JP2019515656A - キメラ抗原受容体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、(a)抗CLEC14A結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、及び(c)細胞内シグナリングドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメインへの結合能を有する、核酸分子に関する。本発明は、その核酸分子によってコードされるキメラ抗原受容体、その核酸分子を含むベクター、その核酸分子、ベクター又はCARを含む細胞、及び特にCLEC14Aを発現する病態の治療におけるその核酸、ベクター又は細胞の治療的使用を更に提供する。
Description
本発明は、キメラ抗原受容体、詳細にはCLEC14Aに特異的に結合するキメラ抗原受容体に関する。本発明は、そのキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド並びにその受容体及び/又はそのコードポリヌクレオチドを含む細胞に更に関する。腫瘍血管新生及び/又は癌を阻害するための本発明のキメラ抗原受容体、ポリヌクレオチド及び/又は細胞の使用も包含される。
血管の内側は、単層の内皮細胞で覆われており、これらの細胞が血流と周囲組織との界面を形成している。新生血管は、既存の小血管の壁から、血管新生と呼ばれる過程で内皮細胞が増殖することによって発達する。内皮細胞は、通常、創傷治癒における血管形成を除き、血管系の発達後に静止したままであり、新たな血管形成はない。しかしながら、固形腫瘍の成長中、新生毛細血管芽を作るよう内皮細胞の刺激を促す腫瘍による因子の分泌に応答して血管形成が起こり得る。腫瘍血管新生は、固形腫瘍の成長における律速過程として広く認識されており、従って腫瘍進行において重要な役割を果たす。血液供給を引き込まない腫瘍は、サイズが限られ、従って、このように腫瘍血管新生の防止又は制限は、固形腫瘍に対する治療選択肢となる。
腫瘍内の血管構造の内側を覆う内皮細胞は、正常組織の内皮細胞と比べて異なる細胞外環境に曝され得る。例えば、腫瘍の内皮細胞は、低酸素条件、栄養枯渇及び/又は高酸性条件を被り得る。更に、腫瘍内皮細胞は、血流速度の低下及び機械的圧迫の増加など、異なる機械的力を受け得る。腫瘍内皮細胞が異なる条件に曝される結果、正常組織の細胞と比べて異なるトランスクリプトームが呈示され、腫瘍内皮細胞において、正常な血管構造内の内皮細胞と比べて高いレベルで存在し得る腫瘍内皮マーカーの発現を伴うことになる。従って、腫瘍内皮細胞は、治療上、腫瘍内皮マーカーのターゲティングによって標的化し得る。
CLEC14Aは、14型カルシウム依存性C型レクチンファミリーのメンバーであり(このファミリーには、エンドシアリン/TEM1/CD248、トロンボモジュリン及びCD93がメンバーとして更に含まれる)、シグナルペプチド(アミノ酸残基1〜21)と、細胞外領域(アミノ酸残基22〜398)と、膜貫通ドメイン(アミノ酸残基399〜421)と、細胞質ドメイン(アミノ酸残基422〜490)とを含む490アミノ酸長のI型1回膜貫通タンパク質である。CLEC14Aの細胞外領域は、1つのC型レクチン様ドメイン(アミノ酸残基22〜173)と、上皮成長因子様領域(アミノ酸残基245〜287)とを有する。ヒト及びマウスにおいて、CLEC14Aタンパク質は、67%のアミノ酸配列同一性を示し、C型レクチン様及び上皮成長因子様ドメイン内で配列保存性がより高い。
本発明者らは、これまで、CLEC14Aが多くの一般的なヒト癌(乳癌、肝癌、前立腺癌、膵癌、膀胱癌及び卵巣癌を含む)の血管構造の内側を覆う内皮細胞の表面に高発現するが、健常組織の血管構造では発現が低いか又は検出不能であることを明らかにしている。血管の形成不良に起因して腫瘍血管構造に起こる低ずり応力条件がCLEC14Aの上方制御の原因であり得ると考えられる。更に、CLEC14Aは、発芽血管新生において役割を果たすものとして、及びマウスにおける腫瘍成長を促進するものとして開示されている。従って、CLEC14Aは、これまで、腫瘍血管新生の阻害標的となり得る腫瘍内皮マーカーとして提案されている。
抗体又は免疫療法が幾つかの腫瘍型のターゲティングに有効であることが明らかになっている。1つのかかる免疫療法治療は、キメラ抗原受容体(CAR)(腫瘍標的に特異的に結合することができ、且つ結合後に免疫細胞を活性化/刺激することができる受容体)による免疫細胞、詳細にはT細胞の修飾に基づくものである。原理的には、どのような細胞表面分子でもCAR免疫療法を用いて標的化することができ、従って自己抗原に対するトレランスを抑えて患者のMHC状態に依存しない治療を提供することができる。最近の試験では、CD19を標的とするキメラ抗原受容体を発現するように操作したT細胞を使用して、白血病及びリンパ腫患者において顕著な臨床応答が実証されている。CARは、通常、可動性リンカーによってつながった重鎖と軽鎖とからなるモノクローナル抗体由来の単鎖可変断片(scFv)が、次に膜貫通ドメインを介して細胞質シグナリングドメイン(通常CD3ζ鎖)に融合したものを含む。最近では、インビボでのT細胞生存を増強するため、これらの構築物にCD28又は4−1BBなどの共刺激分子由来の追加的な細胞質ドメインが取り入れられている。共刺激分子由来の細胞質ドメインを1つ含むCARは、第2世代CARとして知られ、各々が共刺激分子由来の細胞質ドメインを2つ含むCARは、第3世代CARとして知られ、及び各々が共刺激分子由来の細胞質ドメインを2つ(又はそれを超えて)含むと共に、CARをコードする核酸における追加的な遺伝子修飾の存在(例えば、サイトカイン遺伝子の存在)を伴うCARは、第4世代CARとして知られる。他の遺伝子修飾、例えばサイトカイン遺伝子又は腫瘍部位における免疫抑制機構を回避するための遺伝子の付加もCARに対して行われている。ここで、本発明者らは、CLEC14Aを選択的に標的化するCAR免疫療法を開発した。これに関して、この免疫療法は、特にCLEC14AのC型レクチンドメインに選択的に結合する抗体、詳細にはCLEC14AとMMRN2との間の相互作用を妨げる抗体の結合ドメイン/活性を利用する。このように、本発明者らは、CLEC14AとMMRN2との間の相互作用が血管新生において重要な役割を果たすことを特定した(MMRN2は、emilinファミリーの内皮特異的マーカーであり、細胞外マトリックスの一成分である)。本発明者らは、CLEC14AのC型レクチンドメイン、詳細にはCLEC14Aのアミノ酸残基97〜108に結合する抗CLEC14A抗体によってCLEC14AとMMRN2との間の相互作用を妨げ得ることを更に特定した。これに関して、本発明者らは、CAR免疫療法においてCLEC14Aのこれらのドメインを標的とする抗体の結合活性を主に用いており、例えば腫瘍サイズの低減において、かかる免疫療法を用いた有効な結果を実証している。
第1の態様において、従って、本発明は、
(i)抗CLEC14A結合ドメイン、
(ii)膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメインへの結合能を有する、核酸分子を提供する。
(i)抗CLEC14A結合ドメイン、
(ii)膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメインへの結合能を有する、核酸分子を提供する。
詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AとMMRN2との間の相互作用を妨げる能力を有し得る。
従って、本発明によれば及び上記で考察したとおり、CLEC14AのC型レクチンドメインに結合する抗体の発見及び単離、並びにCLEC14AのC型レクチンドメイン内の特定のエピトープに結合する抗体がCLEC14AとMMRN2との間の相互作用(本発明者らが血管新生における関与を明らかにした)を妨げることが可能であるという知見に基づき、CAR免疫療法が開発された。実施例において示すとおり、本発明者らは、CLEC14AのC型レクチンドメインに結合する結合ドメインを組み込んだ幾つかのCAR免疫療法を作製して試験し、かかるCAR免疫療法が腫瘍サイズ及び容積の低減に有効であることを明らかにしている。4つの具体的な新規抗体(本明細書ではそれぞれCRT1、3、4及び5と記載され、そのCDR、重鎖及び軽鎖可変配列を表1に示す)が本発明者らによって同定されており(これらの抗体は、CLEC14AのC型レクチンドメインへの結合能を有するものである)、本明細書に記載されるCAR免疫療法の開発では、本発明の具体的な療法例の提供にこれらの抗体のCLEC14A結合ドメインが用いられている。本発明のCAR療法を用いたときに生じる意外にも有効な結果は、CARを用いたCLEC14AのC型レクチンドメインのターゲティングが腫瘍血管新生に対する、従って癌に対する有効な治療をもたらし得ることを示している。更に、低ずり応力条件下におけるCLEC14Aの上方制御の関連性により、本発明のCAR療法は、現在のところ有効な治療がほとんど利用可能でない血流が特に制限される腫瘍に対して、例えば膵腫瘍又は卵巣腫瘍において特に有効なものとなり得る。
本発明の更なる態様において、本発明者らは、CLEC14Aの外部領域に特異的に結合し、且つ本発明に係るCARに使用することのできる追加的な抗体を同定した。この特異抗体(本明細書ではCRT2と命名され、その軽鎖CDR及び軽鎖可変配列について表1を参照し得る)は、CLEC14Aに有効に結合することができ、従ってこの抗体の抗原結合能を含むCAR免疫療法が本発明に包含される。
これに関して、第2の実施形態において、本発明は、
(i)抗CLEC14A結合ドメイン、
(ii)膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号167又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(b)配列番号168又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(c)配列番号169又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(d)配列番号129又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR、
(e)配列番号68又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR、及び/又は
(f)配列番号130又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR
の少なくとも1つを含む、核酸分子を更に提供する。
(i)抗CLEC14A結合ドメイン、
(ii)膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号167又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(b)配列番号168又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(c)配列番号169又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(d)配列番号129又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR、
(e)配列番号68又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR、及び/又は
(f)配列番号130又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR
の少なくとも1つを含む、核酸分子を更に提供する。
従って、上記に記載したとおりの本発明の核酸は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするポリヌクレオチド配列を含む。「CAR」又は「キメラ抗原受容体」は、本明細書では同義的に使用され、少なくとも3つのドメイン、即ち、抗原結合ドメイン(本発明では抗CLEC14A結合ドメイン)を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナリングドメインを含む細胞内ドメインとを含む分子を指す。
従って、宿主細胞(以下で更に考察するとおり、詳細にはエフェクター細胞)でCARが発現したとき、抗原結合ドメインは、細胞外ドメイン内に又は細胞外ドメインとして存在することになる。典型的には、ほとんど又は全ての抗原結合ドメインが細胞外に存在して、標的抗原へのCARの結合を可能にすることになる(例えば、CARが宿主細胞において発現し、細胞膜に運ばれて提示されたとき、抗原結合ドメインの少なくとも90、95、97、99又は100%が細胞外に存在することになる)。
膜貫通ドメインは、抗原結合ドメイン(即ち、本発明における抗CLEC14A結合ドメイン)を含む細胞外ドメインを細胞内シグナリングドメインに連結し、CARの発現及び膜標的化後、典型的には宿主細胞の細胞膜にわたって存在する。従って、膜貫通ドメインは、CARの発現及び膜標的化後に細胞膜を貫通する。膜貫通ドメインは、少なくとも1つの膜貫通ドメイン並びに/又は細胞外及び/若しくは細胞内部分を有するタンパク質に由来し、又はそれをベースとすることができ、従って、CARの膜貫通ドメインは、N末端及び/又はC末端において、それが由来した又はそのベースとなった元のタンパク質の細胞外及び/又は細胞内配列/ポリペプチド/タンパク質に付加され得る。従って、膜貫通ドメインが既知の膜貫通タンパク質から得られたか又はそれに由来したものであるとき、膜を貫通するか又はそれにわたって存在する膜貫通ドメインと共に、それにCARを付加するための追加的な配列が細胞外及び/又は細胞内に存在してもよい。以下で更に考察するとおり、膜貫通ドメインは、膜貫通領域及び細胞内領域の両方を有するタンパク質又はタンパク質の一部分、例えばCD28に由来してもよく、及びこれらのドメイン又はその一部分の両方が本発明のCAR内に含まれ得る。
CARの細胞内シグナリングドメインは、CARの発現後、宿主細胞内に存在し(即ち、CARの細胞内ドメイン内に含まれ)、典型的には細胞の細胞質内に存在する。このドメインは、CARを発現させる宿主細胞の1つ以上の正常機能を活性化させる能力を有する。例えば、宿主細胞がT細胞である場合、細胞内シグナリングドメインは、T細胞の細胞溶解活性又はヘルパー活性を活性化させる能力を有し得る。本発明のCARは、加えて、以下で更に詳細に考察するとおりの更なるドメインを含み得る。
「抗CLEC14A結合ドメイン」は、本明細書で使用されるとき、CLEC14Aへの結合能を有するドメイン、詳細にはCAR内で発現して細胞表面上に提示されたときにCLEC14Aへの結合能を有するドメインを指す。詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、細胞の表面上に発現したCLEC14Aへの結合能(例えば、フローサイトメトリー又は免疫組織化学によって評価されるとおり)、コンホメーション依存性の(例えば、非線状の)CLEC14Aエピトープへの結合能(例えば、ウエスタンブロッティングによって評価されるとおり)、遊離CLEC14A(例えば、固体支持体上に組換え発現したCLEC14A)への結合能(例えば、ELISAによって評価されるとおり)及び/又はヒトCLEC14Aへの結合能を有する。より詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、細胞の表面上に発現したCLEC14Aへの結合能を有する。
詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aに選択的に結合し、従って他のタンパク質/分子に対するその結合親和性と比較したときにCLEC14Aに対してより高い結合親和性を有する。好ましくは、抗CLEC14A結合ドメインは、他のタンパク質に結合せず、又はCLEC14Aへの結合と比較して大幅に低下した親和性(例えば、CLEC14Aに対するその親和性の少なくとも10、50、100、500、1000又は10000分の1の親和性)で結合する。従って、本明細書において言及されるとおりの抗CLEC14A結合ドメインは、他のタンパク質へのその結合の少なくとも10、50、100、500、1000又は10000倍の親和性でCLEC14Aに結合し得る。抗CLEC14A結合ドメインの結合親和性は、Biacoreシステムなど、当該技術分野において周知の方法を用いて決定することができる。
抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aと同様であるか若しくはそれとの同一性領域を有するタンパク質、又はCLEC14Aの既知のホモログであるタンパク質に対する結合親和性が、CLEC14Aに対するその結合親和性と比較して低下していることが特に好ましい。従って、この抗CLEC14A結合ドメインは、詳細には、CLEC14Aと少なくとも60、70、80、90又は95%の同一性を有するタンパク質、詳細にはCD248/TEM1/エンドシアリン、トロンボモジュリン及び/又はCD93に対する結合親和性が、CLEC14Aに対するその結合親和性と比較したときに低下している(例えば、結合親和性が少なくとも10、50、100、1000又は10000分の1に低下している)はずである。別の見方をすれば、この抗CLEC14A結合ドメインは、詳細には、CD248/TEM1/エンドシアリン、トロンボモジュリン及び/又はCD93に結合するその親和性の少なくとも10、50、100、1000又は10000倍の親和性でCLEC14Aに結合する。
抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aに対して高い結合親和性を有してもよく、即ち10−5M、10−6M、10−7M又は10−9M又はそれ未満の範囲のKdを有し得る。抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aに対して、30nM、20nM、15nM又は10nM未満、より好ましくは10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5又は1nM未満、最も好ましくは0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2又は0.1nM未満のKdに対応する結合親和性を有し得る。
Kdの決定には任意の適切な方法を用い得る。しかしながら、好ましくは、Kdは、インビトロで様々な濃度の抗原(CLEC14A)に対して様々な濃度の試験抗体を試験して、例えばラインウィーバー・バーク法を用いて飽和曲線を作成することによるか、又はBIAcore 1000 Evaluationソフトウェアの1:1結合モデルなど、市販の結合モデルソフトウェアを使用することにより決定される。
Kd値の決定に関して、標的(例えば、CLEC14A)を発現する細胞を使用した結合実験から導き出される見かけのKd値は、実験条件が見かけの結合親和性に影響を及ぼし得るため、親和性の絶対的な指示値と見なすことはできない点を当業者は理解するであろう。例えば、CLEC14Aの発現レベルは、細胞の培養条件に応じて変わり得ると共に、細胞型間の違いによっても異なり得る。結果的に、ある一組の実験の範囲内で得られた見かけのKd値を比較する方がよく、ある一組の実験で得られたKd値を別の一組の実験で得られたKd値と比較するのは、特に実験条件が大きく変わる場合に必ずしも適切でないこともある。
本明細書における「CLEC14A」という表現は、ヒトCLEC14Aと、他の種由来、例えばウマ、イヌ、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット又は霊長類、例えばサル由来のCLEC14Aのオルソログとの両方を指す。従って、抗CLEC14A結合ドメインは、ヒトCLEC14A及び/又は任意の種由来、例えばマウス由来のCLEC14Aのオルソログへの結合能を有し得る。更に、抗CLEC14A結合ドメインは、好ましくは、CLEC14Aの天然に存在する変異体、例えばヒトCLEC14Aの天然に存在する変異体への結合能を有する。抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aオルソログに対してヒトCLEC14Aへのその結合と異なる親和性で結合し得るが、ヒト及びマウスCLEC14Aには同様の親和性で結合し得る。
「同様の親和性」とは、抗CLEC14Aドメイン、例えば抗体又はリガンドの結合親和性がヒトCLEC14Aに対しても、他の目的とする種(例えば、マウス)の1つ以上に対しても同等であり、例えば差が20倍を超えないことを意味する。より好ましくは、結合親和性の差は、15倍未満、より好ましくは10倍未満、最も好ましくは5、4、3又は2倍未満である。
しかしながら、詳細な実施形態において、抗CLEC14A結合ドメインは、ヒトCLEC14A、詳細にはヒトCLEC14Aの細胞外部分に結合する。ヒトCLEC14Aは、概して490アミノ酸を有し、予測分子量が51kDaであり、14q21.2に位置するclec14A遺伝子によってコードされる。ヒトCLEC14Aには、GenBank受託番号NP_778230に見られるアミノ酸配列及びその天然に存在する変異体が含まれる。ヒトCLEC14Aのアミノ酸配列は、(表1に示されるとおりの)配列番号1に記載されるとおりである。従って、詳細には、本発明において使用されるとおりの抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列への結合能を有する。ヒトCLEC14Aは、CLEC14AのmRNA配列に対応する配列番号2のcDNA配列によってコードされ、及びヒトCLEC4Aのコード領域は配列番号3に示される。
詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、シグナルペプチド(これは、490アミノ酸ヒトポリペプチド配列の残基1〜21に存在する)の除去後の成熟CLEC14Aポリペプチドに結合する。(当該技術分野で利用可能なドメイン予測プログラムの違いにより、タンパク質内における特定のドメインの位置に僅かな差異、例えばCLEC14Aにおけるドメイン位置に関して例えば1、2、3又は4アミノ酸残基の差異が生じ得ることが理解されるであろう。従って、シグナリングドメインは、例えば、残基1〜22にあるものとして予測される可能性がある)。従って、典型的には、抗CLEC14A結合ドメインは、ヒトCLEC14Aの場合、469(又は1〜22のシグナルペプチドが予測される場合には468)アミノ酸の成熟CLEC14A配列(完全ポリペプチド配列の残基22(又は23)〜490)に結合する。上記で考察したとおり、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aの細胞外領域に結合する。ヒトCLEC14Aの場合、従って、抗CLEC14A結合ドメインは、詳細には、配列番号1の490アミノ酸配列の残基22(又は23)〜396の範囲内にある領域(即ち、ヒトCLEC14Aの375(又は374)アミノ酸細胞外ドメインの範囲内にある領域)、例えば細胞外ドメインの残基22〜173にある(又は別の見方をすれば残基23〜173、22〜175、23〜175、32〜173又は32〜175にある)C型レクチンドメイン又は残基245〜287にあるEGF様領域に結合する。ヒトCLEC14Aは、膜貫通ドメイン及び細胞質領域(それぞれ残基397〜425及び426〜490にある)を更に含み、本発明に使用される抗CLEC14A結合ドメインがこれらの領域に結合しないか、又は少なくとも、CLEC14Aの細胞外ドメインへの結合に加えて、上記で考察したとおりの親和性で結合するに過ぎないことが好ましい。詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aの任意の他のドメイン、例えば膜貫通領域及び/又は細胞質領域に対するよりも高い親和性で細胞外ドメインに結合する(例えば、他のCLEC14A領域に対するよりも少なくとも10、50、100、1000又は10000倍高い親和性で細胞外ドメインに結合する)ことが好ましい。
本発明に使用される抗CLEC14A結合ドメインがヒトCLEC14Aのオルソログ又は天然に存在する変異体への結合能を有する場合、結合ドメインが、オルソログ内又は変異体内における上記に定義するとおりのヒトCLEC14Aの細胞外ドメインに対応する領域に結合することが好ましい。オルソロガスタンパク質内における対応する領域は、当該技術分野において周知の配列アラインメントプログラムを用いて容易に決定することができる。
上記で考察したとおり、本発明の第1の態様では、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメインとの結合能を有する。このドメインは、ヒト490アミノ酸CLEC14Aタンパク質配列(配列番号1に示されるとおり)の残基22〜173又は22〜173から1〜4残基以内の位置、例えば残基22〜175、23〜173、23〜175、32〜173又は32〜175に存在し得る。従って、本発明のこの態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、C型レクチンドメインのこの領域(CLEC14Aの細胞外ドメインの範囲内に存在する)に対する又はその範囲内への結合能を有する。上記に指摘したとおり、抗CLEC14A結合ドメインがCLEC14Aオルソログ又は変異体への結合能を有するとき、この態様では、抗CLEC14A結合ドメインが、ヒトCLEC14Aの細胞外ドメインの範囲内に存在するC型レクチンドメインに対応する領域に結合することが好ましい。かかる対応する領域は、配列アラインメントを用いて同定することができる。上記で考察したとおり、抗CLEC14A結合ドメインは、詳細には、CLEC14Aにおける任意の他の領域に対するよりも(例えば、ヒトCLEC14Aの残基245〜287にあるEGF様領域に対するよりも)高い親和性(例えば、少なくとも10、50、100、1000又は10000倍高い)でC型レクチンドメインに結合し得る。
詳細には、本発明の第1の態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメイン内のエピトープへの結合能を有し得る。一部の例では、抗CLEC14A結合ドメインは、ヒトCLEC14Aの残基97〜108に存在し、且つERRRSCHTLENE(配列番号24)のアミノ酸配列を有するエピトープ、又はCLEC14Aオルソログ若しくは天然に存在する変異体の対応するエピトープへの結合能を有し得る。しかしながら、他の例では、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメイン内の異なるエピトープ又は領域に(即ち、残基97〜108でなく)、例えば33〜44、45〜56、57〜68、69〜80、81〜92、109〜120、121〜132、133〜144、145〜156又は157〜168に、又はこの領域とオーバーラップする(97〜108とオーバーラップする)領域に結合し得る。従って、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメイン内にある任意のエピトープ又は残基に結合することが可能である。
本発明の第2の態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aの細胞外ドメインに結合するが、配列番号1の残基22〜173にあるC型レクチンドメイン及び/又はそれから1〜4残基以内の位置、例えば配列番号1の22〜175、23〜173、23〜175、32〜173又は32〜175には結合しないものであり得る。従って、第2の態様では、抗CLEC14A結合ドメインは、詳細には、配列番号1のヒトCLEC14Aの残基174〜396又は配列番号1のヒトCLEC14Aの残基175若しくは176〜396に結合する)。詳細には、この態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号1の残基174〜244(又はこの位置から1〜4アミノ酸残基以内、例えば175〜244又は176〜244)に存在するCLEC14AのSushiドメイン(或いは補体制御タンパク質(CCP)ドメインとして知られる)、又はCLEC14Aオルソロガス配列若しくは天然に存在する変異体における均等な部分に結合し得る。詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、SushiドメインのうちのC型レクチンドメインに隣接した部分、例えば残基174〜210、174〜200又は174〜190に結合し得る。
本明細書に定義するとおりの抗CLEC14A結合ドメインは、CAR分子内に存在するか又は含まれ、且つ適切な宿主細胞上に発現したとき、上記で考察したとおり、CLEC14Aに結合し得る。従って、詳細には、本発明のCAR又は本発明の核酸分子によってコードされるCARは、CARの抗CLEC14A結合ドメインを介してCLEC14Aに結合する能力を有することになる。抗CLEC14A結合ドメインは、単独で(例えば、リガンド又はリガンド分子の一部として)発現したとき、或いは抗体分子若しくはその断片又はscFvの一部として発現したときに、上記で考察したとおりのCLEC14A結合能を更に有し得る。
加えて、上記で詳しく考察したとおり、本発明の第1の態様に使用される抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AとMMRN2との間の相互作用を妨げるか又は阻害する能力を有し得る。詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、ヒトCLEC14AとヒトMMRN2との間の相互作用を妨げる能力を有してもよく、ここで、MMRN2のアミノ酸配列は、表1の配列番号28(配列番号29によってコードされる)に記載されるとおりである。従って、この態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、単離された形態で(又は抗体若しくはscFvの一部として)利用されるときに相互作用を妨げる能力を有する。相互作用を妨げるとは、相互作用を形成するCLEC14A及びMMRN2分子の量の減少、即ちCLEC14AとMMRN2との間の結合レベルの阻害を意味する。詳細には、本発明の第1の態様に使用される抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AとMMRN2との間の結合レベルを少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80又は90%阻害し得る。一態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AとMMRN2との間のいかなる相互作用も防ぐ能力を有することができ、従って相互作用を全て消失させ得る(即ち、CLEC14AとMMRN2との相互作用の100%が阻害され得る)。しかしながら、詳細には、相互作用レベルは、検出不能レベルまで低下し得る。
別の見方をすれば、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aへの結合に関してMMRN2と競合する能力を有し得る。
これに関して、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメイン内にあるCLEC14AポリペプチドのMMRN2結合領域に結合し得る。所与のリガンド又は抗体がMMRN2結合領域に選択的に結合するか否か、又はCLEC14Aポリペプチドへの特異的結合に関してMMRN2と競合するか否かは、エピトープマッピング、競合結合試験等、当該技術分野のルーチンの方法を用いて決定することができる。
CLEC14AとMMRN2との間の相互作用レベルを決定する方法は、当該技術分野において公知であり、プルダウンアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、表面プラズモン共鳴アッセイ、チップベースのアッセイ、免疫細胞蛍光法、酵母2ハイブリッド技術、及びファージディスプレイが挙げられる。CLEC14AとMMRN2との間の相互作用を検出する他の方法としては、限外ろ過とイオンスプレー質量分析/HPLCとを合わせた方法又は他の物理的及び分析的方法が挙げられる。蛍光エネルギー共鳴移動法(FRET)を用いてもよく、ここで、蛍光標識した2つの実体(即ち、CLEC14A及びMMRN2又はその一部分、オルソログ又は変異体)の結合は、互いにごく近接しているときの蛍光標識の相互作用を計測することによって計測され得る。
以下に詳細に考察するとおり、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aに結合する抗体に由来しても、又はCLEC14Aに結合する任意の他のリガンド(例えば、ペプチド又はポリペプチド)に由来してもよい。詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、MMRN2(例えば、配列番号28のヒトMMRN2)に由来してもよく、上記に指摘したとおり、MMRN2は、CLEC14Aと相互作用し、従ってCLEC14Aのリガンドである。抗CLEC14A結合ドメインは、(例えば、ヒトMMRN2に関する配列番号28の)完全長MMRN2アミノ酸配列又は少なくともその一部分を含んでもよく、前記一部分は、CLEC14Aへの結合能を有する。従って、詳細には、MMRN2の一部分は、完全長MMRN2としてのCLEC14Aに対する親和性の少なくとも50、60、70、80、90、100%又はそれを超えるものを有し得る。別の見方をすれば、MMRN2の一部分は、抗CLEC14A結合ドメインに関して上記で考察したとおりのCLEC14Aに対する親和性を有し得る。
詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、上記で考察したとおり、CLEC14Aに結合する能力及びMMRN2とCLEC14Aとの相互作用を妨げる能力を有するMMRN2の一部分を含んでもよい。代替的に又は追加的に、MMRN2の少なくとも一部分は、CLEC14AのC型レクチンドメイン、より詳細にはヒトCLEC14Aの残基97〜108に存在し、且つERRRSCHTLENE(配列番号24)のアミノ酸配列を有するエピトープ、又はCLEC14Aオルソログ若しくは天然に存在する変異体における対応するエピトープへの結合能を有してもよい。抗CLEC14A結合ドメイン内に含まれるMMRN2の一部分は、MMRN2からの少なくとも3つの連続アミノ酸、詳細には少なくとも4、5、6、7、8、9、10、15、20又は25アミノ酸を含んでもよい。
代替的に、抗CLEC14A結合ドメインは、完全長MMRN2又はその一部分の変異体を含んでもよく、前記変異体は、CLEC14Aに(例えば、抗CLEC14A結合ドメインに関して上記で考察したとおりの親和性で)結合する能力を有する。変異体は、完全長MMRN2又はMMRN2の一部分と少なくとも60、70、80、90、95、96、97、98又は99%の配列同一性を有することができ、且つ上記に指摘したとおり、CLEC14Aに結合する能力を保持している。別の見方をすれば、MMRN2変異体は、野生型MMRN2配列と比較したときに1個以上、例えば2、3、4、5、10又は15個のアミノ酸置換、欠失及び/又は付加、例えば保存的置換を含んでもよい。MMRN2部分の変異体に行われるアミノ酸置換、欠失及び/又は付加の数は、その部分の長さに比例し得ることが理解され、ここで、部分が短いほど、長い部分と比べて少ないアミノ酸置換、付加及び/又は欠失を含み得る。
抗CLEC14A結合ドメイン内に含まれるMMRN2変異配列は、野生型MMRN2配列と比べてCLEC14Aに対して異なる結合親和性、例えばより高い又はより低い結合親和性を有してもよく、又は変異体は、CLEC14Aに対して同じ又は実質的に同じ結合親和性(例えば、同等の親和性、例えば20倍以下の差)を有してもよい。しかしながら、変異MMRN2又はMMRN2の変異体を含む抗CLEC14A結合ドメインが、好ましくは先に考察したとおりのCLEC14Aに対する結合親和性を有し得ることは理解されるであろう。
本発明の第1の態様に(例えば、本発明のCARに)使用されるとおりの抗CLEC14A結合ドメインは、その配列が上記で考察した結合活性を有する限り、即ち結合ドメインがCLEC14AのC型レクチンドメインに結合し得る限り、いかなるアミノ酸配列を含むこともできる。しかしながら、詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメインへの結合能を有する少なくとも1つの重鎖又は軽鎖相補性決定領域(CDR)を含み得る。1つ以上のCDRは、上記で考察したとおり(即ち、上記で考察したとおりの親和性及び特異性で)、CLEC14Aへの(即ち、CLEC14AのC型レクチンドメインへの)結合能を有する抗体の重鎖及び/又は軽鎖配列から予測し得る。詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、表1に記載されるとおりの抗体CRT1、3、4又は5のいずれか1つからのCDRを1つ以上含み得る。
これとの関連において、本発明の第2の態様では、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号129、配列番号68若しくは配列番号130又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか1つの変異体の重鎖及び/又は軽鎖CDRから選択される少なくとも1つのCDRを含み、ここで、選択されたCDRは、抗体CRT2(これは、実施例で示すとおり及び表1に記載されるとおりCLEC14Aに結合する)の軽鎖配列(配列番号133)及び重鎖配列(配列番号173)から予測することができる。
従って、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aに結合する抗体から予測することができる少なくとも1つのCDR(又はかかる予測されたCDRの変異体(例えば、1、2又は3個のアミノ酸置換を有する変異体))を含んでもよく、ここで、抗CLEC14A結合ドメイン、従って抗CLEC14A結合ドメインを含むCARは、CLEC14Aへの結合能を有する。
3つ以下のCDR領域(例えば、単一のCDR又は更にはその一部)を含有する分子が、そのCDRの由来である抗体の抗原結合活性を保持する能力を有し得ることは理解されるであろう。2つのCDR領域を含有する分子が、例えばミニボディの形態の、標的抗原への結合能を有するものとして当該技術分野において記載されている(Vaughan and Sollazzo, 2001, Combinational Chemistry & High Throughput Screening, 4, 417-430)。単一のCDRを含有する分子が記載されており、これは、標的への強力な結合活性を呈し得る(Laune et al, 1997, JBC, 272, 30937-44; Nicaise et al, 2004, Protein Science, 13: 1882-91)。
これに関して、本発明に使用される抗CLEC14A結合ドメインは、1つ以上の可変重鎖CDR、例えば1、2又は3つの可変重鎖CDRを含んでもよい。代替的に又は追加的に、抗CLEC14A結合ドメインは、1つ以上の可変軽鎖CDR、例えば1、2又は3つの可変軽鎖CDRを含んでもよい。しかしながら、詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、3つの重鎖CDR及び3つの軽鎖CDRを含むことができ(及びより詳細には重鎖可変領域が3つのCDRを含み、且つ軽鎖可変領域が3つのCDRを含む)、ここで、少なくとも1つのCDRは、CLEC14Aに結合する抗体から予測し得るか、又は以下に提供するCDR配列の1つから選択し得る。
本発明の抗CLEC14A結合ドメインは、可変重鎖及び軽鎖CDRの任意の組み合わせ、例えば1つの可変重鎖CDRを1つの可変軽鎖CDRと一緒に、2つの可変重鎖CDRを1つの可変軽鎖CDRと一緒に、2つの可変重鎖CDRを2つの可変軽鎖CDRと一緒に、3つの可変重鎖CDRを1又は2つの可変軽鎖CDRと一緒に、1つの可変重鎖CDRを2又は3つの可変軽鎖CDRと一緒に、又は3つの可変重鎖CDRを3つの可変軽鎖CDRと一緒に含み得る。
抗CLEC14A結合ドメイン内に存在する1つ以上のCDRは、そのドメインが上記に記載した結合活性を有する限り、全て同じ抗体から予測されなくてもよい。従って、あるCDRがCLEC14Aに結合する抗体の重鎖又は軽鎖から予測されてもよく、一方で別の存在するCDRが異なる抗体から予測されてもよい。この場合、CLEC14Aに結合する抗体からCDR3が予測されることが好ましい場合もある。しかしながら、詳細には、抗CLEC14A結合ドメインに2つ以上のCDRが存在する場合、CLEC14Aに結合する抗体からそれらのCDRが予測されることが好ましい。CDRは、同じCLEC14A結合抗体からのものである必要はなく、異なるCLEC14A抗体、詳細には同じ所望の領域又はエピトープに結合するCLEC14A抗体からのCDRの組み合わせが用いられてもよい。
詳細な実施形態において、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aに結合する抗体の可変重鎖配列から予測される3つのCDRと、CLEC14Aに結合する抗体(好ましくは同じ抗体)の可変軽鎖配列から予測される3つのCDRとを含む。
抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aに結合する抗体の可変重鎖及び軽鎖を更に含んでもよく、詳細にはCLEC14Aに結合する抗体の可変重鎖及び軽鎖を含むscFvを含んでもよい。
「相補性決定領域」又は「CDR」という表現は、本明細書で使用されるとき、特異的抗原、例えばCLEC14Aに結合する抗体内の超可変性領域を指す。従って、抗体のCDRは、通常、抗体にその結合特異性を付与する。3つのCDRは、インタクトな抗体分子(即ち、2つの完全長重鎖及び2つの完全長軽鎖を含む)の各重鎖の可変領域に存在してもよく、及び3つのCDRは、各軽鎖の可変領域に存在してもよい(アミノ末端からカルボキシ末端へと付番して、重鎖CDR1、2及び3並びに軽鎖CDR1、2及び3)。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のCDRは、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域配列から、当該技術分野で利用可能な予測ソフトウェアを用いて、例えばAbysisアルゴリズム(www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)を用いるか、又はIMGT/V-QUESTソフトウェア、例えばwww.IMGT.orqで入手可能なIMGTアルゴリズム(ImMunoGeneTics)を用いて予測することができ、例えばLefranc et al, 2009 NAR 37:D1006-D1012及びLefranc 2003, Leukemia 17: 260-266を参照されたい。いずれのアルゴリズムによって同定されたCDR領域も、本発明での使用に等しく好適であると見なされる。CDRは、その予測の元になる抗体に応じて及び重鎖と軽鎖との間で長さが異なり得る。従って、インタクトな抗体の3つの重鎖CDRは、異なる長さであってもよく(又は同じ長さであってもよく)、インタクトな抗体の3つの軽鎖CDRは、異なる長さであってもよい(又は同じ長さであってもよい)。例えば、CDRは、2又は3アミノ酸長〜5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20アミノ酸長の範囲であり得る。詳細には、CDRは、3〜14アミノ酸長、例えば3アミノ酸以上且つ20アミノ酸未満であり得る。
重鎖及び軽鎖可変領域のCDR(即ち、重鎖可変CDR1、2及び3並びに軽鎖可変CDR1、2及び3)は、通常、フレームワーク領域によって互いに分離されている。重鎖及び軽鎖可変領域の両方は、4つのフレームワーク領域(アミノ末端からカルボキシ末端へと付番して、FR1、2、3及び4)を含む。
用語「重鎖可変領域」(VHドメイン)は、本明細書で使用されるとき、抗体分子の重鎖の可変領域を指す。
用語「軽鎖可変領域」(VLドメイン)は、本明細書で使用されるとき、抗体分子の軽鎖の可変領域を指す。哺乳類抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列及びその可変ドメインのフレームワーク領域にある幾つかのアミノ酸に基づいて、明確に異なる2つのタイプ:カッパ及びラムダの一方に割り当てられる。
本明細書では、CDRの位置を定義するために必要に応じてKabat命名法に従うことに留意しなければならない(Kabat et al, 1991, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 647-669、参照により本明細書に援用される)。
「抗体」という表現には、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fab断片及びFab発現ライブラリによって作製された断片が含まれる。かかる断片には、標的に対するその結合活性を保持している全抗体の断片、Fv、F(ab’)及びF(ab’)2断片、並びに一本鎖抗体(scFv)、融合タンパク質及び抗体の抗原結合部位を含む他のタンパク質が含まれる。この用語には、ファージディスプレイ技法、又は指定されたポリペプチド若しくはその特定の領域に結合する分子に関するランダム選択技法を用いて作製し得る他の抗体様分子も含まれる。従って、用語の抗体には、天然抗体の認識部位の一部(即ち、エピトープ又は抗原に結合するか又はそれと組み合わせになる抗体の一部)である構造を含有するあらゆる分子が含まれる。更に、抗体及びその断片は、ヒト化抗体であってもよく、ここで、フレームワーク領域、例えばVH及び/又はVLのフレームワーク領域は、少なくとも1つのヒトフレームワーク領域に対応するように、当該技術分野において公知の方法を用いて修飾されていてもよい。
「scFv」又は「一本鎖可変断片」という表現は、本明細書で使用されるとき、抗体の可変重鎖(VH)と可変軽鎖(VL)とが可動性オリゴペプチドによって連結されている分子を含む。従って、scFvは、少なくとも1つの可変重鎖と少なくとも1つの可変軽鎖との間の融合物である。通常、可変重鎖及び軽鎖を連結する可動性オリゴペプチドは、5アミノ酸長、特に8、9、10又は11アミノ酸〜20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸長、例えば10〜20、12〜18又は14〜17又は14〜16アミノ酸長であり得る。可動性オリゴペプチドは、グリシン、セリン及び/又はスレオニン残基を含んでもよく、詳細には少なくとも50、60、70又は80%のグリシン残基を含んでもよい。可動性リンカーは、概して可変重鎖のC末端を可変軽鎖のN末端につなぐか、又は可変軽鎖のC末端を可変重鎖のN末端につなぎ得る。scFv抗体などの操作された抗体は、当該技術分野において公知の技法及び手法を用いて作製することができる。
Fab、Fv、scFv及びdAb抗体は、全て大腸菌(E. coli)で発現させて、そこから分泌させることができ、これにより大量の抗体断片の作製が容易に可能になる。全抗体又はインタクトな抗体は、二価であり、即ち2つの抗原結合部位を有する。Fab、Fv、scFv及びdAb断片は、通常、一価であり、従って、通常、抗原結合部位を1つのみ有する。従って、一価scFvは、1つの可変重鎖と1つの可変軽鎖とを含み得る。しかしながら、scFvが(一価に加えて)二価、三価又は四価であり得る可能性、及びscFvが2つ以上の可変重鎖及び2つ以上の可変軽鎖、例えば2、3又は4つの可変重鎖又は可変軽鎖を含み得る可能性もある。2つ以上の可変重鎖及び/又は可変軽鎖は、同じであってもよく、又は異なる抗体由来であってもよい。scFvは、ダイアボディ、トリボディ又はテトラボディであってもよい。この態様において、用いられる可動性リンカーは、上記で一価scFvに用いられるとおりのものと比べて短いこともある。
「CLEC14Aに結合する抗体」という表現は、抗CLEC14A結合ドメインに関する上記の考察と同じCLEC14Aに対する結合親和性を有する抗体を指す。詳細には、本発明の第1の態様において、CLEC14Aに結合する抗体は、既に定義したとおりCLEC14AのC型レクチンドメインに結合する。
第1の態様の更なる実施形態において、抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号211又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には(S/T)SYW(I/M)(E/H)(配列番号150)、GYTF(S/T)SYW(配列番号151)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号212又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細にはWIG(E/A)I(L/Y)PG(S/N)(G/S)(S/D)T(N/S)(配列番号152)、I(L/Y)PG(S/N)(G/S)(S/D)T(配列番号153)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号213又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には(A/T)(R/H)(G/X)(G/X)(D/X)Y(D/Y)(E/G)(E/S)(Y/D)Y(V/A/L)MD(配列番号154)、(A/T)(R/H)(G/X)(G/X)(D/X)Y(D/Y)(E/G)(E/S)(Y/D)Y(V/A/L)MDY(配列番号155)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
(式中、Xは、アミノ酸残基なしである)
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号211又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には(S/T)SYW(I/M)(E/H)(配列番号150)、GYTF(S/T)SYW(配列番号151)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号212又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細にはWIG(E/A)I(L/Y)PG(S/N)(G/S)(S/D)T(N/S)(配列番号152)、I(L/Y)PG(S/N)(G/S)(S/D)T(配列番号153)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号213又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には(A/T)(R/H)(G/X)(G/X)(D/X)Y(D/Y)(E/G)(E/S)(Y/D)Y(V/A/L)MD(配列番号154)、(A/T)(R/H)(G/X)(G/X)(D/X)Y(D/Y)(E/G)(E/S)(Y/D)Y(V/A/L)MDY(配列番号155)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
(式中、Xは、アミノ酸残基なしである)
の少なくとも1つを含んでもよい。
従って、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号150、151、152、153、154若しくは155のいずれか1つ以上、又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有する配列番号150〜155のいずれか1つ以上の1つ以上の変異体を含んでもよい。本明細書に記載されるアミノ酸配列との関連において「/」の使用は、特定の位置に存在し得るアミノ酸残基の選択を指す。例えば「S/T」という表現は、その位置にS又はTのいずれかの残基が存在し得ることを示し、及びGYTF/Xという表現は、その位置にGYTFが存在し得るか、又はアミノ酸が存在しないかのいずれかであることを示している。従って、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号150、152及び/若しくは154から選択されるか、又は配列番号151、153及び/若しくは155から選択される1つ以上のアミノ酸配列、或いは上記に定義したとおりのこれらの配列のいずれか1つ以上の変異体を含む。
