ES2897508T3 - Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso que comprende: (a) una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12; y (b) un ácido nucleico heterólogo, en donde el VAAr exhibe al menos 5 veces mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por el VAA2.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas

Referencia cruzada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la patente provisional de Estados Unidos núm. 61/829,735, presentada el 31 de mayo de 2013.

Declaración sobre la investigación patrocinada federalmente

Esta invención se realizó con apoyo gubernamental con la Subvención número HL081527 otorgada por el Instituto Nacional de Salud. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.

Introducción

Los vectores de suministro de genes basados en virus adenoasociados (VAA) han demostrado ser prometedores tanto en modelos preclínicos de enfermedades como recientemente en ensayos clínicos en humanos para varias enfermedades diana. Los vectores basados en VAA son extremadamente seguros porque el VAA de tipo salvaje no es patógeno y no tiene asociación etiológica con ninguna enfermedad conocida. Además, VAA ofrece la capacidad para un suministro de genes altamente eficiente y la expresión transgénica sostenida en numerosos tejidos, incluidos el hígado, los músculos, los pulmones, la retina y el cerebro.

El VAA es un virus de ADN monocatenario que contiene dos marcos de lectura abiertos, rep y cap. El primer gen codifica cuatro proteínas necesarias para la replicación del genoma (Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40), y el segundo expresa tres proteínas estructurales (VP1-3) que se ensamblan para formar la cápside viral. Como su nombre lo indica, el VAA depende de la presencia de un virus auxiliar, tal como un adenovirus o un herpesvirus, para la replicación activa. En ausencia de un auxiliar, establece un estado latente en el que su genoma se mantiene episómicamente o se integra en el cromosoma del huésped. Se han identificado múltiples serotipos de VAA de primates homólogos y numerosos tipos de primates no humanos. El VAA2 es el mejor caracterizado como vehículo de suministro de genes.

En 2010, había 75 ensayos clínicos en curso que usaban VAA como vehículo de suministro de genes. Sin embargo, la alta prevalencia de anticuerpos neutralizantes anticápside, debido a la exposición generalizada a numerosas variantes y serotipos de VAA dentro de la población humana, disminuye la eficacia de la terapia génica de los VAA. Esta inmunidad preexistente, así como también el desarrollo posterior de inmunidad debido a la administración de vectores, pueden impedir la implementación más amplia de la terapia génica de VAA. Por ejemplo, hasta la fecha, los VAA han tenido más éxito en estudios clínicos que involucran el suministro a regiones inmunológicas privilegiadas.

Un análisis reciente indicó que la prevalencia de anticuerpos IgG contra VAA en humanos fue más alta para VAA2 (72 %) y VAA1 (67 %), pero los anticuerpos contra VAA9 (47 %), VAA6 (46 %), VAA5 (40 %) y VAA8 (38 %) también estaban presentes en una gran porción de la población estudiada. Varios estudios encontraron que la inmunidad humoral a la cápside de los VAA durante la terapia génica podría prevenirse reduciendo la cantidad de partículas de VAAr suministradas. Desafortunadamente, la administración de bajas dosis de vector conduce a una baja transducción y, por tanto, a una baja expresión génica terapéutica.

Existe una necesidad en la técnica del desarrollo de nuevas variantes de VAA que sean resistentes a la neutralización por anticuerpos contra VAA.

Literatura

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Resumen

La presente descripción proporciona viriones de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infecciosos que comprenden una proteína de la cápside variante y un ácido nucleico heterólogo. La presente descripción proporciona además las proteínas de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variantes (y/o un ácido nucleico que codifica las proteínas de la cápside de ^vA^a variantes), que confieren a un virión de VAAr infeccioso una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos. La presente descripción proporciona además células huésped que comprenden un virión de VAAr infeccioso y/o un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de VAA variante objeto. La presente descripción proporciona además bibliotecas de los viriones, proteínas de la cápside, ácidos nucleicos y/o células huésped anteriores; donde la proteína de la cápside de VAA variante de al menos un miembro de la biblioteca comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos sustitución de un aminoácido con relación a la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33.

La presente descripción proporciona además métodos para suministrar un ácido nucleico heterólogo a una célula diana donde la célula diana se pone en contacto con un virión de VAAr infeccioso objeto. La presente descripción proporciona además métodos para suministrar un producto génico a un individuo, los métodos generalmente implican la administración de una cantidad efectiva de un virión de VAAr objeto a un individuo que lo necesite. También se proporcionan en la presente descripción composiciones y estuches para practicar los métodos objeto.

Características

Las características de la presente descripción incluyen un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso que comprende (a) una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 11-13 y 26-33; y (b) un ácido nucleico heterólogo. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 11-13 y 26-33. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA variante comprende la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 11-13 y 26-33.

Las características de la presente descripción incluyen un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso que comprende (a) una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, e incluye las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, D472N, N551S, I698V y L735Q con relación a la SEQ ID NO: 2; y (b) un ácido nucleico heterólogo. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA variante comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10. En algunos casos, el VAAr exhibe una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por el VAA2 (serotipo 2 del VAA de tipo salvaje). En algunos casos, el VAAr exhibe al menos aproximadamente 1,5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 30 veces, etc.) mayor resistencia a anticuerpos neutralizantes de VAA humanos que la resistencia exhibida por VAA2. En algunos casos, el VAAr exhibe un aumento de la transducción de las células de mamíferos en presencia de anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la transducción de células de mamíferos exhibidas por el serotipo 2 de VAA de tipo salvaje (VAA2). En algunos casos, las células de mamíferos son células hepáticas, células pancreáticas, células del músculo esquelético, células del músculo cardíaco, fibroblastos, células de la retina, células de la articulación sinovial, células pulmonares, células T, neuronas, células gliales, células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas, células progenitoras hematopoyéticas, células madre neurales, células progenitoras neurales, células madre de la cresta neural, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas (células iPS), células madre mesenquimales, células madre mesodérmicas, células madre hepáticas, células madre pancreáticas, células progenitoras pancreáticas, células madre musculares, células madre retinianas y similares), células endoteliales o células cancerosas. En algunos casos, el ácido nucleico heterólogo comprende un agente de interferencia de ARN. En algunos casos, el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.

Las características de la presente descripción incluyen un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en una de las SEQ ID NO: 11-13 y 26-33. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA variante codificada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 11-13 y 26-33. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA variante codificada comprende la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 11-13 y 26-33.

Las características de la presente descripción incluyen un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10, e incluye las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, D472N, N551S, I698V y L735Q con relación a la SEQ ID NO: 2.

En algunos casos, la proteína de la cápside del VAA variante codificada (codificada por un ácido nucleico aislado) confiere a un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes humano del VAA en comparación con la resistencia exhibida por el VAA2 (VAA de tipo salvaje serotipo 2). En algunos casos, el aumento de la resistencia es al menos aproximadamente 1,5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 30 veces, etc.) mayor que la resistencia exhibida por VAA2. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA variante codificada (codificada por un ácido nucleico aislado) confiere a un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso un aumento de la transducción de células de mamíferos en presencia de anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la transducción exhibida por VAA2.

Las características de la presente descripción incluyen una célula huésped aislada que comprende un ácido nucleico objeto como se describió anteriormente. En algunos casos, la célula huésped se transfecta de forma estable con el ácido nucleico. En algunos casos, la célula huésped comprende además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína rep de VAA. En algunos casos, la célula huésped comprende además un vector VAA recombinante.

Las características de la presente descripción incluyen un método para suministrar un ácido nucleico heterólogo a una célula diana, que comprende poner en contacto la célula diana con un virión objeto (descrito anteriormente). En algunos casos, la célula diana es una célula hepática, una célula pancreática, una célula del músculo esquelético, una célula del músculo cardíaco, un fibroblasto, una célula retiniana, una célula de la articulación sinovial, una célula pulmonar, una célula T, una neurona, una célula glial, una célula madre (por ejemplo, una célula madre hematopoyética, una célula progenitora hematopoyética, una célula madre neural, una célula progenitora neural, una célula madre de la cresta neural, una célula madre embrionaria, una célula madre pluripotente inducida (célula iPS), una célula madre mesenquimatosa, una célula madre mesodérmica, una célula madre hepática, una célula madre pancreática, una célula progenitora pancreática, una célula madre muscular o una célula madre retiniana, y similares), una célula endotelial o una célula cancerosa. En algunos casos, la célula diana es in vitro. En algunos casos, la célula diana es in vivo.

Las características de la presente descripción incluyen un método para suministrar un producto génico a un individuo que lo necesite, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad efectiva de un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso objeto (descrito anteriormente). En algunos casos, el ácido nucleico heterólogo del virión VAAr comprende un agente de interferencia de ARN. En algunos casos, el ácido nucleico heterólogo del virión VAAr comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido. En algunos casos, la etapa de administración comprende el suministro indirecto del virión infeccioso VAAr. En algunos casos, la etapa de administración comprende el suministro directo del virión infeccioso VAAr.

Las características de la presente descripción incluyen una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 11-13 y 26­ 33. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 11-13 y 26-33. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA comprende la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 11-13 y 26-33.

Las características de la presente descripción incluyen una proteína de la cápside del virus adenoasociado (VAA) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10, e incluye las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, D472N, N551S, I698V y L735Q con relación a la SEQ ID NO: 2. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA variante comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA variante confiere a un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por VAA2. En algunos casos, la mayor resistencia es al menos aproximadamente 1,5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 30 veces, etc.) mayor que la resistencia exhibida por VAA2. En algunos casos, la proteína de la cápside de VAA variante confiere a un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso una transducción aumentada de células de mamífero en presencia de anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la transducción exhibida por VAA2.

Las características de la presente descripción incluyen una biblioteca que comprende al menos uno de: (i) dos o más viriones de VAAr infecciosos, cada uno de los cuales comprende una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante y un ácido nucleico heterólogo; (ii) dos o más ácidos nucleicos aislados, cada uno de los cuales comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de VAA variante; (iii) dos o más células huésped, cada una de las cuales comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de VAA variante; y (iv) dos o más proteínas de la cápside de VAA variantes; en donde la proteína de la cápside de VAA variante de al menos un miembro de la biblioteca comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos sustitución de un aminoácido con relación a la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33.

Las características de la presente descripción incluyen un método para generar e identificar un virión de VAAr infeccioso modificado que exhibe una propiedad alterada de infección con relación a un virión iniciador (parental) que comprende una proteína de la cápside iniciadora, el método comprendiendo: (a) generar proteínas de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variantes a partir de la proteína de la cápside de inicio, en donde la proteína de la cápside de inicio comprende la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33, y en donde cada proteína de la cápside de VAA variante comprende al menos una sustitución de aminoácido con relación a la proteína de la cápside de inicio; (b) generar viriones de VAA variantes, cada uno de los cuales comprende una proteína de la cápside de VAA variante generada en la etapa (a); y (c) ensayar viriones de VAA variantes generados en la etapa (b) para determinar la propiedad alterada de infección para identificar el virión de VAAr infeccioso modificado. En algunos casos, la generación de la biblioteca de proteínas de la cápside de VAA variantes comprende un método de mutagénesis seleccionado del grupo que consiste en: mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis de saturación, mutagénesis de intercambio de bucles, mutagénesis por mezcla de fragmentos y una combinación de los mismos. En algunos casos, la propiedad alterada de la infección es una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por el virión iniciador. En algunos casos, la propiedad alterada de la infección es un aumento de la transducción de células de mamífero en presencia de anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la transducción exhibida por el virión iniciador. En algunos casos, el virión de VAAr infeccioso modificado comprende una proteína de la cápside de VAA modificada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína de la cápside de inicio.

Las características de la presente descripción incluyen un método para generar una proteína de la cápside de VAA variante a partir de una proteína de la cápside de inicio, comprendiendo el método: someter un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cápside de inicio a un tipo de mutagénesis seleccionada del grupo que consiste en: mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis de saturación, mutagénesis de intercambio de bucles, mutagénesis de mezcla de fragmentos y una combinación de los mismos; en donde la proteína de la cápside de inicio comprende la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-B representan la evolución dirigida de VAA para mejorar la evasión de anticuerpos.

Las Figuras 2A-B representan los perfiles de neutralización de variantes de evasión de anticuerpos mediante el uso de IgIV humana.

Las Figuras 3A-C representan los perfiles de neutralización de variantes de evasión de anticuerpos mediante el uso de sueros humanos adquiridos de individuos que fueron excluidos de los ensayos clínicos de hemofilia B debido a la presencia de altos títulos de anticuerpos neutralizantes contra VAA.

Las Figuras 4A-B representan las secuencias de aminoácidos de clones de mutagénesis de saturación y mezcla/intercambio de bucle.

La Figura 5 demuestra el tropismo in vitro de variantes de VAA.

Las Figuras 6A-B muestran la localización y neutralización in vivo de nuevas variantes de VAA.

Las Figuras 7A-D demuestran la generación de evasores de anticuerpos humanos.

Las Figuras 8A-I representan la secuencia de la proteína de la cápside de la mezcla 100-1 (SEQ ID NO: 11) alineada con las secuencias de la proteína de la cápside de tipo salvaje de VAA1-9 (SEQ ID NO: 1-9).

Las Figuras 9A-I representan la secuencia de la proteína de la cápside de la mezcla 100-3 (SEQ ID NO: 12) alineada con las secuencias de la proteína de la cápside de tipo salvaje de VAA1-9 (SEQ ID NO: 1-9).

Las Figuras 10A-I representan la secuencia de la proteína de la cápside de la mezcla 100-7 (SEQ ID NO: 13) alineada con las secuencias de la proteína de la cápside de tipo salvaje de VAA1-9 (SEQ ID NO: 1-9).

La Figura 11 muestra los títulos de anticuerpos neutralizantes de los clones de la biblioteca y los serotipos parentales en sueros de ratón inmunizados.

Definiciones

El virus adenoasociado es un parvovirus no patógeno compuesto por un genoma de ADN monocatenario de 4,7 kb dentro de una cápside icosaédrica sin envoltura. "VAA" es una abreviatura de virus adenoasociado, y puede usarse para referirse al virus mismo o sus derivados. El genoma contiene tres marcos de lectura abiertos (ORF) flanqueados por repeticiones terminales invertidas (ITR) que funcionan como el origen viral de la señal de replicación y empaque. Los rep ORF codifican cuatro proteínas no estructurales que desempeñan funciones en la replicación viral, la regulación transcripcional, la integración específica del sitio y el ensamblaje del virión. Los cap ORF codifican tres proteínas estructurales (VP1-3) que se ensamblan para formar una cápside viral de 60 unidades. Finalmente, un ORF presente como un marco de lectura alternativo dentro del cap gen produce la proteína activadora de ensamblaje (AAP), una proteína viral que localiza las proteínas de la cápside de VAA en el nucléolo y funciona en el proceso de ensamblaje de la cápside.

Hay varios serotipos de origen natural y más de 100 variantes de VAA, cada uno de los cuales difiere en la secuencia de aminoácidos, particularmente dentro de las regiones hipervariables de las proteínas de la cápside y, por tanto, en sus propiedades de suministro de genes. No se ha asociado ninguna VAA con alguna enfermedad humana, lo que hace que el VAA recombinante sea atractivo para aplicaciones clínicas.

El término "VAA" como se usa en la presente cubre todos los subtipos y formas tanto naturales como recombinantes, excepto cuando se requiera de cualquier otra manera. El término "vAa " incluye VAA tipo 1 (VAA-1 o VAA1), VAA tipo 2 (VAA-2 o VAA2), VAA tipo 3 (VAA-3 o VAA3), VAA tipo 4 (VAA-4 o VAA4), VAA tipo 5 (VAA-5 o VAA5), VAA tipo 6 (VAA-6 o VAA6), VAA tipo 7 (VAA-7 o VAA7), VAA tipo 8 (VAA-8 o VAA8), VAA tipo 9 (VAA-9 o VAA9), VAA aviar, VAA bovino, VAA canino, VAA equino, VAA de primates, VAA de no primates y VAA ovino. Las "VAA de primates" se refiere a VAA que infecta primates, "VAA de no primates" se refiere a VAA que infectan a mamíferos no primates, "VAA bovino" se refiere a VAA que infecta a mamíferos bovinos, etc.

Se conocen en la técnica las secuencias genómicas de varios serotipos de VAA, así como también las secuencias de las repeticiones terminales nativas (TRs), proteínas Rep y subunidades de la cápside. Dichas secuencias pueden encontrarse en la literatura o en bases de datos públicas tales como GenBank. Ver, por ejemplo, los números de acceso del GenBank NC_002077.1 (VAA-1), AF063497.1 (VAA-1), NC_001401.2 (VAA-2), AF043303.1 (VAA-2), J01901.1 (VAA-2), U48704.1 (VAA-3), NC_001729.1 (VAA-3), NC_001829.1 (VAA-4), U89790.1 (VAA-4), NC_006152.1 (VAA-5), AF085716.1 (VAA-5), AF028704.1 (VAA-6), NC_006260.1 (VAA-7), AF513851.1 (VAA-7), AF513852.1 (VAA-8) NC_006261.1 (VAA-8), y AY530579.1 (VAA-9); para enseñar secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de VAA. Ver también, por ejemplo, Srivistava y otros (1983) J. Virology 45:555; Chiorini y otros (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini y otros. (1999) J.Virology 73:1309; Bantel-Schaal y otros (1999) J. Virology 73:939; Xiao y otros (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu y otros (1996) Virology 221:208; Shade y otros,(1986) J. Virol. 58:921; Gao y otros (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris y otros (2004) Virology 33:375-383; publicaciones de patentes internacionales WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; y la patente de Estados Unidos núm. 6,156,303.

Las secuencias de las proteínas cap (cápside) que existen de forma natural asociadas con los serotipos de VAA se conoces en la técnica, e incluyen: VAA1 (SEQ ID NO: 1), VAA2 (SEQ ID NO: 2), VAA3 (SEQ ID NO: 3), VAA4 (SEQ ID NO: 4), VAA5 (SEQ ID NO: 5), VAA6 (SEQ ID NO: 6), VAA7 (SEQ ID NO: 7), VAA8 (SEQ ID NO: 8) y VAA9 (SEQ ID NO: 9). El término "proteína de la cápside de VAA variante" es una proteína de la cápside de VAA que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una sustitución (que incluye deleción, inserción, etc.) con relación a una de las secuencias de proteína de la cápside de VAA que existen de forma natural establecidas en SEQ ID. NO: 1-9.

Un "virión de VAA" o "partícula viral de VAA" se refiere a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de VAA y un polinucleótido de VAA encapsulado.

"Recombinante", según se aplica a un polinucleótido, significa que el polinucleótido es el producto de varias combinaciones de etapas de clonación, restricción o ligación, y otros procedimientos que dan como resultado una construcción que es distinta de un polinucleótido que se encuentra en la naturaleza. Un virus recombinante es una partícula viral que comprende un polinucleótido recombinante. Los términos incluyen respectivamente réplicas de la construcción polinucleotídica original y la progenie de la construcción viral original.

Si un virión de VAA comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido diferente al genoma de VAA de tipo salvaje, por ejemplo, un transgén que se suministra a una célula diana, un agente de ARNi o un agente CRISPR que se suministrará a una célula diana, etc.), típicamente se lo conoce como un "virión de VAA recombinante (VAAr)" o una "partícula viral de VAAr". En general, el polinucleótido heterólogo está flanqueado por al menos una, y generalmente por dos, secuencias repetidas terminales invertidas (ITR) de VAA.

El término "vector de VAAr" abarca viriones de VAAr (es decir, partículas virales de VAAr) (por ejemplo, un virión de VAAr infeccioso), que por definición incluyen un polinucleótido de VAAr; y también abarca polinucleótidos que codifican VAAr (por ejemplo, un polinucleótido monocatenario que codifica VAAr (ss-VAAr); un polinucleótido bicatenario que codifica VAAr (ds-VAAr), por ejemplo, plásmidos que codifican VAAr; y similares).

"Empaquetado" se refiere a una serie de eventos intracelulares que dan como resultado el ensamblaje y encapsidación de una partícula de VAA.

Los genes "rep" y "cap" de VAA se refieren a secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas de replicación y encapsidación de virus adenoasociados. Los rep y la cap de VAA se denominan en la presente descripción como "genes de empaquetamiento" de VAA.

Un "virus auxiliar" para VAA se refiere a un virus que permite que VAA (por ejemplo, VAA de tipo salvaje) sea replicado y empaquetado por una célula de mamífero. Se conocen en la técnica una variedad de tales virus auxiliares para VAA, que incluyen adenovirus, herpesvirus y poxvirus tales como vaccinia. Los adenovirus abarcan varios subgrupos diferentes, aunque el adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el más comúnmente usado. Numerosos adenovirus de origen humano, mamífero no humano y aviar son conocidos y están disponibles en depósitos tales como la ATCC. Los virus de la familia del herpes incluyen, por ejemplo, los virus del herpes simple (HSV) y los virus de Epstein-Barr (EBV), así como también los citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (PRV); que también están disponibles en depósitos tales como ATCC.

"Función (es) de virus auxiliar" se refiere a funciones codificadas en un genoma de virus auxiliar que permite la replicación y el empaquetamiento de VAA (junto con otros requisitos para la replicación y el empaquetamiento descritos en la presente descripción). Como se describió en la presente descripción, la "función de virus auxiliar" puede proporcionarse de varias formas, que incluyen proporcionando virus auxiliares o proporcionando, por ejemplo, secuencias de polinucleótidos que codifican la función o funciones necesarias a una célula productora en trans. Por ejemplo, un plásmido u otro vector de expresión que comprende secuencias de nucleótidos que codifican una o más proteínas adenovirales se transfecta en una célula productora junto con un vector VAAr.

