JP5328244B2

JP5328244B2 - 筋萎縮性側索硬化症治療剤

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Publication number: JP5328244B2
Application number: JP2008177279A
Authority: JP
Inventors: 穰衛池田; 等大須賀; 一則田中
Original assignee: NEUGEN PHARMA Inc
Current assignee: NEUGEN PHARMA Inc
Priority date: 2008-07-07
Filing date: 2008-07-07
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2028-07-07
Also published as: US20110105517A1; JP2010013425A; WO2010004837A1

Description

本発明は、ブロモクリプチン又はその薬理上許容し得る塩を有効成分として含有する筋萎縮性側索硬化症治療剤に関する。

筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）は、上位運動ニューロン及び下位運動ニューロンがほぼ選択的に障害される進行性の神経変性疾患であり、脊髄及び大脳の運動神経細胞が変性、脱落するため、重篤な筋萎縮、痙縮等をきたし、最終的には呼吸筋の麻痺により発症から数年で死に至る難病である。

しかしながら、ＡＬＳは、その病因がまだ十分には解明されておらず、有効な治療方法も確立されていない。また、現在、唯一承認されているＡＬＳ治療剤のリルゾール（商品名：リルテック、ローヌ・プーラン・ローラー（株））は、その有効性を疑問視する声もあり、新たな治療剤の開発が切望されている。

現在、世界中でＡＬＳ治療剤の開発が進められている。その開発のアプローチのひとつとして、ＡＬＳの原因仮説に基づく探索が挙げられる。主な原因仮説としては、興奮性アミノ酸説、免疫異常説、酸化ストレス説、神経栄養因子欠乏説等がある。これまで、既存の承認薬や化合物について、これらの仮説に基づいた検討がなされているが、有効に治療剤として用いることができるものはほとんど見つかっていないのが現状である。例えば、酸化ストレス説に基づき、ビタミンＥ、クレアチンといった抗酸化剤の臨床治験が行われたが、いずれも不成功に終わっている。
三本博、「筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療戦略」、ＢＲＡＩＮａｎｄＮＥＲＶＥ、２００７年４月、第５９巻、第４号、ｐ．３８３−３９１ＴｒａｙｎｏｒＢＪ，ＢｒｕｉｊｎＬ，ＣｏｎｗｉｔＲ，ＢｅａｌＦ，Ｏ’ＮｅｉｌｌＧ，ｅｔａｌ、ＮｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｓｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓｉｎＡＬＳ：ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６７、２０−２７、２００６

本発明の目的は、難治性疾患であるＡＬＳの治療剤を提供することである。具体的には、ＡＬＳの症状を緩和させたり、進行を遅延させたりすることができる、安全且つ有効な治療剤を提供することである。

本発明者らは、ＡＬＳに効果的な薬剤を見出すべく鋭意研究を行ってきたところ、パーキンソン病の治療剤として承認されているメシル酸ブロモクリプチン（商品名：パーロデル、ノバルティス・ファーマ（株））に、ＡＬＳの症状進行遅延効果があることを見出した。

以下に、本発明者らがメシル酸ブロモクリプチンにＡＬＳの症状改善効果を見出した経緯を述べる。

上述のように、ＡＬＳの原因仮説のひとつとして酸化ストレス説がある。そこで、酸化ストレス性細胞死を選択的に抑制する低分子化合物を探索するために、その標的として神経細胞アポトーシス阻害蛋白質（ＮＡＩＰ）がかかわる細胞死抑制経路に注目した。ＮＡＩＰは、下位運動ニューロンの変性、脱落を特徴とする脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の重篤度にかかわる因子として同定されたものであり、低酸素や炎症、酸化ストレス等の刺激で活性化されることが明らかとなっている。そして、その機能としては、酸化ストレス性細胞死の選択的且つ特異的な抑制、パーキンソン病ラットモデルでのドーパミン作動性ニューロンの細胞死抑制等が報告されている。これらの知見により、ＮＡＩＰは、活性酸素種による神経細胞死に対する生体内防御因子として機能していると推測される。本発明者らは、この点に着目し、内因性ＮＡＩＰがかかわる細胞死抑制経路を標的とする活性化合物のスクリーニング法を開発し、既存の承認薬や化合物等の神経向性化合物群から酸化ストレス性細胞死抑制活性の強い化合物を選抜したところ、メシル酸ブロモクリプチンが得られた。

そこで、東北大学の糸山博士らの研究グループにより作製された緩徐進行型ＡＬＳ病態モデル動物（マウス）であるＳＯＤ１^Ｈ４６Ｒを用いて、メシル酸ブロモクリプチンの薬効を評価したところ、ＡＬＳ病態モデルマウスの神経症候発現後の投与試験において有効性が認められた。本発明は、かかる事実に基づき完成するに至ったものである。

