CN111936513A - 用于抗呼吸道合胞病毒的核酸抗体构筑体 - Google Patents

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卡尔·穆苏马尼
陈静
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Wistar Institute of Anatomy and Biology
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Abstract

本文公开一种包括编码针对呼吸道合胞病毒抗原的抗体的重组核酸序列的组合物。本文还公开一种通过向个体施用所述组合物在所述个体中生成合成抗体的方法。本公开还提供一种使用所述组合物和生成方法预防和/或治疗个体的呼吸道合胞病毒感染的方法。

Description

用于抗呼吸道合胞病毒的核酸抗体构筑体
技术领域
本发明涉及一种组合物，其包含用于在体内生成一种或多种合成抗体和其功能片段的重组核酸序列；和一种通过施用所述组合物预防和/或治疗个体的病毒感染的方法。
相关申请的引证
本申请享有2018年1月31日提交的美国临时申请第62/624,320号和2018年10月23日提交的美国临时申请第62/749,580号的优先权，所述申请中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial virus；RSV)对幼儿和老年人的健康构成重大威胁，并且涉及下呼吸道感染的并发症可导致住院，且一些患者可能会死于疾病。几乎全部人群在生命最初几年感染有所述病毒，但在许多情况下免疫既不保持也不完全保护免受后续感染。尽管仍未满足对疫苗的需要，但用免疫预防抗RSV-F抗体(帕利珠单抗(Pavilizumab))被动免疫接种已成功地使易染病患者减少住院。然而，这一单克隆抗体(mAb)的使用限于高资源背景，并且全球有风险人群中的大部分无法获得。
尽管mAb已展示可有效提供针对许多感染性疾病的防护，但其广泛使用受到限制。有限体内半衰期意味着需要多次剂量来维持免疫，并且开发、制造和分销中所涉及的高成本和复杂性也阻碍其全球使用。作为回应，正在开发基于抗体基因体内递送的新策略。一个此类平台是dMAb，通过体内电基因转移(electrogenetransfer)递送并且利用身体自有的肌肉细胞生成且分泌蛋白质免疫球蛋白的合成DNA编码mAb。不同于基于蛋白质的药物，质粒DNA的制造很便宜，并且归因于其温度稳定性，其将不需要冷链，这使得其对于全球分销来说很理想。在原理论证研究中，这一平台在临床前动物模型中提供针对各种感染性疾病，包括流感、假单胞菌(pseudomonas)和埃博拉(Ebola)的防护。
因此，所属领域中需要预防和/或治疗RSV感染的改良治疗剂。本发明满足这一需要。
发明内容
本发明涉及一种编码一种或多种合成抗体的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自由以下组成的组的至少一种：a)编码抗呼吸道合胞病毒(RSV)合成抗体的核苷酸序列；b)编码抗RSV合成抗体的片段的核苷酸序列；c)编码ScFv抗RSV合成抗体的核苷酸序列；以及d)编码ScFv抗RSV合成抗体的片段的核苷酸序列。在一个实施例中，本发明涉及一种编码ScFv抗RSV DMAb或其片段或变异体的核酸分子。在一个实施例中，本发明涉及一种编码抗RSV抗体或其片段或变异体的核酸分子。
在一个实施例中，合成抗体结合到RSV抗原。在一个实施例中，合成抗体结合到一种或多种选自以下的RSV抗原：RSV-F、RSV-G、RSV-Ga、RSV-Gb、RSV-M2-1、RSV M2-2以及其任何组合。
在一个实施例中，核酸分子包含编码裂解结构域的核苷酸序列。
在一个实施例中，核酸分子包含核苷酸序列，其编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列；或与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段：SEQID NO:7和SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列。在一个实施例中，核酸分子包含与SEQ ID NO:1-6至少90％同源的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1-6至少90％同源的核苷酸序列的片段。
在一个实施例中，核苷酸序列编码前导序列。
在一个实施例中，核酸分子包含表达载体。
在一个实施例中，本发明提供一种包含本发明的核酸分子的组合物。在一个实施例中，组合物包含药学上可接受的赋形剂。在一个实施例中，组合物包含透明质酸酶。
在一个实施例中，本发明提供一种抗RSV单克隆抗体。在一个实施例中，抗RSV单克隆抗体包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列；或与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明提供一种包含本发明的核酸分子的配制物。在一个实施例中，配制物包含透明质酸酶。
在一个实施例中，本发明提供一种预防或治疗个体的疾病的方法。在一个实施例中，所述方法包含向个体施用核酸分子、组合物、配制物或抗RSV单克隆抗体。在一个实施例中，疾病是呼吸道合胞病毒感染。
附图说明
图1包含图1A到图1D，描绘sc-Fv-Fc RSV-FdMAb构筑体的设计和试管内测试：图1A描绘人IgG1和scFv-Fc形式的图示。scFv-Fc形式中保留分子的完整铰链和Fc部分。图1B描绘RSV-F dMAb的质粒图谱。图1C描绘RSV-F dMAb的试管内表达。在转染后3天对293T细胞执行免疫荧光染色(DAPI-蓝色，RSV-F dMAb-红色)。图1C描绘3天后收集的经RSV-F dMAb试管内转染的HEK293T细胞的细胞培养上清液的蛋白质印迹分析(泳道1：IgG-RSV dMAb，泳道2：sc-Fv-Fc RSV-F dMAb)。
图2包含图2A到图2C，描绘RSV-F dMAb体内递送平台。图2A描绘体内电穿孔有助于将dMAb递送到肌肉组织，肌细胞表达并且分泌编码的MAb。MAb全身性地分布。图2B描绘dMAb递送到小鼠TA肌肉后肌细胞中dMAb表达的实例(DAPI-蓝色，dMAb-绿色)。图2C描绘通过ELISA测量的dMAb递送后人IgG的血清浓度(+/-SEM，n＝7)。
图3包含图3A到图3D，描绘Balb/c小鼠中RSV-F dMAb的体内表达。向Balb/c小鼠的腿肌施用RSV-F dMAb质粒。处理后7天取得血清样品。图3A描绘RSV-F dmAb的血清表达。Sc-Fv-Fc构筑体(+/-SEM，n＝5-8)，图3B描绘dMAb的RSV-F抗原结合。血清样品的RSV-F结合信号(+/-SEM，n＝4)，图3C描绘RSV-A病毒的中和。中和效价(空斑形成减少60％的log2血清稀释度；+/-SEM，n＝3-11，点线指示在1/20血清稀释度下的LOD)，图3D描绘RSV-dMAb pDNA递送后7天BAL样品中sc-Fv-Fc RSV-F dMAb的浓度(摩尔sc-Fv-Fc dMAb/克灌洗样品中的总蛋白)。
图4包含图4A到图4D，描绘棉鼠中RSV-F dMAb的表征。图4A描绘向组织部位递送RSV-F dMAb pDNA后7天，棉鼠TA肌肉组织中通过对RSV-F dMAb进行免疫荧光染色展现的dMAb的局部表达(DAPI-蓝色；RSV-F dMAb-绿色；垂直于肌细胞切片)。图4B描绘IM施用800μg dMAb质粒后测量RSV-F dMAb水平(ng/ml)39天(+/-SEM，n＝5)。图4C描绘体内表达的RSV-F dMAb的病毒中和功能。2.4mg sc-Fv-Fc dMAb-pDNA递送后7天，收集并且测试血清样品：中和效价(+/-SEM，点线指示在1/20血清稀释度下的LOD)。图4D描绘来自经处理的棉鼠的BAL样品中RSV-F dMAb的浓度。
图5包含图5A到图5D，描绘展现在棉鼠活病毒攻击中RSV-F dMAb赋予对下呼吸道疾病的防护的实验结果。图5A描绘棉鼠攻击研究的示意图：动物在攻击前7天用2.4mg RSV-dMAb处理，在攻击前1天用15mg/kg帕利珠单抗IM注射处理。图5B描绘用RSV/A/long进行鼻内活病毒攻击后5天收集的棉鼠肺组织的病毒负荷(空斑形成单位/克)(+/-SEM n＝4-5)。图5C描绘用RSV/A/long进行鼻内活病毒攻击后5天棉鼠肺组织的RSV mRNA水平(log2且相对于β-肌动蛋白归一化)(+/-SEM，n＝4-5，曼-惠特尼(Mann-Whitney)非参数t检验：p(未经处理对RSV-dMAb)＝0.0159；p(未经处理对帕利珠单抗)＝0.0079)。图5D描绘攻击当天(第7天)和攻击后5天棉鼠中帕利珠单抗和sc-Fv-Fc RSV-F dMAb的血清水平(+/-SEM，n＝4-5)。
图6描绘展现RSV DMAb的表达动力学的实验结果。
图7描绘展现RSV-DMAb的峰值表达的实验结果。
图8描绘展现支气管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage；BAL)样品中DMAb的量的实验结果。
图9描绘展现RSV-F结合的实验结果。
图10描绘展现中和的实验结果。
图11描绘展现棉鼠中RSV-DMAb的实验结果。
图12描绘展现免疫活性小鼠中人sc-Fv抗RSV的峰值表达和功能性的实验结果。小鼠经递送到balb/c小鼠的腿肌中的200μg人sc-Fv抗RSV dMAb给药。递送由
Figure BDA0002709566920000041
辅助。处理后7天达成13200ng/ml的蛋白质人sc-Fv的平均血清水平表达。体内表达的人sc-Fv结合到RSV-F抗原。经处理小鼠的血清展现如试管内空斑减少分析所展现的活RSV-A病毒中和活性，且产生平均6.9的对数倒数中和效价。人sc-Fv存在于经处理小鼠的肺中，平均浓度为1.1纳克人sc-Fv/微克支气管肺泡灌洗(BAL)中的总蛋白。
图13描绘展现棉鼠中人sc-Fv的维持的表达的实验结果。100μg(蓝色)和800μg(绿色)的人sc-Fv递送到棉鼠的TA肌肉中。递送经
Figure BDA0002709566920000042
辅助。7天后到达血清中的峰值表达(分别226ng/ml和1353ng/ml)。
图14描绘展现棉鼠中人sc-Fv的峰值表达和功能性的实验结果。棉鼠腿肌中2.4mg人sc-Fv的
Figure BDA0002709566920000043
辅助递送引起第7天时7030ng/ml的平均血清表达。经处理棉鼠的血清在试管内空斑减少分析中具有中和能力，产生平均5.4的对数倒数中和效价。
图15描绘RSV-dMAb平台。
图16描绘展现RSV dMAb保护棉鼠免于后续RSV/A攻击的实验结果。
具体实施方式
本发明涉及包含编码抗体、其片段、其变异体或其组合的重组核酸序列的组合物。组合物可向有需要的个体施用以促进合成抗体的体内表达和形成。
特定来说，由重组核酸序列表达的重链和轻链多肽可组装成合成抗体。重链多肽与轻链多肽可彼此相互作用，使得组装产生合成抗体，所述合成抗体能够结合抗原，相比于未如本文所描述组装的抗体免疫原性更强并且能够诱发或诱导针对抗原的免疫反应。
另外，相比于响应于抗原诱导的免疫反应而产生的抗体，这些合成抗体在个体中更快速地生成。合成抗体能够有效地结合并且中和一系列抗原。合成抗体还能够有效地防止疾病和/或提高疾病的生存率。
1.定义
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在有矛盾的情况下，将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选方法和材料，但与本文所描述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文所提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献以全文引用的方式并入。本文所公开的材料、方法和实例仅为说明性的且不意图是限制性的。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有(having/has)”、“可”、“含有”以及其变化形式意图是开放式过渡短语、术语或措辞，其不排除额外动作或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一”、“和”以及“所述”包括多个参考物。本公开还涵盖“包含本文提出的实施例或元件”、“由本文提出的实施例或元件组成”以及“基本上由本文提出的实施例或元件组成”的其它实施例，不管是否明确阐述。
“抗体”可意指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类别的抗体或片段，其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体，以及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物血清样品中分离出来的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体，或其混合物，其对所期望的表位或由其衍生的序列展现充分的结合特异性。
如本文中可互换使用的“抗体片段”或“抗体的片段”是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。所述部分不包括完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3或CH4，视抗体同型而定)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双功能抗体、单链Fv(scFv)分子、仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅含有一个重链可变区的单链多肽以及含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。
“抗原”是指能够在宿主中生成免疫反应的蛋白质。抗原可由抗体识别并且结合。抗原可来源于体内或来源于外部环境。
“CDR”被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其为免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见例如Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》,第4版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Healthand Human Services),美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)(1987)。免疫球蛋白的可变部分中有三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，如本文所用，“CDR”是指所有三个重链CDR，或所有三个轻链CDR(或在适当情况下，所有重链CDR和所有轻链CDR两者)。抗体的结构和蛋白质折叠可以意味着其它残基被视为抗原结合区的一部分，并且将被技术人员理解为如此。参见例如Chothia等人,(1989)《免疫球蛋白高变区的构象(Conformations of immunoglobulin hypervariable regions)》；《自然(Nature)》342,第877-883页。
如本文所用，“编码序列”或“编码核酸”可意指包含编码如本文所阐述的抗体的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列也可包含编码RNA序列的DNA序列。编码序列可进一步包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，调控元件包括能够引导施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达的启动子和聚腺苷酸化信号。编码序列可进一步包括编码信号肽的序列。
如本文所用，“互补序列(complement)”或“互补(complementary)”可意指核酸可在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间进行沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对。
如本文所用，“恒定电流”定义在电脉冲递送到组织的持续时间内，同一组织或限定所述组织的细胞所接受或经历的电流。电脉冲是从本文所描述的电穿孔装置中递送。由于本文提供的电穿孔装置具有反馈元件(优选具有瞬时反馈)，因此这种电流在所述组织中以恒定安培数在电脉冲的寿命期保持。反馈元件可测量在整个脉冲持续时间中组织(或细胞)的电阻，并且使电穿孔装置改变其电能输出(例如，提高电压)，因此同一组织中的电流在整个电脉冲(约几微秒)中和脉冲之间保持恒定。在一些实施例中，反馈元件包含控制器。
如本文所用，“电流反馈”或“反馈”可互换使用并且可意指所提供的电穿孔装置的主动响应，包含测量电极之间的组织中的电流以及相应地改变EP装置所递送的能量输出以便将电流维持在恒定水平。这种恒定水平由用户在起始脉冲序列或电处理之前预设。反馈可利用电穿孔装置的电穿孔组件(例如，控制器)完成，因为其中的电路能够连续地监测电极之间的组织中的电流并且将监测到的那个电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较并且连续地进行能量输出调整以将所监测的电流维持在预设水平。反馈回路因其是模拟闭环反馈而可以是瞬时的。
如本文所用，“分散电流”可意指从本文所描述的电穿孔装置的多个针电极阵列递送的电流模式，其中所述模式使正被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关热应激的发生最小化或优选消除。
如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“EP”)可以指利用跨膜电场脉冲诱导生物膜中产生微观路径(孔隙)；微观路径的存在允许生物分子(如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水)从细胞膜的一侧通过到达另一侧。
如本文所用，“内源性抗体”可以指在施用有效剂量的用于诱导体液免疫反应的抗原的个体中生成的抗体。
如本文所用，“反馈机构”可以指由软件或硬件(或固件)执行的程序，所述程序接收所期望组织(在递送能量脉冲之前、期间和/或之后)的阻抗并且与当前值，优选电流进行比较，并且调整所递送的能量脉冲以达成预设值。反馈机构可由模拟闭环电路执行。