Un virus o partícula viral "infeccioso" es aquel que comprende una cápside viral ensamblada de manera competente y que es capaz de suministrar un componente polinucleotídico en una célula para la que la especie viral es trópica. El término no implica necesariamente ninguna capacidad de replicación del virus. Los ensayos para contar partículas virales infecciosas se describen en otra parte de esta descripción y en la técnica. La infectividad viral puede expresarse como la relación de partículas virales infecciosas con respecto al total de partículas virales. Se conocen en la técnica métodos para determinar la relación de partícula viral infecciosa a partícula viral total. Ver, por ejemplo, Grainger y otros (2005) Mol. Ther. 11:S337 (que describe un ensayo de título infeccioso de TCID50); y Zolotukhin y otros (1999) Gene Ther. 6:973. Ver también los ejemplos.

El término "tropismo", como se usa en la presente, se refiere al direccionamiento preferencial de especies huésped específicas o tipos celulares específicos dentro de una especie huésped por parte de un virus (por ejemplo, un VAA). Por ejemplo, un virus que puede infectar células del corazón, pulmón, hígado y músculo tiene un tropismo más amplio (es decir, aumentado) en relación a un virus que puede infectar sólo células pulmonares y musculares. El tropismo también puede incluir la dependencia de un virus de tipos particulares de moléculas de la superficie celular del huésped. Por ejemplo, algunos virus pueden infectar solo células con glicosaminoglicanos de superficie, mientras que otros virus pueden infectar solo células con ácido siálico (tales dependencias pueden probarse mediante el uso de varias líneas celulares deficientes en clases particulares de moléculas como células huésped potenciales para la infección viral). En algunos casos, el tropismo de un virus describe las preferencias relativas del virus. Por ejemplo, un primer virus puede infectar todos los tipos de células, pero tiene mucho más éxito en infectar esas células con glicosaminoglicanos de superficie. Puede considerarse que un segundo virus tiene un tropismo similar (o idéntico) al primer virus si el segundo virus también prefiere las mismas características (por ejemplo, el segundo virus también tiene más éxito en infectar esas células con glicosaminoglicanos de superficie), incluso si las eficiencias absolutas de transducción no son similares. Por ejemplo, el segundo virus podría ser más eficiente que el primer virus para infectar todos los tipos de células analizados, pero si las preferencias relativas son similares (o idénticas), aún puede considerarse que el segundo virus tiene un tropismo similar (o idéntico) como el primer virus. En algunas modalidades, el tropismo de un virión que comprende una proteína de la cápside de VAA variante objeto no se altera con relación a un virión de origen natural. En algunas modalidades, el tropismo de un virión que comprende una proteína de la cápside del VAA variante objeto se expande (es decir, se ensancha) con relación a un virión de origen natural. En algunas modalidades, el tropismo de un virión que comprende una proteína de la cápside de VAA variante objeto se reduce con relación a un virión de origen natural.

Un virus "competente para la replicación" (por ejemplo, un VAA competente para la replicación) se refiere a un virus fenotípicamente de tipo salvaje que es infeccioso y que también es capaz de replicarse en una célula infectada (es decir, en presencia de un virus auxiliar o funciones de un virus auxiliar). En el caso de VAA, la competencia de replicación generalmente requiere la presencia de genes de empaquetamiento de VAA funcionales. En general, los vectores VAAr como se describió en la presente descripción son incompetentes para la replicación en células de mamíferos (especialmente en células humanas) debido a la falta de uno o más genes de empaquetamiento de VAA. Típicamente, tales vectores de VAAr carecen de secuencias de genes de empaquetamiento de VAA con el fin de minimizar la posibilidad de que se generen VAA competentes para la replicación por recombinación entre genes de empaquetamiento de VAA y un vector de VAAr entrante. En muchas modalidades, las preparaciones de vector de VAAr como se describió en la presente descripción son aquellas que contienen pocos o ningún VAA competente en replicación (rcVAA, también denominado RCA) (por ejemplo, menos de aproximadamente 1 rcVAA por 102 partículas de VAAr, menos de aproximadamente 1 rcVAA por 104 partículas de VAAr, menos de aproximadamente 1 rcVAA por 10(i) *8 *partículas de VAAr, menos de aproximadamente 1 rcVAA por 1012 partículas VAAr, o no rcVAA).

El término "polinudeótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, incluyendo desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, y puede estar interrumpido por componentes que no son nucleótidos. Si se presenta, las modificaciones en la estructura de nucleótidos pueden darse antes o después del ensamblaje del polímero. El término polinucleótido, como se usa en la presente, se refiere de manera intercambiable a moléculas bicatenarias y monocatenarias. A menos que se especifique o requiera de cualquier otra manera, cualquier modalidad en la presente descripción que comprende un polinucleótido abarca la forma bicatenaria y cada una de las dos formas monocatenarias complementarias que se conocen o predicen como parte de la forma de bicatenaria.

Un polinucleótido o polipéptido tiene un cierto porcentaje de "identidad de secuencia" con otro polinucleótido o polipéptido, lo que significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases o aminoácidos es el mismo cuando se comparan las dos secuencias. La similitud de secuencia puede determinarse de varias formas diferentes. Para determinar la identidad de la secuencia, las secuencias pueden alinearse mediante el uso de los métodos y programas de computadora, incluido BLAST, disponibles en la red mundial en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Otro algoritmo de alineación es FASTA, disponible en el paquete Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wisconsin, Estados Unidos, una subsidiaria de propiedad total de Oxford Molecular Group, Inc. Otras técnicas de alineación se describen en Methods in Enzymology, volumen 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), editor Doolittle, Academic Press, Inc., una división de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, Estados Unidos. De particular interés son los programas de alineación que permiten lagunas en la secuencia. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite lagunas en las alineaciones de secuencias. Ver Meth. Mol. Biol.

70: 173-187 (1997). También, el programa GAP que usa el método de alineación de Needleman y Wunsch puede usarse para alinear secuencias. Ver J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)

Un "gen" se refiere a un polinucleótido que realiza una función de algún tipo en la célula. Por ejemplo, un gen puede contener un marco de lectura abierto que es capaz de codificar una proteína particular después de ser transcrito y traducido. Por otro lado, un gen puede codificar un producto de ARN funcional que no se traduce (por ejemplo, un aptámero, un ARN interferente, un ARN ribosómico (ARNr), un ARN de transferencia (ARNt), etc.).

Un "producto de expresión génica" o "producto génico" es una molécula resultante de la expresión de un gen particular, como se definió anteriormente. Los productos de expresión génica incluyen, por ejemplo, un polipéptido, un aptámero, un ARN de interferencia, un ARN mensajero (ARNm), un ARNr, un ARNt, un ARN no codificante (ncARN) y similares.

Un "agente de interferencia de ARN" o "agente de ARNi" abarca cualquier agente (o un polinucleótido que codifica tal agente) que puede usarse para cambiar la expresión de un gen (como se definió anteriormente). Los ejemplos de agentes de ARNi conocidos por un experto en la técnica incluyen, pero no se limitan a, (i) agentes de ARNip; (ii) ARN antisentido; (iii) agentes CRISPR; (iv) agentes de nucleasa con dedos de zinc, y (v) Agentes de nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN).

(i) un agente de ARNip ("ARN interferente pequeño" o "ARN interferente corto" (o ARNip)) es un dúplex de ARN de nucleótidos dirigido a un gen de interés (un "gen diana"). Un "dúplex de ARN" se refiere a la estructura formada por el apareamiento complementario entre dos regiones de una molécula de ARN formando una región de ARN bicatenario (ARNbc). El ARNip se "dirige" a un gen porque la secuencia de nucleótidos de la porción dúplex del ARNip es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen diana. En algunas modalidades, la longitud del dúplex del ARNip es menor de 30 nucleótidos. En algunas modalidades, el dúplex puede tener 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la longitud del dúplex es de 19-25 nucleótidos de longitud. La porción dúplex de ARN del ARNip puede ser parte de una estructura de horquilla. Los agentes de ARNip que contienen una horquilla también pueden denominarse "agentes de ARNhc (ARN de horquilla corta)". Además de la porción dúplex, la estructura de horquilla puede contener una porción de bucle situada entre las dos secuencias que forman el dúplex. El bucle puede variar en longitud. En algunas modalidades, el bucle tiene una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 nucleótidos. La estructura de horquilla también puede contener porciones salientes 3' o 5'. En algunas modalidades, el saliente es un saliente 3' o 5' de 0, 1,2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud. En general, el nivel de producto de expresión (por ejemplo, ARNm, polipéptido, etc.) de un gen diana se reduce mediante un agente ARNip (por ejemplo, un ARNip, un ARNhc, etc.) que contiene secuencias de nucleótidos bicatenarios específicas que son complementarias a al menos un segmento de 19-25 nucleótidos de longitud (por ejemplo, una secuencia de 20-21 nucleótidos) del transcrito del gen diana, que incluye la región 5' no traducida (UT), el ORF o la región 3' UT. En algunas modalidades, los ARN de interferencia cortos tienen una longitud de aproximadamente 19-25 nucleótidos. Véanse, por ejemplo, las solicitudes PCT WO0/44895, WO99/32619, WO01/75164, WO01/92513, WO01/29058, WO01/89304, WO02/16620 y WO02/29858; y la publicación de la patente de Estados Unidos número 20040023390 para descripciones de la tecnología de ARNip. El ARNpi y/o ARNhc puede codificarse por una secuencia de ácido nucleico y la secuencia de ácido nucleico también puede incluir un promotor. La secuencia de ácido nucleico también puede incluir una señal de poliadenilación. En algunas modalidades, la señal de poliadenilación es una señal de poliadenilación mínima sintética.

(ii) el ARN antisentido es ARN que es complementario a un producto de expresión génica. Por ejemplo, un ARN antisentido dirigido a un ARNm específico es un agente basado en ARN (o puede ser un ARN modificado) que es complementario del ARNm, donde la hibridación del ARN antisentido con el ARNm altera la expresión del ARNm (por ejemplo, mediante la alteración de la estabilidad del ARN, la alteración de la traducción del ARN, etc.). También se incluyen en el "ARN antisentido" los ácidos nucleicos que codifican un ARN antisentido.

(iii) Agentes CRISPR. Los sistemas CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas)/asociados a CRISPR (Cas) proporcionan a las bacterias y arqueas inmunidad adaptativa contra virus y plásmidos mediante el uso de ARN CRISPR (ARNcr) para guiar el silenciamiento de los ácidos nucleicos invasores. La proteína Cas 9 (o equivalente funcional y/o variante de la misma, es decir, proteína similar a Cas 9) contiene naturalmente actividad de ADN endonucleasa que depende de la asociación de la proteína con dos moléculas de ARN naturales o sintéticas llamadas ARNcr y ARNtracr (también llamadas RNA guía). En algunos casos, las dos moléculas están ligadas covalentemente para formar una sola molécula (también llamada ARN guía simple (“ARNsg”)). Por lo tanto, la proteína Cas 9 o similar a Cas 9 se asocia con un ARN dirigido al ADN (cuyo término abarca tanto la configuración del ARN guía de dos moléculas como la configuración del ARN guía de una sola molécula), que activa la proteína Cas 9 o similar a Cas 9 y guía la proteína a una secuencia de ácido nucleico diana. Si la proteína Cas 9 o similar a Cas 9 conserva su función enzimática natural, escindirá el ADN objetivo para crear una ruptura de doble cadena, lo que puede conducir a la alteración del genoma (es decir, edición: deleción, inserción (cuando está presente un polinucleótido donante), reemplazo, etc.), alterando de esta manera la expresión génica. Algunas variantes de Cas 9 (cuyas variantes están abarcadas por el término similar a Cas 9) se han alterado de manera que tienen una actividad de escisión del ADN disminuida (en algunos casos, escinden una sola cadena en lugar de ambas cadenas del ADN diana, mientras que en otros casos, han reducido severamente a ninguna actividad de escisión del ADN). Las proteínas similares a Cas 9 con una actividad de escisión de ADN disminuida (incluso sin actividad de escisión de ADN) aún pueden guiarse a un ADN diana y pueden bloquear la actividad de la ARN polimerasa. Por lo tanto, las proteínas de tipo Cas 9 enzimáticamente inactivas pueden dirigirse a una ubicación específica en un ADN diana mediante un ARN dirigido al ADN para bloquear la transcripción del ADN diana. Puede encontrarse información detallada sobre los agentes CRISPR, por ejemplo en (a) Jinek y otros, Science. 17 de agosto de 2012;337(6096):816-21: “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”; (b) Qi y otros, Cell. 28 de febrero de 2013;152(5):1173-83: “Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression”, y (c) la solicitud de patente de los Estados Unidos número 13/842,859 y la solicitud PCT número PCT/US13/32589; todos los cuales se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad. Por lo tanto, el término "agente CRISPR" como se usa en la presente abarca cualquier agente (o ácido nucleico que codifica tales agente), que comprende secuencias sintéticas y/o de origen natural, que pueden usarse en el sistema basado en Cas 9 (por ejemplo, un Cas 9 o Cas 9 similar proteína, cualquier componente de un ARN que se dirige al ADN, por ejemplo, un ARN similar a ARNcr, un ARN similar a ARNtracr, un ARN guía único, etc.; un polinucleótido donante, y similares).

(iv) Agentes de nucleasa con dedos de zinc (ZFN). Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son endonucleasas de ADN artificiales generadas al fusionar un dominio de unión al ADN con dedos de zinc a un dominio de escisión del ADN. Las ZFN pueden diseñarse para apuntar a las secuencias de ADN deseadas y esto permite que las nucleasas con dedos de zinc escindan secuencias diana únicas. Cuando se introducen en una célula, las ZFN pueden usarse para editar el ADN diana en la célula (por ejemplo, el genoma de la célula) induciendo roturas de doble cadena. Para obtener más información sobre el uso de ZFN, consulte, por ejemplo: Asuri y otros, Mol Ther. febrero de 2012;20(2):329-38; Bibikova y otros Science. 2 de mayo de 2003;300(5620):764; Wood y otros Science. 15 de julio de 2011;333(6040):307; Ochiai y otros Genes Cells. Agosto de 2010;15(8):875-85; Takasu y otros al., Insect Biochem Mol Biol. octubre de 2010;40(10):759-65; Ekker y otros, Zebrafish 2008 Summer;5(2):121-3; Young y otros, Proc Natl Acad Sci U S A. 26 de abril de 2011;108(17):7052-7; Goldberg y otros, Cell. 5 de marzo de 2010;140 (5):678-91; Geurts y otros, Science. 24 de julio de 2009;325(5939):433; Flisikowska y otros, PLoS One.

2011;6(6):e21045. doi: 10.1371/journal.pone.0021045. Publicación electrónica del 13 de junio de 2011; Hauschild y otros, Proc Natl Acad Sci U S A. 19 de julio de 2011;108(29):12013-7; y Yu y otros, Cell Res. noviembre de 2011;21(11):1638-40; todos los cuales se incorporan en la presente descripción como referencia por sus enseñanzas relacionadas con las ZFN. El término "agente ZFN" abarca una nucleasa con dedos de zinc y/o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa con dedos de zinc.

(v) Agentes nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN). Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) son endonucleasas de ADN artificiales generadas mediante la fusión de un dominio de unión al ADN efector de tipo activador de la transcripción (TAL) con un dominio de escisión del ADN. TALENS pueden diseñarse rápidamente para unir prácticamente cualquier secuencia de ADN deseada y, cuando se introducen en una célula, los TALEN pueden usarse para editar el ADN diana en la célula (por ejemplo, el genoma de la célula) induciendo roturas de doble cadena. Para obtener más información sobre el uso de TALEN, ver, por ejemplo: Hockemeyer y otros Nat Biotechnol. 7 de julio de 2011; 29 (8): 731-4; Wood y otros Science. 15 de julio de 2011;333(6040):307; Tesson y otros Nat Biotechnol. 5 de agosto de 2011;29(8):695-6; y Huang y otros, Nat Biotechnol. 5 de agosto de 2011;29(8):699-700; todos los cuales se incorporan en la presente descripción como referencia por sus enseñanzas relacionadas con los TALEN. El término "agente TALEN" abarca un TALEN y/o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un TALEN.

Un "elemento de control" o "secuencia de control" es una secuencia de nucleótidos involucrada en una interacción de moléculas, que contribuye a la regulación funcional de un polinucleótido, que incluye la replicación, duplicación, transcripción, empalme, traducción o degradación del polinucleótido. La regulación puede afectar la frecuencia, velocidad o especificidad del proceso y puede ser de naturaleza activadora o inhibitoria. Los elementos de control que se conocen en la técnica incluyen, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripción tales como promotores y potenciadores. Un promotor es una región de ADN capaz, en determinadas condiciones, de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una región codificante normalmente ubicada aguas abajo (en la dirección 3') del promotor.

"Ligado operativamente" o "ligado operablemente" se refiere a una yuxtaposición de elementos genéticos, en donde los elementos están en una relación que les permite operar de la manera esperada. Por ejemplo, un promotor está ligado operativamente a una región codificante si el promotor ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia codificante. Puede haber residuos intermedios entre el promotor y la región codificante siempre que se mantenga esta relación funcional.

Un "vector de expresión" es un vector que comprende una región que codifica un polipéptido de interés y se usa para efectuar la expresión de la proteína en una célula diana deseada. Un vector de expresión comprende además elementos de control ligados operativamente a la región codificante para facilitar la expresión de la proteína en la diana. La combinación de elementos de control y un gen o genes a los que están ligados operativamente para la expresión a veces se denomina "casete de expresión", un gran número de los cuales se conocen y están disponibles en la técnica o pueden construirse fácilmente a partir de componentes disponibles en la técnica.

"Heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta de la del resto de la entidad con la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido introducido mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una especie diferente es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y ligado operativamente a una secuencia codificante con la que no se encuentra ligado de forma natural es un promotor heterólogo. Por lo tanto, por ejemplo, un VAAr que incluye un ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico heterólogo es un VAAr que incluye un ácido nucleico que normalmente no se incluye en un VAA natural, de tipo salvaje, y el producto génico heterólogo codificado es un producto génico. normalmente no codificado por un VAA natural de tipo salvaje.

Los términos "alteración genética" y "modificación genética" (y variantes gramaticales de los mismos), se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un proceso en donde un elemento genético (por ejemplo, un polinucleótido) se introduce en una célula de otra manera que no sea por mitosis o meiosis. El elemento puede ser heterólogo de la célula o puede ser una copia adicional o una versión mejorada de un elemento ya presente en la célula. La alteración genética puede efectuarse, por ejemplo, por transfección de una célula con un plásmido recombinante u otro polinucleótido mediante cualquier proceso conocido en la técnica, tal como electroporación, precipitación con fosfato cálcico o poniendo en contacto con un complejo polinucleótido liposoma. La alteración genética también puede efectuarse, por ejemplo, mediante transducción o infección con un virus de ADN o ARN o un vector viral. Generalmente, el elemento genético se introduce en un cromosoma o minicromosoma en la célula; pero se incluye en este término cualquier alteración que cambie el fenotipo y/o genotipo de la célula y su progenie. Una célula ha sido "modificada genéticamente" o "transformada" o "transfectada" por ADN exógeno (por ejemplo, a través de un virus recombinante), cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. La presencia del ADN exógeno da como resultado un cambio genético permanente o transitorio. El ADN transformante puede o no estar integrado (ligado covalentemente) en el genoma de la célula. Un "clon" es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecer de forma estable in vitro durante muchas generaciones.

Se dice que una célula está alterada, transducida, modificada genéticamente o transformada de forma "estable" con una secuencia genética si la secuencia está disponible para realizar su función durante el cultivo prolongado de la célula in vitro y/o durante un período prolongado de tiempo in vivo. Generalmente, tal célula se altera "heredablemente" (genéticamente modificada) porque se introduce una alteración genética que también es heredable por la progenie de la célula alterada.

Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a los polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los términos abarcan además un polímero de aminoácidos que se ha modificado; por ejemplo, la formación de enlace disulfuro, glucosilación, lipidación, fosforilación o conjugación con un componente de marcaje. Los polipéptidos tales como polipéptidos antiangiogénicos, polipéptidos neuroprotectores y similares, cuando se discuten en el contexto del suministro de un producto génico a un sujeto mamífero, y sus composiciones, se refieren al polipéptido intacto respectivo, o cualquier fragmento o derivado modificado genéticamente del mismo, que conserva la función bioquímica deseada de la proteína intacta. De manera similar, las referencias a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos antiangiogénicos, ácidos nucleicos que codifican polipéptidos neuroprotectores y otros ácidos nucleicos para su uso en la suministro de un producto génico a un sujeto mamífero (que pueden denominarse "transgenes" para su suministro a un célula receptora), incluyen polinucleótidos que codifican el polipéptido intacto o cualquier fragmento o derivado modificado genéticamente que posea la función bioquímica deseada.

