JP2022106929A - Aav sflt-1を用いたamdの処置 - Google Patents
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Abstract
【課題】薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFlt-1)タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む医薬組成物を、ヒト対象へと網膜下投与することにより、ヒト対象において、AMDなどの眼の血管新生を防止または処置するための組成物および方法を提供すること。【解決手段】ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、VEGF阻害剤をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が前記核酸を含む、核酸が提供される。【選択図】なし
Description
配列表
本出願は、EFS-Webを介するASCIIフォーマットで提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2013年5月1日に作成された前記ASCIIコピーは、43016-702.201_SL.txtと名付けられ、84,779バイトのサイズである。
本出願は、EFS-Webを介するASCIIフォーマットで提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2013年5月1日に作成された前記ASCIIコピーは、43016-702.201_SL.txtと名付けられ、84,779バイトのサイズである。
加齢黄斑変性(AMD:age-related macular degeneration)は、50歳を超える人々における視覚の不可逆的な損傷の主要な原因のうちの1つである。AMDは、臨床的に「萎縮型」および「滲出型」という2つの種類へと分けられる。AMDの滲出形態は、急速に発症する可能性があり、失明を結果としてもたらすことが多い。疾患の病理学的変化は、重度の視覚機能障害を引き起こしうる。AMDの症状は、黄斑帯域内の網膜色素上皮(RPE:retinal pigment epithelial)細胞の機能不全および脈絡膜血管新生(CNV:choroidal neovascularization)を含みうるがこれらに限定されない。重度の症例では、流体漏出、RPEまたは神経上皮の剥離、および破裂した血管からの出血も生じうる。その中に血管内皮成長因子(VEGF:vascular endothelial
growth factor)、VEGF受容体(VEGFR:VEGF receptor)、血小板由来成長因子(PDGF)、低酸素誘導因子(HIF)、アンジオポエチン(Ang)および他のサイトカイン、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)などを含みうるがこれらに限定されない、多くの細胞因子が、CNV発生の調節において重要な役割を果たすことが見出されている。
growth factor)、VEGF受容体(VEGFR:VEGF receptor)、血小板由来成長因子(PDGF)、低酸素誘導因子(HIF)、アンジオポエチン(Ang)および他のサイトカイン、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)などを含みうるがこれらに限定されない、多くの細胞因子が、CNV発生の調節において重要な役割を果たすことが見出されている。
現在承認されている、滲出型AMDのための1つの処置は、Lucentis(登録商標)である。Lucentis(登録商標)とは、抗血管形成剤であり、血管内皮成長因子(VEGF)の全てのアイソフォームを標的とする。臨床研究は、偽処置を施された患者のうちの約60%と比較して、Lucentis(登録商標)投与された患者のうちの約95%における視覚の改善または安定を示している。Lucentis(登録商標)は、視覚を改善することが最初に承認された薬剤であるが、最適な視覚への有益性のためには、4週間ごとの硝子体内投与を要求する。Eylea(登録商標)とは、滲出型AMDを処置することが承認されている、別のVEGF阻害剤である。Eylea(登録商標)もまた、最適な視覚への有益性のためには、4~8週間ごとに高頻度の硝子体内注射を要求する。硝子体内投与経路は、投与の反復と共にそれらの累積的な危険性が増大する、感染性眼内炎および網膜剥離などの重篤な合併症に対する危険性を増大させる可能性がある。眼内圧の増大、外傷性白内障、および網膜裂傷もまた報告されている。最後に、処置が眼科医により送達される場合、処置頻度は、患者、医師、および医療システム一般に対する負担を決定し、可能な程度までこれを低減すべきである。当技術分野では、AMDに続発するCNVのために現在利用可能な治療の限界から、要求される高頻度の処置および処置手順の侵襲性に取り組む代替的な手法に対する必要が創出された。VEGFの上昇を伴う血管新生はまた、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫(DME:diabetic macular edema)、および網膜静脈閉塞症(RVO:retinal vein occlusion)など、他の眼病態ももたらしうる。これらの疾患は、網膜血管新生および視覚喪失をもたらす。Lucentis(登録商標)などのVEGF阻害剤は、DMEおよびRVOにおける有効性を裏付けているが、有益性を維持するためには、滲出型AMDの場合と同様に、高頻度の硝子体内投与を要求する。
本開示は、ヒト対象のAMDの滲出形態において見出されるCNVなどのCNVを処置するための組成物および方法を提供する。
一態様において、本開示は、薬学的有効量の、VEGF阻害剤を含む医薬組成物を、AMDの処置を必要とするヒト対象へと網膜下投与するステップを含む、ヒト対象におけるAMDを処置するための組成物および方法を提供する。一態様において、医薬組成物は、組換えウイルスを含む。別の態様では、VEGF阻害剤は、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1:soluble Fms-related tyrosine
kinase-1)タンパク質をコードする核酸を含む。
kinase-1)タンパク質をコードする核酸を含む。
一態様において、本開示は、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、AMDの処置を必要とするヒト対象へと網膜下投与するステップを含む、AMDを有するヒト対象におけるCNVを防止するための組成物および方法を提供する。
一部の態様では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス(AAV:adeno-associated virus)、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスから選択される。一部の態様では、AAVカプシドまたは逆位末端配列(ITR:inverted terminal repeats)は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される。
一部の態様では、組換えウイルスは、サイトメガロウイルス(CMV:cytomegalovirus)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV:Rous sarcoma virus)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む。
一部の態様では、組換えウイルスは、エンハンサーを含む。
一部の態様では、組換えウイルスは、イントロンまたはキメライントロンを含む。
一部の態様では、組換えウイルスは、SV40ポリA配列を含む。
一部の態様では、組換えウイルスは、ヒトsFlt-1タンパク質またはその機能的断片を含む。
一部の態様では、組換えウイルスを、アンピシリン耐性マーカーまたは非アンピシリン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する。
一部の態様では、組換えウイルスは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターなどの細菌性調節配列を含む。
一部の態様では、組換えウイルスは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターなどの細菌性調節配列を欠く。
一部の態様では、組換えウイルスは、眼細胞内のsFlt-1タンパク質またはその機能的断片の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む。
一部の態様では、医薬組成物は、約1×106~約1×1015の組換えウイルスベクターゲノム、約1×107~約1×1014の組換えウイルスベクターゲノム、約1×108~約1×1013の組換えウイルスベクターゲノム、約1×109~約3×1012の組換えウイルスベクターゲノム、または約1×1010~約3×1012の組換えウイルスベクターゲノムを含む。
一部の態様では、医薬組成物を、網膜下注射を介して投与する。
一部の態様では、方法は、薬学的有効量のVEGF阻害剤をヒト対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様では、VEGF阻害剤は、VEGFに対する抗体またはその機能的断片を含む。一部の態様では、VEGF阻害剤は、ラニビズマブを含む。一部の態様では、医薬組成物を、VEGF阻害剤を投与した、少なくとも5、6、7、または8日後に投与する。一部の態様では、医薬組成物を、VEGF阻害剤の投与後30、60、または90日以内に投与する。
一部の態様では、組換えウイルスを含む医薬組成物を投与する前に、VEGF阻害剤を1回投与し、投与後にも1~2回投与する。一部の態様では、医薬組成物を投与する前に、VEGF阻害剤を、少なくとも2回にわたり投与し、投与後にも1~2回投与する。一部の態様では、VEGF阻害剤を、6~7週間にわたり投与する。
一部の態様では、VEGF阻害剤は、ベバシズマブまたはラニビズマブなどの抗VEGF抗体である。他の態様では、VEGF阻害剤は、アフリベルセプトまたはsFLT01など、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの断片である。
一部の態様では、AMDは、滲出型AMDである。
一部の態様では、AMDは、萎縮型AMDである。
一部の態様では、ヒト対象は、滲出型AMDの危険性がある。
一部の態様では、ヒト対象は、早期滲出型AMDの症状を提示する。
一部の態様では、AMDを処置するための異なるVEGF阻害剤による少なくとも3、5、10、15、または20回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている。
一部の態様では、ラニビズマブによる前記処置後において、最高矯正視力(BCVA:best corrected visual acuity)は、改善しなかった。
一部の態様では、ラニビズマブによる前記処置後において、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study))文字により測定される最高矯正視力(BCVA)の改善は、1行を超える。
一部の態様では、ヒト対象は、早期萎縮型AMDの症状を提示する。
一部の態様では、処置を、少なくとも半年ごとに1回の頻度で投与する。
一部の態様では、投与ステップを、20、40、50、55、または65歳以上である前記ヒト対象において実行する。
一部の態様では、投与は、中心窩の外側の部位への投与である。
一部の態様では、投与は、中心網膜の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である。
一部の態様では、投与は、黄斑の外側の1または複数の細胞への投与である。
一部の態様では、投与は、黄斑の内側の1または複数の細胞への投与である。
一部の態様では、投与は、網膜色素上皮細胞への投与である。
一部の態様では、投与が、中心網膜の機能または中心網膜の構造に有害な影響を及ぼさない。
一部の態様では、投与は、ヒト対象におけるVEGF阻害剤の全身レベルを増大させない。
一部の態様では、投与は、ヒト対象におけるsFlt-1の全身レベルを増大させない。
一部の態様では、投与ステップを、両方の眼において同時にまたは逐次的に実行する。
一部の態様では、投与ステップを、一方の眼において実行する。
一部の態様では、対の眼がAMDの症状を提示する場合、投与ステップを一方の眼においても実行する。
一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対して耐性のヒト対象において実行する。
一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対して感受性のヒト対象において実行する。
一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性のヒト対象において実行する。
一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性でないヒト対象において実行する。
一部の態様では、投与ステップは、投与ステップ後において生体顕微鏡法(BE)および間接検眼鏡法(IOE)により観察される、硝子体の炎症を引き起こさない。
一部の態様では、投与ステップは、細胞傷害性T細胞応答を引き起こさない。
一部の態様では、投与ステップは、ベースラインの範囲を10%未満超える細胞傷害性T細胞の増大を尺度とする、細胞傷害性T細胞応答を引き起こさない。
一部の態様では、T細胞は、投与ステップ後において、活性化したエフェクターの表現型を提示しない。
一部の態様では、投与ステップ後において、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定される最高矯正視力(BCVA)は、1、2、3、4、または5行以上改善する。
一部の態様では、血管新生の低減は、投与ステップ後において、フルオレセイン血管造影(FA:fluorscein angiography)を使用して観察される。
一部の態様では、ラニビズマブの投与頻度は、1年間当たり12回未満まで低減される。一部の態様では、アフリベルセプトの投与頻度は、1年間当たり6回未満まで低減される。
一部の態様では、ラニビズマブもしくはアフリベルセプトまたは他のVEGF阻害剤を、頻度を低減させて投与するか、またはもはや投与しない。
一部の態様では、ウイルスは、ヒトsFLT-1遺伝子配列に対する配列相同性が≧90%であるsFLT-1遺伝子またはその機能的断片を含む。
一部の態様では、投与されるウイルスは、sFLT-1遺伝子、遺伝子変異体、または遺伝子断片を含む。
一部の態様では、医薬組成物を投与した7、14、21、または30日後において、ヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中にベクターが検出されない。
一部の態様では、ウイルスベクターの存在を、qPCRまたはELISAにより検出する。
一部の態様では、ヒト対象の硝子体中のsFlt-1タンパク質レベルは、医薬組成物を投与した7、14、21、または30日後において、約500~5,000pg/ml、約600~4,000pg/ml、約800~3,000pg/ml、約900~2,000pg/ml、または約1,000~1,800pg/mlである。一部の態様では、医薬組成物を投与した7、14、31、30、60、90、180、270、および365日後において、ヒト対象の硝子体中の、sFlt-1タンパク質濃度ともまた称しうるsFlt-1タンパク質レベルは上昇する。
一部の態様では、ヒト対象は、少なくとも2カ月間にわたる連続的な眼検査により評価される通り、臨床的に重大な網膜毒性を示さない。
一部の態様では、少なくとも2カ月間にわたり、ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候は存在しない。
一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスを投与した、少なくとも120日後において、VEGF阻害剤による救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスの前記投与の少なくとも180日後または少なくとも210日後において、VEGF阻害剤による救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスの投与後少なくとも270日間にわたり、VEGF阻害剤による救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスの投与後少なくとも365日間にわたり、VEGF阻害剤による救済処置を必要としない。
一部の態様では、組換えウイルスの前記投与の少なくとも180日後または少なくとも210日後の前記ヒト対象において、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。一部の態様では、組換えウイルスを投与した、少なくとも365日後の前記ヒト対象において、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。
別の態様では、本開示は、約1×106~約1×1015個の組換えウイルスを含む医薬組成物であって、組換えウイルスの各々が、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFlt-1)タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、sFLT-1をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の1または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、萎縮型AMD、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される1または複数の状態を有するか、または有することが疑われるヒト対象を提供する。場合によって、ヒト対象は、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、分枝性網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される、1または複数の状態を有するか、または有することが疑われる。
一部の態様では、本開示は、組換えウイルスを含む医薬組成物であって、ウイルスが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスからなる群から選択される医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結した、sFLT-1をコードする核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、sFLT-1が少なくとも1つの二量体化ドメインをコードする、sFLT-1核酸を提供する。場合によって、sFLT-1核酸は、原核生物調節配列を含有しない。場合によって、sFLT-1核酸は、原核生物調節配列を含有する。
一部の態様では、本開示は、ウイルスまたはプラスミドを含む医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、ヒト対象への、VEGF阻害剤による1回または複数回の処置の投与を提供する。場合によって、VEGF阻害剤を、医薬組成物の投与から30、90、または180日以内に投与する。場合によって、本開示の医薬組成物とVEGF阻害剤とを、少なくとも24時間隔てて投与する。
一部の態様では、本開示は、少なくとも55歳のヒト対象に投与される医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、中心窩の外側への、医薬組成物の投与を提供する。
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与後において、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定される、ヒト対象の最高矯正視力(BCVA)が、少なくとも1、2、3、4、または5行改善することを提供する。
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与後において、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)により測定される、最高矯正視力(BCVA)の低下が、15文字より少ないことを提供する。
一部の態様では、本開示は、医薬組成物を一方の眼に投与する条件、医薬組成物を2つの眼に逐次的に投与する条件、および医薬組成物を2つの眼に同時に投与する条件からなる群から選択される条件下における医薬組成物の投与を提供する。
一部の態様では、本開示は、フルオレセイン血管造影(FA)により観察される血管新生の低減が、医薬組成物の投与に後続することを提供する。
一部の態様では、本開示は、注射の少なくとも1週間後のヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候は存在しないことを提供する。
一部の態様では、本開示は、医薬組成物を投与した1週間後または3、6、9、もしくは12カ月後のヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候が存在しないことを提供する。
一部の態様では、本開示は、ヒト対象が、医薬組成物の投与後少なくとも30、60、90、120、180、270、または365日間にわたり、救済処置を必要としないことを提供する。
一部の態様では、本開示は、ヒト対象が、医薬組成物を投与した後で、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、眼内または全身免疫応答を経ないことを提供する。
一部の態様では、本開示は、投与ステップ後において、抗AAV細胞傷害性T細胞応答の増大が測定されないことを提供する。
一部の態様では、本開示は、ウイルスが、医薬組成物を投与した3、7、14、21、または30日後のヒト対象の血液、唾液、または尿試料中に検出されないことを提供する。
一部の態様では、本開示は、ヒト対象に医薬組成物を投与した7、14、21、30、60、90、120、150、180、270、または365日後において、ヒト対象の硝子体中のsFLT-1タンパク質レベルが約500~5,000pg/mlであることを提供する。
一部の態様では、本開示は、ヒト対象に、医薬組成物の投与の前に、VEGF阻害剤による1回または複数回の処置を施すことを提供する。
一部の態様では、本開示は、VEGF阻害剤による処置に対して耐性であるものとしてのヒト対象を提供する。
一部の態様では、本開示は、医薬組成物を投与する前に、VEGF阻害剤をあらかじめ施されていないヒト対象を提供する。
一部の態様では、本開示は、ヒト対象における、1年間に3回未満の頻度の医薬組成物の投与を提供する。
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与により、ヒト対象における、さらなるVEGF阻害剤による処置の投与頻度が低減されることを提供する。
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与の7、14、21、30、60、90、120、150、180、270、または365日後において測定する場合に、ヒト対象の硝子体中のsFLT-1タンパク質の濃度が上昇することを提供する。
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与の前に、またはその1日以内もしくは1週間以内に硝子体ゲルが除去されているヒト対象を提供する。
一部の態様では、本開示は、20ゲージより小さい硝子体切除システムを使用して投与される医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、縫合を必要としない硝子体切除システムを使用して投与される医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、39ゲージより小さいカニューレチップを使用して投与される医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、硝子体腔内のガス/液体交換を後続させる医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、前記薬理作用剤による処置後12カ月以内における対象の網膜中心厚が、50ミクロン、100ミクロン、または250ミクロンを超えて増大しないことを提供する。
一部の態様では、本開示は、ヒト対象の罹患眼において、地図状萎縮が、処置されていないヒト対象の罹患眼と比較して進行しないことを提供する。
一部の態様では、本開示は、sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した、少なくとも1つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含む医薬組成物を提供する。場合によって、本開示の医薬組成物は、300塩基対を超える配列により隔てられたプロモーター配列とsFLT-1導入遺伝子配列とを含む。場合によって、本開示の医薬組成物は、UTR配列により隔てられたプロモーター配列とsFLT-1導入遺伝子配列とを含む。場合によって、UTR配列は、少なくとも10塩基対を含む。場合によって、医薬組成物は、各々が少なくとも50塩基対を含む、少なくとも3つのリンカー配列を含む。
一部の態様では、本開示は、sFlt-1核酸が、少なくとも1つの二量体化ドメインをコードする医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号340、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、および配列番号47からなる群から選択されるプロモーター配列;配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、および配列番号108からなる群から選択される、VEGF阻害剤をコードする配列;配列番号48、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、および配列番号119からなるイントロン配列;配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;ならびに配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群から選択される終結配列を含む医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、1×106~1×1015のベクターゲノムを有する組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結したsFLT-1をコードする核酸を含む単位用量の医薬組成物を提供する。場合によって、単位用量の医薬組成物は、1×1010~3×1012のベクターゲノムを含む。
一部の態様では、本開示は、細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列、ITR配列、およびUTR配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、組換えウイルスを精製するステップとを含む方法を提供する。場合によって、UTR配列は、ヒトUTR配列である。場合によって、核酸配列は、ベータ-ラクタム抗生剤耐性配列を含有しない。場合によって、HEK293細胞に、1×106の感染多重度(MOI:multiplicity of infection)で形質導入した72時間後において測定した場合、組換えウイルスは、sFLT-1タンパク質を、100~10,000pg/mLの範囲で産生する。場合によって、組換えウイルスは、ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC:human umbilical vascular endothelial cell)の増殖を阻害する。
一部の態様では、本開示は、組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ITRポリヌクレオチド配列、およびUTRポリヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。
一部の態様では、本開示は、ヒトにおける眼の血管新生の処置または予防における使用のための、sFLT-1をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、前記sFLT-1が、VEGF阻害剤であり、眼の血管新生の可能性の前記処置または低減が、VEGF阻害の結果として生じる使用のための核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のsFLT-1タンパク質のレベルを、前記医薬組成物の、前記ヒト対象への投与の少なくとも72時間後に、前記投与前における前記ヒトの硝子体中のsFLT-1タンパク質のレベルと比較して上昇させることが可能な使用のための核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、前記sFLT-1を含む核酸が、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む使用のための核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、sFLT-1をコードする核酸が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、使用のための核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、核酸がウイルスによりパッケージングされるか、またはプラスミドDNAである使用のための核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、使用のための核酸を提供する。前記使用が、処置または低減を必要とするヒト対象への、1または複数のさらなるVEGF阻害剤の投与をさらに含み、必要に応じて、前記さらなるVEGF阻害剤は、ラニビズマブまたはベバシズマブである。
一部の態様では、本開示は、前記医薬組成物を、少なくとも50、55、または65歳のヒト対象に投与するステップを含む使用のための核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、前記医薬組成物を中心窩の外側に投与するステップを含む使用のための核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、有効量の医薬組成物の投与後において、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定される、処置を必要とするヒト対象の最高矯正視力(BCVA)が、少なくとも1、2、3、4、または5行改善する使用のための核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、処置を必要とするヒト対象において、医薬組成物の投与を、3、6、9、12、18、または24カ月ごとに少なくとも1回の頻度で実施する使用のための核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与を、ヒト対象において、1年間に3回未満の頻度で実施するか、またはヒト対象における、さらなるVEGF阻害剤による処置の投与頻度を低減する頻度で実施する使用のための核酸を提供する。
一部の態様では、本開示は、約1×106~1×1015または1×1010~3×1012のベクターゲノムを含む単位用量の医薬組成物を提供する。一部の態様では、組換えウイルスは、プロモーターに作動的に連結した、sFLT-1をコードする核酸またはその機能的断片を含む。
一部の態様では、本開示は、ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、VEGF阻害剤をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の1または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、VEGF阻害剤は、抗VEGF抗体またはその機能的断片である。一部の態様では、VEGF阻害剤は、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの機能的断片である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、VEGF阻害剤をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸。
(項目2)
前記VEGF阻害剤が、抗VEGF抗体またはその機能的断片である、項目1に記載の使用のための核酸。
(項目3)
前記VEGF阻害剤が、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの断片である、項目1に記載の使用のための核酸。
(項目4)
ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、sFLT-1をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸。
(項目5)
前記sFLT-1が、VEGF阻害剤であり、眼の血管新生の可能性の前記処置または低減が、VEGF阻害の結果として生じる、項目4に記載の使用のための核酸。
(項目6)
前記医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のsFLT-1タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への前記医薬組成物の投与後の少なくとも72時間後に、前記投与前における前記ヒトの硝子体中のsFLT-1タンパク質のレベルと比較して上昇させることが可能である、項目4に記載の使用のための核酸。
(項目7)
前記sFLT-1を含む前記核酸が、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目8)
前記組換えウイルスが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択されるAAVである、項目7に記載の使用のための核酸。
(項目9)
前記sFLT-1をコードする前記核酸が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目10)
プラスミドであるか、またはウイルスベクターにより送達される、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目11)
前記使用が、処置または低減を必要とする前記ヒト対象への、1または複数のさらなるVEGF阻害剤の投与をさらに含み、必要に応じて、前記さらなるVEGF阻害剤が、ラニビズマブ、ベバシズマブ、またはアフリベルセプトである、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目12)
前記使用が、前記医薬組成物を、少なくとも55歳のヒト対象へと投与するステップを含む、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目13)
前記使用が、前記医薬組成物を中心窩の外側に投与するステップを含む、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目14)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの、処置を必要とする前記ヒト対象の最高矯正視力(BCVA)が、有効量の前記医薬組成物の前記投与後において、少なくとも1、2、3、4、または5行改善する、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目15)
前記医薬組成物の前記投与により、他の抗VEGF療法の投与頻度が低減される、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目16)
他の抗VEGF療法の前記投与が、3カ月当たり1回未満、または6カ月当たり1回未満、または1年当たり1回未満である、項目15に記載の核酸。
(項目17)
前記医薬組成物の前記投与が、前記ヒトにおいて、1年間に3回未満の頻度で実施される、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目18)
組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記単位が少なくとも1×1010~3×1012のベクターゲノムを含み、前記組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結した前記sFLT-1をコードする核酸を含み、前記単位用量が、ヒト対象の硝子体中のsFLT-1タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への投与後の少なくとも7日後に上昇させることが可能である、単位用量の医薬組成物。
(項目19)
組換えウイルスまたはプラスミドを含む医薬組成物であって、各組換えウイルスまたはプラスミドが核酸を含み、前記核酸が、プロモーター配列に作動的に連結したsFLT-1導入遺伝子配列を含み、前記医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のsFLT-1タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への投与後の少なくとも7日後に上昇させることが可能である、医薬組成物。
(項目20)
前記プロモーター配列と、前記sFLT-1導入遺伝子配列とが、300塩基対を超える配列により隔てられている、項目19に記載の医薬組成物。
(項目21)
前記プロモーター配列と、前記sFLT-1導入遺伝子配列とが、UTR配列により隔てられている、項目19に記載の医薬組成物。
(項目22)
以下の順序:
a.配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32からなる群から選択されるプロモーター配列;
b.配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107配列番号108または配列番号122からなる群から選択される、VEGF阻害剤をコードする配列;
c.配列番号48、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119または配列番号120からなるイントロン配列;
d.配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;および
e.配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群から選択される終結配列
で核酸エレメントを含む医薬組成物。
(項目23)
以下の順序:
a.配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59からなる群から選択されるITR配列;
b.配列番号60、配列番号63、配列番号68、配列番号72、配列番号76、配列番号77、および配列番号84からなる群から選択されるリンカー配列;
c.配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46および配列番号47からなる群から選択されるプロモーター配列;
d.配列番号60、配列番号64、配列番号70、配列番号71、配列番号73、配列番号74、配列番号87からなる群から選択されるリンカー配列;
e.配列番号48、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119および配列番号120からなるイントロン配列;
f.配列番号60、配列番号64、配列番号65、配列番号75、配列番号79、配列番号81、配列番号82、および配列番号89からなる群から選択されるリンカー配列;
g.配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;ならびに
h.配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108および配列番号122からなる群から選択される、VEGF阻害剤をコードする配列;
i.配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;
j.配列番号60、配列番号62、配列番号66、配列番号67、配列番号69、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86からなる群から選択されるリンカー配列;
k.配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群から選択される終結配列;
l.配列番号60、配列番号61、配列番号80、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90からなる群から選択されるリンカー配列;ならびに
m.配列番号56、配列番号57、配列番号58、および配列番号59からなる群から選択されるITR配列
で核酸エレメントを含む医薬組成物。
(項目24)
細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、
a.sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列、ITR配列、およびUTR配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、
b.前記組換えウイルスを精製するステップと
を含む方法。
(項目25)
組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ITRポリヌクレオチド配列、およびUTRポリヌクレオチド配列を含む細胞。
(項目26)
ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、VEGF阻害剤をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の1または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法。
(項目27)
前記VEGF阻害剤が、VEGFに対する抗VEGF抗体またはその機能的断片である、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記VEGF阻害剤が、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの機能的断片である、項目26に記載の方法。
(項目29)
ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、sFLT-1をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の1または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法。
(項目30)
前記ヒト対象が、加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、萎縮型AMD、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、1または複数の状態を有するか、または有することが疑われる、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記ヒト対象が、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、分枝性網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される、1または複数の状態を有するか、または有することが疑われる、項目29に記載の方法。
(項目32)
前記医薬組成物が、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む、項目29に記載の方法。
(項目33)
前記sFLT-1をコードする前記核酸が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、項目29に記載の方法。
(項目34)
前記sFLT-1核酸が、少なくとも1つの二量体化ドメインをコードする、項目29に記載の方法。
(項目35)
前記核酸が、原核生物調節配列を含有しない、項目29に記載の方法。
(項目36)
前記核酸が、原核生物調節配列を含有する、項目29に記載の方法。
(項目37)
前記核酸が、プラスミドであるか、またはウイルスにより送達される、項目29に記載の方法。
(項目38)
前記ヒト対象への、VEGF阻害剤による1回または複数回の処置の投与をさらに含む、項目29に記載の方法。
(項目39)
前記VEGF阻害剤を、前記医薬組成物の投与から30日以内、90日以内、または180日以内に投与する、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記医薬組成物と前記VEGF阻害剤とを、少なくとも24時間隔てて投与する、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記医薬組成物を、少なくとも55歳のヒト対象へと投与する、項目29に記載の方法。
(項目42)
前記投与を中心窩の外側で実施する、項目29に記載の方法。
(項目43)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの前記ヒト対象の最高矯正視力(BCVA)が、前記医薬組成物の前記投与後において少なくとも1、2、3、4、または5行改善する、項目29に記載の方法。
(項目44)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が、前記医薬組成物の前記投与後において15文字より少なく低下する、項目29に記載の方法。
(項目45)
前記医薬組成物の投与を、前記医薬組成物を一方の眼に投与する条件、前記医薬組成物を2つの眼に逐次的に投与する条件、および前記医薬組成物を2つの眼に同時に投与する条件からなる群から選択される条件下で実施する、項目29に記載の方法。
(項目46)
フルオレセイン血管造影(FA)により観察したときの血管新生の低減が、前記医薬組成物の前記投与に後続する、項目29に記載の方法。
(項目47)
注射の少なくとも1週間後の前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候がいずれも存在しない、項目29に記載の方法。
(項目48)
前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与後少なくとも30、60、90、120、180、270、または365日間にわたり救済処置を必要としない、項目29に記載の方法。
(項目49)
前記投与ステップ後において、抗AAV細胞傷害性T細胞応答の増大が測定されない、項目32に記載の方法。
(項目50)
ウイルスが、前記医薬組成物を投与した3、7、14、21、または30日後において、前記ヒト対象の血液、唾液、または尿のいずれの試料中にも検出されない、項目32に記載の方法。
(項目51)
前記ヒト対象に前記医薬組成物を投与した7、14、21、30、60、90、120、150、180、270、または365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約500~5,000pg/mlである、項目29に記載の方法。
(項目52)
前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与の前に、VEGF阻害剤による1回または複数回の処置を施されている、項目29に記載の方法。
(項目53)
前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与の前に、VEGF阻害剤による処置をあらかじめ施されていない、項目29に記載の方法。
(項目54)
前記医薬組成物の前記投与が、前記ヒト対象において、1年間に3回未満の頻度で実施される、項目29に記載の方法。
(項目55)
前記医薬組成物の前記投与により、前記ヒト対象における、さらなるVEGF阻害剤による処置の投与頻度が低減される、項目29に記載の方法。
(項目56)
前記医薬組成物の前記投与の7、14、21、30、60、90、120、150、180、270、または365日後において測定する場合に、前記ヒト対象の前記硝子体中のsFLT-1タンパク質の濃度が上昇する、項目29に記載の方法。
(項目57)
前記薬剤の前記投与の前に、または前記投与の1週間以内に前記ヒト対象の硝子体ゲルが除去されている、項目29に記載の方法。
(項目58)
前記薬理作用剤を、20ゲージより小さい硝子体切除システムを使用して投与する、項目29に記載の方法。
(項目59)
前記薬理作用剤を、39ゲージより小さいカニューレチップを使用して投与する、項目29に記載の方法。
(項目60)
前記薬理作用剤による処置後12カ月以内における、前記対象の網膜中心厚が、50ミクロン、100ミクロン、または250ミクロンを超えて増大しない、項目29に記載の方法。
(項目61)
前記ヒト対象の罹患眼において、地図状萎縮が進行しない、項目29に記載の方法。
(項目62)
前記ヒト対象が、ペニシリンに対する感受性またはアレルギーを有する、項目29に記載の方法。
(項目63)
前記ヒト対象のVEGF阻害剤の全身レベルが増大しない、項目29に記載の方法。
(項目64)
sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含み、前記プロモーター配列と、前記sFLT-1導入遺伝子配列とが、300塩基対を超える配列により隔てられている、医薬組成物。
(項目65)
sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含み、前記プロモーター配列と、前記sFLT-1導入遺伝子配列とが、UTR配列により隔てられている、医薬組成物。
(項目66)
前記UTR配列が、少なくとも10塩基対を含む、項目65に記載の医薬組成物。
(項目67)
前記核酸が、各々が少なくとも50塩基対を含む、少なくとも3つのリンカー配列を含む、項目66に記載の医薬組成物。
(項目68)
1×1010~3×1012のベクターゲノムの組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結したsFLT-1をコードする核酸を含む、単位用量の医薬組成物。
(項目69)
細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、
a.sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列、ITR配列、およびUTR配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、
b.前記組換えウイルスを精製するステップと
を含む方法。
(項目70)
前記核酸配列が、ベータ-ラクタム抗生剤耐性配列を含有しない、項目69に記載の方法。
(項目71)
HEK293細胞に、1×104~1×106の感染多重度で形質導入した72時間後において測定した場合、前記組換えウイルスが、sFLT-1タンパク質を、100~10,000pg/mLの範囲で産生する、項目69に記載の方法。
(項目72)
前記組換えウイルスが、ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)の増殖を阻害する、項目69に記載の方法。
(項目73)
