KR20240025645A - 아데노-연관된 바이러스 패키징 시스템 - Google Patents

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KR20240025645A
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리스하우트 로라 판
마리사 스탠빅
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옥스포드 바이오메디카 솔루션즈 엘엘씨
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Abstract

본원은 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV)의 생산을 위한 이중 벡터 형질주입 시스템을 제공한다. 이중 벡터 형질주입 시스템은 일반적으로 다음을 포함한다: (1) AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터; 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터.

Description

아데노-연관된 바이러스 패키징 시스템
관련 출원
본 출원은 2021 년 6 월 25 일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/202,817, 2021 년 10 월 7 일자로 출원된 63/262,218, 및 2022 년 1 월 11 일자로 출원된 63/266,646에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 개시내용은 참조로 본원에 원용된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 서열 목록을 함유한다 (2022 년 6 월 21 일에 생성된 상기 ASCII 사본은 "HMW-043_SL.txt"로 명명되고 336,866 바이트 크기임).
아데노-연관된 바이러스 (AAV)는 유전자 요법의 목적을 위해 외래 DNA를 세포 내로 전달하기 위한 벡터로서 매력적이게 만드는 독특한 특징을 보유하고 있다. AAV의 상업적 제조는 일반적으로 포유동물 세포 또는 곤충 세포 시스템을 사용한다. 상업적인 포유동물 세포-기반 AAV 생산 시스템은 전형적으로 다음의 3 개의 플라스미드의 세포 내로의 형질주입(transfection)을 수반한다: AAV Rep 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 서열을 함유하는 제1 플라스미드; AAV 벡터 게놈을 함유하는 제2 플라스미드; 및 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자 (보통 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 유전자)를 함유하는 제3 플라스미드. 효과적이긴 하지만, 이러한 3 개의 플라스미드 AAV 제조 시스템은 최적화하기 복잡하며, 상업적 AAV 치료제와 연관된 상품의 높은 비용에 기여한다.
따라서, 효율적인 AAV 생산을 초래하지만 감소된 복잡성 및 비용을 갖는 개선된 AAV 제조 시스템에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.
본 개시내용은 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV)의 생산을 위한 이중 벡터 형질주입 시스템을 제공한다. 본원에 기재된 이중 벡터 형질주입 시스템은 일반적으로 다음을 포함한다: (1) AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터; 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터. 이러한 이중 벡터 형질주입 시스템에서, 숙주 생산 세포와 함께 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터는 AAV 생산에 필요한 모든 구성요소를 제공한다. 본원에 개시된 이중 벡터 형질주입 시스템은 기존의 삼중 벡터 형질주입 시스템과 비교하여 증가된 rAAV 생산성을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본원에 기재된 이중 벡터 형질주입 시스템에서 구성요소의 특이적 구성은 선행 기술의 이중 벡터 형질주입 시스템에 비해 우수한 rAAV 생산성을 초래하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 일 양태에서, 본 개시내용은 AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터를 제공하며, 여기서 핵산 벡터는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 핵산 벡터는 5'으로부터 3'으로, AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 핵산 벡터는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 핵산 벡터는 5'으로부터 3'으로, AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 핵산 벡터는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지 않고, 트랜스진은 페닐알라닌 수산화효소 (PAH), 아릴설파타제 A (ARSA), 이두로네이트 2-설파타제 (I2S) 및 항-보체 구성요소 5 (C5) 항체로 이루어진 군으로부터 선택되지 않는다.
특정 실시양태에서, 핵산 벡터는 5'으로부터 3'으로, AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 핵산 벡터는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지 않고, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 여기서 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다.
특정 실시양태에서, 핵산 벡터는 5'으로부터 3'으로, AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 핵산 벡터는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지 않고, (i) 트랜스진은 페닐알라닌 수산화효소 (PAH), 아릴설파타제 A (ARSA), 이두로네이트 2-설파타제 (I2S) 및 항-보체 구성요소 5 (C5) 항체로 이루어진 군으로부터 선택되지 않고, (ii) AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 여기서 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다.
특정 실시양태에서, 핵산 벡터는 5'으로부터 3'으로, AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 핵산 벡터는 DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는, 재조합 AAV (rAAV) 패키징 시스템을 제공한다: (i) 다음을 포함하는, 제1 핵산 벡터: AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터.
특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터는 5'으로부터 3'으로, AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진은 페닐알라닌 수산화효소 (PAH), 아릴설파타제 A (ARSA), 이두로네이트 2-설파타제 (I2S) 및 항-보체 구성요소 5 (C5) 항체로 이루어진 군으로부터 선택되지 않는다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 여기서 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시양태에서, 트랜스진은 페닐알라닌 수산화효소 (PAH), 아릴설파타제 A (ARSA), 이두로네이트 2-설파타제 (I2S) 및 항-보체 구성요소 5 (C5) 항체로 이루어진 군으로부터 선택되지 않고, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 여기서 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다.
특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터는 DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터이다. 특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터이다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 폴리펩티드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진은 miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, gRNA, 안타고미르, miRNA 스폰지, RNA 압타자임, RNA 압타머, lncRNA, 리보자임 또는 mRNA를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진은 페닐알라닌 수산화효소 (PAH), 글루코스-6-포스파타제 (G6Pase), 이두로네이트-2-설파타제 (I2S), 아릴설파타제 A (ARSA) 및 프라탁신 (FXN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진은 글루코스-6-포스파타제 (G6Pase) 또는 프라탁신 (FXN)을 코딩한다.
특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 전사 조절 요소는 프로모터 요소 및/또는 인트론 요소를 포함한다.
특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 트랜스진에 대해 3'이다.
특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 서열번호 71, 85, 86, 87 또는 88에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 트랜스진의 5'의 5' 역전 말단 반복부 (5' ITR) 뉴클레오티드 서열, 및 트랜스진의 3'의 3' 역전 말단 반복부 (3' ITR) 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열번호 39, 41 또는 42에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고/하거나, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열번호 40, 43 또는 44에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 서열번호 75, 78, 80, 82 또는 84에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, AAV Rep 단백질은 야생형 Rep 단백질 또는 이의 변이체이다. 특정 실시양태에서, AAV Rep 단백질은 AAV2 Rep 단백질 또는 이의 변이체이다.
특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 AAV Rep 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 전사 조절 요소는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 P5 프로모터, P19 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVRh32.33, AAVrh74, AAV-DJ, AAV-LK03, NP59, VOY101, VOY201, VOY701, VOY801, VOY1101, AAVPHP.N, AAVPHP.A, AAVPHP.B, PHP.B2, PHP.B3, G2A3, G2B4, G2B5 및 PHP.S로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 및 AAVrh74로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8 및 AAVrh74로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다.
특정 실시양태에서, (a) 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나; (b) 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; (c) 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; (d) 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는 (e) 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다.
특정 실시양태에서, (a) 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나; (b) 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; (c) 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; (d) 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는 (e) 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이거나; 서열번호 16의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 68에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 V이거나; 서열번호 16의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이거나; 서열번호 16의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다.
특정 실시양태에서, (a) 서열번호 16의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이고, 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; (b) 서열번호 16의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Y이거나; (c) 서열번호 16의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; (d) 서열번호 16의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이고, 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; (e) 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이거나; (f) 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; (g) 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; (h) 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제3 뉴클레오티드 서열은 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 전사 조절 요소는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 P40 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터는 서열번호 73 또는 77에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 71, 75, 78, 80, 82, 84, 85, 86, 87 또는 88에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 또는 59에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고; 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 71, 75, 78, 80, 82, 84, 85, 86, 87 또는 88에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고; 제3 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736, 138-736 및/또는 1-736의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩한다.
특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터는 5'으로부터 3'으로, 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 헬퍼 바이러스 유전자는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 배큘로바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 헬퍼 바이러스로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 바이러스 유전자는 E1, E2, E4 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택되는 아데노바이러스로부터 유래된 RNA 유전자이다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 바이러스 유전자는 UL5/8/52, ICP0, ICP4, ICP22 및 UL30/UL42로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤르페스 바이러스로부터 유래된 유전자이다.
특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 헬퍼 바이러스 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 전사 조절 요소는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 RSV LTR 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 60, 61 또는 62에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 서열번호 63에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 벡터 또는 본원에 기재된 패키징 시스템을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 개시내용은 또한 이러한 숙주 세포의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포의 집단은 세포 배양물로 제공된다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 2 리터 이상, 50 리터 이상, 또는 2000 리터 이상의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 5000 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 4000 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 3000 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 2500 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 2000 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 1500 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 1000 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 500 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 250 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 100 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 50 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 25 리터의 부피를 갖는다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포는 COS 세포, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK293F 세포, NS0 세포, PER.C6 세포, VERO 세포, CRL7O3O 세포, HsS78Bst 세포, HeLa 세포, NIH 3T3 세포, HepG2 세포, SP210 세포, R1.1 세포, B-W 세포, L-M 세포, BSC1 세포, BSC40 세포, YB/20 세포 및 BMT10 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 rAAV가 생산되는 조건 하에서 포유동물 세포 내로 본원에 기재된 패키징 시스템을 도입하는 단계를 포함하는, rAAV의 재조합 제조 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:0.2, 1:0.4, 1:0.6, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3 또는 1:4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:2이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:0.2 내지 1:1이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:0.6이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:0.8이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:1이다.
특정 실시양태에서, 방법은 패키징 시스템의 0.1 내지 4 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 패키징 시스템의 0.5 내지 1 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 패키징 시스템의 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 패키징 시스템의 0.75 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 벡터 핵산의 비율은 1:2, 1:3 또는 1:4이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율은 1:2이다.
특정 실시양태에서, 방법은 (i) AAV Rep 단백질 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터; (ii) rAAV 게놈을 포함하는 제2 벡터; 및 (iii) 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제3 벡터를 포함하는 포유동물 세포를 사용하여 rAAV를 생산하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 증가된 rAAV 역가를 초래한다.
특정 실시양태에서, 방법은 (i) AAV Rep 단백질 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터; (ii) rAAV 게놈을 포함하는 제2 벡터; 및 (iii) 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제3 벡터를 포함하는 포유동물 세포를 사용하여 rAAV를 생산하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 온전한 벡터 게놈의 증가된 백분율을 초래한다.
특정 실시양태에서, 포유동물 세포는 COS 세포, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK293F 세포, NS0 세포, PER.C6 세포, VERO 세포, CRL7O3O 세포, HsS78Bst 세포, HeLa 세포, NIH 3T3 세포, HepG2 세포, SP210 세포, R1.1 세포, B-W 세포, L-M 세포, BSC1 세포, BSC40 세포, YB/20 세포 및 BMT10 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포이다.
도 1a-1c는 삼중 벡터 형질주입 시스템 (1) 및 이중 벡터 형질주입 시스템 (2)을 사용하여 소-규모 rAAV 생산으로부터 수득된 바이러스 게놈 (VG) 생산성 (도 1a), 캡시드 생산성 (도 1b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 1c)을 도시하는 그래프이다.
도 2a-2c는 삼중 벡터 형질주입 시스템 (1 및 3) 및 이중 벡터 형질주입 시스템 (2 및 4)을 사용하여 소-규모 rAAV 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 2a), 캡시드 생산성 (도 2b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 2c)을 도시하는 그래프이다. rAAV 생산성은 다음의 2 개의 상이한 rAAV 유전자 편집 벡터에 대해 결정되었다: 인간-특이적 유전자 편집 벡터 (1 및 2) 및 마우스-특이적 벡터 (3 및 4). 다양한 조건은 표 3에 제시되어 있다.
도 3a-3c는 rAAV 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1 (도 3a), 설계-2 (도 3b) 및 설계-3 (도 3c)을 도시하는 개략도이다.
도 4a-4c는 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1 (1-3), 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-2 (4-6), 및 삼중 벡터 형질주입 시스템 (7)을 사용하여 소-규모 rAAV 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 4a), 캡시드 생산성 (도 4b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 4c)을 도시하는 그래프이다. 테스트된 이중 벡터 형질주입 시스템 설계는 도 3a 및 3b에 묘사된 바와 같다. 테스트된 각각의 이중 벡터 형질주입 시스템 설계에 대해, 다음의 3 개의 상이한 트랜스진 벡터 대 헬퍼 벡터 비율을 이용하여 형질주입을 수행하였다: 1:0.5 (1 및 4), 1:1 (2 및 5), 및 1:3 (3 및 6). 다양한 형질주입 조건은 표 4에 제시되어 있다.
도 5a-5c는 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1 (1), 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-2 (2), 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-3 (3) 및 삼중 벡터 형질주입 시스템 (4)을 사용하여 소-규모 rAAV 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 5a), 캡시드 생산성 (도 5b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 5c; "전체 %")을 도시하는 그래프이다. 테스트된 이중 벡터 형질주입 시스템 설계는 도 3a-3c에 묘사된 바와 같다. 다양한 형질주입 조건은 표 5에 제시되어 있다.
도 6a-6c는 다양한 트랜스진 벡터 대 헬퍼 벡터 비율인 1:2 ("이중 1:2"), 1:3 ("이중 1:3") 및 1:4 ("이중 1:4")에서의 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1, 및 삼중 벡터 형질주입 시스템 (삼중)을 사용하여 2 L-규모 rAAV 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 6a), 캡시드 생산성 (도 6b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 6c)을 도시하는 그래프이다. 6 개의 상이한 rAAV 벡터 게놈 (1-6)을 테스트하였다. 조건 1-5는 AAVHSC15 캡시드를 사용하였고, 조건 6은 AAVHSC17 캡시드를 사용하였다. 다양한 형질주입 조건은 표 6에 제시되어 있다.
도 7a-7c는 AAV2 캡시드를 활용하는, 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1 (2 TFX) 및 삼중 벡터 형질주입 시스템 (3 TFX)을 사용하여 소-규모 rAAV 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 7a), 캡시드 생산성 (도 7b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 7c)을 도시하는 그래프이다. 다양한 형질주입 조건은 표 6에 제시되어 있다.
도 8은 설계-1 이중 플라스미드 시스템을 사용하여 rAAV 생산으로부터 수득된 온전한 벡터 게놈의 수를 도시하는 그래프이며, 각각의 경우에 상응하는 삼중 플라스미드 시스템 대조군으로부터 수득된 온전한 벡터 게놈의 수에 대한 백분율 증가로 표현된다. 4 개의 상이한 rAAV 벡터 게놈 (1-4)을 테스트하였다. 조건 1-3은 AAVHSC15 캡시드를 사용하였고, 조건 4는 AAVHSC17 캡시드를 사용하였다. 다양한 형질주입 조건이 표 7에 제시되어 있다.
도 9는 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1 및 설계-2로부터의 캡시드 생성의 수준과 함께 각각 각각의 설계의 Rep/Cap 서열을 함유하는 벡터로부터의 캡시드 생성의 수준을 도시하는 그래프이다. 다양한 형질주입 조건이 표 8에 제시되어 있다.
도 10a-10c는 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1 (2 TFX) 및 삼중 벡터 형질주입 시스템 (3 TFX)을 사용하여 50 L 생물반응기 rAAV 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 10a), 캡시드 생산성 (도 10b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 10c)을 도시하는 그래프이다. 형질주입 조건은 표 6, 조건 4, 설계-1에 대한 벡터 비율 1:2 및 연관된 삼중 형질주입 대조군에 제시되어 있다. 도 10d-10f는 2 TFX 및 3 TFX 시스템을 사용하여 수득된 정제된 AAV 벡터에서의 순도 퍼센트 (도 10d), 응집 퍼센트 (도 10e) 및 잔여 숙주 세포 단백질의 수준 (도 10f)을 도시하는 그래프이다. 도 10g-10j는 2 TFX 및 3 TFX 시스템을 사용하여 수득된 정제된 AAV 벡터에 패키징된 잔류 숙주 세포 DNA (도 10g), Rep/Cap (도 10h), E1a (도 10i) 및 헬퍼 서열 (도 10j)의 양을 도시하는 그래프이다. 도 10f 및 10i에서, 수평 점선은 샘플이 정량 한계 미만 (BLoQ)인 것으로 결정된 검정에 대한 검출 한계를 나타낸다. ns는 유의하지 않음을 의미하고; *는 p<0.05에서 통계적으로 유의함을 의미하며; ***는 p<0.001에서 통계적으로 유의함을 의미한다.
도 11a-11b는 1E12 VG/kg (도 11a) 및 1E14 VG/kg (도 11b)의 용량에서, 설계 1 (2 TFX) 및 연관된 삼중 형질주입 대조군 (3 TFX)에 대해 1:4의 벡터 비율로 표 6의 조건 5로부터 수득된 AAV 벡터가 투여된 Pahenu2 마우스의 혈청에서 측정된 페닐알라닌 (Phe)의 수준을 도시하는 그래프이다. 비히클-단독 투여는 대조군 (비히클)으로서 수행되었다. 도 11c-11e는 투약-후 6 주째에 치료된 마우스에서 간에서의 벡터 게놈 (도 11c), 트랜스진 발현 (도 11d) 및 표적-내(on-target) 통합 (도 11e)의 정량을 도시하는 그래프이다. ns는 유의하지 않음을 의미한다.
도 12a-12c는 형질주입된 총 DNA의 다양한 수준 (x-축)에서, 벡터 V3 및 V12 사이에 표시된 바와 같은 다양한 비율을 테스트한, 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1을 사용하여 소규모 rAAV 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 12a), 캡시드 생산성 (도 12b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 12c)을 도시하는 그래프이다. 사용된 PEI:DNA 비율은 2:1이었다.
도 13a-13c는 형질주입된 총 DNA의 다양한 수준 (x-축)에서, 벡터 V3 및 V8 사이에 표시된 바와 같은 다양한 비율을 테스트한, 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1을 사용하여 소규모 rAAV 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 13a), 캡시드 생산성 (도 13b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 13c)을 도시하는 그래프이다. 사용된 PEI:DNA 비율은 2:1이었다.
도 14a-14c는 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1 및 AAV 캡시드 혈청형 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 및 AAVrh74에 걸친 연관된 삼중 형질주입 대조군을 사용하여 2 L-규모의 rAAV 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 14a), 캡시드 생산성 (도 14b) 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 14c)을 도시하는 그래프이다.
도 15는 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1을 사용하여 50 L 및 2000 L 생물반응기 rAAV 생산으로부터 수득된 VG 생산성을 도시하는 그래프이다.
본 개시내용은 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV)의 생산을 위한 이중 벡터 형질주입 시스템을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 이중 벡터 형질주입 접근법을 사용한 rAAV 생산이 기존의 삼중 벡터 형질주입 접근법에 비해 우수한 AAV 생산성을 초래한다는 발견에 기반한다. 본원에 기재된 이중 벡터 형질주입 시스템의 구성요소의 특이적 구성은 또한 선행 기술의 이중 벡터 형질주입 접근법에 비해 우수한 AAV 생산성을 초래한다.
