CN116981777A - 靶向mhc-ii途径抗原并在宿主中诱导保护性cd8+和cd4+t细胞免疫的慢病毒载体 - Google Patents

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Abstract

一种重组慢病毒载体基因组，其包含编码融合多肽的多核苷酸，其中所述融合多肽包含从N末端到C末端排列的：第一多肽，其包含(i)MHC‑II相关的轻恒定链(li)，或(ii)转铁蛋白受体(TfR)的跨膜结构域和病原体的至少一种抗原性多肽。本发明还涉及一种慢病毒载体和包含其的药物组合物。

Description

靶向MHC-II途径抗原并在宿主中诱导保护性CD8+和CD4+T细 胞免疫的慢病毒载体
技术领域
本发明涉及旨在提供用于将免疫原不仅递送至MHC-I途径、而且递送至MHC-II途径以及诱导CD4+和CD8+T细胞应答的新一代载体的慢病毒载体。
具体地，本发明涉及表达被选择用于在宿主、特别是哺乳动物宿主、尤其是需要其的人类宿主中引发免疫应答的抗原的此类慢病毒载体，其中该免疫应答包括CD4+T细胞应答。抗原可以从由编码融合多肽的多核苷酸组成的载体的慢病毒骨架中的插入物中表达，该融合多肽包含与单个抗原或多个抗原融合的MHC-II途径寻址分子。
本发明的慢病毒载体被提供用于设计免疫学组合物，优选候选疫苗，特别是适用于哺乳动物宿主、尤其是人类宿主的疫苗。
背景技术
慢病毒载体(lentiviral vector，LV)提供了最有效的疫苗平台之一，依赖于其将基因转移至宿主细胞核的突出潜力，特别是包括抗原呈递细胞(APC)。这种基因的核转移启动抗原的表达，抗原容易进入I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递机制，即蛋白酶体，以进一步触发CD8+T细胞。与其将内源性产生的抗原递送至MHC-I途径的卓越能力形成鲜明对比的是，包括LV在内的病毒载体在将非分泌性抗原递送至核内体MHC-II区室(MIIC)方面几乎无效或不起作用，并且无法触发CD4+T细胞。虽然CD8+T细胞在很大程度上有助于传染病或肿瘤生长的免疫控制，但CD4+T细胞是主要的免疫参与者。除了其长寿命和自身直接的效应器功能外，CD4+T细胞还通过调节先天免疫、定制B细胞应答和支持CD8+效应T细胞功能来协调免疫系统。因此，利用LV诱导CD4+T细胞的潜力将使其在疫苗策略中成功率最大化。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种包含编码融合多肽的多核苷酸的重组慢病毒载体基因组，其中所述融合多肽包含从N末端至C末端排列的：
-第一多肽，其包含(i)MHC-II相关的轻恒定链(li)，优选SEQ ID No.11，或(ii)转铁蛋白受体(TfR)的跨膜结构域，优选SEQ ID No.13，和
-病原体的至少一种抗原多肽。
本发明还涉及一种包含根据本发明的重组载体基因组的DNA质粒。
本发明还涉及一种重组慢病毒载体或重组慢病毒载体颗粒，其包含根据本发明的重组慢病毒载体基因组。
本发明还涉及一种融合多肽，其包含从N末端至C末端排列的：
-第一多肽，其包含(i)MHC-II相关的轻恒定链(li)，优选SEQ ID No.11，或(ii)转铁蛋白受体(TfR)的跨膜结构域，优选SEQ ID No.13，和
-病原体的至少一种抗原多肽。
本发明还涉及一种编码所述多肽的多核苷酸。
本发明还涉及一种用根据本发明的DNA质粒转染的宿主细胞、优选哺乳动物宿主细胞、特别是人类宿主细胞，特别是其中所述宿主细胞是HEK-293T细胞系或K562细胞系。
在另一个方面，本发明涉及一种适于施用给哺乳动物宿主、特别是人类宿主的药物组合物、特别是疫苗组合物，其包含本发明的重组慢病毒载体、本发明的重组慢病毒载体颗粒或本发明的宿主细胞，以及一种或多种适于施用给需要其的宿主、特别是哺乳动物宿主、尤其是人类宿主的药学上可接受的赋形剂。
具体地，本发明涉及药物组合物，其用于通过引发针对抗原多肽或其免疫原性片段中所含表位的T细胞应答，和/或需要其的宿主、特别是哺乳动物宿主、尤其是人类宿主中的细胞和/或体液应答，来引发保护性的、优选预防性的免疫应答。
本发明的另一个方面涉及一种用于制备重组慢病毒载体颗粒的方法，该重组慢病毒载体颗粒适于制备药物组合物、特别是疫苗组合物，该方法包括以下步骤：
a)在宿主细胞(例如HEK-293T细胞系或K562细胞系)中转染携带根据本发明的慢病毒载体基因组的重组慢病毒转移载体或根据本发明的DNA质粒；
b)用以下物质共转染步骤a)的细胞：(i)编码慢病毒GAG和POL或突变POL蛋白的作为包装构建体的质粒载体；和(ii)编码VSV-G印第安纳(Indiana)或新泽西(New Jersey)包膜的质粒；
c)在适于产生表达本发明的融合多肽的重组慢病毒载体颗粒的条件下，培养宿主细胞；
d)回收表达本发明的融合多肽的重组慢病毒颗粒。
具体实施方式
本发明人设计并制备了一种编码重组融合蛋白的慢病毒载体平台，其中一种或多种抗原与蛋白质结构域融合，生成通过核内体运输的膜结合蛋白，从而将抗原递送至MHC-II机制。本发明人已经发现，MHC-II途径递送蛋白质结构域，特别是与MHC-II复合物相关联的轻恒定链(li)以及转铁蛋白受体的跨膜结构域，当与病原体的抗原融合时，当使用表达所述抗原的重组慢病毒载体将抗原加工成表达MHC-II分子的抗原呈递细胞时，可以引发MHC-II抗原呈递和强烈的CD4+T细胞免疫应答。这是出人意料的，因为现有慢病毒平台的T细胞免疫原性大多局限于CD8+T细胞免疫应答。
本发明人还观察到，抗原的MHC-II呈递并未表现出对抗原的MHC-I呈递的不利影响，从而能够引发涉及两种呈递途径的免疫应答。
因此，本发明公开了一种重组慢病毒载体基因组，其包含编码融合多肽的多核苷酸，该融合多肽表达为包含与一个或多个抗原结构域融合的MHC-II途径递送结构域的多结构域重组蛋白。
融合多肽由在慢病毒转移载体的骨架中重组的多核苷酸编码，以便能够制备表达携带抗原的融合多肽的慢病毒载体颗粒，以引发免疫应答，特别是保护性免疫原性应答或有利地针对提供抗原的病原体的无菌保护。
在一个方面，本发明因此涉及一种包含编码融合多肽的多核苷酸的重组慢病毒载体基因组，其中所述融合多肽包含从N末端到C末端排列的：
-多肽，其包含(i)MHC-II相关的轻恒定链(li)，优选SEQ ID No.11，或(ii)转铁蛋白受体(TfR)的跨膜结构域，优选SEQ ID No.13，和
-病原体的至少一种抗原多肽。
在一个实施方式中，融合多肽包含与病原体的至少一种抗原多肽融合的MHC-II相关的轻恒定链(li)或由其组成。
在另一个实施方式中，融合多肽包含与病原体的至少一种抗原多肽融合的转铁蛋白受体(TfR)的跨膜结构域或由其组成。
根据本发明，当编码两种多肽的核苷酸序列在框内相互连接，以产生编码融合多肽或蛋白质的嵌合基因时，这两种多肽彼此融合。在本发明中，抗原多肽的核苷酸序列相对于第一多肽的核苷酸序列通常连接在3’位置。两个多肽序列之间的融合可以是直接的或间接的。当第一多肽链的C末端共价键合到第二多肽链的N末端时，两种多肽直接融合。优选地，多肽间接融合，即两种融合的多肽之间存在接头肽或间隔肽或另一种多肽。
恒定链优选地是人MHC-II相关的轻恒定链。在一个实施方式中，轻恒定链包含SEQID No.11的序列或与SEQ ID No.11具有至少70％、优选80％或85％、优选90％或95％、还优选98％或99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，特别是由其组成。在一个实施方式中，轻恒定链相对于SEQ ID No.11具有1至10个、特别是1至5个、更特别是1至3个氨基酸变化。如本文所用，氨基酸变化可以在于氨基酸置换、添加或缺失。优选地，氨基酸置换是保守氨基酸置换。
转铁蛋白受体天然地充当转铁蛋白的载体蛋白。其功能是通过受体介导的内吞作用内化转铁蛋白-铁复合物，将铁输入细胞。在本发明中，转铁蛋白受体优选地是人转铁蛋白受体。
因此，融合多肽可以包含人转铁蛋白受体的跨膜结构域，优选人转铁蛋白受体的氨基酸1至118。在一个实施方式中，包含在本发明的融合多肽内的转铁蛋白受体的跨膜结构域包含SEQ ID No.13的序列或与SEQ ID No.13具有至少70％、优选80％或85％、优选90％或95％、还优选98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，优选地由其组成。在一个实施方式中，转铁蛋白受体的跨膜结构域相对于SEQ ID No.13具有1至10个、特别是1至5个、更特别是1至3个氨基酸变化。
根据本发明，融合多肽携带一种或多种抗原。
在一个实施方式中，抗原多肽是包含病原体的一种抗原或其免疫原性片段的单抗原多肽。可替代地，所述抗原多肽是包含一种或多种病原体的至少两种抗原或其免疫原性片段的多抗原多肽。
如本文所定义的“抗原”或“抗原多肽”为致病生物的野生型或天然抗原，或者为此类野生型或天然抗原的片段，或者为包含相对于野生型或天然抗原少于5％的突变的，特别是置换的氨基酸残基的突变多肽。突变特别是野生型或天然抗原的氨基酸序列的1、2、3或4个氨基酸残基的点突变。野生型或天然抗原的片段有利地保持其所源自的多肽的免疫原性特性，或者当其由本发明的慢病毒载体表达时显示出改进的免疫原性特性，并且当在宿主中表达时有利地显示出免疫保护特性。抗原片段具有这样的氨基酸序列：其足以提供一个或多个表位，特别是T细胞表位，且更特别是CD4+或CD8+T细胞表位或两者，并且其保持免疫原性、特别是导致其所源自的抗原多肽的保护活性的保护特性和/或当由本发明的慢病毒载体表达时表现出此类保护特性。
表述“T细胞表位”是指参与由T细胞驱动的适应性免疫应答的抗原决定簇。特别地，当在合适的条件下递送至宿主时，所述T细胞表位引发T细胞。根据一个具体实施方式，根据本发明靶向的抗原多肽和这些抗原多肽的多肽衍生物包含介导CD4+T细胞应答的表位，并且有利地还包含介导CD8+T细胞应答的表位。
本发明中所述和所用的多肽和抗原可以与天然蛋白质具有至少50％的氨基酸同一性，特别是至少60％，特别是至少70％，特别是至少80％，更特别是至少90％或95％、更特别是至少99％的同一性。
在一个具体的实施方式中，融合多肽提供至少2种，特别是至少3种或至少4种或至少5种，特别是是2、3、4或5种，并且因此包括至少2种、至少3种或至少4种抗原(和/或相对于病原体的天然或野生型确定的抗原的抗原片段或突变抗原)。在一个具体的实施方式中，融合多肽中所含的抗原多肽包含至多6种抗原或其抗原性片段或其突变片段的融合物或由其组成。本发明人已经证明，本发明的融合多肽能够驱动融合在第一多肽后面的大抗原多肽的表达。在一个实施方式中，融合多肽包含至少200个氨基酸，特别是至少300个氨基酸，特别是至少400个氨基酸，更特别是至少500或600个氨基酸。在一个实施方式中，融合多肽包含200至1000个氨基酸，特别是200至800个氨基酸。在一个实施方式中，包含由慢病毒载体表达的一种或多种抗原的抗原多肽包含至少100个氨基酸，特别是至少300个氨基酸，更特别是至少400或500个氨基酸。在一个实施方式中，抗原多肽包含100至1000个氨基酸，特别是200至600个氨基酸。
抗原多肽可以通过接头与第一多肽融合。类似地，当融合多肽内存在几种抗原或其免疫原性片段时，抗原的序列可以通过接头序列分离，以避免新表位的形成。具体地，可以使用肽接头，例如四个氨基酸接头GGGD、NNGG或NNDD。合适的接头也在实施例、特别是表S3中示出。
优选地，选择一种或多种抗原并将其排列在融合多肽内，以便在表达融合多肽时保留抗原的天然三级结构。通过保留天然蛋白质折叠，慢病毒载体可以诱导递送至MHC-II机制的有效抗原。
在一个实施方式中，病原体选自细菌、寄生虫或病毒病原体，特别是感染哺乳动物或人类宿主的病原体，或者是肿瘤抗原或其免疫原性片段，特别是来自哺乳动物肿瘤、尤其是人类肿瘤的抗原或其免疫原性片段。在一个实施方式中，融合多肽包含至少两种抗原或其免疫原性片段，其中至少两种抗原或其免疫原性片段选自相同或不同的病原体。在一个实施方式中，病原体与急性或慢性呼吸道传染病相关，并且特别地可以选自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)、流感病毒，特别是甲型、乙型或丙型流感病毒，更特别是H1N1、H2N2或H3N2流感病毒，或者冠状病毒，特别是SARS-CoV-2。
具体地，抗原多肽可以包含一种或多种结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(Mtb)抗原，其特别选自EsxA(UniProtKB-P9WNK7)、EspC(UniProtKB-P9WJD7)、EsxH(UniProtKB-P9WNK3)、PE19(UniProtKB-Q79FK4)或Ag85A(UniProtKB-P9WQP3)，或其免疫原性片段，特别是缺乏起始甲硫氨酸的片段。优选地，EsxH的免疫原性片段包含SEQ ID No.15的MHC表位和/或SEQ ID No.16的MHC表位。优选地，EsxA的免疫原性片段包含SEQ ID No.17的MHC表位。优选地，PE19的免疫原性片段包含SEQ ID No.18的MHC表位。优选地，Ag85A的免疫原性片段包含SEQ ID No.19的MHC表位。在一个实施方式中，抗原多肽可以包含以下Mtb抗原组合之一：
(a)EsxH；
(b)EsxH和EsxA；
(c)EsxH、EsxA和PE19；
(d)EsxH、EsxA、EspC和PE19；
(e)EsxH、EsxA、EspC、PE19和Ag85A；
或其免疫原性片段，特别是包含本文提及的MHC表位的免疫原性片段的组合。
在一个实施方式中，抗原多肽和/或含有抗原多肽的融合多肽不包含卵清蛋白序列或其免疫原性片段。
在一个实施方式中，融合多肽具有SEQ ID No.24中所列的序列，其中抗原多肽的序列可以被另一种感兴趣的抗原多肽取代。
本发明还涉及如本文所定义的融合多肽。
本发明还涉及一种编码如本文所定义的融合多肽的核酸分子。核酸可以是DNA，特别是cDNA，或者可以是RNA，特别是稳定的RNA。从DNA序列中推导出RNA序列，其中胸腺嘧啶(T)核碱基被尿嘧啶(U)核碱基取代。RNA多核苷酸可以通过DNA或cDNA的转录获得，或者可以被合成。
核酸分子可以进一步包含用于转录或表达包含抗原的融合多肽的对照核苷酸序列。其也可以被修饰，以便可操作地连接到不同的多核苷酸，例如质粒或载体基因组(转移质粒)，特别是慢病毒载体基因组。其也可以被修饰，特别是使其更加稳定，以例如用作RNA。在另一个实施方式中，核酸是哺乳动物密码子优化的序列、特别是人密码子优化的序列，用于分别在哺乳动物细胞和人类细胞中表达。
本发明还涉及一种与编码携带抗原的融合多肽的核酸分子重组的质粒载体，该抗原被选择用于在宿主中引发免疫应答。
在一个实施方式中，质粒载体是转移载体，特别是适于提供本发明的慢病毒载体的基因组的慢病毒转移载体。当在宿主体内表达时，慢病毒载体在其融合多肽内表达所选择的抗原多肽。
在一个具体实施方式中，含有转移载体的基因组的核酸分子以质粒的形式提供，该质粒包含与编码病原体的所选抗原的多核苷酸重组的慢病毒骨架载体，以当所述载体基因组在用于给宿主施用的慢病毒载体颗粒中提供时，表达为融合多肽。
此外，核酸分子可以含有用于控制转录和/或用于控制表达的序列，和/或可以含有用于连接至不同核酸的序列，例如用于连接至质粒或载体基因组的序列。因此，核酸可以含有一个或多个用于限制性位点的序列、Kozak序列、启动子或本文所公开的和实施例中所示的其他序列。
表述“载体”涉及适于将编码本发明的多肽的多核苷酸递送至被施用此类载体的宿主细胞的生物或化学实体。载体是本领域公知的，并且可以是如本文所述的病毒载体，例如感染人类的慢病毒。本发明特别涉及HIV载体、特别是实施例中所示的HIV-1载体的用途。构建HIV-1载体的细节是本领域已知的并且在实施例中提供。
根据本发明，提供了表达抗原多肽的慢病毒载体，其中该载体在其基因组(载体基因组)中具有或包含编码根据本发明的融合多肽的重组多核苷酸，其中所述融合多肽包含至少一种抗原多肽，特别是病原体的抗原多肽。
本发明的慢病毒载体，特别是优选的基于HIV-1的载体，可以是无复制能力的假型慢病毒载体，特别是无复制能力的假型HIV-1慢病毒载体，其中所述载体含有包含哺乳动物密码子优化的合成核酸、特别是人密码子优化的合成核酸的基因组，其中所述合成核酸编码根据本发明的融合多肽，其包含抗原多肽，特别是感染哺乳动物、特别是人类宿主的确定病原体的抗原多肽。慢病毒载体可以使用来自印第安纳血清型或新泽西血清型的水泡性口炎病毒(V-SVG)的糖蛋白G假型化。
在载体颗粒的基因组中使用密码子优化的序列允许特别是抗原多肽在被施用该载体的宿主细胞中强表达，特别是通过提高mRNA稳定性或减少二级结构。此外，表达的抗原多肽经历适于在宿主细胞中处理抗原多肽的翻译后修饰，特别是通过修饰编码多肽中的翻译修饰位点(例如糖基化位点)。密码子优化工具是本领域公知的，包括算法和服务，例如由GeneArt(美国生命技术公司)和DNA2.0(美国加利福尼亚州门洛帕克)提供的算法和服务。在一个具体实施方式中，对编码抗原多肽的开放阅读框(ORF)序列进行密码子优化，并且在将编码ORF的序列引入旨在用于制备载体基因组的质粒中之前进行优化。在另一个实施方式中，载体基因组的附加序列也是密码子优化的。
由病毒载体组成的活性成分可以是整合型假型慢病毒载体，特别是无复制能力的整合型假型慢病毒载体，特别是HIV-1载体。此类慢病毒载体还可以含有基因组，该基因组包含哺乳动物密码子优化的合成核酸，特别是人密码子优化的合成核酸，其中所述合成核酸编码根据本发明的融合多肽，该融合多肽包含(一种或多种)抗原多肽，特别是感染哺乳动物(例如本文所公开的)的确定病原体的抗原多肽，特别是感染人类宿主的病毒或细菌或寄生虫的抗原多肽。
可替代地，慢病毒载体，且特别是基于HIV-1的载体可以是非整合型无复制能力的假型慢病毒载体。
适于实现本发明的慢病毒载体的一个具体实施方式涉及一种慢病毒载体，其基因组获自pTRIP载体质粒或pFLAPdeltaU3载体质粒，优选pFLAPdeltaU3质粒，特别是核苷酸序列SEQ ID No.20的载体质粒，其中编码融合多肽的核酸已在哺乳动物细胞中有功能的启动子的控制下得到克隆，特别是CMV启动子、人β2-微球蛋白启动子、SEQ ID No.21的SP1-β2m启动子或SEQ ID No.22的复合“BCUAG”启动子，优选SP1-β2m启动子，并且其中载体任选地包含野生型或突变的土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调控元件。具体地，WPRE是如SEQ IDNo.23中所示的突变体WPRE。
pFLAPdeltaU3质粒或pFLAP质粒是源自pTRIP质粒的慢病毒质粒载体。pFLAP质粒的实例如图13、图14和图15所示。
在本发明的另一个实施方式中，表达根据本文所述特征的融合多肽的慢病毒载体颗粒使用来自印第安纳血清型或新泽西血清型的水泡性口炎病毒(V-SVG)的糖蛋白G假型化。
此类慢病毒载体的具体特征将在下文进一步详细讨论。
本发明还涉及一种包含根据本文所提供的定义的重组慢病毒载体基因组的DNA质粒，特别是其中所述基因组被插入pFLAPdeltaU3载体质粒内，优选核苷酸序列SEQ IDNo.20的载体质粒内，其中根据本发明的融合多肽被插入限制性位点BamHI和XhoI之间以取代GFP序列。
本发明还涉及一种宿主细胞，优选哺乳动物宿主细胞，其包含本发明的慢病毒载体基因组，或用根据本发明的DNA质粒转染。具体地，所述宿主细胞是HEK-293T细胞系或K562细胞系。本发明还涉及一种所述宿主细胞的培养物。
本发明还涉及一种适于施用给哺乳动物宿主的制剂或药物组合物，特别是疫苗组合物，其包含本发明的重组慢病毒载体，以及一种或多种适于施用给需要其的宿主、特别是哺乳动物宿主、尤其是人类宿主的药学上可接受的赋形剂。
本发明还涉及一种适于施用给哺乳动物宿主、特别是人类宿主的制剂，其包含如本文所定义的用于预防病原体感染或预防病原体诱导的病症或疾病的慢病毒载体颗粒作为活性成分，以及适于施用给需要其的宿主、特别是人类宿主的赋形剂。该疾病可以是急性或慢性呼吸道传染病，例如肺结核、流感，特别是由甲型、乙型或丙型流感病毒引起的，更具体地是由H1N1、H2N2或H3N2流感病毒引起的。该疾病也可以是冠状病毒疾病，特别是由SARS-CoV-2引起的。
根据本发明的药物组合物，特别是疫苗组合物或制剂还可以包含佐剂成分，特别是pro-Th1和/或pro-Th17佐剂，和/或免疫刺激成分。
具体地，该组合物或制剂可以包含pro-Th1佐剂，例如聚肌胞苷酸(polyI:C)或其衍生物。Poly(I:C)的衍生物是指通过在其中引入未配对的碱基来修饰poly(I:C)的特定构型而获得的错配的dsRNA，包括poly(I:CxU)、poly(IxU:C)(其中x平均为3至40的数字)等。优选地，poly(I:C)的衍生物是poly(I:C12U)或poly(C:I12U)，其可以商品名AmpligenTM(安普利近)商购。
组合物或制剂还可以包含pro-Th1/Th17佐剂，例如环状二核苷酸佐剂。环状核苷酸佐剂也称为STING激活环状二核苷酸佐剂。本文所用的术语“环状二核苷酸”(“CDN”)是指在两个嘌呤核苷酸之间包含2’-5’和/或3’-5’磷酸二酯键的一类分子。这包括2’-5’-2’,5’、2’-5’-3’5’和3’,5’-3’,5’键。CDN是由调节多种过程的细菌合成的普遍存在的小分子第二信使，并且是一类相对较新的佐剂，其已被证明可以提高疫苗效力。CDN通过直接结合内质网驻留受体STING(干扰素基因的刺激因子)激活先天免疫，激活诱导干扰素-β(IFN-β)和核因子-κB(NF-κB)依赖性炎性细胞因子表达的信号传导通路。优选地，CDN是环状鸟嘌呤-腺嘌呤二核苷酸(cGAMP)。
本发明人已经表明，佐剂、特别是pro-Th1和/或pro Th17佐剂与本发明的慢病毒载体一起使用，引发了Th1 CD4+或CD8+T细胞以及产生IL-17A的Th17 CD4+T细胞的生成。
在本发明的另一个方面，活性成分、特别是慢病毒载体颗粒或包含其的组合物或制剂用于在哺乳动物宿主、特别是人类宿主中针对病原体感染或针对病原体诱导的病症或疾病的保护性免疫，任选地与合适的递送载体结合，并且任选地与佐剂成分和/或与免疫刺激剂组分(例如本说明书中所定义的佐剂组分和/或免疫刺激剂组分)结合。
因此，本发明的活性成分或组合物，特别是慢病毒载体颗粒，当被施用给需要其的宿主、特别是哺乳动物、特别是人类宿主时，通过引发针对抗原多肽或其免疫原性片段的抗体而引发免疫应答。所述免疫应答可以包括初始淋巴细胞(naive lymphocyte)的激活和效应T细胞应答的产生以及针对病原体的抗原的免疫记忆抗原特异性T细胞应答的产生。
本发明的一个方面涉及本发明的活性成分、特别是慢病毒载体颗粒、药物组合物和/或制剂，其用于预防和/或治疗需要其的哺乳动物宿主、特别是人类宿主中的病原体感染，特别是与哺乳动物中的急性或慢性呼吸道传染病相关的病原体感染。本发明还涉及一种预防和/或治疗需要其的哺乳动物宿主、特别是人类宿主中的病原体感染、特别是与哺乳动物中的急性或慢性呼吸道传染病相关的病原体感染的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物宿主施用有效剂量的本发明的活性成分、药物组合物和/或制剂。
本文所述的产品、方法和用途可以用于人类或兽医应用。
免疫应答涉及由抗原呈递细胞、特别是树突状细胞诱导抗原多肽或其免疫原性片段的MHC-I限制性呈递和MHC-II限制性呈递，以及诱导CD4和CD8介导的免疫应答。相反，使用未与转铁蛋白受体的恒定链(li)或跨膜结构域融合的相同抗原多肽的可比载体不会引发显著的CD4+T细胞应答。因此，由本发明的慢病毒载体引发的强效CD4+T细胞应答是出人意料的，并且克服了使用现有慢病毒载体所遇到的局限于CD8+T细胞应答的缺点。在一个实施方式中，与其中与转铁蛋白受体的恒定链(li)或跨膜结构域融合的抗原多肽单独表达而不在融合蛋白内表达的可比慢病毒载体相比，由本发明的慢病毒载体引发的CD4+T细胞应答高至少30％，优选高至少50％，还优选高至少100％，甚至优选高至少200％。CD4+T细胞应答可以通过评估抗原特异性CD4+T细胞响应于施用(例如注射)本发明的慢病毒载体(优选地以药物组合物，特别是以疫苗组合物)的扩增进行测量。本说明书的实施例说明了这种测量。
本发明的慢病毒载体特别能够引发产生IFN-γ/TNF-α的CD4+或CD8+T细胞的生成。
免疫应答可以防止病原体感染，或者可以防止由感染引起的病理状态的发作或发展。
可以根据免疫组合物的施用途径选择生理学上可接受的载体。在一个优选的实施方式中，可以通过注射、特别是肌内、皮内、皮下注射进行施用，或者通过鼻腔内施用或局部皮肤施用进行施用。
本发明的重组慢病毒载体颗粒被用于在宿主、特别是哺乳动物宿主、尤其是人类宿主中引发针对病原体的免疫应答，该病原体提供由颗粒表达的抗原，所述用途涉及免疫方案，该免疫方案包括施用引发宿主细胞免疫应答的有效量的活性成分、特别是慢病毒颗粒作为初免，然后及时施用有效量的相同活性成分或另一种活性成分(例如慢病毒颗粒)，以增强宿主的细胞免疫应答，并且任选地重复(一次或数次)用于加强的所述施用步骤。
特别是在包括多个施用步骤的方案中，对于施用慢病毒载体颗粒的每个步骤，优选载体颗粒的假型化包膜蛋白与其他步骤中使用的不同，特别是源自不同的病毒，特别是不同的VSV。在初免-加强方案中，每个步骤所施用的化合物组合包含如本文所定义的慢病毒载体。
初免和加强步骤在时间上间隔至少2周、特别是6周、特别是至少8周。
在一个具体实施方式中，本发明的重组慢病毒载体颗粒用于在宿主、特别是哺乳动物宿主、尤其是人类宿主中引发针对病原体的免疫应答，该病原体提供由颗粒表达的抗原，所述用途涉及包括异源初免-加强方案的免疫方案，其中本发明的重组慢病毒载体颗粒被用于加强。初免步骤可以使用减毒活病原体疫苗或另一种关于本发明的重组慢病毒载体颗粒的异源免疫原性组合物进行。施用方案的细节将在下文进一步讨论。
LV颗粒提供细胞免疫应答(T细胞免疫应答)，特别是CD4+T细胞免疫应答以及有利地CD8+T细胞免疫应答，即，由分别携带CD4或CD8受体的活化细胞介导的适应性免疫应答。
在一个特别有利的实施方式中，由LV颗粒赋予的免疫应答是持久的免疫应答，即，所述免疫应答包括记忆细胞应答、且特别是中枢记忆细胞应答；在一个具体实施方式中，在最后一个施用步骤后至少几个月仍然可以检测到它。
根据本发明，当慢病毒颗粒用于初免-加强方案或多步骤施用方案时，提供了用从VSV、印第安纳株或新泽西株获得的第一种确定的假型化包膜G蛋白进行假型化的慢病毒载体颗粒，并且提供了用从VSV、新泽西株或印第安纳株获得的第二种确定的假型化包膜G蛋白进行假型化的随后施用的慢病毒载体颗粒。可替代地，可以颠倒如上所述的第一种和第二种化合物在初免-加强方案中的使用顺序。因此，当旨在用于初免-加强方案时，本发明的组合或组合物的单独活性成分/化合物中所含的慢病毒载体颗粒彼此不同，至少是由于用于假型化载体颗粒的特定假型化包膜蛋白。
当使用整合型载体时，在施用方案中使用的旨在引发细胞免疫应答的慢病毒载体的剂量可以包含105TU至1010TU的重组慢病毒颗粒，特别是105TU至108TU。当使用无整合能力载体时，旨在施用给宿主的剂量可以包含108至1010个每种类型的重组慢病毒载体颗粒。
本发明还涉及一种在哺乳动物宿主、尤其是人类宿主中提供免疫的方法，包括以下步骤：施用本发明的重组慢病毒载体颗粒作为初免或作为加强，以引发免疫应答，并且任选地根据本公开，重复施用步骤一次或数次，特别是为了加强所述应答。
任选地，重组慢病毒载体颗粒可以与适于施用给哺乳动物、特别是人类宿主的佐剂化合物和/或免疫刺激剂化合物以及合适的递送载体一起使用。本说明书中描述了合适的佐剂和免疫刺激剂化合物。
