JP2021529513A - 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療 - Google Patents

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Abstract

本開示は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために使用し得るＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドをコードするＡＡＶ、およびＡＬＳを含む脊髄関連障害を治療するための送達方法に関する。

Description

本開示は、ＳＯＤ１遺伝子発現および／またはＳＯＤ１酵素産生に干渉するために、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子を標的とするか、またはＳＯＤ１を標的とする分子をコードするＡＡＶベクター、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはそれらの前駆体を含むポリヌクレオチドを設計、調製、製造および／または製剤化するための組成物、方法およびプロセスに関する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに挿入される。
脊髄に関連する疾患および／または他の障害を有する対象において、ＳＯＤ１を阻害するための、または脊髄関連疾患もしくは障害に関連する任意の遺伝子の発現を変更するための方法も開示される。本方法は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを、少なくとも脊髄への実質内送達経路により、脊髄に関連する障害（例えば、神経変性疾患）を有する対象に投与することを含む。これらの実施形態において、疾患は運動ニューロン疾患であり、より具体的には、疾患は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、ルー・ゲーリッグ病としても知られており、一次運動皮質、脳幹、および脊髄における上位および下位運動ニューロン（ＭＮ）の顕著な喪失により特徴付けられる致死性の進行性神経変性疾患である。上位運動ニューロン（例えば、皮質）および下位運動ニューロン（例えば、脊髄）は、通常、メッセージを脳から筋肉へと伝達して、随意運動を生成する。これらのニューロンが変性および／または死滅すると、筋肉へのメッセージが喪失し、それにより筋肉が徐々に衰えおよび／または萎縮し、随意運動を開始または制御することができなくなり、ついには最終的に、ＡＬＳを患う個体は、筋力、ならびに運動、発語、摂食、およびさらには呼吸能力を喪失してしまう。ほとんどの患者は、生存のために何らかの形態の呼吸補助を必要とすることになり、呼吸補助があっても、ほとんどのＡＬＳ患者は、診断から２〜５年以内に呼吸不全の結果として死亡する。また、一部の患者（例えば、ＦＴＤ−ＡＬＳ）は、疾患進行中に前頭側頭型認知症を発症する場合がある。
ＡＬＳ協会によれば、アメリカ合衆国では、毎年約５，６００人がＡＬＳと診断される。ＡＬＳの発症率は、１００，０００人当たり２人であり、任意の所与の時点において、３０，０００人ものアメリカ人が、この疾患を有し得ると推測される。
２つの形態のＡＬＳが記載されている。１つは孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）であり、アメリカ合衆国において最も一般的な形態ＡＬＳであり、診断された全症例の９０〜９５％を占める。もう１つは、家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）であり、主に優性遺伝で家系に生じ、アメリカ合衆国における全症例の約５〜１０％を占めるに過ぎない。ｓＡＬＳおよびｆＡＬＳは、臨床的に判別不能である。
病理学的研究により、数多くの細胞プロセスが、具体的には運動ニューロン（ＭＮ）における、ＥＲストレスの増加、フリーラジカル（すなわち、活性酸素種（ＲＯＳ））の生成、ミトコンドリア機能障害、タンパク質凝集、アポトーシス、炎症、およびグルタミン酸興奮毒性などの疾患発症機序と関連付けられている。
ＡＬＳの原因は、複雑かつ多様である。一般に、ＡＬＳは、環境曝露と相まって複数の遺伝子が組み合わされて個人を感受性にする複雑な遺伝障害であると考えられる。ＡＬＳに関連する遺伝子は十数個よりも多くが発見されており、それらには、ＳＯＤ１（Ｃｕ２＋／Ｚｎ２＋スーパーオキシドジスムターゼ）、ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質−４３）、ＦＵＳ（サルコーマ融合／サルコーマ転移（Ｆｕｓｅｄ ｉｎ Ｓａｒｃｏｍａ／Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ｓａｒｃｏｍａ））、ＡＮＧ（アンジオゲニン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン−２）、バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）、ＯＰＴＮ（オプチニューリン）、および染色体９、オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）における非コードＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートの伸長が挙げられる。しかしながら、運動ニューロン変性の正確な機構は依然として解明されていない。
現在、ＡＬＳの治癒的治療は存在しない。最近まで、リルゾールは、唯一のＦＤＡ認可薬であり、グルタミン酸反応をアンタゴナイズして、ＡＬＳの病理学的進展を低減する。しかしながら、初期のＡＬＳ患者で約３か月の寿命延長が報告されているに過ぎず、末期のＡＬＳ患者には治療利益は観察されておらず、この患者集団には治療選択肢が欠如していることが示されている（非特許文献１）。２０１７年には、ＦＤＡがＡＬＳの治療にラジカヴァ（エダラボン）を認可した。かかる認可は２２年ぶりのものだった。ラジカヴァは静脈内投与され、フリーラジカルスカベンジャーとしての役目を果たし、ＡＬＳを患う患者の酸化ストレスを軽減し、それにより疾患進行を遅延させる。１３７人の患者を対象とした臨床第３相試験（ＮＣＴ０１４９２６８６）では、ラジカヴァは、ＡＬＳ機能評定スケール改訂版（ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ）のスコアにより決定したところ、プラセボを投与した患者と比較して、身体機能の低下を遅延させた（非特許文献２）。ラジカヴァの認可は、ＡＬＳの治療の観点では進歩であるとみなされるが、これは依然として治癒ではない。疾患進行を効果的に予防および／または著しく妨げることができる新しい治療戦略には依然として需要がある。
Ｃｕ２＋／Ｚｎ２＋スーパーオキシドジスムターゼＩ型（ＳＯＤ１）の遺伝子における突然変異は、ｆＡＬＳの最も一般的な原因であり、全ｆＡＬＳ症例の約２０〜３０％を占める。最近の報告書は、ＳＯＤ１突然変異が、全ｓＡＬＳ症例の約４％に結び付けられ得ることも示している（非特許文献３）。ＳＯＤ１関連ｆＡＬＳは、正常なＳＯＤ１活性の喪失によって引き起こされるのではなく、むしろ毒性機能の獲得によって引き起こされる可能性が最も高い。突然変異ＳＯＤ１関連ｆＡＬＳ毒性の仮説のうちの１つは、異常なＳＯＤ１酵素が、ペルオキシナイトライトまたは過酸化水素などの小分子による有害フリーラジカルの産生を引き起こすことを提唱する。突然変異ＳＯＤ１神経毒性の他の仮説としては、プロテアソーム活性の阻害、ミトコンドリア損傷、ＲＮＡプロセシングの破壊、および細胞内凝集体の形成が挙げられる。ＡＬＳにおける突然変異ＳＯＤ１変異体および／または野生型ＳＯＤ１の異常蓄積は、病理学的封入体として同定される不溶性線維性凝集体を形成する。凝集したＳＯＤ１タンパク質は、ミトコンドリアストレス（非特許文献４）および細胞、特に運動ニューロンに対する他の毒性を誘導し得る。
これらの知見は、ＳＯＤ１が、家族性および孤発性ＡＬＳの両方の潜在的な治療標的であり得ることを示す。ＡＬＳ患者の中枢神経系で産生されるＳＯＤ１タンパク質を、野生型であるかまたは突然変異体であるかに関わらず低減することができる療法は、運動ニューロン変性ならびに筋力低下および萎縮などの、患者のＡＬＳの症状を改善し得る。野生型および／または突然変異ＳＯＤ１タンパク質凝集の形成を予防するための作用剤および方法は、疾患進行を防止し、ＡＬＳ症状の改善を可能にし得る。近年、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介性遺伝子サイレンシングが、研究者の関心を集めている。ＳＯＤ１遺伝子を標的とする低分子二本鎖ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）分子は、ＡＬＳの治療におけるそれらの可能性が当該技術分野で教示されている（例えば、特許文献１および特許文献２を参照のこと）。
米国特許第７，６３２，９３８号明細書 米国特許出願公開第２００６０２２９２６８号明細書
ベシモン Ｇら（Ｂｅｎｓｉｍｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．２００２ ２４９ ６０９−６１５ 執筆グループ；エダラボン（ＭＣＩ−１８６）ＡＬＳ１９研究グループ（Ｗｒｉｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ；Ｅｄａｒａｖｏｎｅ （ＭＣＩ−１８６） ＡＬＳ １９ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１７ Ｊｕｌ；１６（７）：５０５−５１２） （ロベレヒト（Ｒｏｂｂｅｒｅｃｈｔ）およびフィリップ（Ｐｈｉｌｉｐ）， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， ２０１３， １４， ２４８−２６４） （ペビライネン Ｐら（Ｖｅｈｖｉｌａｉｎｅｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．），Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ．， ２０１４， ８， ｌ ２６）
本開示は、ＡＬＳ患者において、疾患を治療するためにＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害または防止するためのＲＮＡ干渉またはノックダウンに基づく手法を開発する。
本開示は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトおよび／またはｓｉＲＮＡコンストラクト、ｓｈＲＮＡコンストラクトおよび／またはマイクロＲＮＡコンストラクトを含む新規ポリヌクレオチド、ならびにそれらの設計方法を提供する。加えて、これらのｓｉＲＮＡコンストラクトは、細胞送達用の発現ベクター（一方または両方の鎖）にコードされた合成分子であってもよい。かかるベクターとしては、限定はされないが、いずれかのＡＡＶ血清型のベクターゲノムなど、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスなどの他のウイルス送達媒体が挙げられる。
また、本開示は、本開示のＡＡＶベクターおよびウイルスゲノムを送達および／または伝搬するための新規方法であって、限定はされないが、運動ニューロン障害の大ファミリー、ニューロパシー、髄鞘形成の疾患、ならびに固有受容性感覚障害、体性感覚障害、および／または感覚障害などの、脊髄に関連する他の障害に適用し得る方法を提供する。
本開示は、ＳＯＤ１遺伝子発現および／またはＳＯＤ１タンパク質産生を妨害するためのＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドをコードするＡＡＶベクター、ならびにそれらの使用方法を提供する。筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン変性に関連する疾患を治療する方法も、本開示に含まれる。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１は、未治療対象と比較して、ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドをコードするＡＡＶで治療された対象では３０％抑制される。対象には、所定の用量レベルのＡＡＶを注入でまたはボーラスとして投与し得る。非限定的な例として、抑制は、Ｃ１〜Ｌ７前角領域で見られる。
本開示は、遺伝子発現およびタンパク質産生のＲＮＡ分子媒介性遺伝子特異的干渉に関する。筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン変性に関連する疾患を治療する方法も、本開示に含まれる。本明細書で取り上げられる組成物に含まれるｓｉＲＮＡは、ＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な、３０ヌクレオチド以下、概して１９〜２４ヌクレオチド長である領域を有するアンチセンス鎖（アンチセンス鎖またはガイド鎖）を有するｄｓＲＮＡを包含する。
本開示によれば、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖は約１９〜２５ヌクレオチド長、好ましくは約１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、または２５ヌクレオチド長である。一部の態様において、ｓｉＲＮＡは、非修飾ＲＮＡ分子であってもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、ＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、相補性領域は３０ヌクレオチド以下、および少なくとも１５ヌクレオチド長である。概して、ｄｓＲＮＡは１９〜２４、例えば１９〜２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態においてｄｓＲＮＡは約１５〜約２５ヌクレオチド長であり、他の実施形態においてｄｓＲＮＡは約２５〜約３０ヌクレオチド長である。
本開示によれば、ｓｉＲＮＡ二重鎖、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはＳＯＤ１もしくは他の神経変性関連遺伝子もしくは脊髄疾患関連核酸を標的とするｄｓＲＮＡの一方の鎖をコードする核酸を含むＡＡＶベクターが作製され、ＡＡＶベクター血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３−３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２−１ｂ、ＡＡＶ４２−２、ＡＡＶ４２−３ａ、ＡＡＶ４２−３ｂ、ＡＡＶ４２−４、ＡＡＶ４２−５ａ、ＡＡＶ４２−５ｂ、ＡＡＶ４２−６ｂ、ＡＡＶ４２−８、ＡＡＶ４２−１０、ＡＡＶ４２−１１、ＡＡＶ４２−１２、ＡＡＶ４２−１３、ＡＡＶ４２−１５、ＡＡＶ４２−ａａ、ＡＡＶ４３−１、ＡＡＶ４３−１２、ＡＡＶ４３−２０、ＡＡＶ４３−２１、ＡＡＶ４３−２３、ＡＡＶ４３−２５、ＡＡＶ４３−５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１−７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１−８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２−１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２−３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２−４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２−５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３−９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３−１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４−９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４−１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５−３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５−２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ−１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ−５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ−１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ−４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１−８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ ｍｕｔａｎｔ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ ｍｕｔａｎｔ、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ｃａｐｒｉｎｅ ＡＡＶ、ｂｏｖｉｎｅ ＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ、ＡＡＶ−ＬＫ０１、ＡＡＶ−ＬＫ０２、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０４、ＡＡＶ−ＬＫ０５、ＡＡＶ−ＬＫ０６、ＡＡＶ−ＬＫ０７、ＡＡＶ−ＬＫ０８、ＡＡＶ−ＬＫ０９、ＡＡＶ−ＬＫ１０、ＡＡＶ−ＬＫ１１、ＡＡＶ−ＬＫ１２、ＡＡＶ−ＬＫ１３、ＡＡＶ−ＬＫ１４、ＡＡＶ−ＬＫ１５、ＡＡＶ−ＬＫ１６、ＡＡＶ−ＬＫ１７、ＡＡＶ−ＬＫ１８、ＡＡＶ−ＬＫ１９、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ−２−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１０１、ＡＡＶ−８ｈ、ＡＡＶ−８ｂ、ＡＡＶ−ｈ、ＡＡＶ−ｂ、ＡＡＶ ＳＭ １０−２、ＡＡＶシャッフル１００−１、ＡＡＶシャッフル１００−３、ＡＡＶシャッフル１００−７、ＡＡＶシャッフル１０−２、ＡＡＶシャッフル１０−６、ＡＡＶシャッフル１０−８、ＡＡＶシャッフル１００−２、ＡＡＶ ＳＭ １０−１、ＡＡＶ ＳＭ １０−８、ＡＡＶ ＳＭ １００−３、ＡＡＶ ＳＭ １００−１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、ジャパニーズＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．１、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．１０、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．２、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．５、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．７、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．８、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｂ７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｂ７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ１、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ２、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ３、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ４、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ−ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ６、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ７、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ８、ＡＡＶ ＣＨｔ−１、ＡＡＶ ＣＨｔ−２、ＡＡＶ ＣＨｔ−３、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．１、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．１０、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．５、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．６、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．７、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．８、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ１、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ２、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ５、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ８、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ９、ＡＡＶ ＣＫｄ−１、ＡＡＶ ＣＫｄ−１０、ＡＡＶ ＣＫｄ−２、ＡＡＶ ＣＫｄ−３、ＡＡＶ ＣＫｄ−４、ＡＡＶ ＣＫｄ−６、ＡＡＶ ＣＫｄ−７、ＡＡＶ ＣＫｄ−８、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ１、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ２、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ３、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ４、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ５、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ６、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ７、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ８、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ１、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ２、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ３、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ４、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ５、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ６、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｎ３、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｎ４、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｎ９、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ１、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ２、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ３、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ４、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ５、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ６、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ７、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ８、ＡＡＶ ＣＬｖ−１、ＡＡＶ ＣＬｖ１−１、ＡＡＶ Ｃｌｖ１−１０、ＡＡＶ ＣＬｖ１−２、ＡＡＶ ＣＬｖ−１２、ＡＡＶ ＣＬｖ１−３、ＡＡＶ ＣＬｖ−１３、ＡＡＶ ＣＬｖ１−４、ＡＡＶ Ｃｌｖ１−７、ＡＡＶ Ｃｌｖ１−８、ＡＡＶ Ｃｌｖ１−９、ＡＡＶ ＣＬｖ−２、ＡＡＶ ＣＬｖ−３、ＡＡＶ ＣＬｖ−４、ＡＡＶ ＣＬｖ−６、ＡＡＶ ＣＬｖ−８、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ２、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ３、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ４、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ５、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ６、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ７、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ８、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｅ１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｋ１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｋ３、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｋ６、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｌ４、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｌ５、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｌ６、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ１１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ２、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ５、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ６、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ７、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ８、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ９、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ２、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ３、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ４、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ５、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ６、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ７、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ８、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ９、ＡＡＶ ＣＳｐ−１、ＡＡＶ ＣＳｐ−１０、ＡＡＶ ＣＳｐ−１１、ＡＡＶ ＣＳｐ−２、ＡＡＶ ＣＳｐ−３、ＡＡＶ ＣＳｐ−４、ＡＡＶ ＣＳｐ−６、ＡＡＶ ＣＳｐ−７、ＡＡＶ ＣＳｐ−８、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．１０、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．２、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．４、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．５、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．６、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．７、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．８、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．９、ＡＡＶ ＣＳｐ−９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ−３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２



／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ、Ｇ２Ｂ−２６、Ｇ２Ｂ−１３、ＴＨ１．１−３２、ＴＨ１．１−３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５およびそれらのバリアントであってもよい。
本開示はまた、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供する。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖をコードする核酸配列はＡＡＶベクターに挿入される。
一部の実施形態において、本開示は、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子発現の阻害／サイレンシングする方法を提供する。したがって、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを使用して、細胞、詳細には運動ニューロンにおけるＳＯＤ１遺伝子発現を実質的に阻害することができる。一部の態様において、ＳＯＤ１遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％の阻害を指す。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％阻害され得る。ＳＯＤ１遺伝子は、野生型遺伝子、または少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１遺伝子のいずれであってもよい。したがって、ＳＯＤ１タンパク質は、野生型タンパク質、または少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ポリペプチドのいずれかである。
一部の実施形態において、本開示は、治療を必要としている対象の、異常なＳＯＤ１遺伝子および／またはＳＯＤ１タンパク質に関連する筋萎縮性側索硬化症を治療または改善する方法であって、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖の薬学的有効量を対象に投与すること、上記ｓｉＲＮＡ二重鎖を標的細胞に送達すること、ＳＯＤ１遺伝子発現およびタンパク質産生を阻害すること、および対象のＡＬＳの症状を改善することを含む方法を提供する。
一部の実施形態において、ＡＡＶベクターゲノムは、プロモータを含み得る。一態様において、プロモータはＨ１であり得る。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターゲノムは、フィラー配列を含み得る。フィラー配列は、レンチウイルスに由来し得る。一部の実施形態において、フィラーは、哺乳類アルブミン遺伝子に由来し得る。一部の実施形態において、哺乳類アルブミン遺伝子は、ヒトアルブミン遺伝子である。
一部の態様において、ＡＬＳは、ＳＯＤ１突然変異に結び付けられる家族性ＡＬＳである。他の態様において、必ずしも遺伝子突然変異の結果ではないが、ＡＬＳは、ＳＯＤ１タンパク質の異常凝集またはＳＯＤ１タンパク質機能若しくは局在化の混乱により特徴付けられる孤発性ＡＬＳである。本方法によって改善されるＡＬＳの症状としては、運動ニューロン変性、筋力低下、筋肉の硬直、不明瞭発語および／または呼吸困難を挙げることができる。
一部の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖若しくはｄｓＲＮＡまたはかかるｓｉＲＮＡコード分子を含むＡＡＶベクターは、対象の中枢神経系に直接、例えば頭蓋内注射によって導入されてもよい。
一部の実施形態において、本開示の医薬組成物は単独療法として使用される。他の実施形態において、本開示の医薬組成物は併用療法で使用される。併用療法は、運動ニューロン変性に対するそれらの神経保護効果に関して試験済みの、小分子化合物、成長因子およびホルモンなどの１つ以上の神経保護剤との併用であってもよい。
一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるプラスミドまたはＡＡＶベクターの治療有効量をそれを必要としている対象に投与することによって筋萎縮性側索硬化症を治療または改善する方法を提供する。ＡＬＳは、家族性ＡＬＳまたは孤発性ＡＬＳであってもよい。
本方法には、対象の１つ以上の部位にＡＡＶ粒子を実質内投与することが関与してもよい。本方法には、対象の骨髄にＡＡＶ粒子を実質内投与することが関与してもよい。一部の態様において、ＡＡＶ粒子は、脊髄内の２つの部位に投与されてもよい。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、頸部脊髄内の２つの部位に投与されてもよい。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、脊髄のレベルＣ３およびＣ５に投与されてもよい。特定の実施形態において、投与の容積は、脊髄のレベルＣ３では約５ｕＬ〜約２４０μＬであり、脊髄のレベルＣ５では約５μＬ〜約２４０μＬである。特定の実施形態において、投与の容積は、脊髄のレベルＣ３では約５ｕＬ〜約６０μＬであってもよく、脊髄のレベルＣ５では約５μＬ〜約６０μＬであってもよい。一態様において、投与の容積は、脊髄のレベルＣ３では約２５〜約４０μＬであってもよく、脊髄のレベルＣ５では約２５〜約４０μＬであってもよい。骨髄に投与される用量は、脊髄のレベルＣ３では約１×１０１０ｖｇ〜約１×１０１２ｖｇであってもよく、脊髄のレベルＣ５では約１×１０１０ｖｇ〜約１×１０１２ｖｇであってもよい。一部の態様において、骨髄に投与される用量は、脊髄のレベルＣ３では約５×１０１１ｖｇ〜約８×１０１１ｖｇであってもよく、脊髄のレベルＣ５では約５×１０１１ｖｇ〜約８×１０１１ｖｇであってもよい。特定の実施形態において、用量は、脊髄のレベルＣ３では約２×１０１０ｖｇ〜約７×１０１１ｖｇであってもよく、脊髄のレベルＣ５では約２×１０１０ｖｇ〜約７×１０１２ｖｇであってもよい。一態様では、注入速度は５μＬ／分であってもよい。
前出の目的、特徴、および利点ならびに他の目的、特徴、および利点は、付属の図面において例示される、本開示の特定の実施形態についての以下の説明から明らかになるであろう。図面は、必ずしも縮尺通りではなく、本開示の多様な実施形態についての原理を例示することに強調を置いている。
異なるｎＭ濃度のｓｉＲＮＡによるヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現の用量応答曲線を示す図。 ＳＫ−ＲＳＴ細胞株におけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを示す図。
本開示は、治療剤としてのＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドに関する。ＲＮＡ干渉媒介性遺伝子サイレンシングは、遺伝子発現を特異的に阻害することができる。したがって、本開示は、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子（低分子干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびそれらの前駆体などのポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを包含する医薬組成物、ならびにそれらの設計プロセスを提供する。また、本開示は、脊髄に関連する障害および／または神経変性疾患、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するための、ＳＯＤ１遺伝子発現およびタンパク質産生を阻害するためのそれらの使用方法を提供する。
本開示の１つ以上の実施形態の詳細が下記の添付の説明に示される。本発明の実施または試験においては本明細書に記載されるものと同様のまたは等価な任意の材料および方法を使用し得るが、ここで好ましい材料および方法について説明する。本発明の他の特徴、目的および利点が、この説明から明らかになるであろう。説明においては、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形に複数形も含まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、本説明が優先するものとする。
脊髄に関連する障害
脊髄は、中枢神経系（ＣＮＳ；脳および脊髄）を共に特徴付ける２つの構成部分のうちの１つである。脊髄は、身体を脳と接続し、運動および感覚に必要なメッセージおよび情報交換のための導管としての役目を果たす。脊髄は、脊柱内に収容されており、神経線維および細胞体、ならびに支持細胞で構成される、壊れやすく細い管状束である。
運動ニューロンおよび脊髄経路は、運動の開始、実行、修正、および精度にとって重要である。これらのニューロンおよび／または経路は、限定ではないが、外傷、腫瘍性増殖、心臓血管異常、炎症、脱髄、ニューロパシー、変性および／または細胞死など、何らかの様式で損傷すると、その帰結は、典型的には何らかの形態の運動異常である。同様に、感覚ニューロンおよび脊髄経路は、固有受容性感覚および感覚にとって重要であり、損傷すると、特定の刺激を感知できないことおよび／または疼痛症候群がもたらされる場合がある。
上記に記載されているものなど、脊髄に関連する障害の非限定的な例としては、限定ではないが、以下のものが挙げられる：運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリッグ病）、進行性球麻痺、偽性球麻痺、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、ポリオ後症候群、球麻痺、ケネディー病、遺伝性痙性対麻痺、フリードライヒ運動失調症、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性運動感覚性ニューロパシー、腓骨筋萎縮症、ニューロパシー、脱髄疾患、ウイルス性脱髄、代謝性脱髄、多発性硬化症、視神経脊髄炎（デビック病）、同心性硬化症（バロー硬化症）、運動失調症、対麻痺、脊髄小脳失調症、急性散在性脳脊髄炎、複合性局所疼痛症候群（ＣＰＲＳ ＩおよびＣＰＲＳ ＩＩ）、毛細血管拡張性運動失調、発作性運動失調症、多系統萎縮症、散発性運動失調症、脂質蓄積症、ニーマン・ピック病、ファブリ病、ファーバー疾患、ＧＭ１またはＧＭ２ガングリオシドーシス、テイサックス病、サンドホフ病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、マシャド・ジョゼフ病（脊髄小脳失調症３型）、脳膜炎、骨髄炎、ミオパシー、ミトコンドリアミオパシー、脳筋症、バース症候群、慢性進行性外眼筋麻痺、カーンズ・セイヤ症候群、リー症候群、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん、ＮＡＲＰ（ニューロパシー・運動失調・網膜色素変性症）、神経筋接合部の疾患、重症筋無力症、ミオクローヌス、神経障害性疼痛、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、レビー小体病、ビタミンＢ１２欠乏症、亜急性脊髄連合変性症（リヒトハイム症）、熱帯性痙性不全対麻痺、遠位遺伝性運動ニューロパシー、モルヴァン症候群、白質萎縮症、および／またはレット症候群。
特定の実施形態において、本開示の組成物および方法は、中枢神経系の任意の疾患を治療するために使用され得る。
特定の実施形態において、本開示の組成物および方法は、脊髄に関連する疾患を治療するために使用され得る。
特定の実施形態において、本開示の組成物および方法は、神経変性疾患を治療するために使用され得る。
特定の実施形態において、本開示の組成物および方法は、運動ニューロン疾患を治療するために使用され得る。
特定の実施形態において、本開示の組成物および方法は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために使用され得る。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびＳＯＤ１
成人発症型神経変性障害である筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）とは、運動皮質、脳幹、および脊髄における運動ニューロンの選択的死を特徴とする、進行性かつ致死性の疾患である。ＡＬＳと診断された患者は、痙縮、反射亢進または反射低下、線維束性攣縮、筋肉萎縮、および麻痺を特徴とする、進行性の筋肉表現型を発現する。これらの運動機能障害は、運動ニューロンの喪失に起因する、筋肉の除神経により引き起こされる。ＡＬＳの、主要な病理学的特徴は、皮質脊髄路の変性および下位運動ニューロン（ＬＭＮ）または前角細胞の広範囲にわたる喪失（ガタクら（Ｇｈａｔａｋ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．，１９８６、４５、３８５−３９５）、一次運動野内のベッツ細胞および他の錐体細胞の変性および喪失（宇高ら（Ｕｄａｋａ ｅｔ ａｌ．），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，１９８６，７０，２８９−２９５；前川ら（Ｍａｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ．），Ｂｒａｉｎ，２００４，１２７，１２３７−１２５１）、ならびに運動皮質および脊髄における反応性のグリオーシス（川又ら（Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．），Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．，１９９２，１４０，６９１−７０７；およびシッファーら（Ｓｃｈｉｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ．，１９９６，１３９，２７−３３）を含む。ＡＬＳは通例、呼吸器の不全および／または炎症に起因する診断後３〜５年以内に致死性となる（ローランドＬＰおよびシュナイダーＮＡ（Ｒｏｗｌａｎｄ ＬＰおよびＳｈｎｅｉｂｄｅｒ ＮＡ），Ｎ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００１，３４４，１６８８−１７００）。
ＡＬＳの細胞の特徴は、変性しつつある運動ニューロンおよび周囲の細胞（例えば、アストロサイト）における、タンパク質性封入体、ユビキチン化封入体、細胞質性封入体の存在である。ユビキチン化封入体（すなわち、レビー小体様封入体または糸くず様封入体）は、ＡＬＳにおいて、最も一般的かつ特異的なタイプの封入体であり、脊髄および脳幹のＬＭＮ内、ならびに皮質脊髄の上位運動ニューロン（ＵＭＮ）内において見出される（松本ら（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ．，１９９３，１１５，２０８−２１３；および佐々木および丸山（Ｓａｓａｋ ａｎｄ Ｍａｒｕｙａｍａ），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，１９９４，８７，５７８−５８５）。ユビキチン、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、ペリフェリン、およびドルフィンを含む、少数のタンパク質が、封入体の構成要素であると同定されている。神経フィラメント性封入体は、ＡＬＳの脊髄運動ニューロン内の、集塊状ヒアリン封入体（ＨＣＩ）および軸索「スフェロイド」において見出されることが多い。他のタイプの、それほど特殊ではない封入体は、皮質の上層における、ブニナ小体（シスタチンＣ含有封入体）および三日月形封入体（ＳＣＩ）を含む。ＡＬＳにおいて見られる、他の神経病理学的特徴は、ゴルジ装置の断片化、ミトコンドリア空胞変性、およびシナプス末端の超構造的異常を含む（藤田ら（Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，２００２，１０３、２４３−２４７）。
加えて、前頭側頭型認知症性ＡＬＳ（ＦＴＤ−ＡＬＳ）において、ＦＴＤ−ＡＬＳ患者において、認知機能障害を引き起こし得る皮質萎縮（前頭葉および側頭葉を含む）もまた観察される。
ＡＬＳは、複雑かつ多因子性の疾患であり、ＡＬＳの発症機序の一因となると仮定された複数の機構は、タンパク質分解の機能不全、グルタミン酸興奮毒性、ミトコンドリアの機能不全、アポトーシス、酸化ストレス、炎症、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集、ＲＮＡ代謝の異常、および遺伝子発現の変更を含む。
ＡＬＳ症例のうちの約１０％は、疾患の家族歴を有し、これらの患者を、一般に、メンデルの優性遺伝方式および高浸透度を伴う、家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）患者または遺伝性患者と称する。残り（約９０％〜９５％）は、家族歴の記録と関連せず、環境因子、遺伝子的多型、体細胞の突然変異、および、おそらく、遺伝子−環境相互作用を含む、他の危険性因子に起因すると考えられるので、孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）として分類される。大半の症例において、家族性（または遺伝性）ＡＬＳは、常染色体優性疾患として、遺伝性であるが、常染色体劣性遺伝およびＸ連鎖遺伝ならびに不完全な浸透度を伴う家系も存在する。孤発性形態と家族性形態とは、臨床的に識別不可能であることから、共通の発症機序が示唆される。ＡＬＳにおける、運動ニューロンの選択的死の正確な原因は、理解しがたいままである。ｆＡＬＳにおける遺伝的因子の理解が進むと、疾患の両方の形態に対して、光を投げかけ得る。
近年、ＡＬＳの遺伝的原因の研究および理解が急速に進み、ｆＡＬＳを引き起こすことが今や公知である、１０個超の異なる遺伝子における突然変異の発見に結び付いている。最も一般的な突然変異は、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１；約２０％）（ローゼンＤＲら（Ｒｏｓｅｎ ＤＲ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，５９−６２）、ＦＵＳ／ＴＬＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｉｎ ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ；１〜５％）、およびＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ；１〜５％）をコードする遺伝子内に見出される。近年、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子内の、ヘキサヌクレオチドリピート（ＧＧＧＧＣＣ）ｎの伸長が、欧米人口において、ｆＡＬＳの最も高頻度（約４０％）の原因として同定された（レントンら（Ｒｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１４、１７，１７−２３により総説されている）。ＡＬＳにおいて突然変異している他の遺伝子は、アルシン（ＡＬＳ２）、セナタキシン（ＳＥＴＸ）、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＰＢ）、アンギオゲニン（ＡＮＧ）を含む。ｆＡＬＳ遺伝子は、異なる細胞機構を制御することから、ＡＬＳの発症機序が、複雑であり、最終的に、運動ニューロン変性をもたらす、幾つかの異なる過程に関し得ることが示唆される。
ＳＯＤ１は、哺乳動物において同定され、特徴付けられた、３つのヒトスーパーオキシドジスムターゼ：銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤまたはＳＯＤ１）、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ ＳＯＤまたはＳＯＤ２）、および細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣＳＯＤまたはＳＯＤ３）のうちの１つである。ＳＯＤ１は、ヒト第２１染色体上のＳＯＤ１遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４５４．４）によりコードされる、サブユニット１つ当たり１つの銅結合部位と、１つの亜鉛結合部位とを伴う、３２ｋＤａのホモ二量体による、１５３残基のポリペプチドである（表１０を参照のこと）。ＳＯＤ１は、結合した銅イオンにおける、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）の、酸素分子（Ｏ２）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）への反応を触媒する。ＳＯＤ１の細胞内濃度は、高濃度（１０〜１００μＭの範囲）であり、中枢神経系（ＣＮＳ）内の全タンパク質含量のうちの１％を占める。このタンパク質は、真核細胞の細胞質だけでなく、核、リソソーム、ペルオキシソーム、およびミトコンドリア膜間腔にも局在化されている（リンデナウ Ｊら（Ｌｉｎｄｅｎａｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．），Ｇｌｉａ，２０００，２９，２５−３４）。
ＳＯＤ１遺伝子内の突然変異は、ｆＡＬＳ患者のうちの１５〜２０％および全てのＡＬＳ症例のうちの１〜２％により保有されている。現在のところ、１５３アミノ酸のＳＯＤ１ポリペプチド全体にわたって分布する、少なくとも１７０の異なる突然変異が、ＡＬＳを引き起こすことが見出されており、ＡＬＳ Ｏｎｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＡＬＳＯＤ）において、最新のリストを見出すことができる（ロー Ｒら（Ｗｒｏｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．）、Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒ．，２００８，９，２４９−２５０）。表１は、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１内の突然変異の一部の例を列挙する。これらの突然変異は、欠失、挿入、およびＣ末端の切断もまた生じるが、主に、単一のアミノ酸置換（すなわち、ミスセンス突然変異）である。異なるＳＯＤ１突然変異は、異なる領域的分布パターンを提示する。例えば、ＳＯＤ１遺伝子の突然変異により引き起こされるＡＬＳを伴う、全ての米国人のうちの約半分は、特定の突然変異であるＡｌａ４Ｖａｌ（またはＡ４Ｖ）を有する。Ａ４Ｖ突然変異は、典型的に、より重度の徴候および症状と関連する。Ｉ１１３Ｔ突然変異は、英国において、極めて一般的な突然変異である。欧州において最も蔓延する突然変異は、Ｄ９０Ａ置換である。
Figure 2021529513
 ＳＯＤ１遺伝子の欠損と関連するニューロン死の機構について研究するため、当技術分野では、ＳＯＤ１と連関するＡＬＳについての幾つかの齧歯動物モデルであって、ミスセンス突然変異、小規模な欠失、または挿入を含む、様々な突然変異を伴うヒトＳＯＤ１遺伝子を発現する齧歯動物モデルが開発された。ＡＬＳマウスモデルの一部の例は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ、ＳＯＤ１Ｇ３７Ｒ、ＳＯＤ１Ｇ８５Ｒ、ＳＯＤ１Ｄ９０Ａ、ＳＯＤ１Ｌ８４Ｖ、ＳＯＤ１Ｉ１１３Ｔ、ＳＯＤ１Ｈ３６Ｒ／Ｈ４８Ｑ、ＳＯＤ１Ｇ１２７Ｘ、ＳＯＤ１Ｌ１２６Ｘ、およびＳＯＤ１Ｌ１２６ｄｅｌＴＴを含む。２つの異なるヒトＳＯＤ１突然変異：ＳＯＤ１Ｈ４６ＲおよびＳＯＤ１Ｇ９３Ｒを保有する、２つのトランス遺伝子ラットモデルが存在する。これらの齧歯動物ＡＬＳモデルは、ヒトＡＬＳ患者と同様の筋力低下、およびヒト疾患の幾つかの特徴、特に、脊髄運動ニューロンの選択的死、タンパク質封入体の、運動ニューロン内の凝集、およびマイクログリアの活性化を反映する、他の病原性の特徴を発症し得る。当技術分野では、トランスジェニック齧歯動物が、ヒトＳＯＤ１関連ＡＬＳ疾患の良好なモデルであり、疾患の発症機序について研究し、疾患の治療を開発するためのモデルをもたらすことが周知である。
動物モデルおよび細胞モデルにおける研究は、ＳＯＤ１の病原性バリアントが、機能獲得により、ＡＬＳを引き起こすことを示した。すなわち、スーパーオキシドジスムターゼ酵素は、ＳＯＤ１突然変異により変更されると、新規であるが有害な特性を獲得する。例えば、ＡＬＳにおける、一部のＳＯＤ１突然変異バリアントは、レドックスサイクルの破壊により、酸化ストレスを増大させる（例えば、毒性スーパーオキシドラジカルの蓄積の増大）。他の研究はまた、ＡＬＳにおける、一部のＳＯＤ１突然変異バリアントが、その正常な生理学的機能から独立した毒性特性（ミスフォールディングしたＳＯＤ１バリアントの異常な凝集など）を獲得し得ることも指し示す。異常レドックス化学反応モデルにおいて、突然変異体ＳＯＤ１は、不安定であり、異常化学反応を介して、通常とは異なる基質と相互作用し、反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の過剰産生を引き起こす。タンパク質毒性モデルにおいて、不安定な、ミスフォールディングＳＯＤ１は、細胞質性封入体へと凝集し、細胞過程に重要なタンパク質を隔離してしまう。これらの２つの仮説は、相互に排除的ではない。活性部位内の金属に結合する、選択されたヒスチジン残基の酸化が、ＳＯＤ１の凝集を媒介することが示されている。
凝集した突然変異体ＳＯＤ１タンパク質はまた、ミトコンドリア機能不全（ベービライネンら（Ｖｅｈｖｉｌａｉｎｅｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．），Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１４，８，１２６）、軸索輸送の機能障害、ＲＮＡ代謝の異常、グリア細胞病態、およびグルタミン酸興奮毒性も誘導し得る。一部の孤発性ＡＬＳ症例において、ミスフォールディングした野生型ＳＯＤ１タンパク質は、家族性ＡＬＳと連関するＳＯＤ１バリアントと同様の「毒性コンフォメーション」を形成する、罹患運動ニューロン内に見出される（ロトゥンノＭＳおよびボスコＤＡ（Ｒｏｔｕｎｎｏ ＭＳ ａｎｄ Ｂｏｓｃｏ ＤＡ），Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１３，１６，７，２５３）。このような証拠は、ＡＬＳが、アルツハイマー病およびパーキンソン病など、他の神経変性疾患と類似する、タンパク質ミスフォールディングの疾患であることを示唆する。
現在のところ、ＡＬＳを患う患者には、治癒的治療が利用可能でない。最近まで、唯一のＦＤＡ承認薬は、グルタミン酸放出の阻害剤であるリルゾール（リルテックとも呼ばれる）であり、ＡＬＳに対して中程度の効果を示すが、１８カ月間にわたって服用しても、生存を２〜３カ月間延長するに過ぎなかった。残念ながら、リルゾールを服用する患者は、疾患進行の緩徐化または筋肉機能の改善を一切経ない。したがって、リルゾールは、治癒も、有効な治療すらも提示しない。２０１７年には、ＦＤＡがＡＬＳの治療にラジカヴァ（エダラボン）を認可した。かかる認可は２２年ぶりのものだった。静脈内投与され、フリーラジカルスカベンジャーおよび抗酸化剤としての役目を果たすラジカヴァは、疾患進行を遅延させることが示されている。１３７人の患者を対象とした臨床第３相試験（ＮＣＴ０１４９２６８６）では、ラジカヴァは、ＡＬＳ機能評定スケール改訂版（ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ）のスコアにより決定したところ、プラセボを投与した患者と比較して、身体機能の低下を遅延させた（執筆グループ；エダラボン（ＭＣＩ−１８６）ＡＬＳ１９研究グループ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１７ Ｊｕｌ；１６（７）：５０５−５１２）。ラジカヴァの認可は、ＡＬＳの治療の観点では進歩であるとみなされるが、これは依然として治癒ではない。研究者らは、より良好な治療剤の探求を続けている。
異常なＳＯＤ１タンパク質凝集を阻害するための１つの手法は、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１遺伝子の発現をサイレンシングする／阻害することである。突然変異対立遺伝子の特異的な遺伝子サイレンシングのための低分子干渉ＲＮＡが、ＡＬＳの治療に治療的に有益であることが報告されている（例えば、それらの各々の内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に援用される、ラルフＧＳら（Ｒａｌｇｈ ＧＳ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００５，１１（４），４２９−４３３；およびラウールＣら（Ｒａｏｕｌ Ｃ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００５，１１（４），４２３−４２８；およびマックスウェルＭＭら（Ｍａｘｗｅｌｌ ＭＭ ｅｔ ａｌ．），ＰＮＡＳ、２００４、１０１（９），３１７８−３１８３；およびディング Ｈら（Ｄｉｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．），Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊ．，２０１１，１２４（１），１０６−１１０；およびシュワルツＤＳら（Ｓｃｈａｒｚ ＤＳ ｅｔ ａｌ．），Ｐｌｏｓ Ｇｅｎｅｔ．，２００６，２（９），ｅ１４０）。
当技術分野では、ＳＯＤ１遺伝子を標的とし、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１の発現を調節する他の多くのＲＮＡ治療剤も教示されており、のようなＲＮＡベースの薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二本鎖低分子干渉ＲＮＡを含む。例えば、それらの各々の内容が、参照によりその全体において本明細書に援用される、ワンＨら（Ｗａｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００８、２８３（２３），１５８４５−１５８５２；米国特許第７，４９８，３１６号明細書；同第７，６３２，９３８号明細書；同第７，６７８，８９５号明細書；同第７，９５１，７８４号明細書；同第７，９７７，３１４号明細書；同第８，１８３，２１９号明細書；同第８，３０９，５３３号明細書および同第８，５８６，５５４号明細書；および米国特許出願公開第２００６／０２２９２６８号明細書および同第２０１１／０２６３６８０号明細書を参照されたい。
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターを用いて、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを高効率で細胞に送達する。ＲＮＡｉ分子、例えば本開示のｓｉＲＮＡ分子を含むＡＡＶベクターは、運動ニューロンへの活性薬剤の送達を増加させ得る。ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは、細胞内のＳＯＤ１遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡレベル）を、著明に阻害することが可能であってもよく；したがって、タンパク質の凝集および封入体の形成、フリーラジカルの増大、ミトコンドリア機能不全、ならびにＲＮＡ代謝など、ＳＯＤ１の発現に誘導される、細胞内のストレスを改善する。
かかるＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは、ＡＬＳの治療のために使用され得る。本開示によれば、患者のＡＬＳを治療および／または改善する方法であって、患者に対して、１つ以上のｓｉＲＮＡ二重鎖をコードする少なくとも１つのＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドの有効量を細胞に投与すること、およびＳＯＤ１遺伝子発現の阻害／サイレンシングを可能にすることを含む方法が提供される。
組成物
ベクター
一部の実施形態において、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ分子は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入されてもよくまたはコードされてもよい。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、ウイルスベクターに挿入またはコードされる。
ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターなどであってもよい。一部の特定の実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。
レトロウイルスベクター
一部の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖は、レトロウイルスベクターよりコードされてもよい（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号明細書；同第５，１２４，２６３号明細書；同第４，６５０，７６４号明細書および同第４，９８０，２８９号明細書を参照のこと；これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
アデノウイルスベクター
アデノウイルスは、インビボで核酸を様々な細胞タイプへと効率的に送達するように修飾することができる真核生物ＤＮＡウイルスであり、遺伝子を神経細胞へと標的化するためのものを含む遺伝子治療プロトコールにて広範に使用されている。種々の複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが、核酸療法剤に関して記載されている（例えば、国際公開第１９９４２６９１４号パンフレット、国際公開第１９９５０２６９７号パンフレット、国際公開第１９９４２８１５２号パンフレット、国際公開第１９９４１２６４９号パンフレット、国際公開第１９９５０２６９７号パンフレット、国際公開第１９９６２２３７８号パンフレットを参照のこと；これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）。かかるアデノウイルスベクターも、本開示のｓｉＲＮＡ分子の細胞への送達に使用し得る。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
ＡＡＶは、依存性パルボウイルスである。他のパルボウイルスと同様に、ＡＡＶは、複製に関与するタンパク質（Ｒｅｐ）およびカプシドの構造タンパク質（Ｃａｐ）をコードする２つのオープンリーディングフレームを含有する約５０００ヌクレオチド長のゲノムを有する一本鎖非エンベロープＤＮＡウイルスである。オープンリーディングフレームは、ウイルスゲノムの複製開始点としての役目を果たす２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）配列により隣接される。更に、ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶカプシドへのウイルスゲノムのパッケージングを可能にするパッケージング配列を含有する。ＡＡＶベクターには、感染細胞にて増殖性感染を起こすためのコヘルパー（例えば、アデノウイルス）が必要である。かかるヘルパー機能の非存在下では、ＡＡＶビリオンは、本質的に、宿主細胞に侵入し、細胞のゲノムに組み込まれる。
ＡＡＶベクターは、幾つかの固有特徴を有するため、ｓｉＲＮＡ送達について調査されている。これらの特徴としては、（ｉ）分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力；（ｉｉ）ヒト細胞を含む幅広い範囲の宿主に対する感染力；（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶはいかなる疾患にもまったく関連付けられておらず、感染細胞で複製することができないこと；（ｉｖ）ベクターに対する細胞媒介性免疫応答の欠如および（ｖ）宿主染色体に組み込まれるかまたはエピゾーム的に存続し、それにより長期発現能力をもたらすことができることが挙げられる。更に、ＡＡＶベクターによる感染は、細胞遺伝子発現パターンの変化に及ぼす影響が最小限である（スティルウェルおよびサムルスキら（Ｓｔｉｌｗｅｌｌ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００３，３４，１４８）。
典型的には、ｓｉＲＮＡ送達用のＡＡＶベクターは、ウイルスゲノム内に機能的ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする配列を欠如するため複製欠損である組換えウイルスベクターであってもよい。ある場合には、欠損ＡＡＶベクターは、ほとんどのすべてのコード配列を欠如してもよく、本質的に、１つまたは２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列およびパッケージング配列のみを含有する。
また、ＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）を含んでいてもよい。ｓｃＡＡＶベクターは、共にアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成する両方のＤＮＡ鎖を含有する。第２鎖の合成をスキップすることにより、ｓｃＡＡＶは、細胞において迅速に発現することが可能である。
