHC-I 제시에 유해한 영향을 나타내지 않음으로써 제시 경로 둘 다를 포함하는 면역 반응의 유발을 가능하게 한다는 것을 관찰하였다.
따라서 본 발명은 하나 또는 수개의 항원성 도메인과 융합된 MHC-II-경로-전달 도메인을 포함하는 다중-도메인 재조합 단백질(multi-domain recombinant protein)로서 발현된 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈을 개시한다.
융합 폴리펩티드는 렌티바이러스 전달 벡터의 골격 내에 재조합된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되어 면역 반응, 특히 보호성 면역 반응 또는 유리하게는 항원(들)을 제공하는 병원체에 대해 멸균 보호를 유발하기 위한 항원(들)을 지닌 융합 폴리펩티드를 발현하는 렌티바이러스 벡터 입자를 제조할 수 있도록 한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈에 관한 것이며, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 정렬된:
- (i) 바람직하게는 서열 번호: 11의, MHC-II-관련된 경 불변 쇄(MHC-II-associated light invariant chain)(1i), 또는 (ii) 바람직하게는 서열 번호: 13의, 트랜스페린 수용체(transferrins receptor; TfR)의 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 제1의 폴리펩티드, 및
- 병원체의 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 병원체의 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드와 융합된 MHC-II-관련된 경 불변 쇄(1i)을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 병원체의 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드와 융합된 트랜스페린 수용체(TfR)의 막관통 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명에 따라서, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 프레임 내(in-frame)에서 서로 연결되어 융합 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 키메라 유전자(chimeric gene)를 생성하는 경우 2개의 폴리펩티드는 서로 융합된다. 본 발명에서, 항원성 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 제1의 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열과 관련하여 3' 위치에서 연결된다. 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 융합은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 제1의 폴리펩티드 C-말단이 제2의 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 공유결합으로 결합되는 경우 2개의 폴리펩티드는 직접적으로 융합된다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 간접적으로 융합되는데, 즉, 링커 또는 스페이서 펩티드 또는 추가의 폴리펩티드가 2개의 융합된 폴리펩티드 사이에 존재한다.
불변 쇄는 바람직하게는 인간 MHC-II 관련된 경 불변 쇄이다. 일 구현예에서, 경 불변 쇄는 서열 번호: 11의 서열 또는 서열 번호: 11과 적어도 70%, 바람직하게는 80% 또는 85%, 바람직하게는 90% 또는 95%, 여전히 바람직하게는 98 또는 99%의 아미노산 서열 동일성(identity)을 지닌 아미노산 서열을 포함하고, 특히 이로 이루어진다. 일 구현예에서, 경 불변 쇄는 서열 번호: 11과 관련하여 1 내지 10개, 특히 1 내지 5개, 더욱 특히 1 내지 3개의 아미노산 변화를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 변화는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있다.
트랜스페린 수용체는 천연적으로 트랜스페린에 대한 운반 단백질(carrier protein)로서 작용한다. 이의 기능은 수용체-매개된 세포내이입(receptor-mediated endocytosis)을 통해 트랜스페린-철 복합체를 내재화(internalizing)하여 철을 세포 내로 도입시키는 것이다. 본 발명에서 트랜스페린 수용체는 바람직하게는 인간 트랜스페린 수용체이다.
따라서, 융합 폴리펩티드는 인간 트랜스페린 수용체의 막관통 도메인, 바람직하게는 인간 트랜스페린 수용체의 1 내지 118번 아미노산을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드 내에 포함된 바와 같은, 트랜스페린 수용체의 막관통 도메인은 서열번호: 13의 서열 또는 서열 번호: 13과 적어도 70%, 바람직하게는 80% 또는 85%, 바람직하게는 90% 또는 95%, 여전히 바람직하게는 98 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 지닌 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이로 이루어진다. 일 구현예에서, 트랜스페린 수용체의 막관통 도메인은 서열 번호: 13과 관련하여, 1 내지 10개, 특히 1 내지 5개, 보다 특히 1 내지 3개의 아미노산 변화를 갖는다.
본 발명에 따라서, 융합 폴리펩티드는 1개 또는 수개의 항원을 수반한다.
일 구현예에서, 항원성 폴리펩티드는 병원체의 하나의 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 단일-항원성 폴리펩티드(mono-antigenic polypeptide)이다. 대안적으로, 상기 항원성 폴리펩티드는 하나 이상의 병원체의 적어도 2개의 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 다중-항원성 폴리펩티드(poly-antigenic polypeptide)이다.
"항원" 또는 "항원성 폴리펩티드"는 병원성 유기체의 야생형 또는 천연 항원으로서, 또는 이러한 야생형의 천연 항원의 단편으로서, 또는 야생형 또는 천연 항원과 관련하여 돌연변이된 특히 치환된 아미노산 잔기를 5% 미만으로 포함하는 돌연변이된 폴리펩티드로서 본원에 정의된다. 돌연변이는 특수한 관점에서 야생형 또는 천연 항원의 아미노산 서열의 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기의 점 돌연변이(point mutation)이다. 야생형 또는 천연 항원의 단편은 유리하게는 이것이 유래된 폴리펩티드의 면역원성 특성을 유지하거나, 이것이 본 발명의 렌티바이러스 벡터에 의해 발현되는 경우 증진된 면역원성 특성을 나타내고, 숙주에서 발현되는 경우 유리하게는 면역 보호 특성을 나타낸다. 항원의 단편은 하나 또는 여러 개의 에피토프(들), 특히 T 세포 에피토프 및 보다 특히 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 에피토프 또는 둘 다를 제공하기에 충분하고 면역원성, 특히 이로부터 이것이 유래되고/되거나 본 발명의 렌티바이러스 벡터에 의해 발현된 경우 이러한 보호 특성을 나타내는 항원성 폴리펩티드의 보호 활성을 초래하는 보호 특성을 유지하는 아미노산 서열을 갖는다.
표현 "T-세포 에피토프"는 T 세포에 의해 구동된 적응성 면역 반응(adaptive immune response)에 포함된 항원성 결정인자(antigenic determinant)를 지칭한다. 특히, 상기 T-세포 에피토프는, 적합한 조건에서 숙주로 전달되는 경우, T 세포를 유발시킨다. 특수한 구현예에 따라서, 본 발명에 따라 표적화된 항원성 폴리펩티드 및 이러한 항원성 폴리펩티드의 폴리펩티드 유도체는 에피토프(들) 매개된 CD4+ T-세포 반응 및 유리하게는 또한 에피토프(들) 매개된 CD8+ T-세포 반응을 포함한다.
본 발명에 기재되고 사용된 폴리펩티드 및 항원은 천연 단백질과 적어도 50%의 아미노산 동일성, 특히 적어도 60%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 80%, 보다 특히 적어도 90 또는 95%, 보다 특히 적어도 99%의 동일성 이상의 아미노산 동일성을 가질 수 있다. 95%, 특히 적어도 99% 동일성을 가질 수 있다.
특수한 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 항원(및/또는 병원체의 천연 또는 야생형 결정 항원과 관련하여 항원성 단편 또는 돌연변이된 항원)을 적어도 2개, 특히 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 및 특히 2, 3, 4 또는 5개를 제공하고, 따라서 적어도 2개, 적어도 3개 또는 최소 4개를 포함한다. 특수한 구현예에서, 융합 폴리펩티드에 함유된 항원성 폴리펩티드는 6개 이하의 항원 또는 항원성 단편 또는 이의 돌연변이된 단편의 융합체를 포함하거나 이로 이루어진다. 발명자는 본 발명의 융합 폴리펩티드가 제1의 폴리펩티드 뒤에 융합된, 큰 항원성 폴리펩티드의 발현을 구동시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 일 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 적어도 200개의 아미노산, 특히 적어도 300개의 아미노산, 특히 적어도 400개의 아미노산, 보다 특히 적어도 500개 또는 600개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 200 내지 1000개의 아미노산, 특히 200 내지 800개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 렌티바이러스 벡터에 의해 발현된 1개 또는 수개의 항원을 포함하는, 항원성 폴리펩티드는 적어도 100개의 아미노산, 특히 적어도 300개의 아미노산, 보다 특히 적어도 400개 또는 500개 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 항원성 폴리펩티드는 100 내지 1000개의 아미노산, 특히 200 내지 600개의 아미노산을 포함한다.
항원성 폴리펩티드는 링커를 통해 제1의 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 유사하게는, 수개의 항원(들) 또는 이의 면역원성 단편이 융합 폴리펩티드 내에 존재하는 경우, 항원의 서열은 링커 서열에 의해 분리되어, 네오-에피토프(neo-epitope)의 형성을 피할 수 있다. 특히, 4개의 아미노산 링커 GGGD, NNGG 또는 NNDD와 같은 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 적합한 링커는 또한 실시예, 특히 표 S3에 나타나 있다.
바람직하게는, 하나 이상의 항원을 선택하고 융합 폴리펩티드 내에서 정렬시켜 예를 들면, 융합 폴리펩티드가 발현되는 경우 항원(들)의 천연의 3차 구조를 보존한다. 천연 단백질 폴딩(folding)을 보존함으로써, 렌티바이러스 벡터는 MHC-II 기구로의 효율적인 항원 경로를 유도할 수 있다.
일 구현예에서, 병원체는 세균, 기생충 또는 바이러스 병원체, 특히 포유동물 또는 인간 숙주를 감염시키는 병원체로부터 선택되거나 종양 항원 또는 이의 면역원성 단편, 특히 포유동물 종양, 특히 인간 종양으로부터의 항원 또는 이의 면역원성 단편이다. 일 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 적어도 2개의 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 항원 또는 이의 면역원성 단편은 동일한 또는 별개의 병원체로부터 선택된다. 일 구현예에서, 병원체는 급성 또는 만성 호흡기 감염성 질환과 관련되고 특히 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis; Mtb), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 특히 A형, B형 또는 C형 인플루엔자 바이러스, 보다 구체적으로 H1N1, H2N2 또는 H3N2 인플루엔자 바이러스, 또는 코로나바이러스, 특히 SARS-CoV-2로부터 선택될 수 있다.
특히, 항원성 폴리펩티드는 특히 EsxA (UniProtKB - P9WNK7), EspC (UniProtKB - P9WJD7), EsxH (UniProtKB - P9WNK3), PE19 (UniProtKB - Q79FK4) 또는 Ag85A (UniProtKB - P9WQP3)로부터 선택된 하나 이상의 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mtb) 항원, 또는 이의 면역원성 단편(들), 특히 초기 메티오닌이 결여된 단편을 포함할 수 있다. 바람직하게는 EsxH의 면역원성 단편은 서열 번호: 15의 MHC 에피토프 및/또는 서열 번호: 16의 MHC 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, EsxA의 면역원성 단편은 서열 번호: 17의 MHC 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, PE19의 면역원성 단편은 서열 번호: 18의 MHC 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, Ag85A의 면역원성 단편은 서열 번호: 19의 MHC 에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 항원성 폴리펩티드는 다음의 Mtb 항원성 조합 중 하나를 포함할 수 있다:
(a) EsxH;
(b) EsxH 및 EsxA;
(c) EsxH, EsxA 및 PE19;
(d) EsxH, EsxA, EspC 및 PE19;
(e) EsxH, EsxA, EspC, PE19 및 Ag85A;
또는 이의 면역원성 단편, 특히 본원에 언급된 MHC 에피토프를 포함하는 면역원성 단편의 조합.
일 구현예에서, 항원성 폴리펩티드 및/또는 항원성 폴리펩티드를 함유하는 융합 폴리펩티드는 오브알부민의 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열 번호: 24에 제시된 서열을 가지며, 여기서 항원성 폴리펩티드의 서열은 관심 있는 다른 목적한 항원성 폴리펩티드로 대체될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 DNA, 특히 cDNA일 수 있거나 RNA, 특히 안정화된 RNA일 수 있다. RNA 서열은 티민(T) 핵염기가 우라실(U) 핵염기로 대체된 DNA 서열로부터 유추될 수 있다. RNA 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 cDNA의 전사에 의해 수득될 수 있거나 합성될 수 있다.
핵산 분자는 항원(들)을 포함하는 융합 폴리펩티드의 전사 또는 발현을 위한 제어 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이는 또한 플라스미드 또는 벡터 게놈(전달 플라스미드), 특히 렌티바이러스 벡터 게놈과 같은 별개의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되기 위해, 변형될 수 있다. 이는 또한 변형되어, 특히 RNA로서 사용하기 위해서와 같이 보다 안정하게 될 수 있다. 추가의 구현예에서, 핵산은 포유동물 세포, 각각 인간 세포에서의 발현을 위해 포유동물 코돈 최적화된, 특히 인간 코돈 최적화된 서열이다.
본 발명은 또한 숙주에서 면역 반응을 유발하기 위해 선택된 항원(들)을 운반하는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자와 재조합된 플라스미드 벡터에 관한 것이다.
일 구현예에서, 플라스미드 벡터는 전달 벡터, 특히 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 게놈을 제공하기에 적합한 렌티바이러스 전달 벡터이다. 렌티바이러스 벡터는 숙주에서 생체 내(in vivo) 발현된 경우 이의 융합 폴리펩티드 내에서 선택된 항원성 폴리펩티드(들)를 발현한다.
특수한 구현예에서, 전달 벡터의 게놈을 함유하는 핵산 분자는 벡터 게놈이 숙주에게 투여하기 위해 사용된 렌티바이러스 벡터 입자로 제공되는 경우 융합 폴리펩티드로서 이의 발현을 위해, 병원체의 선택된 항원(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 재조합된 렌티바이러스 골격 벡터를 포함하는 플라스미드로서 제공된다.
추가로, 핵산 분자는 전사 제어 및/또는 발현 제어를 위한 서열을 함유할 수 있고/있거나, 플라스미드 또는 벡터 게놈에 대한 연결과 같은 별개의 핵산에 대한 연결을 위한 서열을 함유할 수 있다. 따라서 핵산은 제한 부위(들)에 대한 하나 이상의 서열, Kozak 서열, 프로모터 또는 본 명세서에 개시되고 실시예에 예시된 다른 서열을 함유할 수 있다.
표현 "벡터"는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이러한 벡터와 함께 투여되는 숙주의 세포에 전달하는데 적합한 생물학적 또는 화학적 실체에 관한 것이다. 벡터는 당해 분야에 잘 알려져 있으며 사람을 감염시키는 렌티바이러스와 같이 본원에 기술된 것과 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명은 특히 HIV 벡터, 특히 실시예에 예시된 HIV-1 벡터의 용도에 관한 것이다. HIV-1 벡터의 작제에 대한 세부사항은 당해 분야에 공지되어 있으며 실시예에 제공되어 있다.
본 발명에 따라서, 항원성 폴리펩티드를 발현하는 렌티바이러스 벡터가 제공되며, 여기서 벡터는 이의 게놈(벡터 게놈) 내에 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 갖거나 포함하며, 상기 융합 폴리펩티드는 특히 병원체의 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터, 특히 바람직한 HIV-1 기반 벡터는 복제-불능 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터(replication-incompetent pseudotyped lentiviral vector), 특히 복제 불능 슈도타입화된 HIV-1 렌티바이러스 벡터일 수 있으며, 여기서 상기 벡터는 포유동물 코돈-최적화된(codon-optimized) 합성 핵산, 특히 인간-코돈 최적화된 합성 핵산을 포함하는 게놈을 함유하고, 상기 합성 핵산은 항원성 폴리펩티드(들), 특히 포유동물, 특히 인간 숙주를 감염시키는 결정된 병원체의 항원성 폴리펩티드(들)를 포함하는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 암호화한다. 렌티바이러스 벡터는 인디애나 또는 뉴저지 혈청형의 수포성 구내염 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus; V-SVG)로부터의 당단백질 G로 슈도타입화될 수 있다.
벡터 입자의 게놈에서 코돈 최적화된 서열의 사용은 특히 mRNA 안정성을 증진시키거나 2차 구조를 감소시킴으로써, 벡터가 투여된 숙주의 세포에서 항원성 폴리펩티드의 특히 강력한 발현을 허용한다. 또한, 발현된 항원성 폴리펩티드는 특히 암호화된 폴리펩티드 내의 해독 변형 부위(예를 들면, 글리코실화 부위)를 변형시킴으로써, 숙주의 세포에서 항원성 폴리펩티드를 프로세싱하는데 적합한, 해독 후 변형(post translational modification)을 겪는다. GeneArt(Life technologies-USA) 및 DNA2.0(Menlo Park, California - USA)에 의해 이용 가능하게 된 것과 같은 알고리즘 및 서비스를 포함하는 코돈 최적화 도구는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 특수한 구현예에서, 코돈-최적화는 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임(open reading frame; ORF) 서열에 대해 수행되고, 최적화는 벡터 게놈의 제조를 위해 의도된 플라스미드에 ORF를 암호화하는 서열을 도입하기 전에 수행된다. 다른 구현예에서, 벡터 게놈의 추가 서열도 또한 코돈-최적화된다.
바이러스 벡터로 이루어진 활성 성분은 통합 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터, 특히 복제-불능 통합 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터, 특히 HIV-1 벡터일 수 있다. 이러한 렌티바이러스 벡터는 또한 포유동물-코돈 최적화된 합성 핵산, 특히 인간-코돈 최적화된 합성 핵산을 포함하는 게놈을 함유할 수 있고, 여기서 상기 합성 핵산은 항원성 폴리펩티드(들), 특히 본원에 개시된 것과 같이 포유동물을 감염시키는 결정된 병원체, 특히 인간 숙주를 감염시키는 바이러스 또는 세균 또는 기생충의 항원성 폴리펩티드(들)를 포함하는, 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 암호화한다.
대안적으로, 렌티바이러스 벡터, 특히 HIV-1 기반 벡터는 비통합성 복제-불능 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명을 달성하는데 적합한 렌티바이러스 벡터의 특수한 구현예는 이의 게놈이 pTRIP 벡터 플라스미드 또는 pFLAP델타U3 벡터 플라스미드, 바람직하게는 pFLAP델타U3 플라스미드, 특히 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 서열의 벡터 플라스미드로부터 수득되는 렌티바이러스 벡터에 관한 것이고, 여기서 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 포유동물 세포에서 기능적인 프로모터, 특히 CMV 프로모터, 인간 β2-마이크로글로불린 프로모터, 서열 번호: 21의 SP1-β2m 프로모터 또는 서열 번호: 22의 복합체 BCUAG" 프로모터, 바람직하게는 SP1-β2m 프로모터의 제어 하에 클로닝되었고, 여기서 벡터는 임의로 야생형 또는 돌연변이된 우드척 간염 바이러스(woodchuck hepatitis virus; WPRE)의 전사후 조절 성분을 포함한다. 특히, WPRE는 서열 번호: 23에 제시된 돌연변이체 WPRE이다.
pFLAP델타U3 플라스미드 또는 pFLAP 플라스미드는 pTRIP 플라스미드로부터 유래된 렌티바이러스 플라스미드 벡터이다. pFLAP 플라스미드의 예는 도 13, 14 및 15에 나타나 있다.
본 발명의 추가 구현예에서, 본원에 기재된 특징에 따라 융합 폴리펩티드를 발현하는 렌티바이러스 벡터 입자는 인디애나 또는 뉴저지 혈청형의 수포성 구내염 바이러스(V-SVG)로부터의 당단백질 G로 슈도타입화(pseudotype)된다.
이러한 렌티바이러스 벡터의 특별한 특징은 아래에서 더 자세히 논의될 것이다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 정의에 따른 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 DNA 플라스미드에 관한 것이며, 특히 여기서 상기 게놈은 pFLAP델타U3 벡터 플라스미드, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열 번호: 20의 벡터 플라스미드 내에 삽입되고, 여기서 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드는 GFP 서열을 대체하여 제한 부위 BamHI과 XhoI 사이에 삽입된다.
본 발명은 또한 본 발명의 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하거나 본 발명에 따른 DNA 플라스미드로 형질감염된 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에 관한 것이다. 특히, 상기 숙주 세포는 HEK-293T 세포주 또는 K562 세포주이다. 본 발명은 또한 상기 숙주 세포의 배양물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 숙주, 특히 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들)와 함께 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터를 포함하는, 포유동물 숙주에 투여하기에 적합한 제형 또는 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 이를 필요로 하는 숙주, 특히 인간 숙주에게 투여하기에 적합한 부형제와 함께, 병원체 감염에 대해 또는 병원체-유도된 상태 또는 질환에 대해 보호하기 위해 본원에 정의된 바와 같은 렌티바이러스 벡터 입자를 활성 성분으로서 포함하는 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에 투여하기에 적합한 제형에 관한 것이다. 질환은 급성 또는 만성 호흡기 감염 질환, 예를 들면, 결핵, 특히 A형, B형 또는 C형 인플루엔자 바이러스, 보다 구체적으로는 H1N1, H2N2 또는 H3N2 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 인플루엔자와 같은 급성 또는 만성 호흡기 감염 질환일 수 있다. 이러한 질환은 또한 특히 SARS-CoV-2로 인해 유발된 코로나바이러스 질환일 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물 또는 제형은 또한 보조제(adjuvant) 구성성분, 특히 pro-Th1 및/또는 pro-Th17 보조제 및/또는 면역자극성 구성성분을 포함할 수 있다.
