KR20230087583A - 항원을 mhc-ii 경로로 전달하고 숙주에서 cd4+ 및 cd8+ t-세포 반응을 유도하는 새로운 세대의 렌티바이러스 벡터 - Google Patents

항원을 mhc-ii 경로로 전달하고 숙주에서 cd4+ 및 cd8+ t-세포 반응을 유도하는 새로운 세대의 렌티바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈에 관한 것으로, 상기 융합 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단으로 배열된: (i) 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드와 융합된 제1 폴리펩티드의 다량체의 자가-조립을 가능하게 하기에 적합한 적어도 하나의 콜렉틴 또는 그의 단편을 포함하는 다량체화 스캐폴드를 포함하는, 제1 폴리펩티드; (ii) CD40L 엑토도메인 또는 그의 수용체 결합 단편, 특히 인간 CD40L의 CD40L 엑토도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 또한 이를 포함하는 렌티바이러스 벡터 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

항원을 MHC-II 경로로 전달하고 숙주에서 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응을 유도하는 새로운 세대의 렌티바이러스 벡터
본 발명은 수지상 세포를 표적하고 활성화하고, 면역원을 MHC-II 경로로 전달하고(route), CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응 모두를 유도하기 위해 활용되는 새로운 세대의 다기능 벡터를 제공하도록 설계된 렌티바이러스 벡터에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 숙주, 특히 CD4+ T 세포 반응을 포함하는 면역학적 반응을 필요로 하는 인간 숙주에서의 면역학적 반응을 유도하기 위해 선택된 항원(들)을 발현하는 렌티바이러스 벡터에 관한 것이다. 항원은 단일 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 벡터의 렌티바이러스 골격의 삽입물로부터 또는 다중 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 단일 또는 복수의 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 스캐폴드 운반체에 의해 벡터에 제공된다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 면역학적 조성물, 바람직하게는 백신 후보, 특히 인간 숙주에 적합한 백신의 설계에 사용하기 위해 제공된다.
렌티바이러스 벡터(LV: Lentiviral Vectors)는 가장 효율적인 백신 플랫폼 중의 하나를 제공하며, 특히 항원 제시 세포(APC: Antigen Presenting Cells)를 포함하여 숙주 세포의 핵으로의 유전자 전달의 탁월한 잠재력에 의존한다. 이러한 유전자의 핵 전달은 CD8+ T 세포의 추가적인 촉발을 위한 주요 조직적합성 복합체 클래스-I(MHC-I: Major Histocompatibility Complex Class-I) 제시 기계, 즉, 프로테아좀에 쉽게 접근하는 항원의 발현을 개시한다1 내지 3. 내인성으로 생성된 항원을 MHC-I 경로로 전달하는 상당한 능력과는 대조적으로, LV를 포함하여 바이러스 벡터는 미-분비 항원을 엔도솜 MHC-II 구획(MIIC: MHC-II compartment)으로 전달하는 데 거의 효과적이지 않거나 작동하지 않으며 CD4+ T 세포를 촉발할 수 없다. 비록 CD8+ T 세포가 감염성 질환 또는 종양 성장의 면역 조절에 크게 기여하기는 하나, CD4+ T 세포가 주요 면역 주체이다. CD4+ T 세포는 긴 수명과 직접적인 효과기 기능에 더해, 선천적인 면역을 조절하고, B-세포 반응을 재단하고 CD8+ T-세포 효과기 기능을 지원함으로써 면역계를 조직한다4. 따라서, CD4+ T 세포를 유도하기 위한 LV의 잠재력을 활용하는 것은 백신 전략에서의 성공율을 극대화할 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈에 관한 것이며, 여기에서 상기 융합 폴리펩티드가 N-말단으로부터 C-말단으로 배열된 제1 재조합 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기에서:
(i) 상기 제1 재조합 폴리펩티드가 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드와 융합된 제1 폴리펩티드의 다량체의 자가-조립을 가능하게 하기에 적합한 적어도 하나의 콜렉틴 또는 그의 단편을 포함하는 다량체화 스캐폴드를 포함하고;
(ii) 상기 제2 폴리펩티드가 CD40L 엑토도메인 또는 그의 수용체 결합 단편, 특히 인간 CD40L의 CD40L 엑토도메인을 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 재조합 벡터 게놈을 포함하는 DNA 플라스미드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 재조합 렌티바이러스 벡터 입자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 N-말단으로부터 C-말단으로 배열된 제1 재조합 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기에서:
(i) 상기 제1 재조합 폴리펩티드가 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드와 융합된 제1 폴리펩티드의 다량체의 자가-조립을 가능하게 하기에 적합한 적어도 하나의 콜렉틴 또는 그의 단편을 포함하는 다량체화 스캐폴드를 포함하고;
(ii) 상기 제2 폴리펩티드가 CD40L 엑토도메인 또는 그의 수용체 결합 단편, 특히 인간 CD40L의 CD40L 엑토도메인을 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 DNA 플라스미드로 형질감염된 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포, 특히 인간 숙주에 관한 것이며, 특히 여기에서 숙주 세포가 HEK-293T 세포주 또는 K562 세포주이다.
다른 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 숙주, 특히 인간 숙주에 투여하기에 적합한 하나 이상의 약제학적으로 수용가능한 부형제(들)와 함께 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터, 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자 또는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는, 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 필요로 하는 숙주, 특히 인간 숙주에서 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 및/또는 세포 및/또는 체액 반응에 포함된 에피토프에 대한 T-세포 반응의 유도에 의한 보호적, 우선적으로는 예방적 면역반응의 유도에 사용하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 하기의 단계를 포함하는, 약제학적 조성물, 특히 백신의 제조에 적합한 재조합 렌티바이러스 벡터 입자의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 숙주 세포, 예를 들어 HEK-293T 세포주 또는 K562 세포주에 본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터 게놈 또는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드를 운반하는 재조합 렌티바이러스 전달 벡터를 형질감염시키는 단계;
b) 단계 a)의 세포를: (i) 외피 단백질을 인코딩하는 플라스미드 벡터 및 포장 작제물로서 렌티바이러스 GAG 및 POL 또는 돌연변이된 POL을 인코딩하는 플라스미드 벡터로; 그리고 (ii) VSV-G 인디아나(VSV-G Indiana) 또는 뉴저지 외피(New Jersey envelope)를 인코딩하는 플라스미드로 공동-형질감염시키는 단계;
c) 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편을 발현하는 재조합 렌티바이러스 벡터 입자의 생산에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계;
d) 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편을 발현하는 재조합 렌티바이러스 입자를 회수하는 단계.
본 발명자들은 스캐폴드 단백질 운반체로서 만난-결합 렉틴(MBL: Mannan-Binding Lectin) 또는 계면활성제-연관 단백질 D(SPD: Surfactant-associated Protein D)와 같은 가용성 콜라겐-함유 C-형 렉틴(콜렉틴)을 기반으로 하는 재조합 분비 단백질 단량체를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터의 플랫폼을 설계하고 제조하였다. 본 발명자들은, CD40L 엑토도메인과 융합되었을 때, 이러한 스캐폴드 단백질 운반체가 MHC-II 항원 제시와 강한 CD4-매개 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 기존 렌티바이러스 플랫폼의 T-세포 면역원성이 대부분 CD8+ T-세포-매개 면역 반응으로 제한되었기 때문에 이는 예기치 못한 것이다.
따라서, 본 발명은 재조합 운반체 단백질로서 발현되는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈을 기술한다.
면역학적 반응의 유도를 위해 항원(들)을 수용하는 단백질 운반체를 발현하는 렌티바이러스 벡터 입자를 제조할 수 있도록 렌티바이러스 전달 벡터의 골격에서 재조합되는 폴리뉴클레오티드에 의해 재조합 운반체 단백질이 인코딩된다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터에 의해 발현된 재조합 단백질 운반체는 면역원성 반응, 특히 보호적 면역원성 반응 또는 유리하게는 항원(들)을 제공하는 병원체에 대한 멸균 보호의 유도에 적합한 단일 또는 복수의 상이한 항원을 운반하는 융합 폴리펩티드로서 또는 이러한 융합 폴리펩티드의 다량체로서 수득된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 따라서 N-말단으로부터 C-말단으로 배열된 제1 재조합 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈에 관한 것이고, 여기에서:
(i) 상기 제1 재조합 폴리펩티드가 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드와 융합된 적어도 하나의 콜렉틴 또는 그의 단편을 포함하는 다량체화 스캐폴드를 포함하고;
(ii) 상기 제2 폴리펩티드가 CD40L 엑토도메인 또는 그의 수용체 결합 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 다량체화 스캐폴드는 자가-조립이 가능하고, 그에 의해 다량체성 단백질의 형성을 유도할 수 있는 폴리펩티드 쇄를 의미한다. 콜렉틴의 다량체화는 하나 또는 여러 개의 시스테인 잔기를 포함하는 시스테인-풍부 N-말단 가교 영역34, 54 사이의 이황화 결합의 형성에 의해 매개된다.
따라서, 제1 폴리펩티드의 다량체의 자가 조립을 가능하게 하는 데 적합한 상기 적어도 콜렉틴의 단편은 획득가능한 지식에 따라 결정될 수 있다. 특히, 콜렉틴의 단편은 콜렉틴의 적어도 하나의 N-말단 가교 영역 또는 도메인을 포함한다. 상기 가교 영역은 바람직하게는 최대 6개의 아미노산 잔기, 예를 들어 4 또는 5개의 아미노산으로 분리된 적어도 2개의 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 제2 시스테인 잔기는 전형적으로 소수성 아미노산 잔기에 선행한다. 가교 영역은 일반적으로 5 내지 50개의 아미노산, 보다 구체적으로는 10 내지 35개의 아미노산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 가교 영역은 만난-결합 렉틴(MBL), 계면활성제 단백질 D(SP-D), 계면활성제 단백질 A(SP-A), 콜렉틴 간 1(CL-L1: collectin liver 1), 콜렉틴 태반 1(CL-P1), 교착소, 43 kDa의 콜렉틴(CL-43), 46 kDa의 콜렉틴(CL-46) 및 콜렉틴 신장 1(CL-K1), 특히 인간 MBL(시퀀스 동정 번호 17), SP-D(시퀀스 동정 번호 18), CL-L1(시퀀스 동정 번호 34), SP-A1(시퀀스 동정 번호 35), SP-A2(시퀀스 동정 번호 36), CL-P1(시퀀스 동정 번호 37) 및 CL-K1(시퀀스 동정 번호 38) 또는 상기 콜렉틴의 가교 영역/도메인과 적어도 50%, 특히 적어도 60%, 보다 구체적으로 적어도 80% 또는 90%, 보다 더 구체적으로 적어도 95% 또는 99% 시퀀스 동일성을 갖는 시퀀스로부터 선택되는 콜렉틴의 가교 영역/도메인이다.
본 발명에 따르면, 하나의 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 융합되는 경우, 2개의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 프레임 내에서 서로 연결되어 융합 단백질을 인코딩하는 키메라 유전자를 생성한다. 본 발명에서, 항원성 폴리펩티드의 뉴클레오티드 시퀀스는 콜렉틴의 뉴클레오티드 시퀀스 또는 그의 단편에 대해 5' 또는 3' 위치에 연결될 수 있다. 바람직하게는, 콜렉틴 또는 그의 단편이 그의 폴리펩티드 쇄 내에서 항원성 폴리펩티드를 수용하도록 콜렉틴 또는 그의 단편의 뉴클레오티드 시퀀스 내에서 융합된 프레임 내에 삽입된다. 바람직하게는, 항원성 폴리펩티드는 콜렉틴의 콜라겐-유사 도메인 내에 수용된다. 2개의 폴리펩티드들 간의 융합은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 특히, 링커 또는 스페이서 펩티드 또는 폴리펩티드가 2개의 융합된 폴리펩티드들 사이에 존재할 수 있다.
본 발명에 따르면, 제2 폴리펩티드는 본 발명의 융합 폴리펩티드, 특히 CD40L 엑토도메인 또는 그의 수용체 결합 단편에 포함되는 경우 CD40 수용체에 결합할 수 있는 CD40 리간드(CD40L)을 포함한다. CD40L은 바람직하게는 인간 CD40L이다.
CD40L 엑토도메인은 바람직하게는 인간 CD40L의 엑토도메인이다. 특히, CD40L 엑토도메인은 시퀀스 동정 번호 19에 규정되는 시퀀스를 갖는다. 제2 폴리펩티드는 또한 CD40L의 임의의 수용체 결합 단편 또는 영역 또는 그의 엑토도메인, 즉 CD40을 결합할 수 있는 단편 또는 영역을 포함할 수 있다.
이러한 융합 단백질에서, 콜렉틴 또는 그의 단편은 항원성 폴리펩티드를 위한 운반체로서 작용한다. 콜렉틴은 또한 활성화될 항원 제시 세포(APC)의 표면에서 CD40 수용체를 결합하는 능력이 있는 콜렉틴-CD40L 다량체의 형성을 촉진하는 다량체화 스캐폴드로서 작용한다.
본 발명은 또한 단량체 또는 다량체 형태의 융합 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 콜렉틴 또는 그의 단편은 융합 폴리펩티드의 3량체화를 유도할 수 있다. 콜렉틴 3량체는 또한 추가로 다량체화할 수 있으며, 12량체(3량체의 4량체) 또는 18량체(3량체의 6량체)의 형성을 유도한다.
다량체로서 발현되는 융합 폴리펩티드는 특히 숙주의 혈액에서 순환할 수 있거나 APC에 의해 흡수될 수 있는 가용성 거대분자 운반체이다.
콜렉틴은 전형적으로 하기의 4개의 별개의 영역들로 구성된다: (i) 가교 영역, (ii) 콜라겐-유사 영역, (iii) 목(neck) 영역 및 (iv) 탄수화물-인식 도메인(CRD: Carbohydrate-Recognition Domain). 바람직하게는, 콜렉틴 또는 콜렉틴 단편은 N-말단으로부터 C-말단으로 하기의 콜렉틴 영역들을 포함한다: 적어도 하나의 가교 영역; 콜렉틴의 적어도 하나의 콜라겐-유사 영역; 및 콜렉틴의 적어도 하나의 목 영역. 하나의 구현예에서, 콜렉틴의 탄수화물 인식 도메인(CRD)은 융합 단백질에서 존재하지 않는다. 이 구현예에서, CD40L의 엑토도메인 또는 그의 수용체 결합 단편을 포함하는 제2 폴리펩티드는 콜렉틴의 CRD를 대체할 수 있으며, 즉 제2 폴리펩티드는 임의선택적으로 링커 또는 스페이서와 함께 콜렉틴의 목 영역에 융합될 수 있다. 특히, CD40L 엑토도메인 또는 그의 단편은 CD40L 엑토도메인과 발현되는 항원성 폴리펩티드 간의 상호작용을 방지하는 감겨진 코일 영역과 같은 견고한 스페이서를 통해 목 영역과 융합될 수 있다.
콜렉틴은 만난-결합 렉틴(MBL), 계면활성제 단백질 D(SP-D), 계면활성제 단백질 A(SP-A), 콜렉틴 간 1(CL-L1), 콜렉틴 태반 1(CL-P1), 교착소, 43 kDa의 콜렉틴(CL-43), 46 kDa의 콜렉틴(CL-46) 및 콜렉틴 신장 1(CL-K1)로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 콜렉틴은 인간 MBL(UniProtKB - P11226)(시퀀스 동정 번호 17), SP-D(UniProtKB - P35247)(시퀀스 동정 번호 18), CL-L1(UniProtKB - Q9Y6Z7)(시퀀스 동정 번호 34), SP-A1(UniProtKB - Q8IWL2)(시퀀스 동정 번호 35), SP-A2(UniProtKB - Q8IWL1)(시퀀스 동정 번호 36), CL-P1(UniProtKB - Q5KU26)(시퀀스 동정 번호 37) 및 CL-K1(UniProtKB - Q9BWP8)(시퀀스 동정 번호 38)로부터 선택되는 인간 콜렉틴이다. 바람직하게는, 콜렉틴은 MBL 또는 SP-D, 특히 시퀀스 동정 번호 17의 인간 MBL 또는 시퀀스 동정 번호 18의 인간 SP-D와 같은 인간 MBL 또는 인간 SP-D이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드의 콜렉틴 또는 콜렉틴 단편은 키메라 콜렉틴 또는 그의 단편이다. 키메라 콜렉틴은 상이한 콜렉틴에서 유래하는 2개 이상의 콜렉틴 단편을 포함한다. 하나의 구현예에서, 키메라 콜렉틴은 인간 허파 계면활성제-연관 단백질 D(SP-D, UniProtKB - P35247)(시퀀스 동정 번호 18)의 단편 특히 분비를 보장하는 단일 펩티드를 포함하는 아미노산 1 내지 106, 시스테인-풍부 영역과 콜라겐-유사 도메인 및 인간 만노스-결합 단백질 C(MBL, UniProtKB - P11226)(시퀀스 동정 번호 17)의 단편, 특히 콜라겐-유사 도메인과 감겨진-코일 영역을 포함하는 아미노산 65 내지 130개를 포함한다. 항원성 폴리펩티드는 바람직하게는 SP-D 단편과 MBL 단편 사이에서 키메라 콜렉틴에 융합된다. 키메라 콜렉틴을 포함하는 융합 단백질의 하나의 예시적인 구조를 도 13에 나타내었다.
바람직하게는, 항원성 폴리펩티드(들)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)은 상기 콜렉틴의 콜라겐-유사 영역의 뉴클레오티드 시퀀스 내에 삽입되고, 특히 이는 이러한 시퀀스의 프레임 내에 융합된다.
항원성 폴리펩티드는 링커, 특히 글리신과 세린의 구간으로 이루어지는 "GS" 링커, 특히 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n 링커와 같은 유연한 펩티드 링커를 통하여 상기 콜렉틴의 콜라겐-유사 영역 내에 연결될 수 있다. 적합한 링커를 또한 실시예들, 특히 표 S2 및 S3에 나타내었다.
본 발명에 따르면 융합 폴리펩티드는 하나 또는 여러 개의 항원 또는 항원성 폴리펩티드를 수반한다. 특정한 구현예에서 융합 폴리펩티드는 적어도 2개, 특히 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개의 항원(및/또는 항원성 단편 또는 병원체의 천연 또는 야생형 결정 항원에 대해 돌연변이된 항원)을 제공하고 특히 구체적으로 2, 3, 4 또는 5개의 항원(및/또는 항원성 단편 또는 병원체의 천연 또는 야생형 결정 항원에 대해 돌연변이된 항원)이고 따라서 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 항원(및/또는 항원성 단편 또는 병원체의 천연 또는 야생형 결정 항원에 대해 돌연변이된 항원)을 포함한다. 특정한 구현예에서 융합 폴리펩티드에 포함되는 항원성 폴리펩티드는 최대 6개의 항원 또는 항원성 단편 또는 그의 돌연변이된 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
하나의 구현예에서, 항원 또는 그의 면역원성 단편은 박테리아, 기생충 또는 바이러스 병원체로부터 선택되거나, 종양 항원 또는 그의 면역원성 단편이고, 특히 여기에서 적어도 2개의 항원 또는 그의 면역원성 단편은 별개의 병원체로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 병원체는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 인플루엔자 바이러스 특히 A형, B형 또는 C형 인플루엔자 바이러스, 보다 구체적으로는 H1N1, H2N2 또는 H3N2 인플루엔자 바이러스 또는 코로나바이러스 특히 SARS-CoV-2로부터 선택된다.
특히, 항원성 폴리펩티드는 특히 EsxA(UniProtKB - P9WNK7)(시퀀스 동정 번호 39), EspC(UniProtKB - P9WJD7)(시퀀스 동정 번호 40), EsxH(UniProtKB - P9WNK3)(시퀀스 동정 번호 41), PE19(UniProtKB - Q79FK4)(시퀀스 동정 번호 42), 저산소 반응 단백질(Hrp1: Hypoxic response protein 1)(UniProtKB - P9WJA3)(시퀀스 동정 번호 43) 및 소생 촉진 인자 D(RpfD: Resuscitation promoting factor D)(UniProtKB - P9WG27)(시퀀스 동정 번호 44) 또는 그의 면역원성 단편, 예를 들어 초기 메티오닌을 결여하는 단편으로부터 선택되는 하나 이상의 결핵균(Mtb) 항원을 포함할 수 있다. 바람직하게는, RpfD의 면역원성 단편은 RpfD42-154 엑토도메인이다. 하나의 구현예에서, 항원성 폴리펩티드는 하기의 Mtb 항원성 조합들 중의 하나를 포함할 수 있다:
(a) EsxH;
(b) EsxH 및 EsxA;
(c) EsxH, EsxA 및 PE19;
(d) EsxH, EsxA, PE19 및 EspC;
(e) EsxH, EsxA, PE19, EspC, Hrp1 및 RpfD;
또는 이들의 면역원성 단편.
하나의 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 특히 2A 자가-절단 펩티드를 통해 전-염증성 Th1-연관 케모카인으로서의 CXCL9, CXCL10, CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 또는 Th17-촉진 케모카인으로서의 CXCL20과 같은 다른 면역-조절 기능을 보장하는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 CCL20 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. CCL20 또는 그의 수용체 결합 도메인은 특히 콜렉틴-유사 도메인 내에 삽입될 수 있다.
하나의 구현예에서, 폴리펩티드는 인간 CCL20 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함한다. 특히, 폴리펩티드는 시퀀스 동정 번호 20에 규정되는 인간 CCL20 시퀀스를 포함한다.
