CN108884167A

CN108884167A - 嵌合抗原受体

Info

Publication number: CN108884167A
Application number: CN201780017987.XA
Authority: CN
Inventors: R.比克内尔; S.李; N.芒特; M.夏普
Original assignee: Cell Therapy Leaps LLC; University of Birmingham; Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cell Therapy Leaps LLC; University of Birmingham; Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2018-11-23
Also published as: US20190085081A1; CA3015293A1; JP2019515656A; EP3430049A1; WO2017158337A1; AU2017232431A1

Abstract

本发明涉及包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含(a)抗CLEC14A结合域、(b)跨膜域和(c)胞内信号传导域；其中所述抗CLEC14A结合域能够结合CLEC14A的C‑型凝集素域。本发明进一步提供由核酸分子编码的嵌合抗原受体、包含核酸分子的载体、包含核酸分子、载体或CAR的细胞以及核酸、载体或细胞的治疗用途，特别是在治疗CLEC14A表达性状况中。

Description

嵌合抗原受体

本发明涉及嵌合抗原受体，特别是与CLEC14A特异性结合的嵌合抗原受体。本发明还涉及编码嵌合抗原受体的多核苷酸和包含受体和/或其编码多核苷酸的细胞。还包括嵌合本发明的抗原受体，多核苷酸和/或细胞抑制肿瘤血管生成和/或癌症的用途。

血管衬有单层内皮细胞，其形成血流和周围组织之间的界面。在称为血管生成的过程中，新血管通过内皮细胞的生长从现有小血管的壁发展。内皮细胞通常在血管系统发育后保持静止，没有新的血管形成，除了伤口愈合中的血管形成外。然而，在实体肿瘤生长期间，可响应肿瘤分泌因子发生血管形成，所述肿瘤促进内皮细胞的刺激以构建新的毛细管芽。肿瘤血管生成被广泛认为是实体瘤生长中的限速过程，因此在肿瘤进展中起重要作用。不吸引血液供应的肿瘤的大小受到限制，因此预防或限制肿瘤血管生成因此可代表实体瘤的治疗选择。

与正常组织中的内皮细胞相比，作为肿瘤内血管系统衬里的内皮细胞可以暴露于不同的细胞外环境。例如，肿瘤中的内皮细胞可能经受缺氧条件，营养缺乏和/或更酸性条件。此外，肿瘤内皮细胞可能经历不同的机械力，例如降低的血流速率和增加的机械压缩。与正常组织中的细胞相比，肿瘤内皮细胞暴露于不同条件导致表现不同的转录物组，与正常血管系统内的内皮细胞相比，肿瘤内皮细胞的表达可能在肿瘤内皮细胞中以更高的水平存在。因此，肿瘤内皮细胞可以通过靶向肿瘤内皮标志物进行治疗靶向。

CLEC14A是14型钙依赖性C型凝集素家族的成员(其另外包括内皮唾液酸蛋白/TEM1/CD248，血栓调节蛋白和CD93作为成员)，是长度为490个氨基酸的单次I型跨膜蛋白，其中包含信号肽(氨基酸残基1-21处)，胞外区(氨基酸残基22-398处)，跨膜域(氨基酸残基399-421处)和胞质域(氨基酸残基422-490处)。CLEC14A的胞外区具有一个C型凝集素样域(在氨基酸残基22-173处)和表皮生长因子样区域(在氨基酸残基245-287处)。人和小鼠CLEC14A蛋白显示67％的氨基酸序列同一性，在C型凝集素和表皮生长因子样域内具有更大的序列保守性。

本发明人先前已经表明，CLEC14A在作为许多常见人癌症(包括乳腺癌，肝癌，前列腺癌，胰腺癌，膀胱癌和卵巢癌)的血管系统衬里的内皮细胞表面上高度表达，但在健康组织的血管系统中，表达是低或不可检测的。据信由于血管形成不良而在肿瘤血管系统中经历的低剪切应力的条件可能是CLEC14A上调的原因。此外，CLEC14A已被公开为在发芽血管生成和促进小鼠肿瘤生长中起作用。因此，先前已提出CLEC14A作为肿瘤内皮标志物，其可靶向抑制肿瘤血管生成。

证明抗体或免疫疗法对于靶向某些肿瘤类型是有效的。一种此类免疫疗法治疗基于免疫细胞，特别是T细胞的修饰，其具有嵌合抗原受体(CAR)(一种可以特异性结合肿瘤靶物并且可以在结合后激活/刺激免疫细胞的受体)。原则上，可以通过使用CAR免疫疗法靶向任何细胞表面分子，从而克服对自身抗原的耐受性并提供不依赖于患者MHC状态的治疗。使用工程化改造为表达靶向CD19的嵌合抗原受体的T细胞，最近的试验已证明在白血病和淋巴瘤患者中具有显著的临床反应。CAR通常由单克隆抗体衍生的单链可变片段(scFv)组成，其由通过柔性接头连接，然后通过跨膜域融合至胞质信号传导域(通常为CD3zeta链)的重链和轻链组成。最近，这些构建体掺入了来自共刺激分子如CD28或4-1BB的额外胞质域，以增强体内T细胞存活。包含来自共刺激分子的一个胞质域的CAR称为第二代CAR，包含两个来自共刺激分子的胞质域的CAR称为第三代CARS，并且包含两个(或更多个)各自来自共刺激分子的胞质域以及编码CAR的核酸中另外的遗传修饰的存在(例如细胞因子基因的存在)的CAR称为第四代CAR。还对CAR进行了其他遗传修饰，例如添加细胞因子基因以避免肿瘤部位的免疫抑制机制。本发明人现在开发了选择性靶向CLEC14A的CAR免疫疗法。在这方面，免疫疗法特异性地利用来自选择性地结合CLEC14A的C型凝集素域的抗体，特别是来自破坏CLEC14A和MMRN2之间相互作用的抗体的结合域/活性。因此，发明人已经鉴定CLEC14A和MMRN2之间的相互作用在血管发生中起重要作用(MMRN2是emilin家族的内皮特异性标志物和细胞外基质的组分)。本发明人进一步鉴定了CLEC14A和MMRN2之间的相互作用可以被结合CLEC14A的C型凝集素域，特别是CLEC14A的氨基酸残基97-108的抗CLEC14A抗体破坏。在这方面，本发明人在CAR免疫疗法中主要使用靶向CLEC14A的这些域的抗体的结合活性，并且已经证明使用此类免疫疗法例如在减少肿瘤大小有效的结果。

因此，在第一方面，本发明提供了核酸分子其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含：

(i)抗CLEC14A结合域,

(ii)跨膜域和

(iii)胞内信号传导域；

其中所述抗CLEC14A结合域能够结合CLEC14A的C型凝集素域。

特别地，抗CLEC14A结合域可以能够破坏CLEC14A和MMRN2之间的相互作用。

因此，根据本发明并如上所讨论，基于结合CLEC14A的C型凝集素域的抗体的发现和分离以及结合CLEC14A的C型凝集素域内特定表位的抗体能够破坏CLEC14A和MMRN2之间的相互作用(发明人已经显示其参与血管生成)的发现，已经开发了CAR免疫疗法。如实施方案中所示，本发明人已经制备并测试了几种CAR免疫疗法，其掺入与CLEC14A的C型凝集素域结合的结合域，并且已经显示此类CAR免疫疗法有效减少肿瘤大小和体积。本发明人已经鉴定了四种特异性新抗体(本文分别描述为CRT1,3,4和5，其CDR，重链和轻链可变序列示于表1中)，该抗体能够结合C CLEC14A的C型凝集素域和这些抗体的CLEC14A结合域已经用于开发本文所述的CAR免疫疗法，以提供本发明治疗的具体实例。使用本发明的CAR疗法产生的令人惊讶的有效结果表明，使用CAR靶向CLEC14A的C型凝集素域可以为肿瘤血管生成提供有效的治疗，从而为癌症提供有效的治疗。此外，CLEC14A在低剪切应力条件下的上调的关联可以使本发明的CAR疗法对血流特别受到限制的肿瘤特别有效，例如，在胰腺或卵巢的肿瘤中，对此目前几乎没有有效的治疗方法。

在本发明的另一方面，本发明人已经鉴定了另外的抗体，其特异性结合CLEC14A的外部区域，并且可以用于根据本发明的CAR中。该特异性抗体(在本文中称为CRT2，其轻链CDR和轻链可变序列可见于表1中)可以有效结合CLEC14A，因此本发明涵盖包含该抗体的抗原结合能力的CAR免疫疗法。

在这方面，在第二实施方案中，本发明还提供了核酸分子其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体

(i)抗CLEC14A结合域

(ii)跨膜域和

(iii)胞内信号传导域，

其中所述抗CLEC14A结合域包含以下至少一项：:

(a)重链CDR，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.167或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

(b)重链CDR，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.168或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,

(c)重链CDR，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.169或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

(d)轻链CDR，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.129或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

(e)轻链CDR，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.68或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或

(f)轻链CDR，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.130或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

因此，如上所述的本发明的核酸包含编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸序列。本文可互换使用的“CAR”或“嵌合抗原受体”是指包含至少三个域的分子，即包含抗原结合域(在本发明中为抗CLEC14A结合域)的胞外域，跨膜域和包含胞内信号传导域的胞内域。

因此，当CAR在宿主细胞(特别是效应细胞，如下文进一步讨论)上表达时，抗原结合域将存在于胞外域内或作为胞外域。通常，大多数或所有抗原结合域将存在于细胞外，以允许CAR与靶抗原结合(例如，当CAR在宿主细胞中表达，转运至细胞膜并呈现时抗原结合域的至少90％，95％，97％，99％或100％将存在于细胞外)。

跨膜域将包含抗原结合域(即本发明中的抗CLEC14A结合域)的胞外域连接到胞内信号传导域，并且通常在CAR表达和膜靶向后跨越宿主细胞的细胞膜。因此，跨膜域在CAR表达和膜靶向后穿过细胞膜。跨膜域可以源自或基于具有至少一个跨膜区和/或胞外和/或胞内部分的蛋白质，因此CAR的跨膜域可以连接在来自其来源或基于的蛋白质的胞外和/或细胞内序列/多肽/蛋白质的N和/或C末端。因此，当跨膜蛋白获自或源自已知的跨膜蛋白时，可以与穿过或跨越膜的跨膜域一起在细胞外和/或细胞内存在另外的序列，以将CAR附着于其上。如下面进一步讨论的，跨膜域可以源自具有跨膜和胞内区域两者的蛋白质或蛋白质的一部分，例如CD28，并且这些域或其部分都可以包含在本发明的CAR中。

CAR的胞内信号传导域在CAR表达后存在于宿主细胞内(即包含在CAR的胞内域内)，通常在细胞的细胞质内。该域能够激活表达CAR的宿主细胞的一种或多种正常功能。例如，若宿主细胞是T细胞，则胞内信号传导域可以能够激活T细胞的细胞溶解或辅助活性。本发明的CAR可另外包含其他域，如下文更详细讨论的。

如本文所用，“抗CLEC14A结合域”是指能够结合CLEC14A的域，特别是当在CAR内表达并呈递在细胞表面上时能够结合CLEC14A的域。特别地，抗CLEC14A结合域能够结合在细胞表面上表达的CLEC14A(例如通过流式细胞术或免疫组织化学评估)，结合构象依赖性(例如非线性)CLEC14A表位(例如如通过Western印迹评估)，结合游离CLEC14A(例如在固体支持物上重组表达的CLEC14A)(例如如通过ELISA评估)和/或结合人CLEC14A。最特别地，抗CLEC14A结合域能够结合在细胞表面上表达的CLEC14A。

特别地，抗CLEC14A结合域选择性地结合CLEC14A，因此与其对其他蛋白质/分子的结合亲和力相比，对CLEC14A具有更大的结合亲和力。优选地，与对CLEC14A的结合相比，抗CLEC14A结合域不与其他蛋白质结合或以大大降低的亲和力结合(例如，与其对CLEC14A的亲和力相比小至少10,50,100,500,1000或10000倍的亲和力)。因此，如本文提及的抗CLEC14A结合域可以以其与其他蛋白质结合的亲和力的至少10,50,100,500,1000或10000倍结合CLEC14A。抗CLEC14A结合域的结合亲和力可以使用本领域公知的方法，例如使用Biacore系统测定。

特别优选的是抗CLEC14A结合域与其对CLEC14A的结合亲和力相比对与CLEC14A相似或具有同一性区域的蛋白质或与CLEC14A的已知同源物具有降低的结合亲和力。因此，抗CLEC14A结合域与其对CLEC14A的结合亲和力相比对于与CLEC14A，特别是与CD248/TEM1/内皮唾液酸蛋白，血栓调节蛋白和/或CD93具有至少60,70,80,90或95％同一性的蛋白质特别应当具有降低的结合亲和力(例如，结合亲和力降低至少10,50,100,1000或10000倍)。或者，特别地，抗CLEC14A结合域以其结合CD248/TEM1/内皮唾液酸蛋白，血栓调节蛋白和/或CD93的亲和力的至少10,50,100,1000或10000倍的亲和力结合CLEC14A。

抗CLEC14A结合域可以具有对CLEC14A的高结合亲和力，即可以具有10-⁵M，10-⁶M，10-⁷M或10-⁹M或更低的K_d。抗CLEC14A结合域可以具有对CLEC14A的结合亲和力，其对应于小于30nM,20nM,15nM或10nM，更优选小于10,9.5,9,8.5,8,7.5,7,6.5,6,5.5,5,4.5,4,3.5,3,2.5,2,1.5或1nM,最优选小于0.9,0.8,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.2或0.1nM的K_d。

可以使用任何适当的确定Kd的方法。然而，优选地，通过在体外测试针对各种浓度的抗原(CLEC14A)的各种浓度的测试抗体来确定Kd，以建立饱和曲线，例如使用Lineweaver-Burk方法，或通过使用商品化结合模型软件，例如BIAcore 1000评估软件中的1:1结合模型。

关于K_d值的确定，技术人员将理解使用表达靶物(例如CLEC14A)的细胞的结合实验得到的表观K_d值不能被认为是亲和力的绝对指示，因为实验条件将影响表观结合亲和力。例如，CLEC14A的表达水平可以根据培养细胞的条件，以及不同细胞类型之间的差异而变化。因此，最好比较在一组实验中获得的表观K_d值，并且可能不总是合适的是将一组实验中获得的K_d值与在不同实验组中获得的K_d值进行比较，特别是若实验条件显著变化的话。

本文提及的“CLEC14A”是指人CLEC14A和来自其他物种的CLEC14A的直系同源物，例如来自马，狗，猪，牛，绵羊，大鼠，小鼠，豚鼠或灵长类动物，例如：猴。因此，抗CLEC14A结合域可以能够结合人CLEC14A和/或来自任何物种，例如鼠的CLEC14A的直系同源物。此外，抗CLEC14A结合域优选能够结合天然存在的CLEC14A变体，例如天然存在的人CLEC14A变体。尽管抗CLEC14A结合域可以以不同于其与人CLEC14A结合的亲和力结合CLEC14A直向同源物，但它可以以相似的亲和力结合人和鼠CLEC14A。

“相似的亲和力”指抗CLEC14A域，例如抗体或配体对人CLEC14A和一种或多种其他感兴趣物种(例如小鼠)的结合亲和力是可比的，例如，不超过20倍不同的。更优选地，结合亲和力之间的差异小于15倍，更优选小于10倍，最优选小于5倍，4倍，3倍或2倍。

然而，在一个具体实施方案中，抗CLEC14A结合域结合人CLEC14A，特别是结合人CLEC14A的胞外部分。人CLEC14A通常具有490个氨基酸，预测分子量为51kDa，并由位于14q21.2的clec14A基因编码。人CLEC14A包括Genbank登录号NP_778230中发现的氨基酸序列及其天然存在的变体。人CLEC14A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(如表1所示)。因此，特别地，如本发明中使用的抗CLEC14A结合域能够结合SEQ ID NO:1的氨基酸序列。1。人CLEC14A由SEQ ID NO:2的cDNA序列编码，所述cDNA序列对应于CLEC14A的mRNA序列，并且人CLEC4A的编码区以SEQ ID NO:3所示。

特别地，抗CLEC14A结合域在去除信号肽(其发生在490个氨基酸人多肽序列的残基1-21)后与成熟CLEC14A多肽结合。(应当理解，本领域可用的不同域预测程序可导致蛋白质内特定域的位置的轻微差异，例如通过1,2,3或4个氨基酸残基，例如相对于CLEC14A中的域位置。因此，可以预测信号传导域为例如在残基1-22处)。因此，通常，抗CLEC14A结合域在人CLEC14A(完整的多肽序列的残基22(或23)-490)的情况下结合氨基酸成熟CLEC14A序列的469(468，若预测1-22的信号肽)。如上所讨论，抗CLEC14A结合域结合CLEC14A的胞外区。在人CLEC14A的情况下，抗CLEC14A结合域因此特别结合SEQ ID NO.1的490氨基酸序列的残基22(或23)-396内的区域(即人CLEC14A的375(或374)氨基酸胞外域内的区域)，例如在残基22-173处结合C型凝集素域，(或者在残基23-173,22-175,23-175,32-173或32-175处)或在胞外域的残基245-287处结合EGF样区。人CLEC14A进一步包含跨膜域和胞质区(分别在残基397-425和426-490)，并且优选本发明中使用的抗CLEC14A结合域不结合这些区域，或者除了结合CLEC14A的胞外域外至少仅以如上文讨论的亲和力结合。特别地，优选抗CLEC14A结合域以比对CLEC14A的任何其他域，例如对跨膜和/或胞质区更大的亲和力结合胞外域(例如以比对其他CLEC14A区域大至少10,50,100,1000或10000倍的亲和力结合胞外域)。

若本发明中使用的抗CLEC14A结合域能够结合人CLEC14A的直系同源物或天然存在的变体，则优选结合域结合直向同源物或变体中对应于人CLEC14A的胞外域的区域，如上文定义。使用本领域公知的序列比对程序可以容易地确定直系同源蛋白质中的相应区域。

如上所述，在本发明的第一方面，抗CLEC14A结合域能够结合CLEC14A的C型凝集素域。该域可以在残基22-173或残基22-173的1-4个残基内的位置找到，例如在人490个氨基酸的CLEC14A蛋白质序列(如SEQ ID NO.1所示)的残基22-175,23-173,23-175,32-173或32-175处。因此，在本发明的此方面，抗CLEC14A结合域将能够结合到C型凝集素域的此区域(在CLEC14A的胞外域内发现)或在此区域内结合。如上指示，当抗CLEC14A结合域能够结合CLEC14A直向同源物或变体时，在这方面，优选抗CLEC14A结合域结合对应于在人CLEC14A的胞外域内发现的C型凝集素域的区域。可以使用序列比对来鉴定此类相应区域。如上所讨论，抗CLEC14A结合域特别可以以比对CLEC14A中的任何其他区域(例如比人CLEC14A的残基245-287处对EGF样区域)更大的亲和力(例如，大至少10倍，50倍，100倍，1000倍或10000倍)结合C型凝集素域。

特别地，根据本发明的第一方面，抗CLEC14A结合域可以能够结合CLEC14A的C型凝集素域内的表位。在一些情况下，抗CLEC14A结合域可以能够结合在人CLEC14A的残基97-108处发现并且具有ERRRSCHTLENE(SEQ ID NO.24)的氨基酸序列的表位，或结合CLEC14A直向同源物或天然存在的变体中相应的表位。然而，在其他情况下，抗CLEC14A结合域可以结合CLEC14A的C型凝集素域内的不同表位或区域(即不结合残基97-108)。例如33-44,45-56,57-68,69-80,81-92,109-120,121-132,133-144,145-156或157-168或与该区域重叠(与97-108重叠)的区域。因此，第一方面的抗CLEC14A结合域可能与CLEC14A的C型凝集素域内的任何表位或残基结合。

根据本发明的第二方面，尽管抗CLEC14A结合域与CLEC14A的胞外域结合，但它可以不在SEQ ID NO.1的残基22-173处结合C型凝集素域和/或其1-4个残基内的位置，例如，SEQ ID NO.1的22-175,23-173,23-175,32-173或32-175。因此，在第二方面，抗CLEC14A结合域特别结合SEQ ID NO.1的人CLEC14A的残基174-396或SEQ ID NO.1的人CLEC14A的残基175或176-396)。特别地，在这方面，抗CLEC14A结合域可以结合CLEC14A的Sushi域(或称为补体对照蛋白(CCP)域)，其在SEQ ID NO.1的残基174-244(或此位置的1-4个氨基酸残基内，例如在175-244或176-244)发现，或结合CLEC14A直系同源序列或天然存在的变体中的等同部分。特别地，抗CLEC14A结合域可以结合C型凝集素域近端的Sushi域的一部分，例如在残基174-210,174-200或174-190处。

如上所讨论，如本文所定义的抗CLEC14A结合域可以在存在或包含在CAR分子内，并在合适的宿主细胞上表达时与CLEC14A结合。因此，特别地，本发明的CAR或由本发明的核酸分子编码的CAR能够通过CAR的抗CLEC14A结合域与CLEC14A结合。当分离表达时(例如作为配体或配体分子的一部分)或当作为抗体分子的一部分或其片段或scFv表达时，抗CLEC14A结合域还可以能够结合CLEC14A，如上所讨论。

另外，如上文进一步讨论的，在本发明的第一方面中使用的抗CLEC14A结合域可以能够破坏或抑制CLEC14A和MMRN2之间的相互作用。特别地，抗CLEC14A结合域可以能够破坏人CLEC14A和人MMRN2之间的相互作用，其中MMRN2的氨基酸序列如表1的SEQ ID NO.28所示(由SEQ ID NO.29编码)。因此，在这方面，当以分离形式(或作为抗体的一部分或scFv)使用时，抗CLEC14A结合域能够破坏相互作用。相互作用的破坏意味着形成相互作用的CLEC14A和MMRN2分子的量的减少，即抑制CLEC14A和MMRN2之间的结合水平。特别地，在本发明的第一方面中使用的抗CLEC14A结合域可以将CLEC14A和MMRN2之间的结合水平抑制至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。在一个方面，抗CLEC14A结合域可以能够阻止CLEC14A和MMRN2之间的任何相互作用，因此可以完全消除相互作用(即，可以抑制100％的CLEC14A和MMRN2相互作用)。然而，特别地，相互作用水平可以降低到不可检测的水平。

或者，抗CLEC14A结合域可以能够与MMRN2竞争结合CLEC14A。

在这方面，抗CLEC14A结合域可以与CLEC14A的C型凝集素域内的CLEC14A多肽的MMRN2结合区结合。可以使用本领域的常规方法，例如表位作图，竞争结合研究等，确定给定的配体或抗体是否选择性结合MMRN2结合区或与MMRN2竞争对CLEC14A多肽的特异性结合。

确定CLEC14A和MMRN2之间相互作用水平的方法是本领域已知的，包括下拉测定法，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，表面等离振子共振测定法，基于芯片的测定法，免疫细胞荧光，酵母双杂交技术。和噬菌体展示。检测CLEC14A和MMRN2之间相互作用的其他方法包括超滤及离子喷雾质谱法/HPLC方法或其他物理和分析方法。可以使用荧光能量共振转移方法(FRET)，其中可以通过测量荧光标记物在彼此极其附近时的相互作用来测量两个荧光标记实体(即CLEC14A和MMRN2或其部分，直向同源物或变体)的结合。

如下文详细讨论的，抗CLEC14A结合域可以源自结合CLEC14A的抗体，或结合CLEC14A的任何其他配体(例如肽或多肽)。特别地，抗CLEC14A结合域可以源自MMRN2(例如SEQ ID NO.28的人MMRN2)，如上所述，其与CLEC14A相互作用，因此是CLEC14A的配体。抗CLEC14A结合域可以包含全长MMRN2氨基酸序列(例如对于人MMRN2为SEQ ID NO.28)或其至少一部分，其中所述部分能够结合CLEC14A。因此，特别地，MMRN2的一部分可以与全长MMRN2一样具有对CLEC14A的亲和力的至少50,60,70,80,90,100％或更多。或者，MMRN2的一部分可以具有对CLEC14A的亲和力，如上文关于抗CLEC14A结合域所讨论的。

特别地，抗CLEC14A结合域可以包含MMRN2的一部分，其能够结合CLEC14A并破坏MMRN2与CLEC14A的相互作用，如上所讨论。或者或另外，MMRN2的至少一部分可以能够结合CLEC14A的C型凝集素域，更具体地说，能够结合人CLEC14A的残基97-108处找到并且具有氨基酸序列ERRRSCHTLENE(SEQ ID NO.24)的表位，或CLEC14A直向同源物或天然存在的变体中的相应表位。包含在抗CLEC14A结合域内的MMRN2的一部分可以包含来自MMRN2的至少3个连续氨基酸，特别是至少4,5,6,7,8,9,10,15,20或25个氨基酸。

或者，抗CLEC14A结合域可以包含全长MMRN2或其部分的变体，其中所述变体能够结合CLEC14A(例如以如上文关于抗CLEC14A结合域所讨论的亲和力)。变体可以与全长MMRN2或MMRN2的一部分具有至少60,70,80,90,95,96,97,98或99％的序列同一性，并且如上指示，保留与CLEC14A结合的能力。或者，MMRN2变体可以包含一个或多个，例如，两个，三个，四个，五个，十个或十五个与野生型MMRN2序列相比的氨基酸取代，缺失和/或添加，例如保守替代。应当理解，对MMRN2部分的变体进行的氨基酸取代，缺失和/或添加的数目可以与该部分的长度成比例，其中较短的部分可以比较长的部分包含更少的氨基酸取代，添加和/或缺失。

包含在抗CLEC14A结合域内的MMRN2变体序列可以与野生型MMRN2序列对CLEC14A具有不同的结合亲和力，例如，更高或更低的结合亲和力，或变体可以具有对CLEC14A的相同或基本相同的结合亲和力(例如相当的亲和力，例如不超过20倍不同的)。然而，应当理解，如先前所讨论，变体MMRN2或包含MMRN2变体的抗CLEC14A结合域优选对CLEC14A具有结合亲和力。

如本发明第一方面中使用的抗CLEC14A结合域(例如在本发明的CAR中)可以包含任何氨基酸序列，只要该序列具有上述讨论的结合活性，即只要结合域可以与CLEC14A的C型凝集素域结合。然而，特别地，抗CLEC14A结合域可以包含至少一个重链或轻链互补决定区(CDR)，其能够结合CLEC14A的C型凝集素域。可以从能够结合CLEC14A(即CLEC14A的C型凝集素域)的抗体的重链和/或轻链序列预测一个或多个CDR，如上所讨论(即以如上所讨论的亲和力和特异性)。特别地，抗CLEC14A结合域可以包含来自表1中列出的抗体CRT1,3,4或5中的任一种的一个或多个CDR。

与此相关，在本发明的第二方面，抗CLEC14A结合域包含至少一个选自以下的CDR：SEQ ID NO.167，SEQ ID NO.168，SEQ ID NO.169，SEQ ID NO.129，SEQ ID NO.68或SEQ IDNO.130的重链和/或轻链CDR或具有一个，两个或三个氨基酸取代的这些序列中的任何一个的变体，其中可以从抗体CRT2(其结合CLEC14A，如实施例中所示和如表1中所示)的轻链序列(SEQ ID NO.133)和重链序列(SEQ ID NO.173)预测所选择的CDR。

因此，抗CLEC14A结合域可以包含至少一个CDR，其可以从结合CLEC14A的抗体(或此类预测的CDR的变体(例如具有一个，两个或三个氨基酸取代的变体))预测，其中抗CLEC14A结合域以及因此包含抗CLEC14A结合域的CAR能够结合CLEC14A。

应当理解，含有三个或更少CDR区(例如单个CDR或甚至其一部分)的分子可以能够保留CDR来源的抗体的抗原结合活性。含有两个CDR区的分子在本领域中描述为能够结合靶抗原，例如，以微型抗体(minibody)的形式(Vaughan和Sollazzo，2001，CombinationalChemistry&High Throughput Screening，4,417-430)。已经描述了含有单个CDR的分子，其可以展示对靶物的强结合活性(Laune等，1997，JBC，272,30937-44；Nicaise等，2004，Protein Science，13：1882-91)。

在这方面，本发明中使用的抗CLEC14A结合域可以包含一个或多个可变重链CDR，例如，一个，两个或三个可变重链CDR。或者或另外，抗CLEC14A结合域可以包含一个或多个可变轻链CDR，例如，一个，两个或三个可变轻链CDR。然而，特别地，抗CLEC14A结合域可以包含三个重链CDR和三个轻链CDR(更具体地，包括三个CDR的重链可变区和包含三个CDR的轻链可变区)，其中至少一个CDR可以自与CLEC14A结合的抗体预测，或者可以选自下面提供的CDR序列之一。

本发明的抗CLEC14A结合域可以包含可变重链和轻链CDR的任何组合，例如，一个可变重链CDR与一个可变轻链CDR一起，两个可变重链CDR与一个可变轻链CDR一起，两个可变重链CDR与两个可变轻链CDR一起，三个可变重链CDR与一个或两个变量轻链CDR一起，一个可变重链CDR与两个或三个可变轻链CDR一起，或三个可变重链CDR与三个可变轻链CDR一起。

抗CLEC14A结合域内存在的一个或多个CDR可以不是全部从相同抗体预测，只要该域具有上述结合活性即可。因此，一个CDR可以从结合CLEC14A的抗体的重链或轻链预测，而另一个CDR可以从不同的抗体预测。在此类情况下，可以优选从结合CLEC14A的抗体预测CDR3。然而，特别是若抗CLEC14A结合域中存在多于一个CDR，则优选从结合CLEC14A的抗体预测CDR。CDR不需要来自相同的CLEC14A结合抗体，并且可以使用来自不同的CLEC14A抗体，特别是来自结合相同的所需区域或表位的CLEC14A抗体的CDR的组合。

在一个具体实施方案中，抗CLEC14A结合域包含从结合CLEC14A的抗体的可变重链序列预测的三个CDR和从结合CLEC14A的抗体的可变轻链序列预测的三个CDR(优选相同的抗体)。

抗CLEC14A结合域可以进一步包含来自结合CLEC14A的抗体的可变重链和轻链，特别是可以包含scFv，其包含来自结合CLEC14A的抗体的可变重链和轻链。

如本文所用，提及“互补决定区”或“CDR”是指结合特定抗原，例如CLEC14A的抗体内的高变异性区域。因此，抗体的CDR通常对抗体提供具其结合特异性。三个CDR可以存在于完整抗体分子的每个重链的可变区中(即包含两个全长重链和两个全长轻链)，并且三个CDR可以存在于每个轻链的可变区中(重链CDR1,2和3以及轻链CDR1,2和3，从氨基到羧基末端编号)。可以使用本领域可获得的预测软件，使用Abysis算法(www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)，或使用MGT/V-QUEST软件，例如：可以在www.IMGT.org上找到的IMGT算法(ImMunoGeneTics)，参见例如Lefranc等，2009NAR 37：D1006-D1012和Lefranc 2003，Leukemia 17：260-266，从抗体的重链和轻链可变区序列预测抗体重链和轻链可变区的CDR。通过任一算法鉴定的CDR区被认为同样适用于本发明。CDR在长度(这取决于预测它们的抗体)上和及重链和轻链之间可以变化。因此，完整抗体的三个重链CDR具有不同的长度(或可以具有相同的长度)，并且完整抗体的三个轻链CDR可以具有不同的长度(或可以具有相同的长度)。例如，CDR的长度范围可以是2或3个氨基酸至5,6,7,8,9,10,1 1,12,13,14,15,16,17,18,19或20个氨基酸。特别地，CDR的长度可以是3-14个氨基酸，例如至少3个氨基酸且少于20个氨基酸。

重链和轻链可变区的CDR(即重链可变CDR 1,2和3以及轻链可变CDR 1,2和3)通常通过框架区彼此分开。重链和轻链可变区均包含四个框架区(FR1,2,3和4，从氨基到羧基末端编号)。

如本文所用，术语“重链可变区”(VH域)是指抗体分子的重链的可变区。

如本文所用，术语“轻链可变区”(VL域)是指抗体分子的轻链的可变区。哺乳动物抗体的轻链基于其恒定域的氨基酸序列和其可变域的框架区中的一些氨基酸而归为两种明显不同的类型之一：kappa和lamda。

应当注意，在必要时遵循Kabat命名法，以便定义CDR的定位(Kabat等，1991，5thEd，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,647-669，通过引用并入本文)。

提及“抗体”包括但不限于多克隆，单克隆，嵌合，单链，Fab片段和Fab表达文库产生的片段。这些片段包括保留其对靶物的结合活性的完整抗体片段，Fv，F(ab')和F(ab')2片段以及单链抗体(scFv)，融合蛋白和包含抗体的抗原结合位点的其他蛋白质。该术语还包括抗体样分子，其可以使用噬菌体展示技术或分子的其他随机选择技术产生，所述分子结合特定多肽或其特定区域。因此，术语抗体包括含有结构的所有分子，所述结构是天然抗体的识别位点(即与表位或抗原结合或组合的抗体部分)的一部分。此外，抗体及其片段可以是人源化抗体，其中可以使用本领域已知的方法将框架区，例如VH和/或VL的框架区修饰为对应于至少一个人框架区。

如本文所用，“scFv”或“单链可变片段”包括其中抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)通过柔性寡肽连接的分子。因此，scFv是至少一种可变重链和至少一种可变轻链之间的融合物。通常连接可变重链和轻链的柔性寡肽可以长度为从5个氨基酸，特别是从长度为8,9,10或11个氨基酸至20,21,22,23,24,25,26,27,28，29或30个氨基酸，例如长度10-20，12-18或14-17或14-16个氨基酸。柔性寡肽可以包含甘氨酸，丝氨酸和/或苏氨酸残基，并且特别地可以包含至少50,60,70或80％的甘氨酸残基。柔性接头通常可以将可变重链的C末端连接到可变轻链的N末端，或可变轻链的C末端连接到可变重链的N末端。可以使用本领域已知的技术和方法制备工程化抗体，例如scFv抗体。

Fab，Fv，scFv和dAb抗体均可在大肠杆菌中表达并从大肠杆菌中分泌，这允许容易地产生大量抗体片段。完整或完整的抗体是二价的，即具有两个抗原结合位点。Fab，Fv，scFv和dAb片段通常是单价的，因此通常仅具有一个抗原结合位点。因此，单价scFv可包含一个可变重链和一个可变轻链。然而，scFv可以是二价，三价或四价(除单价外)，并且scFv可以包含多于一个可变重链和多于一个可变轻链，例如两个，三个或四个可变重链或可变轻链。多于一个可变重和/或可变轻链可以是相同的或可以来自不同的抗体。scFv可以是双抗体，三体或四体。在这方面，使用的柔性接头可以比上面在单价scFv中使用的更短。

提及“结合CLEC14A的抗体”是指对CLEC14A具有相同结合亲和力的抗体，如上文针对抗CLEC14A结合域所讨论的。特别地，根据本发明的第一方面，结合CLEC14A的抗体与CLEC14A的C型凝集素域结合，如前所述。

在第一方面的另一个实施方案中，抗CLEC14A结合域可以包含以下中的至少一种：

(a)重链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.211或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是(S/T)SYW(I/M)(E/H)(SEQ ID NO.150),GYTF(S/T)SYW(SEQ ID NO.151)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体),

(b)重链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.212或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是WIG(E/A)I(L/Y)PG(S/N)(G/S)(S/D)T(N/S)(SEQ ID NO.152),I(L/Y)PG(S/N)(G/S)(S/D)T(SEQ ID NO.153)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)和/或

(c)重链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.213或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是(A/T)(R/H)(G/X)(G/X)(D/X)Y(D/Y)(E/G)(E/S)(Y/D)Y(V/A/L)MD(SEQID NO.154),(A/T)(R/H)(G/X)(G/X)(D/X)Y(D/Y)(E/G)(E/S)(Y/D)Y(V/A/L)MDY(SEQ IDNO.155)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)，

其中X是无氨基酸残基。

因此，第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含SEQ ID No.150,151,152,153,154或155中的任一个或多个，或SEQ ID No.150-155中任一个或多个的具有一个，两个或三个氨基酸取代的一个或多个变体。在本文所述的氨基酸序列的上下文中使用“/”是指可以存在于特定位置的氨基酸残基的选择。例如，提及“S/T”指示S或T残基可以存在于该位置，并且提及GYTF/X指示在该位置可以存在GYTF或不存在氨基酸。因此抗CLEC14A结合域可以包含一个或多个选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO.150,152和/或154或SEQ ID NO.151,153和/或155，或如先前所定义的任何一种或多种这些序列的变体。

特别地，在该方面，抗CLEC14A结合域可以包含两个或三个上述CDR。最特别地，抗CLEC14A结合域可以包含具有氨基酸序列SEQ ID 150或151的CDR，具有氨基酸序列SEQ IDNO 152或153和CDR，具有氨基酸序列154或155的CDR，或者如先前所定义的任何这些序列的一个或多个变体，例如抗CLEC14A结合域可以包含SEQ ID No 150,152和154或SEQ ID NO151,153和155，或具有一个，两个或三个氨基酸取代的任何这些CDR的一个或多个变体。

此外，本发明的第一方面，抗CLEC14A结合域可以包括以下中的至少一个：

(a)轻链CDR1，其具有氨基酸序列S/X S/X S Y M/L Y/H W Y(SEQ ID NO.156),SSVS Y/S S/X Y/X(SEQ ID NO.157)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,

(b)轻链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.214或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是L L/W IY D/S TSNLA(SEQ ID NO.158),D/S TS或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)和/或

(c)轻链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.215或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是Q/H Q W/Y S/H S/R Y/S P L/R(SEQ ID NO.160),Q/H Q W/Y S/H S/RY/S P L/R T F/X(SEQ ID NO.161)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)，

其中X是无氨基酸。

因此，第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含SEQ ID No.156,157,158,160,161或D/S TS中的任何一个或多个，或其具有1,2或3个氨基酸取代的变体。因此，抗CLEC14A结合域可以包含一个或多个选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO.156,158和/或160或SEQ IDNO.157,161和/或D/S TS，或如先前所述的这些序列中的一个或多个的变体。

特别地，在这方面，抗CLEC14A结合域可以包含两个或三个如上所述的CDR，例如，选自(a)的一个CDR，选自(b)的一个CDR和/或选自(c)的一个CDR。最特别地，抗CLEC14A结合域可以包含SEQ ID 156或157的CDR，SEQ ID NO 158或D/S TS的CDR和160或161的CDR，例如抗CLEC14A结合域可包含SEQ ID Nos 156,158和160或SEQ ID NO 157,161和D/S TS，或具有一个，两个或三个氨基酸取代的任何这些CDR的变体。

第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含选自SEQ ID No.150-155中的任何一个或多个的至少一个CDR和(或/)选自SEQ ID No.156-161中的任何一个或多个的至少一个CDR，例如来自SEQ ID Nos 150-155的两个CDR和来自SEQ ID No 156-161的两个CDR。特别地，第一方面的抗CLEC14A结合域可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO 150或151的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.152或153的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.154或155的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.156或157的CDR，具有氨基酸序列SEQ NO.158或D/S TS的CDR和具有氨基酸序列SEQ ID NO.160或161的CDR，或这些序列中的任何一个的具有一个，两个或三个氨基酸取代的一个或多个变体。在本发明最优选的方面，根据第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含具有SEQ ID NO.150,152,154,156,158和/或160的氨基酸序列或具有SEQ ID No 151,153,155,157,161和/或D/S TS的氨基酸序列的CDR，或这些序列中的任何一个的具有一个，两个或三个氨基酸取代的一个或多个变体。

根据第一方面，更具体地本发明提供了核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体

(i)抗CLEC14A结合域,

(ii)跨膜域和

(iii)胞内信号传导域；

其中所述抗CLEC14A结合域能够结合CLEC14A的C型凝集素域并且其中所述抗CLEC14A结合域包含以下至少一项：

(a)重链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.32,SEQ ID NO.44,SEQ ID NO.64,SEQ ID NO.76或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,

(b)重链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.45,SEQ ID NO.65,SEQ ID NO.77或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体和/或

(c)重链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.116,SEQ ID NO.118,SEQ ID NO.66,SEQ ID NO.78,SEQ ID NO.34,SEQ ID NO.46,SEQ ID NO.100,SEQ ID NO.102或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

因此，抗CLEC14A结合域可包含选自上文所述的重链可变CDR序列的一个，两个或三个CDR。特别地，抗CLEC14A结合域可包含选自(a)中提供的序列的一个CDR，选自(b)中提供的序列的一个CDR和/或来自(c)中提供的序列的一个CDR，或那些序列的具有一个，两个或三个氨基酸取代的一个或多个变体。例如，抗CLEC14A结合域可包含具有氨基酸序列SEQID NO.32的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID No.33的CDR，和具有氨基酸序列SEQ ID NO.66或116的CDR。

根据第一方面，本发明还提供核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含

(i)抗CLEC14A结合域，

(ii)跨膜域和

(iii)胞内信号传导域；

(a)轻链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.47,SEQ ID NO.67,SEQ ID NO.79或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,

(b)轻链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.36,DTS,SEQ ID NO.68,STS或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或

(c)轻链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.37,SEQ ID NO.49,SEQ ID NO.69,SEQ ID NO.81或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体.