“片段”可意指抗体的多肽片段，其具有功能，即，可结合到所期望的靶标并且与全长抗体具有相同的预期效果。抗体的片段可以与全长具有100％同一性，不同之处在于N和/或C端缺失至少一个氨基酸，在各种情况下具有或不具有信号肽和/或位置1处的甲硫氨酸。片段可包含特定全长抗体20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比的长度，不包括所添加的任何异源信号肽。片段可包含与抗体具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同一性的多肽的片段，并且另外包含在计算同一性百分比时不包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段可进一步包含N端甲硫氨酸和/或信号肽，如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可以连接到抗体的片段。
编码抗体的核酸序列的片段可以与全长具有100％同一性，不同之处在于5'和/或3'端缺失至少一个核苷酸，在各种情况下具有或不具有编码信号肽和/或位置1处的甲硫氨酸的序列。片段可包含特定全长编码序列20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比的长度，不包括所添加的任何异源信号肽。片段可包含编码与抗体具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同一性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码在计算同一性百分比时不包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段可进一步包含N端甲硫氨酸和/或信号肽(如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽)的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以连接到编码序列的片段。
如本文所用，“基因构筑体”是指包含编码蛋白质(如抗体)的核苷酸序列的DNA或RNA分子。基因构筑体也可以指转录RNA的DNA分子。编码序列包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，调控元件包括能够引导施用核酸分子的个体的细胞中的表达的启动子和聚腺苷酸化信号。如本文所用，术语“可表达形式”是指基因构筑体，其含有与编码蛋白质的编码序列可操作连接的必需调控元件，使得当存在于个体的细胞中时，编码序列将得到表达。
如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的情形下所用，“同一”或“同一性”可意指序列在指定区域内具有指定百分比的相同残基。百分比可如下计算：将两个序列最优地对齐，在指定区域内比较两个序列，测定两个序列中存在相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中的位置总数，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。在两个序列具有不同长度或对齐产生一个或多个交错端并且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，将单个序列的残基纳入计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可视为相当。同一性可以人工方式或通过使用计算机序列算法(如BLAST或BLAST 2.0)执行。
当论述反馈机构时，可使用如本文所用的“阻抗”并且能够根据欧姆定律(Ohm'slaw)将其转换成电流值，从而能够与预设电流比较。
如本文所用，“免疫反应”可意指例如哺乳动物的宿主免疫系统响应于一种或多种核酸和/或肽的引入而激活。免疫反应可呈细胞反应或体液反应或两者的形式。
如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“聚核苷酸”可意指至少两个共价连接在一起的核苷酸。单链的描绘还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘单链的互补链。核酸的许多变异体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖大体上相同的核酸和其互补序列。单链提供了可与靶序列在严格杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA两者)、RNA或杂合体，杂合体中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，和包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可通过化学合成方法或重组方法获得。
如本文所用，“可操作地连接”可意指基因在与其空间连接的启动子控制下表达。启动子可位于处于其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与启动子与产生启动子的基因中其控制的基因之间的距离大致相同。如所属领域中已知，可适应这一距离的变化而不损失启动子功能。
如本文所用，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可意指所连接的氨基酸序列并且可以是天然的、合成的，或天然的与合成的变型或组合。
如本文所用，“启动子”可意指能够赋予、激活或增强细胞中的核酸表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定转录调控序列以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可包含远端增强子或抑制子元件，其可位于距离转录起始位点多达数千个碱基对处。启动子可来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的源。启动子可组成性地调控基因组件表达；或根据其中发生表达的细胞、组织或器官，或根据表达发生的发育阶段差异性地调控基因组件的表达；或响应于外部刺激，如生理性应激、病原体、金属离子或诱导剂，调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括细菌噬菌体T7启动子、细菌噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV 40晚期启动子以及CMV IE启动子。
“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用并且是指可在本文所阐述的蛋白质的氨基端连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列典型地引导蛋白质定位。本文所用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞中分泌出来。所述蛋白质从细胞中分泌出来后，信号肽/前导序列通常与蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)裂解。信号肽/前导序列在蛋白质的N端连接。
如本文所用，“严格杂交条件”可意指如在核酸的复杂混合物中，第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)杂交的条件。严格条件是依赖于序列的，并且在不同情况下会有所不同。可选择严格条件比特定序列在所限定的离子强度pH下的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm可以是50％的与靶标互补的探针与靶序列杂交处于平衡(当靶序列过量存在时，在Tm下，在平衡时占据50％探针)时的温度(在限定的离子强度、pH和核浓度下)。严格条件可以是以下条件：其中在pH 7.0到8.3下，盐浓度低于约1.0M钠离子，如约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)；并且对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)温度为至少约30℃，且对于长探针(例如，超过约50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以用添加去稳定化剂(如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号可以是背景杂交的至少2到10倍。示例性的严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS、在42℃下培育，或5×SSC、1％SDS、在65℃下培育，在65℃下、在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。
如本文可互换使用，“个体”和“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，奶牛、猪、骆驼、大羊驼(llama)、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如，猴，如猕猴或恒河猴，黑猩猩等)以及人)。在一些实施例中，个体可以是人或非人。个体或患者可经历其它形式治疗。
如本文所用，“大体上互补”可意指第一序列与第二序列的互补序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或两个序列在严格杂交条件下杂交。
如本文所用，“大体上相同”可意指第一序列与第二序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或就核酸来说，第一序列与第二序列的互补序列大体上互补的情况。
如本文所用，“合成抗体”是指由本文所描述的重组核酸序列编码并且在个体中生成的抗体。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”可意指通过预防、遏制、阻遏或完全消除疾病的方式保护个体以免患病。预防疾病涉及在疾病发作之前向个体施用本发明的疫苗。遏制疾病涉及在诱导疾病之后但在其临床表现之前向个体施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病存在临床表现后向个体施用本发明的疫苗。
本文关于核酸使用的“变异体”可意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其一部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列大体上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其大体上相同的序列杂交的核酸。
关于肽或多肽的“变异体”通过插入、缺失或保守取代氨基酸而使氨基酸序列不同，但保留至少一种生物活性。变异体也可意指氨基酸序列与参考蛋白质大体上相同并且氨基酸序列保留至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守取代，即，用具有相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸在所属领域中被认为是典型地涉及次要改变。这些次要改变可以如所属领域中所理解通过考虑氨基酸的亲水指数来部分地鉴别。Kyte等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。所属领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍保留蛋白质功能。在一个方面中，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示使蛋白质保留生物功能的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性容许计算所述肽的最大局部平均亲水性，这是一种有用的量度，据报道与抗原性和免疫原性很好地相关。美国专利第4,554,101号，以引用的方式完全并入本文中。如所属领域所理解，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以使肽保留生物活性，例如免疫原性。取代可用亲水性值在彼此±2内的氨基酸进行。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受所述氨基酸的特定侧链影响。与观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代应理解为依赖于氨基酸，并且尤其那些氨基酸的侧链的相对相似性，如由疏水性、亲水性、电荷、尺寸和其它特性所揭示。
变异体可以是在全基因序列或其片段的全长上大体上相同的核酸序列。核酸序列在基因序列或其片段的全长上可以80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变异体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大体上相同的氨基酸序列。氨基酸序列在氨基酸序列或其片段的全长上可以80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
如本文所用，“载体”可意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自复制染色体外载体或整合到宿主基因组中的载体。
为了叙述本文的数值范围，明确涵盖其之间具有相同精确度的每一个插入数值。举例来说，对于范围6-9，除了6和9之外涵盖数值7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。
2.组合物
本发明涉及包含编码抗体、其片段、其变异体或其组合的重组核酸序列的组合物。当向有需要的个体施用时，组合物可引起个体中生成合成抗体。合成抗体可结合个体中存在的靶分子(即，抗原)。此类结合可中和抗原，阻断抗原由另一分子(例如，蛋白质或核酸)的识别，并且诱发或诱导针对抗原的免疫反应。
在一个实施例中，组合物包含编码合成抗体的核苷酸序列。在一个实施例中，组合物包含核酸分子，其包含编码第一合成抗体的第一核苷酸序列和编码第二合成抗体的第二核苷酸序列。在一个实施例中，核酸分子包含编码裂解结构域的核苷酸序列。
在一个实施例中，核酸分子包含编码抗呼吸道合胞病毒(抗RSV)抗体的核苷酸序列。
在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含一种或多种密码子优化的核酸序列，其编码与SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含一种或多种密码子优化的核酸序列，其编码与SEQ ID NO:7至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含一种或多种核酸序列，其编码SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含一种或多种编码SEQID NO:7或片段SEQ ID NO:7的核酸序列。
在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含由一种或多种DNA序列转录的一种或多种RNA序列，所述DNA序列编码与SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含由一种或多种DNA序列转录的一种或多种RNA序列，所述DNA序列编码与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的片段至少90％同源的氨基酸序列。在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含由一种或多种DNA序列转录的一种或多种RNA序列，所述DNA序列编码SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含由一种或多种DNA序列转录的一种或多种RNA序列，所述DNA序列编码SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的片段的氨基酸序列。
在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含一种或多种与SEQ ID NO:1-6至少90％同源的密码子优化的核酸序列，或与SEQ ID NO:1-6至少90％同源的核酸序列的片段。在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含一种或多种如SEQ ID NO:1-6中所列的密码子优化的核酸序列，或如SEQ ID NO:1-6中所列的核酸序列的片段。
在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含由一种或多种与SEQ ID NO:1-6至少90％同源的DNA序列或与SEQ ID NO:1-6至少90％同源的DNA序列的片段转录的一种或多种RNA序列。在一个实施例中，编码抗RSV抗体的核苷酸序列包含由一种或多种如SEQID NO:1-6中所列的DNA序列或如SEQ ID NO:1-6中所列的DNA序列的片段转录的一种或多种RNA序列。
在一个实施例中，组合物包含编码合成RSV重链的核苷酸序列。在一个实施例中，组合物包含编码合成RSV轻链的核苷酸序列。在一个实施例中，组合物包含编码合成RSV抗体的核苷酸序列。在一个实施例中，编码合成RSV抗体的序列包含编码合成RSV重链的第一序列和编码合成RSV轻链的第二序列。
本发明的组合物可治疗、预防和/或防止与呼吸道合胞病毒感染相关的任何疾病、病症或病况。在某些实施例中，组合物可治疗、预防和/或防止病毒感染。在某些实施例中，组合物可治疗、预防和/或防止与呼吸道合胞病毒感染相关的病况。
在向个体施用组合物的至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时或60小时内，组合物可引起个体中生成合成抗体。在向个体施用组合物的至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天内，组合物可引起个体中生成合成抗体。在向个体施用组合物的约1小时至约6天、约1小时至约5天、约1小时至约4天、约1小时至约3天、约1小时至约2天、约1小时至约1天、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约1小时至约12小时或约1小时至约6小时内，组合物可引起个体中生成合成抗体。
在向有需要的个体施用时，组合物可引起个体中生成合成抗体，其比施用抗原以诱导体液免疫反应的个体中内源性抗体的生成更快速。组合物可使得在施用抗原以诱导体液免疫反应的个体中生成内源性抗体之前至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天生成合成抗体。