Un plásmido, ácido nucleico, vector, virus, virión, célula huésped, proteína u otra sustancia "aislada" se refiere a una preparación de la sustancia desprovista de al menos algunos de los otros componentes que también pueden estar presentes donde la sustancia o una sustancia similar se produce naturalmente o desde donde se prepara inicialmente. Por lo tanto, por ejemplo, puede prepararse una sustancia aislada mediante el uso de una técnica de purificación para enriquecerla a partir de una mezcla de origen. El enriquecimiento puede medirse de forma absoluta, tal como el peso por volumen de solución, o puede medirse en relación con una segunda sustancia potencialmente interferente presente en la mezcla fuente. Los enriquecimientos crecientes de las modalidades de esta descripción son cada vez más aislados. Un plásmido, ácido nucleico, vector, virus, célula huésped u otra sustancia aislado se purifica en algunas modalidades, por ejemplo, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 % de pureza, al menos aproximadamente 90 % de pureza, al menos aproximadamente 95 % de pureza, al menos aproximadamente un 98 % de pureza, o al menos aproximadamente un 99 %, o más, pura.

Como se usa en la presente, los términos "tratamiento", "tratar" y similares, se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de cura parcial o completa de una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano e incluye: (a) prevenir que la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad) ocurran en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o en riesgo de contraer la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado que la padezca; (b) inhibir la enfermedad (y/o síntomas causados por la enfermedad), es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad), es decir, provocar la regresión de la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad).

Los términos "individuo", "huésped", "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un mamífero, incluidos, pero no se limitan a, seres humanos; primates no humanos, incluidos los simios; animales deportivos de mamíferos (por ejemplo, caballos); animales de granja de mamíferos (por ejemplo, ovejas, cabras, etc.); mascotas de mamíferos (perros, gatos, etc.); y roedores (por ejemplo, ratones, ratas, etc.).

En algunas modalidades, el individuo es un ser humano que ha estado previamente expuesto de forma natural a VAA y, como resultado, alberga anticuerpos contra VAA (es decir, anticuerpos neutralizantes de VAA). En algunas modalidades, el individuo es un ser humano al que se le ha administrado previamente un vector VAA (y como resultado puede albergar anticuerpos contra VAA) y se necesita volver a administrar el vector para el tratamiento de una afección diferente o para el tratamiento adicional de la misma afección. Según los resultados positivos de los ensayos clínicos que implican la suministro de genes VAA, por ejemplo, en el hígado, el músculo y la retina (todos los tejidos afectados por anticuerpos neutralizantes contra este vehículo), existen muchas aplicaciones terapéuticas/enfermedades dianas de este tipo.

El término "cantidad efectiva" como se usa en la presente es una cantidad suficiente para lograr resultados clínicos beneficiosos o deseados. Una cantidad efectiva puede administrarse en una o más administraciones. Para los propósitos de esta descripción, una cantidad efectiva de un compuesto (por ejemplo, un virión infeccioso de VAAr) es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, ralentizar o retrasar la progresión de (y/o síntomas asociados con) una etapa de enfermedad particular (por ejemplo, cáncer). En consecuencia, una cantidad efectiva de un virión de VAAr infeccioso es una cantidad del virión de VAAr infeccioso que es capaz de evadir la actividad neutralizante de los anticuerpos contra VAA de un individuo, para suministrar así de manera efectiva el ácido nucleico heterólogo a una célula diana (o células dianas) del individuo.

Antes de describir la presente invención en detalles, debe entenderse que esta invención no se limita a las modalidades particulares descritas, ya que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción es solo para el propósito de describir las modalidades particulares, y no pretende limitarse, dado que el alcance de la presente invención se limitará solo mediante las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor del intervalo, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor del intervalo o que se declare en ese intervalo establecido, es abarcado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también se abarcan dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Donde el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de estos límites incluidos también se incluyen en la invención.

A menos que se especifique de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que se conoce comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente descripción pueden también usarse en la práctica o las pruebas de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen ahora. Todas las publicaciones mencionadas en la presente descripción son para divulgar y describir los métodos y/o materiales en relación con los que se citan las publicaciones.

Debe destacarse que, como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas del singular “un," "una" y "el/la" incluyen referencias del plural a menos que el contexto lo establezca claramente de cualquier otra manera. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso" incluye una pluralidad de tales viriones y la referencia al "virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso" incluye una referencia a uno o más de tales viriones y equivalentes de los mismos conocidos para los expertos en la técnica, etcétera. Se hace notar además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de tal terminología exclusiva como “solamente,” “solo” y similares en relación con la narración de los elementos de la reivindicación, o usar una limitación “negativa”.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que son, para mayor claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, pueden proporcionarse además en combinación en una sola modalidad. Por el contrario, varias características de la invención que son, descritas por brevedad, en el contexto de una sola modalidad, pueden proporcionarse además por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las modalidades pertenecientes a la invención están específicamente abarcadas por la presente invención y se describen en la presente descripción como si todas y cada una de las combinaciones se revelaran individual y explícitamente. Además, todas las subcombinaciones de las diversas modalidades y elementos de las mismas también están abarcadas específicamente por la presente invención y se describen en la presente descripción como si todas y cada una de tales subcombinaciones se revelaran individual y explícitamente en la presente descripción. Las publicaciones analizadas en la presente descripción se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente descripción debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder tal publicación en virtud de una invención previa. Adicionalmente, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación presentes que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.

Descripción detallada

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. La presente descripción proporciona viriones de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infecciosos que comprenden una proteína de la cápside variante y un ácido nucleico heterólogo. La presente descripción proporciona además las proteínas de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variantes (y/o un ácido nucleico que codifica las proteínas de la cápside de VAA variantes), que confieren a un virión de VAAr infeccioso una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos. La presente descripción proporciona además células huésped que comprenden un virión de VAAr infeccioso y/o un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de VAA variante objeto. La presente descripción proporciona además bibliotecas de los viriones, proteínas de la cápside, ácidos nucleicos y/o células huésped anteriores; donde la proteína de la cápside de VAA variante de al menos un miembro de la biblioteca comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de aminoácidos con relación a la secuencia de aminoácidos expuesta en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33.

La presente descripción proporciona además métodos para suministrar un ácido nucleico heterólogo a una célula diana donde la célula diana se pone en contacto con un virión de VAAr infeccioso objeto. La presente descripción proporciona además métodos para suministrar un producto génico a un individuo, los métodos generalmente implican la administración de una cantidad efectiva de un virión de VAAr objeto a un individuo que lo necesite. También se proporcionan en la presente descripción composiciones y estuches para practicar los métodos objeto. En muchas modalidades, se aísla un virión de VAAr infeccioso objeto, un ácido nucleico objeto, una proteína de la cápside de VAA variante objeto, una célula huésped objeto, etc.

Polipéptidos de la cápside de VAA variantes

Un polipéptido de la cápside de VAA variante objeto (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) confiere a un virión de VAAr infeccioso que comprende el polipéptido de la cápside de VAA variante una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por un VAA de tipo salvaje (por ejemplo, VAA2 (VAA de tipo salvaje serotipo 2)) o un VAA que comprende una proteína de la cápside de tipo salvaje. En algunas modalidades, la mayor resistencia es al menos aproximadamente 1,5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces) veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 12 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 17 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 250 veces, al menos aproximadamente 300 veces, etc.) mayor que la resistencia exhibida por un VAA de tipo salvaje (por ejemplo, VAA2 (VAA de tipo salvaje serotipo 2)) o un VAA que comprende una proteína de la cápside de tipo salvaje.

Puede decirse que una proteína de la cápside de VAA variante objeto (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) confiere a un virión de VAAr infeccioso una transducción aumentada de células de mamífero en presencia de anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la transducción exhibida por un VAA de tipo salvaje (por ejemplo, VAA2 (serotipo 2 de VAA de tipo salvaje)) o un VAA que comprende una proteína de la cápside de tipo salvaje. En algunas modalidades, la transducción aumentada es al menos aproximadamente 1,5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 12 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 17 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 250 veces, al menos aproximadamente 300 veces, etc.) mayor que la transducción exhibida por un VAA de tipo salvaje (por ejemplo, VAA2 (VAA de tipo salvaje serotipo 2)) o un VAA que comprende una proteína de la cápside de tipo salvaje.

En algunas modalidades, una proteína de la cápside de VAA variante objeto (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) exhibe una unión disminuida a un anticuerpo neutralizante que se une a una proteína de la cápside de VAA de tipo salvaje. Por ejemplo, una proteína de la cápside de VAA variante objeto puede exhibir al menos aproximadamente 1,5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 12 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 17 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 250 veces, al menos aproximadamente 300 veces, etc.) unión reducida (por ejemplo, afinidad reducida) a un anticuerpo neutralizante que se une a una proteína VAA de la cápside de tipo salvaje, en comparación con la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína de la cápside de VAA de tipo salvaje.

En algunos casos, un anticuerpo neutralizante contra VAA se une a una proteína de la cápside de VAA variante objeto (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) con una afinidad de menos de aproximadamente 10-7 M, menos de aproximadamente 5 x 10-6 M, menos de aproximadamente 10-6 M, menos de aproximadamente 5 x 10-5 M, menos de aproximadamente 10-5 M, menos de aproximadamente 10-4 M, o menor.

El término "proteína de la cápside variante" no incluye proteínas de la cápside de VAA de tipo salvaje. Una "proteína de la cápside de VAA variante" no comprende una secuencia de aminoácidos presente en una proteína de la cápside de VAA de origen natural. Por ejemplo, una proteína de la cápside variante objeto no comprende una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia del 100 % con cualquiera de las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 1-9. En otras palabras, una proteína de la cápside variante objeto no comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-9. Una proteína de la cápside variante puede diferir en la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de VAA "iniciadora" o "parental", cuya proteína de la cápside de VAA parental puede ser una proteína de la cápside de VAA de tipo salvaje o una proteína de la cápside de VAA de tipo no salvaje.

En algunos casos, una proteína de la cápside de VAA variante (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o 100 %) de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33.

En algunos casos, una proteína de la cápside de VAA variante (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33.

En algunos casos, una proteína de la cápside de VAA variante (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o 100 %) de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:10, e incluye las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, D472N, N551S, I698V y L735Q con relación a la proteína de la cápside de VAA de VAA2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), o las posiciones correspondientes en otro serotipo parental de VAA.

En algunos casos, una proteína de la cápside de VAA variante (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o 100 %) de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, e incluye las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, D472N, N551S, I698V y ^l735Q con relación a la proteína de la cápside de VAA de VAA2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), o las posiciones correspondientes en otro serotipo parental de VAA.

En algunos casos, una proteína de la cápside de VAA variante (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o 100 %) de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 31, e incluye las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, N551S e I698V con relación a la proteína de la cápside de VAA de VAA2 (por ejemplo, SEQ ID NO:2), o las posiciones correspondientes en otro serotipo parental de VAA.

En algunos casos, una proteína de la cápside de VAA variante (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 % (por ejemplo, Al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o 100 %) de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:31, e incluye las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, N551S, e I698V con relación a la proteína de la cápside de VAA de VAA2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), o las posiciones correspondientes en otro serotipo parental de VAA.

En algunos casos, una proteína de la cápside de VAA variante (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o 100 %) de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:32, e incluye las sustituciones de aminoácidos D180N, N312K, Q385R, N449D, N551S, I698V y S721T con relación a la proteína de la cápside de VAA de VAA2 (por ejemplo, SEQ ID NO:2), o las posiciones correspondientes en otro serotipo parental de VAA.

En algunos casos, una proteína de la cápside de VAA variante (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o 100 %) de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:32, e incluye las sustituciones de aminoácidos D180N, N312K, Q385R, N449D, N551S, I698V y S721T con relación a la proteína de la cápside de VAA de VAA2 (por ejemplo, SEQ ID NO:2), o las posiciones correspondientes en otro serotipo parental de VAA.

En algunos casos, una proteína de la cápside de VAA variante (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o 100 %) de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:33, e incluye las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, T450A, N551S e I698V con relación a la proteína de la cápside de VAA de VAA2 (por ejemplo, SEQ ID NO:2), o las posiciones correspondientes en otro serotipo parental de VAA.

En algunos casos, una proteína de la cápside de VAA variante (o la proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:33, e incluye las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, T450A, N551S e I698V con relación a la proteína de la cápside de VAA de VAA2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), o las posiciones correspondientes en otro serotipo parental de VAA.

Las proteínas de la cápside de VAA variantes ilustrativas incluyen, pero no se limitan a (véanse las Figuras 8-10 para alineaciones de secuencias ilustrativas seleccionadas):

SM 10-2 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 10):

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SM10-2 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 22):

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Mezcla 100-1 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 11):

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Mezcla 100-1 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 23):

| atggctgctgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaa cctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcg gacccücaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacga ccagcagctcaaggccggtgacaacccctacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttccagcagcggcttcagggcga cacatcgtttgggggcaacctcggcagagcagtcttccaggccaaaaagagggttcttgaacctcttggtctggttgagcaagc gggtgagacggctcctggaaagaagagaccgttgattgaatccccccagcagcccgactcctccacgggtatcggcaaaaaa ggcaagcagccggctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgacccacaacctctcggag aacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggtggtggcgcaccaatggcagacaataacgaagg cgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacc cgcacctgggccttgcccacctacaataaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcaacgggggccagcaacgacaacca ctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactca tcaacaacaattggggattccggcccaagagactcaacttcaaactcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgacgaatgatg gcgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtc ggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacggga gtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagcta cacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacc igtattacctgaacagaactcagaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgggggtctccagctggca tgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacaacaaca gcaactttacctggactggtgcttcaaaatataaccttaatgggcgtgaatctataatcaaccctggcactgctatggcctcacaca aagacgacaaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaggagagcgccggagcttcaaacactgcattgg acaatgtcatgatcacagacgaagaggaaatcaaagccactaaccccgtggccaccgaaagatttgggactgtggcagtcaat ctccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgttatgggagccttacctggaatggtgtggcaagacagag acgtatacctgcagggtcccatttgggccaaaattcctcacacagatggacactttcacccgtctcctcttatgggcggctttgga ctcaagaacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcggagttttcagctacaaagtttgc ttcattcatcacccaatactccacaggacaagtgagtgtggaaattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaagcgctgga atcccgaagtgcagtacacatccaattatgcaaaatctgccaacgttgattttactgtggacaacaatggactttatactgagcctc ge cccattggc aecc gttucc te accc gtcecc tgt aa;

Mezcla 100-3 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 12):

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DDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAV

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MGGFGLKNPPPQ1LIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKE

NSKRWKPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL;

Mezcla 100-3 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 24):

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Mezcla 100-7 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 13):

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Mezcla 100-7 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 25):

| atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtgggcgctgaa acctggagccccgaagcccaaagccaaccagcaaaagcaggacgacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacct cggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggatgcagcggccctcgagcacgacaaggcctac gaccagcagctcaaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataaccacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaa gatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaagaagcgggttctcgaacctctcggtctggttgagga aggcgctaagacggctcctggaaagaaacgtccggtagagcaatcgccacaagagccagactcctcctcgggcatcggcaa gacaggccagcagcccgctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgacccacaacctctc ggagaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacg aaggcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccag cacccgaacatgggccttgcccacctataacaaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcgacgggggccagcaacgac aaccactacttcggctacagcaccccctgggggtattttgactttaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcg actcatcaacaacaactggggattccggcccaagagactcagcttcaagctcttcaacatccaggtcaaggaggtcacgacga atgatggcgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggíícaagtcttctcggactcggagtaccagcttccgtacgícctc ggctctgcgcaccagggctgcctccctccgttcccggcggacgtgttcatgattccgcaatacggctacctgacgctcaacaat ggcagccaagccgtgggacgttcatccttttactgcctggaatatttcccttctcagatgctgagaacgggcaacaactttaccttc agctacacctttgaggaagtgcctttccacagcagctacgcgcacagccagagcctggaccggctgatgaatcctctcatcgat caatacctgtattacctgaacagaactcaaaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgcigtttagccgtgggtctccag ctggcatgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaaca acaacagcaattttacctggactggtgcttcaaaatataacctcaatgggcgtgaatccatcatcaaccctggcactgctatggcc tcacataaagacgacgaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaagagagcgccggagcttcaaacact gcattggacaatgtcatgattacagacgaagaggaaattaaagccactaaccctgtggccaccgaaagatttgggaccgtggc agtcaatttccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgctatgggagcattacctggcatggtgtggcaag atagagacgtgtacctgcagggtcccatttgggccaaaattcctcacacagatggacactttcacccgtctcctcttatgggcgg ctttggactcaagaacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcggagttttcagctacaa agtttgcttcattcatcacccaatactccacaggacaagtgagcgtggagattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaaa cgctggaatcccgaagtgcagtatacatctaactatgcaaaatctgccaacattgatttcactgtggacaacaatggactttatact gagcctcgccccattggcacccgttacctcacccgiccccagtaa;

Mezcla 10-2 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 26):

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Mezcla 10-2 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 34):

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Mezcla 10-6 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 27):

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Mezcla 10-6 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 35):

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Mezcla 10-8 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 28):

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Mezcla 10-8 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 36):

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Mezcla 100-2 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 29):

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Mezcla 100-2 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 37):

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SM 10-1 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 30):

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SM 10-8 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 39):

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SM 100-3 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 32):

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SM 100-3 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 40):

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SM 100-10 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 33):

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SM 100-10 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 41):

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Ácidos nucleicos y células huésped

La presente descripción proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de la cápside de VAA variante (como se describió anteriormente), así como también células huésped que comprenden un ácido nucleico objeto. Los ácidos nucleicos y las células huésped son útiles para generar viriones VAAr (como se describe más abajo).

La presente descripción proporciona células huésped, por ejemplo, células huésped aisladas, que comprenden un ácido nucleico objeto. Una célula huésped objeto puede denominarse "célula huésped modificada genéticamente" y típicamente es una célula aislada, por ejemplo, una célula en cultivo in vitro. Una célula huésped objeto es útil para producir un virión de VAAr objeto, como se describe más abajo. Cuando una célula huésped objeto se usa para producir un virión de VAAr objeto, se denomina "célula de empaquetamiento." En algunas modalidades, una célula huésped objeto se modifica genéticamente de forma estable (es decir, se transfecta de forma estable) con un ácido nucleico objeto. En otras modalidades, una célula huésped objeto se modifica genéticamente de forma transitoria (es decir, se transfecta transitoriamente) con un ácido nucleico objeto.

Un ácido nucleico objeto se introduce de forma estable o transitoria en una célula huésped, mediante el uso de técnicas establecidas, que incluyen, pero no se limitan a, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección mediada por liposomas y similares. Para la transformación estable, un ácido nucleico objeto generalmente incluirá además un marcador seleccionable, por ejemplo, cualquiera de varios marcadores seleccionables bien conocidos, tales como resistencia a neomicina y similares.

Una célula huésped objeto se genera introduciendo un ácido nucleico objeto en cualquiera de una variedad de células, por ejemplo, células de mamífero, incluidas, por ejemplo, células murinas y células de primates (por ejemplo, células humanas). Las células de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células primarias y líneas celulares, donde las líneas celulares adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células 293, células COS, células HeLa, células Vero, fibroblastos de ratón 3T3, fibroblastos C3H10T1/2, células CHO y similares.

En algunas modalidades, una célula huésped objeto incluye, además de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside mutante, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas rep de VAA. En otras modalidades, una célula huésped objeto comprende además un vector VAAr, como se describe más abajo. Como se describe con más detalle más abajo, se genera un virión de VAAr mediante el uso de una célula huésped objeto.

Viriones de VAAr infecciosos

Un virión infeccioso de VAAr objeto comprende una proteína de la cápside de VAA variante y un ácido nucleico heterólogo (descrito con mayor detalle más abajo), y exhibe una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por un VAA de tipo salvaje (por ejemplo, VAA2 (tipo salvaje VAA serotipo 2)) o un VAA que comprende una proteína de la cápside de tipo salvaje. Por "resistencia aumentada" se entiende que un virión de VAAr infeccioso objeto exhibe una infectividad aumentada en presencia de anticuerpos contra VAA humanos. Como se describió anteriormente, la infectividad viral puede expresarse como la relación de partículas virales infecciosas a partículas virales totales. Por lo tanto, una infectividad aumentada significa una relación aumentada de partículas virales infecciosas con respecto al total de partículas virales. Para determinar la resistencia de un VAA a los anticuerpos contra VAA humanos, se mide la infectividad del VAA en presencia de diversas concentraciones de anticuerpos contra VAA humanos para obtener la concentración de anticuerpos (por ejemplo, concentración sérica, concentración de IgIV, etc.) (mg/mL) necesarios para reducir la eficiencia de la suministro de genes (es decir, la infectividad) al 50 % de la que se necesita en ausencia de anticuerpos humanos anti-VAA. Se dice que un virus que requiere una concentración de anticuerpo más alta para reducir la eficiencia de suministro de genes al 50 % en ausencia de anticuerpos humanos contra VAA tiene una mayor resistencia a la neutralización de anticuerpos. Por lo tanto, un aumento de dos veces en la resistencia significa un aumento de dos veces en la concentración de anticuerpo requerida para reducir la eficiencia de suministro de genes al 50 % de la que se obtiene en ausencia de anticuerpos humanos contra VAA. En algunas modalidades, un virión de VAAr infeccioso objeto exhibe al menos aproximadamente 1,5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 12 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 17 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 250 veces, al menos aproximadamente 300 veces, etc.) mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos que la resistencia exhibida por un

VAA de tipo salvaje (por ejemplo, VAA2 (VAA de tipo salvaje serotipo 2)) o un VAA que comprende una proteína de la cápside de tipo salvaje.