因此，抗CLEC14A结合域可包含选自上文所述的轻链可变CDR序列的一个，两个或三个CDR。特别地，抗CLEC14A结合域可包含选自(a)中提供的序列的一个CDR，选自(b)中提供的序列的一个CDR和/或来自(c)中提供的序列的一个CDR，或那些序列的具有一个，两个或三个氨基酸取代的一个或多个变体。例如，抗CLEC14A结合域可包含具有氨基酸序列SEQID NO.35的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID No.68的CDR，和具有氨基酸序列SEQ ID NO.49的CDR。

第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含至少一种选自以下的CDR：SEQ ID Nos 32,33,34,44,45,46,100,102,116,118,64,65,66,76,77,或78中的任一个或多个和(/或)至少一种选自以下的CDR：SEQ ID Nos 35,36,37,47,49,67,68,69,79,81,STS或DTS中的任一个或多个，例如来自SEQ ID Nos 32,33,34,44,45,46,100,102,116,118,64,65,66,76,77,或78的两个CDR和来自SEQ ID Nos.35,36,37,47,49,67,68,69,79,81,STS或DTS的两个CDR。特别地，第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含具有氨基酸序列SEQ ID NO 32,44,64或76的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.33,45,65或77的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.34,46,100,102,116,118,66或78的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.35,47,67或79的CDR，具有氨基酸序列SEQ NO.36,68,STS或DTS的CDR，和具有氨基酸序列SEQ ID NO.37,49,69或81的CDR，或这些序列的任一个的具有1、2或3个氨基酸取代的一个或多个变体。

更具体地，抗CLEC14A结合域可以包含以下至少一个

(a)重链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.209或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是SEQ ID NO.32,SEQ ID NO.44,或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体),

(b)重链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.210或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.45,或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)，和/或

(c)重链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.207或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是SEQ ID NO.116,SEQ ID NO.118,SEQ ID NO.34,SEQ ID NO.46,SEQ IDNO.100,SEQ ID NO.102或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)。

因此，如上文指示，抗CLEC14A结合域可以包含两个或三个上述CDR并且可以特别包含选自(a)的一个CDR，选自(b)的一个CDR和/或选自(c)的序列的一个CDR。因此，优选地，抗CLEC14A结合域可以包含选自以下的至少一个重链CDR：SEQ ID NO.32,33和/或34；SEQID NO.44,45和/或46；SEQ ID NO.32,33和/或100；SEQ ID NO.44,45和/或102；SEQ IDNO.32,33和/或116或SEQ I D NO.44,45和/或118或这些序列的任一个或多个的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

在一个特别优选的实施方案中，第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含具有以下氨基酸序列的CDR：

SEQ ID NO.32,SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34,

SEQ ID NO.44,SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46,

SEQ ID NO.32,SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.100,

SEQ ID NO.44,SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.102,

SEQ ID NO.32,SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.116,或

SEQ ID NO.44,SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.102,

其中任何以上所示的序列可以包含1、2或3个氨基酸取代。

此外，抗CLEC14A结合域可以包含以下至少一个：

(a)轻链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.47或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,

(b)轻链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.36,DTS或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或

(c)轻链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.208或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是SEQ ID NO.37,SEQ ID NO 49,或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)。

因此，如上文指示，抗CLEC14A结合域可以包含两个或三个上述CDR并且可以特别包含选自(a)的一个CDR，选自(b)的一个CDR和/或选自(c)的序列的一个CDR。因此，优选地，抗CLEC14A结合域可以包含选自以下的至少一个轻链CDR：SEQ ID NO.35,36和/或37；SEQID NO.47,49和/或DTS；或SEQ ID NO.47，和/或DTS；或这些序列的任一个或多个的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。在一个特别优选的实施方案中，第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.36,和SEQ ID NO.37；或SEQ ID NO.47,DTS和SEQ ID NO.49的CDR，其中任一个或多个上述序列可以具有1、2或3个氨基酸取代。

第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含至少一个选自以下的CDR：SEQ ID Nos 32,33,34,44,45,46,100,102,116或118中的任一个或多个和至少一个选自以下的CDR：SEQ IDNos 35,36,37,47,或49或DTS中的任一个或多个，例如选自SEQ ID Nos 32,33,34,44,45,46,100,102,116或118的两个CDR和选自SEQ ID Nos.35,36,37,47或49或DTS的两个CDR。特别地，第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含具有氨基酸序列SEQ ID NO 32或44的CDR,具有氨基酸序列SEQ ID NO.33或45的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.34,46,100,102,116或118的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.35或47的CDR，具有氨基酸序列SEQ NO.36或DTS的CDR和具有氨基酸序列SEQ ID NO.37或49的CDR或这些序列的任一个的具有1、2或3个氨基酸取代的一个或多个变体。

特别地，抗CLEC14A结合域可以包含具有以下氨基酸序列的CDR：

SEQ ID NO.32,SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.34,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.36和/或SEQ ID NO.37；

SEQ ID NO.44,SEQ ID NO.45,SEQ ID NO.46,SEQ ID NO.47,DTS，和/或SEQ IDNO.49；

SEQ ID NO.32,SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.100,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.36，和/或SEQ ID NO.37；

SEQ ID NO.44,SEQ ID NO.45,SEQ ID NO.102,SEQ ID NO.47,DTS，和/或SEQ IDNO.49；

SEQ ID NO.32,SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.116,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.36，和/或SEQ ID NO.37；或者

SEQ ID NO.44,SEQ ID NO.45,SEQ ID NO.118,SEQ ID NO.47,DTS和/或SEQ IDNO.49,

其中任一个或多个上述SEQ ID No可以包含1、2或3个氨基酸取代。

或者，抗CLEC14A结合域可以包含

(a)重链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.209；

(b)重链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.210；

(c)重链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.207；

(d)轻链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.35或47；

(e)轻链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.36或DTS和/或

(f)轻链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.208。

或者，第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含以下至少一个

(a)重链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.216或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是SEQ ID NO.64,SEQ ID NO.76或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体),

(b)重链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.217或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是SEQ ID NO.65,SEQ ID NO.77或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)，和/或

(c)重链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.218或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是SEQ ID NO.66,SEQ ID NO.78或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)。

在此实施方案中，抗CLEC14A结合域可以特别包含来自(a)的一个CDR，来自(b)的一个CDR和/或来自(c)的一个CDR，例如至少一个选自以下的CDR：SEQ ID NO.64,SEQ IDNO.65和SEQ ID NO.66或至少一个选自以下的CDR：SEQ ID NO.76,SEQ ID NO.77和SEQ IDNO.78，或这些序列中任一个的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

因此，在一个优选的实施方案中，第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含具有以下序列的CDR：

SEQ ID NO.64,SEQ ID NO.65和/或SEQ ID NO.66或

SEQ ID NO.76,SEQ ID NO.77和/或SEQ ID NO.78,

其中任何上文所示的序列可以具有1、2或3个氨基酸取代。

此外，第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含以下至少一个

(a)轻链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.219或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是SEQ ID NO.67,SEQ ID NO.79或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体),

(b)轻链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.220或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是SEQ ID NO.68,STS或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)，和/或

(c)轻链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.221或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是SEQ ID NO.69,SEQ ID NO.81或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)。

在此实施方案中，抗CLEC14A结合域可以特别包含来自(a)的一个CDR，来自(b)的一个CDR和/或来自(c)的一个CDR，例如至少一个选自以下的CDR：SEQ ID NO.67,68或69，或至少一个选自以下的CDR：SEQ ID NO.79,81或STS，或任何这些序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

因此，特别地，在此方面，抗CLEC14A结合域可以包含具有以下序列的CDR：

SEQ ID NO.67,SEQ ID NO.68和/或SEQ ID NO.69,或

SEQ ID NO.79,STS和/或SEQ ID NO.81,

其中任一个或多个上述序列可以包含1、2或3个氨基酸取代。

第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含至少一个选自以下的CDR：SEQ ID Nos 64,65,66,76,77和78中的任一个或多个和至少一个选自以下的CDR：SEQ ID Nos 67,68,69,79,81或STS中的任一个或多个，例如两个选自SEQ ID Nos 64,65,66,76,77和78的CDR和两个选自SEQ ID Nos.67,68,69,79,81或STS的CDR。特别地，第一方面的抗CLEC14A结合域可以包含具有氨基酸序列SEQ ID NO 64或76的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.65或77的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.66或78的CDR，具有氨基酸序列SEQ ID NO.67或79的CDR，具有氨基酸序列SEQ NO.68或STS的CDR和具有氨基酸序列SEQ ID NO.69或81的CDR，或这些序列的任一个的具有1、2或3个氨基酸取代的一个或多个变体。

特别地，抗CLEC14A结合域可以包含具有以下氨基酸序列的CDR：

SEQ ID NO 64,SEQ ID NO.65,SEQ ID No.66,SEQ ID NO.67,SEQ ID NO.68和/或SEQ ID NO.69或

SEQ ID NO.76,SEQ ID NO.77,SEQ ID NO.78,SEQ ID NO.79,STS和/或SEQ IDNO.81

其中任一个或多个上述序列可以包含1、2或3个氨基酸取代。

如先前讨论，根据本发明的第二方面，抗CLEC14A结合域包含以下至少一项：

(a)重链CDR，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.167或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,

(c)重链CDR，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.169或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体

(d)轻链CDR，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.129或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,

因此，在第二方面，抗CLEC14A结合域可以包含来自(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和/或(f)的一个，两个或三个CDR，特别是来自(a)的一个CDR，来自(b)的一个CDR和来自(c)的一个CDR，和/或来自(d)的一个CDR，来自(e)的一个CDR和来自(f)的一个CDR，或这些序列的任何一个或多个的具有一个，两个或三个氨基酸取代的变体。

因此，特别地，根据第二方面，抗CLEC14A结合域包含具有SEQ ID NO.167，SEQ IDNO.168和SEQ ID NO.169和/或SEQ ID NO.129，SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.130的氨基酸序列的CDR。

如上所讨论，抗CLEC14A结合域可包含上文讨论的任何CDR序列的变体序列。在这方面，抗CLEC14A结合域中存在的任何CDR序列中的一个或多个可以是变体序列。例如，当抗CLEC14A结合域包含来自可变重链抗体序列的1-3个CDR时，那些CDR中的任何一个、全部或无一可以是变体。或者，当抗CLEC14A结合域包含来自轻链抗体序列的1-3个CDR时，那些CDR中的任何一个，全部或无一可以是变体。因此，当抗CLEC14A结合域包含6个CDR(例如来自重链的3个CDR和来自轻链的3个CDR)时，存在的CDR序列中的一个，两个，三个，四个，五个或六个可以是变体序列并且抗CLEC14A结合域内每个单独的CDR可具有一个，两个或三个氨基酸取代。抗CLEC14A结合域可包含非变体CDR序列和变体CDR序列两者。或者，抗CLEC14A结合域可包含所有变体CDR序列或不包含变体CDR序列。

如前所讨论，变体CDR可包含一个，两个或三个氨基酸取代。然而，应当理解，对于较短的CDR序列，可以优选具有较少的氨基酸取代。例如，在CDR序列长度仅为3个氨基酸的情况下，尽管可以存在3个氨基酸取代(例如保守取代)，但优选CDR可具有少于3个取代，例如两个，一个或无氨基酸取代。

如下文进一步讨论的，变体可具有任何氨基酸取代，但优选可具有保守氨基酸取代。特别地，包含变体CDR的抗CLEC14A结合域(和内部包含它的CAR)应当保持能够结合CLEC14A，如先前所定义的。应当理解，使用变体CDR可以改变抗CLEC14A结合域的结合活性(例如，CLEC14A的结合亲和力可以增加或减少，或者结合域可以识别CLEC14A的不同表位)。然而，如上所述，使用一个或多个变体CDR序列仍应允许如前所定义的CLEC14A结合，即使该结合与包含一个或多个非变体CDR的抗CLEC14A结合域的结合不相同。或者，结合亲和力可以类似，如前所述。可优选在抗CLEC14A结合域中使用一个或多个变体CDR，其产生抗CLEC14A结合域(和本发明的CAR)，其对CLEC14A具有降低的结合亲和力。以此类方式，可以减少脱靶CLEC14A结合并且特别地可以使其最小化(例如与非肿瘤组织结合)，同时维持中靶结合(即结合肿瘤血管系统)。因此，在本发明的另一个实施方案中，涵盖用于鉴定对CLEC14A具有降低的结合亲和力的抗CLEC14A结合域的方法，其中所述方法包括将一个或多个氨基酸取代(特别是一个，两个或三个氨基酸取代)引入包含在抗CLEC14A结合域内的如本文所定义的CDR序列中，并测试变体域对CLEC14A的结合亲和力。

本发明进一步提供包含含有任何一种或多种上文定义的CDR序列或其变体的重链可变区和/或轻链可变区的抗CLEC14A结合域。因此，上述定义的CDR可以存在于抗CLEC14A结合域内的重链和/或轻链可变区内。如前所讨论，抗CLEC14A结合域可包含具有三个CDR的VH和/或具有三个CDR的VL，其中至少一个CDR选自上文列出的CDR序列之一，或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

根据本发明的第一方面，抗CLEC14A结合域可以包含以下氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.56,

(b)SEQ ID NO.88,

(c)SEQ ID NO.90,

(d)SEQ ID NO.104

(e)SEQ ID NO.106或

(0SEQ ID NO.121,

或(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任何一个的与其具有至少80％的同一性，例如，1-20，例如1到10个氨基酸取代的变体。

根据本发明的第二方面，抗CLEC14A结合域可包含SEQ ID NO.173的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性，例如1-20，例如1到10个氨基酸取代的其变体。

因此，根据该方面，抗CLEC14A结合域可包含如上所述的可变重链序列或与其具有至少80％同一性的其变体，如下文进一步所定义，例如具有一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，十五个或二十个氨基酸取代的变体。应当理解，重链可变序列(例如SEQ ID NO.56,88,90,104,106,121和173的那些)可包含一个或多个CDR(例如3个CDR)。在这方面，尽管可以改变上述重链可变区序列，例如，最多20％(例如，通过多达20个氨基酸取代)，优选在重链可变区内发生的任何CDR各自仅经历最多三个氨基酸取代(例如，每个CDR的一个，两个或三个氨基酸取代)。因此，关于SEQ ID NO.56，尽管涵盖了与其具有至少80％同一性的变体，但优选其中包含的SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34的序列各自仅具有最多三个氨基酸取代。关于SEQ ID NO.88，优选其中包含的序列SEQ IDNO.64,65和66各自仅具有最多三个氨基酸取代。这也适用于SEQ ID NO.90中包含的SEQ IDNos 76,77和78，在SEQ ID NO.104中包含的SEQ ID NO:32,33和100，在SEQ ID NO.106中包含的SEQ ID NO.44,45和102，在SEQ ID NO.121中包含的SEQ ID NO:32,33和116以及SEQID No 173中包含的SEQ ID NOs 167,168和169。

根据本发明的第一方面，抗CLEC14A结合域可包含以下氨基酸序列

(a)SEQ ID NO.57

(b)SEQ ID NO.89

(c)SEQ ID NO.91

(d)SEQ ID NO.105

(e)SEQ ID NO.107或

(f)SEQ ID NO.122,

或(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任何一个的与其具有至少80％的同一性，例如具有1-20，例如1到10个氨基酸取代的变体。

根据本发明的第二方面，抗CLEC14A结合域可包含SEQ ID NO.133的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性，例如具有1-20，例如1到10个氨基酸取代的变体的其变体。

因此，根据这些方面，抗CLEC14A结合域可包含如上所述的可变轻链序列或其具有至少80％同一性，例如具有至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，十五个或二十个氨基酸取代的其变体。应当理解，轻链可变序列(例如SEQ ID NO.57,89,91,105,107或122或133的那些)可包含一个或多个CDR(例如3个CDR)。在这方面，尽管上述轻链可变区序列可以改变例如至多20％，优选在轻链可变区内发生的任何CDR各自仅经历最多三个氨基酸取代(例如每个CDR的一个，两个或三个氨基酸取代)。因此，关于SEQ IDNO.57，尽管涵盖了与其具有至少80％同一性的变体，但优选本文含有的SEQ ID NO.35，SEQID NO.36和SEQ ID NO.37的序列仅各自具有最多三个氨基酸取代。关于SEQ ID NO.89，优选本文含有的序列SEQ ID NO.67,68和69各自仅具有最多三个氨基酸取代。这也适用于SEQID NO:91中包含的SEQ ID Nos 79,81和STS中，在SEQ ID NO.105中包含的SEQ ID NO:35,36和37，以及SEQ ID NO.107包含的SEQ ID NO 47和49和DTS，SEQ ID NO.112内包含的SEQID NO:35,36和37和SEQ ID NO.133中包含的SEQ ID NOs 129,68和130。

特别地，根据本发明的第一方面，抗CLEC14A结合域可包含与CLEC14A结合(即与CLEC14A上的C型凝集素域结合)的重链和轻链可变序列。因此，抗CLEC14A结合域可以包含SEQ ID Nos 56,88,90,104,106或121或与其具有至少80％同一性的其变体，以及SEQ IDNos 57,89,91，105,107或122中的任一个或与其具有至少80％同一性的其变体。因此，在这方面，抗CLEC14A结合域可以包含

(a)SEQ ID NO.56或与其具有至少80％同一性的其变体和SEQ ID NO.57或与其具有至少80％同一性的其变体

(b)SEQ ID NO.88或与其具有至少80％同一性的其变体和SEQ ID NO.89或与其具有至少80％同一性的其变体

(c)SEQ ID NO.90或与其具有至少80％同一性的其变体和SEQ ID NO.91或与其具有至少80％同一性的其变体

(d)SEQ ID NO 104或与其具有至少80％同一性的其变体和SEQ ID NO.105或与其具有至少80％同一性的其变体

(e)SEQ ID NO 106或与其具有至少80％同一性的其变体和SEQ ID NO.107或与其具有至少80％同一性的其变体或

(f)SEQ ID NO.121或与其具有至少80％同一性的其变体和SEQ ID NO.122或与其具有至少80％同一性的其变体。

如上所讨论，优选SEQ ID Nos 56,57,88,89,90,91,104,105,106,107,121和122的重链和轻链可变区内存在的任何CDR仅具有至多每个CDR一个，两个或三个氨基酸取代。

在本发明的第二方面，抗CLEC14A结合域可包含与CLEC14A结合(即与CLEC14A上的C型凝集素域结合)的重链和轻链可变序列。因此，抗CLEC14A结合域可包含SEQ ID NO.173的重链可变序列和SEQ ID NO.133的轻链可变序列或与其具有至少80％同一性的任一或两种序列的变体。

如前所讨论，根据本发明的“变体”序列是指与定义的或参考序列(即由SEQ IDNO.提供的)相比具有许多氨基酸取代的序列。因此，与原始序列相比，变体序列可具有不同的氨基酸残基。尽管可以进行任何氨基酸取代以获得变体序列，但如前所述，任何此类变体序列应当在某种程度上保留原始序列的功能活性，例如，结合亲和力。因此，尽管与原始序列相比，变体可具有增加或减少的功能活性(例如结合亲和力)，但应保留一些功能。在包含变体CDR或变体重链或轻链的本发明的抗CLEC14A结合域的情况下，优选包含变体序列的抗CLEC14A结合域仍然可以与CLEC14A结合。尽管变体的实际结合亲和力可能与抗CLEC14A结合域不同(增加或减少)，但仍应选择性地发生与CLEC14A的结合。

因此，包含变体序列(例如CDR或重链/轻链)的抗CLEC14A结合域应当优选具有与包含非变体序列的抗CLEC14A结合域基本相同的结合亲和力。例如，变体可以具有有非变体序列的抗CLEC14A结合域的结合亲和力的至少20,30,40,50,60,70,80,85,90,95,100,105,110,115,120或125％或更多。检测和测量对CLEC14A的结合亲和力的方法是本领域已知的。例如，可以使用下拉测定法，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，表面等离振子共振测定法，基于芯片的测定法，免疫细胞荧光，酵母双杂交技术和噬菌体展示。

本文描述的氨基酸取代可以是保守氨基酸取代，例如其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(如甘氨酸，半胱氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，保守氨基酸取代包括 Gly或Pro；或His； Ile(I)<→Leu；Val或Met；或Cys；或Trp；和或Ala。

在第一方面的另一个实施方案中，抗CLEC14A结合域可以包含scFv，其包含上文定义的重链和轻链，其中所述重链和轻链通过如先前定义的接头序列连接。特别地，在此方面，抗CLEC14A结合域可以包含以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.58

(b)SEQ ID NO.96

(c)SEQ ID NO.112,或

(d)SEQ ID NO.125,

或与其具有至少80％同一性的序列。

在第二方面的另一个实施方案中，抗CLEC14A结合域可包含scFv，其包含上文定义的重链和轻链(SEQ ID No.133和173)，其中所述重链和轻链通过如前所定义的接头序列连接。特别是在这方面，抗CLEC14A结合域可以包含SEQ ID NO.175的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列。

因此，技术人员将理解，可以将变体序列用于本发明的抗CLEC14A结合域中的SEQID NO.58,96,112,125或175的scFv序列。如上所讨论，此类变体优选保留未修饰的scFv序列的结合亲和力，或者基本上保留未修饰的scFv序列的结合亲和力，例如可以具有未修饰的scFv序列的结合亲和力的至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％或120％。

与未修饰的氨基酸或核苷酸序列具有至少80％同一性的本发明的氨基酸或核苷酸序列包括具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的序列。例如，关于SEQ ID No.58，96,112,125或175的上述scFv序列，涵盖与其具有至少85,90,95,96,97,98或99％同一性的序列。可以通过任何方便的方法评估序列同一性。然而，为了确定序列之间的同一性程度，进行序列多重比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W。若期望的话，Clustal W算法可以与BLOSUM 62评分矩阵和缺口开放罚分10并且缺口延伸罚分0.1一起使用，从而在两个序列之间获得最高阶匹配，其中序列之一的总长度的至少50％参与比对。计算两个氨基酸序列之间的百分比同一性的其他方法通常是本领域公认的，包括例如Computational Molecular Biology，Lesk编Oxford University Press,New York,1988,Biocomputing:Informatics and Genomics Projects中描述的那些。

通常，计算机程序将用于此类计算。比较和比对序列对的程序，如ALIGN，FASTA，由缺口的BLAST，BLASTP，BLASTN或GCG也可用于此目的。此外，欧洲生物信息学研究所的Dali服务器提供基于结构的蛋白质序列比对。

通过提供参考点，可以使用ALIGN程序以默认参数(例如，在GENESTREAM网络服务器，IGH,Montpellier,France在因特网上可用)确定具有80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性等的根据本发明的序列。

如上所讨论，与本发明的限定序列具有至少80％序列同一性的变体序列优选仅在其中包含的特定CDR内具有最多3个氨基酸取代。因此，尽管变体可以在其整个长度上与限定的序列显示出至少80％的同一性，但优选其中包含的任何CDR将仅具有最多3个氨基酸取代，例如，无一，一个或两个氨基酸取代。因此，在此类情况下，优选在任何CDR之外的重链或轻链可变链序列或scFv序列的区域中发生变异，例如在框架区内。对于任何CDR之外的变异，例如，在框架区中，变异可包括氨基酸取代，缺失和/或添加。

应当理解，对于VH，VL和scFv，例如，如在抗CLEC14A结合域内，变异可包括框架区的人源化。VH，VL或scFv可以以已知方式人源化，例如通过将鼠序列的CDR区插入人抗体的框架中。可以使用Verhoeyen等(1988)Science，239,1534-1536和Kettleborough等，(1991)Protein Engineering，14(7)，773-783中描述的技术和方法制备人源化抗体。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基取代。通常，人源化抗体将含有可变域，其中所有或大部分CDR区对应于非人免疫球蛋白的域，和框架区基本上或完全是人免疫球蛋白共有序列的域。

根据第一方面，多核苷酸序列可包含以下中的至少一种：

(a)SEQ ID NO.38,SEQ ID NO.50,SEQ ID NO.82,或其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，

(b)SEQ ID NO.39,SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.83,或其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，

和/或

(c)SEQ ID NO.40,SEQ ID NO.52,SEQ ID NO.84,SEQ ID NO.101,SEQ IDNO.103,SEQ ID NO.117,SEQ ID NO.120,或其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

上文定义的核苷酸序列各自编码重链CDR，其可存在于本文所述的抗CLEC14A结合域内。(a)中列出的核苷酸序列编码抗体CRT1,3,4和5的重链CDR1序列(因此SEQ ID NO 38编码SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.50编码SEQ ID NO.44并且SEQ ID NO.82编码SEQ IDNO.76)，(b)中列出的核苷酸序列编码抗体CRT1,3,4和5的重链CDR2序列(因此SEQ IDNO.39编码SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.51编码SEQ ID NO.45并且SEQ ID NO.83编码SEQ IDNO.77)并且(c)中列出的核苷酸序列编码抗体CRT1,3,4和5的重链CDR3序列(因此SEQ IDNO.44编码SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.52编码SEQ ID NO.46，SEQ ID NO.84编码SEQ IDNO.78，SEQ ID NO.101编码SEQ ID NO.100，SEQ ID NO.117编码SEQ ID NO.116并且SEQ IDNO.120编码SEQ ID NO.118)。因此，多核苷酸可包含任何一种限定的核苷酸序列，例如这些序列中的2或3种。特别地，多核苷酸序列可包含一个来自(a)的核苷酸序列，一个来自(b)的核苷酸序列和/或一个来自(c)的核苷酸序列。

此外，涵盖简并变体。应当理解，由于遗传密码的简并性，几种不同的核苷酸序列可以编码相同的氨基酸序列。因此，对于特定的氨基酸，超过一个核苷酸密码子可以编码该氨基酸。因此，简并变体涵盖编码与SEQ ID NO.1所定义的核苷酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸变体。特别地，简并变体可以涵盖密码子优化的变体，其中可以进行密码子优化以增强编码序列在特定生物体中的表达。这是本领域的标准实践，并且技术人员将充分了解如何根据宿主密码优化核苷酸序列。

另外或或者，如第一方面中所定义的多核苷酸可包含以下核苷酸序列中的至少一种：

(a)SEQ ID NO.41,SEQ ID NO.53,SEQ ID NO.85,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，

(b)SEQ ID NO.42,GACACATCC,AGCACATCC,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体和/或

(c)SEQ ID NO.43,SEQ ID NO.55,SEQ ID NO.87,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

上文定义的核苷酸序列各自编码轻链CDR，其可存在于本文所述的抗CLEC14A结合域内。(a)中列出的核苷酸序列编码抗体CRT1,3,4和5的轻链CDR1序列(因此SEQ ID NO.41编码SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.53编码SEQ ID NO.47，并且SEQ ID NO.85编码SEQ IDNO.79)，(b)中列出的核苷酸序列编码抗体CRT1,3,4和5的轻链CDR2序列(因此，SEQ IDNO.42编码SEQ ID NO.36，GACACATCC编码DTS和AGCACATCC编码STS)，(c)中列出的核苷酸序列编码抗体CRT1,3,4和5的轻链CDR3序列(因此SEQ ID NO.43编码SEQ ID NO.37，SEQ IDNO.55编码SEQ ID NO.49，并且SEQ ID NO.87编码SEQ ID NO.81)。因此，多核苷酸可包含任何一种限定的核苷酸序列，例如这些序列中的2或3种。特别地，多核苷酸序列可包含一个来自(a)的核苷酸序列，一个来自(b)的核苷酸序列和/或一个来自(c)的核苷酸序列。

多核苷酸序列可包含至少一个选自以下的编码重链CDR的核苷酸序列：SEQ IDNos 38,39,40,50,51,52,82,83,84,101,103,117或120中的任一个或多个和至少一个选自以下的编码轻链CDR的核苷酸序列：SEQ ID Nos 41,42,43,53,55,85,87，AGCACATCC或GACACATCC中的任何一个或多个，例如至少两个选自SEQ ID Nos 38,39,40,50,51,52,82,83,84,101,103,117或120的核苷酸序列和至少两个选自SEQ ID Nos 41,42，43，53,55,85,87，AGCACATCC或GACACATCC的核苷酸序列。特别地，多核苷酸序列可包含SEQ ID Nos 38,50或82的一个核苷酸序列；SEQ ID Nos 39,51或83的一个核苷酸序列；SEQ ID Nos 40,52,84,101,103,117或120的一个核苷酸序列；41,53或85的一个核苷酸序列；42，或AGCACATCC或GACACATCC的一个核苷酸序列和43,45或87的一个核苷酸序列，或具有1、2或3个核苷酸取代的这些序列的一个或多个变体。

更具体地，多核苷酸可包含至少一种以下的核苷酸序列

(a)SEQ ID NO.38,SEQ ID NO.50,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体

(b)SEQ ID NO.39,SEQ ID NO.51,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或

(c)SEQ ID NO.40,SEQ ID NO.52,SEQ ID NO.101,SEQ ID NO.103,SEQ IDNO.117,SEQ ID NO.120,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

因此，如上文指示，多核苷酸可以包含上述核苷酸序列中的两个或三个，并且可以特别包含一个来自(a)的核苷酸，一个来自(b)的核苷酸和/或一个来自(c)的核苷酸。更特别地，多核苷酸序列可以包含SEQ ID Nos 38,39和/或40；SEQ ID Nos 50,51和/或52；SEQID NOS 38,39和/或101,SEQ ID Nos 50,51和/或103；SEQ ID Nos 38,39和/或117或SEQID NOs 50,51和/或120,或这些序列的任一个的具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

在一个特别优选的实施方案中，第一方面的多核苷酸可以包含以下核苷酸序列：

SEQ ID NO.38,SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40

SEQ ID NO.50,SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52

SEQ ID NO.38,SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.101

SEQ ID NO.50,SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.103

SEQ ID NO.38,SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.117或

SEQ ID NO.50,SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.120,

其中任何上述序列可以包含1、2或3个核苷酸取代。

此外，多核苷酸可以包含以下至少一个以下的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO.41,SEQ ID NO.53,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体

(b)SEQ ID NO.42或GACACATCC,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体和/或

(c)SEQ ID NO.43,SEQ ID NO.55,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体.

因此，如上文指示，多核苷酸可以包含上述核苷酸序列中的两个或三个，并且可以特别包含一个来自(a)的核苷酸，一个来自(b)的核苷酸和/或一个来自(c)的核苷酸。更特别地，多核苷酸序列可以包含至少一个选自SEQ ID NO.41,42和/或43的核苷酸序列；或至少一个选自SEQ ID NO.53,55和/或GACACATCC的核苷酸序列，或这些序列的任一个或多个的具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

在一个具体的实施方案中，多核苷酸序列可以包含SEQ ID NO.41,SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43，或SEQ ID NO.53,GACACATCC和SEQ ID NO.55，其中核苷酸序列的任一个或多个可以具有1、2或3个核苷酸取代或简并序列。

第一方面的多核苷酸可以包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID Nos 38,39,40,50,51,52,101,103,117或120中的任一个或多个和至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID Nos 41,42,43,53或55或GACACATCC中的任一个或多个，例如至少两个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID Nos 38,39,40,50,51,52,101,103,117或120中的任一个或多个和至少两个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID Nos 41,42,43,53,或55或GACACATCC中的任一个或多个。特别地，多核苷酸序列可以包含核苷酸序列SEQ ID NO.38或50；核苷酸序列SEQ IDNO.39或51；核苷酸序列SEQ ID NO.40,52,101,103,117或120，核苷酸序列SEQ ID NO.41或53；核苷酸序列SEQ ID NO.42或GACACATCC和核苷酸序列SEQ ID NO.43或55。

特别地，多核苷酸序列可以包含以下核苷酸序列：

SEQ ID NO.38,39,40,41,42和43；

SEQ ID NO.50,51,52,53,55和GACACATCC；

SEQ ID NO.38,39,101,41,42和43；

SEQ ID NO.50,51,103,53,55和GACACATCC；

SEQ ID NO.38,39,117,41,42和43；或

SEQ ID NO.50,51,120,53,55和GACACATCC，

其中任何一个或多个上述SEQ ID No可以包含1、2或3个氨基酸取代或者是其简并序列。

或者，多核苷酸序列可以包含以下至少一个：

(a)SEQ ID NO.82,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体

(b)SEQ ID NO.83,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或

(c)SEQ ID NO.84,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

特别地，多核苷酸可以包含SEQ ID NO.82,83或84序列中的两个或者可以包含SEQID Nos 82,83和84的全部。

此外，多核苷酸可以包含以下至少一个

(a)SEQ ID NO.85,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体

(b)AGCACATCC,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或

(c)SEQ ID NO.87,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

特别地，多核苷酸序列可以包含SEQ ID NO.85,87或AGCACATCC的序列中的两个或可以包含SEQ ID NOs 85,87和AGCACATCC的全部。第一方面的多核苷酸序列可以包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO.82,83和84中的任一个或多个和至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO.85,87和AGCACATCC中的任一个或多个，例如两个来自SEQ IDNos 82,83和84的核苷酸序列和两个来自SEQ ID Nos 85,87和AGCACATCC的核苷酸序列。特别地，多核苷酸序列可以包含SEQ ID Nos 82,83,84,85,87和AGCACATCC的全部，其中任一个或多个序列可以包含1、2或3个核苷酸取代。

根据本发明的第二方面，多核苷酸序列可以包含以下至少一个：

(a)SEQ ID NO.170,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体,

(b)SEQ ID NO.171,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或

(c)SEQ ID NO.172,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

因此，多核苷酸序列可以包含两个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO.170,SEQID NO.171和SEQ ID NO.172。特别地，根据第二方面，多核苷酸序列可以包含SEQ IDNO.170,SEQ ID NO.171和SEQ ID NO.172。

如先前讨论，根据本发明的第二方面，多核苷酸序列可以包含以下至少一个:

(a)SEQ ID NO.131,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体,

(b)SEQ ID NO.74,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或

(c)SEQ ID NO.132,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体.

因此，在第二方面，多核苷酸序列可包含选自SEQ ID NO.131，SEQ ID NO.74和SEQID NO.132的两个核苷酸序列。特别地，根据第二方面，多核苷酸序列可包含SEQ ID NO131,74和132。

此外，根据第二方面，多核苷酸序列可包含SEQ ID Nos 170,171,172,131,74和/或132中的任何一个或多个。特别地，多核苷酸序列可包含SEQ ID No.170,171,172,131,74和132的全部，或那些序列中的任何一个或多个的简并变体，或任何一个或多个序列的具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

如上所讨论，多核苷酸序列可包含上文列出的任何核苷酸序列的变体。在这方面，一个或多个核苷酸序列可以是变体序列。例如，当多核苷酸包含1-3个编码重链CDR的限定核苷酸序列时，那些序列中的任何一个，全部或无一可以是变体。或者，当多核苷酸序列包含1-3个编码轻链CDR的限定核苷酸序列时，那些序列中的任何一个、全部或无一是变体。因此，当多核苷酸包含编码轻链和重链CDR的6个核苷酸序列(例如3个编码轻链和3个编码重链)时，CDR编码核苷酸序列中的一个，两个，三个，四个，五个或六个可以可以是变体序列，每个单独的核苷酸序列可以包含1、2或3个核苷酸取代。多核苷酸序列可以包含变体和非变体核苷酸序列两者，或备选可以包含所有变体或不包含变体核苷酸序列。

本领域技术人员将理解，由于核酸编码的简并性，序列内的核苷酸取代可以或可以不导致编码的蛋白质或多肽序列中的氨基酸改变。因此，多个密码子可以编码相同的氨基酸。在这方面，本发明的核苷酸变体可以编码与非变体序列相同的氨基酸序列。若核苷酸取代确实导致氨基酸取代，则优选如上所讨论，取代是保守的(尽管本发明不限于保守氨基酸取代)并且编码的抗CLEC14A结合域具有上文先前讨论的功能。

根据本发明的第一方面，多核苷酸序列可以包含以下任何一种

(a)SEQ ID NO.59,

(b)SEQ ID NO.92,

(c)SEQ ID NO.94,

(d)SEQ ID NO.108,

(e)SEQ ID NO.110,或

(0SEQ ID NO.123，

或(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任一个的具有1-10个核苷酸取代的变体。

因此，根据本发明的第一方面，多核苷酸序列可以包含如上所述的核苷酸序列，其编码重链可变区，或其具有1,2,3,4,5,6，7,8,9或10个核苷酸取代的变体。应当理解，编码的重链可变区将包含至少一个CDR(特别是3个CDR)。在这方面，尽管上述核苷酸序列可以变化多达10个核苷酸，但优选编码CDR的SEQ ID Nos 59,92,94,108,110和123的核苷酸序列的部分仅变化每个CDR最多三个核苷酸取代。特别地，优选在编码CDR的任何区域之外的核苷酸序列SEQ ID Nos 59,92,94,108,110和123，例如编码框架区的序列的区域或部分发生任何变异。因此，对于SEQ ID NO.59，尽管可以对该序列进行多达10个核苷酸的取代，但是对于SEQ ID NO:38,39和40中的每一个，或SEQ ID NO 59中包含的SEQ ID NO 50,51和52，可以进行最多三个取代。对于SEQ ID NO.92，可以对SEQ ID Nos 70,71或72中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于SEQ ID NO.94，可以对SEQ ID Nos 82,83和84中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于SEQ ID NO.108，可以对SEQ ID Nos 38,39和101中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于SEQ ID NO.110，可以对SEQ ID Nos 50,51和52中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于SEQ ID NO.123，可以对SEQ ID Nos 38,39和117中的每一个进行最多三个核苷酸取代。

根据第一方面，多核苷酸序列可以包括以下任何一种：

(a)SEQ ID NO.60,

(b)SEQ ID NO.93,

(c)SEQ ID NO.95,

(d)SEQ ID NO.109,

(e)SEQ ID NO.111或

(0SEQ ID NO.124或

(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任一个的具有1-10个核苷酸取代的变体或其简并变体。

根据本发明的第二方面，多核苷酸序列可以包含SEQ ID NO.174和/或SEQ IDNO.134或其具有1至10个核苷酸取代的变体。

因此，多核苷酸序列可以包含编码轻链可变区的如上所述的核苷酸序列(SEQ IDNos 60,93,95,109,111,124或134)，或其具有1,2,3,4,5,6，7,8,9或10个核苷酸取代的变体。应当理解，编码的轻链可变区将包含至少一个CDR(特别是3个CDR)。在这方面，尽管上述核苷酸序列可以变化多达10个核苷酸，但优选编码CDR的SEQ ID Nos 60,93,95,109,111,124或134的核苷酸序列的部分仅变化最多三个核苷酸取代。特别地，优选在编码CDR的任何区域之外的核苷酸序列SEQ ID Nos 60,93,95,109,111,124或134，例如编码框架区的序列的区域或部分发生任何变异。因此，对于SEQ ID NO.60，尽管可以对该序列进行多达10个核苷酸的取代，但是对于SEQ ID NO:41,42和43中的每一个，或SEQ ID NO 60中包含的SEQ IDNOs 53,55和GACACATCC，可以进行最多三个取代。对于SEQ ID NO.93，可以对SEQ ID Nos73,74或75中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于SEQ ID NO.95，可以对SEQ ID Nos85,87和AGCACATCC中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于SEQ ID NO.109，可以对SEQID Nos 41,42和43中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于SEQ ID NO.111，可以对SEQID Nos 53,55和GACACATCC中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于SEQ ID NO.124，可以对SEQ ID Nos 53,55和GACACATCC中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于SEQ IDNO.134，可以对SEQ ID Nos 131,74和132中的每一个进行最多三个核苷酸取代。

在本发明的一个具体的实施方案中，多核苷酸可以包含编码抗体的重链和轻链可变区两者的序列，所述抗体结合CLEC14A(结合根据本发明的第一方面的CLEC14A的C型凝集素域)。因此，多核苷酸可以包含SEQ ID Nos 59,92,94,108,110,123,和174中的任一个或其具有1-10个核苷酸取代的变体，和SEQ ID Nos 60,93,95,109,111,124和134中的任一个或其具有1-10个核苷酸取代的变体。因此，在此方面，多核苷酸可以包含：

(a)SEQ ID NO.59,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和SEQ IDNO.60,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；

(b)SEQ ID NO.92,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和SEQ IDNO.93,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；

(c)SEQ ID NO.94,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和SEQ IDNO.95,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；

(d)SEQ ID NO.108,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和SEQ IDNO.109,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；

(e)SEQ ID NO.110,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和SEQ IDNO.111,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；

(f)SEQ ID NO.123,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和SEQ IDNO.124,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；或

(g)SEQ ID NO.174,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和SEQ IDNO.134,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体。

与此相关，多核苷酸可以包含编码scFv的核苷酸序列，所述scFv包含结合CLEC14A的抗体的轻和重可变链，其中所述轻链和重链可以通过如先前限定的接头序列连接。特别地，多核苷酸序列可以包含编码scFv的以下序列之一：

(a)SEQ ID NO.61

(b)SEQ ID NO.97

(c)SEQ ID NO.113

(d)SEQ ID NO.126，或

(e)SEQ ID NO.176

或其简并变体或与(a),(b),(c)或(d)的任一个具有至少80％同一性的序列。

因此，技术人员将理解，可以将变体序列用于上述scFv编码核苷酸序列(SEQ IDNos 61,97,113,126或176)，其中如上所讨论的此类变体序列将是优选编码scFv，其保留未修饰的scFv的结合亲和力或基本上保留未修饰的scFv序列的结合亲和力，例如可以具有scFv序列的结合亲和力的至少50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％或120％。特别地，scFv可具有抗CLEC14A结合域的结合亲和力，如上文先前所讨论。

如本文所讨论的，还涵盖限定的核苷酸序列的简并变体。特别地，涵盖密码子优化的核苷酸序列，其被优化用于在特定生物体的细胞内表达。例如，可以开发密码子优化以在人或鼠细胞中表达的多核苷酸序列，并且是本发明涵盖的。

更具体地，编码包含在抗CLEC14A结合域中的scFv的多核苷酸序列可以是密码子优化的。在这方面，如本文所定义的抗CLEC14A结合域可以由多核苷酸编码或包含由核苷酸编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID No.177,178,179,180,181,182,183，184,185或186中的任一个，或与其具有至少80％同一性的变体，其中所述变体编码能够结合CLEC14A的scFv，如先前所定义。在这方面，SEQ ID NO 177和178分别涉及SEQ ID NO.61的人和鼠密码子优化的序列；SEQ ID NO:179和180分别涉及SEQ ID NO.176的人和鼠密码子优化的序列；SEQ ID NO 181和182分别涉及SEQ ID NO.97的人和鼠密码子优化序列；SEQID NO:183和184分别涉及SEQ ID NO.113的人和鼠密码子优化的序列；并且SEQ ID NOs185和186分别涉及SEQ ID NO.126的人和鼠密码子优化序列。

可以如前所讨论确定序列同一性。此外，如已经讨论的，优选的是，变异发生在不编码CDR区的核苷酸序列的区域中。这些区域如上所讨论。

尽管上面定义的核苷酸序列是DNA，但在本发明的备选实施方案中，核苷酸序列可以是RNA。因此涵盖与本文所述DNA序列的相应RNA序列。技术人员将理解如何将编码相同蛋白质/多肽产物的RNA序列衍生为上文所示的DNA序列。“T”应当替换为“U”。

如本文所用，术语“核酸序列”或“核酸分子”或“多核苷酸”或“核苷酸序列”是指由天然存在的碱基，糖和糖间(骨架)连接组成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语还包括含有非天然存在的单体或其部分的修饰或取代的序列。本发明的核酸，多核苷酸或核苷酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷和尿嘧啶。序列还可含有修饰的碱基。此类修饰碱基的实例包括氮杂和去氮腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷和尿嘧啶；和黄嘌呤和次黄嘌呤。核酸，多核苷酸或核苷酸序列可以是双链或单链的。核酸，多核苷酸或核苷酸序列可以是完全或部分合成的或重组的。

如上所讨论，本文所述的多核苷酸编码CAR，其包含抗CLEC14A结合域，跨膜域和胞内信号传导域。

如本文所用，“跨膜域”可以基于或源自任何跨膜蛋白的跨膜域。通常，它可以是或可以源自来自CD8a，CD28，CD4，CD3ζCD45，CD9，CD16，CD22，CD33，CD64，CD80，CD86，CD134(OX40)，CD137(4-1BB)，和CD154，优选人CD8a，CD28，CD4，OD3ζCD45，CD9，CD16，CD22，CD33，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154的跨膜域。在一个实施方案中，跨膜域可以是或可以源自来自CD8a，CD28，CD4或CD3ζ，优选来自人CD28，CD4或CD3ζ的跨膜域。在另一个实施方案中，跨膜域可以是合成的，在此类情况下，它将包含主要疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。因此，跨膜域能够跨越或存在于细胞的细胞膜内。如上所讨论，跨膜域可以源自包含胞外和/或胞内部分的蛋白质，因此除了细胞膜内或跨越细胞膜的部分，如本文所用的跨膜域可以附着于源自原始蛋白质的胞外和/或胞内残基。例如，跨膜域可以附着到源自起源蛋白的铰链或间隔物区，例如，源自CD8α的跨膜域可以附着到源自CD8a的间隔物区或铰链域。可以使用本领域已知的任何合适的方法评估细胞膜内跨膜域的存在，包括荧光标记及荧光显微术。

在一个实施方案中，跨膜域可以将CAR的抗CLEC14A结合域连接到胞内信号传导域，其中胞内信号传导域可以源自与跨膜域不同的蛋白质，或者可以源自与跨膜域相同的蛋白质(例如，跨膜域和胞内域可以具有与天然存在于同一蛋白质内的跨膜域和胞内域相同的序列)。因此，在一个实施方案中，跨膜域和胞内信号传导域可以来自相同的蛋白质或源自相同的蛋白质。在另一个实施方案中，跨膜域可以源自也包含共刺激部分的蛋白质，因此CAR可以包含来自该蛋白质的跨膜域以及能够提供共刺激信号的部分两者。

如本文所用，跨膜域可以具有与天然存在的跨膜域的序列不同的序列，只要该域仍然能够存在于膜内。例如，跨膜域可以与天然存在的蛋白质的跨膜域具有至少70,80,90,95,96,97,98或99％的序列同一性，只要修饰的域能够跨越细胞膜。可以如前所讨论测量序列同一性。

在一个优选的实施方案中，跨膜域是CD28跨膜域，其具有氨基酸序列SEQ IDNO.146或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。或者，CD28跨膜域可以由核苷酸序列SEQ ID NO.147或与其具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码。

在进一步的实施方案中，跨膜域是由SEQ ID NO.119中所示的核苷酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码的CD8α跨膜域。该跨膜序列可以进一步附着到来自如SEQ ID NO.165所示，或与其具有至少95％序列同一性的序列的CD8α的铰链域。

如本文所用，“胞内信号传导域”是指CAR蛋白的一部分，其参与将CAR与靶抗原(CLEC14A)的有效结合的信息转导到细胞(宿主细胞，例如免疫效应细胞)内部以引发细胞功能(例如效应子细胞功能)，例如，激活，细胞因子产生，增殖和细胞毒活性，包括细胞毒性因子释放到CAR结合的靶细胞，或通过抗原结合胞外CAR域引起的其他细胞反应。

术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或包括细胞因子分泌的帮助或活性。因此，“效应子细胞”是具有此类效应功能的细胞。因此，术语“胞内信号传导域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然天然存在的蛋白质的整个胞内信号传导域可用于本发明，但在许多情况下，不必使用整个域。就使用变体，例如天然存在的胞内信号传导域的截短部分而言，可以使用此类变体(例如截短的部分)代替整个域，只要它转导效应子功能信号，例如，具有全长域的转导效应子功能的能力的至少50,60,70,80,90或95％。与全长胞内信号传导域相比，变体(例如截短的)胞内信号传导域可以进一步具有增加的转导效应子功能信号的能力，例如，转导效应子功能的能力的至少105,110,120,130或140％。转导效应子功能的能力可以通过测量与靶物相互作用后细胞的效应子功能来测量，例如通过测量细胞因子释放，细胞增殖等。因此，术语胞内信号传导域意味着包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导域的任何截短部分。

变体胞内信号传导域可以与天然存在的胞内信号传导域具有至少70％，80％，90％或95％的序列同一性。应当理解，若使用截短的域，则与全长序列相比，％序列同一性可小于70％。胞内信号传导域也称为“信号转导域”，并且通常源自人CD3ζ或FcRy链的部分。

用于本文所述的多核苷酸编码的CAR的胞内信号传导域的其他实例包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列和协同作用以在抗原受体结合后启动信号转导的共受体，以及如上所讨论的这些序列的任何变体。已知通过单独的TCR产生的信号通常不足以完全激活T细胞，并且还可能需要二次和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说是由两种不同类型的信号序列介导的：那些通过TCR(胞内信号传导域)启动抗原依赖性初级激活的信号序列和那些以抗原非依赖性方式起作用以提供二次或共刺激信号的信号序列(如共刺激域)。共刺激域促进效应子功能的激活，并且还可以促进效应子功能的持久性和/或细胞的存活。

以刺激方式起作用的胞内信号传导域可包含信号基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)(例如2,3,4,5或更多ITAM)。例如，CD3zeta,Fc受体γ,Fc受体β,CD3γ,CD3δ,CD3ε,CD5,CD22,CD79a,CD79b和CD66d包含一个或多个ITAM。因此，在一个实施方案中，本文使用的胞内信号传导域可以包括一个或多个ITAM，例如，来自CD3zeta,Fc受体γ,Fc受体β,CD3γ,CD3δ,CD3ε,CD5,CD22,CD79a,CD79b和CD66d中的任何一个或多个。可以理解，如上所讨论，可以在胞内信号传导域内使用ITAM的变体，只要胞内信号传导域能够诱导效应子功能，如先前所讨论。

特别地，如本文所定义的CAR可包含源自CD3zeta的胞内信号传导域，更具体地，包含SEQ ID NO.148序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列或由核苷酸序列SEQ IDNO.149或与其具有至少95％同一性的核苷酸序列的序列编码的氨基酸序列的胞内信号传导域。

如先前指示，多核苷酸可以编码包含额外部分或域的CAR，即除了抗CLEC14A结合域，跨膜域和胞内信号传导域之外。因此，特别地，CAR可另外包含至少一个共刺激域。如先前指示，通常优选存在至少一个共刺激域以从表达CAR的细胞提供最佳效应子功能。因此，尽管CAR可以仅包含胞内信号传导域，但在具体实施方案中，也将存在共刺激域。

“共刺激域”是指共刺激分子的胞内域的一部分或区域。共刺激分子可以是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是细胞对抗原(例如免疫细胞对抗原)的有效响应所需的。共刺激分子的实例包括CD28，4-1BB(CD137)，OX40，ICOS，DAP10，CD27，CD30，CD40，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，和与CD83特异性结合的配体等。

如上所讨论，若共刺激分子另外包含跨膜部分，则本文所述的CAR的跨膜域和共刺激域可以源自相同的蛋白质。在一个具体实施方案中，CAR可包含跨膜域和来自CD28的共刺激域。

存在于本发明的CAR内的胞内信号传导域和共刺激域可以以任何顺序(例如随机或指定顺序)彼此连接。任选地，例如长度为2至10个氨基酸(例如，2,3,4,5,6,7,8,9或10个氨基酸)的短的寡肽或多肽接头可以形成胞内信号传导域的胞内信号传导序列和一个或多个共刺激域之间的连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可用作合适的接头。在另一个实施方案中，单个氨基酸，例如丙氨酸或甘氨酸可用作合适的接头。

由本发明的核酸编码的CAR可包含两个或更多个，例如3,4,5或更多个共刺激信号传导域。在一个实施方案中，共刺激信号传导域可以通过如上所述的接头分开，例如，由甘氨酸或丙氨酸残基分开。

特别地，本发明的CAR可以包括来自CD3zata的胞内信号传导域，例如一种包含氨基酸序列SEQ ID NO.148或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的胞内信号传导域，和CD28,4-1BB，OX40，ICOS或DAP-10的共刺激域。OX40的共刺激域特别具有如以SEQ IDNO.168所示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性。或者，OX40的共刺激域可以由如以SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列或与其具有至少95％同一性的序列编码。4-1BB的共刺激域可以由如以SEQ ID NO.80所示的核苷酸序列或与其具有至少95％同一性的序列编码，并且CD28的共刺激域可以由如以SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列或与其具有至少95％同一性的序列编码。更具体地，本发明的CAR可以包括来自CD3zeta的胞内信号传导域，例如一种包含氨基酸序列SEQ ID NO.148或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的胞内信号传导域和CD28和OX40的共刺激域，CD28和4-1BB的共刺激域或4-1BB和OX40的共刺激域。

此外，本发明的多核苷酸可以编码CAR，其包含1)来自CD28的跨膜和共刺激域以及来自CD3zeta的胞内信号传导域；2)来自CD8a的跨膜域，来自4-1BB的共刺激域和来自CD3zeta的胞内信号传导域；3)来自CD8a的跨膜域，来自OX40的共刺激域和来自CD3zeta的胞内信号传导域；4)来自CD28的跨膜域，来自CD28和4-1BB的共刺激域和来自CD3zeta的胞内信号传导域；5)来自CD28的跨膜域，来自CD28和OX40的共刺激域和来自CD3zeta的胞内信号传导域；6)来自CD8a的跨膜域，来自4-1BB和OX40的共刺激域和来自CD3zeta的胞内信号传导域；7)来自CD8a的跨膜域，来自CD28的共刺激域和来自CD3zeta的胞内信号传导域；8)来自CD8a的跨膜域，来自CD28和4-1BB的共刺激域和来自CD3zeta的胞内信号传导域或9)来自CD28α的跨膜域，来自CD28和OX40的共刺激域以及来自CD3zeta的胞内信号传导域。特别地，包含来自CD8α的跨膜域的任何一种构建体可以进一步包含铰链或间隔域，其也源自CD8a，例如如以SEQ ID NO.165或与其具有至少95％同一性的序列中定义的铰链或间隔域。

多核苷酸可以进一步编码包含前导物序列的CAR。术语“前导物序列”是指将CAR靶向细胞膜的肽序列。前导物序列可以存在于抗CLEC14A结合域的N末端，和/或前导物序列可以在细胞处理和CAR定位于细胞膜期间从CAR切割。可以在如本文所述的CAR中使用的典型前导物序列是SEQ ID NO.135的制瘤素M前导物序列，由SEQ ID NO.162编码的CD8α前导物序列，或与其具有至少70,80,85,90,95,96,97,98或99％同一性的其变体，其能够将CAR靶向细胞膜。前导物序列的基本部分通常包含一段疏水性氨基酸，其倾向于形成单个α-螺旋。

