CN110072554A - 用于抗铜绿假单胞菌的dna抗体构建体 - Google Patents

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Abstract

本文公开了靶向铜绿假单胞菌的单特异性和双特异性DNA抗体(DMAb)。本文还公开了一种通过向受试者施用所述DMAb来在所述受试者中产生合成抗体的方法。本公开还提供了一种使用所述组合物和产生方法来预防和/或治疗受试者的铜绿假单胞菌感染的方法。

Description

用于抗铜绿假单胞菌的DNA抗体构建体
相关申请的引证
本申请要求2016年5月5日提交的美国临时申请号62/332,363的优先权，该临时申请全文据此以引证的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及一种组合物，所述组合物包含用于体内产生一种或多种合成抗体，包括抗PcrV和双特异性抗PcrV抗Psl抗体及其功能片段的重组核酸序列，以及通过施用所述组合物来预防和/或治疗受试者中的细菌感染的方法。
背景技术
多重耐药性(MDR)假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)是最难治疗的病原体之一。假单胞菌属菌种感染是导致囊性纤维化个体中的急性肺炎和慢性肺感染的主要原因，并且是可以导致败血性死亡的烧伤或其他损伤的最常见感染来源。假单胞菌属菌种能够依附到医疗装置，诸如医疗植入物、导管和人工关节的表面，并且导致多种问题，例如阻塞导管或对植入物造成物理损坏。假单胞菌(Pseudomonas)，作为形成生物膜的细菌，对高水平抗生素具有高耐受性。目前，治疗性抗体已经获得了批准用于治疗多种疾病。遗憾的是，纯化的抗体的制造和递送花费高昂。此外，这些抗体疗法必须每周至每月重新施用–这是治疗慢性病症，诸如预防或治疗医疗植入物上的生物膜形成的一个具有挑战性的考虑因素。
因此，本领域需要预防和/或治疗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染和生物膜形成的改善的治疗剂。本发明满足了此需要。
发明内容
在一个实施方案中，本发明涉及编码一种或多种DNA单克隆抗体(DMAb)的核酸分子，其中所述核酸分子包含以下中的一者或多者：a)编码抗PcrV DMAb(DMAb-αPcrV)的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一者或多者的核苷酸序列；b)编码抗Psl DMAb(DMAb-αPsl)的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一者或多者的核苷酸序列；以及c)编码双特异性抗PcrV抗Psl DMAb(DMAb-BiSPA)的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一者或多者的核苷酸序列。
在一个实施方案中，核酸分子还包含编码裂解结构域的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一者或多者的核酸分子是以下中的一者或多者：a)编码在氨基酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；b)编码选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的核苷酸序列；c)编码在氨基酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；d)编码选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；e)在核苷酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列；f)在核苷酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13和SEQ ID NO:15的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列的片段；g)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及h)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的片段。
在一个实施方案中，编码DMAb-αPsl的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一者或多者的核酸分子是以下中的一者或多者：a)编码在氨基酸序列的整个长度上与SEQ ID NO:20的氨基酸具有至少约95％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；b)编码SEQID NO:20的氨基酸序列的核苷酸序列；c)编码在氨基酸序列的整个长度上与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；d)编码SEQ IDNO:20的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；e)在核苷酸序列的整个长度上与SEQ ID NO:19具有至少约95％同一性的核苷酸序列；e)在核苷酸序列的整个长度上与SEQ ID NO:19具有至少约95％同一性的核苷酸序列的片段；f)SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及g)SEQ IDNO:19的核苷酸序列的片段。
在一个实施方案中，编码DMAb-BiSPA的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一者或多者的核酸分子是以下中的一者或多者：a)编码在氨基酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；b)编码选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22的氨基酸序列的核苷酸序列；c)编码在氨基酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；d)编码选自SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:22的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；e)在核苷酸序列的整个长度上与选自SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:19的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列；f)在核苷酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列的片段；g)选自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及h)选自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的片段。
在一个实施方案中，所述核酸分子还包含编码IRES元件的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述IRES元件选自病毒IRES和真核IRES。
在一个实施方案中，所述核酸分子还包含编码前导序列的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述核酸分子包含表达载体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码选自DMAb-αPcrV、DMAb-αPsl、DMAb-BiSPA或其片段或同系物的一种或多种DNA单克隆抗体的核酸分子的组合物。
在一个实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，本发明涉及预防或治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用核酸分子或包含选自DMAb-αPcrV、DMAb-αPsl、DMAb-BiSPA或其片段或同系物的一种或多种DNA单克隆抗体的组合物。
在一个实施方案中，所述疾病是铜绿假单胞菌感染。
在一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用抗生素剂。在一个实施方案中，在施用核酸分子或组合物之后小于10天施用抗生素。
在一个实施方案中，本发明涉及预防或治疗受试者中的生物膜形成的方法，所述方法包括向受试者施用核酸分子或包含选自DMAb-αPcrV、DMAb-αPsl、DMAb-BiSPA或其片段或同系物的一种或多种DNA单克隆抗体的组合物。
在一个实施方案中，所述生物膜是铜绿假单胞菌生物膜。
在一个实施方案中，所述方法还包括将抗生素剂施用于受试者。在一个实施方案中，在施用核酸分子或组合物之后小于10天施用抗生素。
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码对于体内产生一种或多种抗体具有双特异性的一种或多种DNA单克隆抗体的核酸分子的组合物，其中所述核酸分子包含以下中的一者或多者：a)编码第一抗原的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一者或多者的核苷酸序列；以及b)编码第二抗原的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一者或多者的核苷酸序列。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体分子可以具有两个具有任何所需特异性的结合位点。在一些实施方案中，结合位点中的一个能够结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，结合位点中的一个能够结合免疫细胞上的细胞表面标志物。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体靶向CD19/CD3、HER3/EGFR、TNF/IL-17、IL-1α/IL1β、IL-4/IL-13、HER2/HER3、GP100/CD3、ANG2/VEGFA、CD19/CD32B、TNF/IL17A、IL-17A/IL17E、CD30/CD16A、CD19/CD3、CEA/CD3、HER2/CD3、CD123/CD3、GPA33/CD3、EGRF/CD3、PSMA/CD3、CD28/NG2、CD28/CD20、EpCAM/CD3或MET/EGFR等。
附图说明
图1(包括图1A至图1C)描绘了证实DMAb递送和体外表达的示例性实验的结果。图1A描绘了展示DMAb被设计为编码单克隆抗体克隆V2L2MD和ABC123的IgG抗体重链和轻链，产生DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA构建体的示意图。通过体内IM-EP将优化的DMAb构建体施用于小鼠，肌肉细胞合成产生mAb。全功能DMAb被分泌并进入体循环。图1B描绘了示例性实验的结果，展示用1μg/孔的DMAb-αPcrV、DMAb-BiSPA或对照pGX0001转染HEK 293T细胞。在48小时后收集i)上清液和ii)细胞裂解物。分析样品的人IgG。图1C描绘了用来自经转染的细胞的细胞裂解物进行的示例性Western印迹的结果。将10μg总细胞裂解物上样到每个泳道，并在SDS-PAGE凝胶上运行，然后转移到硝酸纤维素膜。用缀合至HRP的山羊抗人IgG H+L抗体探测膜。使用ECL化学发光试剂盒对样品进行显色并在膜上可视化。
图2(包括图2A至图2D)描绘了示例性实验的结果，展示DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA在小鼠骨骼肌中的表达。BALB/c小鼠接受DNA注射，将DMAb-αPcrV或DMAb-BiSpA DNA注入TA肌肉中，然后进行体内电穿孔。图2A描绘了接受DMAb-αPcrV的细胞的示例性图像。图2B描绘了接受DMAb-BiSPA的细胞的示例性图像。图2C描绘了接受pGX0001空载体骨架的细胞的示例性图像。图2D描绘了初始肌肉细胞的示例性图像。在DMAb注射后3天收集肌肉组织，并用山羊抗人IgG Fc抗体探测，然后用抗山羊IgG AF88和DAPI检测。
图3(包括图3A至图3F)描绘了示例性实验的结果，展示DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA在小鼠中的体内表达。图3A描绘了示例性实验的结果，展示监测通过IM-EP施用100μgDMAb-αPcrV的B6.Cg-Foxn1<nu>/J小鼠(n＝5只/组)达120天的人IgG的血清水平。图3B描绘了示例性实验的结果，展示施用100μg和300μg DMAb-αPcrV的BALB/c小鼠(n＝10只/组)中的第7天血清水平。图3C描绘了示例性实验的结果，展示施用100μg DMAb-αPcrV的BALB/c小鼠(n＝10只/组)中的第7天结合PcrV蛋白的血清。图3D描绘了示例性实验的结果，展示监测通过IM-EP施用100μg DMAb-BiSPA的B6.Cg-Foxn1nu/J小鼠(n＝5只/组)达120天的人IgG的血清水平。图3E描绘了示例性实验的结果，展示施用100μg和300μg DMAb-BiSPA的BALB/c小鼠(n＝10只/组)中的第7天血清水平。图3F描绘了示例性实验的结果，展示施用100μgDMAb-BiSPA的BALB/c小鼠(n＝10只/组)中的第7天结合PcrV蛋白的血清。
图4(包括图4A至图4C)描绘了示例性实验的结果，展示BALB/c小鼠中DMAb-αPcrV、DMAb-BiSPA和小鼠IgG2a DMAb的药代动力学。BALB/c小鼠接受100μg DNA注射，将DMAb注入TA肌肉中，然后进行体内电穿孔(n＝10只/组)。在DMAb注射后21天监测血清人IgG1水平并通过ELISA定量。在DMAb注射后103天监测小鼠IgG2a水平并通过ELISA定量。图4A描绘了示例性实验的结果，展示DMAb-αPcrV的药代动力学。图4B描绘了示例性实验的结果，展示DMAb-BiSPA的药代动力学。图4C描绘了示例性实验的结果，展示对照IgG2A DMAb的药代动力学。
图5(包括图5A至图5D)描绘了示例性实验的结果，展示致死性肺炎激发后BALB/c小鼠中DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA赋予的体内功能和保护。图5A描绘了示例性实验的结果，展示施用300μg DMAb-αPcrV、DMAb-BiSPA或ABC123IgG(2mg/kg)的BALB/c小鼠(n＝5只小鼠/组)的血清IgG水平。DMAb-BiSPA的2只动物低于抗细胞毒性活性测定的检出限。抗体水平表示激发当天血清中的DMAb。图5B描绘了示例性实验的结果，展示在致死性激发之前第-5天施用对照DMAb-DVSF3(黑色空心圆圈)、DMAb-αPcrV(红色圆圈)、DMAb-BiSPA(绿色圆圈)之后，或者在致死性激发之前第-1天施用纯化的ABC123mAb(紫色圆圈)之后，BALB/c小鼠中的体内保护(所提供的数据来自2次独立的实验，n＝8只/组/实验，总共n＝16只)。图5C描绘了示例性实验的结果，展示使用不同剂量的DMAb-BiSPA的保护：100μg(紫色圆圈)、200μg(绿色圆圈)、300μg(红色圆圈)或DMAb-DVSF3(对照)，n＝8只小鼠/组。图5D描绘了示例性实验的结果，展示不同剂量的DMAb-BiSPA的血清DMAb浓度，n＝8只小鼠/组。
图6(包括图6A至图6D)描绘了示例性实验的结果，展示致死性铜绿假单胞菌激发后DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA治疗的动物的器官保护效果。图6A描绘了示例性实验的结果，展示在用DMAb-DVSF3、DMAb-αPcrV、DMAb-ABC123或ABC123IgG治疗的动物中，在致死性肺炎激发后，定量肺、脾和肾的铜绿假单胞菌的器官负荷(CFU/mL)。图6B描绘了示例性实验的结果，展示DMAb治疗后感染动物中的肺重量。图6C描绘了示例性实验的结果，展示在致死性激发后DMAb治疗的动物的肺匀浆物中的促炎性细胞因子和趋化因子的水平。对于图6A至图6C，n＝8只小鼠/组。直线表示平均值。箱线图显示了所有点，条表示最小值至最大值。图6D描绘了示例性实验的结果，展示在致死性肺炎激发后24小时，与感染的动物相比，未感染的动物中的DMAb和ABC123 IgG的血清IgG水平。
图7(包括图7A至图7H)描绘了示例性实验的结果，展示在铜绿假单胞菌6077感染后48小时急性肺炎的组织学(苏木精和伊红(HE))。图7A描绘了示例性实验的结果，展示用DMAb-DVSF3电穿孔后，其示出了显著肺泡侵润和溢血的聚结面积(10x放大)。图7B描绘了示例性实验的结果，展示肺泡具有显著的中性粒细胞侵润、溢血和坏死区域(插图)。图7C描绘了示例性实验的结果，展示轻度肺炎和具有DMAb-αPcrV的偶发细支气管碎片(10x放大)。图7D描绘了示例性实验的结果，展示由混合中性粒细胞和巨噬细胞群构成的肺泡侵润(插图)。图7E描绘了示例性实验的结果，展示DMAb-BiSPA组中的轻度肺泡炎(10x放大)。图7F描绘了示例性实验的结果，主要展示肺泡空间中的中性粒细胞侵润和轻度溢血(插图)。图7G描绘了示例性实验的结果，展示ABC123IgG对照显示出中度肺泡炎(10x放大)。图7H描绘了示例性实验的结果，展示肺泡空间含有中性粒细胞且掺和有细胞碎片和溢血(插图)。代表性数据来自5只小鼠/组。
图8(包括图8A至图8B)描绘了示例性实验的结果，展示DMAb与抗生素方案组合。图8A描绘了示例性实验的结果，展示用对照DMAb-DVSF3(100μg)、盐水+美罗培南(meropenem)(MEM，2.3mg/kg)、DMAb-BiSPA(100μg)或DMAb-BiSPA(100μg)+MEM(2.3mg/kg)注射BALB/c小鼠，然后用致死性剂量的铜绿假单胞菌6077激发。在致死性激发后1小时施用MEM。在感染后监测动物持续144小时，n＝8只小鼠/组。图7B描绘了示例性实验的结果，展示在致死性激发前动物中的DMAb血清水平，n＝8只小鼠/组。直线表示平均值，误差条表示标准偏差。
图9描绘了示例性实验的结果，展示DMAb-V2L2体内表达的优化。BALB/c小鼠接受单次DNA注射，将DMAb-αPcrV或DMAb-BiSpA DNA注入TA肌肉中，然后进行体内电穿孔。图形表示分别在测序、用透明质酸酶(400U/mL)配制和电穿孔优化之前和之后施用100μg、200μg或300μg DMAb-αPcrV的BALB/c小鼠(n＝5只/组)中的第7天血清水。
具体实施方式
本发明涉及包含编码抗体、其片段、其变体或它们的组合的重组核酸序列的组合物。所述组合物可以施用于有需要的受试者，以促进合成抗体的体内表达和形成。
具体来说，由重组核酸序列表达的重链多肽和轻链多肽可以组装成合成抗体。重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用以使得组装产生合成抗体，所述合成抗体能够结合抗原，与并非如本文所述组装的抗体相比具有更大的免疫原性，并且能够引发或诱导针对抗原的免疫应答。
此外，与响应于抗原诱导的免疫应答而产生的抗体相比，这些合成抗体在受试者中更快速地产生。合成抗体能够有效地结合并且中和一系列抗原。所述合成抗体还能够有效地防止疾病和/或促进疾病存活率。
1.定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语所具有的含义与本领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。在矛盾的情况下，将以包括定义在内的本文件为准。虽然可以在实施或测试本发明时使用与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但是下文描述了优选的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献以引用的方式整体并入。本文公开的材料、方法、以及实例仅是说明性的并且不意图具有限制性。
如本文所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“可”、“含有”以及其变形意图是开放式过渡短语、术语、或词语，它们不排除另外的行为或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种”和“该/所述”包括复数指代对象。本公开还考虑了“包含本文提供的实施方案或要素”、“由本文提供的实施方案或要素组成”以及“基本上由本文提供的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确阐述。
“抗体”可以意指类别IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体、或其片段、片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd、和单链抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离的抗体、多克隆抗体、亲和力纯化抗体或它们的混合物，它对所期望的表位或由其衍生的序列表现出足够的结合特异性。
如本文可互换使用的“抗体片段”或“抗体的片段”指的是完整抗体的包含抗原结合位点或可变区的部分。所述部分不包括完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3或CH4，这取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab’片段、Fab’-SH片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、双体抗体、单链Fv(scFv)分子、仅含一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅含一个重链可变区的单链多肽、以及含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。
“抗原”是指具有在宿主中产生免疫应答的能力的蛋白质。抗原可以由抗体识别和结合。抗原可以源自于体内或外部环境。
如本文所用，“编码序列”或“编码核酸”可以指包含编码如本文所述的抗体的核酸序列的核苷酸序列(例如，RNA或DNA)或核酸分子。在一个实施方案中，编码序列包括由此转录编码抗体的RNA序列的DNA序列。在一个实施方案中，编码序列包括编码抗体的RNA序列。编码序列还可以包括与调控元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够指导在接受核酸施用的个体或哺乳动物的细胞中表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。编码序列还可以包括编码信号肽的序列。
如本文所用，“互补序列”或“互补”可以意指核酸，可以意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
如本文所用，“恒定电流”定义了在向组织递送电脉冲的持续时间内同一组织或限定所述组织的细胞接受或经历的电流。电脉冲是从本文所述的电穿孔装置递送的。因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈，所以该电流在所述组织中在电脉冲的寿命内保持在恒定的安培数。反馈元件可以在整个脉冲的持续时间内测量组织(或细胞)的电阻，并且使电穿孔装置改变它的电能输出(例如，增加电压)，以使同一组织中的电流在整个电脉冲期间(约几微秒)和脉冲间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。
如本文所用，“电流反馈”或“反馈”可以互换使用并且可以意指所提供的电穿孔装置的主动响应，所述主动响应包括测量电极之间组织中的电流以及相应地改变由EP装置递送的能量输出，以将电流维持在恒定水平。在开始脉冲序列或电处理之前，由使用者预设该恒定水平。反馈可以通过电穿孔装置的电穿孔部件，例如控制器完成，这是因为其中的电路能够连续地监测电极之间组织中的电流，并且将该所监测的电流(或组织内的电流)与预设电流相比较，并且连续地进行能量输出调整以将所监测的电流维持在预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为它是模拟闭环反馈。
如本文所用，“分散电流”可以意指从本文所述的电穿孔装置的各种针电极阵列递送的电流模式，其中所述模式使正被电穿孔的组织的任何区域上电穿孔相关热应激的发生减到最低限度或优选地消除所述电穿孔相关热应激的发生。
如本文可互换使用，“电穿孔”、“电透化”或“电动增强”(“EP”)可以指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观路径(孔)；它们的存在允许生物分子，诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧传递到另一侧。
如本文所用，“内源性抗体”可以指在接受有效剂量的抗原的施用以诱导体液免疫应答的受试者体内产生的抗体。
如本文所用，“反馈机制”可以指由软件或硬件(或固件)执行的过程，所述过程接收所期望的组织的阻抗并且将其与预设值，优选地电流相比较(在递送能量脉冲之前、期间和/或之后)，并且调整所递送的能量脉冲以达到所述预设值。反馈机制可以由模拟闭环电路执行。
“片段”可以意指可以发挥功能，即可以结合所期望的靶标并且具有与全长抗体相同的预期作用的抗体的多肽片段。抗体的片段可以与全长具有100％同一性，除了缺少来自N末端和/或C末端的至少一个氨基酸之外，在每种情况下在位置1处具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。片段可以包含特定全长抗体的长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比，不包括所添加的任何异源信号肽在内。片段可以包括与抗体具有95％或更大、96％或更大、97％或更大、98％或更大或99％或更大的同一性的多肽片段，并且另外包含在计算同一性百分比时不包括在内的N末端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可以包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如IgE信号肽或IgG信号肽。N末端甲硫氨酸和/或信号肽可以与抗体的片段连接。
编码抗体的核酸序列的片段可以与全长具有100％同一性，除了缺少来自5'末端和/或3'末端的至少一个核苷酸之外，在每种情况下在位置1处具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可以包含特定全长编码序列的长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比，不包括所添加的任何异源信号肽在内。片段可以包括编码与抗体具有95％或更大、96％或更大、97％或更大、98％或更大或99％或更大的同一性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码在计算同一性百分比时不包括在内的N末端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可以包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如IgE信号肽或IgG信号肽的编码序列。编码N末端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以与编码序列的片段连接。
如本文所用，“遗传构建体”是指包含编码蛋白质，诸如抗体的核苷酸序列的DNA分子或RNA分子。遗传构建体也可以指由此转录RNA分子的DNA分子。编码序列包括与调控元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够指导在接受核酸分子施用的个体的细胞中的表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“可表达形式”指的是含有必要调控元件的基因构建体，所述调控元件与编码蛋白质的编码序列可操作地连接以使得当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。在一个实施方案中，遗传构建体包含从本文所述的DNA序列转录的RNA序列。例如，在一个实施方案中，遗传构建体包含从包含编码本发明的抗体、其变体或其片段的序列的DNA分子转录的RNA分子。
如本文所用，“同一”或“同一性”在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下可以意指所述序列在指定区域中具有指定百分比的相同残基。所述百分比可以通过最佳地比对这两个序列，在指定区域中比较这两个序列，确定这两个序列中存在相同残基的位置数量以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中位置的总数，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算。在这两个序列具有不同的长度或比对产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基被包括在计算的分母中，但是不包括在分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动或通过使用计算机序列算法，诸如BLAST或BLAST 2.0来进行。
如本文所用，“阻抗”可以在论述反馈机制时使用并且可以根据欧姆定律(Ohm'slaw)转换成电流值，从而使得能够与预设电流相比较。
如本文所用，“免疫应答”可以意指响应于一种或多种核酸和/或肽的引入，宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统的活化。所述免疫应答可以呈细胞应答或体液应答或这两者的形式。
如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描绘还限定了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖基本上相同的核酸和其互补序列。单链提供了可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链的或双链的，或可以含有双链序列和单链序列二者的部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA、或杂合体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合、以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。
如本文所用，“可操作地连接”可以意指基因的表达处在与它在空间上连接的启动子的控制之下。启动子可以位于处在它的控制之下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离可以与作为该启动子来源的基因中该启动子与它控制的基因之间的距离大致相同。如本领域已知的那样，可以调节该距离的变化而不会丧失启动子功能。
如本文所用，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列并且可以是天然的、合成的、或天然和合成的修饰或组合。
如本文所用，“启动子”可以意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然来源的分子。启动子可以包含一个或多个特定的转录调控序列，以进一步增强其表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏子元件，它们可以位于与转录起始位点相距多达数千个碱基对的位置处。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。对于其中发生表达的细胞、组织或器官，或对于发生表达的发育阶段，或响应于外部刺激，诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，启动子可以组成型地或差异性地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV 40晚期启动子以及CMV IE启动子。
“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用，是指可以在本文所述的蛋白质的氨基末端处连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常引导蛋白质的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从其产生的细胞中的分泌。在从细胞中分泌时，信号肽/前导序列常常从蛋白质的其余部分(常常被称为成熟蛋白)切割。信号肽/前导序列在蛋白质的N末端处连接。
如本文所用，“严格杂交条件”可以意指第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)，诸如核酸的复杂混合物中的第二核酸序列杂交的条件。严格条件具有序列依赖性并且在不同的情况下将是不同的。严格条件可以被选择为在限定的离子强度和pH值下比特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃-10℃。Tm可以是50％的与靶标互补的探针在平衡状态下与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH值以及核酸浓度下)(由于靶序列过量存在，因此在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占据)。严格条件可以是如下的那些条件，其中在pH 7.0至8.3下，盐浓度低于约1.0M钠离子，诸如约0.01M-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如约10个-50个核苷酸)，温度为至少约30℃，对于长探针(例如大于约50个核苷酸)，为至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂，诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2倍至10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％的甲酰胺、5×SSC和1％的SDS，在42℃孵育；或5×SSC、1％的SDS，在65℃孵育，以及在65℃下在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。
如本文可互换使用，“受试者”和“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如猴，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)以及人)。在一些实施方案中，受试者可以是人或非人。受试者或患者可以正接受其他形式的治疗。
如本文所用，“基本上互补”可以意指第一序列在8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或这两个序列在严格杂交条件下杂交。
如本文所用，“基本上同一的”可以意指第一序列和第二序列在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或对于核酸，如果第一序列与第二序列的互补序列基本上互补。
如本文所用，“合成抗体”是指由本文所述的重组核酸序列编码并且在受试者中产生的抗体。
如本文所用，“治疗”可以意指经由预防、抑制、阻遏、或完全消除疾病的手段来保护受试者免受疾病的影响。预防疾病涉及在疾病发作之前向受试者施用本发明的疫苗。抑制疾病涉及在诱发疾病之后，但是在它出现临床表现之前，向受试者施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的临床表现之后向受试者施用本发明的疫苗。
如本文对于核酸所用的“变体”可以意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列、或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
关于肽或多肽的“变体”在氨基酸序列上由于氨基酸的插入、缺失、或保守取代而不同，但是保留至少一种生物学活性。变体还可以意指具有这样的氨基酸序列的蛋白质：其与具有保留至少一种生物学活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同。氨基酸的保守取代，即将氨基酸用具有相似特性(例如带电荷的区域的亲水性、程度以及分布)的不同氨基酸置换，在本领域中通常被认为涉及微小变化。这些微小变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域所理解的那样。Kyte等人,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于它的疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知的是，具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍保留蛋白质功能。在一个方面，具有相差±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以用于揭示将产生保留生物学功能的蛋白质的取代。在肽的背景下氨基酸的亲水性的考虑容许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是已经被报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用的量度。美国专利号4,554,101以引用的方式整体并入本文。具有相似亲水值的氨基酸的取代可以产生保留生物学活性，例如免疫原性的肽，如本领域中所了解的那样。可以使用具有彼此相差±2以内的亲水值的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水指数和亲水值这两者都受该氨基酸的特定侧链的影响。与该观测结果相一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示。
变体可以是在完整基因序列或其片段的全长上基本上相同的核酸序列。核酸序列在基因序列或其片段的全长上可以是至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一的。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列在氨基酸序列或其片段的全长上可以是至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一的。
如本文所用，“载体”可以意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA载体或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体或整合到宿主基因组中的载体。
对于本文中数值范围的叙述，其间具有相同精确度的每一个中间数被明确考虑。举例来说，对于6-9的范围，除了6和9之外，还考虑了数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、以及7.0被明确考虑。
2.组合物
本发明部分基于用于在哺乳动物细胞中产生单克隆或双特异性抗体的新型序列的产生。在一个实施方案中，该序列用于在DNA或RNA载体，包括细菌、酵母以及病毒载体中递送。本发明涉及一种组合物，所述组合物包含编码抗体、其片段、其变体或它们的组合的重组核酸序列。当向有需要的受试者施用时，组合物可以引起合成抗体在受试者中的产生。合成抗体可以结合受试者中存在的靶分子(即，抗原)。这样的结合可以中和抗原，阻断另一种分子(例如蛋白质或核酸)对抗原的识别，并且引发或诱导对抗原的免疫应答。
在一个实施方案中，组合物包含编码合成抗体的核苷酸序列。在一个实施方案中，组合物包含含有编码第一合成抗体的第一核苷酸序列和编码第二合成抗体的第二核苷酸序列的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子包含编码裂解结构域的核苷酸序列。
在一个实施方案中，核酸分子包含编码抗PcrV抗体(DMAb-αPcrV)的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的核苷酸序列包含编码DMAb-αPcrV的可变VH区或可变VL区的密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的可变VH区的核苷酸序列编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的可变VL区的核苷酸序列编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的可变VH区的核苷酸序列编码SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的可变VL区的核苷酸序列编码SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码抗PcrV抗体的核苷酸序列编码SEQ ID NO:2所示的可变VH区和SEQ ID NO:4所示的可变VL区。在一个实施方案中，编码抗PcrV抗体的核苷酸序列编码SEQ ID NO:12所示的可变VH区和SEQ ID NO:16所示的可变VL区。在一个实施方案中，编码抗PcrV抗体的核苷酸序列编码选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:14的氨基酸序列.