Puede decirse que un virión de VAAr infeccioso objeto exhibe una transducción aumentada de células de mamífero en presencia de anticuerpos neutralizantes de VAA humanos. En algunas modalidades, un virión de VAAr infeccioso objeto exhibe al menos aproximadamente 1,5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 12 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 17 veces, al m aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al m aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al m aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 250 veces, al menos aproximadamente 300 veces, etc.) mayor transducción de células de mamífero en presencia de anticuerpos neutralizantes de VAA humanos que la transducción exhibida por un VAA de tipo salvaje (por ejemplo, VAA2 (serotipo de VAA de tipo salvaje 2)) o un VAA que comprende una proteína de la cápside de tipo salvaje.

En algunas modalidades, un virión de VAAr infeccioso objeto exhibe una unión disminuida a un anticuerpo neutralizante que se une a una proteína de la cápside de VAA de tipo salvaje. Por ejemplo, un virión de VAAr infeccioso objeto puede exhibir al menos aproximadamente 1,5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 1,5

ente 17 ente 30

ente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente

200 veces, al menos aproximadamente 250 veces, al menos aproximadamente 300 veces, etc.) unión reducida (por ejemplo, afinidad reducida) a un anticuerpo neutralizante que se une a una proteína VAA de la cápside de tipo salvaje, en comparación con la afinidad de unión del anticuerpo a proteína de la cápside de VAA de tipo salvaje.

En algunos casos, un anticuerpo neutralizante contra VAA se une a un virión de VAAr infeccioso objeto con una afinidad de menos de aproximadamente 10"7 M, menos de aproximadamente 5 x 10"6 M, menos de aproximadamente 10-6 M, menos de aproximadamente 5 x 10-5 M, menos de aproximadamente 10-5 M, menos de aproximadamente 10-4 M, o menor.

En algunos casos, un virión infeccioso VAAr exhibe un aumento in vivo del tiempo de residencia en comparación con un VAA de tipo salvaje. Por ejemplo, un virión de VAAr infeccioso objeto exhibe un tiempo de residencia que es al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces o más, más largo que el tiempo de residencia de un VAA de tipo salvaje.

Se puede determinar si un virión de VAAr infeccioso objeto dado presenta una unión reducida a un anticuerpo neutralizante y/o una mayor resistencia a un anticuerpo neutralizante mediante el uso de cualquier ensayo conveniente conocido por un experto en la técnica.

En algunos casos, un virión de VAAr infeccioso comprende proteínas Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40 de tipo salvaje. En otros casos, un virión de VAAr infeccioso comprende, además de una o más proteínas de la cápside variantes, una o más mutaciones en una o más de las proteínas Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40.

Ácidos nucleicos heterólogos

Una molécula de ADN heteróloga adecuada (también denominada en la presente descripción como "ácido nucleico heterólogo") para su uso en un vector de VAAr objeto (por ejemplo, un virión de VAAr infeccioso objeto) puede ser cualquier ácido nucleico heterólogo. En algunas modalidades, el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido (por ejemplo, una proteína que imparte alguna característica deseada a la célula diana, por ejemplo, una proteína fluorescente que permite el seguimiento celular, una enzima que proporciona una actividad ausente o alterada en la célula diana, etc.). En algunas modalidades, el ácido nucleico heterólogo comprende un agente de interferencia de ARN (como se definió anteriormente).

Un ácido nucleico heterólogo objeto generalmente tendrá un tamaño menor de aproximadamente 5 kilobases (kb) e incluirá, por ejemplo, un gen (una secuencia de nucleótidos) que codifica una proteína que está defectuosa o falta en un individuo receptor o célula diana; un gen que codifica una proteína que tiene un efecto biológico o terapéutico deseado (por ejemplo, una función antibacteriana, antiviral o antitumoral/anticancerosa); una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN que inhibe o reduce la producción de una proteína deletérea o no deseada (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica un agente de interferencia de ARN, como se define anteriormente); y/o una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína antigénica.

Los ácidos nucleicos heterólogos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos que codifican proteínas usadas para el tratamiento de trastornos endocrinos, metabólicos, hematológicos, cardiovasculares, neurológicos, musculoesqueléticos, urológicos, pulmonares e inmunitarios, incluyendo trastornos tales como enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias, crónicas y enfermedades infecciosas, como síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), cáncer, hipercolestemia, enfermedades de almacenamiento lisosómico como deficiencia de activador/gangliosidosis GM2, alfa-manosidosis, aspartilglucosaminuria, enfermedad por almacenamiento de éster de colesterol, deficiencia crónica de hexosaminidasa A, cistinosis, enfermedad de Danon, enfermedad de Fabry, Enfermedad de Farber, Fucosidosis, Galactosialidosis, Enfermedad de Gaucher, Gangliosidosis GM1, Enfermedad de células I/Mucolipidosis II, Enfermedad de almacenamiento de ácido siálico libre infantil/ISSD, Deficiencia de hexosaminidasa A juvenil, Enfermedad de Krabbe, Deficiencia de lipasa ácida lisosómica, Leucodistrofia metacromática, trastornos mucopolisacáridos (incluido polidistrofia Pseudo-Hurler/mucolipidosis IIIA, síndrome de Hurler MPSI, síndrome de Scheie MPSI, síndrome de Hurler-Scheie MPS I, síndrome de Hunter MPS II, síndrome de Sanfilippo tipo A/MPS III A, síndrome de Sanfilippo tipo B/MPS III B, síndrome de Sanfilippo tipo C/MPS III C, síndrome de Sanfilippo tipo D/MPS III D, Morquio tipo A/MPS IVA, Morquio tipo B/MPS IVB, MPS IX Deficiencia de hialuronidasa, MPS VI Maroteaux-Lamy, MPS VII Síndrome de Sly, Mucolipidosis I/Sialidosis, Mucolipidosis IIIC y Mucolipidosis tipo IV), Deficiencia de sulfatasa múltiple, Enfermedad de Niemann-Pick, Lipofuscinosis neuronal Ceroide, Enfermedad de Pompe/Enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II, Picnodisostosis, Enfermedad de Sandhoff/Inicio en la edad adulta/Gangliosidosis GM2, Enfermedad de Sandhoff/gangliosidosis GM2 - Infantil, Enfermedad de Sandhoff/Gangliosidosis GM2 - Juvenil, enfermedad de Schindler, enfermedad de Salla/enfermedad por almacenamiento de ácido siálico, gangliosidosis de Tay-Sachs/GM2 y enfermedad de Wolman, trastornos de la insulina como diabetes, trastornos del crecimiento, diversos trastornos de la sangre que incluyen diversas anemias, talasemias y hemofilia; defectos genéticos tales como fibrosis quística, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa (ADA), enfisema o similares.

Los ácidos nucleicos heterólogos adecuados incluyen, pero no se limitan a, los que codifican cualquiera de una variedad de proteínas, que incluyen, pero no se limitan a: un interferón (por ejemplo, IFN-y, IFN-a, IFN-p, IFN-w; IFN-^t); una insulina (por ejemplo, Novolin, Humulin, Humalog, Lantus, Ultralente, etc.); una eritropoyetina ("EPO"; por ejemplo, Procrit®, Eprex® o Epogen® (epoetina-a); Aranesp® (darbepoyetina-a); NeoRecormon®, Epogin® (epoetina-p); y similares); un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) (por ejemplo, Rituxan® (rituximab); Remicade® (infliximab); Herceptin® (trastuzumab); Humira™ (adalimumab); Xolair® (omalizumab); Bexxar® (tositumomab); Raptiva™ (efalizumab); Erbitux™ (cetuximab); Avastin® (bevacizumab); y similares), incluido un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, Lucentis® (ranibizumab)); un factor sanguíneo (por ejemplo, Activase® (alteplasa) activador de plasminógeno tisular; NovoSeven® (factor VIIa humano recombinante); Factor VIIa; Factor VIII (por ejemplo, Kogenate®); Factor IX; p-globina; hemoglobina; y similares); un factor estimulante de colonias (por ejemplo, Neupogen® (filgrastim; G-CSF); Neulasta (pegfilgrastim); factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-monocitos, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor estimulante de colonias de megacariocitos; y similares); una hormona del crecimiento (por ejemplo, una somatotropina, por ejemplo, Genotropin®, Nutropin®, Norditropin®, Saizen®, Serostim®, Humatrope®, etc.; una hormona del crecimiento humana; y similares); una interleucina (por ejemplo, IL-1; IL-2, que incluye, por ejemplo, Proleukin®; IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9; etc.); un factor de crecimiento (por ejemplo, Regranex® (beclapermin; PDGF); Fiblast® (trafermin; bFGF); Stemgen® (ancestim; factor de células madre); factor de crecimiento de queratinocitos; un factor de crecimiento de fibroblastos ácido, un factor de células madre, un fibroblasto básico factor de crecimiento, factor de crecimiento de hepatocitos y similares); un receptor soluble (por ejemplo, un receptor soluble de unión a TNF-a tal como Enbrel® (etanercept); un receptor de VEGF soluble; un receptor de interleucina soluble; un receptor de células T ^y/§ soluble; y similares); una enzima (por ejemplo, a-glucosidasa; Cerazyme® (imiglucarase; p-glucocerebrosidasa, Ceredase® (alglucerasa;); un activador enzimático (por ejemplo, activador de plasminógeno tisular); una quimiocina (por ejemplo, IP-10; Mig; Groa/IL-8, RANTES; MIP-1a; MIP-1p; MCP-1; PF-4; y similares); un agente angiogénico (por ejemplo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); un agente antiangiogénico (por ejemplo, un soluble Receptor VEGF); una vacuna proteica; un péptido neuroactivo como bradicinina, colecistoquinina, gastina, secretina, oxitocina, hormona liberadora de gonadotropina, beta-endorfina, encefalina, sustancia P, somatostatina, prolactina, galanina, hormona liberadora de hormona del crecimiento, bombesina, dinorfina, neurotensina, motilina, tirotropina, neuropéptido Y, hormona luteinizante, calcitonina, insulina, glucagón, vasopresina, angiotensina II, hormona liberadora de tirotropina, péptido intestinal vasoactivo, péptido del sueño, etc.; otras proteínas tales como un agente trombolítico, un péptido natriurético auricular, proteína morfogénica ósea, trombopoyetina, relaxina, fibrilación glial proteína ácida llary, hormona estimulante del folículo, una alfa-1 antitripsina humana, un factor inhibidor de la leucemia, un factor de crecimiento transformante, un factor de crecimiento similar a la insulina, una hormona luteinizante, un factor de activación de macrófagos, factor de necrosis tumoral, un factor quimiotáctico de neutrófilos, un factor de crecimiento nervioso; un inhibidor tisular de metaloproteinasas; un péptido intestinal vasoactivo, angiogenina, angiotropina, fibrina; hirudina; un factor inhibidor de la leucemia; un antagonista del receptor de IL-1 (por ejemplo, Kineret® (anakinra)); un canal iónico, por ejemplo, regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR); distrofina; utrofina, un supresor de tumores; a-glucosidasa ácida de la enzima lisosómica (GAA); y similares. Los ácidos nucleicos adecuados también incluyen aquellos que codifican un fragmento funcional de cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente; y ácidos nucleicos que codifican variantes funcionales de cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente.

Los ácidos nucleicos heterólogos adecuados también incluyen aquellos que codifican proteínas antigénicas. Un vector de VAAr objeto que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína antigénica es adecuado para estimular una respuesta inmunitaria a la proteína antigénica en un huésped mamífero. La proteína antigénica se deriva de un autoantígeno, un alérgeno, un antígeno asociado a un tumor/cáncer, un virus patógeno, una bacteria patógena, un protozoo patógeno, un helminto patógeno o cualquier otro organismo patógeno que infecte a un huésped mamífero. Como se usa en la presente, el término "un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica derivada de" incluye ácidos nucleicos que codifican proteínas antigénicas de tipo salvaje, por ejemplo, un ácido nucleico aislado de un virus patógeno que codifica una proteína viral; ácidos nucleicos sintéticos generados en el laboratorio que codifican proteínas antigénicas que son idénticas en secuencia de aminoácidos a una proteína antigénica de origen natural; ácidos nucleicos sintéticos generados en el laboratorio que codifican proteínas antigénicas que difieren en la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, de un aminoácido a aproximadamente 15 aminoácidos) de una proteína antigénica de origen natural, pero que, no obstante, inducen una respuesta inmunitaria a la correspondiente proteína antigénica de origen natural; ácidos nucleicos sintéticos generados en el laboratorio que codifican fragmentos de proteínas antigénicas (por ejemplo, fragmentos de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, cuyos fragmentos comprenden uno o más epítopos antigénicos), cuyos fragmentos inducen una respuesta inmunitaria a la correspondiente proteína antigénica de origen natural; etc.

De manera similar, una proteína antigénica "derivada de" un autoantígeno, un alérgeno, un antígeno asociado a un tumor/cáncer, un virus patógeno, una bacteria patógena, un protozoo patógeno, un helminto patógeno o cualquier otro organismo patógeno que infecte a un huésped mamífero, incluye proteínas que son idénticas en la secuencia de aminoácidos a una proteína antigénica de origen natural y proteínas que difieren en la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, de un aminoácido a aproximadamente 15 aminoácidos) de una proteína antigénica de origen natural, pero que no obstante inducir una respuesta inmunitaria a la correspondiente proteína antigénica de origen natural; y fragmentos de proteínas antigénicas (por ejemplo, fragmentos de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos, cuyos fragmentos comprenden uno o más epítopos antigénicos), cuyos fragmentos inducen una respuesta inmunitaria a la correspondiente proteína antigénica de origen natural.

En algunos casos, una respuesta inmunitaria a una proteína antigénica codificada por un vector objeto VAAr estimulará una respuesta inmunitaria protectora a un organismo patógeno que muestra la proteína antigénica o el epítopo antigénico (o a una proteína o un epítopo que tiene una reactividad cruzada con la proteína antigénica o los epítopos antigénicos codificados por el VAAr) en el hospedero mamífero. En algunos casos, se inducirá una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) a la proteína antigénica codificada por VAAr en el huésped mamífero. En otros casos, se inducirá una respuesta humoral a la proteína antigénica codificada por VAAr en el huésped mamífero, de manera que se generen anticuerpos específicos para la proteína antigénica. En muchos casos, se inducirá en el huésped mamífero una respuesta inmunitaria TH1 a la proteína antigénica codificada por VAAr. Las proteínas antigénicas adecuadas incluyen antígenos asociados a tumores/cáncer, antígenos virales, antígenos bacterianos y antígenos protozoarios; y fragmentos antigénicos de los mismos. En algunos casos, la proteína antigénica se deriva de un patógeno intracelular. En otros casos, la proteína antigénica es un autoantígeno. En otros casos más, la proteína antigénica es un alérgeno.

Los antígenos específicos de tumor/cáncer incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los diversos MAGE (antígeno E asociado al melanoma), incluido MAGe 1 (por ejemplo, número de acceso del GenBank M77481), MAGE 2 (por ejemplo, número de acceso del GenBank U03735), MAGE 3, MAGE 4, etc.; cualquiera de las diversas tirosinasas; ras mutante; p53 mutante (por ejemplo, números de acceso del GenBank X54156 y AA494311); y antígeno de melanoma p97 (por ejemplo, número de acceso del GenBank M12154). Otros antígenos específicos de tumores/cáncer incluyen el péptido Ras y el péptido p53 asociados con cánceres avanzados, los antígenos HPV 16/18 y E6/E7 asociados con cánceres de cuello uterino, el antígeno MUCI1-KLH asociado con carcinoma de mama (por ejemplo, número de acceso del GenBank J03651), CEA (antígeno carcinoembrionario) asociado con cáncer colorrectal (por ejemplo, número de acceso del GenBank X98311), gp100 (por ejemplo, número de acceso del GenBank S73003) o antígenos MART1 asociados con melanoma, y el antígeno PSA asociado con cáncer de próstata (por ejemplo, GenBank número de acceso X14810). La secuencia del gen p53 es conocida (véase, por ejemplo, Harris y otros (1986) Mol. Cell. Biol., 6:4650-4656) y está depositada en GenBank con el número de acceso M14694. Por tanto, las proteínas, ácidos nucleicos y/o viriones objeto pueden usarse como inmunoterapéuticos para cánceres que incluyen, pero no se limitan a, cánceres de cuello uterino, mama, colorrectal, próstata, pulmón y melanomas.

Los antígenos virales se derivan de agentes causales conocidos responsables de enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, sarampión, paperas, rubéola, poliomielitis, hepatitis A, B (por ejemplo, número de acceso del GenBank E02707) y C (por ejemplo, número de acceso del GenBank E06890), así como también otros virus de la hepatitis, influenza, adenovirus (por ejemplo, tipos 4 y 7), rabia (por ejemplo, número de acceso del GenBank M34678), fiebre amarilla, encefalitis japonesa (por ejemplo, número de acceso del GenBank E07883), dengue (por ejemplo, número de acceso del GenBank M24444), hantavirus y virus de inmunodeficiencia humana (por ejemplo, número de acceso del GenBank U18552).

Los antígenos bacterianos y parasitarios adecuados incluyen aquellos derivados de agentes causales conocidos responsables de enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, difteria, tosferina (por ejemplo, número de acceso del GenBank M35274), tétanos (por ejemplo, número de acceso del GenBank M64353), tuberculosis, neumonías bacterias y fúngicas (por ejemplo, Haemophilus influenzae, Pneumocystis carinii, etc.), cólera, fiebre tifoidea, peste, shigelosis, salmonelosis (por ejemplo, número de acceso del GenBank L03833), legionariopatía, enfermedad de Lyme (por ejemplo, número de acceso del GenBank U59487), malaria (por ejemplo, número de acceso del GenBank X53832), anquilostoma, oncocercosis (por ejemplo, número de acceso del GenBank M27807), esquistosomiasis (por ejemplo, número de acceso del GenBank L08198), tripanosomiasis, leshmaniasis, giardiasis (por ejemplo, número de acceso del GenBank M33641), amebiasis, filariasis (por ejemplo, número de acceso del GenBank J03266), borreliosis y triquinosis.

Los ácidos nucleicos heterólogos adecuados que codifican productos génicos heterólogos incluyen ARN no traducidos, tales como un agente ARNi (como se describe con mayor detalle anteriormente) (por ejemplo, un ARN antisentido; un ARNip; un ARNhc; un ARN bicatenario (ARNbc); un Agente CRISPR, por ejemplo, una proteína Cas9 o similar a Cas9, un ARN similar a ARNcr, un ARN similar a ARNtracr, un ARN guía único y/o un polinucleótido donante; y similares), una ribozima, etc. Pueden usarse agentes de ARNi para inhibir la expresión génica. Algunos agentes de ARNi proporcionan una herramienta que puede usarse subsecuentemente para inhibir la expresión génica (por ejemplo, un agente CRISPR tal como una proteína cas9 o similar a cas9).

Los genes diana incluyen cualquier gen que codifique un producto génico diana (ARN o proteína) que sea perjudicial (por ejemplo, patológico), por ejemplo, un producto génico diana que no funcione correctamente (por ejemplo, debido a una mutación en la secuencia de la proteína codificada, debido a una mutación en las secuencias no codificantes que controlan el nivel de estado estable del producto génico, etc.). Los productos de genes diana incluyen, pero no se limitan a, huntingtina; virus de la hepatitis C; virus de inmunodeficiencia humana; proteína precursora de amiloide; tau; una proteína que incluye una repetición de poliglutamina; un virus del herpes (por ejemplo, varicela zoster); cualquier virus patológico; y similares.

Como tal, un VAAr objeto que incluye un ácido nucleico heterólogo que codifica un agente de ARNi es útil para tratar una variedad de trastornos y afecciones, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, una enfermedad por repetición de trinucleótidos, tal como una enfermedad asociada con repeticiones de poliglutamina, por ejemplo, enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa, atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), atrofia dentato rubro pálido luisiana (DRPLA), etc.; una patología adquirida (por ejemplo, una enfermedad o síndrome manifestado por un estado fisiológico, bioquímico, celular, estructural o biológico molecular anormal) tal como una infección viral, por ejemplo, hepatitis que ocurre o puede ocurrir como resultado de una infección por VHC, síndrome de inmunodeficiencia adquirido, que ocurre como resultado de una infección por VIH; cáncer; y similares.

En muchas modalidades, un ácido nucleico heterólogo que codifica un agente de ARNi está ligado operativamente a un promotor. Los expertos en la técnica conocen promotores adecuados e incluyen el promotor de cualquier gen que codifica una proteína, por ejemplo, un gen regulado endógenamente o un gen expresado constitutivamente. Por ejemplo, los promotores de genes regulados por eventos fisiológicos celulares, por ejemplo, choque térmico, niveles de oxígeno y/o niveles de monóxido de carbono, por ejemplo, en hipoxia, pueden ligarse operativamente a un ácido nucleico que codifica ARNip.

