KR20220117915A - 항-muc1 조성물 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
MUC1에 대항하는 항체, MUC1-CAR 조성물 및 MUC1 단백질을 표적화하기 위한 이들 항체 및 조성물의 사용 방법이 개시되며, 여기서 MUC1 단백질을 발현하는 세포는, 예를 들어, 세포독성 T 세포에 의해 표적화되고 사멸될 수 있다.
Description
관련 출원
본 출원은 2019년 12월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/951,257호의 우선권 및 이익을 주장한다. 본 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시는 분자 생물학, 및 더욱 구체적으로, 높은 친화성 및 결합활성으로 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
2020년 12월 15일에 작성되고, 크기가 412 KB인, 파일명 "POTH-040_001WO_SequenceListing_ST25"의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
높은 친화성 및 결합활성으로 특이적인 표적 단백질을 인식하고, 이에 결합할 수 있는 작용제를 발견하는 것이 생물 제약 산업의 관심의 초점이 되어왔다. 입수 가능한 옵션보다 더 작고, 더욱 가용성이고, 더욱 안정적인, 더욱 효과적인 작용제가 여전히 요구되고 있다.
본 개시는 하기 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 하기 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체를 제공한다:
여기서, SEQ ID NO: 1의 X1은 V 또는 I이고, SEQ ID NO: 1의 X2는 R 또는 K이고, SEQ ID NO: 1의 X3은 A 또는 R이고, SEQ ID NO: 1의 X4는 G 또는 A이고, SEQ ID NO: 1의 X5는 V 또는 A이고, SEQ ID NO: 1의 X6은 T 또는 S이고, SEQ ID NO: 1의 X7은 D 또는 A이며,
여기서, SEQ ID NO: 2의 X1은 T 또는 S이고, SEQ ID NO: 2의 X2는 L 또는 V이고, SEQ ID NO: 2의 X3은 T 또는 D이다.
단리된 항체는 인간화될 수 있다. 단리된 항체는 IgG일 수 있다. 단리된 항체는 인간 MUC1-C에 결합할 수 있다. 단리된 항체는 단클론성 항체, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, VHH, VH, 단쇄 가변 단편(scFv), Fab 또는 Fab 단편일 수 있다. 바람직하게, 단리된 항체는 scFv이다.
중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함한다.
scFv는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 링커를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 링커는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함한다.
scFv는 SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 또는 SEQ ID NO: 141을 포함할 수 있다. 일 양태에서, scFv는 SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 바와 같은 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 바람직하게, CAR은 본원에 개시된 바와 같은 scFv를 포함한다. CAR은 (a) 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-MUC1 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막관통 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함할 수 있고, 여기서 scFv는 하기 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 하기 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
여기서, SEQ ID NO: 1의 X1은 V 또는 I이고, SEQ ID NO: 1의 X2는 R 또는 K이고, SEQ ID NO: 1의 X3은 A 또는 R이고, SEQ ID NO: 1의 X4는 G 또는 A이고, SEQ ID NO: 1의 X5는 V 또는 A이고, SEQ ID NO: 1의 X6은 T 또는 S이고, SEQ ID NO: 1의 X7은 D 또는 A이며,
여기서, SEQ ID NO: 2의 X1은 T 또는 S이고, SEQ ID NO: 2의 X2는 L 또는 V이고, SEQ ID NO: 2의 X3은 T 또는 D이다.
CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, CAR의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
scFv는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 링커를 포함할 수 있다. 바람직하게, 링커는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함한다. scFv는 SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 또는 SEQ ID NO: 141을 포함할 수 있다. 일 양태에서, scFv는 SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함한다. 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 57의 아미노산 서열을 포함한다. CAR은 항원 인식 영역과 막관통 도메인 사이에 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함한다. 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, CD8 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함한다. 적어도 하나의 공동자극 도메인은 CD3ζ 공동자극 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 적어도 하나의 공동자극 도메인은 CD3ζ 공동자극 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고, 여기서 4-1BB 공동자극 도메인은 막관통 도메인과 CD3ζ 공동자극 도메인 사이에 위치한다. 바람직하게, 4-1BB 공동자극 도메인은 SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, CD3ζ 공동자극 도메인은 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 또한 (a) 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-MUC1 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막관통 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 제공하고, 여기서 scFv는 하기 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 하기 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고;
여기서, SEQ ID NO: 1의 X1은 V 또는 I이고, SEQ ID NO: 1의 X2는 R 또는 K이고, SEQ ID NO: 1의 X3은 A 또는 R이고, SEQ ID NO: 1의 X4는 G 또는 A이고, SEQ ID NO: 1의 X5는 V 또는 A이고, SEQ ID NO: 1의 X6은 T 또는 S이고, SEQ ID NO: 1의 X7은 D 또는 A이며,
여기서, SEQ ID NO: 2의 X1은 T 또는 S이고, SEQ ID NO: 2의 X2는 L 또는 V이고, SEQ ID NO: 2의 X3은 T 또는 D이며,
scFv는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 링커를 포함하고, 엑토도메인은 신호 펩티드를 포함하고, CAR은 항원 인식 영역과 막관통 도메인 사이에 힌지 영역을 추가로 포함하고, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인을 포함하는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 공동자극 도메인은 CD3ζ 공동자극 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고, 4-1BB 공동자극 도메인은 막관통 도메인과 CD3ζ 공동자극 도메인 사이에 위치한다.
일부 양태에서, scFv는 SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하고, 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 57을 포함하고, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 61을 포함하고, CD8 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 63을 포함하고, 4-1BB 공동자극 도메인은 SEQ ID NO: 65를 포함하고; CD3ζ 공동자극 도메인은 SEQ ID NO: 67을 포함한다.
일부 양태에서, CAR은 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, CAR의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 또는 SEQ ID NO; 167의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 양태에서, CAR의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 167의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 본원에 개시된 바와 같은 scFv를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스포존을 제공한다. 일부 양태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 포함한다. 트랜스포존은 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 키메라 자극 수용체를 코딩하는 핵산, 선택 유전자를 코딩하는 핵산, 치료제를 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 선택 유전자는 DHFR 내성 유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게, 트랜스포존은 piggyBac 트랜스포존이다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 SEQ ID NO: 172의 핵산 서열을 포함한다. 본 개시는 또한 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 개시된 임의의 트랜스포존을 포함하는 플라스미드 또는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 바와 같은 임의의 항체, scFv, CAR 또는 트랜스포존을 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시는 또한 세포 집단을 제공하며, 여기서 복수의 집단은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 항체, scFv, CAR 또는 트랜스포존을 발현하도록 변형된다. 일 양태에서, 복수의 변형된 세포는 복수의 변형된 면역 세포이다. 일 양태에서, 복수의 변형된 세포는 복수의 변형된 T-세포이다. 일 양태에서, 복수의 세포 집단은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 CAR을 발현하는 세포를 포함한다. 일 양태에서, CAR은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 복수의 변형된 T-세포의 적어도 50%는 CD45RA 및 CD62L을 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, CD45RO를 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하지 않는다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 바와 같은 임의의 항체, scFv, CAR, 트랜스포존, 세포 또는 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 조성물은 약학적 조성물이고, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본 개시는 또한 치료적 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 임의의 항체, scFv, CAR, 트랜스포존, 세포, 세포 집단, 조성물 또는 약학적 조성물을 투여함으로써 증식 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 증식 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 증식 장애는 암이다. 일 양태에서, 암은 MUC1-양성 암일 수 있다. 일 양태에서, 암은 MUC1-C 양성 암이다. 암은 원발성 종양, 전이성 암, 다중 내성 암, 진행성 종양 또는 재발성 암일 수 있다. 암은 고형 종양일 수 있다. 암은 폐암, 뇌암, 두경부암, 유방암, 피부암, 간암, 췌장암, 위암, 결장암, 직장암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 피부암 또는 식도암일 수 있다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불에 따라 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1a-1b는 MUC1 이종이량체의 구조를 도시하는 한 쌍의 개략도이다. 도 1a는 결과적으로 안정한 비공유 이종이량체를 형성하는 2개의 서브유닛을 생성하기 위해 SEA 도메인(성게 정자 단백질, 엔테로키나제 및 아그린 도메인)에서 자가단백질분해를 겪는 MUC1을 도시한다. MUC1-N 및 MUC1-C 명명법은 절단 후 서브유닛의 위치를 지정하고 이들을 그리스 문자로 하위분류되는 유전적 이소형과 구별하기 위해 사용된다. 도 1b는 MUC1-C 서브유닛의 세부사항을 제공한다. MUC1-C 58 아미노산 세포외 도메인은 N36LT 부위인 위치 36에서 아스파라긴 상에 글리코실화된다. MUC1-C의 C-말단의 세포외 도메인의 아미노산 서열(MUC1-C/ECD)이 제시된다(SEQ ID NO: 77). MUC1-C 72 아미노산 세포질 도메인은 다중 이펙터와 상호작용하고 발암성 형질전환을 유도하기에 충분하다. 도 1a-1b는 문헌[Kufe DW, Oncogene, 32(9):1073]로부터 재현한 것이다.
도 2a는 전장 MUC1(PDB:2ACM)의 리본 구조 또는 MUC1-C 도메인의 예측 구조를 도시하는 한 쌍의 개략도이다.
도 2b는 상이한 세포 유형에서 MUC1 발현을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 3은 상이한 암 세포주에서 Muc1 발현을 도시하는 일련의 유세포 분석 그래프이다.
도 4는 인간화 MUC1-C 키메라 항원 수용체(CAR)의 예시적인 작제를 도시하는 개략도이다. 중쇄(4 + 2 변이체(H1B 및 H2B)) 및 경쇄(3) 서열을 상이한 경쇄-중쇄 조합으로 조립하여 14 개의 새로운 후보 인간화 MUC1-C CAR을 작제하였다. 다음 인간화 MUC1-C CAR 구조를 사용하였다: 신호 펩티드(CD8α) - 경쇄 - 링커 - 중쇄 - 힌지(CD8α) - 막관통(CD8α) - 세포내 신호전달(4-1BB) - 세포내 신호전달(CD3ζ).
도 5a-5b는 본 개시의 인간화 항-MUC-1C 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가면 영역의 아미노산 서열 정렬을 도시하는 다이어그램이다.
도 6은 MUC-1C CAR을 포함하는 본 개시의 piggyBac 나노트랜스포존의 개략도이다. MUC1-C CAR을 트리시스트론성 piggyBac 트랜스포존으로 서브클로닝하였다. 트랜스포존은 EF1알파 프로모터 - iC9 안전성 스위치 - T2A - MUC1-C CAR(L1-링커-H1B scFv) - T2A - DHFR 선택 유전자 작제물을 함유한다.
도 7은 후보 MUC1-C CAR이 T 세포의 표면에서 발현된다는 것을 보여주는 일련의 유세포 분석 그래프이다. 모든 후보 MUC1-C CAR을 piggyBac-생성 CAR-T 세포의 표면에서 발현시키고 검출하였다.
도 8은 후보 MUC1-C CAR T-세포에 의한 MUC1+ 표적 세포의 특이적 사멸을 나타내는 그래프이다. MDA-MB-468의 사멸은 각 CAR에 대해 선 그래프에 제시되어 있다. 모든 CAR+ T 세포는 MUC1+ MDA-MB-468 세포의 특이적 사멸을 나타냈다. 모의-전위된 T 세포는 표적 세포를 특이적으로 사멸시키지 않았다(청색 선).
도 9는 후보 MUC1-C CAR T-세포에 의한 MUC1+ 표적 세포의 특이적 사멸을 나타내는 그래프이다. 각 세포주의 사멸은 막대 그래프에서 각각의 CAR에 대해 나타나 있고, 오차 막대는 3 회 수행된 샘플의 표준 편차를 나타낸다. 모든 CAR+ T 세포는 MUC1+ 조작된 Raji 세포주의 특이적 사멸을 나타냈지만, MUC1- Raji 세포에 대해서는 그렇지 않았다. 모의-전위된 T 세포는 Raji도 조작된 Raji 표적 세포주도 사멸시키지 않았다.
도 10은 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 '스트레스' 용량에서 후보 인간화 MUC1-C CAR-T 세포의 전임상 평가를 위한 연구 설계의 개략도이다.
임의의 상호 참조되거나 관련된 특허 또는 출원을 포함하여 본원에 인용된 모든 문헌은 명시적으로 배제되거나 달리 제한되지 않는 한, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 임의의 문헌의 인용은 본원에 개시되거나 청구된 임의의 발명과 관련하여 선행 기술이거나, 단독으로, 또는 임의의 다른 참고문헌 또는 참고문헌들과 임의의 조합으로, 임의의 이러한 발명을 교시, 제안 또는 개시한다는 것을 인정하는 것이 아니다. 또한, 본 문헌에서 용어의 임의의 의미 또는 정의가 참조로 포함된 문헌에서 동일한 용어의 임의의 의미 또는 정의와 상충하는 경우, 본 문헌에서 해당 용어에 할당된 의미 또는 정의가 우선한다.
도 1a-1b는 MUC1 이종이량체의 구조를 도시하는 한 쌍의 개략도이다. 도 1a는 결과적으로 안정한 비공유 이종이량체를 형성하는 2개의 서브유닛을 생성하기 위해 SEA 도메인(성게 정자 단백질, 엔테로키나제 및 아그린 도메인)에서 자가단백질분해를 겪는 MUC1을 도시한다. MUC1-N 및 MUC1-C 명명법은 절단 후 서브유닛의 위치를 지정하고 이들을 그리스 문자로 하위분류되는 유전적 이소형과 구별하기 위해 사용된다. 도 1b는 MUC1-C 서브유닛의 세부사항을 제공한다. MUC1-C 58 아미노산 세포외 도메인은 N36LT 부위인 위치 36에서 아스파라긴 상에 글리코실화된다. MUC1-C의 C-말단의 세포외 도메인의 아미노산 서열(MUC1-C/ECD)이 제시된다(SEQ ID NO: 77). MUC1-C 72 아미노산 세포질 도메인은 다중 이펙터와 상호작용하고 발암성 형질전환을 유도하기에 충분하다. 도 1a-1b는 문헌[Kufe DW, Oncogene, 32(9):1073]로부터 재현한 것이다.
도 2a는 전장 MUC1(PDB:2ACM)의 리본 구조 또는 MUC1-C 도메인의 예측 구조를 도시하는 한 쌍의 개략도이다.
도 2b는 상이한 세포 유형에서 MUC1 발현을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 3은 상이한 암 세포주에서 Muc1 발현을 도시하는 일련의 유세포 분석 그래프이다.
도 4는 인간화 MUC1-C 키메라 항원 수용체(CAR)의 예시적인 작제를 도시하는 개략도이다. 중쇄(4 + 2 변이체(H1B 및 H2B)) 및 경쇄(3) 서열을 상이한 경쇄-중쇄 조합으로 조립하여 14 개의 새로운 후보 인간화 MUC1-C CAR을 작제하였다. 다음 인간화 MUC1-C CAR 구조를 사용하였다: 신호 펩티드(CD8α) - 경쇄 - 링커 - 중쇄 - 힌지(CD8α) - 막관통(CD8α) - 세포내 신호전달(4-1BB) - 세포내 신호전달(CD3ζ).
도 5a-5b는 본 개시의 인간화 항-MUC-1C 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가면 영역의 아미노산 서열 정렬을 도시하는 다이어그램이다.
도 6은 MUC-1C CAR을 포함하는 본 개시의 piggyBac 나노트랜스포존의 개략도이다. MUC1-C CAR을 트리시스트론성 piggyBac 트랜스포존으로 서브클로닝하였다. 트랜스포존은 EF1알파 프로모터 - iC9 안전성 스위치 - T2A - MUC1-C CAR(L1-링커-H1B scFv) - T2A - DHFR 선택 유전자 작제물을 함유한다.
도 7은 후보 MUC1-C CAR이 T 세포의 표면에서 발현된다는 것을 보여주는 일련의 유세포 분석 그래프이다. 모든 후보 MUC1-C CAR을 piggyBac-생성 CAR-T 세포의 표면에서 발현시키고 검출하였다.
도 8은 후보 MUC1-C CAR T-세포에 의한 MUC1+ 표적 세포의 특이적 사멸을 나타내는 그래프이다. MDA-MB-468의 사멸은 각 CAR에 대해 선 그래프에 제시되어 있다. 모든 CAR+ T 세포는 MUC1+ MDA-MB-468 세포의 특이적 사멸을 나타냈다. 모의-전위된 T 세포는 표적 세포를 특이적으로 사멸시키지 않았다(청색 선).
도 9는 후보 MUC1-C CAR T-세포에 의한 MUC1+ 표적 세포의 특이적 사멸을 나타내는 그래프이다. 각 세포주의 사멸은 막대 그래프에서 각각의 CAR에 대해 나타나 있고, 오차 막대는 3 회 수행된 샘플의 표준 편차를 나타낸다. 모든 CAR+ T 세포는 MUC1+ 조작된 Raji 세포주의 특이적 사멸을 나타냈지만, MUC1- Raji 세포에 대해서는 그렇지 않았다. 모의-전위된 T 세포는 Raji도 조작된 Raji 표적 세포주도 사멸시키지 않았다.
도 10은 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 '스트레스' 용량에서 후보 인간화 MUC1-C CAR-T 세포의 전임상 평가를 위한 연구 설계의 개략도이다.
임의의 상호 참조되거나 관련된 특허 또는 출원을 포함하여 본원에 인용된 모든 문헌은 명시적으로 배제되거나 달리 제한되지 않는 한, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 임의의 문헌의 인용은 본원에 개시되거나 청구된 임의의 발명과 관련하여 선행 기술이거나, 단독으로, 또는 임의의 다른 참고문헌 또는 참고문헌들과 임의의 조합으로, 임의의 이러한 발명을 교시, 제안 또는 개시한다는 것을 인정하는 것이 아니다. 또한, 본 문헌에서 용어의 임의의 의미 또는 정의가 참조로 포함된 문헌에서 동일한 용어의 임의의 의미 또는 정의와 상충하는 경우, 본 문헌에서 해당 용어에 할당된 의미 또는 정의가 우선한다.
본 개시는 높은 친화성 및 결합활성으로 특이적인 표적 단백질, Mucin 1, 세포 표면 관련(MUC1) 단백질을 인식하고, 이에 결합하는 조성물, 및 이들 조성물의 사용 방법을 제공한다.
MUC1
MUC1은 주로 상피 세포에 의해 발현되는, 광범위하게 O-글리코실화된 뮤신 단백질이다. 분비된 및 막-결합된 MUC1은 독소, 미생물, 및 외부 환경과의 경계면에 발생하는 다른 형태의 스트레스에 의해 유도되는 손상으로부터 상피 세포의 첨단 경계부를 보호하는 물리적 장벽을 형성한다. 대부분의 인간 암종에서 발견되는 바와 같은, MUC1의 비정상적인 과다발현이 부착 비의존성 성장 및 종양형성을 부여한다. MUC1의 과다발현은 산화 스트레스 및 유전독성 항암제에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 내성을 부여한다.
인간 MUC1은 단일 폴리펩티드로 번역되고 소포체에서 N- 및 C-말단 서브유닛(MUC1-N 및 MUC1-C)으로 절단되는 이종이량체 당단백질이다. 절단은 자가촉매 과정에 의해 매개될 수 있다. >250 kDa MUC1 N-말단(MUC1 N-말단 또는 MUC1-N) 서브유닛은 고도로 보존된 변이로 불완전하고 O-연결된 글리칸에 의해 변형되는 다양한 개수의 20개 아미노산 탠덤 반복부를 함유한다. MUC1-N은 대략 23 kDa의 C-말단 서브유닛(MUC1 C-말단 또는 MUC1-C)과의 이량체화에 의해 세포 표면에 테더링되며, 이는 58개의 아미노산의 세포외 영역, 28개의 아미노산의 막관통 도메인 및 72개의 아미노산 세포질 도메인(CD)를 포함한다(도 1b). MUC1-C는 하기 (SEQ ID NO: 76)의 아미노산 서열을 포함한다:
본 개시의 조성물은 MUC1-C/ECD의 밑줄로 표시된 58 개 아미노산 부분에 결합할 수 있다. 굵게 표시된 서열은 CD를 나타내고, 기울임꼴로 표시된 부분은 올리고머 억제 펩티드이다. 정상적인 상피에서 암종으로의 형질전환인 경우, MUC1은 세포질에서 그리고 전체 세포막에 걸쳐 비정상적으로 과다발현된다. 세포막-관련 MUC1은 클라트린-매개 세포내이입에 의해 엔도솜으로 표적화된다. 추가로, MUC1-N이 아닌 MUC1-C는 핵 및 미토콘드리아로 표적화된다.
본 개시의 조성물은 "에피토프" MUC1-C/세포외 도메인(MUC1-C/ECD)의 하나 이상의 아미노산에 선택적으로 결합할 수 있다. 에피토프는 선형이거나, 입체형태일 수 있다. 본원에서 사용되는 "에피토프"라는 용어는 개시된 조성물이 특이적으로 결합하게 되는 하나 이상의 아미노산을 지칭하는 것으로 의도된다. 본 개시의 에피토프의 하나 이상의 아미노산은 선형, 비선형, 연속, 또는 비연속 방식으로 배열될 수 있다. 본 개시의 에피토프는 "입체형태"일 수 있는데, 이는 아미노산이 적절하게 폴딩된 펩티드, 단백질, 또는 단백질 복합체의 입체형태로 제공될 때, 단백질 스캐폴드가 더욱 큰 친화성으로 또는 더욱 선택성으로 에피토프의 하나 이상의 아미노산에 결합한다는 것을 의미한다. 특정 양태에서, 입체형태의 에피토프에 결합하는 조성물은 선형 에피토프에는 결합하지 않을 수 있다.
본 개시의 조성물은 SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAG (SEQ ID NO: 77)의 아미노산 서열에 의해 정의되는 MUC1-C/세포외 도메인(MUC1-C/ECD)의 하나 이상의 아미노산에 선택적으로 결합할 수 있다(도 1b 참조). 대안적으로, 또는 추가로, 조성물은 변이체 MUC1-C/세포외 도메인(MUC1-C/ECD)의 하나 이상의 아미노산에 선택적으로 결합한다. 본 개시의 변이체 MUC1-C/ECD 펩티드는 SEQ ID NO: 76 또는 SEQ ID NO: 77에 따라 넘버링된 바와 같은 MUC1-C/ECD-L6A, MUC1-C/ECD-L8A, MUC1-C/ECD-L6,8A, MUC1-C/ECD-Q23V, MUC1-C/ECD-Q26V, MUC1-C/ECD-N36A를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
본 개시의 조성물은 MUC1-C/세포외 도메인(MUC1-C/ECD)으로부터 유래된 다음 펩티드의 하나 이상의 아미노산에 선택적으로 결합할 수 있다:
SVVVQLTLAFREGTINVHDVET ("펩티드 1", SEQ ID NO: 78),
VETQFNQYKTEAASRYNLTISD ("펩티드 2", SEQ ID NO: 79), 또는
TISDVSVSDVPFPFSAQSGAG ("펩티드 3", SEQ ID NO: 80).
본 개시의 조성물은 MUC1-C/ED에서 알파3(α3) 나선 또는 알파4(α4) 나선에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, MUC1-C/ECD는 SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKT EAASRYN LTISDVSVSDVPFPFSAQSGAG(SEQ ID NO: 77)의 아미노산 서열을 포함한다(a3 나선은 굵게 표시되고 a4 나선은 굵게 및 기울임꼴로 표시됨). MUC1-C/ED a3 나선은 VHDVETQFNQ(SEQ ID NO: 81)의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. MUC1-C/ED a4 나선은 EAASRYN (SEQ ID NO: 82)의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 본 개시의 조성물의 에피토프는 SEQ ID NO: 81 또는 SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 에피토프는 선형 또는 입체형태일 수 있다. 일부 양태에서, 에피토프는, 선택적으로, SEQ ID NO: 81 또는 SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열의 2개 이상의 불연속 아미노산을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며 불연속적이다.
본 개시의 조성물
본 개시는 하기 SEQ ID NO: 1와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역; 및 하기 SEQ ID NO: 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체를 제공한다:
여기서, SEQ ID NO: 1의 X1은 V 또는 I이고, SEQ ID NO: 1의 X2는 R 또는 K이고, SEQ ID NO: 1의 X3은 A 또는 R이고, SEQ ID NO: 1의 X4는 G 또는 A이고, SEQ ID NO: 1의 X5는 V 또는 A이고, SEQ ID NO: 1의 X6은 T 또는 S이고, SEQ ID NO: 1의 X7은 D 또는 A이며,
여기서, SEQ ID NO: 2의 X1은 T 또는 S이고, SEQ ID NO: 2의 X2는 L 또는 V이고, SEQ ID NO: 2의 X3은 T 또는 D이다.
바람직하게, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X2는 R 또는 K이고, X3는 A 또는 R이고, X4는 G 또는 A이고, X5는 V 또는 A이고, X6은 T 또는 S이고, X7은 D 또는 A이다. 바람직하게, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X1은 T 또는 S이고, X2는 L 또는 V이고, X3는 T 또는 D이다.
일부 양태에서, 항체는 SEQ ID NO: 160을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 인간 MUC1 폴리펩티드(UniProt 수탁 번호 P15941-1)에 결합한다. 일 양태에서, 항체는 SEQ ID NO: 76을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 인간 MUC1-C 폴리펩티드에 결합한다. 또 다른 양태에서, 항체는 SEQ ID NO: 161을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 인간 MUC1-N 폴리펩티드(MUC1 수용체의 서브유닛은 또한 알파 사슬, 성숙 사슬로도 알려짐)에 결합한다.
일부 양태에서, 항체는 SEQ ID NO: 77을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 인간 MUC1-C 세포외 도메인(ED)에 결합한다. 일부 양태에서, 항체는 인간 전장 MUC1 폴리펩티드(SEQ ID NO: 160)보다 높은 친화성으로 MUC1-C ED(SEQ ID NO: 77)에 결합한다. 일부 양태에서, 항체는 MUC1-N 폴리펩티드(SEQ ID NO: 161)보다 높은 친화성으로 MUC1-C ED(SEQ ID NO: 77)에 결합한다. 일부 양태에서, 항체는 MUC1-C ED(SEQ ID NO: 77)에 결합하고, 인간 전장 MUC1 폴리펩티드(SEQ ID NO: 160)에 결합하지 않는다. 일부 양태에서, 항체는 인간 MUC1-C ED(SEQ ID NO: 77)에 결합하고, MUC1-N 폴리펩티드(SEQ ID NO: 161)에 결합하지 않는다.
일부 양태에서, 인간 중쇄 가변 프레임워크 억셉터는 SEQ ID NO: 162의 IGHV1-69 08의 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 양태에서, 인간 경쇄 가변 프레임워크 억셉터는 SEQ ID NO: 163의 IGKV6-21 02의 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 69를 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDRH1)을 포함한다. 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 70 또는 SEQ ID NO: 75를 포함하는 CDRH2를 포함한다. 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 71을 포함하는 CDRH3을 포함한다.
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 72를 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDRL1)을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 73을 포함하는 CDRH2를 포함한다. 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 74를 포함하는 CDRH3을 포함한다.
중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 164와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직한 양태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 164의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 또는 SEQ ID NO: 165와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직한 양태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 또는 SEQ ID NO: 165의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 항체는 인간 또는 인간화 서열을 포함한다. 일부 양태에서, CDR은 인간화 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 가변 영역은 인간화 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프레임워크 영역은 인간화 서열을 포함한다. 프레임워크 영역은 면역원성을 감소시키거나 항체의 생산을 개선하기 위해 하나 이상의 서열 변이를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 IgG이다.
항체는 단클론성 항체, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, VHH, VH, 단쇄 가변 단편(scFv), 항원-결합 단편(Fab) 또는 Fab 단편일 수 있다. 바람직한 양태에서, 항체는 scFv이다.
본 개시는 높은 친화성 및 결합활성으로 특이적 표적 단백질(예를 들어, MUC1)을 인식하고 이에 결합하는 scFv 조성물 및 이들 조성물의 사용 방법을 제공한다. scFv 조성물은 항-MUC1 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
scFv는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 링커 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 60의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
scFv는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 바람직한 양태에서, scFv는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
scFv는 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 또는 SEQ ID NO: 166과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직한 양태에서, scFv는 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 또는 SEQ ID NO: 166의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 핵산에 의해 코딩된다.
본 개시는 또한 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 항원 인식 영역은 본 개시의 적어도 하나의 항-MUC1 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 것인 엑토도메인, 막관통 도메인, 및 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 제공한다. CAR은 항원 인식 도메인과 막관통 도메인 사이에 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 항원 인식 영역은 적어도 2개의 항-MUC1 scFv를 포함할 수 있다. 항원 인식 영역은 적어도 3개의 항-MUC1 scFv를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본 개시의 CAR은 2개의 별개의 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 scFv를 포함하는 이중특이적 CAR이다.
엑토도메인은 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 신호 펩티드는 인간 CD8 알파(CD8α) 신호 펩티드(SP) 또는 이의 일부를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 인간 CD8α SP는 SEQ ID NO: 57과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 바람직하게, 인간 CD8α SP는 SEQ ID NO: 57의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
인간 CD8α SP는 SEQ ID NO: 58과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직하게, 인간 CD8α SP는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
힌지 도메인 또는 힌지 영역은 인간 CD8α, IgG4, CD4 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 힌지는 인간 CD8 알파(CD8α) 힌지 또는 이의 일부를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 인간 CD8a 힌지는 SEQ ID NO: 61과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 바람직하게, 인간 CD8α 힌지 도메인은 SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
인간 CD8α 힌지는 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 168과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직하게, 인간 CD8α 힌지 도메인은 SEQ ID NO: 62 또는 SEQ ID NO: 168의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
막관통 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막관통 도메인을 코딩하는 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 바람직하게, 막관통 도메인은 인간 CD8 알파(CD8α) 막관통 도메인 또는 이의 일부를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. CD8a 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 63과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 바람직하게, 인간 CD8α 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
CD8α 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 64 또는 SEQ ID NO: 169와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직하게, CD8α 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 64 또는 SEQ ID NO: 169의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
적어도 하나의 공동자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD3 제타(CD3ζ), CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 도메인, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 바람직하게, 적어도 하나의 공동자극 도메인은 CD3ζ, 4-1BB 공동자극 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한다.
4-1BB 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 65와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 바람직하게, 4-1BB 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
4-1BB 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 66 또는 SEQ ID NO: 170과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직하게, 4-1BB 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 66 또는 SEQ ID NO: 170의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
CD3ζ 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 67과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 바람직하게, CD3ζ 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
CD3ζ 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 68 또는 SEQ ID NO: 171과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직하게, CD3ζ 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 68 또는 SEQ ID NO: 171의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
본 개시의 조성물(예를 들어, 항-MUC1 scFv, 항-MUC1 scFv를 포함하는 CAR)은 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하, 10-13 M 이하, 10-14 M 이하, 및 10-15 M 이하인 KD로부터 선택되는 적어도 하나의 친화성으로 인간 MUC1에 결합할 수 있다. KD는 표면 플라스몬 공명을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다.
항-MUC1 scFv 또는 항-MUC1 scFv를 포함하는 CAR을 포함하는 조성물은 본원에 상세히 기재된 바와 같은 세포 전달 조성물(예를 들어, 트랜스포존 또는 벡터)로 혼입될 수 있고, 선택적으로 세포로 혼입될 수 있다.
본 개시의 조성물의 접촉 및/또는 혼입에 의해 변형된 세포(예를 들어, 면역 세포 및 세포독성 면역 세포)는 MUC1-발현 세포를 특이적으로 표적화할 수 있다. 본 개시의 방법의 바람직한 양태는 MUC1-C를 발현하는 세포(MUC1-C+ 세포)의 파괴를 매개하기 위해 세포독성 세포 유형을 재지정하기 위해, 예를 들어, 암과 같은 증식 장애를 치료하기 위해 MUC1-C scFv 결합제를 사용한다. 본 개시의 항-MUC1 scFv 또는 항-MUC1 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 변형된 세포는 개선된 생체내 지속성 및 항-종양 효능을 입증한다. 일부 양태에서, 본 개시의 항-MUC1 scFv 또는 항-MUC1 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 변형된 세포는 뮤린 항-MUC1 scFv 또는 뮤린 항-MUC1 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 세포와 비교하여 개선된 역가 및 감소된 면역원성을 입증한다. 일부 양태에서, 본 개시의 항-MUC1 scFv 또는 항-MUC1 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 변형된 세포는 SEQ ID NO: 176의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 177의 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv 또는 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 세포와 비교하여 개선된 역가 및 감소된 면역원성을 입증한다. 일부 양태에서, 본 개시의 항-MUC1 scFv 또는 항-MUC1 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 변형된 세포는 SEQ ID NO: 178의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 179의 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv 또는 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 세포와 비교하여 개선된 역가 및 감소된 면역원성을 입증한다. 일부 양태에서, 본 개시의 항-MUC1 scFv 또는 항-MUC1 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 변형된 세포는 SEQ ID NO: 180의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 181의 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv 또는 이를 포함하는 CAR을 발현하는 세포와 비교하여 개선된 역가 및 감소된 면역원성을 입증한다.
"L1H1" scFv는 SEQ ID NO: 54의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L1"을 포함하고; SEQ ID NO: 48의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H1"을 포함한다. "L1H1" scFv는 SEQ ID NO: 142의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 124의 아미노산 서열을 포함한다. "L1H1" CAR은 SEQ ID NO: 30의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다.
"L1H1B" scFv는 SEQ ID NO: 54 또는 SEQ ID NO: 165의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L1"을 포함하고; SEQ ID NO: 49 또는 SEQ ID NO: 164의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H1B"를 포함한다. "L1H1B" scFv는 SEQ ID NO: 143 또는 SEQ ID NO: 166의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함한다. "L1H1B" CAR은 SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 167의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함한다.
"L1H1" scFv는 SEQ ID NO: 54의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L1"을 포함하고; SEQ ID NO: 50의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H2"을 포함한다. "L1H2" scFv는 SEQ ID NO: 144의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 126의 아미노산 서열을 포함한다. "L1H2" CAR은 SEQ ID NO: 32의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함한다.
"L1H2B" scFv는 SEQ ID NO: 54의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L1"을 포함하고; SEQ ID NO: 51의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H2B"를 포함한다. "L1H2B" scFv는 SEQ ID NO: 145의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 포함한다. "L1H2B" CAR은 SEQ ID NO: 33의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함한다.
"L1H3" scFv는 SEQ ID NO: 54의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L1"을 포함하고; SEQ ID NO: 52의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H3"을 포함한다. "L1H3" scFv는 SEQ ID NO: 146의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 128의 아미노산 서열을 포함한다. "L1H3" CAR은 SEQ ID NO: 34의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
"L1H4" scFv는 SEQ ID NO: 54의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L1"을 포함하고; SEQ ID NO: 53의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H4"를 포함한다. "L1H4" scFv는 SEQ ID NO: 147의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열을 포함한다. "L1H4" CAR은 SEQ ID NO: 35의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함한다.
"L2H1" scFv는 SEQ ID NO: 55의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L2"을 포함하고; SEQ ID NO: 48의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H1"을 포함한다. "L2H1" scFv는 SEQ ID NO: 148의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 130의 아미노산 서열을 포함한다. "L2H1" CAR은 SEQ ID NO: 36의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
"L2H1B" scFv는 SEQ ID NO: 55의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L2"을 포함하고; SEQ ID NO: 49의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H1B"을 포함한다. "L2H1B" scFv는 SEQ ID NO: 149의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 131의 아미노산 서열을 포함한다. "L2H1B" CAR은 SEQ ID NO: 37의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함한다.
"L2H2" scFv는 SEQ ID NO: 55의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L2"을 포함하고; SEQ ID NO: 50의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H2"를 포함한다. "L2H2" scFv는 SEQ ID NO: 150의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 132의 아미노산 서열을 포함한다. "L2H2" CAR은 SEQ ID NO: 38의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함한다.
"L2H2B" scFv는 SEQ ID NO: 55의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L2"을 포함하고; SEQ ID NO: 51의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H2B"를 포함한다. "L2H2B" scFv는 SEQ ID NO: 151의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 133의 아미노산 서열을 포함한다. "L2H2B" CAR은 SEQ ID NO: 39의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함한다.
"L2H3" scFv는 SEQ ID NO: 55의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L2"을 포함하고; SEQ ID NO: 52의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H3"을 포함한다. "L2H3" scFv는 SEQ ID NO: 152의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 134의 아미노산 서열을 포함한다. "L2H3" CAR은 SEQ ID NO: 40의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다.
"L2H4" scFv는 SEQ ID NO: 55의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L2"을 포함하고; SEQ ID NO: 53의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H4"를 포함한다. "L2H4" scFv는 SEQ ID NO: 153의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 135의 아미노산 서열을 포함한다. "L2H4" CAR은 SEQ ID NO: 41의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함한다.
"L3H1" scFv는 SEQ ID NO: 56의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L3"을 포함하고; SEQ ID NO: 48의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H1"을 포함한다. "L3H1" scFv는 SEQ ID NO: 154의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 136의 아미노산 서열을 포함한다. "L3H1" CAR은 SEQ ID NO: 42의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함한다.
"L3H1B" scFv는 SEQ ID NO: 56의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L3"을 포함하고; SEQ ID NO: 49의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H1B"를 포함한다. "L3H1B" scFv는 SEQ ID NO: 155의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 137의 아미노산 서열을 포함한다. "L3H1B" CAR은 SEQ ID NO: 43의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함한다.
"L3H2" scFv는 SEQ ID NO: 56의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L3"을 포함하고; SEQ ID NO: 50의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H2"을 포함한다. "L3H2" scFv는 SEQ ID NO: 156의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 138의 아미노산 서열을 포함한다. "L3H2" CAR은 SEQ ID NO: 44의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함한다.
"L3H2B" scFv는 SEQ ID NO: 56의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L3"을 포함하고; SEQ ID NO: 51의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H2B"를 포함한다. "L3H2B" scFv는 SEQ ID NO: 157의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 139의 아미노산 서열을 포함한다. "L3H2B" CAR은 SEQ ID NO: 45의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
"L3H3" scFv는 SEQ ID NO: 56의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L3"을 포함하고; SEQ ID NO: 52의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H3"을 포함한다. "L3H3" scFv는 SEQ ID NO: 158의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 140의 아미노산 서열을 포함한다. "L3H3" CAR은 SEQ ID NO: 46의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함한다.
"L3H4" scFv는 SEQ ID NO: 56의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 "L3"을 포함하고; SEQ ID NO: 53의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 "H4"을 포함한다. "L3H4" scFv는 SEQ ID NO: 159의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 포함한다. "L3H4" CAR은 SEQ ID NO: 47의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함한다.
