KR102499953B1

KR102499953B1 - Aav 입자의 생산을 위한 벡터

Info

Publication number: KR102499953B1
Application number: KR1020207020846A
Authority: KR
Inventors: 리안 카우드; 엘리사 사라 브레이; 토마스 아우구스투스 페인
Original assignee: 옥스포드 제네틱스 리미티드
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2023-02-14
Also published as: MX2020005282A; KR20200120613A; EP3697917B1; JP7140830B2; CA3083376C; CN111511922A; GB201800903D0; JP2021510496A; SG11202004734UA; WO2019141993A1; EP3697917A1; AU2019208480B2; US20210163987A1; CA3083376A1; AU2019208480A1; CN111511922B; BR112020010300A2; US11697824B2

Abstract

본 발명은 아데노 관련 바이러스(AAV) 입자의 생산에 유용한 플라스미드의 생산에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 cap 유전자와 rep 유전자를 포함하는 핵산 분자로서, cap 유전자와 rep 유전자가 모두 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포 및 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

AAV 입자의 생산을 위한 벡터

본 발명은 아데노 관련 바이러스(Adeno-Associated Virus, AAV) 입자의 생산에 유용한 플라스미드의 생산에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 cap 유전자와 rep 유전자를 포함하는 핵산 분자로서, cap 유전자와 rep 유전자가 모두 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포 및 이의 사용 방법을 제공한다.

AAV 벡터는 파르보바이러스(Parvoviridae) 과에 속하는 단일가닥 DNA 바이러스로부터 생성된다. 이러한 바이러스는 분열 및 비(非)분열 세포를 모두 포함하는, 광범위한 숙주 세포에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 이는 대부분의 환자에서 제한된 면역 반응만을 생성하는 비(非)병원성 바이러스이다.

AAV 게놈은 각각 다중 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 인코딩하는 2가지 유전자를 포함한다: rep 유전자는 AAV 수명 주기와 바이러스 게놈의 부위 특이적 통합에 필요한 비(非)구조 단백질을 인코딩하고; cap 유전자는 구조 캡시드 단백질을 인코딩함. 또한, 이러한 2가지 유전자에는 헤어핀 구조를 형성하는 능력을 가진 145개의 염기로 이루어진 역방위 말단 반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열이 측면에 있다. 이러한 헤어핀 서열은 제2 DNA 가닥의 프리마아제(primase)-의존 합성 및 바이러스 DNA의 숙주 세포 게놈에의 통합에 필요하다.

바이러스의 임의의 통합 능력을 제거하기 위해, 재조합 AAV 벡터는 바이러스 게놈의 DNA로부터 rep 및 cap 유전자를 제거한다. 이러한 벡터를 생산하기 위해, 목적하는 전이유전자(transgene)(들)은 전이유전자(들)의 전사를 유도하기 위한 프로모터(들)과 함께, 역방위 말단 반복(ITR) 사이에 삽입되고; rep 및 cap 유전자는 제2 플라스미드에서 트랜스(trans)로 제공된다. 아데노바이러스 E4, E2a 및 VA 유전자와 같은 헬퍼 유전자를 제공하는 제3 플라스미드가 또한 사용된다. 이어서, 3가지 플라스미드는 모두 HEK293과 같은 배양된 '패키징(packaging)' 세포로 트랜스펙션된다.

지난 몇 년 동안, AAV 벡터는 매우 유용하고 유망한 유전자 전달 방식으로 등장했다. 이는, 이러한 벡터의 하기 특성 때문이다:

- AAV는 작은 외피 미보유(non-enveloped) 바이러스이며, 이는 단지 2가지 고유 유전자(rep 및 cap)만 갖는다. 따라서, 이는 상이한 유전자 요법을 위한 벡터를 생성하기 위해 용이하게 조작될 수 있다.

- AAV 입자는 전단력, 효소 또는 용매에 의해 쉽게 분해되지 않는다. 이는 이러한 바이러스 벡터의 용이한 정제 및 최종 제형화를 용이하게 한다.

- AAV는 비병원성이며 면역원성이 낮다. 이러한 벡터의 사용은 나아가 역 염증 반응의 위험을 감소시킨다. 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 다른 바이러스 벡터와 달리, AAV는 무해하며, 임의의 인간 질환의 원인이 되는 것으로 여겨지지 않는다.

- AAV 벡터를 사용하여 최대 4000 bp의 유전자 서열을 환자에게 전달할 수 있다.

- 야생형 AAV 벡터는 때때로 유전 물질을 인간 염색체 19에 삽입하는 것으로 알려졌지만, 이러한 특성은 일반적으로 바이러스 게놈으로부터 rep 및 cap 유전자를 제거함으로써 대부분의 AAV 벡터로부터 제거된다. 이러한 경우, 바이러스는 숙주 세포 내에 에피솜 형태로 남아있다. 이러한 에피솜은 비분열 세포에서는 온전히 유지되지만, 분열 세포에서는 세포 분열 동안 소실된다.

하지만, 본 발명자들은, AAV 벡터의 생산 방법이 벡터 생산 공정 동안 존재하는 Rep 및 Cap 단백질의 비율 및 양을 최적화함으로써 개선될 수 있다고 인식하였다.

따라서, 본 발명의 목적은, 단일 프로모터(promoter)의 제어 하에 있는 cap 및 rep 유전자를 포함함으로써, Cap 및 Rep 폴리펩티드가 동일한 mRNA 내에서 인코딩되는, cap 및 rep 유전자를 포함하는 핵산 분자를 제공하는 것이다. cap 유전자의 번역은 리보솜에서, cap mRNA의 5' 말단에 메틸구아닐레이트 캡(m⁷G)을 도킹(docking)함으로써 개시될 것이다. rep 유전자의 번역은 rep 유전자의 업스트림(upstream)에 위치한 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 리보솜을 도킹함으로써 개시될 것이다.

본 발명의 핵산 분자의 사용을 통해, 더 높은 바이러스 역가가 얻어질 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, IRES는 야생형 p5 프로모터를 대체한다. p5 프로모터 제거의 추가의 이점은, 야생형 바이러스에서, p5 프로모터가 E2A DNA 결합 단백질(DBP)에 의해 결합 및 활성화된다는 점이다. 따라서, p5 프로모터의 제거는, E2A 유전자가 (예를 들어 헬퍼 플라스미드에서) 바이러스 입자를 생산하는 데 필요하지 않다는 것을 의미한다.

하나의 구현예에서, 본 발명은,

(i) 프로모터와,

(ii) cap 유전자와,

(iii) rep 유전자를

5' → 3' 방향으로 상기 순서대로 포함하는 핵산 분자로서, cap 유전자와 rep 유전자가 모두 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있고, rep 유전자가 또한 IRES와 작동 가능하게 연결되어 있는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명은 또한,

(i) cap 유전자와

(ii) rep 유전자를

5' → 3' 방향으로 상기 순서대로 포함하는 핵산 분자로서, rep 유전자가 IRES와 작동 가능하게 연결되어 있는 핵산 분자를 제공한다.

핵산 분자는 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA일 수 있다. 핵산 분자는 단일- 또는 이중가닥, 바람직하게는 이중가닥일 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 rep 유전자를 포함한다. 본원에 사용된 "rep 유전자"라는 용어는, 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 인코딩하는 유전자로서, 상기 ORF가 각각 AAV Rep 비(非)구조 단백질, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 유전자를 나타낸다. 이러한 AAV Rep 비구조 단백질(또는 이의 변이체 또는 유도체)은 AAV 게놈 복제 및/또는 AAV 게놈 패키징에 관여한다.

야생형 rep 및 cap 유전자의 구성을 예시하는 야생형 AAV 게놈의 구조는, 도 1에 제시되어 있다.

야생형 rep 유전자는 3가지 프로모터: p5, p19 및 p40을 포함한다. 상이한 길이를 갖는 2개의 중첩되는 메신저 리보핵산(mRNA)이 p5 및 p19로부터 생산될 수 있다. 이러한 mRNA는 각각 단일 스플라이스 공여체 부위와 2가지 상이한 스플라이스 수용체 부위를 사용하여 스플라이싱되거나 되지 않을 수 있는 인트론을 함유한다. 따라서, 6가지 상이한 mRNA가 형성될 수 있으며, 이들 중 4가지만 기능성이다. 인트론을 제거하는 데 실패한 2가지 mRNA(p5에서 전사된 것과 p19에서 전사된 것)는, 각각, 공유된 종결자(terminator) 서열까지 판독하고, Rep78 및 Rep52를 인코딩한다. 인트론을 제거하고 5'-최대 스플라이스 수용체 부위를 사용하더라도 임의의 기능성 Rep 단백질이 생산되지 않는다: 이는 서열의 나머지 프레임이 이동함에 따라 정확한 Rep68 또는 Rep40 단백질을 생산할 수 없으며, 또한 이의 종결자가 스플라이싱되어 있기 때문에 Rep78 또는 Rep52의 정확한 C-말단을 생성하지 못할 것이다. 반대로, 인트론을 제거하고, 3' 스플라이스 수용체를 사용하면, Rep78 및 Rep52의 종결자를 스플라이싱하는 동안 Rep68 및 Rep40에 대한 정확한 C-말단을 포함할 것이다. 따라서, 유일한 기능성 스플라이싱은, 인트론의 스플라이싱을 완전히 회피하거나(Rep78 및 Rep52의 생성), 또는 3' 스플라이스 수용체를 사용하는 것이다(Rep68 및 Rep40의 생성). 결과적으로, 중첩되는 서열을 갖는 4가지 상이한 기능성 Rep 단백질이 이러한 프로모터로부터 합성될 수 있다.

야생형 rep 유전자에서, p40 프로모터는 3' 말단에 위치한다. Cap 단백질(VP1, VP2 및 VP3)의 전사는 야생형 AAV 게놈에서 이러한 프로모터로부터 개시된다.

4가지 야생형 Rep 단백질은 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40이다. 따라서, 야생형 rep 유전자는 4가지 Rep 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 인코딩하는 유전자이다.

Rep78 및 Rep68은 ITR에 의해 형성된 헤어핀을 특이적으로 결합시키고, 헤어핀 내 특정 영역(즉, 말단 분해 부위)에서 이를 절단할 수 있다. 야생형 바이러스에서, 이는 AAV 게놈의 AAV-특이적 통합에도 필요하다. Rep78 및 Rep68은 야생형 바이러스에서 p5 프로모터의 제어 하에서 전사되며, 이들 사이의 차이는 스플라이싱에 의한 인트론의 제거(또는 그렇지 않음)를 반영하기 때문에, 이들은 상이한 C 말단 단백질 조성을 갖는다.