本发明的组合物可具有有效组合物所需的特征，如安全，使得组合物不引起疾病或死亡；防止疾病；以及提供易施用性、几乎没有副作用、生物稳定并且每剂量成本低。
3.重组核酸序列
如上文所描述，组合物可包含重组核酸序列。重组核酸序列可编码抗体、其片段、其变异体或其组合。下文更详细地描述抗体。
重组核酸序列可以是异源核酸序列。重组核酸序列可包括一种或多种异源核酸序列。
重组核酸序列可以是优化的核酸序列。此类优化可提高或改变抗体的免疫原性。优化也可改良转录和/或翻译。优化可包括以下中的一种或多种：低GC含量前导序列以增加转录；mRNA稳定性和密码子优化；添加克扎克(kozak)序列(例如，GCC ACC)以便增加翻译；添加编码信号肽的免疫球蛋白(Ig)前导序列；添加内部IRES序列以及尽可能地消除顺式作用序列基元(即，内部TATA盒)。
重组核酸序列构筑体
重组核酸序列可包括一种或多种重组核酸序列构筑体。重组核酸序列构筑体可包括一种或多种组件，其在下文更详细地描述。
重组核酸序列构筑体可包括编码重链多肽、其片段、其变异体或其组合的异源核酸序列。重组核酸序列构筑体可包括编码轻链多肽、其片段、其变异体或其组合的异源核酸序列。重组核酸序列构筑体还可包括编码蛋白酶或肽酶裂解位点的异源核酸序列。重组核酸序列构筑体还可包括编码内部核糖体进入位点(IRES)的异源核酸序列。IRES可以是病毒IRES或真核IRES。重组核酸序列构筑体可包括一种或多种前导序列，其中每个前导序列编码信号肽。重组核酸序列构筑体可包括一种或多种启动子、一种或多种内含子、一种或多种转录末端区、一种或多种起始密码子、一种或多种终止(termination/stop)密码子和/或一种或多种聚腺苷酸化信号。重组核酸序列构筑体还可包括一种或多种接头或标签序列。标签序列可编码血凝素(HA)标签。
(1)重链多肽
重组核酸序列构筑体可包括编码重链多肽、其片段、其变异体或其组合的异源核酸。重链多肽可包括重链可变(VH)区和/或至少一个重链恒定(CH)区。至少一个重链恒定区可包括重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)和/或铰链区。
在一些实施例中，重链多肽可包括VH区和CH1区。在其它实施例中，重链多肽可包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区以及CH3区。
重链多肽可包括互补决定区(“CDR”)集合。CDR集合可含有VH区的三个高变区。从重链多肽的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以促成抗原的结合或识别。
(2)轻链多肽
重组核酸序列构筑体可包括编码轻链多肽、其片段、其变异体或其组合的异源核酸序列。轻链多肽可包括轻链可变(VL)区和/或轻链恒定(CL)区。
轻链多肽可包括互补决定区(“CDR”)集合。CDR集合可含有VL区的三个高变区。从轻链多肽的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可促成抗原的结合或识别。
(3)蛋白酶裂解位点
重组核酸序列构筑体可包括编码蛋白酶裂解位点的异源核酸序列。蛋白酶裂解位点可由蛋白酶或肽酶识别。蛋白酶可为内肽酶或内切蛋白酶，例如但不限于弗林蛋白酶(furin)、弹性蛋白酶、HtrA、钙蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶以及胃蛋白酶。蛋白酶可为弗林蛋白酶。在其它实施例中，蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或裂解内部肽键(即，不裂解N端或C端肽键)的任何蛋白酶。
蛋白酶裂解位点可包括一种或多种提升或提高裂解效率的氨基酸序列。所述一种或多种氨基酸序列可提升或提高形成或生成离散多肽的效率。所述一种或多种氨基酸序列可包括2A肽序列。
(4)接头序列
重组核酸序列构筑体可包括一种或多种接头序列。接头序列可在空间上分隔或连接一种或多种本文所描述的组件。在其它实施例中，接头序列可编码在空间上分隔或连接两种或更多种多肽的氨基酸序列。
(5)启动子
重组核酸序列构筑体可包括一种或多种启动子。所述一种或多种启动子可以是能够驱动基因表达和调控基因表达的任何启动子。此类启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件。用于引导基因表达的启动子的选择视具体应用而定。启动子在重组核酸序列构筑体中的位置距转录起始的距离可以与其在自然环境中距转录起始位点的距离大致相同。然而，可适应这一距离的变化而不损失启动子功能。
启动子可与编码重链多肽和/或轻链多肽的异源核酸序列可操作地连接。启动子可以是展示对真核细胞中的表达有效的启动子。与编码序列可操作地连接的启动子可以是CMV启动子、来自猴病毒40(SV40)的启动子(如SV40早期启动子和SV40晚期启动子)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子(如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(如CMV即刻早期启动子)、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus；EBV)启动子，或劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus；RSV)启动子。启动子也可以是来自人基因(如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸、人多角体蛋白或人金属硫蛋白)的启动子。
启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，诱导型启动子仅当宿主细胞暴露于某一特定外部刺激时起始转录。在多细胞生物体的情况下，启动子还可以对特定组织或器官或发育阶段具有特异性。启动子还可以是天然或合成的组织特异性启动子，如肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例描述于美国专利申请公开第US20040175727号中，其内容全文并入本文中。
启动子可以与增强剂子相关联。增强子可位于编码序列的上游。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。聚核苷酸功能增强子描述于美国专利第5,593,972号、第5,962,428号和W094/016737中，其各自的内容以引用的方式完全并入。
(6)内含子
重组核酸序列构筑体可包括一种或多种内含子。每个内含子可包括功能性剪接供体和受体位点。内含子可包括剪接增强子。内含子可包括高效剪接所需的一个或多个信号。
(7)转录终止区
重组核酸序列构筑体可包括一个或多个转录转录终止区。转录终止区可以在编码序列的下游以提供高效终止。转录终止区可获自与上文所描述的启动子相同的基因或可获自一种或多种不同基因。
(8)起始密码子
重组核酸序列构筑体可包括一种或多种起始密码子。起始密码子可位于编码序列的上游。起始密码子可与编码序列同框。起始密码子可以与高效翻译起始所需的一个或多个信号(例如但不限于核糖体结合位点)相关联。
(9)终止密码子
重组核酸序列构筑体可包括一种或多种终止密码子。终止密码子可以在编码序列的下游。终止密码子可与编码序列同框。终止密码子可以与高效翻译终止所需的一个或多个信号相关联。
(10)聚腺苷酸化信号
重组核酸序列构筑体可包括一个或多个聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号可包括转录物高效聚腺苷酸化所需的一个或多个信号。聚腺苷酸化信号可位于编码序列的下游。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号，或人β-球蛋白聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司(Invitrogen,SanDiego,CA))的聚腺苷酸化信号。
(11)前导序列
重组核酸序列构筑体可包括一种或多种前导序列。前导序列可编码信号肽。信号肽可以是免疫球蛋白(Ig)信号肽，例如但不限于IgG信号肽和IgE信号肽。
重组核酸序列构筑体的布置
如上文所描述，重组核酸序列可包括一种或多种重组核酸序列构筑体，其中每种重组核酸序列构筑体可包括一种或多种组件。所述一种或多种组件在上文详细地描述。当包含于重组核酸序列构筑体中时，所述一种或多种组件可相对于彼此以任何次序布置。在一些实施例中，所述一种或多种组件可如下文所描述布置于重组核酸序列构筑体中。
(12)布置1
在一个布置中，第一重组核酸序列构筑体可包括编码重链多肽的异源核酸序列，并且第二重组核酸序列构筑体可包括编码轻链多肽的异源核酸序列。举例来说，在一个实施例中，第一重组核酸序列编码重链多肽。在一个实施例中，第二重组核酸序列编码轻链多肽。
第一重组核酸序列构筑体可放置于载体中。第二重组核酸序列构筑体可放置于第二或独立载体中。下文更详细地描述重组核酸序列构筑体向载体中的放置。
第一重组核酸序列构筑体也可包括启动子、内含子、转录终止区、起始密码子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。第一重组核酸序列构筑体可进一步包括前导序列，其中前导序列位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，前导序列所编码的信号肽可由肽键连接到重链多肽。
第二重组核酸序列构筑体也可包括启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。第二重组核酸序列构筑体可进一步包括前导序列，其中前导序列位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，前导序列所编码的信号肽可由肽键连接到轻链多肽。
因此，布置1的一个实例可包括编码包括VH和CH1的重链多肽的第一载体(和因此第一重组核酸序列构筑体)，和编码包括VL和CL的轻链多肽的第二载体(和因此第二重组核酸序列构筑体)。布置1的第二实例可包括编码包括VH、CH1、铰链区、CH2以及CH3的重链多肽的第一载体(和因此第一重组核酸序列构筑体)，和编码包括VL和CL的轻链多肽的第二载体(和因此第二重组核酸序列构筑体)。
(13)布置2
在第二布置中，重组核酸序列构筑体可包括编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列。编码重链多肽的异源核酸序列可位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。替代地，编码轻链多肽的异源核酸序列可位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。
重组核酸序列构筑体可放置于载体中，如下文更详细地描述。
重组核酸序列构筑体可包括编码蛋白酶裂解位点的异源核酸序列和/或接头序列。如果编码蛋白酶裂解位点的异源核酸序列包含于重组核酸序列构筑体中，则其可位于编码重链多肽的异源核酸序列与编码轻链多肽的异源核酸序列之间。因此，蛋白酶裂解位点使得重链多肽和轻链多肽可在表达时分离成相异的多肽。在其它实施例中，如果接头序列包含于重组核酸序列构筑体中，则接头序列可位于编码重链多肽的异源核酸序列与编码轻链多肽的异源核酸序列之间。
重组核酸序列构筑体也可包括启动子、内含子、转录终止区、起始密码子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。重组核酸序列构筑体可包括一种或多种启动子。重组核酸序列构筑体可包括两种启动子，使得一种启动子可与编码重链多肽的异源核酸序列相关联，并且第二启动子可与编码轻链多肽的异源核酸序列相关联。在再其它实施例中，重组核酸序列构筑体可包括一种与编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列相关联的启动子。
重组核酸序列构筑体可进一步包括两个前导序列，其中第一前导序列位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')，并且第二前导序列位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，第一前导序列所编码的第一信号肽可由肽键连接到重链多肽，并且第二前导序列所编码的第二信号肽可由肽键连接到轻链多肽。
因此，布置2的一个实例可包括编码包括VH和CH1的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(和因此重组核酸序列构筑体)，其中接头序列位于编码重链多肽的异源核酸序列与编码轻链多肽的异源核酸序列之间。
布置2的第二实例可包括编码包括VH和CH1的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(和因此重组核酸序列构筑体)，其中编码蛋白酶裂解位点的异源核酸序列位于编码重链多肽的异源核酸序列与编码轻链多肽的异源核酸序列之间。
布置2的第三实例可包括编码包括VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(和因此重组核酸序列构筑体)，其中接头序列位于编码重链多肽的异源核酸序列与编码轻链多肽的异源核酸序列之间。
布置2的第四实例可包括编码包括VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(和因此重组核酸序列构筑体)，其中编码蛋白酶裂解位点的异源核酸序列位于编码重链多肽的异源核酸序列与编码轻链多肽的异源核酸序列之间。
(14)ScFv布置
在ScFv布置中，重组核酸序列可包括编码重链多肽的VH结构域和轻链多肽的VL结构域的序列，并且任选地进一步包括位于编码VH结构域的异源核酸序列与编码VL结构域的异源核酸序列之间的接头序列。
ScFv布置的一个实例可包括编码VH、接头、VL、铰链区、CH2以及CH3的载体(和因此重组核酸序列构筑体)。VH区可通过接头在N端或C端连接到VL区。
由重组核酸序列构筑体进行的表达
如上文所描述，重组核酸序列构筑体可在一种或多种组件中包括编码重链多肽的异源核酸序列和/或编码轻链多肽的异源核酸序列。因此，重组核酸序列构筑体可促进重链多肽和/或轻链多肽的表达。
当利用如上文所描述的布置1时，第一重组核酸序列构筑体可促进重链多肽的表达，并且第二重组核酸序列构筑体可促进轻链多肽的表达。当利用如上文所描述的布置2时，重组核酸序列构筑体可促进重链多肽和轻链多肽的表达。
例如但不限于在细胞、生物体或哺乳动物中表达时，重链多肽和轻链多肽可组装成合成抗体。特定来说，重链多肽和轻链多肽可彼此相互作用，使得组装产生能够结合抗原的合成抗体。在其它实施例中，重链多肽和轻链多肽可彼此相互作用，使得组装产生相比于未如本文所描述组装的抗体免疫原性更高的合成抗体。在再其它实施例中，重链多肽和轻链多肽可彼此相互作用，使得组装产生能够诱发或诱导针对抗原的免疫反应的合成抗体。
载体
上文所描述的重组核酸序列构筑体可放置于一种或多种载体中。所述一种或多种载体可含有复制起点。所述一种或多种载体可以是质粒、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。所述一种或多种载体可以是自复制染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。
载体包括但不限于质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体以及其类似物。“载体”包含可感染、转染、暂时或永久性转导细胞的核酸。应认识到，载体可以是裸核酸，或与蛋白质或脂质复合的核酸。载体任选地包含病毒或细菌核酸和/或蛋白质，和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜(envelope)等)。载体包括但不限于复制子(例如，RNA复制子、细菌噬菌体)，DNA片段可与其连接并且变成被复制的。载体因此包括但不限于RNA、自主自复制环状或线性DNA或RNA(例如，质粒、病毒和其类似物，参见例如美国专利第5,217,879号)，并且包括表达质粒和非表达质粒两者。在一些实施例中，载体包括线性DNA、酶DNA和合成DNA。在重组微生物或细胞培养物被描述为容纳“表达载体”时，这包括染色体外环状和线性DNA以及被并入到(多个)宿主染色体中的DNA两者。在载体由宿主细胞维持时，载体可作为自主结构在有丝分裂期间由细胞稳定地复制，或被并入到宿主基因组内。
一种或多种载体可以是异源表达构筑体，其大体上为用于将特定基因引入到靶细胞中的质粒。一旦表达载体到达细胞内部，则由细胞转录和翻译机构核糖体复合物产生重组核酸序列构筑体所编码的重链多肽和/或轻链多肽。一种或多种载体可表达大量的稳定信使RNA，并且因此表达大量的蛋白质。
(15)表达载体
一种或多种载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒或线性核酸能够引导特定核苷酸序列在适当的个体细胞中的表达。包含重组核酸序列构筑体的一种或多种载体可以是嵌合的，意味着其组件中的至少一个相对于其其它组件中的至少一个是异源的。
(16)质粒
一种或多种载体可以是质粒。质粒可适用于用重组核酸序列构筑体转染细胞。质粒可适用于将重组核酸序列构筑体引入到个体中。质粒还可包含调控序列，其可能较适合于在其中施用质粒的细胞中的基因表达。
质粒还可包含哺乳动物复制起点，以便在染色体外维持质粒并且在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是来自英杰公司(加利福尼亚州圣迭戈)的pVAX1、pCEP4或pREP4，所述质粒可包含埃-巴二氏病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其可在不整合的情况下产生高拷贝游离型复制。质粒的骨架可以是pAV0242。质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)质粒。
质粒可以是pSE420(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)，其可用于在大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)中产生蛋白质。质粒还可以是pYES2(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)，其可用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中产生蛋白质。质粒还可以是MAXBACTM完整杆状病毒表达系统(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)的质粒，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒还可以是pcDNAI或pcDNA3(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)，其可用于在哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞)中产生蛋白质。
