JP2016084362A - 減少した免疫反応性を有するaavビリオン、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般に、組み換え型アデノ随伴ウイルス(rAAV)ビリオンを細胞に送達するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、免疫反応性が減少したrAAVビリオン(例えば、変異型rAAVビリオン)、ならびにその作製方法および使用方法に関する。
科学者は、糖尿病、血友病および癌のようなヒト疾患に関連する遺伝子を頻繁に発見している。研究努力はまた、遺伝的障害に関連しないが、その代わりに多数の疾患を処置するために使用され得るタンパク質をコードする、エリスロポエチン(赤血球産生を増加させる)のような遺伝子を明らかにしている。しかし、遺伝子を同定および単離する試みにおける有意な進歩にも関わらず、生物薬剤学産業が直面する主要な障害は、治療有効量の遺伝子産物を安全かつ持続的に患者に送達する方法である。
AAVは、Dependovirus属に属するパルボウイルスであり、他のウイルスでは見られない、いくつかの魅力的な特徴を有する。例えば、AAVは、非分裂細胞を含む広範な宿主細胞に感染し得る。AAVはまた、異なる種に由来する細胞に感染し得る。重要なことに、AAVは、ヒトまたは動物の疾患のいずれにも関連せず、そして、組み込まれても、宿主細胞の生理学的特性を変更しないようである。さらに、AAVは、広範な物理的条件および化学的条件において安定であり、このことは、製造、保存および輸送の要件に役立つ。
本発明は、新規AAV配列(例えば、対応するネイティブな血清型と比較して、減少した免疫反応性を組み換え型AAVビリオンに提供するが、細胞および組織に効率的に形質導入する能力を保持する、変異型AAV配列)の発見に基づく。免疫反応性が減少したrAAVビリオンは、自然感染によってか、または以前の遺伝子治療もしくは核酸免疫処置によってのいずれかで、以前にAAVに曝露されたことがあり、それゆえ、抗AAV抗体を発生している被験体に、異種性の核酸分子(HNA)を送達するために特に有用である。それゆえ、本明細書中に記載されるrAAVビリオンは、以前に種々のAAV血清型のいずれかに曝露されたことがある脊椎動物被験体において、以下にさらに記載されるような、広範な種々の障害を処置または予防するために有用である。その結果、本発明によれば、脊椎動物被験体(例えば、哺乳動物)の細胞または組織への、組み換え型AAVビリオンを用いた、HNAの効率的な送達のための方法、および、この方法において使用するためのAAVベクターが提供される。
(a)上記のような組み換え型AAVビリオンを提供する工程;
(b)細胞または組織に組み換え型AAVビリオンを送達し、それによって、この上記タンパク質が治療効果を提供するレベルで発現される、工程
を包含する。
(a)組み換え型AAVビリオンを提供する工程であって、このAAVビリオンは、
(i)AAVビリオン中に存在する場合に、霊長類AAV−2の免疫反応性と比較して、減少した免疫反応性をこのビリオンに与える、非霊長類の哺乳動物アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドタンパク質;および
(ii)治療タンパク質をコードする異種性核酸分子であって、このタンパク質は、このタンパク質のインビボ転写および翻訳を命令し得る制御エレメントに作動可能に連結されている、異種性核酸分子
を含む、工程;
(b)組み換え型AAVビリオンを細胞または組織に送達し、それによって、上記タンパク質が治療効果を提供するレベルで発現される、工程
を包含する。
(項目1)
アデノ随伴ウイルス(AAV)のビリオン中に存在する場合に、対応する野生型のビリオンと比較して、減少した免疫反応性を該ビリオンに与える、変異型アデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質。
(項目2)
上記変異が、ネイティブなタンパク質に対して、少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む、項目1に記載のタンパク質。
(項目3)
上記変異が、少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、項目2に記載のタンパク質。
(項目4)
上記少なくとも1つのアミノ酸置換が、上記AAVビリオンの表面のスパイク領域またはプラトー領域にある、項目3に記載のタンパク質。
(項目5)
上記アミノ酸置換が、アミノ酸126、127、128、130、132、134、247、248、315、334、354、357、360、361、365、372、375、377、390、393、394、395、396、407、411、413、418、437、449、450、568、569および571からなる群より選択されるAAV−2 VP2キャプシドの位置に対応する位置に生じる1つ以上のアミノ酸の置換を含む、項目4に記載のタンパク質。
(項目6)
上記位置に天然に存在するアミノ酸が、アラニンで置換されている、項目5に記載のタンパク質。
(項目7)
上記タンパク質が、AAV−2 VP2の360位に見られるアミノ酸に対応する位置に存在するアミノ酸に対するヒスチジンの置換をさらに含む、項目6に記載のタンパク質。
(項目8)
上記タンパク質が、AAV−2 VP2の571位に見られるアミノ酸に対応する位置に存在するアミノ酸に対するリジンの置換を含む、項目5〜7のいずれかに記載のタンパク質。
(項目9)
項目1〜8のいずれかに記載の変異型タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
(項目10)
項目1〜8のいずれかに記載の変異型タンパク質を含む、組換え型AAVビリオン。
(項目11)
上記ビリオンが、アンチセンスRNAまたはリボザイムをコードする異種性核酸分子を含む、項目10に記載の組み換え型AAVビリオン。
(項目12)
上記ビリオンが、治療タンパク質をコードする異種性核酸分子を含み、該タンパク質は、該タンパク質のインビボ転写および翻訳を命令し得る制御エレメントに作動可能に連結されている、項目10に記載の組み換え型AAVビリオン。
(項目13)
脊椎動物被験体の細胞または組織に異種性核酸分子を送達するための、項目11または12のいずれかに記載の組み換え型AAVビリオンの使用であって、該使用により、該異種性核酸分子によりコードされるタンパク質が、治療効果を提供するレベルで発現される、使用。
