KR20230093072A - 안구 장애에 대한 유전자 치료 - Google Patents

안구 장애에 대한 유전자 치료 Download PDF

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지네트 베니셀리
준웨이 순
지-윤 송
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Abstract

대상에서 레베르 선천성 흑암시 (LCA)를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 한 측면에서, 레베르실린을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터가 제공된다. 다른 측면에서, 레베르실린은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가진다. 또 다른 측면에서, 핵산 분자는 서열번호: 3 또는 이의 변이체의 서열을 가진다. 바람직한 양태에서, 대상은 인간, 고양이, 개, 양, 또는 인간이 아닌 영장류이다.

Description

안구 장애에 대한 유전자 치료{GENE THERAPY FOR OCULAR DISORDERS}
연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 안과 연구소(National Eye Institute, NEI) / 국립보건원(National Institutes of Health, NIH)에 의해 수여된 허가번호 제 R21EY020662호 및 제 P30EY001583호 하에서 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
전자 형태로 제출된 자료의 참조로의 포함
본 출원인은 본 명세서에 전자 형태로 파일에 보관된 서열 목록 자료를 참조로 포함한다. 이 파일은 "UPN-16-7696PCT_Seq_Listing_ST25.txt"로 표시되어 있다.
가장 심각한 군의 유전적 시력 상실 질환(disease) 중 하나는 레베르 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis, LCA; OMIM 204000)이다. LCA는 50,000명 중 1명에서 발생하는 희귀한, 상염색체 열성 방식으로 일반적으로 유전되며, 임의의 적어도 22개의 상이한 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다 (sph.uth.edu/RetNet/sum-dis.htm). 임상적 특성은 유아기 또는 유년기의 심각하게 비정상적 시력 (시력(visual acuity), 감소된 시야), 안진(nystagmus), 및 생애 초기에 존재하는 열악한 시력의 점진적 상실을 포함한다. 임상 시험은 소실된 암소시(scotopic) 및 명소시(photopic) 망막전위 (ERG) 반응, 흑암시 동공(amaurotic pupils), 감소된 광 민감도, 및 망막의 색소 변화를 밝혀냈다. 현재 LCA에 대해 승인된 치료는 없다.
망막 색소 상피 65 kDa 단백질-암호화 유전자, RPE65의 돌연변이에 의해 유발된 LCA의 형태(Redmond TM, Yu S, Lee E, Bok D, Hamasaki D, Chen N, et al. Rpe65 is necessary for production of 11-cis-vitamin A in the retinal visual cycle. Nat Genet (1998) 20(4):344-51; Redmond T, Hamel C. Genetic analysis of RPE65: from human disease to mouse model. Methods in Enzymol (2000) 317:705-24, 이들 모두 본원에 참조로 포함됨)는 다중 유전자 증강 요법 임상 시험의 표적이 되어왔기 때문에 최근에 많은 관심을 받고 있다. 아데노 관련 바이러스 (AAV) 혈청형 2를 사용하여, 여러 그룹이 RPE65 cDNA의 야생형 카피의 망막 색소 상피 (RPE)로의 전달이 안전하고, 야맹증(nyctalopia)을 포함하는 다수의 결손을 역전시킬 수 있음을 나타냈다.(3-9) AAV2-hRPE65v2 (또는 보레티젠 네파보벡(voretigene neparvovec), Spark Therapeutics, Philadelphia, PA가 후원함)를 시험한 무작위, 다중 센터 3상 연구는 이 시약의 망막하 주사가 광 민감도, 시야에서의 개선 및 심지어 다양한 휘도 조건에서 시각적 신호를 사용하여 정확하고 빠르게 방향을 찾는 능력을 유도함을 나타낸다.(10, 11) 미국 식품 의약국 (FDA)은 2017년 12월 19일에 보레티젠 네파보벡-르질에 대한 약물 승인을 하였고, 이를 미국에서 최초로 승인된 유전자 치료 약물 중 하나로 만들었다. RPE65 돌연변이, LCA2에 의해 유발된 LCA의 치료법 개발의 진행은 이들 대부분이 단지 RPE-특이적 유전자가 아니라, 광수용체-특이적 유전자의 돌연변이에 의해 유발된 다른 형태의 조기 발병 망막 변성을 위한 치료법 개발의 길을 열었다.
이미 심각한 병태(condition)의 가장 심각한 형태의 중 하나 (LCA)는 레베르실린을 암호화하는 광수용체-특이적 유전자, LCA5의 돌연변이에 의해 유발된다 (12-20). LCA5 돌연변이는 유전적으로 단리된 집단에서 더욱 만연할 수 있음에도 불구하고, LCA 사례의 2% 이하를 차지하는 것으로 추정된다.(16) LCA5 돌연변이는 또한 추체이영양증(cone dystrophy) 및 상염색체 열성 색소성 망막염 (autosomal recessive retinitis pigmentosa, ARRP)을 포함하는 망막 변성의 다른 조기 발병 형태의 원인으로 확인되었다.(15, 16, 21)
따라서, 필요로 하는 대상에서 레베르실린을 발현시키기에 유용한 조성물이 필요하다.
본원에서 기술된 양태는 이를 필요로 하는 대상에 인간 LCA5를 전달한 다음, 장기, 아마도 10년 또는 이상의, 레베르 선천성 흑암시 (LCA)의 임상적으로 의미있는 교정을 유발하는 벡터의 유리체내(intravitreal) 또는 망막하 투여를 위한 AAV 유전자 요법 벡터와 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 인간 레베르실린을 암호화하는 코돈 최적화된, 조작된 핵산 서열이 제공된다. 한 양태에서, 코돈 최적화된 핵산 서열은 서열번호: 3 또는 서열번호: 2의 변이체이다. 다른 양태에서, 코돈 최적화된 핵산 서열은 서열번호: 3이다. 다른 양태에서, 핵산 서열은 인간에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
다른 측면에서, 레베르실린을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트가 제공된다. 한 양태에서, 발현 카세트는 인간 레베르실린을 암호화하는 서열번호: 3의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 레베르실린 암호화 서열은 5' 내지 3' AAV ITR 서열 사이에 위치된다.
또 다른 측면에서, 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV) 벡터가 제공된다. rAAV는 AAV 캡시드, 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 손상시킨다. 한 양태에서, 벡터 게놈은 하기를 포함한다: (a) AAV 5' 역 말단 반복 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 레베르실린을 암호화하는 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR. 한 양태에서, rAAV 벡터는 숙주 세포에서 레베르실린의 발현을 지시하는 발현 제어 서열을 추가로 포함한다. 추가의 양태에서, 레베르실린 서열은 서열번호: 1의 단백질 서열이다. 한 양태에서, 벡터 게놈은 서열번호: 8의 nt 1-4379의 서열이다. 다른 양태에서, 벡터 게놈은 서열번호: 9의 nt 1-4368의 서열이다. 또 다른 양태에서, 식별된 벡터 게놈 중 어느 하나의 LCA5 코딩 서열은 본원에서 기술된 바와 같은 다른 LCA5 코딩 서열로 교체된다.
다른 측면에서, LCA 환자에 투여하기에 적합한 수성 현탁액이 제공된다. 한 양태에서, 현탁액은 LCA의 치료제로서 유용한 본원에서 기술된 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)의 눈 당 수성 현탁 액체 및 약 1 x1O10 GC 또는 바이러스 입자 내지 약 1 x1O13 GC 또는 바이러스 입자를 포함한다.
다른 측면에서, 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 및/또는 보조제 및 핵산 서열, 플라스미드, 벡터, 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 본원에서 구체적으로 기술된 rAAV를 포함한다.
다른 측면에서, 레베르실린 유전자 (LCA5)의 결합 및/또는 LCA를 가지는 포유류 대상에서 시각 기능 회복에 의해 유발된 레베르 선천성 흑암시를 치료하는 방법은 본원에서 기술된 바와 같은 레베르실린을 암호화하는, 재조합 AAV 벡터를 이를 필요로 하는 대상에 대해 유리체내, 망막하 또는 혈관 내 주사를 통해 전달하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본원에서 기술된 바와 같은 AAV 벡터의 사용은 레베르실린 유전자 (LCA5)의 결함 및/또는 LCA를 가지는 포유류 대상에서 시각 기능 회복에 의해 유발된 레베르 선천성 흑암시 치료에 제공된다. 용도는 본원에서 기술된 바와 같은 레베르실린을 암호화하는 재조합 AAV 벡터를 이를 필요로 하는 대상에 대해 유리체내, 망막하 또는 혈관 내 주사를 통해 전달하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 측면 및 이점은 본 발명의 하기 상세한 설명으로부터 용이하게 명백해질 것이다.
도 1a는 본원에서 기술된 바와 같은 AAV7m8.CBA.hopt.LCA5 및 AAV7m8.CBA.EGFP를 생성하는데 사용된 이식유전자 카세트를 나타낸다.
도 1b 내지 1d는 서열번호: 2의 LCA5 (천연_LCA5)의 인간 핵산 서열 및 서열번호: 3의 코돈 최적화된 LCA5 (코돈 최적화된_LCA5) 서열의 정렬을 제공한다.
도 1e 내지 1f는 플라스미드 맵 및 pAAV.CMV.CBA.인간 코돈 최적화된 레베르실린 벡터의 특성 목록을 제공한다. 핵산 서열은 서열번호: 8에서 복제된다.
도 1g 내지 1h는 P5에 AAV7m8-hopt- LCA5를 주입하고 P15에 분석한 눈의 면역형광 분석을 제공하고 실시예 1, 2 및 4에서 기술된 바와 같은 튜불린 양성 외부 세그먼트의 기반과 함께 레베르실린이 공동 국소화됨을 나타낸다. 유리체내 주사 (IVT, 도 1g) 또는 망막하 주사 (SR, 도 11) 후, 레베르실린은 망막 전체에 분포되었고, P95에 광수용체가 거의 없었다. 대조적으로, 레베르실린은 처리되지 않은 P15 및 P95 Lca5-/- 망막에는 존재하지 않는다. SR, 망막하; IVT, 유리체내; (-) 처리되지 않은 Lca5-/-. 유리체내 주사 도식 (도 1g) 및 망막하 주사 도식 (도 1h)을 나타내는 그림이 제공된다.
도 1i는 P20에 AAV.LCA5 벡터를 망막하로 주입한 야생형 마우스 및 Lca5-/- 마우스 모두에서 레베르실린의 발현을 나타낸다.
도 2a 내지 2i는 PN5 및 PN15에 처리된 Lca5-/- 마우스의 대조군 (샴(sham)-주입) 눈과 비교하여 3 개월 령의 AAV7m8.hopt-LCA5-주입된 마우스에서 측정된 정규화된 동공 반사 진폭을 나타낸다. (A) 유리체내 및 (B) 망막하 주사 또는 (C) 처리되지 않은 (-) 대조군 마우스에서 결과를 나타낸다.(D) (A-C) 및 야생형 (C57B16) 양성 (+) 대조군 마우스에서 나타낸 각각의 하위 군에서 동물의 오른쪽 눈의 상대 동공 반사 진폭 (기준 동공 직경의 %)을 그래프로 나타낸다 (E). 도 2f 및 2g는 도 2a 내지 2d에서 나타낸 결과를 생성하는데 사용된 시험 도식의 표현이다. 도 2h 및 2i는 망막하 (SR, I) 또는 유리체내 (IV, H) 주사를 통해 PN5 대 PN15에 처리된, 도 2a 내지 2d에서 나타낸, 실험 및 대조군 마우스에서 정규화된 동공 반사 진폭의 비교를 나타낸다. *. p<0.1; ** p<0.05; ***p<0.01.