특히, 조성물 또는 제형은 폴리이노신-폴리시티딜 산(폴리I:C) 또는 이의 유도체와 같은 프로(pro)-Th1 보조제를 포함할 수 있다. 폴리(I:C)의 유도체는 내부에 비쌍식 염기의 도입을 통해 폴리(I:C)의 특정 구조를 변형시킴으로써 수득된 미스매치된(mismatched) dsRNA를 지칭하며, 폴리(I:CxU), 폴리(IxU:C)(여기서 x는 평균 3 내지 30의 수이다)를 포함한다. 바람직하게는, 폴리(I:C)의 유도체는 폴리(I:C12U) 또는 폴리(C:I12U)이며, 이는 상표명 Ampligen™으로 시판된다.
조성물 또는 제형 또한 사이클릭 디뉴클레오티드 보조제와 같은 프로-Th1/Th17 보조제를 포함할 수 있다. 사이클릭 뉴클레오티드 보조제는 STING-활성화 사이클릭 디뉴클레오티드 보조제로도 지칭된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "사이클릭 디뉴클레오티드"("CDN")는 2개의 퓨린 뉴클레오티드 사이에 2'-5' 및/또는 3'-5' 포스포디에스테르 연결을 포함하는 분자의 부류를 지칭한다. 이는 2'-5'-2',5', 2'-5'-3'5' 및 3',5'-3',5' 연결을 포함한다. CDN은 다양한 공정을 조절하는 세균에 의해 흔한(ubiquitous) 유비쿼터스 소분자 제2의 전령인자(messenger)이며 백신 효능을 증가시키는 것으로 밝혀진 비교적 새로운 부류의 보조제이다. CDN은 소포체-체류 수용체 STING(인터페론 유전자의 자극인자)에 직접 결합하여, 인터페론-β(IFN-β) 및 핵 인자-κB(NF-κB) 의존성 염증성 사이토킨의 발현을 유도하는 신호전달 경로(signaling pathway)를 활성화함으로써 선천적 면역성을 활성화시킨다. 바람직하게는, CDN은 사이클릭 구아닌-아데닌 디뉴클레오티드(cGAMP)이다.
본 발명자들은 본 발명의 렌티바이러스 벡터와 함께 보조제, 특히 프로-Th1 및/또는 프로 Th17 보조제의 사용이 Th1 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 생성 뿐만 아니라, IL-17A을 생산하는 Th17 CD4+ T 세포의 생성을 유발시킴을 밝혔다.
본 발명의 다른 양태에서, 활성 성분, 특히 렌티바이러스 벡터 입자, 또는 이를 포함하는 조성물 또는 제형은 임의로 적절한 전달 비히클과 및 임의로 보조제 구성성분과 및/또는 면역자극성 구성성분, 예컨대, 본 명세서에 정의된 바와 같은 보조제 구성성분 및/또는 면역자극성 구성성분과 함께, 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에서 병원성 감염에 대한 또는 병원체-유도된 상태 또는 질환에 대한 보호 면역화(protective immunization)에 사용하기 위한 것이다.
따라서, 활성 성분 또는 조성물, 특히 본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자는, 이를 필요로 하는 숙주, 특히 포유동물, 특히 인간 숙주에게 투여되는 경우, 이의 항원성 폴리펩티드 또는 면역원성 단편에 대해 지시된 항체의 유발에 의해 면역 반응을 유발한다. 상기 면역 반응은 나이브(naive) 림프구의 활성화 및 효과기 T 세포 반응의 생성 및 병원체의 항원(들)에 대한 면역 기억 항원-특이적인 T 세포 반응의 생성을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 이를 필요로 하는 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에서 병원체에 의한 감염, 특히 포유동물에서 급성 또는 만성 호흡기 감염성 질환과 관련된 병원체에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 활성 성분, 특히 렌티바이러스 벡터 입자, 본 발명의 약제학적 조성물 및/또는 제형에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에서 병원체에 의한 감염, 특히 포유동물에서 급성 또는 만성 호흡기 감염성 질환과 관련된 병원체에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 방법은 유효량의 본 발명의 활성 성분, 약제학적 조성물 및/또는 제형을 상기 포유동물 숙주에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 생성물, 방법 및 용도는 사람 또는 수의학 적용을 위한 것일 수 있다.
면역 반응은 항원 제시 세포, 특히 수지 세포에 의한 항원성 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편의 MHC-I 제한된 제시 및 MHC-II 제한된 제시의 유도, 및 CD4- 및 CD8-매개된 면역 반응의 유도를 포함한다. 대조적으로, 트랜스페린 수용체의 불변 쇄 (1i) 또는 트랜스페린 수용체의 막관통 도메인에 융합되지 않은 동일한 항원성 폴리펩티드를 사용하는 비교가능한 벡터는 유의적인 CD4+ T 세포 반응을 개시하지 않는다. 따라서, 본 발명의 렌티바이러스 벡터에 의해 유발된 풍부한 CD4+ T 세포 반응은 예상치 못한 것이며 CD8+ T 세포 반응으로 제한되는, 기존의 렌티바이러스 벡터를 사용하여 직면하게 되는 단점을 극복한다. 일 구현예에서, 본 발명의 렌티바이러스 벡터에 의해 유발된 CD4+ T 세포 반응은 항원성 폴리펩티드(들)가 단독으로 발현되고 융합 단백질 내에 있지 않거나, 트랜트페린 수용체의 불변 쇄(1i) 또는 막관통 도메인에 융합된 비교가능한 렌티바이러스 벡터와 비교하여 적어도 30% 더 높고, 바람직하게는 적어도 50% 더 높으며, 여전히 바람직하게는 적어도 100% 더 높고, 심지어 바람직하게는 적어도 200% 더 높다. CD4+ T 세포 반응은 바람직하게는 약제학적 조성물로, 특히 백신 조성물로, 본 발명의 렌티바이러스의 투여, 예컨대, 주사에 대한 반응시 항원-특이적인 CD4+ T 세포의 확장을 평가함으로써 측정될 수 있다. 본 명세서의 실시예는 이러한 측정을 예시한다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 특히 IFN-γ/TNF-α를 생산하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 생성을 유발할 수 있다.
면역 반응은 병원체에 의한 감염을 방지할 수도 있거나, 감염으로부터 야기되는 병리학적 상태의 발병이나 발달을 방지할 수 있다.
생리학적으로 허용되는 비히클은 면역화 조성물의 투여 경로와 관련하여 선택될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 투여는 주사, 특히 근육내, 피내, 피하, 또는 비강내 투여 또는 국소 피부 적용에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 입자에 의해 발현되는 항원을 제공하는 병원체에 대한 면역 반응을 숙주, 특히 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에서 유발하기 위해 사용되며, 상기 사용은 유효량의 활성 성분, 특히 프라임(prime)으로서 숙주의 세포 면역 반응을 유발하는 렌티바이러스 입자를 투여하는 단계, 및 후에 시간에 맞추어 유효량의 동일한 활성 성분 또는 다른 활성 성분, 예컨대, 렌티바이러스 입자를 투여하여, 숙주의 세포 면역 반응을 부스트(boost)시키는 단계, 및 임의로 부스트를 위해 상기 투여 단계를 반복(1회 또는 수회)하는 것을 포함하는 면역화 패턴(immunization pattern)을 포함한다.
렌티바이러스 벡터 입자의 각각의 투여 단계를 위해, 특히 다중 투여 단계를 포함하는 요법에서, 벡터 입자의 슈도타입화된 엔벨로프 단백질(들)이 다른 단계에서 사용된 것, 특히 상이한 바이러스, 특히, 상이한 VSV로부터 기원한 것과는 상이한 것이 바람직하다. 프라임-부스트 요법(prime-boost regimen)에서, 각 단계의 화합물의 투여된 조합은 본원에 정의된 바와 같은 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
프라이밍 단계와 부스트 단계는 적어도 2주, 특히 6주, 특히 적어도 8주만큼 시간에 맞춰 분리된다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 숙주, 특히 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에서, 입자에 의해 발현되는 항원을 제공하는 병원체에 대해 면역 반응을 유발하기 위해 사용되며, 상기 사용은 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자가 부스트를 위해 사용되는 이종 프라임-증강 요법을 포함하는 면역화 패턴을 포함한다. 프라이밍 단계는 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자와 관련하여 생-약독화된 병원체 백신 또는 또 다른 이종 면역원성 조성물을 사용하여 수행될 수 있다. 투여 요법에 대한 세부사항은 아래에서 더 논의될 것이다.
LV 입자는 세포성 면역 반응(T 세포 면역 반응), 특히 CD4+ T 세포 면역 반응 및 유리하게는 CD8+ T 세포 면역 반응, 즉, 각각 CD4 또는 CD8 수용체를 보유하는 활성화된 세포에 의해 매개되는 적응성 면역 반응을 제공한다.
특히 유리한 구현예에서, LV 입자에 의해 부여되는 면역 반응은 장기간 지속되는 면역 반응인데, 즉, 상기 면역 반응은 기억 세포 반응, 특히 중심 기억 세포 반응을 포함하고; 특수한 구현예에서 이는 마지막 투여 단계 이후 적어도 수개월 째에서 여전히 검출될 수 있다.
본 발명에 따라서, 렌티바이러스 입자가 프라임-부스트 요법 또는 다 단계 투여 요법에 사용되는 경우, VSV, 인디애나 또는 뉴저지 균주로부터 수득된 제1의 결정된 슈도타입화된 엔벨로프 G 단백질로 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터 입자가 제공되고, 후에 VSV, 뉴저지 또는 인디애나 균주로부터 수득된 제2의 결정된 슈도타입화된 엔벨로프 G 단백질로 슈도타입화된, 이후 투여된 렌티바이러스 벡터 입자가 제공된다. 이렇게 기술된 제1 및 제2 화합물의 프라임-부스트 요법에서의 사용 순서는 대안적으로 역전될 수 있다. 따라서, 프라임-부스트 요법에 사용하도록 의도된 경우 본 발명의 조합 또는 조성물의 별도의 활성 성분/화합물에 함유된 렌티바이러스 벡터 입자는 적어도 벡터 입자를 슈도타입화하는데 사용된 특수한 슈도타입화된 엔벨로프 단백질(들)로 인하여, 서로 구별된다.
투여 패턴에 사용되는 세포 면역 반응을 유발하기 위해 의도된 렌티바이러스 벡터의 용량은, 통합 벡터가 사용되는 경우, 105 TU 내지 1010 TU, 특히 105 내지 108 TU의 재조합 렌티바이러스 입자를 포함할 수 있다. 숙주에 투여하기 위해 의도된 용량은 통합-불능 벡터가 사용되는 경우 108 내지 1010개의 각 유형의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 개시내용에 따라, 프라임으로서 또는 부스트로서, 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자를 투여하여 면역 반응을 유발하는 단계, 및 임의로 특히 상기 반응을 부스트하기 위해, 투여 단계를 1회 또는 수회 반복하는 단계를 포함하여, 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에서 면역화를 제공하는 방법에 관한 것이다.
임의로, 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 포유동물, 특히 인간 숙주에게 투여하기에 적합한 보조제 화합물 및/또는 면역자극성 화합물과 연합하여, 적절한 전달 비히클과 함께 사용될 수 있다. 적합한 보조제 및 면역자극성 화합물은 본 명세서에 기재되어 있다.
재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 피하(s.c.), 피내(i.d.), 근육내(i.m.) 또는 정맥내(i.v.) 주사를 포함하는 다양한 경로를 통한 주사를 통해 숙주에 투여될 수 있거나, 경구 내지 점막 또는 피부 투여, 특히 비강내(i.n.) 투여 또는 흡입을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 투여될 양(투여량)은 환자의 상태, 개인의 면역계 상태, 투여 경로, 숙주의 크기 등을 고려하는 것을 포함하는, 치료할 대상체에 의존한다. 적합한 투여량 범위는 HIV-1 유래된 렌티바이러스 벡터 입자의 등가 형질도입 단위(equivalent transducing unit)의 함량에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예 및 특징은 본 설명에 주어진 정의와 개별적으로 조합될 수 있는 특징을 지닌 렌티바이러스 벡터 입자의 제조 및 적용을 예시하는 실시예 및 도면을 읽을 때 명백해질 것이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 렌티바이러스 벡터의 상세한 설명
본 발명은 따라서 재조합 렌티바이러스 입자(즉, 재조합 벡터 입자)이고, 다음을 특징으로 하는 복제-불능 렌티바이러스 벡터, 특히 복제-불능 HIV-1 기반 벡터일 수 있는 렌티바이러스 벡터를 포함한다: (i) 이는 결정된 이종 바이러스 엔벨로프 단백질 또는 HIV가 아닌 RNA 바이러스로부터 유래된 바이러스 엔벨로프 단백질로 슈도타입화되고, (ii) 이는 이의 게놈 내에 병원체의 항원의 에피토프(들)을 수반하는 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드(또는 이의 폴리펩티드 유도체, 예를 들면, 이의 면역원성 단편)를 포함하는, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 병원체는 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주를 감염시킬 수 있고 여기서 상기 에피토프는 T 세포 에피토프(들), 특히 CD4+ T 세포 에피토프 및 CD8+ T 세포 에피토프 둘 다를 포함한다.
본 발명의 특수한 구현예에 따라서, 렌티바이러스 벡터는 능숙한(즉, 통합-적격성) 입자 또는 결핍된(즉, 통합-불능) 입자를 발현하도록 설계된다. 본 발명의 특수한 구현예에 따라서, 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 통합-불능 및 복제-불능 둘 다이다.
렌티바이러스 벡터의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있으며 문헌에 집중적으로 개시되어 있다(confer for review Sakuma T. et al (Biochem. J. (2012) 443, 603-618). 이러한 벡터의 제조는 또한 본원의 실시예에 예시되어 있다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터의 항원성 폴리펩티드(ORF)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)는 포유동물-코돈 최적화(CO), 특히 인간-코돈 최적화되었다. 임의로, 상기 입자의 게놈의 렌티바이러스 서열은 또한 포유동물-코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 본 발명의 특수한 양태에서, 코돈 최적화는 마우스 세포 내에서의 발현을 위해 수행된다. 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터의 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)의 서열은 인간-코돈 최적화(CO)되어 왔다.
특히 포유동물 및 특히 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화된 경우, 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 이러한 포유동물 또는 인간 세포에서 더 높은 수율의 입자 생성을 가능하게 하는 것으로 관찰되었다. 생산 세포는 실시예에서 예시된다. 따라서, 본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자가 포유동물, 특히 인간 숙주에게 투여되는 경우, 강한 면역 반응의 유발을 선호하는 보다 많은 양의 입자가 상기 숙주 내에서 생산된다.
본 발명에 정의된 재조합 렌티바이러스 벡터(즉, 렌티바이러스 벡터 입자 또는 렌티바이러스 기반 벡터 입자)는 특수한 렌티바이러스와는 상이한 바이러스(특히 HIV, 특히 HIV-1과는 상이한 바이러스)로부터 기원한 엔벨로프 단백질 또는 엔벨로프 단백질들을 지닌 벡터 입자로 이루어진 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터이고, 이는 렌티바이러스 벡터 임자의 벡터 게놈을 제공한다. 따라서, 상기 엔벨로프 단백질 또는 엔벨로프 단백질은 입자의 벡터 게놈과 관련하여 "이종" 바이러스 엔벨로프 단백질 또는 바이러스 엔벨로프 단백질이다. 다음의 페이지에서, 본 발명을 수행하기에 적합한 임의의 유형의 엔벨로프 단백질 또는 엔벨로프 단백질들을 포함하는 "엔벨로프 단백질(들)"에 대한 참고가 이루어질 것이다.
출원에서 "렌티바이러스" 벡터(렌티바이러스-기반 벡터)에 대한 참고가 이루어진 경우, 이는 특히, HIV-기반 벡터 및 특히 HIV-1-기반 벡터에 관한 것이다.
본 발명을 수행하는데 적합한 렌티바이러스 벡터는 소위 대체 벡터이며, 이는 렌티바이러스 단백질을 암호화하는 원래의 렌티바이러스의 서열이 필수적으로 벡터의 게놈에서 결실되거나, 존재하는 경우, 변형되고, 특히 돌연변이되고, 특히 절두(truncation)되어, 생물학적으로 활성인 렌티바이러스 단백질의 발현을 방지하고, 특히, HIV의 경우, 재조합 렌티바이러스 벡터 입자, 기능성 ENV, GAG 및 POL 단백질 및 임의로 렌티바이러스, 특히 HIV의 추가의 구조 및/또는 보조 및/또는 조절 단백질의 게놈을 제공하는 상기 전달 벡터에 의한 발현을 방지한다.
특수한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는, 이것이 (i) 패키징 구성작제물, (ii) 엔벨로프 및 (iii) 전달 벡터 게놈을 제공하기 위해 별개의 플라스미드를 사용하여 수득된다는 점에서 특징화된 1세대 벡터, 특히 제1 세대의 HIV-기반 벡터로부터 구축된다. 대안적으로, 이는 제2 세대 벡터, 특히 바이러스 보조 단백질(예를 들어, HIV-1의 경우에, Vif, Vpu, Vpr 또는 Nef)이 고갈되고 따라서 9개의 HIV 전체 유전자 중 4개: gag, pol, tat 및 rev 만을 포함하는 제2 세대의 HIV-기반 벡터로부터 구축될 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터는 3세대 벡터, 특히 상기 바이러스 보조 단백질이 결여되어 있고 또한 Tat-독립적인 제3 세대의 HIV-기반 벡터로부터 구축되고; 이러한 3세대 벡터는 벡터의 기능적 성분을 제공하기 위해 4개의 플라스미드, 예를 들면, 벡터가 HIV-1을 기반으로 하는 경우 HIV의 Rev 단백질을 암호화하는 하나의 플라스미드를 사용하여 수득될 수 있다. 이러한 벡터 시스템은 HIV-1의 9개 유전자 중 3개 만을 포함한다. 이러한 세대의 HIV-기반 벡터의 구조 및 설계는 당해 분야에 잘 알려져 있다.
임의의 이러한 세대의 벡터에서, 변형이 본원에 기술된 바와 같은 융합 폴리펩타이드의 벡터 골격 내에서 삽입에 의해 본 발명에 따라 추가로 제공됨으로써 APC, 특히 수지 세포를 표적화하고 활성화하여 면역원을 MHC-II 경로에 전달하고 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 유도하기 위해 활용된 LV 벡터를 제공한다.
벡터 입자의 "벡터 게놈"은 특히 본원에 개시된 바와 같은 병원체의 하나 이상의 항원성 폴리펩티드(들) 또는 이의 면역원성 단편(들)을 포함하는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 암호화하는 목적한 폴리뉴클레오티드 또는 전이유전자(trangene)를 재조합 서열로서 또한 포함하는 재조합 핵산이다. 벡터 게놈의 렌티바이러스-기반 서열 및 폴리뉴클레오티드/전이유전자는 플라스미드에 의해 생성되므로, "서열 벡터"로서 또한 지칭된 "전달 벡터(transfer vector)"를 생성한다. 따라서, 이러한 표현은 본 설명에서 상호교환적으로 사용된다. 특수한 구현예에 따라서, 본 발명을 위해 제조된 벡터 게놈은 서열 번호: 20의 서열을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 GFP 서열(서열 번호: 30) 대신에 제한 부위 BamHI과 XhoI 사이에 삽입된다.
따라서 본원에 정의된 바와 같은 벡터 게놈은 이의 발현을 위한 적절한 조절 서열의 제어 하에 있는 항원성 폴리펩티드(들)를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 소위 재조합 폴리뉴클레오티드(들)로부터 떨어져서, 상기 게놈의 비-암호화 영역 내에 있고, DNA 또는 RNA 합성 및 프로세싱을 위한 인식 신호를 제공하는데 필수적인 원래의 렌티바이러스 게놈(미니-바이러스 게놈)의 서열을 포함한다. 이러한 서열은 특히 패키징(ψ), 역전사(원래의 것과 관련하여 가능하게 돌연변이된 LTR) 및 전사 및 임의로 통합(RRE)에 필수적인 시스-작용 서열(cis-acting sequence)이며, 또한 본 발명의 특수한 목적을 위해, 이는 세포 내에서 핵 도입 및 따라서 상기 세포 내에서 전이유전자 전달 효능을 선호하는 기능성 서열을 함유하고, 이러한 성분은 렌티바이러스 게놈 서열, 특히 HIV-1 또는 일부 레트로성분(retroelement), 예를 들면, 효모의 것에 존재하는 소위 중앙 cPPT-CTS 뉴클레오티드성 도인을 포함하거나 이로 이루어진 DNA 플랩 성분(Flap element)으로 기술된다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터를 제조하는데 사용되는 벡터 게놈의 구조 및 조성은 당해 분야에 기술된 원리 및 (Zennou et al, 2000; Firat H. et al, 2002; VandenDriessche T. et al)에 주로 개시된 렌티바이러스 벡터의 예를 기반으로 한다. 이러한 유형의 작제물은 본원에서 지칭될 바와 같이 CNCM에 기탁되어 있다. 이와 관련하여 기탁된 생물학적 물질, 특허 출원 WO 99/55892, WO 01/27300 및 WO 01/27304을 포함하는, 개시내용에 대한 참고가 또한 이루어진다.