すなわち、本発明によれば、ブロモクリプチン又はその薬理上許容し得る塩を有効成分として含有するＡＬＳの治療剤が提供される。本発明の好ましい態様としては、ブロモクリプチンの塩はメシル酸塩である。

本発明の治療剤は、ＡＬＳの患者に投与することで、その症状を緩和させたり、進行を遅延させたりすることができる。また、本発明の治療剤が含有する有効成分は、既存の承認薬であるので、安全性にも問題がない。

本発明の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）治療剤は、ブロモクリプチン又はその薬理上許容し得る塩を有効成分として含有することを特徴とする。

本発明の治療剤において、有効成分として用いられるブロモクリプチンは、フリーラジカルスカベンジャーの１種である。したがって、酸化ストレスに対する細胞死の抑制活性を有すると考えられる。

ブロモクリプチンのメシル酸塩であるメシル酸ブロモクリプチンは、医薬品として、パーキンソン症候群、末端肥大症、下垂体性巨人症、高プロラクチン血性下垂体腺腫、高プロラクチン血性排卵障害、産褥性乳汁分泌抑制、及び乳汁漏出症に対する効果が知られている。

本発明では、ブロモクリプチンは、米国特許第３７５２８１４号明細書、米国特許第３７５２８８８号明細書等に記載された方法又はこれらに準ずる方法に従って製造することができるし、市販品であるメシル酸ブロモクリプチン（商品名：パーロデル、ノバルティス・ファーマ（株））を用いることもできる。

本発明の治療剤において、有効成分として用いられるブロモクリプチンは、遊離の形態の他、薬理上許容し得るその塩を用いることができる。本発明において、薬理上許容し得る塩とは、ブロモクリプチンの生物学的有効性及び性質を保持し、且つ適当な非毒性有機酸又は無機酸から形成される、通常の塩を意味する。酸付加塩には、例えば、塩酸、硫酸、臭化水素、リン酸、ヨウ化水素酸、スルファミン酸、硝酸等の無機酸由来のものや、メシル酸、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、シュウ酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸等の有機酸由来のものが挙げられる。中でも、メシル酸が上述のように市販品を入手できる点において好ましい。

本発明で用いられるブロモクリプチン及びその薬理上許容し得る塩には、全ての異性体が含まれる。例えば、不斉炭素の存在等による異性体（Ｒ体、Ｓ体、α配置、β配置、エナンチオマー、ジアステレオマー）、旋光性を有する光学活性体（Ｄ体、Ｌ体、ｄ体、ｌ体）、クロマトグラフ分離による極性体（高極性体、低極性体）、これらの任意の割合の混合物、ラセミ混合物は、全て本発明に含まれる。

本発明の治療剤の投与経路は、特に限定されず、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内等への注射、あるいは吸入等）に投与することができる。

経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤等が挙げられる。

本発明の治療剤としては、有効成分であるブロモクリプチン又はその塩をそのまま患者に投与してもよいが、好ましくは、有効成分と薬理上及び製剤上許容しうる添加物とを含む医薬組成物の形態の製剤として投与すべきである。有効成分と薬理上及び製剤上許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤（コーティング剤）、色素、希釈剤、基剤、溶解剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、粘着剤等を用いることができる。

賦形剤としては、例えば、ブドウ糖、乳糖、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、デンプン、リン酸カルシウム等を挙げることができる。

崩壊剤としては、例えば、前記賦形剤と同様の化合物又はクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。

結合剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン又は前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。

滑沢剤（コーティング剤）としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン、白糖、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。

溶解剤としては、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等を挙げることができる。

等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等を挙げることができる。

安定化剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸等を挙げることができる。

本発明の治療剤は、ＡＬＳを罹患するヒトを含む任意の動物に投与することができるが、好ましくはヒトに投与される。

本発明の治療剤は、他の薬剤と組み合わせて用いてもよい。他の薬剤との組み合わせは、配合剤のように同一の医薬組成物中に含むものであってもよいし、別々の医薬組成物中に含むものであってもよい。

本明細書でいう治療とは、進行を遅延することを目的とした治療、あるいは症状の緩和・軽減を目的とした治療の全てを含む広い意味を有する。

本発明の治療剤の投与量は、疾患の進行状況又は症状の程度、患者の年齢や体重等の諸条件に応じて適宜選択可能である。例えば、成人に対して１日当たり１．２５〜２２．５ｍｇ程度を１回又は数回に分けて投与することが好ましい。

なお、本発明の治療剤の有効成分であるメシル酸ブロモクリプチンは、他の用途（上述のパーキンソン症候群等）において既に臨床に供されており、その毒性については特に問題はない。

