KR20230093338A - 슈도모나스 에루지노사에 대해 사용하기 위한 dna 항체 작제물 - Google Patents

Abstract

본 명세서는 슈도모나스 에루지노사를 표적으로 하는 단일 및 이중특이적 DNA 항체(DMAb)가 개시되어 있다. 또한, 본 명세서는 대상체에 DMAb를 투여함으로써 대상체에서 합성 항체를 생성시키는 방법이 개시되어 있다. 본 개시내용은 또한, 상기 조성물 및 생성 방법을 사용하여 대상체에서 슈도모나스 에루지노사 감염증을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

슈도모나스 에루지노사에 대해 사용하기 위한 DNA 항체 작제물 {DNA ANTIBODY CONSTRUCTS FOR USE AGAINST PSEUDOMONAS AERUGINOSA}

관련 출원에 대한 상호 참고문헌

본 출원은 2016년 5월 5일자로 출원된 미국 가출원 제62/332,363호를 우선권으로 주장하며, 이러한 기초 출원은 그 전문이 본 명세서에 참고로 원용된다.

기술 분야

본 발명은 생체 내에서 항-PcrV 및 이중특이적 항-PcrV 항-Psl 항체, 및 이의 기능성 단편을 포함하는 하나 이상의 합성 항체를 생성시키기 위한 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 투여함으로써 대상체에서 박테리아 감염증을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

다제내성(multidrug-resistant: MDR) 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)은 치료하기 가장 어려운 병원균 중 하나이다. 슈도모나스 종에 의한 감염증은 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)을 갖는 개체에서 급성 폐렴 및 만성 폐 감염증의 주요 원인이고, 패혈성 사망률(septic mortality)로 이어질 수 있는 화상 상처 또는 다른 손상의 가장 흔한 감염원이다. 슈도모나스 종은 의료 기기, 예를 들어, 의료용 임플란트, 카테터, 및 인공 관절의 표면에 부착될 수 있고, 예를 들어, 카테터가 막히거나 임플란트를 물리적으로 손상시키는, 여러 문제를 야기시킬 수 있다. 바이오필름 형성 박테리아로서 슈도모나스는 고수준의 항생제에 대해 매우 내성적이다. 현재, 치료 항체는 여러 질환의 치료를 위해 승인되었다. 불행하게도, 정제된 항체의 제조 및 전달은 엄청난 비용이 발생한다. 또한, 이러한 항체 치료법은 수 주 내지 여러 달 동안 재-투여되어야 하는데, 이는 의료용 임플란트 상의 바이오필름 형성의 예방 또는 치료와 같은 만성 질환의 치료에서 문제가 되는 고려사항이다.

이에 따라, 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염증 및 바이오필름 형성을 예방 및/또는 치료하는 개선된 치료제가 당해 분야에서 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.

일 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 DNA 단클론성 항체(DMAb)를 암호화하는 핵산 분자로서, 핵산 분자는 a) 항-PcrV DMAb(DMAb-αPcrV)의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체; b) 항-Psl DMAb(DMAb-αPsl)의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체; 및 c) 이중특이적 항-PcrV 항-Psl DMAb(DMAb-BiSPA)의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체 중 하나 이상을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 핵산 분자는 분열 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, DMAb-αPcrV의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 분자, 또는 이의 단편 또는 동족체는 a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 12; 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 12; 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; c) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 12; 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; d) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 12; 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; e) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; f) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 단편; g) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열; 및 h) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 단편 중 하나이다.

일 실시형태에서, DMAb-αPsl의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 분자, 또는 이의 단편 또는 동족체는 a) 서열번호 20의 아미노산에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; c) 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; d) 서열번호 20의 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; e) 서열번호 19에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; e) 서열번호 19에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 단편; f) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열; 및 g) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열의 단편 중 하나이다.

일 실시형태에서, DMAb-BiSPA의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 분자, 또는 이의 단편 또는 동족체는 a) 서열번호 18 및 서열번호 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; b) 서열번호 18 및 서열번호 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; c) 서열번호 18 및 서열번호 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; d) 서열번호 18 및 서열번호 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; e) 서열번호 17 및 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; f) 서열번호 17 및 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 단편; g) 서열번호 17 및 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열; 및 h) 서열번호 17 및 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 단편 중 하나이다.

일 실시형태에서, 핵산 분자는 IRES 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, IRES 요소는 바이러스성 IRES 및 진핵성 IRES로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 실시형태에서, 핵산 분자는 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, 핵산 분자는 발현 벡터를 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 DMAb-αPcrV, DMAb-αPsl, DMAb-BiSPA로부터 선택된 하나 이상의 DNA 단클론성 항체를 암호화하는 핵산 분자, 또는 이의 단편 또는 동족체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 대상체에게 DMAb-αPcrV, DMAb-αPsl, DMAb-BiSPA로부터 선택된 하나 이상의 DNA 단클론성 항체, 또는 이의 단편 또는 동족체를 포함하는 핵산 분자 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 질환은 슈도모나스 에루지노사 감염증이다.

일 실시형태에서, 본 방법은 대상체에게 항생제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 항생제는 핵산 분자 또는 조성물의 투여 후 10일 이내에 투여된다.

일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 바이오필름 형성을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 대상체에게 DMAb-αPcrV, DMAb-αPsl, DMAb-BiSPA로부터 선택된 하나 이상의 DNA 단클론성 항체, 또는 이의 단편 또는 동족체를 포함하는 핵산 분자 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 바이오필름은 슈도모나스 에루지노사 바이오필름이다.

일 실시형태에서, 본 방법은 대상체에게 항생제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 항생제는 핵산 분자 또는 조성물의 투여 후 10일 이내에 투여된다.

일 실시형태에서, 본 발명은 생체 내에서 하나 이상의 항체를 생성시키기 위해 이중특이적인 하나 이상의 DNA 단클론성 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조성물로서, 핵산 분자는 a) 제1 항원의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체; 및 b) 제2 항원의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 분자는 임의의 요망되는 특이성의 2개의 결합 부위를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 부위 중 하나는 종양 관련 항원을 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 부위 중 하나는 면역 세포 상의 세포 표면 마커를 결합할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 다른 것들 중에서, CD19/CD3, HER3/EGFR, TNF/IL-17, IL-1α/IL1β, IL-4/IL-13, HER2/HER3, GP100/CD3, ANG2/VEGFA, CD19/CD32B, TNF/IL17A, IL-17A/IL17E, CD30/CD16A, CD19/CD3, CEA/CD3, HER2/CD3, CD123/CD3, GPA33/CD3, EGRF/CD3, PSMA/CD3, CD28/NG2, CD28/CD20, EpCAM/CD3, 또는 MET/EGFR을 표적으로 한다.

도 1a 내지 도 1c를 포함하는 도 1은 DMAb 전달 및 시험관내 발현을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 1a는 DMAb가 단클론성 항체 클론 V2L2MD 및 ABC123의 IgG 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하여 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA 작제물을 형성하도록 설계된 것을 나타낸 개략적 다이어그램을 도시한 것이다. 최적화된 DMAb 작제물은 생체내 IM-EP에 의해 마우스에 투여되며, 근육 세포는 생산 mAb를 합성하기 위한 것이다. 완전 기능성 DMAb가 분비되고 전신 순환계로 들어간다. 도 1b는 HEK 293 T 세포가 1 ㎍/웰의 DMAb-αPcrV, DMAb-BiSPA, 또는 대조군 pGX0001로 형질주입(트랜스펙션)되었음(transfected)을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. i) 상청액 및 ii) 세포 용해물은 48시간 후에 수확되었다. 샘플은 인간 IgG에 대해 검정되었다. 도 1c는 형질주입된 세포로부터의 세포 용해물과 함께 수행된 예시적인 웨스턴 블롯의 결과를 도시한 것이다. 10㎍ 전체 세포 용해물은 각 레인(lane)에 로딩되고 SDS-PAGE 겔 상에서 진행되고, 이후에, 나이트로셀룰로스 막 상으로 옮겨졌다. 막은 HRP에 접합된 염소 항-인간 IgG H+L 항체로 프로빙되었다. 샘플은 ECL 화학발광 키트를 이용하여 현상되고, 필름 상에서 시각화되었다.
도 2A 내지 도 2D를 포함하는 도 2는 마우스 골격근에서 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA의 발현을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. BALB/c 마우스는 DMAb-αPcrV 또는 DMAb-BiSpA DNA를 갖는 TA 근육에서, DNA 주사를 수용하였고, 이후에 생체내에서 전기천공되었다. 도 2A는 DMAb-αPcrV를 수용한 세포의 예시적인 이미지를 도시한 것이다. 도 2B는 DMAb-BiSPA를 수용한 세포의 예시적인 이미지를 도시한 것이다. 도 2C는 pGX0001 빈(empty) 벡터 골격을 수용한 세포의 예시적인 이미지를 도시한 것이다. 도 2D는 고유 근육 세포의 예시적인 이미지를 도시한 것이다. 근육 조직은 DMAb를 주사하고 3일 후에 수확되었고, 염소 항-인간IgG Fc 항체로 프로빙되고, 이후에 항-염소 IgG AF88 및 DAPI로 검출되었다.
도 3A 내지 도 3F를 포함하는 도 3은 마우스에서 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA의 생체내 발현을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 3A는 100㎍의 DMAb-αPcrV가 투여된 B6.Cg-Foxn1<nu>/J 마우스(n=5/군)에 대해 IM-EP에 의해 120일에 걸쳐 모니터링된 인간 IgG의 혈청 수준을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 3B는 100㎍ 및 300㎍의 DMAb-αPcrV가 투여된 BALB/c 마우스(n=10/군)에서 7일 혈청 수준을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 3C는 100㎍의 DMAb-αPcrV가 투여된 BALB/c 마우스(n=10/군)에서 PcrV 단백질에 대한 7일 혈청 결합을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 3D는 100㎍의 DMAb-BiSPA가 투여된 B6.Cg-Foxn1^nu/J 마우스(n=5/군)에 대해 IM-EP에 의해 120일에 걸쳐 모니터링된 인간 IgG의 혈청 수준을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 3E는 100㎍ 및 300㎍의 DMAb-BiSPA가 투여된 BALB/c 마우스(n=10/군)에서 7일 혈청 수준을 입증한 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 3F는 100㎍의 DMAb-BiSPA가 투여된 BALB/c 마우스(n=10/군)에서 PcrV 단백질에 대한 7일 혈청 결합을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다.
도 4A 내지 도 4C를 포함하는 도 4는 BALB/c 마우스에서 DMAb-αPcrV, DMAb-BiSPA, 및 마우스 IgG2a DMAb의 약물동력학을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. BALB/c 마우스는 TA 근육 내에 DMAb의 100㎍ DNA 주사를 수용하였고, 이후에 생체내 전기천공으로 수행되었다(n=10/군). 혈청 인간 IgG1 수준은 DMAb 주사 후 21일 동안 모니터링되고 ELISA에 의해 정량화되었다. 마우스 IgG2a 수준은 DMAb 주사 후 103일 동안 모니터링되고 ELISA에 의해 정량화되었다. 도 4A는 DMAb-αPcrV의 약물동력학을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 4B는 DMAb-BiSPA의 약물동력학을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 4C는 대조군 IgG2A DMAb의 약물동력학을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다.
도 5A 내지 도 5D를 포함하는 도 5는 치명적인 폐렴 접종 후 BALB/c 마우스에서 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA에 의해 부여된 생체내 기능성 및 보호, 즉, 방어를 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 5A는 300㎍의 DMAb-αPcrV, DMAb-BiSPA, 또는 ABC123 IgG(2 mg/kg)가 투여된 BALB/c 마우스의 혈청 IgG 수준을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. n=5 마우스/군. DMAb-BiSPA로부터의 2마리 동물은 항-세포독성 활성 검정의 검출 한계 미만이었다. 항체 수준은 접종일에 혈청에서의 DMAb의 예시이다. 도 5B는 대조군 DMAb-DVSF3(검정색 고리원), DMAb-αPcrV(적색 원), DMAb-BiSPA(녹색 원)가 투여된 후에 또는 5일 전에 또는 정제된 ABC123 mAb(보라색 원)가 투여된 후에 또는 치사량 접종(lethal challenge) 1일 전에 BALB/c 마우스에서의 생체내 방어를 입증하는 예시적인 실험 결과를 도시한 것이다(제시된 데이터는 2회의 독립적 실험으로부터 얻어진 것이다. n=8/군/실험, 전체 n=16). 도 5C는 상이한 용량의 DMAb-BiSPA로의 방어를 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다: 100㎍(보라색 원), 200㎍(녹색 원), 300㎍(적색 원), 또는 DMAb-DVSF3(대조군). n=8 마우스/군. 도 5D는 상이한 용량의 DMAb-BiSPA로의 혈청 DMAb 농도를 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. n=8 마우스/군.
도 6A 내지 도 6D를 포함하는 도 6은 치사량의 P. 에루지노사 접종 후에 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA 치료된 동물의 장기 방어 효과를 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 6A는 P. 에루지노사 박테리아(CFU/mL)의 장기 부담이 DMAb-DVSF3, DMAb-αPcrV, DMAb-ABC123, 또는 ABC123 IgG로 치료된 동물에서 치사량 폐렴 접종 후 폐, 비장 및 신장으로부터 정량화됨을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 6B는 DMAb-치료 후 감염된 동물에서의 폐 중량을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 6C는 치사량 접종 후 DMAb-치료된 동물의 폐 균질물에서 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 수준을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 6A 내지 도 6C에 대하여, n=8 마우스/군. 라인은 중간 값을 나타낸 것이다. 상자수염도(Box and whisker plot)는 모든 포인트를 나타내며, 막대는 최소값 내지 최대값을 나타낸다. 도 6D는 치사량 폐렴 접종 후 24시간에 감염된 동물과 비교하여 감염되지 않은 동물에서 DMAb 및 ABC123 IgG의 혈청 IgG 수준을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다.
도 7A 내지 도 7H를 포함하는 도 7은 P. 에루지노사 6077로 감염 후 48시간에 급성 폐렴의 조직학을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다(헤마톡실린 및 에오신(HE)). 도 7A는 뚜렷한 폐포 침윤 및 출혈의 유착 영역을 나타내는 DMAb-DVSF3과 함께 전기천공 후를 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다(10배 배율). 도 7B는 폐포가 뚜렷한 호중구 침윤, 출혈 및 괴사 영역(삽도)을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 7C는 DMAb-αPcrV로의 경미한 폐렴 및 간헐적 세기관지 잔해를 나타낸 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다(10배 배율). 도 7D는 혼합된 호중구 및 대식세포 집단(삽도)을 포함하는 폐포 침윤을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 7E는 DMAb-BiSPA 군에서 경미한 폐포염을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다(10배 배율). 도 7F는 폐포 공간(삽도)에서 주로 호중구 침윤 및 경미한 출혈을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 7G는 ABC123 IgG 대조군이 중간 정도의 폐포염을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다(10배 배율). 도 7H는 폐포 공간이 세포 잔해 및 출혈(삽도)과 혼합된 호중구를 함유함을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 5 마우스/군으로부터의 대표적인 데이터.
도 8a 내지 도 8b를 포함하는, 도 8은 항생제 요법과의 DMAb 병용을 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 8a는 BALB/c 마우스에 대조군 DMAb-DVSF3(100㎍), 염수 + 메로페넴(MEM, 2.3 mg/kg), DMAb-BiSPA(100㎍), 또는 DMAb-BiSPA(100㎍) + MEM(2.3 mg/kg)를 주사하고, 이후에, 치사량의 P. 에루지노사 6077을 접종한 것을 나타낸 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. MEM를 치사량 접종 후 1시간에 투여하였다. 동물은 감염 후 144시간 동안 모니터링하였다. n=8 마우스/군. 도 7B는 치명적인 접종 전에 동물에서의 DMAb 혈청 수준을 입증한 예시적 실험의 결과를 도시한 것이다. n=8 마우스/군. 라인은 평균값을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 DMAb-V2L2 생체내 발현의 최적화를 나타내는 예시적인 실험의 결과를 도시한 것이다. BALB/c 마우스는 DMAb-αPcrV 또는 DMAb-BiSpA DNA를 단일 DNA 주사를 통해 이후에, 생체내 전기천공에 의해 TA 근육 내로 단일 DNA 주사를 수용하였다. 그래프는 서열, 히알루로니다제(400 U/ml)를 갖는 제형, 및 전기천공 최적화 전 및 후에, DMAb-αPcrV에 대해 각각 100㎍, 200㎍ 또는 300㎍로 투여된 BALB/c 마우스(n=5/군)에서의 7일 혈청 수준을 나타낸 것이다.

본 발명은 항체를 암호화하는 재조합 핵산 서열, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 조성물은 합성 항체의 생체내 발현 및 형성을 촉진시키기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.

특히, 재조합 핵산 서열로부터 발현된 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 합성 항체 내에 어셈블링될 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는, 어셈블리가 항원을 결합시키고, 본 명세서 기술된 어셈블링되지 않은 항체와 비교하여 더욱 면역원성이고, 항원에 대한 면역 반응을 유발하거나 유도할 수 있는 합성 항체를 형성시키도록 서로 상호작용할 수 있다.

추가적으로, 이러한 합성 항체는 항원 유도 면역 반응에 반응하여 생성된 항체보다 대상체에서 더욱 신속하게 발생된다. 합성 항체는 소정 범위의 항원을 효과적으로 결합하고 중화시킬 수 있다. 합성 항체는 또한, 질환을 효과적으로 방어하고/하거나 질환의 생존을 증진시킬 수 있다.

1. 정의

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충될 때, 정의를 포함하여 본 문서가 우선시 될 것이다. 바람직한 방법 및 물질이 하기에 기재되어 있지만, 본 명세서 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 평가에서 이용될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허출원, 특허 및 다른 참고문헌은 이들의 전문이 참고로 포함된다. 본 명세서 개시된 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서, 제한하려는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "포함한다", "포함된다", "갖는", "갖는다", "수 있다", "함유한다" 및 이들의 변형예는 추가적인 행위 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 전이 어구, 용어 또는 단어로 의도된다. 문맥상 명백하게 달리 기술하지 않는 한, 단수 형태에는 복수 대상물이 포함된다. 본 개시는 또한 명시적으로 기술하는 지의 여부와는 관계없이, 본 명세서 제시된 실시형태 또는 요소를 "포함하는", "이로 구성된" 및 "본질적으로 이로 구성된" 다른 실시형태를 고려한다.

"항체"는 Fab, F(ab')2, Fd, 및 단일쇄 항체, 및 이들의 유도체를 포함하는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 항체, 또는 단편, 이의 단편 또는 유도체를 의미할 수 있다. 항체는 원하는 에피토프 또는 이로부터 유래된 서열에 충분한 결합 특이성을 나타내는 포유류 혈청 샘플에서 단리된 항체, 다클론성 항체, 친화도 정제된 항체, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되는 "항체 단편" 또는 "항체의 단편"은 항원-결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 나타낸다. 이 일부에는 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, 항체 아이소형에 따라 CH2, CH3, 또는 CH4)이 포함되지 않는다. 항체 단편의 예에는 비제한적으로 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 디아바디(diabody), 단일쇄 Fv(scFv) 분자, 하나의 경쇄 가변 도메인만 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 경쇄 가변 도메인의 세개의 CDR을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 하나의 중쇄 가변 영역만 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 및 중쇄 가변 영역의 세개의 CDR을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드가 포함된다.