본 발명의 특수한 구현예에 따라서, 바이러스 게놈은 2개의 긴 말단 반복체(long terminal repeat; LTR) 사이의 바이러스 단백질 암호화 서열 모두가 본원에 개시된 바와 같은 항원성 폴리펩티드(들)을 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 대체된 대체 벡터일 수 있고, 여기서 DNA-플랩 성분은 본원에 기술된 요구된 시스-작용 서열(cis-acting sequence))과 관련되어 재삽입되었다. 벡터 게놈의 조성과 관련된 추가 특징은 입자의 제조와 관련하여 개시되어 있다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 이의 게놈 내에 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특히, 상기 벡터 게놈은 게놈 상에서 연속적이거나 분리되어 있고 병원체 또는 별개의 병원체의 동일하거나 별개의 항원의 상이한 폴리펩티드를 암호화하는 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 다양한 구현예에 따라 사용된 렌티바이러스 벡터의 특수한 특징은 또한 실시예에 개시되어 있으며, 이러한 특징은 단독으로 또는 벡터를 생산하기 위해 조합되어 취해진다.
본 발명의 구현예에 따라서, 렌티바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 입자 게놈의 렌티바이러스 서열을 제공하는 렌티바이러스가 아닌 RNA 바이러스로부터 유래된 이종 바이러스 엔벨로프 단백질 또는 엔벨로프의 바이러스 다중단백질(polyprotein)로 슈도타입화된다.
렌티바이러스 벡터의 제조를 위한 엔벨로프 단백질을 분류하는 예로서, 본 발명은 예를 들어, 인디애나 균주의 수포성 구내염 바이러스(VSV)-G 단백질(들) 및 뉴저지 균주의 VSV-G 단백질의 그룹에서 선택된, VSV의 바이러스 막간통 글리코실화된(소위 G 단백질) 엔벨로프 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터를 슈도타입화하는 데 사용될 수 있는 VSV-G 단백질의 다른 예에는 특히 다음의 베시쿨로바이러스 속(vesiculovirus genus)에 분류된 종 중에서 선택될 수 있는 VSV-G 당단백질이 포함된다: 카라자스 바이러스(CJSV), 찬디푸라 바이러스(CHPV), 코칼 바이러스 (COCV), 이스파한 바이러스(ISFV), 마라바 바이러스(MARAV), 피리 바이러스(PIRYV), 수포성 구내염 알라고아스 바이러스(VSAV), 수포성 구내염 인디애나 바이러스(VSIV) 및 수포성 구내염 뉴저지 바이러스(VSNJV) 및/또는 그래프 카프 라브도바이러스(Grass carp rhabdovirus), BeAn 157575 바이러스(BeAn 157575), 보테케 바이러스(Boteke virus; BTKV), 칼타퀴 바이러스(Calchaqui virus; CQIV), 엘 바이러스 아메리칸(Eel virus American; EVA), 그레이 롯지 바이러스(Gray Lodge virus; GLOV), 조로나 바이러스(Jurona virus JURV), 클라마스 바이러스(Klamath virus; KLAV), 콰타 바이러스(Kwatta virus; KWAV), 라 조야 바이러스(La Joya virus; LJV), 말파이스 스프링 바이러스(Malpais Spring virus; MSPV), 마운트 엘곤 박쥐 바이러스(Mount Elgon bat virus; MEBV), 페리넷 바이러스(Perinet virus; PERV), 파이크 프라이 랍도바이러스(Pike fry rhabdovirus; PFRV), 포톤 바이러스(Porton virus; PORV), 라디 바이러스(Radi virus; RADIV), 카르프 바이러스의 스프링 바이어미아(Spring viremia of carp virus; SVCV), 투파이아 바이러스(Tupaia virus; TUPV), 궤양성 질환 라브도바이러스(Ulcerative disease rhabdovirus; UDRV) 및 유그 보그다노박 바이러스(Yug Bogdanovac virus; YBV)로서 베시쿨로바이러스 속에 잠정 분류된 균주.
수포성 구내염 바이러스(VSV-G)의 엔벨로프 당단백질은 야생형 바이러스 입자의 표면 코트(surface coat)로 기능하는 막관통 단백질이다. 이는 또한 가공된 렌티바이러스 벡터에 적합한 코트 단백질(coat protein)이다. 현재, 9개의 바이러스 종이 VSV 성별로 명확하게 분류되고 19개의 라브도바이러스가 이 성별로 잠정적으로 분류되며, 모두는 다양한 정도의 교차-중화(cross-neutralisation)를 나타낸다. 서열을 분석한 경우, 단백질 G 유전자는 서열 유사성을 나타낸다. VSV-G 단백질은 N-말단 엑토도메인(ectodomain), 막관통 영역 및 C 말단 세포질성 테일(cytoplasmic tail)을 제시한다. 이는 트랜스-골지 네트워크(trans-Golgi network)(소포체 및 골지체)를 통해 세포 표면으로 배출된다.
수포성 구내염 인디애나 바이러스(Vesicular stomatitis Indiana virus; VSIV) 및 수포성 구내염 뉴저지 바이러스(Vesicular stomatitis New Jersey virus; VSNJV)는 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 슈도타입화하거나, 렌티바이러스 벡터를 슈도타입화하기 위해 재조합 엔벨로프 단백질(들)을 설계하는데 바람직한 균주이다. 이의 VSV-G 단백질은 여러 균주가 제시된 GenBank에 개시되어 있다. VSV-G 뉴저지 균주의 경우 특히 수탁 번호 V01214를 갖는 서열에 대해 참고가 이루어진다. 인디애나 균주의 VSV-G의 경우에는, 균주 JO2428에 상응하는 Genbank의 수탁번호 AAA48370.1에 대해 참고가 이루어진다.
상기 바이러스 엔벨로프 단백질(들)은 항원 제시 세포, 특히 수지 세포, 예를 들면, 간 수지 세포에 의해 융합 및/또는 세포 내 이입에 의해 흡수될 수 있다. 특수한 구현예에서, 흡수의 효율은 슈도타입화를 위한 VSV의 엔벨로프를 선택하는 특징으로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 상대적인 형질도입 역가(DC 역가/다른 형질도입된 세포, 예컨대, 293T 세포의 역가)는 시험으로서 고려될 수 있고 DC와 융합할 수 있는 비교적 양호한 능력을 갖는 엔벨로프가 바람직할 수 있다.
항원 제시 세포(APC) 및 특히 수지 세포(DC)는 상응하게 면역 조성물로 사용되는 슈도타입된 렌티바이러스 벡터에 대한 적절한 표적 세포이다.
VSV-G 엔벨로프 단백질(들)은 상기 단백질(들)에 대한 암호화 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현되며, 이러한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자의 제조에 사용되는 플라스미드(설계된 엔벨로프 발현 플라스미드 또는 슈도타입되는 env 플라스미드)에 삽입된다. 엔벨로프 단백질(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암호화 서열, 예를 들면, 임의로 전사 후 조절 성분(post-transcription regulatory element; PRE), 특히 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 우드척 간염 바이러스(Woodchuck hepatitis virus)의 성분, 즉, Invitrogen으로부터 입수가능한, WPRE 서열 또는 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 WPRE의 돌연변이체 서열의 전사 및/또는 발현을 위한 조절 서열의 제어 하에 있다.
따라서, 포유동물 세포, 특히 인간 세포 내에서 생체 내 사용하기에 적합한 내부 프로모터 및 상기 프로모터의 제어 하에 있는 엔벨로프 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다. 이러한 작제물을 함유하는 플라스미드는 벡터 입자의 제조에 적합한 세포의 형질감염을 위해 사용된다. 프로모터는 특히 구성적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 유도성 프로모터로서의 이의 특성에 대해 선택될 수 있다. 적합한 프로모터의 예는 다음 유전자의 프로모터를 포함한다: MHC 제I 부류 프로모터, 인간 베타-2 마이크로글로불린 유전자(β2M 프로모터), EF1α, 인간 PGK, PPI(프레프로인슐린), 티오덱스트린, HLA DR 불변 쇄(P33), HLA DR 알파 쇄, 페리틴 L 쇄 또는 페리틴 H 쇄, 키모신 베타 4, 키모신 베타 10, 시스타틴 리보솜 단백질 L41, CMVie 또는 키메라 프로모터(chimeric promotor), 예를 들면, 존 에스 등(Jones S. et al Human Gene Therapy, 20:630-640(June 2009))에 개시된 GAG(CMV 초기 인핸서/닭 β 앤틴) 또는 본원에 개시된 바와 같은 2m-CMV(BCUAG).
이들 프로모터는 또한 캡시드화 플라스미드(encapsidation plasmid)로부터 gag-pol 유래된 단백질의 발현에 포함되고/되거나, 전달 벡터로부터 항원 폴리펩티드를 발현하기 위한 조절 발현 서열에 사용될 수 있다.
대안적으로, 엔벨로프 발현 플라스미드가 안정한 패키징 세포주에서의 발현을 위해, 특히 연속적으로 발현되는 바이러스 입자로서 안정한 발현을 위해 의도되는 경우, 엔벨로프 단백질(들)을 발현하는 내부 프로모터는 유리하게는 콕크렐 에이. 에스(Cockrell A.S.) 등(Mol. Biotechnol. (2007) 36:184-204)에 개시된 것과 같은 유도성 프로모터이다. 이러한 프로모터의 예로서, 테트라사이클린 및 엑디손 유도성 프로모터에 대한 참고가 이루어진다. 패키징 세포주(packaging cell line)는 STAR 패키징 세포주(ref Cockrell A.S. et al (2007), Ikedia Y. et al (2003) Nature Biotechnol. 21: 569-572) 또는 SODk1 패키징 세포주, 예를 들면, SODk0 유래된 세포주, 예를 들면, SODk1 및 SODk일 수 있다 (ref Cockrell A.S. et al (2007), Cockrell A;S.et al (2006) Molecular Therapy, 14: 276-284, Xu K. et al. (2001) ,Kafri T. et al (1999) Journal of Virol. 73:576-584).
본 발명에 따라서, 렌티바이러스 벡터는 하기를 사용한, 포유동물 세포의 공-형질감염으로부터 회수된 생성물이다:
- (i) 렌티바이러스, 특히 HIV-1, 패키징, 역전사 및 전사에 필수적인 시스-작용 서열을 포함하고 특히 HIV-1로부터 유래된 기능성 렌티바이러스, DNA 플랩 성분을 추가로 포함하는 벡터 플라스미드 및 (ii) 이에 대해 면역 반응이 조절 발현 서열의 제어 하에 고려되는 하나 이상의 병원체의 하나 이상의 항원 폴리펩티드(들) 또는 이의 면역원성 단편(들), 바람직하게는 인간 β2의 마이크로글로불린 프로모터 또는 변형된 인간 β2-마이크로글로불린 프로모터, 예를 들어 서열 번호: 21의 SP1-β2m 프로모터를 포함하고, 임의로 숙주 세포의 게놈 내로의 통합을 위한 서열을 포함하는, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 자체;
- RNA 바이러스로부터 유래된 슈도타입화 엔벨로프를 암호화하는 발현 플라스미드로서, 상기 발현 플라스미드는 엔벨로프 단백질 또는 슈도타입화를 위한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 엔벨로프 슈도타입화 단백질은 유리하게는 VSV로부터 유래되고 특히 인디애나 균주 또는 뉴저지 균주의 VSV-G인, 발현 플라스미드, 및
- 통합-적격성인 벡터 입자(integration-competent vector particle)의 생산에 적합한 렌티바이러스, 특히 HIV-1, gag-pol 패키징 서열 또는 통합-결핍성 벡터 입자의 생산에 적합한 변형된 gag-pol 패키징 서열을 포함하는 캡시드화 플라스미드.
따라서 본 발명은 또한 상술한 바와 같은 렌티바이러스 벡터 입자 및 하기로 형질감염된 안정한 세포주로부터 회수된 생성물에 관한 것이다:
- (i) 패키징, 역전사 및 전사에 필수적인 렌티바이러스, 특히 HIV-1, 시스-작용성 서열을 포함하고 기능성 렌티바이러스, 특히 HIV-1, DNA 플랩 성분을 추가로 포함하고 임의로 통합에 필수적인 시스-작용성 서열을 포함하는 벡터 플라스미드로서, 상기 벡터 플라스미드는 (ii) 조절 발현 성분, 특히 프로모터의 제어 하에서, 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 병원체의 하나 이상의 항원 폴리펩티드(들) 또는 이의 면역원성 단편(들)을 포함하는, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 쥐(murine) 또는 인간에 대한 코돈-최적화된 서열의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 추가로 포함하는, 벡터 플라스미드;
- VSV-G 엔벨로프 단백질, 특히 인디애나 균주 또는 뉴저지 균주의 VSV-G를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 VSV-G 엔벨로프 발현 플라스미드로서, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드가 조절 발현 서열, 특히 프로모터를 포함하는 조절 발현 서열의 제어 하에 있는 VSV-G 엔벨로프 발현 플라스미드, 및;
- 캡시드화 플라스미드로서, 여기서 캡시드화 플라스미드가 렌티바이러스, 특히 HIV-1, 통합-적격 벡터 입자의 생산에 적합한 gag-pol 암호화 서열 또는 통합-결핍 벡터 입자의 생산에 적합한 변형된 gag-pol 암호화 서열을 포함하고, 여기서 상기 gag-pol 서열은 DNA 플랩 성분과 동일한 렌티바이러스 서브-계열(sub-family)로부터 유래되고, 여기서 상기 렌티바이러스 gag-pol 또는 변형된 gag-pol 서열은 조절 발현 서열의 제어 하에 있는, 캡슐화 플라스미드.
본 발명의 벡터 입자를 발현하는 안정한 세포주는 특히 플라스미드의 형질감염에 의해 수득된다.
폴리뉴클레오티드는 (i) MHC-II 관련 경 불변 쇄 (1i) 또는 (ii) 트랜스페린 수용체(TfR)의 막관통 도메인을 포함하는 제1의 폴리펩티드, 및 본 명세서에 개시된 임의의 구현예에 따른, 병원체의 하나 이상의 항원성 폴리펩티드(들)을 포함하는, 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 암호화한다.
따라서, 벡터 플라스미드는 다양한 항원 폴리펩티드의 발현을 위한 하나 또는 수개의 발현 카세트를 포함할 수 있거나 비-시스트론성(bi-cistronic) 또는 멀티-시스트론성(multi-cistronic) 발현 카세트를 포함할 수 있으며, 여기서 항원성 폴리펩티드(들) 및 임의로 추가의 다양한 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 기원의 IRES 서열(내부 리보솜 도입 부위(in))에 의해 분리되거나, 이는 융합 단백질(들)을 암호화할 수 있다.
벡터 게놈에 함유되고 병원체의 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하는 내부 프로모터(전이유전자로서 또는 발현 카세트 내)는 다음 유전자의 프로모터로부터 선택될 수 있다: MHC 제I 부류 프로모터, 예를 들어 인간 β2-마이크로글로불린 프로모터(β2M 프로모터), SP1-β2m 프로모터, 또는 EF1a, 인간 PGK, PPI(프레프로인슐린(preproinsulin)), 티오덱스트린, HLA DR 불변 쇄(P33), HLA DR 알파 쇄, 페리틴 L 쇄 또는 페리틴 H 쇄, 키모신 베타 4, 키모신 베타 10, 또는 시스타틴 리보솜 단백질 L41 CMVie 또는 키메라 프로모터, 예를 들면, Jones S. et al(2009) 또는 BCUAG에 개시된 GAG(CMV 초기 인핸서/닭 β 액틴).
상기 인용된 내부 프로모터 중에서 프로모터는 또한 엔벨로프 단백질(들) 및 패키징(gag-pol 유래된) 단백질의 발현을 위해 선택될 수 있다.
인간 렌티바이러스, 특히 HIV-1 바이러스에 기반한 렌티바이러스 벡터를 제조하는 경우 다음의 특수한 구현예가 수행될 수 있다.
본 발명에 따라서, 렌티바이러스 벡터의 게놈은 인간 렌티바이러스, 특히 HIV 렌티바이러스로부터 유래된다. 특히, 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터는 HIV-기반 벡터, 예를 들면, HIV-1 또는 HIV-2 기반 벡터이고, 특히 HIV-1M, 예를 들어 BRU 또는 LAI 분리물로부터 유래된다. 대안적으로, 벡터 게놈을 위해 필수적인 서열을 제공하는 렌티바이러스 벡터는 포유동물 세포를 형질도입할 수 있는 EIAV, CAEV, VISNA, FIV, BIV, SIV, HIV-2, HIV-O와 같은 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 이것이 최종적으로 함유한 재조합 폴리뉴클레오티드와 별도로 고려하는 경우, 벡터 게놈은 원래 렌티바이러스 게놈내 2개의 긴 말단 반복체(LTR) 사이의 핵산이 DNA 또는 RNA 합성 및 프로세싱을 위해, 예를 들면, 숙주 내에서 세포의 핵으로 전이유전자의 효율적인 전달을 위해 시스-작용성 서열로 제한되거나, 적어도 렌티바이러스 구조 단백질, 예를 들면, 생물학적 기능성 GAG 폴리단백질 및 가능하게는 POL 및 ENV 단백질의 발현을 가능하도록 할 수 있는 필수 핵산 분절이 결실되거나 돌연변이된 대체 벡터이다.
특수한 구현예에서, 렌티바이러스의 5' LTR 및 3' LTR 서열은 벡터 게놈에 사용되지만, 3' LTR은 예를 들면 인핸서(델타 U3)에 대해 결실되거나 부분적으로 결실될 수 있는 적어도 U3 영역에서 원래의 렌티바이러스의 3' LTR과 관련하여 변형된다. 5' LTR은 특히, 예를 들어 Tat-독립서 프로모터가 U3 내인성 프로모터에 대해 치환될 수 있는 프로모터 영역 내에서 변형될 수도 있다.
특수한 구현예에서, 벡터 게놈은 Vif-, Vpr, Vpu- 및 Nef-보조 유전자(HIV-1 렌티바이러스 벡터의 경우)에 대한 암호화 서열 중 하나 또는 수개를 포함한다. 대안적으로, 이러한 서열은 독립적으로 또는 서로 결실될 수 있거나 비기능성일 수 있다(제2 세대 렌티바이러스 벡터).
렌티바이러스 벡터 입자의 벡터 게놈은 삽입된 시스-작용성 단편으로서, DNA 플랩 성분으로 이루어지거나 이러한 DNA 플랩 성분을 함유하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특수한 구현예에서, DNA 플랩은 항원성 폴리펩티드(들)을 수반하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 상부(upstream)에 삽입되고, 유리하게는 - 반드시 그런 것은 아니지만 - 벡터 게놈의 대략적인 중앙 위치에 위치한다. 본 발명에 적합한 DNA 플랩은 레트로바이러스, 특히 렌티바이러스, 특히 인간 렌티바이러스, 특히 HIV-1 레트로바이러스, 또는 레트로트랜스포존(retrotransposon)과 같은 레트로바이러스-유사 유기체로부터 수득할 수 있다. 이는 대안적으로 CAEV(카프린 관절염 뇌염 바이러스(Caprine Arthritis Encephalitis Virus)) 바이러스, EIAV(말 감염성 빈혈 바이러스(Equine Infectious Anemia Virus)) 바이러스, VISNA 바이러스, SIV(시미안 면역결핍성 바이러스(Simian Immunodeficiency Virus)) 바이러스 또는 FIV(고양이 면역결핍성 바이러스(Feline Immunodeficiency Virus)) 바이러스로부터 수득될 수 있다. DNA 플랩은 합성(화학적 합성)적으로 제조되거나 폴리머라제 쇄 반응(Polymerase chain reaction; PCR)과 같이 상기 정의된 바와 같은 적절한 공급원으로부터 DNA 플랩을 제공하는 DNA 증폭에 의해 제조될 수 있다. 보다 바람직한 구현예에서, DNA 플랩은 HIV 레트로바이러스, 예를 들면, HIV-1 또는 HIV-2 바이러스로, 예를 들면, 이들 2개의 유형의 임의의 분리물부터 수득된다.
