PL220644B1 - Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV), kompozycja, wyizolowane białko kapsydowe, wyizolowane lub syntetyczne cząsteczki kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania zrekombinowanego wirusa, komórka gospodarza - Google Patents

Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV), kompozycja, wyizolowane białko kapsydowe, wyizolowane lub syntetyczne cząsteczki kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania zrekombinowanego wirusa, komórka gospodarza

Info

Publication number
PL220644B1
PL220644B1 PL397823A PL39782302A PL220644B1 PL 220644 B1 PL220644 B1 PL 220644B1 PL 397823 A PL397823 A PL 397823A PL 39782302 A PL39782302 A PL 39782302A PL 220644 B1 PL220644 B1 PL 220644B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
aav
seq
virus
capsid
aav2
Prior art date
Application number
PL397823A
Other languages
English (en)
Other versions
PL397823A1 (pl
Inventor
Guangping Gao
James M. Wilson
Mauricio Alvira
Original Assignee
Univ Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27502639&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL220644(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Pennsylvania filed Critical Univ Pennsylvania
Publication of PL397823A1 publication Critical patent/PL397823A1/pl
Publication of PL220644B1 publication Critical patent/PL220644B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human parvovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2750/14162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/90—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates avian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV), kompozycja, wyizolowane białko kapsydowe, wyizolowane lub syntetyczne cząsteczki kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania zrekombinowanego wirusa, komórka gospodarza.
Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV), należący do rodziny Parvowirusów, jest małym, nieotoczkowanym ikozaedronalnym wirusem z genomami jednoniciowego liniowego DNA o wielkości od 4,7 kilozasad (kz) do 6 kz. AAV przypisano do rodzaju Dependovirus, ponieważ wirus ten odkryto jako zanieczyszczenie w oczyszczonych hodowlach adenowirusa. Cykl życiowy AAV obejmuje fazę latentną, w której genomy AAV po infekcji są integrowane w specyficzne miejsce w chromosomach gospodarza i fazę zakaźną, w której po zakażeniu adenowirusem lub wirusem opryszczki zwykłej zintegrowane genomy są wycinane, replikowane i pakowane do zakaźnych wirusów. Niepatogeniczność, szeroki zakres gospodarzy podlegających infekcji, w tym komórki niedzielące się i potencjalna miejscowo-specyficzna integracja do chromosomu czynią AAV atrakcyjnym narzędziem do przenoszenia genów.
Ostatnie badania sugerują, że wektory AAV mogą być korzystnymi nośnikami dla terapii genowej. Dotychczas wyizolowano i dobrze scharakteryzowano 6 różnych serotypów AAV od człowieka i naczelnych innych niż człowiek (NHP). Spośród nich, ludzki serotyp 2 jest pierwszym AAV opracowanym jako wektor do przenoszenia genów; stosowano go szeroko w doświadczeniach nad skutecznym przenoszeniem genów w różnych docelowych tkankach i modelach zwierzęcych. Trwają badania kliniczne nad doświadczalnym zastosowaniem wektorów opartych na AAV2 w modelach niektórych chorób ludzkich, w tym, chorób takich, jak mukowiscydoza i hemofilia B.
Pożądane są konstrukty do dostarczania genów oparte na AAV.
Wynalazek dostarcza nowego wirusa AAV rezus i sposobu jego wytwarzania.
Niniejszy wynalazek dotyczy wirusa stowarzyszonego z adenowirusem (AAV) obejmującego kapsyd AAV o sekwencji aminokwasowej AAVrh10 obejmującej aminokwasy 1 do 738 z Sek. NR ID.: 81 lub o sekwencji, która w 95% lub więcej jest z nią identyczna, minigen mający odwrócone powtórzenia końcowe (ITR) AAV i gen heterologiczny funkcjonalnie połączony z sekwencjami regulatorowymi, które kierują jego ekspresją w komórce gospodarza.
Kapsyd AAV jest złożony z białek apsydowych vp1, vp2 i vp3.
Korzystnie białka kapsydowe vp1 mają sekwencję, która w 95% lub więcej jest identyczna z aminokwasami 1 do 738 SEK. NR ID.: 81, korzystniej w 99% lub więcej jest identyczna z aminokwasami 1 do 738 z SEK. Nr ID.: 81, a najkorzystniej białka kapsydowe vp1 mają sekwencję aminokwasów od 1 do 738 SEK. NR ID.: 81.
Korzystnie białka kapsydowe vp2 AAV mają sekwencję aminokwasów 138 do 738 z SEK. NR ID.: 81.
Korzystnie białka kapsydowe vp3 AAV mają sekwencję aminokwasów 203 do 738 z SEK. NR ID.: 81.
Korzystnie ITR pochodzą z AAV2.
Ponadto wynalazek dotyczy wirusa stowarzyszonego z adenowirusem (AAV) obejmującego kapsyd AAV zawierający vp3 AAVrh10 mające sekwencję aminokwasową 203 do 738 z SEK. NR ID.: 81 lub sekwencję, która w 95% lub więcej jest z nią identyczna, minigen mający odwrócone powtórzenia końcowe (ITR) AAV i gen heterologiczny funkcjonalnie połączony z sekwencjami regulatorowymi, które kierują jego ekspresją w komórce gospodarza.
W wirusie stowarzyszonym z adenowirusem (AAV), kapsyd AAV zawiera białka kapsydowe vp1, białka kapsydowe vp2 i białka kapsydowe vp3. Korzystnie białka kapsydowe vp1 mają sekwencję, która w 95% lub więcej jest identyczna z aminokwasami 1 do 738 SEK. NR ID.: 81.
Korzystnie białka kapsydowe vp3 AAV mają sekwencję aminokwasów 203 do 738 z SEK. NR ID.: 81.
Korzystnie białka kapsydowe vp2 AAV mają sekwencję aminokwasów 138 do 738 z SEK. NR ID.: 81.
Niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji obejmującej AAV określony powyżej i fizjologicznie kompatybilny nośnik.
W zakres wynalazku wchodzi również wyizolowane białko kapsydu obejmujące białko AAVrh10 wybrane z grupy składającej się z:
białka kapsydowego vp1, aminokwasy (aa) 1 do 738 z SEK. NR ID.: 81;
białka kapsydowego vp2, (aa) 138 do 738 z SEK. NR ID.: 81; i
PL 220 644 B1 białka kapsydowego vp3, (aa) 203 do 738 z SEK. NR ID.: 81.
Wynalazek dotyczy również wyizolowanej lub syntetycznej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej białko AAVrh10 określone powyżej.
W zakres wynalazku wchodzi ponadto wyizolowana lub syntetyczna cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fragment białka kapsydu wirusa stowarzyszonego z adenowirusami rh10, przy czym ta cząsteczka kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy składającej się z:
vp1, nukleotydy (nt) 845 do 3061 z SEK. NR ID.: 59; vp2, (nt) 1256 do 3061 z SEK. NR ID.: 59; i vp3, (nt) 1454 do 3061 z SEK. NR ID.: 59.
Korzystnie cząsteczka jest plazmidem.
Korzystnie cząsteczka obejmuje ponadto funkcjonalny gen rep AAV.
Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania rekombinowanego wirusa stowarzyszonego z adenowirusem (AAV), obejmującego kapsyd AAV serotypu rh10, który obejmuje etapy hodowania komórki gospodarza zawierającej (a) cząsteczkę według wynalazku określoną powyżej, która koduje kapsyd wirusa stowarzyszonego z adenowirusami; (b) funkcjonalny gen rep; (c) minigen obejmujący odwrócone powtórzenia końcowe (ITR) i transgen; i (d) geny adenowirusa kodujące wystarczające funkcje pomocnicze pozwalające na upakowanie minigenu do białka kapsydowego AAV.
W zakres wynalazku wchodzi również komórka gospodarza in vitro zawierająca wirus stowarzyszony z adenowirusami określony powyżej lub cząsteczkę określoną powyżej.
KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW
Figury 1A do 1AAAR przedstawiają dopasowania sekwencji nukleotydowych kodujących co najmniej białka cap serotypów AAV. Sekwencje pełnej długości obejmujące ITR, region rep oraz region kapsydu dostarczono dla nowego serotypu 7 AAV [SEKW. NR ID.: 1] i dla opublikowanego uprzednio AAV1 [SEKW. NR ID.: 6], AAV2 [SEKW. NR ID.: 7] i AAV3 [SEKW. NR ID.: 8]. Nowe serotypy AAV8 [SEKW. NR ID.: 4] i AAV9 [SEKW. NR ID.: 5] są przedmiotem równocześnie złożonych zgłoszeń. Do innych nowych klonów według wynalazku dostarczonych w tym dopasowaniu należą: 42-2 [SEKW. NR ID.: 9], 42-8 [SEKW. NR ID.: 27], 42-15 [SEKW. NR ID.: 28], 42-5b [SEKW. NR ID.: 29], 42-1b [SEKW. NR ID.: 30]; 42-13 [SEKW. NR ID.: 31], 42-3a [SEKW. NR ID.: 32], 42-4 [SEKW. NR ID.: 33], 42-5a [SEKW. NR ID.: 34], 42-10 [SEKW. NR ID.: 35], 42-3b [SEKW. NR ID.: 36], 42-11 [SEKW. NR ID.: 37], 42-6b [SEKW. NR ID.: 38], 43-1 [SEKW. NR ID.: 39], 43-5 [SEKW. NR ID.: 40], 43-12 [SEKW. NR ID.: 41], 43-20 [SEKW. NR ID.: 42], 43-21 [SEKW. NR ID.: 43], 43-23 [SEKW. NR ID.: 44], 43-25 [SEKW. NR ID.: 45], 44.1 [SEKW. NR ID.: 47], 44.5 [SEKW. NR ID.: 47], 223.10 [SEKW. NR ID.: 48], 223.2 [SEKW. NR ID.: 49], 223.4 [SEKW. NR ID.: 50], 223.5 [SEKW. NR ID.: 51], 223.6 [SEKW. NR ID.: 52], 223.7 [SEKW. NR ID.: 53], A3.4 [SEKW. NR ID.: 54], A3.5 [SEKW. NR ID.: 55], A3.7 [SEKW. NR ID.: 56], A3.3 [SEKW. NR ID.: 57], 42. 12 [SEKW. NR ID.: 58].
Klonem według wynalazku jest klon 44.2 [SEKW. NR ID.: 59].
Przedstawiono też sekwencje nukleotydowe charakterytycznych regionów AAV10 [SEKW. NR ID.: 117], AAV11 [SEKW. NR ID.: 118] i AAV12 [SEKW. NR ID.: 119] a także krytyczne elementy struktury genomów AAV. Przerwy oznaczono kropkami. 3' ITR AAV1 [SEKW. NR ID.: 6] przedstawiono w tej samej konfiguracji, jak w opublikowanych sekwencjach. TRS oznacza końcowe miejsce rozdziału (terminal resolution site). Należy zauważyć, że AAV7 jest jedynym opisanym AAV wykorzystującym GTG jako kodon inicjacyjny VP3.
Figury 2A do 2F przedstawiają dopasowanie sekwencji aminokwasowych białek kapsydowych vp1 opublikowanych uprzednio serotypów AAV 1 [SEKW. NR ID.: 64], AAV2 [SEKW. NR ID.: 70], AAV3 [SEKW. NR ID.: 71], AAV4 [SEKW. NR ID.: 63], AAV5 [SEKW. NR ID.: 114], i AAV6 [SEKW. NR ID.: 65] i nowych sekwencji AAV, w tym: C1 [SEKW. NR ID.: 60], C2 [SEKW. NR ID.: 61], C5 [SEKW. NR ID.: 62], A3-3 [SEKW. NR ID.: 66], A3-7 [SEKW. NR ID.: 67], A3-4 [SEKW. NR ID.: 68], A3-5 [SEKW. NR ID.: 69], 3.3b [SEKW. NR ID.: 62], 223.4 [SEKW. NR ID.: 73], 223-5 [SEKW. NR ID.: 74], 223-10 [SEKW. NR ID.: 75], 223-2 [SEKW. NR ID.: 76], 223-7 [SEKW. NR ID.: 77], 223-6 [SEKW. NR ID.: 78], 44-1 [SEKW. NR ID.: 79], 44-5 [SEKW. NR ID.: 80], 44-2 [SEKW. NR ID.: 81], 42-15 [SEKW. NR ID.: 84], 42-8 [SEKW. NR ID.: 85], 42-13 [SEKW. NR ID.: 86], 42-3A [SEKW. NR ID.: 87], 42-4 [SEKW. NR ID.: 88], 42-5A [SEKW. NR ID.: 89], 42-1B [SEKW. NR ID.: 90], 42-5B [SEKW. NR ID.: 91], 43-1 [SEKW. NR ID.: 92], 43-12 [SEKW. NR ID.: 93], 43-5 [SEKW. NR ID.: 94], 43-21 [SEKW. NR ID.: 96], 43-25 [SEKW. NR ID.: 97], 43-20 [SEKW. NR ID.: 99], 24.1 [SEKW. NR ID.: 101], 42.2 [SEKW. NR ID.: 102], 7.2 [SEKW. NR ID.: 103], 27.3 [SEKW. NR ID.: 104], 16.3 [SEKW. NR ID.: 105], 42.10 [SEKW. NR ID.: 106], 42-3B [SEKW. NR ID.: 107], 42-11 [SEKW. NR ID.: 108],
PL 220 644 B1
F1 [SEKW. NR ID.: 109], F5 [SEKW. NR ID.: 110], F3 [SEKW. NR ID.: 111], 42-6B [SEKW. NR ID.: 112], 42-12 [SEKW. NR ID.: 113].
Nowe serotypy AAV8 [SEKW. NR ID.: 95] i AAV9 [SEKW. NR ID.: 100] są przedmiotem równocześnie złożonych wniosków patentowych.
Figury 3A do 3C przedstawiają sekwencje aminokwasowe białek rep AAV7 [SEKW. NR ID.: 3].
Ujawnione są także sekwencje nukleinowe nowych serotypów i fragmenty tych sekwencji AAV. Wśród szczególnie pożądanych fragmentów AAV są białka cap, w tym vp1, vp2, vp3, regiony hiperzmienne, białka rep, w tym, rep 78, rep 68, rep 52 i rep 40 oraz sekwencje kodujące te białka. Każdy z tych fragmentów można z łatwością wykorzystać w różnorodnych systemach wektorowych i komórkach gospodarza. Fragmenty takie można wykorzystywać osobno, w kombinacji z innymi sekwencjami i fragmentami AAV, lub w kombinacji z innymi sekwencjami wirusowymi z AAV lub nie z AAV. W jednym szczególnie korzystnym wykonaniu, wektor zawiera sekwencje cap i/lub rep AAV.
Jak tu opisano, dopasowania wykonywane są z zastosowaniem dowolnego z szeregu dostępnych publicznie lub w handlu programów do wielokrotnego dostosowania sekwencji, takich jak Clustal W, dostępny przez serwery Web w Internecie. Alternatywnie, stosowane są także narzędzia z pakietu Vector NTI. W dziedzinie znanych jest także wiele algorytmów, które można zastosować do mierzenia identyczności sekwencji nukleotydowych obejmujących te zawarte w opisanych powyżej programach. W innym przykładzie, sekwencje polinukleotydowe mogą być porównywane z zastosowaniem Fasta, programu w GCG wersja 6.1. Fasta dostarcza dostosowań i procentu identyczności sekwencji regionów najlepszego zachodzenia między sekwencją zapytania i przeszukiwaną. Na przykład, procent identyczności sekwencji między sekwencjami nukleotydowymi może być wyznaczony z zastosowaniem Fasta z domyślnymi parametrami (długość słowa 6 i współczynnik NOPAM dla macierzy podobieństwa), jak dostarczone w GCG wersja 6.1, niniejszym włączonym przez referencję. Podobne programy dostępne są też dla sekwencji aminokwasowych, np. program Clustal X. Na ogół, wszystkie te programy są stosowane z ustawieniami domyślnymi, chociaż specjalista w dziedzinie może w miarę potrzeby zmienić te ustawienia. Alternatywnie, specjalista w dziedzinie może zastosować inny algorytm lub program komputerowy, który dostarcza przynajmniej poziomu identyczności lub dopasowania, jak dostarczone przez odnośnikowe algorytmy i programy.
Termin „znacząca homologia” lub „znaczące podobieństwo” w odniesieniu do kwasu nukleinowego lub jego fragmentu wskazuje, że przy optymalnym dopasowaniu z innym kwasem nukleinowym (lub jego nicią komplementarną) z odpowiednimi insercjami lub delecjami nukleotydowymi, występuje identyczność sekwencji nukleotydowej w co najmniej około 95 do 99% dopasowanych sekwencji. Korzystnie, homologia zachodzi na całej długości sekwencji, lub jej otwartej ramki odczytu, lub innego odpowiedniego fragmentu, który ma długość co najmniej 15 nukleotydów. Przykłady odpowiednich dopasowań są tu opisane.
Termin „znacząca homologia” lub „znaczące podobieństwo” w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej lub jej fragmentu wskazuje, że przy optymalnym dopasowaniu z inną sekwencją aminokwasową z odpowiednimi insercjami lub delecjami aminokwasów, występuje identyczność sekwencji aminokwasowej w co najmniej około 95 do 99% dopasowanych sekwencji. Korzystnie, homologia zachodzi na całej długości sekwencji, lub jej białka, np. białka cap, białka rep lub jej fragmentu, który ma długość co najmniej 8 aminokwasów, lub korzystniej, co najmniej 15 aminokwasów. Przykłady odpowiednich dopasowań są tu opisane.
Termin „wysoce konserwatywne” oznacza co najmniej 80% identyczności, korzystnie co najmniej 90% identyczności, a korzystniej co najmniej 97% identyczności. Specjalista łatwo określi identyczność przy pomocy algorytmów i programów komputerowych znanych specjalistom w dziedzinie.
Termin „procent identyczności sekwencji” lub „identyczne” w kontekście sekwencji kwasów nukleinowych odnosi się do pozycji w obu sekwencjach, które są takie same przy dopasowaniu dla maksymalnej zgodności. Długość porównywania identyczności sekwencji może obejmować całą długość genomu, całą długość sekwencji kodującej gen, lub w razie potrzeby fragment o długości co najmniej 500 do 5000 nukleotydów. Jednak może być również potrzebna identyczność między mniejszymi fragmentami, np. co najmniej dziewięciu nukleotydów, zwykle co najmniej 20 do 24 nukleotydów, co najmniej 28 do 32 nukleotydów, co najmniej 36 lub więcej nukleotydów. Podobnie „procent identyczności sekwencji” można łatwo określić dla sekwencji aminokwasowych na całej długości białka lub jego fragmentu. Odpowiednio, fragment ma długość co najmniej 8 aminokwasów i może dochodzić do około 700 aminokwasów. Przykłady odpowiednich fragmentów są tu opisane.
PL 220 644 B1
Sekwencje AAV i ich fragmenty są przydatne w wytwarzaniu rAAV i są również przydatne jako antysensowne wektory do dostarczania, wektory do terapii genowej lub wektory szczepionkowe. Wynalazek dostarcza ponadto cząsteczek kwasów nukleinowych i komórek gospodarza zawierających sekwencje AAV.
Jak tu opisano, wektory zawierające białka kapsydu AAV szczególnie dobrze nadają się do użycia w zastosowaniach, w których przeciwciała neutralizujące zmniejszają skuteczność wektorów opartych na innych serotypach AAV, jak również innych wektorów wirusowych. Wektory rAAV są szczególnie korzystne przy ponownym podawaniu rAAV i powtórnej terapii genowej.
W użytym w tym opisie i zastrzeżeniach znaczeniu, terminy „obejmujący” i „zawierający” i ich odmiany, obejmują inne składniki, elementy, liczby całkowite, etapy i podobne. Przeciwnie, termin „złożone” i jego odmiany wyklucza inne składniki, elementy, liczby całkowite, etapy i podobne.
I Nowe serotypy AAV
A. Sekwencje nukleotydowe
Dostarczono sekwencje nukleotydowe nowych serotypów AAV zidentyfikowanych wcześniej opisanymi sposobami. Patrz SEKW. NR ID.: 1,9-59 i 117-120, które są tu włączone przez referencję. Patrz też Fig. 1 i lista sekwencji.
Dla nowego serotypu AAV7 sekwencje pełnej długości, w tym 5'ITR AAV, kapsyd, rep i 3' ITR AAV dostarczono w SEKW. NR ID.: 1.
Dla innych nowych serotypów AAV ujawniono fragment około 3,1 kz zawierający sekwencje kodujące białko kapsydu pełnej długości i całość lub część sekwencji kodujących białko rep. Sekwencje te obejmują klony zidentyfikowane poniżej.
Dla jeszcze innych nowych serotypów AAV ujawniono region charakterystyczny kodujący białko kapsydu. Na przykład, sekwencje nukleotydowe AAV10 obejmują przedstawione na Fig. 1 [patrz, SEKW. NR ID.: 117, która obejmuje 255 zasad].
Sekwencje nukleotydowe AAV11 obejmują sekwencje DNA przedstawione na Fig. 1 [patrz, SEKW. NR ID.: 118, która obejmuje 258 zasad]. Sekwencje nukleotydowe AAV12 obejmują sekwencje DNA przedstawione na Fig. 1 [patrz, SEKW. NR ID.: 119, która obejmuje 255 zasad]. Przy zastosowaniu opisanej powyżej metodologii, dalsze sekwencje AAV10, AAV11 i AAV12 mogą być łatwo zidentyfikowane i wykorzystane do szeregu różnych celów, w tym opisanych tu dla AAV7 i innych nowych serotypów.
Na Figurze 1 przedstawiono sekwencje AAV od naczelnych innych niż człowiek (NHP) zgodnie z dotychczas opublikowanymi serotypami AAV, AAV1 [SEKW. NR ID.:6], AAV2 [SEKW. NR ID.: 7] i AAV3 [SEKW. NR ID.: 8]. Te nowe sekwencje NHP obejmują sekwencje dostarczone w następującej Tabeli 1, które są zidentyfikowane przez numer klonu:
T a b e l a 1
Sekwencja Cap AAV Klon numer Źródło
1 2 3 4 5
Gatunek Tkanka SEKW. NR ID. (DNA)
Rh. 1 Klon 9 (AAV 9) Rezus Serce 5
Rh. 2 Klon 43.1 Rezus MLN 39
Rh. 3 Klon 43.5 Rezus MLN 40
Rh. 4 Klon 43.12 Rezus MLN 41
Rh. 5 Klon 43.20 Rezus MLN 42
Rh. 6 Klon 43.21 Rezus MLN 43
Rh. 7 Klon 43.23 Rezus MLN 44
Rh. 8 Klon 43.25 Rezus MLN 45
Rh. 9 Klon 44.1 Rezus Wątroba 46
Rh. 10 Klon 44.2 Rezus Wątroba 59
Rh. 11 Klon 44.5 Rezus Wątroba 47
Rh. 12 Klon 42.1B Rezus MLN 30
PL 220 644 B1 cd. tabeli 1
1 2 3 4 5
Rh. 13 Klon 42.2 Rezus MLN 9
Rh. 14 Klon 42.3A Rezus MLN 32
Rh. 15 Klon 42.3B Rezus MLN 36
Rh. 16 Klon 42.4 Rezus MLN 33
Rh. 17 Klon 42.5A Rezus MLN 34
Rh. 18 Klon 42.5B Rezus MLN 29
Rh. 19 Klon 42.6B Rezus MLN 38
Rh. 20 Klon 42.8 Rezus MLN 27
Rh. 21 Klon 42.10 Rezus MLN 35
Rh. 22 Klon 42.11 Rezus MLN 37
Rh. 23 Klon 42.12 Rezus MLN 58
Rh. 24 Klon 42.13 Rezus MLN 31
Rh. 25 Klon 42.15 Rezus MLN 28
Rh. 26 Klon 223.2 Rezus Wątroba 49
Rh. 27 Klon 223.4 Rezus Wątroba 50
Rh. 28 Klon 223.5 Rezus Wątroba 51
Rh. 29 Klon 223.6 Rezus Wątroba 52
Rh. 30 Klon 223.7 Rezus Wątroba 53
Rh. 31 Klon 223.10 Rezus Wątroba 48
Rh. 32 Klon C1 Rezus Śledziona, dwunastnica, nerka i wątroba 19
Rh. 33 Klon C3 Rezus 20
Rh. 34 Klon C5 Rezus 21
Rh. 35 Klon F1 Rezus Wątroba 22
Rh. 36 Klon F3 Rezus 23
Rh. 37 Klon F5 Rezus 24
Cy. 1 Klon 1.3 Makak Krew 14
Cy.2 Klon 13.3B Makak Krew 15
Cy. 3 Klon 24.1 Makak Krew 16
Cy. 4 Klon 27.3 Makak Krew 17
Cy. 5 Klon 7.2 Makak Krew 18
Cy. 6 Klon 16.3 Makak Krew 10
bb. 1 Klon 29.3 Pawian Krew 11
bb. 2 Klon 29.5 Pawian Krew 13
Ch. 1 Klon A3.3 Szympans Krew 57
Ch. 2 Klon A3.4 Szympans Krew 54
Ch. 3 Klon A3.5 Szympans Krew 55
Ch. 4 Klon A3.7 Szympans Krew 56
PL 220 644 B1
Nowy klon NHP sporządzono włączając fragmenty kapsydu dwóch adenowirusów szympansa do konstruktu AAV2 rep. Ten nowy klon, A3.1 nazwano też Ch.5 [SEKW. NR ID.: 20]. Ponadto, ujawniono dwie sekwencje ludzkiego AAV, nazwane H6 [SEKW. NR ID.: 25] i H2 [SEKW. NR ID.: 26].
Sekwencje kwasu nukleinowego z nowych AAV serotypów obejmują ponadto nić, która jest komplementarna do nici dostarczonych w sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i w Liście Sekwencji [SEKW. NR ID.: 1,9-59, 117-120], sekwencje kwasu nukleinowego, zarówno sekwencje RNA i cDNA odpowiadające sekwencjom przedstawionym na Fig. 1 i w Liście Sekwencji [SEKW. NR ID.: 1, 9-59, 117-120] i ich nici komplementarne. Sekwencje nukleotydowe nowych serotypów obejmują także naturalne warianty i skonstruowane modyfikacje sekwencji z Fig. 1 i Listy Sekwencji [SEKW. NR ID.: 1, 9-59, 117-120] i ich nici komplementarne. Modyfikacje takie obejmują, na przykład, znane w technice znaczniki, metylację i podstawienie jednego lub więcej naturalnie występujących nukleotydów nukleotydem zdegenerowanym.
Ujawniono sekwencje kwasu nukleinowego z nowych serotypów o homologii lub identyczności ponad 85%, korzystnie ponad 90%, a najkorzystniej przynajmniej 98 do 99% względem sekwencji nukleotydowych nowych serotypów, w tym Fig. 1 i Lista Sekwencji [SEKW. NR ID.: 1, 9-59, 117-120]. Terminy te są stosowane zgodnie z podaną tu definicją.
Fragmenty nowych sekwencji AAV zidentyfikowane opisanym tu sposobem mają długość co najmniej 15 nukleotydów i obejmują fragmenty funkcjonalne, tzn. fragmenty, które mają znaczenie biologiczne. W jednym wykonaniu, fragmentami tymi są fragmenty nowych sekwencji z Fig. 1 i Listy Sekwencji [SEKW. NR ID.: 1,9-59, 117-120], ich nici komplementarne, i komplementarne do nich cDNA i RNA.
Przykłady odpowiednich fragmentów dostarczono z uwzględnieniem położenia tych fragmentów w AAV1, AAV2 lub AAV7. Jednak, z zastosowaniem przedstawionego tu dopasowania (uzyskanego za pomocą programu Clustal W przy ustawieniach domyślnych) do tworzenia dopasowania z innymi nowymi serotypami, specjalista bez trudu zidentyfikuje dokładne pozycje nukleotydowe kodonów start i stop dla pożądanych fragmentów.
Przykłady odpowiednich fragmentów obejmują sekwencje kodujące trzy białka zmienne (vp) kapsydu AAV będące wariantami alternatywnego składania: vp1 [np. nt 825 do 3049 AAV7, SEKW. NR ID: 1]; vp2 [np. nt 1234-3049 AAV7, SEKW. NR ID: 1]; i vp 3 [np. nt 1434-3049 AAV7, SEKW. NR ID: 1]. Godne uwagi jest to, że AAV7 ma nietypowy kodon start GTG, za wyjątkiem kilku genów typu house-keeping, takich, jak kodon start nie opisany dotychczas w wirusach DNA. Uważano, że kodony start vp1, vp2 i vp3 dla innych serotypów AAV są takie, że mechanizm komórkowy komórki gospodarza, w której przebywają, może wytworzyć vp1, vp2 i vp3 w stosunku odpowiednio 10%:10%:80% w celu umożliwienia wydajnego złożenie wirionu. Stwierdzono jednak, że wirion AAV7 składa się wydajnie, nawet z tym rzadkim kodonem start GTG. Przewiduje się zatem, że konieczna jest zmiana kodonu start vp3 innych serotypów AAV tak, aby zawierały ten rzadki kodon start GTG, w celu poprawy wydajności pakowania, zmiany struktury wirionu i/lub zmiany położenia epitopów (np. epitopów dla przeciwciał neutralizujących) innych serotypów AAV. Kodony start mogą być zmienione za pomocą konwencjonalnych technik, w tym np. mutagenezy ukierunkowanej. Ujawniono tu zatem zmienione wiriony AAV dowolnego wybranego serotypu, złożone z vp3, i/lub ewentualnie vp1 i/lub vp2 z kodonem start zamienionym na GTG.
Do innych odpowiednich fragmentów AAV należy fragment zawierający kodon start białka kapsydu AAV [np. nt 468 do 3090 AAV7, SEKW. NR ID: 1, nt 725 do 3090, SEKW. NR ID: 1, i odpowiednie regiony innych serotypów AAV]. Jeszcze inne fragmenty AAV7 i innych nowych serotypów AAV zidentyfikowanych za pomocą opisanych tu sposobów obejmują fragmenty kodujące białka rep, w tym rep78 [np. kodon inicjacyjny 334 z Fig. 1 dla AAV7], rep68 [kodon inicjacyjny 334 z Fig. 1 dla AAV7], rep52 [kodon inicjacyjny 1006 z Fig. 1 dla AAV7] i rep40 [kodon inicjacyjny 1006 z Fig. 1 dla AAV7]. Inne fragmenty będące przedmiotem zainteresowania mogą obejmować odwrócone końcowe powtórzenia ITR AAV 5' [nt 1 do 107 z Fig. 1 dla AAV7]; ITR AAV 3' [nt 4704 do 4721 z Fig. 1 dla AAV7]; sekwencje P19, sekwencje P40 AAV, miejsce wiązania rep i końcowe miejsce rozdziału (TRS) (ang. Terminal Resolute Site). Jeszcze inne odpowiednie fragmenty będą oczywiste dla specjalisty. Odpowiednie regiony w innych nowych serotypach mogą być łatwo wyznaczone przez odniesienie do Figury 1 lub przy zastosowaniu konwencjonalnych technik dopasowania z dostarczonymi tu sekwencjami.
Poza włączeniem sekwencji nukleotydowych dostarczonych na figurach i w Liście Sekwencji ujawniono również cząsteczki kwasów nukleinowych i sekwencje, które zaprojektowano do wyrażania sekwencji aminokwasowych, białek i peptydów serotypów AAV tu ujawnionych. Zatem ujawniono
PL 220 644 B1 sekwencje nukleotydowe, które kodują następujące nowe sekwencje aminokwasowe AAV: C1
[SEKW. NR ID: 60], C2 [SEKW. NR ID: 61], C5 [SEKW. NR ID: 62], A3-3 [SEKW. NR ID: 66], A3-7 [SEKW. NR ID: 67], A3-4 [SEKW. NR ID: 68], A3-5 [SEKW. NR ID: 69], 3.3b [SEKW. NR ID: 62], 223.4 [SEKW. NR ID: 73], 223-5 [SEKW. NR ID: 74], 223-10 [SEKW. NR ID: 75], 223-2 [SEKW. NR ID: 76], 223-7 [SEKW. NR ID: 77], 223-6 [SEKW. NR ID: 78], 44-1 [SEKW. NR ID: 79], 44-5 [SEKW. NR ID: 80], 44-2 [SEKW. NR ID: 81], 42-15 [SEKW. NR ID: 84], 42-8 [SEKW. NR ID: 85], 42-13 [SEKW. NR ID: 86], 42-3A [SEKW. NR ID: 87], 42-4 [SEKW. NR ID: 88], 5A [SEKW. NR ID: 89], 42-1B [SEKW. NR ID: 90], 42-5B [SEKW. NR ID: 91],43-1 [SEKW. NR ID: 92], 43-12 [SEKW. NR ID: 93], 5 [SEKW. NR ID: 94], 43-21 [SEKW. NR ID: 96], 43-25[SEKW. NR ID: 97], 43-20 [SEKW. NR ID: 99], 24.1 [SEKW. NR ID: 101], 42.2 [SEKW. NR ID: 102], 7.2 [SEKW. NR ID: 103], 27.3 [SEKW. NR ID: 104], 16.3 [SEKW. NR ID: 105], 42.10 [SEKW. NR ID: 106], 42-3B [SEKW. NR ID: 107], 42-11 [SEKW. NR ID: 108], F1 [SEKW. NR ID: 109], F5 [SEKW. NR ID: 110], F3 [SEKW. NR ID: 111], 42-6B [SEKW. NR ID: 112], i/lub 42-12 [SEKW. NR ID: 113] i sztuczne serotypy AAV wytworzone za pomocą tych sekwencji i/lub ich charakterystycznych fragmentów.
W użytym tu znaczeniu, sztuczne serotypy AAV obejmują, między innymi, AAV z białkiem kapsydu niewystępującym naturalnie. Taki sztuczny kapsyd może być wytworzony dowolną odpowiednią techniką przy wykorzystaniu nowej sekwencji AAV tu ujawnionej (np. fragmentu białka kapsydu vp1) w połączeniu z heterologicznymi sekwencjami, które można uzyskać z innego serotypu AAV (znanego lub nowego), nieciągłej części tego samego serotypu AAV, innego niż AAV źródła wirusowego, lub ze źródła nie będącego wirusem. Sztuczny serotyp AAV może być, między innymi, chimerycznym kapsydem AAV, zrekombinowanym kapsydem AAV lub „humanizowanym” kapsydem AAV.
B. Sekwencje aminokwasowe AAV, białka i peptydy
Ujawniono tu białka i ich fragmenty, kodowane przez sekwencje nukleotydowe zidentyfikowanych tu nowych serotypów AAV, w tym np. AAV7 [nt 825 do 3049 AAV7, SEKW. NR. ID.: 1] i innych dostarczonych tu nowych serotypów. Białka kapsydu nowych serotypów, w tym: H6 [SEKW. NR ID: 25], H2 [SEKW. NR ID: 26], 42-2 [SEKW. NR ID: 9], 42-8 [SEKW. NR ID: 27], 42-15 [SEKW. NR ID: 28],
42- 5b [SEKW. NR ID: 29], 42-1b [SEKW. NR ID: 30], 42-13 [SEKW. NR ID: 31], 42-3a [SEKW. NR ID: 32], 42-4 [SEKW. NR ID: 33], 42-5a [SEKW. NR ID: 34], 42-10 [SEKW. NR ID: 35], 42-3b [SEKW. NR ID: 36], 42-11 [SEKW. NR ID: 37], 6b [SEKW. NR ID: 38], 43-1 [SEKW. NR ID: 39], 43-5 [SEKW. NR ID: 40], 43-12 [SEKW. NR ID: 41], 43-20 [SEKW. NR ID: 42], 21 [SEKW. NR ID: 43], 43-23 [SEKW. NR ID: 44], 43-25 [SEKW. NR ID: 45], 44.1 [SEKW. NR ID: 47], 44.5 [SEKW. NR ID: 47], 223.10 [SEKW. NR ID: 48], 223.2 [SEKW. NR ID: 49], 223.4 [SEKW. NR ID: 50], 223.5 [SEKW. NR ID: 51], 223.6 [SEKW. NR ID: 52], 223.7 [SEKW. NR ID: 53], A3.4 [SEKW. NR ID: 54], A3.5 [SEKW. NR ID: 55], A3.7 [SEKW. NR ID: 56], A3.3 [SEKW. NR ID: 57], 42.12 [SEKW. NR ID: 58], i 44.2 [SEKW. NR ID: 59] mogą zatem być łatwo wytworzone przy użyciu konwencjonalnych technik z otwartych ramek odczytu dostarczonych przez wymienione powyżej klony.
Ujawniono ponadto serotypy AAV wytworzone z zastosowaniem sekwencji nowych serotypów AAV, które są wytworzone technikami syntezy rekombinacji lub innymi technikami znanymi specjalistom. Sekwencje aminokwasowe, peptydy i białka mogą być też wytworzone innymi sposobami znanymi w technice, w tym np. przez syntezę chemiczną, innymi technikami syntezy lub innymi sposobami. Na przykład, sekwencje każdego spośród C1 [SEKW. NR ID: 60], C2 [SEKW. NR ID: 61], C5 [SEKW. NR ID: 62], A3-3 [SEKW. NR ID: 66], A3-7 [SEKW. NR ID: 67], A3-4 [SEKW. NR ID: 68], A3-5 [SEKW. NR ID: 69], 3.3b [SEKW. NR ID: 62], 223.4 [SEKW. NR ID: 73], 223-5 [SEKW. NR ID: 74], 223-10 [SEKW. NR ID: 75], 223-2 [SEKW. NR ID: 76], 223-7 [SEKW. NR ID: 77], 223-6 [SEKW. NR ID: 78], 44-1 [SEKW. NR ID: 79], 445 [SEKW. NR ID: 80], 44-2 [SEKW. NR ID: 81], 42-15 [SEKW. NR ID: 84], 42-8 [SEKW. NR ID: 85], 42-13 [SEKW. NR ID: 86], 42-3A [SEKW. NR ID: 87], 42-4 [SEKW. NR ID: 88], 42-5A [SEKW. NR ID: 89], 42-1B [SEKW. NR ID: 90], 42-5B [SEKW. NR ID: 91],
43- 1 [SEKW. NR ID: 92], 43-12 [SEKW. NR ID: 93], 43-5 [SEKW. NR ID: 94], 43-21 [SEKW. NR ID: 96], 43-25 [SEKW. NR ID: 97], 43-20 [SEKW. NR ID: 99], 24.1 [SEKW. NR ID: 101], 42.2 [SEKW. NR ID: 102], 7.2 [SEKW. NR ID: 103], 27.3 [SEKW. NR ID: 104], 16.3 [SEKW. NR ID: 105], 42.10 [SEKW. NR ID: 106], 42-3B [SEKW. NR ID: 107], 42-11 [SEKW. NR ID: 108] , FI [SEKW. NR ID: 109], F5 [SEKW. NR ID: 110], F3 [SEKW. NR ID: 111], 42-6B [SEKW. NR ID: 112], i/lub 42-12 [SEKW. NR ID: 113] można łatwo wytworzyć z zastosowaniem szeregu różnych technik.
Odpowiednie techniki wytwarzania są dobrze znane specjalistom. Patrz np. Sambrook i wsp.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternatywnie, peptydy mogą być też syntetyzowane za pomocą dobrze znanych sposobów syntezy peptyPL 220 644 B1 dów w fazie stałej (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1962); Stewart i Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) ss. 27-62). Te i inne odpowiednie sposoby wytwarzania są znane specjalistom.
Do szczególnie pożądanych białek należą białka kapsydu AAV, które są kodowane przez zidentyfikowane powyżej sekwencje nukleotydowe. Sekwencje wielu spośród białek kapsydowych dostarczono w dopasowaniu na Fig. 2 i/lub w Liście Sekwencji, SEKW. NR ID.: 2 i 60 do 115, które są tu niniejszym włączone przez referencję. Kapsyd AAV składa się z trzech białek vp1, vp2 i vp3, które są wariantami alternatywnego składania. Pełnej długości sekwencja przedstawiona na tych figurach to sekwencja vp1. Na podstawie numeracji kapsydu AAV7 [SEKW. NR ID.: 2], sekwencje vp2 obejmują aminokwasy 138-737 AAV7, zaś sekwencje vp3 obejmują aminokwasy 203-737 AAV7. Na podstawie tych informacji specjalista może bez trudu wyznaczyć położenie białek vp2 i vp3 dla innych nowych serotypów.
Do innych pożądanych białek i fragmentów białek kapsydu należą stałe i zmienne regiony, położone pomiędzy regionami hiperzmiennymi (HPV) oraz sekwencje samych regionów HPV. Algorytm opracowany dla wyznaczenia obszaru dywergencji sekwencji w AAV2 wykazał 12 regionów hiperzmiennych (HVR), z których 5 nakłada się, lub stanowi część czterech wcześniej opisanych regionów zmiennych. [Chiorini i wsp., J. Virol, 73: 1309-19 (1999); Rutledge i wsp., J : Virol., 72: 309-319] Przy zastosowaniu tego algorytmu i/lub opisanych tu technik dopasowania wyznaczane są HVR nowych serotypów AAV. Na przykład, względem numeracji vp1 AAV2 [SEKW. NR ID.:70], HVR zlokalizowane są następująco: HVR1, aa 146-152; HVR2, aa 182186; HVR3, aa 262-264; HVR4, aa 381-383; HVR5, aa 450-474; HVR6, aa 490-495; HVR7, aa 500-504; HVR8, aa 514-522; HVR9, aa 534-555; HVR10, aa 581-594; HVR11, aa 658-667; i HVR12, aa 705-719. Przy zastosowaniu dopasowania, przygotowanego według konwencjonalnych sposobów, oraz dostarczonych tu nowych sekwencji [patrz, np. Figura 2], można łatwo wyznaczyć położenie HVR w nowych serotypach AAV tu ujawnionych. Przykładowo, przy wykorzystaniu Figury 2 można z łatwością stwierdzić, że dla AAV7 [SEKW. NR ID.: 2] HVR1 jest zlokalizowany w aa 146-152; HVR2 jest zlokalizowany w 182-187; HVR3 jest zlokalizowany w aa 263-266, HVR4 jest zlokalizowany w aa 383-385, HVR5 jest zlokalizowany w aa 451475; HVR6 jest zlokalizowany w aa 491-496 of AAV7; HVR7 jest zlokalizowany w aa 501-505; HVR8 jest zlokalizowany w aa 513-521; HVR9 jest zlokalizowany w 533-554; HVR10 jest zlokalizowany w aa 583-596; HVR11 jest zlokalizowany w aa 660-669; HVR12 jest zlokalizowany w aa 707-721. Z zastosowaniem dostarczonej tu informacji z łatwością można wyznaczyć HVR dla innych nowych serotypów.
Dodatkowo zidentyfikowano w kapsydzie aminokwasowe kasety identyczności. Kasety te są szczególnie interesujące, gdyż są przydatne do konstruowania sztucznych serotypów, np. przez wymianę kasety HVR1 wybranego serotypu na kasetę HVR1 innego serotypu. Niektóre spośród tych kaset identyczności zaznaczono na Fig. 2. Patrz Fig. 2 dostarczająca dopasowania Clustal X, które ma przedstawioną pod sekwencjami linijkę, poczynając od pierwszej pozycji oznaczonej 1. Linia nad linijką jest stosowana do zaznaczenia silnie konserwatywnych pozycji. Wykorzystywane są trzy znaki (*,:,.). „*” oznacza pozycje zawierające jeden, w pełni konserwatywny aminokwas. „:” oznacza, że grupa „silna” jest w pełni konserwatywna. „.” oznacza, że grupa „słabsza” jest w pełni konserwatywna. Są to grupy o dodatniej wartości występujące w macierzy Gonnet Pam250. Grupy silne zdefiniowane są przez silną wartość >0,5, zaś grupy słabe są zdefiniowane przez słabą wartość <0,5.
Dodatkowo, przykłady innych odpowiednich fragmentów kapsydów AAV obejmują według numeracji AAV2 [SEKW. NR ID.: 70], aa 24-42, aa 25-28; aa 81-85; aa 133-165; aa 134-165; aa 137-143; aa 154-156; aa 194-208; aa 261-274; aa 262-274; aa 171-173; aa 413-417; aa 449-478; aa 494-525; aa 534-571; aa 581-601; aa 660-671; aa 709-723. Do jeszcze innych żądanych fragmentów należą, na przykład, dla AAV7 aminokwasy 1 do 184 SEKW. NR ID.: 2, aminokwasy 199 do 259; aminokwasy 274 do 446; aminokwasy 603 do 659; aminokwasy 670 do 706; aminokwasy 724 do 736; aa 185 do 198; aa 260 do 273; aa 447 do 477; aa 495 do 602; aa 660 do 669; i aa 707 do 723.
Jeszcze inne żądane fragmenty, według numeracji AAV7 [SEKW. NR ID.: 2], wybrane są z grupy złożonej z aa 185 do 198; aa 260 do 273; aa 447 do 477; aa 495 do 602; aa 660 do 669; i aa 707 do 723. Stosując dostarczone tu dopasowanie wykonane przy użyciu programu Clustal X przy domyślnych ustawieniach, lub przy zastosowaniu innego dostępnego w handlu lub publicznie programu przy domyślnych ustawieniach, specjalista łatwo określi odpowiadające im fragmenty nowych kapsydów AAV.
PL 220 644 B1
Innymi żądanymi białkami są białka rep AAV [aa 1 do 623 SEKW. NR ID.: 3 dla AAV7] i ich funkcjonalne fragmenty, w tym między innymi np. aa 1 do 171, aa 172 do 372, aa 373 do 444, aa 445 do 623 SEKW. NR ID.: 3. Odpowiednio, fragmenty takie mają przynajmniej 8 aminokwasów długości. Patrz Fig. 3. Porównywalne regiony można zidentyfikować we fragmentach innych nowych AAV z zastosowaniem technik opisanych tu i znanych w dziedzinie. Ponadto, fragmenty innej żądanej długości mogą być łatwo wykorzystane. Fragmenty takie mogą być wytworzone przez rekombinację lub innymi odpowiednimi środkami, np. przez syntezę chemiczną.
Sekwencje, białka i fragmenty mogą być wytworzone dowolnymi odpowiednimi sposobami, w tym przez rekombinację, syntezę chemiczną lub innymi środkami syntezy. Takie metody wytwarzania są znane specjalistom.
II Wytwarzanie rAAV z nowymi kapsydami AAV
Wynalazek dostarcza cząsteczek, które wykorzystują nowe sekwencje AAV ujawnione w opisie niniejszego wynalazku, w tym ich fragmenty, do wytwarzania cząsteczek przydatnych do dostarczania heterologicznych genów lub innych sekwencji kwasów nukleinowych do komórki docelowej.
Cząsteczką według wynalazku jest wyizolowana lub syntetyczna cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fragment białka kapsydu wirusa stowarzyszonego z adenowirusami rh10 zawierająca sekwencję nowego serotypu wirusa AAV według wynalazku, która może być dostarczona do komórki gospodarza, korzystnie jest ona plazmidem. W niniejszym wynalazku ujawniono też inne elementy genetyczne (wektory), które mogą być dostarczone do komórki gospodarza, np. nagi DNA, plazmid, fag, transpozon, kosmid, episom, białko w niewirusowym nośniku (np. nośniku lipidowym), wirus itp., które przenoszą niesione w nich sekwencje. Wybrany wektor może być dostarczony dowolnym odpowiednim sposobem, w tym przez transfekcję, elektroporację, dostarczenie liposomów, techniki fuzji błonowej, opłaszczone DNA kulki o dużej prędkości, infekcję wirusową i fuzję protoplastów. Sposoby stosowane do skonstruowania dowolnego wykonania wynalazku są znane specjalistom w dziedzinie manipulacji kwasami nukleinowymi i obejmują inżynierię genetyczną, inżynierię rekombinacyjną i techniki syntetyczne. Patrz, np. Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
W jednym wykonaniu, wektory zawierają sekwencje kodujące nowy kapsyd AAV (np. kapsyd
AAV7, kapsyd AAV 44-2 (rh.10), kapsyd AAV10, kapsyd AAV11, kapsyd AAV12), lub fragment jednego lub więcej z tych kapsydów. Alternatywnie, wektory mogą zawierać samo białko kapsydu lub jego fragment.
Ewentualnie, wektory mogą zawierać sekwencje kodujące białka rep AAV. Takie sekwencje rep mogą pochodzić z tego samego serotypu AAV, co dostarczający sekwencji cap. Alternatywnie, wektorami są te, w których sekwencje rep pochodzą z serotypu AAV różniącego się od serotypu dostarczającego sekwencji cap. W jednym wykonaniu sekwencje rep i cap są wyrażane z różnych źródeł (np. oddzielnych wektorów, lub komórki gospodarza i wektora). W innym wykonaniu, te sekwencje rep są wyrażane z tego samego źródła, co sekwencje cap. W tym wykonaniu, sekwencje rep mogą być połączone w ramce z sekwencjami cap innego serotypu AAV tworząc chimeryczny wektor AAV. Ewentualnie, wektory zawierają ponadto minigen obejmujący wybrany transgen otoczony ITR 5' AAV i ITR 3' AAV.
Zatem, w jednym wykonaniu, opisane tu wektory zawierają sekwencje nukleotydowe kodujące pełny kapsyd AAV, który może pochodzić z pojedynczego serotypu AAV (np. AAV7 lub innego nowego AAV). Alternatywnie, wektory te zawierają sekwencje kodujące sztuczne kapsydy, które zawierają jeden lub więcej fragmentów kapsydu AAV7 (lub innego nowego AAV) połączone z białkami kapsydu heterologicznego AAV lub nie AAV (lub ich fragmentami). Te sztuczne białka kapsydu są wybrane z nieciągłych części kapsydu AAV7 (lub innego nowego AAV) lub z kapsydów innych serotypów AAV. Na przykład, może być konieczna modyfikacja regionów kodujących jeden lub więcej vp1 AAV, np. w jednym lub więcej regionów hiperzmiennych (tzn. HPV1-12), lub vp2 i/lub vp3. W innym przykładzie, może być konieczna zmiana kodonu start białka vp3 na GTG. Modyfikacje te mogą mieć na celu zwiększenie ekspresji, wydajności i/lub poprawę oczyszczania w wybranych systemach ekspresyjnych lub też inny żądany cel (np. zmianę tropizmu lub zmianę epitopów dla przeciwciał neutralizujących).
Opisane tu wektory, np. plazmidowe, są przydatne w szeregu zastosowań, lecz szczególnie dobrze nadają się do wykorzystania do wytwarzania rAAV zawierającego kapsyd obejmujący sekwencje AAV lub jej fragment. Te wektory, obejmujące rAAV, ich elementy, konstrukcję i zastosowania są tu opisane szczegółowo.
PL 220 644 B1
Wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania rekombinowanego wirusa stowarzyszonego z adenowirusem (AAV) obejmującego kapsyd AAV o serotypie AAV rh10, lub jego części. Sposób taki obejmuje hodowanie komórki gospodarza zawierającej sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko kapsydu wirusa stowarzyszonego z adenowirusem (AAV) serotypu rh10 (, lub jego fragment tak, jak tu określono; funkcjonalny gen rep; minigen złożony minimalnie z odwróconych końcowych powtórzeń (ITR) AAV i transgenu; oraz geny adenowirusa kodujące odpowiednie funkcje pomocnicze dla umożliwienia pakowania minigenu do białka kapsydu AAV.
Składniki wymagane w hodowli w komórce gospodarza do upakowania minigenu AAV do kapsydu AAV mogą być dostarczone do komórki gospodarza in trans. Alternatywnie, dowolny jeden lub więcej z wymaganych składników (np. minigen, sekwencje rep, sekwencje cap, i/lub funkcje pomocnicze) mogą być dostarczone przez stabilną komórkę gospodarza, którą zmieniono tak, aby zawierała jeden lub więcej wymaganych składników, przy użyciu sposobów znanych specjalistom. Najdogodniej, taka stabilna komórka gospodarza będzie zawierać wymagany składnik (i) pod kontrolą indukowalnego promotora. Jednak wymagany składnik(i) może być pod kontrolą promotora konstytutywnego. Przykłady odpowiednich promotorów indukowalnych i konstytutywnych dostarczono tu przy omówieniu elementów regulacyjnych odpowiednich do zastosowania razem z transgenem. Wybrana stabilna komórka gospodarza może zawierać wybrany składniki(i) pod kontrolą promotora konstytutywnego i inny wybrany składnik(i) pod kontrolą jednego lub więcej indukowalnych promotorów. Na przykład, stabilna komórka gospodarza może być wytworzona z komórki pochodzącej z komórek 293 (zawierających funkcje pomocnicze E1 pod kontrolą promotora konstytutywnego), lecz zawierających białka rep i/lub cap pod kontrolą promotorów indukowalnych. Jeszcze inne stabilne komórki gospodarza mogą być wytworzone przez specjalistę.
Minigen, sekwencje rep, sekwencje cap, i funkcje pomocnicze wymagane do wytworzenia rAAV mogą być dostarczone do upakowania w komórce gospodarza w postaci dowolnego elementu genetycznego, który przenosi niesione w sobie sekwencje. Wybrany element genetyczny może być dostarczony dowolnym odpowiednim sposobem, w tym tu opisanymi. Sposoby zastosowane w dowolnym wykonaniu tego wynalazku są znane specjalistom w dziedzinie manipulacji kwasami nukleinowymi i obejmują inżynierię genetyczną, inżynierię rekombinacyjną i techniki syntetyczne. Patrz, np. Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
Podobnie, sposoby wytwarzania wirionów rAAV są dobrze znane i wybór odpowiedniego sposobu nie stanowi ograniczenia niniejszego wynalazku, patrz, np. K. Fisher i wsp., J. Virol., 70: 520-532 (1993) i patent USA nr 5,478,745.
A. Minigen
Minigen składa się minimalnie z transgenu i jego sekwencji regulatorowych, oraz odwróconych końcowych powtórzeń 5' i 3' AAV (ITR). Jest to ten minigen, który jest pakowany do białka kapsydowego i dostarczany do wybranej komórki gospodarza.
1. Transgen
Transgen jest sekwencją nukleotydową, heterologiczną względem sekwencji wektorowych otaczających transgen, która koduje polipeptyd, białko lub inny będący przedmiotem zainteresowania produkt. Kodująca sekwencja kwasu nukleinowego jest funkcjonalnie połączona ze składnikami regulatorowymi w sposób, który pozwala na transkrypcję transgenu i/lub ekspresję w komórce gospodarza.