I. 정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 아데노-연관된 바이러스" 또는 "rAAV"는 기능적 rep 및 cap 유전자가 결여된 게놈을 포함하는 AAV를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "cap 유전자"는 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "rep 유전자"는 AAV 복제에 필요한 AAV Rep 단백질 (예컨대, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Rep-Cap 요소"는 AAV 복제에 필요한 AAV Rep 단백질 (예컨대, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)뿐만 아니라 AAV 캡시드 단백질 (예컨대, VP1, VP2 및 VP3)을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "헬퍼 바이러스 유전자"는 AAV 복제를 매개하는 바이러스 유전자 (예컨대, 아데노바이러스 유전자 또는 헤르페스바이러스 유전자)를 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "rAAV 게놈"은 rAAV의 게놈 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 당업자는 rAAV 게놈이 트랜스진을 포함하는 경우, rAAV 게놈이 트랜스진의 전사의 방향에 대해 센스 또는 안티센스 배향일 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "편집 게놈"은 상동 재조합을 통해 편집 요소 (예컨대, 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 결합)를 표적 유전자좌에 통합하여 표적 유전자 내 유전적 결함을 교정할 수 있는 재조합 AAV 게놈을 지칭한다. 당업자는 5' 상동성 아암, 편집 요소 및 3' 상동성 아암을 포함하는 편집 게놈의 일부가 표적 유전자좌에 대해 센스 또는 안티센스 배향일 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "편집 요소"는 표적 유전자좌에서 통합될 때 표적 유전자좌를 변형시키는 편집 게놈의 일부를 지칭한다. 편집 요소는 표적 유전자좌에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 매개할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 유전자좌"는 편집 요소에 의해 변형되는 염색체의 영역 또는 뉴클레오티드간 결합 (예컨대, 표적 유전자의 영역 또는 뉴클레오티드간 결합)을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상동성 아암"은 표적 유전자좌에 측접하는 게놈과 실질적으로 동일한 편집 요소의 5' 또는 3'에 위치하는 편집 게놈의 일부를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 2 개의 뉴클레오티드 서열 사이 또는 2 개의 아미노산 서열 사이의 "동일성 백분율"은 정렬된 서열의 쌍 사이의 매칭의 수에 100을 곱하고, 내부 갭(gap)을 포함하는 정렬된 영역의 길이로 나누어 계산된다. 동일성 스코어링은 완벽한 매칭만 카운팅하며, 아미노산 간의 유사성의 정도는 고려하지 않는다. 내부 갭만 길이에 포함되고 서열 단부에서의 갭은 포함되지 않는다는 점에 유의한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코딩 서열"은 출발 코돈에서 시작하여 정지 코돈에서 끝나는, 폴리펩티드를 코딩하는 상보성 DNA (cDNA)의 일부를 지칭한다. 유전자는 대체 스플라이싱, 대체 번역 개시, 및 집단 내의 변이로 인해 하나 이상의 코딩 서열을 가질 수 있다. 코딩 서열은 야생형 또는 비-자연 발생 변이체 (예컨대, 코돈 최적화된 변이체)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전사 조절 요소" 또는 "TRE"는 RNA 분자를 형성하기 위해 RNA 중합효소에 의해 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절 (예컨대, 제어, 증가 또는 감소)시키는 시스-작용 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, DNA 서열을 지칭한다. 전사를 조절하기 위해 TRE는 하나 이상의 트랜스-작용 분자, 예컨대, 전사 인자에 따라 좌우된다. 따라서, 하나의 TRE는 상이한 트랜스-작용 분자와 접촉할 때, 예를 들어, 상이한 유형의 세포에 있을 때, 상이한 방식으로 전사를 조절할 수 있다. TRE는 하나 이상의 프로모터 요소 및/또는 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 당업자는 유전자 내의 프로모터 및 인핸서 요소가 위치가 가까울 수 있고, 용어 "프로모터"는 프로모터 요소 및 인핸서 요소를 포함하는 서열을 지칭할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "프로모터"는 서열 내 인핸서 요소를 배제하지 않는다. 프로모터 및 인핸서 요소는 동일한 유전자 또는 종으로부터 유래될 필요가 없으며, 각각의 프로모터 또는 인핸서 요소의 서열은 게놈 내의 상응하는 내인성 서열과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 TRE 및 전사될 코딩 서열 사이의 연접을 기재하기 위해 사용된다. 전형적으로, 유전자 발현은 하나 이상의 프로모터 및/또는 인핸서 요소를 포함하는 TRE의 제어 하에서 배치된다. 코딩 서열의 전사가 TRE에 의해 제어되거나 영향을 받는 경우 코딩 서열은 TRE에 "작동가능하게 연결된다". TRE의 프로모터 및 인핸서 요소는 원하는 전사 활성이 수득되는 한, 코딩 서열로부터 임의의 배향 및/또는 거리에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, TRE는 코딩 서열로부터 상류에 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리아데닐화 서열"은 RNA로 전사될 때 폴리아데닐화 신호 서열을 구성하는 DNA 서열을 지칭한다. 폴리아데닐화 서열은 천연 또는 외인성일 수 있다. 외인성 폴리아데닐화 서열은 포유동물 또는 바이러스 폴리아데닐화 서열 (예컨대, SV40 폴리아데닐화 서열)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "외인성 폴리아데닐화 서열"은 트랜스진의 내인성 폴리아데닐화 서열과 동일하지 않거나 실질적으로 동일하지 않은 폴리아데닐화 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 외인성 폴리아데닐화 서열은 트랜스진과 상이하지만 동일한 종 (예컨대, 인간) 내에 있는 유전자의 폴리아데닐화 서열이다. 특정 실시양태에서, 외인성 폴리아데닐화 서열은 상이한 유기체 (예컨대, 바이러스)의 폴리아데닐화 서열이다.
II. 제1 핵산 벡터
rAAV의 생산을 위한 기존의 삼중 벡터 형질주입 시스템은 전형적으로 다음을 포함한다: AAV Rep 단백질 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 서열을 함유하는 제1 벡터; rAAV 게놈을 포함하는 제2 벡터; 및 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제3 벡터. AAV Rep 단백질, AAV 캡시드 단백질 및 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 코딩하는 유전자가 ("Rep-Cap-헬퍼 벡터")와 동일한 벡터에 클로닝될 수 있다는 것이 이전에 나타나있다. 이러한 경우에, rAAV 게놈을 포함하는 제2 벡터 (즉, Rep, Cap 및 헬퍼 유전자를 rAAV 게놈에 트랜스로 제공함)와 함께 Rep-Cap-헬퍼 벡터의 이중 형질주입을 사용하여, rAAV를 생성할 수 있다. 예컨대, 이의 개시내용이 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 Grimm et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9(18): 2745-2760 참고.
이전의 이중 벡터 형질주입 시스템과 대조적으로, 본 개시내용의 이중 벡터 형질주입 시스템은 rAAV 게놈과 함께 시스로 Rep 및 Cap 유전자를 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV)의 생산을 위한 이중 벡터 형질주입 시스템을 제공하며, 여기서 본원에 기재된 이중 벡터 형질주입 시스템은 일반적으로 다음을 포함한다: (1) AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터; 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터.
특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터는 5'으로부터 3'으로 다음을 포함한다: AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열. 본 개시내용의 특정 양태는 제1 핵산 벡터가 헬퍼 바이러스 유전자 (예컨대, AAV 생산 헬퍼 인자를 코딩하는 유전자)를 포함하지 않는다는 것을 제공한다.
본원에 기재된 이중 벡터 형질주입 시스템은 일반적으로 AAV (예컨대, rAAV)를 생산하기 위해 적합한 숙주 세포 내로의 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터의 형질주입을 수반한다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터는 함께 AAV (예컨대, rAAV) 생산에 필요한 모든 구성요소를 제공한다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터, 그리고 추가로, 숙주 세포는 함께 AAV (예컨대, rAAV) 생산에 필요한 모든 구성요소를 제공한다.
본원에 개시된 이중 벡터 형질주입 시스템은 기존의 삼중 벡터 형질주입 시스템 및 이전에 기재된 이중 벡터 형질주입 시스템 둘 모두와 비교하여 증가된 rAAV 생산성을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 임의의 이론에도 얽매이지 않고, 출원인은 본원에 기재된 이중 벡터 형질주입 시스템에서 rAAV 게놈과 함께 시스로의 Rep 및 Cap 유전자의 제공이 부분적으로 더 적은 빈 AAV 캡시드가 생산되기 때문에 우수한 rAAV 생산성을 초래한다고 믿는다.
rAAV 게놈
본원에 개시된 이중 벡터 시스템에서, 제1 핵산 벡터는 일반적으로 rAAV 게놈을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 트랜스진을 포함한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 RNA 분자를 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 적합한 RNA 분자는 제한 없이, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, gRNA, 안타고미르, miRNA 스폰지, RNA 압타자임, RNA 압타머, mRNA, lncRNA, 리보자임, 및 당업계에 알려진 합성 RNA를 포함한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩한다. 이러한 트랜스진은 폴리펩티드의 완전한 코딩 서열, 또는 폴리펩티드의 코딩 서열의 단편만을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스진은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용한 폴리펩티드를 코딩한다. 적합한 폴리펩티드는 제한 없이, β-글로빈, 헤모글로빈, 조직 플라스미노겐 활성화제 및 응고 인자; 콜로니 자극 인자 (CSF); 인터류킨, 예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 등; 성장 인자, 예컨대, 각질형성세포 성장 인자 (KGF), 줄기 세포 인자 (SCF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF, 예컨대, 염기성 FGF 및 산성 FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 뼈 형태발생 단백질 (BMP), 표피 성장 인자 (EGF), 성장 분화 인자-9 (GDF-9), 간종양 유래된 성장 인자 (HDGF), 미오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀, 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-a) 및 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 등; 가용성 수용체, 예컨대, 가용성 TNF-a 수용체, 가용성 인터류킨 수용체 (예컨대, 가용성 IL-1 수용체 및 가용성 유형 II IL-1 수용체), 가용성 γ/ΔT 세포 수용체, 및 가용성 수용체의 리간드-결합 단편 등; 효소, 예컨대, a-글루코시다제, 이미글루세라제, β-글루코세레브로시다제 및 알글루세라제; 효소 활성화제, 예컨대, 조직 플라스미노겐 활성화제; 케모카인, 예컨대, IP-10, 인터페론-감마에 의해 유도된 모노카인 (Mig), Groα/IL-8, RANTES, MIP-1a, MIP-1β, MCP-1 및 PF-4 등; 혈관신생제, 예컨대, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF, 예컨대, VEGF121, VEGF165, VEGF-C, VEGF-2), 신경교종-유래된 성장 인자, 안지오제닌 및 안지오제닌-2; 등; 항-혈관신생제, 예컨대, 가용성 VEGF 수용체; 단백질 백신; 신경자극성(neuroactive) 펩티드, 예컨대, 신경 성장 인자 (NGF), 브라디키닌, 콜레시스토키닌, 가스트린, 세크레틴, 옥시토신, 성선자극호르몬-방출 호르몬, 베타-엔돌핀, 엔케팔린, 물질 P, 소마토스타틴, 프로락틴, 갈라닌, 성장 호르몬-방출 호르몬, 봄베신, 디노르핀, 와파린, 뉴로텐신, 모틸린, 티로트로핀, 신경펩티드 Y, 황체형성 호르몬, 칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 바소프레신, 안지오텐신 II, 티로트로핀-방출 호르몬, 혈관작용 장 펩티드 및 수면 펩티드 등; 혈전용해제; 심방 나트륨이뇨 펩티드; 릴랙신; 신경교섬유성 산성 단백질; 난포 자극 호르몬 (FSH); 인간 알파-1 항트립신; 백혈병 억제 인자 (LIF); 조직 인자; 대식세포 활성화 인자; 종양 괴사 인자 (TNF); 호중구 화학주성 인자 (NCF); 메탈로프로테이나제의 조직 억제제; 혈관작용 장 펩티드; 안지오제닌; 안지오트로핀; 피브린; 히루딘; IL-1 수용체 길항제; 섬모 신경영양 인자 (CNTF); 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF); 뉴로트로핀 3 및 4/5 (NT-3 및 -4/5); 신경교세포 유래된 신경영양 인자 (GDNF); 방향족 아미노산 탈탄산효소 (AADC); 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X; 디스트로핀 또는 미니-디스트로핀; 리소좀 산 리파제; 페닐알라닌 수산화효소 (PAH); 글리코겐 저장 질환-관련된 효소, 예컨대, 글루코스-6-포스파타제, 산 말타제, 글리코겐 탈분지 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라제, 간 글리코겐 포스포릴라제, 근육 포스포프럭토키나제, 포스포릴라제 키나제, 글루코스 수송체, 알돌라제 A, β-에놀라제, 글리코겐 합성효소; 리소좀 효소, 예컨대, 이두로네이트-2-설파타제 (I2S) 및 아릴설파타제 A; 및 미토콘드리아 단백질, 예컨대, 프라탁신을 포함한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 하나 이상의 리소좀 저장 질환에 결함이 있을 수 있는 단백질을 코딩한다. 적합한 단백질은 제한 없이, α-시알리다제, 카텝신 A, α-만노시다제, β-만노시다제, 글리코실아스파라기나제, α-푸코시다제, α-N-아세틸글루코사미니다제, β-갈락토시다제, β-헥소사미니다제 α-서브유닛, β-헥소사미니다제 β-서브유닛, GM2 활성화제 단백질, 글루코세레브로시다제, 사포신 C, 아릴설파타제 A, 사포신 B, 포르밀-글리신 생성 효소, β-갈락토실세라미다제, α-갈락토시다제 A, 이두로네이트 설파타제, α-이두로니다제, 헤파란 N-설파타제, 아세틸-CoA 트랜스퍼라제, N-아세틸 글루코사미니다제, β-글루쿠로니다제, N-아세틸 글루코사민 6-설파타제, N-아세틸갈락토사민 4-설파타제, 갈락토스 6-설파타제, 히알루로니다제, α-글루코시다제, 산성 스핑고미엘리나제, 산성 세라미다제, 산성 리파제, 카텝신 K, 트리펩티딜 펩티다제, 팔미토일-단백질 티오에스테라제, 시스티노신, 시알린, UDP-N-아세틸글루코사민, 포스포트랜스퍼라제 γ-서브유닛, 뮤코리핀-1, LAMP-2, NPC1, CLN3, CLN 6, CLN 8, LYST, MYOV, RAB27A, 멜라노필린 및 AP3 β-서브유닛을 포함한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 항체 또는 이의 단편 (예컨대, Fab, scFv 또는 전장 항체)을 코딩한다. 적합한 항체는 제한 없이, 뮤로모납-cd3, 에팔리주맙, 토시투모맙, 다클리주맙, 네바쿠맙, 카투막소맙, 에드레콜로맙, 압식시맙, 리툭시맙, 바실릭시맙, 팔리비주맙, 인플릭시맙, 트라스투주맙, 아달리무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 오말리주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 나탈리주맙, 파니투무맙, 라니비주맙, 에쿨리주맙, 세르톨리주맙, 우스테키누맙, 카나키누맙, 골리무맙, 오파투무맙, 토실리주맙, 데노수맙, 벨리무맙, 이필리무맙, 브렌툭시맙 베도틴, 페르투주맙, 락시바쿠맙, 오비누투주맙, 알렘투주맙, 실툭시맙, 라무시루맙, 베돌리주맙, 블리나투모맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이다루시주맙, 네시투무맙, 디누툭시맙, 세쿠키누맙, 메폴리주맙, 알리로쿠맙, 에볼로쿠맙, 다라투무맙, 엘로투주맙, 익세키주맙, 레슬리주맙, 올라라투맙, 베즐로톡수맙, 아테졸리주맙, 오빌톡삭시맙, 이노투주맙 오조가미신, 브로달루맙, 구셀쿠맙, 두필루맙, 사릴루맙, 아벨루맙, 오크렐리주맙, 에미시주맙, 벤랄리주맙, 젬투주맙 오조가미신, 두르발루맙, 부로수맙, 에레누맙, 갈카네주맙, 라나델루맙, 모가물리주맙, 틸드라키주맙, 세미플리맙, 프레마네주맙, 라불리주맙, 에마팔루맙, 이발리주맙, 목세투모맙, 카플라시주맙, 로모소주맙, 리산키주맙, 폴라투주맙, 엡티네주맙, 레론리맙, 사시투주맙, 브로루시주맙, 이사툭시맙 및 테프로투무맙을 포함한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 뉴클레아제를 코딩한다. 적합한 뉴클레아제는 제한 없이, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) (예컨대, 이들 각각이 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, Porteus, and Baltimore (2003) Science 300: 763; Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:778-785; Sander et al. (2011) Nature Methods 8:67-69; 및 Wood et al. (2011) Science 333:307 참고), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) (예컨대, 이들 각각이 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, Wood et al. (2011) Science 333:307; Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501; Christian et al. (2010) Genetics 186:757-761; Miller et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:143-148; Zhang et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:149-153; 및 Reyon et al. (2012) Nat. Biotechnol. 30(5): 460-465 참고), 귀소 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제 (예컨대, 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 미국 특허 공개공보 번호 US 2014/0121115 참고), 및 RNA-가이드된 뉴클레아제 (예컨대, 이들 각각이 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, Makarova et al. (2018) The CRISPR Journal 1(5): 325-336; 및 Adli (2018) Nat. Communications 9:1911 참고)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 RNA-가이드된 뉴클레아제를 코딩한다. 적합한 RNA-가이드된 뉴클레아제는 제한 없이, 클래스 I 및 클래스 II 클러스터링 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 뉴클레아제를 포함한다. 클래스 I은 유형 I, III 및 IV로 나뉘며, 제한 없이, 유형 I (Cas3), 유형 I-A (Cas8a, Cas5), 유형 I-B (Cas8b), 유형 I-C (Cas8c), 유형 I-D (Cas10d), 유형 I-E (Csel, Cse2), 유형 I-F (Csyl, Csy2, Csy3), 유형 I-U (GSU0054), 유형 III (Cas10), 유형 III-A (Csm2), 유형 III-B (Cmr5), 유형 III-C (Csx10 또는 Csx11), 유형 III-D (Csx10) 및 유형 IV (Csf1)를 포함한다. 클래스 II는 유형 II, V 및 VI로 나뉘며, 제한 없이, 유형 II (Cas9), 유형 II-A (Csn2), 유형 II-B (Cas4), 유형 V (Cpf1, C2c1, C2c3), 및 유형 VI (Cas13a, Cas13b, Cas13c)를 포함한다. RNA-가이드된 뉴클레아제는 또한 자연-발생 클래스 II CRISPR 뉴클레아제, 예컨대, Cas9 (유형 II) 또는 Cas12a/Cpf1 (유형 V)뿐만 아니라 이로부터 유래 또는 수득된 기타 뉴클레아제를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 예시적인 Cas9 뉴클레아제는 S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 (SpCas9), S. 아우레우스(S. aureus) Cas9 (SaCas9), N. 메닌기티디스(N. meningitidis) Cas9 (NmCas9), C. 제주니(C. jejuni) Cas9 (CjCas9) 및 지오바실러스(Geobacillus) Cas9 (GeoCas9)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 발현 시 검출가능한 신호를 생산하는 하나 이상의 리포터 서열을 코딩한다. 이러한 리포터 서열은 제한 없이, β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시퍼라제, 예를 들어, CD2, CD4, CD8, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 및 그에 대해 지시된 고친화도 항체가 존재하거나 기존의 수단에 의해 생산될 수 있는 당업계에 잘 알려진 기타 단백질을 포함하는 막 결합된 단백질, 및 특히 헤마글루티닌 또는 Myc로부터의 항원 태그 도메인에 적절하게 융합된 막 결합된 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 트랜스진에 의해 코딩되는 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 제어하기 위해 트랜스진에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소 (TRE)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TRE는 구성적 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, TRE는 임의의 포유동물 세포 (예컨대, 임의의 인간 세포)에서 활성일 수 있다. 특정 실시양태에서, TRE는 광범위한 인간 세포에서 활성이다. 이러한 TRE는 본원에 기재된 것들 중 임의의 것 및 당업자에게 알려진 것들 중 임의의 것을 포함하는, 구성적 프로모터 및/또는 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, TRE는 유도성 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, TRE는 조직-특이적 TRE일 수 있으며, 즉, 이는 특이적 조직(들) 및/또는 기관(들)에서 활성이다. 조직-특이적 TRE는 하나 이상의 조직-특이적 프로모터 및/또는 인핸서 요소, 및 임의로 하나 이상의 구성적 프로모터 및/또는 인핸서 요소를 포함한다. 당업자는 조직-특이적 프로모터 및/또는 인핸서 요소가 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자로부터 단리될 수 있음을 이해할 것이다.