DNA 플랩(cPPT/CTS로 지정됨)(defined in Zennou V. et al. ref 27, 2000, Cell vol 101, 173-185 or in WO 99/55892 and WO 01/27304)은 특히 HIV의 일부 렌티바이러스 게놈의 중심에 있는 구조이며, 여기서 이는 특히 HIV 역 전사 동안 일반적으로 합성되는 3-가닥 DNA 구조를 생성하고 이는 HIV 게놈 핵 도입의 시스-결정인자로서 작용한다. DNA 플랩은 역전사 동안 중앙 폴리퓨린 관(central polypurine tract; cPPT) 및 중앙 종결 서열(contral temination sequence; CTS)에 의해 시스로(in cis) 제어되는 중앙 가닥 교체 현상을 가능하도록 한다. 렌티바이러스-유래된 벡터에 삽입된 경우, 역-전사 동안 DNA 플랩이 생성되도록 하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 전달 효율을 자극하고 핵 도입 수준을 야생형 수준으로 보완한다 (Zennou et al., Cell, 2000 Cell vol 101, 173-185 또는 WO 99/55892 및 WO 01/27304).
DNA 플랩의 서열은 선행 기술, 특히 상기 인용된 특허 출원에 개시되어 있다. 이러한 서열은 또한 본원에 기재된 pTRIP 벡터의 서열에 개시되어 있다. 이는 바람직하게는 벡터 게놈내, 바람직하게는 상기 벡터 게놈의 중심 근처에 있는 위치에 단편으로서, 임의로 추가의 플랭킹 서열(flanking sequence)과 함께 삽입된다. 대안적으로, 이는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)의 발현을 제어하는 프로모터로부터 바로 상부에 삽입될 수 있다. 벡터 게놈에 삽입된 DNA 플랩을 포함하는 상기 단편은 이의 기원 및 제조에 따라, 약 80 내지 약 200bp의 서열을 가질 수 있다.
특정 구현예에 따라서, DNA 플랩은 약 90개 내지 약 140개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
HIV-1에서 DNA 플랩은 안정한 99개-뉴클레오티드 길이 및 가닥 오버랩이다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 게놈 벡터에 사용된 경우, 이는 특히 PCR 단편으로 제조되는 경우, 보다 긴 서열로서 삽입될 수 있다. DNA 플랩을 제공하는 구조를 포함하는 특히 적절한 폴리뉴클레오티드는 HIV-1 DNA의 cPPT 및 CTS 영역을 포함하는 124-염기쌍 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 단편이다.
게놈 벡터에 사용된 DNA 플랩과 GAG 및 POL 폴리단백질을 암호화하는 캡시드화 플라스미드의 폴리뉴클레오티드는 동일한 렌티바이러스 서브-계열 또는 동일한 레트로바이러스 유사 유기체로부터 유래하는 것으로 명시되어 있다.
바람직하게는, 게놈 벡터의 다른 시스-작용 서열도 또한 DNA 플랩을 제공하는 것과 같이, 동일한 렌티바이러스 또는 레트로바이러스-유사 유기체로부터 유래된다.
벡터 게놈은 재조합 폴리뉴클레오티드를 클로닝하기 위한 하나 또는 수 개의 유일한 제한 부위(들)를 추가로 포함할 수 있다.
바람직일 구현예에서, 상기 벡터 게놈에서, 렌티바이러스 벡터 게놈의 3' LTR 서열에는 적어도 U3 영역의 활성인자(인핸서) 및 가능하게는 프로모터가 결여되어 있다. 또 다른 특수한 구현예에서, 3' LTR 영역에는 U3 영역(델타 U3)이 결여되어 있다. 이와 관련하여, WO 01/27300 및 WO 01/27304의 설명에 대해 참고한다.
특수한 구현예에서, 벡터 게놈에서, LTR 5'의 U3 영역은 비 렌티바이러스 U3에 의해 또는 tat-독립적인 1차 전사를 구동시키는데 적합한 프로모터에 의해 대체된다. 이러한 경우 벡터는 tat 전사활성인자(제3 세대 벡터)와는 독립적이다.
벡터 게놈은 또한 psi(y) 패키징 신호를 포함한다. 패키징 신호는 gag ORF의 N-말단 단편에서 유래된다. 특수한 구현예에서, 이의 서열은 프레임쉬프트 돌연변이(frameshift mutation)(들)에 의해 변형되어 전이유전자의 것으로, gag 펩타이드의 가능한 전사/해독의 어떠한 방해도 방지할 수 있다.
벡터 게놈은 임의로 스플라이스 공여체 부위(splice donor site; SD), 스플라이스 수용체 부위(splice acceptor site; SA) 및/또는 Rev-반응성 성분(RRE) 중에서 선택된 성분을 또한 포함할 수 있다.
특정 실시형태에 따라서, 벡터 플라스미드(또는 첨가된 게놈 벡터)는 전이유전자 발현 카세트에 대해 다음의 시스-작용성 서열을 포함한다:
1. 역전사에 필요한 LTR 서열(긴-말단 반복체), 전사에 필요한 서열 및 예를 들면, 임의로 바이러스 DNA 통합을 위한 서열. 3' LTR은 두 가지 주요 이유로, 유전자 전달에 필수적인 기능을 교란하지 않고, SIN 벡터(자가-불활성화)를 제공하기 위한 프로모터에 대해 적어도 U3 영역에서 결실되어 있다: 첫째로, DNA가 게놈에 통합되면, 숙주 유전자의 트랜스 활성화를 방지하기 위해서 및 둘째로, 역전사 후 바이러스 시스-서열의 자가-불활성화를 허용하기 위해. 임의로, 게놈의 전사를 구동하는 5'-LTR로부터의 tat-의존성 U3 서열은 비 내인성 프로모터 서열로 대체된다. 따라서, 표적 세포에서는 내부 프로모터로부터의 서열만이 전사될 것이다(전이유전자).
2. 바이러스 RNA 캡시드화에 필요한 Ψ 영역.
3. Rev 단백질의 결합 후 바이러스 전령인자 RNA를 핵에서 세포질로 배출하도록 하는 RRE 서열(REV 반응성 성분).
4. 핵 도입을 용이하게 하는 DNA 플랩 성분(cPPT/CTS).
5. 임의로, mRNA(Zufferey et al., 1999)의 안정성을 최적화하기 위해 추가된 전사 후 조절 성분, 특히 WPRE 시스-작용성 서열(우드척 B형 간염 바이러스 후-반응성 성분)과 같은 수지 세포에서 융합 폴리펩티드 및/또는 항원성 폴리펩티드의 발현을 증진시키는 성분, 매트릭스 또는 스캐폴드 부착 영역(scaffold attachment region)(SAR and MAR sequences), 예를 들면, 면역글로불린-카파 유전자의 것(Park F. et al Mol Ther 2001; 4: 164-173).
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 비복제성(복제-불능)인데, 즉, 벡터 및 렌티바이러스 벡터 게놈은 복제 적격 렌티바이러스에 관한 우려를 완화하는 데 적합한 것으로 고려되며 특히 투여 후 감염된 숙주 세포로부터 새로운 입자 버딩(budding)을 형성할 없다. 이는 gag, pol 또는 env 유전자의 렌티바이러스 게놈 내 부재 또는 "기능적 유전자"로서의 부재의 결과로서 잘 알려진 방식으로 달성될 수 있다. 따라서 gag 및 pol 유전자는 트랜스로(in trans)만 제공된다. 이는 또한 입자 형성에 필요한 다른 바이러스 암호화 서열(들) 및/또는 시스-작용성 유전 성분을 결실시킴에 의해 달성될 수 있다.
"기능적"이란 정확하게 전사되고/되거나 정확하게 발현되는 유전자를 의미한다. 따라서, 당해 구현예에서 본 발명의 렌티바이러스 벡터 게놈에 존재하는 경우, gag, pol 또는 env의 서열은 개별적으로 전사되지 않거나 불완전하게 전사되며; 표현 "불완전하게 전사된"은 전사체 gag, gag-pro 또는 gag-pro-pol 내 변경을 의미하며, 이들 중 하나 또는 수개는 전사되지 않는다. 렌티바이러스 복제에 포함되는 다른 서열도 이 상태를 달성하기 위해 벡터 게놈에서 돌연변이될 수 있다. 렌티바이러스 벡터의 복제 부재는 렌티바이러스 게놈의 복제와 구별될 수 있다. 더욱이, 앞서 설명한 바와 같이, 렌티바이러스 게놈은 벡터 입자의 복제를 반드시 보장하지 않고도 렌티바이러스 벡터 게놈의 복제를 보장하는 복제 오리진(origin)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터를 수득하기 위해, 벡터 게놈(벡터 플라스미드로서)은 입자 또는 슈도-입자(pseudo-particle) 속에 캡슐화되어야 한다. 따라서, 엔벨로프 단백질을 제외한, 렌티바이러스 단백질은 생산 시스템, 특히 생산 세포 내에서, gag 유전자 및 pol 렌티바이러스 유전자 또는 통합-불능 pol 유전자를 수반하고, 바람직하게는 Vif-, Vpr, Vpu- 및 Nef-보조 유전자에 대한 암호화 서열 중 일부 또는 전부를 결여하고 임의로 Tat(HIV-1 렌티바이러스 벡터의 경우)를 결여한 적어도 하나의 캡시드화 플라스미드에 의존하는 벡터 게놈과 함께, 벡터 게놈에 대해 트랜스(in trans)로 제공되어야만 한다.
슈도타입화 렌티바이러스 벡터 입자에 대해 선택된 엔벨로프-슈도타입화 단백질(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 수반하는 추가의 플라스미드가 사용된다.
바람직한 실시예에서, 패키징 플라스미드는 바이러스 입자 합성에 필수적인 렌티바이러스 단백질 만을 암호화한다. 따라서, 플라스미드 내에서 이의 존재가 안전성 문제를 일으킬 수 있는 보조 유전자는 제거된다. 따라서 패키징을 위해 트랜스로 제공된 바이러스 단백질은 각각 HIV-1에서 유래한 단백질에 대해 나열된 바와 같다:
1. 매트릭스(MA, 겉보기 분자량 p17 포함), 캡시드(CA, p24) 및 뉴클레오캡시드(NC, p6)의 구축을 위한 GAG 단백질.
2. POL 암호화된 효소: 인테그라제, 프로테아제 및 역전사효소(reverse transcriptase).
3. LTR 매개 전사의 개시에 TAT가 필요한 경우 TAT 및 REV 조절 단백질; 5'LTR의 U3 영역이 tat-독립적인 전사를 구동하는 프로모터로 대체되는 경우 TAT 발현은 생략될 수 있다. REV는 변형되고 따라서 예를 들어 벡터 게놈에서 RRE 서열을 대체하는 도메인을 인식할 수 있는 재조합 단백질에 사용될 수 있거나, RBD(RNA 결합 도메인)를 통해 RRE 서열에 결합할 수 있는 단편으로 사용될 수 있다.
바이러스 입자의 패키징 플라스미드에 포함된 유전자로부터 생성된 mRNA의 어떠한 패키징도 방지하기 위해, Ψ 영역이 패키징 플라스미드로부터 제거된다. 재조합 문제를 피하기 위해 이종 프로모터가 플라스미드에 삽입되고 폴리-A 테일이 단백질을 암호화하는 서열의 3'에 추가된다. 적절한 프로모터가 상기에 개시되어 있다.
엔벨로프 플라스미드는 본원에 개시된 바와 같이, 내부 프로모터의 제어 하에, 본원에 개시된 슈도타이화를 위한 엔벨로프 단백질(들)을 암호화한다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자의 제조를 위해 기재된 임의의 또는 모든 플라스미드는 단백질을 암호화하는 분절(segment) 내에서 코돈 최적화(codon optimization; CO)될 수 있다. 본 발명에 따른 코돈 최적화는 바람직하게는 포유동물 세포, 쥐 또는 특히 인간 세포에서, 플라스미드에 함유된 암호화 서열의 해독을 증진시키기 위해 수행된다. 본 발명에 따라서, 코돈 최적화는 벡터 입자의 제조를 직접적으로 또는 간접적으로 증진시키거나, 벡터 입자가 투여되는 숙주의 세포에 의한 이의 흡수를 증진시키거나, 또는 숙주의 형질도입된 세포의 게놈 내에 항원 폴리펩티드(전이유전자)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전달 효율을 증진시키는데 특히 적합하다. 코돈을 최적화하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 코돈 최적화는 특히 그러한 효과를 대해 이용 가능한 프로그램을 사용하여 수행된다. 코돈 최적화는 실시예에 사용된 암호화 서열에 대해 나열된다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 슈도타입된 렌티바이러스 벡터는 또한 또는 대안적으로 통합-적격이어서, 벡터 게놈 및 이것이 함유하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 형질도입된 세포의 게놈 내로 또는 이것이 투여된 숙주의 세포 내로 통합시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 특수한 구현예에서, 슈도타입된 렌티바이러스 벡터는 또한 또는 대안적으로 통합-불능이다. 이러한 경우, 벡터 게놈 및 따라서 이것이 함유하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 형질도입된 세포 또는 이것이 투여된 숙주의 세포 내에서 게놈 내로 통합되지 않는다.
따라서, 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 재조합 통합-결핍성 렌티바이러스 벡터 입자일 수 있고, 특히 여기서 재조합 통합-결핍성 렌티바이러스 벡터 입자가 HIV-1 기반 벡터 입자이고 인테그라제가 발현되지 않거나 기능적으로 발현되지 않는 방식으로 렌티바이러스의 게놈에 암호화된 인테그라제 유전자의 돌연변이의 결과로서 인테그라제 결핍성인 경우, 특히 인테그라제 유전자의 돌연변이는 이의 아미노산 잔기 64번에서 치환된 인테그라제의 발현을 초래하고, 특히 치환은 Pol에 의해 암호화된 HIV-1 인테그라제의 촉매 도메인에서 D64V이다.
본 발명은 발현된 인테그라제 단백질이 결함이 있고 면역원성 조성물 속에, 특히 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하고, 특히 병원체의 에피토프(들)을 수반하는 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 렌티바이러스 벡터의 용도에 관한 것이다.
"통합-불능"이란 바람직하게는 렌티바이러스 기원의 인테그라제가 렌티바이러스 게놈을 숙주 세포의 게놈내로 통합시키는 능력이 결여되어 있는, 즉, 이의 인테그라제 활성을 특이적으로 변경시키도록 돌연변이된 인테그라제 단백질을 의미한다.
통합-불능 렌티바이러스 벡터는 인테그라제를 암호화하는 pol 유전자를 변형시켜, 통합 결핍성 인테그라제를 암호화하는 돌연변이된 pol 유전자를 생성함으로써 수득되며, 상기 변형된 pol 유전자는 캡시드화 플라스미드 내에 함유되어 있다. 이러한 통합-불능 렌티바이러스 벡터는 특허 출원 WO 2006/010834에 기술되어 있다. 따라서, 단백질의 인테그라제 능력은 변경되지만, GAG, PRO 및 POL 단백질의 캡시드화 플라스미드로부터의 정확한 발현 및/또는 캡시드 및 그에 따른 벡터 입자의 형성, 뿐만 아니라 통합 단계, 예를 들면, 역 전사, 핵 도입에 대해 선행하거나 후속적인 바이러스 주기의 다른 단계는 완전하게 유지된다. 이것이 가능할 수 있는 통합이 변경되어 통합 단계가 상응하는 야생형 인테그라제를 함유하는 렌티바이러스 벡터와 비교하는 경우, 1/1000 미만, 바람직하게는 1/10000 미만으로 발생하는 경우, 통합은 결합이 있는 것으로 일컬어진다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 결함이 있는 인테그라제는 제1 부류의 돌연변이, 바람직하게는 아미노산 치환(1개의 아미노산 치환) 또는 결함이 있는 인테그라제의 발현 요건을 충족하는 짧은 결실로부터 야기된다. 돌연변이는 pol 유전자 내에서 수행된다. 이들 벡터는 효소의 촉매 도메인에 돌연변이 D64V가 있는 결함 있는 인테그라제를 수반할 수 있고, 이는 통합 단계의 DNA 절단 및 결합 반응을 특이적으로 차단한다. D64V 돌연변이는 슈도타입화된 HIV-1의 통합을 야생형의 1/10,000까지 감소시키지만 비분할 세포(non dividing cell)를 형질도입하는 능력을 유지하여 효율적인 도입유전자 발현을 허용한다.
HIV-1의 인테그라제의 인테그라제 능력에 영향을 미치기에 적합한 pol 유전자의 다른 돌연변이는 다음과 같다: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D116I, D116A, N120G, N120I, N120E, E152G, E152A, D-35-E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199C, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A 및 K264H.
특수한 구현예에서, pol 유전자 내 돌연변이는 다음 위치 D64, D116 또는 E152 중 하나에서, 또는 단백질의 촉매 부위에 있는 이들 위치 중 수개에서 수행된다. 상술된 것을 포함하여, 이들 위치에서의 어떠한 치환도 적합하다.
또 다른 제안된 치환은 아미노산 잔기 RRK(위치 262 내지 264번)를 아미노산 잔기 AAH로 대체하는 것이다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터가 통합-불능인 경우, 렌티바이러스 게놈은 복제 오리진(ori)을 추가로 포함하며, 이의 서열은 렌티바이러스 게놈이 발현되어야 하는 세포의 성질에 의존한다. 상기 복제 오리진은 진핵세포 오리진, 바람직하게는 포유동물 오리진, 가장 바람직하게는 인간 오리진으로부터 기원할 수 있다. 이는 대안적으로 바이러스 오리진일 수 있으며, 특히 SV40 또는 RPS에서와 같이 원형 에피솜 DNA(circular episomic DNA)에서 유래될 수 있다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 렌티바이러스 게놈에 삽입된 복제 오리진을 갖는 것이 본 발명의 유리한 구현예이다. 더욱이, 렌티바이러스 게놈이 세포 숙주 게놈에 통합되지 않는 경우(결함이 있는 인테그라제로 인해), 빈번한 세포 분열을 겪는 세포에서 렌티바이러스 게놈이 손실되고; 이는 특히 면역 세포, 예를 들면, B 또는 T 세포의 경우이다. 복제 오리진의 존재는 세포 분열 후에도, 각 세포에 적어도 하나의 렌티바이러스 게놈이 존재하도록 함으로써, 면역 반응의 효율성을 극대화시킨다.
본 발명의 상기 렌티바이러스 벡터 게놈은 특히 1999년 10월 11일에 CNCM(Institut Pasteur, 25-28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 번호 I-2330(또한 WO01/27300에도 기술됨)으로 기탁된 HIV-1 플라스미드 pTRIPΔU3.CMV-GFP 또는 이의 변이체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 상기 렌티바이러스 벡터의 렌티바이러스 벡터 게놈은 특히 2021년 2월 16일 CNCM(Institut Pasteur, 25-28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 번호 CNCM I-5657로 기탁된 HIV-1 플라스미드 pFlap-SP1베타2m-GFP-WPREm 또는 이의 변이체로부터 유래될 수 있다.
일 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 게놈은 서열 번호: 20, 서열 번호: 25 또는 서열 번호: 26의 서열을 갖는 플라스미드로부터 유래된다. 특히, 렌티바이러스 벡터 게놈은 서열 번호: 20, 서열 번호: 25 또는 서열 번호: 26과 적어도 70%, 특히 80% 또는 90%, 보다 특히 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
벡터 게놈이 이러한 특수한 플라스미드로부터 유래되는 경우, 특히 본 출원에 개시된 바와 같은 병원체의 항원성 폴리펩티드를 포함하는, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 서열은 추가로 또는 서열 번호: 20에서 GFP 암호화 단편, 서열 번호: 25의 li-EsxH 단편 또는 서열 번호: 26의 TfR-EsxH 단편 대신에 이에 삽입된다. 프로모터, 즉 CMV 또는 SP1-β2m 프로모터는 또한 다른 프로모터, 특히 전이유전자의 발현과 관련하여, 상기 개시된 프로모터 중 하나로 치환될 수 있다.
특수한 pFlap(pFLAP델타U3) 및 pTRIP 벡터에 또한 함유된 WPRE 또는 WPREm 서열은 임의로 삭제될 수 있다.
벡터 입자는 상기 플라스미드에 의해, 또는 다른 공정에 의해 적절한 세포(예를 들면, 포유동물 세포 또는 293 T 세포로 예시된 인간 배아 신장 세포와 같은 인간 세포)의 형질감염 후에 생산될 수 있다. 렌티바이러스 입자의 발현에 사용되는 세포에서, 플라스미드의 전부 또는 일부는 이의 암호화 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 발현하거나 이의 암호화 폴리뉴클레오티드를 일시적으로 또는 반-안정적으로 발현하는 데 사용될 수 있다.
생성된 입자의 농도는 세포 상층액의 P24(HIV-1에 대한 캡시드 단백질) 함량을 측정하여 결정할 수 있다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 일단 숙주에 투여되면, 이것을 슈도타입화하는 엔벨로프 단백질에 따라, 숙주의 세포, 가능하게는 특정 세포를 감염시킨다. 감염은 렌티바이러스 벡터 게놈의 역전사가 일어나는 숙주 세포의 세포질 내로의 방출을 초래한다. 일단 삼중 형태(triplex form)(DNA 플랩을 통해) 하에서, 렌티바이러스 벡터 게놈이 핵 내로 유입되고, 여기서 병원체의 항원(들)의 폴리펩티드(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)가 세포 기구를 통해 발현된다. 비-분할 세포가 형질도입되면(예를 들면, DC), 발현이 안정적일 수 있다. B 세포와 같이, 분열하는 세포가 형질도입되는 경우, 발현은, 핵산 희석 및 세포 분열로 인해, 렌티바이러스 게놈에 복제 오리진의 부재하에서 일시적이다. 세포 분열 후 렌티바이러스 벡터 게놈이 딸 세포로 적절하게 확산되도록 복제 오리진을 제공함으로써 발현이 더 길어질 수 있다. 안정성 및/또는 발현은 또한 벡터 게놈에 MAR(매트릭스 관련된 영역(Matrix Associated Region)) 또는 SAR(스캐폴드 관련된 영역(Scaffold Associated Region)) 성분을 삽입함으로써 증가시킬 수 있다.
