ES2862206T3 - Viriones de AAV con inmunorreactividad disminuida y sus usos - Google Patents

Viriones de AAV con inmunorreactividad disminuida y sus usos Download PDF

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Peter Colosi
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Abstract

Una proteína de la cápside de virus adenoasociado (AAV) mutada que cuando está presente en un virión de AAV imparte inmunorreactividad disminuida al virión en comparación con el virión silvestre correspondiente, en donde la mutación comprende al menos una sustitución de aminoácido en la proteína natural, y en donde la sustitución de aminoácido comprende una sustitución del aminoácido que está presente en una posición correspondiente a una posición de la VP2 de la cápside de AAV-2 seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 127.

Description

DESCRIPCIÓN
Viriones de AAV con inmunorreactividad disminuida y sus usos
CAMPO TÉCNICO
La presente divulgación se refiere generalmente a composiciones y métodos para aportar viriones de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) a células. En particular, la presente divulgación trata de viriones de rAAV con inmunorreactividad disminuida (viriones de AAV mutantes), y de métodos para elaborar y usar los mismos.
ANTECEDENTES
Los científicos están descubriendo continuamente genes que están asociados con enfermedades humanas tales como diabetes, hemofilia y cáncer. Los esfuerzos de investigación también han descubierto genes, tales como eritropoyetina (que incrementa la producción de glóbulos rojos), que no están asociados con trastornos genéticos, pero en cambio codifican proteínas que se pueden usar para tratar numerosas enfermedades. Sin embargo, a pesar del progreso significativo en el esfuerzo para identificar y aislar genes, un importante obstáculo al que hace frente la industria biofarmacéutica es cómo aportar seguramente y persistentemente cantidades terapéuticamente eficaces de productos génicos a pacientes.
Generalmente, los productos proteínicos de estos genes se sintetizan en células bacterianas, de levadura, de insecto, de mamífero u otras cultivadas y se aportan a los pacientes mediante inyección directa. La inyección de proteínas recombinantes ha sido satisfactoria, pero tiene varias desventajas. Por ejemplo, a menudo los pacientes requieren inyecciones semanales, y a veces diarias, a fin de mantener los niveles necesarios de la proteína en la corriente sanguínea. Incluso entonces, la concentración de proteína no se mantiene a niveles fisiológicos - habitualmente, el nivel de la proteína es anormalmente alto inmediatamente después de la inyección. Adicionalmente, el aporte inyectado de proteína recombinante a menudo no puede aportar la proteína a las células, los tejidos o los órganos diana en el cuerpo. Y, si la proteína alcanza satisfactoriamente su diana, se puede diluir hasta un nivel no terapéutico. Por otra parte, el método es incómodo y a menudo restringe el estilo de vida del paciente.
Estos inconvenientes han alimentado el deseo de desarrollar métodos de terapia génica para aportar niveles sostenidos de proteínas específicas a pacientes. Estos métodos se diseñan para que los profesionales clínicos introduzcan ácido desoxirribonucleico (ADN) que codifica un ácido nucleico, tal como un gen terapéutico, directamente en un paciente (terapia génica in vivo) o en células aisladas de un paciente o un donante (terapia génica ex vivo). El ácido nucleico introducido se dirige entonces a las propias células del paciente o células injertadas para producir el producto proteínico deseado. Por lo tanto, el aporte génico obvia la necesidad de inyecciones frecuentes. La terapia génica también puede permitir a los profesionales clínicos seleccionar órganos específicos o dianas celulares (p. ej., músculo, células hemáticas, células cerebrales, etc.) para terapia.
El ADN se puede introducir en las células de un paciente de varios modos. Existen métodos de transfección, incluyendo métodos químicos tales como precipitación con fosfato cálcico y transfección mediada por liposomas, y métodos físicos tales como electroporación. En general, los métodos de transfección no son adecuados para el aporte génico in vivo. También existen métodos que usan virus recombinantes. Vectores de aporte génico mediado viralmente actuales incluyen los basados en retrovirus, adenovirus, herpesvirus, poxvirus y virus adenoasociados (AAV). Como los retrovirus, y a diferencia del adenovirus, el AAV tiene la capacidad para integrar su genoma en un cromosoma de célula hospedadora.
Terapia Génica Mediada por Virus Adenoasociados
El AAV es un parvovirus perteneciente al género Dependovirus, y tiene varias características atractivas no encontradas en otros virus. Por ejemplo, el AAV puede infectar una amplia gama de células hospedadoras, incluyendo células que no se dividen. El AAV también puede infectar células de diferentes especies. De forma importante, el AAV no se ha asociado con ninguna enfermedad humana o animal, y no parece perturbar las propiedades fisiológicas de la célula hospedadora tras la integración. Por otra parte, el AAV es estable a una amplia gama de condiciones físicas y químicas, lo que lo adapta a los requisitos de producción, almacenamiento y transporte.
El genoma del AAV, una molécula de ADN monocatenario lineal que contiene aproximadamente 4700 nucleótidos (el genoma de AAV-2 consiste en 4681 nucleótidos), comprende generalmente un segmento no repetitivo interno flanqueado en cada extremo por repeticiones terminales invertidas (ITRs). Las ITRs tienen una longitud de aproximadamente 145 nucleótidos (AAV-1 tiene ITRs de 143 nucleótidos) y tienen múltiples funciones, incluyendo servir como orígenes de replicación y como señales de empaquetamiento para el genoma viral.
La porción no repetida interna del genoma incluye dos marcos de lectura abiertos (ORFs), conocidos como las regiones de replicación (rep) y cápside (cap) del AAV. Estos ORFs codifican los productos génicos de replicación y cápside, respectivamente: los productos génicos (es decir, las proteínas) de replicación y cápside permiten la replicación, el ensamblaje y el empaquetamiento de un virión de AAV completo. Más específicamente, una familia de al menos cuatro proteínas virales se expresa a partir de la región rep de AAV: Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40, todas las cuales se nombran por sus pesos moleculares aparentes. La región cap de AAV codifica al menos tres proteínas: VP 1, VP2 y VP3.
En la naturaleza, AAV es un virus dependiente de virus cooperadores, es decir, requiere la coinfección con un virus cooperador (p. ej., adenovirus, herpesvirus o virus variolovacunal) a fin de formar viriones de AAV funcionalmente completos. En ausencia de coinfección con un virus cooperador, el AAV establece un estado latente en el que el genoma viral se inserta en un cromosoma de célula hospedadora o existe en una forma episomática, pero no se producen viriones infecciosos. La infección posterior por un virus cooperador "rescata" el genoma integrado, permitiendo que se replique y se empaquete en cápsides virales, reconstituyendo de ese modo el virión infeccioso. Aunque el AAV puede infectar células de diferentes especies, el virus cooperador debe ser de la misma especie que la célula hospedadora. Así, por ejemplo, el AAV humano se replicará en células caninas que se hayan coinfectado con un adenovirus canino.
Para construir AAV recombinante (rAAV) infeccioso que contiene un ácido nucleico, una línea de células hospedadoras adecuada se transfecta con un vector de AAV que contiene un ácido nucleico. A continuación, las funciones cooperadoras y funciones accesorias del AAV se expresan en la célula hospedadora. Una vez que estos factores se reúnen, el HNA se replica y se empaqueta como si fuera un genoma de AAV silvestre (wt), formando un virión recombinante. Cuando las células de un paciente se infectan con el rAAV resultante, e1HNA entra y se expresa en las células del paciente. Debido a que las células del paciente carecen de genes rep y cap , así como los genes de funciones accesorias del adenovirus, los rAAV son defectuosos para la replicación; esto es, no pueden replicar y empaquetar adicionalmente sus genomas. De forma similar, sin una fuente de genes rep y cap, no se puede formar wtAAV en las células del paciente.
Existen varios serotipos de AAV que infectan a seres humanos así como otros primates y mamíferos. Se han identificado ocho serotipos principales, de AAV-1 a AAV-8, incluyendo dos serotipos recientemente aislados de macacos de la India. Gao y cols. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11854-11859. De esos serotipos, AAV-2 es el mejor caracterizado, habiéndose usado para aportar satisfactoriamente transgenes a varias líneas celulares, tipos de tejidos, y órganos en una variedad de ensayos in vitro e in vivo . Los diversos serotipos de AAV se pueden distinguir entre sí usando anticuerpos monoclonales o al emplear análisis de secuencias nucleotídicas; p. ej., AAV-1, AAV-2, AAV-3 y AAV-6 son 82% idénticos a nivel nucleotídico, mientras que AAV-4 es de 75 a 78% idéntico a los otros serotipos (Russell y cols. (1998) J. Virol. 72:309-319). Se aprecia una variación significativa de las secuencias nucleotídicas para regiones del genoma de AAV que codifican proteínas de la cápside. Estas regiones variables pueden ser responsables de diferencias en la reactividad serológica hacia las proteínas de la cápside de los diversos serotipos de AAV.
Después de un tratamiento inicial con un serotipo de AAV dado, a menudo se forman anticuerpos neutralizadores anticápside de AAV que evitan tratamientos posteriores por el mismo serotipo. Por ejemplo, Moskalenko y cols. J. Virol. (2000) 74:1761-1766 mostraban que ratones con anticuerpos anti-AAV-2 preexistentes, cuando se administraba Factor IX en un virión de AAV-2 recombinante, no expresaban el transgén del Factor IX, sugiriendo que los anticuerpos anti-AAV-2 bloqueaban la transducción del virión de rAAV-2. Halbert y cols. J. Virol. (1998) 72:9795-9805 presentaron resultados similares. Otros han demostrado la readministración satisfactoria de viriones de rAAV-2 en animales experimentales, pero solo después de que se alcance la inmunosupresión (véase, p. ej., Halbert y cols., anteriormente).
Así, usar rAAV para terapia génica humana es potencialmente problemático debido a que los anticuerpos anti-AAV son predominantes en poblaciones humanas. La infección se seres humanos por una variedad de serotipos de AAV se produce en niños, y posiblemente incluso en el útero. De hecho, un estudio estimaba que al menos 80% de la población general se ha infectado con AAV-2 (Berns y Linden (1995) Bioessays 17:237-245). Anticuerpos anti-AAV-2 neutralizadores se han encontrado en al menos 20-40% de los seres humanos. Los presentes estudios han mostrado que de un grupo de 50 hemofílicos, aproximadamente 40% tenía capacidades neutralizadoras de AAV-2 que superaban 1e13 partículas virales/ml, o aproximadamente 6e16 partículas virales/volumen total de sangre. Por otra parte, la mayoría del grupo con altos títulos de anti-AAV-2 también tenía títulos significativos contra otros serotipos de AAV, tales como AAV-1, AAV-3, AAV-4, AAV-5 y AAV-6. Por lo tanto, la identificación de mutantes de a Av con inmunorreactividad disminuida, tales como mutantes que no son neutralizados por anticuerpos anti-AAV preexistentes, sería un avance significativo en la especialidad. Estos mutantes de AAV se describen en la presente.
WU P Y COLS, JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 74, n° 18, 1 de septiembre de 2000, páginas 8635-8647, divulga numerosas mutaciones en el gen de la cápside de AAV2.
Huttner y cols. BIOSIS PREV200300369032 es un resumen que se refiere a mutaciones de inserción en la proteína de la cápside de AAV.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se basa en el descubrimiento de nuevas secuencias de AAV, tales como secuencias de AAV mutadas, que proporcionan viriones de AAV recombinantes con inmunorreactividad disminuida en comparación con el serotipo natural correspondiente pero que retienen la capacidad para transducir eficazmente células y tejidos. Los viriones de rAAV con inmunorreactividad disminuida son especialmente útiles para aportar moléculas de ácido nucleico heterólogo (HNAs) a sujetos que han sido expuestos previamente a AAV, bien mediante infección natural o bien debido a tratamientos de terapia génica o inmunización con ácidos nucleicos previos, y por lo tanto han desarrollado anticuerpos anti-AAV. Por lo tanto, los viriones de rAAV descritos en la presente son útiles para tratar o prevenir una amplia variedad de trastornos, como los descritos más adelante, en sujetos vertebrados que se han expuesto previamente a cualquiera de los diversos serotipos de AAV. Entonces, según la presente divulgación, los métodos y los vectores de AAV para el uso en la presente se proporcionan para el aporte eficaz de HNAs a las células o el tejido de un sujeto vertebrado, tal como un mamífero, usando viriones de AAV recombinantes.
En ciertas realizaciones preferidas, la presente divulgación proporciona el uso de viriones de AAV que contienen proteínas de la cápside perturbadas para aportar un HNA que codifica ARN antisentido, ribozimas o uno o más genes que expresan proteínas, en donde la expresión de dicho ARN antisentido, ribozimas o uno o más genes proporciona un efecto biológico en un sujeto mamífero. En una realización, los viriones de rAAV que contienen un HNA se inyectan directamente en un músculo (p. ej., músculo cardíaco, liso y/o esquelético). En otra realización, los viriones de rAAV que contienen un HNA se administran a la vasculatura a través de inyección en venas, arterias u otros conductos vasculares, o al usar técnicas tales como perfusión de extremidades aisladas.
En realizaciones adicionales, los viriones contienen un gen que codifica una proteína de coagulación sanguínea que, cuando se expresa en una concentración suficiente, proporciona un efecto terapéutico, tal como una mejora de la eficacia de coagulación sanguínea de un mamífero que sufra un trastorno de la coagulación sanguínea. El trastorno de la coagulación sanguínea puede ser cualquier trastorno que afecte adversamente a la capacidad del organismo para coagular la sangre. Preferiblemente, el trastorno de la coagulación de la sangre es hemofilia. Entonces, en una realización, el gen que codifica una proteína de coagulación de la sangre es un gen de Factor VIII, tal como el gen de Factor VIII humano o una de sus derivaciones. En otra realización, el gen que codifica una proteína de coagulación sanguínea es un gen de Factor IX, tal como el gen de Factor IX humano (hF.IX).
Según esto, en una realización, la presente divulgación se dirige a una proteína de la cápside de AAV mutada que cuando está presente en un virión de AAV imparte una inmunorreactividad disminuida al virión en comparación con el virión silvestre correspondiente. La mutación puede comprender al menos una sustitución, eliminación o inserción de aminoácidos en la proteína natural, tal como una sustitución en la región de pico o meseta de la superficie del virión de AAV.
En ciertas realizaciones, la sustitución de aminoácidos comprende una sustitución de uno o más de los aminoácidos que están presentes en una posición correspondiente a una posición de la cápside de VP2 de AAV-2 seleccionada del grupo que consiste en el aminoácido 126, 127, 128, 130, 132, 134, 247, 248, 315, 334, 354, 357, 360, 361, 365, 372, 375, 377, 390, 393, 394, 395, 396, 407, 411, 413, 418, 437, 449, 450, 568, 569 y 571. En realizaciones adicionales, el aminoácido presente en la naturaleza en una o más de estas posiciones está sustituido por una alanina. En realizaciones adicionales, la proteína comprende además una sustitución por histidina del aminoácido que está presente en la posición correspondiente al aminoácido encontrado en la posición 360 de VP2 de AAV-2 y/o una sustitución por lisina del aminoácido que está presente en la posición correspondiente al aminoácido encontrado en la posición 571 de VP2 de AAV-2.
En realizaciones adicionales, la divulgación se dirige a un polinucleótido que codifica cualquiera de las proteínas mutadas descritas anteriormente.
En realizaciones adicionales, la divulgación se dirige a un virión de AAV recombinante que comprende cualquiera de las proteínas mutadas descritas anteriormente. El virión de AAV recombinante puede comprender una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica un ARN antisentido o una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína terapéutica conectada operativamente a elementos de control capaces de dirigir la transcripción y traducción in vivo de dicha proteína.
En otras realizaciones adicionales, la divulgación se dirige a un método para aportar un virión de AAV recombinante a una célula o un tejido de un sujeto vertebrado. El método comprende:
(a) proporcionar un virión de AAV recombinante como anteriormente;
(b) aportar el virión de AAV recombinante a la célula o el tejido, con lo que la proteína se expresa a un nivel que proporciona un efecto terapéutico.
En ciertas realizaciones, la célula o el tejido es una célula o un tejido muscular. La célula o el tejido muscular se puede derivar de músculo esquelético.
En realizaciones adicionales, el virión de AAV recombinante se aporta a la célula o el tejido in vivo.
En ciertas realizaciones, el virión de AAV recombinante se aporta mediante inyección intramuscular, o a la corriente sanguínea, tal como intravenosamente o intraarterialmente. En realizaciones adicionales, el virión de AAV recombinante se aporta al hígado o al cerebro.
En realizaciones adicionales, el virión de AAV recombinante se aporta a dicha célula o tejido in vitro.
En una realización adicional más, la divulgación se dirige a un método para aportar un virión de AAV recombinante a una célula o un tejido de un sujeto vertebrado.
El método comprende:
(a) proporcionar un virión de AAV recombinante, en donde el virión de AAV comprende
(i) una proteína de la cápside de virus adenoasociado (AAV) de mamífero no primate que cuando está presente en un virión de AAV imparte inmunorreactividad disminuida al virión en comparación con la inmunorreactividad de AAV-2 de primate; y
(ii) una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína terapéutica conectada operativamente a elementos de control capaces de dirigir la transcripción y traducción in vivo de la proteína;
(b) aportar el virión de AAV recombinante a la célula o el tejido, con lo que la proteína se expresa a un nivel que proporciona un efecto terapéutico.
En ciertas realizaciones, la célula o el tejido es una célula o un tejido muscular, tal como una célula o tejido muscular que se deriva de músculo esquelético.
El virión de AAV recombinante se aporta a dicha célula o tejido in vivo o in vitro y se puede aportar al sujeto mediante inyección intramuscular, o a la corriente sanguínea, tal como intravenosamente o intraarterialmente. En realizaciones adicionales, el virión de AAV recombinante se aporta al hígado o al cerebro. Basándose en la presente divulgación, la invención de la que trata la presente memoria descriptiva se indica en las reivindicaciones adjuntas a esta descripción.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 ilustra la localización de una unidad estructural asimétrica (triángulo blanco) de AAV-2 sobre la superficie de todo el virus (tomada de la Fig 3a de Xie y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:10405-10410). Existen 60 unidades estructurales asimétricas idénticas por virión de AAV. Al menos 145 aminoácidos de un total de 735 en cada capsómero de AAV-2 están expuestos, en grados variables, sobre la superficie.
La Figura 2 ilustra la localización de algunos de los aminoácidos que se mutaban según se describe en los ejemplos dentro de una unidad asimétrica (triángulo negro) de la estructura de AAV-2. Los aminoácidos que se mutaban se muestran como modelos de relleno con espacios negros, mientras que los que no estaban mutados se muestran como modelos de picos blancos. Se indica la localización de las principales figuras superficiales (pico, cilindro, meseta, cañón) y los límites aproximados de estas figuras se muestran mediante líneas negras circulares delgadas. Las regiones de "cañón", que se predice que son relativamente inaccesibles para la unión al anticuerpo, se localizan en las zonas entre el pico, el cilindro y la meseta. Los números 2, 3 y 5 representan los ejes de simetría doble, triple y quíntuple, respectivamente.
La Figura 3 indica la localización de mutaciones que tienen un efecto <10 veces sobre la transducción in vitro. Mutaciones localizadas en aminoácidos que rellenan espacios negros, <10% de transducción silvestre. Los números 2, 3 y 5 representan ejes de simetría doble, triple y quíntuple, respectivamente.
La Figura 4 indica la localización de mutaciones que tienen un efecto >10 veces sobre la transducción in vitro. Mutaciones localizadas en aminoácidos que rellenan espacios negros, <10% de transducción silvestre. Los números 2, 3 y 5 representan ejes de simetría doble, triple y quíntuple, respectivamente. Se indican los límites aproximados de dos zonas muertas que abarcan el eje de simetría doble.
La Figura 5 ilustra la localización de algunos de los mutantes de la cápside de AAV-2 defectuosos en la unión a heparina. Los aminoácidos en negro indican mutantes defectuosos en heparina identificados en la presente. Los aminoácidos en negro ilustrados como modelos que rellenan espacios (347, 350, 356, 375, 395, 448, 451) están sobre la superficie. Los aminoácidos en gris ilustrados como modelos que rellenan espacios (495, 592) están justo bajo la superficie. Los números 2, 3 y 5 representan los ejes de simetría doble, triple y quíntuple, respectivamente. Los efectos que tienen un efecto de más de 100 veces sobre la unión a heparina están encerrados en círculos.
La Figura 6 ilustra la localización de algunos de los aminoácidos (modelo de relleno de espacios en negro) sobre la superficie de la cápside de AAV-2 que confieren resistencia a la neutralización por un anticuerpo monoclonal de ratón cuando se mutan individualmente. La caja rectangular representa el tamaño aproximado de un sitio de unión a anticuerpo (25 Á x 35 Á). Los números 2, 3 y 5 representan los ejes de simetría doble, triple y quíntuple, respectivamente.
La Figura 7 ilustra la localización de algunos de los aminoácidos (modelo de relleno de espacios en negro) sobre la superficie de la cápside de AAV-2 que confieren resistencia a la neutralización por múltiples antisueros humanos. La caja rectangular representa el tamaño aproximado de un sitio de unión a anticuerpo (25 Á x 35 Á). Los números 2, 3 y 5 representan los ejes de simetría doble, triple y quíntuple, respectivamente.
La Figura 8 muestra propiedades de titulación de anticuerpos monoclonales de ratón de cuatro mutantes de la cápside de AAV-2 en comparación con AAV-2 con una cápside silvestre.
La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos de una VP2 de AAV-2 (SEQ ID NO:12).
La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de una VP1 de AAV-2 (SEQ ID NO:13).
La Figura 11 muestra las posiciones relativas de las proteínas de la cápside de AAV-2 VP1, VP2 y VP3. Según se muestra en la figura, VP1, VP2 y VP3 comparten los mismos 533 aminoácidos C-terminales que constituyen VP3. Según se muestra en la figura, todos los mutantes de la cápside descritos en la presente se encuentran dentro de la zona compartida.
Las Figuras 12A-12B muestran una comparación de la secuencia nucleotídica que codifica la proteína VP1 de AAV procedente de un AAV-5 de primate (SEQ ID NO:14) y un AAV caprino (SEQ iD NO:15). La numeración es relativa a la secuencia de longitud completa de AAV-5.
La Figura 13 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de VP1 procedente de un AAV-5 de primate (SEQ ID NO: 16) y un AAV caprino (SEQ ID NO: 17). Las diferencias de aminoácidos están sombreadas. Los cambios conservativos se muestras en gris claro; los cambios no conservativos se muestran en gris oscuro.
Las Figuras 14A-14H muestran una comparación de la secuencia de aminoácidos de VP1s procedentes de AAVs que son sensibles o resistentes a neutralización por anticuerpos como sigue: AAV-2 de primate (SEQ ID NO: 13), AAV-3B de primate (SEQ ID NO:18), AAV-6 de primate (SEQ ID NO:19), AAV-1 de primate (SEQ ID NO:20), AAV-8 de primate (SEQ ID NO:21.), AAV-4 de primate (SEQ ID NO:22), AAV-5 de primate (SEQ ID NO:16) y AAV caprino (cabra) (SEQ ID NO: 17). Línea de parvovirus: *, conservada en casi todos los parvovirus. Línea de neutralización: #, localización de mutaciones simples en la cápside de AAV-2 identificadas como resistentes a la neutralización por sueros humanos. Línea de accesibilidad: B, el aminoácido está enterrado entre la superficie interna y externa; I, el aminoácido se encuentra sobre la superficie interna; O, el aminoácido se encuentra sobre la superficie externa. Línea de características superficiales: C, cilindro; P, meseta; S, pico; Y, cañón. Línea de ADN: B, posible contacto de base; D, probablemente requerido para la unión a ADN pero puede no contactar directamente con ADN; P, posible contacto con fosfato; R, posible contacto con ribosa Otra línea: A, localización de mutaciones simples que disminuyen la unión y la neutralización por anticuerpo monoclonal de ratón A20; H, contacto con heparina en AAV-2; M, posible contacto con Mg2+; P, dominio de fosfolipasa A2.