以下、実施例を挙げて本発明を詳述するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

本実施例では、酸化ストレスにより誘起される細胞死に対するブロモクリプチンの抑制活性を細胞生存率試験により検討し、ブロモクリプチンの薬効をＡＬＳ−ＳＯＤ１^Ｈ４６Ｒトランスジェニックマウスを用いて検討した。

本実施例では、ブロモクリプチンは、式（１）で表されるメシル酸ブロモクリプチン（ＴＯＣＲＩＳＣｏｏｋｓｏｎＬｔｄ．，Ｃａｔ．Ｎｏ：０４２７）を用いた。

細胞：
ＨｅＬａ細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣＣＣＬ２株）
ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ２２６６株）
培地：
ＨｅＬａ細胞の培養；１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧを含むＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社）
ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の培地；１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧを含むＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社）
試薬：
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ＳＩＧＭＡ社）
メナジオン（ＳＩＧＭＡ社）
アラマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ：Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）
全トランス型レチノイン酸（和光純薬工業株式会社）
カルボキシメチルセルロースナトリウム（カルメロースナトリウム、ＣＭＣ−Ｎａ）（丸石製薬株式会社）
機器：
蛍光プレートリーダー（ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ−ＷｅｌｌＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒＳｅｒｉｅｓ４０００：ＰｅｒＳｐｅｃｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）

［実施例１］
＜細胞生存率試験１：非神経細胞での酸化ストレス性細胞死に対する解析＞
（方法）
ＨｅＬａ細胞を７５ｃｍ^２フラスコに１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ播種し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で１６時間培養後、最終濃度が２．５、５、１０μＭになるようにメシル酸ブロモクリプチンと、１０μＭメシル酸ブロモクリプチン作製時添加量と同量のＤＭＳＯとを添加し、さらに２４時間培養した（メシル酸ブロモクリプチン処理）。なお、ＤＭＳＯのみを加えたものをコントロールとした。メシル酸ブロモクリプチン処理したＨｅＬａ細胞に、最終濃度が０、２０、４０、６０、８０μＭになるようにメナジオンを添加し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養を継続した（酸化ストレス処理）。メナジオンの代わりに０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ溶液で処理したものをブランクとした。４時間の酸化ストレス処理後、１０％アラマーブルーを含む培地に置換し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃でさらに培養した。１６時間の培養後、蛍光プレートリーダーを用い、励起波長５３０ｎｍ／検出波長５８０ｎｍにおける蛍光量を測定することで、生細胞数を判定した。

酸化ストレス剤であるメナジオンに対するメシル酸ブロモクリプチンの細胞死抑制効果の結果を図１に示す。グラフの横軸は、メナジオン濃度、縦軸は、細胞生存率を示す。各条件下での縦軸の数値は、コントロールにおけるメナジオン未処理（０μＭ）条件下での細胞の生存率を１００％とした時の相対値として示している。

（結果）
図１に示すように、メシル酸ブロモクリプチンで前処理したＨｅＬａ細胞の生存率は、メナジオンによる酸化ストレス処理したコントロールの細胞生存率との比較から、メシル酸ブロモクリプチンの濃度に依存して増加を示した。このことから、メシル酸ブロモクリプチンが、酸化ストレスにより誘導される細胞死に対して抑制効果を有することがわかった。

［実施例２］
＜細胞生存率試験２：分化誘導した神経細胞での酸化ストレス性細胞死に対する解析＞
（方法）
ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地に懸濁したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌマイクロプレートに播種し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で２４時間培養した。その後、１０μＭ全トランス型レチノイン酸（ＲＡ）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（ＤＭＥＭ／ＦＢＳ／ＲＡ）培地に置換し、５日目に最終濃度が５、１０、２０、４０μＭになるようにメシル酸ブロモクリプチンと、４０μＭメシル酸ブロモクリプチン作製時添加量と同量のＤＭＳＯとを添加し、さらに２４時間培養した（メシル酸ブロモクリプチン処理）。なお、本実験ではＤＭＳＯのみを加えたものをコントロールとした。ＤＭＳＯ及びメシル酸ブロモクリプチン処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に、最終濃度が０、２０、３０、４０、５０μＭになるようにメナジオンを添加し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養を継続した（酸化ストレス処理）。メナジオンの代わりに０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ溶液で処理したものをブランクとした。４時間の酸化ストレス処理後、１０％アラマーブルーを含む培地に置換し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃でさらに培養した。１６時間の培養後、蛍光プレートリーダーを用い、励起波長５３０ｎｍ／検出波長５８０ｎｍの蛍光量を測定することで、生細胞数を判定した。

酸化ストレス剤であるメナジオンに対するメシル酸ブロモクリプチンの細胞死抑制効果の結果を図２に示す。グラフの横軸は、メナジオン濃度、縦軸は、細胞生存率を示す。各条件下での縦軸の数値は、コントロールにおけるメナジオン未処理（０μＭ）条件下での細胞の生存率を１００％とした時の相対値として示している。