在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的可变VH区的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1所示的序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的可变VL区的核苷酸序列包含SEQ IDNO:3所示的序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的可变VH区的核苷酸序列包含SEQID NO:11所示的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的可变VL区的核苷酸序列包含SEQ ID NO:15所示的序列。
在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1所示的可变VH序列和SEQ ID NO:3所示的可变VL序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的核苷酸序列包含SEQ ID NO:11所示的可变VH序列和SEQ ID NO:15所示的可变VL序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13的序列。
在一个实施方案中，编码DMAb-αPcrV的核苷酸序列可操作地连接至编码前导序列的序列。在多个实施方案中，可操作地连接至前导序列的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16分别如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:41所示。
在一个实施方案中，核酸分子包含编码抗Psl抗体(DMAb-αPsl)的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPsl的核苷酸序列包含编码DMAb-αPsl的可变VH区和可变VL区的密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPsl的核苷酸序列包含编码DMAb-αPsl的可变VH区和可变VL区的密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPsl的核苷酸序列编码SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-αPsl的核苷酸序列包含SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码DMAb-αPsl的核苷酸序列可操作地连接至编码前导序列的序列。在多个实施方案中，可操作地连接至前导序列的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20分别如SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示。
在一个实施方案中，核酸分子包含编码双特异性抗体的核苷酸序列。在一个实施方案中，双特异性抗体是抗PcrV和抗Psl双特异性抗体(DMAb-BiSPA)。在一个实施方案中，编码DMAb-BiSPA的核苷酸序列包含编码DMAb-BiSPA的可变VH区和可变VL区的密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-BiSPA的核苷酸序列编码选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码DMAb-BiSPA的核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码双特异性抗体的核苷酸序列可操作地连接至编码前导序列的序列。在多个实施方案中，可操作地连接至前导序列的SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21,和SEQ ID NO:22分别如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46和SEQID NO:47所示。
在一个实施方案中，核酸分子包括包含核糖核苷酸序列的RNA分子。在一个实施方案中，RNA分子包含编码选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ IDNO:47的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，RNA分子包括由DNA分子产生的转录物，所述DNA分子包含编码选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ IDNO:47的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，RNA分子包括DNA分子产生的转录物，所述DNA分子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、选自SEQID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:46的核苷酸序列。
本发明的组合物可以治疗、预防和/或防止与细菌活性相关的任何疾病、病状或病症。在某些实施方案中，该组合物可以治疗、预防和/或防止细菌感染。在某些实施方案中，该组合物可以治疗、预防和/或防止细菌生物膜形成。在某些实施方案中，该组合物可以治疗、预防和/或防止铜绿假单胞菌感染。在某些实施方案中，该组合物可以治疗、预防和/或防止铜绿假单胞菌生物膜形成。在某些实施方案中，该组合物可以治疗、预防和/或防止败血症。
所述合成抗体可以在接受所述组合物的施用的受试者中治疗、预防、和/或防止疾病。所述合成抗体通过结合抗原可以在接受所述组合物的施用的受试者中治疗、预防、和/或防止疾病。所述合成抗体可以在接受所述组合物的施用的受试者中促进疾病存活率。在一个实施方案中，与未接受合成抗体施用的患病受试者的预期存活率相比，合成抗体可以使受试者的疾病存活率提高。在多个实施方案中，与在不存在组合物的情况下的预期存活率相比，合成抗体可以使已接受组合物施用的受试者的疾病存活率提高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一个实施方案中，与未接受合成抗体施用的受试者的预期保护相比，合成抗体可以增加使受试者的针对疾病的保护。在多个实施方案中，与在不存在组合物的情况下的预期保护相比，合成抗体可以防止接受组合物施用的受试者的疾病至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
组合物可以在向所述受试者施用组合物的至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、或60小时内引起合成抗体在受试者中产生。组合物可以在向受试者施用组合物的至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、或10天内引起合成抗体在受试者中产生。组合物可以在向受试者施用组合物的约1小时至约6天、约1小时至约5天、约1小时至约4天、约1小时至约3天、约1小时至约2天、约1小时至约1天、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约1小时至约12小时、或约1小时至约6小时内引起合成抗体在受试者中产生。
当向有需要的受试者施用时，与在接受抗原施用以诱导体液免疫应答的受试者中内源性抗体的产生相比，组合物可以更快地引起合成抗体在受试者中产生。组合物可以在接受抗原施用以诱导体液免疫应答的受试者中产生内源性抗体之前至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天引起合成抗体的产生。
本发明的组合物可以具有有效组合物所需的特征，诸如是安全的以使得组合物不会引起病患或死亡；防止病患；以及提供易施用性、很少的副作用、生物稳定性以及低的每剂成本。
a.双特异性抗体
如本文其他地方所述，组合物可以包含重组核酸序列。重组核酸序列可以编码双特异性抗体、其片段、其变体或它们的组合。抗体在下文中更详细地描述。本发明提供包含特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点和特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点的新型双特异性抗体，该双特异性抗体具有特别有利的特性，诸如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物学活性、特异性靶向某些T细胞、靶向效率和减小的毒性。在一些情况下，存在这样的双特异性抗体，其中该双特异性抗体以高亲和力结合第一靶标，并且以低亲和力结合第二靶标。在其他情况下，存在这样的双特异性抗体，其中该双特异性抗体以低亲和力结合第一靶标，并且以高亲和力结合第二靶标。在其他情况下，存在这样的双特异性抗体，其中该双特异性抗以所需的亲和力体结合第一靶标，并且以所需的亲和力结合第二靶标。
在一个实施方案中，双特异性抗体是包含以下的二价抗体：a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，以及b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链。
根据本发明的双特异性抗体分子可以具有任何所需特异性的两个结合位点。在一些实施方案中，结合位点中的一个能够结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，Fab片段中包括的结合位点是对肿瘤相关表面抗原具有特异性的结合位点。在一些实施方案中，单链Fv片段中包括的结合位点是对肿瘤相关抗原(诸如肿瘤相关表面抗原)具有特异性的结合位点。
如本文所用，术语“肿瘤相关表面抗原”是指存在于或可以存在于表面上的抗原，所述表面位于肿瘤细胞之上或之内。这些抗原可以存在于具有胞外部分的细胞表面上，所述胞外部分通常与分子的跨膜部分和胞质部分组合。在一些实施方案中，这些抗原可以仅由肿瘤细胞提供，而不由正常(即非肿瘤细胞)提供。肿瘤抗原可以专门在肿瘤细胞上表达，或者与非肿瘤细胞相比，可以代表肿瘤特异性突变。在这种实施方案中，各自的抗原可以称为肿瘤特异性抗原。一些抗原由肿瘤细胞和非肿瘤细胞二者提供，它们可以称为肿瘤相关抗原。与非肿瘤细胞相比，这些肿瘤相关抗原可以在肿瘤细胞上过表达，或由于与非肿瘤组织相比，肿瘤组织的压缩结构很小，可以在肿瘤细胞中进行抗体结合。在一些实施方案中，肿瘤相关表面抗原位于肿瘤的血管上。
肿瘤相关表面抗原的示例性实例是CD10、CD19、CD20、CD22、CD33、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、表皮生长因子受体(EGFR)、Her2neu、Her3、IGFR、CD133、IL3R、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CDCP1、Derlin1、腱生蛋白、卷曲受体1-10、血管抗原VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4，CD309)、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)、内皮因子、CLEC14、Tem1-8和Tie2。另外的实例可包括A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD21、CD25、CD30、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、de2-7EGFR、EGFRvIII、EpCAM、Ep-CAM、叶酸结合蛋白、G250、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑素瘤相关细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)和TAG-72。在肿瘤的胞外基质上表达的抗原的实例是腱生蛋白和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子的结合位点中的一个能够结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤细胞(NK细胞)特异性受体分子。T细胞特异性受体是所谓的“T细胞受体”(TCR)，它允许T细胞结合，并且如果存在另外的信号，被另一种称为抗原呈递细胞或APC的细胞提供的表位/抗原活化和对其产生应答。已知T细胞受体类似于天然存在的免疫球蛋白的Fab片段。通常它是单价的，涵盖α链和β链，在一些实施方案中，它涵盖γ链和δ链(出处同上)。因此，在一些实施方案中，TCR是TCR(α/β)，并且在一些实施方案中，它是TCR(γ/δ)。T细胞受体与CD3T细胞共受体形成复合物。CD3是蛋白质复合物，由四条不同的链组成。在哺乳动物中，复合物含有一条CD3γ链、一条CD36链和两条CD3E链。这些链与称为T细胞受体(TCR)的分子以及在T淋巴细胞中产生活化信号的ζ-链关联。因此，在一些实施方案中，T细胞特异性受体是CD3T细胞共受体。在一些实施方案中，T细胞特异性受体是CD28，其也是在T细胞上表达的蛋白质。CD28可提供共刺激信号，这是T细胞活化必需的。CD28在T细胞增殖和存活、细胞因子产生和辅助T细胞2型发育中具有重要作用。T细胞特异性受体的又一个实例是CD134，也称为Ox40。CD134/OX40在活化后24至72小时后表达，并且可以用于定义第二共刺激分子。T细胞受体的另一个实例是能够结合抗原呈递细胞(APC)上的4-1BB-配体，据此产生T细胞的共刺激信号的4-1BB。主要存在于T细胞上的受体的另一个实例是CD5，它也以低水平存在于B细胞上。修改T细胞功能的受体的另一个实例是CD95，也称为Fas受体，它介导Fas配体在其他细胞表面上表达引起的凋亡信号传导。据报道，CD95调节静息T淋巴细胞中TCR/CD3驱动的信号传导通路。
NK细胞特异性受体分子的实例是CD16，其是低亲和力Fc受体和NKG2D。T细胞和自然杀伤(NK)细胞二者的表面上存在的受体分子的实例是CD2以及CD2超家族的另外成员。CD2能够充当T细胞和NK细胞上的共刺激分子。
在一些实施方案中，抗体分子的第一结合位点结合肿瘤相关表面抗原，并且第二结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子。在一些实施方案中，抗体分子的第一结合位点结合A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、CDCP1、Her3、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、CLEC14、Derlin1、表皮生长因子受体(EGFR)、de2-7EGFR、EGFRvIII、EpCAM、内皮因子、Ep-CAM、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、叶酸结合蛋白、G250、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、卷曲受体1-10、Her2/neu、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑素瘤相关细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)、TAG-72、腱生蛋白、Tem1-8、Tie2和VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4，CD309)、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)中的一者，并且第二结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子。在一些实施方案中，抗体分子的第一结合位点结合肿瘤相关表面抗原，并且第二结合位点结合CD3(T细胞受体(TCR))、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5和CD95中的一者。
在一些实施方案中，抗体分子的第一结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子，并且第二结合位点结合肿瘤相关表面抗原。在一些实施方案中，抗体的第一结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子，并且第二结合位点结合A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、CDCP1、Her3、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、CLEC14、Derlin1、表皮生长因子受体(EGFR)、de2-7EGFR、EGFRvIII、EpCAM、内皮因子、Ep-CAM、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、叶酸结合蛋白、G250、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、卷曲受体1-10、Her2/neu、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑素瘤相关细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、TAG-72、腱生蛋白、Tem1-8、Tie2和VEGFR中的一者。在一些实施方案中，抗体的第一结合位点结合CD3(T细胞受体(TCR))、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5和CD95中的一者，并且第二结合位点结合肿瘤相关表面抗原。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体靶向CD19和CD3、HER3和EGFR、TNF和IL-17、IL-1α和IL1β、IL-4和IL-13、HER2和HER3、GP100和CD3、ANG2和VEGFA、CD19和CD32B、TNF和IL17A、IL-17A和IL17E、CD30和CD16A、CD19和CD3、CEA和CD3、HER2和CD3、CD123和CD3、GPA33和CD3、EGRF和CD3、PSMA和CD3、CD28和NG2、CD28和CD20、EpCAM和CD3或MET和EGFR等等。
b.重组核酸序列
如上文所述，组合物可以包含重组核酸序列。重组核酸序列可以编码抗体、其片段、其变体或它们的组合。抗体在下文中更详细地描述。
重组核酸序列可以是异源核酸序列。重组核酸序列可以包括至少一种异源核酸序列或一种或多种异源核酸序列。
重组核酸序列可以是优化的核酸序列。这种优化可以增加或改变抗体的免疫原性。优化还可以改善转录和/或翻译。优化可以包括以下一种或多种：低GC含量前导序列以增加转录；mRNA稳定性和密码子优化；添加kozak序列(例如，GCCACC)以用于增加翻译；添加编码信号肽的免疫球蛋白(Ig)前导序列；以及尽可能消除顺式作用序列基序(即，内部TATA盒)。
c.重组核酸序列构建体
重组核酸序列可以包括一种或多种重组核酸序列构建体。重组核酸序列构建体可以包括一种或多种组分，它们更详细地描述于下文中。
重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽、其片段、其变体或它们的组合的异源核酸序列。重组核酸序列构建体可以包括编码轻链多肽、其片段、其变体或它们的组合的异源核酸序列。重组核酸序列构建体还可以包括编码蛋白酶或肽酶切割位点的异源核酸序列。重组核酸序列构建体还可以包括编码内部核糖体进入位点(IRES)的异源核酸序列。IRES可以是病毒IRES或真核IRES。重组核酸序列构建体可以包括一个或多个前导序列，其中每个前导序列编码信号肽。
在一个实施方案中，信号肽包含氨基酸序列MDWTWRILFLVAAATGTHA(SEQ ID NO:24)。在一个实施方案中，信号肽包含氨基酸序列MVLQTQVFISLLLWISGAYG(SEQ ID NO:25)。可操作地连接至编码信号肽的序列的编码本发明的抗体的示例性核苷酸序列包括但不限于SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列。
重组核酸序列构建体可以包括一个或多个启动子、一个或多个内含子、一个或多个转录终止区、一个或多个起始密码子、一个或多个终止密码或终止密码子和/或一个或多个多聚腺苷酸化信号。重组核酸序列构建体还可以包括一个或多个接头或标签序列。标签序列可以编码血凝素(HA)标签。
(1)重链多肽
重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽、其片段、其变体或它们的组合的异源核酸。重链多肽可以包括可变重链(VH)区和/或至少一个恒定重链(CH)区。至少一个恒定重链区可以包括恒定重链区1(CH1)、恒定重链区2(CH2)以及恒定重链区3(CH3)和/或铰链区。
在一些实施方案中，重链多肽可以包括VH区和CH1区。在其他实施方案中，重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。
重链多肽可以包括互补决定区(“CDR”)组。CDR组可以含有VH区的三个高变区。从重链多肽的N末端开始，这些CDR分别被表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以有助于抗原结合或识别。
(2)轻链多肽
重组核酸序列构建体可以包括编码轻链多肽、其片段、其变体或它们的组合的异源核酸序列。轻链多肽可以包括可变轻链(VL)区和/或恒定轻链(CL)区。
轻链多肽可以包括互补决定区(“CDR”)组。CDR组可以含有VL区的三个高变区。从轻链多肽的N末端开始，这些CDR分别被表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以有助于结合或识别抗原。
(3)蛋白酶切割位点
重组核酸序列构建体可以包括编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列。蛋白酶切割位点可以由蛋白酶或肽酶识别。蛋白酶可以是内肽酶或内切蛋白酶，例如但不限于弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、HtrA、钙蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。蛋白酶可以是弗林蛋白酶。在其他实施方案中，蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、或切割内部肽键(即，不切割N末端肽键或C末端肽键)的任何蛋白酶。
蛋白酶切割位点可以包括促进或增加切割效率的一个或多个氨基酸序列。一个或多个氨基酸序列可以提高或增加形成或产生离散多肽的效率。一个或多个氨基酸序列可以包括2A肽序列。
(4)接头序列
重组核酸序列构建体可以包括一个或多个接头序列。接头序列可以在空间上分隔或连接本文所述的一种或多种组分。在其他实施方案中，接头序列可以编码在空间上分隔或连接两个或更多个多肽的氨基酸序列。
(5)启动子
重组核酸序列构建体可以包括一个或多个启动子。一个或多个启动子可以是能够驱动基因表达和调控基因表达的任何启动子。这种启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件。用于引导基因表达的启动子的选择取决于具体的应用。启动子可以位于与重组核酸序列构建体中的转录起始点相距与它在它的天然环境中与转录起始位点相距的距离大致相同的距离处。然而，可以容许该距离的变化而不会丧失启动子功能。
启动子可以与编码重链多肽和/或轻链多肽的异源核酸序列可操作地连接。启动子可以是被证实对于在真核细胞中表达来说有效的启动子。与编码序列可操作地连接的启动子可以是CMV启动子；来自猿猴病毒40(SV40)的启动子，诸如SV40早期启动子和SV40晚期启动子；小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子；人免疫缺陷病毒(HIV)启动子，诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子；莫洛尼病毒启动子；禽白血病病毒(ALV)启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子，诸如CMV立即早期启动子；爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子也可以是来自人基因的启动子，诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸、人多角体蛋白或人金属硫蛋白。
启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，所述诱导型启动子只有当宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时才会引发转录。在多细胞生物体的情况下，启动子也可以对特定组织或器官或发育阶段具有特异性。启动子也可以是天然或合成的组织特异性启动子，诸如肌肉或皮肤特异性启动子。这些启动子的实例描述于美国专利申请公开号US20040175727中，该美国专利申请公开的内容整体并入本文。
启动子可以与增强子结合。增强子可以位于编码序列的上游。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，诸如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。多核苷酸功能增强描述于美国专利No.5,593,972、5,962,428和W094/016737中，这些美国专利中的每一件的内容以引用的方式整体并入。
(6)内含子
重组核酸序列构建体可以包括一个或多个内含子。每个内含子可以包括功能性剪接供体和受体位点。内含子可以包括剪接的增强子。内含子可以包括有效剪接所需的一个或多个信号。
(7)转录终止区
重组核酸序列构建体可以包括一个或多个转录终止区。转录终止区可以在编码序列的下游以提供有效的终止。转录终止区可以从与上述启动子相同的基因中获得或可以从一个或多个不同的基因中获得。
(8)起始密码子
重组核酸序列构建体可以包括一个或多个起始密码子。起始密码子可以位于编码序列的上游。起始密码子可以与编码序列同框。起始密码子可以与有效翻译起始所需的一个或多个信号结合，例如但不限于核糖体结合位点。
(9)终止密码子
重组核酸序列构建体可以包括一个或多个终止子或终止密码子。终止密码子可以在编码序列的下游。终止密码子可以与编码序列同框。终止密码子可以与有效翻译终止所需的一个或多个信号结合。
(10)多聚腺苷酸化信号
重组核酸序列构建体可以包括一个或多个多聚腺苷酸化信号。多聚腺苷酸化信号可以包括转录物的有效多腺苷酸化所需的一个或多个信号。多聚腺苷酸化信号可以位于编码序列的下游。多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号、或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(Invitrogen,SanDiego,CA)的多聚腺苷酸化信号。
(11)前导序列
重组核酸序列构建体可以包括一个或多个前导序列。前导序列可以编码信号肽。信号肽可以是免疫球蛋白(Ig)信号肽，例如但不限于IgG信号肽和IgE信号肽。
d.重组核酸序列构建体的排列
如上文所述，重组核酸序列可以包括一种或多种重组核酸序列构建体，其中每种重组核酸序列构建体可以包括一种或多种组分。一种或多种组分详细描述于上文中。当被包括在重组核酸序列构建体中时，一种或多种组分可以相对于彼此以任何顺序排列。在一些实施方案中，一种或多种组分可以如下文所述在重组核酸序列构建体中排列。
(1)排列1
在一种排列中，第一重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽的异源核酸序列，并且第二重组核酸序列构建体可以包括编码轻链多肽的异源核酸序列。
第一重组核酸序列构建体可以被放置在载体中。第二重组核酸序列构建体可以被放置在第二或单独的载体中。将重组核酸序列构建体放置到载体中更详细地描述于下文中。
第一重组核酸序列构建体还可以包括启动子、内含子、转录终止区、起始密码子、终止密码子和/或多聚腺苷酸化信号。第一重组核酸序列构建体还可以包括前导序列，其中前导序列位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由前导序列编码的信号肽可以通过肽键与重链多肽连接。
第二重组核酸序列构建体还可以包括启动子、起始密码子、终止密码子和多腺苷酸化信号。第二重组核酸序列构建体还可以包括前导序列，其中前导序列位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由前导序列编码的信号肽可以通过肽键与轻链多肽连接。
因此，排列1的一个实例可以包括编码包括VH和CH1的重链多肽的第一载体(并且因此包括第一重组核酸序列构建体)，以及编码包括VL和CL的轻链多肽的第二载体(并且因此包括第二重组核酸序列构建体)。排列1的第二实例可以包括编码包括VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽的第一载体(并且因此包括第一重组核酸序列构建体)，以及编码包括VL和CL的轻链多肽的第二载体(并且因此包括第二重组核酸序列构建体)。
(2)排列2
在第二排列中，重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列。编码重链多肽的异源核酸序列可以位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。或者，编码轻链多肽的异源核酸序列可以位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。
重组核酸序列构建体可以被放置在载体中，如下文更详细描述的那样。
重组核酸序列构建体可以包括编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列和/或接头序列。如果被包括在重组核酸序列构建体中，那么编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列可以位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。因此，蛋白酶切割位点允许在表达时将重链多肽和轻链多肽分离成不同的多肽。在其他实施方案中，如果接头序列被包括在重组核酸序列构建体中，则接头序列可以位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。
重组核酸序列构建体还可以包括启动子、内含子、转录终止区、起始密码子、终止密码子和/或多聚腺苷酸化信号。重组核酸序列构建体可以包括一个或多个启动子。重组核酸序列构建体可以包括两个启动子以使得一个启动子可以与编码重链多肽的异源核酸序列关联，并且第二启动子可以与编码轻链多肽的异源核酸序列关联。在另外的其他实施方案中，重组核酸序列构建体可以包括一个启动子，该启动子与编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列关联。
重组核酸序列构建体还可以包括两个前导序列，其中第一前导序列位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')，并且第二前导序列位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由第一前导序列编码的第一信号肽可以通过肽键与重链多肽连接，并且由第二前导序列编码的第二信号肽可以通过肽键与轻链多肽连接。
因此，排列2的一个实例可以包括编码包括VH和CH1的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(并且因此包括重组核酸序列构建体)，其中接头序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。
排列2的第二实例可以包括编码包括VH和CH1的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(并且因此包括重组核酸序列构建体)，其中编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。
排列2的第三实例可以包括编码包括VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(并且因此包括重组核酸序列构建体)，其中接头序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。
排列2的第四实例可以包括编码包括VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(并且因此包括重组核酸序列构建体)，其中编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。
e.从重组核酸序列构建体表达
如上文所述，在一种或多种组分中，重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽的异源核酸序列和/或编码轻链多肽的异源核酸序列。因此，重组核酸序列构建体可以促进重链多肽和/或轻链多肽的表达。
当利用如上文所述的排列1时，第一重组核酸序列构建体可以促进重链多肽的表达，并且第二重组核酸序列构建体可以促进轻链多肽的表达。当利用如上文所述的排列2时，重组核酸序列构建体可以促进重链多肽和轻链多肽的表达。
在表达时，例如但不限于在细胞、生物体或哺乳动物中，重链多肽和轻链多肽可以组装成合成抗体。具体来说，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用以使得组装产生能够结合抗原的合成抗体。在其他实施方案中，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用以使得组装产生与并非如本文所述组装的抗体相比具有更大的免疫原性的合成抗体。在另外的其他实施方案中，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用以使得组装产生能够引发或诱导对抗原的免疫应答的合成抗体。
重组核酸序列构建体还可以包含编码前导序列的序列。前导序列可以在编码序列的5’。在一个实施方案中，N-末端前导序列包含选自SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的氨基酸序列。可操作地连接至前导序列的本发明的示例性核酸和氨基酸序列如SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:47所示。
f.载体
上述重组核酸序列构建体可以被放置在一种或多种载体中。一种或多种载体可以含有复制起点。一种或多种载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。一种或多种载体可以是自我复制染色体外载体或整合到宿主基因组中的载体。
载体包括但不限于质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体等等。“载体”包含可以感染、转染、瞬时或永久转导细胞的核酸。应认识到，载体可以是裸核酸，或与蛋白质或脂质复合的核酸。载体任选地包含病毒或细菌核酸和/或蛋白质和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜等)。载体包括但不限于DNA片段可以附接和复制的复制子(例如，RNA复制子、噬菌体)。因此，载体包括但不限于RNA、自主自我复制环状或线性DNA或RNA(例如，质粒、病毒等等，参见例如美国专利号5,217,879)，并且包括表达质粒和非表达质粒二者。在一些实施方案中，载体包括线性DNA、酶DNA或合成DNA。当重组微生物或细胞培养物被描述为具有“表达载体”时，这包括染色体外环状和线性DNA以及已整合进一条或多条宿主染色体的DNA二者。当载体由宿主细胞维持时，载体可以在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定复制，或整合在宿主的基因组内。
一种或多种载体可以是异源表达构建体，它通常是用于将特异性基因引入靶细胞的质粒。一旦表达载体处于细胞内，即可由细胞转录和翻译机构核糖体复合物产生重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。一种或多种载体可以表达大量稳定的信使RNA，从而表达蛋白质。
(1)表达载体
一种或多种载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够引导特定核苷酸序列在适当的受试者细胞中表达。包含重组核酸序列构建体的一种或多种载体可以是嵌合的，这意味着其组分中的至少一种相对于其他组分中的至少一种是异源的。
(2)质粒
一种或多种载体可以是质粒。质粒可用于用重组核酸序列构建体转染细胞。质粒可用于将重组核酸序列构建体引入受试者中。质粒还可以包含调控序列，所述调控序列可以非常适合于其中施用质粒的细胞中的基因表达。
质粒还可以包含哺乳动物复制起点，以在染色体外维持质粒并且在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是来自Invitrogen(San Diego,CA)的pVAX、pCEP4或pREP4，它们可以包含爱泼斯坦-巴尔病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，这可以在没有整合的情况下产生高拷贝游离型复制。质粒的骨架可以是pAV0242。质粒可以是复制缺陷型5型腺病毒(Ad5)质粒。
质粒可以是pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白质。质粒也可以是p YES2(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株中产生蛋白质。质粒也可以是MAXBACTM完整杆状病毒表达系统(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒也可以是pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白质。
(3)RNA载体