더욱이, 이들 SAR 또는 MAR 영역은 AT가 풍부한 서열이고 렌티바이러스 게놈을 세포 염색체의 매트릭스에 고정할 수 있게 함으로써, 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하며, 특히 전이유전자의 유전자 발현을 자극하고 크로마틴(chromatin) 접근성을 증진시킨다.
렌티바이러스 게놈이 비통합성인 경우, 이는 숙주 세포 게놈에 통합되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 전이유전자에 의해 암호화된 적어도 하나의 폴리펩티드는 충분히 발현되고 처리될 만큼 충분히 길어지고, MHC 분자와 연합되어 최종적으로 세포 표면을 향해 지시된다. 병원체의 항원성 폴리펩티드(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)의 성질에 따라, MHC 분자와 연관된 적어도 하나의 폴리펩티드 에피토프는 세포성 면역 반응을 개시한다.
달리 명시되지 않는 한, 또는 기술적으로 관련되지 않는 한, 렌티바이러스 입자의 구조 또는 용도의 다양한 특징, 구현예 또는 실시예, 특히 엔벨로프 단백질(들)과 관련하여 본 출원에 개시된 특성, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드는 임의의 가능한 조합에 따라 조합될 수 있다.
본 발명은 추가로 포유동물 숙주에 대한 개별 투여를 위한 화합물의 조합에 관한 것이며, 이는 적어도:
(i) 처음으로 결정된 이종 바이러스 엔벨로프 슈도타입하 단백질 또는 바이러스 엔벨로프 슈도타입화 단백질로 슈도타입화된 본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자(이러한 첫 번째 슈도타입화 단백질은 VSV의 뉴저지 계통에서 유래할 수 있다);
(ii) (i)에서 렌티바이러스 벡터 입자와 별도로 제공되는, 두 번째 결정된 이종 바이러스 엔벨로프 슈도타입화 단백질 또는 상기 첫 번째 이종 바이러스 엔벨로프 슈도타입화 단백질(들)과 구별되는 바이러스 엔벨로프 슈도타입화 단백질로 슈도타입된 본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자(이러한 두 번째 슈도타입화 단백질은 VSV의 인디애나 계통에서 유래할 수 있다)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 가능하게는 위에 개시된 핵산의 대안의 형태와 함께, 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함하는, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 구조적으로 변형되고/되거나 화학적으로 변형된다. 이를 예시하는 폴리뉴클레오티드는 이의 5' 영역에 Kozak 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence)을 포함한다. 벡터 게놈에 존재할 수 있는 렌티바이러스 기원이 아닌 다른 핵산 서열은 폴리펩티드 합성을 개시하는데 적합한 IRES 서열(들)(내부 리보솜 도입 부위(Internal Ribosome entry site)), WPRE 서열 또는 생산된 RNA를 안정화시키는 전사 후 조절 성분으로서의 변형된 WPRE 서열이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따라서, 다수의 이종 폴리펩티드가 하나의 벡터 게놈에 의해 암호화되는 경우, 암호화 서열은 임의로 핵산 기반 분자 또는 비핵산 기반 분자인 링커 모이어티에 의해 분리될 수 있다. 이러한 분자는 이것이 연결될 3' 기능화된 핵산을 인식하는 것을 목표로 하는 기능화된 링커 분자일 수 있다. 링커로서 기능하기에 적합한 서열은 대안적으로 2A 펩티드와 같이, 자가-절단 펩티드(self-cleaving peptide)를 암호화하는 핵산일 수 있다.
위에서 설명한 구현예에서 사용될 특징을 포함하여, 본 발명의 추가 특징 및 특성은 다음의 실시예 및 도면에서 설명될 것이며 그에 따라 본 발명을 특성화하는데 사용될 수 있다.
서열 목록
서열 번호 1: li-HAEP 아미노산 서열
서열 번호 2: li-HAEP DNA 서열
서열 번호 3: li-HAEPA 아미노산 서열
서열 번호 4: li-HAEPA DNA 서열
서열 번호 5: li-EsxH 아미노산 서열
서열 번호 6: li-EsxH DNA 서열
서열 번호 7: TfR1-118-EsxH 아미노산 서열
서열 번호 8: TfR1-118-EsxH DNA 서열
서열 번호 9: SP-EsxH-MITD 아미노산 서열
서열 번호 10: SP-EsxH-MITD DNA 서열
서열 번호 11: 인간 불변 쇄(li) 아미노산 서열
서열 번호 12: 인간 불변 쇄(li) DNA 서열
서열 번호 13: 인간 트랜스페린 수용체의 막관통 도메인, 아미노산 서열
서열 번호 14: 인간 트랜스페린 수용체의 막관통 도메인, DNA 서열
서열 번호 15: EsxH20-28 에피토프 아미노산 서열
서열 번호 16: EsxH74-88 에피토프 아미노산 서열
서열 번호 17: EsxA1-20 에피토프 아미노산 서열
서열 번호 18: PE-191-18 에피토프 아미노산 서열
서열 번호 19: Ag85A241-260 에피토프 아미노산 서열
서열 번호 20: 플라스미드 pFlap-SP1beta2m-GFP-WPREm (SP1beta2m 프로모터, GFP 전이유전자 및 WPREm) DNA 서열
서열 번호 21: SP1-인간 β2-마이크로글로불린 프로모터
서열 번호 22: BCUAG 프로모터
서열 번호 23: 돌연변이체 WPRE
서열 번호 24: 인간화 li-항원 아미노산 서열(인간 li-EsxH)
서열 번호 25: 인간화 li-EsxH 항원 뉴클레오티드 서열의 융합 서열을 가진 재조합 pFLAP (β2-마이크로글로불린 프로모터)
서열 번호 26: 인간화 TfR-EsxH 항원 뉴클레오티드 서열의 융합 서열을 가진 재조합 pFLAP (β2-마이크로글로불린 프로모터)
서열 번호 27: GGGD 링커
서열 번호 28: NNGG 링커
서열 번호 29: NNDD 링커
서열 번호 30: 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자의 뉴클레오티드 서열(코돈 최적화)
서열 번호 31: Amino-acid sequence of 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자의 아미노산 서열
도 1. 베이징(Beijing) 또는 비베이징(non-Beijing) Mtb 임상 단리체에 의한 Ag85A/B 및 EsxA 분비의 식세포-내(Intra-phagocyte) 정량. (A-B) 골수-유래 DC (H-2b)를 표 S1에 표시된 대로 번호가 매겨진, 비베이징 또는 베이징 임상 단리체의 세트로부터의 각 Mtb 균주의 다양한 CFU/ml로 감염시켰다. 밤새 항온처리한 후, Ag85A/B(DE10) (A) 또는 EsxA(NB11) (B)에 특이적인 MHC-II-제한된 T-세포 하이브리도마(hydridoma)를 가하고 DC 포식체(phagosome) 내부에 분비된 Mtb 항원의 양에 대해 비례하는, T 세포 하이브리도마에 의해 생성된 IL-2의 농도를 24시간 항온처리 후, ELISA로 측정하였다. (C) 4 x 103 CFU/ml에 감염된 DC에서 측정된 것으로서, Ag85A/B 또는 EsxA 분비의 식세포-내 양.
도 2. 항원을 MHC-II 프로세싱 경로로 지시하기 위한 LV의 조정(tailoring).
(A) 통상의 LV에 의한 CD4+ T 세포의 유도 실패. EsxA-Ag85A-EspC-EsxH-PE19 Mtb 면역원의 융합을 위해 암호화된 통상의 LV로 면역화된 C57BL/6 마우스의 비장 세포에 대한 세포 계측 분석. H-2b에서 MHC-I 및 -II-제한 에피토프 둘 다를 함유하는, EspC:45-54 펩티드 또는 음성 대조 펩티드를 사용한 시험관 내 자극 이후의 CD4+ 및 CD8+ T-비장 세포 IFN-γ 반응을 나타낸다. (B) N- 또는 C-ter 끝(extremity)에 가해진 MHC-II 경로를 통한 이의 전달(routing)을 잠재적으로 촉진하는 서열을 지닌 전장 EsxH 단백질의 도해. (C) EsxH 단독, Ii-EsxH, TfR-EsxH 또는 SP-EsxH-를 암호화하는 1x106 TU/ml의 LV로 형질도입되고 EsxH:20-28에 특이적이고 Kd(YB8)에 의해 제한된(상단) 또는 EsxH:74-88에 특이적이고 I-Ad에 의해 제한된(하단) T-세포 하이브리도마로 형질도입한지 3일째에 공-배양된, DC(H-2d)에 의한 MHC-I- 또는 -II-제한 EsxH 에피토프의 제시. 결과는 밤새 공-배양 후 T-세포 하이브리도마에 의해 생산된, IL-2 농도의 평균 ± SD이다.
도 3. 최적화된 LV에 의한 전신 또는 점막 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 유도. BALB/c(H-2d) 쥐(n = 3/그룹)를 5x107 TU의 LV::li-EsxH 단독으로 피하 면역화시키거나(1) 폴리I:C(2) 또는 cGAMP(3)으로 보조제처리하였다. 11dpi에서, 비장세포의 EsxH-특이적인 Th1 사이토킨 반응을 개별 마우스의 ICS로 분석하였다. (A) CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 생산하는 사이토킨에서 수행되는 게이팅 전략(Gating strategy). (B-C) CD4+ (B) 또는 CD8+ (C) T 서브세트(subset) 내의 각각의 (다)기능성 집단의 반복 빈도. (D-E) BALB/c 마우스(n = 3/그룹)를 5x107 TU의 LV::li-EsxH를 단독으로 비강내(i.n.) 면역화하거나 폴리I:C 또는 cGAMP로 보조제처리하였다. 13dpi에서 EsxH-특이적인 폐 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 반응을 EsxH:74-88(MHC-II)(D) 또는 EsxH:20-28(MHC-I)(E)이 로드된 상동성 DC와 함께 폐에서 농축된 림프구의 공-배양에 의해 분석하였다 공-배양 상층액 속의 IL-2, IL-17A 또는 IFN-γ 함량을 ELISA로 정량화하였다.
도 4. 최적화된 LV에 의해 유도된 점막 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 반응의 특성화. BALB/c(H-2d) 마우스(n = 3/그룹)를 5x107 TU의 LV::li-EsxH 단독으로 비강내 면역화하거나 폴리I:C 또는 cGAMP로 보조제처리하였다. 13dpi에서 폐 CD4+ (A) 또는 CD8+ (E) T 세포는 희생 3분 전에, PE-항-CD45 mAb를 정맥내 주사함으로써 간질(CD45i.v -) 또는 혈관계(CD45i.v -) 내부에서 이의 위치에 대해 측정하였다. (B, F) 폐 간질 또는 혈관계의 폐 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서 ICS에 의해 검출된 바와 같이, CD27 대 CD62L 발현 또는 (C, D, G, H) 사이토카인 생산의 프로파일. 2 또는 3개의 독립적인 실험을 대표하는 결과는 정확한 세포 계측 분석을 위해 충분히 높은 세포 수에 도달하도록 실험 그룹별로 혼주시킨 폐에서 나온 것이었다.
도 5. LV 비강내 투여에 의해 유도된 점막 선천적 면역성의 특성화. (A) 다양한 점막 선천성 면역 세포 집단을 분석하기 위하여 전체 폐 세포에서 세포 계측 게이팅 전략을 사용하였다. PBS-주사된 음성 대조군으로부터의 세포가 나타나 있다. (B) 2 dpi에서 측정된 바와 같이, PBS, LV 단독 또는 cGAMP-보조제처리된 LV를비강내 주사받은된 C57BL/6 마우스에서 각각의 선천적 면역 서브세트 대 전체 폐 CD45+ 세포의 퍼센트. 결과는 3마리의 개별 마우스/그룹에서 나온 것이다. ns = 1-테일 만 휘트니 시험(One-tailed Mann Whitney test)에 의해 측정된 바와 같이, 유의적이지 않음.
도 6. CD4 + 및 CD8 + T 세포를 유도하는데 있어서 다중-항원성 LV::li-HAEP의 잠재능. (A) 음성 대조군으로서 LV::li-HAEP 또는 LV::TB로 형질도입되고 Kd(YB8), EsxH:74-88에 의해 제한되거나, I-Ad(1G1), EsxA:1-20(NB11)에 의해 제한된 EsxH:20-28에 대해 또는 I-Ab에 의해 제한된 PE19:1-18(IF6)에 대해 특이적인 T-세포 하이브리도마로 형질도입한지 3일째에 공-배양된 H-2d 또는 H-2b DC에 의한 MHC-I- 또는 -II- 제한 에피토프의 제시. (B-D) C57BL/6(H-2b) 마우스를 5x108 TU의 LV::li-HAEP로 피하 면역화시키거나 PBS를 주사하였다. 11dpi에서, 개별 마우스에서 ELISPOT(B) 또는 ICS(C-D)에 의해 SFU(스폿 형성 단위(Spot Forming Unit))로 측정된, 비장세포의 항원 특이적 사이토킨 반응. (C-D) 각 마우스에 대해 관련 없는 음성 대조군 펩티드로 관찰된 배경 신호(background signal)를 제거한 후, CD4+ (C) 또는 CD8+ (D) T 서브세트 내의 각각의 (다)기능성 집단의 반복적인 빈도가 나타나 있다.
도 7. LV::li-HAEP에 의해 유도된 점막 T 세포 반응의 특징. C57BL/6(H-2b) 마우스를 5 x 108 TU의 LV::li-HAEP로 비강내 면역화하거나, cGAMP(n = 7)로 보조제처리하거나, PBS(n = 3)로 확립하였다. 13dpi에서 희생 3분 전, PE-항-CD45 mAb를 정맥내 주사한 후, CD4+ (A) 또는 CD8+ (B) 폐 T 세포 반응을 EsxA:1-20(MHC-II), PE19:1-18(MHC-II), EspC:40-54(MHC-I 및 -II), EsxH:20-28(MHC-I) 또는 관련 없는 음성 대조 펩티드가 로딩된 동종 DC와 함께 공-배양한 후 ICS로 분석하였다. 간질 (CD45i.v -) 또는 혈관계(CD45i.v +) 내부에 로딩된 CD4+ (A) 또는 CD8+ (B) T 서브세트 내 각각의 (다)기능성 집단의 추정된 절대 숫자가 나타나 있다. (C, D) 간질(CD45i.v -) CD4+ (C) 또는 CD8+ (D)의 표현형. 결과는 세포계측 분석을 위해 충분한 수에 도달하도록 그룹 당 폐에서 혼주된 세포를 사용하여 생성시켰다.
도 8. TB 예방접종의 부스터(booster)로서 최적화된 다중-항원성 LV의 보호 잠재능. (A) 음성 대조군으로 LV::li-HAEPA 또는 LV::TB를 사용하여 형질도입하고 ZsGreen 리포터를 암호화하는 유전자를 지닌 Ag85A- 또는 EsxA-특이적인 T-세포 하이브리도마로 IL-2 프로모터의 제어하에 형질도입한지 3일째에 공-배양한 DC(H-2b)에서 검출된 바와 같은, EsxA와 병행한, Ag85A의 MHC-II 제한 제시. (B) C57BL/6 마우스(n = 5 내지 9마리/그룹)에서 수행된, BCG::ESX-1Mmar를 사용한 프라임, cGAMP-보조제처리된 LV::li-HAEPA를 사용한 부스트 및 Mtb H37Rv 균주를 사용한 챌린지의 시각표. (C) 챌린지 후 5주째에 개별 쥐의 폐 및 비장에서 CFU 계산에 의해 결정된 마이코박테리아 부하(Mycobacterial load). 1-테일 만 휘트니 시험에 의해 측정된 것으로서, ns = 유의적이지 않음, *(p = 0.0415), **(p = 0.0040) ***(p = 0.00105), 통계적으로 유의적임. (D) 대표적인 폐 헤마톡실린 및 에오신 조직병리학적 결과. 예방접종된(좌측), BCG::ESX-1Mmar-예방접종된(중간) 또는 BCG::ESX-1Mmar-프라이밍 및 cGAMP 보조제처리된 LV::li-HAEPA-부스트된(우측) C57BL 마우스의 좌측 폐 엽에서 Mtb 챌린지 후 5주째에 분석을 수행하였다.
도 9. DC 성숙 유도 시 LV의 약한 능력. C57BL/6 마우스의 골수-유래된 DC를 치료하지 않은 채로 두었고(음성 대조군), MOI = 3에서 Mtb(양성 대조군)로, 또는 높은 MOI 50에서 LV로 처리하였다. (A-C) CD40, CD80, CD86, MHC-I 및 MHC-II 표면 분자(B)의 발현을 위해 밤새 항온처리한 후 유세포 분석으로 모니터링한 것으로서, CD11c+CD11b+ 세포의 성숙(A). (C) 밝은(hi) 세포의 MFI 또는 퍼센트. 결과는 2개의 독립된 실험을 대표한다.
도 10. DC에서 IFNAR 신호전달시 LV-매개된 CD8 + T 세포 유도의 비-의존성. (A) ifnar flox/flox pCD11c-Cre-(WT) 또는 ifnar flox/flox pCD11c-Cre+(KO) 마우스의 조혈 줄기 세포로부터 유래된 골수 DC에 의한 IFNAR1 표면 발현을 평가함에 의한 KO 마우스의 DC에서 IFNAR1 결핍증의 검증. (B-G) ifnar flox/flox pCD11c-Cre- (WT) 또는 ifnar flox/flox pCD11c-Cre+(KO)의 마우스를 5 x 107 TU의 LV::OVA(B-C) 또는 LV::li-EsxH(D-G)로 근육내 면역화하였다. 11dpi에서, 항원 특이적인 CD8+ T 비장세포를 사량체 염색, ELISPOT 또는 ICS 분석을 통해 평가하였다. (B) 총 CD3+ CD8+ T 비장세포와 비교하여, "OVA 사량체"로 양성으로 염색된 세포의 퍼센트. (C) ELISPOT에 의해 검출된 바와 같이, OVA:257-264로 생체외(ex vivo) 자극 후 IFN-γ를 분비하는 비장세포의 수. (D) EsxH:3-11 또는 음성 ctrl 펩티드로 생체외 자극 후 또는 ELISPOT(SFU = 스폿 형성 단위)에 의해 검출된 바와 같이, IFN-γ 또는 TNF-α를 분비하는 비장 세포의 수. (E) 표면 CD107a 염색으로 평가된 것으로서, IFN-γ 생산 CD8+ T 세포의 탈과립화 활성. (F) CD8+ T 비장세포에서 수행된 ICS 분석에 사용된 게이팅 전략. (G) 다양한 (다)기능성 EsxH:3-11-특이적인 CD8+ T 세포 효과기의 개괄적인 빈도.
도 11. DC에서 IFNAR 신호 전달에 대한 LV-매개된 CD4+ T 세포 유도의 비-의존성. Ifnar flox/flox pCD11c-Cre- (WT) 및 ifnar flox/flox pCD11c-Cre+ (KO) 마우스를 5 x 108 TU의 LV::li-HAEP로 피하 면역화하였다. 11dpi에서, 항원 특이적 CD4+ T 세포 반응을 ICS를 통해 평가하였다. EsxA:1-20 또는 PE19:1-18 펩티드로 자극한 후 검출된 것으로서, EsxA 또는 PE19에 특이적인 (다)기능성 CD4+ T 비장 세포의 개략적인 빈도가 나타나 있다.
도 12. 근육내 또는 피하 전신 경로를 통해 주사된 LV::li-HAEP의 면역원성의 비교. C57BL/6 쥐를 5 x 108 TUdml LV::li-HAEP를 사용하여 근육내 또는 피하로 면역화시켰다. 14dpi에서 항원 특이적인, IFN-γ 또는 TNF-α T 세포 반응을 ELISPOT으로 평가하였다.
도 13. EsxH 변이체 또는 다중-항원 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드의 지도. EsxH 변이체 또는 목적한 백신의 다중-항원 융합 단백질을 암호화하는, 코돈 최적화된 cDNA 서열(표 S3)을 pFLAP 골격 플라스미드내 SP1-b2m 프로모터 하에에 삽입하였다.
도 14. GFP를 함유하는 pFLAP 골격 플라스미드의 지도. GFP 전이유전자의 서열은 WPREm 서열과 함께, SP1-β2m 프로모터 하에 삽입되었다.