Rep52 및 Rep40은 게놈 패키징에 관여한다. Rep52 및 Rep40은 야생형 바이러스에서 p19 프로모터의 제어 하에서 전사되며, 이들 사이의 차이는 스플라이싱에 의한 인트론의 제거(또는 그렇지 않음)를 반영하기 때문에, 이들은 상이한 C 말단 단백질 조성을 갖는다.

4가지 Rep 단백질은 모두 ATP에 결합하며, 헬리카아제(helicase) 활성을 보유한다. 이들은 p40 프로모터로부터의 전사를 상향조절하지만, 두 가지 p5 및 p19 프로모터로부터의 전사는 모두 하향조절한다.

본원에 사용된 "rep 유전자"라는 용어는, 야생형 rep 유전자와 이의 유도체, 및 동등한 기능을 가진 인공 rep 유전자를 포함한다.

하나의 구현예에서, rep 유전자는 기능성 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 단백질을 인코딩한다.

이러한 구현예의 바람직한 예에서, Rep78 및 Rep68은 5'를 Rep78 및 Rep68 ATG 개시 코돈에 도킹하는 리보솜에 의해 번역되어, 이러한 단백질 둘 모두의 생산을 가능하게 한다. 이러한 예에서, Rep78 및 Rep68 오픈 리딩 프레임은 Rep52 및 Rep40 둘 모두의 발현을 제공하는 활성 p40 프로모터를 함유한다.

본 발명의 일부 구현예에서, p5, p19 및 p40 프로모터 중 하나 이상의 기능은, 예를 들어 코돈 변화 및/또는 TATA 박스의 제거에 의해 제거/불능화되어, 프로모터로부터의 원하지 않는 전사의 개시를 방지한다.

바람직하게는, p5 프로모터는 비(非)기능성이다(즉, 전사를 개시하는 데 사용될 수 없음). 더욱 바람직하게는, p5 프로모터는 IRES로 대체된다(따라서, p5 프로모터의 기능을 제거함). 이는, Rep78 또는 Rep68을 cap 유전자와 동일한 mRNA에서 전사될 수 있게 하지만, Rep78 및 Rep68 단백질의 번역은 IRES의 제어 하에 있을 것이다.

p5 프로모터 제거의 추가의 이점은, 야생형 바이러스에서, p5 프로모터가 E2A DNA 결합 단백질(DBP)에 의해 결합 및 활성화된다는 점이다. 따라서, p5 프로모터의 제거는, E2A 유전자가 (예를 들어 헬퍼 플라스미드에서) 바이러스 입자를 생산하는 데 필요하지 않다는 것을 의미한다.

하나의 구현예에서, rep 유전자는 업스트림에 p5 프로모터가 없다. 또 다른 구현예에서, p5 프로모터는 AAV 패키징에 사용되지 않는다.

바람직하게는, rep 유전자 내 p19 프로모터는 기능성이다.

일부 구현예에서, p40 프로모터의 기능은 하나 이상의 코돈 변화에 의해 Rep 유전자 내에서 제거/불활성화된다.

cap 유전자는 바람직하게는 재배치되며, 이의 전사는 대안적인 프로모터(예를 들어, CMV 전초기(immediate early) 프로모터)의 제어 하에 놓인다.

상이한 Rep 단백질 기능 사이에는 어느 정도 중복성이 존재하므로, 본 발명의 일부 구현예에서, 모든 Rep 단백질이 필요한 것은 아니다.

일부 구현예에서, rep 유전자는 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 중 1개, 2개, 3개 또는 4개만, 바람직하게는 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 중 1개, 2개 또는 4개만 인코딩한다.

일부 구현예에서, rep 유전자는 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 중 하나 이상을 인코딩하지 않는다.

일부 구현예에서, rep 유전자는 Rep78 및 Rep52를 인코딩하지만, Rep68 또는 Rep40은 인코딩하지 않는다. 이러한 구현예에서, 스플라이스 공여체 부위는 DNA에 남아있지만, 5' 및 3' 스플라이스 수용체 부위는 모두 제거된다. 따라서, 인트론은 스플라이싱에 의해 제거될 수 없으며, 전사는 Rep78 및 Rep52에 대한 종결자 서열(둘 모두에 대하여 공통임)까지 계속된다. Rep78 단백질은 동일한 mRNA에서 cap 유전자로서 전사되며(따라서, 동일한 프로모터에 의해 구동됨), Rep78의 번역은 IRES에 의해 구동된다. Rep52의 전사는 p19 프로모터에 의해 구동되므로, 이는 별개의 mRNA를 형성하고, 리보솜에서 5' m⁷G cap-의존적 도킹에 의해 번역된다. 따라서, 이러한 구현예에서 Rep68 및 Rep40은 생산될 수 없다.

다른 구현예에서, rep 유전자는 Rep68 및 Rep40을 인코딩하지만, Rep78 또는 Rep52는 인코딩하지 않는다. 이러한 구현예에서, 스플라이스 공여체와 3' 스플라이스 수용체 사이의 인트론 서열은 DNA 수준에서 제거되어, 업스트림 코딩 서열을 갖는 프레임에 Rep68 및 Rep40의 C 말단을 배치한다. 따라서, Rep68 및 Rep40(Rep78 및 Rep52는 아님)이 생산된다. 명확성을 위해, Rep68은 동일한 mRNA에서 Cap 단백질로서 전사되며, IRES의 제어 하에서 번역된다. 대조적으로, Rep40은 p19 프로모터에 의해 별개의 mRNA로 전사되며, 리보솜에서 5' m⁷G cap 도킹에 의해 번역된다.

일부 구현예에서, rep 유전자는 Rep78 및 Rep68을 인코딩하지만, Rep52 또는 Rep40은 인코딩하지 않는다. 이는 p19 프로모터를 돌연변이화시킴으로써(예를 들어, p19 TATA 박스에 돌연변이를 삽입함) 달성될 수 있다.

일부 구현예에서, rep 유전자는 Rep52 및 Rep40을 인코딩하지만, Rep78 또는 Rep68은 인코딩하지 않는다. 이는 Rep52/40의 ATG로부터 코딩 서열만을 포함시킴으로써 달성될 수 있다.

상기 사용된 "인코딩한다"라는 용어는, rep 유전자가 Rep 단백질의 기능적 형태를 인코딩한다는 것을 의미한다. 유사하게, "인코딩하지 않는다"라는 용어는, rep 유전자가 Rep 단백질의 기능적 형태를 인코딩하지 않는다는 것을 의미한다.

충분한 Rep 단백질의 부재 하에서는, 패키징될 ITR 플라스미드가 더 적고, 효과적으로 패키징될 수 없다는 사실로 인해, 더 낮은 역가(예를 들어, 게놈 카피)가 관찰될 수 있다(이는 qPCR에 의해 결정될 수 있음). 관찰은 또한 과장된 빈(empty):가득찬(full) 입자비를 포함할 수 있으며, 이는 ELISA 또는 광학 밀도 측정에 의해 결정될 수 있다.

야생형 AAV(혈청형 2) rep 유전자 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 제시되어 있다. 야생형 AAV(혈청형 2) Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 아미노산 서열은, 각각, 서열번호 2, 3, 4 및 5에 제시되어 있다. Rep78을 인코딩하는 야생형 AAV(혈청형 2) 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6에 제시되어 있다. Rep68을 인코딩하는 야생형 AAV(혈청형 2) 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7에 제시되어 있다. Rep52를 인코딩하는 야생형 AAV(혈청형 2) 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8에 제시되어 있다. Rep40을 인코딩하는 야생형 AAV(혈청형 2) 뉴클레오티드 서열은 서열번호 9에 제시되어 있다.

하나의 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 폴리펩티드 중 하나 이상을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

또 다른 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, 서열번호 6과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 기능성 Rep78 및/또는 Rep52 폴리펩티드를 인코딩하는 (바람직하게는 기능성 Rep68 또는 Rep40 폴리펩티드를 인코딩하지 않는) 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

또 다른 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, 서열번호 7과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 기능성 Rep68 및/또는 Rep40 폴리펩티드를 인코딩하는 (바람직하게는 기능성 Rep78 또는 Rep52 폴리펩티드를 인코딩하지 않는) 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

또 다른 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, 서열번호 8과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 기능성 Rep52 폴리펩티드를 인코딩하는 (바람직하게는 기능성 Rep78 폴리펩티드를 인코딩하지 않는) 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

또 다른 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, 서열번호 9와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 기능성 Rep40 폴리펩티드를 인코딩하는 (바람직하게는 기능성 Rep68 폴리펩티드를 인코딩하지 않는) 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

또 다른 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, 서열번호 2와 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 기능성 Rep78 및/또는 Rep52 폴리펩티드를 인코딩하는 (바람직하게는 기능성 Rep68 또는 Rep40 폴리펩티드를 인코딩하지 않는) 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

또 다른 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, 서열번호 3과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 기능성 Rep68 및/또는 Rep40 폴리펩티드를 인코딩하는 (바람직하게는 기능성 Rep78 또는 Rep52 폴리펩티드를 인코딩하지 않는) 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

또 다른 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, 서열번호 4와 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 기능성 Rep52 폴리펩티드를 인코딩하는 (바람직하게는 기능성 Rep78 폴리펩티드를 인코딩하지 않는) 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

또 다른 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, 서열번호 5와 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 기능성 Rep40 폴리펩티드를 인코딩하는 (바람직하게는 기능성 Rep68 폴리펩티드를 인코딩하지 않는) 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 기능성 Rep78 폴리펩티드를 인코딩하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 기능성 Rep68 폴리펩티드를 인코딩하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 기능성 Rep52 폴리펩티드를 인코딩하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 기능성 Rep40 폴리펩티드를 인코딩하지 않는다.

핵산 분자는 또한 cap 유전자를 포함한다. 본원에 사용된 "cap 유전자"라는 용어는, 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 인코딩하는 유전자로서, 상기 ORF가 각각 AAV Cap 구조 단백질, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 유전자를 나타낸다. 이러한 AAV Cap 구조 단백질(또는 이의 변이체 또는 유도체)은 AAV 캡시드를 형성한다.

