JP2023524401A - 遺伝子治療の増強のためのアデノ随伴ウイルス（ａａｖ）の制御された修飾 - Google Patents
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Abstract
本発明は、部位及び化学量論に対する制御を伴ってＡＡＶカプシドを化学的に修飾するためのプラットフォームを開示する。３つのカプシドタンパク質の任意のサブセットへの部位特異的な天然アミノ酸変異及び非天然アミノ酸変異の導入を可能にするＡＡＶパッケージング系が記載される。これらの操作された残基は、その後、得られたカプシドを部位及び化学量論に対する精密な制御を伴って化学的に機能化するために使用することができる。このような制御された修飾戦略は、多種多様な実体をＡＡＶカプシドに結合して、その向性、免疫原性等を操作するために使用することができる。【選択図】図２
Description
政府支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（米国国立科学財団）によって授与された助成金番号１８１７８９３の下で政府支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（米国国立科学財団）によって授与された助成金番号１８１７８９３の下で政府支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
関連出願
本出願は、２０２０年５月１日出願の米国仮出願第６３／０１８，５７３号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張する。この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年５月１日出願の米国仮出願第６３／０１８，５７３号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張する。この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルにおける資料の参照による組み込み
本出願は、以下のＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる配列表を参照により組み込む：０３４２＿００１０ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔ；２０２１年５月３日作成、サイズ７６、８７９バイト。
本出願は、以下のＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる配列表を参照により組み込む：０３４２＿００１０ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔ；２０２１年５月３日作成、サイズ７６、８７９バイト。
発明の分野
本発明は、ウイルスカプシドの制御された化学修飾による組換え（操作された）ＡＡＶベースの遺伝子治療ベクターの開発に焦点を当てたバイオテクノロジーの分野に向けられる。
本発明は、ウイルスカプシドの制御された化学修飾による組換え（操作された）ＡＡＶベースの遺伝子治療ベクターの開発に焦点を当てたバイオテクノロジーの分野に向けられる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療のための最も有望な送達ビヒクルの１つとして出現している。これは、天然に複製欠損であり、低い自然免疫応答しか示さず、分裂細胞及び非分裂細胞に効率的に感染し、送達された治療用遺伝子のインビボでの安定な長期発現を提供する。実際、いくつかのＡＡＶベースの遺伝子治療が最近承認されており、他の多くのものが現在臨床試験中である。現在治療不可能である多数の疾患の治癒を提供するＡＡＶベースの遺伝子治療の見込みにもかかわらず、いくつかの重要な課題が存在する。例えば、現在のアプローチのほぼすべては、限定的な先天性組織親和性を示すＡＡＶの天然の血清型に依存する。当然ながら、これらのベクターによって効率的に感染される細胞型に関連する疾患は、このアプローチによって標的とされることが可能である。しかしながら、既存のＡＡＶベクターに容易に感染しない組織に生じる多くの他の疾患は、現在難治性のままである。既存のＡＡＶベクターの組織親和性を再操作する能力は、所望の位置に遺伝子ペイロードを送達することができるカスタムベクターを作製するのに非常に有用であり、ＡＡＶベースの遺伝子治療の範囲を実質的に拡大する。加えて、多くの患者は、既存のＡＡＶベクターに対する既存の免疫を有する。さらには、治療用ＡＡＶベクターの投与は強力な適応免疫応答を誘発し、同じベクターの第２の用量を妨げる。このような免疫認識を回避するために既存のＡＡＶベクターを操作する能力は、持続可能な遺伝子治療の開発にとって重要である。指向性進化法は、より治療的に望ましい形質を有するＡＡＶカプシドを開発するために使用されている。しかしながら、このアプローチはしばしば許容可能な解決手段をもたらすのには信頼性がなく、得られた変異体ＡＡＶカプシドはしばしばパッケージング欠陥を示す。
既存のＡＡＶカプシド上の活性調節実体を制御された様式で提示する能力は、それらの特性を操作するための魅力的なモジュール式アプローチを提供する。マイナーカプシドタンパク質のＮ末端伸長、カプシドタンパク質の許容部位へのペプチドループの挿入、及びカプシド表面上のリシン等の既存のアミノ酸の修飾を含む多数の方法がこの目標に向けて試みられている。しかしながら、Ｎ末端伸長及びループ挿入は、しばしば複合体ＡＡＶカプシドの会合（組立、アセンブリ）を破壊する。ＡＡＶカプシドの繊細さのため、ペプチドループの挿入は非常に少数の位置に制限され、得られるカプシドはしばしば最適以下のパッケージングを示す。これらの方法は、活性調節部分の配置、提示されることが可能な実体の構造的多様性、及びカプシド表面上に提示される標的化部分の数を最適化する能力の最適化において限定された柔軟性しか提供しない。
アジド官能基を有するＵＡＡを組み込んだＡＡＶを産生することが可能であり、次いでこれが、歪み促進型アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）を介してシクロオクチン修飾ｃＲＧＤＦＣにコンジュゲートされ、こうして上記ウイルスが、ある種の癌細胞において過剰発現されるαＶβ３インテグリン受容体に再標的化された。しかしながら、上述のＵＡＡの組み込みは、ＡＡＶの６０種のカプシドタンパク質すべてへのＵＡＡの組み込みに制限されている。本明細書に記載されるように、ＡＡＶウイルス粒子の６０種のカプシドタンパク質（マイナーカプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２並びにメジャーカプシドタンパク質ＶＰ３を含む）すべての過剰修飾は、その感染力（感染性）に強く有害であることが実証されている。（野生型ＡＡＶと比較して）カプシドあたり特定の数の天然アミノ酸及び／又はＵＡＡによる修飾／変異を組み込む／導入するためのバリアントカプシドを生成するためのアミノ酸変異の数を制御する能力は、変異アミノ酸残基を有するバリアント（変異体）カプシドタンパク質を含む感染性遺伝子改変アデノ随伴ウイルスの合成を可能にするための本発明の重要な特徴である。バリアントカプシドタンパク質におけるこれらの変異した残基は、ＡＡＶに部位特異的にバイオコンジュゲーション「ハンドル」を導入して、ＡＡＶ機能の最適操作を可能にする明確な数の活性調節基の組み込み／導入をもたらすための、生物学的及び／又は化学的実体（本明細書において「基」とも呼ばれる）の結合（例えば、共有結合）を可能にする。
本発明は、野生型ＡＡＶの対応する部位と比較してカプシドタンパク質の１つ以上の部位特異的位置に修飾／変異を有する遺伝子操作された／遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びこれらの遺伝子改変ウイルスを作製する方法を包含する。重要なことに、本明細書に記載されるように、改変は、ＡＡＶ粒子の感染力に影響を及ぼすことなく（すなわち、遺伝子改変ＡＡＶの感染力は、類似の生物学的条件下で野生型ＡＡＶの感染力に本質的に匹敵するか、又はそれからわずかしか変化していない）、ＶＰ１、ＶＰ２若しくはＶＰ３等の単一のカプシドタンパク質、又はＶＰ１及びＶＰ２の両方における等のこれらのカプシドタンパク質の複数のものにおける１つ以上の特定の化学選択的位置に限定されてもよい。
ＡＡＶは、非構造Ｒｅｐ及びＡＡＰタンパク質並びに構造Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする４．５ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有する小さな非エンベロープパルボウイルスであり、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は共通のＣ末端を共有しＮ末端伸長によって異なる。エンベロープウイルスは表面タンパク質で装飾された脂質膜を有するが、このようなエンベロープウイルスとは異なり、ＡＡＶは、およそ１：１：１０の化学量論でタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の６０コピーのみからなる密集した２０面体のカプシドを有する。ＡＡＶは複製欠損であり、完全なウイルス産生及びエスケープにはアデノウイルス等のヘルパーウイルスの存在が必要である。ＡＡＶは、異なる天然の向性（親和性）を有するいくつかの異なる血清型を有する。例えば、本明細書に記載される１つの血清型は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン受容体を発現する細胞を標的とするＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）である。
アデノ随伴ウイルスは、ヒト遺伝子治療の最も有望な候補として浮上している。このウイルスは、遺伝子治療ベクターに理想的な、低い免疫原性及び長期遺伝子発現のような望ましい性質を誇る。しかしながら、これらのウイルスの他の特性の多くは、治療上の必要性と整合しないことが多い。例えば、ウイルスの天然血清型は、独特の細胞特異性を有し、これは、どの細胞／組織がヒト遺伝子治療のために標的化できるかを制限する。既存のＡＡＶベクターを、部位及び化学量論に対する正確な制御を伴って機能化する能力は、細胞特異性及び免疫回避等の治療的に望ましい形質を導入するための魅力的な手段を提供する。
バイオコンジュゲーション（生体共役反応）実体又は「ハンドル」（例えば、天然アミノ酸システイン、又は広範囲のバイオコンジュゲーション化学を有する非天然アミノ酸）等の実体又は基を有するアミノ酸、例えばＵＡＡをＡＡＶのマイナーカプシドタンパク質に導入することによって、ＡＡＶを精密かつ部位特異的に遺伝子操作するための技術が本明細書に記載される。マイナーカプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２は、ＡＡＶカプシドあたり各々５コピーで存在する。本明細書に記載されるように、本発明の構築物及び方法は、上記３つのカプシドタンパク質のいずれの部位選択的修飾をも可能にするが、ＶＰ１又はＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方を特異的に修飾し、完全構築ＡＡＶカプシドあたり５個又は１０個の基の結合を可能にする（本明細書で使用される用語「完全会合」は、感染性ウイルス粒子を形成するために、すべての３つのカプシドタンパク質であるマイナーＶＰ１及びＶＰ２カプシドタンパク質並びにメジャーカプシドタンパク質であるＶＰ３を組み込むウイルス会合（ウイルスアセンブリ）を意味する）。当該方法はさらに、バイオコンジュゲーションハンドル（カプシドタンパク質あたり最大２つのバイオコンジュゲーションハンドル）の組み込みを可能にし、カプシドあたり１５個又は２０個のバイオコンジュゲーション基の正確な結合を可能にする。
