ES2711349T3 - Cápside - Google Patents

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ES2711349T3 ES16721917T ES16721917T ES2711349T3 ES 2711349 T3 ES2711349 T3 ES 2711349T3 ES 16721917 T ES16721917 T ES 16721917T ES 16721917 T ES16721917 T ES 16721917T ES 2711349 T3 ES2711349 T3 ES 2711349T3
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Amit Nathwani
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Abstract

Una proteína de la cápside del AAV que tiene una secuencia de aminoácidos que: (i) tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3; o (ii) tiene al menos un 99 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 3 y es una cápside híbrida que comprende regiones de las cápsides de AAV3B y AAV8.

Description

DESCRIPCION
Capside
Campo de la invencion
La invencion se refiere a variantes de la capside del virus adenoasociado (AAV).
Antecedentes de la invencion
En los ultimos anos se han desarrollado multiples vectores de transferencia genica recombinantes basados en diferentes virus. Los vectores de transferencia genica basados en virus adenoasociados (AAV), es decir, vectores de AAV, son preferidos debido a su capacidad para transducir diferentes tipos de celulas en division y no en division de diferentes tejidos y la capacidad de establecer una expresion estable del transgen a largo plazo. Si bien los vectores basados en otros virus, tales como los adenovirus y los retrovirus, pueden poseer ciertas caracterfsticas deseables, tambien se han asociado con efectos secundarios no deseados. Dichos efectos secundarios no se han detectado con vectores de transferencia genica basados en AAV (Manno et al., Nature Medicine, 12(3):342 (2006)).
Se han identificado, clonado, secuenciado y convertido en vectores muchos serotipos de AAV. Estos serotipos incluyen AAV8, AAV5, AAV3B y AAV-LK03 descrito mas recientemente (documento WO 2013/029030). Sin embargo, los presentes inventores han encontrado que muchos de los vectores usados actualmente tienen una baja tasa de transduccion en seres humanos. Por ejemplo, los vectores de AAV8 tienen una transduccion 20 veces menor en seres humanos que en ratones, asf como la transaminitis transitoria, sensible a prednisolona, que se produjo en dos tercios de una cohorte de dosis alta. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de nuevos vectores de AAV para mejorar la potencia y la seguridad, asf como para promover una aplicacion clfnica mas amplia.
Con este fin, los inventores han desarrollado nuevas capsides hfbridas intercambiando empfricamente diversos dominios de 4 capsides de AAV diferentes: (1) AAV8, (2) AAV5, (3) AAV3B, y (4) AAV-LK03. Se desarrollaron capsides que lograron un nivel de transferencia genica hasta 5 veces mas alto que los vectores utilizados actualmente.
Sumario de la invencion
En un primer aspecto de la invencion, se proporciona una protefna de capside de AAV que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 99% de identidad con la SEQ ID NO: 3.
Los inventores han encontrado sorprendentemente que la nueva protefna de la capside produce una capside que proporciona una mayor tasa de transduccion que los vectores de AAV utilizados actualmente. Ademas, se ha encontrado que la prevalencia de anticuerpos contra la capside en pacientes es mas baja que para algunos vectores de AAV actualmente utilizados.
En algunas divulgaciones, la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 4. En divulgaciones particulares, la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 96 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 4. En divulgaciones adicionales, la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 97 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 4. En algunas divulgaciones, la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 98 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 4. En otras divulgaciones, la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 4. En divulgaciones particulares, la secuencia de aminoacidos tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4.
La secuencia de aminoacidos tiene al menos un 99% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 3 y mas preferiblemente al menos un 99,5% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 3. En realizaciones particulares, la secuencia de aminoacidos tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos tiene identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 3. En otras divulgaciones, la secuencia de aminoacidos tiene identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 4. En las divulgaciones preferidas, la secuencia de aminoacidos tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4. Mas preferiblemente, la secuencia de aminoacidos tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3.
La protefna de capside que tiene la secuencia de aminoacidos definida anteriormente es una protefna de capside funcional que puede formar una capside funcional, junto con otras protefnas de capside necesarias. Una capside funcional es aquella que puede encerrar material genetico, entrar en una celula y transducir la celula con el material genetico. Estarfa bien dentro de las capacidades de un experto determinar si una capside es funcional. Por ejemplo, los experimentos descritos a continuacion en la descripcion detallada de la invencion se pueden usar para determinar si una capside puede transducir con exito una celula.
La SEQ ID NO: 3 se genera clonando una region de 146 aminoacidos que abarca la region VP1 de AAV8 aguas arriba de los dominios VP2 y VP3 de la capside de AAV3B. La SEQ ID NO: 4 se genera clonando la region VP1 de AAV5 aguas arriba de las regiones VP2 y VP3 de AAV3B. A continuacion se proporcionan mas detalles de los serotipos de AAV y protemas de la capside.