ＡＡＶベクターを作製および／または修飾する方法は、シュードタイプＡＡＶベクターなど、当該技術分野において開示されている（国際公開第２０００２８００４号パンフレット、同第２００１２３００１号パンフレット、同第２００４１１２７２７号パンフレット、同第２００５００５６１０号パンフレットおよび同第２００５０７２３６４号パンフレット、これらの各々の内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
ｓｉＲＮＡ分子を哺乳類細胞に送達するためのＡＡＶベクターは、限定はされないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８およびＡＡＶ−ＤＪを含む、ＡＡＶの種々の血清型から調製されてもよく、またはそれらに由来してもよい。ある場合には、異なるＡＡＶ血清型が共に、または他のタイプのウイルスと混合されることにより、キメラＡＡＶベクターが作製されてもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶｒｈ１０である。
ｓｉＲＮＡ送達用のＡＡＶベクターは、送達の効率を増強するように修飾されてもよい。ｓｉＲＮＡ発現カセットを含有するかかる修飾ＡＡＶベクターは、効率的にパッケージングすることができ、高頻度でおよび最低限の毒性で標的細胞への感染を成功させるために使用することができる。
一部の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖を送達するためのＡＡＶベクターは、ヒト血清型ＡＡＶベクターであってもよい。かかるヒトＡＡＶベクターは、任意の公知の血清型、例えば、血清型ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１１のいずれか１つに由来し得る。非限定的な例として、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１由来カプシドにＡＡＶ１由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ２由来ゲノムにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ４由来カプシドにＡＡＶ４由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ６由来カプシドにＡＡＶ６由来ゲノムを含むベクターまたはＡＡＶ９由来カプシドにＡＡＶ９由来ゲノムを含むベクターであってもよい。
他の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖を送達するためのＡＡＶベクターは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型を起源とする配列および／または成分を含有するシュードタイプＡＡＶベクターであってもよい。シュードタイプＡＡＶベクターは、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムと、少なくとも一部が異なるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質とを含むベクターであってもよい。非限定的な例として、かかるシュードタイプＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；またはＡＡＶ６由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；またはＡＡＶ４由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノム；もしくはＡＡＶ９由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクターであってもよい。
他の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ｓｉＲＮＡ分子を中枢神経系に送達するために使用し得る（例えば、米国特許第６，１８０，６１３号明細書；この内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
一部の態様において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖を送達するためのＡＡＶベクターは、非ウイルス起源のペプチドを含む修飾カプシドを更に含んでもよい。他の態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖の脳および脊髄への送達を促進するため、ＡＡＶベクターはＣＮＳ特異的キメラカプシドを含んでもよい。例えば、ＣＮＳ向性を呈するＡＡＶバリアントからのｃａｐヌクレオチド配列のアラインメントを作成することにより可変領域（ＶＲ）配列および構造を同定してもよい。
本開示は、カプシド（Ｃａｐ）遺伝子によってコードされる構造カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む）を参照する。これらのカプシドタンパク質は、ＡＡＶなどのウイルスベクターの外側タンパク質構造シェル（つまり、カプシド）を形成する。Ｃａｐポリヌクレオチドから合成されるＶＰカプシドタンパク質は、一般に、ペプチド配列の最初のアミノ酸としてメチオニン（Ｍｅｔ１）を含み、Ｍｅｔ１は、対応するＣａｐヌクレオチド配列の開始コドン（ＡＵＧまたはＡＴＧ）に関連する。しかしながら、最初のメチオニン（Ｍｅｔ１）残基または一般に任意の最初のアミノ酸（ＡＡ１）は、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼなどのタンパク質プロセシング酵素によってポリペプチド合成後または合成中に切断されるのが一般的である。この「Ｍｅｔ／ＡＡクリッピング」プロセスは、ポリペプチド配列の二番目のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、セリン、トレオニンなど）の対応するアセチル化と相関することが多い。Ｍｅｔクリッピングは、一般的にはＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質で生じるが、ＶＰ２カプシドタンパク質でも生じる場合がある。
Ｍｅｔ／ＡＡクリッピングが不完全であると、ウイルスカプシドを含む１つ以上の（１つ、２つ、または３つの）ＶＰカプシドタンパク質の混合物が産生される場合があり、それらの一部はＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）を含み得、それらの一部はＭｅｔ／ＡＡクリッピング（Ｍｅｔ−／ＡＡ−）の結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠如し得る。カプシドタンパク質のＭｅｔ／ＡＡクリッピングに関するさらなる考察については、ジンら（Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．）、組換えアデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質を完全に特徴付けるための直接的液体クロマトグラフィー／質量分析（Ｄｉｒｅｃｔ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｏｃｔ．２８（５）：２５５−２６７；ウォンら（Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）細胞タンパク質のＮ末端アセチル化は特異的分解シグナルを創出する（Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｒｅａｔｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌｓ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９．３２７（５９６８）：９７３−９７７を参照のこと。これらの内容は各々、参照により全体として本明細書に援用される。
本開示によれば、カプシドタンパク質への参照は、クリッピングされた（Ｍｅｔ−／ＡＡ−）またはクリッピングされていない（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）のいずれかに限定されることはなく、状況に応じて、独立したカプシドタンパク質、カプシドタンパク質の混合物で構成されるウイルスカプシド、および／または本開示のカプシドタンパク質をコードする、記述する、産生する、もしくはもたらすポリヌクレオチド配列（またはそれらの断片）を指すことができる。また、「カプシドタンパク質」または「エカプシドポリペプチド」（ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ２など）への直接的参照は、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）ならびにＭｅｔ／ＡＡクリッピング（Ｍｅｔ−／ＡＡ−）の結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠如する対応するＶＰカプシドタンパク質を含むＶＰカプシドタンパク質を含み得る。
さらに、本開示によれば、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）をそれぞれ含む１つ以上のカプシドタンパク質を含むかまたはコードする特定の配列番号（タンパク質であるかまたは核酸であるかに関わらず）への参照は、配列の精査した際にＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠如するＶＰカプシドタンパク質を教示すると理解されるべきであり、それは、最初に挙げられているアミノ酸（Ｍｅｔ１／ＡＡ１であるか否かに関わらず）を単に欠如するあらゆる配列であることは言うまでもなく明らかである。
また、非限定的な例として、７３６アミノ酸長であり、ＡＵＧ／ＡＴＧ開始コドンによってコードされる「Ｍｅｔ１」アミノ酸を含む（Ｍｅｔ＋）ＶＰ１ポリペプチド配列への参照は、７３５アミノ酸長であり、７３６アミノ酸Ｍｅｔ＋配列の「Ｍｅｔ１」アミノ酸を含まない（Ｍｅｔ−）ＶＰ１ポリペプチド配列を教示すると理解することができる。また、第２の非限定的な例として、７３６アミノ酸長であり、ＮＮＮ開始コドンによってコードされる「ＡＡ１」アミノ酸を含む（ＡＡ１＋）ＶＰ１ポリペプチド配列への参照は、７３５アミノ酸長であり、７３６アミノ酸ＡＡ１＋配列の「ＡＡ１」アミノ酸を含まない（ＡＡ１−）ＶＰ１ポリペプチド配列を教示すると理解することができる。
ＶＰカプシドタンパク質から形成されるウイルスカプシドへの参照（特定のＡＡＶカプシド血清型への参照など）は、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を含む（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）ＶＰカプシドタンパク質、Ｍｅｔ／ＡＡ１クリッピングの結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠如する（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）対応するＶＰカプシドタンパク質、およびそれらの組合せ（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋およびＭｅｔ−／ＡＡ１−）を組み込み得る。
非限定的な例として、ＡＡＶカプシド血清型は、ＶＰ１（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）、ＶＰ１（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）、またはＶＰ１（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）およびＶＰ１（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）の組合せを含み得る。ＡＡＶカプシド血清型は、ＶＰ３（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）、ＶＰ３（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）、またはＶＰ３（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）およびＶＰ３（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）の組合せも含み得、ＶＰ２（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１）およびＶＰ２（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）の類似の任意選択の組合せも含み得る。
ウイルスゲノム
特定の実施形態において、示されるように、ＡＡＶ粒子は、ペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。
ウイルスゲノムサイズ
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、一本鎖または二本鎖ウイルスゲノムであってもよい。ウイルスゲノムのサイズは、小型、中型、大型または最大サイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、小型一本鎖ウイルスゲノムであってもよい。小型一本鎖ウイルスゲノムは、約２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、および３．５ｋｂサイズなど、２．７〜３．５ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、小型一本鎖ウイルスゲノムは３．２ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、小型二本鎖ウイルスゲノムであってもよい。小型二本鎖ウイルスゲノムは、約１．３、１．４、１．５、１．６、および１．７ｋｂサイズなど、１．３〜１．７ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、小型二本鎖ウイルスゲノムは１．６ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、中型一本鎖ウイルスゲノムであってもよい。中型一本鎖ウイルスゲノムは、約３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２および４．３ｋｂサイズなど、３．６〜４．３ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、中型一本鎖ウイルスゲノムは４．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、中型二本鎖ウイルスゲノムであってもよい。中型二本鎖ウイルスゲノムは、約１．８、１．９、２．０、および２．１ｋｂサイズなど、１．８〜２．１ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、中型二本鎖ウイルスゲノムは２．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、大型一本鎖ウイルスゲノムであってもよい。大型一本鎖ウイルスゲノムは、約４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９および６．０ｋｂサイズなど、４．４〜６．０ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、大型一本鎖ウイルスゲノムは４．７ｋｂサイズであってもよい。別の非限定的な例として、大型一本鎖ウイルスゲノムは４．８ｋｂサイズであってもよい。更に別の非限定的な例として、大型一本鎖ウイルスゲノムは６．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、大型二本鎖ウイルスゲノムであってもよい。大型二本鎖ベクターゲノムは、約２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９および３．０ｋｂサイズなど、２．２〜３．０ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、大型二本鎖ウイルスゲノムは２．４ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
ウイルスゲノム成分：末端逆位配列（ＩＴＲ）
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＩＴＲ領域とペイロード領域とを有するウイルスゲノムを含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲを有する。これらの２つのＩＴＲは５’末端および３’末端でペイロード領域に隣接する。ＩＴＲは、複製のための認識部位を含む複製起点として働く。ＩＴＲは、相補的でかつ対称に配置され得る配列領域を含む。本開示のウイルスゲノムに組み込まれるＩＴＲは、天然に存在するポリヌクレオチド配列または組換え的に誘導されたポリヌクレオチド配列を含み得る。
ＩＴＲは、本明細書の血清型のいずれか、またはその誘導体から選択される、カプシドと同じ血清型に由来してもよい。ＩＴＲはカプシドと異なる血清型であってもよい。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は２つ以上のＩＴＲを有する。非限定的な例では、ＡＡＶ粒子は、２つのＩＴＲを含むウイルスゲノムを有する。特定の実施形態において、ＩＴＲは互いに同じ血清型である。別の実施形態において、ＩＴＲは異なる血清型である。非限定的な例としては、ＩＴＲのうちゼロ個、一方または両方がカプシドと同じ血清型を有することが挙げられる。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムの両方のＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである。
独立に、各ＩＴＲは約１００〜約１５０ヌクレオチド長であってもよい。ＩＴＲは、約１００〜１０５ヌクレオチド長、１０６〜１１０ヌクレオチド長、１１１〜１１５ヌクレオチド長、１１６〜１２０ヌクレオチド長、１２１〜１２５ヌクレオチド長、１２６〜１３０ヌクレオチド長、１３１〜１３５ヌクレオチド長、１３６〜１４０ヌクレオチド長、１４１〜１４５ヌクレオチド長または１４６〜１５０ヌクレオチド長であってもよい。特定の実施形態において、ＩＴＲは１４０〜１４２ヌクレオチド長である。ＩＴＲ長さの非限定的な例は、１０２、１４０、１４１、１４２、１４５ヌクレオチド長、およびそれと少なくとも９５％の同一性を有するものである。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフリップＩＴＲの５’末端の近傍に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフリップＩＴＲの３’末端の近傍に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。更に別の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフロップＩＴＲの５’末端の近傍に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。更に別の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフロップＩＴＲの３’末端の近傍に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフリップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端との間に（例えば、フリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間またはフロップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端との間の中間に）位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチド超以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチド超以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流に１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０ヌクレオチド以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流に１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流にあるヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流に最初の１〜５％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０％、１〜２５％、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２０％、１５〜２５％、または２０〜２５％で位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。
ウイルスゲノム成分：プロモータ
特定の実施形態において、ウイルスゲノムのペイロード領域は、トランス遺伝子標的特異性および発現を増強する少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）ら著、「遺伝子療法におけるトランス遺伝子標的特異性および発現を増強するウイルス発現カセットエレメント（Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、２０１５年を参照のこと；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。トランス遺伝子標的特異性および発現を増強するエレメントの非限定的な例としては、プロモータ、内因性ｍｉＲＮＡ、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列および上流エンハンサー（ＵＳＥ）、ＣＭＶエンハンサーおよびイントロンが挙げられる。
当業者であれば、標的細胞中での本開示のポリペプチドの発現には、限定はされないが、種特異的な、誘導可能な、組織特異的な、または細胞周期特異的なプロモータを含む、特異的なプロモータが必要とされ得ることを認識し得る（パー（Ｐａｒｒ）ら著、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、第３巻、ｐ．１１４５〜９（１９９７年）；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
特定の実施形態において、プロモータは、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムのペイロード領域にコードされたポリペプチドの発現をドライブする場合、有効と見なされる。
特定の実施形態において、プロモータは、調節性ポリヌクレオチドの発現をドライブするのに有効と見なされるプロモータである。
特定の実施形態において、プロモータは、標的とされている細胞中で発現をドライブする場合、有効と見なされるプロモータである。
特定の実施形態において、プロモータは、標的組織においてペイロードの発現をある期間ドライブする。プロモータによりドライブされた発現は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３週間、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年または１０年超の期間であってもよい。発現は、１〜５時間、１〜１２時間、１〜２日、１〜５日、１〜２週間、１〜３週間、１〜４週間、１〜２カ月、１〜４カ月、１〜６カ月、２〜６カ月、３〜６カ月、３〜９カ月、４〜８カ月、６〜１２カ月、１〜２年、１〜５年、２〜５年、３〜６年、３〜８年、４〜８年または５〜１０年であってもよい。
特定の実施形態において、プロモータは、少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２１年、２２年、２３年、２４年、２５年、２６年、２７年、２８年、２９年、３０年、３１年、３２年、３３年、３４年、３５年、３６年、３７年、３８年、３９年、４０年、４１年、４２年、４３年、４４年、４５年、４６年、４７年、４８年、４９年、５０年、５５年、６０年、６５年、または６５年超にわたって、ペイロードの発現をドライブする。
プロモータは、天然に存在してもよくまたは天然に存在しなくともよい。プロモータの非限定的な例としては、ウイルスプロモータ、植物プロモータおよび哺乳類プロモータが挙げられる。一部の実施形態において、プロモータは、ヒトプロモータであってもよい。一部の実施形態において、プロモータは、トランケート型であってもよい。
ほとんどの組織で発現をドライブまたは促進するプロモータとしては、限定はされないが、ヒト伸長因子１α−サブユニット（ＥＦ１α）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーおよび／もしくはプロモータ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）が挙げられる。限定はされないが、筋肉特異的プロモータ、Ｂ細胞プロモータ、単球プロモータ、白血球プロモータ、マクロファージプロモータ、膵腺房細胞プロモータ、内皮細胞プロモータ、肺組織プロモータ、アストロサイトプロモータ、またはニューロン、アストロサイト、もしくはオリゴデンドロサイトに発現を制限するために使用することができる神経系プロモータなど、組織特異的発現エレメントを使用して、発現を特定の細胞型に限定することができる。
筋肉特異的プロモータの非限定的な例としては、哺乳類筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳類デスミン（ＤＥＳ）プロモータ、哺乳類トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモータ、および哺乳類骨格筋型アルファ−アクチン（ＡＳＫＡ）プロモータ（例えば、米国特許出願公開第２０１１０２１２５２９号明細書を参照。その内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
ニューロンの組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来増殖因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ−β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭｅＣＰ２）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）、代謝調節型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）または重鎖（ＮＦＨ）、β−グロビンミニ遺伝子ｎβ２、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）、エンケファリン（Ｅｎｋ）および興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）プロモータが挙げられる。アストロサイトに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびＥＡＡＴ２プロモータが挙げられる。オリゴデンドロサイトに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモータが挙げられる。
特定の実施形態において、プロモータは、１ｋｂ未満であってもよい。プロモータは、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００または８００ヌクレオチド超の長さを有してもよい。プロモータは、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００〜８００、３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００、３００〜８００、４００〜５００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、６００〜７００、６００〜８００または７００〜８００の長さを有してもよい。
特定の実施形態において、プロモータは、限定はされないが、ＣＭＶおよびＣＢＡなど、同じまたは異なる開始または親プロモータの２つ以上の成分の組合せであってもよい。各成分は、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００または８００超の長さを有してもよい。各成分は、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００〜８００、３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００、３００〜８００、４００〜５００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、６００〜７００、６００〜８００または７００〜８００の長さを有してもよい。特定の実施形態において、プロモータは、３８２ヌクレオチドＣＭＶエンハンサー配列と２６０ヌクレオチドＣＢＡプロモータ配列との組合せである。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムはユビキタスプロモータを含む。ユビキタスプロモータの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＣＢＡ（誘導体ＣＡＧ、ＣＢｈ等を含む）、ＥＦ−１α、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ（ｈＧＢｐ）、およびＵＣＯＥ（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１−ＣＢＸ３のプロモータ）が挙げられる。
ユーら（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ，２０１１，７，６３；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、レンチウイルスベクターを使用してラットＤＲＧ細胞および初代ＤＲＧ細胞におけるＣＡＧ、ＥＦＩα、ＰＧＫおよびＵＢＣプロモータ下のｅＧＦＰの発現を評価し、ＵＢＣが他の３つのプロモータよりも弱い発現を示し、全てのプロモータについて僅か１０〜１２％のグリア細胞発現しか見られなかったことを見出した。セーデルブロムら（Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．）（Ｅ．Ｎｅｕｒｏ，２０１５；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、運動皮質における注射後のＣＭＶおよびＵＢＣプロモータを含むＡＡＶ８およびＣＭＶプロモータを含むＡＡＶ２におけるｅＧＦＰの発現を評価した。ＵＢＣまたはＥＦＩαプロモータを含むプラスミドの鼻腔内投与は、ＣＭＶプロモータによる発現よりも高い持続的気道発現を示した（例えば、ギルら（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１，８，１５３９−１５４６（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）を参照のこと）。フセインら（Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００９；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、ｈＧＵＳＢプロモータ、ＨＳＶ−１ＬＡＴプロモータおよびＮＳＥプロモータを含むＨβＨコンストラクトを評価し、このＨβＨコンストラクトがマウス脳においてＮＳＥよりも弱い発現を示したことを見出した。パッシーニおよびウォルフ（Ｐａｓｓｉｎｉ ａｎｄ Ｗｏｌｆｅ）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１，１２３８２−１２３９２、これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、新生仔マウスにおける脳室内注射後のＨβＨベクターの長期効果を評価し、少なくとも１年間にわたり持続的発現があったことを見出した。スーら（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１，８，１３２３−１３３２；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）により、ＮＦＬおよびＮＦＨプロモータを使用したとき、ＣＭＶ−ｌａｃＺ、ＣＭＶ−ｌｕｃ、ＥＦ、ＧＦＡＰ、ｈＥＮＫ、ｎＡＣｈＲ、ＰＰＥ、ＰＰＥ＋ｗｐｒｅ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）およびＮＳＥ（１．８ｋｂ＋ｗｐｒｅ）と比較して全ての脳領域で低発現が見出された。スー（Ｘｕ）らは、プロモータ活性が、降順に、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、ＥＦ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＧＦＡＰ、ＣＭＶ、ｈＥＮＫ、ＰＰＥ、ＮＦＬおよびＮＦＨであることを見出した。ＮＦＬは６５０−ヌクレオチドプロモータであり、ＮＦＨは９２０ヌクレオチドプロモータであり、両方とも肝臓には存在しないが、ＮＦＨは固有受容感覚ニューロン、脳および脊髄に豊富にあり、ＮＦＨは心臓に存在する。Ｓｃｎ８ａは、ＤＲＧ、脊髄および脳全体にわたって発現する４７０ヌクレオチドプロモータであり、特に海馬ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞、皮質、視床および視床下部に高発現が見られる（例えば、ドレウスら（Ｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．）「ナトリウムチャネル遺伝子ＳＣＮ８Ａにおける、進化的に保存された機能性非コードエレメントの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｇｅｎｅ ＳＣＮ８Ａ）」，Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ（２００７），１８，７２３−７３１；およびレイモンドら（Ｒａｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．）「選択的スプライスによるナトリウムチャネルα−サブユニット遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ Ｓｐｌｉｃｅｄ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ α−ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅｓ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４），２７９（４４），４６２３４−４６２４１を参照のこと；この各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
前述のユー（Ｙｕ）、セーデルブロム（Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ）、ギル（Ｇｉｌｌ）、フセイン（Ｈｕｓａｉｎ）、パッシーニ（Ｐａｓｓｉｎｉ）、スー（Ｘｕ）、ドレウス（Ｄｒｅｗｓ）またはレイモンド（Ｒａｙｍｏｎｄ）によって教示されるプロモータはいずれも、本組成物に使用することができる。
特定の実施形態において、プロモータは細胞特異的ではない。
特定の実施形態において、プロモータはユビキチンｃ（ＵＢＣ）プロモータである。ＵＢＣプロモータは、３００〜３５０ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な例として、ＵＢＣプロモータは３３２ヌクレオチドである。
特定の実施形態において、プロモータは、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータである。ＧＵＳＢプロモータは、３５０〜４００ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な例として、ＧＵＳＢプロモータは３７８ヌクレオチドである。
特定の実施形態において、プロモータはニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）プロモータである。ＮＦＬプロモータはサイズが６００〜７００ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ＮＦＬプロモータは６５０ヌクレオチドである。非限定的な例として、コンストラクトはＡＡＶ−プロモータ−ＣＭＶ／グロビンイントロン−調節性ポリヌクレオチド−ＲＢＧであってもよく、ここでＡＡＶは自己相補的であってもよく、およびＡＡＶはＤＪ血清型であってもよい。
特定の実施形態において、プロモータはニューロフィラメント重鎖（ＮＦＨ）プロモータである。ＮＦＨプロモータはサイズが９００〜９５０ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ＮＦＨプロモータは９２０ヌクレオチドである。非限定的な例として、コンストラクトはＡＡＶ−プロモータ−ＣＭＶ／グロビンイントロン−調節性ポリヌクレオチド−ＲＢＧであってもよく、ここでＡＡＶは自己相補的であってもよく、およびＡＡＶはＤＪ血清型であってもよい。
特定の実施形態において、プロモータはｓｃｎ８ａプロモータである。ｓｃｎ８ａプロモータはサイズが４５０〜５００ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ｓｃｎ８ａプロモータは４７０ヌクレオチドである。非限定的な例として、コンストラクトはＡＡＶ−プロモータ−ＣＭＶ／グロビンイントロン−調節性ポリヌクレオチド−ＲＢＧであってもよく、ここでＡＡＶは自己相補的であってもよく、およびＡＡＶはＤＪ血清型であってもよい。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムはＰｏｌ ＩＩＩプロモータを含む。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムはＰ１プロモータを含む。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムはＦＸＮプロモータを含む。
特定の実施形態において、プロモータは、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモータである。
特定の実施形態において、プロモータは、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモータである。
特定の実施形態において、プロモータは、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモータに融合されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むコンストラクトであるＣＡＧプロモータである。
特定の実施形態において、プロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、Ｈ１プロモータを含む。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、Ｕ６プロモータを含む。
特定の実施形態において、プロモータは、肝臓または骨格筋プロモータである。肝臓プロモータの非限定的な例としては、ヒトα−１−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）およびチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が挙げられる。骨格筋プロモータの非限定的な例としては、デスミン、ＭＣＫまたは合成Ｃ５−１２が挙げられる。
特定の実施形態において、プロモータは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータである。非限定的な例として、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータはＵ６である。非限定的な例として、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータはＨ１である。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのプロモータを含む。非限定的な例として、プロモータは、ＥＦ１αプロモータおよびＣＭＶプロモータである。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサーエレメント、プロモータおよび／または５’ＵＴＲイントロンを含む。また、エンハンサーエレメントは、本明細書では「エンハンサー」とも称され、限定はされないが、ＣＭＶエンハンサーであってもよく、プロモータは、限定はされないが、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、およびＧＦＡＰプロモータであってもよく、および５’ＵＴＲ／イントロンは、限定はされないが、ＳＶ４０およびＣＢＡ−ＭＶＭであってもよい。非限定的な例として、組合せで使用されるエンハンサー、プロモータおよび／またはイントロンは、（１）ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモータ、ＳＶ４０ ５’ＵＴＲイントロン；（２）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモータ、ＳＶ４０ ５’ＵＴＲイントロン；（３）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモータ、ＣＢＡ−ＭＶＭ ５’ＵＴＲイントロン；（４）ＵＢＣプロモータ；（５）ＧＵＳＢプロモータ；（６）ＮＳＥプロモータ；（７）シナプシンプロモータ；（８）ＭｅＣＰ２プロモータ、（９）ＧＦＡＰプロモータ、（１０）Ｈ１プロモータ；および（１１）Ｕ６プロモータであってもよい。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、操作されたプロモータを含む。
別の実施形態において、ウイルスゲノムは、天然に発現されるタンパク質のプロモータを含む。
ウイルスゲノム成分：非翻訳領域（ＵＴＲ）
定義上、遺伝子の野生型非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが翻訳されない。一般的には、５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり、開始コドンで終了し、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から始まり、転写の終結シグナルまで継続する。
特定の標的臓器の、豊富に発現される遺伝子に典型的に見出される特徴を、ＵＴＲ内に操作して、安定性およびタンパク質産生を増強することができる。非限定的な例として、肝臓において通常発現されるｍＲＮＡ（例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子）に由来する５’ＵＴＲを、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに使用して、肝細胞株または肝臓での発現を増強することができる。
理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳開始に役割を果たす特徴を含む。コザック配列は、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させる過程に関与することが広く知られており、通常は５’ＵＴＲに含まれている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、式中Ｒは、開始コドン（ＡＴＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、別の「Ｇ」がその後に続く。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムの５’ＵＴＲは、コザック配列を含む。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムの５’ＵＴＲは、コザック配列を含まない。
理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型３’ＵＴＲは、アデノシンおよびウリジンのストレッチがそこに埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高いターンオーバー率を有する遺伝子において特に広く見受けられる。それらの配列特徴および機能的特性に基づき、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分離することができる（チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．），１９９５。その内容は本明細書において全体として参照により援用される）：限定はされないが、ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏＤなどのクラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフの幾つかの分散コピーを含有する。限定はされないが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａなどのクラスＩＩ ＡＲＥは、２つ以上のオーバーラップＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。限定はされないが、ｃ−ＪｕｎおよびミオゲニンなどのクラスＩＩＩ ＡＲＥＳは、それほど十分に規定されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバーである最も顕著にはＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲ内に、操作により加えることは、インビボにて、ＨｕＲ結合を、したがってメッセージの安定化をもたらすことになる。
３’ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾を使用して、ポリヌクレオチドの安定性を調節することができる。特異的なポリヌクレオチド、例えばウイルスゲノムのペイロード領域を操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、ポリヌクレオチドをより不安定にし、それにより、翻訳を減らし、結果として生じるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを、同定および除去または突然変異させて、細胞内安定性を増加させ、したがって結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲは、ポリＡテールを鋳型付加するためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡシード、結合部位または完全な配列を含み得る。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、核酸標的の部位に結合し、核酸分子安定性を低減することまたは翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する１９〜２５ヌクレオチド非コードＲＮＡである。ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの２〜８位の領域の配列を含む。この配列は、核酸のｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン・クリック型相補性を有する。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位、配列またはシード領域を含む、変更するまたは除去するように操作されていてもよい。
当該技術分野で公知の任意の遺伝子に由来する任意のＵＴＲを、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに組み込むことができる。これらのＵＴＲまたはそれらの部分は、それらが選択されたかまたはそれらの配向性もしくは位置が変更され得る遺伝子と同じ配向性に配置され得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに使用されるＵＴＲは、逆位化、短縮化、延長化、当該技術分野で公知の１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで作製され得る。本明細書で使用されるとき、用語「変更される」は、ＵＴＲに関する場合、ＵＴＲが、参照配列に対して何らかの点で変化していることを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上記で教示されるような配向性または位置の変化によって野生型または天然ＵＴＲに対して変更されていてもよく、または追加ヌクレオチドの介在、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって変更されていてもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、野生型ＵＴＲの変異体でない少なくとも１つの人工ＵＴＲを含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、そのタンパク質が、共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写物のファミリーから選択されているＵＴＲを含む。
ウイルスゲノム成分：ポリアデニル化配列
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは少なくとも１つのポリアデニル化配列を含む。ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、ペイロードコード配列の３’末端と３’ＩＴＲの５’末端との間にポリアデニル化配列を含み得る。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列または「ポリＡ配列」は、存在しない〜約５００ヌクレオチド長の範囲であってもよい。ポリアデニル化配列は、限定はされないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、および５００ヌクレオチド長であってもよい。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜１００ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜１５０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜１６０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜２００ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜１００ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜１５０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜１６０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜２００ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜１００ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜１５０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜１６０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜２００ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜１００ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜１５０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜１６０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜２００ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜１００ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜１５０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜１６０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜２００ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてポリアデニル化配列の上流に位置してもよい、ｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。更に、ＡＡＶ粒子は、限定はされないが、ＣＭＶ、Ｕ６、ＣＡＧ、ＣＢＡ、またはＳＶ４０イントロンもしくはヒトβグロビンイントロンを伴うＣＢＡプロモータなど、発現ベクターにおいてプロモータの下流に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチド超以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０ヌクレオチド以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流にあるヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に最初の１〜５％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０％、１〜２５％、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２０％、１５〜２５％、または２０〜２５％で位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウサギグロビンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（ｒＢＧｐＡ）を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含む。
ウイルスゲノム成分：イントロン
特定の実施形態において、ペイロード領域は、１つ以上のイントロンまたはそれらの部分など、発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む。イントロンの非限定的な例としては、ＭＶＭ（６７〜９７ｂｐｓ）、Ｆ．ＩＸトランケート型イントロン１（３００ｂｐ）、β−グロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター（２５０ｂｐ）、アデノウイルススプライスドナー／イムノグロビンスプライスアクセプター（５００ｂｐ）、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）（１８０ｂｐ）およびハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（２３０ｂｐ）が挙げられる。
特定の実施形態において、イントロンまたはイントロン部分は１００〜５００ヌクレオチド長であってもよい。イントロンは、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００の長さを有してもよい。イントロンは、８０〜１００、８０〜１２０、８０〜１４０、８０〜１６０、８０〜１８０、８０〜２００、８０〜２５０、８０〜３００、８０〜３５０、８０〜４００、８０〜４５０、８０〜５００、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、３００〜４００、３００〜５００、または４００〜５００の長さを有してもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムは、限定はされないが、ＣＭＶまたはＵ６などのプロモータを含み得る。非限定的な例として、本開示のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶのプロモータは、ＣＭＶプロモータである。別の非限定的な例として、本開示のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶのプロモータは、Ｕ６プロモータである。
特定の実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムはＣＭＶプロモータを含み得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムはＵ６プロモータを含み得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムはＣＭＶおよびＵ６プロモータを含み得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムは、Ｈ１プロモータを含み得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムはＣＢＡプロモータを含み得る。
特定の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、限定はされないが、ＣＭＶ、Ｕ６、Ｈ１、ＣＢＡ、ＣＡＧ、またはＳＶ４０もしくは当該技術分野において公知の他のものなどのイントロンを伴うＣＢＡプロモータなど、発現ベクターにおいてプロモータの下流に位置してもよい。更に、コード化ｓｉＲＮＡ分子はまた、発現ベクターにおいてポリアデニル化配列の上流に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチド超以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０ヌクレオチド以内に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流にあるヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に最初の１〜５％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０％、１〜２５％、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２０％、１５〜２５％、または２０〜２５％で位置してもよい。
ウイルスゲノム成分：フィラー配列
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、１つ以上のフィラー配列を含む。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さをパッケージングに最適なサイズにするために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約２．３ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約４．６ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、ベクターゲノムのヘアピン構造（例えば、本明細書に記載される調節性ポリヌクレオチド）が、発現および／またはパッケージング中に末端逆位配列（ＩＴＲ）として読み取られ得る可能性を低減させるために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約２．３ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約４．６ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ウイルスゲノムであり、限定はされないが、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、または３．８ｋｂなどの、約０．１ｋｂ〜３．８ｋｂの長さを有する１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、３．１ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、２．７ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．４ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．４ｋｂである。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、自己相補的（ｓｃ）ウイルスゲノムであり、限定はされないが、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、または１．５ｋｂなどの、約０．１ｋｂ〜１．５ｋｂの長さを有する１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．４ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．４ｋｂである。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、フィラー配列の任意の部分を含む。ウイルスゲノムは、フィラー配列の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を含んでいてもよい。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ウイルスゲノムであり、ウイルスゲノムの長さを約４．６ｋｂにするために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、３’ＩＴＲ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、２つのイントロン配列間に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、イントロン配列内に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の５’に位置する。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、自己相補的（ｓｃ）ウイルスゲノムであり、ウイルスゲノムの長さを約２．３ｋｂにするために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、３’ＩＴＲ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、２つのイントロン配列間に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、イントロン配列内に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の５’に位置する。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムのより多くの領域の１つの間に１つ以上のフィラー配列を含み得る。特定の実施形態において、フィラー領域は、限定はされないが、ペイロード領域、末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモータ領域、イントロン領域、エンハンサー領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、および／またはエクソン領域などの領域の前に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー領域は、限定はされないが、ペイロード領域、末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモータ領域、イントロン領域、エンハンサー領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、および／またはエクソン領域などの領域の後に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー領域は、限定はされないが、ペイロード領域、末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモータ領域、イントロン領域、エンハンサー領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、および／またはエクソン領域などの領域の前および後に位置していてもよい。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの少なくとも１つの領域を二分する（ｂｉｆｕｒｃａｔｅ）１つ以上のフィラー配列を含み得る。ウイルスゲノムの二分された領域は、フィラー配列領域の５’にある領域の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を含んでいてもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の１０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の９０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の２０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の８０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の３０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の７０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の４０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の６０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の５０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の５０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の６０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の４０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の７０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の３０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の８０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の２０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の９０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の１０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、５’ＩＴＲの後にフィラー配列を含む。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、プロモータ領域の後にフィラー配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、ペイロード領域の後にフィラー配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、イントロン領域の後にフィラー配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサー領域の後にフィラー配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列領域の後にフィラー配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、エクソン領域の後にフィラー配列を含む。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、プロモータ領域の前にフィラー配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、ペイロード領域の前にフィラー配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、イントロン領域の前にフィラー配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサー領域の前にフィラー配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列領域の前にフィラー配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、エクソン領域の前にフィラー配列を含む。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、３’ＩＴＲの前にフィラー配列を含む。