(項目14)
上記細胞または組織が、筋肉細胞または筋肉組織である、項目13に記載の使用。
(項目15)
上記筋肉細胞または筋肉組織が、骨格筋由来である、項目14に記載の使用。
(項目16)
上記組み換え型AAVビリオンが、インビボで上記細胞または組織に送達される、項目13に記載の使用。
(項目17)
上記組み換え型AAVビリオンが、筋肉内注射により送達される、項目16に記載の使用。
(項目18)
上記組み換え型AAVビリオンが、インビトロで上記細胞または組織に送達される、項目13に記載の使用。
(項目19)
上記組み換え型AAVビリオンが、血流内に送達される、項目13に記載の使用。
(項目20)
上記組み換え型AAVビリオンが、静脈内送達される、項目19に記載の使用。
(項目21)
上記組換え型AAVビリオンが、動脈内送達される、項目19に記載の使用。
(項目22)
上記組み換え型AAVビリオンが、肝臓に送達される、項目13に記載の使用。
(項目23)
上記組み換え型AAVビリオンが、脳に送達される、項目13に記載の使用。
(項目24)
組み換え型AAVビリオンを、脊椎動物被験体の細胞または組織に送達する方法であって、該方法は、
(a)項目12に記載の組み換え型AAVビリオンを提供する工程;
(b)該組み換え型AAVビリオンを該細胞または組織に送達し、それによって、上記タンパク質が、治療効果を提供するレベルで発現される、工程
を包含する、方法。
(項目25)
脊椎動物被験体の細胞または組織にタンパク質をコードする異種性核酸を送達するための組み換え型アデノ随伴ウイルス(AAV)ビリオンの使用であって、該使用により、該タンパク質が治療効果を提供するレベルで発現され、該使用において、該組み換え型AAVビリオンは、
(i)AAVビリオン中に存在する場合に、霊長類のAAV−2の免疫反応性と比較して、減少した免疫反応性を該ビリオンに与える、非霊長類の哺乳動物AAVキャプシドタンパク質;および
(ii)治療タンパク質をコードし、該タンパク質のインビボ転写および翻訳を命令し得る制御エレメントに作動可能に連結された、異種性核酸分子
を含む、使用。
(項目26)
上記細胞または組織が、筋肉細胞または筋肉組織である、項目25に記載の使用。
(項目27)
上記筋肉細胞または筋肉組織が、骨格筋由来である、項目26に記載の方法。
(項目28)
上記組み換え型AAVビリオンが、インビボで上記細胞または組織に送達される、項目25に記載の使用。
(項目29)
上記組み換え型AAVビリオンが、筋肉内注射により送達される、項目26に記載の方法。
(項目30)
上記組み換え型AAVビリオンが、インビトロで上記細胞または組織に送達される、項目25に記載の使用。
(項目31)
上記組み換え型AAVビリオンが、血流内に送達される、項目25に記載の使用。
(項目32)
上記組み換え型AAVビリオンが、静脈内送達される、項目31に記載の使用。
(項目33)
上記組み換え型AAVが、動脈内送達される、項目31に記載の方法。
(項目34)
上記組み換え型AAVビリオンが、肝臓に送達される、項目25に記載の使用。
(項目35)
上記組み換え型AAVビリオンが、脳に送達される、項目25に記載の使用。
(項目36)
脊椎動物被験体の細胞または組織に組み換え型AAVビリオンを送達する方法であって、該方法は、
(a)組み換え型AAVビリオンを提供する工程であって、該AAVビリオンは、
(i)AAVビリオン中に存在する場合に、霊長類AAV−2の免疫反応性と比較して、減少した免疫反応性を該ビリオンに与える、非霊長類の哺乳動物アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドタンパク質;および
(ii)治療タンパク質をコードする異種性核酸分子であって、該タンパク質は、該タンパク質のインビボ転写および翻訳を命令し得る制御エレメントに作動可能に連結されている、異種性核酸分子
を含む、工程;
(b)該組み換え型AAVビリオンを該細胞または組織に送達し、それによって、該タンパク質が治療効果を提供するレベルで発現される、工程
を包含する、方法。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮すれば、当業者に容易に想到する。
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術範囲内の化学、生化学、組換えDNA技術および免疫学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Fundamental Virology,第2版,vol.I&II(B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編);Handbook of Experimental Immunology,Vols.I〜IV(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編,Blackwell Scientific Publications);T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,最新版);Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989);Methods In Enzymology(S.ColowickおよびN.Kaplan編,Academic Press,Inc.)を参照のこと。
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、これらは、以下に示されるように規定されることが意図される。
アラニン :Ala(A) アルギニン :Arg(R)
アスパラギン:Asn(N) アスパラギン酸 :Asp(D)
システイン :Cys(C) グルタミン :Gln(Q)
グルタミン酸:Glu(E) グリシン :Gly(G)
ヒスチジン :His(H) イソロイシン :Ile(I)
ロイシン :Leu(L) リジン :Lys(K)
メチオニン :Met(M) フェニルアラニン:Phe(F)
プロリン :Pro(P) セリン :Ser(S)
スレオニン :Thr(T) トリプトファン :Trp(W)
チロシン :Tyr(Y) バリン :Val(V)。