도 3a 내지 3f는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 PN5 및 PN15에 처리되고 3 개월 령에 측정된 Lca5-/- 마우스의 AAV7m8.hopt-LCA5-주입 대 대조군 (샴-주입) 눈에 대한 수중 미로 시험의 결과를 나타낸다. 도 3a는 통계적 분석 결과를 나타내는 표이다. 도 3b는 수중 미로 시험의 대표적인 결과의 도시이다. 도 3d는 PN5 또는 PN15에 유리체내로 또는 망막하로 AAV7m8.LCA5 벡터로 출생시 처리된 Lca5-/- 마우스의 훈련에서 첫 번째 성공까지의 일수를 나타내는 막대 그래프이다. 야생형 마우스가 대조군으로서 제공되었다. 도 3d는 PN5에 유리체내로 AAV7m8.LCA5 벡터로 출생시 처리된 Lca5-/- 마우스의 다양한 광 강도 (x축) 하에서 성공율의 선 그래프이다. 도 3e는 PN5에 망막하로 AAV7m8.LCA5 벡터로 출생시 처리된 Lca5-/- 마우스의 다양한 광 강도 (x축) 하에서 성공율의 선 그래프이다. 도 3f는 PN15에 유리체내로 AAV7m8.LCA5 벡터로 출생시 처리된 Lca5-/- 마우스의 다양한 광 강도 (x축) 하에서 성공율의 선 그래프이다.
도 4는 생후 (postnatal day, PN) 5일에 Lca5gt/gt 망막에 AAV7m8.hopt-LCA5 전달 후 대표적인 조직학의 결과를 제공하는 그래프이다. 그래프는 AAV.LCA5 대 샴-주입에 의한 IVT 또는 SR 처리 후 외부 핵 층 (outer nuclear layer, ONL)의 열 수를 나타낸다.
도 5a는 3개월 시점까지 처리된 (하지만 대조군은 처리되지 않음) 광수용체에서 로돕신 (적색)이 지속됨을 나타내는 면역형광의 결과를 제공한다. 간헐적 광수용체 세포가 eGFP-양성 (AAV7m8.eGFP와의 공동 주사를 통해 식별된 주사 부위)이다.
도 5b 내지 5d는 야생형 (WT) 망막의 것과 유사한 Lca5gt/gt AAV7m8.hopt-LCA5-처리된 간상체 및 추상체로부터의 다중 전극 어레이 (Multi-electrode array, MEA) 반응을 제공한다. (B) 반응 진폭 (섬광 온셋 전후 발화율 차이) 대 매 섬광 평균 추적로부터 측정된 섬광 강도 데이터 (나타내지 않음). 처리된 망막의 반응은 WT 망막의 반응의 70% 만큼 높이이며; 처리되지 않은 망막의 무효화된 반응은 최소이다. (C) 1차 및 2차 강도 시리즈 런에 대한 패널 A의 망막으로부터의 반응 진폭 (1차 런의 종료시 가장 밝은 노출 이전/동안 및 이후, 각각의 강도 시리즈 런 동안 자극 시리즈 강도는 암소시 값에서 가장 밝은 명소시 값까지 ~0.5 로그 단위로 증가하였음) (D) 1차 및 2차 강도 시리즈 런에 대한 섬광 강도의 함수로서 일시적 온- (섬광 온셋 전후 발화율 차이), 지속된 온- (섬광 온셋 전 및 오프셋 차이) 및 오프-반응 (섬광 오프셋 전후 차이)의 진폭. 하늘색 음영 영역은 WT 반응 (4개의 망막, MEAN±STD)의 범위를 나타내고, 선 단독 추적은 평균 WT 반응 진폭을 제공한다. 수평 화살표는 1차 강도 시리즈 런의 종료시 가장 밝은 섬광에 대한 노출에 의해 유발되는 민감도의 오른쪽 이동을 보여준다. 처리된 Lca5gt/gt 및 WT 망막은 표백 전후 유사한 반응/강도 의존성을 나타내는 반면, 처리되지 않은 Lca5gt/gt 망막 반응은 평평해진다. 선에 의해 연결된 원은 처리된 LCA5gt/gt를 나타낸다. 선에 의해 연결된 삼각형은 대조군 LCA5gt/gt를 나타낸다.
도 6a 내지 6e는 (A) TUNEL 검정 (도 6a; 도 6b 내지 6e, 제3 열) 및 (B) 로돕신 면역형광 분석 (도 6b 내지 6e, 1열, 3열 및 4열)에 의해 입증된 바와 같은 처리되지 않은 Lca5-/- 망막 (및 AAV.hopt.LCA5로 처리한 후 이러한 변성의 지연)에서의 생애 초기 광수용체 변성 동안 대량 세포 사멸이 있음을 보여준다.
도 7a 내지 7d는 외부 세그먼트가 AAV7m8.hopt.LCA5-처리된 Lca5-/- 망막에 존재하지만, 대조군 Lca5-/- 망막에 존재하지 않음을 보여준다. AAV7m8.hopt.LCA5로 주입된 망막의 주사 전자 현미경 평가는 3 개월 령 Lca5-/-에서 적층 디스크 및 연결 섬모를 가지는 간상체 및 추상체 광수용체 외부 세그먼트 모두를 드러낸다. 이러한 구조는 처리되지 않은 Lca5-/- 망막에는 존재하지 않았다. (A, B) PN5에 AAV7m8p643 (코돈 최적화된 레베르실린)로 유리체내 주사 후 PN80, 대표도; (A1-A3): 12K 해상도, 광수용체 세포, 간상체 세포 (화살표 머리), 추상체 세포 (화살표), 광수용체 세포의 다수의 미토콘드리아 (별표)의 열을 보여주는 합쳐진 그림; (B), 20K 해상도; (B1) 미세소관의 9+0 구조를 보여주는 섬모의 단면, 간상체 세포로부터의 OS의 막성 디스크 (화살표); (C) 30K 해상도, 기저 소체 (화살표 머리); (C1) 연결 섬모의 시상 단면(sagital section); (D) 12K 해상도, ONL에 광수용체 세포가 남아있지 않음; (D1) 죽어가는 세포의 농축핵 (pyknotic nuclei) (화살표 머리); (D2) 조면 ER을 포함하는 죽은 세포 소기관의 부유 잔해 (화살표).
도 8은 연령 비교 가능한 정상 시력 남성 (청색 흔적- 하단 선)의 것과 유사한 시간적 특징을 가지는 LCA5 (적색 흔적 - 상단 선)를 가진 성인 남성의 한 망막의 동공 광 반응의 결과를 나타낸다. 수축의 진폭은 정상 개인과 비교하여 LCA5 환자에서 감소되었다.
도 9는 외부 핵 층 (ONL) 두께는 대조군 망막과 비교하여 처리군 (*)에서 적어도 3개월에 걸쳐 더 두껍게 유지됨을 보여주는 다양한 망막 층의 두께의 표이다. 다른 망막 층 (외부 플렉시폼 층, OPL; 내부 핵층, INL, 내부 플렉시폼 층,IPL)에서는 이러한 명확한 경향이 없었다. 각각의 시점에 대해, 왼쪽에서 오른쪽으로의 막대는 각각, ONL, OPL, INL 및 IPL의 두께를 나타낸다.
도 10은 AAV7m8.hopt.LCA5로의 주사 후 광변환- 특이적 분자의 위치에서의 광 매개 변화의 결과를 제공한다.
도 11a 내지 11b는 pAAV.CMV.CBA.인간 천연 레베르실린 벡터의 플라스미드 맵 및 특성 목록을 제공한다. 핵산 서열은 서열번호: 9로 복제된다.
도 12a 내지 12f는 AAV7m8.hopt-LCA5로의 처리 후 동형 인간 LCA5 p.(Q279*) iPSC-RPE에서 구한 섬모 표현형을 입증한다. (A) 공초점 이미지는 면역형광적으로 검출 가능한 RPE 마커; ZO-1 및 MITF와 함께 성숙한 RPE 세포의 육각형 형태를 보여준다. 위상차 (PC) 이미지는 정상 시력 사람 및 LCA5 환자 모두로부터 유래된 RPE의 iPSC-RPE 배양 구조를 보여준다; (B) 정상 시력 대조군 RPE 및 LCA5 환자-유래 RPE에서의 LCA5 mRNA 발현의 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR). GAPDH가 발현 수준을 정상화하기 위해 사용된다. (C) 웨스턴 블랏 분석은 AAV7m8.eGFP로 처리되지 않거나("-") 처리된("G") 정상 시력 대조군 세포에서 내인성(*) 레베르실린 단백질을 보여준다. 처리되지 않거나 AAV7m8.GFP-처리된 LCA5-영향을 받은 세포에서 내인성 레베르실린은 없다. AAV7m8.LCA5 ("L")로 정상 시력 및 LCA5 개인 모두로부터의 세포의 감염 후 탄탄한 수준의 레베르실린이 존재한다. 면역형광 분석은 정상 시력 (D) 및 LCA5-유래 (E) iPSC-RPE에서의 Arll3b-양성 1차 섬모의 존재를 보여준다. 레베르실린은 정상 시력 대조군 및 AAV7m8.LCA5-처리된 (그러나 AAV7m8.eGFP-처리되지 않은) LCA5-영향을 받은 세포에 존재한다. (F) 정상 시력- 대 LCA5-iPSC-RPE에서 세포 당 섬모 수의 정량적 분석은 AAV7m8.LCA5 (그러나 AAV7m8.eGFP는 아님)로 LCA5-iPSC-RPE 세포의 처리 후 섬모 형성의 구조 효과를 나타낸다.
본원에서 기술된 방법 및 조성물은 레베르 선천성 흑암시 (LCA)의 치료를 위해 이를 필요로 하는 대상에 대해 레베르실린 단백질을 암호화하는 LCA5 핵산 서열을 전달하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 한 양태에서, 이러한 조성물은 레베르실린 코딩 서열의 코돈 최적화를 포함한다. 더 낮은 용량의 시약이 사용될 수 있기 때문에, 제품의 효능을 증가시키고, 따라서, 안전성을 증가시키는 것이 바람직하다. 서열번호: 2에 나타낸 바와 같은, 천연 레베르실린 코딩 서열을 포함하는 조성물이 또한 본원에 포함된다.
본원에서 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자 및 공개된 문서에 의한 참조에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고, 이는 당업자에게 본 출원에서 사용된 다수의 용어에 대한 일반적인 안내를 제공한다. 본 명세서 포함된 정의는 본원의 구성 요소 및 조성물을 기술하는데 명확성을 위한 것이며, 청구된 발명을 제한하려고 의도하지 않는다.
"레베르실린"은 염색체 6ql4 상의 LCA5 유전자에 의해 암호화되고, 광수용체의 연결 섬모 및 배양된 포유류 세포의 미세소관, 중심소 및 1차 섬모에 국한되는 섬모 단백질이다.
레베르실린은 발달 전반에 걸쳐 광범위하게 발현되며, 배양된 세포의 섬모뿐만 아니라 성숙한 광수용체 세포의 연결 섬모에서 발견된다. 연결 섬모는 세포의 생합성 기구에 머무는 광수용체 내부 세그먼트와 옵신-주도 시각 캐스케이드를 함유하는 외부 세그먼트 사이의 좁은 구조이다. 연결 섬모는 도관으로 기능하고, 편모내 운반 (intraflagellar transport, IFT)으로 알려진 과정에서 섬모 미세소관 트랙을 따라 단백질 및 소포의 양방향 수송을 지원한다. 유전자 조작된 Lca5 마우스 모델에 정량적 친화도 단백질체학을 적용함으로써, Boldt 등은 Lca5 기능 상실이 IFT를 교란시킴으로써, 광수용체 외부 세그먼트 발달의 결함을 초래하고 어레스틴 및 옵신 수송을 실패시킴을 입증하였다. Lca5 부재 (Lca5gt/gt) 마우스는 추상체 및 간상체 ERG 반응이 결여되고 19년 2개월 경 외부 핵층 (ONL)에 존재하는 분산된 핵의 단 하나의 열(야생형 마우스의 망막 내 인접한 세포의 8 내지 10개의 열과 비교하여)을 가지는 초기 및 점진적 망막 변성을 겪는다.