より具体的には、本発明は、マイナーカプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２のいずれか１つ又はその組み合わせが部位特異的に化学修飾されることが可能であるＡＡＶベクターを生成する方法を包含する。この３つのカプシドタンパク質は異なる化学量論（カプシドあたりそれぞれ５コピー、５コピー及び５０コピーのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）で存在するので、この方法は、修飾部位及び修飾数の両方に対する正確な制御を伴ってカプシドに修飾を導入することができ、かつウイルスの生物学的活性、とりわけその標的細胞感染力を保持することができる均質なＡＡＶコンジュゲートを作製する能力を提供する。
本明細書に記載されるように、ナンセンスコドンを抑制する操作されたアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）／ｔＲＮＡ対を使用して、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸（ＵＡＡ）をカプシドタンパク質に部位特異的に組み込むことが可能である。それらの小さいサイズに起因して、ＵＡＡは、多くの位置でＡＡＶカプシドにおいて良好に許容される。
遺伝子改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、ＡＡＶカプシドが、少なくとも１つのバリアントマイナーカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ１及びＶＰ２の両方を含み、これらのバリアントマイナーカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ ＶＰ１又はＶＰ２カプシドタンパク質と比較して、１つ以上のアミノ酸残基部位で変異し、野生型ＡＡＶに存在しない天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を組み込んでいる遺伝子改変ＡＡＶが本発明に包含される。重要なことに、本明細書に記載される遺伝子改変ＡＡＶは、同等の条件下で野生型ＡＡＶと比較してそれらの感染力を保持する。
特に、本発明は、バリアントマイナーカプシドタンパク質を含む遺伝子改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、カプシドコード配列（配列番号１）は、ＡＡＶ ＶＰ１又はＶＰ２又はＶＰ３カプシドタンパク質オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳起点において変異し、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方の翻訳を防止し、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３又はＶＰ１及びＶＰ２の両方が欠失したＡＡＶカプシドタンパク質をもたらす遺伝子改変ＡＡＶを包含する。次いで、欠失した／欠損したカプシドタンパク質は、欠失したマイナーカプシドタンパク質（複数種可）をコードする第２のカプシドコード配列からトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）提供され（すなわち、発現され）、１種以上のバリアントカプシドタンパク質を有する遺伝子改変ＡＡＶをもたらす。本明細書において、ＶＰ２は配列番号２によっても表され、ＶＰ３は配列番号３によっても表される。
当該遺伝子改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１、又は配列番号１の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは９０％～９９％の配列同一性を含む配列を含む。このバリアントカプシドタンパク質は、（例えば、図２に示すように）ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方を欠失させるために特定の部位で変異している。例えば、配列番号１の位置Ｔ４５４において、終止コドンが、本明細書に記載される技術を使用して挿入されることが可能である。そのような技術は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５５８３４号、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３８７６６号又はＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２９５６７号にも記載されており、それらの教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。より具体的には、バリアントカプシドタンパク質に組み込まれる終止コドンは、ＴＡＧ、ＴＡＡ又はＴＧＡサプレッサー終止コドンであってもよい。
本発明に特に包含されるのは、マイナーカプシドタンパク質ＣＭＶ－ＶＰ１－ｄｅｌＶＰ２３（図２０、配列番号７）；ＣＭＶ－ＶＰ２－ｄｅｌＶＰ３（図２１、配列番号９）及びＣＭＶ－ＶＰ１－ＶＰ２－ｄｅｌＶＰ３（図２２、配列番号１０）である。本明細書に記載されるように、ＣＭＶプロモーター配列が例示されるが、任意の適切なプロモーター配列を組み込むことができる。加えて、マイナーカプシドタンパク質は、本明細書に記載される天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を組み込むことができる。
本発明の遺伝子改変ＡＡＶの重要な利点は、マイナーカプシドタンパク質に組み込まれるＵＡＡが低レベルであり、従って、それらの産生効率がＵＡＡの組み込みによって損なわれない（著しい影響を受けることはない）ことに留意することが重要である。従って、ＡＡＶは、野生型ウイルスに実質的に匹敵する感染（力）価でパッケージングされ／会合する。
本発明の遺伝子改変ＡＡＶのバリアントカプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方の１つ以上の変異アミノ酸残基を含むことができ、この変異アミノ酸残基部位は、非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を組み込む。本発明での使用に適したＵＡＡの例は図１に示されており、図１は、式１～１２を示す（上から１行目の左から右へ式１～６であり、２行目の左から右へ炭素鎖伸長部分の長さ及び置換基を含んで式７～１２である）。より具体的には、本発明での使用に適した非天然アミノ酸は、フェニルアラニン類似体、チロシル類似体、トリプトファニル類似体、又はリシル類似体からなる群から選択することができる。特に、上記類似体は、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＡ）、Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）、５－アジドトリプトファン、５－プロパルギルオキシアミノトリプトファン、５－アミノトリプトファン、５－メトキシトリプトファン、５－Ｏ－アリルトリプトファン、５－ブロモトリプトファン、アジド－リシン（ＡｚＫ）又はＮε－アセチルリシン（ＡｃＫ）、Ｃ５Ａｚ、ＬＣＡ、Ｎε－アセチルリシン（ＡｃＫ）、シクロプロペンアミノ酸、Ｎε－（１－メチルシクロプロパ－２－エンカルボキシアミド）－リシン（ＣｐＫ）、５－ヒドロキシ－トリプトファン（５－ＨＴＰ）、ＬＣＡｌｋ、ＤｉａａｚＫ及びＬＣＫｅｔからなる群から選択される。
あるいは、遺伝子改変ＡＡＶのバリアントマイナーカプシドタンパク質の変異は、システイン又はセレノシステイン等の天然アミノ酸残基であることができる。具体的には、この天然アミノ酸残基は、野生型ＡＡＶの同じ位置に位置するアミノ酸残基とは異なる。
本発明の遺伝子改変ＡＡＶは、バイオコンジュゲーションハンドルをさらに含むことができる。このようなバイオコンジュゲーションハンドルは、部位特異的にバリアントマイナーカプシドタンパク質の変異した天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基に共有結合することができる。本明細書に記載されるように、５～１０個のバイオコンジュゲーションハンドルは、マイナーカプシドタンパク質に特異的に組み込まれることができ、従って、完全会合ＡＡＶカプシドあたり５～１０個のバイオコンジュゲーションハンドルを有する遺伝子改変ＡＡＶをもたらす。この場合もやはり、少なくとも１つのバリアントマイナーカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方を含む遺伝子改変ＡＡＶは、細胞培養条件等の同様の条件下で野生型ＡＡＶに匹敵する標的細胞の感染力を保持する。例えば、変異アミノ酸は、化学的又は生物学的実体とコンジュゲートされてもよい（例えば、生物学的実体は、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質又は炭水化物を含むことができる）。
本発明によって具体的に包含されるのは、バリアントカプシドタンパク質を含むカプシドを含む遺伝子改変された感染性ＡＡＶである。例えば、このバリアントカプシドタンパク質は、配列番号１、又は配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有する配列を含むことができ、この配列は、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方を欠失するように変異している。遺伝子改変ＡＡＶのカプシドの変異は、１つ以上の位置、例えば、位置２６３、位置４５４、位置４５６、位置５８７及び／又は位置５８８にあってもよく、これらの変異した位置は、野生型ＶＰ１配列に対するものである。ＶＰ１配列は、位置２６３、位置４５４、位置４５６及び位置５８８で変異し、位置５８７では変異していないということも可能である。あるいは、ＶＰ１配列は、位置２６３、位置４５４、位置４５６で変異し、位置５８５でも位置５８８でも変異していないということが可能である。本発明の感染性遺伝子改変ＡＡＶの特徴は、同等の条件下での野生型ＡＡＶの感染力に実質的に匹敵する感染力、同等の条件下での野生型ＡＡＶに実質的に匹敵する力価を有するＡＡＶのパッケージング、又は野生型ＡＡＶに匹敵する感染力及びパッケージングの両方である。
本発明の１つの実施形態では、改変ＡＡＶの変異アミノ酸残基（複数種可）は、化学実体又はタンパク質実体（本明細書においてバイオコンジュゲーションハンドル又は基とも呼ばれる）と機能化又はコンジュゲートされる。本明細書に記載されるように、化学実体又はタンパク質実体は、プローブ、小分子リガンド、ペプチド、環状ペプチド、ヌクレオチド、ポリマー、タンパク質、又はウイルスコンジュゲートからなる群から選択される。特定の実施形態では、遺伝子改変された感染性ＡＡＶは、化学実体又はタンパク質実体を含み、この実体は環状ペプチドｃＲＧＤポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