(17)RNA
在一个实施例中，核酸是RNA分子。在一个实施例中，RNA分子由本文所描述的DNA序列转录。举例来说，在一些实施例中，RNA分子由与SEQ ID NO:1-6中的一个至少90％同源的DNA序列或与SEQ ID NO:1-6中的一个至少90％同源的DNA序列的片段编码。在另一实施例中，核苷酸序列包含由DNA序列转录的RNA序列，所述DNA序列编码与SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列中的一个至少90％同源的多肽序列、与SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段或其变异体或其片段。在一个实施例中，核苷酸序列包含由DNA序列转录的RNA序列，所述RNA序列编码至少90％同源SEQ IDNO:7的多肽序列、至少90％同源SEQ ID NO:7的氨基酸序列的片段或其变异体或其片段。因此，在一个实施例中，本发明提供编码MAb或DMAb中的一个或多个的RNA分子。RNA可以是正链的。因此，在一些实施例中，RNA分子可由细胞翻译，而不需要任何中间复制步骤，如逆转录。适用于本发明的RNA分子可具有5'帽(例如7-甲基鸟苷)。这种帽可增强RNA的体内翻译。适用于本发明的RNA分子的5'核苷酸可具有5'三磷酸基团。在加帽RNA中，这可通过5'到5'桥连接到7-甲基鸟苷。RNA分子可具有3'poly-A尾。其还可在其3'端附近包括poly-A聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。适用于本发明的RNA分子可以是单链的。适用于本发明的RNA分子可包含合成RNA。在一些实施例中，RNA分子是裸RNA分子。在一个实施例中，RNA分子包含在载体内。
在一个实施例中，RNA具有5'和3'UTR。在一个实施例中，5'UTR的长度在零个与3000个核苷酸之间。添加到编码区中的5'和3'UTR序列的长度可通过不同方法改变，包括但不限于设计粘接到UTR的不同区的PCR的引物。使用这种方法，所属领域的普通技术人员可修改在转录RNA转染之后达成最优翻译效率所需的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是所关注基因的天然存在的内源性5'和3'UTR。替代地，可通过将UTR序列并入到正向和反向引物中或通过对模板进行任何其它修改，添加并非所关注基因内源性的UTR序列。并非所关注基因内源性的UTR序列的使用可适用于修改RNA的稳定性和/或翻译效率。举例而言，众所周知3'UTR序列中的富AU元件可降低RNA稳定性。因此，可基于所属领域中众所周知的UTR的特性，选择或设计3'UTR以提高转录RNA的稳定性。
在一个实施例中，5'UTR可含有内源性基因的克扎克序列。替代地，当并非所关注基因内源性的5'UTR如上文所描述通过PCR添加时，可通过添加5'UTR序列重新设计共有克扎克序列。Kozak序列可提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎并非为所有RNA实现高效翻译所必需的。许多RNA对Kozak序列的需要是所属领域中已知的。在其它实施例中，5'UTR可来源于RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其它实施例中，可在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物以阻碍RNA的核酸外切酶降解。
在一个实施例中，RNA在5'端和3'poly(A)尾两者上具有帽，其决定核糖体结合、翻译起始和RNA在细胞中的稳定性。
在一个实施例中，RNA是经核苷修饰的RNA。经核苷修饰的RNA具有优于未经修饰的RNA的特定优点，包括例如提高的稳定性、低或不存在的固有免疫原性和增强的翻译。
(18)环状和线性载体
一种或多种载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中来转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达重组核酸序列构筑体所编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其它表达载体。
本文还提供了线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效递送到个体中并且表达重组核酸序列构筑体所编码的重链多肽和/或轻链多肽。LEC可以是不含任何磷酸骨架的任何线性DNA。LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可以不含与所期望的基因表达无关的其它核酸序列。
LEC可来源于能够线性化的任何质粒。质粒可能能够表达重组核酸序列构筑体所编码的重链多肽和/或轻链多肽。质粒可以是pNP(波多黎各(Puerto Rico)/34)或pM2(新喀里多尼亚(New Caledonia)/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达重组核酸序列构筑体所编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其它表达载体。
LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别来源于pNP(波多黎各/34)或pM2(新喀里多尼亚/99)。
(19)病毒载体
在一个实施例中，本文提供病毒载体，其能够将本发明的核酸递送到细胞。表达载体可以病毒载体形式向细胞提供。病毒载体技术是所属领域中众所周知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001)和Ausubel等人(1997)，以及其它病毒学和分子生物学手册中。适用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒以及慢病毒。一般来说，合适的载体含有在至少一种生物体中具有功能的复制起点、启动子序列、合宜的限制性核酸内切酶位点以及一种或多种可选标记。(参见例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。病毒载体，并且尤其逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入到哺乳动物，例如人细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒，以及其类似物。参见例如美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
(20)制备载体的方法
本文提供用于制备一种或多种其中已放置重组核酸序列构筑体的载体的方法。在最终亚克隆步骤之后，可使用所属领域中已知的方法，用载体接种大型发酵罐中的细胞培养物。
在其它实施例中，在最终亚克隆步骤之后，可将载体与一种或多种电穿孔(EP)装置一起施用。下文更详细地描述EP装置。
一种或多种载体可使用已知装置和技术的组合配制或制造，但其优选使用2007年5月23日提交的已许可的同在申请中的美国临时申请U.S.第60/939,792号中所描述的质粒制造技术制造。在一些实例中，本文所描述的DNA质粒可以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除U.S.第60/939792号中所描述的装置和方案以外，制造技术还包括或并入有所属领域的技术人员通常已知的各种装置和方案，包括2007年7月3日颁发的已许可的专利美国专利第7,238,522号中所描述的装置和方案。以上提及的申请和专利、US第60/939,792号以及美国专利第7,238,522号分别全文并入本文中。
4.抗体
如上文所描述，重组核酸序列可编码抗体、其片段、其变异体或其组合。抗体可结合抗原或与抗原反应，其在下文更详细地描述。
抗体可包含分别插入于重链与轻链框架(“FR”)集合之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)集合，所述框架集合为CDR提供支撑并且限定CDR相对于彼此的空间关系。CDR集合可含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N端开始，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR集合。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先使IgG分子裂解以产生几个片段，其中两者(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。酶胃蛋白酶能够使IgG分子裂解以提供数个片段，包括F(ab')2片段，其包含两个抗原结合位点。因此，抗体可以是Fab或F(ab')2。Fab可包括重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可包括VH区和CH1区。Fab的轻链可包括VL区和CL区。
抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE以及IgG。免疫球蛋白可包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区以及CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可包括VL区和CL区。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的抗体，其结合所期望抗原，具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。
抗体可以是如下文更详细地描述的双特异性抗体。抗体可以是如也在下文更详细地描述的双功能抗体。
如上文所描述，抗体可在向个体施用组合物后在个体中生成。抗体可具有个体内半衰期。在一些实施例中，抗体可经修饰以延长或缩短其个体内半衰期。下文更详细地描述此类修饰。
抗体可去岩藻糖基化，如下文更详细地描述。
抗体可经修饰以减少或防止对与抗原相关的疾病的抗体依赖性增强(ADE)，如下文更详细地描述。
ScFv抗体
在一个实施例中，本发明的DMAb是ScFv DMAb。在一个实施例中，ScFv DMAb是关于不含CH1和CL区的Fab片段。因此，在一个实施例中，ScFv DMAb是关于包含VH和VL的Fab片段DMAb。在一个实施例中，ScFv DMAb包含VH与VL之间的接头。在一个实施例中，ScFv DMAb是ScFv-Fc DMAb。在一个实施例中，ScFv-Fc DMAb包含VH、VL和CH2以及CH3区。在一个实施例中，ScFv-Fc DMAb包含VH与VL之间的接头。在一个实施例中，相比于亲本DMAb，本发明的ScFv DMAb具有经修改的表达、稳定性、半衰期、抗原结合、重链-轻链配对、组织穿透或其组合。
在一个实施例中，相比于亲本DMAb，本发明的ScFv DMAb的表达高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍。
在一个实施例中，相比于亲本DMAb，本发明的ScFv DMAb的抗原结合高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍。
在一个实施例中，相比于亲本DMAb，本发明的ScFv DMAb的半衰期长至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍。
在一个实施例中，相比于亲本DMAb，本发明的ScFv DMAb的稳定性高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍。
在一个实施例中，相比于亲本DMAb，本发明的ScFv DMAb的组织穿透大至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍。
在一个实施例中，相比于亲本DMAb，本发明的ScFv DMAb的重链-轻链配对强至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大于50倍。
双特异性抗体
重组核酸序列可编码双特异性抗体、其片段、其变异体或其组合。双特异性抗体可结合两种抗原或与两种抗原反应，例如下文更详细地描述的抗原中的两种。双特异性抗体可包含本文所描述的抗体中的两种的片段，从而使得双特异性抗体可结合两种所期望的靶分子或与两种所期望的靶分子反应，所期望的靶分子可包括抗原，其在下文更详细地描述；配体，包括受体的配体；受体，包括受体上的配体结合位点；配体-受体复合物；以及标记。
本发明提供新颖双特异性抗体，其包含特异性结合到第一靶标的第一抗原结合位点和特异性结合到第二靶标的第二抗原结合位点，具有特别有利的特性，如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、对某些T细胞的特异性靶向、靶向效率以及降低的毒性。在一些情况下，存在双特异性抗体，其中双特异性抗体以高亲和力结合到第一靶标并且以低亲和力结合到第二靶标。在其它情况下，存在双特异性抗体，其中双特异性抗体以低亲和力结合到第一靶标并且以高亲和力结合到第二靶标。在其它情况下，存在双特异性抗体，其中双特异性抗体以所期望的亲和力结合到第一靶标并且以所期望的亲和力结合到第二靶标。
在一个实施例中，双特异性抗体是二价抗体，其包含a)特异性结合到第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和b)特异性结合到第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链。
根据本发明的双特异性抗体分子可具有具有任何所期望特异性的两个结合位点。在一些实施例中，结合位点中的一个能够RSV抗原。在一些实施例中，Fab片段中所包括的结合位点是对RSV抗原具有特异性的结合位点。在一些实施例中，单链Fv片段中所包括的结合位点是对RSV抗原具有特异性的结合位点，RSV抗原如RSV抗原或RSV包膜抗原，例如RSV-F、RSV-G、RSV-Ga、RSV-Gb、RSV-M2-1或RSV M2-2。
在一些实施例中，根据本发明的抗体分子的结合位点中的一个能够结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤细胞(NK细胞)特异性受体分子。T细胞特异性受体是所谓的“T细胞受体”(TCR)，其使得T细胞可结合到以下并且(如果存在额外信号)由以下激活且对以下作出反应：由被称作抗原呈递细胞或APC的另一细胞呈递的表位/抗原。已知T细胞受体类似于天然存在的免疫球蛋白的Fab片段。其一般是单价的，涵盖α和β链，在一些实施例中，其涵盖γ链和δ链(前述)。因此，在一些实施例中，TCR是TCR(α/β)，并且在一些实施例中，其为TCR(γ/δ)。T细胞受体与CD3 T细胞辅助受体形成复合物。CD3是蛋白质复合物并且由四个相异的链构成。在哺乳动物中，所述复合物含有CD3γ链、CD36链和两条CD3E链。这些链与被称为T细胞受体(TCR)的分子和ζ链缔合，以在T淋巴细胞中生成激活信号。因此，在一些实施例中，T细胞特异性受体是CD3 T细胞辅助受体。在一些实施例中，T细胞特异性受体是CD28，一种也在T细胞上表达的蛋白质。CD28可提供共刺激信号，其为T细胞激活所需的。CD28在T细胞增殖和存活、细胞因子产生和T辅助细胞2型发育中起重要作用。T细胞特异性受体的又另一实例是CD134，又称为Ox40。CD134/OX40在激活之后24到72小时后表达，并且可用于限定次级共刺激分子。T细胞受体的另一实例是4-1BB，其能够结合到抗原呈递细胞(APC)上的4-1BB配体，从而生成T细胞的共刺激信号。主要在T细胞上发现的受体的另一实例是CD5，其也以低水平在B细胞上发现。修改T细胞功能的受体的另一实例是CD95，其也被称为Fas受体，介导由在其它细胞表面上表达的Fas配体进行的凋亡信号传导。已报导CD95调节静息T淋巴细胞中的TCR/CD3驱动信号传导路径。
NK细胞特异性受体分子的一个实例是CD16，一种低亲和力Fc受体和NKG2D。在T细胞和自然杀伤(NK)细胞两者表面上存在的受体分子是一个实例是CD2，并且进一步，CD2超家族成员。CD2能够充当T细胞和NK细胞上的共刺激分子。
在一些实施例中，抗体分子的第一结合位点结合RSV抗原，并且第二结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子。
在一些实施例中，抗体分子的第一结合位点结合选自以下的RSV抗原中的一种：RSV-F、RSV-G、RSV-Ga、RSV-Gb、RSV-M2-1或RSV M2-2，或包含其任何组合的多聚蛋白(polyprotein)，并且第二结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子。在一些实施例中，抗体分子的第一结合位点结合RSV抗原，并且第二结合位点结合以下中的一种：CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5以及CD95。
在一些实施例中，抗体分子的第一结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子，并且第二结合位点结合RSV抗原。在一些实施例中，抗体的第一结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子，并且第二结合位点结合以下中的一种：RSV-F、RSV-G、RSV-Ga、RSV-Gb、RSV-M2-1或RSV M2-2，或包含其任何组合的多聚蛋白。在一些实施例中，抗体的第一结合位点结合以下中的一种：CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5以及CD95，并且第二结合位点结合RSV抗原。
双功能抗体
重组核酸序列可编码双功能抗体、其片段、其变异体或其组合。双功能抗体可结合下文所描述的抗原或与下文所描述的抗原反应。双功能抗体也可经修饰以赋予抗体除抗原识别和与抗原结合以外的额外功能。此类修饰可包括但不限于与H因子或其片段偶联。H因子是可溶性补体激活调控子，并且因此可通过补体介导的溶解(CML)促成免疫反应。
抗体半衰期的延长
如上文所描述，抗体可经修饰以延长或缩短抗体在个体中的半衰期。修饰可延长或缩短抗体在个体血清中的半衰期。