Un segundo aspecto de la invencion proporciona una capside de AAV que comprende la protema de la capside de AAV descrita anteriormente. Una capside de AAV es una cubierta de protema compuesta de protemas VP1, VP2 y VP3 y que encapsula (o encierra) el material genetico del virus.
Ademas, se proporciona una partmula viral que comprende la protema de la capside de AAV descrita anteriormente. La partmula viral comprende la capside de a Av y el material genetico del virus.
En un tercer aspecto de la invencion, se proporciona una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos descrita anteriormente. Esto significa que la secuencia de nucleotidos codifica una protema funcional de la capside.
Preferiblemente, el vector comprende ademas un promotor de tal forma que la secuencia de nucleotidos es expresable. Preferiblemente, el vector comprende el promotor viral p40 de AAV2, que es constitucionalmente activo en la mayona de los tipos de celulas de mairnferos.
Por consiguiente, la presente invencion proporciona vectores de suministro de genes basados en virus adenoasociados (AAV), que normalmente infecta a seres humanos (por ejemplo, los serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 y 6) o primates (por ejemplo, serotipos 1 y 4). Se describe informacion adicional sobre este virus se describe en Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Capttulo 69 en Fields Virology (3a Ed. 1996).
La organizacion genomica de todos los serotipos de AAV conocidos es muy similar. El genoma de AAV es una molecula de ADN lineal monocatenaria que tiene menos de aproximadamente 5.000 nucleotidos (nt) de longitud. Unas repeticiones terminales invertidas (ITR) flanquean las secuencias de nucleotidos codificantes unicas de las protemas de replicacion no estructurales (Rep) y las protemas estructurales (VP). Las protemas VP (VP1, VP2 y VP3) forman la capside. Los 145 nt terminales son autocomplementarios y se organizan de forma que pueda formarse un duplex intramolecular energeticamente estable que forma una horquilla con forma de T. Estas estructuras en horquilla funcionan como origen para la replicacion de ADN viral, actuando como cebadores para el complejo de la ADN polimerasa celular. Despues de la infeccion por AAV de tipo silvestre (wt) de celulas de m ai^ero, se expresan los genes de Rep (es decir, los que codifican protemas Rep78 y Rep52) a partir del promotor P5 y el promotor P19, respectivamente, y las dos protemas Rep intervienen en la replicacion del genoma viral. Un acontecimiento de corte y empalme en el o Rf de Rep tiene como resultado la expresion de exactamente cuatro protemas Rep (es decir, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40). Sin embargo, se ha demostrado que el ARNm no sometido a corte y empalme, que codifica protemas Rep78 y Rep52, en las celulas de mam^era, es suficiente para la produccion del vector de AAV. Tambien son suficientes las protemas Rep78 y Rep52 para la produccion del vector de AAV en las celulas de insecto.
En un AAV adecuado para uso como vector de terapia genica, el genoma del vector tfpicamente comprende un acido nucleico de interes que se empaquetara para liberarse en una celula diana. De acuerdo con esta realizacion particular, el acido nucleico esta localizado entre las ITR virales en cualquier extremo del genoma del vector. Es posible que un genoma de AAV funcione con una sola ITR. Por lo tanto, en un vector de terapia genica de la invencion basado en AAV, el genoma del vector esta flanqueado por al menos una ITR, pero, mas normalmente, por dos ITR de AAV (generalmente una en cada lado del genoma del vector, es decir, una en el extremo 5' y la otra en el extremo 3'). Puede haber secuencias intermedias entre el acido nucleico en el genoma del vector y una o mas de las ITR.
En el contexto de la invencion, "al menos una ITR parvoviral" significa una secuencia palindromica, que comprende principalmente secuencias ordenadas de forma simetrica complementarias, dispuestas simetricamente, tambien denominadas regiones "A", "B" y "C". La ITR funciona como un origen de replicacion, un sitio que tiene un papel "cis" en la replicacion, es decir, que es un sitio de reconocimiento para protemas de replicacion de accion en trans tales como, por ejemplo, Rep 78 (o Rep68), que reconocen las secuencias palindromicas y espedficas internas al palmdromo. Una excepcion a la simetna de las secuencias de ITR es la region "D" de la ITR. Esta es especial (al no tener un complemento dentro de una ITR). El mellado del ADN monocatenario tiene lugar en la union entre las regiones A y D. Es la region en la que se inicia la smtesis de ADN. La region D normalmente se situa en un lado del palmdromo y proporciona direccionalidad a la etapa de replicacion del acido nucleico. Una replicacion de AAV en una celula de marnffero tfpicamente tiene dos secuencias de ITR. Es posible, sin embargo, posible modificar por ingeniena genetica una ITR de manera que los sitios de union esten en las dos cadenas de las regiones A y las regiones D esten localizadas simetricamente, una en cada lado del palmdromo. En una plantilla de ADN bicatenario circular (por ejemplo, un plasmido), despues procede la replicacion del acido nucleico, asistida por Rep78 o Rep68, en las dos direcciones y una sola ITR es suficiente para la replicacion parvoviral de un vector circular. Por lo tanto, En el contexto de la presente invencion puede usarse una secuencia de nucleotidos de ITR. Preferiblemente, sin embargo, se usan dos, u otro numero par, de ITR regulares. Mucho mas preferiblemente, se usan dos secuencias de ITR. Por razones de seguridad, puede ser deseable construir un vector de AAV que no pueda propagarse adicionalmente despues de la introduccion inicial en una celula. Dicho mecanismo de seguridad para limitar la propagacion de un vector indeseable en un receptor puede proporcionarse usando AAV con una ITR quimerica como se describe en el documento US 2003148506.