CAR还可包含抗CLEC14A结合域和跨膜域之间的铰链域或间隔物区(在本文中可互换使用)。铰链域和/或间隔物区可以具有允许其在不同方向上取向的柔性，这可以帮助抗原结合抗CLEC14A结合域。在某些实施方案中，铰链区和/或间隔物区可以是免疫球蛋白铰链区，并且可以是野生型免疫球蛋白铰链区或改变的野生型免疫球蛋白铰链区，例如截短的铰链区。可以使用的其他示例性铰链区和/或间隔物包括源自1型膜蛋白，例如CD8a，CD4，CD28和CD7的胞外区的铰链区和/或间隔物区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区/间隔物区或可以是改变的。优选地，铰链区/间隔物区是或源自人CD8a，CD4，CD28或CD7的铰链区/间隔物区。IgD，CH3和Fc间隔物或铰链也可用于本发明的CAR中。

“改变的野生型铰链或间隔物区”或“改变的铰链或间隔物区”是指(a)具有高达30％氨基酸变化(例如高达25％，20％，15％，10％或5％氨基酸变化，例如取代或缺失)的野生型铰链/间隔物区，(b)具有高达30％的氨基酸变化(例如，高达25％，20％，15％，10％或5％的氨基酸变化，例如取代或缺失)的长度至少10个氨基酸(例如，至少12,13,14或15个氨基酸)的野生型铰链/间隔物区的一部分，或(c)野生型铰链区域的一部分，其包括核心铰链区(其长度可以是4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15，或至少4,5,6,7,8 9,10,11,12,13,14或15个氨基酸)。当改变的野生型铰链区插入本文所述的嵌合抗原受体中的CLEC14A特异性结合域和另一个区域(例如，跨膜域)之间并将它们连接时，它允许嵌合融合蛋白维持与CLEC14A的特异性结合。

在某些实施方案中，野生型免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可被一个或多个其他氨基酸残基(例如，一个或多个丝氨酸残基)取代。或者或另外，改变的免疫球蛋白铰链区可以具有被另一个氨基酸残基(例如丝氨酸残基)取代的野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基。

包含CH₂和CH₃恒定区域的铰链区在本领域中描述用于CAR(例如CH₂CH₃铰链，称为“Fc铰链”或“IgG铰链”，如SEQ ID NO.163所示。或者，CH₂CH₃铰链可以由SEQ ID NO.164编码。然而，优选当铰链域基于或源自免疫球蛋白时，它不包含CH₃域，例如它可以在不包括CH₃的情况下包含CH₂域或其片段或部分，或由CH₂域或其片段或部分组成。

在一个实施方案中，铰链域具有或包含SEQ ID NO.165的氨基酸序列(其代表CD8a的铰链域)或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在另一个优选的实施方案中，铰链域具有或包含SEQ ID NO.166的氨基酸序列(其代表缩短的IgG铰链)或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

铰链域可以通过接头序列附着到跨膜域，所述接头序列可以是如上定义的接头序列。示例性接头序列是KDPK(SEQ ID NO.159)。此类序列或与其具有至少95％序列同一性的序列可包括在由上述多核苷酸编码的CAR中。更具体地，此类序列可以包括在胞外域(例如scFv部分)和跨膜域之间。用于特定CAR的铰链域可以凭经验确定。

如本文所用的铰链域或间隔物区的长度可以是至少10个氨基酸，例如，长度为至少20,30,40,50,60,70,80,90,100,150或200个氨基酸。

在本发明的一个具体实施方案中，可以不使用铰链域，并且抗CLEC14A结合域可以直接附着到跨膜域。

因此，根据本发明的第一方面，多核苷酸可以编码包含以下任何一种序列的CAR：

(a)SEQ ID NO.62,

(b)SEQ ID NO.98,

(c)SEQ ID NO.114,或

(d)SEQ ID NO.127,或

其与(a)，(b)，(c)或(d)中的任一个具有至少80％的同一性的变体。

因此，CAR可以与SEQ ID Nos 62,98,114或127中的任一个具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。特别地，变体CAR应当保留具有SEQ ID NO.62,98,114或127的序列的CAR的活性，例如应当具有非变体CAR的至少50％，60％，70％，80％，90％或95％的活性。这可以测量为CAR的结合亲和力，其可以如先前关于抗CLEC14A结合域所讨论的那样测定，或者可以测量为刺激细胞内效应子功能的能力，其可以如先前关于胞内信号传导域所讨论的那样测定。

或者，编码CAR的多核苷酸可以包含以下任一个的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO.63，

(b)SEQ ID NO.99，

(c)SEQ ID NO.115，或

(d)SEQ ID NO.128，

或其与(a)，(b)，(c)或(d)中任一个具有至少80％同一性的变体。

如上所讨论，变体可以与SEQ ID Nos 63,99,115或128中的任一个具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性，并且编码的CAR应保留由非变体序列编码的CAR的活性，如上所讨论。

本发明提供了由本发明的核酸分子编码的CAR(多肽)。术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指氨基酸的聚合物，不限于任何特定长度。该术语不排除诸如十四烷基化，硫酸化，糖基化，磷酸化和信号序列的添加或删除的修饰。因此，术语“肽”，“多肽”或“蛋白质”是指一条或多条氨基酸链，其中每条链包含通过肽键共价连接的氨基酸。

本发明还涵盖包含本发明核酸的载体。载体可以是例如表达载体(例如mRNA表达载体或用于转移到免疫细胞中的表达载体(例如病毒载体))或克隆载体。可能的表达载体包括但不限于转座子，粘粒，质粒或修饰的病毒(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒和慢病毒)，只要该载体与所用的宿主细胞相容即可。特别地，表达载体可以是gamma逆转录病毒，例如Engels等，Human Gene Therapy，14:1155-1168,2003或Schambach等，Mol.Ther.2:435-445,2000，其通过引用并入本文。表达载体“适合转化宿主细胞”，这意味着表达载体含有本发明的核酸分子和基于宿主细胞选择以用于表达的调节序列，其与核酸分子可操作地连接。可操作地连接意指核酸以允许核酸表达的方式与调节序列连接。

因此，本发明涵盖含有本发明核酸分子的重组表达载体，以及由本发明的核酸分子编码的蛋白质序列的转录和翻译所必需的调节序列。

合适的调节序列可以源自多种来源，包括细菌，真菌，病毒，哺乳动物或昆虫基因。合适的调节序列的选择取决于如下所讨论选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地完成。此类调节序列的实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译起始信号。另外，取决于所选择的宿主细胞和所用的载体，可以将其他序列，例如复制起点，额外的DNA限制性位点，增强子和赋予转录诱导能力的序列掺入表达载体中。

能够在细胞(哺乳动物细胞)中表达CAR分子的启动子的实例是EF1a启动子或CMV启动子。启动子的其他实例包括SV40早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，HIV长末端重复启动子，MoMuLV启动子，禽白血病病毒启动子，埃巴病毒立即早期启动子，劳氏肉瘤病毒启动子或MPSV LTR(如Engel等，同上所述)。

如上所指示，可以使用诱导型系统控制CAR的转录。特别地，可以使用诱导型启动子来控制CAR的表达，其中例如表达可以由小分子或药物(例如，其结合启动子，调节序列或转录抑制物或激活物分子)或通过使用环境触发器诱导。

特别地，可以使用四环素或诸如多西环素的衍生物来控制CAR表达，例如，使用Tet-on系统，其中一个或多个tet操纵基因序列(例如至少2,3,4或5)可以掺入启动子中或附近。然后可以通过添加四环素或其衍生物之一(例如多西环素)来控制来自启动子的基因表达，所述衍生物可以结合四环素反式激活蛋白，允许其与tet操纵基因序列结合。四环素反式激活蛋白可以由与本发明的CAR相同或另外的载体表达。Tet-on系统的变化在本领域中是公知的，并且可以在本发明中使用。

此外，CAR表达可以通过加入他莫昔芬来控制，例如，使用激活剂与突变的ERT域融合的系统。在这方面，可以使用Cre/loxP系统，特别是该系统的修饰形式，其中Cre与雌激素受体(ERT)的配体结合域的突变形式融合，所述突变形式仅与他莫昔芬结合。此类融合物是无活性的，直到加入他莫昔芬，其激活Cre并允许lox P位点之间的重组，这允许CAR的转录。此类系统允许通过加入他莫昔芬来诱导CAR的表达。

其他药物诱导系统是本领域公知的，例如，加入松甾酮(ponasterone)A后激活的系统(例如使用蜕皮激素受体的基因和具有受体结合位点的启动子)，加入香豆霉素(coumermycin)后激活的系统，任何此类系统都可以根据本发明用于CAR表达。

如上所讨论，表达系统也可用于本发明，其中CAR表达由环境触发器控制，例如，缺氧，辐射，升高的温度等。特别地，缺氧诱导型启动子可用于本发明中的CAR表达，例如，包含缺氧反应元件的嵌合启动子。

可以进一步开发新的诱导型启动子用于本发明，例如，由小分子或药物激活的诱导型启动子。

本发明的重组表达载体还可含有选择标志物基因，其有助于选择用本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞。选择标志物基因的实例是编码赋予对某些药物的抗性的蛋白质的基因，例如新霉素和潮霉素，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，萤火虫萤光素酶或免疫球蛋白或其部分，例如免疫球蛋白的Fc部分，优选IgG。通过选择标志物蛋白质如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶的浓度变化来监测选择标志物基因的转录。若选择标志物基因编码赋予抗生素抗性的蛋白质，例如新霉素抗性，则可以用G418选择转化细胞。掺入选择标志物基因的细胞将存活，而其他细胞死亡。这使得可以显现和测定本发明的重组表达载体的表达，特别是测定突变对表达和表型的影响。应当理解，可以在与感兴趣的核酸分开的载体上引入选择标志物。

重组表达载体还可含有编码融合部分的基因，该融合部分提供重组蛋白的增加的表达；增加重组蛋白的溶解度；并且通过在亲和纯化中充当配体来帮助纯化靶重组蛋白(例如，可以存在适当的“标签”以实现纯化和/或鉴定，例如His标签或myc标签)。例如，可以将蛋白水解切割位点添加到靶重组蛋白中，以允许在纯化融合蛋白后从重组蛋白中分离重组蛋白。典型的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp.，Melbourne，Australia)，pMal(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖E结合蛋白，或蛋白A融合到重组蛋白。

可以将重组表达载体引入宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语“用......转化”，“用...转染”，“转化”，“转导”和“转染”旨在包括通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)引入细胞中。如本文所用的，术语“转化的宿主细胞”或“转导的宿主细胞”还意图包括已经用本发明的重组表达载体转化的能够糖基化的细胞。可以通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化用核酸转化原核细胞。例如，可以通过常规技术，例如磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质转染，电穿孔或显微注射将核酸引入哺乳动物细胞。用于转化和转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等，1989(同上)和其他实验室教科书中找到。

包含本发明核酸的载体可以转导或转染到任何细胞类型中，例如以对编码的CAR分子进行体外研究，或产生另外的载体或RNA/病毒载体，用于转导入细胞以对患者施用。例如，载体可以转导入极其多种真核宿主细胞和原核细胞，例如，真核细胞或酵母细胞或哺乳动物细胞或大肠杆菌。因此，本发明进一步提供了包含本发明的核酸或载体的细胞。本发明另外提供包含本发明CAR的细胞。

哺乳动物细胞可以包括：COS(例如，ATCC No.CRL 1650或1651)，BHK(例如，ATCCNo.CRL 6281)，CHO(ATCC No.CCL 61)，HeLa(例如，ATCC No.CCL 2)，293(ATCC No.1573)，NS-1细胞，NSO(ATCC CRL-11177)和(Crucell，Leiden，Netherlands)。用于在哺乳动物细胞中指导表达的合适表达载体通常包括启动子(例如，源自病毒材料，例如多瘤，腺病毒2，巨细胞病毒和猿猴病毒40或源自任何病毒LTR)，以及其他转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8，pMT2PC和pMP71。

对于治疗用途，可以将本发明的载体转导入哺乳动物细胞，特别是免疫细胞，例如T细胞(例如人T细胞)。已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的，例如，慢病毒载体，如HIV，SIV或FIV。特别地，如上所指示，可以使用逆转录病毒载体，例如gamma逆转录病毒，例如MP71。

除CAR分子外，包含本发明核酸的本发明载体还可包含可编码其他蛋白质或多肽的其他核苷酸序列。此类另外的蛋白质或多肽可以由与编码CAR分子的核苷酸序列相同的启动子控制下或者在与编码CAR分子的核苷酸序列的不同启动子的控制下的核苷酸序列编码。若另外的蛋白质/多肽由与编码CAR分子的核苷酸序列相同的启动子控制的核苷酸序列编码(例如，其中两个序列都在启动子的下游)，则编码CAR的核苷酸序列和编码其他蛋白质/多肽的核苷酸序列之间可以存在另外的核苷酸序列，使其在表达后能够分离，例如其切割。此类其他核苷酸序列是本领域公知的，包括编码内含肽的核苷酸序列。或者，若期望来自相同启动子的表达，可以在本发明的载体中使用IRES或2A肽序列。

在这方面，可以期望另外从本发明的CAR表达载体中表达多肽，以允许检测细胞中CAR的表达。因此，通过检测在与编码CAR的核苷酸序列的相同(或不同启动子)控制下的另一多肽的表达，可以鉴定用载体成功转导细胞和成功表达CAR分子。特别地，本发明的CAR分子可另外包含CD34分子或经修饰的CD34分子，例如截短的CD34分子，其中此类分子包含胞外部分，其允许通过公知的技术检测，例如，使用合适的抗体和标记物进行免疫荧光。在一个具体实施方案中，本发明的载体可另外包含核苷酸序列SEQ ID NO.145的核苷酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。或者，载体可以另外编码SEQ ID NO.144的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的序列的序列。可以与本发明的CAR分子共表达以允许鉴定CAR转导的细胞的其他分子包括萤光素酶。

在这方面，本发明特别涵盖包含编码CAR的多核苷酸的核酸分子，所述CAR包含SEQID No.136,138,140或142中任一个的序列，或者与其具有至少80％同一性的序列(并保留如前所述的未修饰CAR的功能活性)。更具体地，本发明的核酸分子可包含SEQ ID NO.137,139,141或143的多核苷酸序列。或与其具有至少80％同一性的序列。特别地，此类修饰的序列将编码CAR，其保留或基本上保留如前所述的未修饰的CAR的功能活性。还涵盖包含这些序列的载体。包含SEQ ID No.136,138,140或142中任一个的序列的CARS包含制瘤素M前导物序列。应当理解，如上所讨论，这可以用另一种前导物序列代替，特别是可以用CD8α的前导物序列代替。因此，可以修饰SEQ ID Nos 136,138,140或142的序列以用由SEQ ID NO162编码的CD8α前导物替换SEQ ID NO.135的制瘤素M前导物序列。

如前所讨论，本发明提供核酸分子，其在转导成合适的细胞类型时能够表达可与CLEC14A结合的CAR分子。因此，本发明的核酸分子可用于治疗与CLEC14A表达增加有关的状况，特别是可用于抑制血管生成(例如肿瘤血管生成)。此类状况的治疗依赖于表达的CAR分子与靶抗原的结合，即与在肿瘤血管系统内表达的CLEC14A结合。应当理解，CAR分子与非靶CLEC14A的结合可以是不想要的，并且应当避免任何此类结合，无论在将转导细胞施用于患者时还是在随后的时间。为了实现这点，可以期望确保转导的细胞不能在患者中长期存活(即在治疗状况后)或转导的细胞仅瞬时表达靶向CLEC14A的CAR分子。

为了实现CAR分子的瞬时表达，可以用编码如本文所述的CAR的RNA(例如mRNA)转导细胞，并使用那些细胞以对患者施用。用于产生mRNA的mRNA表达载体可以根据本领域已知的方法制备(例如使用Gateway Technology)并且是本领域已知的(例如pCIpA102，等，2002，J.Immunol.Methods 259，第191-203页和pCIpA120-G，等，2011，PLoS ONE 6(11)e27930)。在这方面，本发明特别提供了包含编码如本文所述的CAR的RNA分子的细胞。

此外，mRNA可以通过例如体外转录体外产生。然后可以将mRNA导入免疫效应细胞，例如作为裸mRNA，例如通过电穿孔(例如记载于例如Almasbak等,Cytotherapy 2011,13,629-640,Rabinovich等,Hum.Gene Ther.,2009,20,51-60和Beatty等,CancerImmunol.Res.2014,2,112-120)。

或者或另外，可以期望用一旦激活导致细胞死亡的核苷酸序列(所谓的“自杀基因”)转导细胞。以此类方式，一旦细胞用于治疗该状况，就可以激活自杀基因，导致CAR表达细胞的死亡和从患者除去CAR表达细胞。自杀基因可以从与本发明的CAR分子相同的载体表达，例如，使用如前所讨论的元件(单独的启动子，或与内含肽，IRES或2A肽一起的相同启动子)，或者可以从不同的载体表达，所述载体可以在编码CAR的载体或核酸分子同时、之前或之后转导到细胞中。可用于本发明的自杀基因的实例包括胱天蛋白酶9，RQR8和/或TK。可以在编码CAR的载体内，或者在编码CAR的载体或核酸分子同时，在之前或之后将这些基因中的一个或多个转导到细胞中。应当理解，期望任何自杀基因的表达可诱导地控制。

还可以期望对用本发明的载体或核酸转导或要用其转导的细胞进行进一步修饰。特别是对免疫细胞的修饰可能是期望的，所述修饰延长或增强其对CLEC14A的应答。例如，已知TGF由肿瘤分泌，并且这可以抑制T细胞的诱导。在这方面，可以期望能够中和TGFβ的作用的修饰的免疫细胞，例如本发明的T细胞(即用本发明的核酸或载体转导的那些细胞)，例如通过表达显性阴性TGFβ受体II。另外或或者，本发明的细胞可以用编码可以增强细胞的效应子功能的细胞因子，例如IL-15，或IL2，IL7，IL12等的核酸转导。同样，如上所讨论，任何另外的核酸序列可以从与CAR分子相同或不同的载体表达。

还应当理解，本发明的细胞可包含本发明的超过一种核酸或载体。特别地，本发明的细胞可包含2,3,4或5种或更多种本发明的核酸或载体，其各自表达不同的CAR分子。因此，本发明的细胞可包含不同的CAR分子，其能够结合CLEC14A，例如在CLEC14A的相同或不同的位置。在这方面，本发明的细胞可包含CAR分子，其包含结合CLEC14A的scFv和CAR分子，所述CAR分子包含结合CLEC14A的配体(例如MMRN2或其部分或变体)。

此外，除了本发明的表达的CAR之外，本发明的细胞可以包含至少一种其他受体(特别是外源的)(例如多种受体)，其可以与CAR一起以组合方式用于结合靶物。细胞(例如表达CLEC14A的肿瘤血管系统)。因此，在此类方法中，可以需要CAR和至少一种其他受体与靶细胞的结合来刺激针对靶细胞的免疫应答(例如，每种CAR/受体可以仅提供免疫细胞刺激的部分信号，其单独可以不足以免疫细胞刺激，但一起允许免疫细胞刺激)。在本发明的细胞是T细胞的情况下，可以必需CAR结合CLEC14A和至少一种其他受体结合CLEC14A表达细胞上的其配体两者来刺激T细胞。至少一种其他受体可以是另外的CAR分子。

在该实施方案的变型中，可诱导表达本发明细胞内的CAR。特别地，在该实施方案中，细胞上表达的至少一种其他受体与其靶物的结合可以允许或控制CAR分子的表达。因此，在此类情况下，在CAR表达发生之前需要至少一种其他受体与其配体的结合，因此免疫细胞刺激需要至少一种其他受体与其配体的结合以及随后的CAR与靶细胞的结合。此类特定的系统可以包括SynNotch受体的额外表达，所述SynNotch受体工程化改造为具有针对感兴趣的抗原，例如CD19的胞外配体结合域正交转录因子(例如TetR或Gal4)。在与感兴趣的抗原结合后，正交转录因子从SynNotch受体的尾部切割并激活CAR的表达。因此，本发明的细胞可以进一步包含编码受体的核酸或载体，所述受体与CLEC14A以外的抗原结合，特别是与CLEC14A以外的肿瘤相关抗原结合。

或者，也可以使用组合方法，其中除了本发明的CAR之外的另外的受体在本发明的细胞上表达，其中所述另外的受体能够结合脱靶细胞或组织(例如非肿瘤细胞)。在此类情况下，若另外的受体与其配体结合，则产生负信号，阻止免疫细胞刺激(例如T细胞刺激)。

进一步的组合方法可以使用另外的受体与本发明的CAR组合，其中两种受体结合不同的靶物并诱导不同的效果来治疗肿瘤。因此，两种抗肿瘤作用可以完全彼此独立，但是一起可以呈现针对肿瘤的有效疗法。在这方面，本发明的CAR可以与TCR疗法组合使用，其中免疫细胞可以用一种或多种核酸分子转导，所述核酸分子编码本发明的CAR和能够结合可以在肿瘤细胞上发现(例如在特定类型的肿瘤细胞上或在任何肿瘤细胞上)的特定MHC/肽组合的TCR。或者，可以单独、序贯或同时提供用编码CAR的核酸转导的免疫细胞和用编码TCR的核酸转导的分开的免疫细胞群体。还设想了使用一种或多种核酸的基因疗法治疗，所述核酸编码本发明的CAR和识别肿瘤MHC/肽组合的TCR。

无论用于将外源核酸引入宿主细胞的方法如何，细胞内核酸的存在可以使用本领域公知的各种测定来确定，例如Southern和Northern印迹法，RT-PCR和PCR。此外，如前所讨论，可以使用免疫荧光技术，ELISA或Western印迹检测CAR或其他多肽的表达。

在这方面，本发明还提供了产生表达CAR分子的细胞的方法，该方法包括用本发明的核酸或载体转导细胞的步骤。

如前所述，包含本发明的核酸，载体和/或CAR的本发明的细胞可以是免疫细胞，特别是哺乳动物免疫细胞，例如人免疫细胞。免疫细胞能够具有如前所述的效应子功能，并包括T细胞和NK细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，包括α-βT细胞，γ-δT细胞，记忆T细胞(例如具有干细胞样特性的记忆T细胞)。NK细胞可以是不变的NK细胞。

如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，但特别是指人，家畜(例如猫，狗等)，马，小鼠，大鼠，灵长类动物，例如猴，牛，猪等

T细胞可以从许多来源获得，包括来自外周血单个核细胞，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，来自感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾组织和肿瘤。特别是在本发明中，免疫或T细胞可以从具有可以用本发明的核酸，载体或细胞治疗的状况的受试者获得，例如，具有与CLEC14A表达水平增加相关的状况，或更特别地，与肿瘤血管系统中表达CLEC14A的肿瘤相关的状况的受试者。T细胞(或免疫细胞)可通过本领域已知的任何方法获得。

T细胞也可以“现成(off the shelf)”获得，因此可能不一定从具有可用本发明的核酸，载体或细胞治疗的状况的受试者获得。因此，用于本发明的T细胞可以已经在用本发明的核酸或载体转导之前先前已经储存和/或修饰。

特别地，可以使用本领域任何合适的技术例如Ficoll分离自从受试者收集的血液单位(特别是抗凝结血液)获得T细胞。或者，可以通过单采血液成分术(apheresis)从受试者(通常是哺乳动物受试者)获得免疫细胞(例如T细胞)，其中单采血液成分术产品通常包含淋巴细胞(包括T细胞，单核细胞，粒细胞，B细胞，其他有核白细胞，红细胞和血小板)。应当理解，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级份并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理，例如，可以使用PBS洗涤细胞，或使用缺少二价离子，缺少钙和/或镁的洗涤溶液洗涤细胞。洗涤步骤可通过本领域已知的方法实现，例如通过使用半自动“流通”离心机(例如Cobe 2991细胞处理器，Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca，无Mg的PBS，PlasmaLyte A，RPMI 1640(Sigma)或PBS或含有或不含缓冲液的其他盐水溶液。在英国，输血细胞按照http://www.transfusionguidelines.org.uk/red-book上的指南进行处理。欧洲可接受的其他程序可参见“血液成分的制备，使用和质量保证指南”，当前版本，EDQM。在美国，通常遵循AABB血液和血液成分指南。还存在血液，血液成分和血浆衍生物的收集，处理QC的WHO要求。

可以通过裂解红细胞和消耗单核细胞，例如从外周血淋巴细胞中分离T细胞，例如通过经由PERCOLLTM梯度的离心或通过逆流离心淘洗。可以选择用于本发明的特定T细胞群。然而，选择不是强制性的，并且可以用本发明的核酸或载体(例如用于抑制受试者中的肿瘤血管生成)转导混合的细胞群体(例如包含不同类型的T细胞)。可以选择的细胞亚组包括CD3+，CD28+，CD4+，CD8+，CD45RA+和CD45RO+T细胞。使用与选择性结合T细胞群体上表达的抗原的抗体偶联的珠可以实现特定群体的选择。针对在特别地T细胞群中独特表达的表面标志物的抗体组合可用于选择。

可以期望在使用前储存免疫细胞，特别是在用于本发明的治疗方法之前。在这方面，可以冷冻或温育本发明的细胞(例如在2-10℃的旋转器上)。细胞可以在用本发明的核酸或载体转导之前和/或之后以此类方式储存。

如前所讨论，本发明的转导免疫细胞具有治疗效用，特别是可用于抑制肿瘤血管生成。在治疗上使用细胞之前，可以期望使用本领域公知的方法使细胞经历活化或扩增步骤。任何此类步骤可以在用本发明的核酸或载体转导之前或之后进行。可以使用刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体扩增T细胞。例如，T细胞可以在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。

本发明另外特别提供了细胞群体，其中所述群体的至少一种细胞包含本发明的核酸或载体。细胞群体可以包含含有本发明的不同核酸或载体的细胞。因此，群体中的一种细胞可以包含编码第一CAR的本发明的核酸，并且群体的第二种细胞可以包含编码第二CAR的本发明的核酸。

此外，本发明提供了“现成”的细胞产品，其中可以储存本发明的细胞(特别是T细胞)(即包含本发明的核酸或载体)并提供以后的使用(例如在疗法中)。通常，此类细胞可以是同种异体免疫细胞(例如T细胞)。

本发明进一步提供了包含本发明的核酸，载体，细胞或细胞群体的组合物或药物组合物，以及另外提供了用于疗法(或对抗疾病)的包含本发明的核酸，载体，细胞或细胞群体的药物组合物。本发明的组合物或药物组合物可包含另外的或进一步的活性(例如治疗)剂。本发明的核酸，载体，CAR，细胞，细胞群体或组合物可用于治疗与CLEC14A表达水平增加相关的状况，特别是本发明的核酸，载体，CAR，细胞，细胞群体或组合物可用于抑制肿瘤内的血管生成(例如，其中肿瘤血管系统表达CLEC14A)。因此，在这方面，本发明提供了用于疗法的本发明的核酸，载体，CAR，细胞，细胞群体或组合物。此外，本发明提供了本发明的核酸，载体，CAR，细胞，细胞群体或组合物在制备用于对抗疾病的药物中的用途。或者，本发明提供了对抗疾病的方法，包括对有此需要的受试者施用本发明的核酸，载体，CAR，细胞，细胞群体或组合物的步骤。更具体地，本发明提供了用于治疗与CLEC14表达相关的状况的本发明的核酸，载体，CAR，细胞，细胞群体或组合物。此外，本发明提供了本发明的核酸，载体，CAR，细胞，细胞群体或组合物在制备用于治疗与CLEC14A表达相关的状况的药物中的用途。或者，本发明提供了治疗与CLEC14A表达相关的状况的方法，该方法包括对有此需要的受试者，例如具有该状况的受试者施用本发明的核酸，载体，CAR，细胞，细胞群体或组合物的步骤。

尽管可以使用本发明的核酸和/或载体直接治疗患者，如上所述，例如，如上所述，在基因治疗方法中，在一个具体实施方案中，将包含本发明的核酸或载体的细胞用于治疗。优选此类细胞是免疫细胞，特别是T细胞。因此，本发明特别提供了用于治疗，例如用于治疗与CLEC14A表达相关的状况的包含本发明的载体或核酸的T细胞。

通过“对抗”，我们包括该方法可用于减轻病症症状(即姑息使用该方法)，或治疗病症，或预防病症(即预防性使用该方法)的含义。

“与CLEC14A表达相关的病症”是指在表达CLEC14A的情况下期望治疗，预防或改善的任何疾病状况。如前所讨论，CLEC14A在正常健康组织和正常血管系统中的表达非常低或不可检测。因此，通常，CLEC14A在组织，特别是血管系统中的表达(即任何可检测的表达)可以与疾病状况有关。在这方面，CLEC14A表达(例如mRNA或蛋白质)的任何检测可以指示疾病。CLEC14A可以如前所述进行测量和检测，例如，使用免疫荧光。因此，检测CLEC14A的表达是指与相应组织中健康受试者中存在的CLEC14A的量相比，检测受试者组织中CLEC14A的量增加。或者，CLEC14A表达的增加可以是与疾病之前相同受试者中或相同受试者内组织的非患病部分中CLEC14A的表达相比增加。CLEC14A的水平可以增加至少50,60,70,80,90,100,200,300,400或500％，或者备选可以增加至少100,200,300,400,500,600，700,800,900或1000倍。

如前所讨论，CLEC14A在肿瘤血管系统内表达并与血管生成相关，因此，与CLEC14A表达相关的状况可包括任何包含不需要的血管生成的状况。特别地，状况包括治疗实体瘤(即表达CLEC14A的实体瘤)，月经过多，子宫内膜异位症，关节炎(炎症和类风湿两者)，黄斑变性，佩吉特病，视网膜病变及其血管并发症(例如增殖性和早产性和糖尿病性视网膜病变)，良性血管增生，纤维化，肥胖和炎症。

与CLEC14A表达相关的状况的治疗包括治疗与CLEC14A表达相关的现有状况或预防与CLEC14A表达相关的状况。如本文所用，“治疗”是指改善或预防受试者体内疾病状态的恶化。例如，治疗包括肿瘤大小的减小，肿瘤生长速率的降低，肿瘤转移速率的降低，或肿瘤的大小，生长速率或转移速率的维持。“减小”是指减小至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。“维持”意味着没有实质性的增加，例如，增加不超过10％，5％，3％，2％或1％。肿瘤大小可以通过本领域已知的任何方法确定，例如，通过适当的抗体，MRI等进行肿瘤成像，可以通过测量肿瘤大小随时间的增加并确定肿瘤在特定时间段内生长多少来确定肿瘤生长速率。转移率可以通过测量肿瘤生长在受试者中的新位点开始的时间段来确定。

如本文所用，“肿瘤”是指所有形式的新生物细胞生长，并且特别包括实体瘤。用于本发明治疗的实体瘤包括乳腺，卵巢，肝脏，膀胱，前列腺，肾，胰腺，胃，食道，直肠，肺(例如间皮瘤)，脑，宫颈，结肠，皮肤(例如黑素瘤)，子宫，神经系统(如神经母细胞瘤)，甲状腺和肉瘤，如骨肉瘤。特别地，胰腺或卵巢肿瘤可以在本发明中治疗，例如，使用本发明的T细胞。

治疗与CLEC14A表达相关的状况包括抑制血管生成。术语“抑制血管生成”旨在表示降低血管生成的速率或水平。减少可以是血管生成速率或水平的约10％，或约20％，或约30％，或约40％的低水平降低。优选地，所述降低是血管生成速率或水平降低约50％，或约60％，或约70％，或约80％的中等水平降低。更优选地，该降低是血管生成速率或水平的约90％，或约95％，或约99％，或约99.9％的高水平降低。最优选地，抑制还可以包括消除血管生成或将其降低至不可检测的水平。用于确定血管生成的速率或水平，并因此确定抗体是否以及在何种程度上抑制血管生成的方法和测定法是本领域已知的，并且在本文的实施方案中进一步详细描述。

通常，被抑制的血管生成是肿瘤血管生成。因此，个体可具有实体瘤，其可通过抑制肿瘤血管生成来治疗，即实体瘤与新血管生成相关。

如前所讨论，优选将包含本发明的核酸或载体的免疫细胞(例如T细胞)用于本发明的治疗方法中。免疫细胞(例如T细胞)可以是自体的或同种异体的。

“自体”是指要用于治疗方法或用途(即要用核酸或载体转导)的细胞来源于或者获自要进行治疗方法的受试者。因此，从受试者获得自体细胞，用核酸或载体转导并返回相同的受试者。

“同种异体”是指要用于治疗方法或用途(即要用核酸或载体转导)的细胞来源于或获自与要进行治疗方法的受试者的不同受试。因此，同种异体细胞从第一个受试者获得，用核酸或载体转导并施用于第二个受试者。

用于向受试者施用的细胞，特别是T细胞的方法，制剂和量是本领域公知的，并且在下文进一步讨论。特别地，T细胞可以用于肿瘤内施用或通过iv(静脉内)输注施用。典型的剂量可以是每kg的10⁶-10⁸个细胞。本发明还提供了包含本发明的核酸，载体或细胞的药物组合物。

如本文所用，术语“受试者”是指人或非人受试者，例如，如前所定义的哺乳动物。

尽管本发明的核酸，载体或细胞在分离使用时可以有效对抗疾病，但是可以将另外的治疗剂与本发明的核酸，载体或细胞组合使用以对抗疾病。特别地，可以期望通过施用本发明的核酸，载体或细胞，然后用细胞毒性剂治疗肿瘤来抑制肿瘤血管生成并因此减小受试者中肿瘤的大小。

因此，在本发明的另一个实施方案中，可以向受试者施用至少一种另外的或额外的治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)。因此，可以向受试者施用本发明的核酸，载体，CAR，细胞或细胞群体和其他治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)。因此，本发明的组合物或药物组合物可以包含其他活性剂或治疗剂，以及本发明的核酸，载体，CAR，细胞和/或细胞群体。然而，应当理解，本发明的核酸，载体，CAR，细胞或细胞群体和其他治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)可以分开施用，例如通过分开施用途径。另外，本发明的核酸，载体，CAR，细胞或细胞群体和至少一种其他治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)可以序贯或(基本上)同时施用。它们可以在相同的药物制剂或药物中施用，或者它们可以分别配制和给药。对于序贯施用，可以在施用核酸/载体/细胞之前或之后至少1分钟，10分钟，1小时，6小时，12小时，1天，5天，10天，2周，4周或6周施用另外的治疗剂。

在一个具体实施方案中，本发明提供了对抗与CLEC14A表达有关的疾病或状况，例如用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成的方法，例如治疗癌症的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用如本文所定义的本发明的核酸/载体/CAR/细胞/细胞群题，特别是有效量的所述核酸/载体/CAR/细胞/细胞群体并且分开、同时、序贯施用一种或多种另外的活性(例如治疗)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)。

或者，提供了如本文所定义的本发明的核酸，载体，CAR，细胞或细胞群体，用于对抗与CLEC14A表达相关的疾病或状况(例如用于抑制血管生成)其中所述核酸酸，载体，CAR，细胞或细胞群体用于与一种或多种另外的活性(例如治疗)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)分开、同时或序贯施用。

因此，提供了如本文所定义的本发明的核酸，载体，CAR，细胞或细胞群体在制备用于对抗与CLEC14A表达相关的疾病或状况，例如用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成，例如用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述核酸，载体，CAR，细胞或细胞群体与一种或多种另外的活性剂(例如治疗剂)(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)组合施用。

因此，在一个实施方案中，药物可进一步包含一种或多种另外的活性(例如治疗)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)。另外的活性剂还可以是免疫检查点抑制剂。

药物可以是单一组合物的形式，其包含如本文定义的本发明的核酸，载体，抗体或基于配体的CAR或免疫效应细胞以及一种或多种另外的活性(例如治疗性)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)两者，或者它可以是含有它们以用于分开(例如同时或序贯)施用的试剂盒或产品的形式。

在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗癌剂。另外的抗癌剂可以选自烷基化剂，包括氮芥类，例如氮芥(HN2)，环磷酰胺，异环磷酰胺，美法仑(L-沙可来新)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类如六甲基三聚氰胺，塞替派；磺酸烷基酯诸如白消安；亚硝基脲类，如卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，司莫司汀(甲基-CCNU)和链脲佐菌素(链脲佐菌素)；和三嗪类如氨烯咪胺(DTIC；二甲基三氮烯咪唑-咪唑羧酰胺)；抗代谢物，包括叶酸类似物，如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)；嘧啶类似物如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)，氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)和阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)；和嘌呤类似物和相关的抑制剂，如巯嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)，硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)和喷司他丁(2'-脱氧助间型霉素)；天然产物，包括长春花生物碱类诸如长春碱(VLB)和长春新碱；表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素如更生霉素(放线菌素D)，柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)，多柔比星，博来霉素，普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C)；酶诸如L-天冬酰胺酶；和生物反应调节剂，如干扰素alphenomes；混杂的试剂，包括铂配位络合物，如顺铂(cis-DDP)和卡铂；蒽二酮诸如米托蒽醌和蒽环类药物；取代的尿素如羟基脲；甲基肼衍生物如丙卡巴肼(N-甲基肼，MIH)；和肾上腺皮质抑制剂，如米托坦(ο，p'-DDD)和氨鲁米特；紫杉醇和类似物/衍生物；细胞周期抑制剂；蛋白酶体抑制剂如硼替佐米（信号转导酶(例如酪氨酸激酶)抑制剂如伊马替尼COX-2抑制剂和激素激动剂/拮抗剂如氟他胺和他莫昔芬。

临床使用的抗癌剂通常按作用机制分组：烷化剂，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，RNA/DNA抗代谢物，DNA抗代谢物和抗有丝分裂剂。美国国立卫生研究院/国家癌症研究所网站列出了122种化合物(http://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/searches/standard_mechanism.html)，所有这些化合物都可以与本发明的抗体，组合物或免疫效应细胞一起使用。它们包括烷基化剂，包括Asaley，AZQ，BCNU，白消安，羧基邻苯二甲酸铂(carboxyphthalatoplatinum)，CBDCA，CCNU，CHIP，苯丁酸氮芥，氯噻嗪，顺铂，氯乙矾(clomesone)，氰基吗啉代-多柔比星，环二酮(cyclodisone)，二脱水半乳糖醇(dianhydrogalactitol)，氟多潘(fluorodopan)，hepsulfam，海恩酮，美法仑，甲基CCNU，丝裂霉素C，mitozolamide，氮芥，PCNU，哌嗪，哌嗪二酮，哌泊溴烷，泊非霉素，spirohydantoinmustard，替罗昔隆，四铂，picoplatin(SP-4-3)(顺式-氨基二氯(2-甲基吡啶))(Pt-II))，塞替派，曲他胺，尿嘧啶氮芥，Yoshi-864；抗有丝分裂剂，包括allocolchicine，Halichondrin B，秋水仙素，秋水仙素衍生物，多拉司他汀10，美坦辛，根霉素，紫杉醇，紫杉醇衍生物，硫代秋水仙碱，三苯甲基半胱氨酸，硫酸长春碱，硫酸长春新碱；拓扑异构酶I抑制剂，包括喜树碱，喜树碱，钠盐，氨基喜树碱，20种喜树碱衍生物，吗啉代多柔比星；拓扑异构酶II抑制剂，包括多柔比星，氨萘非特，m-AMSA，蒽吡唑衍生物，吡唑啉吖啶，比生群HCL，柔红霉素，脱氧多柔比星，米托蒽醌，美诺立尔，N,N-二苄基道诺霉素，oxanthrazole，柔红霉素苯腙(rubidazone)，VM-26，VP-16；RNA/DNA抗代谢物，包括L-阿拉诺新，5-氮杂胞苷，5-氟尿嘧啶，阿西维辛，3氨基蝶呤衍生物，抗叶酸剂，Baker可溶性抗叶酸剂，二氯烯丙基指甲花醌(dichlorallyl lawsone)，布喹那，替加氟(前药)，5,6-二氢-5-氮杂胞苷，甲氨蝶呤，甲氨蝶呤衍生物，N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)，吡唑霉素，三甲曲沙；DNA抗代谢物，包括3-HP，2'-脱氧-5-氟尿苷，5-HP，α-TGDR，阿非科林甘氨酸盐(aphidicolinglycinate)，ara-C，5-氮杂-2'-脱氧胞苷，β-TGDR，环胞苷，胍那唑，羟基脲，肌苷糖二醛(inosine glycodialdehyde)，macbecin II，吡唑并咪唑(pyrazoloimidazole)，硫鸟嘌呤和硫嘌呤。

在一些优选的实施方案中，至少一种其他抗癌剂选自顺铂；卡铂；picoplatin；5-氟尿嘧啶；紫杉醇；丝裂霉素C；多柔比星；吉西他滨；拓优得；培美曲塞；甲氨蝶呤；伊立替康，氟尿嘧啶和亚叶酸钙(leucovorin)；奥沙利铂，5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸；和紫杉醇和卡铂。

当已经显示另外的抗癌剂对特定肿瘤类型特别有效时，可以优选本发明的核酸，载体或细胞与该另外的抗癌剂组合使用以治疗该特异性肿瘤类型。

在一些实施方案中，抗血管生成化合物可以选自以下任何一种：贝伐单抗伊曲康唑；羧胺三唑(carboxyamidotriazole)；TNP-470(夫马洁林类似物)；CM101；IFN-α；IL-12；血小板因子-4；舒拉明；SU5416；凝血酶敏感蛋白；VEGFR拮抗剂；血管抑制类固醇+肝素；软骨衍生的血管生成抑制因子；基质金属蛋白酶抑制剂；血管他丁；内皮他丁；2-甲氧基雌二醇；tecogalan；四硫钼酸盐；沙利度胺；催乳素；αVβ3抑制剂；利诺胺；他喹莫德(Tasquinimod)；兰尼单抗(ranibizumab)；索拉非尼(sorafenib)；舒尼替尼帕唑帕尼(pazopanib)和依维莫司

另外的治疗剂可以是缺氧激活的细胞毒剂，例如替拉扎明，或细胞因子，其可以增强CAR表达细胞(例如T细胞)的功效/持久性/扩增。或者/另外，另外的治疗剂可以是改善与施用CAR表达细胞相关的一种或多种副作用的治疗剂。

如先前所提及，另外的治疗剂可以是免疫检查点抑制剂。此类抑制剂通常通过阻断免疫细胞和靶细胞(例如肿瘤细胞)之间的相互作用来起作用，所述相互作用阻止或下调免疫细胞的刺激。特别地，检查点抑制剂预防或减少T细胞上表达的蛋白质与肿瘤细胞上表达的蛋白质之间的相互作用，该相互作用将阻止或减少T细胞的刺激。检查点抑制剂可以例如阻止PD1和PDL1之间的相互作用，特别是可以构成结合PD1的试剂。或者，检查点抑制剂可以与CTLA-4结合。此类检查点抑制剂是本领域公知的，包括单克隆抗体，例如派姆单抗(Pembrolizumab)，纳武单抗(Nivolumab)或伊匹单抗(Ipilimumab)。

另外的活性剂也可以是鞘氨醇-1-磷酸酶激动剂，例如FTY720，其能够通过阻断来自鞘氨醇-1磷酸受体的信号来隔离淋巴样器官中的淋巴细胞。以此类方式，此类化合物可以限制对细胞因子如IL-7和IL-15的竞争，并因此可以使施用的CAR表达细胞疗法的增殖增加。特别地，此类化合物可以在本发明的核酸，表达载体，CAR或细胞之前施用，例如，之前至少12小时，24小时，36小时或48小时。

另外，别的或另外的活性(例如治疗)剂可以是TCR分子(例如在免疫细胞例如T细胞上表达，或为可溶形式)，包含编码TCR分子的多核苷酸的核酸分子或包含所述核酸分子的载体。在特别优选的实施方案中，另外的治疗剂是细胞(例如T细胞)，其包含编码TCR分子的核酸(例如RNA或载体)。因此，如前所讨论，在本发明的一个具体实施方案中，编码如本文所述的CAR的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述核酸或表达本发明的CAR的细胞或所述CAR本身可用于与T细胞受体(TCR)分子疗法(例如作为基因或细胞疗法或作为可溶性TCR)一起治疗。本发明的该实施方案涵盖组合产品，其可具有增强的靶向实体瘤的能力。因此，特别地，TCR分子疗法可以将不同的肿瘤相关抗原靶向到靶向CLEC14A的本发明的CAR，因此此类组合产品或疗法可以提供用于治疗实体瘤的特别有效的药物。

如本文所用，“TCR”或“T细胞受体”分子是指能够在T细胞表面上表达并且能够结合特定MHC或HLA/抗原肽复合物的分子(例如呈现在抗原呈递细胞或肿瘤细胞表面上)的分子。因此，当在具有特定MHC或HLA的复合物中发现时，TCR通常识别抗原或抗原片段。如本文所用，TCR分子可包含两条蛋白质或多肽链(例如可包含αTCR链和βTCR链，或γTCR链和δTCR链)，或TCR可为单链分子，其中α和β链或γ和δ链得到表达并包含在单个蛋白质或多肽链中。单链TCR分子记载于Chung等(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,12654-12658，其通过引用并入本文。

每个TCRα，β，γ或δ链通常包含可变区，其中每个可变区通常包含至少一个互补决定区(例如，两个，特别是三个互补决定区)，其能够识别和结合肿瘤相关的抗原肽/MHC复合物。互补决定区(CDR)可以通过一个或多个框架区(FR)彼此分开，并且通常如本文定义的TCRα，β，γ或δ链可变区可以包含三个CDR和三个FR。特别地，如本文所述，TCR分子可包含α链可变区和β链可变区，所述α链可变区以N至C末端顺序包含FR1α-CDR1α-FR2α-CDR2α-FR3α-CDR3α，所述β链可变区以N至C末端顺序包含FR1β-CDR1β-FR2β-CDR2β-FR3β-CDR3β。

此外，α，β，γ或δ链可以包含恒定区(例如具有细胞外和跨膜区)或恒定区的一部分(例如仅具有胞外域)。特别地，包含两个单独的α/β或γ/δ多肽链的TCR可包含其中一个或两个所述链具有恒定域(例如具有细胞外和跨膜域)的链。在一个具体实施方案中，α/β或γ/δTCR链均包含可变区和恒定区。

如本文所用，单链TCR可包含单个恒定区，例如，可以包含在单个多肽链内包含的α链可变区，β链可变区和β链恒定区，或α链可变区，β链可变区和α链恒定区。

如本文所定义，TCR分子可以是可溶性TCR分子或膜结合TCR。可溶性TCR分子通常包含截短的恒定区或不具有恒定区，其中任何截短足以除去恒定区的跨膜部分。缺乏跨膜部分的可溶性TCR可用于将其他分子靶向到显示肿瘤相关抗原肽/MHC复合物的细胞。然而，特别地，膜结合TCR可用于本发明的组合疗法中。因此，特别地，如本文所定义，TCR分子可包含恒定区跨膜域(例如，一个跨膜域或两个跨膜域，在每个链中包含一个)。

应当理解，TCR的α/β和γ/δ链的恒定区在TCR之间是相对保守的。因此，仅存在天然TCR分子中的两个变体β恒定区(其仅在4个氨基酸中不同)，单个α和δ链恒定区，以及三个变体γ恒定区。尽管如本文使用的TCR分子可包含任何天然恒定区，但特别地，TCR可包含对TCR中包含的任何恒定区或其部分的一种或多种修饰。特别优选改善TCR链配对或改善可溶性或单链TCR分子产生的修饰。

如本文所用，TCR分子可以包含通过用半胱氨酸残基取代α/β和γ/δ链中的一个或多个残基而不存在于天然存在的分子内的另外的二硫键。在这方面，在β链恒定区中用半胱氨酸残基取代氨基酸和α链恒定区中用半胱氨酸残基取代氨基酸可以允许取代的半胱氨酸残基之间形成非天然存在的二硫键，其可以防止或减少α和β链与T细胞中内源α和β链的错配。特别地，可以对TCR中包含的两条链的恒定区的细胞外部分进行修饰。