도 15. 인간 면역화를 위한 플라스미드 지도. EsxH 변이체를 암호화하는, 코돈-최적화된 cDNA 서열을 pFLAP 골격 플라스미드내 SP1-β2m 프로모터 하에 삽입하였다. 패널 A: EsxH 항원은 인간 li와 융합되었다. 패널 B: EsxH 항원은 hTfR과 융합되었다.
실시예
도입
세계보건기구(World health Organization; WHO)에 따르면, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mtb)는 매년 800만 명 이상의 새로운 폐 결핵(TB) 사례를 유발하며 전 세계적으로 사망 원인 10위 중 하나이자 감염성 병원체로 인한 사망률의 첫번째 원인으로 남아있다. Mtb에 잠재적으로 감염된 약 17억 명의 무증상 사람들 중에서, 5 내지 15%가 활동성 TB로 발전할 것이다. 질병으로 발달할 위험은 HIV에 동시-감염되었거나 영양 부족, 당뇨병, 흡연 또는 알코올 중독의 영향을 받는 개인에게서 더 높다(1). 현재 유일한 TB 백신은 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 바실러스 칼메태-귀린(Bacillus Calmette-Guerin; BCG)이며, 출생 후 조기에 투여하는 것이 유아에서 Th1-편향된 반응을 유도하는 데 특히 효과적이다. BCG는 폐결핵과 파종성 결핵으로부터 어린이를 보호하는 데 효과적이지만, 이는 청소년 및 성인 폐 TB와 잠복 TB의 재활성화에는 제한적인 영향을 미치므로 전 세계 세균 확산을 방지할 수 없다(2). 따라서, (i) 노출 전 백신으로서 효과적이거나, (ii) 1차 Mtb 감염의 위험을 감소시킬 수 있거나, (iii) 잠복 TB가 활동성 질병으로 진행되는 것을 예방할 수 있거나, 또는 (iv) TB 면역 치료요법에 사용할 수 있는 새로운 면역화 전략이 시급히 요구되고 있다.
TB 보호의 면역 상관관계가 제대로 이해되지 않았음에도 불구하고, 세포내 병원체 Mtb에 대한 보호 면역은 주로 세포-매개된 면역에 의존한다는 것이 잘 확립되어 있다. 적절한 선천성 면역 및 T 세포-매개된 면역성, 특히 IFN-γ/TNF-α를 생하는 CD4+ Th1 세포 및 그보다 적은 정도의 CD8+ T 세포의 기여는 항-마이코박테리아 숙주 방어에 중요한 역할을 하지만 완전한 보호에 도달하기에는 충분하지 않다(3, 4). 1921년 이래로, 40억 명의 사람들이 BCG 백신을 접종받았으며 수많은 증진된 생-약독화된 백신 후보물(live-attenuated vaccine candidate)가 개발 중에 있다(5). BCG가 부여하는 면역성은 기간이 다양하지만, 공식적으로 대략 10년으로 제한된다. 생-약독화 백신의 동종 부스팅(boosting) 및 마이코박테리아의 반복 투여는 IL-6, IL-17, TNF-α 및 CXCL2의 강한 발현과 호중구의 대량 보충을 특징으로 하는, "코흐 현상(Koch phenomenon)"이라는 불리한 괴사성 염증 부작용을 유발할 수 있다(6). 이러한 맥락에서, 증진된 생-약독화된 백신을 사용한 프라이밍에 이어 서브단위(subunit) 백신을 사용한 부스팅에 의존하는, 이종 프라임-부스트 요법(heterogeneous prime-boost regimen)은 Mtb 특이적 보호 면역성을 상승적으로 향상시키는 매력적인 접근법이다(7). 본 발명자는 이전에 Mtb와 계통발생적으로 관련된 어류 병원체의 esx-1 게놈 영역, 즉 Mycobacterium marinum(BCG::ESX-1Mmar)으로 안정하게 보충된 BCG 파스퇴르 균주를 기반으로 하는 유망한 생-약독화된 TB 백신 후보물을 정교하게 제조하였다(8). BCG와 비교하여, 이러한 균주는 동물 모델에서, TB에 대해 크게 증진된 보호 잠재능을 나타내며, 이는 이의 공지된 특성과 일치한다. 실제로 이러한 균주는 확장된 항원 레퍼토리, 즉 cGAS(사이클릭 GMP-AMP 신타제)/STING(인터페론 유전자의 자극인자)/IRF3(인터페론 조절 인자 3)/IFN-I(제I형 IFN) 축을 개시하고 약화된 병독성을 나타내면서, NLRP3(NOD-유사 수용체 계열 단백질 3) 및 세포질성 DNA 센서, AIM-2(흑색종-1에서 부재함) 인플라솜 경로(inflammasome pathway)를 보강하는(8,9) 능력을 나타낸다. 쥐 TB 모델에서 BCG::ESX-1Mmar 백신접종은 모체 BCG보다 우수하게 마이코박테리아 부하를 감소시키지만, 아직 살균 면역성을 초래하지 않아서, 부스터 백신(booster vaccine)의 보호 잠재능을 평가할 가능성이 남아 있다.
강력한 Mtb 항원을 발현하는, 재조합 바이러스 백신 벡터의 사용은 생-약독화된 백신 후보물로 프라이밍된 개인에서 항-마이코박테리아 면역성의 상승적인 향상을야기할 수 있다. 이는 항원 특이적인 T 세포의 빈도를 증가시키고, T 세포 항원항체결합력(avidity)을 증진시킬 뿐만 아니라, 일반적으로 마이코박테리아에 의해 효율적으로 유도되지 않는 CD8+ T 세포 반응을 강화함으로써 달성될 수 있다. 복제-결함성의 렌티바이러스 벡터(LV)는 (i) 낮은 유전독성 잠재능, (ii) 8kb 이하의 삽입체를 수용하는 능력, (iii) 복제하는 및 비-분열하는 세포 둘 다에서 생체내 형질도입시키는 강력한 능력, (iv) 지속적인 항원 발현, 및 (v) 인간 집단에서 기존의 항-벡터 면역성의 표적이지 않은 장점을 기반으로, 강력한 전달 시스템 및 매력적인 면역화 도구이다(10-15). 그러나, LV의 한 가지 한계는 TB 및 기타 여러 질환에 대한 보호의 가장 좋은 상관 관계로 간주되는 CD4+ T 세포를 개시하기 위한 주요 조직적합성 복합체 부류(Major Histocompatibility Complex class II; MHC-II) 경로에 대한 항원을 표적화하는데 있어 이의 불능이다.
여기서, 본 발명자는 벡터에 의해 암호화된 항원(들)의 N-ter 부분에 MHC-II 경 불변 쇄(li)을 가함으로써 생성된, MHC-II 기구를 향해 면역원을 보내는 능력을 지닌, 신-세대의 LV를 설명한다. 전신 또는 점막 경로를 통한 이러한 접근법 및 면역화 전략은 MHC-II 기구에 대한 항원 트래핑(antigen trafficking)의 적절한 구현을 허용함으로써 CD8+ T 세포 외에, 본 발명자가 이의 표현성, 기능 및 폐 국재화에 대해 대략적으로 특성화한 적절한 CD4+ T 세포를 유도한다. 본 발명자는 추가로 BCG::ESX-1Mmar 프라임된 마우스에 전신 및 비강 내(i.n.) 경로를 통해 투여된, 부스터로 사용된, 5개의 강력한 Mtb 항원을 암호화하는 선택된 최적화된 LV의 유의적인 보호 잠재능을 보고한다.
결과
Mtb 면역원의 합리적인 선택
Mtb의 T 세포 표적은 주로 분비된 단백질이므로(16, 17), 다중-항원성 LV 기반 백신을 개발하기 위해, 본 발명자는 다음의 독성-관련 인자를 선택하였다: (i) EsxA(Rv3875), (ii) ESX-1 분비-관련 단백질(Esp)C(Rv3615c), 둘 다 ESX-1 제VII형 분비 시스템(T7SS)을 통해 분비됨, (iii) ESX-3 T7SS를 통해 분비된 EsxH(Rv0288, TB10.4), (iv) ESX-5 T7SS(18-21)를 통해 분비된 PE19(Rv1791), 및 (v) Tat 시스템을 통해 분비된, 마이콜릴 트랜스퍼라제 Ag85 복합체로부터의 Ag85A(Rv3804c)(17, 22). 후자와 관련하여, 본 발명자는 일부 베이징 임상 분리체가 Ag85A/B를 극소량만 발현한다는 것을 이미 관찰했으며, 이는 백신 후보물에 이들 항원을 포함시키는 것의 타당성에 의문이 제기되었다(23). 여기에서, 이러한 가정을 재평가하기 위해, 본 발명자는 표 S1에 나열된 15개의 비-베이징 또는 31개의 베이징 임상 Mtb 단리체 각각으로 감염된 수지 세포 내부의 Ag85A/B (도 1a) 대 EsxA(도 1b)의 식세포 내 분비를 상대적으로 정량화하였다. 이는 Ag85A/B 또는 EsxA에 특이적인 T 세포 하이브리도마(표 S2)를 사용하여 수행되어, 이들 항원에서 유래된 T 세포 에피토프의 MHC-II 매개된 제시를 측정하였고, 이는 식세포 내 분비에 비례하였다(23). 베이징 임상 분리체의 평균 Ag85A/B 발현은 비-베이징 균주에 비해 통계적으로 낮았지만, 이들 항원의 발현은 상당히 다양했으며 많은 베이징 분리체가 다량의 Ag85A/B를 생산하는 것으로 밝혀졌다(도 1c). 이 관찰은 Ag85A/B가 실제로 관련 백신 표적이라는 것을 결정한다.
Mtb 면역원을 MHC-II 경로로 보내기 위한 LV 최적화
내인적으로 생산된 항원을 MHC-I로 보내는 데 매우 효율적인, 바이러스 벡터는 그러나, MHC-II 기구로의 항원 전달에서 작동하지 않는 것은 아니지만, 불량하게 효과적이다. 이는 개개 EsxA, EspC, EsxH, PE19 또는 Ag85A 또는 이들의 다양한 융합체를 암호화하는 본 발명자의 초기의 통상의 LV가 마우스에서 CD4+ T 세포 반응을 개시하지 않는다는 사실에 의해 확인되었다. 이는 EsxA, Ag85A, EspC, EsxH, 및 PE19 (LV::TB)를 포함하는 Mtb 항원의 융합체를 암호화하는 통상적인 LV로 면역화된 C57BL/6 마우스에서 EspC-특이적인 CD8+ T 세포의 존재에도 불구하고, EspC-특이적인 CD4+ T 세포의 부재에 의해 예시되었다(도 2a). EspC:45-54 (23) 내의 MHC-II- 제한된 에피토프 외에도, 이러한 분절은 지금까지 H-2b 마우스에 포함되지 않은 MHC-I 제한 에피토프를 함유하며, 본원에서 LV 사용으로 입증되었다. CD4+ T 세포 유도를 유도할 수 없는 LV의 무능력을 극복하기 위해, 본 발명자는 EsxH-특이적인, MHC-I 또는 -II-제한된 T 세포 하이브리도마의 가용성을 고려하여, 하기 설명한 바와 같이 및 EsxH를 리포터 항원으로 사용하여, 이 벡터를 최적화하는 것을 고려하였다(표 S2)(24, 25).
본 발명자는, MHC-I 분자가 또한 엔도솜을 통해 수송되므로(28), (i) EsxH 단독(LV::EsxH), (ii) 이의 N-ter 부분에 쥐 MHC-II "li" 광 불변 쇄(LV::Ii-EsxH)와 함께 가하여, 해독된 항원을 MHC-II 구획에 대해 표적화한 EsxH(26, 27), (iii) 이의 N-ter 부분에 인간 트랜스페린 수용체의 1-118 막관통 도메인(LV::TfR1-118-EsxH)과 함께 가하여, 엔도솜을 통해 이동해야 하는 막-결합된 단백질을 생성시키고, MHC-II 경로에 잠재적으로 접근할 수 있도록 하는 EsxH(26, 27) 또는 (iv) 이의 N-말단 및 C-말단 끝 각각에서, HLA-B 유래된 리더 SP 펩티드 및 MHC-I 트래피킹 신호(Trafficking signal)와 함께 가해진 EsxH(LV::SP-EsxH-MITD)를 암호화하는 일련의 LV를 생성하였다(도 1b, 도 13). EsxH 변이체를 암호화하는 LV로 형질도입된 DC는 특이적인 T-세포 하이브리도마에 대한 MHC-I-제한된 EsxH:20-28 에피토프를 효율적으로 나타낼 수 있었다(도 2c). 통상의 LV::EsxH와는 대조적으로, 최적화된 LV::li-EsxH와 보다 적은 정도까지, LV::TfR1-118-EsxH은 특이적인 T-세포 하이브리도마에 대해 효율적인 MHC-II 제한된 EsxH:74-88 에피토프 제시를 유도할 수 있었다(도 2c). LV::SP-EsxH-MITD는 MHC-II에 의한 항원 제시를 가능화시키지 않았디. 하기에 추가로 설명된 추가 실험을 위해, 본 발명자는 Ii 플랭킹 전략을 선택하였고, 이는 MHC-I를 통한 제시에 영향을 미치지 않으면서, MHC-II를 통해 최고의 제시를 야기하였다. 요약하면, 본 발명자는 MHC-I뿐만 아니라 MHC-II 경로를 통해서도, 적절한 항원 제시, 즉 "신호 1"(29)을 제공하는 도구적 특성을 얻는 차세대의 LV를 정교하게 제조하였다.
선천성 면역성 대 이의 인식가능한 T-세포 면역원성에서 LV의 매우 작은 영향
생체 내에서 CD4+ T 세포를 유도하는 데 최적화된 좌심실의 잠재력을 탐색하기 전에, 본 발명자는 DC 성숙 또는 염증성 사이토킨 신호 전달, 즉 "신호 2-3"(29)의 유도와 관련된 LV의 일부 특성을 평가하였다. 내독소 함량에 대해 특성화되지 않은 LV 제제는 생체 내에서 몇 가지 염증 반응을 유도하는 것으로 설명되어 왔다(30). 또 다른 연구에서는 수포성 구내염 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus: VSV) G 엔벨로프 당 단백질에 기인한, 일부 정도의 시험관 내 LV-유도된 DC 성숙을 보고하였고, 이를 사용하여 LV는 슈도-타입되었다(31). 쥐 DC는, 본 발명자의 프레-GMP 품질의 다량(50의 MOI)의 VSV-G-슈도타입된 LV에 직면했던 경우에서조차, 매우 작은 CD86 상향 조절 및 MHC-Ihi 또는 -IIhi 세포의 퍼센트에서 미세한 증가로 판단되는 바와 같이, 매우 약간의 표현형 성숙을 나타내었다(도 9a-b, c). 기능적 성숙의 측면에서, LV로 형질도입된 DC는 쉽게 검출 가능한 양의 IFN-α, CCL5 및 IL-10 및 매우 적은 양의 IFN-β를 분비하였다. 중요하게도, IL-1α, IL-1β, IL-6 또는 TNF-α는 검출되지 않았으며, 이는 LV의 불량한 염증 및 심지어 항-염증 특성을 나타낸다(도 9d).
IFN-I 유도 시 LV의 효능(30, 32) 및 나이브 T 세포를 활성화하는 DC의 고유한 능력을 기반으로, 본 발명자는 이후에 DC에서 IFN-I 신호전달에 대한 LV-매개된 CD8+ T 세포 유도(12)의 의존성을 평가하였다. 이를 위해, 본 발명자는 통상의 C57BL/6 돌연변이체인, ifnar1 flox/flox pCD11c-Cre+(IFNAR 결핍성 DC 포함) 대 ifnar1 flox/flox pCD11c-Cre-(IFNAR 능숙 DC 포함)를 사용했으며, 이는 전자로부터 유래한 DC가 표면 IFNAR 발현의 큰 감소를 나타내었음을 예비확인을 거쳤다(도 10a). 동일한 새끼에서 유래한 마우스, ifnar1 flox/flox pCD11c-Cre- 또는 Cre+를 5 x 107 변환 단위(TU)의 LV::OVA 또는 LV::li-EsxH로 피하 면역화하였다. 11일 후 면역화(dpi), 사량체 염색, ELISPOT 또는 세포내 사이토킨 염색(ICS) 검정은 유사한 비율의 IFN-γ+CD107a+ 탈과립화 또는 다기능성 CD8+ T 세포를 포함하여, OVA(도 10 b-c) 또는 EsxH(도 10d-g)에 특이적인, 강하고 비교가능한 CD8+ T 비장 세포 반응을 마우스 유형 둘 다에서 검출하였다. 따라서 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 LV의 능력은 통상의 DC의 IFNAR 신호전달에 의해 지배되지 않는다.
LV의 매우 약한 DC 자극 능력은 이러한 효율적인 벡터의 본질적으로 사소한 염증 특성을 강조한다. 또한, 이들이 유도할 수 있는 드믄 염증 매개인자(IFN-I)를 통한 DC 신호 전달에서 LV-매개된 T-세포 유도의 비의존성은 기본적인 선천성 면역 메커니즘이 엄격하게 최소로 감소함을 시사한다.
전신 및 점막 CD4+ T-세포 면역성을 유도하는 데 최적화된 LV의 실제 능력
이후에, 본 발명자는 전신 또는 점막 수준에서 CD4+ T 세포 반응을 유도하는데 있어 최적화된 LV::li-EsxH의 잠재능을 평가하였다. 선천적 면역계에 대한 LV의 경미한 영향과 이러한 벡터의 지금까지 특성화되지 않은 CD4+ T 세포 면역원성을 고려하여, 본 발명자는 단독으로 또는 pro-Th1 폴리이노신-폴리시티딜산(폴리 I:C) 또는 프로-Th1/Th17 사이클릭 구아닌-아데닌 디뉴클레오티드(cGAMP)로 보조제 처리한, 최적화된 LV::li-EsxH를 조사하였다(33). 먼저 BALB/c 마우스를 단독으로 또는 보조제 처리한 5 x 107 TU의 LV::li-EsxH로 피하 면역화하였다. 11dpi에서, ICS 분석은 놀라운 양의 EsxH-특이적인, Th1 사이토킨을 생산하는 CD4+ (도 3a, b)와 CD8+ (도 3a, c) T 비장 세포를 검출하였다. 전신 면역화에 의해 유도된 이러한 반응에서는 보조제 처리(adjuvantation)의 유의한 영향이 관찰되지 않았다(도 3b, c). 이후에, BALB/c 마우스의 점막 면역화를 5 x 107 TU의 LV::li-EsxH를 단독으로 또는 보조제처리로 비강내(i.n.) 경로로 수행하였다. 13dpi에서, 폐 T 세포를 각각 MHC-II 또는 -IH-H-2d T-세포 에피토프를 지닌, EsxH:74-88 또는 EsxH:20-28 펩티드가 로딩된 동계 DC와 함께 공-배양하였다(24, 25). 점막 항원-특이적인 IL-2- 또는 IL-17A를 생산하는 CD4+ T 세포는 cGAMP 보조제 처리된 LV::li-EsxH로 면역화된 마우스의 폐에서만 검출되었다(도 3d). 동시에, 점막 항원-특이적인 IL-2- 또는 IL-17A를 생산하는 CD8+ T 세포가 어느 하나의 보조제와 조합된 LV::li-EsxH로 면역화시킨 마우스의 폐에서 검출되었다(도 3e). 항원-특이적dls IFN-γ를 생산하는 폐 CD4+ 또는 CD8+ T 세포가 모든 면역화된 그룹에서 검출되었다(도 3d, e).
희생 3분 전에, 쥐에게 PE-항-CD45 mAb를 정맥내(i.v.) 주사하면 폐 간질 내부에 위치한 조혈 세포와 폐 혈관계의 조혈 세포를 구별할 수 있다(34). PBS-주사된 대조군과 비교하여, LV::li-EsxH만으로 면역화된 마우스는 간질에서 CD45i.v - CD4+ (도 4a) 또는 CD45i.v - CD8+ (도 4e) T 세포의 주목할만한 퍼센트를 보유하였다. 이러한 T 세포 보충/확장은 보조제가 처리된 LV::li-EsxH로 면역화된 마우스에서 증가하였다. 간질성 CD4+(도 4b) 또는 CD8+ (도 4f) CD45i.v - T 세포 중, CD27- CD62L- 최근 이주 효과기의 퍼센트도 보조제 처리한 LV::li-EsxH로 면역화된 마우스에서 더 높았다. 주목할 만한 양의 항원-특이적인 IFN-γ/TNF-α를 생산하는 CD4+(도 4c) 또는 CD8+(도 4g) T-세포 효과기가 LV::li-EsxH 단독으로 면역화된 마우스의 간질에서 검출되었으며 훨씬 더 많은 양의 이러한 T 세포가 보조제 처리된 LV::li-EsxH로 면역화된 이의 대응부에서 검출되었다. cGAMP-보조제 처리된 LV::li-EsxH를 사용한 면역화는 간질에서 검출되고 EsxH74-88 또는 EsxH:20-28 펩티드로 시험관 내에서 자극시킨 폐 T 세포의 상층액 속에 방출된 IL-17A와 일치하는 바와 같이, Th17(도 4d) 및 Tc17(도 4h) 세포를 생성하였다(도 3d, e). CD45i.v + Th1 사이토킨을 생산하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포도 또한 혈관계에서 검출되었으며(도 4c, g), 이는 i.n. 예방접종이 또한 혈액 순환에 접근하여 전신 면역성에 기여할 수 있는 항원-특이적인 T 세포를 생성였음을 나타낸다.