표 1A 및 표 1B는 본 개시의 예시적인 MUC-1C CAR 성분 및 서열을 보여준다.
표 1. 본 개시의 MUC-1C CAR 성분 및 아미노산 서열
표 1B. 본 개시의 MUC-1C CAR 성분 및 핵산 서열
본 개시의 세포 및 변형된 세포
본 개시의 세포 및 변형된 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 바람직하게, 본 개시의 세포 및 변형된 세포는 인간 세포이다. 본 개시의 세포 및 변형된 세포는 면역 세포일 수 있다. 본 개시의 면역 세포는 림프구 전구체 세포, 자연 살해(NK) 세포, T 림프구(T-세포), 줄기 기억 T 세포(TSCM 세포), 중심 기억 T 세포(TCM), 줄기 세포유사 T 세포, B 림프구(B-세포), 항원 제시 세포(APC), 사이토카인 유도된 살해(CIK) 세포, 골수 전구체 세포, 호중구, 호염구, 호산구, 단핵구, 마크로파지, 혈소판, 적혈구, 적혈세포(RBC), 거핵구 또는 용골세포를 포함할 수 있다.
면역 전구체 세포는 하나 이상의 유형의 면역 세포로 분화될 수 있는 임의의 세포를 포함할 수 있다. 면역 전구체 세포는 자기-재생할 수 있고 면역 세포로 발생될 수 있는 다능성 줄기 세포를 포함할 수 있다. 면역 전구체 세포는 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 이의 자손을 포함할 수 있다. 면역 전구체 세포는 면역 세포로 발생될 수 있는 전구체 세포를 포함할 수 있다. 면역 전구체 세포는 조혈 전구체 세포(HPC)를 포함할 수 있다.
조혈 줄기 세포(HSC)는 다능성, 자기-재생성 세포이다. 림프구 및 골수 계통으로부터 분화된 모든 혈액 세포는 HSC로부터 발생된다. HSC는 성체 골수, 말초 혈액, 이동성 말초 혈액, 복막 투석 유출액 및 제대혈에서 발견될 수 있다.
HSC는 일차 또는 배양된 줄기 세포로부터 단리되거나 유래될 수 있다. HSC는 배아 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 만능성 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 또는 유도 만능성 줄기 세포(iPSC)로부터 단리되거나 유래될 수 있다.
면역 전구체 세포는 HSC 또는 HSC 자손 세포를 포함할 수 있다. HSC 자손 세포의 비제한적인 예는 다능성 줄기 세포, 림프구 전구체 세포, 자연 살해(NK) 세포, T 림프구 세포(T-세포), B 림프구 세포(B-세포), 골수 전구체 세포, 호중구, 호염구, 호산구, 단핵구 및 마크로파지를 포함한다.
개시된 방법으로 생산된 HSC는 성체 줄기 세포로부터 단리 또는 유래되면서, 단일 계통으로 전념하면서, 배아 줄기 세포의 특징을 공유하는 "원시" 줄기 세포의 특성을 보유할 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법으로 생산된 "원시" HSC는 분열 후에 이들 "줄기세포능"을 보유하지만 분화되지는 않는다. 결론적으로, 양자 세포 요법으로서, 개시된 방법으로 생산된 "원시" HSC는 이들 수를 보충할 뿐만 아니라, 생체내에서 확장된다. 개시된 방법으로 생산된 "원시" HSC는 단일 용량으로서 투여될 때 치료적으로-유효할 수 있다.
원시 HSC는 CD34+일 수 있다. 원시 HSC는 CD34+ 및 CD38-일 수 있다. 원시 HSC는 CD34+, CD38- 및 CD90+일 수 있다. 원시 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+ 및 CD45RA-일 수 있다. 원시 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-, 및 CD49f+일 수 있다. 원시 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-, 및 CD49f+일 수 있다.
원시 HSC, HSC, 및/또는 HSC 자손 세포는 외생성 서열(예를 들어, 키메라 항원 수용체 또는 치료적 단백질)을 발현하도록 개시된 방법에 따라서 변형될 수 있다. 변형된 원시 HSC, 변형된 HSC, 및/또는 변형된 HSC 자손 세포는 제한 없이, 변형된 T 세포, 변형된 자연 살해 세포 및/또는 변형된 B-세포를 포함한, 변형된 면역 세포를 생산하도록 전방으로 분화될 수 있다.
변형된 면역 또는 면역 전구체 세포는 NK 세포일 수 있다. NK 세포는 림프구 전구체 세포로부터 분화된 세포독성 림프구일 수 있다. 변형된 NK 세포는 변형된 조혈 줄기 및 전구체 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 비-활성화 NK 세포는 CD3-고갈된 백혈구 성분 채집술(CD14/CD19/CD56+ 세포 함유)로부터 유래된다.
변형된 면역 또는 면역 전구체 세포는 B 세포일 수 있다. B 세포는 세포 표면 상에서 B 세포 수용체를 발현하는 림프구의 한 유형이다. B 세포 수용체는 특이적 항원에 결합한다. 변형된 B 세포는 변형된 조혈 줄기 및 전구체 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래될 수 있다.
본 개시의 변형된 T 세포는 변형된 조혈 줄기 및 전구체 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래될 수 있다. 전통적인 생물제형 및 화학요법제와 달리, 개시된 변형된-T 세포는 항원 인식 시에 신속하게 재생되는 능력을 가져서, 잠재적으로 반복 치료에 대한 필요성을 피하게 된다. 이를 달성하기 위해서, 일부 구현예에서, 변형된-T 세포는 초기 반응을 구동시킬 뿐만 아니라, 또한 살아있는 기억 T 세포의 안정한 집단으로서 환자에서 지속되어서 잠재적인 재발을 예방한다. 대안적으로, 일부 양태에서, 원치 않는 경우에, 변형된-T 세포는 환자에서 지속되지 않는다.
항원-독립적(토닉) 신호전달을 통해 T 세포 고갈을 초래하지 않는 항원 수용체 분자를 비롯하여, 초기 기억 T 세포, 특히 줄기 세포 기억(TSCM) 또는 줄기 세포-유사 T 세포를 함유하는 변형된-T 세포 생성물의 개발에 집약적인 노력이 집중되어 왔다. 본 개시의 줄기 세포-유사 변형된-T 세포는 중심 기억(TCM) T 세포 또는 TCM 유사 세포, 이펙터 기억(TEM) 및 이펙터 T 세포(TE)를 유도시키기 위한 가장 큰 자기-재생 능력 및 다능성 능력을 나타내서, 보다 양호한 종양 박멸 및 장기간 변형된-T 세포 생착을 일으킨다. 분화의 선형 경로는 이들 세포의 생성을 담당할 수 있고: 미경험 T 세포(TN) > TSCM > TCM > TEM > TE > TTE, 그리하여 TN은 부모 전구체 세포로서 직접적으로 TSCM을 발생시키고, 이후 직접적으로 TCM 등을 발생시킨다. 본 개시의 T 세포의 조성물은 하나 이상의 각각의 부모 T 세포 서브세트를 포함할 수 있고 TSCM 세포가 가장 풍부하다(예를 들어, TSCM > TCM > TEM > TE > TTE).
면역 세포 전구체는 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T-세포, 미경험 T 세포(TN), TSCM, TCM, TEM, TE, 또는 TTE로 분화되거나 또는 분화될 수 있다. 면역 세포 전구체는 본 개시의 원시 HSC, HSC, 또는 HSC 자손 세포일 수 있다. 면역 세포는 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T-세포, 미경험 T 세포(TN), TSCM, TCM, TEM, TE, 또는 TTE일 수 있다.
본 개시의 방법은 변형된 T 세포의 집단을 변형 및/또는 생성시킬 수 있고, 집단 중 복수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 초기 기억 T 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 변형된 초기 기억 T 세포의 집단은 복수의 변형된 줄기 세포-유사 T 세포를 포함한다. 변형된 초기 기억 T 세포의 집단은 복수의 변형된 TSCM 세포를 포함한다. 변형된 초기 기억 T 세포의 집단은 복수의 변형된 TCM 세포를 포함한다.
본 개시의 방법은 변형된 T 세포의 집단을 변형 및/또는 생성시킬 수 있고, 집단 중 복수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 줄기 세포-유사 T 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 변형된 줄기 세포-유사 T 세포의 집단은 복수의 변형된 TSCM 세포를 포함한다. 변형된 줄기 세포-유사 T 세포의 집단은 복수의 변형된 TCM 세포를 포함한다.
일부 양태에서, 집단 중 복수의 변형된 T 세포의 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함한다. 세포-표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 세포-표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 집단 중 복수의 변형된 T 세포의 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함한다. 세포-표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 개시의 방법은 변형된 T 세포의 집단을 변형 및/또는 생성시킬 수 있고, 집단 중 복수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 미경험 T 세포(TN)의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 세포-표면 마커는 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 개시의 방법은 변형된 T 세포의 집단을 변형 및/또는 생성시킬 수 있고, 집단의 복수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 이펙터(변형된 TEFF)의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 세포-표면 마커는 CD45RA, CD95, 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 발현할 수 있다.
본 개시의 방법은 변형된 T 세포의 집단을 변형 및/또는 생성시킬 수 있고, 집단의 복수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다.
집단의 복수의 변형된 세포는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열(예를 들어, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열을 포함하고, 집단의 복수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 백분율은 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 일부 양태에서, CAR은 SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 167의 핵산 서열에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함한다.
집단의 복수의 변형된 세포는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열(예를 들어, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열을 포함하고, 변형된 세포의 집단의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34를 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하거나, 변형된 세포의 집단의 적어도 약 70% 내지 약 99%, 약 75% 내지 약 95% 또는 약 85% 내지 약 95%는 CD34를 포함하는(예를 들어, 세포-표면 마커 표현형 CD34+를 포함하는) 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다.
집단의 복수의 변형된 세포는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열(예를 들어, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열을 포함하고, 변형된 세포의 집단의 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34를 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, CD34를 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 발현하지 않거나, 변형된 세포의 집단의 적어도 약 45% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80% 또는 약 65% 내지 약 75%는 CD34를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하고 CD38을 포함하는(예를 들어, 세포-표면 마커 표현형 CD34+ 및 CD38-를 포함하는) 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 발현하지 않는다.
집단의 복수의 변형된 세포는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열(예를 들어, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열을 포함하고, 변형된 세포의 집단의 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, CD38을 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하지 않거나, 변형된 세포의 집단의 적어도 약 0.2% 내지 약 40%, 약 0.2% 내지 약 30%, 약 0.2% 내지 약 2% 또는 0.5% 내지 약 1.5%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, CD38을 포함하는(예를 들어, 세포-표면 마커 표현형 CD34+, CD38- 및 CD90+를 포함하는) 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 발현하지 않는다.
집단의 복수의 변형된 세포는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열(예를 들어, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열을 포함하고, 변형된 세포의 집단의 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, CD38 및 CD45RA을 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 발현하지 않거나, 변형된 세포 집단의 적어도 약 0.2% 내지 약 40%, 약 0.2% 내지 약 30%, 약 0.2% 내지 약 2% 또는 0.5% 내지 약 1.5%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고 CD38 및 CD45RA를 포함하는(예를 들어, 세포-표면 마커 표현형 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-를 포함하는) 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하지 않는다.
집단의 복수의 변형된 세포는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열(예를 들어, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열을 포함하고, 변형된 세포의 집단의 적어도 0.01%, 적어도 0.02%, 적어도 0.03%, 적어도 0.04%, 적어도 0.05%, 적어도 0.06%, 적어도 0.07%, 적어도 0.08%, 적어도 0.09%, 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34, CD90 및 CD49f를 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, CD38 및 CD45RA를 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 발현하지 않거나, 변형된 세포의 집단의 적어도 약 0.02% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 2%, 약 0.04% 내지 약 2% 또는 약 0.04% 내지 약 1%는 CD34, CD90 및 CD49f를 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, CD38 및 CD45RA를 포함하는(예를 들어, 세포-표면 마커 표현형 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA- 및 CD49f+를 포함하는) 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 발현하지 않는다.
집단의 복수의 변형된 세포는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열(예를 들어, CAR)을 포함하고, 집단의 복수의 세포의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 이식유전자 또는 이식유전자를 코딩하는 서열을 포함하고, 변형된 세포의 집단의 적어도 0.01%, 적어도 0.02%, 적어도 0.03%, 적어도 0.04%, 적어도 0.05%, 적어도 0.06%, 적어도 0.07%, 적어도 0.08%, 적어도 0.09%, 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, CD45RA를 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 발현하지 않거나, 변형된 세포의 집단의 적어도 약 0.2% 내지 약 5%, 약 0.2% 내지 약 3% 또는 약 0.4% 내지 약 3%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고 CD45RA를 포함하는(예를 들어, 세포-표면 마커 표현형 CD34+, CD90+ 및 CD45RA-를 포함하는) 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 발현하지 않는다.
면역 세포 및 면역 전구체 세포(예를 들어, 개시된 변형된 T-세포)를 제조 및/또는 확장시키는 조성물 및 방법, 및 면역 세포 또는 면역 전구체 세포(예를 들어, 개시된 변형된 T-세포)의 세포 생존능 수준 및/또는 줄기-유사 표현형의 유지 또는 증강을 위한 완충제는 본 명세서의 다른 곳에 개시되어 있고 보다 상세하게 미국 특허 제10,329,543호 및 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다.
본 개시의 세포 및 변형된 세포는 체세포일 수 있다. 본 개시의 세포 및 변형된 세포는 분화된 세포일 수 있다. 본 개시의 세포 및 변형된 세포는 자기유래 세포 또는 동종이계 세포일 수 있다. 동종이계 세포는 대상체에게 투여 후 생착에 대한 유해 반응을 예방하도록 조작된다. 동종이계 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 동종이계 세포는 줄기 세포일 수 있거나, 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 동종이계 세포는 분화된 체세포일 수 있다.
키메라 항원 수용체를 발현하는 방법
본 개시는 세포의 표면 상에서 CAR을 발현하는 방법을 제공한다. 방법은 (a) 세포 집단을 수득하는 단계; (b) 세포 집단 중 적어도 하나의 세포의 세포 막을 가로질러 CAR을 전달하기에 충분한 조건 하에서, 세포 집단을 CAR 또는 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 조성물에 접촉시켜서, 변형된 세포 집단을 생성시키는 단계; (c) CAR을 코딩하는 서열의 통합에 적합한 조건 하에서 변형된 세포 집단을 배양하는 단계; 및 (d) 세포 표면 상에서 CAR을 발현하는 변형된 세포 집단으로부터 적어도 하나의 세포를 확장 및/또는 선택하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 세포 집단은 백혈구 및/또는 CD4+ 및 CD8+ 백혈구를 포함할 수 있다. 세포 집단은 최적 비율로 CD4+ 및 CD8+ 백혈구를 포함할 수 있다. CD4+ 대 CD8+ 백혈구의 최적 비율은 생체내에서 천연적으로 발생되지 않는다. 세포 집단은 종양 세포을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 세포 집단 중 적어도 하나의 세포의 세포 막을 가로질러서 CAR 또는 CAR을 코딩하는 서열, 트랜스포존, 또는 벡터를 전달하기에 충분한 조건은 명시된 전압에서 하나 이상의 전기 펄스의 인가, 완충제, 및 하나 이상의 보충 인자(들) 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 양태에서, CAR을 코딩하는 서열의 통합에 적합한 조건은 완충제 및 하나 이상의 보충 인자(들) 중 적어도 하나를 포함한다.
완충제는 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, Amaxa Nucleofector, 인간 T 세포 뉴클레오펙션 완충제 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 보충 인자(들)는 (a) 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터루킨 또는 이의 임의의 조합; (b) 염, 미네랄, 대사산물 또는 이의 임의의 조합; (c) 세포 배지; (d) 세포 DNA 감지, 물질 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이의 조합의 억제형; 및 (e) 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약을 포함할 수 있다. 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터루킨 또는 이의 임의의 조합은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림포톡신-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 염, 미네랄, 대사산물 또는 이의 임의의 조합은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 소듐 피루베이트, L-글루타민, MEM 비필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오시드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청대체물, 항생제, pH 조정제, 얼(Earle)의 염, 2-머캅토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, Nucleofector PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 나트륨 락토바이오네이트, 만니톨, 소듐 숙시네이트, 염화나트륨, CINa, 포도당, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌-글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, Crown-5, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, CellGro DC 배지, CTS OpTimizer T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, ImmunoCult-XF T 세포 확장 배지 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 DNA 감지, 물질대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이의 조합의 억제형은 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 친-염증성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 캐스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β)의 억제형(예를 들어, TWS119), 또는 이의 임의의 조합의 억제형을 포함한다. 이러한 억제형의 예는 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약은 pH 변형제, DNA-결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열 존재 또는 부재의 순 중성 전하 DNA 결합 펩티드, TREX1 효소 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
확장 및 선택 단계는 동시발생적으로 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 확장은 선택 전에 일어날 수 있다. 확장은 선택 이후에 일어날 수 있고, 선택적으로, 추가(즉, 제2) 선택이 확장 후에 일어날 수 있다. 동시발생적 확장 및 선택은 동시적일 수 있다. 확장 및/또는 선택 단계는 종료점을 포함하여, 10일 내지 14일의 기간 동안 진행될 수 있다.
확장은 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를 항원과 접촉시켜서 CAR을 통해 적어도 하나의 세포를 자극시켜, 확장된 세포 집단을 생성시키는 단계를 포함할 수 있다. 항원은 기재의 표면 상에 존재할 수 있다. 기재는 제한 없이 표면, 웰, 비드 또는 이의 복수, 및 매트릭스를 포함한, 임의의 형태를 가질 수 있다. 기재는 상자성 또는 자성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 항원은 기재의 표면 상에 제시될 수 있고, 기재는 자성 비드이며, 자석을 사용하여 변형되고 확장된 세포 집단으로부터 자성 비드를 제거하거나 분리시킬 수 있다. 항원은 세포 또는 인공 항원 제시 세포의 표면 상에 제시될 수 있다. 인공 항원 제시 세포는 종양 세포 및 줄기 세포를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
트랜스포존 또는 벡터가 선택 유전자를 포함하는 일부 양태에서, 선택 단계는 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를 선택 유전자가 내성을 부여한 화합물과 접촉시켜서, 선택에 생존으로 선택 유전자를 발현하는 세포를 확인하고 선택 단계에 생존에 실패하여 선택 유전자 발현에 실패한 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
본 개시는 본 명세서에 기술된 방법의 변형, 확장 및 선택된 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
세포의 표면 상에 CAR을 발현하기 위한 방법의 보다 상세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/049816 및 PCT/US2019/049816에 개시되어 있다.
본 개시는 세포 또는 세포 집단을 제공하고, 세포는 (a) 유도성 프로모터를 코딩하는 서열 및 이식유전자를 코딩하는 서열을 포함하는, 유도성 이식유전자 작제물, 및 (b) 항상성 프로모터를 코딩하는 서열 및 외생성 수용체, 예컨대 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 수용체 작제물을 포함하는 조성물을 포함하고, 세포의 게놈 서열로 (a)의 작제물 및 (b)의 작제물의 통합 시, 외생성 수용체가 발현되고, 외생성 수용체는, 리간드 또는 항원과 결합 시, 유도성 이식유전자 (a)의 발현을 조절하는 유도성 프로모터를 직접적으로 또는 간접적으로 표적화하는 세포내 신호를 전달하여 유전자 발현을 변형시킨다.
조성물은 유전자 발현을 감소시켜서 유전자 발현을 변형시킬 수 있다. 조성물은 유전자 발현을 일시적으로 변형시켜서 유전자 발현을 변형시킬 수 있다(예를 들어, 외생성 수용체에 리간드의 결합 기간 동안). 조성물은 유전자 발현을 급성으로 변형시킬 수 있다(예를 들어, 리간드는 외생성 수용체에 가역적으로 결합함). 조성물은 유전자 발현을 만성으로 변형시킬 수 있다(예를 들어, 리간드가 외생성 수용체에 비가역적으로 결합함).
외생성 수용체는 세포의 게놈 서열에 대해서 내생성 수용체를 포함할 수 있다. 예시적인 수용체는 세포내 수용체, 세포-표면 수용체, 막관통 수용체, 리간드-게이팅된 이온 채널, 및 G-단백질 커플링된 수용체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
외생성 수용체는 비-자연 발생 수용체를 포함할 수 있다. 비-자연 발생 수용체는 합성, 변형, 재조합, 돌연변이체 또는 키메라 수용체일 수 있다. 비-자연 발생 수용체는 T-세포 수용체(TCR)로부터 단리되거나 유래된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 비-자연 발생 수용체는 스캐폴드 단백질로부터 단리되거나 유래된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 비-자연 발생 수용체는 막관통 도메인을 포함하지 않는 것을 포함하고, 비-자연 발생 수용체는 제2 막관통, 막-결합 및/또는 세포내 수용체와 상호작용하여서, 비-자연 발생 수용체와 접촉 이후에, 세포내 신호를 전달한다. 비-자연 발생 수용체는 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 비-자연 발생 수용체는 세포내 신호를 전달하는 세포내 수용체와 상호작용할 수 있다. 비-자연 발생 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 비-자연 발생 수용체는 키메라 리간드 수용체(CLR)일 수 있다. CLR은 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다.
유도성 프로모터를 코딩하는 서열은 NFκB 프로모터를 코딩하는 서열, 인터페론(IFN) 프로모터를 코딩하는 서열 또는 인터루킨-2 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IFN 프로모터는 IFNγ 프로모터이다. 유도성 프로모터는 사이토카인 또는 케모카인의 프로모터로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 사이토카인 또는 케모카인은 IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL10, IL12, IL13, IL17A/F, IL21, IL22, IL23, 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ), 콜로니 자극 인자 2(GM-CSF), 인터페론 감마(IFNγ), 종양 괴사 인자 알파(TNFα), LTα, 퍼포린, 그랜자임 C(Gzmc), 그랜자임 B(Gzmb), C-C 모티프 케모카인 리간드 5(CCL5), C-C 모티프 케모카인 리간드 4(Ccl4), C-C 모티프 케모카인 리간드 3(Ccl3), X-C 모티프 케모카인 리간드 1(Xcl1) 또는 LIF 인터루킨 6 패밀리 사이토카인(Lif)을 포함할 수 있다.
유도성 프로모터는 세포 분화, 활성화, 고갈, 및 기능에 관여하는 표면 단백질을 포함하는 유전자의 프로모터로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 유전자는 CD69, CD71, CTLA4, PD-1, TIGIT, LAG3, TIM-3, GITR, MHCII, COX-2, FASL 또는 4-1BB를 포함한다.
유도성 프로모터는 CD 물질대사 및 분화에 관여하는 유전자의 프로모터로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 유도성 프로모터는 Nr4a1, Nr4a3, Tnfrsf9(4-1BB), Sema7a, Zfp36l2, Gadd45b, Dusp5, Dusp6 및 Neto2의 프로모터로부터 단리되거나 유래될 수 있다.
일부 양태에서, 유도성 이식유전자 작제물은 억제성 체크포인트 신호 하류의 신호전달 성분, 전사 인자, 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 아폽토시스 수용체/리간드, 물질대사 감지 분자, 암 요법에 감응성을 부여하는 단백질, 및 종양유전자 또는 종양 억제자 유전자의 발현을 포함하거나 구동시킨다. 이의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT 출원 번호 PCT/US2019/049816에 개시되어 있다.
본 개시는 변형된 T-세포 집단을 생산하는 방법으로서, 본 개시의 CAR 또는 복수의 변형된 T-세포를 생산하도록 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 일차 인간 T-세포에 도입하는 단계를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는, 방법을 제공한다. 본 개시는 상기 방법에 의해 생산되는 변형된 T-세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 본 개시의 CAR을 발현한다.
강화 세포
본 개시의 변형된 세포(예를 들어, CAR T-세포)는 이들 치료적 잠재성을 증강하도록 추가로 변형될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 변형된 세포는 면역학적 및/또는 물질대사 체크포인트에 덜 감응성이도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 유형의 변형은 세포를 "강화(armor)"시키고, 변형 이후에, "강화" 세포(예를 들어, 강화 T-세포)로 지칭될 수 있다. 강화 세포는 예를 들어, 종양 면역억제성 미세환경 내에서, 천연적으로 세포에게 전달되는 특별한 체크포인트 신호를 차단 및/또는 희석(예를 들어, 체크포인트 억제)시켜서 생성될 수 있다.
본 개시의 강화 세포는 임의의 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, 조혈 전구체 세포, 말초 혈액(PB) 유래 T 세포(G-CSF-이동성 말초 혈액으로부터 단리 또는 유래된 T 세포 포함), 또는 제대혈(UCB) 유래 T 세포로부터 유래될 수 있다. 강화 세포(예를 들어, 강화 T-세포)는 키메라 리간드 수용체(단백질 스캐폴드, 항체, ScFv, 또는 항체 모방체를 포함하는 CLR)/키메라 항원 수용체(단백질 스캐폴드, 항체, ScFv, 또는 항체 모방체를 포함한 CAR), CARTyriN(센트린을 포함한 CAR), 및/또는 VCAR(낙타 VHH 또는 단일 도메인 VH를 포함한 CAR) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 강화 세포(예를 들어, 강화 T-세포)는 본원에 개시된 바와 같은 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 강화 세포(예를 들어, 강화 T-세포)는 외생성 서열을 포함할 수 있다. 외생성 서열은 치료적 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 치료적 단백질은 핵, 세포질, 세포내, 막관통, 세포-표면 결합, 또는 분비 단백질일 수 있다. 강화 세포(예를 들어, 강화 T-세포)에 의해 발현되는 예시적인 치료적 단백질은 강화 세포의 활성을 변형시킬 수 있거나, 제2 세포의 활성을 변형시킬 수 있다. 강화 세포(예를 들어, 강화 T-세포)는 선택 유전자 또는 선택 마커를 포함할 수 있다. 강화 세포(예를 들어, 강화 T-세포)는 합성 유전자 발현 카세트(본 명세서에서 유도성 이식유전자 작제물로도 지칭됨)를 포함할 수 있다.
본 개시의 변형된 세포(예를 들어, CAR T-세포)는 강화 세포(예를 들어, 강화 CAR T-세포)를 생성하도록 억제성 체크포인트 신호의 수용체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵화하거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 억제성 체크포인트 신호의 수용체는 세포 표면 상에서 또는 세포의 세포질 내에서 발현된다. 억제성 체크포인트 신호의 수용체를 코딩하는 유전자의 발현의 침묵화 또는 감소는 강화 세포의 세포질 내에서 또는 표면 상에서 억제성 체크포인트 수용체의 단백질 발현의 상실을 일으킨다. 따라서, 억제성 체크포인트 수용체를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현이 침묵화 또는 감소된 강화 세포는 체크포인트 신호에 내성이거나, 비수용성이거나, 무감응성이다. 억제성 체크포인트 신호에 대한 강화 세포의 내성 또는 감소된 감응성은 이들 억제성 체크포인트 신호의 존재 하에서 강화 세포의 치료적 잠재성을 증강시킨다. 억제성 체크포인트 신호(및 면역억제를 유도하는 단백질)의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다. 침묵화될 수 있는 억제성 체크포인트 신호의 바람직한 예는 PD-1 및 TGFβRII를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 개시의 변형된 세포(예를 들어, CAR T-세포)는 강화된 세포(예를 들어, 강화된 CAR T-세포)를 생성시키도록 체크포인트 신호전달에 관여하는 세포내 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵화 또는 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 변형된 세포의 활성은 체크포인트 신호전달 경로에 관여하는 임의의 세포내 신호전달 단백질을 표적화하여서, 하나 이상의 체크포인트 경로에 대한 체크포인트 억제 또는 간섭을 달성하여 증강될 수 있다. 체크포인트 신호전달에 관여하는 세포내 신호전달 단백질의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다.
본 개시의 변형된 세포(예를 들어, CAR T-세포)는 강화된 세포(예를 들어, 강화된 CAR T-세포)를 생성하도록 요법의 효능을 방해하는 전사 인자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵화 또는 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 변형된 세포의 활성은 요법의 효능을 방해하는 전사 인자의 발현을 침묵화 또는 감소(또는 기능 억제)에 의해 증강되거나 조절될 수 있다. 발현을 침묵화 또는 감소시키거나 이의 기능을 억제하도록 변형될 수 있는 전사 인자의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시된 예시적인 전사 인자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 개시의 변형된 세포(예를 들어, CAR T-세포)는 강화된 세포(예를 들어, 강화된 CAR T-세포)를 생성하도록 세포 사멸 또는 세포 아폽토시스 수용체를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵화 또는 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 사멸 수용체 및 이의 내생성 리간드의 상호작용은 아폽토시스의 개시를 일으킨다. 세포 사멸 및/또는 세포 아폽토시스 수용체 및/또는 리간드의 발현, 활성, 또는 상호작용의 파괴는 변형된 세포가 사멸 신호에 덜 수용성이게 만들어서, 결론적으로, 강화된 세포가 종양 환경에서 보다 효율적이게 만든다. 세포 사멸 및/또는 세포 아폽토시스 수용체 및 리간드의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다. 변형될 수 있는 세포 사멸 수용체의 바람직한 예는 Fas(CD95)이다.
본 개시의 변형된 세포(예를 들어, CAR T-세포)는 강화된 세포(예를 들어, 강화된 CAR T-세포)를 생성시키기 위해 물질대사 감지 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵화 또는 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 변형된 세포에 의한 면역억제성 종양 미세환경(낮은 수준의 산소, pH, 포도당 및 다른 물질을 특징으로 함)의 물질대사 감지의 파괴는 T-세포 기능의 연장된 체류를 유발시키고, 결론적으로 세포 당 더 많은 세포가 사멸된다. 물질대사 감지 유전자 및 단백질의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다. 바람직한 예로서, HIF1a 및 VHL은 저산소 환경에서도 T-세포 기능에서 역할을 한다. 강화된 T-세포는 HIF1a 또는 VHL을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 침묵화 또는 감소시킬 수 있다.
본 개시의 변형된 세포(예를 들어, CAR T-세포)는 강화된 세포(예를 들어, 강화된 CAR T-세포)를 생성하도록, 단클론성 항체를 포함하는, 암 요법에 대한 감응성을 부여하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵화시키거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 강화된 세포가 기능할 수 있고 암 요법(예를 들어, 화학요법, 단클론성 항체 요법, 또는 다른 항종양 치료)의 존재 하에서 우수한 기능 또는 효능을 입증할 수 있다. 암 요법에 감응성을 부여하는 데 관여하는 단백질의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다.
본 개시의 변형된 세포(예를 들어, CAR T-세포)는 강화된 세포(예를 들어, 강화된 CAR T-세포)를 생성하도록 성장 우위 인자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵화 또는 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 종양 유전자의 발현의 침묵화 또는 감소는 세포에 성장 우위를 부여할 수 있다. 예를 들어, CAR T-세포 제조 과정 동안 TET2 유전자의 발현의 침묵화 또는 감소(예를 들어, 발현 파괴)는 확장에 대한 이러한 능력이 결여된 비-강화된 CAR T-세포와 비교했을 때 확장 및 이후 종양의 박멸을 위한 상당한 능력을 갖는 강화된 CAR T-세포의 생성을 일으킨다. 이러한 전략은 강화된 CAR T-세포의 비제어적인 성장 또는 대상체로부터의 유해 반응 사건에서 강화된 CAR T-세포의 표적화된 파괴를 허용하는, 안전성 스위치(예를 들어, 본 명세서에 기술된 iC9 안전성 스위치)에 커플링될 수 있다. 성장 우위 인자의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다.
본 개시의 변형된 세포(예를 들어, CAR T-세포)는 본 개시의 강화된 T-세포를 생성하도록 변형/키메라 체크포인트 수용체를 발현하게 추가로 변형될 수 있다.
변형/키메라 체크포인트 수용체는 무효 수용체, 디코이 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함할 수 있다. 무효 수용체, 디코이 수용체 또는 우성 음성 수용체는 변형/키메라 수용체/단백질일 수 있다. 무효 수용체, 디코이 수용체 또는 우성 음성 수용체는 세포내 신호전달 도메인의 발현을 위해 절두될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 무효 수용체, 디코이 수용체 또는 우성 음성 수용체는 효과적인 신호전달에 필요하거나 결정적인 하나 이상의 아미노산 위치에서 세포내 신호전달 도메인 내에 돌연변이될 수 있다. 무효 수용체, 디코이 수용체 또는 우성 음성 수용체의 돌연변이 또는 절두는 세포로 또는 세포 내에서 체크포인트 신호를 운반 또는 전달하는 수용체의 능력의 상실을 일으킬 수 있다.
예를 들어, 종양 세포의 표면 상에 발현된 PD-L1 수용체로부터의 면역억제성 체크포인트 신호의 희석 또는 차단은 강화된 세포의 내생성 PD-1 수용체를 통한 면역억제성 체크포인트 신호의 전달을 감소시키거나 억제시키도록 강화된 세포의 표면 상에서도 발현되는 내생성(비-변형된) PD-1 수용체와 효과적으로 경쟁하는, 강화된 세포(예를 들어, 강화된 CAR T-세포)의 표면 상의 변형/키메라 PD-1 무효 수용체를 발현시켜 달성될 수 있다. 이러한 비제한적인 예에서, 종양 세포 상에 발현된 PD-L1과의 결합을 위한 2종의 상이한 수용체 간 경쟁은 효과적인 체크포인트 신호전달 수준을 감소시키거나 저하시켜서, PD-1 무효 수용체를 발현하는 강화된 세포의 치료적 잠재성을 증강시킨다.
변형/키메라 체크포인트 수용체는 막관통 수용체, 막-회합 또는 막-연결 수용체/단백질 또는 세포내 수용체/단백질인 무효 수용체, 디코이 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함할 수 있다. 예시적인 무효, 디코이, 또는 우성 음성 세포내 수용체/단백질은 억제성 체크포인트 신호 하류의 신호전달 성분, 전사 인자, 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 아폽토시스 수용체/리간드, 물질대사 감지 분자, 암 요법에 감응성을 부여하는 단백질, 및 종양 유전자 또는 종양 억제인자 유전자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 사이토카인, 사이토카인 수용체, 케모카인 및 케모카인 수용체의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시된다.
변형/키메라 체크포인트 수용체는 스위치 수용체를 포함할 수 있다. 예시적인 스위치 수용체는 변형/키메라 수용체/단백질을 포함하고, 여기서 천연 또는 야생형 세포내 신호전달 도메인은 단백질에 비천연이고/이거나 야생형 도메인이 아닌 상이한 세포내 신호전달 도메인으로 스위치되거나 대체된다. 예를 들어, 자극성 신호전달 도메인으로 억제성 신호전달 도메인의 대체는 면역억제성 신호를 면역자극성 신호로 스위치한다. 대안적으로, 상이한 억제성 도메인으로 억제성 신호전달 도메인의 대체는 억제성 신호전달 수준을 감소시킬 수 있거나 증강시킬 수 있다. 스위치 수용체의 발현 또는 과다발현은 면역억제성 종양 미세환경 내에서 발현되는 동족 체크포인트 수용체에 대한 결합을 위해 내생성 야생형 체크포인트 수용체(스위치 수용체 아님)와 경쟁을 통해서 동족 체크포인트 신호의 희석 및/또는 차단을 일으킬 수 있다. 강화 세포(예를 들어, 강화된 CAR T-세포)는 스위치 수용체를 코딩하는 서열을 포함하여서, 하나 이상의 스위치 수용체의 발현을 유발시키고, 결과적으로, 강화된 세포의 활성을 변경시킬 수 있다. 강화 세포(예를 들어, 강화된 CAR T-세포)는 체크포인트 수용체 하류의 세포내 발현 단백질, 전사 인자, 사이토카인 수용체, 사멸 수용체, 물질대사 감지 분자, 암 요법, 종양 유전자, 및/또는 종양 억제인자 단백질 또는 유전자를 표적화하는 스위치 수용체를 발현할 수 있다.
예시적인 스위치 수용체는 억제성 체크포인트 신호 하류 신호전달 성분, 전사 인자, 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 아폽토시스 수용체/리간드, 물질대사 감지 분자, 암 요법에 감응성을 부여하는 단백질, 및 종양 유전자 또는 종양 억제인자 유전자를 제한 없이 포함한, 단백질을 포함할 수 있거나, 이로부터 유래될 수 있다.
본 개시의 변형된 세포(예를 들어, CAR T-세포)는 강화된 T-세포를 생성하도록 조건적 유전자 발현을 매개하는 CLR/CAR을 발현하도록 추가로 변형될 수 있다. 강화된 T-세포의 핵 내에서 CLR/CAR 및 조건적 유전자 발현 시스템의 조합은 동족 리간드(들)와 CLR 또는 동족 항원(들)과 CAR의 결합 시에 조건적으로 활성화되는 합성 유전자 발현 시스템을 구성한다. 이 시스템은 리간드 또는 항원 결합 부위에서, 또는 예를 들어 종양 환경 내에서, 합성 유전자 발현을 감소 또는 제한하여 변형된 T-세포의 치료적 잠재성을 '강화'시키거나 증강시키는 데 도움을 줄 수 있다.
유전자 편집 조성물 및 방법
변형된 세포는 이식유전자를 세포에 도입시켜 생성될 수 있다. 도입 단계는 비-전위 전달 시스템을 통한 핵산 서열, 이식유전자, 및/또는 게놈 편집 작제물의 전달을 포함할 수 있다.
생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 세포로 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 작제물의 도입은 국소 전달, 흡착, 흡수, 전기영동, 스핀-펙션, 공동-배양, 형질감염, 기계적 전달, 음향 전달, 진동 전달, 마그네토펙션 또는 나노입자-매개 전달 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 세포로 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 작제물의 도입은 리포솜 형질감염, 인산칼슘 형질감염, 퓨진 형질감염, 및 덴드리머-매개 형질감염을 포함할 수 있다. 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 기계적 형질감염에 의해 세포로 핵산 서열, 이식유전자, 및/또는 게놈 편집 작제물의 도입은 세포 압착, 세포 충격, 또는 유전자 총 기술을 포함할 수 있다. 나노입자-매개 형질감염에 의한 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 세포로 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 작제물의 도입은 리포솜 전달, 미셀에 의한 전달, 및 폴리머로솜에 의한 전달을 포함할 수 있다.
생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 세포로 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 작제물의 도입은 비-바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 비-바이러스 벡터는 핵산을 포함할 수 있다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드 DNA, 선형 이중 가닥 DNA(dsDNA), 선형 단일 가닥 DNA(ssDNA), DoggyBone™ DNA, 나노플라스미드, 미니써클 DNA, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN), DDNA 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 mRNA(ssRNA), 및 이중 가닥 mRNA(dsRNA)를 포함할 수 있다. 비-바이러스 벡터는 본 명세서에 기술된 바와 같은 트랜스포존을 포함할 수 있다.