Skład sekwencji transgenu będzie zależał od zastosowania, do którego będzie przeznaczony uzyskany wektor. Na przykład, jeden z typów sekwencji transgenu zawiera sekwencję reporterową, która po ekspresji wytwarza wykrywalny sygnał. Do takich sekwencji reporterowych należą, między innymi, sekwencje DNA kodujące β-laktamazę, β-galaktozydazę (lacZ), alkaliczną fosfatazę, kinazę tymidynową, białko zielonej fluorescencji (GFP), acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT), lucyferazę, białka związane z błoną, w tym, na przykład, CD2, CD4, CD8, białko hemaglutyniny wirusa grypy i inne dobrze znane w dziedzinie, dla których istnieją lub mogą być wytworzone konwencjonalnymi środkami skierowane przeciwko nim przeciwciała o wysokim powinowactwie, oraz białka fuzyjne obejmujące związane z błoną białko odpowiednio połączone z domeną znacznika antygenowego z, między innymi, hemaglutyniny lub Myc.
Te sekwencje kodujące, gdy są połączone z elementami regulatorowymi kontrolującymi ich ekspresję, dostarczają sygnałów wykrywalnych konwencjonalnymi środkami, w tym oznaczeniami enzymatycznymi, radiograficznymi, kolorymetrycznymi, fluorescencją lub innymi oznaczeniami spektrograficznymi, oznaczeniami opartymi na sortowaniu komórek aktywowanego przez fluorescencję i oznaczeniami immunologicznymi, w tym, immunoenzymatycznym (ELISA), radioimmunologicznym
PL 220 644 B1 (RIA) i immunohistochemią. Na przykład, gdy sekwencją znacznikową jest gen LacZ, obecność wektora niosącego sygnał jest wykrywana przez oznaczenia aktywności beta-galaktozydazy. Gdy transgenem jest zielone białko fluorescencji lub lucyferaza, wektor niosący sygnał można oznaczyć wizualnie przez wytwarzanie barwy lub światła w luminometrze.
Jednak, korzystnie, transgenem jest sekwencja nie będąca znacznikiem kodująca produkt, który jest przydatny w biologii i medycynie, taki jak białka, peptydy, RNA, enzymy lub RNA katalityczne. Do pożądanych cząsteczek RNA należą tRNA, dsRNA, rybosomalne RNA, katalityczne RNA i RNA antysensowne. Jednym z przykładów użytecznej sekwencji RNA jest sekwencja hamująca ekspresję docelowej sekwencji kwasu nukleinowego u leczonego zwierzęcia.
Transgen można wykorzystać do skorygowania lub złagodzenia defektów genu, do których mogą należeć defekty genów, w których prawidłowe geny są wyrażane na niższym poziomie, niż prawidłowy lub defekty, w których nie jest wyrażany funkcjonalny produkt genu. Korzystny typ transgenu koduje białko lub polipeptyd terapeutyczny wyrażany w komórce gospodarza. Można stosować wiele transgenów, np. do skorygowania lub złagodzenia defektu genowego powodowanego brakiem białka złożonego z wielu podjednostek. W pewnych sytuacjach osobny transgen może być stosowany do kodowania każdej podjednostki białka, lub kodowania różnych peptydów lub białek. Jest to konieczne, gdy wielkość DNA kodującego podjednostkę białkową jest duża, np. dla immunoglobuliny, czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego lub białka dystrofiny. Aby komórka wytwarzała białko złożone z wielu podjednostek, infekuje się ją zrekombinowanym wirusem zawierającym każdą z różnych podjednostek. Alternatywnie, różne podjednostki białka mogą być kodowane przez ten sam transgen. W tym przypadku, pojedynczy transgen zawiera DNA kodujący każdą z podjednostek, przy czym DNA dla każdej z podjednostek jest oddzielony wewnętrznym miejscem przyłączenia rybosomu (IRES). Jest to pożądane, gdy wielkość DNA kodującego każdą z podjednostek jest niewielka, np. całkowita wielkość DNA kodującego podjednostki i IRES wynosi poniżej pięciu kilozasad. Jako alternatywę dla IRES, DNA można przedzielić sekwencjami kodującymi peptyd 2A, który sam się przecina w procesie posttranslacyjnym. Patrz np., M. L. Donelly i wsp., J. Gen. Virol., 78 (pt 1): 13-21 (Styczeń 1997): Furler S. i wsp., Gene Ther., 8 (11): 864-873 (Czerwiec 2001); Klump H., i wsp., Gene Ther., 8(10): 811-817 (Maj 2001). Ten peptyd 2A jest znacząco mniejszy niż IRES, co czyni go szczególnie przydatnym w zastosowaniach, w których czynnikiem ograniczającym jest przestrzeń. Wybrany transgen może jednak kodować dowolny czynny biologicznie produkt lub inny produkt, np. produkt pożądany w celu badań.
Odpowiednie transgeny mogą być bez trudu wybrane przez specjalistę. Wybór transgenu nie jest uważany za ograniczenie niniejszego wynalazku.
2. Elementy regulatorowe
Oprócz głównych elementów zidentyfikowanych powyżej dla minigenu, wektor zawiera także niezbędne konwencjonalne elementy kontrolne, które są funkcjonalnie połączone z transgenem w sposób umożliwiający jego transkrypcję, translację i/lub ekspresję w komórce transfekowanej wektorem plazmidowym lub zainfekowanej wirusem wytworzonym sposobem według wynalazku. W użytym tu znaczeniu, „funkcjonalnie połączone” sekwencje obejmują zarówno sekwencje kontrolujące ekspresję, które sąsiadują z genem będącym przedmiotem zainteresowania oraz sekwencje kontrolne działające in trans lub na odległość kontrolując gen będący przedmiotem zainteresowania.
Do sekwencji kontrolujących ekspresję należą odpowiednie sekwencje inicjacji transkrypcji, terminacji, sekwencje promotorowe i sekwencje wzmacniaczy; wydajne sygnały obróbki RNA, takie jak sygnały składania i poliadenylacji (poliA); sekwencje stabilizujące mRNA cytoplazmatyczne; sekwencje wzmacniające wydajność translacji (tzn. sekwencja najwyższej zgodności Kozaka); sekwencje wzmacniające stabilność białka; oraz gdy jest to konieczne, sekwencje wzmacniające wydzielanie kodowanego produktu. Duża liczba sekwencji kontrolujących ekspresję, w tym promotorów natywnych, konstytutywnych, indukowalnych i/lub swoistych tkankowo jest znana w dziedzinie i może być wykorzystana.
Przykłady promotorów konstytutywnych obejmują, ale nie wyłącznie, retrowirusowy promotor LTR wirusa mięsaka Rousa (RSV) (ewentualnie ze wzmacniaczem RSV), promotor cytomegalowirusa (CMV) (ewentualnie ze wzmacniaczem CMV) [patrz, np. Boshart i wsp., Cell, 41: 521-530 (1985)], promotor SV40, promotor reduktazy dihydrofolianowej, promotor β-aktyny, promotor kinazy fosfoglicerolowej (PGK) oraz promotor EF1a [Invitrogen].
Promotory indukowalne umożliwiają regulację ekspresji genów i mogą być regulowane przez związki egzogenne, czynniki środowiskowe, takie jak temperatura lub obecność konkretnego stanu fizjologicznego, np. fazy ostrej, konkretnego stanu różnicowania komórki, lub tylko w komórkach repliPL 220 644 B1 kujących się. Indukowalne promotory i indukowalne systemy dostępne są z wielu źródeł handlowych, w tym, ale nie wyłącznie, od Invitrogen, Clontech i Ariad. Wiele innych systemów zostało opisanych i mogą one być łatwo wybrane przez specjalistę. Do przykładów indukowalnych promotorów regulowanych przez związki dostarczane z zewnątrz należą indukowany przez cynk promotor metalotioneiny (MT) owcy, indukowany przez deksametazon (Dex) promotor mysiego wirusa nowotworu sutka (MMTV), system promotora polimerazy T7 [WO 98/10088]; owadzi promotor ekdyzonu [No i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)], system reprymowany przez tetracyklinę [Gossen i wsp., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)], system indukowany przez tetracyklinę [Gossen i wsp., Science, 268: 1766-1769 (1995), patrz też Harvey i wsp., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)], system indukowany przez RU486 [Wang i wsp., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) i Wang i wsp., Gene Ther., 4:432-441 (1997)] oraz system indukowany przez rapamycynę [Magari i wsp., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. Jeszcze innymi typami indukowalnych promotorów, które mogą być przydatne w tym kontekście, są promotory regulowane przez specyficzny stan fizjologiczny, np. temperaturę, fazę ostrą, konkretny stan różnicowania komórki lub tylko w komórkach replikujących się dzielących się.
W innym wykonaniu użyty będzie natywny promotor transgenu. Natywny promotor może być korzystny gdy ekspresja transgenu musi naśladować ekspresję natywną. Natywny promotor może być użyty gdy ekspresja transgenu musi być regulowana czasowo lub rozwojowo, lub w sposób swoisty tkankowo, lub w odpowiedzi na konkretne bodźce transkrypcyjne. W dalszym wykonaniu, inne natywne elementy kontroli ekspresji, takie jak elementy wzmacniaczy, miejsca poliadenylacji lub sekwencje najwyższej zgodności Kozaka mogą być także wykorzystane do naśladowania natywnej ekspresji.
Inne wykonanie transgenu obejmuje transgen funkcjonalnie połączony z promotorem swoistym tkankowo. Na przykład, jeżeli pożądana jest ekspresja w mięśniu szkieletowym, zastosowany powinien być promotor aktywny w mięśniu. Należą do nich promotory genów kodujących szkieletową β-aktynę, lekki łańcuch 2A miozyny, dystrofinę, mięśniową kinazę kreatyny, a także syntetyczne promotory mięśniowe o aktywnościach wyższych, niż w naturalnie występujących promotorach (patrz Li i wsp., Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)). Przykłady promotorów, które są swoiste tkankowo znane są dla wątroby (albumina, Miyatake i wsp., J. Virol., 71: 5124-32 (1997); rdzeniowy promotor wirusa zapalenia wątroby typu B, Sandig i wsp., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); alfa-fetoproteina (AFP), Arbuthnot i wsp., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteokalcyna kości (Stein i wsp., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialoproteina kości (Chen i wsp., J. Bone. Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), limfocytów (CD2, Hansal i wsp., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); ciężki łańcuch immunoglobuliny; łańcuch a receptora komórek T), neuronów takie, jak promotor swoistej dla neuronów enolazy (NSE) (Andersen i wsp., Cell. Mol. Neurohiol., 13: 503-15 (1993)), genu lekkiego łańcucha neurofilamentu (Piccioli i wsp., Proc. natl. Acad. Sci. USAr 88: 5611-5 (1991)), oraz swoistego dla neuronów genu vgf (Piccioli i wsp., Neuron, 15: 373-84 (1995)) i inne.
Ewentualnie, plazmidy niosące przydatne terapeutycznie transgeny mogą także zawierać markery selekcyjne lub geny reporterowe, do których mogą należeć geny kodujące oporność na, między innymi, genetycynę, hygromycynę lub puromycynę. Takie selekcyjne geny reporterowe lub markerowe (umieszczone poza genomem wirusa, który ma być odzyskany) mogą być wykorzystane do sygnalizacji obecności plazmidów w komórkach bakterii, np. przez oporność na ampicylinę. Do innych składników plazmidu może należeć miejsce startu replikacji. Wybór tych i innych promotorów i elementów wektorowych jest konwencjonalny i dostępnych jest wiele takich sekwencji [patrz np., Sambrook i wsp., i cytowane tam referencje].
Połączenie transgenu, promotora/wzmacniacza, oraz ITR 5' i 3' dla ułatwienia jest tu nazywane „minigenem”. Projektowanie takiego minigenu można przeprowadzić za pomocą konwencjonalnych technik.
3. Dostarczenia minigenu do pakującej komórki gospodarza
Minigen może być niesiony w dowolnym odpowiednim wektorze, np. plazmidzie, który jest dostarczany do komórki gospodarza. Plazmidy można skonstruować tak, aby nadawały się do replikacji i ewentualnie, integracji w komórkach prokariotycznych, komórkach ssaków lub w obu typach. Plazmidy te (lub inne wektory niosące 5' ITR AAV-heterologiczna cząsteczka-3' ITR) zawierają sekwencje umożliwiające replikację minigenu w eukariontach i/lub prokariontach oraz markery selekcyjne dla tych systemów. Markery selekcyjne lub geny reporterowe mogą obejmować geny kodujące oporność na, między innymi, genetycynę, hygromycynę lub puromycynę. Plazmidy mogą także zawierać pewne selekcyjne geny markerowe lub reporterowe, które można zastosować do sygnalizacji obecności wek14
PL 220 644 B1 torów w komórkach bakterii, takie jak oporność na ampicylinę. Do innych składników plazmidu może należeć miejsce startu replikacji oraz amplikon, taki jak system amplikonu wykorzystujący antygen jądrowy wirusa Epsteina Barra. Ten system amplikonu lub inne podobne składniki amplikonu pozwalają na replikację episomalną w komórce w wysokiej liczbie kopii. Korzystnie, cząsteczka niosąca minigen jest transfekowana do komórki, gdzie może występować przejściowo. Alternatywnie, minigen (niosący 5' ITR AAV-heterologiczna cząsteczka-3'ITR) może być stabilnie zintegrowany z genomem komórki gospodarza, albo z chromosomem, albo jako episom. W niektórych wykonaniach minigen może być obecny w wielu kopiach, ewentualnie w postaci konkatamerów w układzie głowa do głowy, głowa do ogona lub ogon do ogona. Odpowiednie techniki transfekcji są znane i mogą łatwo być wykorzystane do dostarczenia minigenu do komórki gospodarza.
Na ogół, przy dostarczaniu wektora obejmującego minigen przez transfekcję, wektor dostarczany jest w ilości od około 5 pg do około 100 pg DNA, a korzystnie około 10 do około 50 pg DNA do około 1 x 104 do około 1 x 1013 komórek, a korzystnie około 105 komórek. Względne stosunki ilości DNA wektora do komórek gospodarza mogą jednak być dostosowane, biorąc pod uwagę takie czynniki, jak wybrany wektor, sposób dostarczenia i wybrane komórki gospodarza.
B. Sekwencje Rep i Cap
Poza minigenem, komórka gospodarza zawiera sekwencje kierujące wyrażaniem nowego białka kapsydu AAV (np. kapsydu AAV7 lub innego nowego AAV lub sztucznego białka kapsydu obejmującego fragment jednego lub więcej tych kapsydów) w komórce gospodarza oraz sekwencje rep tego samego serotypu, co serotyp ITR AAV znajdujących się w minigenie. Sekwencje cap i rep AAV można uzyskać niezależnie ze źródła AAV jak opisano powyżej i można wprowadzić do komórki gospodarza dowolnym sposobem znanym specjaliście tak, jak opisano powyżej. Ponadto, przy pseudotypowaniu nowego kapsydu AAV, sekwencje kodujące każde z niezbędnych białek rep mogą być dostarczone przez ten sam serotyp AAV, lub sekwencje kodujące białka rep mogą być dostarczone przez inne serotypy AAV (np. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 lub jeden z nowych zidentyfikowanych tu serotypów). Na przykład, sekwencje rep78/68 mogą pochodzić z AAV2, podczas gdy sekwencje rep52/40 mogą pochodzić z AAV1.
W jednym wykonaniu komórka gospodarza stabilnie zawiera białko kapsydu pod kontrolą odpowiedniego promotora, takiego, jak opisane powyżej. W tym wykonaniu, białko kapsydu jest wyrażane pod kontrolą promotora indukowalnego. W innym wykonaniu, białko kapsydu jest dostarczane do komórki gospodarza in trans. Przy dostarczaniu do komórki gospodarza in trans, białka kapsydu mogą być dostarczane przez plazmid, który zawiera sekwencje niezbędne do kierowania ekspresją wybranego białka kapsydu w komórce gospodarza. Przy dostarczaniu do komórki gospodarza in trans, plazmid niosący białko kapsydu niesie również inne sekwencje wymagane do pakowania rAAV, np. sekwencje rep.
Zatem w innym wykonaniu komórka gospodarza stabilnie zawiera sekwencje rep pod kontrolą odpowiedniego promotora, takiego jak opisane powyżej. W tym wykonaniu, niezbędne białka rep są wyrażane pod kontrolą promotora indukowalnego. W innym wykonaniu, białka rep są dostarczane do komórki gospodarza in trans. Przy dostarczaniu do komórki gospodarza in trans, białka rep mogą być dostarczane przez plazmid, który zawiera sekwencje niezbędne do kierowania ekspresją wybranych białek rep w komórce gospodarza. Przy dostarczaniu do komórki gospodarza in trans, plazmid niosący białko kapsydu niesie również inne sekwencje wymagane do pakowania rAAV, np. sekwencje rep i cap.
Zatem w jednym z wykonań, sekwencje rep i cap mogą być transfekowane do komórki gospodarza na jednej cząsteczce kwasu nukleinowego i istnieć stabilnie w komórce w postaci episomu. W innym wykonaniu, sekwencje rep i cap są stabilnie zintegrowane z genomem komórki. W innym wykonaniu sekwencje rep i cap są przejściowo wyrażane w komórce gospodarza. Na przykład, przydatna w takiej transfekcji cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje od 5' do 3' promotor, ewentualnie łącznik między promotorem a początkiem sekwencji genu rep, sekwencję genu rep AAV oraz sekwencję genu cap AAV.
Ewentualnie, sekwencje rep i/lub cap mogą być dostarczone na wektorze zawierającym inne sekwencje DNA, które mają być wprowadzone do komórek gospodarza. Na przykład, wektor może zawierać konstrukt rAAV obejmujący minigen. Wektor może obejmować jeden lub więcej genów kodujących funkcje pomocnicze, np. adenowirusowe białka E1, E2a i E4ORF6, oraz gen RNA VAI.
Promotor stosowany w tym konstrukcie może być dowolnym z konstytutywnych, indukowalnych lub natywnych promotorów znanych specjalistom lub omówionych powyżej. W jednym wykonaniu zastosowany jest promotor P5 AAV. W innym korzystnym wykonaniu, promotor rep jest promotorem
PL 220 644 B1 indukowalnym, jak omówiono to powyżej w związku z elementami regulacyjnymi transgenu. Jednym z korzystnych promotorów do wyrażania rep jest promotor T7. Wektor obejmujący gen rep regulowany przez promotor T7 i gen cap jest transfekowany lub transformowany do komórki, która konstytutywnie albo indukowalnie wyraża polimerazę T7 . Patrz WO 98/10088, opublikowany 12 marca 1998.
Łącznik jest ewentualnym elementem konstrukcji wektora. Łącznik jest to sekwencja DNA wstawiona między promotorem a kodonem start ATG genu rep. Łącznik może mieć dowolny żądany charakter; to znaczy może być losową sekwencją nukleotydową lub alternatywnie, może on kodować produkt genu takiego, jak gen markerowy. Łącznik może zawierać geny, które typowo zawierają miejsca start/stop i poliA. Łącznik może być niekodującą sekwencją DNA z prokarionta lub eukarionta, powtarzalną sekwencją niekodującą, sekwencją kodującą bez sygnałów kontroli translacji lub sekwencją kodującą z sygnałami kontroli translacji. Dwoma przykładowymi źródłami sekwencji łącznikowej są sekwencje drabinki faga λ oraz sekwencje drabinki drożdży, które są dostępne w handlu, np. z Gibco lub Invitrogen. między innymi. Łącznik może mieć dowolną długość wystarczającą do obniżenia ekspresji produktów genów rep78 i rep68, pozostawiając ekspresję produktów genów rep52, rep40 oraz cap na normalnych poziomach. Długość łącznika może zatem wynosić od około 10 bp do około 10,0 kb, korzystnie w zakresie od około 100 bp do około 8,0 kb. Dla zmniejszenia możliwości rekombinacji, łącznik korzystnie ma długość poniżej 2 kb.
Chociaż cząsteczka(i) dostarczająca rep i cap mogą występować w komórce gospodarza przejściowo (tj. przez transfekcję), korzystne jest, żeby jedno lub więcej spośród białek rep i cap oraz promotor(y) kontrolujący ich ekspresję były stabilnie wyrażane w komórce gospodarza, np. jako episom lub przez integrację z chromosomem komórki gospodarza. Konstrukty takie są wytwarzane konwencjonalnymi technikami inżynierii genetycznej lub inżynierii rekombinacyjnej. Podczas, gdy opis ten dostarcza ilustrujących przykładów konkretnych konstruktów, przy wykorzystaniu dostarczonej tu informacji, specjalista w dziedzinie może wybrać i zaprojektować inne odpowiednie konstrukty stosując wybór łączników, promotorów P5 i innych elementów, w tym co najmniej jeden sygnał start i stop translacji, oraz ewentualny dodatek miejsc poliadenylacji.
W innym wykonaniu białko rep lub cap może być stabilnie dostarczane przez komórkę gospodarza.
C. Funkcje pomocnicze
Pakująca komórka gospodarza wymaga też funkcji pomocniczych w celu pakowania rAAV. Ewentualnie, funkcje te mogą być dostarczane przez wirusa opryszczki. Najkorzystniej, niezbędne funkcje pomocnicze są wszystkie dostarczane przez źródło adenowirusa pochodzącego od człowieka lub naczelnego innego niż człowiek, takiego jak te opisane powyżej i/lub są dostępne z szeregu źródeł, w tym American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA (USA). Komórce gospodarza dostarcza się i/lub zawiera ona produkt genu E1a, produkt genu E1b, produkt genu E2a i/lub produkt genu E4ORF6. Komórka gospodarza może zawierać inne geny adenowirusowe takie, jak RNA VAI, geny te nie są jednak niezbędne. Żadne inne geny lub funkcje genów adenowirusa nie są obecne w komórce gospodarza.
Przez „DNA adenowirusa wyrażający produkt genu E1a” rozumie się dowolną sekwencję adenowirusa kodującą E1a lub dowolną funkcjonalną część E1a. DNA adenowirusa wyrażający produkt genu E2a oraz DNA adenowirusa wyrażający produkt genu E4ORF6 są definiowane podobnie. Włączone są tu również dowolne allele lub inne modyfikacje genu adenowirusa lub jego funkcjonalnej części. Modyfikacje takie mogą być celowo wprowadzone przy pomocy konwencjonalnych technik inżynierii genetycznej lub mutagenezy w celu wzmocnienia w jakiś sposób funkcji adenowirusa lub mogą być jego naturalnie występującymi wariantami allelicznymi. Takie modyfikacje i sposoby manipulowania DNA dla uzyskania tych funkcji genów adenowirusa są znane specjalistom.
Produkty genów adenowirusa E1a, E1b, E2a i/lub E4ORF6, a także dowolne inne pożądane funkcje pomocnicze mogą być dostarczone z zastosowaniem dowolnych środków umożliwiających ich wyrażanie w komórce. Każda z sekwencji kodujących te produkty może być na osobnym wektorze, lub też jeden lub więcej genów może być na tym samym wektorze. Wektorem może być dowolny wektor znany w dziedzinie lub ujawniony powyżej, w tym plazmid, kosmid i wirus. Wprowadzenie do komórki gospodarza można osiągnąć dowolnymi środkami znanymi w dziedzinie lub ujawnionymi powyżej, w tym między innymi, przez transfekcję, infekcję, elektroporację, dostarczenie liposomów, techniki fuzji błonowej, opłaszczone DNA kulki o dużej prędkości, infekcję wirusową i fuzję protoplastów. Jeden lub więcej genów adenowirusa może być stabilnie zintegrowanych z genomem komórki gospodarza, stabilnie wyrażanych jako episomy, lub wyrażanych przejściowo. Wszystkie produkty genów mogą być wyrażane przejściowo, na episomie lub stabilnie wintegrowane, albo niektóre spośród produktów
PL 220 644 B1 genów mogą być wyrażane stabilnie, podczas gdy inne są wyrażane przejściowo. Ponadto, promotory każdego z genów adenowirusa mogą być wybrane niezależnie spośród promotorów, konstytutywnych, promotorów indukowalnych lub natywnych promotorów adenowirusowych. Promotory mogą być regulowane przez specyficzny stan fizjologiczny organizmu lub komórki (np. przez stan różnicowania lub w replikujących się lub będących w spoczynku komórkach) lub przez dodane z zewnątrz czynniki, przykładowo.
D. Komórki gospodarza i pakujące linie komórkowe
Sama komórka gospodarza może być wybrana spośród dowolnych organizmów biologicznych, w tym komórek prokariotycznych (np. bakteryjnych) i komórek eukariotycznych, w tym komórek owadzich, komórek drożdży i komórek ssaków. Szczególnie pożądane komórki gospodarza wybrane są spośród dowolnego gatunku ssaka, w tym, między innymi, komórek takich, jak A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, komórki 293 (które wyrażają funkcjonalne E1 adenowirusa), Saos, C2C12, komórki L, HT1080, HepG2 i pierwotne komórki fibroblastów, hepatocytów i mioblastów pochodzące od ssaków, w tym, od człowieka, małpy, myszy, szczura, królika i chomika. Wybór gatunku ssaka dostarczającego komórek, ani typ komórki ssaka, tzn. fibroblast, hepatocyt, komórka nowotworowa itp. nie jest ograniczeniem wynalazku. Najbardziej pożądane komórki nie niosą żadnych genów adenowirusa poza E1, E2a i/lub E4 ORF6, ani nie zawierają żadnych innych genów wirusowych, które mogłyby spowodować rekombinację homologiczną lub zanieczyszczenie wirusem podczas wytwarzania rAAV; są one także zdolne do infekcji lub transfekcji DNA oraz wyrażania stransfekowanego DNA. W korzystnym wykonaniu, komórka gospodarza posiada rep i cap stabilnie transfekowane do komórki.
Jedną z przydatnych komórek gospodarza jest komórka gospodarza stabilnie stransformowana sekwencjami kodującymi rep i cap i stransfekowana DNA adenowirusa E1, E2a i E40RF6 oraz konstruktem niosącym minigen tak, jak opisano powyżej. Podobnie, mogą być zastosowane komórki stabilnie wyrażające rep i/lub cap, takie, jak B-50 (PCT/US98/19463), lub opisane w Patencie USA nr 5,658,785. Inna pożądana komórka gospodarza zawiera minimalny adenowirusowy DNA wystarczający do wyrażania E4ORF6. Jeszcze inne linie komórkowe można skonstruować wykorzystując nowe sekwencje rep AAV i/lub nowe sekwencje cap AAV.
Przygotowanie komórki gospodarza obejmuje techniki takie, jak składanie wybranych sekwencji DNA. Składanie to można przeprowadzić z zastosowaniem konwencjonalnych technik. Techniki takie obejmują cDNA i klonowanie genomowe, które są dobrze znane i opisane w Sambrook i wsp., cytowanym powyżej, zastosowanie nakładających się sekwencji oligonukleotydowych genomów adenowirusa i genomów AAV, w połączeniu z łańcuchową reakcją polimerazy, metody syntetyczne i dowolne inne odpowiednie sposoby, które dostarczają pożądaną sekwencję nukleotydową.
Cząsteczki (takie jak plazmidy i wirusy) można wprowadzić do komórki gospodarza z zastosowaniem technik znanych specjaliście i omawianych w tym opisie. Stosowane są standardowe techniki transfekcji, np trasfekcja CaPO4 lub elektroporacja i/lub infekcja hybrydowymi wektorami adenowirus/AAV do linii komórkowych, takich jak ludzka zarodkowa linia komórek nerki HEK 293 (linia ludzkich komórek nerki zawierających funkcjonalny gen E1 adenowirusa dostarczający działających w układzie trans białek E1).
Te nowe oparte na AAV wektory, które są wytworzone przez specjalistę, są korzystne dla dostarczania genów do wybranych komórek gospodarza i pacjentów poddanych terapii genowej, ponieważ nie odnaleziono w populacji ludzkiej przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV7. Ponadto, początkowe badania wykazują brak przeciwciał neutralizujących w populacjach makaka i szympansa oraz mniej niż 15% reaktywności krzyżowej AAV7 u rezusów, gatunku, z którego wyizolowano ten serotyp. Specjalista z łatwością może wytworzyć inne wektory wirusowe rAAV zawierające dostarczone tu białka kapsydu AAV7 przy zastosowaniu szeregu technik znanych specjalistom. Podobnie można wytworzyć jeszcze inne wektory wirusowe rAAV zawierające sekwencję AAV7 i kapsydy AAV innego serotypu. Podobne korzyści związane są z użyciem wektorów opartych na innych nowych AAV.
Zatem specjalista z łatwością zrozumie, że sekwencje AAV7 mogą być z łatwością dostosowane do zastosowania w tych i innych systemach wektorów wirusowych do dostarczania genów in vitro, ex vivo lub in vivo. Podobnie, specjalista może łatwo wybrać inne fragmenty nowego genomu AAV do zastosowania w szeregu systemów wektorowych opartych na rAAV, ale nie na rAAV. Do takich systemów wektorowych mogą między innymi należeć np. lentiwrusy, retrowirusy, wirusy ospy, wirusy krowianki i systemy adenowirusowe. Wektory można wytworzyć z zastosowaniem sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych nowych AAV. Wektory takie są przydatne dla różnych celów, w tym, do
PL 220 644 B1 dostarczania cząsteczek terapeutycznych i do stosowania w reżimach szczepień. Szczególnie pożądane do dostarczania cząsteczek terapeutycznych są zrekombinowane AAV zawierające kapsydy nowych AAV. Te, lub inne konstrukty wektorowe zawierające nowe sekwencje AAV mogą być stosowane w reżimach szczepień, np. do współdostarczania cytokiny, lub do dostarczania samego immunogenu.
III Zrekombinowane wektory i ich zastosowania
Przy zastosowaniu opisanych tu technik specjalista może wytworzyć rAAV mający kapsyd nowego serotypu lub nowy kapsyd zawierający jeden lub więcej nowych fragmentów serotypu AAV wytworzonego sposobem według wynalazku. W jednym wykonaniu, może być zastosowany pełnej długości kapsyd z pojedynczego serotypu, np. AAV7 [SEKW. NR. ID.: 2]. W innym wykonaniu można wytworzyć pełnej długości kapsyd zawierający jeden lub więcej fragmentów nowego serotypu sfuzowanych z sekwencjami z innego wybranego serotypu AAV. Na przykład, rAAV może zawierać jedną lub więcej nowych sekwencji regionów hiperzmiennych z serotypu AAV według wynalazku. Alternatywnie, unikatowe serotypy AAV można zastosować w konstruktach zawierających inne sekwencje wirusowe lub niewirusowe.
Specjalista w dziedzinie z łatwością zauważy, że pewne serotypy będą być szczególnie dobrze dopasowane do pewnych zastosowań. Na przykład, wektory oparte na kapsydach AAV7 są szczególnie przydatne do stosowania w mięśniach, podczas gdy wektory oparte na kapsydach rh.10 (44-2) według wynalazku są szczególnie przydatne do stosowania w płucach. Zastosowania takich wektorów nie są w ten sposób ograniczone i specjalista może wykorzystać te wektory do dostarczania do innych typów komórek, tkanek lub narządów. Ponadto, wektory oparte na innych kapsydach mogą być stosowane do dostarczania do tych, lub innych komórek, tkanek lub narządów.
A. Dostarczanie transgenu
Sposób dostarczania transgenu do gospodarza, który obejmuje transfekcję lub infekcję wybranej komórki gospodarza wektorem wytworzonym z sekwencji AAV. Sposoby dostarczania są dobrze znane specjalistom.
Sposób wprowadzania za pośrednictwem AAV transgenu do gospodarza obejmuje transfekcję lub infekcję wybranej komórki gospodarza zrekombinowanym wektorem wirusowym zawierającym wybrany transgen pod kontrolą sekwencji kierujących ekspresją jego i białek kapsydu AAV.
Ewentualnie, próbka od gospodarza może być najpierw zbadana pod kątem obecności przeciwciał przeciwko wybranemu serotypowi AAV. Specjalistom jest dobrze znanych szereg różnych formatów oznaczeń do wykrywania przeciwciał neutralizujących. Patrz np. Fisher i wsp., Nature Med., 3 (3): 306-312 (marzec 1997) i W. C. Manning i wsp., Human Gene Therapy, 9: 477-485 (1 marzec,1998). Wyniki tego oznaczenia mogą być wykorzystane do określania, który wektor AAV zawierający białka kapsydu konkretnego serotypu będzie korzystny do dostarczenia, np. na podstawie nieobecności przeciwciał neutralizujących swoistych wobec tego serotypu kapsydu.
W jednym aspekcie tego sposobu, dostarczenie wektora z wybranymi białkami kapsydu AAV może poprzedzać lub następować po dostarczeniu genu za pośrednictwem wektora z białkiem kapsydu AAV innego serotypu. Podobnie, dostarczenie wektora z innymi nowymi białkami kapsydu AAV może poprzedzać lub następować po dostarczeniu genu za pośrednictwem wektora z białkiem kapsydu AAV innego serotypu. Dostarczenie genów za pośrednictwem wektorów rAAV może zatem być stosowane do wielokrotnego dostarczania genów do wybranej komórki gospodarza. Podawane później wektory rAAV niosą ten sam transgen, co pierwszy wektor rAAV, lecz zawierają białka kapsydu serotypów różnych od tego z pierwszego wektora. Na przykład, jeżeli pierwszy wektor ma białka kapsydu AAV7 [SEKW. NR ID.: 2], podawane później wektory mogą mieć białka kapsydu wybrane spośród innych serotypów, w tym, AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV6, AAV10, AAV11, i AAV12, lub któregokolwiek z innych nowych kapsydów AAV zidentyfikowanych tu, w tym miedzy innymi: A3.1, H2, H6, C1, C2, C5, A3-3, A3-7, A3-4, A3-5, 3.3b, 223.4, 223-5, 223-10, 223-2, 223-7, 2236, 44-1, 44-5, 44-2, 42-15, 42-8, 42-13, 42-3A, 42-4, 42-5A, 42-1B, 42-5B, 43-1, 43-12, 43-5, 43-21, 43-25, 43-20, 24.1, 42.2, 7.2, 27.3, 16.3, 42.10, 42-3B, 42-11, F1, F5, F3, 42-6B, i/lub 42-12.
Opisane powyżej zrekombinowane wektory mogą być dostarczone do komórek gospodarza zgodnie z opublikowanymi sposobami. rAAV zawieszony w zgodnym fizjologicznie nośniku, może być podany pacjentowi - człowiekowi lub ssakowi innemu niż człowiek. Odpowiednie nośniki mogą być łatwo wybrane przez specjalistę zgodnie ze wskazaniami, dla których ukierunkowany jest transfer wirusa. Na przykład, jednym z odpowiednich nośników jest sól fizjologiczna, która może być formułowana z szeregiem roztworów buforujących (np. sól fizjologiczna buforowana fosforanem). Do innych
PL 220 644 B1 przykładowych nośników należą jałowy roztwór soli fizjologicznej, laktoza, sacharoza, fosforan wapnia, żelatyna, dekstran, agar, pektyna, olej z orzeszków ziemnych, olej sezamowy i woda. Ewentualnie, kompozycje mogą zawierać, poza rAAV i nośnikiem(-ami) inne konwencjonalne składniki farmaceutyczne, takie jak środki konserwujące lub chemiczne środki stabilizujące. Do odpowiednich przykładowych środków konserwujących należą chlorobutanol, sorbinian potasu, kwas sorbinowy, ditlenek siarki, galusan propylu, parabeny, etylowanilina, gliceryna, fenol i parachlorofenol. Do odpowiednich chemicznych środków stabilizujących należą żelatyna i albumina.
Wektory wirusowe są podawane w ilościach wystarczających do transfekowania komórek i dostarczenia odpowiedniego poziomu przeniesienia i ekspresji genu dla uzyskania korzyści terapeutycznej bez szkodliwych skutków ubocznych lub z dopuszczalnymi medycznie skutkami fizjologicznymi, które mogą być określone przez specjalistę w dziedzinie medycyny. Do konwencjonalnych i dopuszczalnych farmaceutycznie dróg podawania należą, ale nie wyłącznie, bezpośrednie podanie do wybranego narządu (np. dostarczenie do żyły wrotnej do wątroby), doustne, inhalacja (w tym droga wewnątrznosowa i wewnątrztchawicza), dooczne, dożylne, domięśniowe, podskórne, śródskórne i inne pozajelitowe drogi podawania. Gdy jest to pożądane można łączyć różne drogi podawania.
Dawkowanie wektora wirusowego będzie zależeć głównie od czynników takich, jak leczone schorzenie, wiek, waga i zdrowie pacjenta i może zatem zmieniać się zależnie od pacjenta. Na przykład, skuteczne terapeutycznie dawkowanie wektora wirusowego u człowieka mieści się z reguły w zakresie od około 1 ml do około 100 ml roztworu zawierającego stężenia od około 1 x 109 do 1 x 1016 genomów wektora wirusowego. Korzystna dawka u człowieka może wynosić od około 1 x 1013 do około 1 x 1016 genomów AAV. Dawkowanie będzie dostosowane do zrównoważenia korzyści terapeutycznej z jakimikolwiek skutkami ubocznymi, a dawkowanie to może zmieniać się w zależności od celu terapeutycznego, w którym stosowany jest zrekombinowany wektor. Poziomy ekspresji transgenu można monitorować w celu ustalenia częstości dawkowania uzyskanych wektorów wirusowych, korzystnie wektorów AAV zawierających minigen. Ewentualnie, reżimy dawkowania podobne do opisanych tu dla celów terapeutycznych mogą być stosowane do immunizacji z zastosowaniem kompozycji według wynalazku.
Przykłady produktów terapeutycznych i produktów immunogennych do dostarczania wektorami zawierającymi AAV dostarczone są poniżej. Wektory te mogą być stosowane w szeregu różnych reżimów terapeutycznych lub szczepień tak, jak tu opisano. Dodatkowo, wektory te mogą być dostarczane w połączeniu z jednym lub więcej innymi wektorami lub składnikami czynnymi w żądanym reżimie terapeutycznym i/lub szczepień.
B. Transgeny terapeutyczne
Do użytecznych produktów terapeutycznych kodowanych przez transgen należą hormony i czynniki wzrostu i różnicowania, w tym, ale nie wyłącznie, insulina, glukagon, hormon wzrostu (GH), hormon przytarczycy (PTH), czynnik uwalniający hormon wzrostu (GRF), hormon folikulotropowy (FSH), hormon luteinizujący (LH), ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG), naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF), angiopoetyny, angiostatyna, czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów i makrofagów (GCSF), erytropoetyna (EPO), czynnik wzrostu tkanki łącznej (CTGF), zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), kwaśny czynnik wzrostu fibroblastów (aFGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), transformujący czynnik wzrostu a (TGFa), płytkowy czynnik wzrostu (PDGF), insulinopodobne czynniki wzrostu I i II (IGF-I i IGF-II), dowolny z nadrodziny transformujących czynników wzrostu β, w tym TGFβ, aktywiny, inhibiny lub dowolne z białek morfogenezy kości (BMP) BMP 1-15, dowolny z rodziny czynników wzrostu i różnicowania (NDF) hereguliny/neureguliny/ARIA/neu, czynnik wzrostu nerwu (NGF), czynnik neutroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF), neurotrofiny NT-3 i NT-4/5, rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF), czynnik neutroficzny pochodzący z linii komórek gleju (GDNF), neurturyna, agrina, dowolny z rodziny semaforyn/kolapsyn, netryna-1 i netryna-2, czynnik wzrostu hepatocytów (HGF), efryny, noggina, sonie hedgehog i hydroksylaza tyrozynowa.
Do innych użytecznych produktów transgenu należą białka regulujące układ odpornościowy, w tym, ale nie wyłącznie, cytokiny i limfokiny, takie jak trombopoetyna (TPO), interleukiny (IL) IL-1 do IL-25 (w tym, IL-2, IL-4, IL-12 i IL-18), białko chemotaktyczne monocytów, czynnik hamujący białaczkę, czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów i makrofagów, ligand Fas, czynnik martwicy nowotworów α i β, interferony α, β i γ, czynnik komórek macierzystych, ligand flk-2/flt3. Użyteczne są również produkty genów wytwarzane przez ludzki układ odpornościowy. Należą do nich, ale nie wyłącznie, immunoglobuliny IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, chimeryczne immunoglobuliny, humanizowane przeciwciała, przeciwciała jednołańcuchowe, receptory limfocytów T, chimeryczne receptory limfocyPL 220 644 B1 tów T, jednołańcuchowe receptory limfocytów T, cząsteczki MHC klasy I i II, a także skonstruowane metodami inżynierii immunoglobuliny i cząsteczki MHC. Do użytecznych produktów genów należą także białka regulujące dopełniacz, takie jak białka regulujące dopełniacz, białko kofaktora błonowego (MCP), czynnik przyspieszający rozpad (DAF), CR1, CF2 i CD59.
Do jeszcze innych użytecznych produktów genów należą dowolne spośród receptorów hormonów, czynników wzrostu, cytokin, limfokin, białek regulatorowych i białek układu odpornościowego. Receptory regulacji cholesterolu obejmują receptor lipoproteiny o małej gęstości (LDL), receptor lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL), receptor lipoproteiny bardzo małej gęstości (VLDL) i receptor usuwający resztki. Produktami takich genów mogą być przedstawiciele nadrodziny receptorów hormonów sterydowych, w tym receptory glukokortykoidów i receptory estrogenów, receptory witaminy D inne receptory jądrowe. Dodatkowo, do użytecznych produktów genów należą czynniki transkrypcyjne, takie jak jun, fos, max, mad, czynnik odpowiedzi na surowicę (SRF), AP-1, AP-2, myb, MyoD i miogenina, białka zawierające ETS-box, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, białka wiążące motyw CCAAT, czynnik regulacji przez interferon (IRF-1) , białko guza Wilmsa, białko wiążące ETS, STAT, białka wiążące motyw GATA, np. GATA-3 i rodzina forkhead białek z motywem uskrzydlonej helisy.
Inne użyteczne produkty genów obejmują syntetazę karbamoilową I, transkarbamylazę ornitynową, syntetazę argininobursztynianową, liazę argininobursztynianową, arginazę, hydrolazę fumaryloacetooctanową, hydroksylazę fenyloalaninową, alfa-1 antytrypsynę, glukozo-6-fosfatazę, deaminazę porfobilinogenu, czynnik VIII, czynnik IX, syntazę beta-cystationu, dekarboksylazę rozgałęzionych ketokwasów, albuminę, dehydrogenazę izowalerylo-CoA, karboksylazę propionylo-CoA, mutazę metylo-malonylo CoA, dehydrogenazę glutarylo CoA, insulinę, beta-glukozydazę, karboksylazę pirogronianową, fosforylazę wątrobową, kinazę fosforylazową, dekarboksylazę glicynową, białko H, białko T, transbłonowy regulator mukowiscydozy (CFTR) i sekwencję cDNA dystrofiny. Do jeszcze innych użytecznych produktów genów należą enzymy, takie jakie mogą być przydatne w terapii zastępczej, która jest użyteczna w szeregu schorzeń wynikających z defektu aktywności enzymu. Na przykład, enzymy zawierające mannozo-6-fosforan mogą być przydatne w leczeniu chorób magazynowania lizosomalnego (np. odpowiedni gen kodujący β-glukuronidazę (GUSB)).
Do innych użytecznych produktów genów należą polipeptydy niewystępujące naturalnie, takie jak polipeptydy chimeryczne lub hybrydowe mające sekwencję aminokwasową niewystępującą naturalnie, zawierającą insercje, delecje lub podstawienia aminokwasowe. Na przykład, jednołańcuchowe immunoglobuliny wytworzone metodami inżynierii mogłyby być przydatne u pewnych pacjentów z obniżoną odpornością. Inne typy sekwencji genowych niewystępujących naturalnie obejmują cząsteczki antysensowne i katalityczne kwasy nukleinowe, takie jak rybozymy, które mogłyby być stosowane do zmniejszenia nadekspresji cząsteczki docelowej.
Zmniejszenie, i/lub regulacja ekspresji genu są szczególnie pożądane przy leczeniu schorzeń hiperproliferacyjnych cechujących się hiperproliferacją komórek tak, jak w chorobie nowotworowej i łuszczycy. Docelowe polipeptydy obejmują polipeptydy, które są wytwarzane wyłącznie lub na wyższych poziomach w komórkach hiperproliferujących w porównaniu z komórkami prawidłowymi. Do antygenów docelowych należą polipeptydy kodowane przez onkogeny, takie jak myb, myc, fyn i gen translokacji bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk i EGRF. Oprócz produktów onkogenów jako antygeny docelowe są stosowane docelowe polipeptydy do reżimów leczenia przeciwnowotworowego i ochronnego obejmujące regiony zmienne przeciwciał wytwarzanych przez chłoniaki limfocytów B oraz regiony zmienne receptorów T chłoniaków limfocytów T, które, w niektórych wykonaniach, są też stosowane jako antygeny docelowe w chorobach autoimmunologicznych. Jako polipeptydy docelowe mogą być użyte inne polipeptydy związane z nowotworami takie, jak polipeptydy, których podwyższony poziom stwierdzany jest w komórkach nowotworowych, jak polipeptyd rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne 17-1A i polipeptydy wiążące kwasy foliowy.
Do innych odpowiednich polipeptydów i białek terapeutycznych należą te, które mogą być przydatne w leczeniu osobników cierpiących na choroby i schorzenia auto-immunologiczne nadając szeroką odpowiedź odporności ochronnej przeciwko celom związanym z odpowiedzią autoimmunologiczną, w tym receptorom komórkowym i komórkom wytwarzającym przeciwciała skierowane przeciwko „swoim” celom. Do chorób autoimmunologicznych, w których pośredniczą limfocyty T należą reumatoidalne zapalenie stawów (RA), stwardnienie rozsiane (MS), zespół Sjorgena, sarkoidoza, cukrzyca insulinozależna (IDDM), autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (wole Hashimoto), reaktywne zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, twardzina skóry, zapalenie wielo20
PL 220 644 B1 mięśniowe, zapalenie skórno-mięśniowe, łuszczyca, zapalenie naczyń, ziarniniak Wegenera, choroba Crohna i wrzodziejące zapalenie okrężnicy. Każda z tych chorób cechuje się występowaniem receptorów limfocytów T (TCR), które wiążą się z antygenami endogennymi i zapoczątkowują kaskadę zapalną związaną z chorobą autoimmunologiczną.
C. Transgeny immunogenne