組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ITRポリヌクレオチド配列、およびUTRポリヌクレオチド配列を含む細胞。
(項目74)
前記医薬組成物を投与した1週間後または3、6、9、もしくは12カ月後の前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体のいずれにおける炎症の徴候も存在しない、項目29に記載の方法。
(項目75)
前記ヒト対象が、前記医薬組成物を投与した後で、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、眼内または全身免疫応答のいずれも経験しない、項目29に記載の方法。
(項目76)
前記ヒト対象が、VEGF阻害剤による処置に対して耐性である、項目29に記載の方法。
(項目77)
前記薬理作用剤を、縫合を必要としない硝子体切除システムを使用して投与する、項目29に記載の方法。
(項目78)
前記薬理作用剤の前記投与の後に、硝子体腔内のガス/液体交換を行う、項目29に記載の方法。
(項目79)
ヒト対象における眼の血管新生を処置または低減するための方法であって、
薬学的有効量の、VEGF阻害剤をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
(項目80)
ヒト対象における眼の血管新生を処置または低減するための方法であって、
薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
(項目81)
ヒト対象における眼の血管新生を防止するための方法であって、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、ヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
(項目82)
AMDを伴うヒト対象における脈絡膜血管新生を処置または低減するための方法であって、
薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、AMDの処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
(項目83)
萎縮型AMDを伴うヒト対象における脈絡膜血管新生を防止するための方法であって、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、ヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
(項目84)
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスから選択される、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目85)
前記AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目86)
前記組換えウイルスを、カナマイシン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目87)
前記組換えウイルスを、アンピシリン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目88)
前記組換えウイルスを、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含むプラスミドから生成する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目89)
前記組換えウイルスを、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含まないプラスミドから生成する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目90)
前記組換えウイルスが、アンピシリン耐性マーカーを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目91)
前記組換えウイルスが、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目92)
前記組換えウイルスが、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含まない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目93)
前記組換えウイルスが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目94)
前記組換えウイルスが、エンハンサーを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目95)
前記組換えウイルスが、キメライントロンを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目96)
前記組換えウイルスが、SV40ポリA配列を含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目97)
前記組換えウイルスが、ヒトsFLT-1タンパク質またはその機能的断片を含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目98)
前記組換えウイルスが、眼細胞内の前記sFLT-1タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目99)
前記医薬組成物が、約1×106~約1×1015個の組換えウイルスを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目100)
前記医薬組成物が、約1×107~約1×1014個の組換えウイルスを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目101)
前記医薬組成物が、約1×108~約1×1013個の組換えウイルスを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目102)
前記医薬組成物が、約1×109~約1×1012個の組換えウイルスを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目103)
前記医薬組成物が、約1×1010~約1×1012個の組換えウイルスを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目104)
前記医薬組成物を、網膜下注射を介して投与する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目105)
前記ヒト対象へと、薬学的有効量のVEGF阻害剤を投与するステップをさらに含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目106)
前記VEGF阻害剤が、VEGFに対する抗体またはその機能的断片を含む、項目105に記載の方法。
(項目107)
前記VEGF阻害剤が、ラニビズマブを含む、項目105に記載の方法。
(項目108)
前記医薬組成物を、前記VEGF阻害剤の投与の90日以内に投与する、項目105に記載の方法。
(項目109)
前記医薬組成物を、前記VEGF阻害剤を投与した、少なくとも5、6、7、または8日後に投与する、項目105に記載の方法。
(項目110)
前記VEGF阻害剤を、前記医薬組成物を投与する前に少なくとも1回投与する、項目105に記載の方法。
(項目111)
前記VEGF阻害剤を、前記医薬組成物の投与後に少なくとも1回投与する、項目105に記載の方法。
(項目112)
前記VEGF阻害剤を、前記VEGF阻害剤の投与の90日以内に少なくとも2回投与する、項目105に記載の方法。
(項目113)
前記VEGF阻害剤を、6~7週間の期間にわたり投与する、項目105に記載の方法。
(項目114)
前記AMDが、滲出型AMDである、項目82に記載の方法。
(項目115)
前記ヒト対象が、加齢黄斑変性を発症する危険性がある、項目81に記載の方法。
(項目116)
前記ヒト対象が、早期加齢黄斑変性の症状を提示する、項目81に記載の方法。
(項目117)
前記ヒト対象が、AMDを処置するための異なるVEGF阻害剤であらかじめ処置されている、項目80または82に記載の方法。
(項目118)
前記ヒト対象の前記処置された眼が、AMDを処置するための異なるVEGF阻害剤であらかじめ処置されていない、項目81または83に記載の方法。
(項目119)
AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも5回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目80または82に記載の方法。
(項目120)
AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも10回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目80または82に記載の方法。
(項目121)
AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも15回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目80または82に記載の方法。
(項目122)
AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも20回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目80または82に記載の方法。
(項目123)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が、前記医薬組成物による前記処置後において15文字より少なく低下した、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目124)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が、ラニビズマブによる前記処置後において2行未満改善された、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目125)
前記ヒト対象が、萎縮型加齢黄斑変性を発症する危険性がある、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目126)
前記ヒト対象が、早期萎縮型加齢黄斑変性の症状を提示する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目127)
前記処置を、12カ月当たり1回未満の頻度で投与する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目128)
前記処置を、6カ月当たり1回未満の頻度で投与する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目129)
前記処置を、18カ月当たり1回未満の頻度で投与する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目130)
前記投与ステップを、20歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目131)
前記投与ステップを、40歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目132)
前記投与ステップを、50歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目133)
前記投与ステップを、65歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目134)
前記投与が、中心窩を含まない部位への投与である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目135)
前記投与が、中心窩に隣接する中心網膜における投与である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目136)
投与が、中心網膜の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である、項目80に記載の方法。
(項目137)
投与が、黄斑の外側の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目138)
前記投与が、黄斑の内側の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目139)
前記投与が、網膜色素上皮細胞への投与である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目140)
前記投与が、中心網膜の機能または中心網膜の構造に有害な影響を及ぼさない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目141)
前記投与ステップを、両眼において同時に実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目142)
前記投与ステップを、両眼において逐次的に実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目143)
前記投与ステップを、一方の眼において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目144)
対の眼がAMDの症状を提示する場合、投与ステップを一方の眼において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目145)
前記投与ステップを、ペニシリンに対して耐性の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目146)
前記投与ステップを、ペニシリンに対して感受性の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目147)
前記投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目148)
前記投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性でない前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目149)
前記医薬組成物を投与した3、7、14、21、または30日後において、ベクターが、前記ヒト対象の血液、唾液、または尿のいずれの試料中でも検出されない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目150)
前記ウイルスベクターの存在を、qPCRまたはELISAにより検出する、項目149に記載の方法。
(項目151)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約500~5,000pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目152)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、ま365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約600~4,000pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目153)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約800~3,000pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目154)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約900~2,000pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目155)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約1,000~1,800pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目156)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約4,00~1,000pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目157)
前記ヒト対象が、少なくとも2カ月間の期間にわたる連続的な眼検査により評価したときに、臨床的に重大な網膜毒性を示さない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目158)
少なくとも2カ月間の期間にわたり、前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体のいずれにおける炎症の徴候も存在しない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目159)
前記ヒト対象が、前記投与後少なくとも120日間にわたり救済処置を必要としない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目160)
前記投与後少なくとも120日間にわたり、前記ヒト対象において、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答のいずれの証拠も見られない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目161)
前記投与ステップ後において、生体顕微鏡法(BE)および間接検眼鏡法(IOE)により、硝子体の炎症が観察されない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目162)
細胞傷害性T細胞応答が、前記投与ステップに後続しない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目163)
正常範囲の10%以内の細胞傷害性T細胞応答が、前記投与ステップに後続しない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目164)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が前記投与ステップ後に改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目165)
BCVAが、1行以上改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目166)
BCVAが、少なくとも2行以上改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目167)
BCVAが、少なくとも3行以上改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目168)
BCVAが、少なくとも4行以上改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目169)
BCVAが、少なくとも5行以上改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目170)
フルオレセイン血管造影(FA)により観察したときの血管新生の低減が、前記投与ステップに後続する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目171)
他の抗VEGF療法の投与頻度が低減される、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目172)
他の抗VEGF療法の投与頻度が月1回未満である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目173)
他の抗VEGF療法の投与頻度が3カ月未満である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目174)
他の抗VEGF療法の投与頻度が6カ月未満である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目175)
他の抗VEGF療法の投与頻度が1年未満である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目176)
約1×106~1×1015個の組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記各組換えウイルスが、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む、単位用量の医薬組成物。
(項目177)
約1×1010~約3×1012個の組換えウイルスを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目178)
約1×107~約1×1014個の組換えウイルスを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目179)
約1×108~約1×1013個の組換えウイルスを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目180)
約1×109~約1×1012個の組換えウイルスを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目181)
約1×1010~約1×1012個の組換えウイルスを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目182)
前記sFLT-1タンパク質が、ヒトsFLT-1タンパク質またはその機能的断片を含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目183)
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスから選択される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目184)
前記AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目185)
前記組換えウイルスが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目186)
前記組換えウイルスが、エンハンサーを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目187)
前記組換えウイルスが、イントロンを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目188)
前記組換えウイルスが、SV40ポリAを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目189)
前記組換えウイルスが、眼細胞内の前記sFLT-1タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目190)
前記組換えウイルスが、界面活性剤と共に製剤化される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目191)
前記組換えウイルスが、プロデューサークローン法を使用して製造される、項目168に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目192)
前記組換えウイルスが、組換えバキュロウイルスを使用して製造される、項目168に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目193)
前記組換えウイルスが、Ad-AAVを使用して製造される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目194)
前記組換えウイルスが、HEK293細胞を使用して製造される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目195)
前記組換えウイルスが、昆虫細胞を使用して製造される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目196)
前記組換えウイルスが、ヘルペスヘルパーウイルスを使用して製造される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目197)
ヒト対象における眼の血管新生または黄斑浮腫を処置、低減、または防止する方法であって、薬学的有効量の、抗血管形成性因子の発現を指示する組換えAAV遺伝子送達ベクターを含む医薬組成物を、前記ベクターの投与がヒト対象における血管新生または黄斑浮腫を阻害するように網膜下投与するステップを含む方法。
(項目198)
前記投与ステップを、B型肝炎またはC型肝炎のいずれによる感染歴もない前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目199)
前記医薬組成物の投与の7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、または365日後において測定したときに、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが上昇する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、VEGF阻害剤をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸。
(項目2)
前記VEGF阻害剤が、抗VEGF抗体またはその機能的断片である、項目1に記載の使用のための核酸。
(項目3)
前記VEGF阻害剤が、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの断片である、項目1に記載の使用のための核酸。
(項目4)
ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、sFLT-1をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸。
(項目5)
前記sFLT-1が、VEGF阻害剤であり、眼の血管新生の可能性の前記処置または低減が、VEGF阻害の結果として生じる、項目4に記載の使用のための核酸。
(項目6)
前記医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のsFLT-1タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への前記医薬組成物の投与後の少なくとも72時間後に、前記投与前における前記ヒトの硝子体中のsFLT-1タンパク質のレベルと比較して上昇させることが可能である、項目4に記載の使用のための核酸。
(項目7)
前記sFLT-1を含む前記核酸が、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目8)
前記組換えウイルスが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択されるAAVである、項目7に記載の使用のための核酸。
(項目9)
前記sFLT-1をコードする前記核酸が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目10)
プラスミドであるか、またはウイルスベクターにより送達される、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目11)
前記使用が、処置または低減を必要とする前記ヒト対象への、1または複数のさらなるVEGF阻害剤の投与をさらに含み、必要に応じて、前記さらなるVEGF阻害剤が、ラニビズマブ、ベバシズマブ、またはアフリベルセプトである、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目12)
前記使用が、前記医薬組成物を、少なくとも55歳のヒト対象へと投与するステップを含む、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目13)
前記使用が、前記医薬組成物を中心窩の外側に投与するステップを含む、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目14)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの、処置を必要とする前記ヒト対象の最高矯正視力(BCVA)が、有効量の前記医薬組成物の前記投与後において、少なくとも1、2、3、4、または5行改善する、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目15)
前記医薬組成物の前記投与により、他の抗VEGF療法の投与頻度が低減される、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目16)
他の抗VEGF療法の前記投与が、3カ月当たり1回未満、または6カ月当たり1回未満、または1年当たり1回未満である、項目15に記載の核酸。
(項目17)
前記医薬組成物の前記投与が、前記ヒトにおいて、1年間に3回未満の頻度で実施される、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
(項目18)
組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記単位が少なくとも1×1010~3×1012のベクターゲノムを含み、前記組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結した前記sFLT-1をコードする核酸を含み、前記単位用量が、ヒト対象の硝子体中のsFLT-1タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への投与後の少なくとも7日後に上昇させることが可能である、単位用量の医薬組成物。
(項目19)
組換えウイルスまたはプラスミドを含む医薬組成物であって、各組換えウイルスまたはプラスミドが核酸を含み、前記核酸が、プロモーター配列に作動的に連結したsFLT-1導入遺伝子配列を含み、前記医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のsFLT-1タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への投与後の少なくとも7日後に上昇させることが可能である、医薬組成物。
(項目20)
前記プロモーター配列と、前記sFLT-1導入遺伝子配列とが、300塩基対を超える配列により隔てられている、項目19に記載の医薬組成物。
(項目21)
前記プロモーター配列と、前記sFLT-1導入遺伝子配列とが、UTR配列により隔てられている、項目19に記載の医薬組成物。
(項目22)
以下の順序:
a.配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32からなる群から選択されるプロモーター配列;
b.配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107配列番号108または配列番号122からなる群から選択される、VEGF阻害剤をコードする配列;
c.配列番号48、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119または配列番号120からなるイントロン配列;
d.配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;および
e.配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群から選択される終結配列
で核酸エレメントを含む医薬組成物。
(項目23)
以下の順序:
a.配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59からなる群から選択されるITR配列;
b.配列番号60、配列番号63、配列番号68、配列番号72、配列番号76、配列番号77、および配列番号84からなる群から選択されるリンカー配列;
c.配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46および配列番号47からなる群から選択されるプロモーター配列;
d.配列番号60、配列番号64、配列番号70、配列番号71、配列番号73、配列番号74、配列番号87からなる群から選択されるリンカー配列;
e.配列番号48、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119および配列番号120からなるイントロン配列;
f.配列番号60、配列番号64、配列番号65、配列番号75、配列番号79、配列番号81、配列番号82、および配列番号89からなる群から選択されるリンカー配列;
g.配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;ならびに
h.配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108および配列番号122からなる群から選択される、VEGF阻害剤をコードする配列;
i.配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;
j.配列番号60、配列番号62、配列番号66、配列番号67、配列番号69、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86からなる群から選択されるリンカー配列;
k.配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群から選択される終結配列;
l.配列番号60、配列番号61、配列番号80、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90からなる群から選択されるリンカー配列;ならびに
m.配列番号56、配列番号57、配列番号58、および配列番号59からなる群から選択されるITR配列
で核酸エレメントを含む医薬組成物。
(項目24)
細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、
a.sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列、ITR配列、およびUTR配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、
b.前記組換えウイルスを精製するステップと
を含む方法。
(項目25)
組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ITRポリヌクレオチド配列、およびUTRポリヌクレオチド配列を含む細胞。
(項目26)
ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、VEGF阻害剤をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の1または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法。
(項目27)
前記VEGF阻害剤が、VEGFに対する抗VEGF抗体またはその機能的断片である、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記VEGF阻害剤が、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの機能的断片である、項目26に記載の方法。
(項目29)
ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、sFLT-1をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の1または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法。
(項目30)
前記ヒト対象が、加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、萎縮型AMD、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、1または複数の状態を有するか、または有することが疑われる、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記ヒト対象が、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、分枝性網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される、1または複数の状態を有するか、または有することが疑われる、項目29に記載の方法。
(項目32)
前記医薬組成物が、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む、項目29に記載の方法。
(項目33)
前記sFLT-1をコードする前記核酸が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、項目29に記載の方法。
(項目34)
前記sFLT-1核酸が、少なくとも1つの二量体化ドメインをコードする、項目29に記載の方法。
(項目35)
前記核酸が、原核生物調節配列を含有しない、項目29に記載の方法。
(項目36)
前記核酸が、原核生物調節配列を含有する、項目29に記載の方法。
(項目37)
前記核酸が、プラスミドであるか、またはウイルスにより送達される、項目29に記載の方法。
(項目38)
前記ヒト対象への、VEGF阻害剤による1回または複数回の処置の投与をさらに含む、項目29に記載の方法。
(項目39)
前記VEGF阻害剤を、前記医薬組成物の投与から30日以内、90日以内、または180日以内に投与する、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記医薬組成物と前記VEGF阻害剤とを、少なくとも24時間隔てて投与する、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記医薬組成物を、少なくとも55歳のヒト対象へと投与する、項目29に記載の方法。
(項目42)
前記投与を中心窩の外側で実施する、項目29に記載の方法。
(項目43)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの前記ヒト対象の最高矯正視力(BCVA)が、前記医薬組成物の前記投与後において少なくとも1、2、3、4、または5行改善する、項目29に記載の方法。
(項目44)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が、前記医薬組成物の前記投与後において15文字より少なく低下する、項目29に記載の方法。
(項目45)
前記医薬組成物の投与を、前記医薬組成物を一方の眼に投与する条件、前記医薬組成物を2つの眼に逐次的に投与する条件、および前記医薬組成物を2つの眼に同時に投与する条件からなる群から選択される条件下で実施する、項目29に記載の方法。
(項目46)
フルオレセイン血管造影(FA)により観察したときの血管新生の低減が、前記医薬組成物の前記投与に後続する、項目29に記載の方法。
(項目47)
注射の少なくとも1週間後の前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候がいずれも存在しない、項目29に記載の方法。
(項目48)
前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与後少なくとも30、60、90、120、180、270、または365日間にわたり救済処置を必要としない、項目29に記載の方法。
(項目49)
前記投与ステップ後において、抗AAV細胞傷害性T細胞応答の増大が測定されない、項目32に記載の方法。
(項目50)
ウイルスが、前記医薬組成物を投与した3、7、14、21、または30日後において、前記ヒト対象の血液、唾液、または尿のいずれの試料中にも検出されない、項目32に記載の方法。
(項目51)
前記ヒト対象に前記医薬組成物を投与した7、14、21、30、60、90、120、150、180、270、または365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約500~5,000pg/mlである、項目29に記載の方法。
(項目52)
前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与の前に、VEGF阻害剤による1回または複数回の処置を施されている、項目29に記載の方法。
(項目53)
前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与の前に、VEGF阻害剤による処置をあらかじめ施されていない、項目29に記載の方法。
(項目54)
前記医薬組成物の前記投与が、前記ヒト対象において、1年間に3回未満の頻度で実施される、項目29に記載の方法。
(項目55)
前記医薬組成物の前記投与により、前記ヒト対象における、さらなるVEGF阻害剤による処置の投与頻度が低減される、項目29に記載の方法。
(項目56)
前記医薬組成物の前記投与の7、14、21、30、60、90、120、150、180、270、または365日後において測定する場合に、前記ヒト対象の前記硝子体中のsFLT-1タンパク質の濃度が上昇する、項目29に記載の方法。
(項目57)
前記薬剤の前記投与の前に、または前記投与の1週間以内に前記ヒト対象の硝子体ゲルが除去されている、項目29に記載の方法。
(項目58)
前記薬理作用剤を、20ゲージより小さい硝子体切除システムを使用して投与する、項目29に記載の方法。
(項目59)
前記薬理作用剤を、39ゲージより小さいカニューレチップを使用して投与する、項目29に記載の方法。
(項目60)
前記薬理作用剤による処置後12カ月以内における、前記対象の網膜中心厚が、50ミクロン、100ミクロン、または250ミクロンを超えて増大しない、項目29に記載の方法。
(項目61)
前記ヒト対象の罹患眼において、地図状萎縮が進行しない、項目29に記載の方法。
(項目62)
前記ヒト対象が、ペニシリンに対する感受性またはアレルギーを有する、項目29に記載の方法。
(項目63)
前記ヒト対象のVEGF阻害剤の全身レベルが増大しない、項目29に記載の方法。
(項目64)
sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含み、前記プロモーター配列と、前記sFLT-1導入遺伝子配列とが、300塩基対を超える配列により隔てられている、医薬組成物。
(項目65)
sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含み、前記プロモーター配列と、前記sFLT-1導入遺伝子配列とが、UTR配列により隔てられている、医薬組成物。
(項目66)
前記UTR配列が、少なくとも10塩基対を含む、項目65に記載の医薬組成物。
(項目67)
前記核酸が、各々が少なくとも50塩基対を含む、少なくとも3つのリンカー配列を含む、項目66に記載の医薬組成物。
(項目68)
1×1010~3×1012のベクターゲノムの組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結したsFLT-1をコードする核酸を含む、単位用量の医薬組成物。
(項目69)
細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、
a.sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列、ITR配列、およびUTR配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、
b.前記組換えウイルスを精製するステップと
を含む方法。
(項目70)
前記核酸配列が、ベータ-ラクタム抗生剤耐性配列を含有しない、項目69に記載の方法。
(項目71)
HEK293細胞に、1×104~1×106の感染多重度で形質導入した72時間後において測定した場合、前記組換えウイルスが、sFLT-1タンパク質を、100~10,000pg/mLの範囲で産生する、項目69に記載の方法。
(項目72)
前記組換えウイルスが、ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)の増殖を阻害する、項目69に記載の方法。
(項目73)
組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、sFLT-1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ITRポリヌクレオチド配列、およびUTRポリヌクレオチド配列を含む細胞。
(項目74)
前記医薬組成物を投与した1週間後または3、6、9、もしくは12カ月後の前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体のいずれにおける炎症の徴候も存在しない、項目29に記載の方法。
(項目75)
前記ヒト対象が、前記医薬組成物を投与した後で、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、眼内または全身免疫応答のいずれも経験しない、項目29に記載の方法。
(項目76)
前記ヒト対象が、VEGF阻害剤による処置に対して耐性である、項目29に記載の方法。
(項目77)
前記薬理作用剤を、縫合を必要としない硝子体切除システムを使用して投与する、項目29に記載の方法。
(項目78)
前記薬理作用剤の前記投与の後に、硝子体腔内のガス/液体交換を行う、項目29に記載の方法。
(項目79)
ヒト対象における眼の血管新生を処置または低減するための方法であって、
薬学的有効量の、VEGF阻害剤をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
(項目80)
ヒト対象における眼の血管新生を処置または低減するための方法であって、
薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
(項目81)
ヒト対象における眼の血管新生を防止するための方法であって、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、ヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
(項目82)
AMDを伴うヒト対象における脈絡膜血管新生を処置または低減するための方法であって、
薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、AMDの処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
(項目83)
萎縮型AMDを伴うヒト対象における脈絡膜血管新生を防止するための方法であって、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、ヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
(項目84)
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスから選択される、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目85)
前記AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目86)
前記組換えウイルスを、カナマイシン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目87)
前記組換えウイルスを、アンピシリン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目88)
前記組換えウイルスを、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含むプラスミドから生成する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目89)
前記組換えウイルスを、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含まないプラスミドから生成する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目90)
前記組換えウイルスが、アンピシリン耐性マーカーを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目91)
前記組換えウイルスが、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目92)
前記組換えウイルスが、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含まない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目93)
前記組換えウイルスが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目94)
前記組換えウイルスが、エンハンサーを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目95)
前記組換えウイルスが、キメライントロンを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目96)
前記組換えウイルスが、SV40ポリA配列を含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目97)
前記組換えウイルスが、ヒトsFLT-1タンパク質またはその機能的断片を含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目98)
前記組換えウイルスが、眼細胞内の前記sFLT-1タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目99)
前記医薬組成物が、約1×106~約1×1015個の組換えウイルスを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目100)
前記医薬組成物が、約1×107~約1×1014個の組換えウイルスを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目101)
前記医薬組成物が、約1×108~約1×1013個の組換えウイルスを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目102)
前記医薬組成物が、約1×109~約1×1012個の組換えウイルスを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目103)
前記医薬組成物が、約1×1010~約1×1012個の組換えウイルスを含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目104)
前記医薬組成物を、網膜下注射を介して投与する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目105)