생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 세포로 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 작제물의 도입은 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 비-통합 비-염색체 벡터일 수 있다. 비-통합 비-염색체 벡터의 비제한적인 예는 아데노-연관 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 및 헤르페스 바이러스를 포함한다. 바이러스 벡터는 통합 염색체 벡터일 수 있다. 통합 염색체 벡터의 비제한적인 예는 아데노-연관 벡터(AAV), 렌티바이러스, 및 감마-레트로바이러스를 포함한다.
생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 세포로 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 작제물의 도입은 벡터의 조합을 포함할 수 있다. 벡터 조합의 비제한적인 예는 바이러스 및 비-바이러스 벡터, 복수의 비-바이러스 벡터, 또는 복수의 바이러스 벡터를 포함한다. 벡터 조합의 비제한적인 예는 DNA-유래 및 RNA-유래 벡터의 조합, RNA 및 역전사효소의 조합, 트랜스포존 및 트랜스포사제의 조합, 비-바이러스 벡터 및 엔도뉴클레아제의 조합, 및 바이러스 벡터 및 엔도뉴클레아제의 조합을 포함한다.
게놈 변형은 핵산 서열을 안정하게 통합시키거나, 핵산 서열을 일시적으로 통합시키거나, 핵산 서열의 부위-특이적 통합을 일으키거나, 핵산 서열의 편향된 통합을 일으키도록 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 세포로 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 작제물의 도입을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 이식유전자일 수 있다.
게놈 변형은 핵산 서열을 안정하게 통합시키기 위해서 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 세포로 핵산 서열, 이식유전자, 및/또는 게놈 편집 작제물의 도입을 포함할 수 있다. 안정한 염색체 통합은 무작위 통합, 부위-특이적 통합, 또는 편향적 통합일 수 있다. 부위-특이적 통합은 비-보조적일 수 있거나 보조적일 수 있다. 보조적 부위-특이적 통합은 부위-지정 뉴클레아제와 함께 공동-전달된다. 부위-지정 뉴클레아제는 게놈 통합 부위의 상류 및 하류 영역에 상동성 비율을 함유하는 5' 및 3' 뉴클레오티드 서열 확장부를 갖는 이식유전자를 포함한다. 상동성 뉴클레오티드 연장부를 갖는 이식유전자는 상동성 재조합, 미세상동성-매개 말단 연결, 또는 비상동성 말단-연결을 통해 게놈 통합될 수 있다. 부위-특이적 통합은 안전한 하버 부위에서 일어날 수 있다. 게놈 안전 하버 부위는 새롭게 삽입된 유전자 구성요소가 신뢰할만하게 기능(예를 들어, 발현의 치료적으로 유효한 수준으로 발현)하고 숙주 유기체에 위험을 초래하는 숙주 게놈으로의 유해한 변경을 초래하지 않도록 보장하는 방식으로 새로운 유전자 물질의 통합을 수용할 수 있다. 잠재적인 게놈 안전 하버의 비제한적인 예는 인간 알부민 유전자의 인트론 서열, 아데노-연관 바이러스 부위 1(AAVS1), 염색체 19 상의 AAV 바이러스의 자연 발생 통합 부위, 케모카인(C-C 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자 부위 및 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 오솔로그 부위를 포함한다.
부위-특이적 이식유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 파괴하는 부위에서 일어날 수 있다. 표적 유전자 발현의 파괴는 인트론, 엑손, 프로모터, 유전자 구성요소, 인핸서, 억제인자, 출발 코돈, 중지 코돈, 및 반응 구성요소에서 부위-특이적 통합으로 일어날 수 있다. 부위-특이적 통합에 의해 표적화되는 표적 유전자의 비제한적인 예는 TRAC, TRAB, PDI, 임의의 면역억제 유전자, 및 동종-거부에 관여하는 유전자를 포함한다.
부위-특이적 이식유전자 통합은 표적 유전자의 증강된 발현을 일으키는 부위에서 발생될 수 있다. 표적 유전자 발현의 증강은 인트론, 엑손, 프로모터, 유전자 구성요소, 인핸서, 억제인자, 출발 코돈, 중지 코돈, 및 반응 구성요소에서 부위-특이적 통합에 의해 발생될 수 있다.
효소는 이식유전자의 전달 또는 통합을 촉진하도록 숙주 게놈 내에 가닥 파쇄를 발생시키는 데 사용될 수 있다. 효소는 단일 가닥 파쇄 또는 이중 가닥 파쇄를 발생시킬 수 있다. 파쇄 유도 효소의 비제한적인 예는 트랜스포사제, 인테그라제, 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas9, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), Cas-CLOVER™, 및 CPF1을 포함한다. 파쇄-유도 효소는 DNA에서 코딩되거나, mRNA에서 코딩되거나, 단백질로서, 또는 가이드 RNA(gRNA)와 핵단백질 복합체로서 세포에 전달될 수 있다.
부위-특이적 이식유전자 통합은 벡터-매개 통합 부위 편향성에 의해 제어될 수 있다. 벡터-매개 통합 부위 편향성은 선택된 렌티바이러스 벡터에 의해서 또는 선택된 감마-레트로바이러스 벡터에 의해서 제어될 수 있다.
부위-특이적 이식유전자 통합 부위는 불안정한 염색체 삽입일 수 있다. 통합된 이식유전자는 침묵화되거나, 제거되거나, 절제되거나, 추가로 변형될 수 있다. 게놈 변형은 이식유전자의 불안정한 통합일 수 있다. 불안정한 통합은 일시적 비-염색체 통합, 반-안정 비-염색체 통합, 반지속성 비-염색체 삽입, 또는 불안정한 염색체 삽입일 수 있다. 일시적 비-염색체 삽입은 에피-염색체 또는 세포질일 수 있다. 일 양태에서, 이식유전자의 일시적 비-염색체 삽입은 염색체에 통합되지 않고 변형된 유전자 물질이 세포 분열 동안 복제되지 않는다.
게놈 변형은 이식유전자의 반-안정성 또는 지속성 비-염색체 통합일 수 있다. DNA 벡터는 분열 세포의 핵에서 자가 복제를 허용하는 비-바이러스 벡터의 에피솜 체류를 위해 핵 매트릭스 단백질에 결합하는 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S-MAR) 모듈을 코딩한다.
게놈 변형은 이식유전자의 불안정한 염색체 통합일 수 있다. 통합된 이식유전자는 침묵화되거나, 제거되거나, 절제되거나, 추가로 변형될 수 있다.
이식유전자 삽입에 의한 게놈에서의 변형은 상동성 재조합(HR), 미세상동성-매개 말단 연결(MMEJ), 비상동성 말단 연결(NHEJ), 트랜스포사제 효소-매개 변형, 인테그라제 효소-매개 변형, 엔도뉴클레아제 효소-매개 변형, 또는 재조합 효소-매개 변형에 의한 숙주 세포-지정 이중 가닥 파쇄 복구(상동성-지정 복구)를 통해서 발생될 수 있다. 이식유전자 삽입에 의한 게놈에서의 변형은 CRISPR-Cas9, TALEN, ZFNs, Cas-CLOVER™, 및 cpf1을 통해서 발생될 수 있다.
신규 또는 기존 뉴클레오티드/핵산을 포함한 유전자 편집 시스템에서, 삽입 도구(예를 들어, DNA 주형 벡터, 전위성 구성요소(트랜스포존 또는 레트로트랜스포존)가 절단 효소(예를 들어, 뉴클레아제, 리콤비나제, 인테그라제 또는 트랜스포사제) 이외에도 세포에 전달되어야 한다. 리콤비나제에 대한 이러한 삽입 도구의 예는 DNA 벡터를 포함할 수 있다. 다른 유전자 편집 시스템은 삽입 벡터와 함께 인테그라제, 트랜스포존/레트로트랜스포존과 함께 트랜스포사제 등의 전달을 요구한다. 절단 효소로서 사용될 수 있는 예의 리콤비나제는 CRE 리콤비나제이다. 삽입 도구에서 사용될 수 있는 인테그라제의 비제한적인 예는 AAV, 감마 레트로바이러스, 및 렌티바이러스를 포함한 임의의 다수 바이러스로부터 얻은 바이러스 기반 효소를 포함한다. 삽입 도구에 사용될 수 있는 트랜스포존/레트로트랜스포존의 예는 본 명세서에 보다 상세히 설명된다.
생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리 게놈 변형을 갖는 세포는 생식 세포 또는 체세포일 수 있다. 변형된 세포는 인간, 비-인간, 포유동물, 래트, 마우스, 또는 개 세포일 수 있다. 변형된 세포는 분화, 미분화, 또는 불멸화될 수 있다. 변형된 미분화 세포는 줄기 세포일 수 있다. 변형된 미분화 세포는 유도 만능성 줄기 세포일 수 있다. 변형된 세포는 면역 세포일 수 있다. 변형된 세포는 T 세포, 조혈 줄기 세포, 자연 살해 세포, 마크로파지, 수지상 세포, 단핵구, 거핵구, 또는 용골세포일 수 있다. 변형된 세포는 세포가 휴지기, 활성화 상태, 휴식기, 간기, 전기, 중기, 후기, 또는 말기인 상태에서 변형될 수 있다. 변형된 세포는 신선하거나, 저온저장되거나, 대량이거나, 하위집단으로 분류되거나, 전혈, 백혈구 성분 채집술, 또는 불멸화 세포주 유래일 수 있다. 백혈구 성분 채집술 생성물 또는 혈액으로부터 세포의 단리를 위한 상세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에 개시되어 있다.
본 개시는 유전자 편집 조성물 및/또는 유전자 편집 조성물을 포함하는 세포를 제공한다. 유전자 편집 조성물은 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열 및 뉴클레아제 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 단백질을 코딩하는 서열 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열은 DNA 서열, RNA 서열, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인은 CRISPR/Cas 단백질, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 및 엔도뉴클레아제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인은 뉴클레아제-불활성화 CaS(dCas) 단백질 및 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 엔도뉴클레아제는 Clo051 뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 유전자 편집 조성물은 융합 단백질을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 뉴클레아제-불활성화 Cas9(dCas9) 단백질 및 Clo051 뉴클레아제 또는 Clo051 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 유전자 편집 조성물은 가이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 가이드 서열은 RNA 서열을 포함한다.
본 개시는 이펙터에 작동적으로 연결된 소형, Cas9(Cas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 DNA 국재화 성분 및 이펙터 분자를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 융합 단백질을 제공하고, 이펙터는 소형, Cas9(Cas9)를 포함한다. 본 개시의 소형 Cas9 작제물은 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 이펙터를 포함할 수 있다. 활성 촉매 부위를 갖는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9는 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 이펙터에 작동적으로 연결된 비-활성화, 소형, Cas9(dSaCas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 DNA 국재화 성분 및 이펙터 분자를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 융합 단백질을 제공하고, 이펙터는 소형, 불활성화 Cas9(dSaCas9)를 포함한다. 본 개시의 소형, 불활성화 Cas9(dSaCas9) 작제물은 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 이펙터를 포함할 수 있다. dSaCas9는 촉매 부위를 불활성화시키도록 D10A 및 N580A 돌연변이를 포함하는, SEQ ID NO: 84의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 이펙터에 작동적으로 연결된 불활성화 Cas9(dCas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 DNA 국재화 성분 및 이펙터 분자를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 융합 단백질을 제공하고, 이펙터는 불활성화 Cas9(dCas9)를 포함한다. 본 개시의 불활성화 Cas9(dCas9) 작제물은 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 이펙터를 포함할 수 있다.
dCas9는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptoccocus pyogenes)로부터 단리되거나 유래될 수 있다. dCas9는 촉매 부위를 불활성화시키는 아미노산 위치 10 및 840에 치환을 갖는 dCas9를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이들 치환은 D10A 및 H840A이다. dCas9는 SEQ ID NO: 85 또는 SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 Clo051 뉴클레아제 도메인은 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
예시적인 dCas9-Clo051(Cas-CLOVER) 융합 단백질은 SEQ ID NO: 88의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 예시적인 dCas9-Clo051 융합 단백질은 SEQ ID NO: 89의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. dCas9-Clo051 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
예시적인 dCas9-Clo051(Cas-CLOVER) 융합 단백질은 SEQ ID NO: 90의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 예시적인 dCas9-Clo051 융합 단백질은 SEQ ID NO: 91의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. dCas9-Clo051 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
유전자 편집 조성물을 포함하는 세포는 안정하게 또는 일시적으로 유전자 편집 조성물을 발현할 수 있다. 바람직하게, 유전자 편집 조성물은 일시적으로 발현된다. 가이드 RNA는 게놈 DNA 서열 내 표적 서열에 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 게놈 DNA 서열 내 표적 서열은 게놈 DNA 서열의 안전 하버 부위 내 표적 서열일 수 있다.
Cas-CLOVER를 포함하는 유전자 편집 조성물, 및 유전자 편집을 위한 이들 조성물의 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 제2017/0107541호, 제2017/0114149호, 제2018/0187185호 및 미국 특허 제10,415,024호에 상술되어 있다.
유전자 편집 도구는 또한 하나 이상의 폴리(히스티딘)-기반 미셀을 사용해 세포로 전달될 수 있다. 폴리(히스티딘)(예를 들어, 폴리(L-히스티딘))는 불포화 질소 상에 전자 비결합 쌍을 제공하는 이미다졸 고리로 인한 pH-감응성 중합체이다. 즉, 폴리(히스티딘)은 양자화-탈양자화를 통해 양쪽성 성질을 갖는다. 특히, 일정 pH에서, 폴리(히스티딘)-함유 트리블록 공중합체는 표면 상에서 양으로 하전된 폴리(히스티딘) 단위에 의해 미셀로 조립되어서, 음으로 하전된 유전자 편집 분자(들)와 복합체를 형성할 수 있다. pH-의존적 방식으로 단백질 및/또는 핵산에 결합하고 방출하는 이들 나노입자를 사용하여, 바람직한 유전자 변형을 수행하도록 효율적이고 선택적인 기전을 제공할 수 있다. 특히, 이러한 미셀-기반 전달 시스템은 하전된 재료에 대해 실질적인 가요성을 비롯하여, 대형 페이로드 수용능, 및 나노입자 페이로드의 표적화 방출을 제공한다. 일례에서, 이중 가닥 DNA의 부위-특이적 절단은 폴리(히스티딘)-기반 미셀을 사용해 뉴클레아제를 전달할 수 있다. 특정 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 다양한 트리블록 공중합체에 의해 형성된 미셀 중에서, 소수성 블록이 응집되어 코어를 형성하고, 말단에 친수성 블록 및 폴리(히스티딘) 블록을 남겨서 하나 이상의 주변 층을 형성한다고 여겨진다.
일 양태에서, 본 개시는 친수성 블록, 소수성 블록, 및 하전된 블록으로 제조된 트리블록 공중합체를 제공한다. 일부 양태에서, 친수성 블록은 폴리(에틸렌 옥시드)(PEO)일 수 있고, 하전된 블록은 폴리(L-히스티딘)일 수 있다. 사용할 수 있는 예시적인 삼중-블록 공중합체는 PEO-b-PLA-b-PHIS로서, 디자인에 따라 다양하게 각 블록 내 다양한 수의 반복 단위를 갖는다.
트리블록 공중합체를 제조하기 위한 중간체로서 사용될 수 있는 디블록 공중합체는 제한 없이 폴리(락티드)(PLA), 폴리(글리콜리드)(PLGA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(ε-카프로락톤)(PCL), 및 폴리 (트리메틸렌 카르보네이트)(PTMC)를 포함한, 다양한 소수성 지방족 폴리(무수물), 폴리(핵산), 폴리(에스테르), 폴리(오르쏘 에스테르), 폴리(펩티드), 폴리(포스파젠) 및 폴리(사카라이드)에 커플링된, PEG와 화학적으로 동의어인, 친수성 생체적합성 폴리(에틸렌 옥시드)(PEO)를 가질 수 있다. 100% PEG화 표면으로 구성된 중합체 미셀은 개선된 시험관내 화학적 안정성, 증대된 생체내 생체이용률, 및 연장된 혈액 순환 반감기를 보유한다.
트리블록 공중합체를 포함하는 것들을 포함하여, 중합체 소포체, 폴리머솜 및 폴리(히스티딘)-기반 미셀, 및 이의 제조 방법은 미국 특허 제7,217,427호; 제7,868,512호; 제6,835,394호; 제8,808,748호; 제10,456,452호; 미국 특허 출원 공개 번호 제2014/0363496호; 제2017/0000743호; 및 제2019/0255191호; 및 PCT 공개 번호 WO 2019/126589에 더욱 상세하게 설명된다.
트랜스포존 및 벡터 조성물
본 개시는 항체(예를 들어, scFv) 또는 CAR(예를 들어, scFv 포함)을 세포 또는 세포 집단에 전달하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 세포 또는 세포 집단으로 본 개시의 조성물의 전달을 위한 조성물의 비제한적인 예는 트랜스포존 또는 벡터를 포함한다. 따라서, 본 개시는 항체(예를 들어, scFv) 또는 CAR(예를 들어, scFv 포함)을 포함하는 트랜스포존 또는 항체(예를 들어, scFv) 또는 CAR(예를 들어, scFv 포함)을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시의 CAR을 포함하는 트랜스포존 또는 본 개시의 CAR을 포함하는 벡터는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 하나의 트랜스포존 또는 하나의 벡터는 본 개시의 CAR을 포함할 수 있고 제2 트랜스포존 또는 제2 벡터는 본 개시의 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 본 명세서에서 보다 상세히 설명된다.
본 개시의 CAR을 포함하는 트랜스포존 또는 본 개시의 CAR을 포함하는 벡터는 키메라 자극 수용체(CSR)를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 하나의 트랜스포존 또는 하나의 벡터는 본 개시의 CAR을 포함할 수 있고 제2 트랜스포존 또는 제2 벡터는 본 개시의 CSR을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 키메라 자극 수용체는 본 명세서에서 보다 상세히 설명된다.
본 개시의 CAR을 포함하는 트랜스포존 또는 본 개시의 CAR을 포함하는 벡터는 재조합 HLA-E 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 하나의 트랜스포존 또는 하나의 벡터는 본 개시의 CAR을 포함할 수 있고 제2 트랜스포존 또는 제2 벡터는 재조합 HLA-E 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 재조합 HLA-E 폴리펩티드는 본 명세서에서 보다 상세히 설명된다.
본 개시의 CAR을 포함하는 트랜스포존 또는 본 개시의 CAR을 포함하는 벡터는 선택 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 선택 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선택 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 도전받을 때 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있고 유전자 생성물은 화합물에 내성을 부여한다. 선택 유전자의 비제한적인 예는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여), DHFR(디히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하고 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여), TYMS(티미딜레이트 신써타제를 코딩), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩), 다제내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데히드 데하이드로게나제 1 패밀리, 구성원 A1을 코딩), FRANCF, RAD51C(RAD51 파라로그 C를 코딩), GCS(글루코실세라미드 신타제를 코딩), NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩), 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
바람직한 양태에서, 선택 유전자는 DHFR 뮤테인 효소를 코딩한다. DHFR 뮤테인 효소는 SEQ ID NO: 92의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. DHFR 뮤테인 효소는 SEQ ID NO: 93 또는 SEQ ID NO: 174의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80, 113, 또는 153 중 하나 이상에 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80에서 페닐알라닌(F) 또는 류신(L)의 치환, 위치 113에서 류신(L) 또는 발린(V)의 치환, 및 위치 153에서 발린(V) 또는 아스파르트산(D)의 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 개시의 CAR을 포함하는 트랜스포존 또는 본 개시의 CAR을 포함하는 벡터는 적어도 하나의 자기-절단성 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 자기-절단성 펩티드는 CAR(예를 들어, scFv 포함) 및 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드 사이에 위치될 수 있거나; 자기-절단성 펩티드는 CAR(예를 들어, scFv 포함) 및 선택 유전자에 의해 코딩되는 단백질 사이에 위치될 수 있다.
본 개시의 CAR을 포함하는 트랜스포존 또는 본 개시의 CAR을 포함하는 벡터는 적어도 2개의 자기-절단성 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 자기-절단성 펩티드는 CAR의 상류 또는 바로 상류에 위치되고, 제2 자기-절단성 펩티드는 CAR의 하류 또는 바로 하류에 위치되거나, 제1 자기-절단성 펩티드 및 제2 자기-절단성 펩티드는 CAR이 측접한다. 예를 들어, 제1 자기-절단성 펩티드는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드의 상류 또는 바로 상류에 위치하고 제2 자기-절단성 펩티드는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드의 하류 또는 바로 하류에 위치하거나, 제1 자기-절단성 펩티드 및 제2 자기-절단성 펩티드는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드가 측접된다. 예를 들어, 제1 자기-절단성 펩티드는 선택 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 상류 또는 바로 상류에 위치되고, 제2 자기-절단성 펩티드는 선택 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 하류 또는 바로 하류에 위치되거나, 제1 자기-절단성 펩티드 및 제2 자기-절단성 펩티드는 선택 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 측접한다.
자기-절단성 펩티드의 비제한적인 예는 T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함한다. T2A 펩티드는 SEQ ID NO: 94와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. GSG-T2A 펩티드는 SEQ ID NO: 95와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. GSG-T2A 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 96과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. E2A 펩티드는 SEQ ID NO: 97과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. GSG-E2A 펩티드는 SEQ ID NO: 98과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. F2A 펩티드는 SEQ ID NO: 99와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. GSG-F2A 펩티드는 SEQ ID NO: 100과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. P2A 펩티드는 SEQ ID NO: 101과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. GSG-P2A 펩티드는 SEQ ID NO: 102와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 본 개시의 트랜스포존은 SEQ ID NO: 13의 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, CAR을 코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 95의 T2A 펩티드를 코딩하는 핵산에 측접된다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 SEQ ID NO: 92의 DHFR 효소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 트랜스포존은 SEQ ID NO: 172의 ic9 안전성 스위치 펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시의 트랜스포존은 SEQ ID NO: 175와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
전위 시스템
본 개시는 본원에 개시된 바와 같은 단백질 스캐폴드를 포함하는 트랜스포존을 제공하거나 또는 본 개시는 본원에 개시된 바와 같은 항체(예를 들어, scFv) 또는 CAR(예를 들어, scFv 포함)을 포함하는 트랜스포존을 제공한다. 바람직한 양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스-조절 절연체 구성요소가 측접된 본원에 개시된 바와 같은 scFv 또는 CAR(예를 들어, scFv 포함)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 본 개시는 또한 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 양태에서, 트랜스포존을 포함하는 조성물은 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함한다. 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열일 수 있다. 바람직하게, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 개시의 트랜스포존은 piggyBac™(PB) 트랜스포존일 수 있다. 트랜스포존이 PB 트랜스포존인 일부 양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac™(PB) 트랜스포사제, piggyBac-유사(PBL) 트랜스포사제 또는 Super piggyBac™(SPB) 트랜스포사제이다. SPB 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
PB 트랜스포존 및 PB, PBL 및 SPB 트랜스포사제의 비제한적인 예는 미국 특허 제6,218,182호; 미국 특허 제6,962,810호; 미국 특허 제8,399,643호 및 PCT 공개 번호 WO 2010/099296에 상세히 기술된다.
PB, PBL 및 SPB 트랜스포사제는 트랜스포존의 말단 상에 트랜스포존-특이적 역위 말단 반복 서열(ITR)을 인식하고, 염색체 부위(TTAT 표적 서열) 내 서열 5'-TTAT-3' 또는 염색체 부위(TTAA 표적 서열) 내 서열 5'- TTAA-3'에서 ITR 사이에 내용물을 삽입시킨다. PB 또는 PBL 트랜스포존의 표적 서열은 5'-CTAA-3', 5'-TTAG-3', 5'-ATAA-3', 5'-TCAA-3', 5'AGTT-3', 5'-ATTA-3', 5'-GTTA-3', 5'-TTGA-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTAC-3', 5'-ACTA-3', 5'-AGGG-3', 5'-CTAG-3', 5'-TGAA-3', 5'-AGGT-3', 5'-ATCA-3', 5'-CTCC-3', 5'-TAAA-3', 5'-TCTC-3', 5'TGAA-3', 5'-AAAT-3', 5'-AATC-3', 5'-ACAA-3', 5'-ACAT-3', 5'-ACTC-3', 5'-AGTG-3', 5'-ATAG-3', 5'-CAAA-3', 5'-CACA-3', 5'-CATA-3', 5'-CCAG-3', 5'-CCCA-3', 5'-CGTA-3', 5'-GTCC-3', 5'-TAAG-3', 5'-TCTA-3', 5'-TGAG-3', 5'-TGTT-3', 5'-TTCA-3'5'-TTCT-3' 및 5'-TTTT-3'을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. PB 또는 PBL 트랜스포존 시스템은 ITR 사이에 포함될 수 있는 관심 유전자에 대해서 페이로드 제한이 없다.
하나 이상의 PB, PBL 및 SPB 트랜스포사제에 대한 예시적인 아미노산 서열은 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호 및 미국 특허 제8,399,643호에 개시된다. 바람직한 양태에서, PB 트랜스포사제는 SEQ ID NO: 103과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
PB 또는 PBL 트랜스포사제는 SEQ ID NO: 103의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 2개 이상, 3개 이상, 또는 각각에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. 트랜스포사제는 SEQ ID NO: 103의 서열의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 SPB 트랜스포사제일 수 있고, 여기서 위치 30에서 아미노산 치환은 이소류신(I)의 발린(V)으로의 치환일 수 있고 위치 165에서 아미노산 치환은 글리신(G)의 세린(S)으로의 치환일 수 있고, 위치 282에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)의 발린(V)으로의 치환일 수 있고, 위치 538에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)의 리신(K)으로의 치환일 수 있다. 바람직한 양태에서, SPB 트랜스포사제는 SEQ ID NO: 104와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기 기술된 돌연변이를 포함하는 일정 양태에서, PB, PBL 및 SPB 트랜스포사제는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에서 보다 상세히 기술된 바와 같은 SEQ ID NO: 103 또는 SEQ ID NO: 104의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다.
PB, PBL 또는 SPB 트랜스포사제는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 곤충, 척추동물, 갑각류 또는 미삭동물로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 바람직한 양태에서, PB, PBL 또는 SPB 트랜스포사제는 곤충 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(GenBank 수탁 번호 AAA87375) 또는 봄빅스 모리(Bombyx mori)(GenBank 수탁 번호 BAD11135)로부터 단리되거나 유래된다.
과활성 PB 또는 PBL 트랜스포사제는 유래된 자연 발생 변이체에 비해서 더 활성인 트랜스포사제이다. 바람직한 양태에서, 과활성 PB 또는 PBL 트랜스포사제는 봄빅스 모리 또는 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis)로부터 단리되거나 유래된다. 과활성 PB 또는 PBL 트랜스포사제의 예는 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호, 미국 특허 제8,399,643호 및 WO 2019/173636에 개시된다. 과활성 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에 개시된다.
일부 양태에서, PB 또는 PBL 트랜스포사제는 통합 결함이다. 통합 결함 PB 또는 PBL 트랜스포사제는 이의 상응하는 트랜스포존을 자를 수 있지만, 상응하는 야생형 트랜스포사제에 비해서 더 낮은 빈도로 잘라진 트랜스포존을 통합시키는 트랜스포사제이다. 통합 결함 PB 또는 PBL 트랜스포사제의 예는 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호, 미국 특허 제8,399,643호 및 WO 2019/173636에 개시된다. 통합 결함 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에 개시된다.
일부 양태에서, PB 또는 PBL 트랜스포사제는 핵 국재화 신호에 융합된다. 핵 국재화 신호에 융합된 PB 또는 PBL 트랜스포사제의 예는 미국 특허 제6,218,185호; 미국 특허 제6,962,810호, 미국 특허 제8,399,643호 및 WO 2019/173636에 개시된다.
본 개시의 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존일 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존일 때, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(예를 들어, 미국 특허 제9,228,180호에 개시된 바와 같음) 또는 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제이다. 바람직한 양태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제는 SEQ ID NO: 105와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제는 SEQ ID NO: 106과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본 개시의 트랜스포존은 헬레이저(Helraiser) 트랜스포존일 수 있다. 예시적인 헬레이저 트랜스포존은 SEQ ID NO: 107과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, Helibat1을 포함한다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 헬레이저 트랜스포존일 때, 트랜스포사제는 헬리트론(Helitron) 트랜스포사제(예를 들어, WO 2019/173636에 개시된 바와 같음)이다. 바람직한 양태에서, 헬리트론 트랜스포사제는 SEQ ID NO: 108과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시의 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존일 수 있다. 역위 반복부, 하위말단 서열 및 Tol2 트랜스포사제를 포함하는 예시적인 Tol2 트랜스포존은 SEQ ID NO: 109와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존일 때, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제(예를 들어, WO 2019/173636에 개시된 바와 같음)이다. 바람직한 양태에서, Tol2 트랜스포사제는 SEQ ID NO: 110과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시의 트랜스포존은 TcBuster 트랜스포존일 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스포존이 TcBuster 트랜스포존일 때, 트랜스포사제는 TcBuster 트랜스포사제 또는 과활성 TcBuster 트랜스포사제(예를 들어, WO 2019/173636에 개시된 바와 같음)이다. TcBuster 트랜스포사제는 자연 발생 아미노산 서열 또는 비-자연 발생 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. 바람직한 양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 SEQ ID NO: 111과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. TcBuster 트랜스포사제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 핵산 서열 또는 비-자연 발생 핵산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. 바람직한 양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 SEQ ID NO: 112와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
일부 양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에 보다 상세히 기술된 바와 같은 야생형 TcBuster 트랜스포사제와 비교했을 때 하나 이상의 서열 변이를 포함한다.
트랜스포존은 나노트랜스포존일 수 있다. 나노트랜스포존은 (a) 제1 역위 말단 반복부 (ITR)를 코딩하는 서열, 제2 역위 말단 반복부 (ITR)를 코딩하는 서열, 및 ITR-내 서열을 포함하는, 트랜스포존 삽입부를 코딩하는 서열; (b) 골격을 코딩하는 서열로서, 종결점을 포함하여 1 내지 450개 뉴클레오티드를 갖는 복제 기점을 코딩하는 서열, 및 종결점을 포함하여 1 내지 200개 뉴클레오티드를 갖는 선별 마커를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 골격을 코딩하는 서열, 및 (c) ITR-내 서열을 포함할 수 있거나, 이로 필수적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, (c)의 ITR-내 서열은 (b)의 서열을 포함한다. 일부 양태에서, (a)의 ITR-내 서열은 (b)의 서열을 포함한다.
골격을 코딩하는 서열은 종결점을 포함하여, 1 내지 600개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 골격을 코딩하는 서열은 1 내지 50개 뉴클레오티드, 50 내지 100개 뉴클레오티드, 100 내지 150개 뉴클레오티드, 150 내지 200개 뉴클레오티드, 200 내지 250개 뉴클레오티드, 250 내지 300개 뉴클레오티드, 300 내지 350개 뉴클레오티드, 350 내지 400개 뉴클레오티드, 400 내지 450개 뉴클레오티드, 450 내지 500개 뉴클레오티드, 500 내지 550개 뉴클레오티드, 550 내지 600개 뉴클레오티드로 이루어지고, 각 범위는 종결점을 포함한다.
ITR-내 서열은 종결점을 포함하여, 1 내지 1000개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, ITR-내 서열은 1 내지 50개 뉴클레오티드, 50 내지 100개 뉴클레오티드, 100 내지 150개 뉴클레오티드, 150 내지 200개 뉴클레오티드, 200 내지 250개 뉴클레오티드, 250 내지 300개 뉴클레오티드, 300 내지 350개 뉴클레오티드, 350 내지 400개 뉴클레오티드, 400 내지 450개 뉴클레오티드, 450 내지 500개 뉴클레오티드, 500 내지 550개 뉴클레오티드, 550 내지 600개 뉴클레오티드, 600 내지 650개 뉴클레오티드, 650 내지 700개 뉴클레오티드, 700 내지 750개 뉴클레오티드, 750 내지 800개 뉴클레오티드, 800 내지 850개 뉴클레오티드, 850 내지 900개 뉴클레오티드, 900 내지 950개 뉴클레오티드, 또는 950 내 지 1000개 뉴클레오티드로 이루어지고, 각각의 범위는 종결점을 포함한다.
나노트랜스포존은 짧은 나노트랜스포존(SNT)일 수 있고, ITR-내 서열은 종결점을 포함하여, 1 내지 200개 뉴클레오티드를 포함한다. ITR-내 서열은 1 내지 10개 뉴클레오티드, 10 내지 20개 뉴클레오티드, 20 내지 30개 뉴클레오티드, 30 내지 40개 뉴클레오티드, 40 내지 50개 뉴클레오티드, 50 내지 60개 뉴클레오티드, 60 내지 70개 뉴클레오티드, 70 내지 80개 뉴클레오티드, 80 내지 90개 뉴클레오티드, 또는 90 내지 100개 뉴클레오티드로 이루어질 수 있고, 각각의 범위는 종결점을 포함한다.
종결점을 포함하여, 1 내지 200개 뉴클레오티드를 갖는 선별 마커는 수크로스-선별 마커를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 수크로스-선별 마커를 코딩하는 서열은 RNA-아웃 서열을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. RNA-아웃 서열을 코딩하는 서열은 137 개 염기쌍(bp)을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. 종결점을 포함하여, 1 내지 200개 뉴클레오티드를 갖는 선별 마커는 형광 마커를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 종결점을 포함하여, 1 내지 200개 뉴클레오티드를 갖는 선별 마커는 세포 표면 마커를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
종결점을 포함하여, 1 내지 450개 뉴클레오티드를 갖는 복제 기점을 코딩하는 서열은 미니 복제 기점을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 종결점을 포함하여, 1 내지 450개 뉴클레오티드를 갖는 복제 기점을 코딩하는 서열은 R6K 복제 기점을 코딩하는 서열을 포함한다. R6K 복제 기점은 R6K 감마 복제 기점을 포함할 수 있다. R6K 복제 기점은 R6K 미니 복제 기점을 포함할 수 있다. R6K 복제 기점은 R6K 감마 미니 복제 기점을 포함할 수 있다. R6K 감마 미니 복제 기점은 281 개 염기쌍(bp)을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
나노트랜스포존의 일부 양태에서, 골격을 코딩하는 서열은 재조합 부위, 절개 부위, 결찰 부위 또는 이의 조합을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 나노트랜스포존 또는 골격을 코딩하는 서열은 재조합 부위, 절개 부위, 결찰 부위 또는 이의 조합의 생성물을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 나노트랜스포존 또는 골격을 코딩하는 서열은 재조합 부위, 절개 부위, 결찰 부위 또는 이의 조합으로부터 유래되지 않는다.
나노트랜스포존의 일부 양태에서, 재조합 부위는 재조합 사건에 의해 유래된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 부위는 재조합 사건의 생성물인 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 사건은 리콤비나제의 활성(예를 들어, 리콤비나제 부위)을 포함한다.
나노트랜스포존의 일부 양태에서, 골격을 코딩하는 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 추가로 포함하지 않는다.
나노트랜스포존의 일부 양태에서, ITR-내 서열은 재조합 부위, 절개 부위, 결찰 부위 또는 이의 조합을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, ITR-내 서열은 재조합 사건, 절개 사건, 결찰 사건 또는 이의 조합의 생성물을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, ITR-내 서열은 재조합 사건, 절개 사건, 결찰 사건 또는 이의 조합으로부터 유래되지 않는다. 일부 양태에서, ITR-내 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ITR-내 서열은 적어도 하나의 절연체를 코딩하는 서열 및 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 포유동물 세포은 인간 세포일 수 있다. 일부 양태에서, ITR-내 서열은 절연체를 코딩하는 제1 서열, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열 및 절연체를 코딩하는 제2 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ITR-내 서열은 절연체를 코딩하는 제1 서열, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열, 폴리아데노신(폴리A) 서열 및 절연체를 코딩하는 제2 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ITR-내 서열은 절연체를 코딩하는 제1 서열, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열, 적어도 하나의 외생성 서열, 폴리아데노신(폴리A) 서열 및 절연체를 코딩하는 제2 서열을 포함한다.
나노트랜스포존은 PCT/US2019/067758에 보다 상세히 설명된다.
벡터 시스템
본 개시의 벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 또는 이의 임의의 조합으로부터 단리되거나 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV)로부터 단리되거나 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 재조합 AAV(rAAV)를 포함할 수 있다. 예시적인 아데노-연관 바이러스 및 재조합 아데노-연관 바이러스는 본 개시의 scFv 또는 CAR을 코딩하는 서열 옆에 시스로 위치하는 둘 이상의 역위 말단 반복부(ITR) 서열을 포함한다. 예시적인 아데노-연관 바이러스 및 재조합 아데노-연관 바이러스는 모든 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 아데노-연관 바이러스 및 재조합 아데노-연관 바이러스는 자기-상보성 AAV(scAAV) 및 한 혈청형의 게놈 및 다른 혈청형의 캡시드를 함유하는 AAV 하이브리드(예를 들어, AAV2/5, AAV-DJ 및 AAV-DJ8)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 아데노-연관 바이러스 및 재조합 아데노-연관 바이러스는 rAAV-LK03을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 개시의 벡터는 나노입자일 수 있다. 나노입자 벡터의 비제한적인 예는 핵산(예를 들어, RNA, DNA, 합성 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 이의 임의의 조합), 아미노산(L-아미노산, D-아미노산, 합성 아미노산, 변형된 아미노산, 또는 이의 임의의 조합), 중합체(예를 들어, 폴리머솜), 미셀, 지질(예를 들어, 리포솜), 유기 분자(예를 들어, 탄소 원자, 시트, 섬유, 튜브), 무기 분자(예를 들어, 인산칼슘 또는 금) 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 나노입자 벡터는 세포막을 가로질러 수동적으로 또는 능동적으로 수송될 수 있다.
본원에 개시된 세포 전달 조성물(예를 들어, 트랜스포존, 벡터)은 치료적 단백질 또는 치료제를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 치료적 단백질의 예는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에 개시된 것들을 포함한다.