詳細には、この態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、上記に記載したCDRの2又は3つを含んでもよい。より詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号150若しくは151のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号152若しくは153のアミノ酸配列を有するCDR及び154若しくは155のアミノ酸配列を有するCDR、又は上記に定義したとおりのこれらの配列のいずれかの1つ以上の変異体を含んでもよく、例えば抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号150、152及び154若しくは配列番号151、153及び155又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらのCDRのいずれかの1つ以上の変異体を含んでもよい。
更に、本発明の第1の態様、抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)S/X S/X S Y M/L Y/H W Y(配列番号156)、SSVS Y/S S/X Y/X(配列番号157)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号214又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細にはL L/W IY D/S TSNLA(配列番号158)、D/S TS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号215又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細にはQ/H Q W/Y S/H S/R Y/S P L/R(配列番号160)、Q/H Q W/Y S/H S/R Y/S P L/R T F/X(配列番号161)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
(式中、Xは、アミノ酸なしである)
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)S/X S/X S Y M/L Y/H W Y(配列番号156)、SSVS Y/S S/X Y/X(配列番号157)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号214又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細にはL L/W IY D/S TSNLA(配列番号158)、D/S TS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号215又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細にはQ/H Q W/Y S/H S/R Y/S P L/R(配列番号160)、Q/H Q W/Y S/H S/R Y/S P L/R T F/X(配列番号161)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
(式中、Xは、アミノ酸なしである)
の少なくとも1つを含んでもよい。
従って、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号156、157、158、160、161若しくはD/S TSのいずれか1つ以上、又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体を含んでもよい。従って、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号156、158及び/若しくは160から選択されるか、又は配列番号157、161及び/若しくはD/S TSから選択される1つ以上のアミノ酸配列、或いは上記に記載されるとおりのこれらの配列の1つ以上の変異体を含んでもよい。
詳細には、この態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、上記に記載されるCDRの2又は3つ、例えば(a)から選択される1つのCDR、(b)から選択される1つのCDR及び/又は(c)から選択される1つのCDRを含んでもよい。より詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号156又は157のCDR、配列番号158又はD/S TSのCDR及び160又は161のCDRを含んでもよく、例えば、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号156、158及び160若しくは配列番号157、161及びD/S TS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらのCDRのいずれかの変異体を含んでもよい。
第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号150〜155のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのCDR及び(/又は)配列番号156〜161のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのCDR、例えば配列番号150〜155からの2つのCDR及び配列番号156〜161からの2つのCDRを含んでもよい。詳細には、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号150若しくは151のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号152若しくは153のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号154若しくは155のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号156若しくは157のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号158若しくはD/S TSのアミノ酸配列を有するCDR及び配列番号160若しくは161のアミノ酸配列を有するCDR、又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか1つの1つ以上の変異体を含んでもよい。本発明の最も好ましい態様において、第1の態様に係る抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号150、152、154、156、158及び/若しくは160のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号151、153、155、157、161及び/若しくはD/S TSのアミノ酸配列を有するCDR、或いは1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか1つの1つ以上の変異体を含んでもよい。
第1の態様によれば、本発明は、より詳細には、
(i)抗CLEC14A結合ドメイン、
(ii)膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメインへの結合能を有し、前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号32、配列番号44、配列番号64、配列番号76又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号33、配列番号45、配列番号65、配列番号77又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2及び/又は
(c)配列番号116、配列番号118、配列番号66、配列番号78、配列番号34、配列番号46、配列番号100、配列番号102又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
の少なくとも1つを含む核酸分子を提供する。
(i)抗CLEC14A結合ドメイン、
(ii)膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメインへの結合能を有し、前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号32、配列番号44、配列番号64、配列番号76又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号33、配列番号45、配列番号65、配列番号77又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2及び/又は
(c)配列番号116、配列番号118、配列番号66、配列番号78、配列番号34、配列番号46、配列番号100、配列番号102又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
の少なくとも1つを含む核酸分子を提供する。
従って、抗CLEC14A結合ドメインは、上記に記載される重鎖可変CDR配列から選択される1、2又は3つのCDRを含んでもよい。詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、(a)に提供される配列から選択される1つのCDR、(b)に提供される配列から選択される1つのCDR及び/若しくは(c)に提供される配列からの1つのCDR、又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するそれらの配列の1つ以上の変異体を含んでもよい。例えば、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号32のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号33のアミノ酸配列を有するCDR及び配列番号66又は116のアミノ酸配列を有するCDRを含んでもよい。
第1の態様によれば、本発明は、
(i)抗CLEC14A結合ドメイン、
(ii)膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメインへの結合能を有し、前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号35、配列番号47、配列番号67、配列番号79又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号36、DTS、配列番号68、STS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号37、配列番号49、配列番号69、配列番号81又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
の少なくとも1つを含む核酸分子を更に提供する。
(i)抗CLEC14A結合ドメイン、
(ii)膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメインへの結合能を有し、前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号35、配列番号47、配列番号67、配列番号79又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号36、DTS、配列番号68、STS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号37、配列番号49、配列番号69、配列番号81又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
の少なくとも1つを含む核酸分子を更に提供する。
従って、抗CLEC14A結合ドメインは、上記に記載される軽鎖CDR配列から選択される1、2又は3つのCDRを含んでもよい。詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、(a)に提供される配列から選択される1つのCDR、(b)に提供される配列から選択される1つのCDR及び/若しくは(c)に提供される配列からの1つのCDR、又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するそれらの配列の1つ以上の変異体を含んでもよい。例えば、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号35のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号68のアミノ酸配列を有するCDR及び配列番号49のアミノ酸配列を有するCDRを含んでもよい。
第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号32、33、34、44、45、46、100、102、116、118、64、65、66、76、77若しくは78のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのCDR及び(/又は)配列番号35、36、37、47、49、67、68、69、79、81、STS若しくはDTSのいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのCDR、例えば配列番号32、33、34、44、45、46、100、102、116、118、64、65、66、76、77又は78からの2つのCDR及び配列番号35、36、37、47、49、67、68、69、7981、STS又はDTSからの2つのCDRを含んでもよい。詳細には、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号32、44、64若しくは76のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号33、45、65若しくは77のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号34、46、100、102、116、118、66若しくは78のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号35、47、67若しくは79のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号36、68、STS若しくはDTSのアミノ酸配列を有するCDR及び配列番号37、49、69若しくは81のアミノ酸配列を有するCDR、又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか1つの1つ以上の変異体を含んでもよい。
より詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号209又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号32、配列番号44又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号210又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号33、配列番号45又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号207又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号116、配列番号118、配列番号34、配列番号46、配列番号100、配列番号102又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号209又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号32、配列番号44又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号210又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号33、配列番号45又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号207又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号116、配列番号118、配列番号34、配列番号46、配列番号100、配列番号102又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
の少なくとも1つを含んでもよい。
従って、上記に指摘したとおり、抗CLEC14A結合ドメインは、上述のCDRの2又は3つを含んでもよく、詳細には、(a)から選択される1つのCDR、(b)から選択される1つのCDR及び/又は(c)から選択される1つのCDRを含んでもよい。従って、好ましくは、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号32、33及び/若しくは34、配列番号44、45及び/若しくは46、配列番号32、33及び/若しくは100、配列番号44、45及び/若しくは102、配列番号32、33及び/若しくは116又は配列番号44、45及び/若しくは118、或いは1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか1つ以上の変異体から選択される少なくとも1つの重鎖CDRを含んでもよい。
特に好ましい実施形態において、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、
配列番号32、配列番号33及び配列番号34、
配列番号44、配列番号45及び配列番号46、
配列番号32、配列番号33及び配列番号100、
配列番号44、配列番号45及び配列番号102、
配列番号32、配列番号33及び配列番号116、又は
配列番号44、配列番号45及び配列番号102
(上記に挙げた配列のいずれも1、2又は3個のアミノ酸置換を含み得る)のアミノ酸配列を有するCDRを含んでもよい。
配列番号32、配列番号33及び配列番号34、
配列番号44、配列番号45及び配列番号46、
配列番号32、配列番号33及び配列番号100、
配列番号44、配列番号45及び配列番号102、
配列番号32、配列番号33及び配列番号116、又は
配列番号44、配列番号45及び配列番号102
(上記に挙げた配列のいずれも1、2又は3個のアミノ酸置換を含み得る)のアミノ酸配列を有するCDRを含んでもよい。
更に、抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号35、配列番号47又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号36、DTS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号208又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号37、配列番号49又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号35、配列番号47又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号36、DTS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号208又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号37、配列番号49又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
の少なくとも1つを含んでもよい。
従って、上記に指摘したとおり、抗CLEC14A結合ドメインは、上述のCDRの2又は3つを含んでもよく、詳細には、(a)から選択される1つのCDR、(b)から選択される1つのCDR及び/又は(c)から選択される1つのCDRを含んでもよい。従って、好ましくは、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号35、36及び/若しくは37、配列番号47、49及び/若しくはDTS又は配列番号47及び/若しくはDTS、或いは1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか1つ以上の変異体から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRを含んでもよい。
特に好ましい実施形態において、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号35、配列番号36及び配列番号37又は配列番号47、DTS及び配列番号49(上記の配列の任意の1つ以上が1、2又は3個のアミノ酸置換を有し得る)のアミノ酸配列を有するCDRを含んでもよい。
第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号32、33、34、44、45、46、100、102、116又は118のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのCDR及び配列番号35、36、37、47若しくは49又はDTSのいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのCDR、例えば配列番号32、33、34、44、45、46、100、102、116又は118からの2つのCDR及び配列番号35、36、37、47若しくは49又はDTSからの2つのCDRを含んでもよい。詳細には、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号32若しくは44のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号33若しくは45のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号34、46、100、102、116若しくは118のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号35若しくは47のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号36若しくはDTSのアミノ酸配列を有するCDR及び配列番号37若しくは49のアミノ酸配列を有するCDR、又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか1つの1つ以上の変異体を含んでもよい。
詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、
配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36及び/若しくは配列番号37、
配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、DTS及び/若しくは配列番号49、
配列番号32、配列番号33、配列番号100、配列番号35、配列番号36及び/若しくは配列番号37、
配列番号44、配列番号45、配列番号102、配列番号47、DTS及び/若しくは配列番号49、
配列番号32、配列番号33、配列番号116、配列番号35、配列番号36及び/若しくは配列番号37、又は
配列番号44、配列番号45、配列番号118、配列番号47、DTS及び/若しくは配列番号49
(上記の配列番号の任意の1つ以上が1、2又は3個のアミノ酸置換を含み得る)のアミノ酸配列を有するCDRを含んでもよい。
配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36及び/若しくは配列番号37、
配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、DTS及び/若しくは配列番号49、
配列番号32、配列番号33、配列番号100、配列番号35、配列番号36及び/若しくは配列番号37、
配列番号44、配列番号45、配列番号102、配列番号47、DTS及び/若しくは配列番号49、
配列番号32、配列番号33、配列番号116、配列番号35、配列番号36及び/若しくは配列番号37、又は
配列番号44、配列番号45、配列番号118、配列番号47、DTS及び/若しくは配列番号49
(上記の配列番号の任意の1つ以上が1、2又は3個のアミノ酸置換を含み得る)のアミノ酸配列を有するCDRを含んでもよい。
別の見方をすれば、抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号209のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号210のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、
(c)配列番号207のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
(d)配列番号35又は47のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(e)配列番号36又はDTSのアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(f)配列番号208のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含んでもよい。
(a)配列番号209のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号210のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、
(c)配列番号207のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、
(d)配列番号35又は47のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(e)配列番号36又はDTSのアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(f)配列番号208のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含んでもよい。
代替的に、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号216又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号64、配列番号76又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号217又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号65、配列番号77又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号218又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号66、配列番号78又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号216又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号64、配列番号76又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号217又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号65、配列番号77又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号218又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号66、配列番号78又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
の少なくとも1つを含んでもよい。
この実施形態において、抗CLEC14A結合ドメインは、詳細には、(a)からの1つのCDR、(b)からの1つのCDR及び/又は(c)からの1つのCDR、例えば配列番号64、配列番号65及び配列番号66から選択される少なくとも1つのCDR若しくは配列番号76、配列番号77及び配列番号78から選択される少なくとも1つのCDR、又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれかの変異体を含んでもよい。
従って、好ましい実施形態において、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、
配列番号64、配列番号65及び/又は配列番号66、又は
配列番号76、配列番号77及び/又は配列番号78
(上記に挙げた配列のいずれも1、2又は3個のアミノ酸置換を有し得る)の配列を有するCDRを含んでもよい。
配列番号64、配列番号65及び/又は配列番号66、又は
配列番号76、配列番号77及び/又は配列番号78
(上記に挙げた配列のいずれも1、2又は3個のアミノ酸置換を有し得る)の配列を有するCDRを含んでもよい。
更に、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号219又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号67、配列番号79又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号220又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号68、STS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号221又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号69、配列番号81又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号219又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号67、配列番号79又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号220又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号68、STS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号221又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体(例えば、詳細には配列番号69、配列番号81又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体)のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
の少なくとも1つを含んでもよい。
この実施形態において、抗CLEC14A結合ドメインは、詳細には、(a)からの1つのCDR、(b)からの1つのCDR及び/又は(c)からの1つのCDR、例えば配列番号67、68若しくは69から選択される少なくとも1つのCDR、又は配列番号79、81若しくはSTSから選択される少なくとも1つのCDR、或いは1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれかの変異体を含んでもよい。
従って、詳細には、この態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、
配列番号67、配列番号68及び/又は配列番号69、又は
配列番号79、STS及び/又は配列番号81
(上記の配列の任意の1つ以上が1、2又は3個のアミノ酸置換を含み得る)の配列を有するCDRを含んでもよい。
配列番号67、配列番号68及び/又は配列番号69、又は
配列番号79、STS及び/又は配列番号81
(上記の配列の任意の1つ以上が1、2又は3個のアミノ酸置換を含み得る)の配列を有するCDRを含んでもよい。
第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号64、65、66、76、77及び78のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのCDR及び配列番号67、68、69、79、81又はSTSのいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのCDR、例えば配列番号64、65、66、76、77及び78からの2つのCDR及び配列番号67、68、69、79、81又はSTSからの2つのCDRを含んでもよい。詳細には、第1の態様の抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号64若しくは76のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号65若しくは77のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号66若しくは78のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号67若しくは79のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号68若しくはSTSのアミノ酸配列を有するCDR及び配列番号69若しくは81のアミノ酸配列を有するCDR、又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか1つの1つ以上の変異体を含んでもよい。
詳細には、抗CLEC14A結合ドメインは、
配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68及び/又は配列番号69、又は
配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、STS及び/又は配列番号81
(上記の配列の任意の1つ以上が1、2又は3個のアミノ酸置換を含み得る)のアミノ酸配列を有するCDRを含んでもよい。
配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68及び/又は配列番号69、又は
配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、STS及び/又は配列番号81
(上記の配列の任意の1つ以上が1、2又は3個のアミノ酸置換を含み得る)のアミノ酸配列を有するCDRを含んでもよい。
先に考察したとおり、本発明の第2の態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号167又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(b)配列番号168又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(c)配列番号169又は1、2、若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(d)配列番号129又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR、
(e)配列番号68又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR、及び/又は
(f)配列番号130又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR
の少なくとも1つを含む。
(a)配列番号167又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(b)配列番号168又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(c)配列番号169又は1、2、若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(d)配列番号129又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR、
(e)配列番号68又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR、及び/又は
(f)配列番号130又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR
の少なくとも1つを含む。
従って、第2の態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及び/又は(f)からの1、2又は3つのCDR、詳細には(a)からの1つのCDR、(b)からの1つのCDR及び(c)からの1つのCDR、並びに/若しくは(d)からの1つのCDR、(e)からの1つのCDR及び(f)からの1つのCDR、又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか1つ以上の変異体を含んでもよい。
従って、詳細には、第2の態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号167、配列番号168及び配列番号169並びに/又は配列番号129、配列番号68及び配列番号130のアミノ酸配列を有するCDRを含む。
上記で考察したとおり、抗CLEC14A結合ドメインは、上記で考察したCDR配列のいずれかの変異配列を含んでもよい。これに関して、抗CLEC14A結合ドメインに存在する任意のCDR配列の1つ以上が変異配列であってもよい。例えば、抗CLEC14A結合ドメインが可変重鎖抗体配列からの1〜3つのCDRを含むとき、それらのCDRのいずれか1つが変異体であるか、全てが変異体であるか、又はいずれも変異体でないことがあり得る。代替的に、抗CLEC14A結合ドメインが軽鎖抗体配列からの1〜3つのCDRを含むとき、それらのCDRのいずれか1つが変異体であるか、全てが変異体であるか、又はいずれも変異体でないことがあり得る。従って、抗CLEC14A結合ドメインが6つのCDR(例えば、重鎖から3つ及び軽鎖から3つ)を含むとき、存在するCDR配列の1、2、3、4、5又は6つが変異配列であってもよく、抗CLEC14A結合ドメイン内の各個別のCDRが1、2又は3個のアミノ酸置換を有し得る。抗CLEC14A結合ドメインは、非変異CDR配列及び変異CDR配列の両方を含んでもよい。代替的に、抗CLEC14A結合ドメインは、全て変異CDR配列を含んでもよく、又は変異CDR配列を全く含まなくてもよい。
先に考察したとおり、変異CDRは、1、2又は3個のアミノ酸置換を含み得る。しかしながら、より短いCDR配列について、アミノ酸置換が少ない方が好ましい場合もあることは理解されるであろう。例えば、CDR配列が僅か3アミノ酸長である場合、3個のアミノ酸置換が存在し得るが(例えば、保存的置換)、好ましくは、CDRは、3個より少ない置換、例えば2個、1個のアミノ酸置換を有するか、又はアミノ酸置換を全く有しないものであり得る。
以下で更に考察するとおり、変異体は、任意のアミノ酸置換を有し得るが、好ましくは保存的アミノ酸置換を有し得る。詳細には、変異CDRを含む抗CLEC14A結合ドメイン(及びそれを中に含むCAR)は、上記に定義したとおりCLEC14Aへの結合能を保持していなければならない。変異CDRを使用すると、抗CLEC14A結合ドメインの結合活性が変化し得る(例えば、CLEC14Aに対する結合親和性が増加又は減少し得るか、又は結合ドメインがCLEC14Aの異なるエピトープを認識し得る)ことが理解されるであろう。しかしながら、前述のとおり、1つ以上の変異CDR配列を使用してもなお、上記に定義したとおりのCLEC14A結合が(その結合が1つ以上の非変異CDRを含む抗CLEC14A結合ドメインの結合と同一でないとしても)可能でなければならない。代替的に、先述のとおり、結合親和性は同様であってもよい。CLEC14Aに対する結合親和性が低下した抗CLEC14A結合ドメイン(及び本発明のCAR)をもたらす1つ以上の変異CDRを抗CLEC14A結合ドメインに使用することが好ましい場合もあり得る。このようにしてオフターゲットCLEC14A結合(例えば、非腫瘍組織への結合)を低減し、詳細には最小限に抑える一方、オンターゲット結合(即ち、腫瘍血管構造への結合)を最大化し得る。
従って、本発明の更なる実施形態では、CLEC14Aに対する結合親和性が低下した抗CLEC14A結合ドメインを同定する方法が包含され、前記方法は、抗CLEC14A結合ドメイン内に含まれる本明細書に定義するとおりのCDR配列に1つ以上のアミノ酸置換(詳細には1、2又は3個のアミノ酸置換)を導入すること、及びCLEC14Aに対するその結合親和性に関して変異ドメインを試験することを含む。
本発明は、上記に定義したCDR配列のいずれか1つ以上又はその変異体を含む重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域を含む抗CLEC14A結合ドメインを更に提供する。従って、上記に定義したCDRは、抗CLEC14A結合ドメイン内の重鎖及び/又は軽鎖可変領域内に存在し得る。先に考察したとおり、抗CLEC14A結合ドメインは、3つのCDRを有するVH及び/又は3つのCDRを有するVLを含んでもよく、これらのCDRの少なくとも1つは、上記に記載されるCDR配列の1つ又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体から選択される。
本発明の第1の態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号56、
(b)配列番号88、
(c)配列番号90、
(d)配列番号104
(e)配列番号106、又は
(f)配列番号121
のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも80%の同一性、例えば1〜20個、例えば1〜10個のアミノ酸置換を有する(a)、(b)、(c)、(d)、(e)若しくは(f)のいずれか1つの変異体を含んでもよい。
(a)配列番号56、
(b)配列番号88、
(c)配列番号90、
(d)配列番号104
(e)配列番号106、又は
(f)配列番号121
のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも80%の同一性、例えば1〜20個、例えば1〜10個のアミノ酸置換を有する(a)、(b)、(c)、(d)、(e)若しくは(f)のいずれか1つの変異体を含んでもよい。
本発明の第2の態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号173のアミノ酸配列又はそれと少なくとも80%の同一性を有する、例えば1〜20個、例えば1〜10個のアミノ酸置換を有するその変異体を含んでもよい。
従って、この態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、上記に記載されるとおりの可変重鎖配列又は以下に更に定義するとおりそれと少なくとも80%の同一性を有する、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15又は20個のアミノ酸置換を有するその変異体を含んでもよい。重鎖可変配列(例えば、配列番号56、88、90、104、106、121及び173のもの)が1つ以上のCDR(例えば、3つのCDR)を含み得ることは理解されるであろう。これに関して、上記の重鎖可変領域配列は、例えば、20%まで(例えば、20個のアミノ酸置換まで)改変し得るが、重鎖可変領域内に存在するいずれのCDRも、各々最大3個のアミノ酸置換(例えば、1CDR当たり1、2又は3個のアミノ酸置換)のみを受けることが好ましい。従って、配列番号56に関して、それと少なくとも80%の同一性を有する変異体が包含されるが、そこに含まれる配列番号32、配列番号33及び配列番号34の配列は、アミノ酸置換を各々3個までのみ有することが好ましい。配列番号88に関して、そこに含まれる配列番号64、65及び66の配列は、アミノ酸置換を各々3個までのみ含むことが好ましい。これは、配列番号90内に含まれる配列番号76、77及び78、配列番号104内に含まれる配列番号32、33及び100、配列番号106内に含まれる配列番号44、45及び102、配列番号121内に含まれる配列番号32、33及び116並びに配列番号173内に含まれる配列番号167、168及び169にも適用される。
本発明の第1の態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号57、
(b)配列番号89、
(c)配列番号91、
(d)配列番号105、
(e)配列番号107、又は
(f)配列番号122
のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも80%の同一性を有する、例えば1〜20個、例えば1〜10個のアミノ酸置換を有する(a)、(b)、(c)、(d)、(e)若しくは(f)のいずれか1つの変異体を含んでもよい。
(a)配列番号57、
(b)配列番号89、
(c)配列番号91、
(d)配列番号105、
(e)配列番号107、又は
(f)配列番号122
のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも80%の同一性を有する、例えば1〜20個、例えば1〜10個のアミノ酸置換を有する(a)、(b)、(c)、(d)、(e)若しくは(f)のいずれか1つの変異体を含んでもよい。
本発明の第2の態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号133のアミノ酸配列又はそれと少なくとも80%の同一性を有する、例えば1〜20個、例えば1〜10個のアミノ酸置換を有するその変異体を含んでもよい。
従って、これらの態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、上記に記載されるとおりの可変軽鎖配列又はそれと少なくとも80%の同一性を有する、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15又は20個のアミノ酸置換を有するその変異体を含んでもよい。軽鎖可変配列(例えば、配列番号57、89、91、105、107若しくは122又は133のもの)が1つ以上のCDR(例えば、3つのCDR)を含み得ることは理解されるであろう。これに関して、上記の軽鎖可変領域配列は、例えば、20%まで改変し得るが、軽鎖可変領域内に存在するいずれのCDRも、各々最大3個のアミノ酸置換(例えば、1CDR当たり1、2又は3個のアミノ酸置換)のみを受けることが好ましい。従って、配列番号57に関して、それと少なくとも80%の同一性を有する変異体が包含されるが、そこに含まれる配列番号35、配列番号36及び配列番号37の配列は、アミノ酸置換を各々3個までのみ含むことが好ましい。配列番号89に関して、そこに含まれる配列番号67、68及び69の配列は、アミノ酸置換を各々3個までのみ有することが好ましい。これは、配列番号91内に含まれる配列番号79、81及びSTS、配列番号105内に含まれる配列番号35、36及び37、配列番号107内に含まれる配列番号47及び49及びDTS、配列番号122内に含まれる配列番号35、36及び37並びに配列番号133内に含まれる配列番号129、68及び130にも適用される。
詳細には、本発明の第1の態様によれば、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14A(即ち、CLEC14A上のC型レクチンドメイン)に結合する重鎖及び軽鎖可変配列を含んでもよい。従って、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号56、88、90、104、106若しくは121のいずれか1つ又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体、及び配列番号57、89、91、105、107若しくは122のいずれか1つ又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体を含んでもよい。従って、この態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号56又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号57又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体、
(b)配列番号88又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号89又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体
(c)配列番号90又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号91又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体、
(d)配列番号104又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号105又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体、
(e)配列番号106又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号107又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体、又は
(f)配列番号121又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号122又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体
を含んでもよい。
(a)配列番号56又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号57又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体、
(b)配列番号88又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号89又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体
(c)配列番号90又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号91又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体、
(d)配列番号104又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号105又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体、
(e)配列番号106又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号107又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体、又は