3가지 Cap 단백질은 적합한 세포를 감염시킬 수 있는 감염성 AAV 바이러스 입자의 생산을 가능하게 하는 기능을 해야 한다. 3가지 Cap 단백질은 VP1, VP2 및 VP3이며, 이의 크기는, 각각, 일반적으로 87kDa, 72kDa 및 62kDa이다. 따라서, cap 유전자는 3가지 Cap 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 인코딩하는 유전자이다.

야생형 AAV에서, 이러한 3가지 단백질은 p40 프로모터로부터 번역되어 단일 mRNA를 형성한다. 이러한 mRNA가 합성된 후, 길거나 짧은 인트론이 절단되어, 2.3 kb 또는 2.6 kb mRNA의 형성을 유도할 수 있다.

통상적으로, 특히 아데노바이러스의 존재 하에서, 긴 인트론이 절단된다. 이러한 형태에서, VP1 단백질의 합성이 시작되는 제1 AUG 코돈이 절단되어, VP1 단백질 합성의 전체적인 수준이 감소된다. 남아있는 제1 AUG 코돈은 VP3 단백질에 대한 개시 코돈이다. 하지만, 동일한 오픈 리딩 프레임에서 상기 코돈의 업스트림에는, 최적의 코작(Kozak) 맥락으로 둘러싸인 ACG 서열(트레오닌을 인코딩함)이 있다. 이는, VP1과 같이, 사실상 부가적인 N 말단 잔기를 갖는 VP3 단백질인, VP2 단백질의 낮은 수준의 합성에 기여한다.

긴 인트론이 스플라이싱되는 경우, 주요 스플라이스에서 ACG 코돈은 훨씬 약한 번역 개시 신호이기 때문에, AAV 구조 단백질이 생체내에서 합성되는 비는 약 1:1:10이며, 이는 성숙 바이러스 입자에서와 동일하다. VP1 단백질의 N-말단에 있는 고유한 단편은 포스포리파아제 A2(PLA2) 활성을 보유하는 것으로 나타났는데, 이는 아마도 후기 엔도좀으로부터 AAV 입자를 방출시키는 데 필요할 것이다.

AAV 캡시드는 1:1:10의 비로 정이십면체 대칭으로 배열되어 있는 60개의 캡시드 단백질 서브유닛(VP1, VP2 및 VP3)으로 구성되며, 추정 크기는 3.9 MDa이다.

본원에 사용된 "cap 유전자"라는 용어는, 야생형 cap 유전자와 이의 유도체, 및 동등한 기능을 가진 인공 cap 유전자를 포함한다. AAV(혈청형 2) cap 유전자 뉴클레오티드 서열 및 Cap 폴리펩티드 서열은, 각각, 서열번호 10 및 11에 제시되어 있다.

본원에 사용된 "cap 유전자"라는 용어는, 바람직하게는 서열번호 10에 제시된 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 11을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 서열번호 10과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖거나 서열번호 11을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖고, VP1, VP2 및 VP3 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

rep 및 cap 유전자는 바람직하게는 바이러스 유전자이거나, 바이러스 유전자에서 유도된다. 더욱 바람직하게는, 이는 AAV 유전자이거나, AAV 유전자에서 유도된다. 일부 구현예에서, AAV는 아데노 관련 디펜도파르보바이러스(dependoparvovirus) A이다. 다른 구현예에서, AAV는 아데노 관련 디펜도파르보바이러스 B이다.

11가지 상이한 AAV 혈청형이 공지되어 있다. 공지된 혈청형은 모두 여러가지 다양한 조직 유형으로부터의 세포를 감염시킬 수 있다. 조직 특이성은 캡시드 혈청형에 의해 결정된다. AAV는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, AAV는 혈청형 1, 2, 5, 6, 7 또는 8이다. 가장 바람직하게는, AAV는 혈청형 2(즉, AAV2)이다.

rep 및 cap 유전자(및 그 안에 각각의 단백질-인코딩 ORF)는 1종 이상의 상이한 바이러스(예를 들어 2, 3 또는 4종의 상이한 바이러스)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, rep 유전자는 AAV2로부터 유래될 수 있는 반면, cap 유전자는 AAV5로부터 유래될 수 있다. 당업자는, AAV의 rep 및 cap 유전자가 계통군(clade) 및 단리체(isolate)에 따라 달라진다는 것을 알고 있다. 모든 이러한 계통군 및 단리체로부터의 이러한 유전자, 및 이의 유도체의 서열이 본원에 포함된다.

cap 유전자와 rep 유전자는 5'→ 3' 방향으로 이러한 순서대로 핵산에 존재한다. 하지만, Rep52 및/또는 Rep40이 그 자체의 p19 프로모터로부터 전사될 수 있기 때문에, Rep52 및/또는 Rep40을 인코딩하는 코딩 서열의 위치는 달라질 수 있다. 예를 들어, Rep52 및/또는 Rep40을 인코딩하는 코딩 서열은 Rep78/68을 인코딩하는 cap 유전자와 rep 유전자의 업스트림 또는 다운스트림에, 또는 실제로 본 발명의 핵산의 역방향 가닥 또는 상이한 핵산에 위치할 수 있다.

cap 및 rep 유전자는 모두 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 프로모터는 바람직하게는 cap 및 rep 유전자의 5'(즉, 업스트림)에 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 유도성 또는 억제성이다.

구성적 프로모터의 예에는, CMV, SV40, PGK(인간 또는 마우스), HSV TK, SFFV, 유비퀴틴, 신장 인자 알파, CHEF-1, FerH, Grp78, RSV, 아데노바이러스 E1A, CAG 또는 CMV-베타-글로빈 프로모터, 또는 이들로부터 유도된 프로모터가 포함된다. 바람직하게는, 프로모터는 인간 세포 및 인간 세포주(예를 들어, HEK-293 세포)에서 시토메갈로바이러스(CMV) 전초기 프로모터, 또는 이로부터 유도된 프로모터, 또는 CMV 프로모터와 비교하여 동일하거나 증가된 강도를 갖는 프로모터이다.

일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 또는 억제성 조절(프로모터) 요소를 포함하는 것에 따라 유도성 또는 억제성이다. 예를 들어, 프로모터는 독시시클린(doxycycline), 테트라시클린(tetracycline), IPTG 또는 락토오스로 유도 가능한 것일 수 있다.

바람직하게는, 유도성 프로모터 요소는 Tet 억제자(repressor) 단백질(TetR)이 결합할 수 있는 복수의 Tet 작동자(operator) 서열을 포함한다. 결합된 상태에서, 전사의 엄격한 억제가 얻어진다. 하지만, 독시시클린(또는 덜 바람직하게는, 테트라시클린)의 존재 하에서, 억제가 완화되어, 프로모터가 완전한 전사 활성을 얻을 수 있게 한다. 이러한 유도성 프로모터 요소는 바람직하게는 또 다른 프로모터, 예를 들어 CMV 프로모터의 다운스트림에 위치한다.

TetR 결합 부위는 야생형 서열을 가질 수 있으며, 이들 중 다수는 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, TetR 결합 부위는 미미한 서열 변화를 통합함으로써 하나 이상의 개선을 거쳐왔다. 본 발명의 일 구현예에 사용될 수 있는 바람직한 버전은, 서열 tccctatcagtgatagaga (서열번호 12)를 갖는다.

TetR 억제자 단백질이 사용된 TetR 결합 서열 변이체에 결합하는 한, TetR 단백질 또는 TetR 단백질의 유도체를 결합시키는 억제자 요소의 대안적인 버전이 또한 본 발명의 일 구현예에 사용될 수 있다. 일부 억제자/결합 부위 변이체는 서로 야생형 친화성보다 더 높을 것이며; 이는 본 발명의 일 구현예에서 바람직하다.

TetR 유전자는 일반적으로 인간(숙주) 세포의 염색체로 통합될 것이다. 상기 유전자는 cap 또는 rep 유전자에 인접하게 또는 이와 함께 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, TetR 유전자는 cap 유전자 또는 rep 유전자와 동시 발현된다.

본 발명의 하나의 구현예에서, TetR 단백질의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 13에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖고 TetR 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, TetR 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖고 TetR 단백질을 인코딩하는 아미노산 서열이다.

바람직하게는, cap 및 rep 유전자와 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터는 CMV 전초기 프로모터 또는 이의 유도체이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 프로모터는 WO2017/149292에 정의된 바와 같은 프로모터(더욱 바람직하게는, 상기 문헌에 "p565"로서 정의된 프로모터)이다. 바람직하게는, cap 및 rep 유전자와 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터는 AAV 프로모터가 아니며, 예를 들어 AAV p5, p19 또는 p40 프로모터가 아니다.

cap 유전자의 번역은 바람직하게는 mRNA의 5' 말단에서 표준 5' m⁷G-cap으로부터 개시된다.

rep 유전자는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES)와 작동 가능하게 연결되어 있다. IRES는 rep mRNA의 번역을 조절한다. IRES는 cap-의존적 번역으로 공지된 과정에서 진핵생물 리보솜을 mRNA에 동원할 수 있는 핵산 분자의 별개의 영역이다. IRES는 통상적으로 RNA 바이러스의 5'-UTR에 위치한다. 이는 cap-의존적 방식으로 바이러스 RNA의 번역을 용이하게 한다.

바이러스 IRES의 예에는, 피코르나바이러스(Picornavirus) IRES(뇌심근염 바이러스, EMCV IRES), 아프토바이러스 IRES(구제역 바이러스, FMDV IRES), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 관련 헤르페스 바이러스 IRES, 간염 A IRES, 간염 C IRES, 페스티바이러스(Pestivirus) IRES, 크리파바이러스(Cripavirus) 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 로팔로시품 파디(Rhopalosiphum padi) 바이러스 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 전초기 전사체(IRES) 1의 1.8-kb 패밀리에서 5'-리더(Leader) IRES 및 시스트론간 IRES가 포함된다.

본 발명은 또한 진핵생물 리보솜을 mRNA에 동원하는 능력을 보유하는 상기 IRES의 비(非)천연 유도체를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, IRES는 뇌심근염 바이러스(EMCV) IRES이다. 본 발명의 하나의 구현예에서, EMCV IRES의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖고 IRES를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

다른 구현예에서, IRES는 구제역 바이러스(FMDV) IRES이다. 본 발명의 하나의 구현예에서, FMDV IRES의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖고 IRES를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

rep 유전자는 IRES와 작동 가능하게 연결되어 있다. 바람직하게는, IRES는 cap 유전자의 다운스트림과 Rep 78/68에 대한 번역 개시 부위의 업스트림에 위치한다.