유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드
본원에 개시된 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 본 개시의 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드가 훨씬 덜 면역원성이므로 기존 유도성 폴리펩티드에 비해 우수하다. 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이고, 그러므로, 비-자연 발생이다. 또한, 서열은 비-인간 서열을 포함하지 않는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드를 생성하도록 조합되어서, 숙주 인간 면역계가 "비-자기"로서 인식할 수 있어서, 결론적으로, 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드, 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드를 포함하는 조성물 또는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드를 포함하는 세포를 받은 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 개시는 리간드 결합 영역, 링커, 및 프로아폽토시스 펩티드를 포함하는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드를 제공하고, 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일정 양태에서, 비-인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 일정 양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체 리간드 결합 영역일 수 있다. 일정 양태에서, 프로아폽토시스 펩티드는 캐스파제 폴리펩티드이다. 캐스파제 폴리펩티드의 비제한적인 예는 캐스파제 1, 캐스파제 2, 캐스파제 3, 캐스파제 4, 캐스파제 5, 캐스파제 6, 캐스파제 7, 캐스파제 8, 캐스파제 9, 캐스파제 10, 캐스파제 11, 캐스파제 12, 및 캐스파제 14를 포함한다. 바람직하게, 캐스파제 폴리펩티드는 캐스파제 9 폴리펩티드이다. 캐스파제 9 폴리펩티드는 절두된 캐스파제 9 폴리펩티드일 수 있다. 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 비-자연 발생일 수 있다. 캐스파제가 캐스파제 9 또는 절두된 캐스파제 9일 때, 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 또한 "iC9 안전성 스위치"로도 지칭될 수 있다.
유도성 캐스파제 폴리펩티드는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 캐스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일정 양태에서, 유도성 캐스파제 폴리펩티드는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 절두된 캐스파제 9 폴리펩티드를 포함하고, 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다.
리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함하는 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에 변형을 포함할 수 있다. 변형은 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)일 수 있다. FKBP12 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 113과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. FKBP12 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 114와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
링커 영역은 SEQ ID NO: 115와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 필수적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있거나, 또는 링커 영역은 SEQ ID NO: 116과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 일부 양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
절두된 캐스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 87에 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 절두된 캐스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 282에 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 절두된 캐스파제 9 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 117과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 필수적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있거나, 또는 절두된 캐스파제 9 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 118과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
폴리펩티드가 절두된 캐스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 일정 양태에서, 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 119와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나, 또는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 120과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
폴리펩티드가 절두된 캐스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 일정 양태에서, 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 172와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나, 또는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 173과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 세포에서 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드의 발현을 개시할 수 있고/있거나 조절할 수 있는 당분야에 공지된 임의의 프로모터의 전사 조절 하에 세포에서 발현될 수 있다.
유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드의 활성화는 조건적으로 제어된 단백질 또는 폴리펩티드를 생성시키기 위한 유도제에 의해 매개되는, 예를 들어, 화학적으로 유도된 이량체화(CID)를 통해서 수행될 수 있다. 프로아폽토시스 폴리펩티드는 유도성이지만, 이들 폴리펩티드의 유도는 또한 불안정한 이량체화제의 분해 또는 단량체 경쟁적 억제형의 투여 덕분에 가역적이다.
리간드 결합 영역이 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)을 갖는 FKBP12 폴리펩티드를 포함하는 일정 양태에서, 유도제는 AP1903, 합성 약물(CAS 색인명: 2-피페리딘카르복실산, 1-[(2S)-1-옥소-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부틸]-, 1,2-에탄디일비스[이미도(2-옥소-2,1-에탄디일)옥시-3,1-페닐렌[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)프로필리덴]]에스테르, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS 등록 번호: 195514-63-7; 분자식: C78H98N4O20; 분자량: 1411.65)); AP20187(CAS 등록 번호: 195514-80-8 및 분자식: C82H107N5O20) 또는 AP20187 유사체, 예컨대, 예를 들어 AP1510을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 유도제 AP20187, AP1903 및 AP1510은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
유도성 프로아폽토시스 펩티드 및 이들 펩티드의 유도 방법은 미국 특허 공개 번호 WO 2019/0225667 및 PCT 공개 번호 WO 2018/068022에 상세히 기재되어 있다.
키메라 자극 수용체 및 재조합 HLA-E 폴리펩티드
임의의 환자에게 투여를 위해 "보편적으로" 안전한 양자 세포 조성물은 동종이식편반응의 상당한 감소 또는 제거를 요구한다. 이러한 목적을 위해서, 본 개시의 세포(예를 들어, 동종이계 세포)는 T-세포 수용체(TCR) 및/또는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스의 발현 또는 기능을 파괴하도록 변형될 수 있다. TCR은 이식편 대 숙주(GvH) 반응을 매개하는 반면 MHC는 숙주 대 이식편(HvG) 반응을 매개한다. 바람직한 양태에서, TCR의 임의의 발현 및/또는 기능은 대상체에게 죽음을 초래할 수 있는 T-세포 매개된 GvH를 예방하기 위해 제거된다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 개시는 순수한 TCR-음성 동종이계 T-세포 조성물(예를 들어, 조성물의 각각의 세포는 검출불가하거나 존재하지 않는 정도까지 낮은 수준으로 발현함)을 제공한다.
MHC 클래스 I(MHC-I, 특히, HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C)의 발현 및/또는 기능은 HvG를 예방하고, 결과적으로, 대상체에서 세포의 생착을 개선시키기 위해 감소되거나 제거된다. 개선된 생착은 세포의 보다 긴 지속성을 야기하고, 그러므로, 대상체에 대해 더 큰 치료창을 야기한다. 특히, MHC-I의 구조적 구성요소, 베타-2-마이크 로글로불린(B2M)의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 제거된다.
상기 전략은 추가 도전을 유도한다. T 세포에서 T 세포 수용체(TCR) 녹아웃(KO)은 TCR 복합체의 일부인, CD3-제타(CD3z 또는 CD3ζ)의 발현 상실을 야기한다. TCR-KO T-세포에서 CD3ζ의 상실은 제한 없이, 작용제 항-CD3 mAb를 포함한, 표준 자극/활성화 시약을 사용하여 이들 세포가 최적으로 활성화되고 확장되는 능력을 극적으로 감소시킨다. TCR 복합체의 어느 하나의 성분의 발현 또는 기능이 파괴될 때, TCR-알파(TCRα), TCR-베타(TCR β), CD3-감마(CD3γ), CD3-엡실론(CD3ε), CD3-델타(CD3δ), 및 CD3-제타(CD3ζ)를 포함한, 복합체의 모든 성분이 상실된다. CD3ε와 CD3ζ 둘 모두는 T 세포 활성화 및 확장에 필요하다. 작용제 항-CD3 mAb는 전형적으로 CD3ε 및 복합체 내 가능한 다른 단백질을 인식하고, 이어서 CD3ζ에 신호를 전달한다. CD3ζ는 최적 활성화 및 확장을 위해 T 세포 활성화에 대한(제2 공동자극 신호와 함께) 제1 자극을 제공한다. 정상 상태에서, 전체 T-세포 활성화는 면역 반응을 증강시키는 하나 이상의 공동자극성 수용체(예를 들어, CD28, CD2, 4-1BBL)에 의해 매개되는 제2 신호와 함께 TCR의 관여에 의존한다. 그러나, TCR이 존재하지 않는 경우에, T 세포 확장은 작용제 항-CD3 mAb를 포함한, 표준 활성화/자극 시약을 사용하여 자극될 때 심각하게 감소된다. 사실, T 세포 확장은 작용제 항-CD3 mAb를 포함한, 표준 활성화/자극 시약을 사용해 자극될 때 정상 확장 수준의 오직 20% 내지 40%까지만 감소된다.
따라서, 본 개시는 (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리되거나 유래된 것인 엑토도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하고, 적어도 하나의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 유래되고; 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 것인, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다.
활성화 성분은 활성화 성분의 작용제가 결합하는 T-세포 수용체(TCR)의 성분, TCR 복합체의 성분, TCR 공동수용체의 성분, TCR 공동자극성 단백질의 성분, TCR 억제성 단백질의 성분, 사이토카인 수용체, 및 케모카인 수용체 중 하나 이상의 일부분을 포함할 수 있다. 활성화 성분은 작용제가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
신호 전달 도메인은 인간 신호 전달 도메인의 성분, T-세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 공동수용체의 성분, TCR 공동자극성 단백질의 성분, TCR 억제성 단백질의 성분, 사이토카인 수용체, 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 신호 전달 도메인은 CD3 단백질 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. CD3 단백질은 CD3ζ 단백질 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
엔도도메인은 세포질 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 세포질 도메인은 제3 단백질로부터 유래되거나 단리될 수 있다. 제1 단백질 및 제3 단백질은 동일할 수 있다. 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 제4 단백질로부터 유래될 수 있다. 제1 단백질 및 제4 단백질은 동일할 수 있다. 막관통 도메인은 제5 단백질로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 제1 단백질 및 제5 단백질은 동일할 수 있다.
일부 양태에서, 활성화 성분은 자연 발생 분자에 결합하지 않는다. 일부 양태에서, 활성화 성분은 자연 발생 분자에 결합하지만 CSR은 활성화 성분의 결합 시에 자연 발생 분자에게 신호를 전달하지 않는다. 일부 양태에서, 활성화 성분은 비-자연 발생 분자에 결합한다. 일부 양태에서, 활성화 성분은 자연 발생 분자에 결합하지 않지만 비-자연 발생 분자에 결합한다. CSR은 활성화 성분의 결합 시에 비-자연 발생 분자에 신호를 선택적으로 전달할 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 개시는 (a) 신호 펩티드 및 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 이의 일부를 포함하고 활성화 성분은 작용제가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막관통 도메인으로서, 막관통 도메인은 CD2 막관통 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 것인 막관통 도메인; 및 (c) 세포질 도메인 및 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 이의 일부를 포함하고 적어도 하나의 신호 전달 도메인이 CD3ζ 단백질 또는 이의 일부를 포함하는 것인 엔도도메인을 포함하는, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다. 일부 양태에서, 비-자연 발생 CSR은 SEQ ID NO: 121과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 비-자연 발생 CSR은 SEQ ID NO: 121의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 또한 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공하고, 여기서 엑토도메인은 변형을 포함한다. 변형은 활성화 성분 또는 제1 단백질의 야생형 서열과 비교할 때 활성화 성분 또는 제1 단백질의 아미노산 서열의 돌연변이 또는 절두를 포함할 수 있다. 활성화 성분의 아미노산 서열의 돌연변이 또는 절두는 작용제가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 이의 일부의 돌연변이 또는 절두를 포함할 수 있다. CD2 세포외 도메인의 돌연변이 또는 절두는 자연 발생 CD58과의 결합을 감소시키거나 제거할 수 있다. 일부 양태에서, 돌연변이 또는 절두를 포함하는 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 122와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 돌연변이 또는 절두를 포함하는 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 개시는 (a) 신호 펩티드 및 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 이의 일부를 포함하고 활성화 성분은 작용제가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하고 작용제가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 이의 일부는 돌연변이 또는 절두를 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막관통 도메인으로서, 막관통 도메인은 CD2 막관통 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 것인 막관통 도메인; 및 (c) 세포질 도메인 및 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 이의 일부를 포함하고 적어도 하나의 신호 전달 도메인이 CD3ζ 단백질 또는 이의 일부를 포함하는 것인 엔도도메인을 포함하는, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다. 일부 양태에서, 비-자연 발생 CSR은 SEQ ID NO: 123과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 비-자연 발생 CSR은 SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 개시는 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존 또는 벡터를 제공한다.
본 개시는 본원에 개시된 임의의 CSR을 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시는 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시는 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시는 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 세포를 제공한다.
본원에 개시된 변형된 세포는 동종이계 세포 또는 자기유래 세포일 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 변형된 세포는 동종이계 세포이다. 일부 양태에서, 변형된 세포는 자기유래 T-세포 또는 변형된 자기유래 CAR T-세포이다. 일부 바람직한 양태에서, 변형된 세포는 동종이계 T-세포 또는 변형된 동종이계 CAR T-세포이다.
본 개시는 본원에 개시된 임의의 CSR을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 본원에 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 본원에 개시된 변형된 세포를 포함하는 조성물 또는 본원에 개시된 복수의 변형된 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 (a) T-세포 수용체 (TCR)을 코딩하는 내생성 서열의 변형으로서, TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소시키거나 제거시키는 것인 변형; 및 (b) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리되거나 유래되는 것인 엑토도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 적어도 하나의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 유래되는 것인 엔도도메인을 포함하고, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 것인, 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함하는, 변형된 T 림프구 (T-세포)를 제공한다.
변형된 T-세포는 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 변형된 T-세포는 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내생성 서열의 변형을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 변형은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHCI)의 발현 또는 활성 수준을 감소시키거나 제거시킨다.
변형된 T-세포는 HLA 클래스 I 조직적합성 항원, 알파 사슬 E(HLA-E) 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 링커를 추가로 포함할 수 있고, 링커는 B2M 폴리펩티드와 HLA-E 폴리펩티드 사이에 위치된다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 펩티드 및 B2M 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드 및 펩티드 사이에 위치된 제 1 링커, 및 B2M 폴리펩티드 및 HLA-E를 코딩하는 펩티드 사이에 위치된 제2 링커를 추가로 포함할 수 있다.
변형된 T-세포는 비-자연 발생 항원 수용체, 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 비-자연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함할 수 있다.
CSR은 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. CSR은 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다.
본 명세서에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 제한 없이, dCas9-Clo051을 포함하는 RNA-가이드된 융합 단백질을 포함하는, 유전자 편집 조성물은 내생성 T-세포 수용체의 발현을 표적화하고 감소 또는 제거시키는 데 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 유전자 편집 조성물은 내생성 T-세포 수용체를 코딩하는 유전자, 유전자의 일부, 또는 유전자의 조절 구성요소(예컨대, 프로모터)를 표적화하고 결실시킨다. TCR-알파(TCR-α)의 표적화 및 결실화, TCR-베타(TCR-β)의 표적화 및 결실화, 및 베타-2-마이크로글로불린(β2M)의 표적화 및 결실화를 위한 가이드 RNA(gRNA) 주형의 생성을 위한 프라이머(T7 프로모터, 게놈 표적 서열, 및 gRNA 스캐폴드 포함)의 비제한적인 예는 PCT 출원 번호 PCT/US2019/049816에 개시되어 있다.
제한 없이, dCas9-Clo051을 포함하는 RNA-가이드된 융합 단백질을 포함하는 유전자 편집 조성물은 내생성 MHCI, MHCII, 또는 MHC 활성인자를 표적화하거나 이의 발현을 감소 또는 제거시키는 데 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 유전자 편집 조성물은 내생성 MHCI, MHCII, 또는 MHC 활성인자의 하나 이상의 성분을 코딩하는 유전자, 유전자의 일부분, 또는 유전자의 조절 구성요소(예컨대, 프로모터)를 표적화하고 결실시킨다. MHC 활성인자의 표적화 및 결실을 위한 가이드 RNA(gRNA)의 비제한적인 예는 PCT 출원 번호 PCT/US2019/049816에 개시되어 있다.
비-자연 발생 키메라 자극 수용체, TCR-알파(TCR-α), TCR-베타(TCR-β), 및/또는 베타-2-마이크로글로불린(β2M)을 코딩하는 내생성 서열의 유전자 변형, 및 HLA 클래스 I 조직적합성 항원, 및 알파 사슬 E(HLA-E) 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드의 상세한 설명은 PCT 출원 번호 PCT/US2019/049816에 개시되어 있다.
제형, 투여량, 및 투여 방법
본 개시는 본 명세서에 기술된 조성물의 제형, 투여량, 및 투여 방법을 제공한다.
개시된 조성물 및 약학적 조성물은 적어도 하나의 임의의 적합한 보조제, 예컨대, 제한 없이, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 보강제 등을 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 보조제가 바람직하다. 이러한 멸균 용액의 비제한적인 예, 및 제조 방법은, 제한 없이, 문헌[Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990] 및 문헌["Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics (Montvale, N.J.) 1998]와 같이 당분야에 널리 공지되어 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 본 명세서에 기술되거나 또는 당분야에 널리 공지된 바와 같은 단백질 스캐폴드, 단편 또는 변이체 조성물의 투여 방식, 가용성, 및/또는 안정성에 적합하게 통상적으로 선택될 수 있다.
사용에 적합한 약학적 부형제 및 첨가제의 비제한적인 예는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 및 올리고당류를 포함한, 당류; 유도체화 당류, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당류 등; 및 다당류 또는 당 중합체)을 포함하고, 단독으로 또는 조합하여 존재할 수 있고, 단독으로 또는 조합하여 중량 또는 부피 기준으로 1-99.99%를 포함한다. 단백질 부형제의 비제한적인 예는 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인 등을 포함한다. 완충 능력으로도 기능할 수 있는, 대표적인 아미노산/단백질 성분은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함한다. 다른 바람직한 아미노산은 글리신이다.
사용에 적합한 탄수화물 부형제의 비제한적인 예는 단당류, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 솔보스 등; 이당류, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로바이오스 등; 다당류, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 솔비톨(글루시톨), 미오이노시톨 등을 포함한다. 바람직하게, 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스, 및/또는 라피노스이다.
조성물은 또한 완충제 또는 pH-조정제를 포함할 수 있고; 전형적으로, 완충제는 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충제는 유기 산 염, 예컨대 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 카본산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염; Tris, 트로메타민 하이드로클로라이드, 또는 포스페이트 완충제를 포함한다. 바람직한 완충제는 유기 산 염, 예컨대 시트레이트이다.
추가로, 개시된 조성물은 중합체 부형제/첨가제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 피콜(중합체 당), 덱스트레이트(예를 들어, 시클로덱스트린, 예컨대 2-하이드록시프로필-β-시클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 풍미제, 항미생물제, 감미제, 항산화제, 대전방지제, 계면활성제(예를 들어, 폴리솔베이트, 예컨대 "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80"), 지질(예를 들어, 인지질, 지방산), 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤), 및 킬레이트화제(예를 들어, EDTA)를 포함할 수 있다.
많은 공지되고 개발된 방식은 치료적 유효량의 본원에 개시된 조성물 또는 약학적 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 투여 방식의 비제한적인 예는 볼러스, 구강, 주입, 관절내, 기관지내, 복부내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 병변내, 근육내, 심근내, 비내, 안내, 뼈속, 골내, 골반내, 심낭내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉강내, 자궁내, 종양내, 정맥내, 방광내, 경구, 비경구, 직장, 설하, 피하, 경피 또는 질 수단을 포함한다.
본 개시의 조성물은 비경구(피하, 근육내, 또는 정맥내) 또는 임의의 다른 투여, 특히 액상 용액 또는 현탁액의 형태로 사용을 위해서; 질 또는 직장 투여, 특히 반고체 형태, 예컨대, 제한 없이, 크림 및 좌제로 사용을 위해서; 구강, 또는 설하 투여, 예컨대, 제한 없이, 정제 또는 캡슐의 형태로; 또는 비내로, 예컨대, 제한 없이, 분말, 비강 점적액 또는 에어로솔 또는 일정 작용제의 형태로; 또는 경피로, 예컨대, 제한 없이, 겔, 연고, 로션, 현탁액 또는 경피 팻치 중 약물 농도를 증가시키거나 피부 구조를 변형시키기 위해 디메틸 술폭시드와 같은 화학적 인핸서(Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement;" Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90(Marcel Dekker, Inc. New York 1994,), 또는 피부에 단백질 및 펩티드를 함유하는 제형의 도포가 가능한 산화제(WO 98/53847) 존재의 패치 전달 시스템, 또는 일시적 수송 경로를 생성하도록 전기장의 인가, 예컨대 전기 천공, 또는 피부를 통해 하전된 약물의 이동성을 증가시키기 위해, 예컨대 이온영동법, 또는 초음파의 인가, 예컨대 초음파영동법(미국 특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호)(상기 간행물 및 특허는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)을 위해 제조될 수 있다.
비경구 투여를 위해, 본원에 개시된 임의의 조성물은 약학적으로 허용되는 비경구 비히클과 함께, 별도로 제공되거나, 회합하여, 용액, 현탁액, 에멀젼, 입자, 분자, 또는 동결건조 분말로서 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 일반 부형제로서 멸균수 또는 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원 오일, 수첨가 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사용 수성 또는 오일 현탁액은 공지된 방법에 따라서, 적절한 유화제 또는 가습제 및 현탁제를 사용해 제조될 수 있다. 주사제는 무독성, 비경구적으로 투여가능한 희석제, 예컨대 수성 용액, 멸균 주사용 용액 또는 용매 중 현탁액일 수 있다. 사용가능한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거액, 등장성 염수 등이 허용되고; 통상의 용매 또는 현탁 용매로서, 멸균 비휘발성 오일이 사용될 수 있다. 이들 목적을 위해서, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드 또는 트리글리세리드를 포함한, 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산이 사용될 수 있다. 비경구 투여는 당분야에 공지되어 있고, 통상의 주사 수단, 미국 특허 제5,851,198호에 기술된 바와 같은 가스 가압 무바늘 주사 장치, 및 미국 특허 제5,839,446호에 기술된 바와 같은 레이저 천공 장치를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
경구 투여를 위한 제형은 장벽의 투과성을 인공적으로 증가시키기 위해 보강제(예를 들어, 레솔시놀 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르)의 공동-투여를 비롯하여, 효소 분해를 억제하기 위해 효소 억제형(예를 들어, 췌장 트립신 억제형, 디이소프로필플루오로포스페이트(DFF) 및 트라실롤)의 공동-투여에 의존한다. 단백질 및 단백질 스캐폴드 및 경구, 구강, 점막, 비내, 폐, 질 막관통 또는 직장 투여용으로 의도된 적어도 2종의 계면활성제의 조합을 포함하는 친수성제의 전달을 위한 제형은 미국 특허 제6,309,663호에 설명된다. 경구 투여를 위한 고체-타입 투여형의 활성 성분 화합물은 수크로스, 락토스, 셀룰로스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 알기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 검 트라가칸트, 검 아라빅, 젤라틴, 콜라겐, 카세인, 알부민, 합성 또는 반합성 중합체, 및 글리세리드를 포함하는, 적어도 하나의 첨가제와 혼합될 수 있다. 이들 투여형은 또한 다른 유형(들)의 첨가제, 예를 들어, 불활성 희석제, 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 파라벤, 보존제, 예컨대 솔브산, 아스코르브산, 알파.-토코페롤, 항산화제 예컨대 시스테인, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충제, 감미제, 풍미제, 향미제 등을 함유할 수 있다.
정제 및 알약은 장용-제피 조제물로 추가로 가공될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 조제물은 의학 용도로 허용되는 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 용액 조제물을 포함한다. 이들 조제물은 상기 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어, 물을 함유할 수 있다. 리포솜은 또한 인슐린 및 헤파린에 대한 약물 전달 시스템으로서 설명되었다(미국 특허 제4,239,754호). 보다 최근에, 혼합 아미노산(유단백질)의 인공 중합체의 미세구가 약제를 전달하는 데 사용되어 왔다(미국 특허 제4,925,673호). 더 나아가서, 미국 특허 제5,879,681호 및 미국 특허 제5,871,753호에 기술되고 생물학적 활성제를 경구로 전달하는 데 사용되는 담체 화합물이 당분야에 공지되어 있다.
폐 투여를 위해서, 바람직하게, 본 명세서에 기술된 조성물 또는 약학적 조성물은 부비동 또는 폐의 하기도에 도달하는 데 효과적인 입도로 전달된다. 조성물 또는 약학적 조성물은 흡입을 통한 치료제의 투여를 위해 당분야에 공지된 임의의 다양한 흡입 또는 비내 장치에 의해 전달될 수 있다. 환자의 폐포 또는 부비동강에서 에어로졸화된 제형을 침착시킬 수 있는 이들 장치는 계량 용량 흡입기, 네뷸라이저(예를 들어, 제트 네뷸라이저, 초음파 네뷸라이저), 건조 분말 발생기, 스프레이 등을 포함한다. 모든 이러한 장치는 에어로졸로 본 명세서에 기술된 조성물 또는 약학적 조성물의 분배를 위해 투여에 적합한 제형을 사용할 수 있다. 이러한 에어로졸은 용액(수성과 비수성 둘 모두) 또는 고체 입자를 포함할 수 있다. 추가로, 본 명세서에 기술된 조성물 또는 약학적 조성물을 포함하는 스프레이는 압력 하에 노즐을 통해서 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 현탁액 또는 용액을 밀어서 생성시킬 수 있다. 계량 용량 흡입기(MDI)에서, 추진제, 본 명세서에 기술된 조성물 또는 약학적 조성물, 및 임의의 부형제 또는 다른 첨가제가 액화 압착 가스를 포함하는 혼합물로서 캐니스터에 함유된다. 계량 밸브의 작동 작용은 바람직하게 약 10 ㎛ 미만, 바람직하게, 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 및, 가장 바람직하게, 약 2 ㎛ 내지 약 3 ㎛ 크기 범위의 입자를 함유하는, 에어로졸로서 혼합물을 방출한다. 폐 투여, 제형, 및 관련 장치의 보다 상세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/049816에 개시된다.
점막 표면을 통한 흡수를 위해서, 조성물은 에멀젼 입자의 점막부착을 달성하여 점막 표면을 통한 흡수를 촉진하는, 복수의 미크론 이하의 입자, 점막부착성 거대분자, 생활성 펩티드, 및 수성 연속층을 포함하는 에멀젼을 포함한다(미국 특허 제5,514,670호). 본 개시의 에멀젼의 도포에 적합한 점막 표면은 각막, 결막, 구강, 설하, 코, 질, 폐, 위, 장, 및 직장 투여 경로를 포함할 수 있다. 질 또는 직장 투여를 위한 제형, 예를 들어, 좌제는 부형제로서, 예를 들어, 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 함유할 수 있다. 비내 투여를 위한 제형은 고체일 수 있고 부형제로서, 예를 들어, 락토스를 함유할 수 있거나, 비내 점적액의 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 구강 투여를 위해서, 부형제는 당류, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 전호화 전분 등을 포함한다(미국 특허 제5,849,695호). 점막 투여 및 제형의 보다 상세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/049816에 개시된다.
경피 투여를 위해서, 본원에 개시된 조성물 또는 약학적 조성물은 전달 장치, 예컨대 리포솜 또는 중합체 나노입자, 미세입자, 미세캡슐, 또는 미세구(집합적으로 달리 명시하지 않으면 미세입자로 지칭됨)에 캡슐화된다. 합성 중합체, 예컨대 폴리하이드록시산, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 이의 공중합체, 폴리오르쏘에스테르, 폴리무수물, 및 폴리포스파젠, 및 천연 중합체, 예컨대 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 다른 단백질, 알기네이트 및 다른 다당류, 및 이의 조합으로 제조된 미세입자를 포함하여, 다수의 적합한 장치가 공지되어 있다(미국 특허 제5,814,599호). 경피 투여, 제형 및 적합한 장치의 보다 상세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/049816에 개시된다.
대상체에게 장기간 동안, 예를 들어, 1주 내지 1년의 기간 동안 단일 투여로부터, 개시된 화합물을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 서방형, 데포 또는 임플란트 투여형이 이용될 수 있다. 예를 들어, 투여형은 체액에서 낮은 가용도를 갖는 화합물의 약학적으로 허용되는 무독성 염, 예를 들어, (a) 다염기산, 예컨대 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 팜산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 디-술폰산, 폴리갈락투론산 등과의 산 부가 염; (b) 다가 금속 양이온, 예컨대 아연, 칼슘, 비스무쓰, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등, 또는 예를 들어, N,N'-디벤질-에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온과의 염; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합, 예를 들어 아연 탄네이트 염을 함유할 수 있다. 추가로, 개시된 화합물 또는, 바람직하게, 상대적으로 불용성인 염, 예컨대 바로 기술된 것들은 겔, 예를 들어 주사에 적합한, 예를 들어, 참깨유와 알루미늄 모노스테아레이트 겔에 제형화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 탄네이트 염, 파모에이트 염 등이다. 주사를 위한 다른 유형의 서방형 데포 제형은 예를 들어, 미국 특허 제3,773,919호에 기술된 바와 같이, 서서히 분해되는, 무독성, 비-항원성 중합체, 예컨대 폴리락트산/폴리글리콜산 중합체에 캡슐화를 위해 분산된 화합물 또는 염을 함유하게 된다. 화합물, 또는 바람직하게, 비교적 불용성인 염, 예컨대 상기 기술된 것들은 또한 특히 동물에서 사용을 위해서, 콜레스테롤 매트릭스 시알리스틱 펠렛으로 제형화될 수 있다. 추가의 서방형, 데포 또는 임플란트 제형, 예를 들어, 가스 또는 액체 리포솜은 문헌에 공지되어 있다(미국 특허 제5,770,222호 및 문헌["Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978]).
적합한 투여량은 당분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J.]을 참조한다. 바람직한 용량은 선택적으로 약 0.1-99 및/또는 100-500 mg/kg/투여, 또는 이의 임의의 범위, 값, 또는 분율, 또는 단일 또는 다중 투여 당 약 0.1-5000 ㎍/mL 혈청 농도의 혈청 농도를 획득하도록, 또는 이의 임의의 범위, 값, 또는 분율을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 조성물 또는 약학적 조성물의 바람직한 용량 범위는 대상체의 체중의 약 1 mg/kg, 최대 약 3, 약 6 또는 약 12 mg/kg이다.
대안적으로, 투여되는 투여량은 기지 인자들, 예컨대 특정 작용제의 약력학적 특징, 및 이의 투여 방식 및 경로; 수령체의 연령, 건강, 및 체중; 증상의 성질 및 정도, 동시발생 치료의 종류, 치료 빈도, 및 원하는 효과에 따라 가변적일 수 있다. 일반적으로 활성 성분의 투여량은 체중 킬로그램 당 약 0.1 내지 100 밀리그램일 수 있다. 보통, 지속 방출 형태 중에서 또는 투여 당 킬로그램 당 0.1 내지 50 밀리그램, 및 바람직하게, 0.1 내지 10 밀리그램이 원하는 결과를 수득하는 데 효과적이다.
비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는 본원에 개시된 조성물 또는 약학적 조성물의 1회 또는 주기적 투여량으로서, 단일, 주입 또는 반복 용량을 사용하여, 1일당, 1-40일 중 적어도 하루, 또는 대안적으로 또는 추가적으로, 1주-52주 중 적어도 하나, 대안적으로 또는 추가적으로, 1-20년 중 적어도 하나, 이의 임의의 조합 당, 약 0.1 내지 100 mg/kg 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 분율로 제공될 수 있다.
내부 투여에 적합한 투여형은 일반적으로 유닛 또는 용기 당 약 0.001 밀리그램 내지 약 500 밀리그램의 활성 성분을 함유한다. 이들 약학적 조성물에서 활성 성분은 일반적으로 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5-99.999 중량%의 양으로 존재하게 된다.
유효량은 관련 분야에 공지되거나 본 명세서에 기술된 바와 같이, 공지된 방법을 사용해 수행하고 결정하여, 단일(예를 들어, 볼러스), 다중 또는 연속 투여 당 약 0.001 내지 약 500 mg/kg의 양, 또는 단일, 다중, 또는 연속 투여 당 0.01-5000 ㎍/mL 혈청 농도의 혈청 농도에 도달하도록, 또는 그 안의 임의의 유효 범위 또는 값의 양을 포함할 수 있다.
치료를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물이 본원에 개시된 바와 같은 변형된 세포인 양태에서, 세포는 약 1x103 내지 1x1015 세포; 약 1x104 내지 1x1012 세포; 약 1x105 내지 1x1010 세포; 약 1x106 내지 1x109 세포; 약 1x106 내지 1x108 세포; 약 1x106 내지 1x107 세포; 또는 약 1x106 내지 25x106 세포로 투여될 수 있다. 일 양태에서, 세포는 약 5x106 내지 25x106 세포로 투여된다.
개시된 조성물 및 약학적 조성물의 약학적으로 허용되는 부형제, 제형, 투여량, 및 투여 방법의 보다 상세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/049816에 개시된다.
본 개시의 조성물의 사용 방법
본 개시는 개시된 조성물 및 약학적 조성물을 사용하여, 예를 들어, 치료적 유효량의 조성물 또는 약학적 조성물로 세포, 조직, 장기, 동물, 또는 대상체의 투여 또는 접촉하여 본 명세서에 기술되거나 당분야에 공지된 바와 같이, 세포, 조직, 장기, 동물, 또는 대상체에서 질환 또는 장애의 치료를 위한 개시된 조성물 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 일 양태에서, 대상체는 포유동물이다. 바람직하게, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 개시는 세포, 조직, 장기, 동물, 또는 대상체에서 적어도 하나의 악성 질환 또는 장애를 조절하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게, 악성 질환은 암이다. 악성 질환 또는 장애의 비제한적인 예는 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 림프구성 백혈병, B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수 백혈병(AML), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발 세포 백혈병, 골수이형성 증후군(MDS), 림프종, 호지킨 질환, 악성 림프종, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 카포시 육종, 직결장 암종, 췌장 암종, 비인두 암종, 악성 조직구증, 부신생물성 증후군/악성 고칼슘혈증, 고형 종양, 방광암, 유방암, 직결장암, 자궁내막암, 두부암, 경부암, 유전성 비용종성 암, 호지킨 림프종, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 고환암, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 뼈 재흡수, 암 관련 뼈 통증 등을 포함한다.
바람직한 양태에서, 악성 질환 또는 장애의 치료는 양자 세포 요법을 포함한다. 예를 들어, 일 양태에서, 본 개시는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여를 위해 선택 및/또는 확장된 적어도 하나의 개시된 항체(예를 들어, scFv) 및/또는 항체(예를 들어, scFv)를 포함하는 CAR을 발현하는 변형된 세포를 제공한다. 변형된 세포는 실온 및 체온을 포함한 임의의 온도에서 저장을 위해 제형화될 수 있다. 변형된 세포는 저온저장 및 이후 해동을 위해 제형화될 수 있다. 변형된 세포는 멸균 포장으로부터 대상체에게 직접 투여를 위해 약학적으로 허용되는 담체에 제형화될 수 있다. 변형된 세포는 CAR 발현 및 세포 기능의 최소 수준을 보장하도록 세포 생존능 및/또는 CAR 발현 수준의 지시자와 약학적으로 허용되는 담체에 제형화될 수 있다. 변형된 세포는 추가 확장을 억제하고/하거나 세포 사멸을 예방하도록 하나 이상의 시약과 처방된 밀도로 약학적으로 허용되는 담체에 제형화될 수 있다.
임의의 방법은 이러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 장기, 동물 또는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 임의의 조성물 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 선택적으로 이러한 질환 또는 장애를 치료하기 위한 공동-투여 또는 병용 요법을 추가로 포함할 수 있고, 본원에 개시된 임의의 조성물 또는 약학적 조성물의 투여는 적어도 하나의 화학요법제(예를 들어, 알킬화제, 유사분열 억제형, 방사성약제)를 이전, 동시발생적으로, 및/또는 이후에, 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 대상체는 투여 후에 이식편 대 숙주(GvH) 및/또는 숙주 대 이식편(HvG)이 발생되지 않는다. 일 양태에서, 투여는 전신이다. 전신 투여는 본 명세서에 상술되고 당분야에 공지된 임의의 수단일 수 있다. 바람직하게, 전신 투여는 정맥내 주사 또는 정맥내 주입에 의한다. 일 양태에서, 투여는 국소이다. 국소 투여는 본 명세서에 상술되고 당분야에 공지된 임의의 수단일 수 있다. 바람직하게, 국소 투여는 종양내 주사 또는 주입, 척수내 주사 또는 주입, 뇌실내 주사 또는 주입, 안내 주사 또는 주입, 또는 골내 주사 또는 주입에 의한다.
일부 양태에서, 치료적 유효 용량은 단일 용량이다. 일부 양태에서, 단일 용량은 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 동시에 제조된 이들 사이의 임의의 용량수 중 하나이다. 일부 양태에서, 조성물이 자기유래 세포 또는 동종이계 세포인 경우에, 용량은 질환 또는 장애를 치료하기에 충분한 시간 동안 이식 및/또는 지속되는 세포의 충분량이다.
일례에서, 본 개시는 항체(예를 들어, scFv) 또는 항체(예를 들어, scFv)를 포함하는 CAR을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 항체 또는 CAR은 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 결합한다. 조성물이 변형된 세포 또는 세포 집단을 포함하는 양태에서, 세포 또는 세포 집단은 자기유래 또는 동종이계일 수 있다.
본 명세서에 기술된 치료 방법의 일부 양태에서, 치료는 변형되거나 종료될 수 있다. 특히, 치료에 사용되는 조성물이 유도성 프로아폽토시스 폴리펩티드를 포함하는 양태에서, 아폽토시스는 세포를 유도제와 접촉시켜서 세포에서 선택적으로 유도될 수 있다. 치료는 예를 들어, 회복 징후, 또는 질환 중증도/진행의 감소 징후, 질환 관해/중단의 징후, 및/또는 유해 사례의 발생에 대응하여 변형되거나 종료될 수 있다. 일부 양태에서, 방법은 세포 요법의 변형을 억제하도록 유도제의 억제형을 투여하여서, 세포 요법의 기능 및/또는 효능을 복원시키는 단계를 포함한다(예를 들어, 질환의 징후 또는 증상이 재출현하거나 중증도가 증가하고/하거나 유해 사례가 해결될 때).
항체/scFv 생산, 스크리닝, 및 정제
본 개시의 적어도 하나의 항체(예를 들어, 단클론성 항체, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, VHH, VH, 단쇄 가변 단편(scFv), 항원-결합 단편(Fab) 또는 Fab 단편)는 선택적으로 당분야에 널리 공지된 바와 같은 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포 또는 불멸화 세포의 클론 집단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)]을 참조한다.
scFv로부터의 아미노산은 당분야에 공지된 바와 같이, 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화성, 결합 속도, 해리 속도, 결합활성, 특이성, 반감기, 안정성, 가용성 또는 임의의 다른 적합한 특징을 감소, 증강 또는 변형시키기 위해서 변경, 부가 및/또는 결실될 수 있다.
선택적으로, scFv는 항원에 대한 고친화성 및 다른 유리한 생물학적 성질을 유지하면서 조작될 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 스캐폴드 단백질은 선택적으로 부모 및 조작된 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념적 조작 생성물의 분석 과정을 통해서 제조될 수 있다. 3차원 모델은 통상적으로 이용 가능하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3차원 입체배열 구조를 예시하고 표시하며 가능한 면역원을 측정할 수 있는 컴퓨터 프로그램(예를 들어, Xencor, Inc.(Monrovia, Calif.)의 Immunofilter 프로그램)이 이용 가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 서열의 기능화에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 항원에 결합하는 후보 scFv의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, 잔기를 선택하고 부모 및 기준 서열로부터 조합하여서 원하는 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화성을 획득한다. 상기 절차에 대안적으로, 또는 추가로, 다른 적합한 조작 방법을 사용할 수 있다.