(f)配列番号121又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体及び配列番号122又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体
を含んでもよい。
上記で考察したとおり、配列番号56、57、88、89、90、91、104、105、106、107、121及び122の重鎖及び軽鎖可変領域内に存在するいずれのCDRも、アミノ酸置換を1CDR当たり1、2又は3個までのみ有することが好ましい。
本発明の第2の態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14A(即ち、CLEC14A上のC型レクチンドメイン)に結合する重鎖及び軽鎖可変配列を含んでもよい。従って、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号173の重鎖可変配列及び配列番号133の軽鎖可変配列、又はそれと少なくとも80%の同一性を有するいずれか一方又は両方の配列の変異体を含んでもよい。
先に考察したとおり、本発明に係る「変異」配列とは、定義された配列又は参照配列(即ち、配列番号によって提供されるもの)と比較したときに複数のアミノ酸置換を有する配列を指す。従って、変異配列は、元の配列と比較したときに異なるアミノ酸残基を有し得る。いかなるアミノ酸置換を行って変異配列を得てもよいが、先に考察したとおり、いずれのかかる変異配列も、元の配列の機能活性、例えば結合親和性をある程度保持していなければならない。従って、変異体は、元の配列と比較して増加した又は低下した機能活性(例えば、結合親和性)を有し得るが、一部の機能を保持していなければならない。変異CDR又は変異重鎖若しくは軽鎖を含む本発明の抗CLEC14A結合ドメインの場合、変異配列を含む抗CLEC14A結合ドメインがなおもCLEC14Aに結合できることが好ましい。変異体の実際の結合親和性は、抗CLEC14A結合ドメインと異なり得るが(増加又は低下している)、CLEC14Aに対する結合は、なおも選択的に起こらなければならない。
従って、変異配列(例えば、CDR又は重鎖/軽鎖)を含む抗CLEC14A結合ドメインは、好ましくは非変異配列を含む抗CLEC14A結合ドメインと実質的に同じ結合親和性を有しなければならない。例えば、変異体は、非変異配列を有する抗CLEC14A結合ドメインの結合親和性の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、100、105、110、115、120又は125%又はそれを超えるものを有し得る。CLEC14Aに対する結合親和性の検出及び計測方法は、当該技術分野において公知である。例えば、プルダウンアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、表面プラズモン共鳴アッセイ、チップベースのアッセイ、免疫細胞蛍光法、酵母2ハイブリッド技術及びファージディスプレイを用い得る。
本明細書に記載されるアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であってもよく、例えば、あるアミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含め、当該技術分野において定義されている。従って、保存的アミノ酸置換には、(元の残基⇔置換)Ala(A)⇔Val、Gly又はPro、Arg(R)⇔Lys又はHis、Asn(N)⇔Gln、Asp(D)⇔Glu、Cys(C)⇔Ser、Gln(Q)⇔Asn、Glu(G)⇔Asp、Gly(G)⇔Ala、His(H)⇔Arg、Ile(I)⇔Leu、Leu(L)⇔Ile、Val又はMet、Lys(K)⇔Arg、Met(M)⇔Leu、Phe(F)⇔Tyr、Pro(P)⇔Ala、Ser(S)⇔Thr又はCys、Thr(T)⇔Ser、Trp(W)⇔Tyr、Tyr(Y)⇔Phe又はTrp、及びVal(V)⇔Leu又はAlaが含まれる。
第1の態様の更なる実施形態において、抗CLEC14A結合ドメインは、上記に定義される重鎖及び軽鎖を含むscFvを含んでもよく、ここで、前記重鎖及び軽鎖は、先に定義したとおりのリンカー配列によってつなぎ合わされる。詳細には、この態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号58、
(b)配列番号96、
(c)配列番号112、又は
(d)配列番号125
のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでもよい。
(a)配列番号58、
(b)配列番号96、
(c)配列番号112、又は
(d)配列番号125
のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでもよい。
第2の態様の更なる実施形態において、抗CLEC14A結合ドメインは、上記に定義される重鎖及び軽鎖(配列番号133及び173)を含むscFvを含んでもよく、ここで、前記重鎖及び軽鎖は、先に定義したとおりのリンカー配列によってつなぎ合わされている。詳細には、この態様において、抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号175のアミノ酸配列又はそれと少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでもよい。
従って、当業者は、本発明の抗CLEC14A結合ドメインにおいて配列番号58、96、112、125又は175のscFv配列に対する変異配列を使用することが可能であり得ることを理解するであろう。かかる変異体は、上記で考察したとおり、好ましくは非修飾scFv配列の結合親和性を保持しているか、又は非修飾scFv配列の結合親和性を実質的に保持している、例えば非修飾scFv配列の結合親和性の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110又は120%を有し得る。
非修飾アミノ酸又はヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有する本発明のアミノ酸又はヌクレオチド配列は、少なくとも85、90、95、96、97、98又は99%の同一性を有する配列を含む。例えば、配列番号58、96、112、125又は175の上記のscFv配列に関して、それと少なくとも85、90、95、96、97、98又は99%の同一性を有する配列が包含される。配列同一性は、任意の好都合な方法によって評価し得る。しかしながら、配列間の同一性の程度の決定には、配列の多重アラインメントを行うコンピュータプログラム、例えばClustal Wが有用である。必要に応じて、Clustal WアルゴリズムをBLOSUM 62スコアリング行列及びギャップ開始ペナルティ10及びギャップ伸長ペナルティ0.1と共に使用することができ、そのようにして、配列の一方の全長の少なくとも50%がアラインメントに関与する2つの配列間の高次の一致が達成される。2つのアミノ酸配列間のパーセンテージ同一性を計算する他の方法も一般に当該技術分野で認められており、例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projectsに記載されるものが挙げられる。
概して、かかる計算にはコンピュータプログラムが利用されることになる。配列のペアを比較してアラインメントするプログラム、例えばALIGN、FASTA、ギャップ付きBLAST、BLASTP、BLASTN又はGCGもこの目的に有用である。更に、欧州バイオインフォマティクス研究所のDaliサーバは、構造ベースのタンパク質配列アラインメントを提供している。
参考として、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%等の配列同一性を有する本発明に係る配列は、ALIGNプログラムをデフォルトパラメータで用いて決定し得る(例えば、インターネット上でGENESTREAMネットワークサーバ、IGH、モンペリエ、フランスにおいて利用可能)。
上記で考察したとおり、本発明の定義された配列と少なくとも80%の配列同一性を有する変異配列は、好ましくは、そこに含まれる特定のCDR内にアミノ酸置換を3個までのみ有することになる。従って、変異体は、定義された配列とその長さ全体にわたって少なくとも80%の同一性を示し得るが、好ましくは、そこに含まれるいずれのCDRもアミノ酸置換を最大でも3個のみ有し、例えばアミノ酸置換を全く有しないか、1又は2個のみを有することになる。従って、この場合、任意のCDRの外側、例えばフレームワーク領域内にある重鎖若しくは軽鎖可変鎖配列又はscFv配列の領域に変異が生じることが好ましい。任意のCDRの外側、例えばフレームワーク領域における変異について、変異にはアミノ酸置換、欠失及び/又は付加が含まれ得る。
例えば、抗CLEC14A結合ドメイン内にあるとおりのVH、VL及びscFvに関して、変異にはフレームワーク領域のヒト化が含まれ得ることが理解されるであろう。VH、VL又はscFvは、公知の方法で、例えばマウス配列のCDR領域をヒト抗体のフレームワークに挿入することによりヒト化し得る。ヒト化抗体は、Verhoeyen et al (1988) Science, 239, 1534-1536及びKettleborough et al, (1991) Protein Engineering, l4(7), 773-783に記載される技法及び手法を用いて作製することができる。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域の全て又はほとんどが非ヒト免疫グロブリンのものに対応する可変ドメインと、実質的に又は完全にヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであるフレームワーク領域とを含有することになる。
第1の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、
(a)配列番号38、配列番号50、配列番号82、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号39、配列番号51又は配列番号83、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号40、配列番号52、配列番号84、配列番号101、配列番号103、配列番号117、配列番号120、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号38、配列番号50、配列番号82、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号39、配列番号51又は配列番号83、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号40、配列番号52、配列番号84、配列番号101、配列番号103、配列番号117、配列番号120、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
上記に定義されるヌクレオチド配列は、それぞれ本明細書に記載される抗CLEC14A結合ドメイン内に存在し得る重鎖CDRをコードする。(a)に記載されるヌクレオチド配列は、抗体CRT1、3、4及び5の重鎖CDR1配列をコードし(従って配列番号38が配列番号32をコードし、配列番号50が配列番号44をコードし、及び配列番号82が配列番号76をコードする)、(b)に記載されるヌクレオチド配列は、抗体CRT1、3、4及び5の重鎖CDR2配列をコードし(従って配列番号39が配列番号33をコードし、配列番号51が配列番号45をコードし、及び配列番号83が配列番号77をコードする)、及び(c)に記載されるヌクレオチド配列は、抗体CRT1、3、4及び5の重鎖CDR3配列をコードする(従って配列番号40が配列番号34をコードし、配列番号52が配列番号46をコードし、配列番号84が配列番号78をコードし、配列番号101が配列番号100をコードし、配列番号117が配列番号116をコードし、及び配列番号120が配列番号118をコードする)。従って、ポリヌクレオチドは、定義されたヌクレオチド配列のいずれか1つ、例えばこれらの配列の2又は3つを含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、(a)からの1つ、(b)からの1つ及び/又は(c)からの1つのヌクレオチド配列を含んでもよい。
更に縮重変異体が包含される。遺伝子コードの縮重に起因して幾つかの異なるヌクレオチド配列が同じアミノ酸配列をコードし得ることは理解されるであろう。従って、特定のアミノ酸について、2つ以上のヌクレオチドコドンがそのアミノ酸をコードし得る。従って、縮重変異体には、配列番号によって定義されるヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド変異体が包含される。詳細には、縮重変異体にはコドン最適化変異体が包含されてもよく、ここで、コドン最適化は、特定の生物におけるコード配列の発現を増強するために行われ得る。これは、当該技術分野における標準的実践であり、当業者は、宿主に基づきヌクレオチド配列をコドン最適化する方法を十分に理解しているであろう。
追加的に又は代替的に、第1の態様に定義されるとおりのポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列:
(a)配列番号41、配列番号53、配列番号85、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号42、GACACATCC、AGCACATCC、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号43、配列番号55、配列番号87、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号41、配列番号53、配列番号85、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号42、GACACATCC、AGCACATCC、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号43、配列番号55、配列番号87、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
上記に定義されるヌクレオチド配列は、それぞれ本明細書に記載される抗CLEC14A結合ドメイン内に存在し得る軽鎖CDRをコードする。(a)に記載されるヌクレオチド配列は、抗体CRT1、3、4及び5の軽鎖CDR1配列をコードし(従って配列番号41が配列番号35をコードし、配列番号53が配列番号47をコードし、及び配列番号85が配列番号79をコードする)、(b)に記載されるヌクレオチド配列は、抗体CRT1、3、4及び5の軽鎖CDR2配列をコードし(従って配列番号42が配列番号36をコードし、GACACATCCがDTSをコードし、及びAGCACATCCがSTSをコードする)、及び(c)に記載されるヌクレオチド配列は、抗体CRT1、3、4及び5の軽鎖CDR3配列をコードする(従って配列番号43が配列番号37をコードし、配列番号55が配列番号49をコードし、及び配列番号87が配列番号81をコードする)。従って、ポリヌクレオチドは、定義されたヌクレオチド配列のいずれか1つ、例えばこれらの配列の2又は3つを含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、(a)からの1つ、(b)からの1つ及び/又は(c)からの1つのヌクレオチド配列を含んでもよい。
ポリヌクレオチド配列は、重鎖CDRをコードする配列番号38、39、40、50、51、52、82、83、84、101、103、117又は120のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列及び軽鎖CDRをコードする配列番号41、42、43、53、55、85、87、AGCACATCC又はGACACATCCのいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列、例えば配列番号38、39、40、50、51、52、82、83、84、101、103、117又は120から選択される少なくとも2つのヌクレオチド配列及び配列番号41、42、43、53、55、85、87、AGCACATCC又はGACACATCCから選択される少なくとも2つのヌクレオチド配列を含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号38、50又は82の1つのヌクレオチド配列、配列番号39、51又は83の1つのヌクレオチド配列、配列番号40、52、84、101、103、117又は120の1つのヌクレオチド配列、41、53又は85の1つのヌクレオチド配列、42又はAGCACATCC若しくはGACACATCCの1つのヌクレオチド配列及び43、55又は87の1つのヌクレオチド配列、或いは1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するこれらの配列の1つ以上の変異体を含んでもよい。
より詳細には、ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列
(a)配列番号38、配列番号50、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号39、配列番号51、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号40、配列番号52、配列番号101、配列番号103、配列番号117、配列番号120、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号38、配列番号50、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号39、配列番号51、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号40、配列番号52、配列番号101、配列番号103、配列番号117、配列番号120、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
従って、上記に指摘したとおり、ポリヌクレオチドは、上述のヌクレオチド配列の2又は3つを含んでもよく、詳細には、(a)からの1つ、(b)からの1つ及び/又は(c)からの1つのヌクレオチド配列を含んでもよい。より詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号38、39及び/若しくは40、配列番号50、51及び/若しくは52、配列番号38、39及び/若しくは101、配列番号50、51及び/若しくは103、配列番号38、39及び/若しくは117又は配列番号50、51及び/若しくは120又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するこれらの配列のいずれかの変異体を含んでもよい。
特に好ましい実施形態において、第1の態様のポリヌクレオチドは、
配列番号38、配列番号39及び配列番号40、
配列番号50、配列番号51及び配列番号52、
配列番号38、配列番号39及び配列番号101、
配列番号50、配列番号51及び配列番号103、
配列番号38、配列番号39及び配列番号117、又は
配列番号50、配列番号51及び配列番号120
(上記の配列のいずれも1、2又は3個のヌクレオチド置換を含み得る)のヌクレオチド配列を含んでもよい。
配列番号38、配列番号39及び配列番号40、
配列番号50、配列番号51及び配列番号52、
配列番号38、配列番号39及び配列番号101、
配列番号50、配列番号51及び配列番号103、
配列番号38、配列番号39及び配列番号117、又は
配列番号50、配列番号51及び配列番号120
(上記の配列のいずれも1、2又は3個のヌクレオチド置換を含み得る)のヌクレオチド配列を含んでもよい。
更に、ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列:
(a)配列番号41、配列番号53、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号42又はGACACATCC、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号43、配列番号55、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号41、配列番号53、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号42又はGACACATCC、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号43、配列番号55、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
従って、上記に指摘したとおり、ポリヌクレオチドは、上述のヌクレオチド配列の2又は3つを含んでもよく、詳細には、(a)からの1つ、(b)からの1つ及び/又は(c)からの1つのヌクレオチドを含んでもよい。従って、好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号41、42及び/若しくは43から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列、又は配列番号53、55及び/若しくはGACACATCCから選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列、或いは1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するこれらの配列のいずれか1つ以上の変異体を含んでもよい。
詳細な実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号41、配列番号42及び配列番号43又は配列番号53、GACACATCC及び配列番号55(ヌクレオチド配列のいずれか1つ以上が1、2又は3個のアミノ酸置換を有し得るか、又は縮重配列であり得る)を含んでもよい。
第1の態様のポリヌクレオチドは、配列番号38、39、40、50、51、52、101、103、117又は120のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列及び配列番号41、42、43、53若しくは55又はGACACATCCのいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列、例えば配列番号38、39、40、50、51、52、101、103、117又は120のいずれか1つ以上から選択される少なくとも2つのヌクレオチド配列及び配列番号41、42、43、53若しくは55又はGACACATCCのいずれか1つ以上から選択される少なくとも2つのヌクレオチド配列を含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号38又は50のヌクレオチド配列、配列番号39又は51のヌクレオチド配列、配列番号40、52、101、103、117又は120のヌクレオチド配列、配列番号41又は53のヌクレオチド配列、配列番号42又はGACACATCCのヌクレオチド配列及び配列番号43又は55のヌクレオチド配列を含んでもよい。
詳細には、ポリヌクレオチド配列は、
配列番号38、39、40、41、42及び43、
配列番号50、51、52、53、55及びGACACATCC、
配列番号38、39、101、41、42及び43、
配列番号50、51、103、53、55及びGACACATCC、
配列番号38、39、117、41、42及び43、又は
配列番号50、51、120、53、55及びGACACATCC、
(上記の配列番号の任意の1つ以上が1、2又は3個のアミノ酸置換を有し得るか、又はその縮重配列であり得る)のヌクレオチド配列を含んでもよい。
配列番号38、39、40、41、42及び43、
配列番号50、51、52、53、55及びGACACATCC、
配列番号38、39、101、41、42及び43、
配列番号50、51、103、53、55及びGACACATCC、
配列番号38、39、117、41、42及び43、又は
配列番号50、51、120、53、55及びGACACATCC、
(上記の配列番号の任意の1つ以上が1、2又は3個のアミノ酸置換を有し得るか、又はその縮重配列であり得る)のヌクレオチド配列を含んでもよい。
代替的に、ポリヌクレオチド配列は、
(a)配列番号82、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号83、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号84、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号82、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号83、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号84、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号82、83又は84の配列の2つを含んでもよく、又は配列番号82、83及び84の全てを含んでもよい。
更に、ポリヌクレオチドは、
(a)配列番号85、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)AGCACATCC、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号87、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号85、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)AGCACATCC、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号87、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号85、87又はAGCACATCCの配列の2つを含んでもよく、又は配列番号85、87及びAGCACATCCの全てを含んでもよい。第1の態様のポリヌクレオチド配列は、配列番号82、83及び84のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列及び配列番号85、87及びAGCACATCCから選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列、例えば配列番号82、83及び84からの2つのヌクレオチド配列及び配列番号85、87及びAGCACATCCからの2つのヌクレオチド配列を含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号82、83、84、85、87及びAGCACATCCの全て(配列の任意の1つ以上が1、2又は3個のヌクレオチド置換を含み得る)を含んでもよい。
本発明の第2の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、
(a)配列番号170、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体、
(b)配列番号171、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体、及び/又は
(c)配列番号172、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号170、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体、
(b)配列番号171、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体、及び/又は
(c)配列番号172、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
従って、ポリヌクレオチド配列は、配列番号170、配列番号171及び配列番号172から選択される2つのヌクレオチド配列を含んでもよい。詳細には、第2の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号170、配列番号171及び配列番号172を含んでもよい。
先に考察したとおり、本発明の第2の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、
(a)配列番号131、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体、
(b)配列番号74、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体、及び/又は
(c)配列番号132、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
(a)配列番号131、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体、
(b)配列番号74、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体、及び/又は
(c)配列番号132、その縮重変異体又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する変異体
の少なくとも1つを含んでもよい。
従って、第2の態様では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号131、配列番号74及び配列番号132から選択される2つのヌクレオチド配列を含んでもよい。詳細には、第2の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号131、74及び132を含んでもよい。
更に、第2の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号170、171、172、131、74及び/又は132のいずれか1つ以上を含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号170、171、172、131、74及び132の全て、又はそれらの配列のいずれか1つ以上の縮重変異体、又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有する配列のいずれか1つ以上の変異体を含んでもよい。
上記で考察したとおり、ポリヌクレオチド配列は、上記に記載されるヌクレオチド配列のいずれかの変異体を含んでもよい。これに関して、ヌクレオチド配列の1つ以上が変異配列であってもよい。例えば、ポリヌクレオチドが、重鎖CDRをコードする定義されたヌクレオチド配列の1〜3つを含むとき、それらの配列のいずれか1つが変異体であるか、全てが変異体であるか、又はいずれも変異体でないことがあり得る。代替的に、ポリヌクレオチド配列が、軽鎖CDRをコードする定義されたヌクレオチド配列の1〜3つを含むとき、それらの配列のいずれか1つが変異体であるか、全てが変異体であるか、又はいずれも変異体でないことがあり得る。従って、ポリヌクレオチドが、軽鎖及び重鎖CDRをコードする6つのヌクレオチド配列を含むとき(例えば、軽鎖をコードする3つ及び重鎖をコードする3つ)、CDRをコードするヌクレオチド配列の1、2、3、4、5又は6つが変異配列であってもよく、各個別のヌクレオチド配列が1、2又は3個のヌクレオチド置換を含み得る。ポリヌクレオチド配列は、変異ヌクレオチド配列及び非変異ヌクレオチド配列の両方を含んでもよく、代替的に全て変異ヌクレオチド配列を含んでもよく、又は変異ヌクレオチド配列を全く含まなくてもよい。
当業者によれば、配列内のヌクレオチド置換は、核酸コードの縮重に起因して、コードされるタンパク質又はポリペプチド配列のアミノ酸変化をもたらすことも又はもたらさないこともあることは理解されるであろう。従って、複数のコドンが同じアミノ酸をコードし得る。これに関して、本発明のヌクレオチド変異体は、非変異配列と同じアミノ酸配列をコードし得る。ヌクレオチド置換がアミノ酸置換をもたらす場合、上記で考察したとおり、置換が保存的であり(しかしながら、本発明は、保存的アミノ酸置換に限定されない)、及びコードされる抗CLEC14A結合ドメインが上記で先に考察した機能を有することが好ましい。
本発明の第1の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、
(a)配列番号59、
(b)配列番号92、
(c)配列番号94、
(d)配列番号108、
(e)配列番号110、又は
(f)配列番号123
のいずれか1つ、又は1〜10個のヌクレオチド置換を有する(a)、(b)、(c)、(d)、(e)若しくは(f)のいずれか1つの変異体を含んでもよい。
(a)配列番号59、
(b)配列番号92、
(c)配列番号94、
(d)配列番号108、
(e)配列番号110、又は
(f)配列番号123
のいずれか1つ、又は1〜10個のヌクレオチド置換を有する(a)、(b)、(c)、(d)、(e)若しくは(f)のいずれか1つの変異体を含んでもよい。
従って、本発明の第1の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、重鎖可変領域をコードする上記に記載したとおりのヌクレオチド配列又は1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個のヌクレオチド置換を有するその変異体を含んでもよい。コードされる重鎖可変領域が少なくとも1つのCDR(特に3つのCDR)を含み得ることは理解されるであろう。これに関して、上記のヌクレオチド配列は、10ヌクレオチドまで異なり得るが、配列番号59、92、94、108、110及び123のヌクレオチド配列のうちのCDRをコードする部分は、1CDR当たり3個までのヌクレオチド置換のみ異なることが好ましい。詳細には、配列番号59、92、94、108、110及び123のうちのCDRをコードする任意の領域の外側にあるヌクレオチド配列、例えば配列のうちのフレームワーク領域をコードする領域又は部分に任意の変異が生じることが好ましい。従って、配列番号59について、この配列に対してヌクレオチド置換は10個まで行われ得るが、配列番号59内に含まれる配列番号38、39及び40又は配列番号50、51及び52の各々に最大で3個の置換が行われてもよい。配列番号92について配列番号70、71又は72の各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号94について配列番号82、83及び84の各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号108について配列番号38、39及び101の各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号110について配列番号50、51及び52の各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよく、及び配列番号123について配列番号38、39及び117の各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよい。
第1の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、
(a)配列番号60、
(b)配列番号93、
(c)配列番号95、
(d)配列番号109、
(e)配列番号111、又は
(f)配列番号124
のいずれか1つ、又は1〜10個のヌクレオチド置換を有する(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のいずれか1つの変異体、又はその縮重変異体を含んでもよい。
(a)配列番号60、
(b)配列番号93、
(c)配列番号95、
(d)配列番号109、
(e)配列番号111、又は
(f)配列番号124
のいずれか1つ、又は1〜10個のヌクレオチド置換を有する(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のいずれか1つの変異体、又はその縮重変異体を含んでもよい。
本発明の第2の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号174及び/又は配列番号134又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体を含んでもよい。
従って、ポリヌクレオチド配列は、軽鎖可変領域をコードする上記に記載したとおりのヌクレオチド配列(配列番号60、93、95、109、111、124又は134)又は1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個のヌクレオチド置換を有するその変異体を含んでもよい。コードされる軽鎖可変領域が少なくとも1つのCDR(特に3つのCDR)を含み得ることは理解されるであろう。これに関して、上記のヌクレオチド配列は、10ヌクレオチドまで異なり得るが、配列番号60、93、95、109、111、124又は134のヌクレオチド配列のうちのCDRをコードする部分は、3個までのヌクレオチド置換のみ異なることが好ましい。詳細には、配列番号60、93、95、109、111、124又は134のうちのCDRをコードする任意の領域の外側にあるヌクレオチド配列、例えば配列のうちのフレームワーク領域をコードする領域又は部分に任意の変異が生じることが好ましい。従って、配列番号60について、この配列に対してヌクレオチド置換は10個まで行われ得るが、配列番号60内に含まれる配列番号41、42及び43又は配列番号53、55及びGACACATCCの各々に最大で3個の置換が行われてもよい。配列番号93について配列番号73、74及び75の各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号95について配列番号85、87及びAGCACATCCの各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号109について配列番号41、42及び43の各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号111について配列番号53、55及びGACACATCCの各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号124について配列番号53、55及びGACACATCCの各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよく、及び配列番号134について配列番号131、74及び132の各々に最大で3個のヌクレオチド置換が行われてもよい。
本発明の詳細な実施形態において、ポリヌクレオチドは、CLEC14A(本発明の第1の態様によればCLEC14AのC型レクチンドメイン)に結合する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方をコードする配列を含んでもよい。従って、ポリヌクレオチドは、配列番号59、92、94、108、110、123及び174のいずれか1つ又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体と、配列番号60、93、95、109、111、124及び134のいずれか1つ又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体とを含んでもよい。従って、この態様において、ポリヌクレオチドは、
(a)配列番号59、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号60、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号92、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号93、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(c)配列番号94、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号95、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(d)配列番号108、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号109、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(e)配列番号110、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号111、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(f)配列番号123、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号124、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、又は
(g)配列番号174、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号134、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体
を含んでもよい。
(a)配列番号59、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号60、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号92、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号93、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(c)配列番号94、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号95、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(d)配列番号108、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号109、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(e)配列番号110、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号111、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(f)配列番号123、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号124、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、又は
(g)配列番号174、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号134、その縮重変異体又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体
を含んでもよい。
これとの関連において、ポリヌクレオチドは、CLEC14Aに結合する抗体の軽鎖及び重鎖可変鎖を含むscFvをコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、前記軽鎖と重鎖とは先に定義したとおりのリンカー配列によってつなぎ合わされていてもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、scFvをコードする以下の配列:
(a)配列番号61、
(b)配列番号97、
(c)配列番号113、
(d)配列番号126、又は
(e)配列番号176
の1つ、又はその縮重変異体又は(a)、(b)、(c)若しくは(d)のいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでもよい。
(a)配列番号61、
(b)配列番号97、
(c)配列番号113、
(d)配列番号126、又は
(e)配列番号176
の1つ、又はその縮重変異体又は(a)、(b)、(c)若しくは(d)のいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでもよい。
従って、当業者は、上記のscFvコードヌクレオチド配列(配列番号61、97、113、126又は176)に対する変異配列を使用する可能性があってよく、上記で考察したとおりのかかる変異配列は、好ましくは、非修飾scFvの結合親和性を保持しているか又は非修飾scFv配列の結合親和性を実質的に保持しているscFvをコードすることになり、例えばscFv配列の結合親和性の少なくとも50、60、70、80、90、100、110又は120%を有し得ることを理解するであろう。詳細には、scFvは、上記で先に考察したとおりの抗CLEC14A結合ドメインの結合親和性を有し得る。
本明細書で考察するとおり、定義されたヌクレオチド配列の縮重変異体も包含される。詳細には、特定の生物の細胞内での発現に最適化されたコドン最適化ヌクレオチド配列が包含される。例えば、ヒト又はマウス細胞における発現にコドン最適化されたポリヌクレオチド配列が開発されてもよく、及び本発明に包含される。
より詳細には、抗CLEC14A結合ドメインに含まれるscFvをコードするポリヌクレオチド配列がコドン最適化され得る。これに関して、本明細書に定義するとおりの抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号177、178、179、180、181、182、183、184、185若しくは186のいずれか1つを含むポリヌクレオチド、又はそれと少なくとも80%の同一性を有する変異体によってコードされてもよく、又はそれによってコードされるアミノ酸配列を含んでもよく、ここで、前記変異体は、上記に定義したとおりの、CLEC14Aへの結合能を有するscFvをコードする。この態様において、配列番号177及び178は、それぞれ配列番号61のヒト及びマウスコドン最適化配列に関し、配列番号179及び180は、それぞれ配列番号176のヒト及びマウスコドン最適化配列に関し、配列番号181及び182は、それぞれ配列番号97のヒト及びマウスコドン最適化配列に関し、配列番号183及び184は、それぞれ配列番号113のヒト及びマウスコドン最適化配列に関し、及び配列番号185及び186は、それぞれ配列番号126のヒト及びマウスコドン最適化配列に関する。
配列同一性は、先に考察したとおり決定することができる。更に、既に考察したとおり、変異は、ヌクレオチド配列のうちのCDR領域をコードしない領域に生じることが好ましい。これらの領域については上記で考察したとおりである。
上記に定義されるヌクレオチド配列はDNAであるが、本発明の代替的実施形態では、ヌクレオチド配列はRNAであってもよい。従って、本明細書に記載されるDNA配列に対応するRNA配列が包含される。当業者は、上記に記載されるそれらのDNA配列と同じタンパク質/ポリペプチド産物をコードするRNA配列がどのように得られるかについて、例えば「T」を「U」に置き換えなければならないなどを理解しているであろう。
用語「核酸配列」、又は「核酸分子」、又は「ポリヌクレオチド」、又は「ヌクレオチド配列」は、本明細書で使用されるとき、天然に存在する塩基、糖及び糖間(骨格)連結で構成されるヌクレオシド又はヌクレオチド単量体の配列を指す。この用語には、天然に存在しない単量体又はその一部分を含む修飾又は置換配列も含まれる。本発明の核酸、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列は、デオキシリボ核酸配列(DNA)又はリボ核酸配列(RNA)であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含めた天然に存在する塩基を含み得る。配列は、修飾塩基も含有し得る。かかる修飾塩基の例としては、アザ及びデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシル、並びにキサンチン及びヒポキサンチンが挙げられる。核酸、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列は二本鎖又は一本鎖であってもよい。核酸、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列は、全体的に又は部分的に合成又は組換えであってもよい。
上記で考察したとおり、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、抗CLEC14A結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナリングドメインとを含むCARをコードする。
本明細書で使用されるとおりの「膜貫通ドメイン」は、任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインをベースとし得るか、又はそれに由来し得る。典型的には、それは、CD8α、CD28、CD4、CD3ζ CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86、CD134(OX40)、CD137(4−1BB)及びCD154、好ましくはヒトCD8α、CD28、CD4、CD3ζ CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及びCD154の膜貫通ドメインであり得るか、又はそれに由来し得る。一実施形態において、膜貫通ドメインは、CD8α、CD28、CD4又はCD3ζ、好ましくはヒトCD28、CD4又はCD3ζの膜貫通ドメインであり得るか、又はそれに由来し得る。別の実施形態において膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、それは、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性の残基を含み得る。従って、膜貫通ドメインは、細胞の細胞膜にわたって又はその範囲内に存在することが可能である。上記で考察したとおり、膜貫通ドメインは、細胞外及び/又は細胞内部分を含むタンパク質に由来してもよく、従って、本明細書で使用されるとおりの膜貫通ドメインは、細胞膜内にあるか又はそれにわたる部分に加えて、元のタンパク質に由来する細胞外及び/又は細胞内残基に付加していてもよい。例えば、膜貫通ドメインは、元のタンパク質に由来するヒンジ又はスペーサー領域に付加していてもよく、例えば、CD8αに由来する膜貫通ドメインは、CD8αに由来するスペーサー又はヒンジドメインに付加していてもよい。細胞膜内の膜貫通ドメインの存在は、蛍光顕微鏡法による蛍光標識を含め、当該技術分野において公知の任意の好適な方法を用いて評価することができる。
膜貫通ドメインは、一実施形態において、CARの抗CLEC14A結合ドメインを細胞内シグナリングドメインに連結してもよく、ここで、細胞内シグナリングドメインは、膜貫通ドメインと異なるタンパク質に由来してもよく、又は膜貫通ドメインと同じタンパク質に由来してもよい(例えば、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが、天然で同じタンパク質内に見られる膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインと同じ配列を有してもよい)。従って、一実施形態において、膜貫通ドメインと細胞内シグナリングドメインとは、同じタンパク質からのものであってよく、又は同じタンパク質に由来してもよい。別の実施形態において、膜貫通ドメインは、同様に共刺激部分を含むタンパク質に由来してもよく、従って、CARは、そのタンパク質からの膜貫通ドメインと、また共刺激シグナルを提供する能力を有する部分との両方を含んでもよい。