本発明の別の実施形態では、バリアントＶＰ１又はＶＰ２の変異アミノ酸残基部位は、天然アミノ酸を組み込む。特に、この天然アミノ酸はシステイン又はセレノシステインである。
上記バリアントカプシドタンパク質（複数種可）を含む本発明の遺伝子改変された感染性ＡＡＶ（例えば、ｃＲＧＤペプチドで機能化された変異カプシドタンパク質を含む遺伝子改変ＡＡＶ）は、その天然同族細胞受容体に結合すること、又はそれを認識すること、又はそれと相互作用して、非同族標的細胞に結合すること、又はそれを認識すること、又はそれと相互作用することから「再標的化」されることが可能である。本明細書に記載されるように、カプシドあたりに結合される任意の数の再標的化基は、得られるＡＡＶコンジュゲートの特性に劇的に影響を及ぼす。これは、化学修飾によってＡＡＶベクターの特性を変化させるために部位及び化学量論を制御することの重要性を強調する。本明細書に記載されるように、部位及び化学量論（カプシドあたり何個の修飾が導入されるか）の両方に対する前例のない制御を伴うＡＡＶカプシドの精密で選択的な化学修飾が今や可能である。このような制御は、より治療的に望ましい特性を有する操作されたＡＡＶベクターの開発にとって極めて重要であろう。
感染性遺伝子改変ＡＡＶを製造／作製する方法であって、このＡＡＶがバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含み、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方が、野生型ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方と比較して、１つ以上の変異アミノ酸残基部位を含む方法も本発明に包含される。概して、当該方法は、培養中のコンピテント宿主細胞を提供する工程と、この培養細胞に、１）ＶＰ１若しくはＶＰ２を発現しないか、又はＶＰ１もＶＰ２も発現しないＡＡＶバリアントＶＰ３、２）ＶＰ３を発現しない適切なプロモーターを有するバリアントＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方、３）ＡＡＶ発現に必要なさらなる因子を含む１種以上のプラスミドをトランスフェクトする工程と、４）必要な非天然アミノ酸を提供する工程と、５）終止コドンに応答してその非天然アミノ酸を選択的に導入（チャージ）する操作されたアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対をコードするプラスミドを提供する工程とを含む。上記細胞及びプラスミドは、プラスミド遺伝子の発現及びＡＡＶの会合に充分な条件下で培養され、これにより、バリアントカプシドタンパク質を含む感染性遺伝子改変ＡＡＶを産生し、このバリアントカプシドタンパク質では、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方が、野生型ＡＡＶと比較して１つ以上のアミノ酸残基で変異している。
より具体的には、当該方法は、培養中のコンピテント宿主細胞を提供する工程と、遺伝子改変された感染性ＡＡＶの会合及び発現に必要な配列を含むプラスミド／構築物を上記培養細胞に同時トランスフェクトする工程とを含む。１つのｍＲＮＡは、異なる開始コドン部位を有するＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３をコードする（図２参照）。開始点が変異している場合、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３の発現は、各カプシドタンパク質について別々のｍＲＮＡを発現させることによって制御することができ、カプシドタンパク質は選択的に変異させることができるが、変異したマイナーカプシドタンパク質ＶＰ１及び／又はＶＰ２並びに野生型を会合させて、感染性遺伝子改変ＡＡＶを得ることができる。
例えば、本明細書に記載されるように、非天然アミノ酸は、コンピテント宿主細胞に、その非天然アミノ酸を導入する操作されたｔＲＮＡ合成酵素とｔＲＮＡとの対をコードするプラスミドを同時トランスフェクトすることによって、ＶＰ１及び／又はＶＰ２に部位特異的に組み込むことができる。より具体的には、バリアントＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３又はＶＰ１及びＶＰ２の両方の変異部位に応答して非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を同時翻訳的に組み込むための、操作されたアミノ－アシルＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）と、その対応するｔＲＮＡとを含む直交ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対が提供され、変異部位に組み込むために必要な非天然アミノ酸が提供される。
変異ＶＰ１及び／又はＶＰ２並びに野生型ＶＰ３転写物をコードするプラスミドとともに、細胞培養におけるＡＡＶカプシド発現並びに完全なカプシド（すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む）の会合に必要とされるさらなる因子をコードするプラスミド（複数種可）も提供される（共培養される）。上記細胞、プラスミド及びＵＡＡは、プラスミド遺伝子の発現及びＡＡＶの会合に充分な条件下で培養／維持され、これにより、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方が野生型ＡＶＶと比較して１つ以上のアミノ酸残基部位で変異しているバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含む感染性遺伝子改変ＡＡＶが製造される。
操作されたアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素－ｔＲＮＡ対は、大腸菌ロイシル対、大腸菌トリプトファニル対、大腸菌チロシル対又は古細菌由来ピロリシル対に由来することができる。
当該感染性遺伝子改変ＡＡＶは、細胞培養物から回収／収集することができ、そして本明細書中に記載され当業者に公知のような技術を使用して生物学的活性について評価することができる。
感染性遺伝子改変ＡＡＶの変異アミノ酸残基部位は、図１、式１～１２に示される非天然アミノ酸（ＵＡＡ）類似体を組み込むことができる。より具体的には、非天然アミノ酸は、フェニルアラニン類似体、チロシル類似体、トリプトファニル類似体、又はリシル類似体からなる群から選択される。上記類似体は、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＡ）、Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）、５－アジドトリプトファン、５－プロパルギルオキシトリプトファン、５－アミノトリプトファン、５－メトキシトリプトファン、５－Ｏ－アリルトリプトファン、５－ブロモトリプトファン、アジド－リシン（ＡｚＫ）又はＮε－アセチルリシン（ＡｃＫ）、Ｃ５Ａｚ、ＬＣＡ、Ｎε－アセチルリシン（ＡｃＫ）、シクロプロペンアミノ酸、Ｎε－（１－メチルシクロプロパ－２－エンカルボキシアミド）－リシン（ＣｐＫ）、５－ヒドロキシ－トリプトファン（５－ＨＴＰ）；ＬＣＡｌｋ、ＤｉａａｚＫ及びＬＣＫｅｔからなる群から選択される。
あるいは、バリアントカプシドタンパク質の変異アミノ酸残基部位は、天然アミノ酸を組み込み、この天然アミノ酸はシステイン又はセレノシステインである。
上記バリアントカプシドタンパク質の変異アミノ酸は、化学実体又はタンパク質実体で機能化することができ、この実体は、プローブ、小分子リガンド、ペプチド、環状ペプチド、ヌクレオチド、ポリマー、タンパク質、又はウイルスコンジュゲートからなる群から選択される。１つの実施形態では、当該感染性遺伝子改変ＡＡＶのバリアントカプシドタンパク質の変異アミノ酸を機能化する実体は、環状ペプチドｃＲＧＤである。
当該感染性遺伝子改変ＡＡＶは、配列番号１、又は配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有する配列を含む変異ＶＰ１アミノ酸配列を含むことができ、このバリアントＶＰ１カプシドタンパク質は、ＶＰ１配列の２６３、４５４、４５６、５８７及び／又は５８８に位置する１つ以上の位置で、野生型ＶＰ１配列と比較して変異している。ＶＰ１配列は、位置２６３、位置４５４、位置４５６及び位置５８８で変異し、位置５８７では変異していないということも可能である。あるいは、ＶＰ１配列は、位置２６３、位置４５４、位置４５６で変異し、位置５８５でも位置５８８でも変異していないということが可能である。
当該感染性遺伝子改変ＡＡＶは、配列番号２、又は配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む変異ＶＰ２アミノ酸配列を含むことができる。
当該感染性遺伝子改変ＡＡＶは、配列番号３、又は配列番号３と少なくとも約８０％、８４％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＰ３アミノ酸配列を含むことができる。
本明細書に記載される遺伝子改変ＡＡＶを含み、遺伝子治療又はワクチン接種（例えば、対象における免疫応答を誘発するもの）に適した１種以上の治療用又は抗原性遺伝子構築物をさらに含む、治療用又は抗原性組成物も本発明によって包含される。当該組成物が抗原を含むワクチン組成物である場合、その組成物はアジュバントをさらに含むことができる。
対象における疾患又は状態の治療方法も本発明に包含される。例えば、この治療方法は、対象に治療組成物を投与する工程を含むことができ、この組成物は、対象における疾患又は状態を減少又は軽減することができる治療量の、本明細書に記載されるＡＡＶベクターと、タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子構築物とを含む。治療用組成物における本発明の遺伝子改変ＡＡＶベクターの使用は、癌、又は鎌状赤血球貧血の嚢胞性線維症等の疾患を治療するのに特に有用である可能性があり、機能的タンパク質をコードする置換遺伝子を標的化された様式で提供することは、癌又は疾患の症状を減少させるか、又は完全に軽減するであろう。
別の例は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、この方法は、抗原性／ワクチン組成物を対象に投与する工程を含み、この抗原性組成物は、本発明の遺伝子改変ＡＡＶベクターと、対象において免疫応答を誘発することができる抗原性のタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子構築物とを含む。本発明のＡＡＶベクターを使用するこのような方法は、免疫応答を開始することができる免疫細胞を特異的に標的化するであろう。
本発明の遺伝子改変ＡＡＶを含むキットも本発明に包含される。このようなキットは、本明細書中に記載される遺伝子改変ＡＡＶを含有する適切なバイアル、例えば、滅菌希釈剤中のＡＡＶのバイアル、並びに例えば細胞培養物中でＡＡＶを増殖させるための補充成分のバイアル／容器を含むことができる。説明パンフレットも当該キットに含まれることが可能である。