유사한 단백질 또는 단편과의 특이적 결합을 위한 scFv의 스크리닝은 뉴클레오티드(DNA 또는 RNA 디스플레이) 또는 펩티드 디스플레이 라이브러리, 예를 들어, 시험관내 디스플레이를 사용해 편리하게 획득될 수 있다. 이러한 방법은 원하는 기능 또는 구조를 갖는 개별 구성원에 대한 펩티드의 거대 수집물의 스크리닝을 포함한다. 디스플레이된 뉴클레오티드 또는 펩티드 서열은 3 내지 5000개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 길이, 빈번하게 5-100개 아미노산 길이, 및 종종 약 8 내지 25개 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 직접 화학 합성 방법 이외에도, 몇몇 재조합 DNA 방법이 기술되었다. 한 유형은 박테리오파지 또는 세포의 표면 상에 펩티드 서열의 디스플레이를 포함한다. 각각의 박테리오파지 또는 세포는 특정 디스플레이된 펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이러한 방법은 PCT 공개 번호 WO 91/17271, WO 91/18980, WO 91/19818, 및 WO 93/08278에 기술된다.
펩티드의 라이브러리를 생성시키기 위한 다른 시스템은 시험관내 화학 합성과 재조합 방법 둘 모두의 측면을 갖는다. PCT 공개 번호 WO 92/05258, WO 92/14843, 및 WO 96/19256을 참조한다. 또한, 미국 특허 제5,658,754호; 및 제5,643,768호를 참조한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 스크리닝 키트는 Invitrogen(Carlsbad, Calif.), 및 Cambridge Antibody Technologies(Cambridgeshire, UK) 같은 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 다음 문헌들을 참조한다: Enzon에 양도된, 미국 특허 제4,704,692호, 제4,939,666호, 제4,946,778호, 제5,260,203호, 제5,455,030호, 제5,518,889호, 제5,534,621호, 제5,656,730호, 제 5,763,733호, 제5,767,260호, 제5856456호; Dyax에 양도된 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,698호, 제5,837,500호, Affymax에 양도된 제5,427,908호, 제5,580,717호; Cambridge Antibody Technologies에 양도된 제 5,885,793호; Genentech에 양도된 제5,750,373호, Xoma에 양도된, 제5,618,920호, 제5,595,898호, 제5,576,195호, 제5,698,435호, 제5,693,493호, 제5,698,417호, Colligan, 상동; Ausubel, 상동; 또는 Sambrook, 상동.
본 개시의 scFv는 광범위의 친화성(KD)으로 인간 또는 다른 포유동물 단백질에 결합할 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 개시의 적어도 하나의 scFv는 선택적으로, 당업자가 실시하는 바와 같은, 표면 플라스몬 공명 또는 Kinexa 방법으로 결정하여, 높은 친화성, 예를 들어, 약 10-7 M 이하의 KD, 예컨대 제한 없이, 0.1-9.9(또는 이들 중 임의의 범위 또는 값) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 또는 이들 중 임의의 범위 또는 값으로 표적 단백질에 결합할 수 있다.
항원에 대한 scFv의 친화성 또는 결합활성은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정할 수 있다(예를 들어, 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 본 명세서에 기술된 방법 참조). 특정 scFv-항원 상호작용의 측정된 친화성은 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정하면 다양할 수 있다. 따라서, 친화성 및 다른 항원-결합 매개변수(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정은 바람직하게 단백질 스캐폴드 및 항원의 표준화 용액, 및 표준화 완충제, 예컨대 본 명세서에 기술된 완충제에 의해 이루어진다.
경쟁적 어세이는 어떠한 단백질, 항체, 및 다른 길항제가 본 개시의 scFv와 표적 단백질과의 결합에 대해 경쟁하고/하거나 에피토프 영역을 공유하는지를 결정하기 위해 본 개시의 scFv로 수행할 수 있다. 당업자에게 쉽게 공지된 바와 같이 이들 어세이는 단백질 상의 제한된 수의 결합 부위에 대한 길항제 또는 리간드 간 경쟁을 평가한다. 단백질 및/또는 항체는 경쟁 전 또는 후에 고정화 또는 불용화되고 표적 단백질에 결합된 샘플은 예를 들어, 디캔팅(단백질/항체가 사전-불용성화된 경우) 또는 원심분리(단백질/항체가 경쟁적 반응 후 침전된 경우)에 의해 비결합된 샘플로부터 분리된다. 또한, 경쟁적 결합은 기능이 표적 단백질에 대한 scFv의 결합 또는 결합 결여에 의해 변경되는지 여부, 예를 들어 scFv 분자가 예를 들어, 표지의 효소적 활성을 억제 또는 강화시키는지 여부에 의해 결정될 수 있다. ELISA 및 다른 기능성 어세이는 또한 당분야에 널리 공지된 바와 같이 사용될 수 있다.
핵산 분자
scFv를 코딩하는 본 개시의 핵산 분자는 RNA의 형태, 예컨대 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태, 또는 제한 없이, 클로닝 또는 합성적으로 생성, 또는 이의 임의의 조합으로 수득된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함한, DNA의 형태일 수 있다. DNA는 삼중-가닥, 이중 가닥 또는 단일 가닥, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 하나의 가닥의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 공지된 코딩 가닥일 수 있거나, 안티-센스 가닥으로도 지칭되는 비-코딩 가닥일 수 있다.
본 개시의 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 제한 없이, 적어도 하나의 scFv의 적어도 하나의 특정한 부분을 포함하여, 선택적으로 하나 이상의 인트론을 갖는, 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산 분자; 표적 단백질에 결합하는 단백질 스캐폴드 또는 루프 영역에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상기 기술된 것들과 실질적으로 상이하지만, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 여전히 본 명세서에 기술되고/되거나 당분야에 공지된 단백질 스캐폴드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전자 코드는 당분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 본 개시의 특이적 scFv 단편을 코딩하는 이러한 축퇴성 핵산 변이체를 생성하는 것은 당업자에게 통상적인 것이다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., 상동]을 참조하고, 이러한 핵산 변이체는 본 개시에 포함된다.
본 명세서에 표시된 바와 같이, scFv를 코딩하는 핵산을 포함하는 본 개시의 핵산 분자는 제한 없이, 그 자체로, scFv의 아미노산 서열을 코딩하는 것들; 전체 단백질 스캐폴드 또는 이의 일부의 코딩 서열; scFv, 단편 또는 부분의 코딩 서열을 비롯하여, 추가 서열, 예컨대 제한 없이, 비-코딩 5' 및 3 서열, 예컨대 전사에서 역할을 하는 전사되는, 비-번역 서열을 포함한, 추가의 비-코딩 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 리보솜 결합 및 mRNA의 안정성)를 포함한, mRNA 프로세싱과 함께, 상기 언급된 추가 코딩 서열, 예컨대 적어도 하나의 인트론이 있거나 없는, 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열; 추가 기능성을 제공하는 것과 같은, 추가 아미노산을 코딩하는 추가 코딩 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 단백질 스캐폴드를 코딩하는 서열은 마커 서열, 예컨대 단백질 스캐폴드 단편 또는 부분을 포함하는 융합된 단백질 스캐폴드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 코딩하는 서열에 융합될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드
본 개시는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 대한 선택적 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 단리, 검출, 및/또는 정량하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 기탁된 라이브러리 중 부분 또는 전장 클론을 확인, 단리, 또는 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단리된 게놈 또는 cDNA 서열일 수 있거나, 아니면 인간 또는 포유동물 핵산 라이브러리로부터의 cDNA에 상보성일 수 있다.
바람직하게, cDNA 라이브러리는 적어도 80% 전장 서열, 바람직하게, 적어도 85% 또는 90% 전장 서열, 및 보다 바람직하게, 적어도 95% 전장 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 희귀 서열의 표시를 증가시키도록 정규화될 수 있다. 저 또는 중간 엄격도 혼성화 조건은 전형적으로, 제한 없이, 상보성 서열에 대해 감소된 서열 동일성을 갖는 서열이 적용될 수 있다. 중간 및 고 엄격도 조건은 선택적으로 더 큰 동일성의 서열에 적용될 수 있다. 저 엄격도 조건은 약 70% 서열 동일성을 갖는 서열의 선택적 혼성화를 허용하고 오솔로그 또는 파라로그 서열을 확인하는 데 적용될 수 있다.
선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질 스캐폴드의 적어도 일부분을 코딩할 것이다. 폴리뉴클레오티드는 본 개시의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 선택적 혼성화를 위해 적용될 수 있는 핵산 서열을 포괄한다. 예를 들어, 각각 전체가 본원에 참조로 포함는 문헌[Ausubel, 상동]; 문헌[Colligan, 상동]을 참조한다.
핵산의 작제
본 개시의 단리된 핵산은 당분야에 널리 공지된 바와 같이, (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 및/또는 (d) 이의 조합을 사용하여 제조될 수 있다.
핵산은 본 개시의 폴리뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드 서열을 편리하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함한 다중-클로닝 부위는 폴리뉴클레오티드의 단리를 보조하도록 핵산에 삽입될 수 있다. 또한, 번역가능한 서열이 본 개시의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리를 보조하도록 삽입될 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 개시의 단백질을 정제하기 위한 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 배제한, 본 개시의 핵산은 선택적으로 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터, 또는 링커이다.
추가 서열은 클로닝 및/또는 발현에서 이들 기능을 최적화시키거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 보조하거나, 세포로 폴리뉴클레오티드의 도입을 개선시키기 위해 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 첨가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터, 및 링커의 사용은 당분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel, 상동; 또는 Sambrook, 상동] 참조).
핵산의 작제를 위한 재조합 방법
본 개시의 단리된 핵산 조성물, 예컨대 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 이의 임의의 조합은 당업자에게 공지된 임의의 수의 클로닝 방법론을 사용하여 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 양태에서, 엄격 조건 하에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리 내 원하는 서열을 확인하는 데 사용된다. RNA의 단리, 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 작제는 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel, 상동; 또는 Sambrook, 상동] 참조).
핵산 스크리닝 및 단리 방법
cDNA 또는 게놈 라이브러리는 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 서열을 기반으로 하는 프로브를 사용해 스크리닝할 수 있다. 프로브는 동일하거나 상이한 유기체에서 상동성 유전자를 단리하기 위해서 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화시키는 데 사용될 수 있다. 당업자는 혼성화의 다양한 정도의 엄격도를 어세이에 적용할 수 있고, 혼성화 또는 세척 매질이 엄격할 수 있음을 이해할 것이다. 혼성화 조건이 보다 엄격해짐에 따라, 듀플렉스 형성이 일어나기 위해 표적과 프로브 간에 더 큰 정도의 상보성이 존재해야 한다. 엄격도의 정도는 온도, 이온 강도, pH 및 부분 변성 용매, 예컨대 포름아미드의 존재 중 하나 이상에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 엄격도는 예를 들어, 0% 내지 50% 범위 내로 포름아미드의 농도의 조작을 통해서, 반응물 용액의 극성을 변화시켜서 편리하게 가변화된다. 검출가능한 결합에 필요한 상동성 정도(서열 동일성)는 혼성화 매질 및/또는 세척 매질의 엄격도에 따라서 가변적일 것이다. 상동성 정도는 최적으로 100%, 또는 70-100%, 또는 이 안의 임의의 범위 또는 값일 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머 내 소수 서열 변이가 혼성화 및/또는 세척 매질의 엄격도를 감소시켜서 보완될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고 본 명세서에 제시된 교시 및 지침을 기반으로, 과도한 실험 없이 본 개시에 따라서 사용할 수 있다.
DNA 또는 RNA 증폭의 공지된 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 관련 증폭 공정(예를 들어, Mullis 등의 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호; Tabor 등의 제4,795,699호 및 제 4,921,794호; Innis의 제5,142,033호; Wilson 등의 제5,122,464호; Innis의 제5,091,310호; Gyllensten 등의 제5,066,584호; Gelfand 등의 제4,889,818호; Silver 등의 제4,994,370호; Biswas 등의 제4,766,067호; Ringold 등의 제4,656,134호 참조) 및 이중 가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 표적 서열에 대한 안티-센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증폭(Malek 등의 미국 특허 제5,130,238호, 상표명 NASBA)을 포함하지만, 이로 제한되지 않고, 참조 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다(예를 들어, 문헌[Ausubel, 상동; 또는 Sambrook, 상동] 참조).
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술은 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 서열 및 관련 유전자를 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접적으로 증폭하는 데 사용될 수 있다. PCR 및 다른 시험관내 증폭 방법은 또한 예를 들어, 발현시키려는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하거나, 샘플 중 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용하도록 핵산을 제조하거나, 핵산 서열분석, 또는 다른 목적에 유용할 수 있다. 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자를 지시하기에 충분한 기술의 예는 다음 문헌들에서 확인할 수 있다: Berger, 상동, Sambrook, 상동, 및 Ausubel, 상동, 뿐만 아니라 Mullis, et al., 미국 특허 제4,683,202호 (1987); 및 Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990). 게놈 PCR 증폭을 위한 상업적으로 입수 가능한 키트는 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Advantage-GC 게놈 PCR 키트(Clontech)를 참조한다. 추가로, 예를 들어, T4 유전자 32 단백질(Boehringer Mannheim)은 긴 PCR 산물의 수율을 개선시키는 데 사용될 수 있다.
핵산 작제를 위한 합성 방법
본 개시의 단리된 핵산은 또한 공지된 방법을 통해서 직접 화학 합성으로 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., 상동] 참조). 화학 합성은 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하여서, 상동성 서열과 혼성화에 의해, 또는 주형으로서 단일 가닥을 사용한 DNA 중합효소에 의한 중합반응을 통해서, 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학 합성이 약 100개 이상의 염기 서열에 제한되지만, 더 긴 서열이 더 짧은 서열의 결찰에 의해 수득될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
재조합 발현 카세트
본 개시는 본 개시의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 추가로 제공한다. 본 개시의 핵산 서열, 예를 들어, 본 개시의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열은 적어도 하나의 바람직한 숙주 세포에 도입시킬 수 있는 재조합 발현 카세트를 작제하는 데 사용될 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도하는 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 지정하게 되는 전사 개시 조절 서열에 작동적으로 연결된 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 이종성과 비-이종성(즉, 내생성) 둘 모두의 프로모터는 본 개시의 핵산의 발현을 지시하는 데 적용될 수 있다.
일부 양태에서, 프로모터, 인핸서, 또는 다른 구성요소로서 제공되는 단리된 핵산은 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해서 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 비-이종성 형태의 적절한 위치(상류, 하류, 또는 인트론 내)에 도입될 수 있다. 예를 들어, 내생성 프로모터는 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해서 생체내 또는 시험관내에서 변경될 수 있다.
발현 벡터 및 숙주 세포
본 개시는 또한 본 개시의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 당분야에 널리 공지된 바와 같은, 재조합 기술에 의한 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 제조에 관한 것이다. 예를 들어, 각각 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Sambrook, et al., 상동; Ausubel, et al., 상동]을 참조한다.
폴리뉴클레오티드는 선택적으로 숙주에서 증식을 위한 선별 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예컨대 인산칼슘 침전물에, 또는 하전된 지질과 복합체로 도입된다. 벡터가 바이러스이면, 적절한 포장 세포주를 사용해 시험관내에서 포장될 수 있고 그 다음에 숙주 세포에 형질도입될 수 있다.
DNA 삽입부는 적절한 프로모터에 작동적으로 연결되어야 한다. 발현 작제물은 전사 개시, 종결을 위한 부위, 및 전사된 영역 내에, 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 함유할 것이다. 작제물에 의해 발현되는 성숙한 전사물의 코딩 부분은 바람직하게 시작부에 번역 개시 및 번역하려는 mRNA의 말단에 적절하게 위치된 종결 코돈(예를 들어, UAA, UGA 또는 UAG)을 포함하게 되고, UAA 및 UAG가 포유동물 또는 진핵생물 세포 발현에 바람직하다.
발현 벡터는 바람직하게 그러나, 선택적으로 적어도 하나의 선별 마커를 포함하게 된다. 이러한 마커는 예를 들어, 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 푸로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), DHFR(디하이드로폴레이트 리덕타제를 코딩하고 메토트렉세이트에 대한 내성 부여), 마이코페놀산, 또는 글루타민 신써타제(GS, 미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 제5,827,739호), 블라스티시딘(bsd 유전자), 진핵생물 세포 배양을 위한 내성 유전자를 비롯하여, 이. 콜라이 및 다른 박테리아 또는 원핵 생물의 배양을 위한 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 푸로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 카나마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 카르베니실린, 블레오마이신, 에리쓰로마이신, 폴리믹신 B, 또는 테트라사이클린 내성 유전자(상기 특허는 전체가 본원에 참조로 포함됨)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 상기 기술된 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당분야에 공지되어 있다. 적합한 벡터는 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. 숙주 세포로 벡터 작제물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 공지된 방법으로 실시될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Sambrook, 상동, 챕터 1-4 및 16-18; Ausubel, 상동, 챕터 1, 9, 13, 15, 16]과 같이 당분야에서 설명된다.
발현 벡터는 바람직하게 그러나 선택적으로 본 개시의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포의 단리를 위한 적어도 하나의 선별 세포 표면 마커를 포함할 것이다. 본 개시의 선별 세포 표면 마커는 세포 또는 세포의 서브세트를 다른 한정된 세포의 서브세트와 구별하는 표면 단백질, 당단백질, 또는 단백질의 그룹을 포함한다. 바람직하게 선별 세포 표면 마커는 본 개시의 조성물 또는 방법에 의해 변형된 세포를 본 개시의 조성물 또는 방법으로 변형되지 않은 세포와 구별한다. 이러한 세포 표면 마커는 예를 들어, 제한 없이, "지정 클러스터" 또는 "분류 결정" 단백질(흔히 "CD"로서 축약) 예컨대 절두형 또는 전장 형태의 CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 세포 표면 마커는 자살 유전자 마커 RQR8을 추가로 포함한다(Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87).
발현 벡터는 바람직하게 그러나 선택적으로 본 개시의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포의 단리를 위한 적어도 하나의 선별 약물 내성 마커를 포함하게 된다. 본 개시의 선별 약물 내성 마커는 야생형 또는 돌연변이체 Neo, DHFR, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드는 변형된 형태, 예컨대 융합 단백질로 발현될 수 있고, 분비 신호를 비롯하여, 추가 이종성 기능 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역은 정제 동안, 또는 후속 취급 및 저장 동안, 숙주 세포에서 안정성 및 지속성을 개선시키도록 단백질 스캐폴드의 N-말단에 첨가될 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티는 정제를 용이하게 하기 위해서 본 개시의 단백질 스캐폴드에 첨가될 수 있다. 이러한 영역은 단백질 스캐폴드 또는 이의 적어도 하나의 단편의 최종 제조 이전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Sambrook, 상동, 챕터 17.29-17.42 및 18.1-18.74; Ausubel, 상동, 챕터 16, 17 및 18]에서와 같이 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어 있다.
당업자는 본 개시의 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 이용 가능한 수많은 발현 시스템에 정통하다. 대안적으로, 본 개시의 핵산은 본 개시의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 내생성 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 켜져서(조작에 의함) 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제 5,733,746호, 및 제5,733,761호에 기술된 바와 같이, 당분야에 널리 공지되어 있다.
단백질 스캐폴드, 이의 명시된 부분 또는 변이체의 제조에 유용한 세포 배양의 예시는 당분야에 공지된 바와 같은 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포이다. 포유동물 세포 시스템은 종종 세포의 단층의 형태일 수 있지만 포유동물 세포 현탁액 또는 생물반응기가 사용될 수도 있다. 온전한 글리코실화 단백질을 발현할 수 있는 많은 적합한 숙주 세포주가 당분야에서 개발되었고, COS-1(예를 들어, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들어, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들어, ATCC CRL-10), CHO(예를 들어, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들어, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하고, 이들은, 예를 들어, 미국 생물 자원 센터(American Type Culture Collection, Manassas, Va.)(www.atcc.org)에서 쉽게 입수 가능하다. 바람직한 숙주 세포는 림프구 기원 세포, 예컨대 골수종 및 림프종 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1851)이다. 바람직한 양태에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Ag14 세포이다.
이들 세포에 대한 발현 벡터는 다음 발현 제어 서열 중 하나 이상, 예컨대, 제한 없이, 복제 기점; 프로모터(예를 들어, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터(미국 특허 제5,168,062호; 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgK(포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(미국 특허 제5,266,491호), 적어도 하나의 인간 프로모터; 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40 거대 T Ag 폴리 A 부가 부위), 및 전사 종결부 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., 상동; Sambrook, et al., 상동]을 참조한다. 본 개시의 핵산 또는 단백질의 제조에 유용한 다른 세포는 공지되어 있고/있거나, 예를 들어 미국 생물 자원 센터(American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas)(www.atcc.org) 또는 다른 공지된 또는 상업적 출처에서 입수 가능하다.
진핵생물 숙주 세포를 적용하는 경우에, 폴리아데닐화 또는 전사 종결부 서열은 전형적으로 벡터에 도입된다. 종결부 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다. 전사물의 정확한 스플라이싱을 위한 서열이 또한 포함될 수 있다. 스프라이싱 서열의 예는 SV40 유래의 VP1 인트론이다(Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). 추가로, 숙주 세포에서 복제를 제어하기 위한 유전자 서열이 당분야에 공지된 바와 같이, 벡터에 도입될 수 있다.
scFv 정제
scFv는 제한 없이, 단백질 A 정제, 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하여 널리 공지된 방법을 통해서 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액상 크로마토그래피("HPLC")가 또한 정제에 적용될 수 있다. 예를 들어, 각각 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 예를 들어, 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조한다.
본 개시의 scFv는 정제된 생성물, 화학 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어, 이. 콜라이, 효모, 고등 식물, 곤충, 및 포유동물 세포를 포함한, 원핵생물 또는 진핵생물 숙주로부터의 재조합 기술에 의해 생성된 생성물을 포함한다. 재조합 생성 절차에 적용된 숙주에 따라서, 본 개시의 단백질 스캐폴드는 글리코실화될 수 있거나 비-글리코실화될 수 있다. 이러한 방법은 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Sambrook, 상동, 섹션 17.37-17.42; Ausubel, 상동, 챕터 10, 12, 13, 16, 18 및 20, Colligan, Protein Science, 상동, 챕터 12-14]와 같이 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어 있다.
아미노산 코드
본 개시의 단백질 스캐폴드를 구성하는 아미노산은 종종 축약된다. 아미노산 명칭은 당분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 아미노산을 이의 단일 글자 코드, 이의 3글자 코드, 명칭, 또는 3개 뉴클레오티드 코드(들)로 지정하여 표시될 수 있다(문헌[Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994] 참조). 본 개시의 단백질 스캐폴드는 본 명세서에 명시된 바와 같이, 자발적으로 또는 돌연변이 및/또는 인간 조작으로부터, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 기능에 필수적인 본 개시의 단백질 스캐폴드의 아미노산은 당분야에 공지된 방법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발법 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발법으로 확인할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel, 상동, 챕터 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]). 후자의 절차는 분자의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입시킨다. 생성된 돌연변이체 분자는 이후 생물학적 활성, 예컨대 제한 없이, 적어도 하나의 중화 활성에 대해 시험된다. 단백질 스캐폴드 결합에 핵심적인 부위가 또한 구조 분석, 예컨대 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화성 표지화에 의해 확인될 수 있다(문헌[Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)] 및 문헌[de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)]).
당업자에게 이해될 바와 같이, 본 개시는 본 개시의 적어도 하나의 생물학적 활성 단백질 스캐폴드를 포함한다. 생물학적 활성 단백질 스캐폴드는 천연(비-합성), 내생성 또는 관련 및 공지된 단백질 스캐폴드의 비활성의 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 및, 바람직하게, 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 및 가장 바람직하게, 적어도 80%, 90%, 또는 95%-99% 이상의 비활성을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성의 측정을 어세이하고 정량하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
다른 양태에서, 본 개시는 유기 모이어티의 공유 부착에 의해 변형된, 본 명세서에 기술된 바와 같은 단백질 스캐폴드 및 단편에 관한 것이다. 이러한 변형은 약동학적 성질이 개선된(예를 들어, 생체내 혈청 반감기가 증가된) 단백질 스캐폴드 단편을 생성할 수 있다. 유기 모이어티는 선형 또는 분지형 친수성 중합체 기, 지방산 기, 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 특정 양태에서, 친수성 중합체 기는 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고 폴리알칸 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 기는 약 8개 내지 약 40개 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 개시의 변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 항체에, 간접적으로 또는 직접적으로, 공유 결합된 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 개시의 단백질 스캐폴드 또는 단편에 결합된 각각의 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 중합체 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "지방산"는 모노-카르복실산 및 디-카르복실산을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "친수성 중합체 기"는 옥탄에 비해서 물에 더 가용성인 유기 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 폴리리신은 옥탄에 비해서 물에 더 가용성이다. 따라서, 폴리리신의 공유 부착에 의해 변형된 단백질 스캐폴드는 본 개시에 포괄된다. 본 개시의 단백질 스캐폴드를 변형시키기에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들어 폴리알칸 글리콜(예를 들어, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PPG 등), 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고당류, 다당류 등), 친수성 아미노산의 중합체(예를 들어, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트 등), 폴리알칸 옥시드(예를 들어, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게, 본 개시의 단백질 스캐폴드를 변형시키는 친수성 중합체는 별도 분자 독립체로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG5000 및 PEG20,000이 사용될 수 있고, 옆의 숫자는 달톤으로서 중합체의 평균 분자량이다. 친수성 중합체 기는 1개 내지 약 6개 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 기로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 기로 치환된 친수성 중합체는 적합한 방법을 적용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 아민 기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화 카르복실레이트(예를 들어, N,N-카르보닐 디이미다졸로 활성화)는 중합체 상의 하이드록실 기에 커플링될 수 있다.
본 개시의 단백질 스캐폴드를 변형시키기에 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 개시의 단백질 스캐폴드를 변형시키기에 적합한 지방산은 예를 들어 n-도데카노에이트(C12, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C14, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C18, 스테아레이트), n-아이코사노에이트(C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C22, 베헤네이트), n-트리아콘타노에이트(C30), n-테트라콘타노에이트(C40), 시스-Δ9-옥타데카노에이트(C18, 올레에이트), 모든 시스-Δ5,8,11,14-아이코사테트라에노에이트(C20, 아라키도네이트), 옥탄디오산, 테트라데칸디오산, 옥타데칸디오산, 도코산디오산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는 선형 또는 분지형 저급 알킬 기를 포함하는 디카르복실산의 모노-에스테르를 포함한다. 저급 알킬 기는 1개 내지 약 12개, 바람직하게, 1개 내지 약 6개 탄소 원자를 포함할 수 있다.
변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 적합한 방법을 사용하여, 예컨대 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "변형제"는 활성화 기를 포함한 적합한 유기 기(예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 지칭한다. "활성화 기"는 적절한 조건 하에서, 제2 화학 기와 반응하여, 변형제와 제2 화학기 간에 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 모이어티 또는 작용기이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화 기는 친전자성 기, 예컨대 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(NHS) 등을 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 기는 예를 들어 말레이미드, 아이오도아세틸, 아크릴롤릴, 피리딜 디술피드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등을 포함한다. 알데히드 작용기는 아민- 또는 히드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있고, 아지드 기는 3가 인산 기와 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 연결을 형성할 수 있다. 분자에 활성화 기를 도입하는 적합한 방법은 당분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)] 참조). 활성화 기는 직접적으로 유기 기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)에 결합될 수 있거나, 링커 모이어티, 예를 들어, 2가 C1-C12 기를 통해서 결합될 수 있고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 이종원자, 예컨대 산소, 질소, 또는 황으로 치환될 수 있다. 적합한 링커 모이어티는, 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- 및 -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-를 포함한다. 링커 모이어티를 포함하는 변형기는 예를 들어 모노-Boc-알킬디아민(예를 들어, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 지방산과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)의 존재 하에서 반응시켜서, 유리 아민과 지방산 카르복실레이트 간에 아미드 결합을 형성시킴으로써 생성될 수 있다. Boc 보호 기는 기술된 바와 같이, 다른 카르복실레이트에 커플링될 수 있는 1차 아민에 노출시키도록 트리플루오로아세트산(TFA)으로 처리하여 생성물로부터 제거될 수 있거나, 말레산 무수물과 반응시킬 수 있고 최종 생성물은 고리화되어 지방산의 활성화 말레이미도 유도체를 생성한다(예를 들어, 전체 교시가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Thompson, et al., WO 92/16221] 참조).
본 개시의 변형된 단백질 스캐폴드는 단백질 스캐폴드 또는 단편을 변형제와 반응시켜 생성될 수 있다. 예를 들어, 유기 모이어티는 아민-반응성 변형제, 예를 들어, PEG의 NHS 에스테르를 적용하여 비-부위 특이적 방식으로 단백질 스캐폴드에 결합될 수 있다. 본 개시의 단백질 스캐폴드의 특이적 부위에 결합된 유기 모이어티를 포함하는 변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 적합한 방법, 예컨대 역 단백질가수분해(문헌[Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)]) 및 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)]에 기술된 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다.
정의
본 개시 전반에서 사용되는 단수형 "한", "하나" 및 "그"는 문맥이 명확하게 달리 명시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 방법"에 대한 언급은 복수의 이러한 방법을 포함하고 "한 용량"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 용량 및 이의 동등물에 대한 언급 등을 포함한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 부분적으로 값이 측정 또는 결정되는 방법, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 의존하여, 당업자가 결정되는 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 내를 의미한다. 예를 들어, "약"은 1 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 소정 값의 최대 20%, 또는 최대 10%, 또는 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정에 대해서, 용어는 값의 1자릿수 이내, 바람직하게 5배 이내, 보다 바람직하게 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구항에 기술된 경우에, 달리 명시하지 않으면 용어 "약"은 특정 값이 가정되는 허용되는 오차 범위 이내를 의미한다.
본 개시는 단리되거나 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 조성물을 제공한다. "단리된" 또는 "정제된" 폴리뉴클레오티드 또는 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 부분은 이의 자연 발생 환경에서 발견되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 정상적으로 수반되거나 상호작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없다. 따라서, 단리되거나 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질은 재조합 기술에 의해 제조될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물이 실질적으로 없다. 선택적으로서, "단리된" 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 유래된 유기체의 게놈 DNA 내 폴리뉴클레오티드(즉, 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)가 천연적으로 측접하는 서열(선택적으로 단백질 코딩 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 유래된 세포의 게놈 DNA 내 폴리뉴클레오티드가 천연적으로 측접하는 뉴클레오티드 서열의 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만을 함유할 수 있다. 세포 물질이 실질적으로 없는 단백질은 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1%(건조 중량) 미만의 오염 단백질을 갖는 단백질의 조제물을 포함한다. 본 개시의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 생성될 때, 최적 배양 배지는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1%(건조 중량) 미만의 화학 전구체 또는 비-관심 단백질 화학물을 나타낸다.
본 개시는 이들 DNA 서열에 의해 코딩되는 개시된 DNA 서열 및 단백질의 단편 및 변이체를 제공한다. 본 개시 전반에서 사용되는, 용어 "단편"은 DNA 서열의 일부분 또는 아미노산 서열의 일부분 및 따라서 그에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열의 단편은 천연 단백질의 생물학적 활성, 및 그리하여 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적 DNA 서열에 대한 DNA 인식 또는 결합 활성을 보유하는 단백질 단편을 코딩할 수 있다. 대안적으로, 일반적으로 혼성화 프로브로서 유용한 DNA 서열의 단편은 생물학적 활성을 보유하거나 프로모터 활성을 보유하지 않는 단백질을 코딩하지 않는다. 따라서, DNA 서열의 단편은 적어도 약 20개 뉴클레오 티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 및 최대 본 개시의 전장 폴리뉴클레오티드 범위일 수 있다.
본 개시의 핵산 또는 단백질은 이후에 최종 목적 벡터로 조립될 수 있는 표적 벡터 내 단량체 단위 및/또는 반복 단위의 사전조립을 포함하는 모듈식 접근법으로 작제될 수 있다. 본 개시의 폴리펩티드는 본 개시의 반복 단량체를 포함할 수 있고 이후에 최종 목적 벡터로 조립될 수 있는 표적 벡터 내 반복 단위의 사전조립에 의한 조립식 접근법으로 작제될 수 있다. 본 개시는 이 방법으로 생성되는 폴리펩티드를 비롯하여 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 개시는 이러한 모듈식 접근법으로 생성되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 유기체 및 세포를 제공한다.
용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되고 특히 단일의 단클론성 항체(작용제 및 길항제 항체 포함) 및 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물을 포괄한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 이의 항체의 천연 또는 합성 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자, 상동체 및 오솔로그(이하 총괄하여 "유사체"라고 함)는 이의 범주 내에 속한다. 따라서, 이의 양태에 따라서, 이의 광역 의미에서 용어 "이의 항체"는 이러한 유사체를 또한 포괄한다. 일반적으로, 이러한 유사체에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 본 명세서에 정의된 바와 같은 이의 항체와 비교하여, 치환, 결실 및/또는 부가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "항체 단편", 및 이의 모든 문법적 변이체는 항원 결합 부위를 포함하는 온전한 항체의 일부 또는 온전한 항체의 가변 영역으로서 정의되고, 부분은 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, 항체 이소타입에 따라서, CH2, CH3, 및 CH4)이 없다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'- SH, F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 및 제한 없이 (l) 단쇄 Fv (scFv) 분자 (2) 오직 하나의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 단쇄 폴리펩티드, 또는 회합된 중쇄 모이어티 없이, 경쇄 가변 도메인의 3개 CDR을 함유하는 이의 단편, 및 (3) 오직 하나의 중쇄 가변 영역을 함유하는 단일 사슬 폴리펩티드, 또는 회합된 경쇄 모이어티 없이 중쇄 가변 영역의 3개 CDR을 함유하는 이의 단편을 포함한, 연속 아미노산 잔기의 하나의 비개재 서열로 이루어진 1차 구조를 갖는 폴리펩티드인 항체 단편(본 명세서에서 "단쇄 항체 단편" 또는 "단쇄 폴리펩티드"로 지칭됨); 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 또는 다가 구조를 포함한다. 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체 단편에서, 중쇄(들)는 온전한 항체의 비-Fc 영역에서 발견되는 임의의 불변 도메인 서열(예를 들어, IgG 이소타입 내 CHI)을 함유할 수 있고/있거나, 온전한 항체에서 발견되는 임의의 힌지 영역 서열을 함유할 수 있고/있거나, 중쇄(들)의 불변 도메인 서열 또는 힌지 영역 서열에 위치되거나 융합되는 류신 지퍼 서열을 함유할 수 있다. 용어는 일반적으로 단일 단량체 가변 항체 도메인을 갖는 항체 단편을 지칭하는 단일 도메인 항체("sdAB")(예를 들어, 낙타 유래)를 추가로 포함한다. 이러한 항체 단편 유형은 당업자가 쉽게 이해하게 될 것이다.
"결합"은 거대분자 간(예를 들어, 단백질과 핵산 간) 서열-특이적, 비공유 상호작용을 지칭한다. 전체로서 상호작용이 서열-특이적이면, 결합 상호작용의 모든 성분이 서열-특이적일 필요는 없다(예를 들어, DNA 골격 내 포스페이트 잔기와 접촉).
용어 "포함하다"는 조성물 및 방법이 열거된 구성요소를 포함하지만, 다른 것들을 배제하지는 않는다는 것을 의미하고자 한다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때 "필수적으로 이루어지다"는 의도하는 목적을 위해 사용될 때 조합에 임의의 필수 유의성의 다른 구성요소를 배제한다는 의미이다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 구성요소로 필수적으로 이루어진 조성물은 불활성 담체 또는 미량 오염물을 배제하지 않는다. "이루어지다"는 다른 성분의 미량 초과 구성요소 및 실질적 방법 단계를 배제한다는 의미이다. 각각의 이들 전환 용어에 의해 정의되는 양태는 본 개시의 범주 내에 있다.
용어 "에피토프"는 폴리펩티드의 항원성 결정부를 지칭한다. 에피토프는 에피토프에 고유한 공간적 입체배열 중 3개 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 4, 5, 6, 또는 7개의 이러한 아미노산으로 이루어지고, 보다 일반적으로, 적어도 8, 9, 또는 10개의 이러한 아미노산으로 이루어진다. 아미노산의 공간적 입체배열을 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되면, 발현은 진핵생물 세포 내 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"유전자 발현"은 유전자에 함유된 정보의 유전자 생성물로의 전환을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, shRNA, 마이크로 RNA, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA)의 직접 전사 생성물 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한 과정 예컨대 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조절" 또는 "조정"은 유전자의 활성의 변화를 지칭한다. 발현의 조정은 제한 없이, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된" 또는 이의 동등물(예를 들어, "작동적 연결")은 둘 이상의 분자가 서로에 대해 위치되어서 이의 하나 또는 둘 모두의 분자 또는 이의 조합에 의한 기능에 영향을 미치도록 상호작용할 수 있다는 것을 의미한다.
비공유적으로 연결된 성분 및 비공유적으로 연결된 성분을 제조하는 방법 및 사용하는 방법이 개시된다. 다양한 성분은 본 명세서에 기술된 바와 같은 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 비공유적으로 연결(즉, 작동적으로 연결)된 단백질은 당분야에서 하나 이상의 문제를 피하는 일시적 상호작용을 허용하도록 사용될 수 있다. 회합되고 해리되는 비공유적으로 연결된 성분, 예컨대 단백질의 능력은 이러한 회합이 바람직한 활성에 필요한 상황 하에서만 또는 그 상황에서 주로 기능적 회합될 수 있다. 연결은 원하는 효과를 허용하기에 충분한 지속기간일 수 있다.
유기체의 게놈 내 특이적 유전자좌로 단백질을 유도하기 위한 방법이 개시된다. 방법은 DNA 국재화 성분을 제공하는 단계 및 이펙터 분자를 제공하는 단계를 포함할 수 있고, DNA 국재화 성분 및 이펙터 분자는 비공유 연결을 통해서 작동적으로 연결될 수 있다.
용어 "scFv"는 단쇄 가변 단편을 지칭한다. scFv는 링커 펩티드와 연결된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커 펩티드는 약 5 내지 40개 아미노산 또는 약 10 내지 30개 아미노산 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개 아미노산 길이일 수 있다. 단쇄 가변 단편은 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역, 및 따라서, 항체를 정제하는 데 사용되는 공통 결합 부위(예를 들어, 단백질 G)가 결여된다. 용어는 인트라바디로서, 세포의 세포질 내에서 안정하고, 세포내 단백질에 결합할 수 있는 항체인 scFv를 추가로 포함한다.