적합한 프로모터는 예컨대, 사이토메갈로바이러스 프로모터 (CMV)(Stinski et al. (1985) Journal of Virology 55(2): 431-441), CMV 초기 인핸서/닭 β-액틴 (CBA) 프로모터/토끼 β-글로빈 인트론 (CAG) (Miyazaki et al. (1989) Gene 79(2): 269-277), CBSB (Jacobson et al. (2006) Molecular Therapy 13(6): 1074-1084), 인간 신장 인자 1α 프로모터 (EF1α)(Kim et al. (1990) Gene 91 (2): 217-223), 인간 포스포글리세레이트 키나제 프로모터 (PGK)(Singer-Sam et al. (1984) Gene 32(3): 409-417), 미토콘드리아 중질-가닥 프로모터 (Lodeiro et al. (2012) PNAS 109(17): 6513-6518), 유비퀴틴 프로모터 (Wulff et al. (1990) FEBS Letters 261: 101-105)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TRE는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터/인핸서 (예컨대, 서열번호 18 또는 19와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), SV40 프로모터, 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터 (예컨대, 서열번호 20 또는 21과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), smCBA 프로모터 (예컨대, 서열번호 22와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), 인간 신장 인자 1 알파 (EF1α) 프로모터 (예컨대, 서열번호 23과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), 전사 인자 결합 부위를 포함하는 마우스의 미세(minute) 바이러스 (MVM) 인트론 (예컨대, 서열번호 24 또는 25와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), 인간 포스포글리세레이트 키나제 (PGK1) 프로모터, 인간 유비퀴틴 C (Ubc) 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, 인간 뉴런-특이적 에놀라제 (ENO2) 프로모터, 인간 베타-글루쿠로니다제 (GUSB) 프로모터, 토끼 베타-글로빈 요소 (예컨대, 서열번호 26 또는 27과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), 인간 칼모듈린 1 (CALM1) 프로모터 (예컨대, 서열번호 28과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), 인간 ApoE/C-I 간 제어 영역 (HCR1) (예컨대, 서열번호 29와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), 인간 α1-항트립신 (hAAT) 프로모터 (예컨대, 서열번호 30, 31 또는 32와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), 연장된 HCR1 (예컨대, 서열번호 33과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), hAAT 프로모터의 HS-CRM8 요소 (예컨대, 서열번호 34와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), 인간 트랜스티레틴 (TTR) 프로모터 (예컨대, 서열번호 35와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함), 및/또는 인간 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2) 프로모터를 포함한다. 본원에 기재된 TRE 중 임의의 것은 효율적인 전사를 구동하기 위해 임의의 순서로 조합될 수 있다. 예를 들어, rAAV 게놈은 CMV 인핸서, CBA 프로모터, 및 총체적으로 CAG 프로모터 (예컨대, 서열번호 36과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함)라고 불리는 토끼 베타-글로빈 유전자의 엑손 3으로부터의 스플라이스 수용자를 포함하는 TRE를 포함할 수 있다. 예를 들어, rAAV 게놈은 CMV 인핸서 및 CBA 프로모터의 하이브리드, 이어서, 총체적으로 CASI 프로모터 영역 (예컨대, 서열번호 37과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함)이라고 불리는 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자를 포함하는 TRE를 포함할 수 있다. 예를 들어, rAAV 게놈은 HCR1 및 hAAT 프로모터 (예컨대, 서열번호 38과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, LP1 프로모터로서 또한 지칭됨)를 포함하는 TRE를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, TRE는 뇌-특이적 (예컨대, 뉴런-특이적, 교세포-특이적, 성상교세포-특이적, 희돌기아교세포-특이적, 미세아교세포-특이적 및/또는 중추신경계-특이적)이다. 예시적인 뇌-특이적 TRE는 제한 없이, 인간 신경교섬유성 산성 단백질 (GFAP) 프로모터, 인간 시냅신 1 (SYN1) 프로모터, 인간 시냅신 2 (SYN2) 프로모터, 인간 메탈로티오네인 3 (MT3) 프로모터 및/또는 인간 단백지질 단백질 1 (PLP1) 프로모터로부터의 하나 이상의 요소를 포함할 수 있다. 보다 많은 뇌-특이적 프로모터 요소는 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 WO 2016/100575A1에 개시되어 있다.
특정 실시양태에서, 트랜스진에 대한 천연 프로모터가 사용될 수 있다. 트랜스진의 발현이 천연 발현을 모방해야 하는 것이 바람직할 경우 천연 프로모터가 바람직할 수 있다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 일시적으로 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특이적 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 Kozak 컨센서스 서열을 사용하여 천연 발현을 또한 모방할 수 있다.
특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 편집 게놈을 포함한다. 편집 게놈은 편집 게놈과 세포 내 표적 유전자좌를 둘러싸는 게놈 영역의 상동 재조합에 의해 세포의 게놈을 편집하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 편집 게놈은 상동 재조합에 의해 유전자의 유전적 결함을 교정하도록 설계된다. 편집 게놈은 일반적으로 (i) 표적 유전자 내의 표적 유전자좌를 편집하기 위한 편집 요소; (ii) 표적 유전자좌에 대해 5'인 제1 게놈 영역과 상동성을 갖는 편집 요소의 5'의 5' 상동성 아암 뉴클레오티드 서열; 및 (iii) 표적 유전자좌에 대해 3'인 제2 게놈 영역과 상동성을 갖는 편집 요소의 3'의 3' 상동성 아암 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 5' 상동성 아암, 편집 요소 및 3' 상동성 아암을 포함하는 편집 게놈의 일부는 표적 유전자좌에 대해 센스 또는 안티센스 배향일 수 있다. 편집 게놈을 사용하여 편집하기에 적합한 표적 유전자는 제한 없이, 페닐알라닌 수산화효소 (PAH), 낭포성 섬유증 전도도 막관통 조절자 (CFTR), 베타 헤모글로빈 (HBB), 안구피부 백색증 II (OCA2), 헌팅틴 (HTT), 근긴장성 이영양증-단백질 키나제 (DMPK), 저-밀도 지질단백질 수용체 (LDLR), 아포지질단백질 B (APOB), 뉴로피브로민 1 (NF1), 다낭성 신장 질환 1 (PKD1), 다낭성 신장 질환 2 (PKD2), 응고 인자 VIII (F8), 디스트로핀 (DMD), 포스페이트-조절 엔도펩티다제 동족체, X-연결 (PHEX), 메틸-CpG-결합 단백질 2 (MECP2) 및 유비퀴틴-특이적 펩티다제 9Y, Y-연결 (USP9Y)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 rAAV 게놈은 전사 종결인자 (예컨대, 폴리아데닐화 서열)를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 전사 종결인자는 트랜스진에 대해 3'이다. 전사 종결인자는 전사를 효과적으로 종결시키는 임의의 서열일 수 있으며, 당업자는 항체 코딩 서열의 적어도 일부의 전사가 요망되는 세포에서 발현되는 임의의 유전자로부터 이러한 서열이 단리될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 실시양태에서, 전사 종결인자는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 면역글로불린 유전자의 내인성 폴리아데닐화 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 외인성 폴리아데닐화 서열이다. 특정 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 SV40 폴리아데닐화 서열이다 (예컨대, 서열번호 65, 68 또는 69과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함함). 특정 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 서열번호 65에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 서열번호 65에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 서열이다 (예컨대, 서열번호 67과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함함). 특정 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 서열번호 67에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 서열번호 67에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 서열번호 71, 85, 86, 87 또는 88에 제시된 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 편집 요소는 서열번호 71, 85, 86, 87 또는 88에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 편집 요소는 서열번호 71, 85, 86, 87 또는 88에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 rAAV 게놈은 TRE의 5'의 5' 역전 말단 반복부 (5' ITR) 뉴클레오티드 서열, 및 항체 경쇄 코딩 서열과 연관된 폴리아데닐화 서열의 3'의 3' 역전 말단 반복부 (3' ITR) 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 임의의 AAV 혈청형 또는 이의 변이체로부터의 ITR 서열은 본원에 개시된 rAAV 게놈에 사용될 수 있다. 5' 및 3' ITR은 동일한 혈청형의 AAV 또는 상이한 혈청형의 AAV로부터 유래될 수 있다. 본원에 개시된 rAAV 게놈에 사용하기 위한 예시적인 ITR은 본원의 서열번호 39, 40, 41, 42, 43 및 44에 제시되어 있다.
특정 실시양태에서, 5' ITR 또는 3' ITR은 AAV2로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 5' ITR 및 3' ITR 둘 모두는 AAV2로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열번호 39와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖거나, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열번호 40과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열번호 39와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 가지며, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열번호 40과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 서열번호 39의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호 40의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 5' ITR 또는 3' ITR은 AAV5로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 5' ITR 및 3' ITR 둘 모두는 AAV5로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열번호 42와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖거나, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열번호 43과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열번호 42와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 가지며, 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열번호 43과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 서열번호 42의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호 43의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열 및 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 실질적으로 서로 상보적이다 (예컨대, 5' 또는 3' ITR에서 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 뉴클레오티드 위치에서의 미스매치를 제외하고 서로 상보적임).
특정 실시양태에서, 5' ITR 또는 3' ITR은 변형되어, Rep 단백질에 의한 분해를 감소시키거나 폐지한다 ("비-분해가능한 ITR"). 특정 실시양태에서, 비-분해가능한 ITR은 말단 분해 부위의 뉴클레오티드 서열에서의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 이러한 변형은 rAAV 게놈이 감염된 세포에서 복제된 후 AAV의 자가-상보적인 이중-가닥 DNA 게놈의 형성을 가능하게 한다. 예시적인 비-분해가능한 ITR 서열은 당업계에 알려져 있다 (예컨대, 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, 미국 특허 번호 7,790,154 및 9,783,824에 제공된 것들 참고). 특정 실시양태에서, 5' ITR은 서열번호 41과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5' ITR은 서열번호 41과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 5' ITR은 서열번호 41에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 3' ITR은 서열번호 44와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5' ITR은 서열번호 44와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 3' ITR은 서열번호 44에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 5' ITR은 서열번호 41에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 3' ITR은 서열번호 44에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 5' ITR은 서열번호 41에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 3' ITR은 서열번호 44에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 5' ITR은 야생형 AAV2 게놈 서열로부터 유래된 추가적인 뉴클레오티드 서열에 측접된다. 특정 실시양태에서, 5' ITR은 AAV2 게놈에서 야생형 AAV2 ITR에 인접한 야생형 AAV2 서열로부터 유래된 추가적인 46 bp 서열에 측접된다. 특정 실시양태에서, 추가적인 46 bp 서열은 rAAV 게놈에서 5' ITR에 대해 3'이다. 특정 실시양태에서, 46 bp 서열은 서열번호 45에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 3' ITR은 야생형 AAV2 게놈 서열로부터 유래된 추가적인 뉴클레오티드 서열에 측접된다. 특정 실시양태에서, 3' ITR은 AAV2 게놈에서 야생형 AAV2 ITR에 인접한 야생형 AAV2 서열로부터 유래된 추가적인 37 bp 서열에 측접된다. 예컨대, Savy et al., Human Gene Therapy Methods (2017) 28(5): 277-289 (이는 그 전체가 본원에 본원의 참조로 원용됨) 참고. 특정 실시양태에서, 추가적인 37 bp 서열은 rAAV 게놈에서 3' ITR에 대해 5'이다. 특정 실시양태에서, 37 bp 서열은 서열번호 46에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
특정 실시양태에서, rAAV 게놈은 서열번호 75, 78, 80, 82 또는 84에 제시된 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 편집 요소는 서열번호 75, 78, 80, 82 또는 84에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 편집 요소는 서열번호 75, 78, 80, 82 또는 84에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
AAV Rep 단백질
본 개시내용은 Rep 단백질 코딩 서열 또는 이의 기능적 변이체의 코딩 서열을 포함하는 제1 핵산 벡터를 제공한다. AAV Rep 유전자의 발현은 2 개의 프로모터 및 대체 스플라이싱을 사용하여 제어되며, 4 개의 Rep 단백질인 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 초래한다. Rep 단백질은 AAV 게놈 복제 및 바이러스 게놈의 패키징에 관여한다. Rep 단백질의 발현은 p5 및 p19 프로모터에 의해 제어된다. p5 프로모터는 대체 스플라이스 변이체 Rep78 및 Rep68의 발현을 구동한다. p19 프로모터는 대체 스플라이스 변이체 Rep52 및 Rep40의 발현을 구동한다. 따라서, 제1 핵산 벡터는 하나 이상의 Rep 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
하나 이상의 Rep 단백질은 AAV2로부터 유래될 수 있다. 예시적인 AAV2 게놈 서열은 NCBI 참조 서열 NC_001401.2를 통해 찾아볼 수 있다. NCBI 참조 서열에 따르면, Rep68은 뉴클레오티드 321 내지 2252에 의해 코딩되고; Rep78은 뉴클레오티드 321 내지 2186에 의해 코딩되고; Rep40은 뉴클레오티드 993 내지 2252에 의해 코딩되고; Rep52는 뉴클레오티드 993 내지 2186에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 Rep78을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 Rep78을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 50에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep78을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Rep78을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 Rep78을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep78을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소는 서열번호 47에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep78을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소는 서열번호 47에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Rep78을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 51에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep78을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상이한 아데노바이러스 혈청형에서, AAV2에 대해 기재된 바와 같은 Rep78을 코딩하는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 Rep68을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 Rep68을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 52에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep68을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 52에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Rep68을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 Rep68을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep68을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소는 서열번호 47에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep68을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소는 서열번호 47에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Rep68을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 53에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep68을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 53에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상이한 아데노바이러스 혈청형에서, AAV2에 대해 기재된 바와 같은 Rep68을 코딩하는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 Rep40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 Rep40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 54에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 54에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Rep40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 Rep40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소는 서열번호 48에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소는 서열번호 48에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Rep40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 55에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 55에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상이한 아데노바이러스 혈청형에서, AAV2에 대해 기재된 바와 같은 Rep40을 코딩하는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 56에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 56에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소는 서열번호 48에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소는 서열번호 48에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 57에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 57에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상이한 아데노바이러스 혈청형에서, AAV2에 대해 기재된 바와 같은 Rep52를 코딩하는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 Rep78, Rep68, Rep40 및 Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 Rep78, Rep68, Rep40 및 Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 58에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep78, Rep68, Rep40 및 Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, Rep78, Rep68, Rep40 및 Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 Rep78, Rep68, Rep40 및 Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 각각에 작동가능하게 연결될 수 있는 하나 이상의 전사 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep78, Rep68, Rep40 및 Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 59에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Rep78, Rep68, Rep40 및 Rep52를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 59에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
AAV 캡시드 단백질
본 개시내용은 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 핵산 벡터를 제공한다. 제1 핵산 벡터는 자연 AAV 단리물 및 이의 변이체를 포함하여 당업계에 알려진 임의의 AAV 캡시드로부터의 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
AAV 캡시드 단백질은 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 포함한다. VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질은 rAAV 게놈을 둘러싸는 캡시드로 조립된다. 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질의 조립은 조립-활성화 단백질 (AAP)에 의해 촉진된다. 특정 AAV 혈청형의 캡시드는 조립을 위해 캡시드 단백질을 핵소체로 운반하는 데 AAP의 역할이 필요하다. 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV12는 캡시드를 형성하기 위해 AAP가 필요한 반면, AAV4, AAV5 및 AAV11의 캡시드는 AAP 없이 조립할 수 있다. 예컨대, Earley et al. (2017) J. Virol. 91(3): e01980-16 참고.
상이한 AAV 혈청형 또는 이의 변이체는 상이한 아미노산 서열을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 적합한 AAV 캡시드 단백질은 제한 없이, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-DJ, AAV-LK03, NP59, VOY101, VOY201, VOY701, VOY801, VOY1101, AAVPHP.N, AAVPHP.A, AAVPHP.B, PHP.B2, PHP.B3, G2A3, G2B4, G2B5, PHP.S, AAVrh10, AAVRh32.33, AAVrh74, AAVHSC1, AAVHSC2, AAVHSC3, AAVHSC4, AAVHSC5, AAVHSC6, AAVHSC7, AAVHSC8, AAVHSC9, AAVHSC10, AAVHSC11, AAVHSC12, AAVHSC13, AAVHSC14, AAVHSC15, AAVHSC16, AAVHSC17 및 이들의 임의의 변이체로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 및 AAVrh74로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8 및 AAVrh74로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 AAV 캡시드 단백질의 서열은 예컨대, 이의 개시내용이 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, 미국 특허 공개공보 번호: US20030138772, US20140359799, US20150159173, US20150376607, US20170081680 및 US20170360962A1, 및 PCT 공개공보 번호 WO2020227515에 개시되어 있다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다. 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열번호 16의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다. 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열번호 16의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이거나; 서열번호 16의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 68에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 V이거나; 서열번호 16의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이거나; 서열번호 16의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 D이거나; 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 T이고, 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Q이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 Y이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 K이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 L이고, 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 S이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이고, 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 H이고, 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 N이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 M이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 A이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시양태에서, 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 I이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이고, 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 C이다. 특정 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 2 개 이상을 포함한다: (a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 138-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 1-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 서열번호 8의 아미노산 203-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 8의 아미노산 138-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 1-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 서열번호 8의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 8의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 2 개 이상을 포함한다: (a) 서열번호 8의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 8의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 8의 아미노산 203-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 8의 아미노산 138-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 1-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 서열번호 11의 아미노산 203-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 11의 아미노산 138-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 1-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 서열번호 11의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 11의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 2 개 이상을 포함한다: (a) 서열번호 11의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 11의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 11의 아미노산 203-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 11의 아미노산 138-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 1-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 서열번호 13의 아미노산 203-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 13의 아미노산 138-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 1-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 서열번호 13의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 13의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 2 개 이상을 포함한다: (a) 서열번호 13의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 13의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 13의 아미노산 203-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 13의 아미노산 138-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 1-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 서열번호 16의 아미노산 203-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 16의 아미노산 138-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 16의 아미노산 1-736의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 서열번호 16의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 16의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 16의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음 중 2 개 이상을 포함한다: (a) 서열번호 16의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 16의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 16의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 16의 아미노산 203-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질; (b) 서열번호 16의 아미노산 138-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질; 및 (c) 서열번호 16의 아미노산 1-736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 AAV 캡시드 단백질의 발현을 제어하는 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 전사 조절 요소는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. AAV 캡시드 단백질의 발현을 제어할 수 있는 당업계에 알려진 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 사용하기에 적합한 프로모터는 당업자에게 알려져 있고, 제한 없이, p40 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터를 포함한다. 다른 적합한 프로모터는 제한 없이, CMV 프로모터, CBA 프로모터 및 CAG 프로모터를 포함한다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소는 서열번호 47, 48 또는 49에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소는 서열번호 47, 48 또는 49에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 Rep-Cap 요소를 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, Rep-Cap 요소는 AAV Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. Rep-Cap 요소는 당업계에 알려진 임의의 AAV Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 당업계에 알려진 임의의 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서 Rep-Cap 요소는 서열번호 73 또는 77에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
III. 제2 핵산 벡터
본원에 기재된 이중 벡터 형질주입 시스템은 일반적으로 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터를 포함한다. 당업자가 인식하는 바와 같이, AAV의 복제는 헬퍼 바이러스 유전자에 의해 코딩되는 헬퍼 인자의 존재에 따라 좌우된다. 헬퍼 인자는 헬퍼 바이러스, 예컨대, 제한 없이, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 유두종바이러스, 사이토메갈로바이러스, 배큘로바이러스 및 인간 보카바이러스로부터의 헬퍼 바이러스에 의한 동시감염을 통해 제공될 수 있다. 그러나, 헬퍼 바이러스의 존재 하에 AAV를 성장시키는 것은 숙주 세포의 용해 및/또는 AAV 생성물의 오염을 야기할 수 있다. 이와 같이, AAV 복제에 필요한 헬퍼 인자를 코딩하는 헬퍼 바이러스의 유전자는 숙주 세포를 형질주입시키는 데 사용되는 벡터에 제공될 수 있다.