포유류 배양에서 안정한 세포주의 생산은 전형적으로 임의의 외인적으로 부가된 DNA를 함유하는 세포의 성장을 촉진시키기 위한 선별 방법을 필요로 한다.

바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 부가적으로 선별 유전자 또는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 이를 위하여, 특정 화합물을 인코딩하는 DNA가 포유류 세포 게놈에 삽입될 때 특정 화합물에 대한 내성을 제공하는 다양한 유전자가 공지되어 있다.

바람직하게는, 선별 유전자는 퓨로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라아제(Puro), 히그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(Hygro), 블라스티시딘 데아미나아제(Blast), 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(Neo), 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GS), 제오신 내성 유전자(Sh ble) 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR)이다. 이러한 유전자는 각각 포유류 세포에 대한 독성이 있는 것으로 공지된 소분자에 대한 내성을 제공하거나, GS의 경우, 성장 배지 내 글루타티온의 부재 하에서 세포가 글루타티온을 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 내성 유전자는 Puro이다. 이러한 유전자는 통상의 조직 배양에 사용되는 다수의 세포주가 Puro에 대한 내성이 없기 때문에 특히 효과적이며; Neo의 경우에, 연구자들에 의한 이전 유전 조작으로 인해 다수, 특히 HEK 293 유도체가 이미 Neo에 대한 내성이 있다고 말할 수는 없다(예를 들어 HEK 293T 세포). Puro 선별은 또한 짧은 시간 범위(72 시간 미만)에 걸쳐 독성이 존재하는 이점을 갖기 때문에, 변수를 신속하게 시험할 수 있으며, 게놈에 삽입되는 외인성 DNA를 보유하지 않는 세포를 배양 시스템으로부터 신속하게 제거할 수 있다. 이는 독성이 훨씬 느리게 개시되는 Hygro와 같은 일부 다른 선별 방법에도 해당된다고 할 수 없다.

선별 유전자(예를 들어, Puro)를 사용하여 안정한 세포주를 생성하기 위해서는 내성 유전자가 세포에서 발현되어야 한다. 이는, 비제한적으로, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 2A 절단 시스템, 대안적인 스플라이싱 및 전용 프로모터를 포함하는 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 선별 유전자는 전용 프로모터로부터 발현될 것이다. 이러한 프로모터는 바람직하게는 rep 또는 cap 유전자를 구동시키는 전용 프로모터보다 낮은 수준으로 인간 세포에서 전사될 것이다.

폴리펩티드 또는 RNA를 인코딩하는 핵산 분자에서 각각의 유전자는, 바람직하게는 1종 이상의 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 있을 것이다. 이는, 폴리펩티드 또는 RNA가 목적하는 시간에 목적하는 수준으로 발현된다는 것을 보장한다. 이러한 맥락에서, "조절 요소"라는 용어는, 인핸서(enhancer), 프로모터, 인트론, polyA, 절연인자(insulator) 또는 종결자 중 1종 이상을 포함한다.

본원에 개시된 AAV 플라스미드 또는 벡터에 사용되는 유전자는 바람직하게는 다른 유전자에 대한 전사 판독을 최소한으로 유지시키기 위한 노력으로 polyA 신호 및/또는 절연인자에 의해 분리된다.

하나 초과의 폴리펩티드 또는 RNA-인코딩 뉴클레오티드 서열을 갖는 동일한 조절 요소(예를 들어, 프로모터 서열)의 카피를 사용함으로써 (이의 동조적 발현의 관점에서) 일부 이점이 얻어질 수 있지만, 본 발명의 맥락에서, 각각의 폴리펩티드 또는 RNA-인코딩 뉴클레오티드 서열을 갖는 상이한 조절 요소를 사용하는 것이 매우 바람직하다.

따라서, 바람직하게는, rep 및 cap 유전자는 상이한 조절 요소, 예를 들어 상이한 프로모터, 상이한 인트론, 상이한 polyA, 상이한 절연인자 및/또는 상이한 종결자 서열과 작동 가능하게 연결되어 있다. 더욱 바람직하게는, rep 프로모터와 cap 프로모터 사이의 뉴클레오티드 서열 동일성의 정도는 95% 미만 또는 90% 미만, 더욱 바람직하게는 85%, 80%, 70% 또는 60% 미만이다. 더욱 바람직하게는, rep 종결자와 cap 종결자 사이의 뉴클레오티드 서열 동일성의 정도는 95% 미만 또는 90% 미만, 더욱 바람직하게는 85%, 80%, 70% 또는 60% 미만이다. 이러한 방식으로, 이러한 조절 요소들 사이의 동종 재조합의 위험이 감소된다.

본 발명의 핵산 분자는, 대부분의 구현예에서, AAV의 생산에 유용한 플라스미드 또는 벡터일 것이다. 따라서, 대부분의 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자(또는 이를 포함하는 벡터 또는 플라스미드)는 역방위 말단 반복(ITR)을 포함하지 않을 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자(또는 이를 포함하는 벡터 또는 플라스미드)는 아데노바이러스 E1A, E1B, E4, E2A 또는 VA로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하지 않을 것이다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자(또는 이를 포함하는 벡터 또는 플라스미드 또는 플라스미드 시스템)는 아데노바이러스 E2A 유전자를 포함하지 않는다. 본원에 사용된 "E2A" 또는 "E2A 유전자"라는 용어는, 바이러스 E2A 유전자, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 나타낸다. 바람직하게는, E2A 유전자는 인간 아데노바이러스, 예를 들어 Ad5에서 유래되거나, 이로부터 유도된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 아데노바이러스 E2A 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 17에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖고, 바이러스 DNA 복제의 신장을 돕는 DNA-결합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터가 제공된다.

본 발명의 바람직한 구현예의 예는, 하기 요소를 하기의 순서대로 포함하는 핵산 분자를 포함한다:

CMV 프로모터 - AAV2 cap 유전자 - FMDV IRES - rep 유전자

p565 프로모터 - AAV2 cap 유전자 - EMCV IRES - rep 유전자

CMV 프로모터 - AAV2 cap 유전자 - EMCV IRES - rep 유전자

일부 바람직한 구현예에서, "rep 유전자"는 Rep78, Rep52, Rep68 및 Rep40 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 나타낸다. 다른 바람직한 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, Rep78 및 Rep52 폴리펩티드를 인코딩하는 (바람직하게는 기능성 Rep68 또는 Rep40 폴리펩티드를 인코딩하지 않는) 유전자를 나타낸다.

2개의 아미노산 또는 핵산 서열을 정렬시키는 데 이용 가능한 다수의 확립된 알고리즘이 존재한다. 전형적으로, 하나의 서열은 시험 서열과 비교할 수 있는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘은 설계된 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 아미노산 또는 핵산 서열의 정렬은, 예를 들어 컴퓨터 구현 알고리즘(예를 들어 GAP, BESTFIT, FASTA 또는 TFASTA), 또는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘에 의해 수행될 수 있다.

아미노산 서열 동일성 및 뉴클레오티드 서열 동일성 백분율은 BLAST 정렬 방법([Altschul et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; 및 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)을 사용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 표준 또는 디폴트(default) 정렬 파라미터가 사용된다.

표준 단백질-단백질 BLAST(blastp)는 단백질 데이터베이스에서 유사한 서열을 찾는 데 사용될 수 있다. 다른 BLAST 프로그램과 같이, blastp는 유사한 영역을 찾도록 설계되어 있다. 서열 유사성이 전체 서열에 걸쳐 있는 경우, blastp는 또한 전체 정렬을 보고할 것이며, 이는 단백질 동정을 위한 바람직한 결과이다. 바람직하게는, 표준 또는 디폴트 정렬 파라미터가 사용된다. 일부 경우에, "저복잡도 필터(low complexity filter)"가 제거될 수 있다.

BLAST 단백질 검색은 또한 BLASTX 프로그램(스코어=50, 단어길이=3)을 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST(BLAST 2.0)가 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI-BLAST(BLAST 2.0)는 분자들 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하는 데 사용될 수 있다. (Altschul et al. (1997), 상기 참조). BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST를 이용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.

뉴클레오티드 서열 비교와 관련하여, 이러한 목적을 달성하기 위해 MEGABLAST, 불연속-megablast 및 blastn이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 표준 또는 디폴트 정렬 파라미터가 사용된다. MEGABLAST는 특히 매우 유사한 서열 사이의 긴 정렬을 효율적으로 찾도록 설계되어 있다. 불연속 MEGABLAST는 본 발명의 핵산과 유사하지만, 동일하지는 않은 뉴클레오티드 서열을 찾는 데 사용될 수 있다.

BLAST 뉴클레오티드 알고리즘은 쿼리(query)를 단어라고 불리는 짧은 하위서열로 분해함으로써 유사한 서열을 찾는다. 상기 프로그램은 먼저 쿼리 단어에 정확히 일치하는 것(단어 명중)을 식별한다. 이어서, BLAST 프로그램은 이러한 단어 명중을 다수의 단계로 확장하여, 최종 갭이 있는 정렬을 생성한다. 일부 구현예에서, BLAST 뉴클레오티드 검색은 BLASTN 프로그램(스코어=100, 단어길이=12)을 이용하여 수행될 수 있다.

BLAST 검색의 민감도를 제어하는 중요한 파라미터 중 하나는 단어 크기이다. blastn이 MEGABLAST보다 더 민감한 가장 중요한 이유는, 더 짧은 디폴트 단어 크기(11)를 사용한다는 점이다. 이로 인해, blastn은 다른 유기체로부터의 관련 뉴클레오티드 서열에 대한 정렬을 찾는 데 있어서 MEGABLAST보다 우수하다. 단어 크기는 blastn에서 조정 가능하며, 검색 민감도를 증가시키기 위해 디폴트 값에서 최소 7로 감소시킬 수 있다.