LCA5의 돌연변이는 레베르 선천성 흑암시 (LCA)라 불리는 유전된 형태의 망막 변성을 유발한다. 영향을 받은 개인의 표현형은 눈에 한정적이고 실명을 초래한다. den Hollander에 의해 연구된 6 가족에서, 다섯은 동형 넌센스 및 프레임시프트 돌연변이가 있었고 한 가족에서 LCA5 전사체가 완전히 존재하지 않았다. 레베르실린 cDNA 또는 이의 코돈 최적화된 버전을 암호화하는 핵산은 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터에 적합하도록 적절한 크기이다. 예를 들어, 도 1a 및 1e 내지 1f 및 도 11a 내지 11b의 서열을 참조한다. 하기 실시예에서 기술된 바와 같이, rAAV-매개 유전자 증강 전략을 사용하여, LCA5 돌연변이로 인한 망막 변성이 교정될 수 있음을 보여준다. 이러한 요법은 유전자의 야생형 또는 최적화된 카피가 생애 초기, 예를 들어, 소아기 또는 초기 출생 후 시기에 전달되는 경우 특히 유리하다. 추가로, 한 양태에서 사용된 이러한 유리체내 또는 망막하 투여는 유전자를 표적 세포 (예를 들어, 광수용체)에 효과적으로 제공한다.
레베르실린 유전자, LCA5는 중심체 또는 섬모 기능 및 음(minus) 말단 지향 미세소관 수송에 관여하는 것으로 생각되는 697개 아미노산 단백질, 레베르실린을 암호화한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "LCA5" 및 "레베르실린"은 코딩 서열을 언급하는 경우, 상호 교환적으로 사용된다. 인간 레베르실린을 암호화하는 천연 핵산 서열은 여기서 NCBI 참조 서열 NM_181714.3 (전사체 변이체 1), NM_001122769.2 (전사체 변이체 2), XM_011535504.1 (전사체 변이체 X1) 및 XM_005248665.4 (전사체 변이체 X2)에 보고되어 있고, 각각 서열번호: 4, 5, 6 및 7에서 복제된다. 레베르실린 의 천연 인간 아미노산 서열은 여기서 서열번호: 1 (NCBI 참조 서열: NP_001116241.1 또는 NP_859065.2, 뿐만 아니라 UniProtKB/Swiss-Prot ID: Q86VQ0-1)에서 복제된다. LCA5 유전자의 돌연변이는 레베르 선천성 흑암시 (LCA)와 관련이 있다. 특정 양태에서, 용어 "LCA5" 및 "레베르실린"은 상호 교환적으로 사용된다.
레베르 선천성 흑암시 (LCA)는 빛 및 색상을 감지하는 눈의 뒤쪽의 특화된 조직인, 망막에 주로 영향을 주는 눈 장애(disorder)이다. 이러한 장애를 가진 사람은 전형적으로 유아기부터 심각한 시각 장애를 가진다. 시각 장애는 시간이 지남에 따라 매우 느리게 악화될 수 있지만, 안정된 경향이 있다. 레베르 선천성 흑암시는 또한, 빛에 대한 증가된 민감도 (광선공포증), 눈의 비자발적인 운동 (안진), 및 극도의 원거리시력 (원시)을 포함하는 다른 시력 문제와 관련이 있다. 일반적으로 눈에 들어오는 빛의 양에 반응하여 팽창하고 수축하는, 동공이 정상적으로 빛에 반응하지 않는다. 대신에, 이들은 정상보다 더욱 느리게 팽창하고 수축하거나, 빛에 전혀 반응하지 않는다. 게다가, 눈의 투명한 전면 덮개 (각막)이 원추형이고 비정상적으로 얇은, 원추각막(keratoconus)으로 알려진 상태일 수 있다. 프란체스쉐티(Franceschetti's) 눈- 손가락 징후로 불리는 특정 행동은 레베르 선천성 흑암시의 특징이다. 이러한 징후는 손관절 또는 손가락으로 눈을 찌르고, 누르고, 문지르는 것으로 구성된다. 연구자는 이러한 행동이 영향받은 어린이에서 움푹 들어간 눈 및 원추각막에 기여할 수 있다고 의문을 가진다. 드문 경우에, 레베르 선천성 흑암시의 특성이 있는 사람에서 지연 발달 및 지적 장애가 보고되었다. 하지만, 연구자는 이들 개인이 실제로 레베르 선천성 흑암시인지 유사한 징후 및 증상이 있는 또 다른 증후군인지 확신하지 않는다. 적어도 13가지 유형의 레베르 선천성 흑암시가 기술되어 있다. 유형은 유전적 원인, 시력 상실 패턴, 및 관련 눈 이상으로 구별된다.
핵산 서열의 맥락에서 용어 "백분율 (%) 동일성", "서열 동일성", "백분율 서열 동일성" 또는 "백분율 동일"은 대응을 위해 정렬되는 경우 동일한 2개의 서열의 잔기를 지칭한다. 게놈의 전체 길이, 유전자 코딩 서열의 전체 길이, 또는 적어도 약 500개 내지 5000개 뉴클레오티드의 단편에 걸칠 수 있는 서열 동일성 비교의 길이가 바람직하다. 하지만, 더 작은 단편 중의 동일성, 예를 들어 적어도 약 9개 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 약 20개 내지 24개 뉴클레오티드, 적어도 약 28개 내지 32개 뉴클레오티드, 적어도 약 36개 이상 뉴클레오티드가 또한 바람직할 수 있다.
백분율 동일성은 단백질, 폴리펩티드, 약 32개 아미노산, 약 330개 아미노산, 또는 이의 펩티드 단편 또는 상응하는 핵산 서열 코딩 서열의 전체 길이에 걸친 아미노산 서열에 대해 용이하게 측정될 수 있다. 적합한 아미노산 단편은 적어도 약 8개 아미노산 길이일 수 있고, 약 700개 이하의 아미노산일 수 있다. 일반적으로, 2개의 상이한 서열 간에 "동일성", "상동성" 또는 "유사성"을 지칭하는 경우, "동일성" "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열을 참조하여 측정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은 종종 참조 서열과 비교하여 누락된 또는 추가의 염기 또는 아미노산에 대한 교정을 함유하는 다중 핵산 서열 또는 단백질 (아미노산) 서열을 지칭한다.
동일성은 당업계에 공지된 또는 상업적으로 이용 가능한 다양한 알고리즘 및/또는 컴퓨터 프로그램 [예를 들어, 니들맨-원슈(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘을 사용한 예를 들어, BLAST, ExPASy; ClustalO; FASTA]의 사용을 통해 서열의 정렬을 준비함으로써 측정될 수 있다. 정렬은 임의의 다양한 공개적으로 또는 상업적으로 이용 가능한 다중 서열 정렬 프로그램을 사용하여 수행된다. 서열 정렬 프로그램 예를 들어, "Clustal Omega","Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME", 및 "Match-Box", 프로그램이 아미노산 서열에 대해 이용 가능하다. 당업자는 필요에 따라 이들 설정을 변경할 수 있지만, 일반적으로, 임의의 이들 프로그램이 디폴트 설정에서 사용된다. 대안적으로, 당업자는 적어도 참조된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공되는 것과 같은 동일성 또는 정렬의 수준을 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 활용할 수 있다. 예를 들어, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999)를 참조.
다중 서열 정렬 프로그램이 또한 핵산 서열에 대해 이용 가능하다. 이러한 프로그램의 예시는 인터넷상에서 웹 서버를 통해 접근 가능한 "Clustal Omega","Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP", 및 "MEME"를 포함한다. 이러한 프로그램에 대한 다른 공급원은 당업자에게 공지되어 있다. 대안적으로, 벡터 NTI 유틸리티가 또한 사용된다. 상기 기술된 프로그램에 포함된 것을 포함하는 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 다수의 알고리즘이 또한 당업계에 공지되어 있다. 또 다른 예시로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 GCG 버전 6.1 Fasta™ 프로그램을 사용하여 비교될 수 있다. Fasta™은 쿼리와 검색 서열 사이의 최상의 겹친 부위의 정렬 및 백분율 서열 동일성을 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열 사이의 백분율 서열 동일성은 본원에 참조로 포함된 GCG 버전 6.1에 제공된 것과 같은 그의 디폴트 매개변수(워드 크기 6 및 스코어링 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)를 가지는 Fasta™을 사용하여 측정될 수 있다.
한 측면에서, 인간 레베르실린을 암호화하는 코돈 최적화된, 조작된 핵산 서열이 제공된다. 바람직하게는, 코돈 최적화된 레베르실린 코딩 서열은 전체 길이 천연 레베르실린 코딩 서열 (도 1b 내지 1d, 서열번호: 2)에 대해 약 80% 미만 동일성, 바람직하게는 약 75% 이하 동일성을 가진다. 한 양태에서, 코돈 최적화된 레베르실린 코딩 서열은 서열번호: 2의 천연 레베르실린 코딩 서열과 약 74% 동일성을 가진다. 한 양태에서, 코돈 최적화된 레베르실린 코딩 서열은 AAV- 매개 전달 (예를 들어, rAAV) 후 천연 레베르실린과 비교하여 개선된 번역 속도를 특징으로 한다. 한 양태에서, 코돈 최적화된 레베르실린 코딩 서열은 서열번호: 2의 전체 길이 천연 레베르실린 코딩 서열에 대해 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% 이하의 동일성을 공유한다. 한 양태에서, 코돈 최적화된 핵산 서열은 서열번호: 3의 변이체이다. 다른 양태에서, 코돈 최적화된 핵산 서열 서열은 서열번호: 3과 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% 이상의 동일성을 공유한다. 한 양태에서, 코돈 최적화된 핵산 서열은 서열번호: 3이다. 다른 양태에서, 핵산 서열은 인간에서의 발현에 대해 최적화된 코돈이다. 다른 양태에서, 레베르실린 코딩 서열은 서열번호: 8의 nt 1883 내지 nt 3976이다. 다른 양태에서, 상이한 레베르실린 코딩 서열이 선택된다.
코돈 최적화된 코딩 부위는 다양한 상이한 방법에 의해 설계될 수 있다. 이러한 최적화는 온라인으로 이용 가능한 방법 (예를 들어, GeneArt), 공개된 방법, 또는 코돈 최적화 서비스를 제공하는 회사, 예를 들어, DNA2.0 (Menlo Park, CA)를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 코돈 최적화 방법, 예를 들어, 미국 국제 특허 공보 제 WO 2015/012924호 (이는 본원에서 그 전체가 참조로서 포함됨)에 기술되어 있다. 또한, 예를 들어, 미국 특허 공보 제 2014/0032186호 및 미국 특허 공보 제 2006/0136184를 참조. 적합하게는, 제품에 대한 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 전체 길이가 변경된다. 하지만, 일부 양태에서, ORF의 일부 단편이 변경될 수 있다. 이들 방법 중 하나를 사용함으로써, 임의의 주어진 폴리펩티드 서열에 빈도를 적용하고, 폴리펩티드를 암호화하는 코돈 최적화된 코딩 부위의 핵산 단편을 생산할 수 있다.
