CN115551878A - 用于增强的基因疗法的腺相关病毒(aav)的受控修饰 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于通过控制位点和化学计量来化学修饰AAV衣壳的平台。描述了一种AAV包装系统，该系统允许将定点天然和非天然氨基酸突变引入三种衣壳蛋白的任何子集中。这些工程化的残基随后可用于对所得衣壳进行化学功能化，并精确控制位点和化学计量。这种受控修饰策略可用于将多个实体接附到AAV衣壳上，以便工程化其趋向性、免疫原性等。

Description

用于增强的基因疗法的腺相关病毒(AAV)的受控修饰

政府支持

本发明是在国家科学基金会授予的资助号为1817893的政府资助下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

相关的申请

本申请要求根据35U.S.C.第119(e)条于2020年5月1日提交的美国临时申请号63/018,573的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。

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发明领域

本发明涉及生物技术领域，重点是通过病毒衣壳的受控的化学修饰，开发基于工程化的AAV的基因治疗载体。

背景技术

腺相关病毒(AAV)已成为最有希望的基因治疗的递送载体之一。它是天然复制缺陷的，仅表现出低先天免疫应答，有效感染分裂和非分裂细胞，并在体内提供所递送的治疗基因的稳定、长期表达。事实上，最近已经批准了几种基于AAV的基因疗法，还有许多其他的目前正在临床试验中。尽管基于AAV的基因疗法有望治愈许多目前无法治疗的疾病，但仍存在几个关键挑战。例如，目前几乎所有的方法都依赖于AAV的天然血清型，这些血清型表现出限制性的先天组织趋向性。自然地，这种方法可以靶向与被这些载体有效感染的细胞类型相关的疾病。然而，在不易被现有AAV载体感染的组织中发生的许多其他疾病目前仍然难以治疗。重新工程化现有AAV载体的组织趋向性的能力对于创建可以将遗传有效载荷递送到所需位置的定制载体非常有用，从而实质性扩展基于AAV的基因疗法的范围。此外，许多患者对现有的AAV载体具有预先存在的免疫力。此外，治疗性AAV载体的施用会引发强烈的适应性免疫应答，从而禁止第二剂相同的载体。工程化现有AAV载体以逃避这种免疫识别的能力将是开发可持续基因疗法的关键。定向进化已被用于开发具有更多治疗所需特征的AAV衣壳。然而，这种方法对于产生可接受的解决方案通常是不可靠的，并且由此产生的突变AAV衣壳经常显示包装缺陷。

以受控方式在现有AAV衣壳上展示活性调节实体的能力提供了一种有吸引力的模块化方法来工程化它们的特性。已经尝试了许多方法来实现这一目标，包括次要衣壳蛋白的N端延伸、在衣壳蛋白的允许位点插入肽环以及衣壳表面上现有的氨基酸如赖氨酸的修饰。然而，N端延伸和环插入经常破坏复杂的AAV衣壳的组装。由于AAV衣壳的精细性，肽环的插入仅限于极少数位置，并且由此产生的衣壳通常表现出次优包装。这些方法在优化活性调节部分的位置、可以展示的实体的结构多样性以及优化展示在衣壳表面上的靶向部分的数量的能力方面提供了有限的灵活性。

发明内容

已经有可能生产掺入具有叠氮基官能团(functionality)的UAA的AAV，然后通过菌株促进的叠氮基-炔烃环加成(SPAAC)将其与环辛炔修饰的cRGDFC缀合，从而将病毒重新靶向至在某些类型的癌细胞中过表达的αVβ3整合素受体。然而，如前所述，UAA的掺入已限于将UAA掺入到AAV的所有60种衣壳蛋白中。如本文所述，已证明AAV病毒颗粒的所有60种衣壳蛋白(包括次要衣壳蛋白VP1和VP2以及主要衣壳蛋白VP3)的过度修饰对其感染性是非常有害的。控制氨基酸突变的数量以产生变体衣壳以在每个衣壳中掺入/引入特定数量的天然存在的和/或UAA修饰/突变(相对于野生型AAV)的能力是本发明的关键特征，以允许合成包含具有突变氨基酸残基的变体衣壳蛋白的感染性遗传修饰的腺相关病毒。变体衣壳蛋白中的这些突变残基允许生物和/或化学实体(在本文中也称为“基团”)的接附(例如，共价接附)以便以位点特异性方式将生物缀合“手柄(handle)”引入AAV，从而导致能够最优工程化AAV功能的限定数量的活性调节基团的掺入/引入。

本发明包括遗传工程化/遗传修饰的腺相关病毒(AAV)，其相对于野生型AAV的相应位点在一个或多个衣壳蛋白的位点特异性位置处具有修饰/突变，以及制造这些遗传修饰的病毒的方法。重要的是，如本文所述，修饰可限于单个衣壳蛋白(例如VP1、VP2或VP3)或这些衣壳蛋白的多个(例如VP1和VP2二者)中的一个或多个特定的化学选择性位置，不影响AAV颗粒的感染性(即，其中遗传修饰的AAV的感染性与类似生物条件下野生型AAV的感染性基本可比或略有改变)。

AAV是一种小的无包膜细小病毒，具有4.5kb的单链DNA基因组，其编码非结构Rep和AAP蛋白以及结构Cap蛋白VPl、VP2和VP3，它们共享共同的C末端并且N末端延伸不同。与具有装饰有表面蛋白的脂质膜的包膜病毒不同，AAV具有紧密包装的二十面体衣壳，仅由60个拷贝的蛋白质VP1、VP2和VP3以约为1:1:10的化学计量(stoichiometry)组成。AAV是复制缺陷型的——完整的病毒生产和逃逸需要辅助病毒如腺病毒的存在。AAV有许多具有不同自然趋向性的不同血清型。例如，本文所述的一种血清型是AAV 2型(AAV2)，其靶向表达硫酸类肝素蛋白聚糖受体的细胞。

腺相关病毒已成为人类基因疗法最有希望的候选者。这种病毒具有低免疫原性和长期基因表达等理想特性，是基因疗法载体的理想选择。然而，这些病毒的许多其他特性通常与治疗需求不符。例如，病毒的天然血清型具有不同的细胞特异性，这限制了哪些细胞/组织可以作为人类基因疗法的靶标。通过对位点和化学计量的精确控制，使现有AAV载体功能化的能力为引入治疗所需的特征(如细胞特异性和免疫逃避)提供了一条有吸引力的途径。

本文描述的是一种通过将具有实体或基团(例如生物缀合实体或“手柄”)的氨基酸例如UAA(例如，天然氨基酸半胱氨酸或具有广泛的生物缀合化学的非天然氨基酸)引入AAV的次要衣壳蛋白而精确并且位点特异性遗传工程化AAV的技术。次要衣壳蛋白VP1和VP2分别以每个AAV衣壳5个拷贝存在。如本文所述，本发明的构建体和方法能够对三种衣壳蛋白中的任何一种进行位点选择性修饰，但特异性修饰VP1或VP2或VP1和VP2两者，允许每个完全组装AAV衣壳5或10个基团的接附。(本文所用的术语“完全组装”是指掺入所有三种衣壳蛋白，次要VP1和VP2衣壳蛋白以及主要衣壳蛋白VP3以形成感染性病毒颗粒的病毒组装)。本方法进一步允许掺入生物缀合手柄(每个衣壳蛋白多至两个生物缀合手柄)，从而能够精确接附每个衣壳15或20个生物缀合基团。

更具体地，本发明包括产生AAV载体的方法，其中可以对次要衣壳蛋白VPl和VP2中的任何一种或其组合进行位点特异性化学修饰。由于三种衣壳蛋白以不同的化学计量存在(每个衣壳分别有5、5和50个拷贝的VP1、VP2和VP3)，因此该方法提供了创建均质AAV缀合物的能力，其中可以将修饰引入衣壳并精确控制位点和修饰的数量，并保留病毒的生物活性，尤其是其靶向的细胞感染性。

如本文所述，使用抑制无义密码子的工程化氨酰基-tRNA合成酶(aaRS)/tRNA对，可以将天然和非天然氨基酸(UAA)位点特异性掺入衣壳蛋白中。由于体积小，UAA在AAV衣壳中的许多位置都具有良好的耐受性。

本发明包括遗传修饰的腺相关病毒(AAV)，其中AAV衣壳包含至少一种变体次要衣壳蛋白VP1、VP2或VP1和VP2两者，其中变体次要衣壳蛋白在一个或多个氨基酸残基位点处是突变的以掺入野生型AAV中不存在的天然氨基酸或相对于野生型AAV VP1或VP2衣壳蛋白的非天然氨基酸(UAA)。重要的是，与野生型AAV相比，本文所述的遗传修饰的AAV在可比条件下保留了它们的感染性。