1dpi에서 세포 계측법에 의해 결정된 바와 같이, LV 단독의 i.n. 투여는 PBS 단독 투여에 비해, 다양한 폐 선천성 면역 세포 서브세트의 비율에 유의적인 영향을 미치지 않았다(도 5a, b). 폴리I:C- 또는 cGAMP-보조제 처리된 LV의 i.n. 확립 후, DC 및 간질성 대식세포의 퍼센트에서 경미하고 통계적으로 유의하지 않은 증가가 검출되었다. 주목하게는, 프로-알레르기성 비만 세포 또는 호염기구, 및 염증성 Ly6C+ 대식세포/단핵구 또는 호중구 - 마이코박테리아 감염과 관련하여 잠재적으로 유해함(38) - 의 비율은 LV-처리된 마우스에서 변하지 않은 채로 남았다.
최적화된 다중-항원성 LV의 생성
본 발명자는 이후에 EsxH, EsxA, EspC 및 PE19(LV::li-HAEP)의 li 및 병치된 서열의 융합을 위해 최적화된 LV를 생성하였다(표 S3, 도 5s). LV::li-HAEP-형질도입된 DC는 특이적인 T-세포 하이브리도마에 대해 이들 면역원의 MHC-I- 또는 -II-제한된 에피토프를 제시할 수 있었다(도 6a). ELISPOT에 의해 측정된 바와 같이, C57BL/6 마우스에서, 5 x 108 TU의 LV::li-HAEP 단독을 사용한 전신계 피하 면역화는 서브세트 둘 다에서 주목할만한 이중기능성 또는 다중기능성으로(도 6c, d), 포함된 모든 면역원에 대해 특이적인 IFN-γ/TNF-α를 생산하는 CD4+ 또는 CD8+ T 비장 세포를 유도하였다(도 6b). LV-매개된 CD8+ T 세포 유도와 마찬가지로, 이러한 최적화된 LV를 사용하여, 본 발명자는 DC IFNAR 신호 전달에 대한 CD4+ T 세포 유도의 어떠한 의존성도 검출하지 않았다(도 11). 본 발명자는 또한 LV::li-HAEP 단독을 사용한 피하 또는 근육내(i.m.) 전신 경로를 통한 면역화가 비교가능한 IFN-γ 또는 TNF-α CD4+ 및 CD8+ T 비장세포 반응을 야기하였음을 확립하였다(도 12).
cGAMP-보조제 처리된 LV::li-HAEP를 사용한 C57BL/6 마우스의 점막 i.n. 면역화는 폐 간질에서, 및 또한 혈관계에서 보다 적은 정도로 4개의 Mtb 항원 각각에 특이적인 (다)기능성 CD4+ (도 7a) 또는 CD8+ (도 7b) T 세포를 유발시켰다. 백신접종된 마우스의 CD45i.v. - 간질성 CD4+ 또는 CD8+ T 서브세트는 증가된 비율의 CD27- CD62L- 이동 효과기 및 CD69+ CD103+ 폐-조직 체류 세포를 함유하였다(도 7c). 대부분의 CD69+ CD103+ CD4+ T 세포는 CD8+ T-세포 체류-기억 표현형을 연상시키는(39, 40), CD44+ CXCR3+ 표현형을 나타내었다(도 7c 하단).
최적화된 다중항원 LV의 보호 부스터 잠재능의 평가
백신 표적으로서 Ag85A/B 항원의 관심을 고려하여(도 1), 정교한 벡터의 부스팅 잠재능을 최대화하기 위해, 본 발명자는 Ag85A:241-260 면역원성 영역(41, 42)을 LV::li(LV::li-HAEPA)내 HAEP의 C-ter 끝에 가하였다(표 S3, 도 13). LV::li-HAEPA-형질도입된 DC는 EsxA에 의해 예시되고 특이적인 T-세포 하이브리도마(ref 23)에 의해 검출되는 바와 같이, 다른 Mtb 항원의 제시 외에, 특정의 T 세포 하이브리도마에 대한 Ag85A:241-260의 MHC-II-제한된 제시를 유도할 수 있었다(도 8a). LV::li-HAEPA의 부스터 효능을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스를 백신접종되지 않은 상태로 두거나 0주째에 모체 BCG(8)에 비해 증가된 보호 능력을 지닌 1 x 106 CFU의 BCG::ESX-1Mmar 백신 후보물로 피하 프라임시켰다(도 8b). 프라임 면역화에서 BCG에 비해 이러한 생-약독화된 백신 후보물의 장점은 이종상동성(orthologous) ESX-1 T7SS를 통해 EsxA 및 EspC를 분비하는 이의 능력과 연결되어 있으며, 이는 최적화된 다중-항원원 LV에 포함된 모든 Mtb 항원에 대한 T 세포 반응을 부스트하도록 한다. BCG::ESX-1Mmar-프라이밍된 마우스의 그룹에, 5주째에 5 x 108 TU의 cGAMP-보조제 처리된 LV::li-HAEPA로 피하 부스트한 다음, 다시 10주째에 동일한 양의 cGAMP-보조제 처리된 LV::li-HAEPA로 i.n. 부스트시켜 유도된 면역 효과기를 폐 점막으로 유인하였다. 12주째에, 마우스를 에어로졸을 통해 약 200 CFU의 악성 Mtb H37Rv 균주로 챌린지하고, 17주째에 폐와 비장에서 마이코박테리아 버던(burden)을 측정하였다. 프라임-부스트된 마우스내 평균 폐 마이코박테리아 부하 평균은 백신을 접종하지 않은 대조군에 비해 약 2.5 log10까지 감소하였고(만-휘트니 시험, p 값 = 0,0005), BCG::ESX-1Mmar-백신 접종된 대응부와 비교하여 약 1 log10까지 감소하였다(만-휘트니 시험, p 값 = 0,0415)(도 8c). 그럼에도 불구하고 BCG::ESX-1Mmar로만 백신 접종한 마우스와 비교하여 프라임 및 부스트된 마우스에서 유의적인 감소는 폐 조직병리학에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 여겨진다(도 8d). 비장에서, cGAMP-보조제 처리된 LV::li-HAEPA를 사용한 부스트는 감소된 마이코박테리아 부하로의 순(net) 경형성을 초래하였지만, 이는 통계적인 유의성에 도달하지 않았다. 이는 마우스와 기니아 피그(guinea pig) 모델에서 비장으로의 전파에 대한 ESX-1-보충된 BCG 균주의 특히 강력하고 거의 증진되지 않는 보호 효과로 설명될 수 있었다(22, 43, 44).
논의
건강한 기증자 또는 잠복성 대 활동성 TB를 지닌 개체에서 "오믹스(omics)" 접근법을 통한 인간 면역 세포의 집중적인 조사는 활성 TB에 대한 숙주 반응-기반한 진단을 개발하기 위한 바이오마커의 확인을 허용하였다(45). 그러나, 이러한 연구는 육아종의 면역 부전과 활성 TB로의 진행을 야기하는 다인자 과정(multifactorial process)에 대한 철저한 관점을 제공하지 못하였다. 따라서, 최적의 보호와 잠복기에서 활성 TB로의 비-진행의 원인성 바이오마커의 신뢰가능한 상관관계는 아직 파악하기 어려웠다. 이러한 맥락에서, 차세대 TB 백신의 합리적인 설계는 도전과제이다(46). 도메인 내 1개의 합의는 프라임-부스트 면역화 접근법으로 이루어진다. BCG는 지난 80년 동안 탁월한 안전성 기록을 나타내었고 어린이에서 TB의 파종성 형태에 대해 높은 비율의 보호 효과를 나타낸다. 따라서 (i) BCG 또는 프라이밍을 위한 증진된 생-약독화된 백신, 및 (ii) 부스팅을 위한 서브단위 백신 후보물의 사용은 촉망되는 전략을 나타낸다.
바이러스 벡터, 주목하게는 변형된 박시니아 안카라(Modified Vaccinia Ankara; MVA) 또는 아데노바이러스 벡터는 Mtb에 대한 면역화에 사용해 왔다(7). 전임상 동물 모델에서의 놀라운 성공에도 불구하고, Ag85A를 암호화하는 MVA는 임상 시험에서 불량한 면역원성이었고 보호를 유도할 수 없었다(47). NF-kB 활성인자와 함께, Ag85A를 암호화하는 다른 LV는 전신 및 점막 T-세포 면역성을 유도하였지만, 마우스 모델에서 BCG 공격에 대한 보호를 제공하지 않았다(48). BCG 프라임된 마우스에서, Ag85B-PPE57 융합을 암호화하는 LV를 사용한 부스트는 T-세포 반응 및 고-용량 i.v. MTB 챌린지에 대한 보호의 진폭을 증가시켰다(49). 이러한 연구에서, LV는 1 또는 2개의 Mtb 항원에 대해서만 암호화되었으며 MHC-II 제시 경로에 대해 항원을 표적화하도록 최적화되지 않았고, 이는 Mtb에 대한 보호를 유도하는 이의 불량한 능력을 설명할 수 있다. 실제로, 내인성으로 생산된 항원을 형질도입된 항원 제시 세포의 MHC-1 경로로 표적화하는 놀라운 능력에도 불구하고, LV를 포함한 바이러스 벡터는 대부분 CD4+ T 세포 유도를 위한 MHC-II 기구에 항원을 전달하는데 실패하였다. 여기서, 본 발명자는 다수의 강력한 Mtb 항원을 암호화하는 유전자를 가공하여 MHC-II 경로를 통해 수득된 융합 단백질의 트래피킹하도록 하는 차세대 LV를 생성하였다. 단일 또는 다중-항원성 단백질의 N-ter에서 li 또는 TfR의 첨가는 MHC-I 제시 또는 CD8+ T 세포 유도를 감소시키는 어떠한 경향성 없이, MHC-II 기구로의 적절한 항원 전달(routing) 및 CD4+ T 세포의 풍부한 개시(triggering)를 달성하였다. 그러나, 단백질 서열의 N-ter에 대한 Ii 융합은 항상 충분하지 않을 수 있으며, 수득되는 단백질의 본래의 3차 구조의 보존도 또한 중요한 것으로 여겨진다. 예를 들어, EsxH, EsxA, EspC 및 PE19에서 유래된, Ii의 융합 및 예측된 T 세포 에피토프의 군집을 암호화하는 LV는 단백질 폴딩을 보존하는데 실패하였고 소수성 잔기내 서열을 풍부하게 하여, MHC-II 기구로의 효율적인 항원 전달을 유도하지 못하였다.
최적화된 LV에 삽입된 다중-항원에 포함된 Mtb 면역원의 선택은 다양한 TB 단계 전체에서, 생체 내 마이코박테리아 병독성 및 ESX-1, -3, -5 T7SS 또는 Tat 시스템에 의한 활성 분비와의 이의 직접적인 관계를 기반으로 하였다(16, 17). 이러한 단백질 중에서, PE19는 특히 중요하다. 단일 항원으로서, PE19는 이의 여러 동족체와 공유되는 T 세포 에피토프를 지닌다. Mtb 게놈은 100개 이하의 pe(및 ppe) 유전자를 함유한다. 이의 N-ter PE 또는 PPE 모티프(motif)(18, 50, 51)를 따라 명명된, 수득된 PE/PPE 단백질은, 분비되거나 세포벽-부착된, 큰 다른유전자 계열(multigenic family)을 형성하며 많은 것이 병원성 잠재능과 관련된다(18-21). 조상 유전자 복제로부터 야기되는, PE/PPE 단백질은 실질적인 서열 상동성을 나타내므로 과다한 T-세포 에피토프를 공유한다(42). Mtb 게놈 전체에 걸쳐 pe/ppe 유전자 모두의 임의의 삽입은 독립적인 프로모터의 배열에 의한 이의 발현을 초래 하며, 이는 별개의 감염 상에서 이의 발현 프로파일에 전례 없는 정도의 가변성을 생성한다(52). 이러한 상황은 다양한 TB 상 동안 공유된 PE(/PPE) 에피토프 그룹의 연속적인 표시를 쉽게 생성할 수 있다(42, 53-55).
본 발명자가 최근 SARS-CoV-2에 대한 LV-기반 백신 접종을 통해 입증한 바와 같이(56), 전신 면역 반응은, 심지어 고품질이라 할지라도, 폐 병원체의 복제를 방지하기 위해 폐 점막의 감염 부위에 항상 도달하지 않을 수 있다. 항체와 조직-체류 림프구를 포함하는, 점막 면역성은 기도에서 병원체를 제거하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(56-60). TB 예방 접종에서, 본 발명자의 이전의 결과는 다양한 제형에서 Esx 또는 PE/PPE 항원을 사용한 비강내 면역화의 장점을 입증하였다(9, 61). 더욱이, 폐 TB에 대한 보호는 항원-특이적인 체류-기억 CD4+ T 세포의 존재와 상관관계가 있다(62-65). 여기서, 본 발명자는 EsxH 또는 HAEP(A) 폴리-항원을 암호화하는 최적화된 LV의 전신 또는 i.n.투여를 통해 유도된, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 기능과 표현형을 철저히 특성화하였다. 가장 주목하게도, 점막 면역화는 활성화된, 조직-체류 및 기억 표현형과 동반된, 다기능성효과기 특징을 지닌 폐 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 유도하였다. cGAMP 보조제로 제형화하고 i.n.을 통해 투여되는 경우, 최적화된 LV는 또한 Mtb에 대한 보호에서 예측되는 영향으로 폐 Th17 및 Tc17 반응을 유발하였다(66, 67).
시험 관내 DC 성숙에 대한 LV의 매우 경미한 영향, 및 LV 단독의 i.n. 투여 후 폐 선천 면역 세포 조성의 매우 약간의 변형은 이러한 벡터의 고유하게 낮은 염증 특성을 나타낸다. 흥미롭게도, IFN-I을 통한 DC 신호전달, 즉 LV에 의해 유도되는 드믄 염증 인자는 이러한 벡터에 의한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 유도에 포함되지 않았다. 이는 풍부한 T-세포 면역성을 유도하기 위해 LV와 관련된(engaged) 선천적 면역 경로의 가장 최소의 관여를 시사한다. LV의 비-복제 특성과 함께, 이러한 특성은 특히 점막 경로를 통한, 수의학 또는 사람 예방접종에 대한 이의 안전성에서 유리하게 반영된다. 또한 점막 장벽으로 인해 i.n. 예방접종은 최소화된 전신 부작용을 생성할 수 있었다(68).
마지막으로, 본 발명자는 예방적 C57BL/6 쥐 결핵 모델에서 증진된 생-약독화된 백신인, BCG::ESX-1Mmar(8)를 사용한 프라이밍, 및 cGAMP로 제형화된 최적화된 LV::li-HAEPA를 사용한 부스팅을 기반으로 한 백신 접종 접근법의 보호 가능성을 조사하였다. BCG::ESX-1Mmar 자체는 폐와 비장의 Mtb 부하에서 실질적인 감소를 개시하였지만, 전신 및 비강 경로를 통한 LV 부스팅은 비장으로 약화된 전파에 대한 순 경향성을 동반한, 폐에서 세균 부하의 유의적인 추가의 감소를 달성하였다. 이러한 데이터는 LV의 맥락에서, EsxH와 같은 단일의 소형 항원뿐만 아니라, Ii에 융합된 다수의 항원의 융합이 MHC-II 제시 경로에 접근하여 CD8+ T 세포 개시의 감소없이, CD4+ T 세포를 유도한다는 개념 증명 증거를 제공한다. 또한, 최적화된 LV를 사용한 i.n. 면역화는 체류-기억 표현형을 지닌 다중-특이적인 폐 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역성의 보충 및 확립을 유도하였다. 이러한 접근법은 적절한 보조제를 가함으로써 임의로 증진시킬 수 있다.
i.n. 면역화가 종격동 림프절을 포함하는지의 여부에 상관없이, 직접 보충되어 폐 실질 내로 위치하는 면역 세포 또는 "3차 림프 기관"의 고도로 조직화된 이소성 림프 유사 구조(eectopic lymphoid-like structure)는 아직 밝혀지지 않았다. 후자는 점막 조직의 면역 배 중심을 모사하여, 국소적이고 제어된 염증과 선천적 및 적응성 면역 세포 크로스-톡(cross-talk)을 위한 최적의 환경을 제공하여 잠재적 감염 부위에서 항미생물 숙주 면역성을 강화한다(74).
이제 CD4+ T 세포 반응을 유도하도록 최적화된, LV의 비-복제성 및 매우 약한 염증 특성은 특히 i.n. 경로를 통해, 점막 예방 접종을 위한 선택 도구로 이러한 벡터를 예측한다. 이러한 LV-기반 전략의 개발을 위한 전망은 마이코박테리아 감염을 훨씬 넘어, 급성 또는 만성 호흡기 감염 질환에 대한 접근법을 확장시킨다.
물질 및 방법
Mtb (폴리)항원을 암호화하는 전달 플라스미드의 작제 및 LV 생성
EsxH를 단독으로 또는 li, TfR 및 MITD와 융합하여 암호화하거나 또는 li-HAEP 또는 li-HAEPA를 암호화하는 코돈-최적화된 유전자를 Eurofins에 의해 합성한 다음, (i) 주로 면역 세포 및 특히 활성화된 APC에서 항원 발현을 구동하는 인간 β2 마이크로글로불린(β2m) 프로모터를 기반으로 하고(70), (ii) 최소한의 근위 인핸서 및 따라서 증진된 벡터 안전성(본 발명자의 미공개된 결과)가 있음에도 불구하고 CMV 프로모터에서 유래된 삽입/치환 영역을 함유하는 "SP1" 프로모터의 하부에 클로닝하였다. 프로모터는 유전자 전사를 증가시키기 위한 돌연변이된 WPRE(우드척 전사후 조절 성분(Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element)) 서열을 함유하는 pFLAPΔU3 전달 플라스미드(14)(도 13)의 BamHI과 XhoI 부위 사이에 위치한다. LV의 생산 및 적정은 다른 곳에 설명된 대로 수행하였다(56).
마이코박테리아
Mtb(H37Rv 균주) 또는 BCG::ESX-1Mmar(8)를 알부민, 포도당 및 카탈라제(ADC, Difco, Becton Dickinson, 프랑스 르 퐁-드-클라이스(Le Pont-de-Claix) 소재)가 보충된 Dubos 브로쓰에서 대수 기(exponential phase)까지 배양하였다. 프랑스에서 가장 우세한 유전자형을 대표하는, 비-베이징 및 베이징 임상 Mtb 단리체는 약물-내성 특성화 및 마이코박테리아 산재된 반복-단위-가변-수 탄뎀-반복체(Mycobacterial Interspersed Repetitive-Unit-Variable-Number Tandem-Repeat; MIRU-VNTR) 유전자형분석(genotyping)을 위해 TB에 대한 국립 참조 센터(National Reference Centre for TB)에 제출되었다(75). Mtb 임상 단리체를 올레산 ADC(OADC, Difco)가 보충된 Dubos 브로쓰에서 성장시켰다. 마이코박테리아 배양물의 역가는 OD600 측정에 의해 결정하였다. 병원성 마이코박테리아에 대한 실험은 Institut Pasteur의 위생 및 보안 권장 사항에 따라, BSL3에서 수행하였다.
시험관 내에서 MHC-I 또는 -II 제한된 항원 제시의 검출
조직적합성 골수 유래된 DC를 5% FBS가 포함된 RPMI 1640의 24-웰 플레이트에 웰당 5 x 105개의 세포로 플레이팅하였다. 부착되면, 세포를 LV 벡터로 형질도입하거나, 1μg/ml의 동종 또는 대조군 합성 펩티드로 로딩하였다. 감염 후 24시간 째에 5 x 105 개의 적절한 T 세포 하이브리도마를 가하고 공-배양 상층액을 ELISA로 24시간째에 IL-2 생산에 대해 평가하였다. 이러한 분석에서, 방출된 IL-2의 양은 MHC 분자에 의한 항원 제시의 효능에 비례한다. MHC-I 또는 -II 제한된 에피토프를 포함하는 펩티드는 Proteogenix(프랑스 실티가이(Schiltigheim) 소재)에 의해 합성되었으며 5% 디-메틸 설폭시드(DMSO)(Sigma-Aldrich)를 함유한 H2O 속에서 재구성되었다. 나타낸 항원 제시가 리포터 T 세포 하이브리도마를 사용하여 평가된 경우, 최근에 기술된 바와 같이(23), TCR 유발 후 형광 신호를 방출하도록 형질도입시켰다.