特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびプロモータ領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびペイロード領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびイントロン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。
特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。
特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびペイロード領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびイントロン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびイントロン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。
特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域およびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エンハンサー領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エンハンサー領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エンハンサー領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ポリアデニル化シグナル配列領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ポリアデニル化シグナル配列領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
特定の実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エクソン領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置してもよい。
特定の実施形態において、フィラー配列は、レンチウイルスの領域または部分に由来してもよい。
一部の実施形態において、フィラー配列は、アルブミン遺伝子の領域または部分に由来してもよい。特定の実施形態において、フィラー配列は、ヒトアルブミン遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９２９１．１）の領域または部分に由来してもよい。
ペイロード
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのペイロード領域を含む。本明細書で使用されるとき、「ペイロード」または「ペイロード領域」は、ウイルスゲノムによりもしくはその内にコードされる１つ以上のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、またはかかるポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、例えばトランス遺伝子、ポリペプチドもしくはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現産物、または調節性核酸もしくは制御性核酸を指す。本開示のペイロードは、典型的には、調節性ポリヌクレオチドまたはその断片もしくは変異体をコードする。
ペイロード領域は、ｍＲＮＡの天然構成と同様のまたは反映した領域を再現するように構築され得る。
ペイロード領域は、コードおよび非コード核酸配列の組合せを含み得る。
一部の実施形態では、ＡＡＶペイロード領域は、コードまたは非コードＲＮＡをコードし得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤をコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。かかる実施形態において、２つ以上のポリペプチドをコードするウイルスゲノムが、ウイルス粒子へと複製およびパッケージングされ得る。ウイルス粒子で形質導入された標的細胞は、単一細胞内部において、コード化ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤を発現し得る。
調節性ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ分子を使用して、神経変性疾患、詳細には筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療することができる。本明細書で使用されるとき、「調節性ポリヌクレオチド」は、標的遺伝子のレベルまたは量、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを調節する（増加させるかまたは減少させるかのいずれか）働きをする任意の核酸配列である。
特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み得る。核酸は、２つ以上ある場合には独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、または９個超のｓｉＲＮＡ分子をコードし得る。
特定の実施形態において、分子足場は、ＣＭＶプロモータ、その断片または変異体の下流に位置してもよい。
特定の実施形態において、分子足場は、ＣＢＡプロモータ、その断片または変異体の下流に位置してもよい。
特定の実施形態において、分子足場は、ＣＭＶプロモータの下流に位置する天然ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場であってもよい。非限定的な例として、天然ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場はヒトｍｉＲ１５５足場に由来する。
特定の実施形態において、分子足場は、ＣＢＡプロモータの下流に位置する天然ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場であってもよい。
特定の実施形態において、分子足場および調節性ポリヌクレオチドの選択は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ内での調節性ポリヌクレオチドを比較する方法によって決定される（例えば、ミニアリコバら（Ｍｉｎｉａｒｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．），「ハンチントン病に対する遺伝子療法を開発するためのハンチンチンを標的とする治療用ｍｉＲＮＡの設計、特徴付け、およびリード選択（Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｌｅａｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｉＲＮＡｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１６），５，ｅ２９７および国際公開第２０１６１０２６６４号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）により記載される方法を参照のこと）。調節性ポリヌクレオチドの活性を評価するため、使用し得る使用される分子足場は、ヒトｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場（例えば、ｍｉＲ１５５足場）であり、プロモータはＣＭＶであってもよい。活性はインビトロでＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびレポータ（例えばルシフェラーゼ）を用いて決定されてもよい。
調節性ポリヌクレオチドに最適な分子足場を評価するため、調節性ポリヌクレオチドがｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場においてＣＡＧプロモータと共に使用される。このコンストラクトには５０ｎｇのレポータ（例えば、ルシフェラーゼレポータ）がコトランスフェクトされる。５０ｎｇコトランスフェクションで８０％より高いノックダウンのコンストラクトが有効と見なされる。一態様では、強力なガイド鎖活性を有するコンストラクトが好ましい。分子足場をＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＮＧＳによって処理して、ガイド−パッセンジャー比、およびプロセシング変動性を決定することができる。
インビボでの分子足場および調節性ポリヌクレオチドの評価には、調節性ポリヌクレオチドを含む分子足場がＡＡＶにパッケージングされて（例えば、血清型はＡＡＶ５であってもよい（例えば、国際公開第２０１５０６０７２２号パンフレットに記載される方法およびコンストラクトを参照のこと、この内容は本明細書において全体として参照により援用される））、インビボモデルに投与され、モデルの種々の範囲（例えば、組織領域）においてガイド−パッセンジャー比、５’および３’末端プロセシング、ガイド鎖のパッセンジャー鎖に対する比、およびノックダウンを決定することができる。
特定の実施形態において、分子足場および調節性ポリヌクレオチドの選択は、天然ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよび合成ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡでの調節性ポリヌクレオチドを比較する方法によって決定される。調節性ポリヌクレオチドは、限定はされないが、エクソン１以外のエクソンを標的とし得る。調節性ポリヌクレオチドの活性の評価には、分子足場がＣＢＡプロモータと共に使用される。一態様では、活性はインビトロでＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞およびレポータ（例えば、ルシフェラーゼ）を用いて決定されてもよく、およびノックダウン効率的な調節性ポリヌクレオチドは、試験した細胞において少なくとも８０％のＳＯＤ１ノックダウンを示した。加えて、最も効率的と見なされる調節性ポリヌクレオチドは有意なパッセンジャー鎖（ｐ鎖）活性が低い乃至全くないことを示した。別の態様では、内因性ＳＯＤ１ノックダウン有効性はインビトロでＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞およびレポータを用いてトランスフェクションにより評価される。効率的な調節性ポリヌクレオチドは５０％より高い内因性ＳＯＤ１ノックダウンを示す。更に別の態様では、内因性ＳＯＤ１ノックダウン有効性は、種々の細胞型（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、初代アストロサイト、Ｕ２５１アストロサイト、ＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロン細胞およびＡＬＳ患者に由来する線維芽細胞）において感染（例えば、ＡＡＶ２）によって評価される。効率的な調節性ポリヌクレオチドは６０％より高い内因性ＳＯＤ１ノックダウンを示す。
インビボでの分子足場および調節性ポリヌクレオチドの評価には、調節性ポリヌクレオチドを含む分子足場がＡＡＶにパッケージングされてインビボモデルに投与され、モデルの種々の範囲（例えば組織領域）においてガイド−パッセンジャー比、５’および３’末端プロセシング、ガイド鎖のパッセンジャー鎖に対する比、およびノックダウンを決定することができる。分子足場をＮＧＳによってインビボ試料から処理して、ガイド−パッセンジャー比、およびプロセシング変動性を決定することができる。
特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは以下の特性のうちの少なくとも１つを用いて設計される：ループ変異体、シードミスマッチ／バルジ／ゆらぎ変異体、ステムミスマッチ、ループ変異体およびヴァッサルステム（ｖａｓｓａｌ ｓｔｅｍ）ミスマッチ変異体、シードミスマッチおよびベーサルステム（ｂａｓａｌ ｓｔｅｍ）ミスマッチ変異体、ステムミスマッチおよびベーサルステム（ｂａｓａｌ ｓｔｅｍ）ミスマッチ変異体、シードゆらぎおよびベーサルステム（ｂａｓａｌ ｓｔｅｍ）ゆらぎ変異体、またはステム配列変異体。
本開示は、部分的に、神経変性障害を治療するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導性の遺伝子発現阻害に関する。ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡが提供される。かかるｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、細胞、例えば運動ニューロンにおいてＳＯＤ１遺伝子発現をサイレンシングし、したがって運動死および筋萎縮などのＡＬＳの症状を改善することができる。ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡは、組換えＡＡＶベクターのポリヌクレオチドにコードされてもよい。
特定のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを、標的ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドの一部としてインビトロで設計および合成して、ＲＮＡｉ過程を活性化させるため細胞に導入してもよい。
ｓｉＲＮＡ分子
本開示は、神経変性障害を治療するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導性の遺伝子発現阻害に関する。本明細書には、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡ（本明細書では、まとめて「ｓｉＲＮＡ分子」と称される）が提供される。そのようなｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、限定はされないが、中型有棘ニューロン、皮質ニューロンおよび／またはアストロサイトなどの細胞の遺伝子発現を軽減またはサイレンシングすることができる。
ＲＮＡｉ（転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング、または共抑制としても知られる）は、ＲＮＡ分子が典型的には特異的ｍＲＮＡ分子の破壊を引き起こすことにより遺伝子発現を配列特異的に阻害する転写後遺伝子サイレンシング過程である。ＲＮＡｉの活性成分は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短鎖／低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、これは典型的には１５〜３０ヌクレオチド（例えば、１９〜２５、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチド）および２−ヌクレオチドの３’オーバハングを含有し、かつ標的遺伝子の核酸配列と一致する。これらの低分子ＲＮＡ種は、天然ではインビボでより大きいｄｓＲＮＡのダイサー媒介性切断によって産生されることができ、および哺乳類細胞で機能性である。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と称される、天然で発現する低分子ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡの発現を調節することにより遺伝子サイレンシングを誘発する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を含有するｍｉＲＮＡは、シード領域と呼ばれるｍｉＲＮＡの５’領域におけるヌクレオチド２〜７と完全な配列相補性を呈し、かつその３’領域と他の塩基対を呈するｍＲＮＡを標的とする。ｍｉＲＮＡ媒介性の遺伝子発現下方制御は、標的ｍＲＮＡの切断、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害、またはｍＲＮＡ崩壊によって引き起こされ得る。ｍｉＲＮＡターゲティング配列は、通常、標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに位置する。単一のｍｉＲＮＡが様々な遺伝子の１００より多くの転写物を標的とすることができ、および１つのｍＲＮＡが異なるｍｉＲＮＡの標的となることができる。
特異的ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡがインビトロで設計および合成されて、ＲＮＡｉ過程を活性化させるため細胞に導入されてもよい。エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）らは、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖（低分子干渉ＲＮＡと称される）が哺乳類細胞において免疫応答を誘導することなく強力かつ特異的な遺伝子ノックダウンを生じさせる能力を有したことを実証した（エルバシール・ＳＭら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４−４９８）。この最初の報告以来、ｓｉＲＮＡによる転写後遺伝子サイレンシングは哺乳類細胞における強力な遺伝子解析ツールとして急速に浮上しており、新規療法を生み出す可能性を秘めている。
ハンチントン病などのポリグルタミン伸長疾患を引き起こすポリグルタミンリピートタンパク質をコードする核酸配列を標的とするように設計されたＲＮＡｉ分子が、米国特許第９，１６９，４８３号明細書および同第９，１８１，５４４号明細書ならびに国際公開第２０１５１７９５２５号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。米国特許第９，１６９，４８３号明細書および同第９，１８１，５４４号明細書ならびに国際公開第２０１５１７９５２５号パンフレットは、各々が、第１のＲＮＡ鎖（例えば、１５連続ヌクレオチド）と第２のＲＮＡ鎖（例えば、第１の鎖の少なくとも１２連続ヌクレオチドと相補的）とを含む単離ＲＮＡ二重鎖を提供し、ここでＲＮＡ二重鎖は約１５〜３０塩基対長である。第１のＲＮＡ鎖と第２のＲＮＡ鎖とはＲＮＡループ（約４〜５０ヌクレオチド）により作動可能に連結されてヘアピン構造を形成してもよく、これが発現カセットに挿入され得る。ループ部分の非限定的な例としては、米国特許第９，１６９，４８３号明細書の配列番号９〜１４（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。完全配列または配列の一部のいずれかの、ＲＮＡ二重鎖の形成に使用し得るＲＮＡ鎖の非限定的な例としては、米国特許第９，１６９，４８３号明細書の配列番号１〜８ならびに米国特許第９，１８１，５４４号明細書の配列番号１〜１１、３３〜５９、２０８〜２１０、２１３〜２１５および２１８〜２２１（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。ＲＮＡｉ分子の非限定的な例としては、米国特許第９，１６９，４８３号明細書の配列番号１〜８、米国特許第９，１８１，５４４号明細書の配列番号１〜１１、３３〜５９、２０８〜２１０、２１３〜２１５および２１８〜２２１ならびに国際公開第２０１５１７９５２５号パンフレットの配列番号１、６、７、および３５〜３８（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。
ＲＮＡｉを活性化させるため、インビトロ合成したｓｉＲＮＡ分子が細胞に導入されてもよい。外因性ｓｉＲＮＡ二重鎖は、細胞に導入されると、内因性ｄｓＲＮＡと同様にアセンブルして、ｓｉＲＮＡ二重鎖の２本の鎖のうちの一方（すなわちアンチセンス鎖）に相補的なＲＮＡ配列と相互作用する多ユニット複合体であるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することができる。この過程でｓｉＲＮＡのセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）が複合体から失われ、一方でｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（またはガイド鎖）はその相補ＲＮＡとマッチする。詳細には、ｓｉＲＮＡを含有するＲＩＳＣの標的は、完全な配列相補性を呈するｍＲＮＡである。次に、標的の切断、放出および分解によってｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングが起こる。
標的ｍＲＮＡに相同なセンス鎖と標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ二重鎖は、標的ＲＮＡの破壊効率の点で、一本鎖（ｓｓ）−ｓｉＲＮＡ（例えばアンチセンス鎖ＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）の使用と比較してはるかに大きい利点をもたらす。多くの場合に、ｓｓ−ｓｉＲＮＡの使用は、対応する二重鎖の有効な遺伝子サイレンシング効力を達成するのに、より高い濃度のｓｓ−ｓｉＲＮＡを必要とする。
前述の分子のいずれも、ウイルスゲノムによってコードされてもよい。
目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖の設計および配列
本開示は、遺伝子発現および／またはタンパク質産生に干渉するためにｍＲＮＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖（およびそれらをコードする調節性ポリヌクレオチド）を提供する。
本開示のコード化ｓｉＲＮＡ二重鎖は、共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含有し、ここでアンチセンス鎖は標的遺伝子の核酸配列に相補的であり、センス鎖は標的遺伝子の核酸配列と相同である。一部の態様において、アンチセンス鎖の５’末端は５’リン酸基を有し、センス鎖の３’末端は３’ヒドロキシル基を含む。他の態様において、各鎖の３’末端にはヌクレオチドオーバハングがない、１つある、または２つある。
当該技術分野では、ｓｉＲＮＡの設計に関して幾つかの指針が提案されている。これらの指針は、概して、サイレンシングしようとする遺伝子中の領域を標的とする１９ヌクレオチド二重鎖形成領域、対称２〜３ヌクレオチド３’オーバハング、５’−リン酸基および３’−ヒドロキシル基を作成することを推奨している。ｓｉＲＮＡ配列の好ましさを左右し得る他の規則としては、限定はされないが、（ｉ）アンチセンス鎖の５’末端におけるＡ／Ｕ；（ｉｉ）センス鎖の５’末端におけるＧ／Ｃ；（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’端側３分の１にある少なくとも５個のＡ／Ｕ残基；および（ｉｖ）９ヌクレオチド長より長いいかなるＧＣストレッチも存在しないことが挙げられる。標的遺伝子の具体的な配列と合わせて、かかる考慮点に従い、哺乳類標的遺伝子発現の抑制に不可欠な極めて有効なｓｉＲＮＡ分子を容易に設計し得る。
本開示によれば、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡ）が設計される。かかるｓｉＲＮＡ分子は、特異的に遺伝子発現およびタンパク質産生を抑制することができる。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞の遺伝子変異体、すなわち突然変異型転写物を選択的に「ノックアウト」するように設計および使用される。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞の遺伝子変異体を選択的に「ノックダウン」するように設計および使用される。他の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、目的の遺伝子の野生型および突然変異型の両方を阻害または抑制することが可能である。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、両方の鎖が共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するセンス鎖と相補的アンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ配列に対して標的特異的ＲＮＡｉを導くのに十分な相補性を有し、すなわちｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ機構または過程による標的ｍＲＮＡの破壊を惹起するのに十分な配列を有する。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、両方の鎖が共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するセンス鎖と相補的アンチセンス鎖とを含み、ここでｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの開始部位は、標的ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド１０〜１０００にある。非限定的な例として、開始部位は、標的ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００にあってもよい。更に別の非限定的な例として、開始部位は、標的ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、および１０００にあってもよい。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡ配列とは１００％の相補性を有する。アンチセンス鎖は標的ｍＲＮＡ配列の任意の一部と相補的であってもよい。
他の実施形態において、アンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡ配列とは少なくとも１つのミスマッチを含む。非限定的な例として、アンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡ配列とは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％の相補性を有する。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む。
本開示によれば、ｓｉＲＮＡ分子は長さが約１０〜５０ヌクレオチドまたはそれ以上であり、すなわち、各鎖が１０〜５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は長さが各鎖約１５〜３０、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドであり、ここで鎖の一方は標的領域と十分に相補的である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、約１９〜２５、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、１９ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２３ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２４ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２５ヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、および３’末端に２オーバハングヌクレオチドを含む合成ＲＮＡ二重鎖であり得る。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は非修飾ＲＮＡ分子であってもよい。他の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、塩基、糖または骨格修飾などの少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有し得る。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、アンチセンス配列およびセンス配列またはその断片もしくは変異体を含み得る。非限定的な例として、アンチセンス配列およびセンス配列は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％の相補性を有する。
他の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、細胞への送達用のプラスミドベクター、ＡＡＶ粒子、ウイルスゲノムまたは他の核酸発現ベクターにコードすることができる。
ＤＮＡ発現プラスミドを使用して本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを細胞で安定に発現させ、標的遺伝子発現の長期阻害を実現することができる。一態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖とは、典型的には短いスペーサ配列によって連結され、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれるステム−ループ構造の発現をもたらす。ヘアピンはダイサーによって認識および切断され、そのようにして成熟ｓｉＲＮＡ分子が生じる。
本開示によれば、ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＡＡＶ粒子が産生され、ＡＡＶ血清型は、本明細書に挙げられる血清型のいずれであってもよい。ＡＡＶ血清型の非限定的な例としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５およびそれらのバリアントが挙げられる。
一部の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを抑制（または分解）する。したがって、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡを使用して、細胞、例えばニューロンにおける遺伝子発現を実質的に阻害することができる。一部の態様において、遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、３５〜４５％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、５５〜６５％、５７〜６８％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、８５〜９９％、９０〜９５％、９０〜１００％もしくは９５〜１００％の阻害を指す。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、３５〜４５％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、５５〜６５％、５７〜６８％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、８５〜９９％、９０〜９５％、９０〜１００％もしくは９５〜１００％阻害され得る。非限定的な例として、阻害は、３０〜４０％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、３０〜４５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、３５〜４５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、５０％を超えてもよい。非限定的な例として、阻害は、５０〜６０％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、６０％を超えてもよい。非限定的な例として、阻害は、５０〜７５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、５５〜６５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、５７〜６８％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、７０〜８０％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、７０〜８５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、８５〜９９％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、３５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、３６％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、４０％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、４１％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、４３％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、４５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、４９％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、６２％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、６４％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、７４％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、７７％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、８４％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、８７％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、９５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、９９％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、１００％であってもよい。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、脊髄運動ニューロンにおいて標的ｍＲＮＡを抑制（または分解）する。一部の態様において、遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、３５〜４５％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、５５〜６５％、５７〜６８％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、８５〜９９％、９０〜９５％、９０〜１００％もしくは９５〜１００％の抑制を指す。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、３５〜４５％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、５５〜６５％、５７〜６８％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、８５〜９９％、９０〜９５％、９０〜１００％もしくは９５〜１００％阻害され得る。非限定的な例として、抑制は、３０〜４５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、３５〜４５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、５０％を超えてもよい。非限定的な例として、抑制は、６０％を超えてもよい。非限定的な例として、抑制は、５０〜６０％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、５５〜６５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、５０〜７５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、５７〜６８％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、７０〜８０％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、７０〜８５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、８５〜９９％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、３５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、３６％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、４０％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、４１％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、４３％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、４５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、４９％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、６２％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、６４％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、７４％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、７７％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、８４％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、８７％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、９５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、９９％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、１００％であってもよい。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、脊髄運動ニューロンにおいて標的ｍＲＮＡを７８％抑制（または分解）する。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、脊髄運動ニューロンにおいて標的ｍＲＮＡを４５〜５５％抑制（または分解）する。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、運動ニューロン形態学的特徴のｖｇ＋ 細胞において標的ｍＲＮＡを抑制（または分解）する。一部の態様において、遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％若しくは９５〜１００％の阻害を指す。したがって、標的遺伝子発現のタンパク質産生は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％若しくは９５〜１００％阻害され得る。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、運動ニューロン形態学的特徴のｖｇ＋ 細胞において標的ｍＲＮＡを５３％抑制（または分解）する。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、ガイド鎖に位置する標的に対するｍｉＲＮＡシードマッチを含む。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、パッセンジャー鎖に位置する標的に対するｍｉＲＮＡシードマッチを含む。更に別の実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖に位置する標的に対するシードマッチを含まない。
特定の実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖について有意な完全長オフターゲット効果をほぼ有しないものであり得る。別の実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖について有意な完全長オフターゲット効果をほぼ有しないものであり得る。目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖について１％未満、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１〜５％、２〜６％、３〜７％、４〜８％、５〜９％、５〜１０％、６〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１５〜３０％、１５〜４０％、１５〜４５％、２０〜４０％、２０〜５０％、２５〜５０％、３０〜４０％、３０〜５０％、３５〜５０％、４０〜５０％、４５〜５０％の完全長オフターゲット効果を有し得る。更に別の実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖について有意な完全長オフターゲット効果をほぼ有しないものであり得る。目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖について１％未満、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１〜５％、２〜６％、３〜７％、４〜８％、５〜９％、５〜１０％、６〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１５〜３０％、１５〜４０％、１５〜４５％、２０〜４０％、２０〜５０％、２５〜５０％、３０〜４０％、３０〜５０％、３５〜５０％、４０〜５０％、４５〜５０％の完全長オフターゲット効果を有し得る。
特定の実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡはインビトロで高い活性を有し得る。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子はインビトロで低い活性を有し得る。更に別の実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡはインビトロで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有し得る。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子はインビトロで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有する。ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％または１００％であり得る。ガイド鎖による標的ノックダウンは４０〜５０％、４５〜５０％、５０〜５５％、５０〜６０％、６０〜６５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、６０〜９９．５％、６０〜１００％、６５〜７０％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、６５〜９９％、６５〜９９．５％、６５〜１００％、７０〜７５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、７０〜９９．５％、７０〜１００％、７５〜８０％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、７５〜９９％、７５〜９９．５％、７５〜１００％、８０〜８５％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、８０〜９９．５％、８０〜１００％、８５〜９０％、８５〜９５％、８５〜９９％、８５〜９９．５％、８５〜１００％、９０〜９５％、９０〜９９％、９０〜９９．５％、９０〜１００％、９５〜９９％、９５〜９９．５％、９５〜１００％、９９〜９９．５％、９９〜１００％または９９．５〜１００％であり得る。非限定的な例として、ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は７０％より高い。非限定的な例として、ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は６０％より高い。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の送達に由来する最も高いノックダウンは、注射部位の周囲で見られる。
特定の実施形態において、ノックダウンは、ｓｉＲＮＡ分子の送達後、前角でおよび注射部位の周囲で見られる。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、センス配列またはアンチセンス配列について、目的の遺伝子ではない配列に対するｍｉＲＮＡシードマッチがないように設計される。
特定の実施形態において、最も近いオフターゲットに対するガイド鎖のＩＣ５０は、オンターゲット遺伝子に対するガイド鎖のＩＣ５０の１００倍よりも高い。非限定的な例として、最も近いオフターゲットに対するガイド鎖のＩＣ５０が標的に対するガイド鎖のＩＣ５０の１００倍よりも高い場合、そのｓｉＲＮＡ分子は、インビトロでの目的の遺伝子の阻害に高いガイド鎖選択性を有すると言われる。
特定の実施形態において、ガイド鎖の５’プロセシングは、インビトロまたはインビボで少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも９９％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも９９％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも９０％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも９０％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも８５％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも８５％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は、インビトロまたはインビボで１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１；１、２：１０、２：９、２：８、２：７、２：６、２：５、２：４、２：３、２：２、２：１、３：１０、３：９、３：８、３：７、３：６、３：５、３：４、３：３、３：２、３：１、４：１０、４：９、４：８、４：７、４：６、４：５、４：４、４：３、４：２、４：１、５：１０、５：９、５：８、５：７、５：６、５：５、５：４、５：３、５：２、５：１、６：１０、６：９、６：８、６：７、６：６、６：５、６：４、６：３、６：２、６：１、７：１０、７：９、７：８、７：７、７：６、７：５、７：４、７：３、７：２、７：１、８：１０、８：９、８：８、８：７、８：６、８：５、８：４、８：３、８：２、８：１、９：１０、９：９、９：８、９：７、９：６、９：５、９：４、９：３、９：２、９：１、１０：１０、１０：９、１０：８、１０：７、１０：６、１０：５、１０：４、１０：３、１０：２、１０：１、１：９９、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５、または９９：１である。ガイド対パッセンジャー比とは、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏＲＮＡの細胞内プロセシング後のガイド鎖対パッセンジャー鎖の比を指す。例えば、８０：２０のガイド対パッセンジャー比であれば、前駆体からプロセシングされるパッセンジャー鎖２つにつき８つのガイド鎖を有し得る。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比はインビトロで８：２である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比はインビボで８：２である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比はインビトロで９：１である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比はインビボで９：１である。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）比は、１〜９９、１．３〜９９、５〜９９、１０〜９９、１５〜９９、２０〜９９、２５〜９９、３０〜９９、３５〜９９、４０〜９９、４５〜９９、５０〜９９、５５〜９９、６０〜９９、６５〜９９、７０〜９９、７５〜９９、８０〜９９、８５〜９９、９０〜９９、９５〜９９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５、１〜６０、１〜６５、１〜７０、１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、１０〜６０、１０〜６５、１０〜７０、１０〜７５、１０〜８０、１０〜８５、１０〜９０、１０〜９５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜４５、１５〜５０、１５〜５５、１５〜６０、１５〜６５、１５〜７０、１５〜７５、１５〜８０、１５〜８５、１５〜９０、１５〜９５、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、２０〜６０、２０〜６５、２０〜７０、２０〜７５、２０〜８０、２０〜８５、２０〜９０、２０〜９５、２５〜３０、２５〜３５、２５〜４０、２５〜４５、２５〜５０、２５〜５５、２５〜６０、２５〜６５、２５〜７０、２５〜７５、２５〜８０、２５〜８５、２５〜９０、２５〜９５、３０〜３５、３０〜４０、３０〜４５、３０〜５０、３０〜５５、３０〜６０、３０〜６５、３０〜７０、３０〜７５、３０〜８０、３０〜８５、３０〜９０、３０〜９５、３５〜４０、３５〜４５、３５〜５０、３５〜５５、３５〜６０、３５〜６５、３５〜７０、３５〜７５、３５〜８０、３５〜８５、３５〜９０、３５〜９５、４０〜４５、４０〜５０、４０〜５５、４０〜６０、４０〜６５、４０〜７０、４０〜７５、４０〜８０、４０〜８５、４０〜９０、４０〜９５、４５〜５０、４５〜５５、４５〜６０、４５〜６５、４５〜７０、４５〜７５、４５〜８０、４５〜８５、４５〜９０、４５〜９５、５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５、５５〜６０、５５〜６５、５５〜７０、５５〜７５、５５〜８０、５５〜８５、５５〜９０、５５〜９５、６０〜６５、６０〜７０、６０〜７５、６０〜８０、６０〜８５、６０〜９０、６０〜９５、６５〜７０、６５〜７５、６５〜８０、６５〜８５、６５〜９０、６５〜９５、７０〜７５、７０〜８０、７０〜８５、７０〜９０、７０〜９５、７５〜８０、７５〜８５、７５〜９０、７５〜９５、８０〜８５、８０〜９０、８０〜９５、８５〜９０、８５〜９５、または９０〜９５の範囲である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比は、１．３〜９９の範囲である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比は、１０〜９９の範囲である。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）比は、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、５１、５１．５、５２、５２．５、５３、５３．５、５４、５４．５、５５、５５．５、５６、５６．５、５７、５７．５、５８、５８．５、５９、５９．５、６０、６０．５、６１、６１．５、６２、６２．５、６３、６３．５、６４、６４．５、６５、６５．５、６６、６６．５、６７、６７．５、６８、６８．５、６９、６９．５、７０、７０．５、７１、７１．５、７２、７２．５、７３、７３．５、７４、７４．５、７５、７５．５、７６、７６．５、７７、７７．５、７８、７８．５、７９、７９．５、８０、８０．５、８１、８１．５、８２、８２．５、８３、８３．５、８４、８４．５、８５、８５．５、８６、８６．５、８７、８７．５、８８、８８．５、８９、８９．５、９０、９０．５、９１、９１．５、９２、９２．５、９３、９３．５、９４、９４．５、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、または９９である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）比は１１．５である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）比は、９９である。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は１より大きい。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は２より大きい。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は５より大きい。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は１０より大きい。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は２０より大きい。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は５０より大きい。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は３００より大きい。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は３１４である。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は４００より大きい。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は４３４である。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は少なくとも３：１である。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は少なくとも５：１である。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は少なくとも１０：１である。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は少なくとも２０：１である。
特定の実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は少なくとも５０：１である。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は、インビトロまたはインビボで１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１；１、２：１０、２：９、２：８、２：７、２：６、２：５、２：４、２：３、２：２、２：１、３：１０、３：９、３：８、３：７、３：６、３：５、３：４、３：３、３：２、３：１、４：１０、４：９、４：８、４：７、４：６、４：５、４：４、４：３、４：２、４：１、５：１０、５：９、５：８、５：７、５：６、５：５、５：４、５：３、５：２、５：１、６：１０、６：９、６：８、６：７、６：６、６：５、６：４、６：３、６：２、６：１、７：１０、７：９、７：８、７：７、７：６、７：５、７：４、７：３、７：２、７：１、８：１０、８：９、８：８、８：７、８：６、８：５、８：４、８：３、８：２、８：１、９：１０、９：９、９：８、９：７、９：６、９：５、９：４、９：３、９：２、９：１、１０：１０、１０：９、１０：８、１０：７、１０：６、１０：５、１０：４、１０：３、１０：２、１０：１、１：９９、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５、または９９：１である。パッセンジャー対ガイド比とは、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏＲＮＡの細胞内プロセシング後の、ガイド鎖に対するパッセンジャー鎖の比を指す。例えば、８０：２０のパッセンジャー対ガイド比であれば、前駆体からプロセシングされるガイド鎖２つにつき８つのパッセンジャー鎖を有し得る。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビトロで８０：２０である。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビボで８０：２０である。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビトロで８：２である。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビボで８：２である。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビトロで９：１である。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビボで９：１である。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）比は、１〜９９、１．３〜９９、５〜９９、１０〜９９、１５〜９９、２０〜９９、２５〜９９、３０〜９９、３５〜９９、４０〜９９、４５〜９９、５０〜９９、５５〜９９、６０〜９９、６５〜９９、７０〜９９、７５〜９９、８０〜９９、８５〜９９、９０〜９９、９５〜９９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５、１〜６０、１〜６５、１〜７０、１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、１０〜６０、１０〜６５、１０〜７０、１０〜７５、１０〜８０、１０〜８５、１０〜９０、１０〜９５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜４５、１５〜５０、１５〜５５、１５〜６０、１５〜６５、１５〜７０、１５〜７５、１５〜８０、１５〜８５、１５〜９０、１５〜９５、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、２０〜６０、２０〜６５、２０〜７０、２０〜７５、２０〜８０、２０〜８５、２０〜９０、２０〜９５、２５〜３０、２５〜３５、２５〜４０、２５〜４５、２５〜５０、２５〜５５、２５〜６０、２５〜６５、２５〜７０、２５〜７５、２５〜８０、２５〜８５、２５〜９０、２５〜９５、３０〜３５、３０〜４０、３０〜４５、３０〜５０、３０〜５５、３０〜６０、３０〜６５、３０〜７０、３０〜７５、３０〜８０、３０〜８５、３０〜９０、３０〜９５、３５〜４０、３５〜４５、３５〜５０、３５〜５５、３５〜６０、３５〜６５、３５〜７０、３５〜７５、３５〜８０、３５〜８５、３５〜９０、３５〜９５、４０〜４５、４０〜５０、４０〜５５、４０〜６０、４０〜６５、４０〜７０、４０〜７５、４０〜８０、４０〜８５、４０〜９０、４０〜９５、４５〜５０、４５〜５５、４５〜６０、４５〜６５、４５〜７０、４５〜７５、４５〜８０、４５〜８５、４５〜９０、４５〜９５、５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５、５５〜６０、５５〜６５、５５〜７０、５５〜７５、５５〜８０、５５〜８５、５５〜９０、５５〜９５、６０〜６５、６０〜７０、６０〜７５、６０〜８０、６０〜８５、６０〜９０、６０〜９５、６５〜７０、６５〜７５、６５〜８０、６５〜８５、６５〜９０、６５〜９５、７０〜７５、７０〜８０、７０〜８５、７０〜９０、７０〜９５、７５〜８０、７５〜８５、７５〜９０、７５〜９５、８０〜８５、８０〜９０、８０〜９５、８５〜９０、８５〜９５、または９０〜９５の範囲である。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）比は、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、５１、５１．５、５２、５２．５、５３、５３．５、５４、５４．５、５５、５５．５、５６、５６．５、５７、５７．５、５８、５８．５、５９、５９．５、６０、６０．５、６１、６１．５、６２、６２．５、６３、６３．５、６４、６４．５、６５、６５．５、６６、６６．５、６７、６７．５、６８、６８．５、６９、６９．５、７０、７０．５、７１、７１．５、７２、７２．５、７３、７３．５、７４、７４．５、７５、７５．５、７６、７６．５、７７、７７．５、７８、７８．５、７９、７９．５、８０、８０．５、８１、８１．５、８２、８２．５、８３、８３．５、８４、８４．５、８５、８５．５、８６、８６．５、８７、８７．５、８８、８８．５、８９、８９．５、９０、９０．５、９１、９１．５、９２、９２．５、９３、９３．５、９４、９４．５、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、または９９である。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は１より大きい。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は２より大きい。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は５より大きい。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は１０より大きい。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は２０より大きい。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は５０より大きい。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は少なくとも３：１である。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は少なくとも５：１である。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は少なくとも１０：１である。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は少なくとも２０：１である。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は少なくとも５０：１である。
特定の実施形態において、パッセンジャー鎖−ガイド鎖二重鎖は、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏまたはｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡが、しかし当該技術分野において公知のおよび本明細書に記載される方法、プロセシングを測定したとき２倍より高いガイド鎖対パッセンジャー鎖比を示す場合に有効と見なされる。非限定的な例として、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏまたはｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡは、プロセシングを測定したとき、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍より高い、または２〜５倍、２〜１０倍、２〜１５倍、３〜５倍、３〜１０倍、３〜１５倍、４〜５倍、４〜１０倍、４〜１５倍、５〜１０倍、５〜１５倍、６〜１０倍、６〜１５倍、７〜１０倍、７〜１５倍、８〜１０倍、８〜１５倍、９〜１０倍、９〜１５倍、１０〜１５倍、１１〜１５倍、１２〜１５倍、１３〜１５倍、または１４〜１５倍のガイド鎖対パッセンジャー鎖比を示す。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡをコードするベクターゲノムは、コンストラクトの完全長の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９％超である配列を含む。非限定的な例として、ベクターゲノムは、コンストラクトの完全長配列の少なくとも８０％である配列を含む。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子を使用して、目的の遺伝子配列上の少なくとも１つのエクソンを標的とすることにより、目的の遺伝子の野生型または突然変異バージョンをサイレンシングすることができる。エクソンは、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、および／またはエクソン６７であってもよい。
ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖の設計および配列
本開示は、ＳＯＤ１遺伝子発現および／またはＳＯＤ１タンパク質産生に干渉するためＳＯＤ１ ｍＲＮＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖（およびそれらをコードする調節性ポリヌクレオチド）を提供する。