様々な新規な構成及び部品の組み合わせの詳細を含む本発明の上記及び他の特徴、並びに他の利点が、これより、添付の図面を参照してより詳細に説明され、特許請求の範囲に指摘される。本発明を具体化する特定の方法及び装置は、例示として示されており、本発明を限定するものとして示されているわけではないことが理解されるであろう。本発明の原理及び特徴は、本発明の範囲から逸脱しない範囲で、様々な多数の実施形態において採用されてもよい。
添付の図面において、参照符号は、異なる図を通して同じ部分を指す。図面は必ずしも縮尺通りではない。代わりに、本発明の原理を説明することに重点が置かれている。特許又は出願ファイルは、カラーで実行される少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有するこの特許又は特許出願公開の写しは、請求をして必要な手数料を支払うと、庁によって提供される。
これより、本発明が、本発明の例示的な実施形態が示される添付の図面を参照して、以下でより完全に説明される。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態で具現化されてもよく、本明細書に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供されている。
本明細書で使用する場合、用語「及び／又は」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上の任意の及びすべての組み合わせを含む。さらに、単数形及び冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、明示的に特段の記載がない限り、複数形も含むものとする。さらに、以下の用語が理解されるであろう。ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ及び／又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇは、本明細書で使用する場合、記載された特徴、整数、工程、操作、要素、及び／又は構成要素の存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、及び／若しくはそれらのグループの存在又は追加を排除しない。さらに、構成要素又はサブシステムを含む要素が、別の要素に接続又は結合されると言及され、及び／又は示されるとき、その要素は、他の要素に直接接続若しくは結合されることが可能であるし、又は介在要素が存在してもよいことが理解されるであろう。
「第１の」及び「第２の」等の用語は、本明細書では様々な要素を説明するために使用されるが、これらの要素はこれらの用語によって限定されるべきではないことが理解されよう。これらの用語は、ある要素を別の要素と区別するためにのみ使用される。従って、以下で論じられる要素は、第２の要素と呼ぶことができ、同様に、第２の要素は、本発明の教示から逸脱しない範囲で第１の要素と呼ばれてもよい。
特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般に使用される辞書で定義されるもの等の用語は、関連技術の文脈における意味と整合する意味を有するものとして解釈されるべきであり、本明細書で明示的に理想化された意味又は過度に形式的な意味で定義されない限り、理想化された意味又は過度に形式的な意味で解釈されないことがさらに理解されるであろう。
本発明の説明は、これらの特定の方法論、組成物、細胞株／生物系、又は任意の他の標準プロトコルに限定されないことに留意されたい。本発明は、修飾の部位及び化学量論に対する制御を伴う化学選択的反応を使用して化学的に機能化されることができるＡＡＶベクターを作製するための一般的なプラットフォームを開示するものであり、ウイルスパッケージングに使用される細胞型、操作されたアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）又はｔＲＮＡ又はＵＡＡ若しくは天然アミノ酸の素性（個性）、修飾を導入するために使用される化学反応等は、この分野及びこの研究における技術の進歩に伴って変わってもよい。
以前は、ＡＡＶカプシドへのＵＡＡの組み込みは、６０のカプシドタンパク質すべてに向けられていた。３つの重複するカプシドタンパク質は、選択的スプライシング及び開始コドン使用頻度を介して同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ｃａｐから発現されるので、これらのタンパク質のサブセットを選択的に改変することは不可能であった。しかしながら、６０のカプシドタンパク質のすべてのその後の化学修飾は、ウイルスの感染力を乱す（例えば、図６、青色のトレース）。この乱れのメカニズムはあまり理解されていないが、ウイルスの複雑な侵入経路に関連する分子プロセスが、カプシドの過剰修飾によって影響される可能性があると考えることは妥当である。加えて、明確な数の化学修飾を部位特異的に導入することができるＡＡＶベクターを作製することができることが望ましい。実際に、再標的化実験は、効率的な再標的化に必要とされるカプシドあたりの最適な数のリガンドが存在することを実証する（図６）。修飾試薬の濃度又は反応時間を制御することによって、６０のＵＡＡハンドルを有するＡＡＶカプシドの修飾度を制御することが可能である（図６）。しかしながら、これは、異なる修飾状態にあるカプシドの不均質な混合物をもたらす。カプシドあたり明確な数の修飾が導入される均質なＡＡＶコンジュゲートを作製する能力は、遺伝子治療にとって重要である。
ＡＡＶカプシドにおいて、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、およそ１：１：１０の化学量論で組み込まれる。その結果として、ウイルス粒子あたり合計６０コピーのカプシドタンパク質について、２つのマイナーカプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２の各々のおよそ５コピーがカプシド中に存在し、１０コピーのＶＰ３が存在する。操作された修飾可能な天然アミノ酸又は非天然アミノ酸の残基をこれらのマイナーカプシドタンパク質に選択的に導入する能力は、カプシドあたりの制御された数のハンドルを導入するための手段を提供する。しかしながら、ＡＡＶカプシド遺伝子はすべて同じＯＲＦにコードされ、選択的スプライシング及び開始コドン使用頻度によって発現されるので、他のものに影響を及ぼすことなく１つのカプシドタンパク質を変異させることは困難である。本発明は、ＶＰ１及び／又はＶＰ２が天然のＣａｐ ＯＲＦから発現されないようにＶＰ１及び／又はＶＰ２の翻訳起点に変異を導入することによって、マイナーカプシドタンパク質（ＶＰ１又はＶＰ２又はＶＰ１＋ＶＰ２）を別々に発現させる方法を記載する。次に、欠損カプシドタンパク質は、強力なプロモーター、例えば、本明細書に記載されるＣＭＶプロモーターからトランスで発現されることができる。この第２のＯＲＦからの望ましくないカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ３）の発現も、翻訳起点を変異させることによって同様に排除される（図２）。このプラットフォームは、１つのＯＲＦから上記３つのカプシドタンパク質の任意の組み合わせを発現し、第２のＯＲＦから選択された第３のカプシドタンパクの発現を分離して、上記３つのカプシドタンパク質の任意のサブセットを選択的に操作することを可能にする能力を提供する。
本明細書に記載されるプラットフォームを使用して、部位特異的変異誘発によって、３つのカプシドタンパク質の任意の組み合わせにユニークな非コードコドン（ナンセンスコドン、４塩基コドン、又は非天然塩基対含有コドン等）を選択的に導入することが今や可能である。このような変異体Ｃａｐが、ユニークなコドンを解読することができる適切な操作されたアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）／ｔＲＮＡ対と共発現される場合、ＵＡＡ残基をこれらの部位に組み込むことができる。
本発明の１つの実施形態では、ＵＡＡ ＡｚＫは、ＶＰ１又はＶＰ２又はＶＰ１＋ＶＰ２の残基Ｔ４５４（ＶＰ１番号付け（ナンバリング））に組み込まれた（図３）。ピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を使用する。得られたウイルスは、野生型ウイルスに匹敵する効率でパッケージングされ、匹敵する感染力を有し、これは、これらの改変が良好に許容できることを実証した（図３及び図４）。カプシドあたりの修飾の数を制御することの重要性は、ＵＡＡがカプシドあたり５コピー（ＶＰ１又はＶＰ２のいずれか単独の変異）、又はカプシドあたり１０コピー（ＶＰ１＋ＶＰ２の両方の変異）、又はカプシドあたり６０コピー（３つのカプシドタンパク質すべてが変異された）で組み込まれたＡＡＶの示差的挙動によって実証された。その後、再標的化リガンドはこれらのＵＡＡハンドルに結合された（図６）。６０個の結合ハンドルを有するＡＡＶは、中間の改変状態で効率的な再標的化を可能にしたが、完全な改変では、すべての感染力が失われた。カプシドあたり５個又は１０個の修飾は、良好に許容されたが、効率的な再標的化のために、カプシドあたり１０個の再標的化リガンドが必要であった（図６）。
カプシドタンパク質の任意の他の組み合わせ、及びこれらのタンパク質内の任意の部位を、この戦略を使用して操作することができることに留意されたい。変異に特によく適しているのは、カプシドタンパク質のＮ末端である。というのも、カプシドタンパク質のこのセクションは、機能的カプシドへと折り畳まれると本質的に内部にあるが、カプシドタンパク質のＣ末端は露出しているからである。
加えて、他のａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を使用して（限定されないが、細菌性のチロシル、トリプトファニル、及びロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を含む）、任意の他の非天然アミノ酸（例示的な例は図１に示されており、本明細書に記載されている）を組み込むことができる。この技術は、ＡＡＶの任意の他の天然血清型並びにＡＡＶの操作され進化したバリアントに拡張することもできる。
システイン及びセレノシステインは、タンパク質中に見出される天然アミノ酸残基である。それらの低い存在量及び独特の反応性のため、これらは部位選択的バイオコンジュゲーション反応に使用することができる。本発明の別の実施形態では、操作された表面露出システイン残基をマイナーカプシドタンパク質に導入することができる（図７Ａ及び図７Ｂ）。６０個のカプシドタンパク質すべてに導入した場合、同じ変異は良好に許容されず、低い力価及び乏しい感染力をもたらしたが、表面露出システイン残基がＴ４５４部位でＶＰ１又はＶＰ２のみに導入された場合、強固なウイルスパッケージング及び感染力が観察された。マイナーカプシドタンパク質上の操作されたシステイン残基を選択的に修飾する能力も実証された（図７Ｃ）。