Los expertos en la materia apreciaran que la protefna o protefnas Rep virales usadas para producir un vector de AAV de la invencion pueden seleccionarse teniendo en cuenta la fuente de las ITR virales. Por ejemplo, la ITR de AAV5 tfpicamente interacciona mas eficazmente con la protefna Rep de AAV5, aunque no es necesario que el serotipo de iTr y de la protefna o protefnas Rep sean iguales.
La o las ITR usadas en la invencion tfpicamente son funcionales, es decir, pueden resolverse completamente y son secuencias de AAV, siendo preferidos los serotipos 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Las iTr de AAV resolubles de acuerdo con la presente invencion no necesitan tener una secuencia de ITR de tipo silvestre (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre puede alterarse por insercion, eliminacion, truncamiento o mutaciones de sentido erroneo), siempre que la ITR medie las funciones deseadas, por ejemplo, el empaquetamiento viral, la integracion y/o el rescate de provirus, y similares.
En realizaciones preferidas adicionales, se eliminan del genoma de plantilla (y, por lo tanto, del ADN del virion producido a partir del mismo) los genes cap de AAV y los genes rep de AAV. Esta configuracion maximiza el tamano de la secuencia o secuencias de acido nucleico que puede llevar la capside de AAV.
Las secuencias que pueden usarse en la presente invencion para la produccion de vectores de terapia genica de AAV pueden derivar del genoma de cualquier serotipo de AAV. En general, los serotipos de AAV tienen secuencias genomicas de homologfa significativa a nivel de los aminoacidos y a nivel del acido nucleico, proporcionan un conjunto identico de funciones geneticas, producen viriones que son esencialmente ffsica y funcionalmente equivalentes, y se replican y ensamblan por mecanismos practicamente identicos. Si se desea mas informacion sobre la secuencia genomica de los diversos serotipos de a Av y una vision general de las similitudes genomicas, vease, por ejemplo, la base de datos GenBank Numero de Registro U89790; GenBank, numero de registro J01901; GenBank, numero de registro AF043303; GenBank, numero de registro AF085716. En la presente invencion puede usarse AAV de serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9. Sin embargo, Los serotipos 1,5 u 8 de AAV son fuentes preferidas de secuencias de AAV para uso en el contexto de la presente invencion. Las secuencias de los serotipos de AAV pueden mutarse o modificarse por ingenierfa genetica cuando se van a usar en la produccion de vectores de terapia genica.
Preferiblemente, las secuencias de ITR de AAV para uso en el contexto de la presente invencion proceden de AAV1, AAV2, AAV4 y/o AAV6. Asimismo, las secuencias codificantes de Rep (Rep78 y Rep52) preferiblemente derivan de AAV1, AAV2, AAV4 y/o AAV6.
Las secuencias de ITR y Rep de AAV estan particularmente conservadas entre la mayorfa de serotipos. Las protefnas Rep78 de diversos serotipos de AAV, por ejemplo, tienen una identidad mayor del 89 % y la identidad de las secuencias de nucleotidos totales a nivel del genoma entre AAV2, AAV3A, AAV3B, y AAV6 es de aproximadamente el 82 %. Por otra parte, se sabe que las secuencias de Rep y las ITR de muchos serotipos de AAV complementan de forma cruzada (es decir, sustituyen funcionalmente) eficazmente a las secuencias correspondientes de otros serotipos en la produccion de partfculas de AAV en celulas de mamffero. El documento US 2003148506 revela que las secuencias Rep e ITR de AAV tambien complementan de forma cruzada eficazmente otras secuencias de Rep e ITR de AAV en celulas de insectos.