特别地，本发明包括包含变体次要衣壳蛋白的遗传修饰的腺相关病毒(AAV)，其中衣壳编码序列(SEQ ID NO：1)在AAV VP1或VP2或VP3衣壳蛋白开放阅读框(ORF)的翻译起点发生突变，以防止VP1、VP2或VP1和VP2两者的翻译，导致具有VP1、VP2、VP3或VP1和VP2两者缺失的AAV衣壳蛋白。然后从编码缺失的次要衣壳蛋白的第二衣壳编码序列反式提供(即表达)缺失/缺少的衣壳蛋白，从而产生具有一种或多种变体衣壳蛋白的遗传修饰的AAV。本文中VP2也由SEQ ID NO：2表示并且VP3也由SEQ ID NO：3表示。

遗传修饰的AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1，或包含SEQ ID NO：1的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或90％和99％之间的序列同一性的序列。变体衣壳蛋白在特定位点发生突变以缺失VP1、VP2或VP1和VP2两者(例如，如图2所示)。例如，在SEQ IDNO：1的T454位，可以使用本文描述的技术插入终止密码子。此类技术也在例如PCT/US2020/055834；PCT/US2020/038766或PCT/US2020/029567中有所描述，其教导通过引用以其整体并入本文。更具体地，掺入变体衣壳蛋白中的终止密码子可以是TAG、TAA或TGA抑制终止密码子。

本发明具体包括次要衣壳蛋白CMV-VP1-delVP23(图20，SEQ ID NO：7))；CMV-VP2-delVP3(图21,SEQ ID NO：9)和CMV-VP1-VP2-delVP3(图22,SEQ ID NO：10)。如本文所述，举例说明了CMV启动子序列，但可以掺入任何合适的启动子序列。此外，次要衣壳蛋白可以掺入如本文所述的天然存在的或非天然的氨基酸。

重要的是，本发明的遗传修饰的AAV的关键优势是掺入次要衣壳蛋白中的UAA处于低水平，因此它们的生产效率不会受到UAA掺入的影响(显著影响)。因此，AAV被包装/组装成具有与野生型病毒基本可比的感染性滴度。

本发明的遗传修饰的AAV的变体衣壳蛋白可以包含VPl、VP2或VPl和VP2两者的一个或多个突变氨基酸残基，其中突变氨基酸残基位点掺入非天然氨基酸(UAA)。适用于本发明的UAA的例子示于图1中，显示了化学式1-12(上行1化学式1-6，从左到右，第二行化学式7-12从左到右，包括碳链延伸的长度和取代。更具体地说，适用于本发明的非天然氨基酸可以选自由苯丙氨酸类似物；酪氨酰类似物；色氨酸类似物；或赖氨酰类似物组成的组。特别地，类似物选自由对苯甲酰基苯丙氨酸(pBpA)；O-甲基酪氨酸(OMeY)；5-叠氮基色氨酸；5-炔丙基氧基色氨酸(propargyloxytryptopha)；5-氨基色氨酸；5-甲氧基色氨酸；5-O-烯丙基色氨酸；5-溴色氨酸；叠氮基赖氨酸(AzK)或Nε-乙酰赖氨酸(AcK))；C5AZ；LCA；Nε-乙酰赖氨酸(AcK)；环丙烯氨基酸，N^ε-(1-甲基环丙-2-烯羧酰胺(enecarboxamido))-赖氨酸(CpK)；5-羟基色氨酸(5-HTP)；LCAlk；DiaazK和LCKet组成的组。

或者，遗传修饰的AAV的变体次要衣壳蛋白的突变可以是天然氨基酸残基，例如半胱氨酸或硒代半胱氨酸。具体而言，天然氨基酸残基与位于野生型AAV相同位置处的氨基酸残基不同。

本发明的遗传修饰的AAV可以进一步包含生物缀合手柄。这种生物缀合手柄可以以位点特异性方式共价接附至变体次要衣壳蛋白的突变的天然或非天然氨基酸残基。如本文所述，5至10个生物缀合手柄可特异性掺入次要衣壳蛋白中，从而产生每完全组装的AAV衣壳5-10个生物缀合手柄的遗传修饰的AAV。再次，包含至少一种变体次要衣壳蛋白VP1、VP2或VP1和VP2两者的遗传修饰的AAV在类似条件例如细胞培养条件下保留了与野生型AAV可比的靶细胞感染性。例如，突变的氨基酸可以与化学或生物实体(例如，生物实体可以包括蛋白质、肽、核酸、脂质或碳水化合物)缀合。

本发明特别包括的是一种遗传修饰的感染性AAV，其包含含有变体衣壳蛋白的衣壳。例如，变体衣壳蛋白可以包含SEQ ID NO：1，或与SEQ ID NO：1具有至少约80％序列同一性的序列，其中该序列被突变以缺失VP1、VP2或VP1和VP2两者。遗传修饰的AAV衣壳的突变可以在位置，例如，263、454、456、587和/或588处，其中突变位置相对于野生型VP1序列。VP1序列也可以在位置263、454、456和588发生突变，但在位置587不发生突变。或者，VP1序列可在位置263、454、456突变，但不在位置585或588突变。本发明的感染性遗传修饰的AAV的特征是在可比条件下与野生型AAV的感染性基本可比的感染性，在可比条件下具有与野生型AAV基本可比的滴度的AAV的包装或与野生型AAV可比的感染性和包装。

在本发明的一个实施方案中，修饰的AAV的突变氨基酸残基被功能化或与化学或蛋白质实体(在本文中也称为生物缀合柄或基团)缀合。如本文所述，化学或蛋白质实体选自由探针、小分子配体、肽、环肽、核苷酸、聚合物、蛋白质或病毒缀合物组成的组。在具体实施方案中，遗传修饰的感染性AAV包含化学或蛋白质实体，其中该实体是环肽cRGD聚乙二醇(PEG)。

在本发明的另一个实施方案中，变体VPl或VP2的突变氨基酸残基位点掺入天然存在的氨基酸。特别地，天然存在的氨基酸是半胱氨酸或硒代半胱氨酸。

本发明的包含变体衣壳蛋白的遗传修饰的感染性AAV(例如，包含用cRGD肽功能化的突变的衣壳蛋白的遗传修饰的AAV)可以从结合至、或识别、或与它的天然同源细胞受体相互作用被“重新靶向”，以结合至、识别或与非同源靶细胞相互作用。如本文所述，每个衣壳接附的任何数量的重新靶向基团显著影响所得AAV缀合物的性质。这强调了控制位点和化学计量对于通过化学修饰改变AAV载体特性的重要性。如本文所述，现在可以对AAV衣壳进行精确、选择性的化学修饰，同时对位点和化学计量(每个衣壳引入多少修饰)进行前所未有的控制。这种控制对于开发具有更多治疗所需特性的工程化的AAV载体将非常重要。

本发明还包括生产/制造感染性遗传修饰的AAV的方法，其中AAV包含变体AAV衣壳蛋白，其中相对于野生型VP1、VP2或VP1和VP2两者，VPl、VP2或VPl和VP2两者包含一个或多个突变氨基酸残基位点。一般而言，该方法包括提供在培养中的感受态宿主细胞，用一个或多个质粒转染培养的细胞，所述质粒包含1)不表达VP1或VP2或既不表达VP1也不表达VP2的AAV变体VP3；2)具有不表达VP3的合适启动子的变体VP1、VP2或VP1和VP2两者；3)AAV表达所需的额外因子；4)提供所需的非天然氨基酸和5)提供编码工程化的氨酰-tRNA合成酶/tRNA对的质粒，该对可响应于终止密码子选择性地负载非天然氨基酸进。在足以表达质粒基因和组装AAV的条件下培养细胞和质粒，从而产生包含变体衣壳蛋白的感染性遗传修饰的AAV，其中VPl、VP2或VPl和VP2两者相对于野生型AAV在一个或多个氨基酸残基处突变。

更具体地，该方法包括以下步骤：提供培养中的感受态宿主细胞；用包含组装和表达遗传修饰的感染性AAV所需序列的质粒/构建体共转染培养的细胞。一种mRNA编码具有不同起始密码子位点的VP1、VP2或VP3(参见图2)。如果起始位点发生突变，则VP1、VP2或VP3的表达可以通过对于每个衣壳蛋白表达单独的mRNA来控制，并且衣壳蛋白可以选择性地突变，而突变的次要衣壳蛋白VP1和/或VP2和野生型可以组装成具有感染性的遗传修饰的AAV。