"항원"은 숙주에서 면역 반응을 생성하는 능력을 갖는 단백질을 나타낸다. 항원은 항체에 의해 인식되고 이에 결합될 수 있다. 항원은 체내에서 또는 외부 환경에서 유래될 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "코딩 서열" 또는 "암호화 핵산"은 본 명세서 나타낸 바와 같은 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산(RNA 또는 DNA 분자)을 의미할 수 있다. 일 실시형태에서, 코딩 서열은 항체를 암호화하는 RNA 서열이 전사된 DNA 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 코딩 서열은 항체를 암호화하는 RNA 서열을 포함한다. 코딩 서열은 핵산이 투여되는 개인 또는 포유류의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다. 코딩 서열은 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "상보체" 또는 "상보적인"은 핵산이 핵산 분자의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 간 왓슨-크릭(예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기쌍 형성을 의미할 수 있음을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "정전류"는 조직 또는 상기 조직을 정의하는 세포가 동일한 조직에 전달되는 전기 자극 기간에 걸쳐 수신하거나 경험하는 전류를 정의하기 위한 것이다. 전기 자극은 본 명세서 기재된 전기천공 장치로부터 전달된다. 상기 전류는 본 명세서 제공된 전기천공 장치가 피드백 요소, 바람직하게는 즉각적인 피드백을 가지므로, 전기 자극의 수명에 걸쳐 상기 조직에서 정전류량으로 유지된다. 피드백 요소는 자극 기간에 걸쳐 조직(또는 세포)의 저항을 측정하고, 전기천공장치가 그 전기 에너지 출력을 변경하도록(예컨대, 전압을 증가하도록) 유도하여 동일한 조직에서의 전류가 전기 자극 동안(마이크로초 수준) 그리고 자극 별로 변하지 않고 유지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 피드백 요소는 컨트롤러를 포함한다.

본 명세서에서 이용되는 "전류 피드백" 또는 "피드백"은 상호 교환적으로 이용될 수 있고 제공된 전기천공 장치의 능동 반응을 의미할 수 있으며, 이는 전극 간에 조직에서 전류를 측정하는 단계 및 전류를 불변 수준으로 유지하기 위해 이에 따라 EP 장치에 의해 전달되는 에너지 출력을 변경하는 단계를 포함한다. 상기 불변 수준은 자극 순서 또는 전기 처리의 개시 전에 사용자에 의해 사전 설정된다. 내부 전기 회로가 전극 간에 조직내 전류를 연속적으로 모니터링하고 이 모니터링된 전류(또는 조직 내 전류)를 사전 설정된 전류와 비교하여 모니터링된 전류를 사전 설정된 수준으로 유지하기 위해 연속적으로 에너지-출력 조정을 수행할 수 있으므로, 피드백은 전기천공 장치의 전기천공 성분, 예를 들어, 컨트롤러에 의해 수행될 수 있다. 피드백 루프는 이것이 아날로그 폐쇄 루프 피드백이므로, 즉각적일 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "분산된 전류"는 본 명세서 기재된 전기천공 장치의 다양한 바늘 전극 어레이로부터 전달되는 전기적 전류 패턴을 의미할 수 있고, 여기서 이 패턴은 조직이 전기천공되는 임의의 영역 상에서 전기천공 관련된 열 스트레스의 발생을 최소화하거나 바람직하게 제거한다.

본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되는 "전기천공", "전기-투과화", 또는 "전기-역학 증강"("EP")은 생체막에서 미시적 경로(구멍)를 유도하기 위한 막관통 전기장 자극의 이용을 나타낼 수 있다; 이들의 존재는 생체분자, 예를 들어, 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 약물, 이온, 및 물이 세포막의 한쪽에서 다른 쪽으로 이동할 수 있게 한다.

본 명세서에서 이용되는 "내인성 항체"는 체액성 면역 반응의 유도를 위해 유효 용량의 항원이 투여되는 대상체에서 생성되는 항체를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "피드백 메커니즘"은 소프트웨어 또는 하드웨어(또는 펌웨어)에 의해 수행되는 절차를 나타낼 수 있고, 이 절차는 본 발명의 값, 바람직하게는 전류로 원하는 조직의 임피던스를 (에너지 자극 전달 이전, 동안, 및/또는 이후) 수신하고 비교하며, 사전 설정된 값을 달성하기 위해 전달된 에너지 자극을 조정한다. 피드백 메커니즘은 아날로그 폐쇄 루프 회로에 의해 수행될 수 있다.

"단편"은 기능하고, 즉 원하는 표적에 결합할 수 있고, 전장 항체와 동일한 목적 효과를 갖는 항체의 폴리펩타이드 단편을 의미할 수 있다. 항체의 단편은 N 및/또는 C 말단에서 적어도 하나의 아미노산이 없는 것을 제외하고는 전장과 100% 동일할 수 있고, 각각의 경우 위치 1에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 갖거나 갖지 않는다. 단편은 부가된 임의의 이종성 신호 펩타이드를 제외하고, 특정한 전장 항체 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 백분율을 포함할 수 있다. 단편은 항체와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드의 단편을 포함하며, 추가적으로 동일성 백분율 계산 시 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종성 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 단편은 추가로 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 항체의 단편에 연결될 수 있다.

항체를 암호화하는 핵산 서열의 단편은 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 없는 것을 제외하고는 전장과 100% 동일할 수 있고, 각각의 경우 위치 1에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 암호화하는 서열을 갖거나 갖지 않는다. 단편은 부가된 임의의 이종성 신호 펩타이드를 제외하고, 특정한 전장 코딩 서열 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 백분율을 포함할 수 있다. 단편은 항체와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 단편을 포함하고 선택적으로는 동일성 백분율 계산 시 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종성 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 단편은 추가로 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 암호화하는 코딩 서열이 항체 서열의 단편에 연결될 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "유전적 작제물"은 단백질, 예를 들어, 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 나타낸다. 유전적 작제물은 또한 RNA 분자가 전사되는 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 코딩 서열에는 핵산 분자가 투여되는 개인의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호가 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "발현 가능한 형태"는 개인의 세포에 존재하는 경우, 코딩 서열이 발현되도록 단백질을 암호화하는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 작제물을 나타낸다. 일 실시형태에서, 유전적 작제물은 본 명세서에 기재된 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 유전적 작제물은 본 발명의 항체, 이의 변이체 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자를 포함한다.

둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 본 명세서에서 이용되는 "동일한" 또는 "동일성"은 서열이 명시된 영역에 걸쳐 동일한 명시된 잔기 백분율을 가짐을 의미할 수 있다. 백분율은 두 서열을 최적 정렬하고, 명시된 영역에 걸쳐 두 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 잔기가 나오는 위치의 수를 결정하여 매치된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 명시된 영역에서 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱해서 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 두 서열이 상이한 길이이거나 정렬로 하나 이상의 엇갈린 말단이 생성되고 명시된 비교 영역에 하나의 서열만 포함되는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에는 포함되지만 분자에는 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교하는 경우, 티민(T) 및 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "임피던스"는 피드백 메커니즘을 논의할 때 이용될 수 있고, 옴의 법칙에 따라 전류값으로 전환되어 사전 설정된 전류와의 비교를 가능케 할 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "면역 반응"은 하나 이상의 핵산 및/또는 펩타이드의 도입에 반응하는 숙주의 면역계, 예를 들어, 포유류의 면역계 활성화를 의미할 수 있다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응의 형태 또는 둘 다일 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 서로 공유 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 단일쇄의 도시는 또한 상보쇄의 서열을 정의한다. 따라서 핵산은 또한 도시된 단일쇄의 상보쇄를 포괄한다. 핵산의 여러 변이체가 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 이용될 수 있다. 따라서 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이들의 상보체를 포괄한다. 단일쇄는 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포괄한다.

핵산은 단일쇄 또는 이중쇄일 수도 있고, 또는 이중쇄 및 단일쇄 서열을 모두 일부 함유할 수도 있다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘 다, RNA, 또는 하이브리드일 수 있고, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 아이소시토신 및 아이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 이것이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있음을 의미할 수 있다. 프로모터는 그 제어 하 유전자의 5'(업스트림) 또는 3'(다운스트림)에 배치될 수 있다. 프로모터 및 유전자 간 거리는 프로모터가 유래된 유전자에서 이것이 제어하는 유전자 및 프로모터 간 거리와 대략 동일할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 상기 거리의 변동은 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "펩타이드", "단백질", 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있고, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "프로모터"는 세포 내 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화하거나, 증강시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 의미할 수 있다. 프로모터는 발현을 추가 증강시키고/시키거나 그 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특정 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 원위 인핸서 또는 억제 유전자 요소를 포함할 수 있고, 이는 전사 개시 부위에서 수천 개 염기쌍만큼 떨어져 배치될 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 원천에서 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 발현이 일어나는 발생 단계에 대해, 또는 외부 자극, 예를 들어, 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제에 반응하여 항상적으로 또는 차별적으로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표예에는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동유전자-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 조기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 조기 프로모터 또는 SV 40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터가 포함된다.

"신호 펩타이드" 및 "리더 서열"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되며, 본 명세서 나타낸 단백질의 아미노 말단에 연결될 수 있는 아미노산 서열을 나타낸다. 신호 펩타이드/리더 서열은 전형적으로 단백질의 위치선정을 지시한다. 본 명세서에서 이용된 신호 펩타이드/리더 서열은 바람직하게는 이것이 생산되는 세포로부터 단백질의 분비를 촉진한다. 신호 펩타이드/리더 서열은 종종 세포로부터의 분비 시, 종종 성숙 단백질로 불리는 단백질의 나머지로부터 절단된다. 신호 펩타이드/리더 서열은 단백질의 N 말단에 연결된다.

본 명세서에서 이용되는 "엄격한 혼성화 조건"은 제1 핵산 서열(예를 들어, 프로브)이 제2 핵산 서열(예를 들어, 표적)에, 예를 들어, 핵산의 복합 혼합물로 혼성화할 조건을 의미할 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점(T_m)보다 약 5 내지 10℃ 더 낮게 선택될 수 있다. T_m은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 시(표적 서열이 과량으로 존재하므로, T_m에서 프로브의 50%가 평형 시 점유됨) 표적 서열에 혼성화하는 온도(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에)일 수 있다. 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 예를 들어, pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도가 짧은 프로브(예컨대, 약 10 내지 50개 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예컨대, 약 50개 초과 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 60℃인 것들일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예를 들어, 폼아마이드의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건에는 하기가 포함된다: 50% 폼아마이드, 5×SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 항온처리하거나, 또는 5×SSC, 1% SDS, 65℃에서 항온처리하고, 65℃에서 0.2×SSC, 및 0.1% SDS 중에 세척.

본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되는 "대상체" 및 "환자"는 비제한적으로 포유류(예를 들어, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니아피그, 고양이, 개, 래트 및 마우스, 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 예를 들어, 게잡이 또는 붉은털 원숭이, 침팬지 등) 및 인간)를 포함하는 임의의 척추동물을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간일 수 있다. 대상체 또는 환자는 다른 형태의 치료를 거치고 있을 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "실질적으로 상보적인"은 제1 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 영역에 걸쳐 제2 서열의 상보체에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일함을, 또는 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화함을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "실질적으로 동일한"은 제1 서열이 제2 서열의 상보체에 실질적으로 상보적인 경우, 제1 및 제2 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 영역에 걸쳐 또는 핵산에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%임을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "합성 항체"는 본 명세서에서 기재된 재조합 핵산 서열에 의해 암호화되고 대상체에서 생성되는 항체를 나타낸다.

본 명세서에서 이용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 예방, 억제, 진압 또는 완전 제거 수단을 통한 대상체의 질환으로부터의 방어를 의미할 수 있다. 질환의 예방에는 질환의 개시 전에 대상체에 대한 본 발명의 백신 투여가 관여된다. 질환의 억제에는 질환의 유도 후 그러나 그 임상적 출현 전에 대상체에 대한 본 발명의 백신 투여가 관여된다. 질환의 진압에는 질환의 임상적 출현 후 대상체에 대한 본 발명의 백신 투여가 관여된다.

핵산에 대해 본 명세서에서 이용되는 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 일부의 상보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이들의 상보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 이들의 상보체, 또는 이들과 실질적으로 동일한 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.

펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성(예를 들어, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산을 이용한 아미노산 대체는 당해 분야에서 전형적으로 작은 변화가 관여되는 것으로 인식된다. 이러한 작은 변화는, 부분적으로 당해 분야에서 이해되는 바와 같이 아미노산의 수치 지수를 고려하여 확인될 수 있다[Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132(1982)]. 아미노산의 수치 지수는 그 소수성 및 전하의 고려에 기반한다. 유사한 수치 지수의 아미노산이 치환되고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있음이 당해 분야에 공지되어 있다. 하나의 측면에서, ±2의 수치 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 생성할 치환을 드러내기 위해 이용될 수 있다. 펩타이드의 맥락에서 아미노산의 친수성 고려는 항원성 및 면역원성과 잘 연관되는 것으로 보고된 유용한 척도인 해당 펩타이드의 가장 큰 국소 평균 친수성 계산을 허용한다(본 명세서 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제4,554,101호). 당해 분야에서 이해되는 바와 같은, 유사한 친수성값을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 펩타이드를 생성할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값은 모두 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 그 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 상용성인 아미노산 치환은 아미노산의 상대적 유사성, 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성으로 드러나는 바와 같은 이들 아미노산의 측쇄에 근거하는 것으로 이해된다.

변이체는 전체 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "벡터"는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다.

본 명세서에서 수치 범위의 언급에 있어서, 동일한 정도의 정밀도를 갖는 그 사이의 각각의 개입 숫자가 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위에 있어서, 숫자 7 및 8은 6 및 9에 부가하여 고려되며, 범위 6.0 내지 7.0에 있어서, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 및 7.0이 명시적으로 고려된다.

2. 조성물

본 발명은 일부, 포유동물 세포에서 단클론성 또는 이중특이적 항체를 형성시키기 위해 사용되는 신규한 서열의 생성을 기초로 한다. 일 실시형태에서, 서열은 박테리아, 효모뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함하는 DNA 또는 RNA 벡터에서 전달을 위한 것이다. 본 발명은 항체, 이의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우, 대상체에서 합성 항체의 생성을 일으킬 수 있다. 합성 항체는 대상체에 존재하는 표적 분자(즉, 항원)에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 항원을 중화시키거나, 다른 분자, 예를 들어 단백질 또는 핵산에 의한 항원의 인식을 차단하거나, 항원에 대한 면역 반응을 유발 또는 유도할 수 있다.

일 실시형태에서, 조성물은 합성 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 제1 합성 항체를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 합성 항체를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 분열 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일 실시형태에서, 핵산 분자는 항-PcrV 항체(DMAb-αPcrV)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPcrV를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 DMAb-αPcrV의 가변 VH 또는 VL 영역을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPcrV의 가변 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPcrV의 가변 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPcrV의 가변 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPcrV의 가변 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화한다.

일 실시형태에서, 항-PcrV 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2에 기술된 바와 같은 가변 VH 영역 및 서열번호 4에 기술된 바와 같은 가변 VL 영역을 암호화한다. 일 실시형태에서, 항-PcrV 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12에 기술된 바와 같은 가변 VH 영역 및 서열번호 16에 기술된 바와 같은 가변 VL 영역을 암호화한다. 일 실시형태에서, 항-PcrV 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 14로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화한다.

일 실시형태에서, DMAb-αPcrV의 가변 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 기술된 바와 같은 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPcrV의 가변 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3에 기술된 바와 같은 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPcrV의 가변 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11에 기술된 바와 같은 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPcrV의 가변 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 15에 기술된 바와 같은 서열을 포함한다.

일 실시형태에서, DMAb-αPcrV를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 기술된 바와 같은 가변 VH 서열, 및 서열번호 3에 기술된 바와 같은 가변 VL 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPcrV를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11에 기술된 바와 같은 가변 VH 서열, 및 서열번호 15에 기술된 바와 같은 가변 VL 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPcrV를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 13으로부터 선택된 서열을 포함한다.

일 실시형태에서, DMAb-αPcrV를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 리더 서열을 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다양한 실시형태에서, 리더 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16은 각각 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40 및 서열번호 41에 기술된 바와 같다.

일 실시형태에서, 핵산 분자는 항-Psl 항체(DMAb-αPsl)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPsl을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 DMAb-αPsl의 가변 VH 및 VL 영역을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPsl을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 DMAb-αPsl의 가변 VH 및 VL 영역을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPsl을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 20에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화한다. 일 실시형태에서, DMAb-αPsl을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19에 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일 실시형태에서, DMAb-αPsl을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 리더 서열을 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다양한 실시형태에서, 리더 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 19 및 서열번호 20은 각각 서열번호 44 및 서열번호 45에 기술된 바와 같다.

일 실시형태에서, 핵산 분자는 이중특이적 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 항-PcrV 및 항-Psl 이중특이적 항체(DMAb-BiSPA)이다. 일 실시형태에서, DMAb-BiSPA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 DMAb-BiSPA의 가변 VH 및 VL 영역을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, DMAb-BiSPA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 18 및 서열번호 22로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화한다. 일 실시형태에서, DMAb-BiSPA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 17 및 서열번호 21로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일 실시형태에서, 이중특이적 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 리더 서열을 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다양한 실시형태에서, 리더 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 21, 및 서열번호 22는 각각 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 46 및 서열번호 47에 기술되어 있다.

일 실시형태에서, 핵산 분자는 리보뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, RNA 분자는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39; 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, RNA 분자는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39; 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자로부터 생성된 전사체를 포함한다. 일 실시형태에서, RNA 분자는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38; 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 및 서열번호 46으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자로부터 생성된 전사체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 박테리아 활성과 관련된 임의의 질환, 장애, 또는 질환을 치료, 예방 및/또는 방어할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 박테리아 감염증을 치료, 예방 및/또는 방어할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 바이오필름 형성을 치료, 예방 및/또는 방어할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 슈도모나스 에루지노사 감염증을 치료, 예방 및/또는 방어할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 슈도모나스 에루지노사 바이오필름 형성을 치료, 예방 및/또는 방어할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 박테리아 감염증을 치료, 예방 및/또는 방어할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 패혈증을 치료, 예방 및/또는 방어할 수 있다.

항원의 결합에 의해 합성 항체는 조성물이 투여된 대상체에서 질환을 치료, 예방 및/또는 방어할 수 있다. 합성 항체는 조성물이 투여된 대상체에서 질환의 생존을 촉진시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 합성 항체는 합성 항체가 투여되지 않은 질환을 갖는 대상체의 기대 생존에 비해 대상체에서 질환의 증가된 생존을 제공할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 합성 항체는 조성물의 부재 하에서의 기대 생존에 비해 조성물이 투여된 대상체에서 질환의 생존의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 증가를 제공할 수 있다. 일 실시형태에서, 합성 항체는 합성 항체가 투여되지 않은 대상체의 기대 방어에 비해 대상체에서 질환에 대한 증가된 방어를 제공할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 합성 항체는 조성물의 부재 하에서의 기대 방어에 비해 조성물이 투여된 대상체에서 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로 질환을 방어할 수 있다.

조성물은 대상체에 대한 조성물 투여의 적어도 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 45시간, 50시간 또는 60시간 내에 대상체에서 합성 항체의 생성을 일으킬 수 있다. 조성물은 대상체에 대한 조성물 투여의 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 내에 대상체에서 합성 항체의 생성을 일으킬 수 있다. 조성물은 대상체에 대한 조성물 투여의 약 1시간 내지 약 6일, 약 1시간 내지 약 5일, 약 1시간 내지 약 4일, 약 1시간 내지 약 3일, 약 1시간 내지 약 2일, 약 1시간 내지 약 1일, 약 1시간 내지 약 72시간, 약 1시간 내지 약 60시간, 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 12시간 또는 약 1시간 내지 약 6시간 내에 대상체에서 합성 항체의 생성을 일으킬 수 있다.

조성물은, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우, 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 항원이 투여된 대상체에서 내인성 항체의 생성보다 더 신속하게 대상체에서 합성 항체의 생성을 일으킬 수 있다. 조성물은 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 항원이 투여된 대상체에서 내인성 항체 생성의 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 전에 합성 항체의 생성을 일으킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 조성물이 질환 또는 사망을 유도하지 않으므로 안전하고; 질환을 방어하며; 투여 용이성, 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 낮은 용량 별 비용을 제공하는 것과 같이 효과적인 조성물에 요구되는 특징을 가질 수 있다.

a. 이중특이적 항체

본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 조성물은 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열은 이중특이적 항체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 항체는 하기에 더욱 상세히 기술된다. 본 발명은 특히 유리한 성질, 예를 들어, 생산성, 안정성, 결합 친화력, 생물학적 활성, 특정 T 세포의 특이적 표적화, 표적화 효율 및 감소된 독성을 갖는, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위, 및 제2 표적에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 신규한 이중특이적 항체를 제공한다. 일부 경우에, 높은 친화력을 갖는 제1 표적에 및 낮은 친화력을 갖는 제2 표적에 결합하는, 이중특이적 항체가 존재한다. 다른 경우에, 낮은 친화력을 갖는 제1 표적에 및 높은 친화력을 갖는 제2 표적에 결합하는 이중특이적 항체가 존재한다. 다른 경우에, 요망되는 친화력을 갖는 제1 표적에 및 요망되는 친화력을 갖는 제2 표적에 결합하는 이중특이적 항체가 존재한다.