CRC Handbook of Parvoviruses(P.Tijssen編,1990));E3(Carterら(1983),前出);およびE4(Carterら(1983),前出;Carter(1995))。E1Bコード領域に変異を有するアデノウイルスにより提供される補助機能の研究は、相反する結果を提供しているが、Samulskiら(1988)J.Virol.62:206−210は、最近、E1B55kはAAVビリオン産生に必要とされるが、E1B19kは必要とされないことを報告した。さらに、国際公報WO 97/17458およびMatshushitaら(1998)Gene Therapy 5:938−945は、種々のAd遺伝子をコードする補助機能ベクターを記載する。特に好ましい補助機能ベクターは、アデノウイルスのVA RNAコード領域、アデノウイルスのE4 ORF6コード領域、アデノウイルスのE2A 72kDコード領域、アデノウイルスのE1Aコード領域、およびインタクトなE1B55kコード領域を欠くアデノウイルスのE1B領域を含む。このようなベクターは、国際公報WO 01/83797に記載される。
M.O.Dayhoff編,補遺5.3:353−358,National Biomedical Research Foundation,Washington,DC)のような容易に利用可能なコンピュータプログラムを用いると、分析に役立ち得る。ALIGNは、ペプチド分析に、SmithおよびWaterman(Advance in Appl.Math.2:482−489,1981)の局部的相同性アルゴリズムを適合する。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8(Genetics Computer Group,Madison,WIから入手可能)において入手可能であり、例えば、BESTFITプログラム、FASTAプログラムおよびGAPプログラム(これらはまた、SmithおよびWatermanのアルゴリズムに依存する)が挙げられる。これらのプログラムは、製造業者により推奨され、そして、上で参照されたWisconsin Sequence Analysis Packageに記載される、デフォルトパラメーターを用いて、容易に利用される。例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対する%同一性は、デフォルトのスコア付け表および6ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用い、SmithおよびWatermanの相同性アルゴリズムを用いて決定され得る。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定の処方またはプロセスのパラメーターに限定されず、従って、これらは当然ながら変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、本発明の特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、制限することは意図されないこともまた、理解されるべきである。
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの実施例は、例示目的のためだけに提供され、本発明の範囲を制限することは決して意図されない。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する組み換え型AAV−2ビリオン(rAAV−2
lacZ)を、米国特許第6,001,650号に記載される三重トランスフェクション手順を用いて調製した。β−galに対する完全なcDNA配列は、GenBank登録番号NC 000913(領域:相補体(362455..365529))の下で入
手可能である。
(A.変異型AAVヘルパー機能ベクター)
AAV−2の構造(Xieら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)99:10405−10410を参照のこと)に基づいて、61の変異体を、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発により構築した。AAVの全表面は、正十二面体形状で整列する60の同一な非対称構造単位から構成される。これは、2つの重要な意味を持つ。第1に、作製される任意の単一のアミノ酸変異が、全てが非対称構造単位内の他のアミノ酸に対して同じ位置で、ウイルスの60の位置で見られることである。第2に、単一の非対称構造単位を研究することによって、このウイルスの全表面を理解し得ることである。
補助機能ベクターpLadeno5を以下のように構築した。精製したアデノウイルス血清型−2のDNA(Gibco/BRLから入手)から単離したE2a、E4およびVA RNA領域をコードするDNAフラグメントを、pAmpscriptと呼ばれるプラスミド内に連結した。pAmpscriptプラスミドを、以下のように組み立てた。オリゴヌクレオチド指向型変異誘発を用いて、ポリリンカーおよびpBSII s/k+(Stratageneから入手)に由来するα相補性発現カセットを含む623bpの領域を除去し、EcoRV部位で置き換えた。オリゴヌクレオチド指向型変異誘発に用いた変異原性オリゴの配列は、5’−CCGCTACAGGGCGCGATATCAGCTCACTCAA−3’(配列番号1)であった。
rAAV−2 hF.IXベクターは、2つのAAV−2逆方向末端反復(米国特許第6,093,392号を参照のこと)の間に、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、hF.IXのエキソン1、hF.IXイントロン1の1.4kbフラグメント、hF.IXのエキソン2〜8、227bpのhF.IX 3’UTR、およびSV40後期ポリアデニル化配列を含む11,442bpのプラスミドである。hF.IXイントロン1の1.4kbのフラグメントは、イントロン1の5’末端(ヌクレオチド1098まで)と、エキソン2との接合点まで延びるヌクレオチド5882からの配列、から構成される。CMVの最初期プロモーターおよびSV40後期ポリアデニル化シグナル配列は、pCMV−Script(登録商標)(Stratageneカタログ、Stratagene,La Jolla,CAから入手可能)の公開配列から得られ得る。
(組み換え型AAVプラスミドpVmLacZの構築)