例如，如本文所述，非天然氨基酸可通过用编码工程化的tRNA合成酶和tRNA对的质粒共转染感受态宿主细胞而位点特异性地掺入VPl和/或VP2中，所述工程化的tRNA合成酶和tRNA对负载非天然氨基酸。更具体地，提供了一种正交tRNA/aaRS对，其包含工程化的氨酰RNA合成酶(aaRS)及其相应的tRNA，以响应变体VP1、VP2、VP3或VP1和VP2两者的突变位点共翻译地掺入非天然氨基酸(UAA)，并提供待掺入突变位点的所需的非天然氨基酸。

与编码突变的VPl和/或VP2和野生型VP3转录物的质粒一起还被提供(共培养)的是编码在细胞培养中AAV衣壳表达和完整衣壳(即，包含VP1、VP2和VP3)组装所需的额外因子的质粒。在足以表达质粒基因和组装AAV的条件下培养/维持细胞、质粒和UAA，从而产生包含变体AAV衣壳蛋白的感染性遗传修饰的AAV，其中VP1、VP2或VP1和VP2两者相对于野生型AVV在一个或多个氨基酸残基位点处发生突变。

工程化的氨酰基-tRNA-合成酶-tRNA对可以衍生自大肠杆菌亮氨酰对、大肠杆菌色酰胺对、大肠杆菌酪氨酰对或古细菌衍生的吡咯赖氨酰对。

感染性遗传修饰的AAV可以从细胞培养物中回收/收获，并使用本文所述和本领域技术人员已知的技术评估生物活性。

感染性遗传修饰的AAV的突变氨基酸残基位点可以掺入非天然氨基酸(UAA)类似物，如图1，式1-12所示。更具体地说，非天然氨基酸选自由苯丙氨酸类似物；酪氨酰类似物；色酰胺类似物；或赖氨酰类似物组成的组。类似物选自由对苯甲酰基苯丙氨酸(pBpA)；O-甲基酪氨酸(OMeY)；5-叠氮基色氨酸；5-炔丙基氧基色氨酸；5-氨基色氨酸；5-甲氧基色氨酸；5-O-烯丙基色氨酸；5-溴色氨酸；叠氮基赖氨酸(AzK)或Nε-乙酰赖氨酸(AcK))；C5AZ；LCA；Nε-乙酰赖氨酸(AcK)；环丙烯氨基酸，N^ε-(1-甲基环丙-2-烯羧酰胺)-赖氨酸(CpK)；5-羟基色氨酸(5-HTP)；LCAlk；DiaazK和LCKet组成的组。

或者，变体衣壳蛋白的突变氨基酸残基位点掺入天然存在的氨基酸，并且天然存在的氨基酸是半胱氨酸或硒代半胱氨酸。

变体衣壳蛋白的突变氨基酸可用化学或蛋白质实体功能化，其中该实体选自由探针、小分子配体、肽、环肽、核苷酸、聚合物、蛋白质或病毒缀合物组成的组。在一个实施方案中，使感染性遗传修饰的AAV的变体衣壳蛋白的突变氨基酸功能化的实体是环肽cRGD。

感染性遗传修饰的AAV可以包含突变的VPl氨基酸序列，该序列包含SEQ ID NO：l，或与SEQ ID NO：l具有至少约80％序列同一性的序列，其中变体VP1衣壳蛋白相对于野生型VP1序列在位于VP1序列的263、454、456、587和/或588的一个或多个位置处发生突变。VP1序列也可以在位置263、454、456和588发生突变，但在位置587不发生突变。或者，VP1序列可以在位置263、454、456发生突变，但在位置585或588不发生突变。

感染性遗传修饰的AAV可以包含突变的VP2氨基酸序列，该序列包含SEQ ID NO：2，或与SEQ ID NO：2具有至少约80％、85％、90％、95或99％序列同一性的序列。

感染性遗传修饰的AAV可以包含VP3氨基酸序列，其包含SEQ ID NO：3，或与SEQ IDNO：3具有至少约80％、84％、90％、95％或99％序列同一性的序列。

本发明还包括治疗性或抗原性组合物，其包含如本文所述的遗传修饰的AAV，并且进一步包含一种或多种适用于基因疗法或疫苗接种(例如，在受试者中引发免疫应答)的治疗性或抗原性基因构建体。如果组合物是包含抗原的疫苗组合物，则组合物可以进一步包含佐剂。

本文还包括治疗受试者的疾病或病症的方法。例如，治疗方法可以包括向受试者施用治疗性组合物，其中该组合物包含如本文所述的AAV载体和编码能够减少或减轻受试者的疾病或病症的治疗量的蛋白质或肽的基因构建体。在治疗性组合物中本发明的遗传性修饰的AAV载体的用途可特别用于治疗癌症或疾病例如镰状细胞性贫血的囊性纤维化，其中以靶向方式提供编码功能性蛋白质的替代基因将减少或完全缓解癌症或疾病症状。

另一个例子是在受试者中引发免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用抗原性/疫苗组合物，其中抗原性组合物包含本发明的遗传修饰的AAV载体和编码能够在受试者中引发免疫应答的抗原性蛋白或肽的基因构建体。这种使用本发明的AAV载体的方法将特异性靶向能够引发免疫应答的免疫细胞。

包含本发明的遗传修饰的AAV的试剂盒也包括在本文中。这样的试剂盒可以包括含有如本文所述的遗传修饰的AAV的合适的小瓶，例如无菌稀释剂中的AAV小瓶，以及补充组分的小瓶/容器，例如用于在细胞培养物中繁殖AAV。试剂盒中还可以包含指导手册。

现在将参照附图更具体地描述本发明的上述和其他特征，包括各种新颖的构造细节和部件组合以及其他优点，并在权利要求中指出。应当理解，体现本发明的具体方法和装置是通过说明的方式示出的，而不是对本发明的限制。在不脱离本发明的范围的情况下，本发明的原理和特征可以用于各种和众多的实施方案中。

附图的简要说明

在附图中，附图标记在不同视图中始终指代相同的部件。附图不一定按比例绘制；相反，重点放在说明本发明的原理上。专利或申请文件包含至少一幅彩色绘图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将通过专利局根据要求提供并支付必要的费用。在图中：

图1显示了可以以受控化学计量掺入AAV衣壳中的天然和非天然氨基酸的结构的实例。具体显示的是包含式1-12的UAA类似物(上行1式1-6，从左到右和第二行式7-12从左到右，包括碳链延伸的长度和取代。

图2显示了选择性地将突变(天然或非天然氨基酸)引入VP1或VP2或VP1和VP2的方案。通过使用可变剪接和起始密码子使用从相同的开放阅读框Cap表达三种衣壳蛋白。已在翻译起点处将突变工程化(由红色叉号表示)，阻止了VP1、VP2或VP3从该ORF的表达。然后可以在强启动子(如CMV)的驱动下，以反式形式提供缺少的次要衣壳蛋白。将VP1、VP2或VP1+VP2的表达与剩余衣壳蛋白分开，从而可以在不影响其他衣壳蛋白的情况下选择性地突变这些蛋白质。

图3显示了使用图2中描述的构建体在HEK293T细胞中包装AAV2。具有变体衣壳蛋白的AAV相对于原始系统具有可比的产量。

图4显示了图3中产生的经包装的滴定病毒在恒定滴度下的感染性，通过它们在HEK293T细胞中递送和表达EGFP报告基因的能力测量。

图5显示了AAV衣壳中单个次要衣壳蛋白的选择性非天然氨基酸诱变以及它们用于化学接附荧光团的用途。

图6显示了接附到AAV衣壳的重新靶向配体的数量显著影响其重新靶向效率。

图7A-7C显示了AAV在工程化的半胱氨酸残基处的精确标记。

图8A-C显示了AAV同工型VP1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。图8B和8C分别公开了SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