코돈에 대한 실제 변경을 수행하거나 본원에서 기술된 바와 같이 설계된 코돈 최적화된 코딩 부위를 합성하기 위한 다수의 옵션이 이용 가능하다. 이러한 변경 또는 합성은 당업자에게 널리 알려진 표준 및 일상적인 분자 생물학적 조작을 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 접근법에서, 각각 길이 및 원하는 서열의 길이에 걸친 80 내지 90 뉴클레오티드의 일련의 상보적 올리고뉴클레오티드 쌍이 표준 방법에 의해 합성된다. 이들 올리고뉴클레오티드 쌍은 어닐링(annealing)시, 응집성 말단을 함유하는 80 내지 90 염기 쌍의 이중 가닥 단편을 형성하도록 합성되며, 예를 들어, 쌍에서 각각의 올리고뉴클레오티드는 쌍에서 다른 올리고뉴클레오티드에 대해 상보적인 부위를 넘어서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상 염기가 연장되도록 합성된다. 올리고뉴클레오티드의 각각의 쌍의 단일 가닥 말단은 올리고뉴클레오티드의 또 다른 쌍의 단일 가닥 말단과 어닐링하도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드 쌍은 어닐링이 허용되고, 그런 다음 이들 이중 가닥 단편 중 대략 5 내지 6개는 응집성 단일 가닥 말단을 통해 함께 어닐링될 수 있고, 그런 다음 이들은 함께 결찰되고 표준 박테리아 클로닝 벡터, 예를 들어, Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif로부터 이용 가능한 TOPO® 벡터로 클로닝된다. 그런 다음 작제물은 표준 방법에 의해 시퀀싱된다. 함께 결찰된 80 내지 90 염기 쌍 단편의 5 내지 6개 단편 즉, 약 500 염기 쌍의 단편으로 이루어진 몇몇 이들 작제물은 일련의 플라스미드 작제물에 전체 원하는 서열이 나타나도록 제조된다. 그런 다음 이들 플라스미드의 삽입물은 적절한 제한 효소에 의해 절단되고 최종 작제물을 형성하기 위해 함께 결찰된다. 그런 다음 최종 작제물은 표준 박테리아 클로닝 벡터로 클로닝되고, 시퀀싱된다. 추가 방법은 당업자에게 즉시 명백할 것이다. 게다가, 유전자 합성은 상업적으로 용이하게 이용 가능하다.
"조작된"은 본원에서 기술된 레베르실린 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 조립되고 임의의 적합한 유전적 요소, 예를 들어, 네이키드(naked) DNA, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 에피좀 등에 배치되고, 이는 예를 들어, 비바이러스성 전달 시스템 (예를 들어, RNA-기반 시스템, 네이키드 DNA 등)을 생성하기 위해 또는 패키징 숙주 세포에서 바이러스 벡터를 생성하기 위해 및/또는 대상의 숙주 세포에 전달하기 위해 운반된 레베르실린 서열을 숙주 세포에 전달하는 것을 의미한다. 한 양태에서, 유전적 요소는 플라스미드이다. 이러한 조작된 작제물을 제조하기 위해 사용된 방법은 당업자에 공지되어 있으며, 핵산 조작 및 유전자 공학, 재조합 공학, 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)를 참조.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "숙주 세포"는 재조합 AAV가 생산 플라스미드로부터 생산되는 패키징 세포주를 지칭할 수 있다. 대체적으로, 용어 "숙주 세포"는 코딩 서열의 발현이 바람직한 임의의 표적 세포를 지칭할 수 있다. 따라서, "숙주 세포,"는 임의의 수단, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주사, 형질전환, 바이러스 감염, 형질주입, 리포좀 전달, 막융합 기술, 고속 DNA-코팅 펠렛, 바이러스 감염 및 원형질체 융합에 의해 세포로 도입된 외인성 또는 이종 DNA를 함유하는 원핵 또는 진핵 세포를 지칭한다. 본원의 특정 양태에서, 용어 "숙주 세포"는 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스를 생성하고 패키징하기 위해 이용되는 세포를 지칭한다. 본원의 다른 양태에서, 용어 "숙주 세포"는 본원에서 기술된 조성물의 시험관 내(in vitro) 평가를 위한 다양한 포유류 종의 안구 세포의 배양물을 지칭한다. 또 다른 양태에서, 용어 "숙주 세포"는 LCA를 위해 생체 내(in vivo) 치료되는 대상의 안구 세포를 지칭하는 것을 의도한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "안구 세포"는 눈의 또는 눈의 기능과 관련된 임의의 세포를 지칭한다. 용어는 간상체 광수용체, 추상체 광수용체 및 감광성 신경절 세포, 망막 색소 상피 (RPE) 세포, 뮬러(Mueller) 세포, 맥락막(choroidal) 세포, 쌍극 세포, 수평 세포, 및 무축삭(amacrine) 세포를 포함하는 임의의 하나의 광수용체 세포를 지칭할 수 있다. 한 양태에서, 안구 세포는 광수용체 세포이다. 다른 양태에서, 안구 세포는 추상체 광수용체이다. 다른 양태에서, 안구 세포는 간상체 광수용체이다.
한 양태에서, 레베르실린을 암호화하는 핵산 서열은 이에 공유 결합된 태그 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 태그 폴리펩티드는 myc 태그 폴리펩티드, 글루타티온-S-전이효소 태그 폴리펩티드, 녹색 형광 단백질 태그 폴리펩티드, myc- 피루브산 키나아제 태그 폴리펩티드, His6 태그 폴리펩티드, 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소 태그 폴리펩티드, 플래그 태그 폴리펩티드, 및 말토오스 결합 단백질 태그 폴리펩티드를 포함하지만, 이제 한정되지 않는 공지된 "항원결정기 태그"로부터 선택될 수 있다.
다른 측면에서, 레베르실린을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트가 제공된다. 한 양태에서, 서열은 코돈 최적화된 서열이다. 다른 양태에서, 코돈 최적화된 핵산 서열은 인간 레베르실린을 암호화하는 서열번호: 3이다.
본원에서 사용된 바와 같은, "발현 카세트"는 레베르실린 단백질, 프로모터에 대한 코딩 서열을 포함하고, 그에 대한 다른 조절 서열을 포함할 수 있는 핵산 분자를 지칭하며, 이 카세트는 바이러스 벡터의 캡시드 (예를 들어, 바이러스 입자)로 패키징될 수 있다. 전형적으로, 바이러스 벡터를 생성하기 위한 이러한 발현 카세트는 바이러스 게놈의 패키징 신호에 의해 둘러싸인 본원에서 기술된 LCA5 서열 및 본원에서 기술된 것과 같은 다른 발현 제어 서열을 함유한다. 예를 들어, AAV 바이러스 벡터의 경우, 패키징 신호는 5' 역 말단 반복 (ITR) 및 3' ITR이다. AAV 캡시드로 패키징된 경우, 발현 카세트와 함께 ITR은 본원에서 "재조합 AAV (rAAV) 게놈" 또는 "벡터 게놈"으로 지칭될 수 있다. 한 양태에서, 발현 카세트는 레베르실린 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 한 양태에서, 카세트는 숙주 세포에서 레베르실린을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열의 발현을 지시하는 발현 제어 서열과 작동적으로 연관된 코돈 최적화된 LCA5를 제공한다. 한 양태에서, 벡터 게놈은 서열번호: 8의 nt 1-4379의 서열이다. 다른 양태에서, 벡터 게놈은 서열번호: 9의 nt 1-4368의 서열이다. 또 다른 양태에서, 식별된 벡터 게놈 중 어느 하나의 LCA5 코딩 서열은 본원에서 기술된 바와 같은 또 다른 LCA5 코딩 서열과 교체된다.
다른 양태에서, AAV 벡터에서 사용하기 위한 발현 카세트가 제공된다. 그 양태에서, AAV 발현 카세트는 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복 (ITR) 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 발현 카세트는 5' ITR 서열 및 3' ITR 서열을 포함한다. 한 양태에서, 5' 및 3' ITR은 레베르실린을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열, 선택적으로 숙주 세포에서 레베르실린을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열의 발현을 지시하는 추가 서열과 인접한다. 따라서, 본원에서 기술된 바와 같이, AAV 발현 카세트는 그의 5' 말단 상에 5' AAV 역 말단 반복 서열 (ITR)로 인접된 및 그의 3' 말단 상에 3' AAV ITR로 인접된 상기 기술된 바와 같은 발현 카세트를 기술하는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 rAAV 게놈은 AAV 바이러스 입자로 발현 카세트를 패키징시키는데 필요한 최소 서열, 즉, AAV 5' 및 3' ITR을 함유한다. AAV ITR은 본원에서 기술된 바와 같은, 임의의 AAV의 ITR 서열로부터 획득될 수 있다. 이들 ITR은 생성된 재조합 AAV에 사용된 캡시드와 동일한 AAV 기원, 또는 상이한 AAV 기원 (AAV 위형(pseudotype)을 생산하기 위함)일 수 있다. 한 양태에서, AAV2, 또는 이의 결실된 버전 (△ITR)으로부터의 ITR 서열은 편의를 위해 그리고 조절 승인을 가속화하기 위해 사용된다. 하지만, 다른 AAV 공급원으로부터의 ITR이 선택될 수 있다. ITR의 공급원이 AAV2로부터 유래하고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 공급원으로부터 유래한 경우, 생성된 벡터는 위형으로 지칭될 수 있다. 전형적으로, AAV 벡터 게놈은 AAV 5' ITR, 레베르실린 코딩 서열 및 임의의 조절 서열, 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 하지만, 이들 요소의 다른 배치가 적합할 수 있다. △ITR로 지칭된, 5' ITR의 단축 버전은 D- 서열 및 말단 재생 부위 (trs)가 결실된 것으로 기술되어 있다. 다른 양태에서, 전체 길이 AAV 5' 및 3' ITR이 사용된다. 그런 다음, 각각의 rAAV 게놈은 생산 플라스미드로 도입될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조절 서열", "전사 제어 서열" 또는 "발현 제어 서열"은 DNA 서열, 예를 들어 개시자 서열, 인핸서 서열, 및 프로모터 서열을 지칭하고, 이는 이들이 작동 가능하게 연결된 핵산 서열을 암호화하는 단백질의 전사를 유도, 억제, 또는 달리 제어한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결" 또는 "작동적으로 연관된"은 레베르실린을 암호화하는 핵산 서열과 인접한 발현 제어 서열 및/또는 이의 전사 및 발현을 제어하기 위해 도중에(in trans) 또는 멀리서 작동하는 발현 제어 서열 모두를 지칭한다.
한 측면에서, 본원에서 기술된 임의의 발현 카세트를 포함하는 벡터가 제공된다. 본원에서 기술된 바와 같은, 이러한 벡터는 다양한 기원의 플라스미드일 수 있고, 특정 양태에서 본원에서 추가로 기술된 바와 같은 재조합 복제 불량 바이러스의 생성을 위해 유용하다.
본원에서 사용된 바와 같은 "벡터"는 외인성 또는 이종 또는 조작된 핵산 이식유전자가 삽입될 수 있고, 그런 다음 적절한 숙주 세포로 도입될 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 복제 원점, 및 재조합 DNA가 삽입될 수 있는 하나 이상의 부위를 가진다. 벡터는 종종 벡터를 가지는 세포가 예를 들어, 약물 저항성 유전자를 암호화하지 않는 세포로부터 선택될 수 있는 수단을 가진다. 일반적인 벡터는 플라스미드, 바이러스 게놈, 및 (주로 효모 및 세균에서의) "인공 염색체"를 포함한다. 특정 플라스미드가 본원에서 기술되어 있다.
한 양태에서, 벡터는 이에 기술된 발현 카세트를 포함하는 비바이러스성 플라스미드, 예를 들어, "네이키드 DNA", "네이키드 플라스미드 DNA", RNA, 및 mRNA이고; 예를 들어, 미셀, 리포좀, 양이온성 지질 - 핵산 조성물, 폴리-글리칸 조성물 및 다른 중합체, 지질 및/또는 콜레스테롤-기반 - 핵산 접합체, 및 본원에서 기술된 것과 같은 다른 작제물을 포함하는 다양한 조성물 및 나노 입자와 커플링된다. 예를 들어, X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774-787; web publication: March 21, 2011; WO2013/182683, WO 2010/053572 및 WO 2012/170930를 참조, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 이러한 비바이러스성 레베르실린 벡터는 본원에서 기술된 경로에 의해 투여될 수 있다. 바이러스 벡터, 또는 비-바이러스 벡터는 유전자 전달 및 유전자 치료 적용에서 사용하기 위한 생리학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화될 수 있다.