Alternatywnie lub dodatkowo, wektory mogą zawierać sekwencje AAV oraz transgen kodujący peptyd, polipeptyd lub białko wywołujące odpowiedź odpornościową przeciwko wybranemu immunogenowi. Na przykład, immunogeny mogą być wybrane spośród szeregu rodzin wirusów. Do przykładów celowych rodzin wirusów, przeciwko którym celowa byłaby odpowiedź odpornościowa należą: rodzina pikornawirusów, która obejmuje rodzaje rhinowirusów, odpowiedzialnych za około 50% przypadków przeziębienia, rodzaj enterowirusów, do którego należą poliowirusy, wirusy Coxsackie, echowirusy oraz enterowirusy ludzkie, takie jak wirus zapalenia wątroby typu A oraz rodzaj aptowirusów, które są odpowiedzialne za pryszczycę, głównie u zwierząt innych niż człowiek. W rodzinie pikornawirusów do antygenów docelowych należą VP1, VP2, VP3, VP4 i VPG. Inna rodzina wirusów obejmuje rodzinę kaliciwirusów, która obejmuje grupę wirusów Norwalk, które są istotnym czynnikiem sprawczym epidemicznego zapalenia żołądka i jelit. Jeszcze inną rodziną wirusów wskazaną w zastosowaniu do kierowania antygenów do indukowania odpowiedzi odpornościowej u ludzi i innych zwierząt jest rodzina togawirusów, do której należy rodzaj alfawirus, który obejmuje wirusy Sindbis, wirus RossRiver, wirusy zapalenia mózgu koni i wirus Wenezuelski, Wschodni i Zachodni, oraz rubiwirus, w tym, wirus różyczki. Do rodziny Flaviviridae należą wirusy denga, żółtej febry, japońskiego zapalenia mózgu, zapalenia mózgu St. Louis i wirusy kleszczowego zapalenia mózgu. Inne antygeny docelowe można wytworzyć z rodziny wirusa zapalenia wątroby typu C lub koronawirusów, która obejmuje szereg wirusów zwierząt innych niż człowiek, takich jak zakaźny wirus zapalenia oskrzeli (drobiu), wirus zapalenia żołądka i jelit świń, wirus hemaglutynacyjnego zapalenia mózgu i rdzenia świń, wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów, jelitowy koronawirus kotów, koronawirus psów oraz ludzkie koronawirusy dróg oddechowych, które mogą powodować przeziębienia i/lub zapalenie wątroby inne niż typu A, B lub C. W rodzinie koronawirusów do antygenów docelowych należą E1 (zwany również M lub białkiem macierzy), E2 (zwany również S lub białkiem iglicy), E3 (zwany również HE lub hemaglutyno-elterozą), glikoproteina (niewystępująca u wszystkich koronawirusów) lub N (nukleokapsyd). Jeszcze inne antygeny mogą być skierowane przeciwko rodzinie rabdowirusów, do której należy rodzaj vesiculovirus (np. wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej) iż rodzaj lyssavirus (np. wścieklizny). W rodzinie rabdowirusów odpowiednie antygeny mogą pochodzić z białka G lub białka N. Rodzina filowirusów, do której należą wirusy gorączki krwotocznej takie, jak Marburg lub Ebola może być odpowiednim źródłem antygenów. Do rodziny paramyksowirusów należy wirus grypy rzekomej typu 1, wirus grypy rzekomej typu 3, wirus grypy rzekomej bydła typu 3, rubulawirus (wirus świnki), wirus grypy rzekomej typu 2, wirus grypy rzekomej typu 4, wirus choroby Newcastle kurcząt, wirus księgosuszu bydła, morbiliwirus, w tym wirus odry i nosówki psów oraz pneumowirus, w tym syncytialny wirus oddechowy. Wirus grypy zaliczany jest do grupy ortomyksowirusów i jest odpowiednim źródłem antygenu (np. białko HA, białko N1). Do rodziny bunyawirusów należą rodzaje bunyawirus (zapalenie mózgu Kalifornia, La Crosse), flebowirus (gorączka Rift Valley), hantawirus (puremala jest wirusem gorączki krwotocznej), nairowirus (choroba owiec Nairobi) i szereg niesklasyfikowanych bungawirusów. Rodzina arenawirusów dostarcza źródła antygenów przeciwko wirusowi LCM i gorączki Lassa. Do rodziny reowirusów należą rodzaje reowirus, rotawirus (powodujący ostre zapalenie żołądka i jelit u dzieci), orbiwirusy i kultiwirusy (gorączka kleszczowa Colorado, Lebombo (ludzie), zapalenie mózgu koni, niebieski język).
Do rodziny retrowirusów należy podrodzina onkowirusów, która obejmuje, takie wirusy chorób ludzkich i weterynaryjnych, jak wirus białaczki kotów HTLVI i HTLVII, lentiwirus (który obejmuje ludzki wirus braku odporności (HIV), małpi wirus braku odporności (SIV), koci wirus braku odporności (FIV), wirus zakaźnej anemii koni i spumawirus). Dla HIV i SIV opisano wiele odpowiednich antygenów, które można łatwo wybrać. Przykłady odpowiednich antygenów HIV i SIV obejmują, ale nie wyłącznie, białka gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat i Rev oraz różne ich fragmenty. Ponadto opisano wiele modyfikacji tych antygenów. Odpowiednie do tego celu antygeny są znane specjalistom. Na przykład, można wybrać sekwencję kodującą, między innymi białkami, gag, pol, Vif i Vpr, Env, Tat i Rev. Patrz np. modyfikowane białko gag opisane w opisie patentowym USA nr 5,972,596. Patrz też białka SIV i HIV opisane przez D. H. Barouch i wsp. J. Virol., 75 (5): 2462-2467 (marzec 2001) i R. R. Amara, i wsp., Science, 292: 69-74 (6 kwietnia 2001). Białka te lub ich podjednostki można dostarczyć same, lub w kombinacji za pośrednictwem osobnych wektorów lub na jednym wektorze.
PL 220 644 B1
Rodzina papowawirusów obejmuje podrodziny poliomawirusów (wirusy BKU i JCU) oraz podrodzinę papillomawirusów (związaną z nowotworami lub złośliwym rozwojem brodawczaków). Rodzina adenowirusów obejmuje wirusy (EX, AD7, ARD, O.B.), które wywołują choroby dróg oddechowych i/lub zapalenie jelita. Do rodziny parwowirusów należą koci parwowirus (zapalenie jelita kotów), wirus leukocytopenii kotów, psi parwowirus i parwowirus świń. Do rodziny herpeswirusów należy podrodzina alphaherpesvirinae obejmująca rodzaje simplexvirus (HSVI, HSVII), varicellovirus (wścieklizna rzekoma, półpasiec) oraz podrodzina betaherpesvirinae obejmująca rodzaj cytomegalowirus (HCMV, muromegalovirus) i podrodzina gammaherpesvirinae obejmująca rodzaje lymphocryptovirus, EBV (chłoniak Burkitta), wirus zapalenia nosa i tchawicy, wirus choroby Mareka i rhadinovirus. Do rodziny pokswirusów należy podrodzina chordopoxvirinae obejmująca rodzaje orthopoxvirus (ospa (ospa prawdziwa) i krowianka (ospa bydlęca)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus i podrodzina entomopoxvirinae. Do rodziny hepadnawirusów należy wirus zapalenia wątroby typu B. Jednym z niesklasyfikowanych wirusów, który może być odpowiednim źródłem antygenów jest wirus zapalenia wątroby delta. Jeszcze inne źródła wirusowe mogą obejmować wirus zakaźnej choroby kaletki ptaków i wirus zespołu oddechowego i rozrodczego świń. Do rodziny alfawirusów należy wirus zapalenia tętnicy koni i różne wirusy zapalenia mózgu.
Immunogeny są użyteczne do immunizacji człowieka lub zwierzęcia innego niż człowiek przeciwko innym patogenom obejmującym bakterie, grzyby, mikroorganizmy pasożytnicze lub pasożyty wielokomórkowe zakażające człowieka i inne kręgowce, lub z komórki nowotworowej lub komórki guza. Przykłady patogenów bakteryjnych obejmują patogenne gram-dodatnie ziarniaki, w tym pneumokoki, gronkowce i paciorkowce. Patogenne gram-ujemne ziarniaki obejmują meningokoki i gonokoki. Patogenne jelitowe laseczki gram-ujemne obejmują enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobacteria i eikenella; melioidoza; salmonella; shigella; pałeczki hemofilne; moraxella; H. ducreyi (wywołująca wrzód weneryczny); pałeczkę brucelozy; Francisella tularensis (wywołująca tularemię); yersinia (pasteurella); Streptobacillus moniliformis (zarazek gorączki ukąszenia szczura) i śrubowiec; gram dodatnie laseczki obejmują pałeczkę listeriozy; włoskowiec różycy; Corynebacterium diphtheria (błonica); cholerę; B. anthracis (wąglik); donowanozę (ziarniak pachwinowy); i bartonellozę. Do chorób wywoływanych przez patogenne bakterie beztlenowe należą tężec, botulizm, zakażenia innymi laseczkami; gruźlica; trąd i inne mykobakterie. Do chorób wywoływanych przez patogenne krętki należy kiła, krętkowica, frambezja, pinta i kiła endemiczna oraz leptospiroza. Do innych zakażeń wywoływanych przez wyższe bakterie patogenne i grzyby patogenne należą promienica; nokardioza; kryptokokoza, drożdżyca wywołana przez Blastomyces, histoplasmoza i kokcydioidomykoza; kandydoza, grzybica kropidlakowa, mukormykoza; sporotrychoza; parakokcydioidomykoza, petriellidioza, torulopsoza, mycetoma i chromoblastomykoza i grzybica skóry. Do zakażeń riketsjami należą dur plamisty, gorączka plamista Gór Skalistych, gorączka Q i zakażenie Rickettsia akari. Do przykładów zakażeń mykoplazmami i chlamydiami należą mykoplazma zapalenia płuc, ziarnica weneryczna pachwin, papuzica i okołoporodowe zakażenia chlamydiami. Do patogennych eukariontów należą patogenne pierwotniaki i robaki, zaś do wywoływanych przez nie zakażeń należą pełzakowica, malaria, leiszmanioza, trypanosomatoza, toksoplazmoza, Pneumocystis carinii, Trichans, Toxoplasma gondii, babeszjoza, lamblioza, włośnica, filarioza, schistosomatoza, zakażenia nicieniami, przywrami i tasiemcami.
Wiele spośród tych organizmów i/lub wytwarzanych przez nie toksyn zostało zidentyfikowane przez Centra Zwalczania Chorób Zakaźnych [Centers for Disease Control (CDC), Department of Heath and Human Services, USA] jako czynniki mające potencjalne zastosowanie w atakach biologicznych. Na przykład, niektóre z tych czynników biologicznych obejmują Bacillus anthracis (wąglik), Clostridium botulinum i jego toksynę (botulizm), Yersinia pestis (dżuma), ospę prawdziwą, Franciselia tularensis (tularemia) i wirusową gorączkę krwotoczną, z których wszystkie są obecnie zaliczane do czynników kategorii A; Coxiella burnetti (gorączka Q); Brucella species (bruceloza), Burkholderia mallei (nosacizna), Ricinus communis i jego toksyna (rycyna, toksyna rącznika), Clostridium perfringens i jego toksyna (toksyna epsilon), Staphylococcus species i ich toksyny (enterotoksyna B), z których wszystkie są obecnie zaliczane do kategorii B; oraz wirus Nipan i hantawirusy, które są obecnie zaliczane do kategorii C. Ponadto, inne organizmy, które są tak sklasyfikowane lub sklasyfikowane inaczej mogą być zidentyfikowane i/lub zastosowane w tym celu w przyszłości. Łatwo można zauważyć, że wektory wirusowe i inne konstrukty tu opisane, są przydatne w dostarczaniu antygenów z tych organizmów, wirusów, ich toksyn lub innych produktów ubocznych, co zapobiegnie i/lub wyleczy zakażenie lub inne niepożądane reakcje na te czynniki biologiczne.
PL 220 644 B1
Podanie wektorów w celu dostarczenia immunogenów przeciwko zmiennemu regionowi limfocytów T wywołuje odpowiedź odpornościową, w tym CTL dla wyeliminowania tych limfocytów T. W reumatoidalnym zapaleniu stawów (RA) scharakteryzowano kilka konkretnych regionów zmiennych receptorów limfocytów T (TCR) związanych z chorobą. Do tych TCR należą V-3, V-14, V- 17 i Va-17. Dostarczenie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej przynajmniej jeden z tych polipeptydów wywoła zatem odpowiedź odpornościową skierowaną przeciwko limfocytom T związanym z RA. W stwardnieniu rozsianym (MS) scharakteryzowano kilka konkretnych regionów zmiennych receptorów limfocytów T (TCR) związanych z chorobą. Do tych TCR należą V-7 i Va-10. Dostarczenie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej przynajmniej jeden z tych polipeptydów wywoła zatem odpowiedź odpornościową skierowaną przeciwko limfocytom T związanym z MS. W twardzinie skóry scharakteryzowano kilka konkretnych regionów zmiennych receptorów limfocytów T (TCR) związanych z chorobą. Do tych TCR należą V-6, V-8, V-14 i Va-16, Va-3C, Va-7, Va-14, Va-15, Va-16, Va-28 i Va-12. Dostarczenie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej przynajmniej jeden z tych polipeptydów wywoła zatem odpowiedź odpornościową skierowaną przeciwko limfocytom T związanym z twardziną skóry.
Ewentualnie, wektory zawierające sekwencje AAV można dostarczyć z zastosowaniem reżimu dawki podstawowej i dawki przypominającej. Szereg takich reżimów opisano w dziedzinie i można je łatwo wybrać. Patrz np., WO 00/11140.
Takie reżimy dawki podstawowej i dawki przypominającej typowo obejmują podanie wektora opartego na DNA (np. plazmidu) dla przygotowania układu odpornościowego na drugie, przypominające podanie tradycyjnego antygenu, takiego jak białko lub zrekombinowany wirus niosący sekwencje kodujące taki antygen. Sposób taki zapoczątkowuje i wzmacnia odpowiedź odpornościową na wybrany antygen obejmując dostarczenie wektora plazmidowego DNA niosącego ten antygen, z późniejszym przypomnieniem, np. wektorem zawierającym sekwencje AAV.
Reżim dawki podstawowej i dawki przypominającej obejmuje wyrażanie multiprotein z nośnika podstawowego i przypominającego. Patrz np., R.R. Amara, Science, 292:69-14 (6 kwietnia 2001), opisujący reżim multiproteinowy do wyrażania podjednostek białkowych przydatny do wytwarzania odpowiedzi odpornościowej przeciwko HIV i SIV. Na przykład dawka podstawowa DNA może dostarczać Gag, Pol, Vif, VPX i Vpr oraz Env, Tat i Rev z pojedynczego transkryptu. Alternatywnie, dostarczane są SIV, Gag i Pol oraz Env HIV-I.
Reżimy dawki podstawowej i dawki przypominającej nie są jednak ograniczone do immunizacji przeciwko HIV lub dostarczania tych antygenów. Na przykład, dawka podstawowa może obejmować dostarczenie w pierwszym szympansim wektorze oraz przypomnienie w drugim wektorze szympansim lub kompozycję zawierającą sam antygen w postaci białka. Reżim dawki podstawowej i dawki przypominającej może dostarczyć ochronną odpowiedź odpornościową przeciwko wirusowi, bakterii lub innemu organizmowi, z którego pochodzi antygen. W innym żądanym wykonaniu, reżim dawki podstawowej i dawki przypominającej dostarcza efektu terapeutycznego, który można zmierzyć za pomocą konwencjonalnych oznaczeń wykrywających obecność schorzenia, przeciwko któremu stosowana jest terapia.
Szczepionkę podstawową można podawać w różnych miejscach ciała w sposób zależny od dawki, który zależy od antygenu, przeciwko któremu skierowana jest pożądana odpowiedź odpornościowa i nie jest ograniczany ilością lub miejscem wstrzyknięcia, ani nośnikiem farmaceutycznym. Etap podstawowy obejmuje raczej reżimy terapeutyczne obejmujące jedną dawkę lub dawkowanie co godzina, dzień, tydzień lub miesiąc lub rok. Na przykład, ssaki mogą otrzymać jedną lub dwie iniekcje podstawowe zawierające od około 10 μg do około 50 μg plazmidu w nośniku. Korzystna ilość podstawowa lub dawkowanie kompozycji podstawowej szczepionki DNA wynosi od około 1 μg do 10000 μg szczepionki DNA. Dawki mogą się wahać od około 1 μg do 10000 μg DNA na kg masy ciała pacjenta. Ilość lub miejsce wstrzyknięcia są korzystnie wybierane zależnie od rodzaju i stanu szczepionego ssaka.
Jednostka dawkowania szczepionki DNA odpowiednia do dostarczenia antygenu ssakowi jest tu opisana. Szczepionka DNA jest przygotowywana do podania przez zawieszenie lub rozpuszczenie w farmaceutycznie lub fizjologicznie dopuszczalnym nośniku, takim jak izotoniczna sól, roztwór soli izotonicznych lub inne formulacje, które będą oczywiste dla specjalisty w dziedzinie takiego podawania. Odpowiedni nośnik będzie oczywisty dla specjalisty i będzie w dużej części zależał od drogi podawania. Kompozycje mogą być podawane ssakowi zgodnie z opisanymi powyżej drogami, w formulacji o przedłużonym uwalnianiu wykorzystującej ulegający biodegradacji biozgodny polimer lub przez podanie domiejscowe z zastosowaniem micelli, żeli i liposomów.
PL 220 644 B1
Ewentualnie, etap piętnowania obejmuje także podanie razem z kompozycją podstawowej szczepionki DNA odpowiedniej ilości adiuwanta, takiego jak tu określone.
Kompozycja przypominająca jest podawana około 2 do około 27 tygodni po podaniu podstawowej szczepionki DNA pacjentowi - ssakowi. Podawanie kompozycji przypominającej prowadzi się za pomocą skutecznej ilości kompozycji szczepionki przypominającej zawierającej lub zdolnej do dostarczenia tego samego antygenu, co podawany przez podstawową szczepionkę DNA. Kompozycja przypominająca może składać się ze zrekombinowanego wektora wirusowego pochodzącego z tego samego źródła lub z innego źródła. Alternatywnie, „kompozycja przypominająca” może być kompozycją zawierającą ten sam antygen, jak kodowany przez podstawową szczepionkę DNA, ale w postaci białka lub peptydu, która to kompozycja indukuje odpowiedź odpornościową u gospodarza. Kompozycja szczepionki przypominającej obejmuje kompozycję zawierającą sekwencję DNA kodującą antygen pod kontrolą sekwencji regulatorowej kierującej jego ekspresją w komórce ssaka, np. wektory takie, jak dobrze znane wektory bakteryjne lub wirusowe. Podstawowym wymogiem wobec szczepionki przypominającej jest to, aby antygen kompozycji szczepionki był tym samym antygenem lub antygenem reagującym krzyżowo, co antygen kodowany przez szczepionkę DNA.
Odpowiednio, wektory są również dobrze przystosowane do stosowania w reżimach wykorzystujących wektory inne niż AAV, a także białka, peptydy i/lub inne użyteczne biologicznie związki terapeutyczne lub immunogenne. Reżimy te są szczególnie dobrze przystosowane do dostarczania genów dla celów terapeutycznych i do immunizacji obejmującej wzbudzanie odporności ochronnej. Zastosowania takie będą oczywiste dla specjalisty.
Ponadto, wektor może dostarczać skutecznego nośnika transferu genów, który dostarcza wybrany transgen do wybranej komórki gospodarza in vivo lub ex vivo, nawet gdy organizm ma przeciwciała neutralizujące przeciwko jednemu lub więcej serotypom AAV. Wektor (np. rAAV) i komórki miesza się ex vivo; zainfekowane komórki hoduje się z wykorzystaniem konwencjonalnych metod; zaś transdukowane komórki ponownie wprowadza się pacjentowi. Ponadto, wektory mogą być także wykorzystane do wytwarzania żądanego produktu genu in vitro. Dla wytwarzania in vitro żądany produkt (np. białko) można uzyskać z żądanej hodowli po transfekcji komórek gospodarza rAAV zawierającym cząsteczkę kodującą żądany produkt i hodowli komórek w warunkach pozwalających na ekspresję.
Wyrażany produkt można następnie oczyścić i wyizolować według potrzeby. Odpowiednie techniki transfekcji, hodowli komórek, oczyszczania i izolacji są znane specjalistom.
Następujące przykłady ilustrują kilka aspektów i wykonań wynalazku.
Przykłady
P r z y k ł a d 1: Amplifikacje PCR, klonowanie i charakterystyka nowych sekwencji AAV
Tkanki naczelnych innych niż człowiek przeszukano pod kątem obecności sekwencji AAV stosując metodę PCR opartą na oligonukleotydach komplementarnych do wysoce konserwatywnych sekwencji znanych AAV. Odcinek sekwencji obejmujący pozycje od 2886 do 3143 pz AAV1 [SEKW. NR ID.: 6] wybrano jako amplikon PCR, w którym region hiperzmienny białka kapsydu (Cap), który jest niepowtarzalny w każdym znanym serotypie AAV, nazwany tu „regionem charakterystycznym”, jest otoczony przez sekwencje konserwatywne. W dalszej analizie wykazano, że ten region charakterystyczny jest zlokalizowany pomiędzy konserwatywnymi aminokwasami łączącymi region hiperzmienny 3.
Wstępny przegląd krwi obwodowej szeregu gatunków naczelnych innych niż człowiek ujawnił wykrywalne AAV u podgrupy zwierząt gatunków, takich jak rezusy, makaki jawajskie, szympansy i pawiany. Nie wykryto jednak sekwencji AAV u niektórych innych badanych gatunków, w tym makaków japońskich, lapunderów i sajmiri. Dokładniejszą analizę rozmieszczenia wektorów przeprowadzono w tkankach rezusów z kolonii University of Pennsylvania i Tulane odzyskanych po sekcji. Ujawniła ona sekwencje AAV w szeregu różnych tkanek.
A. Amplifikacja regionu charakterystycznego AAV
Sekwencje DNA AAV1-6 i AAV wyizolowane od osobników Goose i Duck dopasowano do siebie przy użyciu „Clustal W” z domyślnymi ustawieniami. Dopasowanie AAV1-6, w tym informację dla nowego AAV7 przedstawiono na Fig. 1. Porównano podobieństwa sekwencji między AAV.
W trakcie badania twórcy zidentyfikowali region 257 pz rozciągający się od pozycji 2886 do 3143 pz AAV1 [SEKW. NR ID.: 6] i odpowiadający mu region w genomach AAV2-6 [patrz Fig. 1]. Region ten jest położony w genie kapsydu AAV i ma wysoce konserwatywne sekwencje na końcu 5' i 3' i stosunkowo zmienną sekwencję pośrodku. Ponadto, region ten zawiera miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Drain (CACCACGTC, SEKW. NR ID.: 15). Twórcy stwierdzili, że region ten służy jako specyficzny podpis dla każdego znanego typu DNA AAV. Innymi słowy, po reakcjach PCR,
PL 220 644 B1 trawieniu endonukleazami specyficznymi dla każdego znanego serotypu i analizie elektroforetycznej w żelu, regiony te można wykorzystać do ostatecznej identyfikacji amplifikowanego DNA, jako pochodzącego z serotypu 1, 2, 3, 4, 5, 6 lub innego serotypu.
Startery zaprojektowano, walidowano i dokonano optymalizacji warunków PCR posługując się kontrolami DNA AAV1, 2 i 5. Startery bazowały na sekwencji AAV2: starter 5', 1S: pz 2867-2891 AAV2 (SEKW. NR ID.: 7) i starter 3', 18as: pz 3095-3121 AAV2 (SEKW. NR ID.: 7).
Posługując się opisaną powyżej strategią przebadano DNA komórkowe z różnych tkanek, w tym z krwi, mózgu, wątroby, płuca, jądra itd., od różnych rezusów. Wyniki ujawniły, że DNA z różnych tkanek tych małp powodowało silne amplifikacje PCR. Dalsze analizy restrykcyjne produktów PCR wykazały, że amplifikowano je z sekwencji AAV innych niż wszystkie opublikowane sekwencje AAV.
Produkty PCR (wielkości około 255 pz) z DNA szeregu różnych tkanek małp sklonowano i zsekwencjonowano. Bioinformatyczne badanie tych nowych sekwencji AAV wykazało, że są to nowe sekwencje genu kapsydu AAV i różnią się od siebie. Fig. 1 obejmuje dopasowanie nowych regionów charakterystycznych AAV z AAV10-12 [odpowiednio SEKW. NR ID.: 117, 118 i 119]. Analizę wielokrotnego dopasowania sekwencji przeprowadzono za pomocą programu Clustal W (1.81). Procent identyczności sekwencji między regionami charakterystycznymi AAV 1-7 i AAV 10-12 podano poniżej.
T a b e l a 2 Sekwencje do analizy
Sekwencja # Serotyp AAV Wielkość (bp)
1 AAV1 258
2 AAV2 255
3 AAV3 255
4 AAV4 246
5 AAV5 258
6 AAV6 258
7 AAV7 258
10 AAV10 255
11 AAV11 258
12 AAV12 255
T a b e l a 3
Dopasowanie parami (procent identyczności)
AAV2 AAV3 AAV4 AAV5 AAV6 AAV7 AAV10 AAV11 AAV12
AAV1 90 90 81 76 97 91 93 94 93
AAV2 93 79 78 90 90 93 93 92
AAV3 80 76 90 92 92 92 92
AAV4 76 81 84 82 81 79
AAV5 75 78 79 79 76
AAV6 91 92 94 94
AAV7 94 92 92
AAV10 95 93
AAV11 94
Wyizolowano i zsekwencjonowano ponad 300 klonów zawierających sekwencje nowych serotypów AAV obejmujące wybrany region 257 pz. Bioinformatyczna analiza tych ponad 300 klonów sugeruje, że ten region 257 pz jest krytyczny w roli dobrego znacznika lub sekwencji charakterystycznej dla szybkiej izolacji i identyfikacji nowego serotypu AAV.
PL 220 644 B1
B. Zastosowanie regionu charakterystycznego do amplifikacji PCR
Region charakterystyczny 257 pz wykorzystano jako kotwicę PCR do wydłużenia amplifikacji w kierunku 5' w genomie dla pokrycia regionu połączenia genów rep i cap (pozycje 1398 pz - 3143 pz, SEKW. NR ID.: 6) i w kierunku 3' w genomie dla uzyskania całej sekwencji genu cap (pozycje 2866 pz - 4600 pz, SEKW. NR ID.: 6). Amplifikacje w PCR przeprowadzono z zastosowaniem standardowych warunków, w tym denaturacji w 95°C przez 0,5-1 min, przyłączania starterów w 60-65°C przez 0,5-1 min i wydłużania w 72°C przez 1 min na kz, przy całkowitej liczbie cykli amplifikacji w zakresie od 28 do 42.
Przy zastosowaniu dopasowanych sekwencji, jak opisano w punkcie A, zidentyfikowano dwa inne stosunkowo konserwatywne regiony w sekwencji położonej w końcu 3' genów rep i 5' regionu 257 pz i w sekwencji poniżej fragmentu 257 pz, lecz przed 3' ITR AAV. Zaprojektowano dwa nowe zestawy starterów i dokonano optymalizacji warunków PCR dla uzyskania całego kapsydu i części sekwencji rep nowych serotypów AAV. Konkretniej, dla amplifikacji 5' starterem 5', AV1Ns był GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC [nt 1398-1423 AAV1 SEKW. NR ID.: 6] a starterem 3' był zidentyfikowany powyżej 18as. Dla amplifikacji 3', starterem 5' był zidentyfikowany powyżej 1s, zaś starterem 3' był AV2Las, TCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCTGCG [nt 4435-4462 z AAV2 SEKW. NR ID.: 7].
W tych amplifikacjach PCR, regionu 257 pzp użyto w charakterze kotwicy PCR i znacznika dla wytworzenia nakładających się fragmentów dla skonstruowania kompletnego genu kapsydu przez połączenie w miejscu DraIII w regionie charakterystycznym po amplifikacji fragmentów wydłużania 5' i 3' uzyskanych tak, jak tu opisano. Konkretniej, dla wytworzenia całego genu cap AAV7 trzy produkty amplifikacji (a) sekwencje regionu charakterystycznego; (b) sekwencje wydłużania 5'; i (c) sekwencje wydłużania 3' wklonowano w szkielet plazmidu pCR4-Topo [Invitrogen] zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Następnie plazmidy strawiono DraIII i zrekombinowano w celu odtworzenia pełnego genu cap.
W trakcie tych prac wyizolowano i przeanalizowano około 80% sekwencji kapsydów AAV7 i AAV8. Wykryto także nowy serotyp, AAV9, od osobnika małpy #2.
Przy wykorzystaniu opisanych powyżej warunków PCR, pozostałą część sekwencji genu rep dla AAV7 wyizolowano i sklonowano z zastosowaniem starterów amplifikujących pozycje 108 pz do 1461 pz genomu AAV (obliczone na podstawie numeracji AAV2, SEKW. NR ID.: 7). Klon ten zsekwencjonowano w celu skonstruowania pełnego genomu AAV7 bez ITR.
C. Bezpośrednia amplifikacja fragmentu Cap długości 3,1 kz
W celu bezpośredniej amplifikacji fragmentu Cap pełnej długości 3,1 kz z DNA z tkanki i krwi NHP zidentyfikowano dwa inne wysoce konserwatywne regiony w genomach AAV do wykorzystania w amplifikacji dużych fragmentów w PCR. Wybrano starter w konserwatywnym regionie zlokalizowanym w środku genu rep (AV1ns: 5' GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3', nt 13981423 z SEKW. NR ID.: 6) w połączeniu ze starterem 3' zlokalizowanym w innym konserwatywnym regionie poniżej genu Cap (AV2cas: 5' CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3', SEKW. NR ID.: 7) dla amplifikacji fragmentów cap pełnej długości. Produkty PCR klonowano systemem Topo zgodnie ze wskazaniami producenta (Invitrogen), zaś analizę sekwencji przeprowadzono przez Qiagengenomics (Qiagengenomics, Seattle, WA) z dokładnością > 99,9%. W sumie wyizolowano i scharakteryzowano 50 klonów kapsydu. Wśród nich 37 klonów pochodziło z tkanek rezusa (rh.1-rh.37), 6 klonów z tkanek makaka jawajskiego (cy.1-cy.6), 2 klony z tkanek pawianów (bb.1 i bb.2) i 5 klonów z tkanek szympansów (ch.1-ch.5).
Aby wykluczyć możliwość, że zróżnicowanie sekwencji nowej rodziny AAV jest artefaktem PCR, takim jak składanie fragmentów genów w PCR przez wydłużania nakładających się fragmentów różnych niepełnych matryc DNA z sekwencjami homologicznymi, lub wynikiem procesów rekombinacji w bakteriach, przeprowadzono serię doświadczeń w identycznych warunkach dla amplifikacji VP1 z zastosowaniem całkowitych DNA komórkowych. Najpierw zmieszano nienaruszone plazmidy AAV7 i AAV8 w stosunku równomolarnym, po czym rozcieńczono je metodą seryjnych rozcieńczeń. Seryjnie rozcieńczone mieszaniny wykorzystano jako matryce dla amplifikacji w PCR fragmentów VP1 o długości 3,1 kz przy zastosowaniu uniwersalnych starterów i identycznych warunków PCR, jak użyte do amplifikacji DNA, aby sprawdzić, czy nie powstają jakiekolwiek hybrydowe produkty PCR. Mieszaninę transformowano do bakterii i izolowano transformanty poszukując klonów hybrydowych, które mogłyby pochodzić z procesu rekombinacji w komórkach bakterii. W innym doświadczeniu przecięliśmy plazmidy AAV7 i AAV8 enzymami Msp I, Ava I i Hael, z których wszystkie wielokrotnie tną oba genomy w różnych pozycjach, zmieszaliśmy mieszaniny po trawieniu w różnych kombinacjach i zastosowali26
PL 220 644 B1 śmy do amplifikacji fragmentów VP1 w tych samych warunkach, aby zbadać, czy można wytworzyć jakiekolwiek produkty PCR przez wydłużanie nakładających się sekwencji niepełnych sekwencji AAV. W innym doświadczeniu mieszaninę oczyszczonych z żelu fragmentów 5' 1,5 kz VP1 AAV7 i 3' 1,7 kz VP1 AAV8, które nakładają się w regionie charakterystycznym rozcieńczono seryjnie i zastosowano do amplifikacji PCR w obecności lub nieobecności 200 ng DNA komórkowego wyizolowanego z małpiej linii komórek, w której w analizie TaqMan nie wykryto sekwencji AAV. W żadnym z tych doświadczeń nie wykazano skutecznego wytwarzania za pośrednictwem PCR nakładających się sekwencji w warunkach amplifikacji Cap z genomowego DNA (dane nie przedstawione). W celu dalszego potwierdzenia zaprojektowano 3 pary starterów, które były zlokalizowane w różnych HVR i specyficzne dla sekwencji wariantów klonu 42s z rezusa F953, w różnych kombinacjach dla amplifikacji krótszych fragmentów z DNA węzła chłonnego krezki (MLN) z F593, z którego wyizolowano klon 42s. Wszystkie warianty sekwencji zidentyfikowane w klonach Cap pełnej długości odnaleziono w tych krótszych fragmentach (dane nie przedstawione).
P r z y k ł a d 2: Wirusy stowarzyszone z adenowirusami podlegają znaczącej ewolucji u naczelnych podczas naturalnych zakażeń
Analiza sekwencji wybranych izolatów AAV ujawniła zróżnicowanie w całym genomie, najbardziej skoncentrowane w regionach hiperzmiennych białek kapsydu. Dane epidemiologiczne wskazują, że wszystkie znane serotypy są endemiczne u naczelnych, aczkolwiek izolacja izolatów klinicznych była ograniczona do AAV2 i AAV3 z wymazów z odbytu i gardła ludzkich niemowląt oraz AAV5 z kłykciny kończystej człowieka. Zakażeniom AAV nie towarzyszyły żadne znane następstwa kliniczne.
W próbie lepszego zrozumienia biologii AAV, jako modele wykorzystano naczelne inne niż człowiek dla scharakteryzowania następstw naturalnych zakażeń. Tkanki od naczelnych innych niż człowiek badano pod kątem obecności sekwencji AAV z wykorzystaniem ujawnionego sposobu PCR w oparciu o oligonukleotydy komplementarne do wysoce konserwatywnych regionów i znanych AAV (patrz Przykład 1). Jako amplikon PCR wybrano ciąg sekwencji AAV rozciągających się od pozycji 2886 do pozycji 3143 AAV1 [SEKW. NR ID.: 6], w którym konserwatywne sekwencje są flankowane przez region hiperzmienny unikatowy dla każdego znanego serotypu AAV, nazwany tu „regionem charakterystycznym”.
Wstępne badanie krwi obwodowej szeregu gatunków naczelnych innych niż człowiek, w tym, rezusów, makaków jawajskich, szympansów i pawianów, ujawniło wykrywalne AAV u podgrupy zwierząt ze wszystkich gatunków. Dokładniejszą analizę rozmieszczenia wektora przeprowadzono w tkankach rezusów z University of Pennsylvania i kolonii Tulane pozyskanych po sekcji. Badanie to ujawniło sekwencje AAV w szeregu różnych tkanek.
Amplifikowane sekwencje charakterystyczne subklonowano do plazmidów i pojedyncze transformanty poddano analizie sekwencji. Ujawniła ona znaczącą zmienność w sekwencji nukleotydowej klonów pochodzących od różnych zwierząt. Zmienność w sekwencji charakterystycznej odnotowano także w klonach uzyskanych od pojedynczych zwierząt. Tkanki zebrane od dwóch zwierząt, u których zidentyfikowano unikatowe sekwencje charakterystyczne (tj. okrężnica z 98E044 i serce z 98E056) poddano dalszej charakterystyce przez wydłużenie sekwencji amplifikowanej w PCR za pomocą oligonukleotydów komplementarnych do wysoce konserwatywnych sekwencji. W ten sposób zrekonstruowano pełne struktury prowirusowe dla genomów wirusa z obu tkanek, jak tu opisano. Prowirusy te różnią się od innych znanych AAV największym zróżnicowaniem sekwencji zaobserwowanym w regionach genu Cap.
Przeprowadzono dodatkowe doświadczenia dla potwierdzenia, że sekwencje AAV rezydujące w tkance naczelnego, innego niż człowiek, stanowiły prowirusowe genomy zakaźnych wirusów, które można odzyskać tworząc wiriony.
DNA genomowy z tkanki wątroby zwierzęcia 98E056, w którym wykryto sekwencję charakterystyczną AAV8 strawiono endonukleazą, która nie ma miejsca w sekwencji AAV i transfekowano do komórek 293 plazmidem zawierającym pozbawiony E1 genom ludzkiego adenowirusa serotypu 5, jako źródłem funkcji pomocniczych. Uzyskany lizat pasażowano jednokrotnie w komórkach 293, a następnie odzyskano i przeanalizowano pod kątem obecności białek Cap AAV z zastosowaniem szeroko reagującego poliklonalnego przeciwciała przeciwko białkom Cap i pod kątem obecności i ilości sekwencji DNA z amplifikowanego w PCR prowirusa, z którego pochodził AAV8. Transfekcja trawionego endonukleazą DNA z serca i adenowirusowego plazmidu pomocniczego dała duże ilości wirusa AAV8, co wykazano wykrywając białka Cap analizą Western i wykazując obecność 104 genomów wektora AAV8 na komórkę 293. Z preparatu na dużą skalę przygotowano lizaty i oczyszczono
PL 220 644 B1
AAV przez sedymentację w chlorku cezu. Oczyszczony preparat wykazywał obecność ikozaedronalnych struktur o wielkości 26 nm wyglądających identycznie, jak struktury AAV serotypu 2. Transfekcja samym pomocniczym adenowirusem nie dała białek ani genomów AAV, co wyklucza zanieczyszczenie jako źródło odzyskanego AAV.
Dla dalszego scharakteryzowania między- i wewnątrz- osobniczej zmienności sekwencji charakterystycznej AAV wybrane tkanki poddano wydłużonej PCR w celu amplifikacji pełnych otwartych ramek odczytu Cap.
Uzyskane fragmenty wklonowano do plazmidów bakteryjnych i wyizolowano, i w pełni zsekwencjonowano pojedyncze transformanty. Analiza ta obejmowała węzły chłonne krezki od trzech rezusów (Tulane/V223 - 6 klonów; Tulane/T612 - 7 klonów; Tulane/F953 - 14 klonów), wątrobę od dwóch rezusów (Tulane/V251 - 3 klony; Penn/00E033 - 3 klony), śledzionę od jednego rezusa (Penn/97E043 - 3 klony), serce od jednego rezusa (IHGT/98E046 - 1 klon), krew obwodową od jednego szympansa (New Iberia/X133 - 5 klonów), sześć makaków jawajskich (Charles River/A1378, A3099, A3442, A2821, A3242 - w sumie 6 klonów) i jednego pawiana (SFRB/8644 - 2 klony). Spośród 50 klonów zsekwencjonowanych od 15 różnych zwierząt, 30 uznano za niepowtarzające się na podstawie ustalenia co najmniej 7 różnic aminokwasowych między nimi. Niepowtarzające się klony VP1 ponumerowano w kolejności izolacji, z prefiksem wskazującym gatunek naczelnego innego niż człowiek, od którego pochodziły. Związki strukturalne między tymi 30 niepowtarzającymi się klonami oraz opisanymi wcześniej 8 serotypami AAV określono z zastosowaniem programu SplitsTree [Huson, D. H. SplitsTree: analyzing and visualizing evolutionary data. Bioinformatics 14, 68-73 (1998)] z wdrożeniem metody rozkładu dzielonego (split decomposition). Analiza przedstawia homoplazję między zestawem sekwencji raczej w postaci sieci przypominającej drzewo, niż w postaci rozdwajającego się drzewa. Korzyścią jest tu możliwość wykrycia zgrupowań, które są wynikiem konwergencji i przedstawienia związków filogenetycznych nawet, gdy są zaburzone przez zdarzenia równoległe. Dla wyjaśnienia ewolucji AAV konieczna będzie obszerna analiza filogenetyczna, podczas gdy tu zamiarem było jedynie pogrupowanie klonów według podobieństwa sekwencji.
W celu potwierdzenia, że nowe sekwencje VP1 pochodziły z zakaźnych genomów wirusowych, komórkowe DNA z tkanek o wysokiej zawartości DNA wirusowego strawiono endonukleazą, która nie powinna przecinać wewnątrz AAV i transfekowano do komórek 293, po czym zakażano je adenowirusem. Spowodowało to odzyskanie i amplifikację genomów AAV z DNA z tkanek dwóch różnych zwierząt (dane nie przedstawione).
Sekwencje VP1 nowych AAV poddano dalszej charakterystyce pod kątem charakteru i lokalizacji zmienności sekwencji aminokwasowej. Wykazano, że wszystkie 30 klonów VP1 różni się od siebie o ponad 1% sekwencji aminokwasowej po dopasowaniu i podsumowaniu zmienności w każdej pozycji. Algorytm opracowany dla wyznaczenia obszarów dywergencji sekwencji wykazał obecność 12 regionów hiperzmiennych (HVR), z których 5 nakłada się lub stanowi część 4 opisanych uprzednio regionów zmiennych [Kotin, cytowane powyżej; Rutledge, cytowane powyżej]. Wierzchołki bliższe osi trzykrotnej zawierają większość zmienności (HVR5-10). Co ciekawe, pętle zlokalizowane na osi dwui pięciokrotnej także wykazują znaczną zmienność. HVR1 i 2 występują w N-końcowej części białka kapsydu, która nie jest rozstrzygnięta w strukturze rentgenowskiej, co sugeruje, że N-koniec białka VP1 jest eksponowany na powierzchni wirionu.
W celu ilościowego oznaczenia sekwencji AAV z tkanek 21 rezusów zastosowano PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem starterów i sond komplementarnych do wysoce konserwatywnych sekwencji Rep (jeden zestaw) i Cap (dwa zestawy) znanych AAV. Każdy punkt danych przedstawia analizę DNA z tkanki pojedynczego zwierzęcia. Potwierdziło to szeroki zakres występowania sekwencji AAV, chociaż rozmieszczenie ilościowe różniło się między pojedynczymi osobnikami. Pochodzenie zwierząt i wcześniejsza historia leczenia nie wydawały się wpływać na rozmieszczenie sekwencji AAV u rezusów. Trzy różne zestawy starterów i sond zastosowane do ilościowego oznaczenia AAV dały zgodne wyniki. Najwyższe poziomy AAV konsekwentnie znajdowano w krezkowych węzłach chłonnych, ze średnią 0,01 kopii na genom diploidalny dla 13 zwierząt z dodatnim wynikiem. Wątroba i śledziona również zawierały znaczną ilość wirusowego DNA. Stwierdzono przykłady bardzo znacznej ilości AAV, na przykład w sercu rezusa 98E056, śledzionie rezusa 97E043 i wątrobie rezusa RQ4407, w których wykazano odpowiednio 1,5; 3 i 20 kopii sekwencji AAV na genom diploidalny. Stosunkowo niski poziom DNA wirusa odnotowano w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej, co sugeruje, że wyniki dla tkanek nie są spowodowane obecnością resztkowych składników krwi (dane nie przedstawione). Należy zauważyć, że sposób ten nie koniecznie wychwyci wszystkie AAV przebywające
PL 220 644 B1 u naczelnych innych niż człowiek, ponieważ do wykrycia konieczna jest wysoka homologia zarówno do oligonukleotydów, jak i do sondy PCR czasu rzeczywistego. Ponadto tkanki od zwierząt o wysokiej zawartości DNA AAV przeanalizowano pod kątem stanu molekularnego DNA za pomocą technik hybrydyzacji DNA i jego rozmieszczenia w komórce przez hybrydyzację in situ.
Rodzaj zmienności sekwencji ujawniony w prowirusowych fragmentach AAV wyizolowanych od różnych zwierząt i z tkanek tego samego zwierzęcia przypomina ewolucję zachodzącą u wielu wirusów RNA podczas pandemii, a nawet podczas zakażenia jednego osobnika. W niektórych sytuacjach ideę wirusa typu dzikiego zastąpiono występowaniem mnóstwa quasi-gatunków ewoluujących w wyniku szybkiej replikacji i mutacji w obecności presji doboru. Jednym z przykładów jest zakażenie HIV, ewoluujące w odpowiedzi na presję immunologiczną i farmakologiczną. Do wysokiej częstości mutacji u wirusów RNA przyczynia się kilka mechanizmów, w tym niska wierność i brak zdolności korekcyjnych odwrotnej transkryptazy oraz rekombinacja niehomologiczna i homologiczna.
Dowody na powstawanie quasi-gatunków AAV zilustrowano w tych badaniach przez systematyczne sekwencjonowanie wielu sklonowanych fragmentów prowirusowych. Rzeczywiście, nie można było odnaleźć dwóch identycznych sekwencji wśród wszystkich wydłużonych klonów wyizolowanych od tego samego zwierzęcia bądź różnych. Istotnym mechanizmem dla tej ewolucji sekwencji wydaje się być wysoka częstość rekombinacji homologicznej między bardziej ograniczoną liczbą wirusów rodzicielskich. Ostatecznym efektem jest częsta wymiana regionów hiperzmiennych białka Cap prowadząca do powstania szeregu chimer, które mogą mieć różny tropizm i swoistość serologiczną (tj. zdolność do uniknięcia odpowiedzi odpornościowej, zwłaszcza w odniesieniu do przeciwciał neutralizujących). Mechanizmy, przez które może zachodzić rekombinacja homologiczna nie są jasne. Jedną z możliwości jest to, że nici + i - różnych jednoniciowych genomów AAV łączą się podczas replikacji tak, jak opisano to przy wysokiej krotności zakażenia rekombinantami AAV. Nie jest jasne, czy inne mechanizmy przyczyniają się do ewolucji sekwencji w zakażeniach AAV. Ogólna częstość mutacji zachodzących podczas replikacji AAV wydaje się być stosunkowo niska, a dane nie wskazują na to, aby błędy replikacji pojawiały się często. Opisano jednak znaczne rearanżacje genomu AAV podczas zakażenia litycznego, prowadzące do tworzenia się defektywnych cząstek przeszkadzających. Niezależnie od mechanizmów prowadzących do dywergencji sekwencji, z nielicznymi wyjątkami, struktury vp1 quasi-gatunków pozostają nietknięte, bez przesunięć ramki odczytu ani mutacji typu nonsens, co sugeruje wpływ konkurencyjnego doboru wirusów o najkorzystniejszym profilu dopasowania na dynamikę populacji.
Badania te mają implikacje dla kilku obszarów biologii i medycyny. Koncepcja szybkiej ewolucji wirusów, uprzednio uważana za własność wyłącznie wirusów RNA, powinna być uwzględniona dla wirusów DNA, które klasycznie charakteryzowano oznaczeniami serologicznymi. Istotnym będzie opracowanie dla parworwirusów nowego sposobu opisywania izolatów wirusowych, który obejmie złożoność ich struktury i biologii, podobnie jak w przypadku HIV, który znajduje się w kategorii ogólnych rodzin o podobnej strukturze i funkcji zwanych kladami. Alternatywną strategią jest kontynuacja podziału izolatów ze względu na swoistość serologiczną i opracowanie kryteriów opisu wariantów w obrębie grup serologicznych.
P r z y k ł a d 3: Wektorologia zrekombinowanych genomów AAV wyposażonych w ITR AAV2 z zastosowaniem chimerycznych plazmidów zawierających rep AAV2 i nowe geny cap AAV do badań serologicznych i badań transferu genów w różnych modelach zwierzęcych
Chimeryczne konstrukty pakujące tworzy się przez fuzję rep AAV2 z sekwencjami cap nowych serotypów AAV. Te chimeryczne konstrukty pakujące są stosowane początkowo do pseudotypowania zrekombinowanych genomów AAV niosących ITR AAV2 przez potrójną transfekcję w komórkach 293 z zastosowaniem plazmidu pomocniczego Ad5. Te pseudotypowane wektory są następnie stosowane do oceny działania w opartych na transdukcji badaniach serologicznych i oceny skuteczności transferu genów nowych serotypów AAV w różnych modelach zwierzęcych, w tym NHP i gryzoniach, zanim te nowe serotypy całych i zakaźnych wirusów zostaną wyizolowane
A. pAAV2GFP
Plazmid AAV2 zawierający ITR AAV2 i białko zielonej fluorescencji wyrażono pod kontrolą promotora konstytutywnego. Plazmid ten zawiera następujące elementy: ITR AAV2, promotor CMV i sekwencje kodujące GFP.
B. Klonowanie plazmidu trans
Dla skonstruowania chimerycznego plazmidu trans do wytwarzania zrekombinowanych pseudotypowanych wektorów AAV7, plazmid p5E18 (Xiao i wsp., 1999, J. Virol 73: 3994-4003) częściowo
PL 220 644 B1 strawiono XhoI w celu zlinearyzowania plazmidu jedynie w miejscu XhoI w pozycji 2169 pz. Końce po trawieniu XhoI wypełniono następnie i ponownie zligowano. Tak zmodyfikowany plazmid p5E18 strawiono w całkowitym trawieniu Xba I i Xho I w celu usunięcia sekwencji genu cap i zastąpiono ją wyizolowanym z plazmidu pCRAAV7 6-5+15-4 fragmentem Spe I/Xho I o długości 2267 pz zawierającym gen cap AAV7.
Uzyskany plazmid zawiera sekwencje rep AAV2 kodujące Rep78/68 pod kontrolą promotora P5 AAV2 i sekwencje rep AAV2 kodujące Rep52/40 pod kontrolą promotora P19 AAV2. Sekwencje kapsydu AAV7 są pod kontrolą promotora P4 0 AAV7, zlokalizowanego w sekwencjach Rep. Plazmid ten zawiera ponadto łącznik 5'z ORF rep.
C. Wytwarzanie pseudotypowanego rAAV
Cząstki rAAV (wektor AAV2 w kapsydzie AAV7) są wytwarzane z zastosowaniem metody wolnej od adenowirusa. W skrócie, plazmid cis (plazmid pAAv2.1 lacZ zawierający IRT AAV) i plazmid trans pCRAAV7 6-5+15-4 (zawierający rep AAV2 i cap AAV7 ) i plazmid pomocniczy odpowiednio, były jednocześnie kotransfekowane do komórek 293 w stosunkach odpowiednio 1:1:2 przez strącanie fosforanem wapnia.