La Figura 15 (SEQ ID NOS: 16 y 17) muestra las posiciones de las diferencias de aminoácidos entre AAV-5 y AAV caprino, con relación a la superficie de la cápside de AAV.
La Figura 16 muestra la localización predicha de los aminoácidos superficiales que difieren entre AAV-5 y AAV caprino, basándose en la estructura superficial de la cápside de AAV-2. Los 3 triángulos rellenos representan inserciones en AAV caprino, con relación a AAV-2, que es probable que estén localizadas sobre la superficie.
La Figura 17 muestra la transducción de músculo en ratones SCID tratados con IVIG después de la administración intramuscular de diversos viriones de rAAV hFIX.
La Figura 18 muestra la transducción del hígado en ratones SCID tratados con IVIG después de la administración en la vena caudal de diversos viriones de rAAV hFIX.
La Figura 19 muestra la biodistribución de factor IX humano (hFIX) después de la administración intravenosa de un vector de AAV caprino recombinante que codifica el mismo.
Las Figuras 20A (SEQ ID NO:25) y 20B (SEQ ID NO:26) muestran la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos, respectivamente, de una VP1 de AAV bovino, procedente de AAV-Cl.
Las Figuras 21A-21H muestran una comparación de la secuencia de aminoácidos de VP1s procedentes de AAVs que son sensibles o resistentes a neutralización por anticuerpos como sigue: AAV-2 de primate (SEQ ID NO: 13), AAV-3B de primate (SEQ ID NO:18), AAV-6 de primate (SEQ ID NO: 19), AAV-1 de primate (SEQ ID NO:20), AAV-8 de primate (SEQ ID NO:21), AAV-4 de primate (SEQ ID NO:22), Aa V bovino (vaca) ("AAV-C1" (SEQ ID NO:26), AAV-5 de primate (SEQ ID NO:16) y AAV caprino (cabra) ("AAV-C1" SEQ ID NO: 17). Línea de parvovirus: *, conservada en casi todos los parvovirus. Línea de neutralización: #, localización de mutaciones simples en la cápside de AAV-2 identificadas como resistentes a la neutralización por sueros humanos. Línea de accesibilidad: B, el aminoácido está enterrado entre la superficie interna y externa; I, el aminoácido se encuentra sobre la superficie interna; O, el aminoácido se encuentra sobre la superficie externa. Línea de características superficiales: C, cilindro; P, meseta; S, pico; Y, cañón. Línea de ADN: B, posible contacto de base; D, probablemente requerido para la unión a ADN pero puede no contactar directamente con ADN; P, posible contacto con fosfato; R, posible contacto con ribosa. Otra línea: A, localización de mutaciones simples que disminuyen la unión y la neutralización por anticuerpo monoclonal de ratón A20; H, contacto con heparina en AAV-2; M, posible contacto con Mg2+; P, dominio de fosfolipasa A2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, métodos convencionales de química, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e inmunología, dentro de la experiencia de la especialidad. Estas técnicas se explican a fondo en la bibliografía. Véanse, p. ej., Fundamental Virology, 2a Edición, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., adición actual); Sambrook, y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edición, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).
1. DEFINICIONES
Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y están destinados a ser definidos según se indica posteriormente.
Se debe apuntar que, según se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno(a)" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contenido dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una mezcla de dos o más polipéptidos.
Las siguientes abreviaturas de aminoácidos se usan a lo largo del texto:
Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R)
Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D)
Cisteína: Cys (C) Glutamina: Gln (Q)
Ácido glutámico: Glu (E) Glicina: Gly (G)
Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I)
Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K)
Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F)
Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S)
Treonina: Thr (T) Triptófano: Trp (W)
Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V)
Por "vector" se entiende cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc., que sea capaz de replicación cuando esté asociado con los elementos de control apropiados y que pueda transferir secuencias génicas entre células. Así, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales.
Por un "vector de AAV" se entiende un vector derivado de cualquier serotipo de virus adenoasociado aislado de cualquier especie animal, incluyendo sin limitación, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-G1 y AAV-C1. Los vectores de AAV pueden tener uno o más de los genes silvestres de AAV eliminados en todo o en parte, preferiblemente los genes rep y/o cap, pero retienen secuencias de ITR de flanqueo funcionales. Las secuencias de ITR funcionales son necesarias para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión de AAV. Así, se define en la presente que un vector de AAV incluye al menos las secuencias requeridas en cis para la replicación y el empaquetamiento (p. ej., ITRs funcionales) del virus. Las ITRs no necesitan ser las secuencias nucleotídicas silvestres, y pueden estar perturbadas, p. ej., mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos, con la condición de que las secuencias proporcionen rescate, replicación y empaquetamiento funcionales.
"Funciones cooperadoras de AAV" se refiere a secuencias codificantes derivadas de AAV que se pueden expresar para proporcionar productos génicos de AAV que, a su vez, funcionen en trans para la replicación productiva de AAV. Así, funciones cooperadoras de AAV incluyen ambos marcos de lectura abierta (ORFs) principales de AAV, rep y cap. Se ha mostrado que los productos de expresión de Rep poseen muchas funciones, incluyendo, entre otras: reconocimiento, unión y mellado del origen de replicación de ADN de AAV; actividad de ADN helicasa; y modulación de la transcripción a partir de promotores de AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión de Cap suministran funciones de empaquetamiento necesarias. Las funciones cooperadoras de AAV se usan en la presente para complementar funciones de AAV en trans ausentes en vectores de AAV.
El término "construcción cooperadora de AAV" se refiere generalmente a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias nucleotídicas que proporcionan funciones de AAV eliminadas de un vector de AAV que se ha de usar para producir un vector de transducción para el aporte de una secuencia nucleotídica de interés. Las construcciones cooperadoras de AAV se usan comúnmente para proporcionar la expresión transitoria de genes rep y/o cap de AAV para complementar funciones de AAV ausentes que son necesarias para la replicación lítica de AAV; sin embargo, las construcciones cooperadoras carecen de ITRs de AAV y no se pueden replicar ni empaquetar. Las construcciones cooperadoras de AAV pueden estar en la forma de un plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se ha descrito un número de construcciones cooperadoras y vectores de AAV que codifican los productos de expresión Rep y/o Cap. Véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. N° 6.001.650, 5.139.941 y 6.376.237; Samulski y cols. (1989) J. Virol.
63:3822-3828; y McCarty y cols. (1991) J. Virol. 65:2936-2945.
El término "funciones accesorias" se refiere a funciones virales y/o celulares no derivadas de AAV de las que el AAV depende para su replicación. Así, el término abarca proteínas y ARNs que se requieren en la replicación de AAV, incluyendo los restos implicados en la activación de la transcripción génica de AAV, el empalme de ARNm de AAV específico de la fase, la replicación de ADN de AAV, la síntesis de productos de expresión de Cap y el ensamblaje de la cápside de AAV. Las funciones accesorias virales se pueden derivar de cualquiera de los virus cooperadores conocidos tales como adenovirus, herpesvirus (distintos al virus del herpes simple tipo 1) y virus variolovacunal.
El término "vector de función accesoria" se refiere generalmente a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias nucleotídicas que proporcionan funciones accesorias. Un vector de función accesoria se puede transfectar a una célula hospedadora adecuada, en donde el vector es capaz entonces de apoyar la producción de viriones de AAV en la célula hospedadora. Se excluyen expresamente del término las partículas virales infecciosas según existen en la naturaleza, tales como partículas de adenovirus, herpesvirus o virus variolovacunal. Así, los vectores de función accesoria pueden estar en la forma de un plásmido, fago, transposón o cósmido.
Se ha demostrado que no se requiere el complemento completo de genes adenovirales para funciones cooperadoras accesorias. En particular, se ha mostrado que mutantes adenovirales incapaces de replicación de ADN y síntesis génica tardía son permisivos para la replicación de AAV. Ito y cols., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi y cols, (1971) Virology 45:317. De forma similar, se ha mostrado que los mutantes dentro de las regiones E2B y E3 apoyan la replicación de AAV, indicando que las regiones E2B y E3 probablemente no están implicadas en el suministro de funciones accesorias. Carter y cols., (1983) Virology 126:505. Sin embargo, los adenovirus deficientes en la región E1, o que tienen una región E4 eliminada, son incapaces de apoyar la replicación de AAV. Así, es probable que las regiones E1A y E4 se requieran para la replicación de AAV, bien directamente o bien indirectamente. Laughlin y cols., (1982) J. Virol. 41:868; Janik y cols., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter y cols., (1983) Virology 126:505. Otros mutantes de Ad caracterizados incluyen: E1B (Laughlin y cols. (1982), anteriormente; Janik y cols. (1981), anteriormente; Ostrove y cols., (1980) Virology 104:502); E2A (Handa y cols., (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss y cols., (1976) J. Virol. 17:140; Myers y cols., (1980) J. Virol. 35:665; Jay y cols., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers y cols., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, en I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed, 1990)); E3 (Carter y cols. (1983), anteriormente); y E4 (Carter y cols.(1983), anteriormente; Carter (1995)). Aunque los estudios de las funciones accesorias proporcionadas por adenovirus que tienen mutaciones en la región codificante de E1B han producido resultados conflictivos, Samulski y cols., (1988) J. Virol. 62:206-210, recientemente presentaron que se requiere E1B55k para la producción de viriones de AAV, mientras que E1B19k no. Además, la Publicación Internacional WO 97/17458 y Matshushita y cols., (1998) Gene Therapy 5:938-945, describen vectores de función accesoria que codifican genes de diversos Ad. Vectores de función accesoria particularmente preferidos comprenden una región codificante de ARN de VA adenoviral, una región codificante de ORF6 de E4 adenoviral, una región de 72 kD de E2A adenoviral, una región codificante de E1A adenoviral y una región E1B adenoviral que carece de una región codificante de E1B55k intacta. Estos vectores se describen en la Publicación Internacional N° WO 01/83797.
Por "virus recombinante" se entiende un virus que se ha perturbado genéticamente, p. ej., mediante la adición o inserción de una construcción de ácido nucleico heteróloga en la partícula.
Por "virión de AAV" se entiende una partícula viral completa, tal como una partícula viral de AAV silvestre (wt) (que comprende un genoma de ácido nucleico de AAV monocatenario lineal asociado con una envuelta proteínica de la cápside de AAV). A este respecto, moléculas de ácido nucleico de AAV monocatenario de cualquier sentido complementario, p. ej., hebras de "sentido" o "antisentido", se pueden empaquetar en un virión de AAV cualquiera y ambas hebras son igualmente infecciosas.
Un "virión de AAV recombinante" o "virión de rAAV" se define en la presente como un virus infeccioso deficiente para la replicación incluyendo una envuelta proteínica de AAV, que encapsida una secuencia nucleotídica heteróloga de interés que está flanqueada en ambos extremos por ITRs de AAV. Un virión de rAAV se produce en una célula hospedadora adecuada que ha tenido un vector de AAV, funciones cooperadoras y funciones accesorias de AAV introducidos en la misma. De este modo, la célula hospedadora se hace capaz de codificar polipéptidos de AAV que se requieren para el empaquetamiento del vector de AAV (que contiene una secuencia nucleotídica recombinante de interés) en partículas de virión recombinante infecciosas para el aporte génico posterior.
Un "virión de AAV recombinante caprino" o "virión de rAAV caprino" es un virión de rAAV según se describe anteriormente que se ha producido usando funciones cooperadoras de AAV que incluyen un gen que codifica una proteína de cápside caprina, tal como VP1 caprina.
Un "virión de AAV recombinante bovino" o "virión de rAAV bovino" es un virión de rAAV según se describe anteriormente que se ha producido usando funciones cooperadoras de AAV que incluyen un gen que codifica una proteína de cápside bovina, tal como VP1 bovina.
El término "transfección" se usa para referirse a la captación de ADN extraño por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección es conocido generalmente en la especialidad. Véanse, p. ej., Graham y cols. (1973) Virology, 52 :456, Sambrook y cols. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis y cols. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu y cols. (1981) Gene 13:197. Estas técnicas se pueden usar para introducir uno o más restos de ADN exógenos, tales como un vector de integración nucleotídica y otras moléculas de ácido nucleico, en células hospedadoras adecuadas.
El término "célula hospedadora" indica, por ejemplo, microorganismos, células de levadura, células de insecto y células de mamífero, que se pueden usar, o se han usado, como receptores de una construcción cooperadora de AAV, un plásmido de vector de AAV, un vector de función accesoria u otro ADN de transferencia. El término incluye la descendencia de la célula original que se ha transfectado. Así, una "célula hospedadora" según se usa en la presente se refiere generalmente a una célula que se ha transfectado con una secuencia de ADN exógena. Se entiende que la descendencia de una sola célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en genómica o complemento de ADN total al progenitor original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada.
Según se usa en la presente, el término "línea celular" se refiere a una población de células capaz de crecimiento y división continuos o prolongados in vitro. A menudo, las líneas celulares son poblaciones clonales derivadas de una sola célula progenitora. Se sabe además en la especialidad que se pueden producir cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o la transferencia de estas poblaciones clonales. Por lo tanto, las células derivadas de la línea celular mencionada pueden no ser precisamente idénticas a las células o los cultivos ancestrales, y la línea celular mencionada incluye estas variantes.
"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos restos de polinucleótido o dos de polipéptido. Dos secuencias de ADN o dos polipeptídicas son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando la secuencia exhiba al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%-85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95%-98% de identidad de secuencia a lo largo de una longitud definida de las moléculas. Según se usa en la presente, sustancialmente homólogas también se refiere a secuencias que muestran una identidad completa con la secuencia de ADN o polipeptídica especificada.
En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o dos secuencias polipeptídicas, respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas al alinear las secuencias, contar el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividir por la longitud de la secuencia más corta y multiplicar el resultado por 100. Se pueden usar programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, tales como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 para el análisis de péptidos. Programas para determinar la identidad de secuencias nucleotídicas están disponibles en the Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI), por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas son fácilmente utilizados con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en the Wisconsin Sequence Analysis Package mencionado anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia nucleotídica particular con una secuencia de referencia se puede determinar usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización por hueco de seis posiciones nucleotídicas.
Otro método para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete de programas MPSRCH con derechos de autor para the University of Edinburgh, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir de este juego de paquetes informáticos, se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman donde se usan parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización por apertura de hueco de 12, penalización por extensión de hueco de uno, y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor de "Coincidencia" refleja la "identidad de secuencia". Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias se conocen generalmente en la especialidad, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, usado con parámetros por defecto. Por ejemplo, se pueden usar BLASTN y BLASTP utilizando los siguientes parámetros por defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = ALTA PUNTUACIÓN; Bases de datos = no redundantes, GenBank EMBL DDBJ PDB traducciones CDS GenBank Swiss protein Spupdate PIR. Los detalles de estos programas son muy conocidos en la especialidad.
Alternativamente, la homología se puede determinar mediante hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido por digestión con una nucleasa o nucleasas específicas para una sola hebra, y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas se pueden identificar en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones rigurosas, según se define para ese sistema particular. Definir las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia de la especialidad. Véanse, p. ej., Sambrook y cols., anteriormente; DNA Cloning, anteriormente; Nucleic Acid Hybridization, anteriormente.
Por el término "variante degenerada" se entiende un polinucleótido que contiene cambios en su secuencia de ácido nucleico, que codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por el polinucleótido del que se deriva la variante degenerada.
Una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar situada 3' con respecto a la secuencia codificante.
El término "heterólogo" cuando se refiere a secuencias de ácido nucleico tales como secuencias codificantes y secuencias de control, indica secuencias que normalmente no están ligadas entre sí y/o normalmente no están asociadas con una célula particular. Así, una región "heteróloga" de una construcción de ácido nucleico o un vector es un segmento de ácido nucleico dentro de o enlazado a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra asociada con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una construcción de ácido nucleico podría incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias no encontradas en asociación con la secuencia codificante en la naturaleza. Otro ejemplo de una secuencia codificante heteróloga es una construcción en la que la propia secuencia codificante no se encuentra en la naturaleza (p. ej., secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen natural). De forma similar, una célula transformada con una construcción que normalmente no está presente en la célula se consideraría heteróloga para los propósitos de esta invención. La variación alélica o los episodios de mutación presentes en la naturaleza no dan lugar a ADN heterólogo, según se usa en la presente.
Una secuencia de "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o ARN. El término abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos básicos conocidos de ADN y ARN, tales como 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxil-metil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-inetilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-hiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.
El término "secuencias de control" de ADN se refiere colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores aguas arriba, orígenes de replicación, sitios internos de entrada al ribosoma ("IRES"), potenciadores y similares, que proporcionan colectivamente la replicación, transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No todas estas secuencias de control necesitan estar siempre presentes con la condición de que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula hospedadora apropiada.
El término "promotor" se usa en la presente en su sentido ordinario para referirse a una región nucleotídica que comprende una secuencia reguladora de ADN, en donde la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de unirse a ARN polimerasa e inicial la transcripción de una secuencia codificante aguas abajo (dirección 3'). Promotores de la transcripción pueden incluir "promotores inducibles" (donde la expresión de una secuencia polinucleotídica conectada operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), "promotores reprimibles" (donde la expresión de una secuencia polinucleotídica conectada operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.) y "promotores constitutivos".
"Conectado operativamente" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes así descritos están configurados de modo que realicen su función habitual. Así, las secuencias de control conectadas operativamente a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificante. Las secuencias de control no necesitan ser contiguas con la secuencia codificante, con la condición de que funcionen para dirigir su expresión. Así, por ejemplo, secuencias intermedias no traducidas ya transcritas pueden estar presentes entre una secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora se puede considerar todavía "conectada operativamente" a la secuencia codificante.
Por "aislada" cuando se hace referencia a una secuencia nucleotídica, se entiende que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. Así, una "molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido particular" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido en cuestión; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afecten perjudicialmente a las características básicas de la composición.
Con el propósito de describir la posición relativa de secuencias nucleotídicas en una molécula de ácido nucleico particular a lo largo de la presente solicitud, tal como cuando se describe que una secuencia nucleotídica particular está situada "aguas arriba", "aguas abajo", "3 prima (3')" o "5 prima (5')" con relación a otra secuencia, se ha de entender que es la posición de las secuencias en la hebra de "sentido" o "codificante" de una molécula de ADN a la que se está haciendo referencia como es convencional en la especialidad.
Un "homólogo funcional" o un "equivalente funcional" de un polipéptido de AAV dado incluye moléculas derivadas de la secuencia polipeptídica natural, así como polipéptidos producidos recombinantemente o sintetizados químicamente que funcionan de un modo similar a la molécula de AAV de referencia para alcanzar un resultado deseado. Así, un homólogo funcional de Rep68 o Rep78 de AAV abarca derivados y análogos de esos polipéptidos — incluyendo cualesquiera adiciones, sustituciones y/o eliminaciones de un solo o múltiples aminoácidos que se producen internamente o en sus extremos amino o carboxi - con la condición de que continúe la actividad de integración.
Por "capaz de transducción eficaz" se entiende que las construcciones mutadas de la divulgación proporcionan vectores o viriones de rAAV que retienen la capacidad para transfectar células in vitro y/o in vivo a un nivel que está dentro de 1-10% de la eficacia de transfección obtenida usando la secuencia silvestre correspondiente. Preferiblemente, el mutante retiene la capacidad para transfectar células o tejidos a un nivel que está dentro de 10-100% de la secuencia silvestre correspondiente. La secuencia mutada puede proporcionar incluso una construcción con capacidad potenciada para transfectar células y tejidos. La eficacia de transducción se determina fácilmente usando técnicas muy conocidas en la especialidad, incluyendo el ensayo de transducción in vitro descrito en los Ejemplos.
Por "inmunorreactividad reducida" se entiende que la construcción de AAV mutada reacciona con anticuerpos anti-AAV a un nivel reducido en comparación con la construcción de AAV silvestre correspondiente. El término "anticuerpo" según se usa en la presente incluye anticuerpos obtenidos a partir de preparaciones tanto policlonales como monoclonales, así como los siguientes: moléculas de anticuerpos híbridos (quiméricos) (véanse, por ejemplo, Winter y cols. (1991) Nature 349:293-299; y la Patente de EE. UU. N° 4.816.567); fragmentos F(ab')2 y F(ab); moléculas de Fv (heterodímeros no covalentes, véanse, por ejemplo, Inbar y cols. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662; y Ehrlich y cols. (1980) Biochem 19:4091-4096); moléculas de Fv monocatenarias (sFv) (véase, por ejemplo, Huston y cols. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883); construcciones de fragmentos de anticuerpos dímeras y trímeras; minicuerpos (véanse, p. ej., Pack y cols. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber y cols. (1992) J Immunology 149B: 120-126); moléculas de anticuerpo humanizado (véanse, por ejemplo, Riechmann y cols. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan y cols. (1988) Science 239:1534-1536; y la Publicación de Patente del R. U. N° GB 2.276.169, publicada el 21 de septiembre de 1994); y cualesquiera fragmentos funcionales obtenidos a partir de estas moléculas, en donde estos fragmentos retienen las propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo original.
Las construcciones mutadas de la presente divulgación pueden tener inmunorreactividad reducida según se determina usando ensayos in vitro y/o in vivo usando cualquiera de los tipos anteriores de anticuerpos que se han generado contra la correspondiente construcción de AAV silvestre. Preferiblemente, la construcción de AAV mutada reaccionará con estos anticuerpos a un nivel al menos 1,5 veces inferior que la construcción silvestre correspondiente, preferiblemente a un nivel al menos 2 veces inferior, tal como al menos 5-10 veces inferior, incluso a un nivel al menos 50-100 veces o al menos 1000 veces inferior que la construcción silvestre correspondiente.
Preferiblemente, la construcción de AAV mutada reacciona a un nivel reducido con anticuerpos neutralizadores anti-AAV. Por ejemplo, las construcciones mutadas serán preferiblemente al menos 1,5 veces más resistentes a la neutralización que el tipo silvestre correspondiente, preferiblemente al menos 2 veces más resistentes a la neutralización, incluso más preferiblemente al menos 5-10 veces o más, tal como al menos 50-100 veces o más resistentes a la neutralización que el tipo silvestre correspondiente, según se determina usando ensayos estándar, tales como los ensayos de neutralización in vitro descritos en la presente
Los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se usan intercambiablemente en la presente y se refieren a un vertebrado, preferiblemente un mamífero. Mamíferos incluyen múridos, roedores, simios, seres humanos, animales de granja, animales deportivos y mascotas.
Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición o un agente, según se proporcionan en la presente, se refieren a un cantidad atóxica pero suficiente de la composición o el agente para proporcionar la respuesta deseada. La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad y la condición general del sujeto, la gravedad de la afección que se trate y la macromolécula particular de interés, el modo de administración y similares. Una cantidad "eficaz” apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto normal en la especialidad usando experimentación habitual.
"Tratar" o "tratamiento" de una enfermedad incluye: (1) prevenir la enfermedad, es decir hacer que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un sujeto que pueda estar expuesto a o predispuesto a la enfermedad pero no experimente o presente todavía síntomas de la enfermedad, (2) inhibir la enfermedad, es decir, detener el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos o (3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos.
2. MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
Aunque un número de métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente se puede usar en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en la presente.