하나의 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 시퀀스 동정 번호: 24 및 도 13에 규정된 시퀀스를 가지며, 여기에서 항원성 폴리펩티드 EsxH의 시퀀스는 대상의 다른 항원성 폴리펩티드에 의해 대체될 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 본 명세서에서 정의되는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 DNA, 특히 cDNA일 수 있거나 RNA, 특히 안정화된 RNA일 수 있다. RNA 시퀀스는 DNA 시퀀스로부터 도출되며 여기에서 티민(T) 핵염기는 우라실(U) 핵염기로 대체된다. RNA 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 cDNA의 전사에 의해 수득될 수 있거나 합성될 수 있다.
핵산 분자는 항원(들)을 포함하는 융합 폴리펩티드의 전사를 위하거나 발현을 위한 조절 뉴클레오티드 시퀀스를 추가로 포함할 수 있다. 핵산 분자는 또한 플라스미드 또는 벡터 게놈(전달 플라스미드), 특히 렌티바이러스 벡터 게놈과 같은 별개의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되도록 변형될 수 있다. 또한 핵산 분자는 특히 FNA로서 사용하기 위한 것과 같이 보다 안정하게 되도록 변형될 수 있다. 추가의 구현예에서, 핵산은 각각 포유동물 세포, 인간 세포에서의 발현을 위한 포유동물 코돈-최적화 시퀀스, 특히 인간 코돈-최적화 시퀀스이다.
본 발명은 또한 숙주에서의 면역 반응의 유도를 위해 선택된 항원(들)을 운반하는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자와 재조합된 플라스미드 벡터에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 플라스미드 벡터는 전달 벡터, 특히 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 게놈을 제공하기에 적합한 렌티바이러스 전달 벡터이다. 렌티바이러스 벡터는 숙주에서 생체 내 발현되는 경우 분비되는 단량체 또는 다량체로서 운반체 단백질과 함께 선택된 항원성 폴리펩티드를 발현한다.
"항원" 또는 "항원성 폴리펩티드"는 본 명세서에서 병원성 유기체의 야생형 또는 천연 항원으로 또는 이러한 야생형 또는 천연 항원의 단편으로 또는 야생형 또는 천연 항원에 대해 5% 미만 돌연변이된 구체적으로 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이된 폴리펩티드로 정의된다. 돌연변이는 특히 야생형 또는 천연 항원의 아미노산 시퀀스의 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기의 점 돌연변이이다. 야생형 또는 천연 항원의 단편은 유리하게는 본 발명의 렌티바이러스 벡터에 의해 발현되는 경우 향상된 면역원성 특성을 유도하거나 나타내는 폴리펩티드의 면역원성 특성을 유지하고 유리하게는 숙주에서 발현되는 경우 면역 보호 특성을 나타낸다. 항원의 단편은 하나 또는 여러 개의 에피토프(들) 특히 T 세포 에피토프 더욱 특별하게는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 에피토프 또는 둘 모두를 제공하기에 충분하고, 본 발명의 렌티바이러스 벡터에 의해 발현되는 경우 보호 특성을 유도하고/유도하거나 나타내는 항원성 폴리펩티드의 보호 활성을 유도하는 면역원성, 특별히 보호 특성을 유지하는 아미노산 시퀀스를 갖는다.
표현 "T-세포 에피토프"는 T 세포에 의해 구동되는 적응 면역 반응에 관여하는 항원 결정기를 의미한다. 특히 상기 T-세포 에피토프는 적합한 조건에서 숙주에 전달되는 경우 T 세포를 유도한다. 특정한 구현예에 따르면 본 발명에 따라 표적되는 항원성 폴리펩티드 및 이러한 항원성 폴리펩티드의 폴리펩티드 유도체는 CD4+ T 세포 반응 그리고 유리하게는 또한 CD8+ T 세포 반응을 매개하는 에피토프(들)를 포함한다.
본 발명에서 기술되고 사용되는 폴리펩티드 및 항원은 천연 단백질과 적어도 50% 아미노산 동일성, 특히 적어도 60%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 80%, 보다 특별히는 적어도 90% 또는 95%, 보다 특별히는 적어도 99% 동일성을 가질 수 있다.
특정한 구현예에서, 전달 벡터의 게놈을 포함하는 핵산 분자는 단량체성 융합 폴리펩티드로서의 발현을 위한 병원체의 선택된 항원(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 재조합된 렌티바이러스 골격 벡터를 포함하는 플라스미드로서 또는 상기 벡터 게놈이 숙주에 투여하기 위해 사용되는 렌티바이러스 벡터 입자에 제공되는 경우 다량체, 바람직하게는 가용성 운반체 단백질로서 제공된다.
추가적으로, 핵산 분자는 전사의 조절 및/또는 발현의 조절을 위한 시퀀스를 포함할 수 있고/있거나 플라스미드 또는 벡터 게놈으로의 연결을 위한 것과 같은 별개의 핵산에의 연결을 위한 시퀀스를 포함할 수 있다. 따라서 핵산은 제한 부위(들)를 위한 시퀀스, 코작 시퀀스(Kozak sequence), 프로모터 또는 본 명세서에 기술되고 실시예에 도시된 것과 같은 다른 시퀀스 중의 하나 이상을 포함할 수 있다.
표현 "벡터"는 화합물의 조합의 항원성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이러한 벡터로 투여되는 숙주의 세포에 전달하기에 적합한 생물학적 또는 화학적 실체에 관한 것이다. 벡터는 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있고 인간을 감염시키는 렌티바이러스와 같이 본 명세서에 기술되는 것과 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명은 특히 HIV 벡터, 특히 실시예에서 설명되는 HIV-1 벡터에 관한 것이다. HIV-1 벡터의 작제를 위한 상세한 설명은 당해 기술분야에서 공지되어 있고 실시예에 제공된다.
본 발명에 따르면, 항원성 폴리펩티드를 발현하는 렌티바이러스 벡터가 제공되며, 여기에서 상기 벡터는 그의 게놈(벡터 게놈) 내에 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 갖거나 포함하고, 여기에서 상기 융합 폴리펩티드는 특히 병원체의 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터, 특히 바람직하게는 HIV-1 기반 벡터, 복제-불능 가성형태 렌티바이러스 벡터(replication-incompetent pseudotyped lentiviral vector), 특히 복제-불능 가성형태 HIV-1 렌티바이러스 벡터이고, 여기에서 상기 벡터는 포유동물 코돈-최적화 합성 핵산, 특히 인간-코돈 최적화 합성 핵산을 포함하는 게놈을 포함하고, 여기에서 상기 합성 핵산은 항원성 폴리펩티드, 특히 포유동물, 특히 인간 숙주를 감염시키는 결정된 병원체의 항원성 폴리펩티드(들)을 포함하는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩한다.
벡터 입자의 게놈에서 코돈-최적화 시퀀스를 사용하면 특히 mRNA 안정성을 향상시키거나 2차 구조를 감소시킴으로써 벡터로 투여된 숙주의 세포에서 항원성 폴리펩티드를 특히 강하게 발현할 수 있다. 게다가, 발현된 항원성 폴리펩티드는 특히 인코딩된 폴리펩티드의 번역 변형 부위(글리코실화 부위와 같은)를 변형함으로써 숙주의 세포에서 항원성 폴리펩티드의 처리에 적합한 번역후 변형을 진행한다. GeneArt(Life technologies-USA) 및 DNA2.0(Menlo Park, California - USA)에 의해 획득가능하게 된 것과 같은 알고리즘 및 서비스를 포함하여 코돈 최적화 도구가 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있다. 특정한 구현예에서, 코돈-최적화는 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame) 시퀀스에 대해 수행되고 최적화는 벡터 게놈의 제조를 위해 의도된 플라스미드 내로 ORF를 인코딩하는 시퀀스를 도입하기 이전에 수행된다. 다른 구현예에서 벡터 게놈의 추가 시퀀스가 또한 코돈-최적화된다.
바이러스 벡터를 구성하는 활성 성분은 편입형 가성형태 렌티바이러스 벡터(integrative pseudotyped lentiviral vectors), 특히 복제-불능 편입형 가성형태 렌티바이러스 벡터, 특히 HIV-1 벡터일 수 있다. 이러한 렌티바이러스 벡터는 추가로 포유동물-코돈 최적화 합성 핵산, 특히 인간-코돈 최적화 합성 핵산을 포함하는 게놈을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 합성 핵산은 본 명세서에서 기술되는 것과 같은 포유동물을 감염시키는 결정된 병원체, 특히 인간 숙주를 감염시키는 바이러스 또는 박테리아 또는 기생충의 항원성 폴리펩티드(들)를 인코딩한다.
대안으로, 렌티바이러스 벡터 특히 HIV-1 기반 벡터는 비-편입형 복제-불능 가성형태 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명을 달성하기에 적합한 렌티바이러스 벡터의 특정한 구현예는 그의 게놈이 pTRIP 벡터 플라스미드, 특히 뉴클레오티드 시퀀스 시퀀스 동정 번호 21의 pTRIP 벡터 플라스미드로부터 수득되는 렌티바이러스 벡터에 관한 것이며, 여기에서 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 포유동물 세포에서 기능하는 프로모터, 특히 CMV 프로모터, 인간 베타-2 마이크로글로불린 프로모터, 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 복합 "BCUAG" 프로모터(시퀀스 동정 번호 22)의 조절 하에 복제되고 그리고 여기에서 벡터는 임의선택적으로 야생형 또는 돌연변이된 우드척 간염 바이러스의 전사-후 조절 요소(WPRE: post-transcriptional regulatory element of the woodchuck hepatitis virus)를 포함한다. 특히, WPRE는 시퀀스 동정 번호 23에서 규정되는 바와 같은 돌연변이 WPRE이다.
본 발명의 추가의 구현예에서, 본 명세서에 기술된 특징들에 따른 융합 단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터 입자는 인디아나 혈청형 또는 뉴저지 혈청형의 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G(glycoprotein G from a Vesicular Stomatitis Virus (V-SVG))에 대해 가성형태화 된다.
이러한 렌티바이러스 벡터의 특정한 특징들이 아래에 추가로 상세하게 기술될 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 제공된 정의에 따른 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 DNA 플라스미드에 관한 것이며, 특히 여기에서 상기 게놈은 뉴클레오티드 시퀀스 시퀀스 동정 번호 21의 pTRIP 벡터 플라스미드 내에 삽입된다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 DNA 플라스미드로 형질감염된 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에 관한 것이다. 특히, 상기 숙주 세포는 HEK-293T 세포주 또는 K562 세포주이다. 본 발명은 추가로 상기 숙주 세포의 배양에 관한 것이다.
본 발명은 또한 필요로 하는 숙주, 특히 인간 숙주에 투여하기에 적합한 하나 이상의 약제학적으로 수용가능한 부형제(들)와 함께 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터를 포함하는, 포유동물 숙주에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물의 제형화에 관한 것이다.
본 발명은 또한 필요로 하는 숙주, 특히 인간 숙주에 투여하기에 적합한 부형제(들)와 함께 활성 성분으로서 병원체 감염에 대한 또는 병원체-유발 상태에 대한 보호를 위한 본 명세서에 정의되는 바와 같은 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는, 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에 투여하기에 적합한 제형에 관한 것이다. 질환은 특히 결핵, 특히 A형, B형 또는 C형 인플루엔자 바이러스, 보다 구체적으로는 H1N1, H2N2 또는 H3N2 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자일 수 있다. 또한 질환은 특히 SARS-CoV-2에 의해 야기되는 코로나바이러스 질환일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서 활성 성분 또는 이를 포함하는 조성물이나 제형은 임의선택적으로 적절한 전달 비히클과 함께 그리고 임의선택적으로 보조제와 함께 그리고/또는 면역자극 성분과 함께 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에서 병원체 감염에 대한 또는 병원체-유도 상태 또는 질환에 대한 보호 면역에서 사용하기 위한 것이다.
따라서, 본 발명의 활성 성분 또는 조성물, 특히 렌티바이러스 벡터 입자는, 필요로 하는 숙주, 특히 포유동물 특히 인간 숙주에 투여되는 경우, 병원체의 항원(들)에 대한 순수한 림프구의 활성화 및 효과기 T-세포 반응의 생성 및 면역 기억 항원-특이적 T-세포 반응을 포함하여 면역 반응을 유도한다.
면역 반응은 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포에 의한 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편의 MHC-II 제한 제시의 유도 및 CD4+-T-세포 면역 반응의 유도를 포함한다.
면역 반응은 병원체에 의한 감염을 방지하거나 감염으로 인한 병적 상태의 발병 또는 발달을 방지할 수 있다.
면역화 조성물의 투여 경로에 대해 생리학적으로 수용가능한 비히클이 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서 투여는 특히 근육내, 피내, 피하 주사에 의하거나 비강 내 투여 또는 국소 피부 도포에 의해 실행될 수 있다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는, 숙주, 특히 인간 숙주에서, 입자에 의해 발현되는 항원을 제시하는 병원체에 대해 면역 반응을 유도하기 위해 사용되며, 상기 사용은 특히 상기 병원체에 대한 선택된 활성 성분의 시동 용량(priming dose)에 의해 앞서 유도되는 숙주의 세포 면역 반응을 촉진하기 위한 상기 활성 성분의 유효량으로서 숙주의 세포 면역 반응을 유도하는 LV 벡터 입자 유효량을 투여하는 단계 및 임의선택적으로 촉진을 위한 상기 투여 단계를 반복(1회 또는 수회)하는 단계를 포함하는 면역화 패턴을 포함한다.
렌티바이러스 벡터 입자의 각 투여 단계를 위해서, 특히 다중의 투여 단계를 포함하는 요법에서, 벡터 입자의 가성형태 외피 단백질(들)은 다른 단계(들)에서 사용된 것과 상이하고 특히 상이한 바이러스, 특히 상이한 VSV에서 유래하는 것이 바람직하다. 시동-촉진 요법에서, 각 단계의 화합물의 투여 조합은 본 명세서에서 정의되는 바와 같은 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
시동 및 촉진 단계는 시간에 따라 적어도 2주, 특히 6주, 특히 적어도 8주로 분리된다.
투여 요법에 대한 상세가 이하에서 추가로 논의될 것이다.
LV 입자는 세포 면역 반응(T-세포 면역 반응), 특히 CD4+T-세포 면역 반응 및 유리하게는 CD8+-T-세포 면역 반응, 즉, 각각 CD4 또는 CD8 수용체를 수용하는 활성화된 세포에 의해 매개되는 적응 면역 반응을 제공한다.
특히 유리한 구현예에서, LV입자에 의해 부여되는 면역 반응은 장기-지속 면역 반응이고, 즉, 상기 면역 반응은 기억 세포 반응 그리고 특히 중앙 기억 세포 반응을 포함하고; 특정한 구현예에서 면역 반응은 여전히 적어도 수 개월에서 검출될 수 있다.
본 발명에 따라 렌티바이러스 입자가 시동-촉진 요법 또는 다단계 투여 요법에서 사용되는 경우, 렌티바이러스 입자가 제공되고 이 렌티바이러스 입자는 VSV, 균주 인디아나 또는 뉴저지에서 수득되는 제1 결정 가성형태 외피 G 단백질로 가성형태화 되고, 후에 투여되는 렌티바이러스 벡터 입자가 제공되고 이 렌티바이러스는 VSV, 균주 뉴저지 또는 인디아나에서 수득되는 제1 결정 가성형태 외피 G 단백질로 가성형태화 된다. 따라서 기술된 제1 및 제2 화합물의 시동-촉진 요법에서의 사용 순서는 대안으로 역전될 수 있다. 따라서, 시동-촉진 요법에서 사용하도록 의도되는 경우, 본 발명의 조합 또는 조성물의 별개의 활성 성분/화합물에 포함된 렌티바이러스 벡터 입자는 적어도 벡터 입자를 가성형태화 하기 위해 사용되는 특정한 가성형태 외피 단백질(들)로 인하여 서로 구별된다.
투여 패턴에서 사용되는 세포 면역 반응의 유도하기 위해 의도되는 렌티바이러스 벡터의 투여량은, 편입형 벡터가 사용되는 경우, 재조합 렌티바이러스 입자 105 TU 내지 1010 TU, 특히 105 TU 내지 108 TU를 포함할 수 있다. 숙주에의 투여를 위해 의도되는 투여량은 편입-불능 벡터가 사용되는 경우 각 형태의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자 108 TU 내지 1010 TU를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 시동 또는 촉진으로서 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자를 투여하여 면역 반응을 유도하는 단계 및 임의선택적으로 본 상세한 설명에 따라 특히 상기 반응을 촉진하기 위해 투여 단계를 1회 또는 수회 반복하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주, 특히 인간 숙주에서 면역화를 제공하는 방법에 관한 것이다.
임의선택적으로, 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 포유동물, 특히 인간 숙주에 투여하기에 적합한 보조 화합물과 함께 그리고/또는 적절한 전달 비히클과 함께 면역자극 화합물과 함께 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, CD40L 엑토도메인이 이미 약한 보조제로서 작용하기 때문에 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 보조제를 수반함이 없이 사용될 수 있다.
재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 피하(s.c.), 피내(i.d.), 근육내(i.m.) 또는 정맥내(i.v.) 주사를 포함하여 상이한 경로를 통해 주사를 경유하여 숙주에 투여될 수 있거나, 경구로 내지 점막 또는 피부, 특히 비강내 투여 또는 흡기를 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 투여되는 양(투여량)은 환자의 상태, 개인의 면역계의 상태, 투여의 경로 및 숙주의 크기를 고려하는 것을 포함하여 치료되어야 할 대상체에 의존적이다. HIV-1-유래 렌티바이러스 벡터 입자의 등가 전달 단위의 함량에 대해 적합한 투여량 범위가 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 예시들 및 특징들은 본 상세한 설명에서 주어진 정의와 개별적으로 결합될 수 있는 특징들을 갖는 렌티바이러스 벡터 입자의 제조 및 적용을 설명하는 예시들 및 도면들을 판독할 때 명백하게 될 것이다.
본 발명에 따른 용도를 위한 렌티바이러스 벡터의 상세한 설명
따라서 본 발명은 렌티바이러스 벡터에 관한 것이고 이는 재조합 렌티바이러스 입자(즉 재조합 벡터 입자)이고, 이는 복제-불능 렌티바이러스 벡터, 특히 하기들을 특징으로 하는 복제-불능 HIV-1 기반 벡터이다: (i) 렌티바이러스 벡터는 결정 이종기원 바이러스 외피 단백질 또는 HIV가 아닌 RNA 바이러스에서 유래하는 바이러스 외피 단백질로 가성형태화 되고, 그리고 (ii) 렌티바이러스 벡터는 그의 게놈 내에 병원체의 항원의 에피토프(들)를 운반하는 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드(또는 그의 폴리펩티드 유도체)를 인코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하고 여기에서 병원체가 포유동물 숙주를 감염시킬 수 있고, 그리고 여기에서 상기 에피토프가 T-세포 에피토프(들), 특히 CD4+ T-세포 에피토프 및 CD8+ T-세포 에피토프 둘 모두를 포함한다.
본 발명의 특정한 구현예에 따르면, 렌티바이러스 벡터는 입자를 충분하게(즉, 편입-가능) 또는 결핍되게 (즉, 편입-불능) 발현하도록 설계된다. 본 발명의 특정한 구현예에 따르면, 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는 편입-불능 및 복제-불능 둘 모두이다.
렌티바이러스 벡터의 제조는 통상의 기술자에게 충분히 공지되어 있고 문헌에 광범위하게 기술되어 있다(Sakuma T. et al (Biochem. J. (2012) 443, 603-618이 리뷰를 위해 제공됨). 이러한 벡터의 제조는 또한 본 명세서에서 실시예에 설명되어 있다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터의 항원성 폴리펩티드(ORF)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 포유동물-코돈 최적화(CO) 특히 인간-코돈 최적화된다. 임의선택적으로 상기 입자의 게놈의 렌티바이러스 시퀀스는 또한 포유동물-코돈 최적화 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는다. 본 발명의 특정한 양태에서 코돈 최적화는 마우스 세포에서의 발현을 위해 실행된다. 다른 구현예에서 렌티바이러스 벡터의 항원성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)의 시퀀스는 인간-코돈 최적화(CO) 된다.
특히 포유동물에서 특히 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화되는 경우, 코돈 최적화 뉴클레오티드 시퀀스가 그러한 포유동물 또는 인간 세포에서 보다 더 높은 수율의 입자 생산을 가능하게 한다는 것이 관찰되었다. 생산 세포를 실시예에 설명하였다. 따라서, 본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자가 포유동물, 특히 인간 숙주에 투여되는 경우, 보다 더 많은 양의 입자가 상기 숙주에서 생산되며 이는 강한 면역 반응에 유리하다.
본 발명에서 정의되는 재조합 렌티바이러스 벡터(즉, 렌티바이러스 벡터 입자 또는 렌티바이러스-기반 벡터 입자)는 특정한 렌티바이러스(특히 HIV, 특히 HIV-1과 상이한 바이러스)와 상이한 바이러스에서 유래하는 외피 단백질 또는 외피 단백질들을 보유하는 벡터 입자로 이루어지는 가성형태 렌티바이러스 벡터이고, 이는 렌티바이러스 벡터 입자의 벡터 게놈을 제공한다. 따라서, 상기 외피 단백질 또는 외피 단백질들은 입자의 벡터 게놈에 대해 "이종기원" 바이러스 외피 단백질 또는 바이러스 외피 단백질이다. 이하의 페이지에서, 본 발명을 수행하기에 적합한 임의의 유형의 외피 단백질 또는 외피 단백질들을 포함하여 "외피 단백질(들)"에 대한 언급이 이루어질 것이다.
본원에서 "렌티바이러스" 벡터(렌티바이러스-기반 벡터)에 대하여 언급되는 경우, 이는 특히 HIV-기반 벡터 특히 HIV-1-기반 벡터에 관한 것이다.
본 발명을 수행하기에 적합한 렌티바이러스 벡터는 소위 대체 벡터로서, 렌티바이러스 단백질을 인코딩하는 원래의 렌티바이러스가 벡터의 게놈에서 본질적으로 결실되거나, 존재하는 경우, 변형되고, 특히 돌연변이되고, 특히 절두되어 생물학적으로 활성인 렌티바이러스 단백질의 발현을 방지하고, 특히, HIV의 경우, 기능성 ENV, GAG 및 POL 단백질의 그리고 임의선택적으로 렌티바이러스, 특히 HIV의 추가의 구조 및/또는 부속 및/또는 조절 단백질의 재조합 렌티바이러스 벡터 입자의 게놈을 제공하는 것을 의미한다.
특정한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 (i) 포장 작제물, (ii) 외피 및 (iii) 전달 벡터 게놈을 제공하기 위해 별도의 플라스미드를 사용하여 수득되는 것을 특징으로 하는, 1-세대 벡터, 특히 HIV-기반의 1-세대 벡터로부터 구축된다. 대안으로, 렌티바이러스 벡터는 2-세대 벡터, 특히 추가로 바이러스 부속 단백질(HIV-1, Vif, Vpu, Vpr 또는 Nef의 경우에서와 같은)이 없고 따라서 단지 9개의 HIV 전체 유전자 중 4개 즉: gag, pol, tat 및 rev 만을 포함하는 HIV-기반 벡터의 2-세대 벡터로부터 구축된다. 다른 구현예에서, 벡터는 3-세대 벡터, 특히 상기 바이러스 부속 단백질이 더욱 결여되어 있고 또한 Tat-비의존적인 3-세대의 HIV-기반 벡터로부터 구축되고; 이러한 3-세대 벡터는 벡터가 HIV-1에 기반하는 경우 HIV의 Rev 단백질을 인코딩하는 하나의 플라스미드를 포함하여 벡터의 기능적 요소를 제공하기 위한 4개의 플라스미드를 사용하여 수득될 수 있다. 이러한 벡터 시스템은 HIV-1의 9개의 유전자들 중 단지 3개 만을 포함한다. 이러한 세대의 HIV-기반 벡터의 구조 및 설계는 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있다.
이러한 벡터의 세대들 중 임의의 세대에서, CD40L의 엑토도메인 또는 그의 수용체 결합 단편과 융합된 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 콜렉틴 스캐폴드의 벡터 골격에 삽입함으로써 본 발명에 따라 변형이 추가적으로 제공되어 APC, 특히 수지상 세포를 표적하고 활성화하고 면역원을 MHC-II 경로로 전달하고 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응 둘 모두를 유도하기 위해 활용되는 LV 벡터를 제공한다.
벡터 입자의 "벡터 게놈"은 또한 재조합 시퀀스로서 특히 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 병원체의 하나 이상의 항원성 폴리펩티드(들)를 포함하는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 대상의 폴리뉴클레오티드 또는 전이유전자를 포함하는 재조합 핵산이다. 렌티바이러스-기반 시퀀스 및 벡터 게놈의 폴리뉴클레오티드/전이유전자는 플라스미드 벡터에 의해 발생되며 따라서 "시퀀스 벡터"로도 불리우는 "전달 벡터"를 발생시킨다. 따라서, 이들 표현들은 본 상세한 설명에서 상호호환적으로 사용된다. 특정한 구현예에 따르면, 본 발명을 위해 제조된 벡터 게놈은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입되는 시퀀스 동정 번호 21의 군에서 선택되는 시퀀스를 갖는 핵산을 포함한다.
따라서 본 명세서에 정의되는 바와 같은 벡터 게놈은, 그의 발현을 위한 적절한 조절 시퀀스의 조절 하에 놓인 항원성 폴리펩티드(들)를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 소위 재조합 폴리뉴클레오티드(들)와는 별도로, 상기 게놈의 비-코딩 영역이고, DNA 또는 RNA 합성 및 처리를 위한 인식 신호를 제공하는 데 필요한 원래의 렌티바이러스 게놈(미니-바이러스 게놈)의 시퀀스를 포함한다. 이러한 시퀀스는 포장(ψ), 역전사(가능하게는 원래의 LTR에 대해 돌연변이된 LTR) 및 전사 그리고 임의선택적으로 편입(RRE)을 위해 그리고 추가로 본 발명의 특정한 목적을 위해 필요한 시스-작용 시퀀스(cis-acting sequence)이고, 이는 세포에서의 핵 수입 및 그에 따라 상기 세포에서의 전이유전자 전달 효율을 유리하게 하는 기능 시퀀스를 포함하고, 이 요소는 렌티바이러스 게놈 시퀀스 특히 HIV-1 또는 효모의 레트로요소와 같은 일부 레트로요소에 존재하는 소위 중심 cPPT-CTS 뉴클레오티드 도메인을 포함하거나 이로 이루어지는 DNA 플랩 요소로 설명된다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터를 제조하기 위해 사용되는 벡터 게놈의 구조 및 조성은 당해 기술분야에서 기술된 원리 및 문헌(Zennou et al, 2000; Firat H. et al, 2002; VandenDriessche T. et al)에 주로 기술된 그러한 렌티바이러스 벡터의 예에 기초한다. 이러한 형태의 작제물은 본 명세서에 언급될 것과 같은 CNCM(Institut Pasteur, France)에 기탁되었다. 이와 관련하여 국제공개 WO 99/55892, WO 01/27300 및 WO 01/27304에서 기탁된 생물학적 재료를 포함하는 상세한 설명에서도 언급된다.
본 발명의 특정한 구현예에 따르면, 벡터 게놈은 2개의 긴 말단 반복(LTR) 사이의 모든 바이러스 단백질 코딩 시퀀스가 본 명세서에서 기술되는 바와 같이 항원성 폴리펩티드(들)를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 대체된 대체 벡터일 수 있고, 여기에서 DNA-플랩 요소는 본 명세서에서 기술되는 필요한 시스-작용 시퀀스와 관련하여 재-삽입된다. 벡터 게놈의 조성과 관련한 추가의 특징들이 입자의 제조에 관하여 기술된다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 그의 게놈 하나 또는 하나 이상에 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특히, 상기 벡터 게놈은 게놈 상에서 연속적이거나 분리된 것이고 병원체의 동일하거나 별개의 항원 중의 어느 하나 또는 별개의 병원체들의 폴리펩티드를 인코딩하는 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 여러 구현예들에 따라 사용되는 렌티바이러스 벡터의 특정한 특징들이 또한 실시예들에서 기술되어 있으며, 이러한 특징들은 단독으로 또는 조합으로 취해져서 벡터를 생성한다.
본 발명에 따르면, 렌티바이러스 벡터 입자는 이종기원 바이러스 외피 단백질 또는 렌티바이러스 입자의 게놈의 렌티바이러스 시퀀스를 제공하는 렌티바이러스가 아닌 RNA 바이러스로부터 유래하는 외피의 바이러스 폴리단백질로 가성형태화 된다.
렌티바이러스 벡터의 제조를 위한 외피 단백질의 형태화의 예로서, 본 발명은 예를 들어 인디아나 균주의 VSV-G 단백질(들) 및 뉴저지 균주의 VSV-G 단백질(들)의 군에서 선택되는 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 바이러스 막관통 글리코실화(소위 G 단백질) 외피 단백질(들)에 관한 것이다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터를 가성형태화 하는 데 사용될 수 있는 VSV-G 단백질의 다른 예에는 특히 하기의 수포성바이러스 속(vesiculovirus genus)으로 분류되는 종들 중에서 선택될 수 있는 VSV-G 당단백질이 포함된다: 카라자스 바이러스(CJSV: Carajas virus), 찬디푸라 바이러스(CHPV: Chandipura virus), 코칼 바이러스(COCV: Cocal virus), 이스파한 바이러스(ISFV: Isfahan virus), 마라바 바이러스(MARAV: Maraba virus), 피리 바이러스(PIRYV: Piry virus), 베시큘라 스토마티티스 알라고아스 바이러스(VSAV: Vesicular stomatitis Alagoas virus), 베시큘라 스토마티티스 인디아나 바이러스(VSIV: Vesicular stomatitis Indiana virus) 및 베시큘라 스토마티티스 뉴저지 바이러스(VSNJV: Vesicular stomatitis New Jersey virus) 및/또는 그라스 카프 라브도바이러스(Grass carp rhabdovirus), BeAn 157575 바이러스(BeAn 157575), 보테케 바이러스(BTKV: Boteke virus), 칼차키 바이러스(CQIV: Calchaqui virus), 일 바이러스 아메리칸(EVA: Eel virus American), 그레이 롯지 바이러스(GLOV: Gray Lodge virus), 유로나 바이러스(JURV: Jurona virus), 클라마쓰 바이러스(KLAV: Klamath virus), 콰타 바이러스(KWAV: Kwatta virus), 라 조야 바이러스(LJV: La Joya virus), 말파이스 스프링 바이러스(MSPV: Malpais Spring virus), 마운트 엘곤 배트 바이러스(MEBV: Mount Elgon bat virus), 페리네트 바이러스(PERV: Perinet virus), 파이크 프라이 라브도바이러스(PFRV: Pike fry rhabdovirus), 포르톤 바이러스(PORV: Porton virus), 라디 바이러스(RADIV: Radi virus), 잉어 바이러스의 봄바이러스혈증(SVCV: Spring viremia of carp virus), 투파이아 바이러스(TUPV: Tupaia virus), 궤양성 질환 라브도바이러스(UDRV: Ulcerative disease rhabdovirus) 및 유그 복다노박 바이러스(YBV: Yug Bogdanovac virus)와 같이 잠정적으로 수포성바이러스 속으로 분류되는 균주들.
수포성 구내염 바이러스의 외피 당단백질(VSV-G)은 야생형 바이러스 입자의 표면 코팅으로서 기능하는 막관통 단백질이다. 이는 또한 조작된 렌티바이러스 벡터에 적합한 코팅 단백질이다. 현재, 9가지 바이러스 종들이 VSV 성별로 확정적으로 분류되고, 19가지 라브도바이러스가 잠정적으로 이러한 성별로 분류되고 있으며, 모두 다양한 정도의 교차-중화를 나타내고 있다. 염기서열을 분석하면, 단백질 G 유전자는 시퀀스 유사성을 나타낸다. VSV-G 단백질은 N-말단 엑토도메인, 막관통 영역 및 C-말단 세포질 꼬리를 제시한다. VSV-G 단백질은 후기-골지 망(trans-Golgi network)(소포체 및 골지체)을 통해 세포 표면으로 수출된다.
수포성 구내염 인디아나 바이러스(VSIV: Vesicular stomatitis Indiana virus) 및 수포성 구내염 뉴저지 바이러스(VSNJV: Vesicular stomatitis New Jersey virus)가 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 가성형태화 하거나 렌티바이러스 벡터를 가성형태화 하기 위한 재조합 외피 단백질(들)을 설계하는 데 바람직한 균주이다. 이러한 VSV-G 단백질은 GenBank에 공개되어 있고, GenBank에서 몇 가지 변종들이 제시된다. VSV-G 뉴저지 균주의 경우, 특히 승인 번호 V01214를 갖는 시퀀스가 참조된다. 인디아나 균주의 VSV-G의 경우, 균주 JO2428에 대응하는 Genbank에서의 승인 번호 AAA48370을 갖는 시퀀스가 참조된다.
상기 바이러스 외피 단백질(들)은 항원 제시 세포에 의한 흡수에 의해 그리고 구체적으로 융합 및/또는 내포 작용에 의한 간 수지상 세포에 의한 것을 포함하여 수지상 세포에 의해 흡수가 가능하다. 특정한 구현예에서, 흡수의 효율은 가성형태화를 위한 VSV의 외피를 선택하기 위한 특징으로서 사용될 수 있다. 이와 관련하여 형질도입의 상대적인 역가(수지상 세포 역가/다른 형질도입된 세포 예를 들어 293T 세포의 역가)가 시금석으로 고려될 수 있고 상대적으로 양호한 수지상 세포와 융합하는 능력을 갖는 외피가 선호될 것이다.
항원 제시 세포(APC) 및 특히 수지상 세포(DC)는 가성형태화 렌티바이러스 벡터에 대한 적절한 표적 세포이고 따라서 이는 면역 조성물로서 사용된다.
VSV-G 외피 단백질(들)은 상기 단백질(들)에 대한 코딩 시퀀스를 포함하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현되며, 이 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자의 제조를 위해 사용되는 플라스미드(지정 외피 발현 플라스미드 또는 가성형태화 외피 플라스미드(pseudotyping env plasmid))에 삽입된다. 외피 단백질(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코딩 시퀀스(임의선택적으로 전사-후 조절 요소(PRE) 특히 우드척 간염 바이러스의 요소 즉 Invitrogen으로부터 구할 수 있는 WPRE 시퀀스 또는 시퀀스 동정 번호 23에 규정되는 바와 같은 WPRE의 돌연변이 시퀀스를 포함)의 전사 및/또는 발현을 위한 조절 시퀀스의 조절 하에 놓인다.
따라서, 포유동물 세포, 특히 인간 세포에서 생체 내에서 사용하기에 적합한 내부 프로모터 및 상기 프로모터의 조절 하에서 외피 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다. 이러한 작제물을 포함하는 플라스미드가 벡터 입자의 제조에 적합한 세포의 형질감염을 위해 사용된다. 프로모터는 특히 구성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 유도 프로모터로서의 특징들로 선택될 수 있다. 적합한 프로모터의 예에는 하기의 유전자의 프로모터가 포함된다: MHC 클래스-I 프로모터, 인간 베타-2 마이크로글로불린 프로모터(β2M promoter), EF1α, 인간 PKG, PPI(인슐린전구물질), 티오덱스트린, HLA DR 불변 쇄(P33), HLA DR 알파 쇄, 페리틴 L 쇄(Ferritin L chain) 또는 페리틴 H 쇄, 키모신 베타 4(Chymosin beta 4), 키모신 베타 10, 시스타틴 리보솜 단백질 L41(Cystatin Ribosomal Protein L41), CMVie 또는 Jones S. et al(Jones S. et al Human Gene Therapy, 20:630-640(June 2009))에서 기술되는 GAG(CMV 초기 인핸서/치킨 β 액틴) 또는 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 베타-2m-CMV(BCUAG) 등과 같은 키메라 프로모터.
이러한 프로모터는 또한 외피치환 플라스미드로부터의 gag-pol 유도 단백질의 발현에 관여하고/하거나 전달 벡터로부터 항원성 폴리펩티드를 발현하기 위한 조절 발현 시퀀스에서 사용될 수 있다.
대안으로, 외피 발현 플라스미드가 안정적인 포장 세포주에서의 발현, 특히 연속적으로 발현되는 바이러스 입자와 같은 안정한 발현을 위한 것으로 의도되는 경우, 외피 단백질(들)을 발현시키기 위한 내부 프로모터는 유리하게는 Cockrell A.S. et al.(Mol. Biotechnol. (2007) 36:184-204)에 기술되는 것과 같은 유도 프로모터이다. 이러한 프로모터의 예로서, 테트라사이클린 및 엑디손 유도 프로모터가 참조된다. 포장 세포주는 STAR 포장 세포주(Cockrell A.S. et al (2007), Ikedia Y. et al (2003) Nature Biotechnol. 21: 569-572 참조) 또는 SODk1 및 SODk3을 포함하여 SODk0 유도 세포주와 같은 SODk 포장 세포주(Cockrell A.S. et al (2007), Cockrell A;S.et al (2006) Molecular Therapy, 14: 276-284, Xu K. et al. (2001), Kafri T. et al (1999) Journal of Virol. 73:576-584 참조)일 수 있다.
본 발명에 따르면, 렌티바이러스 벡터는 하기로의 포유동물 세포의 공동-형질감염으로부터 회수되는 생성물이다:
- (i) 포장, 역전사 및 전사에 필요한, 렌티바이러스의, 특히 HIV-1, 시스-활성 시퀀스를 포함하고, 이는 추가로 기능성 렌티바이러스의, 특히 HIV-1에서 파생되는, DNA 플랩 요소를 포함하며, 및 (ii) 그 자체가 그에 대해 조절 발현 시퀀스의 조절 하에 면역 반응이 추구되는 하나 이상의 병원체의 하나 이상의 항원성 폴리펩티드(들)를 포함하고, 임의선택적으로 숙주 세포의 게놈 내로의 편입(integration)을 위한 시퀀스를 포함하는, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드,를 포함하는, 벡터 플라스미드;
- RNA 바이러스에서 파생되는 가성형태화(pseudotyping) 외피를 인코딩하는 발현 플라스미드, 상기 발현 플라스미드는 가성형태화를 위한 외피 단백질 또는 단백질들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 상기 외피 가성형태화 단백질은 유리하게는 VSV로부터 생성되고 특히 인디아나 균주 또는 뉴저지 균주의 VSV-G임, 그리고
- 렌티바이러스의, 특히 HIV-1, 편입-가능 벡터 입자의 생산에 적합한 gag-pol 포장 시퀀스 또는 편입-결핍 벡터 입자의 생산에 적합한 변형된 gag-pol 포장 시퀀스,를 포함하는, 외피치환 플라스미드.
따라서, 본 발명은 또한 하기로 형질감염된 안정한 세포주로부터 회수되는 생성물인 위에서 기술되는 바와 같은 렌티바이러스 벡터 입자에 관한 것이다:
- (i) 포장, 역전사 및 전사에 필요한 렌티바이러스의, 특히 HIV-1, 시스-활성 시퀀스를 포함하고, 이는 추가로 렌티바이러스의, 특히 HIV-1, DNA 플랩 요소를 포함하며 및 임의선택적으로 편입을 위해 필요한 시스-활성 시퀀스를 포함하는 벡터 플라스미드, 상기 벡터 플라스미드는 추가로 (ii) 조절 발현 시퀀스, 특히 프로모터의 조절 하에, 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 하나 이상의 병원체의 하나 이상의 항원성 폴리펩티드(들)를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 뮤린 또는 인간에 대한 코돈-최적화 시퀀스의 폴리뉴클레오티드를 포함함;
- VSV-G 외피 단백질 특히 인디아나 균주 또는 뉴저지 균주의 VSV-G를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 VSV-G 외피 발현 플라스미드, 여기에서 상기 폴리뉴클레오티드는 조절 발현 시퀀스, 특히 프로모터를 포함하는 조절 발현 시퀀스의 조절 하에 있음, 그리고;
- 외피치환 플라스미드, 여기에서 외피치환 플라스미드는 렌티바이러스, 특히 HIV-1, 편입-가능 벡터 입자의 제조에 적합한 gag-pol 코딩 시퀀스 또는 편입-결핍 벡터 입자의 생산에 적합한 변형 gag-pol 코딩 시퀀스를 포함하고, 여기에서 상기 gag-pol 시퀀스는 DNA 플랩 요소로서 동일한 렌티바이러스 서브-패밀리(lentivirus sub-family)에서 유래하고, 여기에서 렌티바이러스 gag-pol 또는 변형 gag-pol 시퀀스는 조절 발현 시퀀스의 조절 하에 있음.
본 발명의 벡터 입자를 발현하는 안정한 세포주는 특히 플라스미드의 형질도입에 의해 수득된다.
폴리뉴클레오티드는 본 상세한 설명에서 기술되는 임의의 구현예에 따른 병원체의 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩한다. 특히, 폴리뉴클레오티드는 이러한 병원체의 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 절두된 포유동물, 특히 인간, 코돈-최적화 시퀀스인 폴리펩티드를 인코딩한다.
따라서, 벡터 플라스미드는 여러 항원성 폴리펩티드의 발현을 위한 하나 또는 여러 개의 발현 카세트를 포함할 수 있거나 폴리뉴클레오티드가 항원성 폴리펩티드(들)를 포함하고 임의선택적으로 추가의 여러 폴리펩티드들이 바이러스 기원의 IRES 시퀀스(내부 리보솜 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site))에 의해 분리되는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 바이-시스트론(bi-cistronic) 또는 멀티-시스트론 발현 카세트를 포함할 수 있거나, 벡터 플라스미드는 융합 단백질(들)을 인코딩할 수 있다.
벡터 게놈에 포함되고 병원체(전이유전자로서 또는 발현 카세트 내의)의 항원성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 내부 프로모터는 하기 유전자들의 프로모터로부터 선택될 수 있다: 인간 베타-2 마이크로글로불린 프로모터(β2M 프로모터) 또는 EF1α와 같은 MHC 클래스-I 프로모터, 인간 PKG, PPI(인슐린전구물질), 티오덱스트린, HLA DR 불변 쇄(P33), HLA DR 알파 쇄, 페리틴 L 쇄 또는 페리틴 H 쇄, 키모신 베타 4, 키모신 베타 10, 또는 시스타틴 리보솜 단백질 L41 CMVie 또는 Jones S. et al(2009))에서 기술되는 GAG(CMV 초기 인핸서/치킨 β 액틴) 또는 BCUAG와 같은 키메라 프로모터.
위에서 언급된 내부 프로모터들 중 하나의 프로모터는 또한 외피 단백질(들) 및 포장(gag-pol 유도) 단백질의 발현을 위해 선택될 수 있다.
하기의 특정한 구현예는 인간 렌티바이러스에 기초하여, 그리고 특별히 HIV-1 바이러스에 기초하여 렌티바이러스 벡터를 제조하는 경우에 실행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 렌티바이러스 벡터의 게놈은 인간 렌티바이러스로부터, 특히 HIV 렌티바이러스로부터 파생된다. 특히, 가성형태화 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 또는 HIV-2 기반 벡터와 같은 HIV-기반 벡터이고, 특히 HIV-1M, 예를 들어 BRU 또는 LAI 단리물에서 파생된다. 대안으로, 벡터 게놈에 필요한 시퀀스를 제공하는 렌티바이러스 벡터는 포유동물 세포를 형질도입할 수 있는 EIAV, CAEV, VISNA, FIV, BIV, SIV, HIV-2, HIV-O와 같은 렌티바이러스로부터 기원할 수 있다.
위에서 언급되는 바와 같이, 종국적으로 포함되는 재조합 폴리뉴클레오티드와는 별도로 고려하는 경우, 벡터 게놈은 원래의 렌티바이러스 게놈에서 2개의 긴 말단 반복들(LTRs) 사이의 핵산이 숙주 세포의 핵으로의 전이유전자의 효율적인 전달을 위한 것을 포함하여 DNA 또는 RNA 합성 및 처리를 위한 시스-작용 시퀀스로 제한되거나 생물학적 기능성 GAG 폴리단백질 및 가능하게는 POL 및 ENV 단백질을 포함하여 렌티바이러스 구조 단백질의 발현을 가능하게 할 수 있는 필수 핵산 세그먼트에 대해 결실되거나 돌연변이된 대체 벡터이다.
특정한 구현예에서, 렌티바이러스의 5' LTR 및 3' LTR 시퀀스가 벡터 게놈에 사용되지만, 적어도 3' LTR이 예를 들어 적어도 인핸서에 대해 결실되거나 부분적으로 결실될 수 있는 U3 영역에서 원래의 렌티바이러스의 3'LTR에 대해 변형된다(델타 U3). 5' LTR 또한 특히 예를 들어 Tat-비의존적 프로모터가 U3 내인성 프로모터에 대해 치환될 수 있는 그의 프로모터 영역에서 변형될 수 있다.
특정한 구현예에서 벡터 게놈은 Vif-부속 유전자, Vpr-부속 유전자, Vpu-부속 유전자 및 Nef-부속 유전자(HIV-1 렌티바이러스 벡터를 위한)에 대한 하나 또는 여러 개의 코딩 시퀀스를 포함한다. 대안으로, 이들 시퀀스들은 독립적으로 또는 서로 결실될 수 있거나 비-기능적일 수 있다(2-세대 렌티바이러스 벡터).
렌티바이러스 벡터 입자의 벡터 게놈은, 삽입된 시스-작용 단편으로서, DNA 플랩 요소로 이루어지거나 이러한 DNA 플랩 요소를 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정한 구현예에서, DNA 플랩은 항원성 폴리펩티드(들)를 운반하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 삽입되고 - 비록 필수적인 것은 아니지만 - 유리하게는 벡터 게놈 내 대략적인 중심 위치에 위치된다. 본 발명에 적합한 DNA 플랩은 레트로바이러스, 특히 렌티바이러스, 특히 인간 렌티바이러스, 특별히 HIV-1 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포존과 같은 레트로바이러스-유사 유기체로부터 수득될 수 있다. 이는 달리 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV: Caprine Arthritis Encephalitis Virus), 말 감염 빈혈 바이러스(EIAV: Equine Infectious Anaemia Virus), VISNA 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV: Simian Immunodeficiency Virus) 또는 고양이 면역결핍 바이러스(FIV: Feline Immunodeficiency Virus)에서 수득될 수 있다. DNA 플랩은 합성으로(화학적 합성) 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의하는 것과 같이 위에서 정의된 바와 같은 적절한 공급원으로부터 DNA 플랩을 제공하는 DNA의 증폭에 의해 제조될 수 있다. 보다 바람직한 구현예에서, DNA 플랩은 HIV-1 또는 HIV-2 두 가지 유형의 임의의 단리물을 포함하여 HIV 레트로바이러스, 예를 들어 HIV-1 또는 HIV-2 바이러스로부터 수득된다.
DNA 플랩(cPPT/CTS로도 지정됨)(Zennou V. et al. ref 27, 2000, Cell vol 101, 173-185 또는 WO 99/55892 및 WO 01/27304에서 정의됨)은 특히 HIV 역전사 동안 정상적으로 합성되는 3-가닥의 DNA 구조를 생성하는 일부 렌티바이러스의 게놈에서 특히 HIV에서 중심이고 HIV 게놈 핵 수입의 시스-결정인자로서 작용하는 구조이다. DNA 플랩은 cis에서 역전사 동안 중앙 폴리퓨린관(cPPT: central polypurine tract) 및 중앙 종단 시퀀스(CTS: central termination sequence)에 의해 조절되는 중앙 가닥 변위 이벤트를 가능하게 한다. 렌티바이러스-유래 벡터에 삽입되는 경우, 역-전사 동안 DNA 플랩 생산을 가능하게 하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 전달 효율을 자극하고 핵 수입 수준을 야생형 수준으로 보완한다(Zennou et al., Cell, 2000 Cell vol 101, 173-185 또는 WO 99/55892 및 WO 01/27304).
DNA 플랩의 시퀀스는 종래 기술, 특히 위에서 언급된 특허원들에서 개시된 바 있다. 이러한 시퀀스는 또한 본 명세서에 기술된 pTRIP 벡터의 시퀀스에 개시된다. 이러한 시퀀스는 바람직하게는 상기 벡터 게놈의 중심 근처에 있는 위치에서 임의선택적으로 추가의 측면 시퀀스와 함께 단편으로서 바람직하게 삽입된다. 대안으로, 이러한 시퀀스는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)의 발현을 조절하는 프로모터의 상류 가까이에 삽입될 수 있다. 벡터 게놈에 삽입된 DNA 플랩을 포함하는 상기 단편은 그 기원 및 제조에 따라 약 80 내지 약 200 bp의 시퀀스를 가질 수 있다.
특정한 구현예에 따르면, DNA 플랩은 약 90 내지 약 140개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는다.
HIV-1에서, DNA 플랩은 안정한 99개-뉴클레오티드-길이 플러스 가닥 중첩이다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 벡터 게놈에 사용되는 경우, 특히 PCR 단편으로 제조되는 경우, 보다 더 긴 시퀀스로 삽입될 수 있다. DNA 플랩을 제공하는 구조를 포함하는 특히 적절한 폴리뉴클레오티드는 HIV-1 DNA의 cPPT 및 CTS 영역을 포함하는 124개-염기쌍 중합효소 연쇄 반응(PCR) 단편이다.
벡터 게놈 및 GAG 및 POL 폴리단백질을 인코딩하는 외피치환 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 사용되는 DNA 플랩이 동일한 렌티바이러스 서브-패밀리 또는 동일한 레트로바이러스-유사 유기체에서 유래해야 한다는 것이 명시된다.
바람직하게는, 벡터 게놈의 다른 시스-활성화 시퀀스 또한 DNA 플랩을 제공하는 것과 동일한 렌티바이러스 또는 레트로바이러스-유사 유기체로부터 유래한다.
벡터 게놈은 재조합 폴리뉴클레오티드를 복제하기 위한 하나 또는 여러 개의 고유 제한 부위를 추가로 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 벡터 게놈에서, 렌티바이러스 벡터 게놈의 3' LTR 시퀀스는 적어도 활성화제(인핸서) 및 U3 영역의 프로모터가 박탈된 것이다. 다른 특정한 구현예에서, 3' LTR 영역은 U3 영역에서 박탈된다(델타 U3). 이와 관련하여, WO 01/27300 및 WO 01/27304의 상세한 설명이 참조된다.
특정한 구현예에서, 벡터 게놈에서, LTR 5'의 U3 영역은 비-렌티바이러스 U3 또는 tat-비의존적 1차 전사를 구동하기에 적합한 프로모터로 대체된다. 이러한 경우, 벡터는 tat 트랜스작용인자(tat transactivator)(3세대 벡터)에 비의존적이다.
벡터 게놈은 또한 프사이(ψ) 포장 신호를 포함한다. 포장 신호는 gag ORF의 N-말단 단편에서 파생된다. 특정한 구현예에서, gag 펩티드의 가능한 전사/번역과 전이유전자의 어떠한 간섭도 방지하기 위해 구조전환 돌연변이(들)에 의해 gag 펩티드의 시퀀스가 변형될 수 있다.
벡터 게놈은 또한 임의선택적으로 스플라이스 공여자 사이트(SD: splice donor site), 스플라이스 수신자 사이트(SA: splice acceptor site) 및 Rev-응답 요소(RRE: Rev-responsive element) 중에서 선택되는 요소를 포함할 수 있다.
특정한 구현예에 따르면, 벡터 플라스미드(또는 추가된 벡터 게놈)는 유전자변형 발현 카세트에 대한 하기의 시스-작용 시퀀스를 포함한다:
1. 역전사에 필요한 LTR 시퀀스(긴-말단 반복), 전사에 필요한 시퀀스 및 임의선택적으로 바이러스 DNA 편입을 위한 시퀀스를 포함. 3' LTR은 하기 두 가지 주요 이유들로, 유전자 전달을 위해 필요한 기능을 방해함이 없이, 적어도 프로모터가 SIN 벡터를 제공하도록 U3 영역에서 박탈된다(자가-비활성화): 먼저, 숙주 유전자의 트랜스-활성화를 회피하기 위해, 일단 DNA가 게놈에 편입되면, 두 번째로 역전사 이후 바이러스 시스-시퀀스(cis-sequences)의 자가-비활성화를 허용한다. 임의선택적으로, 게놈의 전사를 촉진하는 5'-LTR의 tat-의존적 U3 시퀀스는 비 내인성 프로모터 시퀀스로 대체된다. 따라서, 표적 세포에서는 단지 내부 프로모터의 시퀀스만 전사될 것이다(전이유전자).
2. 바이러스 RNA 외피치환을 위한 ψ 영역.
3. Rev 단백질의 결합 후 핵으로부터 세포질로의 바이러스 메신저 RNA의 수출을 허용하는 RRE 시퀀스(REV 응답 요소).
4. 핵 수입을 용이하게 하는 DNA 플랩 요소(cPPT/CTS).
5. 임의선택적으로 전사-후 조절 요소, 특히 mRNA의 안정성(Zufferey et al., 1999)을 최적화하기 위해 면역글로불린-카파 유전자(Park F. et al Mol Ther 2001; 4: 164-173)와 같은 매트릭스 또는 스캐폴드 부착 영역(SAR 및 MAR 시퀀스) 또한 첨가된 WPRE cis-활성 시퀀스(우드척 간염 B형 바이러스 전사-후 요소)와 같은, 수지상 세포에서 융합 폴리펩티드 및/또는 항원성 폴리펩티드의 발현을 개선하는 요소.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 비-복제(복제-불능)이고 즉, 벡터 및 렌티바이러스 벡터 게놈이 복제 가능 렌티바이러스에 관련되는 우려를 완화하기에 적합한 것으로 간주되며, 특히 투여 후 감염된 숙주에서 싹트는 신생 입자를 형성할 수 없다. 이는 gag, pol 또는 env 유전자의 렌티바이러스 게놈의 부재 또는 "기능 유전자"로서의 이들의 부재의 결과로서 충분히-공지된 방법으로 달성될 수 있다. 따라서 gag 및 pol 유전자는 트랜스(trans)에서만 제공된다. 이는 또한 입자 형성에 필요한 다른 바이러스 코딩 시퀀스(들) 및/또는 시스-작용 유전 요소를 탈락시킴으로써 달성될 수 있다.
"기능적(functional)"에 대해서는 이는 정확하게 전사되고/되거나 정확하게 발현되는 유전자를 의미한다. 따라서, 본 구현예에서 본 발명의 렌티바이러스 벡터 게놈에 존재하는 경우, gag, pol 또는 env의 시퀀스가 개별적으로 전사되지 않거나 불완전하게 전사되고; 표현 "불완전하게 전사된(incompletely transcribed)"은 전사체들 gag, gag-pro 또는 gag-pro-pol에서의 변경을 의미하며, 이들 중의 하나 또는 여러 개는 전사되지 않는다. 이러한 상태를 달성할 수 있도록 렌티바이러스 복제에 관여하는 다른 시퀀스들 또한 벡터 게놈에서 돌연변이된다. 렌티바이러스 벡터의 복제의 부재는 렌티바이러스 게놈의 복제와 구별되어야 한다. 실제로, 이전에 기술된 바와 같이, 렌티바이러스 게놈은 벡터 입자의 복제를 보장하지 않고도 렌티바이러스 벡터 게놈의 복제를 보장하는 복제 기원을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터를 수득하기 위해서는, 벡터 게놈(벡터 플라스미드로서)이 입자 또는 가성-입자로 외피치환되어야 한다. 따라서, 외피 단백질을 제외하고, 렌티바이러스 단백질은, 생산 시스템에서, 특히 세포를 생산함에 있어서 gag 유전자 및 pol 렌티바이러스 유전자 또는 편입-불능 pol 유전자 중의 어느 하나를 운반하며, 바람직하게는 Vif-부속 유전자, Vpr-부속 유전자, Vpu-부속 유전자 및 Nef-부속 유전자에 대한 코딩 시퀀스들 중의 일부 또는 전부를 결여하고 임의선택적으로 Tat(HIV-1 렌티바이러스에 대해)를 결여하는 적어도 하나의 외피치환 플라스미드에 의존하는 벡터 게놈과 함께 벡터 게놈에 트랜스로(in trans)로 제공되어야 한다.
렌티바이러스 벡터 입자를 가성형태화 하기 위해 선택되는 외피 가성형태화 단백질(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 추가의 플라스미드가 사용된다.
바람직한 구현예에서, 포장 플라스미드는 바이러스 입자 합성에 필수적인 렌티바이러스 단백질 만을 인코딩한다. 따라서 플라스미드가 존재함으로써 안전 문제를 야기할 수 있는 부속 유전자가 제거된다. 따라서, 포장을 위해 트랜스로 반입되는 바이러스 단백질은 HIV-1에서 유래하는 것들에 대해 각각 설명된 바와 같다:
1. 매트릭스의 구축을 위한 GAG 단백질(MA, 겉보기 분자량 p17을 가짐), 캡시드(CA, p24) 및 뉴클레오캡시드(NC, p6).
2. POL 인코딩 효소: 인테그라아제, 프로테아제 및 역전사 효소.
3. TAT가 LTR-매개 전사의 개시를 위해 필요한 경우, TAT 및 REV 조절 단백질; 5'LTR의 U3 영역이 tat-비의존적 전사를 구동하는 프로모터로 치환되는 경우 TAT 발현이 생략될 수 있다. REV가 변형되고 따라서 예를 들어 벡터 게놈에서 RRE 시퀀스를 대체하는 도메인의 인식을 가능하게 하는 재조합 단백질에서 사용되거나 그의 RBD(RNA 결합 도메인)RRE 시퀀스에 결합할 수 있는 조각으로서 사용될 수 있다.
바이러스 입자의 포장 플라스미드에 포함되는 유전자로부터 생성되는 mRNA의 어떠한 포장도 피하기 위해, ψ 영역이 포장 플라스미드에서 제거된다. 재조합 문제를 피하기 위해 이종기원 프로모터가 플라스미드에 삽입되고 폴리-A 꼬리가 단백질을 인코딩하는 시퀀스로부터 3'에 추가된다. 적절한 프로모터가 위에 기술되었다.
외피 플라스미드는 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 내부 프로모터의 조절 하에 본 명세서에서 기술되는 가성형태화 하기 위한 외피 단백질(들)을 인코딩한다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자의 제조를 위한 기재된 플라스미드들 중 어느 하나 또는 전부는 단백질을 인코딩하는 세그먼트에서 코돈 최적화(CO)될 수 있다. 본 발명에 따른 코돈 최적화는 바람직하게는 포유동물 세포, 뮤린 또는 특히 인간 세포에서 플라스미드에 포함되는 코딩 시퀀스의 번역을 향상시키기 위해 수행된다. 본 발명에 따르면, 코돈 최적화는 특히 벡터 입자의 준비를 직접적으로 또는 간접적으로 개선하거나, 또는 벡터 입자가 투여되는 숙주의 세포에 의한 흡수를 향상시키거나, 또는 숙주의 형질도입된 세포의 게놈에서 항원성 폴리펩티드(전이유전자)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전달의 효율을 개선하는 데 적합하다. 코돈을 최적화하기 위한 방법은 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있고 코돈 최적화는 특히 그러한 효과를 위해 획득가능한 프로그램을 사용하여 수행된다. 실시예에서 사용된 코딩 시퀀스에 대해 코돈 최적화가 설명된다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 가성형태화된 렌티바이러스는 또한, 또는 대안으로, 편입-가능하고, 따라서 형질도입된 세포의 또는 렌티바이러스가 투여된 숙주의 세포 내의 게놈 내로의 벡터 게놈 또는 렌티바이러스를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 편입을 가능하게 한다.
본 발명의 다른 특정한 구현예에서, 가성형태화 렌티바이러스 벡터는 또한, 또는 대안으로, 편입-불능이다. 이러한 경우, 벡터 게놈과 따라서 벡터 게놈을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 형질도입된 세포의 또는 폴리뉴클레오티드가 투여된 숙주의 세포 내의 게놈 내로 편입되지 않는다.
본 발명은 발현된 인테그라아제 단백질에 결함이 있고 특히 면역원성 조성물 내에 병원체의 에피토프(들)를 운반하는 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 특별히 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 렌티라이러스 벡터의 용도에 관한 것이다.
"편입-불능(integration-incompetent)"에 대해서는, 이는 특히 렌티바이러스 기원의 인테그라아제가 숙주 세포의 게놈 내로의 렌티바이러스 게놈을 편입하는 능력 즉, 인테그라아제 활성을 특이적으로 변경하도록 돌연변이된 인테그라아제 단백질이 박탈된 것을 의미한다.
인테그라아제를 인코딩하는 pol 유전자를 변형시켜 편입 결핍 인테그라아제를 생성시킴으로써 편입-불능 렌티바이러스 벡터가 수득되고, 상기 변형된 pol 유전자는 외피치환 플라스미드에 포함된다. 이러한 편입-불능 렌티바이러스 벡터는 국제공개 WO 2006/010834에 기술되었다. 따라서 단백질의 인테그라아제 능력은 변경되는 데 반해 GAG, PRO 및 POL 단백질의 외피치환 플라스미드로부터의 정확한 발현 및/또는 캡시드 및 그에 따른 벡터 입자의 형성과 마찬가지로 역전사, 핵 수입과 같은 편입 단계에 선행하거나 후행하는 바이러스 사이클의 다른 단계들은 온전하게 남는다. 편입 단계가 대응하는 야생-형 인테그라아제를 포함하는 렌티바이러스 벡터와 비교할 때 1 내지 1000 미만, 바람직하게는 1 내지 10000 미만으로 발생하는 방식으로 가능해야 하는 편입이 변경되는 경우 인테그라아제가 결함이 있다고 한다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 결함 인테그라아제는 결함 인테그라아제의 발현의 요건을 충족하는 클래스 1, 바람직하게는 아미노산 치환(하나의 아미노산의 치환) 또는 짧은 결실의 돌연변이의 결과이다. 돌연변이는 pol 유전자 내에서 실행된다. 이러한 벡터는 효소의 촉매 영역에서 돌연변이 D64V와 함께 결함 인테그라아제를 운반할 수 있으며, 이는 특히 편입 단계의 DNA 절단 및 결합을 차단한다. D64V 돌연변이는 가성형태 HIV-1의 편입을 야생 형의 1/10,000까지 감소시키나, 비-분열 세포를 형질도입하는 능력을 유지하여 효율적인 전이유전자 발현을 허용한다.
HIV-1의 인테그라아제의 인테그라아제 능력에 영향을 주기에 적합한 pol 유전자에서의 다른 돌연변이들로는 하기들이 있다: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D116I, D116A, N120G, N120I, N120E, E152G, E152A, D-35-E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199C, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A 및 K264H.
특정한 구현예에서, pol 유전자의 돌연변이는 단백질의 촉매 부위 내에 있는 하기의 포지션들 D64, D116 또는 E152 중 어느 하나 또는 이들 포지션들 중 몇 개에서 수행된다. 위에서 기술된 것들을 포함하여 이들 위치들에서의 어떠한 치환도 적합하다.
다른 제안된 치환은 아미노산 잔기 RRK(포지션 262 내지 264)를 아미노산 잔기 AAH로의 대체이다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터가 편입-불능인 경우, 렌티바이러스는 복제 기원의 시퀀스가 렌티바이러스가 발현되어야 하는 세포의 속성에 의존적인 복제 기원(ori)을 추가로 포함한다. 상기 복제 기원은 진핵생물 기원, 바람직하게는 포유동물 기원, 가장 바람직하게는 인간 기원일 수 있다. 대안으로 복제 기원은 특히 SV40 또는 RPS와 같은 원형 에피솜 바이러스에서 오는 바이러스 기원일 수 있다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 렌티바이러스 게놈에 기원하거나 삽입된 복제물을 갖는 것이 본 발명의 유리한 구현예이다. 실제로, 렌티바이러스 게놈이 숙주 세포 게놈 내로 편입되지 않는 경우(결함 인테그라아제로 인해), 렌티바이러스 게놈은 빈번한 세포 분열을 진행하는 세포에서 손실되고; 이는 특히 B 또는 T 세포와 같은 면역 세포에서 특히 그러하다. 복제 기원의 존재는, 심지어 세포 분열 이후에도, 각 세포에서 적어도 하나의 렌티바이러스 게놈이 존재하고, 따라서 면역 반응의 효율을 극대화하는 것을 보장한다.
본 발명의 상기 렌티바이러스 벡터의 렌티바이러스 벡터 게놈은 1999년 10월 11일자로 번호 I-2330으로 CNCM(Paris, France)에 기탁된 HIV-1 플라스미드 pTRIPΔU3.CMV-GFP(또한 WO01/27300에 기술됨) 또는 그의 변종으로부터 파생될 수 있다. 본 발명의 상기 렌티바이러스 벡터의 렌티바이러스 벡터 게놈은 또한 2021년 2월 16일자로 번호 CNCM I-5657로 CNCM(Paris, France)에 기탁된 HIV-1 플라스미드 pFlap-SP1beta2m-GFP-WPREm 또는 그의 변종으로부터 파생될 수 있다.
벡터 게놈이 이러한 특정 플라스미드로부터 파생되는 경우, 특히 본원에서 기술되는 바와 같은 병원체의 항원성 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 시퀀스가 GFP 코딩 단편에 추가로 또는 이를 대체하여 벡터 게놈에 삽입된다. CMV 프로모터는 또한 전이유전자의 발현과 관련하여 다른 프로모터, 특히 위에서 기술되는 프로모터들 중의 하나로 대체될 수 있다.
또한 특정한 기탁된 벡터에 포함된 WPRE 시퀀스가 임의선택적으로 결실될 수 있다.
벡터 입자는 상기 플라스미드에 의한 적절한 세포(포유동물 세포 또는 293 T 세포로 예시된 인간 배아 신장 세포와 같은 인간 세포와 같은)의 형질감염 이후 또는 다른 과정에 의해 생성될 수 있다. 렌티바이러스 입자의 발현을 위해 사용되는 세포에서, 플라스미드의 전부 또는 일부는 플라스미드의 코딩 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 발현시키기 위해 또는 플라스미드의 코딩 폴리뉴클레오티드를 일시적으로 또는 준-안정적으로 발현시키기 위해 사용될 수 있다.
생산된 입자의 농도는 세포 상청액의 P24(HIV-1에 대해서는 캡시드 단백질) 함량을 측정함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는, 일단 숙주에 투여되면, 가성형태화된 외피 단백질에 따라 숙주의 세포, 가능하게는 특정한 세포를 감염시킨다. 감염은 역-전사가 일어나는 숙주 세포의 세포질 내로의 렌티바이러스 벡터 게놈의 방출을 야기한다. 일단 삼중항체 형태(DNA 플랩을 통해)로, 렌티바이러스 벡터 게놈이 핵 내로 수입되고, 여기에서 병원체의 항원(들)의 폴리펩티드(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)이 세포 기계를 통해 발현된다. 미-분열 세포(수지상 세포와 같은)가 형질도입되는 경우, 발현은 안정적일 수 있다. B 세포와 같은 분열 세포가 형질도입되는 경우, 핵산 희석 및 세포 분열로 인하여 렌티바이러스 게놈 내의 복제 기원이 없는 상태에서 발현은 일시적이다. 세포 분열 후 렌티바이러스 벡터 게놈의 딸 세포 내로의 적절한 확산을 보장하는 복제 기원을 제공함으로써 발현이 보다 더 길어질 수 있다. 벡터 게놈에의 MAR(매트릭스 연합 영역) 또는 SAR(스캐폴드 연합 영역) 요소의 삽입에 의해 안정성 및/또는 발현이 증가될 수 있다.
실제로, 이러한 SAR 또는 MAR 영역은 AT-풍부 시퀀스이고 렌티바이러스를 세포 염색체의 매트릭스에 렌티바이러스를 고정할 수 있게 하고, 따라서 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하고, 특히 전이유전자의 유전자 발현을 자극하고 염색질 접근성을 개선한다.
렌티바이러스 게놈이 비-편입적인 경우, 렌티바이러스 게놈은 숙주 세포 게놈 내로 편입되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 전이유전자에 의해 인코딩된 적어도 하나의 폴리펩티드는 충분히 발현되고 처리되기에 충분히 길고, MHC 분자와 연관되어 있고 마지막으로 세포 표면으로 지향된다. 병원체의 항원성 폴리펩티드(들)의 속성에 따라, MHC 분자와 연관된 적어도 하나의 폴리펩티드 에피토프는 세포 면역 반응을 촉발한다.
달리 언급되지 않는 한, 또는 기술적으로 관련이 없는 한, 특히 외피 단백질(들) 또는 재조합 폴리뉴클레오티드와 관련하여 렌티바이러스 입자의 구조 또는 용도의 여러 특징들, 구현예들 또는 실시예들과 관련하여 본원에서 개시된 특성은 임의의 가능한 조합들에 따라 조합될 수 있다.
본 발명은 추가로 적어도 하기들을 포함하는, 포유동물 숙주에의 분리 투여를 위한 화합물의 조합에 관한 것이다.
(i) 제1 결정 이종기원 바이러스 외피 가성형태화 단백질 또는 바이러스 외피 가성형태화 단백질로 가성형태화된 본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자; 이러한 제1 가성형태화 단백질은 VSV의 뉴저지 균주에서유래할 수 있음;
(ii) (i)의 렌티바이러스 벡터 입자와 별개로 제공되는, 상기 제1 이종기원 바이러스 외피 가성형태화 단백질(들)과 구별되는 제2 결정 이종기원 바이러스 외피 가성형태화 단백질 또는 바이러스 외피 가성형태화 단백질로 가성형태화되는 본 발명의 렌티바이러스 벡터 입자; 이러한 제2 가성형태화 단백질은 VSV의 인디아나 균주에서유래할 수 있음.
본 발명의 다른 구현예에서, 가능하게는 위에서 기술되는 핵산의 대안의 형태와의 조합으로, 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구조적으로 변형되고/되거나 화학적으로 변형된다. 폴리뉴클레오티드의 예시는 5' 영역에 코작 공통 시퀀스(Kozak consensus sequence)를 포함한다. 벡터 게놈 내에 존재할 수 있는 렌티바이러스 기원이 아닌 다른 핵산 시퀀스로는 폴리펩티드 합성을 개시하기에 적합한 IRES 시퀀스(들)(내부 리보솜 진입 부위) 생산된 RNA를 안정화시키기 위한 전사-후 조절 요소로서 WPRE 시퀀스가 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 복수의 이종기원 폴리펩티드가 하나의 벡터 게놈에 의해 인코딩되는 경우, 코딩 시퀀스는 핵산-기반 분자 또는 비-핵산-기반 분자인 링커 성분에 의해 임의선택적으로 분리될 수 있다. 이러한 분자는 연결되어야 하는 3' 기능화 핵산을 인식하는 것을 목표로 하는 기능화된 링커 분자일 수 있다. 링커로서 기능하기에 적합한 시퀀스는 2A 펩티드와 같은 자가-절단 펩티드를 인코딩하는 핵산일 수 있다.
상기된 실시형태들에서 사용된 특징들을 포함하여 본 발명의 추가의 특징들과 성질들이 다음의 예들과 도면들에서 기술될 것이며 이에 따라 본 발명을 특징짓는데 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
시퀀스 동정 번호 1: M40-H 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 2: M40-H DNA 시퀀스
시퀀스 동정 번호 3: M40-HA 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 4: M40-HA DNA 시퀀스
시퀀스 동정 번호 5: M40-HAP 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 6: M40-HAP DNA 시퀀스
시퀀스 동정 번호 7: M40-HAPE 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 8: M40-HAPE DNA 시퀀스
시퀀스 동정 번호 9: S40-H 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 10: S40-H DNA 시퀀스
시퀀스 동정 번호 11: S40-HAPE 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 12: S40-HAPE DNA 시퀀스
시퀀스 동정 번호 13: S40-HAPEHR 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 14: S40-HAPEHR DNA 시퀀스
시퀀스 동정 번호 15: S40-HAPEHR-20 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 16: S40-HAPEHR-20 DNA 시퀀스
시퀀스 동정 번호 17: 인간 만노스-결합 단백질(UniProtKB - P11226), 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 18: 인간 허파 계면활성제-연관 단백질(UniProtKB - P35247), 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 19: 엑토도메인 CD40L115-260의 인간 동족체 (UniProtKB - P29965), 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 20: CCL20 단편 28-97의 인간 동족체 (UniprotKB - P78556), 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 21: 작제물을 서브클로닝하는데 사용되는 pTRIP 벡터 (pFlapDeltaU3 kpnI to AscI (프로모터 없음, 전이유전자 및 WPRE 없음)
시퀀스 동정 번호 22: BCUAG 프로모터
시퀀스 동정 번호 23: 돌연변이 WPRE
시퀀스 동정 번호 24: hSPD40-ESXH 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 25: Hrp-1:77-91 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 26: RpfD:57-71 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 27: RpfD:87-101 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 28: pFLAP 플라스미드에 특이적 순방향 프라이머
시퀀스 동정 번호 29: pFLAP 플라스미드에 특이적 역방향 프라이머
시퀀스 동정 번호 30: 숙주 자가보유 유전자 gadph에 특이적 순방향 프라이머
시퀀스 동정 번호 31: 숙주 자가보유 유전자 gadph에 특이적 역방향 프라이머
시퀀스 동정 번호 32: Inf 클러스터의 시퀀스
시퀀스 동정 번호 33: 링커 모티프
시퀀스 동정 번호 34: human CL-L1 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 35: human SP-A1 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 36: human SP-A2 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 37: human CL-P1 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 38: human CL-K1 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 39: EsxA 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 40: EspC 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 41: EsxH 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 42: PE19 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 43: Hrp1 아미노산 시퀀스
시퀀스 동정 번호 44: RpfD 아미노산 시퀀스
도 1. MBL 또는 SPD 콜렉틴 폴리머의 도식 구조. (a) MBL 또는 SPD의 구조 도메인. CRD = 탄수화물-인식 도메인. (b) 체인 간 시스테인 결합에 의해 형성되는 MBL 또는 SPD 자가-조립, 콜라겐-유사 3중 헬릭스. (c) SPD 십자-형 12량체. (d) SPD 또는 MBL "튤립-부케(tulip-bouquet)" 18량체. 개작됨34. (E 내지 F) 선택된 Mtb 항원을 수용하는 설계된 M40(E) 또는 S40(F)의 도식된 1차 구조 모노머. 가교화 영역(S), 콜라겐-유사 영역(Coll), 목 영역(N).
도 2. MHC-I 및 MHC-II 경로에 의한 항원 제시의 유도에서의 LV::M40의 특성. (a) BCUAG 프로모터의 전사 조절 하에서, BALB/c(H-2d) 또는 C57BL/6(H-2b) 마우스로부터의 BM-DC가 LV::M40-H, LV::M40-HA, LV::M40-HAP 또는 LV::M40-HAPE로 형질도입되었다(감염다중도(MOI) = 20). 대조 세포를 LV::EsxH 단독으로 형질도입되었다. (b) BALB/c 또는 C57BL/6 마우스로부터의 BM-DC를 표시된 LV 각각에 의해 48시간 동안 형질도입된(MOI = 20) HEK-293T 세포의 상청액의 연속적인 희석물과 함께 배양하였다. (c) LV의 첨가 3일 후에, 또는 HEK-293T 세포 상청액 또는 펩티드와 함께 배양 1일 후에, 수지상 세포에 의한 EsxH, EsxA, PE19 또는 EspC 마이코박테리아 항원의 MHC-I-제한 에피토프 또는 MHC-II-제한 에피토프의 제시를 이들의 EsxH:20-28에 대해 특이적인 T-세포 하이브리도마와의 공동-배양으로 평가하였다(YB8 세포주, Kd에 의해 제한됨), EsxH:74-88(1G1 세포주, I-Ad에 의해 제한됨), EsxA:1-20(NB11 세포주, I-Ab에 의해 제한됨), PE:19:1-18(IF6 세포주, I-Ab에 의해 제한됨) 또는 EspC:45:54(IF1 세포주, I-Ab에 의해 제한됨). (d) BALB/c 또는 C57BL/6 마우스로부터의 BM-DC를 표시된 LV 각각에 의해 48시간 동안 형질도입된(MOI = 20) HEK-293T 세포의 상청액의 연속적인 희석물과 함께 배양하였다. 결과는 공동-배양의 시작 24시간 후 T-세포 하이브리도마에 의해 생산된 IL-2의 농도이었다. 공동-배양 상청액에서 생산된 IL-2의 양은 수지상 세포 및 T 세포 수용체(TCR) 촉발에 의한 항원 제시의 효능에 비례한다.
도 3. M40 또는 S40에 의해 유도된 수지상 세포의 표현형의 성숙. (a 내지 b) 양성 대조로서, 5의 MOI로 Mtb로 감염되거나, LV::EsxH 단독(H = Ctrl), LV::M40-H 또는 LV::S40-H로 형질도입된(MOI = 20) HEK-293T 세포로부터의 상청액과 함께 배양된 C57BL/6 마우스로부터의 BM-DC의 표현형의 성숙. 공동-자극 또는 MHC 분자의 발현을 감염 24시간 후 CD11b+ CD11c+ 세포에 대한 세포측정법으로 평가하였다. (b) CD40 또는 CD80 표면 발현의 평균 형광 강도(MFI: Mean Fluorescence Intensity) 또는 CD86hi, MHC-Ihi 또는 MHC-IIhi 수지상 세포의 백분율을 요약한 히트맵.
도 4. M40-H를 위한 LV 인코딩의 T-세포 면역원성. (a) β2m, CMV 또는 BCUAG 프로모터를 수용하는 LV::M40-H 1 Х 108 TU/마우스로 피하 면역화된, 개별 BALB/c 마우스(n = 3)의 비장에서의 면역-후 13일차에서 ELISPOT에 의해 평가된 바와 같은 IFN-γ-생성 또는 TNF-α-생성 CD8+(상부) 또는 CD4+(하부) T-세포 반응. 비장세포의 EsxH:20-28(상부) 또는 EsxH:74-88(하부) 합성 펩티드로의 시험관 내 자극 후 반점 형성 세포(SFC: Spot Forming Cell)의 빈도를 결정하였다. 2개의 꼬리 값과 95% 신뢰도를 갖는 중위수를 나타내었다. 다양한 군들 간의 양적 차이는 통계학적으로 유의미하지 않았다(비-모수 Mann & Whitney 검정, p < 0.05). (b) TNF-α 및/또는 IL-2를 발현하는 CD4+ 또는 CD8+ T 비장세포 및 대표 IFN-γ+ 또는 IFN-γ- CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 세포측정 게이팅 전략. (c) β2m, CMV 또는 BCUAG 프로모터를 보유하는 LV::M40-H로 면역화된 마우스로부터의 CD8+ 또는 CD4+ T-세포 모집단 내 각 기능 하위 집합의 요약 백분율. 평균 +/- 표준편차를 나타내었으며 다양한 군들 간의 양적 차이는 통계학적으로 유의미하지 않았다(비-모수 Mann & Whitney 검정, p < 0.05).
도 5. 다-항원성 LV::M40-HAPE의 면역원성. (a) β2m, CMV 또는 BCUAG 프로모터를 수용하는 LV::M40-HAPE 1 Х 108 TU/마우스로 피하 면역화된, 개별 C57BL/6 마우스(n = 3)의 비장에서의 면역-후 14일차에서 ELISPOT에 의해 평가된 바와 같은 IFN-γ T-세포 반응. EsxH:3-11(MHC-I-제한 에피토프를 포함) 또는 EsxA:1-20(MHC-II-제한 에피토프를 포함), PE10:-1-18(MHC-II-제한 에피토프를 포함) 또는 EspC:45-54(MHC-I-제한 에피토프 및 MHC-II-제한 에피토프를 포함) 합성 펩티드로의 시험관 내 자극 후 반응하는 T 세포의 빈도를 결정하였다. 2개의 꼬리 값과 95% 신뢰도를 갖는 중위수를 나타내었다. β2m, CMV 또는 BCUAG 프로모터를 수용하는 LV::M40-HAPE로 면역화된 마우스의 군들 중의 양적 차이는 통계학적으로 유의미하지 않았다(비-모수 Mann & Whitney 검정, p < 0.05). (b) 대표적인 게이팅 전략 (c) 및 음성 대조 EsxH:3-11 또는 EspC:45-54 펩티드로의 자극 후 CD8+ T 비장세포 하위 집합 내 TNF-α+ 대 IFN-γ+ 또는 IL-2+ 대 IFN-γ+의 점 도표. (d 내지 e) β2m, CMV 또는 BCUAG 프로모터로 면역화되거나 PBS와 함께 주입된 마우스에서 EsxH 또는 EspC 항원에 대해 특이적인 각 기능 하위 집합의 각 CD8+ (d) 또는 CD4+ (e)의 백분율을 요약한 히트맵. 별개의 프로모터들을 수용하는 LV::M40-HAPE로 면역화된 마우스의 군들 간의 양적 차이는 통계학적으로 유의미하지 않았다(비-모수 Mann & Whitney 검정, p < 0.05). 면역화된 C57BL/6 마우스는 도 7에 상술된 마우스이었다.
도 6. 다-항원성 LV::S40-HAPEHR 또는 LV::S40-HAPEHR-20의 면역원성. (a) LV::S40-HAPEHR 또는 LV::S40-HAPEHR-20 1 Х 108 TU/마우스로 피하 면역화된, 개별 C57BL/6 마우스(n = 3)의 비장에서의 면역-후 13일차에서 ELISPOT에 의해 평가된 바와 같은 IFN-γ T-세포 반응. 표시된 합성 펩티드로의 시험관 내 자극 후 반응하는 T 세포의 빈도를 결정하였다. 2개의 꼬리 값과 95% 신뢰도를 갖는 중위수를 나타내었다. LV::S40-HAPEHR 또는 LV::S40-HAPEHR-20으로 면역화된 마우스의 군들 중의 양적 차이는 통계학적으로 유의미하지 않았다(비-모수 Mann & Whitney 검정, p < 0.05). (b) PBS로 주사되거나 각각 5개로 차감된 Hrp-1-파생 RfpD-파생 중첩 15량체로부터의 개별 펩티드 각각으로 자극된 후 LV::S40-HAPEHR 1 Х 108 TU/마우스로 피하 면역화된 C57BL/6 마우스로부터 수집된 비장세포에 의해 결정된 바와 같은 Hrp-1 및 RfpD의 에피토프 맵핑. (c) (b)에서 동정된 면역우세 에피토프를 포함하는 표시된 펩티드 10 μg/ml로의 자극 후 CD4+ T 비장세포의 세포 내 IFN-γ 대 IL-2 염색의 세포측정 분석.
도 7. LV::S40-HAPEHR 또는 LV::S40-HAPEHR-20으로의 비강 내 면역화에 의해 촉발되는 점막 CD4 + T 세포의 특징 C57BL/6 마우스를 LV::S40-HAPEHR 또는 LV::S40-HAPEHR-20 1 Х 108 TU로 비강 내 면역화하였다. 면역 후 14일차에서, 폐 CD4+ T 세포를 정맥 내 PE-항-CD45 mAb 주입에 의한 간질 내(CD45i.v -) 또는 맥관 구조 내(CD45i.v +) 위치로 구별하였다. 간질 또는 맥관 구조의 폐 CD4+ T 세포의 (a) CD27 대 CD62L 또는 CD45RB 및 (b) CD103 대 CD69 또는 CD44 대 CXCR3의 프로파일. (c) 세포 내 사이토카인 염색(ICS: Intracellular Cytokine Staining)에 의해 결정된 바와 같이 폐 간질 또는 맥관 구조에서 EsxA, PE19 또는 EspC에 대해 특이적인 (다)관능 CD4+ T 세포의 백분율을 요약한 히트맵. 두 개의 독립적인 실험을 대표하는 결과는 정확한 세포측정 분석을 위해 충분한 세포에 도달하기 위해 그룹 당 수집된 폐에서 나온 것이다.
도 8. LV::S40-HAPEHR 또는 LV::S40-HAPEHR-20으로의 비강 내 면역화에 의해 유발되는 점막 CD8 + T 세포의 특징. 면역화된 C57BL/6 마우스는 도 7에 상술된 마우스이었다. (a) 폐 CD8+ T 세포를 간질 내(CD45i.v -) 또는 맥관 구조 내(CD45i.v +) 위치로 구별하였다. 간질 또는 맥관 구조의 폐 CD8+ T 세포의 (a) CD27 대 CD62L 또는 CD45RB 및 (b) CD103 대 CD69 또는 CD44 대 CXCR3의 프로파일. (c) 세포 내 사이토카인 염색(ICS)에 의해 결정된 바와 같이 폐 간질 또는 맥관 구조에서 EsxH 또는 EspC에 대해 특이적인 (다)관능 CD8+ T 세포의 백분율을 요약한 히트맵. 두 개의 독립적인 실험을 대표하는 결과는 정확한 세포측정 분석을 위해 충분한 세포에 도달하기 위해 그룹 당 수집된 폐에서 나온 것이다.
도 9. Mtb에 대한 부스터로서 최적화된 다-항원성 LV의 보호 잠재력. (a) C57BL/6 마우스(n = 5 내지 9/군)에서 수행된 시동-촉진-시험의 시각표. (b) 시험 후 5주차에서 마우스의 폐 및 비장에서의 CFU 계수에 의해 정량화된 바와 같은 Mtb 부담. NS = 유의미하지 않음, *, **, *** = 단측 만 휘트니 검정(One Tail Mann Whitney test)에 의해 결정된 바와 같이 통계학적으로 유의미함, 각각 p = 0.0415, p = 0.0040, p = 0.00105.
도 10. Mtb 항원 제시 분석에 사용된 T-세포 하이브리도마의 민감도. BALB/c(H-2d) 또는 C57BL/6(H-2b)로부터의 BM-DC를 여러 농도의 동종기원 또는 음성 대조 펩티드와 함께 배양하였다. 1일차에서, EsxH:20-28(YB8, Kd에 의해 제한됨), EsxH:74-88(1G1, I-Ad에 의해 제한됨), EsxA:1-20(NB11, I-Ab에 의해 제한됨), PE:19:1-18(IF6, I-Ab에 의해 제한됨) 또는 EspC:45:54(IF1, I-Ab에 의해 제한됨)에 대해 특이적인 T-세포 하이브리도마를 사용하여 MHC-I-제한 에피토프 또는 MHC-II-제한 에피토프를 평가하였다. 결과는 T-세포 첨가 24시간 후 T-세포 하이브리도마에 의해 생산된 IL-2의 농도이었다.
도 11 (a) 3개의 사용된 프로모터들의 도식적 설명. β2m 프로모터(RefSeq: LRG-1215; 4556 내지 5070), hCMV 프로모터(RefSeq: MN920393.1; 174188 내지 174714), BCUAG는 염증과 연관되는 시스-조절 모티프의 세트인 "Inf" (염증-연관) 클러스터의 첨가를 수반하는 β2m 프로모터 및 hCMV 프로모터의 조합이다. (b) Inf 클러스터의 시퀀스. 시스 조절 모티프 및 연관된 전사 인자는 시퀀스 아래에 표시하였다.
도 12. β2m, CMV 또는 BCUAG 프로모터 하, 선택된 마이코박테리아 항원을 수용하는 M40 또는 S40을 포함하는 pFLAP 플라스미드의 세그먼트의 맵. 관심 백신의 EsxH 변종 또는 다-항원성 융합 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화 cDNA 시퀀스를 SP1-β2m 프로모터36 하에서 pFLAP 골격 플라스미드에 삽입하였다.
도 13. 항원 EsxH를 수용하는 인간 SPD-40 폴리펩티드의 구조.
P1-106: 폐 계면활성제-연관 단백질 D의 단편(UniProtKB - P35247 p1-106), 신호 펩티드(p1-20)를 통한 분비를 보장하고, 형질도입된 세포를 둘러싸는 APC에 대한 항원 접근 및 2 단계 다량체화를 가능하게 함: 콜라겐-유사 도메인(p46-106) 수소 결합 및 시스테인-풍부 영역(p21-45)을 수반하는 3량체화를 생성하고, 이황화 결합을 통해 공유 다량체화(n>3)를 생성함. 스캐폴드는 자연 3량체화를 모방하는 생체이용률 및 CD40L 기능을 향상시키는 것으로 예상된다. P208-273: 만노스-결합 단백질 C의 단편(UniProtKB - P11226 p65-130). 콜라겐-유사 도메인(p208-243) 및 감겨진-코일 영역(p244-273)을 통한 다량체화. 감겨진-코일 영역은 또한 전이유전자와 CD40L 엑토도메인 사이의 경성 스페이서로서 유해한 상호작용을 방지한다. P277-422: CD40L 엑토도메인의 단편(UniProtKB - P29965 p116-261). 천연 수용체 CD40과의 상호작용을 통한 APC 표적화 및 성숙을 보장함. 펩티드 시퀀스는 EMQK 모티프 이후에 개시하여 야생형 CD40L 전장에서 일어나는 천연 메티오닌 절단을 방지함.
실시예
도입부(Indtroducn)
렌티바이러스 벡터(LV)는 특히 항원 제시 세포(APC)를 포함하여 숙주 세포의 핵으로의 유전자 전달의 탁월한 잠재력에 의존하는 가장 효율적인 백신 플랫폼 중 하나를 제공한다. 이러한 유전자의 핵 전달은 CD8+ T 세포의 추가적인 촉발을 위한 주요 조직적합성 복합체 클래스-I(MHC-I) 제시 기계, 즉, 프로테아좀에 쉽게 접근하는 항원의 발현을 개시한다1 내지 3. 내인성으로 생성된 항원을 MHC-I 경로로 전달하는 상당한 능력과는 대조적으로, LV를 포함하여 바이러스 벡터는 미-분비 항원을 엔도솜 MHC-II 구획(MIIC)으로 전달하는 데 거의 효과적이지 않거나 작동하지 않으며 CD4+ T 세포를 촉발할 수 없다. 비록 CD8+ T 세포가 감염성 질환 또는 종양 성장의 면역 조절에 크게 기여하기는 하나, CD4+ T 세포가 주요 면역 주체이다. CD4+ T 세포는 긴 수명과 직접적인 효과기 기능에 더해, 선천적인 면역을 조절하고, B-세포 반응을 재단하고 CD8+ T-세포 효과기 기능을 지원함으로써 면역계를 조직한다4. 따라서, CD4+ T 세포를 유도하기 위한 LV의 잠재력을 활용하는 것은 백신 전략에서의 성공율을 극대화할 것이다.
CD4+ T 세포의 영향은 특히 인간 폐결핵(TB: pulmonary tuberculosis)의 원인체인 단일 감염원, 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mtb: Mycobacterium tuberculosis)에 의한 주요 사망 원인에 대한 면역 보호에서 가장 중요하다5. 만성적인 감염 동안, 이러한 세포 내 간균은 감염된 식세포의 식포 내에 박혀 있고, 이는 MHC-II 분자에 의해 본질적으로 항원이 제시되는 결과를 초래한다. 따라서, 적응 면역 효과기 세포가 감염된 세포를 인식하여 감염된 세포들을 근절하거나 감염된 세포의 세포 내 살균 무기를 강화할 수 있다6, 7. 다-항원성 및 다단계 항-결핵 서브유닛 백신을 개발하기 위해, 본 발명자들은 MHC-II 항원 제시를 유도할 수 있는 새로운 세대의 LV를 조작하여 CD4+ T-세포 개시를 초래하였다. 본 발명자들의 합리적인 설계에서, 본 발명자들은 또한 APC에의 항원의 직접적인 전달하여 적절한 공동-자극 세포 표면 수용체에 접근토록 함으로써 필요한 항원 양의 문턱값을 낮추고 약간의 국소 보조 효과를 제공하여 면역원성을 실질적으로 증가시킨다는 사실을 고려했다8, 9.
본 발명자들은 스캐폴드 단백질 운반체로서 콜라겐-함유 C-형 렉틴(콜렉틴), 즉 만난-결합 렉틴(MBL) 또는 계면활성제-연관 단백질 D(SPD)10를 인코딩하는 LV의 플랫폼을 생성하였다. 계면활성제-연관 단백질 D는 공동-자극 수용체 CD40을 통해 APC를 표적화하고 활성화하는 관점에서 다수의 Mtb 면역원과 종양 괴사 인자(TNF: Tumor Necrosis Factor) 패밀리 구성원 CD40 리간드(CD40L, CD154)의 엑토도메인을 수용하도록 조작되었다11. 이러한 LV로의 숙주 세포의 형질도입은 항원-보유 MBL-CD40L("M40") 또는 SPD-CD40L("S40") 단량체의 분비를 초래한다. 이러한 단량체는 제1 구조 단위로서 나선의 3량체로 자발적으로 자가-조립될 수 있다. 이는 잠재적으로 CD40을 클러스터링하는 데 필요한 CD40L 호모-3량체 구성으로 이어진다. 차례로, 3량체는 추가로 4량체화 또는 6량체화되어 생물학적 유체에서 순환하거나 대기자 APC에 의해 국소적으로 흡수될 수 있는 가용성 거대분자 운반체를 형성할 수 있다. 따라서, 이러한 거대분자 운반체는 CD40+ APC 및 특히 수지상 세포(DC)에 더 효율적으로 전달되어 MIIC에 접근할 수 있다. 더욱이, C-말단 CD40L 3량체 모티프는 보조제와 유사하게 수지상 세포를 활성화하기 위해 CD4+ T 세포 상의 3가 막 CD40L을 모방할 수 있다. 본 발명자들의 결과는, 기존의 LV와는 대조적으로, 다단계 Mtb 면역원을 보유하는 M40 또는 S40 운반체를 인코딩하는 이러한 새로운 세대의 LV가 (i) MHC-II-제한 항원 제시를 유도하고, (ii) 전신 또는 비강 내(i.n.) 면역화에 사용하는 경우, CD4+ - 및 CD8+ - T 세포를 촉발하고, 그리고 (iii) TB 마우스 모델에서 유의미한 부스터 보호 효과를 나타낸다는 개념 증명 증거를 제공하였다. 이러한 혁신적인 접근법은 바이러스 벡터 백신의 희귀한 특성인 강력한 CD4+ T-세포 반응을 유도하는 중요한 이점과 함께 다수의 다른 박테리아 또는 바이러스 감염 질환 또는 암에 대한 LV-기반 백신 후보로 크게 확장될 수 있다.
결과(Results)
항원의 합리적인 선택
M40 또는 S40 항원 운반체를 인코딩하는 LV-기반 백신 벡터를 생성하고 CD4+ T 세포에 의해 조절가능한 감염성 질환에서 잠재적으로 사용가능하도록 하기 위해, 본 발명자들은 Mtb에서 EsxA, EspC(ESX-1 분비-관련 단백질 C), EsxH, PE19, 저산소증 반응 단백질(Hrp1) 및 소생 촉진 인자 D(RpfD) 면역원을 선택했다(표 1). 작은 크기 및 ESX-1 VII형 분비 시스템(T7SS)을 통한 활성 분비로 인해 EsxA 및 EspC 독성 인자는 강력한 면역원성이며, 이는 숙주 식세포의 MHC 제시 기계에 접근하기 유리하다12, 13. ESX-3 T7SS를 통해 분비되는 고 면역원성 EsxH14 내지 16는 여러 서브유닛 백신 후보들에서 보호 잠재력을 나타냈다. 지금까지 연구된 모든 Mtb 임상 단리물에는 EsxH 및 그의 가까운 친척 EsxR이 존재한다17. ESX-5 T7SS를 통해 분비되는 PE/PPE Mtb 단백질의 대규모 패밀리로부터의 PE19를 포함하는 것13, 18 내지 23은 T-세포 에피토프의 내용물을 기반으로 하며, 감염의 구별되는 단계들에서 여러 발현 프로파일을 수반하여 대규모 PE 다유전자적 패밀리의 여러 동종기원의 구성원들에 의해 공유되며, 이는 감염의 과정 동안 이러한 공유된 T-세포 에피토프의 지속적인 표시를 생성할 수 있다20, 23 내지 25.
Mtb가 급성에서 지속 단계로 진화함에 따라, 기아, 저산소증, 질소 스트레스 또는 숙주 면역 압력에 대한 적응이 dosRS 2-성분 조절 시스템에 의해 조절되며26, 이는 가장 강력하게 유도되는 rv2626c를 포함하여 48개의 유전자들의 전사를 개시한다27. 그 결과의 Hrp1은 과립종 내에 간균들이 잠재되어 있는 경우에 숙주 적응 면역의 표적이 될 수 있다28. Hrp1에 대한 면역은 잠복 TB 재활성화를 약화시킬 수 있다. 게다가, Mtb는 5가지 소생 촉진 인자(RpfA-E)를 보유한다. Rpf는 펩티도글리칸 가수분해효소, 트랜스-글리코실화효소 및 용해 활성을 갖는 세포-벽 관련 또는 분비 효소이다. 이러한 효소는 급성 또는 재활성화 단계 둘 모두에서 박테리아 분열 동안 세포벽 재구성에 관여하는 뮤로펩티드의 생합성에 기여한다29 내지 31. 본 발명자들은 마우스32 및 잠복 결핵 인간33 둘 모두에서 입증된 면역원성 때문에 RpfD를 선택했다. Hrp-1 및 Rpf 둘 모두 인간 동족체를 결여한다.
Mtb 항원 및 수지상 세포 표적화 세그먼트를 수용하는 콜렉틴 스캐폴드를 인코딩하는 LV의 설계
콜렉틴은 유기체의 표면에서 올리고당 또는 지질과 결합하고 그에 의해 옵소닌화 또는 보체 활성화에 의한 제거에 기여할 수 있는 가용성 패턴 인식 수용체(PRRs: Pattern Recognition Receptors)이다34. 콜렉틴들 중에서, MBL 및 SPD는 하기 4개의 별개의 세그먼트들로 구성된다: (i) N-말단 시스테인-풍부 가교결합 도메인, (ii) 콜라겐-유사 도메인, (iii) α-헬리칼 목 도메인 및 (iv) 탄수화물-인식 도메인(CRD)(도 1a). 자가-조립된 콜라겐-유사 3중 나선이 제1 구조 MBL 또는 SPD 유닛을 형성한다(도 1b). SPD 3중-서브유닛 자체는 4량체화되어 십자-형 12량체를 형성할 수 있다(도 1c). SPD 또는 MBL 3중-서브유닛은 또한 6량체화되어 "튤립-형 나노-부케" 18량체를 형성할 수 있다(도 1d). 그 결과의 분비된 폴리머는 가용성이다34. 본 발명자들은 먼저 뮤린 CD40L115-260 엑토도메인으로 CRD를 대체하면서, 콜라겐-유사 영역 내에 (i) EsxH 단독, (ii) EsxH 및 EsxA, (iii) EsxH, EsxA 및 PE19 또는 (iv) EsxH, EsxA, PE19 및 EspC의 완전 시퀀스를 수용하도록 뮤린 MBL을 조작하였다. 예비 MBL 폴리머는 각각 "M40-H", "M40-HA", "M40-HAP" 또는 "M40-HAPE"로 언급될 수 있다(도 1e, 표 S1).
병행하여, 본 발명자들은 콜라겐-유사 영역 내에: (i) EsxH 단독, (ii) EsxH, EsxA, PE19, EspC 또는 (iii) EsxH, EsxA, PE19, EspC, Hrp1 및 RpfD42-154를 수용하도록 SPD를 조작하고 본 발명자들은 CRD를 CD40L115-260으로 대체하였다(도 1f, 표 S1). 예상되는 SPD 폴리머는 각각 "S40-H", "S40-HAPE" 또는 "S40-HAPEHR"로 언급된다. 그 결과의 융합 단백질에 일부 화학약품-유인 특성(chemo-attracting properties)을 부여하기 위해, 본 발명자들은 또한 S40-HAPEHR을 설계하였으며, 이는 콜라겐-유사 도메인 내에 뮤린 CCL2028-97 세그먼트를 수용한다("S40-HAPEHR-20"). CCL20은 수지상 세포 및 림프구의 이동 및 모집에 크게 관여하는 CCR6 리간드이다35.
LV::M40에 의한 MHC-II-제한 항원 제시의 유도
수지상 세포(H-2d 또는 H-2b)를 BCUAG를 사용하여 LV::M40-H, LV::M40-HA, LV::M40-HAP 또는 LV::M40-HAPE로 직접적으로 형질도입하였다. 조절 수지상 세포는 조작된 스캐폴드 내로 삽입됨이 없이 EsxH를 인코딩하는 통상적인 LV로 형질도입하였다. 형질도입 3일 후, 수지상 세포를 각각의 Mtb 항원의 면역우세 에피토프에 대해 특이적인 T-세포 하이브리도마와 공동-배양하였다. LV 중 어느 하나로 형질도입된 수지상 세포는 MHC-I를 통해 EsxH의 제시를 크게 유도할 수 있었다(도 2a). 기존의 LV::EsxH와는 대조적으로, M40-H, M40-HA, M40-HAP 또는 M40-HAPE를 인코딩하는 LV는, 이들 항원들이 포함되는 경우, EsxH, EsxA 및 PE19의 제시를 유도하였다. 이러한 맥락에서 EspC의 MHC-II 제시는 검출되지 않았으며, 이는 항-EspC T-세포 하이브리도마의 약한 민감도로 설명될 수 있다(도 10). 형질도입된 세포에 의해 분비된 M40 또는 S40 운반체가 MHC-II를 통해 제시를 유도할 수 있는 지의 여부를 평가하기 위해, 형질도입된 HEK-293T 세포로부터의 M40-H-함유 상청액, M40-HA-함유 상청액, M40-HAP-함유 상청액 또는 M40-HAPE-함유 상청액의 연속적인 희석물과 함께 배양하였다(도 2b). 배양 후 1일차에서, 수지상 세포와 T-세포 하이브리도마의 공동-배양은 이러한 수지상 세포가 MHC-I을 통해 EsxH를 제시할 수 없다는 것을 나타내었으며, 이는 다른 것들에 의해 관찰된 것과는 대조적으로 M40 운반체의 내세포/미소세포흡수작용 또는 CD40-매개 세포 진입이 MHC-I 기계에 대한 접근을 허용하지 않는다는 것을 강하게 시사하였다38. 대조적으로, M40-H-함유 상청액, M40-HA-함유 상청액, M40-HAP-함유 상청액 또는 M40-HAPE-함유 상청액과 함께 배양된 수지상 세포는 EspC를 포함하여 MHC-II를 통해 각 항원의 제시를 유도하는 데 매우 효율적이었다. 항원 제시의 강도는 M40 스캐폴드에 의해 운반되는 항원의 수가 증가함에 따라 감소하는 경향이 있다는 것을 알 수 있었다(도 2a, b). 상호배타적인 방식으로, 이는 다음과 같은 결과를 가져올 수 있다: (i) 항원의 수가 증가함에 따라 운반체의 약간의 구조적 불안정성, (ii) 사용가능한 MHC 제시 부위에 대한 복수의 T 세포 에피토프 간의 경쟁.
LV::S40-HAPE, LV::S40-HAPEHR 또는 LV::S40-HAPEHR-20으로의 수지상 세포의 직접적인 형질도입은 또한 선택된 Mtb 항원의 효율적인 MHC-I-제한 제시 또는 MHC-II-제한 제시를 유도하였다(도 2c). LV::S40-HAPE, LV::S40-HAPEHR 또는 LV::S40-HAPEHR-20으로 형질도입된 HEK-293T 세포로부터의 상청액의 연속적인 희석물과의 수지상 세포의 배양은 Mtb 항원의 MHC-II-제한 제시를 유발하였다(도 2d). Hrp1 또는 RpfD에 특이적인 동정된 T-세포 에피토프 또는 T-세포 하이브리도마가 존재하지 않는 경우, 개발된 벡터의 맥락에서 이러한 항원의 면역원성을 아래에서 기술되는 바와 같이 생체 내에서 연구하였다. 특히, S40 스캐폴드에 Hrp1 및 RpfD 및 CCL20을 추가하는 것은 다른 항원의 제시의 효율에 영향을 주지 않았다. 동종기원 T-세포 에피토프를 수용하는 합성 펩티드로 배양된 수지상 세포에 대해 수행된 분석은 T-세포 하이브리도마-기반 제시 분석의 민감도를 나타내었다(도 10).
이러한 결과는, 기존의 LV와는 반대로, 여러 항원 및 면역 매개체를 통합할 수 있는 분비된 스캐폴드를 인코딩하는 이러한 새로운 세대의 LV가 MHC-II-제한 항원 제시를 유도하는 강력한 능력을 보유하고 그에 따라 CD4+ 및 CD8+ T 세포 유도 둘 모두에 귀중한 플랫폼을 제공한다는 것을 나타내었다.
수지상 세포 성숙을 유도함에 있어서의 M40 및 S40 잠재력
수지상 세포 숙성을 유도하는 M40 및 S40 운반체의 잠재력을 평가하기 위해, BM-DC를 LV::M40-H 또는 LV::S40-H로 형질도입된 HEK-293T 세포로부터의 상청액과 함께 배양하였다. 병행하여, 음성 대조로서 기존의 LV::H로 형질도입된 HEK-293T 세포로부터의 상청액과 함께 배양하거나 양성 대조로서 Mtb로 감염시켰다. 표면 공동-자극 및 MHC 분자의 발현은 배양 1일 후에 CD11b+ CD11c+ 세포에 대해 평가되었다(도 3a, b). M40-H 또는 S40-H와 함께 배양된 수지상 세포에 대해서는, 아마도 CD40의 M40-H 또는 S40-H와의 직접적인 상호작용의 결과로서 CD40 표면 발현의 증가가 감지되지 않았다(도 3a, b). CD80 상향조절은 S40-H와 함께 배양된 수지상 세포에서만 검출된 한편, CD86 상향조절과 MHC-Ihi 또는 MHC-IIhi 세포의 백분율의 증가는 M40-H 또는 S40-H과 함께 배양된 수지상 세포에 대해 검출되었다. 따라서, M40 또는 S40 분비의 유도를 통해, 이러한 새로운 세대의 LV는 적절한 T-세포 활성화에 중요한 수지상 세포 성숙을 유도할 수 있다.
단일 또는 복수의 Mtb 면역원을 운반하는 M40 또는 S40을 인코딩하는 LV의 T-세포 면역원성
이러한 새로운 세대의 LV의 면역원성을 평가하기 위해, 면역 반응의 유도에 대한 뚜렷한 항원 운반체 전사 프로파일의 가능한 결과에 대한 통찰력을 얻기 위해 BALB/c 마우스(n = 3/군)를 인간 β2-마이크로글로불린(β2m) 프로모터36, 인간 거대세포바이러스(CMV: CytoMegaloVirus) 전초기 인핸서 및 프로모터(CMV)37 또는 복합 β2m-CMV 프로모터("BCUAG")를 수용하는 LV::M40-H로 피하 면역화하였다(도 11). 주입 후 13일차에서(dpi), EsxH:20-28(MHC-I) 또는 EsxH:74-88(MHC-II) 펩티드15, 16로의 비장세포의 자극에서 ELISPOT에 의해 CD8+ T 및 CD4+ T 세포 둘 모두가 검출되었다(도 4a). 세포 내 사이토카인 염색(ICS)은 이러한 CD8+ 또는 CD4+ (도 4b, c) T 세포의 다기능 특성을 나타내었다. 기능성 CD8+ T 세포 효과기는 주로 IFN-γ+(단일 양성), IFN-γ+ TNF-α+(이중 양성) 또는 IFN-γ+ TNF-α+ IL-2+(삼중 양성) 하위 집합 중에 분포된 반면, CD4+ T 세포는 본질적으로 IFN-γ+(단일 양성) 또는 IFN-γ+ TNF-α+ IL-2+(삼중 양성) 하위 집합에 분포되었다(도 4c). 단일로 EsxH를 인코딩하는 종래의 LV가 이러한 CD4+ T-세포 반응을 유도하지 않는다는 것은 주목할 만하다39.
개발된 다-항원성 LV::M40-HAPE의 면역원성 잠재력을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스(n = 3/군)을 β2m, CMV 또는 BCUAG 프로모터를 수용하는 LV::M40-HAPE로 피하 면역화하였다. 면역화 후 14일차에서, ELISPOT에 의해 평가된 바와 같이, EsxH:3-11(MHC-I), EsxA:1-20(MHC-II), PE19:1-18(MHC-II) 또는 EspC:45-54(MHC-I 및 MHC-II)39에 대해 특이적인 CD8+ 및 CD4+ T 비장세포 반응이 모든 마우스에서 감지되었다(도 5a). 동일한 마우스로부터의 비장세포의 ICS 분석은 유도된 CD8+ (도 5b) 또는 CD4+ (도 5c) T 세포의 다기능 특성을 나타내었다. 기능성 CD8+ T 세포 효과기는 다시 주로 IFN-γ+ 단일 양성, IFN-γ+ TNF-α+ 이중 양성 또는 IFN-γ+ TNF-α+ IL-2+ 삼중 양성 하위 집합 중에서 주로 분포되었다. EsxA, PE10 또는 EspC 항원에 특이적인 CD4+ T 세포는 IFN-γ+ 단일 양성, IFN-γ+ TNF-α+ 이중 양성 또는 IFN-γ+ TNF-α+ IL-2+ 삼중 양성 하위 집합 중에서 우선적으로 분포되었다(도 5d, e). 별개의 프로모터들 각각을 수용하는 LV::M40으로 면역화된 마우스에서 일관된 양적 또는 질적 차이가 검출되지 않았다. 다시, 다-항원으로서 이러한 Mtb 단백질을 인코딩하는 종래의 LV는 CD4+ T-세포 반응을 유도할 수 없다39.
본 발명자들은 추가로 LV::S40-HAPEHR 또는 LV::S40-HAPEHR-20으로 피하 면역화된 C57BL/6 마우스(n = 3/군)에서 EsxH, EsxA, PE19 및 EspC에 대해 특이적인 CD8+ 및 CD4+ T 세포 둘 모두의 유도를 확립하였다(도 6a). Hrp-1 및 RpfD의 면역원성은 ELISPOT 분석에서 LV::S40-HAPEHR-면역화 마우스로부터의 비장세포를 사용하여 에피토프 맵핑으로 평가하였다(도 6b). Hrp-1:77-91(SIYYVDANASIQEML), RpfD:57-71(IAQCESGGNWAANT) 및 RpfD:87-101(SNGGVGSPAAASPQQ) 면역원성 영역이 확인되었다.
전체적으로, 이러한 결과는 개발된 새로운 세대의 LV로의 면역화에 의한 강력하고 다기능적인 CD4+ T-세포 반응의 유도에 대한 증거를 제공한다.
점막 수준에서의 다-항원성 다단계 LV::S40의 면역원성
계속해서 본 발명자들은 1 X 108 TU로 면역화된(비강 내) C57BL/6 마우스에서 LV::S40-HAPEHR 또는 LV::S40-HAPEHR20의 면역원성을 평가하였다. 면역화 후 14일차에서, 희생 3분 전에 PE-anti-CD45 mAb로의 면역화된 마우스의 정맥 내(i.v.) 주사하여 혈관 내에 있는 것과 구별되는 폐 간질에 대한 대규모 T-세포 모집을 감지할 수 있었다40. 이들 LV::S40-HAPEHR-백신접종 마우스 또는 LV::S40-HAPEHR20-백신접종 마우스의 폐 간질(CD45i.v.-) CD4+ (도 7a) 또는 CD8+ (도 8a) T 세포는 PBS-주사된 대응물에 비해 증가된 빈도의 CD27- CD45RB- CD62L- 이동 효과기 및 CD69+ CD103+ 체류 세포(도 7b, 도 8b)를 포함하였다. 대부분의 CD69+ CD103+ CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 CD44+ CXCR3+이었다. 이러한 세포의 ICS 분석 결과는 EsxA, EspC, EsxH 또는 PE19에 대해 특이적이고, 기본적으로 폐 간질 내에 위치되는 (다)기능성 CD4+ (도 7c) 또는 CD8+ (도 8c) T 세포의 존재를 나타내었다.
Mtb 감염에 대한 LV::S40-HAPEHR-20의 부스터 보호 효과
BCG 또는 시동을 위한 개선된 생-약독화 백신 및 촉진을 위한 서브유닛 백신 후보를 사용하는 시동-촉진 전략은 BCG의 불완전한 효능을 개선하기 위한 유망한 접근법이다. LV::S40-HAPEHR-20의 부스터 잠재력을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스를 0주차에서 1 X 106 CFU의 유전적으로 개선된 BCG, 즉, BCG::ESX-1Mmar 백신 후보로 피하 면역화하였다41 (도 9a). 이러한 생-약독화 백신이 EsxA 및 EspC를 활발하게 분비하기 때문에 BCG::ESX-1Mmar 백신 후보는 개발된 LV 백신으로 시동-촉진을 수행할 수 있는 기회를 제공한다. 5주차에서 BCG::ESX-1Mmar-시동 마우스의 군을 1 X 108 TU의 LV::S40-HAPEHR-20으로 피하 촉진하고, 계속해서 다시 10주차에서 동일 LV로 비강 내 촉진하여 폐 점막에 대해 유도 면역 효과기를 모집하였다. 12주차에서, 마우스를 에어로졸을 통해 200 CFU의 Mtb H37Rv를 투여하고 17주차에서 폐 및 비장 마이코박테리아 부담을 결정하였다(도 9b). 시동-촉진된 마우스에서의 평균 폐 Mtb 부하는 백신접종을 하지 않은 대조군에 비해 약 2.5 log10(Mann-Whitney 시험, p값 = 0,0005)으로 그리고 이들의 BCG::ESX-1Mmar-백신접종 대상체에 비해 약 1 log10(Mann-Whitney 시험, p값 = 0,0415)으로 감소되었다. LV::S40-HAPEHR-20 촉진은 비장 Mtb 부하를 감소시키는 경향을 초래했으나, 이는 통계학적으로 유의미하지 않았다. 이에 대한 설명은 비장으로의 파종에 대한 ESX-1-보완 BCG 균주의 특히 강력한 보호 효과이다12, 42, 43.
논의
본 발명자들은, 기존 벡터와 비교하여: (i) 다-항원 전달을 촉진하고, (ii) 활성화되는 APC에 대해 항원을 표적하고, (iii) MHC-II 경로를 통해 항원을 전달하고, (iv) CD8+ T 세포에 더해, 강력하고 다기능적인 CD4+ T-세포 반응을 유도하는 데 활용되는 새로운 세대의 다기능성 LV를 개발하였다. 이러한 LV는 여러 항원 뿐만 아니라 보조제 또는 화학약품-유인 특성을 갖는 단백질 성분을 수용할 수 있는 절두된 콜렉틴-기반 스캐폴드에 의해 형성되는 다량체성 단백질 운반체의 분비를 유도하도록 조정된다. 이는 CRD 영역에서 CD40L 엑토도메인으로 치환된 MBL 또는 SPD의 콜라겐-풍부 영역 내에 강력한 면역원을 삽입함으로써 달성된다. 시험관 내 또는 생체 내에서 LV-형질도입된 세포에서 생산된 단량체의 자가-조립 및 중합은 항원 제시 세포, 그리고 특히 수지상 세포를 포함하여 CD40+ 세포와 상호작용할 수 있는 분비된 다량체 운반체를 생성한다. 수지상 세포의 적절한 표면 수용체에 대한 항원 전달이 항원 제시의 효과를 몇 단계만큼 개선하는 것으로 알려졌다8, 44, 45. 본 발명자들의 조건에서 제조된 바와 같은 기존의 LV 그 자체는, 심지어 매우 높은 투여량으로 사용되지 않으면서도, 거의 염증을 일으키지 않고 수지상 세포 표현형 또는 기능적 성숙을 거의 유도하지 않는다. 생체 내 IFN-I의 일시적인 분 수준 및 생체 내에서 수지상 세포에서 IFN-I 신호를 유도하는 LV의 능력은 탁월한 T-세포 면역원성과도 관련되지 않는다39. 기존의 LV와는 달리, 본 명세서에서 기술되는 새로운 세대의 LV는 M40 또는 S40 운반체의 3량체의 말단에 의한 CD40 클러스터링을 통해 어느 정도의 수지상 세포 성숙을 유도한다. 따라서, 이러한 벡터는 하기들을 결합한다: (i) 기존의 LV의 고유하고 뛰어난 CD8+ T-세포 면역원성 및 (ii) 약간의 보조 작용의 특성, 수지상 세포 표면 수용체로의 항원 전달, 다량체성 스캐폴드가 인코딩하는 분비된 다량체성 스캐폴드의 MHC-II 및 CD4+ T-세포 면역원성으로의 항원 전달.
결핵이 주로 CD4+ T 반응에 의해 조절되는 질환이기 때문에, 제1 응용으로서, 본 발명자들은 별개의 감염 단계에서 우선적인 발현으로 선택된 Mtb 항원에 대한 T-세포 반응을 유도하는 잠재력에 대해 이러한 최적화된 LV를 조사하였다. 본 발명자들은 시험관 내에서 분비된 M40 또는 S40 운반체의 약한 수지상 세포 활성화 특성 및 이들의 콜라겐-유사 도메인 내에 삽입된 Mtb 항원의 MHC-II-제한 제시(및 MHC-I-제한 제시)에서의 이들의 큰 효율을 입증하였다. 본 발명자들은 계속해서 피하 또는 비강 내 면역화 후 전신 또는 점막 수준 모두에서 (다)기능성 CD8+ 및 CD4+ T-세포 효과기의 생체 내 효율적인 유도를 입증하였다. 특히, 단 1회의 비강 내 면역화 주입만으로도 활성화/효과기/체류 기억 표현형으로 폐 간질에 위치되는 고품질의 CD8+ 및 CD4+ T-세포 효과기를 생성한다. 추가의 실험에서, 이러한 T 세포가 폐 3차 림프 기관 내에 위치하는 지 여부를 결정하는 것이 유용할 것이다46.
다량체성 운반체들 중의 하나, 즉, S40-HAPEHR은 또한 강력한 화학약품-유인 케모카인인 CCL20의 세그먼트를 보유한다. CCL20, CCR6에 대한 수용체는 림프구 및 수지상 세포 상에서 발현되고, 따라서 S40-HAPEHR-20은 면역 세포의 모집을 강화해야 한다. 개선된 생-약독화 백신 후보로의 시동 면역화 및 서브유닛 백신으로의 촉진이 유망한 접근법이라는 것이 인정된다. 본 발명자들은 부모 BCG에 비해 보호 잠재력이 크게 향상된 BCG::ESX-1Mmar 백신 후보로 시동한 후의 마우스 폐결핵 모델에서 서브유닛 부스터로서 LV::S40-HAPEHR-20을 사용하였다41. 본 발명자들은 폐 Mtb 부담이 LV::S40-HAPEHR-20 촉진 이후 통계학적으로 약 1 log10으로 감소되었다는 것을 관찰하였다.
SPD-CD40L을 인코딩하는 플라스미드 DNA는 HIV-1 Gag 단백질을 인코딩하는 다른 플라스미드 DNA와 혼합되는 경우에 보조제로서 이미 사용되었고 CD8+ T 세포 반응의 유의미한 향상으로 이어졌다(43). 본 명세서에서 개발된 LV 플랫폼과는 대조적으로, 이러한 플라스미드 보조제는 CD4+ T-세포 증식 또는 사이토카인 생산을 유도할 수 없었다. SPD-Gag-CD40L을 아데노바이러스 벡터 혈청형 5(Ad5)에 삽입하는 것은 훨씬 더 강력한 Gag-특이적 CD8+ T-세포 반응 및 마우스 모델에서 Gag-발현 종두증 바이러스로부터의 보호를 이끌어내는 것으로 최근에 입증되었다47. 종양 gp100 항원을 보유하는 SPD-gp100-CD40L을 인코딩하는 플라스미드 DNA 및 IL-12p70와 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF: Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor)를 인코딩하는 플라스미드로의 공동-면역화는 마우스에서 흑색종 세포의 면역 조절을 증가시켰다48. 그러나, MHC-II-제한 항원 제시 또는 CD4+ T-세포 개시의 유도는 이러한 연구에서는 다루어지지 않았다. 이러한 이전 연구와 비교하여, 본 발명자들의 프로젝트는 추가의 다른 보조제 또는 면역-자극 분자를 필요로 함이 없이 M40 또는 S40의 폴리머를 사용하여 CD8+ T 세포 뿐만 아니라 특히 (다)기능성 CD4+ T-세포 반응 및 CCL20 화학약품유인 성분을 수용하는 일부 작제물을 생성한다. CD4+ T 세포가 주요 면역 플레이어이기 때문에, CD4+ T 세포를 유도하는 LV의 이러한 새로운 특성은 하기들에 기초하여 가장 중요하다: (i) 긴 수명, (ii) 직접적인 효과기 기능, (iii) 선천 면역을 조절함으로써 면역계를 조정하는 능력, (iv) B-세포 반응을 조정하는 헬퍼 기능 및 (v) CD8+ T-세포 효과기 경로를 지원하는 헬퍼 기능4.
전체적으로, 본 발명자들은 수지상 세포를 표적하고 활성화하고, 면역원을 MHC-II 경로로 전달하고 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응 둘 모두를 유도하기 위해 활용되는 새로운 세대의 LV 벡터를 설정하였다. 이러한 혁신적인 전략의 적용은 훨씬 더 크고 복수의 다른 박테리아, 바이러스, 기생충 감염 질환 또는 암에 대해 백신 LV를 확장할 수 있다.
재료 및 방법
선택된 마이코박테리아 항원, CD40L 및/또는 CCL20을 수용하는 MBL 또는 SPD 콜렉틴 스캐폴드를 인코딩하는 전달 pFLAP 플라스미드의 작제
콜라겐-유사 도메인 내에 선택된 마이코박테리아 항원 및/또는 CCL20을 수용하도록 조작된 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 만난-결합 렉틴(MBL) 또는 계면활성제-연관 단백질 D(SPD) 및 CRD 대신 뮤린 CD40L 엑토도메인을 인코딩하는 유전자를 코돈 최적화 후 GenScript로 합성하였다. 이러한 유전자들 각각을 전달 pFLAPU3 플라스미드의 BamHI 및 XhoI 부위에 삽입하였다49. 전사는 천연의 인간 CMV, 인간 β2-마이크로글로불린 β2m 또는 BCUAG 프로모터의 조절 하에 있으며, β2m 또는 BCUAG 프로모터는 MluI 및 BamHI 부위 사이에 삽입된 후 CMV 프로모터를 대체한다. 인간 β2-마이크로글로불린 프로모터는 이전에 기술되었다50. BCUAG 프로모터는 CMV 인핸서, 염증-연관 시스-조절 영역 및 β2m 코어 프로모터를 포함하는 하이브리드 프로모터이다(도 11). pFLAPU3 플라스미드는 또한 단백질 발현을 개선하기 위해 돌연변이된 WPRE(우드척 전사후 조절 요소) 시퀀스를 포함한다.
플라스미드 증폭 및 정제
플라스미드 DNA를 가나마이신 50 ㎍/㎖이 갖춰진 용원성 배지(LB: Lysogeny Broth)에서 DH5a 대장균(DH5a Escherichia coli)에서 증폭시켰다. 계속해서 플라스미드 DNA를 NucleoBond Xtra Maxi EF 킷트(Macherey Nagel)를 사용하여 정제하였다. 건조 후, DNA 팰릿을 Tris-EDTA 무-내독소(TE-EF: Tris-EDTA Endotoxin-Free) 완충제에 밤새도록 재현탁시키고, NanoDrop 2000c 분광광도계(Thermo Scientific)에서 정량하고, TE-EF 완충제에 1 ㎍/㎕로 조정하고, 분획한 후 -20℃에서 저장하였다. 플라스미드 DNA의 품질은 하기들로 조절하였다: (i) 소화되지 않았거나 2개의 플라스미드-특이적인 적절한 제한 효소의 혼합물로 소화된 후 겔 전기영동을 수행하고, (ii) 각 pFLAP 플라스미드의 삽입물을 염기서열분석함.
LV의 생산 및 적정
앞서 상술된 바와 같이 인간 배아 신장(HEK: Human Embryonic Kidney)-293T 세포에서 비-복제적 통합 LV를 생산하였다(Zennou et al., 2000). 요약하면, 1 Х 107 세포/페트리 접시를 DMEM에서 배양하고 하기의 혼합물 1 ㎖로 3개 1벌 방식으로 공동-형질감염시켰다: (i) 코돈 최적화된 gag-pol-tat-rre-rev를 인코딩하는 pSD-GP-NDK 포장 플라스미드 2.5 ㎍/㎖, (ii) VSV-G 인디아나 외피 플라스미드 10 ㎍/㎖ 및 (iii) 125 mM의 Ca(ClO3)2를 포함하는 Hepes 1X 중의 "전달" pFLAP 플라스미드 10 ㎍/㎖. 형질감염 48시간 후 상청액을 수확하고, 2500 rpm에서 6-분 동안 원심분리하여 청징화하고 22,000 rpm에서 4℃에서 1-시간 동안 초원심분리하여 농축하였다. 계속해서 LV를 PBS 1X, PIPES 20 mM, 슈크로스 2.5%, NaCl 75 mM에서 분획하고 -80℃에서 보존하였다.
생산된 LV의 역가를 결정하기 위해, HEK-293T를 8 μM 아피디콜린(Sigma)의 존재 중에서 완전 DMEM에서 편평-바닥 96-웰 플레이트에 4 Х 104 세포/플레이트로 분배하여 세포 성장을 차단하였다. 계속해서 세포를 농축된 LV의 연속 희석물로 형질도입하였다. 핵 유전자 전달의 효율에 비례하는 역가는 다른 곳에서 기재된 바와 같이 형질도입 후 3일차에서 총 용해물에 대한 정량적 실시간 PCR로 pFLAP 플라스미드에 대해 특이적인 순방향 5'-TGG AGG AGG AGA TAT GAG GG-3' 및 역방향 5'-CTG CTG CAC TAT ACC AGA CA-3' 프라이머 및 숙주 자가보유 유전자 gadph에 대해 특이적인 순방향 5'-TCT CCT CTG ACT TCA ACA GC-3' 및 역방향 5'-CCC TGC ACT TTT TAA GAG CC-3'를 사용하여 "형질도입 단위(Transduction Unit)" (TU)/㎖로 결정되었다51.
마우스, 면역화
7 내지 10주령의 C57BL/6JRj 또는 BALB/cJ 마우스(Janvier, Le Genest Saint Isle, France)를 사용하였다. 마우스에 대한 실험은 European and French 가이드라인(Directive 86/609/CEE and Decree 87-848 of 19 October 1987)에 따라 Institut Pasteur Safety, Animal Care and Use Committee의 승인 후, 지역 윤리 위원회 프로토콜 협정 # CETEA 2013-0036, # CETEA DAP180030 및 CETEA 2012-0005(APAFIS#14638-2018041214002048) 하에 수행하였다. 마우스를 200 ㎕에 포함된 표시된 양의 LV로 꼬리를 기준으로 피하(s.c.) 면역시켰다. 표시된 경우, 이전에 설명된 바와 같이, 마우스를 20 ㎕에 포함된 표시된 양의 LV로 비강 내(i.n.) 면역시켰다52. 자일라진(Rompun, 10 ㎎/㎏)과 케타민(Imalgene, 100 ㎎/㎏)의 혼합물의 복막 내 주입에 의한 마취 하에 비강 내 투여를 실현하였다.
ELISPOT에 의한 T-세포 분석
면역 후 11일 내지 14일차에서, 개별 마우스(n = 3/군)로부터의 비장세포를 균질화하고 100 ㎛-기공 필터를 통해 여과하고 1300 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 계속해서 세포를 적혈구 용해 완충제(Red Blood Cell Lysing Buffer: Sigma)로 처리하고 PBS로 2회 세척하고 MACSQuant10 세포측정 시스템(Miltenyi Biotec)으로 계수하였다. 계속해서 비장세포를 IFN-γ 또는 TNF-α ELISPOT 플레이트(Mouse ELISPOTPLUS, Mabtech)의 웰 내에 10% 열-비활성화 FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1 Х 10-4 M 비-필수 아미노산, 1%(용적/용적) HEPES, 1 Х 10-3 M 피루브산 나트륨 및 5 Х 10-5 M의 β-머캅토-에탄올을 포함하는 RPMI-GlutaMAX 200 ㎕ 중에 0.5 내지 1 Х 105 세포/웰로 파종하였다. 세포는 자극받지 않은 채로 방치되거나 각 마이코박테리아 항원의 잘 정의된 MHC-I-제한 T-세포 에피토프 또는 MHC-II-제한 T-세포 에피토프를 수용하는 합성 펩티드(Proteogenix, Strasbourg, France) 2 ㎍/㎖로 자극하였다. 병행하여, 비장세포를, 기능 대조로서, 콘카나발린 A(Sigma) 2.5 ㎍/㎖로 자극하였다. 각 개체에 대하여, Mabtech의 권장 사항에 따라 기술적으로 3중으로 수행하였다. 스폿들을 ELR04 ELISPOT 판독기(AID, Strassberg, Germany)로 정량하였다.
세포 내 사이토카인 염색에 의한 T-세포 분석, 폐 T-세포 표현형 분석
조직 균질화 및 100 ㎛-기공 필터를 통한 통과에 의해 면역화된 마우스로부터 비장세포를 수득하고 6시간 동안 10 ㎍/㎖의 동종유래 또는 대조 펩티드, 1 ㎍/㎖의 항-CD28(clone 37.51) 및 1 ㎍/㎖의 항-CD49d(클론 9C10-MFR4.B) mAbs(BD Pharmingen)의 존재 중에서 24-웰 플레이트에서 8 Х 106 세포/웰로 배양하였다. 배양 마지막 3시간 동안, 세포에 Golgi Plug 및 Golgi Stop(BD Pharmingen)의 혼합물을 추가하였다. 계속해서 세포를 수집하고 3% 열-비활성화 FBS 및 0.1% NaN3을 포함하는 PBS(FACS 완충제)로 세척하고 FcγII/III 수용체 차단 항-CD16/CD32(클론 2.4G2), APC eF780-항-CD3ε(클론 17A2), eFluor450-항-CD4(RM4-5) 및 BV711-항-CD8α(53-6.7), mAbs(BD Pharmingen and eBioscience)의 혼합물과 함께 4℃에서 25분 동안 배양하였다. 계속해서 세포를 FACS 완충제에서 2회 세척하고 Cytofix/Cytoperm 킷트(BD Pharmingen)를 사용하여 천공하였다. 계속해서 세포를 Cytofix/Cytoperm 킷트로부터의 PermWash 1x 완충제로 2회 세척하고 30분 동안 4℃에서 FITC-항-IL-2(클론 JES6-5H4, eBioscience), PE-Dazzle-항-TNF-α(MP6-XT22, Biolegend) 및 APC-항-IFN-γ(클론 XMG1.2, BD Pharmingen) mAbs의 혼합물 또는 적절한 대조 동종 면역글로불린의 혼합물과 함께 배양하였다. 계속해서 세포를 PermWash에서 2회 그리고 FACS 완충제에서 1회 세척하고 계속해서 밤새도록 4℃에서 Cytofix(BD Pharmingen)로 고정시켰다. 세포는 Attune NxT 세포측정 시스템(Invitrogen)에서 획득하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어(Treestar, OR, USA)로 분석하였다. 폐 T-세포 표현형 분석은 최근 기술된 바와 같이 수행하였다39.
항원 제시 분석
골수 유래 수지상 세포를 5% FBS를 포함하는 RPMI 1640에서 24-웰에 5 X 105 세포/웰로 평판배양 하였다. 세포를 LV로 형질도입하거나 동종 또는 대조 합성 펩티드로 부담시켰다. 감염 24시간 후 5 X 105의 적절한 T-세포 하이브리도마53를 첨가하고 24시간에서 ELISA로 배양 상청액을 IL-2 생산에 대해 정량하였다. 합성 펩티드는 Proteogenix(Schiltigheim, France)에 의해 합성되었다.
보호 분석
Mtb H37Rv 균주 또는 BCG::ESX-1Mmar 41을 알부민, 덱스트로스 및 카탈라아제(ADC, Difco, Becton Dickinson, Le Pont-de-Claix, France)로 보충된 두보스 배지(Dubos broth)에서 배양하였다. 병원성 마이코박테리아에 대한 실험은 파스퇴르 연구소(Institut Pasteur)의 위생 및 보안 권장 사항에 따라 생물안전 3등급(BSL3: BioSafety Level 3)에서 수행하였다. C57BL/6 마우스를 0일차에서 BCG::ESX-1Mmar 41 1 X 106 CFU/마우스로 피하 시동하고, 5주차에서 SPD40-HAPEHR-20 5 X 108 TU로 피하 촉진하고, 10주차에서 SPD40-HAPEHR-20 5 X 108 TU로 비강 내 촉진하였다. 마우스를 점막 촉진 2주 후 앞서 기술된 바와 같이52 자가제작한 분무기를 사용하여 에어로졸을 통해 시험하였다. 요약하면, Mtb H37Rv 균주의 1.7 X 106 CFU/㎖ 현탁액 5 ㎖를 에어로졸화하여 약 200 CFU/마우스의 흡기 투여량을 전달하였다. 계속해서 마우스를 격리기에 위치시켰다. 5주 후, 감염된 마우스의 폐 또는 비장을 MillMixer 균질화기(Qiagen, Courtaboeuf, France)를 사용하여 균질화시키고 PBS에서 제조된 연속 5-배 희석물을 ADC(Difco, Becton Dickinson)로 보충된 7H11 한천(7H11 Agar)에 평판배양 하였다. 37℃에서의 배양 3주 후 CFU를 계수하였다. 군 간의 Mtb 부하 차이의 통계학적 유의미성을 Prism v8.01(GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 Mann-Whitney t-검정으로 결정하였다.
[표 1]
Figure pct00001
[표 1 - 보충]
Figure pct00002
[표 S2]
선택된 Mtb 항원 및 LV로 코딩된 CCL20과 융합된 MBL의 시퀀스
Figure pct00003
[표 S3]
선택된 Mtb 항원 및 LV로 코딩된 CCL20과 융합된 SPD의 시퀀스
Figure pct00004
Figure pct00005
참고문헌
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SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR THERAVECTYS <120> New generation of lentiviral vectors enabling routing antigens to MHC-II pathway and inducing CD4+ and CD8+ T-cell responses immune response in a host <130> IP20234288FR <150> EP20306235.1 <151> 2020-10-16 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 414 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M40-H <400> 1 Met Ser Ile Phe Thr Ser Phe Leu Leu Leu Cys Val Val Thr Val Val 1 5 10 15 Tyr Ala Glu Thr Leu Thr Glu Gly Val Gln Asn Ser Cys Pro Val Val 20 25 30 Thr Cys Ser Ser Pro Gly Leu Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp Gly Arg 35 40 45 Asp Gly Ala Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu Arg Gly 50 55 60 Leu Gln Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Thr Gly Pro Pro Gly Asn 65 70 75 80 Pro Gly Leu Lys Gly Ala Val Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Arg 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Gln Ile Met Tyr Asn Tyr Pro Ala Met Leu Gly His 100 105 110 Ala Gly Asp Met Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala 115 120 125 Glu Ile Ala Val Glu Gln 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aacaaaggag agaacaccag 3000 cttgttacaa cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag tgttagagtg 3060 gaggtttgac agccgcctag catttcatca cggtggcccg agagctgcat ccggagtact 3120 tcaagaactg ctgatatcga gcttgctaca agggactttc cgctggggga ctttccaggg 3180 aggcgtggcc tgggcgggac tggggagtgg cgagccctca gatcctgcat ataagcagct 3240 gctttttgcc tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg 3300 ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt 3360 gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt 3420 gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg gaaaccagag 3480 gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg cgaggggcgg 3540 cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag agatgggtgc 3600 gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat tcggttaagg 3660 ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag ggagctagaa 3720 cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca aatactggga 3780 cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata taatacagta 3840 gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga agctttagac 3900 aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc cgctgatctt 3960 cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata aatataaagt 4020 agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag tggtgcagag 4080 agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag cagcaggaag 4140 cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat tgtctggtat 4200 agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc tgttgcaact 4260 cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa gatacctaaa 4320 ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca ccactgctgt 4380 gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc acacgacctg 4440 gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct taattgaaga 4500 atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata aatgggcaag 4560 tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat tcataatgat 4620 agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag tgaatagagt 4680 taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga ggggacccga 4740 caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat ccattcgatt 4800 agtgaacgga tctcgacggt atcgccgaat tcacaaatgg cagtattcat ccacaatttt 4860 aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca 4920 acagacatac aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt 4980 tattacaggg acagcagaga tccagg 5006 <210> 22 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCuag promoter <400> 22 gatctgttaa cttccccgaa gtagcaatgt atttcccaga aaaggaataa tccttctggg 60 aattctggcg aggtttccgg gaaagcagca ccgcccttgg ccgtcctgcc aatttcactt 120 tctagtttca ctttcccttt tgtaactaaa atgtaaatga cataggaaaa ctgaaaggga 180 gaagtgaaag tgggaaattc ctctgcatgc cttcttaaac atcacgagac tctaagaaaa 240 ggaaactgaa aacgggaaag tccctctctc taacctggca ctgcgtcgct ggcttggaga 300 caggtgacgg tccctgcggg ccttgtcctg attggctggg cacgcgttta atataagtgg 360 aggcgtcgcg ctggcgggca ttcctgaagc tgacagcatt cgggccgagt aacaactccg 420 ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata a 471 <210> 23 <211> 605 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 23 aattcccgat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 60 ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 120 tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta 180 tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc 240 aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt 300 ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 360 ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc 420 gcggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 480 ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 540 tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca 600 tcggg 605 <210> 24 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSPD40-ESXH <400> 24 Met Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Leu Val Leu Leu Thr Gln Pro Leu 1 5 10 15 Gly Tyr Leu Glu Ala Glu Met Lys Thr Tyr Ser His Arg Thr Met Pro 20 25 30 Ser Ala Cys Thr Leu Val Met Cys Ser Ser Val Glu Ser Gly Leu Pro 35 40 45 Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Arg Glu Gly Pro Arg Gly Glu Lys Gly 50 55 60 Asp Pro Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Gln Ala Gly Met Pro Gly Gln 65 70 75 80 Ala Gly Pro Val Gly Pro Lys Gly Asp Asn Gly Ser Val Gly Glu Pro 85 90 95 Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gln Ile 100 105 110 Met Tyr Asn Tyr Pro Ala Met Leu Gly His Ala Gly Asp Met Ala Gly 115 120 125 Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala Glu Ile Ala Val Glu Gln 130 135 140 Ala Ala Leu Gln Ser Ala Trp Gln Gly Asp Thr Gly Ile Thr Tyr Gln 145 150 155 160 Ala Trp Gln Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met Glu Asp Leu Val Arg Ala 165 170 175 Tyr His Ala Met Ser Ser Thr His Glu Ala Asn Thr Met Ala Met Met 180 185 190 Ala Arg Asp Thr Ala Glu Ala Ala Lys Trp Gly Gly Gly Ser Gly Gly 195 200 205 Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn 210 215 220 Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro 225 230 235 240 Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys 245 250 255 Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser 260 265 270 Leu Gly Gly Ser Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile 275 280 285 Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys 290 295 300 Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val 325 330 335 Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala 340 345 350 Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg 355 360 365 Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile 370 375 380 His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val 385 390 395 400 Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser 405 410 415 Phe Gly Leu Leu Lys Leu 420 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis 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Sequence <220> <223> sequence of Inf cluster <400> 32 gatctgttaa cttccccgaa gtagcaatgt atttcccaga aaaggaataa tccttctggg 60 aattctggcg aggtttccgg gaaagcagca ccgcccttgg ccgtcctgcc aatttcactt 120 tctagtttca ctttcccttt tgtaactaaa atgtaaatga cataggaaaa ctgaaaggga 180 gaagtgaaag tgggaaattc ctctg 205 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker motif <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 34 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Asn Gly Phe Ala Ser Leu Leu Arg Arg Asn Gln Phe Ile Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Phe Leu Leu Gln Ile Gln Ser Leu Gly Leu Asp Ile Asp Ser 20 25 30 Arg Pro Thr Ala Glu Val Cys Ala Thr His Thr Ile Ser Pro Gly Pro 35 40 45 Lys Gly Asp Asp Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Glu Glu Gly Lys His 50 55 60 Gly Lys Val Gly Arg Met Gly Pro Lys Gly Ile Lys Gly Glu Leu Gly 65 70 75 80 Asp Met Gly Asp Gln Gly Asn Ile Gly Lys Thr Gly Pro Ile Gly Lys 85 90 95 Lys Gly Asp Lys Gly Glu Lys Gly Leu Leu Gly Ile Pro Gly Glu Lys 100 105 110 Gly Lys Ala Gly Thr 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Gly Thr Pro Val Asn Tyr 195 200 205 Thr Asn Trp Tyr Arg Gly Glu Pro Ala Gly Arg Gly Lys Glu Gln Cys 210 215 220 Val Glu Met Tyr Thr Asp Gly Gln Trp Asn Asp Arg Asn Cys Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Arg Leu Thr Ile Cys Glu Phe 245 <210> 37 <211> 742 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Met Lys Asp Asp Phe Ala Glu Glu Glu Glu Val Gln Ser Phe Gly Tyr 1 5 10 15 Lys Arg Phe Gly Ile Gln Glu Gly Thr Gln Cys Thr Lys Cys Lys Asn 20 25 30 Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser Ile Ile Leu Leu Tyr Ile Leu Cys Ala 35 40 45 Leu Leu Thr Ile Thr Val Ala Ile Leu Gly Tyr Lys Val Val Glu Lys 50 55 60 Met Asp Asn Val Thr Gly Gly Met Glu Thr Ser Arg Gln Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Asp Lys Leu Thr Ala Val Glu Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Asp Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Lys Ala Ile Ser Thr Asn Ser Glu Leu Ser Thr Phe Arg 100 105 110 Ser Asp Ile Leu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Arg Glu Ile Thr Glu Lys 115 120 125 Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr Leu Glu Lys Leu Gln Ala Ser Gly Asp 130 135 140 Ala Leu Val Asp Arg Gln Ser Gln Leu Lys Glu 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<210> 44 <211> 154 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 44 Met Thr Pro Gly Leu Leu Thr Thr Ala Gly Ala Gly Arg Pro Arg Asp 1 5 10 15 Arg Cys Ala Arg Ile Val Cys Thr Val Phe Ile Glu Thr Ala Val Val 20 25 30 Ala Thr Met Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Ser Thr Ile Ser Ser Lys 35 40 45 Ala Asp Asp Ile Asp Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly 50 55 60 Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu Tyr Gly Gly Leu Gln Ile 65 70 75 80 Ser Gln Ala Thr Trp Asp Ser Asn Gly Gly Val Gly Ser Pro Ala Ala 85 90 95 Ala Ser Pro Gln Gln Gln Ile Glu Val Ala Asp Asn Ile Met Lys Thr 100 105 110 Gln Gly Pro Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser Ser Cys Ser Gln Gly Asp 115 120 125 Ala Pro Leu Gly Ser Leu Thr His Ile Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu 130 135 140 Thr Gly Gly Cys Ser Gly Ser Arg Asp Asp 145 150

Claims (20)

  1. 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈으로서, 상기 융합 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단으로 배열된 제1 재조합 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하고,
    (i) 상기 제1 재조합 폴리펩티드는, 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드와 융합된 제1 폴리펩티드의 다량체의 자가-조립을 가능하게 하기에 적합한 적어도 하나의 콜렉틴 또는 그의 단편을 포함하는 다량체화 스캐폴드를 포함하고;
    (ii) 상기 제2 폴리펩티드는, CD40L 엑토도메인 또는 그의 수용체 결합 단편, 특히 인간 CD40L의 CD40L 엑토도메인, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호 19의 CD40L 엑토도메인을 포함하는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 콜렉틴 또는 그의 단편은, N-말단으로부터 C-말단으로 배열된:
    - 콜렉틴의 적어도 하나의 가교 영역;
    - 콜렉틴의 적어도 하나의 콜라겐-유사 영역; 및
    - 콜렉틴의 적어도 하나의 목 영역;을 포함하는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  3. 제2항에 있어서,
    적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 콜렉틴의 콜라겐-유사 영역의 뉴클레오티드 시퀀스 내에 프레임내 융합되는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜렉틴 또는 그의 단편은 콜렉틴의 탄수화물 인식 도메인(CRD)-절두형(truncated form)이고, 상기 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드는 콜렉틴의 콜라겐-유사 영역 내에 삽입되는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩티드는, 특히 CCL20, CXCL9, CXCL10, CCL3, CCL4 및/또는 CCL5와 같은 전-염증성 Th1-연관 케모카인, 및/또는 CXCL20과 같은 Th17-촉진 케모카인, 또는 그의 수용체 결합 도메인 중에서 선택되는, 케모카인을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하며, 바람직하게는 상기 케모카인은 시퀀스 동정 번호 20의 CCL20 도메인이고, 특히 상기 케모카인 또는 그의 단편은 상기 콜렉틴의 콜렉틴-유사 도메인 내에 삽입되는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜렉틴은 만난-결합 렉틴(MBL), 계면활성제 단백질 D(SP-D), 계면활성제 단백질 A(SP-A), 콜렉틴 간 1(CL-L1), 콜렉틴 태반 1(CL-P1), 43 kDa의 교착소 콜렉틴(CL-43), 46 kDa의 콜렉틴(CL-46), 및 콜렉틴 신장 1(CL-K1)로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 콜렉틴은 MBL(시퀀스 동정 번호 17), SP-D(시퀀스 동정 번호 18), CL-L1(시퀀스 동정 번호 34), SP-A1(시퀀스 동정 번호 35), SP-A2(시퀀스 동정 번호 36), CL-P1(시퀀스 동정 번호 37) 및 CL-K1(시퀀스 동정 번호 38)로부터 선택되는 인간 콜렉틴인, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원성 폴리펩티드는 하나의 항원 또는 그의 면역원성 단편을 포함하는 단일-항원성 폴리펩티드이거나, 또는 적어도 2개의 항원 또는 그의 면역원성 단편을 포함하는 다-항원성 폴리펩티드인, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 항원 또는 그의 면역원성 단편은 박테리아, 기생충 또는 바이러스 병원체로부터 선택, 특히 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 인플루엔자 바이러스, 또는 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스로부터 선택되거나, 또는 종양 항원 또는 그의 면역원성 단편인, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원성 폴리펩티드는, EsxA, EspC, EsxH, PE19, 저산소 반응 단백질 1(Hrp1) 및 소생 촉진 인자 D(RpfD)으로부터 선택되는 하나 이상의 결핵균(Mtb) 항원 또는 그의 면역원성 단편을 포함하며, 특히 하기의 Mtb 항원성 조합들:
    (a) EsxH;
    (b) EsxH 및 EsxA;
    (c) EsxH, EsxA 및 PE19;
    (d) EsxH, EsxA, PE19 및 EspC;
    (e) EsxH, EsxA, PE19, EspC, Hrp1 및 RpfD;
    또는 이들의 면역원성 단편,
    중 하나를 포함하는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  10. 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈으로, 상기 게놈이 뉴클레오티드 시퀀스 시퀀스 동정 번호 21의 pTRIP 벡터 플라스미드로부터 수득되며, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서 기능하는 프로모터, 특히 CMV 프로모터, 인간 베타-2 마이크로글로불린 프로모터, 시퀀스 동정 번호 22의 복합 BCUAG 프로모터의 조절 하에 복제되며, 벡터는 선택적으로 우드척 간염 바이러스의 전사-후 조절 요소(WPRE)를 포함하는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    특히 상기 게놈은, 뉴클레오티드 시퀀스 시퀀스 동정 번호 21의 pTRIP 벡터 플라스미드 내에, 또는 2021년 2월 16일자로 번호 CNCM I-5657로 CNCM(Paris, France)에 기탁된 pFlap-SP1beta2m-GFP-WPREm 또는 그의 변종 내에 삽입되는, 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 입자.
  13. 제12항에 있어서,
    재조합 편입-결핍 렌티바이러스 벡터 입자(recombinant integration-deficient lentiviral vector particle)이고, 특히 재조합 편입-결핍 렌티바이러스 벡터가 HIV-1 기반 벡터이고 인테그라아제가 발현되지 않거나 기능적으로 발현되지 않도록 하는 방식으로 렌티바이러스의 게놈에서 인코팅된 인테그라아제 유전자의 돌연변이의 결과로서 편입 결핍이고, 특히 인테그라아제 유전자에서의 돌연변이가 인테그라아제의 아미노산 잔기 64에서 치환된, 특히 그 치환이 Pol에 의해 인코딩된 HIV-1 인테그라아제의 촉매 도메인에서의 D64V인, 인테그라아제의 발현을 유발하는, 재조합 렌티바이러스 벡터 입자.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 재조합 렌티바이러스 벡터 입자는, 복제-불능 가성형태 렌티바이러스 벡터(replication-incompetent pseudotyped lentiviral vector), 특히 복제-불능 가성형태 HIV-1 렌티바이러스 벡터이고, 특히 상기 벡터는 인디아나 또는 뉴저지 혈청형의 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G(V-SVG)로 가성형태화 되는, 재조합 렌티바이러스 벡터 입자.
  15. 제11항에 따른 DNA 플라스미드로 형질감염된 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포로서, 특히 상기 숙주 세포는 HEK-293T 세포주 또는 K562 세포주인, 숙주 세포.
  16. 포유동물 숙주에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물로서, 이를 필요로 하는 숙주, 특히 인간 숙주에 투여하기에 적합한 하나 이상의 약제학적으로 수용가능한 부형제(들)와 함께 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    이를 필요로 하는 숙주, 특히 인간 숙주에서, 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편에 대항하는 항체의 유도, 및/또는 세포성 및/또는 체액성 반응에 의한 보호적, 우선적으로는 예방적, 면역반응의 유도에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    면역 반응은 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포에 의한 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편의 MHC-II 제한 제시의 유도 및 CD4+-T-세포성 면역 반응의 유도를 포함하는, 약제학적 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    이를 필요로 하는 숙주, 특히 인간 숙주에서 병원체에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한, 약제학적 조성물.
  20. 하기의 단계를 포함하는, 약제학적 조성물, 특히 백신의 제조에 적합한 재조합 렌티바이러스 벡터 입자의 제조 방법:
    a) 숙주 세포, 예를 들어 HEK-293T 세포주 또는 K562 세포주에 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 렌티바이러스 벡터 게놈 또는 제11항에 따른 DNA 플라스미드를 운반하는 재조합 렌티바이러스 전달 벡터를 형질감염시키는 단계;
    b) 단계 a)의 세포를: (i) 외피 단백질을 인코딩하는 플라스미드 벡터 및 포장 작제물로서 렌티바이러스 GAG 및 POL 또는 돌연변이된 POL을 인코딩하는 플라스미드 벡터로; 그리고 (ii) VSV-G 인디아나(VSV-G Indiana) 또는 뉴저지 외피(New Jersey envelope)를 인코딩하는 플라스미드로 공동-형질감염시키는 단계;
    c) 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편을 발현하는 재조합 렌티바이러스 벡터 입자의 생산에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계;
    d) 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편을 발현하는 재조합 렌티바이러스 입자를 회수하는 단계.
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