La secuencia de nucleótidos heteróloga seleccionada, tal como el ácido nucleico de interés o que codifica EPO, está operativamente ligada a elementos de control que dirigen la transcripción o expresión de la misma en la secuencia de nucleótidos. in vivo. Dichos elementos de control pueden comprender secuencias de control normalmente asociadas con el gen seleccionado (por ejemplo, elementos de control celular endógenos). Alternativamente, pueden emplearse secuencias de control heterólogas. Las secuencias de control heterólogas útiles incluyen generalmente aquellas derivadas de secuencias que codifican genes de mamíferos o virales. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano de SV40, el promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus del tumor mamario de ratón; promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (HSV), un promotor celular endógeno que es heterólogo del gen de interés, un promotor del citomegalovirus (CMV) tal como la región promotora temprana inmediata del CMV (CMVIE), un promotor del virus del sarcoma rous (RSV), sintético promotores, promotores híbridos y similares. Además, las secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de la metalotioneína murina, también encontrarán uso en la presente descripción. Dichas secuencias promotoras están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Stratagene (San Diego, cA).

En algunas modalidades, el promotor específico del tipo celular o específico del tejido estará ligado operativamente al ácido nucleico heterólogo que codifica el producto génico heterólogo, de manera que el producto génico se produzca de forma selectiva o preferencial en un tipo(s) celular(es) o tejido(s) particular es). En algunas modalidades, un promotor inducible estará ligado operativamente al ácido nucleico heterólogo.

Por ejemplo, los promotores inducibles y específicos de músculo, potenciadores y similares son útiles para la suministro de un producto génico a una célula muscular. Dichos elementos de control incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de las familias de genes de actina y miosina, tales como de la familia de genes myoD; el factor de unión potenciador específico de miocitos MEF-2; elementos de control derivados del gen de la actina esquelética humana y del gen de la actina cardíaca; elementos de la secuencia de la creatina quinasa muscular y el elemento potenciador de la creatina quinasa murina (mCK); elementos de control derivados del gen de la troponina C de contracción rápida esquelética, el gen de la troponina C cardíaca de contracción lenta y el gen de la troponina I de contracción lenta; factores nucleares inducibles por hipoxia; elementos y promotores inducibles por esteroides, tales como el elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE); el elemento de consenso de fusión para la inducción de RU486; y elementos que proporcionan la expresión génica regulada por tetraciclina.

El vector de expresión de VAA que alberga la molécula de ADN de interés (el ADN heterólogo) unido por las ITR de VAA, puede construirse insertando directamente la secuencia o secuencias seleccionadas en un genoma de VAA que ha tenido los principales marcos de lectura abiertos de VAA ("ORF") extirpado de los mismos. También pueden eliminarse otras porciones del genoma de VAA, siempre que quede una porción suficiente de las ITR para permitir las funciones de replicación y empaquetamiento. Dichas construcciones pueden diseñarse mediante el uso de técnicas bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núm. 5,173,414 y 5,139,941; Publicaciones Internacionales núm. WO 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); Lebkowski y otros (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent y otros (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, BJ (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling y Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; y Zhou y otros (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.

Alternativamente, las ITR de VAA pueden escindirse del genoma viral o de un vector de VAA que contiene el mismo y fusionar 5' y 3' de una construcción de ácido nucleico seleccionada que está presente en otro vector mediante el uso de cualquier método conveniente conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, un enfoque adecuado usa técnicas de ligadura estándar, tales como las descritas en Sambrook y otros, supra. Por ejemplo, las ligaduras pueden realizarse en Tris-Cl 20 mM pH 7,5, MgCl 10 mM² , DTT 10 mM, 33 pg/mL BSA, NaCl 10 mM-50 mM, y ATP 40 pM, 0,01-0,02 (Weiss) unidades de ADN ligasa T4 de 0 °C a 16 °C (para la ligadura del "extremo pegajoso") o 1 ATP mM, 0,3-0,6 (Weiss) unidades de ADN ligasa de T4 a 14 °C (para la ligadura de "extremos romos"). Las ligaduras intermoleculares de "extremos pegajoso" se realizan normalmente a concentraciones de ADN total de 30­ 100 |jg/mL (concentración final total de 5-100 nM). Los vectores VAA que contienen ITR se han descrito en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,139,941. En particular, allí se describen varios vectores VAA que están disponibles en la American Type Culture Collection ("ATCC") con los números de acceso 53222, 53223, 53224, 53225 y 53226.

Adicionalmente, los genes quiméricos pueden producirse sintéticamente para incluir secuencias de ITR de VAA dispuestas en 5' y 3' de una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas. Pueden usarse codones preferidos para la expresión de la secuencia del gen quimérico en células de músculo de mamífero. La secuencia quimérica completa se ensambla a partir del solapamiento de oligonucleótidos preparados mediante métodos estándar. Ver, por ejemplo, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair y otros Science (1984) 223:1299; Jay y otros J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.

Generación de viriones de VAAr infecciosos objeto

A modo de introducción, es típico emplear una célula huésped o "productora" para la replicación y empaquetamiento del vector VAAr. Dicha célula productora (normalmente una célula huésped de mamífero) generalmente comprende o se modifica para que comprenda varios tipos diferentes de componentes para la producción de VAAr. El primer componente es un genoma de vector viral adenoasociado recombinante (VAAr) (o "ProVector de VAAr") que puede ser replicado y empaquetado en partículas de vector por la célula de empaquetamiento huésped. El ProVector de VAAr normalmente comprenderá un polinucleótido heterólogo (o "transgén"), con el que se desea alterar genéticamente otra célula en el contexto de la terapia génica (ya que el empaquetamiento de dicho transgén en partículas de vector de VAAr puede usarse de manera efectiva para suministrar el transgén a una variedad de células de mamíferos). El transgén generalmente está flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) de VAA que comprenden secuencias que se reconocen durante la escisión, replicación y empaquetamiento del vector de VAA, así como también durante la integración del vector en el genoma de una célula huésped.

Un segundo componente es un virus auxiliar que puede proporcionar funciones auxiliares para la replicación de VAA. Aunque comúnmente se emplea adenovirus, también pueden usarse otros virus auxiliares como se conoce en la técnica. Alternativamente, las funciones de virus auxiliares requeridas pueden aislarse genéticamente de un virus auxiliar y los genes codificantes pueden usarse para proporcionar funciones de virus auxiliares en trans. Los elementos del vector de VAA y el virus auxiliar (o funciones del virus auxiliar) pueden introducirse en la célula huésped de forma simultánea o secuencial en cualquier orden.

Los componentes finales para la producción de VAA que se proporcionarán en la célula productora son "genes de empaquetamiento de VAÁ' tal como los genes rep y cap de VAA que proporcionan proteínas de replicación y encapsidación, respectivamente. Se pueden proporcionar varias versiones diferentes de genes de empaquetamiento de VAA (incluidos casetes rep y cap unidos y casetes rep y/o cap separados en los que los genes rep y/o cap pueden dejarse bajo el control de los promotores nativos o ligado operativamente a promotores heterólogos. Dichos genes de empaquetamiento de vAa pueden introducirse de forma transitoria o estable en la célula de empaquetamiento huésped, como se conoce en la técnica y se describe con más detalle a continuación.

1. Vector VAAr

Un virión de VAAr objeto, que incluye el ADN heterólogo de interés (donde el "ADN heterólogo de interés" también se denomina como "ácido nucleico heterólogo" en la presente descripción), puede producirse mediante el uso metodología estándar, conocida por los expertos en la técnica. Los métodos implican generalmente las etapas de (1) introducir un vector de VAAr objeto en una célula huésped; (2) introducir una construcción auxiliar de Vá A en la célula huésped, donde la construcción auxiliar incluye regiones codificantes de VAA que se expresan en la célula huésped para complementar las funciones auxiliares de VAA que faltan del vector VAA; (3) introducir uno o más virus auxiliares y/o vectores de función accesoria en la célula huésped, en donde el virus auxiliar y/o vectores de función accesoria proporcionan funciones accesorias capaces de soportar la producción de virión VAÁ recombinante eficiente ("VAAr") en la célula huésped; y (4) cultivar la célula huésped para producir viriones VAAr. El vector de expresión VAA, construcción auxiliar VAA y el virus auxiliar o vector(es) de función accesoria pueden introducirse en la célula huésped ya sea simultáneamente o en serie, mediante el uso de técnicas de transfección estándar.

Los vectores de expresión de VAA se construyen mediante el uso de técnicas conocidas para proporcionar al menos como componentes ligados operativamente en la dirección de la transcripción, elementos de control que incluyen una región de inicio de la transcripción, el ADN de interés y una región de terminación de la transcripción. Los elementos de control se seleccionan para que sean funcionales en una célula de músculo de mamífero. La construcción resultante que contiene los componentes ligados operativamente está unida (5' y 3') con secuencias de ITR de VAA funcionales.

Las secuencias nucleotídicas opcionales de las regiones ITR de VAA son conocidas. Ver, por ejemplo, Kotin, R. M. (1994) “Human Gene Therapy” 5:793-801; Berns, K. I. “Parvoviridae and their Replication” en Fundamental Virology, 2da Edición, (B. N. Fields y D. M. Knipe, editores.)para la secuencia de VAA-2. Las ITR de VAA usadas en los vectores de la invención no necesitan tener una secuencia de nucleótidos de tipo salvaje y pueden alterarse, por ejemplo, mediante la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos. Adicionalmente, los ITR de VAA pueden derivarse de cualquiera de varios serotipos de VAA, que incluyen, pero no se limitan a, VAA-1, VAA-2, VAA-3, VAA-4, VAA-5, VAA-7, etc. Además, las ITR 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de expresión de VAA no necesitan ser necesariamente idénticas o derivadas del mismo serotipo o aislado de VAA, siempre que funcionen según lo previsto, es decir, para permitir la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un vector o genoma de la célula huésped, y para permitir la integración de la molécula de ADN en el genoma de la célula receptora cuando los productos del gen Rep de VAA están presentes en la célula. Las ITR permiten la replicación de la secuencia del vector en presencia de una mezcla apropiada de proteínas Rep. Las ITR también permiten la incorporación de la secuencia del vector en la cápside para generar una partícula de VAA. Para producir viriones de VAAr, se introduce un vector de expresión de VAA en una célula huésped adecuada mediante el uso de técnicas conocidas, tal como por transfección. Generalmente, se conocen en la técnica varias técnicas de transfección. Ver, por ejemplo, Graham y otros (1973) Virology, 52:456, Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis y otros (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu y otros (1981) Gene 13:197. Los métodos de transfección particularmente adecuados incluyen la coprecipitación con fosfato de calcio (Graham y otros (1973) Virol. 52:456-467), microinyección directa en células cultivadas (Capecchi, M.R. (1980) Cell 22: 479-488), electroporación (Shigekawa y otros (1988) BioTechnigues 6:742-751), transferencia génica mediada por liposomas (Mannino y otros (1988) BioTechniques 6:682-690), transducción mediada por lípidos (Felgner y otros (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417), y suministro de ácido nucleico mediante el uso de microproyectiles de alta velocidad (Klein y otros (1987) Nature 327:70-73).

Para los propósitos de esta descripción, las células huésped adecuadas para producir viriones de VAAr incluyen microorganismos, células de levadura, células de insectos y células de mamíferos, que pueden usarse, o se han usado, como receptores de una molécula de ADN heteróloga. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Por tanto, una "célula huésped" para producir viriones de VAAr generalmente se refiere a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógena. Las células de la línea celular humana estable, 293 (fácilmente disponibles a través de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de acceso ATCC CRL1573) se usan en muchas modalidades. Particularmente, la línea celular humana 293 es una línea celular de riñón embrionario humano que se ha transformado con fragmentos de ADN de adenovirus tipo 5 (Graham y otros (1977) J. Gen. Virol. 36:59), y expresa los genes E1a y E1b de adenovirus (Aiello y otros (1979) Virology 94:460). La línea celular 293 se transfecta fácilmente y proporciona una plataforma particularmente conveniente en la que producir viriones VAAr.

2. Funciones auxiliares de VAA

Las células huésped que contienen los vectores de expresión de VAA descritos anteriormente deben volverse capaces de proporcionar funciones auxiliares de VAA con el fin de replicar y encapsidar las secuencias de nucleótidos flanqueadas por las ITR de VAA para producir viriones de VAAr. Las funciones auxiliares de VAA son generalmente secuencias codificantes derivadas de VAA que pueden expresarse para proporcionar productos génicos de VAA que, a su vez, funcionan en trans para la replicación productiva de VAA. Las funciones auxiliares de VAA se usan en la presente descripción para complementar las funciones de VAA necesarias que faltan en los vectores de expresión de VAA. Por lo tanto, las funciones auxiliares de VAA incluyen uno o ambos de los principales ORF de VAA, específicamente, las regiones codificantes rep y cap, u homólogos funcionales de las mismas. En el contexto de la presente descripción, las funciones de cap incluyen una o más proteínas de la cápside mutantes, en donde al menos una proteína de la cápside comprende al menos una mutación, como se describió anteriormente. Por "región codificante de rep de VAA" se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de VAA que codifica las proteínas de replicación Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40. Se ha demostrado que estos productos de expresión de Rep poseen muchas funciones, incluido el reconocimiento, la unión y el corte del origen de la replicación del ADN del VAA, la actividad de la helicasa del ADN y la modulación de la transcripción de los promotores del VAA (u otros heterólogos). Los productos de expresión de Rep se requieren colectivamente para replicar el genoma de VAA. Para una descripción de la región codificante de rep de VAA, véase, por ejemplo, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. e Immunol. 158:97-129; y Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801. Los homólogos adecuados de la región codificante de rep de VAA incluyen el gen rep del herpesvirus humano 6 (HHV-6) que también se sabe que media la replicación del ADN de ^vAA-2 (Thomson y otros (1994) Virology 204:304-311).

Las proteínas cap de VAA incluyen VP1, VP2 y VP3, en donde al menos una de VP1, VP2 y VP3 comprende al menos una mutación, como se describe anteriormente.

Las funciones auxiliares de VAA se introducen en la célula huésped transfectando la célula huésped con una construcción auxiliar de VAA antes o simultáneamente que la transfección del vector de expresión de VAA. Por lo tanto, las construcciones auxiliares de VAA se usan para proporcionar al menos una expresión transitoria de los genes rep y/o cap de VAA para complementar las funciones de VAA faltantes que son necesarias para la infección por VAA productiva. Las construcciones auxiliares de VAA carecen de ITR de VAA y no pueden replicarse ni empaquetarse por sí mismas. Estas construcciones pueden estar en forma de plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se han descrito varias construcciones auxiliares de VAA, tales como los plásmidos pVAA/Ad y pIM29+45 usados comúnmente que codifican productos de expresión tanto Rep como Cap. Ver por ejemplo, Samulski y otros (1989) J. Virol. 63:3822-3828; y McCarty y otros (1991) J. Virol. 65:2936-2945. Se han descrito varios otros vectores que codifican productos de expresión Rep y/o Cap. Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núm. 5,139,941.

Tanto los vectores de expresión de VAA como las construcciones auxiliares de VAA pueden construirse para contener uno o más marcadores seleccionables opcionales. Los marcadores adecuados incluyen genes que confieren resistencia o sensibilidad a los antibióticos, imparten color o cambian las características antigénicas de aquellas células que han sido transfectadas con una construcción de ácido nucleico que contiene el marcador seleccionable cuando las células crecen en un medio selectivo apropiado. Varios genes marcadores seleccionables que son útiles en la práctica de los métodos de la descripción incluyen el gen de resistencia a la higromicina B (que codifica la aminoglucósido fosfotranferasa (APH)) que permite la selección en células de mamífero al conferir resistencia a la higromicina; el gen de la neomicina fosfotranferasa (que codifica la neomicina fosfotransferasa) que permite la selección en células de mamífero al conferir resistencia a G418; y similares. Los expertos en la técnica conocen otros marcadores adecuados.

3. Funciones de los accesorios VAA

La célula huésped (o célula de empaquetamiento) también debe volverse capaz de proporcionar funciones no derivadas de ^vA^a , o "funciones accesorias", para producir viriones de VAAr. Las funciones accesorias son funciones virales y/o celulares no derivadas de VAA de las que VAA depende para su replicación. Por lo tanto, las funciones accesorias incluyen al menos aquellas proteínas y ARN que no son de VAA que se requieren en la replicación de VAA, incluidas las implicadas en la activación de la transcripción del gen de VAA, empalme de ARNm de VAA específico de etapa, replicación de ADN de VAA, síntesis de productos de expresión de Cap y ensamblaje de la cápside de VAA. Las funciones accesorias basadas en virus pueden derivarse de cualquiera de los virus auxiliares conocidos.

Particularmente, las funciones accesorias pueden introducirse y luego expresarse en las células huésped mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Comúnmente, las funciones accesorias se proporcionan mediante la infección de las células huésped con un virus auxiliar no relacionado. Se conocen varios virus auxiliares adecuados, incluidos los adenovirus; virus del herpes tal como los virus del herpes simple de tipos 1 y 2; y virus vaccinia. Las funciones accesorias no virales también encontrarán uso en la presente descripción, tales como las proporcionadas por la sincronización celular mediante el uso de cualquiera de los diversos agentes conocidos. Ver, por ejemplo, Buller y otros (1981) J. Virol. 40:241-247; McPherson y otros (1985) Virology 147:217-222; Schlehofer y otros (1986) Virology 152:110-117.

Alternativamente, las funciones accesorias pueden proporcionarse mediante el uso de un vector de funciones accesorias. Los vectores de funciones accesorias incluyen secuencias de nucleótidos que proporcionan una o más funciones accesorias. Un vector de función accesoria es capaz de introducirse en una célula huésped adecuada con el fin de apoyar la producción eficiente del virión VAA en la célula huésped. Los vectores de funciones accesorias pueden estar en forma de plásmido, fago, transposón, cósmido u otro virus. Los vectores accesorios también pueden estar en forma de uno o más fragmentos de ADN o ARN linealizados que, cuando se asocian con los elementos de control y enzimas apropiados, pueden transcribirse o expresarse en una célula huésped para proporcionar funciones accesorias.

Las secuencias de ácido nucleico que proporcionan las funciones accesorias pueden obtenerse de fuentes naturales, tales como el genoma de una partícula de adenovirus, o construirse mediante el uso de métodos recombinantes o sintéticos conocidos en la técnica. Con respecto a esto, las funciones accesorias derivadas de adenovirus se han estudiado ampliamente y se han identificado y caracterizado parcialmente varios genes de adenovirus implicados en funciones accesorias. Ver, por ejemplo, Carter, B.J. (1990) "Adeno-Associated Virus Helper Functions", en CRC Handbook of Parvoviruses, volumen I (P. Tijssen, editor), y Muzyczka, N. (1992) Curr. Topics. Microbiol. and Immun. 158:97-129. Específicamente, se cree que las regiones de genes adenovirales tempranos E1a, E2a, E4, ARN VAI y, posiblemente, E1b participan en el proceso accesorio. Janik y otros (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925-1929. Se han descrito funciones accesorias derivadas de herpesvirus. Ver, por ejemplo, Young y otros (1979) Prog. Med. Virol. 25:113. También se han descrito funciones accesorias derivadas del virus Vaccinia. Ver, por ejemplo, Carter, B.J. (1990), supra., Schlehofer y otros (1986) Virology 152:110-117.

Como consecuencia de la infección de la célula huésped con un virus auxiliar, o la transfección de la célula huésped con un vector de función accesoria, se expresan funciones accesorias que transactivan la construcción auxiliar de VAA para producir proteínas Rep y/o Cap de VAA. Los productos de expresión de Rep escinden el ADN recombinante (incluido el ADN de interés, por ejemplo, el ácido nucleico heterólogo) del vector de expresión de VAA. Las proteínas Rep también sirven para duplicar el genoma de VAA. Las proteínas Cap expresadas se ensamblan en cápsides y el genoma de VAA recombinante se empaqueta en las cápsides. Por lo tanto, se produce una replicación productiva de VAA y el ADN se empaqueta en viriones de VAAr.

Después de la replicación de VAA recombinante, los viriones de VAAr pueden purificarse de la célula huésped mediante el uso de una variedad de métodos de purificación convencionales, tales como gradientes de CsCl.

Además, si se emplea una infección para expresar las funciones accesorias, el virus auxiliar residual puede inactivarse mediante el uso de métodos conocidos. Por ejemplo, el adenovirus puede inactivarse calentando a temperaturas de aproximadamente 60 °C durante, por ejemplo, 20 minutos o más. Este tratamiento inactiva de manera efectiva sólo el virus auxiliar ya que el VAA es extremadamente estable al calor mientras que el adenovirus auxiliar es termolábil.

Los viriones de VAAr resultantes están entonces listos para su uso para la suministro de ADN, como en aplicaciones de terapia génica, o para la suministro de un producto génico a un huésped mamífero.

Suministro de un ácido nucleico heterólogo

La presente descripción proporciona además métodos para suministrar un ácido nucleico heterólogo a una célula diana y/o a un individuo que lo necesite. En algunas modalidades, un individuo que lo necesita es un ser humano que ha estado previamente expuesto de forma natural a VAA y, como resultado, alberga anticuerpos anti-VAA (es decir, anticuerpos neutralizantes de VAA). Según los resultados positivos de los ensayos clínicos que implican el suministro de genes VAA, por ejemplo, en el hígado, el músculo y la retina (todos los tejidos afectados por anticuerpos neutralizantes contra este vehículo), existen muchas aplicaciones terapéuticas/enfermedades dianas de este tipo.