Fundamental para la presente invención es el descubrimiento de nuevas secuencias de AAV mutantes útiles en la producción de viriones de rAAV que presentan inmunorreactividad reducida en comparación con los viriones silvestres correspondientes. Por otra parte, los mutantes retienen preferiblemente otras propiedades del tipo silvestre correspondiente, tales como empaquetamiento de ADN, unión al receptor, purificación cromatográfica y la capacidad para transducir células in vitro e in vivo. Preferiblemente, estas propiedades están dentro de al menos 1-10% de los valores medidos para el tipo silvestre de AAV correspondiente. Más preferiblemente, estas propiedades están dentro de 10-100% de los valores medidos para el tipo silvestre de AAV correspondiente. Lo más preferiblemente, estas propiedades son al menos 100% o más de los valores medidos para el tipo silvestre de AAV correspondiente. Así, por ejemplo, si la mutación está en la secuencia de la cápside de AAV-2, la comparación de estos atributos estaría entre un virión de AAV-2 con la secuencia de la cápside mutada frente a un virión de AAV-2 con los mismos componentes que el virión mutado excepto con la secuencia proteínica de la cápside silvestre de AAV-2.
Según se explica anteriormente, los mutantes de AAV de la divulgación presentan preferiblemente una inmunorreactividad disminuida con relación a anticuerpos que pueden estar presentes en el hospedador al que se administran los viriones mutantes. De este modo, células y tejidos de sujetos que bien se han infectado naturalmente con AAV (es decir, debido a infección natural previa) o bien han sido infectados artificialmente con AAV (es decir, debido a terapia génica o inmunización con ácidos nucleicos previas) se pueden transfectar más eficazmente con viriones de AAV recombinantes a fin de tratar o prevenir una enfermedad nueva o en marcha.
Un mecanismo bien estudiado para la neutralización es que un anticuerpo neutralizante bloquee físicamente una región sobre el virus requerida para unirse a receptores que se requieren para la infección. Estudios previos con otros virus han mostrado que los receptores y los anticuerpos neutralizantes se unen a un grupo distinto de aminoácidos y que es posible identificar mutantes en posiciones particulares sobre cápsides virales que afectan a la unión de anticuerpos neutralizantes, pero no receptores u otras funciones necesarias para la infección viral. Experimentos en los que se seleccionan virus replicativos silvestres para que sean resistentes a anticuerpos neutralizadores han mostrado que las mutaciones, incluso en aminoácidos simples, tales como las descritas en la presente, pueden dar como resultado incrementos significativos en la resistencia a la neutralización por anticuerpos.
La capacidad o incapacidad de un virión muíante de AAV para unirse a antisueros de AAV es parcialmente una función de la secuencia de las proteínas de la cápside (codificadas por el gen cap de AAV). Así, la invención contempla cambios de aminoácidos simples, dobles, triples, cuádruples y mayores realizados sobre la superficie del virión de AAV, así como eliminaciones y/o inserciones, a fin de disminuir la inmunorreactividad, p. ej., para perturbar la capacidad del virión de AAV para unirse a antisueros de AAV. Estos mutantes se pueden evaluar con respecto a la resistencia a la neutralización y, si es necesario, se pueden realizar cambios más drásticos o múltiples.
Métodos para identificar porciones del virión de AAV propensas a mutación con un virión de rAAV funcional resultante se describen en los ejemplos posteriores. Según se detalla en los mismos, se prefieren mutaciones en aminoácidos sobre la superficie viral, tales como mutaciones en las características salientes de la cápside, incluyendo porciones de la cápside conocidas como el "pico", el "cilindro" y la "meseta". Las mutaciones son preferiblemente en la región VP2, más preferiblemente en la región VP3, y, en particular, dentro de la región de solapamiento entre VP1, VP2 y VP3 según se muestra en la Figura 11. Mutaciones particularmente preferidas se encuentran dentro de las posiciones 80­ 598 de VP2 (correspondientes a los aminoácidos 217-735 de VP1 y los aminoácidos 15-533 de VP3).
La secuencia de una VP2 representativa se muestra en la Figura 9 de la presente (SEQ ID NO:12). La proteína de envuelta principal, VP3, abarca los aminoácidos 203-735 de VP1. La mutación comprende al menos una sustitución, eliminación o inserción de aminoácido con respecto a la proteína natural. Mutaciones representativas incluyen una o más sustituciones de los aminoácidos que se presentan en una posición correspondiente a una posición de la VP2 de la proteína de la cápside de AAV-2 seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 126, 127, 128, 130, 132, 134, 247, 248, 315, 334, 354, 357, 360, 361, 365, 372, 375, 377, 390, 393, 394, 395, 396, 407, 411, 413, 418, 437, 449, 450, 568, 569 y 571.
Generalmente, el aminoácido presente en la naturaleza es sustituido por un aminoácido que tiene una cadena lateral pequeña y/o está descargado y por lo tanto es menos inmunogénico. Estos aminoácidos incluyen, sin limitación, alanina, valina, glicina, serina, cisteína, prolina, así como sus análogos, prefiriéndose la alanina. Por otra parte, pueden estar presentes mutaciones adicionales. Combinaciones representativas incluyen cualquier combinación de los aminoácidos identificados inmediatamente antes, tales como, pero no limitadas a, una mutación del aminoácido 360 por histidina y el aminoácido 361 por alanina; el aminoácido 334 por alanina y el aminoácido 449 por alanina; el aminoácido 334 por alanina y el aminoácido 568 por alanina, el aminoácido 568 por alanina y el aminoácido 571 por alanina; el aminoácido 334 por alanina, el aminoácido 449 por alanina y el aminoácido 568 por alanina; el aminoácido 571 por lisina y cualquiera de los aminoácidos especificados anteriormente. Las combinaciones anteriores son meramente ilustrativas y por supuesto se determinan fácilmente muchas otras combinaciones basándose en la información proporcionada en la presente.
Según se describe adicionalmente en los ejemplos, ciertos aminoácidos de la cápside son adyacentes al sitio de unión a heparina. Esta región se denomina la "zona muerta" o "DZ" en la presente e incluye los aminoácidos G128, N131, D132, H134, N245, N246, D356, D357, H372, G375, D391, D392, E393 y E394. Los aminoácidos de la zona muerta son importantes para la función del AAV y así también son dianas para la unión de anticuerpos neutralizantes. Como esta región es importante para la función del AAV, se prefieren sustituciones de aminoácidos conservativas, tales como Q por H, D por E, E o N por D en la región de la zona muerta y dan como resultado un mutante de la zona muerta más funcional.
Las diversas posiciones de aminoácidos que se presentan en la proteína de la cápside se numeran en la presente con referencia a la VP2 de la secuencia de AAV-2 descrita en el n° de registro del NCBI AF043303 y se muestran en la Figura 9 en la presente. La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de VP1 de AAV-2. Sin embargo, se ha de entender que las mutaciones de aminoácidos que se producen en posiciones correspondientes en cualquiera de los serotipos de AAV son abarcadas por la presente invención. Las secuencias para la cápside procedentes de diversos serotipos de AAV aislados de múltiples especies se conocen y describen en, p. ej., Gao y cols. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11854-11859; Rutledge y cols. (1998) J. Virol. 72:309-319; N2 de Registro del NCBI NC001863; NC004828; NC001862; NC002077; NC001829; NC001729; U89790; U48704; AF369963; AF028705; AF028705; AF028704; AF513852; AF513851; AF063497; AF085716; AF43303; Y18065; AY186198; AY243026; AY243025; AY243024; AY243023; AY243022; AY243021; AY243020; AY243019; AY243018; AY243017; AY243016; AY243015; AY243014; AY243013; AY243012; AY243011; AY243010; AY243009; AY243008; AY243007; AY243006; AY243005; AY243004; AY243003; AY243002; AY243001; AY243000; AY242999; AY242998; y AY242997.
Por otra parte, los inventores de la presente han descubierto un nuevo AAV caprino, aislado de cabra, denominado "AAV-G1" en la presente. La secuencia de VP1 de AAV caprino es altamente homóloga con la secuencia de VP1 de AAV-5, pero es aproximadamente 100 veces más resistente a la neutralización por anticuerpos de AAV existentes que la secuencia de AAV-5 natural. Más particularmente, un fragmento de PCR de 2805 pb del AAV caprino descrito en la presente, que codifica 603 pb de rep, el intrón central y la totalidad de cap, muestra 94% de homología con la secuencia de AAV-5 correspondiente. Las homologías de ADN y proteínas para el rep parcial son 98% y 99%, respectivamente. Una comparación de la secuencia codificante de VP1 caprina con una secuencia codificante de VP1 de AAV-5 de primate se muestra en las Figuras 12A-12B. El ADN para la región cap del AAV caprino es 93% homólogo con el de AAV-5. Las secuencias de aminoácidos para la VP1 caprina frente a un AAV-5 de primate se muestra en la Figura 13. La secuencia caprina codifica una proteína VP1 de 726 aminoácidos, mientras que VP1 de AAV-5 tiene una longitud de 724 aminoácidos. Adicionalmente, las secuencias presentan 94% de identidad de secuencia y 96% de similitud de secuencia. Existen 43 diferencias de aminoácidos entre la secuencia caprina y la de VP1 de a AV-5 de primate. Con respecto a la secuencia de aminoácidos lineal de VP1, la distribución de las diferencias de aminoácidos entre AAV-5 y AAV caprino es muy polar. Todas las diferencias de aminoácidos se presentan exclusivamente en la región hipervariable C-terminal de VP1 de un modo disperso. Esta región relativa a AAV-5 y caprino incluye aproximadamente 348 aminoácidos desde el aminoácido 386 hasta el extremo C, numerados con relación a VP1 de AAV-5. Las regiones hipervariables correspondientes en otros serotipos de AAV son fácilmente identificables y la región procedente de un número de serotipos de AAV se muestra en las figuras en la presente.
Sin querer limitarse por una teoría particular, el hecho de que todas las diferencias de aminoácidos en VP1 de AAV-5 y AAV caprino se produzca en regiones que probablemente estén expuestas superficialmente, implica que la evolución de la cápside está siendo conducida principalmente por el sistema inmunitario humoral del nuevo hospedador y/o por adaptación a receptores de rumiante.
Una comparación de la secuencia de VP1 de AAV caprino con un número de otras secuenciad de VP1 de primate, incluyendo AAV-1, AAV-2, AAV-3B, AAV-4, AAV-6, AAV-8 y AAV-5, se muestra en las Figuras 14A-14H. La accesibilidad de las diversas posiciones de aminoácidos basada en la estructura cristalina también se muestra en las figuras. Por otra parte, también se muestran las características superficiales de los aminoácidos, la localización de mutaciones individuales que disminuyen la unión y la neutralización; los sitios de unión a heparina; el posible contacto de Mg2+; el dominio de fosfolipasa A2; así como las posiciones probables para el contacto con bases y la unión a ADN, el posible contacto con fosfato y ribosa. Como se puede observar en la figura, AAV-5 y AAV caprino son idénticos entre sí en 17 posiciones que difieren tanto en AAV-2 como en AAV-8.
De forma similar, los inventores de la presente han descubierto un nuevo AAV bovino, aislado de vaca, denominado "AAV-C1" en la presente. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de VP1 de AAV-C1 se muestran en las Figuras 20A y 20B, respectivamente. Las Figuras 21A-21H muestran una comparación de la secuencia de aminoácidos de VP1 procedente de AAV-C1 con AAV-1, AAV-2, AAV-3B, AAV-4, AAV-6, AAV-8, AAV-5 de primate y AAV caprino (AAV-G1). La accesibilidad de las diversas posiciones de aminoácidos basada en la estructura cristalina también se muestra en las figuras. Por otra parte, también se muestran las características superficiales de los aminoácidos, la localización de mutaciones individuales que disminuyen la unión y la neutralización; los sitios de unión a heparina; el posible contacto con Mg2+; el dominio de fosfolipasa A2; así como posiciones probables para el contacto con bases y la unión a ADN, el posible contacto con fosfato y ribosa.
Como se puede observar en la figura, VP1 procedente de AAV-C1 muestra aproximadamente 76% de identidad con AAV-4. Las diferencias de secuencia entre AAV-4 y AAV-C1 están dispersas a través de la cápside. VP1 de AAV-C1 presenta aproximadamente 54% de identidad con VP1 de AAV-5, con alta homología en la proteína Rep, los primeros 137 aminoácidos de VP1 de AAV-5 y la región no traducida después de la terminación de VP1 de AAV-5 (no mostrada). Así, AAV-C1 parece ser un híbrido natural entre AAV-5 y AAV-4. AAV-C1 también presentaba aproximadamente 58% de identidad de secuencia con VP1s procedentes de AAV-2 y AAV-8, aproximadamente 59% de identidad de secuencia con VP1s procedentes de AAV-1 y AAV-6, y aproximadamente 60% de identidad de secuencia con VP1 procedente de AAV-3B.
Según se describe con más detalle en los ejemplos, el AAV bovino es aproximadamente 16 veces más resistente a la neutralización por anticuerpos para AAV existentes que la secuencia de AAV-2 natural. Así, las secuencias caprinas y bovinas, y otras secuencias tales de mamífero no primate, se pueden usar para producir viriones de AAV recombinantes con inmunorreactividad disminuida con relación a secuencias de AAV de primate, tal como con relación a AAV-2 y AAV-5. Adicionalmente, se pueden predecir razonablemente regiones de cápsides de AAV que se pueden mutar para proporcionar viriones de AAV con inmunorreactividad reducida a partir de aislados y cepas de AAV no caprino y no bovino, tales como cualquiera de los serotipos de AAV, basándose en las secuencias de AAV caprino y bovino proporcionadas en la presente y una comparación de estas secuencias y las propiedades inmunorreactivas con las de otros aislados y serotipos.
Basándose en el análisis anterior, y los ejemplos proporcionados en la presente, un experto en la especialidad puede predecir razonablemente mutaciones que se pueden realizar en secuencias de AAV silvestres a fin de generar viriones de AAV con inmunorreactividad disminuida. Se espera que los cambios de aminoácidos por aminoácidos encontrados sobre la superficie de la cápside de AAV, y especialmente los de la región hipervariable, proporcionen viriones de AAV con inmunorreactividad disminuida. Por otra parte, basándose en el conocimiento proporcionado por las secuencias de AAV caprino y bovino, se puede identificar que otros AAVs de mamífero no primate proporcionan secuencias de AAV no mutadas para el uso en la preparación de viriones de AAV recombinantes con inmunorreactividad disminuida con relación a AAVs de primate, tales como AAV-2 y AAV-5. Por ejemplo, según se muestra en los ejemplos posteriores, las posiciones en mutantes de AAV-2 que se correlacionan con la resistencia a la neutralización y son comunes entre los mutantes de AAV-2 y AAV caprino incluyen cambios en las posiciones 248, 354, 360, 390, 407, 413 y 449 de AAV-2.
Los mutantes de AAV de la presente invención se pueden generar mediante mutagénesis dirigida al sitio de la región del gen cap de AAV. A continuación, la región cap mutada se puede clonar en un vector con función cooperadora adecuado, y viriones de rAAV generados usando el vector con función cooperadora mutado y cualquier método de transfección adecuado, incluyendo el método de transfección triple descrito en la presente. Mutantes adecuados para el uso con la presente invención se identifican por su inmunorreactividad reducida, según se define anteriormente. Preferiblemente, los mutantes de la presente divulgación tienen una capacidad reducida para ser neutralizados mediante antisueros anti-AAV, preferiblemente antisueros anti-AAV-2, mientras que mantienen otras funciones biológicas tales como la capacidad para ensamblar viriones intactos, empaquetar ADN viral, unirse a receptores celulares y transducir células.
Así, la presente invención implica la identificación y el uso de secuencias de AAV mutadas, así como secuencias de AAV de mamífero no primate silvestres, que presentan una inmunorreactividad disminuida para la incorporación en viriones de rAAV. Tales viriones de rAAV se pueden usar en el aporte de un "ácido nucleico heterólogo" (un "HNA") a un sujeto vertebrado, tal como un mamífero. Según se explica anteriormente, un "virión de AAV recombinante" o "virión de rAAV" es un virus infeccioso compuesto por una envuelta proteínica (es decir, una cápside) de AAV que encapsula un "vector de AAV recombinante (rAAV)", comprendiendo el vector de rAAV e1HNA y una o más repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV. Los vectores de AAV se pueden construir usando técnicas recombinantes que son conocidas en la especialidad e incluyen uno o más HNAs flanqueados por ITRs funcionales. Las ITRs del vector de rAAV no necesitan ser las secuencias nucleotídicas silvestres, y se pueden perturbar, p. ej., mediante inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos, con la condición de que las secuencias proporcionadas proporcionen la función apropiada, es decir, rescate, replicación y empaquetamiento del genoma de AAV.
Los viriones de AAV recombinantes se pueden producir usando una variedad de técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo el método de transfección triple (descrito con detalle en la Patente de EE. UU. N° 6.001.650). Este sistema implica el uso de tres vectores para la producción de viriones de rAAV, incluyendo un vector con función cooperadora de AAV, un vector con función accesoria y un vector de rAAV que contiene e1HNA. Sin embargo, un experto en la especialidad apreciará que las secuencias de ácido nucleico codificadas por estos vectores se pueden proporcionar sobre dos o más vectores en diversas combinaciones. Según se usa en la presente, el término "vector" incluye cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, cromosoma artificial, virus, virión, etc., que sea capaz de replicación cuando esté asociado con los elementos de control apropiados y que pueda transferir secuencias génicas entre células. Así, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales.
El vector con función cooperadora de AAV codifica secuencias con "función cooperadora de AAV" (es decir, rep y cap), que funcionan en trans para la replicación y encapsidación productivas de AAV. Preferiblemente, el vector con función cooperadora de AAV apoya la producción eficaz del vector de AAV sin generar viriones de AAV silvestres (es decir, viriones de AAV que contienen genes rep y cap funcionales) detectables. Ejemplos de vectores adecuados para el uso con la presente invención incluyen pHLP19, descrito en la Patente de EE. UU. N° 6.001.650, y el vector pRep6cap6, descrito en la Patente de EE. UU. N° 6.156.303.
El vector con función accesoria codifica secuencias nucleotídicas para funciones virales y/o celulares no derivadas de AAV con lo que AAV es dependiente para la replicación (es decir, "funciones accesorias"). Las funciones accesorias incluyen las funciones requeridas para la replicación de AAV, incluyendo, sin limitación, los restos implicados en la activación de la transcripción génica de AAV, el empalme de ARNm de AAV específico de la fase, la replicación de ADN de AAV, la síntesis de productos de expresión de cap y el ensamblaje de la cápside de AAV. Las funciones accesorias virales se pueden derivar de cualesquiera de los virus cooperadores conocidos, tales como adenovirus, herpesvirus (distintos del virus del herpes simple tipo 1) y virus variolovacunal. En una realización preferida, se usa el plásmido con función accesoria pladeno5 (detalles referentes a pLadeno5 se describen en la Patente de EE. UU. N° 6.004.797). Este plásmido proporciona un grupo completo de funciones accesorias adenovirales para la producción de vectores de AAV, pero carece de los componentes necesarios para formar un adenovirus competente para la replicación.
El vector de rAAV que contiene el ácido nucleico heterólogo (HNA) se puede construir usando ITRs procedentes de cualquiera de los diversos serotipos de AAV. El HNA comprende secuencias de ácido nucleico ligadas entre sí que de otro modo no se encontrarían juntas en la naturaleza, definiendo este concepto el término "heterólogo". Para ilustrar este punto, un ejemplo de un HNA es un gen flanqueado por secuencias nucleotídicas no encontradas en asociación con ese gen en la naturaleza. Otro ejemplo de un HNA es un gen que no se encuentra él mismo en la naturaleza (p. ej., secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen natural). La variación alélica o los episodios de mutación presentes en la naturaleza no dan lugar a HNAs, según se usa en la presente. Un HNA puede comprender una molécula de ARN antisentido, una ribozima o un gen que codifica un polipéptido.
El HNA está conectado operativamente a un promotor heterólogo (constitutivo, específico de una célula o inducible) de modo que el HNA sea capaz de expresarse en las células diana del paciente bajo condiciones apropiadas o deseables. Se conocen en la especialidad numerosos ejemplos de promotores constitutivos, específicos de una célula e inducibles, y un experto podría seleccionar fácilmente un promotor para un uso pretendido específico, p. ej., la selección del promotor de a-actina esquelético específico del músculo o el promotor/potenciador de creatina cinasa específico del músculo para la expresión específica en células musculares, la selección del promotor de CMV constitutivo para niveles fuertes de expresión continua o casi continua, o la selección del promotor inducible de ecdisona para una expresión inducida. La expresión inducida permite al experto controlar la cantidad de proteína que se sintetiza. De este modo, es posible variar la concentración de producto terapéutico. Otros ejemplos de promotores inducibles muy conocidos son: promotores esteroideos (p. ej., promotores de estrógenos y andrógenos) y promotores de metalotioneína.
La divulgación incluye nuevos viriones mutantes que comprenden HNAs que codifican una o más moléculas de ARN antisentido, preferiblemente, los viriones de rAAV se administran a una o más células o tejido musculares de un mamífero. Se han descrito en la especialidad moléculas de ARN antisentido adecuadas para el uso con la presente invención en la terapia antisentido para el cáncer o el tratamiento de enfermedades virales. Véanse, p. ej., Han y cols., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4313-4317; Uhlmann y cols., (1990) Chem. Rev. 90:543-584; Helene y cols., (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1049:99-125; Agarawal y cols., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083; y Heikkila y cols., (1987) Nature 328:445-449. La divulgación también abarca el aporte de ribozimas usando los métodos divulgados en la presente. Para un análisis de ribozimas adecuadas, véanse, p. ej., Cech y cols., (1992) J. Biol. Chem.
267:17479-17482 y la Pat. EE. UU. N25.225.347.