Se sabe que las protefnas VP de AAV determinan el tropismo celular del virion de AAV. Las secuencias que codifican la protefna VP estan significativamente menos conservadas que los genes y las protefnas Rep entre diferentes serotipos de AAV. La capacidad de las secuencias de Rep e ITR de complementar de forma cruzada las secuencias correspondientes de otros serotipos permite la produccion de partfculas de AAV pseudotipificadas que comprenden protefnas de la capside de un serotipo (por ejemplo, AAV1, 5 u 8) y las secuencias de Rep y/o ITR de otros serotipo de AAV (por ejemplo, AAV2). Dichas partfculas rAAV pseudotipadas son parte de la presente invencion, ya que las secuencias de Rep y/o ITR de cualquier serotipo de AAV se pueden usar con la protefna de la capside modificada de la invencion.
En el contexto de la presente invencion tambien pueden usarse secuencias de "AAV" modificadas, por ejemplo, para la produccion de vectores de terapia genica de AAV. Estas secuencias modificadas, por ejemplo, incluyen secuencias que tienen al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente al 75 %, al menos aproximadamente al 80 %, al menos aproximadamente al 85 %, al menos aproximadamente al 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, o puede usarse mas identidad de secuencia de nucleotidos y/o aminoacidos (por ejemplo, una secuencia que tenga aproximadamente el 75-99 % de la secuencia de nucleotidos de la identidad) con un ITR de AAV1, AAV2, AAV3, Aa V4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9, o Rep, en lugar de la ITR del AAV de tipo silvestre, o las secuencias de Rep.
Aunque es similar a los otros serotipos de AAV en muchos aspectos, AAV5 difiere de otros serotipos de AAV de simio y humanos en mayor medida que otros serotipos de simio y humanos conocidos. En vista de esto, la produccion de rAAV5 puede diferir de la produccion de otros serotipos en celulas de insecto. Cuando se emplean metodos de la invencion para producir rAAV5, se prefiere que uno o mas constructos que comprenden, colectivamente en el caso de mas de un constructo, una secuencia de nucleotidos que comprende una ITR de AAV5, una secuencia de nucleotidos comprenda una secuencia codificante de Rep de AAV5 (es decir, una secuencia de nucleotidos comprende una Rep78 de AAV5). Estas secuencias de ITR y Rep pueden modificarse cuando se desee para obtener una produccion eficaz de vectores de AAV5 o vectores de AAV5 seudotipificados.
Esta dentro de las competencias tecnicas del experto en la materia seleccionar el virus, subtipo de virus o serotipo de virus mas apropiado. Algunos subtipos o serotipos pueden ser mas apropiados que otros para un cierto tipo de tejido.
Por ejemplo, la expresion especffica de hfgado de un acido nucleico de interes puede inducirse ventajosamente por la transduccion mediada por AAV de celulas hepaticas. El hfgado es susceptible de transduccion mediada por AAV y pueden usarse diferentes serotipos (por ejemplo, AAV1, AAV5 o AAV8). La transduccion del musculo puede realizarse mediante la administracion de un AAV que codifica un acido nucleico a traves del torrente sangufneo. Por lo tanto, es aplicable la administracion intravenosa o intraarterial.
Ventajosamente, utilizando el vector de la presente invencion, se puede obtener un mayor grado de transduccion celular. Este es particularmente el caso de las celulas hepaticas.
Por consiguiente, los vectores de la invencion, por lo tanto, representan una herramienta para el desarrollo de estrategias para la administracion in vivo de una secuencia de nucleotidos terapeutica, mediante la modificacion por ingenierfa genetica del acido nucleico dentro de un vector de terapia genica que transduce eficazmente un tipo celular apropiado, tal como celulas hepaticas.
El vector puede comprender otros elementos para permitir que se exprese la protefna terapeutica funcional. Dichos elementos se conocen bien por los expertos en la tecnica.
Preferiblemente, se afslan los acidos nucleicos y las secuencias de aminoacidos descritas anteriormente.
Estarfa bien con las capacidades de un experto en la tecnica producir las moleculas de acido nucleico y las secuencias de aminoacidos descritas anteriormente. Esto podrfa hacerse, por ejemplo, usando la sfntesis qufmica de una secuencia dada.
La invencion tambien se refiere a un metodo para transferir un acido nucleico de interes a un mamffero que comprende introducir un vector de AAV recombinante en un mamffero, el vector de AAV recombinante que comprende un gen de interes que esta encapsidado en una capside que comprende la protefna de capside descrita anteriormente.
La invencion tambien proporciona una celula huesped que comprende la protefna de la capside que tiene las secuencias de aminoacidos descritas anteriormente o la secuencia de nucleotidos descrita anteriormente.
Como se usa en el presente documento, el termino "huesped" se refiere a organismos y/o celulas que albergan una protefna o una secuencia de nucleotidos de la invencion, asf como organismos y/o celulas que son adecuadas para usarse en la expresion de un gen o protefna recombinante. No se pretende limitar la presente invencion a ningun tipo particular de celula u organismo. De hecho, se contempla que en la presente invencion encontrara utilidad como hospedador cualquier organismo y/o celula adecuada. Una celula huesped puede estar en forma de una sola celula, una poblacion de celulas similares o diferentes, por ejemplo, en forma de un cultivo (tal como un cultivo lfquido o un cultivo en un sustrato solido), un organismo o parte del mismo.