1.4311bpのXbaI DNAフラグメントを、AAV rep/cap配列を含むpSUB201から切り出した。XbaI末端を、10bpのNotI合成オリゴヌクレオチド(5’−AGCGGCCGCT−3’)(配列番号5)と再度アニーリングして、プラスミド中間体pUC/ITR−NotIを生じた。このプラスミド中間体は、116bpの残留AAV配列により隔てられたAAV ITR(逆方向末端反復)およびNotIリンカーDNAの両方を有する。
種々の変異型AAVヘルパー機能ベクター(上記)、補助機能ベクターpLadeno5(米国特許第6,004,797号に記載される)、およびrAAV2−lacZベクターであるpVmLacZ(上記)を使用して、組み換え型ビリオンを生成した。
(A.キャプシド合成アッセイ)
タンパク質の変異は、タンパク質を不安定にし、プロテアーゼによる分解に対して正常なものよりもより感受性にし得る。本明細書中に記載される変異により作成されるキャプシドのレベルを決定するために、粗製溶解物のウェスタンブロッティングを行った。1μlの各粗製溶解物を、20mM Tris、PH6.8、0.1% SDS中で、80℃にて5分間インキュベートすることによって変性させた。タンパク質を、10%ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)を用いるSDS−PAGEにより分画し、次いで、以下のようにウェスタンブロッティングにより検出した。これらのタンパク質を、ナイロン膜(Hybond−P,Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)上に、電気泳動的にブロットした(Xcell IIブロットモジュール,Invitrogen,Carlsbad,CA)。この膜を、1:20希釈の抗AAV抗体(モノクローナルクローンB1,Maine Biotechnology Services,Inc.Portland,ME)でプローブし、次いで、1:12000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヒツジ抗マウス抗体(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)でプローブした。B1抗体結合タンパク質を、ECL Plusウェスタンブロッティング検出システム(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)を用いて検出した。この膜を、X線フィルム(Biomax MS,Kodak,Rochester,NY)に1〜5分間曝露し、そして、AlphaImager 3300(Alpha Innotech Corp.,San
Leandro,CA)を用いてシグナルを定量した。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q−PCR)を用いて、変異型キャプシドを有するAAV−2ビリオンによるDNAパッケージングを評価した。この手順において、PCR増幅の前に粗製溶解物をDNAse Iで消化して、誤った陽性シグナルを生じ得る(トランスフェクションにおいて使用された)任意のプラスミドを除去した。この粗製溶解物を、10mM Tris,pH8.0、10μg/ml酵母tRNA中100倍(5μlの粗製溶解物+495μlの緩衝液)に希釈した。この希釈物のアリコート(10μl)を、最終容量50μlの25mM Tris,pH8.0、1mM MgCl2中10単位のDNAse I(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)で、37℃にて60分間消化した。DNAse Iを95℃で30分間加熱することにより不活性化した。1μl(20μg)のプロテイナーゼK(Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN)を加え、55℃で30分間インキュベートした。プロテイナーゼKを、95℃で20分間加熱することによって不活性化した。この時点で、このサンプルを、10mM
Tris,pH8.0、10μg/ml酵母tRNA(必要に応じて)中に希釈した。10μlのDNAse IおよびプロテイナーゼKで処理したサンプルを、以下から構成される40μlのQ−PCRマスターミックスに加えた:
4μl H2O
5μl 9μM lacZプライマー#LZ−1883F(5’−TGCCACTCGCTTTAATGAT−3’(配列番号8)Operon,Inc.,Alameda,CA)
5μl 9μM lacZプライマー#LZ−1948R(5’−TCGCCGCACATCTGAACTT−3’(配列番号9)Operon,Inc.,Alameda,CA)
1μl 10μM lacZプローブ#LZ−1906T(5’−6FAM−AGCCTCCAGTACAGCGCGGCTGA−TAMRA−3’(配列番号10)Applied Biosystems,Inc.Foster City,CA)
25μl TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems,Inc.Foster City,CA)。
粗製溶解物中のウイルスのヘパリン結合を、以下のように実施した。野生型もしくは変異型のキャプシドを有するAAV−2ビリオンを含む20μlの粗製細胞溶解物を、ヘパリンビーズの50%スラリー(25μl)と混合した。このヘパリンビーズ(Ceramic Hyper−DM Hydrogel−Heparin,Biosepra,Cergy−Saint−Christophe,France)は、直径80μmであり、1000Åの孔を有し、AAV(直径約300Å)のヘパリンへのアクセスが可能であった。このビーズを、使用前に、リン酸緩衝化生理食塩水中で十分に洗浄した。このビーズおよびビリオンを、37℃で60分間インキュベートした。このビーズをペレット状にした。未結合のビリオンを含む上清を保存した。このビーズを、500μlのPBSで2回洗浄した。この上清を合せ、未結合のキャプシドタンパク質を10%の最終濃度のトリクロロ酢酸で沈殿させた。沈殿したタンパク質を、20mM Tris,pH6.8、0.1% SDS中で、80℃にて5分間インキュベーションすることにより変性させた。ヘパリンビーズに結合したビリオンを、そのビーズを20mM Tris,pH6.8、0.1% SDS中で、80℃にて5分間インキュベーションすることにより放出した。この様式で調製した全てのタンパク質サンプルを、10%ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)を用いるSDS−PAGEにより分子量で分画し、次いで、以下のようにウェスタンブロッティングにより検出した。