在一个实施方案中，本发明的核酸分子包括编码本发明的抗体的RNA分子。在一个实施方案中，RNA分子包含编码选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，RNA分子包括由DNA分子产生的转录物，所述DNA分子包含编码选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，RNA分子包括由DNA分子产生的转录物，所述DNA分子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、选自SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:46的核苷酸序列。因此，在一个实施方案中，本发明提供编码一种或多种本发明的抗体的RNA分子。RNA可以是正链。因此，在一些实施方案中，RNA分子可以由细胞翻译，而不需要任何中间重复步骤，诸如逆转录。本发明所用的RNA分子可以具有5′帽(例如，7-甲基鸟苷)。该帽可以增加RNA的体内翻译。本发明所用的RNA分子的5′核苷酸可以具有5′三磷酸基团。在加帽RNA中，这可以通过5′至5′桥连接至7-甲基鸟苷。RNA分子可以具有3′多聚腺苷酸尾。它还可包括其3′末端附近的多聚腺苷酸聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。本发明使用的RNA分子可以是单链的。
(4)环状和线性载体
一种或多种载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中来转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其他表达载体。
本文还提供了线性核酸或线性表达盒(“LEC”)，其能够经由电穿孔有效地向受试者递送并且表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。LEC可以是缺乏任何磷酸骨架的任何线性DNA。LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可以不含与所期望的基因表达无关的其他核酸序列。
LEC可以来源于能够线性化的任何质粒。质粒可能能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(NewCaledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其他表达载体。
LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别来源于pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。
(5)病毒载体
在一个实施方案中，本文提供病毒载体，它们能够将本发明的核酸递送至细胞。表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并且例如在Sambrook等人(2001)和Ausubel等人(1997)以及其他病毒学和分子生物学手册中有所描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来讲，合适的载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、启动子序列、简便限制性核酸内切酶位点以及一个或多个选择性标记。(参见例如WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物(例如人)细胞的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等等。参见例如美国专利No.5,350,674和5,585,362。
(6)制备载体的方法
本文提供了一种用于制备一种或多种载体的方法，在一种或多种载体中已经放置了重组核酸序列构建体。在最终亚克隆步骤之后，可以使用本领域已知的方法，使用载体来接种大规模发酵罐中的细胞培养物。
在其他实施方案中，在最终亚克隆步骤之后，可以将载体与一种或多种电穿孔(EP)装置一起使用。EP装置更详细地描述于下文中。
一种或多种载体可以使用已知装置和技术组合配制或制造，但优选地，它们使用2007年5月23日提交的、许可的、共同未决的美国临时专利申请美国序列号60/939,792描述的质粒制造技术来制造。在一些实例中，本文所述的DNA质粒可以以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除了美国序列号60/939792中所述的那些装置和方案之外，制造技术还包括或结合了本领域的普通技术人员通常已知的多种装置和方案，包括2007年7月3日公布的许可专利美国专利号7,238,522中所述的那些。上文引用的申请和专利美国序列号60/939,792和美国专利号7,238,522分别据此整体并入本文。
3.抗体
如上文所述，重组核酸序列可以编码抗体、其片段、其变体或它们的组合。抗体可以与抗原结合或反应，所述抗原更详细地描述于下文中。
抗体可以包含重链互补决定区(“CDR”)组和轻链互补决定区组，其分别插入于重链框架(“FR”)组和轻链框架组之间，这为CDR提供支撑并且限定CDR相对于彼此的空间关系。CDR组可以含有重链V区或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。抗原结合位点因此可以包括六个CDR，包括来自重链V区和轻链V区中的每一个的CDR组。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先地切割IgG分子以产生几个片段，其中两个(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供几个片段，包括F(ab’)2片段，其包含两个抗原结合位点。因此，抗体可以是Fab或F(ab’)2。Fab可以包括重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可以包括VH区和CH1区。Fab的轻链可以包括VL区和CL区。
抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可以包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包括VL区和CL区。
抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的结合所期望的抗原的抗体，所述抗原具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。
抗体可以是如下文更详细描述的双特异性抗体。抗体可以是也如下文更详细描述的双功能抗体。
如上文所述，在向受试者施用组合物后，在受试者体内可以产生抗体。抗体在受试者体内可能具有半衰期。在一些实施方案中，抗体可以被修饰以延长或缩短其在受试者体内的半衰期。这样的修饰更详细地描述于下文中。
抗体可以是脱岩藻糖基化的，如下文更详细描述的那样。
抗体可以被修饰以减少或防止抗原相关的疾病的抗体依赖性增强(ADE)，如下文更详细描述的那样。
a.双特异性抗体
重组核酸序列可以编码双特异性抗体、其片段、其变体或它们的组合。双特异性抗体可以与两种抗原结合或反应，例如下文更详细描述的抗原中的两种。双特异性抗体可以包含本文所述的抗体中的两种的片段，从而允许双特异性抗体与两种所期望的靶分子结合或反应，靶分子可以包括抗原(如下文更详细地描述)、配体(包括受体的配体)、受体(包括受体上的配体结合位点)、配体-受体复合物以及标志物。
b.双功能抗体
重组核酸序列可以编码双功能抗体、其片段、其变体或它们的组合。双功能抗体可以与下文所述的抗原结合或反应。双功能抗体还可以被修饰以赋予抗体除识别和结合抗原之外的另外的功能。这样的修饰可以包括但不限于与因子H或其片段偶联。因子H是补体激活的可溶性调节因子并且因此可以经由补体介导的裂解(CML)来促进免疫应答。
c.延长抗体半衰期
如上文所述，抗体可以被修饰以延长或缩短抗体在受试者体内的半衰期。修饰可以延长或缩短抗体在受试者的血清中的半衰期。
修饰可以存在于抗体的恒定区中。修饰可以是抗体的恒定区中的一个或多个氨基酸取代，与不包含一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期相比，一个或多个氨基酸置换延长了抗体的半衰期。修饰可以是抗体的CH2域中的一个或多个氨基酸取代，与不包含一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期相比，一个或多个氨基酸取代延长了抗体的半衰期。
在一些实施方案中，恒定区中的一个或多个氨基酸取代可以包括用酪氨酸残基置换恒定区中的甲硫氨酸残基、用苏氨酸残基置换恒定区中的丝氨酸残基、用谷氨酸残基置换恒定区中的苏氨酸残基或它们的任何组合，从而延长抗体的半衰期。
在其他实施方案中，恒定区中的一个或多个氨基酸置换可以包括用酪氨酸残基置换CH2结构域中的甲硫氨酸残基、用苏氨酸残基置换CH2结构域中的丝氨酸残基、用谷氨酸残基置换CH2结构域中的苏氨酸残基或它们的任何组合，从而延长抗体的半衰期。
d.脱岩藻糖基化
重组核酸序列可以编码未经岩藻糖基化的抗体(即，脱岩藻糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体)、其片段、其变体或它们的组合。岩藻糖基化包括将糖岩藻糖添加到分子中，例如，将岩藻糖与N-聚糖、O-聚糖以及糖脂连接。因此，在脱岩藻糖基化抗体中，岩藻糖不与恒定区的碳水化合物链连接。进而，与岩藻糖基化抗体相比，这种岩藻糖基化的缺乏可以提高抗体的FcγRIIIa结合和抗体指导的细胞毒性(ADCC)活性。因此，在一些实施方案中，与岩藻糖基化抗体相比，非岩藻糖基化抗体可以表现出增加的ADCC活性。
抗体可以被修饰以防止或抑制抗体的岩藻糖基化。在一些实施方案中，与未修饰的抗体相比，这样的修饰的抗体可以表现出增加的ADCC活性。修饰可以在重链、轻链或它们的组合中。修饰可以是重链中的一个或多个氨基酸取代、轻链中的一个或多个氨基酸取代或它们的组合。
e.减少的ADE反应
抗体可以被修饰以减少或防止抗原相关的疾病的抗体依赖性增强(ADE)，但是仍中和抗原。
在一些实施方案中，抗体可以被修饰以包括减少或防止抗体与FcyR1a结合的一个或多个氨基酸取代。一个或多个氨基酸取代可以在抗体的恒定区中。一个或多个氨基酸取代可以包括在抗体的恒定区中用丙氨酸残基置换亮氨酸残基，即在本文也被称为LA、LA突变或LA取代。一个或多个氨基酸取代可以包括在抗体的恒定区中分别用丙氨酸残基取代两个亮氨酸残基，并且在本文也被称为LALA、LALA突变或LALA取代。LALA取代的存在可以防止或阻断抗体与FcyR1a结合，因此修饰的抗体不会增强或引起抗原相关的疾病的ADE，但是仍中和抗原。
4.抗原
合成抗体涉及抗原或其片段或变体。抗原可以是核酸序列、氨基酸序列、多糖或它们的组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或它们的组合。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或它们的组合。多糖可以是核酸编码的多糖。
抗原可以来自细菌。抗原可以与细菌感染相关。在一个实施方案中，抗原可以是细菌毒力因子。
在一个实施方案中，本发明的合成抗体靶向两个或更多个抗原。在一个实施方案中，双特异性抗体的至少一个抗原选自本文所述的抗原。在一个实施方案中，两个或更多个抗原选自本文所述的抗原。
a.细菌抗原
细菌抗原可以是细菌抗原或其片段或变体。细菌可以来自以下门中的任一者：酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、嗜热丝菌门(Caldiserica)、衣原体门(Chlamydiae)、绿菌门(Chlorobi)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、网团菌门(Dictyoglomi)、迷踪菌门(Elusimicrobia)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、互养菌门(Synergistetes)、软壁菌门(Tenericutes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、热袍菌门(Thermotogae)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。
细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌可以是需氧细菌或厌氧细菌。细菌可以是自养细菌或异养细菌。细菌可以是嗜温菌、嗜中性菌、嗜极端菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌或嗜高渗菌。
细菌可以是炭疽细菌、抗生素抗性细菌、致病细菌、食物中毒细菌、感染性细菌、沙门氏菌属(Salmonella)细菌、葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌、链球菌属(Streptococcus)细菌或破伤风细菌。细菌可以是分枝杆菌(mycobacteria)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus,MRSA)或艰难梭菌(Clostridium difficile)。细菌可以是铜绿假单胞菌。
(a)铜绿假单胞菌抗原
细菌抗原可以是铜绿假单胞菌抗原、或其片段、或其变体。铜绿假单胞菌抗原可以来自毒力因子。与铜绿假单胞菌相关的毒力因子包括但不限于结构组分、酶和毒素。铜绿假单胞菌毒力因子可以是表多糖、粘附素、脂多糖、绿脓素、外毒素A、外毒素S、细胞毒素、弹性蛋白酶、碱性蛋白酶、磷脂酶C、鼠李糖脂和细菌分泌系统的组分中的一者。
在一个实施方案中，抗原是胞外多糖(例如藻酸、Pel和Psl)。在一个实施方案中，抗原是多糖合成基因座(psl)、其中包含的基因(例如pslA、pslB、pslC、pslD、pslE、pslF、pslG、pslH、pslI、pslJ、pslK、pslL、pslM、pslN和pslO)、其中编码的蛋白质或酶(例如糖基转移酶、磷酸甘露糖异构酶/GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶、转运蛋白、水解酶、聚合酶、乙酰酯酶、脱氢酶和拓扑异构酶)或由其产生的产物(例如Psl表多糖，称为“Psl”)中的一者。
在一个实施方案中，抗原是细菌分泌系统的组分。细菌中的六种不同类别的分泌系统(I型至VI型)已有所描述，它们中的五种(I型、II型、II型、V型和VI型)可见于革兰氏阴性菌(包括铜绿假单胞菌)中。在一个实施方案中，抗原是I型分泌系统的基因(例如apr或has基因)或蛋白质(例如AprD、AprE、AprF、HasD、HasE、HasF和HasR)或分泌蛋白(例如AprA、AprX和HasAp)中的一者。在一个实施方案中，抗原是II型分泌系统的基因(例如xcpA/pilD、xphA、xqhA、xcpP至Q和xcpR至Z)或蛋白质(例如GspC至M、GspAB、GspN、GspO、GspS、XcpT至XcpX、FppA)或分泌蛋白(例如LasB、LasA、PlcH、PlcN、PlcB、CbpD、ToxA、PmpA、PrpL、LipA、LipC、PhoA、PsAP、LapA)中的一者。在一个实施方案中，抗原是III型分泌系统的基因(例如psc、pcr、pop或exs基因)或蛋白质(例如PscC、PscE至PscF、PscJ、PscN、PscP、PscW、PopB、PopD、PcrH和PcrV)或分泌蛋白(例如ExoS、ExoT、ExoU和ExoY)中的一者。在一个实施方案中，抗原是III型分泌系统的调节因子(例如ExsA和ExsC)。在一个实施方案中，抗原是V型分泌系统的基因(例如estA)或蛋白质(例如EstA、CupB3、CupB5和LepB)或分泌蛋白(例如EstA、LepA和CupB5)中的一者。在一个实施方案中，抗原是VI型分泌系统的基因(例如HSI-I、HSI-II和HSI-III基因)或蛋白质(例如Fha1、ClpV1、VgrG蛋白或Hcp蛋白)或分泌蛋白(例如Hcp1)中的一者。
5.组合物的赋形剂和其他组分
组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，诸如媒介物、载剂或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐剂(Freunds incompleteadjuvant)；LPS类似物，包括单磷酰脂质A；胞壁酰肽；醌类似物；囊泡，诸如鲨烯和角鲨烯；透明质酸；脂质；脂质体；钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子或纳米颗粒或者其他已知的转染促进剂。
转染促进剂是聚阴离子；聚阳离子，包括聚L-谷氨酸(LGS)；或脂质。转染促进剂是聚L-谷氨酸，聚L-谷氨酸可以以小于6mg/ml的浓度存在于组合物中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐剂；LPS类似物，包括单磷酰脂质A；胞壁酰肽；醌类似物以及囊泡，诸如鲨烯和角鲨烯，并且还可以使用与组合物结合施用的透明质酸。组合物还可以包括转染促进剂，诸如脂质；脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)；钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或者其他已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子；聚阳离子，包括聚L-谷氨酸(LGS)；或脂质。疫苗中转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
组合物还可以包含1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所述的遗传促进剂，该专利以引用的方式整体并入。
组合物可以包含以下量的DNA：约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；或优选地约0.1微克至约10毫克；或更优选地约1毫克至约2毫克。在一些优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选的实施方案中，组合物可以含有约10纳克至约800微克的DNA。在一些优选的实施方案中，组合物可以含有约0.1微克至约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，组合物可以含有约1微克至约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，组合物可以含有约25微克至约250微克、约100微克至约200微克、约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；约0.1微克至约10毫克；约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0.1微克至约500微克、约1微克至约350微克、约25微克至约250微克、约100微克至约200微克的DNA。
组合物可以根据要使用的施用方式来配制。可注射的药物组合物可以是无菌的、无热原的和无颗粒的。可以使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。组合物可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。组合物还可以包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可以允许制剂在室温或环境温度下在一段较长的时间内稳定，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。
6.产生合成抗体的方法
本发明还涉及一种产生合成抗体的方法。该方法可以包括通过使用下文更详细描述的递送方法向有需要的受试者施用组合物。因此，在向受试者施用组合物后，在受试者中或体内产生合成抗体。
该方法还可以包括将组合物引入一种或多种细胞中，并且因此，在一种或多种细胞中可以形成或产生合成抗体。该方法还可以包括将组合物引入一种或多种组织中，例如但不限于皮肤和肌肉，并且因此，在一种或多种组织中可以形成或产生合成抗体。
7.鉴定或筛选抗体的方法
本发明还涉及一种鉴定或筛选上述抗体的方法，所述抗体对上述抗原具有反应性或结合上述抗原。鉴定或筛选抗体的方法可以在本领域技术人员已知的方法中使用抗原来鉴定或筛选抗体。这些方法可以包括但不限于从文库(例如，噬菌体展示)中选择抗体以及对动物进行免疫接种，然后分离和/或纯化抗体。
8.组合物的递送方法
本发明还涉及一种向有需要的受试者递送组合物的方法。递送方法可以包括向受试者施用组合物。施用可以包括但不限于在进行和不进行体内电穿孔的情况下进行DNA注射、脂质体介导的递送以及纳米颗粒促进的递送。
接受组合物的递送的哺乳动物可以是人、灵长类动物、非人灵长类动物、奶牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。
组合物可以通过不同的途径施用，包括口服、肠胃外、舌下、透皮、经直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经由颊面施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、鞘内以及关节内或它们的组合。对于兽医用途，组合物可以根据正常的兽医实践作为可适当接受的制剂施用。兽医可以容易地确定最适合于具体动物的给药方案和施用途径。组合物可以通过传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其他物理方法，诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声来施用。
a.电穿孔
经由电穿孔施用组合物可以使用电穿孔装置来完成，所述电穿孔装置可以被配置成向哺乳动物的所期望的组织递送能够有效引起在细胞膜中形成可逆性孔隙能量脉冲，并且优选的是，能量脉冲是与使用者输入的预设电流相似的恒定电流。电穿孔装置可以包括电穿孔部件和电极组件或柄部组件。电穿孔部件可以包括和结合电穿孔装置的各种元件中的一种或多种，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储部件、电源和电源开关。电穿孔可以使用体内电穿孔装置完成，例如CELLECTRA EP系统(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)或Elgen电穿孔仪(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)，以促进质粒对细胞的转染。
电穿孔部件可以充当电穿孔装置的一个元件，并且其他元件是与电穿孔部件通信的单独元件(或部件)。电穿孔部件可以充当电穿孔装置的多于一个元件，其可以与和电穿孔部件分开的电穿孔装置的另外其他元件通信。作为一个机电装置或机械装置的零件存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为元件可以充当一个装置或彼此通信的单独元件。电穿孔部件可能能够在所期望的组织中递送产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极组件可以包括具有空间排列的多个电极的电极阵列，其中电极组件从电穿孔部件接收能量脉冲并且将其经由电极递送至所期望的组织。多个电极中的至少一个在递送能量脉冲期间是中性的，并且测量所期望组织中的阻抗，并且将阻抗传送给电穿孔部件。反馈机制可以接收所测量的阻抗并且可以调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以维持恒定电流。
多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。多个电极可以经由按照编程序列控制电极以分散模式来递送能量脉冲，并且编程序列是由使用者输入到电穿孔部件。编程序列可以包括按顺序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每一个脉冲是由至少两个有源电极递送的，其中一个中性电极测量阻抗，并且其中多个脉冲的后续脉冲由至少两个有源电极中不同的电极递送，其中一个中性电极测量阻抗。
反馈机制可以通过硬件或软件执行。反馈机制可以通过模拟闭环电路执行。反馈每50微秒、20微秒、10微秒或1微秒发生一次，但优选地是实时反馈或瞬时的(即基本上瞬时的，如通过用于确定响应时间的可用技术确定)。中性电极可以测量所期望的组织中的阻抗并且将阻抗传送给反馈机制，并且反馈机制对阻抗作出响应并且调整能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的值。反馈机制可以在递送能量脉冲期间连续地并且瞬时地维持恒定电流。
可以促进本发明的组合物的递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963、Smith等人递交的美国专利公开2005/0052630中所述的那些，这些文献的内容据此以引用的方式整体并入本文。可以用于促进组合物的递送的其他电穿孔装置和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未决的和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的那些，该美国专利申请依照美国法典第35篇第119条(e)款要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982的权益，所有这些临时申请据此整体并入。
Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963描述了模块化电极系统和它们用于促进将生物分子引入到身体或植物中所选择的组织的细胞中的用途。模块化电极系统可以包括多个针电极；皮下注射针；提供从可编程的恒定电流脉冲控制器到多个针电极的导电连接的电连接器；以及电源。操作人员可以抓住安装在支撑结构上的多个针电极并且将它们牢固地插入到身体或植物中所选择的组织中。然后经由皮下注射针将生物分子递送到所选择的组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器并且将恒定电流电脉冲施加到多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲促进将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的全部内容据此以引用的方式并入。
Smith等人递交的美国专利公开2005/0052630描述了一种电穿孔装置，其可以用于有效地促进生物分子引入到身体或植物中所选择的组织的细胞中。电穿孔装置包括电动装置(“EKD装置”)，其操作由软件或固件指定。EKD装置基于使用者对脉冲参数的控制和输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒定电流脉冲图形，并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包括可更换的电极盘，所述电极盘具有针电极的阵列、用于注射针的中心注射通道以及可移除的引导盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容在此以引用的方式并入。
美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/0052630中所述的电极阵列和方法可以适用于不仅深度穿透到诸如肌肉的组织中，而且还深度穿透到其他组织或器官中。由于电极阵列的配置，因此注射针(递送所选择的生物分子)也完全插入到靶器官中，并且在由电极预先界定的区域中垂直于靶组织施用注射。美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/005263中所述的电极优选地为20mm长和21号。
此外，在包括电穿孔装置和其用途的一些实施方案中考虑，电穿孔装置是以下专利中所述的那些：1993年12月28日公布的美国专利5,273,525、2000年8月29日公布的美国专利6,110,161、2001年7月17日公布的美国专利6,261,281、和2005年10月25日公布的美国专利6,958,060、以及2005年9月6日公布的美国专利6,939,862。此外，本文考虑了涵盖2004年2月24日公布的美国专利6,697,669(涉及使用多种装置中的任一种递送DNA)和2008年2月5日公布的美国专利7,328,064(涉及注射DNA的方法)中提供的主题的专利。上述专利以引用的方式整体并入。
9.治疗方法
本文还提供了一种在有需要的受试者中通过在受试者中产生合成抗体来治疗、防止和/或预防疾病的方法。该方法可以包括向受试者施用组合物。向受试者施用组合物可以使用上述递送方法进行。
在某些实施方案中，本发明提供治疗、防止和/或预防细菌感染的方法。在一个实施方案中，该方法治疗、防止和/或预防细菌生物膜的形成。在一个实施方案中，该方法治疗、防止和/或预防铜绿假单胞菌感染或生物膜形成。在一个实施方案中，该方法治疗、防止和/或预防伤口的铜绿假单胞菌感染。
在受试者中产生合成抗体后，合成抗体可以与抗原结合或反应。这种结合可以中和抗原，阻断另一种分子(例如蛋白质或核酸)对抗原的识别，并且引发或诱导对抗原的免疫应答，从而治疗、防止和/或预防受试者的抗原相关的疾病。
组合物剂量可以是1μg至10mg活性组分/kg体重/次，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/次。组合物可以每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天施用。用于有效治疗的组合物剂量数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
10.与抗生素组合使用
本发明还提供了一种通过施用合成抗体和治疗性抗生素剂的组合在有需要的受试者中治疗、防止和/或预防疾病的方法。
合成抗体和抗生素剂可以使用任何合适的方法施用以使得合成抗体和抗生素剂的组合均存在于受试者体内。在一个实施方案中，该方法可以包括通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第一组合物以及在施用合成抗体之后少于1天、少于2天、少于3天、少于4天、少于5天、少于6天、少于7天、少于8天、少于9天或少于10天施用包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可以包括通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第一组合物以及在施用合成抗体之后多于1天、多于2天、多于3天、多于4天、多于5天、多于6天、多于7天、多于8天、多于9天或多于10天施用包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可以包括施用包含抗生素剂的第一组合物以及在施用抗生素剂之后少于1天、少于2天、少于3天、少于4天、少于5天、少于6天、少于7天、少于8天、少于9天或少于10天通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可以包括施用包含抗生素剂的第一组合物以及在施用抗生素剂之后多于1天、多于2天、多于3天、多于4天、多于5天、多于6天、多于7天、多于8天、多于9天或多于10天通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可以包括同时通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第一组合物和包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可以包括同时通过上文详细描述的方法中的任一种施用包含本发明的合成抗体的第一组合物和包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可以包括施用包含本发明的合成抗体和抗生素剂的单一组合物。
可以与本发明的合成抗体组合使用的抗生素的非限制性实例包括氨基糖苷类(例如，庆大霉素(gentamicin)、阿米卡星(amikacin)、妥布霉素(tobramycin))、喹诺酮类(例如，环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin))、头孢菌素类(cephalosporin)(例如，头孢他啶(ceftazidime)、头孢吡肟(cefepime)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢匹罗(cefpirome)、头孢吡普(ceftobiprole))；抗假单胞菌青霉素类：羧基青霉素类(例如，羧苄西林(carbenicillin)和替卡西林(ticarcillin))和脲基青霉素类(例如，美洛西林(mezlocillin)、阿洛西林(azlocillin)和哌拉西林(piperacillin))、碳青霉烯类(例如，美罗培南、亚胺培南(imipenem)、多尼培南(doripenem))、多粘菌素类(例如，多粘菌素B和粘菌素)以及单酰胺菌素类(例如，氨曲南(aztreonam))。
本发明具有通过以下非限制性实施例说明的多个方面。
11.实施例
在以下实施例中进一步说明本发明。应当了解的是，这些实施例虽然表明了本发明的优选的实施方案，但是仅通过说明方式给出。从上述论述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改以使它适应各种用途和条件。因此，根据上述说明，除本文所示和所述的那些之外，本发明的多种修改对本领域技术人员来说将是显而易见的。这些修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
实施例1：工程改造的双特异性DNA编码的IgG抗体(DMAb)在致死性肺炎激发模型 中防止铜绿假单胞菌
本文提供的研究描述了编码单特异性抗PcrV IgG(DMAb-αPcrV)和临床候选物双特异性抗体ABC123(DMAb-BiSPA)的合成DMAb的开发以及体内产生和活性分析。DMAb体内产生可以迅速进行两种构建体的功能和保护滴定。这些DMAb可以保持和对生物过程产生的mAb具有类似的效力，以及类似地预防主要器官的铜绿假单胞菌定殖。
在当前研究中，据证实针对铜绿假单胞菌的mAb可以在合成DNA载体DMAb中编码，并且由骨骼肌体内产生。抗假单胞菌DMAb有效地结合治疗靶标，并且在由侵袭性铜绿假单胞菌菌株导致的致死性肺炎的小鼠模型中具有保护性。单剂量DMAb瞬时表达3-4个月，并且致死性感染的防止相当于用纯化的IgG治疗小鼠。这是长期mAb施用的重要进展，因为DMAb可以从肌肉连续表达，直到质粒最终丢失。除常规施用之外，抗铜绿假单胞菌DMAb的另一个可预见优点将针对与慢性疾病或植入装置相关的重复感染的高风险患者，其中DMAb可以减少延长抗生素方案的需要。此外，据证实DMAb也可以与通常使用的抗生素美罗培南一起协同发挥功能。DMAb和抗生素组合的协同作用表明，该策略可以在减少抗生素治疗方案方面具有潜力，从而减少抗生素在患者中暴露的时长。该附加活性相当于前述研究中蛋白质IgG的观察结果(DiGiandomenico等人,2014,Sci Transl Med 6,262ra155)。总之，这些结果表明，全长IgG mAb的DNA递送是预防严重细菌感染以及可能地其他治疗适应症的有潜力的平台策略。所有生物加工的抗假单胞菌IgG mAb(抗Psl、抗PcrV和ABC123)已显示出针对来源于不同血清型、多个3型分泌表型(分别为细胞毒性与侵袭性菌株；ExoU+、ExoS-；ExoU-、ExoS+)和多个感染位点的铜绿假单胞菌临床分离株具有保护性(DiGiandomenico等人,2012,J Exp Med 209,1273-1287；Warrener等人,2014,Antimicrob Agents Chemother58,4384-4391；DiGiandomenico等人,2014,Sci Transl Med 6,262ra155；Thaden等人,2016,J Infect Dis 213,640-648；Zegans等人,2016,JAMA Ophthalmol134,383-389)。
现在描述材料和方法
细胞系和细菌
人胚肾(HEK)293T细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)中维持。细胞系处于并维持于无支原体条件下。常规测试在宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)进行。所有细胞以低传代数维持。细胞毒性(ExoU+)菌株，即铜绿假单胞菌角膜炎临床分离株6077(PA6077)用于所有感染实验。
DMAb构建和表达
获得单特异性抗铜绿假单胞菌PcrV蛋白质(克隆V2L2MD)(Warrener等人,2014,Antimicrob Agents Chemother 58,4384-4391)和工程改造的双特异性抗铜绿假单胞菌(对PcrV和Psl具有双特异性，克隆ABC123)(DiGiandomenico等人,2014,Sci Transl Med6,262ra155)的序列。每个人IgG1重链和Igκ轻链的核苷酸序列都是针对小鼠和人偏爱性而密码子优化的，以增强在哺乳动物细胞中的表达(Graf等人,2004,Methods Mol Med 94,197-210；Deml等人,2001,J Virol 75,10991-11001)。序列对于改善mRNA稳定性和核糖体上的有效翻译也是RNA优化的(Schneider等人,1997,J Virol 71,4892-4903；Andre等人,1997,J Virol 72,1497-1503，以使蛋白质收率提高(Fath等人,2011,PLoS One 6,e17596)。然后将优化的重链和轻链基因插入pGX0001DNA表达载体，在人巨细胞病毒(hCMV)启动子和牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸的控制下。
两个基因均以顺式编码，通过弗林蛋白酶切割位点和P2A肽隔开。结果是两种质粒：DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA。通过GeneJammer(Agilent,Wilmington,DE)转染试剂用DMAbDNA转染HEK 293T细胞。在转染后48小时收集细胞上清液和细胞裂解物，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和Western印迹来分析人IgG产生。
小鼠肌肉组织免疫荧光