重组慢病毒载体颗粒可以经由包括皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、肌内(i.m.)或静脉(i.v.)注射在内的不同途径通过注射施用给宿主，或者可以经口施用、或通过粘膜或皮肤施用局部施用，特别是鼻腔内施用或吸入。待施用的量(剂量)取决于待治疗的受试者，包括考虑患者的状况、个体免疫系统的状态、施用途径和宿主的体型。可以根据HIV-1衍生的慢病毒载体颗粒的等效转导单元的含量来确定合适的剂量范围。
当阅读说明慢病毒载体颗粒的制备和应用的实施例和附图时，本发明的其他实施例和特征将是显而易见的，所述其他实施例和特征具有可以与本说明书中给出的定义单独组合的特征。
根据本发明使用的慢病毒载体的详细描述
因此，本发明涉及慢病毒载体，其为重组慢病毒颗粒(即重组载体颗粒)，并且其可以是无复制能力的慢病毒载体，特别是基于无复制能力的HIV-1的载体，其特征在于：(i)它们用确定的异源病毒包膜蛋白或源自非HIV的RNA病毒的病毒包膜蛋白进行假型化，并且(ii)它们在其基因组中包含至少一种编码本发明的融合多肽的重组多核苷酸，其包含至少一种携带病原体的抗原表位的抗原多肽(或其多肽衍生物，例如其免疫原性片段)，其中该病原体能够感染哺乳动物宿主、特别是人类宿主，并且其中所述表位包括T细胞表位，特别是CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位。
根据本发明的一个具体实施方式，慢病毒载体被设计成表达熟练(即，具有整合能力的)或缺陷(即，无整合能力的)颗粒。根据本发明的一个具体实施方式，重组慢病毒载体颗粒既没有整合能力也没有复制能力。
慢病毒载体的制备是本领域技术人员所熟知的，并且已在文献中广泛公开(参见综述，Sakuma T.等人，《生物化学杂志》(Biochem.J)(2012年)443，603-618)。此类载体的制备也在本文的实施例中进行了说明。
在本发明的一个具体实施方式中，编码慢病毒载体的抗原多肽(ORF)的多核苷酸已经进行了哺乳动物密码子优化(CO)，特别是人类密码子优化。任选地，所述颗粒的基因组的慢病毒序列也具有哺乳动物密码子优化的核苷酸序列。在本发明的一个具体方面，已经对小鼠细胞中的表达进行了密码子优化。在另一个实施方式中，编码慢病毒载体的抗原多肽的多核苷酸序列已经进行了人类密码子优化(CO)。
已经观察到，密码子优化的核苷酸序列，特别是当被优化用于在哺乳动物、且特别是人类细胞中表达时，能够在此类哺乳动物或人类细胞中产生更高产量的颗粒。生产细胞如实施例中所示。因此，当将本发明的慢病毒载体颗粒施用给哺乳动物、特别是人类宿主时，在所述宿主中产生更大量的颗粒，这有利于引发强烈的免疫应答。
本发明所定义的重组慢病毒载体(即慢病毒载体颗粒或基于慢病毒的载体颗粒)是假型慢病毒载体，其由携带源自不同于特定慢病毒的病毒(特别是不同于HIV、特别是HIV-1的病毒)的一种或多种包膜蛋白的载体颗粒组成，其提供了慢病毒载体颗粒的载体基因组。因此，所述一种或多种包膜蛋白相对于颗粒的载体基因组是一种或多种“异源”病毒包膜蛋白。在下文中，还将提及“包膜蛋白”以涵盖适于实施本发明的任何类型的一种或多种包膜蛋白。
当在本申请中提及“慢病毒”载体(基于慢病毒的载体)时，其特别涉及基于HIV的载体，且尤其是基于HIV-1的载体。
适于实施本发明的慢病毒载体是所谓的置换型载体，这意味着编码慢病毒蛋白的原始慢病毒的序列在载体的基因组中基本上被删除，或者当存在时被修饰、特别是突变、特别是被截短，以防止具有生物活性的慢病毒蛋白的表达，特别是在HIV的情况下，防止所述提供重组慢病毒载体颗粒的基因组的转移载体表达功能性ENV、GAG和POL蛋白，以及任选地慢病毒、特别是HIV的其他结构和/或辅助和/或调节蛋白。
在一个具体实施方式中，慢病毒载体是从第一代载体、特别是第一代基于HIV的载体构建的，其特征在于其使用单独的质粒获得，以提供(i)包装构建体，(ii)包膜，和(iii)转移载体基因组。可替代地，其可以从第二代载体、特别是第二代基于HIV的载体构建，此外，其不含病毒辅助蛋白(例如在HIV-1、Vif、Vpu、Vpr或Nef的情况下)，因此仅包括九个HIV全基因中的四个：gag、pol、tat和rev。在另一个实施方式中，载体是从第三代载体、特别是第三代基于HIV的载体构建的，其进一步缺乏所述病毒辅助蛋白并且也是Tat非依赖性的；这些第三代载体可以使用4个质粒获得，以提供载体的功能元件，包括当载体基于HIV-1时编码HIV的Rev蛋白的一个质粒。此类载体系统仅包括九个HIV-1基因中的三个。这几代基于HIV的载体的结构和设计是本领域公知的。
在这几代载体的任何一代中，根据本发明通过插入如本文所述的融合多肽的载体骨架中来附加地提供修饰，以提供用于靶向和激活APC、特别是树突状细胞的LV载体，以将免疫原递送至MHC-II途径并诱导CD4+和CD8+T细胞应答。
载体颗粒的“载体基因组”是重组核酸，其还包含作为重组序列的编码根据本发明的融合多肽的感兴趣的多核苷酸或转基因，该融合多肽包含一种或多种抗原多肽或其免疫原性片段，特别是如本文所公开的病原体的抗原多肽或其免疫原性片段。载体基因组的基于慢病毒的序列和多核苷酸/转基因由质粒载体携带，因此产生“转移载体”，也称为“序列载体”。因此，这些表述在本说明书中可互换使用。根据一个具体实施方式，为本发明制备的载体基因组包含具有SEQ ID No.20的序列的核酸，其中编码本发明的融合多肽的多核苷酸被插入限制性位点BamHI和XhoI之间以置换GFP序列(SEQ ID No.30)。
因此，如本文所定义的载体基因组除了编码本发明的融合多肽(包含置于用于其表达的适当调控序列的控制下的抗原多肽)的所谓的重组多核苷酸外，还包含原始慢病毒基因组的序列，这些序列是所述基因组的非编码区，并且是为DNA或RNA合成和处理(迷你病毒基因组)提供识别信号所必需的。这些序列特别是包装(ψ)、逆转录(LTR，可能相对于原始LTR发生突变)和转录以及任选地整合(RRE)所必需的顺式作用序列，此外为了本发明的特定目的，它们含有有利于细胞中的核输入以及相应地所述细胞中的转基因转移效率的功能序列，该元件被描述为DNA瓣元件(DNAFlap element)，其含有存在于慢病毒基因组序列中、特别是在HIV-1中或在一些逆转录元件(例如酵母的逆转录元件)中的所谓的中央cPPT-CTS核苷酸结构域，或由其组成。
用于制备本发明的慢病毒载体的载体基因组的结构和组成基于本领域所述的原理和主要在(Zennou等人，2000年；Firat H.等人，2002年；VandenDriessche T.等人)中公开的此类慢病毒载体的实例。这种类型的构建体已经被保藏在CNCM(法国巴斯德研究所(Institut Pasteur,France))，如本文将提及的。在这方面，还参考了专利申请WO 99/55892、WO 01/27300和WO 01/27304中的公开内容，包括保藏的生物材料。
根据本发明的一个具体实施方式，载体基因组可以是置换型载体，其中2个长末端重复(LTR)之间的所有病毒蛋白编码序列已经被编码本发明的融合多肽的重组多核苷酸置换，该融合多肽包含如本文所公开的抗原多肽，并且其中DNA瓣元件已经与本文所述的所需的顺式作用序列一起被重新插入。与载体基因组的组成相关的其他特征在颗粒的制备中公开。
在一个具体实施方式中，本发明的慢病毒载体可以在其基因组中包含一个或多于一个编码根据本发明的融合多肽的重组多核苷酸。具体地，所述载体基因组包含两个多核苷酸，其在基因组上是连续的或分隔的并且编码病原体或不同病原体的相同或不同抗原的不同多肽。
根据本发明的各种实施方式所用的慢病毒载体的具体特征也在实施例中公开，此类特征单独或组合使用以产生载体。
根据本发明的一个实施方式，使用异源病毒包膜蛋白或源自RNA病毒的包膜的病毒多聚蛋白对慢病毒载体颗粒进行假型化，该RNA病毒不是提供慢病毒颗粒基因组的慢病毒序列的慢病毒。
作为用于制备慢病毒载体的分型包膜蛋白的实例，本发明涉及水泡性口炎病毒(VSV)的病毒跨膜糖基化的(所谓的G蛋白)包膜蛋白，其例如选自VSV-G蛋白的印第安纳株和VSV-G蛋白的新泽西株。
可用于假型化本发明的慢病毒载体的VSV-G蛋白的其他实例包括VSV-G糖蛋白，其可以特别选自归入水泡病毒属的物种：卡拉加斯病毒(Carajas virus)(CJSV)、金迪普拉病毒(Chandipura virus)(CHPV)、可卡耳病毒(Cocal virus)(COCV)、伊斯法罕病毒(Isfahanvirus)(ISFV)、马拉巴病毒(Maraba virus)(MARAV)、皮里病毒(Piry virus)(PIRYV)、阿拉戈斯水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Alagoas virus)(VSAV)、印第安纳水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Indiana virus)(VSIV)和新泽西水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis New Jersey virus)(VSNJV)和/或暂时归入水泡病毒属的菌株，如草鱼弹状病毒(Grass carp rhabdovirus)、比安157575弹状病毒(BeAn 157575virus)(BeAn 157575)、博特克病毒(Boteke virus)(BTKV)、卡尔查基病毒(Calchaqui virus)(CQIV)、美国鳗鱼病毒(Eel virus American)(EVA)、格雷洛奇病毒(Gray Lodge virus)(GLOV)、朱罗纳病毒(Jurona virus)(JURV)、克拉马斯病毒(Klamath virus)(KLAV)、克瓦塔病毒(Kwatta virus)(KWAV)、拉霍亚病毒(La Joya virus)(LJV)、马尔帕斯春季病毒(Malpais Spring virus)(MSPV)、埃尔贡山蝙蝠病毒(Mount Elgon bat virus)(MEBV)、佩里内特病毒(Perinet virus)(PERV)、梭子鱼苗弹状病毒(Pike fry rhabdovirus)(PFRV)、波顿病毒(PORV)、拉迪病毒(RADIV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus)(SVCV)、树鼩病毒(Tupaia virus)(TUPV)、溃疡性疾病弹状病毒(Ulcerative diseaserhabdovirus)(UDRV)和尤格波格丹诺夫奇病毒(Yug Bogdanovac virus)(YBV)。
水泡性口炎病毒(VSV-G)的包膜糖蛋白是一种跨膜蛋白，其可作为野生型病毒颗粒的表面包衣。其也是一种适合工程化的慢病毒载体的包衣蛋白。目前，9个病毒物种被明确归入VSV性(gender)，19种弹状病毒被暂时归入该性，它们均显示出不同程度的交叉中和作用。当测序时，蛋白G基因表明序列相似性。VSV-G蛋白具有N末端胞外域、跨膜区和C末端胞质尾区。其通过反式高尔基体网络(内质网和高尔基体)被输出到细胞表面。
印第安纳水泡性口炎病毒(VSIV)和新泽西水泡性口炎病毒(VSNJV)是假型化本发明的慢病毒载体或设计重组包膜蛋白以假型化慢病毒载体的优选菌株。它们的VSV-G蛋白在GenBank中公开，其中提供了几种菌株。对于VSV-G新泽西株，特别参考登录号为V01214的序列。对于VSV-G的印第安纳株，参考Genbank中登录号为AAA48370.1对应于菌株JO2428的序列。
所述病毒包膜蛋白能够通过融合和/或内吞作用被抗原呈递细胞、特别是被树突状细胞(包括被肝树突状细胞)摄取。在一个具体实施方式中，摄取的效率可以用作选择VSV的包膜进行假型化的特征。在这方面，转导的相对滴度(DC滴度/其他转导细胞例如293T细胞的滴度)可以被视为一种测试，并且优选具有相对良好的与DC融合的能力的包膜。
抗原呈递细胞(APC)且特别是树突状细胞(DC)是相应地用作免疫组合物的假型慢病毒载体的合适靶细胞。
VSV-G包膜蛋白由含有所述蛋白质的编码序列的多核苷酸表达，该多核苷酸被插入用于制备本发明的慢病毒载体颗粒的质粒(称为包膜表达质粒或假型化包膜质粒(envplasmid))中。编码包膜蛋白的多核苷酸处于用于编码序列的转录和/或表达的调控序列的控制下，包括任选地转录后调控元件(PRE)，特别是多核苷酸，例如可从Invitrogen公司获得的土拨鼠肝炎病毒的元件，即WPRE序列，或SEQ ID No.23中列出的WPRE的突变体序列。
因此，提供了一种核酸构建体，其包含适于在哺乳动物细胞、特别是在体内的人类细胞中使用的内部启动子，以及在所述启动子的控制下编码包膜蛋白的核酸。含有该构建体的质粒被用于转染适于制备载体颗粒的细胞。启动子可以特别地根据其作为组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子的特性而进行选择。合适的启动子的实例包括以下基因的启动子：MHC I类启动子、人β-2微球蛋白基因(β2M启动子)、EF1α、人PGK、PPI(前胰岛素原)、硫糊精、HLADR恒定链(P33)、HLA DRα链、铁蛋白轻链或铁蛋白重链、凝乳酶β4、凝乳酶β10、胱抑素核糖体蛋白L41、CMVie或嵌合启动子，例如在Jones S.等人(Jones S.等人《人类基因治疗(Human Gene Therapy)》，20:630-640(2009年6月))中公开的GAG(CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白)或本文所公开的β-2m-CMV(BCUAG)。
这些启动子也可用于参与表达来自衣壳化质粒的gag-pol衍生蛋白的调控表达序列，和/或用于表达来自转移载体的抗原多肽。
可替代地，当包膜表达质粒旨在在稳定的包装细胞系中表达时，特别是作为连续表达的病毒颗粒的稳定表达时，表达包膜蛋白的内部启动子有利地是诱导型启动子，例如Cockrell A.S.等人(《分子生物技术(Mol.Biotechnol.)》(2007年)36:184-204)中公开的启动子。作为此类启动子的实例，参考了四环素和蜕皮激素诱导型启动子。包装细胞系可以是STAR包装细胞系(参考Cockrell A.S.等人(2007年)，Ikedia Y.等人(2003年)《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》21:569-572)或SODk包装细胞系，例如SODk0衍生的细胞系，包括SODk1和SODk3(参考Cockrell A.S.等人(2007年)，Cockrell A.S.等人(2006年)《分子疗法(Molecular Therapy)》，14:276-284，Xu K.等人(2001年)，Kafri T.等人(1999年)《病毒学杂志(Journal of Virol.)》73:576-584)。
根据本发明，慢病毒载体是从用以下物质共转染哺乳动物细胞中回收的产物：
-载体质粒，其包含(i)用于包装、逆转录和转录所必需的慢病毒、特别是HIV-1顺式活性序列，并且进一步包含功能性慢病毒、特别是源自HIV-1的DNA瓣元件，和(ii)编码本发明的融合多肽的多核苷酸，其自身包含处于调控表达序列的控制下寻求针对其的免疫应答的一种或多种病原体的一种或多种抗原多肽或其免疫原性片段，优选人β-2微球蛋白启动子或修饰的人β2-微球蛋白启动子，例如SEQ ID No.21的SP1-β2m启动子，并且任选地包含用于整合到宿主细胞基因组中的序列；
-编码源自RNA病毒的假型化包膜的表达质粒，所述表达质粒包含编码一种或多种用于假型化的包膜蛋白的多核苷酸，其中所述包膜假型化蛋白有利地来自VSV并且特别是VSV-G的印第安纳株或新泽西株；和
-衣壳化质粒，其包含适于产生具有整合能力的载体颗粒的慢病毒、特别是HIV-1gag-pol包装序列或适于产生整合缺陷型载体颗粒的修饰的gag-pol包装序列。
因此，本发明还涉及如上所述的慢病毒载体颗粒，其是从用以下物质转染的稳定的细胞系中回收的产物：
-载体质粒，其包含(i)用于包装、逆转录和转录所必需的慢病毒、特别是HIV-1顺式活性序列，并且进一步包含功能性慢病毒、特别是HIV-1的DNA瓣元件，并且任选地包含用于整合所必需的顺式活性序列，所述载体质粒还包含，(ii)编码本发明的融合多肽的基因的小鼠或人类的密码子优化序列的多核苷酸，包含本文所公开的处于调控表达序列、特别是启动子的控制下的一种或多种病原体的一种或多种抗原多肽或其免疫原性片段；
-VSV-G包膜表达质粒，其包含编码VSV-G包膜蛋白、特别是VSV-G的印第安纳株或新泽西株的多核苷酸，其中所述多核苷酸处于调控表达序列、特别是包含启动子的调控表达序列的控制下；和
-衣壳化质粒，其中衣壳化质粒包含适于产生具有整合能力的载体颗粒的慢病毒、特别是HIV-1gag-pol编码序列或适于产生整合缺陷型载体颗粒的修饰的gag-pol编码序列，其中所述gag-pol序列来自与DNA瓣元件相同的慢病毒亚科，其中所述慢病毒gag-pol或修饰的gag-pol序列处于调控表达序列的控制下。
表达本发明的载体颗粒的稳定细胞系特别地通过质粒的转染获得。
该多核苷酸编码根据本发明的融合多肽，其包含根据本说明书中所公开的任何实施方式的第一多肽和病原体的一种或多种抗原多肽，该第一多肽包含(i)MHC II相关的轻恒定链(li)或(ii)转铁蛋白受体的跨膜结构域(TfR)。
因此，载体质粒可以包含一个或多个用于表达各种抗原多肽的表达盒，或者可以包含双顺反子或多顺反子表达盒，其中编码包含抗原多肽和任选地附加的各种多肽的融合多肽的多核苷酸毒被病毒来源的IRES序列(内部核糖体进入位点)分离，或者其可以编码融合蛋白。
包含在载体基因组中并控制编码病原体的抗原多肽的多核苷酸表达的内部启动子(作为转基因或在表达盒中)可以选自以下基因的启动子：MHC I类启动子，例如人β-2微球蛋白基因(β2M启动子)、SP1-β2m启动子或EF1α、人PGK、PPI(前胰岛素原)、硫糊精、HLA DR恒定链(P33)、HLA DRα链、铁蛋白轻链或铁蛋白重链、凝乳酶β4、凝乳酶β10或胱抑素核糖体蛋白L41、CMVie或嵌合启动子，例如在Jones S.等人(2009年)中公开的GAG(CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白)或BCUAG。
也可以选择上述内部启动子中的启动子用于包膜蛋白的表达和包装(gag-pol衍生的)蛋白的表达。
在制备基于人慢病毒、且特别是基于HIV-1病毒的慢病毒载体时，可以实施以下具体实施方式。
根据本发明，慢病毒载体的基因组源自人慢病毒，特别是源自HIV慢病毒。具体地，假型慢病毒载体是基于HIV的载体，例如基于HIV-1或HIV-2的载体，特别是源自HIV-1M，例如源自BRU或LAI分离株。可替代地，为载体基因组提供必需序列的慢病毒载体可以源自能够转导哺乳动物细胞的慢病毒，例如EIAV、CAEV、VISNA、FIV、BIV、SIV、HIV-2、HIV-O。
如上所述，除了其最终含有的重组多核苷酸外，载体基因组是置换型载体，其中原始慢病毒基因组中2个长末端重复序列(LTR)之间的核酸已被限制为用于DNA或RNA合成和处理的顺式作用序列，包括用于将转基因有效递送至宿主的细胞核，或至少被删除或突变为必需的核酸片段，这些片段将能够表达包括生物功能性GAG多聚蛋白以及可能的POL和ENV蛋白的慢病毒结构蛋白。
在一个具体的实施方式中，载体基因组中使用了慢病毒的5’LTR和3’LTR序列，但3’-LTR至少在U3区中相对于原始慢病毒的3’LTR被修饰，例如可以删除或部分删除增强子(ΔU3)。5’LTR也可以被修饰，特别是在其启动子区，其中例如Tat非依赖性启动子可以置换U3内源启动子。
在一个具体的实施方式中，载体基因组包含一个或多个(用于HIV-1慢病毒载体的)Vif-、Vpr、Vpu-和Nef-辅助基因的编码序列。可替代地，这些序列可以独立地或彼此删除，或者可以是非功能性的(第二代慢病毒载体)。
慢病毒载体颗粒的载体基因组包含作为插入的顺式作用片段的至少一种多核苷酸，其组成为DNA瓣元件或含有此类DNA瓣元件。在一个具体的实施方式中，DNA瓣被插入编码携带抗原多肽的本发明的融合多肽的多核苷酸的上游，并且有利地——但不是必需地——位于载体基因组中的近似中心位置。适合本发明的DNA瓣可以获自逆转录病毒，特别是获自慢病毒，特别是人慢病毒，特别是HIV-1逆转录病毒，或者获自逆转录病毒样生物体例如逆转录转座子。可替代地，其可以获自CAEV(山羊关节炎脑炎病毒)病毒、EIAV(马传染性贫血病毒)病毒、VISNA病毒、SIV(猴免疫缺陷病毒)病毒或FIV(猫免疫缺陷病毒)病毒。DNA瓣可以通过合成(化学合成)进行制备，或通过对来自如上所定义的适当来源的提供DNA瓣的DNA进行扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)进行制备。在一个更优选的实施方式中，DNA瓣获自HIV逆转录病毒，例如HIV-1或HIV-2病毒，包括这两种类型的任何分离物。
DNA瓣(也称为cPPT/CTS)(在Zennou V.等人，参考文献27，2000年，《细胞(cell)》第101卷，173-185或在WO 99/55892和WO 01/27304中定义的)是位于一些慢病毒(特别是HIV)基因组的中心的结构，其中其产生通常在特别是HIV逆转录期间合成的并且作为HIV基因组核输入的顺式决定簇的3链DNA结构。在逆转录过程中，DNA瓣能够实现中央多嘌呤束(cPPT)和中央终止序列(CTS)顺式控制的中央链置换事件。当被插入慢病毒衍生的载体中时，使DNA瓣能够在逆转录过程中产生的多核苷酸刺激基因转移效率，并将核输入水平补充到野生型水平(Zennou等人，《细胞》，2000年，第101卷，173-185或WO 99/55892和WO 01/27304)。
DNA瓣(flap)的序列已经在现有技术中公开，特别是在上述专利申请中公开。这些序列也在本文所述的pTRIP载体的序列中公开。它们优选地作为任选地具有附加侧翼序列的片段被插入载体基因组中，其位置优选地靠近所述载体基因组的中心。可替代地，它们可以被插入紧接控制编码本发明的融合多肽的多核苷酸表达的启动子的上游。插入载体基因组中的包含DNA瓣的所述片段可以具有约80bp至约200bp的序列，这取决于其来源和制备。
根据一个具体的实施方式，DNA瓣具有约90至约140个核苷酸的核苷酸序列。
在HIV-1中，DNA瓣是稳定的99个核苷酸长的正链重叠。当用于本发明的慢病毒载体的基因组载体时，其可以作为较长的序列被插入，特别是当其被制备为PCR片段时。包含提供DNA瓣的结构的特别合适的多核苷酸是包含HIV-1DNA的cPPT和CTS区的124碱基对聚合酶链式反应(PCR)片段。
明确的是，基因组载体中使用的DNA瓣以及编码GAG和POL多聚蛋白的衣壳化质粒的多核苷酸应源自同一个慢病毒亚科或来自同一个逆转录病毒样生物体。
优选地，基因组载体的其他顺式激活序列也源自与提供DNA瓣的慢病毒或逆转录病毒样生物体相同的慢病毒或逆转录病毒样生物体。
载体基因组还可以包含一个或多个用于克隆重组多核苷酸的独特的限制性位点。
在一个优选的实施方式中，在所述载体基因组中，慢病毒载体基因组的3’LTR序列缺失至少U3区的激活子(增强子)并且可能缺失启动子。在另一个具体实施方式中，3’LTR区缺失U3区(ΔU3)。在这方面，参考WO 01/27300和WO 01/27304中的描述。
在一个具体实施方式中，在载体基因组中，LTR 5'的U3区被非慢病毒U3或适于驱动tat非依赖性初级转录的启动子置换。在这种情况下，载体独立于tat反式激活剂(第三代载体)。
载体基因组还包含psi(ψ)包装信号。包装信号源自gag ORF的N末端片段。在一个具体实施方式中，其序列可以通过移码突变进行修饰，以防止gag肽的可能转录/翻译与转基因的转录/翻译的任何干扰。
载体基因组还可以任选地包含选自剪接供体位点(SD)、剪接受体位点(SA)和/或Rev反应元件(RRE)的元件。
根据一个具体实施方式，载体质粒(或添加的基因组载体)包含以下用于转基因表达盒的顺式作用序列：
1.逆转录所需的LTR序列(长末端重复序列)、转录所需的序列，包括任选地用于病毒DNA整合的序列。U3区中的3’LTR被删除，至少是启动子，以提供SIN载体(自失活)，而不干扰基因转移所必需的功能，主要有两个原因：首先，一旦DNA被整合到基因组中，避免宿主基因的反式激活；其次，允许逆转录后病毒顺式序列的自失活。任选地，来自驱动基因组转录的5’-LTR的tat依赖性U3序列被非内源性启动子序列置换。因此，在靶细胞中，只有来自内部启动子的序列会被转录(转基因)。
2.ψ区域，其是病毒RNA衣壳化所必需的。
3.RRE序列(REV反应元件)，其允许病毒信使RNA在结合Rev蛋白后从细胞核输出到细胞溶质。
4.促进核输入的DNA瓣元件(cPPT/CTS)。
5.任选地，转录后调控元件，特别是提高树突状细胞中融合多肽和/或抗原多肽表达的元件，例如WPRE顺式活性序列(土拨鼠乙型肝炎病毒反应后元件)也被添加以优化mRNA的稳定性(Zufferey等人，1999年)、基质或支架附着区(SAR和MAR序列)，例如免疫球蛋白κ基因的那些(Park F.等人《分子治疗(Mol Ther)》2001年；4：164-173)。
本发明的慢病毒载体是非复制型的(无复制能力的)，即该载体和慢病毒载体基因组被认为适于减轻对具有复制能力的慢病毒的担忧，特别是在施用后不能形成从受感染的宿主细胞中发育出的新颗粒。由于慢病毒基因组中不存在gag、pol或env基因，或者它们作为“功能性基因”不存在，这可以通过公知的方式实现。因此，gag和pol基因仅以反式形式提供。这也可以通过删除颗粒形成所需的其他病毒编码序列和/或顺式作用遗传元件来实现。
所谓“功能性的”是指正确转录和/或正确表达的基因。因此，如果存在于本发明的慢病毒载体基因组中，在该实施方式中包含gag、pol或env的序列，则其各自地要么未转录、要么不完全转录；表述“不完全转录”是指转录物gag、gag-pro或gag-pro-pol的改变，其中一个或几个未转录。其他参与慢病毒复制的序列也可能在载体基因组中发生突变，以达到这种状态。应将慢病毒载体的不复制与慢病毒基因组的复制区分开来。事实上，如前所述，慢病毒基因组可能含有复制起点，确保慢病毒载体基因组的复制，而不一定确保载体颗粒的复制。
为了获得根据本发明的慢病毒载体，载体基因组(作为载体质粒)必须被包裹在颗粒或假颗粒中。因此，除了包膜蛋白外，慢病毒蛋白必须与载体基因组一起以反式形式提供给生产系统中、特别是生产细胞中的载体基因组，其依赖于至少一种衣壳化质粒，该衣壳化质粒携带gag基因和pol慢病毒基因或无整合能力的pol基因、并且优选地缺乏Vif-、Vpr、Vpu-和Nef辅助基因的一些或全部编码序列、并且任选地缺乏Tat(用于HIV-1慢病毒载体)。
使用另一种质粒，其携带编码被选择用于假型化慢病毒载体颗粒的包膜假型化蛋白的多核苷酸。
在一个优选的实施方式中，包装质粒仅编码病毒颗粒合成所必需的慢病毒蛋白。相应地去除质粒中存在的可能引起安全问题的辅助基因。因此，用于包装的以反式形式提供的病毒蛋白分别如源自HIV-1的病毒蛋白所示：
1.用于构建基质(MA，表观分子量p17)、衣壳(CA，p24)和核衣壳(NC，p6)的GAG蛋白。
2.POL编码的酶：整合酶、蛋白酶和逆转录酶。
3.TAT和REV调节蛋白，当TAT是启动LTR介导的转录所必需的；如果5’LTR的U3区被驱动tat非依赖性转录的启动子置换，则可以省略TAT表达。REV可以被修饰并相应地用于例如重组蛋白中，该重组蛋白将能够识别载体基因组中取代RRE序列的结构域，或者用作能够通过其RBD(RNA结合结构域)与RRE序列结合的片段。