このタンパク質を、ナイロン膜(Hybond−P,Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)上に電気泳動的にブロットした。この膜を、1:20希釈の抗AAV抗体(モノクローナルクローンB1,Maine Biotechnology Services,Inc.Portland,ME)でプローブし、次いで、1:12000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヒツジ抗マウス抗体(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)でプローブした。このB1抗体結合タンパク質を、ECL Plusウェスタンブロッティング検出システム(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)を用いて検出した。この膜を、X線フィルム(Biomax MS,Kodak,Rochester,NY)に1〜5分間曝露し、そして、AlphaImager 3300(Alpha Innotech Corp.,San Leandro,CA)を用いてシグナルを定量した。
HeLa細胞(American Type Culture Collection,カタログ#CCL−2)を、1ウェルあたり5e4細胞で24ウェルディッシュにプレートした。この細胞を、10%胎仔ウシ血清(Gibco)およびペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco)中で、37℃にて24時間増殖させた。コントロールの野生型ウイルスおよび変異型ウイルスを含む粗製溶解物の10倍希釈物を、DME/10% FBS中で作製した。このウイルス希釈物を、野生型アデノウイルス−5(American Type Culture Collection,カタログ#VR−5)と共に細胞に加えた。使用したアデノウイルスの量は、1ウェルあたり0.1μlであり、これは、前もって力価測定して、rAAV−2 lacZのHeLa細胞への形質導入を最大限に刺激することが示された。37℃にて24時間後、この細胞を、2%ホルムアルデヒドおよび0.2%グルタルアルデヒドを用いて固定し、そして、PBS中1mg/ml(2.5mM)の5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−Dガラクトピラノシド、2mM MgCl2、5mMフェリシアン化カリウム、5mMフェロシアン化カリウム、pH7.2を用いて、β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。さらに24時間後、4つのランダムな顕微鏡視野内の青色細胞の数を計数し、各ウェルについて平均した。HeLa細胞およびアデノウイルス−5を用いる代わりに、HepG2細胞および20μMのエトポシドもまた使用され得、類似の結果が得られた。
HepG2細胞(American Type Culture Collection,カタログ#HB−8065)を、1ウェルあたり1.5e5細胞で24ウェルディッシュにプレートした。細胞を、10%の胎仔ウシ血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した(イーグルの)最小基本培地(KMEM)(ATCC)中で37℃にて24時間増殖させた。A20抗体(Maine Biotechnology,Portland,ME)の2倍希釈物をPBSを用いて作成した。1μlのウイルス調製物の粗製溶解物を15μlのKMEM/0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)と混合することによって、野生型および変異型のウイルスを希釈した。KMEM/0.1% BSAおよびPBSのサンプルを、ネガティブコントロールとして含めた。合計16μlのA20希釈物を、16μLのウイルスと混合し、37℃で1時間インキュベートした。10μlのウイルス/A20混合物を、3つの細胞のウェルの各々に添加した。37℃にて1時間インキュベートした後、エトポシド(ジメチルスルホキシド中20mMストック溶液、Calbiochem)を、20μMの最終濃度で各ウェルに添加した。24時間後、この細胞を、2%ホルムアルデヒドおよび0.2%グルタルアルデヒドを用いて固定し、そして、PBS中1mg/ml(2.5mM)の5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−Dガラクトピラノシド、2mM MgCl2、5mMフェリシアン化カリウム、5mMフェロシアン化カリウム、pH7.2を用いて、β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。さらに24時間後、4つのランダムな顕微鏡視野内の青色細胞の数を計数し、各ウェルについて平均した。抗体の中和力価を、抗体なしの形質導入と比較して、ウイルスの形質導入事象(すなわち、青色細胞)の数の50%減少を生じる抗体の希釈として規定する。
(a)A20 ELISA:
AAV−2を捕捉し、検出するためにモノクローナル抗体(A20)を使用するELISAキット(American Research Products,Belmont,MA)を用いて、粒子数を定量した。このキットを、製造業者の指示に従って使用した。光学密度を、450nmの波長のSpectramax 340PCプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)にて測定した。最大半減の光学密度の読みを生じるために必要とされるウイルスの濃度を計算し、異なるサンプルからの結果と比較するために使用した。