图9显示了AAV衣壳蛋白同工型VP2的氨基酸序列。(SEQ ID NO：2)。

图10显示了AAV衣壳蛋白同工型VP3的氨基酸序列。(SEQ ID NO：3)。

图11A-C显示了UAA C5Az VP1或VP2或VP1+VP2的选择性掺入。

图12A-C显示了掺入到VPl中的LCA的结果。

图13A-C显示了将CpK掺入VP1的结果。

图14A-C显示了将5HTP掺入VPl的结果。

图15A-B显示了几种其他非天然氨基酸LCAlk、DiazK和LCKet掺入VPl中。

图16A-B显示了AAV在VPI位点454处的选择性聚乙二醇化的结果。

图17显示了编码RC2-VP1-del的核酸序列(SEQ ID NO：4)。突变的位置以红色显示。

图18显示了编码RC2-VP2-del的核酸序列(SEQ ID NO：5)。突变的位置以红色显示。

图19显示了编码RC2-VP12-del的核酸序列(SEQ ID NO：L6)。突变的位置以红色显示。

图20显示了编码CMV-VP1-delVP23的核酸序列(SEQ ID NO：7)。突变的位置以红色显示。

图21显示了编码CMV-VP2-delVP3的核酸序列。(SEQ ID NO：8)突变的位置以红色显示。

图22显示了CMV-VP1-VP2-delVP3的核酸序列(SEQ ID NO：9)。突变的位置以红色显示。

图23A是pIDTsmart-ITR-GFP-4xEcLtR-LeuRS的质粒图谱。图23B显示了质粒的核酸序列。(SEQ ID NO：10)。

图24A显示了pIDTsmart-TrpRS-8xWtR-ITR-GFP的质粒图谱。图24B显示了质粒的核酸序列。(SEQ ID NO：11)。

优选实施方案的详细描述

现在将在下文中参考附图更全面地描述本发明，其中示出了本发明的说明性实施方案。然而，本发明可以以许多不同的形式体现，并且不应被解释为限于本文所阐述的实施方案；相反，提供这些实施方案是为了使本公开彻底和完整，并将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。

如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。此外，单数形式和冠词“a”、“an”和“the”也旨在包括复数形式，除非另有明确说明。将进一步理解，术语：包括(include)、包含(comprise)、包括(including)和/或包含(comprising)，当在本说明书中使用时，指定所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组的存在或添加。此外，应当理解，当包括组件或子系统的元件被称为和/或显示为连接或耦合到另一个元件时，它可以直接连接或耦合到另一个元件或者可以存在中间元件。

应当理解，尽管本文使用诸如“第一”和“第二”之类的术语来描述各种元件，但是这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个元件与另一个元件区分开来。因此，以下讨论的元件可以称为第二元件，并且类似地，第二元件可以称为第一元件而不背离本发明的教导。

除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。将进一步理解，术语，例如在常用字典中定义的术语，应被解释为具有与其在相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且不会以理想化或过于正式的意义来解释，除非在此明确如此定义。

应当注意，本发明的描述不限于这些特定的方法、组合物、细胞系/生物系统或任何其他标准方案。本发明公开了一种用于生产AAV载体的通用平台，该载体可以使用化学选择性反应进行化学功能化并控制修饰的位点和化学计量，用于病毒包装的细胞类型、工程化的氨酰-tRNA合成酶(aaRS)或tRNA的鉴定，或UAA或天然氨基酸，用于引入修饰的化学反应等，可以随着该领域的技术和这项工作的进展而变化。

以前，将UAA掺入AAV衣壳中已针对所有60种衣壳蛋白。由于三个重叠的衣壳蛋白通过可变剪接和起始密码子使用从相同的开放阅读框(ORF)Cap表达，因此不可能选择性地修饰这些蛋白质的子集。然而，所有60种衣壳蛋白的后续化学修饰会干扰病毒的感染性(例如，图6，蓝色迹线)。虽然人们对这种干扰的机制知之甚少，但有理由相信与病毒复杂的进入途径相关的分子过程可能会受到衣壳的过度修饰的影响。此外，希望能够创建AAV载体，可以以位点特异性的方式将定义数量的化学修饰引入其中。事实上，重新靶向实验表明，存在着有效重新靶向所需的每衣壳最佳数量的配体(图6)。通过控制修饰试剂的浓度或反应时间，可以控制具有60个UAA手柄的AAV衣壳的修饰程度(图6)。然而，这会导致不同修饰状态的衣壳的异质混合物。创造同质AAV缀合物的能力对于基因疗法至关重要，其中每个衣壳引入了定义数量的修饰。

在AAV衣壳中，三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3以大约1:1:10的化学计量掺入。因此，两种次要衣壳蛋白VP1和VP2中的每一种大约有5个拷贝存在于衣壳中，具有VP3的10拷贝，每个病毒颗粒总共有60个拷贝的衣壳蛋白。将工程化的、可修饰的天然或非天然氨基酸残基选择性地引入这些次要衣壳蛋白的能力为每个衣壳引入受控数量的手柄提供了途径。然而，由于AAV衣壳基因都在同一个ORF中编码并通过可变剪接和起始密码子使用来表达，因此在不影响其他衣壳蛋白的情况下突变一种衣壳蛋白是一项挑战。本发明描述了通过在VP1和/或VP2的翻译起点处引入突变从而这些不从天然Cap ORF表达来单独表达次要衣壳蛋白(VP1或VP2或VP1+VP2)的方法。接下来，缺少的衣壳蛋白可以从强启动子，例如本文所述的CMV启动子反式表达。从该第二ORF的不需要的衣壳蛋白(例如VP3)的表达也同样通过突变翻译起点被消除(图2)。该平台提供了从一个ORF表达三种衣壳蛋白的任何组合并从第二ORF分开所选第三的表达的能力，从而可以选择性地工程化三种衣壳蛋白的任何子集。

使用本文所述的平台，现在可以通过定点诱变将独特的非编码密码子(例如无义、4碱基或含有非天然碱基对的密码子)选择性地引入三种衣壳蛋白的任何组合中。当这样的突变Cap与可以解码独特密码子的合适的工程化的氨酰-tRNA合成酶(aaRS)/tRNA对共表达时，UAA残基可以掺入这些位点。

在本发明的一个实施方案中，UAA AzK在VP1或VP2或VP1+VP2的残基T454(VP1编号)处掺入(图3)。使用吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA对。由此产生的病毒以与野生型病毒可比的效率进行包装，并且具有可比的感染性，证明这些修饰具有良好的耐受性(图3和图4)。控制每个衣壳的修饰数量的重要性通过AAV的差异行为证明，其中UAA以每个衣壳5个拷贝(单独的VP1或VP2的突变)或每个衣壳10个拷贝(VP1+VP2两者的突变)，或每个衣壳60个拷贝(所有三种衣壳蛋白都发生了突变)掺入，并且随后将重新靶向的配体接附到这些UAA手柄上(图6)。具有60个接附手柄的AAV能够在中间修饰状态下实现有效的重新靶向，但在完全修饰后，所有感染性都丢失了。每个衣壳5或10个修饰具有良好的耐受性，但需要每个衣壳10个重新靶向的配体用于有效的重新靶向(图6)。

应当注意，衣壳蛋白的任何其他组合以及这些蛋白质内的任何位点都可以使用该策略进行工程化。特别适合突变的是衣壳蛋白的N末端，因为当折叠成功能性衣壳时，衣壳蛋白的这部分基本上是内部的，而衣壳蛋白的C末端是暴露的。

此外，其他aaRS/tRNA对可用于(包括但不限于细菌酪氨酰、色酰胺和亮氨酰-tRNA合成酶/tRNA对)并掺入任何其他非天然氨基酸(图1中示出的和本文描述的示例性例子)。该技术还可以扩展到AAV的任何其他天然血清型以及AAV的工程化的和进化的变体。

半胱氨酸和硒代半胱氨酸是在蛋白质中发现的天然氨基酸残基。由于它们的低丰度和独特的反应性，它们可用于位点选择性生物缀合反应。在本发明的另一个实施方案中，可以将工程化的表面暴露的半胱氨酸残基引入次要衣壳蛋白中(图7A和7B)。尽管将相同的突变引入所有60种衣壳蛋白时不能很好地耐受，导致滴度低和感染性差，但当将表面暴露的半胱氨酸残基仅在T454位点引入VP1或VP2时，观察到强大的病毒包装和感染性。还证明了选择性修饰次要衣壳蛋白上的工程化的半胱氨酸残基的能力(图7C)。

由于与组装和细胞进入过程相关的复杂性(对于其，已通过进化对AAV衣壳进行了优化)，因此它经常抵制通过天然/非天然氨基酸诱变、环插入、蛋白质融合等工程化衣壳蛋白的尝试。然而，仅对次要衣壳蛋白进行工程化的耐受性明显更好，因为它对衣壳整体的整体干扰要少得多。这可以通过次要衣壳蛋白上的工程化的半胱氨酸残基的耐受性来说明，但并非无处不在(图7)。因此，本发明提供了引入更积极的工程化以便通过将次要衣壳蛋白工程化来改变AAV衣壳的性质的机会。除了天然和非天然氨基酸诱变之外，本发明还可以用于将肽和蛋白质融合和插入引入到次要衣壳蛋白中，其或者直接提供有益特性(例如，结合特定靶标)，或者可以通过化学或酶促反应(例如，生物素化标签、SNAP或HALO标签等)被选择性修饰。