ＡＡＶカプシドが進化を通じて最適化されている会合及び細胞侵入プロセスに関連する複雑さのために、ＡＡＶカプシドは、天然／非天然アミノ酸変異誘発、ループ挿入、タンパク質融合等を通じてカプシドタンパク質を操作する試みにしばしば抵抗する。しかしながら、マイナーカプシドタンパク質のみの操作は、カプシド全体にかなり少ない全体的な乱れしか導入しないので、かなりより良好に許容される。これは、マイナーカプシドタンパク質における操作されたシステイン残基の許容性によって示されるが、どこでもというわけではない（図７）。従って、本発明は、マイナーカプシドタンパク質を操作することによってＡＡＶカプシドの特性を変更するためのより積極的な操作を導入する機会を提供する。天然及び非天然のアミノ酸の変異誘発に加えて、本発明は、有益な形質（例えば、ある特定の標的への結合）を直接提供するか、又は化学反応若しくは酵素反応（例えば、ビオチン化タグ、ＳＮＡＰ若しくはＨＡＬＯタグ等）を介して選択的に修飾することができるペプチド及びタンパク質の融合及び挿入をマイナーカプシドタンパク質に導入するために使用することもできる。
本発明は、ＶＰ１又はＶＰ２又はＶＰ１＋ＶＰ２を選択的に変異誘発することによって、カプシドあたりの明確な数の操作された残基（天然又は非天然）の導入を可能にする。操作された部位の数のさらなる制御は、ＶＰ１又はＶＰ２又はＶＰ１＋ＶＰ２に複数の操作された残基を導入することによって達成することができる。本明細書に記載されるように、２６３、４５４、４５６、５８７及び５８８（この番号付けは、野生型ＶＰ１のアミノ酸残基に対応する）等、ＶＰ１カプシドタンパク質の様々な部位は選択的に変異している。当該プラットフォームは、哺乳動物細胞、昆虫細胞、及び無細胞翻訳／パッケージング系を含むがこれらに限定されない任意のパッケージングプラットフォームに拡張することができる。
本発明は、様々な実体を化学選択的に結合するために使用することができる多種多様な異なる化学を用いて、部位及びコピー数に対する制御を伴うＡＡＶへの多数の天然及び非天然のアミノ酸残基の組み込みを可能にする。本発明の１つの実施形態では、アジド含有ＵＡＡがＡＡＶのマイナーカプシドタンパク質に選択的に導入され、続いて、歪み促進型アジド－アルキンクリック反応を用いてフルオロフォア又は再標的化リガンドにコンジュゲートされた（図５及び図６）。別の実施形態では、マイナーカプシドタンパク質中の操作されたシステイン残基が導入され、続いてシステイン－マレイミドカップリング反応を使用してフルオロフォアにコンジュゲートされた。歪んだアルケンとテトラジン、又はフランとマレイミドとの間の逆電子要請型ディールス－アルダー（Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ）反応、アルデヒド／ケトンとアミノ－オキシ／ヒドラジン基との間の縮合反応、化学選択的高速アゾカップリング反応（ＣＲＡＣＲ）、酸化的カップリング反応及び光触媒カップリング反応、システイン又はセレノシステイン残基による様々な求電子剤への求核置換／付加等を含むがこれらに限定されない任意の他の化学選択的コンジュゲーション反応をカプシド修飾に適用することができる。
本明細書に記載される方法は、限定されないが、プローブ（蛍光プローブ、放射性プローブ、ＭＲＩプローブ、発光プローブ等）、小分子リガンド、ペプチド、環状ペプチド、ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ等）、ポリマー（ＰＥＧ等）、炭水化物（例えば、シアル酸等）、タンパク質（例えば、酵素、ナノボディ、抗体等）、同じ又は異なる血清型の別のＡＡＶ等を含む多種多様な実体を結合するために使用することができる。このような結合は、ユーザー定義受容体に効率的に再標的化し、従って組織親和性を変化させるＡＡＶコンジュゲートを提供することができる。免疫回避ＡＡＶも、免疫系からカプシドを受動的に保護する基（ＰＥＧ、ペプチド、炭水化物、又は他のポリマー等）、又は免疫細胞上の抑制性受容体に能動的に結合して免疫応答をオフにするリガンド（ＳＩＧＬＥＣリガンド等）を部位特異的に結合することによって作製されることが可能である。このような結合は、ＡＡＶカプシドに酵素を結合して優れた感染力プロファイルを有するカプシドを生成するために、又は同じ若しくは異なる血清型を有する２つのＡＡＶをコンジュゲートして拡張されたカーゴ容量及び新規向性を有する新規クラスのベクターを作製するためにも使用することができる。
本明細書に記載される制御されたＡＡＶ改変技術は、限定されないが、小分子、ペプチド、環状ペプチド、ナノボディ、抗体及び抗体断片を含む再標的化リガンド、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＰＮＡアプタマー等を結合することによって、ＡＡＶベクターを所望のタイプの細胞に標的化すること、結合部位、カプシドあたりの再標的化基の数、及びリンカーの化学的特性を系統的に制御することによってそのようなコンジュゲートの特性を最適化すること、ポリエチレングリコール及び他のポリマー、炭水化物（例えば、シアル酸等）、免疫細胞上の抑制性受容体（例えば、ＳＩＧＬＥＣ受容体）に結合するリガンド等を含むがこれらに限定されない免疫調節実体の制御された結合によって、ＡＡＶベクターによって生成される免疫応答を弱めること等の多くの用途に使用することができる。
特に、本発明の遺伝子改変ＡＡＶは、遺伝子治療のための増強ベクターとして使用することができる。本明細書に記載される技術を使用して、ＡＡＶは、非改変ＡＡＶベクターを上回る増強／増加した有効性で、標的細胞への治療用又は抗原性遺伝子構築物の送達を特異的に標的化する／導くために遺伝子改変することができる。細胞は、インビトロ又はインビボ又はエキソビボで培養し、それを必要とする対象に送達することができる。本明細書で使用する場合、用語「対象」は、任意の動物対象を含むことができ、特に、ヒト等の哺乳動物対象を含む。ヒト対象は、既に存在する疾患、障害若しくは状態の治療、若しくは疾患、障害若しくは状態の発症を防止するための予防的処置等の医学的目的のために、又は動物対象は、医学的、獣医学的目的、若しくは開発目的のために、本明細書に記載されるＡＡＶ遺伝子ベクターを使用して処置されることが可能である。本発明の方法及び組成物は、任意のタイプの癌性腫瘍又は癌細胞を処置するために使用されてもよい。加えて、本発明の遺伝子改変ＡＡＶは、タンパク質又はペプチド等の抗原性物質をコードする核酸配列が、免疫応答が対象において誘発されるアジュバント等のさらなる成分とともに標的細胞に送達されるワクチン組成物において使用することができる。
遺伝子改変ＡＡＶによって送達される遺伝子構築物は、治療的に有効である。本明細書で使用する「治療有効」量は、任意の医学的処置に適用可能な妥当な効果／リスク比で、対象における細胞の少なくとも一部の集団において、基礎疾患状態に対して所望の効果をもたらす所望の生物学的効果を有するのに充分な量（例えば、対象における腫瘍増殖を阻害するのに充分な量、抗原に対する免疫応答をもたらすのに充分な量、又は自己免疫疾患を阻害するのに充分な量）を指す。本発明において使用される構築物／薬剤の治療有効量の決定は、当業者によって、公知の技術の使用によって、及び類似の状況下で得られる結果を観察することによって容易に行うことができる。
当該技術は、細胞あたりに送達される遺伝子カーゴの全体的サイズを増加させるために、二官能性リンカーを使用して、同じ又は異なる血清型の２つの別個のＡＡＶベクターをコンジュゲートするために使用することもできる。２つの異なるＡＡＶベクター間のこのような新規コンジュゲートは、独立して又はＡＡＶカプシド内部の遺伝的カーゴと併せて作用する外部ペイロード（例えば、タンパク質、小分子、核酸、プローブ等）を、研究目的又は治療目的のためにインビトロ及びインビボで細胞に送達されるウイルスカプシド上にコンジュゲートすることについて独特の向性をも有する。
最後に、この技術は、蛍光プローブ、光架橋剤、及び親和性ハンドル（ビオチン等）等の基を組み込むことによって、哺乳動物細胞へのＡＡＶカプシドの侵入経路の調査に使用することができる。
さらなる詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。それゆえ、以下の具体的な実施形態及び実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、本開示の残りの部分を決して限定するものではない。
ＡＡＶのカプシドへのＵＡＡの組み込みは、ウイルス増幅のための宿主として役立つコンピテント細胞（例えば、哺乳動物細胞）における所望のＵＡＡ修飾を含む、そのカプシドタンパク質の効率的な発現を必要とする。先に記載したように、ＵＡＡ組み込み部位は、終止コドン（ＴＡＧ等）によって特定することができ、目的のＵＡＡは、同族アンチコドンを有する操作されたｔＲＮＡ／アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素対によって送達することができる。その結果として、ＵＡＡ改変ウイルスの産生は、ウイルス増幅に必要な遺伝成分、及びウイルスの増幅に必要な遺伝成分の同時発現を伴わなければならない。
ＵＡＡをＡＡＶのカプシドタンパク質に組み込むために、いくつかの表面露出内因性アミノ酸残基の置換がＡＡＶカプシド上で標的化された（ウイルス粒子の結晶構造によって導かれることにより。例えば、Ｘｉｅら、Ｔｈｅ ａｔｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ－２），ａ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ、ＰＮＡＳ、２００２年８月６日、第９９巻、第１６号、１０４０７頁を参照されたい）。このようなカプシド変異は潜在的にウイルス感染力を乱すことができるので、３倍近位スパイク上の領域等、変化を許容することが公知である領域が標的とされた。必須アルギニン残基の置換も、ヘパラン硫酸受容体結合領域において標的化され、これは、天然の向性を破壊し、再標的化を促進する。これにより、ＡＡＶの天然の宿主細胞の選好性を「消去」し、正確な標識方法論を用いて標的化剤でそれを書き換えることが可能になる。例えば、標的とされる位置は、３つのＡＡＶカプシドタンパク質のすべての間で保存されたドメインに存在することができ、それらのすべてにおいてＵＡＡによるそれらの置換をもたらす。ＡＡＶは、例えば、ＵＡＡアジド－リシン（「ＡｚＫ」）の存在下で、必要なエレメントを含有するプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって生成することができる。特定の例において、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）由来ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素及びＭ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉｉ）由来ピロリシルｔＲＮＡ（ＴＡＧサプレッサー）を使用して、終止コドンＴＡＧに応答してＡｚＫアミノ酸がＴ４５４に組み込まれた。
以下に記載する実施例において使用されるプラスミドマップ及び配列は、図１７～図２４に見出される。
実施例１：ＡＡＶ２のパッケージング