用100μg DMAb注射BALB/c小鼠(IM注射于TA肌肉中)，然后进行IM-EP。在注射后3天收集组织，在4％中性缓冲福尔马林(BBCBiochemical,Washington State)中固定，并浸入溶于D.I.水的30％(w/v)蔗糖(Sigma,MO)中。然后将组织嵌入O.C.T.化合物(SakuraFinetek,CA)并快速冷冻。将冷冻组织块切成厚度为18um的切片。将切片肌肉与封闭缓冲液(0.3％(v/v)Triton-X(Sigma)、2％(v/v)溶于PBS的驴血清)孵育30分钟，用封口膜覆盖。在孵育缓冲液(1％(w/v)BSA(Sigma)、2％(v/v)驴血清、0.3％(v/v)Triton-X(Sigma)和0.025％(v/v)1g/ml溶于PBS的叠氮化钠(Sigma))中以1:100稀释山羊抗人IgG-Fc片段抗体(A-80-104A,Bethyl,Texas)。将50μl染色溶液加入每个切片并孵育2小时。在1xPBS中洗涤切片5分钟三次。在孵育缓冲液中以1:200稀释驴抗山羊IgG AF488(ab150129,Abcam,USA)，并将50μl加入每个切片。在1小时孵育后洗涤切片，用DAPI-Fluoromount(SouthernBiotech,AL)装片并覆盖。
用配备有Retiga3000单色相机(QImaging)的BX51荧光显微镜(Olympus)对DMAb构建体的体内表达成像。
通过ELISA和抗细胞毒性活性进行人IgG定量
用10μg/mL纯化的抗人IgG-Fc涂覆九十六孔高结合免疫吸附板并在4℃下孵育过夜。第二天，在室温下用含有10％FBS的PBS洗涤和封闭板至少1小时。两倍系列稀释样品，并转移到封闭板，在室温下孵育1小时。纯化的人IgGκ用作标准品。在孵育后，用缀合至辣根过氧化物酶的抗人IgGκ抗体以1:20,000的稀释度探测样品。使用邻苯二胺二盐酸盐底物对板进行显色，并用2N H2SO4终止。使用BioTek Synergy2读板器在OD450nm下读板。或者，如上所述定量来自血清的人IgG，不同的是使用对V2L2MD或ABC123特异的抗独特型mAb(0.05μg/孔，悬浮于0.2M碳酸氢钠缓冲液pH9.4中)作为捕获试剂。纯化的V2L2MD或ABC123用作标准品。
还使用384孔黑色MaxiSorp板(涂覆有10μg/mL山羊抗人IgG(H+L)定量来自血清的DMAb。洗涤板并在室温下用封闭剂溶于PBS的酪蛋白封闭1-2小时。在封闭后，以1:2系列稀释整个板中含有ABC123或V2L2MD的标准品，同时以1:20、1:40、1:80和1:160稀释血清样品。然后在室温下孵育含有样品的板1小时。在洗涤后，用驴抗人IgG-HRP以1:4000的稀释度探测板，并在室温下孵育1小时。在洗涤后，通过添加SuperSignal ELISA Pico试剂使免疫反应显色，并在Perkin Elmer Envision上读取荧光。
还根据DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA介导的抗细胞毒性活性定量来自血清的DMAb，所述抗细胞毒性活性度量保护A549细胞免于PA 6077的细胞毒性的影响。将小鼠血清的活性与V2L2MD IgG加标的初始小鼠血清的标准曲线进行比较。
结合ELISA
用假单胞菌PcrV蛋白以0.5μg/mL涂覆九十六孔板免疫吸附板过夜。第二天，两倍系列稀释来自DMAb施用动物的血清样品，然后转移到封闭板。用缀合至HRP的抗人IgG H+L抗体以1:5000的稀释度探测样品，并用OPD使底物显色。
Western印迹
在细胞裂解缓冲液中收集来自DMAb转染的细胞的细胞裂解物。以20,000rpm离心样品并收集含有蛋白质级分的上清液。使用二辛可宁酸(BCA)测定定量样品，并将10μg总裂解物上样到4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶。使用iBlot2系统将凝胶转移到硝酸纤维素膜。在5％脱脂乳粉+0.5％Tween-20中封闭膜，然后使用缀合至HRP的驴抗人H+L抗体进行探测。使用化学发光系统对条带进行显色，并在膜上成像。
小鼠
雄性六至八周龄B6.Cg-Foxn1nuJ和BALB/c小鼠购自TheJackson Laboratory(BarHarbor,ME)，圈养于宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)或MedImmune,AstraZeneca的动物护理所。所有动物方案均获得宾夕法尼亚大学和MedImmune IACUC机构委员会的批准，根据ALAAC的准则进行。另外的IACUC概览由动物护理和使用评估办公室(ACURO)提供。动物在TA或四头肌中IM注射100μg-300μg DMAb-αPcrV或DMAb-BiSpA之前30分钟至1小时接受肌肉内(IM)预注射透明质酸酶(400U/mL,Sigma Aldrich)，然后进行电穿孔(IM-EP)。在施用后监测DMAb的血清水平。
致死性肺炎激发
BALB/c小鼠(n＝8只/组)在激发前第5天通过IM-EP接受100μg或300μg DMAb-αPcrV或DMAb-BiSpA。纳入不相关的登革热病毒DMAb-DVSF3 20作为对照。第四组动物在激发前第-1天接受腹腔内(IP)注射纯化的蛋白质IgG ABC123(2mg/kg)。在第0天，动物接受9.75e5-1.0e6个集落形成单位(CFU)的侵袭性抗微生物抗性铜绿假单胞菌菌株6077的鼻内激发。如16所述在鼻内激发后6天监测动物的存活率。简而言之，用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉动物，然后鼻内施用在0.05ml中含有的细菌接种物。对于器官负荷分析，在感染后24小时从DMAb治疗的动物收集肺、脾和肝，然后匀浆并接种Luria琼脂板，用于细菌CFU计数。使用多重试剂盒(Meso Scale Diagnostics)根据制造说明定量肺匀浆物的上清液的IL-1β、IL-6和KC/GRO。对于DMAb和美罗培南(MEM)组合实验，在感染后4小时皮下施用MEM。
组织病理学
在感染后48小时收集肺，并在10％中性缓冲福尔马林中固定最少48小时。然后常规处理固定的组织，包埋于石蜡中，切成3μm厚切片，并用Gill苏木精和伊红染色，以便由对实验条件不知情的病理学家进行组织学评估。
统计学
使用GraphPad Prism 6.0软件或SPSS进行所有统计学分析。使用α0.05和功效0.90进行两个独立部分的样品大小计算。为了确保足够的功效，需要计算最小n＝5只小鼠。如有需要，可进行学生T-检验或单因素方差分析(ANOVA)计算。存活率数据以Kaplan-Meier存活率曲线表示，并且使用对数秩检验和单因素ANOVA以及多重比较的校正来计算显著性。如果p<0.05，则数据被视为具有显著性。所有图中的线表示平均值，误差条表示标准偏差。所有样品或动物均未排除在分析之外。动物研究不进行随机分组。在进行每个实验之前，样品和动物不是不知情的。
现在描述实验的结果
抗铜绿假单胞菌DNA递送的单克隆抗体(DMAb)的设计和体外表达
根据其上文所述的针对致死性铜绿假单胞菌感染的强效保护性体内活性，对两个抗铜绿假单胞菌mAb基因再编码，以优化DNA表达载体系统中的表达。考虑到人和小鼠的密码子偏爱性，人免疫球蛋白γ1(IgG1)重链和轻链序列(Fab和Fc部分)是核苷酸和氨基酸序列优化的，并且编码为pGX0001DNA质粒骨架中的单个多顺反子单位，产生两个构建体：DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA(图1A)。重链和轻链以单一mRNA转录物表达，然后在猪捷申病毒12A(P2A)切割位点进行翻译后切割。还包括弗林蛋白酶切割位点(RGRKRRS,SEQ ID NO:23)以确保从最终体内产生的抗体完全移除P2A。
在HEK293T细胞的体外转染后评价每个构建体表达全长人IgG1抗体的能力。在48小时后收集DMAb转染的细胞和上清液，并对细胞裂解物和培养基中进行总IgG ELISA，所述ELISA证实DMAb IgG产生和分泌(图1B，图i和图ii)。还进行Western印迹以确认抗体重链和轻链均表达。双特异性DMAb的重链以高分子量运行，因为它编码两个可变区特异性(图1C)。纳入pGX0001DNA载体作为阴性对照和纯化的抗PcrV IgG1作为阳性对照。
小鼠中抗铜绿假单胞菌DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA的表达
在确认体外表达后，检查小鼠中DNA递送的DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA的表达。为了确认小鼠肌肉中的DMAb表达，通过肌肉内注射(IM)于胫前肌(TA)中将抗铜绿假单胞菌DMAb-αPcrV(100μg)、DMAb-BiSPA(100μg)、对照DMAb-DVSF3(100μg)或对照pGX0001空载体(100μg)施用于BALB/c小鼠，然后进行肌肉内电穿孔(IM-EP)。在注射后3天收集肌肉组织，并用山羊抗人IgG Fc抗体探测切片，然后用缀合至AF488的驴抗山羊IgG检测(图2)。在确认体内表达后，进行另外的实验以分析体循环的DMAb水平。人IgG1在具有免疫能力的小鼠中诱导抗抗体应答，因为它被鼠科动物免疫系统识别为非自身。所以，在缺乏T细胞且具有非功能B细胞的免疫缺损的B6.Cg-Foxn1nu/J无胸腺小鼠(裸)中评估表达。将抗铜绿假单胞菌DMAb-αPcrV(100μg)或DMAb-BiSPA(100μg)IM施用于裸鼠(n＝5只/组)的TA或四头(四)肌中，然后进行IM-EP。收集血清以监控循环中的长期人IgG1表达。观察施用后100-120天两种DMAb的表达，这支持以下假设：这些新型DNA递送的mAb可以可在体循环中检测的显著量在骨骼肌中产生，且表达几周(图3A和图3D)。
然后，评估具有免疫能力的BALB/c小鼠中的DMAb表达，因为所述小鼠通常用作铜绿假单胞菌感染的模型。通过IM-EP给小鼠(n＝10只/组)施用100μg和300μg剂量(3个注射位点x100μg)的DMAb-αPcrV或DMAb-BiSPA。观察在注射后第7天的峰值DMAb表达水平，对于DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA，在100μg剂量下分别为7.1-17.1μg/ml和2.9-7.2μg/ml，在300μg剂量下分别为31.2-49.7μg/mL和3.2-12.7μg/mL(图3B和图3E)。在第14天通过小鼠免疫系统消除BALB/c小鼠中的人IgG1DMAb表达(图4A和图4B)。为了比较，还设计了小鼠IgG2aDMAb。这证实了在具有免疫能力的BALB/c小鼠中的长期表达>100天，证实了DMAb的长期表达未被免疫系统消除(图4C)。为了确认DMAb的靶抗原特异性，还分析了施用后第7天的血清，并通过ELISA确认与重组PcrV蛋白的结合(图3C和图3F)。
在致死性肺炎模型中评估DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA
体外和体内表达研究表明，DMAb形成结合重组PcrV蛋白的完全人IgG1抗体。为了解决体内DNA递送的DMAb的功能活性，使用致死性小鼠肺炎感染模型评估针对高病原性和细胞毒性铜绿假单胞菌菌株6077(PA 6077)的保护。在PA 6077激发前五天，用DMAb-αPcrV(300μg)、DMAb-BiSPA(300μg)或不相关的靶向登革热病毒的对照DMAb-DVSF3(300μg)注射小鼠(Flingai等人,2015,Sci Rep 5,12616)。还纳入其中小鼠在激发前一天接受蛋白质ABC123 IgG(2mg/kg)的阳性对照组。对从DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA处理动物随机选择的动物实施安乐死，以监测激发时血清中的DMAb表达水平，并且评估表达DMAb的效力。如图5A所示，在定量血清的总人IgG时，单特异性DMAb-αPcrV和双特异性DMAb-BiSPA分别展示出大约16和8μg/ml的中位数滴度。通过定量抗体表达根据血清的抗细胞毒性活性来评估体内表达的DMAb-αPcrV和DMAb-BiSPA的效力。在定量方法中未观察到差异，这表明与生物加工的IgG相比，体内表达的单特异性和双特异性DMAb-IgG在活性上是全功能的和等效的(图5A)。然后通过鼻内接种用致死性剂量的铜绿假单胞菌来激发每个组中的其余动物，然后监测感染后6天(144小时)的存活率。接受对照DMAb-DVSF3的动物在24-55小时内死于感染。相比之下，大约94％接受DMAb-αPcrV或DMAb-BiSpA的动物(15/16)在激发中存活(图5B，p<0.0001，与DMAb-DVSF3相比)。正如预期，接受ABC123IgG(2mg/kg)的阳性对照动物均在激发中存活。此外，用DMAb-BiSPA以100μg(1个位点x100μg)、200μg(2个位点x100μg)或300μg(3个位点x100μg)处理小鼠，然后用铜绿假单胞菌感染，得到浓度依赖性存活率(图5C)。这些结果与在这些动物的血清中表达的DMAb-BiSPA的定量一致，其中DMAb-BiSPA的血清蛋白质浓度随着电穿孔DNA的量减少而降低(图5D)。
分析抗假单胞菌DMAb减少肺中的细菌负荷和预防全身细菌传播的能力。测定用铜绿假单胞菌激发后24小时的肺、脾和肾，然后定量每个组织中的集落形成单位(CFU)。观察到DMAb-BiSPA处理的动物的CFU肺负荷显著减少，而DMAb-αPcrV处理的动物则未观察到(图6A)。重要的是，DMAb-BiSPA处理的动物的肺中的细菌负荷类似于从用蛋白质ABC123IgG处理的小鼠观察的肺负荷，并且与对照DMAb-DVSF3相比时，两种抗假单胞菌DMAb均减少了细菌传播至脾和肾(图6A)。此外，与对照DMAb-DVSF3处理的小鼠相比，DMAb-αPcrV、DMAb-BiSPA和ABC123IgG能够有效预防感染动物中的肺水肿，如肺重量所测量(图6B)。与这些结果一致的是，在抗假单胞菌DMAb处理和蛋白质IgG处理的小鼠中，与对照DMAb-DVSF3相比，促炎性细胞因子IL-1β和IL-6以及趋化因子KC/GRO(图6C)也减少。比较PA 6077激发后24小时未感染的动物和感染的动物之间的血清IgG水平(图6D)。总之，此数据表明，在骨骼肌中体内产生的DNA递送的mAb介导保护活性，并且展示出与外部产生的IgG mAb相似的效力。
激发后的肺组织病理学
在感染后48小时收集的肺的组织病理学证实，DMAb-DVSF3处理的动物中具有显著的肺泡炎，在肺泡和血管周隙中具有中性粒细胞和巨噬细胞侵润，以及出血区域和肺泡坏死。相比之下，与如上所述的肺上清液的促炎性细胞因子和趋化因子减少一致，原始中性粒细胞的温和群体导致的炎症明显减少，并且在具有类似变化的DMAb-BiSPA处理的动物中，以及DMAb-αPcrV和对照ABC123IgG组中观察到巨噬细胞较少(图7)。
DMAb与抗生素的组合
当怀疑革兰氏阴性或铜绿假单胞菌感染时，施用广谱碳青霉烯家族抗生素，诸如美罗培南(MEM)。另外的最后抗生素方案，诸如粘菌素，与人体中的高毒性有关(Falagas等人,2005,BMC Infect Dis 5,1；Lim等人,2010,Pharmacotherapy 30,1279-1291)，并且存在细菌获得另外的抗微生物抗性的可能性(Hirsch和Tam,2010,Expert Rev PharmacoeconOutcomes Res 10,441-451；Lister等人,2009,Clin Microbiol Rev 22,582-610；Breidenstein等人,2011,Trends Microbiol 19,419-426)。所以降低这些风险的替代和附加策略将是高度有利的。在与MEM的组合中评估DMAb-BiSPA治疗的潜在应用。对于这些实验，使用MEM的亚治疗剂量(2.3mg/kg)和DMAb-BiSPA的亚治疗剂量(100μg，如图5C所示)模拟抗性细菌感染的患者遭遇的不当药物暴露。组合这些亚治疗剂量得到67％的存活率，而接受单独DMAb-BiSPA的动物则为10％(p＝0.026，图8)。接受单独MEM或DMAb-DVSF3的对照小鼠不能在致死性激发中存活。总之，这扩展了DMAb治疗的应用，无论单独治疗还是与现有的抗生素方案组合。此外，该数据支持以下假设：DMAb施用与纯化的IgG mAb具有类似的功能，并且当与护理抗生素治疗方案标准组合时可介导增强的保护活性。
mAb工程改造领域是不断进展的，并且DMAb递送提供了有助于在体内迅速转运生物功能mAb的另外策略。如此处所示，除了明显的临床有益效果之外，非传统双特异性mAb同种型的体内表达，强调了肌肉作为蛋白质产生工厂的通用性。重要的是，DMAb表达是瞬时的，对其他治疗递送也具有类似的功效。当不再需要DNA质粒时，开发消除DNA质粒的诱导型系统也是可能的。或者，由于无相关抗载体应答，DMAb DNA可以潜在地无限再施用，以允许经由重复施用的长期疗法(Hirao等人,2010,Molecular therapy:the journal of theAmerican Society of Gene Therapy 18,1568-1576；Williams,2013,Vaccines 1,225-249；Schmaljohn等人,2014,Virus research 187,91-96)。无论对于mAb疗法和DNA递送技术，还是对于增强宿主免疫的新型病原体特异性治疗手段，DMAb递送都代表了重要进展。
最近报道了在人乳腺癌的小鼠模型中靶向Her2的DNA编码的抗体的递送(Kim等人,2016,Cancer Gene Ther 23,341-347)。该研究证实了相当于蛋白质IgG的抗肿瘤功效，还支持基因编码的mAb可具有功能的概念。这是防止细菌靶标的DNA编码的mAb(DMAb)递送的首次证实，以及工程改造的IgG同种型的首次递送。DNA质粒编码抗体的早期研究证实了可行性，但展示出IgG在血清中的表达较低(Tjelle等人,2004,Molecular therapy:thejournal of the American Society of Gene Therapy 9,328-336；Perez等人,2004,Genet Vaccines Ther 2,2)。此前研究了靶向病毒感染的DMAb的保护性功效，显示出能够迅速防止基孔肯雅热(Muthumani等人,2016,J Infect Dis 214,369-378)和登革热病毒(DENV)感染(Flingai等人,2005,Sci Rep 5,12616)。靶向DENV的DMAb也不能促进疾病的抗体依赖性增强作用。这两种感染性疾病模型不需要高血清IgG水平，然而，提高表达水平的优化DMAb制剂是所期望的，以提供单次DMAb施用后的延长覆盖。为此，优化血清DMAb表达水平以用于抗铜绿假单胞菌(图9)。本研究包括将透明质酸酶纳入制剂方案，其允许自治疗肌肉的较高IgG表达。
虽然转移到人需要进一步研究，但是DMAb向前迈出了一步，允许mAb的常规递送，其具有提高世界上不同社区的可达性的潜力。在将来的研究中解决大型动物和人的剂量转移将是重要的，特别是理解DMAb施用期间的DNA剂量限制。这包括研究增将强体内DNA表达的不同递送和制剂优化。一种策略可以是利用其他胞外基质酶来促进DNA进入肌肉细胞37。非人灵长类动物中的进一步研究可以帮助理解DNA剂量的阈值和对药代动力学水平的影响。评价肌肉中产生的人IgG DMAb的糖基化模式的另外研究，对于与生物加工的蛋白质IgG进行比较将是有利的，然而在当前研究的背景下，DMAb及其蛋白质IgG对应物之间的功能不存在差异。
最后，本文所述的研究对于AMR感染的治疗具有重要意义，特别是针对很多广谱抗生素方案难治的ESKAPE病原体。DMAb是通用的，可以递送针对多个抗原靶标的单特异性IgG，并且编码新型双特异性IgG。单剂量DMAb产生的持续血清mAb波谷水平与体内生物加工的蛋白质IgG提供的功能和保护水平一致。与蛋白质IgGmAb方案相比，该平台的迅速开发和延长肌肉的瞬时表达是有利的，因为它能够降低mAb施用的频率。此外，DMAb是温度稳定的，这允许运输、长期储存和向广大群体施用。这些具有吸引力的特征与人体中DNA递送的安全特性组合，支持在大型动物模型中进行进一步DMAb研究，作为靶向感染性疾病和其他潜在治疗靶标的病原体特异性方法。
表1：序列描述
应当了解的是，上述详细说明和所附实施例仅仅是说明性的而不应当被认为对本发明的范围构成限制，本发明的范围仅由所附权利要求和它们的等同方案限定。
所公开的实施方案的各种变化和修改方案对本领域技术人员将是显而易见的。这些变化和修改包括但不限于关于本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法的那些，它们可以在不脱离其精神和范围的情况下作出。
序列表
<110> 大卫·韦纳
阿米·帕特尔
严健
<120> 用于抗铜绿假单胞菌的DNA抗体构建体
<130> 206108-0058-00-WO.606335
<150> US 62/332,363
<151> 2016-05-05
<160> 47
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9308的核苷酸序列：V2L2MD重链
<400> 1
gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgaggctg 60
tcctgcgcag catctggctt cacctttagc tcctatgcaa tgaactgggt gcgccaggca 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtgtctgcc atcacaatga gcggcatcac cgcctactat 180
acagacgatg tgaagggcag gtttaccatc agcagagaca actccaagaa tacactgtac 240
ctgcagatga atagcctgag agccgaggat accgccgtgt actattgcgc caaggaggag 300
ttcctgcccg gcacacacta ctattacgga atggacgtgt ggggacaggg aaccacagtg 360
accgtgtcta gcgcctccac aaagggacct agcgtgttcc cactggcacc ctcctctaag 420
tccacctctg gcggcacagc cgccctgggc tgtctggtga aggattattt cccagagccc 480
gtgaccgtgt cttggaacag cggcgccctg acctctggag tgcacacatt tccagccgtg 540
ctgcagagct ccggcctgta tagcctgtct agcgtggtga ccgtgccctc ctctagcctg 600
ggcacccaga catacatctg caacgtgaat cacaagccat ctaatacaaa ggtggacaag 660
aaggtggagc ccaagagctg tgataagacc cacacatgcc ctccctgtcc tgcaccagag 720
ctgctgggcg gcccatccgt gttcctgttt ccacccaagc ctaaggacac cctgatgatc 780
tcccggaccc cagaggtgac atgcgtggtg gtggacgtgt ctcacgagga ccccgaggtg 840
aagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ccaagaccaa gccacgggag 900
gagcagtata acagcaccta ccgcgtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggactgg 960
ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg agcaataagg ccctgcccgc ccctatcgag 1020
aagaccatct ccaaggccaa gggccagcct agggagccac aggtgtatac actgcctcca 1080
agcagagacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgacat gtctggtgaa gggcttctac 1140
ccttccgata tcgccgtgga gtgggagtct aatggccagc cagagaacaa ttataagacc 1200
acaccccctg tgctggactc cgatggctct ttctttctgt actctaagct gaccgtggat 1260
aagagccgct ggcagcaggg caacgtgttt agctgttccg tgatgcacga ggccctgcac 1320
aatcactaca cacagaagtc tctgagcctg tcccctggca ag 1362
<210> 2
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9308的氨基酸序列：V2L2MD重链
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 3
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9309的核苷酸序列：V2L2MD轻链
<400> 3
gcaatccaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagcgcct ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacatgca gagcctctca gggcatccgg aacgatctgg gctggtacca gcagaagcca 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctattct gccagcaccc tgcagtctgg agtgcccagc 180
cggttctccg gctctggcag cggaacagac tttaccctga caatctctag cctgcagcct 240
gaggacttcg ccacctacta ttgcctgcag gattacaatt atccatggac ctttggccag 300
ggcacaaagg tggagatcaa gcgcacagtg gccgccccca gcgtgttcat ctttccccct 360
agcgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tctgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 420
cctagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgccc tgcagagcgg caattcccag 480
gagtctgtga ccgagcagga cagcaaggat tccacatatt ccctgtctaa caccctgaca 540
ctgagcaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgcat gcgaggtgac ccaccaggga 600
ctgtcctctc ccgtgacaaa gtcctttaat aggggcgagt gt 642
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9309的氨基酸序列：V2L2MD轻链
<400> 4
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 5
<211> 2151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9214的核苷酸序列：Pseudo-V2L2MD；DMAb-抗PcrV
<400> 5
gaggtgcagc tgctggagtc aggaggagga ctggtgcagc ccggcggatc actgcgactg 60
agctgcgcag cttccggctt caccttcagc agctatgcca tgaactgggt ccgacaggct 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgagtgca atcaccatgt cagggattac tgcctactat 180
accgacgatg tgaaaggccg attcactatc tctagggaca acagtaagaa taccctgtac 240
ctgcagatga attccctgcg cgctgaggat acagcagtgt actattgcgc caaggaggaa 300
ttcctgccag ggactcacta ctattacgga atggacgtgt ggggacaggg aaccacagtc 360
accgtgtcta gtgcaagcac aaaaggcccc tccgtgtttc ccctggcccc ttcaagcaag 420
tctacaagtg ggggcactgc agccctggga tgtctggtga aggattactt ccctgagcca 480
gtcaccgtga gctggaactc cggcgccctg acttccggag tccatacctt tcctgctgtg 540
ctgcagtcct ctggcctgta tagcctgagt tcagtggtca ccgtcccaag ctcctctctg 600
ggaacacaga cttacatctg caacgtgaat cacaaaccaa gcaatacaaa ggtcgacaag 660
aaagtggaac ccaaatcctg tgataagacc catacatgcc ctccctgtcc agcacctgag 720
ctgctgggag ggccaagcgt gttcctgttt ccacccaagc ctaaagacac actgatgatt 780
tctcggaccc ccgaagtcac atgcgtggtc gtggacgtga gccacgagga ccccgaagtc 840
aagtttaact ggtacgtgga tggcgtcgag gtgcataatg ccaagaccaa accacgagag 900
gaacagtata actctacata cagggtcgtg agtgtcctga ctgtgctgca ccaggactgg 960
ctgaacggga aggagtacaa gtgcaaagtg tccaacaagg ccctgccagc tcccatcgag 1020
aagaccattt ctaaggccaa aggccagcca agagaacccc aggtgtatac actgcctcca 1080
agtcgggacg agctgactaa aaaccaggtc tctctgacct gtctggtgaa gggattctac 1140
ccttccgata tcgctgtgga gtgggaatct aatgggcagc cagaaaacaa ttataagact 1200
acccctcccg tgctggactc tgatggaagt ttctttctgt actccaaact gaccgtggac 1260
aagtctagat ggcagcaggg gaacgtcttt tcatgcagcg tgatgcatga ggccctgcac 1320
aatcattaca ctcagaaatc cctgtctctg agtcctggga aacggggccg caagaggaga 1380
tcaggaagcg gggccaccaa cttctccctg ctgaagcagg ctggcgatgt ggaggaaaat 1440
cctggaccaa tggtcctgca gactcaggtg tttatctcac tgctgctgtg gattagcgga 1500
gcatacgggg ccattcagat gacccagtcc cccagttcac tgtccgcttc tgtcggcgac 1560
agagtgacta tcacctgtcg ggcaagccag ggaattcgca acgatctggg gtggtatcag 1620
cagaagcctg ggaaagctcc aaagctgctg atctacagtg catcaactct gcagtcagga 1680
gtgcctagcc ggttcagcgg ctccggatct ggaaccgact ttacactgac tattagctcc 1740
ctgcagccag aggacttcgc cacatattac tgcctgcagg attataatta cccctggaca 1800
tttggccagg gaactaaagt ggaaatcaag cgcacagtcg ctgcacctag cgtgttcatc 1860
tttccaccct cagacgagca gctgaagtcc ggaactgctt ctgtggtgtg cctgctgaac 1920
aatttctatc caagggaagc aaaagtccag tggaaggtgg ataacgccct gcagtcaggc 1980
aatagccagg agtccgtgac cgaacaggac tctaaagata gtacatacag tctgtcaaac 2040
accctgacac tgagcaaggc tgattatgag aagcacaaag tgtacgcatg cgaagtcacc 2100
caccaggggc tgtcctcacc agtcacaaaa tctttcaatc ggggagaatg c 2151
<210> 6
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9214的氨基酸序列：Pseudo-V2L2MD；DMAb-抗PcrV
<400> 6
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1 5 10 15
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
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195 200 205
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Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
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370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
515 520 525
Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
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Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly
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Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
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<211> 2154
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9247的核苷酸序列：pGX0001中具有恒河猴Fc的V2L2；
DMAb-抗PcrV
<400> 7
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accgtgtcta gtgcttctac aaaagggccc agcgtgttcc cactggcacc ctcaagcagg 420
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ctgcagtcct ctgggctcta tagcctgagt tcagtggtca ccgtgcctag ctcctctctg 600
ggaacacaga cttacgtctg caacgtgaat cataagccat ccaatacaaa ggtcgacaaa 660
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<210> 8
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9247的氨基酸序列：pGX0001中具有恒河猴Fc的V2L2；
DMAb-抗PcrV
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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225 230 235 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
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530 535 540
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser
545 550 555 560
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
565 570 575
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
580 585 590
Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
595 600 605
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610 615 620
Ser Glu Asp Gln Val Lys Ser Gly Thr Val Ser Val Val Cys Leu Leu
625 630 635 640
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Ser Val Lys Trp Lys Val Asp Gly
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Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
705 710 715
<210> 9
<211> 2127
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9248的核苷酸序列：Pseudo-V2L2MD rbFc；DMAb-抗PcrV
<400> 9
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<210> 10
<211> 709