Un método objeto generalmente implica: (i) administrar una cantidad efectiva de un virión de VAAr objeto a un individuo, y/o (ii) poner en contacto una célula diana con un virión objeto. Generalmente, los viriones VAAr se administran a un sujeto mediante el uso de técnicas de transducción ya sea, in vivo ("directo") o in vitro(“indirectas”). Si se transduce in vitro ("indirectamente"), una célula receptora deseada (es decir, "célula diana") puede obtenerse del individuo, transducirse con viriones VAAr y reintroducirse en el individuo. Alternativamente, pueden usarse células singénicas o xenogénicas cuando esas células no generarán una respuesta inmunitaria inapropiada en el individuo.

Se han descrito métodos adecuados para el suministro e introducción de células diana transducidas en un individuo. Por ejemplo, las células pueden transducirse in vitro combinando viriones de VAA recombinantes con células, por ejemplo, en medios apropiados, y rastreando aquellas células que albergan el ADN de interés mediante el uso de técnicas convencionales tales como transferencias Southern y/o PCR, o usando marcadores seleccionables. A continuación, las células transducidas pueden formularse en composiciones farmacéuticas, que se describen con más detalle más abajo, y la composición puede introducirse en el sujeto mediante diversas técnicas, tales como inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea e intraperitoneal.

Para in vivo (es decir, suministro "directa"), los viriones de VAAr se formularán en composiciones farmacéuticas y generalmente se administrarán por vía parenteral (por ejemplo, administrados por vía intramuscular, subcutánea, intratumoral, transdérmica, intratecal, intravenosa, etc.).

Las composiciones farmacéuticas comprenderán suficiente material genético para producir una cantidad terapéuticamente efectiva del producto de expresión génica de interés, es decir, una cantidad suficiente para reducir o mejorar los síntomas del estado patológico en cuestión o una cantidad suficiente para conferir el beneficio deseado. Las composiciones farmacéuticas también contendrán un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición y que pueda administrarse sin una toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Pueden incluirse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Adicionalmente, pueden estar presentes en tales vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tampones del pH y similares. Se conoce en la técnica una amplia variedad de excipientes farmacéuticamente aceptables y no es necesario analizarlos en detalle en la presente descripción. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se han descrito ampliamente en una variedad de publicaciones, que incluyen, por ejemplo, A. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20ma edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel y otros, editores, 7ma edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe y otros,editores, 3ra edición. Amer. Pharmaceutical Assoc. Las dosis apropiadas dependerán del mamífero que se esté tratando (por ejemplo, primate humano o no humano u otro mamífero), la edad y el estado general del sujeto que se va a tratar, la gravedad del estado que se está tratando, la proteína terapéutica particular en cuestión, su modo de administración, entre otros factores. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad efectiva apropiada.

Por lo tanto, una cantidad terapéuticamente efectiva se situará en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos clínicos. Por ejemplo, para la inyección in vivo, es decir, la inyección directamente en el músculo esquelético o cardíaco, una dosis terapéuticamente efectiva será del orden de aproximadamente 106 a aproximadamente 1015 de los viriones VAAr, por ejemplo, de aproximadamente 108 a 1012 viriones VAAr. Para transducción in vitro, una cantidad efectiva de viriones de VAAr que se suministrarán a las células será del orden de aproximadamente 108 a aproximadamente 1013 de los viriones VAAr. Un experto en la técnica puede establecer fácilmente otras dosificaciones eficaces mediante ensayos de rutina que establezcan curvas de respuesta a la dosis. La dosificación del tratamiento puede ser por un esquema de dosis única o un esquema de múltiples dosis. Así mismo, al sujeto se le pueden administrar tantas dosis como sea apropiado. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un número apropiado de dosis.

Las células de interés (es decir, "células diana") son típicamente de mamíferos, donde el término se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, laboratorio, deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, ratones, ratas, conejos, etc. En algunas modalidades, la célula diana es una célula humana.

Las células diana de interés incluyen cualquier célula susceptible de infección por un virión de VAAr objeto. En algunos casos, por ejemplo, cuando el método es un método para suministrar un ácido nucleico heterólogo a una célula objetivo, la célula objetivo puede ser una célula extraída de un individuo (por ejemplo, una célula "primaria"), o la célula objetivo puede ser una célula de cultivo de tejidos (por ejemplo, de una línea celular establecida).

Las células diana ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, células hepáticas, células pancreáticas (por ejemplo, células de los islotes: células alfa, células beta, células delta, células gamma y/o células épsilon), células del músculo esquelético, células del músculo cardíaco, fibroblastos, células retinianas, células de la articulación sinovial, células pulmonares, células T, neuronas, células gliales, células madre, células progenitoras hematopoyéticas, células progenitoras neurales, células endoteliales y células cancerosas. Las células diana de células madre ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, células madre hematopoyéticas, células madre neurales, células madre de la cresta neural, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas (células iPS), células madre mesenquimales, células madre mesodérmicas, células madre hepáticas, células madre pancreáticas, células madre musculares y células madre retinianas.

El término "célula madre" se usa en la presente descripción para referirse a una célula de mamífero que tiene la capacidad tanto de autorrenovarse como de generar una progenie diferenciada (véase, por ejemplo, Morrison y otros (1997) Cell 88:287-298). Generalmente, las células madre también tienen una o más de las siguientes propiedades: la capacidad de experimentar una replicación asincrónica o simétrica, que es donde las dos células hijas después de la división pueden tener diferentes fenotipos; amplia capacidad de autorrenovación; capacidad de existencia en forma mitóticamente inactiva; y regeneración clonal de todo el tejido en el que existen, por ejemplo, la capacidad de las células madre hematopoyéticas para reconstituir todos los linajes hematopoyéticos. Como apreciará un experto en la técnica, las "células progenitoras" se diferencian de las células madre en que típicamente no tienen la capacidad de autorrenovación extensa y, a menudo, pueden generar un subconjunto más restringido de los linajes en el tejido a partir del cual derivan, por ejemplo, sólo linajes linfoides o eritroides en un entorno hematopoyético. Como se usa en la presente, el término "célula madre" abarca tanto "células madre" como "células progenitoras" como se definió anteriormente.

Las células madre pueden caracterizarse tanto por la presencia de marcadores asociados con epítopos específicos identificados por anticuerpos como por la ausencia de ciertos marcadores identificados por la falta de unión de anticuerpos específicos. Las células madre también pueden identificarse mediante ensayos funcionales tanto in vitro e in vivo, particularmente ensayos relacionados con la capacidad de las células madre para dar lugar a una progenie diferenciada múltiple.

Las células madre adecuadas de interés incluyen, pero no se limitan a: células madre hematopoyéticas y células progenitoras derivadas de las mismas (patente de los Estados Unidos núm. 5,061,620); células madre de la cresta neural (véase Morrison y otros (1999) Cell 96:737-749); células madre neurales y células progenitoras neurales; células madre embrionarias; células madre mesenquimales; células madre mesodérmicas; células madre hepáticas, células madre musculares, células madre retinianas, células madre pluripotentes inducidas (células iPS), etc. Otras células "progenitoras" hematopoyéticas de interés incluyen células dedicadas a linajes linfoides, por ejemplo, células T inmaduras y poblaciones de células B.

Pueden usarse poblaciones purificadas de células madre o progenitoras. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas humanas pueden seleccionarse positivamente mediante el uso de anticuerpos específicos para CD34, thy-1; o seleccionado negativamente mediante el uso de marcadores específicos de linaje que pueden incluir glicoforina A, CD3, CD24, CD16, CD14, CD38, CD45RA, CD36, CD2, CD19, CD56, CD66a y CD66b; marcadores específicos de células T, marcadores específicos de tumores/cáncer, etc. Los marcadores útiles para la separación de células madre mesodérmicas incluyen FcyRII, FcyRIII, Thy-1, CD44, VLA-4a, LFA-1p, HsA, ICAM-1, CD45, Aa4.1, Sca-1, etc. Las células madre de la cresta neural pueden seleccionarse positivamente con anticuerpos específicos para el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR), y seleccionarse negativamente para los marcadores sulfatida, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína de mielina Po, periferina y neurofilamento. Las células madre mesenquimales humanas pueden separarse positivamente mediante el uso de los marcadores SH2, SH3 y SH4.

Las células diana que se emplean pueden ser frescas, congeladas o haber sido sometidas a cultivo previo. Pueden ser fetales, de recién nacidos, de adultos. Las células hematopoyéticas pueden obtenerse de hígado fetal, médula ósea, sangre, particularmente G-CSF o sangre periférica movilizada con GM-CSF, o cualquier otra fuente convencional. La manera en que las células madre se separan de otras células del linaje hematopoyético o de otro linaje no es crítica para esta descripción. Como se describió anteriormente, puede obtenerse una población sustancialmente homogénea de células madre o progenitoras mediante el aislamiento selectivo de células libres de marcadores asociados con células diferenciadas, mientras que muestran características epitópicas asociadas con las células madre.

Los ácidos nucleicos que pueden suministrarse a un individuo incluyen cualquiera de los ácidos nucleicos heterólogos definidos anteriormente. Las proteínas que pueden suministrarse mediante el uso un método objeto también incluyen un fragmento funcional de cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente; y variantes funcionales de cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente.

En algunas modalidades, se produce una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína en el huésped mamífero. Si se produce una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína particular en el huésped mamífero mediante el uso de un método objeto se determina fácilmente mediante el uso de ensayos apropiados para la proteína particular. Por ejemplo, cuando la proteína es EPO, se mide el hematocrito.

Cuando el VAAr codifica una proteína antigénica, las proteínas antigénicas adecuadas que pueden suministrarse a un individuo mediante el uso de un método objeto incluyen, pero no se limitan a, antígenos asociados al tumor/cáncer, autoantígenos (antígenos "propios"), antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos protozoarios y alérgenos; y fragmentos antigénicos de los mismos. En algunos casos, se inducirá una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) a la proteína antigénica codificada por VAAr en el huésped mamífero. En otros casos, se inducirá una respuesta humoral a la proteína antigénica codificada por VAAr en el huésped mamífero, de manera que se generen anticuerpos específicos para la proteína antigénica. En muchos casos, se inducirá en el huésped mamífero una respuesta inmunitaria TH1 a la proteína antigénica codificada por VAAr. Si se ha generado una respuesta inmunitaria a la proteína antigénica se determina fácilmente mediante el uso de métodos bien establecidos. Por ejemplo, puede usarse un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima para determinar si se ha generado un anticuerpo contra una proteína antigénica. Los métodos para detectar CTL específicos de antígeno se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, una célula diana marcada de forma detectable que expresa la proteína antigénica en su superficie se usa para analizar la presencia de CTL específicos de antígeno en una muestra de sangre.

Si se ha suministrado una cantidad terapéuticamente efectiva de un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido, un agente de ARNi, etc.) a un huésped mamífero mediante el uso de un método objeto se determina fácilmente mediante el uso de cualquier ensayo apropiado. Por ejemplo, cuando el producto génico es un agente ARNi que inhibe el VIH, puede medirse la carga viral.

Métodos de generación e identificación de viriones de VAAr modificados

La presente descripción proporciona un método para generar e identificar un virión de virus adenoasociado recombinante infeccioso modificado (VAAr) que comprende una proteína de la cápside variante que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos (incluidas deleciones, inserciones, etc.) en comparación a una proteína de la cápside de VAA inicial. Una proteína de la cápside de VAA iniciadora comprende una secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33.

El método generalmente implica generar una biblioteca de viriones de VAAr mutante; y seleccionar la biblioteca para viriones de VAAr modificados con propiedades alteradas con relación a un virión de VAAr iniciador. El virión iniciador de VAAr comprende una proteína de la cápside de VAA variante que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33. La presente descripción proporciona además bibliotecas y composiciones que comprenden las bibliotecas.

En algunos casos, una etapa de selección dada se repite dos, tres, cuatro o más veces para enriquecer una biblioteca de VAA objeto en busca de propiedades de virión alteradas. En algunos casos, siguiendo la selección de una biblioteca de VAA, se aíslan y secuencian clones individuales.

Generación de una biblioteca de VAA mutante

Se genera una biblioteca de VAA mutante que comprende una o más mutaciones con relación a un gene cap iniciador del VAA. Un gen iniciador cap es un cap que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de VAA variante que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33. Mutaciones en el gene cap del VAAr se generan mediante el uso de cualquier método conocido. Métodos adecuados para la mutagénesis de un gen cap iniciador de un VAA incluyen, pero no se limitan a, un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis de saturación, mutagénesis de intercambio de bucles, mutagénesis de mezcla de fragmentos (es decir, mezcla de ADN) y similares. Los métodos para generar mutaciones están bien descritos en la técnica. Ver, por ejemplo, Zhao y otros Nat Biotechnol. marzo de 1998;16(3):234-5; Koerber y otros; Mol Ther. octubre de 2008;16(10):1703-9; Koerber y otros; Mol Ther. Diciembre de 2009; 17 (12):2088-95; patente de Estados Unidos núm. 6,579,678; Patente de Estados Unidos núm. 6,573,098; y Patente de Estados Unidos núm. 6,582,914; todos los cuales son por sus enseñanzas relacionadas con la mutagénesis.

En algunos casos, una biblioteca de VAA mutante que comprende mutaciones en el gen cap se generará mediante el uso de un proceso de extensión escalonado. El proceso de extensión escalonada implica la amplificación del gen cap mediante el uso de un método basado en PCR. La plantilla del gen cap se ceba mediante el uso de cebadores de PCR específicos, seguido de ciclos repetidos de desnaturalización y de hibridación/extensión muy corta catalizada por polimerasa. En cada ciclo, los fragmentos en crecimiento se aparean con diferentes plantillas en función de la complementariedad de la secuencia y se extienden más. Los ciclos de desnaturalización, hibridación y extensión se repiten hasta que se forman secuencias de longitud completa. Las secuencias de longitud completa resultantes incluyen al menos una mutación en el gen cap en comparación con un gen cap del VAA de tipo salvaje. Los productos de PCR que comprenden las secuencias cap de VAA que incluyen una o más mutaciones se insertan en un plásmido que contiene un genoma de VAA de tipo salvaje. El resultado es una biblioteca de VAA cap mutantes. Por lo tanto, la presente descripción proporciona una biblioteca de genes cap mutantes del VAA que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 1010 miembros, y que comprenden mutaciones en el gen cap del VAA. Un miembro dado de la biblioteca tiene de aproximadamente una a aproximadamente 50 mutaciones en el gen cap del VAA. Una biblioteca de materias comprende de 10 a aproximadamente 109 miembros distintos, cada uno con una(s) mutación(es) diferente(s) en el gen cap del VAA.

Una vez se genera una biblioteca cap mutante, se producen partículas virales que luego pueden seleccionarse sobre la base de las propiedades de las cápside alteradas. El ADN del plásmido de la biblioteca se transfecta en una célula huésped adecuada (por ejemplo, células 293), seguido de la introducción en la célula del virus auxiliar. Se recogen las partículas virales producidas por las células huésped transfectadas (partículas de la biblioteca VAAr).

Selección de la biblioteca

Una vez que se genera una biblioteca, se selecciona para una propiedad de virión particular (es decir, una propiedad de infección alterada). Las partículas virales se generan como se discutió anteriormente (produciendo por lo tanto una biblioteca de viriones de VAAr modificados), y se someten a una o más etapas de selección para identificar un virión de VAAr modificado con una propiedad alterada de infección (con relación a un virión de VAAr infeccioso que comprende una variante de la proteína de la cápside que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33). Las propiedades de la infección que se seleccionan pueden incluir, entre otras: 1) unión alterada (por ejemplo, unión disminuida) a anticuerpos neutralizantes de VAA; 2) aumento de la evasión de anticuerpos neutralizantes de VAA; 3) aumento de la infectividad de una célula resistente a la infección por VAA; y 4) unión de heparina alterada.

1. Selección de unión reducida a anticuerpos neutralizantes de VAA

En algunos casos, se selecciona una biblioteca de VAA objeto para la unión alterada (por ejemplo, reducida) a los anticuerpos neutralizantes que se unen y neutralizan los viriones de VAA de tipo salvaje, en comparación con la unión de dichos anticuerpos a los viriones de VAA de tipo salvaje y la neutralización de los viriones de tipo salvaje (o con relación a un virión de VAAr infeccioso que comprende una proteína de la cápside variante que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33). Las partículas de la biblioteca de VAA (virión de la biblioteca de VAA) se ponen en contacto con anticuerpos neutralizantes y se prueba la capacidad de las partículas de la biblioteca de VAA para infectar una célula huésped permisiva. Típicamente, las partículas de la biblioteca de VAA se ponen en contacto con diversas concentraciones de anticuerpos neutralizantes. Cuanto mayor sea la concentración de anticuerpos neutralizantes que se requiere para reducir la infectividad de las partículas de la biblioteca de VAA, más resistentes son las partículas de VAA a la neutralización. Puede usarse cualquier ensayo conveniente conocido por un experto en la técnica para medir directamente la unión (por ejemplo, medir la afinidad de unión) de un virión de la biblioteca de VAA a los anticuerpos neutralizantes contra VAA.

2. Selección para un aumento de la evasión de anticuerpos neutralizantes de VAA

En algunos casos, se selecciona una biblioteca de VAA objeto para un aumento de la evasión de anticuerpos neutralizantes (es decir, una mayor resistencia a anticuerpos neutralizantes humanos de VAA) con relación a un virión de VAAr infeccioso que comprende una proteína de la cápside variante que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33. Las partículas de la biblioteca de VAA se ponen en contacto con células diana en presencia de anticuerpos neutralizantes de VAA (normalmente anticuerpos contra VAA neutralizantes humanos). Después de una cantidad de tiempo adecuada para permitir la infección de las células con partículas de la biblioteca de VAA, se adiciona el virus auxiliar y se recolectan las partículas de la biblioteca de VAA que infectaron con éxito la(s) célula(s). En algunos casos, se mide la infectividad (por ejemplo, como se describió anteriormente) para aquellos viriones que exhiben una infección exitosa. En algunos casos, el ciclo de infección, la adición del virus auxiliar y la recolección de partículas de VAA se repite una, dos, tres o más veces. La selección puede ocurrir con diferentes cantidades (concentraciones) de anticuerpos neutralizantes de VAA para seleccionar varios grados de evasión (por ejemplo, cada ronda repetida puede usar un aumento de la concentración de anticuerpos con respecto a la ronda anterior).

3. Selección para aumentar la infectividad de células no permisivas

En algunos casos, se selecciona una biblioteca de VAA objeto para aumentar la infectividad de las células no permisivas (con relación a un virión de VAAr infeccioso que comprende una proteína de la cápside variante que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33). Las partículas de la biblioteca de VAA se ponen en contacto con una célula no permisiva (por ejemplo, una población de células no permisivas). Después de una cantidad de tiempo adecuada para permitir la infección de las células con partículas de la biblioteca de VAA, se adiciona el virus auxiliar y se recolectan las partículas de la biblioteca de VAA que infectaron con éxito la(s) célula(s) no permisivas. En algunos casos, el ciclo de infección, la adición del virus auxiliar y la recolección de partículas de VAA se repite una, dos, tres o más veces.

4. Selección de unión alterada de heparina

En algunos casos, se selecciona una biblioteca objeto para la unión de heparina alterada, incluida un aumento de la unión de heparina y la unión de heparina disminuida con relación a la unión de heparina del virión del VAA de tipo salvaje (o con relación a un virión de VAAr infeccioso que comprende una proteína de la cápside variante que comprende una secuencia de aminoácidos expuesto en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33). Las partículas de la biblioteca de VAA se ponen en contacto con una matriz de afinidad de heparina. Por ejemplo, las partículas de la biblioteca de VAA se cargan en una columna de afinidad de heparina en condiciones que permiten la unión de las partículas de la biblioteca de VAA a la heparina. Las condiciones ilustrativas incluyen el equilibrio de la columna con NaCl 0,15 M y Tris 50 mM a pH 7,5. Después de permitir que la partícula de la biblioteca de VAA se una a la matriz de afinidad de heparina, el complejo de partícula de la biblioteca de VAA/matriz de afinidad de heparina se lava con volúmenes de tampón que contienen concentraciones progresivamente crecientes de NaCl y, a cada concentración de NaCl, se recogen las partículas de la biblioteca de VAA eluidas. Por ejemplo, después de unir el complejo de matriz de afinidad de partículas/heparina de la biblioteca de VAA se lava con un volumen de tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 200 mM, y se recogen las partículas de la biblioteca de VAA eluidas. Las etapas de elución se repiten con un tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl aproximadamente 250 mM, NaCl aproximadamente 300 mM, NaCl aproximadamente 350 mM, NaCl aproximadamente 400 mM, NaCl aproximadamente 450 mM, NaCl aproximadamente 500 mM, NaCl aproximadamente 550 mM, NaCl aproximadamente 600 mM, NaCl aproximadamente 650 mM, NaCl aproximadamente 700 mM o NaCl aproximadamente 750 mM.

Las partículas de la biblioteca de VAA que eluyen a concentraciones de NaCl inferiores a aproximadamente 450 mM de NaCl exhiben propiedades de unión a heparina disminuidas con relación a el VAA de tipo salvaje. Las partículas de la biblioteca de VAA que eluyen a concentraciones de NaCl superiores a aproximadamente 550 mM de NaCl exhiben un aumento de las propiedades de unión a heparina con relación a el VAA de tipo salvaje.