更具体地，如本文所用，TCR分子可以包含在α链恒定区中的Thr 48处取代为半胱氨酸和在β链恒定区中的Ser 57处取代为半胱氨酸；在α链恒定区中的Thr 45处取代为半胱氨酸和在β链恒定区中的Ser 77处取代为半胱氨酸；在α链恒定区中的Tyr10处取代为半胱氨酸和在β链恒定区中的Ser 17处取代为半胱氨酸；在α链恒定区中的Thr 45处取代为半胱氨酸和在β链恒定区中的Asp 59处取代为半胱氨酸；在α链恒定区中的Ser 15处取代为半胱氨酸和在β链恒定区中的Glu 15处取代为半胱氨酸。

因此，如本文所用的TCR分子可以在α链恒定区中具有Thr 48至半胱氨酸取代以及在β链恒定区中具有Ser 57至半胱氨酸取代。α链和β链恒定区的天然存在的氨基酸序列分别在SEQ ID No.187和188中列出，因此特别地，上述讨论的修饰可以在这些序列内的所述位置进行。

可以对TCR进行其他修改以改善链之间的配对。例如，可以使用亮氨酸拉链，链可以是鼠源化的或部分鼠源化的，例如，至少一个或两个氨基酸可以是鼠源化的，可以构建TCR样分子(例如通过将TCR融合至CD3ζ)，或者可以反向交换α和β恒定区界面处的氨基酸对。特别地，反向交换的氨基酸对在α和β链的天然TCR恒定区中的表面彼此相互作用。可以对该相互作用的氨基酸对进行诱变，使得α链恒定域的氨基酸被与天然存在的氨基酸相比具有空间突出基团的氨基酸替换，并且β链恒定域的氨基酸被与天然存在的氨基酸相比具有空间凹陷基团的氨基酸替换(或反之亦然，即α链氨基酸可以被具有空间凹陷基团的氨基酸取代并且β链氨基酸可以用具有空间突出基团的氨基酸取代)。与天然存在的氨基酸相比可具有空间凹陷基团的氨基酸可选自甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸和丙氨酸。与天然存在的氨基酸相比可具有空间突出基团的氨基酸可选自谷氨酰胺，谷氨酸，α-甲基缬氨酸，组氨酸，羟赖氨酸，色氨酸，赖氨酸，精氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。特别地，α恒定区中的甘氨酸残基可以被精氨酸取代，并且β恒定区中的精氨酸残基可以被甘氨酸残基取代，例如，可以在α链恒定区中的位置85.1处进行甘氨酸至精氨酸取代，并且可以在β链恒定区中的位置88处进行精氨酸至甘氨酸取代(使用ImMunoGeneTics信息系统(IMGT)命名法来编号TCR恒定域)。因此，精氨酸至甘氨酸取代可发生在SEQ ID NO.188的β恒定区的第73位。

此外，可能期望除去在TCR链之间(例如在α链和β链之间)发生的天然存在的二硫。因此，TCR中的链间天然二硫键可以通过取代参与键的半胱氨酸残基，例如取代为丝氨酸或丙氨酸残基，或通过缺失残基来除去。可以期望的另外的或替代的修饰是除去或取代在天然βTCR链中发生的未配对的半胱氨酸残基。此类修饰可以是优选的，其中TCR是单链TCR。

如本文所用，“肿瘤相关抗原”是指其表达与肿瘤(例如与任何肿瘤类型或与多于一种肿瘤类型)相关的任何抗原。因此，特别地，与健康组织或相同类型的细胞相比，肿瘤相关抗原的表达可在肿瘤或肿瘤细胞中上调或增强。与健康组织或相同类型的细胞(例如，相同类型的从相同器官获得的相同类型的细胞或组织)中的该抗原的表达相比，肿瘤相关抗原的表达可在肿瘤或肿瘤细胞中上调至少2,3,4,5,10,20,50或100倍，或者备选至少20,30,40,50,60，70，80，90或100％。因此，检测组织或细胞中的肿瘤相关抗原可指示肿瘤。特别地，肿瘤相关抗原可以仅以非常低的水平表达，或者可以在健康组织或与特定器官相关的健康组织中检测不到。

肿瘤相关抗原的表达水平通常是指用特定细胞/组织表达的蛋白质的量。测量蛋白质表达水平或检测过表达蛋白质的方法是本领域公知的，包括例如Western印迹法，免疫染色等。

本领域已知许多肿瘤相关抗原，与健康组织相比，其在肿瘤细胞中上调或过表达，并且任何这些抗原可以通过TCR作为本发明治疗中的另外的治疗剂来靶向。特别地，根据本发明，期望靶向实体瘤，因此优选地，如本文所讨论的TCR分子可识别并结合在实体瘤上过表达或上调的肿瘤相关抗原。例如，NY-ESO(与黑素瘤和睾丸癌相关的肿瘤相关抗原)，MAGEA家族(特别是MAGEA 10)(与睾丸癌相关的肿瘤相关抗原)，AFP(与肝细胞癌相关的肿瘤相关抗原)和WT1(在几种肿瘤类型上表达的肿瘤相关抗原)可以在本发明的组合疗法中靶向。

应当理解，TCR分子识别并结合肽/MHC或HLA复合物，因此如本文所用的TCR分子通常识别肿瘤相关抗原的部分或肽片段。此类肽片段可以长5-25个氨基酸，例如长5-10,8-15,10-18,15-25个氨基酸，例如，可以长至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个氨基酸，并且通常是包含在肿瘤相关抗原内的连续肽序列。此外，当与特定MHC或HLA(例如MHC I类或II类或HLA-A1或HLA-A2)组合时，TCR分子仅识别来自肿瘤相关抗原的肽。特别地，如本文所定义的TCR分子在与HLA-A2组合时可识别肽肿瘤相关抗原。

TCR与肽/MHC或HLA复合物的结合可通过本领域已知的各种方法测定，例如通过测量与T细胞活化相关的各种参数，当TCR在T细胞上表达时，通过四聚体测定或通过细胞毒性测定。

如前所讨论，本文使用的TCR优选与编码的CAR结合不同的肿瘤相关抗原，即TCR优选不结合CLEC14A。

在本发明的一个具体实施方案中，TCR分子可以识别并结合WT1肽/MHC或HLA复合物，更特别是WT1肽/HLA A2复合物。例如，TCR可以结合WT1肽235-243(CMTWNQMNL)SEQ IDNO.202-HLA A*2402组合。然而，在特别优选的实施方案中，TCR识别并结合WT1/HLA A2复合物的RMFPNAPYL(SEQ ID NO.189)肽。应当理解，超过一种TCR可以能够结合该复合物，并且一种或多种此类TCR可以用于本发明的组合疗法中。此外，关于该方面，组合疗法可以利用双链TCR(即具有单独的α和β或γ和δ链)和/或单链TCR来结合WT1复合物。

因此，如本文所述的组合疗法中使用的TCR分子(例如作为另外的治疗剂)可包含α链和β链，

其中α链包含SEQ ID NO.190的CDR1α，SEQ ID NO.191的CDR2α和SEQ ID NO.192或193和CDR3α，

其中β链包含SEQ ID NO194的CDR1β，SEQ ID NO.195的CDR2β和SEQ ID NO 196或197的CDR3β，

或其变体，其中一个或多个CDR包含一个，两个或三个氨基酸取代，

其中所述TCR分子能够结合HLA A2/RMFPNAPYL复合体。

应当注意，在一些命名系统中，β链的CDR3可以定义为比下面描述的Immunogenetics(IMGT)数据库中使用的命名系统长。另外，在一些命名系统中，α链的CDR3可以定义为比在IMGT系统中短。类似地，恒定区可以包括或不包括在不同命名系统中位于CDR3区侧翼的框架残基。

因此，使用IMGT系统，CDR3α可具有SEQ ID NO.192的氨基酸序列，并且和恒定区包括框架氨基酸序列FGKGTHLIIQP。

使用不同的命名系统(Garcia)(Garcia等，1999，Ann.Rev.Immunol.17,369-397，通过引用并入本文)，CDR3α具有SEQ ID NO.193的氨基酸序列，在此序列直接C端的框架区具有FGKGTHLIIQP的氨基酸序列，并且恒定区以氨基酸序列YIQ开始。

使用IMGT命名系统，CDR3β可具有氨基酸序列SEQ ID NO.196，并且该序列的直接C端的恒定区包括框架氨基酸序列SET。

使用Garcia命名系统，CDR3β具有氨基酸序列SEQ ID NO.197，并且在此序列的直接C端的框架区具有氨基酸序列FGPGTRLLVL，并且直接C端恒定区以氨基酸序列EDL开始。

应当理解，只要框架区与CDR相容，技术人员可以使用任意或任何命名系统容易地设计和合成用于本发明的TCR。氨基酸序列，包括许多TCRα和β链的可变区(以及因此框架区)是本领域公知的，其中一些在IMGT(Immunogenetics)数据库中描述于http://imgt.cines.fr。该信息与例如Garcia等(同上)一起可用于设计和生产包含CDR和FR的TCR。

如上所指示，变体TCR可用于本发明，其中一个或多个CDR可包含一个，两个或三个氨基酸取代。如本文所讨论的，关于CAR序列，特别是取代可以是保守取代，并且任何变体分子应当能够结合HLA A2/RMFPNAPYL复合物。与具有如上定义的CDR的TCR相比，变体结合的亲和力可以是增加或降低的，但仍应当发生结合。用于检测TCR与其肿瘤相关抗原肽/MHC复合物靶物的结合的方法如上所述。

特别地，用作根据本发明的另外的治疗剂的TCR分子可以包含SEQ ID NO.200中所示的TCRα链和SEQ ID NO.201中所示的TCRβ链。或者，TCR分子可包含SEQ ID NO.198中所示的TCRα链和SEQ ID NO.199中所示的TCRβ链，其中所述α和β链序列可以进一步修饰以稳定或增强所述α链和β链的配对。

编码如本文所述的TCR分子的核酸分子可以是DNA或RNA的形式。因此，本发明的组合物可包含编码本发明的CAR和如本文所述的TCR分子的RNA分子。

或者，载体可包含核酸分子，其包含编码TCR的多核苷酸序列。本文描述了用于表达CAR的合适载体，并且此类载体也可用于TCR表达。尽管设想可以使用单独的载体用于CAR和TCR表达，但载体可以编码本发明的CAR和TCR分子两者。在这方面，每个基因的表达可以由不同的启动子控制，或者可以如本文其他地方所述使用单个启动子。

在这方面，本发明提供了包含编码本发明CAR的多核苷酸序列并包含编码能够结合肿瘤相关抗原肽/MHC或HLA复合物的TCR分子的多核苷酸序列的载体。

此外，本发明提供了细胞，所述细胞包含编码CAR的多核苷酸序列的本发明的核酸分子和包含编码能够结合肿瘤相关抗原肽/MHC或HLA复合物的TCR分子的多核苷酸序列的核酸分子。还涵盖细胞，所述细胞包含含有编码本发明的CAR的多核苷酸序列的载体和包含编码能够结合肿瘤相关抗原肽/MHC或HLA复合物的TCR分子的多核苷酸序列的载体。

或者或另外，本发明的细胞可以包含载体，所述载体包含编码本发明的CAR的多核苷酸序列，并且包含编码能够结合肿瘤相关抗原肽/MHC或HLA复合物的TCR分子的多核苷酸序列。

因此，细胞可以表达本发明的CAR分子和如本文所定义的TCR分子(例如来自相同或不同的载体)。

本发明还提供细胞群体，其中至少一个细胞包含包含编码CAR的多核苷酸序列的本发明的核酸，并且至少一个细胞包含含有编码如先前定义的TCR分子的多核苷酸序列的核酸。因此，在该实施方案中，细胞群体可以包含仅表达CAR分子的细胞和仅表达TCR分子的细胞。另外，此类细胞群体还可以包含表达CAR分子和TCR分子的细胞。

通常，如上所讨论，本发明的细胞可以是免疫细胞，特别是T细胞。

本发明的此方面还涵盖包含编码CAR分子和TCR分子的核酸分子或载体(作为分开的多核苷酸序列，或来自相同或不同的载体)的试剂盒。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了组合物，其包含：

(i)核酸分子，其包含编码TCR分子的多核苷酸序列，其中所述TCR分子包含α链和β链，

其中α链包含SEQ ID NO.190的CDR1α，SEQ ID NO.192的CDR2α和SEQ ID NO.192或193的CDR3α，和

其中β链包含SEQ ID NO.194的CDR1β，SEQ ID NO.195的CDR2β和SEQ ID NO.196或197的CDR3β，

其中所述TCR分子能够结合HLA A2/RMFPNAPYL复合物，和

(ii)核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含抗CLEC14A结合域，跨膜域和信号传导域，其中所述抗CLEC14A结合域包含氨基酸序列SEQID NO 58,96,112，125或175，(优选SEQ ID NO 58，优选SEQ ID NO.96或优选SEQ IDNO.125)或其与SEQ ID No 58,96,112，125或175中的任一个具有至少80％序列同一性的变体。

进一步具体提供了包含如上文(i)和(ii)中定义的核酸分子的细胞，特别是T细胞。此外，细胞群体可以包含第一细胞和第二细胞，所述第一细胞包含如上文(i)中定义的核酸，所述第二细胞包含如上文(ii)中定义的核酸。

从上面的讨论中可以明显看出，本发明提供了各种组合物，例如，药物，治疗剂，其包含本发明的核酸，载体，细胞或细胞群体和药学上可接受的稀释剂，载体或赋形剂。在这方面，应当理解，通常可以将本发明的试剂(即核酸，载体或细胞)配制成药物组合物以对个体(即受试者)施用，即与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起。

“药学上可接受的”包括制剂是无菌和无热原的。合适的药物载体，稀释剂和赋形剂在药学领域是公知的。在与药物相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是“可接受的”。通常，载体将是盐水或输注介质(或者称为输注溶液)，其将是无菌和无热原的；但是，可以使用其他可接受的载体。本发明的组合物可包含合适的冷冻保存剂，例如DMSO。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物或制剂用于胃肠外施用，更特别用于静脉内施用。在优选的实施方案中，药物组合物适合于例如通过注射给患者静脉内施用。

适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和溶质，其使制剂与意图接受者的血液等张；和含水无菌悬浮液。

液体药物组合物通常可以包含输注介质中的本发明的细胞，例如，T细胞，其可包含plasmalyte A加HSA(例如为4％)。本发明的细胞通常使用无菌等张溶液输注。胃肠外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。

本发明的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数目和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素确定，尽管适当的剂量可以通过临床试验确定。

本发明的组合物可以以单剂量或多剂量施用。特别地，该组合物可以单次一次性施用。

本发明的试剂或组合物可以通过任何胃肠外途径以包含活性成分的药物制剂的形式施用。取决于病症和待治疗的患者以及施用途径，组合物可以以不同剂量(例如以细胞/kg或m²测量)施用。在任何情况下，内科医生将确定最适合于任何个体患者的实际剂量，并且它将随着特定患者的年龄，体重和反应而变化。然而，通常，对于本发明的细胞，可以提供高达1x10⁹/kg(或以m²计等同)的剂量用于静脉内施用，例如，至少1x10⁸个细胞/kg的剂量。对于肿瘤内施用，设想高达1x10¹⁰个细胞/kg的剂量。

在人疗法中，本发明的试剂或组合物通常与根据预期施用途径和标准药学实践选择的合适的药物赋形剂，稀释剂或载体混合施用。通常，本发明的细胞可以在输注缓冲液中施用。

本发明的试剂或组合物还可以以胃肠外施用，例如静脉内，动脉内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内，颅内，肌内或皮下，或者它们可以通过输注技术施用。它们最好以无菌水溶液的形式使用，其可以含有其他物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等张。若必要的话，水溶液应当适当缓冲(优选pH为3至9)。在无菌条件下制备合适的胃肠外制剂可通过本领域技术人员公知的标准制药技术容易地完成。

制剂可以在单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿，袋和小瓶中呈现。

在一些实施方案中，本发明的试剂或组合物可以通过眼途径施用。对于眼使用，本发明的试剂或组合物可以配制成例如等渗pH调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选地，作为等渗pH调节的无菌盐水中的溶液，任选地与防腐剂例如苄基氯化铵组合。

本发明的核酸分子试剂(例如核酸分子，载体等)可以作为如下所述的合适的遗传构建体施用，并在表达它的情况下递送给患者。通常，遗传构建体中的核酸与可在细胞中表达化合物的启动子可操作地连接。本发明的遗传构建体可以使用本领域公知的方法，例如Sambrook等(2001)中的方法制备。

用于递送多核苷酸的遗传构建体可以是DNA或RNA。因此，本发明涵盖涉及将本发明的核酸分子或表达载体直接施用于受试者的基因疗法治疗方法。此外，还涵盖涉及直接施用CAR的治疗方法。此类方法可以是有利的，因为这些方法避免细胞的离体处理。

优选地，遗传构建体适于递送至人细胞。将遗传构建体导入细胞中的手段和方法是本领域已知的，包括使用免疫脂质体，脂质体，病毒载体(包括痘苗，改良痘苗，慢病毒，细小病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体)，并通过直接递送DNA，例如使用基因枪和电穿孔。此外，将多核苷酸递送至患者的靶组织以进行治疗的方法也是本领域公知的。在另一种方法中，使用利用受体介导的胞吞作用将DNA大分子携带到细胞中的高效核酸递送系统。这通过将铁转运蛋白转铁蛋白与结合核酸的聚阳离子结合来实现。使用高效率受体介导的本发明的DNA构建体或其他遗传构建体的递送，其使用由Cotten等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:6094-6098的方法产生的缺陷或化学灭活的腺病毒颗粒的内体破坏活性进行。应当理解，“裸DNA”和与阳离子和中性脂质复合的DNA也可用于将本发明的DNA导入待治疗个体的细胞中。Ledley(1995，Human Gene Therapy 6,1129-1144)中描述了基因治疗的非病毒方法。

虽然对于特定组织的癌症/肿瘤，在编码多核苷酸抑制剂的载体中使用组织特异性启动子可能是有用的，但这不是必需的，因为预期除了癌症/肿瘤外的位置处的身体中的核酸分子试剂的表达风险与对患有癌症/肿瘤的患者的治疗性益处相比是可耐受的。可以期望能够暂时调节细胞中多核苷酸抑制剂的表达，尽管这也不是必需的。

可以适当地修改用于施用的本发明的试剂(例如核酸，载体，细胞或细胞群)以用于药物组合物。例如，可以例如通过使用适当的添加剂，例如盐或非电解质，乙酸盐，EDTA，柠檬酸盐，Tris，磷酸盐或乙酸盐缓冲液，甘露醇，甘氨酸，HSA(人血清白蛋白)或Polysorbate在本发明的组合物中将试剂稳定化以防止降解。许多稳定剂在本领域中是已知的。特别地，可以将细胞冷冻保存，并且在输注入受试者中之前在适当的时间时解冻。

本发明还包括试剂盒，其包含下列一种或多种：本发明的核酸，载体，细胞或组合物。优选地，所述试剂盒用于如本文所述的方法和用途，例如如本文所述的治疗方法，或用于体外测定或方法。优选地，所述试剂盒包含使用试剂盒组分的说明书。

本文对“肿瘤”的任何提及也指“癌症”或“癌瘤”。也可以治疗转移性癌症，其可以减少原发性肿瘤的转移。留在术后患者中的所谓的微小残留病(MRD)可以适合用如本文定义的试剂进行免疫疗法。

如在整个申请中所使用的，术语“一个”和“一种”在它们意味着所引用的组件或步骤的“至少一个/种”、“至少第一”、“一个/种或多个/种”或“多个/种”的意义上使用，除了在其后具体说明上限的情况之外。因此，如本文所用，“抗体”意指“至少第一抗体”。根据本公开内容，本领域普通技术人员将知道组合的可操作限制和参数，与任何单一试剂的量一样。

本文引用的文献通过引用并入本文。

现在将参考以下实施方案和附图更详细地描述本发明：

图1显示来自Genbank登录号NP_778230(SEQ ID NO.1)的人CLEC14A的多肽序列(图1A)；来自Genbank登录号NM_175060的人CLEC14A的cDNA(SEQ ID NO.2)(图1B)和来自NM_175060的348-1820位的人CLEC14AcDNA的编码区(SEQ ID NO.3)。

图2显示了CLEC14A在HUVEC和其他原代细胞中的相对表达的图。CLEC14A在内皮细胞(HUVEC)中特异性表达，而不在人主动脉平滑肌细胞(HASMC)，人肺成纤维细胞(MRC50，人支气管上皮细胞(HBE)，肝细胞或外周血单个核细胞(PBMC)中表达。

图3显示了用抗CLEC14A单克隆抗体CRT-3进行的HUVEC划痕伤口愈合测定的图示结果，显示了伤口闭合的延迟。

图4显示用CLEC14A抗体处理的HUVEC的小管形成测定的分析。用2Cμg/ml CRT2,3或4或小鼠IgG同种型对照处理HUVEC。在16小时时取小管图像并分析总小管长度，接合(junction)数目，分支数目，分支长度，网孔(mesh)数目和总网孔面积。显示的数据代表三个实验，每个分析五个数据点。误差棒显示SEM。*P，0.05。**P<0.01。

图5显示了CLEC14A的siRNA敲低，其揭示了CLEC14A在内皮发芽中的作用。图5A显示如通过qPCR测定，CLEC14A的siRNA双链体靶向可有效敲低HUVEC中的CLEC14A mRNA表达。通过相对于flotilin2将表达标准化来确定相对表达。图5B显示通过蛋白质印迹分析在蛋白质水平上的CLEC14A敲低。微管蛋白用作上样对照。图5C显示对照或clec14a靶向siRNA处理的HUVEC在16小时后芽长出的代表性图像。图5D显示了用于对照和CLEC14A敲低HUVEC的27个球状体(来自3个带的9个球状体)的芽的定量；Mann-Whitney统计检验p<0.001。图5E显示了混合对照(绿色)和clec14a靶向siRNA处理的HUVEC(红色)24小时后芽长出的代表性图像。图5F显示来自对照(CON)和CLEC14A敲低(KD)HUVEC的尖端和茎细胞的百分比的定量；使用Bonferroni后检验的双因素ANOVA统计检验***＝p<0.001，ns＝不显著。

图6显示CLEC14A的丧失抑制体外和体内发芽。图6A显示了C57BL/6(clec14a+/+)或C57BL/6(Clec14atm1(KOMP)Vlcg)(clec14a-/-)小鼠中clec14a基因的示意图。图6B显示了对于clec14a的5'非翻译区(UTR)，编码序列(CDS)和3'UTR的从三个clec14a+/+小鼠(白色柱)和三个clec14a-/-小鼠(黑色柱)产生的cDNA的定量PCR分析。通过相对于flotilin2将表达标准化确定相对表达。图6C显示了使用针对鼠CLEC14A的多克隆抗血清对来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的肺裂解物中CLEC14A蛋白表达的Western印迹分析。微管蛋白用作上样对照。图6D显示了来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的主动脉环发芽测定的代表性图像。图6E显示了每个环形成的管的定量，图6F显示了内皮管从主动脉环迁移的最大距离的定量，来自每个基因型的48个环的数据，每个基因型的6个小鼠；Mann-Whitney统计检验p<0.001。图6G显示了来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的海绵植入物的苏木精和曙红染色切片的代表性图像，分析了海绵中心的切片。图6H显示了细胞侵入图6G中所示的海绵植入物的定量；Mann-Whitney统计检验p<0.05。图6I显示了血管密度的定量；Mann-Whitney统计检验p<0.001。图6J显示用x-gal染色，用苏木精和曙红复染色的来自clec14a-/-小鼠的肝脏和海绵组织的切片。

图7显示CLEC14A的丧失抑制肿瘤生长。图7A显示了clec14a+/+(带点的黑线)和clec14a-/-(带有正方形的黑线)小鼠中的Lewis肺癌(LLC)肿瘤生长；双因素ANOVA统计分析，*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。图7B显示LLC肿瘤的代表性图像。图7C显示7个clec14a+/+(点)和7个clec14a-/-(正方形)小鼠的终点肿瘤重量；Mann-Whitney统计检验p<0.001。图7D显示了针对鼠CD31染色的LLC肿瘤切片的免疫荧光染色的代表性图像。图7E显示了血管密度的定量，而图7F显示了来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的内皮覆盖百分比；Mann-Whitney统计检验p<0.0001。图7G显示用x-gal染色，用苏木精和曙红复染色的来自clec14a-/-小鼠的肝脏和LLC肿瘤组织的切片。

图8显示MMRN2结合CLEC14A。在图8A中，使用20μgCLEC14A-ECD-Fc或Fc来沉淀相互作用的配偶体。在SDS-PAG上分离沉淀物和HUVEC裂解物，并针对MMRN2(上图)或CLEC14A-ECD-Fc(下图)进行印迹法。在图8B中，使用针对CLEC14A的多克隆抗血清从HUVEC裂解物中免疫沉淀CLEC14A。通过Western印迹分析免疫沉淀物的MMRN2(上图)和CLEC14A(下图)。

图9显示MMRN2-CLEC14A相互作用阻断性抗体抑制肿瘤生长。图9A显示注射LLC的小鼠用mIgG1(带点的黑线；n＝7)或C4抗体(带有正方形的黑线；n＝7)的100μg注射处理的结果；双因素ANOVA统计分析，**＝p<0.01，***＝p<0.001。图9B显示了LLC肿瘤的代表性图像。图9C显示7个mIgG1处理的小鼠(点)和7个C4抗体处理的小鼠(正方形)的终点肿瘤重量；Mann-Whitney统计检验p<0.001。图9D显示了针对鼠CD31染色的LLC肿瘤切片的免疫荧光染色的代表性图像。图9E显示血管密度的定量，而图9F显示用mIgG1或C4抗体处理的小鼠的内皮覆盖百分比；Mann-Whitney统计检验p<0.001。

图10显示CLEC14A单克隆抗体C1，C4和C5阻断CLEC14A-MMRN2相互作用。将人CLEC14A-ECD-Fc与蛋白A珠结合，在20％FCS中封闭，然后在每种阻断条件下温育。然后将这加入过表达具有His标签的全长人MMRN2的HEK293T细胞的裂解物中。与CRT1，CRT4和CRT5预温育降低由CLEC14A-ECD-Fc下拉的MMRN2水平。

图11显示MMRN2在非还原条件下直接结合CLEC14A的C型凝集素或sushi域。用含有CLEC14A野生型(WT)的pCS2载体或每个主要域缺失(Δ)且具有N末端HA标签的构建体模拟转染或转染HEK293T细胞。在用MMRN2蛋白裂解物进行远Western印迹法后，除了缺少C型凝集素域(CTLD)或sushi域的那些突变体外，可以在所有突变体中看到结合。包括抗HA印迹以显示表达所有突变蛋白。

图12显示了嵌合蛋白嵌合体5和嵌合体6的蛋白质序列。

图13显示了使用流式细胞术分析CRT抗体的结合。所有构建体都具有C末端GFP标签，因此将绿色细胞门控并染成红色。所有CRT抗体结合HEK293T细胞中表达的具有C末端GFP标签的CLEC14A野生型。CRT抗体无一结合HEK293T细胞中表达的具有GFP标签的野生型血栓调节蛋白。

图14显示CD141的CLEC14A区域1-42的比对；CD141的CLEC14A区域97-108；和CD141的CLEC14A区域122-142。

图15显示除了在CRT2的情况下荧光的轻微移动之外，任何CRT抗体都不识别嵌合体5(血栓调节蛋白的CTLD，其余CLEC14A)。嵌合体6(血栓调节蛋白的Sushi以确保CLEC14A的CTLD的正确折叠)导致除CRT2之外的所有CRT抗体的结合。

图16显示当残基97-108与来自血栓调节蛋白的相应区域交换时抗体CRT1-5的结合的流式细胞术分析。这导致正确的折叠，因为CRT2和CRT3仍然可以结合。然而，CRT1，CRT4和CRT5不能识别此类突变体，这提示这是结合区。

图17显示当使用CRT-4抗体药物缀合物治疗时肺癌的肿瘤重量减少。图17A显示当将100万个Lewis肺癌细胞皮下注射到小鼠的右体侧中并允许生长至可见大小时的结果。通过尾静脉注射施用1mg/kg抗体CRT4-ADC(右图)或对照B12-ADC(左图)。观察小鼠一小时并在24小时后扑杀。解剖并固定所有器官。n＝1。图17B显示抗体药物缀合物治疗的终点肿瘤重量。当与B12-ADC处理组相比时，CRT4-ADC处理组的湿重之间存在显著差异。MannWhitney检验p＝0.0317。误差棒SEM，n＝5。数据汇集自同一方法的两个分开的实验。

图18显示CRT-3抗体药物缀合物的内化及这在施用后24小时对肿瘤的影响。图18A显示CRV-3抗体药物缀合物在HUVEC中的内化，其中荧光成像显示0和90分钟后CRT-3的定位，而图18B显示通过CRT-3-ADC处理的HUVEC中的Cell Titre Glo发光细胞存活力测定法测量的细胞毒性(IC50＝137.6ng/ml)。图18C显示CRT3-ADC处理的小鼠而不是对照中肿瘤部位的广泛出血，表明血管生成的肿瘤特异性破坏。

图19显示了共表达截短的CD34标志物基因和scFv片段/CD3ζ链嵌合受体的逆转录病毒CAR载体(基于pMP71)(图19A)。表达由LTR启动子驱动，并且2A肽接头确保CD34和CAR两者的等摩尔表达。第二代CAR构建体包括CD28共刺激域。图19B显示通过流式细胞术分析的CD34染色，证明使用共表达CLEC14A特异性CAR的逆转录病毒构建体成功转导T细胞。基于抗体CRT3和CRT5的第一代CAR分别称为CRT3.z和CRT5.z。基于抗体CRT3和CRT5的第二代CAR分别称为CRT3.28z和CRT5.28z。注意在CD4和CD8T细胞亚组中观察到等同表达(数据未显示)。图19C显示使用CLEC14A-Fc针对CAR表达直接染色的细胞(％值显示CLEC14A-Fc的特异性结合，其已经扣除仅用Fc的背景染色)。

图20显示了经转导以表达基于抗体CRT3或CRT5的第一代或第二代CAR的T细胞或模拟转导的(对照)T细胞响应CLEC14A的能力，所述CLEC14A表达为(A)平板结合的重组Fc融合蛋白，(B)在工程化CHO细胞上表达，或(C)在静态培养中培养时天然表达CLEC14A的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上表达。使用用于干扰素γ产生的ELISA测量的T细胞应答。显示的数据代表从3-7次重复实验获得的数据。调节T细胞以使转基因表达细胞的频率相等。所有直方图显示均值响应+SD。

图21显示了CLEC14A特异性CAR转导的T细胞的进一步体外功能测试。在以下功能性测定法中对经转导以表达基于抗体CRT3或CRT5的第一代或第二代CAR的T细胞或模拟转导的(对照)T细胞测试其响应CLEC14A的能力：(A)细胞毒性，使用工程化改造为表达人CLEC14A的CHO细胞(扣除单独CHO(对照细胞)裂解的背景水平)。显示的数据代表5次重复实验。(B)增殖，使用CFSE标记的CAR转导的T细胞，当与HUVEC共培养4天时，我们测量了CAR+(CD34+)和CAR-(CD34-)细胞亚组的增殖。显示的数据代表2次重复实验。(C)使用干扰素γ释放评估(CLEC14A特异性CAR转导的T细胞对人和小鼠CLEC14A两者的响应。调节T细胞以使转基因表达细胞的频率相等。所示数据代表6次重复实验。所有直方图显示均值响应+SD。

图22显示了用基于抗体CRT1的第三种CLEC14A特异性CAR转导的T细胞的体外功能测试。对经转导以表达基于抗体CRT1的第一代或第二代CAR的T细胞或模拟转导(对照)T细胞测试它们响应(A)工程化CHO细胞或(B)人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上表达的CLEC14A的能力，所述人脐静脉内皮细胞当在静态培养中培养时天然表达CLEC14A的细胞。使用用于干扰素γ产生的ELISA测量T细胞响应。(C)细胞毒性，使用工程化改造为表达人CLEC14A的CHO细胞(扣除单独CHO(对照细胞)裂解的背景水平)。所示数据代表从至少3次重复实验获得的数据。调节T细胞以使转基因表达细胞的频率相等。所有直方图显示均值响应+SD。

图23显示了使用注射CLEC14A特异性CAR转导的小鼠T细胞的健康C57/BL6小鼠的体内毒性测试。将经转导以表达基于抗体CRT3或CRT5的第一代或第二代CAR的T细胞或或模拟转导(对照)T细胞注射到先前已经照射(4Gy)以帮助T细胞植入的健康C57BL6小鼠的尾静脉中。T细胞源自携带标志物CD45.1的C57BL6同源株(BoyJ)。每只小鼠输注2000万个T细胞(含有4百万个工程化T细胞)。在接下来的45天监测小鼠并且小鼠没有显示明显的毒性体征。(A)在此时间期间体重正常增加。(B)每周尾部出血证明输注的CD45.1+T细胞在输注后持续至少五周，并且贯穿此时间，它们占总循环T细胞合并物的至少30％(注意随着时间，宿主自身的T细胞恢复)。(C)针对CD34以及CD45.1染色相同样品证明在此时间期间，工程化(CD34+)T细胞相对于总输注T细胞群体的比例保持相对恒定。(D)在实验结束时，从CAR处理的小鼠收获脾细胞，并使用免疫磁珠选择分离CD34+细胞。立即离体测试这些细胞证明它们仍然能够响应人和小鼠CLEC14A两者，如通过用于干扰素γ释放的ELISA测量的。图A-C显示均值+SEM。图D显示均值+SD。

图24显示了使用注射CLEC14A特异性CAR转导的小鼠T细胞的健康C57/BL6小鼠的体内毒性测试。在实验结束时，扑杀小鼠并收获主要器官。组织学检查揭示无病理学证据。

图25显示当注射到携带Lewis肺癌肿瘤的小鼠中时CLEC14A特异性CAR转导的小鼠T细胞的抗肿瘤响应。给C57BL6小鼠皮下注射Lewis肺癌细胞(1百万个细胞/小鼠)，4天后小鼠接受4Gy全身照射以辅助T细胞植入。然后将经转导以表达基于抗体CRT3或CRT5的第二代CAR的T细胞或模拟转导的(对照)T细胞注射到尾静脉中。小鼠接受总共2000万个T细胞(CD8:CD4＝5:2)，其中CRT3.28z和CRT5.28z在220万和140万个这些细胞上表达。然后使用(A)生物发光或(B)卡尺监测肿瘤生长。

图26显示当注射到携带Lewis肺癌肿瘤的小鼠中时CLEC14A特异性CAR转导的小鼠T细胞的抗肿瘤响应。在实验结束时，切除肿瘤并称重(A)。组织学分析表明，来自用CAR处理的小鼠的肿瘤显示显著降低的血管密度(B，MECA-32染色)和更高水平的血管渗漏(C，纤维蛋白原染色)。

图27显示当注射到RipTag2小鼠中时CLEC14A特异性CAR转导的小鼠T细胞的抗肿瘤响应(其中大鼠胰岛素启动子(RIP)指导SV40大T抗原转基因(TAg)表达为胰岛的β细胞)。肿瘤在10周龄左右时出现，并且通常导致动物约14周死亡。将表达基于CRT5的第二代CAR的小鼠T细胞(或模拟转导的对照细胞)输注到10周龄的riptag2小鼠中。将模拟处理的小鼠在14周龄时扑杀并测量肿瘤大小。2周后(16周龄)扑杀CAR处理的小鼠，并再次测量肿瘤大小。结果证明与模拟转导的T细胞处理的动物相比，用CAR转导的T细胞(A)处理的小鼠中肿瘤大小的高度显著的抑制。还有一些存活益处的证据，因为在每项研究中处理12只小鼠，而在接受模拟转导的T细胞的那些小鼠中，4只在14周龄前死亡，而所有12只用CAR转导的T细胞处理的小鼠在14周龄时仍存活，并且两周后它们中的剩余部分仍然存活。数据显示个体小鼠中的肿瘤大小。水平线指示均值肿瘤大小+SEM。注意未处理的小鼠未被照射。

图28显示静脉内注射CAR-T细胞4周后RIP-Tag2肿瘤的共聚焦成像。成像显示CD34+(CAR转导的)T细胞在肿瘤中累积。

图29显示用CAR-(或模拟-)工程化T细胞处理的RipTag2肿瘤的组织学分析。图29A显示CAR-T细胞处理的肿瘤中血管密度降低，如通过内皮标志物MECA32的染色所示。图29B显示了CAR细胞处理的肿瘤相对于模拟T细胞处理的肿瘤中的血管密度的汇总。图29C和D显示用CAR转导的T细胞处理的小鼠显示肿瘤中凋亡血管的增加，如通过胱天蛋白酶3染色指示。图29E和F显示用CAR转导的T细胞处理的小鼠显示肿瘤血管系统中纤维蛋白原染色的减少。

图30显示了人肿瘤组织阵列中CLEC14A表达的进一步表征，其计算表达CLEC14A的肿瘤内血管的百分比。n＝针对每种癌症类型研究的病例数。每个病例用圆圈表示，水平线显示每种癌症类型的均值百分比值+SEM。

图31显示了用CRT4CAR转导T细胞。

图32显示了第一代和第代CRT1CAR T细胞两者均可以介导表达CLEC14A的CHO细胞的细胞裂解。

图33显示了表达第一代和第二代CRT-1CAR构建体的T细胞的增殖活性。

图34显示了表达第一代和第二代CRT-1CAR构建体的T细胞响应于表达人CLEC14A的CHO细胞的干扰素γ释放活性(已经扣除对单独CHO细胞的响应)。数据显示从7次重复实验产生的IFNγ的平均浓度(+SEM)。

图35显示了表达第一代和第二代CRT-1CAR构建体的T细胞响应人或小鼠CLEC14A-Fc融合蛋白(或单独的Fc蛋白)的干扰素γ释放活性。

图36显示逆转录病毒TCR基因转移到人T细胞中和转导后人PBMC中的TCR表达。使用抗CD3抗体，IL-7和IL-2进行外周血淋巴细胞活化，然后在三天后用逆转录病毒载体(编码WT1特异性TCR)进行转导。在第6天，使用TCR-V-β2.1抗体监测TCR表达。使用模拟转导的T细胞显示表达V-β2.1的未操作的人T细胞的百分比。转导后CD8阴性和CD8阳性T细胞两者均具有增加的V-β2.1细胞百分比。

图37显示通过用呈递WT126肽的T2细胞重复刺激TCR转导的T细胞，实现表达V-β2.1的CD8阳性T细胞的扩增。因此，在抗原刺激后发生CD8+-Vb2.1+T细胞的增加。

图38显示HLA-A2/pWT126四聚体和TCR转导的T细胞一起染色。

图39显示用TCR转导的T细胞能够杀死呈递WT126肽的T2细胞但非呈递pWT235肽的T2细胞。转导的T细胞还进一步杀死内源性表达WT1的HLA-A2BV173白血病细胞。因此，TCR转导的整体(bulk)T细胞显示pWT126特异性杀伤活性。

图40显示呈递WT126肽的HLA-A2阳性T2细胞被纯化的TCR转导的CD8阳性T细胞杀死，但是用WT235肽包被的T2细胞未被杀死。此外，CD8阳性转导的T细胞还杀死内源性表达WT1的HLA-A2BV173白血病细胞。因此，转导的CD8⁺T细胞显示pWT126特异性杀伤活性。(图解-未填充的正方形＝T2+pWT235，填充的菱形＝T2+pWT126，未填充的圆＝BV173)。

图41显示少量纯化的CD4阳性转导的T细胞与HLA-A2/pWT126四聚体一起染色。

图42显示呈递WT126肽的HLA-A2阳性T2细胞被纯化的TCR转导的CD4阳性T细胞杀死，但是用WT235肽包被的T2细胞未被杀死。此外，CD4阳性转导的T细胞还杀死内源性表达WT1的HLA-A2BV173白血病细胞。

图43显示在用WT126包被的HLA-A2阳性T2细胞刺激后纯化的TCR-转导的CD8阳性细胞，而不是用pWT235肽包被的等同细胞产生IFN-γ。在用内源性表达WT1的HLA-A2阳性BV173白血病细胞刺激后，CD8阳性转导的T细胞也产生IFN-γ。因此，TCR转导的CD8+T细胞显示pWT126特异性IFNγ产生。

图44显示CRT5CAR不阻碍荷瘤小鼠皮肤伤口的愈合。

图45显示用对照(n＝5)或CRT5CAR(具有CD28共刺激域)表达细胞处理后3周的PDAC肿瘤体积。

图46显示了对滴定浓度的人和小鼠重组CLEC14A的CRT1,3和5CAR(具有CD28共刺激域)T细胞应答。

图47显示了编码具有不同共刺激域的CAR的构建体的设计；1)tCD34-F2A-scFv-CD28 TM-CD28信号-CD3zeta,2)tCD34-F2A-scFv-CD8TM-4-1BB信号-CD3zeta,3)tCD34-F2A-scFv-CD8 TM-OX40信号-CD3zeta,4)tCD34-F2A-scFv-CD28 TM-CD28信号-4-1BB信号–CD3zeta,5)tCD34-F2A-scFv-CD28 TM-CD28信号-OX40信号-CD3zeta,6)tCD34-F2A-scFv-CD8 TM-4-1BB信号–OX40信号-CD3zeta。包括tCD34以鉴定成功转导的细胞，因此构建体可以排除此物和F2A。可以另外包括铰链或间隔物区域，例如，来自CD8a的一个。

图48显示了用CRT1,3和5CAR相对于表达CLEC14A的小鼠内皮细胞的细胞毒性测定结果(图48A)。CRT 1,3和5CAR的增殖测定的结果在图48B中显示。

图49显示了包含不同的共刺激域的CRT3CAR T细胞的功能测试和响应于滴定数目的表达人CLEC14A的CHO细胞的IFNγ产生。

图50显示用模拟(n＝5)或CRT5CAR(CD28共刺激域)T细胞(n＝8)处理后3周的原位PDAC肿瘤体积(p＝0.022；Mann Whitney)。

图51显示在与工程化改造为表达CLEC14A嵌合体(A1-具有小鼠胞内域的人CLEC14A，B1-具有小鼠跨膜和胞内域的人CLEC14A，huCLEC-人CLEC14A)的293或SEND细胞温育后CRT1,3和5CAR(CD28共刺激域)T细胞的IFNγ释放。与SEND细胞一起温育后，CAR T细胞的细胞毒性数据显示在图51B中。

图52显示了通过体外转录产生用于电穿孔的RNA的合适载体的示意图。

图53显示可以用于转导鼠T细胞的编码CAR的构建体。构建体包含来自鼠蛋白的跨膜，共刺激和胞内信号传导序列(参见SEQ ID NO 227-232)。构建体可以进一步包含来自鼠CD8α的铰链或间隔物域。

表1显示了序列

在上表中，氨基酸的名称为“X”表示在该位置可以不存在氨基酸。

实施例

实施例1：对CLEC14A的实验研究

材料和方法

HUVEC制备和培养

在捐赠者知情同意后，从英国国家卫生服务局(UK National Health Service)捐赠的脐带中分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。从胎盘解剖脐带，并在无菌PBS中洗涤静脉以除去血液。将在M199培养基(Sigma)中稀释的1mg/ml胶原酶注射到静脉中，然后在37℃下温育20分钟以分离内皮细胞。通过在含有10％FCS，10％大血管内皮细胞生长补充物(TCSCell Works)和4mM L-谷氨酰胺的M199完全培养基中洗涤来收集HUVEC，并在来自猪皮(Sigma)包被的皿的0.1％1型明胶上铺板。

原代细胞来源

人主动脉平滑肌细胞(HASMC)和人支气管上皮细胞(HBE)购自TCS Cell Works。人肺成纤维细胞(MRC5)获自癌症研究英国中心服务局(Cancer Research UK CentralServices)。人外周血单核细胞(PBMC)获自伯明翰大学癌症研究所。肝细胞是伯明翰大学免疫和感染学院David Adams教授的赠品。

HUVEC免疫荧光

在固定在冰冷甲醇中的玻璃微孔室(Nunc)中培养HUVEC，用PBST清洗，在PBST中的10％FCS 3％BSA中封闭。然后遵循用于石蜡包埋切片的相同方案用CLEC14A抗体染色或用针对人VE-钙粘蛋白的5μg/ml小鼠单克隆IgG抗体(Maria Grazia Lampugnani教授,FircInstitute for Molecular Oncology,Milan友情赠送)共染色细胞。用510激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss)分析切片染色。

用CLEC14A单克隆抗体进行划痕伤口愈合测定

在汇合的HUVEC中用10μl移液管尖端产生划痕。应用新培养基，其含有1μg/ml或10μg/ml在小鼠中针对CLEC14A的胞外域产生的单克隆CLEC14A抗体。通过使用Leica DM 1000光学显微镜和USB 2.0 2M Xli照相机在0、4、6、12小时获取伤口闭合的图像来评估HUVEC的化学动力学迁移。使用Image J软件定量伤口的开放区域。

石蜡包埋组织上的免疫荧光

对从癌症研究英国组织学服务获得的石蜡包埋的正常和癌症人组织收集和癌症正常组织阵列(Superbiochips)进行免疫荧光(数据未显示)。使用人常见癌症1(MA2)，包括以下每种癌症的10个核心：胃，食道，肺，结肠/直肠，甲状腺和肾脏，以及常见癌症2(MB3)，包括以下每种癌的10个核心：乳房，肝，膀胱，卵巢，胰腺和前列腺。还分析了匹配相邻正常组织的另外两个对照阵列。除去石蜡后，将组织再水合并在柠檬酸盐缓冲液pH6中在中等功率下微波处理3分钟以用于抗原修复。在含有10％FCS和3％BSA的PBST中封闭切片。用10μg/ml针对人CLEC14A的胞外域的绵羊IgG多克隆一抗(R&D系统)和15μg/ml缀合有FITC的兔IgG抗绵羊多克隆二抗(Zymax)探测切片。用20μg/ml与罗丹明缀合的乌乐树(Ulex europeaus)凝集素I(UEAI)(Vector labs)染色血管内皮细胞。用具有DAPI的延长金抗褪色试剂(prolong gold anti-fade reagent)(Invitrogen)永久性封固载玻片以复染细胞核。使用510激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss)分析切片染色。

单克隆抗体的制备

用于制备单克隆抗体的抗原是鼠CLEC14A-FC(CM)和人CLEC14A-Fc(CH)，任选地与佐剂蛋白(AP)缀合。使用以下方案将这四种抗原(CM，CH，CM-AP，CH-AP)用于小鼠免疫：

日操作

0 采集免疫前样品

完全弗氏佐剂中100ug抗原的免疫(足垫)

14 不完全弗氏佐剂中100ug抗原的免疫(足垫)

17 测试出血

18 腘淋巴结收获物，用于融合

针对三种抗原：CM，CH和Fc通过ELISA测试血清。采集非免疫血清作为阴性对照。

融合方案如下：

(1)从免疫小鼠收获腘淋巴结并均质化。

(2)用温热的DMEM洗涤细胞。

(3)将细胞与sp2/0骨髓瘤细胞混合。

(4)将混合物离心(1000g)

(5)将沉淀物悬浮在50％PEG 1500中并温育1分钟。

(6)用温热的DMEM缓慢稀释悬浮液。

(7)将悬浮液离心(1000g)。

(8)将细胞接种到具有腹膜巨噬细胞的平板中。

(9)将细胞在37℃和5％CO₂下培养

获得来自每只小鼠的超过500个HAT抗性杂交瘤克隆。通过ELISA针对三种吸收的抗原(CM，CH和Fc)以4天间隔测试所有克隆上清液两次。测试产生5个克隆(所有亚类IgG1)，其与CM和CH两者起反应并且不与Fc起反应。通过有限稀释法将所有阳性克隆2-4倍，在培养瓶中繁殖并注射到小鼠中以得到腹水。由于用CLEC14a人(CH)免疫而得到3个克隆，1个克隆(CRT-3)是用CLEC14a人-AP(CH-AP)免疫的结果，而1个克隆(CRT-2)是用CLEC14a小鼠-AP(CM-AP)免疫的结果。