본원에 기재된 이중 벡터 형질주입 시스템은 일반적으로 AAV (예컨대, rAAV) 생산을 위한 숙주 세포 내로의 다음의 2 개의 핵산 벡터의 형질주입을 수반한다: (1) AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터; 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터. 특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 제1 핵산 벡터에서 발견되는 AAV 생산의 임의의 구성요소를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 Rep 코딩 서열 또는 이의 기능적 단편의 코딩 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하지 않고/않거나, 제2 핵산 벡터는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열을 포함하지 않고/않거나, 제2 핵산 벡터는 Rep 코딩 서열 또는 이의 기능적 단편의 코딩 서열을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 배큘로바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 헬퍼 바이러스로부터 유래될 수 있는 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다. 헬퍼 바이러스 유전자는 헬퍼 바이러스 유전자의 발현을 제어하는 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 전사 조절 요소는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 사용하기에 적합한 프로모터는 당업자에게 알려져 있고, 제한 없이, RSV LTR 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다. 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자는 아데노바이러스 (AdV)로부터 유래될 수 있다. 효율적인 AAV 생산에 필요한 것으로 알려진 최소 세트의 AdV 헬퍼 인자는 AdV 분자 E1, E2, E4 및 VA RNA로 이루어진다 (예컨대, Meier et al. (2020) Viruses 12(6): 662 참고). 특히, 효율적인 AAV 생산에 필요한 최소 세트의 AdV 헬퍼 인자는 AdV 분자 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 숙주 세포 (예컨대, 숙주 AAV 생산 세포)에서 효율적인 AAV 생산 (예컨대, AAV 복제 및 패키징)을 허용할 충분한 세트의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
전형적인 AdV 게놈은 초기 단계 및 후기 단계로 나누어지는 약 40 개의 엄격하게 조절되는 단백질을 발현한다. 초기 단계 단백질은 E1A, E1B, E2A 및 E4를 포함한다. 간략하게, E1A 및 E2A 단백질은 AAV Rep 단백질의 발현을 제어하는 AAV 프로모터 p5 및 p19를 활성화하는 기능을 한다. E1A 매개된 p5 활성은 AAV 복제에 필요한 것으로 밝혀졌다. E2A는 AAV 복제의 다양한 양태를 촉진하는 것으로 알려진 단일-가닥 DNA 결합 단백질이다. E1B 유전자는 E1B19K 및 E1B55K 종양단백질을 코딩한다. E1B19K는 E1A 유도된 아폽토시스를 억제하고, E1B55K는 종양 억압 단백질 p53을 억제한다. E1B55K는 E4orf6과 함께 기능하여, AAV 제2 가닥 합성 및 바이러스 DNA 복제를 촉진한다. E1B55K는 또한 AAV mRNA 수송(export)을 촉진하고 세포 mRNA 수송을 억제하여, 함께 AAV 유전자 발현을 촉진하는 것으로 나타났다. E1B19K는 E1A, E1B55K, E2A 및 E4orf6과 같은 다른 AdV 헬퍼 인자와 공동-발현될 때 AAV 역가를 향상시키는 기능을 하는 것으로 밝혀졌다.
VA RNA는 세포 내재 면역 단백질 이중-가닥 RNA-활성화된 키나제 (PKR)를 억제하는 기능을 하는 것으로 밝혀졌으며, 이의 억제는 효율적인 바이러스 단백질 합성을 보장한다. VA RNA는 또한 AAV 구조 단백질의 합성 및 조립을 촉진하는 것으로 나타났다. AdV 게놈 내의 VA 핵산은 VA RNA를 발생시키는 비-번역된 핵산 서열이라는 것이 당업자에게 용이하게 이해될 것이다.
가장 통상적으로 사용되는 헬퍼 기능 중 하나는 인간 AdV 유형 5로부터 비롯된다. 아데노바이러스 헬퍼 바이러스 유전자는 다른 알려진 아데노바이러스, 예를 들어, AdV 유형 2로부터 유래될 수 있다. AdV5 게놈은 약 36 킬로베이스이며, 예시적인 AdV5 게놈 서열은 NCBI 참조 서열 AC_000008.1을 통해 찾아볼 수 있다. NCBI 참조 서열에 따르면, E1A는 뉴클레오티드 560 내지 1545에 의해 코딩되고; E1B19K는 뉴클레오티드 1714 내지 2244에 의해 코딩되고; E1B55K는 뉴클레오티드 2019 내지 3509에 의해 코딩되고; E2A는 뉴클레오티드 22443 내지 24032에 의해 코딩되며; E4orf6/7은 뉴클레오티드 32914 내지 34077에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 AdV5 E2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 특정 실시양태에서, AdV5 E2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 AdV5 E2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, AdV5 E2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 60에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, AdV5 E2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 60에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상이한 아데노바이러스 혈청형 (예컨대, AdV2)에서, AdV5에 대해 기재된 바와 같은 E2A를 코딩하는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 AdV5 E4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 특정 실시양태에서, AdV5 E4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 AdV5 E4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, AdV5 E4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 61에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, AdV5 E4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 61에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상이한 아데노바이러스 혈청형 (예컨대, AdV2)에서, AdV5에 대해 기재된 바와 같은 E4를 코딩하는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 AdV5 VA RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 특정 실시양태에서, AdV5 VA RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 AdV5 VA RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, AdV5 VA RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 62에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, AdV5 VA RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 62에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. VA RNA 핵산 서열은 VA RNA를 발생시키는 (예컨대, "코딩하는") 비-번역된 핵산 서열이라는 것이 당업자에게 용이하게 이해될 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상이한 아데노바이러스 혈청형 (예컨대, AdV2)에서, AdV5에 대해 기재된 바와 같은 VA RNA를 코딩하는 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 AdV5 E2A, E4 및 VA RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 특정 실시양태에서, AdV5 E2A, E4 및 VA RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 AdV5 E2A, E4 및 VA RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 각각에 작동가능하게 연결될 수 있는 하나 이상의 전사 조절 요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, AdV5 E2A, E4 및 VA RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 63에 제시된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, AdV5 E2A, E4 및 VA RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 63에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 효율적인 AAV 생산에 필요한 최소 세트의 AdV 헬퍼 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 특정 실시양태에서, 최소 세트의 AdV 헬퍼 인자를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산은 AdV 분자 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA RNA를 코딩한다.
특정 숙주 세포, 예컨대, HEK293T 세포는 필요한 헬퍼 인자 전부는 아니지만 일부를 내인적으로 제공하고, 나머지 헬퍼 인자는 플라스미드 형질주입을 통해 외인적으로 제공될 수 있다. 예를 들어, HEK293T 세포는 아데노바이러스 E1A 및 E1B 유전자를 내인적으로 발현하고, 나머지 아데노바이러스 헬퍼 유전자, 즉, AdV5 E4, E2A 및 바이러스-연관된 (VA) RNA를 코딩하는 유전자를 제공한다. 이러한 AdV5 헬퍼 유전자는 형질주입을 통해 단일 벡터에 의해 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 E2A, E4 및 VA RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 AdV5 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상이한 아데노바이러스 혈청형 (예컨대, AdV2)으로부터 유래된, AdV5에 대해 기재된 바와 같은 E2A, E4 및 VA RNA를 코딩하는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터를 제공한다.
헬퍼 바이러스 유전자는 또한 헤르페스바이러스, 유두종바이러스 및 인간 보카바이러스로부터 유래될 수 있다. 헬퍼 바이러스 인자가 유래될 수 있는 헤르페스바이러스의 예는 HSV-1 및 HSV-2를 포함한다. AAV 생산을 지지하는 데 관여하는 것으로 알려진 HSV-1로부터 유래된 헬퍼 바이러스 인자는 제한 없이, UL5, UL8, UL52, ICP8, ICP0, ICP4, ICP22, UL30 및 UL42를 포함한다. 이러한 HSV-1 헬퍼 바이러스 인자의 다양한 기능 및 이들이 AAV 생산을 지지하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 단일-가닥 DNA 결합 단백질 ICP8 외에 HSV-1 헬리카제-프리마제 복합체 UL5/UL8/UL52는 AAV 감염 모델에서 AAV 자손 생산을 복원하는 데 충분한 것으로 알려져 있으며; ICP0, ICP4 및 ICP22는 Rep 단백질의 발현을 촉진하는 데 관여되어 있고; HSV-1 DNA 중합효소 UL30/UL42는 AAV DNA의 복제에 관여되어 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 제2 핵산 벡터는 UL5, UL8, UL52, ICP8, ICP0, ICP4, ICP22, UL30 및 UL42로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다. 헬퍼 바이러스 인자가 유래될 수 있는 유두종바이러스의 예는 HPV-16이다. 특정 실시양태에서, HPV-16으로부터 유래된 헬퍼 바이러스 인자는 AdV 헬퍼 인자의 존재 하에 AAV 생산을 향상시킬 수 있다. AAV 복제를 지지하는 데 관여하는 것으로 알려진 이러한 HPV-16 헬퍼 인자는 제한 없이, E1, E2 및 E6을 포함한다. 헬퍼 바이러스 인자가 유래될 수 있는 인간 보카바이러스의 예는 인간 보카바이러스 1 (HBoV1)이다. AAV 생산을 지지하는 데 관여하는 것으로 알려진 HBoV1로부터 유래된 헬퍼 바이러스 인자는 제한 없이, NP1, NS2, NS4 및 바이러스의 긴 비코딩 RNA BocaSR을 포함한다.
IV. 벡터 및 세포
본 개시내용은 AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터; 및 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터를 제공한다.
제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터는 독립적으로 임의의 형태의 핵산 벡터일 수 있다. 적합한 벡터는 제한 없이, 플라스미드, 최소 벡터 (예컨대, 미니서클, 나노플라스미드(Nanoplasmids)TM, 도기본(doggybones) 및 MIDGE 벡터 등), 바이러스, 코스미드, 인공 염색체, 선형 DNA 및 mRNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 및/또는 제2 핵산 벡터는 DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터이다. 필요한 벡터 요소를 수용할 수 있는 임의의 DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터가 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터에 사용될 수 있다. 적합한 DNA 최소 벡터는 제한 없이, 선형 공유 폐쇄 DNA (예컨대, 미니스트링 DNA), 선형 공유 폐쇄 덤벨 모양의 DNA (예컨대, 도기본 DNA, 덤벨 DNA), 미니서클, 나노플라스미드TM, 최소한의 면역학적으로 정의된 유전자 발현 (MIDGE) 벡터, 및 당업자에게 알려진 기타를 포함한다. DNA 최소 벡터 및 이들의 생산 방법은 예컨대, 이들 모두가 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 미국 특허 출원 번호 20100233814, 20120282283, 20130216562, 20150218565, 20150218586, 20160008488, 20160215296, 20160355827, 20190185924, 20200277624 및 20210010021에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 벡터 내의 핵산은 예컨대, 코돈/RNA 최적화, 이종 신호 서열로의 대체 및/또는 mRNA 불안정성 요소의 제거에 의해 최적화된다. mRNA에서 코돈 변화를 도입하고/하거나 억제 영역을 제거함으로써 재조합 발현을 위한 최적화된 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법은 예컨대, 미국 특허 번호 5,965,726; 6,174,666; 6,291,664; 6,414,132; 및 6,794,498에 기재된 최적화 방법을 적용함으로써 수행될 수 있으며, 이들 모두는 이에 따라 그 전체가 참조로 본원에 원용된다. 예를 들어, RNA 내의 잠재적 스플라이스 부위 및 불안정성 요소 (예컨대, A/T 또는 A/U 풍부 요소)는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산을 변경하지 않으면서 돌연변이되어, 재조합 발현을 위한 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 변경은 예컨대, 동일한 아미노산에 대해 대체 코돈을 사용하는 유전자 코드의 축퇴성을 활용한다. 특정 실시양태에서, 보존적 돌연변이, 예컨대, 원래의 아미노산과 유사한 화학적 구조 및 특성 및/또는 기능을 갖는 유사한 아미노산을 코딩하기 위해 하나 이상의 코돈을 변경하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법은 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 캡시드의 발현에 비해 코딩된 캡시드 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
본원에 개시된 벡터는 벡터의 증식 및/또는 벡터에 의해 코딩된 단백질의 발현을 위해 (당업계에 알려진 임의의 기술을 사용하여) 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 그리고 추가로, 다른 양태에서, 본 개시내용은 rAAV를 생산하는 방법을 제공하며, 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 rAAV가 생산되는 조건 하에서 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
다양한 숙주 세포 및 발현 시스템이 활용될 수 있다. 이러한 발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생산되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 본원에 기재된 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질주입될 때 rAAV를 생산할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 예컨대, 본원에 기재된 뉴클레오티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대, 박테리아 (예컨대, 대장균 및 B. 서브틸리스(B. subtilis)); 예컨대, 본원에 기재된 뉴클레오티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예컨대, 사카로마이세스 피키아(Saccharomyces Pichia)); 예컨대, 본원에 기재된 뉴클레오티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예컨대, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 예컨대, 재조합 바이러스 발현 벡터 (예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나, 예컨대, 본원에 기재된 뉴클레오티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예컨대, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템 (예컨대, 녹조류, 예컨대, 클라마이도모나스 레인하르티이(Chlamydomonas reinhardtii); 또는 예컨대, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 포함하는 본원에 기재된 뉴클레오티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유동물 세포 시스템 (예컨대, COS (예컨대, COS1 또는 COS), CHO, BHK, MDCK, HEK293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa 및 NIH 3T3, HEK293T, HEK293F, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 및 BMT10 세포)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 뉴클레오티드 코딩 서열을 발현하기 위한 세포는 인간 세포, 예컨대, 인간 세포주이다. 특정 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 pOptiVECTM 또는 pcDNA3.3이다. 특정 실시양태에서, 박테리아 세포, 예컨대, 대장균 또는 진핵 세포 (예컨대, 포유동물 세포)는 본원에 기재된 뉴클레오티드 코딩 서열의 발현을 위해 사용된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터 요소와 함께, 포유동물 세포, 예컨대, CHO 또는 HEK293 세포는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대한 효과적인 발현 시스템이다.
박테리아 시스템에서, 발현될 단백질에 대해 의도된 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 대량의 단백질이 생산되어야 하는 경우, 용이하게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는, 단백질 코딩 서열이 lac Z 코딩 영역과 함께 프레임 내 벡터에 개별적으로 결찰되어 융합 단백질이 생산될 수 있도록 하는 대장균 발현 벡터 pUR278 (Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794); 및 pIN 벡터 (Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509); 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 이들 모두가 그 전체가 본원에 참조로 원용된다. 예를 들어, pGEX 벡터는 또한 글루타티온 5-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합 후 유리 글루타티온의 존재 하의 용리에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
곤충 시스템에서, 예를 들어, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다각체증 바이러스 (AcNPV)는 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용될 수 있다. 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 단백질 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자)에 개별적으로 클로닝될 수 있으며, AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에서 배치될 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 활용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심 단백질 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예컨대, 후기 프로모터 및 3부분 리더(tripartite leader) 서열에 결찰될 수 있다. 그런 다음, 이 키메라 유전자는 생체 외 또는 생체 내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역 (예컨대, 영역 E1 또는 E3)에서의 삽입은 감염된 숙주에서 본원에 기재된 뉴클레오티드 코딩 서열을 발현할 수 있고 생존가능한 재조합 바이러스를 초래할 것이다 (예컨대, 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81(12): 3655-9 참고). 삽입된 단백질 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특이적 개시 신호가 또한 필요할 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 더욱이, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 위상이 같아야 한다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 자연 및 합성 둘 모두의 다양한 기원일 수 있다. 발현의 효율성은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결인자 등의 포함에 의해 향상될 수 있다 (예컨대, 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 Bitter Get al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544 참고).
게다가, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나 원하는 특이적 방식으로 유전자 산물을 변형 및 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형 (예컨대, 글리코실화) 및 가공 (예컨대, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역-후 가공 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메커니즘을 가지고 있다. 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 가공을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 일차 전사물의 적절한 가공, 글리코실화 및 유전자 산물의 인산화를 위한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK293, HEK293T, HEK293F, HEK293EBNA, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0 (내인적으로 임의의 면역글로불린 쇄를 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CAP, CAP-T, CRL7O3O, COS (예컨대, COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, AGE1.CR, A549, HsS78Bst, HepG2, C139, EB66, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 대신, 숙주 세포는 적절한 전사 조절 요소 (예컨대, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 제어되는 폴리뉴클레오티드 (예컨대, DNA 또는 RNA)로 형질전환될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 도입 후, 조작된 세포를 농축 배지에서 1-2 일 동안 성장시킨 다음, 선택 배지로 스위칭할 수 있다. 재조합 플라스미드의 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 이들의 염색체에 안정적으로 통합하고 성장시켜 초점을 형성할 수 있도록 하며, 이는 결과적으로 클로닝되어 세포주로 확장될 수 있다. 이 방법은 유리하게는 본원에 기재된 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포주를 조작하기 위해 사용될 수 있다.