本明細書で使用されるとおりの膜貫通ドメインは、そのドメインがなおも膜内に存在する能力を有する限り、天然に存在する膜貫通ドメインの配列と異なる配列を有してもよい。例えば、膜貫通ドメインは、その修飾ドメインが細胞膜にわたって存在する能力を有する限り、天然に存在するタンパク質の膜貫通ドメインと少なくとも70、80、90、95、96、97、98又は99%の配列同一性を有してもよい。配列同一性は、先に考察したとおり計測し得る。
好ましい実施形態において膜貫通ドメインは、配列番号146のアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD28膜貫通ドメインである。別の見方をすれば、CD28膜貫通ドメインは、配列番号147のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。
更なる実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号119に記載されるヌクレオチド配列又はそれと少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるCD8α膜貫通ドメインである。この膜貫通配列は、配列番号165又はそれと少なくとも95%の配列同一性を有する配列に示されるとおりのCD8αからのヒンジドメインに更に付加されていてもよい。
「細胞内シグナリングドメイン」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原(CLEC14A)への有効なCAR結合のメッセージを細胞(宿主細胞、例えば免疫エフェクター細胞)の内部に伝達して、細胞機能(例えば、エフェクター細胞機能)、例えば活性化、サイトカイン産生、増殖及びCARが結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出を含めた細胞傷害活性、又は細胞外CARドメインへの抗原結合によって生じる他の細胞応答を生じさせることに関与するCARタンパク質の一部を指す。
用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含めたヘルプ若しくは活性であり得る。従って、「エフェクター細胞」は、かかるエフェクター機能を有する細胞である。従って、用語「細胞内シグナリングドメイン」は、タンパク質のうちのエフェクター機能シグナルを伝達する一部分であって、且つ細胞が特殊化した機能を果たすように指図する一部分を指す。本発明では、天然に存在するタンパク質の細胞内シグナリングドメイン全体を用いることができるが、多くの場合にドメイン全体を使用する必要はない。天然に存在する細胞内シグナリングドメインの変異体、例えばトランケートされた一部分が使用される限りにおいて、それがエフェクター機能シグナルを伝達する、例えば完全長ドメインとしてのエフェクター機能伝達能力の少なくとも50、60、70、80、90又は95%を有するのであれば、かかる変異体(例えば、トランケートされた一部分)をドメイン全体の代わりに使用し得る。変異体の(例えば、トランケート型の)細胞内シグナリングドメインは、更にエフェクター機能シグナル伝達能力が増加していてもよく、例えば、完全長細胞内シグナリングドメインと比較して少なくとも105、110、120、130又は140%のエフェクター機能伝達能力を有してもよい。エフェクター機能伝達能力は、標的との作用後に細胞のエフェクター機能を計測すること、例えばサイトカイン放出、細胞増殖等を計測することによって計測し得る。従って、用語の細胞内シグナリングドメインには、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナリングドメインの任意のトランケートされた一部分が含まれることが意図される。
変異細胞内シグナリングドメインは、天然に存在する細胞内シグナリングドメインと少なくとも70、80、90又は95%の配列同一性を有し得る。トランケート型ドメインが使用されている場合、%配列同一性は完全長配列と比較したときに70%未満となり得ることが理解されるであろう。細胞内シグナリングドメインは、「シグナル伝達ドメイン」としても知られ、典型的にはヒトCD3ζ又はFcRy鎖の一部分に由来する。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるCARに用いられる細胞内シグナリングドメインの他の例としては、T細胞受容体(TCR)及び抗原受容体会合後に協働して作用してシグナル伝達を惹起する共受容体の細胞質配列、並びに上記で考察したとおりのこれらの配列の任意の変異体が挙げられる。TCR単独で生成されたシグナルは、T細胞の完全な活性化には概して不十分であり、二次シグナル及び/又は共刺激シグナルも必要となり得ることが知られている。従って、T細胞活性化は、2つの異なるシグナリング配列クラス:TCR(細胞内シグナリングドメイン)を介して抗原依存性の一次活性化を惹起するもの及び抗原非依存的に作用して二次シグナル又は共刺激シグナルを提供するもの(共刺激ドメインなど)によって媒介されると言うことができる。共刺激ドメインは、エフェクター機能の活性化を促進し、またエフェクター機能の持続性及び/又は細胞の生存も促進し得る。
刺激性の様式で作用する細胞内シグナリングドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)として知られるシグナリングモチーフ(例えば、2、3、4、5個又はそれを超えるITAM)を含有し得る。例えば、CD3ζ、Fc受容体γ、Fc受容体β、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及びCD66dは、1つ以上のITAMを含む。従って、一実施形態において、本明細書において使用される細胞内シグナリングドメインは、例えば、CD3ζ、Fc受容体γ、Fc受容体β、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及びCD66dのいずれか1つ以上からの1つ以上のITAMを含み得る。上記で考察したとおり、細胞内シグナリングドメインが先に考察したとおりのエフェクター機能の誘導能を有する限り、細胞内シグナリングドメイン内にITAMの変異体を使用し得ることは理解されるであろう。
詳細には、本明細書に定義するとおりのCARは、CD3ζに由来する細胞内シグナリングドメイン、より詳細には配列番号148の配列若しくはそれと少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号149のヌクレオチド配列若しくはそれと少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる細胞内シグナリングドメインを含み得る。
先に指摘したとおり、ポリヌクレオチドは、追加的な部分又はドメインを含み、即ち、抗CLEC14A結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナリングドメインに加えて含むCARをコードし得る。従って、詳細には、CARは、少なくとも1つの共刺激ドメインを更に含み得る。上記で考察したとおり、少なくとも1つの共刺激ドメインの存在は、多くの場合、CARが発現する細胞からの最適なエフェクター機能の提供に好ましい。従って、CARは、細胞内シグナリングドメインのみを含んでもよいが、詳細な実施形態では共刺激ドメインも存在し得る。
「共刺激ドメイン」は、共刺激分子の細胞内ドメインの一部分又は一領域を指す。共刺激分子は、細胞が抗原に対して(例えば、免疫細胞が抗原に対して)効率的に応答するのに必要である、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子であり得る。共刺激分子の例としては、CD28、4−1BB(CD137)、OX40、ICOS、DAP10、CD27、CD30、CD40、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3及びCD83に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
上記で考察したとおり、共刺激分子が膜貫通部分を更に含む場合、本明細書に記載されるCARの膜貫通ドメインと共刺激ドメインとは、同じタンパク質に由来し得る可能性がある。詳細な実施形態において、CARは、CD28の膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含んでもよい。
本発明のCAR内に存在する細胞内シグナリングドメイン及び共刺激ドメインは、互いにいかなる順序で連結されていてもよい(例えば、ランダム又は特定の順序)。任意選択でショートオリゴペプチド又はポリペプチドリンカー、例えば2〜10アミノ酸長(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸長)が、細胞内シグナリングドメインの細胞内シグナリング配列と1つ以上の共刺激ドメインとの間の連結を形成し得る。一実施形態では、好適なリンカーとしてグリシン−セリンダブレットを使用することができる。別の実施形態では、好適なリンカーとして単一のアミノ酸、例えばアラニン又はグリシンを使用することができる。
本発明の核酸によってコードされるCARは、2つ以上、例えば3、4、5つ又はそれを超える共刺激シグナリングドメインを含んでもよい。ある実施形態において、これらの共刺激シグナリングドメインは、上記に記載したとおりのリンカー、例えばグリシン又はアラニン残基によって分離されていてもよい。
詳細には、本発明のCARは、CD3ζからの細胞内シグナリングドメイン、例えばアミノ酸配列の配列番号148又はそれと少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもの、及びCD28、4−1BB、OX40、ICOS又はDAP−10の共刺激ドメインを含んでもよい。OX40の共刺激ドメインは、詳細には、配列番号168に記載されるとおりのアミノ酸配列を有するか、又はそれと少なくとも95%の同一性を有する。別の見方をすれば、OX40の共刺激ドメインは、配列番号48に記載されるとおりのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも95%の同一性を有する配列によってコードされてもよい。4−1BBの共刺激ドメインは、配列番号80に記載されるとおりのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも95%の同一性を有する配列によってコードされてもよく、及びCD28の共刺激ドメインは、配列番号54に記載されるとおりのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも95%の同一性を有する配列によってコードされてもよい。より詳細には、本発明のCARは、CD3ζからの細胞内シグナリングドメイン、例えばアミノ酸配列の配列番号148又はそれと少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むもの、並びにCD28及びOX40の共刺激ドメイン、CD28及び4−1BBの共刺激ドメイン又は4−1BB及びOX40の共刺激ドメインを含んでもよい。
更に、本発明のポリヌクレオチドは、1)CD28からの膜貫通及び共刺激ドメイン並びにCD3ζからの細胞内シグナリングドメイン、2)CD8αからの膜貫通ドメイン、4−1BBからの共刺激ドメイン及びCD3ζからの細胞内シグナリングドメイン、3)CD8αからの膜貫通ドメイン、OX40からの共刺激ドメイン及びCD3ζからの細胞内シグナリングドメイン、4)CD28からの膜貫通ドメイン、CD28及び4−1BBからの共刺激ドメイン並びにCD3ζからの細胞内シグナリングドメイン、5)CD28からの膜貫通ドメイン、CD28及びOX40からの共刺激ドメイン並びにCD3ζからの細胞内シグナリングドメイン、6)CD8αからの膜貫通ドメイン、4−1BB及びOX40からの共刺激ドメイン並びにCD3ζからの細胞内シグナリングドメイン、7)CD8αからの膜貫通ドメイン、CD28からの共刺激ドメイン及びCD3ζからの細胞内シグナリングドメイン、8)CD8αからの膜貫通ドメイン、CD28及び4−1BBからの共刺激ドメイン並びにCD3ζからの細胞内シグナリングドメイン、又は9)CD8αからの膜貫通ドメイン、CD28及びOX40からの共刺激ドメイン並びにCD3ζからの細胞内シグナリングドメインを含むCARをコードしてもよい。詳細には、CD8αからの膜貫通ドメインを含むコンストラクトのいずれか1つは、同様にCD8αに由来するヒンジ又はスペーサードメイン、例えば配列番号165又はそれと少なくとも95%の同一性を有する配列に定義されるとおりのものを更に含んでもよい。
ポリヌクレオチドは、リーダー配列を含むCARを更にコードしてもよい。用語「リーダー配列」は、CARを細胞膜にターゲティングするペプチド配列を指す。リーダー配列は、抗CLEC14A結合ドメインのN末端に存在してもよく、及び/又は細胞プロセシング及び細胞膜へのCARの局在化中にリーダー配列がCARから切断されることが可能である。本明細書に記載されるとおりのCARに使用し得る典型的なリーダー配列は、配列番号135のオンコスタチンMリーダー配列、配列番号162によってコードされるCD8αリーダー配列又はそれと少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98若しくは99%の同一性を有するその変異体であって、CARを細胞膜にターゲティングする能力を有するその変異体である。リーダー配列の必須部分は、典型的には、単一のα−ヘリックスを形成する傾向のある一続きの疎水性アミノ酸を含む。
CARは、抗CLEC14A結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジドメイン又はスペーサー領域(本明細書では同義的に使用される)を更に含んでもよい。ヒンジドメイン及び/又はスペーサーは、可動性を有してそれを様々な方向に配向させることが可能であってもよく、これは、抗CLEC14A結合ドメインへの抗原結合を促進し得る。特定の実施形態において、ヒンジ領域及び/又はスペーサーは、免疫グロブリンヒンジ領域であってもよく、野生型免疫グロブリンヒンジ領域又は改変された野生型免疫グロブリンヒンジ領域、例えばトランケート型ヒンジ領域であってもよい。使用し得る他の例示的ヒンジ領域及び/又はスペーサーとしては、CD8α、CD4、CD28及びCD7などの1型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域及び/又はスペーサーが挙げられ、これは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域/スペーサーであってもよく、又は改変されてもよい。好ましくはヒンジ領域/スペーサーは、ヒトCD8α、CD4、CD28又はCD7のヒンジ領域/スペーサーであるか、又はそれに由来する。IgD、CH3及びFcスペーサー又はヒンジも本発明のCARに使用し得る。
「改変された野生型ヒンジ又はスペーサー領域」又は「改変されたヒンジ又はスペーサー領域」は、(a)30%以下のアミノ酸変化(例えば、25%、20%、15%、10%又は5%以下のアミノ酸変化、例えば置換又は欠失)を有する野生型ヒンジ/スペーサー領域、(b)30%以下のアミノ酸変化(例えば、25%、20%、15%、10%又は5%以下のアミノ酸変化、例えば置換又は欠失)を有する少なくとも10アミノ酸長(例えば、少なくとも12、13、14又は15アミノ酸長)である野生型ヒンジ/スペーサー領域の一部分、又は(c)コアヒンジ領域(これは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14若しくは15又は少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15アミノ酸長であり得る)を含む野生型ヒンジ領域の一部分を指す。本明細書に記載されるキメラ抗原受容体においてCLEC14A特異的結合ドメインと別の領域(例えば、膜貫通ドメイン)との間に改変された野生型ヒンジ領域が置かれてそれらを結び付けるとき、それにより、キメラ融合タンパク質は、CLEC14Aへの特異的結合を維持することが可能になる。
特定の実施形態において、野生型免疫グロブリンヒンジ領域における1つ以上のシステイン残基が1つ以上の他のアミノ酸残基(例えば、1つ以上のセリン残基)に置換されてもよい。代替的に又は追加的に、改変された免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基が別のアミノ酸残基(例えば、セリン残基)によって置換されていてもよい。
CH2及びCH3定常領域ドメインを含むヒンジ領域が、CARにおける使用に関して当該技術分野において記載されている(例えば、配列番号163に示されるとおりの、「Fcヒンジ」又は「IgGヒンジ」と称されるCH2CH3ヒンジ。別の見方をすれば、CH2CH3ヒンジは配列番号164によってコードされ得る。しかしながら、ヒンジドメインが免疫グロブリンをベースとするか又はそれに由来するとき、それはCH3ドメインを含まないことが好ましく、例えば、それは、CH2ドメイン又はその断片若しくは一部を含み、又はそれからなり、CH3を含まないものであり得る。
一実施形態においてヒンジドメインは、配列番号165のアミノ酸配列(CD8αのヒンジドメインに相当する)又はそれと少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、又はそれを含む。
別の好ましい実施形態において、ヒンジドメインは、配列番号166のアミノ酸配列(短縮型のIgGヒンジに相当する)又はそれと少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、又はそれを含む。
ヒンジドメインは、リンカー配列によって膜貫通ドメインに付加されてもよく、リンカー配列は、上記に定義するとおりのリンカー配列であり得る。例示的リンカー配列は、KDPK(配列番号159)である。かかる配列又はそれと少なくとも95%の配列同一性を有する配列は、上記に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるCARに含まれてもよい。より詳細には、かかる配列は、細胞外ドメイン(例えば、scFv部分)と膜貫通ドメインとの間に含まれてもよい。特定のCARに使用するヒンジドメインは、実験的に決定し得る。
本明細書で使用されるとおりのヒンジドメイン又はスペーサー領域は、少なくとも10アミノ酸長、例えば少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、150又は200アミノ酸長であってもよい。
本発明の詳細な実施形態において、ヒンジドメインは利用されなくてもよく、抗CLEC14A結合ドメインが膜貫通ドメインに直接付加されてもよい。
従って、本発明の第1の態様によれば、ポリヌクレオチドは、
(a)配列番号62、
(b)配列番号98、
(c)配列番号114、又は
(d)配列番号127
のいずれか1つの配列、又は(a)、(b)、(c)若しくは(d)のいずれかと少なくとも80%の同一性を有するその変異体を含むCARをコードしてもよい。
(a)配列番号62、
(b)配列番号98、
(c)配列番号114、又は
(d)配列番号127
のいずれか1つの配列、又は(a)、(b)、(c)若しくは(d)のいずれかと少なくとも80%の同一性を有するその変異体を含むCARをコードしてもよい。
従って、CARは、配列番号62、98、114又は127のいずれか1つと少なくとも85、90、95、96、97、98又は99%の同一性を有し得る。詳細には、変異CARは、配列番号62、98、114又は127の配列を有するCARの活性を保持していなければならず、例えば非変異CARの活性の少なくとも50、60、70、80、90又は95%を有していなければならない。これは、CARの結合親和性として計測されてもよく、結合親和性は、抗CLEC14A結合ドメインに関して先に考察したとおり決定することができ、又は細胞内のエフェクター機能を刺激する能力として計測されてもよく、この能力は、細胞内シグナリングドメインに関して上記で考察したとおり決定し得る。
別の見方をすれば、CARをコードするポリヌクレオチドは、
(a)配列番号63、
(b)配列番号99、
(c)配列番号115、又は
(d)配列番号128
のいずれか1つのヌクレオチド配列、又は(a)、(b)、(c)若しくは(d)のいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有するその変異体を含んでもよい。
(a)配列番号63、
(b)配列番号99、
(c)配列番号115、又は
(d)配列番号128
のいずれか1つのヌクレオチド配列、又は(a)、(b)、(c)若しくは(d)のいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有するその変異体を含んでもよい。
上記で考察したとおり、変異体は、配列番号63、99、115又は128のいずれか1つと少なくとも85、90、95、96、97、98又は99%の同一性を有してもよく、コードされたCARは、上記で考察したとおり、非変異配列によってコードされるCARの活性を保持していなければならない。
本発明は、本発明の核酸分子によってコードされるCAR(ポリペプチド)を提供する。用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、本明細書では同義的に使用され、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化及びシグナル配列の付加又は欠失などの修飾を除外しない。従って、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、各鎖がペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸を含む1つ以上のアミノ酸鎖を意味する。
本発明は、本発明の核酸を含むベクターを更に包含する。このベクターは、例えば、発現ベクター(例えば、mRNA発現ベクター又は免疫細胞へのトランスファー用の発現ベクター(例えば、ウイルスベクター))又はクローニングベクターであってもよい。可能な発現ベクターとしては、そのベクターが使用する宿主細胞と適合性を有する限り、限定はされないが、トランスポゾン、コスミド、プラスミド又は修飾ウイルス(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス及びレンチウイルス)が挙げられる。詳細には、発現ベクターは、Engels et al, Human Gene Therapy, 14:1155-1168, 2003又はSchambach et al, Mol. Ther. 2:435-445, 2000(これらは参照により本明細書に援用される)に記載されるものなど、ガンマレトロウイルスであってもよい。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換に好適」であり、これは、発現ベクターが本発明の核酸分子と、核酸分子に作動可能に連結した、発現に使用する宿主細胞に基づき選択された調節配列とを含有することを意味する。作動可能に連結したとは、核酸が核酸の発現を可能にする方法で調節配列に連結されていることを意味するものと意図される。
従って、本発明は、本発明の核酸分子と、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写及び翻訳に必要な調節配列とを含有する組換え発現ベクターを企図する。
好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類又は昆虫遺伝子を含めた種々の供給源に由来し得る。適切な調節配列の選択は、以下で考察するとおり選択の宿主細胞に依存し、当業者は容易に実現し得る。かかる調節配列の例としては、翻訳開始シグナルを含めて、転写プロモーター及びエンハンサー又はRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が挙げられる。加えて、選択の宿主細胞及び用いられるベクターに応じて、複製起点、追加的なDNA制限部位、エンハンサー、及び転写誘導能を付与する配列などの他の配列が発現ベクターに組み込まれ得る。
細胞(哺乳類細胞)においてCAR分子を発現させる能力を有するプロモーターの例は、EF1aプロモーター又はCMVプロモーターである。プロモーターの更なる例としては、SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)、HIV長末端反復配列プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター又はMPSV LTR(Engel et al、前掲に記載されるとおり)が挙げられる。
上記に指摘したとおり、CARの転写は、誘導性システムを用いて制御し得る。詳細には、誘導性プロモーターを使用してCARの発現を制御してもよく、例えば、発現は、小分子又は薬物(例えば、プロモーター、調節配列又は転写リプレッサー若しくはアクチベーター分子に結合するもの)によるか、又は環境的誘因を用いることにより誘導され得る。
詳細には、CAR発現はテトラサイクリン又はドキシサイクリンなどの誘導体、例えばTetオンシステムを用いて制御してもよく、ここで、1つ以上のtetオペレーター配列(例えば、少なくとも2、3、4又は5つ)がプロモーター中に又はその近傍に組み込まれ得る。次に、テトラサイクリン又はその誘導体の1つ(例えば、ドキシサイクリン)を加えることにより、それがテトラサイクリントランスアクチベータータンパク質に結合してtetオペレーター配列とのその会合が可能になり得ることで、プロモーターからの遺伝子発現が制御され得る。テトラサイクリントランスアクチベータータンパク質は、本発明のCARと同じベクター又は追加的なベクターから発現し得る。Tetオンシステムの変形例は、当該技術分野において周知であり、本発明に利用し得る。
更に、CAR発現は、例えば、アクチベーターが変異ERTドメインに融合しているシステムを用いて、タモキシフェンを加えることにより制御し得る。これに関して、Cre/loxPシステム、詳細にはこのシステムの改変バージョンを利用してもよく、ここで、Creがエストロゲン受容体(ERT)の変異型のリガンド結合ドメインに融合しており、これはタモキシフェンにのみ結合する。この融合は、タモキシフェンが加わるまで不活性であり、タモキシフェンがCreを活性化してlox P部位間の組換えを可能にし、それによりCARの転写が可能となる。かかるシステムは、タモキシフェンを加えることによるCARの誘導性発現を可能にする。
他の薬物誘導性システム、例えばポナステロンAを加えると活性化されるシステム(例えば、エクジソン受容体の遺伝子及び受容体の結合部位を有するプロモーターを使用する)、クーママイシンを加えると活性化されるシステムが当該技術分野において周知であり、任意のかかるシステムを本発明においてCAR発現に使用することができる。
上記で考察したとおり、CAR発現が環境的誘因、例えば低酸素、放射線照射、昇温等によって制御される発現システムも本発明において利用し得る。詳細には、低酸素誘導性プロモーター、例えば低酸素応答性エレメントを含むキメラプロモーターが本発明におけるCAR発現に用いられてもよい。
本発明における使用のため、新規誘導性プロモーター、例えば小分子又は薬物によって活性化される誘導性プロモーターが更に開発されてもよい。
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の組換え分子で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を促進する選択可能なマーカー遺伝子を含有してもよい。選択可能なマーカー遺伝子の例は、特定の薬物に対する耐性を付与するネオマイシン及びハイグロマイシン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ又は免疫グロブリン若しくはその一部分、例えば免疫グロブリン、好ましくはIgGのFc部分などのタンパク質をコードする遺伝子である。選択可能なマーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ又はホタルルシフェラーゼなどの選択可能なマーカータンパク質の濃度の変化によってモニタされる。選択可能なマーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合、形質転換細胞は、G418で選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存し得るが、他の細胞は死滅し得る。これにより、本発明の組換え発現ベクターの発現を可視化してアッセイし、詳細には突然変異が発現及び表現型に及ぼす効果を決定することが可能になる。選択可能なマーカーは、目的の核酸と別個のベクターで導入し得ることは理解されるであろう。
組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現の増加、組換えタンパク質の溶解度の増加をもたらす融合部分をコードし、且つアフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより標的組換えタンパク質の精製を補助する遺伝子を含有してもよい(例えば、精製及び/又は同定を可能にする適切な「タグ」、例えばHisタグ又はmycタグが存在してもよい)。例えば、標的組換えタンパク質にタンパク質分解切断部位を加えることにより、組換えタンパク質と融合部分との分離、続く融合タンパク質の精製が可能となり得る。典型的な融合発現ベクターとしては、それぞれグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、又はプロテインAを組換えタンパク質に融合するpGEX(Amrad Corp.、メルボルン、オーストラリア)、pMal(New England Biolabs、ビバリー、MA)及びpRIT5(Pharmacia、ピスカタウェイ、NJ)が挙げられる。
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換宿主細胞を作製することができる。用語「〜で形質転換された」、「〜をトランスフェクトされた」、「形質転換」、「形質導入」及び「トランスフェクション」は、当該技術分野において公知の多くの可能な技法の1つによる細胞への核酸(例えば、ベクター)の導入を包含することが意図される。用語「形質転換宿主細胞」又は「形質導入宿主細胞」は、本明細書で使用されるとき、本発明の組換え発現ベクターで形質転換されているグリコシル化能を有する細胞も含むように意図される。原核細胞は、例えば、電気穿孔又は塩化カルシウム媒介形質転換によって核酸で形質転換することができる。例えば、核酸は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔又はマイクロインジェクションなどの従来技術を用いて哺乳類細胞に導入することができる。宿主細胞の形質転換及びトランスフェクションに好適な方法については、Sambrook et al., 1989(前掲)及び他の実験テキストを参照することができる。
本発明の核酸を含むベクターは、例えば、コードされたCAR分子のインビトロ研究を行うため、又は患者への投与用の細胞に形質導入する更なるベクター又はRNA/ウイルスベクターを作製するため、いかなる細胞型にも形質導入又はトランスフェクトし得る。例えば、ベクターは、多様な真核生物宿主細胞及び原核細胞、例えば酵母細胞又は哺乳類細胞又は大腸菌(Escherichia coli)に形質導入してもよい。従って、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む細胞を更に提供する。本発明は、加えて、本発明のCARを含む細胞を提供する。
哺乳類細胞としては、とりわけ、COS(例えば、ATCC番号CRL 1650又は1651)、BHK(例えば、ATCC番号CRL 6281)、CHO(ATCC番号CCL 61)、HeLa(例えば、ATCC番号CCL 2)、293(ATCC番号1573)、NS−1細胞、NS0(ATCC CRL−11177)及びPer.C6(登録商標)(Crucell、ライデン、オランダ)を挙げることができる。哺乳類細胞における発現を指図するのに好適な発現ベクターは、概して、プロモーター(例えば、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス40などのウイルス性物質に由来するもの又は任意のウイルスLTRに由来するもの)、並びに他の転写及び翻訳制御配列を含む。哺乳類発現ベクターの例としては、pCDM8、pMT2PC及びpMP71が挙げられる。
治療用途には、本発明のベクターは、哺乳類細胞、特にT細胞(例えば、ヒトT細胞)などの免疫細胞に形質導入され得る。哺乳類細胞への遺伝子トランスファー用に幾つものウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子デリバリーシステムに好都合なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子は、当該技術分野において公知の技法を用いてベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離し、インビボ又はエキソビボのいずれかで対象の細胞に送達することができる。幾つものレトロウイルスシステム、例えばHIV、SIV又はFIVなどのレンチウイルスベクターが当該技術分野において公知である。詳細には、上記に指摘したとおり、ガンマレトロウイルスなどのレトロウイルスベクター、例えばMP71が用いられてもよい。
本発明の核酸を含む本発明のベクターは、CAR分子に加えて、更なるタンパク質又はポリペプチドをコードし得る追加的なヌクレオチド配列を更に含んでもよい。かかる追加的なタンパク質又はポリペプチドは、CAR分子をコードするヌクレオチド配列と同じプロモーターの制御下又はCAR分子をコードするヌクレオチド配列と異なるプロモーターの制御下にあるヌクレオチド配列によってコードされ得る。追加的なタンパク質/ポリペプチドが、CAR分子をコードするヌクレオチド配列と同じプロモーターの制御下にあるヌクレオチド配列によってコードされる場合(例えば、両方の配列がそのプロモーターの下流にある)、CARをコードするヌクレオチド配列と更なるタンパク質/ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に更なるヌクレオチド配列が存在してもよく、それにより発現後のその分離、例えばその切断が可能となる。かかる更なるヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知であり、インテインをコードするものが含まれる。代替的に、同じプロモーターからの発現が所望される場合、本発明のベクターにIRES又は2Aペプチド配列を利用することができる。
これに関して、本発明のCAR発現ベクターからポリペプチドを更に発現させて、細胞におけるCARの発現の検出を可能にすることが望ましい場合もある。従って、CARをコードするヌクレオチド配列と同じ(又は異なるプロモーターの)制御下にある更なるポリペプチドの発現を検出することにより、ベクターによる細胞の形質導入の成功及びCAR分子の発現の成功を同定することが可能であり得る。詳細には、本発明のCAR分子は、CD34分子又は修飾CD34分子、例えばトランケート型CD34分子を更に含んでもよく、ここで、かかる分子は、周知の技法、例えば好適な抗体及び標識を用いた免疫蛍光法によるその検出を可能にする細胞外部分を含む。詳細な実施形態において、本発明のベクターは、配列番号145のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を更に含んでもよい。別の見方をすれば、ベクターは、配列番号144のアミノ酸配列又はそれと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を更にコードしてもよい。本発明のCAR分子と共発現してCARが形質導入された細胞の同定を可能にし得る他の分子としては、ルシフェラーゼが挙げられる。
これに関して、本発明は、詳細には、配列番号136、138、140若しくは142のいずれか1つの配列又はそれと少なくとも80%の同一性を有する(及び先述のとおり非修飾CARの機能活性を保持している)配列を含むCARをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を包含する。より詳細には本発明の核酸分子は、配列番号137、139、141若しくは143のポリヌクレオチド配列又はそれと少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでもよい。詳細にはかかる修飾配列は、先述のとおり非修飾CARの機能活性を保持している又は実質的に保持しているCARをコードすることになる。これらの配列を含むベクターも包含される。配列番号136、138、140又は142のいずれか1つの配列を含むCARは、オンコスタチンMリーダー配列を含む。上記で考察したとおり、これは、別のリーダー配列に置換することができ、詳細にはCD8αのリーダー配列に置換されてもよいことが理解されるであろう。従って、配列番号136、138、140又は142の配列は、配列番号135のオンコスタチンMリーダー配列が配列番号162によってコードされるCD8αリーダーに置換されるように修飾されてもよい。
先に考察したとおり、本発明は、適切な細胞型に形質導入されたとき、CLEC14Aに結合することのできるCAR分子の発現能を有する核酸分子を提供する。従って、本発明の核酸分子は、CLEC14Aの発現増加を伴う病態の治療に使用することができ、詳細には血管新生(例えば、腫瘍血管新生)の阻害に使用することができる。かかる病態の治療は、発現したCAR分子による、腫瘍血管構造内で発現する標的抗原への、即ちCLEC14Aへの結合に依存するものである。CAR分子による非標的CLEC14Aへの結合は望ましくないものであり得ること、及び患者への形質導入細胞の投与時点であるか又はそれ以降の時点であるかに関わらず、いかなるかかる結合も回避されるべきであることが理解されるであろう。これを達成するため、形質導入細胞が患者体内で(即ち、病態の治療後に)長期間生存しないこと、又はCLEC14Aを標的化するCAR分子を形質導入細胞が一過性にのみ発現することのいずれかを確実にすることが望ましい場合もある。
CAR分子の一過性発現を達成するため、本明細書に記載されるとおりのCARをコードするRNA(例えば、mRNA)を細胞に形質導入し、それらの細胞を患者への投与に使用することが可能である。mRNAの産生用のmRNA発現ベクターは、当該技術分野において公知の方法に従って(例えば、Gateway技術を用いて)調製してもよく、当該技術分野において公知である(例えば、pClpA102、Saeboee-Larssen et al, 2002, J. Immunol. Methods 259, p 191-203及びpCIpA120-G、Waelchli et al, 2011, PLoS ONE 6 (11) e27930)。これに関して、本発明は、詳細には、本明細書に記載されるとおりのCARをコードするRNA分子を含む細胞を提供する。
更に、mRNAは、例えば、インビトロ転写によってインビトロで作製することができる。次に、mRNAが例えばネイキッドmRNAとして、例えば電気穿孔によって免疫エフェクター細胞に導入されてもよい(例えば、Almasbak et al., Cytotherapy 2011, 13, 629-640、Rabinovich et al., Hum. Gene Ther., 2009, 20, 51-60及びBeatty et al., Cancer Immunol. Res. 2014, 2, 112-120に記載されるとおり)。
代替的に又は追加的に、活性化すると細胞死をもたらすヌクレオチド配列(いわゆる「自殺遺伝子」)を細胞に形質導入することが望ましい場合もある。このようにして、細胞が病態の治療に用いられた後、自殺遺伝子が活性化して、CAR発現細胞の死滅及び患者からの除去がもたらされ得る。自殺遺伝子は、本発明のCAR分子と同じベクターから、例えば先に考察したとおりのエレメント(別個のプロモーター、又はインテイン、IRES又は2Aペプチドと共に同じプロモーター)を用いて発現させてもよく、又は細胞に形質導入され得る異なるベクターから、CARをコードするベクター若しくは核酸分子と同時に、その前に又はその後に発現させてもよい。本発明に使用し得る自殺遺伝子の例としては、カスパーゼ9、RQR8及び/又はTKが挙げられる。これらの遺伝子の1つ以上は、CARをコードするベクター内に含めて、又はCARをコードするベクター若しくは核酸分子と同時に、その前に若しくはその後に細胞に形質導入されてもよい。任意の自殺遺伝子の発現が誘導的に制御されることが望ましいことは理解されるであろう。
また、本発明のベクター又は核酸を形質導入したか又は形質導入しようとする細胞に更なる修飾を行うことが望ましい場合もある。詳細には、CLEC14Aに対するその応答を延ばす又は増強する免疫細胞に対する修飾が望ましい場合もある。例えば、腫瘍によってTGFβが分泌され、これは、T細胞の誘導を抑制し得ることが知られている。これに関して、本発明の修飾免疫細胞、例えばT細胞(即ち、本発明の核酸又はベクターを形質導入したもの)が、TGFβの効果を例えばドミナントネガティブTGFβ受容体IIの発現によって中和する能力を有することが望ましい場合もある。追加的に又は代替的に、本発明の細胞には、サイトカイン、例えばIL−15又はIL2、IL7、IL12等をコードする核酸が形質導入されてもよく、これにより細胞のエフェクター機能を増強し得る。この場合にも、上記で考察したとおり、任意の追加的な核酸配列は、CAR分子と同じ又は異なるベクターから発現させてもよい。
更に、本発明の細胞が本発明の核酸又はベクターを2つ以上含み得ることが理解されるであろう。詳細には、本発明の細胞は、各々が異なるCAR分子を発現する本発明の核酸又はベクターを2、3、4又は5個又はそれを超えて含んでもよい。従って、本発明の細胞は、例えばvCLEC14A上の同じ又は異なる位置でCLEC14Aに結合する能力を有する異なるCAR分子を含んでもよい。この態様において、本発明の細胞は、CLEC14Aに結合するscFvを含むCAR分子と、CLEC14Aに結合するリガンド(例えば、MMRN2又はその一部分若しくは変異体)を含むCAR分子とを含んでもよい。
更に、本発明の細胞は、発現した本発明のCARに加えて、少なくとも1つの他の受容体(詳細には外因性の)(例えば、複数の受容体)を含んでもよく、それらは、コンビナトリアル手法において標的細胞(例えば、CLEC14Aを発現する腫瘍血管構造)への結合のためにCARと共に用いられ得る。従って、かかる手法では、標的細胞に対する免疫応答を刺激するのにCAR及び少なくとも1つの他の受容体の両方が標的細胞に結合する必要があり得る(例えば、CAR/受容体の各々は免疫細胞刺激の部分的なシグナルを提供し得るに過ぎず、単独では免疫細胞刺激に不十分であるが、一緒になると免疫細胞刺激が可能であり得る)。本発明の細胞がT細胞である場合、T細胞を刺激するのに、CLEC14A発現細胞上におけるCLEC14AへのCAR結合と、そのリガンドへの少なくとも1つの他の受容体結合の結合との両方が必要であり得る。少なくとも1つの他の受容体は、更なるCAR分子であってもよい。
この実施形態の変形例において、本発明の細胞内のCARを誘導的に発現してもよい。詳細には、この実施形態では、この細胞上に発現する少なくとも1つの他の受容体のその標的への結合がCAR分子の発現を可能にし、又はそれを制御し得る。従って、この場合、CAR発現が起こる前に少なくとも1つの他の受容体がそのリガンドに結合する必要があり、従って、免疫細胞刺激には、少なくとも1つの他の受容体のそのリガンドへの結合と、続くCARの標的細胞への結合とが必要である。かかる特定のシステムは、SynNotch受容体の追加的な発現を含んでもよく、これは、目的の抗原、例えばCD19に対する胞外リガンド結合ドメイン及び直交性の転写因子(例えば、TetR又はGal4)で操作されるものである。目的の抗原が結合すると、SynNotch受容体のテールから直交性の転写因子が切断され、CARの発現が活性化する。従って、本発明の細胞は、CLEC14A以外の抗原、詳細にはCLEC14A以外の腫瘍関連抗原に結合する受容体をコードする核酸又はベクターを更に含んでもよい。
代替的に、コンビナトリアル手法は、本発明のCARに加えて更なる受容体を本発明の細胞上に発現させる場合にも用いることができ、ここで、前記更なる受容体は、オフターゲット細胞又は組織(例えば、非腫瘍細胞)への結合能を有する。この場合、更なる受容体がそのリガンドに結合する場合、負のシグナルが生じ、免疫細胞刺激(例えば、T細胞刺激)が妨げられる。
更なる組み合わせ手法は、本発明のCARと組み合わせて更なる受容体を使用してもよく、ここで、両方の受容体が異なる標的に結合し、異なる効果を誘導して腫瘍を治療する。従って、両方の抗腫瘍効果は、互いに完全に独立していてもよく、しかし、一緒になると腫瘍に対して有効な療法を呈し得る。これに関して、本発明のCARは、TCR療法と組み合わせて用いられてもよく、ここで、免疫細胞に、本発明のCARと、腫瘍細胞上(例えば、特定のタイプの腫瘍細胞上又は任意の腫瘍細胞上)に存在し得る特定のMHC/ペプチドの組み合わせへの結合能を有するTCRとをコードする1つ以上の核酸分子が形質導入され得る。代替的に、CARをコードする核酸を形質導入された免疫細胞と、TCRをコードする核酸を形質導入された別個の免疫細胞集団とが別々に、逐次的に又は同時に提供されてもよい。本発明のCAR及び腫瘍MHC/ペプチドの組み合わせを認識するTCRをコードする1つ以上の核酸を用いた遺伝子療法治療も想定される。
宿主細胞への外因性核酸の導入に用いられる方法に関わらず、細胞内における核酸の存在は、サザン及びノーザンブロッティング、RT−PCR及びPCRなど、当該技術分野において周知の種々のアッセイを用いて決定することができる。更に、先に考察したとおり、CAR又は他のポリペプチドの発現は、免疫蛍光技法、ELISAを用いるか、又はウエスタンブロッティングによって検出し得る。
これに関して、本発明は、細胞に本発明の核酸又はベクターを形質導入するステップを含む、CAR分子を発現する細胞を作製する方法を更に提供する。
先に考察したとおり、本発明の核酸、ベクター及び/又はCARを含む本発明の細胞は、免疫細胞、詳細にはヒト免疫細胞などの哺乳類免疫細胞であってもよい。免疫細胞は、先述のとおりエフェクター機能を有する能力を有し、T細胞及びNK細胞が含まれる。T細胞は、αβT細胞、γδT細胞、メモリーT細胞(例えば、幹細胞様特性を有するメモリーT細胞)を含め、任意のタイプのT細胞であってもよい。NK細胞は、インバリアントなNK細胞であってもよい。
用語「哺乳類」は、本明細書で使用されるとき、任意の哺乳類を指し、但し詳細には、ヒト、家庭用動物(例えば、ネコ、イヌ等)、ウマ、マウス、ラット、サルなどの霊長類、雌ウシ、ブタ等を指す。
T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含め、幾つもの供給源から入手し得る。詳細には、本発明において、免疫細胞又はT細胞は、本発明の核酸、ベクター又は細胞で治療し得る病態を有する対象、例えばCLEC14Aの発現レベルの増加に関連する病態、又はより詳細には腫瘍血管構造においてCLEC14Aを発現する腫瘍を有する対象から入手し得る。T細胞(又は免疫細胞)は、当該技術分野において公知の任意の方法によって入手し得る。
T細胞は、「既製品」を入手してもよく、従って必ずしも本発明の核酸、ベクター又は細胞で治療し得る病態を有する対象から入手されなくてもよい。従って、本発明に用いられるT細胞は、本発明の核酸又はベクターを形質導入する前に予め貯蔵及び/又は修飾されていてもよい。
詳細には、T細胞は、フィコール分離法など、当該技術分野における任意の好適な技法を用いて対象から収集された血液(特に抗凝固処理血液)ユニットから入手してもよい。代替的に、免疫細胞(例えば、T細胞)は、対象(典型的には哺乳類対象)からアフェレーシスによって入手してもよく、ここで、アフェレーシス産物は、典型的にはリンパ球(T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞及び血小板を含む)を含む。アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄することにより血漿画分が除去され、後の処理のために細胞が適切な緩衝液又は培地中に置かれてもよく、例えば、細胞は、PBSを使用するか、又は二価イオン不含、例えばカルシウム及び/又はマグネシウム不含の洗浄溶液を使用して洗浄され得ることが理解されるであろう。洗浄ステップは、当該技術分野において公知の方法により、例えば半自動「フロースルー」遠心機(例えば、Cobe 2991細胞プロセッサー、Baxter CytoMate又はHaemonetics Cell Saver 5)を使用することにより達成し得る。洗浄後、細胞は、例えば、Ca不含、Mg不含PBS、PlasmaLyte A、RPMI 1640(Sigma)又はPBS又は緩衝液含有若しくは不含の他の生理食塩水など、種々の生体適合性緩衝液に再懸濁されてもよい。典型的には、英国では、輸血用細胞はhttp://www.transfusionguidelines.org.uk/red-bookに掲載されているガイドラインに従って処理される。欧州で認められている更なる手順については、Guide on the preparation, Use and Quality assurance of Blood Components, Current edition, EDQMを参照し得る。米国では、典型的にはAABBの血液及び血液成分ガイドラインに従う。血液、血液成分及び血漿製剤の採取、処理QCについては、WHO要求事項も存在する。
T細胞は末梢血リンパ球から、赤血球を溶解して、例えばPERCOLL(商標)グラジエントを用いた遠心によるか、又は向流式遠心エルトリエーションによって単球を枯渇させることにより単離し得る。本発明に使用する特定のT細胞集団を選択することが可能である。しかしながら、選択は必須でなく、混合細胞集団(例えば、異なる種類のT細胞を含む)に本発明の核酸又はベクター(例えば、対象の腫瘍血管新生の阻害に用いられる)を形質導入してもよい。選択され得る細胞のサブ集団としては、CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及びCD45RO+ T細胞が挙げられる。特定の集団の選択は、T細胞集団上に発現する抗原に選択的に結合する抗体とカップリングしたビーズを使用して達成し得る。特にT細胞集団にユニークに発現する表面マーカーに対する抗体の組み合わせが選択に用いられてもよい。
その使用前、詳細には本発明の治療方法における使用前に免疫細胞を貯蔵することが望ましい場合もある。これに関して、本発明の細胞を凍結し、又は(例えば、2〜10℃のローテータ上で)インキュベートすることが可能である。細胞は、本発明の核酸又はベクターによる形質導入前及び/又は形質導入後のいずれでもかかる方法で貯蔵し得る。
先に考察したとおり、本発明の形質導入免疫細胞は、治療上の有用性があり、詳細には腫瘍血管新生の阻害に用いられ得る。細胞を治療に使用する前に、当該技術分野において周知の方法を用いて細胞を活性化又は増殖ステップに供することが望ましい場合もある。任意のかかるステップが本発明の核酸又はベクターによる形質導入前又はその後に行われてもよい。T細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを使用して増殖させてもよい。例えば、T細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下でT細胞を抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触させてもよい。
本発明は、加えて、細胞集団であって、前記集団中の少なくとも1つの細胞が本発明の核酸又はベクターを含む、細胞集団を特に提供する。細胞集団は、様々な本発明の核酸又はベクターを含む細胞を含んでもよい。従って、集団中のある細胞が、第1のCARをコードする本発明の核酸を含んでもよく、且つ集団中の第2の細胞が、第2のCARをコードする本発明の核酸を含んでもよい。
更に、本発明は、本発明の細胞(特にT細胞)(即ち、本発明の核酸又はベクターを含む)が後の使用(例えば、療法における)のために貯蔵されて提供され得る「既製品」の細胞製品を提供する。典型的には、かかる細胞は、同種異系免疫細胞(例えば、T細胞)であってもよい。