小管形成测定

用20μg/ml的CRT2，CRT3或CRT4或IgG同种型对照处理HUVEC。在16小时时取小管的图像并分析总小管长度，接合数目，分支数目，分支长度，网孔数目和总网孔面积。将实验重复三次，每次实验分析五个数据点。

结果

图2是显示CLEC14A在HUVEC和其他原代细胞中的相对表达的图。CLEC14A在内皮细胞中特异性表达。这确认了我们之前的发现，即CLEC14A是内皮特异性的(Herbert等，2008)。

检测CLEC14A单克隆抗体抑制血管生成的能力。使用单克隆抗体进行划痕伤口愈合测定。如图3所示，与对照中的13％相比，当用10μg/ml单克隆抗体CRT-3处理HUVEC时，25％的伤口区域在12小时时保持开放。这些结果显示CLEC14A抗体对内皮细胞迁移具有抑制作用。内皮细胞迁移是血管生成的必需特征。因此，该测定提供了CLEC14A抗体抑制血管生成的证据。

此外，小管形成测定显示通过用CRT4处理显著增加分支的数目和总长度，并且CRT4也显著减少每个场的网孔数目。这些结果提示CRT4不影响管形成，但它影响管的连接。这可以通过增加分支的数目和长度来证明，指示小管相互连接不太好的。CRT2和CRT3处理产生小管长度的显著减少，并且接合和CRT2的数目也显著减少每个野的网孔面积。因此，这些测定提供进一步的证据，即不同的CLEC14A抗体抑制血管生成(尽管通过对管形成具有不同的影响。

使用CLEC14A特异性探针检查CLEC14A在实体瘤和正常组织切片中的表达(数据未显示)。在分析的所有肿瘤组织的血管中看到CLEC14A表达。卵巢，膀胱，肝，乳腺，肾和前列腺肿瘤对CLEC14A表达呈强阳性，而胃，食道，肺，结肠，直肠，胰腺和甲状腺肿瘤组织显示较低水平的特异性CLEC14A表达。在任何相应的正常对照(非肿瘤)组织中未检测到CLEC14A表达。因此，已经证明CLEC14A在肿瘤血管系统中特异性表达。

实施例2：阻断CLEC14A-MMRN2结合抑制发芽血管生成和肿瘤生长

材料和方法

试剂

对Western印迹法和免疫沉淀；一抗：绵羊多克隆抗人CLEC14A(R&D systems)，小鼠单克隆抗人Tubulin(Sigma)，小鼠多克隆抗人MMRN2(Abnova)；二抗：与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊多克隆抗小鼠IgG(Dako)，与HRP缀合的驴多克隆抗绵羊IgG(R&D系统)。对于免疫荧光；一抗：兔多克隆抗鼠PECAM(Santa Cruz)；二抗：与Alexa Fluor488(Invitrogen)缀合的驴多克隆抗兔。对于流式细胞术；一抗：小鼠单克隆抗HA标签(CRUK)，小鼠单克隆抗CLEC14A(如下文所述的C2，C4)；二抗：与Alexa Fluor488(Invitrogen)缀合的山羊多克隆抗小鼠IgG。

质粒

对于蛋白质产生；使用慢病毒质粒psPAX2(慢病毒包装；Addgene)，pM D2G(包膜质粒；Addgene)和pWPI hCLEC14A-ECD-Fc(含有IRES-EGFP的慢病毒哺乳动物表达质粒；Addgene)。通过从clec14a IMAGE克隆(Origene)初始PCR亚克隆到pcDNA3-Fc质粒中产生pWPI hCLEC14A-Fc和mCLEC14A-Fc。使用的引物如下：人CLEC14Afwd5’TAGTAGGAATTCGAGAGAATGAGGCCGGCGTTCGCCCTG3’(SEQ ID NO:4)；人CLEC14Arev-5’AGAACCGCGGCCGCTGGAGGAGTCGAAAGCCTGAGGAGT3’(SEQ ID NO:5)；鼠CLEC14Afwd-5’TAGTAGGAATTCGAGAGAATGAGGCCAGCGCTTGCCCTG3’(SEQ ID NO:6；鼠CLEC14Arev-5’CTACTAGCGGCCGCTCGTGGAAGAGGTGTCGAAAGT3’(SEQ ID NO:7)。使用EcoR1和Not1限制性位点插入CLEC14A。进行另一轮PCR亚克隆以转移CLEC14A-Fc融合到pWPI中。使用的引物如下：人CLEC14A，fwd-5’TAGTAGTTAATTAAGAGAGAATGAGGCCGGCGTTC3’(SEQ ID NO:8)；鼠CLEC14Afwd-5’TAGTAGTTAATTAAGAGAGAATGAGGCCAGCGCTT3’(SEQ ID NO:9)；人Fcrev-5’CTACTAGTTTAAACTCATTTACCCGGAGACAGGGA3’(SEQ ID NO:10)。对于该步骤，使用Pad和Pme1限制性位点。

通过使用以下引物从mmrn2IMAGE克隆(Thermo)PCR克隆到pHL-Avitag3构建MMRN2哺乳动物表达质粒：fwd–CCGGACCGGTCAGGCTTCCAGTACTAGCC(SEQ ID NO:11)；rev–CGGGGTACCGGTCTTAAACATCAGGAAGC(SEQ ID NO:12)。使用Age1和Kpn1限制酶。

细胞培养

如前所述分离人脐静脉内皮细胞。在获得知情同意的情况下从BirminghamWomen's Health Care NHS Trust获得脐带。在第1-6代之间使用HUVEC，并在含有10％胎牛血清(PAA)，1％牛脑提取物，90μg/ml肝素和4mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen)的M199完全培养基(cM199)中培养，并且在用来自猪皮的0.1％1型明胶中包被的平板上接种。将HEK293T细胞在含有10％胎牛血清(PAA)，4mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen)的DMEM(Sigma)完全培养基(cDMEM)中培养。

如前所述进行HUVEC中的SiRNA转染。通过用上述慢病毒包装，包膜和表达质粒瞬时转染，在HEK293T细胞中产生慢病毒。将质粒在OptiMEM(Invitrogen)中与聚乙烯亚胺(36μg/ml)以1:4比率在室温下温育10分钟，然后加入到cDMEM中的HEK293T细胞。使用培养基上清液来转导新鲜的HEK293T细胞。分选GFP阳性HEK293T细胞并用于蛋白质生产。使用pHL-Avitag3hMMRN2通过如上的聚乙烯亚胺瞬时转染实现MMRN2在HEK293T细胞中的表达。

定量PCR

使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems)从1μg提取的总RNA制备cDNA。用Express QPCR supermix(Invitrogen)在RG-3000(Corbett/Qiagen，Manchester，UK)热循环仪上进行qPCR反应。人clec14a和flot illin-2的引物如前所述。小鼠clec14a 5'UTR，CDS和3'UTR和鼠β-肌动蛋白的引物如下：5’UTRfwd–TTCCTTTTCCAGGGTTTGTG(SEQ ID NO:13)；5’UTRrev–GCCTACAAGGTGGCTTGAAT(SEQ ID NO:14)；CDSfwd–AAGCTGTGCTCCTGCTCTTG(SEQ ID NO:15；CDS rev–TCCTGAGTGCACTGTGAGATG(SEQ ID NO:16)；3’UTRfwd–CTGTAGAGGGCGGTGACTTT(SEQ ID NO 17)；3’UTRrev–AGCTGCTCCCAAGTCCTCT(SEQ ID NO:18)；mACTBfwd–CTAAGGCCAACCGTGAAAAG(SEQ ID NO:19)；mACTBrev–ACCAGAGGCATACAGGGACA(SEQ ID NO:20)。根据效率调节数学模型计算相对表达比率。

蛋白质印迹法和免疫沉淀

制备全细胞蛋白质裂解物并且进行共免疫沉淀实验，如前所述，只是从2x10⁷个HUVEC中提取蛋白质。对于CLEC14A相互作用蛋白的初始分离，使用5μgCLEC14A-Fc或等摩尔量的hFc。对于内源性免疫沉淀实验，使用0.4μg抗CLEC14A抗体或绵羊IgG。对于阻断实验，将5μg CLEC14A-Fc或hFc与蛋白G珠在PBS中结合过夜。将珠在含有20％FCS(PAA)的PBS中封闭5-6小时。用结合缓冲液中增加浓度的mIgG，C2或C4过夜封闭结合的CLEC14A-Fc或hFc蛋白。然后将来自MMRN2转染的HEK293T细胞的裂解物与珠复合物一起温育过夜，然后洗涤并通过Western印迹分析。标准方案用于Western印迹法和SDS-PAGE。如文中所示使用一抗与相应的缀合有HRP的二抗。

流式细胞术

用细胞解离缓冲液(Invitrogen)分离细胞，在PBS中漂洗，然后在封闭缓冲液(PBS，3％BSA，1％NaN₃)中温育15分钟。随后使用封闭缓冲液中10μg/ml抗HA标签(CRUK)，10μg/ml抗CLEC14A(下文描述的C2，C4)作为第一抗体染色30分钟。将细胞在PBS中漂洗并用在封闭缓冲液中与Alexa Fluor488(Invitrogen)缀合的山羊多克隆抗小鼠IgG染色。使用FACSCalibur装置(Becton Dickinson，Oxford，UK)收集数据(15,000个事件/样品)，并用Becton Dickinson Cell Quest软件分析结果。

HUVEC球状体发芽测定和体外基质胶管形成测定

每个球状体使用1000个HUVEC，如前所述进行HUVEC球状体的产生和胶原凝胶中内皮发芽的诱导。在包埋后16小时进行定量。为了量化芽生长，计算芽数目，评估累积芽长度和最大芽长度。对于两个颜色发芽实验，用橙色和绿色CellTracker染料(Invitrogen)预标记HUVEC。24小时后，将球状体固定在4％甲醛中，并用Vectorshield(Vector labs)封固。用Axioskop2显微镜和AxioVision SE64Rel4.8软件(Zeiss，Cambridge，UK)对载玻片成像。

对于基质胶管形成测定，将1.4x10⁵个HUVEC接种到12孔板中的70μl基底膜提取物(Matrigel，BD Bioscience，Oxford，UK)上。16小时后，使用Leica DM IL显微镜(Leica，Milton Keynes，UK)和USB 2.0 2M Xli数码照相机(XL Imaging LLC，Carrollton，TX，USA)以10x放大率拍摄每孔5个视野的图像。使用Image J(Carpentier G.等.,AngiogenesisAnalyzer for ImageJ.4^th ImageJ User and Developer Conference proceedings)并且在NIH网址(http://imagej.nih.gov/ij/macros/toolsets/Angiogenesis％20Analyzer.txt)可获得的血管生成分析仪插件分析图像。

蛋白质生产

收集来自表达CLEC14A-Fc的HEK293T细胞的培养基(CM)。使CM流过HiTrap蛋白AHP柱(GE healthcare，Amersham，UK)，并使用0-100％梯度的100mM柠檬酸钠(pH 3)洗脱蛋白质，然后用1M Tris碱中和。在SDS-PAG上运行级分，并通过考马斯染色和Western印迹法评估蛋白质纯度和特异性。将含有相似浓度蛋白质的级分组合，并在功能测定之前在PBS中透析。

单克隆抗体产生

小鼠单克隆抗体由Serotec Ltd(Oxford，UK)商业制备，使用我们提供的破坏耐受性的以下方案进行。以50μg在完全弗氏佐剂中皮下给予纯化的小鼠CLEC14A-Fc融合蛋白。两周后，对小鼠皮下给予另50μg，但这次是在弗氏佐剂中。将小鼠宰杀并在两周后收获脾脏用于融合。

产生clec14a-/-小鼠

将小鼠圈养在Birmingham Biomedical Services Unit(Birmingham,UK)。含有CLEC14A缺失盒(Clec14atm1(KOMP)Vlcg；项目ID VG10554)的C57BL/6N VGB6饲养细胞依赖性胚胎干细胞从Knockout Mouse Project (University of California，Davis，USA)获得。

伯明翰大学的转基因小鼠房通过将胚胎干细胞注射到白化C57BL/6小鼠中而产生嵌合小鼠，并与C57BL/6雌性育种以产生对于盒杂合的小鼠。动物维护有适当的内政部批准和许可。

主动脉环和鼠皮下海绵血管生成测定

分离主动脉并加工用于胶原中的主动脉环测定。定量管/芽长出，最大内皮迁移和总内皮长出。如前所述进行鼠皮下海绵血管生成测定，稍作修改。在第0天，在每个体侧的背部皮肤下向雄性C57黑色小鼠植入皮下无菌聚醚海绵盘(10x5x5mm)。每隔一天通过皮肤直接注射100μl bFGF(40ng/ml；R&D systems)到海绵中达14天。在第14天切除海绵，在10％福尔马林中固定，并石蜡包埋。切片用苏木精和曙红染色，使用Leica MZ 16显微镜(Leica，Milton Keynes，UK)和USB 2.0 2M Xli数码照相机(XL Imaging LLC，Carrollton，TX，USA)在1倍放大率下拍摄海绵横截面用于细胞侵入分析。分析通过Leica DME显微镜(Leica，Milton Keynes，UK)在40x放大率下捕获的图像的血管密度。在每个海绵的每个切片的五个场中评估血管计数。所有动物实验均按照RB持有的内政部许可证号PPL 40/3339进行。

肿瘤植入测定

在8-10周龄时，将10⁶个Lewis肺癌细胞皮下注射到雄性小鼠的体侧中。通过每日卡尺测量监测肿瘤生长，并且在生长2-4周后，通过重量确定肿瘤质量，在4％PFA中固定，石蜡包埋并且以6μm切割连续切片。

免疫荧光和X-gal染色

使用本领域已知的方法进行免疫荧光染色和X-Gal染色。

结果

CLEC14A在体外调节发芽血管生成

先前已经显示了CLEC14A参与体外内皮迁移和管形成。为了研究CLEC14A在体外发芽血管生成中的作用，从靶向clec14a的siRNA或非互补siRNA双链体处理的HUVEC产生HUVEC球状体。通过qPCR在三个实验间以74％的平均降低(图5A)在mRNA水平上以及通过用抗CLEC14A多克隆抗血清探测的蛋白质提取物的Western印迹分析在蛋白质水平上(图5B)确认clec14a表达的敲低。来自CLEC14A敲低球状体的VEGF诱导的发芽受到损伤，与对照细胞的13.2个相比，敲低球状体平均产生每个球状体的6.9个芽(图5C和5D)。为了确定CLEC14A在尖端/茎细胞形成中的作用，在球体形成和诱导发芽之前，将对照HUVEC和敲低的HUVEC染成红色或绿色并混合(图5E)。与对照细胞(67％)相比，CLEC14A的敲低降低尖端位置处细胞的百分比(33％)，然而，对源自CLEC14A敲低的HUVEC的茎细胞的百分比没有影响(图5F)。这些数据提示CLEC14A在芽起始和迁移中起作用。

CLEC14A调节体内发芽血管生成

先前发表的CLEC14A数据已证明其在体外内皮生物学中的作用，但尚未报告其体内作用。为了研究CLEC14A的体内和离体作用，产生小鼠以用lacZ报告物替换clec14a编码序列(图6A)。杂合子(clec14a-/+)的育种产生相等比例的雄性和雌性小鼠(分别为49.5％/50.5％)和野生型:杂合子:纯合子小鼠的孟德尔比率(分别为26.4％:47.2％:26.4％)。由于clec14a是内皮细胞限制性基因，因此从clec14a+/+和clec14a-/-小鼠中分离出主动脉。通过qPCR分析提取的cDNA并确认clec14a编码区的丧失，但保留5'和3'非翻译区的表达(图6B)。通过肺组织裂解物的Western印迹分析也确认蛋白质水平的CLEC14A丧失(图6C)。

为了确认CLEC14A在多细胞三维共培养中发芽血管生成中的作用，分离主动脉，切成环并包埋在胶原中。VEGF刺激细胞长出，并在内皮发芽的终点定量前7天内监测。同样，CLEC14A的丧失损害内皮芽长出和迁移(图6D)。与对CLEC14A敲除小鼠的观察相比，来自野生型小鼠的主动脉环产生管数目的超过倍增(与13.4个管相比30.6个管)(图6E)。此外，最大迁移(其由远离每个主动脉环的最远距离定义)在敲除培养物中也减少(图6F)。为了评估CLEC14A是否在体内具有相似的功能，将海绵桶皮下植入CLEC14A敲除小鼠中。每两天使用bFGF注射到海绵中刺激细胞浸润和新血管生成，持续两周。用苏木精和曙红染色的海绵切片的宏观分析揭示在clec14a-/-动物中细胞对海绵的浸润受损(图6G和6H)。此外，clec14a-/-动物的血管供应显著降低(p<0.01)(图6I)。为了确认在该模型中作为新血管生成血管衬里的内皮细胞表达clec14a，用x-gal染色来自CLEC14A KO小鼠的海绵和肝脏。与匹配的肝切片相比，在海绵内的血管上观察到强x-gal染色(图6J)。从这些数据，我们可以得出结论，小鼠CLEC14A表达在体内和体外调节内皮迁移和血管生成发芽，并且CLEC14A在发芽内皮上上调。

CLEC14A促进肿瘤生长

发现与来自健康组织的血管相比，CLEC14A表达在人肿瘤血管上高度上调，提示癌症疗法可以靶向CLEC14A。因此，为了研究CLEC14A的丧失是否实现肿瘤生长，我们使用同源Lewis肺癌(LLC)模型。对于这点，将1x10⁶个LLC细胞皮下注射到clec14a+/+或clec14a-/-小鼠的右体侧中。与clec14a+/+同窝小鼠相比，clec14a-/-小鼠中的肿瘤生长受损(图7A)。这通过三次独立实验得到确认。自clec14a-/-小鼠采集的切除的肿瘤比clec14a+/+同窝小鼠尺寸更小(图7B)并且重量更小(图7C)。为了确定这些肿瘤内的血管密度是否也受影响，用抗CD31抗体染色组织切片。分析显示离散血管的密度降低(图7D和7E)和内皮覆盖百分比降低(图7F)。此外，自clec14a-/-小鼠采集的肿瘤和肝脏切片的x-gal染色揭示具有充满红细胞的管腔的成熟血管(图3G，黑色箭头)和肿瘤内未成熟的微血管(图7G，红色箭头)两者上clec14a的高表达，确认clec14a在肿瘤血管上上调。

鉴定和确认CLEC14A-MMRN2相互作用

为了鉴定CLEC14A的胞外域的潜在结合配偶体，我们首先纯化用人Fc标记的CLEC14A胞外域蛋白。将该蛋白质或单独的Fc与HUVEC全细胞裂解物一起温育，并使用蛋白A琼脂糖珠沉淀。然后洗涤沉淀的蛋白质并在SDS-PAG上分离。切下七个凝胶区域，消化并通过质谱术分析。鉴定的最丰富的蛋白质是具有12种肽的MMRN2(11种独特的)，并且在相应的对照下拉级分中没有肽。沉淀物的Western印迹分析确认在CLEC14A-ECD-Fc下拉中存在MMRN2，并且在单独的Fc下拉中未检测到(图8A)。为了进一步确认此相互作用，将内源性CLEC14A从HUVEC全细胞裂解物中免疫沉淀。蛋白质印迹分析确认CLEC14A沉淀物中的MMRN2共沉淀，但在IgG对照中未检测到(图8B)。

开发和验证CLEC14A单克隆抗体

为了进一步了解CLEC14A，我们接下来产生交叉物种反应性抗体。为了实现这点，在HEK293T细胞中表达具有人Fc标签的鼠CLEC14A蛋白，并在蛋白A柱上纯化。然后在完全弗氏佐剂的情况下用50μg mCLEC14A免疫小鼠以破坏耐受性。筛选克隆的针对人CLEC14A或人Fc的活性。为了确认克隆能识别细胞结合的CLEC14A，用克隆C2或C4或单克隆HA标签抗体染色过表达HA-CLEC14A的HEK293T细胞。FAC分析显示与对照转染的细胞相比，HA-CLEC14A过表达细胞中的每种抗体的荧光增加(数据未显示)。为了确认抗体识别CLEC14A的内源形式，将这些克隆用于染色用对照或clec14a靶向性siRNA处理的HUVEC。通过克隆C2和C4强烈染色对照HUVEC，并通过敲低CLEC14A将该染色降低至同种型对照水平(数据未显示)。这些结果确认CLEC14A单克隆抗体的特异性。

为了确定C2和C4克隆是否与CLEC14A的相同区域结合，在C2-FITC染色之前用BSA，C2或C4抗体预处理HUVEC。C2温育有效阻断C2-FITC染色，但C4具有较小的影响。

在C4-FITC染色之前重复相同的预处理。C2抗体不影响C4-FITC染色，然而，用C4预处理的HUVEC显示C4-FITC的结合降低。从这些结果我们可以得出结论，C2和C4结合CLEC14A的离散区域。

CLEC14A单克隆抗体阻断CLEC14A-MMRN2结合

为了确定这些CLEC14A单克隆抗体中的任一种是否可以抑制MMRN2与CLEC14A的结合，在与来自过表达MMRN2的HEK293T细胞的裂解物温育之前，将CLEC14A-ECD-Fc与递增浓度的mIgG1或C2或C4预温育。然后分离沉淀物并探测MMRN2或CLEC14A-ECD-Fc。观察到用mIgG1或C2封闭的CLEC14A-ECD-Fc沉淀物的MMRN2结合，但在C4封闭的沉淀物中未观察到MMRN2结合。这确认C4而非C2单克隆抗体阻断MMRN2与CLEC14A的结合。(数据未显示)

CLEC14A-MMRN2阻断性抗体抑制肿瘤生长

每周两次用10μg C4或mIgG1(对照)腹膜内注射具有LLC肿瘤的小鼠持续整个实验。与对照mIgG1处理组相比，用C4抗体处理的小鼠的肿瘤生长减慢(图9A)。来自C4处理的小鼠的肿瘤尺寸(图9B)和体重(图9C)小于对照动物。我们再次检查这些肿瘤内的血管密度。用抗CD31抗体染色组织切片，并且荧光分析揭示降低的离散血管密度(图9D和9E)和百分比内皮覆盖(图9F)，提示CLEC14A与MMRN2的结合是肿瘤诱导的血管生成的重要功能组分。

讨论

CLEC14A是促成多种肿瘤类型的肿瘤血管生成的一小组内皮基因之一。在这里，我们证明通过CLEC14A的丧失，肿瘤生长在体内被抑制(图7)。对于其他肿瘤内皮标志物，例如TEM8，内皮因子(Endoglin)，半乳凝素(Galectin)，ELTD1和内皮唾液酸蛋白也观察到类似的表型，并且这证明这些肿瘤内皮表达基因在血管化和肿瘤生长中的重要性。

已经在人肿瘤和胰腺癌和宫颈癌的鼠模型中观察到CLEC14A的上调，这支持了clec14a表达在LLC模型中的肿瘤血管上调的发现(图7)。已经显示CLEC14A调节内皮生物学的多个方面，包括粘附，迁移，管形成，并且结果显示它对于体外和体内发芽血管生成也是重要的(图5和6)。我们可以推断CLEC14A的此作用是通过内皮-内皮相互作用或内皮-细胞外基质相互作用，因为体外HUVEC发芽受到CLEC14A敲低的干扰，提示其他细胞类型的存在是可有可无的。我们还首次观察到皮下海绵测定中新血管生成血管上clec14a表达的上调(图6)。这是预期的，因为已经建模新形成的内皮芽以经历从分叉点的4.2μm到芽的尖端的极低剪切应力(0.2Pa)，并且已知clec14a表达被低剪切应力上调。

已经通过使用CLEC14A的胞外域从HUVEC裂解物中下拉蛋白质以及内源蛋白质的共免疫沉淀来显示CLEC14A与MMRN2的相互作用(图8)。通过CLEC14A单克隆抗体的产生和验证，我们鉴定了两种与CLEC14A的离散区域(C2和C4)结合的抗体，并且已经显示C4克隆而非C2克隆阻断CLEC14A与MMRN2的相互作用。为了探测CLEC14A-MMRN2相互作用的功能，我们在基质胶管形成测定中使用C4抗体，并且发现分支增加和演化网孔的减少。进一步发现CLEC14A-MMRN2相互作用对于肿瘤生长是重要的(图9)，C4处理重现肿瘤生长并且降低肿瘤血管供应，如clec14a-/-小鼠中所见(图7)。尽管在该实施例中未鉴定配体或活性模式，但这是第一次显示CLEC14A和特异性细胞外相互作用对肿瘤生长是重要的，并且提示迄今为止的通向新的抗血管生成疗法的途径。

实施例3 CLEC14A单克隆抗体C1，C4和C5阻断CLEC14A-MMRN2相互作用

为了确定哪些CLEC14A单克隆抗体可以抑制MMRN2与CLEC14A的结合，在与来自过表达MMRN2的HEK293T细胞的裂解物温育之前，将CLEC14A-ECD-Fc与递增浓度的mIgG1或CR1-5预温育。然后分离沉淀物并探测MMRN2或CLEC14A-ECD-Fc。对于用mIgG1或C2和C3封闭的CLEC14A-ECD-Fc沉淀物观察到MMRN2结合，但在C1、4和5封闭的沉淀物中未观察到MMRN2结合。这确认抗体C1、4和5在与C2和3单克隆抗体结合的表位不同的表位上结合CLEC14a，因此特异性阻断MMRN2与CLEC14A的相互作用。

实施例4 MMRN2结合域和CRT抗体的定位

1)MMRN2与CTLD或SUSHI域或CLEC14a结合

MMRN2与CLEC14A的结合被缩小至CLEC14A的CTLD或SUSHI域。可能的是在没有域缺失中存在的CTLD或SUSHI域的情况下，CLEC14A不是正确折叠的，导致它不再与MMRN2(或CRT抗体)结合。这是使用图11中显示的用MMRN2进行远Western印迹的CLEC14A的缺失构建体找出的。

2)CRT抗体与CLEC的CTLD域结合而不与SUSHI结合

为了进一步确定CTLD或SUSHI是否是结合域并确保正确折叠，用与血栓调节蛋白(也称为CD141)(不结合MMRN2的14型CTLD家族成员)的那些域交换的CTLD或SUSHI域制备CLEC14A的嵌合构建体。

嵌合体5(具有CD141的CTLD的CLEC14A)和嵌合体6(具有CD141的SUSHI的CLEC14A)的序列显示在图12中。

使用流式细胞术分析CRT抗体的结合。所有构建体都具有C末端GFP标签，因此将绿色细胞门控并染成红色。所有CRT抗体结合WT CLEC14A，并且如预期，无一结合WT CD141(图13)。此外，抗体无一与嵌合体5结合(除CRT2的轻微结合外)并且所有抗体都结合嵌合体6(除CRT2外)(图13)。这确认了抗体CRT1、3、4和5以及MMRN2的结合位点在C型凝集素域内。CRT2可能在CTLD和sushi域之间的区域上结合。

3)阻断MMRN相互作用的CRT抗体不结合WO 2013/187724中规定的区域，而是结合包含CLEC14a CTLD的aa 97-108的区域。

为了进一步确定抗体和MMRN2的结合区，制备嵌合环构建体。这是基于CLEC14ACTLD的结构预测以及WO2013/187724抗体结合的区域。

具有CD141的区域1-42的CLEC14A

CD141序列–MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGP(SEQ ID NO.21)

具有CD141的区域97-108的CLEC14A

CD141序列–QLPPGCGDPKRL(SEQ ID NO.22)

具有CD141的区域122-142的CLEC14A

CD141序列–TSYSRWARLDLNGAPLCGPL (SEQ ID NO.23)

图12中显示了比对。不幸的是，1-42和122-142嵌合体不正确折叠。认为这是由于下述事实：它们存在于细胞表面上(CLEC14A多克隆抗体阳性染色，但它们对于任何C抗体不染色，C2甚至也不。

然而，97-108嵌合体确实结合C2和C3，显示该突变体是正确折叠的。该突变体不结合MMRN2或C1、4或5(其是认为阻断CLEC14A-MMRN2相互作用的抗体)(图15)。因此，我们得出结论，结合域依赖于含有以下残基的环：ERRRSCHTLENE(SEQ ID NO:24)。

残基97-108与来自血栓调节蛋白的相应区域交换。这导致正确的折叠，因为C2和C3仍然可以结合(图16)。然而，C1，C4和C5不能识别该突变体，提示这是结合区。

该实验重复三次，结果相同。

实施例5-抗体药物缀合物肿瘤数据

对6-8周龄的野生型雄性C57BL6小鼠在右体侧中皮下注射1x10⁶个Lewis肺癌(LLC)细胞。一旦肿瘤达到可触知的大小，将小鼠随机分配到每个处理组，B12-ADC或C4-ADC/CRT3-ADC。小鼠每隔1周接受1mg/kg对尾静脉的两次静脉内注射。在最终注射后一周，将小鼠扑杀，切除肿瘤并测量湿重。图17A和B中显示了数据。

用CRT-3ADC处理HUVEC，并进行荧光成像以确定0和90分钟后CRT-3的定位。在图18A中显示结果。此外，使用Cell Titre Glo发光细胞存活力测定法测量细胞毒性，并且在图18B中显示结果。如上所述，将100万个Lewis肺癌细胞皮下注射到2只小鼠的右体侧中并允许生长至可见大小。通过尾静脉注射施用1mg/kg的CRTS-ADC或B12-ADC(对照)。观察小鼠一小时并在24小时后扑杀。

结果

图18A中所示的结果证明CRT3-ADC是内化的。用CRT3-ADC进一步处理24小时对小鼠的整体健康没有影响。仅在CRT3-ADC处理的小鼠而不是对照中观察到肿瘤部位的广泛出血，证明血管生成的肿瘤特异性破坏。

实施例6-CAR构建和实验

材料和方法

生成CAR构建体

如Noy等人(Blocking CLEC14A-MMRN2binding inhibits sproutingangiogenesis and tumour growth.Oncogene.2015)所述，获得表达与蛋白质的人和小鼠形式交叉反应的CLEC14A特异性单克隆抗体的杂交瘤。然后通过使用简并引物组的RT-PCR从每个小鼠杂交瘤中分离编码scFv的基因构建体，所述简并引物组设计为扩增所有小鼠V基因家族，如先前记载于Hawkins等人(Idiotypic vaccination against human B-celllymphoma.Rescue of variable region gene sequences from biopsy material forassembly as single-chain Fvpersonal vaccines.Blood.1994；83(11):3279-88。

然后，将scFv基因以ClaI，NotI片段亚克隆到两个先前描述的CAR载体pMP71.tCD34.2A.CD19ζ和pMP71.tCD34.2A.CD19.IEVζ(Cheadle等,J.Immunol.,2014,192(8),3654-65)，替换CD19特异性scFv区域。最初使用MP71逆转录病毒表达质粒(来自C.Baum，Hannover的友情赠品)构建这些载体，并共表达截短的CD34标志物基因(Fehse等,Mol Ther.,2000；1C5Pt 1:448-56)。

人和小鼠T细胞的转导

为了产生用于转导人T细胞的重组逆转录病毒，根据制造商的说明书，使用FuGENEHD(Roche)，用MP71逆转录病毒载体和pCL ampho(Imgenex)转染Phoenix兼向性包装细胞。以相同的方式，但使用Phoenix同向性(ecotropic)包装细胞和pCL eco产生用于转导小鼠T细胞的重组逆转录病毒。通过在lymphoprep(Axis Shield，Oslo，Norway)上的密度梯度离心从肝素化血液中分离人外周血单个核细胞(PBMC)。使用抗CD3抗体(OKT3，eBioscience；30ng/ml)，抗CD28抗体(R&D Systems；30ng/ml)和白细胞介素-2(IL2；300U/ml；Chiron，Emeryville，CA)使用标准培养基(含有10％胎牛血清(FBS；PAA，Pasching Austria)，2mML-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100pg/ml链霉素)的RPMI 1640(Sigma))加1％人AB血清(TCS Biosciences，Buckingham，UK)预活化PBMC达48小时。使用小鼠脾细胞转导小鼠T细胞，所述小鼠脾细胞用标准培养基中的伴刀豆球蛋白A(2ug/ml；Sigma)和小鼠白细胞介素7(1ng/ml；eBioscience)预活化48小时。随后根据制造商的说明书，在retronectin(Takara)包被的板中通过旋转转染(spinfection)转导(或用来自未转染的phoenix细胞的条件化上清液模拟转导)预活化的人和小鼠T细胞。然后将人T细胞在含有IL2(100U/ml)的标准培养基加1％人AB血清中培养。在旋转感染后，将小鼠T细胞在含有IL2(100U/ml)的标准培养基中培养24小时，然后使用lymphoprep(Axis Shield)纯化。在指出的情况下，根据制造商的说明书，使用抗CD34微珠(Miltenyi Biotec，Germany)通过免疫磁性选择富集转导的细胞。National Research Ethics Service Committee West Midlands(Solihull)批准了对人捐赠者的研究，并且所有捐赠者给出书面知情同意书。

细胞系和重组蛋白

将Phoenix A或E，CHO和Lewis肺癌细胞维持在含有10％胎牛血清(FBS；PAA，Pasching Austria)，2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100pg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DM EM)中。用表达全长人CLEC14A的pWPI载体(Addgene)(或单独的载体)转导CHO细胞。如前所述，使用从Birmingham Women’s Health Care NHS Trust获得的脐带在知情同意和south Birmingham research ethics committee的伦理批准下分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。将HUVEC维持在含有10％FBS，4mM L-谷氨酰胺，10％大血管内皮细胞生长补充物(TCS Cellworks)的M199完全培养基中，并在用来自猪皮的0.1％1型明胶(Sigma)包被的平板中培养。将具有人Fc标签的人和鼠CLEC14A蛋白在HEK293T细胞中表达，并在蛋白A柱上纯化，如Noy等(同上)中所述。

CLEC14A的SiRNA敲低

使用以下siRNA双链体如前所述(Armstrong等,Arteriosclerosis,thrombo sisand vascular biology,2008,28(9):1640-6)进行siRNA转染：D1-GAACAAGACAATTCAGTAA(SEQ ID NO.30)和D2-CAATCAGGGTCGACGAGAA(SEQ ID NO.31)(EuroGentec,Liege,Belgium)。

流式细胞术

将HUVEC用胰蛋白酶处理并在冰上用5％正常山羊血清/PBS中的上述CLEC14A特异性小鼠单克隆抗体(10ug/ml)或1gG1同种型对照(Dako)染色1小时。洗涤细胞并通过与缀合有R-PE的山羊抗小鼠抗体(Serotec)一起温育来检测结合的抗体。通过用碘化丙啶染色鉴定死细胞。用PBS洗涤人T细胞，并在黑暗中用活/死可固定的紫罗兰死细胞染色试剂盒(Life Technologies)染色20分钟。然后用流动缓冲液(PBS中的0.5％w/v BSA+2mM EDTA；pH7.2)洗涤细胞，并用抗人CD4(缀合有PE)，抗人CD8(缀合有FITC)(均来自BD Pharmingen)和抗人CD34(Pe-Cy5)(BioLegend)在黑暗中在冰上染色30分钟。或者，不同于针对CD34染色，通过首先用人Fc片段(10ug/ml)封闭细胞，然后将其与10ug/ml重组人CLEC14A-Fc融合蛋白(或Fc对照)一起温育，然后与绵羊抗CLEC14A多克隆抗体(R&D systems，10ug/ml)温育，直接检测CAR表达。最后，用缀合有FITC的兔抗棉羊抗体(Invitrogen，1:10稀释)染色细胞。所有温育均在冰上进行1小时。

当染色来自肝素化尾部出血的小鼠T细胞时，它们首先进行使用BD Pharm lyse(Becton Dickinson)的红细胞裂解，然后如上所述，但使用抗小鼠CD4-FITC，CD8-PE和CD45.1(缀合有PE-Cy7)(均为BD Biosciences)染色。使用BD LSR II流式细胞仪和FlowJo软件(TreeStar Inc，Ashland，OR)分析细胞。

CFSE标记

用PBS洗涤T细胞两次，并且与2.5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)在37℃下温育10分钟。通过加入含有10％FBS的RPMI-1640淬灭标记反应。洗涤细胞，以1.5x10⁶个细胞/ml重悬于标准培养基加1％人AB血清和IL2(10IU/ml)中，并加入到含有HUVEC的孔中以给出T细胞:HUVEC比率10:1。在37℃/5％CO₂下温育5天后，使用抗人CD34(Pe-Cy5)通过如上所述的流式细胞术分析细胞。

IFNγ释放测定

以指定的响应者:刺激物比率将刺激物细胞(2.5x10⁴/孔)与CD34+CAR-T细胞一式三份共培养。或者，将2x 10⁴个CD34+CAR-T细胞在用重组蛋白(1μg/ml)预包被的孔中温育。将细胞在37℃/5％CO₂下在100μl/孔的补充有IL2(25U/ml)的标准培养基中温育。18小时后，根据制造商的说明书，使用ELISA(Pierce Endogen，Rockford，IL)测试培养上清液的分泌IFNγ。

细胞毒性测定

先前已详细描述铬释放测定。它们以已知的效应器:靶物比率(1250个靶物/孔)建立并在7.5小时后收获。

体内实验

毒性测试

6至8周龄的C57BL6小鼠(Charles River Laboratories)接受4Gy全身照射(TBI)。18小时后，对每只小鼠的尾静脉注射2x 10⁷个CAR或模拟转导的来自CD45.1+同源BoyJ小鼠的T细胞制备物。监测小鼠的毒性体征，并通过每周尾部出血进行免疫监测。最后在45天后扑杀小鼠并取出主要器官进行组织学分析。

RipTag2转基因小鼠肿瘤模型

先前已经报道了RIP-Tag2小鼠的产生作为胰岛细胞癌发生的模型(Hanahan等,Nature,1985,315(6015),115-122)。将RIP-Tag2小鼠维持在C57BL/6J背景(The JacksonLaboratory)上。将冷冻保存的CAR转导的和模拟转导的T细胞解冻，洗涤，并且在单一时段中对12周龄的小鼠将1500万T细胞/小鼠静脉内注射到尾静脉中，所述小鼠在前一天已经用4Gy TBI调理。从12周龄开始，所有RIP-Tag2小鼠接受50％糖食物(Harlan Teklad)以缓解胰岛素分泌肿瘤诱导的低血糖症。使用卡尺测量在16周龄时量化扑杀的CAR-T细胞处理的小鼠中的总肿瘤负荷，以使用以下公式测量单独切除的宏观肿瘤(>1mm³)：体积＝a x b²x0.52，其中a和b代表肿瘤的较长的和较短的直径。加入来自每只小鼠的所有肿瘤的体积，以给出每只动物的总肿瘤负荷。对于16周CAR处理的小鼠，没有年龄匹配的对照比较，因为未处理的RIP-Tag2小鼠不能存活至16周，因此与14周龄模拟处理的小鼠进行比较。

Lewis肺癌(LLC)小鼠模型

在体侧中对6-8周龄雌性C57BL6小鼠皮下接种10⁶个LLC细胞。三天后，小鼠接受4Gy TBI，并且18小时后，对每只小鼠的尾静脉中注射来自CD45.1+同类BoyJ小鼠的2x 10⁷个CAR或模拟T细胞制备物。用卡尺(使用公式：体积＝长度x宽度²x0.5)和生物发光成像(MSSpectrum，Caliper Life Sciences)测量肿瘤生长。通过每周尾部出血进行免疫监测。所有使用RipTag2小鼠的程序均由都灵大学伦理委员会(Ethics Committee of theUniversity of Turin)和意大利卫生部(Italian Ministry of Health)批准，符合国际法律和政策。所有其他小鼠研究均在英国内政部批准的情况下进行。

组织制备和免疫荧光分析

将来自小鼠实验的组织在OCT(Bio Optica)中包埋，在干冰中冷冻并储存在-80℃。如(24)所述用以下一抗进行组织制备和组织学分析：纯化的大鼠单克隆抗-泛内皮细胞抗原(550563，克隆Meca32，BD Pharmingen，USA)，以1:100稀释；兔单克隆抗切割胱天蛋白酶3(asp175，克隆5A1，Cell Signaling，USA)，1:100稀释；兔多克隆抗纤维蛋白原(A0080，Dako)，以1:100稀释；和以1:50稀释的兔单克隆抗CD34(ab174720，Abcam)；以1:50稀释的绵羊多克隆抗CLEC14A(AF4968，R&D)。温育和洗涤后，将样品与二抗抗兔抗Alexa Fluor-488和Alexa Fluor-555一起温育；抗大鼠Alexa Fluor-488和Alexa Fluor-555；和抗绵羊Alexa Fluor-488(Molecular Probes)并用DAPI核酸染剂(Invitrogen)复染。为了检测CAR转导的T细胞，用在PBS中1:50稀释的兔单克隆抗CD34(ab174720，Abcam)染色组织。温育和洗涤后，用抗兔Alexa Fluor-555(Molecular Probes)染色样品并用DAPI复染。

使用1:20稀释的绵羊多克隆抗CLEC14A(AF4968，R&D系统)和与罗丹明(Vectorlabs，UK)缀合的乌乐树凝集素I染色人肿瘤组织阵列(SuperBiochips Inc.，Seoul，Korea)1小时，然后使用抗羊FITC抗体(10μg/ml，Invitrogen，UK)染色。

对于RipTag2肿瘤组织的分析，通过ImageJ软件将血管占据的表面积定量为Meca32阳性结构占据的面积，与通过DAPI可视化的总组织面积进行比较。对于每只动物，量化至少四个视野/图像的总血管面积。为了确定每个图像中的纤维蛋白原外渗量(红色通道)，我们在每个血管附近绘制感兴趣区域(ROI)(Meca32，绿色通道)，然后使用Leica共聚焦软件直方图量化工具量化红色和绿色通道的平均荧光强度(MFI)。为了使得到的血管数值标准化，我们计算红色和绿色通道MFI之间的比率；值表示为红绿共染色的百分比。为了确定每个分析图像中胱天蛋白酶3(绿色通道)的表达水平，我们考虑了5个相同大小的随机ROI。然后我们测量了绿色通道的MFI，我们通过比较胱天蛋白酶3染色区域与组织区域中存在的总细胞来标准化数值。对每个样品分析每个处理组5只小鼠的至少10张图像。使用Leica TCS SP2 AOBS共聚焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems)分析来自RipTag2小鼠的组织。使用Axiovert 100M激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss，Welwyn Garden City，UK)分析所有其他组织。

统计分析

使用指示的检验和GraphPad Prism软件进行数据的统计分析。p值<0.05被认为是显著的。

结果

已经使用CRT1、3、4和5成功制备了CAR构建体，并且已经证明了这些CAR构建体在细胞上的表达(参见图19B和C，图22和图31)。因此，产生共表达截短的CD34标志物基因和scFv片段/CD3ζ链嵌合受体的逆转录病毒CAR载体(基于pMP71)。表达由LTR启动子驱动，并且2A肽接头确保CD34和CAR两者的等摩尔表达。第二代CAR构建体包括CD28共刺激域。如图19B所示，CD34染色显示用包含CRT3和5的载体(第一代和第二代两者)成功转导T细胞。对于使用CLEC14A-Fc针对CAR表达直接染色的细胞，可以得到类似的结果(％值显示CLEC14A-Fc的特异性结合，其中扣除用单独Fc的背景染色)。

此外，图20中的数据显示，经转导以表达基于抗体CRT3或5的第一代或第二代CAR的T细胞可以在体外响应CLEC14A。显示了平板结合蛋白，在工程化CHO细胞上表达的蛋白质或在HUVEC中表达的蛋白质的结果，其中响应于存在的CLEC14A，在所有三个实验中用CAR转导的T细胞可以看到IFNγ产生。

测试基于抗体CRT3和5的CAR在CHO CLEC14A表达细胞中诱导细胞毒性的能力(图21A)，其中在暴露于具有CAR CRT3/5的T细胞的细胞中可以看到％特异性裂解的增加。此外，当与HUVEC一起培养时，CD34+T细胞的增殖显示CRT3和5第一代和第二代CAR T细胞两者在此类培养条件下增殖(即由于暴露于表达CLEC14A的HUVEC)。因此，CRT3/5CAR T细胞能够响应表达CLEC14A的细胞，导致T细胞的增殖和细胞的特异性裂解。

基于CRT1抗体的CAR还显示针对CLEC14A表达靶物的活性。特别地，显示第二代CRT1CAR T细胞响应于在工程化改造为表达CLEC14A的CHO细胞和HUVEC上表达的CLEC14A(通过IFNγ释放测量)。此外，显示第一代和第二代CRT1CAR T细胞在CHO CLEC14A表达细胞中诱导特异性裂解(参见图22)。图32至35进一步显示当用CRT1-CAR转导时对CLEC14A的T细胞应答和由此类转导的T细胞诱导的％裂解。

将第一代或第二代CRT3和5种CAR T细胞注射到C57/BL6小鼠中以确定CAR T细胞对健康小鼠的毒性。监测小鼠45天并且没有显示出明显的毒性体征。图23显示在此时间期间小鼠的体重增加，并且每周尾部出血指示CAR T细胞在注射后持续至少5周并且在此时间期间它们占总循环T细胞群的至少30％。在实验结束时收获的脾细胞仍然能够响应CLEC14A(小鼠和人两者)。此外，如图24所示，几种组织(脑，心脏，肺，肝，结肠和肾)的组织学分析未显示输注第二代CRT3/5CAR T细胞的小鼠的病理学。

在先前已注射100万个Lewis肺癌细胞的C57BL6小鼠中测试基于CRT3或CRT5抗体的第二代CAR的抗肿瘤效果。将用CAR构建体转导的T细胞注射到小鼠的尾静脉(2000万T细胞)中并监测肿瘤生长。从图25中可以看出，注射CRT3或5第二代CAR T细胞的小鼠具有比对照小鼠更小体积的肿瘤，证明了CAR T细胞的抗肿瘤作用。此外，图26显示注射CRT3或5第二代CAR T细胞的小鼠的平均肿瘤重量减少，血管密度降低和血管渗漏水平增加。

将第二代CRT5CAR T细胞注射到RIP-Tag2小鼠中，其中大鼠胰岛素启动子将SV40大T抗原转基因的表达导向胰岛的β细胞，在10周龄左右导致肿瘤并且到第14周导致死亡。从图27中可以看出，与未处理或模拟T细胞对照小鼠相比，注射CAR T细胞的小鼠的肿瘤大小显著降低。此外，图28显示在静脉内注射后4周，CAR转导的T细胞在RIP-Tag2肿瘤中累积。

来自用CAR工程化T细胞处理的小鼠的RipTag2肿瘤的组织学分析显示，与用模拟T细胞处理的小鼠相比，血管密度降低，凋亡血管增加并且纤维蛋白原染色降低(图29)。

实施例7-对WT1衍生肽pWT126(RMFPNAPYL)特异性的功能活性TCR

已经克隆了对由HLA-A2I类分子呈递的Wilms肿瘤抗原-1(WT1)的肽RMFPNAPYL(WT126)特异性的TCR。WT1转录因子在各种人恶性中表达，包括白血病，乳腺癌，结肠癌，肺癌，卵巢癌等。CTL(从所述CTL中克隆TCR)显示针对表达WT1的人癌细胞的杀伤活性，而非针对表达针对表达生理水平WT1的正常人细胞的杀伤活性。