이들 모두가 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포의 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (Wigler M et al. (1977) Cell 11(1): 223-32), 하이포크산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy I et al. (1980) Cell 22(3): 817-23) 유전자를 비제한적으로 포함하는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 저항성은 다음의 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다: 이들 모두가 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr (Wigler M et al. (1980) PNAS 77(6): 3567-70; O'Hare K et al. (1981) PNAS 78: 1527-31); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-6); 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo (Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; 및 Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5); 및 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro (Santerre RF et al. (1984) Gene 30(1-3): 147-56). 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 공지된 방법은 원하는 재조합 클론을 선택하기 위해 일상적으로 적용될 수 있으며, 이러한 방법은 이들 모두가 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, 예를 들어 Ausubel FM et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 제12장 및 제13장, Dracopoli NC et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colbere-Garapin F et al. (1981) J Mol Biol 150: 1-14에 기재되어 있다.
V. 아데노-연관된 바이러스 패키징 시스템 및 방법
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV)의 재조합 제조를 위한 패키징 시스템을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 본원에 기재된 이중 벡터 형질주입 시스템 하에서 AAV 생산에 유용한 패키징 시스템을 제공한다 (예컨대, AAV 생산은 숙주 세포 내로 전달되는 제1 및 제2 핵산 벡터를 포함하는 패키징 시스템의 사용에 의해 매개됨). 이러한 패키징 시스템은 일반적으로 다음을 포함하거나 이로 이루어진다: (1) AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터; 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터. 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터는 함께 rAAV의 생산에 필요한 모든 구성요소를 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, rAAV의 생산에 필요한 구성요소는 rAAV가 생산되는 숙주 세포에 의해 제공된다. 이러한 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터는 숙주 세포와 함께, rAAV의 생산에 필요한 모든 구성요소를 제공할 수 있다. 본원에 기재된 패키징 시스템은 rAAV 게놈을 캡시드에 동봉하여 rAAV를 형성하기 위한 세포에서 작동적이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는, rAAV 패키징 시스템을 제공한다: (1) AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터; 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는, rAAV 패키징 시스템을 제공한다: (1) 5'에서 3'으로, AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터; 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터.
특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제1 핵산 벡터는 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함한다. 본 개시내용의 패키징 시스템의 제1 핵산 벡터는 AAV Rep 단백질 코딩 서열 또는 이의 기능적 변이체의 코딩 서열, 및 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열을 추가로 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 AAV Rep 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 패키징 시스템의 제1 핵산 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제1 핵산 벡터는 5'으로부터 3'으로, AAV Rep 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제1 핵산 벡터는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지 않는다.
임의의 AAV Rep 단백질이 본원에 개시된 패키징 시스템에 사용될 수 있다. 패키징 시스템의 특정 실시양태에서, Rep 뉴클레오티드 서열은 AAV2 Rep 단백질을 코딩한다. 적합한 AAV2 Rep 단백질은 제한 없이, Rep 78/68 또는 Rep 68/52를 포함할 수 있다. 패키징 시스템의 특정 실시양태에서, AAV2 Rep 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 64의 AAV2 Rep 아미노산 서열과 최소 퍼센트 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 최소 퍼센트 서열 동일성은 AAV2 Rep 단백질의 아미노산 서열의 길이에 걸쳐 70% 이상 (예컨대, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%)이다. 패키징 시스템의 특정 실시양태에서, AAV2 Rep 단백질은 서열번호 64에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다. 본 개시내용의 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터는 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 특정 양태는 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터가 본원에 기재된 바와 같은 제1 핵산 벡터에서 발견되는 AAV 생산의 임의의 구성요소를 포함하지 않는다는 것을 제공한다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터는 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터는 Rep 코딩 서열 또는 이의 기능적 변이체의 코딩 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터는 트랜스진을 포함하는 rAAV 게놈을 포함하지 않고/않거나, 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열을 포함하지 않고/않거나, 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터는 Rep 코딩 서열 또는 이의 기능적 변이체의 코딩 서열을 포함하지 않는다.
패키징 시스템의 특정 실시양태에서, 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 (단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 포함), 폭스바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 및 배큘로바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 헬퍼 바이러스가 아데노바이러스인 패키징 시스템의 특정 실시양태에서, 아데노바이러스 게놈은 E1, E2, E4 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아데노바이러스 RNA 유전자를 포함한다. 패키징 시스템의 특정 실시양태에서, 여기서 아데노바이러스 게놈은 E2, E4 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아데노바이러스 RNA 유전자를 포함한다. 헬퍼 바이러스가 HSV인 패키징 시스템의 특정 실시양태에서, HSV 게놈은 UL5/8/52, ICPO, ICP4, ICP22 및 UL30/UL42로 이루어진 군으로부터 선택되는 HSV 유전자 중 하나 이상을 포함한다.
패키징 시스템의 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제1 및 제2 핵산 벡터는 2 개의 플라스미드 내에 함유된다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제1 핵산 벡터는 제1 플라스미드 내에 함유된다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터는 제2 플라스미드 내에 함유된다.
패키징 시스템의 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제1 및 제2 핵산 벡터는 2 개의 재조합 헬퍼 바이러스 내에 함유된다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제1 핵산 벡터는 제1 재조합 헬퍼 바이러스 내에 함유된다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제2 핵산 벡터는 제2 재조합 헬퍼 바이러스 내에 함유된다. 특정 실시양태에서, 패키징 시스템의 제1 및 제2 핵산 벡터는 단일 재조합 헬퍼 바이러스 내에 함유된다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 rAAV의 재조합 제조 방법을 제공하며, 여기서 방법은 rAAV 게놈을 캡시드에 봉입하여 rAAV를 형성하도록 작동하는 조건 하에서 본원에 기재된 바와 같은 패키징 시스템으로 세포를 형질주입 또는 형질도입하는 단계를 포함한다. rAAV의 재조합 제조를 위한 예시적인 방법은 일시적 형질주입 (예컨대, 하나 이상의 형질주입 플라스미드를 이용한), 바이러스 감염 (예컨대, 하나 이상의 재조합 헬퍼 바이러스, 예컨대, 아데노바이러스, 폭스바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스), 헤르페스 바이러스 (HSV, 사이토메갈로바이러스 또는 배큘로바이러스 포함)를 이용한) 및 안정한 생산자 세포주 형질주입 또는 감염 (예컨대, 안정한 생산자 세포, 예컨대, 포유동물 또는 곤충 세포를 이용한)을 포함한다.
따라서, 본 개시내용은 rAAV의 제조를 위한 패키징 시스템을 제공하며, 여기서 패키징 시스템은 다음을 포함한다: (1) AAV Rep 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터, 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV의 제조를 위한 패키징 시스템을 제공하며, 여기서 패키징 시스템은 다음을 포함한다. (1) 5'에서 3'으로, AAV Rep 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터, 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터.
따라서, 본 개시내용은 rAAV의 재조합 제조 방법을 제공하며, 여기서 방법은 다음을 포함하는, 패키징 시스템으로 세포를 형질주입 또는 형질도입하는 단계를 포함한다: (1) AAV Rep 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터, 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV의 재조합 제조 방법을 제공하며, 여기서 방법은 다음을 포함하는, 패키징 시스템으로 세포를 형질주입 또는 형질도입하는 단계를 포함한다: (1) 5'에서 3'으로, AAV Rep 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터, 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터.
특정 실시양태에서, (1) AAV Rep 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; rAAV 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제1 핵산 벡터, 및 (2) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터를 포함하여 세포 내로 형질주입 또는 형질도입되는 핵산의 총량은 0.1 μg의 DNA/1E6 세포 내지 4 μg의 DNA/1E6 세포이다. 예를 들어, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터를 포함하여 세포 내로 형질주입 또는 형질도입되는 핵산의 총량은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4 μg의 DNA/1E6 세포이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터를 포함하여 세포 내로 형질주입 또는 형질도입되는 핵산의 총량은 1 μg의 DNA/1E6 세포이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터를 포함하여 세포 내로 형질주입 또는 형질도입되는 핵산의 총량은 0.6 μg의 DNA/1E6 세포이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터를 포함하여 세포 내로 형질주입 또는 형질도입되는 핵산의 총량은 0.7 μg의 DNA/1E6 세포이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터를 포함하여 세포 내로 형질주입 또는 형질도입되는 핵산의 총량은 0.75 μg의 DNA/1E6 세포이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터를 포함하여 세포 내로 형질주입 또는 형질도입되는 핵산의 총량은 0.8 μg의 DNA/1E6 세포이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 및 제2 핵산 벡터를 포함하여 세포 내로 형질주입 또는 형질도입되는 핵산의 총량은 0.9 μg의 DNA/1E6 세포이다.
특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:0.1 내지 1:20이다. 예를 들어, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1.4.5, 1:5, 1:5.5, 1:6, 1:6.5, 1:7, 1:7.5, 1:8, 1:8.5, 1:9, 1:9.5, 1:10, 1:10.5, 1:11, 1:11.5, 1:12, 1:12.5, 1:13, 1:13.5, 1:14, 1:14.5, 1:15, 1:15.5, 1:16, 1:16.5, 1:17, 1:17.5, 1:18, 1:18.5, 1:19, 1:19.5 또는 1:20이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:0.2, 1:0.4, 1:0.6, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3 또는 1:4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:2이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:0.2 내지 1:1이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:0.6이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:0.8이다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율은 1:1이다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 rAAV의 재조합 제조 방법은 다음을 포함하는 포유동물 세포를 사용하여 rAAV를 생산하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 증가된 rAAV 역가를 초래한다: (i) AAV Rep 단백질 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터; (ii) rAAV 게놈을 포함하는 제2 벡터; 및 (iii) 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제3 벡터. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 rAAV의 재조합 제조 방법은 다음을 포함하는 포유동물 세포를 사용하여 rAAV를 생산하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 증가된 rAAV 역가를 초래한다: (i) AAV Rep 단백질 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터; (ii) rAAV 게놈을 포함하는 제2 벡터; 및 (iii) 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제3 벡터.
특정 실시양태에서, 포유동물 세포는 세포 배양물로 제공된다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 2 리터 이상, 50 리터 이상, 또는 2000 리터 이상의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 5000 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 4000 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 3000 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 2500 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 2000 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 1500 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 1000 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 500 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 250 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 100 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 50 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 약 2 리터 내지 약 25 리터의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 2 리터 이상, 50 리터 이상, 또는 2000 리터 이상의 부피를 갖는 생물반응기에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 2000 리터의 부피를 갖는 생물반응기에서 수행된다.
실시예
다음의 실시예는 제한이 아닌 예시를 위해 제공된다.
실시예 1: 재료 및 방법
다음의 실시예에서는 다음의 일반적인 재료 및 방법을 사용하였다.
소규모 생산: HEK293 세포를 1 회 이상의 계대 동안 확장시키고, 형질주입 전에 적절한 양의 세포 배양 배지를 함유하는 진탕 플라스크에 접종하였다. 진탕 플라스크를 진탕기에서 37℃, 8% CO2 및 135 rpm에서 항온처리하였다. 세포가 1.8E6 내지 2.4E6 개의 세포/mL (실시예 1-8의 경우) 또는 3.6E6 내지 5E6 개의 세포/mL (실시예 9의 경우)의 밀도에 도달하였을 때 세포를 형질주입시켰다. 계산된 부피의 벡터(들), OptiPro 배지 및 폴리에틸렌이민 (PEI)을 모두 주변 온도에서 혼합함으로써 형질주입 혼합물을 제조하였다. 그런 다음, 형질주입 혼합물을 진탕 플라스크에 첨가하고, 수확 전 72 시간 동안 37℃, 8% CO2 및 135 rpm에서 진탕기에서 항온처리하였다. 72 시간의 항온처리 후, 세포를 1 M Tris (pH 9.5), 10% Triton X-100, 1 M MgCl2, 엔도뉴클레아제 (예컨대, 벤조나제(BENZONASE)®, 데나라세(DENARASE)®) 및 5 M NaCl을 함유하는 용해 완충액을 사용하여 용해시키고, 진탕 플라스크를 37℃, 8% CO2 및 135 rpm에서 60 분 동안 항온처리하였다. 조질의 용해물 샘플을 원심분리에 의해 수집하였다.
2 L 생물반응기 생산: HEK293 세포를 1 회 이상의 계대 동안 확장시키고, 형질주입 전에 적절한 양의 세포 배양 배지를 함유하는 2 L 생물반응기 (Millipore Mobius)에 접종하였다. pH를 형질주입-전 7.1±0.1로 이동시키고, 세포를 1.8E6 내지 2.4E6 개의 세포/mL (실시예 4-8의 경우) 또는 3.6E6 내지 5E6 개의 세포/mL (실시예 9-11의 경우)의 밀도로 형질주입시켰다. 계산된 부피의 벡터(들), OptiPro SFM 배지 및 폴리에틸렌이민 (PEI)을 모두 주변 온도에서 혼합함으로써 형질주입 혼합물을 제조하고, 형질주입 혼합물을 세포에 첨가하기 전에 10 분 동안 평형화되도록 하였다. 형질주입 69-75 시간 후에 세포를 수확하였다. 수확된 세포를 1 M Tris (pH 9.5), 10% Triton X-100, 1 M MgCl2, 엔도뉴클레아제 (예컨대, 벤조나제®, 데나라세®) 및 5 M NaCl을 함유하는 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. 적절한 부피의 용해 완충액을 생물반응기에 첨가하고, 세포를 37℃ 및 283 rpm에서 120 분 동안 항온처리하였다. 세포 잔해물을 제거하기 위해 원심분리 후에 조질의 용해물 샘플을 수집하였다.
세포당 벡터 게놈의 수 (vg/세포)의 벡터 게놈 생산성은 트랜스진을 포함하는 벡터 (즉, 트랜스진 벡터)의 트랜스진 페이로드에 특이적인 프라이머/프로브 세트를 사용하는 표준 방법에 의해 액적 디지털 PCR (ddPCR)에 의해 결정되었다. 리터당 벡터 게놈의 수 (vg/L)의 벡터 게놈 생산성은 트랜스진을 포함하는 벡터 (즉, 트랜스진 벡터)의 트랜스진 페이로드에 특이적인 프라이머/프로브 세트를 사용하는 표준 방법에 의해 액적 디지털 PCR (ddPCR)에 의해 결정되었다. 세포당 캡시드의 수는 Cap 서열을 포함하는 벡터에 의해 코딩된 바와 같은 캡시드의 에피토프에 대해 지시된 고정화된 항체를 이용하는 표준 방법에 의한 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 결정되었다. 온전한 벡터 게놈의 백분율 (즉, 전체 캡시드의 백분율)은 ddPCR에 의해 결정된 벡터 게놈 생산성을 (실시예 2-4에서의) ELISA에 의해 결정된 세포당 캡시드의 수로 나눔으로써 계산하거나, (실시예 5에서의) 분석적 초원심분리 침강 속도 (AUC) 분석에 의해 결정되었다.
실시예 2: 이중 및 삼중 형질주입 시스템 간의 비교
벡터 게놈 (VG) 생산성과 관련하여 이중 벡터 형질주입 시스템의 유용성 및 삼중 형질주입 시스템과 비교하여 수득될 수 있는 온전한 벡터 게놈의 백분율을 평가하기 위해 초기 소-규모 생산, 개념-증명 연구를 수행하였다. 형질주입 조건을 표 1에 제시된 조건에 따라 설정하였다.
표 1: 형질주입 조건
표 1에 제시된 바와 같이, 이중 벡터 형질주입 시스템은 제1 V4 벡터 및 제2 V3 벡터를 포함하였다. 삼중 벡터 형질주입 시스템은 벡터 V1, V2 및 V3을 포함한다. 표 1에서, 벡터 비율은 질량을 기반으로 하였다. 다양한 벡터 내에 함유된 요소는 표 2에 제시되어 있다.
계산된 부피의 벡터(들), OptiPro 배지 및 폴리에틸렌이민 (PEI)을 모두 주변 온도에서 첨가함으로써 적절한 크기의 원뿔형 튜브에서 각각의 형질주입 조건에 대한 형질주입 혼합물을 제조하였다. 형질주입 혼합물을 1 μg의 DNA/1E6 세포의 농도로 세포에 첨가하였다. 진탕 플라스크를 수확 전 72 시간 동안 항온처리하였다. 수확 시, 세포를 용해시키고, 후속 액적 디지털 PCR (ddPCR) 및 ELISA에 의한 캡시드 분석을 위해, 원심분리 후에 조질의 용해물 샘플을 수집하여 세포 잔해물을 제거하였다.
표 2: 벡터 요소
도 1a-1c는 이중 및 삼중 형질주입 시스템을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 1a), 캡시드 생산성 (도 1b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 1c)을 도시한다. 도 1a 및 1c에 도시된 바와 같이, 이중 벡터 형질주입 시스템을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율은 삼중 벡터 형질주입 시스템으로부터 수득된 것보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는 이중 벡터 형질주입 시스템을 사용하는 것이 대조군 삼중 벡터 형질주입 시스템과 비교하여 증가된 rAAV 역가를 초래한다는 것을 입증한다. 도 1a-1c에 도시된 다양한 조건이 표 1에 제시되어 있다.
이중 형질주입 시스템으로부터 수득된 증가된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 증가된 백분율이 상이한 트랜스진 벡터를 사용하여 복제될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 추가적인 형질주입 조건을 이용하여 확인 실험을 수행하였다. 형질주입 조건은 표 3에 제시된 조건에 따라 설정되었으며, 다양한 벡터 내에 함유된 요소는 표 2에 제시되어 있다. 표 2에서, 벡터 비율은 질량을 기반으로 하였다.
표 3: 형질주입 조건
계산된 부피의 벡터(들), OptiPro 배지 및 폴리에틸렌이민 (PEI)을 모두 주변 온도에서 첨가함으로써 적절한 크기의 원뿔형 튜브에서 각각의 형질주입 조건에 대한 형질주입 혼합물을 제조하였다. 형질주입 혼합물을 1 μg의 DNA/1E6 세포의 농도로 세포에 첨가하였다. 진탕 플라스크를 수확 전 72 시간 동안 항온처리하였다. 수확 시, 세포를 용해시키고, 후속 액적 디지털 PCR (ddPCR) 및 ELISA에 의한 캡시드 분석을 위해, 원심분리 후에 조질의 용해물 샘플을 수집하여 세포 잔해물을 제거하였다.
도 2a-2c는 이중 및 삼중 형질주입 시스템을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 2a), 캡시드 생산성 (도 2b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 2c)을 도시한다. 도 2a 및 2c에 도시된 바와 같이, 이중 벡터 형질주입 시스템을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율은 삼중 벡터 형질주입 시스템으로부터 수득된 것보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이중 벡터 형질주입 시스템의 증가된 생산성은 인간 게놈 특이적 상동성 아암을 포함하는 편집 게놈 (조건 1 및 2) 또는 마우스 게놈 특이적 상동성 아암을 포함하는 편집 게놈 (조건 3 및 4)을 포함하는 2 개 이상의 상이한 트랜스진 벡터에 걸쳐 일관된 것으로 밝혀졌다. 도 2a-2c에 도시된 다양한 조건은 표 3에 제시되어 있다.