図３は、図２に記載される構築物を用いた、元の系と比較して同等の収率までのＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＡＶ２のパッケージングを示す。元の（野生型（ＷＴ））ＡＡＶ２のｑＰＣＲ力価を示し、残りのものの力価をＷＴに対して示す。ΔＶＰ１及びΔＶＰ２は、それぞれＶＰ１及びＶＰ２の発現が排除されたＣａｐ遺伝子を用いてパッケージングされたＡＡＶ２を表す。ウイルスは依然として、マイナーカプシドタンパク質の不存在下で効率的に会合する。ΔＶＰ１－ＣＭＶ－ＶＰ１及びΔＶＰ２－ＣＭＶ－ＶＰ２は、それぞれＶＰ１及びＶＰ２の発現が排除されそれぞれのタンパク質がＣＭＶプロモーターからトランスで発現された、Ｃａｐ遺伝子を用いてパッケージングされたＡＡＶ２を表す。これらの系において、ＶＰ１又はＶＰ２中のＴ４５４残基はＴＡＧに変異され、ピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を使用して抑制して、ＵＡＡ（ＡｚＫ）が組み込まれ、これらは、それぞれΔＶＰ１－ＣＭＶ－ＶＰ１－４５４ＡｚＫ及びΔＶＰ２－ＣＭＶ－ＶＰ２－４５４ＡｚＫによって表される。培地に添加したＵＡＡの存在下又は不存在下でのウイルスのパッケージング収率を示す。
図３は、図２に記載される構築物を用いた、元の系と比較して同等の収率までのＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＡＶ２のパッケージングを示す。元の（野生型（ＷＴ））ＡＡＶ２のｑＰＣＲ力価を示し、残りのものの力価をＷＴに対して示す。ΔＶＰ１及びΔＶＰ２は、それぞれＶＰ１及びＶＰ２の発現が排除されたＣａｐ遺伝子を用いてパッケージングされたＡＡＶ２を表す。ウイルスは依然として、マイナーカプシドタンパク質の不存在下で効率的に会合する。ΔＶＰ１－ＣＭＶ－ＶＰ１及びΔＶＰ２－ＣＭＶ－ＶＰ２は、それぞれＶＰ１及びＶＰ２の発現が排除されそれぞれのタンパク質がＣＭＶプロモーターからトランスで発現された、Ｃａｐ遺伝子を用いてパッケージングされたＡＡＶ２を表す。これらの系において、ＶＰ１又はＶＰ２中のＴ４５４残基はＴＡＧに変異され、ピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を使用して抑制して、ＵＡＡ（ＡｚＫ）が組み込まれ、これらは、それぞれΔＶＰ１－ＣＭＶ－ＶＰ１－４５４ＡｚＫ及びΔＶＰ２－ＣＭＶ－ＶＰ２－４５４ＡｚＫによって表される。培地に添加したＵＡＡの存在下又は不存在下でのウイルスのパッケージング収率を示す。
実施例２：パッケージングされたウイルスの感染力
図４は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＥＧＦＰレポーター遺伝子を送達及び発現するウイルスの能力によって測定した、一定の力価での、図３において産生されたパッケージングされた力価ウイルスの感染力を示す。ΔＶＰ１及びΔＶＰ２ウイルスは良好にパッケージングされるが、これらは有意に弱毒化された感染力を示す。トランスでのＶＰ１及びＶＰ２の供給（ΔＶＰ１－ＣＭＶ－ＶＰ１及びΔＶＰ２－ＣＭＶ－ＶＰ２）は、感染力を救済する。ＵＡＡの存在下で産生されたΔＶＰ１－ＣＭＶ－ＶＰ１－４５４ＡｚＫ及びΔＶＰ２－ＣＭＶ－ＶＰ２－４５４ＡｚＫウイルスは強力な感染力を示すが、不存在下では示さない。ＵＡＡの不存在下では、マイナーカプシドタンパク質のＴＡＧ変異体は発現しないことに留意されたい。
図４は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＥＧＦＰレポーター遺伝子を送達及び発現するウイルスの能力によって測定した、一定の力価での、図３において産生されたパッケージングされた力価ウイルスの感染力を示す。ΔＶＰ１及びΔＶＰ２ウイルスは良好にパッケージングされるが、これらは有意に弱毒化された感染力を示す。トランスでのＶＰ１及びＶＰ２の供給（ΔＶＰ１－ＣＭＶ－ＶＰ１及びΔＶＰ２－ＣＭＶ－ＶＰ２）は、感染力を救済する。ＵＡＡの存在下で産生されたΔＶＰ１－ＣＭＶ－ＶＰ１－４５４ＡｚＫ及びΔＶＰ２－ＣＭＶ－ＶＰ２－４５４ＡｚＫウイルスは強力な感染力を示すが、不存在下では示さない。ＵＡＡの不存在下では、マイナーカプシドタンパク質のＴＡＧ変異体は発現しないことに留意されたい。
実施例３：変異ＡＡＶの選択的フルオロフォア標識
図５は、ＡＡＶカプシドにおける個々のマイナーカプシドタンパク質の選択的非天然アミノ酸変異誘発及びフルオロフォアを化学的に結合するためのそれらの使用を示す。精製後、異なる組換えＡＡＶ２調製物を、ＵＡＡ ＡｚＫ中に存在するアジド基を選択的に標識するシクロオクチン－フルオロフォアで標識した。上部パネルはＡＡＶ２調製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示し、下部パネルは同じゲルの蛍光像を示す。予想通り、野生型ＡＡＶ２は標識化を示さず、Ｔ４５４ＡｚＫ（６０のカプシドタンパク質すべてにおけるＡｚＫ）はすべてのカプシドタンパク質の標識化を示すが、ΔＶＰ１－ＣＭＶ－ＶＰ１－４５４ＡｚＫ及びΔＶＰ２－ＣＭＶ－ＶＰ２－４５４ＡｚＫはそれぞれＶＰ１及びＶＰ２の選択的標識化を示し、従って本発明者らが別個のマイナーカプシドタンパク質を選択的に標識化する能力を実証する。
図５は、ＡＡＶカプシドにおける個々のマイナーカプシドタンパク質の選択的非天然アミノ酸変異誘発及びフルオロフォアを化学的に結合するためのそれらの使用を示す。精製後、異なる組換えＡＡＶ２調製物を、ＵＡＡ ＡｚＫ中に存在するアジド基を選択的に標識するシクロオクチン－フルオロフォアで標識した。上部パネルはＡＡＶ２調製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示し、下部パネルは同じゲルの蛍光像を示す。予想通り、野生型ＡＡＶ２は標識化を示さず、Ｔ４５４ＡｚＫ（６０のカプシドタンパク質すべてにおけるＡｚＫ）はすべてのカプシドタンパク質の標識化を示すが、ΔＶＰ１－ＣＭＶ－ＶＰ１－４５４ＡｚＫ及びΔＶＰ２－ＣＭＶ－ＶＰ２－４５４ＡｚＫはそれぞれＶＰ１及びＶＰ２の選択的標識化を示し、従って本発明者らが別個のマイナーカプシドタンパク質を選択的に標識化する能力を実証する。
実施例４：変異ＡＡＶの再標的化効率
図６は、ＡＡＶカプシドに結合した再標的化リガンドの数がその再標的化効率に劇的に影響を及ぼすことを示す。ｃＲＧＤリガンドを脱標的化ＡＡＶ２カプシド（天然の一次受容体であるヘパリン硫酸プロテオグリカン受容体ＨＳＰＧの結合が、重要な残基Ｒ５８８及びＲ５８７（ＶＰ１のアミノ酸残基位置によって指定する）をＡｌａに変異させることによって除去されている）に結合させることによって、ｃＲＧＤリガンドが、αＶβ３インテグリン受容体を過剰発現するＳＫ－ＯＶ－３等の癌細胞株に選択的に結合し、感染することが可能になる。シクロオクチン－ｃＲＧＤはＡｚＫ側鎖をｃＲＧＤで漸進的に機能化するので、これらのグラフは、示された非標的化ＡＡＶ２変異体を経時的にシクロオクチン－ｃＲＧＤとインキュベートしたときの、その非標的化ＡＡＶ２変異体の感染力を示す。４５４ＡＡ（６０ＡｚＫ／カプシド）について、ＳＫ－ＯＶ－３細胞に対する感染力は最初に上昇し、次いで低下し、これは、効率的な再標的化に必要とされるカプシドあたりのｃＲＧＤの最適な数を示唆する。後の時点でのカプシドの過剰修飾は、おそらくウイルス侵入プロセスを乱すことによって感染力の喪失をもたらす。ＶＰ１－４５４ＡＡ及びＶＰ２－４５４ＡＡ（各５ＡｚＫ／カプシド）について、感染力は上昇し、長期インキュベーション時にプラトーに達し、これは、カプシドあたり５個のｃＲＧＤの結合がＡＡＶ２感染力に有害でないことを示唆する。しかしながら、これらの変異体が到達する最大感染力は低く、これは、カプシドあたり５個のｃＲＧＤが効率的な再標的化に充分でない可能性があることを示唆している。ＶＰ１＋２－４５４ＡＡ（１０ＡｚＫ／カプシド）は、ちょうどＶＰ１－４５４ＡＡ及びＶＰ２－４５４ＡＡと同様に挙動したが、長期インキュベーション時の感染力は、最適な修飾度でＴ４５４－ＡＡで観察された最適な感染力と同様のレベルに達する。
図６は、ＡＡＶカプシドに結合した再標的化リガンドの数がその再標的化効率に劇的に影響を及ぼすことを示す。ｃＲＧＤリガンドを脱標的化ＡＡＶ２カプシド（天然の一次受容体であるヘパリン硫酸プロテオグリカン受容体ＨＳＰＧの結合が、重要な残基Ｒ５８８及びＲ５８７（ＶＰ１のアミノ酸残基位置によって指定する）をＡｌａに変異させることによって除去されている）に結合させることによって、ｃＲＧＤリガンドが、αＶβ３インテグリン受容体を過剰発現するＳＫ－ＯＶ－３等の癌細胞株に選択的に結合し、感染することが可能になる。シクロオクチン－ｃＲＧＤはＡｚＫ側鎖をｃＲＧＤで漸進的に機能化するので、これらのグラフは、示された非標的化ＡＡＶ２変異体を経時的にシクロオクチン－ｃＲＧＤとインキュベートしたときの、その非標的化ＡＡＶ２変異体の感染力を示す。４５４ＡＡ（６０ＡｚＫ／カプシド）について、ＳＫ－ＯＶ－３細胞に対する感染力は最初に上昇し、次いで低下し、これは、効率的な再標的化に必要とされるカプシドあたりのｃＲＧＤの最適な数を示唆する。後の時点でのカプシドの過剰修飾は、おそらくウイルス侵入プロセスを乱すことによって感染力の喪失をもたらす。ＶＰ１－４５４ＡＡ及びＶＰ２－４５４ＡＡ（各５ＡｚＫ／カプシド）について、感染力は上昇し、長期インキュベーション時にプラトーに達し、これは、カプシドあたり５個のｃＲＧＤの結合がＡＡＶ２感染力に有害でないことを示唆する。しかしながら、これらの変異体が到達する最大感染力は低く、これは、カプシドあたり５個のｃＲＧＤが効率的な再標的化に充分でない可能性があることを示唆している。ＶＰ１＋２－４５４ＡＡ（１０ＡｚＫ／カプシド）は、ちょうどＶＰ１－４５４ＡＡ及びＶＰ２－４５４ＡＡと同様に挙動したが、長期インキュベーション時の感染力は、最適な修飾度でＴ４５４－ＡＡで観察された最適な感染力と同様のレベルに達する。
実施例５：ＡＡＶの操作したシステイン残基の正確な標識
図７Ａ～図７Ｃは、操作したシステイン残基でのＡＡＶの正確な標識を示す。（Ａ）野生型Ｃａｐ（ＷＴ）、ＣａｐのＴ４５４Ｃ変異体（３つのカプシドタンパク質すべてでＴ４５４Ｃ）、ＶＰ１－Ｔ４５４Ｃ（トランス置換ＶＰ１のＴ４５４Ｃ変異体）、ＶＰ２－Ｔ４５４Ｃ（トランス置換ＶＰ２のＴ４５４Ｃ変異体）を使用して産生されたＡＡＶのパッケージング効率（ｑＰＣＲ）。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＥＧＦＰ遺伝子を送達及び発現するそれらの能力によって測定された、これらのウイルスの感染力（ＦＡＣＳ力価）。（Ｃ）ＶＰ１－４５４Ｃウイルス上のフルオレセイン－マレイミドによるＶＰ１上の操作した４５４－システイン残基の選択的標識。ＦＡＭ蛍光像は、ＷＴ及びＶＰ１－４５４Ｃウイルスに対する標識反応の結果を示すが、ＳＹＰＲＯはすべてのタンパク質を染色する。
図７Ａ～図７Ｃは、操作したシステイン残基でのＡＡＶの正確な標識を示す。（Ａ）野生型Ｃａｐ（ＷＴ）、ＣａｐのＴ４５４Ｃ変異体（３つのカプシドタンパク質すべてでＴ４５４Ｃ）、ＶＰ１－Ｔ４５４Ｃ（トランス置換ＶＰ１のＴ４５４Ｃ変異体）、ＶＰ２－Ｔ４５４Ｃ（トランス置換ＶＰ２のＴ４５４Ｃ変異体）を使用して産生されたＡＡＶのパッケージング効率（ｑＰＣＲ）。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＥＧＦＰ遺伝子を送達及び発現するそれらの能力によって測定された、これらのウイルスの感染力（ＦＡＣＳ力価）。（Ｃ）ＶＰ１－４５４Ｃウイルス上のフルオレセイン－マレイミドによるＶＰ１上の操作した４５４－システイン残基の選択的標識。ＦＡＭ蛍光像は、ＷＴ及びＶＰ１－４５４Ｃウイルスに対する標識反応の結果を示すが、ＳＹＰＲＯはすべてのタンパク質を染色する。
実施例６：ＶＰ１又はＶＰ２又はＶＰ１＋ＶＰ２のいずれかへのＵＡＡの選択的組み込み