前記ヒト対象へと、薬学的有効量のVEGF阻害剤を投与するステップをさらに含む、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目106)
前記VEGF阻害剤が、VEGFに対する抗体またはその機能的断片を含む、項目105に記載の方法。
(項目107)
前記VEGF阻害剤が、ラニビズマブを含む、項目105に記載の方法。
(項目108)
前記医薬組成物を、前記VEGF阻害剤の投与の90日以内に投与する、項目105に記載の方法。
(項目109)
前記医薬組成物を、前記VEGF阻害剤を投与した、少なくとも5、6、7、または8日後に投与する、項目105に記載の方法。
(項目110)
前記VEGF阻害剤を、前記医薬組成物を投与する前に少なくとも1回投与する、項目105に記載の方法。
(項目111)
前記VEGF阻害剤を、前記医薬組成物の投与後に少なくとも1回投与する、項目105に記載の方法。
(項目112)
前記VEGF阻害剤を、前記VEGF阻害剤の投与の90日以内に少なくとも2回投与する、項目105に記載の方法。
(項目113)
前記VEGF阻害剤を、6~7週間の期間にわたり投与する、項目105に記載の方法。
(項目114)
前記AMDが、滲出型AMDである、項目82に記載の方法。
(項目115)
前記ヒト対象が、加齢黄斑変性を発症する危険性がある、項目81に記載の方法。
(項目116)
前記ヒト対象が、早期加齢黄斑変性の症状を提示する、項目81に記載の方法。
(項目117)
前記ヒト対象が、AMDを処置するための異なるVEGF阻害剤であらかじめ処置されている、項目80または82に記載の方法。
(項目118)
前記ヒト対象の前記処置された眼が、AMDを処置するための異なるVEGF阻害剤であらかじめ処置されていない、項目81または83に記載の方法。
(項目119)
AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも5回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目80または82に記載の方法。
(項目120)
AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも10回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目80または82に記載の方法。
(項目121)
AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも15回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目80または82に記載の方法。
(項目122)
AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも20回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目80または82に記載の方法。
(項目123)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が、前記医薬組成物による前記処置後において15文字より少なく低下した、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目124)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が、ラニビズマブによる前記処置後において2行未満改善された、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目125)
前記ヒト対象が、萎縮型加齢黄斑変性を発症する危険性がある、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目126)
前記ヒト対象が、早期萎縮型加齢黄斑変性の症状を提示する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目127)
前記処置を、12カ月当たり1回未満の頻度で投与する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目128)
前記処置を、6カ月当たり1回未満の頻度で投与する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目129)
前記処置を、18カ月当たり1回未満の頻度で投与する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目130)
前記投与ステップを、20歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目131)
前記投与ステップを、40歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目132)
前記投与ステップを、50歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目133)
前記投与ステップを、65歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目134)
前記投与が、中心窩を含まない部位への投与である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目135)
前記投与が、中心窩に隣接する中心網膜における投与である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目136)
投与が、中心網膜の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である、項目80に記載の方法。
(項目137)
投与が、黄斑の外側の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目138)
前記投与が、黄斑の内側の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目139)
前記投与が、網膜色素上皮細胞への投与である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目140)
前記投与が、中心網膜の機能または中心網膜の構造に有害な影響を及ぼさない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目141)
前記投与ステップを、両眼において同時に実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目142)
前記投与ステップを、両眼において逐次的に実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目143)
前記投与ステップを、一方の眼において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目144)
対の眼がAMDの症状を提示する場合、投与ステップを一方の眼において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目145)
前記投与ステップを、ペニシリンに対して耐性の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目146)
前記投与ステップを、ペニシリンに対して感受性の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目147)
前記投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性の前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目148)
前記投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性でない前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目149)
前記医薬組成物を投与した3、7、14、21、または30日後において、ベクターが、前記ヒト対象の血液、唾液、または尿のいずれの試料中でも検出されない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目150)
前記ウイルスベクターの存在を、qPCRまたはELISAにより検出する、項目149に記載の方法。
(項目151)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約500~5,000pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目152)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、ま365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約600~4,000pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目153)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約800~3,000pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目154)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約900~2,000pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目155)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約1,000~1,800pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目156)
前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが、約4,00~1,000pg/mlである、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目157)
前記ヒト対象が、少なくとも2カ月間の期間にわたる連続的な眼検査により評価したときに、臨床的に重大な網膜毒性を示さない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目158)
少なくとも2カ月間の期間にわたり、前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体のいずれにおける炎症の徴候も存在しない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目159)
前記ヒト対象が、前記投与後少なくとも120日間にわたり救済処置を必要としない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目160)
前記投与後少なくとも120日間にわたり、前記ヒト対象において、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答のいずれの証拠も見られない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目161)
前記投与ステップ後において、生体顕微鏡法(BE)および間接検眼鏡法(IOE)により、硝子体の炎症が観察されない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目162)
細胞傷害性T細胞応答が、前記投与ステップに後続しない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目163)
正常範囲の10%以内の細胞傷害性T細胞応答が、前記投与ステップに後続しない、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目164)
ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が前記投与ステップ後に改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目165)
BCVAが、1行以上改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目166)
BCVAが、少なくとも2行以上改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目167)
BCVAが、少なくとも3行以上改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目168)
BCVAが、少なくとも4行以上改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目169)
BCVAが、少なくとも5行以上改善する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目170)
フルオレセイン血管造影(FA)により観察したときの血管新生の低減が、前記投与ステップに後続する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目171)
他の抗VEGF療法の投与頻度が低減される、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目172)
他の抗VEGF療法の投与頻度が月1回未満である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目173)
他の抗VEGF療法の投与頻度が3カ月未満である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目174)
他の抗VEGF療法の投与頻度が6カ月未満である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目175)
他の抗VEGF療法の投与頻度が1年未満である、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目176)
約1×106~1×1015個の組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記各組換えウイルスが、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質をコードする核酸を含む、単位用量の医薬組成物。
(項目177)
約1×1010~約3×1012個の組換えウイルスを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目178)
約1×107~約1×1014個の組換えウイルスを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目179)
約1×108~約1×1013個の組換えウイルスを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目180)
約1×109~約1×1012個の組換えウイルスを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目181)
約1×1010~約1×1012個の組換えウイルスを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目182)
前記sFLT-1タンパク質が、ヒトsFLT-1タンパク質またはその機能的断片を含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目183)
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスから選択される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目184)
前記AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目185)
前記組換えウイルスが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目186)
前記組換えウイルスが、エンハンサーを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目187)
前記組換えウイルスが、イントロンを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目188)
前記組換えウイルスが、SV40ポリAを含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目189)
前記組換えウイルスが、眼細胞内の前記sFLT-1タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目190)
前記組換えウイルスが、界面活性剤と共に製剤化される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目191)
前記組換えウイルスが、プロデューサークローン法を使用して製造される、項目168に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目192)
前記組換えウイルスが、組換えバキュロウイルスを使用して製造される、項目168に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目193)
前記組換えウイルスが、Ad-AAVを使用して製造される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目194)
前記組換えウイルスが、HEK293細胞を使用して製造される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目195)
前記組換えウイルスが、昆虫細胞を使用して製造される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目196)
前記組換えウイルスが、ヘルペスヘルパーウイルスを使用して製造される、項目176に記載の単位用量の医薬組成物。
(項目197)
ヒト対象における眼の血管新生または黄斑浮腫を処置、低減、または防止する方法であって、薬学的有効量の、抗血管形成性因子の発現を指示する組換えAAV遺伝子送達ベクターを含む医薬組成物を、前記ベクターの投与がヒト対象における血管新生または黄斑浮腫を阻害するように網膜下投与するステップを含む方法。
(項目198)
前記投与ステップを、B型肝炎またはC型肝炎のいずれによる感染歴もない前記ヒト対象において実行する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
(項目199)
前記医薬組成物の投与の7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、または365日後において測定したときに、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT-1タンパク質レベルが上昇する、項目79、80、81、82、または83に記載の方法。
参照による組込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の新規の特色は、付属の特許請求の範囲において詳密に示される。本開示の特色および利点のよりよい理解は、本開示の原理が利用される例示的な態様を示す、以下の詳細な記載、および添付される図面を参照することにより得られるであろう。
本開示は、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFlt-1)タンパク質をコードする核酸を含む、薬学的有効量のベクターを含む医薬組成物を、ヒト対象へと網膜下投与することにより、ヒト対象における、AMDなどの眼の血管新生の防止または処置のための組成物および方法を提供する。
以下では、例示のための実施例の適用を参照しながら、本開示のいくつかの態様について記載する。本開示の十分な理解をもたらすために、多数の具体的な詳細、関連性、および方法を示すことを理解されたい。しかし、当業者は、本開示を、具体的な詳細のうちの1または複数を伴わずに実施することもでき、他の方法により実施することもできることをたやすく認識するであろう。一部の行為は、異なる順序で、かつ/または他の行為または事象と共時的に生じる可能性があるので、本開示は、行為または事象の例示される順序づけにより限定されない。さらに、全ての例示される行為または事象が、本開示に従い、方法を実装するように要求されるわけでもない。
本開示の用語法は、特定の場合について記載することだけを目的とするものであり、本開示の方法および組成物を限定することを意図するものではない。
別段に指し示されない限り、本明細書で記載される、本開示の組成物および方法は、当業者の技術の範囲内にある、分子生物学(組換え技法を含む)、細胞生物学、生化学、免疫化学、および眼科法の従来の技法および記載を援用しうる。このような従来の技法は、網膜、または対象における視覚を観察および解析するための方法、組換えウイルスのクローニングおよび繁殖、医薬組成物の製剤化、ならびに生化学的精製および免疫化学を含む。適切な技法の具体的な例示は、本明細書の実施例を参照することにより与えられる。しかし、当然ながら、同等な従来の手順もまた、使用することができる。このような従来の技法および記載は、それらの全てが、全ての目的で、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Greenら編、「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」(I~IV巻)(1999年); Weinerら編、「Genetic Variation: A Laboratory Manual」(2007年); Dieffenbach、Dveksler編、「PCR Primer: A Laboratory Manual」(2003年); BowtellおよびSambrook、「DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual」(2003年); Mount、「Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis」(2004年); SambrookおよびRussell、「Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(2006年);ならびにSambrookおよびRussell、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(2002年)(全て、Cold Spring Harbor Laboratory Pressによる); Stryer, L.、「Biochemistry」(4版)、W.H. Freeman、N.Y.(1995年); Gait、「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」、IRL Press、London(1984年); NelsonおよびCox、「Lehninger, Principles of Biochemistry」、3版、W.H. Freeman Pub.、New York(2000年);およびBergら、「Biochemistry」、5版、W.H. Freeman Pub.、New York(2002年)などの標準的な実験室マニュアルにおいて見出す
ことができる。本組成物、本研究ツール、および本方法について記載する前に、本開示は、記載される具体的な方法、組成物、目標、および使用は、当然ながら、変化しうるので、これらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語法は、特定の態様だけについて記載することを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲だけにより限定される本開示の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。
ことができる。本組成物、本研究ツール、および本方法について記載する前に、本開示は、記載される具体的な方法、組成物、目標、および使用は、当然ながら、変化しうるので、これらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語法は、特定の態様だけについて記載することを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲だけにより限定される本開示の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。
本明細書で使用される単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」は、文脈によりそうでないことが別段に指し示されない限りにおいて、複数形もまた含むことを意図する。さらに「~を含む(including)」、「~を含む(includes)」、「~を有する(having)」、「~を有する(has)」、「~を伴う」という用語、またはこれらの変化形が、詳細な記載および/または特許請求の範囲において使用される程度において、このような用語は「~を含む(comprising)」という用語と同様の様式で包含的であることを意図する。
本明細書では、範囲を「約」1つの特定の値から、かつ/または「約」別の特定の値までとして表す場合がある。このような範囲を表すとき、別の場合は、1つの特定の値から、かつ/または他の特定の値までを含む。同様に、前置される「約」を使用することにより値を概数として表すときも、特定の値は、別の場合をなすことが理解されるであろう。範囲の各々の端点は、他の端点との関連で、かつ、他の端点とは独立に有意であることもさらに理解されるであろう。本明細書で使用される「約」という用語は、特定の用法の文脈内では、言明された数値に15%を加えるかまたは言明された数値から15%を減じた範囲を指す。例えば、約10ならば、8.5~11.5の範囲を含むであろう。「約」という用語はまた、値の測定における典型的な誤差または不正確も表す。
I.AMD
AMDとは、50歳を超える患者における失明の主要な原因であり、黄斑における光受容体、網膜の外側、および網膜色素上皮の進行性の変性を特徴とする。AMDの末期「滲出」形態(新生血管形態または滲出性形態)は、それほど一般的ではないが、患者における、急速で、かつ、実質的であることが多い、中心視覚の喪失を高頻度で引き起こしうる。AMDの滲出形態では、脈絡膜血管新生が形成され、網膜色素上皮下および網膜色素上皮内で成長しうる血管のネットワークへと発達する。これは、血漿の漏出および/または網膜下腔への出血を伴うので、これが黄斑内で生じれば、重度で突発的な中心視覚の喪失が見られる場合もあろう。
AMDとは、50歳を超える患者における失明の主要な原因であり、黄斑における光受容体、網膜の外側、および網膜色素上皮の進行性の変性を特徴とする。AMDの末期「滲出」形態(新生血管形態または滲出性形態)は、それほど一般的ではないが、患者における、急速で、かつ、実質的であることが多い、中心視覚の喪失を高頻度で引き起こしうる。AMDの滲出形態では、脈絡膜血管新生が形成され、網膜色素上皮下および網膜色素上皮内で成長しうる血管のネットワークへと発達する。これは、血漿の漏出および/または網膜下腔への出血を伴うので、これが黄斑内で生じれば、重度で突発的な中心視覚の喪失が見られる場合もあろう。
別段に指定されない限り「AMD」という用語は、萎縮型AMDの場合もあり、滲出型AMDの場合もある。本開示は、AMD、滲出型AMD、および/または萎縮型AMDの処置または防止を想定する。
当技術分野では既に公知の通り、AMDは、単一の原因を有さないことが示されている。この高度に複雑な疾患は、年齢、遺伝的素因、および環境、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、様々な寄与から生じうる。例えば、ヒトでは、確立された疫学的危険性因子は、喫煙、食餌、女性、白色人種、およびAMDの家族歴を含みうるがこれらに限定されない。AMDは、50歳より若齢の個体ではまれであるため、唯一の不可避的な危険性因子は、AMDの発症機序において正常な老化に随伴する多数の細胞変化を関与させる年齢である。
AMDの病因的複雑性は、有効な療法、予防戦略、およびそれを研究するための好適な動物モデルの相対的貧弱さに反映されている。疾患の複雑性および不完全な特徴付けに起因して、AMDの動物におけるモデル化は不完全である。これは、動物の網膜と霊長動物の網膜とにおける解剖学的差異に部分的に起因するほか、疾患が発症するのに長期にわたる時間が必要とされることにも起因する。ヒトによる分子的遺伝的研究および動物研究からの証拠は、正常な光受容体-RPE生理学の一因となる多数の機構のホメオスタシスの変化が、疾患を誘発しうるという考えを裏付ける。少なくとも分子レベルでは、疾患を動物モデルにおいて探索することができ、場合によっては、その遺伝子欠損がヒトにおけるAMDの主要な原因ではない患者においてもなお探索することができる。
かつての遺伝的研究ならびに綿密な病理学的解析は、多様なAMD動物モデルには、AMDについての単純な遺伝パターンは一般的でなく、1つの病理も一般的でないことを明らかにしている。当技術分野では、非ヒト霊長動物モデルが、ヒトにおけるCNVを、マウスモデルまたはラットモデルより良好に近似することが公知であるが、非ヒト霊長動物の網膜の解剖学、組織学における根本的な差異は、異なる種特異的病態をもたらし、遺伝学における根本的な差異もなお、異なる種特異的病態をもたらしている。
さらに、そして、本明細書で記載される通り、レーザー光凝固を使用して、動物モデルにおける1つのAMD様症状であるCNVを誘導することができる。場合によって、レーザー処置は、ブルッフ膜を破断させ、脈絡膜に由来する線維血管性の増殖性応答を惹起する。この応答は、後期AMDにおける脈絡膜血管新生をモデル化するための基盤であり、アカゲザルおよびカニクイザルにおいて開発された。
アルゴンレーザーを使用して、スポットを微小に保ち、ブルッフ膜を破断させるのに十分な出力で誘導する。これは、眼底鏡では、光凝固の時点においてバブルとして目視可能である。光凝固は、脈絡膜血管の血栓形成に続き、48時間後における再内皮化、および1週間後までの網膜下腔への新たな血管の成長を誘導する。新たに形成された血管は透過可能性が大きいため、新生血管の発生は、蛍光眼底血管造影法でモニタリングして、血管漏出を評価することができる。
新生血管の自然退縮(フルオレセイン漏出の減少により指し示される)は、約3~7週間後に始まり、次いで、漏出がその部位にもはや現れなくなるまで、徐々に進行する(約2~13カ月にわたり)。
血管化が低度な瘢痕化と比較した新たな血管成長の程度は、全てのモデルにおいて可変的な場合があり、種、網膜内の損傷の位置、およびレーザービームの強度の影響を受ける。種間の処置の差異に固有の可変性は、1つの動物モデルがヒトにおけるAMDを十分に捉えることはないという考えをさらに裏付ける。
AMDのための療法は、タンパク質のVEGFに結合するアプタマー、抗体、および可溶性受容体デコイの利用可能性と共に過去数年間で変化してきた。VEGFタンパク質またはVEGFリガンドは、VEGF受容体を含む細胞内受容体への結合を介して、新たな血管の形成(すなわち、血管形成)を刺激することが示されている。当技術分野で公知の通り、抗VEGF剤は、滲出型AMDにおいて生じる血管新生および血管形成をある程度防止しうる。Macugen(登録商標)またはLucentis(登録商標)またはEylea(登録商標)(抗VEGF剤)の眼内注射は高価であり、大半の症例において、Eylea(登録商標)の場合は、4~6週間ごとまたは8週間ごとに処置を反復しなければならない。例えば、Lucentisは、毎月注射1回当たり約1950ドルの費用がかかるVEGF抗体断片である。Avastin(VEGF抗体)は、未承認で使用されており、Eylea(VEGFトラップ)は、注射1回当たり約1850ドルの費用がかかり、2カ月ごとに投与する。これらの医薬の全ては、薬物動態プロファイルの低下という一般的問題を共有し、したがって、眼注射の反復を要求する。
当技術分野では、実践的で、経済的に実現可能で、長期持続的な処置戦略が必要とされている。本開示は、これらの必要のうちのいくつかに取り組む新規の治療剤を提供する。
本開示は、任意の適切なベクター(例えば、組換えウイルス系)により、AMDまたは類縁の新生血管性網膜疾患を有するか、またはこれを有することが疑われるヒト対象の網膜へと送達される、sFLT-1などの抗VEGF分子を提供する。場合によって、sFLT-1は、VEGFの強力で直接的な結合性タンパク質でありうる。場合によって、sFLT-1はまた、VEGF活性を遮断または阻害することも可能である。
例えば、当技術分野で公知のsFLT-1(本明細書でさらに記載される)は、VEGFタンパク質の二量体に、Kd=10pMで結合することが観察されている。
本発明はまた、rAAVに媒介された眼への遺伝子送達に関する組成物および方法も提供する。AAVベースの系については、イヌの眼(>8歳)における長期にわたる遺伝子発現が観察されている。網膜内のsFLT-1 mRNA発現は、少なくとも18カ月間にわたり維持されている。レーバー先天性黒内障についての3つのヒト試験が行われ、これらにより、LCAなどの網膜変性疾患の文脈におけるAAVベースの送達系の安全性が裏付けられた。
II.VEGFおよびFms関連チロシンキナーゼ1(sFLT-1)タンパク質
A.VEGF
血管内皮成長因子(本明細書では「VEGF」または「VEGFリガンド」と称する)とは、生理学的血管形成において鍵となる役割を果たす強力な内皮細胞特異的マイトジェンである。場合によって、VEGF活性は、VEGFリガンドの、細胞内の1または複数のVEGF受容体への結合から生じる。VEGFリガンドの、VEGF受容体への結合は、下流における多数の細胞効果および生化学的効果であって、組織内の血管形成を含むがこれらに限定されない細胞効果および生化学的効果を及ぼしうる。VEGFは、がん、虚血症、および炎症と関連する障害を含む、事実上あらゆる種類の血管形成性障害または新生血管性障害に関与している。加えて、VEGFは、虚血性網膜症、眼内血管新生、加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、萎縮型AMD、網膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、糖尿病性網膜浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症を含むがこれらに限定されない眼疾患にも関与している。さらに、本明細書で記載される、本開示の組成物および方法を含む抗VEGF処置は、本明細書で記載されるこれらの疾患のうちの1または複数の処置において使用することができる。
A.VEGF
血管内皮成長因子(本明細書では「VEGF」または「VEGFリガンド」と称する)とは、生理学的血管形成において鍵となる役割を果たす強力な内皮細胞特異的マイトジェンである。場合によって、VEGF活性は、VEGFリガンドの、細胞内の1または複数のVEGF受容体への結合から生じる。VEGFリガンドの、VEGF受容体への結合は、下流における多数の細胞効果および生化学的効果であって、組織内の血管形成を含むがこれらに限定されない細胞効果および生化学的効果を及ぼしうる。VEGFは、がん、虚血症、および炎症と関連する障害を含む、事実上あらゆる種類の血管形成性障害または新生血管性障害に関与している。加えて、VEGFは、虚血性網膜症、眼内血管新生、加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、萎縮型AMD、網膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、糖尿病性網膜浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症を含むがこれらに限定されない眼疾患にも関与している。さらに、本明細書で記載される、本開示の組成物および方法を含む抗VEGF処置は、本明細書で記載されるこれらの疾患のうちの1または複数の処置において使用することができる。
近年のデータは、VEGFが、AMDの滲出形態の発症機序における主要な血管形成性成長因子であることを示唆する。
46kDaのホモ二量体の糖ペプチドであるVEGFは、色素上皮細胞、周皮細胞、血管内皮細胞、神経膠細胞、および神経節細胞を含むがこれらに限定されない、複数の異なる眼細胞型が発現させる。場合によって、VEGFは、網膜の発生時に、特殊な空間的パターンおよび時間的パターンで発現する。場合によって、VEGFのヒトアイソフォームは、単量体1つ当たり206、189、183、165、148、145、および121アミノ酸のタンパク質を含みうるが、主要なヒトVEGFアイソフォームは、VEGF121、VEGF165、VEGF189、およびVEGF206を含むがこれらに限定されない。これらのタンパク質は、VEGF mRNAの代替的なスプライシングにより産生され、ヘパリンおよび特異的なVEGF受容体またはVEGF共受容体(ニューロピリン)に結合するそれらの能力が異なる。VEGF遺伝子のエクソン1~5によりコードされるドメインは、公知のVEGF受容体であるKDR/FLK-1およびFLT-1の認識に要求される情報を含有する。このドメインは、全てのVEGFアイソフォームに存在する。VEGFは、高アフィニティーの受容体チロシンキナーゼであるこれらの受容体を介して作用し、内皮細胞増殖、遊走、および血管透過性の増大をもたらす。
VEGFは、血管形成の複雑な過程に関与する複数の因子のうちの1つであり、血管内皮細胞に対して極めて高い特異性を有する。VEGFは、胚形成、骨格成長、および生殖機能などの過程における生理学的血管形成の調節因子であるが、また、がん、胎盤障害、および他の状態などの疾患と関連する病理学的血管形成にも関与している。VEGFの潜在的な生物学的効果は、特異的なfms様膜貫通受容体であるFLT-1およびFLK-1/KDRにより媒介されうる。場合によって、これらの自然発生のVEGFの結合パートナーは、VEGFの、VEGF受容体への結合に影響を及ぼし、これにより、VEGF受容体および後続の下流における経路の活性化をモジュレートすることが可能である。
がんとの関連では、VEGFに対するヒト化モノクローナル抗体(rhuMab VEGF)を含む複数のVEGF阻害剤、抗VEGFR-2抗体、VEGFR-2によるシグナル伝達を阻害する低分子、および可溶性VEGF受容体は、ある程度の治療特性を示している。
糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、または加齢黄斑変性など、眼内血管新生性疾患との関連では、いくつかのVEGFアンタゴニストは、高頻度の投与に対する必要にもかかわらず、治療効果を示している。
B.抗VEGF
本開示の組換えウイルスは、米国特許第5,712,380号、同第5,861,484号、および同第7,071,159号において開示されている、VEGF結合性タンパク質またはそれらの機能的断片、ならびに米国特許第7,635,474号において開示されている、VEGF結合性融合タンパク質を含むがこれらに限定されない、抗VEGFタンパク質をコードする配列を含む。抗VEGFタンパク質はまた、本明細書で記載されるsFLT-1タンパク質も含みうる。
本開示の組換えウイルスは、米国特許第5,712,380号、同第5,861,484号、および同第7,071,159号において開示されている、VEGF結合性タンパク質またはそれらの機能的断片、ならびに米国特許第7,635,474号において開示されている、VEGF結合性融合タンパク質を含むがこれらに限定されない、抗VEGFタンパク質をコードする配列を含む。抗VEGFタンパク質はまた、本明細書で記載されるsFLT-1タンパク質も含みうる。
本開示の組換えウイルスまたはプラスミドは、米国特許第5,861,484号において記載されている、自然発生のタンパク質であるsFlt-1、および配列番号109により記載されている配列を含む、抗VEGFタンパク質をコードする配列を含みうる。本開示の組換えウイルスまたはプラスミドはまた、sFlt-1のドメイン2の配列または配列番号121に示される配列のほか、米国特許第7,635,474号において開示されている、VEGF結合性融合タンパク質などの類縁の構築物を含む、その機能的断片も含むがこれらに限定されない。抗VEGFタンパク質はまた、本明細書で記載されるsFLT-1タンパク質も含みうる。これらの配列は、遺伝子コード、当業者により理解されている標準的な技法を使用して、このような配列をコードするDNAから発現させることができる。当業者により察知されうる通り、遺伝子コードの縮重性のために、抗VEGFタンパク質配列は、いくつかの異なるDNA配列からたやすく発現させることができる。
本明細書では「sFlt-1タンパク質」とは、sFlt-1タンパク質またはsFlt-1ポリペプチドが、VEGFおよび/またはVEGF受容体に結合するように、自然発生のヒトsFLT-1配列に対する少なくとも90%以上の相同性を伴うポリペプチド配列、またはその機能的断片を指す。相同性とは、2つの配列の間のアライメントの残基の保存%を指す。自然発生のヒトsFLT-1タンパク質は、機能的断片、挿入、欠失、置換、偽断片、偽遺伝子、スプライス変異体、または人工最適化配列を含む配列を含むがこれらに限定されない、sFLT-1の任意の適切な変異体を含みうる。場合によって「sFLT-1タンパク質」は、自然発生のヒトsFLT-1タンパク質配列に対して、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、または100%相同でありうる。場合によって「sFLT-1タンパク質」は、自然発生のヒトsFLT-1タンパク質配列に対して、最大で約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、または100%空間的に相同でありうる。場合によって「sFLT-1タンパク質」は、自然発生のヒトsFLT-1タンパク質のコンフォメーションに対して、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、または100%相同でありうる。場合によって「sFLT-1タンパク質」は、自然発生のヒトsFLT-1タンパク質のコンフォメーションに対して、最大で約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、または100%空間的に相同でありうる。
さらに、VEGF受容体FLT-1の可溶性切断形態であるsFLT-1は、VEGFの唯一の公知の内因性の特異的阻害剤である。天然では、sFLT-1は、代替的なmRNAスプライシングにより生成し、膜近位免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通領域、および細胞内チロシンキナーゼドメインを欠く。構造的に、FLT-1タンパク質およびsFLT-1タンパク質はいずれも、複数の機能的ドメインを含みうる。いくつかの変異体では、FLTタンパク質およびsFLTタンパク質は一般に、6つの連結ドメイン;タンパク質の二量体化に関与する3つのドメイン;およびVEGFなどのリガンドの結合に関与する3つのドメインを共有する。
sFLT-1は、FLT-1の可溶性切断形態であり、内因的に発現する。本明細書で記載される「可溶性」FLT-1またはsFLT-1とは、細胞膜に限局されないFLT-1を指す。非結合のsFLT-1は、細胞外腔内または溶液中に遊離して拡散しうる。
sFLT-1は、VEGFの唯一の公知の内因性の特異的阻害剤である。この相互作用は、特異的であり、100倍過剰の非標識VEGFと競合しうる。場合によって、sFLT-1の血管新生抑制活性は、2つの機構:i)それが高アフィニティーで結合するVEGFの隔離、およびii)VEGF受容体であるFLTt-1およびFLK-1/KDRの膜貫通アイソフォームとの、不活性のヘテロ二量体の形成によるVEGFの阻害から生じうる。当技術分野で公知の通り、in vitro結合アッセイは、sFLT-1がVEGFに高アフィニティーで結合し、また、ヒト臍帯血管内皮細胞の、VEGFに駆動される増殖も阻害することを指し示している。がんについての動物モデルでは、sFLT-1は、腫瘍の成長を阻害する。場合によって、細胞外腔内の過剰なVEGFは、VEGF受容体に結合し、その後これを活性化することを阻止されうるので、sFLT-1は、化学量論未満の様式またはドミナントネガティブの様式で機能しうる。sFLT-1のこれらの特性は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、KendallおよびThomas、1993年、Proc Natl Acad Sci.、90巻:10705~10709頁において
記載されている。当技術分野で公知の通り、sFLT-1の機能的断片は、全長タンパク質の代わりに使用することができる。より具体的には、VEGF結合性ドメイン(ドメイン2)、または代替的に、sFLT-1のドメイン2に加えて、sFLT1、KDR、または別のファミリーメンバーに由来するドメイン3を使用して、VEGFに結合させ、これを不活化することができる。このような機能的断片は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Wiesmannら、1997年、Cell、91巻:695~704頁において記載されている。「sFLT-1」および「sFLT-1の機能的断片」という用語は、同義であり、本明細書では互換的に使用される。
記載されている。当技術分野で公知の通り、sFLT-1の機能的断片は、全長タンパク質の代わりに使用することができる。より具体的には、VEGF結合性ドメイン(ドメイン2)、または代替的に、sFLT-1のドメイン2に加えて、sFLT1、KDR、または別のファミリーメンバーに由来するドメイン3を使用して、VEGFに結合させ、これを不活化することができる。このような機能的断片は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Wiesmannら、1997年、Cell、91巻:695~704頁において記載されている。「sFLT-1」および「sFLT-1の機能的断片」という用語は、同義であり、本明細書では互換的に使用される。
III.ベクターおよび組換えウイルス
本開示の組成物および方法は、抗VEGF(例えば、sFLT-1タンパク質)をコードする核酸の、それを必要とするヒト対象または患者における細胞への送達を提供する。場合によって、核酸の送達は、遺伝子治療と称する場合がある。
本開示の組成物および方法は、抗VEGF(例えば、sFLT-1タンパク質)をコードする核酸の、それを必要とするヒト対象または患者における細胞への送達を提供する。場合によって、核酸の送達は、遺伝子治療と称する場合がある。
本開示の組成物および方法は、抗VEGF核酸(例えば、sFLT-1)を送達するための任意の適切な方法を提供する。場合によって、核酸の送達は、任意の適切な「ベクター」(場合によって、「遺伝子送達」または「遺伝子移入ビヒクル」ともまた称する)を使用して実施することもできる。ベクター、送達ビヒクル、遺伝子送達ビヒクル、または遺伝子移入ビヒクルは、標的細胞へと送達されるポリヌクレオチドを含む任意の適切な高分子または分子の複合体を指す場合がある。場合によって、標的細胞は、核酸または遺伝子が送達される任意の細胞でありうる。送達されるポリヌクレオチドは、sFLT-1遺伝子など、遺伝子治療における対象のコード配列を含みうる。
例えば、適切なベクターは、ポリヌクレオチドの標的細胞への送達を媒介することが可能な、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、およびレトロウイルスなどのウイルスベクター、リポソーム、他の脂質含有複合体、および他の高分子複合体を含みうるがこれらに限定されない。
場合によって、ベクターは、有機分子の場合もあり、無機分子の場合もある。場合によって、ベクターは、低分子(すなわち、<5kD)の場合もあり、高分子(すなわち>5kD)の場合もある。例えば、ベクターは、不活性の分子、金属粒子などの生物学的不活性分子を含みうるがこれらに限定されない。場合によって、ベクターは、金粒子でありうる。
場合によって、ベクターは、生物学的活性分子を含みうる。例えば、ベクターは、デンドリマーなどの重合化させた高分子を含みうる。
場合によって、ベクターは、1または複数の核酸を組み込む組換えウイルスベクターを含みうる。本明細書で記載される核酸とは、ポリヌクレオチドを指す場合がある。核酸とポリヌクレオチドとは、互換的に使用することができる。場合によって、核酸は、DNAを含む場合もあり、RNAを含む場合もある。場合によって、核酸は、sFLT-1を発現させるためのDNAを含む場合もあり、sFLT-1を発現させるためのRNAを含む場合もある。場合によって、RNA核酸は、対象の遺伝子(例えば、sFLT-1)の転写物、イントロン、非翻訳領域、終結配列などを含みうるがこれらに限定されない。他の場合には、DNA核酸は、ハイブリッドプロモーター遺伝子配列、強い構成的プロモーター配列、対象の遺伝子(例えば、sFLT-1)、非翻訳領域、終結配列などの配列を含みうるがこれらに限定されない。場合によって、DNAとRNAとの組合せも、使用することができる。
本明細書の本開示で記載される「発現構築物」という用語は、遺伝子産物をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含有する任意の種類の遺伝子構築物であって、配列をコードする核酸の一部または全部の転写が可能な遺伝子構築物を含むことを意味する。転写物は、タンパク質へと翻訳されうる。場合によって、転写物は、部分的に翻訳される場合もあり、翻訳されない場合もある。ある特定の態様では、発現は、遺伝子の転写およびmRNAの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の態様では、発現は、対象の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含む。
一態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルス(rAAV)などの組換えウイルスを、sFLT-1の発現を媒介するベクターとして提供する。
場合によって、本開示のウイルスベクターは、pfu(プラーク形成単位:plaque forming units)として測定することができる。場合によって、本開示の組成物および方法の組換えウイルスまたはウイルスベクターのpfuは、約108~約5×1010pfuでありうる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、および5×1010pfuである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、および5×1010pfuである。
場合によって、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定することができる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×1010~3×1012のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×109~3×1013のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×108~3×1014のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×108~3×1014のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のベクターゲノムである。