本開示のコード化ｓｉＲＮＡ二重鎖は、共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含有し、ここでアンチセンス鎖は、標的ＳＯＤ１遺伝子の核酸配列に相補的であり、センス鎖は標的ＳＯＤ１遺伝子の核酸配列に相同である。一部の態様において、アンチセンス鎖の５’末端は５’リン酸基を有し、センス鎖の３’末端は３’ヒドロキシル基を含有する。他の態様において、各鎖の３’末端にはヌクレオチドオーバハングがない、１つある、または２つある。
当該技術分野では、ｓｉＲＮＡの設計に関して幾つかの指針が提案されている。これらの指針は、概して、サイレンシングしようとする遺伝子中の領域を標的とする１９ヌクレオチド二重鎖形成領域、対称２〜３ヌクレオチド３’オーバハング、５’−リン酸基および３’−ヒドロキシル基を作成することを推奨している。ｓｉＲＮＡ配列の好ましさを左右し得る他の規則としては、限定はされないが、（ｉ）アンチセンス鎖の５’末端におけるＡ／Ｕ；（ｉｉ）センス鎖の５’末端におけるＧ／Ｃ；（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’端側３分の１にある少なくとも５個のＡ／Ｕ残基；および（ｉｖ）９ヌクレオチド長より長いいかなるＧＣストレッチも存在しないことが挙げられる。標的遺伝子の具体的な配列と合わせて、かかる考慮点に従い、ＳＯＤ１遺伝子発現の抑制に不可欠な極めて有効なｓｉＲＮＡ分子を容易に設計し得る。
本開示によれば、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡ）が設計される。かかるｓｉＲＮＡ分子は、特異的にＳＯＤ１遺伝子発現およびタンパク質産生を抑制することができる。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞のＳＯＤ１遺伝子変異体、すなわちＡＬＳ疾患を有する患者に同定される突然変異型ＳＯＤ１転写物を選択的に「ノックアウト」するように設計および使用される。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞のＳＯＤ１遺伝子変異体を選択的に「ノックダウン」するように設計および使用される。他の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、野生型および突然変異型の両方のＳＯＤ１遺伝子を阻害または抑制することが可能である。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、両方の鎖が共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するセンス鎖と相補的アンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は標的特異的ＲＮＡｉを導くのに十分な、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ配列との相補性を有し、すなわちｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ機構または過程による標的ｍＲＮＡの破壊を惹起するのに十分な配列を有する。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、両方の鎖が共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するセンス鎖と相補的アンチセンス鎖とを含み、ここでＳＯＤ１ ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの開始部位は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド１５〜１０００である。非限定的な例として、開始部位は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド１５〜２５、１５〜５０、１５〜７５、１５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０および９５０〜１０００であってもよい。更に別の非限定的な例として、開始部位は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、７４、７６、７７、７８、１４９、１５３、１５７、１６０、１７７、１９２、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２０６、２０９、２１０、２３９、２４１、２６１、２６３、２６４、２６８、２６９、２７６、２７８、２８１、２８４、２９０、２９１、２９５、２９６、３１６、３１７、３２９、３３０、３３７、３５０、３５１、３５２、３５４、３５７、３５８、３６４、３７５、３７８、３８３、３８４、３９０、３９２、３９５、４０４、４０６、４１７、４１８、４６９、４７０、４７５、４７６、４８０、４８７、４９４、４９６、４９７、５０１、５０４、５１５、５１８、５２２、５２３、５２４、５５２、５５４、５５５、５６２、５７６、５７７、５７８、５７９、５８１、５８３、５８４、５８５、５８７、５８８、５８９、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０２、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１６、６２１、６３３、６３５、６３６、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６５４、６６０、６６１、６６６、６６７、６６８、６６９、６７３、６７７、６９２、６９８、６９９、７００、７０１、７０６、７４９、７７０、７７２、７７５、７８１、８００、８０４、８１９、８２９、８３２、８３３、８５１、８５４、８５５、８５７、８５８、８５９、８６１、８６９、８９１、８９２、９０６、９０７、９１２、９１３、９３４、９４４、および９４７であってもよい。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖と標的ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ配列とは１００％の相補性を有する。アンチセンス鎖は標的ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ配列の任意の一部と相補的であってもよい。
他の実施形態において、アンチセンス鎖と標的ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ配列とは少なくとも１つのミスマッチを含む。非限定的な例として、アンチセンス鎖と標的ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ配列とは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％の相補性を有する。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む。
本開示によれば、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子は長さが約１０〜５０ヌクレオチドまたはそれ以上であり、すなわち、各鎖が１０〜５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は長さが各鎖約１５〜３０、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドであり、ここで鎖の一方は標的領域と十分に相補的である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は長さが約１９〜２５、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチドである。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、１９ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２３ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２４ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２５ヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本開示のｓｉＲＮＡ分子は、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、および３’末端に２オーバハングヌクレオチドを含む合成ＲＮＡ二重鎖であり得る。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は非修飾ＲＮＡ分子であってもよい。他の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、塩基、糖または骨格修飾などの少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有し得る。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本開示のｓｉＲＮＡ分子は、限定はされないが、表２のアンチセンス（ガイド）配列またはそれらの断片もしくは変異体などのヌクレオチド配列を含み得る。非限定的な例として、本開示のｓｉＲＮＡ分子に使用されるアンチセンス配列は、表２のヌクレオチド配列の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％である。別の非限定的な例として、本開示のｓｉＲＮＡ分子に使用されるアンチセンス配列は、表２のヌクレオチド配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２１超の連続ヌクレオチドを含む。更に別の非限定的な例として、本開示のｓｉＲＮＡ分子に使用されるアンチセンス配列は、表２の配列のヌクレオチド１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、６〜２２、６〜２１、６〜２０、６〜１９、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、７〜２２、７〜２１、７〜２０、７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、８〜２２、８〜２１、８〜２０、８〜１９、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、９〜２２、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、９〜１４、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１１〜２２、１１〜２１、１１〜２０、１１〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２２、１４〜２１、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２２、１６〜２１、１６〜２０、１７〜２２、１７〜２１、または１８〜２２を含む。
Figure 2021529513
 特定の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本開示のｓｉＲＮＡ分子は、限定はされないが、表３のセンス（パッセンジャー）配列またはそれらの断片もしくは変異体などのヌクレオチド配列を含み得る。非限定的な例として、本開示のｓｉＲＮＡ分子に使用されるセンス配列は、表３のヌクレオチド配列の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％である。別の非限定的な例として、本開示のｓｉＲＮＡ分子に使用されるセンス配列は、表３のヌクレオチド配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２１超の連続ヌクレオチドを含む。更に別の非限定的な例として、本開示のｓｉＲＮＡ分子に使用されるセンス配列は、表３の配列のヌクレオチド１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、６〜２２、６〜２１、６〜２０、６〜１９、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、７〜２２、７〜２１、７〜２０、７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、８〜２２、８〜２１、８〜２０、８〜１９、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、９〜２２、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、９〜１４、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１１〜２２、１１〜２１、１１〜２０、１１〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２２、１４〜２１、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２２、１６〜２１、１６〜２０、１７〜２２、１７〜２１、または１８〜２２を含む。
Figure 2021529513
 特定の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本開示のｓｉＲＮＡ分子は、表２からのアンチセンス配列および表３からのセンス配列、またはそれらの断片もしくは変異体を含み得る。非限定的な例として、アンチセンス配列およびセンス配列は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％の相補性を有する。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本開示のｓｉＲＮＡ分子は、表４に記載されるとおりのセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ二重鎖を含み得る。非限定的な例として、これらのｓｉＲＮＡ二重鎖は、内因性ＳＯＤ１遺伝子発現に対するインビトロ阻害活性に関して試験されてもよい。
Figure 2021529513
 他の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本開示のｓｉＲＮＡ分子は、細胞への送達用のプラスミドベクター、ＡＡＶ粒子、ウイルウゲノムまたは他の核酸発現ベクターにコードすることができる。
ＤＮＡ発現プラスミドを使用して、ＳＯＤ１を標的とする本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを細胞内で安定的に発現させ、標的遺伝子発現の長期阻害を実現することができる。一態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖とは、典型的には、短いスペーサ配列によって連結され、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれるステム−ループ構造の発現をもたらす。ヘアピンはダイサーによって認識および切断され、そのようにして成熟ｓｉＲＮＡ分子が生じる。
本開示によれば、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＡＡＶ粒子が産生され、ＡＡＶ血清型は、本明細書に挙げられる血清型のいずれであってもよい。ＡＡＶ血清型の非限定的な例としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ、および／またはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５およびそれらのバリアントが挙げられる。
一部の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡを抑制（または分解）する。したがって、本ｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡを使用して、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子発現を実質的に阻害することができる。一部の態様において、ＳＯＤ１遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％の阻害を指す。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％阻害され得る。
本開示によれば、ｓｉＲＮＡ分子は、培養細胞でのＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを低下させるように設計され、それらの能力に関して試験される。かかるｓｉＲＮＡ分子は、限定はされないが、表４に挙げられるものなどが挙げられ、二重鎖を形成し得る。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ二重鎖はｓｉＲＮＡ二重鎖ＩＤ：Ｄ−４０１２であってもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、ガイド鎖に位置するＳＯＤ１に対するｍｉＲＮＡシードマッチを含む。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、パッセンジャー鎖に位置するＳＯＤ１に対するｍｉＲＮＡシードマッチを含む。更に別の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖に位置するＳＯＤ１に対するシードマッチを含まない。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖について有意な完全長オフターゲット効果をほぼ有しないものであり得る。別の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖について有意な完全長オフターゲット効果をほぼ有しないものであり得る。ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖について１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１〜５％、２〜６％、３〜７％、４〜８％、５〜９％、５〜１０％、６〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％ ５〜３０％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１５〜３０％、１５〜４０％、１５〜４５％、２０〜４０％、２０〜５０％、２５〜５０％、３０〜４０％、３０〜５０％、３５〜５０％、４０〜５０％、４５〜５０％未満の完全長オフターゲット効果を有し得る。更に別の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖について有意な完全長オフターゲットをほぼ有しないものであり得る。ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖について、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１〜５％、２〜６％、３〜７％、４〜８％、５〜９％、５〜１０％、６〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％ ５〜３０％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１５〜３０％、１５〜４０％、１５〜４５％、２０〜４０％、２０〜５０％、２５〜５０％、３０〜４０％、３０〜５０％、３５〜５０％、４０〜５０％、４５〜５０％未満の完全長オフターゲット効果を有し得る。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、インビトロで高い活性を有し得る。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、インビトロで低い活性を有し得る。更に別の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、インビトロで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有し得る。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子はインビトロで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有する。ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は、少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％または１００％であり得る。ガイド鎖による標的ノックダウンは、４０〜５０％、４５〜５０％、５０〜５５％、５０〜６０％、６０〜６５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、６０〜９９．５％、６０〜１００％、６５〜７０％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、６５〜９９％、６５〜９９．５％、６５〜１００％、７０〜７５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、７０〜９９．５％、７０〜１００％、７５〜８０％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、７５〜９９％、７５〜９９．５％、７５〜１００％、８０〜８５％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、８０〜９９．５％、８０〜１００％、８５〜９０％、８５〜９５％、８５〜９９％、８５〜９９．５％、８５〜１００％、９０〜９５％、９０〜９９％、９０〜９９．５％、９０〜１００％、９５〜９９％、９５〜９９．５％、９５〜１００％、９９〜９９．５％、９９〜１００％または９９．５〜１００％であり得る。非限定的な例として、ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は、７０％よりも大きい。非限定的な例として、ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は、６０％よりも大きい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ二重鎖標的ＳＯＤ１は、センス配列またはアンチセンス配列について非ＳＯＤ１配列に対するｍｉＲＮＡシードマッチがないように設計される。
特定の実施形態において、最も近いオフターゲットに対する、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖のＩＣ５０は、オンターゲット遺伝子、ＳＯＤ１に対するガイド鎖のＩＣ５０の１００倍よりも高い。非限定的な例として、最も近いオフターゲットに対するガイド鎖のＩＣ５０が標的に対するガイド鎖のＩＣ５０の１００倍よりも高い場合、そのｓｉＲＮＡ分子は、インビトロでのＳＯＤ１の阻害に高いガイド鎖選択性を有すると言われる。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、インビトロまたはインビボで、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも９９％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも９９％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも９０％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも９０％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも８５％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも８５％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、７５〜９５％、７５〜９０％、７５〜８５％、７５〜８０％、８０〜９５％、８０〜９０％、８０〜８５％、８５〜９５％、８５〜９０％、または９０〜９５％の範囲の５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、７５〜９５％の範囲の５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、発現されたコンストラクトの７５％、７５．１％、７５．２％、７５．３％、７５．４％、７５．５％、７５．６％、７５．７％、７５．８％、７５．９％、７６％、７６．１％、７６．２％、７６．３％、７６．４％、７６．５％、７６．６％、７６．７％、７６．８％、７６．９％、７７％、７７．１％、７７．２％、７７．３％、７７．４％、７７．５％、７７．６％、７７．７％、７７．８％、７７．９％、７８％、７８．１％、７８．２％、７８．３％、７８．４％、７８．５％、７８．６％、７８．７％、７８．８％、７８．９％、７９％、７９．１％、７９．２％、７９．３％、７９．４％、７９．５％、７９．６％、７９．７％、７９．８％、７９．９％、８０％、８０．１％、８０．２％、８０．３％、８０．４％、８０．５％、８０．６％、８０．７％、８０．８％、８０．９％、８１％、８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％、８１．６％、８１．７％、８１．８％、８１．９％、８２％、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％、８２．６％、８２．７％、８２．８％、８２．９％、８３％、８３．１％、８３．２％、８３．３％、８３．４％、８３．５％、８３．６％、８３．７％、８３．８％、８３．９％、８４％、８４．１％、８４．２％、８４．３％、８４．４％、８４．５％、８４．６％、８４．７％、８４．８％、８４．９％、８５％、８５．１％、８５．２％、８５．３％、８５．４％、８５．５％、８５．６％、８５．７％、８５．８％、８５．９％、８６％、８６．１％、８６．２％、８６．３％、８６．４％、８６．５％、８６．６％、８６．７％、８６．８％、８６．９％、８７％、８７．１％、８７．２％、８７．３％、８７．４％、８７．５％、８７．６％、８７．７％、８７．８％、８７．９％、８８％、８８．１％、８８．２％、８８．３％、８８．４％、８８．５％、８８．６％、８８．７％、８８．８％、８８．９％、８９％、８９．１％、８９．２％、８９．３％、８９．４％、８９．５％、８９．６％、８９．７％、８９．８％、８９．９％、９０％、９０．１％、９０．２％、９０．３％、９０．４％、９０．５％、９０．６％、９０．７％、９０．８％、９０．９％、９１％、９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％、９１．６％、９１．７％、９１．８％、９１．９％、９２％、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％、９２．６％、９２．７％、９２．８％、９２．９％、９３％、９３．１％、９３．２％、９３．３％、９３．４％、９３．５％、９３．６％、９３．７％、９３．８％、９３．９％、９４％、９４．１％、９４．２％、９４．３％、９４．４％、９４．５％、９４．６％、９４．７％、９４．８％、９４．９％、または９５％の５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、発現されたコンストラクトの８１％の５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、発現されたコンストラクトの９０％の５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。
特定の実施形態において、ＳＯＤ１に対するパッセンジャー鎖−ガイド鎖二重鎖は、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏまたはｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡが、当該技術分野において公知のおよび本明細書に記載される方法により、プロセシングを測定したとき２倍より高いガイド鎖対パッセンジャー鎖比を示す場合に有効と見なされる。非限定的な例として、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏまたはｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡは、プロセシングを測定したとき、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍より高い、または２〜５倍、２〜１０倍、２〜１５倍、３〜５倍、３〜１０倍、３〜１５倍、４〜５倍、４〜１０倍、４〜１５倍、５〜１０倍、５〜１５倍、６〜１０倍、６〜１５倍、７〜１０倍、７〜１５倍、８〜１０倍、８〜１５倍、９〜１０倍、９〜１５倍、１０〜１５倍、１１〜１５倍、１２〜１５倍、１３〜１５倍、または１４〜１５倍のガイド鎖対パッセンジャー鎖比を示す。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子を使用して、ＳＯＤ１配列上の少なくとも１つのエクソンを標的とすることにより野生型または突然変異型ＳＯＤ１をサイレンシングすることができる。エクソンは、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、および／またはエクソン６７であってもよい。
特定の実施形態において、全内因性ｍｉＲＮＡプールのガイド鎖の範囲は、０．００１〜０．６％、０．００５〜０．６％、０．０１〜０．６％、０．０１５〜０．６％、０．０２〜０．６％、０．０２５〜０．６％、０．０３〜０．６％、０．０３５〜０．６％、０．０４〜０．６％、０．０４５〜０．６％、０．０５〜０．６％、０．０５５〜０．６％、０．０６〜０．６％、０．０６５〜０．６％、０．０７〜０．６％、０．０７５〜０．６％、０．０８〜０．６％、０．０８５〜０．６％、０．０９〜０．６％、０．０９５〜０．６％、０．１〜０．６％、０．１５〜０．６％、０．２〜０．６％、０．２５〜０．６％、０．３〜０．６％、０．３５〜０．６％、０．４〜０．６％、０．４５〜０．６％、０．５〜０．６％、０．５５〜０．６％、０．００１〜０．５％、０．００５〜０．５％、０．０１〜０．５％、０．０１５〜０．５％、０．０２〜０．５％、０．０２５〜０．５％、０．０３〜０．５％、０．０３５〜０．５％、０．０４〜０．５％、０．０４５〜０．５％、０．０５〜０．５％、０．０５５〜０．５％、０．０６〜０．５％、０．０６５〜０．５％、０．０７〜０．５％、０．０７５〜０．５％、０．０８〜０．５％、０．０８５〜０．５％、０．０９〜０．５％、０．０９５〜０．５％、０．１〜０．５％、０．１５〜０．５％、０．２〜０．５％、０．２５〜０．５％、０．３〜０．５％、０．３５〜０．５％、０．４〜０．５％、０．４５〜０．５％、０．００１〜０．４％、０．００５〜０．４％、０．０１〜０．４％、０．０１５〜０．４％、０．０２〜０．４％、０．０２５〜０．４％、０．０３〜０．４％、０．０３５〜０．４％、０．０４〜０．４％、０．０４５〜０．４％、０．０５〜０．４％、０．０５５〜０．４％、０．０６〜０．４％、０．０６５〜０．４％、０．０７〜０．４％、０．０７５〜０．４％、０．０８〜０．４％、０．０８５〜０．４％、０．０９〜０．４％、０．０９５〜０．４％、０．１〜０．４％、０．１５〜０．４％、０．２〜０．４％、０．２５〜０．４％、０．３〜０．４％、０．３５〜０．４％、０．００１〜０．３％、０．００５〜０．３％、０．０１〜０．３％、０．０１５〜０．３％、０．０２〜０．３％、０．０２５〜０．３％、０．０３〜０．３％、０．０３５〜０．３％、０．０４〜０．３％、０．０４５〜０．３％、０．０５〜０．３％、０．０５５〜０．３％、０．０６〜０．３％、０．０６５〜０．３％、０．０７〜０．３％、０．０７５〜０．３％、０．０８〜０．３％、０．０８５〜０．３％、０．０９〜０．３％、０．０９５〜０．３％、０．１〜０．３％、０．１５〜０．３％、０．２〜０．３％、０．２５〜０．３％、０．００１〜０．２％、０．００５〜０．２％、０．０１〜０．２％、０．０１５〜０．２％、０．０２〜０．２％、０．０２５〜０．２％、０．０３〜０．２％、０．０３５〜０．２％、０．０４〜０．２％、０．０４５〜０．２％、０．０５〜０．２％、０．０５５〜０．２％、０．０６〜０．２％、０．０６５〜０．２％、０．０７〜０．２％、０．０７５〜０．２％、０．０８〜０．２％、０．０８５〜０．２％、０．０９〜０．２％、０．０９５〜０．２％、０．１〜０．２％、０．１５〜０．２％、０．００１〜０．１％、０．００５〜０．１％、０．０１〜０．１％、０．０１５〜０．１％、０．０２〜０．１％、０．０２５〜０．１％、０．０３〜０．１％、０．０３５〜０．１％、０．０４〜０．１％、０．０４５〜０．１％、０．０５〜０．１％、０．０５５〜０．１％、０．０６〜０．１％、０．０６５〜０．１％、０．０７〜０．１％、０．０７５〜０．１％、０．０８〜０．１％、０．０８５〜０．１％、０．０９〜０．１％、または０．０９５〜０．１％である。非限定的な例として、範囲は０．０６〜０．６％である。非限定的な例として、範囲は０．４〜０．５％である。
特定の実施形態において、全内因性ｍｉＲＮＡプールに対するガイド鎖のパーセントは、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、または０．６％である。非限定的な例として、パーセントは０．０６％である。非限定的な例として、パーセントは０．４％である。非限定的な例として、パーセントは０．５％である。
ｓｉＲＮＡ修飾
一部の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、前駆体またはＤＮＡとして送達されるのでない場合、限定はされないがインビボでのｓｉＲＮＡの安定性の増加など、ＲＮＡ分子の幾つかの特徴を調節するように化学的に修飾されてもよい。化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子はヒトの治療適用において使用することができ、ｓｉＲＮＡ分子のＲＮＡｉ活性を損なうことなく改良される。非限定的な例として、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の３’末端および５’末端の両方で修飾されたｓｉＲＮＡ分子。
一部の態様において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖は、限定はされないが、糖修飾ヌクレオチド、核酸塩基修飾および／または骨格修飾など、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、組合せの修飾、例えば組合せの核酸塩基および骨格修飾を含み得る。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは糖修飾ヌクレオチドであってもよい。糖修飾ヌクレオチドとしては、限定はされないが、２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’−チオ修飾リボヌクレオチド、例えば２’−フルオロ修飾リボヌクレオチドが挙げられる。修飾ヌクレオチドは糖部分、ならびにリボシルでない糖類またはその類似体を有するヌクレオチドが修飾されてもよい。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、および他の糖類、複素環、または炭素環であってもよく、またはそれをベースとしてもよい。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは核酸塩基修飾ヌクレオチドであってもよい。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは骨格修飾ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖は骨格に他の修飾を更に含み得る。通常の「骨格」は、本明細書で使用されるとき、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子における交互に繰り返す糖−リン酸配列を指す。デオキシリボース／リボース糖が３’−ヒドロキシル基および５’−ヒドロキシル基の両方においてエステル結合でリン酸基につなぎ合わされ、これは「リン酸ジエステル」結合／リンカーとしても知られる（ＰＯ連結）。ＰＯ骨格は「ホスホロチオエート骨格」として修飾されてもよい（ＰＳ連結）。ある場合には、天然のリン酸ジエステル結合がアミド結合によって置き換えられてもよく、但し２つの糖単位間の４つの原子は保たれる。かかるアミド修飾は、オリゴヌクレオチドの固相合成を促進し、ｓｉＲＮＡ相補体と形成された二重鎖の熱力学的安定性を増加させることができる。例えばメスマエカーら（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，３，４３７−４４０を参照のこと；この内容は全体として参照により本明細書に援用される。
修飾塩基とは、１つ以上の原子または基の置換または付加によって修飾された、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシン、およびキューオシンなどのヌクレオチド塩基を指す。核酸塩基部分に対する修飾の幾つかの例としては、限定はされないが、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化、またはアセチル化塩基が、個別にまたは組合せで挙げられる。より具体的な例としては、例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジンおよび５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザアデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば２−チオウリジンおよび４−チオウリジンおよび２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アーケオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のＯ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えばＮ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えばアミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして働く修飾シトシン、８−置換アデニンおよびグアニン、５−置換ウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドはセンス鎖上にだけあってもよい。
別の実施形態において、修飾ヌクレオチドはアンチセンス鎖上にだけあってもよい。
一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方にあってもよい。
一部の実施形態において、化学的に修飾されたヌクレオチドは、アンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡ配列と対を形成する能力に影響を及ぼさない。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、ポリシストロン性分子であるｓｉＲＮＡ分子をコードし得る。加えてｓｉＲＮＡ分子はｓｉＲＮＡ分子の領域間に１つ以上のリンカーを含んでもよい。
分子足場
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、分子足場もまた含む調節性ポリヌクレオチドにコードされてもよい。本明細書で使用されるとき「分子足場」は、それに対して後続の分子を設計または作製する配列または構造基盤を形成するフレームワークまたは出発分子である。
特定の実施形態において、分子足場は少なくとも１つの５’フランキング領域を含む。非限定的な例として、５’フランキング領域は、任意の長さであってよい、かつ全体または一部が野生型ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列に由来し得るか、または完全に人工的な配列であり得る５’フランキング配列を含み得る。
一部の実施形態において、５’および３’フランキング配列の一方または両方が存在しない。
一部の実施形態において、５’および３’フランキング配列は長さが同じである。
一部の実施形態において、５’フランキング配列は、１〜１０ヌクレオチド長であるか、５〜１５ヌクレオチド長であるか、１０〜３０ヌクレオチド長であるか、２０〜５０ヌクレオチド長であるか、４０ヌクレオチド長よりも長いか、５０ヌクレオチド長よりも長いか、１００ヌクレオチド長よりも長いか、または２００ヌクレオチド長よりも長い。
一部の実施形態において、５’フランキング配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ヌクレオチド長であってもよい。
特定の実施形態において、３’フランキング配列は、１〜１０ヌクレオチド長であるか、５〜１５ヌクレオチド長であるか、１０〜３０ヌクレオチド長であるか、２０〜５０ヌクレオチド長であるか、４０ヌクレオチド長よりも長いか、５０ヌクレオチド長よりも長いか、１００ヌクレオチド長よりも長いか、または２００ヌクレオチド長よりも長い。
特定の実施形態において、３’フランキング配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ヌクレオチド長であってもよい。
一部の実施形態において、５’および３’フランキング配列は配列が同じである。一部の実施形態において、５’および３’フランキング配列は、互いにアラインメントさせると、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、または３０％超が異なる。
特定の実施形態において、分子足場は少なくとも１つの３’フランキング領域を含む。非限定的な例として、３’フランキング領域は、任意の長さであってよい、かつ全体または一部が野生型ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列に由来し得るか、または完全に人工的な配列であり得る３’フランキング配列を含み得る。
特定の実施形態において、分子足場は少なくとも１つのループモチーフ領域を含む。非限定的な例として、ループモチーフ領域は、任意の長さであってよい配列を含み得る。
特定の実施形態において、分子足場は、５’フランキング領域、ループモチーフ領域および／または３’フランキング領域を含む。
特定の実施形態において、本明細書に記載される少なくとも１つのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つの分子足場もまた含む調節性ポリヌクレオチドによってコードされてもよい。分子足場は、任意の長さであってよい、かつ全体または一部が野生型ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列に由来し得るか、または完全に人工的な配列であり得る５’フランキング配列を含み得る。３’フランキング配列はサイズおよび由来の点で５’フランキング配列および／またはある３’フランキング配列を反映し得る。いずれのフランキング配列も存在しないこともある。３’フランキング配列は任意選択で１つ以上のＣＮＮＣモチーフ（式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチドを表す）を含有し得る。
ステムループ構造のステムを形成することが、本明細書に記載される少なくとも１つのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤をコードする調節性ポリヌクレオチドの最低条件（ｍｉｎｉｍｕｍ）である。一部の実施形態において、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤は、標的配列に部分的に相補性であるかまたはハイブリダイズすることになる少なくとも１つの核酸配列を含む。一部の実施形態において、ペイロードはｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子の断片である。
一部の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドのステムループ構造の５’アームは、センス配列をコードする核酸配列を含む。調節性ポリヌクレオチドによってコードされ得るセンス配列、またはその断片もしくは変異体の非限定的な例は表３に記載する。
一部の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドのステムループの３’アームは、アンチセンス配列をコードする核酸配列を含む。アンチセンス配列は、一部の例では、最も５’側の末端に「Ｇ」ヌクレオチドを含む。調節性ポリヌクレオチドによってコードされ得るアンチセンス配列、またはその断片もしくは変異体の非限定的な例は表２に記載する。
他の実施形態では、センス配列が調節性ポリヌクレオチドのステムループ構造のステムの３’アームにあってもよく、一方アンチセンス配列が５’アームにある。調節性ポリヌクレオチドによってコードされ得るセンス配列およびアンチセンス配列の非限定的な例は表２および表３に記載する。
特定の実施形態において、センス配列とアンチセンス配列とは、それらの長さの実質的な部分にわたって完全に相補的であってもよい。他の実施形態においてセンス配列とアンチセンス配列とは、独立にそれらの鎖の長さの少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、または９９％にわたって少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％相補的であってもよい。
センス配列の同一性も、アンチセンス配列の相同性も、標的配列と１００％相補的である必要はない。
特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドのステムループ構造のセンス配列とアンチセンス配列とをループ配列（ループモチーフ、リンカーまたはリンカーモチーフとしても知られる）が分離している。ループ配列は、任意の長さ、４〜３０ヌクレオチド、４〜２０ヌクレオチド、４〜１５ヌクレオチド、５〜１５ヌクレオチド、６〜１２ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、および／または１５ヌクレオチドであってもよい。
一部の実施形態において、ループ配列は、少なくとも１つのＵＧＵＧモチーフをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＵＧＵＧモチーフをコードする核酸配列は、ループ配列の５’末端に位置する。
特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドには、１つ以上のモジュール（例えば、５’フランキング領域、ループモチーフ領域、３’フランキング領域、センス配列、アンチセンス配列）を互いに分離するスペーサ領域が存在してもよい。かかるスペーサ領域は１つ以上存在してもよい。
特定の実施形態において、センス配列とフランキング領域配列との間には、８〜２０、すなわち、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドのスペーサ領域が存在してもよい。
特定の実施形態において、スペーサ領域の長さは１３ヌクレオチドであり、センス配列の５’末端とフランキング配列の３’末端との間に位置する。特定の実施形態において、スペーサは配列の約１ヘリカルターンを形成するのに十分な長さである。
特定の実施形態において、アンチセンス配列とフランキング配列との間には、８〜２０、すなわち、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドのスペーサ領域が存在してもよい。
特定の実施形態において、スペーサ配列は１０〜１３、すなわち、１０、１１、１２または１３ヌクレオチドであり、アンチセンス配列の３’末端とフランキング配列の５’末端との間に位置する。特定の実施形態において、スペーサは配列の約１ヘリカルターンを形成するのに十分な長さである。
特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドの分子足場は、５’から３’方向に、５’フランキング配列、５’アーム、ループモチーフ、３’アームおよび３’フランキング配列を含む。非限定的な例として、５’アームが、センス配列をコードする核酸配列を含んでいてもよく、３’アームが、アンチセンス配列をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例では、５’アームがアンチセンス配列をコードする核酸配列を含み、３’アームがセンス配列をコードする核酸配列を含む。
特定の実施形態において、５’アーム、センスおよび／またはアンチセンス配列、ループモチーフおよび／または３’アーム配列は改変されてもよい（例えば、１ヌクレオチド以上の置換、ヌクレオチドの付加および／またはヌクレオチドの欠失）。改変はコンストラクトの機能に有益な変化を生じさせ得る（例えば、標的配列のノックダウンを増加させ、コンストラクトの分解を低減し、オフターゲット効果を低減し、ペイロードの効率を増加させ、およびペイロードの分解を低減し得る）。
特定の実施形態において、ガイド鎖（本明細書ではアンチセンス鎖とも称される）の切出し率をパッセンジャー鎖（本明細書ではセンス鎖とも称される）の切出し率よりも高くするため、調節性ポリヌクレオチドの分子足場が配列される。ガイド鎖またはパッセンジャー鎖の切出し率は、独立に、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９％超であり得る。非限定的な例として、ガイド鎖の切出し率は少なくとも８０％である。別の非限定的な例として、ガイド鎖の切出し率は少なくとも９０％である。
特定の実施形態において、ガイド鎖の切出し率はパッセンジャー鎖の切出し率よりも高い。一態様において、ガイド鎖の切出し率は、パッセンジャー鎖よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９％超高くてもよい。
特定の実施形態において、ガイド鎖の切出し効率は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９％超である。非限定的な例として、ガイド鎖の切出し効率は８０％よりも高い。
特定の実施形態において、分子足場からのガイド鎖の切出し効率はパッセンジャー鎖の切出しよりも高い。分子足場からのガイド鎖の切出しは、パッセンジャー鎖の切出しよりも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍または１０倍超高効率であり得る。
特定の実施形態において、分子足場は二重機能ターゲティング調節性ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるとき、「二重機能ターゲティング」調節性ポリヌクレオチドは、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方が同じ標的をノックダウンするポリヌクレオチド、またはガイド鎖およびパッセンジャー鎖が異なる標的をノックダウンするポリヌクレオチドである。
特定の実施形態において、本明細書に記載される調節性ポリヌクレオチドの分子足場は、５’フランキング領域、ループモチーフ領域および３’フランキング領域を含み得る。本明細書に記載される調節性ポリヌクレオチドに使用され得るまたは使用されるそれらの断片であり得る５’フランキング領域、ループモチーフ領域（リンカー領域とも称され得る）および３’フランキング領域の配列の非限定的な例は、表５〜表７に示される。
Figure 2021529513
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 特定の実施形態において、分子足場は、表５に挙げられる少なくとも１つの５’フランキング領域、断片、またはその変異体を含み得る。非限定的な例として、５’フランキング領域は、５Ｆ１であってもよい。
特定の実施形態において、分子足場は、少なくとも１つの５Ｆ１フランキング領域を含み得る。
特定の実施形態において、分子足場は、表６に挙げられる少なくとも１つのループモチーフ領域、その断片または変異体を含み得る。非限定的な例として、ループモチーフ領域は、Ｌ１であってもよい。
特定の実施形態において、分子足場は、少なくとも１つのＬ１ループモチーフ領域を含み得る。
特定の実施形態において、分子足場は、表７に挙げられる少なくとも１つの３’フランキング領域、断片、またはその変異体を含み得る。非限定的な例として、３’フランキング領域は、３Ｆ１であってもよい。
特定の実施形態において、分子足場は、少なくとも１つの３Ｆ１フランキング領域を含み得る。
特定の実施形態において、分子足場は、表５および表６に記載されるとおりの、少なくとも１つの５’フランキング領域、その断片または変異体と、少なくとも１つのループモチーフ領域、その断片または変異体とを含み得る。非限定的な例として、５’フランキング領域およびループモチーフ領域は、５Ｆ１およびＬ１であってもよい。
特定の実施形態において、分子足場は、表６および表７に記載されるとおりの、少なくとも１つの３’フランキング領域、その断片または変異体と、少なくとも１つのループモチーフ領域、その断片または変異体とを含み得る。非限定的な例として、３’フランキング領域およびループモチーフ領域は、３Ｆ１およびＬ１であってもよい。
特定の実施形態において、分子足場は、表５および表７に記載されるとおりの、少なくとも１つの５’フランキング領域、その断片または変異体と、少なくとも１つの３’フランキング領域、その断片または変異体とを含み得る。非限定的な例として、フランキング領域は、５Ｆ１および３Ｆ１であってもよい。
特定の実施形態において、分子足場は、表５〜表７に記載されるとおりの、少なくとも１つの５’フランキング領域、その断片または変異体と、少なくとも１つのループモチーフ領域、その断片または変異体と、少なくとも１つの３’フランキング領域、その断片または変異体とを含み得る。非限定的な例として、フランキング領域およびループモチーフ領域は、５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ１であってもよい。
特定の実施形態において、分子足場は天然のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場であってもよい。非限定的な例として、分子足場は、ヒトｍｉＲ１５５足場に由来する足場であってもよい。
特定の実施形態において、分子足場は当該技術分野において公知の１つ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、領域間を、または１つの分子足場を別の分子足場と分離し得る。非限定的な例として、分子足場はポリシストロン性であってもよい。
分子足場と、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子とを含む調節性ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは、表８に記載されるとおりの、５’および３’フランキング領域と、ループモチーフ領域と、センス配列およびアンチセンス配列をコードする核酸配列とを含み得る。表８には、パッセンジャー鎖およびガイド鎖ならびに５’および３’フランキング領域およびループ領域（リンカー領域とも称される）のＤＮＡ配列識別名が記載される。表８において、配列名の「ｍｉＲ」成分は、必ずしもｍｉＲＮＡ遺伝子の配列付番に対応するわけではない（例えば、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ−１０２は配列名であるが、必ずしもｍｉＲ−１０２がその配列の一部であることを意味するわけではない）。
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 調節性ポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、調節性ポリヌクレオチド配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。かかる実施形態において、２つ以上のポリペプチドをコードするウイルスゲノムが、ウイルス粒子へと複製またはパッケージングされ得る。調節性ポリヌクレオチドを含むウイルス粒子で形質導入された標的細胞は、単一細胞中でコード化センスおよび／またはアンチセンス配列を発現し得る。
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、神経学的疾患および／または障害を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
特定の実施形態において、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む調節性ポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶ粒子を、哺乳類細胞に導入し得る。
ＡＡＶ粒子ペイロード領域が調節性ポリヌクレオチドを含む場合、調節性ポリヌクレオチドは、標的遺伝子をノックダウンするためのセンス配列および／またはアンチセンス配列を含み得る。本明細書に記載される調節性ポリヌクレオチドをコードするＡＡＶウイルスゲノムは、ヒト疾患、ウイルス、感染症、獣医学的応用の分野、ならびに様々なインビボおよびインビトロ設定において有用であり得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）領域を含み得る。ＩＴＲ領域は、独立に、限定はされないが、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、および１７５ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのＩＴＲ領域の長さは、７５〜８０、７５〜８５、７５〜１００、８０〜８５、８０〜９０、８０〜１０５、８５〜９０、８５〜９５、８５〜１１０、９０〜９５、９０〜１００、９０〜１１５、９５〜１００、９５〜１０５、９５〜１２０、１００〜１０５、１００〜１１０、１００〜１２５、１０５〜１１０、１０５〜１１５、１０５〜１３０、１１０〜１１５、１１０〜１２０、１１０〜１３５、１１５〜１２０、１１５〜１２５、１１５〜１４０、１２０〜１２５、１２０〜１３０、１２０〜１４５、１２５〜１３０、１２５〜１３５、１２５〜１５０、１３０〜１３５、１３０〜１４０、１３０〜１５５、１３５〜１４０、１３５〜１４５、１３５〜１６０、１４０〜１４５、１４０〜１５０、１４０〜１６５、１４５〜１５０、１４５〜１５５、１４５〜１７０、１５０〜１５５、１５０〜１６０、１５０〜１７５、１５５〜１６０、１５５〜１６５、１６０〜１６５、１６０〜１７０、１６５〜１７０、１６５〜１７５、および１７０〜１７５ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０５ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１４１ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１３０ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）領域を含み得る。ＩＴＲ領域の各々は、独立に、限定はされないが、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、および１７５ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのＩＴＲ領域の長さは、７５〜８０、７５〜８５、７５〜１００、８０〜８５、８０〜９０、８０〜１０５、８５〜９０、８５〜９５、８５〜１１０、９０〜９５、９０〜１００、９０〜１１５、９５〜１００、９５〜１０５、９５〜１２０、１００〜１０５、１００〜１１０、１００〜１２５、１０５〜１１０、１０５〜１１５、１０５〜１３０、１１０〜１１５、１１０〜１２０、１１０〜１３５、１１５〜１２０、１１５〜１２５、１１５〜１４０、１２０〜１２５、１２０〜１３０、１２０〜１４５、１２５〜１３０、１２５〜１３５、１２５〜１５０、１３０〜１３５、１３０〜１４０、１３０〜１５５、１３５〜１４０、１３５〜１４５、１３５〜１６０、１４０〜１４５、１４０〜１５０、１４０〜１６５、１４５〜１５０、１４５〜１５５、１４５〜１７０、１５０〜１５５、１５０〜１６０、１５０〜１７５、１５５〜１６０、１５５〜１６５、１６０〜１６５、１６０〜１７０、１６５〜１７０、１６５〜１７５、および１７０〜１７５ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０５ヌクレオチド長および１４１ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０５ヌクレオチド長および１３０ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１３０ヌクレオチド長および１４１ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、２つのＩＴＲ配列領域を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つの多重フィラー配列領域を含み得る。フィラー領域は、独立に、限定はされないが、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、１０００、１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４、１０２５、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８０、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８５、１０８６、１０８７、１０８８、１０８９、１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、１０９７、１０９８、１０９９、１１００、１１０１、１１０２、１１０３、１１０４、１１０５、１１０６、１１０７、１１０８、１１０９、１１１０、１１１１、１１１２、１１１３、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３、１１２４、１１２５、１１２６、１１２７、１１２８、１１２９、１１３０、１１３１、１１３２、１１３３、１１３４、１１３５、１１３６、１１３７、１１３８、１１３９、１１４０、１１４１、１１４２、１１４３、１１４４、１１４５、１１４６、１１４７、１１４８、１１４９、１１５０、１１５１、１１５２、１１５３、１１５４、１１５５、１１５６、１１５７、１１５８、１１５９、１１６０、１１６１、１１６２、１１６３、１１６４、１１６５、１１６６、１１６７、１１６８、１１６９、１１７０、１１７１、１１７２、１１７３、１１７４、１１７５、１１７６、１１７７、１１７８、１１７９、１１８０、１１８１、１１８２、１１８３、１１８４、１１８５、１１８６、１１８７、１１８８、１１８９、１１９０、１１９１、１１９２、１１９３、１１９４、１１９５、１１９６、１１９７、１１９８、１１９９、１２００、１２０１、１２０２、１２０３、１２０４、１２０５、１２０６、１２０７、１２０８、１２０９、１２１０、１２１１、１２１２、１２１３、１２１４、１２１５、１２１６、１２１７、１２１８、１２１９、１２２０、１２２１、１２２２、１２２３、１２２４、１２２５、１２２６、１２２７、１２２８、１２２９、１２３０、１２３１、１２３２、１２３３、１２３４、１２３５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２２８４、２２８５、２２８６、２２８７、２２８８、２２８９、２２９０、２２９１、２２９２、２２９３、２２９４、２２９５、２２９６、２２９７、２２９８、２２９９、２３００、２３０１、２３０２、２３０３、２３０４、２３０５、２３０６、２３０７、２３０８、２３０９、２３１０、２３１１、２３１２、２３１３、２３１４、２３１５、２３１６、２３１７、２３１８、２３１９、２３２０、２３２１、２３２２、２３２３、２３２４、２３２５、２３２６、２３２７、２３２８、２３２９、２３３０、２３３１、２３３２、２３３３、２３３４、２３３５、２３３６、２３３７、２３３８、２３３９、２３４０、２３４１、２３４２、２３４３、２３４４、２３４５、２３４６、２３４７、２３４８、２３４９、２３５０、２３５１、２３５２、２３５３、２３５４、２３５５、２３５６、２３５７、２３５８、２３５９、２３６０、２３６１、２３６２、２３６３、２３６４、２３６５、２３６６、２３６７、２３６８、２３６９、２３７０、２３７１、２３７２、２３７３、２３７４、２３７５、２３７６、２３７７、２３７８、２３７９、２３８０、２３８１、２３８２、２３８３、２３８４、２３８５、２３８６、２３８７、２３８８、２３８９、２３９０、２３９１、２３９２、２３９３、２３９４、２３９５、２３９６、２３９７、２３９８、２３９９、２４００、２４０１、２４０２、２４０３、２４０４、２４０５、２４０６、２４０７、２４０８、２４０９、２４１０、２４１１、２４１２、２４１３、２４１４、２４１５、２４１６、２４１７、２４１８、２４１９、２４２０、２４２１、２４２２、２４２３、２４２４、２４２５、２４２６、２４２７、２４２８、２４２９、２４３０、２４３１、２４３２、２４３３、２４３４、２４３５、２４３６、２４３７、２４３８、２４３９、２４４０、２４４１、２４４２、２４４３、２４４４、２４４５、２４４６、２４４７、２４４８、２４４９、２４５０、２４５１、２４５２、２４５３、２４５４、２４５５、２４５６、２４５７、２４５８、２４５９、２４６０、２４６１、２４６２、２４６３、２４６４、２４６５、２４６６、２４６７、２４６８、２４６９、２４７０、２４７１、２４７２、２４７３、２４７４、２４７５、２４７６、２４７７、２４７８、２４７９、２４８０、２４８１、２４８２、２４８３、２４８４、２４８５、２４８６、２４８７、２４８８、２４８９、２４９０、２４９１、２４９２、２４９３、２４９４、２４９５、２４９６、２４９７、２４９８、２４９９、２５００、２５０１、２５０２、２５０３、２５０４、２５０５、２５０６、２５０７、２５０８、２５０９、２５１０、２５１１、２５１２、２５１３、２５１４、２５１５、２５１６、２５１７、２５１８、２５１９、２５２０、２５２１、２５２２、２５２３、２５２４、２５２５、２５２６、２５２７、２５２８、２５２９、２５３０、２５３１、２５３２、２５３３、２５３４、２５３５、２５３６、２５３７、２５３８、２５３９、２５４０、２５４１、２５４２、２５４３、２５４４、２５４５、２５４６、２５４７、２５４８、２５４９、２５５０、２５５１、２５５２、２５５３、２５５４、２５５５、２５５６、２５５７、２５５８、２５５９、２５６０、２５６１、２５６２、２５６３、２５６４、２５６５、２５６６、２５６７、２５６８、２５６９、２５７０、２５７１、２５７２、２５７３、２５７４、２５７５、２５７６、２５７７、２５７８、２５７９、２５８０、２５８１、２５８２、２５８３、２５８４、２５８５、２５８６、２５８７、２５８８、２５８９、２５９０、２５９１、２５９２、２５９３、２５９４、２５９５、２５９６、２５９７、２５９８、２５９９、２６００、２６０１、２６０２、２６０３、２６０４、２６０５、２６０６、２６０７、２６０８、２６０９、２６１０、２６１１、２６１２、２６１３、２６１４、２６１５、２６１６、２６１７、２６１８、２６１９、２６２０、２６２１、２６２２、２６２３、２６２４、２６２５、２６２６、２６２７、２６２８、２６２９、２６３０、２６３１、２６３２、２６３３、２６３４、２６３５、２６３６、２６３７、２６３８、２６３９、２６４０、２６４１、２６４２、２６４３、２６４４、２６４５、２６４６、２６４７、２６４８、２６４９、２６５０、２６５１、２６５２、２６５３、２６５４、２６５５、２６５６、２６５７、２６５８、２６５９、２６６０、２６６１、２６６２、２６６３、２６６４、２６６５、２６６６、２６６７、２６６８、２６６９、２６７０、２６７１、２６７２、２６７３、２６７４、２６７５、２６７６、２６７７、２６７８、２６７９、２６８０、２６８１、２６８２、２６８３、２６８４、２６８５、２６８６、２６８７、２６８８、２６８９、２６９０、２６９１、２６９２、２６９３、２６９４、２６９５、２６９６、２６９７、２６９８、２６９９、２７００、２７０１、２７０２、２７０３、２７０４、２７０５、２７０６、２７０７、２７０８、２７０９、２７１０、２７１１、２７１２、２７１３、２７１４、２７１５、２７１６、２７１７、２７１８、２７１９、２７２０、２７２１、２７２２、２７２３、２７２４、２７２５、２７２６、２７２７、２７２８、２７２９、２７３０、２７３１、２７３２、２７３３、２７３４、２７３５、２７３６、２７３７、２７３８、２７３９、２７４０、２７４１、２７４２、２７４３、２７４４、２７４５、２７４６、２７４７、２７４８、２７４９、２７５０、２７５１、２７５２、２７５３、２７５４、２７５５、２７５６、２７５７、２７５８、２７５９、２７６０、２７６１、２７６２、２７６３、２７６４、２７６５、２７６６、２７６７、２７６８、２７６９、２７７０、２７７１、２７７２、２７７３、２７７４、２７７５、２７７６、２７７７、２７７８、２７７９、２７８０、２７８１、２７８２、２７８３、２７８４、２７８５、２７８６、２７８７、２７８８、２７８９、２７９０、２７９１、２７９２、２７９３、２７９４、２７９５、２７９６、２７９７、２７９８、２７９９、２８００、２８０１、２８０２、２８０３、２８０４、２８０５、２８０６、２８０７、２８０８、２８０９、２８１０、２８１１、２８１２、２８１３、２８１４、２８１５、２８１６、２８１７、２８１８、２８１９、２８２０、２８２１、２８２２、２８２３、２８２４、２８２５、２８２６、２８２７、２８２８、２８２９、２８３０、２８３１、２８３２、２８３３、２８３４、２８３５、２８３６、２８３７、２８３８、２８３９、２８４０、２８４１、２８４２、２８４３、２８４４、２８４５、２８４６、２８４７、２８４８、２８４９、２８５０、２８５１、２８５２、２８５３、２８５４、２８５５、２８５６、２８５７、２８５８、２８５９、２８６０、２８６１、２８６２、２８６３、２８６４、２８６５、２８６６、２８６７、２８６８、２８６９、２８７０、２８７１、２８７２、２８７３、２８７４、２８７５、２８７６、２８７７、２８７８、２８７９、２８８０、２８８１、２８８２、２８８３、２８８４、２８８５、２８８６、２８８７、２８８８、２８８９、２８９０、２８９１、２８９２、２８９３、２８９４、２８９５、２８９６、２８９７、２８９８、２８９９、２９００、２９０１、２９０２、２９０３、２９０４、２９０５、２９０６、２９０７、２９０８、２９０９、２９１０、２９１１、２９１２、２９１３、２９１４、２９１５、２９１６、２９１７、２９１８、２９１９、２９２０、２９２１、２９２２、２９２３、２９２４、２９２５、２９２６、２９２７、２９２８、２９２９、２９３０、２９３１、２９３２、２９３３、２９３４、２９３５、２９３６、２９３７、２９３８、２９３９、２９４０、２９４１、２９４２、２９４３、２９４４、２９４５、２９４６、２９４７、２９４８、２９４９、２９５０、２９５１、２９５２、２９５３、２９５４、２９５５、２９５６、２９５７、２９５８、２９５９、２９６０、２９６１、２９６２、２９６３、２９６４、２９６５、２９６６、２９６７、２９６８、２９６９、２９７０、２９７１、２９７２、２９７３、２９７４、２９７５、２９７６、２９７７、２９７８、２９７９、２９８０、２９８１、２９８２、２９８３、２９８４、２９８５、２９８６、２９８７、２９８８、２９８９、２９９０、２９９１、２９９２、２９９３、２９９４、２９９５、２９９６、２９９７、２９９８、２９９９、３０００、３００１、３００２、３００３、３００４、３００５、３００６、３００７、３００８、３００９、３０１０、３０１１、３０１２、３０１３、３０１４、３０１５、３０１６、３０１７、３０１８、３０１９、３０２０、３０２１、３０２２、３０２３、３０２４、３０２５、３０２６、３０２７、３０２８、３０２９、３０３０、３０３１、３０３２、３０３３、３０３４、３０３５、３０３６、３０３７、３０３８、３０３９、３０４０、３０４１、３０４２、３０４３、３０４４、３０４５、３０４６、３０４７、３０４８、３０４９、３０５０、３０５１、３０５２、３０５３、３０５４、３０５５、３０５６、３０５７、３０５８、３０５９、３０６０、３０６１、３０６２、３０６３、３０６４、３０６５、３０６６、３０６７、３０６８、３０６９、３０７０、３０７１、３０７２、３０７３、３０７４、３０７５、３０７６、３０７７、３０７８、３０７９、３０８０、３０８１、３０８２、３０８３、３０８４、３０８５、３０８６、３０８７、３０８８、３０８９、３０９０、３０９１、３０９２、３０９３、３０９４、３０９５、３０９６、３０９７、３０９８、３０９９、３１００、３１０１、３１０２、３１０３、３１０４、３１０５、３１０６、３１０７、３１０８、３１０９、３１１０、３１１１、３１１２、３１１３、３１１４、３１１５、３１１６、３１１７、３１１８、３１１９、３１２０、３１２１、３１２２、３１２３、３１２４、３１２５、３１２６、３１２７、３１２８、３１２９、３１３０、３１３１、３１３２、３１３３、３１３４、３１３５、３１３６、３１３７、３１３８、３１３９、３１４０、３１４１、３１４２、３１４３、３１４４、３１４５、３１４６、３１４７、３１４８、３１４９、３１５０、３１５１、３１５２、３１５３、３１５４、３１５５、３１５６、３１５７、３１５８、３１５９、３１６０、３１６１、３１６２、３１６３、３１６４、３１６５、３１６６、３１６７、３１６８、３１６９、３１７０、３１７１、３１７２、３１７３、３１７４、３１７５、３１７６、３１７７、３１７８、３１７９、３１８０、３１８１、３１８２、３１８３、３１８４、３１８５、３１８６、３１８７、３１８８、３１８９、３１９０、３１９１、３１９２、３１９３、３１９４、３１９５、３１９６、３１９７、３１９８、３１９９、３２００、３２０１、３２０２、３２０３、３２０４、３２０５、３２０６、３２０７、３２０８、３２０９、３２１０、３２１１、３２１２、３２１３、３２１４、３２１５、３２１６、３２１７、３２１８、３２１９、３２２０、３２２１、３２２２、３２２３、３２２４、３２２５、３２２６、３２２７、３２２８、３２２９、３２３０、３２３１、３２３２、３２３３、３２３４、３２３５、３２３６、３２３７、３２３８、３２３９、３２４０、３２４１、３２４２、３２４３、３２４４、３２４５、３２４６、３２４７、３２４８、３２４９、および３２５０ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムの任意のフィラー領域の長さは、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１０５０、１０５０〜１１００、１１００〜１１５０、１１５０〜１２００、１２００〜１２５０、１２５０〜１３００、１３００〜１３５０、１３５０〜１４００、１４００〜１４５０