治疗目标是通过转移编码TCR的基因为患者T细胞提供此类有力且特异性的杀伤活性。为此，已将TCR基因插入逆转录病毒载体中，并且已经证明基因转导的人T细胞显示出针对表达WT1的人癌症和白血病细胞系的杀伤活性。该CTL系的特异性概况已在若干研究论文中描述，并且可以概括为：(1)用WT1衍生的肽pWT126包被的HLA-A2阳性靶物的杀伤(Gaoet al(2000)Blood 95,2198-2203)；(2)表达WT1的新鲜HLA-A2阳性白血病细胞的杀伤(Gaoet al(2000)Blood 95,2198-2203)；(3)HLA-A2阳性白血病CFU祖细胞的杀伤(Gao et al(2000)Blood 95,2198-2203；Bellantuono et al(2002)100,3835-3837)；(4)HLA-A2阳性白血病LTC-IC干细胞的杀伤(Bellantuono et al(2002)Blood 100,3835-3837)；(5)HLA-A2阳性NOD/SCID白血病起始细胞的杀伤(Gao et al(2003)Transplantation75,1429-1436)；(6)正常HLA-A2阳性NOD/SCID移植造血干细胞的无杀伤(Gao et al(2003)Transplantation75,1429-1436)。现在已经显示了用WT1特异性TCR转导的人T细胞显示出与克隆TCR的CTL系相似的特异性。

在图36至43的图例中详细描述的数据指示TCR基因转移到人T细胞中是可行的，并且它导致引入的TCR链的表面表达。接受体T细胞显示针对用pWT126肽包被的HLA-A2阳性靶物的杀伤活性。TCR转导的T细胞还杀死内源性表达WT1的人肿瘤细胞。此外，转导的T细胞以HLA-A2限制的肽特异性方式产生IFN-γ。最后，转移的TCR可以在CD4阳性辅助T细胞中发挥功能。这些CD4阳性T细胞显示出HLA-A2限制的抗原特异性杀伤活性和抗原特异性细胞因子产生(未显示)。这指示TCR基因转移可以用于对CD8阳性和CD4阳性人T细胞两者赋予HLA I类限制性抗原特异性效应器功能。

方法

细胞系

T2是与抗原加工(TAP)缺陷的人HLA-A2+细胞系相关的转运蛋白，其可以有效地加载外源肽。BV173细胞系由患有CML的男性患者的外周血建立。所有细胞在RPMI加10％FCS中于37℃培养。

合成肽和HLA-A2/肽复合物四聚体

pWT126(RMFPNAPYL)和pWT235(CMTWNQMNL)是源自人WT1的HLA-A2结合肽。将pWT126溶解在PBS中，并且将pWT235溶解在DMSO中，然后在PBS中稀释以给出2mM的浓度。

逆转录病毒TCR构建体和TCR基因的转导

从同种限制性(allo-restricted)的pWT126特异性人CTL系77中分离WT1特异性TCRα和β基因。为了克隆TCR基因，从CTL系77中提取总RNA，并逆转录成cDNA。与一组恒定引物组合使用结合可变α和β基因两者的共有引物扩增cDNA。然后使用NotI和EcoRI限制性位点将分离的TCR Vα或Vβ基因克隆到pMP71逆转录病毒载体中。

将2x10⁶个兼向性包装细胞接种到T25烧瓶中，并且24小时后用磷酸钙沉淀用逆转录病毒TCR构建体瞬时转染。在准备转导中，使用抗CD3抗体和IL-2活化PBMC 2天。然后将活化的T细胞(3x10⁶)重悬浮于3ml正常生长培养基加上从转染的包装细胞收获的3ml病毒上清液中，并在用纤连蛋白包被的6孔板中铺板。将平板在37℃，5％CO2下温育，并且转导后24至48小时，进行TCR转基因的表达。

IFNγ分泌测定

用5x104个白血病细胞或肽包被的T2细胞(1:1比例)在96孔板中一式三份刺激TCR转导的T细胞(5x10⁴)。温育24小时后，收获上清液，并使用人IFNγ测定试剂盒(AMSBiotechnology)在干扰素γ酶联免疫吸附测定(ELISA)中测试。

实施例8：患者的选择和治疗

自具有WT1表达恶性的HLA-A2阳性患者采集外周血单个核细胞(PBMC)。用添加到培养物或珠上的抗CD3/CD28抗体活化PBMC达3天，然后如实施例1所述用编码逆转录病毒颗粒的TCR转导。在第5天，我们可以证明转导的CD4和CD8T细胞表达导入的TCR。在第6天，我们可以证明转导的T细胞的抗原特异性活性。在第6天，将转导的T细胞再输注入患者中。

实施例9：荷瘤小鼠的伤口愈合

在第0天，对小鼠皮下注射1x10⁶个Lewis肺癌细胞，并在第3天用4Gy照射。在第3天，给小鼠静脉内注射13x10⁶个模拟(n＝7)或CAR T细胞(n＝7)(CRT5CAR)。细胞为31％CD4+(93％CD34+)和43％CD8+(62％CD34+)。观察伤口愈合7天。

图44中的结果显示与用模拟转导的T细胞处理的类似小鼠相比，表达CRT5CAR的小鼠T细胞不阻碍荷瘤小鼠中的皮肤伤口的愈合。

实施例10：PDAC小鼠模型中的CRT5CAR

将K-RasG12D；Ink4a/Arf-/-；p53R172H细胞注射到同系免疫感受态小鼠的胰腺中以产生PDAC小鼠模型，其是胰腺癌的小鼠模型。来自该小鼠模型的肿瘤染色显示CLEC14A在大多数肿瘤血管上表达。用CRT5CAR T细胞(其中CAR包含来自CD28的共刺激域)处理PDAC小鼠导致治疗后3周显著的肿瘤控制(图45)。可以在图50中看到来自另外的实验的结果。

实施例11：CRT1、3和5针对CLEC14A的滴度

将CLEC14A以Fc融合蛋白表达以与CRT1、3和5CAR(CD28共刺激域)T细胞温育。用模拟T细胞稀释所有CAR-T细胞系以在转导效率方面均衡。可以在图46中看到结果，其中显示所有测试的CAR T细胞良好响应CLEC14A(显示的数据是一式三份培养物平均值+SD)。

实施例12：CRT1、3和5CAR T细胞的细胞毒性和增殖测定

使用CRT1、3和5CAR(具有CD28共刺激域)T细胞进行细胞毒性研究。用模拟T细胞稀释T细胞以在转导效率方面均衡，并与表达人CLEC14A的小鼠内皮细胞一起温育。在图48A中显示结果，其证明所有三种测试的CAR均可介导细胞毒性。显示的数据是一式三份培养物的均值+SD。

此外，用板结合的重组CLEC14A-Fc融合蛋白刺激的CRT1、3和5CAR(CD28共刺激域)T细胞进行增殖测定(CFSE标记)。用模拟T细胞稀释所有CAR T细胞系以在转导效率方面均衡，并且图48B中可以看到结果，其中所有三种测试的CAR在刺激后都能够增殖。显示的数据仅关于CD8+T细胞，但获得关于CD4+T细胞的类似数据。

实施例13：具有不同共刺激和跨膜区的CAR

使用逆转录病毒载体已经将以下CAR克隆并转染到来自单一供体的T细胞中：

1)CRT3-CD28 TM-CD28costim信号-CD3(CRT3.28z)

2)CRT3-CD8 TM-4-1BB costim信号-CD3(CRT3.BBz)

3)CRT3-CD28 TM-CD28和4-1BB costim信号-CD3(CRT3.28BBz)

4)CRT3-CD28 TM-CD28和OX40costim信号-CD3(CRT3.28Oxz)

5)CRT3-CD8 TM-4-1BB和OX40costim信号-CD3(CRT3.BBOxz)

产生的所有构建体均良好地转导到T细胞中。在体外评估不同构建体的功能，分析细胞因子产生，细胞毒性和增殖响应(参见图49)。细胞因子释放指示强抗原特异性应答，特别是由表达CRT3.28z和CRT3.280xz的T细胞产生。通过测量响应滴定数目的表达人CLEC14A(或仅载体对照)的CHO细胞的IFNγ产生来分析细胞因子的产生。用模拟T细胞稀释所有CART细胞系以在转导效率方面均衡。显示的数据是一式三份培养物的均值+SD。针对工程化改造为表达CLEC14A的小鼠内皮细胞(SEND)测量细胞毒活性，并在用平板结合的重组CLEC14A-Fc融合蛋白刺激后测量增殖响应(数据未显示)。

实施例14：用嵌合CLEC14A刺激后测定从CAR T细胞释放的细胞因子

在293和SEND细胞中表达含有人序列但具有小鼠来源的跨膜和/或胞内域的CLEC14A的嵌合形式。使用从慢病毒载体共表达的GFP分选这些细胞以在CLEC表达方面均衡，然后使用CAR T细胞(具有CD28共刺激域的CRT1、3和5)进行测试。在将CAR T细胞与293和SEND细胞两者一起温育后测量IFNγ的释放。可以在图51中看到结果。另外，测定了与表达CLEC14A嵌合体的SEND细胞一起温育时T细胞的细胞毒性。用模拟T细胞稀释所有CAR T细胞系以在转导效率方面均衡。显示的数据是一式三份培养物的平均值。

从图51中可以看出，所有测试的CRT1、3和5CAR T细胞导致从表达人CLEC14A(huCLEC)、具有小鼠胞内域的人CLEC14A(A1)和具有小鼠跨膜和胞内域的人CLEC14A(B1)的293和SEND细胞释放IFNγ。

序列表

<110> 癌症研究技术有限公司

伯明翰大学

细胞治疗飞跃有限责任公司

<120> 嵌合抗原受体

<130> 16/0002/JA

<160> 232

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 490

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Arg Pro Ala Phe Ala Leu Cys Leu Leu Trp Gln Ala Leu Trp Pro

1 5 10 15

Gly Pro Gly Gly Gly Glu His Pro Thr Ala Asp Arg Ala Gly Cys Ser

20 25 30

Ala Ser Gly Ala Cys Tyr Ser Leu His His Ala Thr Met Lys Arg Gln

35 40 45

Ala Ala Glu Glu Ala Cys Ile Leu Arg Gly Gly Ala Leu Ser Thr Val

50 55 60

Arg Ala Gly Ala Glu Leu Arg Ala Val Leu Ala Leu Leu Arg Ala Gly

65 70 75 80

Pro Gly Pro Gly Gly Gly Ser Lys Asp Leu Leu Phe Trp Val Ala Leu

85 90 95

Glu Arg Arg Arg Ser His Cys Thr Leu Glu Asn Glu Pro Leu Arg Gly

100 105 110

Phe Ser Trp Leu Ser Ser Asp Pro Gly Gly Leu Glu Ser Asp Thr Leu

115 120 125

Gln Trp Val Glu Glu Pro Gln Arg Ser Cys Thr Ala Arg Arg Cys Ala

130 135 140

Val Leu Gln Ala Thr Gly Gly Val Glu Pro Ala Gly Trp Lys Glu Met

145 150 155 160

Arg Cys His Leu Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Cys Lys Tyr Gln Phe Glu

165 170 175

Val Leu Cys Pro Ala Pro Arg Pro Gly Ala Ala Ser Asn Leu Ser Tyr

180 185 190

Arg Ala Pro Phe Gln Leu His Ser Ala Ala Leu Asp Phe Ser Pro Pro

195 200 205

Gly Thr Glu Val Ser Ala Leu Cys Arg Gly Gln Leu Pro Ile Ser Val

210 215 220

Thr Cys Ile Ala Asp Glu Ile Gly Ala Arg Trp Asp Lys Leu Ser Gly

225 230 235 240

Asp Val Leu Cys Pro Cys Pro Gly Arg Tyr Leu Arg Ala Gly Lys Cys

245 250 255

Ala Glu Leu Pro Asn Cys Leu Asp Asp Leu Gly Gly Phe Ala Cys Glu

260 265 270

Cys Ala Thr Gly Phe Glu Leu Gly Lys Asp Gly Arg Ser Cys Val Thr

275 280 285

Ser Gly Glu Gly Gln Pro Thr Leu Gly Gly Thr Gly Val Pro Thr Arg

290 295 300

Arg Pro Pro Ala Thr Ala Thr Ser Pro Val Pro Gln Arg Thr Trp Pro

305 310 315 320

Ile Arg Val Asp Glu Lys Leu Gly Glu Thr Pro Leu Val Pro Glu Gln

325 330 335

Asp Asn Ser Val Thr Ser Ile Pro Glu Ile Pro Arg Trp Gly Ser Gln

340 345 350

Ser Thr Met Ser Thr Leu Gln Met Ser Leu Gln Ala Glu Ser Lys Ala

355 360 365

Thr Ile Thr Pro Ser Gly Ser Val Ile Ser Lys Phe Asn Ser Thr Thr

370 375 380

Ser Ser Ala Thr Pro Gln Ala Phe Asp Ser Ser Ser Ala Val Val Phe

385 390 395 400

Ile Phe Val Ser Thr Ala Val Val Val Leu Val Ile Leu Thr Met Thr

405 410 415

Val Leu Gly Leu Val Lys Leu Cys Phe His Glu Ser Pro Ser Ser Gln

420 425 430

Pro Arg Lys Glu Ser Met Gly Pro Pro Gly Leu Glu Ser Asp Pro Glu

435 440 445

Pro Ala Ala Leu Gly Ser Ser Ser Ala His Cys Thr Asn Asn Gly Val

450 455 460

Lys Val Gly Asp Cys Asp Leu Arg Asp Arg Ala Glu Gly Ala Leu Leu

465 470 475 480

Ala Glu Ser Pro Leu Gly Ser Ser Asp Ala

485 490

<210> 2

<211> 2256

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

ctcctcttgc tctaagcagg gtgtttgacc ttctagtcga ctgcgtcccc tgtacccggc 60

gccagctgtg ttcctgaccc cagaataact cagggctgca ccgggcctgg cagcgctccg 120

cacacatttc ctgtcgcggc ctaagggaaa ctgttggccg ctgggcccgc ggggggattc 180

ttggcagttg gggggtccgt cgggagcgag ggcggagggg aagggagggg gaaccgggtt 240

ggggaagcca gctgtagagg gcggtgaccg cgctccagac acagctctgc gtcctcgagc 300

gggacagatc caagttggga gcagctctgc gtgcggggcc tcagagaatg aggccggcgt 360

tcgccctgtg cctcctctgg caggcgctct ggcccgggcc gggcggcggc gaacacccca 420

ctgccgaccg tgctggctgc tcggcctcgg gggcctgcta cagcctgcac cacgctacca 480

tgaagcggca ggcggccgag gaggcctgca tcctgcgagg tggggcgctc agcaccgtgc 540

gtgcgggcgc cgagctgcgc gctgtgctcg cgctcctgcg ggcaggccca gggcccggag 600

ggggctccaa agacctgctg ttctgggtcg cactggagcg caggcgttcc cactgcaccc 660

tggagaacga gcctttgcgg ggtttctcct ggctgtcctc cgaccccggc ggtctcgaaa 720

gcgacacgct gcagtgggtg gaggagcccc aacgctcctg caccgcgcgg agatgcgcgg 780

tactccaggc caccggtggg gtcgagcccg caggctggaa ggagatgcga tgccacctgc 840

gcgccaacgg ctacctgtgc aagtaccagt ttgaggtctt gtgtcctgcg ccgcgccccg 900

gggccgcctc taacttgagc tatcgcgcgc ccttccagct gcacagcgcc gctctggact 960

tcagtccacc tgggaccgag gtgagtgcgc tctgccgggg acagctcccg atctcagtta 1020

cttgcatcgc ggacgaaatc ggcgctcgct gggacaaact ctcgggcgat gtgttgtgtc 1080

cctgccccgg gaggtacctc cgtgctggca aatgcgcaga gctccctaac tgcctagacg 1140

acttgggagg ctttgcctgc gaatgtgcta cgggcttcga gctggggaag gacggccgct 1200

cttgtgtgac cagtggggaa ggacagccga cccttggggg gaccggggtg cccaccaggc 1260

gcccgccggc cactgcaacc agccccgtgc cgcagagaac atggccaatc agggtcgacg 1320

agaagctggg agagacacca cttgtccctg aacaagacaa ttcagtaaca tctattcctg 1380

agattcctcg atggggatca cagagcacga tgtctaccct tcaaatgtcc cttcaagccg 1440

agtcaaaggc cactatcacc ccatcaggga gcgtgatttc caagtttaat tctacgactt 1500

cctctgccac tcctcaggct ttcgactcct cctctgccgt ggtcttcata tttgtgagca 1560

cagcagtagt agtgttggtg atcttgacca tgacagtact ggggcttgtc aagctctgct 1620

ttcacgaaag cccctcttcc cagccaagga aggagtctat gggcccgccg ggcctggaga 1680

gtgatcctga gcccgctgct ttgggctcca gttctgcaca ttgcacaaac aatggggtga 1740

aagtcgggga ctgtgatctg cgggacagag cagagggtgc cttgctggcg gagtcccctc 1800

ttggctctag tgatgcatag ggaaacaggg gacatgggca ctcctgtgaa cagtttttca 1860

cttttgatga aacggggaac caagaggaac ttacttgtgt aactgacaat ttctgcagaa 1920

atcccccttc ctctaaattc cctttactcc actgaggagc taaatcagaa ctgcacactc 1980

cttccctgat gatagaggaa gtggaagtgc ctttaggatg gtgatactgg gggaccgggt 2040

agtgctgggg agagatattt tcttatgttt attcggagaa tttggagaag tgattgaact 2100

tttcaagaca ttggaaacaa atagaacaca atataattta cattaaaaaa taatttctac 2160

caaaatggaa aggaaatgtt ctatgttgtt caggctagga gtatattggt tcgaaatccc 2220

agggaaaaaa ataaaaataa aaaattaaag gattgt 2256

<210> 3

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CLEC14A cds

<400> 3

atgaggccgg cgttcgccct gtgcctcctc tggcaggcgc tctggcccgg gccgggcggc 60

ggcgaacacc ccactgccga ccgtgctggc tgctcggcct cgggggcctg ctacagcctg 120

caccacgcta ccatgaagcg gcaggcggcc gaggaggcct gcatcctgcg aggtggggcg 180

ctcagcaccg tgcgtgcggg cgccgagctg cgcgctgtgc tcgcgctcct gcgggcaggc 240

ccagggcccg gagggggctc caaagacctg ctgttctggg tcgcactgga gcgcaggcgt 300

tcccactgca ccctggagaa cgagcctttg cggggtttct cctggctgtc ctccgacccc 360

ggcggtctcg aaagcgacac gctgcagtgg gtggaggagc cccaacgctc ctgcaccgcg 420

cggagatgcg cggtactcca ggccaccggt ggggtcgagc ccgcaggctg gaaggagatg 480

cgatgccacc tgcgcgccaa cggctacctg tgcaagtacc agtttgaggt cttgtgtcct 540

gcgccgcgcc ccggggccgc ctctaacttg agctatcgcg cgcccttcca gctgcacagc 600

gccgctctgg acttcagtcc acctgggacc gaggtgagtg cgctctgccg gggacagctc 660

ccgatctcag ttacttgcat cgcggacgaa atcggcgctc gctgggacaa actctcgggc 720

gatgtgttgt gtccctgccc cgggaggtac ctccgtgctg gcaaatgcgc agagctccct 780

aactgcctag acgacttggg aggctttgcc tgcgaatgtg ctacgggctt cgagctgggg 840

aaggacggcc gctcttgtgt gaccagtggg gaaggacagc cgacccttgg ggggaccggg 900

gtgcccacca ggcgcccgcc ggccactgca accagccccg tgccgcagag aacatggcca 960

atcagggtcg acgagaagct gggagagaca ccacttgtcc ctgaacaaga caattcagta 1020

acatctattc ctgagattcc tcgatgggga tcacagagca cgatgtctac ccttcaaatg 1080

tcccttcaag ccgagtcaaa ggccactatc accccatcag ggagcgtgat ttccaagttt 1140

aattctacga cttcctctgc cactcctcag gctttcgact cctcctctgc cgtggtcttc 1200

atatttgtga gcacagcagt agtagtgttg gtgatcttga ccatgacagt actggggctt 1260

gtcaagctct gctttcacga aagcccctct tcccagccaa ggaaggagtc tatgggcccg 1320

ccgggcctgg agagtgatcc tgagcccgct gctttgggct ccagttctgc acattgcaca 1380

aacaatgggg tgaaagtcgg ggactgtgat ctgcgggaca gagcagaggg tgccttgctg 1440

gcggagtccc ctcttggctc tagtgatgca tag 1473

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CLEC14A正向引物

<400> 4

tagtaggaat tcgagagaat gaggccggcg ttcgccctg 39

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CLEC14A反向引物

<400> 5

agaaccgcgg ccgctggagg agtcgaaagc ctgaggagt 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠CLEC14A正向引物

<400> 6

tagtaggaat tcgagagaat gaggccagcg cttgccctg 39

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠CLEC14A反向引物

<400> 7

ctactagcgg ccgctcgtgg aagaggtgtc gaaagt 36

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CLEC14A正向引物

<400> 8

tagtagttaa ttaagagaga atgaggccgg cgttc 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠CLEC14A正向引物

<400> 9

tagtagttaa ttaagagaga atgaggccag cgctt 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Fc反向引物

<400> 10

ctactagttt aaactcattt acccggagac aggga 35

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMRN2正向引物

<400> 11

ccggaccggt caggcttcca gtactagcc 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMRN2反向引物

<400> 12

cggggtaccg gtcttaaaca tcaggaagc 29

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'UTR正向引物

<400> 13

ttccttttcc agggtttgtg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'UTR反向引物

<400> 14

gcctacaagg tggcttgaat 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CDS正向引物

<400> 15

aagctgtgct cctgctcttg 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CDS反向引物

<400> 16

tcctgagtgc actgtgagat g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3'UTR正向引物

<400> 17

ctgtagaggg cggtgacttt 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3' UTR反向引物

<400> 18

agctgctccc aagtcctct 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mACTB正向引物

<400> 19

ctaaggccaa ccgtgaaaag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mACTB反向引物

<400> 20

accagaggca tacagggaca 20

<210> 21

<211> 39

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> CD141的N端部分

<400> 21

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly

1 5 10 15

Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu

20 25 30

His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr

35

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> CD141的残基97-108

<400> 22

Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu

1 5 10

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> CD141的残基122-142

<400> 23

Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Leu

1 5 10 15

Cys Gly Pro Leu

20

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 人CLEC14A的残基97-108

<400> 24

Glu Arg Arg Arg Ser Cys His Thr Leu Glu Asn Glu

1 5 10

<210> 25

<211> 169

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> CD141的CTLD

<400> 25

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly

1 5 10 15

Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu

20 25 30

His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala

35 40 45

Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser

50 55 60

Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly

65 70 75 80

Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys

85 90 95

Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr

100 105 110

Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn

115 120 125

Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu

130 135 140

Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val

145 150 155 160

Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe

165

<210> 26

<211> 740

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CLEC14A, CD141和GFP的嵌合体

<400> 26

Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly

1 5 10 15

Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu

20 25 30

His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala

35 40 45

Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser

50 55 60

Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly

65 70 75 80

Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys

85 90 95

Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr

100 105 110

Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn

115 120 125

Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu

130 135 140

Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val

145 150 155 160

Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe Gln Phe Glu Val Leu Cys Pro

165 170 175

Ala Pro Arg Pro Gly Ala Ala Ser Asn Leu Ser Tyr Arg Ala Pro Phe

180 185 190

Gln Leu His Ser Ala Ala Leu Asp Phe Ser Pro Pro Gly Thr Glu Val

195 200 205

Ser Ala Leu Cys Arg Gly Gln Leu Pro Ile Ser Val Thr Cys Ile Ala

210 215 220

Asp Glu Ile Gly Ala Arg Trp Asp Lys Leu Ser Gly Asp Val Leu Cys

225 230 235 240

Pro Cys Pro Gly Arg Tyr Leu Arg Ala Gly Lys Cys Ala Glu Leu Pro

245 250 255

Asn Cys Leu Asp Asp Leu Gly Gly Phe Ala Cys Glu Cys Ala Thr Gly

260 265 270

Phe Glu Leu Gly Lys Asp Gly Arg Ser Cys Val Thr Ser Gly Glu Gly

275 280 285

Gln Pro Thr Leu Gly Gly Thr Gly Val Pro Thr Arg Arg Pro Pro Ala

290 295 300

Thr Ala Thr Ser Pro Val Pro Gln Arg Thr Trp Pro Ile Arg Val Asp

305 310 315 320

Glu Lys Leu Gly Glu Thr Pro Leu Val Pro Glu Gln Asp Asn Ser Val

325 330 335

Thr Ser Ile Pro Glu Ile Pro Arg Trp Gly Ser Gln Ser Thr Met Ser

340 345 350

Thr Leu Gln Met Ser Leu Gln Ala Glu Ser Lys Ala Thr Ile Thr Pro

355 360 365

Ser Gly Ser Val Ile Ser Lys Phe Asn Ser Thr Thr Ser Ser Ala Thr

370 375 380

Pro Gln Ala Phe Asp Ser Ser Ser Ala Val Val Phe Ile Phe Val Ser

385 390 395 400

Thr Ala Val Val Val Leu Val Ile Leu Thr Met Thr Val Leu Gly Leu

405 410 415

Val Lys Leu Cys Phe His Glu Ser Pro Ser Ser Gln Pro Arg Lys Glu

420 425 430

Ser Met Gly Pro Pro Gly Leu Glu Ser Asp Pro Glu Pro Ala Ala Leu

435 440 445

Gly Ser Ser Ser Ala His Cys Thr Asn Asn Gly Val Lys Val Gly Asp

450 455 460

Cys Asp Leu Arg Asp Arg Ala Glu Gly Ala Leu Leu Ala Glu Ser Pro

465 470 475 480

Leu Gly Ser Ser Asp Ala Leu Gln Ser Thr Val Pro Arg Ala Arg Asp

485 490 495

Pro Pro Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

500 505 510

Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys

515 520 525

Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu

530 535 540

Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro

545 550 555 560

Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr

565 570 575

Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu

580 585 590

Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr

595 600 605

Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg

610 615 620

Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly

625 630 635 640

His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala

645 650 655

Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn

660 665 670

Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr

675 680 685

Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser

690 695 700

Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met

705 710 715 720

Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp

725 730 735

Glu Leu Tyr Lys

740

<210> 27

<211> 745

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CLEC14A, CD141和GFP的嵌合体

<400> 27

Met Arg Pro Ala Phe Ala Leu Cys Leu Leu Trp Gln Ala Leu Trp Pro

1 5 10 15

Gly Pro Gly Gly Gly Glu His Pro Thr Ala Asp Arg Ala Gly Cys Ser

20 25 30

Ala Ser Gly Ala Cys Tyr Ser Leu His His Ala Thr Met Lys Arg Gln

35 40 45

Ala Ala Glu Glu Ala Cys Ile Leu Arg Gly Gly Ala Leu Ser Thr Val

50 55 60

Arg Ala Gly Ala Glu Leu Arg Ala Val Leu Ala Leu Leu Arg Ala Gly

65 70 75 80

Pro Gly Pro Gly Gly Gly Ser Lys Asp Leu Leu Phe Trp Val Ala Leu

85 90 95

Glu Arg Arg Arg Ser His Cys Thr Leu Glu Asn Glu Pro Leu Arg Gly

100 105 110

Phe Ser Trp Leu Ser Ser Asp Pro Gly Gly Leu Glu Ser Asp Thr Leu

115 120 125

Gln Trp Val Glu Glu Pro Gln Arg Ser Cys Thr Ala Arg Arg Cys Ala

130 135 140

Val Leu Gln Ala Thr Gly Gly Val Glu Pro Ala Gly Trp Lys Glu Met

145 150 155 160

Arg Cys His Leu Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Cys Lys Tyr His Phe Pro

165 170 175

Ala Thr Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala

180 185 190

Val Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe

195 200 205

Gln Ala Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu

210 215 220

Gln Leu Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala

225 230 235 240

Arg Glu Ala Pro Gly Ala Cys Pro Gly Arg Tyr Leu Arg Ala Gly Lys

245 250 255

Cys Ala Glu Leu Pro Asn Cys Leu Asp Asp Leu Gly Gly Phe Ala Cys

260 265 270

Glu Cys Ala Thr Gly Phe Glu Leu Gly Lys Asp Gly Arg Ser Cys Val

275 280 285

Thr Ser Gly Glu Gly Gln Pro Thr Leu Gly Gly Thr Gly Val Pro Thr

290 295 300

Arg Arg Pro Pro Ala Thr Ala Thr Ser Pro Val Pro Gln Arg Thr Trp

305 310 315 320

Pro Ile Arg Val Asp Glu Lys Leu Gly Glu Thr Pro Leu Val Pro Glu

325 330 335

Gln Asp Asn Ser Val Thr Ser Ile Pro Glu Ile Pro Arg Trp Gly Ser

340 345 350

Gln Ser Thr Met Ser Thr Leu Gln Met Ser Leu Gln Ala Glu Ser Lys

355 360 365

Ala Thr Ile Thr Pro Ser Gly Ser Val Ile Ser Lys Phe Asn Ser Thr

370 375 380

Thr Ser Ser Ala Thr Pro Gln Ala Phe Asp Ser Ser Ser Ala Val Val

385 390 395 400

Phe Ile Phe Val Ser Thr Ala Val Val Val Leu Val Ile Leu Thr Met

405 410 415

Thr Val Leu Gly Leu Val Lys Leu Cys Phe His Glu Ser Pro Ser Ser

420 425 430

Gln Pro Arg Lys Glu Ser Met Gly Pro Pro Gly Leu Glu Ser Asp Pro

435 440 445

Glu Pro Ala Ala Leu Gly Ser Ser Ser Ala His Cys Thr Asn Asn Gly

450 455 460

Val Lys Val Gly Asp Cys Asp Leu Arg Asp Arg Ala Glu Gly Ala Leu

465 470 475 480

Leu Ala Glu Ser Pro Leu Gly Ser Ser Asp Ala Leu Gln Ser Thr Val

485 490 495

Pro Arg Ala Arg Asp Pro Pro Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu

500 505 510

Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp

515 520 525

Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala

530 535 540

Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu

545 550 555 560

Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln

565 570 575

Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys

580 585 590

Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys

595 600 605

Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp

610 615 620

Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp

625 630 635 640

Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn

645 650 655

Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe

660 665 670

Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His

675 680 685

Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp

690 695 700

Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu

705 710 715 720

Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile

725 730 735

Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

740 745

<210> 28

<211> 949

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> MMRN2蛋白质序列

<400> 28

Met Ile Leu Ser Leu Leu Phe Ser Leu Gly Gly Pro Leu Gly Trp Gly

1 5 10 15

Leu Leu Gly Ala Trp Ala Gln Ala Ser Ser Thr Ser Leu Ser Asp Leu

20 25 30

Gln Ser Ser Arg Thr Pro Gly Val Trp Lys Ala Glu Ala Glu Asp Thr

35 40 45

Gly Lys Asp Pro Val Gly Arg Asn Trp Cys Pro Tyr Pro Met Ser Lys

50 55 60

Leu Val Thr Leu Leu Ala Leu Cys Lys Thr Glu Lys Phe Leu Ile His

65 70 75 80

Ser Gln Gln Pro Cys Pro Gln Gly Ala Pro Asp Cys Gln Lys Val Lys

85 90 95

Val Met Tyr Arg Met Ala His Lys Pro Val Tyr Gln Val Lys Gln Lys

100 105 110

Val Leu Thr Ser Leu Ala Trp Arg Cys Cys Pro Gly Tyr Thr Gly Pro

115 120 125

Asn Cys Glu His His Asp Ser Met Ala Ile Pro Glu Pro Ala Asp Pro

130 135 140

Gly Asp Ser His Gln Glu Pro Gln Asp Gly Pro Val Ser Phe Lys Pro

145 150 155 160

Gly His Leu Ala Ala Val Ile Asn Glu Val Glu Val Gln Gln Glu Gln

165 170 175

Gln Glu His Leu Leu Gly Asp Leu Gln Asn Asp Val His Arg Val Ala

180 185 190

Asp Ser Leu Pro Gly Leu Trp Lys Ala Leu Pro Gly Asn Leu Thr Ala

195 200 205

Ala Val Met Glu Ala Asn Gln Thr Gly His Glu Phe Pro Asp Arg Ser

210 215 220

Leu Glu Gln Val Leu Leu Pro His Val Asp Thr Phe Leu Gln Val His

225 230 235 240

Phe Ser Pro Ile Trp Arg Ser Phe Asn Gln Ser Leu His Ser Leu Thr

245 250 255

Gln Ala Ile Arg Asn Leu Ser Leu Asp Val Glu Ala Asn Arg Gln Ala

260 265 270

Ile Ser Arg Val Gln Asp Ser Ala Val Ala Arg Ala Asp Phe Gln Glu

275 280 285

Leu Gly Ala Lys Phe Glu Ala Lys Val Gln Glu Asn Thr Gln Arg Val

290 295 300

Gly Gln Leu Arg Gln Asp Val Glu Asp Arg Leu His Ala Gln His Phe

305 310 315 320

Thr Leu His Arg Ser Ile Ser Glu Leu Gln Ala Asp Val Asp Thr Lys

325 330 335

Leu Lys Arg Leu His Lys Ala Gln Glu Ala Pro Gly Thr Asn Gly Ser

340 345 350

Leu Val Leu Ala Thr Pro Gly Ala Gly Ala Arg Pro Glu Pro Asp Ser

355 360 365

Leu Gln Ala Arg Leu Gly Gln Leu Gln Arg Asn Leu Ser Glu Leu His

370 375 380

Met Thr Thr Ala Arg Arg Glu Glu Glu Leu Gln Tyr Thr Leu Glu Asp

385 390 395 400

Met Arg Ala Thr Leu Thr Arg His Val Asp Glu Ile Lys Glu Leu Tyr

405 410 415

Ser Glu Ser Asp Glu Thr Phe Asp Gln Ile Ser Lys Val Glu Arg Gln

420 425 430

Val Glu Glu Leu Gln Val Asn His Thr Ala Leu Arg Glu Leu Arg Val

435 440 445

Ile Leu Met Glu Lys Ser Leu Ile Met Glu Glu Asn Lys Glu Glu Val

450 455 460

Glu Arg Gln Leu Leu Glu Leu Asn Leu Thr Leu Gln His Leu Gln Gly

465 470 475 480

Gly His Ala Asp Leu Ile Lys Tyr Val Lys Asp Cys Asn Cys Gln Lys

485 490 495

Leu Tyr Leu Asp Leu Asp Val Ile Arg Glu Gly Gln Arg Asp Ala Thr

500 505 510

Arg Ala Leu Glu Glu Thr Gln Val Ser Leu Asp Glu Arg Arg Gln Leu

515 520 525

Asp Gly Ser Ser Leu Gln Ala Leu Gln Asn Ala Val Asp Ala Val Ser

530 535 540

Leu Ala Val Asp Ala His Lys Ala Glu Gly Glu Arg Ala Arg Ala Ala

545 550 555 560

Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gln Val Gln Ala Leu Asp Asp Glu Val Gly

565 570 575

Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Ala Arg His Glu Val Arg Gln Leu

580 585 590

His Ser Ala Phe Ala Ala Leu Leu Glu Asp Ala Leu Arg His Glu Ala

595 600 605

Val Leu Ala Ala Leu Phe Gly Glu Glu Val Leu Glu Glu Met Ser Glu

610 615 620

Gln Thr Pro Gly Pro Leu Pro Leu Ser Tyr Glu Gln Ile Arg Val Ala

625 630 635 640

Leu Gln Asp Ala Ala Ser Gly Leu Gln Glu Gln Ala Leu Gly Trp Asp

645 650 655

Glu Leu Ala Ala Arg Val Thr Ala Leu Glu Gln Ala Ser Glu Pro Pro

660 665 670

Arg Pro Ala Glu His Leu Glu Pro Ser His Asp Ala Gly Arg Glu Glu

675 680 685

Ala Ala Thr Thr Ala Leu Ala Gly Leu Ala Arg Glu Leu Gln Ser Leu

690 695 700

Ser Asn Asp Val Lys Asn Val Gly Arg Cys Cys Glu Ala Glu Ala Gly

705 710 715 720

Ala Gly Ala Ala Ser Leu Asn Ala Ser Leu Asp Gly Leu His Asn Ala

725 730 735

Leu Phe Ala Thr Gln Arg Ser Leu Glu Gln His Gln Arg Leu Phe His

740 745 750

Ser Leu Phe Gly Asn Phe Gln Gly Leu Met Glu Ala Asn Val Ser Leu

755 760 765

Asp Leu Gly Lys Leu Gln Thr Met Leu Ser Arg Lys Gly Lys Lys Gln

770 775 780

Gln Lys Asp Leu Glu Ala Pro Arg Lys Arg Asp Lys Lys Glu Ala Glu

785 790 795 800

Pro Leu Val Asp Ile Arg Val Thr Gly Pro Val Pro Gly Ala Leu Gly

805 810 815

Ala Ala Leu Trp Glu Ala Gly Ser Pro Val Ala Phe Tyr Ala Ser Phe

820 825 830

Ser Glu Gly Thr Ala Ala Leu Gln Thr Val Lys Phe Asn Thr Thr Tyr

835 840 845

Ile Asn Ile Gly Ser Ser Tyr Phe Pro Glu His Gly Tyr Phe Arg Ala

850 855 860

Pro Glu Arg Gly Val Tyr Leu Phe Ala Val Ser Val Glu Phe Gly Pro

865 870 875 880

Gly Pro Gly Thr Gly Gln Leu Val Phe Gly Gly His His Arg Thr Pro

885 890 895

Val Cys Thr Thr Gly Gln Gly Ser Gly Ser Thr Ala Thr Val Phe Ala

900 905 910

Met Ala Glu Leu Gln Lys Gly Glu Arg Val Trp Phe Glu Leu Thr Gln

915 920 925

Gly Ser Ile Thr Lys Arg Ser Leu Ser Gly Thr Ala Phe Gly Gly Phe

930 935 940

Leu Met Phe Lys Thr

945

<210> 29

<211> 2850

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> MMRN2核苷酸

<400> 29

atgatcctga gcttgctgtt cagccttggg ggccccctgg gctgggggct gctgggggca 60

tgggcccagg cttccagtac tagcctctct gatctgcaga gctccaggac acctggggtc 120

tggaaggcag aggctgagga caccggcaag gaccccgttg gacgtaactg gtgcccctac 180

ccaatgtcca agctggtcac cttactagct ctttgcaaaa cagagaaatt cctcatccac 240

tcgcagcagc cgtgtccgca gggagctcca gactgccaga aagtcaaagt catgtaccgc 300

atggcccaca agccagtgta ccaggtcaag cagaaggtgc tgacctcttt ggcctggagg 360

tgctgccctg gctacacggg ccccaactgc gagcaccacg attccatggc aatccctgag 420

cctgcagatc ctggtgacag ccaccaggaa cctcaggatg gaccagtcag cttcaaacct 480

ggccaccttg ctgcagtgat caatgaggtt gaggtgcaac aggaacagca ggaacatctg 540

ctgggagatc tccagaatga tgtgcaccgg gtggcagaca gcctgccagg cctgtggaaa 600

gccctgcctg gtaacctcac agctgcagtg atggaagcaa atcaaacagg gcacgagttc 660

cctgatagat ccttggagca ggtgctgcta ccccacgtgg acaccttcct acaagtgcat 720

ttcagcccca tctggaggag ctttaaccaa agcctgcaca gccttaccca ggccataaga 780

aacctgtctc ttgacgtgga ggccaaccgc caggccatct ccagagtcca ggacagtgcc 840

gtggccaggg ctgacttcca ggagcttggt gccaaatttg aggccaaggt ccaggagaac 900

actcagagag tgggtcagct gcgacaggac gtggaggacc gcctgcacgc ccagcacttt 960

accctgcacc gctcgatctc agagctccaa gccgatgtgg acaccaaatt gaagaggctg 1020

cacaaggctc aggaggcccc agggaccaat ggcagtctgg tgttggcaac gcctggggct 1080

ggggcaaggc ctgagccgga cagcctgcag gccaggctgg gccagctgca gaggaacctc 1140

tcagagctgc acatgaccac ggcccgcagg gaggaggagt tgcagtacac cctggaggac 1200

atgagggcca ccctgacccg gcacgtggat gagatcaagg aactgtactc cgaatcggac 1260

gagactttcg atcagattag caaggtggag cggcaggtgg aggagctgca ggtgaaccac 1320

acggcgctcc gtgagctgcg cgtgatcctg atggagaagt ctctgatcat ggaggagaac 1380

aaggaggagg tggagcggca gctcctggag ctcaacctca cgctgcagca cctgcagggt 1440

ggccatgccg acctcatcaa gtacgtgaag gactgcaatt gccagaagct ctatttagac 1500

ctggacgtca tccgggaggg ccagagggac gccacgcgtg ccctggagga gacccaggtg 1560

agcctggacg agcggcggca gctggacggc tcctccctgc aggccctgca gaacgccgtg 1620

gacgccgtgt cgctggccgt ggacgcgcac aaagcggagg gcgagcgggc gcgggcggcc 1680

acgtcgcggc tccggagcca agtgcaggcg ctggatgacg aggtgggcgc gctgaaggcg 1740

gccgcggccg aggcccgcca cgaggtgcgc cagctgcaca gcgccttcgc cgccctgctg 1800

gaggacgcgc tgcggcacga ggcggtgctg gccgcgctct tcggggagga ggtgctggag 1860

gagatgtctg agcagacgcc gggaccgctg cccctgagct acgagcagat ccgcgtggcc 1920

ctgcaggacg ccgctagcgg gctgcaggag caggcgctcg gctgggacga gctggccgcc 1980

cgagtgacgg ccctggagca ggcctcggag cccccgcggc cggcagagca cctggagccc 2040

agccacgacg cgggccgcga ggaggccgcc accaccgccc tggccgggct ggcgcgggag 2100

ctccagagcc tgagcaacga cgtcaagaat gtcgggcggt gctgcgaggc tgaggccggg 2160

gccggggccg cctccctcaa cgcctccctt gacggcctcc acaacgcact cttcgccact 2220

cagcgcagct tggagcagca ccagcggctc ttccacagcc tctttgggaa cttccaaggg 2280

ctcatggaag ccaacgtcag cctggacctg gggaagctgc agaccatgct gagcaggaaa 2340

gggaagaagc agcagaaaga cctggaagct ccccggaaga gggacaagaa ggaagcggag 2400

cctttggtgg acatacgggt cacagggcct gtgccaggtg ccttgggcgc ggcgctctgg 2460

gaggcaggat cccctgtggc cttctatgcc agcttttcag aagggacggc tgccctgcag 2520

acagtgaagt tcaacaccac atacatcaac attggcagca gctacttccc tgaacatggc 2580

tacttccgag cccctgagcg tggtgtctac ctgtttgcag tgagcgttga atttggccca 2640

gggccaggca ccgggcagct ggtgtttgga ggtcaccatc ggactccagt ctgtaccact 2700

gggcagggga gtggaagcac agcaacggtc tttgccatgg ctgagctgca gaagggtgag 2760

cgagtatggt ttgagttaac ccagggatca ataacaaaga gaagcctgtc gggcactgca 2820

tttgggggct tcctgatgtt taagacctga 2850

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA双链体D1

<400> 30

gaacaagaca attcagtaa 19

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA双链体D2

<400> 31

caatcagggt cgacgagaa 19

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体1的CDR1

<400> 32

Ser Ser Tyr Trp Ile Glu

1 5

<210> 33

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体的CDR2

<400> 33

Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn

1 5 10

<210> 34

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1重链变体1的CDR3

<400> 34

Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Val Met Asp

1 5 10

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1轻链变体1的CDR 1

<400> 35

Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr

1 5

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1轻链变体1的CDR2

<400> 36

Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1轻链变体1的CDR3

<400> 37

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu

1 5

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体1的CDR1

<400> 38

agtagctact ggatagag 18

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体1的CDR2

<400> 39

tggattggag agattttacc tggaagtggt agtactaat 39

<210> 40

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体1的CDR3

<400> 40

gcaagagggg gggattacga cgaagaatac tatgtcatgg ac 42

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的轻链变体1的CDR1

<400> 41

agttacatgt actggtac 18

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的轻链变体1的CDR2

<400> 42

ctcctgattt atgacacatc caacctggct 30

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的轻链变体1的CDR3

<400> 43

cagcagtgga gtagttaccc gctc 24

<210> 44

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体2的CDR1

<400> 44

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体2的CDR2

<400> 45

Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 46

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体2的CDR3

<400> 46

Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Val Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的轻链变体2的CDR1

<400> 47

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 48

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40共刺激域的核苷酸序列

<400> 48

agggaccaga ggctgccccc cgatgcccac aagccccctg ggggaggcag tttccggacc 60

cccatccaag aggagcaggc cgacgcccac tccaccctgg ccaagatc 108

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的轻链变体2的CDR3

<400> 49

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体2的 CDR1

<400> 50

ggctacacat tcagtagcta ctgg 24

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体2的CDR2

<400> 51

attttacctg gaagtggtag tact 24

<210> 52

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的重链变体2的CDR3

<400> 52

gcaagagggg gggattacga cgaagaatac tatgtcatgg actac 45

<210> 53

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的轻链变体2的CDR1

<400> 53

tcaagtgtaa gttac 15

<210> 54

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28共刺激域的核苷酸序列

<400> 54

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1的轻链变体2的CDR3

<400> 55

cagcagtgga gtagttaccc gctcacg 27

<210> 56

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1重链蛋白

<400> 56

Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Val Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

115 120

<210> 57

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1轻链蛋白

<400> 57

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 58

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1 scFv蛋白

<400> 58

Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Val Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

145 150 155 160

Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu

180 185 190

Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

195 200 205

Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

210 215 220

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala

245

<210> 59

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1重链核苷酸

<400> 59

atggccgagg ttcagcttca gcagtctgga gctgagctga tgaagcctgg ggcctcagtg 60

aagatatcct gcaaggctac tggctacaca ttcagtagct actggataga gtgggtaaag 120

cagaggcctg gacatggcct tgagtggatt ggagagattt tacctggaag tggtagtact 180

aattacaatg agaagttcaa gggcaaggcc acattcactg cagatacatc ctccaacaca 240

gcctacatgc aactcagcag cctgacatct gaggactctg ccgtctatta ctgtgcaaga 300

gggggggatt acgacgaaga atactatgtc atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

actgtc 366

<210> 60

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1轻链核苷酸

<400> 60

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagttacc cgctcacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg agctgaaacg t 321