새로 도입된 불연속 megablast 웹 페이지(www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/FallWinter02/blastlab.html)를 사용하여 더 민감한 검색이 달성될 수 있다. 이러한 웹 페이지는 Ma 등에 의해 보고된 바([Bioinformatics. 2002 Mar; 18(3): 440-5])와 유사한 알고리즘을 사용한다. 불연속 megablast는, 정렬 확장을 위한 근원으로서 정확한 단어 일치를 필요로 하는 것이 아니라, 더 긴 범위의 템플릿 내에서 비(非)연속적인 단어를 사용한다. 코딩 방식에서, 제3 위치에서의 불일치를 무시하면서, 제1 및 제2 코돈 위치에서 일치를 찾는 것에 초점을 맞추어 제3 베이스 워블링(wobbling)을 고려한다. 동일한 단어 크기를 사용하는 불연속 MEGABLAST에서의 검색은 동일한 단어 크기를 사용하는 표준 blastn보다 더 민감하고 효율적이다. 불연속 megablast에 고유한 파라미터는 하기와 같다: 단어 크기: 11 또는 12; 템플릿: 16, 18 또는 21; 템플릿 유형: 코딩 (0), 비(非)코딩 (1) 또는 둘 모두 (2).

일부 구현예에서, 디폴트 파라미터를 사용하여 BLASTP 2.5.0+ 알고리즘(예컨대, NCBI로부터 입수 가능한 것)을 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 존재(Existence) 11 및 연장(Extension) 1의 갭 비용을 갖는 2개의 단백질 서열의 니들만-브니쉬(Needleman-Wunsch) 정렬을 사용하여 BLAST 전체 정렬 프로그램(예컨대, NCBI로부터 입수 가능한 것)을 사용할 수 있다.

재조합 AAV의 생산을 위한 하나의 방법은, AAV 생산에 필요한 모든 요소를 숙주 세포, 예컨대 HEK293 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키는 것을 기반으로 한다. 이는 일반적으로 하기 3가지 플라스미드로 AAV 생산 세포를 동시 트랜스펙션시키는 것을 포함한다:

(a) 관심 유전자를 보유하는, AAV ITR-함유 플라스미드;

(b) AAV rep-cap 유전자를 보유하는 플라스미드; 및

(c) 아데노바이러스로부터 단리된 필수 헬퍼 유전자를 제공하는 플라스미드.

일부 경우에, 헬퍼 유전자(및 발현 가능한 형태)는 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되기 때문에; 플라스미드(c)는 필요하지 않다.

따라서, 본 발명은 하기 (a)와, (b) 및 (c) 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다:

(a) 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터;

(b) ITR이 측면에 있는 전이유전자를 포함하는 AAV 전달 플라스미드;

(c) 아데노바이러스 E1A, E1B, E4 및 VA로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드.

본 발명의 일부 구현예에서, 헬퍼 플라스미드는 부가적으로 E2A 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 헬퍼 플라스미드는 E2A 유전자를 포함하지 않는다. 후자의 경우, E2A 유전자의 생략은 헬퍼 플라스미드에서 필요한 DNA의 양을 상당히 감소시킨다.

본 발명은 또한, 하기 (a)와, (b) 및 (c) 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다:

(a) 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터;

(c) 숙주 세포 게놈으로부터 발현 가능한 E1A, E1B, E4 및 VA로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스 유전자를 포함하는 포유류 숙주 세포(예를 들어 HEK293).

본 발명의 일부 구현예에서, 포유류 숙주 세포는 부가적으로 숙주 세포 게놈으로부터 발현 가능한 E2A 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 포유류 숙주 세포는 아데노바이러스 E2A 유전자를 포함하지 않는다.

키트는 또한 AAV 입자의 정제를 위한 물질, 예컨대 바이러스 입자의 밀도 밴드 형성 및 정제에 관여하는 것들, 예를 들어 원심분리 튜브, 요오딕사놀(Iodixanol), 투석 완충액 및 투석 카세트 중 하나 이상을 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자, 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 포유류 세포를 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 포유류 세포의 핵 게놈에 안정적으로 통합되거나, 세포 내 벡터 또는 플라스미드 (예를 들어 에피솜) 내에 존재할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 포유류 세포의 핵 게놈에 안정적으로 통합된다(여기서 rep 및 cap 유전자는 이로부터 발현 가능함).

상기 세포는 단리된 세포일 수 있으며, 예를 들어 이들은 살아있는 동물 또는 포유류에 존재하지 않는다. 포유류 세포의 예에는, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 원숭이, 토끼, 당나귀, 말, 양, 소 및 유인원의 임의의 기관 또는 조직에서 유래된 것들이 포함된다. 바람직하게는, 상기 세포는 인간 세포이다. 상기 세포는 1차 또는 불멸화된(immortalised) 세포일 수 있다.

바람직한 세포에는, HEK-293, HEK 293T, HEK-293E, HEK-293FT, HEK-293S, HEK-293SG, HEK-293FTM, HEK-293SGGD, HEK-293A, MDCK, C127, A549, HeLa, CHO, 마우스 골수종, PerC6, 911 및 Vero 세포주가 포함된다. HEK-293 세포는 E1A 및 E1B 단백질을 함유하도록 변형되며, 이는 이러한 단백질을 헬퍼 플라스미드 상에 공급해야 할 필요성을 없앤다. 유사하게, PerC6 및 911 세포는 유사한 변형을 함유하며, 또한 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 인간 세포는 HEK293, HEK293T, HEK293A, PerC6 또는 911이다. 다른 바람직한 세포에는, CHO 및 VERO 세포가 포함된다.

바람직하게는, 본 발명의 세포는 rep 및 cap 유전자를 유도성으로 발현시킬 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 본 발명의 핵산 분자와, 선택적으로 (b) ITR이 측면에 있는 전이유전자를 포함하는 AAV 전달 플라스미드, 및 (c) E1A, E1B, E4 및 VA로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, AAV 패키징 세포(packaging cell), 바람직하게는 포유류 세포, 더욱 바람직하게는 인간 세포를 제공한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 헬퍼 플라스미드는 부가적으로 E2A 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 헬퍼 플라스미드는 E2A 유전자를 포함하지 않는다. 후자의 경우, E2A 유전자의 생략은 헬퍼 플라스미드에서 필요한 DNA의 양을 상당히 감소시킨다.

본 발명의 핵산 분자, 플라스미드 및 벡터는 임의의 적합한 기술에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자 및 패키징 세포의 생산을 위한 재조합 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition), Green, MR and Sambrook, J.], (2014년 업데이트됨)).

본 발명의 핵산 분자로부터 rep 및 cap 유전자의 발현은 임의의 적합한 검정으로, 예를 들어 (본원의 실시예에 기재된 바와 같이) qPCR에 의해 1 ml 당 게놈 카피의 수를 분석함으로써 분석될 수 있다.

추가의 구현예에서, AAV 패키징 세포를 생산하는 방법으로서,

(a) 본 발명의 핵산 분자를 포유류 세포에 안정적으로 통합시켜, 바이러스 rep 및 cap 유전자를 발현하는 포유류 세포를 생산하는 단계를 포함하는, AAV 패키징 세포를 생산하는 방법이 제공된다.

본 발명은 또한 AAV 입자의 생산에서의 본 발명의 AAV 패키징 세포의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 AAV를 생산하는 방법으로서,

(a)5'- 및 3'-AAV ITR이 측면에 있는 전이유전자를 포함하는 전달 플라스미드를 AAV 패키징 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 AAV 패키징 세포는 본 발명의 핵산 분자와, 전달 플라스미드를 패키징하는 데 충분한 헬퍼 유전자 (바람직하게는 E1A, E1B, E4 및 VA 중 선택되는 1종 이상)를 포함하고, 헬퍼 유전자는 세포 내 에피솜 헬퍼 플라스미드에 존재하거나, 패키징 세포 게놈에 통합되어 있는 단계;

(b)상기 세포를, AAV가 상기 세포에 의해 조립되고 분비되도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및

(c)상청액으로부터 패키징된 AAV를 수확하는 단계를 포함하는, AAV를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일부 구현예에서, 헬퍼 유전자는 부가적으로 E2A 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 헬퍼 유전자는 E2A 유전자를 포함하지 않는다.

바람직하게는, 수확된 AAV는 이어서 정제된다.

본원에 사용된, 하나 이상의 플라스미드 또는 벡터를 세포에 "도입하는"이라는 용어는, 형질전환, 및 특히 전기천공, 접합, 감염, 형질도입 또는 트랜스펙션 중 임의의 형태를 포함한다.

일부 바람직한 구현예에서, 전이유전자는 CRISPR 효소(예를 들어 Cas9, Cpf1) 또는 CRISPR sgRNA를 인코딩한다.

이러한 도입 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 Aug 1;92 (16):7297-301]).

본원에 제공된 각각의 참조문헌의 개시내용은 구체적으로 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

도 1은, 야생형 AAV 게놈에서 Rep 및 Cap 단백질 유전자의 구성을 보여준다.
도 2a, 2b 및 2c는, 본 발명의 핵산 분자의 3가지 구현예를 보여준다. 도 2b에서, "OXGP3"은, 2개의 Tet 작동자 부위를 갖는 CMV 프로모터 변이체를 나타낸다.
도 3 내지 4는, 다양한 rep-cap 플라스미드로 트랜스펙션된 세포에서 생산된, 1 ml 당 AAV 게놈의 카피 수에 대한 검정 결과를 보여준다. OxG = 멀리 배치된 p5 프로모터를 포함하여 야생형 바이러스에서 발견되는 표준 RepCap 구성; CMV-CMV = Rep 및 Cap 서열이 모두 CMV 프로모터 아래 위치한 구성, 5'→3' 방향으로 순서대로 CMV-Cap-CMV-Rep; CMV-PGK = Rep 및 Cap 서열이, 각각, PGK 및 CMV 프로모터 아래에 위치한 구성, 5'→3' 방향으로 순서대로 CMV-Cap-PGK-Rep; CMV-EMCV = Cap 서열이 CMV 프로모터 아래 위치하고, Rep 서열이 IRES EMCV의 제어 하에 위치한 구성, 5'→3' 방향으로 순서대로 CMV-Cap-EMCV-Rep. 도 4에서, 바이러스를 함유하는 세포 용해물을 500배 희석하고, qPCR을 사용하여 정량화하였다. 이는 물리적 역가를 나타낸다.
도 5는, AAV 입자에 의한 감염 72시간 후 HEK293T 세포의 유세포 분석에 따른 결과를 보여준다. 데이터는 P1에서 GFP 양성 세포의 백분율로 제공된다. P1은 샘플에서 생존 세포에 해당한다.
도 6은, 도 5로부터의 결과와 감염된 세포의 수에 의해 계산된, 감염된 바이러스 샘플 1 ml 당 형질도입 단위를 보여준다. 이는 감염 역가를 나타낸다.
도 7은, 다양한 rep-cap 플라스미드로 트랜스펙션된 세포에서 생산된, 1 ml 당 AAV 게놈의 카피 수에 대한 검정 결과를 보여준다. 플라스미드에 대한 세부사항에 대해서는, 상기 도 3 내지 4를 참조한다. Clontech는 Clontech에서 공급된 3-플라스미드 시스템(pAAV-CMV-EGFP; pHelper; pRepCap-miR342)을 나타낸다.
도 8은, a) 본 발명의 3-플라스미드 AAV 시스템; b) a)의 시스템에서, pSF-헬퍼 플라스미드가 CMV-E4orf6(코딩 서열)만을 함유하는 플라스미드로 대체된 시스템; c) a)의 시스템에서, pSF-헬퍼 플라스미드가 pSF-E4orf6-VAI로 대체된 시스템; 및 d) a)의 시스템에서, pSF-헬퍼 플라스미드가 제거되고, 충전제(stuffer) DNA(대조군)로 대체된 시스템으로부터 생산된 바이러스로부터 수득된 역가(GC, 게놈 카피)를 보여준다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 여기서 달리 언급되지 않는 한, 부(part) 및 백분율은 중량 기준이고, 온도는 섭씨 온도이다. 이러한 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 단지 예시로서 제공된 것이라는 점을 이해해야 한다. 상기 논의 및 하기 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않는 한, 다양한 용도 및 조건에 적합하게 하기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변경이 이루어질 수 있다. 따라서, 본원에 제시 및 기재된 것에 더하여, 본 발명의 다양한 변경이 또한 상기 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변경은 또한 첨부된 청구범위의 범위에 속하는 것으로 의도된다.