場合によって、本開示のウイルスベクターは、感染多重度(MOI)を使用して測定することができる。場合によって、MOIとは、ベクターまたはウイルスゲノムの、核酸を送達しうる細胞に対する比または倍数を指す場合がある。場合によって、MOIは、1×106でありうる。場合によって、MOIは、1×105~1×107でありうる。場合によって、MOIは、1×104~1×108でありうる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のMOIである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×108~3×1014のMOIである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のMOIである。
一部の態様では、核酸は、ウイルスを使用せずに(すなわち、非ウイルスベクターにより)送達することができ、核酸量として測定することができる。一般に、任意の適切な核酸量を、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。場合によって、核酸は、少なくとも約1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g、または5gでありうる。場合によって、核酸は、最大で約1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g、または5gでありうる。
一部の態様では、自己相補性ベクター(sc)を使用することができる。参照により本明細書に組み込まれる、Wu、Hum Gene Ther.、2007年、18巻(2号):171~82頁により提供される通り、自己相補性AAVベクターを使用することにより、ウイルス性第2鎖DNAの合成に対する要求を迂回することができ、導入遺伝子タンパク質の発現速度の増大をもたらすことができる。
一部の態様では、複数のAAVベクターを生成して、最適な血清型、プロモーター、および導入遺伝子の選択を可能とすることができる。
場合によって、ベクターは、標的化ベクター、とりわけ、がん細胞または腫瘍細胞または眼細胞などの特異的な細胞に選択的に結合する標的化ベクターでありうる。本開示における使用のためのウイルスベクターは、標的細胞に対して低毒性を呈示し、治療的有用量の抗VEGFタンパク質の産生を細胞特異的な様式で誘導するウイルスベクターを含みうる。
本開示の組成物および方法は、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスのうちの少なくとも1つの使用を含むがこれらに限定されない、任意の適切なウイルス性核酸送達系を提供する。好ましくは、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された強い真核細胞プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含む。
一般に、任意の適切なウイルスベクターは、本開示の組成物および方法を伴う使用に最適化されるように操作することができる。例えば、アデノウイルス(Ad)またはアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するウイルスベクターを使用することができる。ヒトウイルスベクターおよび非ヒトウイルスベクターのいずれも使用することができ、組換えウイルスベクターは、ヒトにおいて複製欠損でありうるように変化させることができる。ベクターがアデノウイルスである場合、ベクターは、抗VEGFタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有するポリヌクレオチドを含むことが可能であり、ヒトにおいて複製欠損である。
2つのウイルスベクター系の有利な特性を組み合わせるために、ハイブリッドウイルスベクターを使用して、sFLT-1タンパク質をコードする核酸を標的細胞または標的組織へと送達することができる。当業者には、ハイブリッドベクターを構築するための標準的な技法が周知である。このような技法は、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、N.Y.または組換えDNA技術について論じる任意の数の実験室マニュアルにおいて見出すことができる。AAV ITRとアデノウイルスITRとの組合せを含有するアデノウイルスカプシド内の二本鎖AAVゲノムを使用して、細胞に形質導入することができる。別の変化形では、AAVベクターを、「ガットレス」アデノウイルスベクター、「ヘルパー依存型」アデノウイルスベクター、または「高容量」アデノウイルスベクターに入れることができる。アデノウイルス/AAVハイブリッドベクターは、Lieberら、J. Virol.、73巻:9314~9324頁、1999年において論じられている。レトロウイルス/アデノウイルスハイブリッドベクターは、Zhengら、Nature Biotechnol.、18巻:176~186頁、2000年において論じられている。
アデノウイルス内に含有されるレトロウイルスゲノムは、標的細胞ゲノム内に組み込み、安定的な遺伝子発現を実行することができる。
複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、公知の技法に従い産生することができる。Quantinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻:2581~2584頁(199
2年); Stratford-Perricadetら、J. Clin. Invest.、90巻:626~630頁(1992年);およびRosenfeldら、Cell、68巻:143~155頁(1992年)を
参照されたい。
2年); Stratford-Perricadetら、J. Clin. Invest.、90巻:626~630頁(1992年);およびRosenfeldら、Cell、68巻:143~155頁(1992年)を
参照されたい。
加えて好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学コンジュゲートを含みうるがこれらに限定されない。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスおよびHIVベースのウイルスを含む。場合によって、HIVベースのウイルスベクターであって、gag遺伝子およびpol遺伝子がHIVゲノムに由来し、env遺伝子が別のウイルスに由来する、少なくとも2つのベクターを含むウイルスベクターを使用することができる。DNAウイルスベクターを使用することができる。これらのベクターは、オルソポックスベクターまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、I型単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターなどのヘルペスウイルスベクター[参照により本明細書に組み込まれる、Geller, A.I.ら、J. Neurochem、64巻:487頁(1995年); Lim, F.ら、「DNA Cloning: Mammalian Systems」、D. Glover編(Oxford Univ. Press、Oxford England)(1995年); Geller, A.I.ら、Proc Natl. Acad. Sci. : U.S.A.:90巻、7603頁(1993年); Geller, A.I.ら、Proc Natl. Acad. Sci USA、87巻:1149頁(1990年)]、アデノウイルスベクター[参照により本明細書に組み込まれる、LeGal LaSalleら、Science、259巻:988頁(1993年); Davidsonら、Nat. Genet.、3巻:219頁(1993年); Yangら、J. Virol.、69巻:2004頁(1995年)]、およびアデノ随伴ウイルスベクター[参照により本明細書に組み込まれる、Kaplitt, M.G.ら、Nat. Genet.、8巻:148頁(1994年)]を含む。
本開示に従い使用しうる、他のウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベースのベクターを含む。1または複数の前初期遺伝子(IE)を欠失させたHSVベクターは一般に、非細胞傷害性であり、標的細胞内の潜伏性と類似の状態で存続し、効率的な標的細胞への形質導入をもたらすために有利である。組換えHSVベクターは、約30kbの異種核酸を組み込むことができる。
本開示ではまた、C型レトロウイルスなどのレトロウイルスおよびレンチウイルスも使用することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、HuおよびPathak、Pharmacol. Rev.、52巻:493511頁、2000年;およびFongら、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.、17巻:1~60頁、2000年により提供される通り、レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(MLV)に基づきうる。MLVベースのベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに最大で8kbの異種(治療的)DNAを含有しうる。異種DNAは、組織特異的プロモーターおよび抗VEGFタンパク質核酸を含みうる。新生物細胞への送達法では、異種DNAはまた、組織特異的な受容体へのリガンドもコードする。
参照により本明細書に組み込まれる、VignaおよびNaldini、J. Gene Med.、5巻:308~316頁、2000年;ならびにMiyoshiら、J. Virol.、72巻:8150~8
157頁、1998年により提供される通り、ヒト免疫不全(HIV)ベースのベクターを含む複製欠損レンチウイルスベースのベクターを含むがこれらに限定されない、さらなるレトロウイルスベクターも使用することができる。レンチウイルスベクターは、活性分裂細胞および非分裂細胞のいずれにも感染することが可能な点で有利でありうる。それらははまた、ヒト上皮細胞に形質導入するときにも高度に効率的でありうる。
157頁、1998年により提供される通り、ヒト免疫不全(HIV)ベースのベクターを含む複製欠損レンチウイルスベースのベクターを含むがこれらに限定されない、さらなるレトロウイルスベクターも使用することができる。レンチウイルスベクターは、活性分裂細胞および非分裂細胞のいずれにも感染することが可能な点で有利でありうる。それらははまた、ヒト上皮細胞に形質導入するときにも高度に効率的でありうる。
本開示における使用のためのレンチウイルスベクターは、ヒトレンチウイルスおよび非ヒト(SIVを含む)レンチウイルスに由来しうる。レンチウイルスベクターの例は、ベクターの繁殖に要求される核酸配列のほか、抗VEGFタンパク質遺伝子に作動可能に連結された組織特異的プロモーターも含む。核酸配列は、ウイルスLTR、プライマー結合性部位、ポリプリントラクト、att部位、およびカプシド形成部位を含みうる。
レンチウイルスベクターは、任意の適切なレンチウイルスカプシドへとパッケージングすることができる。1つの粒子タンパク質の、異なるウイルスに由来する別の粒子タンパク質による置換を、「シュードタイピング」と称する。ベクターカプシドは、マウス白血病ウイルス(MLV:murine leukemia virus)または水疱性口内炎ウイルス(VSV:vesicular stomatitis virus)を含む、他のウイルスに由来するウイルスエンベロープタンパク質を含有しうる。VSV Gタンパク質を使用することにより、高ベクター力価がもたらされ、ベクターウイルス粒子の安定性の増大が結果としてもたらされる。
本開示ではまた、セムリキ森林熱ウイルス(SFV)およびシンドビスウイルス(SIN)から作製されたアルファウイルスベースのベクターなど、アルファウイルスベースのベクターも使用することができる。アルファウイルスの使用は、参照により本明細書に組み込まれる、Lundstrom, K.、Intervirology、43巻:247~257頁、2000年;およびPerriら、Journal of Virology、74巻:9802~9807頁、2000年において記載されている。
組換えの複製欠損アルファウイルスベクターは、高レベルの異種(治療的)遺伝子発現が可能であり、広範な標的細胞範囲に感染しうるため、有利でありうる。アルファウイルスのレプリコンは、それらのビリオン表面上に、コグネイトの結合パートナーを発現させる標的細胞への選択的結合を可能とする機能的な異種リガンドまたは結合性ドメインを提示させることにより、特異的な細胞型へと標的化することができる。アルファウイルスのレプリコンは、潜伏性を確立することが可能であり、したがって、長期にわたる標的細胞内の異種核酸の発現を確立することが可能である。レプリコンははまた、標的細胞内の一過性の異種核酸の発現も呈示しうる。
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を、細胞の細胞質へと導入しうる。アビポックスウイルスベクターは、遺伝子または核酸の短期間の発現だけを結果としてもたらしうる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス(HSV:herpes simplex virus)ベクターは、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。一部の態様では、アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスより短期間の発現(例えば、約1カ月間未満)を結果としてもたらす場合もあるがはるかに長期にわたる発現も呈示しうる。選択される特定のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存しうる。
アデノ随伴ウイルス(AAV)とは、小型の非エンベロープ一本鎖DNAウイルスである。AAVは、非病原性ヒトパルボウイルスであり、複製のためのヘルパーウイルスであって、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびCMVを含むヘルパーウイルスに依存しうる。野生型(wt)AAVへの曝露は、いかなるヒト病態とも関連しないか、またはいかなるヒト病態を引き起こすことも公知ではなく、一般的な集団内に一般的であり、通常は生後最初の10年間にアデノウイルス感染と関連して生じる。
本明細書で記載される「AAV」とは、アデノ随伴ウイルスを指し、「rAAV」とは、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
場合によって、野生型のAAVは、rep遺伝子およびcap遺伝子をコードする。rep遺伝子は、ウイルスの複製に要求され、cap遺伝子は、カプシドタンパク質の合成に要求される。代替的な翻訳開始部位とスプライシング部位とを組み合わせることにより、小型ゲノムは、4つのrep遺伝子産物および3つのcap遺伝子産物を発現させることが可能でありうる。逆位末端配列(ゲノムを挟む145bpのITR)内のrep遺伝子産物およびrep遺伝子配列は、この過程において極めて重要でありうる。現在のところ、AAVの11の血清型が単離されている。AAV2は、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。本開示の組成物および方法は、任意の適切なAAV血清型の使用を提供する。一部の態様では、AAVは、AAV1、AAV2、AAV2.5、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される。
一部の態様では、本開示は、切断型可溶性VEGF受容体1(sFLT-1)のヒト形態をさらに含む核酸を含む組換えウイルスであって、rAAV.sFlt-1と名付けられた組換えウイルスを提供する。ベクターは、血清型2の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性(rAAV)ベクターである。別の態様では、ベクターは、rAAV.sFlt-1と名付けられた、血清型2の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性(rAAV)ベクターである。
AAV2は、特徴付けが最もよくなされている。rAAV2は、多くの動物種の眼における長期にわたる導入遺伝子発現を媒介することが可能なことが示されている。ラットでは、rAAVに媒介されたレポーター遺伝子(緑色蛍光タンパク質)は、注射の18カ月後においてもなお存在した。サルでは、同じレポート遺伝子が、注射の17カ月後において存在した。同様に、rAAV.sFlt-1を注射されたサルの眼の硝子体中でも、高sFLT-1タンパク質レベルが、注射の15カ月後において存在した。
rAAV.sFlt-1は、動物モデルにおいて、眼内血管新生性障害について調べられている。rAAV.sFlt-1は、角膜血管新生および網膜血管新生の動物モデルにおいて、血管新生の進行を遅らせると考えられた。興味深いことに、rAAVを媒介するsFlt-1は、脈絡膜血管新生のサルモデル(加齢黄斑変性またはAMDの滲出形態についてのモデル)において、血管新生のある程度の阻害を指し示した。本研究では、rAAV.sFlt-1構築物の存在は、サルの眼において低レベルのsFLT-1の発現を示し、サルの健全性または網膜機能には影響を及ぼさなかった。rAAV.sFlt-1への全身曝露と関連するいかなる安全性問題を示唆する証拠も見られない。これらの研究におけるrAAVベクターの全体的な肯定的所見および毒性の欠如のほか、脈絡膜血管新生/AMDの哺乳動物モデルにおけるrAAV.sFlt-1による所見は、ベクターが、眼へと投与されると、好適な安全性プロファイルを示すことを裏付ける広範なデータをもたらしている。
サルモデルにおいて、AMDのある種の症状を改善するrAAV.sFlt-1の能力にもかかわらず、網膜内のsFLT-1タンパク質レベルは予測外に低い。当技術分野では、構成的に活性の哺乳動物プロモーターにより駆動されるsFLT-1の発現レベルは、多数の細胞型において高レベルのタンパク質の発現をもたらすことが示されている。理論に束縛されることなく述べると、この予測されるより低い発現レベルについては、複数の可能性が存在しうる。大型のマルチドメインタンパク質としてのsFLT-1は、早期のタンパク質分解に対して感受性である可能性もあり、発現の反応速度が低い可能性もあり、分取が最適でない可能性もある。後者に関しては、分泌されたタンパク質としてのsFLT-1は、細胞内で組換えにより発現すると、分泌経路に入る。RPE細胞を含む網膜細胞では、sFLT-1は、タンパク質のERによる分取またはゴルジ体による分取に応じて、尖端側に分泌される場合もあり、基底側方に分泌される場合もある。場合によって、最適でない分取は、分子を望ましくない基底側方膜へと分泌させ、したがって、VEGFによるシグナル伝達およびRPE細胞層の尖端表面上の新生血管性血管形成を阻害するのに利用可能なsFLT-1分子の濃度を低下させる場合がある。
加えて、当技術分野では、この予測外に低いsFLT-1のレベルが、ヒトにおける実際のAMD疾患の処置に対する薬物の有効性にいかなる影響を及ぼしうるのかについても知られていなかった。サルモデルにおいて高レベルとなることがまれでありながらもAMDの症状を改善する有望な徴候が示されたが、AMD疾患についてのサロゲートを供するのはAMDについてのサルによる動物モデルだけである。本明細書で記載されるAMDの症状は、網膜内で人為的に誘導される(レーザーを介する)。このモデルは、多様な解析に適するが、サルモデルにおける症状の処置における実際の薬物の有効性をヒトにおける疾患の処置へと外挿することは難しい。予測外なことに、rAAV.sFlt-1によりもたらされる低タンパク質レベルは、ヒトにおける実験を伴わずにこれを評価することの困難をさらに増大させる。
加えて、英国および米国では、rAAV2骨格を使用して、レーバー先天性黒内障(LCA:Lebers Congenital Amaurosis)についての3つの臨床試験も行われている。LCAとは、出生時または生後最初の数カ月間に現れるまれな遺伝性眼疾患であり、眼球振とう、瞳孔反射が遅いかまたは見られないこと、および重度の視覚喪失または失明を特徴とする。現在のところ、rAAV2構築物の、これらの2つの試験の6例の参加者の網膜下腔への注射後における安全性問題は報告されていない。臨床試験に関与するいずれのチームも、それらの所見により、LCA患者におけるさらなる遺伝子治療研究が支持されることを結論付けた。
サルにおいて、sFLT-1の実質的または持続的な高レベルをもたらすことの見かけ上の技術的困難を踏まえると、rAAV.sFlt-1を導入した後における網膜内の、sFlt-1の低タンパク質レベルに伏在する技術的問題のうちの1または複数に取り組むために、多様な最適化戦略をとることができる。場合によって、本開示の組成物および方法により提供される最適化戦略を含む最適化戦略は、sFlt-1タンパク質配列もしくはsFlt-1タンパク質ドメインを最適化すること、制御エレメントを導入して、網膜細胞内の発現後における適正な分取を指示すること、またはsFlt-1タンパク質のレベルを上昇させて、これらの可能な因子のうちのいずれかを補償することを含みうる。場合によって、本開示の組成物および方法は、後者へと方向付けられた特異的な戦略であって、ヒト網膜におけるタンパク質レベルを、かつてサル研究において観察されたsFlt-1レベルを上回って上昇させることへと方向付けられた特異的な核酸配列の組込みを伴う戦略を提供する。本明細書で記載される、多様な配列、リンカー、UTR、イントロン、sFLT-1変異体、またはこれらの組合せを使用して、rAAV.sFlt-1へと曝露した後における、網膜内のsFlt-1タンパク質のタンパク質レベルを上昇させることができる。
ベクターは、遺伝子送達および/もしくは遺伝子発現をさらにモジュレートするか、または標的とされる細胞に他の形で有益な特性をもたらす成分または機能性を含みうる。このような他の成分は、例えば、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす成分(細胞型特異的結合または組織特異的結合を媒介する成分を含む);細胞によるベクター核酸の取込みに影響を及ぼす成分;取込み後における細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分(核局在化を媒介する薬剤など);およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分を含む。このような成分はまた、ベクターにより送達される核酸を取り込み、発現させる細胞を検出または選択するのに使用しうる、検出用マーカーおよび/または選択用マーカーなどのマーカーも含みうるであろう。このような成分は、ベクター(結合および取込みを媒介する成分または機能性を有する、ある種のウイルスベクターの使用など)の天然の特色としてもたらすこともでき、ベクターを、このような機能性をもたらすように修飾することもできる。
選択用マーカーは、陽性の場合もあり、陰性の場合もあり、二機能性の場合もありう
る。陽性の選択用マーカーが、マーカーを保有する細胞の選択を可能とするのに対し、陰性の選択用マーカーは、マーカーを保有する細胞を、選択的に除外することを可能とする。二機能性(すなわち、陽性/陰性)マーカー(例えば、1992年5月29日に公開されたLupton, S.、WO92/08796;および1994年12月8日に公開されたLupton, S.、WO94/28143を参照されたい)を含む、様々なこのようなマーカー遺伝子について記載されている。陰性の選択用マーカーの例は、耐性遺伝子の、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生剤への組入れを含みうる。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の文脈において有利でありうる、さらなる制御尺度をもたらしうる。当技術分野では、多種多様なこのようなベクターが公知であり、一般に利用可能である。
る。陽性の選択用マーカーが、マーカーを保有する細胞の選択を可能とするのに対し、陰性の選択用マーカーは、マーカーを保有する細胞を、選択的に除外することを可能とする。二機能性(すなわち、陽性/陰性)マーカー(例えば、1992年5月29日に公開されたLupton, S.、WO92/08796;および1994年12月8日に公開されたLupton, S.、WO94/28143を参照されたい)を含む、様々なこのようなマーカー遺伝子について記載されている。陰性の選択用マーカーの例は、耐性遺伝子の、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生剤への組入れを含みうる。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の文脈において有利でありうる、さらなる制御尺度をもたらしうる。当技術分野では、多種多様なこのようなベクターが公知であり、一般に利用可能である。
場合によって、抗生剤耐性マーカーをコードする核酸は、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、または配列番号114などの配列を含みうるがこれらに限定されない。
本開示の方法に適合的なウイルスベクターの多くでは、1または複数のプロモーターを、ベクター内に組み入れて、ベクターが複数の異種遺伝子を発現させることを可能とすることができる。さらに、ベクターは、抗VEGFタンパク質の標的細胞からの発現を容易とするシグナルペプチドまたは他の部分をコードする配列も含みうる。
遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターによる転写制御下に置くことができる。本明細書で提供される「プロモーター」とは、遺伝子の転写を開始するのに要求される適切なDNA配列を指す。「転写制御下の」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる開始および遺伝子の発現を制御する核酸との関連で適正な位置および配向性にあることを意味する。場合によって、プロモーターは、「強い」プロモーターまたは構成的に活性のプロモーターを含みうる。例えば、CMVプロモーターは、当技術分野で公知の、構成的に活性のプロモーターとして使用することができる。場合によって、CMVプロモーターは、発現を促進するためのさらなる調節エレメントを含みうる。場合によって、CMVプロモーターは、前初期CMVプロモーターを含みうる。
場合によって、プロモーターは、「弱い」プロモーターまたは強いプロモーターより低レベルのsFLT-1タンパク質をもたらす配列を指す場合もある。場合によって、プロモーターは、sFLT-1の選択的発現を駆動するように使用することもできる。場合によって、本明細書で記載される他の配列と組み合わせて使用されるプロモーターまたは他の調節エレメントを使用して、眼細胞内または眼組織内のsFLT-1の選択的発現を駆動することもできる。
加えて、本明細書ではまた、「プロモーター」104を、任意のさらなる適切な転写制御モジュールであって、RNAポリメラーゼの開始部位の近傍に存在しうる転写制御モジュールを指すのに互換的に使用することもできる。本開示の組成物および方法では、導入遺伝子106を発現させるために、任意の適切なプロモーターおよび転写制御モジュールを使用することができる。さらなる転写制御モジュールは、HSVチミジンキナーゼ(tk:thymidine kinase)およびSV40初期転写単位などのエレメントを含みうるがこれらに限定されない。一般に、プロモーターは、各々が約7~20bpのDNA、または20~5000bpのDNAからなる不連続な機能的モジュールからなることが可能であり、転写活性化因子タンパク質または転写抑制因子タンパク質に対する1または複数の認識部位を含有しうる。本開示の組成物および方法は、任意の適切な調節配列、またはこれらの組合せを提供する。場合によって、これらの転写制御モジュール配列は、エンハンサー配列またはリプレッサー配列と称するかまたは同定することができる。
各プロモーター内の少なくとも1つのモジュールは、RNA合成の開始部位の位置を定めるように機能する。1つの例は、TATAボックスである。他の例は、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV40後期遺伝子のプロモーターなど、TATAボックスを欠くいくつかのプロモーターを含むことが可能であり、開始部位自体を占める不連続なエレメントは、開始位置を固定する一助となる。
さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にもまた機能的エレメントを含有しうるが、一般には、プロモーターエレメントは、開始部位の30~110bp上流の領域に位置する。プロモーターエレメントの間の間隔はしばしば、エレメントを互いに対して反転させるかまたは移動させた場合にプロモーター機能が保存されるように、柔軟でありうる。tkプロモーターでは、例えば、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメントの間の間隔を、50bpの隔たりへと増大させることができる。プロモーターに応じて、転写活性化させるのに共作動的または独立に機能するように、個別のエレメントの位置を定めることができる。
本開示の組成物および方法は、標的とされる細胞内の対象の核酸配列の発現を制御するための任意の適切な配列を提供する。したがって、ヒト細胞を標的とする場合、核酸のコード領域の配列を、ヒト細胞内で発現することが可能なプロモーターに隣接し、その制御下にあるように操作することができる。一般に、このようなプロモーターは、ヒトプロモーターを含む場合もあり、ウイルスプロモーターを含む場合もあろう。
本開示の多様な態様では、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期遺伝子プロモーター(ie-CMV)、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、β-アクチン、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、対象のコード配列(例えば、sFLT-1)の高レベルの発現を得ることができる。発現レベルが所与の目的に十分であるという条件で、対象のコード配列の発現を達成することが当技術分野で周知な、他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用もまた想定される。一部の態様では、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列などの原核生物調節配列を、ベクター内に存在させることができる。他の態様では、ベクターは、このような調節配列を含まない。公知の特性を伴うプロモーターを援用することにより、トランスフェクションまたは形質転換後における、対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを、最適化することができる。
特異的な生理学的シグナルまたは合成についてのシグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能としうる。例えば、マルチシストロニックベクターを利用するときに、1または複数の導入遺伝子の発現が、その中でベクターが産生される細胞に対して毒性である場合、導入遺伝子のうちの1または複数の発現を阻止または低減することが所望でありうる。産生細胞系に対して毒性でありうる導入遺伝子の例は、アポトーシス促進性遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。導入遺伝子産物が毒性でありうる場合に、ウイルスベクターを産生させるための、複数の誘導的プロモーター系が利用可能である。本開示の組成物および方法は、プロモーター配列、調節配列、および導入遺伝子の任意の適切な組合せを提供する。場合によって、配列の組合せは、細胞に対する毒性を結果としてもたらさない可能性がある。場合によって、配列の組合せは、細胞に対する高い毒性を結果としてもたらす可能性もある。場合によって、配列の組合せは、細胞内で中等レベルの毒性を結果としてもたらす可能性もある。
エクジソン系(Invitrogen、Carlsbad、Calif)は、導入遺伝子を発現させるための1つのこのような系である。この系は、哺乳動物細胞内の対象の遺伝子の発現の調節を可能とするようにデザインされている。エクジソン系は、導入遺伝子の基礎レベルの発現であるが、200倍を超える誘導性を伴う発現を可能とする、緊密に調節された発現機構からなる。エクジソン系は、Drosophila属のヘテロ二量体のエクジソン受容体に基づき、エクジソンまたはムリステロンAなどの類似体が、受容体に結合すると、受容体がプロモーターを活性化させて、下流における導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのmRNA転写物が得られる。この系では、ヘテロ二量体の受容体のうちの単量体のいずれもが、1つのベクターから構成的に発現するのに対し、対象の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上にある。この種類の系の、対象の遺伝子移入ベクターへの操作は、本開示の組成物および方法において使用することができる。次いで、対象の遺伝子と受容体の単量体とを含有するプラスミドを、産生細胞系へと共トランスフェクションすれば、潜在的に毒性の導入遺伝子を発現させずに、遺伝子移入ベクターの産生が可能となるであろう。適切な時点で、エクジソンまたはムリステロンAにより、導入遺伝子の発現を活性化しうるであろう。
一部の状況では、遺伝子治療ベクター内の導入遺伝子の発現を調節することが所望でありうる。例えば、所望の発現レベルに応じて、活性の強度を変化させる、異なるウイルスプロモーターを利用することができる。哺乳動物細胞内の、CMV前初期遺伝子プロモーターを使用して、強い転写の活性化をもたらすことができる。低レベルの導入遺伝子の発現が所望される場合にはまた、それほど強力ではないCMVプロモーターの修飾形も使用されている。造血細胞内の導入遺伝子の発現が所望される場合は、MLVまたはMMTVに由来するLTR(長末端反復:long terminal repeat)などのレトロウイルスプロモーターを使用することが多い。所望の効果に応じて使用されうる他のウイルスプロモーターは、SV40、RSV LTR、HIV-1 LTRおよびHIV-2 LTR、E1A領域、E2A領域、またはMLP領域に由来するアデノウイルスプロモーターなどのアデノウイルスプロモーター、AAV LTR、カリフラワーモザイクウイルス、HSV-TK、およびニワトリ肉腫ウイルスを含む。
一部の態様では、標的とされない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない作用を低減するように、組織特異的プロモーターを使用して、特異的な組織内または細胞内で転写させる。例えば、PSA、プロバシン、前立腺酸性ホスファターゼ、または前立腺特異的腺性カリクレイン(hK2)などのプロモーターを使用して、前立腺内の遺伝子発現を標的化することができる。
場合によって、プロモーターまたは調節配列エレメントを使用して、眼細胞内または眼組織内の選択的発現を指示することができる。例えば、網膜色素上皮細胞などの特異的な眼細胞型内で見出されるプロモーター、配列エレメント、または調節配列は、適切な発現構築物(例えば、RPE65プロモーターまたはVMD2プロモーター)において使用することができる。
適切なプロモーターの選択は、たやすく達成することができる。場合によって、高発現または強いプロモーターを使用することができる。適切なプロモーターの例は、763塩基対のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス(RSV)(Davisら、Hum Gene Ther、4巻:151頁(1993年))およびMMTプロモーターもまた、使用することができる。ある種のタンパク質は、それらの天然のプロモーターを使用して発現させることができる。エンハンサーなど、発現を増強しうる他のエレメント、またはtat遺伝子およびtarエレメントなど、高レベルの発現を結果としてもたらしうる系もまた、組み入れることができる。次いで、このカセットを、ベクター、例えば、pUC19、pUC118、pBR322、または、例えば、E.coliの複製起点を含む、他の公知のプラスミドベクターなどのプラスミドベクターへと挿入することができる。Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory press(1989年)を参照されたい。プロモーターは、前
出において論じられている。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが、処置される生物の代謝に有害な影響を及ぼさないという条件で、アンピシリン耐性についてのβ-ラクタマーゼ遺伝子などの選択用マーカーも含みうる。カセットはまた、参照により本明細書に組み込まれる、WO95/22618において開示されている系など、合成による送達系内で、核酸結合性部分へと結合させることもできる。一般に、プロモーター配列および/または任意の関連する調節配列は、少なくとも約150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、または10000bpを含みうる。プロモーター配列および任意の関連する調節配列は、最大で約150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、または10000bpを含みうる。
出において論じられている。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが、処置される生物の代謝に有害な影響を及ぼさないという条件で、アンピシリン耐性についてのβ-ラクタマーゼ遺伝子などの選択用マーカーも含みうる。カセットはまた、参照により本明細書に組み込まれる、WO95/22618において開示されている系など、合成による送達系内で、核酸結合性部分へと結合させることもできる。一般に、プロモーター配列および/または任意の関連する調節配列は、少なくとも約150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、または10000bpを含みうる。プロモーター配列および任意の関連する調節配列は、最大で約150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、または10000bpを含みうる。
一部の態様では、組換えウイルスまたはプラスミドは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、およびMMTプロモーター、EF-1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ-アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む。一般に、本開示により提供されるプロモーター配列およびプロモーター/エンハンサー配列は、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号340、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、および配列番号47から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。
一部の態様では、抗生剤マーカーを、組換えウイルスを産生させるための過程において使用する。組換えウイルスを生成するときに、抗生剤耐性マーカーを使用して、陽性のトランスジェニック細胞を同定することができる。一部の態様では、抗生剤マーカーは、図8Aおよび図8Bに示される配列を含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される配列など、抗生剤耐性遺伝子をコードする配列を含む。例えば、耐性を付与するマーカーは、カナマイシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはハイグロマイシンを含みうるがこれらに限定されない。一部の態様では、抗生剤耐性遺伝子は、カナマイシンなど、非ベータ-ラクタム抗生剤耐性遺伝子である。
一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供される複製起点配列などの複製起点配列をコードする配列を含む。複製起点配列は一般に、プラスミドを繁殖させるのに有用な配列を提供する。一般に、本開示により提供される複製起点配列は、図7A、図7B、図7Cおよび図7Dに提供される配列から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。
一部の態様では、起点配列または複製起点配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、または配列番号17などの配列を含みうるがこれらに限定されない。
一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供されるエンハンサーなどのエンハンサーを含む。
一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供され、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7635474号において開示されている、キメライントロンまたはイントロンなどのキメライントロンまたはイントロン105を含む。本明細書では、イントロンまたはキメライントロンを互換的に使用することができる。場合によって、イントロンは、転写される可能性はあるが翻訳されない任意の配列を指す場合がある。場合によって、イントロンは、転写される可能性はあるが細胞内の成熟RNA転写物からは除去される任意の配列を指す場合がある。場合によって、イントロンは、少なくとも約1bp、50bp、100bp、150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、または5000bpを含みうる。場合によって、イントロンは、少なくとも約1bp、50bp、100bp、150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、または5000bpを含みうる。場合によって、イントロンは、約300bpでありうる。場合によって、イントロンは、約200~400bpでありうる。場合によって、キメライントロンは、約100~500bpでありうる。場合によって、イントロンは、約50~200bpでありうる。場合によって、イントロンは、無傷の自然発生のイントロンまたはキメライントロンでありうる。
一部の態様では、イントロンは、配列番号48、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、または配列番号120などの配列を含みうるがこれらに限定されない。
一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供されるポリA(ポリアデニル化)配列(例えば、SV40ポリA配列)などのポリA(ポリアデニル化)配列107を含む。一般に、導入遺伝子(すなわち、sFLT-1)の所望の発現のための、任意の適切なポリA配列を使用することができる。例えば、場合によって、本開示は、SV40ポリA配列またはSV40ポリA配列の一部を含む配列を提供する。場合によっては、ヒトゲノム配列において見出される、ヒトsFLT-1遺伝子の下流に見出される天然のポリA配列(3’UTR)を使用することができる。他の場合には、sFLT-1以外の遺伝子の下流に見出されるポリA配列を使用することができる。他の場合には、本開示は、1または複数のポリA配列またはポリA配列エレメントの組合せを含むポリA配列を提供する。場合によっては、ポリA配列を使用しない。場合によって、1または複数のポリA配列は、非翻訳領域(UTR:untranslated region)、3’UTR、または終結配列と称する場合がある。
本開示のある特定の態様では、内部リボソーム進入部位(IRES:internal ribosome entry site)または口蹄病ウイルス(FMDV:foot-mouth disease virus)エレメントを使用して、多重遺伝子またはポリシストロニックのメッセージを創出することができる。IRESエレメントは、5’メチル化キャップ依存型翻訳のリボソーム走査モデルを迂回し、内部部位で翻訳を始めることが可能である。ピコルナウイルスファミリーの2つのメンバー(ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス)に由来するIRESエレメントのほか、哺乳動物メッセージに由来するIRESも記載されている。IRESエレメントは、異種オープンリーディングフレームへと連結することができる。各々がIRESにより隔てられた複数のオープンリーディングフレームは、併せて転写して、ポリシストロニックのメッセージを創出することが可能である。IRESエレメントにより、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能となりうる。単一のメッセージを転写するように、単一のプロモーター/エンハンサーを使用して、複数の遺伝子を効率的に発現させることができる。遺伝子治療の送達ベクターにおいて2つのタンパク質を共発現させるための代替的な系は、FMDV 2A系である。FMDV 2A系は、2つの遺伝子をピコルナウイルスの口蹄病ウイルスに由来する2A配列をコードするヌクレオチドへ配列と連結しうる、レトロウイルスによるプラスミドベクターを援用する。転写および翻訳は、バイシストロニックのmRNAおよび2つの独立のタンパク質産物をもたらす。
任意の異種オープンリーディングフレームを、IRESエレメントへと連結することができる。これは、独立の遺伝子によりコードされる分泌タンパク質であるマルチサブユニットタンパク質である、細胞内タンパク質または膜結合タンパク質および選択用マーカーの遺伝子を含みうる。この様式で、複数のタンパク質の発現を、単一の構築物および単一の選択用マーカーにより、細胞へと同時に操作することができる。
ポリA配列は、1~10bp、10~20bp、20~50bp、50~100bp、100~500bp、500bp~1Kb、1Kb~2Kb、2Kb~3Kb、3Kb~4Kb、4Kb~5Kb、5Kb~6Kb、6Kb~7Kb、7Kb~8Kb、8Kb~9Kb、および9Kb~10Kbの長さを含みうる。ポリA配列は、少なくとも1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。ポリA配列は、最大で1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。
場合によって、ポリA配列または終結配列は、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55などの配列を含みうるがこれらに限定されない。
一般に、本開示により提供されるポリA配列は、図9Aおよび図9Bに提供されるポリA領域1~10から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。
場合によって、ポリA配列は、細胞内の導入遺伝子のmRNAの半減期、導入遺伝子のmRNAの安定性、または転写の調節を含むがこれらに限定されない、タンパク質の発現に影響を及ぼす多様なパラメータについて最適化することができる。例えば、ポリA配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物を増大させ、この結果としてタンパク質の発現を増大させることができる。場合によって、ポリA配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物の半減期を短縮し、この結果としてタンパク質の発現を減少させることができる。
一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、ヒトsFLT-1タンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む。場合によって、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、別の抗VEGFタンパク質またはVEGF阻害剤をコードする核酸を含む。
場合によって、VEGF阻害剤は、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、または配列番号122などの配列を含みうるがこれらに限定されない。
場合によって、VEGF阻害剤の核酸は、配列番号109、または配列番号121などのポリペプチド配列を含みうるがこれらに限定されないポリペプチド配列をコードしうる。
一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、眼細胞内のsFLT-1タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む。場合によって、眼細胞は、網膜色素上皮細胞(RPE)を含みうる。
一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、1または複数の非翻訳領域(UTR)またはUTR配列を含みうる。一般に、導入遺伝子(すなわち、sFLT-1)の所望の最適な発現のために、任意の適切なUTR配列を使用することができる。例えば、場合によって、UTR領域またはUTR配列は、天然の配列を含みうる。場合によって、UTR配列は、ヒトゲノム配列またはその一部において見出されるヒトsFLT-1遺伝子の上流(5’UTR)または下流(3’UTR)に見出される配列でありうる。他の場合には、UTR配列は、sFLT-1以外の遺伝子の上流または下流に見出される非天然の配列などの非天然の配列を含む場合もあり、本明細書でさらに記載される1または複数のUTR配列エレメントの組合せをさらに含む配列含む場合もある。場合によって、5’UTR配列だけを使用する。場合によって、3’UTR配列だけを使用する。場合によって、UTR配列は使用しない。
UTR配列は、1~10bp、10~20bp、20~50bp、50~100bp、100~500bp、500bp~1Kb、1Kb~2Kb、2Kb~3Kb、3Kb~4Kb、4Kb~5Kb、5Kb~6Kb、6Kb~7Kb、7Kb~8Kb、8Kb~9Kb、および9Kb~10Kbの長さを含みうる。UTR配列は、少なくとも1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。UTR配列は、最大で1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。
一般に、本開示により提供されるUTR配列は、配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101を含むがこれらに限定されない任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。
場合によって、5’UTRおよび/または3’UTRの変化形は、所望のレベルのタンパク質の発現について最適化することができる。場合によって、3’UTR配列は、細胞内の導入遺伝子のmRNAの半減期、導入遺伝子のmRNAの安定性もしくは二次構造、または条件的調節(例えば、翻訳をモジュレートする多様な因子の結合)を含むがこれらに限定されない、タンパク質の発現に影響を及ぼす多様なパラメータについて最適化することができる。例えば、3’UTR配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物の半減期を延長し、この結果としてタンパク質の発現を増大させることができる。場合によって、3’UTR配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物の半減期を短縮し、この結果としてタンパク質の発現を減少させることもできる。
一般に、3’UTR配列は、多様な配列エレメントを含みうる。本開示は、1または複数のポリアデニル化シグナル、リンカー配列、スペーサー配列、SECISエレメント、AUに富む配列もしくはARE配列またはmiRNA結合性配列もしくはRNAi結合性配列、転写ターミネーター配列3’終結配列またはそれらの変異体および/もしくは組合せなどの配列エレメントを含みうるがこれらに限定されない、3’UTR配列を提供する。