（結果）
図２に示すように、メシル酸ブロモクリプチンで前処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存率は、メナジオンによる酸化ストレス処理したコントロールの細胞生存率との比較から、メシル酸ブロモクリプチンの濃度に依存して増加を示した。このことから、メシル酸ブロモクリプチンは、分化誘導ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においても、酸化ストレスにより誘導される細胞死に対して抑制効果を有することがわかった。

［実施例３］
＜ｉｎｖｉｖｏでの薬効試験＞
（方法）
本試験では、ＡＬＳ１病変型ＳＯＤ１遺伝子（ＳＯＤ１^Ｈ４６Ｒ）を導入・発現するＡＬＳ−ＳＯＤ１^Ｈ４６Ｒトランスジェニックマウスを使用した。マウスは昼夜１２時間サイクル、２３℃の条件下で飼育した。メシル酸ブロモクリプチンは０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）に懸濁した。メシル酸ブロモクリプチンは、ＡＬＳ−ＳＯＤ１^Ｈ４６Ｒトランスジェニックマウスのバランスビームテストでの神経症候が確認された時点（発症）から投与を開始した。メシル酸ブロモクリプチンの各個体の体重当たり投与量は、１０ｍｇ、１ｍｇ／ｋｇとし、個体が死亡するまで１日１回腹腔内投与により行った（メシル酸ブロモクリプチン投与群）。０．５％ＣＭＣ−Ｎａ（５ｍｌ／ｋｇ）のみを投与したマウスをコントロール群（メシル酸ブロモクリプチン非投与群）とした。神経症候の発現評価法には、バランスビームテスト（ステンレス製棒使用；５０ｃｍ長、０．９ｃｍ幅）を用いた。評価基準として５段階のグレードを設定した。なお、グレード３を発症と定めた。以下に評価基準を示す。

＜評価基準＞
グレード５：棒上を後肢の滑りがなく正常に渡る
グレード４：時々後肢を滑らせるが、棒上を渡る
グレード３：頻繁に後肢を滑らすが、棒上を何とか渡る
グレード２：棒上を歩こうとすると落下する
グレード１：棒上に乗れない

メシル酸ブロモクリプチン投与群及び非投与群の運動機能は、垂直昇降試験（ステンレス製棒使用；５０ｃｍ長、０．９ｃｍ幅）により評価した。被検マウスが１７週齢に達した時点から垂直昇降試験を開始した。垂直昇降試験の実施頻度は週１回とし、各マウスにつき５回行い、５回の試験の中の最高値を運動機能値とした。統計解析にはＳＰＳＳ１６．０を使用した。

（結果）
垂直昇降試験によるＡＬＳ−ＳＯＤ１^Ｈ４６Ｒトランスジェニックマウスの運動機能の保持能力は、投与開始時点（１７週齢）ではメシル酸ブロモクリプチン投与群（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝５）及び非投与群（ｎ＝４）間で差は認められなかった（図３参照）。一方、２１週齢時点には、メシル酸ブロモクリプチン投与群では運動機能が保持されていたが、非投与群では顕著な運動機能の低下が確認された（図３参照）。このことから、メシル酸ブロモクリプチン投与により生活の質（ＱＯＬ）が向上されることが明らかとなった。
発症後（発症日：１２５．９±２．８日）の生存期間については、非投与群では２７．８±２．１日（ｎ＝４）であったが、メシル酸ブロモクリプチン投与群では３５．３±６．０日（ｎ＝４）（１ｍｇ／ｋｇ）、３８．０±２．９日（ｎ＝５）（１０ｍｇ／ｋｇ）であり、メシル酸ブロモクリプチン投与群で有意な投与量依存的な延命効果が認められた（図４参照）。

ＨｅＬａ細胞におけるメシル酸ブロモクリプチンの酸化ストレス性細胞死抑制効果を示す図である。分化誘導ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるメシル酸ブロモクリプチンの酸化ストレス性細胞死抑制効果を示す図である。垂直昇降試験によるメシル酸ブロモクリプチン投与ＡＬＳ−ＳＯＤ１^Ｈ４６Ｒマウスの運動機能評価を示す図（箱ひげ図）である。発症後ＡＬＳ−ＳＯＤ１^Ｈ４６Ｒマウスへのメシル酸ブロモクリプチン投与における発症後生存期間（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線）を示す図である。

Claims

ブロモクリプチン又はその薬理上許容し得る塩を有効成分として含有する筋萎縮性側索硬化症治療剤。
前記ブロモクリプチンの塩が、メシル酸塩である請求項１に記載の筋萎縮性側索硬化症治療剤。