종합하면, 본 실시예에 제시된 데이터는 삼중 형질주입 시스템과 비교하여 이중 벡터 형질주입 시스템의 효능을 나타낸다. 특히, 이중 벡터 형질주입 시스템은 조질의 용해물 역가 및 온전한 벡터 게놈의 백분율을 증가시켰다.
실시예 3: 이중 벡터 형질주입 시스템 설계 간의 비교
이중 벡터 형질주입 시스템에서 벡터 요소의 구성이 생산성에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 2 개의 이중 벡터 형질주입 시스템 설계을 테스트하였다. 각각의 설계에 기반한 생산으로부터 수득된 벡터 게놈 (VG) 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율을 평가하였다. 이중 벡터 형질주입 시스템 설계-1 ("설계-1") 및 설계-2 ("설계-2")는 벡터 게놈 및 헬퍼 서열과 관련하여 Rep/Cap 서열이 상주하는 벡터가 상이하다. 도 3a-3b는 설계-1 (도 3a) 및 설계-2 (도 3b)의 개략도를 제공한다. 도시된 바와 같이, 설계-1은 Rep/Cap 서열 및 트랜스진 ("GOI")을 포함하는 제1 벡터, 및 헬퍼 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하고 (도 3a); 설계-2는 트랜스진 ("GOI")을 포함하는 제1 벡터, 및 헬퍼 및 Rep/Cap 서열 둘 모두를 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (도 3b). 형질주입 조건은 표 4에 제시된 조건에 따라 설정되었다.
표 4: 형질주입 조건
표 4에 제시된 바와 같이, 설계-1은 제1 V4 벡터 및 제2 V3 벡터를 포함한다. 설계-2는 제1 V1 벡터 및 제2 V7 벡터를 포함한다. 삼중 형질주입으로부터 수득된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율을 대조군으로서 평가하였다. 다양한 벡터 내에 함유된 요소는 표 2에 제시되어 있다. 표 4에서, 벡터 비율은 이중 벡터 형질주입 시스템 설계를 비교할 때 벡터의 상이한 크기를 고려하기 위해 플라스미드 크기 (즉, 몰 비율)를 기반으로 하였다.
계산된 부피의 벡터(들), OptiPro 배지 및 폴리에틸렌이민 (PEI)을 모두 주변 온도에서 첨가함으로써 적절한 크기의 원뿔형 튜브에서 각각의 형질주입 조건에 대한 형질주입 혼합물을 제조하였다. 형질주입 혼합물을 1 μg의 DNA/1E6 세포의 농도로 세포에 첨가하였다. 진탕 플라스크를 수확 전 72 시간 동안 항온처리하였다. 수확 시, 세포를 용해시키고, 후속 액적 디지털 PCR (ddPCR) 및 ELISA에 의한 캡시드 분석을 위해, 원심분리 후에 조질의 용해물 샘플을 수집하여 세포 잔해물을 제거하였다.
도 4a-4c는 이중 및 삼중 형질주입 시스템을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 4a), 캡시드 생산성 (도 4b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 4c)을 도시한다. 도 4a 및 4c에 도시된 바와 같이, 설계-1을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율은 삼중 형질주입 시스템으로부터 수득된 것보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 추가로, 도 4a 및 도 4c에 도시된 바와 같이, 설계-1을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 및 계산된 온전한 벡터 게놈의 백분율은 설계-2를 사용한 생산으로부터 수득된 것들보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과에 기반하여, 추가 연구를 위해 설계-1을 선택하였다. 도 4a-4c에 도시된 다양한 조건이 표 4에 제시되어 있다.
제3 이중 벡터 형질주입 시스템 설계 ("설계-3")를 테스트하였다. 3 개의 설계 각각에 기반한 생산으로부터 수득된 벡터 게놈 (VG) 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율을 나란히 평가하였다. 위에 논의된 바와 같이, 설계-1은 Rep/Cap 서열 및 트랜스진 ("GOI")을 포함하는 제1 벡터, 및 헬퍼 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하고 (도 3a); 설계-2는 트랜스진 ("GOP")을 포함하는 제1 벡터, 및 헬퍼 및 Rep/Cap 서열 둘 모두를 포함하는 제2 벡터를 포함하고 (도 3b); 설계 3은 트랜스진 ("GOI") 및 헬퍼 서열을 포함하는 제1 벡터, 및 Rep/Cap 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (도 3c). 형질주입 조건은 표 5에 제시된 조건에 따라 설정되었다.
표 5: 형질주입 조건
표 5에 기재된 바와 같이, 설계-1은 제1 V20 벡터 및 제2 V3 벡터를 포함한다. 설계-2는 제1 V19 벡터 및 제2 V7 벡터를 포함한다. 설계-3은 제1 V21 벡터 및 제2 V2 벡터를 포함한다. 삼중 형질주입으로부터 수득된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율을 대조군으로서 평가하였다. 다양한 벡터 내에 함유된 요소는 표 2에 제시되어 있다. 표 5에서, 벡터 비율은 1:1 (1:1:1) 몰 비율로부터 전환된 질량-기반 비율이었다.
계산된 부피의 벡터(들), OptiPro 배지 및 폴리에틸렌이민 (PEI)을 모두 주변 온도에서 첨가함으로써 적절한 크기의 원뿔형 튜브에서 각각의 형질주입 조건에 대한 형질주입 혼합물을 제조하였다. 형질주입 혼합물을 1 μg의 DNA/1E6 세포의 농도로 세포에 첨가하였다. 진탕 플라스크를 수확 전 72 시간 동안 항온처리하였다. 수확 시, 세포를 용해시키고, 후속 액적 디지털 PCR (ddPCR) 및 ELISA에 의한 캡시드 분석을 위해, 원심분리 후에 조질의 용해물 샘플을 수집하여 세포 잔해물을 제거하였다.
도 5a-5c는 이중 및 삼중 형질주입 시스템을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 5a), 캡시드 생산성 (도 5b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 5c)을 도시한다. 도 5a 및 5c에 도시된 바와 같이, 설계-1을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율은 삼중 형질주입 시스템으로부터 수득된 것보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 추가로, 도 5a 및 도 5c에 도시된 바와 같이, 설계-1을 사용한 생산으로부터 수득된, VG 생산성 및 계산된 온전한 벡터 게놈의 백분율은 설계-2 및 설계-3을 사용한 생산으로부터 수득된 것보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는 설계-1 이중 벡터 형질주입 시스템을 사용하는 것이 설계-2 이중 벡터 형질주입 시스템, 설계-3 이중 벡터 형질주입 시스템 및 대조군 삼중 벡터 형질주입 시스템과 비교하여 증가된 rAAV 역가를 초래한다는 것을 입증한다. 도 5a-5c에 도시된 다양한 조건이 표 5에 제시되어 있다.
실시예 4: 이중 및 삼중 형질주입 시스템 간의 비교
실시예 3에서 관찰된 삼중 형질주입에 비해 설계-1의 증가된 생산성을 확인하기 위해, 형질주입 조건을 설정하여, 증가된 효능이 더 큰 규모 (2 L 규모)에서 유지되는지 여부, 및 설계-1의 증가된 효능이 상이한 트랜스진을 갖는 그리고 상이한 캡시드로의 rAAV 게놈의 패키징 전반에 걸쳐 확장되는지 여부를 조사하였다. 형질주입 조건은 표 6에 제시된 조건에 따라 설정되었다. 표 6에서, 벡터 비율은 질량을 기반으로 하였다.
표 6: 형질주입 조건
표 6에 제시된 바와 같이, 형질주입 조건 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 설정하여, 설계-1의 증가된 효능이 상이한 트랜스진을 갖는 rAAV 게놈의 패키징 전반에 걸쳐 확장되는지 여부를 조사하였다. 상이한 트랜스진을 갖는 rAAV 게놈의 패키징 전반에 걸쳐 설계-1의 효능을 조사하는 것 외에도, 조건 6 및 7은 또한 효능이 상이한 캡시드로의 rAAV 게놈의 패키징 전반에 걸쳐 확장되는지 여부를 평가한다. 조건 1-5는 각각 AAVHSCS15 캡시드를 활용하고, 조건 6은 AAVHSCS17 캡시드를 활용하고, 조건 7은 AAV2 캡시드를 활용하였다. 삼중 형질주입으로부터 수득된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율을 대조군으로서 평가하였다. 다양한 벡터 내에 함유된 요소는 표 2에 제시되어 있다.
계산된 부피의 벡터(들), OptiPro 배지 및 폴리에틸렌이민 (PEI)을 모두 주변 온도에서 첨가함으로써 적절한 크기의 전달 조립체(assembly)에서 각각의 형질주입 조건에 대한 형질주입 혼합물을 제조하였다. 형질주입 혼합물을 1 μg의 DNA/1E6 세포의 농도로 세포에 첨가하였다. 진탕 플라스크를 수확 전 72 시간 동안 항온처리하였다.
수확 시, 세포를 용해시키고, 후속 액적 디지털 PCR (ddPCR) 및 ELISA에 의한 캡시드 분석을 위해, 원심분리 후에 조질의 용해물 샘플을 수집하여 세포 잔해물을 제거하였다.
도 6a-6c는 설계-1 및 대조군 삼중 형질주입 시스템을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 6a), 캡시드 생산성 (도 6b) 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 6c)을 도시한다. 도 6a 및 6c에 도시된 바와 같이, 설계-1을 사용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율은 테스트된 모든 조건에서 삼중 형질주입 시스템으로부터 수득된 것보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이들 결과에 기반하여, 상이한 캡시드에 상이한 트랜스진을 갖는 rAAV의 패키징 전반에 걸쳐, 삼중 형질주입에 비해 설계-1을 사용한 생산의 증가된 효능이 관찰되었다. 이중 벡터 형질주입 시스템의 증가된 생산성은 5 개의 상이한 rAAV 게놈에 대해 일관된 것으로 밝혀졌으며, 그 중 2 개는 편집 게놈 (조건 1 및 2)을 포함한다. 이들 데이터는 대조군 삼중 벡터 형질주입 시스템에 비해 설계-1 이중 벡터 형질주입 시스템을 사용하여 수득된 증가된 rAAV 역가가 상이한 캡시드에 상이한 트랜스진을 갖는 rAAV의 패키징 전반에 걸쳐 확장된다는 것을 입증한다. 도 6a-6c에 도시된 다양한 조건이 표 6에 제시되어 있다.
도 7a-7c는 설계-1을 사용한 AAV2 캡시드 (조건 7) 및 대조군 삼중 형질주입 시스템을 활용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 7a), 캡시드 생산성 (도 7b) 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 7c)을 도시한다. 도 7a 및 7c에 도시된 바와 같이, 설계-1을 사용한 AAV2 캡시드를 활용한 생산으로부터 수득된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 백분율은 삼중 형질주입 시스템으로부터 수득된 것보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 도 7a-7c의 데이터는 소-규모 생산 연구로부터 생성되었다.
별도의 실험에서, 설계-1이 또한 AAVHSC13 캡시드를 포함하는 rAAV를 생산할 수 있다는 것이 밝혀졌다 (그 전체가 본원에 원용되는 미국 특허 번호 9,803,218 참고).
이들 데이터는 (삼중 플라스미드 시스템 대조군에 비해) 설계-1 이중 플라스미드 시스템에 의해 나타난 AAV 생산의 개선이 일반적으로 적용가능할 가능성이 있음을 시사한다.
실시예 5: 이중 및 삼중 형질주입 시스템 간의 비교
실시예 3 및 4는 대조군 삼중 형질주입 시스템을 사용한 생산과 비교하여, 설계-1을 사용한 생산으로부터 수득된 조질의 용해물에서 측정된 증가된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 증가된 백분율을 입증하였다.
증가된 VG 생산성 및 온전한 벡터 게놈의 증가된 백분율이 정제-후 유지되었는지 확인하기 위해, 표 7에 제시된 것들에 따라 설정된 형질주입으로부터 수득된 조질의 용해물을 정화하고, 후속적으로 친화도 및 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 표 7에서, 50 L 규모에서 수행한 조건 3을 제외하고, 조건 1, 2 및 4를 각각 표 6의 조건 2, 3 및 5 (즉, 2 L 규모)에 따라 수행하였다. 상이한 벡터 비율을 사용하여 생산된 용해물을 별도로 정제하였다. 조건 1-3은 각각 AAVHSCS15 캡시드를 활용한 반면, 조건 4는 AAVHSCS17 캡시드를 활용하였다. 설계-1 이중 플라스미드 시스템으로부터 수득된 온전한 벡터 게놈은 표시된 대조군 삼중 플라스미드 시스템으로부터 수득된 온전한 벡터 게놈의 양에 대한 백분율 증가로서 표현되었다 (표 7 및 도 8). 표 7에서, 벡터 비율은 질량을 기반으로 하였다. 다양한 벡터 내에 함유된 요소는 표 2에 제시되어 있다.
표 7: 형질주입 조건
도 8에 묘사된 데이터는 침강 계수에 기반하여 거대분자를 정량화하는 데 사용되는 방법인 분석적 초원심분리 침강 속도 (AUC) 분석에 기반한다. AUC는 상응하는 삼중 플라스미드 시스템 대조군에 비해, 각각의 설계-1 이중 플라스미드 시스템에 의해 생산된 벡터 게놈이 결여된 온전한 벡터 게놈 및 캡시드의 백분율을 결정하는 데 사용되었다. 도 8에서, 조건 1 및 2에 대해, 설계-1 벡터 비율 (즉, 표 7에 도시된 1:2, 1:3 및 1:4 비율) 각각으로부터 수득된 정제된 벡터에 대해 AUC를 수행하여, 온전한 벡터 게놈의 수를 결정한 다음, 평균화하고, 상응하는 삼중 플라스미드 시스템 대조군에 대한 퍼센트 증가로서 제시하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 테스트된 4 개의 설계-1 이중 플라스미드 시스템 각각에 대해 (상응하는 삼중 플라스미드 시스템 대조군으로부터 수득된 온전한 벡터 게놈의 수에 비해) 온전한 벡터 게놈의 수의 증가를 수득하였다. 이러한 데이터는 (삼중 플라스미드 시스템 대조군에 비해) 설계-1 이중 플라스미드 시스템에 의해 나타난 AAV 생산의 개선이 일반적으로 적용가능하고 확장가능할 가능성이 있음을 시사한다.
실시예 6: 이중 형질주입 시스템에서 캡시드 배경 발현
설계-1이 다른 이중 플라스미드 형질주입 시스템 설계를 능가하는 이유를 설명하기 위한 노력으로, 배경 캡시드 발현의 수준을 설계-1에서 결정하고, 설계-2의 배경 캡시드 발현의 수준과 비교하였다. 형질주입 조건은 표 8에 제시된 것들에 따라 설정되었다. 표 8에서, 벡터 비율은 질량을 기반으로 하였다.
표 8: 형질주입 조건
표 8에 도시된 바와 같이, 설계-1 및 설계-2를, 각각 각각의 이중 설계에 대해 Rep/Cap 함유 벡터만을 이용하여 함께 테스트하였다. 동일한 양의 Rep/Cap 함유 벡터를 단독으로 사용하거나 (예컨대, 조건 2 및 4), 이중 설계에서 벡터로서 사용하였다 (예컨대, 조건 1 및 3).
설계-2 (벡터 V7만의 형질주입; 조건 2)로부터의 배경 캡시드 생성의 수준은 설계-2의 이중 형질주입 (벡터 V1 및 V7 둘 모두의 형질주입; 조건 1)으로부터 생성된 배경 캡시드의 수준과 동일한 것으로 밝혀졌다 (도 9). 도 9에 도시된 바와 같이, 설계-1로부터의 배경 캡시드 생성은 설계-1의 이중 형질주입으로부터 생성된 배경 캡시드의 수준의 1% 미만이었다 (조건 4를 조건 3과 비교함).
실시예 7: 이중 및 삼중 형질주입 시스템으로부터 AAV의 대규모 생산 및 품질 평가
설계-1의 개선된 생산성이 대규모 생산에서 유지되는지 여부를 조사하기 위해, 설계-1에 대해 1:2의 벡터 비율에서 표 6의 조건 4를 50 L 생물반응기 규모에서 반복하였다. 진탕 플라스크 및 2 L 생물반응기 규모에서의 경향과 일관되게, 50 L 생물반응기로부터의 결과는 삼중 형질주입 시스템 ("3 TFX"; 삼중 형질주입 대조군의 조건에 대해 표 6 참고)으로부터 수득된 조질의 용해물과 비교하여 설계-1 ("2 TFX")로부터 수득된 조질의 용해물에서 VG 생산성의 거의 2-배의 증가, 비슷한 캡시드 생산 및 계산된 온전한 벡터 게놈의 배가(doubling)를 나타냈다 (도 10a-10c). 이러한 데이터는 대조군 삼중 벡터 형질주입 시스템과 비교하여 설계-1 이중 벡터 형질주입 시스템을 사용하여 수득된 증가된 rAAV 역가가 대규모 생산에서 유지된다는 것을 입증한다.
설계-1 및 삼중 형질주입 시스템으로부터 수득된 AAV 벡터의 산물 품질을 특성화하기 위해 다양한 분석적 방법을 사용하였다 (도 10d-10j). 도시된 바와 같이, 순도 퍼센트 (도 10d), 응집 퍼센트 (도 10e), 및 잔여 숙주 세포 단백질의 수준 (도 10f; BLoQ는 정량 한계 미만을 의미함)은 모두 형질주입 방법에 관계없이 일관되게 유지되었다. 삼중 형질주입 시스템으로부터 수득된 것들과 비교하여 설계-1로부터 수득된 정제된 AAV 벡터에 패키징된 잔류 숙주 세포 DNA (도 10g), Rep/Cap (도 10h), Ela (도 10i) 및 헬퍼 서열 (도 10j)의 양에서 편차가 발견되지 않았다.
실시예 8: 이중 및 삼중 형질주입 시스템으로부터 수득된 AAV 벡터의 생체활성
설계-1로부터 수득된 AAV 벡터 및 삼중 형질주입 시스템으로부터 수득된 AAV 벡터 간의 산물 비교성을 보장하기 위해, 설계 1에 대해 1:4의 벡터 비율에서 표 6의 조건 5로부터 수득된 AAV 벡터, 및 연관된 삼중 형질주입 대조군을 정제하고, 생체 내 생체활성에 대해 평가하였다. rAAV 게놈은 뮤린-특이적 상동성 아암에 측접된 간 특이적 프로모터의 제어 하에서 페닐알라닌 수산화효소 (PAH)를 발현하는 편집 게놈을 포함한다. 설계-1 및 삼중 형질주입 시스템으로부터 수득된 AAV 벡터를 고전적인 페닐케톤뇨증의 여러 특징을 나타내는 모델인 Pahenu2 마우스에 주사하였다. 2 개의 용량뿐만 아니라 비히클-단독 대조군을 평가하였다. 매주 혈청 샘플을 채취하고, 페닐알라닌 (Phe)의 수준을 분석하였다. 도 11a 및 11b에 도시된 바와 같이, 1E12 VG/kg (도 11a) 및 1E14 VG/kg (도 11b)의 두 용량 모두에서, 설계-1 및 삼중 형질주입 시스템으로부터 수득된 AAV 벡터의 투약-후 혈청 Phe 수준의 감소로 표시된 바와 같은 생체활성은 6-주 기간에 걸쳐 구별할 수 없었다. 더욱이, 6 주째에, 간에서의 벡터 게놈 및 PAH mRNA 발현의 정량은 VG 형질도입 및 트랜스진 발현의 용량 의존적 증가를 나타내었지만, 각각의 용량에서 설계-1 및 삼중 형질주입 그룹 사이에는 유의한 차이가 없었다 (도 11c 및 11d). 표적-내 통합의 정량은 1E14 VG/kg 용량에서 완료되었으며, 설계-1 또는 삼중 형질주입 시스템으로부터 생산된 AAV 벡터에 대해 비슷한 통합 효율성을 입증하였다 (도 11e).