为了避免包装质粒中所含基因生成的mRNA在病毒颗粒中的任何包装，从包装质粒中去除ψ区。将异源启动子插入质粒中以避免重组问题，并在编码蛋白质的序列3’处添加多聚腺苷酸尾(poly-A tail)。上文已经公开了合适的启动子。
包膜质粒在如本文所公开的内部启动子的控制下编码本文公开的用于假型化的包膜蛋白。
用于制备本发明的慢病毒载体颗粒的任何或所有所述质粒可以在编码蛋白质的片段中进行密码子优化(CO)。优选地进行根据本发明的密码子优化以改进哺乳动物细胞(小鼠或特别是人类细胞)的质粒中所含的编码序列的翻译。根据本发明，密码子优化特别适于直接或间接改进载体颗粒的制备，或者改进其所施用于的宿主细胞的摄取，或者改进编码包含抗原多肽(转基因)的融合多肽的多核苷酸在宿主的转导细胞基因组中的转移效率。优化密码子的方法是本领域公知的，并且密码子优化特别是使用可用的程序来进行。针对实施例中所用的编码序列说明了密码子优化。
在本发明的一个具体实施方式中，假型慢病毒载体还具有整合能力，或可替代地具有整合能力，从而能够将载体基因组及其所含的重组多核苷酸整合到转导细胞的基因组中或整合到其被施用的宿主的细胞中。
在本发明的另一个具体实施方式中，假型慢病毒载体还是无整合能力的，或者可替代地是无整合能力的。在这种情况下，载体基因组以及其所含的重组多核苷酸不会整合到转导细胞的基因组中或整合到其被施用的宿主的细胞中。
因此，本发明的重组慢病毒载体颗粒可以是重组整合缺陷型慢病毒载体颗粒，特别是其中重组整合缺陷型慢病毒载体颗粒是基于HIV-1的载体颗粒，并且由于慢病毒基因组中编码的整合酶基因的突变而是整合酶缺陷型，该突变使得该整合酶不表达或不功能性地表达，特别地，该整合酶基因的突变导致在其氨基酸残基64上置换的整合酶的表达，特别地，该置换是由Pol编码的HIV-1整合酶的催化结构域中的D64V。
本发明涉及慢病毒载体在免疫原性组合物中的用途，其中所表达的整合酶蛋白是有缺陷的，并且其还包含特别编码本发明的融合多肽的多核苷酸，特别是包含至少一种携带病原体表位的抗原多肽。
所谓“无整合能力的”是指整合酶、优选慢病毒来源的整合酶缺乏将慢病毒基因组整合到宿主细胞基因组中的能力；即，发生突变以特异性改变其整合酶活性的整合酶蛋白。
无整合能力的慢病毒载体是通过修饰编码整合酶的pol基因而获得的，从而产生编码整合型缺陷型整合酶的突变pol基因，所述修饰的pol基因被包含在衣壳化质粒中。此类无整合能力的慢病毒载体已经在专利申请WO 2006/010834中描述。因此，蛋白质的整合酶能力被改变，而GAG、PRO和POL蛋白的衣壳化质粒的正确表达和/或衣壳的形成以及载体颗粒的形成，以及整合步骤之前或之后的病毒周期的其他步骤例如逆转录、核输入，则保持不变。当与含有相应野生型整合酶的慢病毒载体相比，整合酶应能实现的整合以整合步骤的发生率少于1/1000、优选少于1/10000的方式发生改变时，则称该整合酶有缺陷。
在本发明的一个具体实施方式中，缺陷型整合酶是由1类突变导致的，优选满足缺陷型整合酶表达要求的氨基酸置换(一个氨基酸置换)或短缺失。该突变是在pol基因内进行的。这些载体可能在酶的催化结构域中携带具有突变D64V的缺陷型整合酶，其特异性阻断整合步骤中的DNA切割和连接反应。D64V突变将假型HIV-1的整合最多降低至野生型的1/10000，但保留其转导非分裂细胞的能力，从而实现高效的转基因表达。
pol基因中适于影响HIV-1整合酶的整合酶能力的其他突变如下：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D116I、D116A、N120G、N120I、N120E、E152G、E152A、D-35-E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199C、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A和K264H。
在一个具体实施方式中，pol基因中的突变在以下位置D64、D116或E152中的任一个进行，或者在位于蛋白质催化位点的这些位置中的几个位置进行。在这些位置的任何置换都是合适的，包括上文所述的那些。
另一个建议的置换是用氨基酸残基AAH置换氨基酸残基RRK(位置262至264)。
在本发明的一个具体实施方式中，当慢病毒载体无整合能力时，慢病毒基因组进一步包含复制起点(ori)，其序列取决于必须表达慢病毒基因组的细胞的性质。所述复制起点可以来自真核生物起源，优选哺乳动物起源，最优选人类起源。其可替代地可以是病毒起源的，特别是来自DNA环状附加体病毒，例如SV40或RPS。在本发明的慢病毒载体的慢病毒基因组中插入起点或复制是本发明的有利实施方式。事实上，当慢病毒基因组没有整合到细胞宿主基因组中时(由于缺陷型整合酶)，慢病毒基因组会在经历频繁细胞分裂的细胞中丢失；这在免疫细胞例如B细胞或T细胞中尤其如此。复制起点的存在确保每个细胞中存在至少一个慢病毒基因组，即使在细胞分裂后也是如此，从而最大限度地提高免疫应答的效率。
本发明的所述慢病毒载体的慢病毒载体基因组特别可以源自1999年10月11日保藏于CNCM(巴斯德研究所，25-28，rue du Docteur Roux，75724巴黎Cedex 15，法国)编号为I-2330的HIV-1质粒pTRIPΔU3.CMV-GFP(也在WO01/27300中描述)或其变体。本发明的所述慢病毒载体的慢病毒载体基因组也可以源自2021年2月16日保藏于CNCM(巴斯德研究所，25-28，rue du Docteur Roux，75724巴黎Cedex 15，法国)编号为CNCM I-5657的HIV-1质粒pFlap-SP1beta2m-GFP-WPREm或其变体。
在一个实施方式中，慢病毒载体基因组源自具有SEQ ID No.20、SEQ ID No.25或SEQ ID No.26的序列的质粒。具体地，慢病毒载体基因组包含与SEQ ID No.20、SEQ IDNo.25或SEQ ID No.26具有至少70％、特别是80％或90％、更特别是95％或99％序列同一性的序列。
当载体基因组源自这些特定质粒时，除了SEQ ID No.20中的GFP编码片段、SEQ IDNo.25的li-EsxH片段或SEQ ID No.26的TfR-EsxH片段或者作为SEQ ID No.20中的GFP编码片段、SEQ ID No.25的li-EsxH片段或SEQ ID No.26的TfR-EsxH片段的置换，将编码本发明融合多肽(特别包含本申请中公开的病原体的抗原多肽)的重组多核苷酸序列插入其中。启动子，即CMV或SP1-β2m启动子也可以被另一个启动子置换，特别是上文公开的启动子之一，特别是与转基因表达有关的启动子置换。
可以任选地删除特定pFlap(pFLAPDeltaU3)和pTRIP载体中包含的WPRE或WPREm序列。
载体颗粒可以在通过所述质粒转染合适的细胞(例如哺乳动物细胞或人类细胞，例如293T细胞所示的人胚肾细胞)后产生或通过其他过程产生。在用于表达慢病毒颗粒的细胞中，全部或一些质粒可被用于稳定表达其编码多核苷酸，或瞬时或半稳定表达其编码多核苷酸。
所产生的颗粒的浓度可以通过测量细胞上清液的P24(HIV-1的衣壳蛋白)含量进行确定。
本发明的慢病毒载体一旦被施用给宿主之后，感染宿主的细胞、可能是特定的细胞，这取决于其被假型化的包膜蛋白。感染导致慢病毒载体基因组释放到发生逆转录的宿主细胞的细胞质中。一旦处于三联体形式(经由DNA瓣)下，慢病毒载体基因组被输入细胞核，其中编码病原体的抗原多肽的多核苷酸通过细胞机制表达。当转导非分裂细胞(如DC)时，表达可能是稳定的。当转导分裂细胞(例如B细胞)时，由于核酸稀释和细胞分裂，在慢病毒基因组中没有复制起点的情况下，表达是暂时的。通过提供复制起点确保慢病毒载体基因组在细胞分裂后适当扩散到子细胞中，表达可以更持久。也可以通过在载体基因组中插入MAR(基质附着区)或SAR(支架附着区)元件来增加稳定性和/或表达。
事实上，这些SAR或MAR区是富含AT的序列，并且能够将慢病毒基因组锚定到细胞染色体的基质上，从而调节编码包含至少一种抗原多肽的本发明的融合多肽的多核苷酸的转录，并且特别是刺激转基因的基因表达并改善染色质的可及性。
如果慢病毒基因组是非整合型的，则其不会整合到宿主细胞基因组中。然而，由转基因编码的至少一种多肽被充分表达并且足够长以进行加工、与MHC分子相关联并最终被引导至细胞表面。根据编码病原体的抗原多肽的多核苷酸的性质，与MHC分子相关联的至少一个多肽表位触发细胞免疫应答。
除非另有说明，或除非技术上不相关，否则本申请中公开的关于慢病毒颗粒(特别是关于它们的包膜蛋白或重组多核苷酸)的结构或用途的各种特征、实施方式或实施例中的任何一个的特征，可以根据任何可能的组合进行组合。
本发明还涉及一种用于单独施用给哺乳动物宿主的化合物的组合，其至少包含：
(i)本发明的慢病毒载体颗粒，其用第一种确定的异源病毒包膜假型化蛋白或病毒包膜假型化蛋白进行假型化；此类第一种假型化蛋白可以来自VSV的新泽西株；
(ii)与(i)中的慢病毒载体颗粒分开提供的本发明的慢病毒载体颗粒，其用第二种确定的异源病毒包膜假型化蛋白或不同于所述第一种异源病毒包膜假型化蛋白的病毒包膜假型化蛋白进行假型化；此类第二种假型化蛋白可以来自VSV的印第安纳株。
在本发明的另一个实施方式中，可能与上文公开的核酸的替代形式组合，编码包含至少一种抗原多肽的本发明的融合多肽的多核苷酸被结构修饰和/或化学修饰。作为其示例，多核苷酸在其5’区包含Kozak共有序列。载体基因组中可能存在的非慢病毒来源的其他核酸序列是IRES序列(内部核糖体进入位点)，其适于启动多肽合成WPRE序列或修饰的WPRE序列作为转录后调控元件以稳定所产生的RNA。
根据本发明的另一个实施方式，如果多个异源多肽由一个载体基因组编码，则编码序列可以任选地被接头部分分隔，该接头部分是基于核酸的分子或基于非核酸的分子。此类分子可以是功能化的接头分子，其旨在识别其应连接的3’功能化的核酸。适合用作接头的序列可替代地可以是编码自剪切肽(例如2A肽)的核酸。
本发明的进一步的特征和特性，包括将在上述实施方式中使用的特征，将在下文的实施例和附图中进行描述，并且可以相应地用于表征本发明。
序列表
SEQ ID No.1：li-HAEP氨基酸序列
SEQ ID No.2：li-HAEP DNA序列
SEQ ID No.3：li-HAEPA氨基酸序列
SEQ ID No.4：li-HAEPA DNA序列
SEQ ID No.5：li-EsxH氨基酸序列
SEQ ID No.6：li-EsxH DNA序列
SEQ ID No.7：TfR1-118-EsxH氨基酸序列
SEQ ID No.8：TfR1-118-EsxH DNA序列
SEQ ID No.9：SP-EsxH-MITD氨基酸序列
SEQ ID No.10：SP-EsxH-MITD DNA序列
SEQ ID No.11：人恒定链(li)氨基酸序列
SEQ ID No.12：人恒定链(li)DNA序列
SEQ ID No.13：人转铁蛋白受体的跨膜结构域，氨基酸序列
SEQ ID No.14：人转铁蛋白受体的跨膜结构域，DNA序列
SEQ ID No.15：EsxH20-28表位氨基酸序列
SEQ ID No.16：EsxH74-88表位氨基酸序列
SEQ ID No.17：EsxA1-20表位氨基酸序列
SEQ ID No.18：PE-191-18表位氨基酸序列
SEQ ID No.19：Ag85A241-260表位氨基酸序列
SEQ ID No.20：质粒pFlap-SP1beta2m-GFP-WPREm(SP1beta2m启动子、GFP转基因和WPREm)DNA序列
SEQ ID No.21：Sp1-人β2-微球蛋白启动子
SEQ ID No.22：BCUAG启动子
SEQ ID No.23：突变体WPRE
SEQ ID No.24：人源化的li-抗原氨基酸序列(人li-EsxH)
SEQ ID No.25：具有人源化的li-EsxH抗原核苷酸序列(β2-微球蛋白启动子)的融合序列的重组pFLAP
SEQ ID No.26：具有人源化的TfR-EsxH抗原核苷酸序列(β2-微球蛋白启动子)的融合序列的重组pFLAP
SEQ ID No.27：GGGD接头
SEQ ID No.28：NNGG接头
SEQ ID No.29：NNDD接头
SEQ ID No.30：绿色荧光蛋白(GFP)基因的核苷酸序列(密码子优化的)
SEQ ID No.31：绿色荧光蛋白(GFP)基因的氨基酸序列
附图说明
图1.北京或非北京Mtb临床分离株对Ag85A/B和EsxA分泌的吞噬细胞内定量。(AB)用不同CFU/ml的来自一组非北京或北京临床分离株的每种Mtb菌株感染骨髓衍生的DC(H-2b)，编号如表S1中所示。过夜培养后，加入对Ag85A/B(DE10)(A)或ESXA(NB11)(B)特异性的MHC-II限制性T细胞杂交瘤，并在培养24小时后，通过ELISA确定由T细胞杂交瘤产生的IL-2的浓度，该浓度与DC吞噬体内分泌的Mtb抗原的量成比例。(C)吞噬细胞内Ag85A/B或EsxA的分泌量，如在用4×103CFU/ml感染的DC中确定的。
图2.定制LV以将抗原引导至MHC-II处理途径。(A)常规LV诱导CD4+T细胞的失败。用编码用于融合ESXa-Ag85a-ESPC-ESXH-PE19 Mtb免疫原的常规LV免疫的C57BL/6小鼠脾细胞的细胞计数分析。示出用EspC:45-54肽(其在H-2b中含有MHC-I和MHC-II限制性表位)或阴性对照肽体外刺激后CD4+和CD8+T脾细胞IFN-γ应答。(B)全长EsxH蛋白的方案，在其N末端或C末端添加了可能促进其通过MHC-II的递送的序列。(C)通过DC(H-2d)呈递MHC-I或MHC-II限制性EsxH表位，用1×106TU/ml的单独编码EsxH的LV、Ii-EsxH、TfR-EsxH或SP-EsxH-MITD转导，并在转导后第3天与对EsxH:20-28特异性并受Kd(YB8)(顶部)限制或者对EsxH:74-88特异性且受I-Ad(1H2)(底部)限制的T细胞杂交瘤共培养。结果为过夜共培养后T细胞杂交瘤产生的IL-2浓度的平均值±标准差(SD)。
图3.通过优化的LV诱导全身或粘膜CD4+和CD8+T细胞应答。BALB/c(H-2d)小鼠(n＝3/组)用5×107TU的LV::li-EsxH单独(1)或用polyI:C(2)或cGAMP(3)佐剂进行皮下免疫。在注射后第11天(11dpi)，通过ICS对个体小鼠的脾细胞的EsxH特异性Th1细胞因子应答进行分析。(A)对产生细胞因子的CD4+或CD8+T细胞进行门控策略。(B-C)CD4+(B)或CD8+(C)T亚群内每个(多)功能性群体的概括频率。(D-E)BALB/c小鼠(n＝3/组)用5×107TU的LV::li-EsxH单独(1)或用polyI:C或cGAMP佐剂进行鼻腔免疫。在13dpi时，通过将从肺富集的淋巴细胞与负载EsxH:74-88(MHC-II)(D)或负载EsxH:20-28(MHC-I)(E)的同源DC共培养，对EsxH特异性肺CD4+或CD8+T细胞应答进行分析。通过ELISA定量共培养上清液中的IL-2、IL-17A或IFN-γ的含量。
图4.由优化的LV诱导的粘膜CD4+或CD8+T细胞应答的表征。BALB/c(H-2d)小鼠(n＝3/组)用5×107TU的LV::li-EsxH单独(1)或用polyI:C或cGAMP佐剂进行鼻腔免疫。在13dpi时，通过在处死前3分钟静脉注射PE-抗-CD45mAb，区分肺CD4+(A)或CD8+(E)T细胞在间质内(CD45i.v -)或在脉管系统中(CD45i.v +)的位置。通过ICS在肺间质或脉管系统的肺CD4+或CD8+T细胞中检测到的CD27与CD62L表达的图谱(B、F)或细胞因子产生(C、D、G、H)。代表2-3个独立实验的结果来自每个实验组汇集的肺，以达到足够高的细胞数来进行准确的细胞计数分析。
图5.通过LV鼻腔施用诱导的粘膜先天免疫的表征。(A)对总肺细胞使用细胞计数门控策略分析各种粘膜先天免疫细胞群。示出的是来自注射PBS的阴性对照的细胞。(B)鼻腔注射PBS、单独LV或cGAMP佐剂LV的C57BL/6小鼠中每个先天免疫亚群相对于总肺CD45+细胞的百分比，如在2dpi时确定的。结果来自3只小鼠/每组。ns＝不显著，如单尾曼-惠特尼检验所确定的。
图6.多抗原LV::li-HAEP诱导CD4+和CD8+T细胞的潜力。(A)用LV::li-HAEP或LV::TB作为阴性对照转导的H-2d或H-2b DC呈递MHC-I-或MHC-II-限制性表位，并在转导后第3天与对EsxH:20-28具有特异性并受Kd(YB8)限制、对EsxH:74-88具有特异性并受I-Ad(1G1)限制、对EsxA:1-20(NB11)或PE19:1-18(IF6)具有特异性并受I-Ab限制的T细胞杂交瘤共培养。(B-D)C57BL/6(H-2b)小鼠用5×108TU的LV::li-HAEP进行皮下免疫或注射PBS。在11dpi时，脾细胞的抗原特异性细胞因子应答，通过ELISPOT(B)或ICS(C-D)在个体小鼠中确定为SFU(斑点形成单位)。(C-D)示出的是在去除针对每只小鼠用不相关的阴性对照肽观察到的背景信号之后，CD4+(C)或CD8+(D)T亚群内每个(多)功能性群体的概括频率。
图7.LV::li-HAEP诱导的粘膜T细胞应答的特征。C57BL/6(H-2b)小鼠用5×108TU的LV::li-HAEP、用cGAMP佐剂(n＝7)进行鼻腔免疫或用PBS输注(n＝3)。在13dpi时，在处死前3分钟静脉注射PE-抗-CD45mAb后，在与负载有EsxA:1-20(MHC-II)、PE19:1-18(MHC-Ⅱ)、EspC:40-54(MHC-I和MHC-II)、EsxH:20-28(MHC-I)或不相关的阴性对照肽的同源DC共培养后，通过ICS分析CD4+(A)或CD8+(B)肺T细胞应答。示出的是位于间质(CD45i.v -)内或位于脉管系统(CD45i.v +)中的CD4+(A)或CD8+(B)T亚群内的每个(多)功能性群体的概括绝对数。(C、D)间质(CD45i.v -)CD4+(C)或CD8+(D)的表型。结果是由从每组肺中汇集的细胞产生的，以达到足够的数量进行细胞计数分析。
图8.优化的多抗原LV作为加强剂在TB疫苗接种中的保护潜力。(A)Ag85A的MHC II限制性呈递，与EsxA平行，如在DC(H-2b)上检测到的，其用LV::li-HAEPA或LV::TB作为阴性对照转导，并在转导后第3天与在IL-2启动子控制下携带编码ZsGreen报告基因的基因的Ag85A或EsxA特异性T细胞杂交瘤共培养。(B)在C57BL/6小鼠(n＝5-9/组)中进行的用BCG::ESX-1Mmar初免、用cGAMP佐剂的LV::li-HAEPA加强和用Mtb H37Rv株攻击的时间线。(C)在攻击后第5周，通过个体小鼠的肺部和脾脏中的CFU计数确定的分枝杆菌载量。ns＝不显著，*(p＝0.0415)，**(p＝0.0040)***(p＝0.00105)，统计显著的，通过单尾曼-惠特尼检验确定。(D)具有代表性的肺苏木精-伊红组织病理学结果。在Mtb攻击后第5周，对未接种疫苗(左)、接种BCG::ESX-1Mmar疫苗(中)或BCG::ESX-1Mmar初免和cGAMP佐剂的LV::li-HAEPA加强(右)的C57BL/6小鼠的左肺叶进行分析。
图9.LV诱导DC成熟的能力较弱。来自C57BL/6小鼠的骨髓来源的DC未经处理(阴性对照)，用MOI＝3的Mtb处理(阳性对照)，或用以50的高MOI的LV处理。(A-C)CD11c+CD11b+细胞的成熟(A)，如在过夜培养后通过流式细胞术监测CD40、CD80、CD86、MHC-I和MHC-II表面分子的表达(B)。(C)明亮(hi)细胞的MFI或百分比。结果代表了两个独立的实验。
图10.DC中LV介导的CD8+T细胞诱导对IFNAR信号传导的非依赖性。(A)通过评估源自ifnarflox/flox pCD11c-Cre-(WT)或ifnarflox/flox pCD11c-Cre+(KO)小鼠的造血干细胞的骨髓DC的IFNAR1表面表达对KO小鼠DC中的IFNAR1缺陷的验证。(B-G)用5×107TU的LV::OVA(B-C)或LV::OVA(D-G)肌内免疫小鼠，ifnarflox/flox pCD11c-Cre-(WT)或ifnarflox/floxpCD11c-Cre+(KO)。在11dpi时，通过四聚体染色、ELISPOT或ICS分析评估抗原特异性CD8+T脾细胞。(B)与总CD3+CD8+T脾细胞相比，用“OVA四聚体”阳性染色的细胞的百分比。(C)通过ELISPOT检测到的，用OVA:257-264离体刺激后分泌IFN-γ的脾细胞数量。(D)通过ELISPOT(SFU＝斑点形成单位)检测到的，用EsxH:3-11或阴性对照肽离体刺激后分泌IFN-γ或TNF-α的脾细胞数量。(E)通过表面CD107a染色评估的，产生IFN-γ的CD8+T细胞的脱颗粒活性。(F)在对CD8+T脾细胞进行的ICS分析中使用的门控策略。(G)各种(多)功能性EsxH:3-11特异性CD8+T细胞效应器的概括频率。
图11.DC中LV介导的CD4+T细胞诱导对IFNAR信号传导的非依赖性。ifnarflox/floxpCD11c-Cre-(WT)或ifnarflox/flox pCD11c-Cre+(KO)小鼠用5×108TU的LV::li-HAEP进行皮下免疫。在11dpi时，通过ICS评估抗原特异性CD4+T细胞应答。示出的是在用EsxA:1-20或PE19:1-18肽刺激后检测到的对EsxA或PE19具有特异性的(多)功能性CD4+T脾细胞的概括频率。
图12.通过肌内或皮下全身途径注射的LV::li-HAEP的免疫原性比较。C57BL/6小鼠用5×108TU的LV::li-HAEP进行肌内或皮下免疫。在14dpi时，通过ELISPOT评估抗原特异性IFN-γ或TNF-αT细胞应答。
图13.编码EsxH变体或多抗原融合蛋白的质粒图谱。将编码感兴趣疫苗的EsxH变体或多抗原融合蛋白(表S3)的密码子优化的cDNA序列插入pFLAP骨架质粒中的SP1-β2m启动子下。
图14.含有GFP的pFLAP骨架质粒的图谱。将GFP转基因的序列插入具有WPREm序列的SP1-β2m启动子下。
图15.用于人类免疫的质粒图谱。将编码EsxH变体的密码子优化的cDNA序列插入pFLAP骨架质粒中的SP1-β2m启动子下。A组：EsxH抗原与人li融合。B组：EsxH抗原与hTfR融合。
实施例
引言
根据世界卫生组织，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)每年导致超过800万例新的肺结核(TB)病例，并且由于全世界的传染性病原体，其仍然是全球十大死因之一和第一大死因。据估计，17亿潜伏感染Mtb的无症状人群中，5％至15％将发展成活动性肺结核。合并感染HIV或受营养不良、糖尿病、吸烟或酗酒影响的个体患这种疾病的风险更高(1)。目前唯一的肺结核疫苗是广泛施用的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin)(BCG)，在出生后早期给予，在诱导婴儿的Th1偏向性应答方面特别有效。尽管卡介苗在保护儿童免受肺部和散播性肺结核方面是有效的，但其对青少年和成人肺结核以及潜伏性肺结核的再活化影响有限，因此无法防止全球细菌传播(2)。因此，迫切需要新的免疫策略：(i)作为暴露前疫苗有效，(ii)能够降低原发性Mtb感染的风险，(iii)预防潜伏性肺结核发展成活动性疾病，或(iv)可用于肺结核免疫疗法。
尽管人们对肺结核保护的免疫相关性知之甚少，但已经证实，针对细胞内病原体Mtb的保护性免疫主要依赖于细胞介导的免疫。适当的先天免疫和T细胞介导的免疫，特别是产生IFN-γ/TNF-α的CD4+Th1细胞，以及较小程度的CD8+T细胞有助于抗分枝杆菌宿主防御，甚至不足以达到完全保护(3、4)。自1921年以来，已有40亿人接种了卡介苗，并且许多改进的候选减毒活疫苗正在研发中(5)。卡介苗赋予的免疫力的持续时间不同，但公认限制在约10年。减毒活疫苗的同源加强和分枝杆菌的重复施用可能会导致不良的坏死性炎症，即“科赫现象(Koch phenomenon)”，其特征在于IL-6、IL-17、TNF-α和CXCL2的强表达，以及中性粒细胞的大量募集(6)。在这种情况下，各种各样的初免-加强方案，依赖于用改进的减毒活疫苗初免，然后用亚单位疫苗加强，是一种协同增强Mtb特异性保护性免疫的有吸引力的方法(7)。先前已经详述了一种有前景的减毒活肺结核候选疫苗，该疫苗基于与一种与Mtb系统发育相关的鱼类病原体(即海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)(BCG::ESX-1Mmar))的esx-1基因组区稳定互补的巴斯德BCG菌株(8)。与卡介苗相比，该菌株在动物模型中显示出针对肺结核大幅提高的保护潜力，这与其已知的特性一致。事实上，该菌株显示出扩大的抗原组库，能够触发cGAS(环状GMP-AMP合酶)/STING(干扰素基因刺激因子)/IRF3(干扰素调节因子3)/IFN-I(I型IFN)轴，并增强NLRP3(NOD样受体家族蛋白3)和胞质DNA传感器、AIM-2(黑色素瘤缺乏因子2)炎症小体途径，同时显示减弱的毒力(8、9)。在小鼠肺结核模型中，BCG::ESX-1Mmar疫苗接种比亲本卡介苗更好地减少分枝杆菌载量，但尚未导致清除性免疫，从而留下了评估加强疫苗的保护潜力的可能性。
使用表达强效Mtb抗原的重组病毒疫苗载体可能会协同增强已用候选减毒活疫苗初免的个体的抗分枝杆菌的免疫力。这可以通过增加抗原特异性T细胞的频率、提高T细胞亲和力以及增强分枝杆菌通常不能有效诱导的CD8+T细胞应答来实现。复制缺陷型慢病毒载体(LV)是强大的递送系统和有吸引力的免疫工具，这基于其的：(i)低遗传毒性潜力，(ii)接受高达8kb插入物的能力，(iii)体内转导复制细胞和非分裂细胞的强大能力，(iv)持久的抗原表达，以及(v)在人类群体中不成为预先存在的抗载体免疫的靶点的优势(10-15)。然而，LV的一个局限性是它们无法将抗原靶向II类主要组织相容性复合体(MHC-II)途径来触发CD4+T细胞，而这迄今为止被认为是预防肺结核和多种其他疾病的最佳相关性。
此处，描述了新一代LV，其能够将免疫原递送至MHC-II机制，通过在由载体编码的抗原的N末端处添加MHC-II轻恒定链(li)而产生。这种方法和通过全身或粘膜途径的免疫策略，允许正确实施运输至MHC-II机制的抗原，从而除了诱导CD8+T细胞外，还诱导合适的CD4+T细胞，对其表型、功能和肺部定位进行了彻底的表征。进一步报告了所选的优化LV的显著保护潜力，该LV编码五种强效的Mtb抗原，用作加强剂，通过全身和鼻内(i.n.)途径施用到BCG::ESX-1Mmar初免的小鼠。
结果
Mtb免疫原的合理选择
由于Mtb的T细胞靶点主要是分泌蛋白(16、17)，为了开发基于多抗原LV的疫苗，选择了以下毒力相关因素：(i)EsxA(Rv3875)(ii)ESX-1分泌相关的蛋白(Esp)C(Rv3615c)，两者均通过ESX-1VII型分泌系统(T7SS)分泌，(iii)EsxH(Rv0288，TB10.4)，其通过ESX-3T7SS分泌，(iv)PE19(Rv1791)，其通过ESX-5T7SS分泌(18-21)，和(v)Ag85A(Rv3804c)，其来自分枝酰基转移酶Ag85复合物，通过Tat系统分泌(17、22)。关于后者，先前已经观察到，一些北京临床分离株仅表达微量的Ag85A/B，这对将这些抗原纳入候选疫苗的相关性提出了质疑(23)。此处，为重新评估这一假设，比较定量了表S1中列出的15个非北京或31个北京临床Mtb分离株感染的树突状细胞(DC)内Ag85A/B(图1A)和EsxA(图1B)的吞噬细胞内分泌。这是使用对Ag85A/B或EsxA特异性的T细胞杂交瘤进行的(表S2)，以测量源自这些抗原的T细胞表位的MHC-II介导的呈递，这与其吞噬细胞内分泌成正比(23)。尽管北京临床分离株的Ag85A/B平均表达在统计学上低于非北京菌株，但这些抗原的表达差异很大，并且发现许多北京分离株产生大量的Ag85A/B(图1C)。这一观察结果确定了Ag85A/B实际上是相关的疫苗靶点。