図１１Ａ～図１１Ｃに示すように、Ｃ５Ａｚを導入する操作した大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＥｃＬｅｕＲＳ）及びｔＲＮＡ対をコードするプラスミド（ｐＩＤＴｓｍａｒｔ－ＩＴＲ－ＧＦＰ－４ｘＥｃＬｔＲ－ＬｅｕＲＳ）で、並びに［ＲＣ２－ＶＰ１－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ１－ｄｅｌＶＰ２３］又は［ＲＣ２－ＶＰ２－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ２－ｄｅｌＶＰ３］又は［ＲＣ２－ＶＰ１２－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ１－ＶＰ２－ｄｅｌＶＰ３］をそれぞれコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、Ｃ５ＡｚをＶＰ１又はＶＰ２又はＶＰ１＋ＶＰ２のいずれかに組み込んだ。所望のタンパク質中の４５４位（ＶＰ１番号付け）をＴＡＧ終止コドンで置き換えた。Ａ）Ｃ５Ａｚの構造、Ｂ）Ｃ５Ａｚの存在下又は不存在下での野生型ＡＡＶ２産生に対して示される様々な調製物のｑＰＣＲ力価。Ｃ）ＡＡＶ２－ＶＰ１－４５４－Ｃ５Ａｚに対するＤＢＣＯ－ローダミンを用いたＶＰ１の選択的蛍光標識。
図１１Ａ～図１１Ｃに示すように、Ｃ５Ａｚを導入する操作した大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＥｃＬｅｕＲＳ）及びｔＲＮＡ対をコードするプラスミド（ｐＩＤＴｓｍａｒｔ－ＩＴＲ－ＧＦＰ－４ｘＥｃＬｔＲ－ＬｅｕＲＳ）で、並びに［ＲＣ２－ＶＰ１－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ１－ｄｅｌＶＰ２３］又は［ＲＣ２－ＶＰ２－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ２－ｄｅｌＶＰ３］又は［ＲＣ２－ＶＰ１２－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ１－ＶＰ２－ｄｅｌＶＰ３］をそれぞれコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、Ｃ５ＡｚをＶＰ１又はＶＰ２又はＶＰ１＋ＶＰ２のいずれかに組み込んだ。所望のタンパク質中の４５４位（ＶＰ１番号付け）をＴＡＧ終止コドンで置き換えた。Ａ）Ｃ５Ａｚの構造、Ｂ）Ｃ５Ａｚの存在下又は不存在下での野生型ＡＡＶ２産生に対して示される様々な調製物のｑＰＣＲ力価。Ｃ）ＡＡＶ２－ＶＰ１－４５４－Ｃ５Ａｚに対するＤＢＣＯ－ローダミンを用いたＶＰ１の選択的蛍光標識。
実施例７：ＶＰ１へのＣｐＫの選択的組み込み
図１３Ａ～Ｃに示すように、ＣｐＫを導入する操作した大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＥｃＬｅｕＲＳ）及びｔＲＮＡ対をコードするプラスミド（ｐＩＤＴｓｍａｒｔ－ＩＴＲ－ＧＦＰ－４ｘＥｃＬｔＲ－ＬｅｕＲＳ）、並びに［ＲＣ２－ＶＰ１－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ１－ｄｅｌＶＰ２３］をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、ＣｐＫをＶＰ１に組み込んだ。ＶＰ１における種々の部位（示されるとおり。ＶＰ１番号付け）をＴＡＧ終止コドンで置き換えた。Ａ）ＣｐＫの構造、Ｂ）ＬＣＡの存在下又は不存在下での、野生型ＡＡＶ２産生に対して示される様々な調製物の相対力価。Ｃ）ＶＰ１の部位４５６にＬＣＡを組み込んだＡＡＶ調製物上でのテトラジン－ＦＩＴＣを用いたＶＰ１の選択的蛍光標識。
図１３Ａ～Ｃに示すように、ＣｐＫを導入する操作した大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＥｃＬｅｕＲＳ）及びｔＲＮＡ対をコードするプラスミド（ｐＩＤＴｓｍａｒｔ－ＩＴＲ－ＧＦＰ－４ｘＥｃＬｔＲ－ＬｅｕＲＳ）、並びに［ＲＣ２－ＶＰ１－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ１－ｄｅｌＶＰ２３］をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、ＣｐＫをＶＰ１に組み込んだ。ＶＰ１における種々の部位（示されるとおり。ＶＰ１番号付け）をＴＡＧ終止コドンで置き換えた。Ａ）ＣｐＫの構造、Ｂ）ＬＣＡの存在下又は不存在下での、野生型ＡＡＶ２産生に対して示される様々な調製物の相対力価。Ｃ）ＶＰ１の部位４５６にＬＣＡを組み込んだＡＡＶ調製物上でのテトラジン－ＦＩＴＣを用いたＶＰ１の選択的蛍光標識。
実施例８：ＶＰ１への５－ＨＴＰの選択的組み込み
図１４Ａ～Ｃに示すように、５ＨＴＰを導入するための操作された大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素（ＥｃＴｒｐＲＳ）及びｔＲＮＡ対をコードするプラスミド（ｐＩＤＴｓｍａｒｔ－ＴｒｐＲＳ－８ｘＷｔＲ－ＩＴＲ－ＧＦＰ）、並びに［ＲＣ２－ＶＰ１－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ１－ｄｅｌＶＰ２３］をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、５ＨＴＰをＶＰ１に組み込んだ。ＶＰ１における種々の部位（示されるとおり。ＶＰ１番号付け）をＴＧＡ終止コドンで置き換えた。Ａ）５ＨＴＰの構造、Ｂ）５ＨＴＰの存在下又は不存在下での、野生型ＡＡＶ２産生に対して示される様々な調製物の相対力価。Ｃ）ＶＰ１の部位４５４に５ＨＴＰを組み込んだＡＡＶ調製物上でのフルオレセインアミン及びフェリシアニドを用いたＶＰ１の選択的蛍光標識。
図１４Ａ～Ｃに示すように、５ＨＴＰを導入するための操作された大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素（ＥｃＴｒｐＲＳ）及びｔＲＮＡ対をコードするプラスミド（ｐＩＤＴｓｍａｒｔ－ＴｒｐＲＳ－８ｘＷｔＲ－ＩＴＲ－ＧＦＰ）、並びに［ＲＣ２－ＶＰ１－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ１－ｄｅｌＶＰ２３］をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、５ＨＴＰをＶＰ１に組み込んだ。ＶＰ１における種々の部位（示されるとおり。ＶＰ１番号付け）をＴＧＡ終止コドンで置き換えた。Ａ）５ＨＴＰの構造、Ｂ）５ＨＴＰの存在下又は不存在下での、野生型ＡＡＶ２産生に対して示される様々な調製物の相対力価。Ｃ）ＶＰ１の部位４５４に５ＨＴＰを組み込んだＡＡＶ調製物上でのフルオレセインアミン及びフェリシアニドを用いたＶＰ１の選択的蛍光標識。
実施例９：ＶＰＩへのＵＡＡの組み込み
図１５Ａ～Ｂに示すように、いくつかの他の非天然アミノ酸を導入する操作した大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＥｃＬｅｕＲＳ）及びｔＲＮＡ対をコードするプラスミド（ｐＩＤＴｓｍａｒｔ－ＩＴＲ－ＧＦＰ－４ｘＥｃＬｔＲ－ＬｅｕＲＳ）、並びに［ＲＣ２－ＶＰ１－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ１－ｄｅｌＶＰ２３］をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、これらの非天然アミノ酸をＶＰ１に組み込んだ。ＶＰ１の部位４５４（ＶＰ１番号付け）をＴＡＧ終止コドンで置き換えた。Ａ）非天然アミノ酸の構造、Ｂ）示される非天然アミノ酸の存在下又は不存在下での、野生型ＡＡＶ２産生に対して示される様々な変異体ＡＡＶ２調製物の相対力価。
図１５Ａ～Ｂに示すように、いくつかの他の非天然アミノ酸を導入する操作した大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＥｃＬｅｕＲＳ）及びｔＲＮＡ対をコードするプラスミド（ｐＩＤＴｓｍａｒｔ－ＩＴＲ－ＧＦＰ－４ｘＥｃＬｔＲ－ＬｅｕＲＳ）、並びに［ＲＣ２－ＶＰ１－ｄｅｌ＋ＣＭＶ－ＶＰ１－ｄｅｌＶＰ２３］をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、これらの非天然アミノ酸をＶＰ１に組み込んだ。ＶＰ１の部位４５４（ＶＰ１番号付け）をＴＡＧ終止コドンで置き換えた。Ａ）非天然アミノ酸の構造、Ｂ）示される非天然アミノ酸の存在下又は不存在下での、野生型ＡＡＶ２産生に対して示される様々な変異体ＡＡＶ２調製物の相対力価。
実施例１０：ＡＡＶ２－ＶＰ１－４５４－ＬＣＡのＬＣＡ部位の修飾
図１６Ａ～Ｂに示すように、ＡＡＶ２－ＶＰ１－４５４－ＬＣＡを、対応するＰＥＧ－ＤＢＣＯコンジュゲートを用いて２０ｋＤａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーでＬＣＡ部位で選択的に修飾した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＶＰ１の選択的標識を示す。野生型ＡＡＶ２、ＡＡＶ２－ＶＰ１－４５４－ＬＣＡ、及びＰＥＧ修飾ＡＡＶ２－ＶＰ１－４５４－ＬＣＡは、同様の感染力を示す。各ウイルスの等しいゲノムコピーをＨＥＫ２９３細胞に加え、コードされたルシフェラーゼレポーターの発現を標準的なルシフェラーゼアッセイによってモニターした。
図１６Ａ～Ｂに示すように、ＡＡＶ２－ＶＰ１－４５４－ＬＣＡを、対応するＰＥＧ－ＤＢＣＯコンジュゲートを用いて２０ｋＤａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーでＬＣＡ部位で選択的に修飾した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＶＰ１の選択的標識を示す。野生型ＡＡＶ２、ＡＡＶ２－ＶＰ１－４５４－ＬＣＡ、及びＰＥＧ修飾ＡＡＶ２－ＶＰ１－４５４－ＬＣＡは、同様の感染力を示す。各ウイルスの等しいゲノムコピーをＨＥＫ２９３細胞に加え、コードされたルシフェラーゼレポーターの発現を標準的なルシフェラーゼアッセイによってモニターした。
本発明は、その好ましい実施形態を参照して具体的に図示及び説明されたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱しない範囲で、上記実施形態において形態及び詳細の様々な変更がなされてもよいことは当業者によって理解されるであろう。
Claims (39)
- 遺伝子改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、ＡＡＶカプシドは、少なくとも１つのバリアントマイナーカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ１及びＶＰ２の両方を含み、前記バリアントマイナーカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ ＶＰ１又はＶＰ２カプシドタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸残基部位で変異しており、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を組み込んでいる遺伝子改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