다른 양태에서, 벡터는 그 안에 기술된 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터이다. "바이러스 벡터"는 외인성 또는 이종 LCA5 핵산 이식유전자를 함유하는 복제 불완전 바이러스로 정의된다. 한 양태에서, 본원에서 기술된 바와 같은 발현 카세트는 약물 전달 또는 바이러스 벡터의 생산을 위해 사용되는 플라스미드 상에서 조작될 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 바람직하게는 복제 결함이 있고 안구 세포를 표적으로 하는 것 중에서 선택된다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스; 헤르페스 바이러스; 렌티바이러스; 레트로바이러스; 파르보바이러스 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 유전자 치료에 적합한 임의의 바이러스를 포함할 수 있다. 하지만, 이해의 용이성을 위해, 아데노 관련 바이러스가 본원에서 예시적인 바이러스 벡터로 언급된다.
"복제-불량 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심있는 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 외피에 패키징된 합성 또는 재조합 바이러스 입자를 지칭하며, 여기서 또한 바이러스 캡시드 또는 외피 내에 패키징된 임의의 바이러스 게놈 서열은 복제- 결핍이며; 즉, 이들은 자손 비리온을 생성할 수 없지만, 표적 세포를 감염시키는 능력은 유지한다. 한 양태에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제하는데 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 포함하지 않지만 (게놈은 "무기력하게" 조작될 수 있음 - 증폭 및 인공 게놈의 패키징에 필요한 신호에 둘러싸인 관심있는 이식유전자만을 함유함), 이들 유전자는 생산 도중 공급될 수 있다. 따라서, 복제를 위해 필요한 바이러스 효소의 존재를 제외하고, 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 발생할 수 없기 때문에 유전자 요법이 사용하기에 안전한 것으로 간주된다.
다른 양태에서, 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV) 벡터가 제공된다. rAAV는 AAV 캡시드, 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 손상시킨다. 벡터 게놈은 한 양태에서: (a) AAV 5' 역 말단 반복 (ITR) 서열; (b) 프로모터; (c) 인간 레베르실린을 암호화하는 코딩 서열; 및 (d) AAV 3' ITR을 포함한다. 다른 양태에서, 벡터 게놈은 본원에서 기술된 발현 카세트이다. 한 양태에서, LCA5 서열은 전체 길이 레베르실린 단백질을 암호화한다. 한 양태에서, 레베르실린 서열은 서열번호: 1의 단백질 서열이다. 다른 양태에서, 코딩 서열은 서열번호: 3 또는 이의 변이체이다.
파르보바이러스 패밀리의 구성원인, 아데노 관련 바이러스 (AAV)는 4.7 킬로베이스 (kb) 내지 6 kb의 단일 가닥 선형 DNA 게놈을 가지는 작은, 외피가 없는, 20면체 바이러스이다. 공지된 AAV 혈청형 중에는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 등이 있다. ITR 또는 다른 AAV 구성 요소는 당업자에게 이용 가능한 기술을 사용하여 AAV로부터 용이하게 단리되거나 조작될 수 있다. 이러한 AAV는 학술, 상업, 또는 공공 공급원 (예를 들어, American Type Culture Collection, Manassas, VA)으로부터 단리, 조작, 또는 획득될 수 있다. 대안적으로, AAV 서열은 문헌 또는 예를 들어, GenBank, PubMed 등과 같은 데이터베이스에서 이용 가능한 것과 같은 공개된 서열에 대한 참조에 의한 합성 또는 다른 적합한 수단에 의해 조작될 수 있다. AAV 바이러스는 핵산 서열의 세포 특이적 전달, 면역원성 최소화, 안정성 및 입자 수명 조정, 효율적인 분해, 핵으로의 정확한 전달 등을 위해 이들 입자를 최적화할 수 있도록 하는 통상적인 분자생물학 기술에 의해 조작될 수 있다.
AAV의 단편은 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포에서 용이하게 활용될 수 있다. 바람직한 AAV 단편 중에는 vp1, vp2, vp3 및 초가변 부위를 포함하는 cap 단백질, rep 78, rep 68, rep 52, 및 rep 40을 포함하는 rep 단백질, 및 이들 단백질을 암호화하는 서열이 있다. 이러한 단편은 단독으로, 다른 AAV 혈청형 서열 또는 단편과 조합하여, 또는 다른 AAV 또는 비-AAV 바이러스 서열로부터의 요소와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 인공 AAV 혈청형은 비-자연 발생 캡시드 단백질을 가지는 AAV를 제한없이 포함한다. 이러한 인공 캡시드는 또 다른 AAV 혈청형 (공지된 또는 신규한), 동일 AAV 혈청형의 비-인접 부분, 비-AAV 바이러스 공급원, 비바이러스성 공급원으로부터 획득될 수 있는 이종 서열과 조합한 본 발명의 신규한 AAV 서열 (예를 들어, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 사용하여, 임의의 적합한 기술에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV 혈청형은 제한없이 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드, 또는 "인간화된", AAV 캡시드일 수 있다. 한 양태에서, 벡터는 본 발명의 AAV8 cap 및/또는 rep 서열을 함유한다. 예를 들어, 본원에서 참조로 포함된 미국 특허 출원 공보 US2009/02270030를 참조.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "AAV" 또는 "AAV 혈청형"은 수십 개의 자연 발생 및 이용 가능한 아데노 관련 바이러스, 뿐만 아니라 인공 AAV를 지칭한다. 인간 또는 비-인간 영장류 (NHP)로부터 단리 또는 조작되고 잘 특성화된 AAV 중에서, 인간 AAV2는 유전자 전달 벡터로서 개발된 첫 번째 AAV이며; 이는 상이한 표적 조직 및 동물 모델에서 효율적인 유전자 전달 실험을 위해 널리 사용되어 왔다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 기술된 AAV 캡시드, ITR, 및 다른 선택된 AAV 구성 요소는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAV7M8 및 AAVAnc80, 임의의 공지된 또는 언급된 AAV의 변이체 또는 아직 발견되지 않은 AAV 또는 이의 변이체 또는 혼합물을 포함하지만, 이제 한정되지 않는 임의의 AAV 중에서 용이하게 선택될 것이다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 WO 2005/033321를 참조. 다른 양태에서, AAV 캡시드는 쌍극 세포를 우선적으로 표적화하는 AAV8bp 캡시드이다. 본원에 참조로 포함된, WO 2014/024282를 참조. 다른 양태에서, AAV 캡시드는 AAV7m8 캡시드이며, 이는 외부 망막에 대한 우선적인 전달을 보여주었다. AAV7m8 캡시드 핵산 서열은 서열번호: 11에, 아미노산 서열은 서열번호: 12에 복제된다. 본원에 참조로 포함된, Dalkara et al, In Vivo-Directed Evolution of a New Adeno-Associated Virus for Therapeutic Outer Retinal Gene Delivery from the Vitreous, Sci Transl Med 5, 189ra76 (2013)을 참조.
본원에서 사용된 바와 같이, "aAV7m8 캡시드"는 다중 AAV7m8 vp (가변 단백질) 단백질로 구성된 자가 조립된 AAV 캡시드이다. AAV7m8 vp 단백질은 전형적으로 서열번호: 11의 핵산 서열 또는 이의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 서열에 의해 암호화된 대체 스플라이스 변이체로서 발현되고, 서열번호: 12의 vp1 아미노산 서열을 암호화한다. 이들 스플라이스 변이체는 상이한 길이의 서열번호: 12의 단백질을 생성한다. 특정 양태에서, "AAV7m8 캡시드"는 서열번호: 12와 99% 동일한 아미노산 서열을 가지는 AAV를 포함한다.
다른 양태에서, rAAV 캡시드는 AAV8 캡시드 또는 이의 변이체, AAV6 캡시드 또는 이의 변이체, AAV9 캡시드 또는 이의 변이체, AAV7 캡시드 또는 이의 변이체, AAV5 캡시드 또는 이의 변이체, AAV2 캡시드 또는 이의 변이체, AAV1 캡시드 또는 이의 변이체, AAV3 캡시드 또는 이의 변이체, 및 AAV4 캡시드 또는 이의 변이체로부터 선택된다. 한 양태에서, AAV7m8 캡시드 및 본원에서 기술된 발현 카세트를 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV) 백터가 제공되며, 여기서 상기 발현 카세트는 레베르실린을 암호화하는 핵산 서열, 역 말단 반복 서열 및 숙주 세포에서 레베르실린의 발현을 지시하는 발현 제어 서열을 포함한다.
추가 양태에서, LCA5 작제물 및 본원에서 기술된 최적화된 서열의 전달을 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터가 제공된다. 아데노 관련 바이러스 (AAV) 바이러스 벡터는 표적 세포로의 전달을 위해 패키징된 핵산 서열이 포함된 AAV 단백질 캡시드를 가지는 AAV DNA 분해효소 저항성 입자이다. AAV 캡시드는 60 캡시드 (cap) 단백질 서브유닛, VP1, VP2, 및 VP3로 구성되고, 이는 선택된 AAV에 따라 대략 1:1:10 내지 1:1:20의 비율로 20면체 대칭에서 배열된다. AAV는 상기 확인된 바와 같은 AAV 바이러스 벡터의 캡시드에 대한 공급원으로서 선택될 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제 2007-0036760-A1호; 미국 공개 특허 출원 제 2009-0197338-A1호; EP 1310571를 참조. 또한, WO 2003/042397 (AAV7 및 다른 원숭이(simian) AAV), 미국 특허 7790449 및 미국 특허 7282199 (AAV8), WO 2005/033321 및 US 7,906,111 (AAV9), 및 WO 2006/110689, 및 WO 2003/042397 (rh. 10) 및 (Dalkara D, Byrne LC, Klimczak RR, Visel M, Yin L, Merigan WH, et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med (2013) 5(189): 189ra76. doi: 10.1126/scitranslmed.3005708.)(AAV7m8)를 참조. 이들 문서 각각은 본원에 참조로 포함된다. 이들 문서는 또한 AAV를 생성하기 위해 선택될 수 있는 다른 AAV 캡시드를 기술하고 참조로 포함된다. 일부 양태에서, 바이러스 벡터에서 사용하기 위한 AAV cap은 전술한 AAV 캡시드 중 하나 또는 그의 암호화하는 핵산의 돌연변이화 (즉, 삽입, 결실, 또는 치환)에 의해 생성될 수 있다. 일부 양태에서, AAV 캡시드는 2개 또는 3개 또는 4개 이상의 전술한 AAV 캡시드 단백질로부터의 도메인을 포함하는 키메라이다. 일부 양태에서, AAV 캡시드는 2개 또는 3개 상이한 AAV 또는 재조합 AAV로부터의 Vp1, Vp2, 및 Vp3 단량체의 모자이크이다. 일부 양태에서, rAAV 조성물은 하나 이상의 전술한 Cap을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, AAV에 관하여, 용어 변이체는 아미노산 또는 핵산 서열에 걸쳐 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 더 큰 유래 서열 동일성을 공유하는 것을 포함하는, 공지된 AAV 서열로부터 유래된 임의의 AAV 서열을 의미한다. 다른 양태에서, AAV 캡시드는 임의의 기술된 또는 공지된 AAV 캡시드 서열로부터 최대 약 10% 변이를 포함할 수 있는 변이체를 포함한다. 즉, AAV 캡시드는 본원에서 제공된 및/또는 당업계에 공지된 AAV 캡시드에 대해 약 90% 동일성 내지 약 99.9 % 동일성, 약 95% 내지 약 99% 동일성 또는 약 97% 내지 약 98% 동일성을 공유한다. 한 양태에서, AAV 캡시드는 AAV 캡시드와 적어도 95% 동일성을 공유한다. AAV 캡시드의 백분율 동일성을 측정하는 경우, 임의의 가변 단백질 (예를 들어, vp1, vp2, 또는 vp3)에 대한 비교가 이루어질 수 있다. 한 양태에서, AAV 캡시드는 vp1, vp2 또는 vp3를 통해 AAV7m8와 적어도 95% 동일성을 공유한다. 다른 양태에서, 2013년 4월 26일 온라인에 공개된 문헌[Kay et al, Targeting Photoreceptors via Intravitreal Delivery Using Novel, Capsid- Mutated AAV Vectors, PLoS One. 2013; 8(4): e62097 (이는 본원에 참조로 포함됨)]에 의해 기술된 바와 같이, 캡시드는 Y447F, Y733F 및 T494V 돌연변이를 가지는 AAV8 캡시드 (또한 "AAV8(C&G+T494V)M 및 Mrep2-cap8(Y447F+733F+T494V)"로 불림)이다.