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9248的氨基酸序列：Pseudo-V2L2MD rbFc；DMAb-抗PcrV
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys
115 120 125
Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser
130 135 140
Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr
165 170 175
Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His
195 200 205
Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys
210 215 220
Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg
275 280 285
Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser
290 295 300
Thr Leu Pro Ile Thr His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly
340 345 350
Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met
355 360 365
Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn
370 375 380
Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Asn Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu
405 410 415
Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys Arg
435 440 445
Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
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485 490 495
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500 505 510
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Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Arg Thr
625 630 635 640
Val Lys Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser Val Thr Gln Gly Val
645 650 655
Asp Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
660 665 670
Ser Phe Leu His Leu Thr Ala Asn Gln Trp Lys Ser Tyr Gln Ser Val
675 680 685
Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu Lys Ser Leu Ala
690 695 700
Pro Ala Glu Cys Ser
705
<210> 11
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9257 hc的核苷酸序列：pGX0003中的Pseudo-V2L2MD
(sCMV-轻链、hCMV-重链)；DMAb-抗PcrV
<400> 11
gaggtgcagc tgctggagtc aggaggagga ctggtgcagc ccggcggatc actgcgactg 60
agctgcgcag cttccggctt caccttcagc agctatgcca tgaactgggt ccgacaggct 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgagtgca atcaccatgt cagggattac tgcctactat 180
accgacgatg tgaaaggccg attcactatc tctagggaca acagtaagaa taccctgtac 240
ctgcagatga attccctgcg cgctgaggat acagcagtgt actattgcgc caaggaggaa 300
ttcctgccag ggactcacta ctattacgga atggacgtgt ggggacaggg aaccacagtc 360
accgtgtcta gtgcaagcac aaaaggcccc tccgtgtttc ccctggcccc ttcaagcaag 420
tctacaagtg ggggcactgc agccctggga tgtctggtga aggattactt ccctgagcca 480
gtcaccgtga gctggaactc cggcgccctg acttccggag tccatacctt tcctgctgtg 540
ctgcagtcct ctggcctgta tagcctgagt tcagtggtca ccgtcccaag ctcctctctg 600
ggaacacaga cttacatctg caacgtgaat cacaaaccaa gcaatacaaa ggtcgacaag 660
aaagtggaac ccaaatcctg tgataagacc catacatgcc ctccctgtcc agcacctgag 720
ctgctgggag ggccaagcgt gttcctgttt ccacccaagc ctaaagacac actgatgatt 780
tctcggaccc ccgaagtcac atgcgtggtc gtggacgtga gccacgagga ccccgaagtc 840
aagtttaact ggtacgtgga tggcgtcgag gtgcataatg ccaagaccaa accacgagag 900
gaacagtata actctacata cagggtcgtg agtgtcctga ctgtgctgca ccaggactgg 960
ctgaacggga aggagtacaa gtgcaaagtg tccaacaagg ccctgccagc tcccatcgag 1020
aagaccattt ctaaggccaa aggccagcca agagaacccc aggtgtatac actgcctcca 1080
agtcgggacg agctgactaa aaaccaggtc tctctgacct gtctggtgaa gggattctac 1140
ccttccgata tcgctgtgga gtgggaatct aatgggcagc cagaaaacaa ttataagact 1200
acccctcccg tgctggactc tgatggaagt ttctttctgt actccaaact gaccgtggac 1260
aagtctagat ggcagcaggg gaacgtcttt tcatgcagcg tgatgcatga ggccctgcac 1320
aatcattaca ctcagaaatc cctgtctctg agtcctggga aa 1362
<210> 12
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9257 hc的氨基酸序列：pGX0003中的Pseudo-V2L2MD
(sCMV-轻链、hCMV-重链)；DMAb-抗PcrV
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
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Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 13
<211> 2151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9258的核苷酸序列：pGX0001中的唯一Psuedo-V2L2MD-YTE
；DMAb-抗PcrV
<400> 13
gaggtgcagc tgctggagtc aggaggagga ctggtgcagc ccggcggatc actgcgactg 60
agctgcgcag cttccggctt caccttcagc agctatgcca tgaactgggt ccgacaggct 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgagtgca atcaccatgt cagggattac tgcctactat 180
accgacgatg tgaaaggccg attcactatc tctagggaca acagtaagaa taccctgtac 240
ctgcagatga attccctgcg cgctgaggat acagcagtgt actattgcgc caaggaggaa 300
ttcctgccag ggactcacta ctattacgga atggacgtgt ggggacaggg aaccacagtc 360
accgtgtcta gtgcaagcac aaaaggcccc tccgtgtttc ccctggcccc ttcaagcaag 420
tctacaagtg ggggcactgc agccctggga tgtctggtga aggattactt ccctgagcca 480
gtcaccgtga gctggaactc cggcgccctg acttccggag tccatacctt tcctgctgtg 540
ctgcagtcct ctggcctgta tagcctgagt tcagtggtca ccgtcccaag ctcctctctg 600
ggaacacaga cttacatctg caacgtgaat cacaaaccaa gcaatacaaa ggtcgacaag 660
aaagtggaac ccaaatcctg tgataagacc catacatgcc ctccctgtcc agcacctgag 720
ctgctgggag ggccaagcgt gttcctgttt ccacccaagc ctaaagacac actgtacatt 780
actcgggagc ccgaagtcac atgcgtggtc gtggacgtga gccacgagga ccccgaagtc 840
aagtttaact ggtacgtgga tggcgtcgag gtgcataatg ccaagaccaa accacgagag 900
gaacagtata actctacata cagggtcgtg agtgtcctga ctgtgctgca ccaggactgg 960
ctgaacggga aggagtacaa gtgcaaagtg tccaacaagg ccctgccagc tcccatcgag 1020
aagaccattt ctaaggccaa aggccagcca agagaacccc aggtgtatac actgcctcca 1080
agtcgggacg agctgactaa aaaccaggtc tctctgacct gtctggtgaa gggattctac 1140
ccttccgata tcgctgtgga gtgggaatct aatgggcagc cagaaaacaa ttataagact 1200
acccctcccg tgctggactc tgatggaagt ttctttctgt actccaaact gaccgtggac 1260
aagtctagat ggcagcaggg gaacgtcttt tcatgcagcg tgatgcatga ggccctgcac 1320
aatcattaca ctcagaaatc cctgtctctg agtcctggga aacggggccg caagaggaga 1380
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caccaggggc tgtcctcacc agtcacaaaa tctttcaatc ggggagaatg c 2151
<210> 14
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9258的氨基酸序列：pGX0001中的唯一Psuedo-V2L2MD-YTE
；DMAb-抗PcrV
<400> 14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
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Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
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Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly
545 550 555 560
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
565 570 575
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
580 585 590
Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
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Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
645 650 655
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
660 665 670
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
675 680 685
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
690 695 700
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
705 710 715
<210> 15
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9257 lc中的核苷酸序列；pGX0003中的Pseudo-V2L2MD
(sCMV-轻链、hCMV-重链)；DMAb-抗PcrV
<400> 15
gccattcaga tgacccagtc ccccagttca ctgtccgctt ctgtcggcga cagagtgact 60
atcacctgtc gggcaagcca gggaattcgc aacgatctgg ggtggtatca gcagaagcct 120
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cggttcagcg gctccggatc tggaaccgac tttacactga ctattagctc cctgcagcca 240
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ggaactaaag tggaaatcaa gcgcacagtc gctgcaccta gcgtgttcat ctttccaccc 360
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ctgagcaagg ctgattatga gaagcacaaa gtgtacgcat gcgaagtcac ccaccagggg 600
ctgtcctcac cagtcacaaa atctttcaat cggggagaat gc 642
<210> 16
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9257 lc的氨基酸序列：pGX0003中的Pseudo-V2L2MD
(sCMV-轻链、hCMV-重链)；DMAb-抗PcrV
<400> 16
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 17
<211> 2949
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9213的核苷酸序列：双特异性假单胞菌
(Bis4-V2L2MD/Psl0096); DMAb-BiSPA
<400> 17
gaagtgcagc tgctggagtc agggggaggg ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgactg 60
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ttcctgcctg gcacacacta ctattacgga atggacgtgt ggggccaggg aaccacagtc 360
accgtgtcta gtgcttcaac aaaggggcca agcgtgtttc cactggcacc ctcaagcaaa 420
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ctgcagtcct ctgggctgta ttctctgagt tcagtggtca cagtcccaag ctcctctctg 600
ggcacacaga cttacatctg caacgtgaat cataagccat ccaatactaa ggtcgacaaa 660
cgggtggagc ccaaatcttg tggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag ccaggtccag 720
ctgcaggaga gcggacctgg actggtgaag ccatccgaaa cactgtctct gacctgcacc 780
gtgagcggcg gcagcatctc tccatattac tggacttgga ttaggcagcc ccctggcaag 840
tgtctggagc tgatcgggta cattcacagt tcaggctata ccgactacaa cccctccctg 900
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acccagagcc cctcaagcct gagtgcctca gtcggcgatc gcgtgactat cacctgtcga 1200
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aagctgctga tctacggcgc cagcaatctg cagtccggag tgccctctag gttctctggc 1320
agtggatcag ggacagactt tacactgact atttcctctc tgcagcctga ggatttcgca 1380
acttattact gccagcagag caccggcgcc tggaactggt ttggctgtgg aaccaaggtg 1440
gaaatcaaag gcggaggggg ctctggaggg ggcggaagtg acaagaccca cacatgccca 1500
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cacgaggacc ccgaagtcaa gtttaactgg tacgtggacg gcgtcgaggt gcataatgcc 1680
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gtgctgcatc aggattggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaagtgtc taataaggct 1800
ctgcctgcac caatcgagaa aactattagc aaggccaaag gccagcctag agaaccacag 1860
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9213的氨基酸序列：双特异性假单胞菌
(Bis4-V2L2MD/Psl0096)；DMAb-BiSPA
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
225 230 235 240
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser
245 250 255
Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Trp Thr
260 265 270
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Leu Ile Gly Tyr Ile
275 280 285
His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
290 295 300
Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asp
325 330 335
Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
340 345 350
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
370 375 380
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
385 390 395 400
Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
405 410 415
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser
420 425 430
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
435 440 445
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
450 455 460
Gln Gln Ser Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val
465 470 475 480
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr
485 490 495
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
500 505 510
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
515 520 525
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
530 535 540
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
545 550 555 560
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
565 570 575
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
580 585 590
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
595 600 605
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
610 615 620
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
625 630 635 640
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
645 650 655
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
660 665 670
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
675 680 685
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
690 695 700
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710 715 720
Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
725 730 735
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu
740 745 750
Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr
755 760 765
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770 775 780
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn
785 790 795 800
Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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820 825 830
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
835 840 845
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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
885 890 895
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
980
<210> 19
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9215的核苷酸序列：Pseudo-Ps10096；DMAb-抗Psl
<400> 19
caggtgcagc tgcaggagtc tggacccgga ctggtcaagc ctagcgaaac tctgtccctg 60
acttgcaccg tgtccggcgg atcaatcagc ccatactatt ggacctggat tcgccagccc 120
cctggcaagg gactggagct gatcggctac attcacagct ccggatacac cgactataac 180
ccatcactga aaagccgagt gacaatctct ggcgatacta gtaagaaaca gttcagcctg 240
aagctgtcta gtgtcacagc cgctgacact gcagtgtact attgcgcccg cgctgactgg 300
gatcgactgc gcgctctgga tatttggggg cagggcacta tggtcaccgt gagcagcgcc 360
tcaaccaaag gccctagcgt gtttccactg gcaccctcct ctaagtccac ctctgggggc 420
acagcagccc tgggatgtct ggtgaaggac tacttccccg agcctgtcac agtgtcctgg 480
aactctggag ccctgacctc cggggtccat acatttcccg ctgtgctgca gagttcaggg 540
ctgtactctc tgagctccgt ggtcaccgtg ccttctagtt cactgggcac acagacttat 600
atctgcaacg tgaatcacaa accttccaat acaaaggtcg acaagaaagt ggaaccaaaa 660
tcttgtgata agacccatac atgcccaccc tgtccagcac cagagctgct gggagggcca 720
tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcccaaa gacaccctga tgattagccg gactccagaa 780
gtcacctgcg tggtcgtgga cgtgtcccac gaggaccccg aagtcaagtt caactggtac 840
gtggatggcg tcgaggtgca taatgccaag acaaaacccc gagaggaaca gtacaactcc 900
acttataggg tcgtgtctgt cctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cgggaaggag 960
tataagtgca aagtgtctaa caaggccctg cctgccccaa tcgagaagac cattagcaag 1020
gccaaaggcc agcctagaga accacaggtg tacacactgc cccctagtcg ggacgagctg 1080
actaaaaacc aggtcagcct gacctgtctg gtgaagggct tctatccctc agatatcgct 1140
gtggagtggg aatctaatgg acagcctgaa aacaattaca agaccacacc acccgtgctg 1200
gacagtgatg gatcattctt tctgtatagc aaactgaccg tggacaagtc cagatggcag 1260
caggggaacg tctttagttg ctcagtgatg cacgaggccc tgcacaatca ttacactcag 1320
aaaagcctgt ccctgtctcc cggcaaacga ggaaggaaga ggagaagtgg atcaggggcc 1380
acaaacttca gcctgctgaa gcaggctggg gatgtggagg aaaatcccgg ccctatggtc 1440
ctgcagacac aggtgtttat cagtctgctg ctgtggattt caggggccta tggcgacatc 1500
cagctgactc agtcccctag ctccctgagc gcctccgtcg gagatagagt gactatcacc 1560
tgtcgggctt ctcagagtat tcgcagccat ctgaactggt accagcagaa gcccgggaaa 1620
gctcctaagc tgctgatcta tggagcatca aatctgcaga gcggagtgcc atcccggttc 1680
tcaggcagcg gcagcggaac cgactttaca ctgactattt ctagtctgca gcccgaggat 1740
ttcgcaacat actattgcca gcagtccact ggcgcctgga actggtttgg cggagggacc 1800
aaagtggaaa tcaagcgcac agtcgctgca cctagcgtgt tcatctttcc tccaagtgac 1860
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gaagcaaaag tccagtggaa ggtggataac gccctgcaga gcggaaattc ccaggagtct 1980
gtgacagaac aggacagtaa ggattcaact tactctctga gtaacaccct gacactgagc 2040
aaggctgact acgagaagca caaagtgtat gcatgcgagg tcacccacca ggggctgtcc 2100
agtccagtca ctaagtcctt caatagggga gaatgc 2136
<210> 20
<211> 712
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9215的氨基酸序列：Pseudo-Ps10096；DMAb-抗Psl
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Pro Tyr
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Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile
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Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
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165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
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260 265 270
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
450 455 460
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val
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Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala
485 490 495
Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
500 505 510
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Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
545 550 555 560
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
565 570 575
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr Gly Ala
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Trp Asn Trp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
595 600 605
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
610 615 620
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
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645 650 655
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
660 665 670
Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
675 680 685
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
690 695 700
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
705 710
<210> 21
<211> 2949
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9259的核苷酸序列：双特异性假单胞菌
唯一(Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE pGX0001；DMAb-BiSPA
<400> 21
gaagtgcagc tgctggagtc agggggaggg ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgactg 60
tcttgcgccg ctagtggctt caccttcagc agctatgcta tgaactgggt ccgacaggca 120
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ctgcagatga atagcctgag ggcagaggat accgccgtgt actattgcgc caaggaggaa 300
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accgtgtcta gtgcttcaac aaaggggcca agcgtgtttc cactggcacc ctcaagcaaa 420
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gtcaccgtgt catggaacag cggagccctg acctccggag tccacacatt tcctgctgtg 540
ctgcagtcct ctgggctgta ttctctgagt tcagtggtca cagtcccaag ctcctctctg 600
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ctgcaggaga gcggacctgg actggtgaag ccatccgaaa cactgtctct gacctgcacc 780
gtgagcggcg gcagcatctc tccatattac tggacttgga ttaggcagcc ccctggcaag 840