실시예 9: 벡터 비율의 최적화
개선된 생산성을 초래하는 최적의 벡터 비율이 있는지 여부를 조사하기 위해, 다양한 설계-1 벡터 비율을 테스트하였다. 소규모 생산을 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 형질주입을 설정하였다.
도 12a-12c는 형질주입된 총 DNA의 다양한 수준 (x-축)에서, 표시된 V3:V12 벡터 비율을 테스트한, 조건 1 하에서의 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 12a), 캡시드 생산성 (도 12b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 12c)을 도시한다. V3 및 V12 내에 함유된 요소는 표 2에 제시되어 있다. 도 12a-12c에 도시된 바와 같이, 개선된 VG 및 캡시드 생산성은 1E6 개의 세포당 0.6 내지 1 μg의 형질주입된 총 DNA를 사용하여 1:0.3 내지 1:1의 V3:V12 벡터 비율에서 달성되었다.
도 13a-13c는 형질주입된 총 DNA의 다양한 수준 (x-축)에서, 표시된 V3:V8 비율을 테스트한, 조건 2 하에서의 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 13a), 캡시드 생산성 (도 13b), 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 13c)을 도시한다. V3 및 V8 내에 함유된 요소는 표 2에 제시되어 있다. 도 13a-13c에 도시된 바와 같이, 개선된 VG 및 캡시드 생산성은 1E6 개의 세포당 0.6 내지 1 μg의 형질주입된 총 DNA를 사용하여 1:0.6 내지 1:1의 V3:V8 벡터 비율에서 달성되었다. 이러한 데이터는 증가된 rAAV 역가가 이러한 벡터 비율 및 형질주입된 총 DNA의 수준을 사용하여 달성된다는 것을 입증한다.
실시예 10: 이중 플라스미드 형질주입을 사용한 다중 캡시드 혈청형의 평가
설계-1의 개선된 생산성이 다른 AAV 캡시드 혈청형에 걸쳐 유지되는지 여부를 조사하기 위해, 설계-1 또는 삼중 형질주입 시스템으로부터 생산된 AAV 벡터를 AAV 캡시드 혈청형 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 및 AAVrh74를 활용하여 테스트하였다. 2 L 생물반응기 생산을 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 형질주입을 설정하였다. 형질주입 조건은 표 9에 제시된 것들에 따라 설정되었다.
표 9: 형질주입 조건
도 14a-14c는 표 9에 제시된 조건 하에서 생산으로부터 수득된 VG 생산성 (도 14a), 캡시드 생산성 (도 14b) 및 온전한 벡터 게놈의 백분율 (도 14c)을 도시한다. 도 14a에 도시된 바와 같이, 상응하는 삼중 형질주입 시스템 대조군에 비해 설계-1을 사용한 생산으로부터 수득된 개선된 VG 생산성은 테스트된 모든 AAV 캡시드 혈청형에 걸쳐 유지된다. 도 14b에 도시된 바와 같이, 상응하는 삼중 형질주입 시스템 대조군에 비해 설계-1을 사용한 생산으로부터 수득된 캡시드 생산성은 개선되거나 유지된다. 도 14c에 도시된 바와 같이, 상응하는 삼중 형질주입 시스템 대조군에 비해 설계-1을 사용한 생산으로부터 수득된 온전한 벡터 게놈의 백분율은 개선되거나 유지된다. 이러한 데이터는 대조군 삼중 벡터 형질주입 시스템과 비교하여 설계-1 이중 벡터 형질주입 시스템을 사용하여 수득된 증가된 rAAV 역가가 상이한 AAV 캡시드 혈청형에 걸쳐 확장된다는 것을 입증한다.
실시예 11: 2000 L까지의 이중 플라스미드 확장성
실시예 7은 설계-1의 개선된 생산성이 50 L 생물반응기 규모에서 유지된다는 것을 보여주었다. 50 L 생물반응기로부터의 결과는 삼중 형질주입 시스템 대조군으로부터 수득된 조질의 용해물과 비교하여 설계-1로부터 수득된 조질의 용해물에서의 VG 생산성의 거의 2-배 증가를 나타냈다.
설계-1의 개선된 VG 생산성이 확장가능한지 여부를 조사하기 위해, 50 L 생물반응기 규모에서의 생산성을 2000 L 생물반응기 규모에서의 생산성과 비교하였다. 세포를 50 L 및 2000 L 생물반응기에 접종한 것을 제외하고는, 2 L 생물반응기 생산을 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 형질주입을 설정하였다. 세포를 3.6E6 내지 5E6 개의 세포/mL의 밀도로 형질주입시켰다. 50 L 생물반응기 및 2000 L 생물반응기에 대한 형질주입 조건은 표 10에 제시된 조건에 따라 설정되었다.
표 10: 형질주입 조건
도 15는 50 L 및 2000 L 생물반응기 규모가 비슷한 VG 생산성을 달성한다는 것을 도시한다. 이러한 데이터는 설계-1 이중 플라스미드 형질주입 시스템의 확장성을 입증한다.
본 발명의 추가 실시양태는 다음의 조항에서 제시된다:
1. 제1 핵산 벡터로서, AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 핵산 벡터는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지 않는, 핵산 벡터.
2. 조항 1에 있어서, 5'으로부터 3'으로, AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 핵산 벡터는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지 않는, 핵산 벡터.
3. 조항 1에 있어서, 5'으로부터 3'으로 다음을 포함하는, 헥산 벡터: AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열.
4. 조항 1-3 중 어느 하나에 있어서, 핵산 벡터가 DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터인, 핵산 벡터.
5. 재조합 AAV (rAAV) 패키징 시스템으로서, (i) 다음을 포함하는 제1 핵산 벡터: AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터를 포함하는, 패키징 시스템.
6. 조항 5에 있어서, 제1 핵산 벡터가 5'으로부터 3'으로 다음을 포함하는, 패키징 시스템: AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열.
7. 조항 5 또는 6에 있어서, 제1 핵산 벡터가 DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터인, 패키징 시스템.
8. 조항 5-7 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터가 DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터인, 패키징 시스템.
9. 조항 1-8 중 어느 하나에 있어서, 트랜스진이 폴리펩티드를 코딩하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
10. 조항 1-8 중 어느 하나에 있어서, 트랜스진이 miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, gRNA, 안타고미르, miRNA 스폰지, RNA 압타자임, RNA 압타머, lncRNA, 리보자임 또는 mRNA를 코딩하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
11. 조항 1-8 중 어느 하나에 있어서, 트랜스진이 페닐알라닌 수산화효소 (PAH), 글루코스-6-포스파타제 (G6Pase), 이두로네이트-2-설파타제 (I2S), 아릴설파타제 A (ARSA) 및 프라탁신 (FXN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
12. 임의의 전술한 조항에 있어서, rAAV 게놈이 트랜스진에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
13. 조항 12에 있어서, 전사 조절 요소가 프로모터 요소 및/또는 인트론 요소를 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
14. 임의의 전술한 조항에 있어서, rAAV 게놈이 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
15. 조항 14에 있어서, 폴리아데닐화 서열이 트랜스진에 대해 3'인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
16. 임의의 전술한 조항에 있어서, rAAV 게놈이 서열번호 71, 85, 86, 87 또는 88에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
17. 임의의 전술한 조항에 있어서, rAAV 게놈이 트랜스진의 5'의 5' 역전 말단 반복부 (5' ITR) 뉴클레오티드 서열, 및 트랜스진의 3'의 3' 역전 말단 반복부 (3' ITR) 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
18. 조항 17에 있어서, 5' ITR 뉴클레오티드 서열이 서열번호 39, 41 또는 42에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고/하거나, 3' ITR 뉴클레오티드 서열이 서열번호 40, 43 또는 44에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
19. 임의의 전술한 조항에 있어서, rAAV 게놈이 서열번호 75, 78, 80, 82 또는 84에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
20. 임의의 전술한 조항에 있어서, AAV Rep 단백질이 야생형 Rep 단백질 또는 이의 변이체인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
21. 임의의 전술한 조항에 있어서, AAV Rep 단백질이 AAV2 Rep 단백질 또는 이의 변이체인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
22. 임의의 전술한 조항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열이 AAV Rep 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
23. 조항 22에 있어서, 전사 조절 요소가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
24. 조항 23에 있어서, 프로모터가 P5 프로모터, P19 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
25. 임의의 전술한 조항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVRh32.33, AAVrh74, AAV-DJ, AAV-LK03, NP59, VOY101, VOY201, VOY701, VOY801, VOY1101, AAVPHP.N, AAVPHP.A, AAVPHP.B, PHP.B2, PHP.B3, G2A3, G2B4, G2B5 및 PHP.S로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
26. 임의의 전술한 조항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
27. 조항 26에 있어서, 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
28. 조항 27에 있어서, (a) 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G이고, 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G이거나; (b) 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 H이고, 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 N이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이고, 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 M이거나; (c) 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이고, 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; (d) 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 A이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 또는 (e) 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 I이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이고, 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 C인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
29. 조항 27에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736의 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
30. 임의의 전술한 조항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
31. 조항 30에 있어서, 서열번호 16의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 D이거나; 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
32. 조항 31에 있어서, (a) 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G이고, 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G이거나; (b) 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 H이고, 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 N이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이고, 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 M이거나; (c) 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이고, 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; (d) 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 A이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 또는 (e) 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 I이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이고, 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 C인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
33. 조항 31에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 138-736의 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
34. 임의의 전술한 조항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
35. 조항 34에 있어서, 서열번호 16의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 T이거나; 서열번호 16의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 68에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 V이거나; 서열번호 16의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 L이거나; 서열번호 16의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 D이거나; 서열번호 16의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 C이거나; 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 H이거나; 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 Q이거나; 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 A이거나; 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 N이거나; 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 S이거나; 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 I이거나; 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G 또는 Y이거나; 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 M이거나; 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 K이거나; 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 C이거나; 또는 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
36. 조항 35에 있어서, (a) 서열번호 16의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 T이고, 서열번호 16의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 Q이거나; (b) 서열번호 16의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 I이고, 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 Y이거나; (c) 서열번호 16의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이고, 서열번호 16의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 K이거나; (d) 서열번호 16의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 L이고, 서열번호 16의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 S이거나; (e) 서열번호 16의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G이고, 서열번호 16의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 G이거나; (f) 서열번호 16의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 H이고, 서열번호 16의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 N이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이고, 서열번호 16의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 M이거나; (g) 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이고, 서열번호 16의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; (h) 서열번호 16의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 A이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이거나; 또는 (i) 서열번호 16의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 I이고, 서열번호 16의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 R이고, 서열번호 16의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산이 C인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
37. 조항 35에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 1-736의 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
38. 임의의 전술한 조항에 있어서, 제3 뉴클레오티드 서열이 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
39. 조항 38에 있어서, 전사 조절 요소가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
40. 조항 39에 있어서, 프로모터가 P40 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
41. 임의의 전술한 조항에 있어서, 제1 핵산 벡터가 서열번호 73 또는 77에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
42. 임의의 전술한 조항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 서열번호 71, 75, 78, 80, 82, 84, 85, 86, 87 또는 88에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
43. 임의의 전술한 조항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열이 서열번호 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 또는 59에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고; 제2 뉴클레오티드 서열이 서열번호 71, 75, 78, 80, 82, 84, 85, 86, 87 또는 88에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고; 제3 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 또는 17의 아미노산 203-736, 138-736 및/또는 1-736의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
44. 조항 43에 있어서, 제1 핵산 벡터가 5'으로부터 3'으로 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
45. 조항 5-44 중 어느 하나에 있어서, 헬퍼 바이러스 유전자가 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 배큘로바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 헬퍼 바이러스로부터 유래되는, 패키징 시스템.
46. 조항 5-45 중 어느 하나에 있어서, 헬퍼 바이러스 유전자가 E1, E2, E4 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택되는 아데노바이러스로부터 유래된 RNA 유전자인, 패키징 시스템.
47. 조항 5-46 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터가 헬퍼 바이러스 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 패키징 시스템.
48. 조항 47에 있어서, 전사 조절 요소가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, 패키징 시스템.
49. 조항 48에 있어서, 프로모터가 RSV LTR 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 패키징 시스템.
50. 조항 5-49 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터가 서열번호 60, 61 또는 62에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 패키징 시스템.
51. 조항 5-50 중 어느 하나에 있어서, 제2 핵산 벡터가 서열번호 63에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 패키징 시스템.
52. 조항 5-45 중 어느 하나에 있어서, 헬퍼 바이러스 유전자가 UL5/8/52, ICP0, ICP4, ICP22 및 UL30/UL42로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤르페스 바이러스로부터 유래된 유전자인, 패키징 시스템.
53. 조항 52에 있어서, 제2 핵산 벡터가 헬퍼 바이러스 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 패키징 시스템.
54. 조항 53에 있어서, 전사 조절 요소가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, 패키징 시스템.
55. 조항 54에 있어서, 프로모터가 RSV LTR 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 패키징 시스템.
56. 조항 1-4 또는 9-44 중 어느 하나의 핵산 벡터, 또는 조항 5-55 중 어느 하나의 패키징 시스템을 포함하는, 숙주 세포.
57. 조항 56에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인, 숙주 세포.
58. 조항 57에 있어서, 포유동물 세포가 COS 세포, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK293F 세포, NS0 세포, PER.C6 세포, VERO 세포, CRL7O3O 세포, HsS78Bst 세포, HeLa 세포, NIH 3T3 세포, HepG2 세포, SP210 세포, R1.1 세포, B-W 세포, L-M 세포, BSC1 세포, BSC40 세포, YB/20 세포 및 BMT10 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 숙주 세포.
59. 조항 57 또는 58에 있어서, 포유동물 세포가 HEK293 세포인, 숙주 세포.
60. rAAV의 재조합 제조 방법으로서, rAAV가 생산되는 조건 하에서 조항 5-55 중 어느 하나의 패키징 시스템을 포유동물 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
61. 조항 60에 있어서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:0.2, 1:0.4, 1:0.6, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3 또는 1:4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
62. 조항 60 또는 61에 있어서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:2인, 방법.
63. 조항 60 또는 61에 있어서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:0.2 내지 1:1인, 방법.
64. 조항 63에 있어서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:0.6인, 방법.
65. 조항 63에 있어서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:0.8인, 방법.
66. 조항 63에 있어서, 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:1인, 방법.
67. 조항 60-66 중 어느 하나에 있어서, 방법이 패키징 시스템의 0.1 내지 4 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
68. 조항 60-67 중 어느 하나에 있어서, 방법이 패키징 시스템의 0.5 내지 1 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
69. 조항 60-68 중 어느 하나에 있어서, 방법이 패키징 시스템의 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
70. 조항 60-68 중 어느 하나에 있어서, 방법이 패키징 시스템의 0.75 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
71. 조항 60-70 중 어느 하나에 있어서, 방법이 (i) AAV Rep 단백질 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터; (ii) rAAV 게놈을 포함하는 제2 벡터; 및 (iii) 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제3 벡터를 포함하는 포유동물 세포를 사용하여 rAAV를 생산하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 증가된 rAAV 역가를 초래하는, 방법.
72. 조항 60-70 중 어느 하나에 있어서, 방법이 (i) AAV Rep 단백질 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터; (ii) rAAV 게놈을 포함하는 제2 벡터; 및 (iii) 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제3 벡터를 포함하는 포유동물 세포를 사용하여 rAAV를 생산하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 온전한 벡터 게놈의 증가된 백분율을 초래하는, 방법.
73. 조항 60-72 중 어느 하나에 있어서, 포유동물 세포가 COS 세포, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK293F 세포, NS0 세포, PER.C6 세포, VERO 세포, CRL7O3O 세포, HsS78Bst 세포, HeLa 세포, NIH 3T3 세포, HepG2 세포, SP210 세포, R1.1 세포, B-W 세포, L-M 세포, BSC1 세포, BSC40 세포, YB/20 세포 및 BMT10 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
74. 조항 60-73 중 어느 하나에 있어서, 포유동물 세포가 HEK293 세포인, 방법.
75. 조항 60-74 중 어느 하나에 있어서, 포유동물 세포가 세포 배양물에서 항온처리되는, 방법.
76. 조항 56-59 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 숙주 세포의 집단으로서, 숙주 세포가 세포 배양물로 제공되는, 숙주 세포의 집단.
77. 조항 75 또는 조항 76에 있어서, 세포 배양물이 2 리터 이상, 50 리터 이상 또는 2000 리터 이상의 부피를 갖는, 방법 또는 숙주 세포의 집단.