、１４５０〜１５００、１５００〜１５５０、１５５０〜１６００、１６００〜１６５０、１６５０〜１７００、１７００〜１７５０、１７５０〜１８００、１８００〜１８５０、１８５０〜１９００、１９００〜１９５０、１９５０〜２０００、２０００〜２０５０、２０５０〜２１００、２１００〜２１５０、２１５０〜２２００、２２００〜２２５０、２２５０〜２３００、２３００〜２３５０、２３５０〜２４００、２４００〜２４５０、２４５０〜２５００、２５００〜２５５０、２５５０〜２６００、２６００〜２６５０、２６５０〜２７００、２７００〜２７５０、２７５０〜２８００、２８００〜２８５０、２８５０〜２９００、２９００〜２９５０、２９５０〜３０００、３０００〜３０５０、３０５０〜３１００、３１００〜３１５０、３１５０〜３２００、および３２００〜３２５０ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５６ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約９７ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３５７ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３６３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約７１２ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約７１４ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１２０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１２０９ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１５１２ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１５１９ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２３９５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２４０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２４０５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０１３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０２１ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つの多重フィラー配列領域を含み得る。フィラー領域は、独立に、限定はされないが、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、１０００、１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４、１０２５、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８０、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８５、１０８６、１０８７、１０８８、１０８９、１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、１０９７、１０９８、１０９９、１１００、１１０１、１１０２、１１０３、１１０４、１１０５、１１０６、１１０７、１１０８、１１０９、１１１０、１１１１、１１１２、１１１３、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３、１１２４、１１２５、１１２６、１１２７、１１２８、１１２９、１１３０、１１３１、１１３２、１１３３、１１３４、１１３５、１１３６、１１３７、１１３８、１１３９、１１４０、１１４１、１１４２、１１４３、１１４４、１１４５、１１４６、１１４７、１１４８、１１４９、１１５０、１１５１、１１５２、１１５３、１１５４、１１５５、１１５６、１１５７、１１５８、１１５９、１１６０、１１６１、１１６２、１１６３、１１６４、１１６５、１１６６、１１６７、１１６８、１１６９、１１７０、１１７１、１１７２、１１７３、１１７４、１１７５、１１７６、１１７７、１１７８、１１７９、１１８０、１１８１、１１８２、１１８３、１１８４、１１８５、１１８６、１１８７、１１８８、１１８９、１１９０、１１９１、１１９２、１１９３、１１９４、１１９５、１１９６、１１９７、１１９８、１１９９、１２００、１２０１、１２０２、１２０３、１２０４、１２０５、１２０６、１２０７、１２０８、１２０９、１２１０、１２１１、１２１２、１２１３、１２１４、１２１５、１２１６、１２１７、１２１８、１２１９、１２２０、１２２１、１２２２、１２２３、１２２４、１２２５、１２２６、１２２７、１２２８、１２２９、１２３０、１２３１、１２３２、１２３３、１２３４、１２３５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２２８４、２２８５、２２８６、２２８７、２２８８、２２８９、２２９０、２２９１、２２９２、２２９３、２２９４、２２９５、２２９６、２２９７、２２９８、２２９９、２３００、２３０１、２３０２、２３０３、２３０４、２３０５、２３０６、２３０７、２３０８、２３０９、２３１０、２３１１、２３１２、２３１３、２３１４、２３１５、２３１６、２３１７、２３１８、２３１９、２３２０、２３２１、２３２２、２３２３、２３２４、２３２５、２３２６、２３２７、２３２８、２３２９、２３３０、２３３１、２３３２、２３３３、２３３４、２３３５、２３３６、２３３７、２３３８、２３３９、２３４０、２３４１、２３４２、２３４３、２３４４、２３４５、２３４６、２３４７、２３４８、２３４９、２３５０、２３５１、２３５２、２３５３、２３５４、２３５５、２３５６、２３５７、２３５８、２３５９、２３６０、２３６１、２３６２、２３６３、２３６４、２３６５、２３６６、２３６７、２３６８、２３６９、２３７０、２３７１、２３７２、２３７３、２３７４、２３７５、２３７６、２３７７、２３７８、２３７９、２３８０、２３８１、２３８２、２３８３、２３８４、２３８５、２３８６、２３８７、２３８８、２３８９、２３９０、２３９１、２３９２、２３９３、２３９４、２３９５、２３９６、２３９７、２３９８、２３９９、２４００、２４０１、２４０２、２４０３、２４０４、２４０５、２４０６、２４０７、２４０８、２４０９、２４１０、２４１１、２４１２、２４１３、２４１４、２４１５、２４１６、２４１７、２４１８、２４１９、２４２０、２４２１、２４２２、２４２３、２４２４、２４２５、２４２６、２４２７、２４２８、２４２９、２４３０、２４３１、２４３２、２４３３、２４３４、２４３５、２４３６、２４３７、２４３８、２４３９、２４４０、２４４１、２４４２、２４４３、２４４４、２４４５、２４４６、２４４７、２４４８、２４４９、２４５０、２４５１、２４５２、２４５３、２４５４、２４５５、２４５６、２４５７、２４５８、２４５９、２４６０、２４６１、２４６２、２４６３、２４６４、２４６５、２４６６、２４６７、２４６８、２４６９、２４７０、２４７１、２４７２、２４７３、２４７４、２４７５、２４７６、２４７７、２４７８、２４７９、２４８０、２４８１、２４８２、２４８３、２４８４、２４８５、２４８６、２４８７、２４８８、２４８９、２４９０、２４９１、２４９２、２４９３、２４９４、２４９５、２４９６、２４９７、２４９８、２４９９、２５００、２５０１、２５０２、２５０３、２５０４、２５０５、２５０６、２５０７、２５０８、２５０９、２５１０、２５１１、２５１２、２５１３、２５１４、２５１５、２５１６、２５１７、２５１８、２５１９、２５２０、２５２１、２５２２、２５２３、２５２４、２５２５、２５２６、２５２７、２５２８、２５２９、２５３０、２５３１、２５３２、２５３３、２５３４、２５３５、２５３６、２５３７、２５３８、２５３９、２５４０、２５４１、２５４２、２５４３、２５４４、２５４５、２５４６、２５４７、２５４８、２５４９、２５５０、２５５１、２５５２、２５５３、２５５４、２５５５、２５５６、２５５７、２５５８、２５５９、２５６０、２５６１、２５６２、２５６３、２５６４、２５６５、２５６６、２５６７、２５６８、２５６９、２５７０、２５７１、２５７２、２５７３、２５７４、２５７５、２５７６、２５７７、２５７８、２５７９、２５８０、２５８１、２５８２、２５８３、２５８４、２５８５、２５８６、２５８７、２５８８、２５８９、２５９０、２５９１、２５９２、２５９３、２５９４、２５９５、２５９６、２５９７、２５９８、２５９９、２６００、２６０１、２６０２、２６０３、２６０４、２６０５、２６０６、２６０７、２６０８、２６０９、２６１０、２６１１、２６１２、２６１３、２６１４、２６１５、２６１６、２６１７、２６１８、２６１９、２６２０、２６２１、２６２２、２６２３、２６２４、２６２５、２６２６、２６２７、２６２８、２６２９、２６３０、２６３１、２６３２、２６３３、２６３４、２６３５、２６３６、２６３７、２６３８、２６３９、２６４０、２６４１、２６４２、２６４３、２６４４、２６４５、２６４６、２６４７、２６４８、２６４９、２６５０、２６５１、２６５２、２６５３、２６５４、２６５５、２６５６、２６５７、２６５８、２６５９、２６６０、２６６１、２６６２、２６６３、２６６４、２６６５、２６６６、２６６７、２６６８、２６６９、２６７０、２６７１、２６７２、２６７３、２６７４、２６７５、２６７６、２６７７、２６７８、２６７９、２６８０、２６８１、２６８２、２６８３、２６８４、２６８５、２６８６、２６８７、２６８８、２６８９、２６９０、２６９１、２６９２、２６９３、２６９４、２６９５、２６９６、２６９７、２６９８、２６９９、２７００、２７０１、２７０２、２７０３、２７０４、２７０５、２７０６、２７０７、２７０８、２７０９、２７１０、２７１１、２７１２、２７１３、２７１４、２７１５、２７１６、２７１７、２７１８、２７１９、２７２０、２７２１、２７２２、２７２３、２７２４、２７２５、２７２６、２７２７、２７２８、２７２９、２７３０、２７３１、２７３２、２７３３、２７３４、２７３５、２７３６、２７３７、２７３８、２７３９、２７４０、２７４１、２７４２、２７４３、２７４４、２７４５、２７４６、２７４７、２７４８、２７４９、２７５０、２７５１、２７５２、２７５３、２７５４、２７５５、２７５６、２７５７、２７５８、２７５９、２７６０、２７６１、２７６２、２７６３、２７６４、２７６５、２７６６、２７６７、２７６８、２７６９、２７７０、２７７１、２７７２、２７７３、２７７４、２７７５、２７７６、２７７７、２７７８、２７７９、２７８０、２７８１、２７８２、２７８３、２７８４、２７８５、２７８６、２７８７、２７８８、２７８９、２７９０、２７９１、２７９２、２７９３、２７９４、２７９５、２７９６、２７９７、２７９８、２７９９、２８００、２８０１、２８０２、２８０３、２８０４、２８０５、２８０６、２８０７、２８０８、２８０９、２８１０、２８１１、２８１２、２８１３、２８１４、２８１５、２８１６、２８１７、２８１８、２８１９、２８２０、２８２１、２８２２、２８２３、２８２４、２８２５、２８２６、２８２７、２８２８、２８２９、２８３０、２８３１、２８３２、２８３３、２８３４、２８３５、２８３６、２８３７、２８３８、２８３９、２８４０、２８４１、２８４２、２８４３、２８４４、２８４５、２８４６、２８４７、２８４８、２８４９、２８５０、２８５１、２８５２、２８５３、２８５４、２８５５、２８５６、２８５７、２８５８、２８５９、２８６０、２８６１、２８６２、２８６３、２８６４、２８６５、２８６６、２８６７、２８６８、２８６９、２８７０、２８７１、２８７２、２８７３、２８７４、２８７５、２８７６、２８７７、２８７８、２８７９、２８８０、２８８１、２８８２、２８８３、２８８４、２８８５、２８８６、２８８７、２８８８、２８８９、２８９０、２８９１、２８９２、２８９３、２８９４、２８９５、２８９６、２８９７、２８９８、２８９９、２９００、２９０１、２９０２、２９０３、２９０４、２９０５、２９０６、２９０７、２９０８、２９０９、２９１０、２９１１、２９１２、２９１３、２９１４、２９１５、２９１６、２９１７、２９１８、２９１９、２９２０、２９２１、２９２２、２９２３、２９２４、２９２５、２９２６、２９２７、２９２８、２９２９、２９３０、２９３１、２９３２、２９３３、２９３４、２９３５、２９３６、２９３７、２９３８、２９３９、２９４０、２９４１、２９４２、２９４３、２９４４、２９４５、２９４６、２９４７、２９４８、２９４９、２９５０、２９５１、２９５２、２９５３、２９５４、２９５５、２９５６、２９５７、２９５８、２９５９、２９６０、２９６１、２９６２、２９６３、２９６４、２９６５、２９６６、２９６７、２９６８、２９６９、２９７０、２９７１、２９７２、２９７３、２９７４、２９７５、２９７６、２９７７、２９７８、２９７９、２９８０、２９８１、２９８２、２９８３、２９８４、２９８５、２９８６、２９８７、２９８８、２９８９、２９９０、２９９１、２９９２、２９９３、２９９４、２９９５、２９９６、２９９７、２９９８、２９９９、３０００、３００１、３００２、３００３、３００４、３００５、３００６、３００７、３００８、３００９、３０１０、３０１１、３０１２、３０１３、３０１４、３０１５、３０１６、３０１７、３０１８、３０１９、３０２０、３０２１、３０２２、３０２３、３０２４、３０２５、３０２６、３０２７、３０２８、３０２９、３０３０、３０３１、３０３２、３０３３、３０３４、３０３５、３０３６、３０３７、３０３８、３０３９、３０４０、３０４１、３０４２、３０４３、３０４４、３０４５、３０４６、３０４７、３０４８、３０４９、３０５０、３０５１、３０５２、３０５３、３０５４、３０５５、３０５６、３０５７、３０５８、３０５９、３０６０、３０６１、３０６２、３０６３、３０６４、３０６５、３０６６、３０６７、３０６８、３０６９、３０７０、３０７１、３０７２、３０７３、３０７４、３０７５、３０７６、３０７７、３０７８、３０７９、３０８０、３０８１、３０８２、３０８３、３０８４、３０８５、３０８６、３０８７、３０８８、３０８９、３０９０、３０９１、３０９２、３０９３、３０９４、３０９５、３０９６、３０９７、３０９８、３０９９、３１００、３１０１、３１０２、３１０３、３１０４、３１０５、３１０６、３１０７、３１０８、３１０９、３１１０、３１１１、３１１２、３１１３、３１１４、３１１５、３１１６、３１１７、３１１８、３１１９、３１２０、３１２１、３１２２、３１２３、３１２４、３１２５、３１２６、３１２７、３１２８、３１２９、３１３０、３１３１、３１３２、３１３３、３１３４、３１３５、３１３６、３１３７、３１３８、３１３９、３１４０、３１４１、３１４２、３１４３、３１４４、３１４５、３１４６、３１４７、３１４８、３１４９、３１５０、３１５１、３１５２、３１５３、３１５４、３１５５、３１５６、３１５７、３１５８、３１５９、３１６０、３１６１、３１６２、３１６３、３１６４、３１６５、３１６６、３１６７、３１６８、３１６９、３１７０、３１７１、３１７２、３１７３、３１７４、３１７５、３１７６、３１７７、３１７８、３１７９、３１８０、３１８１、３１８２、３１８３、３１８４、３１８５、３１８６、３１８７、３１８８、３１８９、３１９０、３１９１、３１９２、３１９３、３１９４、３１９５、３１９６、３１９７、３１９８、３１９９、３２００、３２０１、３２０２、３２０３、３２０４、３２０５、３２０６、３２０７、３２０８、３２０９、３２１０、３２１１、３２１２、３２１３、３２１４、３２１５、３２１６、３２１７、３２１８、３２１９、３２２０、３２２１、３２２２、３２２３、３２２４、３２２５、３２２６、３２２７、３２２８、３２２９、３２３０、３２３１、３２３２、３２３３、３２３４、３２３５、３２３６、３２３７、３２３８、３２３９、３２４０、３２４１、３２４２、３２４３、３２４４、３２４５、３２４６、３２４７、３２４８、３２４９、および３２５０ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムの任意のフィラー領域の長さは、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１０５０、１０５０〜１１００、１１００〜１１５０、１１５０〜１２００、１２００〜１２５０、１２５０〜１３００、１３００〜１３５０、１３５０〜１４００、１４００〜１４５０



、１４５０〜１５００、１５００〜１５５０、１５５０〜１６００、１６００〜１６５０、１６５０〜１７００、１７００〜１７５０、１７５０〜１８００、１８００〜１８５０、１８５０〜１９００、１９００〜１９５０、１９５０〜２０００、２０００〜２０５０、２０５０〜２１００、２１００〜２１５０、２１５０〜２２００、２２００〜２２５０、２２５０〜２３００、２３００〜２３５０、２３５０〜２４００、２４００〜２４５０、２４５０〜２５００、２５００〜２５５０、２５５０〜２６００、２６００〜２６５０、２６５０〜２７００、２７００〜２７５０、２７５０〜２８００、２８００〜２８５０、２８５０〜２９００、２９００〜２９５０、２９５０〜３０００、３０００〜３０５０、３０５０〜３１００、３１００〜３１５０、３１５０〜３２００、および３２００〜３２５０ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５６ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約９７ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３５７ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３６３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約７１２ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約７１４ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１２０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１２０９ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１５１２ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１５１９ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２３９５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２４０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２４０５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０１３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０２１ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つのエンハンサー配列領域を含み得る。エンハンサー配列領域は、独立に、限定はされないが、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、および４００ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのエンハンサー領域の長さは、３００〜３１０、３００〜３２５、３０５〜３１５、３１０〜３２０、３１５〜３２５、３２０〜３３０、３２５〜３３５、３２５〜３５０、３３０〜３４０、３３５〜３４５、３４０〜３５０、３４５〜３５５、３５０〜３６０、３５０〜３７５、３５５〜３６５、３６０〜３７０、３６５〜３７５、３７０〜３８０、３７５〜３８５、３７５〜４００、３８０〜３９０、３８５〜３９５、および３９０〜４００ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０３ヌクレオチド長であるエンハンサー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３８２ヌクレオチド長であるエンハンサー領域を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つのプロモータ配列領域を含み得る。プロモータ配列領域は、独立に、限定はされないが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、および６００ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのプロモータ領域の長さは、４〜１０、１０〜２０、１０〜５０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜１００、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１００〜１５０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１５０〜２００、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２００〜２５０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２５０〜３００、２６０〜２７０、２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１０、３００〜３５０、３１０〜３２０、３２０〜３３０、３３０〜３４０、３４０〜３５０、３５０〜３６０、３５０〜４００、３６０〜３７０、３７０〜３８０、３８０〜３９０、３９０〜４００、４００〜４１０、４００〜４５０、４１０〜４２０、４２０〜４３０、４３０〜４４０、４４０〜４５０、４５０〜４６０、４５０〜５００、４６０〜４７０、４７０〜４８０、４８０〜４９０、４９０〜５００、５００〜５１０、５００〜５５０、５１０〜５２０、５２０〜５３０、５３０〜５４０、５４０〜５５０、５５０〜５６０、５５０〜６００、５６０〜５７０、５７０〜５８０、５８０〜５９０、および５９０〜６００ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約４ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１７ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２０４ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２１９ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２６０ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０３ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３８２ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５８８ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つのエクソン配列領域を含み得る。エクソン領域は、独立に、限定はされないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、および１５０ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのエクソン領域の長さは、２〜１０、５〜１０、５〜１５、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１５〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２５〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３０〜５０、３０〜６０、３５〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４０〜６０、４０〜７０、４５〜５０、４５〜５５、５０〜６０、５０〜７０、５０〜８０、５５〜６０、５５〜６５、６０〜７０、６０〜８０、６０〜９０、６５〜７０、６５〜７５、７０〜８０、７０〜９０、７０〜１００、７５〜８０、７５〜８５、８０〜９０、８０〜１００、８０〜１１０、８５〜９０、８５〜９５、９０〜１００、９０〜１１０、９０〜１２０、９５〜１００、９５〜１０５、１００〜１１０、１００〜１２０、１００〜１３０、１０５〜１１０、１０５〜１１５、１１０〜１２０、１１０〜１３０、１１０〜１４０、１１５〜１２０、１１５〜１２５、１２０〜１３０、１２０〜１４０、１２０〜１５０、１２５〜１３０、１２５〜１３５、１３０〜１４０、１３０〜１５０、１３５〜１４０、１３５〜１４５、１４０〜１５０、および１４５〜１５０ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５３ヌクレオチド長であるエクソン領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１３４ヌクレオチド長であるエクソン領域を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つのイントロン配列領域を含み得る。イントロン領域は、独立に、限定はされないが、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、および３５０ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのイントロン領域の長さは、２５〜３５、２５〜５０、３５〜４５、４５〜５５、５０〜７５、５５〜６５、６５〜７５、７５〜８５、７５〜１００、８５〜９５、９５〜１０５、１００〜１２５、１０５〜１１５、１１５〜１２５、１２５〜１３５、１２５〜１５０、１３５〜１４５、１４５〜１５５、１５０〜１７５、１５５〜１６５、１６５〜１７５、１７５〜１８５、１７５〜２００、１８５〜１９５、１９５〜２０５、２００〜２２５、２０５〜２１５、２１５〜２２５、２２５〜２３５、２２５〜２５０、２３５〜２４５、２４５〜２５５、２５０〜２７５、２５５〜２６５、２６５〜２７５、２７５〜２８５、２７５〜３００、２８５〜２９５、２９５〜３０５、３００〜３２５、３０５〜３１５、３１５〜３２５、３２５〜３３５、３２５〜３５０、および３３５〜３４５ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３２ヌクレオチド長であるイントロン領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１７２ヌクレオチド長であるイントロン領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２０１ヌクレオチド長であるイントロン領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３４７ヌクレオチド長であるイントロン領域を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列領域を含み得る。ポリアデニル化シグナル領域配列領域は、独立に、限定はされないが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、および６００ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのポリアデニル化シグナル配列領域の長さは、４〜１０、１０〜２０、１０〜５０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜１００、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１００〜１５０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１５０〜２００、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２００〜２５０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２５０〜３００、２６０〜２７０、２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１０、３００〜３５０、３１０〜３２０、３２０〜３３０、３３０〜３４０、３４０〜３５０、３５０〜３６０、３５０〜４００、３６０〜３７０、３７０〜３８０、３８０〜３９０、３９０〜４００、４００〜４１０、４００〜４５０、４１０〜４２０、４２０〜４３０、４３０〜４４０、４４０〜４５０、４５０〜４６０、４５０〜５００、４６０〜４７０、４７０〜４８０、４８０〜４９０、４９０〜５００、５００〜５１０、５００〜５５０、５１０〜５２０、５２０〜５３０、５３０〜５４０、５４０〜５５０、５５０〜５６０、５５０〜６００、５６０〜５７０、５７０〜５８０、５８０〜５９０、および５９０〜６００ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１２７ヌクレオチド長であるポリアデニル化シグナル配列領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２２５ヌクレオチド長であるポリアデニル化シグナル配列領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約４７６ヌクレオチド長であるポリアデニル化シグナル配列領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約４７７ヌクレオチド長であるポリアデニル化シグナル配列領域を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、２つ以上のポリＡシグナル配列領域を含む。
調節性ポリヌクレオチド配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含むＡＡＶ粒子のＩＴＲ〜ＩＴＲ配列の非限定的な例は、表９Ａに記載される。また、表９Ａには、「ＶＯＹＳＯＤ」識別名によって示されるＩＴＲ〜ＩＴＲコンストラクトの代替的名前を提供する。
Figure 2021529513
 表９Ｂは、アルブミン由来フィラーを有するＨ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２のＩＴＲ〜ＩＴＲ配列を提供する。表９Ｂには、ＩＴＲ〜ＩＴＲ配列を構成する成分も提供されている。一部の実施形態において、成分は、ベクター骨格配列によって互いに隔てられてもよい。
Figure 2021529513
 特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、配列番号９に対して同一性パーセントを有する配列を含むウイルスゲノムを含む。ウイルスゲノムは、配列番号９に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一性を有してもよい。ウイルスゲノムは、配列番号９に対して１〜１０％、１０〜２０％、３０〜４０％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９９％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９９％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９９％、７０〜１００％、８０〜８５％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜９９％、または９０〜１００％を有してもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号９に対して８０％同一性である配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号９に対して８５％同一性である配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号９に対して９０％同一性である配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号９に対して９５％同一性である配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号９に対して９９％同一性である配列を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、配列番号２５に対して同一性パーセントを有する配列を含むウイルスゲノムを含む。ウイルスゲノムは、配列番号２５に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一性を有してもよい。ウイルスゲノムは、配列番号２５に対して１〜１０％、１０〜２０％、３０〜４０％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９９％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９９％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９９％、７０〜１００％、８０〜８５％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜９９％、または９０〜１００％を有してもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号２５に対して８０％同一性である配列を含む。別の限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号２５に対して８５％同一性である配列を含む。別の非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号２５に対して９０％同一性を有する配列を含む。別の非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号２５に対して９５％同一性を有する配列を含む。別の非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号２５に対して９９％同一性を有する配列を含む。
ＡＡＶ粒子は、送達効率が増強されるように修飾されてもよい。本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むかかる修飾ＡＡＶベクターは、効率的にパッケージングすることができ、高頻度でおよび最低限の毒性でおよび標的細胞への感染を成功させるために使用することができる。
一部の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、ヒト血清型ＡＡＶ粒子であってもよい。かかるヒトＡＡＶ粒子は、任意の既知の血清型、例えば血清型ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１１のいずれか１つに由来し得る。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１由来カプシドにＡＡＶ１由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ２由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ４由来カプシドにＡＡＶ４由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ６由来カプシドにＡＡＶ６由来ゲノムを含むベクターまたはＡＡＶ９由来カプシドにＡＡＶ９由来ゲノムを含むベクターであってもよい。
他の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型を起源とする配列および／または成分を含有するシュードタイプハイブリッドまたはキメラＡＡＶ粒子であってもよい。シュードタイプＡＡＶ粒子は、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムと、少なくとも一部が異なるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質とを含むベクターであってもよい。非限定的な例として、かかるシュードタイプＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；またはＡＡＶ６由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；またはＡＡＶ４由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノム；もしくはＡＡＶ９由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクターであってもよい。同様に、本開示は、任意のハイブリッドまたはキメラＡＡＶ粒子を企図する。
他の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、中枢神経系へのｓｉＲＮＡ分子の送達に使用されてもよい（例えば、米国特許第６，１８０，６１３号明細書；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
一部の態様において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、非ウイルス起源のペプチドを含む修飾カプシドを更に含み得る。他の態様において、コード化ｓｉＲＮＡ二重鎖の脳および脊髄への送達を促進するため、ＡＡＶ粒子はＣＮＳ特異的キメラカプシドを含んでもよい。例えば、ＣＮＳ向性を呈するＡＡＶバリアントからのｃａｐヌクレオチド配列のアラインメントを作成することにより可変領域（ＶＲ）配列および構造を同定してもよい。
他の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、細胞への送達用のプラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）、ゲノムまたは他の核酸発現ベクターにコードすることができる。
ＤＮＡ発現プラスミドを使用して、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを細胞で安定に発現させ、標的遺伝子の長期阻害を実現することができる。
一態様において、ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドによってコードされるｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖とは、典型的には、短いスペーサ配列によって連結され、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれるステム−ループ構造の発現をもたらす。ヘアピンはダイサーによって認識および切断され、そのようにして成熟ｓｉＲＮＡ分子が生じる。
本開示によれば、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子の核酸を含むＡＡＶベクターが作製され、ＡＡＶベクター血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８およびＡＡＶ−ＤＪ、およびこれらのバリアントであってもよい。
一部の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、発現されると、標的ｍＲＮＡ（つまり、ＳＯＤ１）を抑制（または分解）する。したがって、ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドによってコードされるｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを使用して、細胞、例えば運動ニューロンにおけるＳＯＤ１遺伝子発現を実質的に阻害することができる。一部の態様において、ＳＯＤ１遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％の阻害を指す。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％阻害され得る。ＳＯＤ１遺伝子は、野生型遺伝子、または少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１遺伝子のいずれであってもよい。したがって、タンパク質は、野生型タンパク質、または少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ポリペプチドのいずれかである。
ウイルス作製
本開示は、ウイルス複製細胞をＡＡＶポリヌクレオチドまたはＡＡＶゲノムに接触させることを含む、ウイルス複製細胞におけるウイルスゲノム複製によるパルボウイルス粒子、例えばＡＡＶ粒子の作成方法を提供する。
本開示は、１）コンピテント細菌細胞にバクミドベクターおよびウイルスコンストラクトベクターおよび／またはＡＡＶペイロードコンストラクトベクターのいずれかをコトランスフェクトする工程、２）得られたウイルスコンストラクト発現ベクターおよびＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを単離し、ウイルス複製細胞に個別にトランスフェクトする工程、３）ウイルスコンストラクト発現ベクターまたはＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを含む得られたペイロードおよびウイルスコンストラクト粒子を単離および精製する工程、４）ウイルス複製細胞に、ウイルスコンストラクト発現ベクターまたはＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを含むＡＡＶペイロードおよびウイルスコンストラクト粒子の両方を共感染させる工程、および５）パルボウイルスゲノムを含むウイルス粒子を回収および精製する工程を含む、形質導入効率が増強された（増加した、向上した）ＡＡＶ粒子の作製方法を提供する。
特定の実施形態において、本開示は、１）限定はされないがＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞にペイロード領域、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するコンストラクトならびにヘルパーコンストラクトを同時にコトランスフェクトする工程、２）ウイルスゲノムを含むＡＡＶ粒子を回収および精製する工程を含む、ＡＡＶ粒子の作製方法を提供する。
細胞
本開示は、ＡＡＶポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶゲノムを含む細胞を提供する。
本明細書に開示されるウイルス作製は、ペイロード分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むペイロードコンストラクト、例えば組換えウイルスコンストラクトを送達するため標的細胞に接触するＡＡＶ粒子の作製プロセスおよび方法を記載する。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、昆虫細胞を含むウイルス複製細胞で作製されてもよい。
培養下の昆虫細胞の成長条件、および培養下の昆虫細胞における異種産物の産生は当該技術分野において周知であり、米国特許第６，２０４，０５９号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）を参照されたい。
本開示においては、パルボウイルスの複製を可能にする、かつ培養下に維持することのできる任意の昆虫細胞を使用することができる。細胞株は、限定はされないがＳｆ９またはＳｆ２１細胞株を含めたスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からの細胞株、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞株、またはヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞株などの蚊細胞株が用いられてもよい。異種タンパク質を発現させるための昆虫細胞の使用については、ベクター、例えば昆虫細胞適合性ベクターなどの核酸をかかる細胞に導入する方法、および培養下のかかる細胞を維持する方法と同様に、十分に実証されている。例えば、「分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄ）編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州、１９９５；オライリーら（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）、「バキュロウイルス発現ベクター、実験マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、１９９４；サムルスキら（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．，６３，３８２２−８，１９８９；カジガヤら（Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４６４６−５０，１９９１；ラフィングら（Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．，６６，６９２２−３０，１９９２；キムバウアーら（Ｋｉｍｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｖｉｒ．，２１９，３７−４４、１９９６；チャオら（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．），Ｖｉｒ．，２７２，３８２−９３，２０００；およびサムルスキら（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，２０４，０５９号明細書を参照されたく、これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される。
ウイルス複製細胞は、原核生物（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳類細胞を含めた真核細胞を含め、任意の生物学的有機体から選択されてもよい。ウイルス複製細胞には、Ａ５４９、ＷＥＨ１、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２ならびに哺乳類に由来する初代線維芽細胞、ヘパトサイトおよび筋芽細胞など、哺乳類細胞が含まれ得る。ウイルス複製細胞には、限定はされないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含めた哺乳類種、または限定はされないが、線維芽細胞、ヘパトサイト、腫瘍細胞、細胞株形質転換細胞等を含めた細胞型に由来する細胞が含まれる。
ＡＡＶ粒子の哺乳類細胞（小規模）産生
本明細書に開示されるウイルス作製は、ペイロードをコードするポリヌクレオチド配列を含むペイロード、例えば組換えウイルスコンストラクトを送達するため標的細胞に接触するＡＡＶ粒子の作製プロセスおよび方法を記載する。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、哺乳類細胞を含むウイルス複製細胞で作製されてもよい。
組換えＡＡＶ粒子の作製に一般的に使用されるウイルス複製細胞としては、限定はされないが、米国特許第６，１５６，３０３号明細書、同第５，３８７，４８４号明細書、同第５，７４１，６８３号明細書、同第５，６９１，１７６号明細書、および同第５，６８８，６７６号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８１７２１号明細書、および国際公開第００／４７７５７号パンフレット、同第００／２４９１６号パンフレット、および同第９６／１７９４７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されるとおりの、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞、および他の哺乳類細胞株が挙げられる。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は哺乳類細胞で作製され、ここでは３つ全てのＶＰタンパク質が１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い化学量論で発現する。この制御された発現レベルを実現する調節機構には、差次的スプライシングによって作製される、一方がＶＰ１用、および他方がＶＰ２およびＶＰ３用の２つのｍＲＮＡの作製が含まれる。
別の実施形態において、ＡＡＶ粒子はトリプルトランスフェクション方法を用いて哺乳類細胞で作製され、ここではペイロードコンストラクトとパルボウイルスＲｅｐおよびパルボウイルスＣａｐとヘルパーコンストラクトとが３つの異なるコンストラクト内に含まれる。ＡＡＶ粒子作製の３成分のトリプルトランスフェクション方法を利用して、形質導入効率、標的組織（向性）評価、および安定性を含めたアッセイ用の小規模ロットのウイルスを作製し得る。
本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、トリプルトランスフェクション、またはバキュロウイルス媒介性ウイルス産生、または当該技術分野で公知の任意の他の方法によって作製してもよい。当該技術分野で公知の任意の好適な許容細胞またはパッケージング細胞を用いて、ベクターを作製してもよい。哺乳類細胞が好ましいことが多い。複製欠損ヘルパーウイルスから欠失されている機能を提供するトランス補完パッケージング細胞株、例えば２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞も好ましい。
遺伝子カセットは、パルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子の一部またはすべてを含んでもよい。しかしながら、好ましくは、ｃａｐおよびｒｅｐ機能の一部またはすべては、カプシドおよび／またはＲｅｐタンパク質をコードするパッケージングベクターを細胞に導入することによって、トランスで提供される。最も好ましくは、遺伝子カセットは、カプシドまたはＲｅｐタンパク質をコードしない。あるいは、安定して形質転換されてｃａｐおよび／またはｒｅｐ遺伝子を発現するパッケージング細胞株が使用される。
組換えＡＡＶウイルス粒子は、ある場合には、米国特許出願公開第２０１６００３２２５４号明細書に記載される通りの手順に従って培養上清から作製および精製されており、この内容は参照により援用される。また、作製には、２９３Ｔ細胞、ｓｆ９昆虫細胞、トリプルトランスフェクションまたは任意の好適な作製方法を使用するものを含む、当該技術分野で公知の方法が関与してもよい。
ある場合には、２９３Ｔ細胞（接着／懸濁）に、ＡＡＶ、すなわちＡＡＶ２ ｒｅｐ、アデノウイルスヘルパーコンストラクトおよびＩＴＲ隣接トランス遺伝子カセットの作製に必要なプラスミドを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてトランスフェクトする。また、ＡＡＶ２ ｒｅｐプラスミドは、研究されている特定のウイルスのｃａｐ配列を含有する。血清有り／無しのＤＭＥＭ／Ｆ１７で生じるトランスフェクションの２４時間後（懸濁の場合は培地を変更しない）、培地を、血清有りまたは無しの新鮮な培地と取り替える。トランスフェクションの３（三）日後、２９３接着細胞の培養培地から試料を得る。続いて、細胞を擦り取るか、または懸濁細胞をペレットにし、容器へと移す。接着細胞の場合は、遠心分離後に細胞ペレットを除去し、擦り取った後の上清から第２の試料を得る。次に、連続３回の凍結融解サイクル（−８０℃〜３７℃）または界面活性剤ｔｒｉｔｏｎの添加によって、細胞溶解を達成する。遠心分離または深層ろ過によって細胞残屑を除去し、培地から試料３を得る。ＤＮＡ ｑＰＣＲによるＤＮａｓｅ耐性ゲノム滴定（ＤＮａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって、試料をＡＡＶ粒子について定量化する。かかるトランスフェクションの総産生収率は、試料３の粒子濃度と等しい。
ＡＡＶ粒子力価を、ゲノムコピー数（１ミリリットル当たりのゲノム粒子）により測定する。ゲノム粒子濃度は、以前に報告されている通りのベクターＤＮＡのＤＮＡ定量ＰＣＲに基づく（クラークら（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１−１０３９；フェルトワイクら（Ｖｅｌｄｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．）（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６：２７２−２７８）。
バキュロウイルス
本明細書に開示される粒子作製は、ペイロードをコードするポリヌクレオチド配列を含むペイロードコンストラクトを送達するため標的細胞に接触するＡＡＶ粒子の作製プロセスおよび方法を記載する。
簡潔に言えば、ウイルスコンストラクトベクターおよびＡＡＶペイロードコンストラクトベクターが、各々、公知の、当業者によって実施されている標準的な分子生物学的技術により、トランスポゾンドナー／アクセプターシステムによってバキュロウイルスプラスミドとしても知られるバクミドに取り込まれる。別個のウイルス複製細胞集団のトランスフェクションにより２つのバキュロウイルスが生じ、一方はウイルスコンストラクト発現ベクターを含み、もう一方はＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを含む。これらの２つのバキュロウイルスを使用して単一のウイルス複製細胞集団を感染させて、ＡＡＶ粒子を作製し得る。
限定はされないが、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞を含め、昆虫細胞においてウイルス粒子を作製するためのバキュロウイルス発現ベクターは、高力価のウイルス粒子産物を提供する。ウイルスコンストラクト発現ベクターおよびＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターをコードする組換えバキュロウイルスは、ウイルス複製細胞の増殖性感染を惹起する。初感染から放出された感染性バキュロウイルス粒子は培養物中の更なる細胞に二次感染し、初期感染多重度の関数である所定回数の感染サイクルで細胞培養物集団全体に指数関数的に感染する。ウラベ・Ｍら（Ｕｒａｂｅ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，２００６Ｆｅｂ，８０（４）：１８７４−８５（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）を参照されたい。
昆虫細胞系におけるバキュロウイルスによるＡＡＶ粒子の作製は、公知のバキュロウイルスの遺伝的および物理的不安定性に対処し得る。特定の実施形態において、この作製システムは、タイターレス感染細胞保存およびスケールアップシステムを利用することにより複数継代をかけてバキュロウイルスの不安定性に対処する。ウイルス作製細胞の小規模シード培養物に、ウイルス粒子の構造、非構造成分をコードするウイルス発現コンストラクトがトランスフェクトされる。バキュロウイルス感染ウイルス作製細胞がアリコートに回収され、それが液体窒素で凍結保存され得る；アリコートは、大規模ウイルス作製細胞培養物の感染のための生存能力および感染力を維持している。ワシルコ ＤＪら（Ｗａｓｉｌｋｏ ＤＪ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００９ Ｊｕｎ；６５（２）：１２２−３２、この内容は本明細書において全体として参照により援用される。
遺伝的に安定したバキュロウイルスを使用して、無脊椎動物細胞においてＡＡＶ粒子を作製するための成分のうちの１つ以上の供給源を作製してもよい。特定の実施形態において、欠損バキュロウイルス発現ベクターが昆虫細胞のエピソームに保持されてもよい。かかる実施形態において、バクミドベクターは、限定はされないが、プロモータ、エンハンサー、および／または細胞周期調節性複製エレメントを含め、複製制御エレメントを有するように操作される。
特定の実施形態において、バキュロウイルスは、キチナーゼ／カテプシン遺伝子座への組換えのため（非）選択可能マーカを有するように操作されてもよい。組織培養におけるバキュロウイルスの増殖にｃｈｉａ／ｖ−ｃａｔｈ遺伝子座は非必須であり、Ｖ−ｃａｔｈ（ＥＣ ３．４．２２．５０）は、Ａｒｇ−Ａｒｇジペプチド含有基質上で最も活性が高いシステインエンドプロテアーゼである。Ａｒｇ−Ａｒｇジペプチドは、デンソウイルスおよびパルボウイルスカプシド構造タンパク質に存在するが、ディペンドウイルスＶＰ１にはまれにしか見られない。
特定の実施形態において、バキュロウイルス感染に許容的な安定ウイルス複製細胞は、限定はされないが、ＡＡＶゲノム全体、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、別個の転写カセットとしての各Ｒｅｐタンパク質、別個の転写カセットとしての各ＶＰタンパク質、ＡＡＰ（アセンブリ活性化タンパク質）、または天然もしくは非天然プロモータを有するバキュロウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも１つを含め、ＡＡＶ複製およびウイルス粒子産生に必要なエレメントのいずれかの少なくとも１つの安定に組み込まれたコピーを有するように操作される。
大規模作製
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子作製は、作製規模を増加させるように改良されてもよい。本開示に係る大規模ウイルス作製方法には、米国特許第５，７５６，２８３号明細書、同第６，２５８，５９５号明細書、同第６，２６１，５５１号明細書、同第６，２７０，９９６号明細書、同第６，２８１，０１０号明細書、同第６，３６５，３９４号明細書、同第６，４７５，７６９号明細書、同第６，４８２，６３４号明細書、同第６，４８５，９６６号明細書、同第６，９４３，０１９号明細書、同第６，９５３，６９０号明細書、同第７，０２２，５１９号明細書、同第７，２３８，５２６号明細書、同第７，２９１，４９８号明細書および同第７，４９１，５０８号明細書または国際公開第１９９６０３９５３０号パンフレット、同第１９９８０１００８８号パンフレット、同第１９９９０１４３５４号パンフレット、同第１９９９０１５６８５号パンフレット、同第１９９９０４７６９１号パンフレット、同第２００００５５３４２号パンフレット、同第２００００７５３５３号パンフレットおよび同第２００１０２３５９７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるもののいずれかが含まれてもよい。ウイルス粒子作製規模を増加させる方法は、典型的には、ウイルス複製細胞の数を増加させることを含む。一部の実施形態において、ウイルス複製細胞は接着細胞を含む。接着ウイルス複製細胞によるウイルス粒子作製規模の増加には、より大きい細胞培養表面が必要である。ある場合には、大規模作製方法は、細胞培養表面を増加させるためのローラーボトルの使用を含む。表面積が増加した他の細胞培養基材が当該技術分野において公知である。表面積が増加した更なる接着細胞培養製品の例としては、限定はされないが、セルスタック（登録商標）（ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標））、セルキューブ（登録商標）（ＣＥＬＬＣＵＢＥ（登録商標））（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）、ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））およびヌンク（商標）（ＮＵＮＣ（商標））セル・ファクトリー（商標）（ＣＥＬＬ ＦＡＣＴＯＲＹ（商標））（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ））が挙げられる。ある場合には、大規模接着細胞表面は約１，０００ｃｍ２〜約１００，０００ｃｍ２を含み得る。ある場合には、大規模接着細胞培養物は、約１０７〜約１０９細胞、約１０８〜約１０１０細胞、約１０９〜約１０１２細胞または少なくとも１０１２細胞を含み得る。ある場合には、大規模接着培養物は、約１０９〜約１０１２、約１０１０〜約１０１３、約１０１１〜約１０１４、約１０１２〜約１０１５または少なくとも１０１５ウイルス粒子を作製し得る。
一部の実施形態において、本開示の大規模ウイルス作製方法は浮遊細胞培養の使用を含み得る。浮遊細胞培養は細胞数の大幅な増加を可能にする。典型的には、約１０〜５０ｃｍ２の表面積で成長させることのできる接着細胞数を懸濁液中では約１ｃｍ３の体積で成長させることができる。