Preferiblemente, la divulgación abarca viriones de rAAV mutantes que comprenden HNAs que codifican uno o más polipéptidos, preferiblemente, los viriones de rAAV se administran a una o más células o tejido de un mamífero. Así, la divulgación abarca el aporte de HNAs que codifican uno o más péptidos, polipéptidos o proteínas, que son útiles para el tratamiento o la prevención de estados patológicos en un sujeto mamífero. Este ADN y los estados patológicos asociados incluyen, pero no se limitan a: ADN que codifica glucosa-6-fosfatasa, asociada con deficiencia de almacenamiento de glucógeno tipo 1A; ADN que codifica fosfoenolpiruvato-carboxicinasa, asociada con deficiencia de Pepck; ADN que codifica galactosa-1 fosfato uridil transferasa, asociada con galactosemia; ADN que codifica fenilalanina hidroxilasa, asociada con fenilcetonuria; ADN que codifica alfa-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, asociada con la enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce; ADN que codifica fumarilacetoacetato hidrolasa, asociada con tirosinemia tipo 1; ADN que codifica metilmalonil-CoA mutasa, asociada con academia metilmalónica; ADN que codifica acil de cadena media-CoA deshidrogenasa, asociada con deficiencia de acetil de cadena media-CoA; ADN que codifica ornitina transcarbamilasa, asociada con deficiencia de ornitina transcarbamilasa; ADN que codifica ácido argininosuccínico sintetasa, asociada con citrulinemia; ADN que codifica proteína de receptores de lipoproteínas de baja densidad, asociada con hipercolesterolemia familiar; ADN que codifica UDP-glucouronosiltransferasa, asociada con enfermedad de Crigler-Najjar; ADN que codifica adenosina desaminasa, asociada con enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave; ADN que codifica hipoxantina guanina fosforribosil transferasa, asociada con gota y síndrome de Lesch-Nyan; ADN que codifica biotinidasa, asociada con deficiencia de biotinidasa; ADN que codifica beta-glucocerebrosidasa, asociada con enfermedad de Gaucher; ADN que codifica betaglucuronidasa, asociada con síndrome de Sly; ADN que codifica proteína membranaria del peroxisoma 70 kDa, asociada con síndrome de Zellweger; ADN que codifica porfobilinógeno desaminasa, asociada con porfiria intermitente aguda; ADN que codifica antitripsina alfa-1 para el tratamiento de deficiencia de antitripsina alfa-1 (enfisema); ADN que codifica eritropoyetina para el tratamiento de anemia debida a talasemia o a insuficiencia renal; ADN que codifica factor de crecimiento endotelial vascular, ADN que codifica angiopoyetina-1 y ADN que codifica factor de crecimiento de fibroblastos para el tratamiento de enfermedades isquémicas; ADN que codifica trombomodulina e inhibidor de la ruta de factores tisulares para el tratamiento de vasos sanguíneos ocluidos como se observa, por ejemplo, en aterosclerosis, trombosis o embolias; ADN que codifica aminoácido aromático descarboxilasa (AADC) y ADN que codifica tirosina hidroxilasa (TH) para el tratamiento de enfermedad de Parkinson; ADN que codifica el receptor betaadrenérgico, ADN que codifica antisentido para, o ADN que codifica una forma mutante de, fosfolambano, ADN que codifica la adenosina trifosfatasa 2 del retículo sarco(endo)plásmico (SERCA2), y ADN que codifica la adenilil ciclasa cardíaca para el tratamiento de insuficiencia cardíaca congestiva; ADN que codifica un gen supresor tumoral tal como p53 para el tratamiento de diversos cánceres; ADN que codifica una citocina tal como una de las diversas interleucinas para el tratamiento de trastornos inflamatorios e inmunitarios y cánceres; ADN que codifica distrofina o minidistrofina y ADN que codifica utrofina o miniutrofina para el tratamiento de distrofias musculares; y ADN que codifica insulina para el tratamiento de diabetes.
La divulgación también incluye nuevos viriones mutantes que comprenden un gen o genes que codifican proteínas de coagulación sanguínea, proteínas que se pueden aportar usando los métodos de la presente divulgación a las células de un mamífero que tiene hemofilia para el tratamiento de hemofilia. Así, la divulgación incluye: el aporte del gen del Factor IX a un mamífero para el tratamiento de hemofilia B, el aporte del gen del Factor VIII a un mamífero para el tratamiento de hemofilia A, el aporte del gen del Factor VII para el tratamiento de deficiencia del Factor VII, el aporte del gen del Factor X para el tratamiento de deficiencia del Factor X, el aporte del gen del Factor XI para el tratamiento de deficiencia de Factor XI, el aporte del gen del Factor XIII para el tratamiento de deficiencia del Factor XIII y el aporte del gen de la Proteína C para el tratamiento de deficiencia de Proteína C. El aporte de cada uno de los genes citados anteriormente a las células de un mamífero se efectúa al generar en primer lugar un virión de rAAV que comprende el gen y a continuación administrar el virión de rAAV al mamífero. Así, la divulgación incluye viriones de rAAV que comprenden genes que codifican uno cualquiera de Factor IX, Factor VIII, Factor X, Factor VII, Factor XI, Factor XIII o Proteína C.
El aporte de los viriones recombinantes que contienen uno o más HNAs a un sujeto mamífero puede ser mediante inyección intramuscular o mediante la administración a la corriente sanguínea del sujeto mamífero. La administración a la corriente sanguínea puede ser mediante inyección en una vena, una arteria o cualquier otro conducto vascular de los viriones mutantes en la corriente sanguínea por medio de perfusión en miembros aislados, una técnica muy conocida en las especialidades quirúrgicas, permitiendo el método esencialmente que el experto aísle un miembro de la circulación sistémica antes de la administración de los viriones de rAAV. Una variante de la técnica de perfusión en miembros aislados, descrita en la Patente de EE. UU. N° 6.177.403, también puede ser empleada por el experto para administrar los viriones mutantes a la vasculatura de un miembro aislado para mejorar potencialmente la transducción en células o tejido musculares. Por otra parte, para ciertas condiciones, puede ser deseable aportar los viriones mutantes al SNC de un sujeto. Por "SNC" se entiende todas las células y el tejido del cerebro y la médula espinal de un vertebrado. Así, el término incluye células neuronales, células gliales, astrocitos, fluido cereobroespinal (CSF), espacios intersticiales, hueso, cartílago. Los viriones de AAV recombinantes o las células transducidas in vitro se pueden aportar directamente al SNC o el cerebro mediante inyección a, p. ej., la región ventricular, así como al cuerpo estriado (p. ej., el núcleo caudado o putamen del cuerpo estriado), la médula espinal y la unión neuromuscular, o el lóbulo cerebelar, con una aguja, un catéter o un dispositivo relacionado, usando técnicas neuroquirúrgicas conocidas en la especialidad, tales como mediante inyección estereotáctica (véanse, p. ej., Stein y cols., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson y cols., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson y cols., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; y Alisky y Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000).
La dosis de viriones de rAAV requerida para alcanzar un "efecto terapéutico" particular, p. ej., las unidades de dosis en genomas del vector/por kilogramo de peso corporal (vg/kg), variará basándose en varios factores incluyendo: la vía de administración de viriones de rAAV, el nivel de expresión génica (o ARN antisentido o ribozima) requerido para alcanzar un efecto terapéutico, la enfermedad o el trastorno específico que se trate, una respuesta inmunitaria del hospedador al virión de rAAV, una respuesta inmunitaria del hospedador al producto de expresión del gen (o ARN antisentido o ribozima) y la estabilidad del producto génico (o ARN antisentido o ribozima). Un experto en la especialidad puede determinar fácilmente un intervalo de dosis de viriones de rAAV para tratar a un paciente que tenga una enfermedad o trastorno particular basándose en los susodichos factores, así como otros factores que son muy conocidos en la especialidad.
Hablando en general, por "efecto terapéutico" se entiende un nivel de expresión de uno o más HNAs suficiente para perturbar un componente de una enfermedad (o trastorno) hacia un resultado o criterio de valoración clínico deseado, de modo que una enfermedad o un trastorno de un paciente muestre mejora clínica, a menudo reflejada por la mejoría de un signo o síntoma clínico relacionado con la enfermedad o el trastorno. Usando la hemofilia como un ejemplo de enfermedad específico, un "efecto terapéutico" para la hemofilia se define en la presente como un incremento en la eficacia de coagulación sanguínea de un mamífero afectado por hemofilia, determinándose la eficacia, por ejemplo, mediante criterios de valoración o técnicas bien conocidos tales como emplear ensayos para medir el tiempo de coagulación sanguínea total o el tiempo de protromboplastina activado. Las reducciones en el tiempo de coagulación sanguínea total o el tiempo de protromboplastina activado son indicaciones de un incremento en la eficacia de coagulación sanguínea. En casos graves de hemofilia, los hemofílicos que tienen menos de 1% de los niveles normales de Factor VIII o Factor IX tienen un tiempo de coagulación sanguínea total de más de 60 minutos en comparación con aproximadamente 10 minutos para no hemofílicos. Se ha observado que la expresión de 1% o más de Factor VIII o Factor IX reduce el tiempo de coagulación sanguínea total en modelos animales de hemofilia, así, alcanzar una concentración plasmática de Factor VIII o Factor IX en circulación de más de 1% probablemente alcanzará el efecto terapéutico deseado de un incremento en la eficacia de coagulación sanguínea.
Las construcciones de la presente divulgación se pueden usar alternativamente para aportar un HNA a una célula hospedadora a fin de elucidar su función o funciones fisiológicas o bioquímicas. E1HNA puede ser un gen bien endógeno o bien heterólogo. Usando un enfoque bien ex vivo o bien in vivo, el experto puede administrar los viriones mutantes que contienen uno o más HNAs de función desconocida a un animal experimental, expresar e1HNA o los HNAs y observar cualesquiera cambios funcionales posteriores. Estos cambios pueden incluir: interacciones proteínaproteína, perturbaciones en rutas bioquímicas, perturbaciones en el funcionamiento fisiológico de células, tejidos, órganos o sistemas orgánicos y/o la estimulación o anulación de la expresión génica.
Alternativamente, el experto puede sobreexpresar un gen de función conocida o desconocida y examinar sus efectos in vivo. Estos genes pueden ser de naturaleza bien endógena para el animal experimental o bien heteróloga (es decir, un transgén).
Al usar los métodos de la presente divulgación, el experto también puede suprimir o reducir significativamente la expresión génica, empleando de ese modo otros medios para determinar la función génica. Un método para efectuar esto es por medio de la administración de viriones de rAAV que contienen ARN antisentido a un animal experimental, la expresión de la molécula de ARN antisentido de modo que el gen endógeno diana esté inactivado ("knocked out") y a continuación la observación de cualesquiera cambios fisiológicos o bioquímicos posteriores.
Los métodos de la presente divulgación son compatibles con otras tecnologías muy conocidas tales como ratones transgénicos y ratones inactivados y se pueden usar para complementar estas tecnologías. Un experto en la especialidad puede determinar fácilmente combinaciones de tecnologías conocidas con los métodos de la presente divulgación para obtener información útil sobre la función génica.
Una vez aportado, en muchos casos no es suficiente simplemente expresar e1HNA; en cambio, a menudo es deseable variar los niveles de expresión de HNA. Variar los niveles de expresión de HNA, lo que varía la dosis del producto de expresión de HNA, es útil frecuentemente para adquirir y/o refinar información funcional sobre e1HNA. Esto se puede efectuar, por ejemplo, al incorporar un promotor inducible heterólogo en el virión de rAAV que contiene e1HNA de modo que el HNA se exprese solamente cuando se induzca el promotor. Algunos promotores inducibles también pueden proporcionar la capacidad para refinar niveles de expresión de HNA; esto es, variar la concentración de inductor ajustará finamente la concentración de producto de expresión de HNA. A veces, esto es más útil que tener un sistema de "activación-desactivación" (es decir, cualquier cantidad de inductor proporcionará el mismo nivel de producto de expresión de HNA, una respuesta de "todo o nada"). Numerosos ejemplos de promotores inducibles son conocidos en la especialidad, incluyendo el promotor de ecdisona, promotores esteroideos (p. ej., promotores de estrógenos y andrógenos) y promotores de metalotioneína.
3. PARTE EXPERIMENTAL
Posteriormente, se dan ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente divulgación que incluye la invención. Los ejemplos se ofrecen solamente con propósitos ilustrativos.
Se han realizado esfuerzos para asegurar exactitud con respecto a los números usados (p. ej., cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, se debe permitir algún error experimental y desviación.
EJEMPLO 1
PREPARACIÓN DE VIRIONES DE AAV-LACZ RECOMBINANTES Y SUS PROPIEDADES
Se prepararon viriones de AAV-2 recombinantes que contenían el gen de p-galactosidasa (rAAV-2 lacZ) usando un procedimiento de transfección triple descrito en la Patente de EE. UU. N° 6.001.650. La secuencia de ADNc completa para p-gal está disponible bajo el N° de Registro del GenBank NC 000913 REGIÓN: complemento (362455..365529).
I. Construcción del Vector
A. Vector con Función Cooperadora de AAV Mutante
Basándose en la estructura de AAV-2 (véase Xie y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:10405-10410), se construyeron 61 mutantes mediante mutagénesis específica para el sitio dirigida por oligonucleótidos. Toda la superficie del AAV está compuesta por 60 unidades estructurales asimétricas idénticas dispuestas en una conformación icosaédrica. Esto tiene dos implicaciones importantes. En primer lugar, cualquier mutación de un solo aminoácido que se realice se encontrará en 60 lugares en el virus, todos en la misma posición con relación a otros aminoácidos dentro de la unidad estructural asimétrica. En segundo lugar, al estudiar una sola unidad estructural asimétrica, se puede entender toda la superficie del virus.
La estructura de AAV-2 se determinó como sigue. Las coordenadas para la proteína de la cápside de AAV-2 monomérica (aminoácidos de VP1 217-735; aminoácidos de VP2 80-598) se obtuvieron de the Protein Data Bank (número de identificación 1LP3). La estructura se analizó usando Swiss PDB Viewer versión 3.7, Vector NTI 3D-Mol versión 8.0 (Invitrogen, Inc.) o Chime (MDL Information Systems, Inc. Se generaron estructuras multiméricas de la cápside de AAV-2 usando el programa generador de oligómeros del cibersitio de Virus Particle Explorer (VIPER), usando las funciones de transformación de coordenadas de Swiss PDB viewer junto con coordenadas de matriz del archivo PBD (1LP3), o se descargan de la base de datos de estructuras cuaternarias de proteínas en the European Bioinformatics Institute (nombre del archivo=1lp3). Se analizaron posibles sitios de unión a anticuerpo sobre multímeros de la cápside de AAV-2 al construir la unidad estructural asimétrica de la cápside de AAV-2 y a continuación clasificar manualmente una estructura de IgG (anticuerpo monoclonal de IgG2a murina; número de identificación de PDB 11GT) en esa estructura o en otras unidades multímeras de la cápside de AAV-2 usando Swiss PDB Viewer. Las distancias, los conflictos de aminoácidos y las zonas de contacto entre la IgG y la cápside de AAV-2 se podrían evaluar usando las herramientas apropiadas dentro del programa Swiss PDB Viewer.
Se aplicaron varios criterios para seleccionar qué aminoácidos mutan de un total de aproximadamente 145 aminoácidos expuestos superficialmente externos (dentro de cada una de las 60 unidades estructurales asimétricas idénticas, véase la Figura 1). Las mutaciones se realizaron solamente en aminoácidos "expuestos superficialmente", aunque es posible para aminoácidos bajo la superficie externa o sobre la superficie interna para influenciar en la unión al anticuerpo. Los aminoácidos que se mutaban eran aquellos con cadenas laterales predichas para ser las más accesibles para la unión a anticuerpo. Esto incluía aminoácidos sobre formas salientes de la cápside, conocidas como el "pico", el "cilindro" y la "meseta". Estas formas salientes a menudo son dianas para la unión de anticuerpos neutralizantes. Los aminoácidos en zonas que no fueran suficientemente anchas para alojar un anticuerpo ("cañón", "hoyo", centro de eje de simetría triple, centro de eje de simetría quíntuple) no se mutaban. Por otra parte, la cadena lateral de aminoácidos se seleccionó basándose en la zona expuesta de al menos 20 Á2, debido a que las disminuciones de 20 Á2 o más en la superficie de contacto entre un antígeno y un anticuerpo (de una superficie de contacto total de aproximadamente 600 Á2 a 900 Á2) pueden tener un efecto medible sobre la afinidad anticuerpoantígeno y por lo tanto sobre el título neutralizante del anticuerpo. Los aminoácidos seleccionados eran aquellos con la cadena lateral (y no solo el esqueleto peptídico) expuesta. Se supone que si solo estaba expuesto el esqueleto peptídico, entonces un anticuerpo que se unía a este aminoácido no era capaz de discriminar bien diversos aminoácidos, puesto que todos los aminoácidos tienen el mismo esqueleto peptídico. Finalmente, zonas relativamente planas de antígenos proteínicos a menudo interactúan con zonas relativamente planas de anticuerpos de modo que los aminoácidos elegidos para la mutación estuvieran en una zona relativamente plana (lado del pico, parte superior del cilindro, parte superior de la meseta). Aplicar todos los criterios anteriores a los aproximadamente 145 aminoácidos de la cápside localizados sobre la superficie externa de AAV-2 daba como resultado la selección de 72 posiciones que lo más probablemente afectarían a la unión de anticuerpos neutralizantes cuando se cambiaran por otros aminoácidos. La localización de estos aminoácidos se indica en la Figura 2 y se lista en las Tablas 1,4 y 5.
La mayoría de los 127 mutantes (en 72 posiciones) que se elaboraban cambiaban aminoácidos individuales por alanina, usando técnicas conocidas por los expertos en la especialidad de la biología molecular. Se eligió la alanina debido a que se ha determinado que, de todas las mutaciones que se podrían realizar, la alanina es la menos perturbadora para la estructura proteínica. Además, puesto que la alanina solo tiene una cadena lateral de metilo, es probable que el cambio de la mayoría de los otros aminoácidos por alanina perturbe la unión al anticuerpo. Esto es, en comparación con otros aminoácidos, la alanina es menos inmunogénica debido a que carece de una cadena lateral que contribuya significativamente a las zonas de contacto antígeno/anticuerpo y de ahí a la afinidad antígeno/anticuerpo. Nótese que la numeración que sigue se basa en la VP2 de la secuencia de AAV-2 según se representa en la Figura 9. Unas pocas posiciones se cambiaron por un aminoácido distinto de alanina. Por ejemplo, en la posición 356 donde ya hay una alanina, se inserta una arginina. La arginina es suficientemente polar para permanecer sobre la superficie del AAV y suficientemente grande para que pueda interferir con la unión de anticuerpos. Existen cinco glicinas que pueden ser accesibles a anticuerpos. Las glicinas se encuentran a menudo donde una cadena peptídica gira y así pueden ser un componente crítico de la estructura. La mutación de glicinas puede ser problemática debido a la posibilidad de que la estructura se pueda alterar drásticamente. Por lo tanto, cada una de las cinco glicinas sobre la superficie de AAV-2 se consideraba caso por caso a fin de decidir por qué cambiarlas. G128 se cambiaba por aspartato debido a que la glicina 128 se encuentra en AAV-1 a 6 excepto para AAV-5 donde la posición 128 es un ácido aspártico. G191 se cambiaba por serina debido a que la glicina 191 se encuentra en AAV-1 a 6 excepto para AAV-5 donde la posición 191 es una serina. G329 se cambiaba por arginina debido a que la glicina 329 se encuentra en AAV-1 a 6 excepto para AAV-4 donde la posición 329 es una arginina. G375 se cambiaba por prolina debido a que la glicina 375 se conserva en AAV-1 a 6 y se pensaba que la prolina podría conservar un giro en la cadena peptídica encontrada en esa posición. G449 se cambiaba por alanina debido a que, aunque es serina o asparagina en otros AAVs, está entre R448 y R451 en AAV-2, que son críticos para la unión a heparina y la transducción. Por lo tanto, la posición 449 se mutaba por un aminoácido más cercano en tamaño a la glicina (es decir, alanina). En algunos casos, se aislaron mutantes dobles (S130A/N131A, N360H/S361A, S361A/N358K, S361A/S494P, S361A/R592K) además del mutante deseado. Estos eran presumiblemente un resultado de errores de polimerasa introducidos durante la mutagénesis, pero se ensayaban como los otros mutantes.
Se construyeron vectores con función cooperadora de AAV usando pHLP19 (descrito en la Patente de EE. UU. N° 6.001.650), 116 oligodesoxinucleótidos mutagénicos y un estuche de mutagénesis in vitro (Quik Change XL, Stratagene, San Diego, CA). Brevemente, dos oligodesoxinucleótidos complementarios que contienen cada secuencia mutante deseada y tienen una temperatura de fusión entre 74-83°C (calculada usando la ecuación: Tm= 81,5 0,41 (%G+C) -(675/N) - % discrepancia, donde G es guanosina, C es citosina, N es la longitud del cebador en nucleótidos) se mezclaron separadamente con pHLP19. Se realizaron tres ciclos de PCR usando las siguientes condiciones: la desnaturalización se realizó a 95°C durante 1 min, la renaturalización se realizó a 60°C durante 1 min y la extensión se realizó a 68°C durante 1 min. A continuación, las dos reacciones separadas se mezclaron y se sometieron a 18 ciclos adicionales de PCR usando las siguientes condiciones: la desnaturalización se realizó a 95°C durante 1 min, la renaturalización se realizó a 60°C durante 1 min y la extensión se realizó a 68°C durante 15 min. Los productos de PCR se digirieron con la enzima de restricción Dpn I para destruir plásmidos totalmente metilados o hemimetilados (es decir, no mutantes), y a continuación se transformaron en la cepa de E. coli XL-10 (Stratagene). Se recogió una colonia de cada reacción de mutagénesis, se prepararon 500 ng de ADN plasmídico y se sometieron a secuenciación de ADN. Se usó un subgrupo de los oligodesoxinucleótidos mutagénicos como cebadores de secuenciación para confirmar las secuencias de los mutantes. Todo el gen de la cápside se secuenció en cada caso. La mayoría de los mutantes se podía aislar de este modo. Si un mutante no se aislaba mediante la primera ronda se secuenciación de ADN, se recogían 1-3 colonias más y se preparaban 500 ng de ADN plasmídico y se sometían a secuenciación de ADN.
B. Vector con Función Accesoria pLadeno5
El vector con función accesoria pLadeno5 se construyó como sigue. Fragmentos de ADN que codifican las regiones de ARN E2a, E4 y VA aisladas de ADN del adenivirus serotipo 2 purificado (obtenido de Gibco/BRL) se ligaron en un plásmido llamado pAmpscript. El plásmido pAmpscript se ensambló como sigue. Se usó mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para eliminar una región de 623 pb que incluye el policonector y el casete de expresión de complementación alfa procedente de pBSII s/k+ (obtenido de Stratagene) y se reemplazó por un sitio EcoRV. La secuencia del oligonucleótido mutagénico usado en la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos era 5'-CCGCTACAGGGCGCGATATCAGCTCACTCAA-3' (SEQ ID NO:1).
Se sintetizó un policonector (que contiene los siguientes sitios de restricción: Bam HI; KpnI; SrfI; XbaI; ClaI; Bst1107I; SalI; PmeI; y NdeI) y se insertó en el sitio EcoRV creado anteriormente de modo que el lado de BamHI del conector estuviera próximo al origen fl en el plásmido modificado para proporcionar el plásmido pAmpscript. La secuencia del policonector era
5’-GGATCCGGTACCGCCCGGGCTCTAGAATCGATGTATACGTCGÁCGTTTAA
ACCATATG-3’ (SEQ ID NO:2).
Fragmentos de ADN que comprenden las secuencias de ARN de E2a y VA del adenivirus serotipo 2 se clonaron directamente en pAmpscript. En particular, un fragmento (parcial) de SrfI-KpnI de 5962 pb que contiene la región E2a se clonó entre los sitios SrfI y KpnI de pAmpscript. El fragmento de 5962 pb comprende los pares de bases 21.606­ 27.568 del genoma del adenivirus serotipo 2. La secuencia completa del genoma del adenivirus serotipo 2 es accesible bajo el N° del GenBank 9626158.
El ADN que comprende las secuencias E4 del adenivirus serotipo 2 se modificó antes de que se insertara en el policonector pAmpscript. Específicamente, se usó mutagénesis por PCR para reemplazar la repetición terminal adenoviral proximal E4 con un sitio SrfI. La localización de este sitio SrfI es equivalente a los pares de bases 35.836­ 35.844 del genoma del adenivirus serotipo 2. Las secuencias de los oligonucleótidos usadas en la mutagénesis eran: 5'-AGAGGCCCGGGCGTTTTAGGGCGGAGTAACTTGC-3' (SEQ ID NO:3) y 5'-ACATACCCGCAGGCGTAGAGAC-3' (SEQ ID NO:4). Un fragmento E4A de 3.192 pb, producido al escindir el gen E4 modificado descrito anteriormente con Srfl y SpeI, se ligó entre los sitios SrfI y XbaI de pAmpscript que ya contenía las secuencias de ARN de E2a y VA para dar como resultado el plásmido pLadeno5. El fragmento de 3.192 pb es equivalente a los pares de bases 32.644­ 35.836 del genoma del adenivirus serotipo 2.