LV优化将Mtb免疫原递送至MHC-II途径
病毒载体在将内源产生的抗原递送至MHC-I方面效率很高，但在将抗原递送至MHC-II机制方面即使不是无效的，效率也很低。最初的常规LV(编码个体EsxA、EspC、EsxH、PE19或Ag85A或它们的各种融合物)未在小鼠中触发CD4+T细胞应答，这一事实证实了这一点。尽管在用编码Mtb抗原融合物(包括EsxA、Ag85A、EspC、EsxH和PE19(LV::TB))的常规LV免疫的C57BL/6小鼠中存在EspC特异性CD8+T细胞，但不存在EspC-特异性CD4+T细胞就是例证(图2A)。值得注意的是，除了EspC:45-54内的MHC-II限制性表位外(23)，该片段还含有MHC-I限制性表位，迄今为止在H-2b小鼠中未发现，并通过使用LV证明了这一点。为了克服LV无法诱导诱导性CD4+T细胞，考虑到EsxH特异性、MHC-I或MHC-II限制性T细胞杂交瘤的可用性，寻求优化该载体，如下所述，并使用EsxH作为报告基因抗原(表S2)(24、25)。
生成了一系列LV，其编码：(i)单独的EsxH(LV::EsxH)，(ii)EsxH在其N末端与小鼠MHC-II“li”轻恒定链(LV::li-EsxH)一起添加，以将翻译的抗原靶向MHC-II区室(26、27)，(iii)EsxH在其N末端与人转铁蛋白受体的1-118跨膜结构域(LV::TfR1-118-EsxH)一起添加，以生成膜结合蛋白，该蛋白应通过核内体运输，从而可能进入MHC-II途径(26,27)，或(iv)EsxH在其N末端和C末端分别与HLA-B衍生的前导SP肽和MHC-I运输信号(LV::SP-EsxH-MITD)一起添加，因为MHC-I分子也通过核内体运输(28)(图2B、图13)。用编码EsxH变体的LV转导的DC能够有效地向特异性T细胞杂交瘤呈递MHC-I限制性EsxH:20-28表位(图2C)。与常规LV::EsxH形成鲜明对比的是，只有优化的LV::li-EsxH，以及较小程度上的LV::TfR1-118-EsxH能够诱导有效的MHC-II限制性EsxH:74-88表位呈递给特定的T细胞杂交瘤(图2C)。LV::SP-EsxH-MITD无法通过MHC-II呈递抗原。对于下文描述的进一步实验，因此选择了li侧翼策略，通过MHC-II实现最高的呈递水平，而不影响通过MHC-I的呈递。总之，详述了新一代LV，其不仅通过MHC-I而且通过MHC-II途径获得了提供适当抗原呈递的工具特性，即“信号1”(29)。
LV对先天免疫相对于其显著的T细胞免疫原性的非常小的影响
在探索优化的LV在体内诱导CD4+T细胞的潜力之前，评估了LV在诱导DC成熟或炎症细胞因子信号传导方面的一些特性，即“信号2-3”(29)。一种未表征内毒素含量的LV制剂已经被描述在体内诱导一些炎症反应(30)。另一项研究报告了一定程度的LV在体外诱导的DC成熟，其归因于水泡性口炎病毒(VSV)G包膜糖蛋白，其中LV是假型化的(31)。小鼠DC，即使面对大量(MOI为50)的前GMP质量，VSV-G假型LV，也表现出非常轻微的表型成熟，如通过仅非常轻微的CD86上调和MHC-Ihi或-IIhi细胞百分比的微小增加判断的(图9A-B、C)。就功能成熟而言，用LV转导的DC分泌易于检测到的量的IFN-α、CCL5和IL-10，以及极少量的IFN-β。重要的是，没有检测到IL-1α,IL-1β、IL-6或TNF-α，这表明LV的炎症甚至抗炎特性较差(图9D)。
基于LV诱导IFN-I的效力(30、32)以及DC激活幼稚T细胞的独特能力，随后评估了LV介导的CD8+T细胞诱导(12)对DC中IFN-I信号传导的依赖性。为此，使用了条件C57BL/6突变体，ifnar1flox/flox pCD11c-Cre+(IFNAR缺陷型DC)与ifnar1flox/flox pCD11c-Cre-(IFNAR熟练型DC)，在初步证实源自前者的DC表现出表面IFNAR表达的大幅降低后(图10A)。来自同一窝的小鼠，ifnar1flox/flox pCD11c-Cre-或Cre+，用5×107转导单元(TU)的LV::OVA或LV::li-EsxH进行皮下免疫。免疫后11天(dpi)，四聚体染色、ELISPOT或细胞内细胞因子染色(ICS)测定在两种小鼠类型中检测到强烈且可比的CD8+T脾细胞应答，对OVA(图10B-C)或EsxH(图10D-G)具有特异性，包括相似比例的IFN-γ+CD107a+脱粒或多功能CD8+T细胞。因此，LV诱导CD8+T细胞应答的能力不受常规DC中IFNAR信号传导的控制。
LV非常轻微的DC刺激能力突出了这些有效载体本质上较小的炎症特性。此外，LV介导的T细胞诱导通过其可以诱导的罕见炎症介质(IFN-I)对DC信号传导的不依赖性表明，潜在的先天免疫机制已被降至最低。
优化的LV在诱导全身和粘膜CD4+T细胞免疫方面的显著能力
随后评估了优化的LV::li-EsxH在诱导全身或粘膜水平的CD4+T细胞应答方面的潜力。考虑到LV对先天免疫系统的轻微影响以及该载体尚未表征的CD4+T细胞免疫原性，研究了优化的LV::li-EsxH，无论是单独使用还是与pro-Th1聚肌胞苷酸(polyI:C)或pro-Th1/Th17环状鸟嘌呤-腺嘌呤二核苷酸(cGAMP)佐剂联合使用(33)。首先，用5×107TU的LV::li-EsxH单独或用佐剂对BALB/c小鼠进行皮下免疫。在免疫后11天时，ICS分析检测到大量EsxH特异性、产生Th1细胞因子的CD4+(图3A、B)以及CD8+(图3A、C)T脾细胞。在全身免疫诱导的此类应答中未观察到佐剂的显著影响(图3B、C)。然后，通过鼻腔内(i.n.)途径用5×107TU的LV::li-EsxH单独或用佐剂对BALB/c小鼠进行粘膜免疫。在免疫后13天，将肺T细胞与负载有EsxH:74-88或EsxH:20-28肽(分别携带MHC-II或MHC-I H-2dT细胞表位)的同源DC共培养(24、25)。产生粘膜抗原特异性IL-2或IL-17A的CD4+T细胞仅在用cGAMP佐剂的LV::li-EsxH免疫的小鼠肺部中检测到(图3D)。同时，产生粘膜抗原特异性IL-2或IL-17A的CD8+T细胞在用LV::li-EsxH与任一佐剂联合免疫的小鼠肺部检测到(图3E)。在所有免疫组均检测到产生抗原特异性IFN-γ的肺CD4+或CD8+T细胞(图3D、E)。
小鼠在处死前3分钟被静脉(i.v.)注射PE-抗-CD45 mAb，可以区分位于肺间质内的造血细胞和位于肺脉管系统中的造血细胞(34)。与注射PBS的对照组相比，单独用LV::li-EsxH免疫的小鼠在间质中具有显著百分比的CD45i.v -CD4+(图4A)或CD45i.v -CD8+(图4E)T细胞。在用佐剂的LV::li-EsxH免疫的小鼠中，这种T细胞募集/扩增增加。在用佐剂的LV::li-EsxH免疫的小鼠中，间质CD4+(图4B)或CD8+(图4F)CD45i.v -T细胞中CD27-CD62L-最近迁移效应器的百分比也更高。在单独用LV::li-EsxH免疫的小鼠的间质中检测到显著量的产生抗原特异性IFN-γ/TNF-α的CD4+(图4C)或CD8+(图4G)T细胞效应器，并且在用佐剂的LV::li-EsxH免疫的小鼠的间质中检测到甚至更多量的这些T细胞。用cGAMP佐剂的LV::li-EsxH免疫生成Th17(图4D)和Tc17(图4H)细胞，如在间质中检测到的，并且与用EsxH:74-88或EsxH:20-28肽体外刺激的肺T细胞上清液中释放的IL-17A一致(图3D、E)。在脉管系统中也检测到产生CD45i.v +Th1细胞因子的CD4+或CD8+T细胞(图4C、G)，表明鼻腔内免疫也生成抗原特异性T细胞，这些细胞可以进入血液循环，从而有助于全身免疫。
如通过细胞术在免疫后1天确定的，与单独的PBS处理相比，鼻腔内施用单独的LV对各种肺部先天免疫细胞亚群的比例没有显著影响(图5A、B)。鼻腔内滴注PolyI:C-或cGAMP佐剂的LV后，检测到DC和间质巨噬细胞的百分比轻微且统计学上不显著的增加。值得注意的是，在LV处理的小鼠中，促过敏性肥大细胞或嗜碱性粒细胞以及炎性Ly6C+巨噬细胞/单核细胞或中性粒细胞的比例保持不变(38)，这在分枝杆菌感染的情况下可能有害。
优化的多抗原LV的生成
然后，生成了优化的LV，其编码用于EsxH、EsxA、EspC和PE19的li和并置序列的融合(LV::li-HAEP)(表S3，图5S)。LV::li-HAEP转导的DC能够将这些免疫原的MHC-I或MHC-II限制性表位呈递给特异性的T细胞杂交瘤(图6A)。如通过ELISPOT确定的，在C57BL/6小鼠中，用5×108TU的单独LV::li-HAEP进行全身皮下免疫诱导产生IFN-γ/TNF-α的CD4+或CD8+T脾细胞，这些脾细胞对所有包括的免疫原均具有特异性(图6B)，在这两个亚群中都具有显著的双功能或多功能性(图6C、D)。类似于LV介导的CD8+T细胞诱导，使用这种优化的LV，未检测到CD4+T细胞诱导对DC IFNAR信号传导的任何依赖性(图11)。还证实了，用单独的LV::li-HAEP通过皮下或肌内(i.m.)全身途径免疫产生了可比的IFN-γ或TNF-αCD4+和CD8+T脾细胞应答(图12)。
用cGAMP佐剂的LV::li-HAEP对C57BL/6小鼠进行粘膜鼻内免疫，在肺间质中以及较小程度在脉管系统中引发(多)功能CD4+(图7A)或CD8+(图7B)T细胞，该T细胞对4种Mtb抗原中的每种都具有特异性。接种疫苗的小鼠中CD45i.v. -间质CD4+或CD8+T亚群含有增加比例的CD27-CD62L-迁移效应器和CD69+CD103+肺组织驻留细胞(图7C)。大多数CD69+CD103+CD4+T细胞表现CD44+CXCR3+表型(图7C底部)，让人想起CD8+T细胞驻留记忆表型(39、40)。
优化的多抗原LV的保护性增强潜力的评估
考虑Ag85A/B抗原作为疫苗靶点的兴趣(图1)，为了最大化精心设计的载体的增强潜力，将Ag85A:241-260免疫原性区域(41、42)添加到LV::li中HAEP(LV::li-HAEPA)的C末端(表S3，图13)。LV::li-HAEPA转导的DC能够诱导Ag85A:241-260向特异性T细胞杂交瘤的MHC-II限制性呈递(图8A)，以及其他Mtb抗原的呈递，如EsxA所示和通过特异性T细胞杂交瘤所检测到的(参考文献23)。为评估LV::li-HAEPA的加强效力，C57BL/6小鼠在第0周未接种疫苗或者用1×106CFU的BCG::ESX-1Mmar候选疫苗皮下初免，与亲代BCG相比，其保护能力增强(8)(图8B)。这种候选减毒活疫苗在初免免疫中优于BCG的优势与其通过直源ESX-1T7SS分泌EsxA和EspC的能力有关，其在此允许加强针对优化的多抗原LV中包括的所有Mtb抗原的T细胞应答。在第5周用5×108TU的cGAMP佐剂的LV::li-HAEPA皮下加强一组BCG::ESX-1Mmar初免的小鼠，然后在第10周再次用相同量的cGAMP佐剂的LV::li-HAEPA鼻腔内加强，以将诱导的免疫效应器吸引到肺粘膜。在第12周，用约200CFU的毒力Mtb H37Rv菌株通过气溶胶攻击小鼠，并且在第17周确定肺部和脾脏中的分枝杆菌载量。与未接种疫苗的对照组(曼-惠特尼检验，p值＝0.0005)相比，初免-加强小鼠的肺分枝杆菌载量平均值降低了约2.5log10，并且与接种BCG::ESX-1Mmar疫苗的小鼠(曼-惠特尼检验，p值＝0.0415)相比，初免-加强小鼠的肺分枝杆菌载量平均值降低了约1log10(图8C)。与仅接种BCG::ESX-1Mmar的小鼠相比，初免和加强小鼠中的这种显著降低似乎对肺组织病理学没有重大影响(图8D)。在脾脏中，用cGAMP佐剂的LV::li-HAEPA的加强导致分枝杆菌载量减少的净趋势，但这并未达到统计学显著性。这可以解释为ESX-1补充的卡介苗菌株对小鼠和豚鼠模型中的脾脏传播具有特别强烈且几乎无法改善的保护作用(22、43、44)。
讨论
通过“组学”方法对健康供体或患有潜伏性肺结核和活动性肺结核的个体的人体免疫细胞进行广泛研究，从而可以鉴定生物标志物，以开发基于宿主应答的活动性肺结核诊断(45)。然而，这些研究并未提供导致肉芽肿的免疫失败和进展成活动性肺结核的多因素过程的透彻观点。因此，最佳保护的可靠相关性，以及潜伏性肺结核未进展成活动性肺结核的致病生物标志物在很大程度上仍难以解释。在这种情况下，合理设计新一代的肺结核疫苗具有挑战性(46)。该领域的一项共识是初免-加强免疫方法。卡介苗在过去80年中显示出优异的安全记录，并显示出对儿童中播散型肺结核的高保护率。因此，使用：(i)用于初免的卡介苗或改良的减毒活疫苗，以及(ii)用于加强的亚单位候选疫苗，代表了一种有前景的策略。
病毒载体，尤其是修饰的安卡拉牛痘病毒(MVA)或腺病毒载体已用于针对Mtb的免疫接种(7)。尽管其在临床前动物模型中取得了显著的成功，但编码Ag85A的MVA在临床试验中免疫原性较差，无法诱导保护(47)。另一种编码Ag85A的LV与NF-kB激活剂一起诱导全身和粘膜T细胞免疫，但在小鼠模型中未提供针对卡介苗攻击的保护(48)。在卡介苗初免的小鼠中，用编码Ag85B-PPE57融合物的LV加强，增加了针对高剂量静脉Mtb攻击的T细胞应答的幅度和保护作用(49)。在这些研究中，LV仅编码一种或两种Mtb抗原，并且未针对将抗原靶向MHC-II呈递途径进行优化，这可以解释为何它们诱导针对Mtb的保护的能力较差。事实上，尽管病毒载体(包括LV)具有将内源产生的抗原靶向进入转导的抗原呈递细胞的MHC-I途径的卓越能力，但它们大多无法将抗原递送至用于CD4+T细胞诱导的MHC-II机制。此处，生成了新一代LV，其中编码多种强效Mtb抗原的基因被工程化，以允许通过MHC-II途径运输所产生的融合蛋白。在单抗原蛋白或多抗原蛋白的N末端添加li或TfR，实现了向MHC-II机制的适当抗原递送和CD4+T细胞的强力触发，而没有任何减少MHC-I呈递或CD8+T细胞诱导的倾向。然而，li与蛋白质序列的N末端融合可能并不总是足够的，并且所产生的蛋白质的天然三级结构的保存似乎也很重要。例如，编码li和源自EsxH、EsxA、EspC和PE19的预测T细胞表位簇的融合物的LV，无法保存蛋白质折叠并富集疏水残基中的序列，不能诱导有效的抗原递送至MHC-II机制。
插入优化的LV中的多抗原中包括的Mtb免疫原的选择是基于其与体内分枝杆菌毒力以及ESX-1、ESX-3、ESX-5T7SS或Tat系统在各个肺结核阶段的主动分泌的直接关系(16、17)。在这些蛋白质中，PE19特别令人感兴趣。作为单一抗原，PE19携带与其几种同源物共享的T细胞表位。Mtb基因组含有多达一百个pe(和ppe)基因。所产生的PE/PPE蛋白，以其N末端PE或PPE基序命名(18、50、51)，形成大的多基因蛋白质家族，这些蛋白质是被分泌的或附着在细胞壁的，并且许多与致病潜力相关(18-21)。由于祖先基因重复，PE/PPE蛋白表现出大量的序列同源性，因此共享大量的T细胞表位(42)。在整个Mtb基因组中任意插入pe/pee基因导致它们通过独立启动子阵列的表达，这在不同的感染阶段在它们的表达谱中产生了前所未有程度的可变性(52)。在不同的肺结核阶段，这种情况可以很容易地产生共享PE(/PPE)表位组的连续显示(42、53-55)。
正如最近通过基于LV的SARS-CoV-2疫苗接种所证明的(56)，即使是高质量的全身免疫应答，也可能并不总是到达肺粘膜的感染部位来防止肺部病原体的复制。粘膜免疫，包括抗体和组织驻留淋巴细胞，已被证明有助于清除呼吸道中的病原体(56-60)。在肺结核疫苗接种中，先前的结果证明了在各种制剂中使用Esx或PE/PPE抗原进行鼻腔内免疫的优势(9、61)。此外，针对肺结核的保护与抗原特异性驻留记忆CD4+T细胞的存在相关(62-65)。此处，彻底表征了CD4+和CD8+T细胞的功能和表型，该T细胞通过全身或鼻腔内施用编码EsxH或HAEP(A)多抗原的优化的LV来诱导。最值得注意的是，粘膜免疫诱导了具有多功能效应器特征的肺CD4+和CD8+T细胞，并伴有活化、组织驻留和记忆表型。当与cGAMP佐剂一起配制并通过鼻腔内施用时，优化的LV也触发了肺Th17和Tc17应答，在针对Mtb的保护中具有预期的影响(66、67)。
LV在体外对DC成熟有非常轻微的影响，以及在鼻腔内施用单独的LV后肺先天免疫细胞组成的轻微改变，表明这些载体本质上具有低炎症特性。有趣的是，通过IFN-I(即由LV诱导的罕见炎症因子)的DC信号传导并不参与这些载体诱导CD4+或CD8+T细胞。这表明LV参与的先天免疫途径最小限度地参与诱导强效T细胞免疫。这些特征，加上LV的非复制型特性，有利地反映了它们对兽医或人类疫苗接种的安全性，特别是通过粘膜途径。此外，由于粘膜屏障，鼻内免疫甚至可以将全身不良反应降到最低(68)。
最后，在预防性C57BL/6小鼠肺结核模型中研究了基于用改良减毒活疫苗BCG::ESX-1Mmar初免(8)并用cGAMP中配制的优化LV::li-HAEPA加强的疫苗接种方法的保护潜力。BCG::ESX-1Mmar本身引发肺部和脾脏中Mtb载量的大幅减少，而通过全身和鼻腔途径的LV加强则实现了肺部细菌载量的显著额外减少，并伴有向脾脏传播减弱的净趋势。这些数据提供了概念验证证据，证明在LV的情况下，不仅像EsxH这样的单一小抗原，而且与li融合的多种抗原的融合物都能够进入MHC-II呈递途径来诱导CD4+T细胞，而不会减少CD8+T细胞的触发。此外，用优化的LV进行鼻腔内诱导具有驻留记忆表型的多特异性肺CD4+和CD8+T细胞免疫的募集和建立。该方法可以任选地通过添加适当的佐剂来改进。
鼻内免疫是否涉及纵隔淋巴结，直接募集并定位到肺实质中的免疫细胞或“三级淋巴器官”的高度组织化的异位淋巴样结构还有待揭示。后者模仿粘膜组织中的免疫生发中心，提供局部和受控的炎症以及用于先天和适应性免疫细胞串扰的最佳环境，以增强潜在感染部位的抗微生物宿主免疫力(74)。
LV的非复制性和非常弱的炎症特性，其现在被优化以诱导CD4+T细胞应答，预测这些载体是粘膜疫苗接种的首选工具，特别是通过鼻腔内途径。这些基于LV的策略的发展前景远远超出分枝杆菌感染，将方法扩展到急性或慢性呼吸道传染病。
材料和方法
编码Mtb(多)抗原的转移质粒的构建和LV的生成
编码单独的EsxH或者与li、TfR和MITD融合或者编码li-HAEP或li-HAEPA的密码子优化基因由Eurofins合成，然后在“SP1”启动子的下游克隆：(i)基于人β2微球蛋白(β2m)启动子，其主要在免疫细胞和显著活化的APC中衍生抗原表达，以及(ii)含有源自CMV启动子的插入/置换区域，尽管具有最小的近端增强子，并因此提高了载体安全性(未发表的结果)。增强子位于pFLAPΔU3转移质粒的BamHI和XhoI位点之间(14)(图13)，该质粒含有突变的WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)序列以增加基因转录。LV的生产和滴定如其他地方所述进行(56)。
分枝杆菌
Mtb(H37Rv株)或BCG::ESX-1Mmar(8)，在补充有白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶(ADC，Difco，Becton Dickinson，Le Pont de Claix，法国)的Dubos肉汤中培养至指数期。非北京和北京临床Mtb分离株(代表法国最流行的基因型)已被提交给国家结核病参考中心进行耐药性表征和分枝杆菌散布重复单元-可变数目串联重复(MIRU-VNTR)基因分型(75)。Mtb临床分离株在补充有油酸ADC(OADC，Difco)的Dubos肉汤中生长。通过OD600测量确定分枝杆菌培养物的滴度。根据巴斯德研究所的卫生和安全建议，在BSL3中进行了致病分枝杆菌实验。
体外MHC-I或MHC-II限制性抗原呈递的检测
在含有5％FBS的RPMI 1640中，将组织相容性骨髓来源的DC以5×105个细胞/孔接种在24孔板中。当附着时，用LV载体转导细胞，或加载1μg/ml的同源或对照合成肽。在感染后24小时，加入5×105的适当的T细胞杂交瘤，并在24小时通过ELISA评估共培养上清液的IL-2产生。在该测定中，释放的IL-2的量与MHC分子抗原呈递的效力成正比。携带MHC-I或MHC-II限制性表位的肽由Proteogenix(Schiltigheim，法国)合成，并在含有5％二甲基亚砜(DMSO)的H2O(Sigma-Aldrich)中重构。当使用报告基因T细胞杂交瘤评估指示的抗原呈递时，如最近所述的，该杂交瘤被转导以在TCR触发后发射荧光信号(23)。
小鼠，免疫
雌性BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)(Janvier Labs，Le Genest-Saint-Isle，法国)在环境适应至少一周后进行免疫，其中所含LV的指示剂量为肌内注射用50μl/只小鼠、尾部皮下注射用200μl/小鼠或鼻腔内滴注用20μl/只小鼠。在全身麻醉下进行鼻腔内施用，通过腹腔注射100μl的PBS来获得，该PSB含有适应体重的量的Imalgène1000的(氯胺酮(Kétamine)，即100mg/kg，Merial，法国)和Rompun 2％(赛拉嗪(Xylazine)溶液，10mg/kg，Bayer，德国)。当指示时，LV添加10μg/只小鼠的polyI:C或cGAMP(Invivogen)佐剂。
在小鼠CD11c启动子的调控下(76)，携带编码Cre DNA重组酶的基因的半合子C57BL/6(H-2b)小鼠与“floxed”ifnar1等位基因(77)纯合的C57BL/6小鼠杂交，以获得数窝携带或不携带Cre转基因的纯合ifnar1flox/flox小鼠。在ifnar1flox/flox pCD11c-Cre+小鼠中，除表达CD11c的浆细胞样DC外，所有其他DC群体均缺乏IFNAR1(77)。繁殖是在巴斯德研究所的中央动物设施中、在SPF条件下进行的。
依照欧洲和法国指令(第86/609/CEE号指令和1987年10月19日第87-848号法令)，经巴斯德研究所安全、动物护理和使用委员会(the Institut Pasteur Safety，AnimalCare and Use Committee)批准，并根据当地伦理委员会协议#CETEA 2013–0036和CETEA2012–0005(APAFIS#14638-2018041214002048)，使用8至16周龄之间的小鼠。
细胞内细胞因子染色
通过组织均质化并通过100μm尼龙过滤器(Cell Strainer，BD Biosciences)获得免疫小鼠的脾细胞，并以4×106个细胞/孔接种在24孔板中。将肺在37℃下用400U/ml IV型胶原酶和DNase I(Roche)处理30分钟，并使用GentleMac(Miltenyi)均质化。然后通过70μm尼龙过滤器(Cell Strainer，BD Biosciences)过滤细胞，并在不制动的情况下在Ficoll梯度培养基(Lympholytem，Cedarlane Laboratories)上在室温下以3000rpm离心20分钟。富含肺T细胞的组分在24孔板中以4×106个细胞/孔与组织相容性骨髓来源的DC(8×105个细胞/孔)共培养。将脾细胞或肺T细胞在10μg/ml同源或对照肽、1μg/ml抗CD28(克隆37.51)和1μg/ml抗CD49d(克隆9C10-MFR4.B)mAb(BD Biosciences)的存在下共培养6h。在培养的最后3小时，用来自BD Biosciences的Golgi Plug和Golgi Stop的混合物处理细胞。当指示时，PE-Cy7-抗-CD107a(克隆1D4B，BioLegend)mAb也在该步骤被添加到培养物中。然后收集细胞，用含有3％FBS和0.1％NaN3的PBS(FACS缓冲液)洗涤，并在4℃下与FcγII/III受体阻断的抗CD16/CD32(克隆2.4G2)和APC-eFluor780-抗-CD3ε(克隆17A2)、eF450-抗-CD4(克隆RM4-5)、BV711-抗-CD8(克隆53-6.7)mAb(BD Biosciences或eBioscience)的混合物培养25分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次，然后使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BDBioscience)进行透化。然后用来自Cytofix/Cytoperm试剂盒的PermWash 1X缓冲液洗涤细胞两次，并与AF488-抗IL-2(克隆JES6-5H4，BD Biosciences)、PE/Dazzle 594-抗TNF-α(MP6-XT22，BioLegend)和APC抗IFN-γ(克隆XMG1.2，BD Biosciences)mAb的混合物或者合适的对照Ig同种型的混合物一起在4℃下培养30分钟。然后将细胞在PermWash中洗涤两次，在FACS缓冲液中洗涤一次，然后在4℃下用Cytofix(BD Biosciences)固定过夜。在AttuneNxT细胞仪系统(Invitrogen)中获取细胞，并使用FlowJo软件(Treestar，OR，美国)进行数据分析。
肺细胞表型分析
如上所述制备在处死前3分钟静脉注射PE-抗-CD45(克隆30-F11，BioLegend)的小鼠的富含淋巴细胞的肺细胞，并用APC-eFluor780-抗-CD3ε(克隆17A2，eBioscience)、eF450-抗-CD4(克隆RM4-5，eBiosciences)、BV711-anti-CD8(克隆53-6.7，BDBiosciences)mAb的混合物与以下任一种染色：(i)PE-Cy7-抗CD27(克隆LG.7F9，eBioscience)和AF700-抗-CD62L(克隆MEL-14，BD Biosciences)mAb，或(ii)BV605-抗-CD69(克隆H1.2F3，BioLegend)、FITC-抗-CD103(克隆2E7，BioLegend)、PE-Cy7-抗-CD49a(克隆HM1，BioLegent)、AF700-抗-CD44(克隆IM7，BioLegend)和APC-Fire750-anti-CXCR3(克隆CXCR3-173，BioLegen)mAb，全部在FcγII/III受体阻断的抗CD16/CD32(BDBiosciences)的存在下进行。在4℃下培养25分钟后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次，并通过在4℃下用Cytofix(BD Bioscience)孵育过夜来固定。肺先天免疫细胞的细胞计数分析最近在其他地方详细说明(56)。
ELISPOT测定