本发明允许通过选择性诱变VPl、或VP2、或VPl+VP2，在每个衣壳中引入确定数量的工程化的残基(天然或非天然)。可以通过将多于一个的工程化的残基引入VP1、或VP2或VP1+VP2来实现进一步控制工程化的位点的数量。如本文所述，VP1衣壳蛋白的多个位点已被选择性突变，例如263、454、456、587和588(编号对应于野生型VPI的氨基酸残基)。该平台可以扩展到任何包装平台，包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞和无细胞翻译/包装系统。

本发明能够将大量天然和非天然氨基酸残基掺入AAV中，同时控制位点和拷贝数，所述氨基酸残基具有多种不同的化学性质，可用于化学选择性地接附各种实体。在本发明的一个实施方案中，将含有叠氮基的UAA选择性地引入AAV的次要衣壳蛋白中，然后使用应变促进的叠氮化物-炔烃点击反应将它们缀合到荧光团或重新靶向的配体上(图5和图6)。在另一个实施方案中，引入次要衣壳蛋白中的工程化的半胱氨酸残基并随后使用半胱氨酸-马来酰亚胺偶联反应将其与荧光团缀合。任何其他化学选择性缀合反应都可用于衣壳修饰，包括但不限于应变烯烃与四嗪或呋喃与马来酰亚胺之间的反电子需求狄尔斯-阿德尔反应、醛/酮和氨基-氧基/肼基团之间的缩合反应、化学选择性快速偶氮偶联反应(CRACR)、氧化和光催化偶联反应、半胱氨酸或硒代半胱氨酸残基对各种亲电子体的亲核取代/加成等。

本文所述的方法可用于接附多种实体，包括但不限于探针(荧光的、放射性、MRI、发光的等)、小分子配体、肽、环肽、核苷酸(DNA、RNA、LNA、PNA等)、聚合物(如PEG)、碳水化合物(如唾液酸等)、蛋白质(如酶、纳米抗体、抗体等)、相同或不同的血清型的另一种AAV等。这种接附可以提供AAV缀合物，其有效地重新靶向至用户定义的受体，从而改变其组织趋向性。逃避免疫的AAV也可以通过位点特异性接附基团(例如PEG、肽、碳水化合物或其他聚合物)或配体来产生，其中所述基团被动地保护衣壳免受免疫系统的影响，所述配体主动结合免疫细胞上的抑制性受体以关闭免疫应答(例如SIGLEC配体)。它还可用于将酶接附在AAV衣壳上以产生具有优异感染性的衣壳，或将两种具有相同或不同血清型的AAV缀合以创建具有扩展载货能力和新趋向性的新型载体。

本文所述的受控AAV修饰技术可用于许多应用，例如，通过接附重新靶向的配体将AAV载体靶向所需类型的细胞，其中所述重新靶向的配体包括但不限于小分子、肽、环肽、纳米抗体、抗体和抗体片段；DNA/RNA/PNA适体等；通过系统地控制接附位点、每个衣壳的重新靶向基团的数量和接头的化学性质来优化此类缀合物的性质；通过受控接附免疫调节实体(包括但不限于聚乙二醇和其他聚合物、碳水化合物(例如唾液酸等)、结合免疫细胞上抑制性受体(例如SIGLEC受体)的配体)等来减弱AAV载体产生的免疫应答。

特别地，本发明的遗传修饰的AAV可以用作基因疗法的增强载体。使用本文描述的技术，AAV可以被遗传修饰以特异性靶向/直接递送与未修饰的AAV载体相比具有增强/增加的功效的治疗性或抗原性基因构建体至靶细胞。细胞可以体外或体内或离体培养递送至有需要的受试者。如本文所用，术语“受试者”可以包括任何动物受试者，并且特别包括哺乳动物受试者，例如人。可以使用本文所述的AAV基因载体治疗人类受试者用于医学目的，例如用于治疗现有疾病、病症、病况或用于预防疾病、病症或病况发作的预防性治疗，或用于医疗、兽医目的或开发目的的动物受试者。本发明的方法和组合物可用于治疗任何类型的癌性肿瘤或癌细胞。此外，本发明的遗传修饰的AAV可用于疫苗组合物中，其中编码抗原剂如蛋白质或肽的核酸序列连同附加组分如佐剂一起递送至靶细胞，其中在受试者中引发免疫应答。

由遗传修饰的AAV递送的基因构建体在治疗上是有效的。如本文所用的“治疗有效”量是指足以具有期望的生物学效应以在适用于任何医学治疗的合理收益/风险比下对受试者的至少一个细胞亚群中的潜在疾病状态产生期望效果的量(例如，例如，足以抑制受试者的肿瘤生长、产生对抗原的免疫应答或抑制自身免疫疾病的量)。本领域技术人员通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果可以容易地确定本发明中使用的构建体/试剂的治疗有效量。

该技术还可用于使用双功能接头缀合具有相同或不同血清型的两个不同AAV载体，以增加每个细胞递送的遗传货物的总体大小。两个不同AAV载体之间的这种新型缀合物也将具有独特的趋向性，用于将外部有效载荷(例如蛋白质、小分子、核酸、探针等)体外和体内缀合到待递送到细胞中的病毒衣壳上，所述病毒衣壳独立工作或与AAV衣壳内的遗传货物联合工作用于研究或治疗目的。

最后，该技术可用于通过掺入基团例如荧光探针、光交联剂和亲和手柄(例如生物素)来研究AAV衣壳进入哺乳动物细胞的途径。

无需进一步详述，相信本领域技术人员可以基于以上描述充分利用本发明。因此，以下具体实施方案和实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。

将UAA掺入AAV的衣壳需要其衣壳蛋白的有效表达，包括在作为病毒扩增宿主的感受态细胞(例如哺乳动物细胞)中所需的UAA修饰。如前所述，UAA掺入的位点可以通过终止密码子(例如TAG)指定，并且目的UAA可以通过工程化的tRNA/氨酰-tRNA合成酶对和同源反密码子传递。因此，UAA修饰病毒的生产必须涉及同时表达病毒扩增所必需的遗传成分，以及病毒扩增所必需的那些。

为了将UAA掺入AAV的衣壳蛋白中，靶向AAV衣壳上几个表面暴露的内源氨基酸残基的替换(由病毒颗粒的晶体结构引导，参见，例如，Xie等人,The atomic structure ofadeno-associated virus(AAV-2),a vector for human gene therapy”PNAS 2002年8月6日：第99卷：第16期，第10407页)。由于这种衣壳突变可能会干扰病毒的感染性，因此靶向已知可以耐受改变的区域，例如三倍近端刺突(threefold proximal spike)上的区域。也靶向硫酸类肝素受体结合区域中的必需精氨酸残基的替换，这会破坏天然趋向性并有助于重新靶向。这允许“擦除”AAV的天然宿主细胞偏好，并使用具有精确标记方法的靶向剂重写它。例如，靶向的位置可以位于所有三种AAV衣壳蛋白的保守结构域中，导致它们在所有这些蛋白中都被UAA替换。AAV可以通过在存在UAA叠氮基赖氨酸(“AzK”)的情况下用含有所需元件的质粒转染例如HEK293T细胞来产生。在具体实施例中，使用源自巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶和源自马氏甲烷八叠球菌(M.mazeii)的吡咯赖氨酰tRNA(TAG抑制子)来在T454处响应于终止密码子TAG掺入AzK氨基酸。

下文描述的实施例中使用的质粒图谱和序列见图17-24。

实施例1:AAV2的包装

图3显示了使用图2中描述的构建体的AAV2在HEK293T细胞中的包装，相对于原始系统具有可比的产量。显示了原始(WT)AAV2的qPCR滴度，其余的滴度显示为相对于WT。ΔVP1和ΔVP2代表使用Cap基因包装的AAV2，其中VP1和VP2的表达分别被消除。在没有次要衣壳蛋白的情况下，病毒仍能有效组装。ΔVP1-CMV-VP1和ΔVP2-CMV-VP2代表使用Cap基因包装的AAV2，其中VP1和VP2的表达分别被消除并且各自的蛋白质从CMV启动子反式表达。在这些系统中，VP1或VP2中的T454残基突变为TAG，并使用吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA对进行抑制以掺入UAA(AzK)，其由ΔVP1-CMV-VP1-454AzK和ΔVP2-CMV-VP2-454AzK分别表示。显示了在存在或不存在添加到培养基中的UAA的情况下病毒的包装产量。