マイクロタイタープレート(96ウェルEIA/RIA平底、高結合ポリスチレン、Costar,Corning,NY)を、0.1M重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.2中100μl(10μg)のPanglobulinを用いて、20℃にて16時間コーティングした。プレートを、200μlのPBS、1% BSA、0.05% Tween−20で、20℃にて1時間ブロッキングした。1ウェルあたり3.08〜1.010ベクターゲノムの範囲で増加する量のCsCl勾配精製したネイティブ、または変異型のAAV−2を添加し、20℃にて16時間インキュベートした。未結合のウイルスを、PBS、0.1% Tween−20緩衝液のアリコート(200μl)を3回用いて洗い出した。AAV−2 ELISAキットからのA20−ビオチンを、1:50に希釈し、1ウェルあたり100μlを添加し、37℃で1時間インキュベートした。未結合のA20−ビオチンを、PBS、0.1% Tween−20緩衝液のアリコート(200μl)を3回用いて洗い出した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを1:20に希釈し、37℃で1時間インキュベートした。未結合のストレプトアビジン−HRPを、PBS、0.1% Tween−20緩衝液のアリコート(200μl)を3回用いて洗い出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質(Immunopure TMB基質キット Pierce,Rockford,IL)を添加し、20℃で15分間インキュベートした。この反応を、100μlの2M硫酸で停止し、光学密度を、450nmの波長のSpectramax 340PCプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)にて測定した。最大半減の光学密度の読みを生じるために必要とされるウイルスの濃度を計算し、異なるサンプルからの結果と比較するために使用した。
マイクロタイタープレート(96ウェルEIA/RIA平底、高結合ポリスチレン、Costar,Corning,NY)を、0.1M重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.2中、1ウェルあたり3.08〜1.010ベクターゲノムの範囲で増加する量のCsCl勾配精製したネイティブもしくは変異型のAAV−2を用いて、20℃にて16時間コーティングした。プレートを、200μlのPBS、1% BSA、0.05% Tween−20で、20℃にて1時間ブロッキングした。未結合のウイルスを、PBS、0.1% Tween−20緩衝液のアリコート(200μl)を3回用いて洗い出した。パングロブリンを添加し、37℃で1時間インキュベートした。未結合のパングロブリンを、PBS、0.1% Tween−20緩衝液のアリコート(200μl)を3回用いて洗い出した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したロバ抗ヒトIgG(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。未結合の二次抗体を、PBS、0.1% Tween−20緩衝液のアリコート(200μl)を3回用いて洗い出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質(Immunopure TMB基質キット Pierce,Rockford,IL)を添加し、20℃で15分間インキュベートした。この反応を、100μlの2M硫酸で停止し、光学密度を、450nmの波長のSpectramax 340PCプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)にて測定した。最大半減の光学密度の読みを生じるために必要とされるウイルスの濃度を計算し、異なるサンプルからの結果と比較するために使用した。
rAAV−F.IXを、rAAV−2 hF.IXベクターおよび上記の方法を用いて調製する。トランスフェクトした細胞の凍結−融解溶解物を沈殿させ、2サイクルの等密度遠心法によりrAAVビリオンを精製し;そして、rAAVビリオンを含む分画をプールし、透析し、濃縮する。濃縮したビリオンを処方し、滅菌濾過(0.22μM)し、ガラスバイアルに無菌的に充填する。ベクターゲノムを、「Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction」法(Real Time Quantitative PCR.Heid C.A.,Stevens J.,Livak K.J.およびWilliams P.M.1996.Genome Research 6:986−994.Cold Spring Harbor Laboratory Press)により定量する。
イヌ第IX因子(cF.IX)遺伝子の触媒ドメインにおける点変異についてヘミ接合性の雄と、ホモ接合性の雌を含む、重篤な血友病Bを有するイヌの群を用いて、変異型rAAVビリオン(rAAV−cF.IX)により送達されるcF.IXの効果を試験する。重篤な血友病のイヌは、血漿cF.IXを欠き、その結果、全血凝固時間(WBCT)が60分を超えるまで増加し(正常なイヌは、6〜8分の間のWBCTを有する)、活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)が50〜80秒まで増加している(正常なイヌは、13〜18秒の間のaPPTを有する)。これらのイヌは、再発性の自然出血を被る。代表的には、有意な出血エピソードは、10mL/kgの正常なイヌ血漿の単回の静脈内注入により首尾よく管理される;時折、繰り返し注入が、出血の制御のために必要とされる。
(A.筋肉送達)
プロトコールの0日目に、患者に、hF.IX濃縮物を注入して、因子のレベルを約100%までにし、そして、超音波誘導の下で、変異型rAAV−h.FIXビリオンを、片側もしくは両側の前部大腿の外側広筋において10〜12部位に直接注射する。各部位の注射容量は、250〜500μLであり、これらの部位は、少なくとも2cm間隔が空いている。塩化エチルまたは、局所麻酔薬の共融混合物により皮膚への局所麻酔を施す。その後の筋肉生検を容易にするために、いくつかの注射部位の上にかかる皮膚に傷をつけて印をつけ、超音波により注射の座標を記録する。患者を、注射後24時間、病院内で観察する;この期間の間に慣用的な隔離措置を取り、ビリオンの水平感染の危険性を最小限にする。患者を退院させ、そして、退院後、3日間、外来診察室にて毎日見、次の8週間は、在宅血友病センターにて毎週見、そして、5ヶ月までは1月に2回見、そして、その年の残りは1ヶ月毎に見、そして、その後毎年追跡する。hF.IXの循環血漿レベルを、上記のようにELISAを用いて定量する。