場合によって、5’UTR配列は、細胞内の導入遺伝子のmRNAの半減期、導入遺伝子のmRNAの安定性もしくは二次構造、または転写の調節を含むがこれらに限定されない、タンパク質の発現に影響を及ぼす多様なパラメータについて最適化することができる。例えば、5’UTR配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物の翻訳効率を増大させ、この結果としてタンパク質の発現を増大させることができる。場合によって、5’UTR配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物の翻訳効率を減少させ、この結果としてタンパク質の発現を減少させることができる。
一般に、5’UTR配列は、多様な配列エレメントを含みうる。本開示は、1または複数のリボソーム結合性部位(RBS)、リンカー配列、スペーサー配列、調節配列、調節応答エレメント、リボスイッチ、翻訳開始を促進または阻害する配列、mRNA輸送のための調節配列またはそれらの変異体および/もしくは組合せなどの配列エレメントを含みうるがこれらに限定されない、5’UTR配列を提供する。
一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、1または複数のリンカー配列またはスペーサー配列を含みうる。本明細書で記載されるリンカー配列またはスペーサー配列は、互換的に使用することができる。一般に、リンカー配列またはスペーサー配列は、少なくとも2つの配列エレメントの間の非隣接配列を創出するのに使用される任意の適切な配列でありうる。例えば、本開示の一態様では、リンカー配列は、図1Aに反映される通り、ITR-1(108)配列、またはITR-2(103)、および抗生剤耐性遺伝子配列106の間に挿入されて見出されうる。別の例では、リンカー配列は、ITR配列、プロモーター配列もしくはプロモーター/エンハンサー配列、イントロン配列、導入遺伝子配列、およびポリA領域配列を含む、組換えウイルスまたは組換えウイルスをコードするプラスミドの任意の配列エレメントに隣接させて挿入することができる。一般に、任意の適切なリンカー配列またはスペーサー配列を使用して、非隣接配列を創出することができる。例えば、場合によっては、リンカー配列は、ランダムに生成された配列でありうる。場合によって、リンカー配列は、タンパク質の発現に有害な影響を及ぼしうる二次構造または分子内相互作用の形成を防止するように最適化された、非特異的な配列でありうる。場合によって、リンカー配列は、イントロン、調節配列、エンハンサーなどを含むがこれらに限定されない、任意のさらなる機能的配列エレメントを含みうる。リンカー配列内の機能的エレメントを、ウイルスの所望の最適な産生および/または導入遺伝子の発現のために使用することができる。場合によって、リンカー配列は、クローニング部位、先行するクローニング部位の残余部分、または他の重要でない配列であり、任意の2つの配列エレメントの間におけるこのようなリンカーの挿入は必要に応じてである。
一般に、本開示により提供されるリンカー配列は、図9D、図9E、および図9Fに提供される配列から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。
場合によって、リンカー配列の長さは、ウイルスの所望の最適な産生および/または導入遺伝子の発現のために最適化することができる。場合によって、ウイルスゲノム内またはプラスミド内の1または複数の部位に配置される1または複数のリンカー配列の長さは、所望の最適なタンパク質の発現をもたらすように変化させることができる。例えば、リンカー配列は、本明細書で記載されるイントロンと導入遺伝子(すなわち、sFLT-1)との間に見出すことができる。細胞内の導入遺伝子の転写および後続の翻訳に対する効果を変化させるように、リンカー配列の長さを変化させることができる。
リンカー配列は、1~10bp、10~20bp、20~50bp、50~100bp、100~500bp、500bp~1Kb、1Kb~2Kb、2Kb~3Kb、3Kb~4Kb、4Kb~5Kb、5Kb~6Kb、6Kb~7Kb、7Kb~8Kb、8Kb~9Kb、および9Kb~10Kbの長さを含みうる。リンカー配列は、少なくとも1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。リンカー配列は、最大で1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。
場合によって、リンカー配列またはスペーサー配列は、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、および配列番号90を含みうるがこれらに限定されない。
一部の態様では、組換えウイルスは、組換え遺伝子発現カセットを、ウイルスベクターのビリオンへとパッケージングするために使用される逆位末端配列(ITR)を含む。場合によって、ITRは、アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来する。場合によって、ITRは、AAV血清型2に由来する。場合によって、ITRは、配列番号56、配列番号57、配列番号58、または配列番号59を含みうるがこれらに限定されない。
一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、以下:a)第1のITR配列;b)プロモーター配列;c)イントロン配列;d)第1のUTR配列;e)VEGF阻害剤をコードする配列;f)第2のUTR配列;g)ポリA配列;およびh)第2のITR配列の順序で核酸エレメントを含む。組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドの一部の態様では、プロモーター配列は、プロモーター/エンハンサー配列を含む。一部の態様では、VEGF阻害剤をコードする配列は、ヒトsFLT-1タンパク質またはその機能的断片をコードする配列を含む。他の態様では、組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、複製起点配列102をさらに含む。一部の態様では、プラスミドは、本明細書で提供される抗生剤耐性遺伝子の配列をさらに含む。
一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、以下:a)第1のITR配列;b)第1のリンカー配列;c)プロモーター配列;d)第2のリンカー配列;e)イントロン配列;f)第3のリンカー配列;g)第1のUTR配列;h)VEGF阻害剤をコードする配列; i)第2のUTR配列;j)第4のリンカー配列;k)ポリA配列;l)第5のリンカー配列;およびm)第2のITR配列の順序で核酸エレメントを含む。組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドの一部の態様では、プロモーター配列は、プロモーター/エンハンサー配列を含む。一部の態様では、VEGF阻害剤をコードする配列は、ヒトsFLT-1タンパク質またはその機能的断片をコードする配列を含む。他の態様では、組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、複製起点配列をさらに含む。一部の態様では、プラスミドは、本明細書で提供される抗生剤耐性遺伝子の配列をさらに含む。
IV.医薬組成物
医薬組成物とは、所望の診断結果または治療効果もしくは予防効果を達成するために、1または複数の有効成分のほか、ヒト患者への投与に適する1または複数の賦形剤、担体、安定化剤、または充填剤を含有する処方物である。保存における安定性および取扱いの簡便性のために、医薬組成物は、患者への投与の前に、生理食塩水または水で再構成しうる、凍結乾燥させた(すなわち、凍結させて乾燥させた)または真空乾燥させた粉末として製剤化することができる。代替的に、医薬組成物は、水溶液として製剤化することもできる。医薬組成物は、タンパク質性の有効成分を含有しうる。残念ながら、タンパク質は、安定化させることが極めて難しいことの結果として、製剤化し、再構成(要求される場合)するとき、および医薬組成物を含有するタンパク質を使用する前に保存するときに、タンパク質の喪失および/またはタンパク質活性の喪失をもたらす場合がある。安定性の問題は、タンパク質の変性、分解、二量体化、および/または重合化のために生じうる。アルブミンおよびゼラチンなどの多様な賦形剤が、医薬組成物中に存在するタンパク質の有効成分を安定化させようと試みて、異なる程度の成功を収めながら使用されている。加えて、アルコールなどの凍結保護剤も、凍結乾燥の凍結状態下におけるタンパク質の変性を低減するために使用されている。
医薬組成物とは、所望の診断結果または治療効果もしくは予防効果を達成するために、1または複数の有効成分のほか、ヒト患者への投与に適する1または複数の賦形剤、担体、安定化剤、または充填剤を含有する処方物である。保存における安定性および取扱いの簡便性のために、医薬組成物は、患者への投与の前に、生理食塩水または水で再構成しうる、凍結乾燥させた(すなわち、凍結させて乾燥させた)または真空乾燥させた粉末として製剤化することができる。代替的に、医薬組成物は、水溶液として製剤化することもできる。医薬組成物は、タンパク質性の有効成分を含有しうる。残念ながら、タンパク質は、安定化させることが極めて難しいことの結果として、製剤化し、再構成(要求される場合)するとき、および医薬組成物を含有するタンパク質を使用する前に保存するときに、タンパク質の喪失および/またはタンパク質活性の喪失をもたらす場合がある。安定性の問題は、タンパク質の変性、分解、二量体化、および/または重合化のために生じうる。アルブミンおよびゼラチンなどの多様な賦形剤が、医薬組成物中に存在するタンパク質の有効成分を安定化させようと試みて、異なる程度の成功を収めながら使用されている。加えて、アルコールなどの凍結保護剤も、凍結乾燥の凍結状態下におけるタンパク質の変性を低減するために使用されている。
内用に適する医薬組成物は、滅菌水溶液または滅菌分散液および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液を即席で調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与では、適切な担体は、生理学的生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS:phosphate buffered saline)を含む。全ての場合に、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流体であるものとする。組成物は、製造条件下および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でありうる。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持することにより、かつ、ポリソルベート(Tween(商標))、ドデシル硫酸ナトリウム(ラウリル硫酸ナトリウム)、ラウリルジメチルアミンオキシド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、ポリエトキシル化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール(Triton X 100(商標))、N,N-ジメチルドデシルアミン-N-オキシド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(HTAB)、ポリオキシル10ラウリルエーテル、Brij 721(商標)、胆汁塩(デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム)、プルロニック酸(F-68、F-127)、ポリオキシルヒマシ油(Cremophor(商標))、ノニフェノールエトキシレート(Tergitol(商標))、シクロデキストリン、およびエチルベンゼトニウム塩化物(Hyamine(商標))などの界面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物の作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。内用組成物の遅延吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらすことができる。
滅菌溶液は、活性化合物を、要求に応じて、適切な溶媒中に、要求される量で、上記で列挙した1つの成分または成分の組合せと共に組み込んだ後、濾過滅菌を施すことにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および上記で列挙した成分に由来する、要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクルへと組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製法は、有効成分の粉末に加えた任意のさらなる所望の成分を、そのあらかじめ滅菌濾過された溶液からもたらす真空乾燥および凍結-乾燥である。
一態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出処方物など、化合物を体内からの急速な排出に対して保護する担体と共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーを使用することができる。当業者には、このような処方物を調製するための方法が明らかであろう。材料はまた、購入することもできる。リポソーム懸濁液(ウイルス性抗原に対するモノクローナル抗体を伴う、感染細胞へと標的化されたリポソームを含む)もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,522,811号に記載される、当業者に公知の方法に従い調製することができる。
経口組成物または非経口組成物を、投与の容易さおよび投与量の均一性のための単位剤形で製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、処置されるヒト対象の1回分の投与量として適する物理的に個別の単位であって、各単位が、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物であり、要求される医薬担体と会合させた活性化合物を含有する単位を指す。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに個体を処置するためのこのような活性化合物の調合に対する、当技術分野に内在する制約により決定され、これらに直接依存する。
医薬組成物は、投与のための指示書と共に、容器内、パック内、または分注器内に組み入れることができる。
本開示の医薬組成物は、ヒトを含む動物へと投与されると、生物学的に活性の代謝物またはその残留物をもたらす(直接的にまたは間接的に)ことが可能な、任意の、薬学的に許容される塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、または他の任意の化合物を包摂する。したがって、例えば、本開示はまた、本開示の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、ならびに他の生物学的同等物にも引き寄せられる。
「プロドラッグ」という用語は、体内またはその細胞内で、内因性酵素もしくは他の化学物質の作用、および/または条件により、活性形態(すなわち、薬物)へと転換される不活性形態で調製される治療剤を指し示す。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩:すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果をそれに付与しない塩を指す。
薬学的に許容される塩基添加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンにより形成する。カチオンとして使用される金属は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどを含む。アミンは、N-N’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、およびプロカインを含む(例えば、Bergeら、「Pharmaceutical Salts」、J. Pharma Sci.、1977年、66巻、119頁を参照されたい)。前記酸性化合物の塩基添加塩は、遊離酸形態を十分量の所望の塩基と接触させて、従来の様式で塩を産生することにより調製する。遊離酸形態は、塩形態を酸と接触させ、従来の様式で遊離酸を単離することにより再生することができる。遊離酸形態は、それらのそれぞれの塩形態と、極性溶媒中の可溶性など、ある種の物理的特性において、何らかの形で異なるが、本開示で目的とする塩は、他の点では、それらのそれぞれの遊離酸と同等である。
本明細書で使用される、「薬学的添加塩」は、本開示の組成物の成分のうちの1つの酸形態の薬学的に許容される塩を含む。これらは、アミンの有機酸塩または無機酸塩を含む。好ましい酸塩は、塩化物塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩、およびリン酸塩である。他の適切な薬学的に許容される塩は、当業者に周知であり、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸など、例えば、無機酸との塩基性塩;有機のカルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはホスホ酸またはN置換されたスルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデリン酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸、またはイソニコチン酸との塩基性塩;および自然界におけるタンパク質の合成に関与する20のアルファアミノ酸、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸との塩基性塩;ならびにまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸(4-methylbenzenesulfoic acid)、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-ホスホグリセリン酸もしくは3-ホスホグリセリン酸、グルコース-6-リン酸、N-シクロヘキシルスルファミン酸(シクラミン酸塩の形成を伴う)との塩基性塩、またはアスコルビン酸など、他の酸有機化合物など、様々な無機酸および有機酸の塩基性塩を含む。化合物の薬学的に許容される塩はまた、薬学的に許容されるカチオンにより調製することもできる。適切な、薬学的に許容されるカチオンは、当業者に周知であり、アルカリカチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムカチオン、および四級アンモニウムカチオンを含む。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。オリゴヌクレオチドのためには、薬学的に許容される塩の好ましい例は、以下を含むがこれらに限定されない。(I)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどのカチオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミドにより形成される塩;(II)無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸添加塩;(III)例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸により形成される塩;ならびに(IV)塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩。
本開示の医薬組成物は、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有処方物を含むがこれらに限定されない。これらの組成物は、あらかじめ形成された液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体を含むがこれらに限定されない、様々な成分から生成することができる。
本開示のある種の組成物はまた、担体化合物も処方物中に組み込む。本明細書で使用される「担体化合物」または「担体」は、不活性(すなわち、それ自体では生物学的活性を保有しない)であるが、例えば、生物学的に活性の核酸を分解するかまたは循環からのその除去を促進することにより、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを低減するin vivo過程により、核酸としては認識される核酸またはその類似体を指す場合もある。一般に、後者の物質を過剰とする、核酸と担体化合物との共投与は、おそらくは、共通の受容体についての、担体化合物と核酸との間の競合に起因して、肝臓、腎臓または他のさらなる循環の貯留部分内に回収される核酸の量の実質的な低減を結果としてもたらしうる。例えば、肝臓組織内のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの部分的な回収は、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸、または4-アセトアミド-4’イソチオシアノ-スチルベン-2,2’ジスルホン酸と共に共投与されると低減される場合がある(Miyaoら、Antisense Res. Dev.、1995年、5巻、115~121頁; Takakuraら、Antisense & Nucl. Acid Drug Dev.、1996年、6巻、177~183頁)。
ベクターまたは組換えウイルス(ビリオン)は、哺乳動物患者、特に、ヒトへと投与するための医薬組成物へと組み込むことができる。ベクターまたはビリオンは、非毒性で不活性の、薬学的に許容される水性担体中、好ましくは3~8の範囲、より好ましくは6~8の範囲のpHで製剤化することができる。このような滅菌組成物は、再構成したときに許容可能なpHを示す水性の緩衝液中に溶解した治療用分子をコードする核酸を含有するベクターまたはビリオンを含むであろう。
一部の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容される担体および/または賦形剤、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、保存剤、ならびに他のタンパク質と混合した治療有効量のベクターまたはビリオンを含む。例示的なアミノ酸、ポリマー、および糖などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアリン酸化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、果糖、デキストロース、マルトース、ブドウ糖、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン、クエン酸、酢酸、リンゲル液およびハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ならびにグリコールである。好ましくは、この処方物は、4℃で少なくとも6カ月間にわたり安定である。
一部の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはリン酸ナトリウム/硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、およびGoodら(1966年)、Biochemistry、5巻:467頁により記載されている緩衝液など、当業者に公知の他の緩衝液などの緩衝液を含む。アデノウイルスベクター送達系内に含有される抗VEGFを含む医薬組成物を溶解した緩衝液のpHは、6.5~7.75、7~7.5、または7.2~7.4の範囲内でありうる。処方物のpHは、約3.0~約12.0の範囲でありうる。免疫原性組成物のpHは、少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12pH単位でありうる。免疫原性組成物のpHは、最大で約3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12pH単位でありうる。
一部の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、カルボキシメチルナトリウムセルロース、ソルビトール、またはデキストランなど、懸濁液の粘度を増大させる物質を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10パーセントなど、約1~10パーセントの量で含む。
本開示のある特定の態様は、1または複数の組換えウイルスおよび1または複数の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。
このような化学療法剤の例は、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、窒素マスタード、クロランブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン(CA)、5-フルオロウラシル(5-FU)、フロクスウリジン(5-FUdR)、メトトレキサート(MIX)、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール(DES)などの抗がん薬を含むがこれらに限定されない。一般に、「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」、15版、Berkowら編、1987年、Rahway, N.J.、1206~1228頁)を参照
されたい。
されたい。
非ステロイド性抗炎症薬およびコルチコステロイドを含むがこれらに限定されない抗炎症薬、ならびにを含むがこれらに限定されない抗ウイルス薬、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルもまた、本開示の組成物中に組み合わせることができる(「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」、15版、Berkowら編、1987年、Rahway, N.J.、それぞれ、2499~2506頁および46~49頁)。他の非アンチセンス化学療法剤もまた、本開示の範囲内にある。2つ以上の組み合わせた化合物を、併せて使用することもでき、逐次的に使用することもできる。
別の関連する態様では、本開示の組成物は、1または複数の組換えウイルス、特に、配列の異なるsFLT-1を含有しうる。2つ以上の組み合わせたウイルスを、併せて使用することもでき、逐次的に使用することもできる。
別の態様では、本開示は、約1×106~約1×1015のウイルスゲノムを含む単位用量の医薬組成物であって、ウイルスがsFLT-1をコードする核酸を含む単位用量の医薬組成物を提供する。
場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、pfu(プラーク形成単位)として測定することができる。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量のpfuは、約1×108~約5×1010pfuでありうる。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量のpfuは、少なくとも約1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、および5×1010pfuである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量のpfuは、最大で約1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、および5×1010pfuである。
場合によって、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定することができる。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、1×1010~3×1012のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、1×109~3×1013のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、1×1010~1×1011のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、1×108~3×1014のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、少なくとも約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、1×108~3×1014のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、最大で約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のベクターゲノムである。
場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、感染多重度(MOI)を使用して測定することができる。場合によって、MOIとは、ベクターまたはウイルスゲノムの、核酸を送達しうる細胞に対する比または倍数を指す場合がある。場合によって、MOIは、1×106でありうる。場合によって、MOIは、1×105~1×107でありうる。場合によって、MOIは、1×104~1×108でありうる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のMOIである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×108~3×1014のMOIである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のMOIである。
一部の態様では、核酸は、ウイルスを使用せずに(すなわち、非ウイルスベクターにより)送達することができ、核酸量として測定することができる。一般に、任意の適切な核酸量を、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。場合によって、核酸の量は、少なくとも約1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g、または5gでありうる。場合によって、核酸は、最大で約1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g、または5gでありうる。
一部の態様では、医薬組成物は、約1×106~約1×1015個の組換えウイルス、約1×107~約1×1014個の組換えウイルス、約1×108~約1×1013個の組換えウイルス、約1×109~約3×1012個の組換えウイルス、または約1×1010~約3×1012個の組換えウイルスを含む。
キット
本開示に有用な組成物および試薬は、キット内にパッケージングして、本開示の適用を容易とすることができる。一部の態様では、本方法は、本開示の組換え核酸を含むキットを提供する。一部の態様では、本方法は、本開示の組換えウイルスを含むキットを提供する。指示書は、キットの添付文書上に印字された指示書、1または複数の容器上に印字された指示書のほか、コンピュータで読取り可能な保存媒体など、電子的保存媒体上で提供される、電子的に保存された指示書を含むがこれらに限定されない、任意の所望の形態でありうるであろう。また、必要に応じて、使用者が情報を組み込み、対照用量を計算することを可能とする、コンピュータで読取り可能な保存媒体上のソフトウェアパッケージも組み入れられる。
本開示に有用な組成物および試薬は、キット内にパッケージングして、本開示の適用を容易とすることができる。一部の態様では、本方法は、本開示の組換え核酸を含むキットを提供する。一部の態様では、本方法は、本開示の組換えウイルスを含むキットを提供する。指示書は、キットの添付文書上に印字された指示書、1または複数の容器上に印字された指示書のほか、コンピュータで読取り可能な保存媒体など、電子的保存媒体上で提供される、電子的に保存された指示書を含むがこれらに限定されない、任意の所望の形態でありうるであろう。また、必要に応じて、使用者が情報を組み込み、対照用量を計算することを可能とする、コンピュータで読取り可能な保存媒体上のソフトウェアパッケージも組み入れられる。
別の態様では、本開示は、本明細書で提供される医薬組成物を含むキットを提供する。さらに別の態様では、本開示は、例えば、AMD、DME、RVO、血管形成関連疾患、がん、自己免疫疾患、感染性疾患生物などの疾患の処置におけるキットを提供する。
一態様において、キットは、(a)本明細書で提供される組換えウイルスおよび(b)治療有効量の組換えウイルスを細胞または個体に投与するための指示書を含む。一部の態様では、キットは、組換えウイルスを投与するための、薬学的に許容される塩または溶液を含みうる。必要に応じて、キットは、表示または別個の添付文書の形態における適切な操作パラメータのための指示書もさらに含みうる。例えば、キットは、医師または実験室の技師に、ある用量の組換えウイルスを調製するための情報をもたらす標準的な指示書を有しうる。
必要に応じて、キットは、患者試料を、組換えウイルスの被験量が、例えば、腫瘍の退縮と符合する治療量であるのかどうかを決定するための基準となる対照の情報と比較しうるように、基準の情報または対照の情報をさらに含みうる。必要に応じて、キットは、シリンジ、フィルターニードル、延長チューブ、カニューレ、および網膜下注射器など、投与のためのデバイスもさらに含みうるであろう。
組換えウイルスは、任意の適切な手段により生成することができる。本開示の方法および組成物は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、動物細胞、または真菌細胞を含みうる、トランスジェニック細胞の使用を含む、多様な手段による組換えウイルスの生成を提供する。
例えば、一部の態様では、組換えウイルスは、組換えバキュロウイルスを介する昆虫細胞のトランスフェクションにより生成することができる。場合によって、組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルスが、AAVウイルスまたはrAAV2ウイルスなど、他のウイルスを生成するのに必要な配列を含有しうる、中間体として生成することができる。場合によって、本開示の処置の組成物および方法に使用される組換えウイルスの生成では、1または複数のバキュロウイルスを使用することもできる。場合によって、Sf9細胞系、High-Five細胞系、またはSf21細胞系などの昆虫細胞も使用することができる。ある場合には、細胞系は、一過性の方法(すなわち、安定的に組み込まれるわけではない導入遺伝子による感染)を使用して生成することができる。他の場合には、細胞系は、安定的な細胞系(すなわち、宿主細胞ゲノムへと安定的に組み込まれた導入遺伝子による感染)の生成により生成することができる。他の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、接着性ヒト胎児由来腎臓293(HEK293:human embryonic kidney 293)細胞を使用して製造する。代替的な態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、懸濁液に適応させたHEK293細胞を使用して製造する。別の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、バキュロウイルス発現系(BVES)を昆虫細胞内で使用して製造する。一部の態様では、ベクターは、ヘルペスヘルパーウイルスを使用して産生する。一部の態様では、ベクターは、プロデューサークローン法を使用して産生する。一部の態様では、ベクターは、Ad-AAVを使用して産生する。
一般に、任意の適切な方法は、本明細書で記載される医薬組成物における使用のための、組換えウイルスの生化学的精製において使用することができる。組換えウイルスは、細胞から直接採取することもでき、宿主細胞を取り巻く培養培地から採取することもできる。ウイルスは、ゲル濾過、濾過、クロマトグラフィー、アフィニティー精製、勾配超遠心分離、またはサイズ除外法など、多様な生化学的手段を使用して精製することができる。組換えウイルスは、医薬組成物へと製剤化する前に、任意の適切な手段を使用して、内容物(すなわち、識別)、純度、または効力(すなわち、活性)について調べることができる。方法は、イムノアッセイ、ELISA、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、またはPCR、HUVECアッセイなどを含みうるがこれらに限定されない。
V.処置法
別の態様では、本開示は、病理学的血管形成関連疾患を処置するための方法であって、薬学的有効量の、本明細書で提供される医薬組成物を、このような処置を必要とするヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、疾患は、加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、萎縮型AMD、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、分枝性網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる眼の血管新生性疾患の群から選択される。
別の態様では、本開示は、病理学的血管形成関連疾患を処置するための方法であって、薬学的有効量の、本明細書で提供される医薬組成物を、このような処置を必要とするヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、疾患は、加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、萎縮型AMD、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、分枝性網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる眼の血管新生性疾患の群から選択される。
場合によって、萎縮型AMDも処置することができる。場合によって、萎縮型AMDは、網膜の下方における網膜色素上皮層の萎縮、およびその後の眼の中心部における光受容体の喪失を特徴とする中心地図状萎縮と称する場合がある。本開示の組成物および方法は、AMDの任意の形態および全ての形態の処置を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書で記載されるAMDまたは眼の血管新生性疾患の予防的処置ための方法であって、薬学的有効量の、本明細書で提供される医薬組成物を、このような処置を必要とするヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。本開示を使用して、AMDを発症するか、またはAMDの初期症状を提示する危険性がある患者を処置することができる。これは、同時的または逐次的な眼の処置を含みうる。同時的な処置とは、処置を各眼へと同時に投与するか、または両方の眼を、処置する医師または他の医療ケア提供者への、同じ来院時に処置することを意味する場合がある。患者は、AMDの症状を提示する眼の健康な対の眼においてもAMDを発症する危険性が高いか、またはAMDの発症に対する遺伝的素因を有する患者においてもAMDを発症する危険性が高いことが記録されている。本開示は、対の眼におけるAMDの防止における予防的処置として使用することができる。
対の眼における眼の血管新生性疾患の進行に対する危険性の増大に伏在する機構は知られていないが、当技術分野では、この危険性の上昇について詳述する複数の研究がなされている。例えば、110例の対の眼についての、1つのこのような大規模研究では、98例の眼で、進行期~末期のAMD、脈絡膜血管新生(CNV)が発症し、15例の眼で、中心窩地図状萎縮(GA)が発症することが観察された(Ophthalmologica.、2011年、226巻(3号):110~8頁、doi: 10.1159/000329473; Curr Opin Ophthalmol.、1998年6月、9巻(3号):38~46頁)。眼以外の特徴(年齢、性別、高
血圧症または喫煙の履歴)によっても、ベースラインにおける被験眼の眼特性(病変の組成、病変のサイズ、または視力)によっても、このコホート内の進行期~末期のAMDは予測されなかった。しかし、統計学的解析は、ドルーゼンのサイズ、限局性の色素過剰、および非中心窩地図状萎縮を含む第1の眼のAMD症状が、対の眼におけるAMDの発症の危険性の評価において有意な独立の関連性を有したことを指し示している。近年の研究は、眼の特徴のうち、遺伝因子およびある種の環境因子が、対の眼においてAMDを発症する危険性の増大に役割を果たしうることを指し示している(JAMA Ophthalmol.、2013年4月1日、131巻(4号):448~55頁、doi: 10.1001/jamaophthalmol.2013.2578)。処置されていない対の眼におけるAMDの発症(development)の危険性の十分に特徴付けられた増大を踏まえると、当技術分野では、発症(onset)およびこの疾患に起因するその後の視覚喪失を防止するための方法が必要とされる。
血圧症または喫煙の履歴)によっても、ベースラインにおける被験眼の眼特性(病変の組成、病変のサイズ、または視力)によっても、このコホート内の進行期~末期のAMDは予測されなかった。しかし、統計学的解析は、ドルーゼンのサイズ、限局性の色素過剰、および非中心窩地図状萎縮を含む第1の眼のAMD症状が、対の眼におけるAMDの発症の危険性の評価において有意な独立の関連性を有したことを指し示している。近年の研究は、眼の特徴のうち、遺伝因子およびある種の環境因子が、対の眼においてAMDを発症する危険性の増大に役割を果たしうることを指し示している(JAMA Ophthalmol.、2013年4月1日、131巻(4号):448~55頁、doi: 10.1001/jamaophthalmol.2013.2578)。処置されていない対の眼におけるAMDの発症(development)の危険性の十分に特徴付けられた増大を踏まえると、当技術分野では、発症(onset)およびこの疾患に起因するその後の視覚喪失を防止するための方法が必要とされる。
本明細書で使用される「対象」または「個体」または「患者」という用語は、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害などを有することが疑われる個体を指す。本開示では、対象、個体、または患者を互換的に使用することができ、哺乳動物および非哺乳動物を包摂しうる。哺乳動物の例は、哺乳動物のクラス:ヒト、チンパンジー、ならびに他の類人猿種およびサル種などの非ヒト霊長動物;ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの農場動物;ウサギ、イヌ、およびネコなどの愛玩動物;ラット、マウス、およびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物などのうちの任意のメンバーを含むがこれらに限定されない。非哺乳動物の例は、鳥類、魚類などを含むがこれらに限定されない。本明細書で提供される方法および組成物の一部の態様では、哺乳動物は、ヒトである。
「対象」または「個体」という用語はまた、障害または疾患を患う、20歳以上のヒトも含む。予測外のことに、本開示は、ある範囲の患者年齢において使用することができる。これは、65歳を超える患者においてより高頻度で現れるAMD疾患と一般に関連しない若齢の患者を含む。本開示のヒト対象またはヒト患者は、少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100歳を含みうる。本開示のヒト対象またはヒト患者は、最大で約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100歳を含みうる。
一部の態様では「対象」または「個体」という用語は、その効果に対する耐性または感受性など、ペニシリンに対する応答を変化させる患者、または薬物に対するアレルギー反応の症状を示すかもしくは欠く患者を含む。
A.送達法
一部の態様では、医薬組成物を、任意の方向付け法を使用して、網膜下部位へと投与する。場合によって、送達法は、参照によりその全体において組み込まれる、米国特許第2010008170号において記載されている送達法など、注射による送達法でありうる。場合によって、網膜下部位への直接的な投与は、シリンジを介する液体医薬組成物の注射を含む。別の例では、直接的な投与は、カニューレまたはベクターまたは組換えウイルスを送達するための他の適切な器具を介する注射を伴いうる。他の例では、直接的な投与は、sFLT-1などの導入遺伝子を送達するための適切なベクターをさらに含むインプラントを含みうる。場合によって、インプラントは、網膜内または網膜近傍に直接植え込むことができる。
一部の態様では、医薬組成物を、任意の方向付け法を使用して、網膜下部位へと投与する。場合によって、送達法は、参照によりその全体において組み込まれる、米国特許第2010008170号において記載されている送達法など、注射による送達法でありうる。場合によって、網膜下部位への直接的な投与は、シリンジを介する液体医薬組成物の注射を含む。別の例では、直接的な投与は、カニューレまたはベクターまたは組換えウイルスを送達するための他の適切な器具を介する注射を伴いうる。他の例では、直接的な投与は、sFLT-1などの導入遺伝子を送達するための適切なベクターをさらに含むインプラントを含みうる。場合によって、インプラントは、網膜内または網膜近傍に直接植え込むことができる。
網膜の中心網膜領域、黄斑領域、および中心窩領域は、哺乳動物~霊長動物の間で固有である。さらに、霊長動物とヒトとでは、解剖学およびその後のAMDの発症機序において顕著に異なる差異が見られる。中心網膜とは、霊長動物の眼の血管アーケードの間の後極を取り巻く網膜の帯域であって、中心窩、黄斑、および周囲帯域を含む帯域である。黄斑は、網膜の中心の近傍にあり、直径が約1.5mmである。この帯域は、杆体光受容体および錐体光受容体の両方を最高濃度で含有する。黄斑の中心には、最大濃度の錐体光受容体を含有する小窩である中心窩が存在する。網膜の黄斑領域および中心窩領域はまた、下層のRPE細胞も含有する。網膜のこれらの領域は、微細な細部に対する知覚(視力)および色彩に対する知覚の一因となる。この領域は、ヒト視覚(微細視覚)の最も重要な部分の一因となるので、ベクターの、黄斑および中心窩の網膜下腔への安全かつ有効な標的化が所望される。場合によって、本開示の医薬組成物は、中心網膜に投与する。場合によって、本開示の医薬組成物は、中心窩の外側の中心網膜に投与する。
略述すると、ベクターを、黄斑および中心窩の網膜下腔へと送達するための一般的な方法は、以下の短い概略により例示することができる。この例は、方法のある種の特色を例示することだけを意図し、限定的であることを意図するものではない。
一般に、ベクターは、手術用顕微鏡を使用する直接的な観察下において、眼内(網膜下)注射される懸濁液の形態で送達することができる。この手順は、硝子体切除術後において、網膜下腔への1カ所以上の微小な網膜切開部分を通す細型カニューレを使用する、ベクター懸濁液の注射を伴いうる。
略述すると、注入用カニューレを適所に縫合して、手術中にわたり注入(例えば、生理食塩水を)することにより、正常な球体容量を維持することができる。適切な内径サイズ(例えば、20~27ゲージ)のカニューレを使用して、生理食塩水または他の等張性溶液を、注入用カニューレから注入することにより、除去される硝子体ゲルの容量を置き換える、硝子体切除術を実施する。(1)その皮質(後部ヒアリン膜)の除去は、カニューレによる網膜の穿通を容易とし、(2)その除去および流体(例えば、生理食塩水)による置き換えは、ベクターの眼内注射に応じる空間を創出し、(3)その除去を制御することにより、網膜裂傷および意想外の網膜剥離の可能性を低減するため、硝子体切除術を実施することが有利である。
一部の態様では、ベクターは、適切な内径サイズ(例えば、27~45ゲージ)のカニューレを利用し、したがって、網膜下腔内にブレブを創出することにより、中心網膜内の網膜下腔へと直接注射する。他の態様では、ベクター懸濁液の網膜下注射に、微小容量(例えば、約0.1~約0.5ml)の適切な流体(生理食塩水またはリンゲル液など)の、中心網膜内の網膜下腔への網膜下注射を先行させる。この網膜下腔への初期注射は、網膜下腔内に初期流体ブレブを確立し、初期ブレブの位置に限局的な網膜剥離を引き起こす。この初期流体ブレブは、ベクター懸濁液の、網膜下腔への標的化送達を容易とし(ベクターを送達する前に、注射面を規定することにより)、脈絡膜への可能なベクター投与および硝子体腔へのベクターの注射または還流の可能性を最小化することが可能である。一部の態様では、これらの流体を、初期流体ブレブへと、同じ内径またはさらに微小内径のカニューレにより直接投与することにより、この初期流体ブレブに、1または複数のベクター懸濁液および/または1または複数のさらなる治療剤を含む流体を、さらに注射することができる。
ベクター懸濁液および/または初期小容量流体の眼内投与は、シリンジへと取り付けた微小内径のカニューレ(例えば、27~45ゲージ)を使用して実施することができる。一部の態様では、このシリンジのプランジャーは、足踏みペダルを踏むことによるなど、機械化されたデバイスにより駆動することができる。微小内径のカニューレを、強膜切開を介して、硝子体腔を越えて、標的とされる網膜の帯域(中心網膜内の)に応じて、網膜内の各対象の所定の部位に送り込む。一態様において、投与は、中心窩の外側の部位へと実施する。直接可視化下で、ベクター懸濁液を、感覚神経網膜下に機械で注射し、セルフシーリング非拡大網膜切開術により限局的な網膜剥離を引き起こす。上記で言及した通り、ベクターは、網膜下腔へと直接注射し、中心網膜内にブレブを創出することもでき、ベクターは、中心網膜内の初期ブレブへと注射し、それを拡大させる(および網膜剥離帯域を拡大させる)こともできる。一部の態様では、ベクター懸濁液の注射に続いて、ブレブへの別の流体の注射を行う。
理論に束縛されることを望まずに述べると、網膜下注射の速度および位置によって、黄斑、中心窩、および/または下層のRPE細胞を損傷しうる限局的なせん断力が結果としてもたらされる場合もある。網膜下注射は、せん断力を最小化または回避する速度で実施することができる。一部の態様では、ベクターは、約15~17分間にわたり注射する。一部の態様では、ベクターは、約17~20分間にわたり注射する。一部の態様では、ベクターは、約20~22分間にわたり注射する。一部の態様では、ベクターは、約1分間にわたり、または約1~3分間もしくは1分間未満にわたり注射する。一部の態様では、ベクターを、約35~約65μl/分または65μl/分~約150μl/分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約35μl/分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約40μl/分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約45μl/分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約50μl/分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約55μl/分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約60μl/分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約65μl/分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約100μl/分の速度で注射する。当業者であれば、ブレブの注射の速度および回数は、例えば、中心網膜の細胞にアクセスするのに十分な網膜剥離を創出するのに必要なベクターの容量またはブレブのサイズ、ベクターを送達するのに使用されるカニューレのサイズ、および本開示のカニューレの位置を安全に維持する能力により方向付けうることを認識するであろう。