용어 "단일 도메인 항체"는 특이적 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 단일 단량체 가변 항체 도메인을 갖는 항체 단편을 의미한다. 단일-도메인 항체는 일반적으로 전체 항체로서 항원에 대해 유사한 친화성을 갖지만, 내열성이 더 높고, 세제 및 고농도 우레아에 대해 안정한, 공통 IgG, 또는 중쇄 항체의 하나의 가변 도메인(VH)을 포함하는, 약 110개 아미노산 길이의 펩티드 사슬이다. 예에는 낙타 또는 조류 항체로부터 유래된 것들이 있다. 대안적으로, 단일-도메인 항체는 4개 사슬을 갖는 공통 뮤린 또는 인간 IgG로부터 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하다" 및 "특이적으로 결합하는"은 상이한 항원의 균질한 혼합물에 존재하는 특정 항원에 우선적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 또는 나노바디의 능력을 지칭한다. 일부 양태에서, 특이적 결합 상호작용은 샘플 중 원하는 항원 및 원하지 않는 항원을 구별할 것이다. 일부 양태에서, 약 10배 내지 100배 이상(예를 들어, 약 1000배 또는 10,000배 초과). "특이성"은 상이한 항원 표적에 비해서 하나의 항원성 표적에 우선적으로 결합하는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편, 예컨대 나노바디의 능력을 지칭하고, 반드시 고친화성을 의미하지 않는다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합에 충분한 조건이 존재하면, 결합 분자가 결합하게 되는 핵산의 부분을 한정하는 핵산 서열이다.
용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 함께 공유적으로 연결된 적어도 2개 뉴클레오티드를 지칭한다. 단일 가닥의 기술은 또한 상보성 가닥의 서열을 한정한다. 따라서, 핵산은 또한 기술된 단일 가닥의 상보성 가닥을 포괄할 수 있다. 본 개시의 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 동일 단백질을 코딩하거나 동일 구조를 보유한 이의 상보체를 포괄한다.
본 개시의 프로브는 엄격 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 단일 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시의 핵산은 엄격 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 프로브를 지칭할 수 있다.
본 개시의 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 개시의 핵산은 분자의 대부분이 단일 가닥일 때도 이중 가닥 서열을 함유할 수 있다. 본 개시의 핵산은 분자의 대부분이 이중 가닥일 때도 단일 가닥 서열을 함유할 수 있다. 본 개시의 핵산은 게놈 DNA, cDNA, RNA, 또는 이의 하이브리드를 포함할 수 있다. 본 개시의 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합을 함유할 수 있다. 본 개시의 핵산은 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신, 및 이소구아닌을 포함한 염기의 조합을 함유할 수 있다. 본 개시의 핵산은 비천연 아미노산 변형을 포함하도록 합성될 수 있다. 본 개시의 핵산은 화학 합성 방법 또는 재조합 방법으로 수득될 수 있다.
본 개시의 핵산, 이들 전체 서열, 또는 이의 임의의 부분은 비-자연 발생일 수 있다. 본 개시의 핵산은 전체 핵산 서열을 비-자연 발생되도록 하는, 자연 발생이 아닌 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실, 또는 삽입을 함유할 수 있다. 본 개시의 핵산은 하나 이상의 이중, 역위 또는 반복 서열을 함유할 수 있고, 이의 생성된 서열은 자연 발생이 아니어서, 전체 핵산 서열을 비-자연 발생이도록 한다. 본 개시의 핵산은 자연 발생이 아닌 변형, 인공, 또는 합성 뉴클레오티드를 함유하여, 전체 핵산 서열을 비-자연 발생이도록 할 수 있다.
유전자 코드의 중복성을 고려하면, 복수의 뉴클레오티드 서열은 임의의 특정 단백질을 코딩할 수 있다. 모든 이러한 뉴클레오티드 서열이 본 명세서에서 고려된다.
본 개시 전반에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결된"은 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 발현을 지칭한다. 프로모터는 이의 제어 하의 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치될 수 있다. 프로모터와 유전자 간 거리는 프로모터 및 프로모터가 유래된 유전자에서 이것이 제어하는 유전자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이 거리의 변동은 프로모터 기능 상실 없이 수용될 수 있다.
본 개시 전반에서 사용되는 용어 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 증강시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 지칭한다. 프로모터는 발현을 더 증강시키고/시키거나 이의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변경시키기 위한 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 전사 출발 부위로부터 수천개 염기쌍만큼 떨어져 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 리프레서 구성요소를 포함할 수도 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함한, 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 장기에 대해서, 또는, 발현이 일어나는 발생 단계에 대해서, 또는 외부 자극 예컨대 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온, 또는 유도제에 반응하여, 유전자 성분의 발현을 항시적으로 또는 차등적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, EF-1 알파 프로모터, CAG 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
본 개시 전반에서 사용되는 용어 "실질적으로 상보성"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역 상의 제2 서열의 상보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 2개 서열이 엄격 혼성화 조건하에서 혼성화하는, 제1 서열을 지칭한다.
본 개시 전반에서 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역 상에서, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 핵산 경우에, 제1 서열이 제2 서열의 상보체에 실질적으로 상보성인 것을 지칭한다.
핵산을 설명하기 위해 사용될 때 본 개시의 전반에서 사용되는 용어 "변이체"는 (i) 기준 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 단편; (ii) 기준 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부의 상보체; (iii) 기준 핵산 또는 이의 상보체에 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 기준 핵산, 이의 상보체, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열과 엄격 조건 하에서 혼성화하는 핵산을 지칭한다.
본 개시 전반에서 사용되는 용어 "벡터"는 복제 기점을 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자기-복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게, DNA 플라스미드이다. 벡터는 DNA 서열, RNA 서열, 또는 DNA 및 RNA 서열 둘 모두와 아미노산의 조합을 포함할 수 있다.
펩티드 또는 폴리펩티드를 설명하기 위해 사용될 때 본 개시 전반에서 사용되는 용어 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존성 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 기준 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다.
아미노산의 보존성 치환, 즉 유사한 성질(예를 들어, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 아미노산의 치환은 당분야에서 전형적으로 소수 변화를 포함하는 것으로 인식된다. 이들 소수 변화는 당분야에서 이해하는 바와 같이, 부분적으로, 아미노산의 수치 지수를 고려하여, 확인할 수 있다(Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)). 아미노산의 수치 지수는 이의 소수성 및 전하의 고려를 기준으로 한다. 유사한 수치 지수의 아미노산이 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유한다. 일 양태에서, ±2의 수치 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 야기하는 치환을 밝히는 데 사용될 수 있다. 펩티드의 맥락에서 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 충분히 상관있는 것으로 보고된 유용한 척도인, 펩티드의 최대 국소 평균 친수성의 계산을 허용한다(전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제4,554,101호).
유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들어, 면역원성을 보유하는 펩티드를 생성시킬 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 수치 지수와 친수성 값 둘 모두는 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 관찰과 일관되게, 생물학적 기능과 상용성인 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 성질을 통해 밝혀진 바와 같이, 아미노산의 상대적 유사성, 및 특히 아미노산의 측쇄에 따라서 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 "보존성" 아미노산 치환은 하기 표 A, B, 또는 C에 기재된 바와 같이 정의될 수 있다. 일부 양태에서, 융합 폴리펩티드 및/또는 이러한 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 본 개시의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변형에 의해 도입된 보존성 치환을 포함한다. 아미노산은 물리적 성질에 따라서, 그리고 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여에 따라 분류될 수 있다. 보존성 치환은 유사한 성질을 갖는 다른 아미노산으로 한 아미노산의 치환이다. 예시적인 보존성 치환은 하기 표 A에 기재된다.
표 A -- 보존성 치환 I
대안적으로, 보존성 아미노산은 하기 표 B에 기재된 바와 같이 문헌[Lehninger, (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY, N.Y. (1975), pp. 71-77)]에 기재된 바와 같이 그룹화될 수 있다.
표 B -- 보존성 치환 II
대안적으로, 예시적인 보존성 치환은 하기 표 C에 기재된다.
표 C -- 보존성 치환 III
본 개시의 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 하나 이상의 삽입, 결실, 또는 치환, 또는 이의 임의의 조합을 비롯하여, 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환 이외의 변형을 보유하는 폴리펩티드를 포함하고자 한다는 것을 이해해야 한다. 본 개시의 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 보존성 치환을 함유할 수 있다.
본 개시 전반에서 사용되는 용어, 상기 언급된 아미노산 치환의 "하나 초과"는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 열거된 아미노산 치환을 지칭한다. 용어 "하나 초과"는 2, 3, 4, 또는 5개의 열거된 아미노산 치환을 지칭할 수 있다.
이들 전체 서열, 또는 이의 임의의 일부로서, 본 개시의 폴리펩티드 및 단백질은 비-자연 발생일 수 있다. 본 개시의 폴리펩티드 및 단백질은 자연 발생되지 않은 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실, 또는 삽입을 함유할 수 있어서, 전체 아미노산 서열을 비-자연 발생이도록 한다. 본 개시의 폴리펩티드 및 단백질은 하나 이상의 이중, 역위 또는 반복 서열을 함유할 수 있고, 이의 최종 서열은 자연 발생이 아니어서, 전체 아미노산 서열을 비-자연 발생이도록 한다. 본 개시의 폴리펩티드 및 단백질은 자연 발생이 아닌 변형, 인공, 또는 합성 아미노산을 함유하여서, 전체 아미노산 서열을 비-자연 발생이도록 한다.
본 개시 전반에서 사용되는 "서열 동일성"은 디폴트 매개변수를 사용하여, 미국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(NCBI) ftp 사이트에서 검색할 수 있는, 2개 서열을 블라스팅하기 위한 독립 실행가능한 BLAST 엔진 프로그램(bl2seq)을 사용하여 결정될 수 있다(전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Tatusova and Madden, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174, 247-250]). 둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 사용될 때 용어 "동일한" 또는 "동일성"은 각 서열의 특정 영역 상에서 동일한 잔기의 특정 백분율을 지칭한다. 백분율은 2개 서열을 최적으로 정렬하고, 특정 영역 상의 2개 서열을 비교하고, 동일한 잔기가 양쪽 서열에서 발생된 위치의 개수를 결정하여 일치하는 위치의 개수를 산출하고 나서, 특정 영역 내 위치의 총 개수로 일치하는 위치의 개수를 나누어서, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출하여 계산될 수 있다. 2개 서열이 상이한 길이이거나 정렬이 하나 이상의 스태거드 말단을 생성시키고 비교의 특정 영역이 오직 단일 서열을 포함하는 경우에, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에 포함되고 분자에는 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교할 때, 티민(T) 및 우라실(U)은 동등하게 간주될 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 컴퓨터 서열 알고리즘 예컨대 BLAST 또는 BLAST 2.0을 사용해 수행될 수 있다.
본 개시 전반에서 사용되는 용어 "내생성"은 표적 유전자와 천연적으로 회합된 핵산 또는 단백질 서열 또는 그것이 도입된 숙주 세포를 지칭한다.
본 개시 전반에서 사용되는 용어 "외생성"은 자연 발생 핵산의 비-자연 발생 다수 카피, 예를 들어 비-자연 발생 게놈 위치에 위치하는 DNA 서열, 또는 자연 발생 핵산 서열을 포함하여, 표적 유전자와 천연적으로 회합되지 않은 핵산 또는 단백질 서열 또는 그것이 도입된 숙주 세포를 지칭한다.
본 개시는 숙주 세포에 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 도입하는 방법을 제공한다. "도입하는"이란, 작제물이 숙주 세포의 내부로의 접근을 획득하는 방식으로 폴리뉴클레오티드 작제물이 세포에 존재하게 되는 것이다. 본 개시의 방법은 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드 작제물을 도입하는 특정 방법에 의존하는 것이 아니라, 오직 폴리뉴클레오티드 작제물이 숙주의 한 세포의 내부로의 접근을 획득하는 것에 의존한다. 박테리아, 식물, 진균, 및 동물로 폴리뉴클레오티드 작제물을 도입시키는 방법은, 제한 없이, 안정한 형질전환 방법, 일시적 형질전환 방법, 및 바이러스-매개 방법을 포함하여, 당분야에 공지되어 있다.
실시예
실시예 1: 인간화 MUC1-C scFv 항체 및 키메라 항원 수용체(CAR)의 생성
MUC1-C의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단쇄 항체를 포함하는 항원 인식 영역을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR)를 생성하였다(도 1a 및 1b).
초기 연구로서, K562 세포(불멸화 인간 만성 골수성 백혈병 세포), Raji 세포(암의 모델로서 사용된 인간 조혈 세포주), MUC1-C, 활성화 T 세포를 발현하도록 변형된 Raji 세포 및 RPMI8226 세포(인간 말초 혈액 B 세포 형질세포종/골수종 세포주)를 포함하는 상이한 세포 유형(도 2a 및 2b)에서 MUC1 발현을 평가하였다. 이들 세포 각각에서 MUC1 발현을 항-MUC1-N 항체로 염색함으로써 평가하였다. K562 세포의 경우, 염색 대조 피크는 항-MUC1-N Ab 피크의 좌측에 나타난다. Raji 세포의 경우, 염색 대조 피크는 항-MUC1-N Ab 피크와 중첩되지만, 항-MUC1-N Ab 피크는 더 높다. MUC1-C를 발현하도록 변형된 Raji 세포의 경우, 염색 대조 피크는 항-MUC1-N Ab 피크와 중첩되지만, 항-MUC1-N Ab 피크는 더 높다. 활성화 T 세포의 경우, 염색 대조 피크는 항-MUC1-N Ab 피크의 좌측에 나타난다. RPMI8226 세포의 경우, 염색 대조 피크는 항-MUC1-N Ab 피크의 좌측에 나타난다. MUC-1C를 또한 유방암 또는 유선암(MDA-MB 468), 자궁경부암, 췌장암, 폐암, 백혈병 및 다발성 골수종을 포함하는 상이한 암 세포주의 패널에서 발현시켰다(도 3).
인간화 MUC1-C scFv CAR을 생성하기 위해, MUC1-C를 인식하는 마우스 단클론성 항체의 가변 영역의 인 실리코 상보성-결정 영역(CDR) 이식 인간화를 수행하였다. 가변 영역(가변 중쇄(VH)와 가변 경쇄(VL) 둘 모두)에 대한 컴퓨터 모델링을 수행하고, CDR 영역을 변화시키지 않으면서 가장 적절한 인간 VH/VL 프레임워크 억셉터를 확인하였는데; 가장 적절한 인간 VH 및 VL 프레임워크 억셉터는 각각 IGHV1-69 08 및 IGKV6-21 02였다. 인간화 과정 동안, 마우스 CDR을 인간 프레임워크 억셉터에 이식하였다. 마우스 프레임워크의 잔기와 상이한 인간 프레임워크의 잔기를 연구하였다. 새로운 접촉이 생성된 경우, 오래된 접촉이 손실된 경우, 표준 마우스 잔기가 생성된 경우, 또는 항원 결합 영역 내에서 불안정성이 예측된 경우, 억셉터 프레임워크에서 인간 잔기에서 마우스 잔기로의 역-돌연변이를 설계하였다. 모든 생성된 중쇄(4+2 변이체(H1B 및 H2B)) 및 경쇄(3) 서열은 이들의 정렬과 함께 표시되었다(도 5a 및 5b).
인간화 MUC1-C scFv CAR을 생성하는 데 사용되는 예시적인 마우스 CDR 영역은 하기 아미노산 서열을 포함하였다:
CDRH1 - NFWMN (SEQ ID NO: 69); CDRH2 - QIYPGDGDTNYNGKFKG (SEQ ID NO: 70); CDRH3 - SYYRSAWFAY (SEQ ID NO: 71); CDRL1 - RASQSIGTSIH (SEQ ID NO: 72); CDRL2 - YASESIS (SEQ ID NO: 73); CDRL3 - QQSNNWPLT (SEQ ID NO: 74). 일부 경우에, CDRH2 영역을 돌연변이시켜 인간화 MUC1-C scFv CAR을 생성시켰다. 이는 QIYPGDGDTNYNAKFKG(SEQ ID NO: 75)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2를 포함하였다.
예시적인 인간화 MUC1-C-scFv CAR의 다이어그램은 도 4에 도시되어 있다. 다음 인간화 MUC1-C CAR 구조를 사용하였다: 신호 펩티드(CD8α) - 경쇄 - 링커 - 중쇄 - 힌지(CD8α) - 막관통(CD8α) - 세포내 신호전달(4-1BB) - 세포내 신호전달(CD3ζ).
실시예 2 - 인간화 MUC1-C scFv CAR-T 세포의 기능 분석
MUC1-C 후보 CAR을 트리시스트론성 piggyBac 트랜스포존(EF1알파 프로모터 - iC9 안전성 스위치 - T2A - MUC1-C CAR - T2A - DHFR 선택 유전자)에 서브클로닝하고, 본원에 기재된 바와 같은 정상 인간 혈액 공여자로부터 팬 T 세포를 사용하여 CAR-T 세포를 생산하였다(도 6). piggyBac-변형된 세포의 표면에서 각각의 후보 CAR의 발현을 His-태깅된 p62/p58 MUC1 단백질, 및 이어서 항-His 이차 항체를 사용하여 트랜스포존 전달 19 일 후에 FACS 염색에 의해 확인하였다(도 6). 구체적으로, CAR을 코딩하는 트랜스포존을 수용한 모의 전위된(청색) 또는 항-CD3/CD28 비드 재활성화(적색) 세포(48 시간 동안 활성화)에서 CAR의 표면-발현에 대해 세포를 유세포 분석에 의해 조사하였고, 데이터는 오버레이된 히스토그램으로 나타나 있고; 수치는 세포 표면에서 CAR을 발현하는 세포의 백분율을 나타낸다. 모든 후보 MUC1-C CAR을 piggyBac-생성 CAR-T 세포의 표면에서 발현시키고 검출하였다(도 7). 표 2는 비-활성화 및 활성화 T 세포의 표면에서 CAR 발현에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 보여준다.
표 2. CAR 후보 MUC1-C CAR-T 세포의 표면 발현.
후보 MUC1-C CAR-T 세포를 본원에 기재된 바와 같은 정상 인간 혈액 공여자로부터의 팬 T 세포를 사용하여 생성하였다. CAR+ T 세포를 표면 CD45RA, CD45RO, 및 CD62L의 발현에 대해 트랜스포존 전달 19 일 후에 FACS 염색하여 TSCM, TCM, TEM, 및 TEFF 세포를 지정하였다; TSCM(CD45RA+/CD45RO-/CD62L+), TCM(CD45RA-/CD45RO+/CD62L+), TEM(CD45RA-/CD45RO+/CD62L-), TEFF(CD45RA+/CD45RO-/CD62L-). 결과는 표 3에 제시되어 있다. 모든 piggyBac-생성 후보 MUC1-C CAR-T 세포 집단은 주로 예외적으로 높은 수준의 유리한 TSCM 및 TCM 세포로 구성되었다.
표 3. 19 일에 CD8+ 후보 MUC-1C CAR-T 세포에서 TEFF, TSCM, TCM 및 TEM의 비율
모든 piggyBac-생성 후보 MUC1-C CAR-T 세포 집단은 주로 높은 수준의 TSCM 및 TCM 세포로 구성되었다.
후보 MUC1-C CAR-T 세포를 본원에 기재된 바와 같은 정상 인간 혈액 공여자로부터의 팬 T 세포를 사용하여 생성하였다. CAR-T 세포를 다양한 E:T 비(40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1, 0.625:1, 0.313:1)로 24 시간 동안 삼중-음성 유방암 세포주 MDA-MB-468.lucGFP(루시페라제(luc) 및 녹색 형광 단백질(GFP)를 발현하는 MDA-MB-468)와 공동-배양하였다(도 8). 리포터 신호를 측정하여 세포독성을 결정하였다. MDA-MB-468의 사멸은 각 CAR에 대해 선 그래프로 제시되어 있다. 모든 CAR+ T 세포는 MUC1+ MDA-MB-468의 특이적 사멸을 나타냈다. 모의-전위된 T 세포는 표적 세포를 특이적으로 사멸시키지 않았다(회색 점선). E:T의 범위에서 MDA-MB-468의 사멸에 대한 SEM(3 회 반복된 샘플의 평균의 표준 오차)을 갖는 곡선하 면적은 각 CAR에 대하여 표 4에 제시되어 있다. 모든 CAR+ T 세포는 MUC1+ MDA-MB-468의 특이적 사멸을 나타냈다.
표 4. 후보 MUC1-C CAR-T 세포에 의한 MDA-MB-468(MUC1+ 표적 세포)의 특이적 사멸의 곡선하 면적(AUC)
후보 MUC1-C CAR-T 세포를 본원에 기재된 바와 같은 정상 인간 혈액 공여자로부터의 팬 T 세포를 사용하여 생성하였다. 둘 모두 녹색 형광 단백질(GFP)를 발현하는 Raji 세포주(MUC1-; 청색 막대) 또는 인간 MUC1 이소형 10 GenBank NP_001191215.1을 발현하도록 조작된 Raji 세포주(MUC1+; 적색 막대)와 CAR-T 세포를 10:1의 E:T 비로 24 시간 동안 공동-배양하였다(도 9). 리포터 신호를 측정하여 세포독성을 결정하였다. 각 세포주의 사멸은 막대 그래프로 각각의 CAR에 대해 나타나 있고, 오차 막대는 3 회 수행된 샘플의 표준 편차를 나타낸다. 모든 CAR+ T 세포는 MUC1+ 조작된 Raji 세포주의 특이적 사멸을 나타냈지만, MUC1- Raji 세포에 대해서는 그렇지 않았다. 모의-전위된 T 세포는 Raji도 조작된 Raji 표적 세포주도 사멸시키지 않았다.
실시예 3 - 뮤린 이종이식편 모델을 사용한 스트레스 용량에서 후보 인간화 MUC1-C CAR-T 세포의 전임상 평가
뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 '스트레스' 용량에서 후보 인간화 MUC1-C CAR-T 세포의 전임상 평가를 위한 연구 설계의 개략도가 도 10에 나타나 있다. 암컷 NSG 마우스에 피하(SC) 주사된 5x106 개 세포의 용량으로 루시페라제-발현 MDA-MB-468.lucGFP(MDA-MB-468) 세포주를 사용한 뮤린 이종이식편 모델을 이용하여 '스트레스' 용량(4x106)에서 후보 MUC1-C CAR-T 세포의 생체내 항종양 효능을 평가하였다. 본 연구를 위해 총 후보 CAR-T 세포의 패널을 선택하였다. 모든 CAR-T 세포를 본원에 기재된 바와 같은 후보 P-MUC1-C-101 트랜스포존의 piggyBac(PB) 전달을 사용하여 생성하였다. 마우스의 겨드랑이에 MDA-MB-468을 주사하고 종양이 확립되었을 때 치료하였다(캘리퍼 측정에 의해 100-200 mm3). 표 5는 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 '스트레스' 용량에서 후보 인간화 MUC1-C CAR-T 세포의 전임상 평가를 보여준다. 모든 치료를 받은 동물에 대한 캘리퍼 측정에 따른 종양 부피 평가를 비치료군으로부터의 측정으로 표준화하였다. 표 5는 비히클 및 치료군에서 캘리퍼에 의한 종양 부피를 보여준다.
표 5. 후보 MUC1-C CAR-T 세포로 치료 후 곡선하 면적(AUC)에 의해 측정된 종양 부피
마우스를 상이한 CAR 후보 사이에서 효능의 가능한 기능적 차이를 검출하는 데 있어서 더 큰 분해능을 위해 IV 주사에 의해 '스트레스' 용량(4x106)의 후보 P-MUC1-C-101 CAR-T로 치료하였다. 비히클 및 치료 마우스의 혈중 총 T 세포를 TruCount 염색에 의해 측정하였다. 비히클 및 치료 마우스의 혈중 T 세포의 곡선하 면적(AUC)을 채혈로부터 결정하고, 결과를 표 6에 제시하였다.
표 6. MUC1-C CART-T 세포 후보로의 치료 후 혈중 T 세포(hCD45+) 증식의 곡선하 면적.
비히클 및 치료 마우스의 CD8+ T 세포 표현형을 결정하였다. 혈중 CD8+ T 세포의 표현형을 모든 동물에 대해 FACS 염색에 의해 측정하고 백분율을 SEM으로서 오차 막대를 갖는 군 평균으로 나열하였다. 세포를 표면 CD45RA, CD45RO, 및 CD62L의 발현에 대해 염색하여 TSCM, TCM, TEM, 및 TEFF 세포를 지정하였다; TSCM(CD45RA+/CD45RO-/CD62L+), TCM(CD45RA-/CD45RO+/CD62L+), TEM(CD45RA-/CD45RO+/CD62L-), TEFF(CD45RA+CD45RO-CD62L-). 시험된 모든 MUC-1C CAR-T 세포에 대해, TSCM 및 TCM 표현형은 주입 전, 12 일 및 19 일에 TEM 및 TEFF 표현형보다 더 풍부했다.
SEQUENCE LISTING
<110> Poseida Therapeutics, Inc.
<120> MUC1 COMPOSITIONS AND METHODS FOR USE
<130> POTH-040/001WO 325002-2400
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Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Xaa Lys Phe
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<223> X is a Thr or a Asp
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1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile Asn Ser Xaa Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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region
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region
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<223> Synthetic Polypeptide - "L1H1" CAR
<400> 12
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His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln
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Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln
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Ser Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser
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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
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245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
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<223> Synthetic Polypeptide - "L3H3" CAR
<400> 28
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln
20 25 30
Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile
85 90 95
Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
100 105 110
Asn Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
145 150 155 160
Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe Trp
165 170 175
Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
195 200 205
Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
210 215 220
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Ala Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
225 230 235 240
Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
290 295 300
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
305 310 315 320
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
325 330 335
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
340 345 350
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
355 360 365
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
370 375 380
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
385 390 395 400
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
405 410 415
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
420 425 430
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
435 440 445
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
450 455 460
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
465 470 475 480
Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 29
<211> 485
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - "L3H4" CAR
<400> 29
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln
20 25 30
Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile
85 90 95
Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
100 105 110
Asn Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
145 150 155 160
Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe Trp
165 170 175
Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
195 200 205
Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
210 215 220
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Ala Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
225 230 235 240
Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
290 295 300
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
305 310 315 320
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
325 330 335
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
340 345 350
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
355 360 365
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
370 375 380
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
385 390 395 400
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
405 410 415
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
420 425 430
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
435 440 445
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
450 455 460
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
465 470 475 480
Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 30
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L1H1" CAR
<400> 30
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accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180
cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240
agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300
tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360
cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420
ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480
gtgaaggtgt cctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540
cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600
accaactaca acggcaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660
accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggata ccgccgtgta cttctgcgcc 720
cggtcctact acagaagcgc ttggtttgcc tattggggcc agggaaccct cgtgaccgtt 780
agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840
cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900
ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960
ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020
attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080
tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140
gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200
cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260
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gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380
gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440
gcactgcctc caagg 1455
<210> 31
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L1H1B" CAR
<400> 31
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accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180
cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240
agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300
tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360
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cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600
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agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840
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attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080
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gcactgcctc caagg 1455
<210> 32
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L1H2" CAR
<400> 32
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cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600
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agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840
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ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020
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gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440
gcactgcctc caagg 1455
<210> 33
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L1H2B" CAR
<400> 33
atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60
cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120
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cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240
agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300
tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360
cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420
ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480
gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540
cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600
accaactaca acgccaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660
accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720
agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780
agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840
cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900
ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960
ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020
attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080
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gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200
cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260
aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320
gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380
gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440
gcactgcctc caagg 1455
<210> 34
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L1H3" CAR
<400> 34
atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60
cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120
accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180
cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240
agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300
tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360
cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420
ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480
gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540
aagcagcggc caggccaagg cctggaatgg atcggacaaa tctatcccgg cgacggcgac 600
accaactaca acggcaagtt caagggcaga gctacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660
accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720
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agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840
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ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020
attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080
tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140
gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200
cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260
aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320
gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380
gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440
gcactgcctc caagg 1455
<210> 35
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L1H4" CAR
<400> 35
atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60
cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120
accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180
cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240
agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300
tccgaggaca ttgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360
cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420
ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480
gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540
aagcagcggc caggccaagg cctggaatgg atcggacaaa tctatcccgg cgacggcgac 600
accaactaca acggcaagtt caagggcaga gctacactga ccgccgacaa gagcagcagc 660
accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720
agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780
agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840
cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900
ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960
ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020
attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080
tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140
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cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260
aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320
gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380
gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440
gcactgcctc caagg 1455
<210> 36
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L2H1" CAR
<400> 36
atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60
cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120
accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180
cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240
agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcgtggaa 300
tccgaggaca ttgccgacta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360
cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420
ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480
gtgaaggtgt cctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540
cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600
accaactaca acggcaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660
accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggata ccgccgtgta cttctgcgcc 720
cggtcctact acagaagcgc ttggtttgcc tattggggcc agggaaccct cgtgaccgtt 780
agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840
cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900
ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960
ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020
attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080
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agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780
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<210> 45
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L3H2B" CAR
<400> 45
atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60
cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120
accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180
cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240
agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgtctatcaa cagcgtggaa 300
tccgaggaca ttgccgacta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360
cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420
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gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540
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accaactaca acgccaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660
accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720
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gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200
cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260
aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320
gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380
gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440
gcactgcctc caagg 1455
<210> 46
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L3H3" CAR
<400> 46
atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60
cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120
accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180
cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240
agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgtctatcaa cagcgtggaa 300
tccgaggaca ttgccgacta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360
cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420
ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480
gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540
aagcagcggc caggccaagg cctggaatgg atcggacaaa tctatcccgg cgacggcgac 600
accaactaca acggcaagtt caagggcaga gctacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660
accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720
agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780
agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840
cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900
ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960
ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020
attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080
tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140
gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200
cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260
aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320
gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380
gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440
gcactgcctc caagg 1455
<210> 47
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L3H4" CAR
<400> 47
atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60
cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120
accttcacct gtagagccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180
cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240
agcagatttt ctggcagcgg aagcggcacc gacttcaccc tgtctatcaa cagcgtggaa 300
tccgaggaca ttgccgacta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360
cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420
ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480
gtgaagatca gctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540
aagcagcggc caggccaagg cctggaatgg atcggacaaa tctatcccgg cgacggcgac 600
accaactaca acggcaagtt caagggcaga gctacactga ccgccgacaa gagcagcagc 660
accgcctaca tggaactgag cagcctgaga agcgaggcta ccgccgtgta cttctgtgcc 720
agaagctact acagaagcgc ttggtttgcc tactggggcc agggaacact cgtgaccgtt 780
agctctacca caacaccggc gcctagacct ccaacaccag ctcctacaat cgcgagtcag 840
cccctgtctc tcagacccga agcctgcagg ccagctgcag gaggagctgt gcacaccagg 900
ggcctggact tcgcctgcga catctacatt tgggcaccac tggccgggac ctgtggagtg 960
ctgctgctga gcctggtcat cacactgtac tgcaagagag gcaggaagaa actgctgtat 1020
attttcaaac agcccttcat gcgccccgtg cagactaccc aggaggaaga cgggtgctcc 1080
tgtcgattcc ctgaggaaga ggaaggcggg tgtgagctgc gcgtgaagtt tagtcgatca 1140
gcagatgccc cagcttacaa acagggacag aaccagctgt ataacgagct gaatctgggc 1200
cgccgagagg aatatgacgt gctggataag cggagaggac gcgaccccga aatgggaggc 1260
aagcccaggc gcaaaaaccc tcaggaaggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaaaatg 1320
gcagaagcct attctgagat cggcatgaag ggggagcgac ggagaggcaa agggcacgat 1380
gggctgtacc agggactgag caccgccaca aaggacacct atgatgctct gcatatgcag 1440
gcactgcctc caagg 1455
<210> 48
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "H1" humanized heavy chain variable
region
<400> 48
caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaaggtg 60
tcctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt ccgacaggcc 120
cctggacaag gcctggaatg gatcggccaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180
aacggcaagt tcaagggcag agtgacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggat accgccgtgt acttctgcgc ccggtcctac 300
tacagaagcg cttggtttgc ctattggggc cagggaaccc tcgtgaccgt tagctct 357
<210> 49
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "H1B" humanized heavy chain variable
region
<400> 49
caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaaggtg 60
tcctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt ccgacaggcc 120
cctggacaag gcctggaatg gatcggccaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180
aacgccaagt tcaagggcag agtgacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggat accgccgtgt acttctgcgc ccggtcctac 300
tacagaagcg cttggtttgc ctattggggc cagggaaccc tcgtgaccgt tagctct 357
<210> 50
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "H2" humanized heavy chain variable
region
<400> 50
caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaagatc 60
agctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt ccgacaggcc 120
cctggacaag gcctggaatg gatcggccaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180
aacggcaagt tcaagggcag agtgacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggct accgccgtgt acttctgtgc cagaagctac 300
tacagaagcg cttggtttgc ctactggggc cagggaacac tcgtgaccgt tagctct 357
<210> 51
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "H2B" humanized heavy chain variable
region
<400> 51
caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaagatc 60
agctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt ccgacaggcc 120
cctggacaag gcctggaatg gatcggccaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180
aacgccaagt tcaagggcag agtgacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggct accgccgtgt acttctgtgc cagaagctac 300
tacagaagcg cttggtttgc ctactggggc cagggaacac tcgtgaccgt tagctct 357
<210> 52
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "H3" humanized heavy chain variable
region
<400> 52
caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaagatc 60
agctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt caagcagcgg 120
ccaggccaag gcctggaatg gatcggacaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180
aacggcaagt tcaagggcag agctacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggct accgccgtgt acttctgtgc cagaagctac 300
tacagaagcg cttggtttgc ctactggggc cagggaacac tcgtgaccgt tagctct 357
<210> 53
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "H4" humanized heavy chain variable
region
<400> 53
caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaagatc 60
agctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt caagcagcgg 120
ccaggccaag gcctggaatg gatcggacaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180
aacggcaagt tcaagggcag agctacactg accgccgaca agagcagcag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggct accgccgtgt acttctgtgc cagaagctac 300
tacagaagcg cttggtttgc ctactggggc cagggaacac tcgtgaccgt tagctct 357
<210> 54
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L1" humanized light chain variable
region
<400> 54
gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60
ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120
aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180
agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240
gaggacattg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 55
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L2" humanized light chain variable
region
<400> 55
gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60
ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120
aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180
agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cgtggaatcc 240
gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 56
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L3" humanized light chain variable
region
<400> 56
gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60
ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120
aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180
agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacag cgtggaatcc 240
gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 57
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CD8a signal peptide
<400> 57
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 58
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - CD8a signal peptide
<400> 58
atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60
cct 63
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - linker sequence
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 60
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - linker sequence
<400> 60
ggcggaggcg gtagcggtgg cggaggtagc ggaggtggtg gatct 45
<210> 61
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CD8a hinge
<400> 61
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 62
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - CD8a hinge
<400> 62
accacaacac cggcgcctag acctccaaca ccagctccta caatcgcgag tcagcccctg 60
tctctcagac ccgaagcctg caggccagct gcaggaggag ctgtgcacac caggggcctg 120
gacttcgcct gcgac 135
<210> 63
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CD8a transmembrane domain
<400> 63
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 64
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - CD8a transmembrane domain
<400> 64
atctacattt gggcaccact ggccgggacc tgtggagtgc tgctgctgag cctggtcatc 60
acactgtact gc 72
<210> 65
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - 41BB ICS
<400> 65
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 66
<211> 126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - 41BB ICS
<400> 66
aagagaggca ggaagaaact gctgtatatt ttcaaacagc ccttcatgcg ccccgtgcag 60
actacccagg aggaagacgg gtgctcctgt cgattccctg aggaagagga aggcgggtgt 120
gagctg 126
<210> 67
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CD3z ICS
<400> 67
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 68
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - CD3z ICS
<400> 68
cgcgtgaagt ttagtcgatc agcagatgcc ccagcttaca aacagggaca gaaccagctg 60
tataacgagc tgaatctggg ccgccgagag gaatatgacg tgctggataa gcggagagga 120
cgcgaccccg aaatgggagg caagcccagg cgcaaaaacc ctcaggaagg cctgtataac 180
gagctgcaga aggacaaaat ggcagaagcc tattctgaga tcggcatgaa gggggagcga 240
cggagaggca aagggcacga tgggctgtac cagggactga gcaccgccac aaaggacacc 300
tatgatgctc tgcatatgca ggcactgcct ccaagg 336
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CDRH1
<400> 69
Asn Phe Trp Met Asn
1 5
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CDRH2
<400> 70
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CDRH3
<400> 71
Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CDRL1
<400> 72
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His
1 5 10
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CDRL2
<400> 73
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CDRL3
<400> 74
Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CDRL3
<400> 75
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 76
<211> 158
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 76
Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn
1 5 10 15
Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala
20 25 30
Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro
35 40 45
Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile
50 55 60
Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr
65 70 75 80
Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln
85 90 95
Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr
100 105 110
Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp
115 120 125
Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu
130 135 140
Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu
145 150 155
<210> 77
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 77
Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn
1 5 10 15
Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala
20 25 30
Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro
35 40 45
Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly
50 55
<210> 78
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - MUC1C/ECD peptide
<400> 78
Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn
1 5 10 15
Val His Asp Val Glu Thr
20
<210> 79
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - MUC1C/ECD peptide
<400> 79
Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr
1 5 10 15
Asn Leu Thr Ile Ser Asp
20
<210> 80
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - MUC1C/ECD peptide
<400> 80
Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala
1 5 10 15
Gln Ser Gly Ala Gly
20
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - MUC1C/ED peptide
<400> 81
Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln
1 5 10
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - MUC1C/ED peptide
<400> 82
Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn
1 5
<210> 83
<211> 1053
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 83
Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
20 25 30
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
35 40 45
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
50 55 60
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
65 70 75 80
Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu
85 90 95
Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
100 105 110
Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr
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Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
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Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
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Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
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His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
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660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
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Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
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755 760 765
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Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 88
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515 520 525
Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu
530 535 540
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys
885 890 895
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900 905 910
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Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly
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Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser
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Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln
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Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu
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Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala
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Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro
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Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr
1535 1540 1545
Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser
1550 1555 1560
Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly
1565 1570 1575
Gly Asp Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Ser
1580 1585 1590
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<211> 4776
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - dCas9-Clo051
<400> 89
atggcaccaa agaagaaaag aaaagtggag ggcatcaagt caaacatcag cctgctgaaa 60
gacgaactgc ggggacagat tagtcacatc agtcacgagt acctgtcact gattgatctg 120
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gagtatggct tcaagggcag acatctgggc gggtctagga aacctgacgg catcgtgtac 240
agtaccacac tggaagacaa cttcggaatc attgtcgata ccaaggctta ttccgagggc 300
tactctctgc caattagtca ggcagatgag atggaaaggt acgtgcgcga aaactcaaat 360
agggacgagg aagtcaaccc caataagtgg tgggagaatt tcagcgagga agtgaagaaa 420
tactacttcg tctttatctc aggcagcttc aaagggaagt ttgaggaaca gctgcggaga 480
ctgtccatga ctaccggggt gaacggatct gctgtcaacg tggtcaatct gctgctgggc 540
gcagaaaaga tcaggtccgg ggagatgaca attgaggaac tggaacgcgc catgttcaac 600
aattctgagt ttatcctgaa gtatggaggc gggggaagcg ataagaaata ctccatcgga 660
ctggccattg gcaccaattc cgtgggctgg gctgtcatca cagacgagta caaggtgcca 720
agcaagaagt tcaaggtcct ggggaacacc gatcgccaca gtatcaagaa aaatctgatt 780
ggagccctgc tgttcgactc aggcgagact gctgaagcaa cccgactgaa gcggactgct 840
aggcgccgat atacccggag aaaaaatcgg atctgctacc tgcaggaaat tttcagcaac 900
gagatggcca aggtggacga tagtttcttt caccgcctgg aggaatcatt cctggtggag 960
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cacgagaagt accctactat ctatcatctg aggaagaaac tggtggactc caccgataag 1080
gcagacctgc gcctgatcta tctggccctg gctcacatga tcaagttccg ggggcatttt 1140
ctgatcgagg gagatctgaa ccctgacaat tctgatgtgg acaagctgtt catccagctg 1200
gtccagacat acaatcagct gtttgaggaa aacccaatta atgcctcagg cgtggacgca 1260
aaggccatcc tgagcgccag actgtccaaa tctaggcgcc tggaaaacct gatcgctcag 1320
ctgccaggag agaagaaaaa cggcctgttt gggaatctga ttgcactgtc cctgggcctg 1380
acacccaact tcaagtctaa ttttgatctg gccgaggacg ctaagctgca gctgtccaaa 1440
gacacttatg acgatgacct ggataacctg ctggctcaga tcggcgatca gtacgcagac 1500
ctgttcctgg ccgctaagaa tctgagtgac gccatcctgc tgtcagatat tctgcgcgtg 1560
aacacagaga ttactaaggc cccactgagt gcttcaatga tcaaaagata tgacgagcac 1620
catcaggatc tgaccctgct gaaggctctg gtgaggcagc agctgcccga gaaatacaag 1680
gaaatcttct ttgatcagag caagaatgga tacgccggct atattgacgg cggggcttcc 1740
caggaggagt tctacaagtt catcaagccc attctggaaa agatggacgg caccgaggaa 1800
ctgctggtga agctgaatcg ggaggacctg ctgagaaaac agaggacatt tgataacgga 1860
agcatccctc accagattca tctgggcgaa ctgcacgcca tcctgcgacg gcaggaggac 1920
ttctacccat ttctgaagga taaccgcgag aaaatcgaaa agatcctgac cttcagaatc 1980
ccctactatg tggggcctct ggcacgggga aatagtagat ttgcctggat gacaagaaag 2040
tcagaggaaa ctatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tcgataaagg cgctagcgca 2100
cagtccttca ttgaaaggat gacaaatttt gacaagaacc tgccaaatga gaaggtgctg 2160
cccaaacaca gcctgctgta cgaatatttc acagtgtata acgagctgac taaagtgaag 2220
tacgtcaccg aagggatgcg caagcccgca ttcctgtccg gagagcagaa gaaagccatc 2280
gtggacctgc tgtttaagac aaatcggaaa gtgactgtca aacagctgaa ggaagactat 2340
ttcaagaaaa ttgagtgttt cgattcagtg gaaatcagcg gcgtcgagga caggtttaac 2400
gcctccctgg ggacctacca cgatctgctg aagatcatca aggataagga cttcctggac 2460
aacgaggaaa atgaggacat cctggaggac attgtgctga cactgactct gtttgaggat 2520
cgcgaaatga tcgaggaacg actgaagact tatgcccatc tgttcgatga caaagtgatg 2580
aagcagctga aaagaaggcg ctacaccgga tggggacgcc tgagccgaaa actgatcaat 2640
gggattagag acaagcagag cggaaaaact atcctggact ttctgaagtc cgatggcttc 2700
gccaacagga acttcatgca gctgattcac gatgactctc tgaccttcaa ggaggacatc 2760
cagaaagcac aggtgtctgg ccagggggac agtctgcacg agcatatcgc aaacctggcc 2820
ggcagccccg ccatcaagaa agggattctg cagaccgtga aggtggtgga cgaactggtc 2880
aaggtcatgg gacgacacaa acctgagaac atcgtgattg agatggcccg cgaaaatcag 2940
acaactcaga agggccagaa aaacagtcga gaacggatga agagaatcga ggaaggcatc 3000
aaggagctgg ggtcacagat cctgaaggag catcctgtgg aaaacactca gctgcagaat 3060
gagaaactgt atctgtacta tctgcagaat ggacgggata tgtacgtgga ccaggagctg 3120
gatattaaca gactgagtga ttatgacgtg gatgccatcg tccctcagag cttcctgaag 3180
gatgactcca ttgacaacaa ggtgctgacc aggtccgaca agaaccgcgg caaatcagat 3240
aatgtgccaa gcgaggaagt ggtcaagaaa atgaagaact actggaggca gctgctgaat 3300
gccaagctga tcacacagcg gaaatttgat aacctgacta aggcagaaag aggaggcctg 3360
tctgagctgg acaaggccgg cttcatcaag cggcagctgg tggagacaag acagatcact 3420
aagcacgtcg ctcagattct ggatagcaga atgaacacaa agtacgatga aaacgacaag 3480
ctgatcaggg aggtgaaagt cattactctg aaatccaagc tggtgtctga ctttagaaag 3540
gatttccagt tttataaagt cagggagatc aacaactacc accatgctca tgacgcatac 3600
ctgaacgcag tggtcgggac cgccctgatt aagaaatacc ccaagctgga gtccgagttc 3660
gtgtacggag actataaagt gtacgatgtc cggaagatga tcgccaaatc tgagcaggaa 3720
attggcaagg ccaccgctaa gtatttcttt tacagtaaca tcatgaattt ctttaagacc 3780
gaaatcacac tggcaaatgg ggagatcaga aaaaggcctc tgattgagac caacggggag 3840
acaggagaaa tcgtgtggga caagggaagg gattttgcta ccgtgcgcaa agtcctgtcc 3900
atgccccaag tgaatattgt caagaaaact gaagtgcaga ccgggggatt ctctaaggag 3960
agtattctgc ctaagcgaaa ctctgataaa ctgatcgccc ggaagaaaga ctgggacccc 4020
aagaagtatg gcgggttcga ctctccaaca gtggcttaca gtgtcctggt ggtcgcaaag 4080
gtggaaaagg ggaagtccaa gaaactgaag tctgtcaaag agctgctggg aatcactatt 4140
atggaacgca gctccttcga gaagaatcct atcgattttc tggaagccaa gggctataaa 4200
gaggtgaaga aagacctgat cattaagctg ccaaaatact cactgtttga gctggaaaac 4260
ggacgaaagc gaatgctggc aagcgccgga gaactgcaga agggcaatga gctggccctg 4320
ccctccaaat acgtgaactt cctgtatctg gctagccact acgagaaact gaaggggtcc 4380
cctgaggata acgaacagaa gcagctgttt gtggagcagc acaaacatta tctggacgag 4440
atcattgaac agatttcaga gttcagcaag agagtgatcc tggctgacgc aaatctggat 4500
aaagtcctga gcgcatacaa caagcaccga gacaaaccaa tccgggagca ggccgaaaat 4560
atcattcatc tgttcaccct gacaaacctg ggcgcccctg cagccttcaa gtattttgac 4620
accacaatcg atcggaagag atacacttct accaaagagg tgctggatgc taccctgatc 4680
caccagagta ttaccggcct gtatgagaca cgcatcgacc tgtcacagct gggaggcgat 4740
gggagcccca agaaaaagcg gaaggtgtct agttaa 4776
<210> 90
<211> 1588
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - dCas9-Clo051
<400> 90
Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Gly Ile Lys Ser Asn Ile Ser
1 5 10 15
Leu Leu Lys Asp Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ser His Ile Ser His Glu
20 25 30
Tyr Leu Ser Leu Ile Asp Leu Ala Phe Asp Ser Lys Gln Asn Arg Leu
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Phe Glu Met Lys Val Leu Glu Leu Leu Val Asn Glu Tyr Gly Phe Lys
50 55 60
Gly Arg His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ile Val Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Thr Leu Glu Asp Asn Phe Gly Ile Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr
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Ser Glu Gly Tyr Ser Leu Pro Ile Ser Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg
100 105 110
Tyr Val Arg Glu Asn Ser Asn Arg Asp Glu Glu Val Asn Pro Asn Lys
115 120 125
Trp Trp Glu Asn Phe Ser Glu Glu Val Lys Lys Tyr Tyr Phe Val Phe
130 135 140
Ile Ser Gly Ser Phe Lys Gly Lys Phe Glu Glu Gln Leu Arg Arg Leu
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Ser Met Thr Thr Gly Val Asn Gly Ser Ala Val Asn Val Val Asn Leu
165 170 175
Leu Leu Gly Ala Glu Lys Ile Arg Ser Gly Glu Met Thr Ile Glu Glu
180 185 190
Leu Glu Arg Ala Met Phe Asn Asn Ser Glu Phe Ile Leu Lys Tyr Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr
210 215 220
Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser
225 230 235 240
Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys
245 250 255
Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala
260 265 270
Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn
275 280 285
Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val
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Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu
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Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu
325 330 335
Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys
340 345 350
Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala
355 360 365
Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp
370 375 380
Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val
385 390 395 400
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405 410 415
Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg
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Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys
450 455 460
Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln
485 490 495
Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu
500 505 510
Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu
515 520 525
Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr
530 535 540
Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu
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Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly
565 570 575
Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu
580 585 590
Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp
595 600 605
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865 870 875 880
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885 890 895
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Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg
965 970 975
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980 985 990
Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys
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1010 1015 1020
Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu
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Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val
1040 1045 1050
Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu
1055 1060 1065
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1085 1090 1095
Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys
1100 1105 1110
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1130 1135 1140
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Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile
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Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe
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Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu
1250 1255 1260
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Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys
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Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp
1325 1330 1335
Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser
1340 1345 1350
Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu
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Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser
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Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr
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Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser
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Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala
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Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr
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Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly
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Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His
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Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser
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Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser
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Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu
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Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala
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Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr
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Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile
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Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly
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Asp Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1580 1585
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - dCas9-Clo051
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atgcctaaga agaagcggaa ggtggaaggc atcaaaagca acatctccct cctgaaagac 60
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gaggaattct acaagtttat caaacccata ttagagaaga tggatgggac ggaagagttg 1800
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tatccgttcc tcaaagacaa tcgtgaaaag attgagaaaa tcctaacctt tcgcatacct 1980
tactatgtgg gacccctggc ccgagggaac tctcggttcg catggatgac aagaaagtcc 2040
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<212> PRT
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<223> Synthetic Polypeptide - DHFR mutein
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Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile
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Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp
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<213> Artificial Sequence
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<213> Homo Sapiens
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Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
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<213> Homo Sapiens
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<213> Homo Sapiens
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Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 101
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 101
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 102
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 102
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 103
<211> 594
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - PB transposase
<400> 103
Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln
1 5 10 15
Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp
20 25 30
His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile
35 40 45
Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu
50 55 60
Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn
65 70 75 80
Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His
85 90 95
Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu
100 105 110
Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile
115 120 125
Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile
130 135 140
Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg
145 150 155 160
Glu Ser Met Thr Gly Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile
165 170 175
Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn
180 185 190
His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr
195 200 205
Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu
210 215 220
Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val
225 230 235 240
Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile
245 250 255
Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu
260 265 270
Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Met Tyr Ile Pro Asn Lys Pro
275 280 285
Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Tyr Lys
290 295 300
Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn
305 310 315 320
Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val
325 330 335
His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile
340 345 350
Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val
355 360 365
Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn
370 375 380
Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro
385 390 395 400
Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu
405 410 415
Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys
420 425 430
Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr
435 440 445
Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg
450 455 460
Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn
465 470 475 480
Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val
485 490 495
Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser
500 505 510
Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu
515 520 525
Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser
530 535 540
Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr
545 550 555 560
Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys
565 570 575
Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser
580 585 590
Cys Phe
<210> 104
<211> 594
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - SPB transposase
<400> 104
Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln
1 5 10 15
Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp
20 25 30
His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile
35 40 45
Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu
50 55 60
Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn
65 70 75 80
Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His
85 90 95
Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu
100 105 110
Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile
115 120 125
Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile
130 135 140
Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg
145 150 155 160
Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile
165 170 175
Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn
180 185 190
His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr
195 200 205
Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu
210 215 220
Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val
225 230 235 240
Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile
245 250 255
Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu
260 265 270
Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro
275 280 285
Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys
290 295 300
Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn
305 310 315 320
Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val
325 330 335
His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile
340 345 350
Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val
355 360 365
Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn
370 375 380
Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro
385 390 395 400
Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu
405 410 415
Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys
420 425 430
Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr
435 440 445
Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg
450 455 460
Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn
465 470 475 480
Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val
485 490 495
Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser
500 505 510
Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu
515 520 525
Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser
530 535 540
Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr
545 550 555 560
Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys
565 570 575
Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser
580 585 590
Cys Phe
<210> 105
<211> 340
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - SB100x transposase
<400> 105
Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val
1 5 10 15
Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu
20 25 30
Lys Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His
35 40 45
His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu
50 55 60
Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro
65 70 75 80
Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr
85 90 95
Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu
100 105 110
Lys Gly Arg Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys
115 120 125
Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr
130 135 140
Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe
145 150 155 160
Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys
165 170 175
Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile
180 185 190
Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys
195 200 205
Ile Asp Gly Ile Met Arg Lys Glu Asn Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln
210 215 220
His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val
225 230 235 240
Phe Gln Met Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys
245 250 255
Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser
260 265 270
Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg
275 280 285
Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys
290 295 300
Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Thr Tyr Cys Gly Lys Leu Val
305 310 315 320
Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn
325 330 335
Ala Thr Lys Tyr
340
<210> 106
<211> 340
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - hyperSB100x transposase
<400> 106
Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val
1 5 10 15
Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu
20 25 30
Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His
35 40 45
His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu
50 55 60
Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro
65 70 75 80
Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr
85 90 95
Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu
100 105 110
Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys
115 120 125
Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr
130 135 140
Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe
145 150 155 160
Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys
165 170 175
Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile
180 185 190
Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys
195 200 205
Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln
210 215 220
His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val
225 230 235 240
Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys
245 250 255
Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser
260 265 270
Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg
275 280 285
Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys
290 295 300
Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val
305 310 315 320
Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn
325 330 335
Ala Thr Lys Tyr
340
<210> 107
<211> 5296
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - Helraiser transposon
<400> 107
tcctatataa taaaagagaa acatgcaaat tgaccatccc tccgctacgc tcaagccacg 60
cccaccagcc aatcagaagt gactatgcaa attaacccaa caaagatggc agttaaattt 120
gcatacgcag gtgtcaagcg ccccaggagg caacggcggc cgcgggctcc caggaccttc 180
gctggccccg ggaggcgagg ccggccgcgc ctagccacac ccgcgggctc ccgggacctt 240
cgccagcaga gagcagagcg ggagagcggg cggagagcgg gaggtttgga ggacttggca 300
gagcaggagg ccgctggaca tagagcagag cgagagagag ggtggcttgg agggcgtggc 360
tccctctgtc accccagctt cctcatcaca gctgtggaaa ctgacagcag ggaggaggaa 420
gtcccacccc cacagaatca gccagaatca gccgttggtc agacagctct cagcggcctg 480
acagccagga ctctcattca cctgcatctc agaccgtgac agtagagagg tgggactatg 540
tctaaagaac aactgttgat acaacgtagc tctgcagccg aaagatgccg gcgttatcga 600
cagaaaatgt ctgcagagca acgtgcgtct gatcttgaaa gaaggcggcg cctgcaacag 660
aatgtatctg aagagcagct actggaaaaa cgtcgctctg aagccgaaaa acagcggcgt 720
catcgacaga aaatgtctaa agaccaacgt gcctttgaag ttgaaagaag gcggtggcga 780
cgacagaata tgtctagaga acagtcatca acaagtacta ccaataccgg taggaactgc 840
cttctcagca aaaatggagt acatgaggat gcaattctcg aacatagttg tggtggaatg 900
actgttcgat gtgaattttg cctatcacta aatttctctg atgaaaaacc atccgatggg 960
aaatttactc gatgttgtag caaagggaaa gtctgtccaa atgatataca ttttccagat 1020
tacccggcat atttaaaaag attaatgaca aacgaagatt ctgacagtaa aaatttcatg 1080
gaaaatattc gttccataaa tagttctttt gcttttgctt ccatgggtgc aaatattgca 1140
tcgccatcag gatatgggcc atactgtttt agaatacacg gacaagttta tcaccgtact 1200
ggaactttac atccttcgga tggtgtttct cggaagtttg ctcaactcta tattttggat 1260
acagccgaag ctacaagtaa aagattagca atgccagaaa accagggctg ctcagaaaga 1320
ctcatgatca acatcaacaa cctcatgcat gaaataaatg aattaacaaa atcgtacaag 1380
atgctacatg aggtagaaaa ggaagcccaa tctgaagcag cagcaaaagg tattgctccc 1440
acagaagtaa caatggcgat taaatacgat cgtaacagtg acccaggtag atataattct 1500
ccccgtgtaa ccgaggttgc tgtcatattc agaaacgaag atggagaacc tccttttgaa 1560
agggacttgc tcattcattg taaaccagat cccaataatc caaatgccac taaaatgaaa 1620
caaatcagta tcctgtttcc tacattagat gcaatgacat atcctattct ttttccacat 1680
ggtgaaaaag gctggggaac agatattgca ttaagactca gagacaacag tgtaatcgac 1740
aataatacta gacaaaatgt aaggacacga gtcacacaaa tgcagtatta tggatttcat 1800
ctctctgtgc gggacacgtt caatcctatt ttaaatgcag gaaaattaac tcaacagttt 1860
attgtggatt catattcaaa aatggaggcc aatcggataa atttcatcaa agcaaaccaa 1920
tctaagttga gagttgaaaa atatagtggt ttgatggatt atctcaaatc tagatctgaa 1980
aatgacaatg tgccgattgg taaaatgata atacttccat catcttttga gggtagtccc 2040
agaaatatgc agcagcgata tcaggatgct atggcaattg taacgaagta tggcaagccc 2100
gatttattca taaccatgac atgcaacccc aaatgggcag atattacaaa caatttacaa 2160
cgctggcaaa aagttgaaaa cagacctgac ttggtagcca gagtttttaa tattaagctg 2220
aatgctcttt taaatgatat atgtaaattc catttatttg gcaaagtaat agctaaaatt 2280
catgtcattg aatttcagaa acgcggactg cctcacgctc acatattatt gatattagat 2340
agtgagtcca aattacgttc agaagatgac attgaccgta tagttaaggc agaaattcca 2400
gatgaagacc agtgtcctcg actttttcaa attgtaaaat caaatatggt acatggacca 2460
tgtggaatac aaaatccaaa tagtccatgt atggaaaatg gaaaatgttc aaagggatat 2520
ccaaaagaat ttcaaaatgc gaccattgga aatattgatg gatatcccaa atacaaacga 2580
agatctggta gcaccatgtc tattggaaat aaagttgtcg ataacacttg gattgtccct 2640
tataacccgt atttgtgcct taaatataac tgtcatataa atgttgaagt ctgtgcatca 2700
attaaaagtg tcaaatattt atttaaatac atctataaag ggcacgattg tgcaaatatt 2760
caaatttctg aaaaaaatat tatcaatcat gacgaagtac aggacttcat tgactccagg 2820
tatgtgagcg ctcctgaggc tgtttggaga ctttttgcaa tgcgaatgca tgaccaatct 2880
catgcaatca caagattagc tattcatttg ccaaatgatc agaatttgta ttttcatacc 2940
gatgattttg ctgaagtttt agatagggct aaaaggcata actcgacttt gatggcttgg 3000
ttcttattga atagagaaga ttctgatgca cgtaattatt attattggga gattccacag 3060
cattatgtgt ttaataattc tttgtggaca aaacgccgaa agggtgggaa taaagtatta 3120
ggtagactgt tcactgtgag ctttagagaa ccagaacgat attaccttag acttttgctt 3180
ctgcatgtaa aaggtgcgat aagttttgag gatctgcgaa ctgtaggagg tgtaacttat 3240
gatacatttc atgaagctgc taaacaccga ggattattac ttgatgacac tatctggaaa 3300
gatacgattg acgatgcaat catccttaat atgcccaaac aactacggca actttttgca 3360
tatatatgtg tgtttggatg tccttctgct gcagacaaat tatgggatga gaataaatct 3420
cattttattg aagatttctg ttggaaatta caccgaagag aaggtgcctg tgtgaactgt 3480
gaaatgcatg cccttaacga aattcaggag gtattcacat tgcatggaat gaaatgttca 3540
catttcaaac ttccggacta tcctttatta atgaatgcaa atacatgtga tcaattgtac 3600
gagcaacaac aggcagaggt tttgataaat tctctgaatg atgaacagtt ggcagccttt 3660
cagactataa cttcagccat cgaagatcaa actgtacacc ccaaatgctt tttcttggat 3720
ggtccaggtg gtagtggaaa aacatatctg tataaagttt taacacatta tattagaggt 3780
cgtggtggta ctgttttacc cacagcatct acaggaattg ctgcaaattt acttcttggt 3840
ggaagaacct ttcattccca atataaatta ccaattccat taaatgaaac ttcaatttct 3900
agactcgata taaagagtga agttgctaaa accattaaaa aggcccaact tctcattatt 3960
gatgaatgca ccatggcatc cagtcatgct ataaacgcca tagatagatt actaagagaa 4020
attatgaatt tgaatgttgc atttggtggg aaagttctcc ttctcggagg ggattttcga 4080
caatgtctca gtattgtacc acatgctatg cgatcggcca tagtacaaac gagtttaaag 4140
tactgtaatg tttggggatg tttcagaaag ttgtctctta aaacaaatat gagatcagag 4200
gattctgctt atagtgaatg gttagtaaaa cttggagatg gcaaacttga tagcagtttt 4260
catttaggaa tggatattat tgaaatcccc catgaaatga tttgtaacgg atctattatt 4320
gaagctacct ttggaaatag tatatctata gataatatta aaaatatatc taaacgtgca 4380
attctttgtc caaaaaatga gcatgttcaa aaattaaatg aagaaatttt ggatatactt 4440
gatggagatt ttcacacata tttgagtgat gattccattg attcaacaga tgatgctgaa 4500
aaggaaaatt ttcccatcga atttcttaat agtattactc cttcgggaat gccgtgtcat 4560
aaattaaaat tgaaagtggg tgcaatcatc atgctattga gaaatcttaa tagtaaatgg 4620
ggtctttgta atggtactag atttattatc aaaagattac gacctaacat tatcgaagct 4680
gaagtattaa caggatctgc agagggagag gttgttctga ttccaagaat tgatttgtcc 4740
ccatctgaca ctggcctccc atttaaatta attcgaagac agtttcccgt gatgccagca 4800
tttgcgatga ctattaataa atcacaagga caaactctag acagagtagg aatattccta 4860
cctgaacccg ttttcgcaca tggtcagtta tatgttgctt tctctcgagt tcgaagagca 4920
tgtgacgtta aagttaaagt tgtaaatact tcatcacaag ggaaattagt caagcactct 4980
gaaagtgttt ttactcttaa tgtggtatac agggagatat tagaataagt ttaatcactt 5040
tatcagtcat tgtttgcatc aatgttgttt ttatatcatg tttttgttgt ttttatatca 5100
tgtctttgtt gttgttatat catgttgtta ttgtttattt attaataaat ttatgtatta 5160
ttttcatata cattttactc atttcctttc atctctcaca cttctattat agagaaaggg 5220
caaatagcaa tattaaaata tttcctctaa ttaattccct ttcaatgtgc acgaatttcg 5280
tgcaccgggc cactag 5296
<210> 108
<211> 1496
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - Helitron transposase
<400> 108
Met Ser Lys Glu Gln Leu Leu Ile Gln Arg Ser Ser Ala Ala Glu Arg
1 5 10 15
Cys Arg Arg Tyr Arg Gln Lys Met Ser Ala Glu Gln Arg Ala Ser Asp
20 25 30
Leu Glu Arg Arg Arg Arg Leu Gln Gln Asn Val Ser Glu Glu Gln Leu
35 40 45
Leu Glu Lys Arg Arg Ser Glu Ala Glu Lys Gln Arg Arg His Arg Gln
50 55 60
Lys Met Ser Lys Asp Gln Arg Ala Phe Glu Val Glu Arg Arg Arg Trp
65 70 75 80
Arg Arg Gln Asn Met Ser Arg Glu Gln Ser Ser Thr Ser Thr Thr Asn
85 90 95
Thr Gly Arg Asn Cys Leu Leu Ser Lys Asn Gly Val His Glu Asp Ala
100 105 110
Ile Leu Glu His Ser Cys Gly Gly Met Thr Val Arg Cys Glu Phe Cys
115 120 125
Leu Ser Leu Asn Phe Ser Asp Glu Lys Pro Ser Asp Gly Lys Phe Thr
130 135 140
Arg Cys Cys Ser Lys Gly Lys Val Cys Pro Asn Asp Ile His Phe Pro
145 150 155 160
Asp Tyr Pro Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Met Thr Asn Glu Asp Ser Asp
165 170 175
Ser Lys Asn Phe Met Glu Asn Ile Arg Ser Ile Asn Ser Ser Phe Ala
180 185 190
Phe Ala Ser Met Gly Ala Asn Ile Ala Ser Pro Ser Gly Tyr Gly Pro
195 200 205
Tyr Cys Phe Arg Ile His Gly Gln Val Tyr His Arg Thr Gly Thr Leu
210 215 220
His Pro Ser Asp Gly Val Ser Arg Lys Phe Ala Gln Leu Tyr Ile Leu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Glu Ala Thr Ser Lys Arg Leu Ala Met Pro Glu Asn Gln
245 250 255
Gly Cys Ser Glu Arg Leu Met Ile Asn Ile Asn Asn Leu Met His Glu
260 265 270
Ile Asn Glu Leu Thr Lys Ser Tyr Lys Met Leu His Glu Val Glu Lys
275 280 285
Glu Ala Gln Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly Ile Ala Pro Thr Glu Val
290 295 300
Thr Met Ala Ile Lys Tyr Asp Arg Asn Ser Asp Pro Gly Arg Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Pro Arg Val Thr Glu Val Ala Val Ile Phe Arg Asn Glu Asp Gly
325 330 335
Glu Pro Pro Phe Glu Arg Asp Leu Leu Ile His Cys Lys Pro Asp Pro
340 345 350
Asn Asn Pro Asn Ala Thr Lys Met Lys Gln Ile Ser Ile Leu Phe Pro
355 360 365
Thr Leu Asp Ala Met Thr Tyr Pro Ile Leu Phe Pro His Gly Glu Lys
370 375 380
Gly Trp Gly Thr Asp Ile Ala Leu Arg Leu Arg Asp Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Asp Asn Asn Thr Arg Gln Asn Val Arg Thr Arg Val Thr Gln Met Gln
405 410 415
Tyr Tyr Gly Phe His Leu Ser Val Arg Asp Thr Phe Asn Pro Ile Leu
420 425 430
Asn Ala Gly Lys Leu Thr Gln Gln Phe Ile Val Asp Ser Tyr Ser Lys
435 440 445
Met Glu Ala Asn Arg Ile Asn Phe Ile Lys Ala Asn Gln Ser Lys Leu
450 455 460
Arg Val Glu Lys Tyr Ser Gly Leu Met Asp Tyr Leu Lys Ser Arg Ser
465 470 475 480
Glu Asn Asp Asn Val Pro Ile Gly Lys Met Ile Ile Leu Pro Ser Ser
485 490 495
Phe Glu Gly Ser Pro Arg Asn Met Gln Gln Arg Tyr Gln Asp Ala Met
500 505 510
Ala Ile Val Thr Lys Tyr Gly Lys Pro Asp Leu Phe Ile Thr Met Thr
515 520 525
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530 535 540
Lys Val Glu Asn Arg Pro Asp Leu Val Ala Arg Val Phe Asn Ile Lys
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Leu Asn Ala Leu Leu Asn Asp Ile Cys Lys Phe His Leu Phe Gly Lys
565 570 575
Val Ile Ala Lys Ile His Val Ile Glu Phe Gln Lys Arg Gly Leu Pro
580 585 590
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595 600 605
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Pro Cys Gly Ile Gln Asn Pro Asn Ser Pro Cys Met Glu Asn Gly Lys
645 650 655
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740 745 750
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885 890 895
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Pro Cys His Lys Leu Lys Leu Lys Val Gly Ala Ile Ile Met Leu
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Leu Arg Asn Leu Asn Ser Lys Trp Gly Leu Cys Asn Gly Thr Arg
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Phe Ile Ile Lys Arg Leu Arg Pro Asn Ile Ile Glu Ala Glu Val
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Leu Thr Gly Ser Ala Glu Gly Glu Val Val Leu Ile Pro Arg Ile
1385 1390 1395
Asp Leu Ser Pro Ser Asp Thr Gly Leu Pro Phe Lys Leu Ile Arg
1400 1405 1410
Arg Gln Phe Pro Val Met Pro Ala Phe Ala Met Thr Ile Asn Lys
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Ser Gln Gly Gln Thr Leu Asp Arg Val Gly Ile Phe Leu Pro Glu
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Pro Val Phe Ala His Gly Gln Leu Tyr Val Ala Phe Ser Arg Val
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Arg Arg Ala Cys Asp Val Lys Val Lys Val Val Asn Thr Ser Ser
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Val Val Tyr Arg Glu Ile Leu Glu
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - Tol2 transposon
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cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60
ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120
tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180
ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240
cgctgatgcc cagtttaatt taaatgttat ttattctgcc tatgaaaatc gttttcacat 300
tatatgaaat tggtcagaca tgttcattgg tcctttggaa gtgacgtcat gtcacatcta 360
ttaccacaat gcacagcacc ttgacctgga aattagggaa attataacag tcaatcagtg 420
gaagaaaatg gaggaagtat gtgattcatc agcagctgcg agcagcacag tccaaaatca 480
gccacaggat caagagcacc cgtggccgta tcttcgcgaa ttcttttctt taagtggtgt 540
aaataaagat tcattcaaga tgaaatgtgt cctctgtctc ccgcttaata aagaaatatc 600
ggccttcaaa agttcgccat caaacctaag gaagcatatt gaggtaagta cattaagtat 660
tttgttttac tgatagtttt tttttttttt tttttttttt tttttgggtg tgcatgtttt 720
gacgttgatg gcgcgccttt tatatgtgta gtaggcctat tttcactaat gcatgcgatt 780
gacaatataa ggctcacgta ataaaatgct aaaatgcatt tgtaattggt aacgttaggt 840
ccacgggaaa tttggcgcct attgcagctt tgaataatca ttatcattcc gtgctctcat 900
tgtgtttgaa ttcatgcaaa acacaagaaa accaagcgag aaattttttt ccaaacatgt 960
tgtattgtca aaacggtaac actttacaat gaggttgatt agttcatgta ttaactaaca 1020
ttaaataacc atgagcaata catttgttac tgtatctgtt aatctttgtt aacgttagtt 1080
aatagaaata cagatgttca ttgtttgttc atgttagttc acagtgcatt aactaatgtt 1140
aacaagatat aaagtattag taaatgttga aattaacatg tatacgtgca gttcattatt 1200
agttcatgtt aactaatgta gttaactaac gaaccttatt gtaaaagtgt taccatcaaa 1260
actaatgtaa tgaaatcaat tcaccctgtc atgtcagcct tacagtcctg tgtttttgtc 1320
aatataatca gaaataaaat taatgtttga ttgtcactaa atgctactgt atttctaaaa 1380
tcaacaagta tttaacatta taaagtgtgc aattggctgc aaatgtcagt tttattaaag 1440
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gcccgtaaga cctccgttca tcttcagaac acagtttaag atattttaga tttagtccga 1560
gagctttctg tgcctccatt gagaatgtat gtacggtata ctgtccatgt ccagaaaggt 1620
aataaaaaca tcaaagtagt ccatgtgaca tcagtgggtt agttagaatt ttttgaagca 1680
tcgaatacat tttggtccaa aaataacaaa acctacgact ttattcggca ttgtattctc 1740
ttccgggtct gttgtcaatc cgcgttcacg acttcgcagt gacgctacaa tgctgaataa 1800
agtcgtaggt tttgttattt ttggaccaaa atgtattttc gatgcttcaa ataattctac 1860
ctaacccact gatgtcacat ggactacttt gatgttttta ttacctttct ggacatggac 1920
agtataccgt acatacattt tcagtggagg gacagaaagc tctcggacta aatctaaaat 1980
atcttaaact gtgttccgaa gatgaacgga ggtgttacgg gcttggaacg acatgagggt 2040
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ttttgaggta ctggccagtg ccatgaatga tatccactca gagtatgaaa tacgtgacaa 2700
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ccaagacgat ggcttcgaat tccagctacc aaaacatcaa aagtgtgcct gtcacttact 2940
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tatcgatgta aacaaatgtg ggttgttttt gtttaatact ctttgattat gctgatttct 3300
cctgtaggtt taatccagca gaaatgctgt tcttgacaga gtgggccaac acaatgcgtc 3360
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gtgacccact tgtggatgcc ctacaacaag gaatccaaac acgattcaag catatgtttg 3540
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taatctgggc aacctttgag ccataccaaa attattcttt tatttattta tttttgcact 3720
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gatgtagatg actgcacgta aatgtagtta atgacaaaat ccataaaatt tgttcccagt 3960
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aaccttgtat gcatttcatt taatgttttt tgagattaaa agcttaaaca agaatctcta 4500
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cttttttact tttactcaag taagattcta gccagatact tttactttta attgagtaaa 4620
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<210> 110
<211> 649
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - Tol2 transposase
<400> 110
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Asn Gln Pro Gln Asp Gln Glu His Pro Trp Pro Tyr Leu Arg Glu Phe
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50 55 60
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Asn Tyr Ser Lys Leu Thr Ala Gln Lys Arg Lys Ile Gly Thr Ser Thr
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130 135 140
Glu Leu Ile Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Ser Val Ile Thr Arg Pro
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165 170 175
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Cys Trp Thr Ala Arg Arg Lys Ser Phe Ile Gly Val Thr Ala His Trp
195 200 205
Ile Asn Pro Gly Ser Leu Glu Arg His Ser Ala Ala Leu Ala Cys Lys
210 215 220
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225 230 235 240
Asp Ile His Ser Glu Tyr Glu Ile Arg Asp Lys Val Val Cys Thr Thr
245 250 255
Thr Asp Ser Gly Ser Asn Phe Met Lys Ala Phe Arg Val Phe Gly Val
260 265 270
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275 280 285
Thr Asp Ser Glu Gly Cys Gly Glu Gly Ser Asp Gly Val Glu Phe Gln
290 295 300
Asp Ala Ser Arg Val Leu Asp Gln Asp Asp Gly Phe Glu Phe Gln Leu
305 310 315 320
Pro Lys His Gln Lys Cys Ala Cys His Leu Leu Asn Leu Val Ser Ser
325 330 335
Val Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ser Asn Glu His Tyr Lys Lys Leu Tyr
340 345 350
Arg Ser Val Phe Gly Lys Cys Gln Ala Leu Trp Asn Lys Ser Ser Arg
355 360 365
Ser Ala Leu Ala Ala Glu Ala Val Glu Ser Glu Ser Arg Leu Gln Leu
370 375 380
Leu Arg Pro Asn Gln Thr Arg Trp Asn Ser Thr Phe Met Ala Val Asp
385 390 395 400
Arg Ile Leu Gln Ile Cys Lys Glu Ala Gly Glu Gly Ala Leu Arg Asn
405 410 415
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Arg Tyr Cys Asp Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ile Gln Thr
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Leu Asp Ser Thr Asp Ile Ile Gly Glu Glu Asn Lys Ala Gly Thr Thr
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atgatgttga attggctgaa aagtggaaag cttgaaagtc aatcacagga acagagttcc 60
tgctaccttg agaactctaa ctgcctgcca ccaacgctcg attctacaga tattatcggt 120
gaagagaaca aagctggtac cacctctcgc aagaagcgga aatatgacga ggactatctg 180
aacttcggtt ttacatggac tggcgacaag gatgagccca acggactttg tgtgatttgc 240
gagcaggtag tcaacaattc ctcacttaac ccggccaaac tgaaacgcca tttggacaca 300
aagcatccga cgcttaaagg caagagcgaa tacttcaaaa gaaaatgtaa cgagctcaat 360
caaaagaagc atacttttga gcgatacgta agggacgata acaagaacct cctgaaagct 420
tcttatctcg tcagtttgag aatagctaaa cagggcgagg catataccat agcggagaag 480
ttgatcaagc cttgcaccaa ggatctgaca acttgcgtat ttggagaaaa attcgcgagc 540
aaagttgatc tcgtccccct gtccgacacg actatttcaa ggcgaatcga agacatgagt 600
tacttctgtg aagccgtgct ggtgaacagg ttgaaaaatg ctaaatgtgg gtttacgctg 660
cagatggacg agtcaacaga tgttgccggt cttgcaatcc tgcttgtgtt tgttaggtac 720
atacatgaaa gctcttttga ggaggatatg ttgttctgca aagcacttcc cactcagacg 780
acaggggagg agattttcaa tcttctcaat gcctatttcg aaaagcactc catcccatgg 840
aatctgtgtt accacatttg cacagacggt gccaaggcaa tggtaggagt tattaaagga 900
gtcatagcga gaataaaaaa actcgtccct gatataaaag ctagccactg ttgcctgcat 960
cgccacgctt tggctgtaaa gcgaataccg aatgcattgc acgaggtgct caatgacgct 1020
gttaaaatga tcaacttcat caagtctcgg ccgttgaatg cgcgcgtctt cgctttgctg 1080
tgtgacgatt tggggagcct gcataaaaat cttcttcttc ataccgaagt gaggtggctg 1140
tctagaggaa aggtgctgac ccgattttgg gaactgagag atgaaattag aattttcttc 1200
aacgaaaggg aatttgccgg gaaattgaac gacaccagtt ggttgcaaaa tttggcatat 1260
atagctgaca tattcagtta tctgaatgaa gttaatcttt ccctgcaagg gccgaatagc 1320
acaatcttca aggtaaatag ccgcattaac agtattaaat caaagttgaa gttgtgggaa 1380
gagtgtataa cgaaaaataa cactgagtgt tttgcgaacc tcaacgattt tttggaaact 1440
tcaaacactg cgttggatcc aaacctgaag tctaatattt tggaacatct caacggtctt 1500
aagaacacct ttctggagta ttttccacct acgtgtaata atatctcctg ggtggagaat 1560
cctttcaatg aatgcggtaa cgtcgataca ctcccaataa aagagaggga acaattgatt 1620
gacatacgga ctgatacgac attgaaatct tcattcgtgc ctgatggtat aggaccattc 1680
tggatcaaac tgatggacga atttccagaa attagcaaac gagctgtcaa agagctcatg 1740
ccatttgtaa ccacttacct ctgtgagaaa tcattttccg tctatgtagc cacaaaaaca 1800
aaatatcgaa atagacttga tgctgaagac gatatgcgac tccaacttac tactatccat 1860
ccagacattg acaacctttg taacaacaag caggctcaga aatcccactg a 1911
<210> 113
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - FKBP12
<400> 113
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 114
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - FKBP12
<400> 114
ggggtccagg tcgagactat ttcaccaggg gatgggcgaa catttccaaa aaggggccag 60
acttgcgtcg tgcattacac cgggatgctg gaggacggga agaaagtgga cagctccagg 120
gatcgcaaca agcccttcaa gttcatgctg ggaaagcagg aagtgatccg aggatgggag 180
gaaggcgtgg cacagatgtc agtcggccag cgggccaaac tgaccattag ccctgactac 240
gcttatggag caacaggcca cccagggatc attccccctc atgccaccct ggtcttcgat 300
gtggaactgc tgaagctgga g 321
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - linker
<400> 115
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 116
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - linker
<400> 116
ggaggaggag gatcc 15
<210> 117
<211> 282
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - truncated Cas9
<400> 117
Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp
1 5 10 15
Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile
20 25 30
Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly
35 40 45
Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His
50 55 60
Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu
65 70 75 80
Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys
85 90 95
Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe
100 105 110
Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys
115 120 125
Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys
130 135 140
Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His
145 150 155 160
Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser
165 170 175
Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe
180 185 190
Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe
195 200 205
Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys
210 215 220
Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp
225 230 235 240
Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala
245 250 255
Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe
260 265 270
Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser
275 280
<210> 118
<211> 843
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - truncated Cas9
<400> 118
tttggggacg tgggggccct ggagtctctg cgaggaaatg ccgatctggc ttacatcctg 60
agcatggaac cctgcggcca ctgtctgatc attaacaatg tgaacttctg cagagaaagc 120
ggactgcgaa cacggactgg ctccaatatt gactgtgaga agctgcggag aaggttctct 180
agtctgcact ttatggtcga agtgaaaggg gatctgaccg ccaagaaaat ggtgctggcc 240
ctgctggagc tggctcagca ggaccatgga gctctggatt gctgcgtggt cgtgatcctg 300
tcccacgggt gccaggcttc tcatctgcag ttccccggag cagtgtacgg aacagacggc 360
tgtcctgtca gcgtggagaa gatcgtcaac atcttcaacg gcacttcttg ccctagtctg 420
gggggaaagc caaaactgtt ctttatccag gcctgtggcg gggaacagaa agatcacggc 480