将来自个体小鼠的脾细胞均质化并通过100μm孔过滤器过滤，并在5分钟内以1500rpm离心。然后用红细胞裂解缓冲液(Sigma)处理细胞，在PBS中洗涤两次，并在MACSQuant-10细胞仪(Miltenyi Biotec)中计数。然后将脾细胞以1×105个细胞/孔接种在200μl RPMI GlutaMAX中，该RPMI GlataMAX的在ELISPOT平板(小鼠IFN-γ或NF-αELISPOTPLUS，Mabtech)中含有10％热灭活的FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、1x 10- 4M非必需氨基酸、1％vol/vol HEPES、1x 10-3M丙酮酸钠和5x10-5Mβ-巯基乙醇。不刺激细胞或用2μg/ml适当的合成肽(Proteogenix)或2.5μg/ml伴刀豆球蛋白A(Sigma)刺激细胞，作为功能性对照。根据制造商的建议，对每只小鼠进行三次重复测定。在ELR04 ELISPOT读数器(AID，Strassberg，德国)中对平板进行分析。
保护测定
C57BL/6小鼠在第0天皮下注射1×106CFU/小鼠的BCG::ESX-1Mmar进行初免，在第5周皮下注射5×108TU/小鼠的佐剂的LV进行加强，并在第10周鼻腔注射5×108TU/小鼠的佐剂的LV进行再次加强。如前所述，通过气雾剂使用自制喷雾器在鼻腔加强后2周对免疫小鼠以及年龄匹配的未接种疫苗的对照组进行攻击(9)。简而言之，将5ml 1.7×106CFU/ml的Mtb H37Rv菌株的悬浮液进行雾化，以提供约200CFU/小鼠的吸入剂量。将受感染的小鼠置于巴斯德研究所的BSL3设施中的隔离器中。五周后，使用MillMixer均质器(Qiagen，Courtaboeuf，法国)将受感染小鼠的肺部或脾脏均质化，并将在PBS中制备的连续5倍稀释液涂布在补充有ADC的7H11琼脂(Difco，Becton Dickinson)上。在37℃下培养3周后对CFU进行计数。使用Prism v8.01(GraphPad Software，Inc.)通过曼-惠特尼(Mann-Whitney)t检验确定组间CFU差异的统计学显著性。
表S1.来自MIRU-VNTR的非北京或北京Mtb临床分离株，测试吞噬细胞内Ag85A/B和EsxA表达。
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表S2.对所选Mtb免疫原具有特异性的MHC-I或MHC-II限制性T细胞杂交瘤
表S3.插入LV的融合的li和所选Mtb抗原的序列
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突出显示的序列是为避免新表位生成而插入的接头。
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67.Shen H、Chen ZW，2018年，Th17相关细胞因子/信号通路在结核分枝杆菌感染中的关键作用，《细胞与分子免疫学》15：216-225(Shen H,Chen ZW.2018.The crucialroles of Th17-related cytokines/signal pathways in M.tuberculosisinfection.Cell Mol Immunol 15:216-225)。
68.Raeven RHM、Rockx-Brouwer D、Kanojia G、van der Maas L、Bindels THE、Ten Have R、van Riet E、Metz B、Kersten GFA，2020年，使用外膜囊泡百日咳疫苗的鼻腔免疫通过粘膜IgA和Th17应答提供广泛的保护，《科学报告》10：7396(Raeven RHM,Rockx-Brouwer D,Kanojia G,van der Maas L,Bindels THE,Ten Have R,van Riet E,Metz B,Kersten GFA.2020.Intranasal immunization with outer membrane vesiclepertussis vaccine confers broad protection through mucosal IgA and Th17responses.Sci Rep 10:7396)。
69.Kim TS、Gorski SA、Hahn S、Murphy KM、Braciale TJ，2014年，不同的树突状细胞亚群通过CD24依赖性机制决定效应和记忆CD8(+)T细胞分化之间的命运决定，《免疫》40：400-13(Kim TS,Gorski SA,Hahn S,Murphy KM,Braciale TJ.2014.Distinctdendritic cell subsets dictate the fate decision between effector and memoryCD8(+)T cell differentiation by a CD24-dependent mechanism.Immunity 40:400-13)。
70.Ng SL、Teo YJ、Setiagani YA、Karjalainen K、Ruedl C，2018年，I型常规CD103(+)树突状细胞控制流感感染期间效应CD8(+)T细胞迁移、存活和记忆反应，《免疫学前沿》9：3043(Ng SL,Teo YJ,Setiagani YA,Karjalainen K,Ruedl C.2018.Type1Conventional CD103(+)Dendritic Cells Control Effector CD8(+)T CellMigration,Survival,and Memory Responses During Influenza Infection.FrontImmunol 9:3043)。
71.Zelante T、Wong AY、Ping TJ、Chen J、Sumatoh HR、Vigano E、Hong Bing Y、Lee B、Zolezzi F、Fric J、Newell EW、Mortellaro A、Poidinger M、Puccetti P、Ricciardi-Castagnoli P，CD103(+)树突状细胞控制肺部中的Th17细胞功能，《细胞报道》12：1789-801(Zelante T,Wong AY,Ping TJ,Chen J,Sumatoh HR,Vigano E,Hong Bing Y,Lee B,Zolezzi F,Fric J,Newell EW,Mortellaro A,Poidinger M,Puccetti P,Ricciardi-Castagnoli P.2015.CD103(+)Dendritic Cells Control Th17 CellFunction in the Lung.Cell Rep 12:1789-801)。
72.Kaufmann E、Sanz J、Dunn JL、Khan N、Mendonca LE、Pacis A、Tzelepis F、Pernet E、Dumaine A、Grenier JC、Mailhot-Leonard F、Ahmed E、Belle J、Besla R、MazerB、King IL、Nijnik A、Robbins CS、Barreiro LB、Divangahi M，2018年，卡介苗培养造血干细胞产生针对肺结核的保护性先天免疫，《细胞》172：176-190e19(Kaufmann E,Sanz J,Dunn JL,Khan N,Mendonca LE,Pacis A,Tzelepis F,Pernet E,Dumaine A,Grenier JC,Mailhot-Leonard F,Ahmed E,Belle J,Besla R,Mazer B,King IL,Nijnik A,RobbinsCS,Barreiro LB,Divangahi M.2018.BCG Educates Hematopoietic Stem Cells toGenerate Protective Innate Immunity against Tuberculosis.Cell172:176-190e19)。
73.Kaufmann SH，2010年，未来肺结核疫苗接种策略：打破常规思考，《免疫》33：567-77(Kaufmann SH.2010.Future vaccination strategies against tuberculosis:thinking outside the box.Immunity 33:567-77)。
74.Jones GW、Hill DG、Jones SA，2016年，了解三级淋巴器官发育中的免疫细胞：全部开始汇集到一起，《免疫学前沿》7：401(Jones GW,Hill DG,JonesSA.2016.Understanding Immune Cells in Tertiary Lymphoid Organ Development:ItIs All Starting to Come Together.Front Immunol 7:401)。
75.Allix-Beguec C、Harmsen D、Weniger T、Supply P、Niemann S，2008年，MIRUVNTRplus的评估和使用策略，这是一个用于在线分析结核分枝杆菌复合物分离株的基因分型数据和系统发育鉴定的多功能数据库，《临床微生物学杂志》46：2692-9(Allix-BeguecC,Harmsen D,Weniger T,Supply P,Niemann S.2008.Evaluation and strategy for useof MIRU-VNTRplus,a multifunctional database for online analysis of genotypingdata and phylogenetic identification of Mycobacterium tuberculosis complexisolates.J Clin Microbiol 46:2692-9)。
76.Caton ML、Smith-Raska MR、Reizis B，2007年，Notch-RBP-J信号传导控制脾脏中CD8树突状细胞的稳态。《实验医学杂志》204：1653-64(Caton ML,Smith-Raska MR,Reizis B.2007.Notch-RBP-J signaling controls the homeostasis of CD8-dendriticcells in the spleen.J Exp Med 204:1653-64)。
77.Le Bon A、Thompson C、Kamphuis E、Durand V、Rossmann C、Kalinke U、ToughDF，2006年，前沿：通过I型IFN直接刺激B细胞和T细胞增强抗体应答，《免疫学杂志》176：2074-8(Le Bon A,Thompson C,Kamphuis E,Durand V,Rossmann C,Kalinke U,ToughDF.2006.Cutting edge:enhancement of antibody responses through directstimulation of B and T cells by type I IFN.J Immunol 176:2074-8)。
SEQUENCE LISTING
<110> 巴斯德研究所
赛拉福柯蒂斯公司
<120> 靶向MHC-II途径抗原并在宿主中诱导保护性CD8+和CD4+T细胞免疫的慢病毒载体
<130> B14370WO
<150> EP21305317.6
<151> 2021-03-12
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 617
<212> PRT
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cctagagagc cagagaggtg ctctcgcggc gccctgtaca ccggcgtgag cgtgctggtg 120
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ctggataagc tgaccatcac atcccagaat ctgcagctgg agtctctgcg catgaagctg 240
ccaaagtccg ccaagcccgt gtctcagatg aggatggcca cccctctgct gatgcgccca 300
atgtctatgg acaacatgct gctgggcccc gtgaagaacg tgaccaagta cggcaatatg 360
acacaggatc acgtgatgca cctgctgacc aggagcggac cactggagta tcctcagctg 420
aagggcacat ttcctgagaa cctgaagcac ctgaagaatt ctatggacgg cgtgaactgg 480
aagatcttcg agagctggat gaagcagtgg ctgctgtttg agatgagcaa gaattccctg 540
gaggagaaga agccaaccga ggcaccacct aaggagccac tggacatgga ggatctgagc 600
tccggcctgg gcgtgaccag gcaggagctg ggacaggtga cactgggagg aggcgacagc 660
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ggcacactgc agagcctggg agcagagatc gcagtggagc aggccgccct gcagtccgcc 780
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<211> 1911
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> li-HAEPA DNA序列
<400> 4
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<220>
<223> li-EsxH氨基酸序列
<400> 5
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile
1 5 10 15
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50 55 60
Thr Ile Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Met Lys Leu
65 70 75 80
Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Gln Met Arg Met Ala Thr Pro Leu
85 90 95
Leu Met Arg Pro Met Ser Met Asp Asn Met Leu Leu Gly Pro Val Lys
100 105 110
Asn Val Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Gln Asp His Val Met His Leu
115 120 125
Leu Thr Arg Ser Gly Pro Leu Glu Tyr Pro Gln Leu Lys Gly Thr Phe
130 135 140
Pro Glu Asn Leu Lys His Leu Lys Asn Ser Met Asp Gly Val Asn Trp
145 150 155 160
Lys Ile Phe Glu Ser Trp Met Lys Gln Trp Leu Leu Phe Glu Met Ser
165 170 175
Lys Asn Ser Leu Glu Glu Lys Lys Pro Thr Glu Ala Pro Pro Lys Glu
180 185 190
Pro Leu Asp Met Glu Asp Leu Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Arg Gln
195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
His Ala Met Ser Ser Thr His Glu Ala Asn Thr Met Ala Met Met Ala
290 295 300
Arg Asp Thr Ala Glu Ala Ala Lys Trp Gly Gly
305 310 315
<210> 6
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> li-EsxH DNA序列
<400> 6
atggatgacc aacgcgacct catctctaac catgagcaat tgcccatact gggcaaccgc 60
cctagagagc cagaaaggtg cagccgtgga gctctgtaca ccggtgtttc tgtcctggtg 120
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gaggagaaga agcccacaga ggctccacct aaagagccac tggacatgga agacctatct 600
tctggcctgg gagtgaccag gcaggaactg ggtcaagtca ccctgggagc tggagctatg 660
tcccagatta tgtacaacta tccagcaatg ttggggcatg ccggggatat ggccggctat 720
gcaggcaccc ttcaatccct gggagccgaa attgccgtag agcaggctgc ccttcagagt 780
gcatggcaag gcgatactgg tatcacatac caagcgtggc aggcacagtg gaatcaggca 840
atggaagatt tggtgcgagc ttatcatgcc atgagttcca cacacgaagc caacaccatg 900
gcgatgatgg ctagggatac cgccgaagct gccaagtggg gaggatga 948
<210> 7
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TfR1-118-EsxH氨基酸序列
<400> 7
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50 55 60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala Gly Ala Gly Ala Met Ser Gln Ile Met Tyr
115 120 125
Asn Tyr Pro Ala Met Leu Gly His Ala Gly Asp Met Ala Gly Tyr Ala
130 135 140
Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala Glu Ile Ala Val Glu Gln Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gln Ser Ala Trp Gln Gly Asp Thr Gly Ile Thr Tyr Gln Ala Trp
165 170 175
Gln Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met Glu Asp Leu Val Arg Ala Tyr His
180 185 190
Ala Met Ser Ser Thr His Glu Ala Asn Thr Met Ala Met Met Ala Arg
195 200 205
Asp Thr Ala Glu Ala Ala Lys Trp Gly Gly
210 215
<210> 8
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TfR1-118-EsxH DNA序列
<400> 8
atgatggatc aagctagatc agcattctct aacttgtttg gtggagaacc attgtcatat 60
acccggttca gcctggctcg gcaagtagat ggcgataaca gtcatgtgga gatgaaactt 120
gctgtagatg aagaagaaaa tgctgacaat aacacaaagg ccaatgtcac aaaaccaaaa 180
aggtgtagtg gaagtatctg ctatgggact attgctgtga tcgtcttttt cttgattgga 240
tttatgattg gctacttggg ctattgtaaa ggggtagaac caaaaactga gtgtgagaga 300
ctggcaggaa ccgagtctcc agtgagggag gagccaggag aggacttccc tgcaggagct 360
ggagctatgt cccagattat gtacaactat ccagcaatgt tggggcatgc cggggatatg 420
gccggctatg caggcaccct tcaatccctg ggagccgaaa ttgccgtaga gcaggctgcc 480
cttcagagtg catggcaagg cgatactggt atcacatacc aagcgtggca ggcacagtgg 540
aatcaggcaa tggaagattt ggtgcgagct tatcatgcca tgagttccac acacgaagcc 600
aacaccatgg cgatgatggc tagggatacc gccgaagctg ccaagtgggg aggatga 657
<210> 9
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SP-EsxH-MITD氨基酸序列
<400> 9
Met Ala Arg Val Thr Ala Pro Arg Thr Val Leu Leu Leu Leu Ser Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Met Ser Gln Ile Met Tyr Asn
20 25 30
Tyr Pro Ala Met Leu Gly His Ala Gly Asp Met Ala Gly Tyr Ala Gly
35 40 45
Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala Glu Ile Ala Val Glu Gln Ala Ala Leu
50 55 60
Gln Ser Ala Trp Gln Gly Asp Thr Gly Ile Thr Tyr Gln Ala Trp Gln
65 70 75 80
Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met Glu Asp Leu Val Arg Ala Tyr His Ala
85 90 95
Met Ser Ser Thr His Glu Ala Asn Thr Met Ala Met Met Ala Arg Asp
100 105 110
Thr Ala Glu Ala Ala Lys Trp Gly Gly Val Gly Ile Val Ala Gly Leu
115 120 125
Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Thr Val Met
130 135 140
Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala
145 150 155 160
Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala
165 170 175
<210> 10
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SP-EsxH-MITD DNA序列
<400> 10
atggctcggg tcacggcgcc ccgaaccgtc ctcctgctgc tctcgggagc cctggccctg 60
accgagacct gggccatgtc ccagattatg tacaactatc cagcaatgtt ggggcatgcc 120
ggggatatgg ccggctatgc aggcaccctt caatccctgg gagccgaaat tgccgtagag 180
caggctgccc ttcagagtgc atggcaaggc gatactggta tcacatacca agcgtggcag 240
gcacagtgga atcaggcaat ggaagatttg gtgcgagctt atcatgccat gagttccaca 300
cacgaagcca acaccatggc gatgatggct agggataccg ccgaagctgc caagtgggga 360
ggagtgggca ttgttgctgg cctggctgtc ctagcagttg tggtcatcgg agctgtggtc 420
gctactgtga tgtgtaggag gaagagctca ggtggaaaag gagggagcta ctctcaggct 480
gcgtccagcg acagtgccca gggctctgat gtgtctctca cagcttga 528
<210> 11
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val
1 5 10 15
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met
20 25 30
Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala
35 40 45
Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln
50 55 60
Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys
65 70 75 80
Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys
85 90 95
Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro
100 105 110
Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met
115 120 125
Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His
130 135 140
Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly
145 150 155 160
Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile
165 170 175
Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu
180 185 190
Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys
195 200 205
Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys
210 215 220
Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met
225 230
<210> 12
<211> 699
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
atgcacagga ggagaagcag gagctgtcgg gaagatcaga agccagtcat ggatgaccag 60
cgcgacctta tctccaacaa tgagcaactg cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg 120
gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac acaggctttt ccatcctggt gactctgctc 180
ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa 240
ctgacagtca cctcccagaa cctgcagctg gagaacctgc gcatgaagct tcccaagcct 300
cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg 360
ggagccctgc cccaggggcc catgcagaat gccaccaagt atggcaacat gacagaggac 420
catgtgatgc acctgctcca gaatgctgac cccctgaagg tgtacccgcc actgaagggg 480
agcttcccgg agaacctgag acaccttaag aacaccatgg agaccataga ctggaaggtc 540
tttgagagct ggatgcacca ttggctcctg tttgaaatga gcaggcactc cttggagcaa 600
aagcccactg acgctccacc gaaagagtca ctggaactgg aggacccgtc ttctgggctg 660
ggtgtgacca agcaggatct gggcccagtc cccatgtga 699
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50 55 60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala
115
<210> 14
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
atgatggatc aagctagatc agcattctct aacttgtttg gtggagaacc attgtcatat 60
acccggttca gcctggctcg gcaagtagat ggcgataaca gtcatgtgga gatgaaactt 120
gctgtagatg aagaagaaaa tgctgacaat aacacaaagg ccaatgtcac aaaaccaaaa 180
aggtgtagtg gaagtatctg ctatgggact attgctgtga tcgtcttttt cttgattgga 240
tttatgattg gctacttggg ctattgtaaa ggggtagaac caaaaactga gtgtgagaga 300
ctggcaggaa ccgagtctcc agtgagggag gagccaggag aggacttccc tgca 354
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）
<400> 15
Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu
1 5
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）
<400> 16
Ser Thr His Glu Ala Asn Thr Met Ala Met Met Ala Arg Asp Thr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）
<400> 17
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly
20
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）
<400> 18
Met Ser Phe Val Thr Thr Gln Pro Glu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Asn Leu
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）
<400> 19
Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe
1 5 10 15
Pro Asp Ser Gly
20
<210> 20
<211> 7129
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pFlap-SP1b2m-GFP-WPREm
<220>
<221> misc_feature
<222> (3195)..(3200)
<223> BamHI
<220>
<221> misc_feature
<222> (3953)..(3958)
<223> XhoI
<400> 20
ggcgttggga gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg 60
aatagctcag aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 120
tggggcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc 180
gggactatgg ttgctgacta attgagatgc ccgacattga ttattgacta gttggaaggg 240
ctaattcact cccaaagaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc 300
tacttccctg attagcagaa ctacacacca gggccagggg tcagatatcc actgaccttt 360
ggatggtgct acaagctagt accagttgag ccagataagg tagaagaggc caataaagga 420
gagaacacca gcttgttaca ccctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa 480
gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acgtggcccg agagctgcat 540
ccggagtact tcaagaactg ctgatatcga gcttgctaca agggactttc cgctggggac 600
tttccaggga ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag atcctgcata 660
taagcagctg ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga 720
gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct 780
tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt 840
ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg 900
aaaccagagg agctctctcg acgcaggact cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc 960
gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga 1020
gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt 1080
cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg 1140
gagctagaac gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa 1200
atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag aagaacttag atcattatat 1260
aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag agataaaaga caccaaggaa 1320
gctttagaca agatagagga agagcaaaac aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc 1380
gctgatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa 1440
atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt 1500
ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc 1560
agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt 1620
gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc aacagcatct 1680
gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag 1740
atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac 1800
cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct ctggaacaga tttggaatca 1860
cacgacctgg atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt 1920
aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa 1980
atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt 2040
cataatgata gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt 2100
gaatagagtt aggcagggat attcaccatt atcgtttcag acccacctcc caaccccgag 2160
gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc 2220
cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta tcgccgaatt cacaaatggc agtattcatc 2280
cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac 2340
ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat 2400
tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccacggcgcg cccttacggt aaatggcccg 2460
cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 2520
gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 2580
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 2640
ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacggaaacc ctgcagggaa ttccccagct 2700
gtagttataa acagaagttc tccttctgct aggtagcatt caaagatctt aatcttctgg 2760
gtttccgttt tctcgaatga aaaatgcagg tccgagcagt taactggcgg gggcaccatt 2820
agcaagtcac ttagcatctc tggggccagt ctgcaaagcg agggggcagc cttaatgtgc 2880
ctccagcctg aagtcctaga atgagcgccc ggtgtcccaa gctggggcgc gcaccccaga 2940
tcggagggcg ccgatgtaca gacagcaaac tcacccagtc tagtgcatgc cttcttaaac 3000
atcacgagac tctaagaaaa ggaaactgaa aacgggaaag tccctctctc taacctggca 3060
ctgcgtcgct ggcttggaga caggtgacgg tccctgcggg ccttgtcctg attggctggg 3120
cacgcgttta atataagtgg aggcgtcgcg ctggcgggca ttcctgaagc tgacagcatt 3180
cgggccgagc gatcggatcc ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt 3240
tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 3300
gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 3360
gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 3420
tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 3480
tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 3540
cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 3600
tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc 3660
acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 3720
gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 3780
tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 3840
gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 3900
ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaaagcgg ccgcgactct agctcgagaa 3960
ttcccgataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact 4020
atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg 4080
cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg 4140
aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa 4200
cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc 4260
ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg 4320
ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccgc 4380
ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt 4440
cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc 4500
cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcggt 4560
acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa 4620
ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa aatcgtcgag agatgctgca 4680
tataagcagc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg 4740
gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg 4800
cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc 4860
ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 4920
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 4980
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 5040
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 5100
gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctact 5160
gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg 5220
ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca 5280
ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 5340
gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 5400
aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 5460
ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 5520
ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 5580
aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 5640
accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 5700
ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 5760
ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 5820
cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 5880
tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 5940
tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 6000
gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 6060
tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa 6120
ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt 6180
cacaccgcat caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 6240
ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 6300
taatagcacg tgctaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 6360
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 6420
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 6480
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 6540
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 6600
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 6660
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 6720
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 6780
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 6840
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 6900
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 6960
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 7020
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 7080
tttgctcaca tgttcttgct gcttcgcgat gtacgggcca gatatacgc 7129
<210> 21
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SP1-beta2微球蛋白启动子（microglobulin promoter）
<400> 21
cggccgccag tgtgctggaa ttcgcccttg gcgcgccctt acggtaaatg gcccgcctgg 60
ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 120
gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 180
ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 240
atggcccgcc tggcattatg cccagtacgg aaaccctgca gggaattccc cagctgtagt 300
tataaacaga agttctcctt ctgctaggta gcattcaaag atcttaatct tctgggtttc 360
cgttttctcg aatgaaaaat gcaggtccga gcagttaact ggcgggggca ccattagcaa 420
gtcacttagc atctctgggg ccagtctgca aagcgagggg gcagccttaa tgtgcctcca 480
gcctgaagtc ctagaatgag cgcccggtgt cccaagctgg ggcgcgcacc ccagatcgga 540
gggcgccgat gtacagacag caaactcacc cagtctagtg catgccttct taaacatcac 600
gagactctaa gaaaaggaaa ctgaaaacgg gaaagtccct ctctctaacc tggcactgcg 660
tcgctggctt ggagacaggt gacggtccct gcgggccttg tcctgattgg ctgggcacgc 720
gtttaatata agtggaggcg tcgcgctggc gggcattcct gaagctgaca gcattcgggc 780
cgagcgatcg gatccgccac 800
<210> 22
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCUAG启动子
<400> 22
gatctgttaa cttccccgaa gtagcaatgt atttcccaga aaaggaataa tccttctggg 60
aattctggcg aggtttccgg gaaagcagca ccgcccttgg ccgtcctgcc aatttcactt 120
tctagtttca ctttcccttt tgtaactaaa atgtaaatga cataggaaaa ctgaaaggga 180
gaagtgaaag tgggaaattc ctctgcatgc cttcttaaac atcacgagac tctaagaaaa 240
ggaaactgaa aacgggaaag tccctctctc taacctggca ctgcgtcgct ggcttggaga 300
caggtgacgg tccctgcggg ccttgtcctg attggctggg cacgcgttta atataagtgg 360
aggcgtcgcg ctggcgggca ttcctgaagc tgacagcatt cgggccgagt aacaactccg 420
ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata a 471
<210> 23
<211> 605
<212> DNA
<213> 土拨鼠肝炎病毒( woodchuck hepatitis virus)
<400> 23
aattcccgat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 60
ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 120
tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta 180
tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc 240
aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt 300
ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 360
ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc 420
gcggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 480
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 540
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca 600
tcggg 605
<210> 24
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人li - EsxH
<400> 24
Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val
1 5 10 15
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met
20 25 30
Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala
35 40 45
Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln
50 55 60
Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys
65 70 75 80
Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys
85 90 95
Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro
100 105 110
Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met
115 120 125
Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His
130 135 140
Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly
145 150 155 160
Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile
165 170 175
Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu
180 185 190
Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys
195 200 205
Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys
210 215 220
Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met Gly Ala Gly Ala Met Ser Gln Ile
225 230 235 240
Met Tyr Asn Tyr Pro Ala Met Leu Gly His Ala Gly Asp Met Ala Gly
245 250 255
Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala Glu Ile Ala Val Glu Gln
260 265 270
Ala Ala Leu Gln Ser Ala Trp Gln Gly Asp Thr Gly Ile Thr Tyr Gln
275 280 285
Ala Trp Gln Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met Glu Asp Leu Val Arg Ala
290 295 300
Tyr His Ala Met Ser Ser Thr His Glu Ala Asn Thr Met Ala Met Met
305 310 315 320
Ala Arg Asp Thr Ala Glu Ala Ala Lys Trp Gly Gly
325 330
<210> 25
<211> 7408
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pFlap-SP1b2m-hli-EsxH-WPREm
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(164)
<223> SV40 ORI
<220>
<221> misc_feature
<222> (233)..(868)
<223> HIV1-5LTR
<220>
<221> misc_feature
<222> (870)..(1086)
<223> HIV-1 psi
<220>
<221> misc_feature
<222> (1533)..(1766)
<223> RRE
<220>
<221> misc_feature
<222> (2288)..(2411)
<223> cPPT-CTS
<220>
<221> misc_feature
<222> (2461)..(2691)
<223> SP1
<220>
<221> misc_feature
<222> (2693)..(3208)
<223> b2m-启动子
<220>
<221> misc_feature
<222> (3213)..(3218)
<223> BamHI
<220>
<221> misc_feature
<222> (3225)..(3920)
<223> 人li
<220>
<221> misc_feature
<222> (3933)..(4223)
<223> EsxH
<220>
<221> misc_feature
<222> (4224)..(4229)
<223> XhoI
<220>
<221> misc_feature
<222> (4230)..(4834)
<223> WPRE-突变的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4904)..(5165)
<223> LTR截短的
<220>
<221> misc_feature
<222> (5202)..(5429)
<223> bGH PolyA
<220>
<221> misc_feature
<222> (5605)..(6396)
<223> Kan/neoR
<220>
<221> misc_feature
<222> (6700)..(7328)
<223> ColE1 原点
<400> 25
cgcgttggga gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg 60
aatagctcag aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 120
tggggcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc 180
gggactatgg ttgctgacta attgagatgc ccgacattga ttattgacta gttggaaggg 240
ctaattcact cccaacgaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc 300
tacttccctg attagcagaa ctacacacca gggccaggga tcagatatcc actgaccttt 360
ggatggtgct acaagctagt accagttgag ccagagaagt tagaagaagc caacaaagga 420
gagaacacca gcttgttaca acctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa 480
gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acggtggccc gagagctgca 540
tccggagtac ttcaagaact gctgatatcg agcttgctac aagggacttt ccgctggggg 600
actttccagg gaggcgtggc ctgggcggga ctggggagtg gcgagccctc agatcctgca 660
tataagcagc tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg 720
gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg 780
cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc 840
ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag 900
ggaaaccaga ggagctctct cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag 960
gcgaggggcg gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga 1020
gagatgggtg cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa 1080
ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca 1140
gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac 1200
aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat 1260
ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg 1320
aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg 1380
ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat 1440
aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga 1500
gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga 1560
gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta 1620
ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat 1680
ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa 1740
agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc 1800
accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat 1860
cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc 1920
ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat 1980
aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta 2040
ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata 2100
gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg 2160
aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga 2220
tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccgaa ttcacaaatg gcagtattca 2280
tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag 2340
acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa 2400
attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccactttg gctgatacgc gtggagttcc 2460
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 2520
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 2580
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 2640
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta cggaaaccct 2700
gcagggaatt ccccagctgt agttataaac agaagttctc cttctgctag gtagcattca 2760
aagatcttaa tcttctgggt ttccgttttc tcgaatgaaa aatgcaggtc cgagcagtta 2820
actggcgggg gcaccattag caagtcactt agcatctctg gggccagtct gcaaagcgag 2880
ggggcagcct taatgtgcct ccagcctgaa gtcctagaat gagcgcccgg tgtcccaagc 2940
tggggcgcgc accccagatc ggagggcgcc gatgtacaga cagcaaactc acccagtcta 3000
gtgcatgcct tcttaaacat cacgagactc taagaaaagg aaactgaaaa cgggaaagtc 3060
cctctctcta acctggcact gcgtcgctgg cttggagaca ggtgacggtc cctgcgggcc 3120
ttgtcctgat tggctgggca cgcgtttaat ataagtggag gcgtcgcgct ggcgggcatt 3180
cctgaagctg acagcattcg ggccgagcga tcggatccgc caccatgcac aggaggagaa 3240
gcaggagctg tcgggaagat cagaagccag tcatggatga ccagcgcgac cttatctcca 3300
acaatgagca actgcccatg ctgggccggc gccctggggc cccggagagc aagtgcagcc 3360
gcggagccct gtacacaggc ttttccatcc tggtgactct gctcctcgct ggccaggcca 3420
ccaccgccta cttcctgtac cagcagcagg gccggctgga caaactgaca gtcacctccc 3480
agaacctgca gctggagaac ctgcgcatga agcttcccaa gcctcccaag cctgtgagca 3540
agatgcgcat ggccaccccg ctgctgatgc aggcgctgcc catgggagcc ctgccccagg 3600
ggcccatgca gaatgccacc aagtatggca acatgacaga ggaccatgtg atgcacctgc 3660
tccagaatgc tgaccccctg aaggtgtacc cgccactgaa ggggagcttc ccggagaacc 3720
tgagacacct taagaacacc atggagacca tagactggaa ggtctttgag agctggatgc 3780
accattggct cctgtttgaa atgagcaggc actccttgga gcaaaagccc actgacgctc 3840
caccgaaaga gtcactggaa ctggaggacc cgtcttctgg gctgggtgtg accaagcagg 3900
atctgggccc agtccccatg ggagctggag ctatgtccca gattatgtac aactatccag 3960
caatgttggg gcatgccggg gatatggccg gctatgcagg cacccttcaa tccctgggag 4020
ccgaaattgc cgtagagcag gctgcccttc agagtgcatg gcaaggcgat actggtatca 4080
cataccaagc gtggcaggca cagtggaatc aggcaatgga agatttggtg cgagcttatc 4140
atgccatgag ttccacacac gaagccaaca ccatggcgat gatggctagg gataccgccg 4200
aagctgccaa gtggggagga tgactcgaga attcccgata atcaacctct ggattacaaa 4260
atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac 4320
gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc 4380
ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt 4440
ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc 4500
tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc 4560
gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg 4620
gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttccg cggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt 4680
ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc 4740
cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt 4800
cggatctccc tttgggccgc ctccccgcat cgggggtacc tttaagacca atgacttaca 4860
aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc 4920
actcccaacg aagacaagat cgtcgagaga tgctgcatat aagcagctgc tttttgcttg 4980
tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa 5040
cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct 5100
gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc 5160
tagcagttct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 5220
ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 5280
cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 5340
tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 5400
gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctactggg cggttttatg gacagcaagc 5460
gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac 5520
tggatggctt tctcgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagctc tgatcaagag 5580
acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc 5640
gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat 5700
gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg 5760
tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg 5820
ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta 5880
ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta 5940
tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc 6000
gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc 6060
gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg 6120
ctcaaggcga gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg 6180
ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt 6240
gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc 6300
ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc 6360
atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgaatta ttaacgctta caatttcctg 6420
atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcataca ggtggcactt 6480
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 6540
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atagcacgtg ctaaaacttc 6600
atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 6660
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 6720
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 6780
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 6840
tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 6900
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 6960
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 7020
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 7080
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 7140
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 7200
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 7260
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 7320
acgcggcctt tttacggttc ctgggctttt gctggccttt tgctcacatg ttcttgactc 7380
ttcgcgatgt acgggccaga tatacgcg 7408
<210> 26
<211> 7063
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pFlap-SP1b2m-hTfR-EsxH-WPREm
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(164)
<223> SV40 ORI
<220>
<221> misc_feature
<222> (233)..(868)
<223> HIV1-5LTR
<220>
<221> misc_feature
<222> (870)..(1086)
<223> HIV-1 psi
<220>