修饰可存在于抗体的恒定区中。修饰可以是在抗体恒定区中的一个或多个氨基酸取代，相比于不含所述一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期，取代使抗体的半衰期延长。修饰可以是在抗体CH2结构域中的一个或多个氨基酸取代，相比于不含所述一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期，取代使抗体的半衰期延长。
在一些实施例中，恒定区中的一个或多个氨基酸取代可包括用酪氨酸残基置换恒定区中的甲硫氨酸残基、用苏氨酸残基置换恒定区中的丝氨酸残基、用谷氨酸残基置换恒定区中的苏氨酸残基或其任何组合，从而延长抗体的半衰期。
在其它实施例中，恒定区中的一个或多个氨基酸取代可包括用酪氨酸残基置换CH2结构域中的甲硫氨酸残基、用苏氨酸残基置换CH2结构域中的丝氨酸残基、用谷氨酸残基置换CH2结构域中的苏氨酸残基或其任何组合，从而延长抗体的半衰期。
去岩藻糖基化
重组核酸序列可编码未经岩藻糖基化的抗体(即，去岩藻糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体)、其片段、其变异体或其组合。岩藻糖基化包括将糖岩藻糖添加到分子中，例如将岩藻糖连接到N-聚糖、O-聚糖和糖脂。因此，在去岩藻糖基化抗体中，岩藻糖不与恒定区的碳水化合物链连接。继而，相比于岩藻糖基化抗体，这种岩藻糖基化的缺乏可改良抗体的FcγRIIIa结合和抗体引导的细胞的细胞毒性(ADCC)活性。因此，在一些实施例中，相比于岩藻糖基化抗体，非岩藻糖基化抗体可展现提高的ADCC活性。
抗体可经修饰从而阻止或抑制抗体的岩藻糖基化。在一些实施例中，相比于未经修饰抗体，此类经修饰抗体可展现提高的ADCC活性。修饰可以在重链、轻链或其组合中。修饰可以是重链中的一个或多个氨基酸取代、轻链中的一个或多个氨基酸取代或其组合。
减少的ADE反应
抗体可经修饰以减少或防止对与抗原相关的疾病的抗体依赖性增强(ADE)，但仍然中和抗原。
在一些实施例中，抗体可经修饰以包括减少或防止抗体与FcγR1a结合的一个或多个氨基酸取代。所述一个或多个氨基酸取代可以在抗体的恒定区中。所述一个或多个氨基酸取代可包括在抗体恒定区中用丙氨酸残基置换亮氨酸残基，即，在本文中也称为LA、LA突变或LA取代。所述一个或多个氨基酸取代可包括在抗体恒定区中将两个亮氨酸残基各自用丙氨酸残基置换，并且在本文中也称为LALA、LALA突变或LALA取代。LALA取代的存在可阻止或阻断抗体结合到FcγR1a，并且因此，经修饰抗体不增强或导致与抗原相关的疾病的ADE，但仍然中和抗原。
单克隆抗体
在一个实施例中，本发明提供抗RSV抗体。抗体可以是完整单克隆抗体和免疫活性片段(例如，Fab或(Fab)2片段)、单克隆抗体重链或单克隆抗体轻链。
抗体可包含分别插入于重链与轻链框架(“FR”)集合之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)集合，所述框架集合为CDR提供支撑并且限定CDR相对于彼此的空间关系。CDR集合可含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N端开始，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR集合。
抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE以及IgG。免疫球蛋白可包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区以及CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可包括VL区和CL区。
在一个实施例中，抗RSV抗体包含与SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗RSV抗体包含与SEQ ID NO:7至少90％同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7至少90％同源的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗RSV抗体包含SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列的片段。在一个实施例中，抗RSV抗体包含SEQ ID NO:7中所列的氨基酸序列，或SEQ ID NO:7中所列的氨基酸序列的片段。
5.抗原
合成抗体是针对抗原或其片段或变异体。抗原可以是核酸序列、氨基酸序列、多糖或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变异体、其片段或其组合。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变异体、其片段或其组合。多糖可以是核酸编码的多糖。
抗原可以来自病毒。抗原可与病毒感染相关。在一个实施例中，抗原可与呼吸道合胞病毒感染相关。在一个实施例中，抗原可以是RSV糖蛋白或RSV结构蛋白。在一个实施例中，RSV抗原可以是RSV-F、RSV-G、RSV-Ga、RSV-Gb、RSV-M2-1或RSV M2-2。
在一个实施例中，抗原可以是RSV蛋白的片段。在一个实施例中，抗原可以是RSV糖蛋白或RSV结构蛋白的片段。
在一个实施例中，本发明的合成抗体靶向两种或更多种抗原。在一个实施例中，双特异性抗体的至少一种抗原选自本文所描述的抗原。在一个实施例中，所述两种或更多种抗原选自本文所描述的抗原。
病毒抗原
病毒抗原可以是病毒抗原或其片段或变异体。病毒可以是致病病毒。病毒可以是呼吸道合胞病毒。
抗原可以是RSV抗原，或其片段，或其变异体。RSV抗原可以来自使得病毒可复制、感染或存活的因子。使得RSV可复制或存活的因子包括但不限于结构蛋白和非结构蛋白。此类蛋白质可以是糖蛋白、结构蛋白或非结构蛋白。在一个实施例中，RSV抗原可包括RSV-G、RSV-F、RSV-SH、RSV-N、RSV-P、RSV-M以及RSV-L。
6.组合物的赋形剂和其它组分
组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，如媒剂、载剂或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant)、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰基肽、醌类似物、囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。
转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且所述聚-L-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于组合物中。转染促进剂还可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰基肽、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸也可结合组合物施用。组合物还可包括转染促进剂，如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或所属领域中已知的其它脂质体作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)；钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。转染剂在疫苗中的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
组合物可进一步包含如1994年4月1日提交的U.S.第021,579号中所描述的基因促进剂，所述文献以引用的方式完全并入。
组合物可以约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；或优选约0.1微克到约10毫克；或更优选约1毫克到约2毫克的数量包含DNA。在一些优选实施例中，根据本发明的组合物包含约5纳克到约1000微克DNA。在一些优选实施例中，组合物可含有约10纳克到约800微克DNA。在一些优选实施例中，组合物可含有约0.1微克到约500微克DNA。在一些优选实施例中，组合物可含有约1微克到约350微克DNA。在一些优选实施例中，组合物可含有约25微克到约250微克、约100微克到约200微克、约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；约0.1微克到约10毫克；约1毫克到约2毫克、约5纳克到约1000微克、约10纳克到约800微克、约0.1微克到约500微克、约1微克到约350微克、约25微克到约250微克、约100微克到约200微克DNA。
组合物可根据待使用的施用模式配制。可注射的医药组合物可以是无菌的、不含热原质的以及不含微粒的。可使用等渗配制物或溶液。等渗性添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。组合物可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗可进一步包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使配制物在室温或环境温度下稳定延长的时间段，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。
7.产生合成抗体的方法
本发明还涉及生成合成抗体的方法。所述方法可包括通过使用下文更详细地描述的递送方法，向有需要的个体施用组合物。因此，在向个体施用组合物后，合成抗体在个体中或体内生成。
所述方法还可包括将组合物引入到一种或多种细胞中，并且因此，合成抗体可在一种或多种细胞中生成或产生。所述方法可进一步包括将组合物引入到一种或多种组织(例如但不限于皮肤和肌肉)中，并且因此，合成抗体可在一种或多种组织中生成或产生。
8.鉴别或筛选抗体的方法
本发明进一步涉及鉴别或筛选上文所描述的抗体的方法，所述抗体对上文所描述的抗原具有反应性或结合上文所描述的抗原。鉴别或筛选抗体的方法可以所属领域的技术人员已知的方法使用抗原来鉴别或筛选抗体。此类方法可包括但不限于从库选择抗体(例如，噬菌体展示)和对动物进行免疫接种，接着分离和/或纯化抗体。
9.递送组合物的方法
本发明还涉及向有需要的个体递送组合物的方法。递送方法可包括向个体施用组合物。施用可包括但不限于在存在和不存在体内电穿孔情况下的DNA注射、脂质体介导的递送和纳米粒子促进的递送。
接受组合物递送的哺乳动物可以是人、灵长类动物、非人灵长类动物、奶牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物(bovid)、鹿、刺猬、象、大羊驼、羊驼(alpaca)、小鼠、大鼠以及鸡。
组合物可通过不同途径施用，包括口服、肠胃外、舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局部、通过吸入、通过颊部施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内以及关节内或其组合。对于兽医用途，可根据普通兽医实践将组合物作为适当可接受的配制物施用。兽医能够容易地确定最适于特定动物的给药方案和施用途径。组合物可通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击枪”或其它物理方法，如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波来施用。
电穿孔
通过电穿孔施用组合物可使用电穿孔装置完成，所述电穿孔装置可被配置成向所期望的哺乳动物组织递送可有效引起可逆孔隙在细胞膜中形成的能量脉冲，并且优选所述能量脉冲是类似于用户输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置可包含电穿孔组件和电极组合件或手柄组合件。电穿孔组件可包括并且并入有电穿孔装置的多个元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器组件、电源以及电源开关。电穿孔可使用体内电穿孔装置实现，例如CELLECTRA EP系统(宾夕法尼亚州普利茅斯米丁(Plymouth Meeting,PA)Inovio制药公司(Inovio Pharmaceuticals))或Elgen电穿孔器(宾夕法尼亚州普利茅斯米丁Inovio制药公司)，以促进质粒转染细胞。
电穿孔组件可充当电穿孔装置的一个元件，并且其它元件是与电穿孔组件通信的独立元件(或组件)。电穿孔组件可充当电穿孔装置的多于一个元件，其可与电穿孔装置的与电穿孔组件分开的另外其它元件通信。作为一个机电或机械装置的部分存在的电穿孔装置的元件可不受限制，因为所述元件可充当一个装置或充当与彼此通信的独立元件。电穿孔组件可能能够递送在所期望的组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机构。电极组合件可包括在空间布置中具有多个电极的电极阵列，其中电极组合件从电穿孔组件接收能量脉冲，并且将其通过电极递送到所期望的组织。多个电极中的至少一个在能量脉冲递送期间是中性的，并且测量所期望的组织中的阻抗且将阻抗传达到电穿孔组件。反馈机构可接收测得的阻抗，并且可调整电穿孔组件所递送的能量脉冲以维持恒定电流。
多个电极可以分散型模式递送能量脉冲。多个电极可通过在编程序列下控制电极，以分散型模式递送能量脉冲，并且编程序列由用户输入到电穿孔组件。编程序列可包含依序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每个脉冲由至少两个作用电极递送，伴随一个测量阻抗的中性电极，并且其中多个脉冲中的后续脉冲由至少两个作用电极中的不同一个递送，伴随一个测量阻抗的中性电极。
反馈机构可由硬件或软件执行。反馈机构可由模拟闭环电路执行。反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生，但优选是实时反馈或瞬时的(即，如可用于测定响应时间的技术所测定，大体上瞬时)。中性电极可测量所期望的组织中的阻抗且将阻抗传达到反馈机构，并且反馈机构对阻抗作出响应且调整能量脉冲以将恒定电流维持在类似于预设电流的值下。反馈机构可在能量脉冲递送期间连续且瞬时地维持恒定电流。
可促进本发明的组合物递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号和Smith等人所提交的美国专利公开2005/0052630中所描述的那些，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。可用于促进组合物递送的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的同在申请中且共同拥有的美国专利申请第11/874072号中所提供的那些，所述申请依据35 USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请第60/852,149号和2007年10月10日提交的美国临时申请第60/978,982号的权益，所述文献均全文并入本文中。
Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号描述模块化电极系统和其用途，其用于使得便于将生物分子引入到身体或植物中选定组织的细胞中。模块化电极系统可包含多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；以及电源。操作人员可握住安装在支撑结构上的多个针电极并且将其牢固地插入身体或植物中的选定组织中。随后通过皮下注射针将生物分子递送到选定组织中。将可编程恒流脉冲控制器激活并且将恒流电脉冲施加到多个针电极。施加的恒流电脉冲有助于将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利第7,245,963号的完整内容以引用的方式并入本文中。
Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630描述电穿孔装置，其可以用于有效便于将生物分子引入到身体或植物中选定组织的细胞中。所述电穿孔装置包含电动装置(“EKD装置”)，其操作通过软件或固件来指定。所述EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输入，在阵列中的电极之间产生一系列可编程恒流脉冲图案，并且使得能够存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包含具有针电极阵列的可更换电极盘、用于注射针的中心注射通道，以及可拆卸式导引盘。美国专利公开2005/0052630的完整内容以引用的方式并入本文中。
美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/0052630中所描述的电极阵列和方法可适用于不仅深穿透到如肌肉的组织中，而且深穿透到其它组织或器官中。由于电极阵列的配置，还将注射针(用于递送所选生物分子)完全插入靶器官中，并且在电极预先划定的区域中垂直于靶组织施用注射。美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/005263中所描述的电极优选是20mm长和21号规格。
另外，并入有电穿孔装置和其用途的一些实施例中涵盖电穿孔装置，其为以下专利中所描述的电穿孔装置：1993年12月28日颁发的美国专利5,273,525、2000年8月29日颁发的美国专利6,110,161、2001年7月17日颁发的美国专利6,261,281和2005年10月25日颁发的美国专利6,958,060，以及2005年9月6日颁发的美国专利6,939,862。此外，本文所涵盖的专利涵盖2004年2月24日颁发的美国专利6,697,669中所提供的主题，其涉及使用多种装置中的任一种递送DNA；和2008年2月5日颁发的美国专利7,328,064，其涉及注射DNA的方法。以上专利以全文引用的方式并入。
10.治疗方法
本文还提供通过在个体中生成合成抗体，治疗、防止和/或预防有需要的个体的疾病的方法。所述方法可包括向个体施用组合物。向个体施用组合物可使用上文所描述的递送方法进行。
在某些实施例中，本发明提供治疗防止和/或预防RSV感染的方法。在一个实施例中，所述方法治疗、防止和/或预防与RSV相关的疾病。
在个体中生成合成抗体后，合成抗体可结合到抗原或与抗原反应。此类结合可中和抗原，阻断抗原由另一分子(例如，蛋白质或核酸)的识别，并且诱发或诱导针对抗原的免疫反应，从而治疗、防止和/或预防个体的与抗原相关的疾病。