<210> 61

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1 scFv核苷酸

<400> 61

atggccgagg ttcagcttca gcagtctgga gctgagctga tgaagcctgg ggcctcagtg 60

aagatatcct gcaaggctac tggctacaca ttcagtagct actggataga gtgggtaaag 120

cagaggcctg gacatggcct tgagtggatt ggagagattt tacctggaag tggtagtact 180

aattacaatg agaagttcaa gggcaaggcc acattcactg cagatacatc ctccaacaca 240

gcctacatgc aactcagcag cctgacatct gaggactctg ccgtctatta ctgtgcaaga 300

gggggggatt acgacgaaga atactatgtc atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

actgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgcaa 420

attgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 480

acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgtactggt accagcagaa gccaggatcc 540

tcccccagac tcctgattta tgacacatcc aacctggctt ctggagtccc tgttcgcttc 600

agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat 660

gctgccactt attactgcca gcagtggagt agttacccgc tcacgttcgg tgctgggacc 720

aagctggagc tgaaacgtgc ggccgca 747

<210> 62

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1 CAR1蛋白

<400> 62

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln

20 25 30

Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys

35 40 45

Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys

50 55 60

Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly

65 70 75 80

Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe

85 90 95

Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu

100 105 110

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr

115 120 125

Asp Glu Glu Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

130 135 140

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala

165 170 175

Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val

180 185 190

Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met

225 230 235 240

Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr

245 250 255

Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala

260 265 270

Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

275 280 285

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

290 295 300

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

305 310 315 320

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

325 330 335

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

340 345 350

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

355 360 365

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg

420 425 430

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

435 440 445

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

450 455 460

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

465 470 475 480

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 63

<211> 1502

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1 CAR1核苷酸

<400> 63

atgggcgtgc tgctgaccca gaggaccctg ctgagcctgg tgctggccct gctgtttcca 60

tctatggcat cgatggccga ggttcagctt cagcagtctg gagctgagct gatgaagcct 120

ggggcctcag tgaagatatc ctgcaaggct actggctaca cattcagtag ctactggata 180

gagtgggtaa agcagaggcc tggacatggc cttgagtgga ttggagagat tttacctgga 240

agtggtagta ctaattacaa tgagaagttc aagggcaagg ccacattcac tgcagataca 300

tcctccaaca cagcctacat gcaactcagc agcctgacat ctgaggactc tgccgtctat 360

tactgtgcaa gaggggggga ttacgacgaa gaatactatg tcatggacta ctggggtcaa 420

ggaacctcag tcactgtctc ctcaggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 480

ggcggatcgc aaattgttct cacccagtct ccagcaatca tgtctgcatc tccaggggag 540

aaggtcacca tgacctgcag tgccagctca agtgtaagtt acatgtactg gtaccagcag 600

aagccaggat cctcccccag actcctgatt tatgacacat ccaacctggc ttctggagtc 660

cctgttcgct tcagtggcag tgggtctggg acctcttact ctctcacaat cagccgaatg 720

gaggctgaag atgctgccac ttattactgc cagcagtgga gtagttaccc gctcacgttc 780

ggtgctggga ccaagctgga gctgaaacgt gcggccgcaa ttgaagttat gtatcctcct 840

ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 900

tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 960

ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 1020

agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080

cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 1200

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1260

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aataaaagct taacacgagc 1500

ca 1502

<210> 64

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3重链变体1的CDR1

<400> 64

Thr Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体1的CDR2

<400> 65

Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser

1 5 10

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体1的CDR3

<400> 66

Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp

1 5 10

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的轻链变体1的CDR1

<400> 67

Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr

1 5

<210> 68

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的轻链变体1的CDR2

<400> 68

Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的轻链变体1的CDR3

<400> 69

His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg

1 5

<210> 70

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体1的CDR1

<400> 70

accagctact ggatgcac 18

<210> 71

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体1的CDR2

<400> 71

tggattggcg ctatttatcc tggaaatagt gatactagc 39

<210> 72

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体1的CDR3

<400> 72

acacattact acggtagtga ctatgctatg gac 33

<210> 73

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的轻链变体1的CDR1

<400> 73

agttccagtt acttgcactg gtac 24

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的轻链变体1的CDR2

<400> 74

ctctggattt atagcacatc caacctggct 30

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的轻链变体1的CDR3

<400> 75

ccaccagtat catcgttccc cacgg 25

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体2的CDR1

<400> 76

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 77

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体2的CDR2

<400> 77

Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr

1 5

<210> 78

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体2的CDR3

<400> 78

Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的轻链变体2的CDR1

<400> 79

Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 80

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BB共刺激域的核苷酸序列

<400> 80

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的轻链变体2的CDR3

<400> 81

His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr

1 5

<210> 82

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体2的CDR1

<400> 82

ggctacacct ttaccagcta ctgg 24

<210> 83

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体2的CDR2

<400> 83

atttatcctg gaaatagtga tact 24

<210> 84

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的重链变体2的CDR3

<400> 84

acacattact acggtagtga ctatgctatg gactac 36

<210> 85

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的轻链变体2的CDR1

<400> 85

tcaagtgtaa gttccagtta c 21

<210> 86

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40共刺激域

<400> 86

Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr

20 25 30

Leu Ala Lys Ile

35

<210> 87

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3的轻链变体2的CDR3

<400> 87

caccagtatc atcgttcccc acggacg 27

<210> 88

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3重链变体1

<400> 88

Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe

85 90 95

Tyr Cys Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Ile Ser Ser Gly

115 120

<210> 89

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3轻链变体1

<400> 89

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala

100 105 110

<210> 90

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3重链变体2

<400> 90

Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe

85 90 95

Tyr Cys Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

115

<210> 91

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3轻链变体2

<400> 91

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

100 105 110

<210> 92

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3重链变体1核苷酸序列

<400> 92

atggccgagg tccagctgca gcagtctggg actgtgctgg caaggcctgg ggcttcagtg 60

aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttaccagct actggatgca ctgggtaaaa 120

cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt ggcgctattt atcctggaaa tagtgatact 180

agctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc aaactgactg cagtcacatc caccagcact 240

gcctacatgg agctcagcag cctgacaaat gaggactctg cggtctttta ctgtacacat 300

tactacggta gtgactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360

tca 363

<210> 93

<211> 335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3轻链变体1核苷酸序列

<400> 93

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacg gacgttcggt 300

ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgc 335

<210> 94

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3重链变体2核苷酸序列

<400> 94

atggccgagg tccagctgca gcagtctggg actgtgctgg caaggcctgg ggcttcagtg 60

aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttaccagct actggatgca ctgggtaaaa 120

cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt ggcgctattt atcctggaaa tagtgatact 180

agctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc aaactgactg cagtcacatc caccagcact 240

gcctacatgg agctcagcag cctgacaaat gaggactctg cggtctttta ctgtacacat 300

tactacggta gtgactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtc 357

<210> 95

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3轻链变体2核苷酸序列

<400> 95

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacg gacgttcggt 300

ggaggcacca agctggaaat caaacgt 327

<210> 96

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3 scFV

<400> 96

Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe

85 90 95

Tyr Cys Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr

145 150 155 160

Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala

180 185 190

Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

195 200 205

Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

210 215 220

Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

245

<210> 97

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3 scFV核苷酸序列

<400> 97

atggccgagg tccagctgca gcagtctggg actgtgctgg caaggcctgg ggcttcagtg 60

aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttaccagct actggatgca ctgggtaaaa 120

cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt ggcgctattt atcctggaaa tagtgatact 180

agctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc aaactgactg cagtcacatc caccagcact 240

gcctacatgg agctcagcag cctgacaaat gaggactctg cggtctttta ctgtacacat 300

tactacggta gtgactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360

tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgca aattgttctc 420

acccagtctc cagcaatcat gtctgcatct ctaggggaac gggtcaccat gacctgcact 480

gccagctcaa gtgtaagttc cagttacttg cactggtacc agcagaagcc aggatcctcc 540

cccaaactct ggatttatag cacatccaac ctggcttctg gagtcccagc tcgcttcagt 600

ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc acaatcagca gcatggaggc tgaagatgct 660

gccacttatt actgccacca gtatcatcgt tccccacgga cgttcggtgg aggcaccaag 720

ctggaaatca aacgtgcggc cgca 744

<210> 98

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3 CAR3

<400> 98

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln

20 25 30

Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys

35 40 45

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys

50 55 60

Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly

65 70 75 80

Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu

85 90 95

Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu

100 105 110

Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys Thr His Tyr Tyr Gly Ser

115 120 125

Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

165 170 175

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

180 185 190

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

195 200 205

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

225 230 235 240

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro

245 250 255

Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

260 265 270

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

275 280 285

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

290 295 300

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

305 310 315 320

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

325 330 335

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

340 345 350

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

355 360 365

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser

370 375 380

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

385 390 395 400

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

405 410 415

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 99

<211> 1499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3 CAR3核苷酸序列

<400> 99

atgggcgtgc tgctgaccca gaggaccctg ctgagcctgg tgctggccct gctgtttcca 60

tctatggcat cgatggccga ggtccagctg cagcagtctg ggactgtgct ggcaaggcct 120

ggggcttcag tgaagatgtc ctgcaaggct tctggctaca cctttaccag ctactggatg 180

cactgggtaa aacagaggcc tggacagggt ctggaatgga ttggcgctat ttatcctgga 240

aatagtgata ctagctacaa ccagaagttc aagggcaagg ccaaactgac tgcagtcaca 300

tccaccagca ctgcctacat ggagctcagc agcctgacaa atgaggactc tgcggtcttt 360

tactgtacac attactacgg tagtgactat gctatggact actggggtca aggaacctca 420

gtcactgtct cctcaggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 480

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 540

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 600

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 660

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 720

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacg gacgttcggt 780

ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaattg aagttatgta tcctcctcct 840

tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt 900

ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga 960

gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 1020

aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 1080

acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 1140

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1200

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260

gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1320

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1380

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1440

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaat aaaagcttaa cacgagcca 1499

<210> 100

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4的CDR3重链变体1

<400> 100

Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Leu Met Asp

1 5 10

<210> 101

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4的CDR3重链变体1

<400> 101

gcgagagggg gggattacga cgaagaatac tatctcatgg ac 42

<210> 102

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4的重链变体2的CDR3

<400> 102

Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Leu Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 103

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4的重链变体2的CDR3

<400> 103

gcgagagggg gggattacga cgaagaatac tatctcatta c 41

<210> 104

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4变体1重链

<400> 104

Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Asn Arg Arg Pro Gly His Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Leu Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 105

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4变体1轻链

<400> 105

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala

100 105

<210> 106

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4变体2重链

<400> 106

Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Asn Arg Arg Pro Gly His Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Leu Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

115 120

<210> 107

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4变体2轻链

<400> 107

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

100 105 110

<210> 108

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4变体1重链

<400> 108

atggcccagg ttcagctgca gcagtctgga gctgagctga tgaagcctgg ggcctcagtg 60

aagatatcct gcaaggctac tggctacaca ttcagtagct actggataga gtgggtaaac 120

cggaggcctg gacatggcct tgagtggatt ggagagattt tacctggaag tggtagtact 180

aattacaatg agaagttcaa gggcaaggcc acattcactg cagatacatc ctccaataca 240

gcctacatgc aactcagcag cctcacatct gaggactctg ccgtctatta ctgtgcgaga 300

gggggggatt acgacgaaga atactatctc atggactact ggggtcaagg caccactctc 360

acagtctcct ca 372

<210> 109

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4变体1轻链核苷酸序列

<400> 109

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagttacc cgctcacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg aaatcaaacg tgcggccgc 329

<210> 110

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4变体2重链核苷酸序列

<400> 110

atggcccagg ttcagctgca gcagtctgga gctgagctga tgaagcctgg ggcctcagtg 60

aagatatcct gcaaggctac tggctacaca ttcagtagct actggataga gtgggtaaac 120

cggaggcctg gacatggcct tgagtggatt ggagagattt tacctggaag tggtagtact 180

aattacaatg agaagttcaa gggcaaggcc acattcactg cagatacatc ctccaataca 240

gcctacatgc aactcagcag cctcacatct gaggactctg tcgtctatta ctgtgcgaga 300

gggggggatt acgacgaaga atactatctc atggactact ggggtcaagg caccactctc 360

acagtc 366

<210> 111

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4变体2轻链核苷酸序列

<400> 111

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagttacc cgctcacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg aaatcaaacg t 321

<210> 112

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4 scFv

<400> 112

Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Asn Arg Arg Pro Gly His Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Val Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Leu Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

145 150 155 160

Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu

180 185 190

Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

195 200 205

Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

210 215 220

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

245

<210> 113

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4 scFv核苷酸序列

<400> 113

atggcccagg ttcagctgca gcagtctgga gctgagctga tgaagcctgg ggcctcagtg 60

aagatatcct gcaaggctac tggctacaca ttcagtagct actggataga gtgggtaaac 120

cggaggcctg gacatggcct tgagtggatt ggagagattt tacctggaag tggtagtact 180

aattacaatg agaagttcaa gggcaaggcc acattcactg cagatacatc ctccaataca 240

gcctacatgc aactcagcag cctcacatct gaggactctg tcgtctatta ctgtgcgaga 300

gggggggatt acgacgaaga atactatctc atggactact ggggtcaagg caccactctc 360

acagtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgcaa 420

attgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 480

acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgtactggt accagcagaa gccaggatcc 540

tcccccagac tcctgattta tgacacatcc aacctggctt ctggagtccc tgttcgcttc 600

agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat 660

gctgccactt attactgcca gcagtggagt agttacccgc tcacgttcgg tgctgggacc 720

aagctggaaa tcaaacgtgc ggccgca 747

<210> 114

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4 CAR4

<400> 114

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln

20 25 30

Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys

35 40 45

Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Asn

50 55 60

Arg Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly

65 70 75 80

Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe

85 90 95

Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu

100 105 110

Thr Ser Glu Asp Ser Val Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr

115 120 125

Asp Glu Glu Tyr Tyr Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

130 135 140

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala

165 170 175

Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val

180 185 190

Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met

225 230 235 240

Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr

245 250 255

Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala

260 265 270

Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

275 280 285

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

290 295 300

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

305 310 315 320

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

325 330 335

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

340 345 350

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

355 360 365

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg

420 425 430

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

435 440 445

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

450 455 460

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

465 470 475 480

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 115

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4 CAR4核苷酸序列

<400> 115

atggcccagg ttcagctgca gcagtctgga gctgagctga tgaagcctgg ggcctcagtg 60

aagatatcct gcaaggctac tggctacaca ttcagtagct actggataga gtgggtaaac 120

cggaggcctg gacatggcct tgagtggatt ggagagattt tacctggaag tggtagtact 180

aattacaatg agaagttcaa gggcaaggcc acattcactg cagatacatc ctccaataca 240

gcctacatgc aactcagcag cctcacatct gaggactctg tcgtctatta ctgtgcgaga 300

gggggggatt acgacgaaga atactatctc atggactact ggggtcaagg caccactctc 360

acagtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgcaa 420

attgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 480

acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgtactggt accagcagaa gccaggatcc 540

tcccccagac tcctgattta tgacacatcc aacctggctt ctggagtccc tgttcgcttc 600

agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat 660

gctgccactt attactgcca gcagtggagt agttacccgc tcacgttcgg tgctgggacc 720

aagctggaaa tcaaacgtgc ggccgcaatt gaagttatgt atcctcctcc ttacctagac 780

aatgagaaga gcaatggaac cattatccat gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc 840

ctatttcccg gaccttctaa gcccttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 900

tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 960

aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 1020

cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc 1080

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1140

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1200

atggggggaa agccgcagag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1260

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1320

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1380

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa taa 1413

<210> 116

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5重链变体1的CDR3

<400> 116

Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Ala Met Asp

1 5 10

<210> 117

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5的CDR3重链变体1

<400> 117

gcaagagggg gggattacga cgaagaatac tatgctatgg ac 42

<210> 118

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5的重链变体2的CDR3

<400> 118

Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 119

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8alpha跨膜域的核苷酸序列

<400> 119

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 120

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5的重链变体2的CDR3

<400> 120

gcaagagggg gggattacga cgaagaatac tatgctatgg actac 45

<210> 121

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5重链

<400> 121

Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Leu

115 120

<210> 122

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5轻链

<400> 122

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 123

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5重链的核苷酸序列

<400> 123

atggccgagg ttcagcttca gcagtctgga gctgagctga tgaagcctgg ggcctcagtg 60

aagatatcct gcaaggctac tggctacaca ttcagtagct actggataga gtgggtaaat 120

cagaggcctg gacatggcct tgagtggatt ggagagattt tacctggaag tggtagtact 180

aattacaatg agaagttcaa gggcaaggcc acattcactg cagatacatc ctccaacaca 240

gcctacatgc aactcagcag cctgacatct gaggactctg ccgtctatta ctgtgcaaga 300

gggggggatt acgacgaaga atactatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

accctc 366

<210> 124

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5轻链的核苷酸序列

<400> 124

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagttacc cgctcacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg agctgaaacg t 321

<210> 125

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5 scFv

<400> 125

Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Leu Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met

145 150 155 160

Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu

180 185 190

Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser

195 200 205

Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

210 215 220

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala

245

<210> 126

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5 scFv的核苷酸序列

<400> 126

atggccgagg ttcagcttca gcagtctgga gctgagctga tgaagcctgg ggcctcagtg 60

aagatatcct gcaaggctac tggctacaca ttcagtagct actggataga gtgggtaaat 120

cagaggcctg gacatggcct tgagtggatt ggagagattt tacctggaag tggtagtact 180

aattacaatg agaagttcaa gggcaaggcc acattcactg cagatacatc ctccaacaca 240

gcctacatgc aactcagcag cctgacatct gaggactctg ccgtctatta ctgtgcaaga 300

gggggggatt acgacgaaga atactatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

accctctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgcaa 420

attgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 480

acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgtactggt accagcagaa gccaggatcc 540

tcccccagac tcctgattta tgacacatcc aacctggctt ctggagtccc tgttcgcttc 600

agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat 660

gctgccactt attactgcca gcagtggagt agttacccgc tcacgttcgg tgctgggacc 720

aagctggagc tgaaacgtgc ggccgca 747

<210> 127

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR5 CRT5 (制瘤素前导物, scFv CRT5, CD28-CD3部分)

<400> 127

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln

20 25 30

Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys

35 40 45

Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Asn

50 55 60

Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly

65 70 75 80

Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe

85 90 95

Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu

100 105 110

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr

115 120 125

Asp Glu Glu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

130 135 140

Thr Leu Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala

165 170 175

Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val

180 185 190

Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met

225 230 235 240

Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr

245 250 255

Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala

260 265 270

Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

275 280 285

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

290 295 300

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

305 310 315 320

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

325 330 335

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

340 345 350

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

355 360 365

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg

420 425 430

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

435 440 445

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

450 455 460

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

465 470 475 480

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 128

<211> 1502

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAr5 CRT5的核苷酸序列

<400> 128

atgggcgtgc tgctgaccca gaggaccctg ctgagcctgg tgctggccct gctgtttcca 60

tctatggcat cgatggccga ggttcagctt cagcagtctg gagctgagct gatgaagcct 120

ggggcctcag tgaagatatc ctgcaaggct actggctaca cattcagtag ctactggata 180

gagtgggtaa atcagaggcc tggacatggc cttgagtgga ttggagagat tttacctgga 240

agtggtagta ctaattacaa tgagaagttc aagggcaagg ccacattcac tgcagataca 300

tcctccaaca cagcctacat gcaactcagc agcctgacat ctgaggactc tgccgtctat 360

tactgtgcaa gaggggggga ttacgacgaa gaatactatg ctatggacta ctggggtcaa 420

ggaacctcag tcaccctctc ctcaggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 480

ggcggatcgc aaattgttct cacccagtct ccagcaatca tgtctgcatc tccaggggag 540

aaggtcacca tgacctgcag tgccagctca agtgtaagtt acatgtactg gtaccagcag 600

aagccaggat cctcccccag actcctgatt tatgacacat ccaacctggc ttctggagtc 660

cctgttcgct tcagtggcag tgggtctggg acctcttact ctctcacaat cagccgaatg 720

gaggctgaag atgctgccac ttattactgc cagcagtgga gtagttaccc gctcacgttc 780

ggtgctggga ccaagctgga gctgaaacgt gcggccgcaa ttgaagttat gtatcctcct 840

ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 900

tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 960

ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 1020

agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080

cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 1200

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1260

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aataaaagct taacacgagc 1500

ca 1502

<210> 129

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2的轻链的CDR1

<400> 129

Ser Tyr Met His Trp Phe

1 5

<210> 130

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2的轻链的CDR3

<400> 130

Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu

1 5

<210> 131

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2的轻链的CDR1

<400> 131

agttacatgc actggttc 18

<210> 132

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2的轻链的CDR3

<400> 132

cagcaaagga gtagttaccc cctc 24

<210> 133

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2轻链

<400> 133

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Pro Gly Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala

100 105

<210> 134

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2轻链的核苷酸序列

<400> 134

gaaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120

acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc ccctcacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg agctgaaacg tgcggccgc 329

<210> 135

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 制瘤素M前导物

<400> 135

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser

20

<210> 136

<211> 836

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有截短的CD34的CAR5 CRT5

<400> 136

Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro

20 25 30

Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu

35 40 45

Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser

50 55 60

Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys

65 70 75 80

Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser

85 90 95

Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro

100 105 110

Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro

115 120 125

Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser

130 135 140

Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys

145 150 155 160

Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly

165 170 175

Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys

180 185 190

Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala

195 200 205

Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser

210 215 220

Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu

225 230 235 240

Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys

245 250 255

Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln

260 265 270

Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu

275 280 285

Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser

290 295 300

Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val

305 310 315 320

Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu

325 330 335

Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr

340 345 350

Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met

355 360 365

Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly

370 375 380

Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser

385 390 395 400

Tyr Trp Ile Glu Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp

405 410 415

Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys

420 425 430

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala

435 440 445

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr

450 455 460

Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

465 470 475 480

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Leu Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

485 490 495

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln

500 505 510

Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr

515 520 525

Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys

530 535 540

Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala

545 550 555 560

Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

565 570 575

Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

580 585 590

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

595 600 605

Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro

610 615 620

Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly

625 630 635 640

Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe

645 650 655

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu

660 665 670

Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg

675 680 685

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

690 695 700

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

705 710 715 720

Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

725 730 735

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

740 745 750

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

755 760 765

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

770 775 780

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

785 790 795 800

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

805 810 815

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

820 825 830

Leu Pro Pro Arg

835

<210> 137

<211> 2514

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有截短的CD34的CAR5-CRT5的核苷酸序列

<400> 137

atgcctcgcg gctggacagc cctgtgcctg ctgtctctgc tgccatccgg cttcatgagc 60

ctggataata acggcacagc caccccagag ctgcctacac agggcacctt cagcaatgtg 120

tccacaaacg tgagctatca ggagaccaca accccttcta ccctgggatc cacaagcctg 180

caccccgtgt ctcagcacgg caacgaagcc accaccaaca tcaccgagac cacagtgaag 240

tttacctcca cctctgtgat tacctctgtg tacggaaata caaactccag cgtgcagtct 300

cagacatctg tgatctccac agtgtttaca acacctgcca atgtgtccac cccagagaca 360

accctgaagc ccagcctgtc tcctggaaat gtgtccgatc tgtctaccac ctccaccagc 420

ctggccacct ctcccaccaa gccctatacc tcctcttctc ccatcctgag cgatatcaaa 480

gccgagatca aatgcagcgg gattcgggaa gtgaaactga cacagggcat ctgcctggaa 540

cagaataaga catccagctg cgccgagttt aagaaagata gaggagaggg actggccagg 600

gtgctgtgtg gcgaagagca ggccgacgcc gatgccggcg cccaggtgtg ttccctgctg 660

ctggcccagt ctgaggtgcg cccccagtgc ctgctgctgg tgctggccaa tcggacagaa 720

attagcagca agctgcagct gatgaaaaaa caccagagcg atctgaaaaa gctgggcatc 780

ctggacttta ccgagcagga cgtggcctct caccagagct acagccagaa aacactgatc 840

gccctggtga ccagcggagc cctgctggcc gtgctgggca tcaccggata tttcctgatg 900

aataggcgca gctggagccc caccggcgag cggctggagc tggagcctgt cgaccgagtg 960

aagcagaccc tgaactttga tctgctgaag ctggccggcg acgtggagtc caaccccggg 1020

ccagggaata tgggcgtgct gctgacccag aggaccctgc tgagcctggt gctggccctg 1080

ctgtttccat ctatggcatc gatggccgag gttcagcttc agcagtctgg agctgagctg 1140

atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc tgcaaggcta ctggctacac attcagtagc 1200

tactggatag agtgggtaaa tcagaggcct ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt 1260

ttacctggaa gtggtagtac taattacaat gagaagttca agggcaaggc cacattcact 1320

gcagatacat cctccaacac agcctacatg caactcagca gcctgacatc tgaggactct 1380

gccgtctatt actgtgcaag agggggggat tacgacgaag aatactatgc tatggactac 1440

tggggtcaag gaacctcagt caccctctcc tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc 1500

tctggcggtg gcggatcgca aattgttctc acccagtctc cagcaatcat gtctgcatct 1560

ccaggggaga aggtcaccat gacctgcagt gccagctcaa gtgtaagtta catgtactgg 1620

taccagcaga agccaggatc ctcccccaga ctcctgattt atgacacatc caacctggct 1680

tctggagtcc ctgttcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 1740

agccgaatgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag tagttacccg 1800

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgtg cggccgcaat tgaagttatg 1860

tatcctcctc cttacctaga caatgagaag agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg 1920

aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg 1980

gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 2040

tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc 2100

cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 2160

tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 2220

aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 2280

agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgcaga gaaggaagaa ccctcaggaa 2340

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 2400

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 2460

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta ataa 2514

<210> 138

<211> 836

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有截短的CD34的CAR1 CRT1

<400> 138

Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro

20 25 30

Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu

35 40 45

Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser

50 55 60

Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys

65 70 75 80

Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser

85 90 95

Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro

100 105 110

Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro

115 120 125

Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser

130 135 140

Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys

145 150 155 160

Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly

165 170 175

Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys

180 185 190

Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala

195 200 205

Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser

210 215 220

Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu

225 230 235 240

Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys

245 250 255

Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln

260 265 270

Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu

275 280 285

Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser

290 295 300

Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val

305 310 315 320

Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu

325 330 335

Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr

340 345 350

Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met

355 360 365

Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly

370 375 380

Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser

385 390 395 400

Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp

405 410 415

Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys

420 425 430

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala

435 440 445

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr

450 455 460

Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Val Met Asp Tyr

465 470 475 480

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

485 490 495

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln

500 505 510

Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr

515 520 525

Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys

530 535 540

Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala

545 550 555 560

Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

565 570 575

Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

580 585 590

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

595 600 605

Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro

610 615 620

Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly

625 630 635 640

Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe

645 650 655

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu

660 665 670

Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg

675 680 685

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

690 695 700

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

705 710 715 720

Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

725 730 735

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

740 745 750

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

755 760 765

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

770 775 780

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

785 790 795 800

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

805 810 815

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

820 825 830

Leu Pro Pro Arg

835

<210> 139

<211> 2515

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有截短的CD34的CAR1 CRT1的核苷酸序列

<400> 139

atgcctcgcg gctggacagc cctgtgcctg ctgtctctgc tgccatccgg cttcatgagc 60

ctggataata acggcacagc caccccagag ctgcctacac agggcacctt cagcaatgtg 120

tccacaaacg tgagctatca ggagaccaca accccttcta ccctgggatc cacaagcctg 180

caccccgtgt ctcagcacgg caacgaagcc accaccaaca tcaccgagac cacagtgaag 240

tttacctcca cctctgtgat tacctctgtg tacggaaata caaactccag cgtgcagtct 300

cagacatctg tgatctccac agtgtttaca acacctgcca atgtgtccac cccagagaca 360

accctgaagc ccagcctgtc tcctggaaat gtgtccgatc tgtctaccac ctccaccagc 420

ctggccacct ctcccaccaa gccctatacc tcctcttctc ccatcctgag cgatatcaaa 480

gccgagatca aatgcagcgg gattcgggaa gtgaaactga cacagggcat ctgcctggaa 540

cagaataaga catccagctg cgccgagttt aagaaagata gaggagaggg actggccagg 600

gtgctgtgtg gcgaagagca ggccgacgcc gatgccggcg cccaggtgtg ttccctgctg 660

ctggcccagt ctgaggtgcg cccccagtgc ctgctgctgg tgctggccaa tcggacagaa 720

attagcagca agctgcagct gatgaaaaaa caccagagcg atctgaaaaa gctgggcatc 780

ctggacttta ccgagcagga cgtggcctct caccagagct acagccagaa aacactgatc 840

gccctggtga ccagcggagc cctgctggcc gtgctgggca tcaccggata tttcctgatg 900

aataggcgca gctggagccc caccggcgag cggctggagc tggagcctgt cgaccgagtg 960

aagcagaccc tgaactttga tctgctgaag ctggccggcg acgtggagtc caaccccggg 1020

ccagggaata tgggcgtgct gctgacccag aggaccctgc tgagcctggt gctggccctg 1080

ctgtttccat ctatggcatc gatggccgag gttcagcttc agcagtctgg agctgagctg 1140

atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc tgcaaggcta ctggctacac attcagtagc 1200

tactggatag agtgggtaaa gcagaggcct ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt 1260

ttacctggaa gtggtagtac taattacaat gagaagttca agggcaaggc cacattcact 1320

gcagatacat cctccaacac agcctacatg caactcagca gcctgacatc tgaggactct 1380

gccgtctatt actgtgcaag agggggggat tacgacgaag aatactatgt catggactac 1440

tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc 1500

tctggcggtg gcggatcgca aattgttctc acccagtctc cagcaatcat gtctgcatct 1560

ccaggggaga aggtcaccat gacctgcagt gccagctcaa gtgtaagtta catgtactgg 1620

taccagcaga agccaggatc ctcccccaga ctcctgattt atgacacatc caacctggct 1680

tctggagtcc ctgttcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 1740

agccgaatgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag tagttacccg 1800

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgtg cggccgcaaa ttgaagttat 1860

gtatcctcct ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg 1920

gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt 1980

ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt 2040

ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg 2100

ccgccccggg cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc 2160

ctatcgctcc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca 2220

gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa 2280

gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga 2340

aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat 2400

gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc 2460

caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aataa 2515

<210> 140

<211> 835

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有截短的CD34的CAR3 CRT3

<400> 140

Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro

20 25 30

Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu

35 40 45

Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser

50 55 60

Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys

65 70 75 80

Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser

85 90 95

Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro

100 105 110

Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro

115 120 125

Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser

130 135 140

Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys

145 150 155 160

Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly

165 170 175

Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys

180 185 190

Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala

195 200 205

Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser

210 215 220

Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu

225 230 235 240

Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys

245 250 255

Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln

260 265 270

Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu

275 280 285

Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser

290 295 300

Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val

305 310 315 320

Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu

325 330 335

Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr

340 345 350

Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met

355 360 365

Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly

370 375 380

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

385 390 395 400

Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

405 410 415

Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys

420 425 430

Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala

435 440 445

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr

450 455 460

Cys Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

465 470 475 480

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

485 490 495

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala

500 505 510

Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala

515 520 525

Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

530 535 540

Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

545 550 555 560

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

565 570 575

Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

580 585 590

His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

595 600 605

Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

610 615 620

Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys

625 630 635 640

His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp

645 650 655

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

660 665 670

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu

675 680 685

Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr

690 695 700

Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr

705 710 715 720

Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

725 730 735

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

740 745 750

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

755 760 765

Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

770 775 780

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

785 790 795 800

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

805 810 815

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

820 825 830

Pro Pro Arg

835

<210> 141

<211> 2512

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有截短的CD34的CAR3 CRT3的核苷酸序列

<400> 141

atgcctcgcg gctggacagc cctgtgcctg ctgtctctgc tgccatccgg cttcatgagc 60

ctggataata acggcacagc caccccagag ctgcctacac agggcacctt cagcaatgtg 120

tccacaaacg tgagctatca ggagaccaca accccttcta ccctgggatc cacaagcctg 180

caccccgtgt ctcagcacgg caacgaagcc accaccaaca tcaccgagac cacagtgaag 240

tttacctcca cctctgtgat tacctctgtg tacggaaata caaactccag cgtgcagtct 300

cagacatctg tgatctccac agtgtttaca acacctgcca atgtgtccac cccagagaca 360

accctgaagc ccagcctgtc tcctggaaat gtgtccgatc tgtctaccac ctccaccagc 420

ctggccacct ctcccaccaa gccctatacc tcctcttctc ccatcctgag cgatatcaaa 480

gccgagatca aatgcagcgg gattcgggaa gtgaaactga cacagggcat ctgcctggaa 540

cagaataaga catccagctg cgccgagttt aagaaagata gaggagaggg actggccagg 600

gtgctgtgtg gcgaagagca ggccgacgcc gatgccggcg cccaggtgtg ttccctgctg 660

ctggcccagt ctgaggtgcg cccccagtgc ctgctgctgg tgctggccaa tcggacagaa 720

attagcagca agctgcagct gatgaaaaaa caccagagcg atctgaaaaa gctgggcatc 780

ctggacttta ccgagcagga cgtggcctct caccagagct acagccagaa aacactgatc 840

gccctggtga ccagcggagc cctgctggcc gtgctgggca tcaccggata tttcctgatg 900

aataggcgca gctggagccc caccggcgag cggctggagc tggagcctgt cgaccgagtg 960

aagcagaccc tgaactttga tctgctgaag ctggccggcg acgtggagtc caaccccggg 1020

ccagggaata tgggcgtgct gctgacccag aggaccctgc tgagcctggt gctggccctg 1080

ctgtttccat ctatggcatc gatggccgag gtccagctgc agcagtctgg gactgtgctg 1140

gcaaggcctg gggcttcagt gaagatgtcc tgcaaggctt ctggctacac ctttaccagc 1200

tactggatgc actgggtaaa acagaggcct ggacagggtc tggaatggat tggcgctatt 1260

tatcctggaa atagtgatac tagctacaac cagaagttca agggcaaggc caaactgact 1320

gcagtcacat ccaccagcac tgcctacatg gagctcagca gcctgacaaa tgaggactct 1380

gcggtctttt actgtacaca ttactacggt agtgactatg ctatggacta ctggggtcaa 1440

ggaacctcag tcactgtctc ctcaggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 1500

ggcggatcgc aaattgttct cacccagtct ccagcaatca tgtctgcatc tctaggggaa 1560

cgggtcacca tgacctgcac tgccagctca agtgtaagtt ccagttactt gcactggtac 1620

cagcagaagc caggatcctc ccccaaactc tggatttata gcacatccaa cctggcttct 1680

ggagtcccag ctcgcttcag tggcagtggg tctgggacct cttactctct cacaatcagc 1740

agcatggagg ctgaagatgc tgccacttat tactgccacc agtatcatcg ttccccacgg 1800

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtgcgg ccgcaaattg aagttatgta 1860

tcctcctcct tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa 1920

acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt 1980

ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg 2040

ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg 2100

ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta 2160

tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa 2220

ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag 2280

acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga aggaagaacc ctcaggaagg 2340

cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa 2400

aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac 2460

caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaat aa 2512

<210> 142

<211> 836

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有截短的CD34的CAR4 CRT4

<400> 142

Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro

20 25 30

Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu

35 40 45

Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser

50 55 60

Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys

65 70 75 80

Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser

85 90 95

Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro

100 105 110

Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro

115 120 125

Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser

130 135 140

Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys

145 150 155 160

Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly

165 170 175

Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys

180 185 190

Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala

195 200 205

Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser

210 215 220

Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu

225 230 235 240

Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys

245 250 255

Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln

260 265 270

Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu

275 280 285

Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser

290 295 300

Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val

305 310 315 320

Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu

325 330 335

Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr

340 345 350

Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met

355 360 365

Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly

370 375 380

Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser

385 390 395 400

Tyr Trp Ile Glu Trp Val Asn Arg Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp

405 410 415

Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys

420 425 430

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala

435 440 445

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Val Val Tyr Tyr

450 455 460

Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Leu Met Asp Tyr

465 470 475 480

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

485 490 495

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln

500 505 510

Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr

515 520 525

Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys

530 535 540

Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala

545 550 555 560

Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

565 570 575

Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

580 585 590

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

595 600 605

Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro

610 615 620

Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly

625 630 635 640

Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe

645 650 655

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu

660 665 670

Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg

675 680 685

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

690 695 700

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

705 710 715 720

Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

725 730 735

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

740 745 750

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

755 760 765

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

770 775 780

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

785 790 795 800

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

805 810 815

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

820 825 830

Leu Pro Pro Arg

835

<210> 143

<211> 2515

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有截短的CD34的CAR4 CRT4的核苷酸序列

<400> 143

atgcctcgcg gctggacagc cctgtgcctg ctgtctctgc tgccatccgg cttcatgagc 60

ctggataata acggcacagc caccccagag ctgcctacac agggcacctt cagcaatgtg 120

tccacaaacg tgagctatca ggagaccaca accccttcta ccctgggatc cacaagcctg 180

caccccgtgt ctcagcacgg caacgaagcc accaccaaca tcaccgagac cacagtgaag 240

tttacctcca cctctgtgat tacctctgtg tacggaaata caaactccag cgtgcagtct 300

cagacatctg tgatctccac agtgtttaca acacctgcca atgtgtccac cccagagaca 360

accctgaagc ccagcctgtc tcctggaaat gtgtccgatc tgtctaccac ctccaccagc 420

ctggccacct ctcccaccaa gccctatacc tcctcttctc ccatcctgag cgatatcaaa 480

gccgagatca aatgcagcgg gattcgggaa gtgaaactga cacagggcat ctgcctggaa 540

cagaataaga catccagctg cgccgagttt aagaaagata gaggagaggg actggccagg 600

gtgctgtgtg gcgaagagca ggccgacgcc gatgccggcg cccaggtgtg ttccctgctg 660

ctggcccagt ctgaggtgcg cccccagtgc ctgctgctgg tgctggccaa tcggacagaa 720

attagcagca agctgcagct gatgaaaaaa caccagagcg atctgaaaaa gctgggcatc 780

ctggacttta ccgagcagga cgtggcctct caccagagct acagccagaa aacactgatc 840

gccctggtga ccagcggagc cctgctggcc gtgctgggca tcaccggata tttcctgatg 900

aataggcgca gctggagccc caccggcgag cggctggagc tggagcctgt cgaccgagtg 960

aagcagaccc tgaactttga tctgctgaag ctggccggcg acgtggagtc caaccccggg 1020

ccagggaata tgggcgtgct gctgacccag aggaccctgc tgagcctggt gctggccctg 1080

ctgtttccat ctatggcatc gatggcccag gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg 1140

atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc tgcaaggcta ctggctacac attcagtagc 1200

tactggatag agtgggtaaa ccggaggcct ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt 1260

ttacctggaa gtggtagtac taattacaat gagaagttca agggcaaggc cacattcact 1320

gcagatacat cctccaatac agcctacatg caactcagca gcctcacatc tgaggactct 1380

gtcgtctatt actgtgcgag agggggggat tacgacgaag aatactatct catggactac 1440

tggggtcaag gcaccactct cacagtctcc tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc 1500

tctggcggtg gcggatcgca aattgttctc acccagtctc cagcaatcat gtctgcatct 1560

ccaggggaga aggtcaccat gacctgcagt gccagctcaa gtgtaagtta catgtactgg 1620

taccagcaga agccaggatc ctcccccaga ctcctgattt atgacacatc caacctggct 1680

tctggagtcc ctgttcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 1740

agccgaatgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag tagttacccg 1800

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggaa atcaaacgtg cggccgcaaa ttgaagttat 1860

gtatcctcct ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg 1920

gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt 1980

ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt 2040

ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg 2100

ccgccccggg cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc 2160

ctatcgctcc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca 2220

gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa 2280

gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga 2340

aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat 2400

gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc 2460

caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aataa 2515

<210> 144

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的CD34加上肽2A接头

<400> 144

Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro

20 25 30

Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu

35 40 45

Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser

50 55 60

Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys

65 70 75 80

Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser

85 90 95

Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro

100 105 110

Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro

115 120 125

Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser

130 135 140

Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys

145 150 155 160

Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly

165 170 175

Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys

180 185 190

Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala

195 200 205

Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser

210 215 220

Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu

225 230 235 240

Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys

245 250 255

Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln

260 265 270

Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu

275 280 285

Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser

290 295 300

Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val

305 310 315 320

Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu

325 330 335

Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr

340 345 350

Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser

355 360 365

<210> 145

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的CD34加上肽2A的核苷酸序列

<400> 145

atgcctcgcg gctggacagc cctgtgcctg ctgtctctgc tgccatccgg cttcatgagc 60

ctggataata acggcacagc caccccagag ctgcctacac agggcacctt cagcaatgtg 120

tccacaaacg tgagctatca ggagaccaca accccttcta ccctgggatc cacaagcctg 180

caccccgtgt ctcagcacgg caacgaagcc accaccaaca tcaccgagac cacagtgaag 240

tttacctcca cctctgtgat tacctctgtg tacggaaata caaactccag cgtgcagtct 300

cagacatctg tgatctccac agtgtttaca acacctgcca atgtgtccac cccagagaca 360

accctgaagc ccagcctgtc tcctggaaat gtgtccgatc tgtctaccac ctccaccagc 420

ctggccacct ctcccaccaa gccctatacc tcctcttctc ccatcctgag cgatatcaaa 480

gccgagatca aatgcagcgg gattcgggaa gtgaaactga cacagggcat ctgcctggaa 540

cagaataaga catccagctg cgccgagttt aagaaagata gaggagaggg actggccagg 600

gtgctgtgtg gcgaagagca ggccgacgcc gatgccggcg cccaggtgtg ttccctgctg 660

ctggcccagt ctgaggtgcg cccccagtgc ctgctgctgg tgctggccaa tcggacagaa 720

attagcagca agctgcagct gatgaaaaaa caccagagcg atctgaaaaa gctgggcatc 780

ctggacttta ccgagcagga cgtggcctct caccagagct acagccagaa aacactgatc 840

gccctggtga ccagcggagc cctgctggcc gtgctgggca tcaccggata tttcctgatg 900

aataggcgca gctggagccc caccggcgag cggctggagc tggagcctgt cgaccgagtg 960

aagcagaccc tgaactttga tctgctgaag ctggccggcg acgtggagtc caaccccggg 1020

ccagggaata tgggcgtgct gctgacccag aggaccctgc tgagcctggt gctggccctg 1080

ctgtttccat ctatggcatc g 1101

<210> 146

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 146

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

65 70 75 80

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

85 90 95

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

100 105

<210> 147

<211> 322

<212> DNA

<213> 智人

<400> 147

aattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag aagagcaatg gaaccattat 60

ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt 120

ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc 180

ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa 240

catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg 300

cgacttcgca gcctatcgct cc 322

<210> 148

<211> 113

<212> PRT

<213> 智人

<400> 148

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 149

<211> 345

<212> DNA

<213> 智人

<400> 149

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aataa 345

<210> 150

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4 和5变体1重链CDR1的共有序列

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> X是S或T

<220>

<221> X

<222> (5)..(5)

<223> X是I或M

<220>

<221> X

<222> (6)..(6)

<223> X是E或H

<400> 150

Xaa Ser Tyr Trp Xaa Xaa

1 5

<210> 151

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4和5变体2重链CDR1的共有序列

<220>

<221> X

<222> (5)..(5)

<223> X是S或T

<400> 151

Gly Tyr Thr Phe Xaa Ser Tyr Trp

1 5

<210> 152

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4和5变体1重链CDR2的共有序列

<220>

<221> X

<222> (4)..(4)

<223> X是E或A

<220>

<221> X

<222> (6)..(6)

<223> X是L或Y

<220>

<221> X

<222> (9)..(9)

<223> X是S或N

<220>

<221> X

<222> (10)..(10)

<223> X是G或S

<220>

<221> X

<222> (11)..(11)

<223> X是S或D

<220>

<221> X

<222> (13)..(13)

<223> X是N或S

<400> 152

Trp Ile Gly Xaa Ile Xaa Pro Gly Xaa Xaa Xaa Thr Xaa

1 5 10

<210> 153

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4和5变体2重链CDR2的共有序列

<220>

<221> X

<222> (2)..(2)

<223> X是L或Y

<220>

<221> X

<222> (5)..(5)

<223> X是S或N

<220>

<221> X

<222> (6)..(6)

<223> X是G或S

<220>

<221> X

<222> (7)..(7)

<223> X是S或D

<400> 153

Ile Xaa Pro Gly Xaa Xaa Xaa Thr

1 5

<210> 154

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4和5变体1重链CDR3的共有序列

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> X是A或T

<220>

<221> X

<222> (2)..(2)

<223> X是R或H

<220>

<221> X

<222> (3)..(3)

<223> X是G或无氨基酸

<220>

<221> X

<222> (4)..(4)

<223> X是G或无氨基酸

<220>

<221> X

<222> (5)..(5)

<223> X是D或无氨基酸

<220>

<221> X

<222> (7)..(7)

<223> X是D或Y

<220>

<221> X

<222> (8)..(8)

<223> X是E或G

<220>

<221> X

<222> (9)..(9)

<223> X是E或S

<220>

<221> X

<222> (10)..(10)

<223> X是Y或D

<220>

<221> X

<222> (12)..(12)

<223> X是V, A或L

<400> 154

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Met Asp

1 5 10

<210> 155

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4和5变体2重链CDR3的共有序列

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> X是A或T

<220>

<221> X

<222> (2)..(2)

<223> X是R或H

<220>

<221> X

<222> (3)..(3)

<223> X是G或无氨基酸

<220>

<221> X

<222> (4)..(4)

<223> X是G或无氨基酸

<220>

<221> X

<222> (5)..(5)

<223> X是D或无氨基酸

<220>

<221> X

<222> (7)..(7)

<223> X是D或Y

<220>

<221> X

<222> (8)..(8)

<223> X是E或G

<220>

<221> X

<222> (9)..(9)

<223> X是E或S

<220>

<221> X

<222> (10)..(10)

<223> X是Y或D

<220>

<221> X

<222> (12)..(12)

<223> X是V, A或L

<400> 155

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 156

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4和5变体1轻链CDR1的共有序列

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> X是S或无氨基酸

<220>

<221> X

<222> (2)..(2)

<223> X是S或无氨基酸

<220>

<221> X

<222> (5)..(5)

<223> X是M或L

<220>

<221> X

<222> (6)..(6)

<223> X是Y或H

<400> 156

Xaa Xaa Ser Tyr Xaa Xaa Trp Tyr

1 5

<210> 157

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4,和5变体2轻链CDR1的共有序列

<220>

<221> X

<222> (5)..(5)

<223> X是Y或S

<220>

<221> X

<222> (6)..(6)

<223> X是S或无氨基酸

<220>

<221> X

<222> (7)..(7)

<223> X是Y或无氨基酸

<400> 157

Ser Ser Val Ser Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 158

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4和5变体1轻链CDR2的共有序列

<220>

<221> X

<222> (2)..(2)

<223> X是L或W

<220>

<221> X

<222> (5)..(5)

<223> X是D或S

<400> 158

Leu Xaa Ile Tyr Xaa Thr Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 159

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 159

Lys Asp Pro Lys

1

<210> 160

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4和5变体1轻链CDR3的共有序列

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> X是Q或H

<220>

<221> X

<222> (3)..(3)

<223> X是W或Y

<220>

<221> X

<222> (4)..(4)

<223> X是S或H

<220>

<221> X

<222> (5)..(5)

<223> X是S或R

<220>

<221> X

<222> (6)..(6)

<223> X是Y或S

<220>

<221> X

<222> (8)..(8)

<223> X是L或R

<400> 160

Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa

1 5

<210> 161

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1, 3, 4和5变体2轻链CDR3的共有序列

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> X是Q或H

<220>

<221> X

<222> (3)..(3)

<223> X是W或Y

<220>

<221> X

<222> (4)..(4)

<223> X是S或H

<220>

<221> X

<222> (5)..(5)

<223> X是S或R

<220>

<221> X

<222> (6)..(6)

<223> X是Y或S

<220>

<221> X

<222> (8)..(8)

<223> X是L或R

<220>

<221> X

<222> (10)..(10)

<223> X是F或无氨基酸

<400> 161

Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr Xaa

1 5 10

<210> 162

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8alpha前导物的核苷酸序列

<400> 162

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 163

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH2CH3铰链

<400> 163

Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

1 5 10 15

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

20 25 30

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

35 40 45

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

50 55 60

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

65 70 75 80

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

85 90 95

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

100 105 110

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

115 120 125

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

130 135 140

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

165 170 175

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

180 185 190

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

195 200 205

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

210 215 220

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys

225 230 235

<210> 164

<211> 703

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CH2CH3铰链的核苷酸序列

<400> 164

aaaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg 60

accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc 120

tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg 180

gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa 240

cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa 300

ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc 360

caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga 420

gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat 480

cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt 540

gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg 600

gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag ggtctgcaca accactacac 660

gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa agggccggcc gct 703

<210> 165

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8alpha铰链

<400> 165

Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

35 40 45

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

50 55

<210> 166

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 缩短的IgG铰链

<400> 166

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

1 5 10

<210> 167

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2的重链可变区的CDR1

<400> 167

Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala

1 5

<210> 168

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2的重链可变区的CDR2

<400> 168

Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 169

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2的重链可变区的CDR3

<400> 169

Val Arg Glu Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Met

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 170

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CRT2重链CDR1的核苷酸序列

<400> 170

ggtttcacct tcaataccta tgcc 24

<210> 171

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CRT2重链CDR2的核苷酸序列

<400> 171

ataagaagta aaagtaataa ttatgcaaca 30

<210> 172

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CRT2重链CDR3的核苷酸序列

<400> 172

gtgagagaag gggtttatta ctacggtagt agtgggtact atgctatgga ctac 54

<210> 173

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2重链可变区

<400> 173

Met Ala Glu Val Gln Gly Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

20 25 30

Thr Tyr Ala Met His Trp Val Cys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln

65 70 75 80

Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Met Tyr Tyr Cys Val Arg Glu Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Gly

100 105 110

Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Gly

130

<210> 174

<211> 401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CRT2重链可变区的核苷酸序列

<400> 174

gacgcttatc gatggccgag gtgcaggggg tggagtctgg tggaggattg gtgcagccta 60

aaggatcatt gaaactctca tgtgccgcct ctggtttcac cttcaatacc tatgccatgc 120

actgggtctg ccaggctcca ggaaagggtt tggaatgggt tgctcgcata agaagtaaaa 180

gtaataatta tgcaacatat tatgccgatt cagtgaaaga cagattcacc atctccagag 240

atgattcaca aagcatgctc tatctgcaaa tgaacaacct gaaaactgag gacacagcca 300

tgtattactg tgtgagagaa ggggtttatt actacggtag tagtgggtac tatgctatgg 360

actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagg t 401

<210> 175

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2 scFv

<400> 175

Met Ala Glu Val Gln Gly Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

20 25 30

Thr Tyr Ala Met His Trp Val Cys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln

65 70 75 80

Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Met Tyr Tyr Cys Val Arg Glu Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Gly

100 105 110

Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro

145 150 155 160

Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr

165 170 175

Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile

180 185 190

Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala

210 215 220

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu

225 230 235 240

Thr Phe Gly Ala Pro Gly Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala

245 250

<210> 176

<211> 781

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2 scFv核苷酸

<400> 176

gacgcttatc gatggccgag gtgcaggggg tggagtctgg tggaggattg gtgcagccta 60

aaggatcatt gaaactctca tgtgccgcct ctggtttcac cttcaatacc tatgccatgc 120

actgggtctg ccaggctcca ggaaagggtt tggaatgggt tgctcgcata agaagtaaaa 180

gtaataatta tgcaacatat tatgccgatt cagtgaaaga cagattcacc atctccagag 240

atgattcaca aagcatgctc tatctgcaaa tgaacaacct gaaaactgag gacacagcca 300

tgtattactg tgtgagagaa ggggtttatt actacggtag tagtgggtac tatgctatgg 360

actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagg ttcctcaggt ggaggcggtt 420

caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cggaaattgt tctcacccag tctccagcaa 480

tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccataacctg cagtgccagc tcaagtgtaa 540

gttacatgca ctggttccag cagaagccag gcacttctcc caaactctgg atttatagca 600

catccaacct ggcttctgga gtccctgctc gcttcagtgg cagtggatct gggacctctt 660

actctctcac aatcagccga atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccagcaaa 720

ggagtagtta ccccctcacg ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa cgtgcggccg 780

c 781

<210> 177

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1 scFv密码子优化的人序列

<400> 177

atggcagagg tgcagctgca gcagagcgga gcagagctga tgaagccagg agcctctgtg 60

aagatcagct gtaaggccac cggctataca ttcagctcct actggatcga gtgggtgaag 120

cagcggcctg gccacggcct ggagtggatc ggagagatcc tgccaggcag cggctccacc 180

aactataatg agaagttcaa gggcaaggcc acctttacag ccgacacctc tagcaacaca 240

gcctacatgc agctgtcctc tctgacaagc gaggattccg ccgtgtacta ttgcgccagg 300

ggcggcgact atgatgagga gtactatgtg atggactact ggggccaggg cacctccgtg 360

accgtgagca gcggcggagg cggcagcgga ggaggaggct ccggcggcgg cggctctcag 420

atcgtgctga cccagagccc agcaatcatg tctgccagcc caggagagaa ggtgaccatg 480

acatgttccg cctctagctc cgtgagctac atgtattggt atcagcagaa gcccggctct 540

agccctcggc tgctgatcta tagaacctcc aatctggcat ctggcgtgcc cgcaaggttc 600

tccggctctg gcagcggcac ctcctactct ctgaccatcg gcacaatgga ggccgaggat 660

gccgccacat actattgcca gcagtggtcc tcttaccctc tgacctttgg cgccggcaca 720

aagctggaga tcaagcgcgc ggccgca 747

<210> 178

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT1 scFv密码子优化的鼠序列

<400> 178

atggctgagg tgcagctgca gcagtccgga gctgagctga tgaagccagg cgcctctgtg 60

aagatcagct gtaaggccac cggctacaca ttcagctcct actggatcga gtgggtgaag 120

cagaggcctg gccacggact ggagtggatc ggagagatcc tgccaggcag cggcagcacc 180

aactacaacg agaagttcaa gggcaaggct acctttacag ccgacacctc tagcaacaca 240

gcttacatgc agctgtcctc tctgacaagc gaggatagcg ccgtgtacta ctgcgccagg 300

ggcggagact acgatgagga gtactacgtg atggactact ggggccaggg aacctctgtg 360

accgtgagca gcggaggagg aggaagcggc ggaggaggca gcggaggagg aggatctcag 420

atcgtgctga cccagagccc agctatcatg tctgccagcc ccggcgagaa ggtgaccatg 480

acatgtagcg cctctagctc cgtgtcctac atgtactggt atcagcagaa gcccggatct 540

agccctaggc tgctgatcta cagaacatcc aacctggctt ctggcgtgcc cgctcggttc 600

tccggctctg gaagcggcac ctcctactct ctgaccatcg gcacaatgga ggctgaggat 660

gccgctacat actactgcca gcagtggtcc tcttaccctc tgacctttgg agccggcaca 720

aagctggaga tcaagcgcgc ggccgca 747

<210> 179

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2 scFV密码子优化的人序列

<400> 179

atggcagagg tgcagggagt ggagagcgga ggcggcctgg tgcagcctaa gggctccctg 60

aagctgtctt gcgccgccag cggcttcacc tttaacacat atgcaatgca ctgggtgtgc 120

caggcaccag gcaagggcct ggagtgggtg gcacggatca gaagcaagtc caacaattat 180

gccacctact atgccgacag cgtgaaggat aggttcacaa tctcccgcga cgattctcag 240

agcatgctgt acctgcagat gaacaatctg aagaccgagg acacagccat gtactattgc 300

gtgcgggagg gcgtgtacta ttacggcagc tccggctatt acgctatgga ctactggggc 360

cagggcacca gcgtgacagt gtctagcgga ggaggaggct ccggaggagg aggctctggc 420

ggcggcggca gcgagatcgt gctgacccag tccccagcaa tcatgtccgc ctctccagga 480

gagaaggtga ccatcacatg ctccgcctcc tctagcgtgt cttatatgca ctggttccag 540

cagaagcccg gcacctctcc taagctgtgg atctacagca catccaatct ggcatccggc 600

gtgcccgcaa ggttttctgg cagcggctcc ggcacctctt atagcctgac aatcagccgg 660

atggaggcag aggacgcagc aacctattac tgtcagcaga gatcctctta ccctctgacc 720

tttggcgccg gcacaaagct ggagctgaag cgcgcggccg ca 762

<210> 180

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT2 scFv密码子优化的人序列

<400> 180

atggctgagg tgcagggagt ggagagcgga ggaggcctgg tgcagcctaa gggctccctg 60

aagctgtctt gcgccgctag cggattcacc tttaacacat acgctatgca ctgggtgtgc 120

caggctccag gaaagggcct ggagtgggtg gccaggatca gaagcaagtc caacaactac 180

gctacctact acgccgacag cgtgaaggat cggttcacaa tctcccgcga cgattctcag 240

agcatgctgt acctgcagat gaacaacctg aagaccgagg acacagctat gtactactgc 300

gtgcgggagg gcgtgtacta ctacggcagc tccggatact acgctatgga ctactgggga 360

cagggcacct ccgtgacagt gtctagcgga ggaggaggct ccggaggagg aggctctgga 420

ggcggaggca gcgagatcgt gctgacccag tctccagcta tcatgtccgc ctctcccggc 480

gagaaggtga ccatcacatg ctccgcctcc tctagcgtgt cttacatgca ctggttccag 540

cagaagcccg gcacctctcc taagctgtgg atctacagca catccaacct ggctagcgga 600

gtgcccgctc ggttttctgg aagcggctcc ggaacctctt acagcctgac aatctccagg 660

atggaggctg aggacgccgc tacatactac tgtcagcaga gatcctctta ccctctgacc 720

tttggcgccg gaacaaagct ggagctgaag cgcgcggccg ca 762

<210> 181

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3 scFv密码子优化的人序列

<400> 181

atggccgagg tgcagctgca gcagtctggc accgtgctgg ccaggcccgg agcaagcgtg 60

aagatgtcct gcaaggcctc tggctacacc ttcacaagct attggatgca ctgggtgaag 120

cagcgcccag gacagggcct ggagtggatc ggagcaatct accccggcaa ctccgacacc 180

tcttataatc agaagttcaa gggcaaggcc aagctgacag ccgtgacctc tacaagcacc 240

gcctacatgg agctgagcag cctgaccaac gaggatagcg ccgtgtttta ttgcacacac 300

tactatggct ccgactacgc tatggactat tggggccagg gcacctccgt gacagtgtct 360

agcggaggag gaggcagcgg aggaggaggc tccggcggcg gcggctctca gatcgtgctg 420

acccagagcc ctgccatcat gtccgcctct ctgggcgagc gggtgacaat gacctgtaca 480

gcctcctcta gcgtgtcctc tagctacctg cactggtatc agcagaagcc cggctcctct 540

cctaagctgt ggatctacag cacctccaat ctggcatccg gcgtgcctgc aaggttctct 600

ggcagcggct ccggcacctc ttacagcctg acaatcagca gcatggaggc agaggacgca 660

gcaacatact attgtcacca gtatcaccgg agcccaagaa cctttggcgg cggcacaaag 720

ctggagatca agcgggcggc cgca 744

<210> 182

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3 scFv密码子优化的鼠序列

<400> 182

atggccgagg tgcagctgca gcagtctggc accgtgctgg ctcggcccgg agctagcgtg 60

aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcacaagct actggatgca ctgggtgaag 120

cagcgcccag gacagggcct ggagtggatc ggcgccatct accccggaaa ctccgacacc 180

tcttacaacc agaagttcaa gggcaaggct aagctgacag ccgtgacctc tacaagcacc 240

gcttacatgg agctgagcag cctgaccaac gaggatagcg ccgtgtttta ctgcacacac 300

tactacggct ccgactacgc tatggattac tggggacagg gcacctccgt gacagtgtct 360

agcggaggag gaggaagcgg cggaggcggc agcggaggag gaggatctca gatcgtgctg 420

acccagtctc ctgctatcat gtccgcctct ctgggcgaga gggtgacaat gacctgtaca 480

gcctcctcta gcgtgtcctc tagctacctg cactggtatc agcagaagcc cggctcctct 540

cctaagctgt ggatctacag cacctccaac ctggcttccg gagtgcctgc tcggttctct 600

ggaagcggct ccggaacctc ttacagcctg acaatcagca gcatggaggc tgaggacgcc 660

gctacatact actgtcacca gtaccacagg agcccaagaa cctttggcgg aggcacaaag 720

ctggagatca agagggcggc cgca 744

<210> 183

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4 scFv密码子优化的人序列

<400> 183

atggcacagg tgcagctgca gcagagcgga gcagagctga tgaagccagg agcctctgtg 60

aagatcagct gtaaggccac cggctataca ttcagctcct actggatcga gtgggtgaac 120

agacggcccg gccacggcct ggagtggatc ggagagatcc tgccaggcag cggctccacc 180

aactataatg agaagttcaa gggcaaggcc acctttacag ccgacacctc tagcaataca 240

gcctacatgc agctgtcctc tctgacaagc gaggattccg tggtgtacta ttgcgccagg 300

ggcggcgact atgatgagga gtactatctg atggactact ggggccaggg caccacactg 360

accgtgagca gcggaggagg aggcagcgga ggaggaggct ccggcggcgg cggctctcag 420

atcgtgctga cacagtcccc agcaatcatg tctgccagcc caggagagaa ggtgaccatg 480

acatgttccg cctctagctc cgtgagctac atgtattggt atcagcagaa gcccggctct 540

agccctaggc tgctgatcta tgacacctcc aacctggcat ctggcgtgcc cgtgcgcttc 600

tccggctctg gcagcggcac ctcctactct ctgacaatca gccggatgga ggcagaggat 660

gcagcaacct actattgcca gcagtggtcc tcttaccctc tgacctttgg cgccggcaca 720

aagctggaga tcaagcgggc ggccgca 747

<210> 184

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT4 scFv密码子优化的鼠序列

<400> 184

atggctcagg tgcagctgca gcagtccgga gctgagctga tgaagccagg cgcctctgtg 60

aagatcagct gtaaggccac cggctacaca ttcagctcct actggatcga gtgggtgaac 120

aggaggcccg gccacggact ggagtggatc ggagagatcc tgccaggcag cggcagcacc 180

aactacaacg agaagttcaa gggcaaggct acctttacag ccgacacctc tagcaacaca 240

gcttacatgc agctgtcctc tctgacaagc gaggattccg tggtgtacta ctgcgccagg 300

ggcggagact acgatgagga gtactacctg atggactact ggggccaggg aaccacactg 360

accgtgagca gcggaggagg aggaagcggc ggaggaggca gcggaggagg aggatctcag 420

atcgtgctga cacagtctcc agctatcatg tctgccagcc ccggcgagaa ggtgaccatg 480

acatgtagcg ccagcagcag cgtgagctac atgtactggt atcagcagaa gcccggatct 540

agccctcggc tgctgatcta cgacacctcc aacctggctt ctggcgtgcc cgtgcgcttc 600

tccggctctg gaagcggcac ctcctactct ctgacaatca gcaggatgga ggctgaggat 660

gccgctacat actactgcca gcagtggtcc tcttaccctc tgacctttgg agccggcaca 720

aagctggaga tcaagagggc ggccgca 747

<210> 185

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5 scFv密码子优化的人序列

<400> 185

atggcagagg tgcagctgca gcagtccgga gcagagctga tgaagccagg agcctctgtg 60

aagatcagct gtaaggccac cggctataca ttcagctcct actggatcga gtgggtgaac 120

cagcgccctg gccacggcct ggagtggatc ggagagatcc tgccaggcag cggctccacc 180

aactataatg agaagttcaa gggcaaggcc acctttacag ccgacacctc tagcaataca 240

gcctacatgc agctgtcctc tctgacaagc gaggattccg ccgtgtacta ttgcgccaga 300

ggcggcgact atgatgagga gtactatgct atggactact ggggccaggg cacctctgtg 360

accctgagca gcggaggagg aggcagcggc ggaggaggct ccggcggcgg cggctctcag 420

atcgtgctga cccagagccc agcaatcatg tctgccagcc caggagagaa ggtgaccatg 480

acatgtagcg cctctagctc cgtgtcctac atgtattggt atcagcagaa gcccggctct 540

agccctcggc tgctgatcta tgacacctcc aacctggcct ctggcgtgcc cgtgagattc 600

tccggctctg gcagcggcac ctcctactct ctgacaatca gcaggatgga ggccgaggat 660

gccgccacat actattgcca gcagtggtcc tcttaccctc tgacctttgg cgccggcaca 720

aagctggagc tgaagagggc ggccgca 747

<210> 186

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5 scFv密码子优化的鼠序列

<400> 186

atggctgagg tgcagctgca gcagtccgga gctgagctga tgaagccagg cgcctctgtg 60

aagatcagct gtaaggccac cggctacaca ttcagctcct actggatcga gtgggtgaac 120

cagcgccctg gccacggact ggagtggatc ggagagatcc tgccaggcag cggcagcacc 180

aactacaacg agaagttcaa gggcaaggct acctttacag ccgacacctc tagcaacaca 240

gcttacatgc agctgtcctc tctgacaagc gaggatagcg ccgtgtacta ctgcgccagg 300

ggcggagact acgatgagga gtactacgct atggactact ggggccaggg aacctctgtg 360

accctgagca gcggaggagg aggaagcggc ggaggaggca gcggaggagg aggatctcag 420

atcgtgctga cccagagccc agctatcatg tctgccagcc ccggcgagaa ggtgaccatg 480

acatgtagcg ccagcagcag cgtgagctac atgtactggt atcagcagaa gcccggatct 540

agccctaggc tgctgatcta cgacacctcc aacctggcct ctggcgtgcc cgtgagattc 600

tccggctctg gaagcggcac ctcctactct ctgacaatca gccggatgga ggctgaggat 660

gccgctacat actactgcca gcagtggtcc tcttaccctc tgacctttgg agccggcaca 720

aagctggagc tgaagcgggc ggccgca 747

<210> 187

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TCR alpha链恒定区

<400> 187

Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

1 5 10 15

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

20 25 30

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp

85 90 95

Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe

100 105 110

Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala

115 120 125

Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 188

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TCR beta链恒定区

<400> 188

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175

Ser Arg Gly

<210> 189

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT1表位

<400> 189

Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu

1 5

<210> 190

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT1 TCR alpha链的CDR1

<400> 190

Ser Ser Tyr Ser Pro Ser

1 5

<210> 191

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT1 TCR alpha链的CDR2

<400> 191

Tyr Thr Ser Ala Ala Thr Leu

1 5

<210> 192

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT1 TCR alpha链的CDR3

<400> 192

Val Val Ser Pro Phe Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr

1 5 10

<210> 193

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT1 TCR alpha链的CDR3

<400> 193

Ser Pro Phe Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr

1 5 10

<210> 194

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT1 TCR beta 链的CDR1

<400> 194

Asp Phe Gln Ala Thr Thr

1 5

<210> 195

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT1 TCR beta链的CDR2

<400> 195

Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala

1 5

<210> 196

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT1 TCR beta链的CDR3

<400> 196

Ser Ala Arg Asp Gly Gly Glu Gly

1 5

<210> 197

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT1 TCR beta 链的CDR3

<400> 197

Arg Asp Gly Gly Glu Gly Ser Glu Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 198

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TCR alpha链WT1

<400> 198

Met Leu Leu Leu Leu Val Pro Val Leu Glu Val Ile Phe Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gly Thr Arg Ala Gln Ser Val Thr Gln Leu Asp Ser His Val Ser Val

20 25 30

Ser Glu Gly Thr Pro Val Leu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Ser Ser Tyr

35 40 45

Ser Pro Ser Leu Phe Trp Tyr Val Gln His Pro Asn Lys Gly Leu Gln

50 55 60

Leu Leu Leu Lys Tyr Thr Ser Ala Ala Thr Leu Val Lys Gly Ile Asn

65 70 75 80

Gly Phe Glu Ala Glu Phe Lys Lys Ser Glu Thr Ser Phe His Leu Thr

85 90 95

Lys Pro Ser Ala His Met Ser Asp Ala Ala Glu Tyr Phe Cys Val Val

100 105 110

Ser Pro Phe Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly

115 120 125

Thr His Leu Ile Ile Gln Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val

130 135 140

Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe

145 150 155 160

Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp

165 170 175

Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe

180 185 190

Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys

195 200 205

Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro

210 215 220

Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu

225 230 235 240

Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg

245 250 255

Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg

260 265 270

Leu Trp Ser Ser

275

<210> 199

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TCR beta链WT1

<400> 199

Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ser Gly Leu Gly Ala

1 5 10 15

Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser

20 25 30

Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe

35 40 45

Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser

50 55 60

Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys

65 70 75 80

Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr

85 90 95

Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Arg Asp

100 105 110

Gly Gly Glu Gly Ser Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Leu Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

130 135 140

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

145 150 155 160

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

165 170 175

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

180 185 190

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser

195 200 205

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His

210 215 220

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

225 230 235 240

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala

245 250 255

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly

260 265 270

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

275 280 285

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys

290 295 300

Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 200

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有Thr 48至Cys取代的人TCR alpha链(WT1)

<400> 200

Met Leu Leu Leu Leu Val Pro Val Leu Glu Val Ile Phe Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gly Thr Arg Ala Gln Ser Val Thr Gln Leu Asp Ser His Val Ser Val

20 25 30

Ser Glu Gly Thr Pro Val Leu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Ser Ser Tyr

35 40 45

Ser Pro Ser Leu Phe Trp Tyr Val Gln His Pro Asn Lys Gly Leu Gln

50 55 60

Leu Leu Leu Lys Tyr Thr Ser Ala Ala Thr Leu Val Lys Gly Ile Asn

65 70 75 80

Gly Phe Glu Ala Glu Phe Lys Lys Ser Glu Thr Ser Phe His Leu Thr

85 90 95

Lys Pro Ser Ala His Met Ser Asp Ala Ala Glu Tyr Phe Cys Val Val

100 105 110

Ser Pro Phe Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly

115 120 125

Thr His Leu Ile Ile Gln Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val

130 135 140

Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe

145 150 155 160

Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp

165 170 175

Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe

180 185 190

Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys

195 200 205

Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro

210 215 220

Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu

225 230 235 240

Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg

245 250 255

Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg

260 265 270

Leu Trp Ser Ser

275

<210> 201

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有Ser 57至Cys取代的的人TCR beta 链(WT1)

<400> 201

Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ser Gly Leu Gly Ala

1 5 10 15

Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser

20 25 30

Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe

35 40 45

Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser

50 55 60

Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys

65 70 75 80

Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr

85 90 95

Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Arg Asp

100 105 110

Gly Gly Glu Gly Ser Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Leu Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

130 135 140

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

145 150 155 160

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

165 170 175

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln

180 185 190

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser

195 200 205

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His

210 215 220

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

225 230 235 240

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala

245 250 255

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly

260 265 270

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

275 280 285

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys

290 295 300

Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 202

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT1表位 235-243

<400> 202

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu

1 5

<210> 203

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 框架区

<400> 203

Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Ile Ile Gln Pro

1 5 10

<210> 204

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 框架区

<400> 204

Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu

1 5 10

<210> 205

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1和4变体1重链CDR3的共有序列

<220>

<221> X

<222> (12)..(12)

<223> X是A或V或L

<400> 205

Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Xaa Met Asp

1 5 10

<210> 206

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1和4变体2重链CDR3的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是A或V或L

<400> 206

Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Xaa Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 207

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1和4变体1和2重链CDR3的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是A或V或L

<220>

<221> Xaa

<222> (15)..(15)

<223> Xaa是Y或无氨基酸

<400> 207

Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Xaa Met Asp Xaa

1 5 10 15

<210> 208

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1和4变体1和2轻链CDR3的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是T或无氨基酸

<400> 208

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Xaa

1 5

<210> 209

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1和4 变体1和2重链CDR1的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是GYTF或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是IE或无氨基酸

<400> 209

Xaa Ser Ser Tyr Trp Xaa

1 5

<210> 210

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1和4 变体1和2重链CDR2的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是WIGE或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是N或无氨基酸

<400> 210

Xaa Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Xaa

1 5 10

<210> 211

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1, 4和3变体1和2重链CDR1的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是GYTF或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是S或T

<220>

<221> Xaa

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是I或M和E或H,或无氨基酸

<400> 211

Xaa Xaa Ser Tyr Trp Xaa

1 5

<210> 212

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1, 4和3变体1和2重链CDR2的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是WIG和E或A,或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是L或Y

<220>

<221> Xaa

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是S或N

<220>

<221> Xaa

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是G或S

<220>

<221> Xaa

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是S或D

<220>

<221> Xaa

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是N或S或无氨基酸

<400> 212

Xaa Ile Xaa Pro Gly Xaa Xaa Xaa Thr Xaa

1 5 10

<210> 213

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1, 4和3变体1和2重链CDR3的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是A或T

<220>

<221> Xaa

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是R或H

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是G或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是G或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是D或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是D或Y

<220>

<221> Xaa

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是E或G

<220>

<221> Xaa

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是E或S

<220>

<221> Xaa

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是Y或D

<220>

<221> Xaa

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是V或A或L

<220>

<221> Xaa

<222> (15)..(15)

<223> Xaa是Y或无氨基酸

<400> 213

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Met Asp Xaa

1 5 10 15

<210> 214

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1, 4和3变体1和2轻链CDR2的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是(L, L或W ,IY)或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (2)..(2)

<223> D或S

<220>

<221> Xaa

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是NLA或无氨基酸

<400> 214

Xaa Xaa Thr Ser Xaa

1 5

<210> 215

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT5, 1, 4,和3变体1和2轻链CDR3的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是Q或H

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是W或Y

<220>

<221> Xaa

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是S或H

<220>

<221> Xaa

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是S或R

<220>

<221> Xaa

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是Y或S

<220>

<221> Xaa

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是L或R

<220>

<221> Xaa

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是TF或无氨基酸

<400> 215

Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa

1 5

<210> 216

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3 变体1和2重链CDR1的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是GYTF或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是MH或无氨基酸

<400> 216

Xaa Thr Ser Tyr Trp Xaa

1 5

<210> 217

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3 变体1和2重链CDR2的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是WIGA或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是S或无氨基酸

<400> 217

Xaa Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Xaa

1 5 10

<210> 218

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3 变体1和2重链CDR3的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是Y或无氨基酸

<400> 218

Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Xaa

1 5 10

<210> 219

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3变体1和2轻链CDR1的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是SSV或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是LHWY或无氨基酸

<400> 219

Xaa Ser Ser Ser Tyr Xaa

1 5

<210> 220

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3 变体1和2轻链CDR2的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是LWIY或无氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是NLA或无氨基酸

<400> 220

Xaa Ser Thr Ser Xaa

1 5

<210> 221

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRT3变体1和2轻链CDR3的共有序列

<220>

<221> Xaa

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是T或无氨基酸

<400> 221

His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Xaa

1 5

<210> 222

<211> 216

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 222

actactacca agccagtgct gcgaactccc tcacctgtgc accctaccgg gacatctcag 60

ccccagagac cagaagattg tcggccccgt ggctcagtga aggggaccgg attggacttc 120

gcctgtgata tttacatctg ggcacccttg gccggaatct gcgtggccct tctgctgtcc 180

ttgatcatca ctctcatctg ctaccacagg agccga 216

<210> 223

<211> 123

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 223

aatagtagaa ggaacagact ccttcaaagt gactacatga acatgactcc ccggaggcct 60

gggctcactc gaaagcctta ccagccctac gcccctgcca gagactttgc agcgtaccgc 120

ccc 123

<210> 224

<211> 135

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 224

aaatggatca ggaaaaaatt cccccacata ttcaagcaac catttaagaa gaccactgga 60

gcagctcaag aggaagatgc ttgtagctgc cgatgtccac aggaagaaga aggaggagga 120

ggaggctatg agctg 135

<210> 225

<211> 334

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 225

agagcaaaat tcagcaggag tgcagagact gctgccaacc tgcaggaccc caaccagctc 60

tacaatgagc tcaatctagg gcgaagagag gaatatgacg tcttggagaa gaagcgggct 120

cgggatccag agatgggagg caaacagcag aggaggagga acccccagga aggcgtatac 180

aatgcactgc agaaagacaa gatggcagaa gcctacagtg agatcggcac aaaaggcgag 240

aggcggagag gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagcactgc caccaaggac 300

acctatgatg ccctgcatat gcagaccctg gccc 334

<210> 226

<211> 108

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 226

cggaaggctt ggagattgcc taacactccc aaaccttgtt ggggaaacag cttcaggacc 60

ccgatccagg aggaacacac agacgcacac tttactctgg ccaagatc 108

<210> 227

<211> 752

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠CD8 alpha 铰链CD8 alpha跨膜域- CD28

共刺激域-CD3 zeta胞内信号传导域

<400> 227

ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60

actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120

ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180

cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240

cacaggagcc gaaatagtag aaggaacaga ctccttcaaa gtgactacat gaacatgact 300

ccccggaggc ctgggctcac tcgaaagcct taccagccct acgcccctgc cagagacttt 360

gcagcgtacc gccccagagc aaaattcagc aggagtgcag agactgctgc caacctgcag 420

gaccccaacc agctctacaa tgagctcaat ctagggcgaa gagaggaata tgacgtcttg 480

gagaagaagc gggctcggga tccagagatg ggaggcaaac agcagaggag gaggaacccc 540

caggaaggcg tatacaatgc actgcagaaa gacaagatgg cagaagccta cagtgagatc 600

ggcacaaaag gcgagaggcg gagaggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagc 660

actgccacca aggacaccta tgatgccctg catatgcaga ccctggcccc tcgctaataa 720

aagcttaaca cgagccatag atagaataaa ag 752

<210> 228

<211> 764

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠CD8alpha 铰链CD8alpha跨膜域-41BB

共刺激域- CD3 zeta胞内信号传导域

<400> 228

ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60

actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120

ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180

cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240

cacaggagcc gaaaatggat caggaaaaaa ttcccccaca tattcaagca accatttaag 300

aagaccactg gagcagctca agaggaagat gcttgtagct gccgatgtcc acaggaagaa 360

gaaggaggag gaggaggcta tgagctgaga gcaaaattca gcaggagtgc agagactgct 420

gccaacctgc aggaccccaa ccagctctac aatgagctca atctagggcg aagagaggaa 480

tatgacgtct tggagaagaa gcgggctcgg gatccagaga tgggaggcaa acagcagagg 540

aggaggaacc cccaggaagg cgtatacaat gcactgcaga aagacaagat ggcagaagcc 600

tacagtgaga tcggcacaaa aggcgagagg cggagaggca aggggcacga tggcctttac 660

cagggtctca gcactgccac caaggacacc tatgatgccc tgcatatgca gaccctggcc 720

cctcgctaat aaaagcttaa cacgagccat agatagaata aaag 764

<210> 229

<211> 737

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠CD8alpha铰链-CD8alpha跨膜域-OX40

共刺激域-CD3 zeta胞内信号传导域

<400> 229

ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60

actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120

ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180

cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240

cacaggagcc gacggaaggc ttggagattg cctaacactc ccaaaccttg ttggggaaac 300

agcttcagga ccccgatcca ggaggaacac acagacgcac actttactct ggccaagatc 360

agagcaaaat tcagcaggag tgcagagact gctgccaacc tgcaggaccc caaccagctc 420

tacaatgagc tcaatctagg gcgaagagag gaatatgacg tcttggagaa gaagcgggct 480

cgggatccag agatgggagg caaacagcag aggaggagga acccccagga aggcgtatac 540

aatgcactgc agaaagacaa gatggcagaa gcctacagtg agatcggcac aaaaggcgag 600

aggcggagag gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagcactgc caccaaggac 660

acctatgatg ccctgcatat gcagaccctg gcccctcgct aataaaagct taacacgagc 720

catagataga ataaaag 737

<210> 230

<211> 887

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠CD8alpha铰链-CD8alpha跨膜域-CD28

共刺激域- 41BB共刺激域-CD3 zeta

胞内信号传导域

<400> 230

ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60

actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120

ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180

cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240

cacaggagcc gaaatagtag aaggaacaga ctccttcaaa gtgactacat gaacatgact 300

ccccggaggc ctgggctcac tcgaaagcct taccagccct acgcccctgc cagagacttt 360

gcagcgtacc gccccaaatg gatcaggaaa aaattccccc acatattcaa gcaaccattt 420

aagaagacca ctggagcagc tcaagaggaa gatgcttgta gctgccgatg tccacaggaa 480

gaagaaggag gaggaggagg ctatgagctg agagcaaaat tcagcaggag tgcagagact 540

gctgccaacc tgcaggaccc caaccagctc tacaatgagc tcaatctagg gcgaagagag 600

gaatatgacg tcttggagaa gaagcgggct cgggatccag agatgggagg caaacagcag 660

aggaggagga acccccagga aggcgtatac aatgcactgc agaaagacaa gatggcagaa 720

gcctacagtg agatcggcac aaaaggcgag aggcggagag gcaaggggca cgatggcctt 780

taccagggtc tcagcactgc caccaaggac acctatgatg ccctgcatat gcagaccctg 840

gcccctcgct aataaaagct taacacgagc catagataga ataaaag 887

<210> 231

<211> 860

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠CD8alpha铰链-CD8alpha跨膜域- CD28和

OX40共刺激域s- CD3 zeta 胞内信号传导域

<400> 231

ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60

actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120

ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180

cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240

cacaggagcc gaaatagtag aaggaacaga ctccttcaaa gtgactacat gaacatgact 300

ccccggaggc ctgggctcac tcgaaagcct taccagccct acgcccctgc cagagacttt 360

gcagcgtacc gcccccggaa ggcttggaga ttgcctaaca ctcccaaacc ttgttgggga 420

aacagcttca ggaccccgat ccaggaggaa cacacagacg cacactttac tctggccaag 480

atcagagcaa aattcagcag gagtgcagag actgctgcca acctgcagga ccccaaccag 540

ctctacaatg agctcaatct agggcgaaga gaggaatatg acgtcttgga gaagaagcgg 600

gctcgggatc cagagatggg aggcaaacag cagaggagga ggaaccccca ggaaggcgta 660

tacaatgcac tgcagaaaga caagatggca gaagcctaca gtgagatcgg cacaaaaggc 720

gagaggcgga gaggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagcac tgccaccaag 780

gacacctatg atgccctgca tatgcagacc ctggcccctc gctaataaaa gcttaacacg 840

agccatagat agaataaaag 860

<210> 232

<211> 872

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠CD8alpha铰链-CD8alpha跨膜域- 41BB和

OX40共刺激域s-CD3 zeta胞内信号传导域

<400> 232

ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60

actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120

ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180

cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240

cacaggagcc gaaaatggat caggaaaaaa ttcccccaca tattcaagca accatttaag 300

aagaccactg gagcagctca agaggaagat gcttgtagct gccgatgtcc acaggaagaa 360

gaaggaggag gaggaggcta tgagctgcgg aaggcttgga gattgcctaa cactcccaaa 420

ccttgttggg gaaacagctt caggaccccg atccaggagg aacacacaga cgcacacttt 480

actctggcca agatcagagc aaaattcagc aggagtgcag agactgctgc caacctgcag 540

gaccccaacc agctctacaa tgagctcaat ctagggcgaa gagaggaata tgacgtcttg 600

gagaagaagc gggctcggga tccagagatg ggaggcaaac agcagaggag gaggaacccc 660

caggaaggcg tatacaatgc actgcagaaa gacaagatgg cagaagccta cagtgagatc 720

ggcacaaaag gcgagaggcg gagaggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagc 780

actgccacca aggacaccta tgatgccctg catatgcaga ccctggcccc tcgctaataa 840

aagcttaaca cgagccatag atagaataaa ag 872

Claims

1.核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含：

(i)抗CLEC14A结合域，

(ii)跨膜域和

(iii)胞内信号传导域；

其中所述抗CLEC14A结合域能够结合CLEC14A的C型凝集素域。

2.权利要求1的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域抑制CLEC14A和MMRN2之间的相互作用。

3.权利要求1或2的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域结合CLEC14A的残基97-108，其中CLEC14A具有如SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列。

4.权利要求1的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含重链CDR3的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQ ID NO.213的氨基酸序列或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

5.权利要求1或4的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含轻链CDR3的氨基酸序列，所述轻链CDR3具有SEQ ID NO.215的氨基酸序列或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

6.权利要求1、4或5中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下至少一项的氨基酸序列：

(a)重链CDR1，其具有氨基酸序列(S/T)SYW(I/M)(E/H)(SEQ ID NO.150)、GYTF(S/T)SYW(SEQ ID NO.151)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

(b)重链CDR2，其具有氨基酸序列WIG(E/A)I(L/Y)PG(S/N)(G/S)(S/D)T(N/S)(SEQ IDNO.152)、I(L/Y)PG(S/N)(G/S)(S/D)T(SEQ ID NO.153)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或

(c)重链CDR3，其具有氨基酸序列(A/T)(R/H)(G/X)(G/X)(D/X)Y(D/Y)(E/G)(E/S)(Y/D)Y(V/A/L)MD(SEQ ID NO.154)、(A/T)(R/H)(G/X)(G/X)(D/X)Y(D/Y)(E/G)(E/S)(Y/D)Y(V/A/L)MDY(SEQ ID NO.155)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

其中X是无氨基酸残基。

7.权利要求1或4至6中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下至少一项的氨基酸序列：

(a)轻链CDR1，其具有氨基酸序列S/X S/X S Y M/L Y/H W Y(SEQ ID NO.156)、SSVSY/S S/X Y/X(SEQ ID NO.157)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

(b)轻链CDR2，其具有氨基酸序列LL/W IY D/S TSNLA(SEQ ID NO.158)、D/S TS或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体和/或

(c)轻链CDR3，其具有氨基酸序列Q/H Q W/Y S/H S/R Y/S P L/R(SEQ ID NO.160)、Q/H Q W/Y S/H S/R Y/S P L/R T F/X(SEQ ID NO.161)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,

其中X是无氨基酸。

8.权利要求1-7中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含重链CDR3的氨基酸序列，所述重链CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.207或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

9.权利要求1-8中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下至少一项的氨基酸序列：

(a)重链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.44或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

(b)重链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.45或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体和/或

(c)重链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.34、SEQID NO.46、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

10.权利要求1-9中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含轻链CDR3的氨基酸序列，所述轻链CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.208或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

11.权利要求1-10中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下至少一项的氨基酸序列：

(a)轻链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.47或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,

(b)轻链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.36、DTS或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或

(c)轻链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.49或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

12.权利要求1-11中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.116或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO.32、33和/或116，

(b)SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.118或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO.44、45和/或118，

(c)SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.100或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO.32、33和/或100，

(d)SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.102或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO.44、45和/或102，

(e)SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO.32、33和/或34；或

(f)SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO.44、45和/或46。

13.权利要求1-12中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO.35、36和/或37或

(b)SEQ ID NO.47、DTS和SEQ ID NO.49或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO.47、49和/或DTS。

14.权利要求1-13中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36和SEQID NO.37或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 32、33、116、35、36和/或37；

(b)SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.47、DTS和SEQ ID NO.49或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 44、45、118、47、49和/或DTS；

(c)SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36和SEQID NO.37或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 32、33、100、35、36和/或37；

(d)SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.47、DTS和SEQ ID NO.49或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 44、45、102、47、49和/或DTS；

(e)SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36和SEQID NO.37或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 32、33、34、35、36和/或37；或

(f)SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、DTS和SEQ ID NO.49或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 44、45、46、47、49和/或DTS。

15.权利要求1或4-7中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下至少一项的氨基酸序列：

(a)重链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.216或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,

(b)重链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.217或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或

(c)重链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.218或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

16.权利要求1、4-7或15中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下至少一项的氨基酸序列：

(a)重链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.76或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

(b)重链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.77或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或

(c)重链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.78或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

17.权利要求1、4-7、15或16中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下至少一项的氨基酸序列：

(a)轻链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.219或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

(b)轻链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.220或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或

(c)轻链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.221或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

18.权利要求1、4-7或15-17中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下至少一项的氨基酸序列：

(a)轻链CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.79或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

(b)轻链CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.68、STS或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或

(c)轻链CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.81或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。

19.权利要求1、4-7或15-18中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 64、65和/或66；或

(b)SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78或其在以下任一项或多项中具有1、2和/或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 76、77和/或78。

20.权利要求1、4-7或15-19中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.69或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 67、68和/或69；或

(b)SEQ ID NO.79、STS和SEQ ID NO.81或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 79、81和/或STS。

21.权利要求1、4-7或15-20中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有包含以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO 64、SEQ ID NO.65、SEQ ID No.66、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68和SEQID NO.69或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 64、65、66、67、68和/或69；或

(b)SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79、STS和SEQ ID NO.81或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 76、77、78、79、81和/或STS。

22.核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含：

(i)抗CLEC14A结合域，

(ii)跨膜域和

(iii)胞内信号传导域，

其中所述抗CLEC14A结合域包含以下至少一项：

(b)重链CDR，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.168或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，

23.权利要求1或22的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO.129、SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.130或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 129、68和/或130，和/或包含SEQ ID NO.167、SEQ ID NO.168和SEQ ID NO.169或其在以下任一项或多项中具有1、2或3个氨基酸取代的变体：SEQ ID NO 167、168和/或169。

24.权利要求1-14中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域包含；

(a)重链可变区，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106或SEQ ID NO.121，或与其具有至少80％同一性的其变体，和/或

(b)轻链可变区，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107或SEQ ID NO.122，或与其具有至少80％同一性的其变体。

25.权利要求1、4-7或15-21中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域包含

(a)重链可变区，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.88或SEQ ID NO.90，或与其具有至少80％同一性的其变体，和/或

(b)轻链可变区，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.91，或与其具有至少80％同一性的其变体。

26.权利要求22或23的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO.173或与其具有至少80％同一性的其变体，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO.133或与其具有至少80％同一性的其变体。

27.权利要求1-26中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域包含至少一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区。

28.权利要求1-14、24或27中任一项的核酸分子，其中所述抗CLEC14A结合域包含scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.112或SEQ ID NO.125，或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。

29.权利要求1、4-7、15-21或27中任一项的核酸分子，其中所述CLEC14A结合域包含scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.96、或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。

30.权利要求1-14、24、27或28中任一项的核酸分子，其中所述多核苷酸包含以下核苷酸序列的至少一项：

(a)SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.50或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，

(b)SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.51或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或

(c)SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.120或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

31.权利要求1-14、24、27、28或30中任一项的核酸分子，其中所述多核苷酸包含以下核苷酸序列的至少一项：

(a)SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.53或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体

(b)SEQ ID NO.42、GACACATCC或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体和/或

(c)SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.55或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体.

32.权利要求1、4-7、15-21、27或29中任一项的核酸分子，其中所述多核苷酸包含以下核苷酸序列的至少一项：

(a)SEQ ID NO.82或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，

(b)SEQ ID NO.83或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或

(c)SEQ ID NO.84或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

33.权利要求1、4-7、15-21、27、29或32中任一项的核酸分子，其中所述多核苷酸包含以下至少一项：

(a)SEQ ID NO.85或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，

(b)AGCACATCC或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或

(c)SEQ ID NO.87或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。

34.权利要求1至14、24、27、28、30或31中任一项的核酸分子，其中所述多核苷酸包含

(a)SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110或SEQ ID NO.123，或其具有1至10个核苷酸取代的变体，和/或

(b)SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111或SEQ ID NO.124，或其具有1至10个核苷酸取代的变体。

35.权利要求1至14、24、27、28、30、31或34中任一项的核酸分子，其中所述多核苷酸包含SEQ ID No.61、SEQ ID NO.113或SEQ ID NO.126，或与其具有至少80％同一性的序列。

36.权利要求1、4至7、15至21、27、29、32或33中任一项的核酸分子，其中所述多核苷酸包含

(a)SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94或其具有1至10个核苷酸取代的变体，和/或

(b)SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95或其具有1至10个核苷酸取代的变体。

37.权利要求1、4至7、15至21、27、29、32、33或36中任一项的核酸分子，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO.97或与其具有至少80％同一性的序列。

38.权利要求1至37中任一项的核酸分子，其中所述跨膜域源自CD8α或CD28，并且优选包含氨基酸序列SEQ ID NO.146或与其具有至少95％同一性的序列.

39.权利要求1至38中任一项的核酸分子，其中所述胞内信号传导域源自CD3zeta，并且优选包含氨基酸序列SEQ ID NO.148或与其具有至少95％同一性的序列。

40.权利要求1至39中任一项的核酸分子，其中所述CAR包含至少一个共刺激域，优选选自以下任一项：CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP10、CD27、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C，和/或B7-H3。

41.权利要求40的核酸分子，其中所述跨膜域和所述共刺激域源自CD28。

42.权利要求1-41中任一项的核酸分子，其中所述CAR包含前导物序列，优选SEQ IDNO.135的制瘤素(oncostatin)M前导物序列、由SEQ ID NO.162编码的CD8α前导物序列，或与其具有至少95％同一性的序列，和/或其中所述CAR包含铰链或间隔物，优选源自CD8α。

43.权利要求1的核酸分子，其中所述CAR

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.114或SEQ ID NO.127，或与其具有至少80％同一性的序列，和/或

(b)由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含核苷酸序列SEQ ID NO.63、SEQ IDNO.99、SEQ ID NO.115或SEQ ID NO.128，或与其具有至少80％同一性的序列。

44.权利要求1至29中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子是RNA。

45.嵌合抗原受体(CAR)，其由权利要求1至44中任一项的核酸分子编码。

46.载体，其包含权利要求1至43中任一项的核酸分子，并且任选包含含有多核苷酸序列的核酸分子，所述多核苷酸序列编码T细胞受体分子。

47.权利要求46的载体，其中所述载体是病毒载体，优选gamma逆转录病毒载体。

48.权利要求46或47的载体，其中所述载体进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码自杀基因、细胞因子、显性阴性ΤGΡβ受体和/或CD34分子，优选截短的CD34分子。

49.细胞，其包含权利要求1至44中任一项的核酸、权利要求45的CAR或权利要求46至48中任一项的载体，并且任选地包含核酸分子或载体，其包含编码T细胞受体分子的多核苷酸序列。

50.权利要求49的细胞，其中所述细胞是免疫细胞，优选T细胞或天然杀伤细胞。

51.权利要求49或50的细胞，其中所述细胞包含另外的编码自杀基因、显性阴性ΤGΡβ受体或细胞因子的多核苷酸或载体。

52.权利要求1至44中任一项的核酸分子、权利要求46至48中任一项的载体或权利要求49至51中任一项的细胞，用于疗法中的用途。

53.对抗或治疗疾病的方法，其包括对有此需要的受试者施用权利要求1至44中任一项的核酸分子、权利要求46至48中任一项的载体或权利要求49至51中任一项的细胞的步骤。

54.权利要求1至44中任一项的核酸分子、权利要求46至48中任一项的载体或权利要求49至51中任一项的细胞，用于治疗与CLEC14A表达相关的状况。

55.治疗与CLEC14A表达相关的状况的方法，其包括对有此需要的受试者施用权利要求1至44中任一项的核酸分子、权利要求46至48中任一项的载体或权利要求49至51中任一项的细胞的步骤。

56.权利要求1至44中任一项的核酸分子、权利要求46至48中任一项的载体或权利要求49至51中任一项的细胞用于制备药物的用途，所述药物用于治疗与CLEC14A表达相关的状况。

57.根据权利要求54中使用的核酸分子、载体或细胞、权利要求55的方法或权利要求56的用途，其中所述与CLEC14A表达相关的状况是表达CLEC14A的实体瘤，或肿瘤血管发生。

58.根据权利要求54中使用的核酸分子、载体或细胞、权利要求55的方法或权利要求56的用途，其中所述核酸分子、载体或细胞用于与一种或多种治疗剂组合分开、同时或序贯施用，所述治疗剂优选是(i)抗癌剂，更优选替拉扎明；(ii)核酸分子，其包含编码TCR分子的多核苷酸序列；(iii)包含(ii)的核酸分子的载体；或(iv)包含(ii)的核酸分子或(iii)的载体的细胞。

59.在权利要求58中使用的核酸分子、载体或细胞、方法或用途，其中所述TCR分子结合WT1，优选结合HLA A2/RMFPNAPYL。

60.在权利要求59中使用的核酸分子、载体或细胞、方法或用途，其中所述TCR分子包含α链和β链，其中所述α链包含SEQ ID NO.190的CDR1α、SEQ ID NO.191的CDR2α和SEQ IDNO.192或193的CDR3α，并且其中所述β链包含SEQ ID NO.194的CDR1β、SEQ ID NO.195的CDR2β和SEQ ID NO.196或197的CDR3β，或其变体，其中一个或多个CDR包含1、2或3个氨基酸取代，其中所述TCR分子能够结合HLA A2/RMFPNAPYL复合物。

61.药物组合物，其包含根据权利要求1至44中任一项的核酸分子、根据权利要求46至48中任一项的载体或根据权利要求49至51中任一项的细胞和任选包含含有编码TCR的多核苷酸序列的核酸分子、包含含有编码TCR的多核苷酸序列的核酸分子的载体，或细胞，所述细胞包含含有编码TCR的多核苷酸的核酸分子或包含含有编码TCR的多核苷酸的核酸分子的载体。