本発明は、本発明の核酸、ベクター、細胞又は細胞集団を含む組成物又は医薬組成物、及び更には療法(又は疾患への対処)における使用のための本発明の核酸、ベクター、細胞又は細胞集団を含む医薬組成物を更に提供する。本発明の組成物又は医薬組成物は、追加的な又は更なる活性(例えば、療法用)薬剤を含んでもよい。本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞、細胞集団又は組成物は、CLEC14Aの発現レベルの増加に関連する病態の治療に使用されてもよく、詳細には、本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞、細胞集団又は組成物は、腫瘍内(例えば、ここで、腫瘍血管構造がCLEC14Aを発現する)における血管新生の阻害に使用されてもよい。従って、この態様において、本発明は、療法における使用のための本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞、細胞集団又は組成物を提供する。更に、本発明は、疾患への対処における使用のための医薬の製造における本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞、細胞集団又は組成物の使用を提供する。別の見方をすれば、本発明は、本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞、細胞集団又は組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患に対処する方法を提供する。より詳細には、本発明は、CLEC14の発現に関連する病態の治療における使用のための本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞、細胞集団又は組成物を提供する。更に、本発明は、CLEC14Aの発現に関連する病態の治療用医薬の製造における本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞、細胞集団又は組成物の使用を提供する。別の見方をすれば、本発明は、CLEC14Aの発現に関連する病態を治療する方法であって、本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞、細胞集団又は組成物を、それを必要とする対象、例えばその病態を有する対象に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明の核酸及び/又はベクターは、上記に記載したとおり、例えば遺伝子療法的方法において患者を直接治療するのに使用することが可能であるが、詳細な実施形態では、本発明の核酸又はベクターを含む細胞が療法に使用される。かかる細胞は、免疫細胞、詳細にはT細胞であることが好ましい。従って、本発明は、詳細には、療法における使用のための、例えばCLEC14Aの発現に関連する病態を治療するための本発明のベクター又は核酸を含むT細胞を提供する。
「対処する」には、その方法を用いて障害の症状を軽減し得る(即ち、その方法が対症療法的に用いられる)か、又は障害を治療し得るか、又は障害を予防し得る(即ち、その方法が予防的に用いられる)という意味が含まれる。
「CLEC14Aの発現に関連する病態」は、CLEC14Aが発現する、治療、予防又は回復が所望される任意の疾患状態を指す。先に考察したとおり、正常な健常組織及び正常な血管構造におけるCLEC14A発現は極めて低いか又は検出不能である。従って、概して、組織、詳細には血管構造におけるCLEC14Aの発現(即ち、任意の検出可能な発現)は、疾患状態に関連し得る。これに関して、CLEC14A発現(例えば、mRNA又はタンパク質)の任意の検出が疾患の指標となり得る。CLEC14Aは、先述のとおり、例えば免疫蛍光法を用いて計測及び検出することができる。従って、CLEC14Aの発現の検出とは、健常対象において対応する組織に存在するCLEC14A量と比較したときの対象の組織中におけるCLEC14A量の増加の検出を指す。代替的に、CLEC14Aの発現の増加は、同じ対象における疾患前の、又は同じ対象の体内にある組織の非罹患部分におけるCLEC14Aの発現と比較した増加であってもよい。CLEC14Aのレベルは、少なくとも50、60、70、80、90、100、200、300、400又は500%増加してもよく、又は別の見方をすれば少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、900又は1000倍増加してもよい。
先に考察したとおり、CLEC14Aは、腫瘍血管構造内で発現して血管新生に関連し、従ってCLEC14Aの発現に関連する病態には、望ましくない血管新生を含む任意の病態が含まれ得る。詳細には、病態には、固形腫瘍、(即ち、CLEC14Aを発現する固形腫瘍)、月経過多、子宮内膜症、関節炎(炎症性及びリウマチ性の両方)、黄斑変性症、パジェット病、網膜症及びその血管合併症(例えば、増殖性のもの並びに未熟児及び糖尿病性網膜症)、良性血管増殖、線維化、肥満症及び炎症の治療が含まれる。
CLEC14Aの発現に関連する病態の治療には、CLEC14Aの発現に関連する既存の病態の治療又はCLEC14Aの発現に関連する病態の予防が含まれる。「治療」は、本明細書で使用されるとき、対象体内の病状の改善又はその悪化の予防を指す。例えば、治療には、腫瘍サイズの低減、腫瘍の成長速度の低減、腫瘍の転移速度の低減、又は腫瘍のサイズ、成長速度若しくは転移速度の維持が含まれる。「低減」とは、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80又は90%の低減が意味される。「維持」とは、実質的な増加がないこと、例えば10、5、3、2又は1%以下の増加が意味される。腫瘍サイズは当該技術分野において公知の任意の方法、例えば適切な抗体による腫瘍イメージング、MRI等により決定することができ、腫瘍成長速度は、時間の経過に伴う腫瘍サイズの増加を計測し、特定の期間にわたって腫瘍がどの程度成長するかを決定することにより決定し得る。転移速度は、対象体内の新しい部位で腫瘍成長が始まる期間を計測することにより決定し得る。
「腫瘍」は、本明細書で使用されるとき、あらゆる形態の新生物性細胞成長を指し、詳細には固形腫瘍を含む。本発明において治療される固形腫瘍には、乳房、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、腎臓、膵臓、胃、食道、直腸、肺(例えば、中皮腫)、脳、子宮頸部、結腸、皮膚(例えば、黒色腫)、子宮、神経系(例えば、神経芽細胞腫)、甲状腺の腫瘍及び骨肉腫などの肉腫が含まれる。詳細には、本発明では、例えば本発明のT細胞を使用して膵腫瘍又は卵巣腫瘍が治療され得る。
CLEC14Aの発現に関連する病態の治療には血管新生の阻害が含まれる。用語「血管新生の阻害」は、血管新生の速度又はレベルを低減することを意味するものと意図される。低減は、血管新生の速度又はレベルの約10%、又は約20%、又は約30%、又は約40%の低レベルの低減であってもよい。好ましくは、低減は、血管新生の速度又はレベルの約50%、又は約60%、又は約70%、又は約80%の低減の中レベルの低減である。より好ましくは、低減は、血管新生の速度又はレベルの約90%、又は約95%、又は約99%、又は約99.9%の高レベルの低減である。最も好ましくは、阻害には、血管新生の消失又はその検出不能なレベルに至るまでの低減も含まれ得る。血管新生の速度又はレベルを決定する方法及びアッセイ、従って抗体が血管新生を阻害するかどうか、及びそれがどの程度かを決定する方法及びアッセイは、当該技術分野において公知であり、本明細書において実施例に更に詳細に記載される。
典型的には、阻害される血管新生は、腫瘍血管新生である。従って、個体は、腫瘍血管新生を阻害することによって治療し得る固形腫瘍を有してもよく、即ち固形腫瘍は新生血管の生成に関連する。
先に考察したとおり、本発明の核酸又はベクターを含む免疫細胞(例えば、T細胞)が本発明の治療方法において使用されることが好ましい。免疫細胞(例えば、T細胞)は、自己細胞又は同種異系細胞であってもよい。
「自己」とは、治療方法又は使用において使用される(即ち、核酸又はベクターによって形質導入される)細胞が、治療方法が行われる対象に由来するか又はそれから得られることが意味される。従って、自己細胞は、対象から得られ、核酸又はベクターによって形質導入されて、同じ対象に戻される。
「同種異系」とは、治療方法又は使用において使用される(即ち、核酸又はベクターによって形質導入される)細胞が、治療方法が行われる対象と異なる対象に由来するか又はそれから得られることが意味される。従って、同種異系細胞は、第1の対象から得られ、核酸又はベクターによって形質導入されて、第2の対象に投与される。
細胞、詳細にはT細胞を対象に投与するための方法、製剤及び量は、当該技術分野において周知であり、以下で更に考察する。詳細には、T細胞は、腫瘍内に又はiv(静脈内)注入によって投与されるものであり得る。典型的な用量は、1kg当たり106〜108細胞の範囲であり得る。本発明は、本発明の核酸、ベクター又は細胞を含む医薬組成物も提供する。
用語「対象」は、本明細書で使用されるとき、ヒト又は非ヒト対象、例えば先に定義したとおりの哺乳類を指す。
本発明の核酸、ベクター又は細胞は、単独で使用されるときに疾患への対処において有効であり得るが、本発明の核酸、ベクター又は細胞と組み合わせて更なる療法用薬剤を使用して疾患に対処することが可能である。詳細には、本発明の核酸、ベクター又は細胞を投与することによって腫瘍血管新生を阻害し、結果的に対象の腫瘍サイズを低減した後、続いて細胞傷害剤で腫瘍を治療することが望ましい場合もある。
従って、本発明の更なる実施形態において、少なくとも1つの更なる又は追加的な療法用薬剤(例えば、抗癌及び/又は抗血管新生化合物/薬剤)が対象に投与されてもよい。従って、本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞又は細胞集団と更なる療法用薬剤(例えば、抗癌及び/又は抗血管新生化合物/薬剤)とが対象に投与されてもよい。従って、本発明の組成物又は医薬組成物は、更なる活性薬剤又は療法用薬剤を本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞及び/又は細胞集団と共に含んでもよい。しかしながら、本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞又は細胞集団と更なる療法用薬剤(例えば、抗癌及び/又は抗血管新生化合物/薬剤)とは別個に、例えば別個の投与経路によって投与されてもよいことは理解される。加えて、本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞又は細胞集団と少なくとも1つの更なる療法用薬剤(例えば、抗癌及び/又は抗血管新生化合物/薬剤)とは、逐次的に又は(実質的に)同時に投与することができる。それらは、同じ医薬製剤中又は医薬中にあって投与されてもよく、又はそれらは別個に製剤化され、投与されてもよい。逐次投与について、更なる療法用薬剤は、核酸/ベクター/細胞の投与の少なくとも1分、10分、1時間、6時間、12時間、1日、5日、10日、2週間、4週間又は6週間前又は後に投与されてもよい。
詳細な実施形態において、本発明は、CLEC14Aの発現に関連する疾患又は病態に対処する方法、例えば血管新生、詳細には腫瘍血管新生の阻害方法、例えば癌を治療する方法を提供し、前記方法は、本明細書に定義するとおりの本発明の核酸/ベクター/CAR/細胞/細胞集団、特に有効量の前記核酸/ベクター/CAR/細胞/細胞集団を、それを必要とする対象に投与すること、及び1つ以上の追加的な活性(例えば、療法用)薬剤(例えば、抗癌及び/又は抗血管新生化合物/薬剤)を別個に、同時に又は逐次的に投与することを含む。
別の見方をすれば、CLEC14Aの発現に関連する疾患又は病態への対処において使用される(例えば、血管新生の阻害において使用される)本明細書に定義するとおりの本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞又は細胞集団が提供され、前記核酸、ベクター、CAR、細胞又は細胞集団は、1つ以上の追加的な活性(例えば、療法用)薬剤(例えば、抗癌及び/又は抗血管新生化合物/薬剤)と併用して別個に、同時に又は逐次的に投与されるものである。
従って、CLEC14Aの発現に関連する疾患又は病態への対処において使用される、例えば血管新生、詳細には腫瘍血管新生の阻害用、例えば癌の治療用の医薬の製造における、本明細書に定義するとおりの本発明の核酸、ベクター、CAR、細胞又は細胞集団の使用が提供され、前記核酸、ベクター、CAR、細胞又は細胞集団は、1つ以上の追加的な活性(例えば、療法用)薬剤(例えば、抗癌及び/又は抗血管新生化合物/薬剤)と併用して投与されるものである。
従って、一実施形態において、本医薬は、1つ以上の追加的な活性(例えば、療法用)薬剤(例えば、抗癌及び/又は抗血管新生化合物/薬剤)を更に含んでもよい。追加的な活性薬剤は、更に免疫チェックポイント阻害薬であってもよい。
本医薬は、本明細書に定義するとおりの本発明の核酸、ベクター、抗体又はリガンドベースのCAR又は免疫エフェクター細胞と、1つ以上の追加的な活性(例えば、療法用)薬剤(例えば、抗癌及び/又は抗血管新生化合物/薬剤)との両方を含む単一の組成物の形態であってもよく、又はそれらを別個に(例えば、同時に又は逐次的に)投与するように含むキット又は製品の形態であってもよい。
一部の実施形態において、更なる療法用薬剤は、抗癌剤である。更なる抗癌剤は、メクロレタミン(HN2)、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン(L−サルコリシン)及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード類;ヘキサメチルメラミン、チオテパなどのエチレンイミン類及びメチルメラミン類;ブスルファンなどのスルホン酸アルキル類;カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、セムスチン(メチル−CCNU)及びストレプトゾシン(ストレプトゾトシン)などのニトロソウレア類;及びデカルバジン(decarbazine)(DTIC;ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド)などのトリアゼン類を含めたアルキル化剤;メトトレキサート(アメトプテリン)などの葉酸類似体;フルオロウラシル(5−フルオロウラシル;5−FU)、フロクスウリジン(フルオロデオキシウリジン;FUdR)及びシタラビン(シトシンアラビノシド)などのピリミジン類似体;及びメルカプトプリン(6−メルカプトプリン;6−MP)、チオグアニン(6−チオグアニン;TG)及びペントスタチン(2’−デオキシコホルマイシン)などのプリン類似体及び関連阻害薬を含めた代謝拮抗薬;ビンブラスチン(VLB)及びビンクリスチンなどのビンカアルカロイド;エトポシド及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシン類;ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン(ダウノマイシン;ルビドマイシン)、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)及びマイトマイシン(マイトマイシンC)などの抗生物質;L−アスパラギナーゼなどの酵素;及びインターフェロンアルフェノム(interferon alphenome)などの生物学的反応修飾物質を含めた天然産物;シスプラチン(cis−DDP)及びカルボプラチンなどの白金配位錯体;ミトキサントロン及びアントラサイクリンなどのアントラセンジオン;ヒドロキシウレアなどの置換尿素;プロカルバジン(N−メチルヒドラジン、MIH)などのメチルヒドラジン誘導体;及びミトタン(o,p’−DDD)及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制薬を含めた他の薬剤;タキソール及び類似体/誘導体;細胞周期阻害薬;ボルテゾミブ(Velcade(登録商標))などのプロテオソーム阻害薬;イマチニブ(Glivec(登録商標))などのシグナルトランスダクターゼ(signal transductase)(例えば、チロシンキナーゼ)阻害薬、COX−2阻害薬、並びにフルタミド及びタモキシフェンなどのホルモン作動薬/拮抗薬から選択され得る。
臨床で用いられている抗癌剤は、典型的には作用機序によって分類される:アルキル化剤、トポイソメラーゼI阻害薬、トポイソメラーゼII阻害薬、RNA/DNA代謝拮抗薬、DNA代謝拮抗薬及び抗有糸分裂剤。米国NIH/国立癌研究所のウェブサイトは、122個の化合物を挙げており(http://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/searches/standard_mechanism.html)、その全てを本発明の抗体、組成物又は免疫エフェクター細胞と併せて使用し得る。それらには、アサレイ(Asaley)、AZQ、BCNU、ブスルファン、カルボキシフタラート白金(carboxyphthalatoplatinum)、CBDCA、CCNU、CHIP、クロラムブシル、クロロゾトシン、シスプラチナム、クロメソン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドパン(fluorodopan)、ヘプスルファム、ヒカントン、メルファラン、メチルCCNU、マイトマイシンC、ミトゾラミド(mitozolamide)、ナイトロジェンマスタード、PCNU、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、テロキシロン、テトラプラチン、ピコプラチン(SP−4−3)(cis−アミンジクロロ(2−メチルピリジン)Pt(II))、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、Yoshi−864を含めたアルキル化剤;アロコルヒチン、ハリコンドリンB、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン10、メイタンシン、リゾキシン、タキソール、タキソール誘導体、チオコルヒチン、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチンを含めた抗有糸分裂剤;カンプトテシン、カンプトテシンNa塩、アミノカンプトテシン、20種のカンプトテシン誘導体、モルホリノドキソルビシンを含めたトポイソメラーゼI阻害薬;ドキソルビシン、アモナファイド、m−AMSA、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンHCL、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、ミトキサントロン、メノガリル、N,N−ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール、ルビダゾン、VM−26、VP−16を含めたトポイソメラーゼII阻害薬;L−アラノシン、5−アザシチジン、5−フルオロウラシル、アシビシン、3種のアミノプテリン誘導体、アンチフォール、ベーカーズ可溶性アンチフォール、ジクロルアリルローソン(dichlorallyl lawsone)、ブレキナル、フトラフル(プロドラッグ)、5,6−ジヒドロ−5−アザシチジン、メトトレキサート、メトトレキサート誘導体、N−(ホスホノアセチル)−L−アスパラギン酸(PALA)、ピラゾフリン、トリメトレキサートを含めたRNA/DNA代謝拮抗薬;3−HP、2’−デオキシ−5−フルオロウリジン、5−HP、α−TGDR、グリシン酸アフィディコリン、ara−C、5−アザ−2’−デオキシシチジン、β−TGDR、シクロシチジン、グアナゾール、ヒドロキシウレア、イノシングリコジアルデヒド、マクベシンII、ピラゾロイミダゾール、チオグアニン及びチオプリンを含めたDNA代謝拮抗薬が含まれる。
一部の好ましい実施形態では、少なくとも1つの更なる抗癌剤は、シスプラチン;カルボプラチン;ピコプラチン;5−フルロウラシル(5-flurouracil);パクリタキセル;マイトマイシンC;ドキソルビシン;ゲムシタビン;トムデックス;ペメトレキセド;メトトレキサート;イリノテカン、フルオロウラシル及びロイコボリン;オキサリプラチン、5−フルオロウラシル及びロイコボリン;並びにパクリタキセル及びカルボプラチンから選択される。
更なる抗癌剤が特定の腫瘍型に特に有効であることが示されている場合、本発明の核酸、ベクター又は細胞がその更なる抗癌剤と併用してその特異的な腫瘍型の治療に使用されることが好ましい場合もある。
一部の実施形態において、抗血管新生化合物は、以下のいずれか1つから選択され得る:ベバシズマブ(Avastin(登録商標));イトラコナゾール;カルボキシアミドトリアゾール;TNP−470(フマギリンの類似体);CM101;IFN−α;IL−12;血小板因子4;スラミン;SU5416;トロンボスポンジン;VEGFR拮抗薬;血管新生抑制ステロイド+ヘパリン;軟骨由来血管新生阻害因子;マトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬;アンジオスタチン;エンドスタチン;2−メトキシエストラジオール;テコガラン;テトラチオモリブデート;サリドマイド;プロラクチン;αVβ3阻害薬;リノミド;タスキニモド;ラニビズマブ;ソラフェニブ;(Nexavar(登録商標));スニチニブ(Sutent(登録商標));パゾパニブ(Votrient(登録商標));及びエベロリムス(Afinitor(登録商標))。
更なる療法用薬剤は、低酸素活性化型細胞傷害剤、例えばチラパザミン、又はCAR発現細胞(例えば、T細胞)の有効性/持続性/増殖を増強し得るサイトカインであってもよい。代替的に又は追加的に、更なる療法用薬剤は、CAR発現細胞の投与に関連する1つ以上の副作用を改善するものであってもよい。
先述したとおり、更なる療法用薬剤は、免疫チェックポイント阻害薬であってもよい。かかる阻害薬は、概して、免疫細胞の刺激を妨げるか又は下方制御する免疫細胞と標的細胞(例えば、腫瘍細胞)との間の相互作用を遮断することによって機能する。詳細には、チェックポイント阻害薬は、T細胞上に発現するタンパク質と腫瘍細胞上に発現するタンパク質との間の相互作用(この相互作用は、T細胞の刺激を妨げるか又は低減し得る)を妨げるか又は低減する。チェックポイント阻害薬は、例えば、PD1とPDL1との間の相互作用を妨げてもよく、詳細にはPD1に結合する薬剤で構成されてもよい。代替的に、チェックポイント阻害薬は、CTLA−4に結合してもよい。かかるチェックポイント阻害薬は、当該技術分野において周知であり、ペンブロリズマブ(Penbrolizumab)、ニボルマブ又はイピリムマブなどのモノクローナル抗体が含まれる。
更なる活性薬剤は、スフィンゴシン−1−リン酸アゴニスト、例えばFTY720であってもよく、これは、スフィンゴシン−1リン酸受容体からのシグナルを遮断することによってリンパ系器官におけるリンパ球を隔離する能力を有する。このように、かかる化合物は、IL−7及びIL−15などのサイトカインに関する競合を制限することができ、従って投与されたCAR発現細胞療法の高い増殖を可能にし得る。詳細には、かかる化合物は、本発明の核酸、発現ベクター、CAR又は細胞より前、例えば少なくとも12時間、24時間、36時間又は48時間前に投与されてもよい。
加えて、更なる又は追加的な活性(例えば、療法用)薬剤は、TCR分子(例えば、T細胞などの免疫細胞上に発現したか又は可溶性形態の)、TCR分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子又は前記核酸分子を含むベクターであってもよい。特に好ましい実施形態において、追加的な療法用薬剤は、TCR分子をコードする核酸(例えば、RNA又はベクター)を含む細胞(例えば、T細胞)である。従って、先に考察したとおり、本発明の詳細な実施形態において、本明細書に記載されるとおりのCARをコードする核酸、核酸を含むベクター、その核酸を含むか若しくは本発明のCARを発現する細胞又はCAR自体は、T細胞受容体(TCR)分子療法(例えば、遺伝子療法若しくは細胞療法として又は可溶性TCRとして)と併せた治療に有用であり得る。本発明のこの実施形態は、固形腫瘍のターゲティング能力が増強したものであり得る併用製剤を包含する。従って、詳細には、TCR分子療法は、CLEC14Aを標的化する本発明のCARと異なる腫瘍関連抗原を標的化するものであってよく、従って、かかる併用製剤又は併用療法は、固形腫瘍の治療に特に有効な医薬を呈し得る。
「TCR」又は「T細胞受容体」分子は、本明細書で使用されるとき、T細胞の表面上に発現する能力を有する分子であって、特定のMHC又はHLA/抗原ペプチド複合体(例えば、抗原提示細胞又は腫瘍細胞の表面上に提示される)に結合する能力を有する分子を指す。従って、TCRは、通常、特定のMHC又はHLAと複合体化して存在するときの抗原又は抗原断片を認識する。本明細書で使用されるとおりのTCR分子は、2つのタンパク質鎖又はポリペプチド鎖を含み得る(例えば、αTCR鎖及びβTCR鎖、又はγTCR鎖及びδTCR鎖を含み得る)か、又はTCRは単鎖分子であってもよく、ここで、α及びβ鎖又はγ及びδ鎖が単一のタンパク質鎖又はポリペプチド鎖内に発現してそこに含まれる。単鎖TCR分子については、Chung et al (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12654-12658(参照により本明細書に援用される)に記載されている。
各TCRα、β、γ又はδ鎖は、概して可変領域を含み、各可変領域は、典型的には、腫瘍関連抗原ペプチド/MHC複合体を認識してそれに結合する能力を有する少なくとも1つの相補性決定領域(例えば、2つ及び詳細には3つの相補性決定領域)を含む。相補性決定領域(CDR)は、1つ以上のフレームワーク領域(FR)によって互いに隔てられていてもよく、典型的には、本明細書に定義するとおりのTCRα、β、γ又はδ鎖可変領域は、3つのCDRと3つのFRとを含み得る。詳細には、本明細書に記載されるとおりのTCR分子は、N末端からC末端に順にFR1α−CDR1α−FR2α−CDR2α−FR3α−CDR3αを含むα鎖可変領域及びN末端からC末端に順にFR1β−CDR1β−FR2β−CDR2β−FR3β−CDR3βを含むβ鎖可変領域を含み得る。
更に、α、β、γ又はδ鎖は、定常領域(例えば、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する)又は定常領域の一部分(例えば、細胞外ドメインのみを有する)を含み得る。詳細には、2つの別個のα/β又はγ/δポリペプチド鎖を含むTCRは、前記鎖の一方又は両方が定常ドメインを有する(例えば、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する)鎖を含み得る。詳細な実施形態では、α/β又はγ/δTCR鎖の両方が可変ドメイン及び定常ドメインを含む。
本明細書で使用されるとおりの単鎖TCRは、単一の定常領域を含んでもよく、例えば単一のポリペプチド鎖内に含まれるα鎖可変領域、β鎖可変領域及びβ鎖定常領域、又はα鎖可変領域、β鎖可変領域及びα鎖定常領域を含んでもよい。
本明細書に定義するとおりのTCR分子は、可溶性TCR分子又は膜結合型TCRであってもよい。可溶性TCR分子は、概してトランケートされた定常領域を含むか、又は定常領域を含まず、いかなるトランケーションも、定常領域の膜貫通部分を除去するのに十分である。膜貫通部分を欠く可溶性TCRは、腫瘍関連抗原ペプチド/MHC複合体を提示する細胞への他の分子のターゲティングにおいて有用であり得る。しかしながら、詳細には、膜結合型TCRが本発明の併用療法において使用されてもよい。従って、詳細には、本明細書に定義されるとおりのTCR分子は、定常領域膜貫通ドメイン(例えば、1つの膜貫通ドメイン又は各鎖に1つずつ含まれる2つの膜貫通ドメイン)を含んでもよい。
TCRのα/β及びγ/δ鎖の定常領域は、TCR間で比較的保存されていることが理解されるであろう。従って、天然TCR分子には、僅か2つの変異β定常領域(これらは4アミノ酸だけ異なる)、単一のα及びδ鎖定常領域及び3つの変異γ定常領域があるに過ぎない。本明細書で使用されるとおりのTCR分子は、これらの天然定常領域のいずれを含んでもよいが、詳細には、TCRは、TCR内に含まれる任意の定常領域又はその一部分に1つ以上の修飾を含み得る。TCR鎖の対形成を改善する修飾又は可溶性若しくは単鎖TCR分子の産生を改善する修飾が特に好ましい。
本明細書で使用されるとおりのTCR分子は、α/β及びγ/δ鎖における1つ以上の残基がシステイン残基に置き換わることによる、天然に存在する分子内に存在しない追加的なdi−S結合を含んでもよい。これに関して、β鎖定常領域におけるシステイン残基によるアミノ酸の置換及びα鎖定常領域におけるシステイン残基によるアミノ酸の置換により、置換されたシステイン残基間で天然に存在しないdi−S結合の形成が可能となってもよく、これによりT細胞における内因性α及びβ鎖とのα及びβ鎖の対形成ミスが防止又は低減され得る。詳細には、この修飾は、TCR内に含まれる両方の鎖の定常領域の細胞外部分に行われてもよい。
より詳細には、本明細書で使用されるとおりのTCR分子は、α鎖の定常領域におけるThr48にシステインの置換及びβ鎖の定常領域におけるSer57にシステインの置換、α鎖の定常領域におけるThr45にシステインの置換及びβ鎖の定常領域におけるSer77にシステインの置換、α鎖の定常領域におけるTyr10にシステインの置換及びβ鎖の定常領域におけるSer17にシステインの置換、α鎖の定常領域におけるThr45にシステインの置換及びβ鎖の定常領域におけるAsp59にシステインの置換、及び/又はα鎖の定常領域におけるSer15にシステインの置換及びβ鎖の定常領域におけるGlu15にシステインの置換を含み得る。
従って、本明細書で使用されるとおりのTCR分子は、α鎖定常領域におけるThr48からシステインへの置換及びβ鎖定常領域におけるSer57からシステインへの置換を有し得る。α鎖及びβ鎖定常領域の天然に存在するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号187及び188に記載され、従って詳細には、上記に考察される修飾は、これらの配列内における記載の位置に行われ得る。
他の修飾をTCRに行い、鎖間の対形成を改善してもよい。例えば、ロイシンジッパーが利用されてもよく、鎖がマウス化されるか又は部分的にマウス化されてもよく、例えば少なくとも1又は2アミノ酸がマウス化されてもよく、TCR様分子が構築されてもよく(例えば、TCRをCD3ζと融合することにより)、又はα及びβ定常領域の接合点にあるアミノ酸対が逆に交換されてもよい。詳細には、逆に交換されたアミノ酸対は、α鎖及びβ鎖の天然TCR定常領域におけるそれらの表面で互いに相互作用する。この相互作用するアミノ酸対は、α鎖定常ドメインのアミノ酸が天然に存在するアミノ酸と比較したときに立体的に突出した基を有するアミノ酸に置き換わり、且つβ鎖定常ドメインのアミノ酸が天然に存在するアミノ酸と比較したときに立体的に後退した基を有するアミノ酸に置き換わるような突然変異誘発(又は逆も同様であり、即ち、α鎖アミノ酸が立体的に後退した基を有するアミノ酸で置換されてもよく、及びβ鎖アミノ酸が立体的に突出した基を有するアミノ酸で置換されてもよい)に供され得る。天然に存在するアミノ酸と比較したときに立体的に後退した基を有し得るアミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、バリン及びアラニンから選択され得る。天然に存在するアミノ酸と比較したときに立体的に突出した基を有し得るアミノ酸は、グルタミン、グルタミン酸、α−メチルバリン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、トリプトファン、リジン、アルギニン、フェニルアラニン及びチロシンから選択され得る。詳細には、α定常領域のグリシン残基がアルギニンで置換されてもよく、及びβ定常領域のアルギニン残基がグリシン残基で置換されてもよく、例えばグリシンからアルギニンへの置換はα鎖定常領域における85.1位で行われてもよく、及びアルギニンからグリシンへの置換はβ鎖定常領域における88位で行われてもよい(TCR定常ドメインの付番には、免疫遺伝学(ImMunoGeneTics)情報システム(IMGT)の命名法を使用する)。従って、アルギニンからグリシンへの置換は、配列番号188のβ定常領域の73位に存在してもよい。
更に、TCR鎖間(例えば、α鎖とβ鎖との間)に存在する天然に存在するdi−Sを除去することが望ましい場合もある。従って、TCRにおける鎖間天然di−S結合が、その結合に関わるシステイン残基を例えばセリン又はアラニン残基に置換することによるか、又はそれらの残基を欠失させることにより除去されてもよい。望ましいものであり得る追加的な又は代替的な修飾は、天然βTCR鎖に存在する対を形成しないシステイン残基の除去又は置換である。かかる修飾は、TCRが単鎖TCRである場合に好ましいものであり得る。
「腫瘍関連抗原」は、本明細書で使用されるとき、その発現が腫瘍(例えば、任意の腫瘍型又は2つ以上の腫瘍型)と関連付けられる任意の抗原を指す。従って、詳細には、腫瘍関連抗原の発現は、同じ型の健常組織又は細胞と比較したときに腫瘍又は腫瘍細胞で上方制御又は増強され得る。腫瘍関連抗原の発現は、同じ型の健常な組織又は細胞(例えば、同じ臓器から得られた同じ型の細胞又は組織由来のもの)におけるその抗原の発現と比較したときに腫瘍又は腫瘍細胞で少なくとも2、3、4、5、10、20、50若しくは100倍、又は別の見方をすれば少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90若しくは100%上方制御され得る。従って、組織又は細胞における腫瘍関連抗原の検出は、腫瘍の指標となり得る。詳細には、腫瘍関連抗原は、健常組織又は特定の臓器に関連する健常組織で極めて低いレベルでのみ発現し得るか、又は検出不能であり得る。
腫瘍関連抗原の発現レベルとは、典型的には特定の細胞/組織で発現するタンパク質の量を指す。タンパク質発現レベルの計測方法又は過剰発現したタンパク質の検出方法は、当該技術分野において周知であり、例えばウエスタンブロッティング、免疫染色等が挙げられる。
健常組織と比較したときに腫瘍細胞において上方制御されるか又は過剰発現する多くの腫瘍関連抗原が当該技術分野において公知であり、これらの抗原のいずれも、本発明の療法における追加的な療法用薬剤としてのTCRによって標的化し得る。詳細には、本発明によれば、固形腫瘍を標的化することが望ましく、従って好ましくは、本明細書で考察するとおりのTCR分子は、固形腫瘍で過剰発現するか又は上方制御される腫瘍関連抗原を認識してそれに結合し得る。例えば、NY−ESO(黒色腫及び精巣癌に関連する腫瘍関連抗原)、MAGEAファミリー(及び特にMAGEA 10)(精巣癌に関連する腫瘍関連抗原)、AFP(肝細胞癌に関連する腫瘍関連抗原)及びWT1(幾つかの腫瘍型で発現する腫瘍関連抗原)が本発明の併用療法において標的化され得る。
TCR分子は、ペプチド/MHC又はHLA複合体を認識してそれに結合し、従って本明細書で使用されるとおりのTCR分子は、典型的には腫瘍関連抗原の一部分又はペプチド断片を認識し得ることが理解されるであろう。かかるペプチド断片は、5〜25アミノ酸長、例えば5〜10、8〜15、10〜18、15〜25アミノ酸長であってもよく、例えば少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15アミノ酸長であってもよく、典型的には腫瘍関連抗原内に含まれる連続ペプチド配列である。更に、TCR分子は、特定のMHC又はHLA(例えば、MHCクラスI若しくはII又はHLA−A1若しくはHLA−A2)と組み合わせになったときの腫瘍関連抗原のペプチドのみを認識し得る。詳細には、本明細書に定義するとおりのTCR分子はHLA−A2と組み合わせになったときのペプチド腫瘍関連抗原を認識し得る。
TCRとペプチド/MHC又はHLA複合体との結合は、当該技術分野において公知の様々な方法により、例えばTCRがT細胞上に発現しているときにT細胞活性化に関連する様々なパラメータを計測することによるか、四量体アッセイによるか、又は細胞傷害性アッセイにより決定することができる。
先に考察したとおり、本明細書において使用されるTCRは、好ましくは、コードされるCARと異なる腫瘍関連抗原に結合し、即ち、TCRは、好ましくはCLEC14Aに結合しない。
本発明の詳細な実施形態において、TCR分子は、WT1ペプチド/MHC又はHLA複合体、より詳細にはWT1ペプチド/HLA A2複合体を認識してそれに結合し得る。例えば、TCRは、WT1ペプチド235〜243(CMTWNQMNL)配列番号202−HLA A*2402の組み合わせに結合し得る。しかしながら、特に好ましい実施形態において、TCRは、WT1/HLA A2複合体のRMFPNAPYL(配列番号189)ペプチドを認識してそれに結合する。2つ以上のTCRがこの複合体への結合能を有してもよく、かかるTCRの1つ以上を本発明の併用療法で使用し得ることが理解されるであろう。更に、この態様との関連において、併用療法は、二重鎖TCR(即ち、別個のα及びβ又はγ及びδ鎖を有する)及び/又は単鎖TCRを利用してWT1複合体に結合し得る。
従って、本明細書に記載される併用療法において(例えば、更なる療法用薬剤として)使用されるとおりのTCR分子は、α鎖及びβ鎖であって、α鎖は、配列番号190のCDR1α、配列番号191のCDR2α及び配列番号192又は193のCDR3αを含み、β鎖は、配列番号194のCDR1β、配列番号195のCDR2β及び配列番号196又は197のCDR3βを含む、α鎖及びβ鎖、又はその変異体であって、CDRの1つ以上は、1、2又は3個のアミノ酸置換を含む、その変異体を含んでもよく、前記TCR分子は、HLA A2/RMFPNAPYL複合体への結合能を有する。
一部の命名方式では、β鎖のCDR3は、以下に記載する免疫遺伝学(IMGT)データベースで使用される命名方式よりも長い定義となり得ることに留意しなければならない。加えて、一部の命名方式では、α鎖のCDR3は、IMGT方式よりも短い定義となり得る。同様に、定常領域は、命名方式の違いでCDR3領域に隣接するフレームワーク残基を含むことも又は含まないこともある。
従って、IMGT方式を使用すると、CDR3αは、配列番号192のアミノ酸配列を有することができ、定常領域は、フレームワークアミノ酸配列FGKGTHLIIQPを含む。
別の命名方式(Garcia)(Garcia et al, 1999, Ann. Rev. Immunol. 17, 369-397、参照により本明細書に援用される)を使用すると、CDR3αは、配列番号193のアミノ酸配列を有し、その直ちにC端側にあるフレームワーク領域は、FGKGTHLIIQPのアミノ酸配列を有し、定常領域は、アミノ酸配列YIQで始まる。
IMGT命名方式を使用すると、CDR3βは、アミノ酸配列の配列番号196を有することができ、その直ちにC端側にある定常領域は、フレームワークアミノ酸配列SETを含む。
Garcia命名方式を使用すると、CDR3βは、アミノ酸配列の配列番号197を有し、その直ちにC端側にあるフレームワーク領域は、アミノ酸配列FGPGTRLLVLを有し、直ちにC端側の定常領域は、アミノ酸配列EDLで始まる。
当業者は、フレームワーク領域がCDRと適合性を有するならば、いずれの命名方式を用いても本発明で使用するTCRを容易に設計及び合成し得ることが理解されるであろう。アミノ酸配列は、多くのTCRα鎖及びβ鎖の可変領域(従ってフレームワーク領域)を含め、当該技術分野において周知であり、その一部は、http://imgt.cines.frのIMGT(免疫遺伝学)データベースに記載されている。この情報を例えばGarcia et al(前掲)と併せて用いることにより、CDR及びFRを含むTCRを設計及び作製し得る。
上記に指摘したとおり、変異TCRが本発明に使用されてもよく、ここで、1つ以上のCDRが1、2又は3個のアミノ酸置換を含み得る。本明細書で考察するとおり、CAR配列に関して、詳細には置換は保存的置換であってもよく、いかなる変異体分子もHLA A2/RMFPNAPYL複合体への結合能を有しなければならない。変異体の結合の親和性は、上記に定義するとおりのCDRを有するTCRと比較したときに増加又は減少してもよいが、しかし、結合は、なおも起こらなければならない。TCRのその腫瘍関連抗原ペプチド/MHC複合体標的への結合を検出する方法は、上記に記載される。
詳細には、本発明に係る更なる療法用薬剤として使用されるTCR分子は、配列番号200に記載されるとおりのTCRα鎖及び配列番号201に記載されるとおりのTCRβ鎖を含んでもよい。代替的に、TCR分子は、配列番号198に記載されるとおりのTCRα鎖及び配列番号199に記載されるとおりのTCRβ鎖を含んでもよく、ここで、前記α鎖及びβ鎖配列は、前記α鎖及びβ鎖の対形成を安定化させるか又は増強するため更に修飾されてもよい。
本明細書に記載されるとおりのTCR分子をコードする核酸分子は、DNA又はRNAの形態であってもよい。従って、本発明の組成物は、本発明のCAR及び本明細書に記載されるとおりのTCR分子をコードするRNA分子を含んでもよい。
代替的に、ベクターは、TCRをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を含んでもよい。CARの発現に好適なベクターは、本明細書に記載され、かかるベクターは、TCR発現にも利用することができる。CAR発現とTCR発現とに別個のベクターを用い得ることも想定されるが、あるベクターが本発明のCARとTCR分子との両方をコードし得ることが可能である。これに関して、各遺伝子の発現が異なるプロモーターによって制御されてもよく、又は本明細書の他の部分に記載されるとおり単一のプロモーターが利用されてもよい。
これに関して、本発明のCARをコードするポリヌクレオチド配列を含み、且つ腫瘍関連抗原ペプチド/MHC又はHLA複合体への結合能を有するTCR分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターが本発明によって提供される。
更に、CARをコードするポリヌクレオチド配列を含む本発明の核酸分子と、腫瘍関連抗原ペプチド/MHC又はHLA複合体への結合能を有するTCR分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子とを含む細胞が本発明によって提供される。本発明のCARをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターと、腫瘍関連抗原ペプチド/MHC又はHLA複合体への結合能を有するTCR分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターとを含む細胞も包含される。
本発明の細胞は、代替的に又は追加的に、本発明のCARをコードするポリヌクレオチド配列を含み、且つ腫瘍関連抗原ペプチド/MHC又はHLA複合体への結合能を有するTCR分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含んでもよい。
従って、細胞は、本発明のCAR分子及び本明細書に定義するとおりのTCR分子を(例えば、同じ又は異なるベクターから)発現し得る。
細胞集団も本発明によって提供され、ここで、少なくとも1つの細胞が、CARをコードするポリヌクレオチド配列を含む本発明の核酸を含み、且つ少なくとも1つの細胞が、先に定義したとおりのTCR分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。従って、この実施形態において、細胞集団は、CAR分子のみを発現する細胞と、TCR分子のみを発現する細胞とを含んでもよい。加えて、かかる細胞集団は、CAR分子とTCR分子との両方を発現する細胞を含んでもよい。
典型的には、上記で考察したとおり、本発明の細胞は、免疫細胞、詳細にはT細胞であってもよい。
本発明のこの態様は、CAR分子及びTCR分子をコードする(別個のポリヌクレオチド配列として又は同じ若しくは異なるベクターからのいずれか)核酸分子又はベクターを含むキットを更に包含する。
本発明の詳細な実施形態において、
(i)TCR分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記TCR分子は、α鎖及びβ鎖であって、α鎖は、配列番号190のCDR1α、配列番号191のCDR2α及び配列番号192又は193のCDR3αを含み、β鎖は、配列番号194のCDR1β、配列番号195のCDR2β及び配列番号196又は197のCDR3βを含む、α鎖及びβ鎖、又はその変異体であって、CDRの1つ以上は、1、2又は3個のアミノ酸置換を含む、その変異体を含み、前記TCR分子は、HLA A2/RMFPNAPYL複合体への結合能を有する、核酸分子、及び
(ii)抗CLEC14A結合ドメインと、膜貫通ドメインと、シグナリングドメインとを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号58、96、112、125若しくは175のアミノ酸配列(好ましくは配列番号58、好ましくは配列番号96若しくは好ましくは配列番号125)又は配列番号58、96、112、125若しくは175のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性有するその変異体を含む、核酸分子
を含む組成物が提供される。
(i)TCR分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記TCR分子は、α鎖及びβ鎖であって、α鎖は、配列番号190のCDR1α、配列番号191のCDR2α及び配列番号192又は193のCDR3αを含み、β鎖は、配列番号194のCDR1β、配列番号195のCDR2β及び配列番号196又は197のCDR3βを含む、α鎖及びβ鎖、又はその変異体であって、CDRの1つ以上は、1、2又は3個のアミノ酸置換を含む、その変異体を含み、前記TCR分子は、HLA A2/RMFPNAPYL複合体への結合能を有する、核酸分子、及び
(ii)抗CLEC14A結合ドメインと、膜貫通ドメインと、シグナリングドメインとを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号58、96、112、125若しくは175のアミノ酸配列(好ましくは配列番号58、好ましくは配列番号96若しくは好ましくは配列番号125)又は配列番号58、96、112、125若しくは175のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性有するその変異体を含む、核酸分子
を含む組成物が提供される。
上記の(i)及び(ii)に定義されるとおりの核酸分子を含む細胞、特にT細胞が更に具体的に提供される。更に、細胞集団は、上記の(i)に定義されるとおりの核酸を含む第1の細胞と、上記の(ii)に定義されるとおりの核酸を含む第2の細胞とを含んでもよい。
上記の考察から、本発明が、本発明の核酸、ベクター、細胞又は細胞集団と薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤とを含む様々な組成物、例えば医薬組成物、療法用組成物を提供することは明らかであろう。これに関して、本発明の薬剤(即ち、核酸、ベクター又は細胞)は、典型的には医薬組成物としての個体(即ち、対象)への投与用に、即ち薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と共に製剤化され得ることが理解される。
「薬学的に許容可能」には、製剤が無菌且つパイロジェンフリーであることが含まれる。好適な医薬担体、希釈剤及び賦形剤は薬学の技術分野において周知である。担体は、医薬と適合性があり、且つその被投与者にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的には、担体は、無菌且つパイロジェンフリーの生理食塩水又は注入媒体(或いは注入用溶液と呼ばれる)であり得る。しかしながら、他の許容可能な担体が用いられてもよい。本発明の組成物は、好適な凍結保存剤、例えばDMSOを含んでもよい。
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物又は製剤は、非経口投与用、より詳細には静脈内投与用である。好ましい実施形態において、医薬組成物は、患者への例えば注射による静脈内投与に好適である。
非経口投与に好適な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び意図する被投与者の血液と製剤を等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射溶液、並びに水性滅菌懸濁液が含まれる。
液体医薬組成物は、典型的には、プラズマライトA+HSA(例えば、4%)を含んでもよい注入媒体中に本発明の細胞、例えばT細胞を含み得る。本発明の細胞は、概して滅菌等張溶液を用いて注入される。非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアルに封入することができる。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
本発明の医薬組成物は、治療(又は予防)しようとする疾患に適切な方法で投与され得る。投与の分量及び頻度は、患者の状態並びに患者の疾患のタイプ及び重症度などの要因によって決まり得るが、適切な投薬量は、臨床試験によって決定されてもよい。
本発明の組成物は、単回投与又は複数回投与で投与されるものであり得る。詳細には、本組成物は、単回の一度限りの投与で投与されるものであり得る。
本発明の薬剤又は組成物は、活性成分を含む医薬製剤の形態で任意の非経口経路によって投与されてもよい。治療する障害及び患者並びに投与経路に応じて、組成物は、様々な用量(例えば、細胞/kg又はm2単位で測られる)で投与され得る。いずれの場合にも、医師は、任意の個々の患者に最も好適となり得る実際の投薬量を決定することになり、それは、特定の患者の年齢、体重及び応答によって異なり得る。しかしながら、典型的には、本発明の細胞について、静脈内投与では1×109/kg以下の用量(又はm2単位での均等量)、例えば少なくとも1×108細胞/kgの用量が提供され得る。腫瘍内投与では、1×1010細胞/kg以下の用量が想定される。
ヒト療法では、本発明の薬剤又は組成物は、概して、意図される投与経路及び標準的薬学実践の点で選択される好適な医薬賦形剤、希釈剤又は担体と混合して投与されることになる。典型的には、本発明の細胞は、注入用緩衝液中にあって投与されてもよい。
本発明の薬剤又は組成物は、非経口的に、例えば静脈内に、動脈内に、腹腔内に、髄腔内に、脳室内に、胸骨内に、頭蓋内に、筋肉内に又は皮下に投与することもでき、又は注入技法によって投与されてもよい。これらは、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有し得る滅菌水溶液の形態での使用が最も適している。水溶液は、必要に応じて好適に(好ましくは3〜9のpHに)緩衝されなければならない。無菌条件下における好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技法によって容易に達成される。
製剤は、単位用量容器又は複数用量容器、例えば密封されたアンプル、バッグ及びバイアルに提供されてもよい。
一部の実施形態において、本発明の薬剤又は組成物は、眼経路によって投与されてもよい。眼科使用には、本発明の薬剤又は組成物は、例えば、等張性のpH調整済み滅菌生理食塩水中の微粒子化懸濁液として、又は好ましくは等張性のpH調整済み滅菌生理食塩水中の溶液として、任意選択で塩化ベンジルアルコニウム(benzylalkonium chloride)などの保存剤と組み合わせて製剤化することができる。
本発明の核酸分子薬剤(例えば、核酸分子、ベクター等)は、以下に記載するとおりの好適な遺伝子コンストラクトとして投与して患者に送達し、そこで発現させてもよい。典型的には、遺伝子コンストラクト中の核酸は、細胞において化合物を発現させることのできるプロモーターに作動可能に連結されている。本発明の遺伝子コンストラクトは、当該技術分野において例えばSambrook et al (2001)で周知の方法を用いて調製することができる。