Una celula huesped de acuerdo con la invencion puede permitir la expresion de una molecula de acido nucleico terapeutico. Por lo tanto, la celula huesped puede ser, por ejemplo, una bacteria, una levadura, una celula de insecto o una celula de mamffero.
Ademas, la invencion proporciona un animal transgenico no humano que comprende celulas que comprenden la protefna de la capside que tiene la secuencia de aminoacidos descrita anteriormente o una secuencia de nucleotidos descrita anteriormente. Preferiblemente, el animal es un mamffero no humano; especialmente un primate. Como alternativa, el animal puede ser un roedor, especialmente un raton; o puede ser canino, felino, ovino o porcino.
En un aspecto, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende la protefna de la capside que tiene la secuencia de aminoacidos de la presente invencion o un vector de la invencion y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. El uno o mas excipientes incluyen vehfculos, diluyentes y/u otros agentes medicinales, agentes farmaceuticos o adyuvantes, etc.
Los niveles mas altos de transferencia genica logrados con las secuencias de la presente invencion representan un avance mas alla del estado actual de la tecnica. Se ha observado una mejora en la potencia que permitira la transferencia de genes utilizando dosis mas bajas de vectores, mejorando de este modo la seguridad (especialmente reduciendo la toxicidad hepatica, que depende de la dosis) y a un menor coste. Por consiguiente, las secuencias y el vector de la presente invencion pueden tener una aplicabilidad clfnica a trastornos tales como la deficiencia congenita del FVII, enfermedad de Gaucher, deficiencia de OTC, enfermedad de Fabry, enfermedades por almacenamiento de glucogeno, deficiencia de a-1-antitripsina, colestasis intrahepatica familiar progresiva, enfermedad de Wilson, sfndrome de Crigler Najjar y carcinoma hepatocelular entre otros.
Por consiguiente, la divulgacion puede proporcionar un metodo para tratar una o mas de las enfermedades enumeradas anteriormente que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un vector como se ha descrito anteriormente a un paciente que padece dicha enfermedad. Preferiblemente, el paciente es un ser humano.
Cuando dicha enfermedad se "trata" en el metodo anterior, esto significa que uno o mas sfntomas de dicha enfermedad se mejoran. No significa que los sfntomas de dicha enfermedad esten completamente remediados, de modo que ya no esten presentes en el paciente, aunque en algunos metodos, esto puede ocurrir. El metodo de tratamiento da como resultado que uno o mas de los sfntomas de dicha enfermedad sean menos graves que antes del tratamiento.
Una "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapeutico deseado.
Ademas, la invencion puede proporcionar la protefna de la capside como se ha descrito anteriormente, o un vector como se ha descrito anteriormente para su uso en terapia, preferiblemente para una de las enfermedades mencionadas anteriormente.
Ademas, la divulgacion puede proporcionar el uso de la protefna de la capside como se ha descrito anteriormente o un vector como se ha descrito anteriormente en la fabricacion de un medicamento para tratar una de las enfermedades como se ha mencionado anteriormente.
En la descripcion anterior, el termino "identidad" se usa para hacer referencia a la similitud de dos secuencias. A efectos de la presente invencion, se define aquf que para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos, las secuencias se alinean con fines de comparacion optimos (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la secuencia de un aminoacido para un alineamiento optimo con una segunda secuencia de aminoacidos). Luego se comparan los residuos de aminoacidos. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto de aminoacido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. La identidad porcentual entre las dos secuencias esta en funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, identidad % = n.° de posiciones identicas/n.° de posiciones total (es decir, posiciones solapantes) x 100). Preferiblemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.
Puede realizarse una comparacion de secuencias a lo largo de las longitudes enteras de las dos secuencias que se estan comparando o sobre fragmentos de las dos secuencias. Por lo general, la comparacion se realizara sobre toda la longitud de las dos secuencias que se estan comparando. Sin embargo, la identidad de la secuencia puede realizarse sobre una region de, por ejemplo, aproximadamente veinte, aproximadamente cincuenta, aproximadamente cien, aproximadamente doscientos, aproximadamente quinientos, aproximadamente 1000 o aproximadamente 2000 o mas residuos de aminoacidos contiguos.