標準的なシェルディンガー技術を用いて、総大腿動脈に、血管造影用導入シースを用いてカニューレ挿入する。次いで、100U/kgのヘパリンのIV注射により患者をヘパリン処理する。次いで、ピッグテールカテーテルを大動脈内に進め、腹部大動脈撮影を実施する。腹腔および肝臓の動脈解剖図を描写した後、標準的な選択的血管造影用カテーテル(Simmons,Sos−Omni,Cobraまたは類似のカテーテル)を用いて、適切なHAを選択する。患者内への挿入の前に、全てのカテーテルを、正常生理食塩水でフラッシュする。次いで、非イオン性造影物質(OmnipaqueまたはVisipaque)を用いて選択的な動脈図を実施する。このカテーテルを、0.035ワイヤ(Bentsen,angled Glide、または類似のワイヤ)から取り除く。次いで、6F ガイドシース(またはガイドカテーテル)を、このワイヤに沿って総HA内へと進める。次いで、このワイヤを、0.018ワイヤ(FlexT,Microvena
Nitenolまたは類似のカテーテル)と交換し、6×2 Savvyバルーンをこのワイヤに沿って胃十二指腸の動脈から離れた適切なHA内へと進める。次いで、このワイヤを取り除き、バルーンカテーテル内に造影剤を手動で注入することによってカテーテルの先端の位置を確認し、そして、管腔を、15mlのヘパリン処理した正常生理食塩水(NS)でフラッシュして、造影剤を完全に取り除く。AAV−hFIXの注入の前に、このバルーンを、2atmまで膨張させて、HAの流動管腔を塞ぐ。8×10E10〜2×10E12の用量のAAV−hFIXを、およそ40ml以下の最終容量(用量および患者の体重に依存する)にし、次いで、自動容積測定注入ポンプを用いて、10〜12分にわたって注入する。次いで、3mlの正常生理食塩水(NS)を(AAV−hFIXと同じ速度で)注入し、カテーテルの空隙容量をなくす。バルーンを、2分間膨張させたままにし、2分後に、バルーンを収縮させ、カテーテルを取り除く。次いで、大腿穿刺部位の診断用動脈図撮影を、同側側の前部斜方突出部内で実施する。この穿刺部位を、標準的な方法(例えば、6F Closer(Perclose Inc.,Menlo Park,CA)または6F Angiosealのいずれかを用いる経皮閉鎖デバイスを利用すること)によってか、または、カテーテルの除去部位を15〜30分間、手で圧迫することによって、閉鎖する。
(A.細胞培養およびウイルス単離)
パルボウイルスの混入の証拠を有するヒツジアデノウイルス調製物を、以下のようにヤギの回腸から単離した。組織を、Earles塩(PH7.2)およびゲントマイシン(gentomycin)を含むイーグルのMEM培地中でホモジナイズした。このホモジネートを、20分間の低速遠心分離(1,500×g)により清浄し、0.45μmデバイスを通して濾過滅菌した。上清(500μl)を、3回継代した胎性仔ヒツジ腎臓細胞の初代培養物を含む25cm2フラスコに播種し、胎仔ウシ血清(USA)およびラクトアルブミン加水分解物(USA)と共に、37℃にて、加湿した5%CO2インキュベーター内で1週間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、スプリットし、そして、再度上記のようにインキュベートし、そして、最終的に、典型的なアデノウイルス細胞変性効果(cytophatic effect)(CPE)についてアッセイした。CPEを示すフラスコを−70℃にて凍結し、溶解し、そして他の細胞型の上に重ねた。これらのフラスコを、その後インキュベートし、CPEについて試験した。
異なる細胞培養物および継代からの4つの調製物を、DNA抽出のために個々に処理した。ウイルスを含有する上清を、消化緩衝液(10mM Tris−HCl(PH8.0),10mM EDTA(PH8.0)および0.5%SDS)中のプロテイナーゼK(200μg)で処理し、37℃で1時間インキュベートした。フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、ウイルスDNAをTE中に再懸濁した。
公知のAAVの間で高度に保存されているセグメントからの配列アライメントに基づいて、オリゴヌクレオチドプライマーを選択した。
フォワードプライマー1(GTGCCCTTCTACGGCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAACTTTCC)(配列番号23)は、ヘリカーゼドメインに対して相補的であり、そしてリバースプライマー2(GGAATCGCAATGCCAATTTCCTGAGGCATTAC)(配列番号24)は、DNA結合ドメインに対して相補的であった。PCRフラグメントの予想サイズは1.5kbであった。
全ての反応を、自動Eppendorf Mastercycler Gradient熱サイクラー(PerkinElmer,Boston,MA)において、50μlで行なった。各反応混合物は、1×XL緩衝液II中に、200ngの鋳型DNA、各1μMのオリゴヌクレオチドプライマー、1mM Mn(Oac)2、各200μMのデオキシヌクレオチドトリホスフェート(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)、および1.0単位のrTthポリメラーゼ,XL(Applied Biosystems,Foster City,CA)を含んだ。Ampliwax PCR gem 100(Applied Biosystems,Foster City,CA)を用いてホットスタートを容易にした。サイクリング条件は、以下の通りであった:94℃にて2分の変性、その後、94℃にて15秒の変性、45℃にて30秒のアニーリング、および72℃にて2分の伸長の35サイクルを続けた。
PCR生成物を、1%低融点アガロースゲル(FMC BioProducts,Rockland,ME)にて精製し、この配列を、AAV−5配列から設計したプライマーを用いて決定した。
(A.霊長類AAV血清型の中和活性)
表12に示される霊長類AAV血清型の中和活性を、上記の方法を用いて評価した。免疫反応性を、精製し、プールしたヒトIgG(表12および表13においてIVIg8と命名した)を用いて決定した。
ヤギAAVの中和活性を、上記の方法を用いて霊長類AAV−5と比較した。免疫反応性を、精製し、プールしたヒトIgG(表14においてIVIg8と命名した)を用いて決定した。表14に示すように、ヤギAAVは、AAV−5よりも中和に対してより大きい抵抗性を示した。表14はまた、上記の実施例において決定したように、ヤギAAVに関しての、AAV−1、AAV−2、AAV−3、AAV−4、AAV−5、AAV−6およびAAV−8の中和活性を示す。