Do konstrukcji plazmidów pomocniczych pAd zakupiono plazmid pBG10 z Microbix (Kanada). Fragment Rsrll zawierający L2 i L3 usunięto z pBHG10 uzyskując pierwszy plazmid pomocniczy pAdAF13. Plazmid AdAF1 skonstruowano klonując fragment Asp700/Sall z delecją Pmel/Sgfl wyizolowany z pBHG10 do Bluescript. W pAdAF1 usunięte są MLP, L2, L2 i L3. Dalsze delecje fragmentu Nrul o wielkości 2,3 kz a następnie fragmentu RsRII/NruI o wielkości 0,5 kz wytworzyły odpowiednio plazmidy pomocnicze pAdAF5 i pAdAF6. Plazmid pomocniczy nazwany pAF6 dostarcza niezbędnych funkcji pomocniczych E2A i E4ORF6 niedostarczanych przez wyrażającą E1 komórkę pomocniczą, pozbawiony jest jednak adenowirusowych białek kapsydu i funkcjonalnych regionów E1.
Zazwyczaj 50 μg DNA (cis: trans: pomocniczy) transfekowano do szalkę do hodowli tkankowych o średnicy 150 mm. Komórki 293 zbierano 72 godziny po transfekcji, sonikowano i traktowano 0,5% deoksycholanu sodu (37°C przez 10 min.) Lizaty komórkowe poddawano następnie dwóm rundom oczyszczania w gradiencie CsCl. Frakcje pików zawierające wektory rAAV zbierano, łączono i dializowano wobec PBS.
P r z y k ł a d 4: Tworzenie zakaźnych klonów niosących całe nowe serotypy AAV w celu zbadania podstawowej wirusologii w liniach komórek pochodzących od człowieka i NHP i oceny patogenezy nowych serotypów AAV u NHP i w innych modelach zwierzęcych
Dla osiągnięcia tego celu zastosowano system kroczenia po genomie (genome walker) w celu uzyskania sekwencji końcowych 5' i 3' (ITR) oraz pełnej konstrukcji klonów zawierających pełne genomy nowych serotypów AAV.
W skrócie, przy zastosowaniu dostępnego w handlu zestawu Universal Genome Walker [Clontech] DNA genomowy z tkanek małp lub linii komórkowych, które zidentyfikowano pozytywnie na obecność sekwencji AAV7, trawiono endonukleazami Dra I, EcoR V, Pvu II i Stu I i zligowano z adaptorem Genome Walker Adaptor, tworząc 4 osobne biblioteki systemu Genome Walker (Genome Walker Libraries, GWL). Stosując DNA z GWL jako matryce AAV7 i przylegające sekwencje genomowe amplifikuje się przez PCR za pomocy startera adaptorowego 1 (AP1, dostarczony z zestawem) i swoistego dla AAV7 startera 1, po czym przez kolejny, zagnieżdżony PCR z zastosowaniem startera adaptorowego 2 (AP2) i innego swoistego dla AAV7 startera 2, z których oba są wewnętrzne w stosunku do pierwszego zestawu starterów. Główne produkty PCR z zagnieżdżonego PCR są klonowane i charakteryzowane przez analizę sekwencji.
W tym doświadczeniu startery pokrywające 257 pz lub inny fragment charakterystyczny rodzajowego genomu AAV są stosowane do amplifikacji w PCR komórkowych DNA wyekstrahowanych z linii komórkowych pochodzących od człowieka i NHP dla identyfikacji i scharakteryzowania latentnych sekwencji AAV. Zidentyfikowane latentne genomy AAV odzyskuje się z dających pozytywny sygnał linii komórkowych przy zastosowaniu pomocniczych adenowirusów różnych gatunków i szczepów.
W celu wyizolowania zakaźnych klonów AAV z pochodzących z linii komórkowych NHP, żądaną linię uzyskuje się z ATCC i przeszukuje przez PCR w celu zidentyfikowania amplikonu 257 pz, tj. regionu charakterystycznego. Produkt PCR o długości 257 pz klonuje się i poddaje identyfikacji serotypu przez analizę sekwencji. Dla tych linii komórkowych zawierających AAV7 komórki są zakażane SV-15, małpim adenowirusem nabytym z ATCC, ludzkim Ad5, lub transfekowane konstruktem plazmidowym niosącym ludzkie geny Ad odpowiadające za funkcje pomocnicze dla AAV. 48 godzin po infekcji lub
PL 220 644 B1 transfekcji komórki są zbierane i przygotowywany jest DNA Hirt do klonowania genomu AAV7 według Xiao i wsp., 1999, J. Virol, 73: 3994-4003.
P r z y k ł a d 5 - Wytwarzanie wektorów AAV
Strategię pseudotypowania podobną do użytej w Przykładzie 3 dla AAV1/7 zastosowano do wytworzenia wektorów AAV2 pakowanych z białkami kapsydu AAV1, AAV5 i AAV8. W skrócie, zrekombinowane genomy AAV wyposażone w ITR AAV2 pakowano przez potrójną transfekcję komórek 293 plazmidem cis, adenowirusowym plazmidem pomocniczym i chimerycznym konstruktem pakującym, w którym gen rep AAV2 jest połączony z genami cap nowych serotypów AAV. Dla stworzenia chimerycznych konstruktów pakujących usunięto miejsce Xho I w pozycji 3169 pz plazmidu p5E18 a zmodyfikowany plazmid strawiono Xba I i Xho I w całkowitym trawieniu z usunięciem genu cap AAV2 i zastąpieniem go fragmentem Spe I/Xho I długości 2267 pz zawierającym gen cap AAV8 [Xiao i wsp., 1999, J. Virol, 73: 3994-4003]. Podobną strategię klonowania zastosowano w celu utworzenia chimerycznych plazmidów pakujących AAV2/1 i AAV2/5. Wszystkie zrekombinowane wektory oczyszczono standardową metodą sedymentacji w CsCl2, z wyjątkiem AAV2/2, który oczyszczono przez jednoetapową chromatografię na heparynie.
Miana kopii genomu (GC) wektorów AAV określono analizą TaqMan z zastosowaniem sond i starterów rozpoznających region poli A SV40 tak, jak opisano uprzednio [Gao, G., i wsp., (2000) Hum Gene Ther 11, 2079-91].
Dla każdego serotypu skonstruowano wektory do szeregu badań in vitro i in vivo. Osiem różnych kaset transgenicznych włączono do wektorów i wytworzono zrekombinowane wirusy dla każdego serotypu. Odzyskiwanie wirusów, w oparciu o liczbę kopii genomu, podsumowano w Tabeli 4 poniżej. Wydajność uzyskania wektora była wysoka dla każdego serotypu bez powtarzalnych różnic między serotypami. Dane przedstawione w tabeli to średnia liczba kopii genomu z odchyleniem standardo13 wym x 1013 wielu serii produkcyjnych transfekcji 50 szalek (150 mm).
T a b e l a 4
Wytwarzanie zrekombinowanych wektorów
AAV2/1 AAV2/2 AAV2/5 AAV2/7 AAV2/8
CMV LacZ 7,30 ± 4,33 (n=9) 4,49 ± 2,89 (n=6) 5, 19 ± 5,19 (n=8) 3,42 (n=1) 0,87 (n=1)
CMV EGFP 6,43 ± 2,42 (n=2) 3,39 ± 2,42 (n=2) 5, 55 ± 6,49 (n=4) 2,98 ± 2,66 (n=2) 3,74 ± 3,88 (n=2)
TBG LacZ 4,18 (n=1) 0,23 (n=1) 0,704 ± 0,43 (n=2) 2,16 (n=1) 0,532 (n=1)
Alb A1AT 4,67 ± 0,75 (n=2) 4,77 (n=1) 4,09 (n=1) 5,04 (n=1) 2,02 (n=1)
CB A1AT 0,567 (n=1) 0,438 (n=1) 2,82 (n=1) 2,78 (n=1) 0,816 ± 0,679 (n=2)
TBG rgCG 8,51 ± 6,65 (n=6) 3,47 ± 2,09 (n=5) 5,26 ± 3,85 (n=4) 6,52 ± 3,08 (n=4) 1,83 ± 0,98 (n=5)
TBG cFIX 1,24 ± 1,29 (n=3) 0, 63 ± 0,394 (n=6) 3,74 ± 2,48 (n=7) 4,05 (n=1) 15,8 ± 15,0 (n=5)
P r z y k ł a d 6 - Serologiczna analiza pseudotypowanych wektorów
Myszom C57BL/6 wstrzyknięto domięśniowo wektory różnych serotypów AAVCBA1AT (5 x 1011 GC) i 34 dni później pobrano próbki surowicy. Aby zbadać aktywność neutralizującą i neutralizującą krzyżowo surowic względem każdego serotypu AAV surowice przebadano w oznaczeniu przeciwciał neutralizujących opartym na transdukcji [Gao, G. P., i wsp., (1996) J. Virol 70, 8934-43]. Konkretniej, obecność przeciwciał neutralizujących wyznaczono oznaczając zdolność surowicy do hamowania transdukcji komórek 84-31 przez wirusy reporterowe (AAVCMVEGFP) różnych serotypów. Konkretnie, wirus reporterowy AAVCMVEGFP każdego serotypu [przy krotności infekcji (MOI) prowadzącej do transdukcji 90% komórek wskaźnikowych] preinkubowano ze zinaktywowaną cieplnie surowicą od zwierząt, które otrzymały różne serotypy AAV lub od myszy nie stykających się z antygenem (naiwnych). Po 1-godzinnej inkubacji w 37°C wirusy dodano do komórek 84-31 w płytkach 96-studzienkowych na 48 lub 72 godziny, zależnie od serotypu wirusa. Ekspresję GFP mierzono za pomocą Fluorolmagin (Molecular Dynamics) i oznaczano ilościowo za pomocą oprogramowania Image Quant. Miana przeciwciał neutralizujących podawano jako najwyższe rozcieńczenie surowicy, które hamowało transdukcję do mniej niż 50%.
Dostępność wektorów wyrażających GFP uprościła opracowanie oznaczenia przeciwciał neutralizujących opartego na hamowaniu transdukcji w permisywnej linii komórkowej (tj. komórkach 293 stabilnie wyrażających E4 z Ad5). Surowice przeciwko wybranym serotypom AAV wytworzono przez
PL 220 644 B1 domięśniowe wstrzyknięcie zrekombinowanych wirusów. Oznaczono neutralizację transdukcji AAV przez rozcieńczenia 1:20 i 1:80 surowic odpornościowych (patrz Tabela 5 poniżej). Surowice odpornościowe przeciwko AAV1, AAV2, AAV5 i AAV8 neutralizowały transdukcję serotypu, przeciwko któremu wytworzono surowicę odpornościową (AAV5 i AAV8 w mniejszym stopniu niż AAV1 i AAV2), lecz nie innego serotypu (tj. nie było dowodów na neutralizację krzyżową, co sugeruje, że AAV 8 jest w istocie unikatowym serotypem).
Tabela 5. Analiza serologiczna nowych serotypów AAV
% infekcji komórek 84-31 wirusem AAVCMVEGFP
AAV2/1 AAV2/2 AAV2/5 AAV2/7 AAV2/8
Rozcień- czenie surowicy Rozcień- czenie surowicy Rozcień- czenie surowicy Rozcień- czenie surowicy Rozcień- czenie surowicy
Suro- wice Wek- tor immu- nizu- 1:20 1:80 1:20 1:80 1:20 1:80 1:20 1:80 1:20 1: 80
Grupa 1 AAV2/1 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100
Grupa 2 AAV2/2 100 100 0 0 100 100 100 100 100 100
Grupa 3 AAV2/5 100 100 100 100 16,5 16,5 100 100 100 100
Grupa 4 AAV2/7 100 100 100 100 100 100 61,5 100 100 100
Grupa 5 AAV2/8 100 100 100 100 100 100 100 100 26,3 60
Surowice ludzkie od 52 zdrowych osobników przebadano na neutralizację przeciwko wybranym serotypom. Żadna z próbek surowicy nie neutralizowała AAV2/7 i AAV2/8, podczas gdy wektory AAV2/2 i AAV2/1 były neutralizowane w odpowiednio 20% i 10% surowic. Frakcja połączonej ludzkiej IgG reprezentująca zbiór 60 000 pojedynczych próbek nie neutralizowała AAV2/7 i AAV2/8, podczas gdy wektory AAV2/2 i AAV2/1 były neutralizowane przy mianie surowicy wynoszącym odpowiednio 1/1280 i 1/640.
P r z y k ł a d 7 - Badanie in vivo różnych serotypów wektorów AAV
W tym badaniu 7 zrekombinowanych genomów AAV: AAV2CBhA1AT, AAV2AlbhA1AT, AAV2CMVrhCG, AAV2TBGrhCG, AAV2TBGcFIX, AAV2CMVLacZ i AAV2TBGLacZ upakowano w białka kapsydu różnych serotypów. We wszystkich konstruktach kasety minigenu otoczono ITR AAV2. Jako genów reporterowych użyto cDNA antytrypsyny ludzkiej (A1AT) [Xiao, W., i wsp., (1999) J. Virol 73,3994-4003], podjednostki β gonadotropiny kosmówkowej małpy rezusa (CG) [Zoltick, P. W. & Wilson, J. M. (2000) Mol Ther 2,657-9], psiego czynnika IX [Wang, L., i wsp., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 11563-6] i bakteryjnej β-galaktozydazy (tj. LacZ). Dla transferu genów skierowanego do wątroby w celu kierowania ekspresją genów specyficznie w wątrobie użyto albo promotora mysiego genu albuminy (Alb) [Xiao, W. (1999), cytowane powyżej] albo promotora ludzkiego genu globuliny wiążącej hormon tarczycy (TBG) [Wang (1997), cytowane powyżej]. W doświadczeniach transferu genów skierowanego do mięśni w celu kierowania ekspresją genów użyto albo wczesnego promotora cytomegalowirusa (CMV) albo promotora β-aktyny kurzej ze wzmacniaczem CMV (CB).
PL 220 644 B1
Dla transferu genów skierowanego do mięśni wektory wstrzykiwano do prawego przedniego mięśnia piszczelowego nagich myszy NCR lub C57BL/6 (Taconic, Germantown, NY) w wieku 4-6 tygodni. W badaniach transferu genów skierowanego do wątroby dokonywano wlewu wektorów do żyły wrotnej myszy NCR nagich lub C57BL/6 (Taconic, Germantown, NY) w wieku 7-9 tygodni. Próbki surowicy pobierano wewnątrzoczodołowo w różnych punktach czasowych po podaniu wektora. Tkanki mięśni i wątroby pobrano od zwierząt, które otrzymały wektory lacZ w różnych punktach czasowych dla uzyskania skrawków kriogennych i wybarwienia histochemicznego Xgal. W ponownym doświadczeniu myszy C56BL/6 początkowo otrzymały domięśniowo wektory AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/7 i 2/8CBA1AT, po czym monitorowano ekspresję genu A1AT przez 7 tygodni. Następnie zwierzętom podano do żyły wrotnej AAV2/8TBGcFIX i badano ekspresję genu cFIX.
Dla ilościowego oznaczenia poziomów osoczowych białek hA1AT, rhCG i cFIX przeprowadzono oznaczenia oparte na teście ELISA tak, jak opisano poprzednio [Gao, G. P., i wsp., (1996) J Virol, 8934-43; Zoltick, P. W. & Wilson, J. M. (2000) Mol Ther 2,657-9; Wang, L., i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 94, 11563-6]. Doświadczenia zakończono gdy zwierzęta uśmiercono w celu pobrania tkanek mięśni i wątroby do ekstrakcji DNA i ilościowej analizy liczby kopii genomu wektora obecnego w tkankach docelowych metodą TaqMan z zastosowaniem tych samych zestawów starterów i sond, co przy miareczkowaniu preparatów wektora [Zhang, Y., i wsp., (2001) Mol Ther 3, 697-707].
Wydajność działania wektorów opartych na nowych serotypach oceniono w mysich modelach transferu genów skierowanego do mięśni i do wątroby i porównano z wektorami opartymi na znanych serotypach AAV1, AAV2 i AAV5. Wektory wyrażające białka wydzielane na zewnątrz komórki - (alfaantytrypsynę (A1AT) i gonadotropinę kosmówkową (CG)) zastosowano do ilościowego oznaczenia względnych wydajności transdukcji między różnymi serotypami za pomocą analizy surowic w ELISA. Rozmieszczenie komórkowe transdukcji wewnątrz narządu docelowego oceniono z zastosowaniem wektorów wyrażających lacZ i histochemii X-gal.
Przeanalizowano działanie wektorów AAV w mięśniu szkieletowym po bezpośrednim wstrzyknięciu do przedniego mięśnia piszczelowego. Wektory zawierały ten sam genom oparty na AAV2 z promotorem najwcześniejszego genu CMV lub wzmocnionym CMV promotorem β-aktyny kierującym ekspresją transgenu. Wcześniejsze badania wykazały, że immuno-kompetentne myszy C57BL/6 wywołują humoralną odpowiedź odpornościową przeciwko ludzkiemu białku A1AT wyrażanemu z wektorów AAV [Xiao, W., i wsp., (1999) J Virol 73, 39944003] .
W każdym ze szczepów wektor AAV2/1 wytwarzał najwyższy poziom A1AT, zaś wektor AAV2/2 - najniższy, natomiast wektory AAV2/7 i AAV2/8 wykazywały pośrednie poziomy ekspresji. Szczytowy poziom CG 28 dni po wstrzyknięciu myszom nu/nu NCR wykazywał najwyższą wartość dla AAV2/7 a najniższą dla AAV2/2, przy pośrednich wartościach dla AAV2/8 i AAV2/1. Wstrzyknięcie wektorów AAV2/1 i AAV2/7 lacZ dawało ekspresję genu w miejscu wstrzyknięcia we wszystkich włóknach mięśniowych, przy czym znacząco mniej włókien dodatnich pod względem lacZ zaobserwowano dla wektorów AAV2/2 i AAV2/8. Dane te wskazują, że wydajność transdukcji wektorami AAV2/7 w mięśniu szkieletowym jest podobna do uzyskiwanej dla AAV2/1, który wśród opisanych wcześniej serotypów jest najwydajniejszy w mięśniu szkieletowym [Xiao, W. (1999), cytowane powyżej; Chao, H., i wsp., (2001) Mol Ther 4,217-22; Chao, H., i wsp., (2000) Mol Ther 2, 619-23].
Podobne mysie modele stosowano do oceny transferu genów skierowanego do wątroby. Identyczne dawki wektorów na podstawie liczby kopii genomu podawano we wlewie do żył wrotnych myszy, które następnie analizowano pod kątem ekspresji transgenu. Każdy wektor zawierał genom oparty na AAV2 wykorzystujący opisane uprzednio specyficzne dla wątroby promotory (tj. promotor albuminy lub globuliny wiążącej hormon tarczycy) kierujące ekspresją transgenu. Konkretniej, kasety CMVCG i minigenu TBGCG użyto do transferu genów skierowanego odpowiednio do mięśni i wątroby. Pozio3 my rhCG określono w jednostkach względnych (RU x 103) . Dane pochodziły z oznaczeń próbek surowicy zebranych w dniu 28 po podaniu wektora (4 zwierzęta na grupę). Jak przedstawiono w Tabeli 3, wpływ białek kapsydu na wydajność transdukcji wektorów A1AT u myszy nu/nu i C57BL/6 i wektorów CG u myszy C57BL/6 był zgodny (patrz Tabela 6).
PL 220 644 B1
T a b e l a 6
Ekspresja podjednostki β gonadotropiny kosmówkowej małpy rezus (rhCG)
Wektor Mięsień Wątroba
AAV2/1 4,5 ± 2,1 1,6 ± 1,0
AAV2 0,5 ± 0,1 0,7 ± 0,3
AAV2/5 ND* 4,8 ± 0,8
AAV2/7 14,2 ± 2,4 8,2 ± 4,3
AAV2/8 4,0 ± 0,7 76,0 ± 22,8
* Nie określone w tym doświadczeniu.
We wszystkich przypadkach wektory AAV2/8 dawały najwyższy poziom ekspresji transgenu, który był w zakresie od 16 do 110 razy większy niż uzyskany dla wektorów AAV2/2; ekspresja z wektorów AAV2/5 i AAV2/7 miała wartość pośrednią, przy czym wyższą dla AAV2/7 niż dla AAV2/5. Analiza wybarwionych X-Gal skrawków wątroby zwierząt, które otrzymały odpowiednie wektory lacZ wykazała korelację między liczbą transdukowanych komórek a ogólnym poziomem ekspresji transgenu. DNA wyizolowany z wątrób myszy C57BL/6, które otrzymały wektory A1AT przebadano pod katem ilości DNA wektora przy zastosowaniu technologii PCR w czasie rzeczywistym.
Ilość DNA wektora stwierdzona w wątrobie 56 dni po iniekcji korelowała z poziomami ekspresji transgenu (patrz Tabela 7). Dla tego doświadczenia do PCR TaqMan zastosowano zestaw sondy i starterów rozpoznających region poliA SV40 genomu wektora. Przedstawione wartości są średnimi z odchyleniami standardowymi. Zwierzęta uśmiercono w 56 dniu w celu pobrania tkanek wątroby do ekstrakcji DNA. Badania te wskazują, że AAV8 jest najwydajniejszym wektorem dla skierowanego do wątroby transferu genów ze względu na zwiększoną liczbę transdukowanych hepatocytów.
T a b e l a 7
Analiza PCR w czasie rzeczywistym ilości wektorów AAV w wątrobie myszy nu/nu po wstrzyknięciu 1 x 1011 kopii genomu wektora
Wektory AAV/dawka Kopie genomu na komórkę
AAV2/1AlbA1AT 0,6 ± 0,36
AAV2AlbA1AT 0,003 ± 0,001
AAV2/5AlbA1AT 0,83 ± 0,64
AAV2/7AlbA1AT 2,2 ± 1,7
AAV2/8AlbA1AT 18 ± 11
Opisane powyżej dane serologiczne sugerują, że wektor AAV2/8 nie powinien być neutralizowany in vivo po immunizacji innymi serotypami. Myszy C57BL/6 otrzymały do żyły wrotnej iniekcje z wektora AAV2/8 wyrażającego psi czynnik IX (1011 kopii genomu) 56 dni po otrzymaniu domięśniowych iniekcji z wektorów A1AT różnych serotypów. Wysoki poziom ekspresji czynnika IX uzyskano 14 dni po wlewie AAV2/8 do zwierząt naiwnych (17 ± 2 μg/ml, n=4), który nie różnił się znacząco od poziomu zaobserwowanego u zwierząt immunizowanych AAV2/1 (31 ± 23 μg/ml, n=4), AAV2/2 (16 μg/ml, n=2) i AAV2/7 (12 μg/ml, n=2). Stanowi to przeciwieństwo sytuacji zaobserwowanej u zwierząt immunizowanych AAV2/8, którym podawano we wlewie wektor AAV2/8 z czynnikiem IX, u których nie zaobserwowano wykrywalnego czynnika IX (< 0,1 μg/ml, n=4).
Oligonukleotydy komplementarne do konserwatywnych regionów genu cap amplifikowały sekwencje rezusów stanowiące unikatowe AAV. Identyczne sekwencje charakterystyczne cap odnaleziono w wielu tkankach rezusów pochodzących z co najmniej dwóch różnych kolonii. Pełnej długości otwarte ramki odczytu rep i cap wyizolowano i zsekwencjonowano z pojedynczych źródeł. Jedynie otwarte ramki odczytu cap nowych AAV były niezbędne do oceny ich potencjału jako wektorów, ponieważ wektory z kapsydami AAV7 lub AAV8 wytworzono wykorzystując ITR i rep z AAV2. Uprościło to także porównanie różnych wektorów, ponieważ rzeczywisty genom wektora jest identyczny w różnych serotypach wektora. W istocie wydajność zrekombinowanych wektorów wytworzonych w tym podejściu nie wykazywała różnic dla różnych serotypów.
PL 220 644 B1
Wektory oparte na AAV7 i AAV8 wydają się być immunologicznie różne (tj. nie są neutralizowane przez przeciwciała wytworzone przeciwko innym serotypom). Ponadto, surowice ludzkie nie neutralizują transdukcji przez wektory AAV7 i AAV8, co stanowi istotną przewagę nad obecnie opracowywanymi AAV pochodzącymi od ludzi, przeciwko którym u znaczącej części populacji ludzkiej występuje istniejąca wcześniej odporność, która jest neutralizującą [Chirmule, N., i wsp., (1999) Gene Ther 6, 1574-83].
Tropizm każdego z nowych wektorów jest korzystny dla zastosowań in vivo. Wektory AAV2/7 wydają się transdukować do mięśni szkieletowych równie wydajnie, jak AAV2/1, który jest serotypem nadającym najwyższy poziom transdukcji w mięśniu szkieletowym spośród zbadanych do tej pory AAV naczelnych [Xiao, W., cytowane powyżej; Chou (2001), cytowane powyżej i Chou (2000), cytowane powyżej]. Co ważne, AAV2/8 dostarcza istotnej przewagi w porównaniu z innymi serotypami w odniesieniu do transferu genów do wątroby, który dotychczas był stosunkowo zawodny w kategoriach ilości stabilnie stransdukowanych hepatocytów. AAV2/8 powtarzalnie osiągał 10 do 100-krotną poprawę wydajności transferu genów w porównaniu z innymi wektorami. Podstawa poprawionej wydajności AAV2/8 jest niejasna, choć przypuszczalnie jest ona związana z pobieraniem przez inny receptor, który jest bardziej aktywny na bazolateralnej powierzchni hepatocytów. Ta poprawiona wydajność będzie bardzo przydatna w opracowywaniu skierowanego do wątroby transferu genów, gdzie liczba transdukowanych komórek jest krytyczna tak, jak w schorzeniach cyklu mocznikowego i rodzinnej hipercholesterolemii.
Zaprezentowano nowe podejście do wykrywania nowych AAV, oparte na odzyskiwaniu sekwencji genomowych przez PCR. Amplifikowane sekwencje łatwo wbudowano do wektorów i przebadano na zwierzętach. Brak uprzedniej odporności przeciwko AAV7 i korzystny tropizm wektorów wobec mięśni wskazuje, że AAV7 jest odpowiedni do wykorzystania jako wektor w terapii genowej człowieka i innych zastosowaniach in vivo. Podobnie, brak uprzedniej odporności przeciwko innym serotypom AAV i ich tropizm czyni je użytecznymi do dostarczania cząsteczek terapeutycznych i innych użytecznych cząsteczek.
P r z y k ł a d 9 - Badania tropizmu tkankowego
W projekcie schematu wysoko wydajnego przeszukiwania funkcjonalnego nowych konstruktów AAV na szeroką skalę wybrano niespecyficzny względem tkanki i wysoce aktywny promotor CB (wzmocniony CMV promotor kurzej β-aktyny) do kierowania ekspresją łatwo wykrywalnego i oznaczalnego ilościowo genu - ludzkiego genu a-antytrypsyny. Zatem dla każdego nowego klonu AAV powinien być wykonany tylko jeden wektor do badania transferu genów skierowanego do trzech różnych tkanek: wątroby, płuca i mięśni, w celu zbadania tropizmu tkankowego konkretnego konstruktu AAV.
W następującej tabeli podsumowano dane uzyskane z 4 nowych wektorów AAV w badaniach tropizmu tkankowego (AAVCBA1AT), w których stwierdzono, że nowy klon kapsydu AAV-44.2 jest bardzo silnym nośnikiem transferu genów we wszystkich 3 tkankach, ze szczególnie dużą przewagą w tkance płuca. Tabela 8 przedstawia dane (w μg A1AT/ml surowicy) w 14 dniu badania.
T a b e l a 8
Wektor Tkanka docelowa
Płuco Wątroba Mięsień
AAV2/1 ND ND 45 ± 11
AAV2/5 0,6 ± 0,2 ND ND
AAV2/8 ND 84 ± 30 ND
AAV2/rh.2 (43.1) 14 ± 7 25 ± 7,4 35 ± 14
AAV2/rh.10 (44.2) 23 ± 6 53 ± 19 46 ± 11
AAV2/rh.13 (42.2) 3,5 ± 2 2 ± 0,8 3,5 ± 1,7
AAV2/rh.21 (42.10) 3,1 ± 2 2 ± 1,4 4,3 ± 2
Dla potwierdzenia lepszego tropizmu AAV 44.2 w tkance płuca przeprowadzono kilka innych doświadczeń. Najpierw wektor AAV niosący minigen CC10hA1AT dla specyficznej ekspresji w płucach pseudotypowano kapsydami nowych AAV i podano zwierzętom pozbawionym odporności (nagie
NCR) w takiej samej objętości (50 μl każdego z oryginalnych preparatów) przez wstrzyknięcie
PL 220 644 B1 dotchawicze tak, jak przedstawiono w następującej tabeli. W Tabeli 9, 50 μΙ każdego oryginalnego preparatu na mysz, nagie NCR, granica wykrywalności >0,033 μg/ml, dzień 28.
T a b e l a 9
Wektor Całkowite GC w 50 μ! wektora μ9 AlAT/ml dla 50 μ! wektora μ9 AlAT/ml na 1Χ1011 wektora Względny transfer genu w porównaniu z rh.10 (klon 44.2)
2/1 3 x 1012 2,6 ± 0,5 0,09 ± 0,02 2,2
2/2 5,5 x 1011 <0,03 <0,005 <0,1
2/5 3,6 x 1012 0,65 ± 0,16 0,02 ± 0,004 0,5
2/7 4,2 x 1012 1 ± 0,53 0,02 ± 0,01 0,5
2/8 7,5 x 1011 0,9 ± 0,7 0,12 ± 0,09 2,9
2/ch.5 (A.3.1) 9 x 1012 1 ± 0,7 0,01 ± 0,008 0,24
2/rh.8 (43.25) 4,6 x 1012 26 ± 21 0,56 ± 0,46 13,7
2/rh.10 (44.2) 2,8 x 1012 115 ± 38 4,1 ± 1,4 100
2/rh.13 (42.2) 6 x 1012 7,3 ± 0,8 0,12 ± 0,001 2,9
2/rh.21 (42.10) 2,4 x 1012 9 ± 0,9 0,38 ± 0,04 9,3
2/rh.22 (42.11) 2,6 x 1012 6 ± 0,4 0,23 ± 0,02 5,6
2/rh.24 (42.13) 1,1 x 1011 0,4 ± 0,3 0,4 ± 0,3 1
Wektory podano także zwierzętom immunokompetentnym (C57BL/6) w jednakowej liczbie kopii genomu (1x1011 GC) jak przedstawiono w Tabeli 10. (1x1011 GC na zwierzę, C57BL/6, dzień 14, granica wykrywalności >0,033 μg/ml).
T a b e l a 10
Wektor AAV μg AlAT/ml na 1Χ1011 wektora Względny transfer genu w porównaniu z rh.10 (klon 44.2)
2/1 0,076 ± 0,031 2,6
2/2 0,1 ± 0,09 3,4
2/5 0,0840 ± 0,033 2,9
2/7 0,33 ± 0,01 11
2/8 1,92 ± 1,3 2,9
2/ch.5 (A.3.1) 0,048 ± 0,004 1,6
2/rh.8 (43.25) 1,7 ± 0,7 58
2/rh.10 (44.2) 2,93 ± 1,7 100
2/rh.13 (42.2) 0,45 ± 0,15 15
2/rh.21 (42.10) 0,86 ± 0,32 29
2/rh.22 (42.11) 0,38 ± 0,18 13
2/rh.24 (42.13) 0,3 ± 0,19 10
Dane z obu doświadczeń potwierdzają doskonały tropizm klonu 44.2 w transferze genów skierowanym do płuc.
Co ciekawe, skuteczność klonu 44.2 w transferze genów skierowanym do wątroby i mięśni była również znakomita, zbliżona do AAV8 najskuteczniejszego w transdukcji do wątroby i AAV1 najskuteczniejszego w transdukcji do mięśni, co sugeruje, że ten nowy AAV ma jakieś intrygujące znaczenie biologiczne.
PL 220 644 B1
W celu zbadania właściwości serologicznych tych nowych AAV, stworzono pseudotypowane wektory AAVGFP do immunizacji królików i transdukcji in vitro komórek 84-31 w obecności i pod nieobecność surowic odpornościowych przeciwko różnym kapsydom. Dane podsumowano poniżej:
T a b e l a 11a
Oznaczenia krzyżowych NAB w komórkach 8431 i koinfekcja adenowirusem (Adv) Infekcja w komórkach 8431 (koinfekowanych Adv) z:
Surowica królika immunizowanego: 109 GC 109 GC 109 GC 1010 GC
rh.13 rh.21 rh.22 rh.24
AAV2/42.2 AAV2/42.10 AAV2/42.11 AAV2/42.13
AAV2/1 1/20 1/20 1/20 brak NAB
AAV2/2 1/640 1/1280 1/5120 brak NAB
AAV2/5 brak NAB 1/40 1/160 brak NAB
AAV2/7 1/81920 1/81920 1/40960 1/640
AAV2/8 1/640 1/640 1/320 1/5120
Ch.5 AAV2/A3 1/20 1/160 1/640 1/640
rh.8 AAV2/43.25 1/20 1/20 1/20 1/320
rh.10 AAV2/44.2 brak NAB brak NAB brak NAB 1/5120
rh. 13 AAV2/42.2 1/5120 1/5120 1/5120 brak NAB
rh.21 AAV2/42.10 1/5120 1/10240 1/5120 1/20
rh.22 AAV2/42.11 1/20480 1/20480 1/40960 brak NAB
rh.24 AAV2/43.13 brak NAB 1/20 1/20 1/5120
PL 220 644 B1
Tabela llb. Oznaczenie krzyżowych NAB w komórkach 8431 i koinfekcja Adv
Infekcja w komórkach 8431 (koinfekowanych Adv) z:
Surowica królika immunizowan ego
109 GC rh. 12
AAV2/43.2 AAV2/44.2 AAV2/42.8 5 .2
AAV2/42.1B AAV2/A3
AAV2/1 brak NAB 1/20480 brak NAB 1/80 ND
AAV2/2 1/20 brak NAB brak NAB brak NAB ND
AAV2/5 brak NAB 1/320 brak NAB brak NAB ND
AAV2/7 1/2560 1/640 1/160 1/81920 ND
AAV2/8 1/10240 1/2560 1/2560 1/81920 ND
ch. 5 AAV2 /A3 1/1280 1/10240 ND 1/5120 1/320
rh. 8 AAV2/43.25 1/1280 ND 1/20400 1/5120 1/2560
rh. 10 AAV2/44.2 1/5120 ND ND 1/5120 1/5120
rh. 13 AAV2/42.2 1/20 ND ND brak NAB 1/320
rh.21 AAV2/42.10 1/20 ND ND 1/40 1/80
rh. 22 AAV2/42.11 brak NAB ND ND ND brak NAB
rh.24 AAY2/43.13 1/5120 ND ND ND 1/2560
PL 220 644 B1
T a b e l a 12
Miano surowic królika Miano po dawce przypominającej
Wektor Miano d21
ch.5 AAV2/A3 1/10,240 1/40960
rh.8 AAV2/43.25 1/20,400 1/163840
rh.10 AAV2/44.2 1/10,240 1/527680
rh.13 AAV2/42.2 1/5,120 1/20960
rh.21 AAV2/42.10 1/20,400 1/81920
rh.22 AAV2/42.11 1/40,960 ND
rh.24 AAV2/43.13 1/5,120 ND
T a b e l a 13a
Infekcja w komórkach 8431 (koinfekowanych Adv) z GFP:
109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę
ch.5
AAV2/1 AAV2/2 AAV2/5 AAV2/7 AAV2/8 AAV2/A3
# GFU/pole 128 >200 95 56 13 1
83 >200 65 54 11 1
T a b e l a 13b
Infekcja w komórkach 8431 (koinfekowanych Adv) z GFP:
109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę 109 GC/studzienkę
rh.8 rh.10 rh.13 rh.21 rh.22 rh.24 rh.12
AAV2/43.25 AAV2/44.2 AAV2/42.2 AAV2/42.10 AAV2/42.11 AAV2/42.13 AAV2/42.1B
# GFU/ pole 3 13 54 62 10 3 18
2 12 71 60 14 2 20
48 47 16 3 12
P r z y k ł a d 10 - Mysi model rodzinnej hipercholesterolemii
Następujące doświadczenie wykazuje, że konstrukt AAV2/7 dostarcza receptora LDL i wyraża receptor LDL w ilości wystarczającej do zmniejszenia poziomu cholesterolu i tri- glicerydów w osoczu w zwierzęcych modelach rodzinnej hipercholesterolemii.
A. Konstrukcja wektora
Wektory AAV upakowane w białkach kapsydowych AAV7 lub AAV8 skonstruowano stosując strategię pseudotypowania [Hildinger M, i wsp., J. Virol 2001; 75: 6199-6203]. Zrekombinowane genomy AAV z odwróconymi powtórzeniami końcowymi (ITR) AAV2 upakowano przez potrójną transfekcję komórek 293 plazmidem cis, adenowirusowym plazmidem pomocniczym i chimerycznym konstruktem pakującym - fuzją kapsydów nowych serotypów AAV z genem rep AAV2. Chimeryczny plazmid pakujący skonstruowano tak, jak opisano poprzednio [Hildinger i wsp., cytowane powyżej]. Zrekombinowane wektory oczyszczono standardową metodą sedymentacji w CsCl2. Dla określenia wydajności przeprowadzono analizę TaqMan (Applied Biosystems) z zastosowaniem sond i starterów rozpoznających region poli(A) SV40 wektorów [Gao GP, i wsp., Hum Gene Ther. 2000 10 października; 11 (15): 2079-91]. Uzyskane wektory wyrażają transgen pod kontrolą promotora ludzkiego genu globuliny wiążącej hormon tarczycy (TBG).
PL 220 644 B1
B. Zwierzęta
Myszy pozbawione receptora LDL w tle C57BL/6 nabyto z Jackson Laboratory (Bay Harbor, ME, USA) i utrzymywano jako kolonię rozrodczą. Myszom dawano nieograniczony dostęp do wody i podawano bogatą w tłuszcz dietę Western (wysoki % cholesterolu) począwszy od trzech tygodni przed infekcją. W dniu -7 oraz w dniu 0 pobrano krew przez skrwawienie zaoczodołowe i oznaczono profil lipidowy. Myszy losowo podzielono na siedem grup. Wektor wstrzyknięto do żyły wrotnej tak, jak opisano uprzednio [Chen SJ i wsp., Mol Therapy 2000; 2 (3), 256-261]. W skrócie, myszy znieczulono ketaminą i ksylazyną. Przeprowadzono laparotomię i odsłonięto żyłę wrotną. Za pomocą igły 30 G wstrzyknięto odpowiednią dawkę wektora rozcieńczonego w 100 μl PBS bezpośrednio do żyły wrotnej. W miejscu wstrzyknięcia zastosowano ucisk, aby zapewnić zatrzymanie krwawienia. Ranę zamknięto i opatrzono, a myszy starannie obserwowano kolejnego dnia. Cotygodniowe skrwawienia przeprowadzano począwszy od 14 dnia 14 skierowanym do wątroby transferze genów dla zmierzenia poziomu lipidów krwi. Dwa zwierzęta z każdej grupy uśmiercono w punktach czasowych -6 tydzień i 12 tydzień po wstrzyknięciu wektora w celu zbadania wielkości płytek miażdżycowych oraz ekspresji wektora. Pozostałe myszy uśmiercono w 20 tygodniu w celu zmierzenia płytek i określenia ekspresji transgenu.
T a b e l a 14
Wektor dawka n
Grupa 1 AAV2/7-TBG-hLDLr 1 x 1012 gc 12
Grupa 2 AAV2/7-TBG-hLDLr 3 x 1011 gc 12
Grupa 3 AAV2/7-TBG-hLDLr 1 x 1011 gc 12
Grupa 4 AAV2/8-TBG-hLDLr 1 x 1012 gc 12
Grupa 5 AAV2/8-TBG-hLDLr 3 x 1011 gc 12
Grupa 6 AAV2/8-TBG-hLDLr 1 x 1011 gc 12
Grupa 7 AAV2/7-TBG-LacZ 1 x 1011 gc 16
C. Analiza lipoprotein osocza i funkcji wątroby
Próbki krwi pobrano ze splotu zaoczodołowego po 6 godzinnym okresie postu. Surowicę oddzielono od osocza przez wirowanie. Ilość lipoprotein osocza i transaminaz wątroby w surowicy wykryto z zastosowaniem automatycznego analizatora chemii klinicznej (ACE, Schiapparelli Biosystems, Alpha Wassermann).
D. Wykrywanie ekspresji transgenu
Ekspresję receptora LDL oceniono barwieniem immunofluorescencyjnym i analizą Western blot. Do analizy Western biot zamrożoną tkankę wątroby homogenizowano z buforem do lizy (20 mM Tris, pH 7,4, 130 mM NaCl, 1% Triton X 100, inhibitor proteazy (kompletny, pozbawiony EDTA, Roche, Mannheim, Niemcy). Stężenie białka określono stosując zestaw Micro BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL). 40 μg białka rozdzielano na żelach 4-15% Tris-HCl Ready (Biorad, Hercules, CA) i przenoszono na filtr nitrocelulozowy (Invitrogen). Dla wytworzenia przeciwciał przeciwko receptorowi hLDL królikowi wstrzyknięto dożylnie preparat AdhLDLr (1 x 1013 GC). Cztery tygodnie później pozyskano surowicę królika i wykorzystano do analizy Western . Jako przeciwciało pierwszorzędowe wykorzystano rozcieńczenie 1:100 surowicy, po czym zastosowano skoniugowane z HRP IgG anty-królik i detekcję chemiluminescencyjną ECL (zestaw ECL Western Blot Detection Kit, Amersham, Arlington Heights, IL).
E. Immunocytochemia
Dla określenia ekspresji receptora LDL w zamrożonych skrawkach wątroby przeprowadzono analizę immunocytochemiczną. 10 μm skrawki z kriostatu utrwalano w acetonie przez 5 minut albo pozostawiano nieutrwalone. Blokowanie uzyskiwano przez 1 godzinną inkubację z 10% surowicą kozią. Skrawki inkubowano następnie przez godzinę z pierwszorzędowym przeciwciałem w temperaturze pokojowej. Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiemu LDL (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) zostało użyte w rozcieńczeniu zgodnym z zaleceniami wytwórcy. Skrawki przepłukano PBS i inkubowano z rozcieńczonym 1:100 kozim przeciwciałem przeciw króliczym skoniugowanym z fluoresceiną (Sigma, St. Louis, MO). Próbki ostatecznie badano pod mikroskopem fluorescencyjnym Nikon Microphot-FXA. We wszystkich przypadkach po inkubacji skrawki intensywnie płukano w PBS. Na negatywne kontrole składały się preinkubacja w PBS, pominięcie pierwszorzędowego przeciwciała
PL 220 644 B1 i zamiana pierwszorzędowego przeciwciała na dopasowane izotypowo nieimunogenne przeciwciało kontrolne. Wspomniane powyżej trzy typy kontroli przeprowadzono dla każdego z doświadczeń tego samego dnia.
F. Wydajność transferu genów
Tkankę wątroby pozyskano po uśmierceniu myszy w wyznaczonych punktach czasowych. Tkankę błyskawicznie zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -80°C do dalszej obróbki. DNA ekstrahowano z tkanki wątroby z zastosowaniem zestawu QIAmp DNA Mini (QIAGEN GmbH, Niemcy) według protokołu wytwórcy. Liczbę kopii genomu wektorów AAV w tkance wątroby oznaczono przy użyciu analizy TaqMan z zastosowaniem sond i starterów rozpoznających ogon poli(A) SV40 tak, jak opisano powyżej.
G. Pomiar płytek miażdżycowych
Dla ilościowego oznaczenia płytek miażdżycowych w aorcie, myszy znieczulano (10% ketamina i ksylazyna, ip), otwierano klatkę piersiową i poddawano perfuzji lodowatym roztworem soli buforowanej fosforanem przez lewy przedsionek. Następnie, starannie pobierano aortę, przecinano wzdłuż linii brzusznej od łuku aorty do tętnic udowych i utrwalano w formalinie. Bogate w lipidy płytki miażdżycowe wybarwiano Sudanem IV (Sigma, Niemcy) i rozpinano aortę na płaskiej czarnej woskowej powierzchni. Obraz utrwalono kolorową kamerą wideo Sony DXC-960 MD. Powierzchnię płytek jak również całkowitą powierzchnię aorty określano za pomocą sytemu analizy obrazu Phase 3 Imaging Systems (Media Cybernetics).
H. Klirens I125 LDL
125
Zbadano dwa zwierzęta z każdej grupy doświadczalnej. Dawkę wyznakowanego I125 LDL (uprzejmie udostępnionego przez Dana Radera, U Penn) wlewano powoli przez żyłę ogonową w ciągu
125 sek (1 000 000 zliczeń [I ]-LDL rozcieńczonych w 100 μl jałowego PBS na zwierzę). W punktach czasowych 3 min, 30 min, 1,5 godz., 3 godz., 6 godz. po wstrzyknięciu pobierano próbkę krwi przez splot zaoczodołowy. Osocze oddzielono od krwi i zliczono 10 μl osocza w liczniku gamma. Ostatecznie na podstawie danych klirensu lipoprotein obliczono metabolizm w jednostce czasu (ang. fractional catabolic rate”).
I. Ocena nagromadzenia lipidów w wątrobie
Przeprowadzono barwienie czerwienią oleistą (Oil Red) zamrożonych skrawków wątroby dla określenia nagromadzenia lipidów. Zamrożone skrawki wątroby krótko przepłukano w destylowanej wodzie, po czym inkubowano przez 2 minuty w absolutnym glikolu propylenowym. Skrawki wybarwiano następnie w roztworze czerwieni oleistej (0,5% w glikolu propylenowym) przez 16 godzin, po czym barwiono kontrastowo roztworem hematoksyliny Mayera przez 30 sekund i osadzano w ogrzanym roztworze galaretki glicerynowej.
Dla ilościowego określenia cholesterolu i zawartości triglicerydów w wątrobie, skrawki wątroby homogenizowano i inkubowano w mieszaninie chloroform/metanol (2:1) przez noc. Po dodaniu 0,05% H2SO4 i odwirowaniu przez 10 minut zebrano dolną warstwę każdej próbki, podzielono na dwie porcje i wysuszono w atmosferze azotu. Do pomiaru cholesterolu wysuszone lipidy pierwszej porcji rozpuszczano w 1% Triton X-100 w chloroformie. Po rozpuszczeniu roztwór suszono w atmosferze azotu. Po rozpuszczeniu lipidów w ddH2O i inkubacji przez 30 minut w 37°C całkowite stężenie cholesterolu mierzono przy zastosowaniu zestawu Total Cholesterol Kit (Wako Diagnostics). Dla drugiej porcji wysuszone lipidy rozpuszczano w alkoholowym roztworze KOH i inkubowano w 60°C przez 30 minut. Następnie dodawano 1M MgCl2, po czym inkubowano na lodzie przez 10 minut i wirowano przy 14000 rpm przez 30 minut. Ostatecznie w supernatancie oznaczano triglicerydy (Wako Diagnostics).
Wszystkie wektory pseudotypowane w kapsydzie AAV2/8 lub AAV2/7 obniżały całkowity cholesterol, LDL i triglicerydy w porównaniu z kontrolą. Te wektory doświadczalne poprawiały także fenotyp hipercholesterolemii w sposób zależny od dawki. Obniżenie powierzchni płytek u myszy z AAV2/8 i AAV2/7 zaobserwowano u traktowanych myszy w pierwszym teście (2 miesiące) i obserwowano utrzymywanie się tego efektu przez cały czas trwania doświadczenia (6 miesięcy).
P r z y k ł a d 10 - Ekspresja funkcjonalnego czynnika IX i poprawa w hemofilii
A. Myszy z nokautem
Ekspresję funkcjonalnego psiego czynnika IX (FIX) zbadano u myszy z hemofilią B. Skonstruowano wektory z kapsydami AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 lub AAV8 dla dostarczenia konstruktu 5' ITR AAV2 - promotor specyficzny dla wątroby [LSP] - FIX psa - element post-regulacyjny wirusa zapalenia wątroby świstaka amerykańskiego (woodchuck hepatitis post-regulatory element - WPRE) - ITR
PL 220 644 B1
3' AAV2. Wektory skonstruowano tak, jak opisano to w Wang i wsp., Molecular Therapy 2:154-158, z zastosowaniem odpowiednich kapsydów.
Myszy z nokautem skonstruowano tak, jak opisano w Wang i wsp., 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11563-11566. Model ten blisko naśladuje fenotypy hemofilii B u człowieka.
Wektory różnych serotypów (AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 i AAV8) dostarczano w pojedynczej iniekcji do żyły wrotnej do wątroby dorosłych myszy C57BL/6 cierpiących na hemofilię w dawce 1 x 1011 GC/mysz dla pięciu różnych serotypów, zaś jedna grupa otrzymała AAV8 w mniejszej dawce 1 x 1010 GC/mysz. Grupie kontrolnej wstrzyknięto 1 x 1011 GC AAV2/8 TBG LacZ3. Każda grupa składała się z 5-10 samców i samic myszy. Myszy skrwawiano co dwa tygodnie po podaniu wektorów.
1. ELISA
Stężenie psiego FIX w osoczu myszy określono za pomocą oznaczenia ELISA swoistego wobec psiego czynnika IX, przeprowadzanego zasadniczo tak, jak opisano w Axelrod i wsp, 1990, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 87: 5173-5177 z modyfikacjami. Jako pierwszorzędowego przeciwciała użyto przeciwciała owcy przeciwko psiemu czynnikowi IX (Enzyme Research Laboratories), zaś jako drugorzędowego przeciwciała użyto przeciwciała królika przeciwko psiemu czynnikowi IX (Enzyme Research Laboratories). Począwszy od dwóch tygodni po wstrzyknięciu wykryto podwyższone poziomy cFIX w osoczu dla wszystkich wektorów doświadczalnych. Podwyższone poziomy utrzymywały się na poziomie terapeutycznym przez cały czas trwania doświadczenia, tj. do 12 tygodni. Za poziom terapeutyczny uważa się 5% poziomu prawidłowego, czyli około 250 ng/ml.
Najwyższy poziom ekspresji zaobserwowano dla konstruktów AAV2/8 (przy 1011) i AAV2/7 z utrzymującym się ponad fizjologicznym poziomem cFIX (dziesięciokrotnie wyższym, niż poziom prawidłowy. Poziomy ekspresji dla AAV2/8 (1011) były w przybliżeniu dziesięciokrotnie większe, niż obserwowane dla AAV2/2 i AAV2/8 (1010). Najniższy poziom ekspresji, choć ciągle w granicach poziomu terapeutycznego, zaobserwowano dla AAV2/5.
2. Oznaczenie czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) in vitro
Aktywność funkcjonalnego czynnika IX w osoczu myszy z nokautem FIX określono za pomocą oznaczenia czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) in vitro. Próbki krwi myszy pobrano ze splotu zaoczodołowego do 1/10 objętości buforu cytrynianowego. Oznaczenie aPTT przeprowadzono tak, jak opisano to w Wang i wsp., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11563-11566.
Czasy krzepnięcia w aPTT w próbkach osocza wszystkich myszy, którym wstrzyknięto wektor były w prawidłowym zakresie (około 60 sek.) przy pomiarze dwa tygodnie po wstrzyknięciu i utrzymywały się w prawidłowym, lub niższym niż prawidłowy zakresie przez okres badania (12 tygodni).
Najniższe utrzymujące się czasy krzepnięcia zaobserwowano u zwierząt otrzymujących AAV2/8 (1011) i AAV2/7. Do tygodnia 12 AAV2/2 również indukował czas krzepnięcia podobny do obserwowanego dla AAV2/8 i AAV2/7. Tego krótszego czasu krzepnięcia nie zaobserwowano jednak dla AAV2/2 przed tygodniem 12, podczas gdy obniżone czasy krzepnięcia (w zakresie 25-40 sek.) obserwowano dla AAV2/8 i AAV2/7 począwszy od drugiego tygodnia.
Obecnie przeprowadza się barwienie immunohistochemiczne tkanek wątroby pobranych od niektórych z leczonych myszy. Około 70-80% hepatocytów wybarwia się dodatnio pod kątem psiego FIX u myszy, której wstrzyknięto wektor AAV2/8.cFIX.
B. Psy cierpiące na hemofilię B
Psy mające mutację w domenie katalitycznej genu F.IX, która, na podstawie badań modelowych, wydaje się destabilizować białko, cierpią na hemofilię B [Evans i wsp., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10095-10099] . Grupę takich psów utrzymywano przez ponad dwadzieścia lat w University of North Carolina, Chapel Hill. Parametry hemostatyczne tych psów są dobrze opisane i obejmują brak antygenu osocza F.IX, czasy krzepnięcia całej krwi ponad 60 minut, podczas gdy u zdrowych psów wynoszą one 6-8 minut, a przedłużony czas częściowej tromboplastyny po aktywacji 5080 sekund, podczas gdy u zdrowych psów wynosi on 13-28 sekund. Psy te cierpią na nawracające samorzutne krwotoki. Zazwyczaj poważne epizody krwawienia są leczone z sukcesem pojedynczym dożylnym wlewem 10 ml/kg prawidłowego osocza psa; niekiedy dla powstrzymania krwawienia konieczne są powtórne wlewy.
Czterem psom wstrzyknięto do żyły wrotnej AAV.cFIX zgodnie z poniższym schematem. Pierwszy pies otrzymał pojedynczy zastrzyk AAV2/2.cFIX w dawce 3,7 x 1011 kopii genomu (GC)/kg. Drugi pies otrzymał pierwszy zastrzyk AAV2/2.cFIX (2,8 x 1011 GC/kg), po czym drugi zastrzyk AAV2/7.cFIX (2,3 x 1013 GC/kg) w dniu 1180. Trzeci pies otrzymał pojedynczy zastrzyk AAV2/2.cFIX w dawce
PL 220 644 B1
4,6 x 1012 GC/kg. Czwarty pies otrzymał zastrzyk AAV2/2.cFIX (2,8 x 1012 GC/kg) oraz zastrzyk w dniu 995 z AAV2/7.CFIX (5 x 1012 GC/kg).
Podbrzusze cierpiących na hemofilię psów otwiera się chirurgicznie i aseptycznie pod ogólnym znieczuleniem i podaje się do żyły wrotnej pojedynczą dawkę wektora. Zwierzęta chroni się przed krwotokiem w czasie około operacyjnym przez dożylne podanie prawidłowego osocza psa. Pies jest usypiany, intubowany dla uzyskania znieczulenia ogólnego, a podbrzusze golone i przygotowywane. Po otwarciu podbrzusza śledziona jest przesuwana w pole operacyjne. Lokalizowana jest żyła śledzionowa i umieszcza się luźno szew w pobliżu małego dystalnego nacięcia w żyle. Do żyły szybko wprowadza się igłę, po czym luzuje się szew i przewleka kaniulę 5F do miejsca w żyle w pobliżu odgałęzienia żyły wrotnej. Po zabezpieczeniu hemostazy i napełnieniu balonika cewnika do żyły wrotnej wlewa się około 5,0 ml wektora rozcieńczonego w PBS w czasie 5 minut. Następnie opróżnia się balonik, usuwa kaniulę i zabezpiecza hemostazę żylną. Następnie umieszcza się śledzionę z powrotem na miejscu, przyżega krwawiące naczynia i zamyka ranę operacyjną. Po dobrym zniesieniu operacji zwierze jest ekstubowane. Próbki krwi analizuje się tak, jak opisano. [Wang i wsp., 2000, Molecular Therapy 2: 154-158]
Oczekiwane są wyniki wskazujące na poprawę lub częściową poprawę dla AAV2/7.
Podczas, gdy wynalazek opisano w odniesieniu do szczególnie korzystnych wykonań, należy zauważyć, że modyfikacje mogą być wprowadzone.