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tccgtcactg ctgcagacac cgccgtgtat tactgcgcac gcgccgactg ggatcgactg 1020
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acccagagcc cctcaagcct gagtgcctca gtcggcgatc gcgtgactat cacctgtcga 1200
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acttattact gccagcagag caccggcgcc tggaactggt ttggctgtgg aaccaaggtg 1440
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gaaaacaatt ataagactac cccacccgtc ctggacagtg atggctcatt ctttctgtac 2040
agtaagctga ccgtggataa atcaaggtgg cagcagggaa acgtctttag ctgctccgtg 2100
atgcacgagg ccctgcacaa tcattacaca cagaagtctc tgagtctgtc acctggcaag 2160
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tctgcaagtg tcggcgacag agtgactatc acctgtcggg cttcccaggg aattcgcaac 2400
gatctggggt ggtatcagca gaaaccagga aaggctccca aactgctgat ctactcagca 2460
agcacactgc agagtggggt gccatcaaga ttctccggat ctgggagtgg cactgacttc 2520
accctgacta ttagctccct gcagccagag gacttcgcca cctattactg cctgcaggat 2580
tataattacc cctggacatt tggacagggg actaaggtgg agatcaaacg gactgtcgcc 2640
gctcccagcg tgttcatttt tcctccatcc gacgaacagc tgaagagcgg aaccgcatcc 2700
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acctacagcc tgtctagtac cctgacactg tccaaagctg actatgagaa gcataaagtg 2880
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ggcgaatgc 2949
<210> 22
<211> 983
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9259的氨基酸序列：双特异性假单胞菌
唯一(Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE pGX0001；DMAb-BiSPA
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
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165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
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195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
225 230 235 240
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser
245 250 255
Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Trp Thr
260 265 270
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Leu Ile Gly Tyr Ile
275 280 285
His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
290 295 300
Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asp
325 330 335
Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
340 345 350
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
370 375 380
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
385 390 395 400
Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
405 410 415
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser
420 425 430
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
435 440 445
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
450 455 460
Gln Gln Ser Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val
465 470 475 480
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr
485 490 495
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
565 570 575
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
580 585 590
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
595 600 605
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
610 615 620
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
625 630 635 640
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
645 650 655
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
660 665 670
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
675 680 685
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
690 695 700
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710 715 720
Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
725 730 735
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu
740 745 750
Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr
755 760 765
Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
770 775 780
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn
785 790 795 800
Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
805 810 815
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820 825 830
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
835 840 845
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro
850 855 860
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
865 870 875 880
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
885 890 895
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
900 905 910
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
915 920 925
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
930 935 940
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
945 950 955 960
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
965 970 975
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
980
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割序列
<400> 23
Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser
1 5
<210> 24
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽氨基酸序列
<400> 24
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽氨基酸序列
<400> 25
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly
20
<210> 26
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9308的核苷酸序列：可操作地
连接至编码IgE前导序列的序列的V2L2MD重链
<400> 26
atggactgga cctggagaat cctgttcctg gtggcagcag caaccggaac acacgcagag 60
gtgcagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcctg gcggcagcct gaggctgtcc 120
tgcgcagcat ctggcttcac ctttagctcc tatgcaatga actgggtgcg ccaggcacca 180
ggcaagggac tggagtgggt gtctgccatc acaatgagcg gcatcaccgc ctactataca 240
gacgatgtga agggcaggtt taccatcagc agagacaact ccaagaatac actgtacctg 300
cagatgaata gcctgagagc cgaggatacc gccgtgtact attgcgccaa ggaggagttc 360
ctgcccggca cacactacta ttacggaatg gacgtgtggg gacagggaac cacagtgacc 420
gtgtctagcg cctccacaaa gggacctagc gtgttcccac tggcaccctc ctctaagtcc 480
acctctggcg gcacagccgc cctgggctgt ctggtgaagg attatttccc agagcccgtg 540
accgtgtctt ggaacagcgg cgccctgacc tctggagtgc acacatttcc agccgtgctg 600
cagagctccg gcctgtatag cctgtctagc gtggtgaccg tgccctcctc tagcctgggc 660
acccagacat acatctgcaa cgtgaatcac aagccatcta atacaaaggt ggacaagaag 720
gtggagccca agagctgtga taagacccac acatgccctc cctgtcctgc accagagctg 780
ctgggcggcc catccgtgtt cctgtttcca cccaagccta aggacaccct gatgatctcc 840
cggaccccag aggtgacatg cgtggtggtg gacgtgtctc acgaggaccc cgaggtgaag 900
ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cacaatgcca agaccaagcc acgggaggag 960
cagtataaca gcacctaccg cgtggtgtcc gtgctgacag tgctgcacca ggactggctg 1020
aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc aataaggccc tgcccgcccc tatcgagaag 1080
accatctcca aggccaaggg ccagcctagg gagccacagg tgtatacact gcctccaagc 1140
agagacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacatgtc tggtgaaggg cttctaccct 1200
tccgatatcg ccgtggagtg ggagtctaat ggccagccag agaacaatta taagaccaca 1260
ccccctgtgc tggactccga tggctctttc tttctgtact ctaagctgac cgtggataag 1320
agccgctggc agcagggcaa cgtgtttagc tgttccgtga tgcacgaggc cctgcacaat 1380
cactacacac agaagtctct gagcctgtcc cctggcaag 1419
<210> 27
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9308的氨基酸序列：可操作地
连接至IgE前导序列的V2L2MD重链
<400> 27
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 28
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9309的核苷酸序列：可操作地
连接至编码IgE前导序列的序列的V2L2MD轻链
<400> 28
atggtgctgc agacacaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctccgg agcatacgga 60
gcaatccaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagcgcct ccgtgggcga cagggtgacc 120
atcacatgca gagcctctca gggcatccgg aacgatctgg gctggtacca gcagaagcca 180
ggcaaggccc ccaagctgct gatctattct gccagcaccc tgcagtctgg agtgcccagc 240
cggttctccg gctctggcag cggaacagac tttaccctga caatctctag cctgcagcct 300
gaggacttcg ccacctacta ttgcctgcag gattacaatt atccatggac ctttggccag 360
ggcacaaagg tggagatcaa gcgcacagtg gccgccccca gcgtgttcat ctttccccct 420
agcgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tctgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 480
cctagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgccc tgcagagcgg caattcccag 540
gagtctgtga ccgagcagga cagcaaggat tccacatatt ccctgtctaa caccctgaca 600
ctgagcaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgcat gcgaggtgac ccaccaggga 660
ctgtcctctc ccgtgacaaa gtcctttaat aggggcgagt gt 702
<210> 29
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9309的氨基酸序列：可操作地
连接至IgE前导序列的V2L2MD轻链
<400> 29
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr
100 105 110
Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 30
<211> 2208
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9214的核苷酸序列：Pseudo-V2L2MD；
可操作地连接至编码IgE前导序列的序列的DMAb-?PcrV
<400> 30
atggattgga catggaggat tctgtttctg gtcgccgccg ctactggaac ccacgccgag 60
gtgcagctgc tggagtcagg aggaggactg gtgcagcccg gcggatcact gcgactgagc 120
tgcgcagctt ccggcttcac cttcagcagc tatgccatga actgggtccg acaggctcct 180
ggcaagggac tggaatgggt gagtgcaatc accatgtcag ggattactgc ctactatacc 240
gacgatgtga aaggccgatt cactatctct agggacaaca gtaagaatac cctgtacctg 300
cagatgaatt ccctgcgcgc tgaggataca gcagtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgccaggga ctcactacta ttacggaatg gacgtgtggg gacagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg caagcacaaa aggcccctcc gtgtttcccc tggccccttc aagcaagtct 480
acaagtgggg gcactgcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc tgagccagtc 540
accgtgagct ggaactccgg cgccctgact tccggagtcc atacctttcc tgctgtgctg 600
cagtcctctg gcctgtatag cctgagttca gtggtcaccg tcccaagctc ctctctggga 660
acacagactt acatctgcaa cgtgaatcac aaaccaagca atacaaaggt cgacaagaaa 720
gtggaaccca aatcctgtga taagacccat acatgccctc cctgtccagc acctgagctg 780
ctgggagggc caagcgtgtt cctgtttcca cccaagccta aagacacact gatgatttct 840
cggacccccg aagtcacatg cgtggtcgtg gacgtgagcc acgaggaccc cgaagtcaag 900
tttaactggt acgtggatgg cgtcgaggtg cataatgcca agaccaaacc acgagaggaa 960
cagtataact ctacatacag ggtcgtgagt gtcctgactg tgctgcacca ggactggctg 1020
aacgggaagg agtacaagtg caaagtgtcc aacaaggccc tgccagctcc catcgagaag 1080
accatttcta aggccaaagg ccagccaaga gaaccccagg tgtatacact gcctccaagt 1140
cgggacgagc tgactaaaaa ccaggtctct ctgacctgtc tggtgaaggg attctaccct 1200
tccgatatcg ctgtggagtg ggaatctaat gggcagccag aaaacaatta taagactacc 1260
cctcccgtgc tggactctga tggaagtttc tttctgtact ccaaactgac cgtggacaag 1320
tctagatggc agcaggggaa cgtcttttca tgcagcgtga tgcatgaggc cctgcacaat 1380
cattacactc agaaatccct gtctctgagt cctgggaaac ggggccgcaa gaggagatca 1440
ggaagcgggg ccaccaactt ctccctgctg aagcaggctg gcgatgtgga ggaaaatcct 1500
ggaccaatgg tcctgcagac tcaggtgttt atctcactgc tgctgtggat tagcggagca 1560
tacggggcca ttcagatgac ccagtccccc agttcactgt ccgcttctgt cggcgacaga 1620
gtgactatca cctgtcgggc aagccaggga attcgcaacg atctggggtg gtatcagcag 1680
aagcctggga aagctccaaa gctgctgatc tacagtgcat caactctgca gtcaggagtg 1740
cctagccggt tcagcggctc cggatctgga accgacttta cactgactat tagctccctg 1800
cagccagagg acttcgccac atattactgc ctgcaggatt ataattaccc ctggacattt 1860
ggccagggaa ctaaagtgga aatcaagcgc acagtcgctg cacctagcgt gttcatcttt 1920
ccaccctcag acgagcagct gaagtccgga actgcttctg tggtgtgcct gctgaacaat 1980
ttctatccaa gggaagcaaa agtccagtgg aaggtggata acgccctgca gtcaggcaat 2040
agccaggagt ccgtgaccga acaggactct aaagatagta catacagtct gtcaaacacc 2100
ctgacactga gcaaggctga ttatgagaag cacaaagtgt acgcatgcga agtcacccac 2160
caggggctgt cctcaccagt cacaaaatct ttcaatcggg gagaatgc 2208
<210> 31
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9214的氨基酸序列：Pseudo-V2L2MD；
可操作地连接至IgE前导序列的DMAb-?PcrV
<400> 31
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser
465 470 475 480
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
485 490 495
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser
500 505 510
Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln
515 520 525
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
530 535 540
Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln
545 550 555 560
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu
565 570 575
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
580 585 590
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
595 600 605
Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
610 615 620
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
625 630 635 640
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
645 650 655
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
660 665 670
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
675 680 685
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser
690 695 700
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
705 710 715 720
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
725 730 735
<210> 32
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9247的核苷酸序列：pGX0001中具有恒河猴Fc的V2L2；
可操作地连接至编码IgE前导序列的序列的DMAb-?PcrV
<400> 32
atggactgga catggagaat cctgttcctg gtcgccgccg ctactgggac tcacgccgag 60
gtgcagctcc tggaaagtgg gggagggctg gtgcagcccg gcgggtccct cagactgtct 120
tgcgccgcta gtggcttcac ctttagctcc tatgcaatga actgggtgcg gcaggcacct 180
gggaaaggac tggagtgggt gagcgccatc accatgtccg gcattactgc atactatacc 240
gacgatgtga aagggaggtt cacaatctca agagacaaca gcaagaatac tctctacctg 300
cagatgaata gcctgcgcgc tgaggatact gcagtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgccaggca cccactacta ttacggaatg gacgtgtggg gacagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg cttctacaaa agggcccagc gtgttcccac tggcaccctc aagcaggagt 480
acatcagaga gcactgcagc cctcggatgt ctggtgaagg attacttccc cgaacctgtc 540
accgtgtcct ggaactccgg atctctcact tctggcgtcc acacctttcc cgccgtgctg 600
cagtcctctg ggctctatag cctgagttca gtggtcaccg tgcctagctc ctctctggga 660
acacagactt acgtctgcaa cgtgaatcat aagccatcca atacaaaggt cgacaaaaga 720
gtggagatca aaacctgtgg aggcgggtct aagcccccta catgcccacc ctgtccagca 780
ccagaactgc tcggaggccc aagcgtgttc ctctttcctc caaagcccaa agacaccctg 840
atgatttccc ggaccccaga ggtcacatgc gtggtcgtgg acgtgagcca ggaagaccct 900
gatgtcaaat tcaactggta cgtgaatggc gccgaggtgc accatgctca gacaaagccc 960
agagaaactc agtataactc aacctaccgg gtcgtgagcg tcctcaccgt gacacaccag 1020
gactggctga acggcaaaga gtatacatgc aaagtgagca ataaggccct gcctgctcca 1080
atccagaaga ctattagcaa ggataaaggg cagcctcgcg aaccacaggt gtacaccctg 1140
cctcccagca gggaggaact gactaaaaac caggtcagcc tcacctgtct ggtgaagggc 1200
ttctaccctt ccgacatcgt cgtggagtgg gaaagttcag gccagccaga gaatacctac 1260
aagactaccc cacccgtgct ggactctgat ggaagttatt tcctctacag caaactgaca 1320
gtggataagt ccagatggca gcagggcaac gtctttagtt gctcagtgat gcatgaggcc 1380
ctccacaatc attacacaca gaaaagcctg tccgtgtctc cccggggcag gaagaggaga 1440
agtggatcag gcgcaactaa cttcagcctg ctcaagcagg caggggacgt ggaggaaaat 1500
cccggaccta tggtcctgca gacccaggtg tttatctccc tgctcctgtg gatttctggc 1560
gcatacgggg ccatccagat gacacagagc cccagctccc tgagcgcctc cgtcggcgac 1620
cgggtgacta tcacctgtcg cgctagccag ggaattagga acgatctggg ctggtatcag 1680
cagaagcccg gcaaagcccc taagctcctg atctactctg ctagtacact gcagtccggg 1740
gtgccttcta ggttctcagg gagcggcagc ggcactgact tcaccctcac tatttctagt 1800
ctgcagccag aggacttcgc aacctattac tgcctgcagg attataatta cccctggaca 1860
tttgggcagg gaactaaagt ggagatcaag cgcgctgtcg ctgcacctag cgtgttcatc 1920
tttcctccaa gtgaagacca ggtcaagagt ggcaccgtgt cagtggtgtg cctcctgaac 1980
aatttctatc caagggaggc ctccgtgaag tggaaagtcg atggggtgct gaaaacagga 2040
aactcacagg agagcgtgac tgaacaggac agtaaggata atacctactc actgtcaagc 2100
accctcacac tgtcctctac cgactatcag tctcacaacg tgtacgcttg cgaagtcacc 2160
caccaggggc tcagtagtcc agtcacaaaa tctttcaata gaggcgaatg ttgataa 2217
<210> 33
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9247的氨基酸序列：pGX0001中具有恒河猴Fc的V2L2；
可操作地连接至IgE前导序列的DMAb-?PcrV
<400> 33
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser
145 150 155 160
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Val Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys Thr Cys Gly Gly Gly Ser Lys Pro Pro Thr Cys Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
260 265 270
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
275 280 285
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Asp Val Lys Phe
290 295 300
Asn Trp Tyr Val Asn Gly Ala Glu Val His His Ala Gln Thr Lys Pro
305 310 315 320
Arg Glu Thr Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
325 330 335
Val Thr His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val
340 345 350
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gln Lys Thr Ile Ser Lys Asp
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
370 375 380
Glu Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
385 390 395 400
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro
405 410 415
Glu Asn Thr Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
420 425 430
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
435 440 445
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
450 455 460
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Val Ser Pro Arg Gly Arg Lys Arg Arg
465 470 475 480
Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
485 490 495
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile
500 505 510
Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr
515 520 525
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
530 535 540
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln
545 550 555 560
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr
565 570 575
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
580 585 590
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
595 600 605
Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
610 615 620
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
625 630 635 640
Phe Pro Pro Ser Glu Asp Gln Val Lys Ser Gly Thr Val Ser Val Val
645 650 655
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Ser Val Lys Trp Lys
660 665 670