ttcgaggtgg ccagcaccag ccctgaggac gaatcaccag ggagcaaccc tgaaccagat 540
gcaactccat tccaggaggg actgaggacc tttgaccagc tggatgctat ctcaagcctg 600
cccactccta gtgacatttt cgtgtcttac agtaccttcc caggctttgt ctcatggcgc 660
gatcccaagt cagggagctg gtacgtggag acactggacg acatctttga acagtgggcc 720
cattcagagg acctgcagag cctgctgctg cgagtggcaa acgctgtctc tgtgaagggc 780
atctacaaac agatgcccgg gtgcttcaat tttctgagaa agaaactgtt ctttaagact 840
tcc 843
<210> 119
<211> 394
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 119
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp
115 120 125
Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile
130 135 140
Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly
145 150 155 160
Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His
165 170 175
Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu
180 185 190
Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys
195 200 205
Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe
210 215 220
Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys
225 230 235 240
Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys
245 250 255
Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His
260 265 270
Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser
275 280 285
Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe
290 295 300
Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe
305 310 315 320
Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys
325 330 335
Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp
340 345 350
Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala
355 360 365
Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe
370 375 380
Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser
385 390
<210> 120
<211> 1182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 120
ggggtccagg tcgagactat ttcaccaggg gatgggcgaa catttccaaa aaggggccag 60
acttgcgtcg tgcattacac cgggatgctg gaggacggga agaaagtgga cagctccagg 120
gatcgcaaca agcccttcaa gttcatgctg ggaaagcagg aagtgatccg aggatgggag 180
gaaggcgtgg cacagatgtc agtcggccag cgggccaaac tgaccattag ccctgactac 240
gcttatggag caacaggcca cccagggatc attccccctc atgccaccct ggtcttcgat 300
gtggaactgc tgaagctgga gggaggagga ggatccggat ttggggacgt gggggccctg 360
gagtctctgc gaggaaatgc cgatctggct tacatcctga gcatggaacc ctgcggccac 420
tgtctgatca ttaacaatgt gaacttctgc agagaaagcg gactgcgaac acggactggc 480
tccaatattg actgtgagaa gctgcggaga aggttctcta gtctgcactt tatggtcgaa 540
gtgaaagggg atctgaccgc caagaaaatg gtgctggccc tgctggagct ggctcagcag 600
gaccatggag ctctggattg ctgcgtggtc gtgatcctgt cccacgggtg ccaggcttct 660
catctgcagt tccccggagc agtgtacgga acagacggct gtcctgtcag cgtggagaag 720
atcgtcaaca tcttcaacgg cacttcttgc cctagtctgg ggggaaagcc aaaactgttc 780
tttatccagg cctgtggcgg ggaacagaaa gatcacggct tcgaggtggc cagcaccagc 840
cctgaggacg aatcaccagg gagcaaccct gaaccagatg caactccatt ccaggaggga 900
ctgaggacct ttgaccagct ggatgctatc tcaagcctgc ccactcctag tgacattttc 960
gtgtcttaca gtaccttccc aggctttgtc tcatggcgcg atcccaagtc agggagctgg 1020
tacgtggaga cactggacga catctttgaa cagtgggccc attcagagga cctgcagagc 1080
ctgctgctgc gagtggcaaa cgctgtctct gtgaagggca tctacaaaca gatgcccggg 1140
tgcttcaatt ttctgagaaa gaaactgttc tttaagactt cc 1182
<210> 121
<211> 463
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CSR-CD2z
<400> 121
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30
Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
50 55 60
Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu
195 200 205
Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met
210 215 220
Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln
225 230 235 240
Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val
245 250 255
Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr
260 265 270
Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His
275 280 285
Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val
290 295 300
Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val
305 310 315 320
His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys
325 330 335
Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg
340 345 350
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln
355 360 365
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
370 375 380
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
385 390 395 400
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
405 410 415
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
420 425 430
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
435 440 445
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 122
<211> 184
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CD2 ECD with D111H
<400> 122
Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp
1 5 10 15
Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp
20 25 30
Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg
35 40 45
Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys
50 55 60
Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Lys Val Ser Ile Tyr His Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys
85 90 95
Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser
100 105 110
Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr
115 120 125
Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser
130 135 140
Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe
145 150 155 160
Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro
165 170 175
Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu
180
<210> 123
<211> 463
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - CSR-CD2z with D111H
<400> 123
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30
Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
50 55 60
Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr His Thr
100 105 110
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu
195 200 205
Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met
210 215 220
Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln
225 230 235 240
Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val
245 250 255
Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr
260 265 270
Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His
275 280 285
Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val
290 295 300
Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val
305 310 315 320
His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys
325 330 335
Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg
340 345 350
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln
355 360 365
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
370 375 380
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
385 390 395 400
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
405 410 415
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
420 425 430
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
435 440 445
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 124
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - "L1H1" scFv
<400> 124
Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe Trp Met Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly
165 170 175
Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg
210 215 220
Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser
<210> 125
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - "L1H1B" scFv
<400> 125
Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe Trp Met Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly
165 170 175
Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg
210 215 220
Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser
<210> 126
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide - "L1H2" scFv
<400> 126
Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
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20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys
130 135 140
Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe Trp Met Asn Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly
165 170 175
Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Ala Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg
210 215 220
Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser
<210> 142
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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tct 723
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<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L1H1B" scFv
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<212> DNA
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<212> DNA
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tct 723
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tct 723
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tct 723
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L3H1B" scFv
<400> 155
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tct 723
<210> 156
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L3H2" scFv
<400> 156
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<210> 157
<211> 723
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<213> Artificial Sequence
<220>
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aactacaacg ccaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600
gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660
agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720
tct 723
<210> 158
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L3H3" scFv
<400> 158
gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60
ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120
aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180
agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacag cgtggaatcc 240
gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360
ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420
aagatcagct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtcaag 480
cagcggccag gccaaggcct ggaatggatc ggacaaatct atcccggcga cggcgacacc 540
aactacaacg gcaagttcaa gggcagagct acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600
gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660
agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720
tct 723
<210> 159
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide - "L3H4" scFv
<400> 159
gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60
ttcacctgta gagccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120
aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180
agattttctg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacag cgtggaatcc 240
gaggacattg ccgactacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360
ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420
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aactacaacg gcaagttcaa gggcagagct acactgaccg ccgacaagag cagcagcacc 600
gcctacatgg aactgagcag cctgagaagc gaggctaccg ccgtgtactt ctgtgccaga 660
agctactaca gaagcgcttg gtttgcctac tggggccagg gaacactcgt gaccgttagc 720
tct 723
<210> 160
<211> 1255
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 160
Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr
1 5 10 15
Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly
20 25 30
Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser
35 40 45
Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His
50 55 60
Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu
65 70 75 80
Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln
85 90 95
Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr
100 105 110
Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
130 135 140
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
145 150 155 160
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
165 170 175
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
180 185 190
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
195 200 205
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
210 215 220
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
225 230 235 240
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
245 250 255
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
260 265 270
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
275 280 285
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
290 295 300
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
305 310 315 320
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
325 330 335
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
340 345 350
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
355 360 365
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
370 375 380
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
385 390 395 400
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
405 410 415
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
420 425 430
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
435 440 445
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
450 455 460
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
465 470 475 480
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
485 490 495
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
500 505 510
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
515 520 525
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
530 535 540
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
545 550 555 560
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
565 570 575
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
580 585 590
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
595 600 605
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
610 615 620
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
625 630 635 640
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
645 650 655
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
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Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln
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Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn
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Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly
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1220 1225 1230
Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val
1235 1240 1245
Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu
1250 1255
<210> 161
<211> 1074
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 161
Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala
1 5 10 15
Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser
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Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser
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Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln Asp Val Thr Ser Val Pro Val
65 70 75 80
Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr Pro Pro Ala His Asp Val Thr
85 90 95
Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
100 105 110
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
115 120 125
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
130 135 140
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
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Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
165 170 175
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180 185 190
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
210 215 220
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
225 230 235 240
Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
245 250 255
Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
260 265 270
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
275 280 285
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
290 295 300
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
305 310 315 320
Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
325 330 335
Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
340 345 350
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
355 360 365
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
370 375 380
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
385 390 395 400
Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
405 410 415
Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
420 425 430
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
435 440 445
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
450 455 460
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
465 470 475 480
Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
485 490 495
Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
500 505 510
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
515 520 525
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
530 535 540
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
545 550 555 560
Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
565 570 575
Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
580 585 590
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
595 600 605
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
610 615 620
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
625 630 635 640
Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
645 650 655
Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
660 665 670
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
675 680 685
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
690 695 700
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
705 710 715 720
Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
725 730 735
Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
740 745 750
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
755 760 765
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
770 775 780
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
785 790 795 800
Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
805 810 815
Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
820 825 830
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
835 840 845
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
850 855 860
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
865 870 875 880
Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
885 890 895
Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
900 905 910
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr
915 920 925
Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly
930 935 940
Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr
945 950 955 960
Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro Ser His His Ser
965 970 975
Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser
980 985 990
Ser Thr His His Ser Ser Val Pro Pro Leu Thr Ser Ser Asn His Ser
995 1000 1005
Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser
1010 1015 1020
Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro
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Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met
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Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn
1055 1060 1065
Ile Lys Phe Arg Pro Gly
1070
<210> 162
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 162
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 163
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 163
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro
85 90 95
<210> 164
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1B VH polynucleotide sequence
<400> 164
caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaaggtg 60
tcctgcaaga caagcggcta cgccttcagc aacttctgga tgaactgggt ccgacaggcc 120
cctggacaag gcctggaatg gatcggccaa atctatcccg gcgacggcga caccaactac 180
aacgccaagt tcaagggcag agtgacactg accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240
atggaactgt ccagcctgag aagcgaggat acagccgtgt acttctgcgc ccggtcctac 300
tacagaagcg cttggtttgc ctattggggc cagggaaccc tggtcaccgt gtctagt 357
<210> 165
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L1 VL polynucleotide sequence
<400> 165
gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60
ttcacctgtc gcgccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120
aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180
agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 166
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L1H1B scFv polynucleotide sequence
<400> 166
gagattctgc tgacacagag ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60
ttcacctgtc gcgccagcca gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc 120
aatcagagcc ccaagctgct gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc 180
agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt 360
ggatctcagg ttcagctggt tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg 420
aaggtgtcct gcaagacaag cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga 480
caggcccctg gacaaggcct ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc 540
aactacaacg ccaagttcaa gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc 600
gcctacatgg aactgtccag cctgagaagc gaggatacag ccgtgtactt ctgcgcccgg 660
tcctactaca gaagcgcttg gtttgcctat tggggccagg gaaccctggt caccgtgtct 720
agt 723
<210> 167
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L1H1B CAR polynucleotide sequence
<400> 167
atggctctgc ctgtgacagc tctgcttctg cctctggcac tgcttcttca tgcggcgcgc 60
cctgagattc tgctgacaca gagccctgac ttccagagcg tgacccctaa agaaaaagtg 120
accttcacct gtcgcgccag ccagagcatc ggcacctcca tccactggta tcagcagaag 180
cccaatcaga gccccaagct gctgattaag tacgccagcg agtccatcag cggcgtgcca 240
agcagatttt ctggcagcgg ctctggcacc gacttcaccc tgaccatcaa cagcctggaa 300
tccgaggata tcgccaccta ctactgccag cagtccaaca actggcccct gacatttggc 360
cagggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggtagcg gtggcggagg tagcggaggt 420
ggtggatctc aggttcagct ggttcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcagcagc 480
gtgaaggtgt cctgcaagac aagcggctac gccttcagca acttctggat gaactgggtc 540
cgacaggccc ctggacaagg cctggaatgg atcggccaaa tctatcccgg cgacggcgac 600
accaactaca acgccaagtt caagggcaga gtgacactga ccgccgacaa gagcacaagc 660
accgcctaca tggaactgtc cagcctgaga agcgaggata cagccgtgta cttctgcgcc 720
cggtcctact acagaagcgc ttggtttgcc tattggggcc agggaaccct ggtcaccgtg 780
tctagtacaa caacaccggc gcctcggcct ccaacaccag ctcctacaat tgctagccag 840
ccactgtctc tgaggcccga ggcttgtaga cctgctgctg gcggagctgt gcacacaaga 900
ggactggatt tcgcctgcga catctatatc tgggcccctc tggccggaac atgtggcgtt 960
ctgctgctca gcctggtcat caccctgtac tgcaagcggg gcagaaagaa gctgctgtac 1020
atctttaagc agcccttcat gaggcccgtg cagaccacac aagaagagga cggctgctcc 1080
tgccgcttcc ccgaggaaga agaaggcggt tgcgaactga gagtgaagtt cagcagatcc 1140
gccgacgcac ccgcctataa gcagggacag aatcagctgt acaacgagct gaatctgggg 1200
cgcagagaag agtacgacgt gctggacaag agaagaggca gggaccctga gatgggcggc 1260
aagcccagaa gaaagaaccc tcaagagggc ctgtataatg agctgcagaa agacaagatg 1320
gccgaggcct acagcgagat cggaatgaag ggcgagcgca gaagaggcaa gggtcacgat 1380
ggactgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct atgatgccct gcacatgcag 1440
gccctgcctc caaga 1455
<210> 168
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8a hinge polynucleotide sequence
<400> 168
acaacaacac cggcgcctcg gcctccaaca ccagctccta caattgctag ccagccactg 60
tctctgaggc ccgaggcttg tagacctgct gctggcggag ctgtgcacac aagaggactg 120
gatttcgcct gcgac 135
<210> 169
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8a transmembrane polynucleotide sequence
<400> 169
atctatatct gggcccctct ggccggaaca tgtggcgttc tgctgctcag cctggtcatc 60
accctgtact gc 72
<210> 170
<211> 126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 41BB polynucleotide sequence
<400> 170
aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc tttaagcagc ccttcatgag gcccgtgcag 60
accacacaag aagaggacgg ctgctcctgc cgcttccccg aggaagaaga aggcggttgc 120
gaactg 126
<210> 171
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3z polynucleotide sequence
<400> 171
agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgca cccgcctata agcagggaca gaatcagctg 60
tacaacgagc tgaatctggg gcgcagagaa gagtacgacg tgctggacaa gagaagaggc 120
agggaccctg agatgggcgg caagcccaga agaaagaacc ctcaagaggg cctgtataat 180
gagctgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgc 240
agaagaggca agggtcacga tggactgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300
tatgatgccc tgcacatgca ggccctgcct ccaaga 336
<210> 172
<211> 395
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ic9 polypeptide sequence
<400> 172
Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe
1 5 10 15
Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu
20 25 30
Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys
35 40 45
Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val
50 55 60
Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp
65 70 75 80
Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala
85 90 95
Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala
115 120 125
Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile
130 135 140
Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr
145 150 155 160
Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu
165 170 175
His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val
180 185 190
Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys
195 200 205
Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln
210 215 220
Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu
225 230 235 240
Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly
245 250 255
Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp
260 265 270
His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly
275 280 285
Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr
290 295 300
Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile
305 310 315 320
Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro
325 330 335
Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln
340 345 350
Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn
355 360 365
Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn
370 375 380
Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser
385 390 395
<210> 173
<211> 1185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ic9 polynucleotide sequence
<400> 173
atgggcgtgc aggtcgagac aatttctcct ggcgacggcc ggacattccc taagcgagga 60
cagacatgcg tggtgcacta caccggcatg ctggaagatg gcaagaaggt ggacagcagc 120
cgggacagaa acaagccctt caagttcatg ctgggcaagc aagaagtgat cagaggctgg 180
gaagagggcg tcgcccagat gtctgttgga cagagagcca agctgacaat cagccccgat 240
tacgcctatg gcgccacagg acaccctggc atcattcctc cacatgccac actggtgttc 300
gacgtggaac tgctgaagct ggaaggcggc ggaggatctg gctttggaga tgtgggagcc 360
ctggaaagcc tgagaggcaa tgccgatctg gcctacatcc tgagcatgga accttgcggc 420
cactgcctga ttatcaacaa cgtgaacttc tgcagagaga gcggcctgag aaccagaacc 480
ggcagcaaca tcgactgcga gaagctgcgg agaagattca gcagcctgca cttcatggtg 540
gaagtgaagg gcgacctgac cgccaagaaa atggtgctgg ctctgctgga actggcccag 600
caagatcatg gcgccctgga ttgctgtgtg gtcgtgatcc tgtctcacgg ctgtcaggcc 660
agccatctgc aattccctgg cgccgtgtat ggcaccgatg gctgtcctgt gtccgtggaa 720
aagatcgtga acatcttcaa cggcaccagc tgtcctagcc tcggcggaaa gcccaagctg 780
ttcttcatcc aagcctgtgg cggcgagcag aaggatcacg gatttgaggt ggccagcaca 840
agccccgagg atgagtctcc tggaagcaac cctgagcctg acgccacacc tttccaagag 900
ggactgagaa ccttcgacca gctggacgct atcagctccc tgcctacacc tagcgacatc 960
ttcgtgtcct acagcacatt ccccggcttt gtgtcttggc gggaccctaa gtctggctct 1020
tggtatgtgg aaaccctgga cgatatcttc gagcagtggg cccatagcga ggacctgcaa 1080
tctctgctgc tgagagtggc caatgccgtg tccgtgaagg gcatctacaa gcagatgcct 1140
ggctgcttca acttcctgcg gaagaagctg tttttcaaga ccagc 1185
<210> 174
<211> 561
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DHFR polynucleotide sequence
<400> 174
atggtcggaa gcctgaactg catcgtggcc gtgtctcaga acatgggcat cggcaagaac 60
ggcgacttcc cttggcctcc tctgagaaac gagagccgct acttccagcg gatgaccacc 120
acaagctccg tggaaggcaa gcagaacctc gtgatcatgg gcaagaaaac ctggttcagc 180
atccctgaga agaacagacc cctgaagggc agaatcaacc tggtgctgag cagagagctg 240
aaagagcctc ctcaaggcgc ccacttcctg agcagatctc tggacgatgc cctgaagctg 300
accgagcagc cagaactggc caacaaagtg gacatggtct ggatcgtcgg cggcagctcc 360
gtgtacaaag aagccatgaa tcaccccggc cacctgaaac tgttcgtgac cagaatcatg 420
caggacttcg agagcgacac attcttcccg gagatcgacc tggaaaagta caaactgctg 480
cctgagtacc ccggcgtgct gagcgacgtg caagaggaaa agggcatcaa gtacaagttc 540
gaggtgtacg agaagaacga c 561
<210> 175
<211> 6616
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L1H1B transposon polynucleotide sequence
<400> 175
tgtacataga ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg 60
cgtaaaattg acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa 120
tagatattaa gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt 180
tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta 240
acaaaacttt tatcgaatac ctgcagcccg ggggatgcag agggacagcc cccccccaaa 300
gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc cgctaggggg cagcagcgag ccgcccgggg 360
ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg gcagcgtgcg gggacagccc 420
gggcacgggg aaggtggcac gggatcgctt tcctctgaac gcttctcgct gctctttgag 480
cctgcagaca cctgggggga tacggggaaa agttgactgt gcctttcgat cgaaccatgg 540
acagttagct ttgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg 600
gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 660
cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 720
gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 780
cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 840
cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt 900
tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct 960
tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc 1020
cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat 1080
ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt 1140
ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga 1200
tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca 1260
gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta 1320
gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc 1380
ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc 1440
cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga 1500
gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac 1560
ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc 1620
tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac 1680
tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt 1740
tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca 1800
ggtgtcgtga gaattctaat acgactcact atagggtgcg gccgccacca tgggcgtgca 1860
ggtcgagaca atttctcctg gcgacggccg gacattccct aagcgaggac agacatgcgt 1920
ggtgcactac accggcatgc tggaagatgg caagaaggtg gacagcagcc gggacagaaa 1980
caagcccttc aagttcatgc tgggcaagca agaagtgatc agaggctggg aagagggcgt 2040
cgcccagatg tctgttggac agagagccaa gctgacaatc agccccgatt acgcctatgg 2100
cgccacagga caccctggca tcattcctcc acatgccaca ctggtgttcg acgtggaact 2160
gctgaagctg gaaggcggcg gaggatctgg ctttggagat gtgggagccc tggaaagcct 2220
gagaggcaat gccgatctgg cctacatcct gagcatggaa ccttgcggcc actgcctgat 2280
tatcaacaac gtgaacttct gcagagagag cggcctgaga accagaaccg gcagcaacat 2340
cgactgcgag aagctgcgga gaagattcag cagcctgcac ttcatggtgg aagtgaaggg 2400
cgacctgacc gccaagaaaa tggtgctggc tctgctggaa ctggcccagc aagatcatgg 2460
cgccctggat tgctgtgtgg tcgtgatcct gtctcacggc tgtcaggcca gccatctgca 2520
attccctggc gccgtgtatg gcaccgatgg ctgtcctgtg tccgtggaaa agatcgtgaa 2580
catcttcaac ggcaccagct gtcctagcct cggcggaaag cccaagctgt tcttcatcca 2640
agcctgtggc ggcgagcaga aggatcacgg atttgaggtg gccagcacaa gccccgagga 2700
tgagtctcct ggaagcaacc ctgagcctga cgccacacct ttccaagagg gactgagaac 2760
cttcgaccag ctggacgcta tcagctccct gcctacacct agcgacatct tcgtgtccta 2820
cagcacattc cccggctttg tgtcttggcg ggaccctaag tctggctctt ggtatgtgga 2880
aaccctggac gatatcttcg agcagtgggc ccatagcgag gacctgcaat ctctgctgct 2940
gagagtggcc aatgccgtgt ccgtgaaggg catctacaag cagatgcctg gctgcttcaa 3000
cttcctgcgg aagaagctgt ttttcaagac cagcggcagc ggcgaaggca gaggatccct 3060
tttgacatgc ggcgacgtcg aagagaaccc cggacctatg gctctgcctg tgacagctct 3120
gcttctgcct ctggcactgc ttcttcatgc ggcgcgccct gagattctgc tgacacagag 3180
ccctgacttc cagagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc ttcacctgtc gcgccagcca 3240
gagcatcggc acctccatcc actggtatca gcagaagccc aatcagagcc ccaagctgct 3300
gattaagtac gccagcgagt ccatcagcgg cgtgccaagc agattttctg gcagcggctc 3360
tggcaccgac ttcaccctga ccatcaacag cctggaatcc gaggatatcg ccacctacta 3420
ctgccagcag tccaacaact ggcccctgac atttggccag ggcaccaagc tggaaatcaa 3480
aggcggaggc ggtagcggtg gcggaggtag cggaggtggt ggatctcagg ttcagctggt 3540
tcagtctggc gccgaagtga agaaacctgg cagcagcgtg aaggtgtcct gcaagacaag 3600
cggctacgcc ttcagcaact tctggatgaa ctgggtccga caggcccctg gacaaggcct 3660
ggaatggatc ggccaaatct atcccggcga cggcgacacc aactacaacg ccaagttcaa 3720
gggcagagtg acactgaccg ccgacaagag cacaagcacc gcctacatgg aactgtccag 3780
cctgagaagc gaggatacag ccgtgtactt ctgcgcccgg tcctactaca gaagcgcttg 3840
gtttgcctat tggggccagg gaaccctggt caccgtgtct agtacaacaa caccggcgcc 3900
tcggcctcca acaccagctc ctacaattgc tagccagcca ctgtctctga ggcccgaggc 3960
ttgtagacct gctgctggcg gagctgtgca cacaagagga ctggatttcg cctgcgacat 4020
ctatatctgg gcccctctgg ccggaacatg tggcgttctg ctgctcagcc tggtcatcac 4080
cctgtactgc aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc tttaagcagc ccttcatgag 4140
gcccgtgcag accacacaag aagaggacgg ctgctcctgc cgcttccccg aggaagaaga 4200
aggcggttgc gaactgagag tgaagttcag cagatccgcc gacgcacccg cctataagca 4260
gggacagaat cagctgtaca acgagctgaa tctggggcgc agagaagagt acgacgtgct 4320
ggacaagaga agaggcaggg accctgagat gggcggcaag cccagaagaa agaaccctca 4380
agagggcctg tataatgagc tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg 4440
aatgaagggc gagcgcagaa gaggcaaggg tcacgatgga ctgtaccagg gcctgagcac 4500
cgccaccaag gatacctatg atgccctgca catgcaggcc ctgcctccaa gaggaagtgg 4560
cgaaggacgg ggatctcttc tcacgtgcgg ggatgttgaa gagaatcctg gtccaatggt 4620
cggaagcctg aactgcatcg tggccgtgtc tcagaacatg ggcatcggca agaacggcga 4680
cttcccttgg cctcctctga gaaacgagag ccgctacttc cagcggatga ccaccacaag 4740
ctccgtggaa ggcaagcaga acctcgtgat catgggcaag aaaacctggt tcagcatccc 4800
tgagaagaac agacccctga agggcagaat caacctggtg ctgagcagag agctgaaaga 4860
gcctcctcaa ggcgcccact tcctgagcag atctctggac gatgccctga agctgaccga 4920
gcagccagaa ctggccaaca aagtggacat ggtctggatc gtcggcggca gctccgtgta 4980
caaagaagcc atgaatcacc ccggccacct gaaactgttc gtgaccagaa tcatgcagga 5040
cttcgagagc gacacattct tcccggagat cgacctggaa aagtacaaac tgctgcctga 5100
gtaccccggc gtgctgagcg acgtgcaaga ggaaaagggc atcaagtaca agttcgaggt 5160
gtacgagaag aacgactaat aaggtaccga tcacatatgc ctttaattaa acactagttc 5220
tatagtgtca cctaaattcc ctttagtgag ggttaatggc cgtaggccgc cagaattggg 5280
tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 5340
aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 5400
caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt 5460
gtgggaggtt ttttcggact ctaggacctg cgcatgcgct tggcgtaatc atggtcatag 5520
ctgtttcctg ttttccccgt atccccccag gtgtctgcag gctcaaagag cagcgagaag 5580
cgttcagagg aaagcgatcc cgtgccacct tccccgtgcc cgggctgtcc ccgcacgctg 5640
ccggctcggg gatgcggggg gagcgccgga ccggagcgga gccccgggcg gctcgctgct 5700
gccccctagc gggggaggga cgtaattaca tccctggggg ctttgggggg gggctgtccc 5760
tctcaccgcg gtggagctcc agcttttgtt cgaattgggg ccccccctcg agggtatcga 5820
tgatatctat aacaagaaaa tatatatata ataagttatc acgtaagtag aacatgaaat 5880
aacaatataa ttatcgtatg agttaaatct taaaagtcac gtaaaagata atcatgcgtc 5940
attttgactc acgcggtcgt tatagttcaa aatcagtgac acttaccgca ttgacaagca 6000
cgcctcacgg gagctccaag cggcgactga gatgtcctaa atgcacagcg acggattcgc 6060
gctatttaga aagagagagc aatatttcaa gaatgcatgc gtcaatttta cgcagactat 6120
ctttctaggg ttaatctagc tagccttaag ggcgcagccc gcctaatgag cgggcttttt 6180
tttggcttgt tgtccacaac cgttaaacct taaaagcttt aaaagcctta tatattcttt 6240
tttttcttat aaaacttaaa accttagagg ctatttaagt tgctgattta tattaatttt 6300
attgttcaaa catgagagct tagtacgtga aacatgagag cttagtacgt tagccatgag 6360
agcttagtac gttagccatg agggtttagt tcgttaaaca tgagagctta gtacgttaaa 6420
catgagagct tagtacgtac tatcaacagg ttgaactgct gatccacgtt gtggtagaat 6480
tggtaaagag agtcgtgtaa aatatcgagt tcgcacatct tgttgtctga ttattgattt 6540
ttggcgaaac catttgatca tatgacaaga tgtgtatcta ccttaactta atgattttga 6600
taaaaatcat taggta 6616
<210> 176
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide sequence
<400> 176
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Phe Trp
20 25 30
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
35 40 45
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr
100 105
<210> 177
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide sequence
<400> 177
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr
<210> 178
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide sequence
<400> 178
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Ala Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Ser Val Ser Ala
115
<210> 179
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide sequence
<400> 179
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 180
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide sequence
<400> 180
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Leu
115
<210> 181
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide sequence
<400> 181
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
Claims (92)
- 하기 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
하기 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체:
여기서, SEQ ID NO: 1의 X1은 V 또는 I이고,
SEQ ID NO: 1의 X2는 R 또는 K이고,
SEQ ID NO: 1의 X3은 A 또는 R이고,
SEQ ID NO: 1의 X4는 G 또는 A이고,
SEQ ID NO: 1의 X5는 V 또는 A이고,
SEQ ID NO: 1의 X6은 T 또는 S이고,
SEQ ID NO: 1의 X7은 D 또는 A이며,
여기서, SEQ ID NO: 2의 X1은 T 또는 S이고,
SEQ ID NO: 2의 X2는 L 또는 V이고,
SEQ ID NO: 2의 X3은 T 또는 D이다. - 제1항에 있어서, 항체는 단클론성 항체, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, VHH, VH, scFv, Fab 또는 Fab 단편인 항체.
- 제1항에 있어서, 항체는 인간화된 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 항체는 IgG인 항체.
- 제1항에 있어서, 항체는 인간 MUC1-C에 결합하는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
- 하기 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
하기 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv):
여기서, SEQ ID NO: 1의 X1은 V 또는 I이고,
SEQ ID NO: 1의 X2는 R 또는 K이고,
SEQ ID NO: 1의 X3은 A 또는 R이고,
SEQ ID NO: 1의 X4는 G 또는 A이고,
SEQ ID NO: 1의 X5는 V 또는 A이고,
SEQ ID NO: 1의 X6은 T 또는 S이고,
SEQ ID NO: 1의 X7은 D 또는 A이며,
여기서, SEQ ID NO: 2의 X1은 T 또는 S이고,
SEQ ID NO: 2의 X2는 L 또는 V이고,
SEQ ID NO: 2의 X3은 T 또는 D이다. - 제8항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 scFv.
- 제8항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 scFv.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 링커를 포함하는 scFv.
- 제11항에 있어서, 링커는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함하는 것인 scFv.
- 제11항에 있어서, SEQ ID NO: 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140 또는 141의 아미노산 서열을 포함하는 scFv.
- 제11항에 있어서, SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하는 scFv.
- 제1항의 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
- 제8항의 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
- (a) 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 항원 인식 영역은 적어도 하나의 항-MUC1 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 것인 엑토도메인;
(b) 막관통 도메인, 및
(c) 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 엔도도메인
을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
scFv는 하기 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
하기 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체(CAR):
여기서, SEQ ID NO: 1의 X1은 V 또는 I이고,
SEQ ID NO: 1의 X2는 R 또는 K이고,
SEQ ID NO: 1의 X3은 A 또는 R이고,
SEQ ID NO: 1의 X4는 G 또는 A이고,
SEQ ID NO: 1의 X5는 V 또는 A이고,
SEQ ID NO: 1의 X6은 T 또는 S이고,
SEQ ID NO: 1의 X7은 D 또는 A이며,
여기서, SEQ ID NO: 2의 X1은 T 또는 S이고,
SEQ ID NO: 2의 X2는 L 또는 V이고,
SEQ ID NO: 2의 X3은 T 또는 D이다. - 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, scFv는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 링커를 포함하는 것인 CAR.
- 제38항에 있어서, 링커는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, scFv는 SEQ ID NO: 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140 또는 141의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, scFv는 SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 CAR.
- 제42항에 있어서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 57의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 인식 영역과 막관통 도메인 사이에 힌지 영역을 추가로 포함하는 CAR.
- 제44항에 있어서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제46항에 있어서, CD8 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 적어도 하나의 공동자극 도메인은 CD3ζ 공동자극 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서, 적어도 하나의 공동자극 도메인은 CD3ζ 공동자극 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고, 4-1BB 공동자극 도메인은 막관통 도메인과 CD3ζ 공동자극 도메인 사이에 위치하는 것인 CAR.
- 제49항에 있어서, 4-1BB 공동자극 도메인은 SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제49항에 있어서, CD3ζ 공동자극 도메인은 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
- 제17항에 있어서,
scFv는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 링커를 포함하고,
엑토도메인은 신호 펩티드를 포함하고,
CAR은 항원 인식 영역과 막관통 도메인 사이에 힌지 영역을 추가로 포함하고,
막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인을 포함하는 서열을 포함하고;
적어도 하나의 공동자극 도메인은 CD3ζ 공동자극 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고, 4-1BB 공동자극 도메인은 막관통 도메인과 CD3ζ 공동자극 도메인 사이에 위치하는 것인 CAR. - 제52항에 있어서,
scFv는 SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하고;
신호 펩티드는 SEQ ID NO: 57을 포함하고;
힌지 영역은 SEQ ID NO: 61을 포함하고;
CD8 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 63을 포함하고;
4-1BB 공동자극 도메인은 SEQ ID NO: 65를 포함하고;
CD3ζ 공동자극 도메인은 SEQ ID NO: 67을 포함하는 것인 CAR. - 제52항에 있어서, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CAR.
- 제52항에 있어서, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CAR.
- 제52항에 있어서, CAR의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 또는 SEQ ID NO; 167의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 CAR.
- 제56항에 있어서, CAR의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 167의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 CAR.
- 제1항의 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제8항의 scFv를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제17항의 CAR 또는 제52항의 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제17항의 CAR 또는 제52항의 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스포존.
- 제61항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 포함하는 것인 트랜스포존.
- 제61항에 있어서, 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 키메라 자극 수용체를 코딩하는 핵산, 선택 유전자를 코딩하는 핵산, 치료제를 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 트랜스포존.
- 제63항에 있어서, 선택 유전자는 DHFR 내성 유전자를 포함하는 것인 트랜스포존.
- 제61항에 있어서, piggyBac 트랜스포존인 트랜스포존.
- 제61항에 있어서, SEQ ID NO: 172의 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존.
- 제60항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제61항의 트랜스포존을 포함하는 벡터.
- 제1항의 항체를 포함하는 세포.
- 제8항의 scFv를 포함하는 세포.
- 제17항의 CAR을 포함하는 세포.
- 제61항의 트랜스포존을 포함하는 세포.
- 세포 집단으로서, 복수의 세포 집단이 제17항의 CAR을 발현하도록 변형된 것인 세포 집단.
- 제73항에 있어서, 복수의 변형된 세포는 복수의 변형된 면역 세포인 세포 집단.
- 제73항에 있어서, 복수의 변형된 세포는 복수의 변형된 T-세포인 세포 집단.
- 제73항에 있어서, 복수의 세포 집단은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 제17항의 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 것인 세포 집단.
- 제76항에 있어서, CAR은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포 집단.
- 제75항에 있어서, 복수의 변형된 T-세포의 적어도 50%는 CD45RA 및 CD62L을 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고, CD45RO를 포함하는 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하지 않는 것인 세포 집단.
- 제1항의 항체를 포함하는 조성물.
- 세포독성제에 접합된 제1항의 항체를 포함하는 조성물.
- 제8항의 scFv를 포함하는 조성물.
- 제17항의 CAR을 포함하는 조성물.
- 제71항의 세포를 포함하는 조성물.
- 제73항의 세포 집단을 포함하는 조성물.
- 제79항 내지 제84항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 치료적 유효량의 제79항 내지 제84항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
- 치료적 유효량의 제85항의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
- 제86항에 있어서, 암은 MUC1-양성 암인 방법.
- 제86항에 있어서, 암은 MUC1-C 양성 암인 방법.
- 제86항에 있어서, 암은 원발성 종양, 전이성 암, 다중 내성 암, 진행성 종양 또는 재발성 암인 방법.
- 제86항에 있어서, 암은 고형 종양인 방법.
- 제86항에 있어서, 암은 폐암, 뇌암, 두경부암, 유방암, 피부암, 간암, 췌장암, 위암, 결장암, 직장암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 피부암 또는 식도암인 방법.
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