C. Vector rAAV-2 hF.IX
El vector hF.IX de rAAV-2 es un plásmido de 11.442 pb que contiene el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el exón 1 de hF.IX, un fragmento de 1,4 kb del intrón 1 de hF.IX, los exones 2-8 de h.FIX, 227 pb de 3’ UTR de h.FIX y la secuencia de poliadenilación tardía de SV40 entre las dos repeticiones terminales invertidas de AAV-2 (véase la Patente de EE. UU. N° 6.093.392). El fragmento de 1,4 kb del intrón 1 de hF.IX consiste en el extremo 5' del intrón 1 hasta el nucleótido 1098 y la secuencia desde el nucleótido 5882 que se extiende hasta el empalme con el exón 2. Las secuencias del promotor temprano intermedio de CMV y la señal de poliadenilación tardía de SV40 se pueden obtener de la secuencia publicada de pCMV-Script®, que está disponible del catálogo de Stratagene, Stratagene, La Jolla, CA.
D. Vector rAAV-2 lac Z
Construcción del plásmido de AAV recombinante pVmLacZ
1. Un fragmento de ADN Xba I de 4311 pb se cortó de pSUB201 que contiene las secuencias de rep/cap de AAV. Los extremos de Xba I se renaturalizaron con un oligonucleótido sintético Not I de 10 pb (5'-AGCGGCCGCT-3') (SEQ ID NO:5) para dar un producto intermedio plasmídico pUC/ITR-Not I que tiene ambas ITR's (repeticiones terminales invertidas) de AAV separadas por 116 pb de la secuencia de AAV residual y ADN del conector Not I.
2. Un fragmento de ADN Not I de 1319 pb se cortó de p1.1c que contiene promotor de CMV y secuencias intrónicas de hGH. Esta secuencia de ADN se insertó en el sitio Not I de pUC/ITR-Not I, para dar el producto intermedio pSUB201 N.
3. Un casete de expresión de CMV unido a ITR de Pvu II de 1668 pb (5131-1493) se cortó de pSUB201N y se insertó en el sitio Pvu II (posición 12) de pWee.1a, para dar el producto intermedio plasmídico pWee.1b. La escisión del fragmento PvuII de 1668 pb procedente de pSUB201N retiraba 15 pb del exterior de cada ITR, en la región palindrómica "A".
4. Una secuencia de ADN de “rep/cap de AAV” de RV Not I/Eco de 4737 pb se cortó de pGN1909 y los extremos se enromaron al rellenar los extremos ahuecados 3' usando ADN polimerasa de Klenow. Conectores Asc I se ligaron a ambos extremos, seguido por la clonación de este fragmento de ADN "pGN1909/AscI" en el esqueleto de pWee.1b en un sitio Asc I (2703), para dar el producto intermedio pWee1909 (8188bp). Este plásmido tiene el casete de expresión de CMV unido a ITR con un esqueleto de los genes rep/cap de AAV.
5. Un gen LacZ Sma I/Dra I de 3246 pb se cortó de pCMV-beta y conectores Asc I se ligaron al fragmento con extremos romos. Este fragmento LacZ/Asc I se clonó en p1.1c entre los sitios Bss HII, para dar p1.1cADHLacZ, que tiene el gen LacZ conducido por el promotor de CMV.
6. Un fragmento de ADN Not I de 4387 pb se cortó de p1.1cADHLacZ, que tiene el gen LacZ conducido por el promotor de CMV. Este fragmento se insertó entre los sitios Not I de pWee1909, después de retirar un casete de expresión de "promotor de CMV/intrón de hGH" de 1314 pb. La construcción resultante, pW1909ADHLacZ, tiene el gen de p-galactosidasa bajo el control del promotor de CMV y unido por ITRs. El esqueleto del plásmido soporta los genes "rep" y "cap" que proporcionan funciones cooperadoras de AAV y el gen de p-lactamasa (ampicilina) confiere resistencia a antibióticos.
7. Un fragmento de ADN Sse I de 4772 pb que contenía un casete "CMV/LacZ" se cortó de pW1909ADHLacZ y se insertó en el sitio Sse I de pUC19, para dar Pre-pVLacZ. Esta construcción todavía contiene aproximadamente 50 pb de secuencias de pSUB201 5' y 3' remanentes internas a cada ITR.
8. Las secuencias de pSUB201 remanentes se retiraron al cortar un fragmento de ADN "pUC/AITR" Msc I de 2912 pb de Pre-pVLacZ, que también retira aproximadamente 35 pb de la región "D" de cada ITR. Un conector sintético "145NA/NB" (5'-CCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCC-3') (SEQ ID NO:6) que contenía un sitio de restricción Msc I, la región "D" de ITR y un sitio Not I se usó para clonar un fragmento Not I de 4384 pb a partir de pW1909ADHLacZ, que tiene el casete de expresión "CMV/LacZ". El plásmido pVLacZ resultante tiene el gen de p-galactosidasa bajo el control de una secuencia potenciadora de alcohol deshidrogenasa y el promotor de CMV, todos unidos por ITRs de AAV.
9. pVLacZ se modificó adicionalmente al retirar el elemento LacZ y la secuencia policonectora fuera del casete de expresión de LacZ unido a ITR, como sigue. Una secuencia de LacZ/policonectora Ehe I/Afl III de 534 pb se cortó de pUC119, los extremos se enromaron usando ADN polimerasa de Klenow y el plásmido se ligó a un conector Sse I (5'-c Ct GCAGG-3') (SEQ ID NO:7), para producir pUC119/SseI. La secuencia de ADN de "AAVLacZ" se retiró de pVLacZ al cortar un fragmento Sse I de 4666 pb. Este fragmento SseI se clonó en el sitio Sse I de pUC119/SseI para generar pVmLacZ. pVmLacZ tiene el promotor de CMV/el potenciador de ADH/el gen de pgalactosidasa unidos por ITRs de AAV en un esqueleto derivado de pUC119 que confiere resistencia a ampicilina y tiene un origen de replicación de alto número de copias.
II. Procedimiento de Transfección Triple
Los diversos vectores con función cooperadora de AAV mutados (descritos anteriormente), el vector con función accesoria pLadeno5 (descrito en la Patente de EE. UU. N° 6.004,797) y el vector rAAV2-lacZ, pVmLacZ (descrito anteriormente) se usaron para producir viriones recombinantes.
Brevemente, células renales embrionarias humanas tipo 293 (American Type Culture Collection, número de catálogo CRL-1573) se sembraron en placas estériles tratadas con cultivo tisular de 10 cm a una densidad de 3x106 células por placa en 10 ml de medio de cultivo que consistía en medio de Eagle con modificación de Dulbeco complementado con 10% de suero de ternero fetal y se incubaron en un ambiente humidificado a 37°C en CO2 al 5%. Después de la incubación durante la noche, las células 293 eran confluentes aproximadamente al ochenta por ciento. A continuación, las células 293 se transfectaron con ADN mediante el método del precipitado de fosfato cálcico, un método de transfección muy conocido en la especialidad. Se añadieron 10 gg de cada vector (pHLP19, pLadeno5 y pVm lacZ. mutados) a un tubo de poliestireno estéril de 3 ml con tapón a presión usando puntas de pipeta estériles. Se añadió 1,0 ml de CaCl2 300 mM (clase JRH) a cada tubo y se mezcló al pipetear hacia arriba y hacia abajo. Se añadió un volumen igual de 2X HBS (NaCl 274 mM, KCl 10 mM, HEPES 42 mM, Na2PO4 1,4 mM, dextrosa 12 mM, pH 7,05, clase JRH) con una pipeta de 2 ml, y la solución se pipeteó hacia arriba y hacia abajo tres veces. La mezcla de ADN se añadió inmediatamente a las células 293, una gota cada vez, uniformemente a través de la placa. Las células se incubaron en un ambiente humidificado a 37°C en CO2 al 5% durante seis horas. Era visible un precipitado granular en los cultivos celulares transfectados. Después de seis horas, la mezcla de ADN se retiró de las células, que a continuación se proveyeron de medio de cultivo celular reciente sin suero de ternero fetal y se incubaron durante 72 horas adicionales.
Después de 72 horas, las células se sometieron a lisis mediante 3 ciclos de congelación sobre dióxido de carbono sólido y se descongelaron en un baño de agua a 37°C. Estos lisados de congelación-descongelación de las células transfectadas se caracterizaron con respecto a la síntesis de la cápside total (mediante transferencia Western), empaquetamiento de ADN (mediante Q-PCR), unión a heparina, transducción in vitro (sobre células HeLa o HepG2 más adenovirus-2 o etopósido) y neutralización mediante anticuerpos.
III. Propiedades de los viriones mutantes
A. Ensayo de Síntesis de la Cápside
Las mutaciones en proteínas pueden hacerlas inestables y más sensibles de lo normal a la degradación por proteasas. A fin de determinar el nivel de cápsides elaboradas por los mutantes descritos en la presente, se realizó la transferencia Western de lisados crudos. Un microlitro de cada lisado crudo se desnaturalizó mediante incubación en Tris 20 mM, pH 6,8, SDA al 0,1% a 80°C durante 5 minutos. Las proteínas se fraccionaron mediante SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida al 10% (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y a continuación se detectaron mediante transferencia Western como sigue. Las proteínas se transfirieron electroforéticamente (módulo de transferencia Xcell II, Invitrogen, Carlsbad, CA) sobre membranas de nailon (Hybond-P, Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.). Las membranas se sondaron con un anticuerpo anti-AAV (clon monoclonal B1, Maine Biotechnology Services, Inc. Portland, ME) a una dilución de 1:20 y a continuación con un anticuerpo de oveja contra inmunoglobulinas de ratón acoplado a peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.) a una dilución de 1:12000. Las proteínas que se unen a anticuerpo B1 se detectaron usando el sistema de detección por transferencia Western ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.). Las membranas se expusieron a película de rayos X Biomax MS, Kodak, Rochester, NY) durante 1 -5 minutos y las señales se cuantificaron usando un AlphaImager 3300 (Alpha Innotech Corp., San Leandro, CA)
B. Ensayo de empaquetamiento de ADN.
Se usó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR) para evaluar el empaquetamiento de ADN mediante viriones de AAV-2 con cápsides mutantes. En este procedimiento, el lisado crudo se digirió con ADNasa I antes de la amplificación por PCR para retirar cualquier plásmido (usado en la transfección) que pudiera dar como resultado una señal positiva falsa. Los lisados crudos se diluyeron 100 veces (5 gl de lisado crudo más 495 gl de tampón) en Tris 10 mM, pH 8,0, 10 gg/ml de ARNt de levadura. Una parte alícuota de la dilución (10 gl) se digirió con 10 unidades de ADNasa I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) en Tris 25 mM, pH 8,0, MgCl2 1 mM a 37°C durante 60 minutos en un volumen final de 50 gl. La ADNasa I se inactivó al calentar a 95°C durante 30 minutos. Se añadió un microlitro (20 gg) de proteinasa K (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) y se incubó a 55°C durante 30 minutos. La proteinasa K se inactivó al calentar a 95°C durante 20 minutos. En este punto, la muestra se diluyó en Tris 10 mM, pH 8,0, 10 gg/ml de ARNt de levadura si fuera necesario. Se añadieron diez microlitros de muestra tratada con ADNasa 1 y proteinasa K a 40 gl de mezcla madre para Q-PCR, que consistía en:
4 gl de H2O
5 Ml de cebador de lac Z #LZ-1883F (5'- TGCCACTCGCTTTAATGAT-3', (SEQ ID NO:8) Operon, Inc., Alameda, CA) 9 mM
5 Ml de cebador de lac Z #LZ-1948R (5'-TCGCCGCACATCTGAACTT-3', (SEQ ID NO:9) Operon, Inc., Alameda, CA) 9 mM
1 Ml de cebador de lacZ # LZ-1906T (5'-6FAM-AGCCTCCAGTACAGCGCGGCTGA-TAMRA-3', (SEQ ID NO: 10) Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) 10 mM
25 Ml de TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA)
La amplificación por Q-PCR se realizó usando un sistema de detección de secuencias de Applied Biosystems modelo 7000 según el siguiente programa. Había dos incubaciones iniciales a 50°C durante 2 minutos y 95°C durante 10 minutos para activar polimerasa de Taq y desnaturalizar la plantilla de ADN, respectivamente. A continuación, el ADN se amplificó mediante incubación a 95°C durante 15 s, a continuación 60°C durante 60 segundos durante 40 ciclos. Se construyó una curva estándar usando diluciones cuádruples de pVm lac Z linealizado que variaban de un número de copias de 61 a 1.000.000. El número de copias de genomas de rAAV-lacZ empaquetados en cada muestra se calculó a partir de los valores de Ct obtenidos a partir de la Q-PCR usando el programa de sistema de detección de secuencias Prism 7000 de Applied Biosystems versión 1.0.
C. Ensayo de unión a Heparina
La unión de virus a heparina en lisados crudos se realizó como sigue. Veinte microlitros de lisado celular crudo que contiene viriones de AAV-2 con cápsides silvestres o mutantes se mezclaron con 25 mI de una suspensión al 50% de cuentas de heparina. Las cuentas de heparina (Ceramic Hyper-DM^ Hidrogel-Heparin, Biosepra, Cergy-Saint-Christophe, Francia) tenían 80 Mm de diámetro y tenían poros de 1000 Á para permitir el acceso de AAV (que tiene ~300 Á de diámetro) a la heparina. Las cuentas se lavaron a fondo en solución salina tamponada con fosfato antes del uso. Las cuentas y los viriones se incubaron a 37°C durante 60 minutos. Las cuentas se nodulizaron. El sobrenadante que contenía viriones no unidos se guardó. Las cuentas se lavaron 2 veces con 500 mI de PBS. Los sobrenadantes se combinaron y las proteínas de la cápside no unidas se precipitaron con ácido tricloroacético a una concentración final de 10%. Las proteínas precipitadas se desnaturalizaron mediante incubación en Tris 20 mM, pH 6,8, SDS al 0,1% a 80°C durante 5 minutos. Los viriones unidos a cuentas de heparina se liberaron mediante la incubación de las cuentas en Tris 20 mM, pH 6,8, SDS al 0,1% a 80°C durante 5 minutos. Todas las muestras de proteína preparadas de este modo se fraccionaron por peso molecular mediante SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida al 10% (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y a continuación se detectaron mediante transferencia Western como sigue. Las proteínas se transfirieron electroforéticamente sobre membranas de nailon (Hybond-P, Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.). Las membranas eran sondas con un anticuerpo anti-AAV (clon monoclonal B1, Maine Biotechnology Services, Inc. Portland, ME) a una dilución de 1:20 y a continuación con un anticuerpo de oveja contra inmunoglobulinas de ratón acoplado a peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.) a una dilución de 1:12000. Las proteínas que se unen a anticuerpo B1 se detectaban usando el sistema de detección por transferencia Western ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.). Las membranas se expusieron a película de rayos X Biomax MS, Kodak, Rochester, NY) durante 1-5 minutos y las señales se cuantificaron usando un AlphaImager 3300 (Alpha Innotech Corp., San Leandro, CA)
D. Ensayo de transducción in vitro.
Células HeLa (American Type Culture Collection, n° catálogo CCL-2) se sembraron en placas de 24 pocilios a 5e4 células por pocilio. Las células se hicieron crecer durante 24 h en medio de Eagle con modificación de Dulbecco (DMEM) (Gibco) complementado con suero bovino fetal al 10% (Gibco) y penicilina-estreptomicina (Gibco) a 37°C. Se realizaron diluciones de diez veces de lisados crudos que contenían los virus silvestre de control y mutante en DME/FBS al 10%. Las diluciones del virus se añadieron a las células junto con adenovirus-5 silvestre (American Type Culture Collection, n° de catálogo VR-5). La cantidad de adenovirus usada era 0,1 mI por pocilio, que se valoraba previamente y se muestra que estimula máximamente la transducción de rAAV-2 Lac Z de células HeLa. Después de 24 horas a 37°C, las células se fijaron usando formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2% y se tiñeron con respecto a la actividad de p-galactosidasa usando 1 mg/ml (2,5 mM) de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D galactopiranósido en PBS, MgCÍ22 mM, ferricianuro potásico 5 mM, ferrocianuro potásico 5 mM, pH 7,2. Después de otras 24 horas, el número de células azules en cuatro campos microscópicos aleatorios se contó y se promedió para cada pocillo. En lugar de usar células HeLa y adenovirus-5, también se podían usar células HepG2 y etopósido 20 mM y se obtenían resultados similares.
E. Ensayos de neutralización de anticuerpo y suero.
Células Hep G2 (American Type Culture Collection, n° de catálogo HB-8065) se sembraron en placas de 24 pocilios a 1,5e5 células por pocillo. Las células se hicieron crecer durante 24 h en medio esencial mínimo (de Eagle) (KMEM) (ATCC) complementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina-estreptomicina a 37°C. Se realizaron diluciones dobles del anticuerpo A20 (Maine Biotechnology, Portland, ME) usando PBS. Virus silvestre y mutante se diluyeron al mezclar 1 microlitro de lisado crudo de la preparación viral con 15 microlitros de KMEM/albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1%. Muestras de KMEM/BSA al 0,1% y PBS se incluyeron como controles negativos. Un total de 16 gl de dilución de A20 se mezcló con 16 gl de virus y se incubó a 37°C durante una hora. Se añadieron diez microlitros de mezcla de virus/A20 a cada uno de tres pocillos de células. Después de una incubación de una hora a 37°C, se añadió etopósido (solución de reserva 20 mM en dimetilsulfóxido, Calbiochem) a cada pocillo a una concentración final de 20 gM. Después de 24 horas las células se fijaron usando formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2% y se tiñeron con respecto a la actividad de p-galactosidasa usando 1 mg/ml (2,5 mM) de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D galactopiranósido en PBS, MgCl22 mM, ferricianuro potásico 5 mM, ferrocianuro potásico 5 mM, pH 7,2. Después de otras 24 horas, el número de células azules en cuatro campos microscópicos aleatorios se contó y se promedió para cada pocillo. El título neutralizante de un anticuerpo se define como la dilución de anticuerpo a la que hay una reducción de 50% en el número de episodios de transducción viral (es decir, células azules) en comparación con la transducción en ausencia de anticuerpo.
La neutralización de mutantes por sueros humanos recogidos de hemofílicos o para IgG humana purificada procedente de >10.000 donantes (Panglobulin, ZLB Bioplasma AG, Berna, Suiza) se ensayó del mismo modo. Para IgG humana purificada, se consideraba que una concentración de 10 mg/ml era equivalente a los sueros no diluidos puesto que la concentración normal de IgG en sueros humanos varía de 5-13 mg/ml.
F. ELISAs.
(a) ELISA de A20:
Se usó un estuche de ELISA (American Research Products, Belmont, MA) que usa un anticuerpo monoclonal (A20) para capturar y detectar AAV-2 para cuantificar los números de partículas. El estuche se usó según las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió en un lector de placas Spectramax 340PC (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a una longitud de onda de 450 nm. La concentración de virus necesaria para dar como resultado una lectura de la densidad óptica semimáxima se calculó y se usó para comparar los resultados procedentes de diferentes muestras.
(b) ELISA de IgG/A20:
Se revistieron placas de microvaloración (fondo plano para EIA/RIA de 96 pocillos, poliestireno con alta capacidad de unión, Costar, Corning, NY) usando 100 gl (10 gg) de Panglobulin en tampón de bicarbonato sódico 0,1 M, pH 9,2 durante 16 horas a 20°C. Las placas se bloquearon con 200 gl de PBS, BSA al 1%, Tween-20 al 0,05% durante 1 hora a 20°C. Cantidades crecientes de AAV-2 natural o mutante purificado con gradiente de CsCl que variaban de 3,08 a 1,010 genomas vectoriales por pocillo se añadieron y se incubaron durante 16 horas a 20°C. El virus no unido se eliminó por lavado usando partes alícuotas de 3-200 gl de PBS, tampón de Tween-20 al 0,1%. A20-biotina procedente del estuche de ELISA de AAV-2 se diluyó 1:50, se añadieron 100 gl por pocillo y se incubó durante 1 hora a 37°C. A20-biotina no unidos se eliminaron por lavado usando 3 partes alícuotas de 200 gl de PBS, tampón de Tween-20 al 0,1%. A continuación, estreptavidina acoplada a peroxidasa de rábano picante se diluyó 1:20 y se incubó durante 1 hora a 37°C. Estreptavidina-HRP no unidos se eliminaron por lavado usando 3 partes alícuotas de 200 gl de PBS, tampón de Tween-20 al 0,1%. Sustratos de peroxidasa de rábano picante (Immunopure TMB substrate kit Pierce, Rockford, IL) se añadieron y se incubaron durante 15 min a 20°C. La reacción se detuvo con 100 gl de ácido sulfúrico 2 M y la densidad óptica se midió en un lector de placas Spectramax 340PC (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a una longitud de onda de 450 nm. La concentración de virus necesaria para dar como resultado una lectura de la densidad óptica semimáxima se calculó y se usó para comparar los resultados procedentes de diferentes muestras.
(c) ELISA de IgG:
Se revistieron placas de microvaloración (fondo plano para EIA/RIA de 96 pocillos, poliestireno con alta capacidad de unión, Costar, Corning, NY) con cantidades crecientes de AAV-2 natural o mutante purificado con gradiente de CsCl que variaban de 3,08 a 1,010 genomas vectoriales por pocillo durante 16 horas a 20°C en tampón de bicarbonato sódico 0,1 M, pH 9,2 durante 16 horas a 20°C. Las placas se bloquearon con 200 gl de PBS, BSA al 1%, Tween-20 al 0,05% durante 1 hora a 20°C. El virus no unido se eliminó por lavado usando partes alícuotas de 3-200 gl de PBS, tampón de Tween-20 al 0,1%. Se añadió Panglobulin y se incubó durante 1 hora a 37°C. Panglobulin no unida se eliminó por lavado usando partes alícuotas de 3-200 gl de PBS, tampón de Tween-20 al 0,1%. A continuación, se añadió anticuerpo de burro anti-IgG humana acoplado a peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se incubó durante 1 hora a 37°C. El anticuerpo secundario no unido se eliminó por lavado usando partes alícuotas de 3-200 de PBS, tampón de Tween-20 al 0,1%. Se añadieron sustratos de peroxidasa de rábano picante (Immunopure TMB substrate kit Pierce, Rockford, IL) y se incubaron durante 15 min a 20°C. La reacción se detuvo con 100 pl de ácido sulfúrico 2 M y la densidad óptica se midió en un lector de placas Spectramax 340PC (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a una longitud de onda de 450 nm. La concentración de virus necesaria para dar como resultado una lectura de la densidad óptica semimáxima se calculó y se usó para comparar los resultados procedentes de diferentes muestras.
Las propiedades de empaquetamiento de ADN, unión a heparina y transducción de los mutantes descritos en la presente se resumen en la Tabla 1. Las propiedades de neutralización por anticuerpos de algunos de los mutantes descritos en la presente se resumen en las Tablas 2 y 3.
Tabla 1. Propiedades de mutantes de la cápside de AAV-2.