마우스, 예방접종
암컷 BALB/c(H-2d) 및 C57BL/6(H-2b)(Janvier Labs, 프랑스 르 게네스-상-이슬(Le Genest-Saint-Isle) 소재)을 적어도 1주일의 적응 후, 근육내 주사의 경우 50 μl/마우스, 꼬리의 기부에 피하의 경우 200μl/마우스, 또는 i.n. 확립의 경우 20 μl/마우스 속에 함유된 나타낸 용량의 LV로 면역화시켰다. i.n. 투여는 Imalgene1000(케타민, 즉 100 mg/kg, 프랑스 머리아(Merial) 소재) 및 롬푼(Rompun) 2%(크실라진 용액, 10 mg/kg, Bayer, 독일)의 중량-적응된 양을 함유하는 100 μl의 PBS의 복강내 주사로 수득된, 전신 마취하에 수행하였다. 나타내진 경우, LV에 10μg/마우스의 폴리I:C 또는 cGAMP (Invivogen)로 보조제처리하였다.
쥐 CD11c 프로모터의 조절하에, Cre DNA 리컴비나제를 암호화하는 유전자를 수반하는, 반접합(Hemizygous) C57BL/6(H-2b) 마우스를 "플록스드(floxed)" ifnar1 대립유전자(77)에 대해 동형접합성인 C57BL/6 마우스와 교배시켜 Cre 전이유전자를 수반하거나 수반하지 않는 동형접합성 ifnar1 flox/flox 마우스의 새끼를 수득하였다. CD11c를 발현하는 형질세포성 DC를 제외하고, ifnar1 flox/flox pCD11c-Cre+ 마우스에서, 다른 모든 DC 집단은 IFNAR1을 결여하였다(77). 사육은 파스퇴르 연구소의 중앙 동물 시설에서 SPF 조건 하에 수행되었다.
모든 마우스는 유럽 및 프랑스 지침(1987년 10월 19일자 지침 86/609/CEE 및 법령 87-848)에 따라, 지역 윤리 위원회 프로토콜 계약 # CETEA 2013-0036 및 CETEA 2012?0005(APAFIS-14638-2018041214002048) 하에서, 파스퇴르 연구소 안전성, 동물 보호 및 사용 위원회( Institut Pasteur Safety, Animal Care and Use Committee)에 의한 승인을 받은 후에, 8 내지 16주령 사이에서 사용하였다.
세포내 사이토킨 염색
면역화된 마우스로부터의 비장세포는 조직 균질화 및 100-μm 나일론 필터(Cell Strainer, BD Biosciences)를 통한 통과에 의해 수득하였고 24-웰 플레이트에 웰 당 4 x 106개의 세포로 플레이팅하였다. 폐를 400 U/ml IV 유형 콜라게나제 및 DNase I(Roche)로 37℃에서 30분 동안 처리하고 GentleMacs(Miltenyi)를 사용하여 균질화하였다. 이후에, 세포를 70-μm 나일론 필터(Cell Strainer, BD Biosciences)를 통해 여과하고 Ficoll 구배 배지(Lympholyte M, Cedarlane Laboratories)에서 쉬지않고, RT에서 3000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 폐 T-세포가 풍부한 분획을 24-웰 플레이트에서 조직적합성 골수-유래된 DC(8 x 105개의 세포/웰)와 함께 4 x 106 세포/웰로 공-배양하였다. 비장세포 또는 폐 T 세포를 10μg/ml의 상동성 또는 대조군 펩티드, 1μg/ml의 항-CD28(클론 37.51) 및 1μg/ml의 항-CD49d(클론 9C10-MFR4.B) mAb(BD Biosciences)의 존재 하에 6시간 동안 공-배양하였다. 마지막 3시간의 항온처리 동안, 세포를 BD Biosciences로부터의 Golgi Plug와 Golgi Stop의 혼합물로 처리하였다. 나타낸 경우, PE-Cy7-항-CD107a(클론 1D4B, BioLegend) mAb도 이 단계에서 배양물에 가하였다. 이후에, 세포를 수집하고, 3% FBS 및 0.1% NaN3(FACS 완충액)을 함유한 PBS로 세척하고 FcγII/III 수용체 차단 항-CD16/CD32(클론 2.4G2) 및 APC-eFluor780-항-CD3ε(클론17A2), eF450-항-CD4(클론 RM4-5), BV711-항-CD8(클론 53-6.7) mAb(BD Biosciences 또는 eBioscience)의 혼합물과 함께 4℃에서 25분 동안 항온처리하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척한 후, Cytofix/Cytoperm 키트(BD Bioscience)를 사용하여 투과시켰다. 이후에, 세포를 Cytofix/Cytoperm 키트로부터의 PermWash 1X 완충액으로 2회 세척하고 AF488-항-IL-2(클론 JES6-5H4, BD Biosciences), PE/Dazzle 594-항-TNF-α(MP6-XT22, BioLegend) 및 APC-항-IFN-γ(클론 XMG1.2, BD Biosciences) mAb의 혼합물 또는 적절한 대조 Ig 동형의 혼합물과 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 이후에, 세포를 PermWash로 2회, FACS 완충제로 1회 세척한 다음, Cytofix(BD Biosciences)로 4℃에서 밤새 고정시켰다. 세포는 Attune NxT 세포계측기 시스템(Invitrogen)에서 획득되었으며 데이터 분석은 FlowJo 소프트웨어(Treestar, 미국 오레곤 주 소재)를 사용하여 수행하였다.
폐 세포 표현형
PE-항-CD45(클론 30-F11, BioLegend)이 정맥 주사된 마우스로부터의 림프구가 풍부한 폐 세포를 희생 3분 전에 상술한 바와 같이 제조하고 APC-eFluor780-항-CD3ε(clone17A2, eBioscience), eF450-항-CD4(클론 RM4-5, eBioscience), BV711-항-CD8(클론 53-6.7, BD Biosciences) mAb와, (i) PE-Cy7-항-CD27(클론 LG.7F9, eBioscience) 및 AF700-항-CD62L(클론 MEL-14, BD Biosciences) mAb, 또는 (ii) BV605-항-CD69(클론 H1.2F3, BioLegend), FITC-항-CD103(클론 2E7, BioLegend), PE-Cy7-항-CD49a(클론 HM1, BioLegend), AF700-항-CD44(클론 IM7, BioLegend) 및 APC-Fire750-항-CXCR3(클론 CXCR3-173, BioLegend) mAb의 혼합물로, 모두 항-CD16/CD32( BD 바이오사이언스)를 차단하는 FcγII/III 수용체의 존재하에 염색하였다. 4℃에서 25분 동안 항온처리한 후, 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하고 4℃에서 밤새 Cytofix(BD Bioscience)와 함께 항온처리함으로써 고정시켰다. 폐 선천성 면역 세포의 세포 계측 분석은 최근 다른 곳에서 자세히 설명되었다(56).
ELISPOT 분석
개개 마우스로부터의 비장세포를 균질화하고 100μm 공극 필터를 통해 여과하고 5분 동안 1500rpm에서 원심분리하였다. 이후에, 세포를 적혈 세포 분해 완충제(Red Blood Cell Lysing Buffer)(Sigma)로 처리하고, PBS로 2회 세척하고 MACSQuant-10 세포계측기(Miltenyi Biotec)에서 계수하였다. 이후에, 비장세포를 ELISPOT 플레이트(마우스 IFN-γ 또는 TNF-α ELISPOTPLUS, Mabtech) 내에서 10%의 열불활성화된 FBS, 100 U/ml의 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신, 1 x 10-4 M의 비-필수 아미노산, 1 vol/vol HEPES, 1 x 10-3 M 피루브산나트륨 및 5 x 10-5 M의 β-머캅토에탄올을 함유하는, 200 μl의 RPMI-GlutaMAX 속에서 1 x 105개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 기능성 대조군으로서, 2 μg/ml의 적절한 합성 펩티드(Proteogenix) 또는 2.5 μg/ml의 콘카나발린 A(Sigma)로 자극시키거나, 자극시키지 않고 두었다. 각각의 마우스에 대해, 검정은 제조업자의 추천에 따라, 3배수로 수행하였다. 플레이트는 ELR04 ELISPOT 판독기(AID, Strassberg, Germany)에서 분석하였다.
보호 검정
C57BL/6 마우스를 s0일째에 1 x 106 CFU/마우스의 BCG::ESX-1Mmar (8)를 사용하여 피하 프라임하고, 5주째에 5 x 108 TU/마우스의 보조제 처리된 LV를 사용하여 피하 부스트하고, 다시 10주째에 5 x 108 TU/마우스의 보조제처리된 LV를 사용하여 i.n. 부스트하였다. 면역화된 마우스, 뿐만 아니라, 연령-매치된, 예방접종되지 않은 대조군을 i.n. 부스트 후 앞서 기술한 바와 같이(9), 에어로졸을 통한 실험실제조 네불라이저(nebulizer)를 사용하여 i.n. 부스트 후 2주째에 챌린지하였다. 요약하면, H37Rv Mtb 균주의 1.7 x 106 CFU/ml 현탁액 5ml를 에어로졸화하여 약 200 CFU/마우스의 흡입 용량을 전달하였다. 감염된 마우스를 Institut Pasteur의 BSL3 시설에 있는 격리소에 두었다. 5주 후, 감염된 마우스의 폐 또는 비장을 MillMixer 균질화기(Qiagen, 프랑스 코르타보우(Courtaboeuf) 소재)를 사용하여 균질화하고 PBS에서 제조된 연속 5배 희석액을 ADC(Difco, Becton Dickinson)가 보충된 7H11 한천에 플레이팅하였다. CFU는 37℃에서 3주간 항온처리한 후에 계수하였다. 그룹간 CFU 차이의 유의성은 Prism v8.01(GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 만-휘트니 t-시험으로 측정하였다.
[표 S1]
[표 S2]
[표 S3]
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CNCM COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICRO-ORGANISMES (CNCM) CNCMI-2330 19991011 CNCM COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICRO-ORGANISMES (CNCM) CNCMI-5657 20210216
SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR THERAVECTYS <120> LENTIVIRAL VECTORS TARGETING ANTIGENS TO MHC-II PATHWAY AND INDUCING PROTECTIVE CD8+ AND CD4+ T-CELL IMMUNITY IN A HOST <130> IP20234357FR <150> EP21305317.6 <151> 2021-03-12 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 617 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> li-HAEP amino acid sequence <400> 1 Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile 1 5 10 15 Leu Gly Asn Arg Pro Arg Glu Pro Glu Arg Cys Ser Arg Gly Ala Leu 20 25 30 Tyr Thr Gly Val Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala 35 40 45 Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu 50 55 60 Thr Ile Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Met Lys Leu 65 70 75 80 Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Gln Met Arg Met Ala Thr Pro Leu 85 90 95 Leu Met Arg Pro Met Ser Met Asp Asn Met Leu Leu Gly Pro Val Lys 100 105 110 Asn Val Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Gln Asp His Val Met His Leu 115 120 125 Leu Thr Arg Ser Gly Pro Leu Glu Tyr 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gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta 1620 ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat 1680 ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa 1740 agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc 1800 accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat 1860 cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc 1920 ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat 1980 aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta 2040 ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata 2100 gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg 2160 aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga 2220 tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccgaa ttcacaaatg gcagtattca 2280 tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag 2340 acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa 2400 attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccactttg gctgatacgc gtggagttcc 2460 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 2520 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 2580 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 2640 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta cggaaaccct 2700 gcagggaatt ccccagctgt agttataaac agaagttctc cttctgctag gtagcattca 2760 aagatcttaa tcttctgggt ttccgttttc tcgaatgaaa aatgcaggtc cgagcagtta 2820 actggcgggg gcaccattag caagtcactt agcatctctg gggccagtct gcaaagcgag 2880 ggggcagcct taatgtgcct ccagcctgaa gtcctagaat gagcgcccgg tgtcccaagc 2940 tggggcgcgc accccagatc ggagggcgcc gatgtacaga cagcaaactc acccagtcta 3000 gtgcatgcct tcttaaacat cacgagactc taagaaaagg aaactgaaaa cgggaaagtc 3060 cctctctcta acctggcact gcgtcgctgg cttggagaca ggtgacggtc cctgcgggcc 3120 ttgtcctgat tggctgggca cgcgtttaat ataagtggag gcgtcgcgct ggcgggcatt 3180 cctgaagctg acagcattcg ggccgagcga tcggatccgc caccatggat caagctagat 3240 cagcattctc taacttgttt ggtggagaac cattgtcata tacccggttc agcctggctc 3300 ggcaagtaga tggcgataac agtcatgtgg agatgaaact tgctgtagat gaagaagaaa 3360 atgctgacaa taacacaaag gccaatgtca caaaaccaaa aaggtgtagt ggaagtatct 3420 gctatgggac tattgctgtg atcgtctttt tcttgattgg atttatgatt ggctacttgg 3480 gctattgtaa aggggtagaa ccaaaaactg agtgtgagag actggcagga accgagtctc 3540 cagtgaggga ggagccagga gaggacttcc ctgcaggagc tggagctatg tcccagatta 3600 tgtacaacta tccagcaatg ttggggcatg ccggggatat ggccggctat gcaggcaccc 3660 ttcaatccct gggagccgaa attgccgtag agcaggctgc ccttcagagt gcatggcaag 3720 gcgatactgg tatcacatac caagcgtggc aggcacagtg gaatcaggca atggaagatt 3780 tggtgcgagc ttatcatgcc atgagttcca cacacgaagc caacaccatg gcgatgatgg 3840 ctagggatac cgccgaagct gccaagtggg gaggatgact cgagaattcc cgataatcaa 3900 cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt 3960 acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct 4020 ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc 4080 gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg 4140 ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc 4200 acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 4260 actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccgcggct gctcgcctgt 4320 gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca 4380 gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt 4440 cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgggg gtacctttaa 4500 gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac 4560 tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatcgtcg agagatgctg catataagca 4620 gctgcttttt gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc 4680 tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt 4740 agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc 4800 agtgtggaaa atctctagca gttctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac 4860 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 4920 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 4980 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 5040 ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttcta ctgggcggtt 5100 ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 5160 ccctgcaaag taaactggat ggctttctcg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 5220 agctctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 5280 gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 5340 atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 5400 gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcaag acgaggcagc gcggctatcg 5460 tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 5520 agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 5580 cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 5640 gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 5700 gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 5760 gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 5820 ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 5880 tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 5940 gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 6000 cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aattattaac 6060 gcttacaatt tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 6120 atacaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 6180 tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatagc 6240 acgtgctaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 6300 tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 6360 agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 6420 aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 6480 cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 6540 agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 6600 tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 6660 gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 6720 gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 6780 ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 6840 gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 6900 ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 6960 ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggg cttttgctgg ccttttgctc 7020 acatgttctt gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcg 7063 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 27 Gly Gly Gly Asp 1 <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 28 Asn Asn Gly Gly 1 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 29 Asn Asn Asp Asp 1 <210> 30 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotidic sequence of Green Fluorescent Protein (GFP) gene (codon optimized) <400> 30 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720 <210> 31 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino-Acid sequence of Green Fluorescent Protein (GFP) gene <400> 31 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235

Claims (16)

  1. 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈으로, 상기 융합 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단으로 정렬된:
    - (i) 바람직하게는 서열 번호: 11의, MHC-II-관련 경불변 쇄 (MHC-II-associated light invariant chain)(li), 또는 (ii) 바람직하게는 서열 번호: 13의, 트랜스페린 수용체(TfR)의 막관통 도메인, 및
    - 병원체의 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드,
    를 포함하는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항원성 폴리펩티드는 병원체의 하나의 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 단일-항원성 폴리펩티드이거나, 또는 하나 이상의 병원체의 적어도 2개의 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 다중-항원성 폴리펩티드인, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 병원체는 세균, 기생충 또는 바이러스 병원체, 특히 포유동물에서 급성 또는 만성 호흡기 감염성 질환과 관련된 병원체, 특히 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 인플루엔자 바이러스, 또는 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스인, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항원성 폴리펩티드는 EsxA, EspC, EsxH, PE19 또는 Ag85A로부터 선택되는 하나 이상의 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mtb) 항원, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하며,
    특히 다음의 Mtb 항원성 조합:
    (a) EsxH;
    (b) EsxH 및 EsxA;
    (c) EsxH, EsxA 및 PE19;
    (d) EsxH, EsxA, EspC 및 PE19;
    (e) EsxH, EsxA, EspC, PE19 및 Ag85A;
    또는 이의 면역원성 단편
    중 하나를 포함하는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 게놈은 pFLAP 벡터 플라스미드, 특히 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 서열의 벡터 플라스미드로부터 수득되며, 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서 기능적인 프로모터, 특히 CMV 프로모터, 인간 β2-마이크로글로불린 프로모터, 서열 번호: 21의 SP1-인간 베타-2 마이크로글로불린 프로모터 또는 서열 번호: 22의 복합체 BCUAG 프로모터의 제어 하에 클로닝되었고, 상기 벡터는 선택적으로 우드척 간염 바이러스(woodchuck hepatitis virus; WPRE), 특히 서열 번호: 23에 제시된 돌연변이(mutant) WPRE의 전사후 조절 성분을 포함하는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    특히 상기 게놈은 pFLAP 벡터 플라스미드, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열 서열 번호: 20의 벡터 플라스미드 내에 삽입되고, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈 내에 포함된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 융합 폴리펩티드는 GFP 서열을 대체하여 제한 부위 BamHI과 XhoI 사이에 삽입되는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 입자.
  8. 제7항에 있어서,
    재조합 통합-결핍성 렌티바이러스 벡터 입자이고, 특히 재조합 통합-결핍성 렌티바이러스 벡터 입자는 HIV-1 기반 벡터 입자이고 인테그라제가 발현되지 않거나 기능적으로 발현되지 않도록 렌티바이러스의 게놈에 암호화된 인테그라제 유전자의 돌연변이의 결과로서 인테그라제 결핍성이며, 특히 인테그라제 유전자의 돌연변이는 이의 아미노산 잔기 64번에서 치환된 인테그라제의 발현을 초래하고, 특히 상기 치환은 Pol에 의해 암호화된 HIV-1 인테그라제의 촉매 도메인에서 D64V인, 재조합 렌티바이러스 벡터 입자.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 재조합 복제-불능 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터 입자(replication-incompetent pseudotyped lentiviral vector particle), 특히 복제-불능 슈도타입화된 HIV-1 렌티바이러스 벡터 입자이며, 특히 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 인디애나 또는 뉴저지 혈청형의 수포성 구내염 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus; V-SVG)로부터의 당단백질 G로 슈도타입화되는, 재조합 렌티바이러스 벡터 입자.
  10. 제6항에 따른 DNA 플라스미드로 형질감염된 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포, 특히 HEK-293T 세포주 또는 K562 세포주인, 숙주 세포.
  11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자와, 이를 필요로 하는 숙주, 특히 인간 숙주에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들)을 포함하는, 포유동물 숙주에 투여하기에 적합한, 특히 백신 조성물인, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    보조제(adjuvant), 특히 폴리이노신-폴리시티딜 산(폴리I:C) 또는 이의 유도체, 또는 사이클릭 디뉴클레오티드 보조제, 특히 사이클릭 구아닌-아데닌 디뉴클레오티드(cGAMP)와 같은 pro-Th1 및/또는 pro-Th17 보조제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    이를 필요로 하는 숙주, 특히 인간 숙주에서, 항원성 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편에 대해 지시된 항체의 유발에 의해, 보호적, 유리하게는 예방적 면역 반응을 유발하는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 면역 반응은, 항원 제시 세포, 특히 수지 세포에 의한 항원성 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편의 MHC-I 제한된 제시 및 MHC-II 제한된 제시의 유도, 및 CD4- 및 CD8-매개된 세포성 면역 반응의 유도를 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    이를 필요로 하는 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에서, 병원체에 의한 감염, 특히 포유동물에서 급성 또는 만성 호흡기 감염성 질환과 관련된 병원체에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  16. 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물의 제조에 적합한 재조합 렌티바이러스 벡터 입자의 제조 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른, 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈을 수반하는 재조합 렌티바이러스 전달 벡터, 또는 제6항에 따른 DNA 플라스미드를 숙주 세포, 예를 들어 HEK-293T 세포주 또는 K562 세포주 내 형질감염시키는 단계;
    b) 단계 a)의 세포를, (i) 엔벨로프 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터 및 패키징 작제물(packaging construct)로서 렌티바이러스 GAG 및 POL 또는 돌연변이된 POL 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터; 및 (ii) VSV-G 인디애나(VSV-G indiana) 또는 뉴저지 엔벨로프(New Jersey envelope)를 암호화하는 플라스미드로 공-형질감염(co-transfection)시키는 단계;
    c) 융합 폴리펩티드를 발현하는 재조합 렌티바이러스 벡터 입자의 생산에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    d) 융합 폴리펩티드를 발현하는 재조합 렌티바이러스 입자를 회수하는 단계;
    의 단계들을 포함하는, 제조 방법.
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