实施例2:包装病毒的感染性

图4显示了图3中产生的经包装的滴定(tittered)病毒在恒定滴度下的感染性，通过它们在HEK293T细胞中递送和表达EGFP报告基因的能力测量。虽然ΔVP1和ΔVP2病毒包装良好，但它们的感染性显著减弱。反式提供VP1和VP2(ΔVP1-CMV-VP1和ΔVP2-CMV-VP2)可挽救感染性。在UAA存在下产生的ΔVP1-CMV-VP1-454AzK和ΔVP2-CMV-VP2-454AzK病毒显示出强大的感染性，而在没有UAA的情况下则没有。应该注意的是，在没有UAA的情况下，次要衣壳蛋白的TAG突变体将无法表达。

实施例3：突变AAV的选择性荧光团标记

图5显示了AAV衣壳中单个次要衣壳蛋白的选择性非天然氨基酸诱变以及它们用于化学接附荧光团的用途。纯化后，用环辛炔荧光团标记不同的重组AAV2制剂，该荧光团选择性地标记UAA AzK中存在的叠氮基。上图显示了AAV2制剂的SDS-PAGE分析，下图显示了相同凝胶的荧光图像。正如所预期的，野生型AAV2不显示标记，T454AzK(所有60种衣壳蛋白中的AzK)显示所有衣壳蛋白的标记，而ΔVP1-CMV-VP1-454AzK和ΔVP2-CMV-VP2-454AzK分别显示VP1和VP2的选择性标记，从而证明了我们选择性标记不同次要衣壳蛋白的能力。

实施例4:突变AAV的重新靶向效率

图6显示了接附到AAV衣壳的重新靶向配体的数量显著影响其重新靶向效率。将cRGD配体接附到去靶向的AAV2衣壳上(其中天然初级受体硫酸肝素蛋白聚糖受体HSPG的结合通过将关键残基R588和R587突变为Ala被消除；由VP1的氨基酸残基位置指定)使其能够选择性地结合和感染过表达αVβ3整合素受体的癌细胞系，例如SK-OV-3。这些图显示了所示去靶向的AAV2突变体随着时间的推移与环辛炔-cRGD一起孵育时的感染性，因为它逐渐用cRGD使AzK侧链功能化。对于454AA(每个衣壳60AzK)，对SK-OV-3细胞的感染性首先上升然后回落，这表明有效重新靶向所需的每个衣壳的最佳cRGD数量。后期对衣壳的过度修饰会导致感染性丧失，这可能是由于干扰了病毒进入过程。对于VP1-454AA和VP2-454AA(每个衣壳各5个AzK)，感染性上升并在延长时间孵育后达到平台期，这表明每个衣壳5个cRGD的接附对AAV2感染性无害。然而，这些突变体达到的最大感染性很低，这表明每个衣壳5个cRGD可能不足以有效地重新靶向。VP1+2-454AA(每个衣壳10个AzK)的行为与VP1-454AA和VP2-454AA一样，但延长时间孵育后的感染性达到与T454-AA在最佳修饰程度下观察到的最佳感染性相似的水平。

实施例5:AAV的工程化的半胱氨酸残基的精确标记

图7A-7C显示了AAV在工程化的半胱氨酸残基处的精确标记。(A)使用野生型Cap(WT)、Cap的T454C突变体(所有三种衣壳蛋白的T454C)、VP1-T454C(反式取代VP1的T454C突变体)、VP2-T454C(反式取代的VP2的T454C突变体)产生的AAV的包装效率(qPCR)。(B)这些病毒的感染性，如通过它们在HEK293T细胞中传递和表达EGFP基因的能力所测量的(FACS滴度)。(C)通过VP1-454C病毒上的荧光素马来酰亚胺选择性标记VP1上工程化的454-半胱氨酸残基。FAM荧光图像显示了WT和VP1-454C病毒上的标记反应的结果，而SYPRO染色所有蛋白质。

实施例6：UAA选择性掺入VP1或VP2或VP1+VP2

如图11A-C所示，通过用编码负载C5Az的工程化的大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶(EcLeuRS)和tRNA对的质粒(pIDTsmart-ITR-GFP-4xEcLtR-LeuRS)以及分别编码[RC2-VP1-del+CMV-VP1-delVP23]或[RC2-VP2-del+CMV-VP2-delVP3]或[RC2-VP12-del+CMV-VP1-VP2-delVP3]的质粒共转染HEK293T细胞，将C5Az掺入VP1或VP2或VP1+VP2。所需蛋白质中的位置454(VP1编号)被替换为TAG终止密码子。A)C5Az的结构，B)在存在或不存在C5Az的情况下，相对于野生型AAV2生产显示的各种制剂的qPCR滴度。C)使用DBCO-罗丹明在AAV2-VP1-454-C5Az上的VP1的选择性荧光标记。

实施例7:将CpK选择性掺入VPl

如图13A-C所示，通过用编码负载CpK的工程化的大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶(EcLeuRS)和tRNA对的质粒(pIDTsmart-ITR-GFP-4xEcLtR-LeuRS)以及编码[RC2-VP1-del+CMV-VP1-delVP23]的质粒共转染HEK293T细胞，将CpK掺入VP1中。VP1中的多个位点(如所示；VP1编号)被TAG终止密码子替换。A)CpK的结构，B)在存在或不存在LCA的情况下，显示的各种制剂相对于野生型AAV2产生的相对滴度。C)使用四嗪-FITC在将LCA掺入VP1位点456的AAV制剂上的VP1的选择性荧光标记。

实施例8:将5-HTP选择性掺入VPl

如图14A-C所示，通过用编码负载5HTP的工程化大肠杆菌色酰胺-tRNA合成酶(EcTrpRS)和tRNA对的质粒(pIDTsmart-TrpRS-8xWtR-ITR-GFP)，以及编码[RC2-VP1-del+CMV-VP1-delVP23]的质粒共转染HEK293T细胞，将5HTP掺入VP1中。VP1中的多个位点(如所示；VP1编号)被TGA终止密码子替换。A)5HTP的结构，B)在存在或不存在5HTP的情况下，显示的各种制剂相对于野生型AAV2产生的相对滴度。C)使用荧光素胺和铁氰化物在将5HTP掺入VP1位点454的AAV制剂上的VP1的选择性荧光标记。

实施例9:将UAA掺入VPI

如图15A-B所示，通过用编码负载这些非天然氨基酸的工程化的大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶(EcLeuRS)和tRNA对的质粒(pIDTsmart-ITR-GFP-4xEcLtR-LeuRS)以及编码[RC2-VP1-del+CMV-VP1-delVP23]的质粒共转染HEK293T细胞，将几种其他非天然氨基酸掺入VPl。VP1中的位点454(VP1编号)被TAG终止密码子替换。A)非天然氨基酸的结构，B)在指定的非天然氨基酸存在或不存在的情况下，显示的各种突变体AAV2制剂相对于野生型AAV2生产的相对滴度。

实施例10:AAV2-VP1-454-LCA的LCA位点的修饰

如图16A-B所示，AAV2-VP1-454-LCA在LCA位点用20kDa聚乙二醇(PEG)聚合物使用相应的PEG-DBCO缀合物进行选择性修饰。SDS-PAGE分析显示VP1的选择性标记。野生型AAV2、AAV2-VP1-454-LCA和PEG修饰的AAV2-VP1-454-LCA显示出相似的感染性。每种病毒的等量基因组拷贝也添加到HEK293细胞中，并通过标准荧光素酶测定监测编码的荧光素酶报告基因的表达。

虽然本发明已参照其优选实施方案进行了具体展示和描述，但本领域技术人员将理解，在不背离所附权利要求所包括的本发明范围的情况下，可以对形式和细节进行各种改变。

序列表

<110> 波士顿学院董事会

<120>用于增强的基因疗法的腺相关病毒(AAV)的受控修饰

<130> 0342.0010WO1

<140>

<141>

<150> 63/018,573

<151> 2020-05-01

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 735

<212> PRT

<213> 腺相关病毒 2

<400> 1

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

145 150 155 160

Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr

435 440 445

Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln

450 455 460

Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly

465 470 475 480

Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn

485 490 495

Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly

500 505 510

Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp

515 520 525

Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys

530 535 540

Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr

545 550 555 560

Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr

565 570 575

Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr

580 585 590

Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp

595 600 605

Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr

610 615 620

Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys

625 630 635 640

His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn

645 650 655

Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln

660 665 670

Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys

675 680 685

Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr

690 695 700

Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr

705 710 715 720

Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 2

<211> 598

<212> PRT

<213> 腺相关病毒 2

<400> 2

Met Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys

20 25 30

Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro

35 40 45

Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn

50 55 60

Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly

65 70 75 80

Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr

85 90 95

Trp Met Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu

100 105 110

Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly

115 120 125

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<212> PRT

<213> 腺相关病毒 2

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<210> 4

<211> 4642

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成的多核苷酸"