*한 양태에서, 원하는 표적 세포, 예를 들어, 광수용체 (예를 들어, 간상체 및/또는 추상체), RPE 또는 다른 안구 세포에 대한 친화성을 나타내는 AAV 캡시드를 활용하는 것이 바람직하다. 한 양태에서, AAV 캡시드는 특정 표면 노출된 티로신 잔기가 페닐알라닌 (F)로 치환된 티로신 캡시드-돌연변이이다. 이러한 AAV 변이체는 예를 들어, 본원에 참조로 포함된, 문헌[Mowat et al, Tyrosine capsid-mutant AAV vectors for gene delivery to the canine retina from a subretinal or intravitreal approach, Gene Therapy 21, 96-105 (January 2014)]에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인공 AAV"는 비-자연 발생 캡시드 단백질을 가지는 AAV를 제한없이 의미한다. 이러한 인공 캡시드는 상이한 선택된 AAV, 동일 AAV의 비-인접부분, 비-AAV 바이러스 공급원, 또는 비바이러스성 공급원으로부터 획득될 수 있는 이종 서열과 조합하여 선택된 AAV 서열 (예를 들어, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 사용하여 임의의 적합한 기술에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV는 제한없이, 위형화 AAV, 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드, 또는 "인간화" AAV 캡시드일 수 있다. 하나의 AAV의 캡시드가 이종 캡시드 단백질로 대체된, 위형화 벡터가 본 발명에서 유용하다. 한 양태에서, AAV2/5 및 AAV2/8는 예시적인 위형화 벡터이다.
다른 양태에서, 자기-상보적 AAV가 사용된다. "자기-상보적 AAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해 운반되는 코딩 부위가 분자 내 이중 가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계된 발현 카세트를 가지는 플라스미드 또는 벡터를 지칭한다. 감염시, 제 2 가닥의 세포 매개 합성을 기다리는 대신에, scAAV의 2개의 상보적 절반은 즉각적인 복제 및 전사를 위해 준비된 하나의 이중 가닥 DNA (dsDNA) 유닛을 형성하도록 연관될 것이다. 예를 들어, 문헌[D M McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254]를 참조. 자기-상보적 AAV는 예를 들어, 미국 특허 제 6,596,535호; 제 7,125,717호; 및 제 7,456,683호에 기술되어 있다 (이의 각각은 그 전체로 본원에 참조로 포함됨).
핵산 서열 또는 단백질을 기술하기 위해 사용된 용어 "외인성"은 염색체, 또는 숙주 세포에 존재하는 위치에서 자연적으로 발생하지 않는 핵산 또는 단백질을 의미한다. 외인성 핵산 서열은 또한 동일 숙주 세포 또는 대상으로부터 유래하고 삽입되지만, 비-천연 상태, 예를 들어 상이한 카피 수, 또는 상이한 조절 요소의 제어 하에 존재하는 서열을 지칭한다.
핵산 서열 또는 단백질을 기술하기 위해 사용된 용어 "이종"은 그것이 발현되는 숙주 세포 또는 대상과 상이한 유기체 또는 동일 유기체의 상이한 종으로부터 유래된 핵산 또는 단백질을 의미한다. 플라스미드, 발현 카세트, 또는 벡터에서의 단백질 또는 핵산과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "이종"은 문제의 단백질 또는 핵산이 자연적으로 서로 동일 관계로 발견되지 않는, 또 다른 서열 또는 하위 서열과 함께 존재하는 단백질 또는 핵산을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술된 임의의 것을 포함하는 발현 카세트가 재조합 AAV 게놈을 생성하기 위해 사용된다.
한 양태에서, 본원에서 기술된 발현 카세트는 바이러스 벡터를 생성하고/거나 숙주 세포에 전달하기에 유용한 적합한 유전적 요소 (벡터), 예를 들어, 네이키드 DNA, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 에피좀 등으로 조작되며, 이는 그 안에 운반된 LCA5 서열을 전달한다. 선택된 벡터는 형질주입, 전기천공, 리포좀 전달, 막융합 기술, 고속 DNA-코팅 펠렛, 바이러스 감염 및 원형질체 융합을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 이러한 작제물을 제조하는데 사용하는 방법은 핵산 조작 당업자에게 공지되어 있으며 유전자 조작, 재조합 공학, 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY]를 참조.
발현 카세트 또는 rAAV 게놈 또는 생산 플라스미드를 비리온으로 패키징하기 위해, ITR은 발현 카세트로서 동일 작제물 쪽에서 필요한 유일한 AAV 구성 요소이다. 한 양태에서, 복제 (rep) 및/또는 캡시드 (cap)에 대한 코딩 서열은 AAV 게놈으로부터 제거되고 AAV 벡터를 생성하기 위해 도중에 또는 세포주 패키징에 의해 공급된다.
대상에 전달하기에 적합한 AAV 바이러스 벡터를 생성하고 단리하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 7790449; 미국 특허 7282199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; 및 US 7588772 B2]를 참조. 하나의 시스템에서, 생산자 세포주는 ITR 및 rep 및 cap을 암호화하는 작제물(들)로 둘러싸인 이식유전자를 암호화하는 작제물로 일시적으로 형질주입된다. 두 번째 시스템에서, rep 및 cap을 안정적으로 공급하는 패키징 세포주는 ITR로 둘러싸인 이식유전자를 암호화하는 작제물로 일시적으로 형질주입된다. 각각의 이들 시스템에서, AAV 비리온이 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스에 의한 감염에 반응하여 생산되며, 오염 바이러스로부터 rAAV의 분리가 필요하다. 더욱 최근에는, 시스템은 AAV를 회복시키기 위해 헬퍼 바이러스에 의한 감염이 필요하지 않도록 개발되었으며 - 필요한 헬퍼 기능 (즉, 아데노바이러스 E1, E2a, VA, 및 E4 또는 헤르페스바이러스 UL5, UL8, UL52, 및 UL29, 및 헤르페스바이러스 중합효소)은 또한 도중에, 시스템에 의해 공급된다. 이들 새로운 시스템에서, 헬퍼 기능은 필요한 헬퍼 기능을 암호화하는 작제물을 가지는 세포의 일시적 형질주입에 의해 공급될 수 있거니, 세포는 헬퍼 기능을 암호화하는 유전자를 안정적으로 함유하도록 조작될 수 있고, 이의 발현은 전사 또는 전사후 수준에서 제어될 수 있다.
용어 "단리된"은 물질이 그의 원래 환경(예를 들어, 자연 발생의 경우, 천연 환경)으로부터 제거되었음을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않았지만, 천연 시스템에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된, 동일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 차후에 자연 시스템으로 재도입되더라도 단리된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 벡터 또는 조성물이 그의 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된 것이다.
또 다른 시스템에서, ITR 및 rep/cap 유전자로 둘러싸인 발현 카세트는 바큘로바이러스-기반 벡터에 의한 감염에 의해 곤충 세포로 도입된다. 이들 생산 시스템에 대한 리뷰는, 일반적으로, 예를 들어, 이의 내용이 그 전체로 본원에 참조로 포함된, 문헌[Zhang et al., 2009, "Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929]를 참조한다. 이들 및 다른 AAV 생산 시스템을 제조하고 생산하는 방법은 또한 이의 각각의 내용이 그 전체로 본원에 참조로 포함된, 하기 미국 특허에 기술되어 있다: 제 5,139,941호; 제 5,741,683호; 제 6,057,152호; 제 6,204,059호; 제 6,268,213호; 제 6,491,907호; 제 6,660,514호; 제 6,951,753호; 제 7,094,604호; 제 7,172,893호; 제 7,201,898호; 제 7,229,823호; 및 제 7,439,065호. 일반적으로, 예를 들어, 문헌[Grieger & Samulski, 2005,"Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications," Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology," J. Gene Med. 10:717-733]; 및 이의 각각이 그 전체로 본원에 참조로 포함된, 하기 언급된 참고 문헌을 참조.
본 발명의 임의의 양태를 구성하기 위해 사용된 방법은 핵산 조작 당업자에게 공지되어 있고, 유전자 조작, 재조합 공학, 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)]를 참조. 유사하게, rAAV 비리온을 생성하는 방법은 널리 공지되어 있고 적합한 방법의 선택은 본 발명에 대한 제한이 아니다. 예를 들어, 문헌[K. Fisher et al, (1993) J. Virol., 70:520-532] 및 미국 특허 제 5,478,745호를 참조.
"플라스미드"는 일반적으로 당업자에게 친숙한 표준 명명 규칙에 따라 선행하는 소문자 p 및/또는 후속 대문자 및/또는 숫자로 본원에서 표기된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다수의 플라스미드 및 다른 클로닝 및 발현 벡터는 잘 알려져있고 당업자가 용이하게 이용 가능하다. 또한, 당업자는 본 발명에서 사용하기 위한 적합한 임의의 수의 다른 플라스미드를 용이하게 구성할 수 있다. 본 발명의 이러한 플라스미드뿐만 아니라 다른 벡터의 성질, 구성 및 용도는 본 개시로부터 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
한 양태에서, 생산 플라스미드는 본원에서 기술된, 또는 본원에 참조로 포함된, WO2012/158757에서 기술된 바와 같다. rAAV 벡터를 생산하는데 사용하기 위한 다양한 플라스미드가 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 유용하다. 생산 플라스미드는 AAV cap 및/또는 rep 단백질을 발현하는 숙주 세포에서 배양된다. 숙주 세포에서, 각각의 rAAV 게놈이 구제되고, 감염성 바이러스 입자를 형성하기 위해 캡시드 단백질 또는 외피 단백질로 패키징된다.
한 측면에서, 상기 기술된 발현 카세트를 포함하는 생산 플라스미드가 제공된다. 한 양태에서, 생산 플라스미드를 서열번호: 8, 및 도 1e 내지 1f에 나타내고, 이는 p643로 불린다. 이러한 플라스미드는 rAAV- 인간 코돈 최적화된 레베르실린 벡터의 생성을 위한 실시예에서 사용된다. 이러한 플라스미드는 5' AAV ITR 서열; 선택된 프로모터; 폴리A 서열; 및 3' ITR을 함유하는 것이고; 게다가, 이는 람다와 같은, 스터퍼(stuffer) 서열을 또한 함유한다. 추가의 양태에서, 스태퍼(staffer) 서열은 약 3 킬로베이스 (kb) 내지 약 6 kb, 약 4.7 kb 내지 약 6 kb, 약 3 kb 내지 약 5.5kb, 또는 약 4.7 kb 내지 5.5 kb의 크기로 rAAV 벡터 게놈을 유지한다. 한 양태에서, 비-코딩 람다 스태퍼 부위는 벡터 백본에 포함된다. 레베르실린 암호화 서열을 포함하는 p643의 예를 서열번호: 8에서 찾을 수 있다. 다른 양태에서, 생산 플라스미드는 도 11a 내지 11b 및 서열번호: 9에 나타낸다. 다른 양태에서, 생산 플라스미드는 최적화된 벡터 플라스미드 생산 효율을 위해 변형된다. 이러한 변형은 다른 중성 서열의 첨가, 또는 일부(들)의 결실 또는 벡터 플라스미드의 슈퍼코일의 수준을 조절하기 위한 전체 람다 스태퍼 서열을 포함한다. 이러한 변형이 본원에서 고려된다. 다른 양태에서, 종결자 및 다른 서열이 플라스미드에 포함된다.