본 발명은 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 의해 범주가 제한되지 않는다. 실제로, 기재된 것들 외에 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하도록 의도된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌 (예컨대, 공개물 또는 특허 또는 특허 출원)은 각각의 개별 참고문헌 (예컨대, 공개물 또는 특허 또는 특허 출원)이 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 원용되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 원용된다. 다른 실시양태는 다음의 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> OXFORD BIOMEDICA SOLUTIONS LLC <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS PACKAGING SYSTEMS <130> G211157PM <140> PCT/US2022/073138 <141> 2022-06-24 <150> US 63/202,817 <151> 2021-06-25 <150> US 63/262,218 <151> 2021-10-07 <150> US 63/266,646 <151> 2022-01-11 <160> 106 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Adeno-associated virus 9 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 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aataatctca ggagcacaaa cattcctgga 180 ggcaggagaa gaaatcaaca tcctggactt atcctctggg cctctcccca cccccaggat 240 tgtaactgaa atgcttcact ggtgctcctt ttgttttaag gcattggatc ttcatagcta 300 ctgatcgtgc ccaagcacac agtatctgca gcaaccactt aggcctccag gaatgtggtg 360 accattgacc ctaattcatt ccccttcatg gatcctatgt aaccatcctc caaaaagagc 420 tttcgcaaac tcaaataaac acaggaaagg aagaccttct tatctttgag agtatatgtt 480 tagccctata gctctaaccc actctgatct cccagggcgg cagtaagtct tcagcatcag 540 gcattttggg gtgactcagt aaatggtaga tcttgctacc agtggaacag ccactaagga 600 ttctgcagtg agagcagagg gccagctaag tggtactctc ccagagactg tctgactcac 660 gccaccccct ccaccttgga cacaggacgc tgtggtttct gagccaggta caatgactcc 720 tttcggtaag tgcagtggaa gctgtacact gcccaggcaa agcgtccggg cagcgtaggc 780 gggcgactca gatcccagcc agtggactta gcccctgttt gctcctccga taactggggt 840 gaccttggtt aatattcacc agcagcctcc cccgttgccc ctctggatcc actgcttaaa 900 tacggacgag gac 913 <210> 32 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 32 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tcgttcatca cgcagtacag caccggacag 2040 gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaagaaaaca gcaaacgctg gaacccagag 2100 attcaataca cttccaacta ctacaaatct acaaatgtgg actttgctgt taacacagat 2160 ggcacttatt ctgagcctcg ccccatcggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217 <210> 104 <211> 4269 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 104 ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag ggttagggag gtcctgtatt agaggtcacg 60 tgagtgtttt gcgacatttt gcgacaccat gtggtcacgc tgggtattta agcccgagtg 120 agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga ggtttgaacg cgcagccgcc atgccggggt 180 tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc ggcatttctg 240 acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat tctgacatgg 300 atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag cgcgactttc 360 tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg caatttgaga 420 agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg aaatccatgg 480 ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga 540 tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg 600 ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa acccagcctg 660 agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg 720 agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca 780 aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt 840 acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag cagtggatcc 900 aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg tcccaaatca 960 aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc cccgactacc 1020 tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa attttggaac 1080 taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc acgaaaaagt 1140 tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag accaacatcg 1200 cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc aatgagaact 1260 ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg aagatgaccg 1320 ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc gtggaccaga 1380 aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc aacaccaaca 1440 tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg ttgcaagacc 1500 ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag gtcaccaagc 1560 aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg gagcatgaat 1620 tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca gatataagtg 1680 agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg gaagcttcga 1740 tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg aatctgatgc 1800 tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc ttcactcacg 1860 gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt tctgtcgtca 1920 aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg ccagacgctt 1980 gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa caataaatga 2040 cttaaaccag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga caacctctct 2100 gagggcattc gcgagtggtg ggacttgaaa cctggagccc cgaaacccaa agccaaccag 2160 caaaagcagg acgacggccg gggtctggtg cttcctggct acaagtacct cggacccttc 2220 aacggactcg acaaggggga gcccgtcaac gcggcggacg cagcggccct cgagcacgac 2280 aaggcctacg accagcagct caaagcgggt gacaatccgt acctgcggta taaccacgcc 2340 gacgccgagt ttcaggagcg tctgcaagaa gatacgtctt ttgggggcaa cctcgggcga 2400 gcagtcttcc aggccaagaa gcgggttctc gaacctctcg gtctggttga ggaaggcgct 2460 aagacggctc ctggaaagaa gagaccggta gagccatcac cccagcgttc tccagactcc 2520 tctacgggca tcggcaagaa aggccagcag cccgcgaaaa agagactcaa ctttgggcag 2580 actggcgact cagagtcagt gcccgaccct caaccaatcg gagaaccccc cgcaggcccc 2640 tctggtctgg gatctggtac aatggctgca ggcggtggcg ctccaatggc agacaataac 2700 gaaggcgccg acggagtggg tagttcctca ggaaattggc attgcgattc cacatggctg 2760 ggcgacagag tcatcaccac cagcacccga acctgggccc tccccaccta caacaaccac 2820 ctctacaagc aaatctccaa cgggacttcg ggaggaagca ccaacgacaa cacctacttc 2880 ggctacagca ccccctgggg gtattttgac tttaacagat tccactgcca cttctcacca 2940 cgtgactggc agcgactcat caacaacaac tggggattcc ggcccaagag actcaacttc 3000 aagctcttca acatccaggt caaggaggtc acgcagaatg aaggcaccaa gaccatcgcc 3060 aataacctta ccagcacgat tcaggtcttt acggactcgg aataccagct cccgtacgtc 3120 ctcggctctg cgcaccaggg ctgcctgcct ccgttcccgg cggacgtctt catgattcct 3180 cagtacgggt acctgactct gaacaatggc agtcaggccg tgggccgttc ctccttctac 3240 tgcctggagt actttccttc tcaaatgctg agaacgggca acaactttga gttcagctac 3300 cagtttgagg acgtgccttt tcacagcagc tacgcgcaca gccaaagcct ggaccggctg 3360 atgaaccccc tcatcgacca gtacctgtac tacctgtctc ggactcagtc cacgggaggt 3420 accgcaggaa ctcagcagtt gctattttct caggccgggc ctaataacat gtcggctcag 3480 gccaaaaact ggctacccgg gccctgctac cggcagcaac gcgtctccac gacactgtcg 3540 caaaataaca acagcaactt tgcctggacc ggtgccacca agtatcatct gaatggcaga 3600 gactctctgg taaatcccgg tgtcgctatg gcaacccaca aggacgacga agagcgattt 3660 tttccgtcca gcggagtctt aatgtttggg aaacagggag ctggaaaaga caacgtggac 3720 tatagcagcg ttatgctaac cagtgaggaa gaaattaaaa ccaccaaccc agtggccaca 3780 gaacagtacg gcgtggtggc cgataacctg caacagcaaa acgccgctcc tattgtaggg 3840 gccgtcaaca gtcaaggagc cttacctggc atggtctggc agaaccggga cgtgtacctg 3900 cagggtccta tctgggccaa gattcctcac acggacggaa actttcatcc ctcgccgctg 3960 atgggaggct ttggactgaa acacccgcct cctcagatcc tgattaagaa tacacctgtt 4020 cccgcggatc ctccaactac cttcagtcaa gctaagctgg cgtcgttcat cacgcagtac 4080 agcaccggac aggtcagcgt ggaaattgaa tgggagctgc agaaagaaaa cagcaaacgc 4140 tggaacccag agattcaata cacttccaac tactacaaat ctacaaatgt ggactttgct 4200 gttaacacag atggcactta ttctgagcct cgccccatcg gcacccgtta cctcacccgt 4260 aatctgtaa 4269 <210> 105 <211> 2217 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 105 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg acctgaaacc tggagccccg aaacccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 aacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctcc aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata atcacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgcgc agtcttccag 360 gccaaaaagc gggttctcga acctctgggc ctggttgaat cgccggttaa gacggctcct 420 ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgctctc cagactcctc tacgggcatc 480 ggcaagaaag gccagcagcc cgcaaaaaag agactcaatt ttgggcagac tggcgactca 540 gagtcagtcc ccgaccctca accaatcgga gaaccaccag caggcccctc tggtctggga 600 tctggtacaa tggctgcagg cggtggcgct ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660 ggagtgggta gttcctcagg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720 atcaccacca gcacccgcac ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa 780 atctccaacg ggacctcggg aggaagcacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 840 ccctgggggt attttgactt caacagattc cactgccact tttcaccacg tgactggcag 900 cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagaggc tcaacttcaa gctcttcaac 960 atccaagtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga ccatcgccaa taaccttacc 1020 agcacgattc aggtctttac ggactcggaa taccagctcc cgtacgtgct cggctcggcg 1080 caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtcttca tgattcctca gtacgggtac 1140 ctgactctga acaatggcag tcaggctgtg ggccggtcgt ccttctactg cctggagtac 1200 tttccttctc aaatgctgag aacgggcaac aactttgaat tcagctacaa cttcgaggac 1260 gtgcccttcc acagcagcta cgcgcacagc cagagcctgg accggctgat gaaccctctc 1320 atcgaccagt acttgtacta cctgtcccgg actcaaagca cgggcggtac tgcaggaact 1380 cagcagttgc tattttctca ggccgggcct aacaacatgt cggctcaggc caagaactgg 1440 ctacccggtc cctgctaccg gcagcaacgc gtctccacga cactgtcgca gaacaacaac 1500 agcaactttg cctggacggg tgccaccaag tatcatctga atggcagaga ctctctggtg 1560 aatcctggcg ttgccatggc tacccacaag gacgacgaag agcgattttt tccatccagc 1620 ggagtcttaa tgtttgggaa acagggagct ggaaaagaca acgtggacta tagcagcgtg 1680 atgctaacca gcgaggaaga aataaagacc accaacccag tggccacaga acagtacggc 1740 gtggtggccg ataacctgca acagcaaaac gccgctccta ttgtaggggc cgtcaatagt 1800 caaggagcct tacctgggat ggtgtggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1860 tgggccaaga ttcctcatac ggacggcaac tttcatccct cgccgctgat gggaggcttt 1920 ggactgaagc atccgcctcc tcagatcctg attaaaaaca cacctgttcc cgcggatcct 1980 ccgaccacct tcaatcaggc caagctggct tctttcatca cgcagtacag taccggccag 2040 gtcagcgtgg agatcgagtg ggagctgcag aaggagaaca gcaaacgctg gaacccagag 2100 attcagtaca cttccaacta ctacaaatct acaaatgtgg actttgctgt caatactgag 2160 ggtacttatt ccgagcctcg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217 <210> 106 <211> 4099 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 106 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataaatga cttaaaccag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920 caacctctct gagggcattc gcgagtggtg ggacctgaaa cctggagccc cgaaacccaa 1980 agccaaccag caaaagcagg acaacggccg gggtctggtg cttcctggct acaagtacct 2040 cggacccttc aacggactcg acaaggggga gcccgtcaac gcggcggacg cagcggccct 2100 cgagcacgac aaggcctacg accagcagct ccaagcgggt gacaatccgt acctgcggta 2160 taatcacgcc gacgccgagt ttcaggagcg tctgcaagaa gatacgtctt ttgggggcaa 2220 cctcgggcgc gcagtcttcc aggccaaaaa gcgggttctc gaacctctgg gcctggttga 2280 atcgccggtt aagacggctc ctggaaagaa gagaccggta gagccatcac cccagcgctc 2340 tccagactcc tctacgggca tcggcaagaa aggccagcag cccgcaaaaa agagactcaa 2400 ttttgggcag actggcgact cagagtcagt ccccgaccct caaccaatcg gagaaccacc 2460 agcaggcccc tctggtctgg gatctggtac aatggctgca ggcggtggcg ctccaatggc 2520 agacaataac gaaggcgccg acggagtggg tagttcctca ggaaattggc attgcgattc 2580 cacatggctg ggcgacagag tcatcaccac cagcacccgc acctgggccc tgcccaccta 2640 caacaaccac ctctacaagc aaatctccaa cgggacctcg ggaggaagca ccaacgacaa 2700 cacctacttc ggctacagca ccccctgggg gtattttgac ttcaacagat tccactgcca 2760 cttttcacca cgtgactggc agcgactcat caacaacaac tggggattcc ggcccaagag 2820 gctcaacttc aagctcttca acatccaagt caaggaggtc acgcagaatg aaggcaccaa 2880 gaccatcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtcttt acggactcgg aataccagct 2940 cccgtacgtg ctcggctcgg cgcaccaggg ctgcctgcct ccgttcccgg cggacgtctt 3000 catgattcct cagtacgggt acctgactct gaacaatggc agtcaggctg tgggccggtc 3060 gtccttctac tgcctggagt actttccttc tcaaatgctg agaacgggca acaactttga 3120 attcagctac aacttcgagg acgtgccctt ccacagcagc tacgcgcaca gccagagcct 3180 ggaccggctg atgaaccctc tcatcgacca gtacttgtac tacctgtccc ggactcaaag 3240 cacgggcggt actgcaggaa ctcagcagtt gctattttct caggccgggc ctaacaacat 3300 gtcggctcag gccaagaact ggctacccgg tccctgctac cggcagcaac gcgtctccac 3360 gacactgtcg cagaacaaca acagcaactt tgcctggacg ggtgccacca agtatcatct 3420 gaatggcaga gactctctgg tgaatcctgg cgttgccatg gctacccaca aggacgacga 3480 agagcgattt tttccatcca gcggagtctt aatgtttggg aaacagggag ctggaaaaga 3540 caacgtggac tatagcagcg tgatgctaac cagcgaggaa gaaataaaga ccaccaaccc 3600 agtggccaca gaacagtacg gcgtggtggc cgataacctg caacagcaaa acgccgctcc 3660 tattgtaggg gccgtcaata gtcaaggagc cttacctggg atggtgtggc agaaccggga 3720 cgtgtacctg cagggtccca tctgggccaa gattcctcat acggacggca actttcatcc 3780 ctcgccgctg atgggaggct ttggactgaa gcatccgcct cctcagatcc tgattaaaaa 3840 cacacctgtt cccgcggatc ctccgaccac cttcaatcag gccaagctgg cttctttcat 3900 cacgcagtac agtaccggcc aggtcagcgt ggagatcgag tgggagctgc agaaggagaa 3960 cagcaaacgc tggaacccag agattcagta cacttccaac tactacaaat ctacaaatgt 4020 ggactttgct gtcaatactg agggtactta ttccgagcct cgccccattg gcacccgtta 4080 cctcacccgt aatctgtaa 4099

Claims (58)

  1. 제1 핵산 벡터로서,
    AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;
    트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및
    AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열
    을 포함하고, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지 않는 핵산 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    5'으로부터 3'으로
    AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;
    트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및
    AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열
    을 포함하고, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지 않는 핵산 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    5'으로부터 3'으로
    AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;
    트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및
    AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 핵산 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터인 핵산 벡터.
  5. 재조합 AAV (rAAV) 패키징 시스템으로서,
    (i) AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;
    트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및
    AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 제1 핵산 벡터, 및
    (ii) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제2 핵산 벡터
    를 포함하는 패키징 시스템.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1 핵산 벡터가 5'으로부터 3'으로
    AAV Rep 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;
    트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 게놈을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및
    AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는, 패키징 시스템.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 제1 핵산 벡터가 DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터인, 패키징 시스템.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 핵산 벡터가 DNA 플라스미드 또는 DNA 최소 벡터인, 패키징 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트랜스진이 폴리펩티드를 코딩하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트랜스진이 miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, gRNA, 안타고미르, miRNA 스폰지, RNA 압타자임, RNA 압타머, lncRNA, 리보자임 또는 mRNA를 코딩하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트랜스진이 글루코스-6-포스파타제 (G6Pase) 또는 프라탁신 (FXN)을 코딩하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 rAAV 게놈이 트랜스진에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 전사 조절 요소가 프로모터 요소 및/또는 인트론 요소를 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 rAAV 게놈이 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 폴리아데닐화 서열이 트랜스진에 대해 3'인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 rAAV 게놈이 트랜스진의 5'의 5' 역전 말단 반복부 (5' ITR) 뉴클레오티드 서열, 및 트랜스진의 3'의 3' 역전 말단 반복부 (3' ITR) 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV Rep 단백질이 야생형 Rep 단백질 또는 이의 변이체인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV Rep 단백질이 AAV2 Rep 단백질 또는 이의 변이체인, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 뉴클레오티드 서열이 AAV Rep 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 전사 조절 요소가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 프로모터가 P5 프로모터, P19 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 캡시드 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVRh32.33, AAVrh74, AAV-DJ, AAV-LK03, NP59, VOY101, VOY201, VOY701, VOY801, VOY1101, AAVPHP.N, AAVPHP.A, AAVPHP.B, PHP.B2, PHP.B3, G2A3, G2B4, G2B5 및 PHP.S로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제3 뉴클레오티드 서열이 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 전사 조절 요소가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 프로모터가 P40 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 벡터 또는 패키징 시스템.
  26. 제5항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헬퍼 바이러스 유전자가 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 배큘로바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 헬퍼 바이러스로부터 유래되는, 패키징 시스템.
  27. 제5항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헬퍼 바이러스 유전자가 E1, E2, E4 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택되는 아데노바이러스로부터 유래된 RNA 유전자인, 패키징 시스템.
  28. 제5항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 핵산 벡터가 헬퍼 바이러스 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 패키징 시스템.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 전사 조절 요소가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, 패키징 시스템.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 프로모터가 RSV LTR 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 패키징 시스템.
  31. 제5항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 핵산 벡터가 서열번호 60, 61 또는 62에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 패키징 시스템.
  32. 제5항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 핵산 벡터가 서열번호 63에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 패키징 시스템.
  33. 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헬퍼 바이러스 유전자가 UL5/8/52, ICP0, ICP4, ICP22 및 UL30/UL42로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤르페스 바이러스로부터 유래된 유전자인, 패키징 시스템.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 제2 핵산 벡터가 헬퍼 바이러스 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 패키징 시스템.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 전사 조절 요소가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 천연 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, 패키징 시스템.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 프로모터가 RSV LTR 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억압성 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, RU486-유도성 프로모터 및 라파마이신-유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 패키징 시스템.
  37. 제1항 내지 제4항 및 제9항 내지 제25항 중 어느 한 항의 핵산 벡터, 또는 제5항 내지 제36항 중 어느 한 항의 패키징 시스템을 포함하는 숙주 세포.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 숙주 세포가 포유동물 세포인, 숙주 세포.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가 COS 세포, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK293F 세포, NS0 세포, PER.C6 세포, VERO 세포, CRL7O3O 세포, HsS78Bst 세포, HeLa 세포, NIH 3T3 세포, HepG2 세포, SP210 세포, R1.1 세포, B-W 세포, L-M 세포, BSC1 세포, BSC40 세포, YB/20 세포 및 BMT10 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 숙주 세포.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가 HEK293 세포인, 숙주 세포.
  41. rAAV가 생산되는 조건 하에서 포유동물 세포에 제5항 내지 제36항 중 어느 한 항의 패키징 시스템을 도입하는 단계를 포함하는, rAAV의 재조합 제조 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:0.2, 1:0.4, 1:0.6, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3 및 1:4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    상기 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:2인, 방법.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    상기 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:0.2 내지 1:1인, 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:0.6인, 방법.
  46. 제44항에 있어서,
    상기 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:0.8인, 방법.
  47. 제44항에 있어서,
    상기 제1 핵산 벡터 대 제2 핵산 벡터의 비율, 또는 제2 핵산 벡터 대 제1 핵산 벡터의 비율이 1:1인, 방법.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 패키징 시스템의 0.1 내지 4 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 패키징 시스템의 0.5 내지 1 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 패키징 시스템의 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 패키징 시스템의 0.75 μg의 DNA/1E6 세포를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  52. 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) AAV Rep 단백질 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터;
    (ii) rAAV 게놈을 포함하는 제2 벡터; 및
    (iii) 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제3 벡터
    를 포함하는 포유동물 세포를 사용하여 rAAV를 생산하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 증가된 rAAV 역가를 초래하는 방법.
  53. 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) AAV Rep 단백질 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터;
    (ii) rAAV 게놈을 포함하는 제2 벡터; 및
    (iii) 하나 이상의 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 제3 벡터
    를 포함하는 포유동물 세포를 사용하여 rAAV를 생산하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 온전한 벡터 게놈의 증가된 백분율을 초래하는 방법.
  54. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가 COS 세포, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK293F 세포, NS0 세포, PER.C6 세포, VERO 세포, CRL7O3O 세포, HsS78Bst 세포, HeLa 세포, NIH 3T3 세포, HepG2 세포, SP210 세포, R1.1 세포, B-W 세포, L-M 세포, BSC1 세포, BSC40 세포, YB/20 세포 및 BMT10 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가 HEK293 세포인, 방법.
  56. 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가 세포 배양물로 제공되는, 방법.
  57. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 숙주 세포의 집단이 세포 배양물로 제공되는, 숙주 세포의 집단.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서,
    상기 세포 배양물이 2 리터 이상, 50 리터 이상, 또는 2000 리터 이상의 부피를 갖는, 방법 또는 숙주 세포의 집단.
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