- バリアントマイナーカプシドタンパク質を含み、バリアントカプシドコード配列が、ＡＡＶ ＶＰ１、又はＶＰ２、又はＶＰ３カプシドタンパク質オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳起点において変異しており、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方の翻訳が防止されている請求項１に記載の遺伝子改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
- 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１、又は配列番号１の少なくとも約８０％の配列同一性を含む配列を含む請求項２に記載の遺伝子改変ＡＡＶ。
- 終止コドンが前記カプシドタンパク質に組み込まれており、前記終止コドンがＴＡＧ、ＴＡＡ又はＴＧＡコドンである請求項３に記載の遺伝子改変ＡＡＶ。
- バリアントマイナーカプシドタンパク質を含み、前記天然アミノ酸残基がシステイン又はセレノシステインのいずれかである請求項１に記載の遺伝子改変ＡＡＶ。
- バリアントマイナーカプシドタンパク質を含み、前記非天然アミノ酸が、フェニルアラニン類似体、チロシル類似体、トリプトファニル類似体、又はリシル類似体からなる群から選択される請求項１に記載の遺伝子改変ＡＡＶ。
- 前記類似体が、以下の群から選択される式を含む請求項６に記載の遺伝子改変ＡＡＶ。
- バリアントマイナーカプシドタンパク質を含み、前記類似体が、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＡ）、Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）、５－アジドトリプトファン、５－プロパルギルオキシトリプトファン、５－アミノトリプトファン、５－メトキシトリプトファン、５－Ｏ－アリルトリプトファン、５－ブロモトリプトファン、アジド－リシン（ＡｚＫ）、Ｃ５Ａｚ、ＬＣＡ、Ｎε－アセチルリシン（ＡｃＫ）、シクロプロペンアミノ酸、Ｎε－（１－メチルシクロプロパ－２－エンカルボキシアミド）－リシン（ＣｐＫ）、５－ヒドロキシ－トリプトファン（５－ＨＴＰ）、ＬＣＡｌｋ、ＤｉａａｚＫ及びＬＣＫｅｔからなる群から選択される請求項７に記載の遺伝子改変ＡＡＶ。
- 前記バリアントマイナーカプシドタンパク質の前記天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基が、バイオコンジュゲーションハンドルを組み込んでいる請求項１に記載の遺伝子改変ＡＡＶ。
- 前記ＡＡＶカプシドが、カプシドあたり５～１０個のバイオコンジュゲーションハンドルを含む請求項９に記載の遺伝子改変ＡＡＶ。
- 少なくとも１つのバリアントマイナーカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方を含み、前記ＡＡＶが、
ａ）野生型ＡＡＶに匹敵する標的細胞の感染力、
ｂ）野生型ＡＡＶに匹敵する力価でパッケージングされていること、又は
ｃ）特徴ａ）及びｂ）の両方
を特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の遺伝子改変ＡＡＶ。 - 遺伝子改変された感染性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、バリアントマイナーカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方を含み、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方は、１つ以上の変異アミノ酸残基を含む遺伝子改変された感染性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
- 前記バリアントカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方の１つ以上の変異アミノ酸残基を含み、変異アミノ酸残基部位が非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を組み込んでいる請求項１２に記載の遺伝子改変された感染性ＡＡＶ。
- バリアントカプシドタンパク質を含み、前記非天然アミノ酸が、フェニルアラニン類似体、チロシル類似体、トリプトファニル類似体、又はリシル類似体からなる群から選択される請求項１３に記載の遺伝子改変された感染性ＡＡＶ。
- バリアントカプシドタンパク質を含み、前記類似体が、以下からなる群から選択される請求項１４に記載の遺伝子改変された感染性ＡＡＶ。
- 前記バリアントカプシドタンパク質が、配列番号１、又は配列番号１の少なくとも約８０％の配列同一性を含む配列を含むＶＰ１である請求項１２から請求項１５のいずれか１項に記載の遺伝子改変された感染性ＡＡＶ。
- 前記バリアントＶＰ１カプシドタンパク質が、前記タンパク質の位置２６３、位置４５４、位置４５６、位置５８７及び位置５８８の１つ以上の場所で変異している請求項１６に記載の遺伝子改変された感染性ＡＡＶ。
- 前記バリアントカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方の１つ以上の変異アミノ酸残基を含み、変異アミノ酸残基部位が天然アミノ酸を組み込んでいる請求項１２から請求項１７のいずれか１項に記載の遺伝子改変された感染性ＡＡＶ。
- 前記天然アミノ酸がシステイン又はセレノシステインである請求項１８に記載のバリアントカプシドタンパク質。
- 変異したＶＰ１アミノ酸配列が、配列番号１、又は配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有する配列を含み、前記バリアントＶＰ１カプシドタンパク質が、位置２６３、位置４５４、位置４５６、位置５８７又は位置５８８の１つ以上の場所で変異している請求項１８又は請求項１９に記載の遺伝子改変ＡＡＶ。
- 変異アミノ酸残基を含む前記バリアントカプシドタンパク質を含み、前記変異アミノ酸が化学的実体又は生物学的実体（タンパク質、核酸、脂質、又は炭水化物）とコンジュゲートされている請求項１２から請求項２０のいずれか１項に記載の遺伝子改変された感染性ＡＡＶ。
- 化学実体又はタンパク質実体を含み、前記実体が、プローブ、小分子リガンド、ペプチド、環状ペプチド、ヌクレオチド、ポリマー、又はタンパク質コンジュゲートからなる群から選択される請求項２１に記載の遺伝子改変された感染性ＡＡＶ。
- 化学実体又はタンパク質実体を含み、前記実体が環状ペプチドｃＲＧＤ又はポリエチレングリコールである請求項２２に記載の遺伝子改変された感染性ＡＡＶ。
- 感染性遺伝子改変ＡＡＶの製造方法であって、前記ＡＡＶはバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含み、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方は、野生型ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方と比較して、１つ以上の変異アミノ酸残基部位を含み、
ａ）培養中のコンピテントな宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）前記培養細胞に、
１）ＶＰ１、又はＶＰ２、又はＶＰ１及びＶＰ２の両方を発現しないＡＡＶバリアントＶＰ３、
２）ＶＰ３を発現しない適切なプロモーターを有するバリアントＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ１及びＶＰ２の両方、
３）ＡＡＶ発現に必要なさらなる因子
を含む１種以上のプラスミドをトランスフェクトする工程と、
ｃ）必要な非天然アミノ酸、及び終止コドンに応答して前記非天然アミノ酸を選択的に導入する操作されたアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対をコードするプラスミドを提供する工程と、
ｄ）前記細胞を、前記プラスミド遺伝子の発現及び前記ＡＡＶの会合に充分な条件下で培養する工程と
を含み、
これにより、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３又はＶＰ１及びＶＰ２の両方が、野生型ＡＶＶと比較して１つ以上のアミノ酸残基部位で変異しているバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含む感染性遺伝子改変ＡＡＶを製造する方法。 - 前記適切なプロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである請求項２４に記載の方法。
- 前記バリアントカプシドタンパク質が、前記アミノ酸残基部位において天然アミノ酸又は非天然アミノ酸で変異している請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
- 前記変異アミノ酸残基部位が非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を組み込んでいる請求項２５又は請求項２６に記載の方法。
- 前記非天然アミノ酸が、フェニルアラニン類似体、チロシル類似体、トリプトファニル類似体、又はリシル類似体からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
- 前記類似体が、以下からなる群から選択される式を含む請求項２８に記載の方法。
- 前記変異アミノ酸残基部位が天然アミノ酸を組み込んでいる請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
- 前記天然アミノ酸がシステイン又はセレノシステインである請求項３０に記載の方法。
- 前記変異アミノ酸が化学的実体又は生物学的実体とコンジュゲートされている請求項２４から請求項３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記実体が、プローブ、小分子リガンド、ペプチド、環状ペプチド、ヌクレオチド、ポリマー、タンパク質、又はウイルスコンジュゲートからなる群から選択される請求項３２に記載の方法。
- 前記実体が環状ペプチドｃＲＧＤ又はポリエチレングリコールである請求項３３に記載の方法。
- 請求項１から請求項２３のいずれか１項に記載の遺伝子改変ＡＡＶを含み、１種以上の治療用又は抗原性遺伝子構築物をさらに含む治療用又は抗原性組成物。
- 抗原性組成物であり、アジュバントをさらに含む請求項３５に記載の組成物。
- 対象における疾患又は状態の治療方法であって、請求項３５に記載の治療用組成物を前記対象に投与する工程を含み、前記組成物は、前記対象における前記疾患又は状態を減少又は軽減することができる治療量の、タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子構築物を含む方法。
- 対象において免疫応答を誘発する方法であって、請求項３５又は請求項３６に記載の抗原性組成物を前記対象に投与する工程を含み、前記抗原性組成物は、前記対象において免疫応答を誘発することができる抗原をコードする遺伝子構築物を含む方法。
- 請求項１から請求項２３のいずれか１項に記載の遺伝子改変ＡＡＶを含むキット。
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