合成抗体可治疗、预防和/或防止施用组合物的个体的疾病。合成抗体通过结合抗原可治疗、预防和/或防止施用组合物的个体的疾病。合成抗体可提高施用组合物的个体的疾病生存率。在一个实施例中，相比于尚未施用合成抗体的患有疾病的个体的预期生存率，合成抗体可在个体中提供提高的疾病生存率。在各种实施例中，相比于在不存在组合物的情况下的预期生存率，合成抗体可在施用组合物的个体中提供疾病生存率的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％提高。在一个实施例中，相比于尚未施用合成抗体的个体的预期防护，合成抗体可在个体中提供提高的对疾病的防护。在各种实施例中，相比于在不存在组合物的情况下的预期防护，合成抗体可在至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的施用组合物的个体中防止疾病。
组合物剂量可以在1微克到10毫克活性组分/千克体重/时间之间，并且可以是20微克到10毫克组分/千克体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用组合物。用于有效治疗的组合物剂量数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次剂量。
11.与抗生素组合的用途
本发明还提供治疗、防止和/或有需要个体的疾病的方法，其通过施用合成抗体与治疗性抗生素剂的组合进行。
合成抗体和抗生素剂可使用任何合适方法施用，使得合成抗体与抗生素剂的组合都存在于个体中。在一个实施例中，所述方法可包含通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第一组合物，和在施用合成抗体之后少于1天、少于2天、少于3天、少于4天、少于5天、少于6天、少于7天、少于8天、少于9天或少于10天施用包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施例中，所述方法可包含通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第一组合物，和在施用合成抗体之后多于1天、多于2天、多于3天、多于4天、多于5天、多于6天、多于7天、多于8天、多于9天或多于10天施用包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施例中，所述方法可包含施用包含抗生素剂的第一组合物，和在施用抗生素剂之后少于1天、少于2天、少于3天、少于4天、少于5天、少于6天、少于7天、少于8天、少于9天或少于10天通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第二组合物。在一个实施例中，所述方法可包含施用包含抗生素剂的第一组合物，和在施用抗生素剂之后多于1天、多于2天、多于3天、多于4天、多于5天、多于6天、多于7天、多于8天、多于9天或多于10天通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第二组合物。在一个实施例中，所述方法可包含并行地通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第一组合物并且施用包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施例中，所述方法可包含并行地通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第一组合物并且施用包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施例中，所述方法可包含施用包含本发明的合成抗体和抗生素剂的单一组合物。
可与本发明的合成抗体组合使用的抗生素的非限制性实例包括氨基糖苷类(例如，庆大霉素(gentamicin)、氨丁卡霉素(amikacin)、妥布霉素(tobramycin))、喹诺酮(quinolone)(例如，环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin))、头孢菌素(cephalosporin)(例如，头孢他啶(ceftazidime)、头孢吡肟(cefepime)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢匹罗(cefpirome)、头孢吡普(ceftobiprole))、抗假单胞菌青霉素：羧基青霉素(carboxypenicillin)(例如，羧苄西林(carbenicillin)和替卡西林(ticarcillin))和脲基青霉素(ureidopenicillin)(例如，美洛西林(mezlocillin)、阿洛西林(azlocillin)和哌拉西林(piperacillin))、碳青霉烯(例如，美罗培南(meropenem)、亚胺培南(imipenem)、多尼培南(doripenem))、多粘菌素类(polymyxin)(例如，多粘菌素B和粘杆菌素(colistin))以及单环β-内酰胺类(monobactam)(例如，氨曲南(aztreonam))。
12.合成抗体的试管内和体外生成
在一个实施例中，在试管内或体外生成合成抗体。举例来说，在一个实施例中，可在试管内或体外细胞中引入并且表达编码合成抗体的核酸。将基因引入并且表达到细胞中的方法是所属领域中已知的。在表达载体的情形下，可容易地通过所属领域中的任何方法将载体引入到宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。举例来说，可通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。
将聚核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、微注射、电穿孔以及其类似方法。产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是所属领域中众所周知的。参见例如Sambrook等人(2012,《分子克隆：实验指南(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》,纽约州冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory,New York))。将聚核苷酸引入到宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染。
将所关注的聚核苷酸引入到宿主细胞中的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入到哺乳动物，例如人细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒，以及其类似物。参见例如美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
用于将聚核苷酸引入到宿主细胞中的化学方法包括胶体分散系统，如高分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒，和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束以及脂质体。用作试管内和体内递送媒剂的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒剂是脂质体。设想了使用脂质配制物以便将核酸引入到宿主细胞中(试管内、体外或体内)。在另一方面中，核酸可与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可囊封于脂质体的含水内部中、穿插在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子连接到脂质体、包覆在脂质体中、与脂质体复合、分散于含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液含于脂质中、与胶束一起含有或与胶束复合，或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。举例来说，其可以双层结构存在、以胶束形式存在或以“崩塌(collapsed)”结构存在。其也可简单地散布在溶液中，有可能形成尺寸或形状不均一的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的脂质或合成脂质。举例来说，脂质包括细胞质中天然产生的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃和其衍生物的化合物种类，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇以及醛。
13.实例
本发明在以下实例中进一步说明。应理解，这些实例虽然指出本发明的优选实施例，但是其仅为了说明而提供。根据以上论述和这些实例，所属领域的技术人员可确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，所属领域的技术人员根据以上描述将显而易知除本文所示和所述之外的本发明的各种修改。此类修改也意图在所附权利要求书的范围内。
实例1
本文所呈现的数据展现采用经工程改造的抗RSV-F DNA编码的单克隆抗体(dMAb)的抗体基因递送平台，其可克服使得重组单克隆抗体(mAb)作为靶标感染性疾病的预防剂的全球使用受限的许多障碍。在实验动物模型中，这种抗体构筑体基因的体内递送在血清中产生稳健全身水平的抗体。在作为模型化RSV感染的黄金标准动物的棉鼠中，观察到dMAb的持续血清表达和抗体在肺灌洗样品中的存在，展现长效免疫和有效生物分布的潜能。此外，来自携带RSV-F dMAb的动物的血清就抗原结合和中和活病毒来说具有功能活性，并且RSV-F dMAb赋予对疾病攻击的防护。重要的是，在替代模型化人RSV感染的黄金标准动物，即棉鼠中，这种RSV-F dMAb在活病毒攻击研究中提供对下呼吸道疾病的防护。这些研究结果证明了dMAb作为拓宽对基于单克隆抗体的免疫预防剂的全球获取性和解决感染性疾病的负担的潜在平台技术的重要性。
现描述材料和方法。
动物
将4与6周龄之间的雌性Balb/c小鼠和6与8周龄之间的棉鼠群养，其任意获取饲料和水。
动物处理
将小鼠和棉鼠在其后腿肌肉上方刮毛。将RSV-F dMAb质粒DNA与117.8-128.5U/ml人重组透明质酸酶(
Figure BDA0002709566920000371
加利福尼亚州圣迭戈Halozyme)一起配制。小鼠接受30μl并且棉鼠接受200μl肌肉内(IM)注射的配制物。注射深度在小鼠中控制为2mm并且在棉鼠中控制为5mm。在注射部位用
Figure BDA0002709566920000372
递送EP。三个针电极的阵列以3mm插入深度用于小鼠并且以6mm深度用于棉鼠。EP处理由两组0.1安培恒定电流的脉冲组成。第二脉冲组延迟3秒。每个组内存在两个52ms脉冲，脉冲之间延迟198ms。
免疫荧光染色
IM递送pDNA后7天，收集棉鼠和小鼠肌肉组织，将其固定在10％中性缓冲福尔马林(马萨诸塞州斯坦福(Stanford,MA)BBC Biochemical)中，并且浸没在30％(w/v)蔗糖(密苏里州圣路易斯西格玛(Sigma,Saint Louis,MO))的D.I.水溶液中以便dMAb表达的体内染色。随后将组织包埋到O.C.T.化合物(加利福尼亚州托兰斯(Torrance,CA)SakuraFinetek)中并且速冻(snap-frozen)。将冷冻组织块切片为18μm厚度。
对于dMAb表达的试管内染色，将经转染293T细胞在腔式载玻片上培养，并且在转染后3天在室温下用10％中性缓冲福尔马林(BBC Biochemical)固定10分钟，且随后用PBS洗涤。
将载玻片与封闭缓冲液(0.3％(v/v)Triton-X(西格玛)，2％(v/v)驴血清，在PBS中)一起培育30分钟，用石蜡膜覆盖。将山羊抗人IgG-Fc片段抗体(德克萨斯州蒙哥马利(Montgomery,TX)Bethyl)1:100稀释于培育缓冲液(1％(w/v)BSA(西格玛)，2％(v/v)驴血清，0.3％(v/v)Triton-X(西格玛)和0.025％(v/v)1g/ml叠氮化钠(西格玛)，在PBS中)中。将150μl染色溶液添加到每个载玻片中并且培育2小时。将载玻片在1×PBS中洗涤5分钟，进行三次。将驴抗山羊IgG AF488(英国剑桥艾博抗(Abcam,Cambridge,UK))1:200稀释于培育缓冲液中，并且将50μl添加到每个切片中。将载玻片在1小时培育后洗涤，并且与DAPI-Fluoromount(亚拉巴马州伯明翰南方生物科技(SouthernBiotech,Birmingham,AL))一起安放且覆盖。
用配备有Retiga3000单色相机(加拿大素里(Surrey,Canada)QImaging)的BX51荧光显微镜(宾夕法尼亚州中心谷奥林巴斯(Olympus,Center Valley,PA))对dMAb构筑体的体内和试管内表达进行成像。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
使用脂染胺3000转染试剂盒(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔(ThermoFisher,Waltham,MA))，用编码人RSV IgG和sc-Fv-Fc RSV-dMAb的质粒来转染贴壁HEK 293T细胞(
Figure BDA0002709566920000381
CRL11268TM)。转染后72小时收集培养基，并且使用0.22μm stericup-GP真空过滤系统(马萨诸塞州伯林顿密理博(Millipore,Burlington,MA))对其进行过滤。根据制造商说明书，使用蛋白A离心柱(赛默飞世尔)纯化来自经sc-Fv-Fc RSV dMAb转染的细胞的上清液。将洗脱蛋白质通过Amicon Ultra-15离心过滤器单元(30kDa)浓缩并且通过Nanodrop定量。根据制造商说明书，使用蛋白G GraviTrap(伊利诺伊州芝加哥通用电气医疗集团(GEHealthcare,Chicago,IL))纯化来自经人RSV IgG转染的细胞的上清液。通过AmiconUltra-15离心过滤器单元(30kDa)浓缩洗脱蛋白质。将10μg的每种样品上样到NuPAGETM 4-12％Bis-Tris凝胶(赛默飞世尔)上。Precision Plus Protein Kaleidoscope预染色蛋白质标准品(加利福尼亚州赫拉克勒斯拜耳雷德(Bio-Rad,Hercules,CA))用作标准标记。使用iBlotTM 2转移装置(马萨诸塞州沃尔瑟姆英杰公司)将凝胶转移到PVDF膜。将膜在室温下用山羊组织学缓冲液(1％(w/v)BSA(西格玛)，2％(v/v)山羊血清，0.3％(v/v)Triton-X(西格玛)和0.025％(v/v)1g/ml叠氮化钠(西格玛)，在PBS中)封闭30分钟。添加山羊抗人IgG重链和轻链猴吸附抗体HRP缀合物(A80-319P，Bethyl)于山羊组织学缓冲液中的1:5000稀释液，并且将其在室温下培育1小时。在1×DPBS(犹他州洛根海克隆(HyClone,Logan,UT))中洗涤印迹5分钟三次后，添加山羊抗人IgG-Fc片段抗体HRP(A80-104P，Bethyl)于山羊组织学缓冲液中的1:5000稀释液，并且将其在室温下培育1小时。在1×DPBS中洗涤印迹5分钟三次后，将膜使用ECLTM Prime蛋白质印迹系统(通用电气医疗集团)显色，并且使用ProteinSimple FluorChem系统成像。
动物血清和BAL中人RSV-F dMAb的定量
将96孔分析板(赛默科技(Thermo Scientific))用1微克/孔于1×DPBS(赛默飞世尔)中的山羊抗huIgG Fc片段抗体(Bethyl)在4℃下涂布过夜。第二天，将板用于1×PBS洗涤缓冲液中的0.2％(v/v)吐温(TWEEN)洗涤，并且在室温下用于1×DPBS中的10％(v/v)FBS封闭1小时。将血清样品在于0.2％(v/v)吐温-1×PBS中的1％(v/v)FBS中稀释，并且将100μl的这种混合物添加到洗涤过的分析板中。另外，在稀释缓冲液中以1:2连续稀释液形式，以500ng/ml起始制备纯化人单链抗体的标准稀释液，并且将其一式两份添加到每个分析板中。在室温下培育样品和标准品1小时。洗涤后，将板在室温下与1:10,000稀释山羊抗人IgG-Fc片段抗体HRP(Bethyl，A80-104P)一起培育1小时。为了进行检测，将SureBlue底物溶液(马萨诸塞州米尔福德(Milford,MA)Seracare)添加到洗涤过的板中。通过在6分钟后将TMB停止溶液(马萨诸塞州米尔福德Seracare)添加到分析板中停止反应。在450nm下读取O.D.。使用浓度对数的S形四参数逻辑曲线拟合，从标准曲线内插血清水平表达。
抗原结合ELISA
将分析板用1微克/孔在1×DPBS(赛默飞世尔)中稀释的人呼吸道合胞病毒(RSV)(A2)融合糖蛋白(宾夕法尼亚州韦恩义翘神州(Sino Biological,Wayne,PA))在4℃下涂布过夜。将板用含0.05％吐温的1×PBS缓冲液洗涤。添加250微升/孔于含0.05％吐温的1×PBS中的3％(w/v)BSA，并且将其在室温下培育1小时。将血清样品在含0.05％吐温的1×PBS中的1％(w/v)BSA中稀释。洗涤分析板后，以三倍连续稀释添加血清样品。将板在室温下培育1小时。洗涤后，添加100μl 1:10000稀释的山羊抗人IgG-Fc片段抗体HRP(Bethyl，A80-104P)，并且将其在室温下培育1小时。为了显色，使用SureBlue/TMB停止溶液(马萨诸塞州米尔福德Seracare)，并且在450nm下记录O.D.。
RSV中和抗体分析(60％减少)
将热处理血清样品用EMEM 1:10稀释，并且进一步1:4连续稀释。将稀释血清样品与RSV(25-50个空斑形成单位)在室温下一起培育1小时，并且在24孔板中一式两份接种到汇合HEp-2单层上。在5％CO2培育箱中在37℃下培育一小时后，将孔上覆0.75％甲基纤维素培养基。4天培育后，去除上覆物，并且将细胞用0.1％结晶紫染色剂固定一小时且随后漂洗并风干。使用统计程序，在病毒控制60％减少端点处测定对应倒数中和抗体效价。计算一组中所有动物的几何平均值±标准误差。
棉鼠攻击研究
动物：
将十五(15)只6与8周龄之间的近交雌性刚毛棉鼠(Sigmodon hispidus)棉鼠(来源：马里兰州罗克维尔(Rockville MD)Sigmovir Biosystems,Inc.)根据美国国立卫生研究院准则和Sigmovir机构动物护理和使用委员会批准的动物研究方案在兽医学监督下维持且处置。将棉鼠分别圈养于透明聚碳酸酯笼中，并且提供有标准啮齿动物普通食物(Harlan#7004)和自由获取的自来水。
攻击病毒：