일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및 b) 제 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄를 포함하는 이가 항체이다.

본 발명에 따른 이중특이적 항체 분자는 임의의 요망되는 특이성의 2개의 결합 부위를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 부위 중 하나는 종양 관련 항원을 결합시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Fab 단편에 포함된 결합 부위는 종양 관련 표면 항원에 대해 특이적인 결합 부위이다. 일부 실시형태에서, 단쇄 Fv 단편에 포함된 결합 부위는 종양 관련 항원, 예를 들어, 종양 관련 표면 항원에 대해 특이적인 결합 부위이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "종양 관련 표면 항원"은 종양 세포 상에 또는 내에 위치된 표면 상에 나타나거나 나타날 수 있는 항원을 지칭한다. 이러한 항원은 세포외 부분을 갖는 세포 표면 상에 나타날 수 있으며, 이는 종종 분자의 막관통 및 세포질 부분과 결합된다. 이러한 항원은 일부 실시형태에서, 단지 종양 세포에 의해 존재할 수 있고, 정상, 즉, 비-종양 세포에 의해 나타날 수 있다. 종양 항원은 종양 세포 상에 배타적으로 발현될 수 있거나, 비-종양 세포와 비교하여 종양 특이적 돌연변이를 나타낼 수 있다. 이러한 일 실시형태에서, 개개 항원은 종양-특이적 항원으로서 지칭될 수 있다. 일부 항원은 종양 세포 및 비-종양 세포 둘 모두에 의해 나타나며, 이는 종양-관련 항원으로서 지칭될 수 있다. 이러한 종양-관련 항원은 비-종양 세포와 비교할 때 종양 세포 상에서 과발현될 수 있거나, 비-종양 조직과 비교하여 종양 조직의 덜 조밀한 구조로 인해 종양 세포에서 항체 결합을 위해 접근 가능하다. 일부 실시형태에서, 종양 관련 표면 항원은 종양의 혈관계 상에 위치된다.

종양 관련 표면 항원의 예시적인 예에는 CD10, CD19, CD20, CD22, CD33, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT-3, CD135), 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR), Her2neu, Her3, IGFR, CD133, IL3R, 섬유아세포 활성 단백질(FAP), CDCP1, Derlin1, 테나신, 프리즐드 1-10, 혈관 항원 VEGFR2(KDR/FLK1), VEGFR3(FLT4, CD309), PDGFR-알파(CD140a), PDGFR-베타(CD140b) 엔도글린, CLEC14, Tem1-8, 및 Tie2가 있다. 추가 예는 A33, CAMPATH-1(CDw52), 암배아 항원(CEA), 카보언하이드라제 IX(MN/CA IX), CD21, CD25, CD30, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Ep-CAM, 폴레이트-결합 단백질, G250, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT-3, CD135), c-Kit(CD117), CSF1R (CD115), HLA-DR, IGFR, IL-2 수용체, IL3R, MCSP(흑색종-관련 세포 표면 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), Muc-1, 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 항원(PSA), 및 TAG-72를 포함할 수 있다. 종양의 세포외 기질 상에서 발현되는 항원의 예에는 테나신 및 섬유아세포 활성 단백질(FAP)이 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 분자의 결합 부위 중 하나는 T-세포 특이적 수용체 분자 및/또는 자연 살해 세포(NK 세포) 특이적 수용체 분자를 결합할 수 있다. T-세포 특이적 수용체는 소위 "T-세포 수용체"(TCR)로서, 이는 T 세포를 결합시킬 수 있고, 추가 신호가 존재하는 경우에 항원-제시 세포 또는 APC로 불리는 다른 세포에 의해 나타나는 에피토프/항원에 의해 활성화되고 이에 반응할 수 있다. T 세포 수용체는 자연 발생 면역글로불린의 Fab 단편을 닮은 것으로 알려져 있다. 이는 일반적으로, 일가로서, 알파- 및 베타-사슬을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이는 감마-사슬 및 델타-사슬을 포함한다(상기 참조). 이에 따라, 일부 실시형태에서, TCR은 TCR(알파/베타)이며, 일부 실시형태에서, 이는 TCR(감마/델타)이다. T 세포 수용체는 CD3 T-세포 보조-수용체와 복합물을 형성한다. CD3은 단백질 복합물이고, 4개의 별개의 사슬로 구성된다. 포유동물에서, 복합물은 CD3감마 사슬, CD36 사슬, 및 2개의 CD3E 사슬을 함유한다. 이러한 사슬은 T 림프구에서 활성화 신호를 발생시키기 위해 T 세포 수용체(TCR)로 알려진 분자 및 제타-사슬과 결합한다. 이에 따라, 일부 실시형태에서, T-세포 특이적 수용체는 CD3 T-세포 보조-수용체이다. 일부 실시형태에서, T-세포 특이적 수용체는 또한 T 세포 상에 발현된 단백질인 CD28이다. CD28은 T 세포 활성화를 위해 요구되는, 보조-자극 신호를 제공할 수 있다. CD28은 T-세포 증식 및 생존, 사이토카인 생산, 및 T-헬퍼 타입-2 발달에서 중요한 역할을 한다. T-세포 특이적 수용체의 또 다른 예는 Ox40로도 불리는 CD134이다. CD134/OX40은 활성화 후 24 내지 72시간 후에 발현되고, 2차 보조자극 분자를 정의하기 위해 취해질 수 있다. T-세포 수용체의 다른 예는 항원 제시 세포(APC) 상에 4-1 BB-리간드에 결합할 수 있는 4-1 BB이며, 이에 의해 T 세포에 대한 보조자극 신호가 발생된다. 주로 T-세포 상에서 발견된 수용체의 다른 예는 CD5이며, 이는 또한, B 세포 상에 낮은 수준으로 발견되었다. T 세포 기능을 변경시키는 수용체의 추가 예는 Fas 수용체로도 알려진 CD95이며, 이는 다른 세포의 표면 상에 발현된 Fas-리간드에 의해 아폽토시스성 신호전달을 매개한다. CD95는 잔류 T 림프구에서 TCR/CD3-유도 신호전달 경로를 조절하는 것으로 보고되었다.

NK 세포 특이적 수용체 분자의 예에는 CD16, 낮은 친화력 Fc 수용체 및 NKG2D가 있다. T 세포 및 자연 살해(NK) 세포 둘 모두의 표면 상에 존재하는 수용체 분자의 예는 CD2, 및 CD2-수퍼패밀리의 추가 구성원이다. CD2는 T 및 NK 세포 상의 보조-자극 분자로서 작용할 수 있다.

일부 실시형태에서, 항체 분자의 제1 결합 부위는 종양 관련 표면 항원을 결합하며, 제2 결합 부위는 T 세포 특이적 수용체 분자 및/또는 자연 살해(NK) 세포 특이적 수용체 분자를 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 분자의 제1 결합 부위는 A33, CAMPATH-1(CDw52), 암배아 항원(CEA), 카보언하이드라제 IX(MN/CA IX), CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, CDCP1, Her3, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), CLEC14, Derlin1, 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR), de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, 엔도글린, Ep-CAM, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 폴레이트-결합 단백질, G250, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT-3, CD135), c-Kit(CD117), CSF1R(CD115), 프리즐드 1-10, Her2/neu, HLA-DR, IGFR, IL-2 수용체, IL3R, MCSP(흑색종-관련 세포 표면 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), Muc-1, 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 항원(PSA), TAG-72, 테나신, Tem1-8, Tie2 및 VEGFR2(KDR/FLK1), VEGFR3(FLT4, CD309), PDGFR-알파(CD140a), PDGFR-베타(CD140b) 중 하나와 결합하며, 제2 결합 부위는 T 세포 특이적 수용체 분자 및/또는 자연 살해(NK) 세포 특이적 수용체 분자와 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 분자의 제1 결합 부위는 종양 관련 표면 항원과 결합하며, 제2 결합 부위는 CD3, T 세포 수용체(TCR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 및 CD95 중 하나와 결합한다.

일부 실시형태에서, 항체 분자의 제1 결합 부위는 T 세포 특이적 수용체 분자 및/또는 자연 살해(NK) 세포 특이적 수용체 분자와 결합하며, 제2 결합 부위는 종양 관련 표면 항원과 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체의 제1 결합 부위는 T 세포 특이적 수용체 분자 및/또는 자연 살해(NK) 세포 특이적 수용체 분자와 결합하며, 제2 결합 부위는 A33, CAMPATH-1(CDw52), 암배아 항원(CEA), 카보언하이드라제 IX(MN/CA IX), CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, CDCP1, Her3, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), CLEC14, Derlin1, 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR), de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, 엔도글린, Ep-CAM, 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 폴레이트-결합 단백질, G250, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT-3, CD135), 프리즐드 1-10, Her2/neu, HLA-DR, IGFR, IL-2 수용체, IL3R, MCSP(흑색종-관련 세포 표면 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), Muc-1, 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 전립선 특이적 항원(PSA), TAG-72, 테나신, Tem1-8, Tie2 및 VEGFR 중 하나와 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체의 제1 결합 부위는 CD3, T 세포 수용체(TCR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 및 CD95 중 하나와 결합하며, 제2 결합 부위는 종양 관련 표면 항원과 결합한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 다른 것들 중에서, CD19 및 CD3, HER3 및 EGFR, TNF 및 IL-17, IL-1α 및 IL1β, IL-4 및 IL-13, HER2 및 HER3, GP100 및 CD3, ANG2 및 VEGFA, CD19 및 CD32B, TNF 및 IL17A, IL-17A 및 IL17E, CD30 및 CD16A, CD19 및 CD3, CEA 및 CD3, HER2 및 CD3, CD123 및 CD3, GPA33 및 CD3, EGRF 및 CD3, PSMA 및 CD3, CD28 및 NG2, CD28 및 CD20, EpCAM 및 CD3 또는 MET 및 EGFR을 표적화한다.

b. 재조합 핵산 서열

전술한 바와 같이, 조성물은 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열은 항체, 이의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 항체는 하기에서 보다 상세히 기재된다.

재조합 핵산 서열은 이종성 핵산 서열일 수 있다. 재조합 핵산 서열에는 적어도 하나의 이종성 핵산 서열 또는 하나 이상의 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다.

재조합 핵산 서열은 최적화된 핵산 서열일 수 있다. 이러한 최적화는 항체의 면역원성을 증가시키거나 변경할 수 있다. 최적화는 또한 전사 및/또는 번역을 개선할 수 있다. 최적화에는 하기 중 하나 이상이 포함될 수 있다: 전사를 증가시키기 위한 낮은 GC 함량의 리더 서열; mRNA 안정성 및 코돈 최적화; 증가된 번역을 위한 코작 서열(예를 들어, GCC ACC)의 부가; 신호 펩타이드를 암호화하는 면역글로불린(Ig) 리더 서열의 부가; 및 시스-작용 서열 모티프(즉 내부 TATA 박스)가 작용 가능한 범위까지의 제거.

c. 재조합 핵산 서열 작제물

재조합 핵산 서열에는 하나 이상의 재조합 핵산 서열 작제물이 포함될 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 성분이 포함될 수 있고, 이는 하기에서 보다 상세히 기재된다.

재조합 핵산 서열 작제물에는 중쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물에는 경쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물에는 또한 프로테아제 또는 펩티다제 절단 부위를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물은 또한 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site: IRES)를 암호화하는 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있다. IRES는 바이러스성 IRES 또는 진핵성 IRES일 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 리더 서열을 포함할 수 있으며, 여기서, 각 리더 서열은 신호 펩타이드를 암호화한다.

일 실시형태에서, 신호 펩타이드는 MDWTWRILFLVAAATGTHA(서열번호 24)의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 신호 펩타이드는 MVLQTQVFISLLLWISGAYG(서열번호 25)의 아미노산 서열을 포함한다. 신호 펩타이드를 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 항체를 암호화하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 26 내지 서열번호 47에 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 인트론, 하나 이상의 전사 종결 영역, 하나 이상의 개시 코돈, 하나 이상의 종결 또는 정지 코돈, 및/또는 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물은 또한, 하나 이상의 링커 또는 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열은 헤마글루티닌(HA) 태그를 암호화할 수 있다.

(1) 중쇄 폴리펩타이드

재조합 핵산 서열 작제물에는 중쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화하는 이종성 핵산이 포함될 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드에는 가변 중쇄(VH) 영역 및/또는 적어도 하나의 불변 중쇄(CH) 영역이 포함될 수 있다. 적어도 하나의 불변 중쇄 영역에는 불변 중쇄 영역 1(CH1), 불변 중쇄 영역 2(CH2), 및 불변 중쇄 영역 3(CH3), 및/또는 힌지 영역이 포함될 수 있다.

일부 실시형태에서, 중쇄 폴리펩타이드에는 VH 영역 및 CH1 영역이 포함될 수 있다. 다른 실시형태에서, 중쇄 폴리펩타이드에는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역이 포함될 수 있다.

중쇄 폴리펩타이드에는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: "CDR") 세트가 포함될 수 있다. CDR 세트는 VH 영역의 세 고가변 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드의 N-말단에서 시작하여, 이들 CDR은 각각 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"으로 표시된다. 중쇄 폴리펩타이드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 항원의 결합 또는 인식에 기여할 수 있다.

(2) 경쇄 폴리펩타이드

재조합 핵산 서열 작제물에는 경쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 경쇄 폴리펩타이드에는 가변 경쇄(VL) 영역 및/또는 불변 경쇄(CL) 영역이 포함될 수 있다.

경쇄 폴리펩타이드에는 상보성 결정 영역("CDR") 세트가 포함될 수 있다. CDR 세트는 VL 영역의 세 고가변 영역을 함유할 수 있다. 경쇄 폴리펩타이드의 N-말단에서 시작하여, 이들 CDR은 각각 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"으로 표시된다. 경쇄 폴리펩타이드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 항원의 결합 또는 인식에 기여할 수 있다.

(3) 프로테아제 절단 부위

재조합 핵산 서열 작제물에는 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 프로테아제 또는 펩티다제에 의해 인식될 수 있다. 프로테아제는 엔도펩티다제 또는 엔도 프로테아제, 예를 들어 비제한적으로 퓨린, 엘라스타제, HtrA, 칼파인, 트립신, 키모트립신, 트립신, 및 펩신일 수 있다. 프로테아제는 퓨린일 수 있다. 다른 실시형태에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 또는 내부 펩타이드 결합을 절단하는(즉, N-말단 또는 C-말단 펩타이드 결합을 절단하지 않는) 임의의 프로테아제일 수 있다.

프로테아제 절단 부위에는 절단 효율을 촉진시키거나 증가시키는 하나 이상의 아미노산 서열이 포함될 수 있다. 하나 이상의 아미노산 서열은 별도의 폴리펩타이드를 형성 또는 생성하는 효율을 촉진하거나 증가시킬 수 있다. 하나 이상의 아미노산 서열에는 2A 펩타이드 서열이 포함될 수 있다.

(4) 링커 서열

재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 링커 서열이 포함될 수 있다. 링커 서열은 본 명세서 기재된 하나 이상의 성분을 공간적으로 분리하거나 연결할 수 있다. 다른 실시형태에서, 링커 서열은 두 개 이상의 폴리펩타이드를 공간적으로 분리하거나 연결하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.

(5) 프로모터

재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 프로모터가 포함될 수 있다. 하나 이상의 프로모터는 유전자 발현을 유도하고 유전자 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 DNA 의존적 RNA 폴리머라제를 통해 전사에 필요한 시스-작용 서열 요소이다. 유전자 발현을 지시하기 위해 이용된 프로모터의 선택은 구체적 용도에 의존한다. 프로모터는 이것이 그 천연 설정에서 전사 개시 부위로부터 유래됨으로, 재조합 핵산 서열 작제물에서 전사 개시로부터 대략 동일한 거리에 배치될 수 있다. 그러나 상기 거리의 변동이 프로모터의 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

프로모터는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 진핵 세포에서 발현에 효과적으로 나타난 프로모터일 수 있다. 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 CMV 프로모터, 원숭이 바이러스 40(SV40)에서 유래된 프로모터, 예를 들어, SV40 조기 프로모터 및 SV40 후기 프로모터, 마우스 유방암 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 예를 들어, 소 면역결핍 바이러스(BIV) 긴 말단 반복서열(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 조류 백혈증 바이러스(ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예를 들어, CMV 최조기 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터, 또는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 유전자, 예를 들어, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 인간 폴리헤드린, 또는 인간 메탈로티오나인에서 유래된 프로모터일 수 있다.

프로모터는 구성적 프로모터 또는 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도 가능한 프로모터일 수 있다. 다세포 개체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다. 프로모터는 또한 천연 또는 합성의 조직 특이적 프로모터, 예를 들어, 근육 또는 피부 특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 미국 특허출원 공개 번호 US20040175727호에 기재되며, 그 내용은 전문이 본 명세서 포함된다.

프로모터는 인핸서와 연관될 수 있다. 인핸서는 코딩 서열의 업스트림에 배치될 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 바이러스 인핸서, 예를 들어, CMV, FMDV, RSV 또는 EBV 유래의 인핸서일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 기능 증강은 미국 특허 제5,593,972호, 제5,962,428호, 및 WO94/016737호에 기재되며, 각각의 내용은 전체가 참고로 포함된다.

(6) 인트론

재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 인트론이 포함될 수 있다. 각각의 인트론에는 기능적 스플라이스 공여체 및 수신체 부위가 포함될 수 있다. 인트론에는 스플라이싱 인핸서가 포함될 수 있다. 인트론에는 효율적인 스플라이싱을 위해 필요한 하나 이상의 신호가 포함될 수 있다.

(7) 전사 종결 영역

재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 전사 종결 영역이 포함될 수 있다. 전사 종결 영역은 효율적인 종결을 제공하기 위해 코딩 서열의 다운스트림일 수 있다. 전사 종결 영역은 전술한 프로모터와 동일한 유전자에서 수득될 수도 있고, 또는 하나 이상의 상이한 유전자에서 수득될 수도 있다.

(8) 개시 코돈

재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 개시 코돈이 포함될 수 있다. 개시 코돈은 코딩 서열의 업스트림에 배치될 수 있다. 개시 코돈은 코딩 서열과 같은 틀에 있을 수 있다. 개시 코돈은 효율적인 번역 개시를 위해 필요한 하나 이상의 신호, 예를 들어 비제한적으로 리보솜 결합 부위에 연합될 수 있다.

(9) 종결 코돈

재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 종결 또는 정지 코돈이 포함될 수 있다. 종결 코돈은 코딩 서열의 다운스트림일 수 있다. 종결 코돈은 코딩 서열과 같은 틀에 있을 수 있다. 종결 코돈은 효율적인 번역 종결을 위해 필요한 하나 이상의 신호에 연합될 수 있다.

(10) 폴리아데닐화 신호

재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다. 폴리아데닐화 신호에는 전사체의 효율적인 폴리아데닐화를 위해 필요한 하나 이상의 신호가 포함될 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 코딩 서열의 다운스트림에 배치될 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 신호, 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 플라스미드(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)로부터의 폴리아데닐화 신호일 수 있다.