실시예 1:AAV cap-rep 플라스미드의 생산

도 2a, 2b 및 2c에 제시된 바와 같은 유전 요소를 갖는 하기 플라스미드를 생산하였다:

pSF-CMV-AAV2Cap-FMDV-AAV2Rep

pSF-CMV-AAV2Cap-EMCV-AAV2Rep

pSF-p565_2xTetO-AAV2Cap-EMCV-AAV2Rep

OxGP3 프로모터는 WO2017/149292에 정의된 바와 같은 p565 프로모터이다. FMDV는 구제역 바이러스 IRES이다. CMV는 시토메갈로바이러스 프로모터이다. AAV2Cap은 아데노 관련 바이러스 2 cap 유전자이다. Rep는 Rep78 및 Rep52만을 인코딩하는 아데노 관련 바이러스 rep 유전자이다.

pSF-AAV-CMV-EGFP

이러한 플라스미드는 2개의 AAV2 ITR 서열이 측면에 있는 CMV 프로모터에 의해 구동되는 EGFP 단백질을 인코딩하여, ITR-CMV-EGFP-ITR 서열을 AAV 캡시드 쉘에 패키징하는 것을 가능하게 한다.

pSF-헬퍼

이러한 플라스미드는 HEK293 세포에서 AAV 생산에 필요한 헬퍼 기능을 제공하기 위해, 아데노바이러스 5 서열 E2A, E4orf6 및 VAI RNA를 함유한다.

pSF-RepCap

이러한 플라스미드는 Rep78/68의 전체적인 발현을 낮추기 위해 p5 프로모터가 제거되어 멀리 배치되어 있는, 야생형 구성의 RepCap 서열을 함유한다.

pSF-CMV-Cap-CMV-Rep78/52

이러한 플라스미드는 CMV에 의해 구동되는 Cap 서열과 CMV 프로모터에 의해 별도로 구동되는 Rep78/52 서열을 함유한다. 이는 2개의 코딩 서열의 동일하게 강한 발현을 제공한다.

pSF-CMV-Cap-PGK-Rep78/52

이러한 플라스미드는 CMV에 의해 구동되는 Cap 서열과 PGK 프로모터에 의해 별도로 구동되는 Rep78/52 서열을 함유하며, 이는 CMV 프로모터보다 낮은 발현을 제공한다.

pSF-CMV-Cap-EMCV-Rep78/52

이러한 플라스미드는 CMV 프로모터에 의해 구동되는 Cap 서열과 IRES EMCV로부터 생산된 Rep78/52 단백질을 함유한다. EMCV는 CMV 프로모터보다 훨씬 낮은 발현 수준을 제공한다.

실시예 2:게놈 카피(GC)의 분석

플라스미드 벡터 pSF-AAV-CMV-EGFP와, pSF-헬퍼와, pSF-RepCap, pSF-CMV-Cap-CMV-Rep78/52, pSF-CMV-Cap-PGK-Rep78/52 또는 pSF-CMV-Cap-EMCV-Rep78/52 중 하나를, 1:1:1의 몰비로, 6-웰 플레이트 내 80% 초과의 합류(confluent) HEK293T 세포에 웰 당 총 2.5 μg의 DNA로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 시약 리포펙타민 2000을 총 DNA 질량 대 리포펙타민 1:2.4의 비로 사용하였다. 전체 웰 내용물을 유세포 분석 및 qPCR 둘 모두에 의한 분석을 위해 48시간 시점에서 수확하였다. 데이터를 용해물 1 ml 당 형질도입 단위(TU) (도 6) 및 용해물 1 ml 당 게놈 카피 (도 3 내지 4)로 표시하였다.

플라스미드 pSF-CMV-Cap-EMCV-Rep78/52를 사용함으로써, 감염 및 물리적 역가가 OxG 양성 대조군에 사용된 야생형 구성에 비해 개선되었다.

도 5는, AAV와 함께 72시간 인큐베이션 후 GFP 양성인 생존 세포의 백분율을 보여준다. 바이러스 용액을 1대 500, 1 대 2500 및 1 대 12500으로 희석하였다. 5 내지 25%의 GFP 양성 세포를 제공하는 희석액을 사용하여, 바이러스 용액 1 ml 당 형질도입 단위를 계산하였다.

실시예 3:

플라스미드 벡터 pSF-AAV-CMV-EGFP와, pSF-헬퍼와, pSF-RepCap, pSF-CMV-Cap-EMCV-Rep78/52 또는 pSF-CMV-Cap-FMDV-Rep78/52 중 하나를, 1:1:1의 몰비로, 6-웰 플레이트 내 70 내지80%의 합류 HEK293T 세포에 웰 당 총 2.5 μg의 DNA로 트랜스펙션시켰다. 이를, 또한 1:1:1 몰비로 총 DNA 질량 2.5 μg으로 트랜스펙션시킨 Clontech 3-플라스미드 시스템(www.clontech.com/GB/Products/Viral_Transduction/AAV_Vector_Systems/Helper_Free_Expression_System?sitex=10030:22372:US)과 함께 수행하였다. 트랜스펙션 시약 리포펙타민 2000을 총 DNA 질량 대 리포펙타민 1:2.4의 비로 사용하였다. 전체 웰 내용물을 유세포 분석 및 qPCR에 의한 분석을 위해 48시간 시점에서 수확하였다. 데이터는 용해물 1 ml 당 게놈 카피로서 제시되어 있으며 (도 7), 여기서 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.

이러한 실험은, pSF-CMV-Cap-EMCV-Rep78/52가 pSF-RepCap 및 Clontech pRepCap-miR342 모두에서 사용된 표준 야생형 구성을 확실히 능가함을 보여준다. 이는 또한, 대안적인 IRES를 사용함으로써, FMDV가 야생형 구성에 비해 바이러스 역가가 증가한다는 것을 입증한다.

실시예 4: E2A를 사용하지 않고 수득된 증강된 역가

본 발명의 AAV 생산 시스템에서 E2A의 존재 또는 부재의 효과를 Ad5 E2A 유전자를 함유하거나 함유하지 않는 일련의 플라스미드를 사용하여 평가하였다.

모든 실험에는 하기 플라스미드가 포함되어 있었다:

(i) 실시예 1에 정의된 바와 같은 pSF-AAV-CMV-EGFP;

(ii) pSF-CMV-Cap-EMCV-Rep. 이러한 플라스미드는 CMV 프로모터에 의해 구동되는 Cap 서열과 EMCV IRES로부터 생산된 Rep 단백질을 함유한다.

상기 (i) 및 (ii)에 더하여, 하기 실험에는 하기 플라스미드가 포함되어 있었다:

a) pSF-헬퍼(이는 Ad5 영역 E2A, E4orf6 및 VA RNA I을 함유함);

b) pSF-나노-CMV-E4orf6(이는 E4orf6 단백질에 대한 코딩 서열만을 함유함);

c) pSF-E4orf6-VA I(이는 전체 E4orf6 영역 및 전체 VA RNA I 서열을 함유함); 및

d) OG10(이는 빈 pSF-CMV-Kan임).

결과는 도 8에 제시되어 있으며, 여기서 실험 a), b), c) 및 d)의 결과는 각각, "OxG Pro", "E4Orf6/Pro", "no E2A" 및 "no Ad5 Help"로 표지되어 (1 ml 당 게놈 카피로서) 제시되어 있다.

상기 결과는, AAV 생산 시스템에서 E2A를 사용하지 않고, 본 발명의 Cap/Rep 플라스미드를 사용함으로써 더 높은 바이러스 역가가 수득될 수 있다는 것을 보여준다.