<400> 4

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<211> 4642

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成的多核苷酸"

<400> 6

gctctagaac tagtggatcc cccggaagat cagaagttcc tattccgaag ttcctattct 60

ctagaaagta taggaacttc tgatctgcgc agccgccatg ccggggtttt acgagattgt 120

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gaaccaccac gcagtcaagg cttcagtttt ctcaggccgg agcgagtgac attcgggacc 4680

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tttttcctca gagcggggtt ctcatctttg ggaagcaagg ctcagagaaa acaaatgtgg 4920

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成的多核苷酸"

<400> 10

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caaaaatcga tgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 9480

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<210> 11

<211> 10183

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成的多核苷酸"

<400> 11

cccgtgtaaa acgacggcca gtttatctag tcagcttgat tctagctgat cgtggaccgg 60

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tggtgcaaag aggcatgata cattgtatca ttattgccct gaaagaaaga gattagggaa 2040

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ctatagactc tataggcggt acttacgtca ctcttggcac ggggaatccg cgttccaatg 2160

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gaggtcaaaa cagcgtggat ggcgtctcca ggcgatctga cggttcacta aacgagctct 2280

gcttatatag acctcccacc gtacacgcct accgcccatt tgcgtcaatg gggcggagtt 2340

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acatacgtca ttattgacgt caatgggcgg gggtcgttgg gcggtcagcc aggcgggcca 2760

tttaccgtaa gttatgtaac gcggaactcc atatatgggc tatgaactaa tgaccccgta 2820

attgattact attaataact agctccacgc gtgcggccgc aggaacccct agtgatggag 2880

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 2940

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag 3000

gctcgatccg ctcgcaccct aggtcgggca ggaagagggc ctatttccca tgattccttc 3060

atatttgcat atacgataca aggctgttag agagataatt agaattaatt tgactgtaaa 3120

cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc 3180

agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt 3240

cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa aggacgaaac accaggggcg tagttcaatt 3300

ggtagagcac cggtcttcaa aaccgggtgt tgggagttcg agtctctccg cccctgccat 3360

tttttgctag gtcgggcagg aagagggcct atttcccatg attccttcat atttgcatat 3420

acgatacaag gctgttagag agataattag aattaatttg actgtaaaca caaagatatt 3480

agtacaaaat acgtgacgta gaaagtaata atttcttggg tagtttgcag ttttaaaatt 3540

atgttttaaa atggactatc atatgcttac cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc 3600

tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac caggggcgta gttcaattgg tagagcaccg 3660

gtcttcaaaa ccgggtgttg ggagttcgag tctctccgcc cctgccattt tttgctaggt 3720

cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 3780

tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 3840

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 3900

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 3960

gtggaaagga cgaaacacca ggggcgtagt tcaattggta gagcaccggt cttcaaaacc 4020

gggtgttggg agttcgagtc tctccgcccc tgccattttt tgctaggtcg ggcaggaaga 4080

gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg ttagagagat 4140

aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt gacgtagaaa 4200

gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg actatcatat 4260

gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt ggaaaggacg 4320

aaacaccagg ggcgtagttc aattggtaga gcaccggtct tcaaaaccgg gtgttgggag 4380

ttcgagtctc tccgcccctg ccattttttg ctaggtcggg caggaagagg gcctatttcc 4440

catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt agagagataa ttagaattaa 4500

tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga cgtagaaagt aataatttct 4560

tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt taaaatggac tatcatatgc ttaccgtaac 4620

ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg aaaggacgaa acaccagggg 4680

cgtagttcaa ttggtagagc accggtcttc aaaaccgggt gttgggagtt cgagtctctc 4740

cgcccctgcc attttttgct aggtcgggca ggaagagggc ctatttccca tgattccttc 4800

atatttgcat atacgataca aggctgttag agagataatt agaattaatt tgactgtaaa 4860

cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc 4920

agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt 4980

cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa aggacgaaac accaggggcg tagttcaatt 5040

ggtagagcac cggtcttcaa aaccgggtgt tgggagttcg agtctctccg cccctgccat 5100

tttttgctag gtcgggcagg aagagggcct atttcccatg attccttcat atttgcatat 5160

acgatacaag gctgttagag agataattag aattaatttg actgtaaaca caaagatatt 5220

agtacaaaat acgtgacgta gaaagtaata atttcttggg tagtttgcag ttttaaaatt 5280

atgttttaaa atggactatc atatgcttac cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc 5340

tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac caggggcgta gttcaattgg tagagcaccg 5400

gtcttcaaaa ccgggtgttg ggagttcgag tctctccgcc cctgccattt tttgctaggt 5460

cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 5520

tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 5580

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 5640

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 5700

gtggaaagga cgaaacacca ggggcgtagt tcaattggta gagcaccggt cttcaaaacc 5760

gggtgttggg agttcgagtc tctccgcccc tgccattttt tgctaggtta ttaatagtaa 5820

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 5880

gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 5940

tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggactattta 6000

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 6060

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 6120

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 6180

tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 6240

cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 6300

cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 6360

ataagcagag ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat cgaaattaat 6420

acgactcact atagggagac ccaagctggc tagcgccacc atgactaagc ccatcgtttt 6480

tgctggcgca cagccctcag gtgaattgac cattggtaac tacatgggtg cgctgcgtca 6540

gtgggtaaac atgcaggatg actaccattg catttactgt atcgttgacc aacacgcgat 6600

caccgtgcgc caggatgcac agaagctgcg taaagcgacg ctggatacgc tggccttgta 6660

tctggcttgt ggtatcgatc ctgagaaaag caccattttt gttcagtccc acgtgccgga 6720

acatgcacag ttaggctggg cactgaactg ctatacctac ttcggcgaac tgagtcgcat 6780

gacgcagttt aaagataaat ctgcgcgtta tgccgagaac atcaacgctg gtctgtttga 6840

ctatccggtg ctgatggcag cggacatcct gctgtatcaa actaatctgg gtccttgtgg 6900

tgaagaccag aaacagcacc tcgaactgag ccgcgatatt gcccagcgtt tcaacgcgct 6960

gtatggcgag atctttaagg tgccggagcc gtttattccg aaatctggcg cgcgcgtaat 7020

gtcgctgctg gagccgacca agaagatgtc caagtctgac gataatcgca ataacgttat 7080

cggcctgctg gaagatccga aatcggtagt gaagaaaatc aaacgtgcgg tcactgactc 7140

cgacgagccg ccggtagttc gctacgatgt gcagaacaaa gcgggcgttt ccaacctgtt 7200

ggatatcctt tcagcggtaa cgggccagag catcccagaa ctggaaaaac agttcgaagg 7260

caagatgtat ggtcatctga aaggtgaagt ggctgatgcc gtttccggta tgctgactga 7320

attgcaggaa cgctatcacc gtttccgcaa cgatgaagcc ttcctgcaac aggtgatgaa 7380

agatggcgcg gaaaaagcca gcgcgcacgc ttcccgtacg ctaaaagcgg tgtacgaagc 7440

gattggtttt gtggcgaagc cgtaagaatt caacgcgtta agtcgacaat caacctctgg 7500

attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat 7560

gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt 7620

tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 7680

ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 7740

ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 7800

aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 7860

attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca 7920

cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc 7980

ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc 8040

agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcgtcg actttaactc gagtctagag 8100

ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 8160

tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 8220

aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 8280

gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 8340

cggtgggctc tatggactag gggtgcgagc ggatcgagca gtgtcgatca ctactggacc 8400

gcgagctgtg ctgcgacccg tgatcttacg gcattatacg tatgatcggt ccacgatcag 8460

ctagattatc tagtcagctt gatgtcatag ctgtttcctg aggctcaata ctgaccattt 8520

aaatcatacc tgacctccat agcagaaagt caaaagcctc cgaccggagg cttttgactt 8580

gatcggcacg taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta 8640

ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatgagcca tattcaacgg 8700

gaaacgtctt gcttgaagcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat 8760

aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag 8820

cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca 8880

gatgagatgg tcaggctaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat 8940

tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatcccagg gaaaacagca 9000

ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg 9060

ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacgg cgatcgcgta 9120

tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttggtgc gagtgatttt 9180

gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taaactcttg 9240

ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt 9300

gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac 9360

caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg 9420

ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcacttgatg 9480

ctcgatgagt ttttctaatg aggacctaaa tgtaatcacc tggctcacct tcgggtgggc 9540

ctttctgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 9600

cgatgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 9660

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 9720

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 9780

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 9840

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 9900

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 9960

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 10020

gctctgctga agccagttac ctcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 10080