(11) 리더 서열

재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 리더 서열이 포함될 수 있다. 리더 서열은 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린(Ig) 신호 펩타이드, 예를 들어 비제한적으로 IgG 신호 펩타이드 및 IgE 신호 펩타이드일 수 있다.

d. 재조합 핵산 서열 작제물의 배열

전술한 바와 같이, 재조합 핵산 서열에는 하나 이상의 재조합 핵산 서열 작제물이 포함될 수 있으며, 여기서 각각의 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 성분이 포함될 수 있다. 하나 이상의 성분이 상기에 상세히 기재된다. 재조합 핵산 서열 작제물에 포함되는 경우, 하나 이상의 성분은 서로에 대해 임의의 순서로 배열될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 성분은 아래 기재된 바와 같이 재조합 핵산 서열 작제물에 배열될 수 있다.

(1) 배열 1

하나의 배열에서, 제1 재조합 핵산 서열 작제물에는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있고, 제2 재조합 핵산 서열 작제물에는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다.

제1 재조합 핵산 서열 작제물은 벡터에 배치될 수 있다. 제2 재조합 핵산 서열 작제물은 제2 또는 별도의 벡터에 배치될 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물의 벡터 내로의 배치는 하기에서 보다 상세히 기재된다.

제1 재조합 핵산 서열 작제물에는 또한 프로모터, 인트론, 전사 종결 영역, 개시 코돈, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다. 제1 재조합 핵산 서열 작제물에는 추가로 리더 서열이 포함될 수 있고, 여기서 리더 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림(또는 5')에 배치된다. 따라서 리더 서열에 의해 암호화된 신호 펩타이드는 중쇄 폴리펩타이드에 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다.

제2 재조합 핵산 서열 작제물에는 또한 프로모터, 개시 코돈, 종결 코돈, 및 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다. 제2 재조합 핵산 서열 작제물에는 추가로 리더 서열이 포함될 수 있고, 여기서 리더 서열은 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림(또는 5')에 배치된다. 따라서 리더 서열에 의해 암호화된 신호 펩타이드는 경쇄 폴리펩타이드에 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다.

따라서 배열 1의 하나의 예에는 VH 및 CH1이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 벡터(및 이에 따른 제1 재조합 핵산 서열 작제물), 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터(및 이에 따른 제2 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있다. 배열 1의 제2 예에는 VH, CH1, 힌지 영역, CH2, 및 CH3이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 벡터(및 이에 따른 제1 재조합 핵산 서열 작제물), 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터(및 이에 따른 제2 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있다.

(2) 배열 2

제2 배열에서, 재조합 핵산 서열 작제물에는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림(또는 5')에 배치될 수 있다. 대안적으로, 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림(또는 5')에 배치될 수 있다.

재조합 핵산 서열 작제물은 하기에서 보다 상세히 기재된 바와 같이 벡터에 배치될 수 있다.

재조합 핵산 서열 작제물에는 프로테아제 절단 부위 및/또는 링커 서열을 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물에 포함되는 경우, 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치될 수 있다. 따라서 프로테아제 절단 부위는 발현 시 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드의 다른 폴리펩타이드로의 분리를 허용한다. 다른 실시형태에서, 링커 서열이 재조합 핵산 서열 작제물에 포함되는 경우, 링커 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치될 수 있다.

재조합 핵산 서열 작제물에는 또한 프로모터, 인트론, 전사 종결 영역, 개시 코돈, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 프로모터가 포함될 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나의 프로모터가 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열에 연관될 수 있고 제2 프로모터가 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열에 연관될 수 있도록 두 프로모터가 포함될 수 있다. 다른 실시형태에서, 재조합 핵산 서열 작제물에는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열에 연관된 하나의 프로모터가 포함될 수 있다.

재조합 핵산 서열 작제물에는 2개의 리더 서열이 추가로 포함될 수 있고, 여기서 제1 리더 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림(또는 5')에 배치되고 제2 리더 서열은 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림(또는 5')에 배치된다. 따라서 제1 리더 서열에 의해 암호화된 제1 신호 펩타이드가 중쇄 폴리펩타이드에 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있고, 제2 리더 서열에 의해 암호화된 제2 신호 펩타이드가 경쇄 폴리펩타이드에 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다.

따라서 배열 2의 하나의 예에는 VH 및 CH1이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터(및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있고, 여기서 링커 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치된다.

배열 2의 제2 예에는 VH 및 CH1이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터(및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있고, 여기서 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치된다.

배열 2의 제3 예에는 VH, CH1, 힌지 영역, CH2, 및 CH3이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터(및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있고, 여기서 링커 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치된다.

배열 2의 제4 예에는 VH, CH1, 힌지 영역, CH2, 및 CH3이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터(및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있고, 여기서 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치된다.

e. 재조합 핵산 서열 작제물로부터의 발현

전술한 바와 같이, 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 성분 가운데, 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 따라서 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있다.

전술한 바와 같은 배열 1이 이용되는 경우, 제1 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있고, 제2 재조합 핵산 서열 작제물은 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있다. 전술한 바와 같은 배열 2가 이용되는 경우, 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있다.

예를 들어, 비제한적으로 세포, 개체 또는 포유류에서의 발현 시, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 합성 항체로 조립될 수 있다. 특히, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 조립으로 항원에 결합할 수 있는 합성 항체가 생성되도록 서로 상호작용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 조립으로 본 명세서 기재된 바와 같이 조립되지 않은 항체에 비해 더 면역원성이 높은 합성 항체를 생성하도록 서로 상호작용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 조립으로 항원에 대해 면역 반응을 야기하거나 유도할 수 있는 합성 항체를 생성하도록 서로 상호작용할 수 있다.

재조합 핵산 서열 작제물은 리더 서열을 암호화하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 리더 서열은 코딩 서열의 5'일 수 있다. 일 실시형태에서, N-말단 리더는 서열번호 24 및 서열번호 25로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 리더 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 예시적인 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 26 내지 서열번호 47에 기술되어 있다.

f. 벡터

전술한 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 벡터에 배치될 수 있다. 하나 이상의 벡터는 복제 기원을 함유할 수 있다. 하나 이상의 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 하나 이상의 벡터는 자가 복제 염색체외 벡터, 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다.

벡터는 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 임의의 형태의 재조합 "네이키드 DNA" 벡터, 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. "벡터"는 세포를 감염, 형질주입, 일시적으로 또는 영구적으로 형질도입할 수 있는 핵산을 포함한다. 벡터가 네이키드 핵산, 또는 단백질 또는 지질과 복합화된 핵산일 수 있다는 것이 인지될 것이다. 벡터는 선택적으로, 바이러스 또는 박테리아 핵산 및/또는 단백질, 및/또는 막(예를 들어, 세포막, 바이러스 지질 엔벨로프, 등)을 포함한다. 벡터는 레플리콘(예를 들어, RNA 레플리콘, 박테리오파지)를 포함하지만, 이로 제한되지 않으며, 여기에 DNA의 단편이 부착되고 복제될 수 있다. 이에 따라, 벡터는 RNA, 자율 자가-복제 원형 또는 선형 DNA 또는 RNA(예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 등, 미국 특허 제5,217,879호 참조)를 포함하지만, 이로 제한되지 않고, 발현 및 비-발현 플라스미드 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 선형 DNA, 효소 DNA 또는 합성 DNA를 포함한다. 재조합 미생물 또는 세포 배양물이 "발현 벡터"를 숙주화하는 것으로 기술되는 경우에, 이는 염색체외 원형 및 선형 DNA 및 숙주 염색체(들) 내에 도입된 DNA 둘 모두를 포함한다. 벡터가 숙주 세포에 의해 유지되는 경우에, 벡터는 자율 구조(autonomous structure)로서 유사분열 동안 세포에 의해 안정적으로 복제될 수 있거나 숙주 게놈 내에 도입된다.

하나 이상의 벡터는 이종성 발현 작제물일 수 있고, 이는 일반적으로 표적 세포 내로 특정 유전자를 도입하기 위해 이용되는 플라스미드이다. 일단 발현 벡터가 세포 내로 들어가면, 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화되는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드가 세포-전사 및 번역 기전 리보솜 복합체에 의해 생성된다. 하나 이상의 벡터는 다량의 안정한 메신저 RNA, 그리고 이에 따라 단백질을 발현할 수 있다.

(1) 발현 벡터

하나 이상의 벡터는 원형 플라스미드 또는 선행 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물을 포함하는 하나 이상의 벡터는 키메라일 수 있다, 즉 그 성분의 적어도 하나가 그 다른 성분의 적어도 하나에 대해 이종성이다.

(2) 플라스미드

하나 이상의 벡터는 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 재조합 핵산 서열 작제물로 세포를 형질주입하기 위해 유용할 수 있다. 플라스미드는 대상체 내로 재조합 핵산 서열 작제물을 도입하기 위해 유용할 수 있다. 플라스미드는 또한 조절 서열을 포함할 수 있고, 이는 플라스미드가 투여되는 세포에서 유전자 발현에 매우 적합할 수 있다.

플라스미드는 또한 염색체외로 플라스미드를 유지하고 세포에서 복수의 플라스미드 사본을 생산하기 위해 포유류 복제 기원을 포함할 수 있다. 플라스미드는 Invitrogen(캘리포니아주 샌디에이고 소재)의 pVAX, pCEP4 또는 pREP4일 수 있고, 이는 엡스타인 바 바이러스 복제 기원 및 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 포함할 수 있고, 이는 통합 없이 고사본 에피솜 복제를 생산할 수 있다. 플라스미드 골격은 pAV0242일 수 있다. 플라스미드는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5(Ad5) 플라스미드일 수 있다.

플라스미드는 pSE420(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)일 수 있고, 이는 대장균(E.coli)에서 단백질 생산을 위해 이용될 수 있다. 플라스미드는 또한 pYES2(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)일 수 있으며, 이는 효모의 사카로마이세스 세레비시애 균주에서 단백질 생산을 위해 이용될 수 있다. 플라스미드는 또한 MAXBAC™ 완전 배큘로바이러스 발현 시스템(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)일 수 있고, 이는 곤충 세포에서 단백질 생산을 위해 이용될 수 있다. 플라스미드는 또한 pcDNAI 또는 pcDNA3(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)일 수 있고, 이는 포유류 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 단백질 생산을 위해 이용될 수 있다.

(3) RNA 벡터

일 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 항체를 암호화하는 RNA 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, RNA 분자는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39; 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, RNA 분자는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39; 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자로부터 발생된 전사체를 포함한다. 일 실시형태에서, RNA 분자는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38; 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 및 서열번호 46으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자로부터 발생된 전사체를 포함한다. 이에 따라, 일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항체를 암호화하는 RNA 분자를 제공한다. RNA는 펄스-가닥일 수 있다. 이에 따라, 일부 실시형태에서, RNA 분자는 임의의 개재 복제 단계, 예를 들어, 역전사를 필요로 하지 않으면서 세포에 의해 번역될 수 있다. 본 발명에서 유용한 RNA 분자는 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아노신)을 가질 수 있다. 이러한 캡은 RNA의 생체내 번역을 향상시킬 수 있다. 본 발명에서 유용한 RNA 분자의 5' 뉴클레오타이드는 5' 트리포스페이트 기를 가질 수 있다. 캡핑된 RNA에서, 이러한 것은 5'-대-5' 브릿지를 통해 7-메틸구아노신에 연결될 수 있다. RNA 분자는 3' 폴리-A 테일을 가질 수 있다. 이는 또한, 이의 3' 단부 부근에 폴리-A 폴리머라제 인지 서열(예를 들어, AAUAAA)을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 RNA 분자는 단일-가닥일 수 있다.

(4) 원형 및 선형 벡터

하나 이상의 벡터는 원형 플라스미드일 수 있고, 이는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체외(예를 들어, 복제 기원이 있는 자가 복제 플라스미드)로 존재할 수 있다. 벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.

또한 선형 핵산, 또는 선형 발현 카세트("LEC")가 본 명세서 제공되며, 이는 전기천공을 통해 대상체에 효율적으로 전달되고 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. LEC는 임의의 인산염 골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 인산염 골격을 함유하지 않을 수 있다. LEC는 원하는 유전자 발현에 관련되지 않은 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수 있다.

LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드에서 유래될 수 있다. 플라스미드는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 플라스미드는 pNP(Puerto Rico/34) 또는 pM2(New Caledonia/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.

LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 각각 pNP(Puerto Rico/34) 및 pM2(New Caledonia/99)에서 유래될 수 있다.

(5) 바이러스 벡터

일 실시형태에서, 세포에 본 발명의 핵산을 전달할 수 있는 바이러스 벡터가 본 명세서 제공된다. 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001), 및 Ausubel et al. (1997)]에 그리고 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 복제 기능의 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유한다(예를 들어, WO 01/96584호; WO 01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호). 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예를 들어 인간 세포에 유전자를 삽입하기 위한 가장 널리 사용된 방법이 된다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스, 등으로부터 유도될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호 참조).

(6) 벡터의 제조방법

재조합 핵산 서열 작제물이 배치된 하나 이상의 벡터의 제조 방법이 본 명세서 제공된다. 최종 서브클로닝 단계 후, 벡터는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 대규모 발효 탱크에서 세포 배양에 접종하기 위해 이용될 수 있다.

다른 실시형태에서, 최종 서브클로닝 단계 후, 벡터는 하나 이상의 전기천공(EP) 장치와 함께 이용될 수 있다. EP 장치는 하기에서 보다 상세히 기재된다.

하나 이상의 벡터는 공지된 장치 및 기법의 조합을 이용하여 제형화되거나 제조될 수 있지만, 바람직하게는 2007년 5월 23일자로 출원된, 라이센스 받고 공동 계류중인 미국 가출원 제60/939,792호에 기재된 플라스미드 제조 기법을 이용하여 제조된다. 일부 예에서, 본 명세서 기재된 DNA 플라스미드는 10 mg/mL 이상의 농도로 제형화될 수 있다. 제조 기법에는 또한 미국 출원 제60/939792호에 기재된 것에 더하여, 2007년 7월 3일자로 허여된 라이센스 받은 특허, 미국 특허 제7,238,522호에 기재된 것들을 포함하는 당업자에게 일반적으로 공지된 다양한 장치 및 프로토콜이 포함되거나 도입된다. 상기 인용된 출원 및 특허인, 미국 출원 제60/939,792호 및 미국 특허 제7,238,522호는 각각 이들의 전문이 본 명세서 포함된다.

3. 항체

전술한 바와 같이, 재조합 핵산 서열은 항체, 이의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 항체는 항원에 결합하거나 이와 반응할 수 있고, 이는 하기에서 보다 상세히 기재된다.

항체는 CDR에 대한 지지를 제공하고 서로에 대해 CDR의 공간적 관계를 정의하는 중쇄 및 경쇄 틀("FR") 세트 사이에 각각 배치된 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 세 고가변 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에서 시작하여, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 표시된다. 따라서 항원-결합 부위에는 중쇄 또는 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR이 포함될 수 있다.

단백분해 효소 파파인은 우선적으로 IgG 분자를 절단하여 몇몇 단편을 생성하며, 그 중 둘(F(ab) 단편)은 각각 온전한 항원-결합 부위가 포함되는 공유 이종이량체를 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 절단하여 F(ab')₂ 단편을 포함하는 몇몇 단편을 제공할 수 있고, 이는 두 항원-결합 부위를 모두 포함한다. 따라서 항체는 Fab 또는 F(ab')₂일 수 있다. Fab에는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. Fab의 중쇄 폴리펩타이드에는 VH 영역 및 CH1 영역이 포함될 수 있다. Fab의 경쇄에는 VL 영역 및 CL 영역이 포함될 수 있다.

항체는 면역글로불린(Ig)일 수 있다. Ig는, 예를 들어 IgA, IgM, IgD, IgE, 및 IgG일 수 있다. 면역글로불린에는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 폴리펩타이드에는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역이 포함될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄 폴리펩타이드에는 VL 영역 및 CL 영역이 포함될 수 있다.

항체는 다클론성 또는 단클론성 항체일 수 있다. 항체는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 친화도 성숙된 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 인간화된 항체는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 틀 영역을 갖고 원하는 항원에 결합하는 비인간 종으로부터의 항체일 수 있다.

항체는 하기에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같은 이중특이적 항체일 수 있다. 항체는 또한 하기에 더욱 상세히 기술되는 바와 같은 이중기능성 항체일 수 있다.

전술한 바와 같이, 항체는 대상체에 조성물의 투여 시에 대상체에서 생성될 수 있다. 항체는 대상체 내에 반감기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 대상체 내에서 이의 반감기를 연장하거나 단축시키기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 하기에서 더욱 상세히 기술된다.

항체는 하기에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이 탈푸코실화될 수 있다.

항체는 하기에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이 항원과 관련된 질환의 항체-의존 향상(ADE)을 감소 또는 예방하기 위해 변형될 수 있다.

a. 이중특이적 항체

재조합 핵산 서열은 이중특이적 항체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 이중특이적 항체는 2개의 항원, 예를 들어, 하기에서 더욱 상세히 기술되는 항원들 중 2개와 결합 또는 반응할 수 있다. 이중특이적 항체는 본 명세서 기술된 항체 중 2개의 단편으로 이루어질 수 있으며, 이에 의해, 이중 특이적 항체를 2개의 요망되는 표적 분자와 결합 또는 반응시킬 수 있으며, 이는 하기에서 더욱 상세히 기술되는 항원, 수용체를 위한 리간드를 포함하는 리간드, 수용체 상의 리간드-결합 부위를 포함하는 수용체, 리간드-수용체 복합물, 및 마커를 포함할 수 있다.

b. 이중기능성 항체

재조합 핵산 서열은 이중기능성 항체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 이중기능성 항체는 하기에 기술된 항체와 결합 또는 반응할 수 있다. 이중기능성 항체는 또한, 항원의 인식 및 항원에 대한 결합을 넘어서 항체에 대한 추가적인 기능성을 부여하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 인자 H 또는 이의 단편에 대한 커플링을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 인자 H는 보체 활성화의 가용성 조절제이고, 이에 따라, 보체-매개 용해(CML)를 통해 면역 반응에 기여할 수 있다.

c. 항체 반감기의 연장

위에서 기술된 바와 같이, 항체는 대상체에서 항체의 반감기를 연장하거나 단축시키기 위해 변형될 수 있다. 변형은 대상체의 혈청에서 항체의 반감기를 연장하거나 단축시킬 수 있다.

변형은 항체의 불변 영역에 존재할 수 있다. 변형은 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하지 않는 항체의 반감기와 비교하여 항체의 반감기를 연장하는 항체의 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환일 수 있다. 변형은 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하지 않는 항체의 반감기와 비교하여 항체의 반감기를 연장하는 항체의 CH2 도메인에서의 하나 이상의 아미노산 치환일 수 있다.

일부 실시형태에서, 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 불변 영역에서의 메티오닌 잔부를 티로신 잔부로, 불변 영역에서의 세린 잔부를 트레오닌 잔부로, 불변 영역에서의 트레오닌 잔부를 글루타메이트 잔부로, 또는 이들의 임의의 조합으로 대체하는 것을 포함할 수 있으며, 이에 의해 항체의 반감기를 연장할 수 있다.

다른 실시형태에서, 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 CH2 도메인에서의 메티오닌을 티로신 잔부로, CH2 도메인에서의 세린 잔부를 트레오닌 잔부로, CH2 도메인에서의 트레오닌 잔부를 글루타메이트 잔부로, 또는 이들의 임의의 조합으로 대체하는 것을 포함할 수 있으며, 이에 의해, 항체의 반감기를 연장할 수 있다.

d. 탈푸코실화

재조합 핵산 서열은 푸코실화되지 않은 항체(즉, 탈푸코실화 항체 또는 비-푸코실화 항체), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 푸코실화는 분자에 당 푸코스의 첨가, 예를 들어, N-글리칸, O-글리칸 및 인지질에 푸코스의 부착을 포함한다. 이에 따라, 탈푸코실화된 항체에서, 푸코스는 불변 영역의 탄수화물 사슬에 부착되지 않는다. 또한, 이러한 푸코실화의 결여는 푸코실화된 항체와 비교하여 항체에 의해 FcγRIIIa 결합 및 항체 지향 세포 독성(ADCC) 활성을 개선시킬 수 있다. 이에 따라, 비-푸코실화된 항체는 푸코실화된 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성을 나타낼 수 있다.

항체는 항체의 푸코실화를 예방 또는 억제하기 위해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형된 항체는 비변형된 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성을 나타낼 수 있다. 변형은 중쇄, 경쇄, 또는 이들의 조합에서 이루어질 수 있다. 변형은 중쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 경쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 또는 이들의 조합일 수 있다.

e. 감소된 ADE 반응

항체는 항원과 관련된 질환의 항체-의존 향상(ADE)을 감소 또는 예방하기 위해 변형될 수 있지만, 여전히 항원을 중화시킨다.

일부 실시형태에서, 항체는 FcyR1a에 대한 항체의 결합을 감소 또는 예방하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하기 위해 변형될 수 있다. 하나 이상의 아미노산 치환은 항체의 불변 영역에 존재할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 치환은 항체의 불변 영역에서 류신 잔부를 알라닌 잔부로 대체하는 것을 포함할 수 있으며, 즉, 또한, 본 명세서에서 LA, LA 돌연변이 또는 LA 치환으로서 알려져 있다. 하나 이상의 아미노산 치환은 항체의 불변 영역에서, 2개의 류신 잔부를 각각 알라닌 잔부로 대체하는 것을 포함할 수 있고, 이는 또한, 본 명세서에서 LALA, LALA 돌연변이, 또는 LALA 치환으로서 알려져 있다. LALA 치환의 존재는 FcyR1a에 대한 결합으로부터 항체를 예방 또는 차단할 수 있으며, 이에 따라, 변형된 항체는 항원과 관련된 질환의 ADE를 향상 또는 야기시키지 않지만, 여전히 항원을 중화시킨다.

4. 항원

합성 항체는 항원 또는 이의 단편 또는 변이체에 대한 것이다. 항원은 핵산 서열, 아미노산 서열, 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이들의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩타이드, 이들의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩타이드, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 다당류는 핵산 암호화된 다당류일 수 있다.

항원은 박테리아로부터 유래할 수 있다. 항원은 박테리아 감염증과 관련이 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 항원은 박테리아 독성 인자일 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 합성 항체는 둘 이상의 항원을 표적화한다. 일 실시형태에서, 이중특이적 항체의 적어도 하나의 항원은 본 명세서 기술된 항원으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 둘 이상의 항원은 본 명세서 기술된 항원으로부터 선택된다.

a. 박테리아 항원

박테리아 항원은 바이러스 항원, 또는 이의 단편, 또는 이들의 변이체일 수 있다. 바이러스 항원은 하기 패밀리 중 하나로부터의 바이러스에서 유래될 수 있다: 아시도박테리아(Acidobacteria), 악티노박테리아(Actinobacteria), 아퀴피카에(Aquificae), 박테로이데데스(Bacteroidetes), 칼디세리카(Caldiserica), 클라미디애(Chlamydiae), 클로로비(Chlorobi), 클로로플렉시(Chloroflexi), 크리시오제네테스(Chrysiogenetes), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 데페리박테레스(Deferribacteres), 다이노코커스-써무스(Deinococcus-Thermus), 딕티오글로미(Dictyoglomi), 엘루시마이크로비아(Elusimicrobia), 파이브로박테레스(Fibrobacteres), 퍼미큐테스(Firmicutes), 푸소박테리아(Fusobacteria), 젬마티모나데테스(Gemmatimonadetes), 렌티스패래(Lentisphaerae), 니트로스피라(Nitrospira), 플랑크토마이세테스(Planctomycetes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로헤테스(Spirochaetes), 시네르기스테테스(Synergistetes), 테네리큐테스(Tenericutes), 써모데설포박테리아(Thermodesulfobacteria), 써모토개(Thermotogae) 및 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia).

박테리아는 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 박테리아는 호기성 박테리아 또는 혐기성 박테리아일 수 있다. 박테리아는 자력영양 박테리아 또는 종속영양 박테리아일 수 있다. 박테리아는 중온균, 중성친화균, 극한서식균, 호산균, 호염기균, 호열균, 한냉균, 호염균, 또는 호삼투균일 수 있다.

박테리아는 탄저병 박테리아, 항생제 내성 박테리아, 질환 유도 박테리아, 식중독 박테리아, 감염성 박테리아, 살모넬라 박테리아, 스타필로코커스 박테리아, 스트렙토코커스 박테리아, 또는 파상풍 박테리아일 수 있다. 박테리아는 미코박테리아, 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus(MRSA)), 또는 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)일 수 있다. 박테리아는 슈도모나스 에루지노사일 수 있다.

(a) 슈도모나스 에루지노사 항원

박테리아 항원은 슈도모나스 에루지노사 항원, 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. 슈도모나스 에루지노사 항원은 독성 인자로부터 유래할 수 있다. 슈도모나스 에루지노사와 관련된 독성 인자는 구조 성분, 효소 및 독소를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 슈도모나스 에루지노사 독성 인자는 엑소다당류, 부착소, 지질다당류, 피오시아닌, 엑소톡신 A, 엑소톡신 S, 시토톡신, 엘라스타제, 알칼리 프로타제, 포스포리파아제 C, 람노리피드, 및 박테리아 분비계의 성분 중 하나일 수 있다.

일 실시형태에서, 항원은 세포외 다당류(예를 들어, 알기네이트, Pel 및 Psl)이다. 일 실시형태에서, 항원은 다당류 합성 유전자좌(psl), 여기에 함유된 유전자(예를 들어, pslA, pslB, pslC, pslD, pslE, pslF, pslG, pslH, pslI, pslJ, pslK, pslL, pslM, pslN 및 pslO), 여기에서 암호화된 단백질 또는 효소(예를 들어, 글리코실 트랜스퍼라제, 포스포만노스 이성질화효소/GDP-D-만노스 피로포스포릴라제, 트랜스포터, 하이드롤라제, 폴리머라제, 아세틸라제, 데하이드로게나아제, 및 토포이성질화효소), 또는 이로부터 생성된 산물(예를 들어, Psl 엑소다당류, "Psl"로서 지칭됨) 중 하나이다.

일 실시형태에서, 항원은 박테리아 분비계의 구성성분이다. 분비계의 6개의 상이한 부류(타입 I 내지 타입 VI)는 박테리아에 기술되었으며, 이들 중 5개(타입 I, II, II, V 및 VI)는 슈도모나스 에루지노사를 포함하는, 그램 음성 박테리아에서 발견된다. 일 실시형태에서, 항원은 타입 I 분비계의 유전자(예를 들어, apr 또는 has 유전자) 또는 단백질(예를 들어, AprD, AprE, AprF, HasD, HasE, HasF 및 HasR) 또는 분비된 단백질(예를 들어, AprA, AprX 및 HasAp) 중 하나이다. 일 실시형태에서, 항원은 타입 II 분비계의 유전자(예를 들어, xcpA/pilD, xphA, xqhA, xcpP 내지 Q 및 xcpR 내지 Z) 또는 단백질(예를 들어, GspC 내지 M, GspAB, GspN, GspO, GspS, XcpT 내지 XcpX, FppA,) 또는 분비된 단백질(예를 들어, LasB, LasA, PlcH, PlcN, PlcB, CbpD, ToxA, PmpA, PrpL, LipA, LipC, PhoA, PsAP, LapA) 중 하나이다. 일 실시형태에서, 항원은 타입 III 분비계의 유전자(예를 들어, psc, pcr, pop 또는 exs 유전자) 또는 단백질(예를 들어, PscC, PscE 내지 PscF, PscJ, PscN, PscP, PscW, PopB, PopD, PcrH 및 PcrV) 또는 분비된 단백질(예를 들어, ExoS, ExoT, ExoU 및 ExoY) 중 하나이다. 일 실시형태에서, 항원은 타입 III 분비계의 조절제(예를 들어, ExsA 및 ExsC)이다. 일 실시형태에서, 항원은 타입 V 분비계의 유전자(예를 들어, estA) 또는 단백질(예를 들어, EstA, CupB3, CupB5 및 LepB) 또는 분비된 단백질(예를 들어, EstA, LepA 및 CupB5) 중 하나이다. 일 실시형태에서, 항원은 타입 VI 분비계의 유전자(예를 들어, HSI-I, HSI-II 및 HSI-III 유전자) 또는 단백질(예를 들어, Fha1, ClpV1, VgrG 단백질 또는 Hcp 단백질) 또는 분비된 단백질(예를 들어, Hcp1) 중 하나이다.

5. 조성물의 부형제 및 다른 성분

조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 기능적 분자, 예를 들어, 운반체, 담체, 또는 희석제일 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 형질주입 촉진제일 수 있고, 여기에는 표면 활성제, 예를 들어, 면역 자극 복합체(immune-stimulating complexe: ISCOMS), 프로인트 불완전 보강제, LPS 유사체, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체, 소포체, 예를 들어, 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질주입 촉진제가 포함될 수 있다.

형질주입 촉진제는 다중 음이온, 다중 양이온, 예를 들어, 폴리-L-글루타메이트(LGS), 또는 지질이다. 형질주입 촉진제는 폴리-L-글루타메이트이고, 폴리-L-글루타메이트는 6 mg/ml 미만의 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 형질주입 촉진제에는 또한 표면 활성제, 예를 들어, 면역-자극 복합체(ISCOMS), 프로인트 불완전 보강제, LPS 유사체, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 소포체, 예를 들어, 스쿠알렌 및 스쿠알렌이 포함될 수 있고, 히알루론산이 또한 조성물과 함께 투여되어 이용될 수 있다. 조성물에는 또한 형질주입 촉진제, 예를 들어, 지질, 리포좀, 예를 들어, 레시틴 리포좀 또는 당해 분야에 공지된 다른 리포좀, 예를 들어, DNA-리포좀 혼합물(예를 들어 WO9324640 참고), 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질주입 촉진제가 포함될 수 있다. 형질주입 촉진제는 다중 음이온, 다중 양이온, 예를 들어, 폴리-L-글루타메이트(LGS), 또는 지질이다. 백신 중 형질주입 제제의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만, 또는 0.010 mg/ml 미만이다.

조성물은 전문이 참고로 도입되는 1994년 4월 1일자로 출원된 미국 일련번호 제021,579호에 기재된 바와 같은 유전적 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.

조성물은 약 1나노그램 내지 100밀리그램; 약 1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 또는 바람직하게는 약 0.1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 또는 보다 바람직하게는 약 1밀리그램 내지 약 2밀리그램인 양으로 DNA를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 약 5나노그램 내지 약 1000마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약 10나노그램 내지 약 800마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약 0.1 내지 약 500마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약 1 내지 약 350마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약 25 내지 약 250마이크로그램, 약 100 내지 약 200마이크로그램, 약 1나노그램 내지 100밀리그램; 약 1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 약 0.1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 약 1밀리그램 내지 약 2밀리그램, 약 5나노그램 내지 약 1000마이크로그램, 약 10나노그램 내지 약 800마이크로그램, 약 0.1 내지 약 500마이크로그램, 약 1 내지 약 350마이크로그램, 약 25 내지 약 250마이크로그램, 약 100 내지 약 200마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다.

조성물은 사용될 투여 경로에 따라 제형화될 수 있다. 주사 가능한 약학 조성물은 멸균이며, 발열원이 없고 입자가 없을 수 있다. 등장성 제형물 또는 용액이 이용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제에는 나트륨 클로라이드, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토오스가 포함될 수 있다. 조성물은 혈관수축 제제를 포함할 수 있다. 등장성 용액에는 인산염 완충 식염수가 포함될 수 있다. 조성물은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. LGS 또는 다중 양이온 또는 다중 음이온을 포함하는 안정화제는 제형이 연장된 시기 동안 실온 또는 상온에서 안정하도록 할 수 있다.

6. 합성 항체를 생산하는 방법

본 발명은 또한 합성 항체의 생성 방법에 대한 것이다. 방법에는 하기에서 보다 상세히 기재된 전달 방법을 이용함으로써 이를 필요로 하는 대상체에게 조성물을 투여하는 단계가 포함될 수 있다. 따라서 합성 항체는 대상체에 대한 조성물의 투여 시 생체 내 또는 대상체에서 생성된다.

방법에는 또한 하나 이상의 세포 내로 조성물을 투여하는 단계가 포함될 수 있고, 이에 따라 합성 항체는 하나 이상의 세포에서 생성되거나 생산될 수 있다. 방법에는 하나 이상의 조직, 예를 들어 비제한적으로 피부 및 근육 내로 조성물을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이에 따라 합성 항체는 하나 이상의 조직에서 생성되거나 생산될 수 있다.

7. 항체에 대한 동정 또는 스크리닝 방법

본 발명은 추가로 전술한 항원에 반응성이거나 이에 결합하는 전술한 항체의 확인 또는 스크리닝 방법에 관한 것이다. 항체의 확인 또는 스크리닝 방법은 항체를 확인하거나 스크리닝하기 위해 당업자에게 공지된 방법론으로 항원을 이용할 수 있다. 이러한 방법론에는 비제한적으로 라이브러리(예를 들어, 파지 디스플레이)로부터의 항체 선택 및 동물의 면역화 이후 항체의 단리 및/또는 정제가 포함될 수 있다.

8. 조성물의 전달 방법

본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에 조성물을 전달하는 방법에 관한 것이다. 전달 방법에는 대상체에게 조성물을 투여하는 단계가 포함될 수 있다. 투여에는 비제한적으로 생체 내 전기천공을 포함하는 및 포함하지 않는 DNA 주입, 리포좀 매개된 전달 및 나노입자 촉진된 전달이 포함될 수 있다.

조성물 전달을 수신하는 포유류는 인간, 영장류, 비인간 영장류, 젖소, 육우, 양, 염소, 영양, 유럽들소, 물소, 유럽들소, 소과, 사슴, 고슴도치, 코끼리, 라마, 알파카, 마우스, 래트 및 닭일 수 있다.

조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입을 통해, 협측 투여를 통해, 흉막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내 경막내, 및 관절내 또는 이들의 조합을 포함하는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 수의학적 용도를 위해, 조성물은 정상적인 수의학적 관례에 따라 적합하게 허용 가능한 제형으로 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 가장 적절한 투여 방식 및 투여 경로를 쉽게 결정할 수 있다. 조성물은 전통적인 주사기, 무바늘 주입 장치, "마이크로돌출형 폭탄 곤 건", 또는 다른 물리적 방법, 예를 들어, 전기천공("EP"), "수력학적 방법", 또는 초음파에 의해 투여될 수 있다.

a. 전기천공

전기천공을 통한 조성물의 투여는 가역적 구멍을 세포막에 형성하기 위해 효과적인 에너지 자극을 원하는 포유류 조직으로 전달하도록 배치될 수 있는 전기천공 장치를 이용해서 달성될 수 있고, 바람직한 에너지 자극은 사용자에 의해 사전 설정된 전류 입력과 유사한 정전류이다. 전기천공 장치는 전기천공 성분 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함한다. 전기천공 성분에는 하기를 포함하는 전기천공 장치의 다양한 요소의 하나 이상이 포함되고 도입될 수 있다: 컨트롤러, 전류 파형 생성기, 임피던스 평가기, 파형 로거, 입력 요소, 상태 보고 요소, 소통 포트, 메모리 성분, 전원 및 전력 스위치. 전기천공은 플라스미드에 의한 세포의 형질주입을 촉진시키기 위해, 생체 내 전기천공 장치, 예를 들어 CELLECTRA EP 시스템(Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) 또는 Elgen 전기천공기(Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA)를 이용해서 달성될 수 있다.

전기천공 성분은 전기천공 장치의 하나의 요소로 기능할 수 있고, 다른 요소가 전기천공 성분과 소통하는 별도의 요소(또는 성분)이다. 전기천공 성분은 전기천공 장치의 둘 이상의 요소로 기능할 수 있고, 이는 전기천공 성분과 별도의 전기천공 장치의 다른 요소와 여전히 소통할 수 있다. 하나의 전기기계적 또는 기계적 장치의 일부로 존재하는 전기천공 장치의 요소는 요소가 하나의 장치로 또는 서로 소통하는 별도 요소로서 기능할 수 있는 것으로 제한되지 않을 수 있다. 전기천공 성분은 원하는 조직에서 정전류를 생성하는 에너지 자극을 전달할 수 있고, 피드백 메커니즘이 포함된다. 전극 어셈블리에는 복수 전극을 공간적 배열로 갖는 전극 어레이가 포함될 수 있고, 여기서 전극 어셈블리는 전기천공 성분으로부터 에너지 자극을 수신하고, 이를 전극을 통해 원하는 조직으로 전달한다. 적어도 하나의 복수 전극은 에너지 자극의 전달 동안 중성이고, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 전기천공 성분으로 임피던스와 소통한다. 피드백 메커니즘은 측정된 임피던스를 수신할 수 있고, 정전류를 유지하기 위해 전기천공 성분에 의해 전달된 에너지 자극을 조정할 수 있다.

복수의 전극은 분산된 패턴으로 에너지 자극을 전달할 수 있다. 복수의 전극은 프로그래밍된 순서로 전극 제어를 통해 분산된 패턴으로 에너지 자극을 전달할 수 있고, 프로그래밍된 순서는 전기천공 성분으로 사용자에 의해 입력된다. 프로그래밍된 순서는 순서대로 전달된 복수의 자극을 포함할 수 있고, 여기서 복수 자극의 각각의 자극은 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해 전달되며, 복수 자극의 후속 자극은 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중 다른 것에 의해 전달된다.

피드백 메커니즘은 하드웨어 또는 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 피드백 메커니즘은 아날로그 폐쇄-루프 회로에 의해 수행될 수 있다. 피드백은 50㎲, 20㎲, 10㎲ 또는 1㎲마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백이거나 순간적이다(즉, 반응 시간을 결정하기 위해 이용 가능한 기법에 의해 결정되는 바에 따라 실질적으로 순간적임). 중성 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 피드백 메커니즘으로 임피던스를 소통할 수 있고, 피드백 메커니즘은 임피던스에 반응하여 정전류를 사전 설정된 전류와 유사한 값으로 유지하기 위해 에너지 자극을 조정한다. 피드백 메커니즘은 에너지 자극의 전달 동안 연속적으로 및 순간적으로 정전류를 유지할 수 있다.

본 발명의 조성물 전달을 촉진할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예에는 그 내용의 전문이 본 명세서 참고로 도입된 미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli 등), 미국 특허 공개 제2005/0052630호(Smith 등)에 기재된 것들이 포함된다. 조성물의 전달을 촉진시키기 위해 이용될 수 있는 다른 전기천공 장치 및 전기천공 방법에는 2006년 10월 17일자로 출원된 미국 가출원 제60//852,149호 및 2007년 10월 10일자로 출원된 제60/978,982호에 대해 35 USC 119(e) 하에 이익을 청구하는, 2007년 10월 17일자로 출원된 공동 계류중이고 공동 소유된 미국 특허 출원 제11/874072호에 제공된 것들이 포함되며, 모두 본 명세서 이들의 전문이 도입된다.

미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli 등)는 체내 또는 식물에서 선택된 조직 세포 내 생체분자의 도입을 촉진시키기 위한 모듈형 전극 시스템 및 이들의 용도를 기재한다. 모듈형 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그래밍 가능한 정전류 자극 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극으로 전도성 링크를 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 운영는 지지 구조 상에 실장된 복수의 바늘 전극을 쥐고 이들을 체내 또는 식물에서 선택된 조직 내로 단단히 삽입할 수 있다. 이어서 생체분자는 피하 바늘을 통해 선택된 조직 내로 전달된다. 프로그래밍 가능한 정전류 자극 컨트롤러가 활성화되며 정전류 전기 자극이 복수의 바늘 전극에 적용된다. 적용된 정전류 전기 자극은 복수의 전극 간에서 세포 내로 생체분자의 도입을 촉진한다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용이 본 명세서 참고로 포함된다.

미국 특허 공개 제2005/0052630호(Smith 등)는 체내 또는 식물에서 선택된 조직 세포 내로 생체분자의 도입을 효과적으로 촉진시키기 위해 이용될 수 있는 전기천공 장치를 기재한다. 전기천공 장치는 그 작동이 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 특정되는 전기-역학 장치("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 자극 파라미터의 입력 및 사용자 제어에 기반하여 어레이 내 전극 간에 일련의 프로그래밍 가능한 정전류 자극 패턴을 생성하며, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 바늘 전극 어레이, 주입 바늘을 위한 중심 주입 채널, 및 제거 가능한 가이드 디스크를 갖는 대체 가능한 전극 디스크를 포함한다. 미국 특허 공개 제2005/0052630호의 전체 내용이 본 명세서 참고로 포함된다.

미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 제2005/0052630호에 기재된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직뿐만 아니라 다른 조직 또는 기관 내로의 심부 침투를 위해 채택될 수 있다. 전극 어레이의 구조로 인해, (선택한 생체분자의 전달을 위한) 주입 바늘도 표적 기관 내로 완전 삽입되고, 주입은 전극에 의해 사전-서술된 영역에서 해당 표적에 수직으로 투여된다. 미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 제2005/005263호에 기재된 전극은 바람직하게는 20 mm 길이 및 21 게이지이다.

추가적으로, 전기천공 장치 및 이들의 용도를 도입하는 일부 실시형태에, 하기 특허에 기재된 것들인 전기천공 장치가 고려된다: 1993년 12월 28일자로 허여된 미국 특허 제5,273,525호, 2000년 8월 29일자로 허여된 미국 특허 제6,110,161호, 2001년 7월 17일자로 허여된 제6,261,281호, 및 2005년 10월 25일자로 허여된 제6,958,060호, 및 2005년 9월 6일자로 허여된 미국 특허 제6,939,862호. 또한, 임의의 다양한 장치를 이용한 DNA 전달에 관한 2004년 2월 24일자로 허여된 미국 특허 제6,697,669호, 및 DNA의 주입 방법에 대한 2008년 2월 5일자로 허여된 미국 특허 제7,328,064호에서 제공된 요지를 포괄하는 특허가 본 명세서에서 고려된다. 상기 특허는 이들의 전문이 참고로 포함된다.

9. 치료 방법

또한 대상체에서 합성 항체를 생성함으로써 이를 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료, 방어 및/또는 예방 방법이 본 명세서 제공된다. 방법에는 대상체에 대한 조성물의 투여 단계가 포함될 수 있다. 대상체에 대한 조성물의 투여는 전술한 전달 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 박테리아 감염증을 치료, 방어 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 박테리아 바이오필름의 형성을 치료, 방어 및/또는 예방한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 슈도모나스 에루지노사 감염증 또는 바이오필름 형성을 치료, 방어 및/또는 예방한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 상처의 슈도모나스 에루지노사 감염증을 치료, 방어 및/또는 예방한다.

대상체에서 합성 항체의 생성 시, 합성 항체는 항원에 결합하거나 이와 반응할 수 있다. 이러한 결합은 항원을 중화시키거나, 다른 분자, 예를 들어 단백질 또는 핵산에 의한 항원의 인식을 차단하거나, 항원에 대한 면역 반응을 야기 또는 유도하여 대상체에서 항원에 연관된 질환을 치료, 방어 및/또는 예방할 수 있다.

조성물 용량은 1㎍ 내지 10 mg의 활성 성분/체중kg/시간일 수 있고, 20㎍ 내지 10 mg 성분/체중kg/시간일 수 있다. 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 조성물 투여 횟수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다.

10. 항생제와의 병용 사용

본 발명은 또한, 합성 항체 및 치료 항생제의 조합을 투여함으로써, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료, 방어 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

합성 항체 및 항생제는, 합성 항체 및 항생제의 조합이 둘 모두가 대상체에 존재하도록 임의의 적합한 방법을 이용하여 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 방법은 상기에 상세히 기술된 임의의 방법에 의한 본 발명의 합성 항체를 포함하는 제1 조성물의 투여, 및 합성 항체의 투여 후 1일 미만, 2일 미만, 3일 미만, 4일 미만, 5일 미만, 6일 미만, 7일 미만, 8일 미만, 9일 미만 또는 10일 미만 내에 항생제를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 방법은 상기에 상세히 기술된 임의의 방법에 의한 본 발명의 합성 항체를 포함하는 제1 조성물의 투여, 및 합성 항체의 투여 후 1일 초과, 2일 초과, 3일 초과, 4일 초과, 5일 초과, 6일 초과, 7일 초과, 8일 초과, 9일 초과 또는 10일 초과 내에 항생제를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 방법은 상기에 상세히 기술된 임의의 방법에 의한 본 발명의 항생제를 포함하는 제1 조성물의 투여, 및 항생제의 투여 후 1일 미만, 2일 미만, 3일 미만, 4일 미만, 5일 미만, 6일 미만, 7일 미만, 8일 미만, 9일 미만, 또는 10일 미만 내에 합성 항체를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 방법은 상기에 상세히 기술된 임의의 방법에 의한 본 발명의 항생제를 포함하는 제1 조성물의 투여, 및 항생제의 투여 후 1일 초과, 2일 초과, 3일 초과, 4일 초과, 5일 초과, 6일 초과, 7일 초과, 8일 초과, 9일 초과 또는 10일 초과 내에 합성 항체를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 방법은 상기에 상세히 기술된 임의의 방법에 의한 본 발명의 합성 항체를 포함하는 제1 조성물의 투여, 및 동시에 항생제를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 방법은 상기에 상세히 기술된 임의의 방법에 의한 본 발명의 합성 항체를 포함하는 제1 조성물의 투여, 및 동시에 항생제를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 합성 항체 및 항생제를 포함하는 단일 조성물의 투여를 포함할 수 있다.

본 발명의 합성 항체와 조합하여 사용될 수 있는 항생제의 비-제한적인 예는 아미노글리코사이드(예를 들어, 겐타마이신, 아미카신, 토브라마이신), 퀴놀론(예를 들어, 시프로플록사신, 레보플록사신), 세팔로스포린(예를 들어, 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 세프피롬, 세프토비프롤), 항슈도모날 페니실린; 카복시페니실린(예를 들어, 카르베니실린 및 티카르실린) 및 우레이도페니실린(예를 들어, 메즐로실린, 아즐로실린, 및 피페라실린), 카르바페넴(예를 들어, 메로페넴, 이미페넴, 도리페넴), 폴리믹신(예를 들어, 폴리믹신 B 및 콜리스틴) 및 모노박탐(예를 들어, 아즈트레오남)을 포함한다.

본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 예시되는 여러 양태를 갖는다.

11. 실시예

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 예시된다. 이러한 실시예가 본 발명의 바람직한 실시형태를 명시하지만, 단지 예시로서 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적 특징을 확인할 수 있고, 이들의 요지 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 이용 및 조건에 이를 채택하기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 수행할 수 있다. 따라서 본 명세서 나타내고 기재된 것들에 부가하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 속하는 것이다.

실시예 1: 조작된 이중특이적, DNA-암호화된 IgG 항체(DMAb)는 치명적인 폐렴 과제 모델에서 슈도모나스 에루지노사를 방어한다

본 명세서 제시된 연구는 생체 생산 및 활성을 위한, 모노특이적 항-PcrV IgG(DMAb-αPcrV)를 암호화하는 합성 DMAb의 개발 및 분석 및 임상 후보물질 이중특이적 항체 ABC123(DMAb-BiSPA)을 기술한다. 생체내 DMAb 생산은 두 작제물 모두에 대한 기능적 및 방어 역가를 빠르게 생성할 수 있다. 이러한 DMAb는 주요 장기의 P. 에루지노사 콜로니화의 유사한 예방과 함께, 생체과정 생성된 mAb에 대해 유사한 효능을 지속하고 가질 수 있다.

현 연구에서, P. 에루지노사에 대한 mAb가 합성 DNA 벡터, DMAb에서 암호화될 수 있고, 골격근에 의해 생체내에서 생성된다는 것이 입증되어 있다. 항-슈도모나스 DMAb는 치료 표적에 효과적으로 결합하고, 침습적 P. 에루지노사 균주에 의해 야기된 치명적인 폐렴의 마우스 모델에서 방어적이었다. 단일 용량의 DMAb는 3 내지 4달 동안 일시적으로 발현되며, 치명적인 감염증에 대한 방어는 정제된 IgG로의 마우스의 치료와 유사하다. 이는, 플라스미드가 결국 사라질 때까지 근육으로부터 DMAb가 연속적으로 발현될 수 있기 때문에 장기 mAb 투여에 상당한 진전을 이룬다. 일상적인 투여 이외에, 항-P. 에루지노사 DMAb에 대한 다른 예측 가능한 장점은 만성 질환 또는 이식된 장치와 관련된 재발하는 감염증을 갖는 고위험 환자를 위한 것이며, 여기서, DMAb는 연장된 항생제 요법에 대한 필요성을 감소시킬 수 있다. 또한, DMAb가 또한, 일반적으로 사용되는 항생제인 메로페넴과 상승적으로 작용할 수 있다는 것이 나타났다. DMAb 및 항생제 조합의 상승 효과는, 이러한 전략이 항생제 치료 요법을 감소시키고 이에 의해 환자에서 항생제의 길이를 감소시키는 가능성을 가질 수 있음을 시사한다. 이러한 보조 활성은 이전 연구에서 단백질 IgG로 관찰된 것과 동등하다(DiGiandomenico et al., 2014, Sci Transl Med 6, 262ra155). 종합하면, 이러한 결과는, 전장 IgG mAb의 DNA 전달이 심각한 박테리아 감염증의 예방 및 가능하게, 다른 치료 적응증에 대한 유망한 플랫폼 전략임을 시사한다. 모든 생체처리된 항-슈도모날 IgG mAbs(항-Psl, 항-PcrV, 및 ABC123)는 다양한 혈청타입으로부터 유래된 P. 에루지노사 임상 단리물, 다수의 타입 3 분비 표현형(세포독성 대 침습성 균주; 각각 ExoU+, ExoS-; ExoU-, ExoS+), 및 다수의 감염 부위에 대해 방어성임을 나타내었다(DiGiandomenico et al., 2012, J Exp Med 209, 1273-1287; Warrener et al., 2014, Antimicrob Agents Chemother 58, 4384-4391; DiGiandomenico et al., 2014, Sci Transl Med 6, 262ra155; Thaden et al., 2016, J Infect Dis 213, 640-648; Zegans er al., 2016, JAMA Ophthalmol 134, 383-389).

물질 및 방법은 하기에 기술된다.

세포주 및 박테리아

인간 배아 신장(HEK) 293T 세포를 10% 우태아혈청(FBS)가 보충된 둘베코 변형 이글 매질(DMEM)에 유지시켰다. 세포주를 마이코플라스미아-부재 조건 하에서 유지시켰다. 일반적인 시험을 펜실베니아 대학교에서 수행하였다. 모든 세포를 낮은 계대배양 수에서 유지시켰다. P. 에루지노사 케라티티스 임상 단리물 6077(PA 6077), 세포독성(ExoU⁺) 균주를 모든 감염증 실험에 대해 사용하였다.

DMAb 구성 및 발현

단일 특이성 항-P. 에루지노사 PcrV 단백질(클론 V2L2MD)(Warrener et al., 2014, Antimicrob Agents Chemother 58, 4384-4391) 및 조작된 이중특이적 항- P. 에루지노사(PcrV 및 Psl에 대해 이중 특이성, 클론 ABC123)(DiGiandomenico et al., 2014, Sci Transl Med 6, 262ra155)의 서열을 획득하였다. 각 인간 IgG1 중쇄 및 Igκ 경쇄에 대한 뉴클레오타이드 서열은 포유류 세포에서 발현을 향상시키기 위한 마우스 및 인간 바이어스 둘 모두에 대해 최적화된 코돈이다. (Graf et al., 2004, Methods Mol Med 94, 197-210; Deml et al., 2001, J Virol 75, 10991-11001). 서열은 또한, 단백질 수율 증가를 초래하도록(Fath et al., 2011, PLoS One 6, e17596), 개선된 mRNA 안정성 및 리보솜 상에서의 효율적인 번역을 위해 최적화된 RNA이다(Schneider et al., 1997, J Virol 71, 4892-4903; Andre et al., 1997, J Virol 72, 1497-1503). 이후에, 최적화된 중쇄 및 경쇄 유전자를 인간 시토메갈로바이러스(hCMV) 프로모터 및 소 성장 호르몬(BGH) polyA의 제어 하에서, pGX0001 DNA 발현 벡터 내에 삽입하였다.

두 유전자 모두를 푸린 분열 사이트 및 P2A 펩타이드에 의해 분리된 시스(cis)에 암호화하였다. 결과는 2개의 플라스미드였다: DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA. HEK 293T 세포를 GeneJammer(Agilent, 델라웨어주 월밍턴 소재) 형질주입 시약을 사용하여 DMAb DNA로 형질주입하였다. 세포 상청액 및 세포 용리액을 형질주입후 48시간에 수확하고, 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA) 및 웨스턴 블롯에 의해 인간 IgG 생산에 대해 검정하였다.

마우스 근육 조직 면역형광법

BALB/c 마우스에 TA 근육에서 IM 주사에 의해 100㎍의 DMAb를 주사한 후에, IM-EP를 주사하였다. 조직을 주사후 3일에 수확하고, 4% 중성-완충된 포르말린(BBC Biochemical, 워싱턴주 소재)에서 고정시키고, D.I.수 중 30%(w/v) 수크로스(Sigma, 미주리주)에 함침시켰다. 이후에, 조직을 O.C.T. 화합물(Sakura Finetek, 캘리포니아주 소재) 내에 포매하고, 스냅-동결시켰다. 동결된 조직 블록을 18㎛의 두께로 절편화하였다. 절편화된 근육을 블로킹-완충제(0.3%(v/v) Triton-X(Sigma), PBS 중 2%(v/v) 당나귀 혈청)과 함께 30분 동안 항온처리하고, 파라필름(Parafilm)으로 덮었다. 염소 항-인간 IgG-Fc 단편 항체(A-80-104A, Bethyl, 텍사스주 소재)을 항온처리 완충제(PBS 중1%(w/v) BSA(Sigma), 2%(v/v) 당나귀 혈청, 0.3%(v/v) Triton-X(Sigma) 및 0.025%(v/v) 1 g/ml 나트륨 아자이드(Sigma))에 1:100으로 희석시켰다. 50㎕의 염색 용액을 각 절편에 첨가하고, 2시간 동안 항온처리하였다. 절편을 1×PBS 중에서 5분 동안 3회 세척하였다. 당나귀 항-염소 IgG AF488(ab150129, Abcam, 미국 소재)을 항온처리 완충제에 1:200으로 희석시키고, 50㎕를 각 절편에 첨가하였다. 절편을 1시간 항온처리 후에 세척하고, DAPI-Fluoromount(SouthernBiotech, 앨러배마주)와 함께 마운팅하고, 덮었다.

DMAb 작제물의 생체내 발현을 Retiga3000 모노크로매틱 카메라(QImaging)가 장착된 BX51 형광 현미경(Olympus)으로 영상화하였다.

ELISA에 의한 및 항-세포독성 활성에 의한 인간 IgG 정량화

96 웰, 고-결합 면역흡착제 플레이트를 10 ㎍/mL 정제된 항-인간 IgG-Fc로 코팅하고, 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음날에, 플레이트를 세척하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 10% FBS를 함유한 PBS로 블로킹하였다. 샘플을 연속적으로 2배 희석하고, 블로킹된 플레이트로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 정제된 인간 IgGκ를 표준물로서 사용하였다. 항온처리 후에, 샘플을 1:20,000 희석으로 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-인간 IgGκ 항체로 프로빙하였다. 플레이트를 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 기질을 사용하여 발현시키고, 2N H₂SO₄로 정지시켰다. 바이오텍 시너지2(BioTek Synergy2) 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 OD450nm에서 판독하였다. 대안적으로, 혈청으로부터의 인간 IgG를 캡처 시약으로서 V2L2MD 또는 ABC123에 대해 특이적인 항-이디오타입 mAb(0.2M 나트륨 바이카보네이트 완충제에 현탁된 0.05 ㎍/웰, pH 9.4)를 사용하는 것을 제외하고, 전술한 바와 같이 정량화하였다. 정제된 V2L2MD 또는 ABC123을 표준물로서 사용하였다.

DMAb를 또한, 384-웰 블랙 MaxiSorp 플레이트(10㎍/mL 염소 항-인간 IgG로 코팅됨(H+L))를 사용하여 혈청으로부터 정량화하였다. 플레이트를 세척하고, 실온에서 1 내지 2시간 동안 PBS 중 블로커 카제인(Blocker Casein)으로 블로킹하였다. 블로킹 후에, ABC123 또는 V2L2MD를 함유한 표준물을 플레이트를 가로질러 1:2로 연속적으로 희석하고, 혈청 샘플을 1:20, 1:40, 1:80 및 1:160으로 희석하였다. 이후에, 샘플을 함유한 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후에, 플레이트를 1:4000 희석으로 당나귀 항-인간 IgG-HRP로 프로빙하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후에, 수퍼시그널 ELISA 피코 시약(SuperSignal ELISA Pico Reagent)을 첨가함으로써 면역 반응을 발현시키고, 형광을 퍼킨 엘머 엔비전(Perkin Elmer Envision) 상에서 판독하였다.

DMAb를 또한, PA 6077의 세포독성 효과로부터 A549 세포의 방어를 측정하는 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA에 의해 매개된 항-세포독성 활성을 기초로 하여 혈청으로부터 정량화하였다. 마우스 혈청의 활성을 V2L2MD IgG와 혼합된 천연 마우스 혈청의 표준 곡선과 비교하였다.

결합 ELISA

96 웰 플레이트 면역흡착제 플레이트를 밤새 슈도모나스 PcrV 단백질로 0.5 ㎍/mL로 코팅하였다. 다음날에, DMAb-투여된 동물로부터의 혈청 샘플을 2배 연속 희석시키고, 이후에, 블로킹된 플레이트로 옮겼다. 샘플을 1:5000의 희석으로 HRP에 접합된 항-인간 IgG H+L 항체로 프로빙하고, OPD 기질로 발현시켰다.

웨스턴 블롯

DMAb-형질주입된 세포로부터의 세포 용해물을 세포 용해 완충제에 수거하였다. 샘플을 20,000 rpm으로 원심분리하고, 단백질 분획을 함유한 상청액을 수거하였다. 샘플을 비신코닌산(BCA) 검정을 이용하여 정량화하고, 10㎍ 전체 용해물을 4 내지 12% Bis-Tris SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 겔을 iBlot2 시스템을 이용하여 나이트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 5% 분말 탈지유 + 0.5% Tween-20에서 블로킹하고, 이후에, HRP에 접합된 당나귀 항-인간 H+L 항체를 이용하여 프로빙하였다. 밴드를 화학발광 시스템을 이용하여 발현시키고, 필름 상에 시각화하였다.

마우스

암컷의 6주령 내지 8주령 B6.Cg-Foxn1nuJ 및 BALB/c 마우스를 The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)로부터 구매하고, 펜실바니아 대학 또는 MedImmune, AstraZeneca에서의 동물 설비에서 사육하였다. 모든 동물 프로토콜은 ALAAC로부터의 가이드라인에 따라, 펜실베이나 대학 또는 MedImmune IACUC 위원회에 의해 승인되었다. 또한, IACUC 감독은 동물 관리 및 사용 검토 사무국(ACURO)에 의해 제공되었다. 동물은 TA 또는 quad 근육에 100㎍ 내지 300㎍ DMAb-αPcrV 또는 DMAb-BiSPA의 근육내(IM) 주사 전 30분 내지 1시간에 히알루로니다제(400 U/mL, Sigma Aldrich)의 IM 사전-주사를 수용하고, 이후에 전기천공(IM-EP)을 수행하였다. DMAb의 혈청 수준을 투여 후에 모니터링하였다.

치명적인 폐렴 접종

BALB/c 마우스(n=8/군)는 접종 전 -5일에 IM-EP에 의해 100㎍ 또는 300㎍의 DMAb-αPcrV 또는 DMAb-BiSPA를 수용하였다. 관련이 없는 뎅기 바이러스 DMAb-DVSF3²⁰을 대조군으로서 포함하였다. 제4 동물 군은 접종 전 -1일에 정제된 단백질 IgG ABC123(2 mg/kg)의 복강내(IP) 주사를 수용하였다. 0일째에, 동물은 응집성, 항-미생물 내성 슈도모나스 에루지노사 균주 6077의 9.75e5 내지 1.0e6의 콜로니 형성 단위(CFU)의 비내 접종을 수용하였다. 동물을 문헌¹⁶에 기술된 바와 같이 생존을 위한 비내 접종 후 6일 동안 모니터링하였다. 간단하게, 동무를 케타민 및 자일라진으로 마취시키고, 이후에, 0.05 ml 중에 함유된 박테리아 접종물을 비내로 투여하였다. 장기 부담(organ burden) 분석을 위하여, 폐, 비장, 및 간을 감염 후 24시간에 DMAb-치료된 동물로부터 수확하고, 이후에, 박테리아 CFU의 열거를 위해 루리아(Luria) 아가 플레이트를 균질화하고 플레이팅하였다. IL-1β, IL-6 및 KC/GRO를 제조업체 설명서에 따라 멀티플렉스 키트(Meso Scale Diagnostics)를 이용하여 폐 균질물의 상청액으로부터 정량화하였다. DMAb 및 메로페넴(MEM) 병용 실험을 위하여, MEM을 감염 후 4시간째에 피하로 투여하였다.

조직병리학

폐를 감염 후 48시간에 수확하고, 최소 48시간 동안 10% 중성 완충된 포르말린에서 고정시켰다. 이후에, 고정된 조직을 일상적으로 처리하고, 파라핀에 포매하고, 3㎛ 두께로 절편화하고, 실험 조건에 대해 알지 못하는 병리학자에 의한 조직학적 평가를 위해 길(Gill)의 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.

통계학

모든 통계학적 분석을 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어 또는 SPSS를 이용하여 수행하였다. 2개의 독립적인 비율에 대한 샘플 크기의 계산치를 알파 0.05 및 검정력 0.90으로 계산하였다. 적절한 검정력을 보장하기 위해 최소 n=5 마우스가 필요하다고 계산되었다. 스튜던트 T-시험(Student's T-test) 또는 일원 변량 분석(ANOVA) 계산을 필요한 경우에 수행하였다. 생존 데이터는 Kaplan-Meier 생존 곡선에 의해 나타내었으며, 유의성은 다중 비교를 위한 보정을 갖는 log-랭크 시험 및 한방향 ANOVA를 이용하여 계산되었다. 데이터는 p<0.05인 경우에 유의미한 것으로 여겨졌다. 모든 그래프에서 라인은 평균 값을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 샘플 또는 동물이 분석으로부터 배제되지 않았다. 무작위화는 동물 연구를 위해 수행되지 않았다. 샘플 및 동물을 각 실험을 수행하기 전에 눈이 멀지 않았다.

실험 결과는 하기에 기술되어 있다.

항-P. 에루지노사 DNA-전달 단클론성 항체(DMAb)의 설계 및 시험관내 발현

치명적인 P. 에루지노사 감염증에 대한 종래에 기술된 강력한 방어 생체내 활성을 기초로 한 DNA 발현 벡터 시스템으로의 최적 발현을 위해 재-암호화되는 2개의 항-P. 에루지노사 mAb 유전자. 인간 면역글로불린 감마 1(IgG1) 중쇄 및 경쇄(Fab 및 Fc 부분)는 인간 및 마우스 코돈 바이어스 둘 모두를 고려하여 최적화되고 pGX0001 DNA 플라스미드 골격에서 단일의 폴리시스트론성 단위로서 암호화되어 2개의 작제물, 즉, DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA를 형성하는, 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이다(도 1a). 중쇄 및 경쇄는 단일 mRNA 전사체로서 발현되고, 이후에, 돼지 테스코바이러스(porcine teschovirus)-1 2A(P2A) 분열 부위에서 후-전사적으로 분열된다. 최종 생체내 생성 항체로부터 P2A의 완전한 제거를 보장하기 위해, 푸린 분열 부위(RGRKRRS; 서열번호 23)를 또한 포함하였다.

각 작제물이 전장 인간 IgG1 항체를 발현시키는 능력은 HEK293T 세포의 시험관내 형질주입 후에 평가되었다. DMAb-형질주입된 세포 및 상청액을 48시간 후에 수확하고, 전체 IgG ELISA를 DMAb IgG 생성 및 분비를 확인한, 세포 용해물 상에 및 배지에서 수행되었다(도 1b, 패널 i 및 패널 ii). 항체 중쇄 및 경쇄 둘 모두가 발현되었는 지를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 또한 수행하였다. 이중특이적 DMAb는 2개의 가변 영역 특이성을 암호화할 때 더 높은 분자량에서 진행한다(도 1c). pGX0001 DNA 벡터를 음성 대조군으로서 포함되었으며, 정제된 항-PcrV IgG1은 음성 대조군으로서 포함되었다.

마우스에서 항-P. 에루지노사 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA의 발현

시험관내 발현의 확인 후에, 마우스에서 DNA-전달 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA의 발현을 시험하였다. 마우스 근육에서 DMAb 발현을 확인하기 위하여, 항-P. 에루지노사 DMAb-αPcrV(100㎍), DMAb-BiSPA(100㎍), 대조군 DMAb-DVSF3(100㎍), 또는 대조군 pGX0001 빈(empty) 벡터(100㎍)를 BALB/c 마우스에 전경골(tibialis anterior: TA)에서 근육내 주사(IM), 이후 근육내 전기천공(IM-EP)에 의해 투여하였다. 근조직을 주사후 3일에 수확하고, 절편을 염소 항-인간 IgG Fc 항체로 프로빙하고, 이후에, AF488에 접합된 당나귀 항-염소 IgG로 검출하였다(도 2). 생체내에서의 발현의 확인 후에, 추가 실험을 수행하여 전신 순환계에서 DMAb 수준을 검정하였다. 인간 IgG1은, 뮤린 면역계에 의해 비-자기로서 인식되기 때문에, 면역수용성 마우스에서 항-항체 반응을 유도한다. 이에 따라, 발현을 T 세포가 부족하고 비-기능성 B 세포를 갖는 면역저하된 B6.Cg-Foxn1nu/J 흉선 마우스(누드)에서 평가하였다. 항-P. 에루지노사 DMAb-αPcrV(100㎍) 또는 DMAb-BiSPA(100㎍)를 TA 또는 사두근(quadricep: quad) 근육에서 누드 마우스(n=5/군) IM에 투여하고 나서, IM-EP를 수행하였다. 순환계에서 장기간 인간 IgG1 발현을 모니터링하기 위해 혈청을 수거하였다. 두 DMAb 모두의 발현은 투여 후 100 내지 120일 동안 관찰되었으며, 이는 이러한 신규한 DNA-전달 mAb가 수 주 동안 발현과 함께, 전신 순환계에서 검출 가능한 유의미한 양으로 골격근에서 생성될 수 있다는 가설을 지지한다(도 3A 및 도 3D).

다음으로, DMAb 발현을, 이러한 것이 P. 에루지노사 감염에 대한 모델로서 일반적으로 사용되기 때문에, 면역적격 BALB/c 마우스에서 평가하였다. 마우스(n=10/군)에 IM-EP에 의해 100㎍ 및 300㎍ 용량(3 주사 부위×100㎍)의 DMAb-αPcrV 또는 DMAb-BiSPA를 투여하였다. 피크 DMAb 발현 수준은 주사 후 7일에 관찰되었고, DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA 각각에 대하여 100㎍ 용량에서 7.1 내지 17.1 ㎍/ml 및 2.9 내지 7.2 ㎍/ml였고, 300㎍ 용량에서 31.2 내지 49.7 ㎍/mL 및 3.2 내지 12.7 ㎍/mL였다(도 3B 및 도 3E). BALB/c 마우스에서 인간 IgG1 DMAb 발현을 14일까지 마우스 면역계에 의해 제거하였다(도 4A 및 도 4B). 비료를 위하여, 마우스 IgG2a DMAb를 또한 설계하였다. 이는 면역 적격 BALB/c 마우스에서 100일 초과의 장기간 발현을 나타내었으며, 면역계에 의한 제거 없이 DMAb의 긴 발현을 입증한다(도 4C). DMAb의 표적 항원 특이성을 확인하기 위하여, 투여 후 7일째의 혈청을 또한, ELISA에 의해 재조합 PcrV 단백질에 대한 결합에 대해 검정하고 확인하였다(도 3C 및 도 3F).

치명적인 폐렴 모델에서 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA의 평가

시험관내 및 생체내 발현 연구는, DMAb가 재조합 PcrV 단백질에 결합하는 전체, 인간 IgG1 항체를 형성함을 명시하였다. 생체내 DNA-전달 DMAb의 기능적 활성을 다루기 위하여, 높은 병원성 및 세포독성 P. 에루지노사 균주 6077(PA 6077)에 대한 방어를 치명적인 마우스 폐렴 감염 모델을 이용하여 평가하였다. 마우스에 PA 6077 접종하기 5일 전에 DMAb-αPcrV(300㎍), DMAb-BiSPA(300㎍), 또는 댕기 배이러스를 표적화하는 관련되지 않은 대조군 DMAb-DVSF3(300㎍)(Flingaiet al., 2015, Sci Rep 5, 12616)을 주사하였다. 접종하기 1일 전에 마우스가 단백질 ABC123 IgG(2 mg/kg)를 수용한 양성 대조군이 또한 포함되었다. 접종 시에 혈청에서의 DMAb 발현 수준을 모니터링할 뿐만 아니라 발현된 DMAb의 효능을 평가하기 위해 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA 치료된 동물로부터의 무작위적으로 선택된 동물을 안락사시켰다. 도 5A에 명시된 바와 같이, 단일특이적 DMAb-αPcrV 및 이중특이적 DMAb-BiSPA 둘 모두는 혈청으로부터 전체 인간 IgG를 정량화할 때, 각각 대략 16 및 8 ㎍/ml의 중간값 역가(median titer)를 나타내었다. 혈청으로부터 항-세포독성 활성을 기초로 한 항체 발현을 정량화함으로써 생체내 발현된 DMAb-αPcrV 및 DMAb-BiSPA의 효능을 평가하였다. 정량화 방법에서 차이가 관찰되지 않았는데, 이는 생체내 발현된 단일특이적 및 이중특이적 DMAb-IgG가 생체학적 처리된 IgG와 비교하여 완전히 기능적이고 활성에 있어서 동등함을 명시하는 것이다(도 5A). 이후에, 각 군에서의 나머지 동물에 비강내 접종에 의해 치사량의 P. 에루지노사를 접종하고, 이후에, 감염 후 6일(144 시간) 동안 생존을 모니터링하였다. 대조군 DMAb-DVSF3을 수용한 동물은 24 내지 55시간 내에 감염으로 쓰러졌다. 상반되게, DMAb-αPcrV 또는 DMAb-BiSPA 중 어느 하나를 수용한 동물의 대략 94%(15/16)는 접종에서 생존하였다(도 5B, DMAb-DVSF3과 비교하여 p<0.0001). 예상되는 바와 같이, ABC123 IgG(2 mg/kg)를 수용한 양성 대조군 동물 모두는 접종에서 생존하였다. 또한, 100㎍(1개 부위 × 100㎍), 200㎍(2개 부위 × 100㎍), 또는 300㎍(3개 부위 × 100㎍)의 DMAb-BiSPA로 마우스의 치료 후 P. 에루지노사로의 감염은 농도-의존 생존을 산출하였다(도 5C). 이러한 결과는 이러한 동물로부터의 혈청에서 발현된 DMAb-BiSPA의 정량화와 일치하였으며, 여기서, 전기천공된 DNA의 양이 감소함에 따라, DMAb-BiSPA의 혈청 단백질 농도가 감소하였다(도 5D).

폐에서 박테리아 부담을 감소시키고 전신 박테리아 전파를 예방하는 항-슈도모나스 DMAb의 능력을 분석하였다. 폐, 비장, 및 신장을 P. 에루지노사로의 접종 후 24시간에 검정하고, 이후에, 각 조직에서 콜로니 형성 단위(CFU)를 정량화하였다. CFU 폐 부담에서의 유의미한 감소는 DMAb-BiSPA-치료되었지만 DMAb-αPcrV-치료되지 않은 동물에서 관찰되었다(도 6A), 중요하게, DMAb-BiSPA-치료된 동물의 폐에서의 박테리아 부담은 단백질 ABC123 IgG로 치료된 마우스로부터 관찰된 폐 부담과 유사하였으며, 두 항-슈도모나스 DMAb 모두는 대조군 DMAb-DVSF3과 비교할 때 비장 및 신장으로의 박테리아의 전파를 감소시켰다(도 6A). 또한, DMAb-αPcrV, DMAb-BiSPA, 및 ABC123 IgG는 대조군 DMAb-DVSF3 치료된 마우스와 비교하여, 폐 중량에 의해 측정하는 경우에, 감염된 동물에서 폐 부종을 예방하는 데 효과적이었다(도 6B). 이러한 결과와 일치하여, 전염증성 사이토카인 IL-1β 및 IL-6뿐만 아니라 케모카인 KC/GRO(도 6C)는 대조군 DMAb-DVSF3에 대해 항-슈도모나스 DMAb-치료 및 단백질 IgG-치료 마우스에서 감소되었다. 혈청 IgG 수준을 감염되지 않은 동물과 PA 6077 접종 후 24시간에 감염된 동물 간에 비교하였다(도 6D). 종합하면, 이러한 데이터는, 골격근에서 생체내에서 생성된 DNA-전달 mAb가 방어 활성을 매개하고 외인성으로 생성된 IgG mAb와 유사한 효능을 나타냄을 시사한다.

접종 후 폐 조직병리학

감염 후 48시간에 수확된 폐의 조직병리학은 출혈 및 폐포 괴사 영역과 함께, 폐포 및 혈관주위 공간에서 호중구 및 대식세포의 침윤으로 DMAb-DVSF3-치료된 동물에서 현저한 폐포염(alveolitis)을 나타내었다. 상반되게, 그리고, 전술한 폐 상청액으로부터의 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 감소와 일치하게, 유사한 변화를 갖는 DMAb-BiSPA 치료된 동물에서뿐만 아니라 DMAb-αPcrV 및 대조군 ABC123 IgG에서 주로 호중구 및 적은 대식세포의 경미한 집단에서 염증이 명백하게 감소되었다(도 7).

항생제와 함께 DMAb 병용

그램 음성 또는 P. 에루지노사 감염이 의심될 때, 메로페넴(MEM)과 같은 광범위한 스펙트럼의 카르바페넴 패밀리 항생제를 투여하였다. 콜리스틴과 같은 추가의 최종 수단인 항생제 요법은 인간에서 높은 독성과 관련이 있으며(Falagas et al., 2005, BMC Infect Dis 5, 1; Lim et al., 2010, Pharmacotherapy 30, 1279-1291), 박테리아가 추가의 항-미생물 내성을 획득할 가능성이 존재한다(Hirsch and Tam, 2010, Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res 10, 441-451; Lister et al., 2009, Clin Microbiol Rev 22, 582-610; Breidenstein et al., 2011, Trends Microbiol 19, 419-426). 이에 따라, 이러한 위험을 감소시키기 위한 대안적이고 보조적인 전략이 매우 유리할 것이다. DMAb-BiSPA 치료의 잠재적인 적용은 MEM과 병용하여 평가되었다. 이러한 실험을 위하여, 내성 박테리아로 감염되고 하위치료 용량의 DMAb-BiSPA(100㎍, 도 5C에서 확인됨)로 감염된 환자에게 마주치는 부적절한 약물 노출을 시뮬레이션하기 위해 하위치료 용량의 MEM(2.3 mg/kg)을 사용하였다. 하위치료 투약량의 조합은 DMAb-BiSPA 단독을 수용한 동물에서의 10%와 비교하여 67% 생존을 야기시켰다(p=0.026, 도 8). MEM 단독 또는 DMAb-DVSF3을 수용한 대조 마우스는 치명적인 접종에서 생존하지 못하였다. 종합하면, 이는 독립적 치료로서 또는 기존 항생제 요법과 병용하여 DMAb 치료의 적용을 확대한다. 또한, 이러한 데이터는 DMAb 투여가 정제된 IgG mAb와 유사하게 기능하고, 표준 항생제 치료 요법과 병용할 때 향상된 방어 활성을 매개할 수 있다는 가설을 지지한다.

mAb 공학 분야는 급진적으로 진화하고 있으며, DMAb 전달은 생물학적으로 기능적인 mAb를 생체내에서 신속하게 전달하는 데 도움이 되는 추가적인 전략을 제공한다. 명백한 임상적 이점 이외에, 본 명세서에서 제시된 바와 같은 비-전통적인 이중특이적 mAb 아이소형(isoform)의 생체내 발현은 단백질 생산 공장으로서 관여되는 근육의 다목적성을 강조한다. 중요하게, DMAb 발현은 일시적이고, 다른 치료 전달제에 대한 유사한 효능을 갖는다. DNA 플라스미드가 더 이상 요구되지 않을 때 DNA 플라스미드를 제거하는 유도성 시스템을 개발하는 것이 가능할 수 있다. 대안적으로, DMAb DNA는 관련된 항-벡터 반응이 존재하지 않기 때문에 잠재적으로 무한하게 재-투여될 수 있어서, 반복 투여를 통한 장기 치료를 가능하게 한다(Hirao et al., 2010, Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 18, 1568-1576; Williams, 2013, Vaccines 1, 225-249; Schmaljohn et al., 2014, Virus research 187, 91-96). DMAb 전달은 mAb 치료법 및 DNA-전달 기술뿐만 아니라 숙주 면역을 향상시키기 위한 신규한 병원성-특이적 치료의 중요한 발전을 나타낸다.

최근에, 인간 유방암 암종의 마우스 모델에서 Her2를 표적화하는 DNA-암호화된 항체의 전달이 보고되었다(Kim et al., 2016, Cancer Gene Ther 23, 341-347). 이러한 연구는 단백질 IgG와 유사한 항-종양 효능을 입증하였으며, 이는 유전자-암호화된 mAb가 기능성을 가질 수 있다는 개념을 추가로 지지하는 것이다. 이는 박테리아 표적에 대해 방어적인 DNA-암호화된 mAb(DMAb) 전달의 제1 입증 및 조작된 IgG 아이소형의 제1 전달이다. DNA 플라스미드-암호화된 항체로의 초기 연구는 타당성을 입증했지만, 혈청에서 낮은 IgG 발현을 나타내었다(Tjelle et al., 2004, Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 9, 328-336; Perez et al., 2004, Genet Vaccines Ther 2, 2). DMAb 표적화 바이러스 감염의 방어 효능은 종래에 연구되었으며, 이러한 연구는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya)(Muthumani et al., 2016, J Infect Dis 214, 369-378) 및 댕기 바이러스(DENV) 감염증(Flingai et al., 2005, Sci Rep 5, 12616)에 대한 신속한 방어를 나타낸다. DMAb 표적화 DENV는 또한, 질환의 항체-의존적 향상을 증진시키지 못하였다. 이러한 2개의 감염성 질환 모델은 높은 혈청 IgG 수준을 필요로 하지 않지만, 발현 수준을 증가시키기 위한 최적화된 DMAb 제형은 단일 DMAb 투여 후 확장된 커버리지(coverage)를 제공하기 위해 요망될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 혈청 DMAb 발현 수준은 슈도모나스 에루지노사에 대한 사용을 위해 최적화되었다(도 9). 이러한 연구는 제형 요법 내에 히알루로니다제의 포함을 포함하였으며, 이는 치료된 근육으로부터 더 큰 IgG 발현을 가능하게 하였다.

추가 연구가 인간으로의 전환(translation)을 필요로 하지만, DMAb는 전세계적으로 다양한 지역에 대한 접근 가능성을 증가시킬 가능성을 가지면서, mAb의 일상적인 전달을 가능하게 하는 단계이다. 더 큰 동물 및 인간에서의 용량 변환은 향후 연구를 다루기 위해, 특히, DMAb 투여 동안 DNA 용량-제한을 이해하는 데 중요할 것이다. 이는 생체내에서 DNA 발현을 향상시키는 상이한 전달 및 제형 최적화를 조사하는 것을 포함한다. 하나의 전략은 근세포 내로의 DNA 진입을 촉진시키기 위해 다른 세포외 기질 효소를 사용하는 것일 수 있다³⁷. 비-인간 영장류에서의 추가 연구는 DNA 투여량에 대한 문턱값 및 약물동력학 수준에 대한 영향을 이해하는 데 도움을 줄 수 있다. 근육에서 생성된 인간 IgG DMAb의 글리코실화 패턴을 평가하는 추가적인 연구는 생체학적으로 처리된 단백질 IgG와 비교하여 유익할 것이지만, 현재의 연구의 맥락에서, DMAb와 이의 단백질 IgG 대응물 간의 기능성에 차이가 존재하지 않았다.

결론적으로, 본 명세서 기술된 연구는 AMR 감염증, 특히, 많은 넓은 스펙트럼의 항생제 요법에 대해 난치성인 ESKAPE 병원체에 대한 치료에 대해 엄청난 유의성을 가질 수 있다. DMAb는 다목적이고, 다중 항원성 표적에 대해 단일특이적 IgG를 전달할 수 있을 뿐만 아니라 신규한 이중특이적 IgG를 암호화할 수 있다. 단일 용량의 DMAb에 의해 생성된 지속적인 혈청 mAb 최저치는 생체내에서 생물학적으로 처리된 단백질 IgG에 의해 제공된 기능성 및 방어 수준과 일치한다. 이러한 플랫폼의 빠른 개발 및 근육으로부터의 연장된 일시적 발현은 mAb 투여 빈도가 낮을 수 있기 때문에, 단백질 IgG mAb 요법과 비교하여 바람직할 수 있다. 또한, DMAb는 수송, 장기 보관, 및 더 많은 집단에 대한 투여를 가능하도록 온도 안정적이다. 인간에서 DNA 전달의 안전성 프로파일과 조합한 이러한 매력적인 특징은 표적화 감염성 질환 및 다른 잠재적인 치료 표적에 대한 병원체-특이적 접근으로서 더 큰 동물 모델에서 추가의 DMAb 연구를 지지한다.

상기 상세한 설명 및 함께 제공되는 실시예는 단지 예시적인 것이며, 오로지 첨부된 청구범위 및 이들의 균등부에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되는 것으로 이해된다.

개시된 실시형태에 대한 다양한 변화 및 변형은 당업자에게 자명할 것이다. 비제한적으로 본 발명의 화학적 구조, 치환체, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 제형 또는 이용 방법에 관한 것들을 포함하는 이러한 변화 및 변형이 발명의 요지 및 범위에서 벗어나지 않고 수행될 수 있다.

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nucleotide sequence of pGX9257 hc: Pseudo-V2L2MD in pGX0003 (sCMV-light chain, hCMV-heavy chain); DMAb-antiPcrV <400> 11 gaggtgcagc tgctggagtc aggaggagga ctggtgcagc ccggcggatc actgcgactg 60 agctgcgcag cttccggctt caccttcagc agctatgcca tgaactgggt ccgacaggct 120 cctggcaagg gactggaatg ggtgagtgca atcaccatgt cagggattac tgcctactat 180 accgacgatg tgaaaggccg attcactatc tctagggaca acagtaagaa taccctgtac 240 ctgcagatga attccctgcg cgctgaggat acagcagtgt actattgcgc caaggaggaa 300 ttcctgccag ggactcacta ctattacgga atggacgtgt ggggacaggg aaccacagtc 360 accgtgtcta gtgcaagcac aaaaggcccc tccgtgtttc ccctggcccc ttcaagcaag 420 tctacaagtg ggggcactgc agccctggga tgtctggtga aggattactt ccctgagcca 480 gtcaccgtga gctggaactc cggcgccctg acttccggag tccatacctt tcctgctgtg 540 ctgcagtcct ctggcctgta tagcctgagt tcagtggtca ccgtcccaag ctcctctctg 600 ggaacacaga cttacatctg caacgtgaat cacaaaccaa gcaatacaaa ggtcgacaag 660 aaagtggaac ccaaatcctg tgataagacc catacatgcc ctccctgtcc agcacctgag 720 ctgctgggag ggccaagcgt gttcctgttt ccacccaagc ctaaagacac actgatgatt 780 tctcggaccc ccgaagtcac atgcgtggtc gtggacgtga gccacgagga ccccgaagtc 840 aagtttaact ggtacgtgga tggcgtcgag gtgcataatg ccaagaccaa accacgagag 900 gaacagtata actctacata cagggtcgtg agtgtcctga ctgtgctgca ccaggactgg 960 ctgaacggga aggagtacaa gtgcaaagtg tccaacaagg ccctgccagc tcccatcgag 1020 aagaccattt ctaaggccaa aggccagcca agagaacccc aggtgtatac actgcctcca 1080 agtcgggacg agctgactaa aaaccaggtc tctctgacct gtctggtgaa gggattctac 1140 ccttccgata tcgctgtgga gtgggaatct aatgggcagc cagaaaacaa ttataagact 1200 acccctcccg tgctggactc tgatggaagt ttctttctgt actccaaact gaccgtggac 1260 aagtctagat ggcagcaggg gaacgtcttt tcatgcagcg tgatgcatga ggccctgcac 1320 aatcattaca ctcagaaatc cctgtctctg agtcctggga aa 1362 <210> 12 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of pGX9257 hc: Pseudo-V2L2MD in pGX0003 (sCMV-light chain, hCMV-heavy chain); DMAb-antiPcrV <400> 12 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg 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cctcaagcct gagtgcctca gtcggcgatc gcgtgactat cacctgtcga 1200 gctagccagt ccattaggtc ccatctgaac tggtatcagc agaagcccgg aaaagcacct 1260 aagctgctga tctacggcgc cagcaatctg cagtccggag tgccctctag gttctctggc 1320 agtggatcag ggacagactt tacactgact atttcctctc tgcagcctga ggatttcgca 1380 acttattact gccagcagag caccggcgcc tggaactggt ttggctgtgg aaccaaggtg 1440 gaaatcaaag gcggaggggg ctctggaggg ggcggaagtg acaagaccca cacatgccca 1500 ccctgtccag caccagagct gctgggcggc ccatccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 1560 aaagatacac tgatgattag cagaacaccc gaagtcactt gcgtggtcgt ggacgtgtcc 1620 cacgaggacc ccgaagtcaa gtttaactgg tacgtggacg gcgtcgaggt gcataatgcc 1680 aagaccaaac cccgagagga acagtataac tcaacctaca gggtcgtgag cgtcctgaca 1740 gtgctgcatc aggattggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaagtgtc taataaggct 1800 ctgcctgcac caatcgagaa aactattagc aaggccaaag gccagcctag agaaccacag 1860 gtgtataccc tgcccccttc tcgggaggaa atgacaaaga accaggtcag cctgacttgt 1920 ctggtgaaag gcttctaccc ttctgacatc gctgtggagt gggaaagtaa tggacagcca 1980 gaaaacaatt 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aatctctggc gatactagta agaaacagtt cagcctgaag 300 ctgtctagtg tcacagccgc tgacactgca gtgtactatt gcgcccgcgc tgactgggat 360 cgactgcgcg ctctggatat ttgggggcag ggcactatgg tcaccgtgag cagcgcctca 420 accaaaggcc ctagcgtgtt tccactggca ccctcctcta agtccacctc tgggggcaca 480 gcagccctgg gatgtctggt gaaggactac ttccccgagc ctgtcacagt gtcctggaac 540 tctggagccc tgacctccgg ggtccataca tttcccgctg tgctgcagag ttcagggctg 600 tactctctga gctccgtggt caccgtgcct tctagttcac tgggcacaca gacttatatc 660 tgcaacgtga atcacaaacc ttccaataca aaggtcgaca agaaagtgga accaaaatct 720 tgtgataaga cccatacatg cccaccctgt ccagcaccag agctgctggg agggccatcc 780 gtgttcctgt ttcctccaaa gcccaaagac accctgatga ttagccggac tccagaagtc 840 acctgcgtgg tcgtggacgt gtcccacgag gaccccgaag tcaagttcaa ctggtacgtg 900 gatggcgtcg aggtgcataa tgccaagaca aaaccccgag aggaacagta caactccact 960 tatagggtcg tgtctgtcct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg gaaggagtat 1020 aagtgcaaag tgtctaacaa ggccctgcct gccccaatcg agaagaccat tagcaaggcc 1080 aaaggccagc ctagagaacc acaggtgtac acactgcccc ctagtcggga cgagctgact 1140 aaaaaccagg tcagcctgac ctgtctggtg aagggcttct atccctcaga tatcgctgtg 1200 gagtgggaat ctaatggaca gcctgaaaac aattacaaga ccacaccacc cgtgctggac 1260 agtgatggat cattctttct gtatagcaaa ctgaccgtgg acaagtccag atggcagcag 1320 gggaacgtct ttagttgctc agtgatgcac gaggccctgc acaatcatta cactcagaaa 1380 agcctgtccc tgtctcccgg caaacgagga aggaagagga gaagtggatc aggggccaca 1440 aacttcagcc tgctgaagca ggctggggat gtggaggaaa atcccggccc tatggtcctg 1500 cagacacagg tgtttatcag tctgctgctg tggatttcag gggcctatgg cgacatccag 1560 ctgactcagt cccctagctc cctgagcgcc tccgtcggag atagagtgac tatcacctgt 1620 cgggcttctc agagtattcg cagccatctg aactggtacc agcagaagcc cgggaaagct 1680 cctaagctgc tgatctatgg agcatcaaat ctgcagagcg gagtgccatc ccggttctca 1740 ggcagcggca gcggaaccga ctttacactg actatttcta gtctgcagcc cgaggatttc 1800 gcaacatact attgccagca gtccactggc gcctggaact ggtttggcgg agggaccaaa 1860 gtggaaatca agcgcacagt cgctgcacct agcgtgttca tctttcctcc aagtgacgag 1920 cagctgaagt ctggcaccgc cagtgtggtg tgcctgctga acaatttcta cccaagggaa 1980 gcaaaagtcc agtggaaggt ggataacgcc ctgcagagcg gaaattccca ggagtctgtg 2040 acagaacagg acagtaagga ttcaacttac tctctgagta acaccctgac actgagcaag 2100 gctgactacg agaagcacaa agtgtatgca tgcgaggtca cccaccaggg gctgtccagt 2160 ccagtcacta agtccttcaa taggggagaa tgc 2193 <210> 45 <211> 731 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of pGX9215: Pseudo-Ps10096; DMAb-?Psl operably linked to an IgE leader sequence <400> 45 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Pro Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Leu Ile Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Ala Asp Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val 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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 530 535 540 Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 545 550 555 560 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro 565 570 575 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 580 585 590 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 595 600 605 Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 610 615 620 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 625 630 635 640 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 645 650 655 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 660 665 670 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 675 680 685 Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 690 695 700 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 705 710 715 720 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 725 730 <210> 46 <211> 3006 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of pGX9259: Bispecific Pseudomonas (Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE only pGX0001; DMAb-BiSPA operably linked to a sequence encoding an IgE leader sequence <400> 46 atggactgga catggagaat cctgtttctg gtcgccgccg caactggaac ccacgccgaa 60 gtgcagctgc tggagtcagg gggagggctg gtgcagcccg gcggcagcct gcgactgtct 120 tgcgccgcta gtggcttcac cttcagcagc tatgctatga actgggtccg acaggcacca 180 ggaaagggac tggaatgggt gtctgccatc accatgagtg gaattacagc ttactatact 240 gacgatgtga aggggagatt cacaatctca cgggacaaca gcaaaaatac tctgtacctg 300 cagatgaata gcctgagggc agaggatacc gccgtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360 ctgcctggca cacactacta ttacggaatg gacgtgtggg gccagggaac cacagtcacc 420 gtgtctagtg cttcaacaaa ggggccaagc gtgtttccac tggcaccctc aagcaaatca 480 accagcgggg gcacagcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc cgagcctgtc 540 accgtgtcat ggaacagcgg agccctgacc tccggagtcc acacatttcc tgctgtgctg 600 cagtcctctg ggctgtattc tctgagttca gtggtcacag tcccaagctc ctctctgggc 660 acacagactt acatctgcaa cgtgaatcat aagccatcca atactaaggt cgacaaacgg 720 gtggagccca aatcttgtgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcca ggtccagctg 780 caggagagcg gacctggact ggtgaagcca tccgaaacac tgtctctgac ctgcaccgtg 840 agcggcggca gcatctctcc atattactgg acttggatta ggcagccccc tggcaagtgt 900 ctggagctga tcgggtacat tcacagttca ggctataccg actacaaccc ctccctgaag 960 tctagagtga ctatcagtgg cgatacctca aagaaacagt tctccctgaa actgagctcc 1020 gtcactgctg cagacaccgc cgtgtattac tgcgcacgcg ccgactggga tcgactgcgc 1080 gctctggata tctggggaca ggggactatg gtcaccgtgt ctagtggggg cggagggagt 1140 ggcggagggg gctcaggagg gggcggaagc gggggcggag ggtccgacat tcagctgacc 1200 cagagcccct caagcctgag tgcctcagtc ggcgatcgcg tgactatcac ctgtcgagct 1260 agccagtcca ttaggtccca tctgaactgg tatcagcaga agcccggaaa agcacctaag 1320 ctgctgatct acggcgccag caatctgcag tccggagtgc cctctaggtt ctctggcagt 1380 ggatcaggga cagactttac actgactatt tcctctctgc agcctgagga tttcgcaact 1440 tattactgcc agcagagcac cggcgcctgg aactggtttg gctgtggaac caaggtggaa 1500 atcaaaggcg gagggggctc tggagggggc ggaagtgaca agacccacac atgcccaccc 1560 tgtccagcac cagagctgct gggcggccca tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaaa 1620 gatacactgt atattactag agagcccgaa gtcacttgcg tggtcgtgga cgtgtcccac 1680 gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag 1740 accaaacccc gagaggaaca gtataactca acctacaggg tcgtgagcgt cctgacagtg 1800 ctgcatcagg attggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aagtgtctaa taaggctctg 1860 cctgcaccaa tcgagaaaac tattagcaag gccaaaggcc agcctagaga accacaggtg 1920 tataccctgc ccccttctcg ggaggaaatg acaaagaacc aggtcagcct gacttgtctg 1980 gtgaaaggct tctacccttc tgacatcgct gtggagtggg aaagtaatgg acagccagaa 2040 aacaattata agactacccc acccgtcctg gacagtgatg gctcattctt tctgtacagt 2100 aagctgaccg tggataaatc aaggtggcag cagggaaacg tctttagctg ctccgtgatg 2160 cacgaggccc tgcacaatca ttacacacag aagtctctga gtctgtcacc tggcaagcga 2220 ggaaggaaaa ggagaagcgg gtccggagca accaacttca gcctgctgaa acaggctggg 2280 gacgtggagg aaaatcccgg ccctatggtc ctgcagaccc aggtgtttat ctccctgctg 2340 ctgtggattt ctggggccta cggcgctatc cagatgacac agtctcctag ttcactgtct 2400 gcaagtgtcg gcgacagagt gactatcacc tgtcgggctt cccagggaat tcgcaacgat 2460 ctggggtggt atcagcagaa accaggaaag gctcccaaac tgctgatcta ctcagcaagc 2520 acactgcaga gtggggtgcc atcaagattc tccggatctg ggagtggcac tgacttcacc 2580 ctgactatta gctccctgca gccagaggac ttcgccacct attactgcct gcaggattat 2640 aattacccct ggacatttgg acaggggact aaggtggaga tcaaacggac tgtcgccgct 2700 cccagcgtgt tcatttttcc tccatccgac gaacagctga agagcggaac cgcatccgtg 2760 gtgtgcctgc tgaacaattt ctatcctcgc gaagcaaagg tccagtggaa agtggataac 2820 gccctgcaga gcggcaattc ccaggagtct gtgactgaac aggacagtaa ggattcaacc 2880 tacagcctgt ctagtaccct gacactgtcc aaagctgact atgagaagca taaagtgtac 2940 gcatgtgagg tcacccacca ggggctgtcc agtccagtca ccaagtcttt caataggggc 3000 gaatgc 3006 <210> 47 <211> 1002 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of pGX9259: Bispecific Pseudomonas (Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE only pGX0001; DMAb-BiSPA operably linked to an IgE leader sequence <400> 47 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr 65 70 75 80 Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 145 150 155 160 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 165 170 175 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 180 185 190 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 195 200 205 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 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Claims (24)

1. 하나 이상의 DNA 단클론성 항체(DMAb)를 암호화하는 핵산 분자로서,
   a) 항-PcrV DMAb(DMAb-αPcrV)의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체;
   b) 항-Psl DMAb(DMAb-αPsl)의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체; 및
   c) 이중특이적 항-PcrV 항-Psl DMAb(DMAb-BiSPA)의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 분열 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, 핵산 분자.
3. 제1항에 있어서, 신호 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, 핵산 분자.
4. 제1항에 있어서, a)는,
   a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 12; 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 12; 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   c) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 12; 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   d) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 12; 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   e) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열;
   f) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 단편;
   g) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열; 및
   h) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된, 핵산 분자.
5. 제1항에 있어서, b)는,
   a) 서열번호 20의 아미노산에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   c) 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   d) 서열번호 20의 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   e) 서열번호 19에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열;
   f) 서열번호 19에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 단편;
   g) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열; 및
   h) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된, 핵산 분자.
6. 제1항에 있어서, c)는,
   a) 서열번호 18 및 서열번호 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   b) 서열번호 18 및 서열번호 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   c) 서열번호 18 및 서열번호 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   d) 서열번호 18 및 서열번호 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
   e) 서열번호 17 및 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열;
   f) 서열번호 17 및 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대해 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 단편;
   g) 서열번호 17 및 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열; 및
   h) 서열번호 17 및 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된, 핵산 분자.
7. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 IRES 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, 핵산 분자.
8. 제6항에 있어서, 상기 IRES 요소는 바이러스성 IRES 및 진핵성 IRES로 이루어진 군으로부터 선택된, 핵산 분자.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된 신호 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, 핵산 분자.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 리보핵산 분자인, 핵산 분자.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터를 포함하는, 핵산 분자.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 상기 핵산 분자를 포함하는 조성물.
13. 제12항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함하는, 조성물.
14. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 상기 핵산 분자 또는 제12항 또는 제13항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 치료하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 질환은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염증인, 질환을 치료하는 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 대상체에게 항생제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 질환을 치료하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 항생제가 상기 핵산 분자 또는 조성물의 투여 후 10일 이내에 투여되는, 질환을 치료하는 방법.
18. 대상체에서 바이오필름 형성을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 상기 핵산 분자 또는 제12항 또는 제13항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 바이오필름 형성을 예방 또는 치료하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 바이오필름은 슈도모나스 에루지노사 바이오필름인, 바이오필름 형성을 예방 또는 치료하는 방법.
20. 제18항에 있어서, 상기 대상체에게 항생제를 투여하는 단계를 포함하는, 바이오필름 형성을 예방 또는 치료하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 항생제가 상기 핵산 분자 또는 조성물의 투여 후 10일 이내에 투여되는, 바이오필름 형성을 예방 또는 치료하는 방법.
22. 대상체에서 합성 이중특이적 항체를 생성시키기 위한 조성물로서, 하나 이상의 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자 또는 이의 단편을 포함하되, 상기 이중특이적 항체는 제1 표적 및 제2 표적에 결합하는, 조성물.
23. 제22항에 있어서, 상기 제1 표적은 종양 관련 항원인, 조성물.
24. 제22항에 있어서, 상기 제2 표적은 면역 세포 상의 세포 표면 마커인, 조성물.

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