서열

서열번호 1 - Rep 뉴클레오티드 서열(AAV 혈청형 2)

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서열번호 2 - Rep78 아미노산 서열(AAV 혈청형 2)

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서열번호 3 - Rep68 아미노산 서열(AAV 혈청형 2)

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서열번호 4 - Rep52 아미노산 서열(AAV 혈청형 2)

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서열번호 5 - Rep40 아미노산 서열(AAV 혈청형 2)

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서열번호 6 - Rep78 뉴클레오티드 서열(AAV 혈청형 2)

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서열번호 7 - Rep68 뉴클레오티드 서열(AAV 혈청형 2)

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서열번호 8 - Rep52 뉴클레오티드 서열

CATGGAGCTGGTCGGGTGGctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgaCTGCATCTTTGAACAATAG

서열번호 9 - Rep40 뉴클레오티드 서열

ATGGAGCTGGTCGGGTGGctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacagattggctcgaggacactctctcTAG

서열번호 10 - Cap 뉴클레오티드 서열(AAV 혈청형 2)

CagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaA

서열번호 11 - Cap 아미노산 서열(AAV 혈청형 2)

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*

서열번호 12 - TetR 결합 부위

tccctatcagtgatagaga

서열번호 13 - TetR 단백질의 뉴클레오티드 서열

Atgtcgcgcctggacaaaagcaaagtgattaactcagcgctggaactgttgaatgaggtgggaattgaaggactcactactcgcaagctggcacagaagctgggcgtcgagcagccaacgctgtactggcatgtgaagaataaacgggcgctcctagacgcgcttgccatcgaaatgctggaccgccatcacacccacttttgccccctggagggcgaatcctggcaagattttctgcggaacaatgcaaagtcgttccggtgcgctctgctgtcccaccgcgatggcgcaaaagtgcacctgggcactcggcccaccgagaaacaatacgaaaccctggaaaaccaactggctttcctttgccaacagggattttcactggagaatgccctgtacgcactatccgcggtcggccactttaccctgggatgcgtcctcgaagatcaggagcaccaagtcgccaaggaggaaagagaaactcctaccactgactcaatgcctccgctcctgagacaagccatcgagctgttcgaccaccagggtgctgaacctgcatttctgttcgggcttgaactgattatctgcggcctggagaaacagttgaagtgcgagtcgggatcctag

서열번호 14 - TetR 단백질의 아미노산 서열

MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGS

서열번호 15 - EMCV IRES

CGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCCCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGAC

서열번호 16 - FMDV IRES

AGCAGGTTTCCCCAACTGACACAAAACGTGCAACTTGAAACTCCGCCTGGTCTTTCCAGGTCTAGAGGGGTAACACTTTGTACTGCGTTTGGCTCCACGCTCGATCCACTGGCGAGTGTTAGTAACAGCACTGTTGCTTCGTAGCGGAGCATGACGGCCGTGGGAACTCCTCCTTGGTAACAAGGACCCACGGGGCCAAAAGCCACGCCCACACGGGCCCGTCATGTGTGCAACCCCAGCACGGCGACTTTACTGCGAAACCCACTTTAAAGTGACATTGAAACTGGTACCCACACACTGGTGACAGGCTAAGGATGCCCTTCAGGTACCCCGAGGTAACACGCGACACTCGGGATCTGAGAAGGGGACTGGGGCTTCTATAAAAGCGCTCGGTTTAAAAAGCTTCTATGCCTGAATAGGTGACCGGAGGTCGGCACCTTTCCTTTGCAATTACTGACCAC

서열번호 17 - Ad5 E2A

GGTACCCAACTCCATGCTCAACAGTCCCCAGGTACAGCCCACCCTGCGTCGCAACCAGGAACAGCTCTACAGCTTCCTGGAGCGCCACTCGCCCTACTTCCGCAGCCACAGTGCGCAGATTAGGAGCGCCACTTCTTTTTGTCACTTGAAAAACATGTAAAAATAATGTACTAGAGACACTTTCAATAAAGGCAAATGCTTTTATTTGTACACTCTCGGGTGATTATTTACCCCCACCCTTGCCGTCTGCGCCGTTTAAAAATCAAAGGGGTTCTGCCGCGCATCGCTATGCGCCACTGGCAGGGACACGTTGCGATACTGGTGTTTAGTGCTCCACTTAAACTCAGGCACAACCATCCGCGGCAGCTCGGTGAAGTTTTCACTCCACAGGCTGCGCACCATCACCAACGCGTTTAGCAGGTCGGGCGCCGATATCTTGAAGTCGCAGTTGGGGCCTCCGCCCTGCGCGCGCGAGTTGCGATACACAGGGTTGCAGCACTGGAACACTATCAGCGCCGGGTGGTGCACGCTGGCCAGCACGCTCTTGTCGGAGATCAGATCCGCGTCCAGGTCCTCCGCGTTGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTAGCTGCCTTCCCAAAAAGGGCGCGTGCCCAGGCTTTGAGTTGCACTCGCACCGTAGTGGCATCAAAAGGTGACCGTGCCCGGTCTGGGCGTTAGGATACAGCGCCTGCATAAAAGCCTTGATCTGCTTAAAAGCCACCTGAGCCTTTGCGCCTTCAGAGAAGAACATGCCGCAAGACTTGCCGGAAAACTGATTGGCCGGACAGGCCGCGTCGTGCACGCAGCACCTTGCGTCGGTGTTGGAGATCTGCACCACATTTCGGCCCCACCGGTTCTTCACGATCTTGGCCTTGCTAGACTGCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTTTCGCTCGTCACATCCATTTCAATCACGTGCTCCTTATTTATCATAATGCTTCCGTGTAGACACTTAAGCTCGCCTTCGATCTCAGCGCAGCGGTGCAGCCACAACGCGCAGCCCGTGGGCTCGTGATGCTTGTAGGTCACCTCTGCAAACGACTGCAGGTACGCCTGCAGGAATCGCCCCATCATCGTCACAAAGGTCTTGTTGCTGGTGAAGGTCAGCTGCAACCCGCGGTGCTCCTCGTTCAGCCAGGTCTTGCATACGGCCGCCAGAGCTTCCACTTGGTCAGGCAGTAGTTTGAAGTTCGCCTTTAGATCGTTATCCACGTGGTACTTGTCCATCAGCGCGCGCGCAGCCTCCATGCCCTTCTCCCACGCAGACACGATCGGCACACTCAGCGGGTTCATCACCGTAATTTCACTTTCCGCTTCGCTGGGCTCTTCCTCTTCCTCTTGCGTCCGCATACCACGCGCCACTGGGTCGTCTTCATTCAGCCGCCGCACTGTGCGCTTACCTCCTTTGCCATGCTTGATTAGCACCGGTGGGTTGCTGAAACCCACCATTTGTAGCGCCACATCTTCTCTTTCTTCCTCGCTGTCCACGATTACCTCTGGTGATGGCGGGCGCTCGGGCTTGGGAGAAGGGCGCTTCTTTTTCTTCTTGGGCGCAATGGCCAAATCCGCCGCCGAGGTCGATGGCCGCGGGCTGGGTGTGCGCGGCACCAGCGCGTCTTGTGATGAGTCTTCCTCGTCCTCGGACTCGATACGCCGCCTCATCCGCTTTTTTGGGGGCGCCCGGGGAGGCGGCGGCGACGGGGACGGGGACGACACGTCCTCCATGGTTGGGGGACGTCGCGCCGCACCGCGTCCGCGCTCGGGGGTGGTTTCGCGCTGCTCCTCTTCCCGACTGGCCATTTCCTTCTCCTATAGGCAGAAAAAGATCATGGAGTCAGTCGAGAAGAAGGACAGCCTAACCGCCCCCTCTGAGTTCGCCACCACCGCCTCCACCGATGCCGCCAACGCGCCTACCACCTTCCCCGTCGAGGCACCCCCGCTTGAGGAGGAGGAAGTGATTATCGAGCAGGACCCAGGTTTTGTAAGCGAAGACGACGAGGACCGCTCAGTACCAACAGAGGATAAAAAGCAAGACCAGGACAACGCAGAGGCAAACGAGGAACAAGTCGGGCGGGGGGACGAAAGGCATGGCGACTACCTAGATGTGGGAGACGACGTGCTGTTGAAGCATCTGCAGCGCCAGTGCGCCATTATCTGCGACGCGTTGCAAGAGCGCAGCGATGTGCCCCTCGCCATAGCGGATGTCAGCCTTGCCTACGAACGCCACCTATTCTCACCGCGCGTACCCCCCAAACGCCAAGAAAACGGCACATGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCCGTATTTGCCGTGCCAGAGGTGCTTGCCACCTATCACATCTTTTTCCAAAACTGCAAGATACCCCTATCCTGCCGTGCCAACCGCAGCCGAGCGGACAAGCAGCTGGCCTTGCGGCAGGGCGCTGTCATACCTGATATCGCCTCGCTCAACGAAGTGCCAAAAATCTTTGAGGGTCTTGGACGCGACGAGAAGCGCGCGGCAAACGCTCTGCAACAGGAAAACAGCGAAAATGAAAGTCACTCTGGAGTGTTGGTGGAACTCGAGGGTGACAACGCGCGCCTAGCCGTACTAAAACGCAGCATCGAGGTCACCCACTTTGCCTACCCGGCACTTAACCTACCCCCCAAGGTCATGAGCACAGTCATGAGTGAGCTGATCGTGCGCCGTGCGCAGCCCCTGGAGAGGGATGCAAATTTGCAAGAACAAACAGAGGAGGGCCTACCCGCAGTTGGCGACGAGCAGCTAGCGCGCTGGCTTCAAACGCGCGAGCCTGCCGACTTGGAGGAGCGACGCAAACTAATGATGGCCGCAGTGCTCGTTACCGTGGAGCTTGAGTGCATGCAGCGGTTCTTTGCTGACCCGGAGATGCAGCGCAAGCTAGAGGAAACATTGCACTACACCTTTCGACAGGGCTACGTACGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTCTGCAACCTGGTCTCCTACCTTGGAATTTTGCACGAAAACCGCCTTGGGCAAAACGTGCTTCATTCCACGCTCAAGGGCGAGGCGCGCCGCGACTACGTCCGCGACTGCGTTTACTTATTTCTATGCTACACCTGGCAGACGGCCATGGGCGTTTGGCAGCAGTGCTTGGAGGAGTGCAACCTCAAGGAGCTGCAGAAACTGCTAAAGCAAAACTTGAAGGACCTATGGACGGCCTTCAACGAGCGCTCCGTGGCCGCGCACCTGGCGGACATCATTTTCCCCGAACGCCTGCTTAAAACCCTGCAACAGGGTCTGCCAGACTTCACCAGTCAAAGCATGTTGCAGAACTTTAGGAACTTTATCCTAGAGCGCTCAGGAATCTTGCCCGCCACCTGCTGTGCACTTCCTAGCGACTTTGTGCCCATTAAGTACCGCGAATGCCCTCCGCCGCTTTGGGGCCACTGCTACCTTCTGCAGCTAGCCAACTACCTTGCCTACCACTCTGACATAATGGAAGACGTGAGCGGTGACGGTCTACTGGAGTGTCACTGTCGCTGCAACCTATGCACCCCGCACCGCTCCCTGGTTTGCAATTCGCAGCTGCTTAACGAAAGTCAAATTATCGGTACCTTTGAGCTGCAGGGTCCCTCGCCTGACGAAAAGTCCGCGGCTCCGGGGTTGAAACTCACTCCGGGGCTGTGGACGTCGGCTTACCTTCGCAAATTTGTACCTGAGGACTACCACGCCCACGAGATTAGGTTCTACGAAGACCAATCCCGCCCGCCTAATGCGGAGCTTACCGCCTGCGTCATTACCCAGGGCCACATTCTTGGCCAATTGCAAGCCATCAACAAAGCCCGCCAAGAGTTTCTGCTACGAAAGGGACGGGGGGTTTACTTGGACCCCCAGTCCGGCGAGGAGCTCAACCCAATCCCCCCGCCGCCGCAGCCCTATCAGCAGCAGCCGCGGGCCCTTGCTTCCCAGGATGGCACCCAAAAAGAAGCTGCAGCTGCCGCCGCCACCCACGGACGAGGAGGAATACTGGGACAGTCAGGCAGAGGAGGTTTTGGACGAGGAGGAGGAGGACATGATGGAAGACTGGGAGAGCCTAGACGAGGAAGCTTCCGAGGTCGAAGAGGTGTCAGACGAAACACCGTCACCCTCGGTCGCATTCCCCTCGCCGGCGCCCCAGAAATCGGCAACCGGTTCCAGCATGGCTACAACCTCCGCTCCTCAGGCGCCGCCGGCACTGCCCGTTCGCCGACCCAACCGTAGATGGGACACCACTGGAACCAGGGCCGGTAAGTCCAAGCAGCCGCCGCCGTTAGCCCAAGAGCAACAACAGCGCCAAGGCTACCGCTCATGGCGCGGGCACAAGAACGCCATAGTTGCTTGCTTGCAAGACTGTGGGGGCAACATCTCCTTCGCCCGCCGCTTTCTTCTCTACCATCACGGCGTGGCCTTCCCCCGTAACATCCTGCATTACTACCGTCATCTCTACAGCCCATACTGCACCGGCGGCAGCGGCAGCAACAGCAGCGGCCACACAGAAGCAAAGGCGACCGGATAGCAAGACTCTGACAAAGCCCAAGAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGCAGGAGGAGGAGCGCTGCGTCTGGCGCCCAACGAACCCGTATCGACCCGCGAGCTTAGAAACAGGATTTTTCCCACTCTGTATGCTATATTTCAACAGAGCAGGGGCCAAGAACAAGAGCTGAAAATAAAAAACAGGTCTCTGCGATCCCTCACCCGCAGCTGCCTGTATCACAAAAGCGAAGATCAGCTTCGGCGCACGCTGGAAGACGCGGAGGCTCTCTTCAGTAAATACTGCGCGCTGACTCTTAAGGACTAGTTTCGCGCCCTTTCTCAAATTTAAGCGCGAAAACTACGTCATCTCCAGCGGCCACACCCGGCGCCAGCACCTGTTGTCAGCGCCATTATGAGCAAGGAAATTCCCACGCCCTACATGTGGAGTTACCAGCCACAAATGGGACTTGCGGCTGGAGCTGCCCAAGACTACTCAACCCGAATAAACTACATGAGCGCGGGACCCCACATGATATCCCGGGTCAACGGAATACGCGCCCACCGAAACCGAATTCCCTTGGAACAGGCGGCTATTACCACCACACCTCGTAATAACCTTAATCCCCGTAGTTGGCCCGCTGCCCTGGTGTACCAGGAAAGTCCCGCTCCCACCACTGTGGTACTTCCCAGAGACGCCCAGGCCGAAGTTCAGATGACTAACTCAGGGGCGCAGCTTGCGGGCGGCTTTCGTCACAGGGTGCGGTCGCCCGGGC