ポリヌクレオチドを送達するための遺伝子コンストラクトは、DNA又はRNAであってもよい。従って、対象への本発明の核酸分子又は発現ベクターの直接投与が関わる遺伝子療法的治療方法が本発明に包含される。更に、CARの直接投与が関わる治療方法も包含される。かかる方法は、細胞をエキソビボで操作することが回避されるために有利であり得る。
好ましくは、遺伝子コンストラクトは、ヒト細胞への送達に適合される。遺伝子コンストラクトを細胞に導入する手段及び方法は、当該技術分野において公知であり、免疫リポソーム、リポソーム、ウイルスベクター(ワクシニア、改良ワクシニア、レンチウイルス、パルボウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含む)の使用、及びDNAの例えば遺伝子銃及び電気穿孔を用いた直接送達によることが挙げられる。更に、治療のためにポリヌクレオチドを患者の標的組織に送達する方法も当該技術分野において周知である。代替的方法では、受容体介在性エンドサイトーシスを用いてDNA巨大分子を細胞に運び込む高効率核酸送達システムが用いられる。これは、核酸に結合するポリカチオンに鉄輸送タンパク質トランスフェリンをコンジュゲートすることにより達成される。Cotten et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6094-6098の方法によって作製された欠損の若しくは化学的に不活性なアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を用いたDNAコンストラクト、又は本発明の他の遺伝子コンストラクトの高効率受容体介在性送達も用いることができる。「ネイキッドDNA」並びにカチオン性及び中性脂質と複合体化したDNAも、治療する個体の細胞に本発明のDNAを導入するのに有用であり得ることが理解されるであろう。遺伝子療法の非ウイルス手法については、Ledley(1995, Human Gene Therapy 6, 1129-1144)に記載されている。
特定の組織の癌/腫瘍には、ポリヌクレオチド阻害薬をコードするベクター内に組織特異的プロモーターを使用することが有用であり得るが、核酸分子薬剤が体内において癌/腫瘍以外の部位で発現するリスクは、癌/腫瘍に罹患している患者にとっての治療利益に比して許容可能であると思われるため、これは必須ではない。細胞におけるポリヌクレオチド阻害薬の発現を時間的に調節可能であることが望ましい場合もあるが、これも必須ではない。
投与用の本発明の薬剤(例えば、核酸、ベクター、細胞又は細胞集団)は、医薬組成物における使用向けに適切に修飾されてもよい。例えば、薬剤は、例えば、塩又は非電解質、酢酸塩、EDTA、クエン酸塩、トリス、リン酸塩又は酢酸塩緩衝液、マンニトール、グリシン、HSA(ヒト血清アルブミン)又はポリソルベートなどの適切な添加剤を使用することにより、本発明の組成物中で分解に対して安定化されてもよい。多数の安定化剤が当該技術分野において公知である。細胞は、詳細には凍結保存され、対象への注入前に適切な時点で解凍されてもよい。
本発明は、本発明の核酸、ベクター、細胞又は組成物の1つ以上を含むキットを更に含む。好ましくは、前記キットは、本明細書に記載されるとおりの方法及び使用、例えば本明細書に記載されるとおりの治療方法に用いられるものであり、又はインビトロアッセイ又は方法に用いられるものである。好ましくは、前記キットは、キット構成要素の使用説明書を含む。
本明細書における「腫瘍」といういかなる表現は、「癌」又は「癌腫」も指す。転移性癌も治療することができ、原発腫瘍からの転移を低減することもできる。術後患者に残るいわゆる微小残存病変(MRD)が、本明細書に定義するとおりの薬剤による免疫療法に適していることもある。
本願全体を通じて使用されるとき、用語「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、それらが、上限が後に具体的に記載される場合を除き、言及される構成要素又はステップの「少なくとも1つ」、「少なくとも第1」、「1つ以上」又は「複数」を意味するという意味で用いられる。従って、「抗体」は、本明細書で使用されるとき、「少なくとも第1の抗体」を意味する。併用の機能し得る限度及びパラメータは、任意の単剤の量と同様に本開示を踏まえて当業者に公知であり得る。
本明細書に引用される文献は、参照により本明細書に援用される。
ここで、以下の実施例及び図を参照して本発明を更に詳細に説明する。
実施例
実施例1:CLEC14Aに関する実験研究
材料及び方法
HUVECの調製及び培養
ドナーのインフォームドコンセントを得た上で英国国民保健サービス(National Health Service)によって供与された臍帯からヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を単離した。臍帯は、胎盤から解剖し、滅菌PBSで静脈を洗浄して血液を除去した。M199培地(Sigma)に希釈した1mg/mlのコラゲナーゼを静脈注射し、次に37℃で20分間インキュベートして内皮細胞を剥離させた。10%FCS、10%大血管内皮細胞成長添加物(TCS Cell Works)、及び4mM L−グルタミンを含有するM199完全培地で洗浄することによってHUVECを収集し、ブタ皮膚(Sigma)由来の0.1%タイプ1ゼラチンをコートしたディッシュにプレーティングした。
実施例1:CLEC14Aに関する実験研究
材料及び方法
HUVECの調製及び培養
ドナーのインフォームドコンセントを得た上で英国国民保健サービス(National Health Service)によって供与された臍帯からヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を単離した。臍帯は、胎盤から解剖し、滅菌PBSで静脈を洗浄して血液を除去した。M199培地(Sigma)に希釈した1mg/mlのコラゲナーゼを静脈注射し、次に37℃で20分間インキュベートして内皮細胞を剥離させた。10%FCS、10%大血管内皮細胞成長添加物(TCS Cell Works)、及び4mM L−グルタミンを含有するM199完全培地で洗浄することによってHUVECを収集し、ブタ皮膚(Sigma)由来の0.1%タイプ1ゼラチンをコートしたディッシュにプレーティングした。
初代細胞供給源
ヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)及びヒト気管支上皮細胞(HBE)は、TCS Cell Worksから購入した。ヒト肺線維芽細胞(MRC5)は、英国癌研究所中央サービス(Cancer Research UK Central Services)から入手した。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、バーミンガム大学の癌研究所(Institute of Cancer Studies)から入手した。ヘパトサイトは、バーミンガム大学免疫・感染学部(School of Immunity and Infection, University of Birmingham)のDavid Adams教授から供与いただいた。
ヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)及びヒト気管支上皮細胞(HBE)は、TCS Cell Worksから購入した。ヒト肺線維芽細胞(MRC5)は、英国癌研究所中央サービス(Cancer Research UK Central Services)から入手した。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、バーミンガム大学の癌研究所(Institute of Cancer Studies)から入手した。ヘパトサイトは、バーミンガム大学免疫・感染学部(School of Immunity and Infection, University of Birmingham)のDavid Adams教授から供与いただいた。
HUVEC免疫蛍光法
ガラスマイクロウェルチャンバ(Nunc)内でHUVECを成長させて、氷冷メタノールで固定し、PBSTで洗浄し、PBST中10%FCS3%BSAでブロックした。次に、パラフィン包埋切片に用いるのと同じプロトコルに従い細胞をCLEC14A抗体で染色し、又はミラノのFirc分子腫瘍学研究所のMaria Grazia Lampugnani教授から供与いただいた、ヒトVE−カドヘリンに対する5μg/mlマウスモノクローナルIgG抗体と共染色した。切片染色を510レーザー走査共焦点顕微鏡(Carl Zeiss)で分析した。
ガラスマイクロウェルチャンバ(Nunc)内でHUVECを成長させて、氷冷メタノールで固定し、PBSTで洗浄し、PBST中10%FCS3%BSAでブロックした。次に、パラフィン包埋切片に用いるのと同じプロトコルに従い細胞をCLEC14A抗体で染色し、又はミラノのFirc分子腫瘍学研究所のMaria Grazia Lampugnani教授から供与いただいた、ヒトVE−カドヘリンに対する5μg/mlマウスモノクローナルIgG抗体と共染色した。切片染色を510レーザー走査共焦点顕微鏡(Carl Zeiss)で分析した。
CLEC14Aモノクローナル抗体による引っ掻き傷治癒アッセイ
10μlピペットの先端でコンフルエントなHUVECに引っ掻き傷を付けた。CLEC14Aの細胞外ドメインに対してマウス体内で産生された1μg/ml又は10μg/mlのモノクローナルCLEC14A抗体を含有する新しい培地を加えた。時点0、4、6、12時間における創傷閉鎖の画像をLeica DM 1000光学顕微鏡及びUSB 2.0 2M Xliカメラで取得することにより、HUVECの化学遊走性を評価した。Image Jソフトウェアを用いて創傷の開口面積を定量化した。
10μlピペットの先端でコンフルエントなHUVECに引っ掻き傷を付けた。CLEC14Aの細胞外ドメインに対してマウス体内で産生された1μg/ml又は10μg/mlのモノクローナルCLEC14A抗体を含有する新しい培地を加えた。時点0、4、6、12時間における創傷閉鎖の画像をLeica DM 1000光学顕微鏡及びUSB 2.0 2M Xliカメラで取得することにより、HUVECの化学遊走性を評価した。Image Jソフトウェアを用いて創傷の開口面積を定量化した。
パラフィン包埋組織に対する免疫蛍光法
英国癌研究所(Cancer Research UK)組織学サービスから入手したパラフィン包埋された正常及び癌ヒト組織コレクション並びに癌及び正常組織アレイ(Superbiochips)に対して免疫蛍光法を実施した(データは示さず)。以下の癌腫:胃癌、食道癌、肺癌、結腸/直腸癌、甲状腺癌及び腎癌の各々のコアを10個含むヒトの一般的な癌1(MA2)、及び以下の癌腫:乳癌、肝癌、膀胱癌、卵巣癌、膵癌及び前立腺癌の各々のコアを10個含む一般的な癌2(MB3)を使用した。対応する隣接正常組織の2つの追加的な対照アレイも分析した。パラフィンを除去した後、組織を再水和させ、クエン酸塩緩衝液pH6中、中程度の出力で電子レンジに3分間かけて抗原を回復させた。10%FCS及び3%BSAを含有するPBSTで切片をブロックした。10μg/mlのヒトCLEC14Aの細胞外ドメインに対するヒツジIgG一次ポリクローナル抗体(R&D system)及び15μg/mlのFITCコンジュゲートウサギIgG二次抗ヒツジポリクローナル抗体(Zymax)で切片をプローブした。ローダミン(Vector labs)とコンジュゲートしたハリエニシダ凝集素I(UEAI)20μg/mlで血管内皮細胞を染色した。DAPI(Invitrogen)を含有するprolong gold褪色防止試薬でスライドを永久的にマウントして細胞核を対比染色した。510レーザー走査共焦点顕微鏡(Carl Zeiss)を用いて切片染色を分析した。
英国癌研究所(Cancer Research UK)組織学サービスから入手したパラフィン包埋された正常及び癌ヒト組織コレクション並びに癌及び正常組織アレイ(Superbiochips)に対して免疫蛍光法を実施した(データは示さず)。以下の癌腫:胃癌、食道癌、肺癌、結腸/直腸癌、甲状腺癌及び腎癌の各々のコアを10個含むヒトの一般的な癌1(MA2)、及び以下の癌腫:乳癌、肝癌、膀胱癌、卵巣癌、膵癌及び前立腺癌の各々のコアを10個含む一般的な癌2(MB3)を使用した。対応する隣接正常組織の2つの追加的な対照アレイも分析した。パラフィンを除去した後、組織を再水和させ、クエン酸塩緩衝液pH6中、中程度の出力で電子レンジに3分間かけて抗原を回復させた。10%FCS及び3%BSAを含有するPBSTで切片をブロックした。10μg/mlのヒトCLEC14Aの細胞外ドメインに対するヒツジIgG一次ポリクローナル抗体(R&D system)及び15μg/mlのFITCコンジュゲートウサギIgG二次抗ヒツジポリクローナル抗体(Zymax)で切片をプローブした。ローダミン(Vector labs)とコンジュゲートしたハリエニシダ凝集素I(UEAI)20μg/mlで血管内皮細胞を染色した。DAPI(Invitrogen)を含有するprolong gold褪色防止試薬でスライドを永久的にマウントして細胞核を対比染色した。510レーザー走査共焦点顕微鏡(Carl Zeiss)を用いて切片染色を分析した。
モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体の調製に使用した抗原は、任意選択でアジュバントタンパク質(AP)とコンジュゲートした、マウスCLEC14A−Fc(CM)及びヒトCLEC14A−Fc(CH)であった。これらの4つの抗原(CM、CH、CM−AP、CH−AP)を、以下のプロトコルを用いたマウス免疫に使用した。
日数 操作
0 免疫前試料を採取
完全フロイントアジュバント中100ugの抗原の免疫(足蹠)
14 不完全フロイントアジュバント中100ugの抗原の免疫(足蹠)
17 試験採決
18 融合用の膝窩リンパ節採取
モノクローナル抗体の調製に使用した抗原は、任意選択でアジュバントタンパク質(AP)とコンジュゲートした、マウスCLEC14A−Fc(CM)及びヒトCLEC14A−Fc(CH)であった。これらの4つの抗原(CM、CH、CM−AP、CH−AP)を、以下のプロトコルを用いたマウス免疫に使用した。
日数 操作
0 免疫前試料を採取
完全フロイントアジュバント中100ugの抗原の免疫(足蹠)
14 不完全フロイントアジュバント中100ugの抗原の免疫(足蹠)
17 試験採決
18 融合用の膝窩リンパ節採取
血清は、3つの抗原:CM、CH及びFcに対してELISAによって試験した。陰性対照として非免疫血清をとった。
融合プロトコルは、以下のとおりであった:
(1)免疫マウスから膝窩リンパ節を採取し、ホモジナイズした。
(2)温かいDMEMで細胞を洗浄した。
(3)細胞をsp2/0骨髄腫細胞と混合した。
(4)この混合物を遠心した(1000g)。
(5)このペレットを50%PEG1500に懸濁し、1分間インキュベートした。
(6)この懸濁液を温かいDMEMでゆっくりと希釈した。
(7)懸濁液を遠心した(1000g)。
(8)細胞を腹膜マクロファージと共にプレートに播種した。
(9)細胞を37℃及び5%CO2で培養した。
(1)免疫マウスから膝窩リンパ節を採取し、ホモジナイズした。
(2)温かいDMEMで細胞を洗浄した。
(3)細胞をsp2/0骨髄腫細胞と混合した。
(4)この混合物を遠心した(1000g)。
(5)このペレットを50%PEG1500に懸濁し、1分間インキュベートした。
(6)この懸濁液を温かいDMEMでゆっくりと希釈した。
(7)懸濁液を遠心した(1000g)。
(8)細胞を腹膜マクロファージと共にプレートに播種した。
(9)細胞を37℃及び5%CO2で培養した。
各マウスから500個超のHAT耐性ハイブリドーマクローンを得た。クローン上清は、全て3つの吸収された抗原(CM、CH及びFc)に対するELISAによって4日の間隔を置いて2回試験した。試験の結果、CM及びCHの両方と反応し、且つFcと反応しなかった5つのクローンが得られた(全てサブクラスIgG1)。全ての陽性を限界希釈法によって2〜4回クローニングし、培養フラスコ内で増殖させて、腹水のためマウスに注射した。CLEC14aヒト(CH)による免疫の結果として3つのクローンが得られ、1つのクローン(CRT−3)はCLEC14aヒト−AP(CH−AP)による免疫の結果であり、及び1つのクローン(CRT−2)はCLEC14aマウス−AP(CM−AP)による免疫の結果であった。
細管形成アッセイ
HUVECを20μg/mlのCRT2、CRT3又はCRT4又はIgGアイソタイプ対照で処置した。16時間の時点で細管の画像を撮り、細管の全長、ジャンクションの数、分岐の数、分岐の長さ、網目の数及び網目の総面積について分析した。実験は3回繰り返し、各実験につき5つのデータ点を分析した。
HUVECを20μg/mlのCRT2、CRT3又はCRT4又はIgGアイソタイプ対照で処置した。16時間の時点で細管の画像を撮り、細管の全長、ジャンクションの数、分岐の数、分岐の長さ、網目の数及び網目の総面積について分析した。実験は3回繰り返し、各実験につき5つのデータ点を分析した。
結果
図2は、HUVEC及び他の初代細胞におけるCLEC14Aの相対発現を示すグラフである。CLEC14Aは内皮細胞で特異的に発現した。これは、CLEC14Aが内皮特異的であるという本発明者らの以前の知見を裏付けている(Herbert et al, 2008)。
図2は、HUVEC及び他の初代細胞におけるCLEC14Aの相対発現を示すグラフである。CLEC14Aは内皮細胞で特異的に発現した。これは、CLEC14Aが内皮特異的であるという本発明者らの以前の知見を裏付けている(Herbert et al, 2008)。
CLEC14Aモノクローナル抗体が血管新生を阻害する能力を調べた。モノクローナル抗体を用いて引っ掻き傷治癒アッセイを行った。図3に示すとおり、HUVECを10μg/mlのモノクローナル抗体CRT−3で処置したとき、対照における13%と比較して、12時間の時点で創傷面積の25%が開いたままであった。これらの結果は、CLEC14A抗体が内皮細胞遊走に対して阻害効果を有することを示している。内皮細胞遊走は、血管新生の本質的特徴である。従って、このアッセイは、CLEC14A抗体が血管新生を阻害することのエビデンスを提供する。
更に、細管形成アッセイから、CRT4による処置によって分岐の数及び全長が有意に増加したこと、及びCRT4は、1視野当たりの網目の数も有意に減少させたことが示された。これらの結果は、CRT4がチューブ形成に影響を及ぼさないが、チューブの接続には影響を及ぼすことを示唆している。これは、細管があまりよく相互接続されないことの指標である分岐の数及び長さの増加によって明らかである。CRT2及びCRT3処置では、細管長さ及びジャンクション数の有意な減少が生じ、CRT2は、1視野当たりの網目面積も有意に減少させた。従って、これらのアッセイは、個別的なCLEC14A抗体が血管新生を阻害する(チューブ形成に対して異なる効果を有することによるが)ことの更なるエビデンスを提供する。
CLEC14A特異的プローブを用いて固形腫瘍及び正常組織の切片におけるCLEC14Aの発現を調べた(データは示さず)。CLEC14A発現は、分析した全ての腫瘍組織の血管に見られた。卵巣、膀胱、肝臓、乳房、腎臓及び前立腺腫瘍はCLEC14A発現が強陽性であった一方、胃、食道、肺、結腸、直腸、膵臓及び甲状腺腫瘍組織は、より低い特異的CLEC14A発現レベルを示した。対応する正常対照(非腫瘍)組織のいずれにもCLEC14A発現は検出されなかった。従って、CLEC14Aは、腫瘍血管構造に特異的に発現することが実証されている。
実施例2:CLEC14A−MMRN2結合を遮断すると発芽血管新生及び腫瘍成長が阻害される
材料及び方法
試薬
ウエスタンブロッティング及び免疫沈降用;一次抗体:ヒツジポリクローナル抗ヒトCLEC14A(R&D systems)、マウスモノクローナル抗ヒトチューブリン(Sigma)、マウスポリクローナル抗ヒトMMRN2(Abnova);二次抗体:西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスIgG(Dako)、HRPコンジュゲートロバポリクローナル抗ヒツジIgG(R&D systems)。免疫蛍光法用;一次抗体:ウサギポリクローナル抗マウスPECAM(Santa Cruz);二次抗体:Alexa Fluor488コンジュゲートロバポリクローナル抗ウサギ(Invitrogen)。フローサイトメトリー用;一次抗体:マウスモノクローナル抗HAタグ(CRUK)、マウスモノクローナル抗CLEC14A(C2、C4、以下に記載);二次抗体:Alexa Fluor488コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスIgG(Invitrogen)。
材料及び方法
試薬
ウエスタンブロッティング及び免疫沈降用;一次抗体:ヒツジポリクローナル抗ヒトCLEC14A(R&D systems)、マウスモノクローナル抗ヒトチューブリン(Sigma)、マウスポリクローナル抗ヒトMMRN2(Abnova);二次抗体:西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスIgG(Dako)、HRPコンジュゲートロバポリクローナル抗ヒツジIgG(R&D systems)。免疫蛍光法用;一次抗体:ウサギポリクローナル抗マウスPECAM(Santa Cruz);二次抗体:Alexa Fluor488コンジュゲートロバポリクローナル抗ウサギ(Invitrogen)。フローサイトメトリー用;一次抗体:マウスモノクローナル抗HAタグ(CRUK)、マウスモノクローナル抗CLEC14A(C2、C4、以下に記載);二次抗体:Alexa Fluor488コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスIgG(Invitrogen)。
プラスミド
タンパク質産生用;レンチウイルスプラスミドpsPAX2(レンチウイルスパッケージング;Addgene)、pMD2G(エンベローププラスミド;Addgene)及びpWPI hCLEC14A-ECD-Fc(IRES−EGFP含有レンチウイルス哺乳類発現プラスミド;Addgene)を使用した。clec14a IMAGEクローン(Origene)からpcDNA3-Fcプラスミドへの初期PCRサブクローニングによってpWPI hCLEC14A-Fc及びmCLEC14A-Fcを作成した。使用したプライマーは以下のとおりであった:ヒトCLEC14Aフォワード5’TAGTAGGAATTCGAGAGAATGAGGCCGGCGTTCGCCCTG3’(配列番号4);ヒトCLEC14Aリバース−5’AGAACCGCGGCCGCTGGAGGAGTCGAAAGCCTGAGGAGT3’(配列番号5);マウスCLEC14Aフォワード−5’TAGTAGGAATTCGAGAGAATGAGGCCAGCGCTTGCCCTG3’(配列番号6;マウスCLEC14Aリバース−5’CTACTAGCGGCCGCTCGTGGAAGAGGTGTCGAAAGT3’(配列番号7)。EcoR1及びNot1制限部位を用いてCLEC14Aを挿入した。更なるPCRサブクローニングラウンドを実施してCLEC14A−Fc融合物をpWPIにトランスファーした。使用したプライマーは、以下のとおりであった:ヒトCLEC14Aフォワード−5’TAGTAGTTAATTAAGAGAGAATGAGGCCGGCGTTC3’(配列番号8);マウスCLEC14Aフォワード−5’TAGTAGTTAATTAAGAGAGAATGAGGCCAGCGCTT3’(配列番号9);ヒトFcリバース−5’CTACTAGTTTAAACTCATTTACCCGGAGACAGGGA3’(配列番号10)。このステップには、Pac1及びPme1制限部位を使用した。
タンパク質産生用;レンチウイルスプラスミドpsPAX2(レンチウイルスパッケージング;Addgene)、pMD2G(エンベローププラスミド;Addgene)及びpWPI hCLEC14A-ECD-Fc(IRES−EGFP含有レンチウイルス哺乳類発現プラスミド;Addgene)を使用した。clec14a IMAGEクローン(Origene)からpcDNA3-Fcプラスミドへの初期PCRサブクローニングによってpWPI hCLEC14A-Fc及びmCLEC14A-Fcを作成した。使用したプライマーは以下のとおりであった:ヒトCLEC14Aフォワード5’TAGTAGGAATTCGAGAGAATGAGGCCGGCGTTCGCCCTG3’(配列番号4);ヒトCLEC14Aリバース−5’AGAACCGCGGCCGCTGGAGGAGTCGAAAGCCTGAGGAGT3’(配列番号5);マウスCLEC14Aフォワード−5’TAGTAGGAATTCGAGAGAATGAGGCCAGCGCTTGCCCTG3’(配列番号6;マウスCLEC14Aリバース−5’CTACTAGCGGCCGCTCGTGGAAGAGGTGTCGAAAGT3’(配列番号7)。EcoR1及びNot1制限部位を用いてCLEC14Aを挿入した。更なるPCRサブクローニングラウンドを実施してCLEC14A−Fc融合物をpWPIにトランスファーした。使用したプライマーは、以下のとおりであった:ヒトCLEC14Aフォワード−5’TAGTAGTTAATTAAGAGAGAATGAGGCCGGCGTTC3’(配列番号8);マウスCLEC14Aフォワード−5’TAGTAGTTAATTAAGAGAGAATGAGGCCAGCGCTT3’(配列番号9);ヒトFcリバース−5’CTACTAGTTTAAACTCATTTACCCGGAGACAGGGA3’(配列番号10)。このステップには、Pac1及びPme1制限部位を使用した。
以下のプライマー:フォワード−CCGGACCGGTCAGGCTTCCAGTACTAGCC(配列番号11);リバース−CGGGGTACCGGTCTTAAACATCAGGAAGC(配列番号12)を用いたmmrn2 IMAGEクローン(Thermo)からpHL-Avitag3へのPCRクローニングによってMMRN2哺乳類発現プラスミドを構築した。Age1及びKpn1制限酵素を使用した。
細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞を先述のとおり単離した。臍帯は、インフォームドコンセントを得てバーミンガム・ウィメンズ・ヘルスケア(Birmingham Women’s Health Care)NHSトラストから入手した。継代1〜6代目間のHUVECを使用し、10%ウシ胎仔血清(PAA)、1%ウシ脳抽出物、90μg/mlヘパリン、及び4mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン(Invitrogen)を含有するM199完全培地(cM199)で培養し、0.1%ブタ皮膚由来タイプ1ゼラチンでコートしたプレートに播種した。HEK293T細胞は、10%ウシ胎仔血清(PAA)、4mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン(Invitrogen)を含有するDMEM(Sigma)完全培地(cDMEM)で培養した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞を先述のとおり単離した。臍帯は、インフォームドコンセントを得てバーミンガム・ウィメンズ・ヘルスケア(Birmingham Women’s Health Care)NHSトラストから入手した。継代1〜6代目間のHUVECを使用し、10%ウシ胎仔血清(PAA)、1%ウシ脳抽出物、90μg/mlヘパリン、及び4mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン(Invitrogen)を含有するM199完全培地(cM199)で培養し、0.1%ブタ皮膚由来タイプ1ゼラチンでコートしたプレートに播種した。HEK293T細胞は、10%ウシ胎仔血清(PAA)、4mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン(Invitrogen)を含有するDMEM(Sigma)完全培地(cDMEM)で培養した。
HUVECにおけるsiRNAトランスフェクションを先述のとおり実施した。HEK293T細胞において、上記のレンチウイルスパッケージング、エンベロープ及び発現プラスミドによる一過性トランスフェクションによりレンチウイルスを作製した。プラスミドをOptiMEM(Invitrogen)中においてポリエチレンイミン(36μg/ml)と1:4の比において室温で10分間インキュベートした後、cDMEM中のHEK293T細胞に加えた。培地上清を使用して新鮮なHEK293T細胞を形質導入した。GFP陽性HEK293T細胞を選別し、タンパク質産生に使用した。pHL-Avitag3 hMMRN2を使用した上記のとおりのポリエチレンイミン一過性トランスフェクションにより、HEK293T細胞におけるMMRN2の発現を実現した。
定量的PCR
High-Capacity cDNA Archiveキット(Applied Biosystems)を使用して、1μgの抽出全RNAからcDNAを調製した。RG-3000(Corbett/Qiagen、Manchester、英国)サーモサイクラーでExpress qPCR supermix(Invitrogen)を用いてqPCR反応を実施した。ヒトclec14a及びフロチリン−2のプライマーは先述のとおりであった。マウスclec14a 5’UTR、CDS及び3’UTR並びにマウスβアクチンのプライマーは以下のとおりである:5’UTRフォワード−TTCCTTTTCCAGGGTTTGTG(配列番号13);5’UTRリバース−GCCTACAAGGTGGCTTGAAT(配列番号14);CDSフォワード−AAGCTGTGCTCCTGCTCTTG(配列番号15;CDSリバース−TCCTGAGTGCACTGTGAGATG(配列番号16);3’UTRフォワード−CTGTAGAGGGCGGTGACTTT(配列番号17);3’UTRリバース−AGCTGCTCCCAAGTCCTCT(配列番号18);mACTBフォワード−CTAAGGCCAACCGTGAAAAG(配列番号19);mACTBリバース−ACCAGAGGCATACAGGGACA(配列番号20)。効率調整した数学的モデルに従い相対発現比を計算した。
High-Capacity cDNA Archiveキット(Applied Biosystems)を使用して、1μgの抽出全RNAからcDNAを調製した。RG-3000(Corbett/Qiagen、Manchester、英国)サーモサイクラーでExpress qPCR supermix(Invitrogen)を用いてqPCR反応を実施した。ヒトclec14a及びフロチリン−2のプライマーは先述のとおりであった。マウスclec14a 5’UTR、CDS及び3’UTR並びにマウスβアクチンのプライマーは以下のとおりである:5’UTRフォワード−TTCCTTTTCCAGGGTTTGTG(配列番号13);5’UTRリバース−GCCTACAAGGTGGCTTGAAT(配列番号14);CDSフォワード−AAGCTGTGCTCCTGCTCTTG(配列番号15;CDSリバース−TCCTGAGTGCACTGTGAGATG(配列番号16);3’UTRフォワード−CTGTAGAGGGCGGTGACTTT(配列番号17);3’UTRリバース−AGCTGCTCCCAAGTCCTCT(配列番号18);mACTBフォワード−CTAAGGCCAACCGTGAAAAG(配列番号19);mACTBリバース−ACCAGAGGCATACAGGGACA(配列番号20)。効率調整した数学的モデルに従い相対発現比を計算した。
ウエスタンブロッティング及び免疫沈降
全細胞タンパク質ライセートを作製し、2×107個のHUVECからタンパク質を抽出したことを除き、先述のとおり共免疫沈降実験を実施した。CLEC14A相互作用タンパク質の初回の単離には、5μg CLEC14A−Fc又は等モル量のhFcを使用した。内因性免疫沈降実験には、0.4μg 抗CLEC14A抗体又はヒツジIgGを使用した。遮断実験には、5μg CLEC14A−Fc又はhFcをPBS中でプロテインGビーズに一晩結合させた。ビーズは20%FCS(PAA)含有PBS中で5〜6時間ブロックした。結合したCLEC14A−Fc又はhFcタンパク質を結合緩衝液中の漸増濃度のmIgG、C2又はC4で一晩ブロックした。次に、MMRN2トランスフェクトHEK293T細胞からのライセートをビーズ複合体と一晩インキュベートした後、洗浄し、ウエスタンブロットによって分析した。ウエスタンブロッティング及びSDS−PAGEには標準プロトコルを用いた。一次抗体は、対応するHRPコンジュゲート二次抗体と共に本文中に指示するとおり使用した。
全細胞タンパク質ライセートを作製し、2×107個のHUVECからタンパク質を抽出したことを除き、先述のとおり共免疫沈降実験を実施した。CLEC14A相互作用タンパク質の初回の単離には、5μg CLEC14A−Fc又は等モル量のhFcを使用した。内因性免疫沈降実験には、0.4μg 抗CLEC14A抗体又はヒツジIgGを使用した。遮断実験には、5μg CLEC14A−Fc又はhFcをPBS中でプロテインGビーズに一晩結合させた。ビーズは20%FCS(PAA)含有PBS中で5〜6時間ブロックした。結合したCLEC14A−Fc又はhFcタンパク質を結合緩衝液中の漸増濃度のmIgG、C2又はC4で一晩ブロックした。次に、MMRN2トランスフェクトHEK293T細胞からのライセートをビーズ複合体と一晩インキュベートした後、洗浄し、ウエスタンブロットによって分析した。ウエスタンブロッティング及びSDS−PAGEには標準プロトコルを用いた。一次抗体は、対応するHRPコンジュゲート二次抗体と共に本文中に指示するとおり使用した。
フローサイトメトリー
細胞を細胞解離緩衝液(Invitrogen)で剥離し、PBSでリンスした後、ブロッキング緩衝液(PBS、3%BSA、1%NaN3)中で15分間インキュベートした。続いて、ブロッキング緩衝液中の10μg/ml抗HAタグ(CRUK)、一次抗体としての10μg/ml抗CLEC14A(C2、C4、以下に記載する)を使用して30分間染色した。細胞をPBSでリンスし、ブロッキング緩衝液中のAlexa Fiuor488コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスIgG(Invitrogen)で染色した。データ(15,000イベント/試料)はFACSCalibur装置(Becton Dickinson、オックスフォード、英国)を使用して収集し、結果はBecton Dickinson Cell Questソフトウェアで分析した。
細胞を細胞解離緩衝液(Invitrogen)で剥離し、PBSでリンスした後、ブロッキング緩衝液(PBS、3%BSA、1%NaN3)中で15分間インキュベートした。続いて、ブロッキング緩衝液中の10μg/ml抗HAタグ(CRUK)、一次抗体としての10μg/ml抗CLEC14A(C2、C4、以下に記載する)を使用して30分間染色した。細胞をPBSでリンスし、ブロッキング緩衝液中のAlexa Fiuor488コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスIgG(Invitrogen)で染色した。データ(15,000イベント/試料)はFACSCalibur装置(Becton Dickinson、オックスフォード、英国)を使用して収集し、結果はBecton Dickinson Cell Questソフトウェアで分析した。
HUVECスフェロイド発芽アッセイ及びインビトロマトリゲルチューブ形成アッセイ
HUVECスフェロイドの作成及びコラーゲンゲルにおける内皮発芽の誘導を、スフェロイド当たり1000個のHUVECを使用して先述のとおり実施した。包埋後16時間で定量化を実施した。新芽成長を定量化するため新芽の数をカウントし、累積新芽長さ及び最大新芽長さを評価した。2色発芽実験のため、HUVECをオレンジ色及び緑色のCellTracker色素(Invitrogen)で予め標識した。24時間後、スフェロイドを4%ホルムアルデヒドで固定し、Vectorshield(Vector labs)でマウントした。Axioskop2顕微鏡及びAxioVision SE64 Rel4.8ソフトウェア(Zeiss、ケンブリッジ、英国)でスライドを画像化した。
HUVECスフェロイドの作成及びコラーゲンゲルにおける内皮発芽の誘導を、スフェロイド当たり1000個のHUVECを使用して先述のとおり実施した。包埋後16時間で定量化を実施した。新芽成長を定量化するため新芽の数をカウントし、累積新芽長さ及び最大新芽長さを評価した。2色発芽実験のため、HUVECをオレンジ色及び緑色のCellTracker色素(Invitrogen)で予め標識した。24時間後、スフェロイドを4%ホルムアルデヒドで固定し、Vectorshield(Vector labs)でマウントした。Axioskop2顕微鏡及びAxioVision SE64 Rel4.8ソフトウェア(Zeiss、ケンブリッジ、英国)でスライドを画像化した。
マトリゲルチューブ形成アッセイについて、1.4×105個のHUVECを12ウェルプレート内の70μl基底膜抽出物(Matrigel、BD Bioscience、オックスフォード、英国)に播種した。16時間後、USB 2.0 2M Xliデジタルカメラ(XL Imaging LLC、キャロルトン、TX、米国)を備えたLeica DM IL顕微鏡(Leica、ミルトン・キーンズ、英国)を10倍の倍率で使用して1ウェル当たり5視野の画像を撮った。NIHウェブサイト((http://imagej.nih.gov/ij/macros/toolsets/Angiogenesis%20Analyzer.txt)で利用可能である、Image J用の血管新生アナライザープラグイン(Carpentier G. et al., Angiogenesis Analyzer for ImageJ. 4th ImageJ User and Developer Conference proceedings)で画像を分析した。
タンパク質産生
CLEC14A−Fcを発現するHEK293T細胞から培養培地(CM)を回収した。CMをHiTrapプロテインA HPカラム(GE healthcare、Amersham、英国)に流し、0〜100%グラジエントの100mMクエン酸ナトリウム(pH3)を用いてタンパク質を溶出させた後、1M トリス塩基で中和した。画分をSDS−PAG上で泳動させて、クーマシー染色及びウエスタンブロッティングによりタンパク質純度及び特異性に関して評価した。機能アッセイ前に、同様の濃度のタンパク質を含有する画分を合わせ、PBSで透析した。
CLEC14A−Fcを発現するHEK293T細胞から培養培地(CM)を回収した。CMをHiTrapプロテインA HPカラム(GE healthcare、Amersham、英国)に流し、0〜100%グラジエントの100mMクエン酸ナトリウム(pH3)を用いてタンパク質を溶出させた後、1M トリス塩基で中和した。画分をSDS−PAG上で泳動させて、クーマシー染色及びウエスタンブロッティングによりタンパク質純度及び特異性に関して評価した。機能アッセイ前に、同様の濃度のタンパク質を含有する画分を合わせ、PBSで透析した。
モノクローナル抗体作成
マウスモノクローナル抗体は、Serotec Ltd(オックスフォード、英国)により、本発明者らが提供したトレランスを破綻させるための以下のプロトコルを用いて商業的に調製された。精製マウスCLEC14A−Fc融合タンパク質をフロイント完全アジュバント中50μgで皮下投与した。2週間後、マウスに更なる50μgを皮下投与したが、このときにはフロイントアジュバント中であった。マウスを殺処分し、2週間後の融合のため脾臓を摘出した。
マウスモノクローナル抗体は、Serotec Ltd(オックスフォード、英国)により、本発明者らが提供したトレランスを破綻させるための以下のプロトコルを用いて商業的に調製された。精製マウスCLEC14A−Fc融合タンパク質をフロイント完全アジュバント中50μgで皮下投与した。2週間後、マウスに更なる50μgを皮下投与したが、このときにはフロイントアジュバント中であった。マウスを殺処分し、2週間後の融合のため脾臓を摘出した。
clec14a −/−マウスの作成
マウスはバーミンガム生物医学サービスユニット(Birmingham Biomedical Services Unit)(Birmingham、英国)で飼育した。CLEC14A欠失カセットを含有するC57BL/6N VGB6フィーダー依存胚性幹細胞(Clec14atm1(KOMP)Vlcg;プロジェクト番号VG10554)をノックアウトマウスプロジェクト(Knockout Mouse Project)(カリフォルニア大学、Davis、米国)から調達した。バーミンガム大学のトランスジェニックマウス施設において胚性幹細胞をアルビノC57BL/6マウスに注射することによってキメラマウスが作成され、C57BL/6雌と交配することにより、カセットに関してヘテロ接合のマウスが作成された。動物管理は、適切を有した。
マウスはバーミンガム生物医学サービスユニット(Birmingham Biomedical Services Unit)(Birmingham、英国)で飼育した。CLEC14A欠失カセットを含有するC57BL/6N VGB6フィーダー依存胚性幹細胞(Clec14atm1(KOMP)Vlcg;プロジェクト番号VG10554)をノックアウトマウスプロジェクト(Knockout Mouse Project)(カリフォルニア大学、Davis、米国)から調達した。バーミンガム大学のトランスジェニックマウス施設において胚性幹細胞をアルビノC57BL/6マウスに注射することによってキメラマウスが作成され、C57BL/6雌と交配することにより、カセットに関してヘテロ接合のマウスが作成された。動物管理は、適切を有した。
内務省(Home Office)の承認及び許可
大動脈リング及びマウス皮下スポンジ血管新生アッセイ
大動脈を分離し、コラーゲン中での大動脈リングアッセイ用に処理した。管/新芽成長、最大内皮遊走及び全内皮成長を定量化した。マウス皮下スポンジ血管新生アッセイは、先述のものに少し変更を加えて実施した。0日目、雄C57黒色マウスの各側腹部の背側皮下に皮下滅菌ポリエーテルスポンジディスク(10×5×5mm)を植え込んだ。隔日で14日間にわたり、皮膚から100μl bFGF(40ng/ml;R&D systems)をスポンジに直接注入した。14日目にスポンジを摘出し、10%ホルマリンで固定してパラフィン包埋した。切片をヘマトキシリン・エオシンで染色し、細胞侵入分析のため、USB 2.0 2M Xliデジタルカメラ(XL Imaging LLC、キャロルトン、TX、米国)を備えたLeica MZ 16顕微鏡(Leica、ミルトン・キーンズ、英国)を1倍の倍率で使用してスポンジ断面を撮った。Leica DM E顕微鏡(Leica、ミルトン・キーンズ、英国)によって40倍の倍率で取得された画像を血管密度に関して分析した。1スポンジ当たり各切片につき5視野で血管カウントを評価した。全ての動物実験は、RBが保有する内務省認可番号PPL 40/3339に基づき行われた。
大動脈リング及びマウス皮下スポンジ血管新生アッセイ
大動脈を分離し、コラーゲン中での大動脈リングアッセイ用に処理した。管/新芽成長、最大内皮遊走及び全内皮成長を定量化した。マウス皮下スポンジ血管新生アッセイは、先述のものに少し変更を加えて実施した。0日目、雄C57黒色マウスの各側腹部の背側皮下に皮下滅菌ポリエーテルスポンジディスク(10×5×5mm)を植え込んだ。隔日で14日間にわたり、皮膚から100μl bFGF(40ng/ml;R&D systems)をスポンジに直接注入した。14日目にスポンジを摘出し、10%ホルマリンで固定してパラフィン包埋した。切片をヘマトキシリン・エオシンで染色し、細胞侵入分析のため、USB 2.0 2M Xliデジタルカメラ(XL Imaging LLC、キャロルトン、TX、米国)を備えたLeica MZ 16顕微鏡(Leica、ミルトン・キーンズ、英国)を1倍の倍率で使用してスポンジ断面を撮った。Leica DM E顕微鏡(Leica、ミルトン・キーンズ、英国)によって40倍の倍率で取得された画像を血管密度に関して分析した。1スポンジ当たり各切片につき5視野で血管カウントを評価した。全ての動物実験は、RBが保有する内務省認可番号PPL 40/3339に基づき行われた。
腫瘍移植アッセイ
106個のルイス肺癌細胞を8〜10週齢の雄マウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍成長を毎日ノギスで計測することによりモニタし、2〜4週間成長させた後、腫瘍質量を重量で決定し、4%PFAで固定し、パラフィン包埋して、6μmの連続切片を切り出した。
106個のルイス肺癌細胞を8〜10週齢の雄マウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍成長を毎日ノギスで計測することによりモニタし、2〜4週間成長させた後、腫瘍質量を重量で決定し、4%PFAで固定し、パラフィン包埋して、6μmの連続切片を切り出した。
免疫蛍光法及びX−gal染色
当該技術分野において公知の方法を用いて免疫蛍光染色及びX−Gal染色を実施した。
当該技術分野において公知の方法を用いて免疫蛍光染色及びX−Gal染色を実施した。
結果
CLEC14Aは、インビトロで発芽血管新生を調節する
CLEC14Aは、インビトロで内皮遊走及びチューブ形成に関与することがこれまでに示されている。インビトロでの発芽血管新生におけるCLEC14Aの役割を調べるため、clec14aを標的とするsiRNA又は非相補的siRNA二重鎖で処置したHUVECからHUVECスフェロイドを作成した。clec14a発現のノックダウンが、qPCRによってmRNAレベルで(3つの実験で平均74%の低下)(図5A)、及び抗CLEC14Aポリクローナル抗血清でプローブしたタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析によってタンパク質レベルで(図5B)確認された。CLEC14AノックダウンスフェロイドからのVEGF誘導性の発芽が妨げられ、ノックダウンスフェロイドは、スフェロイド当たり平均6.9個の新芽を生じ、それに対して対照細胞では13.2個であった(図5C及び図5D)。先端/柄細胞形成におけるCLEC14Aの役割を決定するため、対照HUVEC及びノックダウンHUVECを赤色又は緑色のいずれかで染色して混合した後にスフェロイドを形成し、発芽を誘導した(図5E)。CLEC14Aのノックダウンにより、先端位置にある細胞の割合(33%)は、対照細胞(67%)と比較して減少したが、しかしながら、CLEC14AノックダウンHUVECに由来した柄細胞の割合に何らの効果もなかった(図5F)。これらのデータは、CLEC14Aが新芽の惹起及び遊走において役割を有することを示唆している。
CLEC14Aは、インビトロで発芽血管新生を調節する
CLEC14Aは、インビトロで内皮遊走及びチューブ形成に関与することがこれまでに示されている。インビトロでの発芽血管新生におけるCLEC14Aの役割を調べるため、clec14aを標的とするsiRNA又は非相補的siRNA二重鎖で処置したHUVECからHUVECスフェロイドを作成した。clec14a発現のノックダウンが、qPCRによってmRNAレベルで(3つの実験で平均74%の低下)(図5A)、及び抗CLEC14Aポリクローナル抗血清でプローブしたタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析によってタンパク質レベルで(図5B)確認された。CLEC14AノックダウンスフェロイドからのVEGF誘導性の発芽が妨げられ、ノックダウンスフェロイドは、スフェロイド当たり平均6.9個の新芽を生じ、それに対して対照細胞では13.2個であった(図5C及び図5D)。先端/柄細胞形成におけるCLEC14Aの役割を決定するため、対照HUVEC及びノックダウンHUVECを赤色又は緑色のいずれかで染色して混合した後にスフェロイドを形成し、発芽を誘導した(図5E)。CLEC14Aのノックダウンにより、先端位置にある細胞の割合(33%)は、対照細胞(67%)と比較して減少したが、しかしながら、CLEC14AノックダウンHUVECに由来した柄細胞の割合に何らの効果もなかった(図5F)。これらのデータは、CLEC14Aが新芽の惹起及び遊走において役割を有することを示唆している。
CLEC14Aは、インビボで発芽血管新生を調節する
CLEC14Aに関する既発表のデータでは、インビトロで内皮生物学におけるその役割が実証されているが、しかしながら、そのインビボでの役割については依然として報告されていない。CLEC14Aのインビボ及びエキソビボでの役割を調べるため、マウスを作成してclec14aコード配列をlacZレポーターに置き換えた(図6A)。ヘテロ接合体(clec14a −/+)の交配により、等しい割合の雄マウス及び雌マウス(それぞれ49.5%/50.5%)及び野生型:ヘテロ接合体:ホモ接合体マウス(それぞれ26.4%:47.2%:26.4%)のメンデル比が生じた。clec14aは内皮限定遺伝子であるため、clec14a +/+及びclec14a −/−マウスから大動脈を分離した。抽出したcDNAをqPCRによって分析して、clec14aコード領域が欠損しているものの、5’及び3’非翻訳領域の発現は保持されていることが確認された(図6B)。タンパク質レベルでのCLEC14Aの欠損も肺組織ライセートのウエスタンブロット分析によって確認された(図6C)。
CLEC14Aに関する既発表のデータでは、インビトロで内皮生物学におけるその役割が実証されているが、しかしながら、そのインビボでの役割については依然として報告されていない。CLEC14Aのインビボ及びエキソビボでの役割を調べるため、マウスを作成してclec14aコード配列をlacZレポーターに置き換えた(図6A)。ヘテロ接合体(clec14a −/+)の交配により、等しい割合の雄マウス及び雌マウス(それぞれ49.5%/50.5%)及び野生型:ヘテロ接合体:ホモ接合体マウス(それぞれ26.4%:47.2%:26.4%)のメンデル比が生じた。clec14aは内皮限定遺伝子であるため、clec14a +/+及びclec14a −/−マウスから大動脈を分離した。抽出したcDNAをqPCRによって分析して、clec14aコード領域が欠損しているものの、5’及び3’非翻訳領域の発現は保持されていることが確認された(図6B)。タンパク質レベルでのCLEC14Aの欠損も肺組織ライセートのウエスタンブロット分析によって確認された(図6C)。
多細胞三次元共培養下での発芽血管新生におけるCLEC14Aの役割を確認するため、大動脈を分離し、大動脈リングに切断し、コラーゲンに包埋した。VEGFによって細胞成長を刺激し、7日間にわたってモニタした後、内皮発芽のエンドポイント定量化を行った。この場合にも、CLEC14Aの欠損によって内皮の新芽成長及び遊走が妨げられた(図6D)。野生型マウスの大動脈リングでは、CLEC14Aノックアウトマウスにおける観察と比較して2倍を超える数の管が生じた(それぞれ30.6本の管に対して13.4本の管)(図6E)。加えて、各大動脈リングから最も離れて遊走した距離によって定義される最大遊走量もノックアウト培養物では低下した(図6F)。CLEC14Aがインビボで同様の機能を有するかどうかを評価するため、CLEC14Aノックアウトマウスの皮下にスポンジバレルを植え込んだ。2週間にわたる2日毎のスポンジへのbFGF注射を用いて細胞浸潤及び新血管新生を刺激した。ヘマトキシリン・エオシン染色したスポンジ切片の肉眼的分析により、clec14a −/−動物ではスポンジへの細胞の浸潤が妨げられたことが明らかになった(図6G及び図6H)。加えて、clec14a −/−動物について血管増生が有意に低下した(p<0.01)(図6I)。このモデルにおいて血管新生によって生じた血管の内側を覆う内皮細胞がclec14aを発現することを確認するため、CLEC14A KOマウスのスポンジ及び肝臓をx−galで染色した。対応する肝切片と比較してスポンジ内の血管にx−gal強染色が観察された(図6J)。これらのデータから、本発明者らは、マウスCLEC14A発現がインビボで且つインビトロでも内皮遊走及び血管新生発芽を調節し、及び発芽内皮でCLEC14Aが上方制御されると結論付けることができる。
CLEC14Aは、腫瘍成長を促進する