El experto en la materia sera consciente del hecho de que se dispone de varios programas informaticos diferentes para determinar la homologfa o identidad entre dos secuencias. En las realizaciones preferidas, la identidad entre dos secuencias se analiza utilizando el paquete de software Clone Manager Professional version 9 (preferiblemente, version 9.4). Esta herramienta de analisis es producida por Sci-Ed Software (Scientific & Educational Software, 11010 Lake Grove Blvd, Ste 100, PMB 122, Morrisville, NC 27560, EE.UU. - http://www.scied.com/index.htm). Los ajustes utilizados para comparar las secuencias son preferiblemente los siguientes: alineamiento: alineamiento global del ADN; parametros: ambas hebras; matriz de puntuacion: lineal (no coincidencia 2, OpenGap 4, ExtGap 1). Como alternativa, tambien se pueden usar metodos tales como Fast Scan -MaxScore y Fast Scan MaxQual con el mismo software y la misma configuracion local.
Tambien pueden usarse otros metodos para determinar la identidad de secuencia. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos o de acido nucleico puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software Accelrys GCG (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), usando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un "gap weight" (penalizacion por creacion de hueco) de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
Un experto en la materia apreciara que todos los aspectos de la invencion, esten relacionados con, por ejemplo, el aminoacido, la partfcula viral, el vector, la celula huesped o el uso, son igualmente aplicables a todos los demas aspectos de la invencion. En particular, ciertos aspectos del metodo de tratamiento, por ejemplo, la administracion del vector, pueden haberse descrito con mayor detalle que en algunos de los otros aspectos, por ejemplo, relacionados con el uso del vector en terapia. Sin embargo, el experto en la materia apreciara cuando se ha proporcionado mas informacion detallada para un aspecto particular de la invencion que, esta informacion generalmente es igualmente aplicable a otros aspectos de la invencion. Ademas, el experto en la tecnica tambien apreciara que la descripcion en relacion con el metodo de tratamiento es igualmente aplicable al uso del vector en terapia.
Descripcion detallada de la invencion
La invencion se describira ahora en detalle, solo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras, en las que: La Figura 1 muestra la evaluacion de las capsides hfbridas de AAV. La parte A muestra un esquema de las capsides hfbridas y la parte B ilustra la eficiencia de transferencia in vitro de las diferentes capsides hfbridas en dos MOI diferentes (multiplicidad de infecciones) en celulas HUH7.
La Figura 2 muestra los resultados de los experimentos de transduccion celular. La Figura 2A muestra los resultados de la transduccion de celulas HUH7 con los vectores de AAV8, AAV5, AAV-rh 10, AAV-LK03 y AAV Mutante C. La Figura 2B muestra los resultados de la transduccion de celulas HepG2 adherentes con los vectores de AAV8, AAV5, AAV-LK03 y AAV Mutante C.
La Figura 3A muestra el analisis de citometrfa de flujo de la transduccion de hepatocitos primarios con los vectores de AAV8, AAV5, AAV-rh10 y AAV Mutante C. La Figura 3B son imagenes de microscopio fluorescente de los hepatocitos transducidos.
La Figura 4A muestra la excitacion/emision de GFP a 485 nm/535 nm resultante de la transduccion de cultivos 3D de celulas HepG2 con vectores de AAV8 y AAV Mutante C que contienen un gen GFP en una MOI de 1 x 104 o 1 x 105. La Figura 4B son imagenes de microscopio fluorescente de las celulas 3D HepG2 transducidas (objetivo 5x, constante de tiempo de exposicion de GFP [300 ms]).
La Figura 5 muestra la prevalencia de los anticuerpos contra vectores de AAV en pacientes con hemofilia grave como resultado de un metodo de inmunoadsorcion ELISA.
El programa de investigacion de los inventores se diseno para establecer un vector de AAV que tiene una tasa de transduccion relativamente alta y efectos secundarios mfnimos. Como resultado, los inventores han desarrollado nuevas capsides y vectores hfbridos.
Ejemplo 1
Se generaron nuevas capsides hfbridas intercambiando empfricamente diversos dominios de 4 capsides de AAV diferentes: (1) AAV8, (2) AAV5, (3) AAV3B, y (4) AAV-LK03 (vease la Figura 1). Se ha informado que este ultimo transduce hepatocitos humanos de manera mas eficiente que las capsides de AAV de origen natural que existen en la actualidad. De forma destacable, LK03 tiene una homologfa de secuencia de aminoacidos >95% con AAV3B. La protefna de la capside de la presente invencion es una capside sintetica que se ha desarrollado mediante la seleccion de motivos de capsides de AAV de tipo silvestre de los serotipos 1-rh10. Las regiones VP2 y VP3 de LK03 se reemplazaron con las regiones correspondientes de AAV8 y AAV5 para generar los mutantes A (SEQ ID NO: 1) (Mut A) y B (SEQ ID NO: 2) (Mut B) respectivamente. En el mutante C (SEQ ID NO: 3) (Mut C), se clono una region de 146 aminoacidos que abarca la region VP1 de AAV8 aguas arriba de los dominios VP2 y VP3 de la capside de AAV3B. De manera similar, en el mutante D (SEQ ID NO: 4) (Mut D), la region AAV5-VP1 se clono aguas arriba de las regiones VP2 y VP3 AAV3B. En el mutante E (SEQ ID NO: 5) (Mut E), los dominios v-I, v-II y v-IX de AAV8 se reemplazaron con el cognado de AAV3B. En la mutante F (SEQ ID NO: 6) (Mut F), se clono una region de 262 aminoacidos que contenfa el sitio de union del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos de AAV3B en la region correspondiente de la capside de AAV8.