Val Asp Gly Val Leu Lys Thr Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
675 680 685
Gln Asp Ser Lys Asp Asn Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
690 695 700
Ser Ser Thr Asp Tyr Gln Ser His Asn Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
705 710 715 720
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
725 730 735
Cys
<210> 34
<211> 2184
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9248的核苷酸序列：Pseudo-V2L2MD rbFc；
可操作地连接至编码IgE前导序列的序列的DMAb-?PcrV
<400> 34
atggactgga catggagaat cctgtttctg gtcgccgccg ccaccggaac ccacgccgaa 60
gtgcagctgc tggaatctgg agggggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaggctgtcc 120
tgcgccgcca gcggcttcac cttctccagc tacgccatga actgggtgcg ccaggcccca 180
ggcaagggac tggagtgggt gtccgccatc accatgagcg gcatcaccgc ctactacacc 240
gacgacgtga agggccgctt caccatctcc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccaa ggaggagttc 360
ctgccaggaa cccactacta ctacggaatg gacgtgtggg gacagggaac caccgtgacc 420
gtgtccagcg gccagcccaa ggcccccagc gtgttcccac tggccccatg ctgcggcgac 480
accccctcca gcaccgtgac cctgggatgc ctggtgaagg gatacctgcc agagccagtg 540
accgtgacct ggaactccgg caccctgacc aacggcgtga ggaccttccc aagcgtgcgc 600
cagtccagcg gactgtactc cctgtccagc gtggtgagcg tgacctccag ctcccagcca 660
gtgacctgca acgtggccca cccagccacc aacaccaagg tggacaagac cgtggcccca 720
agcacctgct ccaagccaac ctgccctcct cccgagctgc tgggcggccc ctccgtgttc 780
atcttccctc ccaagcccaa ggacaccctg atgatctcca ggaccccaga ggtgacctgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca ggacgacccc gaggtgcagt tcacctggta catcaacaac 900
gagcaggtgc ggaccgcccg ccctcccctg cgcgagcagc agttcaactc caccatccgg 960
gtggtgagca ccctgccaat cacccaccag gactggctga ggggcaagga gttcaagtgc 1020
aaggtgcaca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatcagcaa ggccaggggc 1080
cagccactgg agcccaaggt gtacaccatg ggccctcccc gcgaggagct gagctccagg 1140
agcgtgtccc tgacctgcat gatcaacggc ttctacccca gcgacatctc cgtggagtgg 1200
gagaagaacg gcaaggccga ggacaactac aagaccaccc cagccgtgct ggacagcgac 1260
ggctcctact tcctgtacaa caagctgtcc gtgcccacca gcgagtggca gcggggcgac 1320
gtgttcacct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcatc 1380
tccaggagcc ccggcaagag gggaaggaag cgccggtccg gcagcggagc caccaacttc 1440
agcctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaacccag gaccaatggt gctgcagacc 1500
caggtgttca tctccctgct gctgtggatc agcggagcct acggagccat ccagatgacc 1560
cagtccccca gctccctgtc cgccagcgtg ggcgacaggg tgaccatcac ctgcagggcc 1620
agccagggca tcaggaacga cctgggctgg taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag 1680
ctgctgatct actccgccag caccctgcag tccggagtgc ccagccggtt ctccggcagc 1740
ggctccggaa ccgacttcac cctgaccatc agctccctgc agcccgagga cttcgccacc 1800
tactactgcc tgcaggacta caactacccc tggaccttcg gccagggcac caaggtggag 1860
atcaagaggc agccagccgt gaccccatcc gtgatcctgt tccctccctc ctccgaggag 1920
ctgaaggaca acaaggccac cctggtgtgc ctgatctccg acttctaccc ccgcaccgtg 1980
aaggtgaact ggaaggccga cggaaacagc gtgacccagg gagtggacac cacccagcca 2040
agcaagcagt ccaacaacaa gtacgccgcc agctccttcc tgcacctgac cgccaaccag 2100
tggaagagct accagtccgt gacctgtcag gtcacccacg aagggcacac cgtcgaaaaa 2160
tctctggccc ccgccgaatg ttct 2184
<210> 35
<211> 728
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9248的氨基酸序列：Pseudo-V2L2MD rbFc；
可操作地连接至IgE前导序列的DMAb-?PcrV
<400> 35
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp
145 150 155 160
Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly
180 185 190
Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn
210 215 220
Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro
225 230 235 240
Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp
275 280 285
Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg
290 295 300
Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Thr His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys
325 330 335
Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr
355 360 365
Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Asn Lys Leu Ser Val Pro
420 425 430
Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro
450 455 460
Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
465 470 475 480
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
485 490 495
Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly
500 505 510
Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
515 520 525
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile
530 535 540
Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
545 550 555 560
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
565 570 575
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
580 585 590
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn
595 600 605
Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gln
610 615 620
Pro Ala Val Thr Pro Ser Val Ile Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
625 630 635 640
Leu Lys Asp Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
645 650 655
Pro Arg Thr Val Lys Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser Val Thr
660 665 670
Gln Gly Val Asp Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
675 680 685
Ala Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ala Asn Gln Trp Lys Ser Tyr
690 695 700
Gln Ser Val Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu Lys
705 710 715 720
Ser Leu Ala Pro Ala Glu Cys Ser
725
<210> 36
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9257重链的核苷酸序列：pGX0003中的Pseudo-V2L2MD
(sCMV-轻链、hCMV-重链)；可操作地
连接至编码IgE前导序列的序列的DMAb-?PcrV
<400> 36
atggattgga catggaggat tctgtttctg gtcgccgccg ctactggaac ccacgccgag 60
gtgcagctgc tggagtcagg aggaggactg gtgcagcccg gcggatcact gcgactgagc 120
tgcgcagctt ccggcttcac cttcagcagc tatgccatga actgggtccg acaggctcct 180
ggcaagggac tggaatgggt gagtgcaatc accatgtcag ggattactgc ctactatacc 240
gacgatgtga aaggccgatt cactatctct agggacaaca gtaagaatac cctgtacctg 300
cagatgaatt ccctgcgcgc tgaggataca gcagtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgccaggga ctcactacta ttacggaatg gacgtgtggg gacagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg caagcacaaa aggcccctcc gtgtttcccc tggccccttc aagcaagtct 480
acaagtgggg gcactgcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc tgagccagtc 540
accgtgagct ggaactccgg cgccctgact tccggagtcc atacctttcc tgctgtgctg 600
cagtcctctg gcctgtatag cctgagttca gtggtcaccg tcccaagctc ctctctggga 660
acacagactt acatctgcaa cgtgaatcac aaaccaagca atacaaaggt cgacaagaaa 720
gtggaaccca aatcctgtga taagacccat acatgccctc cctgtccagc acctgagctg 780
ctgggagggc caagcgtgtt cctgtttcca cccaagccta aagacacact gatgatttct 840
cggacccccg aagtcacatg cgtggtcgtg gacgtgagcc acgaggaccc cgaagtcaag 900
tttaactggt acgtggatgg cgtcgaggtg cataatgcca agaccaaacc acgagaggaa 960
cagtataact ctacatacag ggtcgtgagt gtcctgactg tgctgcacca ggactggctg 1020
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accatttcta aggccaaagg ccagccaaga gaaccccagg tgtatacact gcctccaagt 1140
cgggacgagc tgactaaaaa ccaggtctct ctgacctgtc tggtgaaggg attctaccct 1200
tccgatatcg ctgtggagtg ggaatctaat gggcagccag aaaacaatta taagactacc 1260
cctcccgtgc tggactctga tggaagtttc tttctgtact ccaaactgac cgtggacaag 1320
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cattacactc agaaatccct gtctctgagt cctgggaaa 1419
<210> 37
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9257重链的氨基酸序列：pGX0003中的Pseudo-V2L2MD
(sCMV-轻链、hCMV-重链)；可操作地
连接至IgE前导序列的DMAb-?PcrV
<400> 37
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 38
<211> 2208
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9258的核苷酸序列：pGX0001中的唯一Psuedo-V2L2MD-YTE；
可操作地连接至编码IgE前导序列的序列的DMAb-?PcrV
<400> 38
atggattgga catggaggat tctgtttctg gtcgccgccg ctactggaac ccacgccgag 60
gtgcagctgc tggagtcagg aggaggactg gtgcagcccg gcggatcact gcgactgagc 120
tgcgcagctt ccggcttcac cttcagcagc tatgccatga actgggtccg acaggctcct 180
ggcaagggac tggaatgggt gagtgcaatc accatgtcag ggattactgc ctactatacc 240
gacgatgtga aaggccgatt cactatctct agggacaaca gtaagaatac cctgtacctg 300
cagatgaatt ccctgcgcgc tgaggataca gcagtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgccaggga ctcactacta ttacggaatg gacgtgtggg gacagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg caagcacaaa aggcccctcc gtgtttcccc tggccccttc aagcaagtct 480
acaagtgggg gcactgcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc tgagccagtc 540
accgtgagct ggaactccgg cgccctgact tccggagtcc atacctttcc tgctgtgctg 600
cagtcctctg gcctgtatag cctgagttca gtggtcaccg tcccaagctc ctctctggga 660
acacagactt acatctgcaa cgtgaatcac aaaccaagca atacaaaggt cgacaagaaa 720
gtggaaccca aatcctgtga taagacccat acatgccctc cctgtccagc acctgagctg 780
ctgggagggc caagcgtgtt cctgtttcca cccaagccta aagacacact gtacattact 840
cgggagcccg aagtcacatg cgtggtcgtg gacgtgagcc acgaggaccc cgaagtcaag 900
tttaactggt acgtggatgg cgtcgaggtg cataatgcca agaccaaacc acgagaggaa 960
cagtataact ctacatacag ggtcgtgagt gtcctgactg tgctgcacca ggactggctg 1020
aacgggaagg agtacaagtg caaagtgtcc aacaaggccc tgccagctcc catcgagaag 1080
accatttcta aggccaaagg ccagccaaga gaaccccagg tgtatacact gcctccaagt 1140
cgggacgagc tgactaaaaa ccaggtctct ctgacctgtc tggtgaaggg attctaccct 1200
tccgatatcg ctgtggagtg ggaatctaat gggcagccag aaaacaatta taagactacc 1260
cctcccgtgc tggactctga tggaagtttc tttctgtact ccaaactgac cgtggacaag 1320
tctagatggc agcaggggaa cgtcttttca tgcagcgtga tgcatgaggc cctgcacaat 1380
cattacactc agaaatccct gtctctgagt cctgggaaac ggggccgcaa gaggagatca 1440
ggaagcgggg ccaccaactt ctccctgctg aagcaggctg gcgatgtgga ggaaaatcct 1500
ggaccaatgg tcctgcagac tcaggtgttt atctcactgc tgctgtggat tagcggagca 1560
tacggggcca ttcagatgac ccagtccccc agttcactgt ccgcttctgt cggcgacaga 1620
gtgactatca cctgtcgggc aagccaggga attcgcaacg atctggggtg gtatcagcag 1680
aagcctggga aagctccaaa gctgctgatc tacagtgcat caactctgca gtcaggagtg 1740
cctagccggt tcagcggctc cggatctgga accgacttta cactgactat tagctccctg 1800
cagccagagg acttcgccac atattactgc ctgcaggatt ataattaccc ctggacattt 1860
ggccagggaa ctaaagtgga aatcaagcgc acagtcgctg cacctagcgt gttcatcttt 1920
ccaccctcag acgagcagct gaagtccgga actgcttctg tggtgtgcct gctgaacaat 1980
ttctatccaa gggaagcaaa agtccagtgg aaggtggata acgccctgca gtcaggcaat 2040
agccaggagt ccgtgaccga acaggactct aaagatagta catacagtct gtcaaacacc 2100
ctgacactga gcaaggctga ttatgagaag cacaaagtgt acgcatgcga agtcacccac 2160
caggggctgt cctcaccagt cacaaaatct ttcaatcggg gagaatgc 2208
<210> 39
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9258的氨基酸序列：pGX0001中的唯一Psuedo-V2L2MD-YTE；
可操作地连接至IgE前导序列的DMAb-?PcrV
<400> 39
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser
465 470 475 480
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
485 490 495
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser
500 505 510
Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln
515 520 525
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
530 535 540
Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln
545 550 555 560
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu
565 570 575
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
580 585 590
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
595 600 605
Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
610 615 620
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
625 630 635 640
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
645 650 655
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
660 665 670
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
675 680 685
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser
690 695 700
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
705 710 715 720
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
725 730 735
<210> 40
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9257轻链的核苷酸序列：pGX0003中的Pseudo-V2L2MD
(sCMV-轻链、hCMV-重链)；可操作地
连接至编码IgE前导序列的序列的DMAb-?PcrV
<400> 40
atggtcctgc agactcaggt gtttatctca ctgctgctgt ggattagcgg agcatacggg 60
gccattcaga tgacccagtc ccccagttca ctgtccgctt ctgtcggcga cagagtgact 120
atcacctgtc gggcaagcca gggaattcgc aacgatctgg ggtggtatca gcagaagcct 180
gggaaagctc caaagctgct gatctacagt gcatcaactc tgcagtcagg agtgcctagc 240
cggttcagcg gctccggatc tggaaccgac tttacactga ctattagctc cctgcagcca 300
gaggacttcg ccacatatta ctgcctgcag gattataatt acccctggac atttggccag 360
ggaactaaag tggaaatcaa gcgcacagtc gctgcaccta gcgtgttcat ctttccaccc 420
tcagacgagc agctgaagtc cggaactgct tctgtggtgt gcctgctgaa caatttctat 480
ccaagggaag caaaagtcca gtggaaggtg gataacgccc tgcagtcagg caatagccag 540
gagtccgtga ccgaacagga ctctaaagat agtacataca gtctgtcaaa caccctgaca 600
ctgagcaagg ctgattatga gaagcacaaa gtgtacgcat gcgaagtcac ccaccagggg 660
ctgtcctcac cagtcacaaa atctttcaat cggggagaat gc 702
<210> 41
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9257轻链的氨基酸序列：pGX0003中的Pseudo-V2L2MD
(sCMV-轻链、hCMV-重链)；可操作地
连接至IgE前导序列的DMAb-?PcrV
<400> 41
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr
100 105 110
Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 42
<211> 3006
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9213的核苷酸序列：双特异性假单胞菌
(Bis4-V2L2MD/Psl0096)；可操作地连接至
编码IgE前导序列的序列的DMAb-BiSPA
<400> 42
atggactgga catggagaat cctgtttctg gtcgccgccg caactggaac ccacgccgaa 60
gtgcagctgc tggagtcagg gggagggctg gtgcagcccg gcggcagcct gcgactgtct 120
tgcgccgcta gtggcttcac cttcagcagc tatgctatga actgggtccg acaggcacca 180
ggaaagggac tggaatgggt gtctgccatc accatgagtg gaattacagc ttactatact 240
gacgatgtga aggggagatt cacaatctca cgggacaaca gcaaaaatac tctgtacctg 300
cagatgaata gcctgagggc agaggatacc gccgtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgcctggca cacactacta ttacggaatg gacgtgtggg gccagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg cttcaacaaa ggggccaagc gtgtttccac tggcaccctc aagcaaatca 480
accagcgggg gcacagcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc cgagcctgtc 540
accgtgtcat ggaacagcgg agccctgacc tccggagtcc acacatttcc tgctgtgctg 600
cagtcctctg ggctgtattc tctgagttca gtggtcacag tcccaagctc ctctctgggc 660
acacagactt acatctgcaa cgtgaatcat aagccatcca atactaaggt cgacaaacgg 720
gtggagccca aatcttgtgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcca ggtccagctg 780
caggagagcg gacctggact ggtgaagcca tccgaaacac tgtctctgac ctgcaccgtg 840
agcggcggca gcatctctcc atattactgg acttggatta ggcagccccc tggcaagtgt 900
ctggagctga tcgggtacat tcacagttca ggctataccg actacaaccc ctccctgaag 960
tctagagtga ctatcagtgg cgatacctca aagaaacagt tctccctgaa actgagctcc 1020
gtcactgctg cagacaccgc cgtgtattac tgcgcacgcg ccgactggga tcgactgcgc 1080
gctctggata tctggggaca ggggactatg gtcaccgtgt ctagtggggg cggagggagt 1140
ggcggagggg gctcaggagg gggcggaagc gggggcggag ggtccgacat tcagctgacc 1200
cagagcccct caagcctgag tgcctcagtc ggcgatcgcg tgactatcac ctgtcgagct 1260
agccagtcca ttaggtccca tctgaactgg tatcagcaga agcccggaaa agcacctaag 1320
ctgctgatct acggcgccag caatctgcag tccggagtgc cctctaggtt ctctggcagt 1380
ggatcaggga cagactttac actgactatt tcctctctgc agcctgagga tttcgcaact 1440
tattactgcc agcagagcac cggcgcctgg aactggtttg gctgtggaac caaggtggaa 1500
atcaaaggcg gagggggctc tggagggggc ggaagtgaca agacccacac atgcccaccc 1560
tgtccagcac cagagctgct gggcggccca tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaaa 1620
gatacactga tgattagcag aacacccgaa gtcacttgcg tggtcgtgga cgtgtcccac 1680
gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag 1740
accaaacccc gagaggaaca gtataactca acctacaggg tcgtgagcgt cctgacagtg 1800
ctgcatcagg attggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aagtgtctaa taaggctctg 1860
cctgcaccaa tcgagaaaac tattagcaag gccaaaggcc agcctagaga accacaggtg 1920
tataccctgc ccccttctcg ggaggaaatg acaaagaacc aggtcagcct gacttgtctg 1980
gtgaaaggct tctacccttc tgacatcgct gtggagtggg aaagtaatgg acagccagaa 2040
aacaattata agactacccc acccgtcctg gacagtgatg gctcattctt tctgtacagt 2100
aagctgaccg tggataaatc aaggtggcag cagggaaacg tctttagctg ctccgtgatg 2160
cacgaggccc tgcacaatca ttacacacag aagtctctga gtctgtcacc tggcaagcga 2220
ggaaggaaaa ggagaagcgg gtccggagca accaacttca gcctgctgaa acaggctggg 2280
gacgtggagg aaaatcccgg ccctatggtc ctgcagaccc aggtgtttat ctccctgctg 2340
ctgtggattt ctggggccta cggcgctatc cagatgacac agtctcctag ttcactgtct 2400
gcaagtgtcg gcgacagagt gactatcacc tgtcgggctt cccagggaat tcgcaacgat 2460
ctggggtggt atcagcagaa accaggaaag gctcccaaac tgctgatcta ctcagcaagc 2520
acactgcaga gtggggtgcc atcaagattc tccggatctg ggagtggcac tgacttcacc 2580
ctgactatta gctccctgca gccagaggac ttcgccacct attactgcct gcaggattat 2640
aattacccct ggacatttgg acaggggact aaggtggaga tcaaacggac tgtcgccgct 2700
cccagcgtgt tcatttttcc tccatccgac gaacagctga agagcggaac cgcatccgtg 2760
gtgtgcctgc tgaacaattt ctatcctcgc gaagcaaagg tccagtggaa agtggataac 2820
gccctgcaga gcggcaattc ccaggagtct gtgactgaac aggacagtaa ggattcaacc 2880
tacagcctgt ctagtaccct gacactgtcc aaagctgact atgagaagca taaagtgtac 2940
gcatgtgagg tcacccacca ggggctgtcc agtccagtca ccaagtcttt caataggggc 3000
gaatgc 3006
<210> 43
<211> 1002
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9213的氨基酸序列：双特异性假单胞菌
(Bis4-V2L2MD/Psl0096)；可操作地连接至IgE前导序列的DMAb-BiSPA
<400> 43
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
260 265 270
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Pro Tyr
275 280 285
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Leu Ile
290 295 300
Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
305 310 315 320
Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
325 330 335
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
340 345 350
Arg Ala Asp Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
355 360 365
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr
385 390 395 400
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