CLEC14A発現は、健常組織の血管と比較してヒト腫瘍血管で高度に上方制御されることが認められ、CLEC14Aに対して癌療法を標的化し得ることが示唆される。従って、CLEC14Aの欠損が腫瘍成長に効果を及ぼすかどうかを調べるため、本発明者らは、同系ルイス肺癌(LLC)モデルを使用した。そのため、1×106個のLLC細胞をclec14a +/+又はclec14a −/−マウスのいずれかの右側腹部に皮下注射した。clec14a −/−マウスでは、clec14a +/+同腹仔と比較して腫瘍成長が低下した(図7A)。これは、3つの独立した実験によって確認された。clec14a −/−マウスから取った摘出腫瘍は、clec14a +/+同腹仔と比べてサイズが小さく(図7B)、重量が軽かった(図7C)。これらの腫瘍内の血管密度も影響を受けたかどうかを決定するため、抗CD31抗体で組織切片を染色した。分析によれば、個々の血管の密度の低下(図7D及び図7E)及びパーセンテージ内皮被覆率の低下(図7F)が示される。更には、clec14a −/−マウスから採取した腫瘍及び肝臓切片のx−gal染色により、赤血球が充満した管腔を持つ成熟血管(図3G、黒色の矢印)と、腫瘍内の未熟微小血管(図7G、赤色の矢印)との両方におけるclec14aの高発現が明らかであり、腫瘍血管でclec14aが上方制御されることが確認される。
CLEC14A発現は、健常組織の血管と比較してヒト腫瘍血管で高度に上方制御されることが認められ、CLEC14Aに対して癌療法を標的化し得ることが示唆される。従って、CLEC14Aの欠損が腫瘍成長に効果を及ぼすかどうかを調べるため、本発明者らは、同系ルイス肺癌(LLC)モデルを使用した。そのため、1×106個のLLC細胞をclec14a +/+又はclec14a −/−マウスのいずれかの右側腹部に皮下注射した。clec14a −/−マウスでは、clec14a +/+同腹仔と比較して腫瘍成長が低下した(図7A)。これは、3つの独立した実験によって確認された。clec14a −/−マウスから取った摘出腫瘍は、clec14a +/+同腹仔と比べてサイズが小さく(図7B)、重量が軽かった(図7C)。これらの腫瘍内の血管密度も影響を受けたかどうかを決定するため、抗CD31抗体で組織切片を染色した。分析によれば、個々の血管の密度の低下(図7D及び図7E)及びパーセンテージ内皮被覆率の低下(図7F)が示される。更には、clec14a −/−マウスから採取した腫瘍及び肝臓切片のx−gal染色により、赤血球が充満した管腔を持つ成熟血管(図3G、黒色の矢印)と、腫瘍内の未熟微小血管(図7G、赤色の矢印)との両方におけるclec14aの高発現が明らかであり、腫瘍血管でclec14aが上方制御されることが確認される。
CLEC14A−MMRN2相互作用の同定及び確認
CLEC14Aの細胞外ドメインの潜在的な結合パートナーを同定するため、本発明者らは、初めに、ヒトFcタグを付加したCLEC14A細胞外ドメインタンパク質を精製した。このタンパク質又はFc単独をHUVEC全細胞ライセートとインキュベートし、プロテインAアガロースビーズを用いて沈降させた。次に、沈降したタンパク質を洗浄し、SDS−PAG上で分離した。7つのゲル領域を切り出し、消化し、質量分析法によって分析した。同定された最も豊富なタンパク質はMMRN2で、12個のペプチド(11個がユニーク)があり、対応する対照プルダウン画分にはペプチドはなかった。沈降物のウエスタンブロット分析から、CLEC14A−ECD−FcプルダウンにおけるMMRN2の存在が確認され、これは、Fc単独プルダウンには検出されなかった(図8A)。この相互作用を更に確認するため、HUVEC全細胞ライセートから内因性CLEC14Aを免疫沈降させた。ウエスタンブロット分析により、CLEC14A沈降物におけるMMRN2共沈降が確認され、しかし、IgG対照では検出されなかった(図8B)。
CLEC14Aの細胞外ドメインの潜在的な結合パートナーを同定するため、本発明者らは、初めに、ヒトFcタグを付加したCLEC14A細胞外ドメインタンパク質を精製した。このタンパク質又はFc単独をHUVEC全細胞ライセートとインキュベートし、プロテインAアガロースビーズを用いて沈降させた。次に、沈降したタンパク質を洗浄し、SDS−PAG上で分離した。7つのゲル領域を切り出し、消化し、質量分析法によって分析した。同定された最も豊富なタンパク質はMMRN2で、12個のペプチド(11個がユニーク)があり、対応する対照プルダウン画分にはペプチドはなかった。沈降物のウエスタンブロット分析から、CLEC14A−ECD−FcプルダウンにおけるMMRN2の存在が確認され、これは、Fc単独プルダウンには検出されなかった(図8A)。この相互作用を更に確認するため、HUVEC全細胞ライセートから内因性CLEC14Aを免疫沈降させた。ウエスタンブロット分析により、CLEC14A沈降物におけるMMRN2共沈降が確認され、しかし、IgG対照では検出されなかった(図8B)。
CLEC14Aモノクローナル抗体の開発及び検証
CLEC14Aに関する更なる我々の理解のため、本発明者らは、次に異種間反応性抗体を作製した。これを実現するため、ヒトFcタグを有するマウスCLEC14Aタンパク質をHEK293T細胞において発現させて、プロテインAカラムで精製した。次に、マウスを50μgの完全フロイントアジュバント含有mCLEC14Aで免疫してトレランスを破綻させた。ヒトCLEC14A又はヒトFcに対する活性に関してクローンをスクリーニングした。これらのクローンが細胞に結合したCLEC14Aを認識し得ることを確認するため、HA−CLEC14Aを過剰発現するHEK293T細胞をクローンC2若しくはC4又はモノクローナルHAタグ抗体で染色した。FACs分析では、対照トランスフェクト細胞と比較して、HA−CLEC14A過剰発現細胞における抗体の各々について蛍光の増加が示される(データは示さず)。抗体が内因性型のCLEC14Aを認識することを確認するため、対照又はclec14a標的化siRNAで処置したHUVECをこれらのクローンを用いて染色した。対照HUVECは、クローンC2及びC4によって強染色され、この染色は、CLEC14Aのノックダウンによりアイソタイプ対照レベルまで低下した(データは示さず)。これらの結果から、CLEC14Aモノクローナル抗体の特異性が確認された。
CLEC14Aに関する更なる我々の理解のため、本発明者らは、次に異種間反応性抗体を作製した。これを実現するため、ヒトFcタグを有するマウスCLEC14Aタンパク質をHEK293T細胞において発現させて、プロテインAカラムで精製した。次に、マウスを50μgの完全フロイントアジュバント含有mCLEC14Aで免疫してトレランスを破綻させた。ヒトCLEC14A又はヒトFcに対する活性に関してクローンをスクリーニングした。これらのクローンが細胞に結合したCLEC14Aを認識し得ることを確認するため、HA−CLEC14Aを過剰発現するHEK293T細胞をクローンC2若しくはC4又はモノクローナルHAタグ抗体で染色した。FACs分析では、対照トランスフェクト細胞と比較して、HA−CLEC14A過剰発現細胞における抗体の各々について蛍光の増加が示される(データは示さず)。抗体が内因性型のCLEC14Aを認識することを確認するため、対照又はclec14a標的化siRNAで処置したHUVECをこれらのクローンを用いて染色した。対照HUVECは、クローンC2及びC4によって強染色され、この染色は、CLEC14Aのノックダウンによりアイソタイプ対照レベルまで低下した(データは示さず)。これらの結果から、CLEC14Aモノクローナル抗体の特異性が確認された。
C2及びC4クローンがCLEC14Aの同じ領域に結合するかどうかを決定するため、HUVECをBSA、C2又はC4抗体で前処置した後、C2−FITC染色した。C2インキュベーションによりC2−FITC染色が有効に遮断されたが、C4は、ほとんど効果を有しなかった。同じ前処置を繰り返した後、C4−FITC染色した。C2抗体は、C4−FITC染色に影響を及ぼさなかったが、しかしながら、C4で前処置したHUVECはC4−FITC結合の減少を示した。これらの結果から、本発明者らは、C2及びC4がCLEC14Aの個別的な領域に結合すると結論付けることができる。
CLEC14Aモノクローナル抗体は、CLEC14A−MMRN2結合を遮断する
これらのCLEC14Aモノクローナル抗体のいずれかがMMRN2によるCLEC14Aへの結合を阻害し得るかどうかを決定するため、CLEC14A−ECD−Fcを漸増濃度のmIgG1、又はC2、又はC4とプレインキュベートした後、MMRN2を過剰発現するHEK293T細胞からのライセートとインキュベートした。次に、沈降物を分離し、MMRN2又はCLEC14A−ECD−Fcに関してプローブした。mIgG1又はC2によって遮断したCLEC14A−ECD−Fc沈降物についてMMRN2結合が観察されたが、C4で遮断した沈降物ではMMRN2結合は観察されなかった。このことから、C4モノクローナル抗体は、CLEC14AへのMMRN2結合を遮断するが、C2モノクローナル抗体を遮断しないことが確認される(データは示さず)。
これらのCLEC14Aモノクローナル抗体のいずれかがMMRN2によるCLEC14Aへの結合を阻害し得るかどうかを決定するため、CLEC14A−ECD−Fcを漸増濃度のmIgG1、又はC2、又はC4とプレインキュベートした後、MMRN2を過剰発現するHEK293T細胞からのライセートとインキュベートした。次に、沈降物を分離し、MMRN2又はCLEC14A−ECD−Fcに関してプローブした。mIgG1又はC2によって遮断したCLEC14A−ECD−Fc沈降物についてMMRN2結合が観察されたが、C4で遮断した沈降物ではMMRN2結合は観察されなかった。このことから、C4モノクローナル抗体は、CLEC14AへのMMRN2結合を遮断するが、C2モノクローナル抗体を遮断しないことが確認される(データは示さず)。
CLEC14A−MMRN2遮断抗体は、腫瘍成長を阻害する
LLC腫瘍を有するマウスに、実験の継続期間中、10μg C4又はmIgG1(対照)を週2回腹腔内注射した。C4抗体で処置したマウスについて、対照mIgG1処置群と比較して腫瘍成長が減速した(図9A)。C4処置マウスの腫瘍は、対照動物と比べてサイズ(図9B)及び重量(図9C)が小さかった。この場合にも、本発明者らは、これらの腫瘍内における血管密度を調べた。抗CD31抗体で組織切片を染色し、蛍光分析から、個々の血管の密度(図9D及び図9E)及びパーセンテージ内皮被覆率(図9F)の低下が明らかになり、MMRN2へのCLEC14A結合が腫瘍誘導性血管新生の重要な機能要素であることが示唆された。
LLC腫瘍を有するマウスに、実験の継続期間中、10μg C4又はmIgG1(対照)を週2回腹腔内注射した。C4抗体で処置したマウスについて、対照mIgG1処置群と比較して腫瘍成長が減速した(図9A)。C4処置マウスの腫瘍は、対照動物と比べてサイズ(図9B)及び重量(図9C)が小さかった。この場合にも、本発明者らは、これらの腫瘍内における血管密度を調べた。抗CD31抗体で組織切片を染色し、蛍光分析から、個々の血管の密度(図9D及び図9E)及びパーセンテージ内皮被覆率(図9F)の低下が明らかになり、MMRN2へのCLEC14A結合が腫瘍誘導性血管新生の重要な機能要素であることが示唆された。
考察
CLEC14Aは、複数の腫瘍型で腫瘍血管新生に寄与する内皮遺伝子の小規模な群の1つである。ここで、本発明者らは、CLEC14Aの欠損によってインビボで腫瘍成長が阻害されることを実証する(図7)。TEM8、エンドグリン、ガレクチン、ELTD1、及びエンドシアリンなど、他の腫瘍内皮マーカーについても同様の表現型が観察されており、これは、血管新生及び腫瘍成長におけるこれらの腫瘍内皮発現遺伝子の重要性を実証している。
CLEC14Aは、複数の腫瘍型で腫瘍血管新生に寄与する内皮遺伝子の小規模な群の1つである。ここで、本発明者らは、CLEC14Aの欠損によってインビボで腫瘍成長が阻害されることを実証する(図7)。TEM8、エンドグリン、ガレクチン、ELTD1、及びエンドシアリンなど、他の腫瘍内皮マーカーについても同様の表現型が観察されており、これは、血管新生及び腫瘍成長におけるこれらの腫瘍内皮発現遺伝子の重要性を実証している。
ヒト腫瘍及び膵癌及び子宮頸癌マウスモデルでCLEC14Aの上方制御が観察されており、これは、LLCモデルにおいて腫瘍血管でclec14a発現が上方制御されるという知見を裏付けている(図7)。CLEC14Aは、接着、遊走、管形成を含め、内皮生物学の複数の側面を調節することが示されており、これらの結果は、それがインビトロ及びインビボでの発芽血管新生にも重要であることを示している(図5及び図6)。CLEC14AノックダウンによってインビトロHUVEC発芽が乱れるため、本発明者らは、CLEC14Aのこの役割が内皮間相互作用又は内皮−細胞外マトリックス相互作用を介すると推論することができ、他の細胞型の存在は重要でないことが示唆される。本発明者らは、皮下スポンジアッセイにおいて、新血管新生によって生じた血管におけるclec14a発現の上方制御も初めて観察した(図6)。これは、新しく形成された内皮新芽が分岐点から新芽の先端までの4.2μmから極めて低いずり応力(0.2Pa)を受けることがモデル化されており、及びclec14a発現が低いずり応力によって上方制御されることが知られていることから予想される。
CLEC14AとMMRN2との相互作用は、CLEC14Aの細胞外ドメインを用いたHUVECライセートからのタンパク質のプルダウン、並びに内因性タンパク質の免疫共沈降によって示されている(図8)。CLEC14Aモノクローナル抗体の作成及び検証を通じて、本発明者らは、CLEC14Aの個別的な領域に結合する2つの抗体を同定しており(C2及びC4)、C4クローンがCLEC14AとMMRN2との相互作用を遮断するが、C2クローンを遮断しないことを示した。CLEC14A−MMRN2相互作用の機能を調べるため、本発明者らは、マトリゲルチューブ形成アッセイにおいてC4抗体を使用し、分岐の増加及び網目発生の減少を見出した。更に、CLEC14A−MMRN2相互作用が腫瘍成長に重要であり(図9)、C4処置がclec14a −/−マウスで見られるとおりの腫瘍成長を再現し、及び腫瘍血管増生を低下させることが見出された(図7)。本例では、リガンド又は活性様式は同定されなかったが、これは、CLEC14A及び特異的細胞外相互作用が腫瘍成長に重要であることを初めて明らかにしたものであり、新規抗血管新生療法へのこれまでの道を示唆している。
実施例3 CLEC14Aモノクローナル抗体C1、C4及びC5は、CLEC14A−MMRN2相互作用を遮断する
いずれのCLEC14Aモノクローナル抗体がMMRN2によるCLEC14Aへの結合を阻害し得るかを決定するため、CLEC14A−ECD−Fcを漸増濃度のmIgG1又はCR1〜5とプレインキュベートした後、MMRN2を過剰発現するHEK293T細胞からのライセートとインキュベートした。次に、沈降物を分離し、MMRN2又はCLEC14A−ECD−Fcに関してプローブした。mIgG1又はC2及びC3で遮断したCLEC14A−ECD−Fc沈降物についてMMRN2結合が観察されたが、C1、4及び5で遮断した沈降物ではMMRN2結合は観察されなかった。このことから、抗体C1、4及び5が、C2及び3モノクローナル抗体が結合するのと異なるエピトープ上のCLEC14aに結合し、従ってCLEC14AとのMMRN2相互作用を特異的に遮断することが確認される。
いずれのCLEC14Aモノクローナル抗体がMMRN2によるCLEC14Aへの結合を阻害し得るかを決定するため、CLEC14A−ECD−Fcを漸増濃度のmIgG1又はCR1〜5とプレインキュベートした後、MMRN2を過剰発現するHEK293T細胞からのライセートとインキュベートした。次に、沈降物を分離し、MMRN2又はCLEC14A−ECD−Fcに関してプローブした。mIgG1又はC2及びC3で遮断したCLEC14A−ECD−Fc沈降物についてMMRN2結合が観察されたが、C1、4及び5で遮断した沈降物ではMMRN2結合は観察されなかった。このことから、抗体C1、4及び5が、C2及び3モノクローナル抗体が結合するのと異なるエピトープ上のCLEC14aに結合し、従ってCLEC14AとのMMRN2相互作用を特異的に遮断することが確認される。
実施例4 MMRN2結合ドメインのマッピング及びCRT抗体
1)MMRN2は、CTLD又はSushiドメイン又はCLEC14aのいずれにも結合する
MMRN2によるCLEC14Aへの結合は、CLEC14AのCTLD又はSUSHIドメインに絞り込まれた。ドメイン欠失にCTLD又はSUSHIドメインが存在しない場合、CLEC14Aは正しく折り畳まれず、それがもはやMMRN2(又はCRT抗体)に結合しなくなるものと思われる。これは、図11に示すMMRN2でファーウエスタンブロットしたCLEC14Aの欠失コンストラクトを用いて見出された。
1)MMRN2は、CTLD又はSushiドメイン又はCLEC14aのいずれにも結合する
MMRN2によるCLEC14Aへの結合は、CLEC14AのCTLD又はSUSHIドメインに絞り込まれた。ドメイン欠失にCTLD又はSUSHIドメインが存在しない場合、CLEC14Aは正しく折り畳まれず、それがもはやMMRN2(又はCRT抗体)に結合しなくなるものと思われる。これは、図11に示すMMRN2でファーウエスタンブロットしたCLEC14Aの欠失コンストラクトを用いて見出された。
2)CRT抗体は、CLECのCTLDドメインに結合し、SUSHIには結合しない
CTLD又はSUSHIが結合ドメインであったかどうかを更に決定するため、及び正しい折り畳みを確実にするため、CTLD又はSUSHIドメインをトロンボモジュリン(CD141としても知られる)−MMRN2に結合しない14型CTLDファミリーメンバーのものとスワップしたCLEC14Aのキメラコンストラクトを作製した。
CTLD又はSUSHIが結合ドメインであったかどうかを更に決定するため、及び正しい折り畳みを確実にするため、CTLD又はSUSHIドメインをトロンボモジュリン(CD141としても知られる)−MMRN2に結合しない14型CTLDファミリーメンバーのものとスワップしたCLEC14Aのキメラコンストラクトを作製した。
キメラ5(CD141のCTLDを有するCLEC14A)及びキメラ6(CD141のSUSHIを有するCLEC14A)の配列を図12に示す。
CRT抗体の結合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。全てのコンストラクトがC末端GFPタグを有するため、緑色の細胞をゲーティングし、赤色で染色した。全てのCRT抗体は、WT CLEC14Aと結合し、且つ − 予想どおり − いずれもWT CD141に結合しない(図13)。加えて、抗体は、いずれもキメラ5に結合せず(CRT2による僅かな結合を除く)、及び全ての抗体がキメラ6に結合する(CRT2を除く)(図13)。このことから、抗体CRT1、3、4及び5及びMMRN2の結合部位がC型レクチンドメイン内にあることが確認される。CRT2は、CTLDとsushiドメインとの間の領域で結合する可能性がある。
3)MMRN相互作用を遮断するCRT抗体は、国際公開第2013/187724号に指定される領域には結合せず、CLEC14a CTLDのaa 97〜108を含む領域には結合する
抗体とMMRN2との結合領域を更に決定するため、キメラループコンストラクトを作製した。これは、CLEC14A CTLDの構造予測と、また国際公開第2013/187724号の抗体が結合する領域とに基づいた。
抗体とMMRN2との結合領域を更に決定するため、キメラループコンストラクトを作製した。これは、CLEC14A CTLDの構造予測と、また国際公開第2013/187724号の抗体が結合する領域とに基づいた。
CD141の領域1〜42を含むCLEC14A
CD141配列 − MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGP(配列番号21)
CD141の領域97〜108を含むCLEC14A
CD141配列 − QLPPGCGDPKRL(配列番号22)
CD141の領域122〜142を含むCLEC14A
CD141配列 − TSYSRWARLDLNGAPLCGPL(配列番号23)。
CD141配列 − MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGP(配列番号21)
CD141の領域97〜108を含むCLEC14A
CD141配列 − QLPPGCGDPKRL(配列番号22)
CD141の領域122〜142を含むCLEC14A
CD141配列 − TSYSRWARLDLNGAPLCGPL(配列番号23)。
アラインメントを図12に示す。残念ながら、1〜42及び122〜142キメラは正しく折り畳まれなかった。これは、それらが細胞表面上に存在することに起因するものと思われる(CLEC14Aポリクローナル抗体に関して染色陽性、しかし、これらは、C抗体のいずれに関しても、更にはC2さえも染色されない。
しかしながら、97〜108キメラは、C2及びC3と結合し、この突然変異体が正しく折り畳まれることを示す。この突然変異体は、MMRN2又はC1、4又は5(これらは、CLEC14A−MMRN2相互作用を遮断するものと思われる抗体である)とは結合しない(図15)。従って、本発明者らは、結合ドメインが以下の残基:ERRRSCHTLENE(配列番号24)を含有するループに依存するものと結論付ける。
残基97〜108をトロンボモジュリンの対応する領域とスワップした。この結果、C2及びC3がなおも結合できるように正しい折り畳みが生じた(図16)。しかしながら、C1、C4及びC5は、この突然変異体を認識することができず、これが結合領域であることが示唆される。
この実験を3回繰り返し、同じ結果が得られた。
実施例5 − 抗体薬物コンジュゲート腫瘍データ
6〜8週齢の野生型雄C57BL6マウスの右側腹部に1×10^6個のルイス肺癌(LLC)細胞を皮下注射した。腫瘍が触知可能なサイズに達したところでマウスを各処置群B12−ADC、又はC4−ADC/CRT3−ADCに無作為に割り付けた。マウスに、1週間の間を置いて2回、1mg/kgの静脈内注射を尾静脈投与した。最終回の注射から1週間後、マウスを殺処分し、腫瘍を摘出して湿重量を計測した。データを図17A及び図17Bに示す。
6〜8週齢の野生型雄C57BL6マウスの右側腹部に1×10^6個のルイス肺癌(LLC)細胞を皮下注射した。腫瘍が触知可能なサイズに達したところでマウスを各処置群B12−ADC、又はC4−ADC/CRT3−ADCに無作為に割り付けた。マウスに、1週間の間を置いて2回、1mg/kgの静脈内注射を尾静脈投与した。最終回の注射から1週間後、マウスを殺処分し、腫瘍を摘出して湿重量を計測した。データを図17A及び図17Bに示す。
HUVECをCRT−3 ADCで処置し、蛍光イメージングを実施して0及び90分後のCRT−3の局在化を決定した。結果を図18Aに示す。更に、Cell Titre Glo発光細胞生存アッセイを用いて細胞傷害性を計測しており、結果を図18Bに示す。上記に記載したとおり、100万個のルイス肺癌細胞を2匹のマウスの右側腹部に皮下注射し、目に見えるサイズまで成長させた。1mg/kgのCRT−3−ADC又はB12−ADC(対照)を尾静脈注射によって投与した。マウスを1時間観察し、24時間後に殺処分した。
結果
図18Aに示す結果は、CRT3−ADCがインターナライズされることを実証している。CRT3−ADCで24時間にわたって更に処置したが、マウスの全般的な健康に何ら効果を及ぼさなかった。腫瘍部位における広範な出血がCRT3−ADC処置マウスにおいてのみ観察され、対照では観察されず、血管新生の腫瘍特異的破壊が実証される。
図18Aに示す結果は、CRT3−ADCがインターナライズされることを実証している。CRT3−ADCで24時間にわたって更に処置したが、マウスの全般的な健康に何ら効果を及ぼさなかった。腫瘍部位における広範な出血がCRT3−ADC処置マウスにおいてのみ観察され、対照では観察されず、血管新生の腫瘍特異的破壊が実証される。
実施例6 − CARの構築及び実験
材料及び方法
CARコンストラクトの作成
ヒト型及びマウス型のタンパク質と交差反応するCLEC14A特異的モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを、Noy et al(Blocking CLEC14A-MMRN2 binding inhibits sprouting angiogenesis and tumour growth. Oncogene. 2015)に記載されるとおり入手した。次に、マウスハイブリドーマの各々から、Hawkins et al(Idiotypic vaccination against human B-cell lymphoma. Rescue of variable region gene sequences from biopsy material for assembly as single-chain Fv personal vaccines. Blood. 1994;83(11):3279-88に以前に記載されたとおり、あらゆるマウスV遺伝子ファミリーを増幅するように設計された縮重プライマーセットを用いたRT−PCRにより、scFvをコードする遺伝子コンストラクトを単離した。
材料及び方法
CARコンストラクトの作成
ヒト型及びマウス型のタンパク質と交差反応するCLEC14A特異的モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを、Noy et al(Blocking CLEC14A-MMRN2 binding inhibits sprouting angiogenesis and tumour growth. Oncogene. 2015)に記載されるとおり入手した。次に、マウスハイブリドーマの各々から、Hawkins et al(Idiotypic vaccination against human B-cell lymphoma. Rescue of variable region gene sequences from biopsy material for assembly as single-chain Fv personal vaccines. Blood. 1994;83(11):3279-88に以前に記載されたとおり、あらゆるマウスV遺伝子ファミリーを増幅するように設計された縮重プライマーセットを用いたRT−PCRにより、scFvをコードする遺伝子コンストラクトを単離した。
次に、以前に記載されている2つのCARベクターpMP71.tCD34.2A.CD19ζ及びpMP71.tCD34.2A.CD19.IEVζ(Cheadle et al, J.Immunol., 2014, 192(8), 3654-65)にClaI、NotI断片としてscFv遺伝子をサブクローニングして、CD19特異的scFv領域を置き換えた。これらのベクターは、当初、MP71レトロウイルス発現プラスミド(C. Baum、Hannoverからの供与)を用いて構築されたものであり、トランケート型CD34マーカー遺伝子を共発現した(Fehse et al, Mol Ther., 2000;1C5 Pt 1: 448-56)。
ヒト及びマウスT細胞の形質導入
ヒトT細胞の形質導入用の組換えレトロウイルスを作成するため、FuGENE HD(Roche)を製造者の指示に従い使用してPhoenixアンホトロピックパッケージング細胞にMP71レトロウイルスベクター及びpCL ampho(Imgenex)をトランスフェクトした。マウスT細胞の形質導入用の組換えレトロウイルスを同じように、但しPhoenixエコトロピックパッケージング細胞及びpCL ecoを使用して作成した。lymphoprep(Axis Shield、オスロ、ノルウェイ)でヘパリン添加血液から密度勾配遠心法によってヒト末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。標準培地(10%ウシ胎仔血清(FBS;PAA、Pasching Austria)、2mM L−グルタミン、100IU/mlペニシリン、及び100pg/mlストレプトマイシンを含有するRPMI1640(Sigma))+1%ヒトAB血清(TCS Biosciences、バッキンガム、英国)を使用して、抗CD3抗体(OKT3、eBioscience;30ng/ml)、抗CD28抗体(R&D Systems;30ng/ml)及びインターロイキン−2(IL2;300U/ml;Chiron、エメリービル、CA)を使用してPBMCを予め48時間活性化させた。マウスT細胞の形質導入は、標準培地中のコンカナバリンA(2ug/ml;Sigma)及びマウスインターロイキン7(1ng/ml;eBioscience)で予め48時間活性化させたマウス脾細胞を使用して行った。予め活性化させたヒト及びマウスT細胞を、続いて製造者の指示に従いretronectin(Takara)をコートしたプレートにおいてスピンフェクションにより形質導入した(又は非トランスフェクトphoenix細胞からの馴化上清でモック形質導入した)。次に、ヒトT細胞をIL2(100U/ml)含有標準培地+1%ヒトAB血清中で培養した。スピンフェクション後、マウスT細胞は、IL2(100U/ml)含有標準培地で24時間培養し、次にlymphoprep(Axis Shield)を使用して精製した。指示がある場合、形質導入細胞は、抗CD34マイクロビーズ(Miltenyi Biotec、独国)を製造者の指示に従い使用して免疫磁気分離法によりエンリッチした。ヒトドナーによる研究は国立研究倫理局委員会ウェストミッドランド州(National Research Ethics Service Committee West Midlands)(Solihull)によって承認されたものであり、全てのドナーから書面によるインフォームドコンセントを得た。
ヒトT細胞の形質導入用の組換えレトロウイルスを作成するため、FuGENE HD(Roche)を製造者の指示に従い使用してPhoenixアンホトロピックパッケージング細胞にMP71レトロウイルスベクター及びpCL ampho(Imgenex)をトランスフェクトした。マウスT細胞の形質導入用の組換えレトロウイルスを同じように、但しPhoenixエコトロピックパッケージング細胞及びpCL ecoを使用して作成した。lymphoprep(Axis Shield、オスロ、ノルウェイ)でヘパリン添加血液から密度勾配遠心法によってヒト末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。標準培地(10%ウシ胎仔血清(FBS;PAA、Pasching Austria)、2mM L−グルタミン、100IU/mlペニシリン、及び100pg/mlストレプトマイシンを含有するRPMI1640(Sigma))+1%ヒトAB血清(TCS Biosciences、バッキンガム、英国)を使用して、抗CD3抗体(OKT3、eBioscience;30ng/ml)、抗CD28抗体(R&D Systems;30ng/ml)及びインターロイキン−2(IL2;300U/ml;Chiron、エメリービル、CA)を使用してPBMCを予め48時間活性化させた。マウスT細胞の形質導入は、標準培地中のコンカナバリンA(2ug/ml;Sigma)及びマウスインターロイキン7(1ng/ml;eBioscience)で予め48時間活性化させたマウス脾細胞を使用して行った。予め活性化させたヒト及びマウスT細胞を、続いて製造者の指示に従いretronectin(Takara)をコートしたプレートにおいてスピンフェクションにより形質導入した(又は非トランスフェクトphoenix細胞からの馴化上清でモック形質導入した)。次に、ヒトT細胞をIL2(100U/ml)含有標準培地+1%ヒトAB血清中で培養した。スピンフェクション後、マウスT細胞は、IL2(100U/ml)含有標準培地で24時間培養し、次にlymphoprep(Axis Shield)を使用して精製した。指示がある場合、形質導入細胞は、抗CD34マイクロビーズ(Miltenyi Biotec、独国)を製造者の指示に従い使用して免疫磁気分離法によりエンリッチした。ヒトドナーによる研究は国立研究倫理局委員会ウェストミッドランド州(National Research Ethics Service Committee West Midlands)(Solihull)によって承認されたものであり、全てのドナーから書面によるインフォームドコンセントを得た。
細胞株及び組換えタンパク質
10%ウシ胎仔血清(FBS;PAA、Pasching Austria)、2mM L−グルタミン、100IU/mlペニシリン、及び100pg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中にPhoenix A又はE、CHO及びルイス肺癌細胞を維持した。CHO細胞は、完全長ヒトCLEC14Aを発現するpWPIベクター(Addgene)(又はベクター単独)を形質導入したものであった。先述のとおり、インフォームドコンセント及びサウスバーミンガム研究倫理委員会の倫理承認を得た上でバーミンガム・ウィメンズ・ヘルスケアNHSトラストから入手した臍帯を使用してヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を単離した。HUVECは、10%FBS、4mM L−グルタミン、10%大血管内皮細胞成長添加物(TCS Cellworks)を含有するM199完全培地に維持し、0.1%ブタ皮膚由来タイプ1ゼラチン(Sigma)をコートしたプレートにおいて培養した。ヒトFcタグを有するヒト及びマウスCLEC14Aタンパク質をHEK293T細胞で発現させて、Noy et al(前掲)に記載されるとおりプロテインAカラムで精製した。
10%ウシ胎仔血清(FBS;PAA、Pasching Austria)、2mM L−グルタミン、100IU/mlペニシリン、及び100pg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中にPhoenix A又はE、CHO及びルイス肺癌細胞を維持した。CHO細胞は、完全長ヒトCLEC14Aを発現するpWPIベクター(Addgene)(又はベクター単独)を形質導入したものであった。先述のとおり、インフォームドコンセント及びサウスバーミンガム研究倫理委員会の倫理承認を得た上でバーミンガム・ウィメンズ・ヘルスケアNHSトラストから入手した臍帯を使用してヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を単離した。HUVECは、10%FBS、4mM L−グルタミン、10%大血管内皮細胞成長添加物(TCS Cellworks)を含有するM199完全培地に維持し、0.1%ブタ皮膚由来タイプ1ゼラチン(Sigma)をコートしたプレートにおいて培養した。ヒトFcタグを有するヒト及びマウスCLEC14Aタンパク質をHEK293T細胞で発現させて、Noy et al(前掲)に記載されるとおりプロテインAカラムで精製した。
CLEC14AのSiRNAノックダウン
siRNAによるトランスフェクションを、以前に記載されているとおり(Armstrong et al, Arteriosclerosis, thrombosis and vascular biology, 2008, 28(9): 1640-6)、以下のsiRNA二重鎖:D1−GAACAAGACAATTCAGTAA(配列番号30)及びD2−CAATCAGGGTCGACGAGAA(配列番号31)(EuroGentec、リエージュ、ベルギー)を使用して実施した。
siRNAによるトランスフェクションを、以前に記載されているとおり(Armstrong et al, Arteriosclerosis, thrombosis and vascular biology, 2008, 28(9): 1640-6)、以下のsiRNA二重鎖:D1−GAACAAGACAATTCAGTAA(配列番号30)及びD2−CAATCAGGGTCGACGAGAA(配列番号31)(EuroGentec、リエージュ、ベルギー)を使用して実施した。
フローサイトメトリー
HUVECをトリプシン処理し、5%正常ヤギ血清/PBS中の上記に記載したCLEC14A特異的マウスモノクローナル抗体(10ug/ml)又はIgG1アイソタイプ対照(Dako)によって氷上で1時間染色した。細胞を洗浄し、R−PEコンジュゲートヤギ抗マウス抗体(Serotec)とインキュベートすることにより結合抗体を検出した。ヨウ化プロピジウムで染色することにより死細胞を同定した。ヒトT細胞をPBSで洗浄し、Live/Dead Fixable Violet死細胞染色キット(Life Technologies)によって暗所下20分間染色した。次に、細胞をフロー緩衝液(PBS中0.5%w/v BSA+2mM EDTA;pH7.2)で洗浄し、抗ヒトCD4(PEコンジュゲート)、抗ヒトCD8(FITCコンジュゲート)(全てBD Pharmingenから)及び抗ヒトCD34(Pe−Cy5)(BioLegend)によって暗所下氷上で30分間染色した。代替的に、CD34に関して染色するのでなく、むしろ、初めに細胞をヒトFc断片(10ug/ml)でブロックし、次にそれらの細胞を10ug/ml組換えヒトCLEC14A−Fc融合タンパク質(又はFc対照)と共に、続いてヒツジ抗CLEC14Aポリクローナル抗体(R&D systems、10ug/ml)と共にインキュベートすることにより、CAR発現を直接検出した。最後に細胞をFITCコンジュゲートウサギ抗ヒツジ抗体(Invitrogen、1:10希釈)によって染色した。インキュベーションは、全て氷上で1時間行った。
HUVECをトリプシン処理し、5%正常ヤギ血清/PBS中の上記に記載したCLEC14A特異的マウスモノクローナル抗体(10ug/ml)又はIgG1アイソタイプ対照(Dako)によって氷上で1時間染色した。細胞を洗浄し、R−PEコンジュゲートヤギ抗マウス抗体(Serotec)とインキュベートすることにより結合抗体を検出した。ヨウ化プロピジウムで染色することにより死細胞を同定した。ヒトT細胞をPBSで洗浄し、Live/Dead Fixable Violet死細胞染色キット(Life Technologies)によって暗所下20分間染色した。次に、細胞をフロー緩衝液(PBS中0.5%w/v BSA+2mM EDTA;pH7.2)で洗浄し、抗ヒトCD4(PEコンジュゲート)、抗ヒトCD8(FITCコンジュゲート)(全てBD Pharmingenから)及び抗ヒトCD34(Pe−Cy5)(BioLegend)によって暗所下氷上で30分間染色した。代替的に、CD34に関して染色するのでなく、むしろ、初めに細胞をヒトFc断片(10ug/ml)でブロックし、次にそれらの細胞を10ug/ml組換えヒトCLEC14A−Fc融合タンパク質(又はFc対照)と共に、続いてヒツジ抗CLEC14Aポリクローナル抗体(R&D systems、10ug/ml)と共にインキュベートすることにより、CAR発現を直接検出した。最後に細胞をFITCコンジュゲートウサギ抗ヒツジ抗体(Invitrogen、1:10希釈)によって染色した。インキュベーションは、全て氷上で1時間行った。
ヘパリン添加尾採血からのマウスT細胞を染色する場合、それらは、初めにBD Pharm lyse(Becton Dickinson)を使用して赤血球溶解に供してから上記に記載したとおり染色し、但し抗マウスCD4−FITC、CD8−PE及びCD45.1(PE−Cy7コンジュゲート)(全てBD Biosciences)を使用した。細胞は、BD LSR IIフローサイトメーター及びFlowJoソフトウェア(TreeStar Inc、アシュランド、OR)を使用して分析した。
CFSE標識
T細胞をPBSで2回洗浄し、2.5μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)と37℃で10分間インキュベートした。10%FBSを含有するRPMI−1640を加えることにより標識反応をクエンチした。細胞を洗浄し、標準培地+1%ヒトAB血清及びIL2(10IU/ml)に1.5×106細胞/mlで再懸濁し、10:1のT細胞:HUVEC比が得られるようにHUVECが入ったウェルに加えた。37℃/5%CO2で5日間インキュベートした後、細胞を上記に記載したとおり抗ヒトCD34(Pe−Cy5)を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
T細胞をPBSで2回洗浄し、2.5μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)と37℃で10分間インキュベートした。10%FBSを含有するRPMI−1640を加えることにより標識反応をクエンチした。細胞を洗浄し、標準培地+1%ヒトAB血清及びIL2(10IU/ml)に1.5×106細胞/mlで再懸濁し、10:1のT細胞:HUVEC比が得られるようにHUVECが入ったウェルに加えた。37℃/5%CO2で5日間インキュベートした後、細胞を上記に記載したとおり抗ヒトCD34(Pe−Cy5)を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
IFNγ放出アッセイ
刺激細胞(2.5×104/ウェル)をCD34+ CAR−T細胞と指示する応答細胞:刺激細胞比においてトリプリケートで共培養した。代替的に、組換えタンパク質(1ug/ml)をプレコートしたウェルにおいて2×104個のCD34+ CAR−T細胞をインキュベートした。IL2(25U/ml)を補足した100μl/ウェルの標準培地中、37℃/5%CO2で細胞をインキュベートした。18時間後、ELISA(Pierce Endogen、ロックフォード、IL)を製造者の指示に従い用いて培養上清を分泌IFNγに関して試験した。
刺激細胞(2.5×104/ウェル)をCD34+ CAR−T細胞と指示する応答細胞:刺激細胞比においてトリプリケートで共培養した。代替的に、組換えタンパク質(1ug/ml)をプレコートしたウェルにおいて2×104個のCD34+ CAR−T細胞をインキュベートした。IL2(25U/ml)を補足した100μl/ウェルの標準培地中、37℃/5%CO2で細胞をインキュベートした。18時間後、ELISA(Pierce Endogen、ロックフォード、IL)を製造者の指示に従い用いて培養上清を分泌IFNγに関して試験した。
細胞傷害性アッセイ
クロム遊離アッセイについては、以前詳細に記載されている。このアッセイを既知のエフェクター:標的比(1250標的/ウェル)でセットアップし、7.5時間後に回収した。
クロム遊離アッセイについては、以前詳細に記載されている。このアッセイを既知のエフェクター:標的比(1250標的/ウェル)でセットアップし、7.5時間後に回収した。
インビボ実験
毒性試験
6〜8週齢C57BL6マウス(Charles River Laboratories)に4Gyの全身照射(TBI)を行った。18時間後、各マウスに、CD45.1+コンジェニックBoyJマウスからの2×107個のCAR形質導入又はモック形質導入T細胞調製物を尾静脈注射した。毒性の徴候に関してマウスをモニタし、及び週1回の尾採血によって免疫モニタリングを行った。マウスは、最終的に45日後に殺処分し、組織学的分析のため主要臓器を摘出した。
毒性試験
6〜8週齢C57BL6マウス(Charles River Laboratories)に4Gyの全身照射(TBI)を行った。18時間後、各マウスに、CD45.1+コンジェニックBoyJマウスからの2×107個のCAR形質導入又はモック形質導入T細胞調製物を尾静脈注射した。毒性の徴候に関してマウスをモニタし、及び週1回の尾採血によって免疫モニタリングを行った。マウスは、最終的に45日後に殺処分し、組織学的分析のため主要臓器を摘出した。
RipTag2トランスジェニックマウス腫瘍モデル
膵島細胞発癌モデルとしてのRIP−Tag2マウスの作成については、以前報告されている(Hanahan et al, Nature, 1985, 315 (6015), 115-122)。C57BL/6Jバックグラウンド(The Jackson Laboratory)でRIP−Tag2マウスを維持した。凍結保存したCAR形質導入及びモック形質導入T細胞を解凍し、洗浄し、前日に4Gy TBIでコンディショニングしておいた12週齢のマウスに1500万T細胞/マウスを一度に尾静脈に静脈内注射した。12週齢から、全てのRIP−Tag2マウスに50%糖分食(Harlan Teklad)を摂らせて、インスリン分泌腫瘍によって誘導される低血糖を軽減した。殺処分したCAR−T細胞処置マウスの全腫瘍量を、16週齢でノギスを使用して定量化して、個別に摘出した肉眼的腫瘍(>1mm3)を、式:容積=a×b2×0.52(式中、a及びbは、腫瘍のそれぞれ長い方の直径及び短い方の直径を表す)を用いて計測した。各マウスの全ての腫瘍の容積を加えて動物1匹当たりの総腫瘍量を求めた。未処置RIP−Tag2マウスが16週まで生存しないため、16週CAR処置マウスの年齢対応対照比較はなく、従って、比較は、14週齢モック処置マウスと行った。
膵島細胞発癌モデルとしてのRIP−Tag2マウスの作成については、以前報告されている(Hanahan et al, Nature, 1985, 315 (6015), 115-122)。C57BL/6Jバックグラウンド(The Jackson Laboratory)でRIP−Tag2マウスを維持した。凍結保存したCAR形質導入及びモック形質導入T細胞を解凍し、洗浄し、前日に4Gy TBIでコンディショニングしておいた12週齢のマウスに1500万T細胞/マウスを一度に尾静脈に静脈内注射した。12週齢から、全てのRIP−Tag2マウスに50%糖分食(Harlan Teklad)を摂らせて、インスリン分泌腫瘍によって誘導される低血糖を軽減した。殺処分したCAR−T細胞処置マウスの全腫瘍量を、16週齢でノギスを使用して定量化して、個別に摘出した肉眼的腫瘍(>1mm3)を、式:容積=a×b2×0.52(式中、a及びbは、腫瘍のそれぞれ長い方の直径及び短い方の直径を表す)を用いて計測した。各マウスの全ての腫瘍の容積を加えて動物1匹当たりの総腫瘍量を求めた。未処置RIP−Tag2マウスが16週まで生存しないため、16週CAR処置マウスの年齢対応対照比較はなく、従って、比較は、14週齢モック処置マウスと行った。
ルイス肺癌(LLC)マウスモデル
6〜8週齢雌C57BL6マウスの側腹部に106個のLLC細胞を皮下接種した。3日後、マウスは、4Gy TBIを受け、その18時間後、各マウスにCD45.1+コンジェニックBoyJマウスからの2×107個のCAR又はモックT細胞調製物を尾静脈注射した。ノギス(式:容積=長さ×幅2×0.5を使用)及び生物発光イメージング(IVIS Spectrum、Caliper Life Sciences)によって腫瘍成長を計測した。週1回の尾採血により免疫モニタリングを行った。
6〜8週齢雌C57BL6マウスの側腹部に106個のLLC細胞を皮下接種した。3日後、マウスは、4Gy TBIを受け、その18時間後、各マウスにCD45.1+コンジェニックBoyJマウスからの2×107個のCAR又はモックT細胞調製物を尾静脈注射した。ノギス(式:容積=長さ×幅2×0.5を使用)及び生物発光イメージング(IVIS Spectrum、Caliper Life Sciences)によって腫瘍成長を計測した。週1回の尾採血により免疫モニタリングを行った。
RipTag2マウスを用いた手順は、全て国際法及び方針に準じてトリノ大学の倫理委員会及びイタリア保健省(Ministry of Health)によって承認されたものである。他の全てのマウス研究は適切な英国内務省の承認を得て実施した。
組織調製及び免疫蛍光分析
マウス実験からの組織をOCT(Bio Optica)に包埋し、ドライアイスで凍結して−80℃で保存した。組織調製及び組織学的分析は、以下の一次抗体を用いて記載のとおり(24)行った:精製ラットモノクローナル抗汎内皮細胞抗原(550563、クローンMeca32、BD Pharmingen、米国)、1:100希釈;ウサギモノクローナル抗切断型カスパーゼ3(asp175、クローン5A1、Cell Signaling、米国)、1:100希釈;ウサギポリクローナル抗フィブリノゲン(A0080、Dako)、1:100希釈;及びウサギモノクローナル抗CD34(ab174720、Abcam)1:50希釈;ヒツジポリクローナル抗CLEC14A(AF4968、R&D)1:50希釈。インキュベートして洗浄した後、試料を二次抗体抗ウサギAlexa Fluor-488及びAlexa Fluor-555;抗ラットAlexa Fluor-488及びAlexa Fluor-555;及び抗ヒツジAlexa Fluor-488(Molecular Probes)とインキュベートし、DAPI核酸染色(Invitrogen)で対比染色した。CAR形質導入T細胞を検出するため、PBS中に1:50希釈したウサギモノクローナル抗CD34(ab174720、Abcam)で組織を染色した。インキュベートして洗浄した後、試料を抗ウサギAlexa Fluor-555(Molecular Probes)で染色し、DAPIで対比染色した。
マウス実験からの組織をOCT(Bio Optica)に包埋し、ドライアイスで凍結して−80℃で保存した。組織調製及び組織学的分析は、以下の一次抗体を用いて記載のとおり(24)行った:精製ラットモノクローナル抗汎内皮細胞抗原(550563、クローンMeca32、BD Pharmingen、米国)、1:100希釈;ウサギモノクローナル抗切断型カスパーゼ3(asp175、クローン5A1、Cell Signaling、米国)、1:100希釈;ウサギポリクローナル抗フィブリノゲン(A0080、Dako)、1:100希釈;及びウサギモノクローナル抗CD34(ab174720、Abcam)1:50希釈;ヒツジポリクローナル抗CLEC14A(AF4968、R&D)1:50希釈。インキュベートして洗浄した後、試料を二次抗体抗ウサギAlexa Fluor-488及びAlexa Fluor-555;抗ラットAlexa Fluor-488及びAlexa Fluor-555;及び抗ヒツジAlexa Fluor-488(Molecular Probes)とインキュベートし、DAPI核酸染色(Invitrogen)で対比染色した。CAR形質導入T細胞を検出するため、PBS中に1:50希釈したウサギモノクローナル抗CD34(ab174720、Abcam)で組織を染色した。インキュベートして洗浄した後、試料を抗ウサギAlexa Fluor-555(Molecular Probes)で染色し、DAPIで対比染色した。
ヒト腫瘍組織アレイ(SuperBiochips Inc.、ソウル、韓国)を1:20希釈のヒツジポリクローナル抗CLEC14A(AF4968、R&D systems)及びローダミンにコンジュゲートしたハリエニシダ(Ulex europaeus)凝集素I(Vectorlabs、英国)を用いて1時間、続いて抗ヒツジFITC抗体(10μg/ml、Invitrogen、英国)を用いて染色した。
RipTag2腫瘍組織の分析のため、血管が占有する表面積を、Meca32陽性構造が占有する面積としてImageJソフトウェアによって定量化し、DAPIによって可視化された総組織面積と比較した。各動物につき少なくとも4視野/画像の総血管面積を定量化した。各画像におけるフィブリノゲン溢出量(赤色のチャンネル)を決定するため、本発明者らは、各血管(Meca32、緑色チャンネル)の近くに関心領域(ROI)を描き、次にLeica共焦点ソフトウェアヒストグラム定量化ツール(Confocal Software Histogram Quantification Tool)を使用して赤色及び緑色チャンネルの平均蛍光強度(MFI)を定量化した。得られた血管本数の値を正規化するため、本発明者らは、赤色チャンネルMFIと緑色チャンネルMFIとの比を計算した。値は、赤色−緑色共染色に対するパーセンテージとして表す。各分析画像におけるカスパーゼ3(緑色チャンネル)の発現レベルを決定するため、本発明者らは、同じサイズの5つのランダムなROIを検討した。次に、本発明者らは、緑色チャンネルのMFIを計測し、及び本発明者らは、カスパーゼ3染色面積を組織範囲に存在する全細胞と比較することにより値を正規化した。各試料につき、1処置群当たり5匹のマウスの少なくとも10画像を分析した。Leica TCS SP2 AOBS共焦点レーザー走査型顕微鏡(Leica Microsystems)を使用してRipTag2マウスからの組織を分析した。他の全ての組織は、Axiovert 100Mレーザー走査型共焦点顕微鏡(Carl Zeiss、ウェリン・ガーデン・シティ、英国)を使用して分析した。
統計分析
データの統計分析は、指示する検定及びGraphPad Prismソフトウェアを用いて行った。p値<0.05を有意と見なした。
データの統計分析は、指示する検定及びGraphPad Prismソフトウェアを用いて行った。p値<0.05を有意と見なした。
結果