<221> misc_feature
<222> (1533)..(1766)
<223> RRE
<220>
<221> misc_feature
<222> (2288)..(2411)
<223> cPPT-CTS
<220>
<221> misc_feature
<222> (2461)..(2691)
<223> SP1
<220>
<221> misc_feature
<222> (2693)..(3208)
<223> b2m-启动子
<220>
<221> misc_feature
<222> (3213)..(3218)
<223> BamHI
<220>
<221> misc_feature
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<223> hTfR
<220>
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<222> (3588)..(3878)
<223> EsxH
<220>
<221> misc_feature
<222> (3879)..(3884)
<223> XhoI
<220>
<221> misc_feature
<222> (3885)..(4489)
<223> WPRE-变异的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4559)..(4820)
<223> LTR截短的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4857)..(5084)
<223> bGH PolyA
<220>
<221> misc_feature
<222> (5260)..(6051)
<223> Kan/neoR
<220>
<221> misc_feature
<222> (6355)..(6983)
<223> ColE1 原点
<400> 26
cgcgttggga gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg 60
aatagctcag aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 120
tggggcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc 180
gggactatgg ttgctgacta attgagatgc ccgacattga ttattgacta gttggaaggg 240
ctaattcact cccaacgaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc 300
tacttccctg attagcagaa ctacacacca gggccaggga tcagatatcc actgaccttt 360
ggatggtgct acaagctagt accagttgag ccagagaagt tagaagaagc caacaaagga 420
gagaacacca gcttgttaca acctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa 480
gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acggtggccc gagagctgca 540
tccggagtac ttcaagaact gctgatatcg agcttgctac aagggacttt ccgctggggg 600
actttccagg gaggcgtggc ctgggcggga ctggggagtg gcgagccctc agatcctgca 660
tataagcagc tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg 720
gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg 780
cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc 840
ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag 900
ggaaaccaga ggagctctct cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag 960
gcgaggggcg gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga 1020
gagatgggtg cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa 1080
ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca 1140
gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac 1200
aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat 1260
ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg 1320
aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg 1380
ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat 1440
aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga 1500
gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga 1560
gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta 1620
ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat 1680
ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa 1740
agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc 1800
accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat 1860
cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc 1920
ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat 1980
aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta 2040
ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata 2100
gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg 2160
aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga 2220
tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccgaa ttcacaaatg gcagtattca 2280
tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag 2340
acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa 2400
attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccactttg gctgatacgc gtggagttcc 2460
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 2520
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 2580
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 2640
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta cggaaaccct 2700
gcagggaatt ccccagctgt agttataaac agaagttctc cttctgctag gtagcattca 2760
aagatcttaa tcttctgggt ttccgttttc tcgaatgaaa aatgcaggtc cgagcagtta 2820
actggcgggg gcaccattag caagtcactt agcatctctg gggccagtct gcaaagcgag 2880
ggggcagcct taatgtgcct ccagcctgaa gtcctagaat gagcgcccgg tgtcccaagc 2940
tggggcgcgc accccagatc ggagggcgcc gatgtacaga cagcaaactc acccagtcta 3000
gtgcatgcct tcttaaacat cacgagactc taagaaaagg aaactgaaaa cgggaaagtc 3060
cctctctcta acctggcact gcgtcgctgg cttggagaca ggtgacggtc cctgcgggcc 3120
ttgtcctgat tggctgggca cgcgtttaat ataagtggag gcgtcgcgct ggcgggcatt 3180
cctgaagctg acagcattcg ggccgagcga tcggatccgc caccatggat caagctagat 3240
cagcattctc taacttgttt ggtggagaac cattgtcata tacccggttc agcctggctc 3300
ggcaagtaga tggcgataac agtcatgtgg agatgaaact tgctgtagat gaagaagaaa 3360
atgctgacaa taacacaaag gccaatgtca caaaaccaaa aaggtgtagt ggaagtatct 3420
gctatgggac tattgctgtg atcgtctttt tcttgattgg atttatgatt ggctacttgg 3480
gctattgtaa aggggtagaa ccaaaaactg agtgtgagag actggcagga accgagtctc 3540
cagtgaggga ggagccagga gaggacttcc ctgcaggagc tggagctatg tcccagatta 3600
tgtacaacta tccagcaatg ttggggcatg ccggggatat ggccggctat gcaggcaccc 3660
ttcaatccct gggagccgaa attgccgtag agcaggctgc ccttcagagt gcatggcaag 3720
gcgatactgg tatcacatac caagcgtggc aggcacagtg gaatcaggca atggaagatt 3780
tggtgcgagc ttatcatgcc atgagttcca cacacgaagc caacaccatg gcgatgatgg 3840
ctagggatac cgccgaagct gccaagtggg gaggatgact cgagaattcc cgataatcaa 3900
cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt 3960
acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct 4020
ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc 4080
gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg 4140
ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc 4200
acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 4260
actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccgcggct gctcgcctgt 4320
gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca 4380
gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt 4440
cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgggg gtacctttaa 4500
gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac 4560
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatcgtcg agagatgctg catataagca 4620
gctgcttttt gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc 4680
tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt 4740
agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc 4800
agtgtggaaa atctctagca gttctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac 4860
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 4920
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 4980
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 5040
ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttcta ctgggcggtt 5100
ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 5160
ccctgcaaag taaactggat ggctttctcg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 5220
agctctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 5280
gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 5340
atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 5400
gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcaag acgaggcagc gcggctatcg 5460
tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 5520
agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 5580
cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 5640
gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 5700
gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 5760
gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 5820
ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 5880
tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 5940
gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 6000
cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aattattaac 6060
gcttacaatt tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 6120
atacaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 6180
tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatagc 6240
acgtgctaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 6300
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 6360
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 6420
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 6480
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 6540
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 6600
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 6660
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 6720
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 6780
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 6840
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 6900
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 6960
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggg cttttgctgg ccttttgctc 7020
acatgttctt gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcg 7063
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头（linker）
<400> 27
Gly Gly Gly Asp
1
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头（linker）
<400> 28
Asn Asn Gly Gly
1
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头（linker）
<400> 29
Asn Asn Asp Asp
1
<210> 30
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 绿色荧光蛋白(GFP)基因的核苷酸序列
(密码子优化的)
<400> 30
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 31
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 绿色荧光蛋白(GFP)基因的氨基酸序列
<400> 31
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235

Claims (16)

1.一种重组慢病毒载体基因组，其包含编码融合多肽的多核苷酸，其中所述融合多肽包含从N末端至C末端排列的：
-第一多肽，其包含(i)MHC-II相关的轻恒定链(li)，优选SEQ ID No.11，或(ii)转铁蛋白受体(TfR)的跨膜结构域，优选SEQ ID No.13，和
-病原体的至少一种抗原多肽。
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述抗原多肽是包含病原体的一种抗原或其免疫原性片段的单抗原多肽，或者是包含一种或多种病原体的至少两种抗原或其免疫原性片段的多抗原多肽。
3.根据权利要求1或2所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述病原体是细菌、寄生虫或病毒病原体，特别是与哺乳动物中的急性或慢性呼吸道传染病相关的病原体，更特别是结核分枝杆菌、流感病毒或冠状病毒例如SARS-CoV-2。
4.根据权利要求3所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述抗原多肽包含一种或多种选自EsxA、EspC、EsxH、PE19或Ag85A的结核分枝杆菌(Mtb)抗原，或其免疫原性片段，特别是以下Mtb抗原组合之一：
(a)EsxH；
(b)EsxH和EsxA；
(c)EsxH、EsxA和PE19；
(d)EsxH、EsxA、EspC和PE19；
(e)EsxH、EsxA、EspC、PE19和Ag85A；
或其免疫原性片段。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述基因组获自pFLAP载体质粒，特别是核苷酸序列SEQ ID No.20的载体质粒，其中所述编码融合多肽的多核苷酸已经在哺乳动物细胞中有功能的启动子的控制下克隆，所述有功能的启动子特别是CMV启动子、人β-2微球蛋白启动子、SEQ ID No.21的SP1-人β-2微球蛋白启动子或SEQIDNo.22的复合BCUAG启动子，并且其中所述载体任选地包含土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调控元件，特别是如SEQ ID No.23中所示的突变体WPRE。
6.一种DNA质粒，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，特别地，其中所述基因组被插入pFLAP载体质粒内，优选核苷酸序列SEQ ID No.20的载体质粒内，其中所述由包含在重组慢病毒载体基因组内的多核苷酸编码的融合多肽被插入限制性位点BamHI和XhoI之间以取代GFP序列。
7.一种重组慢病毒载体颗粒，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的重组慢病毒载体基因组。
8.根据权利要求7所述的重组慢病毒载体颗粒，其是重组整合缺陷型慢病毒载体颗粒，特别地，其中所述重组整合缺陷型慢病毒载体颗粒是基于HIV-1的载体颗粒，并且由于慢病毒基因组中以整合酶不表达或功能性不表达的方式编码的整合酶基因的突变而导致整合酶缺陷，特别地，所述整合酶基因中的突变导致在其氨基酸残基64上所置换的整合酶的表达，特别地，所述置换是由Pol编码的HIV-1整合酶的催化结构域中的D64V。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的重组慢病毒载体颗粒，其中所述重组慢病毒载体颗粒是重组无复制能力的假型慢病毒载体颗粒，特别是无复制能力的假型HIV-1慢病毒载体颗粒，特别地，其中所述慢病毒载体颗粒是用来自印第安纳或新泽西血清型的水泡性口炎病毒(V-SVG)的糖蛋白G假型化的。
10.一种宿主细胞、优选哺乳动物宿主细胞，其用根据权利要求6所述的DNA质粒进行转染，特别地，其中所述宿主细胞是HEK-293T细胞系或K562细胞系。
11.一种适于施用给哺乳动物宿主的药物组合物、特别是疫苗组合物，其包含根据权利要求7至9中任一项所述的重组慢病毒载体颗粒以及一种或多种适于施用给需要其的宿主、特别是人类宿主的药学上可接受的赋形剂。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其还包含佐剂，特别是pro-Th1和/或pro-Th17佐剂，例如聚肌胞苷酸(polyI:C)或其衍生物，或环状二核苷酸佐剂，特别是环状鸟嘌呤-腺嘌呤二核苷酸(cGAMP)。
13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其用于通过在需要其的宿主、特别是人类宿主中引发针对抗原多肽或其免疫原性片段的抗体来引发保护性、优选预防性的免疫应答。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述免疫应答涉及通过抗原呈递细胞、特别是树突状细胞诱导所述抗原多肽或其免疫原性片段的MHC-I限制性呈递和MHC-II限制性呈递，以及诱导CD4-和CD8-介导的细胞免疫应答。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗需要其的哺乳动物宿主、特别是人类宿主中的病原体感染，特别是与哺乳动物中与急性或慢性呼吸道传染病相关的病原体感染。
16.一种用于制备适于制备药物组合物、特别是疫苗组合物的重组慢病毒载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在宿主细胞、例如HEK-293T细胞系或K562细胞系中转染携带根据权利要求1至5中任一项所述的包含编码融合多肽的多核苷酸的慢病毒载体基因组或根据权利要求6所述的DNA质粒的重组慢病毒转移载体；
b)用以下物质共转染步骤a)的细胞：(i)编码包膜蛋白的质粒载体，并用编码所述慢病毒GAG和POL或突变POL蛋白的质粒载体作为包装构建体；和(ii)编码VSV-G印第安纳或新泽西包膜的质粒，
c)在适于产生表达所述融合多肽的重组慢病毒载体颗粒的条件下，培养所述宿主细胞；
d)回收表达所述融合多肽的所述重组慢病毒颗粒。
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