Claims (19)

1. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) obejmujący kapsyd AAV o sekwencji aminokwasowej AAVrh10 obejmującej z aminokwasy 1 do 738 z Sek. NR ID.: 81 lub o sekwencji, która w 95% lub więcej jest z nią identyczna, minigen mający odwrócone powtórzenia końcowe (ITR) AAV i gen heterologiczny funkcjonalnie połączony z sekwencjami regulatorowymi, które kierują jego ekspresją w komórce gospodarza.
2. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) według zastrz. 1, w którym kapsyd AAV ma białka kapsydowe vp1, białka kapsydowe vp2 i białka kapsydowe vp3, znamienny tym, że białka kapsydowe vp1 maja sekwencje, która w 95% lub wiecej jest identyczna z aminokwasami i do 738 SEK. NR ID.: 81.
3. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) według zastrz. 1 lub zastrz. 2, znamienny tym, że białka kapsydowe vp1 mają sekwencję aminokwasowa, która w 99% lub więcej jest identyczna z aminokwasami 1 do 738 z SEK. Nr ID.: 81.
4. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) według zastrz. 1-3, w którym kapsyd AAV ma białka kapsydowe vp1, białka kapsydowe vp2 i białka kapsydowe vp3, znamienny tym, że białka kapsydowe vp1 mają sekwencję aminokwasów od 1 do 738 SEK. NR ID.: 81.
5. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) według zastrz. 1-4, znamienny tym, że białka kapsydowe vp2 AAV mają sekwencję aminokwasów 138 do 738 z SEK. NR ID.: 81.
6. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) według zastrz. 3-5, znamienny tym, że białka kapsydowe vp3 AAV mają sekwencję aminokwasów 203 do 738 z SEK. NR ID.: 81.
7. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) według zastrz. 1-6, znamienny tym, że ITR pochodzą z AAV2.
8. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) obejmujący kapsyd AAV zawierający vp3 AAVrh10 mające sekwencję aminokwasową 203 do 738 z SEK. NR ID.: 81 lub sekwencję, która w 95% lub więcej jest z nią identyczna, minigen mający odwrócone powtórzenia końcowe (ITR) AAV, i gen heterologiczny funkcjonalnie połączony z sekwencjami regulatorowymi, które kierują jego ekspresją w komórce gospodarza.
9. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) według zastrz. 8, w którym kapsyd AAV ma białka kapsydowe vp1, białka kapsydowe vp2 i białka kapsydowe vp3, znamienny tym, że białka kapsydowe vp1 mają sekwencję, która w 95% lub więcej jest identyczna z aminokwasami 1 do 738 SEK. NR ID.: 81.
10. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) według zastrz. 8, znamienny tym, że białka kapsydowe vp3 AAV mają sekwencje aminokwasów 203 do 738 z SEK. NR ID.: 81.
11. Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV) według zastrz. 8-10, znamienny tym, że białka kapsydowe vp2 AAV mają sekwencję aminokwasów 138 do 738 z SEK. NR ID.: 81.
PL 220 644 B1
12. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje AAV określony w zastrz. 1-11 i fizjologicznie kompatybilny nośnik.
13. Wyizolowane białko kapsydu obejmujące białko AAVrh10 wybrane z grupy składajacej się z: białka kapsydowego vp1, aminokwasy (aa) 1 do 738 z SEK. NR ID.: 81;
białka kapsydowego vp2, (aa) 138 do 738 z SEK. NR ID.: 81; i białka kapsydowego vp3, (aa) 203 do 738 z SEK. NR ID.: 81.
14. Wyizolowana lub syntetyczna cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko określone w zastrz. 13.
15. Wyizolowana lub syntetyczna cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fragment białka kapsydu wirusa stowarzyszonego z adenowirusami rh10, przy czym ta cząsteczka kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy składającej się z:
vp1, nukleotydy (nt) 845 do 3061 z SEK. NR ID.: 59; vp2, (nt) 1256 do 3061 z SEK. NR ID.: 59; i vp3, (nt) 1454 do 3061 z SEK. NR ID.: 59.
16. Cząsteczka według zastrz 14 lub 15, znamienna tym, że jest plazmidem.
17. Cząsteczka według zastrz. 14-16, znamienna tym, że obejmuje ponadto funkcjonalny gen rep AAV.
18. Sposób wytwarzania rekombinowanego wirusa stowarzyszonego z adenowirusem (AAV), obejmującego kapsyd AAV serotypu rh10, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania komórki gospodarza zawierającej (a) cząsteczkę określoną w z zastrz. 14-16, która koduje kapsyd wirusa stowarzyszonego z adenowirusami; (b) funkcjonalny gen rep; (c) minigen obejmujący odwrócone powtórzenia końcowe (ITR) i transgen; i (d) geny adenowirusa kodujące wystarczające funkcje pomocnicze pozwalające na upakowanie minigenu do białka kapsydowego AAV.
19. Komórka gospodarza in vitro zawierająca wirus stowarzyszony z adenowirusami określony w zastrz. 1-11 lub cząsteczkę określoną w zastrz. 13-16.
PL397823A 2001-11-13 2002-11-12 Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV), kompozycja, wyizolowane białko kapsydowe, wyizolowane lub syntetyczne cząsteczki kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania zrekombinowanego wirusa, komórka gospodarza PL220644B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35060701P 2001-11-13 2001-11-13
US34111701P 2001-12-17 2001-12-17
US37706602P 2002-05-01 2002-05-01
US38667502P 2002-06-05 2002-06-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL397823A1 PL397823A1 (pl) 2012-07-16
PL220644B1 true PL220644B1 (pl) 2015-11-30