405 410 415
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln
420 425 430
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn
435 440 445
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
450 455 460
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
465 470 475 480
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Cys Gly
485 490 495
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
500 505 510
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
515 520 525
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
530 535 540
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
545 550 555 560
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
565 570 575
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
580 585 590
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
595 600 605
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
610 615 620
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
625 630 635 640
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
645 650 655
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
660 665 670
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
675 680 685
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
690 695 700
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
705 710 715 720
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
725 730 735
Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn
740 745 750
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
755 760 765
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
770 775 780
Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
785 790 795 800
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
805 810 815
Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
820 825 830
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
835 840 845
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
850 855 860
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr
865 870 875 880
Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
885 890 895
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
900 905 910
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
915 920 925
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
930 935 940
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
945 950 955 960
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
965 970 975
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
980 985 990
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
995 1000
<210> 44
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9215的核苷酸序列：Pseudo-Ps10096；
可操作地连接至编码IgE前导序列的序列的DMAb-?Psl
<400> 44
atggattgga catggaggat tctgtttctg gtggccgccg ctactggaac ccacgctcag 60
gtgcagctgc aggagtctgg acccggactg gtcaagccta gcgaaactct gtccctgact 120
tgcaccgtgt ccggcggatc aatcagccca tactattgga cctggattcg ccagccccct 180
ggcaagggac tggagctgat cggctacatt cacagctccg gatacaccga ctataaccca 240
tcactgaaaa gccgagtgac aatctctggc gatactagta agaaacagtt cagcctgaag 300
ctgtctagtg tcacagccgc tgacactgca gtgtactatt gcgcccgcgc tgactgggat 360
cgactgcgcg ctctggatat ttgggggcag ggcactatgg tcaccgtgag cagcgcctca 420
accaaaggcc ctagcgtgtt tccactggca ccctcctcta agtccacctc tgggggcaca 480
gcagccctgg gatgtctggt gaaggactac ttccccgagc ctgtcacagt gtcctggaac 540
tctggagccc tgacctccgg ggtccataca tttcccgctg tgctgcagag ttcagggctg 600
tactctctga gctccgtggt caccgtgcct tctagttcac tgggcacaca gacttatatc 660
tgcaacgtga atcacaaacc ttccaataca aaggtcgaca agaaagtgga accaaaatct 720
tgtgataaga cccatacatg cccaccctgt ccagcaccag agctgctggg agggccatcc 780
gtgttcctgt ttcctccaaa gcccaaagac accctgatga ttagccggac tccagaagtc 840
acctgcgtgg tcgtggacgt gtcccacgag gaccccgaag tcaagttcaa ctggtacgtg 900
gatggcgtcg aggtgcataa tgccaagaca aaaccccgag aggaacagta caactccact 960
tatagggtcg tgtctgtcct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg gaaggagtat 1020
aagtgcaaag tgtctaacaa ggccctgcct gccccaatcg agaagaccat tagcaaggcc 1080
aaaggccagc ctagagaacc acaggtgtac acactgcccc ctagtcggga cgagctgact 1140
aaaaaccagg tcagcctgac ctgtctggtg aagggcttct atccctcaga tatcgctgtg 1200
gagtgggaat ctaatggaca gcctgaaaac aattacaaga ccacaccacc cgtgctggac 1260
agtgatggat cattctttct gtatagcaaa ctgaccgtgg acaagtccag atggcagcag 1320
gggaacgtct ttagttgctc agtgatgcac gaggccctgc acaatcatta cactcagaaa 1380
agcctgtccc tgtctcccgg caaacgagga aggaagagga gaagtggatc aggggccaca 1440
aacttcagcc tgctgaagca ggctggggat gtggaggaaa atcccggccc tatggtcctg 1500
cagacacagg tgtttatcag tctgctgctg tggatttcag gggcctatgg cgacatccag 1560
ctgactcagt cccctagctc cctgagcgcc tccgtcggag atagagtgac tatcacctgt 1620
cgggcttctc agagtattcg cagccatctg aactggtacc agcagaagcc cgggaaagct 1680
cctaagctgc tgatctatgg agcatcaaat ctgcagagcg gagtgccatc ccggttctca 1740
ggcagcggca gcggaaccga ctttacactg actatttcta gtctgcagcc cgaggatttc 1800
gcaacatact attgccagca gtccactggc gcctggaact ggtttggcgg agggaccaaa 1860
gtggaaatca agcgcacagt cgctgcacct agcgtgttca tctttcctcc aagtgacgag 1920
cagctgaagt ctggcaccgc cagtgtggtg tgcctgctga acaatttcta cccaagggaa 1980
gcaaaagtcc agtggaaggt ggataacgcc ctgcagagcg gaaattccca ggagtctgtg 2040
acagaacagg acagtaagga ttcaacttac tctctgagta acaccctgac actgagcaag 2100
gctgactacg agaagcacaa agtgtatgca tgcgaggtca cccaccaggg gctgtccagt 2160
ccagtcacta agtccttcaa taggggagaa tgc 2193
<210> 45
<211> 731
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9215的氨基酸序列：Pseudo-Ps10096；
可操作地连接至IgE前导序列的DMAb-?Psl
<400> 45
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
Ser Pro Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Leu Ile Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln
85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Asp Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr
465 470 475 480
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
485 490 495
Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile
500 505 510
Ser Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
515 520 525
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
530 535 540
Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
545 550 555 560
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro
565 570 575
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
580 585 590
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
595 600 605
Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
610 615 620
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
625 630 635 640
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
645 650 655
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
660 665 670
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
675 680 685
Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
690 695 700
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
705 710 715 720
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
725 730
<210> 46
<211> 3006
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9259的核苷酸序列：双特异性假单胞菌
唯一(Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE pGX0001；可操作地
连接至编码IgE前导序列的序列的DMAb-BiSPA
<400> 46
atggactgga catggagaat cctgtttctg gtcgccgccg caactggaac ccacgccgaa 60
gtgcagctgc tggagtcagg gggagggctg gtgcagcccg gcggcagcct gcgactgtct 120
tgcgccgcta gtggcttcac cttcagcagc tatgctatga actgggtccg acaggcacca 180
ggaaagggac tggaatgggt gtctgccatc accatgagtg gaattacagc ttactatact 240
gacgatgtga aggggagatt cacaatctca cgggacaaca gcaaaaatac tctgtacctg 300
cagatgaata gcctgagggc agaggatacc gccgtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgcctggca cacactacta ttacggaatg gacgtgtggg gccagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg cttcaacaaa ggggccaagc gtgtttccac tggcaccctc aagcaaatca 480
accagcgggg gcacagcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc cgagcctgtc 540
accgtgtcat ggaacagcgg agccctgacc tccggagtcc acacatttcc tgctgtgctg 600
cagtcctctg ggctgtattc tctgagttca gtggtcacag tcccaagctc ctctctgggc 660
acacagactt acatctgcaa cgtgaatcat aagccatcca atactaaggt cgacaaacgg 720
gtggagccca aatcttgtgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcca ggtccagctg 780
caggagagcg gacctggact ggtgaagcca tccgaaacac tgtctctgac ctgcaccgtg 840
agcggcggca gcatctctcc atattactgg acttggatta ggcagccccc tggcaagtgt 900
ctggagctga tcgggtacat tcacagttca ggctataccg actacaaccc ctccctgaag 960
tctagagtga ctatcagtgg cgatacctca aagaaacagt tctccctgaa actgagctcc 1020
gtcactgctg cagacaccgc cgtgtattac tgcgcacgcg ccgactggga tcgactgcgc 1080
gctctggata tctggggaca ggggactatg gtcaccgtgt ctagtggggg cggagggagt 1140
ggcggagggg gctcaggagg gggcggaagc gggggcggag ggtccgacat tcagctgacc 1200
cagagcccct caagcctgag tgcctcagtc ggcgatcgcg tgactatcac ctgtcgagct 1260
agccagtcca ttaggtccca tctgaactgg tatcagcaga agcccggaaa agcacctaag 1320
ctgctgatct acggcgccag caatctgcag tccggagtgc cctctaggtt ctctggcagt 1380
ggatcaggga cagactttac actgactatt tcctctctgc agcctgagga tttcgcaact 1440
tattactgcc agcagagcac cggcgcctgg aactggtttg gctgtggaac caaggtggaa 1500
atcaaaggcg gagggggctc tggagggggc ggaagtgaca agacccacac atgcccaccc 1560
tgtccagcac cagagctgct gggcggccca tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaaa 1620
gatacactgt atattactag agagcccgaa gtcacttgcg tggtcgtgga cgtgtcccac 1680
gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag 1740
accaaacccc gagaggaaca gtataactca acctacaggg tcgtgagcgt cctgacagtg 1800
ctgcatcagg attggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aagtgtctaa taaggctctg 1860
cctgcaccaa tcgagaaaac tattagcaag gccaaaggcc agcctagaga accacaggtg 1920
tataccctgc ccccttctcg ggaggaaatg acaaagaacc aggtcagcct gacttgtctg 1980
gtgaaaggct tctacccttc tgacatcgct gtggagtggg aaagtaatgg acagccagaa 2040
aacaattata agactacccc acccgtcctg gacagtgatg gctcattctt tctgtacagt 2100
aagctgaccg tggataaatc aaggtggcag cagggaaacg tctttagctg ctccgtgatg 2160
cacgaggccc tgcacaatca ttacacacag aagtctctga gtctgtcacc tggcaagcga 2220
ggaaggaaaa ggagaagcgg gtccggagca accaacttca gcctgctgaa acaggctggg 2280
gacgtggagg aaaatcccgg ccctatggtc ctgcagaccc aggtgtttat ctccctgctg 2340
ctgtggattt ctggggccta cggcgctatc cagatgacac agtctcctag ttcactgtct 2400
gcaagtgtcg gcgacagagt gactatcacc tgtcgggctt cccagggaat tcgcaacgat 2460
ctggggtggt atcagcagaa accaggaaag gctcccaaac tgctgatcta ctcagcaagc 2520
acactgcaga gtggggtgcc atcaagattc tccggatctg ggagtggcac tgacttcacc 2580
ctgactatta gctccctgca gccagaggac ttcgccacct attactgcct gcaggattat 2640
aattacccct ggacatttgg acaggggact aaggtggaga tcaaacggac tgtcgccgct 2700
cccagcgtgt tcatttttcc tccatccgac gaacagctga agagcggaac cgcatccgtg 2760
gtgtgcctgc tgaacaattt ctatcctcgc gaagcaaagg tccagtggaa agtggataac 2820
gccctgcaga gcggcaattc ccaggagtct gtgactgaac aggacagtaa ggattcaacc 2880
tacagcctgt ctagtaccct gacactgtcc aaagctgact atgagaagca taaagtgtac 2940
gcatgtgagg tcacccacca ggggctgtcc agtccagtca ccaagtcttt caataggggc 3000
gaatgc 3006
<210> 47
<211> 1002
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX9259的氨基酸序列：双特异性假单胞菌
唯一(Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE pGX0001；可操作地
连接至IgE前导序列的DMAb-BiSPA
<400> 47
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
260 265 270
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Pro Tyr
275 280 285
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Leu Ile
290 295 300
Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
305 310 315 320
Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
325 330 335
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
340 345 350
Arg Ala Asp Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
355 360 365
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr
385 390 395 400
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
405 410 415
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln
420 425 430
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn
435 440 445
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
450 455 460
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
465 470 475 480
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Cys Gly
485 490 495
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
500 505 510
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
515 520 525
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
530 535 540
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
545 550 555 560
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
565 570 575
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
580 585 590
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
595 600 605
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
610 615 620
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
625 630 635 640
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
645 650 655
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
660 665 670
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
675 680 685
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
690 695 700
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
705 710 715 720
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
725 730 735
Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn
740 745 750
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
755 760 765
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
770 775 780
Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
785 790 795 800
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
805 810 815
Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
820 825 830
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
835 840 845
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
850 855 860
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr
865 870 875 880
Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
885 890 895
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
900 905 910
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
915 920 925
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
930 935 940
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
945 950 955 960
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
965 970 975
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
980 985 990
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
995 1000

Claims (24)

1.一种编码一种或多种DNA单克隆抗体(DMAb)的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自以下的至少一种：
a)编码抗PcrV DMAb(DMAb-αPcrV)的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一种或多种的核苷酸序列；
b)编码抗Psl DMAb(DMAb-αPsl)的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一种或多种的核苷酸序列；以及
c)编码双特异性抗PcrV抗Psl DMAb(DMAb-BiSPA)的可变重链区和可变轻链区或其片段或同系物中的一种或多种的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，还包含编码裂解结构域的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，还包含编码信号肽的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中a)选自：
a)编码在氨基酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；
b)编码选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的核苷酸序列；
c)编码在氨基酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；
d)编码选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；
e)在核苷酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列；
f)在核苷酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列的片段；
g)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
h)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的片段。
5.根据权利要求1所述的核酸分子，其中b)选自：
a)编码在氨基酸序列的整个长度上与SEQ ID NO:20的氨基酸具有至少约95％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；
b)编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的核苷酸序列；
c)编码在氨基酸序列的整个长度上与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；
d)编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；
e)在核苷酸序列的整个长度上与SEQ ID NO:19具有至少约95％同一性的核苷酸序列；
f)在核苷酸序列的整个长度上与SEQ ID NO:19具有至少约95％同一性的核苷酸序列的片段；
g)SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及
h)SEQ ID NO:19的核苷酸序列的片段。
6.根据权利要求1所述的核酸分子，其中c)选自：
a)编码在氨基酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；
b)编码选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22的氨基酸序列的核苷酸序列；
c)编码在氨基酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；
d)编码选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22的氨基酸序列的片段的核苷酸序列；
e)在核苷酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列；
f)在核苷酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列的片段；
g)选自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及
h)选自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的片段。
7.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子还包含编码IRES元件的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的核酸分子，其中IRES元件选自病毒IRES和真核IRES。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子还包含编码选自SEQID NO:24和SEQ ID NO:25的信号肽的核苷酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是核糖核酸分子。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸分子，包含表达载体。
12.一种组合物，包含根据权利要求1-11中任一项所述的核酸分子。
13.根据权利要求12所述的组合物，还包含药学上可接受的赋形剂。
14.一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-11中任一项所述的核酸分子或根据权利要求12-13中任一项所述的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病是铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)感染。
16.根据权利要求14所述的方法，还包括向所述受试者施用抗生素剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在施用所述核酸分子或所述组合物后小于10天施用抗生素。
18.一种预防或治疗受试者的生物膜形成的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-11中任一项所述的核酸分子或根据权利要求12-13中任一项所述的组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述生物膜是铜绿假单胞菌生物膜。
20.根据权利要求18所述的方法，还包括向所述受试者施用抗生素剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在施用所述核酸分子或所述组合物后小于10天施用抗生素。
22.一种用于在受试者中产生合成双特异性抗体的组合物，其包含编码一种或多种抗体或其片段的一种或多种核酸分子，其中所述双特异性抗体结合至第一靶标和第二靶标。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述第一靶标是肿瘤相关抗原。
24.根据权利要求22所述的组合物，其中所述第二靶标是免疫细胞上的细胞表面标志物。
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