서열번호 18 - CMV 프로모터 WT

AGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTC

서열번호 19 - CMV 유도성 프로모터(p565-2xTetO)

CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCACTAGTCGCCGTGAACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGtccctatcagtgatagagatgtccctatcagtgatagagatcgtcgagcagctcGTTTAGTGAACCGTCAGATC

서열번호 20 - 5' UTR 서열: Cap 서열

서열번호 21 - 3' UTR: 폴리아데닐화 서열(SV40)

CAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTT

<110> Oxford Genetics Limited <120> VECTOR FOR THE PRODUCTION OF AAV PARTICLES <130> MPI20-008 <150> GB 1800903.5 <151> 2018-01-19 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1866 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 1 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caatag 1866 <210> 2 <211> 621 <212> PRT <213> adeno-associated virus 2 <400> 2 Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp 1 5 10 15 Gly His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu 20 25 30 Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile 35 40 45 Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu 50 55 60 Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val 65 70 75 80 Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu 85 90 95 Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile 100 105 110 Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu 115 120 125 Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys 145 150 155 160 Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu 165 170 175 Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His 180 185 190 Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn 195 200 205 Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr 210 215 220 Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys 225 230 235 240 Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala 245 250 255 Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys 260 265 270 Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln 275 280 285 Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu 290 295 300 Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly 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accaccaaag cccgcagagc ggcataagga cgacagcagg 480 ggtcttgtgc ttcctgggta caagtacctc ggacccttca acggactcga caagggagag 540 ccggtcaacg aggcagacgc cgcggccctc gagcacgaca aagcctacga ccggcagctc 600 gacagcggag acaacccgta cctcaagtac aaccacgccg acgcggagtt tcaggagcgc 660 cttaaagaag atacgtcttt tgggggcaac ctcggacgag cagtcttcca ggcgaaaaag 720 agggttcttg aacctctggg cctggttgag gaacctgtta agacggctcc gggaaaaaag 780 aggccggtag agcactctcc tgtggagcca gactcctcct cgggaaccgg aaaggcgggc 840 cagcagcctg caagaaaaag attgaatttt ggtcagactg gagacgcaga ctcagtacct 900 gacccccagc ctctcggaca gccaccagca gccccctctg gtctgggaac taatacgatg 960 gctacaggca gtggcgcacc aatggcagac aataacgagg gcgccgacgg agtgggtaat 1020 tcctcgggaa attggcattg cgattccaca tggatgggcg acagagtcat caccaccagc 1080 acccgaacct gggccctgcc cacctacaac aaccacctct acaaacaaat ttccagccaa 1140 tcaggagcct cgaacgacaa tcactacttt ggctacagca ccccttgggg gtattttgac 1200 ttcaacagat tccactgcca cttttcacca cgtgactggc aaagactcat caacaacaac 1260 tggggattcc gacccaagag actcaacttc 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tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 120 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 180 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 240 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 300 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgctgatgc 360 ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 420 tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 480 aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 540 tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtc 573 <210> 19 <211> 637 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV promoter inducible (p565-2xTetO) <400> 19 cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180 gtgcactagt cgccgtgaac gtcaatggaa agtccctatt ggcgttacta tgggaacata 240 cgtcattatt 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Claims

(i) 프로모터,
(ii) AAV cap 유전자, 및
(iii) AAV rep 유전자를
5' → 3' 방향으로 상기 순서대로 포함하는 핵산 분자로서, cap 유전자와 rep 유전자가 모두 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있고, rep 유전자가 또한 IRES와 작동 가능하게 연결되어 있는, 핵산 분자.
제1항에 있어서,
(a) 상기 rep 유전자가 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 인코딩하거나; 또는
(b) 상기 rep 유전자가 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 중 1개, 2개 또는 3개만을 인코딩하는, 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 rep 유전자가
(a) Rep78 및 Rep52를 인코딩하지만, Rep68 또는 Rep40은 인코딩하지 않거나;
(b) Rep68 및 Rep40을 인코딩하지만, Rep78 또는 Rep52는 인코딩하지 않거나;
(c) Rep68 및 Rep52를 인코딩하지만, Rep78 또는 Rep40은 인코딩하지 않거나; 또는
(d) Rep78 및 Rep40을 인코딩하지만, Rep68 또는 Rep52는 인코딩하지 않는, 핵산 분자.
제2항에 있어서, Rep52 및/또는 Rep40이 상기 프로모터로부터 전사되지 않는, 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 rep 및 cap 유전자의 뉴클레오티드 서열이 AAV 혈청형 2 rep 또는 cap 유전자로부터 유래된 것인, 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 프로모터가 시토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 전초기(immediate early) 프로모터인, 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 프로모터가 유도성 프로모터인, 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 IRES가 뇌심근염 바이러스 IRES 또는 구제역 바이러스 IRES인, 핵산 분자.
(i) AAV cap 유전자, 및
(ii) AAV rep 유전자를
5' → 3' 방향으로 상기 순서대로 포함하는 RNA 분자로서, rep 유전자가 IRES와 작동 가능하게 연결되어 있는, RNA 분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
하기 (a)와 함께, (b) 및 (c) 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 키트:
(a) 제10항에 따른 벡터;
(b) ITR이 측면에 있는 전이유전자를 포함하는 AAV 전달 플라스미드;
(c) E1A, E1B, E2A, E4 및 VA로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드.
하기 (a)와 함께, (b) 및 (c) 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 키트:
(a) 제10항에 따른 벡터;
(b) ITR이 측면에 있는 전이유전자를 포함하는 AAV 전달 플라스미드;
(c) 숙주 세포 게놈으로부터 발현 가능한 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스 유전자를 포함하는, 단리된 포유류 숙주 세포.
제1항 내지 제8항 중 어느 항에 따른 핵산 분자를 포함하는, 단리된 포유류 세포.
삭제
AAV 패키징 세포(packaging cell)를 생산하는 방법으로서,
(a) 제1항 내지 제8항 중 어느 항에 따른 핵산 분자를 단리된 포유류 세포에 안정적으로 통합시켜,
AAV rep 및 cap 유전자를 발현하는 포유류 세포를 생산하는 단계를 포함하는, AAV 패키징 세포를 생산하는 방법.
AAV를 생산하는 방법으로서,
(a) 5'- 및 3'-AAV ITR이 측면에 있는 전이유전자를 포함하는 전달 플라스미드를 단리된 AAV 패키징 세포에 도입하는 단계로서, 상기 단리된 AAV 패키징 세포는 제1항 내지 제8항 중 어느 항에 따른 핵산 분자와, 전달 플라스미드를 패키징하는 데 충분한 헬퍼 유전자를 포함하고, 상기 헬퍼 유전자는 세포 내 에피솜 헬퍼 플라스미드에 존재하거나, 패키징 세포 게놈에 통합되어 있는 단계;
(b) 상기 세포를, AAV가 상기 세포에 의해 조립되고 분비되도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
(c) 상청액으로부터 패키징된 AAV를 수확하고, 수확된 AAV를 선택적으로 정제하는 단계를 포함하는, AAV를 생산하는 방법.
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