특정 양태에서, rAAV 발현 카세트, 벡터 (예를 들어 rAAV 벡터), 바이러스 (예를 들어 rAAV), 생산 플라스미드는 AAV 역 말단 반복 서열, 레베르실린을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열, 및 숙주 세포에서 암호화된 단백질의 발현을 지시하는 발현 제어 서열을 포함한다. 다른 양태에서, rAAV 발현 카세트, 바이러스, 벡터 (예를 들어 rAAV 벡터), 생산 플라스미드는 하나 이상의 인트론, 코작 서열, 폴리A, 전사 후 조절 요소 및 기타를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 전사 후 조절 요소는 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE)이다.
발현 카세트, 벡터 및 플라스미드는 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같은, 코돈 최적화를 포함하는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 특정 종에 대해 최적화될 수 있는 다른 구성 요소를 포함한다. 본원에서 기술된 카세트, 벡터, 플라스미드 및 바이러스 또는 다른 조성물의 구성 요소는 발현 제어 서열의 일부로서 프로모터 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 프로모터는 세포 특이적이다. 용어 "세포 특이적"는 재조합 벡터를 위해 선택된 특정 프로모터가 특정 안구 세포 유형에서 최적화된 레베르실린 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있음을 의미한다. 한 양태에서, 프로모터는 광수용체 세포에서 이식유전자의 발현에 특이적이다. 다른 양태에서, 프로모터는 간상체 및 추상체에서의 발현에 특이적이다. 다른 양태에서, 프로모터는 간상체에서의 발현에 특이적이다. 다른 양태에서, 프로모터는 추상체에서의 발현에 특이적이다. 한 양태에서, 광수용체-특이적 프로모터는 인간 로돕신 키나아제 프로모터이다. 로돕신 키나아제 프로모터는 간상체 및 추상체 모두에서 활성인 것으로 나타났다. 예를 들어, 그 전체로, 본원에 참조로 포함된 문헌[Sun et al, Gene Therapy with a Promoter Targeting Both Rods and Cones Rescues Retinal Degeneration Caused by AIPL1 Mutations, Gene Ther. 2010 January; 17(1): 117-131]을 참조. 한 양태에서, 프로모터는 클로닝을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 제한 부위를 첨가하도록 변형된다.
다른 양태에서, 프로모터는 인간 로돕신 프로모터이다. 한 양태에서, 프로모터는 클로닝을 위한 말단 상에 제한을 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 그 전체로, 본원에 참조로 포함된 Nathans and Hogness, Isolation and nucleotide sequence of the gene encoding human rhodopsin, PNAS, 81:4851-5 (August 1984)를 참조. 다른 양태에서, 프로모터는 인간 로돕신 프로모터의 일부 또는 단편이다. 다른 양태에서, 프로모터는 인간 로돕신 프로모터의 변이체이다.
다른 예시적인 프로모터는 인간 G-단백질-커플링된 수용체 단백질 키나아제 1 (GRK1) 프로모터 (Genbank 수탁 번호 AY327580)를 포함한다. 다른 양태에서, 프로모터는 GRK1 프로모터의 292 nt 단편 (위치 1793-2087)이다 (Beltran et al, Gene Therapy 2010 17:1162-74를 참조, 그 전체로 참조로 포함됨). 또 다른 바람직한 양태에서, 프로모터는 인간 광수용체간 레티노이드 결합 단백질 근위 (IRBP) 프로모터이다. 한 양태에서, 프로모터는 hIRBP 프로모터의 235 nt 단편이다. 한 양태에서, 프로모터는 RPGR 근위 프로모터 (Shu et al, IOVS, May 2102, 그 전체로 참조로서 포함됨). 본 발명에 유용한 다른 프로모터는 제한없이 하기를 포함한다: 간상체 옵신 프로모터, 적-녹 옵신 프로모터, 청색 옵신 프로모터, cGMP-β-포스포디에스테라아제 프로모터 (Qgueta et al, IOVS, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Dec;41(13):4059-63), 마우스 옵신 프로모터 (상기 언급된 Beltran et al 2010), 로돕신 프로모터 (Mussolino et al, Gene Ther, July 2011, 18(7):637-45); 추상체 트랜스듀신의 알파-서브유닛 (Morrissey et al, BMC Dev, Biol, Jan 2011, 11:3); 베타 포스포디에스테라아제 (PDE) 프로모터; 색소성 망막염 (RP1) 프로모터 (Nicord et al, J.Gene Med, Dec 2007, 9(12): 1015-23); NXNL2/NXNL1 프로모터 (Lambard et al, PLoS One, Oct. 2010, 5(10):e13025), RPE65 프로모터; 망막 변성 완화/페리페린 2 (Rds/perph2) 프로모터 (Cai et al, Exp Eye Res. 2010 Aug;91(2): 186-94); 및 VMD2 프로모터 (Kachi et al, Gene Therapy, 2009 (20:31-9)). 각각의 이들 문서는 그 전체로 본원에서 참조로 포함된다. 다른 양태에서, 프로모터는 인간 인간 EF1α프로모터, 로돕신 프로모터, 로돕신 키나아제, 광수용체간 결합 단백질 (IRBP), 추상체 옵신 프로모터 (적-녹, 청색), 적-녹 추상체 유전자좌 제어 부위를 함유하는 추상체 옵신 업스트림 서열, 추상체 형질전환, 및 전사 인자 프로모터 (신경 망막 류신 지퍼 (Nrl) 및 광수용체-특이적 핵 수용체 Nr2e3, bZIP)로부터 선택된다.
다른 양태에서, 프로모터는 편재 또는 구성 프로모터이다. 적합한 프로모터의 예시는 도 1e 내지 1f에 나타낸 바와 같은, 시토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서 요소를 가지는 교배 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터이다. 다른 양태에서, 프로모터는 CB7 프로모터이다. 다른 적합한 프로모터는 인간 β-액틴 프로모터, 인간 신장 인자-lα 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 원숭이 바이러스 40 프로모터, 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Damdindorj et al, (August 2014) A Comparative Analysis of Constitutive Promoters Located in Adeno- Associated Viral Vectors. PLoS ONE 9(8): e 106472]를 참조. 또 다른 적합한 프로모터는 바이러스 프로모터, 구성 프로모터, 조절 가능한 프로모터를 포함한다 [예를 들어, WO 2011/126808 및 WO 2013/04943을 참조]. 대안적으로 생리적 신호에 반응하는 프로모터는 본원에서 기술된 발현 카세트, rAAV 게놈, 벡터, 플라스미드 및 바이러스에 활용될 수 있다. 한 양태에서, 프로모터는 AAV 벡터의 크기 제한으로 인해 1000 bp 미만의 작은 크기이다. 다른 양태에서, 프로모터는 400 bp 미만이다. 다른 프로모터는 당업자에 의해 선택될 수 있다.
추가의 양태에서, 프로모터는 SV40 프로모터, 디히드로엽산환원효소 프로모터, 및 포스포글리세롤 키나아제 (PGK) 프로모터, 로돕신 키나아제 프로모터, 간상체 옵신 프로모터, 적-녹 옵신 프로모터, 청색 옵신 프로모터, 광수용체간 결합 단백질 (IRBP) 프로모터 및 cGMP-β-포스포디에스테라아제 프로모터, 파지 람다 (PL) 프로모터, 단순 포진 바이러스 (HSV) 프로모터, 테트라시클린-제어 트랜스 활성자 반응 프로모터 (tet) 시스템, RSV LTR, MoMLV LTR, BIV LTR 또는 HIV LTR과 같은 장말단 반복(LTR) 프로모터, 몰로니 쥐 육종바이러스의 U3 부위 프로모터, 그랜자임 프로모터, 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(들), CD34 프로모터, CD8 프로모터, 티미딘 키나아제 (TK) 프로모터, B19 파르보바이러스 프로모터, PGK 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, HSP65 및 HSP70 프로모터와 같은 열 충격 단백질 (HSP) 프로모터, 면역글로불린 프로모터, MMTV 프로모터, 라우스 육종바이러스 (RSV) 프로모터, lac 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, MND 프로모터, 또는 MNC 프로모터로부터 선택된다. 이의 프로모터 서열은 당업자에게 공지되어있거나 문헌 또는 데이터베이스, 예를 들어, GenBank, PubMed 등과 같이 공개적으로 이용 가능하다.
다른 양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터는 라파마이신/라파로그 프로모터, 엑디손 프로모터, 에스트로겐-반응성 프로모터, 및 테트라시클린-반응성 프로모터, 또는 이종이량체 억제자 스위치를 포함하는 공지된 프로모터로부터 선택될 수 있다. 이들 모두 그 전체로 본원에 참조로 포함된 문헌[Sochor et al, An Autogenously Regulated Expression System for Gene Therapeutic Ocular Applications. Scientific Reports, 2015 Nov 24;5:17105 및 Daber R, Lewis M., A novel molecular switch. J Mol Biol. 2009 Aug 28;391(4):661-70, Epub 2009 Jun 21]을 참조.
추가의 양태에서, 프로모터는 서열번호. 8의 nt 546 내지 nt 283으로부터의 핵산 서열을 가지는 닭 베타-액틴 프로모터이다.
다른 양태에서, 본원에서 기술된 발현 카세트, 벡터, 플라스미드 및 바이러스는 다른 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열, 효율적인 RNA 처리 신호 예를 들어 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리A) 신호; TATA서열; 서열 안정화 세포질 mRNA; 서열 증진 번역 효율 (즉, 코작 공통 서열); 인트론; 서열 증진 단백질 안정성; 및 바람직한 경우, 암호화된 생성물의 분비를 증진시키는 서열을 함유한다. 발현 카세트 또는 벡터는 본원에서 기술된 임의의 하나 이상의 요소를 함유하지 않을 수 있다.
적합한 폴리A 서열의 예시는 예를 들어, 합성 폴리A 또는 소 성장 호르몬 (bGH), 인간 성장 호르몬 (hGH), SV40, 토끼 β-글로빈 (RGB)으로부터 유래한 것, 또는 변형 RGB (mRGB)를 포함한다. 추가의 양태에서, 폴리 A는 서열번호:8의 nt 3993 내지 nt 4200으로부터의 핵산 서열을 가진다.
적합한 인핸서의 예시는 다른 것들 중에서 예를 들어, CMV 인핸서, RSV 인핸서, 알파 태아 단백질 인핸서, TTR 최소 프로모터/인핸서, LSP (TH-결합 글로불린 프로모터/알파-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서), APB 인핸서, ABPS 인핸서, 알파 mic/bik 인핸서, TTR 인핸서, en34, ApoE를 포함한다. 한 양태에서, 인핸서는 서열번호: 8의 nt 241 내지 nt 544로부터의 핵산 서열을 가진다.
한 양태에서, 코작 서열은 정확한 개시 코돈으로부터의 번역을 증진시키기 위해 레베르실린 코딩 서열의 업스트림에 포함된다. 다른 양태에서, CBA 엑손 1 및 인트론이 발현 카세트에 포함된다. 한 양태에서, 레베르실린 코딩 서열은 교배 닭 β 액틴 (CBA) 프로모터의 제어 하에 놓인다. 이러한 프로모터는 시토메갈로바이러스 (CMV) 전초기 인핸서, 근위 닭 β 액틴 프로모터, 및 인트론 1 서열로 둘러싸인 CBA 엑손 1으로 이루어진다.
다른 양태에서, 인트론은 CBA, 인간 베타 글로빈, IVS2, SV40, bGH, 알파-글로불린, 베타-글로불린, 콜라겐, 오발부민, p53, 또는 이의 단편으로부터 선택된다.
한 양태에서, 발현 카세트, 벡터, 플라스미드 및 바이러스는 5' ITR, 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터, CMV 인핸서, CBA 엑손 1 및 인트론, 인간 코돈 최적화된 레베르실린 서열, bGH 폴리 A 및 3' ITR을 함유한다. 추가의 양태에서, 발현 카세트는 서열번호: 8의 nt 1 내지 4379를 포함한다. 추가의 양태에서, 5' ITR은 서열번호: 8의 nt 1 내지 nt 130으로부터의 핵산 서열을 가지고, 3' ITR은 서열번호: 8의 nt 4250 내지 nt 4379로부터의 핵산 서열을 가진다. 추가의 양태에서, CBA 엑손 l 및 인트론은 서열번호:8의 nt 824 내지 nt 1795로부터의 핵산 서열을 가진다. 추가의 양태에서, 생산 플라스미드는 또한 도 1e 내지 1f에 나타낸, 서열번호: 8의 서열을 가진다. 추가의 양태에서, 생산 플라스미드는 또한 도 1a 내지 11b에 나타낸, 서열번호: 9의 서열을 가진다.