La relacion de VP1, VP2 y VP3 para las capsides sinteticas, en particular el mutante C y el mutante D, es similar a la observada para AAV2, 3b, 5 u 8. Tanto el mutante C como el mutante D tienen un fuerte tropismo para las celulas hepaticas humanas y son capaces de mediar niveles mas altos de transferencia genica en estas celulas cuando se comparan con las capsides de AAV de tipo silvestre, incluyendo AAV5 y AAV8.
Las secuencias de la capside se ensamblaron mediante PCR superpuesta o se generaron por sfntesis genica (GenScript; Mut C, Mut E y F). Las secuencias de la capside se clonaron en un plasmido auxiliar de AAV que contenfa la secuencia de codificacion Rep78 de AAV2 que tiene un codon de inicio modificado (ATG a ACG). Las reservas de vectores se prepararon mediante transfeccion de plasmidos triples estandar de celulas HEK293 con pCMV-eGFP, pRep2Cap y el plasmido auxiliar adenoviral, pHGTI. El vector se purifico por centrifugacion en gradiente de densidad con iodixanol. Los genomas de vectores se titularon por QPCR con cebadores especfficos para eGFP. El rendimiento de los vectores de AAV hfbridos fue comparable al observado previamente con AAV8. La eficiencia de transferencia genica de estas capsides hfbridas se evaluo in vitro utilizando la lfnea celular de carcinoma hepatocelular HUH7 en la multiplicidad de infeccion (MOI) 1 x 104 y 1 x 105. El nivel de transferencia genica se determino mediante la deteccion del gen indicador, eGFP, mediante citometrfa de flujo. El mayor nivel de transferencia genica se logro con el mutante C a niveles que fueron al menos 5 veces mas altos que el AAV8 (Figura 1B). Este mutante medio niveles similares de transferencia genica como AAV3B y el nuevo serotipo LK03. La eficiencia de la transferencia genica del mutante D fue menor que la del mutante C, pero 3 veces mayor que el serotipo parental, AAV5. Los mutantes E y F tuvieron niveles mucho mas bajos de transferencia genica en comparacion con los mutantes C con niveles similares de celulas positivas para GFP que se observaron con AAV8 y AAV5 de tipo silvestre.
Ejemplo 2
Produccion de vectores de AAV recombinantes. Los vectores de AAV se realizaron mediante co-transfeccion de celulas T HEK293 adherentes con una combinacion de plasmidos que consistfan en el plasmido vector en el que el gen indicador EGFP estaba bajo el control del promotor CMV, un plasmido auxiliar adenoviral y un plasmido de empaquetamiento en el que el respectivo gen cap de AAV estaba aguas abajo del gen Rep de AAV2 bajo el control de los promotores endogenos. Los vectores se purificaron utilizando cromatograffa en columna AVB. La valoracion de todos los vectores se realizo mediante el ensayo de qPCR, asf como el analisis de gel alcalino.
Transduccion in vitro. Las lfneas celulares de cancer de hfgado cultivadas en monocapa se transdujeron con AAV a varias MOI seguidas de una evaluacion de la eficiencia de transduccion utilizando citometrfa de flujo a las ~72 horas despues de la transferencia genica.
Los hepatocitos humanos primarios se obtuvieron de Life-technologies y se mantuvieron en cultivo segun las instrucciones del proveedor. Luego se expusieron a GFP que codificaba AAV bajo el promotor CMV. La eficiencia de la transferencia genica se evaluo 3-4 dfas mas tarde utilizando citometrfa de flujo o microscopfa de fluorescencia directa.
Se expusieron cultivos en 3D de celulas HepG2 encapsuladas a diferentes MOI de AAV, seguido de una evaluacion por cuantificacion de fluorescencia verde utilizando un lector de placa o mediante microscopfa de fluorescencia directa.
Tftulo de anticuerpo anti-AAV. Se utilizo un metodo de inmunoabsorcion para evaluar el tftulo de anticuerpo anti-AAV en muestras de plasma obtenidas de pacientes con hemofilia grave. Los tftulos de anticuerpos anti-AAV se expresaron como el tftulo de criterio de valoracion (Unidades relativas/ml) definido como el recfproco de la dilucion interpolada con un valor de absorbancia igual a cinco veces el valor de fondo de la absorbancia media.