将RSV/A原型Long病毒株(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA)ATCC)在连续空斑纯化以减少缺损干扰颗粒后在HEp-2细胞中繁殖。对于这一体内实验，使用指定为hRSV/A/Long批号021413的病毒池，其在蔗糖稳定化培养基中制备，并且含有大致2×107个空斑形成单位/毫升。这一病毒储备液在-80℃条件下储存，并且已针对上呼吸道和下呼吸道复制使用棉鼠模型体内表征。
程序：
将15只成年雌性棉鼠(6-8周龄)分成三个组，每组五只动物。将RSV-dMAb组的动物在实验第0天如上文所描述处理。将帕利珠单抗对照组中的动物在实验第6天用0.1ml15mg/kg帕利珠单抗IM注射。第三组动物保持未处理。在第7天，将所有动物用105个空斑形成单位的RSV/A/Long(IN)以0.1mL体积攻击。在第12天处死所有动物。整体收集肺并且三等分，左部用于病毒滴定，并且舌叶用于qPCR。
肺病毒滴定
将肺匀浆通过离心澄清并且在EMEM中稀释。在24孔板中将汇合HEp-2单层用稀释匀浆一式两份感染。在5％CO2培育箱中在37℃下培育一小时后，将孔上覆0.75％甲基纤维素培养基。培育4天后，去除上覆物，并且将细胞用0.1％结晶紫染色剂固定一小时且随后漂洗并风干。对空斑进行计数并且病毒滴度表述为空斑形成单位/克组织。病毒滴度按给定时间下一组中所有动物的几何平均值+标准误差计算。
肺组织的实时PCR
使用RNeasy纯化试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚凯杰(QIAGEN,Valencia,CA))从均质化肺组织中提取总RNA。使用Super Script II RT(英杰公司)和寡核苷酸dT引物(1μl，英杰公司)，用一μg总RNA来制备cDNA。对于实时PCR反应，以25μl最终体积使用拜耳雷德iQTMSYBR Green超混合液，最终引物浓度为0.5μM。在96孔托板中一式两份设置反应。扩增在拜耳雷德iCycler上执行1个95℃循环持续3分钟，接着40个95℃循环持续10秒，60℃循环持续10秒，以及72℃循环持续15秒。通过iQ5软件以PCR基线减除曲线拟合模式计算基线循环和循环阈值(Ct)。DNA相对定量应用于所有样品。使用最富含所关注转录物的连续稀释cDNA样品(例如，来自初次RSV感染后第4天的肺)建立标准曲线。Ct值相对于log10 cDNA稀释系数绘制。这些曲线用于将针对不同样品获得的Ct值转换为相对表达单位。随后将这些相对表达单位相对于对应样品中所表达的b肌动蛋白mRNA(“管家基因”)水平归一化。对于动物研究，mRNA水平表述为给定时间下一组中所有动物的几何平均值+SEM。
统计
用GraphPad Prism v.7使用非参数双尾曼-惠特尼t检验执行统计分析。
现描述结果。
RSV-F-dMAb构筑体设计
抗RSV-F dMAb是基于经FDA批准抗RSV mAb帕利珠单抗。为了辅助分子设计，使用Discovery Studio 4.5(加利福尼亚州圣迭戈Biovia)生成呈可变片段(Fv)格式和单链可变片段(scFv)格式两者的dMAb模型。使用(G4S)3接头以VH-VL和VL-VH取向两者模型化scFv。基于模型化结果，选择VL-VH取向，因为预测其引起对scFv可变结构域的最小干扰(图1A)。sc-Fv-Fc RSV-F dMAb(RSV-F dMAb)的基因克隆到pVAX骨架中，并且处于人CMV启动子的控制下(图1B)。RSV-F dMAb表达由试管内经RSV-F dMAb pDNA转染的293T细胞的免疫荧光染色证实(图1C)。染色展现RSV-F-dMAb的胞质表达。293T细胞分泌RSV-F dMAb由细胞培养上清液的蛋白质印迹分析证实(图1D)。如所预期，对于帕利珠单抗-IgG观察到2条带，表示重链(57kDa)和轻链(26kDa)，并且对于单链RSV-F dMAb构筑体检测到单一带(60kDa)。
dMAb体内表达模型
为了dMAb的最优体内表达，开发增强的pDNA递送方案。将dMAb pDNA与细胞外基质(ECM)干扰酶、透明质酸酶一起配制，并且用体内电穿孔递送到肌肉。图2A中所呈现的示意图概述dMAb平台，突出显示递送和体内表达。简单来说，借助于电穿孔将dMAb pDNA递送到骨骼肌。可通过在肌细胞中对人IgG进行染色，使IM递送部位处的dMAb表达可视化(图2B)。在产生dMAb后，肌细胞将抗体构筑体分泌到循环血量中。可在血清中测量dMAb(图2C)。dMAb的表达可持续数月。
BALB/c小鼠中的RSV-F dMAb体内表达
体内评定功能性RSV-F dMAb的表达。将BALB/c小鼠用向TA肌肉施用的50μg RSV-FdMAb pDNA给药。RSV-F dMAb的第7天血清浓度平均值为7500ng/ml(图3A)。第7天后存在血清浓度的衰减，其与针对异种人抗体构筑体产生的宿主抗药物抗体(ADA)反应相关(数据未图示)。所表达的RSV-F dMAb结合RSV-F抗原的能力由与未经处理动物相比，来自经处理动物的血清样品的ELISA证实(图3B)。来自经RSV-dMAb构筑体处理的动物的血清展示强烈血清稀释依赖性结合信号，并且在较高血清浓度下展现‘钩效应(hook-effect)’。体内表达的RSV-F dMAb的RSV-F结合能力转化成病毒中和功能。携带RSV-F-dMAb的血清达到7log2的稳健RSV/A病毒中和滴度(图3C)。RSV-F dMAb向RSV感染部位的生物分布在肺灌洗样品中证实。RSV-F dMAb施用到TA肌肉后7天，成功地测量到支气管肺泡灌洗(BAL)样品中的dMAb，其为11.25摩尔mAb/克总蛋白+/-SEM 2.65(图3D)。综上所述，IM递送RSV-F dMAb引起功能性抗RSV-F抗体构筑体产生，其存在于体循环中和自然RSV感染的生理相关部位处。
棉鼠中RSV-F dMAb的体内表达
棉鼠被视为模型化RSV感染和药物干预的黄金标准模型。棉鼠对非适应性人RSV敏感，并且对感染的容许度比小鼠高100倍。其还显示人疾病病理的许多特征21,22。
首先，在向腿肌递送RSV-F dMAb pDNA后评定棉鼠肌细胞表达dMAb构筑体的能力(图4A)。接下来，测试局部dMAb表达是否引起全身表达。测量到棉鼠血清中持续(超过5周)水平(1,000ng/ml以上)的RSV-F dMAb(图4B)。在RSV/A中和分析中测试所表达的dMAb的功能。在空斑减少分析中，测量到5.4的平均中和效价(图4C)。在BAL液中评定dMAb向RSV感染部位的生物分布。
来自这些动物的BAL样品中的RSV-F dMAb的平均水平是10.8摩尔/克总蛋白(图4D)。综上所述，向棉鼠肌肉递送RSV-F-dMAb pDNA引起功能性抗体的全身产生，所述抗体中和RSV病毒并且存在于肺中。
体内表达的RSV-dMAb赋予对下呼吸道疾病的防护
在棉鼠中达成功能性抗RSV-F dMAb的能力引导我们在主动免疫预防研究中测试平台的功效(图5A)。将独立组的棉鼠用RSV-F-dMAb(第1组)或帕利珠单抗(第2组)给药，或保持未经处理。在第0天用105个空斑形成单位的RSV/A/Long鼻内攻击所有组。攻击后五天收集肺组织并且测量病毒负荷。第1组和第2组都受保护免于与RSV感染相关的下呼吸道疾病。鼻内攻击后5天，经dMAb处理的棉鼠的肺含有250个空斑形成单位(SEM＝50)的均值病毒负荷。对于经帕利珠单抗处理的棉鼠的肺测量到类似的病毒负荷：200个空斑形成单位(SEM＝0)。相比之下，未经处理的棉鼠的肺含有27,520个空斑形成单位(SEM＝8408.9)的高病毒负荷)(图5B)。利用实时PCR，使用靶向RSV的非结构蛋白1(NS1)的引物，测量到下呼吸道组织中显著减少的病毒基因组拷贝数。与未经处理的动物(均值RSV mRNA＝1.175，SEM＝0.306)相比，经dMAb(均值RSV mRNA＝0.181，SEM＝0.050)处理的棉鼠和经帕利珠单抗(均值RSV mRNA＝0.032，SEM＝0.004)处理的棉鼠中的均值RSV-mRNA水平降低(图5C)。值得注意的，经dMAb处理的棉鼠受保护免于下呼吸道疾病，不过RSV-F dMAb血清水平比针对帕利珠单抗测量到的血清水平低大致10倍(图5D)。综上所述，这些数据展现在黄金标准疾病模型中，AIP平台使用抗RSV-F dMAb防止病毒攻击的能力。
在活病毒攻击中DMAb保护免于下呼吸道疾病
紧迫需要开发可用以提高预防和治疗性单克隆抗体的患者获取性的平台技术。这里呈现的工作突出显示抗体基因递送平台dMAb实现此的潜能。这是使用基于经FDA批准的mAb帕利珠单抗的dMAb构筑体适用于RSV靶标的技术。数据展现dMAb构筑体在多个临床前模型中的成功体内表达，和赋予宿主防止病毒攻击的能力(图5)。这里和其它最近报导10-13,23中呈现的数据突出显示dMAb平台作为大量感染性疾病的预防选项的特征和功效。
dMAb技术的成功依赖于pDNA向宿主的有效递送。体内dMAb递送靶向骨骼肌中的宿主肌细胞，骨骼肌被视为内分泌器官，极擅长合成和分泌多种因子24。此外，肌细胞存活时间极长，并且这些特征在一起使得肌肉成为高水平转基因表达的理想生物工厂，可持续至多几个月递送25,26。然而，为了利用肌肉部位作为产生mAb的生物工厂的全部潜能需要dMAbpDNA向肌细胞的高效递送。为优化dMAb pDNA向肌肉中的递送，使用EP和ECM修饰酶透明质酸酶。这突出显示这种递送方案如何在递送部位处肌细胞中实现稳健dMAb表达(图2b)，其引起高水平的dMAb分泌到循环中(图2c)。重要的是，其展现这种稳健表达得到保持。在不存在针对异种dMAb的适应性宿主免疫反应的情况下，展现23周长的表达(图2C)。即使在野生型棉鼠中具有功能的免疫系统的存在下也展示39天的表达(图4B)。持续表达是免疫预防模态的极重要组成部分，并且是在常规重组mAb的情况下缺少的特征。举例来说，帕利珠单抗的施用理想地在RSV季开始之前起始，RSV季通常从11月持续到4月，具有地区偏差27。帕利珠单抗以15mg/kg给药并且必须在整个RSV季中通过肌肉内注射每月施用。已报导血清半衰期为20天28,29。另一方面，帕利珠单抗的dMAb对应物连续表达并分泌，并且可维持有效循环水平的mAb。单次递送dMAb将在整个RSV季中在患者血清中提供保护性mAb。在延长的药代动力学(pK)研究中观察到在棉鼠中人RSV-F dMAb水平保持稳定至多6周(图4B)，并且在T细胞耗乏小鼠中保持稳定持续数月(图2C)，支持了这一点。
sc-Fv抗体的特征为其优秀的生物分布。由于其尺寸小，因此其高效穿透组织。然而，在那里，有效性受到仅几个小时的血清半衰期的限制。融合到Fc蛋白将所得sc-Fv-Fc分子的血清半衰期从数小时延长到多天30。尽管其未超过全长IgG分子的半衰期，但归因于由于其较小尺寸仍展现优良生物分布31。在小鼠和棉鼠的肺中成功地检测到RSV-dMAb(图3D和4D)。较小sc-Fv-Fc分子存在于RSV感染部位处的提高的能力可解释相似水平的对下呼吸道疾病的防护(图5B和图5C)，尽管与帕利珠单抗相比血清浓度低10倍(图5D)。为了使得可更精确比较两种分子和其生物分布，将针对在病毒攻击时在动物血清中处于相同浓度下的两种mAb构筑体设计未来实验。之前报导了RSV攻击后mAb的生物分布在预防LRD中的重要性。Wu等人报导帕利珠单抗变异体归因于不良生物分布体内功效较低，不管试管内中和能力如何高32。Tiwari等人报导通过直接靶向肺组织以便表达mRNA编码的RSV-Ab的有前景的结果33。
尽管已采用其它平台来递送抗体基因，但dMAb具有优于其它基于核酸的单克隆抗体技术，包括病毒载体和基于mRNA递送抗体的多个优点。首先，dMAb是裸pDNA平台，因此其避免抗载体免疫(这限制了基于腺病毒或重组腺相关病毒的基因递送)，并且不需要潜在具有毒性的化学递送平台媒剂。基于mRNA的mAb一般需要脂质纳米粒子配制物34-36。如上文所论述和本研究中呈现的数据中所突出显示，存在dMAb的持续但有限的表达谱。mRNA编码的抗体具有显著较短血清半衰期，更紧密地与重组抗体的那些匹配，而腺病毒或重组腺相关病毒递送抗体基因可能导致无限制的表达，由转基因整合到体细胞DNA中和潜在不受限表达引起安全问题37。另外，不同于IV递送并且在现场需要大量基础设施以向患者给药的许多重组和基于mRNA的抗体候选物，dMAb可就地IM施用。质粒DNA相对容易制造，使得可非常节约成本地生产。配制的质粒DNA温度稳定而不需要冻干，并且其储存和分销不需要冷链。
综上所述，在已建立的疾病模型中应用dMAb平台靶向感染性疾病RSV，这一数据展现RSV抗体构筑体在动物的血清和肺中的稳健循环水平。此外，在活病毒攻击研究中，体内表达的抗体构筑体具有功能活性，并且提供对下呼吸道疾病的防护(图5)。这些研究结果证明了dMAb技术的重要性，和其对抗由感染性疾病所引起的全球死亡的潜能。
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实例2
本文描述经工程改造的单链抗RSV-F可变片段(scFv)DMAb(表1)。体内递送这种抗体构筑体基因在小鼠血清中产生稳健全身水平的抗体。等效水平与对来自RSV感染的下呼吸道疾病的防护相关。在作为模型化RSV感染之后人疾病的黄金标准的棉鼠中，观察到递送后至多60天的维持的DMAb血清表达。还在肺灌洗样品中检测到抗体，展现有效生物分布。此外，来自携带RSV-F scFv DMAb的动物的血清就抗原结合和中和活病毒来说具有功能活性。这些研究结果证明了作为携带基于单克隆抗体的免疫预防剂的可行平台技术的dMAb作为解决感染性疾病的经济且有效选项的重要性。
表1.RSV DMAb质粒
DMAb 描述 Fc/构象 递送方案
9206 莫维珠单抗 huIgG 30分钟预处理西格玛-HYA
9368 帕利珠单抗 huIgG 共配制Intropharma HYA
9369 帕利珠单抗 huIgG sc-Fv 共配制Intropharma HYA
9370 帕利珠单抗 muIgG 共配制Intropharma HYA
9371 帕利珠单抗 muIgG sc-Fv 共配制Intropharma HYA
9283 ADImab huIgG 共配制透明质酸酶
实例3
这里数据呈现经工程改造的抗RSV-F dMAb和优化递送方案。dMAb的全身表达的动力学和量值按动物血清中sc-FV IgG dMAb的浓度测量。通过测量经处理动物的肺灌洗样品检查生物分布。还针对结合和中和功能测试体内表达的dMAb。
本文呈现的数据展现工程改造抗RSV sc-Fv编码DNA质粒与全长人IgG相比具有改良体内表达谱。为进一步增强全身表达，采用优化递送方案。优化配制物通过修改靶组织的胞外基质增强质粒DNA的分散。电穿孔增加靶细胞对DNA分子的细胞摄入。在试管内证实来自经处理小鼠的体内表达的人sc-Fb\v结合到RSV融合蛋白(RSV-F)和中和活RSV-A病毒的功能。除血清水平表达以外，还在肺，自然RSV感染位置中检测到体内表达的人sc-Fv。随后将给药和递送方法应用于棉鼠，RSV治疗开发的标准临床前模型。
这种dMAb的体内递送在小鼠血清中产生稳健全身水平的抗体(图12)。匹配水平的重组帕利珠单抗提供对RSV感染后下呼吸道疾病的防护。在作为模型化RSV感染之后人疾病的黄金标准的棉鼠中，递送后至多60天观察到保持的dMAb血清表达(图13)。还在肺灌洗样品中检测到抗体，展现有效生物分布(图12)。此外，来自携带RSV-F dMAb的动物的血清就抗原结合和中和活病毒来说具有功能活性(图12和14)。
这些结果表明抗RSV人sc-Fv dMAb可以是在整个RSV季中反复注射蛋白质-mAb的有效替代方案。RSV-dMAb具有克服与被动免疫接种相关的障碍中的一些的潜能。
实例4
本文呈现的数据展现RSV dMAb在用于人RSV感染的棉鼠模型中的功效。
描述材料和方法。
肌肉内pDNA递送
将小鼠和棉鼠在其后腿肌肉上方刮毛。将RSV-F dMAb质粒DNA与用于小鼠的128.5U/ml透明质酸酶或用于棉鼠的117.8U/ml透明质酸酶在1×SSC中共同配制。
小鼠接受30ul肌肉内注射，并且棉鼠接受200ul肌肉内注射(图15)。注射深度在小鼠中控制为2mm并且在棉鼠中控制为5mm。pDNA注射后60秒，在注射部位用
Figure BDA0002709566920000511
递送EP。三个针电极的阵列以3mm插入深度用于小鼠并且以6mm深度用于棉鼠。
对动物血清中人Fc RSV-F dMAb的定量
将96孔分析板(赛默科技TM NuncTM)用1微克/孔于1×DPBS(马萨诸塞州赛默飞世尔)中的山羊抗huIgG Fc片段抗体(德克萨斯州Bethyl)在4℃下涂布过夜。第二天，将板用于1×PBS洗涤缓冲液中的0.2％(v/v)吐温洗涤，并且在室温下用于1×DPBS中的10％(v/v)FBS封闭1小时。
将血清样品在于0.2％(v/v)吐温-1×PBS中的1％(v/v)FBS中稀释，并且将100μl的这种混合物在另一洗涤步骤后添加到分析板中。另外，在稀释缓冲液中制备纯化人κ轻链(德克萨斯州Bethyl)的标准稀释液，并且将其添加到每个分析板中。在室温下培育样品和标准品1小时。洗涤后，将板在室温下与山羊抗人IgGκ轻链HRP(德克萨斯州Bethyl)的1:10,000稀释液一起培育1小时。为了进行检测，将SureBlue底物溶液(马里兰州KPL)添加到洗涤过的板中。通过在6分钟后将TMB停止溶液(马里兰州KPL)添加到分析板中停止反应。在450nm下读取O.D.。使用浓度对数的S形四参数逻辑曲线拟合，从标准曲线内插血清水平表达。
棉鼠攻击研究
动物：
将十五(15)只6与8周龄之间的近交雌性刚毛棉鼠(Sigmodon hispidus)棉鼠(来源：马里兰州罗克维尔Sigmovir Biosystems,Inc.)在兽医学监督下维持且处置。将棉鼠分别圈养于透明聚碳酸酯笼中，并且提供有标准啮齿动物普通食物(Harlan#7004)和自由获取的自来水。
攻击病毒：
将RSV/A原型Long病毒株(弗吉尼亚州马纳萨斯ATCC)在连续空斑纯化以减少缺损干扰颗粒后在HEp-2细胞中繁殖。对于这一体内实验，使用指定为hRSV/A/Long批号021413的病毒池，其在蔗糖稳定化培养基中制备，并且含有大致2×107个空斑形成单位/毫升。这一病毒储备液在-80℃条件下储存，并且已针对上呼吸道和下呼吸道复制使用棉鼠模型体内表征。
程序：
将15只成年雌性棉鼠(6-8周龄)分成三个组，每组五只动物。将RSV-dMAb组的动物在实验第0天如上文所描述处理。将帕利珠单抗对照组中的动物在实验第6天用0.1ml15mg/kg帕利珠单抗IM注射。第三组动物保持未处理。
在第7天，将所有动物用105个空斑形成单位的RSV/A/Long(IN)以0.1mL体积攻击。在第12天处死所有动物。收集鼻用于病毒滴定。整体收集肺并且三等分，左部用于病毒滴定，并且舌叶用于qPCR。
肺和鼻病毒滴定
将肺和鼻匀浆通过离心澄清并且在EMEM中稀释。在24孔板中将汇合HEp-2单层用稀释匀浆一式两份感染。在5％CO2培育箱中在37℃下培育一小时后，将孔上覆0.75％甲基纤维素培养基。培育4天后，去除上覆物，并且将细胞用0.1％结晶紫染色剂固定一小时且随后漂洗并风干。对空斑进行计数并且病毒滴度表述为空斑形成单位/克组织。病毒滴度按给定时间下一组中所有动物的几何平均值+标准误差计算。
实时PCR