Family

ID=27502639

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL397823A PL220644B1 (pl) 2001-11-13 2002-11-12 Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV), kompozycja, wyizolowane białko kapsydowe, wyizolowane lub syntetyczne cząsteczki kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania zrekombinowanego wirusa, komórka gospodarza
PL409838A PL222683B1 (pl) 2001-11-13 2002-11-12 Rekombinowane wirusy stowarzyszone z adenowirusem (AAV), sposoby ich wytwarzania, pakująca komórka gospodarza, kompozycja zawierająca wirus, zastosowanie wirusa, wyizolowane wirusy AAV, białka,sztuczne białka kapsydu, cząsteczki, komórki gospodarza, sposoby dostarczania transgenu, sposób identyfikacji serotypu, zestaw diagnostyczny, sposób izolacji nowych wirusów, rekombinowana komórka
PL373864A PL217623B1 (pl) 2001-11-13 2002-11-12 Sposób wykrywania sekwencji wirusa stowarzyszonego z adenowirusem (AAV) w próbce
PL404537A PL221877B1 (pl) 2001-11-13 2002-11-12 Wirus stowarzyszony z adenowirusem, kompozycja, wyizolowane białko kapsydu, wyizolowane lub syntetyczne cząsteczki kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania rekombinowanego wirusa, komórka gospodarza

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL409838A PL222683B1 (pl) 2001-11-13 2002-11-12 Rekombinowane wirusy stowarzyszone z adenowirusem (AAV), sposoby ich wytwarzania, pakująca komórka gospodarza, kompozycja zawierająca wirus, zastosowanie wirusa, wyizolowane wirusy AAV, białka,sztuczne białka kapsydu, cząsteczki, komórki gospodarza, sposoby dostarczania transgenu, sposób identyfikacji serotypu, zestaw diagnostyczny, sposób izolacji nowych wirusów, rekombinowana komórka
PL373864A PL217623B1 (pl) 2001-11-13 2002-11-12 Sposób wykrywania sekwencji wirusa stowarzyszonego z adenowirusem (AAV) w próbce
PL404537A PL221877B1 (pl) 2001-11-13 2002-11-12 Wirus stowarzyszony z adenowirusem, kompozycja, wyizolowane białko kapsydu, wyizolowane lub syntetyczne cząsteczki kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania rekombinowanego wirusa, komórka gospodarza

Country Status (22)

Country Link
US (15) US20030138772A1 (pl)
EP (4) EP2338900B1 (pl)
JP (6) JP4677187B2 (pl)
KR (2) KR101014207B1 (pl)
CN (6) CN103555677B (pl)
AT (2) ATE520707T1 (pl)
AU (1) AU2002361573B2 (pl)
BR (3) BRPI0214119B8 (pl)
CA (7) CA2945734C (pl)
DE (1) DE60209193T2 (pl)
DK (1) DK1310571T3 (pl)
ES (3) ES2439515T3 (pl)
HU (2) HU230406B1 (pl)
IL (11) IL161827A0 (pl)
MX (3) MX359371B (pl)
NO (4) NO334379B1 (pl)
NZ (7) NZ600121A (pl)
PH (2) PH12014501487A1 (pl)
PL (4) PL220644B1 (pl)
SG (5) SG168422A1 (pl)
WO (1) WO2003042397A2 (pl)
ZA (1) ZA200403360B (pl)