En algunos casos, las partículas de la biblioteca de VAA eluidas se amplifican por coinfección de células permisivas con un virus auxiliar y se vuelven a fraccionar en una matriz de afinidad de heparina. Esta etapa puede repetirse varias veces para enriquecer las partículas de la biblioteca de VAA con propiedades de unión a heparina alteradas. En los presentes métodos, una o más etapas de selección pueden seguir a la generación de partículas de la biblioteca de VAA. Por ejemplo, en algunos casos, el método comprende seleccionar el aumento de la unión de heparina, seguido de seleccionar la disminución de la unión a los anticuerpos neutralizantes. En otros casos, el método comprende seleccionar la unión disminuida a anticuerpos neutralizantes, seguido de seleccionar la unión aumentada de heparina. En otros casos, el método comprende seleccionar la unión disminuida de heparina, seguido de seleccionar la unión disminuida a los anticuerpos neutralizantes. En otros casos, el método comprende seleccionar la unión disminuida a anticuerpos neutralizantes, seguido de seleccionar la unión disminuida de heparina. En otros casos, el método comprende seleccionar la unión disminuida a los anticuerpos neutralizantes, seguido de seleccionar para el aumento la infectividad de una célula madre. En otros casos, el método comprende seleccionar la unión disminuida a los anticuerpos neutralizantes, seguido de seleccionar para el aumento de la evasión de los anticuerpos neutralizantes. En otros casos, el método comprende seleccionar para el aumento de la evasión de anticuerpos neutralizantes, seguido de seleccionar para la unión disminuida a los anticuerpos neutralizantes.

Por lo tanto, la presente descripción proporciona una biblioteca de virus adenoasociado (VAA) que incluye una pluralidad de ácidos nucleicos, cada uno de los cuales incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de VAA variante. La proteína de la cápside de VAA variante codificada incluye al menos una sustitución de aminoácido con relación a una secuencia establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33. La presente descripción proporciona una biblioteca de partículas de virus adenoasociado mutante (VAA), que incluye una pluralidad de partículas de VAA, cada una de las cuales incluye una proteína de la cápside de VAA que incluye al menos una sustitución de aminoácidos con relación a una secuencia establecida en una de las SEQ ID NOs: 1013 y 26-33. Los ácidos nucleicos que codifican proteínas de la cápside de VAA mutantes se describen anteriormente, al igual que las propiedades de las proteínas de la cápside de VAA mutantes codificadas.

La presente descripción proporciona además una biblioteca que comprende al menos uno de: (i) dos o más viriones de VAAr infecciosos, cada uno de los cuales comprende una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante y un ácido nucleico heterólogo; (ii) dos o más ácidos nucleicos aislados, cada uno de los cuales comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de VAA variante; (iii) dos o más células huésped, cada una de las cuales comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de VAA variante; y (iv) dos o más proteínas de la cápside de VAA variantes; donde la proteína de la cápside de VAA variante de al menos un miembro de la biblioteca comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de aminoácidos con relación a la secuencia de aminoácidos establecida en una de las SEQ ID NO: 10-13 y 26-33.

Composiciones y estuches

También se proporcionan composiciones y estuches para usar en los métodos de la presente descripción. Las composiciones y estuches objeto incluyen al menos uno de: un virión de VAAr infeccioso objeto, un vector de VAAr objeto, un ácido nucleotídico objeto que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de VAA variante objeto, una célula huésped aislada que comprende un ácido nucleico objeto (es decir, una célula huésped modificada genéticamente objeto que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de VAA variante objeto); una biblioteca temática (por ejemplo, cualquiera de las bibliotecas descritas anteriormente); y una proteína de la cápside de VAA variante objeto. Una composición o estuche puede incluir cualquier combinación conveniente de los anteriores. Una composición o estuche también puede incluir un virus auxiliar y/o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un virus auxiliar. Un estuche también puede incluir reactivos para la generación de ácidos nucleicos (es decir, ácidos nucleicos "mutantes") que codifican proteínas de la cápside de VAA variantes modificadas.

Además de los componentes anteriores, los estuches objeto pueden incluir además instrucciones para practicar los métodos objeto. Estas instrucciones pueden estar presentes en los estuches objeto en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el estuche. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una pieza o piezas de papel en la cual la información se imprime, en el empaque del estuche, en un prospecto y similares. Otra forma más de estas instrucciones es un medio legible por computadora, por ejemplo, disquete, disco compacto (CD), unidad flash y similares, en el que se ha grabado la información. Otra forma más de estas instrucciones que pueden estar presentes es una dirección de sitio web que puede usarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio separado.

La invención, como está ahora completamente descrita, resultará evidente para un experto en la técnica que pueden realizarse varios cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu o alcance de la invención.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni pretenden representar que los experimentos más abajo sean todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc), pero deben tomarse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de cualquier otra manera, las partes son las partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura es en grados centígrados, y la presión es la atmosférica o cercana. Pueden usarse abreviaturas estándar, por ejemplo, pb, par(es) de base(s); kb, kilobase(s); mL, mililitro(s); |jL, microlitro(s); nL, nanolitro(s); pL, picolitro(s); s o seg, segundo(s); min, minuto(s); h o hr, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, kilobase(s); pb, par(es) de base(s); nt, nucleótido(s); im, intramuscular(mente); ip, intraperitoneal(mente); sc, subcutánea(mente); iv, intravenosa(mente); y similares.

Ejemplo 1:

Los vectores de terapia génica de virus adenoasociados (VAA) han demostrado ser muy prometedores en varios ensayos clínicos hasta la fecha. Sin embargo, los anticuerpos contra VAA circulantes, que resultan de la exposición infantil o la administración previa de un vector de VAA, han impedido la implementación de la terapia génica de VAA para muchos pacientes potenciales. Hemos aislado nuevas variantes de VAA que son capaces de mejorar la evasión de los anticuerpos contra VAA, tanto in vitro como in vivo. La rigurosa presión resultante de las selecciones mediante el uso de sueros humanos de baja y alta potencia e IglV humana desarrolló variantes de VAA capaces de evadir la neutralización de anticuerpos de sueros humanos individuales, IglV humana y sueros de ratón, las variantes más evasivas hasta la fecha.

Materiales y Métodos

Líneas celulares

Las líneas celulares se cultivaron a 37 °C y 5 % de CO²y, a menos que se indique de cualquier otra manera, se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA). Se cultivaron células HEK293T, HeLa y HT1080 en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco, Carlsbad, CA) y penicilina/estreptomicina al 1 % (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se cultivaron células CHO K1 y CHO pgsA en medio F-12K (ATCC) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco) y penicilina/estreptomicina al 1 % (Invitrogen). Se cultivaron células Pro5 y Lec1 en medio MEM-alfa (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco) y penicilina/estreptomicina al 1 % (Invitrogen).

Sueros humanos combinados para la selección

Se obtuvieron dieciocho muestras individuales de suero humano de Innovative Research, Inc. (Southfield, MI) y se determinó el título de anticuerpos neutralizantes para VAA2 de tipo salvaje para cada muestra (Tabla 2). Dado que las muestras individuales probablemente posean variaciones tanto en las afinidades como en las especificidades del epítopo de los anticuerpos, se generaron tres combinaciones de sueros potentes (a = A F G, p = B H M y Y = I J N) mediante la mezcla de volúmenes iguales de muestras de suero individuales. La selección en presencia de estas variaciones de anticuerpos debería dar como resultado un aumento general de la resistencia a muchos anticuerpos humanos preexistentes. Las selecciones posteriores se realizaron en presencia de Gamimune N, 10 % Human IgIV(Bayer, Elkhart IN) para seleccionar la resistencia a un intervalo aún más amplio de anticuerpos. Tabla 2: Títulos de anticuerpos neutralizantes de muestras individuales de suero humano

Los títulos de anticuerpos neutralizantes (NAb) para cada muestra se informan como el recíproco de la fracción de volumen de suero necesaria para reducir la infectividad al 37 % del valor medido en ausencia de suero. A continuación, se generaron tres combinaciones de sueros (a = A F G, p = B H M y y = I J N) mezclando cantidades equivalentes de tres muestras de suero individuales.

Tabla 2

Generación de bibliotecas y producción viral

Para crear la biblioteca de mutagénesis de saturación, se generó una biblioteca de VAA2 cap mediante PCR propensa a errores seguida del proceso de extensión escalonada descrito por Zhao y otros mediante el uso de 5'-GCGGAAGCTTCGATCAACTACGC-3' (SEQ ID NO: 14) y 5'-GGGGCGGCCGCAATTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGGTG-3' (SEQ ID NO: 15) como cebadores directos e inversos, respectivamente. Las selecciones mediante el uso de sueros humanos individuales combinados revelaron una variante que contenía cuatro mutaciones puntuales (descritas en la sección de resultados) que sirvieron como base para la biblioteca de mutagénesis de saturación. El gen cap para esta variante se sometió a mutagénesis adicional cambiando los aminoácidos en sitios específicos. Se usaron el cebador 5'-cattNNKgaccagtctaggaactgg-3' (SEQ ID NO: 16) y el cebador de complemento inverso correspondiente para mutagenizar el sitio de aminoácidos R471. Se usaron el cebador 5'-gccacaaggacgatgaagaaNNKttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcaNNKaaaacaagtgtggacattg-3' (SEQ ID NO: 17) y el cebador de complemento inverso correspondiente para mutagenizar los sitios de aminoácidos K532 y E548. Se usaron el cebador 5'-ccaacctccagagaggcNNKagacaagcagctacc-3' (SEQ ID NO: 18) y el cebador de complemento inverso correspondiente para mutagenizar el sitio de aminoácidos N587. Se usaron el cebador 5'-ccaactacaacaagtctNNKaatgtggactttactgtggacNNKaatggcgtgtatt-3' (SEQ ID NO: 19) y el cebador de complemento inverso correspondiente para mutagenizar los sitios de aminoácidos V708 y T716. Una biblioteca que consiste de VAA2 que contiene regiones de bucle cap aleatorizadas y una biblioteca que contiene ADN mezclado de los genes cap VAA1, VAA2, VAA4, VAA5, VAA6, VAA8, VAA9 tipo salvaje se empaquetaron y combinaron para las etapas de selección iniciales (Koerber y otros; Mol Ther. 2008 Oct; 16 (10): 1703-9; y Koerber y otros; Mol Ther. 2009 Dic; 17 (12): 2088-95; ambos se incorporan aquí como referencia en su totalidad).

Para la segunda y tercera rondas de evolución, se generaron bibliotecas de mutagénesis aleatorias sometiendo genes cap de la biblioteca de intercambio de bucles/mezcla y la biblioteca de mutagénesis de saturación para PCR propensa a errores usando 5'-CATGGGAAAGGTGCCAGACG-3' (SEQ ID NO: 20) y 5'-ACCATCGGCAGCCATACCTG-3' (SEQ ID NO: 21) como cebadores directo e inverso, respectivamente, como se describió anteriormente. Las bibliotecas de VAA competentes para la replicación y los vectores de VAA recombinantes que expresan GFP bajo el control de un promotor de CMV se empaquetaron mediante el uso de células HEK293T (ATCc ) mediante el uso del método de transfección de fosfato de calcio, y los virus se purificaron mediante centrifugación en gradiente yodixonal. Vectores de VAA recombinantes que expresan GFP o luciferasa bajo el control de un promotor de CMV para su uso in vivo se purificaron adicionalmente mediante filtración con Amicon. Los títulos genómicos resistentes a la ADNasa se determinaron mediante PCR cuantitativa. (Excoffon y otros, Proc Natl Acad Sci U S A. 10 de marzo de 2009; 106(10):3865-70; y Maheshri y otros, Nat Biotechnol. febrero 2006; 24(2):198-204; ambos se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad).

Selección y evolución de bibliotecas

Una ronda de selección se define como infección de células HEK293T mediante el uso de la biblioteca de partida de VAA (incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente para los sueros humanos individuales combinados o durante 1 hora a 37 °C con IgIV inactivada por calor antes de la infección), seguida de rescate de adenovirus y cosecha de variantes exitosas. Cada ciclo de evolución consiste en mutagénesis del gen cap para crear la biblioteca inicial y tres rondas de selección. Se realizaron tres rondas de evolución con cada biblioteca, con análisis clonal realizado entre cada ronda de evolución. Las bibliotecas de partida para cada ronda de evolución se generaron como se describe anteriormente. Después de la tercera ronda de selección, los genes cap del VAA se aislaron del conjunto de variantes de VAA exitosas y se amplificaron mediante PCR. Los genes cap se insertaron en el plásmido de empaquetamiento de VAA recombinante pXX2 mediante el uso de Notl y HindlIl. A continuación, los genes cap se secuenciaron en la instalación de secuenciación de ADN de la Universidad de California, Berkeley, y se analizaron mediante el uso del software Geneious (Biomatters, Auckland, Nueva Zelanda). Se generaron modelos tridimensionales de la cápside del VAA2 (número de acceso 1LP3 del Protein Databank) en Pymol (DeLano Scientific, San Carlos, CA).

Análisis de transducción in vitro de variantes que evitan anticuerpos

Células HEK293T se platearon a una densidad de 3x104 células/pocillo 24 horas antes de la infección. Las variantes se incubaron a 37 °C durante 1 hora con IgIV inactivada por calor, sueros humanos individuales o sueros de ratones individuales antes de la infección, y luego las células se infectaron con VAAr-GFP a una MOI genómica de 2000. El porcentaje de células positivas para GFP se evaluó 48 horas después de la infección mediante el uso de un sistema de análisis e imágenes microcelulares ImageXpress (dispositivos moleculares, Sunnyvale, CA) y el software de análisis de imágenes MetaXpress, versión 3.1.0, módulo de aplicación de puntuación de células de longitud de onda múltiple (dispositivos moleculares).

Análisis de transducción in vitro

Para determinar las eficiencias relativas de transducción de los mutantes seleccionados en comparación con los serotipos parentales de VAA de tipo salvaje, HEK293T, CHO K1, CHO pgsA (que carece de todos los glucosaminoglicanos de superficie), CHO Pro5 (la línea parental de varios mutantes de glucosilación, incluidas las células Lec1), CHO Lec1 (glucosilación defectuosa), células HeLa y HT1080 (una línea celular de fibrosarcoma humano) se sembraron a una densidad de 2,5 x 104 células por pocillo 24 horas antes de la infección. Las células se infectaron con VAAr1-GFP, VAAr2-GFP, VAAr6-GFP, la mezcla 100.1-GFP, la mezcla 100.3-GFP, SM 10.2-GFP o la mezcla 100.7-GFP en un intervalo de MOI de 100-1000. El porcentaje de células positivas para GFP se evaluó 48 horas después de la infección mediante el uso de un citómetro de flujo Beckman-Coulter Cytomics FC500 (Beckman-Coulter, Brea, CA).

Análisis in vivo de variantes que evitan anticuerpos

Para el análisis de la expresión génica in vivo, se prepararon ratones Balb/c hembras, de ocho semanas de edad, con 4 mg de IgIV por ratón o solución salina tamponada con fosfato (para ratones de control) mediante inyección en la vena de la cola 24 horas antes de la administración de la mezcla 100-3 recombinante (ver SEQ ID NO: 12), SM 10-2 (ver SEQ ID NO: 10) o vectores VAA2. Los ratones se infectaron con 1011 genomas virales de vectores VAA recombinantes que codifican luciferasa bajo el control de un promotor de CMV mediante inyección en la vena de la cola. Para la obtención de imágenes de bioluminiscencia, los ratones se anestesiaron con isofluorano al 2 % y oxígeno. El sustrato de D-luciferina (GOLD Biotechnology, St. Louis, MO) se inyectó por vía intraperitoneal, a una dosis de 500 pg/g de peso corporal. Las imágenes se generaron mediante el uso de un generador de imágenes VivoVision IVIS Lumina (Xenogen, Alameda, CA). Para cada ratón, se tomaron imágenes ventrales de 7-10 minutos después de la inyección del sustrato, cada semana durante cuatro semanas. Cinco semanas después de la infección, se recogió suero mediante punción cardíaca y luego se perfundió a los ratones con solución salina al 0,9 %. Se recogieron y congelaron el corazón, el hígado, los pulmones, el riñón, el bazo, el cerebro, la médula espinal y el músculo de las extremidades traseras. Las muestras de tejido congelado se homogeneizaron y se resuspendieron en tampón de lisis informador (Promega, Mannheim, Alemania) para in vitro análisis de luciferasa. El lisado que contenía luciferasa se clarificó mediante centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g. Para analizar las muestras, se adiciona 20 pL del lisado a 100 pL del tampón de ensayo de luciferasa, se mezclaron, se incubaron durante 5 minutos y se colocaron en el luminómetro. La señal se integró durante 30 segundos con un retraso de 2 segundos y se informó en unidades de luz relativa (RLU) detectadas por un luminómetro TD 20/20 (Turner Designs, Sunnyvale, CA). La señal de luciferasa se normalizó al contenido de proteína total determinado por un ensayo de ácido bicinconínico (Pierce).

Resultados

Nuestros resultados demuestran que el VAA puede evolucionar para superar significativamente la neutralización por anticuerpos contra el VAA, tanto in vitro e in vivo. Se aislaron nuevas variantes de VAA que requerían títulos de anticuerpos neutralizantes de 2 a 35 veces más altos (mediante el uso de IglV humana) que los VAA de tipo salvaje in vitro. Las propiedades de neutralización de anticuerpos también se traducen en una mejor transducción in vivo en presencia de anticuerpos neutralizantes. El aislamiento de estos nuevos clones resistentes a los anticuerpos contra VAA permite la implementación más amplia de tratamientos basados en VAA como vector de suministro de ácido nucleico (incluidos los individuos con títulos altos de anticuerpos que actualmente no son elegibles para la terapia génica de VAA).

Generación y selección de bibliotecas VAA a través de la evolución dirigida

La Figura 1a muestra un esquema del enfoque de evolución dirigida usado para aislar nuevas variantes de VAA capaces de evadir la neutralización de anticuerpos humanos. Se crearon bibliotecas de virus mediante el uso de las técnicas de mutagénesis de ADN descritas en los siguientes párrafos (Figura 1a, etapas 1 y 2). Durante las selecciones iniciales, se incubaron grupos de bibliotecas virales desarrolladas a partir de mutaciones de PCR propensas a errores en genes cap de VAA2 con varias diluciones de la combinación de sueros humanos a de baja potencia durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de la infección de las células HEK293T (etapa 3). Después de tres rondas de selección contra la combinación de sueros humanos a de baja potencia (Figura 1a, etapas 4 y 5), se obtuvieron varias variantes con mayor resistencia a este conjunto de sueros neutralizantes (Figura 1a, etapa 6, Figura 7a). La variante 1.45, contenía dos mutaciones puntuales (N312K, N449D), que dieron como resultado > 10 veces más resistencia a la neutralización por la combinación a en comparación con el VAA2 de tipo salvaje.

El gen cap de la variante 1,45 se sometió a mutagénesis aleatoria adicional y la biblioteca resultante se seleccionó para tres rondas adicionales de selección contra las combinaciones p y y, en paralelo. Como solo se observaron mejoras menores en la evasión de anticuerpos (datos no mostrados), los genes cap recuperados se combinaron y se sometieron a una diversificación adicional mediante la mezcla de ADN y la PCR de EP. Tres rondas más de selección contra cantidades crecientes de sueros de las combinaciones p y Y dieron como resultado un enriquecimiento sustancial en la cantidad de virus recuperado de la biblioteca viral en comparación con el VAA2 de tipo salvaje (Figura 7b, c). La secuenciación de los genes exitosos cap de ambas combinaciones revelaron varios mutantes de baja frecuencia y un único mutante dominante, la variante ^y4,3, que contenía cuatro mutaciones puntuales (N312K, N449D, N551S e I698V), presentes dentro de ambas bibliotecas. En presencia de IglV humana, la variante 1,45 demostró una modesta resistencia mejorada de 1,2 veces a la neutralización, mientras que ^y4,3 demostró una resistencia mejorada de 3,1 veces a la neutralización (Figura 7d). Esta observación confirma la hipótesis de que pueden usarse combinaciones de sueros humanos individuales para aislar variantes de VAA capaces de mejorar la evasión de anticuerpos presentes en la población humana en general.

El éxito moderado de la variante ^y4,3 en resistir la neutralización por anticuerpos contra VAA impulsó el desarrollo de una biblioteca basada en el gen cap de ^y4,3. Los sitios de aminoácidos R471, K532, E548, N587, V708, T716, previamente determinados como sitios inmunogénicos en la cápside de VAA2, se sometieron a mutagénesis de saturación en un intento de encontrar mutaciones de aminoácidos que pudieran mejorar la resistencia a los anticuerpos de ^y4,3. Esta biblioteca de "mutagénesis de saturación", junto con una biblioteca "mezclada" compuesta de cap quimeras de 7 serotipos de VAA parentales y una biblioteca de "intercambio de bucle" compuesta de VAA2 cap con regiones de bucle sustituido se sometieron a tres rondas adicionales de selección, en las que los conjuntos de bibliotecas virales se incubaron con diversas diluciones de IglV humana durante una hora a 37 °C° antes de la infección de las células HEK293T. Después de la infección con bibliotecas de VAA y la amplificación de las variantes de VAA infecciosas a través de la superinfección de adenovirus, se cuantificó el número de genomas virales o título viral de cada condición de biblioteca y se comparó con los títulos de VAA2 de tipo salvaje como método para determinar el éxito de la selección (Figura 1b). Para cada ronda de selección mediante el uso de la mutagénesis de saturación y las bibliotecas de intercambio de bucle/mezclado, se usaron complejos virales de las condiciones de dilución de IgIV 1:10 y 1:100 que produjeron títulos virales más altos que el VAA2 de tipo salvaje como punto de partida para la ronda de selección posterior. Después de tres rondas de selección, los genes virales cap exitoso se aislaron y probaron individualmente para determinar el virus con la suministro de genes más eficiente. Además, los genes cap aislados de la tercera ronda de selección se sometieron a rondas adicionales de mutagénesis por PCR propensa a errores, y el proceso se repitió para aumentar iterativamente la aptitud del virus.