大規模培養フォーマットでの複製細胞のトランスフェクションは、当該技術分野において公知の任意の方法により行われてもよい。大規模接着細胞培養には、トランスフェクション方法として、限定はされないが、無機化合物（例えばリン酸カルシウム）、有機化合物［例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）］の使用または非化学的方法（例えば電気穿孔）の使用を挙げることができる。懸濁液中で成長させる細胞では、トランスフェクション方法として、限定はされないが、リン酸カルシウムの使用およびＰＥＩの使用を挙げることができる。ある場合には、大規模浮遊培養物のトランスフェクションは、Ｆｅｎｇ．Ｌ．ら（Ｆｅｎｇ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．），２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５０：１２１−３２（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される「トランスフェクション手順（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」と題される節に従い行われてもよい。かかる実施形態によれば、トランスフェクトしようとするプラスミドの導入用にＰＥＩ−ＤＮＡ複合体が形成され得る。ある場合には、ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体をトランスフェクトされる細胞に、トランスフェクション前に「ショック」が与えられてもよい。これは、細胞培養物温度を約１時間にわたって４℃に下げることを含む。ある場合には、約１０分〜約５時間の時間にわたって細胞培養物にショックが与えられてもよい。ある場合には、約０℃〜約２０℃の温度で細胞培養物にショックが与えられてもよい。
ある場合には、トランスフェクションは、１つ以上のＡＡＶペイロードコンストラクトからの核酸の発現を低下させるため１つ以上のＲＮＡエフェクター分子発現ベクターを含み得る。かかる方法は、ペイロードコンストラクトの発現に浪費される細胞リソースを減少させることによりウイルス粒子の産生を増強し得る。ある場合には、かかる方法は、米国特許出願公開第２０１４／００９９６６６号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるものに従い行われてもよい。
バイオリアクター
一部の実施形態において、大規模ウイルス作製には細胞培養バイオリアクターが用いられ得る。ある場合には、バイオリアクターは撹拌槽型リアクターを含む。かかるリアクターは、概して、典型的には円筒形状の、撹拌機（例えばインペラ）を備えたベッセルを含む。一部の実施形態において、かかるバイオリアクターベッセルは、ベッセル温度を制御し、および／または周囲温度の変化による影響を最小限に抑えるため、ウォータジャケット内に置かれ得る。バイオリアクターベッセル容積は、サイズが約５００ｍｌ〜約２Ｌ、約１Ｌ〜約５Ｌ、約２．５Ｌ〜約２０Ｌ、約１０Ｌ〜約５０Ｌ、約２５Ｌ〜約１００Ｌ、約７５Ｌ〜約５００Ｌ、約２５０Ｌ〜約２，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約５０，０００Ｌまたは少なくとも５０，０００Ｌの範囲であり得る。ベッセルの底は丸底または平底であり得る。ある場合には、動物細胞培養物が丸底ベッセルのバイオリアクターに維持され得る。
ある場合には、バイオリアクターベッセルはサーモサーキュレータを用いて温められてもよい。サーモサーキュレータは熱水をウォータジャケットの周りに圧送する。ある場合には、熱水は、バイオリアクターベッセル内に存在する管（例えばコイル管）を通じて圧送されてもよい。ある場合には、限定はされないが、培養培地の真上にある空気層を含め、バイオリアクターの周りに温風が循環してもよい。加えて、細胞生存が最適となるようにｐＨおよびＣＯ２レベルが維持され得る。
ある場合には、バイオリアクターは中空糸リアクターを含み得る。中空糸バイオリアクターは、足場依存性および足場非依存性の両方の細胞の培養を支持し得る。更なるバイオリアクターとしては、限定はされないが、充填床または固定床バイオリアクターを挙げることができる。かかるバイオリアクターは、接着細胞の付着用ガラスビーズを有するベッセルを含み得る。更なる充填床リアクターはセラミックビーズを含み得る。
ある場合には、ウイルス粒子は使い捨てバイオリアクターを用いて作製される。一部の実施形態において、かかるバイオリアクターとしては、ウェーブ（商標）（ＷＡＶＥ（商標））使い捨てバイオリアクターを挙げることができる。
一部の実施形態において、動物細胞バイオリアクター培養物におけるＡＡＶ粒子作製は、米国特許第５，０６４７６４号明細書、同第６，１９４，１９１号明細書、同第６，５６６，１１８号明細書、同第８，１３７，９４８号明細書または米国特許出願公開第２０１１／０２２９９７１号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示される方法により行われてもよい。
細胞溶解
本開示の細胞は、限定はされないがウイルス作製細胞を含め、当該技術分野において公知の任意の方法により細胞溶解に供されてもよい。細胞溶解は、本明細書に記載される任意の細胞内に存在する１つ以上の薬剤（例えばウイルス粒子）を入手するために行われ得る。一部の実施形態において、細胞溶解は、米国特許第７，３２６，５５５号明細書、同第７，５７９，１８１号明細書、同第７，０４８，９２０号明細書、同第６，４１０，３００号明細書、同第６，４３６，３９４号明細書、同第７，７３２，１２９号明細書、同第７，５１０，８７５号明細書、同第７，４４５，９３０号明細書、同第６，７２６，９０７号明細書、同第６，１９４，１９１号明細書、同第７，１２５，７０６号明細書、同第６，９９５，００６号明細書、同第６，６７６，９３５号明細書、同第７，９６８，３３３号明細書、同第５，７５６，２８３号明細書、同第６，２５８，５９５号明細書、同第６，２６１，５５１号明細書、同第６，２７０，９９６号明細書、同第６，２８１，０１０号明細書、同第６，３６５，３９４号明細書、同第６，４７５，７６９号明細書、同第６，４８２，６３４号明細書、同第６，４８５，９６６号明細書、同第６，９４３，０１９号明細書、同第６，９５３，６９０号明細書、同第７，０２２，５１９号明細書、同第７，２３８，５２６号明細書、同第７，２９１，４９８号明細書および同第７，４９１，５０８号明細書または国際公開第１９９６０３９５３０号パンフレット、同第１９９８０１００８８号パンフレット、同第１９９９０１４３５４号パンフレット、同第１９９９０１５６８５号パンフレット、同第１９９９０４７６９１号パンフレット、同第２００００５５３４２号パンフレット、同第２００００７５３５３号パンフレットおよび同第２００１０２３５９７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に挙げられる方法のいずれかにより行われてもよい。細胞溶解方法は化学的または機械的であってもよい。化学的細胞溶解は、典型的には、１つ以上の細胞を１つ以上の溶解剤と接触させることを含む。機械的溶解は、典型的には、１つ以上の細胞を１つ以上の溶解条件および／または１つ以上の溶解力に供することを含む。
一部の実施形態では、化学的溶解を用いて細胞が溶解されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「溶解剤」は、細胞の破壊を助け得る任意の薬剤を指す。ある場合には、溶解剤は溶液中に導入され、溶解溶液または溶解緩衝液と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、用語「溶解溶液」は、１つ以上の溶解剤を含む溶液（典型的には水性）を指す。溶解剤に加えて、溶解溶液は、１つ以上の緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤、凍結保護物質、酵素、酵素阻害薬および／またはキレータを含み得る。溶解緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含む溶解溶液である。溶解溶液の更なる成分としては、１つ以上の可溶化剤を挙げることができる。本明細書で使用されるとき、用語「可溶化剤」は、溶液の１つ以上の成分の溶解度および／または溶液が適用される１つ以上の実体の溶解度を増強する化合物を指す。ある場合には、可溶化剤はタンパク質溶解度を増強する。ある場合には、可溶化剤は、タンパク質のコンフォメーションおよび／または活性を維持しながらもタンパク質溶解度を増強するその能力に基づき選択される。
例示的溶解剤としては、米国特許第８，６８５，７３４号明細書、同第７，９０１，９２１号明細書、同第７，７３２，１２９号明細書、同第７，２２３，５８５号明細書、同第７，１２５，７０６号明細書、同第８，２３６，４９５号明細書、同第８，１１０，３５１号明細書、同第７，４１９，９５６号明細書、同第７，３００，７９７号明細書、同第６，６９９，７０６号明細書および同第６，１４３，５６７号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されるもののいずれかを挙げることができる。ある場合には、溶解剤は、溶解塩、両性薬剤、カチオン性薬剤、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤から選択され得る。溶解塩としては、限定はされないが、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および塩化カリウム（ＫＣｌ）を挙げることができる。更なる溶解塩としては、米国特許第８，６１４，１０１号明細書、同第７，３２６，５５５号明細書、同第７，５７９，１８１号明細書、同第７，０４８，９２０号明細書、同第６，４１０，３００号明細書、同第６，４３６，３９４号明細書、同第７，７３２，１２９号明細書、同第７，５１０，８７５号明細書、同第７，４４５，９３０号明細書、同第６，７２６，９０７号明細書、同第６，１９４，１９１号明細書、同第７，１２５，７０６号明細書、同第６，９９５，００６号明細書、同第６，６７６，９３５号明細書および同第７，９６８，３３３号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されるもののいずれかを挙げることができる。塩の濃度は、細胞膜を破裂させる有効濃度が得られるように増加または減少させてもよい。両性薬剤とは、本明細書において参照されるとき、酸または塩基として反応する能力を有する化合物である。両性薬剤としては、限定はされないが、リゾホスファチジルコリン、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニウム）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、ツヴィッタージェント（登録商標）（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標））などを挙げることができる。カチオン性薬剤としては、限定はされないが、臭化セチルトリメチルアンモニウム（Ｃ（１６）ＴＡＢ）および塩化ベンザルコニウムを挙げることができる。界面活性剤を含む溶解剤には、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤が含まれ得る。界面活性剤は、限定はされないが、細胞膜、細胞壁、脂質、炭水化物、リポタンパク質および糖タンパク質を含めた細胞構造を分解するまたは溶解させる働きをし得る。例示的イオン性界面活性剤としては、米国特許第７，６２５，５７０号明細書および同第６，５９３，１２３号明細書または米国特許出願公開第２０１４／００８７３６１号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるもののいずれかが挙げられる。幾つかのイオン性界面活性剤としては、限定はされないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸塩およびデオキシコール酸塩を挙げることができる。ある場合には、イオン性界面活性剤は溶解溶液中に可溶化剤として含まれてもよい。非イオン性界面活性剤としては、限定はされないが、オクチルグルコシド、ジギトニン、ルブロール、Ｃ１２Ｅ８、ツイーン（登録商標）−２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）、ツイーン（登録商標）−８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびノニデットＰ−４０（Ｎｏｎｉｏｄｅｔ Ｐ−４０）を挙げることができる。非イオン性界面活性剤は、典型的には弱溶解剤であるが、細胞性および／またはウイルス性タンパク質を可溶化するための可溶化剤として含まれてもよい。更なる溶解剤としては、酵素および尿素を挙げることができる。ある場合には、細胞溶解およびタンパク質溶解度のうちの１つ以上を増強するため、１つ以上の溶解剤が溶解溶液中に組み合わされてもよい。ある場合には、細胞膜破壊によって引き起こされ得るタンパク質分解を防ぐため、酵素阻害薬が溶解溶液中に含まれてもよい。
一部の実施形態において、機械的細胞溶解が行われる。機械的細胞溶解方法としては、１つ以上の溶解条件および／または１つ以上の溶解力の使用を挙げることができる。本明細書で使用されるとき、用語「溶解条件」とは、細胞破壊を促進する状態または状況を指す。溶解条件には、特定の温度、圧力、浸透圧純度、塩分などが含まれ得る。ある場合には、溶解条件には温度の増加または低下が含まれる。一部の実施形態によれば、溶解条件には、細胞破壊を促進する温度の変化が含まれる。かかる実施形態により行われる細胞溶解には、凍結融解溶解が含まれ得る。本明細書で使用されるとき、用語「凍結融解溶解」とは、細胞溶液が１回以上の凍結融解サイクルに供される細胞溶解を指す。凍結融解溶解方法によれば、溶液中の細胞が凍結されて、氷の結晶の形成および拡大によって引き起こされる細胞膜の機械的破壊が誘導される。凍結融解溶解方法により用いられる細胞溶液としては、１つ以上の溶解剤、可溶化剤、緩衝剤、凍結保護物質、界面活性剤、保存剤、酵素、酵素阻害薬および／またはキレータを更に挙げることができる。凍結に供した細胞溶液を解凍すると、かかる成分が所望の細胞産物の回収を増強し得る。ある場合には、凍結融解溶解を受ける細胞溶液中に１つ以上の凍結保護物質が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「凍結保護物質」は、１つ以上の物質を凍結に起因する損傷から保護するために使用される薬剤を指す。凍結保護物質としては、米国特許出願公開第２０１３／０３２３３０２号明細書または米国特許第６，５０３，８８８号明細書、同第６，１８０，６１３号明細書、同第７，８８８，０９６号明細書、同第７，０９１，０３０号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるもののいずれかを挙げることができる。ある場合には、凍結保護物質としては、限定はされないが、ジメチルスルホキシド、１，２−プロパンジオール、２，３−ブタンジオール、ホルムアミド、グリセロール、エチレングリコール、１，３−プロパンジオールおよびｎ−ジメチルホルムアミド、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルデンプン、アガロース、デキストラン類、イノシトール、グルコース、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトース、ソルビトール、メチルグルコース、スクロースおよび尿素を挙げることができる。一部の実施形態において、凍結融解溶解は、米国特許第７，７０４，７２１号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法のいずれかにより行われてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「溶解力」は、細胞を破壊するために用いられる物理的活性を指す。溶解力としては、限定はされないが、機械的力、音波的力、重力、光学的力、電気的力などを挙げることができる。機械的力によって行われる細胞溶解は、本明細書では「機械的溶解」と称される。機械的溶解により用いられ得る機械的力としては、高剪断流体力を挙げることができる。かかる機械的溶解方法によれば、マイクロフルイダイザーが使用されてもよい。マイクロフルイダイザーは、典型的には、細胞溶液が適用され得る入力リザーバを含む。次に細胞溶液がポンプ（例えば高圧ポンプ）によって高速および／または高圧で相互作用チャンバに圧送されることにより剪断流体力が生じ得る。次に得られたライセートが１つ以上の出力リザーバに収集され得る。ポンプ速度および／または圧力を調整することにより、細胞溶解を調節し、および産物（例えばウイルス粒子）の回収を増強し得る。他の機械的溶解方法としては、スクレイピングすることによる細胞の物理的破壊を挙げることができる。
細胞溶解方法は、溶解させる細胞の細胞培養フォーマットに基づき選択されてもよい。例えば、接着細胞培養物では、幾つかの化学的および機械的溶解方法が用いられてもよい。かかる機械的溶解方法としては、凍結融解溶解またはスクレイピングを挙げることができる。別の例では、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）などの界面活性剤を含む溶解溶液とのインキュベーションによって接着細胞培養物の化学的溶解が行われてもよい。ある場合には、遊離ＤＮＡによって生じるライセートの粘度を低下させるため、接着細胞培養物から生成された細胞ライセートがもう一つのヌクレアーゼで処理されてもよい。
特定の実施形態において、効率的で規模を調整可能なＡＡＶ粒子作製に、溶解のないＡＡＶ粒子の回収方法が用いられてもよい。非限定的な例では、ＡＡＶ粒子は、米国特許出願公開第２００９０２７５１０７号明細書（この内容は全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、ヘパリン結合部位を欠くＡＡＶ粒子を培養し、それによりＡＡＶ粒子を細胞培養物の上清中に移らせて、培養物から上清を収集し；および上清からＡＡＶ粒子を単離することにより作製されてもよい。
清澄化
ウイルス粒子を含む細胞ライセートは清澄化に供され得る。清澄化とは、細胞ライセートからのウイルス粒子の精製において行われる最初の工程を指す。清澄化は、より大きい不溶性のデブリを除去することにより更なる精製にかけるためのライセートを調製する働きをする。清澄化工程としては、限定はされないが、遠心およびろ過を挙げることができる。清澄化において、遠心は、より大きいデブリのみを除去するため低速で行われてもよい。同様に、ろ過は、より大きいデブリのみが除去されるように、より大きい孔径のフィルタを使用して行われてもよい。ある場合には、清澄化の間にタンジェンシャルフローろ過が用いられてもよい。ウイルス清澄化の目的には、細胞ライセートのハイスループット処理および最終的なウイルス回収率の最適化が含まれる。清澄化工程を含める利点には、更に大容積のライセートを処理するため規模を調整可能であることが含まれる。一部の実施形態において、清澄化は、米国特許第８，５２４，４４６号明細書、同第５，７５６，２８３号明細書、同第６，２５８，５９５号明細書、同第６，２６１，５５１号明細書、同第６，２７０，９９６号明細書、同第６，２８１，０１０号明細書、同第６，３６５，３９４号明細書、同第６，４７５，７６９号明細書、同第６，４８２，６３４号明細書、同第６，４８５，９６６号明細書、同第６，９４３，０１９号明細書、同第６，９５３，６９０号明細書、同第７，０２２，５１９号明細書、同第７，２３８，５２６号明細書、同第７，２９１，４９８号明細書、同第７，４９１，５０８号明細書、米国特許出願公開第２０１３／００４５１８６号明細書、同第２０１１／０２６３０２７号明細書、同第２０１１／０１５１４３４号明細書、同第２００３／０１３８７７２号明細書、および国際公開第２００２０１２４５５号パンフレット、同第１９９６０３９５３０号パンフレット、同第１９９８０１００８８号パンフレット、同第１９９９０１４３５４号パンフレット、同第１９９９０１５６８５号パンフレット、同第１９９９０４７６９１号パンフレット、同第２００００５５３４２号パンフレット、同第２００００７５３５３号パンフレットおよび同第２００１０２３５９７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に提示される方法のいずれかにより行われてもよい。
ろ過による細胞ライセート清澄化方法は当該技術分野において十分に理解されており、限定はされないが、受動ろ過およびフローろ過を含め、種々の利用可能な方法により行われてもよい。使用されるフィルタは種々の材料および孔径を含み得る。例えば、細胞ライセートフィルタは、約１μＭ〜約５μＭ、約０．５μＭ〜約２μＭ、約０．１μＭ〜約１μＭ、約０．０５μＭ〜約０．０５μＭおよび約０．００１μＭ〜約０．１μＭの孔径を含み得る。細胞ライセートフィルタの例示的孔径としては、限定はされないが、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．９５、０．９、０．８５、０．８、０．７５、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１、０．０５、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．０２、０．０１９、０．０１８、０．０１７、０．０１６、０．０１５、０．０１４、０．０１３、０．０１２、０．０１１、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２、０．００１および０．００１μＭを挙げることができる。特定の実施形態において、清澄化は、大きいデブリを除去するための２．０μＭ孔径のフィルタによるろ過と、続くインタクトな細胞を除去するための０．４５μＭ孔径のフィルタへの通過を含み得る。
フィルタ材料は種々の材料を含み得る。かかる材料としては、限定はされないが、ポリマー材料および金属材料（例えば焼結金属および有孔アルミニウム）を挙げることができる。例示的材料としては、限定はされないが、ナイロン、セルロース材料（例えば酢酸セルロース）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリスルホン、ポリプロピレン、およびポリエチレンテレフタレートを挙げることができる。ある場合には、細胞ライセートの清澄化に有用なフィルタとしては、限定はされないが、ウルチプリーツ・プロフィール（商標）（ＵＬＴＩＰＬＥＡＴ ＰＲＯＦＩＬＥ（商標））フィルタ（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニューヨーク州ポートワシントン）、スポー（商標）（ＳＵＰＯＲ（商標））メンブレンフィルタ（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニューヨーク州ポートワシントン）を挙げることができる。
ある場合には、ろ過速度および／または有効性を増加させるためフローろ過が行われてもよい。ある場合には、フローろ過は真空ろ過を含み得る。かかる方法によれば、フィルタのうちろ過される細胞ライセートと反対側に真空が作り出される。ある場合には、細胞ライセートを遠心力によってフィルタに通過させてもよい。ある場合には、ポンプを使用して細胞ライセートが清澄化フィルタに押し通される。１つ以上のフィルタを通る細胞ライセートのフロー速度は、チャネルサイズおよび／または流圧の一方を調整することにより調節し得る。
一部の実施形態によれば、細胞ライセートは遠心によって清澄化されてもよい。遠心を用いると、ライセート中の不溶性粒子をペレット化し得る。清澄化の間、遠心強度［標準重力の倍数を表す重力単位（ｇ）で表される］は続く精製工程よりも低くてよい。ある場合には、遠心は細胞ライセートに対して約２００ｇ〜約８００ｇ、約５００ｇ〜約１５００ｇ、約１０００ｇ〜約５０００ｇ、約１２００ｇ〜約１００００ｇまたは約８０００ｇ〜約１５０００ｇで行われてもよい。一部の実施形態において、細胞ライセートの遠心は８０００ｇで１５分間行われる。ある場合には、細胞ライセート中の粒子状物質を沈降速度によって分配するため密度勾配遠心法が行われてもよい。本開示の方法により用いられる勾配としては、限定はされないが、塩化セシウム勾配およびイオジキサノール段階勾配を挙げることができる。
精製：クロマトグラフィー
ある場合には、ＡＡＶ粒子は、清澄化細胞ライセートから１つ以上のクロマトグラフィー方法によって精製されてもよい。クロマトグラフィーとは、混合物から１つ以上の要素を取り分けるための当該技術分野において公知のあらゆる方法を指す。かかる方法としては、限定はされないが、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー）、イムノアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを挙げることができる。一部の実施形態において、ウイルスクロマトグラフィー方法としては、米国特許第５，７５６，２８３号明細書、同第６，２５８，５９５号明細書、同第６，２６１，５５１号明細書、同第６，２７０，９９６号明細書、同第６，２８１，０１０号明細書、同第６，３６５，３９４号明細書、同第６，４７５，７６９号明細書、同第６，４８２，６３４号明細書、同第６，４８５，９６６号明細書、同第６，９４３，０１９号明細書、同第６，９５３，６９０号明細書、同第７，０２２，５１９号明細書、同第７，２３８，５２６号明細書、同第７，２９１，４９８号明細書および同第７，４９１，５０８号明細書または国際公開第１９９６０３９５３０号パンフレット、同第１９９８０１００８８号パンフレット、同第１９９９０１４３５４号パンフレット、同第１９９９０１５６８５号パンフレット、同第１９９９０４７６９１号パンフレット、同第２００００５５３４２号パンフレット、同第２００００７５３５３号パンフレットおよび同第２００１０２３５９７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるもののいずれかを挙げることができる。
一部の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーを用いてウイルス粒子が単離されてもよい。イオン交換クロマトグラフィーを用いると、カプシドタンパク質と、固定相、典型的にはウイルス調製物（例えば清澄化ライセート）を通過させるカラムに存在する荷電部位との間の電荷間相互作用に基づきウイルス粒子が結合する。ウイルス調製物を加えた後、次に溶出溶液を加えることにより電荷間相互作用が破壊されて、結合したウイルス粒子が溶出し得る。溶出溶液は、結合したウイルス粒子の回収が促進されるように塩濃度および／またはｐＨを調整することにより最適化されてもよい。単離されるウイルスカプシドの電荷に応じて、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー方法が選択され得る。イオン交換クロマトグラフィー方法としては、限定はされないが、米国特許第７，４１９，８１７号明細書、同第６，１４３，５４８号明細書、同第７，０９４，６０４号明細書、同第６，５９３，１２３号明細書、同第７，０１５，０２６号明細書および同第８，１３７，９４８号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるもののいずれかを挙げることができる。
一部の実施形態において、イムノアフィニティークロマトグラフィーが用いられてもよい。イムノアフィニティークロマトグラフィーは、１つ以上の免疫化合物（例えば抗体または抗体関連構造）を利用してウイルス粒子を保持するクロマトグラフィーの一形態である。免疫化合物は、限定はされないが、１つ以上のウイルスコートタンパク質を含め、ウイルス粒子表面上の１つ以上の構造に特異的に結合し得る。ある場合には、免疫化合物は特定のウイルス変種に特異的であってもよい。ある場合には、免疫化合物は複数のウイルス変種に結合してもよい。一部の実施形態において、免疫化合物は組換え一本鎖抗体を含んでもよい。かかる組換え一本鎖抗体としては、スミス・Ｒ・Ｈら（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．），２００９，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（１１）：１８８８−９６（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されるものを挙げることができる。かかる免疫化合物は、限定はされないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８を含め、幾つかのＡＡＶカプシド変種への結合能を有する。
一部の実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が用いられてもよい。ＳＥＣは、ゲルを使用したサイズによる粒子の分離を含み得る。ウイルス粒子精製では、ＳＥＣろ過は時に「ポリッシング」と称されることもある。ある場合には、ＳＥＣは、ほぼ均一な最終産物を生じさせるために行われ得る。かかる最終産物は、ある場合には、前臨床試験および／または臨床試験で使用され得る（コーチン・Ｒ・Ｍ（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．），２０１１，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０（１）：Ｒ２−Ｒ６、この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。ある場合には、ＳＥＣは、米国特許第６，１４３，５４８号明細書、同第７，０１５，０２６号明細書、同第８，４７６，４１８号明細書、同第６，４１０，３００号明細書、同第８，４７６，４１８号明細書、同第７，４１９，８１７号明細書、同第７，０９４，６０４号明細書、同第６，５９３，１２３号明細書、および同第８，１３７，９４８号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示される方法のいずれかにより行われてもよい。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＡＡＶ粒子を含む組成物は、米国特許第６１４６８７４号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法を用いて単離または精製されてもよい。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＡＡＶ粒子を含む組成物は、米国特許第６６６０５１４号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法を用いて単離または精製されてもよい。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＡＡＶ粒子を含む組成物は、米国特許第８２８３１５１号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法を用いて単離または精製されてもよい。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＡＡＶ粒子を含む組成物は、米国特許第８５２４４４６号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法を用いて単離または精製されてもよい。
細胞への導入
ｓｉＲＮＡ二重鎖の化学的および生物学的安定性を確保するためには、ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを標的細胞の内部に送達することが重要である。本開示のポリヌクレオチドは、様々な手法のいずれかを使用して、細胞へと導入することができる。
一部の実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、細胞をポリヌクレオチドと接触させることによって細胞へと導入される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞を、ポリヌクレオチドおよび親油性担体を含む組成物と接触させることによって細胞へと導入される。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞において転写されるとｓｉＲＮＡ二重鎖を産生する能力を有する核酸配列を含むベクターを細胞にトランスフェクトするかまたは感染させることによって細胞へと導入される。
一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、細胞において転写されるとｓｉＲＮＡ二重鎖を産生する能力を有する核酸配列を含むベクターを細胞に注入することによって細胞へと導入される。
他の実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、電気穿孔によって細胞に送達されてもよい（例えば米国特許出願公開第２００５００１４２６４号明細書；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
加えて、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）に挿入されたｓｉＲＮＡ分子を、ウイルス感染によって細胞へと送達してもよい。これらのウイルスベクターは、トランスフェクションに容易には適さない細胞へのｓｉＲＮＡ分子の侵入を促進するように操作および最適化される。また、幾つかの合成ウイルスベクターはｓｈＲＮＡを細胞ゲノムに組み込む能力を有し、それにより安定したｓｉＲＮＡ発現および標的遺伝子の長期ノックダウンがもたらされる。このように、ウイルスベクターは、野生型ウイルスに見られる有害な複製および／または組込み特徴を欠きながらも、特異的送達媒体として操作される。
一部の実施形態において、細胞としては、限定はされないが、哺乳類起源の細胞、ヒト起源の細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、神経幹細胞、および神経前駆細胞を挙げることができる。
医薬組成物および製剤
医薬組成物に加えて、例えば、本明細書で提供される、送達しようとするｓｉＲＮＡ二重鎖（ウイルス、例えばＡＡＶなどのコードプラスミドまたは発現ベクターを含む）は、原理的にヒトへの投与に好適な医薬組成物に関し、当業者であれば、かかる組成物は、一般に、任意の他の動物への、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類への投与に好適であることを理解するであろう。組成物を種々の動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の修飾については十分に理解されており、獣医薬理学の当業者は、あったとしても通常どおりに過ぎない実験をもって、かかる修飾を設計および／または実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象としては、限定はされないが、ヒトおよび／または他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットなど、商業的に関連性のある哺乳類を含めた哺乳類；および／または、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなど、商業的に関連性のある鳥類を含めた鳥類が挙げられる。
一部の実施形態において、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的では、「活性成分」という語句は一般に、合成ｓｉＲＮＡ二重鎖、またはｓｉＲＮＡ二重鎖を保持するウイルスベクター、または本明細書に記載されるとおりのウイルスベクターによって送達されるｓｉＲＮＡ分子のいずれかを指す。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製されてもよい。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と合わせる工程、および次に、必要であればおよび／または望ましい場合には、生成物を所望の単回または複数回用量単位に分割、付形および／または包装する工程を含む。
本開示に係る医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加成分の相対量は、治療対象のアイデンティティ、サイズ、および／または状態に応じて、更には組成物が投与される経路に応じて異なることになる。
それらをコードするｓｉＲＮＡ二重鎖またはウイルスベクターは、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化することにより、（１）安定性を増加させる；（２）細胞トランスフェクションまたは形質導入を増加させる；（３）持続または遅延放出を可能にする；または（４）体内分布を変化させる（例えば、ウイルスベクターを脳および運動ニューロンなどの特異的組織または細胞型に標的化する）ことができる。
本開示の製剤は、限定なしに、生理食塩水、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞（例えば、対象への移植用）、ナノ粒子模倣体およびこれらの組合せを含むことができる。更に、本開示のウイルスベクターは、自己集合性核酸ナノ粒子を使用して製剤化されてもよい。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製されてもよい。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と合わせる工程を含む。
本開示に係る医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として調製、包装、および／または販売されてもよい。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別的な量を指す。活性成分の量は、概して対象に投与されるであろう活性成分の投薬量に等しく、および／またはかかる投薬量の好都合な一部、例えばかかる投薬量の２分の１または３分の１である。
本開示に係る医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加成分の相対量は、治療下の対象のアイデンティティ、サイズ、および／または状態に応じて、更には組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載される製剤は、少なくとも１つのＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを含んでもよい。非限定的な例として、製剤は、ＳＯＤ１遺伝子を異なる部位に標的化する１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのポリヌクレオチドを含んでもよい。
一部の実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の純度であってもよい。一部の実施形態において、賦形剤はヒトへの使用および動物への使用が承認されている。一部の実施形態において、賦形剤は米国食品医薬品局によって承認されていてもよい。一部の実施形態において、賦形剤は医薬品グレードであってもよい。一部の実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の規格に適合し得る。
賦形剤には、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、所望の特定の剤形に適するとおりのあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散液または懸濁液助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤などが含まれる。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物の調製技法は当該技術分野において公知である（「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ・Ｒ・ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、２００６年を参照のこと；全体として参照により本明細書に援用される）。従来の賦形剤媒体の使用は本開示の範囲内に企図され得るが、但し、任意の望ましくない生物学的効果を生じたり、またはその他、医薬組成物の任意の他の１つまたは複数の成分と有害な形で相互作用したりするなどにより、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合である場合は除く。
例示的希釈剤としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖等、および／またはこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態において、製剤は少なくとも１つの非活性成分を含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「非活性成分」は、製剤に含まれる１つ以上の非活性薬剤を指す。一部の実施形態において、本開示の製剤に使用し得る非活性成分は、全てが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されているか、いずれも承認されていないか、または一部が承認されているものであり得る。
本明細書で開示されるＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを保持するウイルスベクターの製剤としては、カチオンまたはアニオンを挙げることができる。特定の実施形態において、製剤は、限定はされないが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋およびこれらの組合せなど、金属カチオンを含む。
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、ここで親化合物は、既存の酸または塩基部分からその塩形態への変換（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによる）によって修飾される。薬学的に許容可能な塩の例としては、限定はされないが、アミン類などの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミン陽イオン、例えば、限定はされないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩には、例えば非毒性無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法により塩基または酸部分を含有する親化合物から合成することができる。概して、かかる塩は、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物と、水中または有機溶媒中、またはこれら２つの混合物中（概して、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい）にある化学量論量の適切な塩基または酸とを反応させることにより調製し得る。好適な塩の一覧については、「レミントンの薬学科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、１９８５年、ｐ．１４１８、「薬学的塩：特性、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ）」、Ｐ・Ｈ・シュタールおよびＣ・Ｇ・ウェルムス（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）編、ワイリー−ブイシーエイチ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年、およびベルジュら（Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１−１９，１９７７が参照される；この各々の内容は全体として参照により本明細書に援用される。
用語「薬学的に許容可能な溶媒和物」は、本明細書で使用されるとき、好適な溶媒の分子が結晶格子に取り込まれている本開示の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に忍容可能である。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはこれらの混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製されてもよい。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、および三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒であるとき、その溶媒和物は「水和物」と称される。
本開示によれば、ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドまたはそれを含むＡＡＶベクターは、ＣＮＳ送達用に製剤化されてもよい。脳血液関門を通過する薬剤が使用されてもよい。例えば、脳血液関門内皮をｓｉＲＮＡ分子の標的とし得る、一部の細胞透過性ペプチドを使用して、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖を製剤化してもよい（例えば、マスパラ（Ｍａｔｈｕｐａｌａ），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｐａｔ．，２００９，１９，１３７−１４０；この内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、エチレンオキシド／プロピレンオキシドコポリマー（プルロニック（登録商標）またはポロキサマーとしても知られている）と組み合わせて、ＰＢＳで製剤化され得る。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、約７．０のｐＨにて、０．００１％プルロニック酸（Ｆ−６８）（ポロキサマー１８８）を有するＰＢＳで製剤化され得る。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、約７．３のｐＨにて、０．００１％プルロニック酸（Ｆ−６８）（ポロキサマー１８８）を有するＰＢＳで製剤化され得る。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、約７．４のｐＨにて、０．００１％プルロニック酸（Ｆ−６８）（ポロキサマー１８８）を有するＰＢＳで製剤化され得る。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびエチレンオキシド／プロピレンオキシドコポリマーを含む溶液で製剤化され得る。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性、リン酸ナトリウム一塩基性およびポロキサマー１８８／プルロニック酸（Ｆ−６８）を含む溶液で製剤化され得る。
投与
本開示のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは、治療上有効な結果をもたらす任意の経路によって投与し得る。経路としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる：実質内（脳組織の中）、実質内（脊髄）、実質内（ＣＮＳ）、経腸（腸の中）、胃腸、硬膜外（硬膜の中）、経口（口を経由して）、経皮的、硬膜上、脳内（大脳の中）、脳室内（脳室の中）、上皮性（皮膚への塗布）、皮内（皮膚そのもの内への）、皮下（皮膚の下）鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈内への）静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈の中）、筋肉内（筋肉の中）、心臓内（心臓の中）、骨内注入（骨髄の中）、髄腔内（脊柱管の中）、腹腔内（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（目を通じて）、海綿体内注射（病的腔の中）、膣内（陰茎の基部の中）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のためのインタクトな皮膚を通じた拡散）、径粘膜（粘膜を通じた拡散）、経膣、インサフレーション（鼻から吸い込む）、舌下、唇下、浣腸、点眼薬（結膜上）、点耳薬で、耳介（耳内または耳を介して）、頬側（頬の方に向けて）、結膜、皮膚、歯（１本または複数の歯に対して）、電気浸透、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨の範囲内）、仙骨内（馬尾（ｃａｕｄａ ｅｑｕｉｎｅ）の範囲内）、大槽内（大槽小脳延髄の範囲内）、角膜内（角膜の範囲内）、歯冠内、冠内（冠動脈の範囲内）、海綿体内（ｉｎｔｒａｃｏｒｐｏｒｕｓ ｃａｖｅｒｎｏｓｕｍ）（陰茎核海綿体（ｃｏｒｐｏｒｕｓ ｃａｖｅｒｎｏｓａ）の可膨張性腔の範囲内）、椎間板内（椎間板の範囲内）、管内（腺管の範囲内）、十二指腸内（十二指腸の範囲内）、硬膜内（硬膜の範囲内または真下）、表皮内（表皮に対して）、食道内（食道に対して）、胃内（胃の範囲内）、歯肉内（歯肉の範囲内）、回腸内（小腸の遠位部分の範囲内）、病巣内（局所病変の範囲内、またはそこに直接導入される）、管腔内（管の管腔の範囲内）、リンパ内（リンパの範囲内）、髄内（骨の髄腔の範囲内）、髄膜内（髄膜の範囲内）、眼内（眼の範囲内）、卵巣内（卵巣の範囲内）、心膜内（心膜の範囲内）、胸膜内（胸膜の範囲内）、前立腺内（前立腺の範囲内）、肺内（肺、またはその気管支の範囲内）、洞内（鼻洞または眼窩周囲洞の範囲内）、脊髄内（脊柱の範囲内）、滑液嚢内（関節の滑膜腔の範囲内）、腱内（腱の範囲内）、精巣内（睾丸の範囲内）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルにおける脳脊髄液の範囲内）、胸腔内（胸郭の範囲内）、細管内（臓器の細管の範囲内）、腫瘍内（腫瘍の範囲内）、鼓室内（中耳（ａｕｒｕｓ ｍｅｄｉａ）の範囲内）、血管内（１つまたは複数の血管の範囲内）、脳室内（脳室の範囲内）、イオントフォレシス（電流を用いるもので、可溶性塩のイオンが体の組織に移動する）、潅注（開放創または体腔を浸すまたはフラッシュする）、喉頭（喉頭に対して直接）、経鼻胃（鼻を通じて胃内の中に）、密封包帯療法（局所経路投与、これは次に包帯で覆われ、包帯がその範囲を閉塞する）、眼（外眼部に対して）、中咽頭（口および咽頭に対して直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所または全身作用のため経口的または経鼻的に吸入することにより気道の範囲内に）、球後（橋の後ろまたは眼球の後ろ）、軟部組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通じてまたは越えて）、経気管（気管の壁を通じて）、経鼓室（鼓室を越えてまたは通じて）、尿管（尿管に対して）、尿道（尿道に対して）、腟、仙骨ブロック、診断的、神経ブロック、胆管潅流、心潅流、フォトフェレーシス、線条体内（線条体の範囲内）または脊髄。
具体的な実施形態において、少なくとも１つのＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを含む組成物は、それらが中枢神経系に侵入し、運動ニューロンに入り込むことが可能になるように投与してもよい。
一部の実施形態において、本開示の療法剤は、筋肉注射によって投与してもよい。リズバノブら（Ｒｉｚｖａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．）は、突然変異体ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、ＳＯＤ１Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳマウスでは、坐骨神経によって取り込まれ、運動ニューロンの周核体に逆行的に輸送され、突然変異体ＳＯＤ１ ｍＲＮＡを阻害することを初めて示した（リズバノブ エーエーら（Ｒｉｚｖａｎｏｖ ＡＡ ｅｔ ａｌ．），Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２００９，１９５（１），１−４；この内容は全体として参照により本明細書に援用される）。また、別の研究は、突然変異体ＳＯＤ１遺伝子に対する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）を発現するＡＡＶの筋肉送達が、筋肉ならびに神経支配運動ニューロンにおける著しい突然変異体ＳＯＤ１ノックダウンに結び付いたことを示した（タウン シーら（Ｔｏｗｎｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２０１１；１９（２）：２７４−２８３；この内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
一部の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖を発現するＡＡＶベクターは、末梢注射および／または鼻腔内送達によって対象に投与されてもよい。当該技術分野では、ｓｉＲＮＡ二重鎖のＡＡＶベクターの末梢投与が中枢神経系まで、例えば運動ニューロンまで輸送され得ることが開示された（例えば、米国特許出願公開第２０１００２４０７３９号明細書；および同第２０１００１３０５９４号明細書；この各々の内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
他の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖を含む組成物は、頭蓋内送達によって対象に投与されてもよい（例えば、米国特許第８，１１９，６１１号明細書を参照のこと；この内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
本開示のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは任意の好適な形態で、液体溶液または懸濁液、液体溶液または液体溶液中の懸濁液に好適な固体形態のいずれとして投与されてもよい。ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは、任意の適切なかつ薬学的に許容可能な賦形剤と共に製剤化されてもよい。
本開示のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは、「治療上有効な」量、すなわち、疾患に関連する少なくとも１つの症状を軽減および／または予防するのに十分な、または対象の状態の改善をもたらすのに十分な量で投与されてもよい。
一部の実施形態において、本開示の医薬組成物は、実質内注射または注入によって投与されてもよい。本明細書で使用されるとき、「注射」および「注入」は同義的に使用され、同じことを示し得る。非限定的な例として、本開示の医薬組成物は、実質内注射によって対象に投与されてもよい。特定の実施形態において、実質内注射は、脊髄実質内注射であってもよく、その場合、医薬組成物は、脊髄の組織に直接投与されてもよい。特定の実施形態において、実質内注射は、ＣＮＳ（中枢神経系）実質内注射であってもよく、その場合、医薬組成物は、ＣＮＳの組織に直接投与されてもよい。
特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、脊髄運動ニューロンおよび／またはアストロサイトに形質導入するため、治療有効量で大槽に投与されてもよい。
特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、線条体内注入によって投与されてもよい。
一部の実施形態において、本開示の医薬組成物は、実質内注射によって、ならびに本明細書に記載される別の投与経路によって投与されてもよい。
一部の実施形態において、本開示の医薬組成物は、実質内注射によって、ＣＮＳ、脳、および／または脊髄に投与されてもよい。
一部の実施形態において、本開示の医薬組成物は、実質内注射および髄腔内注射によって投与されてもよい。特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、実質内注射および線条体内注射によって投与されてもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、１ｕＬよりも多くの容積で、脊髄の任意のレベルの単一部位または複数部位に実質内（ＩＰａ）注入することにより投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜１００ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜２４０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜２４０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜２２０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜２００ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜１８０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜１６０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜１５０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜１４０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜１３０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜１２０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜１１０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜９０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜８０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜７０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜６０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜５０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜４０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜３０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１ｕＬ〜２０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、５ｕＬ〜６０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、５ｕＬ〜２４０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１０ｕＬ〜２０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１０ｕＬ〜３０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１０ｕＬ〜４０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１０ｕＬ〜５０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１０ｕＬ〜６０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１０ｕＬ〜８０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１０ｕＬ〜９０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜２４０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜２００ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜１８０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜１５０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜１２０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜１００ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜８０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜６０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜５０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜４０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、２０ｕＬ〜３０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、５０ｕＬ〜２００ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、５０ｕＬ〜１８０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、５０ｕＬ〜１５０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、５０ｕＬ〜１００ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、５０ｕＬ〜８０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、５０ｕＬ〜７０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１００ｕＬ〜２４０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１００ｕＬ〜２００ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１００ｕＬ〜１８０ｕＬの容積が投与される。特定の実施形態において、１００ｕＬ〜１５０ｕＬの容積が投与される。
脊髄は脊柱内に位置する。脊柱は、一連の椎骨分節で構成される。７個の頚部（Ｃ１〜Ｃ７）、１２個の胸部（Ｔ１〜Ｔ１２）、５個の腰部（Ｌ１〜Ｌ５）、および５個の仙骨（Ｓ１〜Ｓ５）椎骨分節が存在する。本明細書に記載されるＡＡＶ粒子の脊髄への実質内注射または注入は、これらの椎骨分節のうちの１つまたは複数で生じ得る。例えば、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子の脊髄への実質内注射または注入は、１、２、３、４、５部位、または５部位よりも多くの箇所で生じ得る。実質内注射または注入部位は、頚部脊髄、胸部脊髄、腰部脊髄、および仙骨脊髄から独立に選択される１つ以上の領域であってもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において脊髄へと実質内（ＩＰａ）注入により投与される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、およびＣ７から選択される１つ以上の部位（例えば、２、３、４または５つの部位）に実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、およびＣ７から選択される２つの部位に実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、およびＴ１２から選択される１つ以上の部位（例えば、２、３、４または５つの部位）に実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、およびＴ１２から選択される２つの部位に実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５から選択される１つ以上の部位（例えば、２、３、４または５つの部位）に実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５から選択される２つの部位に実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、およびＳ５から選択される１つ以上の部位（例えば、２、３、４または５つの部位）に実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、およびＳ５から選択される２つの部位に実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、およびＳ５から選択される１つ以上の部位（例えば、２、３、４または５つの部位）において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、およびＳ５から選択される２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５から選択される１つ以上の部位（例えば、２、３、４または５つの部位）に投与されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５から選択される２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、およびＴ１２から選択される１つ以上のレベル（例えば、２、３、または４つの部位）に投与されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、およびＴ１２から選択される２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。非限定的な例として、２つの部位は、頸部脊髄領域（例えば、Ｃ１〜Ｃ７）から１つの部位および胸部脊髄領域（例えば、Ｔ１〜Ｔ１２）から１つの部位を含み得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５から選択される１つ以上のレベル（例えば、２、３、または４つの部位）に投与されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５から選択される２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。非限定的な例として、２つの部位は、頸部脊髄領域（例えば、Ｃ１〜Ｃ７）から１つの部位および腰部脊髄領域（例えば、Ｌ１〜Ｌ５）から１つの部位を含み得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５から選択される１つ以上のレベル（例えば、２、３、または４つの部位）に投与されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５から選択される２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。非限定的な例として、２つの部位は、胸部脊髄領域（例えば、Ｔ１〜Ｔ１２）から１つの部位および腰部脊髄領域（例えば、Ｌ１〜Ｌ５）から１つの部位を含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、および／またはＬ１において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ２において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ３において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ４において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ５において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ６において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ７において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１およびＣ２において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１およびＣ３において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１およびＣ４において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１およびＣ５において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１およびＣ６において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ１およびＣ７において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ２およびＣ３において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ２およびＣ４において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ２およびＣ５において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ２およびＣ６において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ２およびＣ７において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ３およびＣ４において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ３およびＣ５において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ３およびＣ６において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ３およびＣ７において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ４およびＣ５において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ４およびＣ６において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ４およびＣ７において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ５およびＣ６において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ５およびＣ７において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、脊髄のＣ６およびＣ７において実質内（ＩＰａ）注入により投与される。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において脊髄注入により投与される。別の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、脊髄のレベルＣ３またはＣ５における投与を含む。さらに別の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、脊髄のレベルＣ３およびＣ５において投与される。