Families Citing this family (622)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4645697A (en) 1996-09-11 1998-04-02 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Aav4 vector and uses thereof
WO1999061601A2 (en) 1998-05-28 1999-12-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Aav5 vector and uses thereof
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US7718354B2 (en) 2001-03-02 2010-05-18 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US20040121311A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
SG168422A1 (en) 2001-11-13 2011-02-28 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
ES2526341T3 (es) * 2001-12-17 2015-01-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Secuencias de serotipo 9 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen, y usos de las mismas
JP4810062B2 (ja) * 2001-12-17 2011-11-09 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）血清型８の配列
EP1359217B1 (en) 2002-04-29 2006-12-13 The Trustees of The University of Pennsylvania Method for direct rescue and amplification of integrated viruses from cellular DNA of tissues
US7419817B2 (en) 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
US7220577B2 (en) * 2002-08-28 2007-05-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Modified AAV
EP1578399A4 (en) 2002-12-06 2007-11-28 Isis Pharmaceuticals Inc Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8927269B2 (en) 2003-05-19 2015-01-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Avian adenoassociated virus and uses thereof
PL2357189T3 (pl) * 2003-06-19 2017-08-31 Genzyme Corporation Wiriony AAV o zmniejszonej immunoreaktywności i ich zastosowanie
US9233131B2 (en) * 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
AU2010201278B2 (en) * 2003-09-01 2012-11-15 Academisch Medisch Centrum AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis
NZ545656A (en) * 2003-09-01 2009-02-28 Amc Amsterdam AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8242254B2 (en) 2003-09-11 2012-08-14 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
EP3910063A1 (en) * 2003-09-30 2021-11-17 The Trustees of The University of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
AU2011250849B2 (en) * 2003-09-30 2013-09-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
WO2005056807A2 (en) * 2003-12-04 2005-06-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Bovine adeno-associated viral (baav) vector and uses thereof
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
ES2361000T3 (es) * 2004-04-28 2011-06-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Suministro secuencial de moléculas inmunogénicas mediante administraciones de un adenovirus y de un virus adeno-asociado.
JP2007535541A (ja) 2004-04-28 2007-12-06 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｅ４欠失アデノウイルス初回免疫およびｅ１欠失アデノウイルス追加免疫を用いる免疫化方式
JP4810533B2 (ja) 2004-05-24 2011-11-09 アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド ディジタルスレショルド化による選択的イオン濾過作用を用いた質量分光測定法
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
WO2006073496A2 (en) * 2004-07-30 2006-07-13 Targeted Genetics Corporation Recombinant aav based vaccine methods
US7309589B2 (en) * 2004-08-20 2007-12-18 Vironix Llc Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing
WO2006135400A2 (en) 2004-08-24 2006-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of recombinant organisms
EA200700807A1 (ru) * 2004-10-05 2007-08-31 Мерц Фарма Гмбх Унд Ко. Кгаа Новые циклические и ациклические пропеноны для лечения заболеваний цнс
US8182992B2 (en) 2005-03-03 2012-05-22 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious viruses
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
EP3409296A1 (en) 2005-04-07 2018-12-05 The Trustees of the University of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
WO2006119432A2 (en) * 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
WO2007014045A2 (en) 2005-07-21 2007-02-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
EP1957678B1 (en) * 2005-11-28 2012-06-13 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
JP5268890B2 (ja) 2006-04-28 2013-08-21 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖの規模適応性の製造方法
PL2044199T3 (pl) * 2006-07-25 2013-04-30 Celladon Corp Przedłużony, podawany z prądem krwi, nasierdziowy, wieńcowy wlew wektorów wirusowych na bazie wirusów towarzyszących adenowirusom, zawierający SERCA2a do terapii genowej
WO2008143627A2 (en) 2006-09-14 2008-11-27 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
JP5680304B2 (ja) 2007-02-23 2015-03-04 アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド 迅速な法医学的ｄｎａ分析法
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
EP3492596A1 (en) 2007-04-09 2019-06-05 University of Florida Research Foundation, Inc. Raav vector compositions having tyrosine-modified capsid proteins and methods for use
US9611302B2 (en) 2007-04-09 2017-04-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. High-transduction-efficiency RAAV vectors, compositions, and methods of use
WO2008151023A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
EP2058401A1 (en) * 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
EP2910637A1 (en) 2008-05-20 2015-08-26 University of Florida Research Foundation, Inc. Vectors for delivery of light-sensitive proteins and methods of use
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
EP2349549B1 (en) 2008-09-16 2012-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, and system
WO2010033625A1 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
EP2347254A2 (en) 2008-09-16 2011-07-27 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
ES2724122T3 (es) 2009-04-30 2019-09-06 Univ Pennsylvania Composiciones para dirigir células de las vías respiratorias de conducción que comprenden construcciones de virus adenoasociado
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
WO2010143761A1 (ko) * 2009-06-12 2010-12-16 (주)바이오니아 미지시료 내 감염성 미생물을 신속하게 검출하는 방법
WO2011008972A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent identification
WO2011008971A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
WO2011041502A1 (en) 2009-10-01 2011-04-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav vectors expressing sec1o for treating kidney damage
US9890408B2 (en) 2009-10-15 2018-02-13 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
WO2011126808A2 (en) 2010-03-29 2011-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
US9272053B2 (en) 2010-04-23 2016-03-01 University Of Massachusetts AAV-based treatment of cholesterol-related disorders
EP3540055A1 (en) 2010-04-23 2019-09-18 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
CA2833905C (en) 2010-04-23 2019-09-10 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
US9309534B2 (en) 2010-07-12 2016-04-12 Universidad Autonoma De Barcelona Gene therapy composition for use in diabetes treatment
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
EP2699688A1 (en) 2011-04-20 2014-02-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
US9226976B2 (en) 2011-04-21 2016-01-05 University Of Massachusetts RAAV-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies
LT3254703T (lt) 2011-04-22 2020-05-25 The Regents Of The University Of California Adenoasocijuoto viruso virionai su variantine kapside ir jų panaudojimo būdai
EP2748185A1 (en) * 2011-08-24 2014-07-02 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University New aav capsid proteins for nucleic acid transfer
US20130136729A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-30 University of Virginia Patent Foundation, d/b/a University of Virginia Licensing & Ventures Group Compositions and methods for targeting and treating diseases and injuries using adeno-associated virus vectors
CN104520428B (zh) * 2012-02-17 2018-09-21 费城儿童医院 将基因转移到细胞、器官和组织的aav载体组合物和方法
WO2013130393A1 (en) * 2012-02-28 2013-09-06 Cornell University Aav-directed persistent expression of an anti-nicotine antibody gene for smoking cessation
WO2013154744A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Cornell University Development of a highly efficient second generation nicotine-conjugate vaccine to treat nicotine addiction
US10294281B2 (en) 2012-05-15 2019-05-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use
US12358954B2 (en) 2012-05-15 2025-07-15 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Capsid-modified rAAV vector compositions and methods therefor
EP2692868A1 (en) 2012-08-02 2014-02-05 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue
DK2954051T3 (da) 2013-02-08 2019-07-08 Univ Pennsylvania Modificeret kapsid til genoverførsel til behandling af nethinden
PL2956477T5 (pl) 2013-02-15 2024-05-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Zoptymalizowany gen czynnika viii
US8957044B2 (en) 2013-03-01 2015-02-17 Wake Forest University Health Sciences Systemic gene replacement therapy for treatment of X-linked myotubular myopathy (XLMTM)
JP6591956B2 (ja) 2013-03-15 2019-10-16 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｍｐｓ１を治療するための組成物および方法
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
WO2014194132A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
PH12016500162B1 (en) 2013-07-22 2024-02-21 Childrens Hospital Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene trnsfer to cells, organs, and tissues
EP3099333B8 (en) * 2014-01-31 2020-12-30 Temple University of the Commonwealth System of Higher Education Bag3 as a target for therapy of heart failure
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
WO2015127128A2 (en) 2014-02-19 2015-08-27 University Of Massachusetts Recombinant aavs having useful transcytosis properties
SI3116900T1 (sl) 2014-03-09 2021-02-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sestavki uporabni pri zdravljenju pomanjkanja ornitin transkarbamilaze(OTC)
CA2942776C (en) 2014-03-17 2023-01-24 Adverum Biotechnologies, Inc. Polyneucleotide cassette and expression vector for expression of a gene in cone cells using truncated m-opsin promoter
JP6756700B2 (ja) 2014-03-18 2020-09-16 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 筋萎縮性側索硬化症を処置するためのｒＡＡＶベースの組成物および方法
UA120050C2 (uk) 2014-03-21 2019-09-25 Джензайм Корпорейшн Генна терапія для лікування пігментного ретиніту
EP2933335A1 (en) 2014-04-18 2015-10-21 Genethon A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases
WO2015164778A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 The Trustees Of The University Of Pennysylvania Ldlr variants and their use in compositions for reducing cholesterol levels
JP6983511B2 (ja) 2014-04-25 2021-12-17 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 脳中の転移乳癌および他の癌を処置するための方法および組成物
EP3134522B1 (en) 2014-04-25 2021-10-06 University of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products
ES2833230T3 (es) 2014-05-13 2021-06-14 Univ Pennsylvania Composiciones que comprenden AVV que expresan construcciones y usos de doble anticuerpo del mismo
US10689653B2 (en) 2014-06-03 2020-06-23 University Of Massachusetts Compositions and methods for modulating dysferlin expression
EP3151866B1 (en) 2014-06-09 2023-03-08 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
EP2960336A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Genethon Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
JP6619758B2 (ja) 2014-07-03 2019-12-11 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 疾患を処置するためのｇｌｓ１阻害薬
EP4012035B1 (en) 2014-09-16 2024-11-06 Genzyme Corporation Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma
ES3011359T3 (en) 2014-09-16 2025-04-07 Genzyme Corp Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma
JP6842410B2 (ja) 2014-10-03 2021-03-17 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 新規の高効率ライブラリーにより同定されるａａｖベクター
WO2016054554A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted aavs
RU2738421C2 (ru) 2014-10-21 2020-12-14 Юниверсити Оф Массачусетс Варианты рекомбинантных aav и их применения
KR20170096998A (ko) 2014-11-05 2017-08-25 보이저 테라퓨틱스, 인크. 파킨슨병의 치료를 위한 aadc 폴리뉴클레오티드
WO2016077689A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
WO2016077687A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
EP3242945B1 (en) 2015-01-07 2021-09-01 Universitat Autònoma de Barcelona Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes
MX2017009336A (es) 2015-01-16 2017-11-15 Voyager Therapeutics Inc Polinucleótidos dirigidos al sistema nervioso central.
IL296391B2 (en) 2015-01-20 2024-06-01 Genzyme Corp Analytical ultracentrifugation for characterization of recombinant viral particles
US20180030096A1 (en) 2015-02-03 2018-02-01 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant aav1, aav5, and aav6 capsid mutants and uses thereof
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
CR20170407A (es) 2015-02-10 2017-11-14 Genzyme Corp Mejora del suministro de partículas virales al cuerpo estriado y al córtex
MA40819B1 (fr) 2015-02-10 2020-04-30 Genzyme Corp Variant d'arni
WO2016131009A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 University Of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
KR20170137730A (ko) 2015-03-02 2017-12-13 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 망막 추상체에 폴리뉴클레오타이드의 유리체 내 전달을 위한 조성물 및 방법
WO2016145217A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Recombinant glut1 adeno-associated viral vector constructs and related methods for restoring glut1 expression
WO2016154344A1 (en) 2015-03-24 2016-09-29 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
US11020443B2 (en) 2015-04-23 2021-06-01 University Of Massachusetts Modulation of AAV vector transgene expression
US11046955B2 (en) 2015-04-24 2021-06-29 University Of Massachusetts Modified AAV constructs and uses thereof
US20180110877A1 (en) 2015-04-27 2018-04-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania DUAL AAV VECTOR SYSTEM FOR CRISPR/Cas9 MEDIATED CORRECTION OF HUMAN DISEASE
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
EP3307310A2 (en) 2015-05-13 2018-04-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof
MX2017014665A (es) 2015-05-16 2018-04-24 Genzyme Corp Edicion de genes de mutaciones intronicas profundas.
CA2990193A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 The Children's Hospital Of Philadelphia Modified factor ix, and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues
WO2017015637A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
HK1256909A1 (zh) 2015-08-06 2019-10-04 宾夕法尼亚大学 Glp-1和其在用於治疗代谢疾病的组合物中的用途
KR102699944B1 (ko) 2015-08-25 2024-09-13 듀크 유니버시티 Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 이용하는 게놈 조작에서 특이성을 개선하는 조성물 및 방법
CN108137664B (zh) 2015-08-31 2021-11-26 宾夕法尼亚州大学信托人 用于治疗伴侣动物的aav-epo
AU2016326627B2 (en) 2015-09-24 2022-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composition and method for treating complement-mediated disease
PT3356390T (pt) * 2015-09-28 2021-04-21 Univ Florida Métodos e composições para vetores virais que se evadem a anticorpos
US11273227B2 (en) 2015-10-09 2022-03-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful in treating Stargardt's disease and other ocular disorders
WO2017066497A2 (en) 2015-10-13 2017-04-20 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
WO2017070516A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
DK3364997T5 (da) 2015-10-22 2024-09-30 Univ Massachusetts Aspartoacylase genterapi til behandling af canavans sygdom
EP3368054A4 (en) 2015-10-28 2019-07-03 Voyager Therapeutics, Inc. REGULATORY EXPRESSION USING THE ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV)
EP3368563A1 (en) 2015-10-28 2018-09-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Intrathecal administration of adeno-associated-viral vectors for gene therapy
HK1254836A1 (zh) 2015-10-30 2019-07-26 Nbe-Therapeutics Ag 抗-ror1抗体
US10983110B2 (en) 2015-12-02 2021-04-20 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of AAV neutralizing antibodies
FR3044926B1 (fr) 2015-12-09 2020-01-31 Genethon Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine
ES2918998T3 (es) 2015-12-11 2022-07-21 Univ Pennsylvania Método de purificación escalable para AAVrh10
EP3387138B1 (en) 2015-12-11 2022-01-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav9
WO2017100674A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav1
EP3387117B1 (en) 2015-12-11 2022-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav8
CN115957350A (zh) 2015-12-11 2023-04-14 宾夕法尼亚州大学信托人 用于治疗家族性高胆固醇血症的基因疗法
RU2762747C2 (ru) 2015-12-14 2021-12-22 Зе Трастис Оф Зе Юниверсити Оф Пенсильвания Генная терапия офтальмологических нарушений
JP7061067B2 (ja) 2015-12-14 2022-04-27 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア クリグラー・ナジャー症候群の処置のための組成物
CN108603199A (zh) 2015-12-15 2018-09-28 建新公司 用于治疗粘脂贮积症ii型的腺伴随病毒载体
SG11201804664XA (en) 2015-12-22 2018-07-30 Univ Texas Salt forms and polymorphs of (r)-1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorocyclobutoxy)-6-methylpyridin-2-yl) acetamido) pyridazin-3-yl)-2-fluorobutyl)-n-methyl-1h-1,2,3-triazole-4-carboxamide
BR112018014615A2 (pt) 2016-01-20 2018-12-11 The Scripps Research Institute composições de anticorpo para ror1 e métodos relacionados
PT3411478T (pt) 2016-02-01 2022-09-13 Bioverativ Therapeutics Inc Genes do fator viii otimizados
EP3411059A4 (en) 2016-02-02 2019-10-16 University Of Massachusetts METHOD FOR INCREASING THE EFFECTIVENESS OF THE SYSTEMIC DELIVERY OF AVV GENES TO THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM
EP3411488A1 (en) 2016-02-03 2018-12-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type i
WO2017139643A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 University Of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
US10729789B2 (en) * 2016-03-01 2020-08-04 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for adeno-associated virus mediated gene expression in myofibroblast-like cells
EP3440210A4 (en) 2016-04-05 2019-11-27 University of Massachusetts COMPOSITIONS AND METHOD FOR SELECTIVELY INHIBITING THE EXPRESSION OF GRAINYHEAD LIKE PROTEIN
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
US20190127713A1 (en) 2016-04-13 2019-05-02 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
WO2017180936A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for treatment of wet age-related macular degeneration
IL305449B1 (en) 2016-04-15 2025-09-01 Univ Pennsylvania Gene therapy for the treatment of mucocutaneous type ii diabetes
WO2017180861A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsulvania Gene therapy for treating hemophilia b
WO2017181105A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance
US11091776B2 (en) * 2016-04-15 2021-08-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV8 mutant capsids and compositions containing same
KR102450833B1 (ko) 2016-04-15 2022-10-05 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 혈우병 a 치료용 유전자 요법
US11401527B2 (en) 2016-04-17 2022-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful for prophylaxis of organophosphates
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
GB201608046D0 (en) * 2016-05-09 2016-06-22 Cambridge Entpr Ltd And Syndey Children S Hospitals Network Randwick And Westmead Incorporating The Treatment of complement-mediated disorders
MX2018013463A (es) 2016-05-13 2019-07-04 4D Molecular Therapeutics Inc Capsides variantes de virus adenoasociados y metodos de uso de las mismas.
BR112018073472A2 (pt) 2016-05-18 2019-08-27 Voyager Therapeutics Inc composições e métodos de tratamento da doença de huntington
CA3024448C (en) 2016-05-18 2025-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. MODULATING POLYNUCLEOTIDES
WO2017212929A1 (ja) * 2016-06-08 2017-12-14 ソニー株式会社 撮像制御装置および方法、並びに車両
WO2017218852A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 University Of Massachusetts Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells
MX2019000221A (es) 2016-07-05 2020-02-07 Univ Massachusetts Suministro genetico de sfasl mediado por aav2 como una terapia neuro-protectora en el glaucoma.
CN110191954B (zh) 2016-07-08 2024-05-14 宾夕法尼亚州大学信托人 用于治疗涉及rdh12的病症和疾病的方法和组合物
EP4275747A3 (en) 2016-07-19 2024-01-24 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
WO2018022511A1 (en) 2016-07-25 2018-02-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions comprising a lecithin cholesterol acyltransferase variant and uses thereof
EP3491008A2 (en) 2016-07-26 2019-06-05 BioMarin Pharmaceutical Inc. Novel adeno-associated virus capsid proteins
KR20230039779A (ko) 2016-07-29 2023-03-21 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 변이체 캡시드를 갖는 아데노-관련된 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법
US11698377B2 (en) 2016-08-15 2023-07-11 Genzyme Corporation Methods for detecting AAV
WO2018035503A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Crispr-cas genome engineering via a modular aav delivery system
JP2019531787A (ja) 2016-08-30 2019-11-07 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 生物医学的ターゲティング及びデリバリーの方法並びにそれを実行するための装置及びシステム
US10457940B2 (en) 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
EP3518985A4 (en) 2016-09-29 2020-08-05 University of Florida Research Foundation, Incorporated AAVRH.10 VARIANTS WITH HOST ANTIBODY EXHAUST CAPACITIES AND MODIFIED TISSUE TARGETING PROPERTIES
US11578340B2 (en) 2016-10-13 2023-02-14 University Of Massachusetts AAV capsid designs
EP3528785A4 (en) 2016-10-19 2020-12-02 Adverum Biotechnologies, Inc. MODIFIED AAV CASPIDS AND USES THEREOF
EP3548065B1 (en) 2016-12-01 2022-11-09 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Pharmaceutical compositions for the treatment of retinal degenerative diseases
WO2018112225A1 (en) * 2016-12-14 2018-06-21 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for generating a deletion library and for identifying a defective interfering particle (dip)
MX2019007876A (es) * 2016-12-30 2019-10-15 Univ Pennsylvania Terapia genetica para tratar fenilcetonuria.
WO2018136710A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Treatment of krabbe disease with umbilical cord blood transplantion (ucbt) and increased galactocerebrosidase (galc) expression
US11554147B2 (en) 2017-02-20 2023-01-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating familial hypercholesterolemia
US11827906B2 (en) 2017-02-28 2023-11-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clade f vector and uses therefor
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
AU2018229293A1 (en) 2017-02-28 2019-08-29 Janssen Biotech, Inc. Influenza vaccines based on AAV vectors
KR20230093072A (ko) 2017-03-01 2023-06-26 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 안구 장애에 대한 유전자 치료
US11376321B2 (en) 2017-03-02 2022-07-05 Genethon Method for removing anti-AAV antibodies from a blood-derived composition
EP3606544B1 (en) 2017-04-05 2025-06-04 University of Massachusetts Minigene therapy
WO2018189208A1 (en) 2017-04-10 2018-10-18 Genethon Antisense targeting dynamin 2 and use for the treatment of centronuclear myopathies and neuropathies
US11613739B2 (en) 2017-04-14 2023-03-28 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis II with recombinant human iduronate-2-sulfatase (IDS) produced by human neural or glial cells
EP3634986A4 (en) 2017-04-24 2021-09-08 The Trustees of The University of Pennsylvania GENE THERAPY FOR EYE DISORDERS
SG11201909868YA (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
WO2018204786A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
US11859179B2 (en) 2017-05-09 2024-01-02 University Of Massachusetts Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
CA3061655A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
CN108103058A (zh) * 2017-05-12 2018-06-01 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种i型糖尿病的基因治疗药物
AU2018265541B2 (en) 2017-05-12 2023-05-25 University Of Massachusetts Viral vector production
EP3630986A4 (en) 2017-05-31 2021-08-11 The Trustees of The University of Pennsylvania GENE THERAPY FOR TREATMENT OF PEROXISOMAL DISEASES
AU2018281145A1 (en) 2017-06-06 2020-01-02 University Of Massachusetts Self-regulating AAV vectors for safe expression of MeCP2 in rett syndrome
JP7766393B2 (ja) 2017-06-14 2025-11-10 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 眼疾患のための遺伝子療法
US10693918B2 (en) 2017-06-15 2020-06-23 Palo Alto Networks, Inc. Radio access technology based security in service provider networks
US10834136B2 (en) 2017-06-15 2020-11-10 Palo Alto Networks, Inc. Access point name and application identity based security enforcement in service provider networks
US10708306B2 (en) 2017-06-15 2020-07-07 Palo Alto Networks, Inc. Mobile user identity and/or SIM-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks
US10721272B2 (en) 2017-06-15 2020-07-21 Palo Alto Networks, Inc. Mobile equipment identity and/or IOT equipment identity and application identity based security enforcement in service provider networks
US10812532B2 (en) 2017-06-15 2020-10-20 Palo Alto Networks, Inc. Security for cellular internet of things in mobile networks
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US11050789B2 (en) 2017-06-15 2021-06-29 Palo Alto Networks, Inc. Location based security in service provider networks
AU2018288863A1 (en) * 2017-06-22 2020-01-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing regulatory immune cells and uses thereof
CN110461368A (zh) 2017-06-30 2019-11-15 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
AU2018298133A1 (en) 2017-07-06 2020-01-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV9-mediated gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type I
WO2019008157A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Genethon NOVEL POLYNUCLEOTIDES ENCODING HUMAN FKRP PROTEIN
CA3070087A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
EP3662060A2 (en) 2017-08-03 2020-06-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
SG11202000846WA (en) 2017-08-07 2020-02-27 Nbe Therapeutics Ag Anthracycline-based antibody drug conjugates having high in vivo tolerability
EP3676373A4 (en) * 2017-08-28 2021-06-09 The Regents of The University of California Adeno-associated virus capsid variants and methods of use thereof
DK3684423T5 (da) 2017-09-20 2024-08-26 4D Molecular Therapeutics Inc Adeno-associerede virusvariantcapsider og fremgangsmåder til anvendelse deraf
SG11202002457RA (en) 2017-09-22 2020-04-29 Univ Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
WO2019060686A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 University Of Massachusetts NEW DUAL EXPRESSION VECTORS OF SOD1 AND USES THEREOF
WO2019060726A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Genzyme Corporation Variant rnai
CA3075656A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Voyager Therapeutics, Inc. Rescue of central and peripheral neurological phenotype of friedreich's ataxia by intravenous delivery
AU2018346102B2 (en) * 2017-10-03 2023-05-11 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
US12441998B2 (en) 2017-10-12 2025-10-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York SLC2A1 lncRNA as a biologic and related treatments and methods
EP4454654A3 (en) 2017-10-16 2025-02-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2019079240A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
WO2019079496A2 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Regenxbio, Inc. FULLY HUMAN ANTIBODY-BASED THERAPEUTIC AGENTS HAVING POST-TRANSLATION MODIFICATION
EP3697764B1 (en) * 2017-10-18 2025-06-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Gls-1 inhibitors for use in the treatment of cancer
EP3697449A1 (en) 2017-10-18 2020-08-26 REGENXBIO Inc. Treatment of ocular diseases and metastatic colon cancer with human post-translationally modified vegf-trap
JP7184894B2 (ja) 2017-11-27 2022-12-06 ４ディー モレキュラー セラピューティクス インコーポレイテッド アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用
KR20200104864A (ko) 2017-11-30 2020-09-04 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 뮤코다당류증 iiib형에 대한 유전자 요법
JP7389744B2 (ja) 2017-11-30 2023-11-30 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア ムコ多糖症ｉｉｉａ型のための遺伝子療法
MX2020006435A (es) 2017-12-19 2021-02-09 Akouos Inc Administracion de anticuerpos terapeuticos mediada por vector de virus adenoasociado (aav) en el oido interno.
WO2019152843A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for restoring pah gene function and methods of use thereof
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
US11306329B2 (en) 2018-02-19 2022-04-19 City Of Hope Adeno-associated virus compositions for restoring F8 gene function and methods of use thereof
SG11202007942YA (en) 2018-02-27 2020-09-29 Univ Pennsylvania Novel adeno-associated virus (aav) vectors, aav vectors having reduced capsid deamidation and uses therefor
US20210010028A1 (en) 2018-03-06 2021-01-14 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
KR20200135433A (ko) 2018-03-23 2020-12-02 유니버시티 오브 매사추세츠 골 장애 치료를 위한 유전자 치료제
SG11202009452WA (en) 2018-04-03 2020-10-29 Stridebio Inc Antibody-evading virus vectors
JP2021519581A (ja) 2018-04-03 2021-08-12 ストライドバイオ，インコーポレイテッド 抗体を回避するウイルスベクター
JP7425738B2 (ja) 2018-04-03 2024-01-31 ギンコ バイオワークス インコーポレイテッド 眼組織を標的とするウイルスベクター
US12054724B2 (en) 2018-04-10 2024-08-06 President And Fellows Of Harvard College AAV vectors encoding clarin-1 or GJB2 and uses thereof
JP7575273B2 (ja) 2018-04-16 2024-10-29 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための組成物及び方法
US11981892B2 (en) 2018-04-16 2024-05-14 University Of Massachusetts Compositions and methods for improved gene editing
US11472848B2 (en) 2018-04-27 2022-10-18 University Of Massachusetts AAV capsids identified by in vivo library selection
US12378576B2 (en) 2018-04-27 2025-08-05 Spacecraft Seven, Llc Gene therapy for CNS degeneration
US12365865B2 (en) 2018-04-29 2025-07-22 Regenxbio Inc. Scalable clarification process for recombinant AAV production
WO2019212922A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Regenxbio Inc. Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome content, capsid content and full/empty ratios of adeno-associated virus particles
CA3098871A1 (en) 2018-05-08 2019-11-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Aav-compatible laminin-linker polymerization proteins
EP3790627A2 (en) 2018-05-09 2021-03-17 BioMarin Pharmaceutical Inc. Methods of treating phenylketonuria
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
JP2021523914A (ja) 2018-05-15 2021-09-09 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． パーキンソン病を治療するための組成物および方法
TW202015742A (zh) 2018-05-15 2020-05-01 美商航海家醫療公司 投遞腺相關病毒（ａａｖ）之組成物和方法
EP3793686A1 (en) 2018-05-16 2021-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
US20210214749A1 (en) 2018-05-16 2021-07-15 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
US12163129B2 (en) 2018-06-08 2024-12-10 University Of Massachusetts Antisense oligonucleotides to restore dysferlin protein expression in dysferlinopathy patient cells
EP3806888B1 (en) 2018-06-12 2024-01-31 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
US12060567B2 (en) 2018-06-13 2024-08-13 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered untranslated regions (UTR) for AAV production
US12070702B2 (en) 2018-06-14 2024-08-27 Regenxbio Inc. Anion exchange chromatography for recombinant AAV production
JP7565218B2 (ja) 2018-07-02 2024-10-10 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療
GB201811368D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Ucb Biopharma Sprl Antibody
MX2021000443A (es) 2018-07-12 2021-05-28 Spacecraft Seven Llc Vectores de terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de danon.
SG11202100139VA (en) 2018-07-17 2021-02-25 Neuromyon Inc Treatment of neuropathy with dna constructs expressing igf-1 isoforms
US20210355454A1 (en) 2018-07-24 2021-11-18 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
US12188040B2 (en) * 2018-07-30 2025-01-07 Gene Therapy Research Institution Co., Ltd. Method for enhancing gene expression using AAV vector
WO2020028816A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Genzyme Corporation Variant rnai against alpha-synuclein
AU2019319976B2 (en) 2018-08-10 2025-08-14 Regenxbio Inc. Scalable method for recombinant AAV production
SG11202102058UA (en) 2018-08-30 2021-03-30 Tenaya Therapeutics Inc Cardiac cell reprogramming with myocardin and ascl1
US12274733B2 (en) 2018-09-28 2025-04-15 President And Fellows Of Harvard College Cellular reprogramming to reverse aging and promote organ and tissue regeneration
AU2019347666B2 (en) 2018-09-28 2025-10-02 President And Fellows Of Harvard College Cellular reprogramming to reverse aging and promote organ and tissue regeneration
CA3113470A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 President And Fellows Of Harvard College Mutant reverse tetracycline transactivators for expression of genes
JP7528066B2 (ja) 2018-09-28 2024-08-05 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 操作されたプロモータを有するフラタキシン発現コンストラクトおよびその使用方法
PE20211596A1 (es) 2018-10-01 2021-08-18 Univ Pennsylvania Composiciones utiles para tratar la gangliosidosis gm1
AR116569A1 (es) 2018-10-01 2021-05-19 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Terapia génica para tratar la acidemia propiónica
US20210348242A1 (en) 2018-10-04 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
AU2019354793A1 (en) 2018-10-05 2021-05-13 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acid constructs encoding AAV production proteins
WO2020077165A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
MX2021004213A (es) 2018-10-12 2021-07-16 Genzyme Corp Generacion de pah humana mejorada para el tratamiento de pku grave mediante terapia de sustitucion de genes dirigida al higado.
WO2020081415A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Regenxbio Inc. Method for measuring the infectivity of replication defective viral vectors and viruses
UY38407A (es) 2018-10-15 2020-05-29 Novartis Ag Anticuerpos estabilizadores de trem2
EP3867389A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Voyager Therapeutics, Inc. Expression vectors for large-scale production of raav in the baculovirus/sf9 system
KR20210082205A (ko) 2018-10-22 2021-07-02 유니버시티 오브 로체스터 레트로바이러스 인테그라제-Cas9 융합 단백질을 이용한 유도된 비상동 DNA 삽입에 의한 게놈 편집
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
EP3880823A4 (en) * 2018-11-16 2022-08-17 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus for treating pompe disease
CN113271982B (zh) 2018-11-16 2024-07-30 摩大力斯医疗株式会社 通过靶向肌营养相关蛋白基因来治疗肌营养不良的方法
US12391947B2 (en) 2018-11-29 2025-08-19 University Of Massachusetts Modulation of SPTLC1 via recombinant adeno-associated vectors
WO2020140007A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 University Of Rochester Gene therapy for best1 dominant mutations
US12338450B2 (en) 2019-01-04 2025-06-24 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy constructs for treating Wilson disease
US12371698B2 (en) 2019-01-14 2025-07-29 University Of Rochester Targeted nuclear RNA cleavage and polyadenylation with CRISPR-Cas
US20220064671A1 (en) 2019-01-18 2022-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
KR20210130158A (ko) 2019-01-31 2021-10-29 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 Aav 캡시드의 전사 의존적 유도 진화를 사용하는 방법
US20220054655A1 (en) 2019-02-22 2022-02-24 University Of Massachusetts Oxr1 gene therapy
KR20210131370A (ko) 2019-02-22 2021-11-02 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 Grn-연관 성인-발병 신경퇴화의 치료를 위한 재조합 아데노-연관 바이러스
EP3931334A1 (en) 2019-02-25 2022-01-05 Novartis AG Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
JP2022520875A (ja) 2019-02-25 2022-04-01 ノバルティス アーゲー Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症を治療するための組成物及び方法
AU2020228028A1 (en) 2019-02-25 2021-09-30 University Of Massachusetts DNA-binding domain transactivators and uses thereof
PE20212072A1 (es) 2019-02-26 2021-10-26 Univ Pennsylvania Composiciones utiles en el tratamiento de la enfermedad de krabbe
US20220047618A1 (en) 2019-02-28 2022-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Adeno-associated virus vectors for the delivery of therapeutics
AU2020241888A1 (en) 2019-03-21 2021-09-30 Ginkgo Bioworks, Inc. Recombinant adeno-associated virus vectors
EP3947427A1 (en) 2019-03-25 2022-02-09 Genethon Production of large-sized quasidystrophins using overlapping aav vectors
CA3135609A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
EP4667578A2 (en) 2019-04-03 2025-12-24 REGENXBIO Inc. Gene therapy for eye pathologies
TW202102526A (zh) 2019-04-04 2021-01-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 重組腺相關病毒及其用途
HUE064411T2 (hu) 2019-04-11 2024-03-28 Regenxbio Inc Méretkizárásos kromatográfiás módszerek rekombináns adeno-asszociált víruskészítmények jellemzésére
BR112021020668A2 (pt) 2019-04-17 2022-01-11 Codiak Biosciences Inc Composições de exossomos e aav
CN113993552A (zh) 2019-04-19 2022-01-28 再生生物股份有限公司 腺相关病毒载体制剂和方法
SG11202111414RA (en) 2019-04-24 2021-11-29 Regenxbio Inc Fully-human post-translationally modified antibody therapeutics
WO2020219990A1 (en) 2019-04-26 2020-10-29 President And Fellows Of Harvard College Aav vectors encoding mini-pcdh15 and uses thereof
WO2020223236A1 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel aav capsids and compositions containing same
EP3962536A1 (en) 2019-04-29 2022-03-09 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing baculoviral infected insect cells (biics) in bioreactors
BR112021021908A2 (pt) 2019-05-03 2022-02-01 Univ Pennsylvania Composições úteis no tratamento da leucodistrofia metacromática
US20240124889A1 (en) 2019-05-07 2024-04-18 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
EP3972610B1 (en) 2019-05-20 2025-09-03 University of Massachusetts Minigene therapy
KR20220011664A (ko) * 2019-05-24 2022-01-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 변형된 바이러스 입자 및 이의 용도
JP7565620B2 (ja) 2019-05-28 2024-10-11 株式会社モダリス Ｄｍｐｋ遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法
EP3987024A4 (en) 2019-06-20 2023-11-01 University Of Massachusetts COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED GENOMIC EDITING
BR112021026866A2 (pt) 2019-07-02 2022-03-03 M6P Therapeutics Composições de vetor e métodos de seu uso para o tratamento de distúrbios do armazenamento lisossômico
WO2021007473A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Masonic Medical Research Institute Vgll4 with ucp-1 cis-regulatory element and method of use thereof
US20220251567A1 (en) 2019-07-10 2022-08-11 Inserm (Institut National De La Santè Et De La Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
EP3997226A1 (en) 2019-07-11 2022-05-18 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
AU2020311618B2 (en) 2019-07-11 2025-04-10 Centre Hospitalier Universitaire De Nantes Chemically-modified adeno-associated virus
US10557149B1 (en) * 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
US10653731B1 (en) 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
WO2021016453A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 University Of Rochester Targeted rna cleavage with crispr-cas
WO2021021661A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory element and methods of uses thereof
EP4007814A1 (en) 2019-07-26 2022-06-08 Akouos, Inc. Methods of treating hearing loss using a secreted target protein
WO2021030125A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
EP4013770A4 (en) * 2019-08-14 2023-12-13 University of Florida Research Foundation, Incorporated AAV CAPSID VARIANTS FOR GENE THERAPY
TW202122582A (zh) 2019-08-26 2021-06-16 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
MX2022002366A (es) 2019-08-26 2022-07-19 Regenxbio Inc Tratamiento de la retinopatía diabética con fab anti-vegf completamente humano modificado postraduccionalmente.
EP4022057A1 (en) 2019-08-27 2022-07-06 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of disorders associated with repetitive dna
WO2021046155A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
CN114555814A (zh) 2019-09-13 2022-05-27 罗特格斯新泽西州立大学 Aav相容的层粘连蛋白-连接子聚合蛋白
CN114521143B (zh) 2019-09-19 2025-03-14 吉尼松公司 减轻fkrp心脏毒性的基因治疗表达系统
US11492622B2 (en) 2019-09-26 2022-11-08 Massachusetts Institute Of Technology MicroRNA-based logic gates and uses thereof
WO2021062092A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Trans-activated functional rna by strand displacement and uses thereof
WO2021067389A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
WO2021067598A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods for improved therapeutic use of recombinant aav
KR20220081365A (ko) 2019-10-07 2022-06-15 리젠엑스바이오 인크. 아데노-연관 바이러스 벡터 약제학적 조성물 및 방법
WO2021076656A1 (en) 2019-10-15 2021-04-22 University Of Massachusetts Rna editor-enhanced rna trans-splicing
WO2021073568A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Wuxi Apptec (Shanghai) Co., Ltd. A novel aav variant
KR20220083714A (ko) 2019-10-17 2022-06-20 스트라이드바이오 인코포레이티드 니만-피크 질환 c형의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 벡터
AU2020384294A1 (en) 2019-11-14 2022-06-02 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of hereditary angioedema with liver-specific gene therapy vectors
US20230016983A1 (en) 2019-11-19 2023-01-19 lNSERM (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ ET DE LA RECHERCHE MÉDICALE) Antisense oligonucleotides and thier use for the treatment of cancer
JP2023503637A (ja) * 2019-11-28 2023-01-31 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド マイクロジストロフィン遺伝子治療コンストラクト及びその使用
EP4072595A1 (en) 2019-12-10 2022-10-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adeno associated virus vectors for the treatment of hunter disease
KR20220128632A (ko) 2019-12-31 2022-09-21 스완바이오 테라퓨틱스 리미티드 개선된 aav-abcd1 구축물 및 부신백질이영양증 (ald) 및/또는 부신척수신경병증 (amn)의 치료 또는 예방을 위한 용도
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
WO2021150570A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis i with fully-human glycosylated human alpha-l-iduronidase (idua)
JP2023512043A (ja) 2020-01-29 2023-03-23 レジェンクスバイオ インコーポレーテッド ムコ多糖症ｉｖａの治療
AU2021214174A1 (en) 2020-01-29 2022-08-18 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis II with recombinant human iduronate-2-sulfatase (IDS) produced by human neural or glial cells
CA3165713A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Andrew Scharenberg Bispecific transduction enhancer
CA3165057A1 (en) 2020-02-02 2021-08-05 James M. Wilson Compositions useful for treating gm1 gangliosidosis
EP4100533A1 (en) 2020-02-07 2022-12-14 University of Rochester Ribozyme-mediated rna assembly and expression
US20230078498A1 (en) 2020-02-07 2023-03-16 University Of Rochester Targeted Translation of RNA with CRISPR-Cas13 to Enhance Protein Synthesis
BR112022015921A2 (pt) 2020-02-14 2022-10-04 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Terapia gênica para tratar o transtorno de deficiência de cdkl5
EP4110931A4 (en) 2020-02-25 2024-03-27 University of Massachusetts Inducible single aav system and uses thereof
JP2023518327A (ja) * 2020-02-25 2023-04-28 チルドレンズ・メディカル・リサーチ・インスティテュート アデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチドおよびベクター
EP4114421A1 (en) 2020-03-02 2023-01-11 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene vector control by cardiomyocyte-expressed micrornas
KR20220160069A (ko) 2020-03-27 2022-12-05 유씨비 바이오파마 에스알엘 자율적 노브 도메인 펩티드
JP2023519344A (ja) 2020-03-27 2023-05-10 ユニバーシティ オブ ロチェスター ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ ｃｒＲＮＡアレイ
EP4127169A1 (en) 2020-03-27 2023-02-08 University of Rochester Targeted destruction of viral rna by crispr-cas13
WO2021202532A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating propionic acidemia
AU2021248577A1 (en) 2020-03-31 2022-09-29 Sichuan Univeristy AAV capsids variants and uses thereof
AR122409A1 (es) 2020-04-03 2022-09-07 Biomarin Pharm Inc Tratamiento de la fenilcetonuria con aav y formulaciones terapéuticas
KR20220167324A (ko) 2020-04-10 2022-12-20 솔라 바이오사이언시즈 엘엘씨 단백질 응집 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2021211753A1 (en) 2020-04-15 2021-10-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2021222168A2 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of tdp-43 proteinopathies
CN115803064A (zh) 2020-05-12 2023-03-14 宾夕法尼亚州大学信托人 用于drg特异性降低转基因表达的组合物
AU2021271635A1 (en) 2020-05-12 2023-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of krabbe disease
EP4165194A2 (en) 2020-05-13 2023-04-19 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss
CA3183171A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating slc26a4-associated hearing loss
WO2021230385A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
WO2021247995A2 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating neuropathic pain
JP2023529371A (ja) 2020-06-05 2023-07-10 ソラ・バイオサイエンシズ・エルエルシー シヌクレイノパチーの処置のための組成物および方法
US20230220069A1 (en) 2020-06-17 2023-07-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of gene therapy patients
JP2023530171A (ja) 2020-06-19 2023-07-13 ジェネトン 筋肉内及び心臓内でのｓｇｃｇの適切な発現を可能にする遺伝子療法発現系
US12173307B2 (en) 2020-06-24 2024-12-24 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods for the purification of viral vectors
KR20230050336A (ko) 2020-07-10 2023-04-14 인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸) 뇌전증을 치료하기 위한 방법과 조성물
JP2023532806A (ja) 2020-07-10 2023-07-31 ジェネトン 新規の筋肉特異的プロモーター
EP4179097A1 (en) 2020-07-13 2023-05-17 The Trustees of The University of Pennsylvania Compositions useful for treatment of charcot-marie-tooth disease
EP4182455A1 (en) 2020-07-15 2023-05-24 University of Rochester Targeted rna cleavage with dcasl3-rnase fusion proteins
WO2022017630A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Ucl Business Ltd GENE THERAPY VECTOR FOR eEF1A2 AND USES THEREOF
US20230285596A1 (en) 2020-07-27 2023-09-14 Voyager Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease
EP4189095A1 (en) 2020-07-27 2023-06-07 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
WO2022032153A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
CN116209430A (zh) 2020-08-07 2023-06-02 阿米库斯治疗学公司 囊泡靶向蛋白及其用途
CA3185267A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Spacecraft Seven, Llc Plakophilin-2 (pkp2) gene therapy using aav vector
CN114075610B (zh) * 2020-08-11 2023-11-17 北京荷塘生华医疗科技有限公司 检测野生型腺相关病毒的通用引物及其应用
AU2021325954A1 (en) 2020-08-14 2023-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel AAV capsids and compositions containing same
AR123288A1 (es) 2020-08-19 2022-11-16 Stridebio Inc Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento del síndrome de rett
GB202013194D0 (en) 2020-08-24 2020-10-07 Combigene Ab Gene therapy for lipodystrophy
EP4200429A1 (en) 2020-08-24 2023-06-28 The Trustees of The University of Pennsylvania Viral vectors encoding glp-1 receptor agonist fusions and uses thereof in treating metabolic diseases
JP2023540054A (ja) 2020-08-26 2023-09-21 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｇｒｎ関連成人発症性神経変性の治療のための組換えアデノ随伴ウイルス
TW202218686A (zh) 2020-09-09 2022-05-16 美商維泰克斯製藥公司 用於治療杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)之組合物及方法
CN116323641A (zh) 2020-09-10 2023-06-23 路德维希-马克西米利安慕尼黑大学 工程化的aav载体
US12129287B2 (en) 2020-09-14 2024-10-29 President And Fellows Of Harvard College Recombinant adeno associated virus encoding clarin-1 and uses thereof
EP4213890A1 (en) 2020-09-15 2023-07-26 RegenxBio Inc. Vectorized lanadelumab and administration thereof
EP4214242A1 (en) 2020-09-15 2023-07-26 RegenxBio Inc. Vectorized antibodies for anti-viral therapy
US20230383278A1 (en) 2020-09-18 2023-11-30 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Novel adeno-associated viral (aav) vectors to treat hereditary methylmalonic acidemia (mma) caused by methylmalonyl-coa mutase (mmut) deficiency
WO2022066849A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 University Of Massachusetts Aav vectors encoding nf1 and uses thereof
BR112023003929A2 (pt) 2020-10-01 2023-04-11 Genzyme Corp Cassete de expressão de pah humano para tratamento de pku por terapia de reposição gênica direcionada ao fígado
JP2023545424A (ja) 2020-10-07 2023-10-30 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド ゲル製剤などの脈絡膜上投与用製剤
IL301643A (en) 2020-10-07 2023-05-01 Regenxbio Inc Gene therapy for ocular manifestations of CLN2 disease
MX2023004035A (es) 2020-10-07 2023-07-05 Regenxbio Inc Formulaciones para la administración supracoroidea tales como formulaciones de viscosidad alta.
JP2023545722A (ja) 2020-10-07 2023-10-31 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 遺伝子治療剤の眼送達のためのアデノ随伴ウイルス
WO2022076750A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns or muscle delivery
CA3198368A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Formulations for suprachoroidal administration such as formulations with aggregate formation
US11781156B2 (en) 2020-10-09 2023-10-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions
KR20230118075A (ko) 2020-10-09 2023-08-10 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 파브리병 치료를 위한 조성물 및 방법
US20230383313A1 (en) 2020-10-18 2023-11-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved adeno-associated virus (aav) vector and uses therefor
AU2021371307A1 (en) 2020-10-28 2023-06-01 Regenxbio, Inc. VECTORIZED ANTI-TNF-α ANTIBODIES FOR OCULAR INDICATIONS
WO2022094157A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Regenxbio Inc. Vectorized anti-cgrp and anti-cgrpr antibodies and administration thereof
WO2022094078A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of rett syndrome
US20230390418A1 (en) 2020-10-29 2023-12-07 Regenxbio Inc. Vectorized factor xii antibodies and administration thereof
CN116457373A (zh) 2020-10-29 2023-07-18 再生生物股份有限公司 用于眼部适应症的载体化TNF-α拮抗剂
EP4240854A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of dm1 with slucas9 and sacas9
CN112322791B (zh) * 2020-11-27 2023-10-27 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
MX2023006444A (es) 2020-12-01 2023-08-10 Univ Pennsylvania Composiciones novedosas con motivos dirigidos a tejido específico y composiciones que los contienen.
IL303239A (en) 2020-12-01 2023-07-01 Univ Pennsylvania Compositions and their uses for the treatment of Engelmann syndrome
CR20230228A (es) 2020-12-01 2023-07-18 Akouos Inc Construcciones de anticuerpos anti-vegf y métodos relacionados para el tratamiento de los síntomas asociados al schwannoma vestibular
IL303614A (en) 2020-12-16 2023-08-01 Regenxbio Inc Method of producing a recombinant adeno-associated virus particle
EP4271419A1 (en) 2020-12-29 2023-11-08 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating clrn1-associated hearing loss and/or vision loss
TW202241943A (zh) 2020-12-29 2022-11-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 Tau特異性抗體基因療法組合物、方法及其用途
CN116981697A (zh) 2021-01-14 2023-10-31 森迪生物科学公司 可分泌有效载荷调节
EP4281568A1 (en) 2021-01-21 2023-11-29 RegenxBio Inc. Improved production of recombinant polypeptides and viruses
EP4281559A4 (en) 2021-01-22 2024-12-04 University of Massachusetts Use of novel mirna-binding site cassettes for antigen-presenting cell detargeting of transgene expression by raav gene therapy vectors
AU2022212952A1 (en) 2021-01-27 2023-08-10 Umoja Biopharma, Inc. Lentivirus for generating cells expressing anti-cd19 chimeric antigen receptor
AU2022214429A1 (en) 2021-02-01 2023-09-14 Tern Therapeutics, Llc Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
WO2022173605A2 (en) 2021-02-10 2022-08-18 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis ii with recombinant human iduronate-2-sulfatase (ids)
GB202101958D0 (en) 2021-02-12 2021-03-31 Ucl Business Ltd Gene therapy for dopamine transporter deficiency syndrome
KR20230150836A (ko) 2021-02-26 2023-10-31 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 파브리병 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2022182959A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/slucas9
WO2022182957A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/sacas9
US20240141377A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
US20240141378A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CN117460832A (zh) 2021-03-22 2024-01-26 建新公司 空aav衣壳和完整aav衣壳的尺寸排阻色谱分析
EP4314295A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Nucleotide editing to reframe dmd transcripts by base editing and prime editing
KR20230170022A (ko) 2021-04-12 2023-12-18 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 척수 및 연수 근위축증(sbma) 치료에 유용한 조성물
AU2022261125A1 (en) 2021-04-23 2023-11-23 University Of Rochester Genome editing by directed non-homologous dna insertion using a retroviral integrase-cas fusion protein and methods of treatment
AR125406A1 (es) 2021-04-23 2023-07-12 Univ Pennsylvania Nuevas composiciones con motivos selectivos para el cerebro y composiciones que las contienen
WO2022229851A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences
JP2024515974A (ja) 2021-04-26 2024-04-11 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ シュタルガルト病（ａｂｃａ４）の遺伝子治療
TW202309293A (zh) 2021-04-26 2023-03-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於治療肌縮蛋白症(dystrophinopathy)之微小肌縮蛋白基因療法給藥
US20240218397A1 (en) 2021-05-04 2024-07-04 Regenxbio Inc. Novel aav vectors and methods and uses thereof
WO2022234519A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
EP4337267A1 (en) 2021-05-11 2024-03-20 RegenxBio Inc. Treatment of duchenne muscular dystrophy and combinations thereof
WO2022272296A2 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus packaging systems
US20240318157A1 (en) 2021-07-01 2024-09-26 Amicus Therapeutics, Inc. Neurotensin Variants And Tagged Proteins Comprising Neurotensin Or Sortilin Propeptide
WO2023278811A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and related methods
WO2023283649A1 (en) 2021-07-08 2023-01-12 Tenaya Therapeutics, Inc. Optimized expression cassettes for gene therapy
EP4373947A1 (en) 2021-07-19 2024-05-29 New York University Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease
EP4377459A2 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
WO2023010135A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
WO2023018637A1 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene editing of regulatory elements
US20240425820A1 (en) 2021-08-11 2024-12-26 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
EP4384193A2 (en) 2021-08-11 2024-06-19 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
AU2022325232A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
JP2024534772A (ja) 2021-08-11 2024-09-26 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 同種異系細胞療法用の遺伝子改変細胞
EP4396237A4 (en) 2021-08-31 2025-11-19 Scout Bio Inc Antigen-binding molecules and their uses
EP4399302A2 (en) 2021-09-08 2024-07-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy
PE20241065A1 (es) 2021-09-30 2024-05-13 Akouos Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de la perdida de audicion asociada a kcnq4
US20240408240A1 (en) 2021-10-01 2024-12-12 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of hereditary angioedema with aav gene therapy vectors and therapeutic formulations
WO2023056399A1 (en) 2021-10-02 2023-04-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel aav capsids and compositions containing same
CN118202060A (zh) 2021-10-05 2024-06-14 再生生物股份有限公司 用于重组aav生产的组合物和方法
WO2023060113A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
EP4413019A2 (en) 2021-10-07 2024-08-14 RegenxBio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
US20250001006A1 (en) 2021-10-07 2025-01-02 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for targeted delivery
EP4413024A2 (en) 2021-10-08 2024-08-14 SOLA Biosciences LLC Compositions and methods for the treatment of proteopathies
JP2024537178A (ja) 2021-10-08 2024-10-10 ソラ・バイオサイエンシズ・エルエルシー ｐ５３媒介性癌の処置のための組成物および方法
JP2024540987A (ja) 2021-10-21 2024-11-06 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 低免疫細胞
EP4423285A1 (en) 2021-10-28 2024-09-04 RegenxBio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
US20250295807A1 (en) 2021-11-15 2025-09-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
US20250011812A1 (en) 2021-11-23 2025-01-09 University Of Massachusetts Gene therapy for spinal muscular atrophy
WO2023102442A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Jaguar Gene Therapy, Llc Gene therapy methods for treatment of diabetes
WO2023102517A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of fabry disease
KR20240126864A (ko) 2021-12-17 2024-08-21 타팔지 세러퓨틱스 통증 치료에서 사용을 위한 펩티드 및 방법
EP4442698A4 (en) 2021-12-28 2025-10-15 Chengdu Origen Biotechnology Co Ltd MODIFIED AAV CAPSID PROTEIN AND ITS USE
TW202340467A (zh) 2022-01-10 2023-10-16 賓州大學委員會 有用於治療c9orf72介導之病症之組成物及方法
TW202338086A (zh) 2022-01-10 2023-10-01 賓州大學委員會 有用於治療異染性白質失養症之組成物
US20250084129A1 (en) * 2022-01-10 2025-03-13 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav5 capsid variants
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4215614A1 (en) 2022-01-24 2023-07-26 Dynacure Combination therapy for dystrophin-related diseases
EP4469584A1 (en) 2022-01-25 2024-12-04 The Trustees of The University of Pennsylvania Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver
WO2023150142A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Akouos, Inc. Anti-vegf antibody constructs and related methods for treating vestibular schwannoma associated symptoms
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023154693A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023156530A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Lysogene Gene therapy for neurodegenerative diseases
IL315000A (en) 2022-02-17 2024-10-01 Sana Biotechnology Inc Engineered cd47 proteins and uses thereof
EP4490291A1 (en) 2022-03-08 2025-01-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy
EP4490292A1 (en) 2022-03-08 2025-01-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 44, 50, and 53 for treatment of duchenne muscular dystrophy
US20250101382A1 (en) 2022-03-11 2025-03-27 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells and compositions and uses thereof
EP4493226A1 (en) 2022-03-13 2025-01-22 RegenxBio Inc. Modified muscle-specific promoters
US20250213727A1 (en) 2022-03-25 2025-07-03 Regenxbio Inc. Dominant-negative tumor necrosis factor alpha adeno-associated virus gene therapy
EP4504950A1 (en) 2022-04-01 2025-02-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy for diseases with cns manifestations
WO2023196892A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Passive immunization with anti- aav neutralizing antibodies to prevent off-target transduction of intrathecally delivered aav vectors
KR20250007064A (ko) 2022-04-06 2025-01-13 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 Her2 양성 전이성 유방암 및 기타 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
JP2025511883A (ja) 2022-04-06 2025-04-16 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 中枢神経系の加齢を逆行させること
TW202345913A (zh) 2022-04-06 2023-12-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如凝膠調配物
CN119234040A (zh) 2022-04-06 2024-12-31 建新公司 Dm-1肌强直性营养不良的靶向基因疗法
TW202404651A (zh) 2022-04-06 2024-02-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如形成聚集體之調配物
WO2023196873A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Regenxbio Inc. Pharmaceutical composition comprising a recombinant adeno-associated virus vector with an expression cassette encoding a transgene forsuprachoidal administration
EP4508222A1 (en) 2022-04-11 2025-02-19 Centre National de la Recherche Scientifique Chemically-modified adeno-associated viruses
EP4508062A1 (en) 2022-04-11 2025-02-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
CN119365208A (zh) 2022-04-13 2025-01-24 巴塞罗那自治大学 通过表达klotho蛋白的基因疗法治疗神经肌肉疾病
WO2023201277A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
US20250249127A1 (en) 2022-04-14 2025-08-07 Regenxbio Inc. Gene therapy for treating an ocular disease
WO2023205606A1 (en) 2022-04-18 2023-10-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for enhancing aav therapy and decreasing tropism of aav to the liver
EP4518973A1 (en) 2022-05-03 2025-03-12 RegenxBio Inc. Vectorized anti-tnf-alpha inhibitors for ocular indications
WO2023215806A2 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Regenxbio Inc. Vectorized anti-complement antibodies and complement agents and administration thereof
US20250353883A1 (en) 2022-05-06 2025-11-20 Novartis Ag Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides
AR129441A1 (es) 2022-05-25 2024-08-28 Tafalgie Therapeutics Péptidos y métodos para el tratamiento del dolor
WO2023239627A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Regenxbio Inc. Methods for recombinant aav production
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders
CN119731321A (zh) 2022-06-24 2025-03-28 图恩疗法股份有限公司 通过靶向基因阻遏减少低密度脂蛋白的组合物、系统和方法
TW202409289A (zh) * 2022-06-27 2024-03-01 美商安斯泰來基因治療股份有限公司 用於治療肌強直性營養不良之組合物及方法
CA3259902A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Voyager Therapeutics, Inc. AAV Capsid Variants and Their Uses
CA3259982A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Indapta Therapeutics, Inc. COMBINATION OF MODIFIED NATURAL KILLER (NK) CELLS AND ANTIBODY THERAPY AND ASSOCIATED METHODS
TW202424201A (zh) 2022-07-06 2024-06-16 美商航海家醫療公司 Ａａｖ殼體變異體及其用途
EP4554967A2 (en) 2022-07-12 2025-05-21 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
EP4558634A1 (en) 2022-07-18 2025-05-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing
EP4558149A1 (en) 2022-07-21 2025-05-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders
WO2024026377A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors
CN115354049A (zh) * 2022-07-29 2022-11-18 中国科学院深圳先进技术研究院 一种基因递送系统在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用
JP2025527658A (ja) 2022-08-24 2025-08-22 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 組換えアデノ随伴ウイルス及びその使用
JP2025529884A (ja) 2022-08-25 2025-09-09 武田薬品工業株式会社 ファブリー病の治療に使用するための組成物
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
UY40442A (es) 2022-09-22 2024-02-15 Biomarin Pharm Inc Tratamiento de la miocardiopatía arritmogénica con vectores de genoterapia con aav
CA3267804A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Dinaqor Ag TREATMENT OF CARDIOMYOPATHY USING AAV GENE THERAPY VECTORS
IL319873A (en) 2022-09-30 2025-05-01 Regenxbio Inc Treatment of eye diseases with recombinant viral vectors containing anti-VEGF FAB
JP2025534666A (ja) 2022-10-11 2025-10-17 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 操作された核酸調節エレメントならびにその使用方法
WO2024105638A1 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Recombinant aav vectors and methods for treatment of hunter syndrome
WO2024130070A2 (en) 2022-12-17 2024-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav capsids with cardiac- and skeletal muscle- specific targeting motifs and uses thereof
EP4634394A2 (en) 2022-12-17 2025-10-22 The Trustees of The University of Pennsylvania Recombinant aav mutant vectors with cardiac and skeletal muscle-specific targeting motifs and compositions containing same
IT202200026595A1 (it) 2022-12-22 2024-06-22 Fond Telethon Ets Nuovi inibitori di regolatori epigenetici
US12252518B2 (en) 2023-01-06 2025-03-18 Life Biosciences, Inc. Methods of treating non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy
CN120752339A (zh) 2023-01-06 2025-10-03 国家医疗保健研究所 静脉内施用用于治疗疼痛的反义寡核苷酸
WO2024151541A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Sana Biotechnology, Inc. Type-1 diabetes autoimmune mouse
WO2024149844A1 (en) 2023-01-12 2024-07-18 Nantes Université Chemically-modified adeno-associated virus
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods
WO2024163012A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
AU2024215852A1 (en) 2023-02-03 2025-09-18 Janssen Pharmaceutica Nv Gene therapy vectors for use in parkinson's disease
GB202302480D0 (en) 2023-02-22 2023-04-05 Drishti Discoveries Ltd shRNA for the treatment of disease
CN116286988A (zh) * 2023-03-03 2023-06-23 西咸新区沣厚原创医药科技有限公司 一种稳定表达冠状病毒3cl蛋白酶的腺相关病毒体系、动物模型及构建方法和应用
WO2024192281A2 (en) 2023-03-15 2024-09-19 Regenxbio Inc. Exon skipping gene therapy constructs, vectors and uses thereof
WO2024196855A2 (en) 2023-03-17 2024-09-26 University Of Rochester Ribozyme-mediated rna assembly and expression
WO2024211780A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2024215653A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Guide rnas, vectors, and virions for targeting mutations in the pln gene
WO2024215655A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective bag3 therapies
CN116622908B (zh) * 2023-04-13 2024-02-06 武汉珈创生物技术股份有限公司 快速检测野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用
WO2024216244A2 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Regenxbio Inc. Targeting aav capsids, methods of manufacturing and using same
AR132545A1 (es) 2023-04-26 2025-07-16 Sanofi Sa Líneas celulares hospedadoras y métodos para identificar y usar dichas líneas celulares hospedadoras
WO2024228938A1 (en) * 2023-05-01 2024-11-07 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified aav p5 promoter for improved vector titer and purity
WO2024229309A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Manifold Biotechnologies, Inc. Methodsand compositions for high-throughput protein delivery, screening, and detection
WO2024229302A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Sana Biotechnology, Inc. Methods of dosing and administration of engineered islet cells
WO2024233529A2 (en) 2023-05-07 2024-11-14 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2024233791A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Seelos Therapeutics, Inc. Methods of treating neurodegenerative disorders
WO2024238859A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Vectorized c5 inhibitor agents and administration thereof
WO2024238867A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Vectorized anti-complement antibodies and administration thereof
WO2024238853A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Adeno-associated viruses for ocular delivery of gene therapy
WO2024243236A2 (en) 2023-05-22 2024-11-28 Sana Biotechnology, Inc. Methods of delivery of islet cells and related methods
WO2024241176A1 (en) 2023-05-24 2024-11-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Recombinant aav vectors and methods for treatment of diseases with central nervous system disorders
WO2024243563A1 (en) 2023-05-25 2024-11-28 Juno Therapeutics, Inc. Aav purification method
WO2024258961A1 (en) 2023-06-12 2024-12-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav gene therapy for mucopolysaccharidosis iiib
WO2025007046A1 (en) 2023-06-29 2025-01-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mutant aav with central nervous system targeting motifs and compositions containing same
WO2025008406A1 (en) 2023-07-04 2025-01-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
WO2025017168A1 (en) 2023-07-19 2025-01-23 Genethon Novel optimized utrophin micro-genes
WO2025017169A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 Genethon Novel mididystrophins
WO2025035143A1 (en) 2023-08-10 2025-02-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of spinal muscular atrophy
WO2025038430A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2025072604A1 (en) 2023-09-28 2025-04-03 University Of Rochester Rna-editing gene therapy approaches for treating myotonic dystrophy type 1 (dm1)
WO2025075963A1 (en) 2023-10-02 2025-04-10 Regenxbio Inc. Methods and formulations for treating mucopolysaccharidosis ii-associated hearing loss with recombinant human iduronate-2-sulfatase
WO2025080780A1 (en) 2023-10-10 2025-04-17 University Of Rochester Delivery and expression of prime editing crispr systems
WO2025090962A1 (en) 2023-10-25 2025-05-01 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2025090858A1 (en) 2023-10-27 2025-05-01 Biogen Ma Inc. Methods for identifying aav capsid variants with desired characteristics
WO2025102034A1 (en) 2023-11-10 2025-05-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for barth syndrome
WO2025106374A1 (en) 2023-11-13 2025-05-22 Juno Therapeutics, Inc. Aav production method
WO2025106661A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions with cardiac and skeletal musclespecific targeting motifs and uses thereof
WO2025108407A2 (en) 2023-11-23 2025-05-30 Neuexcell Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Gene therapy compositions and methods for treating glioma
WO2025113676A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 Neuexcell Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treating stroke in primates
WO2025129157A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treatment of canavan disease
US20250197862A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Genzyme Corporation ARTIFICIAL microRNAs TARGETING TAU
WO2025137219A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
WO2025147436A1 (en) 2024-01-03 2025-07-10 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2025160429A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting snca
WO2025160434A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting huntington's disease
WO2025188625A1 (en) 2024-03-03 2025-09-12 Passage Bio, Inc. Recombinant adeno-associated virus for treatment of neurodegenerative disorders
WO2025217230A1 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Regenxbio Inc. Vectorized anti-complement antibodies and complement agents and administration thereof
WO2025217214A2 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses and uses thereof
WO2025214477A1 (en) 2024-04-12 2025-10-16 Skyline Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Treatment of genetic cardiomyopathies with aav gene therapy vectors
CN118459608B (zh) * 2024-04-26 2025-01-24 泰州博莱得利生物科技有限公司 犬细小病毒特异性免疫制剂、制备方法和应用
WO2025237990A1 (en) 2024-05-14 2025-11-20 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of pulmonary fibrosis
CN118460614B (zh) * 2024-07-05 2025-03-11 凌意(杭州)生物科技有限公司 一种腺相关病毒Cap蛋白的表达框
CN120249230B (zh) * 2025-06-05 2025-11-07 鼐济医药科技(杭州)有限公司 一种用于同时生产多种重组腺相关病毒的方法