1または複数の(例えば、2つ、3つ以上の)ブレブを創出することができる。一般に、本開示の方法およびシステムにより創出される1または複数のブレブの全容量は、眼の流体容量、例えば、典型的なヒト対象における約4mlを超えることができない。各個別のブレブの全容量は、好ましくは約0.1~0.2mlである。当業者は、本開示の方法およびシステムに従うブレブの創出において、適切な眼内圧を維持して、眼構造への損傷を回避しなければならないことを察知するであろう。各個別のブレブのサイズは、例えば、約50μl~約100μl、約50μl~約200μl、約0.1~約0.2ml、約0.1~約0.3ml、または>0.3mlでありうる。
ブレブの元の位置の縁辺部の外側における標的網膜(例えば、中心網膜)の帯域に安全かつ効率的に形質導入するために、場合によっては、ブレブを操作して、ブレブを形質導入のための標的帯域へとリポジショニングすることが所望でありうる。ブレブの操作は、ブレブの容量により創出されるブレブの依存性、ブレブを含有する眼のリポジショニング、1または複数のブレブを含有する1もしくは複数の眼を伴うヒトの頭部のリポジショニング、および/または液体-空気交換により施すことができる。中心網膜は一般に、網膜下注射による剥離に耐性であるので、ブレブの操作は特に、中心網膜に関与性である。
一部の態様では、網膜下注射後において、注入用カニューレからの流体を、空気、例えば、網膜の表面上へと吹き込ませる空気で一時的に置き換える、液体-空気交換を利用する。空気の容量により、硝子体腔に由来する生理食塩水流体を移動させるとき、ブレブは、硝子体腔へと溢出せずにその場に保たれる。場合によって、眼球を適切にポジショニングすることにより、網膜下ベクターのブレブを、隣接する帯域(例えば、黄斑および/または中心窩)に関与するように操作することができる。場合によって、ブレブの質量は、液体-空気交換を使用せずになお、ブレブを重力に引き寄せさせるのに十分である。ブレブの移動は、ブレブが眼内の所望の位置へと引き寄せられることを可能とするように、ヒト対象の頭部の位置を変えることによってもさらに容易とすることができる。ブレブの所望の立体配置を達成したら、流体を硝子体腔へと戻す。流体とは、適切な流体、例えば、新鮮な生理食塩水である。一般に、網膜下のベクターは、網膜切開術に対する網膜復位術を行わず、眼内タンポナーデを伴わずに、in situに放置することができ、網膜は、約48時間以内に自発的に再付着する。
眼疾患を処置するためのAAV-2の網膜下投与は、まれな遺伝性疾患であるレーバー先天性黒内障(「LCA」)の処置において裏付けられている。LCAの病理およびLCAの患者集団は、滲出型AMDの病理および患者集団と異なり、したがって、遺伝子治療による滲出型AMDの処置であり、特に、AAV-2による滲出型AMDの処置が、rAAV.sFLTによる臨床研究の前に安全かつ有効であろうとは予測されなかった。とりわけ、LCAは、網膜タンパク質であるRPE-65の発現が不十分であることにより引き起こされる変性遺伝性疾患である。LCAは、乳児および幼齢小児における緩慢な視覚の減退を引き起こし、一般に、25~30歳以前の若齢成年までに全失明をもたらす。これに対し、本明細書で既に記載した滲出型AMDは、一般に、65~75歳の間に始まる晩年における、網膜内の新たな血管の成長により引き起こされる。新たな血管の存在は、AAV粒子、導入遺伝子、または導入遺伝子産物が、LCA研究において示されるより大量に眼の外側に輸送されるという憂慮をもたらす。加えて、実施例12において開示される、rAAV.sFLT-1などのウイルスベクターによる滲出型AMDの処置が安全かつ有効であるという研究結果以前には、患者が老化するにつれて、外来物質に対する免疫系および免疫応答が変化することは、不確実性をもたらしていた。
B.処置の効果
一部の態様では、本開示の医薬組成物の、罹患した眼への単回の注射は、Lucentis(登録商標)処置の有益性を示すだけでなく、また、単回だけの注射も要求する可能性がある。
一部の態様では、本開示の医薬組成物の、罹患した眼への単回の注射は、Lucentis(登録商標)処置の有益性を示すだけでなく、また、単回だけの注射も要求する可能性がある。
本開示の医薬組成物は、既存の血管内の漏出を停止させ、AMDに続発するCNVを患う患者の網膜下腔内の新たな血管形成を、少なくとも18カ月間にわたりさらに阻害することが可能であり、一部の態様では、3~5年間にわたり活性が持続する。漏出および新たな血管形成の阻害は、罹患した患者における失明の発症を防止する。
一部の態様では、前記ヒト対象の硝子体中のsFLT-1タンパク質レベルは、約500~5,000pg/ml、約600~4,000pg/ml、約800~3,000pg/ml、約900~2,000pg/ml、または約1,000~1,800pg/ml、500~700pg/ml、700~1,000pg/ml、1,000~1200pg/ml、1200~1,500pg/ml、1,800~2000pg/mlである。場合によって、ヒト対象の硝子体中のタンパク質レベルは、少なくとも約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、または2400pg/mlである。場合によって、ヒト対象の硝子体中のタンパク質レベルは、最大で約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、または2400pg/mlである。
場合によって、タンパク質「レベル」は、タンパク質の任意の量または任意の相対量を指す場合がある。場合によって、レベルは、濃度(例えば、pM、nM、uMなど)、モル濃度(例えば、m)、質量(例えば、pg、ug、ngなど)、または任意の適切な測定値として測定することができる。場合によって、無単位の測定値は、レベルを指し示しうる。
場合によって、タンパク質レベルは、前記医薬組成物を投与した、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2、3、4、5、6、7、14、21、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、または365日後において測定することができる。場合によって、タンパク質レベルは、前記医薬組成物を投与した、最大で約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2、3、4、5、6、7、14、21、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、または365日後において測定することができる。場合によって、タンパク質レベルは、前記医薬組成物を投与した、少なくとも72時間後において測定する。
本開示の医薬組成物の投与は一般に、副作用または有害事象をもたらさない。
一部の態様では、前記医薬組成物を投与した、7、14、21、または30日後において、ヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中にベクターが検出されない。一部の態様では、ウイルスベクターの存在を、当技術分野で公知のqPCRまたはELISAにより検出する。
場合によって、前記医薬組成物を投与した、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2、3、4、5、6、7、14、21、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、または365日後において、ヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中にベクターが検出されない。場合によって、前記医薬組成物を投与した、最大で約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2、3、4、5、6、7、14、21、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、または365日後において、ヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中にベクターが検出されない。場合によって、前記医薬組成物を投与した、少なくとも72時間後において測定されたヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中にベクターが検出されない。
一部の態様では、ヒト対象は、少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12カ月間にわたる連続的な眼検査により評価される通り、臨床的に重大な網膜毒性を示さない。一部の態様では、ヒト対象は、最大で約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12カ月間にわたる連続的な眼検査により評価される通り、臨床的に重大な網膜毒性を示さない。
一部の態様では、少なくとも2カ月間にわたり、ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候は存在しない。場合によって、医薬組成物を投与した1週間後または3、6、9、もしくは12カ月後のヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候は存在しない。
一部の態様では、投与ステップ後において、正常な範囲の約10%以内の細胞傷害性T細胞応答を含む炎症性徴候は見られない。一部の態様では、ELISpotにより測定されるT細胞応答の増大は見られない。一部の態様では、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Laiら、2011年、Gene Therapyにおいて記載されている通り、T細胞は、HLA-DRまたはKi67を発現させず、活性化したエフェクターの表現型を発生させない。一部の態様では、投与ステップ後において、硝子体の炎症が、生体顕微鏡法(BE)および間接検眼鏡法(IOE)により観察されない。一部の態様では、投与ステップ後において、10日以内に消失する硝子体の軽微な炎症が、生体顕微鏡法(BE)および間接検眼鏡法(IOE)により観察される。一部の態様では、ヒト対象は、投与後少なくとも120日間にわたり、救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、投与後少なくとも30日間、少なくとも60日間、少なくとも90日間、少なくとも120日間、少なくとも180日間、少なくとも270日間、または少なくとも365日間にわたり、救済処置を必要としない。
本明細書で使用される、救済処置とは、本開示において記載されている医薬組成物の初期投与の後における、ある用量のVEGF阻害剤の投与を指す。救済処置は、疾患の進行の徴候および症状を停止または逆転するために、患者の眼内のVEGF阻害量をブーストするのに投与する。救済処置を投与する決定は、実施例12で記載される臨床研究における所定の診断基準に基づく場合もあり、活性の疾患の徴候が患者において存在するという医師の臨床判断に基づく場合もある。
一部の態様では、投与後少なくとも120日間にわたり、前記ヒト対象において、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。一部の態様では、投与後少なくとも30日間、少なくとも60日間、少なくとも90日間、少なくとも120日間、少なくとも180日間、少なくとも270日間、または少なくとも365日間にわたり、前記ヒト対象において、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。一部の態様では、投与後最大で30日間、少なくとも60日間、少なくとも90日間、少なくとも120日間、少なくとも180日間、少なくとも270日間、または少なくとも365日間にわたり、前記ヒト対象において、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。
一部の態様では、患者の最高矯正視力(BCVA)は、1、2、3、4、5行以上改善する。
一部の態様では、フルオレセイン血管造影(FA)により評価される血管新生の低減が投与ステップに後続する。
場合によって、網膜厚を測定して、処置の効果を検討することができる。場合によって、ヒト対象の網膜中心厚は、本開示の医薬組成物による処置後12カ月以内において、50ミクロン、100ミクロン、または250ミクロンを超えて増大しない。場合によって、ヒト対象の網膜中心厚は、本開示の医薬組成物による処置後3カ月、6カ月、9カ月、または12カ月以内に少なくとも50ミクロン、100ミクロン、200ミクロン、250ミクロン、300ミクロン、400ミクロン、500ミクロン、600ミクロン減少する。ヒト対象の網膜中心厚の減少は、ある時点における網膜中心厚を、本開示の医薬組成物の投与の1、3、7、もしくは10日後、または1、3、7、もしくは10日以内に行ったベースラインの測定と比較して測定することができる。
C.VEGF阻害剤による組合せ処置
一部の態様では、方法は、薬学的有効量のVEGF阻害剤をヒト対象に投与するステップをさらに含む。
一部の態様では、方法は、薬学的有効量のVEGF阻害剤をヒト対象に投与するステップをさらに含む。
一部の態様では、VEGF阻害剤は、VEGFに対する抗体またはその機能的断片を含む。一部の態様では、VEGF阻害剤は、ラニビズマブを含む。他の態様では、VEGF阻害剤は、アフリベルセプトまたはsFLT01など、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの断片である。一部の態様では、医薬組成物を、前記VEGF阻害剤を投与した、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、または8日後に投与する。一部の態様では、医薬組成物を、前記VEGF阻害剤を投与した、最大で1、2、3、4、5、6、7、または8日後に投与する。一部の態様では、医薬組成物を、前記VEGF阻害剤の投与後90日以内に投与する。
一部の態様では、図13において概括されるプロトコールなどのプロトコール下で患者を処置する。組換えウイルスが発現させるタンパク質を、適切なレベルで発現させた後(または「発現させたとき」)、患者には基準ベースの再処置を施す:
a.疾患が再発する場合は、ラニビズマブによる再処置が許容される
b.対照群には1年当たり5~8回の再処置が予期される
c.処置群では、再処置の回数を実質的に減少させながら、同等な視覚が期待される。
a.疾患が再発する場合は、ラニビズマブによる再処置が許容される
b.対照群には1年当たり5~8回の再処置が予期される
c.処置群では、再処置の回数を実質的に減少させながら、同等な視覚が期待される。
患者は、活性CNVの徴候:
a.盲検化された従事者(技師、および眼科医)により査定される客観的基準に基づく徴候
b.再処置基準が、抗VEGF剤による先行試験における「必要に応じた」(PRN)処置による実質的な経過に基づく徴候
が存在する場合、再処置に適格である。
a.盲検化された従事者(技師、および眼科医)により査定される客観的基準に基づく徴候
b.再処置基準が、抗VEGF剤による先行試験における「必要に応じた」(PRN)処置による実質的な経過に基づく徴候
が存在する場合、再処置に適格である。
再処置は、
a.ヒト対象の前回の来院からの、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字の減退が>10である(網膜性原因に帰することが可能な)、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ETDRSによる文字の減少が>5であること;
b.OCT時において、感覚網膜下、網膜色素上皮(RPE)下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること;
c.FAを介するCNVからの漏出の増大の徴候が見られること
など、活性の疾患の徴候に基づき正当化される。
a.ヒト対象の前回の来院からの、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字の減退が>10である(網膜性原因に帰することが可能な)、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ETDRSによる文字の減少が>5であること;
b.OCT時において、感覚網膜下、網膜色素上皮(RPE)下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること;
c.FAを介するCNVからの漏出の増大の徴候が見られること
など、活性の疾患の徴候に基づき正当化される。
一部の態様では、VEGF阻害剤を、前記医薬組成物を投与する前に少なくとも1回投与し、前記投与後において、約30日間の間隔でさらに1または2回投与して、タンパク質の発現が、適切なレベルまで増大する間に、疾患の進行を防止する。一部の態様では、VEGF阻害剤を、前記医薬組成物を投与する前に、少なくとも2回にわたり投与する。一部の態様では、VEGF阻害剤を、前記医薬組成物の投与後6~7週間にわたり投与する。
一部の態様では、VEGF阻害剤の投与頻度は、1年未満まで低減されるか、完全に停止される。
一部の態様では、VEGF阻害剤による3回以上の処置の後で、本開示を使用する。一部の態様では、AMD患者が、他のVEGF阻害剤を使用した後でBCVAの改善を示さないことを観察した後で、本開示を使用する。
D.他の組合せ処置
別の好ましい態様では、患者の処置は、他の療法、例えば、化学療法、放射線、手術、抗炎症薬剤、選択されたビタミンなどと共に、本明細書で提供される医薬組成物のうちの1または複数の投与を含む。他の薬剤は、医薬組成物の前に投与することもでき、医薬組成物の後で投与することもでき、医薬組成物と共投与することもできる。
別の好ましい態様では、患者の処置は、他の療法、例えば、化学療法、放射線、手術、抗炎症薬剤、選択されたビタミンなどと共に、本明細書で提供される医薬組成物のうちの1または複数の投与を含む。他の薬剤は、医薬組成物の前に投与することもでき、医薬組成物の後で投与することもでき、医薬組成物と共投与することもできる。
本開示の態様は、理論的側面を提示せずに実施することができる。なおさらに、本出願人らが、提示される理論により束縛されることを欲しないことを理解した上で、理論的側面も提示する。
本明細書では、本開示の好ましい態様について示し、記載してきたが、当業者には、このような態様は、例だけを目的として提供されることが明白であろう。当業者は今や、本開示から逸脱することなく、多数の変化形、変更、および置換に想到するであろう。本明細書で記載される本開示の態様に対する多様な代替物を、本開示の実施において援用することができることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、ならびにそこで対象とされるそれらの同等物を規定することが意図される。
核酸の有効用量は、発現させる特定のタンパク質、標的とされる特定の疾患、患者および患者の臨床状態、体重、年齢、性別などの関数となろう。
当業者は、多数かつ多様な改変を施して、本開示の精神から逸脱することなく、本質的に同様の結果をもたらしうることを理解するであろう。論じられる対象物について、本明細書で言及される参考文献の全ては、参照によりそれらの全体において組み込まれる。以下の実施例は、例示的目的だけのために組み入れられるものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
以下の実施例による百分率は、指定されない場合も、全て内容物の重量パーセント(wt%)であることを説明しなければならない。
(実施例1)
rAAV.sFlt-1
組換えウイルスの1つの例は、rAAV.sFlt-1である。rAAV.sFLT-1は、ベクターおよび切断型可溶性VEGF受容体1(sFLT-1)のヒト形態をコードする。ベクターは、血清型2の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性(rAAV)ベクターである。
rAAV.sFlt-1
組換えウイルスの1つの例は、rAAV.sFlt-1である。rAAV.sFLT-1は、ベクターおよび切断型可溶性VEGF受容体1(sFLT-1)のヒト形態をコードする。ベクターは、血清型2の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性(rAAV)ベクターである。
rAAV.sFlt-1は、「医薬品の製造管理および品質管理の基準」(cGMP)の下で製造した。製造施設では、プロトコール要件に従い、最終生成物を、滅菌で低ウイルス結合性のマイクロ遠心管(個別包装された低残留量で滅菌平型キャップ式のバイアル)へとアリコート分割(すなわち、1×1010または1×1011のウイルスゲノム200□l)し、-80□Cで保存して、最終生成物の放出を待機した。各バイアルは、単一の患者における使用(100□lを投与する)に十分なベクターを含有した。
組換えウイルス、rAAV.sFlt-1とは、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターにより駆動される可溶性VEGFR受容体1(VEGFR1)またはsFLT-1を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス2(rAAV2)ベクターである。rAAV.sFlt-1ベクターのおよび骨格として使用される無傷のAAV2ゲノムは、Lai
ら、Gene Therapy、2002年、9巻(12号):804~813頁において記載され
ている通りに調製した。rAAV2ベクターは、ウイルス性コード配列を欠く、すなわち、repおよびcapが、治療用遺伝子のための発現カセットで置き換えられている。rAAV.sFlt-1の活性部分は、sFlt-1である。sFLT-1とは、自然発生の血管内皮成長因子受容体1(VEGFR1またはFlt-1)の可溶性切断形態である。sFLT-1は、VEGFの唯一の公知の内因性の特異的阻害剤である。sFLT-1は、代替的なスプライシングにより生成され、膜近位免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通領域、および細胞内チロシンキナーゼドメインを欠く。よって、sFLT-1は、31の固有なアミノ酸残基を後続させる第1の6回細胞外免疫グロブリン様ループだけを含有する。sFLT-1は、ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)において最初に同定されたが、それ以来、妊婦の胎盤内および全身の循環中で自然発生することが見出されている。rAAV.sFlt-1の生成において使用されるsFLT-1は、全長膜貫通FLT-1の第1の6回細胞外免疫グロブリン様ドメインだけをコードするオープンリーディングフレームであって、代替的にスプライスされる、既に記載されている分泌型可溶性FLT-1アイソフォームを表す、固有な31アミノ酸長のC末端伸長を後続させるオープンリーディングフレームを含有する。
ら、Gene Therapy、2002年、9巻(12号):804~813頁において記載され
ている通りに調製した。rAAV2ベクターは、ウイルス性コード配列を欠く、すなわち、repおよびcapが、治療用遺伝子のための発現カセットで置き換えられている。rAAV.sFlt-1の活性部分は、sFlt-1である。sFLT-1とは、自然発生の血管内皮成長因子受容体1(VEGFR1またはFlt-1)の可溶性切断形態である。sFLT-1は、VEGFの唯一の公知の内因性の特異的阻害剤である。sFLT-1は、代替的なスプライシングにより生成され、膜近位免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通領域、および細胞内チロシンキナーゼドメインを欠く。よって、sFLT-1は、31の固有なアミノ酸残基を後続させる第1の6回細胞外免疫グロブリン様ループだけを含有する。sFLT-1は、ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)において最初に同定されたが、それ以来、妊婦の胎盤内および全身の循環中で自然発生することが見出されている。rAAV.sFlt-1の生成において使用されるsFLT-1は、全長膜貫通FLT-1の第1の6回細胞外免疫グロブリン様ドメインだけをコードするオープンリーディングフレームであって、代替的にスプライスされる、既に記載されている分泌型可溶性FLT-1アイソフォームを表す、固有な31アミノ酸長のC末端伸長を後続させるオープンリーディングフレームを含有する。
ITRは、軽微なプロモーター活性を保有することが示されているが、最大レベルの導入遺伝子発現のために、カセットは一般に、プロモーター/エンハンサーの組合せ、短いイントロン配列、治療用遺伝子のcDNA、およびポリアデニル化シグナルを含む。rAAV.sFlt-1では、ヒトCMV主要前初期遺伝子のエンハンサー/プロモーターおよびキメライントロンを、sFLT-1 cDNAの上流に配置した。サルウイルス40ポリアデニル化(SV40ポリA)シグナルは、sFLT-1 cDNAの下流に配置した。
sFLT-1のVEGFへのin vitroにおける結合は、広範に裏付けられている。VEGFに駆動される血管形成を阻害するsFLT-1の能力は、その潜在的な臨床適用についての無視できない関心を惹きつけてきたが、実施例12で記載されるrAAV.sFlt-1についての臨床研究以前には、ヒトにおける有効性または適性の証拠は示されなかった。sFLT-1の血管新生抑制活性は、2つの機構:i)それが高アフィニティーで結合するVEGFの隔離、ならびにii)VEGF受容体であるFlt-1およびKDR/Flk-1の膜貫通アイソフォームとの、不活性のヘテロ二量体の形成によるVEGFの阻害から生じうる。
rAAV.sFlt-1を生成するのに使用されるプラスミドベクターのヌクレオチド配列および概略図
rAAV.sFlt-1は、当技術分野で公知の通り(Xiaoら、1998年、J Virololgy、72巻(3号):2224~2232頁)に、ヒト胎児由来腎臓293細胞の、pSSV.CI.hsFlt-1プラスミドベクターおよびヘルパープラスミドに由来するDNAによる3連のトランスフェクションを介して生成した。rAAV.sFlt-1は、核単離、密度勾配遠心分離、および硫酸ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーの連続工程を使用して精製した。sFLT-1のプラスミドベクターについての概略表示を、図1に示す。
rAAV.sFlt-1は、当技術分野で公知の通り(Xiaoら、1998年、J Virololgy、72巻(3号):2224~2232頁)に、ヒト胎児由来腎臓293細胞の、pSSV.CI.hsFlt-1プラスミドベクターおよびヘルパープラスミドに由来するDNAによる3連のトランスフェクションを介して生成した。rAAV.sFlt-1は、核単離、密度勾配遠心分離、および硫酸ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーの連続工程を使用して精製した。sFLT-1のプラスミドベクターについての概略表示を、図1に示す。
処方物
rAAV.sFlt-1は、2つの濃度:滅菌低ウイルス結合性マイクロ遠心管内に100uL当たり1×1010のベクターゲノム(低用量)および100uL当たり1×1011のベクターゲノム(高用量)の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(pH7)中で製剤化した。処方物は、1回融解で網膜下注射による単回使用だけのための保存剤非含有処方物である。
rAAV.sFlt-1は、2つの濃度:滅菌低ウイルス結合性マイクロ遠心管内に100uL当たり1×1010のベクターゲノム(低用量)および100uL当たり1×1011のベクターゲノム(高用量)の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(pH7)中で製剤化した。処方物は、1回融解で網膜下注射による単回使用だけのための保存剤非含有処方物である。
rAAV(bv).sFlt-1
組換えウイルスの第2の例は、rAAV(bv).sFlt-1である。rAAV(bv).sFlt-1は、Sf9昆虫細胞内のバキュロウイルス発現系(BEVS)を使用して産生され、切断型可溶性VEGF受容体1(sFLT-1)のヒト形態をコードする、血清型2の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性(rAAV)ベクターである。ベクターは、Sf9細胞の2つの組換えバキュロウイルスであるBac-inRep-inCapおよびBac-sFlt-1による感染を使用して産生させた。Bac-sFlt-1は、Maniatisらにおいて記載されており、以下でもさらに記載されている、標準的な分子生物学法を使用して、Frag001m-BHKanおよびプラスミド骨格であるV109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kanからクローニングされた、8.7kbのプラスミドであるAVA01-pFB-CMV-sFltによる、エレクトロコンピテントセルの形質転換から生成された、バクミドDNAに由来した。Frag001mは、Blue Heron Biotech,LLC(Bothell、WA)により化学合成され、BHKan骨格へとクローニングされた、以下の連続核酸エレメント:ITR(AAV血清型2)、CMV-IEプロモーター、キメライントロン、5’非翻訳領域(UTR)、sFlt-1コード配列、SV40ポリA領域、ITR(AAV血清型2)から形成した。プラスミドであるV109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kanは、Virovek,Inc.(Hayward、CA)から得た。プラスミドは、カナマイシン抗生剤耐性遺伝子、ColE1起点、ならびにCMV-IEプロモーター、イントロン、複数のクローニング配列、およびAAV血清型2に由来する逆位末端配列(ITR)で挟まれたSV40ポリA領域を含有する組換えAAVカセットを含有した。このrAAVカセットは、ゲンタマイシン耐性遺伝子とTn7L接合部位とで挟んだ。AVA0l-pFB-CMV-sFltは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターまたは他の原核生物調節配列を含有しなかった。Bac-inRep-inCapとは、AAV血清型2に由来するrep遺伝子およびcap遺伝子のための発現カセットを含有する組換えバキュロウイルスである。
組換えウイルスの第2の例は、rAAV(bv).sFlt-1である。rAAV(bv).sFlt-1は、Sf9昆虫細胞内のバキュロウイルス発現系(BEVS)を使用して産生され、切断型可溶性VEGF受容体1(sFLT-1)のヒト形態をコードする、血清型2の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性(rAAV)ベクターである。ベクターは、Sf9細胞の2つの組換えバキュロウイルスであるBac-inRep-inCapおよびBac-sFlt-1による感染を使用して産生させた。Bac-sFlt-1は、Maniatisらにおいて記載されており、以下でもさらに記載されている、標準的な分子生物学法を使用して、Frag001m-BHKanおよびプラスミド骨格であるV109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kanからクローニングされた、8.7kbのプラスミドであるAVA01-pFB-CMV-sFltによる、エレクトロコンピテントセルの形質転換から生成された、バクミドDNAに由来した。Frag001mは、Blue Heron Biotech,LLC(Bothell、WA)により化学合成され、BHKan骨格へとクローニングされた、以下の連続核酸エレメント:ITR(AAV血清型2)、CMV-IEプロモーター、キメライントロン、5’非翻訳領域(UTR)、sFlt-1コード配列、SV40ポリA領域、ITR(AAV血清型2)から形成した。プラスミドであるV109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kanは、Virovek,Inc.(Hayward、CA)から得た。プラスミドは、カナマイシン抗生剤耐性遺伝子、ColE1起点、ならびにCMV-IEプロモーター、イントロン、複数のクローニング配列、およびAAV血清型2に由来する逆位末端配列(ITR)で挟まれたSV40ポリA領域を含有する組換えAAVカセットを含有した。このrAAVカセットは、ゲンタマイシン耐性遺伝子とTn7L接合部位とで挟んだ。AVA0l-pFB-CMV-sFltは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターまたは他の原核生物調節配列を含有しなかった。Bac-inRep-inCapとは、AAV血清型2に由来するrep遺伝子およびcap遺伝子のための発現カセットを含有する組換えバキュロウイルスである。
バキュロウイルス内のrAAV(bv).sFlt-1の産生
rAAV(bv).sFlt-1は、米国特許出願第12/297,958号において記載されており、より具体的には、以下の通りの方法に従い、バキュロウイルス内で産生させた。Sf9細胞を、28℃で、1ml当たり100単位のペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを含有するSF900 II SFM培地中に1ml当たり約107個の細胞へと成長させ、感染させる前に、約1ml当たり5×106個の細胞へと希釈した。Bac-inRep-inCapおよびBac-sFlt-1の各々を、m.o.i.を1として、28℃で3日間にわたり、細胞に感染させるのに使用して、AAV型2ベクターを産生した。3日間にわたる感染の後、細胞ペレットを、卓上用遠心分離器内、2,000rpmで15分間にわたる遠心分離により回収した。細胞ペレットは、Urabeら、Hum Gene Ther.、1、13巻(16号)、1935~43頁(2002年)により記載されている通りに、溶解緩衝液中で溶解させ、細胞内核酸(DNAおよびRNA)を、ベンゾナーゼ(Sigma、St.Louis、Mo)で消化させた。細胞溶解物を、Avanti J-25遠心分離器(Beckman、Fullerton、Calif)内、8,000rpmで30分間にわたる遠心分離により清浄にし、次いで、1cc当たり1.55gのCsCl溶液5ml、および1cc当たり1.32gのCsCl溶液10mlを含有するSW28遠心分離管へとロードした。15℃、28,000rpmで約16時間にわたる遠心分離の後、シリンジ注射針を使用して遠心分離管に穿刺することによりrAAV含有画分を回収し、第2ラウンドのCsCl超遠心分離にかけた。rAAV含有画分を、シリンジ注射針を使用して遠心分離管に穿刺することにより再度回収し、PBS緩衝液中で透析して、塩および洗浄剤を除去した。ベクター力価は、製造元(Applied Biosystems、Foster City、Calif)のプロトコールに従う定量的リアルタイムPCRアッセイにより決定した。
rAAV(bv).sFlt-1は、米国特許出願第12/297,958号において記載されており、より具体的には、以下の通りの方法に従い、バキュロウイルス内で産生させた。Sf9細胞を、28℃で、1ml当たり100単位のペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを含有するSF900 II SFM培地中に1ml当たり約107個の細胞へと成長させ、感染させる前に、約1ml当たり5×106個の細胞へと希釈した。Bac-inRep-inCapおよびBac-sFlt-1の各々を、m.o.i.を1として、28℃で3日間にわたり、細胞に感染させるのに使用して、AAV型2ベクターを産生した。3日間にわたる感染の後、細胞ペレットを、卓上用遠心分離器内、2,000rpmで15分間にわたる遠心分離により回収した。細胞ペレットは、Urabeら、Hum Gene Ther.、1、13巻(16号)、1935~43頁(2002年)により記載されている通りに、溶解緩衝液中で溶解させ、細胞内核酸(DNAおよびRNA)を、ベンゾナーゼ(Sigma、St.Louis、Mo)で消化させた。細胞溶解物を、Avanti J-25遠心分離器(Beckman、Fullerton、Calif)内、8,000rpmで30分間にわたる遠心分離により清浄にし、次いで、1cc当たり1.55gのCsCl溶液5ml、および1cc当たり1.32gのCsCl溶液10mlを含有するSW28遠心分離管へとロードした。15℃、28,000rpmで約16時間にわたる遠心分離の後、シリンジ注射針を使用して遠心分離管に穿刺することによりrAAV含有画分を回収し、第2ラウンドのCsCl超遠心分離にかけた。rAAV含有画分を、シリンジ注射針を使用して遠心分離管に穿刺することにより再度回収し、PBS緩衝液中で透析して、塩および洗浄剤を除去した。ベクター力価は、製造元(Applied Biosystems、Foster City、Calif)のプロトコールに従う定量的リアルタイムPCRアッセイにより決定した。
(実施例2)
VEGFに誘導される内皮細胞増殖のin vitroにおける阻害
ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)増殖のVEGFによる誘導を評価し、VEGFに誘導されるHUVEC増殖が、rAAVを媒介するsFLT-1により阻害されるのかどうかを決定するための研究を実施した。形質導入された細胞内のsFLT-1の存在を、馴化培地についてのウェスタンブロット解析によりまず確認した(図2、パネルa)。rAAV.sFlt-1を形質導入した293細胞およびrAAV.gfpを形質導入した293細胞に由来する馴化培地を、VEGFで処置されたHUVECへと、希釈率を増大させながら添加した。また、対照の飢餓培地(ウシ内皮成長因子を伴わない通常のHUVEC成長培地)だけも組み入れた。ヘパリンを、100μg/mLで各ウェルへと添加した。VEGFおよび異なる馴化培地で処置されたHUVECSの、VEGFに誘導される相対増殖は、25μLの3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrozolium bromide)(MTT、5mg/mL、Sigma)を、各ウェルへと、37℃で4時間にわたり添加することによりアッセイした。rAAV.sFlt-1を形質導入した293細胞に由来する40μLの馴化培地中のrAAVベクターによりコードされて分泌されるsFLT-1は、VEGFに誘導されるHUVECSの増殖を32%阻害することが確認された。馴化培地の容量を倍加することにより、細胞成長同等物による、飢餓培地中の培養物と同様な基底レベルまでの完全な阻害を結果としてもたらした(図2、パネルb)。
VEGFに誘導される内皮細胞増殖のin vitroにおける阻害
ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)増殖のVEGFによる誘導を評価し、VEGFに誘導されるHUVEC増殖が、rAAVを媒介するsFLT-1により阻害されるのかどうかを決定するための研究を実施した。形質導入された細胞内のsFLT-1の存在を、馴化培地についてのウェスタンブロット解析によりまず確認した(図2、パネルa)。rAAV.sFlt-1を形質導入した293細胞およびrAAV.gfpを形質導入した293細胞に由来する馴化培地を、VEGFで処置されたHUVECへと、希釈率を増大させながら添加した。また、対照の飢餓培地(ウシ内皮成長因子を伴わない通常のHUVEC成長培地)だけも組み入れた。ヘパリンを、100μg/mLで各ウェルへと添加した。VEGFおよび異なる馴化培地で処置されたHUVECSの、VEGFに誘導される相対増殖は、25μLの3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrozolium bromide)(MTT、5mg/mL、Sigma)を、各ウェルへと、37℃で4時間にわたり添加することによりアッセイした。rAAV.sFlt-1を形質導入した293細胞に由来する40μLの馴化培地中のrAAVベクターによりコードされて分泌されるsFLT-1は、VEGFに誘導されるHUVECSの増殖を32%阻害することが確認された。馴化培地の容量を倍加することにより、細胞成長同等物による、飢餓培地中の培養物と同様な基底レベルまでの完全な阻害を結果としてもたらした(図2、パネルb)。
rAAV.sFt-1ベクターの効力についてのin vitroにおける評価
形質導入されたヒト胎児由来腎臓293(HEK293)細胞によるヒトsFlt-1タンパク質の発現を、ELISAを介して定量化することにより、組換えヒトsFlt-1遺伝子をコードするAAVベクターの効力を評価するための研究を実施した。ヒト胎児由来腎臓293細胞は、American Type Culture Collection(Rockville、MD、USA)から得、10%のウシ胎仔血清(FBS:fetal bovine serum、GIBCO)および1倍濃度のペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンを伴うダルベッコ改変イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle Medium;Gibco、Grand Island、NY、USA)中で培養した。全ての培養物は、加湿雰囲気中、37℃および5%のCO2で維持した。
形質導入されたヒト胎児由来腎臓293(HEK293)細胞によるヒトsFlt-1タンパク質の発現を、ELISAを介して定量化することにより、組換えヒトsFlt-1遺伝子をコードするAAVベクターの効力を評価するための研究を実施した。ヒト胎児由来腎臓293細胞は、American Type Culture Collection(Rockville、MD、USA)から得、10%のウシ胎仔血清(FBS:fetal bovine serum、GIBCO)および1倍濃度のペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンを伴うダルベッコ改変イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle Medium;Gibco、Grand Island、NY、USA)中で培養した。全ての培養物は、加湿雰囲気中、37℃および5%のCO2で維持した。
HEK293細胞は、24ウェル当たり8×104個または1.5×105個の細胞で播種し、60~90%のコンフルエンシーのとき、2%のFBSを補充したDMEM培地中に1×103~1×106の範囲の感染多重度(MOI)の組換えAAVベクターを形質導入した。72時間後、形質導入後の馴化培地を回収した。馴化培地のアリコートを、試薬を使用して、R&D Systems SVR100B Quantikine ELISA Human sVEGF R1/sFlt-1キット(R&D Systems、Minneapolis、MN)による標準的な指示書に従い、ELISAのために調製した。ELISAキットの指示書に従い、R&D SYSTEMS ELISA試薬により、試料、基準物質、および対照を調製し、次いで、sVEGF R1/sFlt-1に対する抗体であらかじめコーティングされたELISAプレートへと移し、水平軌道型マイクロプレートシェーカー上、室温で2時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、抗sVEGF R1コンジュゲート(2時間)、基質溶液(30分間)および停止溶液を、標準的なELISAアッセイ手順に従い、各々の間に吸引ステップおよび洗浄ステップを伴いながら、逐次的に各ウェルへと適用した。試料、基準物質、および対照の光学密度(OD:optical density)は、基質反応を停止させて30分以内に、ELISAプレートリーダーにより測定した。pg/mL単位のsFlt-1の濃度は、ELISAプレートリーダーによるOD測定値を使用するSoftmaxProソフトウェアを使用して計算した。
rAAV.sFlt-1およびrAAV(bv).sFlt-1についての研究の結果を、図25Aおよび図25Bに示す。rAAV.sFlt-1およびrAAV(bv).sFlt-1を形質導入した72時間後において、HEK293細胞が発現させるsFlt-1タンパク質の濃度は、1×104のMOIで100~1,000pg/mLの範囲、1×105のMOIで100~10,000pg/mLの範囲、および1×106のMOIで1,000~10,000pg/mLの範囲であった。
(実施例3)
マウスにおけるrAAV.sFlt-1研究
ヒトVEGFの、光受容体細胞からのトランスジェニック発現により誘導される、緩慢であるが安定的な網膜血管新生を伴うトランスジェニックマウス(trVEGF029)を、網膜血管新生についてのモデルとして使用した。これらのマウスにより、2つの個別の研究を行った。
マウスにおけるrAAV.sFlt-1研究
ヒトVEGFの、光受容体細胞からのトランスジェニック発現により誘導される、緩慢であるが安定的な網膜血管新生を伴うトランスジェニックマウス(trVEGF029)を、網膜血管新生についてのモデルとして使用した。これらのマウスにより、2つの個別の研究を行った。
第1のマウス研究では、13匹のトランスジェニックマウスを、一方の眼内のrAAV.sFlt-1ベクター(1×1011個のベクター粒子)の投与および反対側の眼内の対照ベクターの投与の前と後における眼の血管新生の変化について評価した。注射の1、3、および8カ月後において、蛍光眼底血管造影法を使用して、眼を新生血管性変化について評価した。被験眼内に施された処置に対して盲検化された3名の観察者を介して、血管新生の程度、強度、および段階をグレード付けした(0~4)。「3」の中央値グレード(注射前)から、注射の1カ月後における「1」の中央値グレードへの、新生血管のグレード付けの、統計学的に有意な全体的低減(P=0.012)が見られた。この低減は、rAAV.sFlt-1による注射の3カ月後(中央値=1;P=0.001)および8カ月後(中央値=1;P=0.001)においても維持された。rAAV.sFlt-1ベクターの注射は、対照ベクターで処置された眼では、8%(13例中1例)と比較して、処置された眼のうちの85%(13例中11例)において、新生血管性血管の長期(少なくとも8カ月間)にわたる退縮を結果としてもたらした。
この前臨床研究における眼の組織学的検討は、光受容体の撹乱または喪失が、対照ベクターを注射された眼では、rAAV.sFlt-1を注射された眼と比較して有意に(P<0.01)より顕著であることを明らかにした。sFLT-1の発現はまた、組織試料についての逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応解析によっても確認し;sFLT-1のmRNAは、4例の被験眼全てにおいて検出された。対照(rAAV.gfp)ベクターを注射された眼と比較したところ、rAAV.sFlt-1を注射された眼では、rAAV.sFlt-1ベクター特異的有害作用が認められなかった。
trVEGF02トランスジェニックマウスにおいて行った第2の研究では、研究の目的は、rAAV.sFlt-1の網膜下注射が、任意の細胞を媒介する免疫応答であって、sFLT-1の長期にわたる発現に対して否定的な影響を及ぼすか、または網膜に対する免疫応答関連損傷を引き起こす可能性がある免疫応答を結果としてもたらすのかどうかを決定することであった。本研究では、50匹のtrVEGF02トランスジェニックマウスの一方の眼に、rAAV.sFlt-1の網膜下注射(8×109個のウイルス粒子)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を施した。次いで、rAAV.sFlt-1処置群または対照処置群に由来する30匹のマウスの網膜を、注射の1週間後および1カ月後において、免疫細胞(白血球、マクロファージ、ならびにBリンパ球およびTリンパ球)の存在について評価した。後部眼杯についてのフローサイトメトリーによる検討は、注射の1週間後において、CD45+白血球(対照と比較して6.6倍の増大;P<0.05)およびCD11b+マクロファージ(対照と比較して5.7倍の増大;P<0.036)の統計学的に有意な増大が見られることを示した。しかし、この時点で、CD19+、CD8+、およびCD4+(Bリンパ球およびTリンパ球)には差異が見られなかった。注射の1カ月後、rAAV.sFlt-1またはPBS対照で処置されたマウスの眼において、白血球サブセット(すなわち、CD45+細胞、CD19+細胞、CD11b+細胞、CD8+細胞、またはCD4+細胞)の間の細胞数の差異が見られなかったことから、白血球およびマクロファージの浸潤は一過性であったことが示唆される。これらのマウスに由来する脾臓のリンパ球サブセットについての、1週間後および1カ月後の時点におけるフローサイトメトリーによる査定は、リンパ球の数の有意差を示さなかった。この所見は、網膜内では、一過性の限局的な免疫応答が示されたが、全身性の免疫応答は観察されなかったことを示唆する。
この第2の研究では、rAAV.sFlt-1またはPBSを注射されたマウスのうちの5匹に由来する眼についての組織学的検討では、被験マウスのうちのいずれにおいても、網膜内の観察可能な免疫応答関連破壊または続発症が明らかになることはなかった。
網膜血管新生についての、このトランスジェニックマウスモデル(trVEGF02)における、rAAV.sFlt-1の、血管新生のレベルに対する影響を評価するために、また、rAAV.sFlt-1またはPBSを注射されたマウスの網膜も、2名の異なる評価者を介して、処置の2カ月後において独立にグレード付けした。総じて、rAAV.sFlt-1を注射された眼では、平均血管新生グレードの有意な低減(注射前:1.46±0.58;注射後:0.81±0.57;P<0.00015)が見られたのに対し、PBS対照を注射された眼では、平均血管新生グレードの有意な増大が見られた(注射前:1.08±0.56;注射後:1.63±0.96;P<0.018)。
この第2のマウス研究からの所見は、rAAV.sFlt-1による処置は、この網膜血管新生およびAMDについてのマウスモデルにおいて観察される血管新生の進行性の増大を逆転すると考えられたことを明確に指し示す。さらに、rAAV.sFlt-1による網膜下注射の1週間後に観察されたのは、限定された限局性の炎症応答だけであり、1カ月後には消失した。この免疫応答は、網膜内のrAAV.sFlt-1の長期にわたる治療的有効性を損なわないと考えられた。
この実施例3で記載したトランスジェニックマウスモデルは、本明細書で開示される医薬組成物は、VEGFの阻害が関与する他の網膜の血管疾患の処置および/または予防のために使用しうることを裏付ける。これらは、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、糖尿病性網膜浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、および網膜静脈分枝閉塞症を含む。臨床研究では、Lucentisなど、いくつかのVEGF阻害剤は、糖尿病性黄斑浮腫および網膜静脈閉塞症を含むある種のこれらの疾患を効果的に処置することが示されている。これらのマウスモデルにおいて裏付けられるrAAV.sFlt-1の有効性は、rAAV.sFlt-1はまた、これらのVEGFを媒介する疾患を処置するのにも有効であることを指し示す。
(実施例4)
ラットにおけるrAAV.sFlt-1研究
ラットrAAV.sFlt-1研究では、眼の血管新生についての2つのモデル:焼灼誘導型角膜血管新生モデルおよびレーザー光凝固誘導型脈絡膜血管新生(CNV)モデルを使用した。角膜血管新生モデルでは、22匹のラットの一方の眼の前房に、rAAV.sFlt-1ベクター(8×108個のウイルス粒子)を注射し、反対側の眼に対照ベクター(rAAV.gfp)を注射した後、角膜を焼灼した。次いで、眼を、焼灼の4日後に、細隙灯撮影を使用して、血管新生について検討した。rAAV.sFlt-1で処置された眼では、対照で処置された眼と比較して、著明により低い割合の角膜血管形成が見出された(それぞれ、27%および63%;P=0.009)。眼についての組織学的検討は、焼灼され、rAAV.sFlt-1で処置された眼の大半では、角膜血管が観察されないことを示した。組織学的検討はまた、対照ベクターを注射された眼では、角膜間質層に対する細胞浸潤が、rAAV.sFlt-1で処置された眼と比較してより顕著であることも明らかにした。加えて、対照ベクターで処置された眼では、明白な浮腫および角膜間質の腫脹も見られたのに対し、rAAV.sFlt-1で処置された眼では、有意な組織腫脹の証拠は見られなかった。
ラットにおけるrAAV.sFlt-1研究
ラットrAAV.sFlt-1研究では、眼の血管新生についての2つのモデル:焼灼誘導型角膜血管新生モデルおよびレーザー光凝固誘導型脈絡膜血管新生(CNV)モデルを使用した。角膜血管新生モデルでは、22匹のラットの一方の眼の前房に、rAAV.sFlt-1ベクター(8×108個のウイルス粒子)を注射し、反対側の眼に対照ベクター(rAAV.gfp)を注射した後、角膜を焼灼した。次いで、眼を、焼灼の4日後に、細隙灯撮影を使用して、血管新生について検討した。rAAV.sFlt-1で処置された眼では、対照で処置された眼と比較して、著明により低い割合の角膜血管形成が見出された(それぞれ、27%および63%;P=0.009)。眼についての組織学的検討は、焼灼され、rAAV.sFlt-1で処置された眼の大半では、角膜血管が観察されないことを示した。組織学的検討はまた、対照ベクターを注射された眼では、角膜間質層に対する細胞浸潤が、rAAV.sFlt-1で処置された眼と比較してより顕著であることも明らかにした。加えて、対照ベクターで処置された眼では、明白な浮腫および角膜間質の腫脹も見られたのに対し、rAAV.sFlt-1で処置された眼では、有意な組織腫脹の証拠は見られなかった。
レーザー光凝固誘導型CNVモデルでは、10匹のラットの一方の眼に、rAAV.sFlt-1ベクター(8×108個のウイルス粒子)を網膜下注射し、反対側の眼に対照ベクター(rAAV.gfp)を網膜下注射した。レーザー光凝固を使用して、注射の1カ月後にCNVを誘導した。レーザー光凝固の5週間後、蛍光眼底血管造影法を使用して、眼をCNVについて検討した。rAAV.sFlt-1で処置された眼では、レーザーで処理した帯域のうちで漏出を示したのは、対照ベクターで処置された眼における60%と比較して41%だけであった(P=0.002)。レーザー誘導型CNVの16週間後、rAAV.sFlt-1で処置された眼が示す血管新生は、対照の眼よりなおも著明により低かった。注射部位に直に隣接する帯域内の眼についての組織学的検討は、網膜色素上皮の正常ならびに外節および外核層の正常を明らかにした。これらの所見は、sFLT-1の発現と関連する明白な毒性が見られないことを示唆した。網膜電図はまた、rAAV.sFlt-1で処置された眼の正常な機能も指し示した。rAAV.sFlt-1ベクターおよび対照ベクターで処置されたレーザー病変の大半は、網膜下細胞膜を発生させた。しかし、rAAV.sFlt-1で処置された眼内の病変における増殖性内皮細胞は一般に少数であったことから、蛍光眼底血管造影法の所見が反映され、rAAV.sFlt-1で処置された眼では、血管形成(すなわち、血管新生)の割合が低減されることが指し示される。
糖尿病についてのラットモデルにおける、rAAV.sFlt-1およびrAAV(bv).sFlt-1による研究
糖尿病性網膜症(DR:diabetic retinopathy)および糖尿病性黄斑浮腫(DME)を処置するための、rAAV.sFlt-1およびrAAV(bv).sFlt-1の安全性および有効性をさらに評価するために、糖尿病についてのラットモデルにおける実験を行う。
糖尿病性網膜症(DR:diabetic retinopathy)および糖尿病性黄斑浮腫(DME)を処置するための、rAAV.sFlt-1およびrAAV(bv).sFlt-1の安全性および有効性をさらに評価するために、糖尿病についてのラットモデルにおける実験を行う。
糖尿病患者における視覚喪失は、炎症により媒介され、血液網膜関門の最終的な破断および後続の血管漏出をもたらす結果として、黄斑浮腫をもたらす。ストレプトゾシン(STZ:streptozotocin)糖尿病ラットモデルは、十分に特徴付けられた血管漏出のパターンであって、VEGFが、2週間後には早くも強く上方調節されるパターンを提示する(Miyamoto, K.ら、Proc Natl Acad Sci USA、96巻、10836~
10841頁(1999年))。DRについての動物モデルの処置への現行の接近法により裏付けられているのは、血管漏出についての部分的な解明に過ぎない。
10841頁(1999年))。DRについての動物モデルの処置への現行の接近法により裏付けられているのは、血管漏出についての部分的な解明に過ぎない。
糖尿病を、ブラウンノルウェーラットにおいて、ストレプトゾシンの腹腔内注射により誘導する(50mg/kg)。糖尿病は、血中グルコース測定値により確認およびモニタリングする。血中グルコース>350mg/dlであるラットは、糖尿病性であると考える。糖尿病発症の8日後において、Chalberg, T.W.ら、Invest Ophthalmol Vis Sci
、46巻、2140~2146頁(2005年)において記載されている、確立された技法を使用して、1×1010または5×1010vgのrAAV.sFlt-1またはrAAV(bv).sFlt-1を含有する、5μLの網膜下注射によりラットを処置する(1群当たりn=12例の眼)。AAV2.GFP(5×1010vg)およびビヒクルは、対照として注射する。非糖尿病性および糖尿病性の非処置群もまた、対照として使用する。
、46巻、2140~2146頁(2005年)において記載されている、確立された技法を使用して、1×1010または5×1010vgのrAAV.sFlt-1またはrAAV(bv).sFlt-1を含有する、5μLの網膜下注射によりラットを処置する(1群当たりn=12例の眼)。AAV2.GFP(5×1010vg)およびビヒクルは、対照として注射する。非糖尿病性および糖尿病性の非処置群もまた、対照として使用する。
sFLT-1を発現させるrAAV(bv).sFlt-1の、血管漏出に対する効果は、60日後に測定する。網膜血管漏出は、FITC-アルブミン漏出法により、FITCでコンジュゲートしたアルブミンをトレーサーとして使用する注射後において測定する。FITC-アルブミン漏出法は、循環から網膜へと漏出するFITC-アルブミンの漏出を直接測定し、網膜の血管透過性を測定するのに一般的に使用される方法である。注射された眼における網膜血管漏出を、非糖尿病性対照、処置されていない糖尿病性眼、およびビヒクルで処置された糖尿病性眼、ならびに野生型のAAV血清型2および8と比較する。
結果:sFLT-1を発現させるrAAV(bv).sFlt-1が、STZ-糖尿病性ラットにおける血管漏出を低減するのに対し、AAV2.GFPおよび他の対照の注射は、血管漏出を低減しない。
(実施例5)
サルにおけるrAAV.sFlt-1研究
rAAV.sFlt-1の有効性および安全性はまた、AMDの非ヒト霊長動物(マカクザル)モデルにおいて、レーザー光凝固を使用してCNVを誘導しても調べた。ヒトにおけるAMDの処置の開発における1つの難題は、非ヒト霊長動物が、AMDを発症しないことである。レーザー光凝固により誘導されるCNVは、いくつかのAMDの症状をシミュレートするが、伏在する生物学的過程は、慢性疾患の進行ではなく、急性損傷の治癒であり、したがって、AMDまたは他のCNVベースの疾患を伴うヒトにおけるCNVのための任意の特定の処置の効能を予測できない可能性がある。にもかかわらず、ヒトの眼は、非霊長動物の眼より非ヒト霊長動物の眼と解剖学的に類似するため、潜在的な処置または他の介入の毒性およびこれに対する組織学的応答を評価するためには、非ヒト霊長動物が高頻度で研究される。
サルにおけるrAAV.sFlt-1研究
rAAV.sFlt-1の有効性および安全性はまた、AMDの非ヒト霊長動物(マカクザル)モデルにおいて、レーザー光凝固を使用してCNVを誘導しても調べた。ヒトにおけるAMDの処置の開発における1つの難題は、非ヒト霊長動物が、AMDを発症しないことである。レーザー光凝固により誘導されるCNVは、いくつかのAMDの症状をシミュレートするが、伏在する生物学的過程は、慢性疾患の進行ではなく、急性損傷の治癒であり、したがって、AMDまたは他のCNVベースの疾患を伴うヒトにおけるCNVのための任意の特定の処置の効能を予測できない可能性がある。にもかかわらず、ヒトの眼は、非霊長動物の眼より非ヒト霊長動物の眼と解剖学的に類似するため、潜在的な処置または他の介入の毒性およびこれに対する組織学的応答を評価するためには、非ヒト霊長動物が高頻度で研究される。
非ヒト霊長動物についての第1の研究では、5匹のマカクザルの一方の眼に、rAAV.sFlt-1(4×1012個のウイルス粒子)を網膜下注射し、反対側の眼に対照ベクター(rAAV.gfp)を網膜下注射した。サルの眼の健康は、網膜下注射後において定期的に評価した。対照ベクターまたはrAAVsFlt-1ベクターの網膜下注射と直接関連する見かけの合併症は見られなかった。注射後の週に、一過性の結膜刺激および硝子体のかすみが感知されたが、2週目までに消失した。サルのうちの1匹の右眼では、網膜下注射は奏効せず、したがって、この動物をさらなる査定にかけなかった。
40~100uLのrAAV懸濁液の網膜下注射により網膜を持ち上げ、色素上皮と光受容体層との間にベクターを収容するブレブを、限局性の様式で創出した。このブレブは、24~48時間以内に自己補正された。注射針穿通点における、網膜色素上皮に対する微小な撹乱を除き、他の網膜の異常は、追跡期間(注射後3~17カ月)にわたり観察されなかった。他の異常または有害事象も観察されず、いかなる時点においても、手術と関連する網膜剥離は観察されなかった。
次いで、rAAVsFlt-1の長期にわたる治療有効性を評価するため、4匹の注射されたサルを、ベクターによる処置の16カ月後において、強いレーザー光凝固にかけた。各眼において、レーザーを使用して、8カ所の病変を誘導し、次いで、レーザー処置の2および4週間後に、眼をCNVについてモニタリングした。レーザー光凝固の後、4匹中3匹のサルだけが解析可能であり、したがって、3匹の動物について、有効性データを回収した。rAAVsFlt-1で処置された3例のサルの眼のうちのいずれも、CNV関連病変を発症せず、弱いフルオレセイン染色だけが観察されたことから、漏出/血管新生は最小限であることが指し示される。対照ベクターで処置された、全ての反対側の眼は、CNV関連病変を発症した。
網膜下腔へと注射されたrAAV.sFlt-1の安全性および毒性の評価を目的とする追跡研究では、8匹のサルを使用した。5匹には、それらの左眼にrAAV.sFlt-1を注射し、2匹には、それらの左眼にrAAV.gfpを注射し、1匹には、両方の眼に組換えFlt-1タンパク質を注射し、1匹は、注射されない対照として保った。サルは、注射前および注射後において、カラー眼底撮影、蛍光眼底血管造影法、および網膜電図写真により調べた。血液は、sFLT-1レベルをアッセイするために日常的に回収し、末梢血リンパ球をフローサイトメトリーのために単離して、免疫細胞サブセット応答について評価した。屠殺時(注射の3、9、および12カ月後)において、i)抽出されたゲノムDNAに対するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用する、rAAV.sFlt-1ベクターについての生体内分布研究;ii)ELISAによる、hsFlt-1タンパク質レベルおよびAAV2カプシドタンパク質レベルの定量化;ならびにiii)眼についての組織学のために組織を回収した。
カラー眼底撮影、蛍光眼底血管造影法、および網膜電図写真は、注射後における眼に対するいかなる有害作用も検出しなかった。試験した雄または雌のサルのうちのいずれにおける血漿sFLT-1レベルも、rAAV.sFlt-1注射に関連するレベルの上昇を示さなかった。視神経試料を除き、サンプリングされた他の組織(リンパ節、脾臓、肝臓、脳、脳、心臓、脾臓、角膜)のうちのいずれのゲノムDNAにおいても、rAAV.sFlt-1配列は検出されなかった。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された眼のパラフィン包埋切片は、正常な外見を呈した。
非ヒト霊長動物の解剖学は、マウスなどの小型の哺乳動物の解剖学よりヒト解剖学に類似する一方で、非ヒト霊長動物における研究を興味深いものとするものの、ヒトにおける臨床結果を予測しない限界も存在する。上記で言及した通り、本実施例における研究では、動物が、レーザー損傷がなければ健康な網膜組織を有する、レーザー損傷モデルを使用する。網膜組織は、経時的に疾患の網膜組織内で退化することも、疾患特異的な病原性因子が存在することもなかった。非ヒト霊長動物は、生体内分布、薬物動態、ならびに用量依存性、抗体力価、免疫応答および炎症応答に関して、予測可能でない形でヒトと異なる頻度が高い。さらなる差異は、ILM(内境界膜:inner limiting membrane)、およびヒトでは本研究において使用される非ヒト霊長動物の約4倍である硝子体腔の容量を含む。網膜と硝子体との間の輸送を限定するように作用する障壁であるヒト内境界膜は、サルのILMより根本的で有効な障壁である。
(実施例6)
安全性研究
これらの研究では、sFLT-1タンパク質を検出するための酵素免疫測定アッセイキットを使用して、sFLT-1タンパク質を、動物の硝子体中および血漿中で測定した。sFLT-1タンパク質レベルは、rAAV.sFlt-1を注射された動物の硝子体内および眼内で上方調節された。図3Aは、rAAV.sFlt-1を注射されたサルの眼(左眼)およびrAAV.gfpを注射された対照のサルの眼ならびに注射されなかったサルの眼(右眼)の硝子体内のsFLT-1タンパク質レベルを示す。sFLT-1タンパク質レベルは、5例のrAAV.sFlt-1を注射された眼のうちの4例において著明に高かった。表5.3.1は、注射されなかったマウスの眼内、およびrAAV.sFlt-1を注射されたマウスの眼内、および注射の1カ月後において除核されたマウスの眼内のsFLT-1タンパク質レベルを示す。マウスの眼およびサルの硝子体におけるsFLT-1の過剰発現は、それらの全体的な健全性に対していかなる有害作用も及ぼさなかった。サルでは、硝子体中のsFLT-1の過剰発現は、それらの網膜機能に対していかなる影響も及ぼさず、眼に対して臨床的または組織学的に明らかな毒性効果も及ぼさなかった。rAAV.sFlt-1を注射された眼における有意に高いsFLT-1タンパク質レベルは、長期にわたるrAAVを媒介するhsFLT-1の発現を示唆し、注射の17カ月後のサルの網膜におけるウイルス性mRNA配列の検出およびrAAVに媒介されるgfp発現の存在についての既往のデータを裏付ける。
安全性研究
これらの研究では、sFLT-1タンパク質を検出するための酵素免疫測定アッセイキットを使用して、sFLT-1タンパク質を、動物の硝子体中および血漿中で測定した。sFLT-1タンパク質レベルは、rAAV.sFlt-1を注射された動物の硝子体内および眼内で上方調節された。図3Aは、rAAV.sFlt-1を注射されたサルの眼(左眼)およびrAAV.gfpを注射された対照のサルの眼ならびに注射されなかったサルの眼(右眼)の硝子体内のsFLT-1タンパク質レベルを示す。sFLT-1タンパク質レベルは、5例のrAAV.sFlt-1を注射された眼のうちの4例において著明に高かった。表5.3.1は、注射されなかったマウスの眼内、およびrAAV.sFlt-1を注射されたマウスの眼内、および注射の1カ月後において除核されたマウスの眼内のsFLT-1タンパク質レベルを示す。マウスの眼およびサルの硝子体におけるsFLT-1の過剰発現は、それらの全体的な健全性に対していかなる有害作用も及ぼさなかった。サルでは、硝子体中のsFLT-1の過剰発現は、それらの網膜機能に対していかなる影響も及ぼさず、眼に対して臨床的または組織学的に明らかな毒性効果も及ぼさなかった。rAAV.sFlt-1を注射された眼における有意に高いsFLT-1タンパク質レベルは、長期にわたるrAAVを媒介するhsFLT-1の発現を示唆し、注射の17カ月後のサルの網膜におけるウイルス性mRNA配列の検出およびrAAVに媒介されるgfp発現の存在についての既往のデータを裏付ける。
サルにおける血漿hsFLT-1レベルは、異なるサンプリング時点において、いかなる傾向も示さなかった(図3B)。これは、rAAV.sFlt-1の注射が、血漿hsFLT-1レベルに対して明白な影響を及ぼさなかったことを示唆する。レベルの変動は、任意のサルの健全性に対していかなる影響も及ぼさなかった。
(実施例7)
マウスについての免疫原性研究
フローサイトメトリーを使用して、注射の1、2、および4週間後におけるマウスの眼内の、rAAV.sFlt-1治療に対する細胞性免疫応答を評価した。浸潤白血球は、CD45の発現に基づき同定し、CD11b、CD19、CD4、およびCD8のそれぞれの発現に基づき、単球/顆粒球、B細胞、CD4+T細胞、およびCD8+T細胞として分類した。後部眼杯を、各群内5匹のマウス(rAAV.sFLT-1を注射されたマウス、PBSを注射された対照マウス、注射されない対照マウス)から回収し、解析のためにプールした。図4Aに示す通り、この実験の経過にわたり、各群のマウスから回収される細胞の数には差異が見られない。しかし、注射の1および2週間後において、CD45+細胞の数の有意な増大が見られたが、これは、4週間後までに消滅した(図4B)。CD4+細胞、CD8+細胞、およびCD19+細胞の数(図4D~F)の差異が見られないので、1週間後において見られた増大のほとんど全ては、CD11b+細胞の増大に帰せられうるであろう(図4C)。2週間後において、AAV.sFlt-1を注射されたマウスの眼に存在するCD11b+の数に有意差はもはや見られなかったが、代わりに、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の数の有意な増大、ならびにB細胞の増大への可能な傾向が見られた。CD4+細胞およびCD8+細胞の数は、4週間後において急激に減少したが、PBSを注射されたマウスおよび注射されなかったマウスと比較した著明な増大を維持した。これに対し、この実験の経過において、脾臓内のCD11b+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞、およびCD19+細胞の数の変化は見られなかった(図5A~E)。
マウスについての免疫原性研究
フローサイトメトリーを使用して、注射の1、2、および4週間後におけるマウスの眼内の、rAAV.sFlt-1治療に対する細胞性免疫応答を評価した。浸潤白血球は、CD45の発現に基づき同定し、CD11b、CD19、CD4、およびCD8のそれぞれの発現に基づき、単球/顆粒球、B細胞、CD4+T細胞、およびCD8+T細胞として分類した。後部眼杯を、各群内5匹のマウス(rAAV.sFLT-1を注射されたマウス、PBSを注射された対照マウス、注射されない対照マウス)から回収し、解析のためにプールした。図4Aに示す通り、この実験の経過にわたり、各群のマウスから回収される細胞の数には差異が見られない。しかし、注射の1および2週間後において、CD45+細胞の数の有意な増大が見られたが、これは、4週間後までに消滅した(図4B)。CD4+細胞、CD8+細胞、およびCD19+細胞の数(図4D~F)の差異が見られないので、1週間後において見られた増大のほとんど全ては、CD11b+細胞の増大に帰せられうるであろう(図4C)。2週間後において、AAV.sFlt-1を注射されたマウスの眼に存在するCD11b+の数に有意差はもはや見られなかったが、代わりに、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の数の有意な増大、ならびにB細胞の増大への可能な傾向が見られた。CD4+細胞およびCD8+細胞の数は、4週間後において急激に減少したが、PBSを注射されたマウスおよび注射されなかったマウスと比較した著明な増大を維持した。これに対し、この実験の経過において、脾臓内のCD11b+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞、およびCD19+細胞の数の変化は見られなかった(図5A~E)。
網膜に浸潤するT細胞の機能を、それらをPMA/イオノマイシンまたは抗CD3で刺激し、フローサイトメトリーを介して細胞内IFN-ガンマ産生を測定することにより緊密に調べた。図6は、rAAV.sFlt-1を注射した後、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の両方の小部分が、注射されない対照と比較して、IFN-ガンマを産生するようにプライミングされたことを示す。IFN-ガンマ産生細胞の頻度は、3日目におけるCD8+T細胞の見かけの増大にもかかわらず、実験の経過にわたり、著明には変化しなかった(図6B)。T細胞を、rAAVカプシドタンパク質のクラスI MHC制限エピトープで再刺激したところ、低レベルのIFN-ガンマが測定され、また、いかなる刺激の不在下(データは示さない)でも、ある程度のIFN-ガンマが検出された。まとめると、これらの結果は、rAAV.sFlt-1を注射されたマウスの眼に浸潤するT細胞の小部分は、IFN-ガンマを産生するように新たに活性化されたが、これは、この実験の経過において、T細胞サブセットの間で変化しなかったことを指し示す。
AAV-sFLT-1を注射されたマウスの眼への免疫細胞の浸潤に関するこれらの実験について提示されたデータは、細胞浸潤の2つの波を明確に示す。1週間後におけるCD11b+細胞による初期波の後、2週間後において、CD4+T細胞およびCD8+T細胞による波が見られた。重要なことは、浸潤のいずれの波も、4週間後にはもはや存在しなかったことから、浸潤はそれ自体で消失したと示唆されることである。重要なことは、sFLT-1タンパク質の産生が、この時点で減衰したわけではなく、極めて高レベルで発現し続けたことである。
IFN-ガンマ産生についてのデータは、CD4+T細胞およびCD8+T細胞のうちの約5%が、新たにプライミングされたものであり、この頻度は、実験の経過にわたり変化しなかったことを指し示した。Huらは、活性化T細胞による血液網膜関門の破断について最初に記載し、本明細書で提示したデータは、活性化CD4+細胞および活性化CD8+細胞の浸潤と符合する。しかし、特異的なペプチドによる再刺激だけが、実験の経過にわたり変化しない低レベルのIFN-ガンマ産生を明らかにしたので、この集団内における、カプシド特異的なT細胞の数の増大の証拠は見られなかった。まとめると、これらの観察は、rAAV.sFlt-1の注射により生じた初期の刺激は、免疫細胞浸潤の短命の波を生み出したが、4週間以内にそれ自体で消失し、眼の組織に有害な可能性があり、sFLT-1の発現に影響を及ぼしうる、進行中の免疫応答を誘発しなかったことを示唆する。
(実施例8)
サルについての免疫原性研究
免疫細胞サブセット集団の変化を同定する抗体のパネルを使用して、rAAV.sFlt-1またはrAAV.gfpの網膜下注射後における免疫応答を解析した。結果を、図4にまとめる。何匹かのサルでは、免疫細胞サブセット集団の極めて小さな変化が観察されたが、それらは、統計学的に有意ではなかった。この結果にもかかわらず、この後、循環細胞についてのより徹底された研究を行った。具体的には、本発明者らは、ベクター(rAAV)または挿入される遺伝子産物(sFLT-1)が、免疫の活性化を引き起こしうる可能性について評価した。B細胞およびT細胞の活性化について探索した(図5および図6)。他のリンパ球集団もまた解析して、治療が、直接的な活性化または活性化に対する応答の指標でありうる観察可能な差異を引き起こすのかどうかを決定した。解析は、古典的なマーカーの組合せ(Pitcher、2002年、129頁)のほか、近年公表された
報告(Miller、2008年、126頁)において記載されている新規の表現型解析を使用して行った。表現型マーカーの小さなサブセット(HLA-DR、Ki-67、およびBcl-2)を使用して、本発明者らは、rAAV-sFLT-1の投与後において、CD4+T細胞もしくはCD8+T細胞および/またはB細胞が、活性化の徴候を示すのかどうかについて探索した。Millerらにより公表された研究では、活性化T細胞は、分化マーカーであるHLA-DR、および増殖についてのマーカーとして使用される、細胞周期に関連する核抗原であるKi-67の発現を特徴とする、活性化したエフェクターの表現型を提示する。休眠T細胞は、Ki-67を発現させないのに対し、循環T細胞または新たに分裂したT細胞は、Ki-67の発現を上方調節する。Ki-67発現のレベルは通常、ホメオスタシス細胞の循環の一部として検出される。
サルについての免疫原性研究
免疫細胞サブセット集団の変化を同定する抗体のパネルを使用して、rAAV.sFlt-1またはrAAV.gfpの網膜下注射後における免疫応答を解析した。結果を、図4にまとめる。何匹かのサルでは、免疫細胞サブセット集団の極めて小さな変化が観察されたが、それらは、統計学的に有意ではなかった。この結果にもかかわらず、この後、循環細胞についてのより徹底された研究を行った。具体的には、本発明者らは、ベクター(rAAV)または挿入される遺伝子産物(sFLT-1)が、免疫の活性化を引き起こしうる可能性について評価した。B細胞およびT細胞の活性化について探索した(図5および図6)。他のリンパ球集団もまた解析して、治療が、直接的な活性化または活性化に対する応答の指標でありうる観察可能な差異を引き起こすのかどうかを決定した。解析は、古典的なマーカーの組合せ(Pitcher、2002年、129頁)のほか、近年公表された
報告(Miller、2008年、126頁)において記載されている新規の表現型解析を使用して行った。表現型マーカーの小さなサブセット(HLA-DR、Ki-67、およびBcl-2)を使用して、本発明者らは、rAAV-sFLT-1の投与後において、CD4+T細胞もしくはCD8+T細胞および/またはB細胞が、活性化の徴候を示すのかどうかについて探索した。Millerらにより公表された研究では、活性化T細胞は、分化マーカーであるHLA-DR、および増殖についてのマーカーとして使用される、細胞周期に関連する核抗原であるKi-67の発現を特徴とする、活性化したエフェクターの表現型を提示する。休眠T細胞は、Ki-67を発現させないのに対し、循環T細胞または新たに分裂したT細胞は、Ki-67の発現を上方調節する。Ki-67発現のレベルは通常、ホメオスタシス細胞の循環の一部として検出される。
(実施例9)
rAAV.sFlt-1の生体内分布
ゲノムDNAは、サルを安楽死させた直後に回収された組織(視神経、リンパ節、脳、心臓、肺、脾臓、肝臓、角膜)から抽出した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を、ゲノムDNAについて実施して、網膜下腔に注射したrAAV.sFlt-1ベクター構築物が、別の部位に存在するのかどうかを決定した。既知量の対照プラスミドであるpssv.C1.sflt-1 DNAにおけるCt値の比較に基づき、rAAV.sFlt-1構築物は、注射された一方の眼の視神経において低遺伝子コピー数で見出されたが、他の組織試料のうちのいずれにおいても見出されなかった。これは、網膜下腔へと注射されたrAAV.sFlt-1が、主に眼内に滞留していることを示唆する。表4は、注射されなかったサル、またはrAAV.sFlt-1を注射されたサル、およびrAAV.gfpを注射されたサルから抽出されたゲノムDNAによるCt値の概要である。
rAAV.sFlt-1の生体内分布
ゲノムDNAは、サルを安楽死させた直後に回収された組織(視神経、リンパ節、脳、心臓、肺、脾臓、肝臓、角膜)から抽出した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を、ゲノムDNAについて実施して、網膜下腔に注射したrAAV.sFlt-1ベクター構築物が、別の部位に存在するのかどうかを決定した。既知量の対照プラスミドであるpssv.C1.sflt-1 DNAにおけるCt値の比較に基づき、rAAV.sFlt-1構築物は、注射された一方の眼の視神経において低遺伝子コピー数で見出されたが、他の組織試料のうちのいずれにおいても見出されなかった。これは、網膜下腔へと注射されたrAAV.sFlt-1が、主に眼内に滞留していることを示唆する。表4は、注射されなかったサル、またはrAAV.sFlt-1を注射されたサル、およびrAAV.gfpを注射されたサルから抽出されたゲノムDNAによるCt値の概要である。
(実施例10)
網膜血管新生のマウスモデルについての有効性研究
光受容体細胞内のVEGFの上方調節を介して生成されたトランスジェニックマウスを、研究において使用した。一方の眼には、rAAV.sFlt-1を注射し、反対側の眼には、rAAV.gfpを注射した。盲検化された観察者を介して、合意されたスケールに基づき、血管新生の程度、強度、および段階をグレード付けした。結果は、注射の1カ月後において、3(重度)の中央値から、注射の1カ月後における1(軽度)の中央値への、血管新生グレードの、統計学的に有意な全体的低減(P=0.012)が見られることを示した。この低レベルのフルオレセイン漏出が、rAAV.sFlt-1を注射した3カ月後(中央値=1;P=0.001)および8カ月後(中央値=1;P=0.001)において維持されたことから、rAAV.sFlt-1の、長期にわたる持続的な治療効果が示唆される。
網膜血管新生のマウスモデルについての有効性研究
光受容体細胞内のVEGFの上方調節を介して生成されたトランスジェニックマウスを、研究において使用した。一方の眼には、rAAV.sFlt-1を注射し、反対側の眼には、rAAV.gfpを注射した。盲検化された観察者を介して、合意されたスケールに基づき、血管新生の程度、強度、および段階をグレード付けした。結果は、注射の1カ月後において、3(重度)の中央値から、注射の1カ月後における1(軽度)の中央値への、血管新生グレードの、統計学的に有意な全体的低減(P=0.012)が見られることを示した。この低レベルのフルオレセイン漏出が、rAAV.sFlt-1を注射した3カ月後(中央値=1;P=0.001)および8カ月後(中央値=1;P=0.001)において維持されたことから、rAAV.sFlt-1の、長期にわたる持続的な治療効果が示唆される。
(実施例11)
レーザー誘導型脈絡膜血管新生のサルモデルについての有効性研究
5匹のサルの一方の眼にrAAV.sFlt-1を注射し、他方の眼にrAAV.gfpを注射した。サルのうちの1匹の右眼では、網膜下注射は奏効せず、したがって、この動物をさらなる査定にかけなかった。40~100μlのrAAV懸濁液の網膜下注射により網膜を持ち上げ、色素上皮と光受容体層との間にベクターを収容するブレブを、限局性の様式で創出した。このブレブは、24~48時間以内に自己補正された。注射針穿通点における、網膜色素上皮に対する微小な撹乱を除き、他の網膜の異常は、追跡期間(注射後3~17カ月)にわたり観察されなかった。他の異常または有害事象も観察されず、いかなる時点においても、手術と関連する網膜剥離は観察されなかった。
レーザー誘導型脈絡膜血管新生のサルモデルについての有効性研究
5匹のサルの一方の眼にrAAV.sFlt-1を注射し、他方の眼にrAAV.gfpを注射した。サルのうちの1匹の右眼では、網膜下注射は奏効せず、したがって、この動物をさらなる査定にかけなかった。40~100μlのrAAV懸濁液の網膜下注射により網膜を持ち上げ、色素上皮と光受容体層との間にベクターを収容するブレブを、限局性の様式で創出した。このブレブは、24~48時間以内に自己補正された。注射針穿通点における、網膜色素上皮に対する微小な撹乱を除き、他の網膜の異常は、追跡期間(注射後3~17カ月)にわたり観察されなかった。他の異常または有害事象も観察されず、いかなる時点においても、手術と関連する網膜剥離は観察されなかった。
次いで、rAAVsFlt-1の長期にわたる治療有効性を評価するため、4匹の注射されたサルを、ベクターによる処置の16カ月後において、強いレーザー光凝固にかけた。各眼において、レーザーを使用して、8カ所の病変を誘導し、次いで、レーザー処置の2および4週間後に、眼を脈絡膜血管新生についてモニタリングした。レーザー光凝固の後、4匹中3匹のサルだけが解析可能であり、したがって、3匹の動物について、有効性データを回収した。rAAVsFlt-1で処置された3例のサルの眼のうちのいずれも、脈絡膜血管新生関連病変を発症せず、弱いフルオレセイン染色だけが観察されたことから、漏出/血管新生は最小限であることが指し示される。対照ベクターで処置された、全ての反対側の眼は、脈絡膜血管新生関連病変を発症した。3匹の動物についての有効性データを表5に示す。
サルの網膜機能は、網膜電図写真により評価した。注射された眼および注射されなかった反対側の眼の応答に由来する振幅および陰的時間を計算し、注射前と、注射後の異なる時点とで比較した。結果は、rAAV.sFlt-1、組換えsFLT-1タンパク質、またはrAAV.gfpの注射が、サルの網膜機能に対していかなる有害作用も及ぼさないことを示した。
サルの網膜機能は、網膜電図写真により評価した。注射された眼および注射されなかった反対側の眼の応答に由来する振幅および陰的時間を計算し、注射前と、注射後の異なる時点とで比較した。結果は、rAAV.sFlt-1、組換えsFLT-1タンパク質、またはrAAV.gfpの注射が、サルの網膜機能に対していかなる有害作用も及ぼさないことを示した。
(実施例12)
滲出型AMDの処置における標準的ケアは、組換え抗VEGFタンパク質の、4~8週間ごとの高頻度の眼内注射に関与する。rAAV構築物は、滲出型AMDを処置するための、強力な(Kd≒10pM)、自然発生の抗VEGFタンパク質である、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFlt-1)のために開発された。rAAV.sFlt-1は、UNC Vector Core Human Application Laboratoryにおいて、FDAおよびICHによるガイドラインに従い産生した。rAAV.sFlt-1の安全性および有効性についての、8例の患者による対照研究を行った。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
滲出型AMDの処置における標準的ケアは、組換え抗VEGFタンパク質の、4~8週間ごとの高頻度の眼内注射に関与する。rAAV構築物は、滲出型AMDを処置するための、強力な(Kd≒10pM)、自然発生の抗VEGFタンパク質である、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFlt-1)のために開発された。rAAV.sFlt-1は、UNC Vector Core Human Application Laboratoryにおいて、FDAおよびICHによるガイドラインに従い産生した。rAAV.sFlt-1の安全性および有効性についての、8例の患者による対照研究を行った。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
適格性基準
研究に適格な年齢:65歳以上
研究に適格な性別:男女
健常ボランティアの受け入れ:なし
研究に適格な年齢:65歳以上
研究に適格な性別:男女
健常ボランティアの受け入れ:なし
組入れ基準:
・年齢が65歳以上であること;
・AMDに続発する中心窩下CNVを有し、他方の眼における最高の補正視力が、20/80~20/400以上であること;
・被験眼のフルオレセイン血管造影図が、漏出する中心窩下脈絡膜新生血管性病変の証拠を示さなければならないこと;
・抗VEGFの硝子体内注射の候補者でなければならないこと;
・病変全体の大きさが、黄斑光凝固研究(Macular Photocoagulation Study)による円板面積で12を超えてはならないこと;
・過去に光力学療法またはレーザーによる網膜の処置を施されていないこと;
・インフォームドコンセントを提供することが可能なこと;
・参加者が、登録の時点において、臨床的に許容可能な検査室パラメータおよびECGを示すこと;ならびに
・追跡来院を含むプロトコール要件を順守することが可能なこと。
・年齢が65歳以上であること;
・AMDに続発する中心窩下CNVを有し、他方の眼における最高の補正視力が、20/80~20/400以上であること;
・被験眼のフルオレセイン血管造影図が、漏出する中心窩下脈絡膜新生血管性病変の証拠を示さなければならないこと;
・抗VEGFの硝子体内注射の候補者でなければならないこと;
・病変全体の大きさが、黄斑光凝固研究(Macular Photocoagulation Study)による円板面積で12を超えてはならないこと;
・過去に光力学療法またはレーザーによる網膜の処置を施されていないこと;
・インフォームドコンセントを提供することが可能なこと;
・参加者が、登録の時点において、臨床的に許容可能な検査室パラメータおよびECGを示すこと;ならびに
・追跡来院を含むプロトコール要件を順守することが可能なこと。
除外基準:
・肝臓酵素>正常の上限の2倍であること;
・アデノウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、もしくはC型肝炎ウイルス、またはHIVウイルスを含む任意の種類の活性感染の臨床的証拠があること;
・被験眼/対照眼において、AMDのための、抗VEGF注射を除く、任意の先行する処置が施されていること;
・網膜色素上皮内に裂傷があること;
・広範な黄斑下瘢痕組織が見られること;
・糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞症など、中心窩下CNV、AMD以外の著明な網膜疾患を有すること;
・眼の萎縮または白内障など、著明な非網膜疾患を有すること;
・フルオレセインに対するアレルギーが既知であること;
・プレドニゾロン、他の抗炎症性ステロイド剤、または免疫抑制薬を現在使用していること。アスピリンなどの非ステロイド薬が許容されていること;
・治験責任医師の所見で、研究への参加のために参加者を危険にさらしうるか、または研究の結果もしくは研究に参加する参加者の能力に影響を及ぼしうる、他の任意の著明な疾患または障害を有すること;
・過去12週間以内に、被験生成物を伴う別の研究に参加したことがある参加者であること;および
・ペニシリン感受性があること。
・肝臓酵素>正常の上限の2倍であること;
・アデノウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、もしくはC型肝炎ウイルス、またはHIVウイルスを含む任意の種類の活性感染の臨床的証拠があること;
・被験眼/対照眼において、AMDのための、抗VEGF注射を除く、任意の先行する処置が施されていること;
・網膜色素上皮内に裂傷があること;
・広範な黄斑下瘢痕組織が見られること;
・糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞症など、中心窩下CNV、AMD以外の著明な網膜疾患を有すること;
・眼の萎縮または白内障など、著明な非網膜疾患を有すること;
・フルオレセインに対するアレルギーが既知であること;
・プレドニゾロン、他の抗炎症性ステロイド剤、または免疫抑制薬を現在使用していること。アスピリンなどの非ステロイド薬が許容されていること;
・治験責任医師の所見で、研究への参加のために参加者を危険にさらしうるか、または研究の結果もしくは研究に参加する参加者の能力に影響を及ぼしうる、他の任意の著明な疾患または障害を有すること;
・過去12週間以内に、被験生成物を伴う別の研究に参加したことがある参加者であること;および
・ペニシリン感受性があること。
投与手順:rAAV.sFlt-1を含有する医薬組成物を、網膜下注射に適切な状況下にある被験対象へと、以下の手順:
1.ドレーピングの前に、対象の眼周囲の皮膚および眼瞼縁辺部および睫毛を、5%のポビドンヨウ素で清浄化し;
2.滅菌全身用ドレープをかけた後で、さらに眼用ドレープをかけ;
3.眼瞼鏡を挿入し、睫毛を視野から遠ざけ、視野が眼用ドレープで保護されるように、眼瞼鏡が眼瞼の下にうまく配置されていることを確認し;
4.23Gまたは25Gの硝子体切除術用ポートを3つ挿入し;
5.生理食塩水注入部を第1のポートへと接続し;
6.光ファイバーを第2のポートへと挿入し;
7.36G~41Gの網膜下カニューレを薬物シリンジへと、第3のポート内のマイクロコネクターを介して接続し;
8.顕微鏡制御下で、100マイクロリットルを網膜下に注射し;
9.注射後、器具およびポートを引き抜き;
10.クロラムフェニコール軟膏を適用し;
11.滅菌単回使用容器からの1%のアトロピン滴下剤を、滴下し;
12.眼用パッドおよび眼用シールドを適用する
に従い投与した。
1.ドレーピングの前に、対象の眼周囲の皮膚および眼瞼縁辺部および睫毛を、5%のポビドンヨウ素で清浄化し;
2.滅菌全身用ドレープをかけた後で、さらに眼用ドレープをかけ;
3.眼瞼鏡を挿入し、睫毛を視野から遠ざけ、視野が眼用ドレープで保護されるように、眼瞼鏡が眼瞼の下にうまく配置されていることを確認し;
4.23Gまたは25Gの硝子体切除術用ポートを3つ挿入し;
5.生理食塩水注入部を第1のポートへと接続し;
6.光ファイバーを第2のポートへと挿入し;
7.36G~41Gの網膜下カニューレを薬物シリンジへと、第3のポート内のマイクロコネクターを介して接続し;
8.顕微鏡制御下で、100マイクロリットルを網膜下に注射し;
9.注射後、器具およびポートを引き抜き;
10.クロラムフェニコール軟膏を適用し;
11.滅菌単回使用容器からの1%のアトロピン滴下剤を、滴下し;
12.眼用パッドおよび眼用シールドを適用する
に従い投与した。
ここでは、rAAV.sFlt-1研究の結果についてまとめる。8例の登録対象(平均年齢:77歳)全ては、活性の中心窩下脈絡膜血管新生を有し、視力が20/40~20/400であり、1~25回の間のラニビズマブの硝子体内注射をあらかじめ施されていた。患者は、対照群および2つの被験群である3つの群へと無作為に分配した。全ての患者には、研究の1日目および30日目に、ラニビズマブの硝子体内注射を施した。7日目に、100ulの容量中に1×1010のrAAV.sFlt-1ベクターゲノムを、網膜下注射を介して、第1の被験群へと投与し、100ulの容量中に1×1011のrAAV.sFlt-1ベクターゲノムを、網膜下注射を介して、第2の被験群へと投与した。被験群内の患者6例全てにおいて、網膜下流体のブレブは、4時間以内に消失した。24時間後、硝子体中の空気の大半は吸収され、網膜の注射部位だけが依然として目視可能であった。1例の患者が、手順と関連する軽度の出血を発症したが、これは視覚に影響を及ぼさなかった。予測される通り、硝子体切除術後において、好中球カウントの一過性の増大が見られたが、これは、注射の14日後までに正常へと戻った。ベクター配列は、注射の1日後において、1例の対象の涙液中で見出されたが、これは、30日目までにクリアランスされた。これまでに、この単回の発生以外に、AAV2は、対象の血液、唾液、または尿試料のうちのいずれにおいても、qPCRまたはELISAにより検出されなかった。自然発生のsFLT-1タンパク質のバックグラウンドレベルは、尿中、血清中、および唾液中で大きなベースラインのばらつきを示したが、処置後においては増大しなかった。硝子体中のsFLT-1レベルはまた、対象間でも変化した(975~2085pg/ml)。血液生化学、全血球計算、およびT細胞応答は、ベースラインと比較して、いかなる有意な変化も伴わずに維持された。rAAV.sFlt-1の網膜下注射は、2カ月間にわたる連続的眼科検査により評価される、臨床的に重大な網膜毒性を示さなかった。表面、前部、または硝子体における炎症性徴候は、対象のうちのいずれにおいても存在しなかった。患者のうちのいずれにおいても、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠は見られなかった。初期処置および救済処置の両方である、抗VEGF処置の概要を、表6において、各患者についてまとめる。
被験群内の患者のうちのいずれも、60日目において救済処置を要求せず、低用量被験群における患者の大半も、90日目、120日目、150日目、180日目、または210日目、または270日目、または365日目(1年後)において要求した救済処置が0回であったことは注目に値する。対照の患者は、複数回の救済処置を要求した。これらの結果は、予測外であり、遺伝子治療の有望性を、滲出型AMDを患う老齢患者の大型のコホートへと拡張する。一般に、VEGF阻害剤タンパク質または他の抗VEGF剤の硝子体内注射など、現行の抗VEGF療法で処置された患者は、30、60、または90日間のうちに、さらなる注射を要求するであろう。
被験対象または患者におけるsFLT-1の最高発現レベルには、rAAV.sFLT-1の網膜下投与の6~8週間後に到達する。このいわゆる「ランプアップ」期間において、少なくとも1、2、または3回にわたる抗VEGF剤の硝子体内注射を、15~45日間隔で注射し、好ましくは約30日間隔で注射して、疾患の進行を防止する。抗VEGF剤の1回目の硝子体内注射は、rAAV.sFlt-1の投与の1~30日間の間前に投与し、好ましくはrAAV.sFlt-1の投与の5~10日間の間前に投与して、硝子体内注射された抗VEGF剤(LucentisもしくはAvastinもしくはEyleaまたは他のsFLT以外の薬剤)の吸収を可能とすることが好ましい。この1回目の硝子体内注射を、rAAV.sFLTの網膜下投与前の24時間未満に投与する場合、この1回目の硝子体内注射は、網膜下注射手順時に、硝子体からウォッシュアウトすることができるが、抗VEGF剤の濃度を治療濃度未満とし、疾患の進行をもたらす場合がある。
ランプ期間が完了した後、それらのAMDを処置するか、またはそれらのAMDの進行を防止するのに十分なsFLT-1を発現させる患者は、さらなる硝子体内抗VEGF注射を必要としない場合もあるが、それらの注射は、医師のケアの下で依然としてなされることが予期される。患者は、光コヒーレンストモグラフィーによる中心点網膜厚の測定値の増大などの客観的基準に基づく必要ベースで、モニタリングおよび処置される。
本研究では、対照群および被験群の両方における患者を、活性の脈絡膜血管新生の徴候について約1カ月ごとのベースで査定し、以下の基準:
・対象の前回の来院(網膜性原因に帰することが可能な)からの、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字の減退が>10であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ETDRSによる文字の減少が>5であること;
・OCT時において、感覚網膜下、網膜色素上皮(RPE)下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること;
・FAを介するCNVからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置した。
・対象の前回の来院(網膜性原因に帰することが可能な)からの、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字の減退が>10であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ETDRSによる文字の減少が>5であること;
・OCT時において、感覚網膜下、網膜色素上皮(RPE)下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること;
・FAを介するCNVからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置した。
(実施例13)
光コヒーレンストモグラフィー(OCT)
スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー(SD-OCT:spectral domain optical coherence tomography)は、承認されている装置(Heidelberg Spectralis(登録商標)SD-OCT)、ならびに患者の中心点網膜厚および網膜内の流体漏出をモニタリングする標準的な技法を使用して実施した。
光コヒーレンストモグラフィー(OCT)
スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー(SD-OCT:spectral domain optical coherence tomography)は、承認されている装置(Heidelberg Spectralis(登録商標)SD-OCT)、ならびに患者の中心点網膜厚および網膜内の流体漏出をモニタリングする標準的な技法を使用して実施した。
光コヒーレンストモグラフィー(OCT:optical coherence tomography)とは、超音波およびMRIと同様に、非接触型の医用造影技術である。OCTでは、反射光を使用して、眼の詳細な断面画像および三次元画像をもたらす。SPECTRALIS(登録商標)SD-OCTは、あるスペクトルにわたる複数波長の反射光を同時に測定するので、スペクトルドメインの名称がある。走査の速度および回数の増大は、高解像度および疾患を観察する可能性の増大へと変換される。滲出型AMDを伴う患者では、新たな網膜内流体の検出または臨床的に重大な網膜厚の増大を、SD-OCTにより検出することができる(Adhiら、Curr Opin Ophthalmol.、2013年5月、
24巻(3号)、213~21頁; Malamosら、Invest Ophthalmol Vis Sci.、20
09年10月、50巻(10号)、4926~33頁)。AMDを伴う患者におけるこれらの症状の検出は、LucentisまたはEyleaなどの抗VEGF療法による処置を正当化する疾患の進行を指し示す。
24巻(3号)、213~21頁; Malamosら、Invest Ophthalmol Vis Sci.、20
09年10月、50巻(10号)、4926~33頁)。AMDを伴う患者におけるこれらの症状の検出は、LucentisまたはEyleaなどの抗VEGF療法による処置を正当化する疾患の進行を指し示す。
研究中の各対象の網膜の健康およびAMD進行の症状は、SD-OCTを介してモニタリングした。各回約6mmの長さにわたる、黄斑内の少なくとも6回にわたる放射状の走査を行い、各回の指定された来院時にOCT画像/走査を回収した。SD-OCT画像は、盲検化された解読者を介して、網膜内流体の存在について査定し、網膜中心厚は、Heidelberg Heyex SD-OCTソフトウェアを使用して測定した。各回の来院の8例の患者についての網膜中心厚の結果を、下記の表7に示す。
表7に示す通り、全ての投薬コホート内の対象の平均網膜中心厚は、プロトコールにより要求される、研究の開始時における抗VEGFタンパク質(Lucentis)の硝子体内注射を投与した後で減少した。予測される通り、対照群における患者の網膜中心厚は増大し始め、抗VEGFタンパク質を投与して30~90日間以内に、SD-OCT画像上で流体を見ることができる。予測外のことに、低用量群および高用量群における対象の網膜中心厚は一般に、rAAV.sFlt-1により良好にコントロールされ、経時的に増大することはない。新たな網膜内流体は、低用量群対象または高用量群対象の網膜内では生じない。これは、例えば、図24におけるOCTにより示される。12カ月後において、rAAV.sFlt-1で処置された対象の網膜中心厚は、rAAV.sFlt-1を含む医薬組成物を投与した12カ月以内に、50ミクロンを超えて、または100ミクロンを超えて、または250ミクロンを超えて増大することがなかった。ベースラインに照らして比較した場合に、rAAV.sFlt-1で処置されたヒト対象の網膜中心厚は、50ミクロン、または場合によっては100ミクロン、または場合によっては200ミクロン減少した。この減少は、sFlt-1を投与した8週間以内に観察され、3カ月間、6カ月間、9カ月間、および12カ月間にわたり維持された。この結果は、驚くべきことであり、ヒト対象におけるAMDおよび眼の血管新生の臨床処置では知られていなかった。より一般に、抗VEGFタンパク質または他のVEGF阻害剤阻害剤のさらなる投与を伴わなければ、30日間、60日間、90日間、または180日間にわたる初期抗VEGF処置を伴っても、網膜内流体および網膜中心厚の増大が観察されるであろう。
蛍光眼底血管造影法(FA)
標準的な技法を使用して、FAを実施した。被験眼の推移画像を撮影する。被験眼および非被験眼の中期および後期の画像を撮影するが、FAは、各回の指定された来院時に得る。
標準的な技法を使用して、FAを実施した。被験眼の推移画像を撮影する。被験眼および非被験眼の中期および後期の画像を撮影するが、FAは、各回の指定された来院時に得る。
生体内分布研究
涙液、血漿、尿、および唾液による試料から単離されたベクターゲノムを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR:polymerase chain reaction)で増幅することにより、ベクターの播種を探索した。ベクターおよびsFLT-1の生体内分布は、血漿中、涙液中、および唾液中のsFLT-1およびAAV2カプシドについてのELISAにより探索した。
涙液、血漿、尿、および唾液による試料から単離されたベクターゲノムを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR:polymerase chain reaction)で増幅することにより、ベクターの播種を探索した。ベクターおよびsFLT-1の生体内分布は、血漿中、涙液中、および唾液中のsFLT-1およびAAV2カプシドについてのELISAにより探索した。
DNAの抽出
試料(100~300ul)を、Sample Collection Cards(Qiagen、Valencia、CA)または滅菌フォームチップアプリケーターへとピペティングした。製造元のプロトコールに従い、DNAを、各試料から抽出した。精製されたDNAを、50ulの溶出緩衝液中に溶解した。存在するDNAの量は、分光光度計により決定した。
試料(100~300ul)を、Sample Collection Cards(Qiagen、Valencia、CA)または滅菌フォームチップアプリケーターへとピペティングした。製造元のプロトコールに従い、DNAを、各試料から抽出した。精製されたDNAを、50ulの溶出緩衝液中に溶解した。存在するDNAの量は、分光光度計により決定した。
リアルタイムPCRによるrAAV.sFlt-1の検出
TaqMan(登録商標)Gene Expression Assays(Applied Biosystems、U.S.A.)を使用して、ゲノムDNA試料(0.5~1μg)を、AAV.sFlt-1のベクターの存在についてスクリーニングした。アッセイは、AAV2配列とsFLT-1配列との間の断片を増幅する非標識PCRプライマーの対、ならびにFAM(商標)色素標識またはVIC(登録商標)色素標識を伴うTaqMan(登録商標)プローブ、ならびに5’端における副溝結合剤部分および3’端における非蛍光消光剤色素からなる。サイクリング条件は、50℃で2分間にわたって1ホールドおよび95℃で20秒間にわたって別のホールド、続いて95℃で3秒間および60℃で30秒間を45サイクルであった。
TaqMan(登録商標)Gene Expression Assays(Applied Biosystems、U.S.A.)を使用して、ゲノムDNA試料(0.5~1μg)を、AAV.sFlt-1のベクターの存在についてスクリーニングした。アッセイは、AAV2配列とsFLT-1配列との間の断片を増幅する非標識PCRプライマーの対、ならびにFAM(商標)色素標識またはVIC(登録商標)色素標識を伴うTaqMan(登録商標)プローブ、ならびに5’端における副溝結合剤部分および3’端における非蛍光消光剤色素からなる。サイクリング条件は、50℃で2分間にわたって1ホールドおよび95℃で20秒間にわたって別のホールド、続いて95℃で3秒間および60℃で30秒間を45サイクルであった。
rAAV.sFlt-1断片について陽性の試料をさらに調べ、存在するrAAV.sFlt-1の遺伝子コピー数を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により定量化した。IQ5 Bio-RadリアルタイムPCRシステム(Bio-Rad、Hercules、California、USA)を使用して、0.5~1.0ugの間の抽出されたDNAを、Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG(Invitrogen、Carlsbad、California、USA)および0.5uMの各プライマーを含有する20ulの反応ミックス中で増幅した。標的配列を含有するプラスミドDNAでスパイクした同様の試料のセットを、スパイクされた試料と並行して用意した。使用されたプライマー対(フォワード:CACTAGTCCAGTGTGGTGGA;リバース:AGCCAGGAGACAACCACTTC)は、Primer3 Output(Whitehead Institute、MA、USA)を一助として、ベクターcDNAに由来する領域を、Rotorgene(Corbett)を使用して、sFLT-1遺伝子へと増幅するようにデザインした。使用したサイクリング条件は、以下の通りであった。50.0℃で2分間、95.0℃で2分間、および95.0℃で20秒間、60.0℃で20秒間および72.0℃で20秒間による3ステップサイクル60回であった。検量線は、同じ標的ベクター配列を有するプラスミドDNA(pSSV.sFlt-1)の10倍希釈液による各試行において作成した。各試料を三連で解析した。
sFlt-1タンパク質濃度のELISAによる定量化
血漿中、涙液中、および唾液中に存在するsFLT-1の濃度は、サンドイッチイムノアッセイ法に基づくQuantikine ELISAキット(R&D Systems、Minneapolis、MN)を使用して、ELISAにより定量的に測定した。試料(100ul)を、VEGF R1/sFLT-1に特異的なモノクローナル抗体でコーティングした96ウェルプレートへと添加し、2時間にわたりインキュベートさせた。結合していないsFLT-1は、緩衝液で洗浄することにより除去した。酵素に連結したVEGF R1/sFLT-1に特異的なポリクローナル抗体とのインキュベーションの後、過剰量の抗体-酵素コンジュゲートを洗い落とし、次いで、試料を基質溶液と共にインキュベートした。酵素により触媒される色原体の形成を、450nmにおける可視光の吸光度を測定することにより定量化した。試料中のsFLT-1の濃度(pg/mL単位の)は、組換えヒトsFLT-1でプロットした検量線を使用して、吸光度値から計算した。
血漿中、涙液中、および唾液中に存在するsFLT-1の濃度は、サンドイッチイムノアッセイ法に基づくQuantikine ELISAキット(R&D Systems、Minneapolis、MN)を使用して、ELISAにより定量的に測定した。試料(100ul)を、VEGF R1/sFLT-1に特異的なモノクローナル抗体でコーティングした96ウェルプレートへと添加し、2時間にわたりインキュベートさせた。結合していないsFLT-1は、緩衝液で洗浄することにより除去した。酵素に連結したVEGF R1/sFLT-1に特異的なポリクローナル抗体とのインキュベーションの後、過剰量の抗体-酵素コンジュゲートを洗い落とし、次いで、試料を基質溶液と共にインキュベートした。酵素により触媒される色原体の形成を、450nmにおける可視光の吸光度を測定することにより定量化した。試料中のsFLT-1の濃度(pg/mL単位の)は、組換えヒトsFLT-1でプロットした検量線を使用して、吸光度値から計算した。
ELISAによるAAV2の検出
AAV2 Titration ELISA Kit(American Research Products,Inc.、Belmont、Massachusetts、USA)を使用して、血漿中、涙液中、尿中、および唾液中のAAV2カプシドの存在を解析した。このキットは、サンドイッチELISA法に基づき、アセンブルされたAAV粒子上のコンフォメーションエピトープに特異的なマウスモノクローナル抗体を使用する。このモノクローナル抗体は、マイクロプレートストリップ上にコーティングし、AAV粒子を検体から捕捉するのに使用する。捕捉されたAAV粒子は、2ステップで検出した。まず、ビオチンでコンジュゲートした、AAVに対するモノクローナル抗体を、免疫複合体へと結合させた。第2のステップでは、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートを、ビオチン分子と反応させる。基質溶液を添加する結果として、特異的に結合したウイルス粒子に応じた色彩反応がもたらされる。吸光度は、450nmにおける光度法により測定した。提供されたキットの対照は、空のカプシドのAAV粒子調製物を含有し、粒子力価が未知の試料を定量的に決定することを可能とした。試料(100ul)を、プレートへと添加し、アッセイは、製造元のプロトコールに従い実行するものとした。
AAV2 Titration ELISA Kit(American Research Products,Inc.、Belmont、Massachusetts、USA)を使用して、血漿中、涙液中、尿中、および唾液中のAAV2カプシドの存在を解析した。このキットは、サンドイッチELISA法に基づき、アセンブルされたAAV粒子上のコンフォメーションエピトープに特異的なマウスモノクローナル抗体を使用する。このモノクローナル抗体は、マイクロプレートストリップ上にコーティングし、AAV粒子を検体から捕捉するのに使用する。捕捉されたAAV粒子は、2ステップで検出した。まず、ビオチンでコンジュゲートした、AAVに対するモノクローナル抗体を、免疫複合体へと結合させた。第2のステップでは、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートを、ビオチン分子と反応させる。基質溶液を添加する結果として、特異的に結合したウイルス粒子に応じた色彩反応がもたらされる。吸光度は、450nmにおける光度法により測定した。提供されたキットの対照は、空のカプシドのAAV粒子調製物を含有し、粒子力価が未知の試料を定量的に決定することを可能とした。試料(100ul)を、プレートへと添加し、アッセイは、製造元のプロトコールに従い実行するものとした。
AAV-2中和抗体の検出
血漿を、HEK293細胞への、AAV2.gfpの形質導入を遮断する能力についてアッセイした。患者の血漿を、マルチウェルプレート内の正常マウス血清中で系列希釈した。AAV2.gfpを、各ウェルへと添加し、HEK293細胞へと三連で添加する前に、プレートを、37℃で1時間にわたりインキュベートした。中和抗体力価は、AAV2-gfpによる形質導入の50%の阻害を結果としてもたらす血漿希釈率として表した。最大gfp活性は、正常マウス血清中で希釈されたベクターで表し、最大阻害は、正常マウス血清中の培地だけで表した。各対象に由来するベースラインの血漿を、各術後試料と共にアッセイした。48時間後における被験ウェル内の、293T細胞への、AAV2.gfpの形質導入による緑色細胞をカウントし、ベースラインの血清試料中の緑色細胞の数と比較した。
血漿を、HEK293細胞への、AAV2.gfpの形質導入を遮断する能力についてアッセイした。患者の血漿を、マルチウェルプレート内の正常マウス血清中で系列希釈した。AAV2.gfpを、各ウェルへと添加し、HEK293細胞へと三連で添加する前に、プレートを、37℃で1時間にわたりインキュベートした。中和抗体力価は、AAV2-gfpによる形質導入の50%の阻害を結果としてもたらす血漿希釈率として表した。最大gfp活性は、正常マウス血清中で希釈されたベクターで表し、最大阻害は、正常マウス血清中の培地だけで表した。各対象に由来するベースラインの血漿を、各術後試料と共にアッセイした。48時間後における被験ウェル内の、293T細胞への、AAV2.gfpの形質導入による緑色細胞をカウントし、ベースラインの血清試料中の緑色細胞の数と比較した。
抗AAV2抗体の検出
AAV2カプシドに対する血漿中抗体を検出するために、タンパク質結合増強型ELISAプレートを、109vg/mlのAAV2(Vector Core Facility、North Carolina)で、4℃で一晩にわたりコーティングした。プレートを、37℃で2時間にわたりブロッキングし、次いで、系列希釈した抗AAV2モノクローナル抗体(Industries International、Concord、MA)、または患者の血漿の1:50希釈液、1:100希釈液、1:200希釈液、もしくは1:400希釈液と共に、4℃で一晩にわたりインキュベートした。プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)でコンジュゲートした抗ヒトIgと共に、37℃で2時間にわたりインキュベートし、次いで、テトラメチルベンジジン(TMP)基質および過酸化水素(H2O2)と共にインキュベートした。反応は、リン酸(H3PO4)により停止させ、プレートリーダー上450nmで読み取った。抗AAV2抗体の力価は、並行して決定した市販抗体の検量線に基づき計算した。各値は、三連で決定した。
AAV2カプシドに対する血漿中抗体を検出するために、タンパク質結合増強型ELISAプレートを、109vg/mlのAAV2(Vector Core Facility、North Carolina)で、4℃で一晩にわたりコーティングした。プレートを、37℃で2時間にわたりブロッキングし、次いで、系列希釈した抗AAV2モノクローナル抗体(Industries International、Concord、MA)、または患者の血漿の1:50希釈液、1:100希釈液、1:200希釈液、もしくは1:400希釈液と共に、4℃で一晩にわたりインキュベートした。プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)でコンジュゲートした抗ヒトIgと共に、37℃で2時間にわたりインキュベートし、次いで、テトラメチルベンジジン(TMP)基質および過酸化水素(H2O2)と共にインキュベートした。反応は、リン酸(H3PO4)により停止させ、プレートリーダー上450nmで読み取った。抗AAV2抗体の力価は、並行して決定した市販抗体の検量線に基づき計算した。各値は、三連で決定した。
地図状萎縮
ヒト被験対象を、それらの処置された眼および処置されていない眼における地図状萎縮の徴候について、標準的な技法に従い検討した。rAAV.sFlt-1で処置された患者における地図状萎縮の増大は、3カ月、6カ月、9カ月、または12カ月後には観察されなかった。処置は、処置された眼における地図状萎縮の進行を、最大で15カ月、18カ月、24カ月、36カ月、5年間および10年間にわたり停止させうることが仮定される。
ヒト被験対象を、それらの処置された眼および処置されていない眼における地図状萎縮の徴候について、標準的な技法に従い検討した。rAAV.sFlt-1で処置された患者における地図状萎縮の増大は、3カ月、6カ月、9カ月、または12カ月後には観察されなかった。処置は、処置された眼における地図状萎縮の進行を、最大で15カ月、18カ月、24カ月、36カ月、5年間および10年間にわたり停止させうることが仮定される。
(実施例14)
被験滲出型AMDおよび脈絡膜血管新生を処置するための、rAAV.sFlt-1の安全性および有効性をさらに調べるために、40例のさらなる対象を、対照臨床研究に登録した。実施例12の場合の通り、rAAV.sFlt-1は、UNC Vector Core Human Application Laboratoryにおいて、FDAおよびICHによるガイドラインに従い産生した。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
被験滲出型AMDおよび脈絡膜血管新生を処置するための、rAAV.sFlt-1の安全性および有効性をさらに調べるために、40例のさらなる対象を、対照臨床研究に登録した。実施例12の場合の通り、rAAV.sFlt-1は、UNC Vector Core Human Application Laboratoryにおいて、FDAおよびICHによるガイドラインに従い産生した。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
適格性:
研究に適格な年齢:55歳以上
研究に適格な性別:男女
健常ボランティアの受け入れ:なし
研究に適格な年齢:55歳以上
研究に適格な性別:男女
健常ボランティアの受け入れ:なし
組入れ基準:
・年齢が55歳以上であること;
・AMDに続発する中心窩下CNVを有し、被験眼における最高の補正視力が、20/30~20/400であり、他方の眼における最高の補正視力が、20/200以上であること;
・被験眼のフルオレセイン血管造影図が、漏出する中心窩下脈絡膜新生血管性病変の証拠を示さなければならないこと;または脈絡膜血管新生が、現在抗VEGF療法による能動的な管理下にあること;
・抗VEGFの硝子体内注射の候補者でなければならないこと;
・病変全体の大きさが、黄斑光凝固研究による円板面積で12を超えてはならないこと;
・過去に光力学療法またはレーザーによる網膜の処置を施されていないこと;
・インフォームドコンセントを提供することが可能なこと;
・参加者が、登録の時点において、臨床的に許容可能な検査室パラメータおよびECGを示すこと;ならびに
・追跡来院を含むプロトコール要件を順守することが可能なこと。
・年齢が55歳以上であること;
・AMDに続発する中心窩下CNVを有し、被験眼における最高の補正視力が、20/30~20/400であり、他方の眼における最高の補正視力が、20/200以上であること;
・被験眼のフルオレセイン血管造影図が、漏出する中心窩下脈絡膜新生血管性病変の証拠を示さなければならないこと;または脈絡膜血管新生が、現在抗VEGF療法による能動的な管理下にあること;
・抗VEGFの硝子体内注射の候補者でなければならないこと;
・病変全体の大きさが、黄斑光凝固研究による円板面積で12を超えてはならないこと;
・過去に光力学療法またはレーザーによる網膜の処置を施されていないこと;
・インフォームドコンセントを提供することが可能なこと;
・参加者が、登録の時点において、臨床的に許容可能な検査室パラメータおよびECGを示すこと;ならびに
・追跡来院を含むプロトコール要件を順守することが可能なこと。
除外基準:
・肝臓酵素>正常の上限の2倍であること;
・アデノウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、もしくはC型肝炎ウイルス、またはHIVウイルスを含む任意の種類の活性感染の臨床的証拠があること;あるいはB型肝炎またはC型肝炎の履歴が記録されていること;
・被験眼/対照眼において、AMDのための、抗VEGF注射を除く、任意の先行する処置が施されていること;
・網膜色素上皮内に裂傷があること;
・治験責任医師により決定される、被験眼内に広範な中心窩下瘢痕化、広範な地図状萎縮、または網膜下血液の増粘が見られること;
・被験眼における視覚を損ないうる、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞症など、中心窩下CNV、AMD以外の著明な網膜疾患を有すること;
・被験眼における眼の萎縮または著明な白内障などであり、視力に影響を及ぼす中心角膜の瘢痕化、視野欠損を伴う緑内障、または任意の測定可能なブドウ膜炎を含む、著明な非網膜疾患を有すること;
・フルオレセインに対するアレルギーが既知であること;
・プレドニゾロン、他の抗炎症性ステロイド剤、または免疫抑制薬を現在使用していること。吸入用ステロイドおよびアスピリンなどの非ステロイド薬が許容されていること;
・治験責任医師の所見で、研究への参加のために参加者を危険にさらしうるか、または研究の結果もしくは研究に参加する参加者の能力に影響を及ぼしうる、他の任意の著明な疾患または障害を有すること;
・過去12週間以内に、被験生成物を伴う別の研究に参加したことがある参加者であること;および
・参加者の医療記録により確認される、ペニシリン感受性があること。
・肝臓酵素>正常の上限の2倍であること;
・アデノウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、もしくはC型肝炎ウイルス、またはHIVウイルスを含む任意の種類の活性感染の臨床的証拠があること;あるいはB型肝炎またはC型肝炎の履歴が記録されていること;
・被験眼/対照眼において、AMDのための、抗VEGF注射を除く、任意の先行する処置が施されていること;
・網膜色素上皮内に裂傷があること;
・治験責任医師により決定される、被験眼内に広範な中心窩下瘢痕化、広範な地図状萎縮、または網膜下血液の増粘が見られること;
・被験眼における視覚を損ないうる、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞症など、中心窩下CNV、AMD以外の著明な網膜疾患を有すること;
・被験眼における眼の萎縮または著明な白内障などであり、視力に影響を及ぼす中心角膜の瘢痕化、視野欠損を伴う緑内障、または任意の測定可能なブドウ膜炎を含む、著明な非網膜疾患を有すること;
・フルオレセインに対するアレルギーが既知であること;
・プレドニゾロン、他の抗炎症性ステロイド剤、または免疫抑制薬を現在使用していること。吸入用ステロイドおよびアスピリンなどの非ステロイド薬が許容されていること;
・治験責任医師の所見で、研究への参加のために参加者を危険にさらしうるか、または研究の結果もしくは研究に参加する参加者の能力に影響を及ぼしうる、他の任意の著明な疾患または障害を有すること;
・過去12週間以内に、被験生成物を伴う別の研究に参加したことがある参加者であること;および
・参加者の医療記録により確認される、ペニシリン感受性があること。
初期登録対象は、活性の中心窩下脈絡膜血管新生を有し、被験眼における視力が20/30~20/400であり、0~25回の間のラニビズマブの硝子体内注射をあらかじめ施されていた。患者は、14例の対照患者および26例の被験患者の全てを登録するまで、対照群または被験群へと無作為に分配した。全ての患者には、研究の1日目および30日目に、ラニビズマブの硝子体内注射を施した。7日目に、100ulの容量中に1×1011のrAAV.sFlt-1ベクターゲノムを、網膜下注射を介して、被験群へと投与する。
実施例12における研究の場合の通り、被験対象または患者におけるsFLT-1の最高発現レベルには、rAAV.sFLT-1の網膜下投与の6~8週間後に到達した。このいわゆる「ランプアップ」期間において、少なくとも1、2、または3回にわたる抗VEGF剤の硝子体内注射を、15~45日間隔で注射し、好ましくは約30日間隔で注射して、疾患の進行を防止した。抗VEGF剤の1回目の硝子体内注射は、rAAV.sFLT-1の投与の1~30日間の間前に投与し、好ましくはrAAV.sFLT-1の投与の5~10日間の間前に投与して、硝子体内注射された抗VEGF剤(LucentisもしくはAvastinもしくはEyleaまたは他のsFLT以外の薬剤)の吸収を可能とすることが好ましい。この1回目の硝子体内注射を、rAAV.sFLTの網膜下投与前の24時間未満に投与する場合、この1回目の硝子体内注射は、網膜下注射手順時に、硝子体からウォッシュアウトすることができるが、抗VEGF剤の濃度を治療濃度未満とし、疾患の進行をもたらす場合がある。
ランプ期間が完了した後、それらのAMDまたは脈絡膜血管新生の他の症状を処置するか、またはそれらのAMDまたは脈絡膜血管新生の他の症状の進行を防止するのに十分なsFLT-1を発現させる患者は、さらなる硝子体内抗VEGF注射を必要としなかったが、それらの注射は、医師のケアの下で依然としてなされることが予期される。
本実施例で再掲される本研究では、対照群および被験群における患者を、活性の脈絡膜血管新生の徴候について約1カ月ごとのベースで査定し、以下の基準:
・対象の前回の来院(網膜性原因に帰することが可能な)からの、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字の減退が>10であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ETDRSによる文字の減少が>5であること;
・OCT時において、感覚網膜下、網膜色素上皮(RPE)下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること;
・FAを介するCNVからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置した。
・対象の前回の来院(網膜性原因に帰することが可能な)からの、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字の減退が>10であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ETDRSによる文字の減少が>5であること;
・OCT時において、感覚網膜下、網膜色素上皮(RPE)下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること;
・FAを介するCNVからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置した。
(実施例15)
眼の新生血管性の疾患または加齢黄斑変性(AMD)を防止または予防するためのrAAV.sFlt-1の安全性および有効性を調べるために、40例(150)の患者によるさらなる対照臨床研究を行う。rAAV(bv).sFlt-1は、Lonza Houston,Inc.(Houston、Texas)において、FDAおよびICHによるガイドラインに従い作製する。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
眼の新生血管性の疾患または加齢黄斑変性(AMD)を防止または予防するためのrAAV.sFlt-1の安全性および有効性を調べるために、40例(150)の患者によるさらなる対照臨床研究を行う。rAAV(bv).sFlt-1は、Lonza Houston,Inc.(Houston、Texas)において、FDAおよびICHによるガイドラインに従い作製する。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
適格性:
・研究に適格な年齢:50歳以上
・研究に適格な性別:男女
・健常ボランティアの受け入れ:あり
・研究に適格な年齢:50歳以上
・研究に適格な性別:男女
・健常ボランティアの受け入れ:あり
組入れ基準:
・非滲出性AMD(AREDS基準による、類型2、3、または4;群4には、末期以外のAMDを伴う眼を組み入れる)を伴う患者;「滲出型」または「萎縮型」として分類されるAMDを伴う患者を組み入れること;
・年齢が50~90歳の間であること;
・試験の要件を理解および遵守することが可能であること;
・視力>0.4であること。
・非滲出性AMD(AREDS基準による、類型2、3、または4;群4には、末期以外のAMDを伴う眼を組み入れる)を伴う患者;「滲出型」または「萎縮型」として分類されるAMDを伴う患者を組み入れること;
・年齢が50~90歳の間であること;
・試験の要件を理解および遵守することが可能であること;
・視力>0.4であること。
除外基準:
・現在眼科の臨床試験に登録されていること;
・眼がAMD以外の黄斑障害または脈絡膜障害を併発し、AMDの性状不詳の徴候を伴うこと;
・眼が、被験眼において、活性の網膜下血管新生(SRNV)またはレーザー光凝固を要求するCNV病変を伴う滲出性AMDの診断を伴うこと;
・対象が、視覚減退を引き起こす著明な水晶体の混濁を伴うこと;
・対象が、弱視を伴うこと;
・対象が、視神経疾患(神経障害、萎縮、乳頭浮腫)、25mmHgを超える眼内圧、3つ以上の緑内障薬、緑内障と符合する0.8以上のC/Dおよび視野により規定される不安定性緑内障;網膜硝子体手術の履歴、変性近視、活性の後部眼内炎症性疾患、外用の眼用ステロイド薬の慢性使用、血管増殖性網膜症(AMD以外の)、裂孔原性網膜剥離、および遺伝性黄斑ジストロフィーを伴うこと;
・対象が、デマンド型のペースメーカーまたはてんかんを伴うこと;
・対象が、コントロール不良の高血圧症(90以上の拡張期血圧および150以上の収縮期血圧として規定される)を伴うこと;
・対象が、脳血管疾患の最近の履歴(前年以内の)を伴うこと;
・一過性脳虚血発作(TIA)または脳血管発作(CVA)を呈すること;
・対象が、AIDSの履歴を伴うこと;
・対象が、被験眼において、試験への登録前3カ月以内に眼内手術を受けていること;
・患者が、来院検査スケジュールに従うことを望まないこと。
・現在眼科の臨床試験に登録されていること;
・眼がAMD以外の黄斑障害または脈絡膜障害を併発し、AMDの性状不詳の徴候を伴うこと;
・眼が、被験眼において、活性の網膜下血管新生(SRNV)またはレーザー光凝固を要求するCNV病変を伴う滲出性AMDの診断を伴うこと;
・対象が、視覚減退を引き起こす著明な水晶体の混濁を伴うこと;
・対象が、弱視を伴うこと;
・対象が、視神経疾患(神経障害、萎縮、乳頭浮腫)、25mmHgを超える眼内圧、3つ以上の緑内障薬、緑内障と符合する0.8以上のC/Dおよび視野により規定される不安定性緑内障;網膜硝子体手術の履歴、変性近視、活性の後部眼内炎症性疾患、外用の眼用ステロイド薬の慢性使用、血管増殖性網膜症(AMD以外の)、裂孔原性網膜剥離、および遺伝性黄斑ジストロフィーを伴うこと;
・対象が、デマンド型のペースメーカーまたはてんかんを伴うこと;
・対象が、コントロール不良の高血圧症(90以上の拡張期血圧および150以上の収縮期血圧として規定される)を伴うこと;
・対象が、脳血管疾患の最近の履歴(前年以内の)を伴うこと;
・一過性脳虚血発作(TIA)または脳血管発作(CVA)を呈すること;
・対象が、AIDSの履歴を伴うこと;
・対象が、被験眼において、試験への登録前3カ月以内に眼内手術を受けていること;
・患者が、来院検査スケジュールに従うことを望まないこと。
主要転帰尺度:
MPODおよび多局所網膜電図[時間枠:1年後][安全性問題としての指定:あり]
MPODおよび多局所網膜電図[時間枠:1年後][安全性問題としての指定:あり]
(実施例16)
眼の新生血管性の疾患または糖尿病性黄斑浮腫(DME)を処置するためのrAAV.sFlt-1の安全性および有効性を調べるために、40例の患者によるさらなる対照臨床研究を行う。rAAV(bv).sFlt-1は、Lonza Houston,Inc.(Houston、Texas)において、FDAおよびICHによるガイドラインに従い産生する。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
眼の新生血管性の疾患または糖尿病性黄斑浮腫(DME)を処置するためのrAAV.sFlt-1の安全性および有効性を調べるために、40例の患者によるさらなる対照臨床研究を行う。rAAV(bv).sFlt-1は、Lonza Houston,Inc.(Houston、Texas)において、FDAおよびICHによるガイドラインに従い産生する。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
適格性:
・研究に適格な年齢:18歳以上
・研究に適格な性別:男女
・健常ボランティアの受け入れ:なし
・研究に適格な年齢:18歳以上
・研究に適格な性別:男女
・健常ボランティアの受け入れ:なし
一般的な組入れ基準:
・以下の基準を満たす場合、対象は適格である。
・書面によるインフォームドコンセント、ならびに、米国内の施設では、医療保険の携行性と責任に関する法律(Health Insurance Portability and Accountability Act)(HIPAA)による認証であり
、他の諸国では、国内の法律により適用可能な認証である認証を提供する意思があること;
・糖尿病(1型または2型)を有すること;
・糖尿病(diabetes mellitus)(DME)に続発する網膜の肥厚であって、光コヒーレンストモグラフィー(OCT)上で評価される、中心サブフィールド内の黄斑中心厚が≧275μmであり、中心窩の中心に及ぶ肥厚が見られること;
・4メートルの初期検査距離でETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)プロトコールを使用する、被験眼における最高矯正視力(BCVA)スコアが、20/40~20/320の近似スネレン等価視力であること;
・視覚の減退が主にDMEの結果であり、他の原因の結果ではないと決定されていること;
・全てのスケジュールされた来院および評価に戻る能力(治験責任医師の所見による)および意思があること。
・以下の基準を満たす場合、対象は適格である。
・書面によるインフォームドコンセント、ならびに、米国内の施設では、医療保険の携行性と責任に関する法律(Health Insurance Portability and Accountability Act)(HIPAA)による認証であり
、他の諸国では、国内の法律により適用可能な認証である認証を提供する意思があること;
・糖尿病(1型または2型)を有すること;
・糖尿病(diabetes mellitus)(DME)に続発する網膜の肥厚であって、光コヒーレンストモグラフィー(OCT)上で評価される、中心サブフィールド内の黄斑中心厚が≧275μmであり、中心窩の中心に及ぶ肥厚が見られること;
・4メートルの初期検査距離でETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)プロトコールを使用する、被験眼における最高矯正視力(BCVA)スコアが、20/40~20/320の近似スネレン等価視力であること;
・視覚の減退が主にDMEの結果であり、他の原因の結果ではないと決定されていること;
・全てのスケジュールされた来院および評価に戻る能力(治験責任医師の所見による)および意思があること。
除外基準:
・被験眼において、硝子体網膜手術の履歴があること;
・スクリーニングの3カ月以内に、被験眼において、汎網膜光凝固(PRP)または黄斑レーザー光凝固を施されていること;
・被験眼において、不活性の消褪したPDRを除く、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)を有すること;
・被験眼において、虹彩血管新生、硝子体出血、牽引性網膜剥離、または黄斑に及ぶ網膜前線維症を有すること;
・被験眼に硝子体黄斑牽引または網膜上膜を有すること;
・被験眼において眼炎症(炎症の痕跡またはそれを上回る炎症を含む)を有すること;
・いずれかの眼に特発性ブドウ膜炎または自己免疫性ブドウ膜炎の履歴があること;
・被験眼において、黄斑の中心に対する構造的損傷であって、黄斑浮腫の消失後において、VAの改善を妨げる可能性が高く、網膜色素上皮(RPE)の萎縮、網膜下線維症、または組織化されて硬化した浸出物プラークを含む構造的損傷が見られること;
・被験眼における眼障害であって、研究結果の解釈を混同させる可能性があり、任意の原因(例えば、加齢黄斑変性(AMD)、眼ヒストプラズマ症、または病理学的近視)による、網膜静脈閉塞症、網膜剥離、黄斑円孔、または脈絡膜血管新生(CNV)を含む眼障害を有すること;
・0日目をさかのぼる3カ月以内に、被験眼において、白内障手術を施されているか、過去2カ月以内に、イットリウム-アルミニウム-ガーネット(YAG)レーザー嚢切開を施されているか、または90日以内に他の任意の眼内手術を施されていること;
・被験眼において、コントロール不良の緑内障を有するか、またはかつて濾過手術を施されていること;
・コントロール不良の血圧が見られること;
・0日目以前の3カ月以内に脳血管発作または心筋梗塞の履歴があること;
・コントロール不良の糖尿病を有すること;
・透析または腎移植を要求する腎不全を有すること;
・他の疾患、代謝機能不全、身体検査所見、または臨床検査室所見の履歴であって、被験薬の使用を禁忌とするか、研究結果の解釈に影響を及ぼしうるか、または対象を処置による合併症に由来する大きな危険にさらす疾患または状態の合理的な疑いをもたらす履歴があること。
・被験眼において、硝子体網膜手術の履歴があること;
・スクリーニングの3カ月以内に、被験眼において、汎網膜光凝固(PRP)または黄斑レーザー光凝固を施されていること;
・被験眼において、不活性の消褪したPDRを除く、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)を有すること;
・被験眼において、虹彩血管新生、硝子体出血、牽引性網膜剥離、または黄斑に及ぶ網膜前線維症を有すること;
・被験眼に硝子体黄斑牽引または網膜上膜を有すること;
・被験眼において眼炎症(炎症の痕跡またはそれを上回る炎症を含む)を有すること;
・いずれかの眼に特発性ブドウ膜炎または自己免疫性ブドウ膜炎の履歴があること;
・被験眼において、黄斑の中心に対する構造的損傷であって、黄斑浮腫の消失後において、VAの改善を妨げる可能性が高く、網膜色素上皮(RPE)の萎縮、網膜下線維症、または組織化されて硬化した浸出物プラークを含む構造的損傷が見られること;
・被験眼における眼障害であって、研究結果の解釈を混同させる可能性があり、任意の原因(例えば、加齢黄斑変性(AMD)、眼ヒストプラズマ症、または病理学的近視)による、網膜静脈閉塞症、網膜剥離、黄斑円孔、または脈絡膜血管新生(CNV)を含む眼障害を有すること;
・0日目をさかのぼる3カ月以内に、被験眼において、白内障手術を施されているか、過去2カ月以内に、イットリウム-アルミニウム-ガーネット(YAG)レーザー嚢切開を施されているか、または90日以内に他の任意の眼内手術を施されていること;
・被験眼において、コントロール不良の緑内障を有するか、またはかつて濾過手術を施されていること;
・コントロール不良の血圧が見られること;
・0日目以前の3カ月以内に脳血管発作または心筋梗塞の履歴があること;
・コントロール不良の糖尿病を有すること;
・透析または腎移植を要求する腎不全を有すること;
・他の疾患、代謝機能不全、身体検査所見、または臨床検査室所見の履歴であって、被験薬の使用を禁忌とするか、研究結果の解釈に影響を及ぼしうるか、または対象を処置による合併症に由来する大きな危険にさらす疾患または状態の合理的な疑いをもたらす履歴があること。
主要転帰尺度:
・12カ月後において、それらの最高矯正視力(BCVA)スコアがベースラインから≧15文字上がる患者の百分率[時間枠:ベースライン~12カ月後][安全性問題としての指定:なし]
・12カ月後において、それらの最高矯正視力(BCVA)スコアがベースラインから≧15文字上がる患者の百分率[時間枠:ベースライン~12カ月後][安全性問題としての指定:なし]
副次的転帰尺度:
・12、24、および36カ月後における、最高矯正視力(BCVA)スコアのベースラインからの平均変化
・12、24、および36カ月後において、スネレン等価視力による視力(VA)が20/40以上である患者の百分率
・12、24、および36カ月後における、SD-OCTにより測定される中心窩厚の、ベースラインからの平均変化
・併用される抗VEGF処置(例えば、Lucentis、Avastin、Macugen、またはEyelea)の頻度の低減[安全性問題としての指定:なし]
・12、24、および36カ月後における、最高矯正視力(BCVA)スコアのベースラインからの平均変化
・12、24、および36カ月後において、スネレン等価視力による視力(VA)が20/40以上である患者の百分率
・12、24、および36カ月後における、SD-OCTにより測定される中心窩厚の、ベースラインからの平均変化
・併用される抗VEGF処置(例えば、Lucentis、Avastin、Macugen、またはEyelea)の頻度の低減[安全性問題としての指定:なし]
初期登録対象は、DMEを有し、被験眼における視力が20/40~20/320であり、0~25回の間のラニビズマブまたはアフリベルセプトの硝子体内注射をあらかじめ施されているであろう。患者は、14例の対照患者ならびに13例の低用量被験患者および13例の高用量被験患者の全てを登録するまで、対照群または2つの被験群へと無作為に分配する。全ての患者には、研究の1日目および30日目に、ラニビズマブの硝子体内注射を施した。7日目に、100ulの容量中に1×1010または1×1011のrAAV(bv).sFlt-1ベクターゲノムを、網膜下注射を介して、被験群へと投与する。
実施例12における研究の場合の通り、被験対象または患者におけるsFLT-1の最高発現レベルには、rAAV(bv).sFLT-1の網膜下投与の6~8週間後に到達する。このいわゆる「ランプアップ」期間において、少なくとも1、2、または3回にわたる抗VEGF剤の硝子体内注射を、15~45日間隔で注射し、好ましくは約30日間隔で注射して、疾患の進行を防止する。抗VEGF剤の1回目の硝子体内注射は、rAAV(bv).sFLT-1の投与の1~30日間の間前に投与し、好ましくはrAAV(bv).sFLT-1の投与の5~10日間の間前に投与して、硝子体内注射された抗VEGF剤(LucentisもしくはAvastinもしくはEyleaまたは他のsFLT以外の薬剤)の吸収を可能とすることが好ましい。この1回目の硝子体内注射を、rAAV(bv).sFLTの網膜下投与前の24時間未満に投与する場合、この1回目の硝子体内注射は、網膜下注射手順時に、硝子体からウォッシュアウトすることができるが、抗VEGF剤の濃度を治療濃度未満とし、疾患の進行をもたらす場合がある。
ランプ期間が完了した後、それらのDMEを処置するか、またはそれらのDMEの進行を防止するのに十分なsFLT-1を発現させる患者は、さらなる硝子体内抗VEGF注射を必要としない場合もあるが、それらの注射は、医師のケアの下で依然としてなされることが予期される。
本実施例で再掲される本研究では、対照群および被験群における患者を、活性のDMEまたは新たなDMEおよび血管新生の徴候について約1カ月ごとのベースで査定し、以下の基準:
・対象の前回の来院(網膜性原因に帰することが可能な)からの、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字の減退が>10であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ETDRSによる文字の減少が>5であること;
・OCT時において、感覚網膜下、網膜色素上皮(RPE)下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること;
・FAを介するCNVからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置する。
・対象の前回の来院(網膜性原因に帰することが可能な)からの、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字の減退が>10であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ETDRSによる文字の減少が>5であること;
・OCT時において、感覚網膜下、網膜色素上皮(RPE)下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること;
・FAを介するCNVからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置する。
(実施例17)
眼の新生血管性の疾患または網膜静脈閉塞症(RVO:Retinal Vein Occlusion)を処置するためのrAAV.sFlt-1の安全性および有効性を調べるために、40例の患者によるさらなる対照臨床研究を行う。臨床研究は、網膜中心静脈閉塞症(CRVO:Central Retinal Vein Occlusion)を伴う患者を含む1つのコホートおよび網膜静脈分枝閉塞症(BRVO:Branched Retinal Vein Occlusion)を伴う患者を含む1つのコホートである、2つのコホートの患者により実施する。実施例15の場合の通り、rAAV(bv).sFlt-1は、Lonza Houston,Inc.(Houston、Texas)において、FDAおよびICHによるガイドラインに従い産生する。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
眼の新生血管性の疾患または網膜静脈閉塞症(RVO:Retinal Vein Occlusion)を処置するためのrAAV.sFlt-1の安全性および有効性を調べるために、40例の患者によるさらなる対照臨床研究を行う。臨床研究は、網膜中心静脈閉塞症(CRVO:Central Retinal Vein Occlusion)を伴う患者を含む1つのコホートおよび網膜静脈分枝閉塞症(BRVO:Branched Retinal Vein Occlusion)を伴う患者を含む1つのコホートである、2つのコホートの患者により実施する。実施例15の場合の通り、rAAV(bv).sFlt-1は、Lonza Houston,Inc.(Houston、Texas)において、FDAおよびICHによるガイドラインに従い産生する。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
組入れ基準:
・9カ月間以内にわたり、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)に続発する、中心部に及ぶ黄斑浮腫、またはBRVOに続発する、分枝に及ぶ黄斑浮腫であって、光コヒーレンストモグラフィー(OCT)上で評価される、平均中心サブフィールド厚が≧250μmである黄斑浮腫が見られること;
・≧18歳の成人であること;
・ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)による、被験眼における最高矯正視力(BCVA)が、20/40~20/320(73~24文字)であること。
・9カ月間以内にわたり、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)に続発する、中心部に及ぶ黄斑浮腫、またはBRVOに続発する、分枝に及ぶ黄斑浮腫であって、光コヒーレンストモグラフィー(OCT)上で評価される、平均中心サブフィールド厚が≧250μmである黄斑浮腫が見られること;
・≧18歳の成人であること;
・ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)による、被験眼における最高矯正視力(BCVA)が、20/40~20/320(73~24文字)であること。
除外基準:
・被験眼において、任意の先行する、抗VEGF剤による処置(ペガプタニブナトリウム、酢酸アネコルタブ、ベバシズマブ、ラニビズマブなど)または既往の全身性抗血管形成薬の投与が施されていること;
・被験眼において、先行する汎網膜レーザー光凝固または黄斑レーザー光凝固が施されていること;
・診断日からのCRVOの疾患持続期間が>9カ月間であること;診断日からのBRVOの疾患持続期間が>9カ月間であること;
・被験眼において、眼内コルチコステロイドがかつて使用されたか、または1日目の3カ月以内前に、被験眼において、眼周囲コルチコステロイドが使用されていること;
・被験眼または対の眼において、黄斑に及ぶ、虹彩血管新生、硝子体出血、牽引性網膜剥離、または網膜前線維症を有すること。
・被験眼において、任意の先行する、抗VEGF剤による処置(ペガプタニブナトリウム、酢酸アネコルタブ、ベバシズマブ、ラニビズマブなど)または既往の全身性抗血管形成薬の投与が施されていること;
・被験眼において、先行する汎網膜レーザー光凝固または黄斑レーザー光凝固が施されていること;
・診断日からのCRVOの疾患持続期間が>9カ月間であること;診断日からのBRVOの疾患持続期間が>9カ月間であること;
・被験眼において、眼内コルチコステロイドがかつて使用されたか、または1日目の3カ月以内前に、被験眼において、眼周囲コルチコステロイドが使用されていること;
・被験眼または対の眼において、黄斑に及ぶ、虹彩血管新生、硝子体出血、牽引性網膜剥離、または網膜前線維症を有すること。
主要転帰尺度:
・6カ月後における最高矯正視力(BCVA)スコアのベースラインからの平均変化[時間枠:ベースラインおよび6カ月後][安全性問題としての指定:なし]
・被験眼における、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)で規定された研究ベースライン範囲による、最高矯正視力(BCVA)文字スコアが、73~24(=20/40~20/320の視力)であること(高スコアは、より良好な機能を表す;分子=(視覚を維持した参加者の数×100);分母=解析される参加者の数)
・6カ月後における最高矯正視力(BCVA)スコアのベースラインからの平均変化[時間枠:ベースラインおよび6カ月後][安全性問題としての指定:なし]
・被験眼における、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)で規定された研究ベースライン範囲による、最高矯正視力(BCVA)文字スコアが、73~24(=20/40~20/320の視力)であること(高スコアは、より良好な機能を表す;分子=(視覚を維持した参加者の数×100);分母=解析される参加者の数)
副次的転帰尺度:
・6カ月後において、ベースラインと比較したBCVAスコアが≧15文字上がる患者の百分率
・6カ月後における、中心網膜厚(CRT)のベースラインからの平均変化[時間枠:ベースラインおよび6カ月後][安全性問題としての指定:なし]
・併用される抗VEGF処置(例えば、Lucentis、Avastin、Macugen、またはEyelea)の頻度の低減[安全性問題としての指定:なし]
・6カ月後において、ベースラインと比較したBCVAスコアが≧15文字上がる患者の百分率
・6カ月後における、中心網膜厚(CRT)のベースラインからの平均変化[時間枠:ベースラインおよび6カ月後][安全性問題としての指定:なし]
・併用される抗VEGF処置(例えば、Lucentis、Avastin、Macugen、またはEyelea)の頻度の低減[安全性問題としての指定:なし]
初期登録対象は、CRVOまたはBRVOを有し、被験眼における視力が20/40~20/320であり、0~25回の間のラニビズマブの硝子体内注射をあらかじめ施されているであろう。患者は、14例の対照患者ならびに13例の低用量被験患者および13例の高用量被験患者の全てを登録するまで、対照群または2つの被験群へと無作為に分配する。全ての患者には、研究の1日目および30日目に、ラニビズマブの硝子体内注射を施した。7日目に、100ulの容量中に1×1010または1×1011のrAAV(bv).sFlt-1ベクターゲノムを、網膜下注射を介して、被験群へと投与する。
実施例14における研究の場合の通り、被験対象または患者におけるsFLT-1の最高発現レベルには、rAAV(bv).sFLT-1の網膜下投与の6~8週間後に到達する。実施例14で記載した通り、ランプ期間が完了した後、それらのCRVOまたはBRVOを処置するか、またはそれらのCRVOまたはBRVOの進行を防止するのに十分なsFLT-1を発現させる患者は、さらなる硝子体内抗VEGF注射を必要としない場合もあるが、それらの注射は、医師のケアの下で依然としてなされることが予期される。
本実施例で再掲される本研究では、対照群および被験群における患者を、活性の網膜静脈閉塞症または新たな網膜静脈閉塞症および血管新生の徴候について約1カ月ごとのベースで査定し、以下の基準:
・対象の前回の来院(網膜性原因に帰することが可能な)からの、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字の減退が>10であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ETDRSによる文字の減少が>5であること;
・OCT時において、感覚網膜下、網膜色素上皮(RPE)下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること;
・FAを介するCNVからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置する。
・対象の前回の来院(網膜性原因に帰することが可能な)からの、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字の減退が>10であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ETDRSによる文字の減少が>5であること;
・OCT時において、感覚網膜下、網膜色素上皮(RPE)下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること;
・FAを介するCNVからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置する。
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- 本明細書に記載の使用のための組成物および同様のもの。
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