Eficacia de transduccion de vectores de mutante C de AAV en comparacion con otros serotipos en lfneas celulares de hfgado humano y hepatocitos humanos primarios
En un estudio enfocado, se comparo la eficacia de transduccion in vitro de AAV8, AAV5, AAV-rh10, AAV-LK03 y AAV Mut C en Huh7 (lfnea celular de cancer de hfgado) y lfneas celulares HepG2 (lfnea celular de cancer de hfgado). Todos los vectores contenfan el gen indicador de la protefna fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV).
Los vectores AAV8, AAV5 y AAV-rh10 fueron menos eficientes en la transduccion de celulas Huh7 con una expresion media de GFP que variaba del 15 %-26 %. En comparacion, se observaron niveles mas altos de transferencia genica con AAV-LK03 y Mut C con una eficiencia de transduccion cercana al 70 % para los vectores pseudotipados con estas protefnas de la capside (Figura 2A). La diferencia en la eficiencia de transferencia genica entre Mut C y AAV8 fue altamente significativa (p = 0,0012).
Se obtuvieron resultados similares en la lfnea celular HepG2 (Figura 2B) con una eficiencia de transferencia genica casi 10 veces mayor observada cuando las celulas HepG2 se transdujeron con AAV Mut C y AAV-LK03 en comparacion con a AV8 y AAV5, independientemente de MOI (P = <0,05).
Se evaluo la siguiente eficiencia de transferencia genica de hepatocitos humanos primarios derivados de 3 donantes diferentes. Todos los donantes eran hombres, siendo 2 de origen caucasico y 1 de origen afro-caribeno. La edad de estos donantes vario de 21-52 anos. Los hepatocitos primarios se expusieron a un vector de AAV a una MOI de 106 usando un vector que codifica GFP bajo el control del promotor de CMV. La eficiencia de la transduccion se evaluo mediante microscopfa fluorescente o citometrfa de flujo a los 4-5 dfas despues de la transferencia genica. Como se muestra en la Figura 3, la eficiencia de transferencia genica lograda con AAV Mut C (32,06 ± 4%) fue mas de 4 veces superior a la alcanzada con AAV8 (7,3 ± 7%). La diferencia en la eficiencia de transferencia genica de los hepatocitos humanos primarios entre los grupos AAV Mut C y AAV8 fue altamente significativa (p = 0,0015 utilizando una prueba t de muestra). El analisis de imagen fluorescente directa valido los datos de citometrfa de flujo que muestran un nivel mucho mas alto de expresion de GFP en las celulas transducidas con AAV Mut C (Figura 3B).
Los inventores examinaron a continuacion la transferencia genica mediada por AAV en cultivos 3D de celulas HepG2 encapsuladas en alginato usando JetCutter para producir aproximadamente 500 pm de perlas esfericas que contenfan celulas HepG2 a una concentracion aproximada de 1,7 M por ml de perlas. La resistencia de este modelo es que dentro de las perlas las celulas encapsuladas proliferan para formar esferoides celulares compactos (AELS) con buen contacto celula a celula y funcion celular. Los AELS presentan un mejor crecimiento y una funcion especffica del hfgado regulada positivamente en comparacion con los cultivos en monocapa, con una arquitectura celular tfpica que muestra desmosomas, uniones estrechas y micro-vellosidades, una alta representacion del retfculo endoplasmico y las mitocondrias, y una generacion de matriz extracelular que recuerda al hfgado normal.
Los cultivos de perlas en 3D se transdujeron con AAV8 o AAV Mut C en una MOI de 1 x 104 o 1 x 105 usando un vector que contiene el casete de expresion de CMV GFP. Como anteriormente, la eficiencia de transduccion se determino

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una protefna de la capside del AAV que tiene una secuencia de aminoacidos que:
(i) tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3; o
(ii) tiene al menos un 99 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 3 y es una capside hfbrida que comprende regiones de las capsides de AAV3B y AAV8.
2. La protefna de la capside del AAV de la reivindicacion 1, en la que la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 99,5 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3.
3. La protefna de la capside de AAV de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que la secuencia de aminoacidos tiene la secuencia de la SEQ ID NO.3.
4. Una capside de AAV que comprende la protefna de la capside de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Una partfcula viral que comprende la protefna de la capside de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. Una secuencia de nucleotidos que codifica la protefna de la capside de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. Una celula huesped que comprende la protefna de la capside de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la secuencia de nucleotidos de la reivindicacion 6.
8. Un animal transgenico no humano que comprende celulas que comprenden la protefna de la capside de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la secuencia de nucleotidos de la reivindicacion 6.
9. Una composicion farmaceutica que comprende la protefna de la capside de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la secuencia de nucleotidos de la reivindicacion 6, y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.
10. La protefna de la capside de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la secuencia de nucleotidos de la reivindicacion 6 para su uso en terapia.
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