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 10140

gatctcaaga agatcctttg attttctacc gaagaaaggc cca 10183

Claims (39)

1.一种遗传修饰的腺相关病毒(AAV)，其中所述AAV衣壳包含至少一个变体次要衣壳蛋白VP1，VP2，或VP1和VP2两者，其中，相对于野生型AAV VP1或VP2衣壳蛋白，所述变体次要衣壳蛋白在一个或多个氨基酸残基位点处发生突变以掺入天然氨基酸或非天然氨基酸(UAA)。

2.根据权利要求1所述的遗传修饰的腺相关病毒(AAV)，其包含变体次要衣壳蛋白，其中所述变体衣壳编码序列在所述AAV VP1，或VP2，或VP3衣壳蛋白开放阅读框(ORF)的翻译起点处发生突变以防止VP1，VP2，或VP1和VP2二者的翻译。

3.根据权利要求2所述的遗传修饰的AAV，其中所述AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1，或包含SEQ ID NO：1的至少约80％序列同一性的序列。

4.根据权利要求3所述的遗传修饰的AAV，其中终止密码子掺入一个或多个衣壳蛋白，和所述终止密码子是TAG、TAA或TGA密码子。

5.根据权利要求1所述的遗传修饰的AAV，其包含变体次要衣壳蛋白，其中所述天然氨基酸残基为半胱氨酸或硒代半胱氨酸。

6.根据权利要求1所述的遗传修饰的AAV，其包含变体次要衣壳蛋白，其中所述非天然存在的氨基酸选自由苯丙氨酸类似物；酪氨酰类似物；色氨酰类似物；或赖氨酰类似物组成的组。

7.根据权利要求6所述的遗传修饰的AAV，其中所述类似物包含选自下组的式：

8.根据权利要求7所述的遗传修饰的AAV，其包含变体次要衣壳蛋白，其中所述类似物选自由对苯甲酰基苯丙氨酸(pBpA)；O-甲基酪氨酸(OMeY)；5-叠氮基色氨酸；5-炔丙基氧基色氨酸；5-氨基色氨酸；5-甲氧基色氨酸；5-O-烯丙基色氨酸；5-溴色氨酸；叠氮基赖氨酸(AzK)；C5AZ；LCA；Nε-乙酰赖氨酸(AcK)；环丙烯氨基酸，N^ε-(1-甲基环丙-2-烯羧酰胺)-赖氨酸(CpK)；5-羟基色氨酸(5-HTP)；LCAlk；DiaazK和LCKet组成的组。

9.根据权利要求1所述的遗传修饰的AAV，其中所述变体次要衣壳蛋白的天然或非天然氨基酸残基掺入生物缀合手柄。

10.根据权利要求9所述的遗传修饰的AAV，其中所述AAV衣壳包含每个衣壳5至10个生物缀合手柄。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的遗传修饰的AAV，其包含至少一种变体次要衣壳蛋白VP1，VP2，或VP1和VP2二者，其中所述AAV的特征在于：

a)与野生型AAV可比的靶细胞的感染性；

b)以与野生型AAV可比的滴度被包装；或者

C)特征a)和b)两者。

12.遗传修饰的感染性腺相关病毒(AAV)，其中所述遗传修饰的AAV包含变体次要衣壳蛋白VP1，VP2，或VP1和VP2两者，其中所述VP1，VP2，或VP1和VP2两者包含一个或多个突变的氨基酸残基。

13.根据权利要求12所述的遗传修饰的感染性AAV，其中所述变体衣壳蛋白包含VP1，VP2，或VP1和VP2两者的一个或多个突变的氨基酸残基，并且所述突变的氨基酸残基位点掺入非天然氨基酸(UAA)。

14.根据权利要求13所述的遗传修饰的感染性AAV，其包含变体衣壳蛋白，其中所述非天然存在的氨基酸选自由苯丙氨酸类似物；酪氨酰类似物；色氨酰类似物；或赖氨酰类似物组成的组。

15.根据权利要求14所述的遗传修饰的感染性AAV，其包含变体衣壳蛋白，其中所述类似物选自由以下组成的组：

16.根据权利要求12至15中任一项所述的遗传修饰的感染性AAV，其中所述变体衣壳蛋白是包含SEQ ID NO：1，或包含SEQ ID NO：1的至少约80％的序列同一性的序列的VP1。

17.根据权利要求16所述的遗传修饰的感染性AAV，其中所述变体VPl衣壳蛋白在所述蛋白的位置263、454、456、587和588处的一个或多个位置发生突变。

18.根据权利要求12至17中任一项所述的遗传修饰的感染性AAV，其中所述变体衣壳蛋白包含VP1，VP2，或VP1和VP2两者的一个或多个突变的氨基酸残基，并且所述突变的氨基酸残基位点掺入天然存在的氨基酸。

19.根据权利要求18所述的变体衣壳蛋白，其中所述天然存在的氨基酸是半胱氨酸或硒代半胱氨酸。

20.根据权利要求18或19所述的遗传修饰的AAV，其中所述突变的VP1氨基酸序列包含SEQ ID NO：l，或与SEQ ID NO：l具有至少约80％序列同一性的序列，其中所述变体VP1衣壳蛋白在位置263、454、456、587或588处的一个或多个位置发生突变。

21.根据权利要求12至20中任一项所述的遗传修饰的感染性AAV，其包含含有突变的氨基酸残基的变体衣壳蛋白，其中所述突变的氨基酸与化学或生物(蛋白质、核酸、脂质或碳水化合物)实体缀合。

22.根据权利要求21所述的包含化学或蛋白质实体的遗传修饰的感染性AAV，其中所述实体选自由探针、小分子配体、肽、环肽、核苷酸、聚合物或蛋白质缀合物组成的组。

23.根据权利要求22所述的包含化学或蛋白质实体的遗传修饰的感染性AAV，其中所述实体是环肽cRGD或聚乙二醇。

24.生产感染性遗传修饰的AAV的方法，其中所述AAV包含变体AAV衣壳蛋白，其中相对于野生型VP1、VP2或VP1和VP2两者，VPl、VP2或VPl和VP2两者包含一个或多个突变的氨基酸残基位点，所述方法包括：

a)提供培养中的感受态宿主细胞；

b)用一个或多个质粒转染培养的细胞，所述质粒包含：

1)不表达VP1，或VP2，或VP1和VP2两者的AAV变体VP3；

2)具有不表达VP3的合适启动子的变体VP1、VP2或VP1和VP2两者；

3)AAV表达所需的额外因子；

c)提供所需的非天然氨基酸；和编码工程化的氨酰-tRNA合成酶/tRNA对的质粒，所述对响应于终止密码子选择性地负载非天然氨基酸；

d)在足以表达质粒基因和组装AAV的条件下培养细胞；

从而产生包含变体AAV衣壳蛋白的感染性遗传修饰的AAV，其中相对于野生型AVV，VP1、VP2、VP3或VP1和VP2两者在一个或多个氨基酸残基位点处发生突变。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述合适的启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。

26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述变体衣壳蛋白在氨基酸残基位点处用天然存在的或非天然的氨基酸突变。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述突变的氨基酸残基位点掺入非天然氨基酸(UAA)。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述非天然存在的氨基酸选自由苯丙氨酸类似物；酪氨酰类似物；色氨酰类似物；或赖氨酰类似物组成的组。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述类似物包含选自由以下各项组成的组的式：

30.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述突变的氨基酸残基位点掺入天然存在的氨基酸。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述天然存在的氨基酸是半胱氨酸硒代半胱氨酸。

32.根据权利要求24至31中任一项所述的方法，其中所述突变的氨基酸与化学或生物实体缀合。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述实体选自由探针、小分子配体、肽、环肽、核苷酸、聚合物、蛋白质或病毒缀合物组成的组。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述实体是环肽cRGD或聚乙二醇。

35.治疗性或抗原性组合物，其包含权利要求1至23中任一项所述的遗传修饰的AAV，并且还包含一个或多个治疗性或抗原性基因构建体。

36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述组合物是抗原性组合物并且所述组合物还包含佐剂。

37.治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用权利要求35的治疗性组合物，其中所述组合物包含编码以能够减少或减轻受试者疾病或病症的治疗性量的蛋白质或肽的基因构建体。

38.在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求35或36所述的抗原性组合物，其中所述抗原性组合物包含编码能够在受试者中引发免疫应答的抗原的基因构建体。

39.试剂盒，其包含权利要求1至23中任一项所述的遗传修饰的AAV。

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