実質内（ＩＰａ）注入は、１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０分、または６０分超にわたってもよい。非限定的な例として、注入は１０分間にわたる。非限定的な例として、注入は１１分間にわたる。非限定的な例として、注入は１２分間にわたる。非限定的な例として、注入は１３分間にわたる。非限定的な例として、注入は１４分間にわたる。非限定的な例として、注入は１５分間にわたる。
実質内（ＩＰａ）注入、例えば脊髄注入は、独立に、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、８０、１２０、２４０ｕＬまたは２４０ｕＬ超の用量容積であってもよい。非限定的な例として、用量容積は約２０ｕＬである。非限定的な例として、用量容積は約２５ｕＬである。非限定的な例として、用量容積は約３０ｕＬである。非限定的な例として、用量容積は約３５ｕＬである。非限定的な例として、用量容積は約４０ｕＬである。非限定的な例として、用量容積は約４５ｕＬである。非限定的な例として、用量容積は約５０ｕＬである。非限定的な例として、用量容積は約６０ｕＬである。非限定的な例として、用量容積は約８０ｕＬである。非限定的な例として、用量容積は約１２０ｕＬである。非限定的な例として、用量容積は約２４０ｕＬである。
特定の実施形態において、用量容積は、投与の１部位当たり５ｕＬ〜６０ｕＬである。別の実施形態において、用量容積は、投与の１部位当たり２５ｕＬ〜４０ｕＬである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬである。別の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ５への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬである。さらに別の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量容積は、脊髄のレベルＣ５への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬである。別の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ５への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬである。さらに別の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、脊髄のレベルＣ５への投与の用量容積は、２５ｕＬ〜４０ｕＬである。
実質内（ＩＰａ）注入、例えば脊髄注入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ｕＬ／分、または１５ｕＬ／分超の注射速度であってもよい。非限定的な例として、注射速度は、５ｕＬ／分である。
実質内（ＩＰａ）注入、例えば脊髄注入は、約１×１０６ＶＧ〜約１×１０１６ＶＧの用量であってもよい。一部の実施形態において、送達は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、２．１×１０１１、２．２×１０１１、２．３×１０１１、２．４×１０１１、２．５×１０１１、２．６×１０１１、２．７×１０１１、２．８×１０１１、２．９×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、４．１×１０１１、４．２×１０１１、４．３×１０１１、４．４×１０１１、４．５×１０１１、４．６×１０１１、４．７×１０１１、４．８×１０１１、４．９×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、６．１×１０１１、６．２×１０１１、６．３×１０１１、６．４×１０１１、６．５×１０１１、６．６×１０１１、６．７×１０１１、６．８×１０１１、６．９×１０１１、７×１０１１、７．１×１０１１、７．２×１０１１、７．３×１０１１、７．４×１０１１、７．５×１０１１、７．６×１０１１、７．７×１０１１、７．８×１０１１、７．９×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、１．１×１０１２、１．２×１０１２、１．３×１０１２、１．４×１０１２、１．５×１０１２、１．６×１０１２、１．７×１０１２、１．８×１０１２、１．９×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、４．１×１０１２、４．２×１０１２、４．３×１０１２、４．４×１０１２、４．５×１０１２、４．６×１０１２、４．７×１０１２、４．８×１０１２、４．９×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、８．１×１０１２、８．２×１０１２、８．３×１０１２、８．４×１０１２、８．５×１０１２、８．６×１０１２、８．７×１０１２、８．８×１０１２、８．９×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、６．７×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、９×１０１３、１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、９×１０１４、１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、９×１０１５、または１×１０１６ＶＧの組成物濃度を含み得る。非限定的な例として、用量は、４．４×１０１０ＶＧである。非限定的な例として、用量は、１．４×１０１１ＶＧである。非限定的な例として、用量は、４．１×１０１１ＶＧである。非限定的な例として、用量は、４．４×１０１１ＶＧである。非限定的な例として、用量は、５．０×１０１１ＶＧである。非限定的な例として、用量は、５．１×１０１１ＶＧである。非限定的な例として、用量は、６．６×１０１１ＶＧである。非限定的な例として、用量は、７．２×１０１１ＶＧである。非限定的な例として、用量は、８．０×１０１１ＶＧである。非限定的な例として、用量は、８．１×１０１１ＶＧである。非限定的な例として、用量は、１．０×１０１２ＶＧである。非限定的な例として、用量は、１．１×１０１２ＶＧである。非限定的な例として、用量は、１．２×１０１２ＶＧである。非限定的な例として、用量は、１．３×１０１２ＶＧである。非限定的な例として、用量は、１．０×１０１０ｖｇ〜１．０×１０１２ＶＧである。非限定的な例として、用量は、５．０×１０１１ｖｇ〜８．０×１０１１ＶＧである。
特定の実施形態において、実質内（ＩＰａ）注入、例えば脊髄注入は、約１．０×１０１３ＶＧ／ｍｌ〜約３×１０１３ＶＧ／ｍｌであってもよい。別の実施形態において、実質内（ＩＰａ）注入、例えば脊髄注入は、１．５×１０１３ＶＧ／ｍｌ〜３．０×１０１３ＶＧ／ｍｌである。さらに別の実施形態において、実質内（ＩＰａ）注入、例えば脊髄注入は、１．８×１０１３ＶＧ／ｍｌ〜２．５×１０１３ＶＧ／ｍｌである。特定の実施形態において、実質内（ＩＰａ）注入、例えば脊髄注入は、１．８×１０１３ＶＧ／ｍｌ、１．８５×１０１３ＶＧ／ｍｌ、１．９×１０１３ＶＧ／ｍｌ、１．９５×１０１３ＶＧ／ｍｌ、２×１０１３ＶＧ／ｍｌ、２．０１×１０１３ＶＧ／ｍｌ、２．０２×１０１３ＶＧ／ｍｌ、２．０３×１０１３ＶＧ／ｍｌ、２．０４×１０１３ＶＧ／ｍｌ、２．０５×１０１３ＶＧ／ｍｌ、２．０６×１０１３ＶＧ／ｍｌ、２．０７×１０１３ＶＧ／ｍｌ、２．０８×１０１３ＶＧ／ｍｌ、２．０９×１０１３ＶＧ／ｍｌ、または２．１０×１０１３ＶＧ／ｍｌである。
特定の実施形態において、用量容積は、投与の１部位当たり５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧである。特定の実施形態において、用量容積は、投与の１部位当たり５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量は、５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧである。別の実施形態において、用量容積は、投与の１部位当たり２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧである。別の実施形態において、用量容積は、投与の１部位当たり２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、用量は、５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量は、５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量は、５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧである。別の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ５への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧである。別の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ５への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量は、５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧである。さらに別の実施形態では：ｉ）用量容積は、脊髄のレベルＣ３への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧ、例えば５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧであり、ｉｉ）用量容積は、脊髄のレベルＣ５への投与の場合、５ｕＬ〜６０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧ、例えば５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、用量は、５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧである。特定の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ３への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、用量は、５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧである。別の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ５への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧである。別の実施形態において、用量容積は、脊髄のレベルＣ５への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、用量は、５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧである。さらに別の実施形態では：ｉ）用量容積は、脊髄のレベルＣ３への投与の場合、２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧ、例えば５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧであり、ｉｉ）脊髄のレベルＣ５への投与の用量容積は、２５ｕＬ〜４０ｕＬであり、用量は、１．０×１０１０ＶＧ〜１．０×１０１２ＶＧ、例えば５．０×１０１１ＶＧ〜８．０×１０１１ＶＧである。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じまたは異なる容積（単回）で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じまたは異なる容積（複数回）で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じまたは異なる注入速度で送達されてもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ容積で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ用量で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ注入速度で送達されてもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる容積で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる容積で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる注入速度で送達されてもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ容積で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる用量で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる注入速度で送達されてもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ容積で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる用量で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ注入速度で送達されてもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ容積で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ用量で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる注入速度で送達されてもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる容積で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ用量で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ注入速度で送達されてもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる容積で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる用量で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ注入速度で送達されてもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、２つの部位において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる容積で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に同じ用量で送達されてもよい。ＡＡＶ粒子は、両方の部位に異なる注入速度で送達されてもよい。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、Ｃ３およびＣ５において実質内（ＩＰａ）注入により投与されてもよい。Ｃ３での注入の場合、容積は２５ｕＬであってもよく、用量は４．１×１０１１ｖｇであってもよい。Ｃ５での注入の場合、容積は４０ｕＬであってもよく、用量は６．６×１０１１ｖｇであってもよい。両注入の注射速度は、約１３分間にわたって５ｕＬ／分であってもよい。
一部の実施形態において、ＩＰａ注入（例えば、脊髄）は、脊髄の吻側−尾側軸の長さに沿った医薬組成物（つまり、ＡＡＶ粒子）の送達をもたらし得る。一部の実施形態において、ＩＰａ注入（例えば、脊髄）は、ＡＡＶ粒子伝搬の吻側尾側勾配をもたらす。一部の実施形態において、ＩＰａ注入（例えば、脊髄）は、注射部位から遠位にある領域への医薬組成物の送達をもたらす。理論により束縛されることは望まないが、本開示のＡＡＶ粒子は、特定の部位でのＩＰａ注入後、脊髄の吻側尾側軸の長さを移動し得る。言い換えれば、ＡＡＶ粒子は、注射部位の近近傍に限局されなくともよい。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、経シナプス（シナプスを越える）機序によって輸送され得る。この経シナプス機序は、脊髄の吻側−尾側軸に沿って存在する路またはチャネルを追従し得る。
デバイス
本明細書で使用されるとき、用語「デバイス」は、対象への医薬組成物の送達または対象における投与された医薬組成物の検出を促進するなど、特定の目的に適合するように構築または改変されている任意の物品を指す。
一部の実施形態において、デバイスは、医薬組成物を実質内注射するために利用され得る。デバイスは、医薬組成物を脊髄へと投与するためにも使用されてもよい。
一部の実施形態において、デバイスは、特注のフローティングカニューレであってもよい。特定の実施形態において、小さな直径を有する特注の注入カニューレが、注射に使用される。カニューレは、可変長の３０ゲージ可撓性サイラスティック管材に接続されている固定長の３０ゲージ斜角針を含み得る。遠位端部にはハミルトンルアーロックを装着することができ、ハミルトンルアーロックには、ひいては微量注入器ポンプを取り付けることができる。近位サイラスティック管材は、注射針フランジの近位端部に据え付けられている２４ゲージ剛性外側カニューレ内に鞘収され得る。フランジは、外側カニューレに着座し、注射針の深さ止めとしての役目を果たすことができる。
特定の実施形態において、デバイスは、脊髄内カニューレであってもよい。脊髄内カニューレは、近位注射器接続部および遠位先端を含み得る。近位注射器接続部は、保護シースを有する３〜２０’カニューレに接続され得るメスルアーロック注射器コネクターを備える。カニューレは、遠位先端から注射器までの単一内部管腔を含み得る。カニューレは、遠位先端付近に４〜６’’可撓性部分を含み得る。遠位先端は、フランジ／深さ止めおよび平坦剛性先端を含む。また、脊髄内カニューレは、対象に取り付けるための機構を含み得る。
特定の実施形態において、デバイスは、複雑な定位フレームであってもよい。
特定の実施形態において、デバイスは、簡易な定位フレームであってもよい。
特定の実施形態において、医薬組成物は、フレームを用いずに送達されてもよい。
特定の実施形態において、デバイスは、磁気共鳴撮像装置であってもよい。かかる撮像装置は、ガドリニウムなどの造影剤と共に使用される場合、対象における投与された医薬組成物を検出することができる。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるデバイスはいずれも、投与された医薬組成物を送達および／または検出するために組み合わせることができる。
用量設定
本開示の医薬組成物は、ＳＯＤ１関連の障害（例えば、ＡＬＳ）を予防および治療するのに有効な任意の量を用いて対象に投与されてもよい。必要となる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、詳細な組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象毎に異なることになる。
本開示の組成物は典型的には、投与の簡便性および投薬量の均一性のため、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本開示の組成物の１日の総使用量は主治医が妥当な医学的判断の範囲内で決定し得ることは理解されるであろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効性は、治療下の障害および障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別および食事；投与時間、および投与経路；治療継続期間；用いられる具体的な化合物と併用してまたは同時に使用される薬物；および医学分野で周知の同様の要因を含めた種々の要因に依存することになる。
一部の具体的な実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖を送達するためのＡＡＶベクターの用量は、疾患の状態、対象および治療戦略などに応じて適合され得る。典型的には、１用量当たり約１０５、１０６、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５〜１０１６ウイルスゲノム（単位）が投与されてもよい。
所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日に１回、週１回、２週に１回、３週に１回または４週に１回送達されてもよい。
特定の実施形態において、所望の投薬量は、複数回の投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはそれ以上の投与）を用いて送達されてもよい。複数回の投与が利用される場合、本明細書に記載されるような分割用量投与レジメンが用いられてもよい。本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、単一単位用量または総１日用量を２つ以上の用量に分割するもの、例えば単一単位用量の２回以上の投与である。本明細書で使用されるとき、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一の経路／単一の接触点、すなわち単一の投与イベントで投与される任意の調節性ポリヌクレオチド治療薬の用量である。本明細書で使用されるとき、「総１日用量」は、２４時間に与えられるまたは処方される量である。これは単一単位用量として投与されてもよい。特定の実施形態において、本開示のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは分割用量で対象に投与される。それらの用量は、緩衝液のみに、または本明細書に記載される製剤に製剤化されてもよい。
ＡＬＳを含む脊髄に関連する障害を治療する方法
本開示では、本明細書に記載されるＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを細胞へと導入する方法であって、ポリヌクレオチドのいずれかを、標的ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの分解が生じるのに十分な量で前記細胞へと導入することを含む方法が提供される。一部の態様において、細胞は、幹細胞、運動ニューロンなどのニューロン、筋細胞およびアストロサイトなどのグリア細胞であってもよい。
本明細書には、限定はされないが、運動ニューロン疾患（例えば、ＡＬＳ）など、脊髄に関連する障害を治療するために、ＡＡＶ粒子を脊髄へと送達する方法が記載される。特定の実施形態において、これらの方法は、経シナプス伝搬をもたらす。
また、本明細書には、治療を必要としている対象における異常なＳＯＤ１機能に関連するＡＬＳを治療するための方法が開示される。本方法は、任意選択で、対象に、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖を含むかまたはコードする組成物の治療有効量を投与することを含む。前記ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＡＬＳを治療的に処置するように、対象におけるＳＯＤ１遺伝子の発現をサイレンシングし、ＳＯＤ１タンパク質の産生を阻害し、ＡＬＳの１つ以上の症状を軽減するであろう。
一部の実施形態において、本開示のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドまたは含むかもしくはコードする組成物は、対象の中枢神経系に投与される。他の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ二重鎖またはそれを含む組成物は、対象の筋肉に投与される。
特に、ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは、運動ニューロンを含む特定のタイプの標的細胞；オリゴデンドロサイト、アストロサイトおよびミクログリアを含むグリア細胞；ならびに／またはＴ細胞など、ニューロンを取り囲む他の細胞へと送達されてもよい。ヒトＡＬＳ患者および動物ＳＯＤ１ ＡＬＳモデルにおける研究は、グリア細胞が、ＡＬＳニューロンの機能不全および死に早期の役割を果たすことを示唆した。突然変異体のＳＯＤ１が、運動ニューロン内に存在してもなお、周囲の保護的グリア細胞内の正常なＳＯＤ１は、運動ニューロンが、死滅することを防止し得る（例えば、その内容が、参照によりその全体において本明細書に援用される、フィリップスおよびロートシュタイン（Ｐｈｉｌｉｐｓ ａｎｄ Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ），Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２０１４，Ｍａｙ ２２．ｐｉｉ：Ｓ００１４−４８８６（１４）００１５７−５により総説されている）。
一部の具体的な実施形態において、ＡＬＳの療法として使用される、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターに挿入される。
一部の実施形態において、本組成物は、ＡＬＳを治療するための単剤療法剤または組合せ療法剤として投与される。
ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖を含むかまたはコードするウイルスベクターは、１つ以上の他の治療剤と組み合わせて使用され得る。「〜と組み合わせて」とは、その薬剤を同時に投与しなければならず、かつ／または併せた送達のために製剤化されなければならないことを含意するように意図するものではないが、これらの送達方法も、本開示の範囲内にある。組成物は、１つ以上の他の所望の治療剤または医療手技と共時的に、この前に、またはこの後で投与することができる。一般に、各薬剤は、この薬剤について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与されることになる。
本開示のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドと組み合わせて使用され得る治療剤は、抗酸化剤である低分子化合物、抗炎症性薬剤、抗アポトーシス薬剤、カルシウム調節剤、抗グルタミン酸作動性薬剤、構造的タンパク質阻害剤、および金属イオンの調節に関与する化合物であり得る。
ＡＬＳを治療するために組み合わせて使用される化合物としては、限定はされないが、以下のものを挙げることができる：フリーラジカルスカベンジャーまたはラジカヴァ（エダラボン）などの酸化ストレスを低減する薬剤、抗グルタミン作動剤：リルゾール、トピラマート、タランパネル、ラモトリジン、デキストロメトルファン、ガバペンチンおよびＡＭＰＡアンタゴニスト；抗アポトーシス剤：ミノサイクリン、フェニル酪酸ナトリウムおよびアリモクロモール；抗炎症剤：ガングリオシド、セレコキシブ、シクロスポリン、アザチオプリン、シクロホスファミド、血漿分離交換法、酢酸グラチラメールおよびサリドマイド；セフトリアキソン（ベリーら（Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．），Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１３，８（４））；ベータ−ラクタム抗生物質；プラミペキソール（ドーパミンアゴニスト）（ワンら（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．），Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒ．，２００８，９（１），５０−５８）；米国特許出願公開第２００６００７４９９１号明細書におけるニメスリド；米国特許出願公開第２０１３０１４３８７３号明細書において開示されているジアゾキシド；米国特許出願公開第２００８０１６１３７８号明細書において開示されているピラゾロン誘導体；ブロモクリプチンなど、酸化ストレス誘導性細胞死を阻害するフリーラジカルスカベンジャー（米国特許出願公開第２０１１０１０５５１７号明細書）；国際公開第２０１３１００５７１号パンフレットにおいて論じられているフェニルカルバメート化合物；米国特許第６，９３３，３１０号明細書および同第８，３９９，５１４号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１１０２３７９０７号明細書および同第２０１４００３８９２７号明細書において開示されている神経保護化合物；ならびに米国特許出願公開第２００７０１８５０１２号明細書において教示されている糖ペプチド；それらの各々の内容は、参照により全体として本明細書に援用される。
本開示のＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖との組合せ療法において使用され得る治療剤は、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）またはその断片など、ニューロンの喪失を保護し得るホルモンまたはバリアント（例えば、米国特許出願公開第２０１３０２５９８７５号明細書）；エストロゲン（例えば、米国特許第６，３３４，９９８号明細書および同第６，５９２，８４５号明細書）であり得る。これらの各々の内容は、参照により全体として本明細書に援用される。
ＡＬＳを治療するために、本開示のＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖との組合せ療法において、神経栄養因子を使用してもよい。一般に、神経栄養因子は、ニューロンの生存、成長、分化、増殖、および／もしくは成熟を促進するか、またはニューロンの活性の増大を刺激する物質として規定される。一部の実施形態において、本方法は、１つ以上の栄養因子の、治療を必要とする対象への送達を更に含む。栄養因子は、限定はされないが、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＴＮＦ、ＶＥＧＦ、コリベリン、キサリプロデン、サイロトロフィン放出ホルモン、およびＡＤＮＦ、ならびにこれらのバリアントを含み得る。
一態様において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖を含むＡＡＶベクターを、ＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ（その内容が、参照によりその全体において本明細書に援用される、ビンセントら（Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．），Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００４，６，７９−８５）およびＡＡＶ−ＧＤＮＦ（その内容が、参照によりその全体において本明細書に援用される、ワンら（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２，２２，６９２０−６９２８）などの神経栄養因子を発現させるＡＡＶベクターと共に共投与してもよい。
一部の実施形態において、ＡＬＳを治療するための本開示の組成物を、それを必要とする対象に、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、腹腔内投与、髄腔内投与、実質内（ＣＮＳ、脳および／または脊髄）および／または脳室内投与し、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含むベクターは、血液脳関門および血液脊髄関門の一方または両方を通過することを可能にする。一部の態様において、本方法は、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖、またはＡＬＳが治療的に処置されるように、対象においてＳＯＤ１遺伝子を標的とし、ＳＯＤ１遺伝子発現をサイレンシング／抑制し、およびＡＬＳの１つ以上の症状を軽減する少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖を含むＡＡＶベクターを含む組成物の治療有効量を、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に（例えば、注入ポンプおよび／または送達足場を使用して）直接投与（例えば、実質内投与、脳室内投与および／または髄腔内投与）することを含む。
一部の実施形態において、ＡＬＳを治療するための本開示の組成物を、それを必要とする対象に、実質内（ＣＮＳ、脳および／または脊髄）投与し、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含むベクターが、血液脳関門および血液脊髄関門の一方または両方を通過することを可能とする。
ある特定の態様において、運動ニューロンの変性、筋力低下、筋萎縮、筋肉の硬直、呼吸困難、発話の不明瞭、線維束性攣縮の発症、前頭側頭型認知症、および／または若年死を含むＡＬＳの症状は、治療される対象において改善される。他の態様において、本開示の組成物を、脳および脊髄の一方または両方へと適用する。他の態様において、筋肉の協調運動および筋肉の機能の一方または両方を改善する。他の態様において、対象の生存を延長する。
定義
特に明記しない限り、以下の用語および語句は以下に説明する意味を有する。これらの定義は、本質的に限定するよう意図するものでなく、本開示の特定の態様のより明確な理解を提供するために供される。
本明細書で使用されるとき、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、またはポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）のいずれか、またはプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾プリンもしくはピリミジン塩基のＮグリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチドで構成される任意の核酸ポリマーを指す。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の間で長さに意図される違いはなく、これらの用語は同義的に用いられ得る。これらの用語は分子の一次構造のみを指す。したがって、これらの用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡが含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」は、リボヌクレオチドのポリマーを指す；用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡおよびＲＮＡは、例えばそれぞれＤＮＡ複製およびＤＮＡの転写により、天然で合成されることもでき；または化学的に合成されることもできる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）または多重鎖（例えば、二本鎖、すなわち、それぞれｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）であり得る。用語「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする一本鎖ＲＮＡを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または干渉または「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子によって媒介される配列特異的調節機構を指す。ＲＮＡｉは、植物、動物および真菌を含めた多くの種類の生物で観察されている。ＲＮＡｉは細胞において天然で外来性ＲＮＡ（例えばウイルスＲＮＡ）を除去するために起こる。天然ＲＮＡｉは、遊離ｄｓＲＮＡから切断された、分解機構を他の類似のＲＮＡ配列に仕向ける断片によって進行する。ＲＮＡｉはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御され、細胞質において短鎖／低分子ｄｓＲＮＡ分子によって開始され、そこでｄｓＲＮＡ分子は触媒ＲＩＳＣ成分アルゴノートと相互作用する。ｄｓＲＮＡ分子は細胞に外因的に導入されることができる。外因性ｄｓＲＮＡはリボヌクレアーゼタンパク質ダイサーを活性化させることによってＲＮＡｉを開始し、ダイサーはｄｓＲＮＡに結合してそれを切断することにより、数個の対を成さないオーバハング塩基を各末端に有する２１〜２５塩基対の二本鎖断片を生じさせる。これらの短鎖二本鎖断片は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。
本明細書で使用されるとき、用語「短鎖／低分子干渉性ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを誘導または媒介する能力を有する約５〜６０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ分子（またはＲＮＡ類似体）を指す。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５〜３０ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、より好ましくは約１６〜２５ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、更により好ましくは約１８〜２３ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、および更により好ましくは約１９〜２２ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）（例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）を含む。用語「短鎖」ｓｉＲＮＡは、５〜２３ヌクレオチド、好ましくは２１ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。用語「長鎖」ｓｉＲＮＡは、２４〜６０ヌクレオチド、好ましくは約２４〜２５ヌクレオチド、例えば、２３、２４、２５または２６ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。短鎖ｓｉＲＮＡは、一部の例では、１９ヌクレオチド未満、例えば、１６、１７または１８ヌクレオチド、または僅か５ヌクレオチドを含んでもよく、但し、これらの短いｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを媒介する能力を保持しているものとする。同様に、長鎖ｓｉＲＮＡは、一部の例では、２６ヌクレオチド超、例えば、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または更には６０ヌクレオチドを含んでもよく、但し、これらの長いｓｉＲＮＡは、短鎖ｓｉＲＮＡへの更なるプロセシング、例えば酵素的プロセシングがない限りＲＮＡｉまたは翻訳抑制を媒介する能力を保持しているものとする。ｓｉＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓ−ｓｉＲＮＡ）またはハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖と呼ばれる二重鎖構造を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓ−ｓｉＲＮＡ）であってもよい。本開示によれば、組換えＡＡＶベクターは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはそれらの前駆体など、１つ以上のＲＮＡｉ分子をコードし得る。
本明細書で使用されるとき、ｓｉＲＮＡ分子の「アンチセンス鎖」または「第１鎖」または「ガイド鎖」という用語は、サイレンシングの標的となる遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０ヌクレオチド、例えば、約１５〜３０、１６〜２５、１８〜２３または１９〜２２ヌクレオチドの一部分と実質的に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖または第１鎖は、標的特異的サイレンシングを誘導するのに所望の標的ｍＲＮＡ配列と十分に相補的な、例えば、ＲＮＡｉ機構または過程によって所望の標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分に相補的な配列を有する。
本明細書で使用されるとき、ｓｉＲＮＡ分子の「センス鎖」または「第２鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、アンチセンス鎖または第１鎖と相補的な鎖を指す。ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖とセンス鎖とはハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。本明細書で使用されるとき、「ｓｉＲＮＡ二重鎖」は、サイレンシングの標的となる遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０ヌクレオチドの一部分と十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖と、ｓｉＲＮＡ鎖と二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖とを含む。本開示によれば、組換えＡＡＶベクターは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖をコードし得る。
本明細書で使用されるとき、用語「相補」は、ポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成する能力を指す。塩基対は、典型的には逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリック方式（例えば、ＡとＴ、ＡとＵ、ＣとＧ）、または二重鎖の形成を可能にする任意の他の方式で塩基対を形成することができる。当業者は認識しているとおり、ＤＮＡと対照的にＲＮＡを使用するとき、チミンでなくウラシルがアデノシンと相補的と見なされる塩基である。しかしながら、本開示の文脈でＵと表記されるとき、特に指定されない限り、Ｔに置き換え可能であることが含意される。完全な相補性または１００％の相補性とは、一方のポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合を形成することができる状況を指す。完全でない相補性とは、２本の鎖の全てではないものの一部のヌクレオチド単位が互いに水素結合を形成することができる状況を指す。例えば、２本の２０ｍｅｒについて、各鎖の２個の塩基対のみが互いに水素結合を形成することができる場合、このポリヌクレオチド鎖は１０％の相補性を呈する。同じ例で、各鎖の１８個の塩基対が互いに水素結合を形成することができる場合、このポリヌクレオチド鎖は９０％の相補性を呈する。
本明細書で使用されるとき、「ターゲティング」は、標的核酸にハイブリダイズして所望の効果を誘導するであろう核酸配列の設計および選択過程を意味する。
用語「遺伝子発現」は、核酸配列が首尾よく転写およびほとんどの場合に翻訳を受けてタンパク質またはペプチドを産生する過程を指す。明確にするため、「遺伝子発現」の測定に言及するとき、それは、測定が核酸転写産物、例えばＲＮＡもしくはｍＲＮＡの測定またはアミノ酸翻訳産物、例えばポリペプチドもしくはペプチドの測定であり得ることを意味するものと理解されなければならない。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチドおよびペプチドの量またはレベルの測定方法は当該技術分野において周知である。
本明細書で使用されるとき、用語「突然変異」は、後続の世代に伝達され得る変異型（「突然変異型」とも称される）をもたらす遺伝子の構造の任意の変化を指す。遺伝子の突然変異は、ＤＮＡにおける一塩基の変化、または遺伝子もしくは染色体のより大きい一部分の欠失、挿入、もしくは再配列によって引き起こされ得る。
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、本開示のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドなどの異種分子を輸送し、形質導入し、またはその他担体として働く任意の分子または部分を意味する。「ウイルスベクター」は、目的の分子、例えば、トランス遺伝子をコードするか、もしくは含む、１つ以上のポリヌクレオチド領域、ポリペプチドもしくはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの調節性核酸を含むベクターである。ウイルスベクターは一般に、遺伝物質を細胞に送達するのに使用される。ウイルスベクターは、具体的適用のために修飾されることが多い。ウイルスベクターの種類は、レトロウイルスのベクター、レンチウイルスのベクター、アデノウイルスのベクター、およびアデノ随伴ウイルスのベクターを含む。
用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」もしくは「ＡＡＶベクター」は、本明細書で使用されるとき、アデノ随伴ベクターの成分を含む、またはそれに由来する任意のベクターを指し、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞を感染させるのに好適である。用語ＡＡＶベクターは、典型的には、ｓｉＲＮＡ二重鎖をコードする核酸分子を含むＡＡＶ型ウイルス粒子またはビリオンを意味する。ＡＡＶベクターは、血清型の組合せ（すなわち「シュードタイプ」ＡＡＶ）を含めた様々な血清型または様々なゲノム（例えば一本鎖または自己相補的）に由来し得る。加えて、ＡＡＶベクターは複製欠損型および／またはターゲット型であってもよい。
本明細書で使用されるとき、語句「遺伝子の発現を阻害する」は、遺伝子の発現産物量の減少を生じさせることを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的には、ｍＲＮＡのレベルが減少することにより、そこから翻訳されるポリペプチドのレベルが減少することになる。発現レベルは標準的なｍＲＮＡまたはタンパク質測定技法を用いて決定し得る。
本明細書で使用されるとき、用語「インビトロ」は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）の中でなく、むしろ人工環境、例えば試験管または反応槽、細胞培養物、ペトリ皿等で起こるイベントを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「インビボ」は、生物（例えば、動物、植物、または微生物またはその細胞もしくは組織）の中で起こるイベントを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「修飾された」は、本開示の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的に修飾することを含め、多くの方法で修飾し得る。
本明細書で使用されるとき、用語「合成」は、人間の手で作製、調製、および／または製造されることを意味する。本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は化学的または酵素的であってもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「トランスフェクション」は、外因性核酸を細胞に導入する方法を指す。トランスフェクション方法としては、限定はされないが、化学的方法、物理的処理およびカチオン性脂質または混合が挙げられる。細胞にトランスフェクトし得る薬剤の一覧は広範であり、限定はされないが、ｓｉＲＮＡ、センスおよび／またはアンチセンス配列、ＡＡＶベクターまたはＡＡＶ粒子、１つ以上の遺伝子をコードし、かつ発現プラスミドに編成されるＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片などが含まれる。
本明細書で使用されるとき、「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図しない効果を指す。
本明細書で使用されるとき、語句「薬学的に許容可能」は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症のない、妥当なリスク対効果比に相応の、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指して用いられる。
本明細書で使用されるとき、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば臨床結果を生じさせるのに十分な量であり、そのため「有効量」は、それが適用されるコンテクストに依存する。例えば、ＡＬＳを治療する薬剤を投与する文脈では、薬剤の有効量は、例えば、薬剤の投与を伴わずに得られる応答と比較して、本明細書に規定される、ＡＬＳの治療を達成するのに十分な量である。
本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療用薬剤、診断用薬剤、予防用薬剤等）についての、感染、疾患、障害、および／または病態に罹患しているまたはそれに罹り易い対象に投与したとき感染、疾患、障害、および／または病態を治療し、その症状を改善し、それを診断し、予防し、および／またはその発症を遅延させるのに十分な量を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「対象」または「患者」は、例えば実験的、診断的、予防的、および／または治療的目的で本開示に係る組成物を投与し得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、チンパンジーならびに他の類人猿およびサル種などの非ヒト霊長類、およびヒトなど、哺乳類）および／または植物が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「予防する」または「予防」は、数週間、数カ月間、または数年間を含めたある期間にわたり病態または疾患の発生、展開または進行を遅延させるまたは未然に防ぐことを指す。
用語「治療」または「治療する」は、本明細書で使用されるとき、疾患の治癒または改善に用いられる１つ以上の特定の手順の適用を指す。特定の実施形態において、特定の手順は１つ以上の医薬品の投与である。本開示の文脈では、特定の手順は、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡの投与である。
本明細書で使用されるとき、用語「改善」または「改善する」は、病態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度を低下させることを指す。例えば、神経変性障害のコンテクストでは、改善には、ニューロン喪失の低減が含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「投与する」は、対象に医薬品または組成物を提供することを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「神経変性」は、神経細胞死をもたらす病的状態を指す。多数の神経障害が共通の病的状態として神経変性を共有する。例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、いずれも慢性神経変性を引き起こし、慢性神経変性は数年の期間にわたる緩慢な進行性の神経細胞死によって特徴付けられる一方、急性神経変性は、脳卒中などの虚血、または外傷性脳傷害などの外傷の結果としての、または例えば脊髄損傷もしくは多発性硬化症によって引き起こされる脱髄または外傷による軸索切断の結果としての、神経細胞死の突発的な発生によって特徴付けられる。一部の神経障害では、例えばＡＬＳにおける運動ニューロン変性など、主に１つのタイプのニューロン細胞が変性する。
（実施例）
実施例１．ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチド設計（ｓｉＲＮＡ）
ｓｉＲＮＡ設計を実施して、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを同定する。設計には、それぞれ、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿ ０００４５４．４（配列番号１０））、カニクイザル（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２８５４０６．１（配列番号１１））、アカゲザルＳＯＤ１転写物（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０３２８０４．１（配列番号１１））、およびスース・スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１９０４２２．１（配列番号１２））に由来するＳＯＤ１転写物を使用する（表１０）。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、アンチセンス鎖の２〜１８位がヒトＳＯＤ１転写物に対して１００％同一性を有し、アンチセンス鎖の２〜１８位が非ヒトＳＯＤ１転写物に対して部分的または１００％同一性を有するように設計する。全てのｓｉＲＮＡ二重鎖において、アンチセンス鎖の１位は、Ｕを有するように操作し、センス鎖の１９位は、この位置で二重鎖と対合しないようにするために、Ｃを有するように操作する。
Figure 2021529513
Figure 2021529513
 実施例２．脊髄へのＡＡＶの実質内送達
髄腔内投与または静脈内投与など、ＡＡＶ送達の従来経路は、大型哺乳類の頚部脊髄および胸部脊髄のロバストな形質導入をもたらさない。したがって、ＡＡＶ送達の新しいルート（実質内注射）を、頚部脊髄形質導入効率の向上について評価した。ウイルスゲノムの生体内分布およびＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを、頚部レベルを含む、脊髄の複数レベルの前角において評価した。
最初の実験では、各々体重が１４〜２０ｋｇである３頭のゲッチンゲン成体（６か月齢）雌ミニブタを研究に利用した。動物は、ＡＡＶに対する中和抗体をプレスクリーニングしなかった。Ｃ３とＣ５との間で４〜５ｃｍの椎弓切除を実施し、注射間に３ｃｍの余裕をとった。Ｈ１プロモータとＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡを含む調節性ポリヌクレオチド（配列番号６）とを含む、配列番号９のＩＴＲ〜ＩＴＲ配列を有する自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）を、ＡＡＶｒｈ１０にパッケージングした（ｓｃＡＡＶ−ｍｉＲＳＯＤ１）。
ｓｃＡＡＶ−ｍｉＲＳＯＤ１（力価 ２．０３×１０１３ｖｇ／ｍＬ）の２回注射を、１．３×１０１２ｖｇの合計用量／動物で投与した。椎弓切除の吻側端部において、つまり、脊髄のレベルＣ３において、単一２５μＬ（５．１×１０１１ｖｇ）容積を脊髄の前角内へと注射した。椎弓切除の尾側端部において、つまり、脊髄のレベルＣ５において、単一４０μＬ（８．１×１０１１ｖｇ）容積を対側の前角内へと注射した。注射は両方とも５μＬ／分の速度で投与し、およそ１３分間の合計注入時間がもたらされた。この手順の４週間後に動物を犠牲にし、脊髄組織を分析のために収集した。
ｓｃＡＡＶ−ｍｉＲＳＯＤ１の実質内投与が、脊髄の形質導入およびＳＯＤ１ ｍＲＮＡのノックダウンに結び付くか否かを決定するため、前角パンチを、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡのレベルを定量化するための分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法によって分析し、ベータアクチン（ＡＣＴＢ）ｍＲＮＡレベル、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡレベルおよびペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ｍＲＮＡレベルの幾何平均に対して正規化した。次に、これらの正規化ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを、同じ動物に由来する脊髄の腰部領域（Ｌ１〜Ｌ３）に由来する前角パンチの正規化ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルと比べて表した。
Ｌ１〜Ｌ３に由来する前角パンチのＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルと比べて、有意なＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンが、Ｃ１からＴ７〜Ｔ１０までの前角パンチで明らかだった。脊髄の両側に由来する前角パンチのＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルは同様だった。一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット検定は、脊髄の各レベルにて有意なＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを示した（Ｃ１〜Ｔ５ ｐ＜０．０００１；Ｔ７〜Ｔ１０ ｐ＜０．０５）。表１１に示されるように、注射に最も近い脊髄分節は、最も大きなＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを呈した。脊髄分節Ｃ１〜Ｃ８は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡのロバストで有意なノックダウンを示した（およそ５０〜７５％ノックダウン）。ベクター注射の部位から離れた脊髄分節Ｔ５でさえ、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの有意なノックダウンが観察された（３２．６±５．１％ノックダウン）。
Figure 2021529513
 また、ＡＡＶ粒子で処置したブタに由来する前角パンチの正規化ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを、単一未感作ブタの脊髄に由来する前角パンチの正規化ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルと比べて表した。ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを、ベータアクチン（ＡＣＴＢ）ｍＲＮＡレベル、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡレベルおよびペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ｍＲＮＡレベルの幾何平均に対して正規化した。次に、処置ブタの各頚部分節に由来するＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを、未感作ブタに由来するＣ２ ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを使用して正規化されたＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルと比べて表した。胸部ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベル（処置ブタ）を、Ｔ２ ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベル（未感作ブタ）を使用して正規化し、腰部ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベル（処置ブタ）を、未感作ブタに由来するＬ２ ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを使用して正規化した。未感作ブタ脊髄に由来する前角パンチを、Ｃ２、Ｔ２およびＬ２レベルから収集した。表１２に示されるように、ｓｃＡＡＶ−ｍｉＲＳＯＤ１を投与したブタの前角パンチのＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルは、試験したすべての脊髄レベルにおいて、未感作ブタと比べて有意なノックダウンを示した（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット検定；ｐ＜０．０００１）。同様のＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルが、脊髄の両側に由来する前角パンチで観察された。ＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンは、Ｃ３およびＣ５注射部位付近で最も強力だった（７９〜８４％ノックダウン）。ＡＡＶ注射の部位から離れた脊髄レベルでさえ、前角パンチは、有意なＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを呈した。Ｔ５、Ｔ７〜Ｔ１０、およびＬ１脊髄レベルにおいて、前角パンチは、それぞれＳＯＤ１ ｍＲＮＡの有意な５５．１±３．４％、４４．０±２．６％および３３．４±１．２％ノックダウンを示した。
Figure 2021529513
 表１３に示されるように、デジタル液滴ＰＣＲによるベクターゲノム生体内分布の分析は、注射部位に最も近い頸部脊髄の前角パンチにおける１二倍体細胞当たりのベクターゲノムコピー数が高いことを示した。ベクターゲノムコピー数は、Ｃ３からＣ２脊髄レベルへとおよびＣ７からＣ８脊髄レベルへと急激に低下した（＞１０倍）。ＡＡＶ注射のＣ３〜Ｃ５部位から離れた脊髄レベルでさえ、前角パンチは、有意なベクターゲノムコピーを呈した。Ｔ５、Ｔ７〜Ｔ１０、およびＬ１〜Ｌ３脊髄レベルにおいて、前角パンチは、それぞれ有意な１．７±１．２、０．２±０．０、および０．５±０．２の１二倍体細胞当たりのベクターゲノムコピーを示した。
Figure 2021529513
 ベクターゲノム分布は、両分析において、つまり、ＳＯＤ１ノックダウンをＬ１〜Ｌ３と比較した場合（ｒ２＝０．２６、ｐ＜０．０００１）および未感作対照と比較した場合（ｒ２＝０．２６、ｐ＜０．０００１）において、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルと線形相関性を示した。平均で１二倍体細胞当たり０．２または０．５ベクターゲノムコピーなど、１二倍体細胞当たりの低ベクターゲノムコピー数（＜１ｖｇ／ｄｃ）は、依然として実質的なＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンをもたらした。
第２の実験では、各々体重が１５〜３０ｋｇの６頭のゲッチンゲン成体（＞９か月齢）雌および雄ミニブタを利用した。動物は、ＡＡＶに対する中和抗体をプレスクリーニングしなかった。Ｃ３〜Ｃ５レベルにて多レベル椎弓切除を実施して脊髄に接近し、注射間に３ｃｍの余裕をもたせた。
第１の群の３頭のブタには、ｓｃＡＡＶ−ｍｉＲＳＯＤ１（力価 ２．０３×１０１３ｖｇ／ｍＬ）の２回注射を、１．６×１０１２ｖｇの合計用量／動物で投与した。椎弓切除の吻側端部において、単一４０μＬ（８．１×１０１１ｖｇ）容積を、右側の吻側Ｃ３の前角内へと注射した。椎弓切除の尾側端部において、単一４０μＬ（８．１Ｅ１１ｖｇ）容積を、左側の尾側Ｃ５の前角内へと注射した。注射は両方とも５μＬ／分の速度で投与し、およそ１６分間の合計注入時間がもたらされた。第２の群の３頭のブタには、同じ投薬パラダイムで媒体を注射した。この手順の４週間後に動物を犠牲にし、脊髄組織を分析のために収集した。
前角パンチを、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡをノックダウンするための分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法によって分析し、ベータアクチン（ＡＣＴＢ）ｍＲＮＡレベル、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡレベルおよびペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ｍＲＮＡレベルの幾何平均に対して正規化し、媒体処置動物の同じ脊髄レベルに由来する前角パンチの正規化ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルと比べて表した。有意なＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンは、Ｃ１〜Ｔ１２に由来する左前角から採取したパンチ、およびＣ１〜Ｌ１に由来する右前角から採取したパンチで明らかであり、脊髄の両側に由来する前角パンチのＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルは同様だった。二元配置ＡＮＯＶＡおよびシダック多重比較検定では、媒体対照群と比べて、脊髄の各レベルにおいて有意なＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンが示された（左側：Ｃ１〜Ｔ７ ｐ＜０．０００１；Ｔ１０ ｐ＜０．００１、Ｔ１２ Ｐ＜０．０１；右側：Ｃ１〜Ｔ１０ ｐ＜０．０００１；Ｔ１２ ｐ＜０．００１、Ｌ１ Ｐ＜０．０１）。表１４に示されるように、注射に最も近い脊髄分節が、最も大きなＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを呈し、ＳＯＤ１ｍＲＮＡノックダウンはＣ５で最大だった。脊髄分節Ｃ１〜Ｔ５は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡのロバストで有意なノックダウンを示した（５０〜８２％ノックダウン）。ベクター注射の部位から離れた左側の脊髄分節Ｔ１２および右側の脊髄分節Ｌ１でさえ、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの有意なノックダウンが観察された（それぞれ、３５．２２±２．７６％ノックダウン；２９．１４±１０．３６％ノックダウン）。