Mutante 1 Síntesis de la Empaquetamiento de Unión a Transducción5
cápside 2 ADN 3 heparina4
silvestre 100 100 >95 100
Q126A 65 67 >95 55
Q126A/S127L 78 4 >95 0,02
S127A 68 98 >95 53
G128D 100 674 >95 0,02
A128ins1 77 777 >95 0,02
S130A/N131A 55 np >95 0,02
N131A 67 563 >95
0,005
D132A 75 23 >95 0,04
H134A 44 540 >95 2
Q188A 55 16 >95 0,36
D190A 60 51 >95 95
G191S 108 18 >95 22
T193A 38 7 >95 6
S247A 18 83 >95 24
Q248A 60 374 >95 280
S315A 101 122 >95 232
T317A 101 111 >95 208
T318A 100 132 >95 224
Q320A 97 89 >95 68
R322A 100 560 >95 106
G329R 43 21 >95 0,24
S331A 168 80 >95 158
D332A 85 474 >95 8
R334A 169 601 >95 79
D335A 136 127 >95 38
T354A 132 301 >95 93
S355A 69 353 >95 38
S355T 110 183 >95 88
A356R 85 18 25 13
D357A 39 166 >95 4
N359A 24 365 >95 89
N360A 8 246 >95 33
N360H/S361A 145 472 >95 38
S361A 81 608 >95 89
S361A/N358K 59 np >95 0,45
S361A/S494P 87 np 90 0,02
S361A/R592K 108 np 90 180 Mutante 1 Síntesis de la Empaquetamiento de Unión a Transducción5 cápside 2 ADN 3 heparina4
E362A 149 56 >95 12 W365A 195 60 >95 4 T366A 151 8 >95 0,01 G375P 221 82 50 0,01 D377A 211 80 >95 20 K390A 155 267 >95 189 D392A 98 48 >95 0,01 E393A 54 81 >95 2 E394A 29 108 >95 22 K395A 34 2046 >95 14 F396A 178 np >95 148 K407A 220 112 >95 32 E411A 90 513 >95 20 T413A 233 34 >95 252 E418A 264 74 >95 37 K419A 81 806 >95 160 E437A 239 94 >95 24 Q438A 28 101 >95 92 G449A 104 106 >95 196 N450A 217 144 >95 207 Q452A 313 533 >95 473 N568A 439 412 >95 536 K569A 831 333 >95 20 V571A 98 251 >95 142
1 Los mutantes se nombran como sigue: La primera letra es el aminoácido en la cápside de AAV-2 silvestre, el número es la posición en la cápside que se mutaba (numerada según la VP2 de la secuencia de AAV-2), y la última letra es el aminoácido mutante. A128ins1 tiene el aminoácido 128 eliminado y la secuencia DASNDNLSSQSD insertada en su lugar.
2 Según se determina por transferencia Western de lisados crudos. Expresada como un porcentaje de síntesis de la cápside silvestre.
3 Resistente a ADNasa, ADN específico de vector, cuantificado mediante Q-PCR y expresado como un porcentaje del tipo silvestre, que se normalizaba hasta 100%. Promedio de 2 experimentos, cada uno realizado por triplicado. np, no probado.
3 Unión a heparina, expresada como un porcentaje del tipo silvestre. Determinación simple excepto para el tipo silvestre, que es un promedio de tres determinaciones, normalizada hasta 100%.
4 Transducción sobre células 293 humanas expresada como un porcentaje del tipo silvestre. Promedio de 2 experimentos.
Tabla 2. Propiedades de neutralización por anticuerpo de mutantes de la cápside de AAV-2.
Transducción en número de veces células azules neutralización de células azules
Suero1 Mutante (% del tipo silvestre) (- suero) (+ suero) % Resistente neut. HA2 silvestre 100 13275 3 99,98
1,0 R334A 114 15102 146 99,04
42,7
N450A 89 11802 14 99,88
5,2 silvestre 100 25960 8 99,97
1,0 E394A 6 1593 6 99,64
11,2
T413A 21 5505 15 99,73
8,5
N360H/S361A 41 10691 7 99,94
2,0
HA151 silvestre 100 11965 16 99,87
1,0 R334A 185 22125 459 97,93
15,8
E394A 16 1947 14 99,27
5,6 V571A 73 8732 39 99,56
3,4 G449A 218 26137 121 99,54
3,5 N568A 122 14632 36 99,75
1,9 N450A 95 11387 53 99,54
3,5
silvestre 100 15989 13 99,92
1,0 E411A 18 2876 13 99,54
5,7
N360H/S361A 100 15989 21 99,87
1,6
HA165 silvestre 100 22833 14 99,94
1,0 N360A 16 3717 9 99,75
4,0 R334A 74 16872 162 99,04
15,3
1,4 E394A 11 2566 2 99,91
N568A 102 23246 30 99,87
2,1
N450A 64 14514 26 99,82
2,9
N360H/S361A 49 9558 8 99,92
1,3_________________________________________________________________________________________________ 1 Los mutantes se cribaron rápidamente al comparar el número de células transducidas resultantes de la infección de células HepG2 por rAAV-2 lac Z con cápsides mutantes o silvestres en presencia o ausencia de un anticuerpo monoclonal (A20) a una dilución de 1:80 o suero policlonal humano a una dilución de 1:100.
Tabla 3. Propiedades de valoración de anticuerpos de 4 anticuerpos contra mutantes de la cápside de AAV-2.
Disminución en número de veces en el título neutralizante 1 Anticuerpo2: A20 151 165 HA2
Mutante 3
silvestre 1,0 1,0 1,0 1,0
Q126A 2,5 NR NR NR
S127A 57,0 NR NR NR
S247A 2,8 NR NR NR
Q248A 5,7 NR NR NR
R334A NR 3,6 2,4 2,0
N360H/S361A NR 2,2 1,2 1,3
E394A NR 2,1 1,2 1,9
N450A NR 1,7 1,6 1,3
Resistencia multiplicativa predicha:
2415 29 6 11
1 Los títulos se determinaron al usar diluciones dobles de anticuerpo monoclonal y ajustar los datos a una curva logística de cuatro parámetros usando el programa gráfico Sigma Plot. Los valores presentados en la tabla son la disminución en número de veces del mutante con relación a la cápside silvestre. NR, no resistente a la neutralización por el anticuerpo indicado.
2 A20 es un anticuerpo monoclonal de ratón anti-AAV-2 purificado con proteína A. Los sueros 151, 165 y HA2 son 3 sueros humanos no purificados.
3 Los mutantes se nombran como sigue: La primera letra es el aminoácido en la cápside de AAV-2 silvestre, el número es la posición en la cápside que se mutaba (numerada según la VP2 de la secuencia de AAV-2), y la última letra es el aminoácido mutante. A128ins1 tiene el aminoácido
128 eliminado y la secuencia DASNDNLSSQSD (SEQ ID NO:11) insertada en su lugar.
Como se puede observar, al cambiar aminoácidos individuales sobre la superficie de AAV-2, se identificó que 32 mutantes de 61 tenían propiedades casi normales con respecto a la síntesis de la cápside, el empaquetamiento de ADN, la unión a heparina y la transducción de células in vitro. Diez mutantes eran más resistentes a la neutralización por anticuerpos.
Los mutantes formaban proteínas de la cápside a un nivel entre 5 veces inferior y 8 veces inferior que el tipo silvestre. Empaquetaban ADN a un nivel entre 25 veces inferior y 20 veces inferior que el tipo silvestre. Con respecto a la transducción, 28 de los mutantes transducían al menos 50% tan bien como el tipo silvestre, 16 transducían 10-50% del tipo silvestre, 6 transducían 1-10% del tipo silvestre y 11 transducían menos de 1% del tipo silvestre (Tabla 1). No había diferencias significativas en la transducción de células HeLa derivadas de carcinoma de cuello uterino humano o células Hep G2 derivadas de hígado humano, o cuando se usaba bien adenovirus o bien etopósido para potenciar la transducción. Varios mutantes tenían reproduciblemente hasta 5 veces más actividad de transducción que el tipo silvestre (Tabla 1).
La mayoría de los mutantes con <1% de actividad de transducción se agrupaba en una sola zona, sobre una cara del sitio de unión a heparina (propuesto) (Tabla 1, compárese la Figura 4 con la Figura 5). Sin querer limitarse por una teoría particular, las mutaciones cubren una zona que puede ser un sitio de unión a proteína. El mutante que era más defectuoso para la transducción era N131A. No se ha descrito una función para N131, pero se conserva en 40 de 42 subtipos de AAV conocidos.
Cuatro mutaciones afectaban a la unión a heparina más notablemente que las otras (A356R, G375A, S361A/S494P, S361A/R592K). Cada una de estas está cerca de R347, R350, K390, R448 y R451, que se han identificado previamente como aminoácidos que son importantes para la unión a heparina (Figura 5).
Cuarentaicinco de los mutantes (Q126A, S127A, D190A, G191S, S247A, Q248A, S315A, T317A, T318A, Q320A, R322A, S331A, D332A, R334A, D335A, T354A, S355A, S355T, A356R, D357A, N359A, N360A, N360H/S361A, S361A, S361A/R592K, E362A, D377A, K390A, E393A, E394A,K395A,F396A, K407A, E411A, T413A, E418A, K419A, E437A, Q438A, G449A, N450A, Q452A, N568A, K569A, V571A) con más de aproximadamente 10% de la actividad de transducción de la cápside de AAV-2 silvestre se cribaron con respecto a la neutralización por el anticuerpo monoclonal A20 murino. Cuatro mutantes (Q126A, S127A, S247A, Q248A) eran significativamente más resistentes a la neutralización por A20 que AAV2 con una cápside silvestre (véase la Tabla 3). El título de estos mutantes (Q126A, S127A, S247A, Q248A) era 1:203, 1:9, 1:180 y 1:89, respectivamente (Figura 8), que es 2,5, 57, 2,8 y 5,7 veces mayor que el título neutralizante del anticuerpo monoclonal A20 contra la cápside de AAV-2 silvestre (1:509). Estos 4 mutantes están situados inmediatamente adyacentes entre sí sobre la superficie de la cápside de AAV-2 (Figura 6).
Tres (Q126A, S127A, Q248A) de las cuatro mutaciones que reducen la neutralización por A20 eran esencialmente normales con respecto a la síntesis de la cápside, el empaquetamiento de ADN, la unión a heparina y la transducción. La síntesis de la cápside y la transducción por S247A mutante era de 4 a 5 veces menor que la cápside de AAV-2 silvestre. Así, es posible tener un virus que sea normal en varias propiedades importantes pero tenga una resistencia incrementada a la neutralización por anticuerpos.
Los viriones de rAAV mutantes Q126A, S127A, S247A, Q248A daban una resistencia inesperada de 2,5 a 57 veces al anticuerpo neutralizante mientras que mantenían la eficacia de transducción en 2 líneas celulares humanas diferentes (HeLa y HepG2). Estos cuatro aminoácidos son inmediatamente adyacentes entre sí sobre la superficie de AAV-2 (Figura 6). Por otra parte, están en una zona que previamente ha estado implicada en la unión del anticuerpo A20, basándose en experimentos de competición de péptidos y mutagénesis de inserción. Basándose en estas observaciones, es posible que el anticuerpo A20 bloquee una o más funciones necesarias para que AAV-2 transduzca células. En un estudio previo, se ha observado que A20 no bloquea la unión de AAV-2 a heparina (Wobus y cols (2000) J. Virol. 74:9281-93). Los resultados presentados aquí apoyan estos datos ya que las mutaciones que afectan a la unión a heparina están situadas lejos de las mutaciones que afectan a la unión a A20. Aunque A20 no bloquea la unión a heparina, impide que AAV-2 entre en las células. Es posible que A20 no interfiera con la unión a un "receptor de acoplamiento" tal como heparina, pero en cambio interfiere con la unión de AAV-2 a un "receptor de entrada". Se han descrito dos proteínas que se requieren para la transducción de AAV-2 que pueden entrar en receptores: el receptor de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGFR) e integrina avp5. Las zonas sobre AAV-2 a las que se pueden unir estos receptores no se han identificado. Es posible que la integrina avp5, el bFGFR o ambos se puedan unir a la zona localizada descrita en la presente que tiene una alta concentración de mutantes que son significativamente defectuosos en la transducción (<1% de lo normal). Nótese que la zona que es más defectuosa para la transducción está situada adyacente a los mutantes que afectan a la unión a A20.
Los mismos 45 mutantes (Q126A, S127A, D190A, G191S, S247A, Q248A, S315A, T317A, T318A, Q320A, R322A, S331A, D332A, R334A, D335A, T354A, S355A, S355T, A356R, D357A, N359A, N360A, N360H/S361A, S361A, S361A/R592K, E362A, D377A, K390A,E393A,E394A,K395A,F396A, K407A, E411A, T413A, E418A, K419A, E437A, Q438A, G449A, N450A, Q452A, N568A, K569A, V571A) con más de aproximadamente 10% de la actividad de transducción de la cápside de AAV-2 silvestre se cribaron con respecto a la neutralización por 3 antisueros neutralizantes humanos. Se identificaron cuatro mutantes (R334A, N360H/S361A, E394A, N450A) en un cribado inicial que eran más resistentes a la neutralización por los tres antisueros humanos que AAV2 con una cápside silvestre (véase la Tabla 2). El título de los antisueros cuando se probaban sobre estos mutantes variaba de 1,3 a 3,6 veces más que el título neutralizante de los tres antisueros humanos contra la cápside de AAV-2 silvestre (Tabla 3). Otros seis mutantes (N360A, E411A, T413A, G449A, N568A, V571A) tenían niveles incrementados de resistencia a la neutralización en 1 o 2 de los 3 sueros probados (Tabla 2).
La localización de las mutaciones que confieren resistencia a la neutralización por anticuerpos es informativa. En primer lugar, los mutantes que confieren resistencia a un anticuerpo monoclonal de ratón están localizados inmediatamente adyacentes entre sí sobre la superficie de la cápside de AAV-2 mientras que los que confieren resistencia a antisueros humanos están extendido a lo largo de una superficie mayor (Figura 7). Esto sugiere que los antisueros humanos son policlonales, lo que no es sorprendente. En segundo lugar, ambos grupos de mutantes están localizados sobre la meseta y el pico pero no sobre el cilindro, aunque el cilindro sería fácilmente accesible para la unión del anticuerpo. En tercer lugar, las mutaciones que afectan a la neutralización están cerca de zonas importantes para la función del AAV. Varios mutantes que afectan a la neutralización por antisueros humanos (en las posiciones 360, 394, 449, 450) están localizados dentro de 2 aminoácidos del sitio de unión a heparina, que es probable que sea una diana funcionalmente importante para la unión por anticuerpos neutralizantes. Otros mutantes (en las posiciones 126, 127, 247, 248, 334, 568, 571) están localizados en la periferia de la gran región sobre la meseta (zona muerta) que contiene la mayoría de los mutantes que tenían <10% de la actividad de transducción del tipo silvestre (Figura 4). Como el sitio de unión a heparina, esta zona tiene presumiblemente una función importante y es probable que sea una diana funcionalmente importante para la unión por anticuerpos neutralizantes.
Cuando se combinan múltiples mutaciones que confieren resistencia a la neutralización por anticuerpos, la resistencia acumulativa a la neutralización por anticuerpos a menudo es multiplicativa, especialmente cuando las mutaciones individuales den como resultado bajos niveles de resistencia. Por lo tanto, es probable que si los mutantes descritos en la presente están combinados en una cápside, esas cápsides puedan ser de 5 veces a más de 1000 veces más resistentes a la neutralización en comparación con una cápside silvestre (Tabla 3). Las diluciones de A20 mayores de 1:1000 neutralizan <3% de AAV-2 silvestre. Así, un mutante con una combinación de los 4 aminoácidos individuales que proporcione alguna resistencia a la neutralización por A20 podría ser casi completamente resistente a la neutralización incluso por antisueros de A20 no diluidos.
Aunque los mutantes con <10% de actividad de transducción del tipo silvestre también pueden ser resistentes a la neutralización por anticuerpos, no se probaron debido a que el ensayo de neutralización, según se describe en la presente, trabaja mejor cuando se usa para ensayar mutantes que tienen >~10% de la actividad de transducción del tipo silvestre (Figura 3). Esto se debe a que es deseable ser capaz de detectar la neutralización a lo largo de una amplia gama de concentraciones de anticuerpo de modo que se pueda calcular precisamente un título. Sin embargo, los mutantes con <10% de actividad de transducción del tipo silvestre se podrían probar con respecto a su capacidad para unirse a un anticuerpo neutralizante usando una modificación del ensayo descrito en la presente en la que se usaría un mutante defectuoso en la transducción como un competidor. Por ejemplo, un virus de rAAV-2 lacZ "indicador" silvestre se podría mezclar con un AAV-2 "competidor" defectuoso en la transducción que carece de genoma ("virus vacío") o con un virus AAV-2 que tiene empaquetado otro gen (p. ej., proteína fluorescente verde). Si un AAV-2 "competidor" protege a una AAV-2 indicador de la neutralización, entonces la cápside del "competidor" sería capaz de unirse al anticuerpo neutralizante y así no sería resistente a la neutralización. Si un AAV-2 "competidor" no protege a un AAV-2 indicador de la neutralización, entonces la cápside del "competidor" puede no ser capaz de unirse al anticuerpo neutralizador y así podría ser resistente a la neutralización con la condición de que se muestre que forma una cantidad normal de cápside. En este caso, incluso se podrían identificar mutantes que son defectuosos para la transducción pero resistentes a la neutralización por anticuerpos. A fin de elaborar estos mutantes útiles como vehículos para aportar genes en presencia de anticuerpos neutralizantes, sería deseable encontrar una sustitución de aminoácido distinto de alanina que restaurara la actividad de transducción normal, pero todavía retuviera una sensibilidad disminuida a la neutralización.
Se elaboraron 66 mutantes más y se probaron usando los protocolos descritos anteriormente. Las propiedades de empaquetamiento de ADN, unión a heparina y transducción de los mutantes adicionales se resumen en la Tabla 4.
Tabla 4. Propiedades de mutantes de la cápside de AAV-2 adicionales.
Mutante Síntesis de la Empaquetamiento de Unión a Transducción cápside 2 ADN heparina
G128A 207 >95% 1,5 S130A 172 >95% 92 S130T 232 >95% 1164 N131Q 113 >95% 0,01 D132E 202 >95% 4 D132N 188 >95% 75 N133A 187 >95% 418 H134F 180 >95% 0,2 H134Q 340 >95% 17 H134T 102 >95% 0,4 N245A 145 >95% 1,8 G246A 353 >95% 0,6 R350K 52 >95% 16 D357E 222 >95% 427 D357N 157 >95% 28 D357Q 204 >95% 1,6 N360H 129 >95% 37 N360K 59 >95% 0,06 W365F 253 >95% 6 T366S 251 >95% 18 H372F 130 >95% 4,1 H372K 154 >95% 72 H372N 221 >95% 122 H372Q 248 >95% 73 G375A 55 >95% 2,4 D391A 140 >95% 1,21 D392E 158 >95% 15 D392I 411 >95% 0,5 D392N 236 >95% 0,2 D392V 247 >95% 0,001 E393D 218 >95% 80 Mutante Síntesis de la Empaquetamiento de Unión a Transducción cápside 2 ADN heparina
E393K 123 >95% 0,02
E393Q 92 >95% 1,2
E394K 190 >95% 6,0
E411K 28 >95% 4,6
T413K 196 >95% 57
R448A 3255 < 1% 0,3
R448K 768 >95% 80
G449K 270 >95% 3,1
N450K 281 >95% 0,7
R451A 2971 < 1% 0,07
R451K 10 >95% 133
N568K 488 >95% 16
V571K 614 >95% 40
R334A/N360K 380 >95% 0,6
R334A/ G449A 87 >95% 91
R334A/N450A 738 >95% 238
R334A/N568A 150 >95% 147
N360K/N450A 166 >95% 0,2
E411A/T413A 548 >95% 74
G449A/ N450A 94 >95% 111
G449A/ N568A 102 >95% 105
G449K/ N568K 284 >95% 0,02
N568A/V571A 139 >95% 59
R334A/N360K/ E394A 38 >95% 0,8
R334A/N360K/ E394A ins21 21 >95% 0,001
R334A/N360K/ G449K 320 >95% 0,01
R334A/G449A/ N568A 746 >95% 424
R334A/G449K/ N568K 50 >95% 2,0
R347C/G449A/ N450A 102 50% 0,02
R334A/N360K/ N450A 26 >95% 0,3
R334A/N360K/ E394A/N450A 445 >95% 0,9
R334A/N360K/ G449K/ N568K 26 >95% 0,001
E411A/T413A/ G449A/ N450A 372 >95% 74
E411A/T413A/ G449A/ N450A/
N568A/V571A + 437 >95% 14
R334A/N360K/ E394A/E411A/ 0,006
T413A/G449A 152 >95%
N450A/N568A/ V571A_____________________________________________________________
1 ins2 es una inserción de la secuencia HKDDEAKFFPQ después del aminoácido de VP2399.
2 = dentro de 10 veces del tipo silvestre.
Según se muestra en la Tabla 4, se obtuvieron varios mutantes con transducción incrementada en comparación con cápsides silvestres, Por ejemplo, los mutantes S130T, N133A, D357E, H372N, R451K, G449A/N450A, R334A/N450A, R334A/G449A/N568A, R334A/N568A, G449A/N568A presentaban una transducción incrementada. El mutante S130T era el mejor transductor, con aproximadamente 11 veces sobre los niveles del tipo silvestre. Esto era destacable debido a que la única diferencia entre S (serina) y T (treonina) es un grupo CH2. Además, como se observa en la Tabla 4, los mutantes de combinación habitualmente se transducían al mismo nivel que el mutante individual con el nivel de transducción más bajo.
Ciertos aminoácidos de la cápside se solapan con el sitio de unión a heparina. Esta región se denomina la "zona muerta" o "DZ" en la presente. Las mutaciones en la zona muerta pueden dar como resultado cápsides que todavía se unen a uno de los receptores de AAV-2 (p. ej., heparina) pero no transducen células. Se realizaron sustituciones de aminoácido en aminoácidos de la zona muerta y estas sustituciones se compararon con la sustitución del mismo aminoácido por alanina. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Efecto de sustituciones distintas de alanina en la zona muerta.
Posición en la zona muerte Sustitución Transducción (% del tipo silvestre)
G128 A 1,5
D 0,02
N131 A 0,005
Q 0,01
D132 A 0,04
E 4
N 75
H134 A 2
F 0,2
Q 17
T 0,4
D357 A 4
E 427
N 128
Q 1,6
H372 A 0,008 a
F 4
K 72
N 122
Q 73
G375 A 2,4
P 0,01
D392 A 0,01
E 15
I 0,5
N 0,2
V 0,001
E393 A 2
D 80
K 0,2
Q 1.2
a Datos procedentes de Opie, S.R., y cols., J. Virology 77, 6995-7006, (2003)
Según se muestra anteriormente, cuanto más conservativa era la sustitución, más funcional era el mutante de la zona muerta. Por ejemplo, Q era un buen sustituto para H. D era un buen sustituto para E. E o N eran buenos sustitutos para D. No era una sorpresa que la glicina, que tiene varias propiedades únicas, fuera difícil de sustituir.
Se compararon las propiedades de unión a heparina del muíante G375P (transducción 0,01% del tipo silvestre) y G375A (transducción 2,4% del tipo silvestre). El mutante G375P se unía a heparina al 50% y G375a al 95%. La posición 375 se podría requerir tanto para la zona muerta como para el sitio de unión a heparina. La sustitución de glicina por alanina en el mutante G375A da como resultado un fenotipo que es igual que otros mutantes de la zona muerta - - se une a heparina normalmente, pero presenta <10% de la transducción normal. Sin embargo, la sustitución de glicina por prolina en el mutante G375P da como resultado un fenotipo más similar a un mutante defectuoso en la unión a heparina (tal como R347C/ G449A/N450A). Sin querer limitarse por una teoría particular, las diferencias en la estructura entre glicina, alanina y prolina implican que la cadena lateral de glicina se puede requerir para la función de la zona muerta, puesto que la sustitución por alanina reduce la transducción. El grupo amina se puede requerir para la unión a heparina puesto que la sustitución por prolina, que no tiene un grupo amina, afecta a la unión a heparina. Alternativamente, la sustitución por prolina puede alterar la estructura del sitio de unión a heparina a partir de una distancia. Existían tres mutantes (R448A, R451A, R347C/G449A/N450A) que no se unían a heparina, pero estos estaban en posiciones previamente conocidas por ser requeridas para la unión a heparina (347, 448, 451).
Se determinó la actividad de neutralización de varios de estos mutantes por un anticuerpo monoclonal murino (A20) y también por una IgG humana mezclada purificada. La preparación de IgG humana mezclada se usó según está bien caracterizada, disponible comercialmente, altamente purificada, y se cree que representa casi todas las especificidades que se encontrarían en los Estados Unidos que era la fuente de sangre usada para purificar la IgG. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Neutralización mediante IgG humana mezclada purificada y el anticuerpo monoclonal murino A20
Mutante Disminución en número de veces en el Disminución en número de veces en título neutralizante 1 el título de A20
WT 1,0
S127A 2,2 *
G128A 4,1 *
S130A 1,4
S130T 1,8
D132N 3,8 *
N133A 0,9
H134Q 1,5
R334A 2,2 *
T354A 2,9 *
D357E 1,7
D357N 1,8
N360H/S361A 2,1 *
W365A 10,4* 0,5
H372K 1,1
G375P 1,9
D377A 1,9
K390A 2,3 *
E394A 1,5
E394K 2,3 * 0,9
K395A 4,9 * 0,9
F396A 1,6
K407A 3,3 * 1,6
E411A 2,7*
T413K 2,6 *
E418A 1,5
E437A 2,0 * 0,8*
Q438A 1,3
R448K 1,0
G449A 2,5 *
N450A 1,6
Q452A 1,3
Mutante Disminución en número de veces en el Disminución en número de veces en título neutralizante 1 el título de A20
N568A 2,0 *
K569A 4,0 * 1,7
V571A 3,9 * 1,4
V571K 1,0 217*
R334A/ G449A 3,9 *
R334A/N568A 2,4 *
G449A/N568A 1,7
N568A/V571A 2,5 *
R334A/ G449A/N568A 3,0 *
E411A/T413A/G449A/ N450A 1,0
E411A/T413A/ G449A/
N450A/N568A/V571A 1,3
1 *= estadísticamente significativo, p<0,05. Los títulos se determinaron al realizar diluciones dobles de IgG. Los datos se representaron usando el programa Sigma Plot y la recíproca de la dilución a la que se producía 50% de neutralización se define como el título.
Según se muestra en la tabla, 21 mutantes (S127A, G128A, D132N, R334A, T354A, N360H/S361A, W365A, K390A, E394K, K395A, K407A, T413K, E437A, G449A, N568A, K569A, V571A, R334A/ G449A, R334A/N568A, N568A/ V571A, R334A/G449A/N568A) eran 2-10 veces más resistentes a la neutralización por una gran mezcla de IgG humana en comparación con la cápside de AAV-2 natural. Como se esperaría, algunos de los mutantes que eran resistentes a la neutralización por IgG humana mezclada también eran resistentes a la neutralización por sueros humanos individuales (p. ej., R334A, N360H/S361A, G449A, N568A, V571A). Sin querer limitarse por una teoría particular, los epítopos que contienen esos aminoácidos se pueden unir a un anticuerpo con alta afinidad o a alta frecuencia. Sin embargo, algunos mutantes resistentes a la neutralización por IgG humana mezclada no se identificaban como resistentes a sueros individuales, posiblemente debido a que los epítopos que contienen esos aminoácidos se encuentran más raramente en la población humana. Además, algunos mutantes eran resistentes a la neutralización por sueros individuales, pero no a IgG humana mezclada (p. ej., E394A, N450A). En estos casos, es posible que los anticuerpos que se unen a epítopos que contienen estos aminoácidos sean de baja afinidad o de baja abundancia de modo que las mutaciones que afecten a su unión no sean detectables en el contexto de una gran mezcla compleja de IgG.
Como se puede observar en la Figura 7, estas mutaciones están dispersadas en diversas localizaciones a través de la superficie de AAV-2. El tamaño de la zona que cubren es 2-3 veces el tamaño de un epítopo promedio, implicando que hay al menos 2-3 epítopos implicados en la neutralización por la suma total de todas las IgGs humanas.
Las combinaciones de mutantes de resistencia a la neutralización individuales a veces daban como resultado un grado ligeramente superior de resistencia a la neutralización en comparación con los mutantes individuales que comprendían un mutante múltiple. Sin embargo, el grado del efecto claramente no es multiplicativo para estos mutantes a estos niveles de resistencia a la neutralización.
También se identificaron otros dos mutantes resistentes a la neutralización por el anticuerpo monoclonal murino A20: E411A que es 2,7 veces resistente y V571K que es 217 veces resistente a la neutralización por A20. El mutante V571K proporciona una evidencia para un concepto denominado por los presentes inventores "barrido de lisina". En lugar de retirar parte de un sitio de unión a anticuerpo al cambiar un aminoácido con una cadena lateral grande por uno con una cadena lateral menor tal como alanina, el concepto del barrido de lisina es sustituir un aminoácido que tiene una cadena lateral pequeña (p. ej., V571) por lisina que tiene una cadena lateral grande. En lugar de retirar parte de un sitio de unión a anticuerpo como podría ser el caso para sustituciones por alanina, el objetivo del barrido de lisina es insertar aminoácidos más grandes que podrían interferir estéricamente con la unión al anticuerpo. La lisina se eligió debido a que se encuentra comúnmente en la superficie del AAV-2 y así a que probablemente sea una sustitución aceptada. Sin embargo, otras sustituciones de aminoácidos grandes tales como arginina, triptófano, fenilalanina, tirosina o glutamina también dan como resultado un efecto similar sin comprometer la actividad biológica. Nótese que mientras que V571A no es resistente a la neutralización por el anticuerpo A20 murino, V571K es 217 veces más resistente a la neutralización por A20 que la cápside de AAV-2 V571 natural.
V571K está situado sobre la meseta, inmediatamente adyacente a los otros cuatro mutantes identificados como resistentes a la neutralización por A20 (Q126A, S127A, S247A, Q248A; Tabla 3). Sin embargo, E411A está localizado sobre el pico, aunque suficientemente cerca de Q126A, S127A, S247A, Q248A y V571K para estar dentro del mismo epítopo. La inclusión de E411 en el epítopo de A20 evidencia que A20 se puede unir tanto a la meseta como al pico, es decir a través del cañón. El modelado molecular sugiere que uno de los receptores de AAV-2, el receptor de FGF básico (PDB ID: 1FQ9), se podría ajustar muy bien en el cañón de AAV-2 (de un modo y en una localización notablemente similares al modo en que se cree que el receptor de transferrina se une a parvovirus canino). Si el receptor de FGF básico se une al cañón de AAV-2, entonces la unión de A20 a través del cañón bloquearía la unión del receptor de FGF básico y explicaría la observación de que A20 neutraliza AAV-2 al bloquear la entrada, una etapa en la transducción en la que es probable que medie el receptor de FGF.
La zona de meseta y pico se puede unir a anticuerpos que neutralizan otros AAVs al evitar la unión al receptor. Por ejemplo, se ha mostrado que AAV-5 requiere el receptor de PDGF para entrar en células (Di Pasquale y cols., Nature Medicine (2003) 9:1306-1312). Aunque la estructura del receptor de PDGF no se conoce, es homóloga en secuencia de aminoácidos al receptor de FGF básico; Por ejemplo, ambos están compuestos por dominios de secuencia similares a Ig repetitivos similares y así se esperaría que tuvieran estructuras tridimensionales similares. Así, es posible que el receptor de PDGF se pueda unir al cañón de AAV-5.
V571A, pero no V571K, es resistente a la neutralización por IgG humana mezclada. A la inversa, V571K, pero no V571A, es resistente a la neutralización por A20 monoclonal murino. Es posible que los anticuerpos en la mezcla de IgG humana se unan directamente a V571. La sustitución de la cadena lateral de valina por la cadena lateral de alanina menor puede dar como resultado menos unión por IgG humana. La cadena lateral de lisina todavía puede proporcionar suficientes contactos hidrófobos para permitir que se produzca la unión, pero no ser tan grande que impida la unión. A20 puede no unirse directamente a V571 (explicando la ausencia de un efecto del mutante V571A sobre la unión o la neutralización por A20). Sin embargo, A20 se une claramente en la vecindad de V571. Es posible que V571K interfiera indirectamente con la unión a A20, por ejemplo mediante interferencia estérica.
También se realizó un ELISA de IgG. Existen muchos mecanismos potenciales de neutralización, especialmente in vivo. La unión de una IgG a AAV en una región que no se requiere para la función de AAV todavía podría conducir a la reducción de la capacidad de AAV para aportar genes. Por ejemplo, la función principal de los macrófagos es unirse a organismos extraños que están unidos a anticuerpos. Cuando un organismo unido a un anticuerpo está unido a un macrófago (a través de receptores de Fc) el organismo extraño es fagocitado y destruido. Otra ruta potencial que podrían usar los anticuerpos a fin de neutralizar AAV es mediante reticulación. Los anticuerpos son bivalentes y el AAV tendría probablemente 60 sitios de unión a anticuerpo por epítopo (y posiblemente múltiples epítopos). Así, como está bien documentado en la bibliografía científica, a ciertas concentraciones de anticuerpo y virus, se puede formar una red reticulada de AAVs y anticuerpos. Estos complejos inmunitarios se pueden hacer tan grandes que precipiten o se queden alojados en la vasculatura antes de alcanzar un órgano diana. Por esta razón, los anticuerpos que se unen a AAV in vivo, sobre zonas del AAV que no son funcionalmente significativas, pueden dar como resultado una transducción reducida tanto como anticuerpos que se unen a zonas funcionalmente significativas. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7. ELISA de IgG
Disminución en número de veces de Disminución en número de veces de
Mutante IgG humana A20 murino
Silvestre 1 1
S130A 1 1
S130T 1 1
D132N 1 1
H134Q 1 1
G246A 1 1
R334A 1 1
D357E 1 1
N360H 1 1
H372K 1 1
H372Q 1 1
E393D 1 1
T413K 1 1
G449A 1 1
N568K 1 1
N568A 1 1
V571K 10 10
E411A, T413A 1 1 Disminución en número de veces de Disminución en número de veces de Muíante IgG humana A20 murino
N568A, N571A 1 1
E411A, T413A,
G449A, N450A 1 1
R334A, G449A,
N568A
R334A, G449A
R334A, N568A
G449A, N568A
Según se muestra en la Tabla 7, se identificó un muíante (V571K) que se unía tanto a A20 como a una mezcla de IgG humana 10 veces peor que AAV-2 natural. En el ELISA únicamente de A20, la unión del mutante V571K se reducía 10 veces. En el ELISA únicamente de IgG humana, la unión del mutante V571K se reducía 10 veces. Cuando se usaba un formato de ELISA tipo sándwich de A20/IgG, la unión del mutante V571K se reducía 100 veces. La posición (571) es inmediatamente adyacente a las posiciones 126, 127, 247 y 248 sobre la superficie de la cápside de AAV-2. Las posiciones 126, 127, 247 y 248 se identificaron como importantes para la neutralización por el anticuerpo monoclonal de ratón A20. Por lo tanto, esta región puede ser antigénica tanto en ratones como en seres humanos.
En resumen, se identificaron varias mutaciones en la superficie externa de la cápside de AAV-2 que reducían la neutralización por anticuerpos, pero tenían efectos mínimos sobre las propiedades biológicas. En particular, se realizaron 127 mutaciones en 72 posiciones (55% de la superficie específica) consideradas las más probables para ser accesible a la unión a anticuerpos basándose en el acoplamiento de las estructuras de IgG y AAV-2. Se realizaron sustituciones individuales de alanina (57), sustituciones individuales diferentes de alanina (41), mutaciones múltiples (27) e inserciones (2). Todos los mutantes formaban proteínas de la cápside y empaquetaban ADN a niveles dentro de 10 veces del tipo silvestre. Todos los mutantes se unían a heparina tan bien como el tipo silvestre, excepto seis que estaban cerca de o dentro del sitio de unión a heparina. 42 de 98 mutantes individuales se transducían al menos tan bien como el tipo silvestre. Varios mutantes tenían una actividad de transducción incrementada. Uno, un mutante de S por T, tenía una actividad de transducción 11 veces mayor que el tipo silvestre. Los mutantes de combinación (ascendentes o descendentes) habitualmente se transducían al mismo nivel que los mutantes individuales con el nivel de transducción más bajo.
13 de 15 mutantes de sustitución de alanina individuales con <10% de actividad de transducción eran adyacentes entre sí en una zona (10% de la superficie) que se solapa con el sitio de unión a heparina. Aunque estos mutantes de "zona muerta (DZ)" tenían de 0,001%-10% de la actividad de transducción normal, todos ellos se unían a heparina tan eficazmente como el tipo silvestre. La transducción por mutantes de DZ se podría incrementar, y en tres casos restaurar hasta niveles del tipo silvestre, al realizar sustituciones conservativas.
Cinco mutantes tenían unión reducida a un anticuerpo monoclonal de ratón (A20) en un ELISA y eran 2,5-217 veces más resistentes a la neutralización por A20 in vitro. Estos 5 mutantes eran adyacentes entre sí y a la DZ. Un total de 21 mutantes individuales eran 2-10 veces resistentes a la neutralización por tres sueros humanos o por una gran mezcla de IgG humana purificada (IVIG, Panglobulin) en comparación con el tipo silvestre. Diferentes grupos de mutaciones conferían resistencia a diferentes sueros humanos. La localización de estas mutaciones era extendida. El tamaño de la zona que cubrían sugería que los sueros humanos neutralizan AAV-2 al unirse a al menos dos epítopos. Tres mutantes eran resistentes a todos los sueros probados, pero las combinaciones de estos tres mutantes no incrementaban la resistencia a la neutralización por IVIG. Se identificó un mutante (V por K) que se unía a IVIG 10 veces peor que el tipo silvestre en un ELISA únicamente de IVIG. Sin embargo, este mutante no era resistente a la neutralización por IVIG.
En resumen, las mutaciones en la "zona muerta" afectan a la transducción, pero no a la unión a heparina. Las mutaciones alrededor de la DZ pueden incrementar la transducción o disminuir la unión de anticuerpos. La DZ es muy ácida (6 aminoácidos ácidos, 0 básicos). Sin querer limitarse por una teoría particular, puede haber un sitio de unión para una proteína básica, tal como bFGF o el receptor de bFGF. Puesto que la zona muerta es adyacente al sitio de unión a heparina sobre AAV-2, puede ser que si una proteína se une a la zona muerta, entonces esa proteína también se pueda unir a heparina. Tanto bFGF como el receptor de bFGF se unen a heparina.
EJEMPLO 2
EXPRESIÓN DEL FACTOR IX EN RATONES USANDO AAV-hF.IX MUTANTE
Se prepara rAAV-F.IX usando el vector rAAV-2 hF.IX y los métodos descritos anteriormente. Lisados de congelacióndescongelación de las células transfectadas se precipitan, viriones de rAAV se purifican mediante dos ciclos de centrifugación isopícnica; y fracciones que contienen viriones de rAAV se reúnen, se dializan y se concentran. Los viriones concentrados se formulan, se filtran estérilmente (0,22 qM) y se cargan asépticamente en viales de vidrio. Los genomas vectoriales se cuantifican mediante el método de la "reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real" (Real Time Quantitative PCR. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., y Williams P.M. 1996. Genome Research 6:986-994. Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Ratones hembra de 4-6 semanas de edad son inyectados con viriones de rAAV-hF.IX mutantes. Los ratones se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de ketamina (70 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg), y se realiza una incisión longitudinal de 1 cm en la extremidad inferior. Los viriones de AAV-hF.IX recombinantes mutantes (2 x 1011 genomas del vector viral/kg en solución salina tamponada con HEPES, pH 7,8) se inyectan en el músculo tibial anterior (25 ql) y el cuádriceps (50 ql) de cada pata usando una jeringa de Hamilton. Las incisiones se cierran con sutura de Vicril 4­ 0. Se recogen muestras de sangre a intervalos de siete días desde el plexo retroorbital en tubos capilares para microhematocrito y el plasma se ensaya con respecto a hF.IX mediante ELISA. El antígeno F.IX humano en plasma de ratón se valora mediante ELISA según se describe por Walter y cols. (Proc Natl Acad Sci USA (1996) 3:3056-3061). El ELISA no reacciona de forma cruzada con F.IX de ratón. Todas las muestras se valoran por duplicado. Se preparan extractos proteínicos obtenidos de músculo de ratón inyectado mediante la maceración del músculo en PBS que contiene leupeptina (0,5 mg/ml) seguido por ultrasonidos. El residuo celular se retira mediante microcentrifugación, y diluciones 1:10 de los extractos proteínicos se ensayan con respecto a hF.IX en el ELISA. Las concentraciones en plasma en circulación de hF.IX se miden mediante ELISA en diversos momentos después de la inyección IM (p. ej., cero, tres, siete y once semanas).
EJEMPLO 3
TRATAMIENTO DE HEMOFILIA B EN PERROS CON AAV-cF.IX MUTANTE
Se usa una colonia de perros que tienen hemofilia B grave que comprende machos que son hemicigóticos y hembras que son homocigóticas para una mutación puntual en el dominio catalítico del gen de factor IX canino (cF.IX), para probar la eficacia de cF.IX aportado por viriones de rAAV mutantes (rAAV-cF.IX). Los perros hemofílicos graves carecen de cF.IX plasmático, lo que da como resultado un incremento en el tiempo de coagulación sanguínea total (WBCT) hasta >60 minutos (los perros normales tienen un WBCT entre 6-8 minutos) y un incremento en el tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) hasta 50-80 segundos (los perros normales tienen un aPTT entre 13-18 segundos). Estos perros experimentan hemorragias espontáneas recurrentes. Típicamente, los episodios de sangrado significativos son tratados satisfactoriamente mediante la infusión intravenosa individual de 10 ml/kg de plasma canino normal; ocasionalmente, se requieren infusiones repetidas para controlar el sangrado.
Bajo anestesia general, los perros con hemofilia B son inyectados intramuscularmente con viriones de rAAV1-cF.IX a una dosis de 1x1012 vg/kg. A los animales no se les administra plasma canino normal durante el procedimiento.
El tiempo de coagulación de sangre entera se valora con respecto al cF.IX en plasma. Se mide el tiempo de tromboplastina parcial activado. También se realiza un cribado de inhibidores de la coagulación. Plasma obtenido de un perro hemofílico tratado y de un perro normal se mezcla en volúmenes iguales y se incuba durante 2 horas a 37°C. El cribado de inhibidores se puntúa como positivo si el tiempo de coagulación aPTT es 3 segundos mayor que el de los controles (plasma de perro normal incubado con tampón de imidazol y plasma de perro hemofílico de pretratamiento incubado con plasma de perro normal). Se evalúa el título de anticuerpos neutralizantes contra vector de AAV.
EJEMPLO 4
TRATAMIENTO DE HEMOFILIA B EN SERES HUMANOS CON AAV-hF.IX MUTANTE
A. Aporte Muscular
El Día 0 del protocolo, los pacientes son infundidos con concentrado de hF.IX para producir niveles de factor hasta ~100%, y, bajo guía ultrasónica, viriones de rAAV-h.FIX mutantes se inyectan directamente en 10-12 puntos en el músculo vasto lateral de cualquiera o ambos muslos anteriores. El volumen inyectable en cada punto es 250-500 ql, y los puntos están separados al menos 2 cm. Se proporciona anestesia local a la piel mediante cloruro de etilo o una mezcla eutéctica de anestésicos locales. Para facilitar la biopsia muscular posterior, la piel que recubre varios puntos de inyección se tatúa y las coordenadas de inyección se registran mediante ultrasonidos. Los pacientes son observados en el hospital durante 24 h después de la inyección; se observarán las precauciones de aislamiento habituales durante este período para minimizar cualquier riesgo de transmisión horizontal de viriones. Los pacientes son dados de alta y son observados diariamente en consultas externas diariamente durante tres días después del alta, a continuación, semanalmente en el centro para hemofilia local durante las ocho semanas siguientes, a continuación, dos veces al mes hasta cinco meses, a continuación, mensualmente durante el resto del año, a continuación, anualmente en el seguimiento. Los niveles plasmáticos en circulación de hF.IX se cuantifican usando ELISA según se describe anteriormente.
B. Aporte Hepático
Usando la técnica de Seldinger estándar, la arteria femoral común se cánula con una envuelta de introducción angiográfica. A continuación, el paciente se hepariniza mediante inyección IV de 100 U/kg de heparina. A continuación, un catéter doble se hace avanzar en la aorta y se realiza un aortograma abdominal. Después de la delineación de la anatomía arterial celíaca y hepática, se selecciona la HA apropiada usando un catéter de angiografía selectiva estándar (Simmons, Sos-Omni, Cobra o catéteres similares). Antes de la inserción en el paciente, todos los catéteres se lavan con solución salina normal. A continuación, se realiza un arteriograma selectivo usando un material de contraste iniónico (Omnipaque o Visipaque). El catéter se retira sobre un alambre de 0,035 (un alambre de Bentsen, Glide sesgado o similar). A continuación, una envuelta de guía (o catéter de guía) 6F se hace avanzar sobre el alambre dentro de la HA común. A continuación, el alambre se intercambia por un alambre de 0,018 (un alambre FlexT, Microvena Nitenol o similar) y un globo 6X2 Savvy se hace avanzar sobre el alambre dentro de la HA apropiada distal a la arteria gastroduodenal. A continuación, el alambre se retira, la posición de la punta del catéter se confirma mediante la inyección a mano de contraste en el catéter de globo, y la luz se lava con 15 ml de solución salina normal (NS) heparinizada para depurar totalmente el contraste. Antes de la infusión del AAV-hFIX, el globo se infla hasta 2 atm para ocluir la luz de flujo de la HA. AAV-hFIX, en una dosis de 8 x 10E10 - 2 x 10E12, se lleva hasta un volumen final de aproximadamente menos de o igual a 40 ml (dependiendo de la dosis y el peso del paciente) y a continuación se infunde a lo largo de 10-12 minutos usando una bomba de infusión volumétrica automática. A continuación, se infunden tres mililitros (ml) de solución salina normal (NS) (a la misma velocidad que el AAV-hFIX), para depurar el volumen de huecos del catéter. El globo permanece inflado durante 2 minutos, momento en el cual el globo se desinfla y el catéter se retira. A continuación, se realiza un arteriograma de diagnóstico del punto de punción femoral en la proyección oblicua anterior ipsilateral. El punto de punción se cierra mediante métodos estándar, p. ej., utilizando un dispositivo de cierre percutáneo usando bien un 6 F Closer (Perclose Inc., Menlo Park, CA) o bien un 6 F Angioseal, o mediante compresión manual aplicada durante de 15 a 30 minutos en el punto de retirada del catéter.
EJEMPLO 5
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO AAV CAPRINO
A. Cultivo Celular y Aislamiento del Virus
Preparaciones de adenovirus ovino con evidencia de contaminación por parvovirus se aislaron de íleon caprino como sigue. El tejido se homogeneizó en medio MEM de Eagle que contiene sales de Earles (pH 7,2) y gentomicina. El homogenado se clarificó mediante centrifugación a baja velocidad (1.500 x g) durante 20 minutos y se esterilizó por filtración a través de un dispositivo de 0,45 pm. El sobrenadante (500 pl) se inoculó sobre un matraz de 25 cm2 que contiene cultivos primarios de células renales de cordero fetal en el pase 3 y se incubó con suero bovino fetal (USA) e hidrolizado de lactoalbúmina (USA) a 37°C en una incubadora húmeda de CO2 al 5% durante una semana. Las células se tripsinizaron, se separaron y se incubaron de nuevo según se describe anteriormente y finalmente se ensayaron con respecto al efecto citopático (CPE) adenoviral típico. Los matraces que mostraban CPE se congelaron a -70°C, se descongelaron y se estratificaron sobre otros tipos de células. Estos matraces se incubaron más tarde y se probaron con respecto al CPE.
Otros tipos de células usados incluían células de cornete nasal fetal ovino no inmortalizado (pase 8) derivadas de tejido ovino fetal y células renales bovinas de Maden Darby, mantenidas mediante pase a largo plazo (usadas en el pase 160). Se usó tripsina porcina (USA) en todos los procedimientos de cultivo tisular y no se usaron cultivos o productos celulares humanos.
B. Aislamiento de ADN Viral e Identificación y Comparación de Secuencias de AAV
Cuatro preparaciones procedentes de diferentes cultivos celulares y pases se procesaron individualmente con respecto a la extracción de ADN. El sobrenadante que contiene virus se trató con proteinasa K (200 pg) en tampón de digestión (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM (pH 8,0) y SDS al 0,5%) y se incubó a 37°C durante 1 hora. Después de la extracción con fenol-cloroformo y la precipitación con etanol, el ADN viral se resuspendió en TE.
El contenido de ADN de cada preparación se determinó mediante cuantificación de ADN por PicoGreen (Molecular Probes, Eugene, OR) y las preparaciones se diluyeron hasta 20 ng/pl para estandarizar la concentración de ADN para ensayos de PCR posteriores.
Cebadores oligonucleotídicos
Se seleccionaron cebadores oligonucleotídicos basándose en alineamientos de secuencia procedentes de segmentos que estaban altamente conservados entre AAVs conocidos.
El cebador directo 1
(GTGCCCTTCTACGGCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAACTTTCC) (SEQ ID NO:23) era complementario al dominio de helicasa y el cebador inverso 2 (GGAATCGCAATGCCAATTTCCTGAGGCATTAC) (SEQ ID NO:24) era complementario al dominio de unión a ADN. El tamaño esperado de fragmentos de PCR era 1,5 kb.
Amplificaciones por PCR
Todas las reacciones se realizaron en 50 pl en un termociclador de gradiente Eppendorf Mastercycler automático (PerkinElmer, Boston, MA). Cada mezcla de reacción contenía 200 ng de ADN de plantilla, 1 pM de cada cebador oligonucleotídico, 1 mM de Mn(Oac)2, 200 pM de cada trifosfato de desoxinucleósido (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), y 1,0 unidades de polimerasa de rTth, XL (Applied Biosystems, Foster City, CA) en 1 x XL Buffer II. Se usó Ampliwax PCR gem 100 para facilitar el inicio en caliente (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Las condiciones de ciclación eran como sigue: 2 min de desnaturalización a 94°C, seguido por 35 ciclos de 15 s de desnaturalización a 94°C, 30 s de renaturalización a 45°C y 2 min de elongación a 72°C.
Los productos de PCR (10 pl) se separaron electroforéticamente en un gel de agarosa NuSieve (FMC BioProducts, Rockland, MN) al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron mediante luz UV. Se usaron marcadores moleculares de ADN sobre cada gel para facilitar la determinación de los tamaños de los productos de reacción.
Para controlar la especificidad del ensayo, también se realizó una PCR con 100 ng de ADN procedente de un plásmido que contiene secuencias de AAV2.
Secuenciación de ADN
Los productos de PCR se purificaron sobre geles de agarosa de bajo punto de fusión (FMC Bioproducts, Rockland, ME) al 1%, y las secuencias se determinaron usando cebadores diseñados a partir de secuencias de AAV-5.
Los datos de secuencias se analizaron con el paquete informático NTI vector suite (InforMax, Frederick, MD).
Preparaciones virales procedentes de diferentes cultivos celulares y pases se procesaron individualmente con respecto a la extracción de ADN y el análisis por PCR. La amplificación por PCR usando los cebadores directo 1 e inverso 2 revelaba la presencia de secuencias pseudoparvovirales en las cuatro preparaciones. El análisis de secuencias revelaba la presencia de secuencias de AAV. El ORF de VP1 de AAV caprino, correspondiente a los nucleótidos 2.207 a 4.381 del genoma de AAV-5, tiene 93% de identidad nucleotídica (2.104/2.266, Huecos 6/2.266) con AAV-5 de primate (véanse las Figuras 12A-12B) aislado de seres humanos (J. Virol 1999; 73:1309-1319). La comparación de proteínas mostraba 94% de identidad (682/726) y 96% de similitud (698/726) entre el AAV-5 de primate y VP1 de AAV caprino (véase la Figura 13). La mayoría si no todas las mutaciones parecían estar sobre la superficie (véase la Figura 15). La Figura 16 muestra la localización predicha de los aminoácidos superficiales que difieren entre AAV-5 y AAV caprino, basándose en la estructura superficial de la cápside de AAV-2. Los 3 triángulos rellenos representan inserciones en AAV caprino, con relación a AAV-2, que es probable que estén localizadas sobre la superficie.
Sin querer limitarse por una teoría particular, las mutaciones superficiales probablemente eran conducidas mediante presión selectiva debido al sistema inmunitario humoral y/o la adaptación a receptores de rumiante. La falta de cambios en zonas expuestas no superficiales puede implicar la falta de presión procedente de la respuesta inmunitaria celular. Estas regiones mutadas en el virus caprino pueden mejorar la resistencia a anticuerpos anti-AAV5 humanos preexistentes.
La secuencia de AAV caprino se comparó con otros serotipos de AAV y estos serotipos se compararon entre sí a fin de analizar las diferencias en la región no conservada. En particular, las Figuras 14A-14H muestran una comparación de la secuencia de aminoácidos de VP1 procedente de Aa V-1, a Av -2, AAV-3B, AAV-4, AAV-6, AAV-8, AAV-5 de primate y AAV caprino. Los aminoácidos conservados en las secuencias se indican mediante * y se muestra la accesibilidad de las diversas posiciones de aminoácidos basada en la estructura cristalina. B indica que el aminoácido está enterrado entre la superficie interior y la exterior. I indica que el aminoácido se encuentra sobre la superficie interior y O indica que el aminoácido se encuentra sobre la superficie externa.
La región no conservada entre AAV-5 y AAV caprino incluye 43 mutaciones. 17 de estas 43 mutaciones no se conservan entre AAV-2 y AAV-8. Solamente una de estas mutaciones se originaba en el mismo aminoácido en AAV caprino y AAV-8. La región no conservada entre AAV-5 y AAV caprino incluye 348 aminoácidos. Esta región no conservada está comprimida hasta 157 aminoácidos cuando se analiza la región que contiene las mutaciones de las 17 uniones.
Las Tablas 8-11 muestran los resultados de las comparaciones.
Tabla 8
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Tabla 9
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Tabla 10
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Tabla 11
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EJEMPLO 6
INMUNORREACTIVIDAD DE AAV CAPRINO Y COMPARACIÓN CON OTROS AAVS
A. Actividad de Neutralización de Serotipos de AAV de Primate
La actividad de neutralización de los serotipos de AAV de primate indicados en la Tabla 12 se evaluó usando los métodos descritos anteriormente. La inmunorreactividad se determinó usando una IgG humana mezclada purificada (denominada IVIg 8 en las Tablas 12 y 13).
Según se muestra en las Tablas 12 y 13, la mayoría de los serotipos eran neutralizados por la IgG humana mezclada a concentraciones clínicamente pertinentes. AAV-4 y AAV-8 eran más resistentes a la neutralización que AAV-1, AAV-2 y AAV-6, que eran más resistentes a la neutralización que AAV-3, que era más resistente a la neutralización que AAV-5.
B. Actividad de Neutralización de AAV Caprino frente a Serotipos de AAV de Primate
La actividad de neutralización de AAV caprino se comparó con AAV-5 de primate usando los métodos descritos anteriormente. La inmunorreactividad se determinó usando una IgG humana mezclada purificada (denominada IVIg 8 en la Tabla 14). Según se muestra en la Tabla 14, el AAV caprino presentaba más resistencia a la neutralización que AAV-5. La Tabla 14 también muestra la actividad de neutralización de AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6 y AAV-8, según se determina en el ejemplo anterior, con relación al AAV caprino.
En otro experimento, la actividad de neutralización de AAV caprino con relación a AAV-8 se examinó usando tres mezclas purificadas diferentes de IgG humana, denominadas IVIg 3, IVIg 6 e IVIg 8, respectivamente, en las Tablas 15 y 16. Según se muestra en las tablas, el AAV caprino era más resistente a la neutralización que AAV-8 usando las tres mezclas de IgG humana.
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TABLA 13
Vector Concentración más baja de IVIG (mg/ml) que muestra >50% de neutralización del virus
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°
TABLA 14
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TABLA 16
Vector Concentración más baja de IVIG (mg/ml) que muestra >50% de neutralización del virus.
IVIG (Panglobulina, ZLB Bloplasma, IVIG (Panglobulina, ZLB Bioplasma, IVIG (Baxter, Polygam S/D. lote n51838-00299) lote ne 1838-00351) lote ns 02J06AX11) AAV8 10 10 10
AAV
caprino 40 40 40
EJEMPLO 7
CAPACIDAD DE AAV CAPRINO PARA TRANSDUCIR NEURONAS DEL CUERPO ESTRIADO Y CÉLULAS GLIALES Y COMPARACIÓN CON OTROS AAVS
A fin de examinar la capacidad de los diversos AAVs para transducir neuronas del cuerpo estriado y células gliales, se realizó el siguiente experimento. Se prepararon cultivos primarios de neuronas del cuerpo estriado disociadas a partir de embriones de rata Sprague-Dawley embrionaria de 18 días. El tejido del cuerpo estriado disecado se molió en trozos pequeños y se incubó en tripsina durante 30 min. A continuación, el tejido se trituró a través de una pipeta de Pasteur y las células se sembraron a una densidad de 350.000 por pocillo en placas de cultivo de 12 pocillos que contenían cubreobjetos de vidrio redondos de 18 mm revestidos con poli-D-lisina. El medio de cultivo era medio neurobasal complementado con 2% de B-27, 0,5 mM de L-glutamina y 25 mM de ácido L-glutámico. Los cultivos se mantuvieron a 37°C en CO2 al 5% y se usaron en experimentos de dos a tres semanas después de la disociación. En esta fase, las neuronas dopaminérgicas y del cuerpo estriado se distinguen tanto morfológicamente como mediante la expresión de marcadores biológicos.
Los cultivos de cuerpo estriado se incubaron durante cinco días con 104 MOI de viriones de rAAV derivados de AAV-2, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-8 y AAV caprino que contenían el gen de p-galactosidasa (LacZ), preparados usando el método de transfección triple descrito en el Ejemplo 1. Para el AAV caprino, la secuencia codificante de la cápside presente en pHLP19 (descrita en la Patente de EE. UU. N° 6.001.650) se sustituyó por la secuencia codificante de VP1 caprina como sigue. Brevemente, el plásmido pHLP19 se digirió con SwaI y AgeI (New England Biolabs, Beverly, MA 01915-5599), el fragmento de interés se purificó sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión (FMC Bioproducts, Rockland, ME) al 1% y se usó para la ligación con el fragmento de PCR que contenía la cápside caprina. El fragmento de PCR de la cápside caprina se amplificó usando un cebador directo: AAATCAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCC (SEQ ID NO:27) y un cebador inverso:
ACACGAATTAACCGGTTTATTGAGGGTATGCGACATGAATGGG (SEQ ID NO:28). El fragmento de PCR se digirió con la enzima AgeI (New England Biolabs, Beverly, MA 01915-5599) y se usó para la ligación con el plásmido digerido.
Se observaba una expresión eficaz y sostenida de la proteína de p-gal en neuronas del cuerpo estriado después de la transducción con los vectores. La eficacia de expresión era la más alta en AAV6 seguido por AAV8, AAV2, AAV5, AAV caprino y AAV4. Las neuronas transducían AAV6 exclusivamente, mientras que la transferencia génica mediada por AAV5 era ineficaz en neuronas pero transducía células gliales. Todos los otros vectores transducían tanto neuronas como células gliales.
EJEMPLO 8
CAPACIDAD DEL AAV CAPRINO PARA TRANSDUCIR EL MÚSCULO Y COMPARACIÓN CON OTROS AAVS
A fin de determinar la capacidad de los diversos AAVs para transducir el músculo en presencia o ausencia de IVIG, se realizó el siguiente experimento. Ratones SCID macho (15-25 g) fueron inyectados intramuscularmente con 2e11 genomas vectoriales de viriones de rAAV caprino, viriones de rAAV-1 o viriones de rAAV-8 (5 ratones por grupo), codificando cada uno de dichos viriones factor IX humano. Estos viriones se elaboraron usando el método de transfección triple descrito en el Ejemplo 1. La secuencia codificante de la cápside presente en pHLP19 se sustituyó por la secuencia codificante de VP1 caprina según se describe anteriormente. Se recogió sangre retroorbital 1 y 2 semanas después de la inyección del vector y se extrajo plasma. Los ratones probados con IVIG (Carimune: inmunoglobulina purificada procedente de una mezcla de sueros humanos, ZLB Bioplasma, lote n° 03287-00117) fueron inyectados a través de la vena caudal (250 |jl), 24 horas antes de la inyección del vector. El FIX humano se midió en las muestras de plasma usando un ELISA de hFIX.
Según se muestra en la Figura 17, los viriones de rAAV caprino no transducían músculo, los viriones de rAAV-8 y rAAV-1 presentaban niveles similares de expresión de hFIX. AAV-1 era más resistente a la neutralización que AAV-8 in vivo.
EJEMPLO 9
CAPACIDAD DE AAV CAPRINO PARA TRANSDUCIR EL HÍGADO Y COMPARACIÓN CON OTROS AAVS Y BIODISTRIBUCIÓN DE PROTEÍNAS EXPRESADAS A PARTIR DE GENES APORTADOS POR VIRIONES DE AAV CAPRINO
A fin de determinar la capacidad de los diversos AAVs para transducir el hígado en presencia o ausencia de IVIG, se realizó el siguiente experimento. Ratones SCID macho (15-25 g) fueron inyectados a través de la vena caudal con 5e11 genomas vectoriales de viriones de rAAV caprino o viriones de rAAV-8 (5 ratones por grupo). Los viriones incluían el gen que codifica factor IX humano (hFIX). Los datos de los viriones de rAAV-2 posteriores procedían de otro experimento. En particular, los viriones se generaban usando el plásmido pAAV-hFIX16, que contenía el gen del factor IX humano bajo el control de un promotor específico del hígado (descrito en Miao y cols., Mol. Ther. (2000) 1:522-532). El plásmido pAAV-hFIX16 es un plásmido de 11.277 pb que codifica un minigén de Factor IX humano. En esta construcción, el ADNc de FIX se interrumpe entre los exones 1 y 2 con una forma eliminada del intrón 1 que se ha mostrado que incrementa la expresión de FIX. La expresión de FIX está bajo el control transcripcional de la región de control hepática (HCR) de ApoE y el promotor de antitripsina alfa 1 humano (hAAT), así como una señal de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina (gGH PA). El esqueleto del plásmido pAAV-hFIX16 contiene el gen de p-lactamasa, que confiere resistencia a ampicilina, un origen de replicación bacteriano, un origen de replicación de M13/F1 y un fragmento de ADN de bacteriófago lambda. El ADN lambda incrementa el tamaño del esqueleto del plásmido hasta 6.966 pb, lo que impide su empaquetamiento durante la producción del vector de AAV.
Los viriones de AAV recombinantes se produjeron usando el método de transfección triple descrito anteriormente. Para los viriones de rAAV caprino, la secuencia codificante de VP1 presente en el plásmido pHLP19 se sustituyó por la secuencia codificante de VP1 caprina según se describe anteriormente.
Después de la inyección, se recogió sangre retroorbital 1,2, 4 (5 ratones por grupo) y 8 semanas (2 ratones por grupo) después de la inyección y el plasma se extrajo. Los ratones probados con IVIG (Panglobulin: inmunoglobulina purificada procedente de una mezcla de suero humano, ZLB Bioplasma, lote n° 1838-00299) fueron inyectados a través de la vena caudal (250 pl), 24 horas antes de la inyección del vector. Se midió FIX humano en las muestras de plasma mediante un ELISA de hFIX.
Según se muestra en la Figura 18, la transducción del hígado con los viriones de AAV caprino recombinantes después de la administración intravenosa era baja. Se observaba una expresión de hFIX superior usando los viriones de rAAV-8 que con los viriones de rAAV-2, y los viriones de rAAV-2 mostraban una expresión superior que los viriones de rAAV caprino. Los viriones de rAAV caprino eran más resistentes a la neutralización que los viriones de rAAV-2 in vivo. La expresión de FIX humano se reducía en los ratones inyectados con rAAV caprino con títulos neutralizantes de IVIG preexistentes de 120 mientras que la expresión de hFIX se bloqueaba completamente en los ratones inyectados con rAAV-2 con títulos neutralizantes de IVIG preexistentes de 10.
Para el análisis de biodistribución, los ratones (2 ratones por grupo) fueron sacrificados y los órganos se recogieron 4 semanas después de la inyección del vector. Los órganos recogidos incluían cerebro, testículos, músculo (cuádriceps), riñón, bazo, pulmón, corazón e hígado. Para medir hFIX, se realizó PCR cuantitativa sobre muestras de ADN extraídas de diferentes tejidos. Según se muestra en la Figura 19, la biodistribución de viriones de rAAV caprino administrados intravenosamente en ratones SCID mostraba que los viriones de rAAV caprinos tenían tropismo pulmonar.
EJEMPLO 10
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO AAV BOVINO
Se observó evidencia de contaminación por parvovirus en adenovirus bovino (BAV) tipo 8, cepa Misk/67 (disponible de la ATCC, Manassas, VA, N° Registro VR-769) aislado de pulmones de ternero, usando técnicas conocidas en la especialidad. Este nuevo aislado se denominó "AAV-C1". AAV-C1 se amplificó parcialmente mediante PCR, y se secuenció. Las Figuras 20A y '20B muestran la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos, respectivamente, de VP1 procedente de AAV-C1. La secuencia de aminoácidos de VP1 procedente de AAV-C1 se comparó con otras VP1s de AAV. En particular, las Figuras 21A-21H muestran una comparación de la secuencia de aminoácidos de VP1 procedente de AAV-C1 con AAV-1, AAV-2, AAV-3B, AAV-4, AAV-6, AAV-8, AAV-5 de primate y AAV caprino. Los aminoácidos conservados en las secuencias se indican mediante * y se muestra la accesibilidad de las diversas posiciones de aminoácido basada en la estructura cristalina. B indica que el aminoácido está enterrado entre la superficie interior y exterior. I indica que el aminoácido se encuentra sobre la superficie interna y O indica que el aminoácido se encuentra sobre la superficie externa.
VP1 procedente de AAV-C1 presentaba aproximadamente 76% de identidad con AAV-4. AAV-C1 presentaba aproximadamente 54% de identidad con VP1 de AAV-5, con alta homología en la proteína Rep, los primeros 137 aminoácidos de VP1 de AAV-5 y la región no traducida después de la terminación de VP1 de AAV-5 (no mostrada). Así, AAV-C1 parece ser un híbrido natural entre AAV-5 y AAV-4. AAV-C1 también presentaba aproximadamente 58% de identidad de secuencia con VP1s procedentes de AAV-2 y AAV-8, aproximadamente 59% de identidad de secuencia con VP1s procedentes de AAV-1 y AAV-6 y aproximadamente 60% de identidad de secuencia con VP1 procedente de AAV-3B.
Las diferencias de secuencia entre AAV-4 y AAV-C1 estaban dispersas por toda la cápside, al contrario que las diferencias entre AAV-5 y AAV caprino (AAV-G1), en donde los cambios estaban exclusivamente en la región hipervariable C-terminal de VP1. La similitud con la secuencia de AAV-4 era desde el inicio de VP2 hasta la terminación de la cápside. AAV-C1 parece ser uno de los más divergentes de los AAVs de mamífero con aproximadamente 58% de homología de secuencia con AAV-2. En particular, el AAV bovino descrito en Schmidt y cols. se amplificó parcialmente a partir de adenovirus bovino tipo 2. La comparación de la secuencia nucleotídica de VP1 procedente de

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de la cápside de virus adenoasociado (AAV) mutada que cuando está presente en un virión de AAV imparte inmunorreactividad disminuida al virión en comparación con el virión silvestre correspondiente, en donde la mutación comprende al menos una sustitución de aminoácido en la proteína natural, y en donde la sustitución de aminoácido comprende una sustitución del aminoácido que está presente en una posición correspondiente a una posición de la VP2 de la cápside de AAV-2 seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 127.
2. Uso de una proteína de la cápside de virus adenoasociado (AAV) recombinante, dentro de un virión de AAV recombinante, para disminuir la inmunorreactividad de los viriones en comparación con los viriones silvestres correspondientes, en donde dicha proteína de la cápside de AAV mutada comprende una sustitución en la proteína natural del aminoácido que está presente en una posición que corresponde a una posición en la VP2 de la cápside de AAV-2 seleccionada del grupo que consiste en el aminoácido 569, el aminoácido 127 y el aminoácido 450.
3. La proteína según la reivindicación 1 o el uso según la reivindicación 2, en donde el aminoácido presente en la naturaleza en la posición está sustituido por una alanina.
4. Un polinucleótido que codifica la proteína mutada según las reivindicaciones 1 o 3.
5. Un virión de AAV recombinante que comprende la proteína mutada según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4.
6. El virión de AAV recombinante según la reivindicación 5, en donde dicho virión comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica un ARN antisentido o una ribozima.
7. El virión de AAV recombinante según la reivindicación 5, en donde dicho virión comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína terapéutica conectada operativamente a elementos de control capaces de dirigir la transcripción y la traducción in vivo de dicha proteína.
8. El uso según la reivindicación 2 o 3, en el que dicho virión de AAV recombinante comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica un ARN antisentido o una ribozima.
9. El uso según la reivindicación 2 o 3, en el que dicho virión de AAV recombinante comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína terapéutica conectada operativamente a elementos de control capaces de dirigir la transcripción y la traducción in vivo de dicha proteína.
10. Un virión de AAV recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para el uso en el aporte de una molécula de ácido nucleico heterólogo a una célula o un tejido de un sujeto vertebrado, en donde la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico heterólogo se expresa a un nivel que proporciona un efecto terapéutico.
11. El virión de AAV recombinante para el uso según la reivindicación 10, en donde dicha célula o tejido es una célula o tejido muscular.
12. El virión de AAV recombinante para el uso según la reivindicación 11, en donde dicha célula o tejido muscular se deriva de músculo esquelético.
13. El virión de AAV recombinante para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde dicho virión de AAV recombinante se ha de aportar: (i) mediante inyección intramuscular; (ii) a la corriente sanguínea; (iii) intravenosamente; (iv) intraarterialmente; (v) al hígado; o (vi) al cerebro.
14. Uso de un virión de AAV recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para aportar un ácido nucleico heterólogo a una célula o tejido de un sujeto vertebrado in vitro.
15. Uso de un virión de virus adenoasociado (AAV) recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para la fabricación de un medicamento para el uso en un método de tratamiento de un sujeto vertebrado, en donde el virión se aporta a una célula o tejido, en donde el producto codificado por el ácido nucleico heterólogo se expresa a un nivel que proporciona un efecto terapéutico.
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