CRT1、3、4、及び5を使用してCARコンストラクトの作製に成功し、細胞上でのこれらのCARコンストラクトの発現が実証された(図19B及び図19C、図22及び図31を参照されたい)。従って、トランケート型CD34マーカー遺伝子及びscFv断片/CD3ζ鎖キメラ受容体を共発現するレトロウイルスCARベクター(pMP71ベース)が作成された。発現はLTRプロモーターからドライブされ、2AペプチドリンカーがCD34とCARとの両方の等モル発現を確実にする。第2世代CARコンストラクトはCD28共刺激ドメインを含んだ。図19Bに示されるとおり、CD34染色は、CRT3及び5(両方とも第1及び第2世代)を含むベクターによるT細胞の形質導入の成功を示している。CLEC14A−Fcを用いてCARの発現に関して直接染色した細胞についても同様の結果が見られる(%値は、Fc単独によるバックグラウンド染色を差し引いたCLEC14A−Fcの特異的結合を示す)。
CRT1、3、4、及び5を使用してCARコンストラクトの作製に成功し、細胞上でのこれらのCARコンストラクトの発現が実証された(図19B及び図19C、図22及び図31を参照されたい)。従って、トランケート型CD34マーカー遺伝子及びscFv断片/CD3ζ鎖キメラ受容体を共発現するレトロウイルスCARベクター(pMP71ベース)が作成された。発現はLTRプロモーターからドライブされ、2AペプチドリンカーがCD34とCARとの両方の等モル発現を確実にする。第2世代CARコンストラクトはCD28共刺激ドメインを含んだ。図19Bに示されるとおり、CD34染色は、CRT3及び5(両方とも第1及び第2世代)を含むベクターによるT細胞の形質導入の成功を示している。CLEC14A−Fcを用いてCARの発現に関して直接染色した細胞についても同様の結果が見られる(%値は、Fc単独によるバックグラウンド染色を差し引いたCLEC14A−Fcの特異的結合を示す)。
更に、図20におけるデータは、抗体CRT3又は5ベースの第1又は第2世代CARを発現するように形質導入したT細胞がインビトロでCLEC14Aに応答できることを示している。結果は、プレート結合タンパク質、操作されたCHO細胞上に発現したか又はHUVECに発現したタンパク質について示され、ここで、3つの実験全てにおいて、CARを形質導入したT細胞によるCLEC14Aの存在に応答したIFNγ産生が見られる。
抗体CRT3及び5ベースのCARについて、CHO CLEC14A発現細胞において細胞傷害性を誘導するその能力を試験し(図21A)、ここで、CAR CRT3/5を有するT細胞に曝露した細胞において%特異的溶解の増加が見られる。更に、HUVECと培養したときのCD34+ T細胞の増殖は、CRT3及び5 第1及び第2世代CAR T細胞の両方がかかる培養条件下で(即ち、CLEC14Aを発現するHUVECへの曝露に起因して)増殖することを示している。従って、CRT3/5 CAR T細胞は、CLEC14A発現細胞に応答可能であり、T細胞の増殖及び細胞の特異的溶解をもたらす。
CRT1抗体ベースのCARも、CLEC14Aを発現する標的に対して活性を示す。詳細には、第2世代CRT1 CAR T細胞は、CLEC14Aを発現するように操作したCHO細胞及びHUVECに発現するCLEC14Aに応答することが示された(IFNγ放出によって計測した)。更に、第1及び第2世代CRT1 CAR T細胞は、CHO CLEC14A発現細胞において特異的溶解を誘導することが示された(図22を参照されたい)。図32〜図35は、CRT1−CARを形質導入したときのCLEC14Aに対するT細胞応答及びかかる形質導入T細胞によって誘導された%溶解を更に示す。
第1又は第2世代CRT3及び5 CAR T細胞をC57/BL6マウスに注射して健常なマウスに対するCAR T細胞の毒性を決定した。マウスを45日間モニタし、目に見える毒性の徴候は見られなかった。図23は、この間にマウスの体重が増加したことを示し、週1回の尾採血は、CAR T細胞が注射後少なくとも5週間残存したこと、及びこの間、それらが全循環T細胞集団の少なくとも30%を占めたことを示している。実験終了時に採取した脾細胞は、なおもCLEC14A(マウス及びヒトの両方)に応答する能力を有した。更に、図24に示されるとおり、幾つかの組織(脳、心臓、肺、肝臓、結腸及び腎臓)の組織学的分析から、第2世代CRT3/5 CAR T細胞を注入したマウスに関して病変は示されなかった。
100万個のルイス肺癌細胞を予め注射しておいたC57BL6マウスにおいて、CRT3又はCRT5抗体ベースの第2世代CARの抗腫瘍効果を試験した。CARコンストラクトを形質導入したT細胞をマウスの尾静脈に注射し(2000万個のT細胞)、腫瘍成長をモニタした。図25から分かるとおり、CRT3又はCRT5のいずれの第2世代CAR T細胞を注射したマウスも対照マウスより小さい容積の腫瘍を有し、これらのCAR T細胞の抗腫瘍効果が実証された。更に、図26は、CRT3又はCRT5のいずれの第2世代CAR T細胞を注射したマウスにおいても平均腫瘍重量の低下、血管密度の低下、及び血管漏出レベルの増加があることを示している。
RIP−Tag2マウスに第2世代CRT5 CAR T細胞を注射したところ(ここで、ラットインスリンプロモーターがSV40ラージT抗原トランス遺伝子の発現を膵島のβ細胞に仕向ける)、約10週齢で腫瘍が生じ、14週齢までに死亡した。図27を見ると分かるとおり、CAR T細胞を注射したマウスでは、未処置又はモックT細胞対照マウスと比較して腫瘍サイズが有意に低下した。更に、図28は、静脈内注射後4週間においてCAR形質導入T細胞がRIP−Tag2腫瘍に貯留していることを示す。
CARを操作したT細胞によって処置したマウスのRipTag2腫瘍の組織学的分析から、モックT細胞で処置したマウスと比較して血管密度が低下し、アポトーシス血管が増加し、及びフィブリノゲン染色が減少することが示された(図29)。
実施例7 − WT1由来ペプチドpWT126(RMFPNAPYL)に特異的な機能活性TCR
HLA−A2クラスI分子によって提示されるウィルムス腫瘍抗原−1(WT1)のペプチドRMFPNAPYL(WT126)に特異的なTCRがクローニングされている。WT1転写因子は、白血病、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌などを含め、様々なヒト悪性病変において発現する。CTL(これからTCRがクローニングされた)は、WT1を発現するヒト癌細胞に対して死滅活性を示すが、生理的レベルのWT1を発現する正常ヒト細胞に対しては示さない。
HLA−A2クラスI分子によって提示されるウィルムス腫瘍抗原−1(WT1)のペプチドRMFPNAPYL(WT126)に特異的なTCRがクローニングされている。WT1転写因子は、白血病、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌などを含め、様々なヒト悪性病変において発現する。CTL(これからTCRがクローニングされた)は、WT1を発現するヒト癌細胞に対して死滅活性を示すが、生理的レベルのWT1を発現する正常ヒト細胞に対しては示さない。
処置目標は、TCRをコードする遺伝子のトランスファーによって患者T細胞にこの強力且つ特異的な死滅活性を備えさせることであった。そのため、TCR遺伝子がレトロウイルスベクターに挿入されており、WT1を発現するヒト癌及び白血病細胞株に対して遺伝子形質導入ヒトT細胞が死滅活性を示すことが実証されている。このCTL株の特異性プロファイルについては、幾つかの研究論文に記載されており、以下のとおり要約することができる:(1)WT1由来ペプチドpWT126で被覆したHLA−A2陽性標的の死滅(Gao et al (2000) Blood 95, 2198-2203);(2)WT1を発現する新鮮HLA−A2陽性白血病細胞の死滅(Gao et al (2000) Blood 95, 2198-2203);(3)HLA−A2陽性白血病CFU前駆細胞の死滅(Gao et al (2000) Blood 95, 2198-2203;Bellantuono et al (2002) 100, 3835-3837);(4)HLA−A2陽性白血病LTC−IC幹細胞の死滅(Bellantuono et al (2002) Blood 100, 3835-3837);(5)HLA−A2陽性NOD/SCID白血病開始細胞の死滅(Gao et al (2003) Transplantation 75, 1429-1436);及び(6)正常HLA−A2陽性NOD/SCID移植造血幹細胞の死滅なし(Gao et al (2003) Transplantation 75, 1429-1436)。現在、WT1特異的TCRを形質導入したヒトT細胞が、TCRのクローニング元であるCTL株と同様の特異性を呈することが示されている。
図36〜図43の凡例に詳細に記載されるデータは、ヒトT細胞へのTCR遺伝子トランスファーが実現可能であること、及びそれが導入されたTCR鎖の表面発現につながることを示している。レシピエントT細胞は、pWT126ペプチドで被覆したHLA−A2陽性標的に対して死滅活性を示す。TCRを形質導入したT細胞は、WT1を内因的に発現するヒト腫瘍細胞も死滅させる。加えて、形質導入T細胞は、HLA−A2制限的、ペプチド特異的にIFN−γを産生する。最後に、形質導入TCRはCD4陽性ヘルパーT細胞で機能することができる。これらのCD4陽性T細胞は、HLA−A2制限的、抗原特異的な死滅活性及び抗原特異的なサイトカイン産生を示す(図示せず)。このことから、TCR遺伝子トランスファーを用いて、CD8陽性及びCD4陽性の両方のヒトT細胞にHLAクラス1制限的抗原特異的エフェクター機能を付与し得ることが示される。
方法
細胞株
T2は、外因性ペプチドを効率的に負荷することのできる抗原プロセシング関連トランスポーター(TAP)が欠損したヒトHLA−A2+細胞株である。男性CML患者の末梢血からBV173細胞株を樹立した。細胞は、全て37℃でRPMI+10%FCS中において培養した。
細胞株
T2は、外因性ペプチドを効率的に負荷することのできる抗原プロセシング関連トランスポーター(TAP)が欠損したヒトHLA−A2+細胞株である。男性CML患者の末梢血からBV173細胞株を樹立した。細胞は、全て37℃でRPMI+10%FCS中において培養した。
合成ペプチド及びHLA−A2/ペプチド複合体四量体
pWT126(RMFPNAPYL)及びpWT235(CMTWNQMNL)は、ヒトWT1に由来するHLA−A2結合ペプチドである。pWT126をPBSに溶解させ、及びpWT235をDMSOに溶解させた後、PBSで希釈して2mMの濃度とした。
pWT126(RMFPNAPYL)及びpWT235(CMTWNQMNL)は、ヒトWT1に由来するHLA−A2結合ペプチドである。pWT126をPBSに溶解させ、及びpWT235をDMSOに溶解させた後、PBSで希釈して2mMの濃度とした。
レトロウイルスTCRコンストラクト及びTCR遺伝子の形質導入
アロ制限pWT126特異的ヒトCTL株77からWT1特異的TCRα及びβ遺伝子を単離した。これらのTCR遺伝子をクローニングするため、CTL株77から全RNAを抽出し、cDNAに逆転写した。可変α及びβ遺伝子の両方に結合するコンセンサスプライマーを普遍プライマーの組と組み合わせて用いてcDNAを増幅した。次に、単離したTCR Vα又はVβ遺伝子を、NotI及びEcoRI制限部位を用いてpMP71レトロウイルスベクターにクローニングした。
アロ制限pWT126特異的ヒトCTL株77からWT1特異的TCRα及びβ遺伝子を単離した。これらのTCR遺伝子をクローニングするため、CTL株77から全RNAを抽出し、cDNAに逆転写した。可変α及びβ遺伝子の両方に結合するコンセンサスプライマーを普遍プライマーの組と組み合わせて用いてcDNAを増幅した。次に、単離したTCR Vα又はVβ遺伝子を、NotI及びEcoRI制限部位を用いてpMP71レトロウイルスベクターにクローニングした。
2×106個のアンホトロピックパッケージング細胞をT25フラスコに播種し、24時間後、リン酸カルシウム沈殿を用いてレトロウイルスTCRコンストラクトで一過性にトランスフェクトした。形質導入の調製において、抗CD3抗体及びIL−2を用いてPBMCを2日間活性化させた。次に、活性化T細胞(3×106)を3mlの通常成長培地+トランスフェクトしたパッケージング細胞から回収した3mlのウイルス上清に再懸濁し、フィブロネクチンをコートした6ウェルプレートにプレーティングした。プレートを37℃、5%CO2でインキュベートし、形質導入の24〜48時間後、TCRトランス遺伝子の発現を行った。
IFNγ分泌アッセイ
TCRを形質導入したT細胞(5×104)を96ウェルプレートにおいて5×104個の白血病細胞又はペプチド被覆T2細胞(1:1比)においてトリプリケートで刺激した。24時間インキュベートした後、上清を回収し、ヒトIFNγ測定キット(AMS Biotechnology)を用いてインターフェロンγ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で試験した。
TCRを形質導入したT細胞(5×104)を96ウェルプレートにおいて5×104個の白血病細胞又はペプチド被覆T2細胞(1:1比)においてトリプリケートで刺激した。24時間インキュベートした後、上清を回収し、ヒトIFNγ測定キット(AMS Biotechnology)を用いてインターフェロンγ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で試験した。
実施例8:患者の選択及び治療
WT1を発現する悪性病変を有するHLA−A2陽性患者から末梢血単球細胞(PBMC)を採取する。PBMCは、実施例1に記載されるとおり、培養液に加えた又はビーズ上の抗CD3/CD28抗体で3日間活性化させて、次にTCRをコードするレトロウイルス粒子で形質導入する。5日目、本発明者らは、形質導入したCD4及びCD8 T細胞が、導入されたTCRを発現することを実証し得る。6日目、本発明者らは、形質導入T細胞の抗原特異的活性を実証し得る。6日目、形質導入T細胞を患者に再注入する。
WT1を発現する悪性病変を有するHLA−A2陽性患者から末梢血単球細胞(PBMC)を採取する。PBMCは、実施例1に記載されるとおり、培養液に加えた又はビーズ上の抗CD3/CD28抗体で3日間活性化させて、次にTCRをコードするレトロウイルス粒子で形質導入する。5日目、本発明者らは、形質導入したCD4及びCD8 T細胞が、導入されたTCRを発現することを実証し得る。6日目、本発明者らは、形質導入T細胞の抗原特異的活性を実証し得る。6日目、形質導入T細胞を患者に再注入する。
実施例9:腫瘍担持マウスにおける創傷治癒
0日目、マウスに1×106個のルイス肺癌細胞を皮下注射し、3日目に4Gyを照射した。3日目、マウスに13×106個のモックT細胞(n=7)又はCAR T細胞(n=7)(CRT5 CAR)を静脈内注射した。細胞は31%CD4+(93%CD34+)及び43%CD8+(62%CD34+)であった。創傷治癒を7日間観察した。
0日目、マウスに1×106個のルイス肺癌細胞を皮下注射し、3日目に4Gyを照射した。3日目、マウスに13×106個のモックT細胞(n=7)又はCAR T細胞(n=7)(CRT5 CAR)を静脈内注射した。細胞は31%CD4+(93%CD34+)及び43%CD8+(62%CD34+)であった。創傷治癒を7日間観察した。
図44における結果は、CRT5 CARを発現するマウスT細胞が、モック形質導入T細胞で処置した同様のマウスと比較して、腫瘍担持マウスにおける皮膚創傷の治癒を妨げなかったことを示している。
実施例10:PDACマウスモデルにおけるCRT5 CAR
K−RasG12D;Ink4a/Arf−/−;p53R172H細胞を同系イムノコンピテントマウスの膵臓に注射して、膵臓腺癌のマウスモデルであるPDACマウスモデルを作成する。このマウスモデルからの腫瘍の染色では、大多数の腫瘍血管上にCLEC14A発現が示されている。PDACマウスをCRT5 CAR T細胞(ここで、CARは、CD28の共刺激ドメインを含む)で処置すると、処置後3週間で有意な腫瘍制御が得られる(図45)。更なる実験の結果は、図50に見ることができる。
K−RasG12D;Ink4a/Arf−/−;p53R172H細胞を同系イムノコンピテントマウスの膵臓に注射して、膵臓腺癌のマウスモデルであるPDACマウスモデルを作成する。このマウスモデルからの腫瘍の染色では、大多数の腫瘍血管上にCLEC14A発現が示されている。PDACマウスをCRT5 CAR T細胞(ここで、CARは、CD28の共刺激ドメインを含む)で処置すると、処置後3週間で有意な腫瘍制御が得られる(図45)。更なる実験の結果は、図50に見ることができる。
実施例11:CLEC14Aに対するCRT1、3及び5の滴定
CRT1、3及び5 CAR(CD28共刺激ドメイン)T細胞とインキュベートするためのFc融合タンパク質としてCLEC14Aを発現させた。形質導入効率を等しくするため、全てのCAR−T細胞株をモックT細胞と希釈した。結果は、図46に見ることができ、ここで、試験した全てのCAR T細胞がCLEC14Aに良好に応答することが示される(示されるデータはトリプリケート培養の平均値+SDである)。
CRT1、3及び5 CAR(CD28共刺激ドメイン)T細胞とインキュベートするためのFc融合タンパク質としてCLEC14Aを発現させた。形質導入効率を等しくするため、全てのCAR−T細胞株をモックT細胞と希釈した。結果は、図46に見ることができ、ここで、試験した全てのCAR T細胞がCLEC14Aに良好に応答することが示される(示されるデータはトリプリケート培養の平均値+SDである)。
実施例12:CRT1、3及び5 CAR T細胞の細胞傷害性及び増殖アッセイ
CRT1、3及び5 CAR(CD28共刺激ドメインを含む)T細胞を使用して細胞傷害性試験を行った。T細胞をモックT細胞と希釈して形質導入効率を等しくし、ヒトCLEC14Aを発現するマウス内皮細胞とインキュベートした。結果を図48Aに示し、これは、3つの試験したCARが全て、細胞傷害性を媒介し得ることを実証している。示されるデータはトリプリケート培養の平均値+SDである。
CRT1、3及び5 CAR(CD28共刺激ドメインを含む)T細胞を使用して細胞傷害性試験を行った。T細胞をモックT細胞と希釈して形質導入効率を等しくし、ヒトCLEC14Aを発現するマウス内皮細胞とインキュベートした。結果を図48Aに示し、これは、3つの試験したCARが全て、細胞傷害性を媒介し得ることを実証している。示されるデータはトリプリケート培養の平均値+SDである。
更に、プレート結合組換えCLEC14A−Fc融合タンパク質で刺激したCRT1、3及び5 CAR(CD28共刺激ドメイン)T細胞を用いて増殖アッセイ(CFSE標識)を行った。CAR T細胞株は、全てモックT細胞と希釈して形質導入効率を等しくし、結果は、図48Bに見ることができ、ここで、3つの試験したCARが全て刺激後に増殖能を有した。示されるデータは、CD8+ T細胞のみのものであるが、CD4+ T細胞についても同様のデータが得られた。
実施例13:異なる共刺激及び膜貫通領域を有するCAR
以下のCARをクローニングし、レトロウイルスベクターを使用して単一ドナーからのT細胞に入れる操作を行っている:
1)CRT3−CD28 TM−CD28 共刺激シグナル−CD3(CRT3.28z)
2)CRT3−CD8 TM−4−1BB 共刺激シグナル−CD3(CRT3.BBz)
3)CRT3−CD28 TM−CD28及び4−1BB 共刺激シグナル−CD3(CRT3.28BBz)
4)CRT3−CD28 TM−CD28及びOX40 共刺激シグナル−CD3(CRT3.28Oxz)
5)CRT3−CD8 TM−4−1BB及びOX40 共刺激シグナル−CD3(CRT3.BBOxz)。
以下のCARをクローニングし、レトロウイルスベクターを使用して単一ドナーからのT細胞に入れる操作を行っている:
1)CRT3−CD28 TM−CD28 共刺激シグナル−CD3(CRT3.28z)
2)CRT3−CD8 TM−4−1BB 共刺激シグナル−CD3(CRT3.BBz)
3)CRT3−CD28 TM−CD28及び4−1BB 共刺激シグナル−CD3(CRT3.28BBz)
4)CRT3−CD28 TM−CD28及びOX40 共刺激シグナル−CD3(CRT3.28Oxz)
5)CRT3−CD8 TM−4−1BB及びOX40 共刺激シグナル−CD3(CRT3.BBOxz)。
作成した全てのコンストラクトがT細胞に良好に形質導入された。これらの異なるコンストラクトの機能をインビトロで評価し、サイトカイン産生、細胞傷害性及び増殖応答について評価した(図49を参照されたい)。サイトカイン放出から、特にCRT3.28z及びCRT3.28Oxzを発現するT細胞による強力な抗原特異的応答が示された。ヒトCLEC14Aを発現する滴定数のCHO細胞(又はベクターのみの対照)に応答したIFNγ産生を計測することにより、サイトカイン産生を分析した。CAR T細胞株は、全てモックT細胞と希釈して形質導入効率を等しくした。示されるデータは、トリプリケート培養の平均値+SDである。CLEC14Aを発現するように操作したマウス内皮細胞(SEND)に対する細胞傷害活性を計測し、プレート結合組換えCLEC14A−Fc融合タンパク質による刺激後の増殖応答を計測した(データは示さず)。
実施例14:キメラCLEC14Aによる刺激後のCAR T細胞からのサイトカイン放出の決定
ヒト配列を含有するが、膜貫通及び/又は細胞内ドメインはマウス由来であるキメラ型のCLEC14Aを293及びSEND細胞で発現させた。CLEC発現を等しくするためレンチウイルスベクターから共発現するGFPを用いてこれらの細胞を選別し、次にCAR T細胞(CD28共刺激ドメインを含むCRT1、3及び5)を用いて試験した。CAR T細胞を293細胞及びSEND細胞の両方とインキュベートした後、IFNγの放出を計測した。結果は、図51に見ることができる。加えて、CLEC14Aキメラを発現するSEND細胞とインキュベートしたときのT細胞の細胞傷害性を決定した。CAR T細胞株は、全てモックT細胞と希釈して形質導入効率を等しくした。示されるデータは、トリプリケート培養の平均値である。
ヒト配列を含有するが、膜貫通及び/又は細胞内ドメインはマウス由来であるキメラ型のCLEC14Aを293及びSEND細胞で発現させた。CLEC発現を等しくするためレンチウイルスベクターから共発現するGFPを用いてこれらの細胞を選別し、次にCAR T細胞(CD28共刺激ドメインを含むCRT1、3及び5)を用いて試験した。CAR T細胞を293細胞及びSEND細胞の両方とインキュベートした後、IFNγの放出を計測した。結果は、図51に見ることができる。加えて、CLEC14Aキメラを発現するSEND細胞とインキュベートしたときのT細胞の細胞傷害性を決定した。CAR T細胞株は、全てモックT細胞と希釈して形質導入効率を等しくした。示されるデータは、トリプリケート培養の平均値である。
図51を見て分かるとおり、試験した全てのCRT1、3及び5 CAR T細胞が、ヒトCLEC14A(huCLEC)、マウス細胞内ドメインを有するヒトCLEC14A(A1)及びマウス膜貫通及び細胞内ドメインを有するヒトCLEC14A(B1)のいずれかを発現する293及びSEND細胞からのIFNγの放出をもたらす。
Claims (61)
- (i)抗CLEC14A結合ドメイン、
(ii)膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AのC型レクチンドメインへの結合能を有する、核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14AとMMRN2との間の相互作用を阻害する、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記抗CLEC14A結合ドメインは、CLEC14Aの残基97〜108に結合し、CLEC14Aは、配列番号1に記載されるとおりのアミノ酸配列を有する、請求項1又は2に記載の核酸分子。
- 前記抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号213又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含むアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号215又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含むアミノ酸配列を有する、請求項1又は4に記載の核酸分子。
- 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)(S/T)SYW(I/M)(E/H)(配列番号150)、GYTF(S/T)SYW(配列番号151)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)WIG(E/A)I(L/Y)PG(S/N)(G/S)(S/D)T(N/S)(配列番号152)、I(L/Y)PG(S/N)(G/S)(S/D)T(配列番号153)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び/又は
(c)(A/T)(R/H)(G/X)(G/X)(D/X)Y(D/Y)(E/G)(E/S)(Y/D)Y(V/A/L)MD(配列番号154)、(A/T)(R/H)(G/X)(G/X)(D/X)Y(D/Y)(E/G)(E/S)(Y/D)Y(V/A/L)MDY(配列番号155)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
(式中、Xは、アミノ酸残基なしである)
の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有する、請求項1、4又は5のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)S/X S/X S Y M/L Y/H W Y(配列番号156)、SSVS Y/S S/X Y/X(配列番号157)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)L L/W IY D/S TSNLA(配列番号158)、D/S TS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)Q/H Q W/Y S/H S/R Y/S P L/R(配列番号160)、Q/H Q W/Y S/H S/R Y/S P L/R T F/X(配列番号161)又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
(式中、Xは、アミノ酸なしである)
の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有する、請求項1又は4〜6のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号207又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含むアミノ酸配列を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号32、配列番号44又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号33、配列番号45又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号116、配列番号118、配列番号34、配列番号46、配列番号100、配列番号102又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号208又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含むアミノ酸配列を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号35、配列番号47又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号36、DTS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号37、配列番号49又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号32、配列番号33及び配列番号116、又は配列番号32、33及び/若しくは116のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、
(b)配列番号44、配列番号45及び配列番号118、又は配列番号44、45及び/若しくは118のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、
(c)配列番号32、配列番号33及び配列番号100、又は配列番号32、33及び/若しくは100のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、
(d)配列番号44、配列番号45及び配列番号102、又は配列番号44、45及び/若しくは102のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、
(e)配列番号32、配列番号33及び配列番号34、又は配列番号32、33及び/若しくは34のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
(f)配列番号44、配列番号45及び配列番号46、又は配列番号44、45及び/若しくは46のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号35、配列番号36及び配列番号37、又は配列番号35、36及び/若しくは37のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
(b)配列番号47、DTS及び配列番号49、又は配列番号47、49及び/若しくはDTSのいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号32、配列番号33、配列番号116、配列番号35、配列番号36及び配列番号37、又は配列番号32、33、116、35、36及び/若しくは37のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、
(b)配列番号44、配列番号45、配列番号118、配列番号47、DTS及び配列番号49、又は配列番号44、45、118、47、49及び/若しくはDTSのいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、
(c)配列番号32、配列番号33、配列番号100、配列番号35、配列番号36及び配列番号37、又は配列番号32、33、100、35、36及び/若しくは37のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、
(d)配列番号44、配列番号45、配列番号102、配列番号47、DTS及び配列番号49、又は配列番号44、45、102、47、49及び/若しくはDTSのいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、
(e)配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36及び配列番号37、又は配列番号32、33、34、35、36及び/若しくは37のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
(f)配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、DTS及び配列番号49、又は配列番号44、45、46、47、49及び/若しくはDTSのいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号216又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号217又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号218又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有する、請求項1又は4〜7のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号64、配列番号76又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
(b)配列番号65、配列番号77又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号66、配列番号78又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有する、請求項1、4〜7又は15のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号219又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号220又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号221又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有する、請求項1、4〜7、15又は16のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号67、配列番号79又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
(b)配列番号68、STS又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び/又は
(c)配列番号69、配列番号81又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有する、請求項1、4〜7又は15〜17のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号64、配列番号65及び配列番号66、又は配列番号64、65及び/若しくは66のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
(b)配列番号76、配列番号77及び配列番号78、又は配列番号76、77及び/若しくは78のいずれか1つ以上に1、2及び/又は3個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項1、4〜7又は15〜18のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号67、配列番号68及び配列番号69、又は配列番号67、68及び/若しくは69のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
(b)配列番号79、STS及び配列番号81、又は配列番号79、81及び/若しくはSTSのいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項1、4〜7又は15〜19のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68及び配列番号69、又は配列番号64、65、66、67、68及び/若しくは69のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
(b)配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、STS及び配列番号81、又は配列番号76、77、78、79、81及び/若しくはSTSのいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項1、4〜7又は15〜20のいずれか一項に記載の核酸分子。 - (i)抗CLEC14A結合ドメイン、
(ii)膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号167又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(b)配列番号168又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(c)配列番号169又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖CDR、
(d)配列番号129又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR、
(e)配列番号68又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR、及び/又は
(f)配列番号130又は1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR
の少なくとも1つを含む、核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号129、配列番号68及び配列番号130、又は配列番号129、68及び/若しくは130のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、且つ/又は配列番号167、配列番号168及び配列番号169、又は配列番号167、168及び/若しくは169のいずれか1つ以上に1、2若しくは3個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むアミノ酸配列を有する、請求項1又は22に記載の核酸分子。
- 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号56、配列番号104、配列番号106若しくは配列番号121、又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び/又は
(b)配列番号57、配列番号105、配列番号107若しくは配列番号122、又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、
(a)配列番号88若しくは配列番号90、又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び/又は
(b)配列番号89若しくは配列番号91、又はそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項1、4〜7又は15〜21のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号173若しくはそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び/又は配列番号133若しくはそれと少なくとも80%の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項22又は23に記載の核酸分子。
- 前記抗CLEC14A結合ドメインは、3つのCDRを含む少なくとも1つの重鎖可変領域と、3つのCDRを含む少なくとも1つの軽鎖可変領域とを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記抗CLEC14A結合ドメインは、配列番号58、配列番号112若しくは配列番号125のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むscFvを含む、請求項1〜14、24又は27のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記CLEC14A結合ドメインは、配列番号96のアミノ酸配列又はそれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むscFvを含む、請求項1、4〜7、15〜21又は27のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列:
(a)配列番号38、配列番号50又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号39、配列番号51又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号40、配列番号52、配列番号101、配列番号103、配列番号117、配列番号120又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含む、請求項1〜14、24、27又は28のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列:
(a)配列番号41、配列番号53又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号42、GACACATCC又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号43、配列番号55又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含む、請求項1〜14、24、27、28又は30のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列:
(a)配列番号82又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)配列番号83又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号84又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含む、請求項1、4〜7、15〜21、27又は29のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列
(a)配列番号85又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
(b)AGCACATCC又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(c)配列番号87又は1、2若しくは3個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも1つを含む、請求項1、4〜7、15〜21、27、29又は32のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記ポリヌクレオチドは、
(a)配列番号59、配列番号108、配列番号110若しくは配列番号123、又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(b)配列番号60、配列番号109、配列番号111若しくは配列番号124、又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体
を含む、請求項1〜14、24、27、28、30又は31のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記ポリヌクレオチドは、配列番号61、配列番号113若しくは配列番号126、又はそれと少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜14、24、27、28、30、31又は34のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ポリヌクレオチドは、
(a)配列番号92、配列番号94又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び/又は
(b)配列番号93、配列番号95又は1〜10個のヌクレオチド置換を有するその変異体
を含む、請求項1、4〜7、15〜21、27、29、32又は33のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記ポリヌクレオチドは、配列番号97又はそれと少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、請求項1、4〜7、15〜21、27、29、32、33又は36のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記膜貫通ドメインは、CD8α又はCD28に由来し、且つ好ましくは配列番号146のアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜37のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記細胞内シグナリングドメインは、CD3ζに由来し、且つ好ましくは配列番号148のアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記CARは、CD28、4−1BB、OX40、ICOS、DAP10、CD27、CD30、CD40、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C及び/又はB7−H3のいずれか1つから好ましくは選択される少なくとも1つの共刺激ドメインを含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記膜貫通ドメイン及び前記共刺激ドメインは、CD28に由来する、請求項40に記載の核酸分子。
- 前記CARは、リーダー配列、好ましくは配列番号135のオンコスタチンMリーダー配列、配列番号162によってコードされるCD8αリーダー配列又はそれと少なくとも95%の同一性を有する配列を含み、及び/又は前記CARは、好ましくはCD8αに由来するヒンジ又はスペーサーを含む、請求項1〜41のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記CARは、
(a)配列番号62、配列番号98、配列番号114又は配列番号127のアミノ酸配列又はそれと少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、且つ/又は
(b)配列番号63、配列番号99、配列番号115又は配列番号128のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも80%の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1に記載の核酸分子。 - 前記核酸分子は、RNAである、請求項1〜29のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 請求項1〜44のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるキメラ抗原受容体(CAR)。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載の核酸分子を含み、且つ任意選択で、T細胞受容体分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクター。
- ウイルスベクター、好ましくはガンマレトロウイルスベクターである、請求項46に記載のベクター。
- 自殺遺伝子、サイトカイン、ドミナントネガティブTGFβ受容体及び/又はCD34分子、好ましくはトランケート型CD34分子をコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項46又は47に記載のベクター。
- 請求項1〜44のいずれか一項に記載の核酸、請求項45に記載のCAR又は請求項46〜48のいずれか一項に記載のベクターを含み、且つ任意選択で、T細胞受容体分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子又はベクターを含む細胞。
- 免疫細胞、好ましくはT細胞又はナチュラルキラー細胞である、請求項49に記載の細胞。
- 自殺遺伝子、ドミナントネガティブTGFβ受容体又はサイトカインをコードする更なるポリヌクレオチド又はベクターを含む、請求項49又は50に記載の細胞。
- 療法における使用のための、請求項1〜44のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項46〜48のいずれか一項に記載のベクター又は請求項49〜51のいずれか一項に記載の細胞。
- 請求項1〜44のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項46〜48のいずれか一項に記載のベクター又は請求項49〜51のいずれか一項に記載の細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患に対処するか又はそれを治療する方法。
- CLEC14Aの発現に関連する病態の治療における使用のための、請求項1〜44のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項46〜48のいずれか一項に記載のベクター又は請求項49〜51のいずれか一項に記載の細胞。
- 請求項1〜44のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項46〜48のいずれか一項に記載のベクター又は請求項49〜51のいずれか一項に記載の細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、CLEC14Aの発現に関連する病態を治療する方法。
- CLEC14A発現に関連する病態を治療するための医薬の製造における使用のための、請求項1〜44のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項46〜48のいずれか一項に記載のベクター又は請求項49〜51のいずれか一項に記載の細胞の使用。
- 前記CLEC14Aの発現に関連する病態は、CLEC14Aを発現する固形腫瘍又は腫瘍血管新生である、請求項54に記載の使用のための核酸分子、ベクター若しくは細胞、請求項55に記載の方法又は請求項56に記載の使用。
- 前記核酸分子、ベクター又は細胞は、1つ以上の療法用薬剤、好ましくは(i)抗癌剤、より好ましくはチラパザミン、(ii)TCR分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、(iii)(ii)の核酸分子を含むベクター、又は(iv)(ii)の核酸分子若しくは(iii)のベクターを含む細胞と併用して別個に、同時に又は逐次的に投与されるものである、請求項54に記載の使用のための核酸分子、ベクター若しくは細胞、請求項55に記載の方法又は請求項56に記載の使用。
- 前記TCR分子は、WT1、好ましくはHLA A2/RMFPNAPYLに結合する、請求項58に記載の使用のための核酸分子、ベクター若しくは細胞、方法又は使用。
- 前記TCR分子は、α鎖及びβ鎖であって、前記α鎖は、配列番号190のCDR1α、配列番号191のCDR2α及び配列番号192又は193のCDR3αを含み、前記β鎖は、配列番号194のCDR1β、配列番号195のCDR2β及び配列番号196又は197のCDR3βを含む、α鎖及びβ鎖、又はその変異体であって、前記CDRの1つ以上は、1、2又は3個のアミノ酸置換を含む、その変異体を含み、前記TCR分子は、HLA A2/RMFPNAPYL複合体への結合能を有する、請求項59に記載の使用のための核酸分子、ベクター若しくは細胞、方法又は使用。
- 請求項1〜44のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項46〜48のいずれか一項に記載のベクター又は請求項49〜51のいずれか一項に記載の細胞を含み、且つ任意選択で、TCRをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、TCRをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクター、又はTCRをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子若しくはTCRをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を含むベクターを含む細胞を含む医薬組成物。
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