種々のAAVが線条体ニューロンおよびグリア細胞に形質導入する能力を調べるために、以下の実験を行なった。解離させた線条体ニューロンの初代培養物を、胚日数18のSprague−Dawleyラット胚から調製した。解離させた線条体組織を、小さな片に刻み、そして、トリプシン中で30分間インキュベートした。次いで、この組織を、パスツールピペットを通してトリチュレートし、そして、細胞を、1ウェルあたり350,000細胞の密度にて、ポリ−D−リジンでコーティングした18mmの円形のカバーガラスを含む12ウェル培養ディッシュにプレートした。この培養培地は、2% B−27、0.5mM L−グルタミンおよび25mM L−グルタミン酸を補充した神経基礎培地であった。培養物を、37℃にて5% CO2内で維持し、そして、解離後、2〜3週間で、実験に使用した。この段階で、ドーパミン作動性ニューロンおよび線条体ニューロンを、形態学的に、そして、生物学的マーカーの発現により、区別する。
IVIGの存在下または非存在下で、種々のAAVが筋肉に形質導入する能力を決定するために、以下の実験を行なった。雄性のSCIDマウス(15〜25g)に、ヤギrAAVビリオン、rAAV−1ビリオン、またはrAAV−8ビリオンの2e11ベクターゲノム(各群マウス5匹)を筋肉内注射した。上記ビリオンの各々は、ヒト第IX因子をコードする。これらのビリオンを、実施例1に記載した三重トランスフェクション法を用いて作製した。pHLP19中に存在するキャプシドコード配列を、上記のようにヤギVP1コード配列で置き換えた。ベクターの注射後1週間および2週間で、眼窩後血を回収し、血漿を抽出した。ベクター注射の24時間前に、IVIG(Carimune:ヒト血清のプールからの精製免疫グロブリン,ZLB Bioplasma,ロット番号03287−00117)で試験したマウスに、尾静脈を介して注射した(250μl)。hFIX ELISAを用いて、ヒトFIXを、血漿サンプル中で測定した。
IVIGの存在下または非存在下で、種々のAAVが肝臓に形質導入する能力を決定するために、以下の実験を行なった。雄性のSCIDマウス(15〜25g)に、ヤギrAAVビリオンまたはrAAV−8ビリオンの5e11ベクターゲノム(各群マウス5匹)を尾静脈を介して注射した。これらのビリオンは、ヒト第IX因子(hFIX)をコードする遺伝子を含んだ。以下のrAAV−2ビリオンのデータは、別の実験からのものであった。特に、肝臓特異的プロモーター(Miaoら,Mol.Ther.(2000)1:522−532に記載される)の制御下にヒト第IX因子遺伝子を含む、プラスミドpAAV−hFIX16を用いて、ビリオンを作製した。プラスミドpAAV−hFIX16は、ヒト第IX因子ミニ遺伝子をコードする11,277bpのプラスミドである。この構築物において、FIX cDNAは、エキソン1とエキソン2との間に挟まれており、イントロン1が欠失している形態である。このcDNAは、FIXの発現の増加を示している。FIXは、ApoE肝臓制御領域(HCR)およびヒトα1アンチトリプシンプロモーター(hAAT)、ならびにウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル(gGH
PA)の転写制御下で発現する。プラスミドpAAV−hFIX16の骨格は、アンピシリン抵抗性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子、細菌の複製起点、M13/F1複製起点、およびバクテリオファージλDNAのフラグメントを含む。λDNAは、プラスミド骨格のサイズを6,966bpまで増加させ、AAVベクター産生の間にそのパッケージングを防止する。
パルボウイルスの混入の証拠が、当該分野で公知の方法を使用して、ウシの肺から単離したウシアデノウイルス(BAV)8型、Misk/67株(ATCC,Manassas,VAから入手可能、寄託番号VR−769)において見られた。この新しい単離対を、「AAV−C1」と名付けた。AAV−C1を、PCRにより部分的に増幅し、そして配列決定した。図20Aおよび20Bは、それぞれ、AAV−C1に由来するVP1のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。AAV−C1に由来するVP1アミノ酸配列を、他のAAV VP1と比較した。特に、図21A〜21Hは、AAV−C1に由来するVP1アミノ酸配列の霊長類AAV−1、AAV−2、AAV−3B、AAV−4、AAV−6、AAV−8、AAV−5およびヤギAAVに由来するVP1のアミノ酸配列との比較を示す。これらの配列において保存されているアミノ酸を、*で示し、結晶構造に基づく種々のアミノ酸位置のアクセス可能性を示す。Bは、アミノ酸が、内側表面と外側表面との間に埋もれていることを示す。Iは、アミノ酸が、内側表面上に見られることを示し、Oは、アミノ酸が外側表面上に見られることを示す。
VP1において、Kの代わりにTが存在する)、499位(AAV−C1 VP1において、Gの代わりにRが存在する)、および514位(AAV−C1 VP1において、Rの代わりにGが存在する)で生じた。
LacZベクターを、効率よく生成し;Q−PCRにより高い力価のベクター(2.45e10vg/ml)を検出した。AAV−C1 LacZベクターは、インビトロにおいて十分な細胞の形質導入を示した(LacZを発現する細胞が、他のAAVと匹敵する数で存在した)。
霊長類AAV−2に関するウシAAV−C1の中和活性を、実施例6において上述した方法を用いて評価した。免疫反応性を、精製し、プールしたヒトIgG(IVIG−8、Panglobulin ロット番号1838−00351,ZLB Bioplasma AG,Berne,Switzerland)を用いて決定した。インビトロでの中和アッセイは、AAV−C1が、AAV−2よりも、ヒトIVIGによる中和に対して16倍より抵抗性であったことを示した。AAV−2の50%以上の中和を示すIVIGの最低濃度(mg/ml)は、0.2mg/mlであったが、AAV−C1は、3.25mg/mlであった。
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JP2021534766A (ja) * | 2018-08-30 | 2021-12-16 | リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル | ガラクトース血症の処置のための遺伝子治療 |
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