La Figura 1 representa la evolución dirigida del VAA para la evasión de anticuerpos mejorada. (a) Esquema de evolución dirigida. 1) Se crea una biblioteca viral diversificando genéticamente el gen cap mediante el uso varios enfoques complementarios. 2) Los virus se empaquetan en células HEK293T mediante el uso de transfección de plásmido, luego se recolectan y purifican. 3) La biblioteca viral se incuba con IgIV humana a varias concentraciones y se introduce en células HEK293T in vitro. 4) Los virus exitosos se amplifican y recuperan mediante superinfección de adenovirus. 5) Los clones exitosos se enriquecen mediante selecciones repetidas en MOI más bajos. 6) El ADN viral aislado revela genes cap exitosos. 7) Los genes cap exitosos se mutan nuevamente para servir como un nuevo punto de partida para la selección. (b) Selección de mutantes de evasión de anticuerpos a partir de bibliotecas de mutagénesis de saturación/intercambio de bucles/mezclado. Se infectaron células HEK293T con bibliotecas virales durante 24 horas. Las partículas virales que infectaron productivamente las células se amplificaron mediante infección por adenovirus y el VAA rescatado se cuantificó mediante qPCR. Una dilución 1:10 de IgIV corresponde a una concentración de 10 mg IgIV/mL. Las barras de error indican la desviación estándar (n = 3).

LaFigura 7 demuestra la generación de evasores de anticuerpos humanos basados en VAA2. (a) Cuatro clones virales seleccionados después de tres rondas de selección contra la combinación a de baja rigurosidad demuestran una mayor resistencia a 1 pL de suero a a una MOI de 1. Dos rondas adicionales de diversificación (es decir, mutagénesis y mezcla de ADN) y selección (3 rondas de cantidades crecientes de suero) dieron como resultado una recuperación viral significativamente mejorada en presencia de grandes cantidades de combinaciones altamente potentes (b) p y (c)y. (d) Adicionalmente, dos clones virales (1,45 y y4,3) demuestran resistencias mejoradas de 1,23 y 3,10 veces a la combinación muy diversa de anticuerpos preexistentes presentes con combinada inmunoglobulina intravenosa humana (IgIV) de ~ 100000 individuos en comparación con el tipo salvaje VAA2. Aumento en la evasión de anticuerpos de las nuevas variantes de VAA evolucionadas in vitro

De los doce clones seleccionados y empaquetados para el análisis individual de las bibliotecas de mutagénesis de saturación y de intercambio de bucle/mezclado después de nueve rondas de cribado contra IgIV humana, los doce requirieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que los VAA1 y VAA2 de tipo salvaje (Figura 2a y Tabla 1). La mezcla 100-3 variante (ver SEQ ID NO: 12), que requería 35 veces más concentración de IgIV in vitro para la neutralización que el VAA2 de tipo salvaje, todavía era capaz de transducir aproximadamente el 10 % de las células en presencia de 1 mg/mL de IgIV (Figura 2b). Además, la variante SM 10-2 de la biblioteca de mutagénesis de saturación de VAA2 requirió un 7,5 veces más concentración de IgIV in vitro para neutralización que VAA2 de tipo salvaje. Además, la mezcla 100-3 y SM 10-2 variantes (ver SEQ ID NO: 10) mostraron una transducción mejorada en presencia de muestras de suero de pacientes individuales excluidos de un ensayo clínico de hemofilia B (Figura 3) (Nathwani y otros, N Engl J Med. 22 de diciembre de 2011; 365(25)2357-65).

La Figura 2 representa los perfiles de neutralización de variantes de evasión de anticuerpos. Los genes cap de mutantes que evitan los anticuerpo aislados después de tres rondas de evolución se usaron para empaquetar el VAA recombinante que codifica GFP y se incubaron con IgIV humana antes de la infección de las células HEK293T. La fracción de partículas infecciosas restantes se determinó mediante el uso de imágenes de fluorescencia de alto contenido y se normalizó al título infeccioso en ausencia de IgIV. Se muestran dos clones de cada biblioteca con resistencia a IgIV. Los datos de los otros clones analizados se muestran en la Tabla 1. (a) Curvas de neutralización. Las barras de error indican la desviación estándar (n = 3). (b) Imágenes de fluorescencia representativas de varias diluciones de IgIV muestran que los mutantes son capaces de la transducción de HEK293T en presencia de altas concentraciones de anticuerpos neutralizantes.

La Figura 3 representa los perfiles de neutralización de variantes de evasión de anticuerpos. Se adquirieron sueros humanos de individuos que fueron excluidos de los ensayos clínicos de hemofilia B debido a la presencia de altos títulos de anticuerpos neutralizantes contra VAA. Se incubó el VAA recombinante que codifica GFP con muestras de suero humano individuales antes de la infección de las células HEK293T. La fracción de partículas infecciosas restantes se determinó mediante el uso de microscopía de fluorescencia y se normalizó al título infeccioso en ausencia de sueros humanos. Las barras de error indican la desviación estándar (n = 3).

El análisis de secuencia de los doce clones reveló que las dos variantes con la mayor resistencia a los anticuerpos neutralizante, la mezcla 100-3 (ver SEQ ID NO: 12) y la mezcla 100-1 (ver SEQ ID NO: 11), son cápsides mezcladas casi idénticas que contienen fragmentos de VAA1-4, VAA6 y VAA9 (Figura 4). Las diferencias en los aminoácidos 469 (residuo de VAA6 a residuo de VAA7) y 598 (residuo de VAA6 a residuo de VAA1) entre las dos variantes se traducen en un aumento de casi 3 veces en el título de anticuerpos neutralizantes para la mezcla 100-3 (ver SEQ ID NO: 12) (Tabla 1). La mezcla 100-7 variante (ver SEQ ID NO: 13), que tenía la cuarta resistencia más alta a anticuerpos neutralizantes (Tabla 1), es también una cápside mezclada que contiene fragmentos de VAA1, VAA6 y VAA8 (Figura 4), que concuerda bien con los datos reportados que muestran que VAA1 y VAA8 de tipo salvaje son eficaces para evadir anticuerpos contra VAA2. Curiosamente, la variante SM 10-2 (SEE SEQ ID NO: 10) retuvo las mutaciones puntuales adquiridas por la variante y4.3 y también retuvo residuos de tipo salvaje en los sitios de saturación de mutagénesis. La variante SM 10-2 (SEE SEQ ID NO: 10) adquirió mutaciones puntuales adicionales en el residuo superficial D472N y el residuo interno L735Q.

La Figura 4 representa las secuencias de aminoácidos de clones de mutagénesis de saturación/intercambio de bucle/mezclada. (a) Se muestran esquemas de la proteína de la cápside para los dos clones de cada biblioteca con las concentraciones de IgIV neutralizante más altas. Cada región está sombreada de acuerdo con el serotipo parental del que se deriva. Las flechas negras indican (de izquierda a derecha) los codones de inicio de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3. Las flechas grises indican (de izquierda a derecha) las regiones de bucle de superficie I, II, III, IV y V basadas en la cápside de VAA2. (b) Se muestran modelos moleculares de la cápside VAA2 completa, basados en la estructura resuelta, para los dos clones de cada biblioteca con las concentraciones de IgIV neutralizante más altas. Cada región está sombreada de acuerdo con el serotipo parental del que se deriva. Para la mezcla de la variante 100-3 (ver SEQ ID NO: 12), las flechas negras indican diferencias con la mezcla de la variante 100-1 (ver SEQ ID NO: 11). Para la variante SM 10-2 (VER SEQ ID NO: 10), las mutaciones N449D, D472N, N551S e I698V son mutaciones de superficie (negro).

Tabla 1: Se usaron títulos de anticuerpos neutralizantes de IgIV de clones de biblioteca y serotipos parentales de IgIV humana para neutralizar vectores de VAA-GFP recombinantes con cápsides de VAA1, vAA2, VAA8 de tipo salvaje y variantes recuperadas de las bibliotecas de mutagénesis de saturación e intercambio de bucles/mezcla. Se muestra la concentración de IgIV (mg/mL) requerida para reducir la eficiencia de la suministro de genes al 50 % de la que se obtiene en ausencia de IgIV, y se compara con la concentración requerida para reducir la suministro de VAA2. Todas las variantes analizadas requirieron concentraciones más altas de IgIV que las VAA1 y VAA2 de tipo salvaje. El título de anticuerpos neutralizantes se determinó ajustando las curvas en la Figura 2 a una curva exponencial. Las SEQ ID NO se enumeran como "aminoácidos, nucleótidos".

Tabla 1

Clon SEQ ID Concentración neutralizante de IgIV Resistencia al

NO: doblez con

relación a VAA2 mg/mL

VAA1 1 0,026 1,757

VAA2 2 0,015 1,000

VAA8 8 0,092 6,113

Mezcla 10-2 26, 34 0,037 2,443

Mezcla 10-6 27, 35 0,028 1,842

Mezcla 10-8 28, 36 0,084 5,583

Mezcla 100-1 11, 23 0,183 12,178

Mezcla 100-2 29, 37 0,073 4,831

Mezcla 100-3 12, 24 0,529 35,227

Mezcla 100-7 13, 25 0,090 6,025

SM 10-1 30, 38 0,071 4,732

SM 10-2 10, 22 0,113 7,519

SM 10-8 31, 39 0,051 3,409

SM 100-3 32, 40 0,074 4,941

SM 100-10 33, 41 0,066 4,393

La mezcla 100-3 (ver SEQ ID NO: 12), la mezcla 100-1 (ver SEQ ID NO: 11) y la mezcla 100-7 (ver SEQ ID NO: 13) de las variantes tienen perfiles de transducción que imitan los perfiles de transducción de los serotipos VAA1 y VAA6 parentales (Figura 5). Además, las mutaciones en SM 10-2 (ver SEQ ID NO: 10) no previenen la dependencia de la heparina (como se observa en el serotipo parental VAA2)lo que conduce a un perfil similar al VAA2 (Figura 5).

La Figura 5 demuestra el tropismo in vitro de nuevas variantes de VAA. Se usaron vectores de VAA recombinantes que expresan proteína verde fluorescente para transducir un panel de líneas celulares: CHO, pgsA (que carece de todos los glicosaminoglicanos de superficie), Pro5, Lec1 (que carece de ácido siálico), HEK293T, HeLa y HT1080 (línea celular de fibrosarcoma humano) para perfilar las propiedades de transducción de las nuevas variantes de VAA. Las barras de error indican la desviación estándar (n = 3).

Aumento de la evasión de anticuerpos de las nuevas variantes de VAA evolucionadas in vivo

Para determinar el patrón de localización de la mezcla 100-3 y la mezcla 100-7 variantes, se examinó la actividad de la enzima luciferasa en varios tejidos de ratones ingenuos inyectados con VAA2, la mezcla 100-3 o la mezcla 100-7 (Figura 6a). La mezcla 100-7 variante muestra similar tropismo in vivo a VAA2, excepto por una transducción 7 veces mayor del corazón, una transducción 5 veces mayor de los pulmones y una transducción 4,5 veces menor del hígado. La mezcla 100-3 variante exhibió una transducción del cerebro más de 4 veces mayor, una transducción de los pulmones más de 3 veces mayor y una transducción de músculo 27 veces mayor que el VAA2. El análisis del suero de estos ratones mostró que la mezcla 100-3 variante requería igual o mayores concentraciones séricas in vitro para neutralización que VAA1 y VAA8 para suero de ratones que recibieron vectores de suministro de genes VAA1, VAA2, VAA8 o la mezcla 100-3 (Figura 11). La mezcla 100-7 requería igual o mayores concentraciones séricas in vitro para neutralización que VAA1 para suero de ratones a los que recibieron vectores de suministro de genes VAA1, VAA2, VAA8, la mezcla 100-3 o SM 10-2 (Figura 11). Además, ambas variantes fueron menos neutralizadas por suero de ratones que recibieron vectores de suministro de genes VAA2 que todos los serotipos de VAA de tipo salvaje probadas. Curiosamente, la mezcla 100-3 variante también se neutralizó menos por el suero de ratones inmunizados contra ella que cualquiera de los otros serotipos o variantes probados (Figura 11). Estos datos ilustran la posibilidad de que estas variantes puedan usarse en combinación con serotipos de VAA de tipo salvaje o la otra variante en aplicaciones que requieren múltiples administraciones de vectores.

La Figura 11 muestra los títulos de anticuerpos neutralizantes de los clones de la biblioteca y los serotipos parentales en sueros de ratón inmunizados. Se usaron sueros de ratones a los que se les administraron clones de bibliotecas o VAA de tipo salvaje para neutralizar vectores de VAA-GFP recombinantes con cápsides de VAA1, VAA2, VAA8 de tipo salvaje y variantes recuperadas de las bibliotecas de mutagénesis de saturación/mezcla/intercambio de bucle. Se muestra la dilución de suero necesaria para reducir la eficiencia de la suministro de genes al 50 % de la que se obtiene en ausencia de suero.

Para determinar la capacidad de la mezcla 100-7 y la mezcla 100-3 variantes para evadir la neutralización de anticuerpos in vivo, los ratones se inmunizaron pasivamente con IgIV humana antes de la inyección de VAA. La mezcla 100-7 variante tuvo una transducción cardíaca, hepática y muscular significativamente mayor que VAA2, medida por la actividad de la enzima luciferasa (Figura 6b). La mezcla 100-3 variante tuvo una transducción cardíaca y muscular significativamente mayor en comparación con el VAA2 (Figura 6b).

La Figura 6 muestra la localización y neutralización in vivo de nuevas variantes de VAA. (a) Se administraron vectores de VAA recombinantes que codifican la luciferasa mediante inyección en la vena de la cola a ratones hembra BALB/c. Después de 5 semanas, se determinaron los niveles de actividad luciferasa y se normalizaron a la proteína total para cada muestra analizada. (b) Se administraron vectores de VAA recombinantes que expresan la luciferasa mediante inyección en la vena de la cola a ratones BALB/c hembras 24 horas después de la inyección en la vena de la cola de 4 mg de IgIV humana. Después de 5 semanas, los niveles de expresión de luciferasa se normalizaron a la proteína total para cada muestra analizada. Las barras de error indican la desviación estándar (n = 3), * = p <0,05. RLU, unidad relativa de luciferasa.

La variante ^y4.3, aislada de una biblioteca propensa a errores basada en VAA2 seleccionada frente a un grupo de sueros humanos individuales, contenía cuatro mutaciones puntuales (N312K, N449D, N551S e I698V). Curiosamente, dos de estas posiciones (N449 y N551) se identificaron previamente como residuos inmunogénicos mediante el uso de otras combinaciones de suero humano, lo que demuestra que los epítopos antigénicos que involucran estos sitios son el objetivo de muchos anticuerpos neutralizantes diferentes. Por lo tanto, estos sitios son objetivos interesantes y valiosos para la mutación. El emparejamiento de la evolución dirigida y el diseño racional en la biblioteca de mutagénesis de saturación dio como resultado el aislamiento de la variante SM 10-2, que era capaz de una mayor resistencia a los anticuerpos que VAA1 y VAA2 in vitro. La variante SM 10-2 incorpora dos mutaciones puntuales adicionales (D472N y L735Q) a las encontradas en la variante ^y4.3. Se demostró previamente que la mutación D472N aumenta el nivel de síntesis de la cápside en las células HEK293. De manera similar, el reemplazo de la cadena lateral de lisina cargada positivamente en la posición del aminoácido 735 con la cadena lateral de glutamina no cargada puede funcionar para estabilizar la cápside, ya que también está presente en la mezcla 100-7 variante a pesar de estar ubicada dentro del interior de la cápside ensamblada (Figura 4).

La creación de cápsides quiméricas de VAA permite la creación de variantes virales que pueden fusionar propiedades conveniente de múltiples serotipos de VAA. Aunque también se ha demostrado que VAA8 y VAA9 son mucho más resistentes a la neutralización por IgIV que VAA2, los aminoácidos específicos de estas cápsides solo estaban presentes en pequeños tramos en la superficie de las variantes mezcladas aisladas durante nuestras selecciones (Figura 4). La variante que muestra la evasión más eficiente de la neutralización de anticuerpos in vitro, la mezcla 100-3, muestra similar tropismo in vitro a sus serotipos parentales VAA1 y VAA6, pero a una tasa de infectividad más alta que cualquiera de los serotipos de tipo salvaje. Las diferencias en los aminoácidos 469 y 598 entre la mezcla 100-1 y la mezcla 100-3 variantes se traducen en un aumento de casi 3 veces en el título de anticuerpos neutralizantes para la mezcla 100-3. Un estudio de Lochrie y otros informó que los residuos inmunogénicos reconocidos por los sueros humanos y la IgIV son diferentes, lo que sugiere que diferentes humanos pueden producir varios anticuerpos neutralizantes para diferentes conjuntos de epítopos en la cápside de VAA y que el escape completo de la neutralización no es fácil (Lochrie y otros, J Virol. 2006 enero; 80(2):821-34). Nuestro trabajo demuestra que el uso de múltiples rondas de evolución dirigida mediante el uso de varios conjuntos de sueros diferentes que contienen diversas cantidades y potencias de anticuerpos contra VAA dará como resultado el aislamiento de nuevas variantes de VAA que son capaces de mejorar la transducción celular, tanto in vitro e in vivo, en presencia de combinaciones múltiples de anticuerpos contra VAA.

Las respuestas inmunitarias adaptativas a los componentes del vector de VAA en animales y seres humanos a menudo previenen la readministración de vectores de VAA del mismo serotipo, lo que dificulta las aplicaciones de

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso que comprende:

(a) una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12; y

(b) un ácido nucleico heterólogo, en donde el VAAr exhibe al menos 5 veces mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por el VAA2.

2. El VAAr infeccioso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el VAAr exhibe una aumento de la transducción de células de mamífero en presencia de anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la transducción de células de mamífero exhibidas por VAA2.

3. El VAAr infeccioso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las células de mamífero son células hepáticas, células pancreáticas, células del músculo esquelético, células del músculo cardíaco, fibroblastos, células retinianas, células de la articulación sinovial, células pulmonares, células T, neuronas, células gliales, células madre, células endoteliales o células cancerosas.

4. El VAAr infeccioso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico heterólogo comprende: i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido; o ii) un agente de interferencia de ARN.

5. El VAAr infeccioso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12.

6. El VAAr infeccioso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el VAAr exhibe al menos 10 veces mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por el VAA2.

7. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de virus adenoasociado (^vA^a ) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12 en donde la proteína de la cápside de VAA variante codificada confiere a un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso una mayor resistencia a anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por VAA2, en donde la mayor resistencia es al menos 5 veces mayor que la resistencia exhibida por VAA2.

8. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la proteína de la cápside de VAA variante confiere a un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso una transducción aumentada de células de mamífero en presencia de anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la transducción exhibida por VAA2.

9. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde la proteína de la cápside de VAA variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:12.

10. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 7, 8 o 9, en donde el VAAr exhibe al menos 10 veces mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por el VAA2.

11. Una célula huésped aislada que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7-10.

12. Un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en un método para suministrar un producto génico a un individuo que lo necesite.

13. El virión de VAAr para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el ácido nucleico heterólogo comprende: i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido; o ii) un agente de interferencia de ARN.

14. Una proteína de la cápside del virus adenoasociado (VAA) variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12 en donde la proteína de la cápside de VAA variante confiere a un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por VAA2, en donde la mayor resistencia es al menos 5 veces mayor que la resistencia exhibida por VAA2.

15. La proteína de la cápside de VAAr de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 203-736 de la secuencia de aminoácido expuesta en SEQ ID NO: 12.

16. La proteína de la cápside de VAAr de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde el VAAr exhibe una resistencia al menos 10 veces mayor a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por el VAA2.

17. Una biblioteca que comprende al menos uno de:

(i) dos o más viriones de VAAr infecciosos, cada uno de los cuales comprende una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante y un ácido nucleico heterólogo;

(ii) dos o más ácidos nucleicos aislados, cada uno de los cuales comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de VAA variante;

(iii) dos o más células huésped, cada una de las cuales comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de VAA variante; y

(iv) dos o más proteínas de la cápside de VAA variantes,

en donde la proteína de la cápside de VAA variante de al menos un miembro de la biblioteca comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de aminoácidos con relación a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12, en donde la proteína de la cápside de VAA variante confiere a un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) infeccioso una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes de VAA humanos en comparación con la resistencia exhibida por VAA2, en donde la mayor resistencia es al menos 5 veces mayor que la resistencia exhibida por VAA2.

18. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la mayor resistencia es al menos 10 veces mayor que la resistencia exhibida por VAA2.