使用RNeasy纯化试剂盒(凯杰)从均质化肺组织中提取总RNA。使用Super ScriptII RT(英杰公司)和寡核苷酸dT引物(1μl，英杰公司)，用一μg总RNA来制备cDNA。对于实时PCR反应，以25μl最终体积使用拜耳雷德iQTM SYBR Green超混合液，最终引物浓度为0.5μM。在96孔托板中一式两份设置反应。扩增在拜耳雷德iCycler上执行1个95℃循环持续3分钟，接着40个95℃循环持续10秒，60℃循环持续10秒，以及72℃循环持续15秒。通过iQ5软件以PCR基线减除曲线拟合模式计算基线循环和循环阈值(Ct)。DNA相对定量应用于所有样品。使用最富含所关注转录物的连续稀释cDNA样品(例如，来自初次RSV感染后第4天的肺)建立标准曲线。Ct值相对于log10 cDNA稀释系数绘制。这些曲线用于将针对不同样品获得的Ct值转换为相对表达单位。随后将这些相对表达单位相对于对应样品中所表达的b肌动蛋白mRNA(“管家基因”)水平归一化。对于动物研究，mRNA水平表述为给定时间下一组中所有动物的几何平均值+SEM。
现描述结果。
RSV-F dMAb在棉鼠中的体内表达
棉鼠的大小和重量是小鼠的大致4-5倍。为了适应这些较大的啮齿动物，将处理方案修改为200μl的较大注射体积和较深的注射深度和电穿孔电极穿透，如先前RSV-F棉鼠疫苗研究(Smith等人,2017,《疫苗》35(21):2840-47)中所描述。
为了实现较高的RSV-dMAb全身水平，处理部位数增加到每只动物6个，并且能够递送2.4mg dMAb pDNA的总剂量。递送这一最优剂量之后7天和活病毒攻击当天，测量到均值dMAb血清水平为1384.5ng/ml(SD＝189.1，n＝4)。RSV-dMAb表达保持稳定直到攻击实验结束。处理之后第12天，棉鼠血清含有1455.5ng/ml(SD＝345.7，n＝4)的均值dMAb浓度(图15)。
相比之下，注射15mg/kg帕利珠单抗之后一天人IgG均值血清含量是15290.3ng/ml(SD＝6486.7，n＝4)，并且在注射之后5天衰减到10096.6ng/ml(SD＝2110.7，n＝5)的均值血清浓度。
体内表达的RSV-dMAb赋予对下呼吸道疾病的防护
当用活RSV-A病毒攻击时，经dMAb处理的棉鼠类似地受保护免于下呼吸道疾病，不过RSV-dMAb表达水平比帕利珠单抗注射后的血清水平低几乎10倍(图16)。鼻内攻击之后5天，经dMAb处理的棉鼠的肺含有250个空斑形成单位(SEM＝50，n＝4)的均值病毒负荷。针对经帕利珠单抗处理的棉鼠的肺测量到相似的病毒负荷：200个空斑形成单位(SEM＝0，n＝5)。相比之下，不受保护的棉鼠的肺含有27520个空斑形成单位(SEM＝8408.9，n＝5)的高病毒负荷。
当使用靶向RSV的非结构蛋白1(NS1)的引物，用实时PCR测量病毒基因组拷贝数时，发现朝向减少的下呼吸道组织感染的相同趋势。与不受保护的动物(均值RSV mRNA＝1.175，SEM＝0.306，n＝5)相比，受dMAb保护(均值RSV mRNA＝0.181，SEM＝0.050，n＝4)和受帕利珠单抗保护(均值RSV mRNA＝0.032，SEM＝0.004，n＝5)的棉鼠中的均值RSV-mRNA水平降低。
结论
棉鼠是用于人RSV感染的黄金标准模型。这些动物对非适应性人RSV敏感，并且显示病毒特异性人病理学的许多特征，包括用1960'福尔马林灭活RSV疫苗免疫接种后疫苗增强性疾病(VED)的症状。
帕利珠单抗(西那吉斯(Synagis))是当前唯一经FDA批准的保护高风险婴儿免于RSV相关LRI和住院的预防选项。与大部分基于单克隆抗体的疗法一样，用帕利珠单抗治疗昂贵，并且归因于温敏稳定性，其使用主要限于基础设施高度发达的环境。
在大部分相关临床前模型中，蛋白质帕利珠单抗和基于帕利珠单抗的优化dMAb构筑体展现对RSV感染后LRI的类似防护。一般来说，制造dMAb构筑体节约成本并且DNA质粒温度稳定。
基于DNA的单克隆抗体与优化递送方案的组合显现为蛋白质单克隆抗体的有利替代方案。
应理解，前述详细描述和随附实例仅仅是说明性的并且不认为是对本发明范围的限制，本发明的范围仅由随附权利要求书以及其等效物限定。
对所公开实施例的各种改变和修改对于所属领域的技术人员来说是显而易见的。这类改变和修改包括(但不限于)与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间物、合成、组合物、配制物或使用方法有关的那些改变和修改，可以进行这类改变和修改而不脱离其精神和范围。
序列表
<110> 威斯塔解剖学和生物学研究所（THE WISTAR INSTITUTE OF ANATOMY ANDBIOLOGY）
艾诺奥医药品有限公司（INOVIO PHARMACEUTICALS, INC.）
大卫·韦纳（Weiner, David）
卡尔·穆苏马尼（Muthumani, Kar）
陈静（Chen, Jing）
特雷沃·史密斯（Smith, Trevor）
凯瑟琳·舒尔特海斯（Schultheis, Katherine）
<120> 用于抗呼吸道合胞病毒的核酸抗体构筑体
<130> 206194-0023-00WO
<150> 62/624,320
<151> 2018-01-31
<150> 62/749,580
<151> 2018-10-23
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5153
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9368
<400> 1
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accgagctcg gatccgccac catggactgg acatggagaa tcctgttcct ggtggcagca 780
gcaaccggaa cacacgcaca ggtgaccctg agagagtccg gaccagccct ggtgaagcca 840
acccagacac tgaccctgac atgcaccttc tccggctttt ctctgagcac ctccggcatg 900
tctgtgggat ggatcaggca gccccctggc aaggccctgg agtggctggc cgacatctgg 960
tgggacgata agaaggatta caaccctagc ctgaagtccc gcctgacaat cagcaaggac 1020
acctccaaga accaggtggt gctgaaggtg acaaatatgg acccagccga tacagccacc 1080
tactattgcg cccggagcat gatcaccaat tggtatttcg acgtgtgggg cgccggaacc 1140
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agcaagtcta caagcggcgg caccgccgcc ctgggatgtc tggtgaagga ctacttcccc 1260
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tccctgggca cacagaccta tatctgcaac gtgaatcaca agccctctaa taccaaggtg 1440
gacaagaagg tggagcctaa gagctgtgat aagacacaca cctgcccacc ctgtccagca 1500
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atgatctcca gaacacctga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgtctca cgaggacccc 1620
gaggtgaagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcct 1680
cgggaggagc agtacaacag cacatataga gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 1740
gattggctga acggcaagga gtataagtgc aaggtgtcca ataaggccct gcctgcccca 1800
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aagaccacac cacccgtgct ggactccgat ggctctttct ttctgtattc caagctgacc 2040
gtggacaagt ctaggtggca gcagggcaac gtgttttcct gttctgtgat gcacgaggcc 2100
ctgcacaatc actacacaca gaagagcctg tccctgtctc caggcaagag gggaaggaag 2160
cggagaagcg gctccggagc aaccaacttc tccctgctga agcaggcagg cgatgtggag 2220
gagaatccag gacctatggt gctgcagacc caggtgttta tctctctgct gctgtggatc 2280
agcggcgcct acggcgacat ccagatgaca cagtctccaa gcaccctgtc cgcctctgtg 2340
ggcgataggg tgacaatcac ctgcaagtgt cagctgagcg tgggctacat gcactggtat 2400
cagcagaagc ccggcaaggc ccctaagctg ctgatctacg acacctctaa gctggcaagc 2460
ggagtgccct cccgcttcag cggctccggc tctggaacag agtttacact gaccatctct 2520
agcctgcagc ccgacgattt cgccacctac tattgctttc agggcagcgg ctatcccttc 2580
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aagcggacag tggccgcccc cagcgtgttc 2640
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aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact 3300
ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagctct gatcaagaga 3360
caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg 3420
cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg 3480
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cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 4320
ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat 4380
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<210> 2
<211> 4439
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<223> pGX9369
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<220>
<223> pGX9370
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aaccccagag gtgacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt 960
caattggtac gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccaa gagaggagca 1020
gtataactct acatatcgcg tggtgtccgt gctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa 1080
tggcaaggag tacaagtgca aggtgtccaa taaggccctg ccagccccta tcgagaagac 1140
aatctccaag gccaagggcc agcccagaga gccacaggtg tatacactgc caccctccag 1200
agatgagctg acaaagaatc aggtgtccct gacatgtctg gtgaagggct tttatccctc 1260
cgatatcgcc gtggagtggg agtctaatgg ccagcccgag aataactata agacaacccc 1320
tccagtgctg gactccgatg gctccttttt cctgtattcc aagctgaccg tggataagag 1380
caggtggcag cagggcaacg tgttctcttg ttccgtgatg cacgaagcac tgcacaacca 1440
ctacacccag aagtcactgt cactgtcacc aggaaaat 1478
<210> 7
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9369氨基酸序列
<400> 7
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Cys Gln Leu Ser
35 40 45
Val Gly Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr
130 135 140
Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr
145 150 155 160
Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser
165 170 175
Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
180 185 190
Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys
210 215 220
Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
225 230 235 240
Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
340 345 350
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
355 360 365
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
385 390 395 400
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
450 455 460
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
465 470 475 480
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490

Claims (17)

1.一种核酸分子，其编码一种或多种合成抗体，其中所述核酸分子包含选自由以下组成的组的至少一种：
a)编码抗呼吸道合胞病毒(RSV)合成抗体的核苷酸序列；
b)编码抗RSV合成抗体的片段的核苷酸序列；
c)编码ScFv抗RSV合成抗体的核苷酸序列；以及
d)编码ScFv抗RSV合成抗体的片段的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述一种或多种合成抗体结合到RSV抗原。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述抗原选自由以下组成的组：RSV-F、RSV-G、RSV-Ga、RSV-Gb、RSV-M2-1、RSV M2-2以及它们的任何组合。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，进一步包含编码裂解结构域的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的核酸分子，包含编码抗RSV抗体的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列；或与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1-6至少90％同源的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1-6至少90％同源的核苷酸序列的片段。
8.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码前导序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含表达载体。
10.一种组合物，其包含根据权利要求1-9中任一项所述的核酸分子。
11.根据权利要求10所述的组合物，进一步包含药学上可接受的赋形剂。
12.根据权利要求10所述的组合物，进一步包含透明质酸酶。
13.一种抗RSV单克隆抗体，其包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列；或与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的片段：SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:1-6中的一个所编码的氨基酸序列。
14.一种预防或治疗个体的疾病的方法，所述方法包含向所述个体施用根据权利要求1-9中任一项所述的核酸分子或根据权利要求10-12中任一项所述的组合物。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述疾病是呼吸道合胞病毒感染。
16.一种配制物，其包含根据权利要求1所述的核酸分子。
17.根据权利要求16所述的配制物，其中所述配制物进一步包含透明质酸酶。
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