Figure 2021529513
 表１５に示されるように、デジタル液滴ＰＣＲによるベクターゲノム生体内分布の分析は、注射部位に最も近い頸部脊髄の前角パンチにおける、１二倍体細胞あたりのベクターゲノムコピー数が高いことを示した。ベクターゲノムコピー数は、Ｃ３からＣ２脊髄レベルへとおよびＣ５からＣ７脊髄レベルへと急激に低下した（＞１０倍）。しかしながら、ＡＡＶ注射のＣ３〜Ｃ５部位から離れた脊髄レベルでさえ、前角パンチは、バックグラウンドレベルを大きく超えるベクターゲノムコピーを呈した。Ｔ５、Ｔ７、Ｔ１０、Ｔ１２、およびＬ１脊髄レベルにおいて、前角パンチは、それぞれ０．７３±０．１８、０．３５±０．０３、０．２７±０．０４、０．２５±０．０３、および０．３８±０．１９の１二倍体細胞当たりのベクターゲノムコピーを示した。
Figure 2021529513
 ベクターゲノム分布は、媒体対照と比較して、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルと線形相関性を示した（ｒ２＝０．１５、ｐ＝０．０００２）。５０％ＳＯＤ１ノックダウンが、注射部位の尾側約３０ｃｍの前角パンチにおいて、平均して０．２または０．５の１二倍体細胞当たりのベクターゲノムコピーなど、低い１二倍体細胞当たりのベクターゲノムコピー（＜１ｖｇ／ｄｃ）で達成された。
実施例３：組織および細胞におけるＳＯＤ１低減
ＳＯＤ１ ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究を、実質内送達研究（実施例２）で使用した動物の脊髄の前角に由来する組織切片を使用して実施した。
ｓｃＡＡＶ−ｍｉＲＳＯＤ１粒子を注射したブタ３０２のＣ６およびＴ５脊髄分節の前角は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ特異的染色をほとんどまたはまったく示さず、ＳＯＤ１がノックダウンされたことを示した。大きな運動ニューロンでは、内因性ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現の実質的な低減が吻側尾側勾配で観察され、低減は頸部領域で最も強力だった。ｓｃＡＡＶ粒子を注射したブタ３０２のＬ１〜Ｌ３脊髄分節では、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ特異的染色が観察された。これは、Ｌ１〜Ｌ３のｂＤＮＡ法データと一致し、Ｌ１〜Ｌ３脊髄分節におけるＳＯＤ１のノックダウンが限定的だったことを示す。予想の通り、未感作未注射ブタの脊髄分節Ｌ２の前角は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの強い染色を示した。
ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを、レーザー捕捉によって脊髄分節Ｔ１３から単離された運動ニューロンプールにおいて、実施例２に記載される研究に由来する枯渇灰白質または脊髄分節全体の断面において測定した。また、運動ニューロン細胞質マーカであるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）のレベルを測定して、単離運動ニューロン試料中の運動ニューロンの濃縮を確認した。結果は表１６ａに示されている。表中、ＶＨは前角を示し、ＭＮは運動ニューロンを示し、ＤＧＭは枯渇灰白質を示し、左／右は、試料が得られた脊髄の側を示す。表１６ａのＳＯＤ１倍数変化値は、媒体群と比べたものであり、ＣｈＡＴ濃縮は、脊髄全体の媒体Ｔ１３断面と比べて測定した。値は、平均±標準誤差として表されている。
Figure 2021529513
 左前角および右前角の両方から得られた単離運動ニューロンは、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低減を示した（ｐ＜０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ、一致媒体対照と比較したシダック検定）。これらの結果は、同じブタに由来するＴ１２およびＬ１分節におけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベル（ｂＤＮＡアッセイ）と類似している。ＣｈＡＴ濃縮は、単離運動ニューロンでは観察されたが、Ｔ１３脊髄断面試料では観察されなかった。
ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを、レーザー捕捉によって脊髄分節Ｃ４から単離した運動ニューロンにおいて、および実施例２に記載される研究に由来する枯渇灰白質において測定した。結果は表１６ｂに示されている。表中、ＶＨは前角を示し、ＭＮは運動ニューロンを示し、ＤＧＭは枯渇灰白質を示し、左／右は、試料が得られた脊髄の側を示す。表１６ｂのＳＯＤ１倍数変化値は、媒体群と比べたものであり、媒体Ｃ４断面と比べて測定された。値は、平均±標準誤差として表されている。
Figure 2021529513
 Ｃ４における単離運動ニューロンおよび運動ニューロン枯渇灰白質（ＤＧＭ）は両方とも、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低減を示す（ｐ＜０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ、一致媒体対照と比較したシダック検定）。これらのデータは、Ｃ３およびＣ５におけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルと一致する（ｂＤＮＡアッセイ）。また、これらのデータは、灰白質と比較して、運動ニューロンではＳＯＤ１ ｍＲＮＡの観察された低減がさらに特異的に増加し、頸部脊髄運動ニューロンにおけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡのほぼ完全な抑制（９７％ノックダウン）がもたらされることを実証する。
舌下神経核および疑核は、ＡＬＳによって影響を受け得る脳幹核の領域である。舌下神経核は、舌の筋肉に行き渡っている大きな運動ニューロンの顕著なクラスターを含み、疑核は、発話と嚥下と強く関連する大きな運動ニューロンを含む。ＳＯＤ１ ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、ｓｃＡＡＶ−ｍｉＲ ＳＯＤ１を脊髄に実質内注射したブタの脳幹に由来する組織切片を使用して実施した。ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで測定したところ、媒体処置群およびＳＯＤ１ ＡＡＶ粒子処置群において類似していることが見出された。ＡＡＶ粒子の実質内脊髄投与が、脳幹の形質導入およびＳＯＤ１ ｍＲＮＡのノックダウンに結び付いたか否かを決定するため、左右の尾側脳幹試料も分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法で分析した。ｍＲＮＡレベルを、ベータアクチン（ＡＣＴＢ）ｍＲＮＡレベル、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡレベルおよびペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ｍＲＮＡレベルの幾何平均に対して正規化した。正規化ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルは、媒体対照で処置した動物に由来する脳幹における正規化ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルと比べて表されている（表１７）。ベクターゲノム生体内分布を、ｓｃＡＡＶ−ｍｉＲＳＯＤ１の両用量について、デジタル液滴ＰＣＲによって測定し、ベクターゲノム数／二倍体細胞を測定した（表１７）。表１７において、ＢＬＬＱは、「定量化の下限未満」を表し、４０ｎｇのテンプレート入力ではおよそ＜０．００５ｖｇ／ｄｃである。
Figure 2021529513
 統計的に有意なＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンが、尾側脳幹の左側および右側において、それぞれｐ値＜０．０１およびｐ値＜０．００１で観察された（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット多重比較検定）。ＩＰａ投薬後、脊髄分節Ｔ５〜Ｌ１において観察されたものと同様のレベルのベクターゲノムが脳幹領域において検出された。
ｓｃＡＡＶ−ｍｉＲＳＯＤ１または媒体対照を注射したブタの血漿中の血清中和抗体レベルを測定した。中和抗体状態とＳＯＤ１ ｍＲＮＡまたはウイルスゲノムのレベルとの間に、相関性は観察されなかった。これらの結果は、中和抗体が、観察されたＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさないことを示唆する。
実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡの効果
ＳＯＤ１を標的とするＥｍｉＲ７８８．２ ｓｉＲＮＡを、ＨｕＨ−７細胞における内因性ヒトＳＯＤ１発現の阻害についてアッセイした。様々な用量のｓｉＲＮＡによるＨｕＨ−７のトランスフェクションを、製造業者の使用説明書に従って、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン／ライフ・テクノロジーズ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて実施した。ｂＤＮＡ（分岐ＤＮＡ）アッセイを使用して、ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルおよびＧＡＰＤＨ（対照）ｍＲＮＡレベルの定量化を実施した。ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現レベルのパーセントが図１に示されている。図１に示されるように、ｓｉＲＮＡの濃度が増加すると共に、相対的ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現レベルが減少した。ＩＣ５０は、図１の点線によって示されるように、５０％ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現レベルを達成するために必要なｓｉＲＮＡの濃度である。
ｍｉＲ７８８．２が、ヒトＳＯＤ１に対して選択的であるか否かを試験するため、アンチセンス鎖のバイオインフォマティクス分析を使用して、９つの潜在的ヒトオフターゲット遺伝子を同定した。これらの遺伝子には、スリットガイダンスリガンド２（ＳＬＩＴ２、Ｓｌｉｔ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｌｉｇａｎｄ ２）、核内受容体コアクチベーター２（ＮＣＯＡ２）、ホスホリパーゼＣ Ｅｔａ１（ＰＬＣＨ１）、ＢＲＤ４相互作用クロマチンリモデリング複合体関連タンパク質様（ＢＩＣＲＡＬ）、ブロモドメイン含有１（ＢＲＤ１）、Ｓｃｍ様４Ｍｂｔドメイン１（ＳＦＭＢＴ１、Ｓｃｍ Ｌｉｋｅ Ｗｉｔｈ Ｆｏｕｒ Ｍｂｔ Ｄｏｍａｉｎｓ １）、ダイニン軸糸重鎖７（ＤＮＡＨ７、Ｄｙｎｅｉｎ Ａｘｏｎｅｍａｌ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ ７）、ジンクフィンガー−マトリン３型（ＺＭＡＴ３、Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｍａｔｒｉｎ−Ｔｙｐｅ ３）およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１Ｂ（ＭＤＨ１Ｂ）が含まれていた。ヒトＳＯＤ１およびこれらの潜在的オフターゲットのうちの１つを両方とも発現する細胞株を選択し、ｍｉＲ７８８．２のガイド鎖を含むＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現、潜在的オフターゲットｍＲＮＡ発現およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ発現のレベルを評価した。任意の所与のオンターゲットまたはオフターゲットに対するｍｉＲ７８８．２のガイド鎖を含むＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡの活性を、対照ウェル全体のオンターゲットｍＲＮＡレベルまたはオフターゲットｍＲＮＡレベル（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化した）と比べた、処置細胞におけるオンターゲットｍＲＮＡレベルまたはオフターゲットｍＲＮＡレベル（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化した）のパーセントとして表した。ｍｉＲ７８８．２のガイド鎖を含むＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡによるＳＯＤ１ノックダウンのＩＣ５０値は、Ｈｕｈ−７細胞では＜０．０２ｎＭであり、Ｃ４２細胞では＜０．１５ｎＭだった。これは、強力なオンターゲットノックダウンを示す。対照的に、ｍｉＲ７８８．２のガイド鎖を含むＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡの０．１ｐＭ〜２４ｎＭの濃度範囲では、どの潜在的オフターゲットのＩＣ５０値も算出することができなかった。これらの結果は、９つの潜在的オフターゲットの場合、オンターゲット（ヒトＳＯＤ１）ｍＲＮＡ抑制のＩＣ５０対オフターゲットｍＲＮＡ抑制のＩＣ５０には、少なくとも１６０倍の分離があることを示す。したがって、ｍｉＲ７８８．２のガイド鎖は、最も近い予測潜在的オフターゲットよりも少なくとも１６０倍、ＳＯＤ１に対して選択的である。
実施例５．ＳＯＤ１を標的とするＡＡＶ−ｍｉＲＮＡベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
ｍｉＲＮＡ発現ベクターは、２つの異なるフィラー配列のうちの１つを含むＩＴＲ〜ＩＴＲ配列、すなわち、レンチウイルス由来フィラーを有するＩＴＲ〜ＩＴＲ（配列番号９）またはアルブミンフィラーを有するＩＴＲ〜ＩＴＲ（配列番号２５）を含むＩＴＲ〜ＩＴＲ配列内の、ＳＯＤ１を標的とするＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８．２（調節性ポリヌクレオチド配列番号６）を操作することによって設計した。ＩＴＲ〜ＩＴＲ配列をＡＡＶｒｈ１０にパッケージングして、それぞれ、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）コンストラクトまたはｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）コンストラクトを生成した。本明細書で使用されるとき、コンストラクト名の括弧内に示される「レンチ」という用語は、コンストラクトがレンチウイルス由来フィラー配列を含むことを示し、コンストラクト名の括弧内に示される「アルブミン」という用語は、コンストラクトがアルブミン遺伝子由来フィラー配列を含むことを意味する。ＨＥＫ２９３Ｔ、およびローラーボトルを使用したトリプルトランスフェクション（ＴＴ）法を使用して、ＡＡＶ粒子を作製した。粒子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子を有するＡＡＶｒｈ１０を含むベクターを、陰性対照として使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種し（１００μＬ細胞培養培地中２．０×１０４細胞／ウェル）、１．５２×１０３〜１×１０７の範囲の９つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、１条件当たり三重重複のウェルを使用した。感染の４８時間後、細胞を回収して、直ちに細胞溶解した。細胞溶解物を定量的ＲＴ−ＰＣＲに使用して、ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルならびにハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡレベルを定量化した。ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを、アラニル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）ｍＲＮＡレベルおよびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡレベルの幾何平均に対して正規化し、次にＧＦＰ対照群に対してさらに正規化して、相対的ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを得た。試験した両ベクターのＭＯＩ、ならびにＡＡＲＳおよびＧＡＰＤＨの幾何平均に対して正規化した相対的ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベル（ＧＦＰ対照と比べた、％）を表１８に示す。
Figure 2021529513
 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡの用量依存的ノックダウンが、ベクターｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）およびｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）の両方で観察された。また、ヒトＳＯＤ１の相対的ｍＲＮＡ値を曲線にフィッティングした。値は表１９に示されている。
Figure 2021529513
 表１９に示されるように、同様の効力が両ベクターで観察され、ｐ値は０．０８だった。ＩＣ５０値も同様であり、両ベクターとも１０４の範囲だった。
ウイルスゲノムおよびカプシドタンパク質を、精製ＡＡＶ調製物から独立に抽出した。変性ゲルを使用してゲノム完全性を評価し、変性ゲルでは約３ｋｂのバンドが検出された。ポリアクリルアミドゲル電気泳動でのカプシドタンパク質の銀染色を使用してカプシド完全性を測定し、銀染色では、７５ｋＤａ範囲に３つのバンドが示された。
実施例６．トランスジェニックマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏヒトＳＯＤ１ノックダウン
ＳＯＤ１を標的とし、実施例４に記載される通りのＩＴＲ〜ＩＴＲ内に異なるフィラー配列を含むｓｉＲＮＡコンストラクト（ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８．２）を有する自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）をＡＡＶｒｈ１０にパッケージングし、０．００１％Ｆ−６８を有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で製剤化した。ヒトＳＯＤ１を発現する１４〜３０週齢の雌または雄Ｔｇ（ＳＯＤ１）３Ｃｊｅ／Ｊマウス（ジャクソンラボラトリー社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、メイン州バーハーバー（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ）所在）は、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）、または媒体（１群当たりｎが３〜５）の両側線条体内注入（０．５μＬ／分で５μＬ）を受けた。ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）の場合、ベクター濃度は、１．５×１０１３、３．０×１０１２、５．６×１０１１または１．９×１０１１ｖｇ／ｍＬであった。これは、７．５×１０１０、１．５×１０１０、２．８×１０９または９．４×１０８ｖｇの総用量に対応する。ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）の場合、ベクター濃度は、１．５×１０１３、３．０×１０１２、５．７×１０１１または１．９×１０１１ｖｇ／ｍＬであった。これは、７．６×１０１０、１．５×１０１０、２．９×１０９または９．５×１０８ｖｇの総用量に対応する。投薬の４週間後、動物を安楽死させ、脳を摘出し、左右の線条体領域を切除し、瞬間冷凍した。各動物の線条体試料全体を、ｑＲＴ−ＰＣＲによってヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡ抑制について評価した。製造業者のプロトコール（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））に従ってＲＮｅａｓｙミニキットを使用して、線条体組織試料から全ＲＮＡを抽出した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用した逆転写によって、相補的ＤＮＡ合成を実施した。すべてのＴａｑＭａｎアッセイおよびマスターミックスは、テイフ・テクノロジーズ社（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に注文し、製造業者の推奨に従って使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＣＦＸ３８４リアルタイムシステム（バイオ−ラッド社（ＢＩＯ−ＲＡＤ））を使用して実施し、データをΔΔＣＴ法で分析した。ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを、マウスＧＡＰＤＨ（ｍＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、次に媒体対照群に対してさらに正規化した。これらの群平均を算出して、群（処置）平均を得た。ｑＲＴ−ＰＣＲ ｍＲＮＡの結果は、下記の表２０に示されている。ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルは、平均パーセント±標準偏差（ＳＤ）として表されている。
Figure 2021529513
 ヒトＳＯＤ１トランスジェニックマウス線条体において、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）は、１線条体当たり９．４×１０８ｖｇ〜１．５×１０１０ｖｇの線条体内注入の約２８日後に、約４８％〜６４％のヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡのサイレンシングを引き起こした。ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）は、１線条体当たり１．０×１０９ｖｇ〜８．０×１０１０ｖｇの線条体内注入の約２８日後に、約６０％〜７９％のヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングを引き起こした。ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）８．０×１０１０用量のウイルスゲノム（ｖｇ）／５μＬで、７９％の最大ノックダウンが観察された。試験したいずれの最低用量のベクターでも、実質的なノックダウンが観察された。
線条体内注入によって投与されたＡＡＶベクターの耐容性を、ヒトＳＯＤ１トランスジェニックマウスで調査した。媒体、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）、またはｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）の投薬前後で体重を記録した。各群で得られた体重変化を、投薬前に測定した体重のパーセンテージとして表２１に示す。
Figure 2021529513
 一元配置ＡＮＯＶＡ、ダネット検定を使用してｐ値を算出した。最高用量１．６０Ｅ＋１０（ｖｇ／５μＬ）のｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）ベクターで、＜０．０５のｐ値が得られ、最高用量８．００Ｅ＋１０（ｖｇ／５μＬ）のｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）ベクターで、＜０．００１のｐ値が得られた。これは、最高用量のベクターで有意な体重喪失が生じたことを示唆する。病的状態は、より高用量の群でも観察された。１．６０Ｅ＋１０（ｖｇ／５μＬ）の用量では、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）群の２／６マウス、およびｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）群の５／５マウスは、注射後４週目までに死亡していることが見出されたかまたは安楽死させたかのいずれかだった。最高用量（８．００Ｅ＋１０）のｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）群の２／５マウスは、それぞれ２日および３．５週で死亡していることが見出された。死後分析により、死亡は、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）感染またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染によるものであり得ることが明らかになった。
実施例７．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡの効果
ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８．２、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−８６０、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１１４−８０６およびＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１１４−８６１を、ＣＢＡプロモータを有するｓｃＡＡＶＤＪベクターへと操作した。ブタ上皮細胞株ＳＫ−ＲＳＴをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、３つの異なるＭＯＩで、すなわち４．００Ｅ＋０３、２．００Ｅ＋０４、および１．００Ｅ＋０５で、記載のベクターで感染させた。対照ｃＡＡＶＤＪ．ＥＧＦＰベクターも、これらのＭＯＩで評価した。ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現を測定し、ブタＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化した。図２には、相対的ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルが、ＧＦＰ発現％と比べて示されている。ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８．２は、最も強力な用量依存性ノックダウンを示した。
実施例８．脊髄へのＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡの実質内送達
ウイルスゲノムの生体内分布およびＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを、ブタの頸部レベルを含む、脊髄の複数レベルの前角において評価した。
各々体重が１４〜２０ｋｇである３頭のゲッチンゲン成体（６か月齢）雌ミニブタを、この研究の群の各々に利用した。動物は、ＡＡＶに対する中和抗体をプレスクリーニングしなかった。Ｃ３とＣ５との間で４〜５ｃｍの椎弓切除を実施し、注射間に３ｃｍの余裕をとった。ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡを含む調節性ポリヌクレオチド（配列番号６）およびアルブミン由来フィラー配列を含む（配列番号２５）のＩＴＲ〜ＩＴＲ配列を有する自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）を、ＡＡＶｒｈ１０ベクターにパッケージングして、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）を生成した。
高用量の場合、ｓｃＡＡＶ（力価 １．７３×１０１３ｖｇ／ｍＬ）の２回注射を投与した。椎弓切除の吻側端部（ｒｏｓｔｒａｌ ｅｎｄ）において、つまり、脊髄のレベルＣ３において、単一４０μＬ（６．９×１０１１ｖｇ／注射）容積を脊髄の前角内へと注射した。椎弓切除の尾側端部（ｃａｕｄａｌ ｅｎｄ）において、つまり、脊髄のレベルＣ５において、単一４０μＬ（６．９×１０１１ｖｇ／注射）容積を対側の前角内へと注射した。総用量は１．３８×１０１２ｖｇだった。２回の用量のうち低い方の場合、ｓｃＡＡＶ（力価 ５．８×１０１１ｖｇ／ｍＬ）の２回注射を投与した（高用量の１／３０）。椎弓切除の吻側端部において、つまり、脊髄のレベルＣ３において、単一４０μＬ（２．３×１０１０ｖｇ／注射）容積を脊髄の前角内へと注射した。椎弓切除の尾側端部において、つまり、脊髄のレベルＣ５において、単一４０μＬ（２．３×１０１０ｖｇ／注射）容積を対側の前角内へと注射した。総用量は４．６×１０１０ｖｇだった。注射はすべて、５μＬ／分の速度で投与し、およそ１３分間の合計注入時間がもたらされた。この手順の４週間後に動物を犠牲にし、脊髄組織を分析のために収集した。
ＡＡＶ粒子の実質内投与が、脊髄の形質導入およびＳＯＤ１ ｍＲＮＡのノックダウンに結び付いたか否かを決定するため、前角パンチを、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法によって分析した。ＳＯＤ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡレベルを、ベータアクチン（ＡＣＴＢ）ｍＲＮＡレベル、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡレベルおよびペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ｍＲＮＡレベルの幾何平均に対して正規化した。正規化ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルは、媒体対照で処置した動物に由来する前角パンチにおける正規化ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルと比べて表されている。
６．９Ｅ＋１１ｖｇ／注射で処置したブタのＣ１〜Ｌ１に由来する前角パンチにおいて、有意なＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンが明らかであった。ｍＲＮＡノックダウンを、媒体対照処置動物に由来する前角パンチにおけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルと比べて評価した。結果は表２２ａに示されている。同様のＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルが、脊髄の両側に由来する前角パンチで得られた。一元配置ＡＮＯＶＡおよびシダック多重比較検定は、脊髄の各レベルにおいて有意なＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを示した（Ｃ１〜Ｔ５左側 ｐ＜０．０００１；Ｔ２右側 ｐ＜０．００１；Ｌ１ ｐ＜０．０１）。表２２ａに示されるように、注射に最も近い脊髄分節は、最も大きなＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを呈した。脊髄分節Ｃ１〜Ｔ１２は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡのロバストで有意なノックダウンを示した（およそ５０〜７５％ノックダウン）。ベクター注射の部位から離れた脊髄分節Ｌ１でさえ、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの有意なノックダウンが観察された（およそ３０％ノックダウン）。
Figure 2021529513
 ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）で得られたＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベル（表１１）を、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）で得られたレベル（表２２ａ）と比較することにより、同様のＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンが、レンチウイルス由来フィラーを含むＡＡＶ（合計で１．６Ｅ＋１２ｖｇ）またはアルブミン由来フィラーを含むＡＡＶ（合計で１．４Ｅ＋１２ｖｇ）の両方で達成されたことが示された。
より低用量のｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）を注射したブタの結果を表２２ｂに示す。
Figure 2021529513
 ２つの用量のうちの低い方（２．３Ｅ＋１０ｖｇ／注射）を注射したブタは、脊髄分節Ｃ２〜Ｃ８の前角パンチにおいてＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを示した。同様のＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルが、脊髄の両側に由来する前角パンチで得られた。二元配置ＡＮＯＶＡおよびシダック多重比較検定は、脊髄の各レベルにおいて有意なＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンを示した（Ｃ３〜Ｃ５ ５０％ノックダウンでｐ＜０．０００１）。
６．９Ｅ＋１１ｖｇ／注射で得られたＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを、２．３Ｅ＋１０ｖｇ／注射で得られたＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルと比較した。二元配置ＡＮＯＶＡおよびシダック多重比較検定は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンが、以下の脊髄分節において低用量群では有意により低いことを示した：Ｃ１右側、Ｃ２右側、Ｃ７、Ｃ８右側、Ｔ１〜Ｔ４、Ｔ７左側、Ｔ１０右側、Ｔ１２右側（ｐ＜０．０００１）；Ｃ１左側、Ｔ５（ｐ＜０．００１）；Ｃ２左側、Ｔ７右側、Ｔ１２左側（ｐ＜０．０１；Ｃ５左側、およびＬ１（ｐ＜０．０５）。注射部位Ｃ３〜Ｃ５では、ノックダウンに有意差は観察されなかった。
ベクターゲノム生体内分布を、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）の両用量についてデジタル液滴ＰＣＲで測定した。両用量レベルの結果を、１二倍体細胞（ｄｃ）当たりのベクターゲノム（ｖｇ）の平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表２３に示す。
Figure 2021529513
 高用量（６．９Ｅ＋１１ｖｇ／注射）群では、注入部位に最も近い頸部脊髄の前角パンチにおいて１二倍体細胞当たりのベクターゲノムコピー数が高いことが示された。次いて、ベクターゲノムコピー数は、Ｃ３からＣ１脊髄レベルへと、およびＣ７からＴ１脊髄レベルへと急激に低下し（＞１０倍）、その後Ｔ４からＬ１までは一定に保持された。両用量群のベクターゲノムコピー数の平均の比を算出し、表２４に示す。表中、ＶＨは前角を示す。
Figure 2021529513
 ベクターゲノム分布レベルは、注射部位付近を除いて、脊髄の両側で類似していることが見出された。注射部位付近での高用量（６．９Ｅ＋１１ｖｇ／注射）群と低用量（２．３Ｅ＋１０ｖｇ／注射）群とのベクターゲノムの比は、用量の３０倍の差異に類似するが、この比は、注射部位に対して遠位の領域（Ｔ５〜Ｌ１）では徐々に１〜３倍に減少した。
表２５に示されるように、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）およびｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）で同様のベクターゲノム分布が観察された。表中、ＶＨは前角を示す。
Figure 2021529513
 同様のベクターゲノム分布が観察され、ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（レンチ）でより多くのベクターゲノムが観察される傾向があった（小さいものの）。Ｃ５において２群間の最大の差異が観察され、レンチウイルス由来フィラー配列を含むベクターは、アルブミン由来フィラー配列を含むベクターよりも４〜９倍高い値を示した。Ｔ４右側、Ｔ７右側およびＴ１２右側で、２群間のベクターゲノム分布の統計的に有意差が観察された（ｐ＜０．０１）。
脊髄のＣ３注射部位に由来する組織切片のＨ＆Ｅ染色を使用して、組織病理学的分析を実施した。媒体対照と比べた組織病理の変化を、表２６に示されているすべてのコンストラクトについて評価した。試料を、以下のものの１つにグレード分けした：グレード１：コンストラクトと媒体との差異が最小限、グレード２：差異が軽度、グレード３：差異が中程度、グレード４：差異が顕著、またはグレード５：差異が重大。表２６では、グレードの隣の括弧内の数字は、表記の表現型を示した標本（ブタ）の頭数を示す。
Figure 2021529513
 ＡＡＶ処置群において、最小限から軽度の変化が観察された。
ブタＳＯＤ１ ｍＲＮＡおよびベクターゲノムのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を、媒体またはｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉｒ１０４−７８８．２（アルブミン）で処置した動物に由来する頸部脊髄および胸部脊髄の断面に対して実施した。ＡＡＶ処置動物では、前角の両側の運動ニューロンにおいてベクターゲノムシグナルが観察された。ｖｇシグナルは、注射に最も近い側の運動ニューロンでより豊富だった。大きな運動ニューロンでは、内因性ＳＯＤ１ ｍＲＮＡシグナルの実質的な低減が吻側尾側勾配で観察され、低減は頸部領域で最も強力だった。ＡＡＶを注射した動物のＣ５脊髄分節の両側の前角の運動ニューロンにおいて、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡシグナルの劇的な低減が観察された。ＩＳＨによるＳＯＤ１ ｍＲＮＡの低減は、ｂＤＮＡによって評価した前角パンチのＳＯＤ１ ｍＲＮＡノックダウンと相関していた。
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本開示に係る具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、またはルーチンに過ぎない実験を用いて確かめることが可能であろう。本開示の範囲が上記の説明に限定されることは意図されず、それはむしろ添付の特許請求の範囲に示されるとおりである。
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反する旨が示されない限り、または文脈上特に明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。ある群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含むクレームまたは説明は、反する旨が示されない限り、または文脈上特に明らかでない限り、その群メンバーの１つ、２つ以上、または全てが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する場合に満たされるものと見なされる。本開示は、群の正確に１つのメンバーが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する実施形態を含む。本開示は、２つ以上の、または全部の群メンバーが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する実施形態を含む。
また、用語「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は非限定的（ｏｐｅｎ）であることが意図され、追加の要素または工程の包含を許容するが必須ではないことも注記される。用語「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用されるとき、したがって用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」もまた包含され、開示される。
範囲が提供されるとき、端点は含まれる。更に、特に指示されない限り、または文脈および当業者の理解から特に明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈上特に明確に指示されない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１に至るまでの、本開示の種々の実施形態において明示される範囲内にある任意の具体的な値または部分的範囲を想定し得ることが理解されるべきである。
加えて、先行技術に含まれる本開示の任意の特定の実施形態は、クレームの任意の１つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。かかる実施形態は当業者に公知であると見なされるため、除外が本明細書に明示的に示されないとしても、それらは除外され得る。本開示の組成物の任意の詳細な実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療薬または活性成分；任意の作製方法；任意の使用方法等）が、先行技術の存在に関係するか否かに関わらず、何らかの理由で任意の１つ以上のクレームから除外されることがある。
使用した文言は、限定でなく、むしろ説明の文言であること、およびその広義の態様における本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が行われ得ることが理解されるべきである。
本開示をかなり詳しく、幾つかの説明される実施形態に関するある具体性をもって説明したが、それが任意のかかる具体例もしくは実施形態または任意の具体的な実施形態に限定されるべきであることを意図するものではなく、しかし先行技術を考慮してかかる特許請求の範囲の最も広義の可能な解釈を提供し、したがって本開示の意図される範囲を有効に包含するように添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
引用された情報源、例えば本明細書で引用された参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリー、および技術はすべて、たとえ引用において明示的に記載されていなくとも、参照により本出願に援用される。引用された情報源の記載と本出願の記載が矛盾する場合、本出願の記載が優先するものとする。
セクションおよび表の見出しは、限定を意図しない。

Claims (36)

  1. 細胞におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための方法であって、対象の１つ以上の部位に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物を実質内送達によって投与する工程を含み、前記ＡＡＶベクターは、細胞におけるＳＯＤ１の発現を阻害または抑制するための、２つの末端逆位反復（ＩＴＲ）間に配置された核酸配列を含み、前記核酸配列は、センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含み、前記センス鎖配列は、配列番号７のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖配列は、配列番号８のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記センス鎖配列および前記アンチセンス鎖配列は、少なくとも４ヌクレオチド長の相補性の領域を共有する、方法。
  2. ＳＯＤ１の発現が阻害または抑制される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＳＯＤ１は、野生型ＳＯＤ１、少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１、または野生型ＳＯＤ１および少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１の両方である、請求項２に記載の方法。
  4. ＳＯＤ１の発現が約２０％〜約１００％阻害または抑制される、請求項２に記載の方法。
  5. 前記核酸配列は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ＩＴＲを含む２つの末端逆位反復（ＩＴＲ）間に配置された前記核酸配列は、配列番号２５からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記相補性の領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記相補性の領域は、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記相補性の領域は、１９ヌクレオチド長である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記センス鎖配列および前記アンチセンス鎖は、独立に３０ヌクレオチド以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  11. 細胞におけるＳＯＤ１の発現を阻害または抑制するための、２つの末端逆位反復（ＩＴＲ）間に配置された核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記核酸配列は、センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含み、前記センス鎖配列は、配列番号７のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖配列は、配列番号８のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記センス鎖配列および前記アンチセンス鎖配列は、少なくとも４ヌクレオチド長の相補性の領域を共有する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
  12. 配列番号９を含むポリヌクレオチド配列。
  13. 配列番号２５からなるポリヌクレオチド配列。
  14. ＡＡＶカプシドにパッケージングされた配列番号２５を含むベクターゲノム配列を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
  15. 前記ＡＡＶカプシドの血清型は、ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶ９から選択される、請求項１４に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
  16. 前記ベクターゲノムは、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である、請求項１４に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
  17. 治療を必要としている対象の神経変性疾患または脊髄関連疾患を治療および／または改善する方法であって、前記対象の２つ以上の部位に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む治療有効量の組成物を実質内送達によって投与する工程を含み、前記ＡＡＶベクターは、細胞における前記神経変性疾患または前記脊髄関連疾患に関連する遺伝子の発現を阻害または抑制するための、２つの末端逆位反復（ＩＴＲ）間に配置された核酸配列を含み、前記核酸配列は、センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含み、前記センス鎖配列は、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖配列は、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記センス鎖配列および前記アンチセンス鎖配列は、少なくとも４ヌクレオチド長の相補性の領域を共有する、方法。
  18. 前記相補性の領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記相補性の領域は、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記相補性の領域は、１９ヌクレオチド長である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記センス鎖配列および前記アンチセンス鎖は、独立に３０ヌクレオチド以下である、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３−３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２−１ｂ、ＡＡＶ４２−２、ＡＡＶ４２−３ａ、ＡＡＶ４２−３ｂ、ＡＡＶ４２−４、ＡＡＶ４２−５ａ、ＡＡＶ４２−５ｂ、ＡＡＶ４２−６ｂ、ＡＡＶ４２−８、ＡＡＶ４２−１０、ＡＡＶ４２−１１、ＡＡＶ４２−１２、ＡＡＶ４２−１３、ＡＡＶ４２−１５、ＡＡＶ４２−ａａ、ＡＡＶ４３−１、ＡＡＶ４３−１２、ＡＡＶ４３−２０、ＡＡＶ４３−２１、ＡＡＶ４３−２３、ＡＡＶ４３−２５、ＡＡＶ４３−５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１−７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１−８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２−１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２−３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２−４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２−５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３−９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３−１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４−９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４−１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５−３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５−２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ−１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ−５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ−１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ−４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１−８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ、ＡＡＶ−ＬＫ０１、ＡＡＶ−ＬＫ０２、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０４、ＡＡＶ−ＬＫ０５、ＡＡＶ−ＬＫ０６、ＡＡＶ−ＬＫ０７、ＡＡＶ−ＬＫ０８、ＡＡＶ−ＬＫ０９、ＡＡＶ−ＬＫ１０、ＡＡＶ−ＬＫ１１、ＡＡＶ−ＬＫ１２、ＡＡＶ−ＬＫ１３、ＡＡＶ−ＬＫ１４、ＡＡＶ−ＬＫ１５、ＡＡＶ−ＬＫ１６、ＡＡＶ−ＬＫ１７、ＡＡＶ−ＬＫ１８、ＡＡＶ−ＬＫ１９、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ−２−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１０１、ＡＡＶ−８ｈ、ＡＡＶ−８ｂ、ＡＡＶ−ｈ、ＡＡＶ−ｂ、ＡＡＶ ＳＭ１０−２、ＡＡＶシャッフル１００−１、ＡＡＶシャッフル１００−３、ＡＡＶシャッフル１００−７、ＡＡＶシャッフル１０−２、ＡＡＶシャッフル１０−６、ＡＡＶシャッフル１０−８、ＡＡＶシャッフル１００−２、ＡＡＶ ＳＭ １０−１、ＡＡＶ ＳＭ １０−８、ＡＡＶ ＳＭ １００−３、ＡＡＶ ＳＭ １００−１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、ジャパニーズＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．１、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．１０、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．２、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．５、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．７、ＡＡＶ ＣＢｒ−７．８、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｂ７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｂ７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ１、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ２、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ３、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ４、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ−ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ６、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ７、ＡＡＶ ＣＢｒ−Ｅ８、ＡＡＶ ＣＨｔ−１、ＡＡＶ ＣＨｔ−２、ＡＡＶ ＣＨｔ−３、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．１、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．１０、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．５、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．６、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．７、ＡＡＶ ＣＨｔ−６．８、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ１、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ２、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ５、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ８、ＡＡＶ ＣＨｔ−Ｐ９、ＡＡＶ ＣＫｄ−１、ＡＡＶ ＣＫｄ−１０、ＡＡＶ ＣＫｄ−２、ＡＡＶ ＣＫｄ−３、ＡＡＶ ＣＫｄ−４、ＡＡＶ ＣＫｄ−６、ＡＡＶ ＣＫｄ−７、ＡＡＶ ＣＫｄ−８、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ１、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ２、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ３、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ４、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ５、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ６、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ７、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｂ８、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ１、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ２、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ３、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ４、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ５、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｈ６、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｎ３、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｎ４、ＡＡＶ ＣＫｄ−Ｎ９、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ１、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ２、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ３、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ４、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ５、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ６、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ７、ＡＡＶ ＣＬｇ−Ｆ８、ＡＡＶ ＣＬｖ−１、ＡＡＶ ＣＬｖ１−１、ＡＡＶ Ｃｌｖ１−１０、ＡＡＶ ＣＬｖ１−２、ＡＡＶ ＣＬｖ−１２、ＡＡＶ ＣＬｖ１−３、ＡＡＶ ＣＬｖ−１３、ＡＡＶ ＣＬｖ１−４、ＡＡＶ Ｃｌｖ１−７、ＡＡＶ Ｃｌｖ１−８、ＡＡＶ Ｃｌｖ１−９、ＡＡＶ ＣＬｖ−２、ＡＡＶ ＣＬｖ−３、ＡＡＶ ＣＬｖ−４、ＡＡＶ ＣＬｖ−６、ＡＡＶ ＣＬｖ−８、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ２、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ３、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ４、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ５、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ６、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ７、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｄ８、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｅ１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｋ１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｋ３、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｋ６、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｌ４、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｌ５、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｌ６、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ１１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ２、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ５、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ６、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ７、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ８、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｍ９、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ１、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ２、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ３、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ４、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ５、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ６、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ７、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ８、ＡＡＶ ＣＬｖ−Ｒ９、ＡＡＶ ＣＳｐ−１、ＡＡＶ ＣＳｐ−１０、ＡＡＶ ＣＳｐ−１１、ＡＡＶ ＣＳｐ−２、ＡＡＶ ＣＳｐ−３、ＡＡＶ ＣＳｐ−４、ＡＡＶ ＣＳｐ−６、ＡＡＶ ＣＳｐ−７、ＡＡＶ ＣＳｐ−８、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．１０、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．２、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．４、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．５、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．６、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．７、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．８、ＡＡＶ ＣＳｐ−８．９、ＡＡＶ ＣＳｐ−９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ−３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、



    ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ、Ｇ２Ｂ−２６、Ｇ２Ｂ−１３、ＴＨ１．１−３２、ＴＨ１．１−３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５およびこれらのバリアントからなる群から選択されるカプシド血清型を含む、請求項１７に記載の方法。
  23. 前記カプシド血清型は、ＡＡＶｒｈ．１０である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＡＡＶベクターはプロモータを含み、前記プロモータはＨ１である、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記ＡＡＶは、フィラー配列を含む、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記フィラー配列は、レンチウイルス由来フィラー配列およびアルブミン遺伝子由来フィラー配列から選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 実質内送達による前記投与工程は、脊髄内の２つの部位で生じる、請求項１または１７に記載の方法。
  28. 実質内送達による前記投与は、頸部脊髄内の２つの部位で生じる、請求項１または１７に記載の方法。
  29. 投与のための前記２つの部位は、脊髄のレベルＣ３およびＣ５である、請求項１または１７に記載の方法。
  30. 投与の容積は、脊髄のレベルＣ３では約５ｕＬ〜約２４０μＬであり、脊髄のレベルＣ５では約５μＬ〜約２４０μＬである、請求項１または１７に記載の方法。
  31. 投与の容積は、脊髄のレベルＣ３では約５ｕＬ〜約６０μＬであり、脊髄のレベルＣ５では約５μＬ〜約６０μＬである、請求項１または１７に記載の方法。
  32. 前記投与の容積は、脊髄のレベルＣ３では約２５〜約４０μＬであり、脊髄のレベルＣ５では約２５〜約４０μＬである、請求項３１に記載の方法。
  33. 用量は、脊髄のレベルＣ３では約１×１０１０ｖｇ〜約１×１０１２ｖｇであり、脊髄のレベルＣ５では約１×１０１０ｖｇ〜約１×１０１２ｖｇである、請求項１または１７に記載の方法。
  34. 前記用量は、脊髄のレベルＣ３では約５×１０１１ｖｇ〜約８×１０１１ｖｇであり、脊髄のレベルＣ５では約５×１０１１ｖｇ〜約８×１０１１ｖｇである、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記用量は、脊髄のレベルＣ３では約２×１０１０ｖｇ〜約７×１０１１ｖｇであり、脊髄のレベルＣ５では約２×１０１０ｖｇ〜約７×１０１２ｖｇである、請求項３３に記載の方法。
  36. 注射速度は、５μＬ／分である、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
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