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8929110D0 (en) * 1989-12-22 1990-02-28 3I Res Expl Ltd Polypeptides and dna encoding therefor
US5449616A (en) 1990-05-23 1995-09-12 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid encoding dystrophin-associated protein
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
CA2046745A1 (en) 1991-07-10 1993-01-11 Isaac Neuman Article including a container containing at least one precious stone
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US6001650A (en) * 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
JPH11514853A (ja) * 1995-09-08 1999-12-21 ジエンザイム コーポレイション 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター
EP0870044B1 (en) * 1995-12-01 2004-04-14 Crucell Holland B.V. Regulated protein expression in stably transfected mammalian cells
WO1998010087A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
JP2001500015A (ja) 1996-09-06 2001-01-09 トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｔ７ポリメラーゼを利用する組換えアデノ随伴ウイルスの誘導可能な製造方法
WO1998009657A2 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US20020037867A1 (en) * 1999-02-26 2002-03-28 James M. Wilson Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US5866552A (en) * 1996-09-06 1999-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for expressing a gene in the absence of an immune response
CA2264499A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses
AU4645697A (en) * 1996-09-11 1998-04-02 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Aav4 vector and uses thereof
WO1998024924A1 (en) * 1996-12-05 1998-06-11 Introgene B.V. Genetic modification of primate hemopoietic repopulating stem cells
US6039942A (en) * 1996-12-20 2000-03-21 Novo Nordick A/S Phytase polypeptides
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6251677B1 (en) * 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
EP1015619A1 (en) * 1997-09-19 2000-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
AU9774998A (en) 1997-09-19 1999-04-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Method for gene transfer using bcl2 and compositions useful therein
CA2303768C (en) * 1997-09-19 2009-11-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
US6953690B1 (en) 1998-03-20 2005-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
ATE286138T1 (de) 1998-03-20 2005-01-15 Univ Pennsylvania Zusammensetzungen und verfahren zur helfer-freien herstellung von rekombinante adeno-assoziierten viren
WO1999061601A2 (en) 1998-05-28 1999-12-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Aav5 vector and uses thereof
US6210663B1 (en) 1998-08-20 2001-04-03 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting
US6759237B1 (en) * 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
DK1127150T3 (da) * 1998-11-05 2007-09-24 Univ Pennsylvania Nucleinsyresekvenser fra det adeno-associerede virus af serotype 1 samt vektorer og værtsceller, der indeholder disse
US6387368B1 (en) * 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
JP4693244B2 (ja) * 1999-03-18 2011-06-01 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法
AU2409200A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Compositions and methods useful for production of recombinant viruses which require helper viruses
WO2001014539A2 (en) * 1999-08-20 2001-03-01 Johns Hopkins University School Of Medicine Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
EP1218035A2 (en) * 1999-09-29 2002-07-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rapid peg-modification of viral vectors
US6365394B1 (en) * 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
WO2001040455A2 (en) 1999-12-03 2001-06-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for increasing packaging and yields of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals
US6821512B1 (en) 1999-12-03 2004-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for increasing packaging and yield of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals
WO2001068888A2 (en) * 2000-03-14 2001-09-20 Neurologix, Inc. Production of chimeric capsid vectors
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
US6468524B1 (en) * 2000-03-22 2002-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services AAV4 vector and uses thereof
WO2001083692A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
CN1293204C (zh) * 2000-08-30 2007-01-03 戴诺生物技术有限公司 等位基因的测定方法
US7749492B2 (en) 2001-01-05 2010-07-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. AAV vectors and methods
US20020159978A1 (en) * 2001-02-06 2002-10-31 James Allen Muscle-directed gene transfer by use of recombinant AAV-1 and AAV-6 virions
SG168422A1 (en) 2001-11-13 2011-02-28 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
ES2526341T3 (es) 2001-12-17 2015-01-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Secuencias de serotipo 9 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen, y usos de las mismas
JP4810062B2 (ja) * 2001-12-17 2011-11-09 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）血清型８の配列
WO2003104392A2 (en) 2001-12-18 2003-12-18 University Of North Carolina At Chapel Hill Improved reagents and methods for producing parvoviruses
US20040002159A1 (en) * 2002-04-05 2004-01-01 Weidong Xiao Methods for the production of chimeric adeno-associated virus (AAV) vectors, compositions of chimeric AAV vectors, and methods of use thereof
EP1359217B1 (en) * 2002-04-29 2006-12-13 The Trustees of The University of Pennsylvania Method for direct rescue and amplification of integrated viruses from cellular DNA of tissues
PL2357189T3 (pl) 2003-06-19 2017-08-31 Genzyme Corporation Wiriony AAV o zmniejszonej immunoreaktywności i ich zastosowanie
EP3910063A1 (en) * 2003-09-30 2021-11-17 The Trustees of The University of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
WO2006039218A2 (en) 2004-09-30 2006-04-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Perfusion circuit and use therein in targeted delivery of macromolecules
EP3409296A1 (en) 2005-04-07 2018-12-05 The Trustees of the University of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
US7788045B2 (en) 2005-09-01 2010-08-31 Meditasks, Llc Systems and method for homeostatic blood states
JP5268890B2 (ja) 2006-04-28 2013-08-21 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖの規模適応性の製造方法
JP2009102988A (ja) 2007-10-19 2009-05-14 Toyota Motor Corp 内燃機関の燃料噴射装置
AU2009223115B2 (en) 2008-03-14 2015-09-24 Humanzyme, Inc. Recombinant production of authentic human proteins using human cell expression systems
US20090280103A1 (en) 2008-04-04 2009-11-12 Martin Flueck Regulation of muscle repair
US8729041B2 (en) 2008-12-03 2014-05-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating hepatic neoplasia
EP3540055A1 (en) 2010-04-23 2019-09-18 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
EP2731470B1 (de) 2011-07-15 2017-09-06 Alfred Kärcher GmbH & Co. KG Rotationsbürste und kehrmaschine mit einer rotationsbürste
US9434928B2 (en) 2011-11-23 2016-09-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
CN104520428B (zh) 2012-02-17 2018-09-21 费城儿童医院 将基因转移到细胞、器官和组织的aav载体组合物和方法
JP6385920B2 (ja) 2012-05-09 2018-09-05 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー アデノ随伴ウイルスプラスミド及びベクター
US9819463B2 (en) 2016-02-18 2017-11-14 Huawei Technologies Co., Ltd. Method and apparatus for transmitting data in a wireless communication system
US11827906B2 (en) 2017-02-28 2023-11-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clade f vector and uses therefor

Also Published As

Publication number Publication date
ATE317916T1 (de) 2006-03-15
US11034976B2 (en) 2021-06-15
CA3066428C (en) 2022-05-24
JP2013013414A (ja) 2013-01-24
BR122016004546B8 (pt) 2021-07-27
CA2945734A1 (en) 2003-05-22
SG168422A1 (en) 2011-02-28
CA2756866A1 (en) 2003-05-22
BR0214119A (pt) 2005-06-28
US20210285012A1 (en) 2021-09-16
IL227866A0 (en) 2013-09-30
IL258545B (en) 2019-11-28
CA3066428A1 (en) 2003-05-22
IL233391A (en) 2016-12-29
WO2003042397A3 (en) 2004-02-05
PH12016502583A1 (en) 2017-10-18
US10041090B2 (en) 2018-08-07
BR122016004546B1 (pt) 2016-11-29
CN103555678B (zh) 2018-02-09
IL221602A0 (en) 2012-10-31
JP3958191B2 (ja) 2007-08-15
US11499167B2 (en) 2022-11-15
US20190024117A1 (en) 2019-01-24
ES2258601T3 (es) 2006-09-01
IL234063A (en) 2017-06-29
CN103555676B (zh) 2016-08-31
SG10202108118RA (en) 2021-08-30
NZ600121A (en) 2013-12-20
NO336801B1 (no) 2015-11-02
NO336468B1 (no) 2015-08-31
US20160097040A1 (en) 2016-04-07
PH12014501487B1 (en) 2015-12-07
US20170240921A1 (en) 2017-08-24
US10544432B2 (en) 2020-01-28
MXPA04004600A (es) 2004-08-13
EP1310571A3 (en) 2003-08-13
US11041171B2 (en) 2021-06-22
HK1068925A1 (en) 2005-05-06
NZ532635A (en) 2007-05-31
HU229379B1 (en) 2013-11-28
JP2005525086A (ja) 2005-08-25
CN103555676A (zh) 2014-02-05
US20110263027A1 (en) 2011-10-27
IL270065B1 (en) 2023-06-01
JP2016136953A (ja) 2016-08-04
JP6212142B2 (ja) 2017-10-11
IL213810A0 (en) 2011-07-31
HUP0600229A2 (en) 2006-06-28
US10308958B2 (en) 2019-06-04
CA3159060A1 (en) 2003-05-22
DK1310571T3 (da) 2006-06-19
CN103555678A (zh) 2014-02-05
US20130045186A1 (en) 2013-02-21
MX359371B (es) 2018-09-25
PL397823A1 (pl) 2012-07-16
CN102181480A (zh) 2011-09-14
CA2465868C (en) 2017-02-28
NZ618298A (en) 2015-04-24
JP5669795B2 (ja) 2015-02-18
US20200087684A1 (en) 2020-03-19
CA2864537A1 (en) 2003-05-22
IL213810A (en) 2014-08-31
BR122016004944B1 (pt) 2016-11-22
EP1456419B1 (en) 2011-08-17
IL161827A (en) 2009-11-18
CA2915124A1 (en) 2003-05-22
AU2002361573B2 (en) 2008-06-12
NZ548094A (en) 2008-07-31
US20170298388A1 (en) 2017-10-19
CA2915124C (en) 2018-08-14
ZA200403360B (en) 2005-04-26
KR101014207B1 (ko) 2011-02-14
CN103555677A (zh) 2014-02-05
NO338362B1 (no) 2016-08-15
CA3159060C (en) 2023-05-16
NO334379B1 (no) 2014-02-24
CN103589692B (zh) 2018-07-24
CN105671005A (zh) 2016-06-15
US10508286B2 (en) 2019-12-17
DE60209193D1 (de) 2006-04-20
NZ591012A (en) 2012-06-29
PH12014501487A1 (en) 2015-12-07
IL248724B (en) 2018-04-30
KR20050058234A (ko) 2005-06-16
EP2338900A1 (en) 2011-06-29
BRPI0214119B8 (pt) 2021-05-25
US20220213501A1 (en) 2022-07-07
CA2406745C (en) 2006-01-10
IL270065A (pl) 2019-12-31
IL233391A0 (en) 2014-08-31
US20200080109A1 (en) 2020-03-12
SG10201506627PA (en) 2015-10-29
IL258545A (en) 2018-06-28
EP2341068A1 (en) 2011-07-06
NO20042183L (no) 2004-07-14
HU230406B1 (hu) 2016-04-28
CA2406745A1 (en) 2003-05-13
CA2945734C (en) 2020-02-25
NO20150196L (no) 2004-07-14
US20220025401A1 (en) 2022-01-27
SG157224A1 (en) 2009-12-29
US11034977B2 (en) 2021-06-15
MX346493B (es) 2017-03-21
IL161827A0 (en) 2005-11-20
JP2003235562A (ja) 2003-08-26
US9790472B2 (en) 2017-10-17
EP1456419A4 (en) 2005-11-09
EP2341068B1 (en) 2013-09-25
BR122016004944B8 (pt) 2021-07-27
IL221602A (en) 2015-09-24
CN102181480B (zh) 2016-01-27
EP1456419A2 (en) 2004-09-15
JP5969547B2 (ja) 2016-08-17
CN103589692A (zh) 2014-02-19
ATE520707T1 (de) 2011-09-15
PL217623B1 (pl) 2014-08-29
IL227866A (en) 2015-11-30
EP2338900B1 (en) 2014-01-01
KR20100029134A (ko) 2010-03-15
IL248724A0 (en) 2017-01-31
US20030138772A1 (en) 2003-07-24
DE60209193T2 (de) 2006-09-28
JP5140627B2 (ja) 2013-02-06
PL222683B1 (pl) 2016-08-31
PL221877B1 (pl) 2016-06-30
NO20131359L (no) 2004-07-14
NZ578982A (en) 2011-03-31
US8906675B2 (en) 2014-12-09
ES2439515T3 (es) 2014-01-23
US20180030479A1 (en) 2018-02-01
PL373864A1 (pl) 2005-09-19
PL404537A1 (pl) 2014-02-17
PL409838A1 (pl) 2015-07-20
IL193525A0 (en) 2009-02-11
US11377669B2 (en) 2022-07-05
NO20140988L (no) 2004-07-14
US8524446B2 (en) 2013-09-03
JP2009195237A (ja) 2009-09-03
WO2003042397A2 (en) 2003-05-22
US10526617B2 (en) 2020-01-07
HUP0600229A3 (en) 2010-01-28
KR101015854B1 (ko) 2011-02-23
JP4677187B2 (ja) 2011-04-27
HK1056198A1 (en) 2004-02-06
EP1310571A2 (en) 2003-05-14
CA2864537C (en) 2016-11-29
IL193525A (en) 2014-08-31
US20110151434A1 (en) 2011-06-23
US20200131534A1 (en) 2020-04-30
SG10201912509RA (en) 2020-02-27
JP2014239680A (ja) 2014-12-25
IL234063A0 (en) 2014-09-30
EP1310571B1 (en) 2006-02-15
IL270065B2 (en) 2023-10-01
NZ564506A (en) 2009-09-25
CA2756866C (en) 2017-06-06
CN105671005B (zh) 2020-09-15
CA2465868A1 (en) 2003-05-22
ES2455126T3 (es) 2014-04-14
CN103555677B (zh) 2018-01-30
BRPI0214119B1 (pt) 2016-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11377669B2 (en) Method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby
AU2002361573A1 (en) A method of detecting and/or identifying ADENO-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby
AU2013202568B2 (en) Adeno-associated virus rh.8 (AAVrh.8) sequences and recombinant AAVs comprising same
AU2011250837B2 (en) A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby
AU2008202344B2 (en) A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby
HK1068925B (en) A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby