CN115135672A

CN115135672A - 抗muc1组合物和使用方法

Info

Publication number: CN115135672A
Application number: CN202080097120.1A
Authority: CN
Inventors: E·M·奥斯特塔; D·舍德洛克
Original assignee: Poseida Therapeutics Inc
Current assignee: Poseida Therapeutics Inc
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-09-30
Also published as: JP2023510121A; AU2020407235A1; WO2021127505A1; US20230079955A1; KR20220117915A; EP4077395A1; CA3162246A1

Abstract

所公开的是针对MUC1的抗体、MUC1‑CAR组合物以及使用这些抗体和组合物靶向MUC1蛋白的方法，其中表达MUC1蛋白的细胞可以被例如细胞毒性T细胞靶向且杀死。

Description

抗MUC1组合物和使用方法

相关申请

本申请要求于2019年12月20日提交的美国临时申请号62/951,257的优先权和权益。该申请的内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开内容涉及分子生物学，并且更具体而言，涉及以高亲和力和亲合力特异性结合靶蛋白的抗体和嵌合抗原受体。

通过引用并入的序列表

于2020年12月15日创建且大小为412 KB，命名为“POTH-040_001WO_SequenceListing_ST25”的文件的内容在此通过引用以其整体并入。

背景技术

能够以高亲和力和亲合力识别且结合特定靶蛋白的药剂的开发一直是生物制药行业的焦点。仍然存在比可用选项更小、更可溶和更稳定的更有效药剂的需要。

发明内容

本公开内容提供了包含重链可变区和轻链可变区的分离的抗体，所述重链可变区包含QVQLVQSGAEVKKPGSSVKX₁SCKTSGYAFSNFWMNWVX₂QX₃PGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNX₄KFKGRX₅TLTADKSX₆STAYMELSSLRSEX₇TAVYFCARSYYRSAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 1的X1是V或I，其中SEQ ID NO: 1的X2是R或K，其中SEQ ID NO: 1的X3是A或R，其中SEQ ID NO: 1的X4是G或A，其中SEQ ID NO: 1的X5是V或A，其中SEQ ID NO: 1的X6是T或S，并且其中SEQ ID NO: 1的X7是D或A；所述轻链可变区包含EILLTQSPDFQSVTPKEKVTFTCRASQSIGTSIHWYQQKPNQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLX₁INSX₂ESEDIAX₃YYCQQSNNWPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 2的X1是T或S，其中SEQ ID NO: 2的X2是L或V，并且其中SEQ ID NO: 2的X3是T或D。

分离的抗体可以是人源化的。分离的抗体可以是IgG。分离的抗体可以与人MUC1-C结合。分离的抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、单结构域抗体、VHH、VH、单链可变片段(scFv)、Fab或Fab片段。优选地，分离的抗体是scFv。

重链可变区包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。轻链可变区包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11的氨基酸序列。

scFv可以包含在重链可变区和轻链可变区之间的接头。在一个方面，接头包含SEQID NO: 59的氨基酸序列。

scFv可以包含SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140或SEQ ID NO: 141。在一个方面，scFv包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列。

本公开内容还提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含如本文公开的抗体。优选地，CAR包含如本文公开的scFv。CAR可以包含(a)包含抗原识别区的胞外结构域，其中所述抗原识别区包含至少一个抗MUC1单链可变片段(scFv)；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域；其中所述scFv包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含QVQLVQSGAEVKKPGSSVKX₁SCKTSGYAFSNFWMNWVX₂QX₃PGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNX₄KFKGRX₅TLTADKSX₆STAYMELSSLRSEX₇TAVYFCARSYYRSAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 1的X1是V或I，其中SEQ ID NO: 1的X2是R或K，其中SEQ ID NO: 1的X3是A或R，其中SEQ ID NO: 1的X4是G或A，其中SEQ ID NO: 1的X5是V或A，其中SEQ ID NO: 1的X6是T或S，并且其中SEQ ID NO: 1的X7是D或A；所述轻链可变区包含EILLTQSPDFQSVTPKEKVTFTCRASQSIGTSIHWYQQKPNQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLX₁INSX₂ESEDIAX₃YYCQQSNNWPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 2的X1是T或S，其中SEQID NO: 2的X2是L或V，并且其中SEQ ID NO: 2的X3是T或D。

CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQID NO:5的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQID NO:6的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。CAR的重链可变区可以包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且CAR的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

scFv可以包含在重链可变区和轻链可变区之间的接头。优选地，接头包含SEQ IDNO: 59的氨基酸序列。scFv可以包含SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140或SEQ ID NO: 141。在一个方面，scFv包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列。胞外结构域可以进一步包含信号肽。优选地，信号肽包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列。CAR可以进一步包含在抗原识别区和跨膜结构域之间的铰链区。优选地，铰链区包含SEQ ID NO: 61的氨基酸序列。跨膜结构域可以包含编码CD8跨膜结构域的序列。优选地，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO: 63的氨基酸序列。至少一个共刺激结构域可以包含CD3ζ共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或其组合。在一个方面，至少一个共刺激结构域包含CD3ζ共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域，并且其中所述4-1BB共刺激结构域定位于跨膜结构域和CD3ζ共刺激结构域之间。优选地，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO: 65的氨基酸序列。优选地，CD3ζ共刺激结构域包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。

本公开内容还提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含(a)包含抗原识别区的胞外结构域，其中所述抗原识别区包含至少一个抗MUC1单链可变片段(scFv)；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域；其中所述scFv包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含QVQLVQSGAEVKKPGSSVKX₁SCKTSGYAFSNFWMNWVX₂QX₃PGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNX₄KFKGRX₅TLTADKSX₆STAYMELSSLRSEX₇TAVYFCARSYYRSAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ IDNO:1)的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 1的X1是V或I，其中SEQ ID NO: 1的X2是R或K，其中SEQ ID NO: 1的X3是A或R，其中SEQ ID NO: 1的X4是G或A，其中SEQ ID NO: 1的X5是V或A，其中SEQ ID NO: 1的X6是T或S，并且其中SEQ ID NO: 1的X7是D或A；所述轻链可变区包含EILLTQSPDFQSVTPKEKVTFTCRASQSIGTSIHWYQQKPNQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLX₁INSX₂ESEDIAX₃YYCQQSNNWPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 2的X1是T或S，其中SEQ ID NO: 2的X2是L或V，并且其中SEQ ID NO: 2的X3是T或D，其中所述scFv包含在重链可变区和轻链可变区之间的接头，其中所述胞外结构域包含信号肽，其中所述CAR进一步包含在抗原识别区和跨膜结构域之间的铰链区，其中所述跨膜结构域包括包含CD8跨膜结构域的序列；并且其中所述至少一个共刺激结构域包含CD3ζ共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域，并且其中所述4-1BB共刺激结构域定位于跨膜结构域和CD3ζ共刺激结构域之间。

在一些方面，scFv包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列，信号肽包含SEQ ID NO:57，铰链区包含SEQ ID NO: 61，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO: 63，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO: 65；并且CD3ζ共刺激结构域包含SEQ ID NO: 67。

在一些方面，CAR包含SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ IDNO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29的氨基酸序列。在一些方面，CAR包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。在一些方面，CAR的氨基酸序列由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO；167的核酸序列。在一些方面，CAR的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 167的核酸序列的多核苷酸编码。

本公开内容还提供了多核苷酸，其包含编码如本文公开的抗体的核酸序列；包含编码如本文公开的scFv的核酸序列的多核苷酸；和/或包含编码如本文公开的CAR的核酸序列的多核苷酸。

本公开内容还提供了包含编码如本文公开的CAR的核酸的转座子。在一些方面，核酸序列包括包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的CAR。转座子可以进一步包含编码诱导型半胱天冬酶多肽的核酸、编码嵌合刺激受体的核酸、编码选择基因的核酸、编码治疗剂的核酸或其组合。选择基因可以包含DHFR抗性基因。优选地，转座子是piggyBac转座子。在一些方面，转座子包含SEQ ID NO: 172的核酸序列。本公开内容还提供了包含本文公开的任何多核苷酸或本文公开的任何转座子的质粒或载体。

本公开内容还提供了细胞，其包含如本文公开的抗体、scFv、CAR或转座子中的任一种。本公开内容还提供了细胞群体，其中多个群体被修饰，以表达如本文公开的抗体、scFv、CAR或转座子中的任一种。在一个方面，多个修饰的细胞是多个修饰的免疫细胞。在一个方面，多个修饰的细胞是多个修饰的T细胞。在一个方面，多个细胞群体包含至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的表达CAR的细胞。在一个方面，CAR包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。在一个方面，至少50%的多个修饰的T细胞表达包含CD45RA和CD62L的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD45RO的一种或多种细胞表面标记物。

本公开内容还提供了组合物，其包含如本文公开的抗体、scFv、CAR、转座子、细胞或细胞群体中的任一种。在一个方面，组合物是药物组合物，并且进一步包含药学上可接受的载体。

本公开内容还提供了通过施用治疗有效量的如本文公开的抗体、scFv、CAR、转座子、细胞、细胞群体、组合物或药物组合物中的任一种，来治疗有需要的受试者中的增殖性病症的方法。在一个方面，增殖性病症是癌症。在一个方面，癌症可以是MUC1阳性癌症。在一个方面，癌症是MUC1-C阳性癌症。癌症可以是原发性肿瘤、转移性癌症、多重抗性癌症、进行性肿瘤或复发性癌症。癌症可以是实体瘤。癌症可以是肺癌、脑癌、头颈癌、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌或食管癌。

附图说明

专利或申请文件含有至少一幅彩色绘图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。

图1A-1B是描绘MUC1异源二聚体的结构的一对示意图解。图1A描绘了MUC1经历在SEA结构域(海胆精子蛋白、肠激酶和聚集蛋白结构域)处的自蛋白酶解，以生成因而形成稳定的非共价异源二聚体的两个亚基。MUC1-N和MUC1-C命名法用于指定在切割后亚基的定位，并且将它们与用希腊字符再分类的遗传同种型区分开。图1B提供了MUC1-C亚基的细节。MUC1-C 58氨基酸的细胞外结构域在位置36处(其为N³⁶LT位点)的天冬酰胺上是糖基化的。显示了MUC1-C的C末端的细胞外结构域(MUC1-C/ECD)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 77)。MUC1-C 72氨基酸的细胞质结构域与多种效应物相互作用，并且足以诱导致癌性转化。图1A-1B由Kufe DW，Oncogene，32(9):1073复制。

图2A是描绘全长MUC1 (PDB:2ACM)的带状结构或MUC1-C结构域的预测结构的一对示意图解。

图2B是描绘不同细胞类型中的MUC1表达的一系列图。

图3是描绘不同癌细胞系中的Muc1表达的一系列流式细胞术图。

图4是描绘人源化MUC1-C嵌合抗原受体(CAR)的示例性构建的示意图解。重链(4 +2个变体(H1B和H2B))和轻链(3)序列组装成不同的轻-重链组合，以构建14种新的候选人源化MUC1-C CAR。使用了下述人源化MUC1-C CAR结构：信号肽(CD8α) – 轻链 – 接头 – 重链– 铰链(CD8α) – 跨膜(CD8α) – 细胞内信号传导(4-1BB) – 细胞内信号传导(CD3ζ)。

图5A-5B是描绘本公开内容的人源化抗MUC-1C抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列比对的图解。

图6是包含MUC-1C CAR的本公开内容的piggyBac纳米转座子的示意图解。将MUC1-C CAR亚克隆到三顺反子piggyBac转座子内。转座子含有EF1α启动子 – iC9安全开关 –T2A – MUC1-C CAR (L1-接头-H1B scFv) –T2A – DHFR选择基因构建体。

图7是显示了候选MUC1-C CAR在T细胞的表面上表达的一系列流式细胞术图。所有候选MUC1-C CAR都在piggyBac产生的CAR-T细胞的表面上进行表达且检测出。

图8是显示了MUC1+靶细胞被候选MUC1-C CAR T细胞特异性杀死的图。对于线图中的每种CAR显示了MDA-MB-468的杀死。所有CAR+ T细胞都表达了MUC1+ MDA-MB-468细胞的特异性杀死。模拟转座的T细胞并未特异性杀死靶细胞(蓝线)。

图9是显示了MUC1+靶细胞被候选MUC1-C CAR T细胞特异性杀死的图。对于条形图中的每种CAR显示了每个细胞系的杀死，并且误差条表示一式三份运行的样品的标准差。所有CAR+ T细胞都表达了MUC1+改造的Raji细胞系的特异性杀死，但并不针对MUC1-Raji细胞。模拟转座的T细胞既不杀死Raji，也不杀死改造的Raji靶细胞系。

图10是关于使用鼠异种移植模型，在‘应激’剂量下，候选人源化MUC1-C CAR-T细胞的临床前评估的研究设计的示意图解。

本文引用的所有文件，包括任何交叉引用或有关的专利或申请，在此通过引用以其整体并入本文用于所有目的，除非明确排除或以其它方式限制。任何文件的引用并非承认它是关于本文公开或请求保护的任何发明的现有技术，或者它单独或与任何其它一个或多个参考文献的任何组合教导、暗示或公开任何此类发明。进一步地，就本文件中术语的任何含义或定义与引入作为参考的文件中相同术语的任何含义或定义冲突而言，应以本文件中赋予该术语的含义或定义为准。

具体实施方式

本公开内容提供了组合物，以及关使用这些组合物从而以高亲和力和亲合力识别且结合特定靶蛋白、粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)蛋白的方法。

MUC1

MUC1是占优势地由上皮细胞表达的一种广泛O-糖基化的粘蛋白。分泌的和膜结合的MUC1形成物理屏障，其保护上皮细胞的顶缘免于由毒素、微生物和其它形式的应激引起的损伤，所述应激在与外部环境的界面处发生。如在大多数人癌中发现的，MUC1的异常过表达赋予锚定非依赖性生长和致瘤性。MUC1的过表达赋予对通过氧化性应激和遗传毒性抗癌剂诱导的细胞凋亡的抗性。

人MUC1是在内质网中翻译为单一多肽并且切割成N和C末端亚基(MUC1-N和MUC1-C)的异源二聚体糖蛋白。切割可以通过自催化过程介导。>250 kDa MUC1 N末端(MUC1 N-ter或MUC1-N)亚基含有可变数目的20氨基酸的串联重复，其由于高度保守的变异而是不完全的，并且通过O联聚糖进行修饰。MUC1-N通过与大约23kDa C末端亚基(MUC1 C-ter或MUC1-C)的二聚化而栓系至细胞表面，所述C末端亚基包括58氨基酸的细胞外区域、28氨基酸的跨膜结构域和72氨基酸的细胞质结构域(CD) (图1B)。MUC1-C包含(SEQ ID NO: 76):SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL的氨基酸序列。

本公开内容的组合物可以结合MUC1-C/ECD的加下划线的58氨基酸部分。粗体序列指示CD，并且斜体部分是寡聚体抑制性肽。随着正常上皮向癌的转化，MUC1在胞质溶胶和整个细胞膜上是异常过表达的。细胞膜相关的MUC1通过网格蛋白介导的内吞作用靶向内体。另外，MUC1-C而不是MUC1-N靶向核和线粒体。

本公开内容的组合物可以选择性地结合“表位”MUC1-C/细胞外结构域(MUC1-C/ECD)的一个或多个氨基酸。表位可以是线性的或构象的。如本文使用的，术语“表位”意指所公开的组合物与之特异性结合的一个或多个氨基酸。本公开内容的表位的一个或多个氨基酸可以以线性、非线性、连续或不连续的方式排列。本公开内容的表位可以是“构象的”，其意指当氨基酸以适当折叠的肽、蛋白质或蛋白质复合物的构象呈现时，蛋白质支架以更大的亲和力或更大的选择性与表位的一个或多个氨基酸结合。在某些方面，与构象表位结合的组合物可能并不与线性表位结合。

本公开内容的组合物可以选择性地结合MUC1-C/细胞外结构域(MUC1-C/ECD)的一个或多个氨基酸，所述MUC1-C/细胞外结构域由SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAG (SEQ ID NO: 77)的氨基酸序列限定(参见图1B)。可替代地或另外，组合物选择性地结合变体MUC1-C/细胞外结构域(MUC1-C/ECD)的一个或多个氨基酸。本公开内容的变体MUC1-C/ECD肽可以包括但不限于MUC1-C/ECD-L6A、MUC1-C/ECD-L8A、MUC1-C/ECD-L6,8A、MUC1-C/ECD-Q23V、MUC1-C/ECD-Q26V、MUC1-C/ECD-N36A，如根据SEQ ID NO:76或SEQ ID NO: 77编号的。

本公开内容的组合物可以选择性地结合衍生自MUC1-C/细胞外结构域(MUC1-C/ECD)的下述肽的一个或多个氨基酸：SVVVQLTLAFREGTINVHDVET (“肽1”，SEQ ID NO: 78)、VETQFNQYKTEAASRYNLTISD (“肽2”，SEQ ID NO: 79)、或TISDVSVSDVPFPFSAQSGAG (“肽3”，SEQ ID NO: 80)。

本公开内容的组合物可以选择性地结合MUC1-C/ED中的alpha3 (α3)螺旋或alpha4 (α4)螺旋。在一些实施方案中，MUC1-C/ECD包含SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAG (SEQ ID NO: 77)的氨基酸序列；a3螺旋是粗体的且a4螺旋是粗体且斜体的)。MUC1-C/ED a3螺旋可以包含VHDVETQFNQ (SEQ ID NO: 81)的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。MUC1-C/ED a4螺旋可以包含EAASRYN (SEQ ID NO:82)的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。本公开内容的组合物的表位可以包含SEQID NO: 81或SEQ ID NO: 82的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。表位可以是线性的或构象的。在一些方面，表位是不连续的，任选地包含SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82的氨基酸序列的两个或更多个不连续氨基酸、基本上由其组成或由其组成。

本公开内容的组合物

本公开内容提供了包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与QVQLVQSGAEVKKPGSSVKX₁SCKTSGYAFSNFWMNWVX₂QX₃PGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNX₄KFKGRX₅TLTADKSX₆STAYMELSSLRSEX₇TAVYFCARSYYRSAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1)至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同，其中SEQ ID NO: 1的X1是V或I，其中SEQ ID NO: 1的X2是R或K，其中SEQ ID NO: 1的X3是A或R，其中SEQ ID NO: 1的X4是G或A，其中SEQ IDNO: 1的X5是V或A，其中SEQ ID NO: 1的X6是T或S，并且其中SEQ ID NO: 1的X7是D或A；所述轻链可变区包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与EILLTQSPDFQSVTPKEKVTFTCRASQSIGTSIHWYQQKPNQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLX₁INSX₂ESEDIAX₃YYCQQSNNWPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:2)至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同，其中SEQ ID NO: 2的X1是T或S，其中SEQ IDNO: 2的X2是L或V，并且其中SEQ ID NO: 2的X3是T或D。

优选地，重链可变区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中X2是R或K，其中X3是A或R，其中X4是G或A，其中X5是V或A，其中X6是T或S，并且其中X7是D或A。优选地，轻可变链可变区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中X1是T或S，其中X2是L或V，并且其中X3是T或D。

在一些方面，抗体结合人MUC1多肽(UniProt登录号P15941-1)，所述人MUC1多肽包含SEQ ID NO: 160、基本上由其组成或由其组成。在一个方面，抗体结合人MUC1-C多肽，其包含SEQ ID NO: 76、基本上由其组成或由其组成。在另一个方面，抗体结合人MUC1-N多肽(MUC1受体的亚基，也称为α链、成熟链)，其包含SEQ ID NO: 161、基本上由其组成或由其组成。

在一些方面，抗体结合人MUC1-C细胞外结构域(ED)，其包含SEQ ID NO: 77、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，抗体以比人全长MUC1多肽(SEQ ID NO: 160)更高的亲和力结合MUC1-C ED (SEQ ID NO: 77)。在一些方面，抗体以比MUC1-N多肽(SEQ ID NO:161)更高的亲和力结合人MUC1-C ED (SEQ ID NO: 77)。在一些方面，抗体结合MUC1-C ED(SEQ ID NO: 77)，并且不结合人全长MUC1多肽(SEQ ID NO: 160)。在一些方面，抗体结合人MUC1-C ED (SEQ ID NO: 77)，并且不结合MUC1-N多肽(SEQ ID NO: 161)。

在一些实施方案中，人可变重链构架受体包含SEQ ID NO: 162的IGHV1-69 08的多肽、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，人可变轻链构架受体包含SEQ ID NO: 163的IGKV6-21 02的多肽、基本上由其组成或由其组成。

重链可变区包括包含SEQ ID NO: 69的互补决定区1 (CDRH1)。重链可变区包括包含SEQ ID NO: 70或SEQ ID NO: 75的CDRH2。重链可变区包括包含SEQ ID NO: 71的CDRH3。

轻链可变区包括包含SEQ ID NO: 72的互补决定区1 (CDRL1)。轻链可变区包括包含SEQ ID NO: 73的CDRL2。轻链可变区包括包含SEQ ID NO: 74的CDRL3。

重链可变区包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO: 8至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一个优选的方面，重链可变区包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ IDNO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

重链可变区由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 164至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一个优选的方面，重链可变区由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 164的核酸序列，基本上由其组成或由其组成。

轻链可变区包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一个优选的方面，轻链可变区包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

轻链可变区由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 165至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一个优选的方面，轻链可变区由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 54、SEQ IDNO: 55、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 165的核酸序列，基本上由其组成或由其组成。

抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。抗体的重链可变区可以包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在一些方面，抗体包含人或人源化序列。在一些方面，CDR包含人源化序列。在一些方面，可变区包含人源化序列。在一些方面，构架区包含人源化序列。构架区可以进一步包含一种或多种序列变异，以降低免疫原性或改善抗体的产生。在一些方面，抗体是IgG。

抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、单结构域抗体、VHH、VH、单链可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)或Fab片段。在一个优选的方面，抗体是scFv。

本公开内容提供了scFv组合物，以及使用这些组合物从而以高亲和力和亲合力识别且结合特定靶蛋白(例如，MUC1)的方法。scFv组合物可以包含抗MUC1抗体的重链可变区和轻链可变区。

scFv可以包含在重链可变区和轻链可变区之间的接头多肽。在一些实施方案中，接头多肽包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。接头多肽可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 60的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。

scFv包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一个优选的方面，scFv包含以下的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ IDNO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29。

scFv由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ IDNO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ IDNO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 166。在一个优选的方面，scFv由核酸编码，所述核酸包含以下的核酸序列、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO: 30、SEQID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO: 166。

本公开内容还提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包括包含抗原识别区的胞外结构域，其中所述抗原识别区包含本公开内容的至少一个抗MUC1单链可变片段(scFv)；跨膜结构域和包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域。CAR可以进一步包含在抗原识别结构域和跨膜结构域之间的铰链区。抗原识别区可以包含至少两个抗MUC1 scFv。抗原识别区可以包含至少三个抗MUC1 scFv。在一个方面，本公开内容的CAR是包含特异性结合两种不同抗原的至少两个scFv的双特异性CAR。

胞外结构域可以包含信号肽。信号肽可以包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。在一个优选的方面，信号肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：人CD8 α (CD8α)信号肽(SP)或其一部分。人CD8α SP包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQID NO: 57至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。优选地，人CD8α SP包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

人CD8α SP由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 58至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。优选地，人CD8α SP由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

铰链结构域或铰链区可以包含人CD8α、IgG4、CD4序列或其组合。在一个优选的方面，铰链可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：人CD8 α (CD8α)铰链或其一部分。人CD8a铰链包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 61至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。优选地，人CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO: 61的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

人CD8α铰链由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 168至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。优选地，人CD8α铰链结构域由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 168的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。

跨膜结构域可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。优选地，跨膜结构域可以包含人CD8 α (CD8α)跨膜结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。CD8a跨膜结构域包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 63至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。优选地，人CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO: 63的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

CD8α跨膜结构域由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 64或SEQ ID NO: 169至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。优选地，CD8α跨膜结构域由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 64或SEQ ID NO: 169的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。

至少一个共刺激结构域可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：人4-1BB、CD28、CD3 zeta (CD3ζ)、CD40、ICOS、MyD88、OX-40细胞内结构域或其任何组合。优选地，至少一个共刺激结构域包含CD3ζ、4-1BB共刺激结构域或其组合。

4-1BB细胞内结构域包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 65至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。优选地，4-1BB细胞内结构域包含SEQ ID NO: 65的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

4-1BB细胞内结构域由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 170至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。优选地，4-1BB细胞内结构域由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 170的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。

CD3ζ细胞内结构域包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 67至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同。优选地，CD3ζ细胞内结构域包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

CD3ζ细胞内结构域由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 68或SEQ ID NO: 171至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。优选地，CD3ζ细胞内结构域由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 68或SEQ ID NO: 171的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。

本公开内容的组合物(例如，抗MUC1 scFv、包含抗MUC1 scFv的CAR)可以以选自以下的至少一种亲和力K_D结合人MUC1：小于或等于10⁻⁹M、小于或等于10⁻¹⁰M、小于或等于10⁻ ¹¹M、小于或等于10⁻¹²M、小于或等于10⁻¹³M、小于或等于10⁻¹⁴M、以及小于或等于10⁻¹⁵M。K_D可以通过任何手段进行确定，所述手段包括但不限于表面等离振子共振。

包含抗MUC1 scFv或含有抗MUC1 scFv的CAR的组合物可以掺入如本文详细描述的细胞递送组合物(例如转座子或载体)内，并且任选地，可以掺入细胞内。

通过接触和/或掺入本公开内容的组合物进行修饰的细胞(例如，免疫细胞和细胞毒性免疫细胞)可以特异性地靶向表达MUC1的细胞。本公开内容的方法的优选方面使用MUC1-C scFv结合剂来重定向细胞毒性细胞类型，以介导表达MUC1-C的细胞(MUC1-C+细胞)的破坏。例如，治疗增殖性病症如癌症。表达本公开内容的抗MUC1 scFv或包含抗MUC1 scFv的CAR的修饰的细胞证实改善的体内持久性和抗肿瘤功效。在一些方面，与表达鼠抗MUC1scFv或包含鼠抗MUC1 scFv的CAR的细胞相比，表达本公开内容的抗MUC1 scFv或包含抗MUC1 scFv的CAR的修饰的细胞证实改善的效力和减少的免疫原性。在一些方面，与表达包含SEQ ID NO: 176的重链可变区和SEQ ID NO: 177的轻链可变区的scFv或包含scFv的CAR的细胞相比，表达本公开内容的抗MUC1 scFv或包含抗MUC1 scFv的CAR的修饰的细胞证实改善的效力和减少的免疫原性。在一些方面，与表达包含SEQ ID NO: 178的重链可变区和SEQ ID NO: 179的轻链可变区的scFv或包含scFv的CAR的细胞相比，表达本公开内容的抗MUC1 scFv或包含抗MUC1 scFv的CAR的修饰的细胞证实改善的效力和减少的免疫原性。在一些方面，与表达包含SEQ ID NO: 180的重链可变区和SEQ ID NO: 181的轻链可变区的scFv或包含其的CAR的细胞相比，表达本公开内容的抗MUC1 scFv或包含抗MUC1 scFv的CAR的修饰的细胞证实改善的效力和减少的免疫原性。

“L1H1” scFv包含轻链可变区“L1”，其具有由SEQ ID NO: 54的核酸序列编码的SEQ ID NO: 9的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H1”，其具有由SEQ ID NO: 48的核酸序列编码的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。“L1H1” scFv包含由SEQ ID NO: 142的核酸序列编码的SEQ ID NO: 124的氨基酸序列。“L1H1” CAR包含由SEQ ID NO: 30的核酸序列编码的SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。

“L1H1B” scFv包含轻链可变区“L1”，其具有由SEQ ID NO: 54或SEQ ID NO: 165的核酸序列编码的SEQ ID NO: 9的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H1B”，其具有由SEQID NO: 49或SEQ ID NO: 164的核酸序列编码的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。“L1H1B”scFv包含由SEQ ID NO: 143或SEQ ID NO: 166的核酸序列编码的SEQ ID NO: 125的氨基酸序列。“L1H1B” CAR包含由SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 167的核酸序列编码的SEQ IDNO: 13的氨基酸序列。

“L1H2” scFv包含轻链可变区“L1”，其具有由SEQ ID NO: 54的核酸序列编码的SEQ ID NO: 9的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H2”，其具有由SEQ ID NO: 50的核酸序列编码的SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。“L1H2” scFv包含由SEQ ID NO: 144的核酸序列编码的SEQ ID NO: 126的氨基酸序列。“L1H2” CAR包含由SEQ ID NO: 32的核酸序列编码的SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。

“L1H2B” scFv包含轻链可变区“L1”，其具有由SEQ ID NO: 54的核酸序列编码的SEQ ID NO: 9的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H2B”，其具有由SEQ ID NO: 51的核酸序列编码的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。“L1H2B” scFv包含由SEQ ID NO: 145的核酸序列编码的SEQ ID NO: 127的氨基酸序列。“L1H2B” CAR包含由SEQ ID NO: 33的核酸序列编码的SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。

“L1H3” scFv包含轻链可变区“L1”，其具有由SEQ ID NO: 54的核酸序列编码的SEQ ID NO: 9的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H3”，其具有由SEQ ID NO: 52的核酸序列编码的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。“L1H3” scFv包含由SEQ ID NO: 146的核酸序列编码的SEQ ID NO: 128的氨基酸序列。“L1H3” CAR包含由SEQ ID NO: 34的核酸序列编码的SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。

“L1H4” scFv包含轻链可变区“L1”，其具有由SEQ ID NO: 54的核酸序列编码的SEQ ID NO: 9的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H4”，其具有由SEQ ID NO: 53的核酸序列编码的SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。“L1H4” scFv包含由SEQ ID NO: 147的核酸序列编码的SEQ ID NO: 129的氨基酸序列。“L1H4” CAR包含由SEQ ID NO: 35的核酸序列编码的SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。

“L2H1” scFv包含轻链可变区“L2”，其具有由SEQ ID NO: 55的核酸序列编码的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H1”，其具有由SEQ ID NO: 48的核酸序列编码的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。“L2H1” scFv包含由SEQ ID NO: 148的核酸序列编码的SEQ ID NO: 130的氨基酸序列。“L2H1” CAR包含由SEQ ID NO: 36的核酸序列编码的SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。

“L2H1B” scFv包含轻链可变区“L2”，其具有由SEQ ID NO: 55的核酸序列编码的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H1B”，其具有由SEQ ID NO: 49的核酸序列编码的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。“L2H1B” scFv包含由SEQ ID NO: 149的核酸序列编码的SEQ ID NO: 131的氨基酸序列。“L2H1B” CAR包含由SEQ ID NO: 37的核酸序列编码的SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。

“L2H2” scFv包含轻链可变区“L2”，其具有由SEQ ID NO: 55的核酸序列编码的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H2”，其具有由SEQ ID NO: 50的核酸序列编码的SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。“L2H2” scFv包含由SEQ ID NO: 150的核酸序列编码的SEQ ID NO: 132的氨基酸序列。“L2H2” CAR包含由SEQ ID NO: 38的核酸序列编码的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列。

“L2H2B” scFv包含轻链可变区“L2”，其具有由SEQ ID NO: 55的核酸序列编码的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H2B”，其具有由SEQ ID NO: 51的核酸序列编码的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。“L2H2B” scFv包含由SEQ ID NO: 151的核酸序列编码的SEQ ID NO: 133的氨基酸序列。“L2H2B” CAR包含由SEQ ID NO: 39的核酸序列编码的SEQ ID NO: 21的氨基酸序列。

“L2H3” scFv包含轻链可变区“L2”，其具有由SEQ ID NO: 55的核酸序列编码的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H3”，其具有由SEQ ID NO: 52的核酸序列编码的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。“L2H3” scFv包含由SEQ ID NO: 152的核酸序列编码的SEQ ID NO: 134的氨基酸序列。“L2H3” CAR包含由SEQ ID NO: 40的核酸序列编码的SEQ ID NO: 22的氨基酸序列。

“L2H4” scFv包含轻链可变区“L2”，其具有由SEQ ID NO: 55的核酸序列编码的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H4”，其具有由SEQ ID NO: 53的核酸序列编码的SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。“L2H4” scFv包含由SEQ ID NO: 153的核酸序列编码的SEQ ID NO: 135的氨基酸序列。“L2H4” CAR包含由SEQ ID NO: 41的核酸序列编码的SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。

“L3H1” scFv包含轻链可变区“L3”，其具有由SEQ ID NO: 56的核酸序列编码的SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H1”，其具有由SEQ ID NO: 48的核酸序列编码的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。“L3H1” scFv包含由SEQ ID NO: 154的核酸序列编码的SEQ ID NO: 136的氨基酸序列。“L3H1” CAR包含由SEQ ID NO: 42的核酸序列编码的SEQ ID NO: 24的氨基酸序列。

“L3H1B” scFv包含轻链可变区“L3”，其具有由SEQ ID NO: 56的核酸序列编码的SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H1B”，其具有由SEQ ID NO: 49的核酸序列编码的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。“L3H1B” scFv包含由SEQ ID NO: 155的核酸序列编码的SEQ ID NO: 137的氨基酸序列。“L3H1B” CAR包含由SEQ ID NO: 43的核酸序列编码的SEQ ID NO: 25的氨基酸序列。

“L3H2” scFv包含轻链可变区“L3”，其具有由SEQ ID NO: 56的核酸序列编码的SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H2”，其具有由SEQ ID NO: 50的核酸序列编码的SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。“L3H2” scFv包含由SEQ ID NO: 156的核酸序列编码的SEQ ID NO: 138的氨基酸序列。“L3H2” CAR包含由SEQ ID NO: 44的核酸序列编码的SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。

“L3H2B” scFv包含轻链可变区“L3”，其具有由SEQ ID NO: 56的核酸序列编码的SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H2B”，其具有由SEQ ID NO: 51的核酸序列编码的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。“L3H2B” scFv包含由SEQ ID NO: 157的核酸序列编码的SEQ ID NO: 139的氨基酸序列。“L3H2B” CAR包含由SEQ ID NO: 45的核酸序列编码的SEQ ID NO: 27的氨基酸序列。

“L3H3” scFv包含轻链可变区“L3”，其具有由SEQ ID NO: 56的核酸序列编码的SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H3”，其具有由SEQ ID NO: 52的核酸序列编码的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。“L3H3” scFv包含由SEQ ID NO: 158的核酸序列编码的SEQ ID NO: 140的氨基酸序列。“L3H3” CAR包含由SEQ ID NO: 46的核酸序列编码的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列。

“L3H4” scFv包含轻链可变区“L3”，其具有由SEQ ID NO: 56的核酸序列编码的SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；并且包含重链可变区“H4”，其具有由SEQ ID NO: 53的核酸序列编码的SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。“L3H4” scFv包含由SEQ ID NO: 159的核酸序列编码的SEQ ID NO: 141的氨基酸序列。“L3H4” CAR包含由SEQ ID NO: 47的核酸序列编码的SEQ ID NO: 29的氨基酸序列。

表1A和表1B显示了本公开内容的示例性MUC-1C CAR组分和序列。

表1. 本公开内容的MUC-1C CAR组分和氨基酸序列

表1B. 本公开内容的MUC-1C CAR组分和核酸序列

MUC1C CAR组分	SEQ ID NO:
		"H1"人源化重链可变区	48
"H1B"人源化重链可变区	49、164
		"H2"人源化重链可变区	50
"H2B"人源化重链可变区	51
		"H3"人源化重链可变区	52
"H4"人源化重链可变区	53
		"L1"人源化轻链可变区	54、165
"L2"人源化轻链可变区	55
		"L3"人源化轻链可变区	56
"L1H1" scFv	142
		"L1H1B" scFv	143、166
"L1H2" scFv	144
		"L1H2B" scFv	145
"L1H3" scFv	146
		"L1H4" scFv	147
"L2H1" scFv	148
		"L2H1B" scFv	149
"L2H2" scFv	150
		"L2H2B" scFv	151
"L2H3" scFv	152
		"L2H4" scFv	153
"L3H1" scFv	154
		"L3H1B" scFv	155
"L3H2" scFv	156
		"L3H2B" scFv	157
"L3H3" scFv	158
		"L3H4" scFv	159
"L1H1" CAR	30
		"L1H1B" CAR	31、167
"L1H2" CAR	32
		"L1H2B" CAR	33
"L1H3" CAR	34
		"L1H4" CAR	35
"L2H1" CAR	36
		"L2H1B" CAR	37
"L2H2" CAR	38
		"L2H2B" CAR	39
"L2H3" CAR	40
		"L2H4" CAR	41
"L3H1" CAR	42
		"L3H1B" CAR	43
"L3H2" CAR	44
		"L3H2B" CAR	45
"L3H3" CAR	46
		"L3H4" CAR	47
CD8a信号肽	58
		接头序列	60
CD8a铰链	62、168
		CD8a跨膜结构域	64、169
41BB ICS	66、170
		CD3z ICS	68、171
"L1H1B" CAR转座子序列	175

本公开内容的细胞和修饰的细胞

本公开内容的细胞和修饰的细胞可以为哺乳动物细胞。优选地，细胞和修饰的细胞是人细胞。本公开内容的细胞和修饰的细胞可以为免疫细胞。本公开内容的免疫细胞可以包含淋巴样祖细胞、天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(T细胞)、干性记忆T细胞(T_SCM细胞)、中枢记忆T细胞(T_CM)、干细胞样T细胞、B淋巴细胞(B细胞)、抗原呈递细胞(APC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、髓样祖细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、红细胞、红血细胞(RBC)、巨核细胞或破骨细胞。

免疫前体细胞可以包含可以分化成一种或多种类型的免疫细胞的任何细胞。免疫前体细胞可以包含可以自我更新并发育成免疫细胞的多能干细胞。免疫前体细胞可以包含造血干细胞(HSC)或其后代。免疫前体细胞可以包含可以发育成免疫细胞的前体细胞。免疫前体细胞可以包含造血祖细胞(HPC)。

造血干细胞(HSC)是多潜能、自我更新的细胞。来自淋巴样和髓样谱系的所有分化的血细胞都起于HSC。HSC可以在成人骨髓、外周血、动员的外周血、腹膜透析流出液和脐带血中找到。

HSC可以分离自或衍生自原代或培养的干细胞。HSC可以分离自或衍生自胚胎干细胞、多潜能干细胞、多能干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。

免疫前体细胞可以包含HSC或HSC后代细胞。HSC后代细胞的非限制性实例包括多潜能干细胞、淋巴样祖细胞、天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(T细胞)、B淋巴细胞(B细胞)、髓样祖细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。

通过所公开的方法产生的HSC可以保留“原始”干细胞的特征，所述干细胞在分离自或衍生自成体干细胞并且定型至单一谱系时，共享胚胎干细胞的特性。例如，通过所公开的方法产生的“原始”HSC在分裂之后保留其“干性”，并且不分化。因而，作为过继细胞疗法，通过所公开的方法产生的“原始”HSC不仅补充其数目，而且在体内扩增。当作为单一剂量施用时，通过所公开的方法产生的“原始”HSC可以是治疗上有效的。

原始HSC可以为CD34+。原始HSC可以为CD34+和CD38-。原始HSC可以为CD34+、CD38-和CD90+。原始HSC可以为CD34+、CD38-、CD90+和CD45RA-。原始HSC可以为CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-和CD49f+。原始HSC可以为CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-和CD49f+。

原始HSC、HSC和/或HSC后代细胞可以根据所公开的方法进行修饰，以表达外源序列(例如，嵌合抗原受体或治疗性蛋白质)。修饰的原始HSC、修饰的HSC和/或修饰的HSC后代细胞可以向前分化，以产生修饰的免疫细胞，包括但不限于修饰的T细胞、修饰的天然杀伤细胞和/或修饰的B细胞。

修饰的免疫或免疫前体细胞可以为NK细胞。NK细胞可以为从淋巴样祖细胞分化的细胞毒性淋巴细胞。修饰的NK细胞可以衍生自修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)或修饰的HSC。在一些方面，未活化的NK细胞衍生自CD3耗竭的白细胞去除术(leukapheresis) (含有CD14/CD19/CD56+细胞)。

修饰的免疫或免疫前体细胞可以为B细胞。B细胞是在细胞表面上表达B细胞受体的一类淋巴细胞。B细胞受体与特异性抗原结合。修饰的B细胞可以衍生自修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)或修饰的HSC。

本公开内容的修饰的T细胞可以衍生自修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)或修饰的HSC。与传统的生物制品和化学治疗剂不同，所公开的修饰的T细胞能够在抗原识别后快速繁殖，从而潜在地避免了重复治疗的需要。为了实现这一点，在一些实施方案中，修饰的T细胞不仅驱动初始应答，而且还作为稳定的活记忆T细胞群体持续存在于患者中，以预防潜在的复发。可替代地，在一些方面，当不需要时，修饰的T细胞并不持续存在于患者中。

大量努力已集中于并不通过抗原非依赖性(强直)信号传导导致T细胞耗尽的抗原受体分子的开发，以及含有早期记忆T细胞，尤其是干细胞记忆(T_SCM)或干细胞样T细胞的修饰T细胞产物的开发。本公开内容的干细胞样修饰的T细胞显示出最大的自我更新能力和多潜能能力，以衍生中枢记忆(T_CM) T细胞或T_CM样细胞、效应记忆(T_EM)和效应T细胞(T_E)，从而产生更好的肿瘤根除和长期修饰的T细胞移植物植入。分化的线性途径可能负责生成这些细胞：幼稚T细胞(T_N) > T_SCM > T_CM > T_EM > T_E > T_TE，由此T_N是直接产生T_SCM的亲代前体细胞，然后，其依次又直接产生T_CM等。本公开内容的T细胞的组合物可以包含每个亲代T细胞子集中的一个或多个，其中T_SCM细胞是最丰富的(例如，T_SCM > T_CM > T_EM > T_E > T_TE)。

免疫细胞前体可以分化成或能够分化成早期记忆T细胞、干细胞如T细胞、幼稚T细胞(T_N)、T_SCM、T_CM、T_EM、T_E或T_TE。免疫细胞前体可以为本公开内容的原始HSC、HSC或HSC后代细胞。免疫细胞可以为早期记忆T细胞、干细胞如T细胞、幼稚T细胞(T_N)、T_SCM、T_CM、T_EM、T_E或T_TE。

本公开内容的方法可以修饰和/或产生修饰的T细胞群体，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达早期记忆T细胞的一种或多种细胞表面标记物。修饰的早期记忆T细胞群体包含多个修饰的干细胞样T细胞。修饰的早期记忆T细胞群体包含多个修饰的T_SCM细胞。修饰的早期记忆T细胞群体包含多个修饰的T_CM细胞。

本公开内容的方法可以修饰和/或产生修饰的T细胞群体，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达干细胞样T细胞的一种或多种细胞表面标记物。修饰的干细胞样T细胞群体包含多个修饰的T_SCM细胞。修饰的干细胞样T细胞群体包含多个修饰的T_CM细胞。

在一些方面，群体中至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达干性记忆T细胞(T_SCM)或T_SCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中一种或多种细胞表面标记物包含CD45RA和CD62L。细胞表面标记物可以包含CD62L、CD45RA、CD28、CCR7、CD127、CD45RO、CD95、CD95和IL-2Rβ中的一种或多种。细胞表面标记物可以包含CD45RA、CD95、IL-2Rβ、CCR7和CD62L中的一种或多种。

在一些方面，群体中至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的多个修饰的T细胞，表达中枢记忆T细胞(T_CM)或T_CM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中一种或多种细胞表面标记物包含CD45RO和CD62L。细胞表面标记物可以包含CD45RO、CD95、IL-2Rβ、CCR7和CD62L中的一种或多种。

本公开内容的方法可以修饰和/或产生修饰的T细胞群体，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达幼稚T细胞(T_N)的一种或多种细胞表面标记物。细胞表面标记物可以包含CD45RA、CCR7和CD62L中的一种或多种。

本公开内容的方法可以修饰和/或产生修饰的T细胞群体，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达效应T细胞(修饰的T_EFF)的一种或多种细胞表面标记物。细胞表面标记物可以包含CD45RA、CD95和IL-2Rβ中的一种或多种。

本公开内容的方法可以修饰和/或产生修饰的T细胞群体，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达干细胞样T细胞、干性记忆T细胞(T_SCM)或中枢记忆T细胞(T_CM)的一种或多种细胞表面标记物。

群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达干细胞样T细胞、干性记忆T细胞(T_SCM)或中枢记忆T细胞(T_CM)的一种或多种细胞表面标记物。在一些方面，CAR包含由SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 167的核酸序列编码的SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。

群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约70%至约99%、约75%至约95%、或约85%至约95%的修饰的细胞群体，表达包含CD34的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+)。

群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约45%至约90%、约50%至约80%、或约65%至约75%的修饰的细胞群体，表达包含CD34的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+和CD38-)。

群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约0.2%至约40%、约0.2%至约30%、约0.2%至约2%、或0.5%至约1.5%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+、CD38-和CD90+)。

群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38和CD45RA的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约0.2%至约40%、约0.2%至约30%、约0.2%至约2%、或0.5%至约1.5%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38和CD45RA的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA)。

群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.07%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34、CD90和CD49f的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38和CD45RA的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约0.02%至约30%、约0.02%至约2%、约0.04%至约2%、或约0.04%至约1%的修饰的细胞群体，表达包含CD34、CD90和CD49f的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38和CD45RA的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA和CD49f+)。

群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.07%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD45RA的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约0.2%至约5%、约0.2%至约3%、或约0.4%至约3%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD45RA的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+、CD90+和CD45RA-)。

产生和/或扩增免疫细胞或免疫前体细胞(例如，所公开的修饰的T细胞)的组合物和方法、以及用于维持或增强免疫细胞或免疫前体细胞(例如，所公开的修饰的T细胞)的细胞活力水平和/或干样表型的缓冲液，在本文其它地方公开，并且在美国专利号10,329,543和PCT公开号WO 2019/173636中更详细地公开。

本公开内容的细胞和修饰的细胞可以为体细胞。本公开内容的细胞和修饰的细胞可以为分化的细胞。本公开内容的细胞和修饰的细胞可以为自体细胞或同种异体细胞。对同种异体细胞进行改造，以预防在施用于受试者之后对移植物植入的不良反应。同种异体细胞可以为任何类型的细胞。同种异体细胞可以为干细胞或可以衍生自干细胞。同种异体细胞可以为分化的体细胞。

表达嵌合抗原受体的方法

本公开内容提供了在细胞的表面上表达CAR的方法。该方法包括(a)获得细胞群体；(b)在足以将CAR转移跨越细胞群体中的至少一种细胞的细胞膜的条件下，使细胞群体与包含CAR或编码CAR的序列的组合物接触，从而生成修饰的细胞群体；(c)在适合于整合编码CAR的序列的条件下，培养修饰的细胞群体；(d)从在细胞表面上表达CAR的修饰的细胞群体扩增和/或选择至少一种细胞。

在一些方面，细胞群体可以包含白细胞和/或CD4+和CD8+白细胞。细胞群体可以包含以优化比率的CD4+和CD8+白细胞。CD4+与CD8+白细胞的优化比率并不在体内天然发生。细胞群体可以包含肿瘤细胞。

在一些方面，足以将CAR或编码CAR的序列、转座子或载体转移跨越细胞群体中的至少一种细胞的细胞膜的条件，包括在特定电压下施加一种或多种电脉冲、缓冲液和一种或多种补充因子中的至少一种。在一些方面，适合于整合编码CAR的序列的条件包括缓冲液和一种或多种补充因子中的至少一种。

缓冲液可以包含PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲液或其任何组合。一种或多种补充因子可以包含(a)重组人细胞因子、趋化因子、白介素或其任何组合；(b)盐、矿物质、代谢物或其任何组合；(c)细胞培养基；(d)细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导、一种或多种细胞凋亡途径或其组合的抑制剂；以及(e)修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白介素或其任何组合可以包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1 α/IL-1F1、IL-1 β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异源二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32 β、IL-32 γ、IL-33、LAP (TGF-β 1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可以包含HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代物、抗生素、pH调节剂、Earle’s盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS Supplement、KCL、MgCl₂、Na₂HPO₄、NAH₂PO₄、乳糖酸钠、甘露糖醇、琥珀酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO₃)₂、Tris/HCl、K₂HPO₄、KH₂PO₄、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5或其任何组合。细胞培养基可以包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导、一种或多种细胞凋亡途径或其组合的抑制剂包含以下的抑制剂：TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNApol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A、糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)抑制剂(例如TWS119)或其任何组合。此类抑制剂的实例可以包含巴弗洛霉素、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包含pH调节剂、DNA结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、具有或不具有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。

扩增和选择步骤可以并发或序贯地发生。扩增可以在选择之前发生。扩增可以在选择之后发生，并且任选地，进一步(即第二)选择可以在扩增之后发生。并发扩增和选择可以是同时的。扩增和/或选择步骤可以进行10至14天的时期，包括端点在内。

扩增可以包含使修饰的细胞群体的至少一种细胞与抗原接触，以通过CAR刺激至少一种细胞，从而生成扩增的细胞群体。抗原可以在基底的表面上呈递。基底可以具有任何形式，包括但不限于表面、孔、珠或多个珠以及基质。基底可以进一步包含顺磁性或磁性组分。抗原可以在基底的表面上呈递，其中所述基底是磁珠，并且其中磁体可以用于从修饰且扩增的细胞群体中去除或分离磁珠。抗原可以在细胞或人工抗原呈递细胞的表面上呈递。人工抗原呈递细胞可以包括但不限于肿瘤细胞和干细胞。

在其中转座子或载体包含选择基因的一些方面，选择步骤包括使修饰的细胞群体中的至少一种细胞与选择基因对其赋予抗性的化合物接触，从而将表达选择基因的细胞鉴定为从选择中存活，并且将未能表达选择基因的细胞鉴定为未能从选择步骤中存活。

本公开内容提供了组合物，其包含本文所述的方法的修饰、扩增且选择的细胞群体。

用于在细胞的表面上表达CAR的方法的更详细描述公开于PCT公开号WO 2019/049816和PCT/US2019/049816中。

本公开内容提供了细胞或细胞群体，其中所述细胞构成组合物，所述组合物包含(a)诱导型转基因构建体，其包含编码诱导型启动子的序列和编码转基因的序列，以及(b)受体构建体，其包含编码组成型启动子的序列和编码外源受体例如CAR的序列，其中在(a)的构建体和(b)的构建体整合到细胞的基因组序列内后，表达外源受体，并且其中外源受体在结合配体或抗原后转导细胞内信号，所述细胞内信号直接或间接靶向调控诱导型转基因(a)的表达的诱导型启动子，以修饰基因表达。

组合物可以通过降低基因表达来修饰基因表达。组合物可以通过瞬时修饰基因表达(例如，对于配体与外源受体结合的持续时间)来修饰基因表达。组合物可以剧烈地修饰基因表达(例如，配体与外源受体可逆地结合)。组合物可以长期修饰基因表达(例如，配体与外源受体不可逆地结合)。

外源受体可以包含相对于细胞的基因组序列的内源受体。示例性受体包括但不限于细胞内受体、细胞表面受体、跨膜受体、配体门控离子通道和G蛋白偶联受体。

外源受体可以包含非天然存在的受体。非天然存在的受体可以为合成、修饰、重组、突变型或嵌合受体。非天然存在的受体可以包含分离自或衍生自T细胞受体(TCR)的一种或多种序列。非天然存在的受体可以包含分离自或衍生自支架蛋白的一种或多种序列。在一些方面，包括其中非天然存在的受体不包含跨膜结构域的那些方面，非天然存在的受体与第二跨膜、膜结合和/或细胞内受体相互作用，所述第二跨膜、膜结合和/或细胞内受体在与非天然存在的受体接触之后，转导细胞内信号。非天然存在的受体可以包含跨膜结构域。非天然存在的受体可以与转导细胞内信号的细胞内受体相互作用。非天然存在的受体可以包含细胞内信号传导结构域。非天然存在的受体可以为嵌合配体受体(CLR)。CLR可以为嵌合抗原受体(CAR)。

编码诱导型启动子的序列包含编码NFĸB启动子的序列、编码干扰素(IFN)启动子的序列或编码白介素-2启动子的序列。在一些方面，IFN启动子是IFNγ启动子。诱导型启动子可以分离自或衍生自细胞因子或趋化因子的启动子。细胞因子或趋化因子可以包含IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、IL17A/F、IL21、IL22、IL23、转化生长因子β (TGFβ)、集落刺激因子2 (GM-CSF)、干扰素γ (IFNγ)、肿瘤坏死因子α (TNFα)、LTα、穿孔素、颗粒酶C(Gzmc)、颗粒酶B (Gzmb)、C-C基序趋化因子配体5 (CCL5)、C-C基序趋化因子配体4(Ccl4)、C-C基序趋化因子配体3 (Ccl3)、X-C基序趋化因子配体1 (Xcl1)或LIF白介素6家族细胞因子(Lif)。

诱导型启动子可以分离自或衍生自包含表面蛋白质的基因的启动子，所述表面蛋白质涉及细胞分化、活化、耗尽和功能。在一些方面，基因包含CD69、CD71、CTLA4、PD-1、TIGIT、LAG3、TIM-3、GITR、MHCII、COX-2、FASL或4-1BB。

诱导型启动子可以分离自或衍生自涉及CD代谢和分化的基因的启动子。诱导型启动子可以分离自或衍生自Nr4a1、Nr4a3、Tnfrsf9 (4-1BB)、Sema7a、Zfp36l2、Gadd45b、Dusp5、Dusp6和Neto2的启动子。

在一些方面，诱导型转基因构建体包含或驱动抑制性检查点信号下游的信号传导组分、转录因子、细胞因子或细胞因子受体、趋化因子或趋化因子受体、细胞死亡或细胞凋亡受体/配体、代谢传感分子、赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白质、以及癌基因或肿瘤抑制基因的表达。其非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636和PCT申请号PCT/US2019/049816中。

本公开内容提供了产生修饰的T细胞群体的方法，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：将包含本公开内容的CAR或编码其的序列的组合物引入多个原代人T细胞内，以产生多个修饰的T细胞。本公开内容提供了组合物，其包含通过该方法产生的修饰的T细胞群体。在一些方面，群体中的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%表达本公开内容的CAR。

武装的细胞(Armored Cells)

本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以增强其治疗潜力。可替代地或另外，修饰的细胞可以进一步进行修饰，以致使它们对免疫学和/或代谢检查点较不敏感。这种类型的修饰“武装”细胞，在修饰之后，所述细胞在此处可以被称为“武装的”细胞(例如，武装的T细胞)。可以通过例如在肿瘤免疫抑制微环境内，阻断和/或稀释天然递送至细胞的特异性检查点信号(例如检查点抑制)，来产生武装的细胞。

本公开内容的武装的细胞可以衍生自任何细胞，例如，T细胞、NK细胞、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞(包括分离自或衍生自G-CSF动员的外周血的T细胞)、或脐带血(UCB)衍生的T细胞。武装的细胞(例如，武装的T细胞)可以包含以下中的一种或多种：嵌合配体受体(包含蛋白质支架、抗体、ScFv或抗体模拟物的CLR)/嵌合抗原受体(包含蛋白质支架、抗体、ScFv或抗体模拟物的CAR)、CARTyrin (包含Centyrin的CAR)和/或VCAR (包含骆驼科动物VHH或单结构域VH的CAR)。武装的细胞(例如，武装的T细胞)可以包含如本文公开的诱导型促凋亡多肽。武装的细胞(例如，武装的T细胞)可以包含外源序列。外源序列可以包含编码治疗性蛋白质的序列。示例性治疗性蛋白质可以为核、细胞质、细胞内、跨膜、细胞表面结合或分泌的蛋白质。由武装的细胞(例如，武装的T细胞)表达的示例性治疗性蛋白质，可以修饰武装的细胞的活性或可以修饰第二细胞的活性。武装的细胞(例如，武装的T细胞)可以包含选择基因或选择标记物。武装的细胞(例如，武装的T细胞)可以包含合成基因表达盒(在本文中也被称为诱导型转基因构建体)。

本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码抑制性检查点信号的受体的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。抑制性检查点信号的受体在细胞表面上或在细胞的细胞质内表达。沉默或减少编码抑制性检查点信号的受体的基因的表达，导致在武装的细胞的表面上或在细胞质内抑制性检查点受体的蛋白质表达的丧失。因此，具有编码抑制性检查点受体的一种或多种基因的沉默或减少表达的武装的细胞对检查点信号是抗性的、不接受的或不敏感的。在这些抑制性检查点信号的存在下，武装的细胞对抑制性检查点信号的抗性或敏感性降低增强了武装的细胞的治疗潜力。抑制性检查点信号(和诱导免疫抑制的蛋白质)的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。可以被沉默的抑制性检查点信号的优选实例包括但不限于PD-1和TGFβRII。

本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码涉及检查点信号传导的细胞内蛋白质的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。可以通过靶向涉及检查点信号传导途径的任何细胞内信号传导蛋白，来增强修饰的细胞的活性，从而实现对一个或多个检查点途径的检查点抑制或干扰。涉及检查点信号传导的细胞内信号传导蛋白的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。

本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码阻碍疗法功效的转录因子的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。可以通过沉默或减少阻碍疗法功效的转录因子的表达(或阻遏功能)，来增强或调节修饰的细胞的活性。可以进行修饰以沉默或减少表达或阻遏其功能的转录因子的非限制性实例，包括但不限于PCT公开号WO 2019/173636中公开的示例性转录因子。

本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码细胞死亡或细胞凋亡受体的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。死亡受体与其内源性配体的相互作用导致细胞凋亡的开始。细胞死亡和/或细胞凋亡受体和/或配体的表达、活性或相互作用的破坏致使修饰的细胞对死亡信号较不接受，因而，使得武装的细胞在肿瘤环境中更有效。细胞死亡和/或细胞凋亡受体和配体的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。可以进行修饰的细胞死亡受体的优选实例是Fas (CD95)。

本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码代谢传感蛋白的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。通过修饰的细胞破坏免疫抑制性肿瘤微环境(特征在于低水平的氧、pH、葡萄糖和其它分子)的代谢传感，导致T细胞功能的延长保留，并且因而，每个细胞杀死更多的肿瘤细胞。代谢传感基因和蛋白质的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。优选的实例，HIF1a和VHL在缺氧环境中发挥T细胞功能的作用。武装的T细胞可能具有编码HIF1a或VHL的一种或多种基因的沉默或减少表达。

本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码蛋白质的一种或多种基因的表达，所述蛋白质赋予对癌症疗法包括单克隆抗体的敏感性，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。因此，在癌症疗法(例如，化学疗法、单克隆抗体疗法或另一种抗肿瘤治疗)的存在下，武装的细胞可以起作用，并且可以证实优良的功能或功效。涉及赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白质的非限制性实例公开于PCT公开号WO2019/173636中。

本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码生长优势因子的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。沉默或减少癌基因的表达可以对于细胞赋予生长优势。例如，在CAR T细胞制造过程期间沉默或减少TET2基因的表达(例如，破坏表达)，导致当与缺乏这种扩增能力的非武装的CAR T细胞相比较时，具有扩增和随后根除肿瘤的显著能力的武装的CAR T细胞的生成。该策略可以与安全开关(例如，本文所述的iC9安全开关)偶联，所述安全开关允许在来自受试者的不良反应或武装的CAR T细胞不受控制的生长的情况下，武装的CAR T细胞的靶向破坏。生长优势因子的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。

本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以表达修饰/嵌合检查点受体，以产生本公开内容的武装的T细胞。

修饰/嵌合检查点受体可以包含无效受体、诱饵受体或显性失活受体。无效受体、诱饵受体或显性失活受体可以为修饰/嵌合受体/蛋白质。无效受体、诱饵受体或显性失活受体可以被截断，用于细胞内信号传导结构域的表达。可替代地或另外，无效受体、诱饵受体或显性失活受体可以在细胞内信号传导结构域内的一个或多个氨基酸位置处突变，所述氨基酸位置对于有效信号传导是决定性或必需的。无效受体、诱饵受体或显性失活受体的截断或突变，可以导致受体丧失向细胞或细胞内传递或转导检查点信号的能力。

例如，可以通过在武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)的表面上表达修饰的/嵌合的PD-1无效受体，来实现来自在肿瘤细胞的表面上表达的PD-Ll受体的免疫抑制性检查点信号的稀释或阻断，所述无效受体与也在武装的细胞的表面上表达的内源性(未修饰的)PD-1受体有效地竞争，以减少或抑制免疫抑制性检查点信号通过武装的细胞的内源性PD-1受体的转导。在该非限制性实例中，两种不同受体之间与肿瘤细胞上表达的PD-L1结合的竞争，减少或减弱了有效检查点信号传导的水平，从而增强了表达PD-1无效受体的武装的细胞的治疗潜力。

修饰/嵌合检查点受体可以包含无效受体、诱饵受体或显性失活受体，其为跨膜受体、膜相关或膜连接受体/蛋白质或细胞内受体/蛋白质。示例性无效、诱饵或显性失活的细胞内受体/蛋白质包括但不限于抑制性检查点信号下游的信号传导组分、转录因子、细胞因子或细胞因子受体、趋化因子或趋化因子受体、细胞死亡或细胞凋亡受体/配体、代谢传感分子、赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白质、以及癌基因或肿瘤抑制基因。细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和趋化因子受体的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。

修饰/嵌合检查点受体可以包含开关受体(switch receptor)。示例性开关受体包含修饰/嵌合受体/蛋白质，其中天然或野生型细胞内信号传导结构域被不同的细胞内信号传导结构域转换或替换，所述不同的细胞内信号传导结构域或对蛋白质是非天然的和/或不是野生型结构域。例如，用刺激性信号传导结构域替换抑制性信号传导结构域将免疫抑制信号转换为免疫刺激信号。可替代地，用不同的抑制性结构域替换抑制性信号传导结构域可以减少或增强抑制性信号传导的水平。经由与内源性野生型检查点受体(而不是开关受体)竞争结合免疫抑制性肿瘤微环境内表达的同源检查点受体，开关受体的表达或过表达可以导致同源检查点信号的稀释和/或阻断。武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)可以包含编码开关受体的序列，导致一种或多种开关受体的表达，并且因而改变武装的细胞的活性。武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)可以表达开关受体，其靶向检查点受体下游的细胞内表达的蛋白质、转录因子、细胞因子受体、死亡受体、代谢传感分子、癌症疗法、癌基因和/或肿瘤抑制蛋白或基因。

示例性开关受体可以包含蛋白质或可以衍生自蛋白质，所述蛋白质包括但不限于抑制性检查点信号下游的信号传导组分、转录因子、细胞因子或细胞因子受体、趋化因子或趋化因子受体、细胞死亡或细胞凋亡受体/配体、代谢传感分子、赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白质、以及癌基因或肿瘤抑制基因。

本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以表达介导条件基因表达的CLR/CAR，以产生武装的T细胞。CLR/CAR与武装的T细胞的核中的条件基因表达系统的组合构成合成基因表达系统，其在同源配体与CLR或同源抗原与CAR结合时被条件激活。例如，该系统可以通过减少或限制在配体或抗原结合的位点处、在肿瘤环境处或在肿瘤环境内的合成基因表达，来帮助‘武装’或增强修饰的T细胞的治疗潜力。

基因编辑组合物和方法

通过将转基因引入细胞内来产生修饰的细胞。引入步骤可以包含经由非转座递送系统来递送核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体。

将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，可以包含局部递送、吸附、吸收、电穿孔、旋转感染(spin-fection)、共培养、转染、机械递送、声波递送、振动递送、磁转染或通过纳米颗粒介导的递送中的一种或多种。将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，可以包含脂质体转染、磷酸钙转染、fugene转染和树枝状聚合物介导的转染。通过机械转染将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，可以包含细胞挤压、细胞轰击或基因枪技术。通过纳米颗粒介导的转染将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，可以包含脂质体递送、通过胶束递送和通过聚合物囊泡(polymerosome)递送。

将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内可以包含非病毒载体。非病毒载体可以包含核酸。非病毒载体可以包含质粒DNA、线性双链DNA (dsDNA)、线性单链DNA (ssDNA)、DoggyBone™ DNA、纳米质粒、小环DNA、单链寡脱氧核苷酸(ssODN)、DDNA寡核苷酸、单链mRNA (ssRNA)和双链mRNA (dsRNA)。非病毒载体可以包含如本文所述的转座子。

将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内可以包含病毒载体。病毒载体可以为非整合的非染色体载体。非整合的非染色体载体的非限制性实例包括腺伴随病毒(AAV)、腺病毒和疱疹病毒。病毒载体可以为整合染色体载体。整合染色体载体的非限制性实例包括腺相关载体(AAV)、慢病毒和γ逆转录病毒。

将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内可以包含载体的组合。载体组合的非限制性实例包括病毒和非病毒载体、多个非病毒载体或多个病毒载体。载体组合的非限制性实例包括DNA衍生的载体和RNA衍生的载体的组合、RNA和逆转录酶的组合、转座子和转座酶的组合、非病毒载体和内切核酸酶的组合、以及病毒载体和内切核酸酶的组合。

基因组修饰可以包含将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，以稳定整合核酸序列、瞬时整合核酸序列、产生核酸序列的位点特异性整合、或产生核酸序列的偏向整合。核酸序列可以为转基因。

基因组修饰可以包含将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，以稳定整合核酸序列。稳定的染色体整合可以为随机整合、位点特异性整合或偏向整合。位点特异性整合可以为非辅助的或辅助的。辅助位点特异性整合与定点核酸酶共递送。定点核酸酶包含具有5'和3'核苷酸序列延伸的转基因，其含有与基因组整合位点的上游和下游区域的同源性百分比。具有同源核苷酸延伸的转基因使得能够通过同源重组、微同源性介导的末端连接或非同源末端连接的基因组整合。位点特异性整合可以在安全港位点处发生。基因组安全港位点能够容纳新遗传材料的整合，其方式确保新近插入的遗传元件可靠地起作用(例如，以治疗有效的表达水平表达)，并且不对宿主基因组造成对宿主生物体造成风险的有害改变。潜在基因组安全港的非限制性实例包括人白蛋白基因的内含子序列、腺伴随病毒位点1 (AAVS1)、AAV病毒在染色体19上的天然存在的整合位点、趋化因子(C-C基序))受体5 (CCR5)基因的位点和小鼠Rosa26基因座的人直向同源物的位点。

位点特异性转基因整合可以在破坏靶基因的表达的位点处发生。通过在内含子、外显子、启动子、遗传元件、增强子、抑制子、起始密码子、终止密码子和应答元件处的位点特异性整合，可以发生靶基因表达的破坏。通过位点特异性整合靶向的靶基因的非限制性实例包括TRAC、TRAB、PDI、任何免疫抑制性基因和涉及同种异体排斥的基因。

位点特异性转基因整合可以在导致靶基因的表达增强的位点处发生。通过在内含子、外显子、启动子、遗传元件、增强子、抑制子、起始密码子、终止密码子和应答元件处的位点特异性整合，可以发生靶基因表达的增强。

酶可以用于在宿主基因组中产生链断裂，以促进转基因的递送或整合。酶可以产生单链断裂或双链断裂。断裂诱导酶的非限制性实例包括转座酶、整合酶、内切核酸酶、CRISPR-Cas9、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、Cas-CLOVER™和CPF1。断裂诱导酶可以以DNA编码、以mRNA编码、作为蛋白质或作为具有指导RNA (gRNA)的核蛋白复合物递送至细胞。

位点特异性转基因整合可以由载体介导的整合位点偏向进行控制。载体介导的整合位点偏向可以通过所选的慢病毒载体或所选的γ逆转录病毒载体进行控制。

位点特异性转基因整合位点可以为非稳定的染色体插入。整合的转基因可以变得沉默、去除、切除或进一步修饰。基因组修饰可以为转基因的非稳定整合。非稳定整合可以为瞬时的非染色体整合、半稳定的非染色体整合、半持久的非染色体插入或非稳定的染色体插入。瞬时的非染色体插入可以为染色体外的或细胞质的。在一个方面，转基因的瞬时的非染色体插入并不整合到染色体内，并且修饰的遗传材料在细胞分裂期间不复制。

基因组修饰可以为转基因的半稳定或持久的非染色体整合。DNA载体编码支架/基质附着区(S-MAR)模块，其与核基质蛋白结合，用于非病毒载体的附加型保留，允许在分裂细胞的核中的自主复制。

基因组修饰可以为转基因的非稳定的染色体整合。整合的转基因可以变得沉默、去除、切除或进一步修饰。

通过转基因插入对基因组的修饰可以经由以下发生：通过同源重组(HR)的宿主细胞指导的双链断裂修复(同源性介导的修复)、微同源性介导的末端连接(MMEJ)、非同源末端连接(NHEJ)、转座酶介导的修饰、整合酶介导的修饰、内切核酸酶介导的修饰或重组酶介导的修饰。通过转基因插入对基因组的修饰可以经由CRISPR-Cas9、TALEN、ZFN、Cas-CLOVER™和cpf1而发生。

在涉及插入新的或现有的核苷酸/核酸的基因编辑系统中，除切割酶(例如，核酸酶、重组酶、整合酶或转座酶)之外，还必须将插入工具(例如，DNA模板载体、可转座元件(转座子或逆转录转座子)递送到细胞。用于重组酶的此类插入工具的实例可能包括DNA载体。其它基因编辑系统需要整合酶连同插入载体一起、转座酶连同转座子/逆转录转座子一起等的递送。可以用作切割酶的重组酶的实例是CRE重组酶。可以用于插入工具中的整合酶的非限制性实例包括取自多种病毒(包括AAV、γ逆转录病毒和慢病毒)中的任一种的基于病毒的酶。可以用于插入工具中的转座子/逆转录转座子的实例在本文中更详细地描述。

具有离体、在体内、在体外或原位基因组修饰的细胞可以为种系细胞或体细胞。修饰的细胞可以为人、非人、哺乳动物、大鼠、小鼠或犬细胞。修饰的细胞可以为分化的、未分化的或永生化的。修饰的未分化细胞可以为干细胞。修饰的未分化细胞可以为诱导多能干细胞。修饰的细胞可以为免疫细胞。修饰的细胞可以为T细胞、造血干细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、巨核细胞或破骨细胞。修饰的细胞可以在细胞休眠、处于激活状态、静止、处于间期、处于前期、处于中期、处于后期或处于末期时进行修饰。修饰的细胞可以为新鲜的、冷冻保存的、散装的、分选成亚群、来自全血、来自白细胞去除术或来自永生化的细胞系。用于从白细胞去除术产物或血液中分离细胞的详细描述公开于PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中。

本公开内容提供了基因编辑组合物和/或包含基因编辑组合物的细胞。基因编辑组合物可以包含编码DNA结合结构域的序列，以及编码核酸酶蛋白或其核酸酶结构域的序列。编码核酸酶蛋白的序列或编码其核酸酶结构域的序列可以包含DNA序列、RNA序列或其组合。核酸酶或其核酸酶结构域可以包含CRISPR/Cas蛋白、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和内切核酸酶中的一种或多种。

核酸酶或其核酸酶结构域可以包含核酸酶失活的Cas (dCas)蛋白和内切核酸酶。内切核酸酶可以包含Clo051核酸酶或其核酸酶结构域。基因编辑组合物可以包含融合蛋白。融合蛋白可以包含核酸酶失活的Cas9 (dCas9)蛋白和Clo051核酸酶或Clo051核酸酶结构域。基因编辑组合物可以进一步包含引导序列。引导序列包含RNA序列。

本公开内容提供了包含与效应物可操作连接的小Cas9 (Cas9)的组合物。本公开内容提供了融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应分子、基本上由其组成或由其组成，其中所述效应物包含小Cas9 (Cas9)。本公开内容的小Cas9构建体可以包括包含IIS型内切核酸酶的效应物。具有活性催化位点的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cas9包含SEQ ID NO: 83的氨基酸序列。

本公开内容提供了包含与效应物可操作地连接的失活的小Cas9 (dSaCas9)的组合物。本公开内容提供了融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应分子、基本上由其组成或由其组成，其中所述效应物包含小的失活的Cas9 (dSaCas9)。本公开内容的小的失活的Cas9(dSaCas9)构建体可以包括包含IIS型内切核酸酶的效应物。dSaCas9包含SEQ ID NO: 84的氨基酸序列，其包括D10A和N580A突变，以使催化位点失活。

本公开内容提供了包含与效应物可操作地连接的失活的Cas9 (dCas9)的组合物。本公开内容提供了融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应分子、基本上由其组成或由其组成，其中所述效应物包含失活的Cas9 (dCas9)。本公开内容的失活的Cas9 (dCas9)构建体可以包括包含IIS型内切核酸酶的效应物。

dCas9可以分离或衍生自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)。dCas9可以包含在氨基酸位置10和840处具有取代的dCas9，所述取代使催化位点失活。在一些方面，这些取代是D10A和H840A。dCas9可以包含SEQ ID NO: 85或SEQ ID NO: 86的氨基酸序列。

示例性Clo051核酸酶结构域包含SEQ ID NO: 87的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

示例性dCas9-Clo051 (Cas-CLOVER)融合蛋白可以包含SEQ ID NO: 88的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。示例性dCas9-Clo051融合蛋白可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 89的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。编码dCas9-Clo051融合蛋白的核酸可以为DNA或RNA。

示例性dCas9-Clo051 (Cas-CLOVER)融合蛋白可以包含SEQ ID NO: 90的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。示例性dCas9-Clo051融合蛋白可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 91的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。编码dCas9-Clo051融合蛋白的核酸可以为DNA或RNA。

包含基因编辑组合物的细胞可以稳定或瞬时表达基因编辑组合物。优选地，基因编辑组合物是瞬时表达的。引导RNA可以包含与基因组DNA序列内的靶序列互补的序列。基因组DNA序列内的靶序列可以为基因组DNA序列的安全港位点内的靶序列。

基因编辑组合物，包括Cas-CLOVER，以及使用这些组合物用于基因编辑的方法在美国专利公开号2017/0107541、2017/0114149、2018/0187185和美国专利号10,415,024中详细描述。

还可以使用一种或多种基于聚(组氨酸)的胶束，将基因编辑工具递送至细胞。聚(组氨酸) (例如，聚(L组氨酸))是pH敏感性聚合物，由于咪唑环在不饱和的氮上提供孤电子对。即，聚(组氨酸)通过质子化-去质子化具有两性性质。特别地，在某些pH下，含聚(组氨酸)的三嵌段共聚物可以组装成在表面上具有带正电荷的聚(组氨酸)单元的胶束，从而使得能够与带负电荷的基因编辑分子复合。使用这些纳米颗粒以pH依赖性方式结合且释放蛋白质和/或核酸，可以提供有效和选择性的机制来执行所需的基因修饰。特别地，这种基于胶束的递送系统提供了关于荷电材料的大量灵活性、以及大的有效载荷容量和纳米颗粒有效载荷的靶向释放。在一个实例中，通过使用基于聚(组氨酸)的胶束来递送核酸酶，使得能够位点特异性切割双链DNA。不希望受特定理论的束缚，认为在由各种三嵌段共聚物形成的胶束中，疏水性嵌段聚集以形成核，在端部上留下亲水性嵌段和聚(组氨酸)嵌段，以形成一个或多个包围层。

在一个方面，本公开内容提供了由亲水性嵌段、疏水性嵌段和荷电嵌段制成的三嵌段共聚物。在一些方面，亲水性嵌段可以为聚(环氧乙烷) (PEO)，并且荷电嵌段可以为聚(L组氨酸)。可以使用的示例三嵌段共聚物是PEO-b-PLA-b-PHIS，其中在每个嵌段中可变数目的重复单元因设计而变。

可以用作用于制备三嵌段共聚物的中间体的二嵌段共聚物可以具有与以下偶联的亲水性生物相容性聚(环氧乙烷) (PEO) (其在化学上与PEG同义)：各种疏水性脂肪族聚(酸酐)、聚(核酸)、聚(酯)、聚(原酸酯)、聚(肽)、聚(磷腈)和聚(糖)，包括但不限于聚(丙交酯) (PLA)、聚(乙交酯) (PLGA)、聚(乳酸共乙醇酸) (PLGA)、聚(ε-己内酯) (PCL)和聚(三亚甲基碳酸酯) (PTMC)。由100%聚乙二醇化表面构成的聚合物胶束具有改善的体外化学稳定性、加强的体内生物利用度和延长的血液循环半衰期。

聚合囊泡、聚合物囊泡和基于聚(组氨酸)的胶束，包括包含三嵌段共聚物的那些，及其制备方法，在美国专利号7,217,427；7,868,512；6,835,394；8,808,748；10,456,452；美国公开号2014/0363496；2017/0000743；和2019/0255191；以及PCT公开号WO 2019/126589中进一步详细描述。

转座子和载体组合物

本公开内容提供了用于将抗体(例如scFv)或CAR (例如，包含scFv)递送到细胞或细胞群体的组合物和方法。用于将本公开内容的组合物递送到细胞或细胞群体的组合物的非限制性实例包括转座子或载体。因此，本公开内容提供了包含抗体(例如scFv)或CAR (例如，包含scFv)的转座子、或者包含抗体(例如scFv)或CAR (例如，包含scFv)的载体。

包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含编码诱导型促凋亡多肽的序列。可替代地或另外，一个转座子或一个载体可以包含本公开内容的CAR，而第二转座子或第二载体可以包含编码本公开内容的诱导型促凋亡多肽的序列。诱导型促凋亡多肽在本文中更详细地进行描述。

包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含编码嵌合刺激受体(CSR)的序列。可替代地或另外，一个转座子或一个载体可以包含本公开内容的CAR，而第二转座子或第二载体可以包含编码本公开内容的CSR的序列。嵌合刺激受体在本文中更详细地进行描述。

包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含编码重组HLA-E多肽的序列。可替代地或另外，一个转座子或一个载体可以包含本公开内容的CAR，而第二转座子或第二载体可以包含编码重组HLA-E多肽的序列。重组HLA-E多肽在本文中更详细地进行描述。

包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含选择基因。选择基因可以编码对于细胞活力和存活所必需的基因产物。当受到选择性细胞培养条件的挑战时，选择基因可以编码对于细胞活力和存活所必需的基因产物。选择性细胞培养条件可以包含对细胞活力或存活有害的化合物，并且其中基因产物赋予对化合物的抗性。选择基因的非限制性实例包括neo (赋予对新霉素的抗性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对氨甲蝶呤的抗性)、TYMS (编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药抗性基因(MDR1)、ALDH1 (编码醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51旁系同源物C)、GCS (编码葡萄糖神经酰胺合酶)、NKX2.2 (编码NK2同源框2)或其任何组合。

在一个优选的方面，选择基因编码DHFR突变蛋白酶。DHFR突变蛋白酶包含SEQ IDNO: 92的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。DHFR突变蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 93或SEQ ID NO: 174的核酸序列、基本由其组成或由其组成。DHFR突变蛋白酶的氨基酸序列可以进一步包含在位置80、113或153中的一个或多个位置处的突变。DHFR突变蛋白酶的氨基酸序列可以包含以下中的一个或多个：在位置80处的苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)取代、在位置113处的亮氨酸(L)或缬氨酸(V)取代、以及在位置153处的缬氨酸(V)或天冬氨酸(D)取代。

包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含至少一种自切割肽。例如，自切割肽可以位于CAR (例如，包含scFv)和诱导型促凋亡多肽之间；或者，自切割肽可以位于CAR (例如，包含scFv)以及由选择基因编码的蛋白质之间。

包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含至少两种自切割肽。例如，第一自切割肽位于CAR的上游或紧上游，而第二自切割肽位于CAR的下游或紧下游；或者，第一自切割肽和第二自切割肽侧接CAR。例如，第一自切割肽位于诱导型促凋亡多肽的上游或紧上游，而第二自切割肽位于诱导型促凋亡多肽的下游或紧下游；或者，第一自切割肽和第二自切割肽侧接诱导型促凋亡多肽。例如，第一自切割肽位于由选择基因编码的蛋白质的上游或紧上游，而第二自切割肽位于由选择基因编码的蛋白质的下游或紧下游；或者，第一自切割肽和第二自切割肽侧接由选择基因编码的蛋白质。

自切割肽的非限制性实例包括T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽或GSG-P2A肽。T2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 94至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。GSG-T2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 95至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。GSG-T2A多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 96至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。E2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 97至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。GSG-E2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 98至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。F2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 99至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。GSG-F2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 100至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。P2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 101至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。GSG-P2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 102至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。

在一些方面，本公开内容的转座子包含编码SEQ ID NO: 13的CAR的核酸。在一些方面，编码CAR的核酸侧翼为编码SEQ ID NO: 95的T2A肽的核酸。在一些方面，转座子进一步包含编码SEQ ID NO: 92的DHFR酶的核酸。在一些方面，转座子进一步包含编码SEQ IDNO: 172的ic9安全开关肽的核酸。

在一些方面，本公开内容的转座子包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 175至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。

转座系统

本公开内容提供了包含如本文公开的蛋白质支架的转座子，或者本公开内容提供了包含如本文公开的抗体(例如scFv)或CAR (例如，包含scFv)的转座子。在一个优选的方面，转座子是质粒DNA转座子，其包含如本文公开的编码scFv或CAR (例如，包含scFv)的核苷酸序列，侧翼为两个顺式调控绝缘子元件。本公开内容还提供了包含转座子的组合物。在一个优选的方面，包含转座子的组合物进一步包括包含编码转座酶的核苷酸序列的质粒。编码转座酶的核苷酸序列可以为DNA序列或RNA序列。优选地，编码转座酶的序列是mRNA序列。

本公开内容的转座子可以为piggyBac™ (PB)转座子。在一些方面，当转座子是PB转座子时，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶、piggyBac样(PBL)转座酶或Super piggyBac™ (SPB)转座酶。编码SPB转座酶的序列是mRNA序列。

PB转座子以及PB、PBL和SPB转座酶的非限制性实例在以下中详细描述：美国专利号6,218,182；美国专利号6,962,810；美国专利号8,399,643和PCT公开号WO 2010/099296。

PB、PBL和SPB转座酶识别在转座子的端部上的转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且在染色体位点(TTAT靶序列)内的序列5’-TTAT-3’处或在染色体位点(TTAA靶序列)内的序列5’-TTAA-3’处在ITR之间插入内容物。PB或PBL转座子的靶序列可以包含以下或由以下组成：5’-CTAA-3’、5’-TTAG-3’、5’-ATAA-3’、5’-TCAA-3’、5’AGTT-3’、5’-ATTA-3’、5’-GTTA-3’、5’-TTGA-3’、5’-TTTA-3’、5’-TTAC-3’、5’-ACTA-3’、5’-AGGG-3’、5’-CTAG-3’、5’-TGAA-3’、5’-AGGT-3’、5’-ATCA-3’、5’-CTCC-3’、5’-TAAA-3’、5’-TCTC-3’、5’TGAA-3’、5’-AAAT-3’、5’-AATC-3’、5’-ACAA-3’、5’-ACAT-3’、5’-ACTC-3’、5’-AGTG-3’、5’-ATAG-3’、5’-CAAA-3’、5’-CACA-3’、5’-CATA-3’、5’-CCAG-3’、5’-CCCA-3’、5’-CGTA-3’、5’-GTCC-3’、5’-TAAG-3’、5’-TCTA-3’、5’-TGAG-3’、5’-TGTT-3’、5’-TTCA-3’5’-TTCT-3’和5’-TTTT-3’。PB或PBL转座子系统对于可以包括在ITR之间的目的基因没有有效载荷限制。

一种或多种PB、PBL和SPB转座酶的示例性氨基酸序列公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810和美国专利号8,399,643中。在一个优选的方面，PB转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 103至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。

PB或PBL转座酶可以包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 103的序列的位置30、165、282或538中的2个或更多个、3个或更多个或者每一个处的氨基酸取代。转座酶可以为SPB转座酶，其包含SEQ ID NO: 103的序列的氨基酸序列或由其组成，其中在位置30处的氨基酸取代可以为缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)，在位置165处的氨基酸取代可以为丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)，在位置282处的氨基酸取代可以为缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M))，并且在位置538处的氨基酸取代可以为赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。在一个优选的方面，SPB转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 104至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。

在其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的某些方面，PB、PBL和SPB转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO: 103或SEQ ID NO: 104的序列的位置3、46、82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591中的一个或多个位置处的氨基酸取代，在PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中更详细地进行描述。

如PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中更详细地描述的，PB、PBL或SPB转座酶可以分离自或衍生自昆虫、脊椎动物、甲壳类动物或尾索动物。在优选的方面，PB、PBL或SPB转座酶分离自或衍生自昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni) (GenBank登录号AAA87375)或家蚕(Bombyx mori) (GenBank登录号BAD11135)。

高活性PB或PBL转座酶是比它衍生自其的天然存在的变体更具活性的转座酶。在一个优选的方面，高活性PB或PBL转座酶分离自或衍生自家蚕或热带爪蟾(Xenopus tropicalis)。高活性PB或PBL转座酶的实例公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810、美国专利号8,399,643和WO 2019/173636中。高活性氨基酸取代的列表公开于美国专利号10,041,077中。

在一些方面，PB或PBL转座酶是整合缺陷型的。整合缺陷型PB或PBL转座酶是这样的转座酶，其可以切除其相应的转座子，但以低于相应的野生型转座酶的频率整合切除的转座子。整合缺陷型PB或PBL转座酶的实例公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810、美国专利号8,399,643和WO 2019/173636中。整合缺陷型氨基酸取代的列表公开于美国专利号10,041,077中。

在一些方面，PB或PBL转座酶与核定位信号融合。与核定位信号融合的PB或PBL转座酶的实例公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810、美国专利号8,399,643和WO 2019/173636中。

本公开内容的转座子可以为睡美人(Sleeping Beauty)转座子。在一些方面，当转座子是睡美人转座子时，转座酶是睡美人转座酶(例如，如美国专利号9,228,180中公开的)或高活性睡美人(SB100X)转座酶。在一个优选的方面，睡美人转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 105至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一个优选的方面，高活性睡美人(SB100X)转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 106至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。

本公开内容的转座子可以为Helraiser转座子。示例性的Helraiser转座子包括Helibat1，其包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 107至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一些方面，当转座子是Helraiser转座子时，转座酶是Helitron转座酶(例如，如WO 2019/173636中公开的)。在一个优选的方面，Helitron转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 108至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。

本公开内容的转座子可以为Tol2转座子。示例性Tol2转座子，包括反向重复、亚末端序列和Tol2转座酶，包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 109至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一些方面，当转座子是Tol2转座子时，转座酶是Tol2转座酶(例如，如WO 2019/173636中公开的)。在一个优选的方面，Tol2转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 110至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。

本公开内容的转座子可以为TcBuster转座子。在一些方面，当转座子是TcBuster转座子时，转座酶是TcBuster转座酶或高活性TcBuster转座酶(例如，如WO 2019/173636中公开的)。TcBuster转座酶可以包含天然存在的氨基酸序列或非天然存在的氨基酸序列，或者由其组成。在一个优选的方面，TcBuster转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 111至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。编码TcBuster转座酶的多核苷酸可以包含天然存在的核酸序列或非天然存在的核酸序列，或者由其组成。在一个优选的方面，TcBuster转座酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO:112至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。

在一些方面，当与如PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中更详细地描述的野生型TcBuster转座酶相比时，突变型TcBuster转座酶包含一个或多个序列变异。

转座子可以为纳米转座子。纳米转座子可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)编码转座子插入物的序列，其包含编码第一反向末端重复(ITR)的序列、编码第二反向末端重复(ITR)的序列和ITR内序列；(b)编码骨架的序列，其中所述编码骨架的序列包含具有1至450个核苷酸(包括端点在内)的编码复制起点的序列、以及具有1至200个核苷酸(包括端点在内)的编码可选择标记物的序列，和(c) ITR间序列。在一些方面，(c)的ITR间序列包含(b)的序列。在一些方面，(a)的ITR内序列包含(b)的序列。

编码骨架的序列可以包含1至600个核苷酸，包括端点在内。在一些方面，编码骨架的序列由以下组成：1至50个核苷酸、50至100个核苷酸、100至150个核苷酸、150至200个核苷酸、200至250个核苷酸、250至300个核苷酸、300至350个核苷酸、350至400个核苷酸、400至450个核苷酸、450至500个核苷酸、500至550个核苷酸、550至600个核苷酸，每个范围都包括端点在内。

ITR间序列可以包含1至1000个核苷酸，包括端点在内。在一些方面，ITR间序列由以下组成：1至50个核苷酸、50至100个核苷酸、100至150个核苷酸、150至200个核苷酸、200至250个核苷酸、250至300个核苷酸、300至350个核苷酸、350至400个核苷酸、400至450个核苷酸、450至500个核苷酸、500至550个核苷酸、550至600个核苷酸、600至650个核苷酸、650至700个核苷酸、700至750个核苷酸、750至800个核苷酸、800至850个核苷酸、850至900个核苷酸、900至950个核苷酸、或950至1000个核苷酸，每个范围都包括端点在内。

纳米转座子可以为短纳米转座子(SNT)，其中所述ITR间序列包含1至200个核苷酸，包括端点在内。ITR间序列可以由以下组成：1至10个核苷酸、10至20个核苷酸、20至30个核苷酸、30至40个核苷酸、40至50个核苷酸、50至60个核苷酸、60至70个核苷酸、70至80个核苷酸、80至90个核苷酸、或90至100个核苷酸，每个范围都包括端点在内。

具有1至200个核苷酸(包括端点在内)的可选择标记物可以包含编码蔗糖可选择标记物的序列。编码蔗糖可选择标记物的序列可以包含编码RNA-OUT序列的序列。编码RNA-OUT序列可以包含137个碱基对(bp)或由137个碱基对(bp)组成。具有1至200个核苷酸(包括端点在内)的可选择标记物可以包含编码荧光标记物的序列。具有1至200个核苷酸(包括端点在内)的可选择标记物可以包含编码细胞表面标记物的序列。

具有1至450个核苷酸(包括端点在内)的编码复制起点的序列可以包含编码微型复制起点的序列。在一些方面，具有1至450个核苷酸(包括端点在内)的编码复制起点的序列包含编码R6K复制起点的序列。R6K复制起点可以包含R6K γ复制起点。R6K复制起点可以包含R6K微型复制起点。R6K复制起点可以包含R6K γ微型复制起点。R6K γ微型复制起点可以包含281个碱基对(bp)或由281个碱基对(bp)组成。

在纳米转座子的一些方面，编码骨架的序列不包含重组位点、切除位点、连接位点或其组合。在一些方面，纳米转座子和编码骨架的序列两者均不包含重组位点、切除位点、连接位点或其组合的产物。在一些方面，纳米转座子和编码骨架的序列两者均并非衍生自重组位点、切除位点、连接位点或其组合。

在纳米转座子的一些方面，重组位点包含起因于重组事件的序列。在一些方面，重组位点包含其为重组事件的产物的序列。在一些方面，重组事件包含重组酶(例如，重组酶位点)的活性。

在纳米转座子的一些方面，编码骨架的序列不进一步包含编码外来DNA的序列。

在纳米转座子的一些方面，ITR间序列不包含重组位点、切除位点、连接位点或其组合。在一些方面，ITR间序列不包含重组事件、切除事件、连接事件或其组合的产物。在一些方面，ITR间序列并非衍生自重组事件、切除事件、连接事件或其组合。在一些方面，ITR间序列包含编码外来DNA的序列。在一些方面，ITR内序列包含编码绝缘子的至少一个序列、以及编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列。哺乳动物细胞可以为人细胞。在一些方面，ITR内序列包含编码绝缘子的第一序列、编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列、以及编码绝缘子的第二序列。在一些方面，ITR内序列包含编码绝缘子的第一序列、编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列、聚腺苷(聚A)序列和编码绝缘子的第二序列。在一些方面，ITR内序列包含编码绝缘子的第一序列、编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列、至少一个外源序列、聚腺苷(聚A)序列和编码绝缘子的第二序列。

纳米转座子在PCT/US2019/067758中更详细地进行描述。

载体系统

本公开内容的载体可以为病毒载体或重组载体。病毒载体可以包含分离自或衍生自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒或其任何组合的序列。病毒载体可以包含分离自或衍生自腺伴随病毒(AAV)的序列。病毒载体可以包含重组AAV (rAAV)。示例性的腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包含紧靠编码本公开内容的scFv或CAR的序列顺式定位的、两个或更多个反向末端重复(ITR)序列。示例性腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包括但不限于所有血清型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9)。示例性腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包括但不限于自互补的AAV (scAAV)和AAV杂合体，其含有一种血清型的基因组和另一种血清型的衣壳(例如，AAV2/5、AAV-DJ和AAV-DJ8)。示例性腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包括但不限于rAAV-LK03。

本公开内容的载体可以为纳米颗粒。纳米颗粒载体的非限制性实例包括核酸(例如，RNA、DNA、合成核苷酸、修饰的核苷酸或其任何组合)、氨基酸(L-氨基酸、D-氨基酸、合成氨基酸、修饰的氨基酸或其任何组合)、聚合物(例如，聚合物囊泡(polymersome))、胶束、脂质(例如，脂质体)、有机分子(例如，碳原子、片层、纤维、管)、无机分子(例如，磷酸钙或金)或其任何组合。纳米颗粒载体可以被动或主动转运跨越细胞膜。

本文公开的细胞递送组合物(例如，转座子、载体)可以包含编码治疗性蛋白质或治疗剂的核酸。治疗性蛋白质的实例包括在PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中公开的那些治疗性蛋白质。

诱导型促凋亡多肽

本文公开的诱导型促凋亡多肽优于现有的诱导型多肽，因为本公开内容的诱导型促凋亡多肽的免疫原性低得多。诱导型促凋亡多肽是重组多肽，且因此是非天然存在的。进一步地，序列经重组以产生诱导型促凋亡多肽，其不包含宿主人免疫系统可以识别为“非自身的”非人序列，并且因而在受试者中诱导免疫应答，所述受试者接受诱导型促凋亡多肽、包含诱导型促凋亡多肽的细胞、或者包含诱导型促凋亡多肽或含有诱导型促凋亡多肽的细胞的组合物。

本公开内容提供了包含配体结合区、接头和促凋亡肽的诱导型促凋亡多肽，其中所述诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。在某些方面，非人序列包含限制位点。在某些方面，配体结合区可以为多聚体配体结合区。在某些方面，促凋亡肽是半胱天冬酶多肽。半胱天冬酶多肽的非限制性实例包括半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12和半胱天冬酶14。优选地，半胱天冬酶多肽是半胱天冬酶9多肽。半胱天冬酶9多肽可以为截短的半胱天冬酶9多肽。诱导型促凋亡多肽可以为非天然存在的。当半胱天冬酶是半胱天冬酶9或截短的半胱天冬酶9时，诱导型促凋亡多肽也可以被称为“iC9安全开关”。

诱导型半胱天冬酶多肽可以包含(a)配体结合区、(b)接头和(c)半胱天冬酶多肽，其中所述诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。在某些方面，诱导型半胱天冬酶多肽包含(a)配体结合区、(b)接头和(c)截短的半胱天冬酶9多肽，其中所述诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。

配体结合区可以包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。包含FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可以包含在序列的位置36处的修饰。修饰可以为在位置36 (F36V)处的缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)。FKBP12多肽可以包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 113至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。FKBP12多肽可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQID NO: 114至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。

接头区可以包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 115至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同，或者接头区可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 116至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一些方面，编码接头的核酸序列不包含限制位点。

截短的半胱天冬酶9多肽可以包含在序列的位置87处不包含精氨酸(R)的氨基酸序列。可替代地或另外，截短的半胱天冬酶9多肽可以包含在序列的位置282处不包含丙氨酸(A)的氨基酸序列。截短的半胱天冬酶9多肽可以包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 117至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同，或者截短的半胱天冬酶9多肽可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQID NO: 118至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。

在某些方面，当多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽时，诱导型促凋亡多肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:119至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同，或者诱导型促凋亡多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 120至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同。

在某些方面，当多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽时，诱导型促凋亡多肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:172至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同，或者诱导型促凋亡多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 173至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同。

诱导型促凋亡多肽可以在本领域已知的任何启动子的转录调控下在细胞中表达，所述启动子能够启动和/或调控诱导型促凋亡多肽在该细胞中的表达。

诱导型促凋亡多肽的活化可以通过例如由诱导剂介导的化学诱导的二聚化(CID)来完成，以产生条件控制的蛋白质或多肽。由于不稳定二聚化试剂的降解或单体竞争性抑制剂的施用，促凋亡多肽不仅是诱导型，而且这些多肽的诱导也是可逆的。

在某些方面，当配体结合区包含在位置36处具有缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)(F36V)的FKBP12多肽时，诱导剂可以包含AP1903，一种合成药物(CAS索引名称：2-哌啶羧酸、1-[(2S)-1-氧代-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁基]-、1,2-乙二基双[亚氨基(2-氧代-2,1-乙二基)氧基-3,1-亚苯基[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)亚丙基]]酯、[2S-[1 (R*),2R*[S*[S*[1 (R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS登记号：195514-63-7；分子式：C78H98N4O20；分子量：1411.65))；AP20187 (CAS登记号：195514-80-8和分子式：C82H107N5O20)或AP20187类似物，例如AP1510。如本文使用的，诱导剂AP20187、AP1903和AP1510可以互换使用。

诱导型促凋亡肽和诱导这些肽的方法在美国专利公开号WO 2019/0225667和PCT公开号WO2018/068022中详细描述。

嵌合刺激受体和重组HLA-E多肽

对于施用于任何患者“普遍”安全的过继细胞组合物需要同种异体反应性的显著减少或消除。为此，可以修饰本公开内容的细胞(例如，同种异体细胞)，以中断T细胞受体(TCR)和/或一类主要组织相容性复合物(MHC)的表达或功能。TCR介导移植物抗宿主(GvH)反应，而MHC介导宿主抗移植物(HvG)反应。在优选的方面，消除TCR的任何表达和/或功能，以预防可以引起受试者死亡的T细胞介导的GvH。因此，在一个优选的方面，本公开内容提供了纯的TCR阴性同种异体T细胞组合物(例如，组合物中的每种细胞以如此低的水平表达，以致于或无法检测或不存在)。

MHC I类(MHC-I，具体而言，HLA-A、HLA-B和HLA-C)的表达和/或功能被减少或消除，以预防HvG并因而改善细胞在受试者中的移植物植入。改善的移植物植入导致细胞的更长持久性，并且因此对于受试者更大的治疗窗口。具体而言，MHC-1的结构元件β-2-微球蛋白(B2M)的表达和/或功能被减少或消除。

上述策略引起进一步的挑战。T细胞中的T细胞受体(TCR)敲除(KO)导致CD3-ζ(CD3z或CD3ζ)的表达丧失，所述CD3-ζ是TCR复合物的部分。TCR-KO T细胞中的CD3ζ丧失急剧减少了使用标准刺激/激活试剂(包括但不限于激动剂抗CD3 mAb)，最佳地激活且扩增这些细胞的能力。当TCR复合物的任何一种组分的表达或功能中断时，该复合物的所有组分都丧失，包括TCR-α (TCRα)、TCR-β (TCRβ)、CD3-γ (CD3γ)、CD3-ε (CD3ε)、CD3-δ (CD3δ)和CD3-ζ (CD3ζ)。CD3ε和CD3ζ两者均为T细胞激活和扩增所需要的。激动剂抗CD3 mAb通常识别CD3ε和复合物内可能的另一种蛋白质，其依次又向CD3ζ发信号。CD3ζ提供了用于T细胞激活的主要刺激(连同次要共刺激信号一起)，用于最佳激活和扩增。在正常条件下，完全T细胞激活取决于与第二信号结合的TCR的接合，所述第二信号由一种或多种共刺激受体(例如，CD28、CD2、4-1BBL)介导，其增强免疫应答。然而，当TCR不存在时，当使用标准激活/刺激试剂(包括激动剂抗CD3 mAb)刺激时，T细胞扩增严重减少。事实上，当使用标准激活/刺激试剂(包括激动剂抗CD3 mAb)刺激时，T细胞扩增减少到正常扩增水平的仅20-40%。

因此，本公开内容提供了非天然存在的嵌合刺激受体(CSR)，其包括：(a)包含激活组分的胞外结构域，其中所述激活组分分离自或衍生自第一蛋白质；(b)跨膜结构域；以及(c)包含至少一个信号转导结构域的胞内结构域，其中所述至少一个信号转导结构域分离自或衍生自第二蛋白质；其中所述第一蛋白质和第二蛋白质并非等同的。

激活组分可以包含以下中的一种或多种的一部分：T细胞受体(TCR)的组分、TCR复合物的组分、TCR共受体的组分、TCR共刺激蛋白的组分、TCR抑制蛋白的组分、细胞因子受体和激活组分的激动剂与之结合的趋化因子受体。激活组分可以包含激动剂与之结合的CD2细胞外结构域或其一部分。

信号转导结构域可以包含以下中的一种或多种：人信号转导结构域的组分、T细胞受体(TCR)、TCR复合物的组分、TCR共受体的组分、TCR共刺激蛋白的组分、TCR抑制蛋白的组分、细胞因子受体和趋化因子受体。信号转导结构域可以包含CD3蛋白或其一部分。CD3蛋白可以包含CD3ζ蛋白或其一部分。

胞内结构域可以进一步包含细胞质结构域。细胞质结构域可以分离自或衍生自第三蛋白质。第一蛋白质和第三蛋白质可以是等同的。胞外结构域可以进一步包含信号肽。信号肽可以衍生自第四蛋白质。第一蛋白质和第四蛋白质可以是等同的。跨膜结构域可以分离自或衍生自第五蛋白质。第一蛋白质和第五蛋白质可以是等同的。

在一些方面，激活组分并不结合天然存在的分子。在一些方面，激活组分结合天然存在的分子，但CSR在激活组分与天然存在的分子结合后并不转导信号。在一些方面，激活组分结合非天然存在的分子。在一些方面，激活组分并不结合天然存在的分子，而是结合非天然存在的分子。CSR可以在激活组分与非天然存在的分子结合后选择性地转导信号。

在一个优选的方面，本公开内容提供了非天然存在的嵌合刺激受体(CSR)，其包括：(a)包含信号肽和激活组分的胞外结构域，其中所述信号肽包含CD2信号肽或其一部分，并且其中所述激活组分包含激动剂与之结合的CD2细胞外结构域或其一部分；(b)跨膜结构域，其中所述跨膜结构域包含CD2跨膜结构域或其一部分；以及(c)包含细胞质结构域和至少一个信号转导结构域的胞内结构域，其中所述细胞质结构域包含CD2细胞质结构域或其一部分，并且其中所述至少一个信号转导结构域包含CD3ζ蛋白或其一部分。在一些方面，非天然CSR包含与SEQ ID NO: 121至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQID NO: 121的氨基酸序列。

本公开内容还提供了非天然存在的嵌合刺激受体(CSR)，其中胞外结构域包含修饰。当与激活组分或第一蛋白质的野生型序列相比较时，修饰可以包含激活组分或第一蛋白质的氨基酸序列的突变或截短。激活组分的氨基酸序列的突变或截短可以包含激动剂与之结合的CD2细胞外结构域或其一部分的突变或截短。CD2细胞外结构域的突变或截短可以减少或消除与天然存在的CD58的结合。在一些方面，包含突变或截短的CD2细胞外结构域包含与SEQ ID NO: 122至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，包含突变或截短的CD2细胞外结构域包含SEQ ID NO: 122的氨基酸序列。

在一个优选的方面，本公开内容提供了非天然存在的嵌合刺激受体(CSR)，其包括：(a)包含信号肽和激活组分的胞外结构域，其中所述信号肽包含CD2信号肽或其一部分，并且其中所述激活组分包含激动剂与之结合的CD2细胞外结构域或其一部分，并且其中激动剂与之结合的CD2细胞外结构域或其一部分包含突变或截短；(b)跨膜结构域，其中所述跨膜结构域包含CD2跨膜结构域或其一部分；以及(c)包含细胞质结构域和至少一个信号转导结构域的胞内结构域，其中所述细胞质结构域包含CD2细胞质结构域或其一部分，并且其中所述至少一个信号转导结构域包含CD3ζ蛋白或其一部分。在一些方面，非天然CSR包含与SEQ ID NO: 123至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 123的氨基酸序列。

本公开内容提供了编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列的转座子或载体。

本公开内容提供了包含本文公开的任何CSR的细胞。本公开内容提供了包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列的细胞。本公开内容提供了包含载体的细胞，所述载体包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含转座子的细胞，所述转座子包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。

本文公开的修饰的细胞可以为同种异体细胞或自体细胞。在一些优选的方面，修饰的细胞是同种异体细胞。在一些方面，修饰的细胞是自体T细胞或修饰的自体CAR T细胞。在一些优选的方面，修饰的细胞是同种异体T细胞或修饰的同种异体CAR T细胞。

本公开内容提供了包含本文公开的任何CSR的组合物。本公开内容提供了包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列的组合物。本公开内容提供了包含载体的组合物，所述载体包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含转座子的组合物，所述转座子包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含本文公开的修饰的细胞的组合物、或包含本文公开的多个修饰的细胞的组合物。

本公开内容提供了修饰的T淋巴细胞(T细胞)，其包含：(a)编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰，其中所述修饰减少或消除了TCR的表达或活性水平；以及(b)嵌合刺激受体(CSR)，其包括：(i)包含激活组分的胞外结构域，其中所述激活组分分离自或衍生自第一蛋白质；(ii)跨膜结构域；以及(iii)包含至少一个信号转导结构域的胞内结构域，其中所述至少一个信号转导结构域分离自或衍生自第二蛋白质；其中所述第一蛋白质和第二蛋白质并非等同的。

修饰的T细胞可以进一步包含诱导型促凋亡多肽。修饰的T细胞可以进一步包含编码β-2-微球蛋白(B2M)的内源序列的修饰，其中所述修饰减少或消除了主要组织相容性复合物(MHC) I类(MHC-I)的表达或活性水平。

修饰的T细胞可以进一步包含非天然存在的多肽，其包含HLA I类组织相容性抗原，α链E (HLA-E)多肽。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含B2M信号肽。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含B2M多肽。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含接头，其中所述接头置于B2M多肽和HLA-E多肽之间。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含肽和B2M多肽。包含HLA-E的非天然存在的多肽可以进一步包含置于B2M信号肽和肽之间的第一接头，以及置于B2M多肽和编码HLA-E的肽之间的第二接头。

修饰的T细胞可以进一步包含非天然存在的抗原受体、编码治疗性多肽的序列或其组合。非天然存在的抗原受体可以包含嵌合抗原受体(CAR)。

CSR可以在修饰的T细胞中瞬时表达。CSR可以在修饰的T细胞中稳定表达。包含HLA-E多肽的多肽可以在修饰的T细胞中瞬时表达。包含HLA-E多肽的多肽可以在修饰的T细胞中稳定表达。诱导型促凋亡多肽可以在修饰的T细胞中瞬时表达。诱导型促凋亡多肽可以在修饰的T细胞中稳定表达。非天然存在的抗原受体或编码治疗性蛋白质的序列可以在修饰的T细胞中瞬时表达。非天然存在的抗原受体或编码治疗性蛋白质的序列可以在修饰的T细胞中稳定表达。

如本文详细描述的，基因编辑组合物，包括但不限于包含dCas9-Clo051的RNA引导的融合蛋白，可以用于靶向且降低或消除内源性T细胞受体的表达。在优选的方面，基因编辑组合物靶向并缺失编码内源性T细胞受体的基因、基因的一部分或基因的调控元件(例如启动子)。用于生成引导RNA (gRNA)模板的引物(包括T7启动子、基因组靶序列和gRNA支架)的非限制性实例公开于PCT申请号PCT/US2019/049816中，所述引导RNA模板用于靶向且缺失TCR-α (TCR-α)、靶向且缺失TCR-β (TCR-β)、以及靶向且缺失β-2-微球蛋白(β2M)。

基因编辑组合物，包括但不限于包含dCas9-Clo051的RNA引导的融合蛋白，可以用于靶向且降低或消除内源性MHCI、MHCII或MHC激活物的表达。在优选的方面，基因编辑组合物靶向且缺失编码内源性MHCI、MHCII或MHC激活物的一种或多种组分的基因、基因的一部分或基因的调控元件(例如启动子)。用于靶向且缺失MHC激活物的引导RNA (gRNA)的非限制性实例公开于PCT申请号PCT/US2019/049816中。

非天然存在的嵌合刺激受体，编码TCR-α (TCR-α)、TCR-β (TCR-β)和/或β-2-微球蛋白(β2M)的内源序列的遗传修饰，以及包含HLA I类组织相容性抗原α链E (HLA-E)多肽的非天然存在的多肽的详细描述，公开于PCT申请号PCT/US2019/049816中。

制剂、剂量和施用模式

本公开内容提供了用于施用本文所述的组合物的制剂、剂量和方法。

所公开的组合物和药物组合物可以进一步包含任何合适的辅助剂中的至少一种，所述辅助剂例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲液、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等等。药学上可接受的辅助剂是优选的。此类无菌溶液的非限制性实例和制备方法是本领域众所周知的，例如但不限于Gennaro，编辑，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co. (Easton，Pa.) 1990，以及“Physician's Desk Reference”，第52版，Medical Economics (Montvale，N.J.) 1998。如本领域众所周知的或如本文所述的，可以常规选择药学上可接受的载体，其适合于蛋白质支架、片段或变体组合物的施用模式、溶解性和/或稳定性。

适合于使用的药物赋形剂和添加剂的非限制性实例包括蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合存在，单独或组合构成按重量或体积计的1-99.99%。蛋白质赋形剂的非限制性实例包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等等。也可以在缓冲能力方面起作用的代表性的氨基酸/蛋白质组分，包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。

适合于使用的碳水化合物赋形剂的非限制性实例包括单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇等等。优选地，碳水化合物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖和/或棉子糖。

组合物还可以包括缓冲液或pH调节剂；通常，缓冲液是由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲液包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的盐；Tris、盐酸氨丁三醇或磷酸盐缓冲液。优选的缓冲液是有机酸盐，例如柠檬酸盐。

另外，所公开的组合物可以包括聚合赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗聚糖(聚合糖)、葡萄糖结合剂(dextrate) (例如环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯，例如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。

许多已知和开发的模式可以用于施用治疗有效量的本文公开的组合物或药物组合物。施用模式的非限制性实例包括推注、经颊、输注、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、病灶内、肌内、心肌内、鼻内、眼内、骨内(intraosseous)、骨内(intraosteal)、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、子宫内、瘤内、静脉内、膀胱内、经口、肠胃外、直肠、舌下、皮下、经皮或阴道手段。

本公开内容的组合物可以制备用于特别是以液体溶液或悬浮液的形式的肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或任何其它施用；用于特别是以半固体形式例如但不限于乳膏和栓剂的阴道或直肠施用；用于例如但不限于以片剂或胶囊的形式的经颊或舌下施用；或鼻内施用，例如但不限于粉末、滴鼻剂或气溶胶或某些药剂的形式；或经皮施用，例如但不限于凝胶、软膏、洗剂、悬浮液或贴剂递送系统，其具有化学增强剂例如二甲基亚砜，以或修饰皮肤结构或增加经皮贴剂中的药物浓度(Junginger等人，于“Drug PermeationEnhancement；” Hsieh，D. S.，编辑，第59-90页(Marcel Dekker，Inc. New York 1994)，或具有氧化剂，其使得能够将含有蛋白质和肽的制剂施加到皮肤上(WO 98/53847)，或施加电场以产生瞬时转运途径，例如电穿孔，或增加荷电药物通过皮肤的流动性，例如离子电渗疗法，或施加超声波，例如超声导入(美国专利号4,309,989和4,767,402) (上述公开和专利通过引用以其整体并入本文)。

对于肠胃外施用，本文公开的任何组合物可以配制为与药学上可接受的肠胃外媒介物结合或分开提供的溶液、悬浮液、乳状液、颗粒、粉末或冻干粉末。用于肠胃外施用的制剂可以含有作为常见赋形剂的无菌水或盐水、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、植物起源的油、氢化萘等等。用于注射的水性或油性悬浮液可以根据已知方法，通过使用适当的乳化剂或增湿剂和助悬剂来制备。用于注射的药剂可以为无毒、非经口施用的稀释剂，例如在溶剂中的水溶液、无菌可注射溶液或悬浮液。作为可用的媒介物或溶剂，水、林格氏溶液、等渗盐水等是允许的；作为普通溶剂或助悬溶剂，可以使用无菌不挥发性油。为了这些目的，可以使用任何种类的不挥发性油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成的甘油单酯或甘油二酯或甘油三酯。肠胃外施用是本领域已知的，并且包括但不限于常规注射手段，如美国专利号5,851,198中所述的气压无针注射装置、以及如美国专利号5,839,446中所述的激光穿孔装置。

用于经口施用的制剂依赖佐剂(例如，间苯二酚和非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)的共施用，以人为地增加肠壁的渗透性，以及酶促抑制剂(例如，胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(DFF)和抑肽酶(trasylol))的共施用，以抑制酶促降解。在美国专利号6,309,663中描述了用于递送亲水性药剂包括蛋白质和蛋白质支架以及至少两种表面活性剂的组合的制剂，所述制剂预期用于经口、经颊、粘膜、鼻、肺、阴道、跨膜或直肠施用。用于经口施用的固体型剂型的活性组成成分化合物可以与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸、几丁质、脱乙酰壳多糖、果胶、黄蓍树胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂型还可以含有其它类型的添加剂，例如惰性稀释剂、润滑剂(例如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯)、防腐剂(例如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚)、抗氧化剂(例如半胱氨酸)、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂、加香剂等。

片剂和丸剂可以进一步加工成肠包衣制剂。用于经口施用的液体制剂包括可允许医学用途的乳状液、糖浆剂、酏剂、悬浮液和溶液制剂。这些制剂可以含有通常用于所述领域中的惰性稀释剂，例如水。脂质体也已被描述为用于胰岛素和肝素的药物递送系统(美国专利号4,239,754)。最近，混合氨基酸(类蛋白)的人工聚合物的微球已用于递送药物(美国专利号4,925,673)。此外，美国专利号5,879,681和美国专利号5,871,753中描述且用于经口递送生物活性剂的载体化合物是本领域已知的。

对于肺施用，优选地，本文所述的组合物或药物组合物以有效到达肺的下气道或鼻窦的粒径递送。组合物或药物组合物可以通过本领域已知的各种吸入或鼻装置中的任一种进行递送，所述装置用于通过吸入的治疗剂施用。能够将气溶胶化制剂沉积在患者的窦腔或肺泡中的这些装置包括计量吸入器、雾化器(例如喷射雾化器、超声雾化器)、干粉发生器、喷雾器等等。所有此类装置都可以使用适合于施用的制剂，用于将本文所述的组合物或药物组合物以气溶胶分配。这种气溶胶可以由溶液(水性和非水性)或固体颗粒组成。另外，可以通过在压力下迫使至少一种蛋白质支架的悬浮液或溶液通过喷嘴，来生产包括本文所述的组合物或药物组合物的喷雾剂。在计量吸入器(MDI)中，推进剂、本文所述的组合物或药物组合物、以及任何赋形剂或其它添加剂作为包括液化压缩气体的混合物包含在罐中。计量阀的致动将混合物作为气溶胶释放，所述气溶胶优选含有在小于约10 μm、优选约1 μm至约5 μm、并且最优选约2 μm至约3 μm的尺寸范围中的颗粒。肺施用、制剂和有关装置的更详细描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。

对于通过粘膜表面的吸收，组合物包括包含多个亚微米颗粒、粘膜粘附大分子、生物活性肽和水性连续相的乳状液，其通过实现乳状液颗粒的粘膜粘附来促进通过粘膜表面的吸收(美国专利号5,514,670)。适合于施加本公开内容的乳状液的粘液表面可以包括角膜、结膜、颊、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠施用途径。用于阴道或直肠施用的制剂，例如栓剂，可以含有作为赋形剂的例如聚亚烷基二醇、凡士林、可可脂等等。用于鼻内施用的制剂可以为固体，并且含有作为赋形剂的例如乳糖，或者可以为滴鼻剂的水性或油性溶液。对于经颊施用，赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等等(美国专利号5,849,695)。粘膜施用和制剂的更详细描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。

对于经皮施用，本文公开的组合物或药物组合物被封装在递送装置中，所述递送装置例如脂质体或聚合物纳米颗粒、微粒、微胶囊或微球体(除非另有说明，否则统称为微粒)。许多合适的装置是已知的，包括由合成聚合物和天然聚合物制成的微粒，所述合成聚合物例如聚羟基酸，例如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物，聚原酸酯、聚酐和聚磷腈，所述天然聚合物例如胶原、聚氨基酸、白蛋白和其它蛋白质、海藻酸盐和其它多糖及其组合(美国专利号5,814,599)。经皮施用、制剂和合适装置的更详细描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。

可以期望在延长的时间段内，例如从单次施用开始一周到一年的时期，将所公开的化合物递送至受试者。可以利用各种缓慢释放、贮库或植入剂型。例如，剂型可以含有在体液中具有低溶解度的化合物的药学上可接受的无毒盐，例如，(a)与多元酸的酸加成盐，所述多元酸例如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、鞣酸、扑酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘单磺酸或萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等等；(b)与多价金属阳离子的盐，所述多价金属阳离子例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等等，或与有机阳离子的盐，所述有机阳离子由例如N,N'-二苄基乙二胺或乙二胺形成；或(c) (a)和(b)的组合，例如鞣酸锌盐。另外，所公开的化合物或优选地相对不溶性的盐，例如刚刚描述的那些盐，可以在适合于注射的凝胶中进行配制，所述凝胶例如具有例如芝麻油的单硬脂酸铝凝胶。特别优选的盐是锌盐、鞣酸锌盐、双羟萘酸盐等等。另一种类型的用于注射的缓慢释放贮库制剂，将含有分散用于封装在缓慢降解、无毒、无抗原性聚合物中的化合物或盐，所述聚合物例如如美国专利号3,773,919中描述的聚乳酸/聚乙醇酸聚合物。化合物或优选相对不溶性的盐，例如上文描述的那些盐，也可以在胆固醇基质硅橡胶丸剂中进行配制，特别是用于动物中。另外的缓慢释放、贮库或植入制剂，例如气体或液体脂质体，是文献中已知的(美国专利号5,770,222和“Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems”，J. R. Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1978)。

合适的剂量是本领域众所周知的。参见例如，Wells等人，编辑，PharmacotherapyHandbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford，Conn. (2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，豪华版，Tarascon Publishing，Loma Linda，Calif. (2000)；Nursing 2001 Handbook of Drugs，第21版，Springhouse Corp.，Springhouse，Pa.，2001；Health Professional's Drug Guide 2001，编辑，Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，Upper Saddle River，N.J。优选剂量可以任选地包括约0.1-99和/或100-500 mg/kg/施用，或者其任何范围、值或分数，或者达到约0.1-5000 μg/ml血清浓度/单次施用或多重施用的血清浓度，或者其任何范围、值或分数。关于本文公开的组合物或药物组合物的优选剂量范围是约1 mg/kg，直到约3、约6或约12 mg/kg受试者的体重。

可替代地，施用的剂量可以取决于已知因素而变，所述因素例如特定药剂的药效学特性、以及其施用模式和途径；接受者的年龄、健康和重量；症状的性质和程度、并发治疗的种类、治疗频率和所需效应。通常，活性成分的剂量可以为约0.1至100毫克/千克体重。通常，0.1至50，且优选0.1至10毫克/千克/施用或以持续释放形式有效获得所需结果。

作为非限制性实例，人或动物的治疗可以使用单一、输注或重复剂量，在第1-40天中的至少一天，或者可替代地或另外，在第1-52周中的至少一周，或者可替代地或另外，在1-20年中的至少一年，或其任何组合，作为约0.1至100 mg/kg或者其任何范围、值或分数/天的本文公开的组合物或药物组合物的一次性或周期性剂量提供。

适合于内部施用的剂型一般含有约0.001毫克至约500毫克的活性成分/单位或容器。在这些药物组合物中，基于组合物的总重量，活性成分通常以按重量计约0.5-99.999%的量存在。

有效量可以包含约0.001至约500 mg/kg/单次(例如，推注)、多重或连续施用的量，以达到0.01-5000 μg/ml血清浓度/单次、多重或连续施用的血清浓度，或者其中的任何有效范围或值，如使用已知方法来完成且确定的，如本文所述或有关领域已知的。

在其中待施用于有需要的受试者的组合物是如本文公开的修饰的细胞的方面，可以施用约1x10³至1x10¹⁵个细胞；约1x10⁴至1x10¹²个细胞；约1x10⁵至1x10¹⁰个细胞；约1x10⁶至1x10⁹个细胞；约1x10⁶至1x10⁸个细胞；约1x10⁶至1x10⁷个细胞；或约1x10⁶至25x10⁶个细胞的细胞。在一个方面，施用约5x10⁶至25x10⁶个细胞的细胞。

所公开的组合物和药物组合物的药学上可接受的赋形剂、制剂、剂量和施用方法的更详细描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。

使用本公开内容的组合物的方法

本公开内容提供了所公开的组合物或药物组合物用于治疗细胞、组织、器官、动物或受试者中的疾病或病症的用途，如本领域已知的或如本文所述的，使用所公开的组合物和药物组合物，例如用治疗有效量的组合物或药物组合物施用或接触细胞、组织、器官、动物或受试者。在一个方面，受试者是哺乳动物。优选地，受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

本公开内容提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或受试者中的至少一种恶性疾病或病症的方法。优选地，恶性疾病是癌症。恶性疾病或病症的非限制性实例包括白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性淋巴细胞性白血病、B细胞、T细胞或FAB ALL、急性髓样白血病(AML)、急性粒细胞性白血病、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增生症、副肿瘤综合征/恶性肿瘤的高钙血症、实体瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、头癌、颈癌、遗传性非息肉病性癌、何杰金氏淋巴瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、睾丸癌、腺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌症有关的骨吸收、癌症有关的骨痛等等。

在优选的方面，恶性疾病或病症的治疗包括过继细胞疗法。例如，在一个方面，本公开内容提供了表达至少一种公开的抗体(例如，scFv)和/或包含抗体(例如，scFv)的CAR的修饰的细胞，其已进行选择和/或扩增用于施用于有需要的受试者。修饰的细胞可以配制用于在任何温度包括室温和体温下贮存。修饰的细胞可以配制用于冷冻贮存和随后的解冻。修饰的细胞可以在药学上可接受的载体中进行配制，用于从无菌包装中直接施用于受试者。修饰的细胞可以在具有细胞活力和/或CAR表达水平的指示剂的药学上可接受的载体中进行配制，以确保细胞功能和CAR表达的最低水平。修饰的细胞可以用一种或多种试剂以规定的密度在药学上可接受的载体中进行配制，以抑制进一步扩增和/或预防细胞死亡。

任何可以包括将有效量的本文公开的任何组合物或药物组合物施用于需要此类调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或受试者。此类方法可以任选地进一步包括用于治疗此类疾病或病症的共施用或组合疗法，其中本文公开的任何组合物或药物组合物的施用进一步包括之前、同时和/或之后施用至少一种化学治疗剂(例如，烷化剂、有丝分裂抑制剂、放射性药物)。

在一些方面，受试者在施用之后并未发展移植物抗宿主(GvH)和/或宿主抗移植物(HvG)。在一个方面，施用是全身的。全身施用可以为本领域已知并在本文中详细描述的任何手段。优选地，全身施用是通过静脉内注射或静脉内输注。在一个方面，施用是局部的。局部施用可以为本领域已知并在本文中详细描述的任何手段。优选地，局部施用是通过瘤内注射或输注、脊柱内注射或输注、脑室内注射或输注、眼内注射或输注、或者骨内注射或输注。

在一些方面，治疗有效剂量是单次剂量。在一些方面，单次剂量是同时制造的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或两者之间的任何数目的剂量之一。在一些方面，当组合物是自体细胞或同种异体细胞时，剂量是足以使细胞植入和/或持续足够的时间以治疗疾病或病症的量。

在一个实例中，本公开内容提供了治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括向受试者施用组合物，所述组合物包含抗体(例如，scFv)或包含抗体(例如，scFv)的CAR，所述抗体或CAR与肿瘤细胞上的抗原特异性结合。在其中组合物包含修饰的细胞或细胞群体的方面，细胞或细胞群体可以为自体的或同种异体的。

在本文描述的治疗方法的一些方面，可以修改或终止治疗。具体而言，在其中用于治疗的组合物包含诱导型促凋亡多肽的方面，可以通过使细胞与诱导剂接触，在细胞中选择性地诱导细胞凋亡。可以响应例如恢复的征兆或疾病严重性/进展降低的征兆、疾病缓解/停止的征兆、和/或不良事件的发生来修改或终止治疗。在一些方面，该方法包括施用诱导剂的抑制剂以抑制细胞疗法的修改的步骤，从而恢复细胞疗法的功能和/或功效(例如，当疾病的征兆或症状再次出现、或者严重性增加和/或不良事件得到解决时)。

抗体/scFv生产、筛选和纯化

本公开内容的至少一种抗体(例如，单克隆抗体、嵌合抗体、单结构域抗体、VHH、VH、单链可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)或Fab片段)，可以任选地由细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群体产生，如本领域众所周知的。参见例如，Ausubel等人，编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，N.Y.(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor，N.Y. (1989)；Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，N.Y. (1989)；Colligan等人，编辑，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY (1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols inProtein Science，John Wiley & Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)。

可以改变、添加和/或缺失来自scFv的氨基酸，以减少免疫原性，或者减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、稳定性、溶解性或任何其它合适的特性，如本领域已知的。

任选地，scFv可以进行改造，伴随对于抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质的保留。为了实现这一目标，可以通过使用亲本序列和改造序列的三维模型，分析亲本序列和各种概念性改造产物的过程，来任选地制备支架蛋白质。三维模型是普遍可用的并且是本领域技术人员熟悉的。计算机程序是可获得的，其示出且展示所选候选序列的可能的三维构象结构，并且可以测量可能的免疫原性(例如，Monrovia，Calif.的Xencor，Inc.的Immunofilter程序)。这些展示的检查允许分析残基在候选序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选scFv结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从亲本序列和参考序列中选择且组合残基，使得实现所需的特性，例如对于靶抗原的亲和力。可替代地或除上述程序之外，可以使用其它合适的改造方法。

可以使用核苷酸(DNA或RNA展示)或肽展示文库，例如在体外展示中，方便地实现与相似蛋白质或片段特异性结合的scFv的筛选。该方法涉及对于具有所需功能或结构的各个成员筛选大型肽集合。展示的核苷酸或肽序列的长度可以为3至5000个或更多个核苷酸或氨基酸，频繁为5-100个氨基酸长，且经常为约8至25个氨基酸长。除用于生成肽文库的直接化学合成方法之外，还已描述了几种重组DNA方法。一种类型涉及在细菌噬菌体或细胞的表面上的肽序列展示。每种细菌噬菌体或细胞含有编码特定展示肽序列的核苷酸序列。此类方法在PCT专利公开号WO 91/17271、WO 91/18980、WO 91/19818和WO 93/08278中进行描述。

用于生成肽文库的其它系统具有体外化学合成和重组方法两者的方面。参见PCT专利公开号WO 92/05258、WO 92/14843和WO 96/19256。还参见美国专利号5,658,754；和5,643,768。肽展示文库、载体和筛选试剂盒从此类供应商如Invitrogen (Carlsbad、Calif.)和Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire、UK)商购可得。参见例如，转让给Enzon的美国专利号4,704,692、4,939,666、4,946,778、5,260,203、5,455,030、5,518,889、5,534,621、5,656,730、5,763,733、5,767,260、5856456；转让给Dyax的5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,837,500；转让给Affymax的5,427,908、5,580,717；转让给CambridgeAntibody Technologies的5,885,793；转让给Genentech的5,750,373；转让给Xoma、Colligan，同上；Ausubel，同上；或Sambrook，同上的5,618,920、5,595,898、5,576,195、5,698,435、5,693,493、5,698,417。

本公开内容的scFv可以以宽范围的亲和力(KD)结合人或其它哺乳动物蛋白质。在一个优选的方面，本公开内容的至少一种scFv可以任选地以高亲和力结合靶蛋白，例如，其KD等于或小于约10⁻⁷ M，例如但不限于，0.1-9.9 (或其中的任何范围或值) X 10⁻⁸、10⁻⁹、10⁻¹⁰、10⁻¹¹、10⁻¹²、10⁻¹³、10⁻¹⁴、10⁻¹⁵或者其中的任何范围或值，如通过表面等离振子共振或Kinexa方法确定的，如通过本领域技术人员实践的。

可以使用任何合适的方法在实验上确定scFv对于抗原的亲和力或亲合力。(参见例如，Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions,” In FundamentalImmunology，Paul，W. E.，编辑，Raven Press: New York，N.Y. (1984)；Kuby，JanisImmunology，W.H. Freeman and Company: New York，N.Y. (1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，则所测量的特定scFv-抗原相互作用的亲和力可以不同。因此，亲和力和其它抗原结合参数(例如，KD、Kon、Koff)的测量优选用蛋白质支架和抗原的标准化溶液，以及标准化缓冲液例如本文所述的缓冲液来进行。

可以用本公开内容的scFv执行竞争性测定法，以便确定哪些蛋白质、抗体和其它拮抗剂与本公开内容的scFv竞争结合靶蛋白和/或共享表位区域。如本领域普通技术人员容易知道的这些测定法，评估了拮抗剂或配体之间对于蛋白质上有限数目的结合位点的竞争。蛋白质和/或抗体在竞争之前或之后是固定或不溶解的，并且例如通过倾析(其中蛋白质/抗体是预先不溶解的)、或通过离心(其中蛋白质/抗体在竞争反应后是沉淀的)，将与靶蛋白结合的样品与未结合的样品分开。另外，竞争性结合可以通过以下进行确定：功能是通过scFv与靶蛋白的结合还是结合的缺乏而改变，例如，scFv分子是抑制还是加强例如标记的酶促活性。可以使用ELISA和其它功能测定性，如本领域众所周知的。

核酸分子

本公开内容的编码scFv的核酸分子可以为RNA的形式，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其它形式，或者是DNA的形式，包括但不限于通过克隆获得或合成产生的cDNA和基因组DNA，或其任何组合。DNA可以为三链、双链或单链的，或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以为编码链，也称为有义链，或者它可以为非编码链，也被称为反义链。

本公开内容的分离的核酸分子可以包括包含开放读码框(ORF)的核酸分子，任选地，具有一个或多个内含子，例如但不限于，至少一种scFv的至少一个指定部分；包含与靶蛋白结合的蛋白质支架或环区的编码序列的核酸分子；以及包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与上文所述的那些基本上不同，但由于遗传密码的简并性，仍编码如本文所述和/或如本领域已知的蛋白质支架。当然，遗传密码是本领域众所周知的。因此，对于本领域技术人员，生成编码本公开内容的特定scFv的此类简并核酸变体将是常规的。参见例如，Ausubel等人，同上，并且此类核酸变体包括在本公开内容中。

如本文指示的，包含编码scFv的核酸的本公开内容的核酸分子，可以包括但不限于编码scFv片段的氨基酸序列本身的那些核酸分子；整个蛋白质支架或其一部分的编码序列；scFv、片段或一部分的编码序列，以及另外的序列，例如至少一种信号前导区或融合肽的编码序列，伴随或不伴随上述另外的编码序列，例如至少一个内含子，连同另外的非编码序列，包括但不限于非编码5'和3'序列，例如在转录、mRNA加工包括剪接和多聚腺苷酸化信号(例如，核糖体结合和mRNA的稳定性)中起作用的转录的非翻译序列；编码另外的氨基酸例如提供另外功能性的那些氨基酸的另外的编码序列。因此，可以将编码蛋白质支架的序列与标记物序列例如编码肽的序列融合，所述肽促进包含蛋白质支架片段或一部分的融合蛋白质支架的纯化。

与如本文所述的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸

本公开内容提供了在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，多核苷酸可以用于分离、检测和/或定量包含此类多核苷酸的核酸。例如，本公开内容的多核苷酸可以用于鉴定、分离或扩增保藏文库中的部分或全长克隆。多核苷酸可以为从人或哺乳动物核酸文库中分离的基因组或cDNA序列，或者以其它方式与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA互补的基因组或cDNA序列。

优选地，cDNA文库包含至少80%的全长序列，优选地，至少85%或90%的全长序列，并且更优选地，至少95%的全长序列。cDNA文库可以进行标准化，以增加稀有序列的表示。通常但非排他地对于相对于互补序列具有减少的序列同一性的序列采用低或中等严格性杂交条件。可以任选地对于具有更高同一性的序列采用中等和高严格性条件。低严格性条件允许具有约70%序列同一性的序列的选择性杂交，并且可以用于鉴定直向同源或旁系同源序列。

任选地，多核苷酸将编码由本文所述的多核苷酸编码的蛋白质支架的至少一部分。多核苷酸包括可以用于与编码本公开内容的蛋白质支架的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见例如，Ausubel，同上；Colligan，同上，各自通过引用以其整体并入本文。

核酸的构建

本公开内容的分离的核酸可以使用(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术和/或(d)其组合进行制备，如本领域众所周知的。

核酸可以方便地包含除本公开内容的多核苷酸之外的核苷酸序列。例如，可以将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入核酸内，以帮助多核苷酸的分离。另外，可以插入可翻译序列，以帮助本公开内容的翻译的多核苷酸的分离。例如，六组氨酸标记物序列提供了方便的手段来纯化本公开内容的蛋白质。本公开内容的核酸，排除编码序列，任选地是用于克隆和/或表达本公开内容的多核苷酸的载体、衔接子或接头。

可以将另外的序列加入这种克隆和/或表达序列中，以优化其在克隆和/或表达中的功能，以帮助多核苷酸的分离，或改善多核苷酸引入细胞内。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域众所周知的。(参见例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。

用于构建核酸的重组方法

本公开内容的分离的核酸组合物，例如RNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合，可以使用本领域技术人员已知的任何数目的克隆方法从生物来源中获得。在一些方面，在严格条件下，与本公开内容的多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。RNA的分离以及cDNA和基因组文库的构建是本领域普通技术人员众所周知的。(参见例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。

核酸筛选和分离方法

可以使用基于本公开内容的多核苷酸序列的探针来筛选cDNA或基因组文库。探针可以用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离相同或不同生物体中的同源基因。本领域技术人员将了解，可以在测定法中采用各种严格性程度的杂交；并且杂交或洗涤介质都可以为严格的。随着用于杂交的条件变得更严格，探针和靶之间必须存在更大程度的互补性用于双链体形成发生。严格性程度可以通过温度、离子强度、pH和部分变性溶剂如甲酰胺的存在中的一种或多种进行控制。例如，通过例如在0%至50%的范围内操纵甲酰胺浓度来改变反应物溶液的极性，方便地改变杂交的严格性。可检测结合所需的互补性(序列同一性)程度将依照杂交介质和/或洗涤介质的严格性而变。互补性程度最佳为100%，或70-100%，或者其中的任何范围或值。然而，应当理解，探针和引物中的微小序列变化可以通过减少杂交和/或洗涤介质的严格性进行补偿。

RNA或DNA的扩增方法是本领域众所周知的，并且可以基于本文呈现的教导和指导，无需过度实验，根据本公开内容而使用。

已知的DNA或RNA扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)和有关的扩增过程(参见例如，给予Mullis等人的美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；给予Tabor等人的4,795,699和4,921,794；给予Innis的5,142,033；给予Wilson等人的5,122,464；给予Innis 的5,091,310；给予Gyllensten等人的5,066,584；给予Gellensten等人的4,889,818；给予Silver等人的4,994,370，给予Biswas的4,766,067；给予Ringold的4,656,134)，以及RNA介导的扩增，其使用针对靶序列的反义RNA作为用于双链DNA合成的模板(给予Malek等人的美国专利号5,130,238，具有商品名NASBA)，所述参考文献的全部内容通过引用并入本文。(参见例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上。)

例如，聚合酶链反应(PCR)技术可以用于直接从基因组DNA或cDNA文库中扩增本公开内容的多核苷酸和有关基因的序列。PCR和其它体外扩增方法也可以是有用的，例如，以克隆编码待表达的蛋白质的核酸序列，制备核酸以用作探针用于检测样品中所需mRNA的存在、用于核酸测序或用于其它目的。足以指导技术人员完成体外扩增方法的技术实例在以下中找到：Berger，同上，Sambrook，同上和Ausubel，同上，以及Mullis等人，美国专利号4,683,202 (1987)；以及Innis等人，PCR Protocols A Guide to Methods andApplications，编辑，Academic Press Inc.，San Diego，Calif. (1990)。用于基因组PCR扩增的商购可得的试剂盒是本领域已知的。参见例如，Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)。另外，例如，T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可以用于改善长PCR产物的产率。

用于构建核酸的合成方法

本公开内容的分离的核酸也可以通过经由已知方法的直接化学合成来制备(参见例如，Ausubel等人，同上)。化学合成一般产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列杂交，或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶的聚合，转换成双链DNA。本领域技术人员将认识到，虽然DNA的化学合成可以限于约100个或更多个碱基的序列，但可以通过较短序列的连接来获得较长序列。

重组表达盒

本公开内容进一步提供了包含本公开内容的核酸的重组表达盒。本公开内容的核酸序列，例如编码本公开内容的蛋白质支架的cDNA或基因组序列，可以用于构建可以引入至少一种所需宿主细胞内的重组表达盒。重组表达盒通常包含与转录起始调控序列可操作地连接的本公开内容的多核苷酸，所述转录起始调控序列将指导多核苷酸在预期的宿主细胞中的转录。异源和非异源(即内源)启动子两者均可以用于指导本公开内容的核酸的表达。

在一些方面，充当启动子、增强子或其它元件的分离的核酸可以被引入本公开内容的多核苷酸的非异源形式的适当位置中(上游、下游或内含子中)，以便上调或下调本公开内容的多核苷酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或取代在体内或体外加以改变。

表达载体和宿主细胞

本公开内容还涉及包括本公开内容的分离的核酸分子的载体、用重组载体遗传改造的宿主细胞、以及通过重组技术生产至少一种蛋白质支架，如本领域众所周知的。参见例如，Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上，各自通过引用以其整体并入本文。

可以任选地将多核苷酸连接到含有可选择标记物的载体，用于在宿主中繁殖。一般地，质粒载体在沉淀物例如磷酸钙沉淀物、或具有荷电脂质的复合物中引入。如果载体是病毒，则它可以使用适当的包装细胞系在体外进行包装，然后转导到宿主细胞内。

DNA插入物应该与适当的启动子可操作地连接。表达构建体将进一步含有用于转录起始、终止的位点，以及在转录区域中，用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选包括在开始处的翻译起始、以及在待翻译的mRNA的端部处适当地放置的终止密码子(例如UAA、UGA或UAG)，其中UAA和UAG优选用于哺乳动物或真核细胞表达。

表达载体将优选地但任选地包括至少一种可选择标记物。此类标记物包括例如但不限于用于真核细胞培养的氨苄青霉素、zeocin (Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B (hygB基因)、G418/遗传霉素(neo基因)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对氨甲蝶呤的抗性)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利号5,122,464；5,770,359；5,827,739)、杀稻瘟菌素(bsd基因)抗性基因，以及用于在大肠杆菌(E. coli)和其它细菌或原核生物中培养的氨苄青霉素、zeocin (Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B (hygB基因)、G418/遗传霉素(neo基因)、卡那霉素、壮观霉素、链霉素、羧苄青霉素、博莱霉素、红霉素、多粘菌素B或四环素抗性基因(上述专利在此通过引用以其整体并入)。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。合适的载体对于技术人员将是显而易见的。将载体构建体引入宿主细胞内可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知方法来实现。此类方法在本领域中进行描述，例如Sambrook，同上，第1-4和16-18章；Ausubel，同上，第1、9、13、15、16章。

表达载体将优选地但任选地包括至少一种可选择的细胞表面标记物，用于分离通过本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的可选择的细胞表面标记物包含将细胞或细胞子集与另一个限定的细胞子集区分开的表面蛋白质、糖蛋白或蛋白质组。优选地，可选择的细胞表面标记物将通过本公开内容的组合物或方法修饰的那些细胞与未通过本公开内容的组合物或方法修饰的那些细胞区分开。此类细胞表面标记物包括例如但不限于“指定簇”或“分类决定簇”蛋白(经常缩写为“CD”)，例如截短或全长形式的CD19、CD271、CD34、CD22、CD20、CD33、CD52或其任何组合。细胞表面标记物进一步包括自杀基因标记物RQR8 (Philip B等人Blood. 2014 Aug 21；124(8):1277-87)。

表达载体将优选地但任选地包括至少一种可选择的药物抗性标记物，用于分离通过本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的可选择的药物抗性标记物可以包含野生型或突变型Neo、DHFR、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2或其任何组合。

本公开内容的至少一种蛋白质支架可以以修饰的形式例如融合蛋白进行表达，并且不仅可以包括分泌信号，而且还可以包括另外的异源功能区域。例如，另外的氨基酸特别是荷电氨基酸的区域，可以加入蛋白质支架的N末端，以改善在宿主细胞中、在纯化过程中或在随后的处理和贮存过程中的稳定性和持久性。另外，可以将肽部分加入本公开内容的蛋白质支架中，以促进纯化。可以在蛋白质支架或其至少一个片段的最终制备之前去除此类区域。此类方法在许多标准实验室手册中进行描述，所述实验室手册例如Sambrook，同上，第17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel，同上，第16、17和18章。

本领域普通技术人员知道可用于表达编码本公开内容的蛋白质的核酸的众多表达系统。可替代地，本公开内容的核酸可以通过在宿主细胞中开启(通过操纵)而在宿主细胞中表达，所述宿主细胞含有编码本公开内容的蛋白质支架的内源性DNA。此类方法是本领域众所周知的，例如，如通过引用以其整体并入本文的美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所述的。

可用于产生蛋白质支架、其指定部分或变体的细胞培养物的示例是如本领域已知的细菌、酵母和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统经常是单层细胞的形式，尽管也可以使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域已开发了能够表达完整的糖基化蛋白的许多合适的宿主细胞系，并且包括COS-1 (例如ATCC CRL 1650)、COS-7 (例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21 (例如ATCC CRL-10)、CHO (例如ATCC CRL 1610)和BSC-1 (例如ATCC CRL-26)细胞系，Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等等，其可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，Va. (www.atcc.org)容易获得。优选的宿主细胞包括淋巴样起源的细胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC登录号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登录号CRL-1851)。在一个优选的方面，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。

用于这些细胞的表达载体可以包括下述表达控制序列中的一种或多种，例如但不限于复制起点；启动子(例如，晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利号5,168,062；5,385,839)、HSV tk启动子、pgk (磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1 α启动子(美国专利号5,266,491)、至少一种人启动子；增强子和/或加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点(例如，SV40大T Ag 多聚A添加位点)和转录终止子序列。参见例如，Ausubel等人，同上；Sambrook等人，同上。可用于生产本公开内容的核酸或蛋白质的其它细胞是已知的，和/或例如可得自美国典型培养物保藏中心的细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或者其它已知或商业来源。

当采用真核宿主细胞时，通常将多聚腺苷酸花或转录终止子序列引入载体内。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸化序列。还可以包括用于转录物的准确剪接的序列。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，J. Virol. 45:773-781 (1983))。另外，如本领域已知的，可以将控制宿主细胞中的复制的基因序列引入载体内。

scFv纯化

可以通过众所周知的方法，从重组细胞培养物中回收且纯化scFv，所述方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。高效液相层析(“HPLC”)也可以用于纯化。参见例如，Colligan，Current Protocols in Immunology，或CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)，例如，第1、4、6、8、9、10章，各自通过引用以其整体并入本文。

本公开内容的scFv包括纯化的产物、化学合成程序的产物和通过重组技术从原核或真核宿主产生的产物，所述宿主包括例如大肠杆菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。取决于重组生产程序中采用的宿主，本公开内容的蛋白质支架可以为糖基化的或可以为非糖基化的。此类方法在许多标准实验室手册中进行描述，所述实验室手册例如Sambrook，同上，节段17.37-17.42；Ausubel，同上，第10、12、13、16、18和20章，Colligan，Protein Science，同上，第12-14章，全部通过引用以其整体并入本文。

氨基酸密码

构成本公开内容的蛋白质支架的氨基酸经常是缩写的。氨基酸命名可以通过经由其单字母代码、其三字母代码、名称或三核苷酸密码子指定氨基酸得到指示，如本领域众所周知的(参见Alberts，B.等人，Molecular Biology of The Cell，第三版，GarlandPublishing，Inc.，New York，1994)。本公开内容的蛋白质支架可以包括来自自发或突变和/或人为操纵的一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，如本文指定的。可以通过本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如，Ausubel，同上，第8、15章；Cunningham和Wells，Science 244:1081-1085 (1989))，来鉴定本公开内容的蛋白质支架中对于功能必需的氨基酸。后一程序在分子中的每一个残基处引入单个丙氨酸突变。然后测试所得到的突变型分子的生物活性，例如但不限于至少一种中和活性。对于蛋白质支架结合关键的位点也可以通过结构分析进行鉴定，所述结构分析例如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith等人，J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)和de Vos等人，Science 255:306-312(1992))。

如本领域技术人员将了解的，本公开内容包括本公开内容的至少一种生物活性蛋白质支架。生物活性蛋白质支架具有的比活性是天然(非合成)、内源性或有关和已知的蛋白质支架的比活性的至少20%、30%或40%，且优选至少50%、60%或70%，且最优选至少80%、90%或95%-99%或更多。测定且定量酶促活性和底物特异性的方法是本领域技术人员众所周知的。

在另一个方面，本公开内容涉及如本文所述的蛋白质支架和片段，其通过有机部分的共价附着进行修饰。此类修饰可以产生具有改善的药代动力学性质(例如，增加的体内血清半衰期)的蛋白质支架片段。有机部分可以为线性或支链的亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在特定方面，亲水聚合物基团可以具有约800至约120,000道尔顿的分子量，并且可以为聚烷烃二醇(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，并且脂肪酸或脂肪酸酯基团可以包含约八至约四十个碳原子。

本公开内容的修饰的蛋白质支架和片段可以包含一个或多个有机部分，其直接或间接地与抗体共价键合。与本公开内容的蛋白质支架或片段键合的每个有机部分可以独立地是亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文使用的，术语“脂肪酸”涵盖一元羧酸和二元羧酸。如该术语在本文中使用的，“亲水聚合物基团”指在水中比在辛烷中更可溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更可溶。因此，通过聚赖氨酸的共价附着修饰的蛋白质支架由本公开内容涵盖。适合于修饰本公开内容的蛋白质支架的亲水聚合物可以为线性或支链的，并且包括例如聚烷烃二醇(例如，PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等等)、碳水化合物(例如，葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等等)、亲水性氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等等)、聚烷烃氧化物(例如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本公开内容的蛋白质支架的亲水聚合物作为分开的分子实体具有约800至约150,000道尔顿的分子量。例如，可以使用PEG5000和PEG20,000，其中下标是以道尔顿计的聚合物的平均分子量。亲水聚合物基团可以由1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。由脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水聚合物可以通过采用合适的方法进行制备。例如，包含胺基团的聚合物可以偶联到脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸酯，并且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧酸酯(例如，用N,N-羰基二咪唑激活)可以偶联到聚合物上的羟基。

适合于修饰本公开内容的蛋白质支架的脂肪酸和脂肪酸酯可以为饱和的，或者可以包含一个或多个不饱和单元。适合于修饰本公开内容的蛋白质支架的脂肪酸包括例如正十二酸(C12，月桂酸)、正十四酸(C14，肉豆蔻酸)、正十八酸(C18，硬脂酸)、正二十酸(C20，花生酸)、正二十二酸(C22，山萮酸)、正三十酸(C30)、正四十酸(C40)、顺式-Δ9-十八酸(C18，油酸)、所有顺式Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸C20，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等等。合适的脂肪酸酯包括包含直链或支链低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基可以包含1至约12个，优选1至约6个碳原子。

可以使用合适的方法，例如通过与一种或多种改性剂反应，来制备修饰的蛋白质支架和片段。如该术语在本文中使用的，“改性剂”指包含活化基团的合适的有机基团(例如，亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是化学部分或官能团，其可以在适当条件下与第二化学基团反应，从而在改性剂和第二化学基团之间形成共价键。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等等。可以与硫醇反应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等等。醛官能团可以与含胺或酰肼的分子偶联，并且叠氮基团可以与三价磷基团反应，以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺(phosphorimide)键合。将活化基团引入分子内的合适方法是本领域已知的(参见例如，Hermanson，G. T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press: San Diego，Calif.(1996))。活化基团可以直接与有机基团(例如，亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)键合，或通过接头部分键合，所述接头部分例如其中一个或多个碳原子可以替换为杂原子例如氧、氮或硫的二价C1-C12基团。合适的接头部分包括例如四甘醇、—(CH2)3—、—NH—(CH2)6—NH—、—(CH2)2—NH—和—CH2—O—CH2—CH2—O—CH2—CH2—O—CH—NH—。包含接头部分的改性剂可以例如通过以下产生：在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的存在下，使单-Boc-烷基二胺(例如，单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应，以在游离胺和脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键。Boc保护基团可以通过用三氟乙酸(TFA)处理从产物中去除，以暴露可以偶联到另一种羧酸酯的伯胺，如所述的，或者可以与马来酸酐反应，并且使所得到的产物环化，以产生脂肪酸的活化的马来酰亚胺衍生物。(参见例如，Thompson等人，WO 92/16221，其全部教导通过引用并入本文。)

本公开内容的修饰的蛋白质支架可以通过使蛋白质支架或片段与改性剂反应来产生。例如，有机部分可以通过采用胺反应性改性剂，例如PEG的NHS酯，以非位点特异性方式与蛋白质支架键合。包含有机部分(其与本公开内容的蛋白质支架的特异性位点键合)的修饰的蛋白质支架和片段可以使用合适的方法进行制备，所述方法例如反向蛋白酶解(Fisch等人，Bioconjugate Chem.，3:147-153 (1992)；Werlen等人，Bioconjugate Chem.，5:411-417 (1994)；Kumaran等人，Protein Sci. 6 (10):2233-2241 (1997)；Itoh等人，Bioorg. Chem.，24(1): 59-68 (1996)；Capellas等人，Biotechnol. Bioeng.，56 (4):456-463 (1997))，以及Hermanson，G. T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press:San Diego，Calif. (1996)中描述的方法。

定义

如本公开内容自始至终使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数所指物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“方法”包括多种此类方法，并且提及“剂量”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个剂量及其等价物等等。

术语“约”或“大约”意指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，例如，测量系统的局限性。例如，“约”可以意指在1个或多个标准差内。可替代地，“约”可以意指至多20%、或至多10%、或至多5%、或至多1%的给定值的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在值的一个数量级内，优选在5倍内，且更优选在2倍内。当本申请和权利要求中描述特定值时，除非另有说明，否则术语“约”应该假定在特定值的可接受误差范围内的含义。

本公开内容提供了分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质、或其生物活性部分，实质上或基本上不含如在其天然存在的环境中发现的，通常与多核苷酸或蛋白质伴随或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质当通过重组技术生产时基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学制品。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在多核苷酸衍生自其的生物体的基因组DNA中，天然侧接多核苷酸的序列(最佳地蛋白质编码序列) (即，位于多核苷酸的5'和3'端处的序列)。例如，在各个方面，分离的多核苷酸可以含有少于约5kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb或0.1 kb的核苷酸序列，其天然侧接多核苷酸衍生自其的细胞的基因组DNA中的多核苷酸。基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有小于约30%、20%、10%、5%或1% (按干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当重组生产本公开内容的蛋白质或其生物活性部分时，最佳地，培养基代表少于约30%、20%、10%、5%或1% (按干重计)的化学前体或非目的蛋白质化学制品。

本公开内容提供了所公开的DNA序列以及由这些DNA序列编码的蛋白质的片段和变体。在本公开内容自始至终使用的，术语“片段”指DNA序列的一部分或氨基酸序列的一部分以及因此由此编码的蛋白质。包含编码序列的DNA序列的片段可以编码蛋白质片段，其保留天然蛋白质的生物活性，并且因此保留如本文所述的对靶DNA序列的DNA识别或结合活性。可替代地，可用作杂交探针的DNA序列的片段一般不编码保留生物活性或不保留启动子活性的蛋白质。因此，DNA序列的片段的范围可以为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，且直到本公开内容的全长多核苷酸。

本公开内容的核酸或蛋白质可以通过模块化方法进行构建，所述模块化方法包括在靶载体中预组装单体单元和/或重复单元，所述靶载体随后可以组装成最终的目的载体。本公开内容的多肽可以包含本公开内容的重复单体，并且可以通过在靶载体中预组装重复单元通过模块化方法进行构建，所述靶载体随后可以组装成最终的目的载体。本公开内容提供了通过该方法产生的多肽以及编码这些多肽的核酸序列。本公开内容提供了宿主生物体和细胞，其包含编码这种模块化方法产生的多肽的核酸序列。

术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体地涵盖单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)和具有多表位特异性的抗体组合物。使用如本文定义的其抗体的天然或合成类似物、突变体、变体、等位基因、同源物和直向同源物(在本文中统称为“类似物”)也在其范围内。因此，根据其一个方面，术语“其抗体”在其最广泛的含义上也涵盖此类类似物。一般地，在此类类似物中，与如本文定义的其抗体相比，一个或多个氨基酸残基可能已被替换、缺失和/或添加。

如本文使用的，“抗体片段”及其所有语法变体被定义为完整抗体的一部分，其包含完整抗体的抗原结合位点或可变区，其中所述部分不含完整抗体的Fc区的恒定重链结构域 (即CH2、CH3和CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；其为具有一级结构的多肽的任何抗体片段，所述多肽由邻接氨基酸残基的一个不间断序列组成(在本文中被称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(l)单链Fv (scFv)分子，(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、或其含有轻链可变结构域的三个CDR的片段，而不含相关的重链部分，以及(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽、或其含有重链可变区的三个CDR的片段，而不含相关的轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一条或多条重链的抗体片段中，重链可以含有在完整抗体的非Fc区中发现的任何恒定结构域序列(例如，IgG同种型中的CHI)，和/或可以含有在完整抗体中发现的任何铰链区序列，和/或可以含有与重链的铰链区序列或恒定结构域序列融合或位于其中的亮氨酸拉链序列。该术语进一步包括单结构域抗体(“sdAB”)，其一般指具有单个单体可变抗体结构域的抗体片段(例如，来自骆驼科动物)。此类抗体片段类型通过本领域普通技术人员将容易理解。

“结合”指大分子之间(例如，蛋白质和核酸之间)的序列特异性、非共价相互作用。结合相互作用的并非所有组分都需要是序列特异性的(例如，与DNA骨架中的磷酸残基接触)，只要相互作用整体上是序列特异性的。

术语“包含”预期意指组合物和方法包括所叙述的要素，但不排除其它要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应该意指排除当用于预期目的时，对组合具有任何重要意义的其它要素。因此，基本上由如本文定义的要素组成的组合物将不排除痕量杂质或惰性载体。“由……组成”应该意指排除多于痕量要素的其它成分和基本的方法步骤。由这些过渡术语各自定义的方面在本公开内容的范围内。

术语“表位”指多肽的抗原决定簇。表位可以包含空间构象中的三个氨基酸，其为表位所独有的。一般地，表位由至少4、5、6或7个此类氨基酸组成，并且更通常地，由至少8、9或10个此类氨基酸组成。确定氨基酸的空间构象的方法是本领域已知的，并且包括例如x射线晶体学和二维核磁共振。

如本文使用的，“表达”指多核苷酸通过其转录成mRNA的过程，和/或转录的mRNA通过其随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中的mRNA剪接。

“基因表达”指将包含在基因中的信息转换成基因产物。基因产物可以为基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、shRNA、微小RNA、结构RNA或任何其它类型的RNA)，或通过mRNA的翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过过程如加帽、多聚腺苷酸化、甲基化和编辑进行修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻化和糖基化进行修饰的蛋白质。

基因表达的“调节”或“调控”指基因活性的变化。表达的调节可以包括但不限于基因激活和基因阻遏。

术语“可操作地连接的(operatively linked)”或其等价物(例如，“可操作地连接的(linked operatively)”)意指两个或更多个分子相对于彼此定位，使得它们能够相互作用以实现可归于一个或两个分子或其组合的功能。

公开了非共价连接的组分以及制备且使用非共价连接的组分的方法。各种组分可以采取如本文所述的各种不同形式。例如，可以使用非共价连接的(即，可操作地连接的)蛋白质，以允许暂时的相互作用，其避免了本领域中的一个或多个问题。非共价连接的组分例如蛋白质结合和解离的能力，仅或主要在其中此类结合对于所需活性需要的情况下实现功能性结合。键合可以具有足以允许所需效应的持续时间。

公开了用于将蛋白质导向生物体的基因组中的特异性基因座的方法。该方法可以包括提供DNA定位组分和提供效应分子的步骤，其中所述DNA定位组分和效应分子能够经由非共价键合可操作地连接。

术语“scFv”指单链可变片段。scFv是用接头肽相连接的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白。接头肽的长度可以为约5至40个氨基酸，或约10至30个氨基酸，或约5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。单链可变片段缺少完整抗体分子中发现的恒定Fc区，并且因此缺少用于纯化抗体的常见结合位点(例如蛋白G)。该术语进一步包括其为细胞内抗体(其为在细胞的细胞质中稳定的抗体)，并且可以与细胞内蛋白质结合的scFv。

术语“单结构域抗体”意指具有能够选择性结合特异性抗原的单个单体可变抗体结构域的抗体片段。单结构域抗体一般是约110个氨基酸长的肽链，包含重链抗体或常见IgG的一个可变结构域(VH)，其一般具有与完整抗体相似的对抗原的亲和力，但更耐热且针对洗涤剂和高浓度尿素更稳定。实例是衍生自骆驼科动物的抗体或鱼抗体。可替代地，单结构域抗体可以由具有四条链的常见鼠或人IgG制成。

如本文使用的，术语“特异性结合(specifically bind)”和“特异性结合(specific binding)”指抗体、抗体片段或纳米抗体优先结合存在于不同抗原的均质混合物中的特定抗原的能力。在一些方面，特异性结合相互作用将区别样品中的期望抗原和不期望抗原。在一些方面，多于约10倍至100倍或更多(例如，多于约1000倍或10,000倍)。“特异性”指免疫球蛋白或免疫球蛋白片段例如纳米抗体相对于不同的抗原靶优先结合一种抗原靶的能力，并不一定暗示高亲和力。

“靶位点”或“靶序列”是定义结合分子与之结合的核酸的一部分的核酸序列，条件是存在用于结合的充分条件。

术语“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸也可以涵盖所描绘的单链的互补链。本公开内容的核酸还涵盖保留相同结构或编码相同蛋白质的基本上等同的核酸及其互补体。

本公开内容的探针可以包含可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的单链核酸。因此，本公开内容的核酸可以指在严格杂交条件下杂交的探针。

本公开内容的核酸可以为单链或双链。即使当分子的大部分是单链时，本公开内容的核酸也可以含有双链序列。即使当分子的大部分是双链时，本公开内容的核酸也可以含有单链序列。本公开内容的核酸可以包括基因组DNA、cDNA、RNA或其杂交体。本公开内容的核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合。本公开内容的核酸可以含有碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。可以合成本公开内容的核酸，以包含非天然氨基酸修饰。本公开内容的核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法来获得。

本公开内容的核酸，或其整个序列、或其任何部分，可以为非天然存在的。本公开内容的核酸可以含有并非天然存在的一个或多个突变、取代、缺失或插入，致使整个核酸序列非天然存在。本公开内容的核酸可以含有一个或多个一式两份的、反向的或重复的序列，其所得的序列并非天然存在的，致使整个核酸序列非天然存在。本公开内容的核酸可以含有并非天然存在的修饰的、人工的或合成的核苷酸，致使整个核酸序列非天然存在。

考虑到遗传密码的冗余，多个核苷酸序列可以编码任何特定的蛋白质。本文考虑了所有此类核苷酸序列。

如本公开内容自始至终使用的，术语“可操作地连接的”指基因的表达，所述基因处于它与之在空间上相连接的启动子的控制下。启动子可以置于处于其控制下的基因的5'(上游)或3' (下游)。启动子和基因之间的距离可以与衍生启动子的基因中该启动子和它控制的基因之间的距离大致相同。可以适应启动子和基因之间的距离变化，而无启动子功能的丧失。

如本公开内容自始至终使用的，术语“启动子”指能够赋予、激活或增强细胞中的核酸表达的合成或天然衍生的分子。启动子可以包含一个或多个特异性转录调控序列，以进一步增强其表达和/或改变空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对处。启动子可以衍生自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以关于表达在其中发生的细胞、组织或器官，或者关于表达在其下发生的发育阶段，或者响应外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，组成性或差异性地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括细菌噬菌体T7启动子、细菌噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、EF-1 α启动子、CAG启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。

如本公开内容自始至终使用的，术语“基本上互补的”指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540个或更多个核苷酸或氨基酸的区域上，第一序列与第二序列的互补体至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%等同，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。

如本公开内容自始至终使用的，术语“基本上等同的”指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540个或更多个核苷酸或氨基酸的区域上，第一序列和第二序列至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%等同，或就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补。

如本公开内容自始至终使用的，当用于描述核酸时，术语“变体”指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其一部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上等同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补体或基本上等同于其的序列杂交的核酸。

如本公开内容自始至终使用的，术语“载体”指含有复制起点的核酸序列。载体可以为病毒载体、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以为DNA或RNA载体。载体可以为自复制的染色体外载体，且优选为DNA质粒。载体可以包含氨基酸与DNA序列、RNA序列、或DNA和RNA序列两者的组合。

如本公开内容自始至终使用的，当用于描述肽或多肽时，术语“变体”指这样的肽或多肽，其通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列中不同，但保留至少一种生物活性。变体还可以意指具有氨基酸序列的蛋白质，其与保留至少一种生物活性的具有氨基酸序列的参考蛋白质基本上等同。

氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、荷电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域理解的，通过考虑氨基酸的亲水指数，可以部分地鉴定这些微小变化。Kyte等人，J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代，且仍保留蛋白质功能。在一个方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可以用于揭示将导致蛋白质保留生物学功能的取代。在肽的背景下氨基酸的亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，已报告与抗原性和免疫原性良好关联的一种有用度量。美国专利号4,554,101，完全通过引用并入本文。

具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以导致保留生物活性，例如免疫原性的肽。可以用亲水性值在彼此±2内的氨基酸来执行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者均受该氨基酸的特定侧链的影响。与该观察一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸且特别是这些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质所揭示的。

如本文使用的，“保守”氨基酸取代可以如下表A、B或C中阐述的进行定义。在一些方面，融合多肽和/或编码此类融合多肽的核酸包括已通过修饰编码本公开内容的多肽的多核苷酸引入的保守取代。氨基酸可以根据物理性质以及对二级蛋白质结构和三级蛋白质结构的贡献进行分类。保守取代是用一种氨基酸取代具有相似性质的另一种氨基酸。示例性的保守取代在表A中阐述。

表A -- 保守取代I

可替代地，如表B中阐述的，保守氨基酸可以如Lehninger，(Biochemistry，第二版；Worth Publishers，Inc. NY，N.Y. (1975)，第71-77页)中所述进行分组。

表B -- 保守取代II

可替代地，示例性保守取代在表C中阐述。

表C -- 保守取代III

原始残基	示例性取代
		Ala (A)	Val Leu Ile Met
Arg (R)	Lys His
		Asn (N)	Gln
Asp (D)	Glu
		Cys (C)	Ser Thr
Gln (Q)	Asn
		Glu (E)	Asp
Gly (G)	Ala Val Leu Pro
		His (H)	Lys Arg
Ile (I)	Leu Val Met Ala Phe
		Leu (L)	Ile Val Met Ala Phe
Lys (K)	Arg His
		Met (M)	Leu Ile Val Ala
Phe (F)	Trp Tyr Ile
		Pro (P)	Gly Ala Val Leu Ile
Ser (S)	Thr
		Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr Phe Ile
		Tyr (Y)	Trp Phe Thr Ser
Val (V)	Ile Leu Met Ala

应当理解，本公开内容的多肽预期包括荷有氨基酸残基的一个或多个插入、缺失或取代或其任何组合，以及除氨基酸残基的插入、缺失或取代外的修饰的多肽。本公开内容的多肽或核酸可以含有一个或多个保守取代。

如本公开内容自始至终使用的，术语“多于一个”上述氨基酸取代指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个所述氨基酸取代。术语“多于一个”可以指2、3、4或5个所述氨基酸取代。

本公开内容的多肽和蛋白质，或其整个序列、或其任何部分，可以为非天然存在的。本公开内容的多肽和蛋白质可以含有并非天然存在的一个或多个突变、取代、缺失或插入，致使整个氨基酸序列非天然存在。本公开内容的多肽和蛋白质可以含有一个或多个一式两份的、反向的或重复的序列，其所得的序列并非天然存在的，致使整个氨基酸序列非天然存在。本公开内容的多肽和蛋白质可以含有并非天然存在的修饰的、人工的或合成的氨基酸，致使整个氨基酸序列非天然存在。

如本公开内容自始至终使用的，“序列同一性”可以通过使用独立的可执行BLAST引擎程序用于比对(blast)两个序列(bl2seq)进行确定，所述程序可以从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) (NCBI) ftp网站检索，使用缺省参数(Tatusova和Madden，FEMS Microbiol Lett.，1999，174，247-250；其通过引用以其整体并入本文)。当在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下使用时，术语“等同的”或“同一性”指在每个序列的指定区域上相同的残基的指定百分比。百分比可以通过以下进行计算：最佳地比对两个序列，在指定区域上比较两个序列，确定等同残基在两个序列中出现的位置数目，以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数目，并且将结果乘以100，以得到序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同长度，或比对产生一个或多个交错端部且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括在计算的分母而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被视为等价的。可以手动地或通过使用计算机序列算法如BLAST或BLAST 2.0来执行同一性。

如本公开内容自始至终使用的，术语“内源的”指与靶基因或它引入其内的宿主细胞天然相关的核酸或蛋白质序列。

如本公开内容自始至终使用的，术语“外源的”指与靶基因或它引入其内的宿主细胞并非天然相关的核酸或蛋白质序列，包括天然存在的核酸例如DNA序列的非天然存在的多重拷贝、或位于非天然存在的基因组位置中的天然存在的核酸序列。

本公开内容提供了将包含DNA序列的多核苷酸构建体引入宿主细胞内的方法。“引入”意指以这样的方式将多核苷酸构建体呈递给细胞，使得构建体获得对宿主细胞的内部的接近。本公开内容的方法并不依赖用于将多核苷酸构建体引入宿主细胞内的特定方法，仅依赖于多核苷酸构建体获得对宿主的一种细胞的内部的接近。用于将多核苷酸构建体引入细菌、植物、真菌和动物内的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

实施例

实施例1：人源化MUC1-C scFv抗体和嵌合抗原受体(CAR)的生成

生成具有抗原识别区的嵌合抗原受体(CAR)，所述抗原识别区包含特异性结合MUC1-C的表位的单链抗体(图1A和1B)。

作为初步研究，MUC1表达在不同的细胞类型(图2A和2B)中进行评价，所述细胞类型包括K562细胞(永生化的人慢性粒细胞性白血病细胞)、Raji细胞(用作癌症模型的人造血细胞系)、经修饰以表达MUC1-C的Raji细胞、活化的T细胞和RPMI8226细胞(人外周血B细胞浆细胞瘤/骨髓瘤细胞系)。通过用抗MUC1-N抗体染色来评价这些细胞各自中的MUC1表达。对于K562细胞，染色对照峰出现在抗MUC1-N Ab峰的左侧。对于Raji细胞，染色对照峰与抗MUC1-N Ab峰重叠，然而，抗MUC1-N Ab峰更高。对于经修饰以表达MUC1-C的Raji细胞，染色对照峰与抗MUC1-N Ab峰重叠，然而，抗MUC1-N Ab峰更高。对于活化的T细胞，染色对照峰出现在抗MUC1-N Ab峰的左侧。对于RPMI8226细胞，染色对照峰出现在抗MUC1-N Ab峰的左侧。MUC-1C还在不同癌细胞系的实验对象组上表达，所述实验对象组包括乳腺癌(breastcancer)或乳腺癌(mammary gland cancer) (MDA-MB 468)、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、白血病和多发性骨髓瘤(图3)。

为了生成人源化MUC1-C scFv CAR，执行了识别MUC1-C的小鼠单克隆抗体的可变区的计算机上(in silico)互补决定区(CDR)移植人源化。执行了关于可变区(可变重(VH)和可变轻(VL)两者)的计算建模，并且在不改变CDR区的情况下鉴定了最适当的人VH/VL构架受体；最适当的人VH和VL构架受体分别是IGHV1-69 08和IGKV6-21 02。在人源化过程期间，将小鼠CDR移植到人构架受体内。研究了人构架中不同于小鼠构架中的残基。如果产生了新的接触，如果丧失了旧的接触，如果制备了规范的小鼠残基，或者如果预测到抗原结合区域内的不稳定性，则设计受体构架中的从人残基到小鼠残基的回复突变。所有得到的重链(4 + 2个变体(H1B和H2B))和轻链(3)序列连同它们的比对一起展示(图5A和5B)。

用于生成人源化MUC1-C scFv CAR的示例性小鼠CDR区包含下述氨基酸序列：

CDRH1 – NFWMN (SEQ ID NO: 69)；CDRH2 – QIYPGDGDTNYNGKFKG (SEQ ID NO:70)；CDRH3 – SYYRSAWFAY (SEQ ID NO: 71)；CDRL1 – RASQSIGTSIH (SEQ ID NO: 72)；CDRL2 – YASESIS (SEQ ID NO: 73)；CDRL3 – QQSNNWPLT (SEQ ID NO: 74)。在一些情况下，CDRH2区进行突变，以生成人源化MUC1-C scFv CAR。这包括包含QIYPGDGDTNYNAKFKG(SEQ ID NO: 75)的氨基酸序列的CDRH2。

示例性的人源化MUC1-C-scFv CAR的图解在图4中进行描绘。使用下述人源化MUC1-C CAR结构：信号肽(CD8α) – 轻链 – 接头 – 重链 – 铰链(CD8α) – 跨膜(CD8α) –细胞内信号传导(4-1BB) – 细胞内信号传导(CD3ζ)。

实施例2 - 人源化MUC1-C scFv CAR-T细胞的功能分析

将MUC1-C候选CAR亚克隆到三顺反子piggyBac转座子内(EF1α启动子 - iC9安全开关 - T2A - MUC1-C CAR - T2A - DHFR选择基因)，并且如本文所述的，使用来自正常的人献血者的泛T细胞产生CAR-T细胞(图6)。在转座子递送后19天，使用加上His标签的p62/p58 MUC1蛋白，随后为抗His二抗，通过FACS染色确认每种候选CAR在piggyBac修饰细胞表面上的表达(图6)。具体而言，细胞通过流式细胞术就CAR在模拟转座(蓝色)或抗CD3/CD28珠再激活(红色)细胞(激活48小时)上的表面表达进行检查，所述细胞接受编码CAR的转座子，并且数据显示为叠加直方图；数字代表在细胞表面上表达CAR的细胞百分比。所有候选MUC1-C CAR都在piggyBac产生的CAR-T细胞的表面上进行表达且检测(图7)。表2显示了关于非活化和活化T细胞表面上的CAR表达的平均荧光强度(MFI)。

表2. CAR候选MUC1-C CAR-T细胞的表面表达。

如本文所述的，使用来自正常的人献血者的泛T细胞产生候选MUC1-C CAR-T细胞。CAR+ T细胞在转座子递送后19天就表面CD45RA、CD45RO和CD62L的表达进行FACS染色，以限定T_SCM、T_CM、T_EM和T_EFF细胞；T_SCM (CD45RA+/CD45RO-/CD62L+)、T_CM (CD45RA-/CD45RO+/CD62L+)、T_EM (CD45RA-/CD45RO+/CD62L-)、T_EFF (CD45RA+/CD45RO-/CD62L-)。结果显示于表3中。所有piggyBac产生的候选MUC1-C CAR-T细胞群体都占优势地由异常高水平的有利的T_SCM和T_CM细胞构成。

表3. 在第19天时，在CD8+候选MUC-1C CAR-T细胞中的TEFF、TSCM、TCM和TEM比例

所有piggyBac生产的候选MUC1-C CAR-T细胞群体都占优势地由高水平的T_SCM和T_CM细胞构成。

如本文所述的，使用来自正常的人献血者的泛T细胞产生候选MUC1-C CAR-T细胞。CAR-T细胞与三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468.lucGFP (表达萤光素酶(luc)和绿色荧光蛋白(GFP)的MDA-MB-468)一起以各种E:T比(40:1、20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1、0.313:1)共培养24小时(图8)。测量报道分子信号，以确定细胞毒性。对于线图中的每种CAR显示了MDA-MB-468的杀死。所有CAR+ T细胞都表达了MUC1+ MDA-MB-468的特异性杀死。模拟转座的T细胞并未特异性杀死靶细胞(灰色虚线)。对于每种CAR在表4中显示了在E:T的范围内杀死MDA-MB-468的曲线下面积伴随SEM (一式三份运行的样品的平均值的标准误)。所有CAR+ T细胞都表达了MUC1+ MDA-MB-468的特异性杀死。

表4. MDA-MB-468 (MUC1+靶细胞)通过候选MUC1-C CAR-T细胞的特异性杀死的曲线下面积

如本文所述的，使用来自正常的人献血者的泛T细胞产生候选MUC1-C CAR-T细胞。CAR-T细胞与Raji细胞系(MUC1-；蓝色条)或经改造以表达人MUC1同种型10 GenBank NP_001191215.1的Raji细胞系(MUC1+；红色条)一起在10:1的E:T比下共培养24小时，所述两种细胞系均表达绿色荧光蛋白(GFP) (图9)。测量报道分子信号，以确定细胞毒性。对于条形图中的每种CAR显示了每个细胞系的杀死，并且误差条表示一式三份运行的样品的标准差。所有CAR+ T细胞都表达了MUC1+改造的Raji细胞系的特异性杀死，但并不针对MUC1-Raji细胞。模拟转座的T细胞既不杀死Raji，也不杀死改造的Raji靶细胞系。

实施例3 - 使用鼠异种移植模型，在应激剂量下，候选人源化MUC1-C CAR-T细胞的临床前评估

关于使用鼠异种移植模型，在‘应激’剂量下，候选人源化MUC1-C CAR-T细胞的临床前评估的研究设计的示意图解显示于图10中。使用以5x10⁶个细胞的剂量皮下(SC)注射到雌性NSG小鼠内的表达萤光素酶的MDA-MB-468.lucGFP (MDA-MB-468)细胞系的鼠异种移植模型，用于评价在‘应激’剂量(4x10⁶)下的候选MUC1-C CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效。对于这项研究选择了总候选CAR-T细胞的实验对象组。如本文所述的，使用候选P-MUC1-C-101转座子的piggyBac (PB)递送来产生所有CAR-T细胞。小鼠用MDA-MB-468在腋窝中进行注射，并且在肿瘤建立(根据卡尺测量的100-200 mm³)时进行治疗。表5显示了使用鼠异种移植模型，在‘应激’剂量下的候选人源化MUC1-C CAR-T细胞的临床前评估。对于所有治疗的动物根据卡尺测量的肿瘤体积评价针对未治疗组的测量进行标准化。表5显示了在媒介物和治疗组中根据卡尺的肿瘤体积。

表5. 在用候选MUC1-C CAR-T细胞治疗之后，通过曲线下面积(AUC)测量的肿瘤体积

小鼠通过IV注射用‘应激’剂量(4x10⁶)的候选P-MUC1-C-101 CAR-T进行治疗，用于检测不同CAR候选物中可能的功效功能差异的更大分辨率。通过TruCount染色测量媒介物和治疗小鼠的血液中的总T细胞。由抽血确定媒介物和治疗小鼠的血液中T细胞的曲线下面积(AUC)，且结果显示于表6中。

表6. 在用MUC1-C CART-T细胞候选物治疗之后，血液中的T细胞(hCD45+)增殖的曲线下面积。

确定了媒介物和治疗小鼠的CD8+ T细胞表型。对于所有动物通过FACS染色测量了血液中的CD8+ T细胞表型，并且百分比作为组平均值列出，误差条作为SEM。细胞对于表面CD45RA、CD45RO和CD62L的表达进行染色，以限定T_SCM、T_CM、T_EM和T_EFF细胞；T_SCM (CD45RA+/CD45RO-/CD62L+)、T_CM (CD45RA-/CD45RO+/CD62L+)、T_EM (CD45RA-/CD45RO+/CD62L-)、T_EFF(CD45RA+CD45RO-CD62L-)。对于测试的所有MUC-1C CAR-T细胞，在输注前一天、第12天和第19天时，T_SCM和T_CM表型比T_EM和T_EFF表型更丰富。

序列表

<110> 波赛达治疗公司

<120> 抗MUC1组合物和使用方法

<130> POTH-040/001WO 325002-2400

<150> 62/951,257

<151> 2019-12-20

<160> 181

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

<223> X是Val或Ile

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (38)..(38)

<223> X是Arg或Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (40)..(40)

<223> X是Ala或Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (62)..(62)

<223> X是Gly或Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (68)..(68)

<223> X是Val或Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (76)..(76)

<223> X是Thr或Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (90)..(90)

<223> X是Asp或Ala

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Xaa Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Xaa Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Xaa Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (74)..(74)

<223> X是Thr或Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (78)..(78)

<223> X是Leu或Val

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (85)..(85)

<223> X是Thr或Asp

<400> 2

Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile Asn Ser Xaa Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "H1"人源化重链可变区

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "H1B"人源化重链可变区

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "H2"人源化重链可变区

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Ala Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "H2B"人源化重链可变区

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Ala Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "H3"人源化重链可变区

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Ala Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "H4"人源化重链可变区

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Ala Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L1"人源化轻链可变区

<400> 9

Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L2"人源化轻链可变区

<400> 10

Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L3"人源化轻链可变区

<400> 11

Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L1H1" CAR

<400> 12

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln

20 25 30

Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Asn Ser Leu Glu Ser Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

100 105 110

Asn Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser

145 150 155 160

Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe Trp

165 170 175

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

180 185 190

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

195 200 205

Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met

210 215 220

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

225 230 235 240

Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 13

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L1H1B" CAR

<400> 13

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln

20 25 30

Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

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<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成多肽 - "L2H1B" CAR

<400> 19

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 20

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Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 29

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L3H4" CAR

<400> 29

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln

20 25 30

Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile

85 90 95

Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

100 105 110

Asn Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser

145 150 155 160

Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe Trp

165 170 175

Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

180 185 190

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

195 200 205

Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

210 215 220

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Ala Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

225 230 235 240

Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 30

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H1" CAR

<400> 30

atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60

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agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300

tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

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cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600

accaactaca acggcaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660

accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggata ccgccgtgta cttctgcgcc 720

cggtcctact acagaagcgc ttggtttgcc tattggggcc agggaaccct cgtgaccgtt 780

agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840

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gcactgcctc caagg 1455

<210> 31

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H1B" CAR

<400> 31

atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60

cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120

accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180

cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300

tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480

gtgaaggtgt cctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540

cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600

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accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggata ccgccgtgta cttctgcgcc 720

cggtcctact acagaagcgc ttggtttgcc tattggggcc agggaaccct cgtgaccgtt 780

agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840

cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900

ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960

ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020

attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080

tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140

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gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380

gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440

gcactgcctc caagg 1455

<210> 32

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H2" CAR

<400> 32

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cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300

tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

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gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540

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agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780

agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840

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gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440

gcactgcctc caagg 1455

<210> 33

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H2B" CAR

<400> 33

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cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300

tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480

gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540

cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600

accaactaca acgccaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660

accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720

agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780

agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840

cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900

ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960

ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020

attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080

tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140

gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200

cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260

aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320

gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380

gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440

gcactgcctc caagg 1455

<210> 34

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H3" CAR

<400> 34

atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60

cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120

accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180

cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300

tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480

gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540

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accaactaca acggcaagtt caagggcaga gctacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660

accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720

agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780

agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840

cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900

ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960

ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020

attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080

tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140

gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200

cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260

aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320

gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380

gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440

gcactgcctc caagg 1455

<210> 35

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H4" CAR

<400> 35

atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60

cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120

accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180

cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300

tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480

gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540

aagcagcggc caggccaagg cctggaatgg atcggacaaa tctatcccgg cgacggcgac 600

accaactaca acggcaagtt caagggcaga gctacactga ccgccgacaa gagcagcagc 660

accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720

agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780

agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840

cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900

ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960

ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020

attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080

tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140

gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200

cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260

aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320

gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380

gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440

gcactgcctc caagg 1455

<210> 36

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L2H1" CAR

<400> 36

atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60

cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120

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cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcgtggaa 300

tccgaggaca ttgccgacta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480

gtgaaggtgt cctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540

cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600

accaactaca acggcaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660

accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggata ccgccgtgta cttctgcgcc 720

cggtcctact acagaagcgc ttggtttgcc tattggggcc agggaaccct cgtgaccgtt 780

agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840

cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900

ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960

ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020

attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080

tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140

gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200

cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260

aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320

gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380

gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440

gcactgcctc caagg 1455

<210> 37

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L2H1B" CAR

<400> 37

atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60

cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120

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cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcgtggaa 300

tccgaggaca ttgccgacta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480

gtgaaggtgt cctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540

cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600

accaactaca acgccaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660

accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggata ccgccgtgta cttctgcgcc 720

cggtcctact acagaagcgc ttggtttgcc tattggggcc agggaaccct cgtgaccgtt 780

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<213> 人工序列

<220>

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<211> 1455

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cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

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<210> 45

<211> 1455

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<220>

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cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgtctatcaa cagcgtggaa 300

tccgaggaca ttgccgacta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

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gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540

cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600

accaactaca acgccaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660

accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720

agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780

agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840

cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900

ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960

ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020

attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080

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cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgtctatcaa cagcgtggaa 300

tccgaggaca ttgccgacta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

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accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720

agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780

agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840

cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900

ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960

ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020

attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080

tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140

gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200

cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260

aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320

gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380

gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440

gcactgcctc caagg 1455

<210> 47

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L3H4" CAR

<400> 47

atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60

cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120

accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180

cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgtctatcaa cagcgtggaa 300

tccgaggaca ttgccgacta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480

gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540

aagcagcggc caggccaagg cctggaatgg atcggacaaa tctatcccgg cgacggcgac 600

accaactaca acggcaagtt caagggcaga gctacactga ccgccgacaa gagcagcagc 660

accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720

agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780

agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840

cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900

ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960

ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020

attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080

tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140

gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200

cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260

aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320

gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380

gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440

gcactgcctc caagg 1455

<210> 48

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "H1"人源化重链可变区

<400> 48

caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaaggtg 60

tcctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt ccgacaggcc 120

cctggacaag gcctggaatg gatcggccaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180

aacggcaagt tcaagggcag agtgacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgag aagcgaggat accgccgtgt acttctgcgc ccggtcctac 300

tacagaagcg cttggtttgc ctattggggc cagggaaccc tcgtgaccgt tagctct 357

<210> 49

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "H1B"人源化重链可变区

<400> 49

caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaaggtg 60

tcctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt ccgacaggcc 120

cctggacaag gcctggaatg gatcggccaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180

aacgccaagt tcaagggcag agtgacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgag aagcgaggat accgccgtgt acttctgcgc ccggtcctac 300

tacagaagcg cttggtttgc ctattggggc cagggaaccc tcgtgaccgt tagctct 357

<210> 50

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "H2"人源化重链可变区

<400> 50

caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaagatc 60

agctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt ccgacaggcc 120

cctggacaag gcctggaatg gatcggccaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180

aacggcaagt tcaagggcag agtgacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgag aagcgaggct accgccgtgt acttctgtgc cagaagctac 300

tacagaagcg cttggtttgc ctactggggc cagggaacac tcgtgaccgt tagctct 357

<210> 51

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "H2B"人源化重链可变区

<400> 51

caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaagatc 60

agctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt ccgacaggcc 120

cctggacaag gcctggaatg gatcggccaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180

aacgccaagt tcaagggcag agtgacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgag aagcgaggct accgccgtgt acttctgtgc cagaagctac 300

tacagaagcg cttggtttgc ctactggggc cagggaacac tcgtgaccgt tagctct 357

<210> 52

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "H3"人源化重链可变区

<400> 52

caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaagatc 60

agctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt caagcagcgg 120

ccaggccaag gcctggaatg gatcggacaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180

aacggcaagt tcaagggcag agctacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgag aagcgaggct accgccgtgt acttctgtgc cagaagctac 300

tacagaagcg cttggtttgc ctactggggc cagggaacac tcgtgaccgt tagctct 357

<210> 53

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "H4"人源化重链可变区

<400> 53

caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaagatc 60

agctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt caagcagcgg 120

ccaggccaag gcctggaatg gatcggacaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180

aacggcaagt tcaagggcag agctacactg accgccgaca agagcagcag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgag aagcgaggct accgccgtgt acttctgtgc cagaagctac 300

tacagaagcg cttggtttgc ctactggggc cagggaacac tcgtgaccgt tagctct 357

<210> 54

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1"人源化轻链可变区

<400> 54

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240

gaggacattg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 55

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L2"人源化轻链可变区

<400> 55

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 56

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L3"人源化轻链可变区

<400> 56

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 57

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CD8a信号肽

<400> 57

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 58

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - CD8a信号肽

<400> 58

atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60

cct 63

<210> 59

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - 接头序列

<400> 59

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 60

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - 接头序列

<400> 60

ggcggaggcg gtagcggtgg cggaggtagc ggaggtggtg gatct 45

<210> 61

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CD8a铰链

<400> 61

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 62

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - CD8a铰链

<400> 62

accacaacac cggcgcctag acctccaaca ccagctccta caatcgcgag tcagcccctg 60

tctctcagac ccgaagcctg caggccagct gcaggaggag ctgtgcacac caggggcctg 120

gacttcgcct gcgac 135

<210> 63

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CD8a跨膜结构域

<400> 63

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 64

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - CD8a跨膜结构域

<400> 64

atctacattt gggcaccact ggccgggacc tgtggagtgc tgctgctgag cctggtcatc 60

acactgtact gc 72

<210> 65

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - 41BB ICS

<400> 65

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 66

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - 41BB ICS

<400> 66

aagagaggca ggaagaaact gctgtatatt ttcaaacagc ccttcatgcg ccccgtgcag 60

actacccagg aggaagacgg gtgctcctgt cgattccctg aggaagagga aggcgggtgt 120

gagctg 126

<210> 67

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CD3z ICS

<400> 67

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 68

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - CD3z ICS

<400> 68

cgcgtgaagt ttagtcgatc agcagatgcc ccagcttaca aacagggaca gaaccagctg 60

tataacgagc tgaatctggg ccgccgagag gaatatgacg tgctggataa gcggagagga 120

cgcgaccccg aaatgggagg caagcccagg cgcaaaaacc ctcaggaagg cctgtataac 180

gagctgcaga aggacaaaat ggcagaagcc tattctgaga tcggcatgaa gggggagcga 240

cggagaggca aagggcacga tgggctgtac cagggactga gcaccgccac aaaggacacc 300

tatgatgctc tgcatatgca ggcactgcct ccaagg 336

<210> 69

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CDRH1

<400> 69

Asn Phe Trp Met Asn

1 5

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CDRH2

<400> 70

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 71

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CDRH3

<400> 71

Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 72

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CDRL1

<400> 72

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His

1 5 10

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CDRL2

<400> 73

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

1 5

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CDRL3

<400> 74

Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 75

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CDRL3

<400> 75

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 76

<211> 158

<212> PRT

<213> 智人

<400> 76

Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn

1 5 10 15

Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala

20 25 30

Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro

35 40 45

Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile

50 55 60

Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln

85 90 95

Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr

100 105 110

Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp

115 120 125

Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu

130 135 140

Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu

145 150 155

<210> 77

<211> 58

<212> PRT

<213> 智人

<400> 77

Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn

1 5 10 15

Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala

20 25 30

Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro

35 40 45

Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly

50 55

<210> 78

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - MUC1C/ECD肽

<400> 78

Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn

1 5 10 15

Val His Asp Val Glu Thr

20

<210> 79

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - MUC1C/ECD肽

<400> 79

Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr

1 5 10 15

Asn Leu Thr Ile Ser Asp

20

<210> 80

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - MUC1C/ECD肽

<400> 80

Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala

1 5 10 15

Gln Ser Gly Ala Gly

20

<210> 81

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - MUC1C/ED肽

<400> 81

Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln

1 5 10

<210> 82

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - MUC1C/ED肽

<400> 82

Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn

1 5

<210> 83

<211> 1053

<212> PRT

<213> 合成

<400> 83

Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly

20 25 30

Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg

35 40 45

Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile

50 55 60

Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His

65 70 75 80

Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu

85 90 95

Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu

100 105 110

Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr

115 120 125

Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala

130 135 140

Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys

145 150 155 160

Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr

165 170 175

Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln

180 185 190

Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg

195 200 205

Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys

210 215 220

Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe

225 230 235 240

Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr

245 250 255

Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn

260 265 270

Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe

275 280 285

Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu

290 295 300

Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys

305 310 315 320

Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr

325 330 335

Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala

340 345 350

Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu

355 360 365

Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser

370 375 380

Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile

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Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

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Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

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Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

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Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

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<210> 87

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - Clo051

<400> 87

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - dCas9-Clo051

<400> 88

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1 5 10 15

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755 760 765

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770 775 780

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<212> DNA

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<223> 合成多核苷酸 - dCas9-Clo051

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gacgaactgc ggggacagat tagtcacatc agtcacgagt acctgtcact gattgatctg 120

gccttcgaca gcaagcagaa tagactgttt gagatgaaag tgctggaact gctggtcaac 180

gagtatggct tcaagggcag acatctgggc gggtctagga aacctgacgg catcgtgtac 240

agtaccacac tggaagacaa cttcggaatc attgtcgata ccaaggctta ttccgagggc 300

tactctctgc caattagtca ggcagatgag atggaaaggt acgtgcgcga aaactcaaat 360

agggacgagg aagtcaaccc caataagtgg tgggagaatt tcagcgagga agtgaagaaa 420

tactacttcg tctttatctc aggcagcttc aaagggaagt ttgaggaaca gctgcggaga 480

ctgtccatga ctaccggggt gaacggatct gctgtcaacg tggtcaatct gctgctgggc 540

gcagaaaaga tcaggtccgg ggagatgaca attgaggaac tggaacgcgc catgttcaac 600

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gaagataaga aacacgagcg gcatcccatc tttggcaaca ttgtggacga agtcgcttat 1020

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ctgatcgagg gagatctgaa ccctgacaat tctgatgtgg acaagctgtt catccagctg 1200

gtccagacat acaatcagct gtttgaggaa aacccaatta atgcctcagg cgtggacgca 1260

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gatttccagt tttataaagt cagggagatc aacaactacc accatgctca tgacgcatac 3600

ctgaacgcag tggtcgggac cgccctgatt aagaaatacc ccaagctgga gtccgagttc 3660

gtgtacggag actataaagt gtacgatgtc cggaagatga tcgccaaatc tgagcaggaa 3720

attggcaagg ccaccgctaa gtatttcttt tacagtaaca tcatgaattt ctttaagacc 3780

gaaatcacac tggcaaatgg ggagatcaga aaaaggcctc tgattgagac caacggggag 3840

acaggagaaa tcgtgtggga caagggaagg gattttgcta ccgtgcgcaa agtcctgtcc 3900

atgccccaag tgaatattgt caagaaaact gaagtgcaga ccgggggatt ctctaaggag 3960

agtattctgc ctaagcgaaa ctctgataaa ctgatcgccc ggaagaaaga ctgggacccc 4020

aagaagtatg gcgggttcga ctctccaaca gtggcttaca gtgtcctggt ggtcgcaaag 4080

gtggaaaagg ggaagtccaa gaaactgaag tctgtcaaag agctgctggg aatcactatt 4140

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gaggtgaaga aagacctgat cattaagctg ccaaaatact cactgtttga gctggaaaac 4260

ggacgaaagc gaatgctggc aagcgccgga gaactgcaga agggcaatga gctggccctg 4320

ccctccaaat acgtgaactt cctgtatctg gctagccact acgagaaact gaaggggtcc 4380

cctgaggata acgaacagaa gcagctgttt gtggagcagc acaaacatta tctggacgag 4440

atcattgaac agatttcaga gttcagcaag agagtgatcc tggctgacgc aaatctggat 4500

aaagtcctga gcgcatacaa caagcaccga gacaaaccaa tccgggagca ggccgaaaat 4560

atcattcatc tgttcaccct gacaaacctg ggcgcccctg cagccttcaa gtattttgac 4620

accacaatcg atcggaagag atacacttct accaaagagg tgctggatgc taccctgatc 4680

caccagagta ttaccggcct gtatgagaca cgcatcgacc tgtcacagct gggaggcgat 4740

gggagcccca agaaaaagcg gaaggtgtct agttaa 4776

<210> 90

<211> 1588

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - dCas9-Clo051

<400> 90

Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Gly Ile Lys Ser Asn Ile Ser

1 5 10 15

Leu Leu Lys Asp Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ser His Ile Ser His Glu

20 25 30

Tyr Leu Ser Leu Ile Asp Leu Ala Phe Asp Ser Lys Gln Asn Arg Leu

35 40 45

Phe Glu Met Lys Val Leu Glu Leu Leu Val Asn Glu Tyr Gly Phe Lys

50 55 60

Gly Arg His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ile Val Tyr Ser

65 70 75 80

Thr Thr Leu Glu Asp Asn Phe Gly Ile Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr

85 90 95

Ser Glu Gly Tyr Ser Leu Pro Ile Ser Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg

100 105 110

Tyr Val Arg Glu Asn Ser Asn Arg Asp Glu Glu Val Asn Pro Asn Lys

115 120 125

Trp Trp Glu Asn Phe Ser Glu Glu Val Lys Lys Tyr Tyr Phe Val Phe

130 135 140

Ile Ser Gly Ser Phe Lys Gly Lys Phe Glu Glu Gln Leu Arg Arg Leu

145 150 155 160

Ser Met Thr Thr Gly Val Asn Gly Ser Ala Val Asn Val Val Asn Leu

165 170 175

Leu Leu Gly Ala Glu Lys Ile Arg Ser Gly Glu Met Thr Ile Glu Glu

180 185 190

Leu Glu Arg Ala Met Phe Asn Asn Ser Glu Phe Ile Leu Lys Tyr Gly

195 200 205

Gly Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr

210 215 220

Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser

225 230 235 240

Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys

245 250 255

Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala

260 265 270

Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn

275 280 285

Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val

290 295 300

Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu

305 310 315 320

Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu

325 330 335

Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys

340 345 350

Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala

355 360 365

Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp

370 375 380

Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val

385 390 395 400

Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly

405 410 415

Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg

420 425 430

Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu

435 440 445

Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys

450 455 460

Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp

465 470 475 480

Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln

485 490 495

Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu

500 505 510

Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu

515 520 525

Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr

530 535 540

Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu

545 550 555 560

Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly

565 570 575

Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu

580 585 590

Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp

595 600 605

Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln

610 615 620

Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe

625 630 635 640

Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr

645 650 655

Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg

660 665 670

Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn

675 680 685

Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu

690 695 700

Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro

705 710 715 720

Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr

725 730 735

Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser

740 745 750

Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg

755 760 765

Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu

770 775 780

Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala

785 790 795 800

Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp

805 810 815

Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu

820 825 830

Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys

835 840 845

Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg

850 855 860

Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly

865 870 875 880

Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser

885 890 895

Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser

900 905 910

Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly

915 920 925

Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile

930 935 940

Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys

945 950 955 960

Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg

965 970 975

Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met

980 985 990

Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys

995 1000 1005

Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr

1010 1015 1020

Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu

1025 1030 1035

Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val

1040 1045 1050

Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu

1055 1060 1065

Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser

1070 1075 1080

Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu

1085 1090 1095

Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys

1100 1105 1110

Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile

1115 1120 1125

Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala

1130 1135 1140

Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp

1145 1150 1155

Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu

1160 1165 1170

Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

1175 1180 1185

Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

1190 1195 1200

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu

1205 1210 1215

Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile

1220 1225 1230

Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe

1235 1240 1245

Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu

1250 1255 1260

Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly

1265 1270 1275

Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr

1280 1285 1290

Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys

1295 1300 1305

Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro

1310 1315 1320

Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp

1325 1330 1335

Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser

1340 1345 1350

Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu

1355 1360 1365

Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser

1370 1375 1380

Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr

1385 1390 1395

Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser

1400 1405 1410

Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala

1415 1420 1425

Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1430 1435 1440

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly

1445 1450 1455

Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His

1460 1465 1470

Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser

1475 1480 1485

Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser

1490 1495 1500

Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu

1505 1510 1515

Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala

1520 1525 1530

Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr

1535 1540 1545

Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile

1550 1555 1560

Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly

1565 1570 1575

Asp Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1580 1585

<210> 91

<211> 4767

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - dCas9-Clo051

<400> 91

atgcctaaga agaagcggaa ggtggaaggc atcaaaagca acatctccct cctgaaagac 60

gaactccggg ggcagattag ccacattagt cacgaatacc tctccctcat cgacctggct 120

ttcgatagca agcagaacag gctctttgag atgaaagtgc tggaactgct cgtcaatgag 180

tacgggttca agggtcgaca cctcggcgga tctaggaaac cagacggcat cgtgtatagt 240

accacactgg aagacaactt tgggatcatt gtggatacca aggcatactc tgagggttat 300

agtctgccca tttcacaggc cgacgagatg gaacggtacg tgcgcgagaa ctcaaataga 360

gatgaggaag tcaaccctaa caagtggtgg gagaacttct ctgaggaagt gaagaaatac 420

tacttcgtct ttatcagcgg gtccttcaag ggtaaatttg aggaacagct caggagactg 480

agcatgacta ccggcgtgaa tggcagcgcc gtcaacgtgg tcaatctgct cctgggcgct 540

gaaaagattc ggagcggaga gatgaccatc gaagagctgg agagggcaat gtttaataat 600

agcgagttta tcctgaaata cggtggcggt ggatccgata aaaagtattc tattggttta 660

gccatcggca ctaattccgt tggatgggct gtcataaccg atgaatacaa agtaccttca 720

aagaaattta aggtgttggg gaacacagac cgtcattcga ttaaaaagaa tcttatcggt 780

gccctcctat tcgatagtgg cgaaacggca gaggcgactc gcctgaaacg aaccgctcgg 840

agaaggtata cacgtcgcaa gaaccgaata tgttacttac aagaaatttt tagcaatgag 900

atggccaaag ttgacgattc tttctttcac cgtttggaag agtccttcct tgtcgaagag 960

gacaagaaac atgaacggca ccccatcttt ggaaacatag tagatgaggt ggcatatcat 1020

gaaaagtacc caacgattta tcacctcaga aaaaagctag ttgactcaac tgataaagcg 1080

gacctgaggt taatctactt ggctcttgcc catatgataa agttccgtgg gcactttctc 1140

attgagggtg atctaaatcc ggacaactcg gatgtcgaca aactgttcat ccagttagta 1200

caaacctata atcagttgtt tgaagagaac cctataaatg caagtggcgt ggatgcgaag 1260

gctattctta gcgcccgcct ctctaaatcc cgacggctag aaaacctgat cgcacaatta 1320

cccggagaga agaaaaatgg gttgttcggt aaccttatag cgctctcact aggcctgaca 1380

ccaaatttta agtcgaactt cgacttagct gaagatgcca aattgcagct tagtaaggac 1440

acgtacgatg acgatctcga caatctactg gcacaaattg gagatcagta tgcggactta 1500

tttttggctg ccaaaaacct tagcgatgca atcctcctat ctgacatact gagagttaat 1560

actgagatta ccaaggcgcc gttatccgct tcaatgatca aaaggtacga tgaacatcac 1620

caagacttga cacttctcaa ggccctagtc cgtcagcaac tgcctgagaa atataaggaa 1680

atattctttg atcagtcgaa aaacgggtac gcaggttata ttgacggcgg agcgagtcaa 1740

gaggaattct acaagtttat caaacccata ttagagaaga tggatgggac ggaagagttg 1800

cttgtaaaac tcaatcgcga agatctactg cgaaagcagc ggactttcga caacggtagc 1860

attccacatc aaatccactt aggcgaattg catgctatac ttagaaggca ggaggatttt 1920

tatccgttcc tcaaagacaa tcgtgaaaag attgagaaaa tcctaacctt tcgcatacct 1980

tactatgtgg gacccctggc ccgagggaac tctcggttcg catggatgac aagaaagtcc 2040

gaagaaacga ttactccatg gaattttgag gaagttgtcg ataaaggtgc gtcagctcaa 2100

tcgttcatcg agaggatgac caactttgac aagaatttac cgaacgaaaa agtattgcct 2160

aagcacagtt tactttacga gtatttcaca gtgtacaatg aactcacgaa agttaagtat 2220

gtcactgagg gcatgcgtaa acccgccttt ctaagcggag aacagaagaa agcaatagta 2280

gatctgttat tcaagaccaa ccgcaaagtg acagttaagc aattgaaaga ggactacttt 2340

aagaaaattg aatgcttcga ttctgtcgag atctccgggg tagaagatcg atttaatgcg 2400

tcacttggta cgtatcatga cctcctaaag ataattaaag ataaggactt cctggataac 2460

gaagagaatg aagatatctt agaagatata gtgttgactc ttaccctctt tgaagatcgg 2520

gaaatgattg aggaaagact aaaaacatac gctcacctgt tcgacgataa ggttatgaaa 2580

cagttaaaga ggcgtcgcta tacgggctgg ggacgattgt cgcggaaact tatcaacggg 2640

ataagagaca agcaaagtgg taaaactatt ctcgattttc taaagagcga cggcttcgcc 2700

aataggaact ttatgcagct gatccatgat gactctttaa ccttcaaaga ggatatacaa 2760

aaggcacagg tttccggaca aggggactca ttgcacgaac atattgcgaa tcttgctggt 2820

tcgccagcca tcaaaaaggg catactccag acagtcaaag tagtggatga gctagttaag 2880

gtcatgggac gtcacaaacc ggaaaacatt gtaatcgaga tggcacgcga aaatcaaacg 2940

actcagaagg ggcaaaaaaa cagtcgagag cggatgaaga gaatagaaga gggtattaaa 3000

gaactgggca gccagatctt aaaggagcat cctgtggaaa atacccaatt gcagaacgag 3060

aaactttacc tctattacct acaaaatgga agggacatgt atgttgatca ggaactggac 3120

ataaaccgtt tatctgatta cgacgtcgat gccattgtac cccaatcctt tttgaaggac 3180

gattcaatcg acaataaagt gcttacacgc tcggataaga accgagggaa aagtgacaat 3240

gttccaagcg aggaagtcgt aaagaaaatg aagaactatt ggcggcagct cctaaatgcg 3300

aaactgataa cgcaaagaaa gttcgataac ttaactaaag ctgagagggg tggcttgtct 3360

gaacttgaca aggccggatt tattaaacgt cagctcgtgg aaacccgcca aatcacaaag 3420

catgttgcac agatactaga ttcccgaatg aatacgaaat acgacgagaa cgataagctg 3480

attcgggaag tcaaagtaat cactttaaag tcaaaattgg tgtcggactt cagaaaggat 3540

tttcaattct ataaagttag ggagataaat aactaccacc atgcgcacga cgcttatctt 3600

aatgccgtcg tagggaccgc actcattaag aaatacccga agctagaaag tgagtttgtg 3660

tatggtgatt acaaagttta tgacgtccgt aagatgatcg cgaaaagcga acaggagata 3720

ggcaaggcta cagccaaata cttcttttat tctaacatta tgaatttctt taagacggaa 3780

atcactctgg caaacggaga gatacgcaaa cgacctttaa ttgaaaccaa tggggagaca 3840

ggtgaaatcg tatgggataa gggccgggac ttcgcgacgg tgagaaaagt tttgtccatg 3900

ccccaagtca acatagtaaa gaaaactgag gtgcagaccg gagggttttc aaaggaatcg 3960

attcttccaa aaaggaatag tgataagctc atcgctcgta aaaaggactg ggacccgaaa 4020

aagtacggtg gcttcgatag ccctacagtt gcctattctg tcctagtagt ggcaaaagtt 4080

gagaagggaa aatccaagaa actgaagtca gtcaaagaat tattggggat aacgattatg 4140

gagcgctcgt cttttgaaaa gaaccccatc gacttccttg aggcgaaagg ttacaaggaa 4200

gtaaaaaagg atctcataat taaactacca aagtatagtc tgtttgagtt agaaaatggc 4260

cgaaaacgga tgttggctag cgccggagag cttcaaaagg ggaacgaact cgcactaccg 4320

tctaaatacg tgaatttcct gtatttagcg tcccattacg agaagttgaa aggttcacct 4380

gaagataacg aacagaagca actttttgtt gagcagcaca aacattatct cgacgaaatc 4440

atagagcaaa tttcggaatt cagtaagaga gtcatcctag ctgatgccaa tctggacaaa 4500

gtattaagcg catacaacaa gcacagggat aaacccatac gtgagcaggc ggaaaatatt 4560

atccatttgt ttactcttac caacctcggc gctccagccg cattcaagta ttttgacaca 4620

acgatagatc gcaaacgata cacttctacc aaggaggtgc tagacgcgac actgattcac 4680

caatccatca cgggattata tgaaactcgg atagatttgt cacagcttgg gggtgacgga 4740

tcccccaaga agaagaggaa agtctga 4767

<210> 92

<211> 187

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - DHFR突变蛋白

<400> 92

Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly

1 5 10 15

Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser

20 25 30

Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln

35 40 45

Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys

50 55 60

Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu

65 70 75 80

Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp

85 90 95

Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met

100 105 110

Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His

115 120 125

Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu

130 135 140

Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu

145 150 155 160

Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile

165 170 175

Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp

180 185

<210> 93

<211> 561

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - DHFR突变蛋白

<400> 93

atggtcgggt ctctgaattg tatcgtcgcc gtgagtcaga acatgggcat tgggaagaat 60

ggcgatttcc catggccacc tctgcgcaac gagtcccgat actttcagcg gatgacaact 120

acctcctctg tggaagggaa acagaatctg gtcatcatgg gaaagaaaac ttggttcagc 180

attccagaga agaaccggcc cctgaaaggc agaatcaatc tggtgctgtc ccgagaactg 240

aaggagccac cacagggagc tcactttctg agccggtccc tggacgatgc actgaagctg 300

acagaacagc ctgagctggc caacaaagtc gatatggtgt ggatcgtcgg gggaagttca 360

gtgtataagg aggccatgaa tcaccccggc catctgaaac tgttcgtcac acggatcatg 420

caggactttg agagcgatac tttctttcct gaaattgacc tggagaagta caaactgctg 480

cccgaatatc ctggcgtgct gtccgatgtc caggaagaga aaggcatcaa atacaagttc 540

gaggtctatg agaagaatga c 561

<210> 94

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人

<400> 94

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 95

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 95

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 96

<211> 63

<212> DNA

<213> 智人

<400> 96

ggatctggag agggaagggg aagcctgctg acctgtggag acgtggagga aaacccagga 60

cca 63

<210> 97

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 97

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 98

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 98

Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 99

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人

<400> 99

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 100

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人

<400> 100

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 101

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<400> 101

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 102

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人

<400> 102

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 103

<211> 594

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - PB转座酶

<400> 103

Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln

1 5 10 15

Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp

20 25 30

His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile

35 40 45

Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu

50 55 60

Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn

65 70 75 80

Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His

85 90 95

Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu

100 105 110

Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile

115 120 125

Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile

130 135 140

Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg

145 150 155 160

Glu Ser Met Thr Gly Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile

165 170 175

Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn

180 185 190

His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr

195 200 205

Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu

210 215 220

Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val

225 230 235 240

Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile

245 250 255

Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu

260 265 270

Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Met Tyr Ile Pro Asn Lys Pro

275 280 285

Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Tyr Lys

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Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn

305 310 315 320

Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val

325 330 335

His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile

340 345 350

Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val

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Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn

370 375 380

Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro

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Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu

405 410 415

Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys

420 425 430

Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr

435 440 445

Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg

450 455 460

Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn

465 470 475 480

Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val

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Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser

500 505 510

Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu

515 520 525

Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser

530 535 540

Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr

545 550 555 560

Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys

565 570 575

Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser

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Cys Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - SPB转座酶

<400> 104

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50 55 60

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Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile

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Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg

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Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile

165 170 175

Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn

180 185 190

His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr

195 200 205

Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu

210 215 220

Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val

225 230 235 240

Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile

245 250 255

Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu

260 265 270

Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro

275 280 285

Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys

290 295 300

Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn

305 310 315 320

Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val

325 330 335

His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile

340 345 350

Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val

355 360 365

Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn

370 375 380

Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro

385 390 395 400

Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu

405 410 415

Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys

420 425 430

Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr

435 440 445

Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg

450 455 460

Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn

465 470 475 480

Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val

485 490 495

Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser

500 505 510

Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu

515 520 525

Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser

530 535 540

Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr

545 550 555 560

Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys

565 570 575

Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser

580 585 590

Cys Phe

<210> 105

<211> 340

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - SB100x转座酶

<400> 105

Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val

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Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu

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Lys Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His

35 40 45

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50 55 60

Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro

65 70 75 80

Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr

85 90 95

Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu

100 105 110

Lys Gly Arg Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys

115 120 125

Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr

130 135 140

Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe

145 150 155 160

Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys

165 170 175

Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile

180 185 190

Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys

195 200 205

Ile Asp Gly Ile Met Arg Lys Glu Asn Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln

210 215 220

His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val

225 230 235 240

Phe Gln Met Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys

245 250 255

Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser

260 265 270

Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg

275 280 285

Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys

290 295 300

Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Thr Tyr Cys Gly Lys Leu Val

305 310 315 320

Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn

325 330 335

Ala Thr Lys Tyr

340

<210> 106

<211> 340

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - hyperSB100x转座酶

<400> 106

Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val

1 5 10 15

Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu

20 25 30

Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His

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65 70 75 80

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85 90 95

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Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys

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130 135 140

Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe

145 150 155 160

Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys

165 170 175

Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile

180 185 190

Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys

195 200 205

Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln

210 215 220

His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val

225 230 235 240

Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys

245 250 255

Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser

260 265 270

Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg

275 280 285

Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys

290 295 300

Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val

305 310 315 320

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325 330 335

Ala Thr Lys Tyr

340

<210> 107

<211> 5296

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - Helraiser转座子

<400> 107

tcctatataa taaaagagaa acatgcaaat tgaccatccc tccgctacgc tcaagccacg 60

cccaccagcc aatcagaagt gactatgcaa attaacccaa caaagatggc agttaaattt 120

gcatacgcag gtgtcaagcg ccccaggagg caacggcggc cgcgggctcc caggaccttc 180

gctggccccg ggaggcgagg ccggccgcgc ctagccacac ccgcgggctc ccgggacctt 240

cgccagcaga gagcagagcg ggagagcggg cggagagcgg gaggtttgga ggacttggca 300

gagcaggagg ccgctggaca tagagcagag cgagagagag ggtggcttgg agggcgtggc 360

tccctctgtc accccagctt cctcatcaca gctgtggaaa ctgacagcag ggaggaggaa 420

gtcccacccc cacagaatca gccagaatca gccgttggtc agacagctct cagcggcctg 480

acagccagga ctctcattca cctgcatctc agaccgtgac agtagagagg tgggactatg 540

tctaaagaac aactgttgat acaacgtagc tctgcagccg aaagatgccg gcgttatcga 600

cagaaaatgt ctgcagagca acgtgcgtct gatcttgaaa gaaggcggcg cctgcaacag 660

aatgtatctg aagagcagct actggaaaaa cgtcgctctg aagccgaaaa acagcggcgt 720

catcgacaga aaatgtctaa agaccaacgt gcctttgaag ttgaaagaag gcggtggcga 780

cgacagaata tgtctagaga acagtcatca acaagtacta ccaataccgg taggaactgc 840

cttctcagca aaaatggagt acatgaggat gcaattctcg aacatagttg tggtggaatg 900

actgttcgat gtgaattttg cctatcacta aatttctctg atgaaaaacc atccgatggg 960

aaatttactc gatgttgtag caaagggaaa gtctgtccaa atgatataca ttttccagat 1020

tacccggcat atttaaaaag attaatgaca aacgaagatt ctgacagtaa aaatttcatg 1080

gaaaatattc gttccataaa tagttctttt gcttttgctt ccatgggtgc aaatattgca 1140

tcgccatcag gatatgggcc atactgtttt agaatacacg gacaagttta tcaccgtact 1200

ggaactttac atccttcgga tggtgtttct cggaagtttg ctcaactcta tattttggat 1260

acagccgaag ctacaagtaa aagattagca atgccagaaa accagggctg ctcagaaaga 1320

ctcatgatca acatcaacaa cctcatgcat gaaataaatg aattaacaaa atcgtacaag 1380

atgctacatg aggtagaaaa ggaagcccaa tctgaagcag cagcaaaagg tattgctccc 1440

acagaagtaa caatggcgat taaatacgat cgtaacagtg acccaggtag atataattct 1500

ccccgtgtaa ccgaggttgc tgtcatattc agaaacgaag atggagaacc tccttttgaa 1560

agggacttgc tcattcattg taaaccagat cccaataatc caaatgccac taaaatgaaa 1620

caaatcagta tcctgtttcc tacattagat gcaatgacat atcctattct ttttccacat 1680

ggtgaaaaag gctggggaac agatattgca ttaagactca gagacaacag tgtaatcgac 1740

aataatacta gacaaaatgt aaggacacga gtcacacaaa tgcagtatta tggatttcat 1800

ctctctgtgc gggacacgtt caatcctatt ttaaatgcag gaaaattaac tcaacagttt 1860

attgtggatt catattcaaa aatggaggcc aatcggataa atttcatcaa agcaaaccaa 1920

tctaagttga gagttgaaaa atatagtggt ttgatggatt atctcaaatc tagatctgaa 1980

aatgacaatg tgccgattgg taaaatgata atacttccat catcttttga gggtagtccc 2040

agaaatatgc agcagcgata tcaggatgct atggcaattg taacgaagta tggcaagccc 2100

gatttattca taaccatgac atgcaacccc aaatgggcag atattacaaa caatttacaa 2160

cgctggcaaa aagttgaaaa cagacctgac ttggtagcca gagtttttaa tattaagctg 2220

aatgctcttt taaatgatat atgtaaattc catttatttg gcaaagtaat agctaaaatt 2280

catgtcattg aatttcagaa acgcggactg cctcacgctc acatattatt gatattagat 2340

agtgagtcca aattacgttc agaagatgac attgaccgta tagttaaggc agaaattcca 2400

gatgaagacc agtgtcctcg actttttcaa attgtaaaat caaatatggt acatggacca 2460

tgtggaatac aaaatccaaa tagtccatgt atggaaaatg gaaaatgttc aaagggatat 2520

ccaaaagaat ttcaaaatgc gaccattgga aatattgatg gatatcccaa atacaaacga 2580

agatctggta gcaccatgtc tattggaaat aaagttgtcg ataacacttg gattgtccct 2640

tataacccgt atttgtgcct taaatataac tgtcatataa atgttgaagt ctgtgcatca 2700

attaaaagtg tcaaatattt atttaaatac atctataaag ggcacgattg tgcaaatatt 2760

caaatttctg aaaaaaatat tatcaatcat gacgaagtac aggacttcat tgactccagg 2820

tatgtgagcg ctcctgaggc tgtttggaga ctttttgcaa tgcgaatgca tgaccaatct 2880

catgcaatca caagattagc tattcatttg ccaaatgatc agaatttgta ttttcatacc 2940

gatgattttg ctgaagtttt agatagggct aaaaggcata actcgacttt gatggcttgg 3000

ttcttattga atagagaaga ttctgatgca cgtaattatt attattggga gattccacag 3060

cattatgtgt ttaataattc tttgtggaca aaacgccgaa agggtgggaa taaagtatta 3120

ggtagactgt tcactgtgag ctttagagaa ccagaacgat attaccttag acttttgctt 3180

ctgcatgtaa aaggtgcgat aagttttgag gatctgcgaa ctgtaggagg tgtaacttat 3240

gatacatttc atgaagctgc taaacaccga ggattattac ttgatgacac tatctggaaa 3300

gatacgattg acgatgcaat catccttaat atgcccaaac aactacggca actttttgca 3360

tatatatgtg tgtttggatg tccttctgct gcagacaaat tatgggatga gaataaatct 3420

cattttattg aagatttctg ttggaaatta caccgaagag aaggtgcctg tgtgaactgt 3480

gaaatgcatg cccttaacga aattcaggag gtattcacat tgcatggaat gaaatgttca 3540

catttcaaac ttccggacta tcctttatta atgaatgcaa atacatgtga tcaattgtac 3600

gagcaacaac aggcagaggt tttgataaat tctctgaatg atgaacagtt ggcagccttt 3660

cagactataa cttcagccat cgaagatcaa actgtacacc ccaaatgctt tttcttggat 3720

ggtccaggtg gtagtggaaa aacatatctg tataaagttt taacacatta tattagaggt 3780

cgtggtggta ctgttttacc cacagcatct acaggaattg ctgcaaattt acttcttggt 3840

ggaagaacct ttcattccca atataaatta ccaattccat taaatgaaac ttcaatttct 3900

agactcgata taaagagtga agttgctaaa accattaaaa aggcccaact tctcattatt 3960

gatgaatgca ccatggcatc cagtcatgct ataaacgcca tagatagatt actaagagaa 4020

attatgaatt tgaatgttgc atttggtggg aaagttctcc ttctcggagg ggattttcga 4080

caatgtctca gtattgtacc acatgctatg cgatcggcca tagtacaaac gagtttaaag 4140

tactgtaatg tttggggatg tttcagaaag ttgtctctta aaacaaatat gagatcagag 4200

gattctgctt atagtgaatg gttagtaaaa cttggagatg gcaaacttga tagcagtttt 4260

catttaggaa tggatattat tgaaatcccc catgaaatga tttgtaacgg atctattatt 4320

gaagctacct ttggaaatag tatatctata gataatatta aaaatatatc taaacgtgca 4380

attctttgtc caaaaaatga gcatgttcaa aaattaaatg aagaaatttt ggatatactt 4440

gatggagatt ttcacacata tttgagtgat gattccattg attcaacaga tgatgctgaa 4500

aaggaaaatt ttcccatcga atttcttaat agtattactc cttcgggaat gccgtgtcat 4560

aaattaaaat tgaaagtggg tgcaatcatc atgctattga gaaatcttaa tagtaaatgg 4620

ggtctttgta atggtactag atttattatc aaaagattac gacctaacat tatcgaagct 4680

gaagtattaa caggatctgc agagggagag gttgttctga ttccaagaat tgatttgtcc 4740

ccatctgaca ctggcctccc atttaaatta attcgaagac agtttcccgt gatgccagca 4800

tttgcgatga ctattaataa atcacaagga caaactctag acagagtagg aatattccta 4860

cctgaacccg ttttcgcaca tggtcagtta tatgttgctt tctctcgagt tcgaagagca 4920

tgtgacgtta aagttaaagt tgtaaatact tcatcacaag ggaaattagt caagcactct 4980

gaaagtgttt ttactcttaa tgtggtatac agggagatat tagaataagt ttaatcactt 5040

tatcagtcat tgtttgcatc aatgttgttt ttatatcatg tttttgttgt ttttatatca 5100

tgtctttgtt gttgttatat catgttgtta ttgtttattt attaataaat ttatgtatta 5160

ttttcatata cattttactc atttcctttc atctctcaca cttctattat agagaaaggg 5220

caaatagcaa tattaaaata tttcctctaa ttaattccct ttcaatgtgc acgaatttcg 5280

tgcaccgggc cactag 5296

<210> 108

<211> 1496

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - Helitron转座酶

<400> 108

Met Ser Lys Glu Gln Leu Leu Ile Gln Arg Ser Ser Ala Ala Glu Arg

1 5 10 15

Cys Arg Arg Tyr Arg Gln Lys Met Ser Ala Glu Gln Arg Ala Ser Asp

20 25 30

Leu Glu Arg Arg Arg Arg Leu Gln Gln Asn Val Ser Glu Glu Gln Leu

35 40 45

Leu Glu Lys Arg Arg Ser Glu Ala Glu Lys Gln Arg Arg His Arg Gln

50 55 60

Lys Met Ser Lys Asp Gln Arg Ala Phe Glu Val Glu Arg Arg Arg Trp

65 70 75 80

Arg Arg Gln Asn Met Ser Arg Glu Gln Ser Ser Thr Ser Thr Thr Asn

85 90 95

Thr Gly Arg Asn Cys Leu Leu Ser Lys Asn Gly Val His Glu Asp Ala

100 105 110

Ile Leu Glu His Ser Cys Gly Gly Met Thr Val Arg Cys Glu Phe Cys

115 120 125

Leu Ser Leu Asn Phe Ser Asp Glu Lys Pro Ser Asp Gly Lys Phe Thr

130 135 140

Arg Cys Cys Ser Lys Gly Lys Val Cys Pro Asn Asp Ile His Phe Pro

145 150 155 160

Asp Tyr Pro Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Met Thr Asn Glu Asp Ser Asp

165 170 175

Ser Lys Asn Phe Met Glu Asn Ile Arg Ser Ile Asn Ser Ser Phe Ala

180 185 190

Phe Ala Ser Met Gly Ala Asn Ile Ala Ser Pro Ser Gly Tyr Gly Pro

195 200 205

Tyr Cys Phe Arg Ile His Gly Gln Val Tyr His Arg Thr Gly Thr Leu

210 215 220

His Pro Ser Asp Gly Val Ser Arg Lys Phe Ala Gln Leu Tyr Ile Leu

225 230 235 240

Asp Thr Ala Glu Ala Thr Ser Lys Arg Leu Ala Met Pro Glu Asn Gln

245 250 255

Gly Cys Ser Glu Arg Leu Met Ile Asn Ile Asn Asn Leu Met His Glu

260 265 270

Ile Asn Glu Leu Thr Lys Ser Tyr Lys Met Leu His Glu Val Glu Lys

275 280 285

Glu Ala Gln Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly Ile Ala Pro Thr Glu Val

290 295 300

Thr Met Ala Ile Lys Tyr Asp Arg Asn Ser Asp Pro Gly Arg Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Pro Arg Val Thr Glu Val Ala Val Ile Phe Arg Asn Glu Asp Gly

325 330 335

Glu Pro Pro Phe Glu Arg Asp Leu Leu Ile His Cys Lys Pro Asp Pro

340 345 350

Asn Asn Pro Asn Ala Thr Lys Met Lys Gln Ile Ser Ile Leu Phe Pro

355 360 365

Thr Leu Asp Ala Met Thr Tyr Pro Ile Leu Phe Pro His Gly Glu Lys

370 375 380

Gly Trp Gly Thr Asp Ile Ala Leu Arg Leu Arg Asp Asn Ser Val Ile

385 390 395 400

Asp Asn Asn Thr Arg Gln Asn Val Arg Thr Arg Val Thr Gln Met Gln

405 410 415

Tyr Tyr Gly Phe His Leu Ser Val Arg Asp Thr Phe Asn Pro Ile Leu

420 425 430

Asn Ala Gly Lys Leu Thr Gln Gln Phe Ile Val Asp Ser Tyr Ser Lys

435 440 445

Met Glu Ala Asn Arg Ile Asn Phe Ile Lys Ala Asn Gln Ser Lys Leu

450 455 460

Arg Val Glu Lys Tyr Ser Gly Leu Met Asp Tyr Leu Lys Ser Arg Ser

465 470 475 480

Glu Asn Asp Asn Val Pro Ile Gly Lys Met Ile Ile Leu Pro Ser Ser

485 490 495

Phe Glu Gly Ser Pro Arg Asn Met Gln Gln Arg Tyr Gln Asp Ala Met

500 505 510

Ala Ile Val Thr Lys Tyr Gly Lys Pro Asp Leu Phe Ile Thr Met Thr

515 520 525

Cys Asn Pro Lys Trp Ala Asp Ile Thr Asn Asn Leu Gln Arg Trp Gln

530 535 540

Lys Val Glu Asn Arg Pro Asp Leu Val Ala Arg Val Phe Asn Ile Lys

545 550 555 560

Leu Asn Ala Leu Leu Asn Asp Ile Cys Lys Phe His Leu Phe Gly Lys

565 570 575

Val Ile Ala Lys Ile His Val Ile Glu Phe Gln Lys Arg Gly Leu Pro

580 585 590

His Ala His Ile Leu Leu Ile Leu Asp Ser Glu Ser Lys Leu Arg Ser

595 600 605

Glu Asp Asp Ile Asp Arg Ile Val Lys Ala Glu Ile Pro Asp Glu Asp

610 615 620

Gln Cys Pro Arg Leu Phe Gln Ile Val Lys Ser Asn Met Val His Gly

625 630 635 640

Pro Cys Gly Ile Gln Asn Pro Asn Ser Pro Cys Met Glu Asn Gly Lys

645 650 655

Cys Ser Lys Gly Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Asn Ala Thr Ile Gly Asn

660 665 670

Ile Asp Gly Tyr Pro Lys Tyr Lys Arg Arg Ser Gly Ser Thr Met Ser

675 680 685

Ile Gly Asn Lys Val Val Asp Asn Thr Trp Ile Val Pro Tyr Asn Pro

690 695 700

Tyr Leu Cys Leu Lys Tyr Asn Cys His Ile Asn Val Glu Val Cys Ala

705 710 715 720

Ser Ile Lys Ser Val Lys Tyr Leu Phe Lys Tyr Ile Tyr Lys Gly His

725 730 735

Asp Cys Ala Asn Ile Gln Ile Ser Glu Lys Asn Ile Ile Asn His Asp

740 745 750

Glu Val Gln Asp Phe Ile Asp Ser Arg Tyr Val Ser Ala Pro Glu Ala

755 760 765

Val Trp Arg Leu Phe Ala Met Arg Met His Asp Gln Ser His Ala Ile

770 775 780

Thr Arg Leu Ala Ile His Leu Pro Asn Asp Gln Asn Leu Tyr Phe His

785 790 795 800

Thr Asp Asp Phe Ala Glu Val Leu Asp Arg Ala Lys Arg His Asn Ser

805 810 815

Thr Leu Met Ala Trp Phe Leu Leu Asn Arg Glu Asp Ser Asp Ala Arg

820 825 830

Asn Tyr Tyr Tyr Trp Glu Ile Pro Gln His Tyr Val Phe Asn Asn Ser

835 840 845

Leu Trp Thr Lys Arg Arg Lys Gly Gly Asn Lys Val Leu Gly Arg Leu

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Phe Thr Val Ser Phe Arg Glu Pro Glu Arg Tyr Tyr Leu Arg Leu Leu

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Leu Leu His Val Lys Gly Ala Ile Ser Phe Glu Asp Leu Arg Thr Val

885 890 895

Gly Gly Val Thr Tyr Asp Thr Phe His Glu Ala Ala Lys His Arg Gly

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Leu Leu Leu Asp Asp Thr Ile Trp Lys Asp Thr Ile Asp Asp Ala Ile

915 920 925

Ile Leu Asn Met Pro Lys Gln Leu Arg Gln Leu Phe Ala Tyr Ile Cys

930 935 940

Val Phe Gly Cys Pro Ser Ala Ala Asp Lys Leu Trp Asp Glu Asn Lys

945 950 955 960

Ser His Phe Ile Glu Asp Phe Cys Trp Lys Leu His Arg Arg Glu Gly

965 970 975

Ala Cys Val Asn Cys Glu Met His Ala Leu Asn Glu Ile Gln Glu Val

980 985 990

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Cys Thr Met Ala Ser Ser His Ala Ile Asn Ala Ile Asp Arg Leu

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Leu Arg Glu Ile Met Asn Leu Asn Val Ala Phe Gly Gly Lys Val

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Leu Leu Leu Gly Gly Asp Phe Arg Gln Cys Leu Ser Ile Val Pro

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His Ala Met Arg Ser Ala Ile Val Gln Thr Ser Leu Lys Tyr Cys

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Asn Val Trp Gly Cys Phe Arg Lys Leu Ser Leu Lys Thr Asn Met

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Arg Ser Glu Asp Ser Ala Tyr Ser Glu Trp Leu Val Lys Leu Gly

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Asp Gly Lys Leu Asp Ser Ser Phe His Leu Gly Met Asp Ile Ile

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Glu Ile Pro His Glu Met Ile Cys Asn Gly Ser Ile Ile Glu Ala

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Thr Phe Gly Asn Ser Ile Ser Ile Asp Asn Ile Lys Asn Ile Ser

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Lys Arg Ala Ile Leu Cys Pro Lys Asn Glu His Val Gln Lys Leu

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Asn Glu Glu Ile Leu Asp Ile Leu Asp Gly Asp Phe His Thr Tyr

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Leu Ser Asp Asp Ser Ile Asp Ser Thr Asp Asp Ala Glu Lys Glu

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Asn Phe Pro Ile Glu Phe Leu Asn Ser Ile Thr Pro Ser Gly Met

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Pro Cys His Lys Leu Lys Leu Lys Val Gly Ala Ile Ile Met Leu

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Leu Arg Asn Leu Asn Ser Lys Trp Gly Leu Cys Asn Gly Thr Arg

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Phe Ile Ile Lys Arg Leu Arg Pro Asn Ile Ile Glu Ala Glu Val

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Leu Thr Gly Ser Ala Glu Gly Glu Val Val Leu Ile Pro Arg Ile

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Asp Leu Ser Pro Ser Asp Thr Gly Leu Pro Phe Lys Leu Ile Arg

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Ser Gln Gly Gln Thr Leu Asp Arg Val Gly Ile Phe Leu Pro Glu

1430 1435 1440

Pro Val Phe Ala His Gly Gln Leu Tyr Val Ala Phe Ser Arg Val

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Arg Arg Ala Cys Asp Val Lys Val Lys Val Val Asn Thr Ser Ser

1460 1465 1470

Gln Gly Lys Leu Val Lys His Ser Glu Ser Val Phe Thr Leu Asn

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Val Val Tyr Arg Glu Ile Leu Glu

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸 - Tol2转座子

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tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180

ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240

cgctgatgcc cagtttaatt taaatgttat ttattctgcc tatgaaaatc gttttcacat 300

tatatgaaat tggtcagaca tgttcattgg tcctttggaa gtgacgtcat gtcacatcta 360

ttaccacaat gcacagcacc ttgacctgga aattagggaa attataacag tcaatcagtg 420

gaagaaaatg gaggaagtat gtgattcatc agcagctgcg agcagcacag tccaaaatca 480

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tg 4682

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Asp Ile His Ser Glu Tyr Glu Ile Arg Asp Lys Val Val Cys Thr Thr

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Asp Ala Ser Arg Val Leu Asp Gln Asp Asp Gly Phe Glu Phe Gln Leu

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Pro Lys His Gln Lys Cys Ala Cys His Leu Leu Asn Leu Val Ser Ser

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Val Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ser Asn Glu His Tyr Lys Lys Leu Tyr

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Arg Ser Val Phe Gly Lys Cys Gln Ala Leu Trp Asn Lys Ser Ser Arg

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Ser Ala Leu Ala Ala Glu Ala Val Glu Ser Glu Ser Arg Leu Gln Leu

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Ile Cys Thr Ser Leu Glu Val Pro Met Phe Asn Pro Ala Glu Met Leu

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Ser Val His Gln Leu Ser Leu Lys Leu Gln Arg Leu His His Ser Leu

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Arg Tyr Cys Asp Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ile Gln Thr

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Arg Phe Lys His Met Phe Glu Asp Pro Glu Ile Ile Ala Ala Ala Ile

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Leu Leu Pro Lys Phe Arg Thr Ser Trp Thr Asn Asp Glu Thr Ile Ile

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Lys Arg Gly Met Asp Tyr Ile Arg Val His Leu Glu Pro Leu Asp His

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Lys Lys Glu Leu Ala Asn Ser Ser Ser Asp Asp Glu Asp Phe Phe Ala

545 550 555 560

Ser Leu Lys Pro Thr Thr His Glu Ala Ser Lys Glu Leu Asp Gly Tyr

565 570 575

Leu Ala Cys Val Ser Asp Thr Arg Glu Ser Leu Leu Thr Phe Pro Ala

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Ile Cys Ser Leu Ser Ile Lys Thr Asn Thr Pro Leu Pro Ala Ser Ala

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Leu Asp Ser Thr Asp Ile Ile Gly Glu Glu Asn Lys Ala Gly Thr Thr

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Thr Trp Thr Gly Asp Lys Asp Glu Pro Asn Gly Leu Cys Val Ile Cys

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Lys Arg Lys Cys Asn Glu Leu Asn Gln Lys Lys His Thr Phe Glu Arg

115 120 125

Tyr Val Arg Asp Asp Asn Lys Asn Leu Leu Lys Ala Ser Tyr Leu Val

130 135 140

Ser Leu Arg Ile Ala Lys Gln Gly Glu Ala Tyr Thr Ile Ala Glu Lys

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Leu Ile Lys Pro Cys Thr Lys Asp Leu Thr Thr Cys Val Phe Gly Glu

165 170 175

Lys Phe Ala Ser Lys Val Asp Leu Val Pro Leu Ser Asp Thr Thr Ile

180 185 190

Ser Arg Arg Ile Glu Asp Met Ser Tyr Phe Cys Glu Ala Val Leu Val

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Asn Arg Leu Glu Asn Ala Lys Cys Gly Phe Thr Leu Gln Met Asp Glu

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Ile His Glu Ser Ser Phe Glu Glu Asp Met Leu Phe Cys Lys Ala Leu

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325 330 335

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Lys Asn Leu Leu Leu His Thr Glu Val Arg Trp Leu Ser Arg Gly Lys

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Val Leu Thr Arg Phe Trp Glu Leu Arg Asp Glu Ile Arg Ile Phe Phe

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Ser Asn Thr Ala Leu Asp Pro Asn Leu Lys Ser Asn Ile Leu Glu His

485 490 495

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Asn Asn Ile Ser Trp Val Glu Asn Pro Phe Asn Glu Cys Gly Asn Val

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Asp Thr Leu Pro Ile Lys Glu Arg Glu Gln Leu Ile Asp Ile Arg Thr

530 535 540

Asp Thr Thr Leu Lys Ser Ser Phe Val Pro Asp Gly Ile Gly Pro Phe

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Trp Ile Lys Leu Met Asp Glu Phe Pro Glu Ile Ser Lys Arg Ala Val

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Ser Val Tyr Val Ala Thr Lys Thr Lys Tyr Arg Asn Arg Leu Asp Ala

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<210> 112

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<212> DNA

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aacttcggtt ttacatggac tggcgacaag gatgagccca acggactttg tgtgatttgc 240

gagcaggtag tcaacaattc ctcacttaac ccggccaaac tgaaacgcca tttggacaca 300

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gagtgtataa cgaaaaataa cactgagtgt tttgcgaacc tcaacgattt tttggaaact 1440

tcaaacactg cgttggatcc aaacctgaag tctaatattt tggaacatct caacggtctt 1500

aagaacacct ttctggagta ttttccacct acgtgtaata atatctcctg ggtggagaat 1560

cctttcaatg aatgcggtaa cgtcgataca ctcccaataa aagagaggga acaattgatt 1620

gacatacgga ctgatacgac attgaaatct tcattcgtgc ctgatggtat aggaccattc 1680

tggatcaaac tgatggacga atttccagaa attagcaaac gagctgtcaa agagctcatg 1740

ccatttgtaa ccacttacct ctgtgagaaa tcattttccg tctatgtagc cacaaaaaca 1800

aaatatcgaa atagacttga tgctgaagac gatatgcgac tccaacttac tactatccat 1860

ccagacattg acaacctttg taacaacaag caggctcaga aatcccactg a 1911

<210> 113

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - FKBP12

<400> 113

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

1 5 10 15

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

20 25 30

Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

35 40 45

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

50 55 60

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

85 90 95

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu

100 105

<210> 114

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - FKBP12

<400> 114

ggggtccagg tcgagactat ttcaccaggg gatgggcgaa catttccaaa aaggggccag 60

acttgcgtcg tgcattacac cgggatgctg gaggacggga agaaagtgga cagctccagg 120

gatcgcaaca agcccttcaa gttcatgctg ggaaagcagg aagtgatccg aggatgggag 180

gaaggcgtgg cacagatgtc agtcggccag cgggccaaac tgaccattag ccctgactac 240

gcttatggag caacaggcca cccagggatc attccccctc atgccaccct ggtcttcgat 300

gtggaactgc tgaagctgga g 321

<210> 115

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - 接头

<400> 115

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 116

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - 接头

<400> 116

ggaggaggag gatcc 15

<210> 117

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - 截短的Cas9

<400> 117

Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp

1 5 10 15

Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile

20 25 30

Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly

35 40 45

Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His

50 55 60

Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu

65 70 75 80

Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys

85 90 95

Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe

100 105 110

Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys

115 120 125

Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys

130 135 140

Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His

145 150 155 160

Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser

165 170 175

Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe

180 185 190

Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe

195 200 205

Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys

210 215 220

Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp

225 230 235 240

Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala

245 250 255

Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe

260 265 270

Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser

275 280

<210> 118

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - 截短的Cas9

<400> 118

tttggggacg tgggggccct ggagtctctg cgaggaaatg ccgatctggc ttacatcctg 60

agcatggaac cctgcggcca ctgtctgatc attaacaatg tgaacttctg cagagaaagc 120

ggactgcgaa cacggactgg ctccaatatt gactgtgaga agctgcggag aaggttctct 180

agtctgcact ttatggtcga agtgaaaggg gatctgaccg ccaagaaaat ggtgctggcc 240

ctgctggagc tggctcagca ggaccatgga gctctggatt gctgcgtggt cgtgatcctg 300

tcccacgggt gccaggcttc tcatctgcag ttccccggag cagtgtacgg aacagacggc 360

tgtcctgtca gcgtggagaa gatcgtcaac atcttcaacg gcacttcttg ccctagtctg 420

gggggaaagc caaaactgtt ctttatccag gcctgtggcg gggaacagaa agatcacggc 480

ttcgaggtgg ccagcaccag ccctgaggac gaatcaccag ggagcaaccc tgaaccagat 540

gcaactccat tccaggaggg actgaggacc tttgaccagc tggatgctat ctcaagcctg 600

cccactccta gtgacatttt cgtgtcttac agtaccttcc caggctttgt ctcatggcgc 660

gatcccaagt cagggagctg gtacgtggag acactggacg acatctttga acagtgggcc 720

cattcagagg acctgcagag cctgctgctg cgagtggcaa acgctgtctc tgtgaagggc 780

atctacaaac agatgcccgg gtgcttcaat tttctgagaa agaaactgtt ctttaagact 840

tcc 843

<210> 119

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 119

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

1 5 10 15

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

20 25 30

Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

35 40 45

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

50 55 60

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

85 90 95

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp

115 120 125

Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile

130 135 140

Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly

145 150 155 160

Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His

165 170 175

Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu

180 185 190

Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys

195 200 205

Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe

210 215 220

Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys

225 230 235 240

Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys

245 250 255

Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His

260 265 270

Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser

275 280 285

Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe

290 295 300

Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe

305 310 315 320

Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys

325 330 335

Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp

340 345 350

Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala

355 360 365

Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe

370 375 380

Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser

385 390

<210> 120

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 120

ggggtccagg tcgagactat ttcaccaggg gatgggcgaa catttccaaa aaggggccag 60

acttgcgtcg tgcattacac cgggatgctg gaggacggga agaaagtgga cagctccagg 120

gatcgcaaca agcccttcaa gttcatgctg ggaaagcagg aagtgatccg aggatgggag 180

gaaggcgtgg cacagatgtc agtcggccag cgggccaaac tgaccattag ccctgactac 240

gcttatggag caacaggcca cccagggatc attccccctc atgccaccct ggtcttcgat 300

gtggaactgc tgaagctgga gggaggagga ggatccggat ttggggacgt gggggccctg 360

gagtctctgc gaggaaatgc cgatctggct tacatcctga gcatggaacc ctgcggccac 420

tgtctgatca ttaacaatgt gaacttctgc agagaaagcg gactgcgaac acggactggc 480

tccaatattg actgtgagaa gctgcggaga aggttctcta gtctgcactt tatggtcgaa 540

gtgaaagggg atctgaccgc caagaaaatg gtgctggccc tgctggagct ggctcagcag 600

gaccatggag ctctggattg ctgcgtggtc gtgatcctgt cccacgggtg ccaggcttct 660

catctgcagt tccccggagc agtgtacgga acagacggct gtcctgtcag cgtggagaag 720

atcgtcaaca tcttcaacgg cacttcttgc cctagtctgg ggggaaagcc aaaactgttc 780

tttatccagg cctgtggcgg ggaacagaaa gatcacggct tcgaggtggc cagcaccagc 840

cctgaggacg aatcaccagg gagcaaccct gaaccagatg caactccatt ccaggaggga 900

ctgaggacct ttgaccagct ggatgctatc tcaagcctgc ccactcctag tgacattttc 960

gtgtcttaca gtaccttccc aggctttgtc tcatggcgcg atcccaagtc agggagctgg 1020

tacgtggaga cactggacga catctttgaa cagtgggccc attcagagga cctgcagagc 1080

ctgctgctgc gagtggcaaa cgctgtctct gtgaagggca tctacaaaca gatgcccggg 1140

tgcttcaatt ttctgagaaa gaaactgttc tttaagactt cc 1182

<210> 121

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - CSR-CD2z

<400> 121

Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu

20 25 30

Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe

35 40 45

Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp

50 55 60

Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu

65 70 75 80

Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His

85 90 95

Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr

100 105 110

Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu

115 120 125

Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu

130 135 140

Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln

145 150 155 160

Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp

165 170 175

Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val

180 185 190

Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu

195 200 205

Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met

210 215 220

Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln

225 230 235 240

Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val

245 250 255

Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr

260 265 270

Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His

275 280 285

Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val

290 295 300

Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val

305 310 315 320

His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys

325 330 335

Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg

340 345 350

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

355 360 365

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

370 375 380

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

385 390 395 400

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

405 410 415

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

420 425 430

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

435 440 445

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 122

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - 具有D111H的CD2 ECD

<400> 122

Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp

1 5 10 15

Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp

20 25 30

Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg

35 40 45

Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys

50 55 60

Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile

65 70 75 80

Tyr Lys Val Ser Ile Tyr His Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys

85 90 95

Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser

100 105 110

Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr

115 120 125

Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser

130 135 140

Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe

145 150 155 160

Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro

165 170 175

Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu

180

<210> 123

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - 具有D111H的CSR-CD2z

<400> 123

Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu

20 25 30

Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe

35 40 45

Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp

50 55 60

Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu

65 70 75 80

Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His

85 90 95

Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr His Thr

100 105 110

Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu

115 120 125

Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu

130 135 140

Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln

145 150 155 160

Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp

165 170 175

Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val

180 185 190

Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu

195 200 205

Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met

210 215 220

Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln

225 230 235 240

Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val

245 250 255

Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr

260 265 270

Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His

275 280 285

Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val

290 295 300

Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val

305 310 315 320

His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys

325 330 335

Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg

340 345 350

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

355 360 365

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

370 375 380

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

385 390 395 400

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

405 410 415

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

420 425 430

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

435 440 445

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 124

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L1H1" scFv

<400> 124

Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln

115 120 125

Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys

130 135 140

Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe Trp Met Asn Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly

165 170 175

Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

180 185 190

Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg

210 215 220

Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser

<210> 125

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L1H1B" scFv

<400> 125

Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln

115 120 125

Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys

130 135 140

Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe Trp Met Asn Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly

165 170 175

Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

180 185 190

Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg

210 215 220

Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser

<210> 126

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L1H2" scFv

<400> 126

Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln

115 120 125

Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys

130 135 140

Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe Trp Met Asn Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly

165 170 175

Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu

180 185 190

Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Arg Ser Glu Ala Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg

210 215 220

Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser

<210> 127

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L1H2B" scFv

<400> 127

Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<400> 138

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<210> 139

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<213> 人工序列

<220>

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<400> 139

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<210> 140

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L3H3" scFv

<400> 140

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<210> 141

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽 - "L3H4" scFv

<400> 141

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<210> 142

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H1" scFv

<400> 142

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240

gaggacattg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aaggtgtcct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggataccg ccgtgtactt ctgcgcccgg 660

tcctactaca gaagcgcttg gtttgcctat tggggccagg gaaccctcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 143

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H1B" scFv

<400> 143

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240

gaggacattg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aaggtgtcct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg ccaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggataccg ccgtgtactt ctgcgcccgg 660

tcctactaca gaagcgcttg gtttgcctat tggggccagg gaaccctcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 144

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H2" scFv

<400> 144

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240

gaggacattg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 145

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H2B" scFv

<400> 145

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240

gaggacattg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg ccaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 146

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H3" scFv

<400> 146

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240

gaggacattg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtcaag 480

cagcggccag gccaaggcct ggaatggatc ggacaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagct acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 147

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L1H4" scFv

<400> 147

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240

gaggacattg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtcaag 480

cagcggccag gccaaggcct ggaatggatc ggacaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagct acactgaccg ccgacaagag cagcagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 148

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L2H1" scFv

<400> 148

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aaggtgtcct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggataccg ccgtgtactt ctgcgcccgg 660

tcctactaca gaagcgcttg gtttgcctat tggggccagg gaaccctcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 149

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L2H1B" scFv

<400> 149

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aaggtgtcct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg ccaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggataccg ccgtgtactt ctgcgcccgg 660

tcctactaca gaagcgcttg gtttgcctat tggggccagg gaaccctcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 150

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L2H2" scFv

<400> 150

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 151

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L2H2B" scFv

<400> 151

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg ccaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 152

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L2H3" scFv

<400> 152

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtcaag 480

cagcggccag gccaaggcct ggaatggatc ggacaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagct acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 153

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L2H4" scFv

<400> 153

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtcaag 480

cagcggccag gccaaggcct ggaatggatc ggacaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagct acactgaccg ccgacaagag cagcagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 154

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L3H1" scFv

<400> 154

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aaggtgtcct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggataccg ccgtgtactt ctgcgcccgg 660

tcctactaca gaagcgcttg gtttgcctat tggggccagg gaaccctcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 155

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L3H1B" scFv

<400> 155

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aaggtgtcct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg ccaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggataccg ccgtgtactt ctgcgcccgg 660

tcctactaca gaagcgcttg gtttgcctat tggggccagg gaaccctcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 156

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L3H2" scFv

<400> 156

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aataatccga ggacattgcc gactactact gccagcagtc caacaactgg cccctgacat 180

ttggccaggg caccaagctg gaaatcaaag gcggaggcgg tagcggtggc ggaggtagcg 240

gagcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 300

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacag cgtgggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 157

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L3H2B" scFv

<400> 157

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg ccaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 158

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L3H3" scFv

<400> 158

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtcaag 480

cagcggccag gccaaggcct ggaatggatc ggacaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagct acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 159

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸 - "L3H4" scFv

<400> 159

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacag cgtggaatcc 240

gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtcaag 480

cagcggccag gccaaggcct ggaatggatc ggacaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg gcaagttcaa gggcagagct acactgaccg ccgacaagag cagcagcacc 600

gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660

agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720

tct 723

<210> 160

<211> 1255

<212> PRT

<213> 智人

<400> 160

Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr

1 5 10 15

Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly

20 25 30

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Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His

50 55 60

Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu

65 70 75 80

Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln

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Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr

100 105 110

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Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

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Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

165 170 175

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

180 185 190

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

195 200 205

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

275 280 285

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

290 295 300

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

305 310 315 320

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

325 330 335

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

340 345 350

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

355 360 365

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

370 375 380

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

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Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

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Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

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Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

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Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

485 490 495

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

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Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

515 520 525

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

530 535 540

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Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

565 570 575

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

580 585 590

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

595 600 605

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

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725 730 735

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

740 745 750

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

755 760 765

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

770 775 780

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

785 790 795 800

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<210> 161

<211> 1074

<212> PRT

<213> 智人

<400> 161

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1 5 10 15

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Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr Pro Pro Ala His Asp Val Thr

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Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala

100 105 110

His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr

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Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr

165 170 175

Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala

180 185 190

His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr

195 200 205

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Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp

385 390 395 400

Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr

405 410 415

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Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp

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Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr

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805 810 815

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820 825 830

His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr

835 840 845

Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala

850 855 860

Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp

865 870 875 880

Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr

885 890 895

Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala

900 905 910

His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr

915 920 925

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Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr

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Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro Ser His His Ser

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Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser

980 985 990

Ser Thr His His Ser Ser Val Pro Pro Leu Thr Ser Ser Asn His Ser

995 1000 1005

Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser

1010 1015 1020

Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro

1025 1030 1035

Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met

1040 1045 1050

Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn

1055 1060 1065

Ile Lys Phe Arg Pro Gly

1070

<210> 162

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 162

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg

<210> 163

<211> 95

<212> PRT

<213> 智人

<400> 163

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro

85 90 95

<210> 164

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1B VH多核苷酸序列

<400> 164

caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaaggtg 60

tcctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt ccgacaggcc 120

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aacgccaagt tcaagggcag agtgacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240

atggaactgt ccagcctgag aagcgaggat acagccgtgt acttctgcgc ccggtcctac 300

tacagaagcg cttggtttgc ctattggggc cagggaaccc tggtcaccgt gtctagt 357

<210> 165

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L1 VL多核苷酸序列

<400> 165

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgtc gcgccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

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agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240

gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 166

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L1H1B scFv多核苷酸序列

<400> 166

gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60

ttcacctgtc gcgccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120

aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240

gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360

ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420

aaggtgtcct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480

caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540

aactacaacg ccaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600

gcctacatgg aactgtccag cctgagaagc gaggatacag ccgtgtactt ctgcgcccgg 660

tcctactaca gaagcgcttg gtttgcctat tggggccagg gaaccctggt caccgtgtct 720

agt 723

<210> 167

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L1H1B CAR多核苷酸序列

<400> 167

atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60

cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120

accttcacct gtcgcgccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180

cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240

agcagatttt ctggcagcgg ctctggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300

tccgaggata tcgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360

cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420

ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480

gtgaaggtgt cctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540

cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600

accaactaca acgccaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660

accgcctaca tggaactgtc cagcctgaga agcgaggata cagccgtgta cttctgcgcc 720

cggtcctact acagaagcgc ttggtttgcc tattggggcc agggaaccct ggtcaccgtg 780

tctagtacaa caacaccggc gcctcggcct ccaacaccag ctcctacaat tgctagccag 840

ccactgtctc tgaggcccga ggcttgtaga cctgctgctg gcggagctgt gcacacaaga 900

ggactggatt tcgcctgcga catctatatc tgggcccctc tggccggaac atgtggcgtt 960

ctgctgctca gcctggtcat caccctgtac tgcaagcggg gcagaaagaa gctgctgtac 1020

atctttaagc agcccttcat gaggcccgtg cagaccacac aagaagagga cggctgctcc 1080

tgccgcttcc ccgaggaaga agaaggcggt tgcgaactga gagtgaagtt cagcagatcc 1140

gccgacgcac ccgcctataa gcagggacag aatcagctgt acaacgagct gaatctgggg 1200

cgcagagaag agtacgacgt gctggacaag agaagaggca gggaccctga gatgggcggc 1260

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gccgaggcct acagcgagat cggaatgaag ggcgagcgca gaagaggcaa gggtcacgat 1380

ggactgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct atgatgccct gcacatgcag 1440

gccctgcctc caaga 1455

<210> 168

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8a铰链多核苷酸序列

<400> 168

acaacaacac cggcgcctcg gcctccaaca ccagctccta caattgctag ccagccactg 60

tctctgaggc ccgaggcttg tagacctgct gctggcggag ctgtgcacac aagaggactg 120

gatttcgcct gcgac 135

<210> 169

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8a跨膜多核苷酸序列

<400> 169

atctatatct gggcccctct ggccggaaca tgtggcgttc tgctgctcag cctggtcatc 60

accctgtact gc 72

<210> 170

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BB多核苷酸序列

<400> 170

aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc tttaagcagc ccttcatgag gcccgtgcag 60

accacacaag aagaggacgg ctgctcctgc cgcttccccg aggaagaaga aggcggttgc 120

gaactg 126

<210> 171

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3z多核苷酸序列

<400> 171

agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgca cccgcctata agcagggaca gaatcagctg 60

tacaacgagc tgaatctggg gcgcagagaa gagtacgacg tgctggacaa gagaagaggc 120

agggaccctg agatgggcgg caagcccaga agaaagaacc ctcaagaggg cctgtataat 180

gagctgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgc 240

agaagaggca agggtcacga tggactgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300

tatgatgccc tgcacatgca ggccctgcct ccaaga 336

<210> 172

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ic9多肽序列

<400> 172

Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe

1 5 10 15

Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu

20 25 30

Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys

35 40 45

Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val

50 55 60

Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala

85 90 95

Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala

115 120 125

Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile

130 135 140

Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr

145 150 155 160

Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu

165 170 175

His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val

180 185 190

Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys

195 200 205

Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln

210 215 220

Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu

225 230 235 240

Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly

245 250 255

Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp

260 265 270

His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly

275 280 285

Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr

290 295 300

Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile

305 310 315 320

Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro

325 330 335

Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln

340 345 350

Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn

355 360 365

Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn

370 375 380

Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser

385 390 395

<210> 173

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ic9多核苷酸序列

<400> 173

atgggcgtgc aggtcgagac aatttctcct ggcgacggcc ggacattccc taagcgagga 60

cagacatgcg tggtgcacta caccggcatg ctggaagatg gcaagaaggt ggacagcagc 120

cgggacagaa acaagccctt caagttcatg ctgggcaagc aagaagtgat cagaggctgg 180

gaagagggcg tcgcccagat gtctgttgga cagagagcca agctgacaat cagccccgat 240

tacgcctatg gcgccacagg acaccctggc atcattcctc cacatgccac actggtgttc 300

gacgtggaac tgctgaagct ggaaggcggc ggaggatctg gctttggaga tgtgggagcc 360

ctggaaagcc tgagaggcaa tgccgatctg gcctacatcc tgagcatgga accttgcggc 420

cactgcctga ttatcaacaa cgtgaacttc tgcagagaga gcggcctgag aaccagaacc 480

ggcagcaaca tcgactgcga gaagctgcgg agaagattca gcagcctgca cttcatggtg 540

gaagtgaagg gcgacctgac cgccaagaaa atggtgctgg ctctgctgga actggcccag 600

caagatcatg gcgccctgga ttgctgtgtg gtcgtgatcc tgtctcacgg ctgtcaggcc 660

agccatctgc aattccctgg cgccgtgtat ggcaccgatg gctgtcctgt gtccgtggaa 720

aagatcgtga acatcttcaa cggcaccagc tgtcctagcc tcggcggaaa gcccaagctg 780

ttcttcatcc aagcctgtgg cggcgagcag aaggatcacg gatttgaggt ggccagcaca 840

agccccgagg atgagtctcc tggaagcaac cctgagcctg acgccacacc tttccaagag 900

ggactgagaa ccttcgacca gctggacgct atcagctccc tgcctacacc tagcgacatc 960

ttcgtgtcct acagcacatt ccccggcttt gtgtcttggc gggaccctaa gtctggctct 1020

tggtatgtgg aaaccctgga cgatatcttc gagcagtggg cccatagcga ggacctgcaa 1080

tctctgctgc tgagagtggc caatgccgtg tccgtgaagg gcatctacaa gcagatgcct 1140

ggctgcttca acttcctgcg gaagaagctg tttttcaaga ccagc 1185

<210> 174

<211> 561

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DHFR多核苷酸序列

<400> 174

atggtcggaa gcctgaactg catcgtggcc gtgtctcaga acatgggcat cggcaagaac 60

ggcgacttcc cttggcctcc tctgagaaac gagagccgct acttccagcg gatgaccacc 120

acaagctccg tggaaggcaa gcagaacctc gtgatcatgg gcaagaaaac ctggttcagc 180

atccctgaga agaacagacc cctgaagggc agaatcaacc tggtgctgag cagagagctg 240

aaagagcctc ctcaaggcgc ccacttcctg agcagatctc tggacgatgc cctgaagctg 300

accgagcagc cagaactggc caacaaagtg gacatggtct ggatcgtcgg cggcagctcc 360

gtgtacaaag aagccatgaa tcaccccggc cacctgaaac tgttcgtgac cagaatcatg 420

caggacttcg agagcgacac attcttcccg gagatcgacc tggaaaagta caaactgctg 480

cctgagtacc ccggcgtgct gagcgacgtg caagaggaaa agggcatcaa gtacaagttc 540

gaggtgtacg agaagaacga c 561

<210> 175

<211> 6616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L1H1B转座子多核苷酸序列

<400> 175

tgtacataga ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg 60

cgtaaaattg acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa 120

tagatattaa gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt 180

tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta 240

acaaaacttt tatcgaatac ctgcagcccg ggggatgcag agggacagcc cccccccaaa 300

gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc cgctaggggg cagcagcgag ccgcccgggg 360

ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg gcagcgtgcg gggacagccc 420

gggcacgggg aaggtggcac gggatcgctt tcctctgaac gcttctcgct gctctttgag 480

cctgcagaca cctgggggga tacggggaaa agttgactgt gcctttcgat cgaaccatgg 540

acagttagct ttgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg 600

gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 660

cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 720

gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 780

cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 840

cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt 900

tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct 960

tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc 1020

cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat 1080

ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt 1140

ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga 1200

tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca 1260

gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta 1320

gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc 1380

ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc 1440

cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga 1500

gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac 1560

ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc 1620

tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac 1680

tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt 1740

tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca 1800

ggtgtcgtga gaattctaat acgactcact atagggtgcg gccgccacca tgggcgtgca 1860

ggtcgagaca atttctcctg gcgacggccg gacattccct aagcgaggac agacatgcgt 1920

ggtgcactac accggcatgc tggaagatgg caagaaggtg gacagcagcc gggacagaaa 1980

caagcccttc aagttcatgc tgggcaagca agaagtgatc agaggctggg aagagggcgt 2040

cgcccagatg tctgttggac agagagccaa gctgacaatc agccccgatt acgcctatgg 2100

cgccacagga caccctggca tcattcctcc acatgccaca ctggtgttcg acgtggaact 2160

gctgaagctg gaaggcggcg gaggatctgg ctttggagat gtgggagccc tggaaagcct 2220

gagaggcaat gccgatctgg cctacatcct gagcatggaa ccttgcggcc actgcctgat 2280

tatcaacaac gtgaacttct gcagagagag cggcctgaga accagaaccg gcagcaacat 2340

cgactgcgag aagctgcgga gaagattcag cagcctgcac ttcatggtgg aagtgaaggg 2400

cgacctgacc gccaagaaaa tggtgctggc tctgctggaa ctggcccagc aagatcatgg 2460

cgccctggat tgctgtgtgg tcgtgatcct gtctcacggc tgtcaggcca gccatctgca 2520

attccctggc gccgtgtatg gcaccgatgg ctgtcctgtg tccgtggaaa agatcgtgaa 2580

catcttcaac ggcaccagct gtcctagcct cggcggaaag cccaagctgt tcttcatcca 2640

agcctgtggc ggcgagcaga aggatcacgg atttgaggtg gccagcacaa gccccgagga 2700

tgagtctcct ggaagcaacc ctgagcctga cgccacacct ttccaagagg gactgagaac 2760

cttcgaccag ctggacgcta tcagctccct gcctacacct agcgacatct tcgtgtccta 2820

cagcacattc cccggctttg tgtcttggcg ggaccctaag tctggctctt ggtatgtgga 2880

aaccctggac gatatcttcg agcagtgggc ccatagcgag gacctgcaat ctctgctgct 2940

gagagtggcc aatgccgtgt ccgtgaaggg catctacaag cagatgcctg gctgcttcaa 3000

cttcctgcgg aagaagctgt ttttcaagac cagcggcagc ggcgaaggca gaggatccct 3060

tttgacatgc ggcgacgtcg aagagaaccc cggacctatg gctctgcctg tgacagctct 3120

gcttctgcct ctggcactgc ttcttcatgc ggcgcgccct gagattctgc tgacacagag 3180

ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc ttcacctgtc gcgccagcca 3240

gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc aatcagagcc ccaagctgct 3300

gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc agattttctg gcagcggctc 3360

tggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc gaggatatcg ccacctacta 3420

ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag ggcaccaagc tggaaatcaa 3480

aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt ggatctcagg ttcagctggt 3540

tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg aaggtgtcct gcaagacaag 3600

cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga caggcccctg gacaaggcct 3660

ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc aactacaacg ccaagttcaa 3720

gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc gcctacatgg aactgtccag 3780

cctgagaagc gaggatacag ccgtgtactt ctgcgcccgg tcctactaca gaagcgcttg 3840

gtttgcctat tggggccagg gaaccctggt caccgtgtct agtacaacaa caccggcgcc 3900

tcggcctcca acaccagctc ctacaattgc tagccagcca ctgtctctga ggcccgaggc 3960

ttgtagacct gctgctggcg gagctgtgca cacaagagga ctggatttcg cctgcgacat 4020

ctatatctgg gcccctctgg ccggaacatg tggcgttctg ctgctcagcc tggtcatcac 4080

cctgtactgc aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc tttaagcagc ccttcatgag 4140

gcccgtgcag accacacaag aagaggacgg ctgctcctgc cgcttccccg aggaagaaga 4200

aggcggttgc gaactgagag tgaagttcag cagatccgcc gacgcacccg cctataagca 4260

gggacagaat cagctgtaca acgagctgaa tctggggcgc agagaagagt acgacgtgct 4320

ggacaagaga agaggcaggg accctgagat gggcggcaag cccagaagaa agaaccctca 4380

agagggcctg tataatgagc tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg 4440

aatgaagggc gagcgcagaa gaggcaaggg tcacgatgga ctgtaccagg gcctgagcac 4500

cgccaccaag gatacctatg atgccctgca catgcaggcc ctgcctccaa gaggaagtgg 4560

cgaaggacgg ggatctcttc tcacgtgcgg ggatgttgaa gagaatcctg gtccaatggt 4620

cggaagcctg aactgcatcg tggccgtgtc tcagaacatg ggcatcggca agaacggcga 4680

cttcccttgg cctcctctga gaaacgagag ccgctacttc cagcggatga ccaccacaag 4740

ctccgtggaa ggcaagcaga acctcgtgat catgggcaag aaaacctggt tcagcatccc 4800

tgagaagaac agacccctga agggcagaat caacctggtg ctgagcagag agctgaaaga 4860

gcctcctcaa ggcgcccact tcctgagcag atctctggac gatgccctga agctgaccga 4920

gcagccagaa ctggccaaca aagtggacat ggtctggatc gtcggcggca gctccgtgta 4980

caaagaagcc atgaatcacc ccggccacct gaaactgttc gtgaccagaa tcatgcagga 5040

cttcgagagc gacacattct tcccggagat cgacctggaa aagtacaaac tgctgcctga 5100

gtaccccggc gtgctgagcg acgtgcaaga ggaaaagggc atcaagtaca agttcgaggt 5160

gtacgagaag aacgactaat aaggtaccga tcacatatgc ctttaattaa acactagttc 5220

tatagtgtca cctaaattcc ctttagtgag ggttaatggc cgtaggccgc cagaattggg 5280

tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 5340

aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 5400

caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt 5460

gtgggaggtt ttttcggact ctaggacctg cgcatgcgct tggcgtaatc atggtcatag 5520

ctgtttcctg ttttccccgt atccccccag gtgtctgcag gctcaaagag cagcgagaag 5580

cgttcagagg aaagcgatcc cgtgccacct tccccgtgcc cgggctgtcc ccgcacgctg 5640

ccggctcggg gatgcggggg gagcgccgga ccggagcgga gccccgggcg gctcgctgct 5700

gccccctagc gggggaggga cgtaattaca tccctggggg ctttgggggg gggctgtccc 5760

tctcaccgcg gtggagctcc agcttttgtt cgaattgggg ccccccctcg agggtatcga 5820

tgatatctat aacaagaaaa tatatatata ataagttatc acgtaagtag aacatgaaat 5880

aacaatataa ttatcgtatg agttaaatct taaaagtcac gtaaaagata atcatgcgtc 5940

attttgactc acgcggtcgt tatagttcaa aatcagtgac acttaccgca ttgacaagca 6000

cgcctcacgg gagctccaag cggcgactga gatgtcctaa atgcacagcg acggattcgc 6060

gctatttaga aagagagagc aatatttcaa gaatgcatgc gtcaatttta cgcagactat 6120

ctttctaggg ttaatctagc tagccttaag ggcgcagccc gcctaatgag cgggcttttt 6180

tttggcttgt tgtccacaac cgttaaacct taaaagcttt aaaagcctta tatattcttt 6240

tttttcttat aaaacttaaa accttagagg ctatttaagt tgctgattta tattaatttt 6300

attgttcaaa catgagagct tagtacgtga aacatgagag cttagtacgt tagccatgag 6360

agcttagtac gttagccatg agggtttagt tcgttaaaca tgagagctta gtacgttaaa 6420

catgagagct tagtacgtac tatcaacagg ttgaactgct gatccacgtt gtggtagaat 6480

tggtaaagag agtcgtgtaa aatatcgagt tcgcacatct tgttgtctga ttattgattt 6540

ttggcgaaac catttgatca tatgacaaga tgtgtatcta ccttaactta atgattttga 6600

taaaaatcat taggta 6616

<210> 176

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽序列

<400> 176

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Phe Trp

20 25 30

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

35 40 45

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr

100 105

<210> 177

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽序列

<400> 177

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr

<210> 178

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽序列

<400> 178

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Ala Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Ser Val Ser Ala

115

<210> 179

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽序列

<400> 179

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 180

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽序列

<400> 180

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Leu

115

<210> 181

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽序列

<400> 181

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含QVQLVQSGAEVKKPGSSVKX₁SCKTSGYAFSNFWMNWVX₂QX₃PGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNX₄KFKGRX₅TLTADKSX₆STAYMELSSLRSEX₇TAVYFCARSYYRSAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，

其中SEQ ID NO: 1的X1是V或I，

其中SEQ ID NO: 1的X2是R或K，

其中SEQ ID NO: 1的X3是A或R，

其中SEQ ID NO: 1的X4是G或A，

其中SEQ ID NO: 1的X5是V或A，

其中SEQ ID NO: 1的X6是T或S，和

其中SEQ ID NO: 1的X7是D或A；

所述轻链可变区包含EILLTQSPDFQSVTPKEKVTFTCRASQSIGTSIHWYQQKPNQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLX₁INSX₂ESEDIAX₃YYCQQSNNWPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，

其中SEQ ID NO: 2的X1是T或S，

其中SEQ ID NO: 2的X2是L或V，和

其中SEQ ID NO: 2的X3是T或D。

2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、单结构域抗体、VHH、VH、scFv、Fab或Fab片段。

3.权利要求1的抗体，其中所述抗体是人源化的。

4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是IgG。

5.权利要求1的抗体，其中所述抗体与人MUC1-C结合。

6.权利要求1的抗体，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。

7.权利要求1的抗体，其中轻链可变区包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ IDNO: 11的氨基酸序列。

8.一种单链可变片段(scFv)，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含QVQLVQSGAEVKKPGSSVKX₁SCKTSGYAFSNFWMNWVX₂QX₃PGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNX₄KFKGRX₅TLTADKSX₆STAYMELSSLRSEX₇TAVYFCARSYYRSAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，

其中SEQ ID NO: 1的X1是V或I，

其中SEQ ID NO: 1的X2是R或K，

其中SEQ ID NO: 1的X3是A或R，

其中SEQ ID NO: 1的X4是G或A，

其中SEQ ID NO: 1的X5是V或A，

其中SEQ ID NO: 1的X6是T或S，和

其中SEQ ID NO: 1的X7是D或A；

其中SEQ ID NO: 2的X1是T或S，

其中SEQ ID NO: 2的X2是L或V，和

其中SEQ ID NO: 2的X3是T或D。

9.权利要求8的scFv，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。

10.权利要求8的scFv，其中轻链可变区包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ IDNO: 11的氨基酸序列。

11.权利要求8-10中任一项的scFv，其中scFv包含在重链可变区和轻链可变区之间的接头。

12.权利要求11的scFv，其中所述接头包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列。

13.权利要求11的scFv，其中所述scFv包含SEQ ID NO: 124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140或141的氨基酸序列。

14.权利要求11的ScFv，其中所述ScFv包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列。

15.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含权利要求1的抗体。

16.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含权利要求8的scFv。

17.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：

(a)包含抗原识别区的胞外结构域，其中所述抗原识别区包含至少一个抗MUC1单链可变片段(scFv)；

(b)跨膜结构域，和

(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域；

其中所述scFv包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含QVQLVQSGAEVKKPGSSVKX₁SCKTSGYAFSNFWMNWVX₂QX₃PGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNX₄KFKGRX₅TLTADKSX₆STAYMELSSLRSEX₇TAVYFCARSYYRSAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，

其中SEQ ID NO: 1的X1是V或I，

其中SEQ ID NO: 1的X2是R或K，

其中SEQ ID NO: 1的X3是A或R，

其中SEQ ID NO: 1的X4是G或A，

其中SEQ ID NO: 1的X5是V或A，

其中SEQ ID NO: 1的X6是T或S，和

其中SEQ ID NO: 1的X7是D或A；

其中SEQ ID NO: 2的X1是T或S，

其中SEQ ID NO: 2的X2是L或V，和

其中SEQ ID NO: 2的X3是T或D。

18.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。

19.权利要求17的CAR，其中轻链可变区包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ IDNO: 11的氨基酸序列。

20.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

21.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

22.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

23.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

24.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

25.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

26.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。

27.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。

28.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。

29.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。

30.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。

31.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。

32.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。

33.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。

34.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。

35.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。

36.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。

37.权利要求17的CAR，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。

38.权利要求17-37中任一项的CAR，其中scFv包含在重链可变区和轻链可变区之间的接头。

39.权利要求38的CAR，其中所述接头包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列。

40.权利要求17的CAR，其中所述scFv包含SEQ ID NO: 124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140或141的氨基酸序列。

41.权利要求17的CAR，其中所述scFv包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列。

42.权利要求17的CAR，其中所述胞外结构域进一步包含信号肽。

43.权利要求42的CAR，其中所述信号肽包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列。

44.权利要求17-43中任一项的CAR，其中CAR进一步包含在抗原识别区和跨膜结构域之间的铰链区。

45.权利要求44的CAR，其中所述铰链区包含SEQ ID NO: 61的氨基酸序列。

46.权利要求17的CAR，其中所述跨膜结构域包含编码CD8跨膜结构域的序列。

47.权利要求46的CAR，其中所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO: 63的氨基酸序列。

48.权利要求17的CAR，其中所述至少一个共刺激结构域包含CD3ζ共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或其组合。

49.权利要求17的CAR，其中所述至少一个共刺激结构域包含CD3ζ共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域，并且其中所述4-1BB共刺激结构域定位于跨膜结构域和CD3ζ共刺激结构域之间。

50.权利要求49的CAR，其中所述4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO: 65的氨基酸序列。

51.权利要求49的CAR，其中所述CD3ζ共刺激结构域包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列。

52.权利要求17的CAR，其中

所述scFv包含在重链可变区和轻链可变区之间的接头，

所述胞外结构域包含信号肽，

所述CAR进一步包含在抗原识别区和跨膜结构域之间的铰链区，

所述跨膜结构域包括包含CD8跨膜结构域的序列；和

所述至少一个共刺激结构域包含CD3ζ共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域，并且其中所述4-1BB共刺激结构域定位于跨膜结构域和CD3ζ共刺激结构域之间。

53.权利要求52的CAR，其中

所述scFv包含SEQ ID NO: 125的氨基酸序列；

其中所述信号肽包含SEQ ID NO: 57；

其中所述铰链区包含SEQ ID NO: 61；

其中所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO: 63；

其中所述4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO: 65；和

其中所述CD3ζ共刺激结构域包含SEQ ID NO: 67。

54.权利要求52的CAR，其中所述CAR包含SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29的氨基酸序列。

55.权利要求52的CAR，其中所述CAR包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。

56.权利要求52的CAR，其中所述CAR的氨基酸序列由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ IDNO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ IDNO: 46、SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 167的核酸序列。

57.权利要求56的CAR，其中所述CAR的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 167的核酸序列的多核苷酸编码。

58.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1的抗体的核酸序列。

59.一种多核苷酸，其包含编码权利要求8的scFv的核酸序列。

60.一种多核苷酸，其包含编码权利要求17的CAR或权利要求52的CAR的核酸序列。

61.一种转座子，其包含编码权利要求17的CAR或权利要求52的CAR的核酸。

62.权利要求61的转座子，其中所述核酸序列包括包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的CAR。

63.权利要求61的转座子，其中所述转座子进一步包含编码诱导型半胱天冬酶多肽的核酸、编码嵌合刺激受体的核酸、编码选择基因的核酸、编码治疗剂的核酸或其组合。

64.权利要求63的转座子，其中所述选择基因包含DHFR抗性基因。

65.权利要求61的转座子，其中所述转座子是piggyBac转座子。

66.权利要求61的转座子，其中所述转座子包含SEQ ID NO: 172的核酸序列。

67.一种载体，其包含权利要求60的多核苷酸。

68.一种载体，其包含权利要求61的转座子。

69.一种细胞，其包含权利要求1的抗体。

70.一种细胞，其包含权利要求8的scFv。

71.一种细胞，其包含权利要求17的CAR。

72.一种细胞，其包含权利要求61的转座子。

73.一种细胞群体，其中多个细胞群体被修饰以表达权利要求17的CAR。

74.权利要求73的细胞群体，其中多个修饰的细胞是多个修饰的免疫细胞。

75.权利要求73的细胞群体，其中多个修饰的细胞是多个修饰的T细胞。

76.权利要求73的细胞群体，其中所述多个细胞群体包含至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的表达权利要求17的CAR的细胞。

77.权利要求76的细胞群体，其中所述CAR包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。

78.权利要求75的细胞群体，其中至少50%的多个修饰的T细胞表达包含CD45RA和CD62L的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD45RO的一种或多种细胞表面标记物。

79.一种组合物，其包含权利要求1的抗体。

80.一种组合物，其包含与细胞毒性剂缀合的权利要求1的抗体。

81.一种组合物，其包含权利要求8的scFv。

82.一种组合物，其包含权利要求17的CAR。

83.一种组合物，其包含权利要求71的细胞。

84.一种组合物，其包含权利要求73的细胞群体。

85.一种药物组合物，其包含权利要求79-84中任一项的组合物和药学上可接受的载体。

86.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求79-84中任一项的组合物。

87.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求85的药物组合物。

88.权利要求86的方法，其中所述癌症是MUC1阳性癌症。

89.权利要求86的方法，其中所述癌症是MUC1-C阳性癌症。

90.权利要求86的方法，其中所述癌症是原发性肿瘤、转移性癌症、多重抗性癌症、进行性肿瘤或复发性癌症。

91.权利要求86的方法，其中所述癌症是实体瘤。

92.权利要求86的方法，其中所述癌症是肺癌、脑癌、头颈癌、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌或食管癌。