다른 측면에서, 레베르실린 유전자의 결함에 의해 유발된 레베르 선천성 흑암시를 치료하는 및/또는 LCA를 가진 대상에서 시각 기능을 회복시키는 방법은 본원에서 기술된 바와 같이, 레베르실린을 암호화하는 벡터 (예를 들어 rAAV)를 이를 필요로 하는 대상에게 전달하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, LCA를 가진 대상을 본원에서 기술된 rAAV를 사용하여 치료하는 방법이 제공된다.
방법에 사용된 바와 같은, "투여"는 LCA에 의해 특징지어지는 표적 선택된 세포에 조성물을 전달하는 것을 의미한다. 한 양태에서, 방법은 RPE, 광수용체 세포 또는 다른 안구 세포에 대해 망막하 주사에 의해 조성물을 전달하는 것을 포함한다. 다른 양태에서, 대상에 대해 유리체내 주사가 사용된다. 다른 양태에서, 대상에 대해 망막하 주사가 사용된다. 또 다른 방법에서, 혈관 내 주사, 예를 들어 안검 정맥을 통한 주사가 사용될 수 있다. 또 다른 투여 방법은 본 개시물을 고려하여 당업자에 의해 선택될 수 있다.
"투여", 또는 "투여 경로"는 대상의 약제학적 담체 또는 부형제와 함께 및/또는 없이 본원에서 기술된 조성물의 전달이다. 바람직한 경우, 투여 경로는 조합될 수 있다. 일부 양태에서, 투여는 주기적으로 반복된다. 본원에서 기술된 약제학적 조성물은 임의의 적합한 경로 또는 상이한 경로의 조합에 의해 이를 필요로 하는 대상에 전달되도록 설계된다. 일부 양태에서, 눈에 대한 직접 전달 (선택적으로 안구 전달, 망막하 주사, 망막내 주사, 유리체내, 국소를 통함), 또는 전신 경로를 통한 전달이 사용되고, 예를 들어, 혈관내, 동맥내, 안구내, 정맥내, 근육 내, 피하, 피내, 및 다른 비경구 경로 투여이다. 본원에서 기술된 핵산 분자, 발현 카세트 및/또는 벡터는 단일 조성물 또는 다중 조성물로 전달될 수 있다. 선택적으로, 둘 이상의 상이한 AAV 또는 다중 바이러스 [예를 들어, WO20 2011/126808 및 WO 2013/049493을 참조]가 전달될 수 있고, 다른 양태에서, 다중 바이러스는 단독 또는 단백질과 조합하여 상이한 복제-불완전 바이러스 (예를 들어, AAV 및 아데노바이러스)를 함유할 수 있다.
또한 본원에서 약제학적 조성물이 제공된다. 본원에서 기술된 약제학적 조성물은 임의의 적합한 경로 또는 상이한 경로의 조합에 의해 이를 필요로 하는 대상에 전달되도록 설계된다. 이들 전달 수단은 본원에서 기술된 AAV 조성물(들)을 함유하는 현탁액의 직접 전신 전달을 회피하기 위해 설계된다. 적합하게는, 이는 전신 투여와 비교하여, 용량을 감소시키고, 독성을 감소시키는/시키거나 AAV 및/또는 이식유전자 제품에 대해 바람직하지 않는 면역 반응을 감소시키는 이점을 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, 이들 핵산 서열, 벡터, 발현 카세트 및 rAAV 바이러스 벡터는 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 완충제, 희석제, 계면활성제, 보존제 및/또는 보조제, 등을 포함하는 약학 조성물에 유용하다. 이러한 약제학적 조성물은 이러한 재조합 조작된 AAV 또는 인공 AAV에 의한 전달을 통해 숙주 세포에서 최적화된 레베르실린을 발현시키기 위해 사용된다.
핵산 서열, 벡터, 발현 카세트 및 rAAV 바이러스 벡터를 함유하는 이들 약제학적 조성물을 제조하기 위해, 서열 또는 벡터 또는 바이러스 벡터는 바람직하게는 통상적인 방법에 의해 오염에 대해 평가되고 그런 다음 눈에 투여하기에 적합한 약학 조성물로 제제화된다. 이러한 제형은 특히 눈에 투여하기에 적합한, 약제학적으로 및/또는 생리학적으로 허용 가능한 운반체 또는 담체, 예를 들어 완충 식염수 또는 다른 완충제, 예를 들어, 적절한 생리학적 수준에서 pH를 유지하기 위한 HEPES, 및 선택적으로, 다른 의약제, 안정화제, 담체, 보조제, 희석제, 계면활성제 또는 부형제 등의 사용을 포함한다. 주입을 위해, 담체는 전형적으로 액체일 수 있다. 예시적인 생리학적으로 허용 가능한 담체는 멸균, 발열원이 없는 물 및 멸균, 발열원이 없는, 인산염 완충 식염수를 포함한다. 다양한 이러한 공지된 담체는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공보 제 7,629,322호에서 제공된다. 한 양태에서, 담체는 등장성 염화나트륨 용액이다. 다른 양태에서, 담체는 평형 염 용액이다. 한 양태에서, 담체는 트윈을 포함한다. 바이러스를 장기 보존해야 하는 경우, 이는 글리세롤 또는 트윈20의 존재 하에 냉동될 수 있다.
특정 양태에서, 인간 환자에게 투여하기 위해, rAAV는 적합하게는 식염수, 계면활성제, 및 생리학적으로 적합한 염 또는 염의 혼합물을 함유하는 수용액에 현탁된다. 적합하게는, 제제는 생리학적으로 허용 가능한 pH, 예를 들어, pH 6 내지 9, 또는 pH 6.5 내지 7.5, pH 7.0 내지 7.7, 또는 pH 7.2 내지 7.8의 범위로 조정된다. 뇌척수액의 pH가 약 7.28 내지 약 7.32이므로, 척수강 내 전달을 위해, 이러한 범위 내의 pH가 바람직할 수 있으며; 반면 유리체내 또는 망막하 전달을 위해, 6.8 내지 약 7.2의 pH가 바람직할 수 있다. 하지만, 가장 넓은 범위 및 이들 하위 범위 내의 다른 pH가 다른 전달 경로를 위해 선택될 수 있다.
적합한 계면활성제, 또는 계면활성제의 조합은 비독성인 비이온성 계면활성제 중에서 선택될 수 있다. 한 양태에서, 예를 들어, 중성 pH, 8400의 평균 분자량을 가지는, 또한 폴록사머 188로 알려진 플루로닉® F68 [BASF]와 같은 1차 히드록실기에서 종결되는 2작용성 블록 공중합체 계면활성제가 선택된다. 다른 계면활성제 및 다른 폴록사머, 즉, 2개의 친수성 사슬의 폴리옥시에틸렌 (폴리에틸렌 옥사이드)로 둘러싸인 중심 소수성 사슬의 폴리옥시프로필렌 (폴리프로필렌 옥사이드)로 구성된 비이온성 삼블록 공중합체, SOLUTOL HS 15 (마크로골-15 히드록시스테아레이트), LABRASOL (폴리옥시 카르릴릭 글리세리드), 폴리옥시 10 올레일 에테르, 트윈 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르), 에탄올 및 폴리에틸렌 글리콜이 선택될 수 있다. 한 양태에서, 제제는 폴록사머를 함유한다. 이들 공중합체는 일반적으로 문자 "P" (폴록사머) 다음에 3자리 숫자로 명명되며: 처음 두 자리 숫자 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략의 분자 질량을 제공하고, 마지막 숫자 x 10은 폴리옥시에틸렌 함량 백분율을 제공한다. 한 양태에서 폴록사머 188이 선택된다. 계면활성제는 현탁액의 약 0.0005 % 내지 약 0.001%까지의 양으로 존재할 수 있다.
한 예시에서, 제제는 예를 들어, 하나 이상의 염화나트륨, 중탄산 나트륨, 덱스트로스, 황산 마그네슘 (예를 들어, 황산 마그네슘 -7H20), 염화 칼륨, 염화 칼슘 (예를 들어, 염화 칼슘 -2H20), 이염기성 인산 나트륨, 및 이의 혼합물을 포함하는 완충 식염수 용액을 물 중 함유할 수 있다. 적합하게는, 척수강 내 전달을 위해, 삼투압은 뇌척수액과 호환되는 범위 (예를 들어, 약 275 내지 약 290) 내 이다; 예를 들어, emedicine.medscape.com/article/2093316-overview를 참조. 선택적으로, 척수강 내 전달을 위해, 상업적으로 이용 가능한 희석제가 현탁제로서, 또는 또 다른 현탁제 및 다른 선택적 부형제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, Elliotts B® 용액 [Lukare Medical]을 참조. 다른 양태에서, 제제는 하나 이상의 투과 증강제를 함유할 수 있다. 적합한 투과 증강제의 예시는 예를 들어, 만니톨, 소디움 글리코콜레이트, 소디움 타우로콜레이트, 소디움 디옥시콜레이트, 소디움 살리실레이트, 소디움 카프릴레이트, 소디움 카프레이트, 소디움 라우릴 술페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우렐 에테르, 또는 EDTA를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 조성물은 담체, 희석제, 부형제 및/또는 보조제를 포함한다. 적합한 담체는 전이 바이러스가 지시되는 표시의 관점에서 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 담체는 다양한 완충 용액 (예를 들어, 인산염 완충 식염수)으로 제형화될 수 있는 식염수를 포함한다. 다른 예시적인 담체는 멸균 식염수, 락토오스, 수트로오스, 인산 칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩 오일, 참기름, 및 물을 포함한다. 완충제/담체는 rAAV가 주입 튜브에 접착되는 것을 방지하지만, 생체 내에서 rAAV 결합 활성을 방해하지 않는 구성 요소를 포함하여야 한다.
선택적으로, 본 발명의 조성물은 rAAV 및 담체(들), 다른 통상적인 약제학적 성분, 예를 들어 보존제, 또는 화학 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 소르브산 칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 상기 정의된 바와 같은, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 적합하게는, 본원에서 기술된 조성물은 약제학적으로 적합한 담체에 현탁되고/되거나 주사, 삼투 펌프, 척수강 내 카테터를 통한 대상으로의 전달, 또는 또 다른 장치 또는 경로에 의한 전달을 위해 설계된 적합한 부형제와 혼합된 유효량의 하나 이상의 AAV를 포함한다. 한 예에서, 조성물은 유리체내 전달을 위해 제형화된다. 한 예에서, 조성물은 망막하 전달을 위해 제형화된다.
하나의 예시적인 특정 양태에서, 담체 또는 부형제의 조성물은 180 mM NaCl, 10 mM NaPi, pH 7.3, 0.0001% 내지 0.01% 플루로닉 F68 (PF68)을 함유한다. 완충제의 식염수 성분의 정확한 조성은 160 mM 내지 180 mM NaCl의 범위이다. 선택적으로, 상이한 pH의 완충제 (잠재적으로 HEPES, 중탄산 나트륨, TRIS)가 구체적으로 기술된 완충제 대신에 사용된다. 여전히 대안적으로, 0.9% NaCl을 함유하는 완충제가 유용하다.
AAV 바이러스 벡터의 경우, 게놈 카피 ("GC"), 벡터 게놈 ("VG"), 또는 바이러스 입자의 정량화가 제제 또는 현탁액에 함유된 용량의 측정치로서 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 방법이 본 발명의 복제-불완전 바이러스 조성물의 게놈 카피 (GC) 수를 측정하기 위해 사용될 수 있다. AAV GC 수 적정을 수행하기 위한 한 가지 방법은 하기와 같다: 정제된 AAV 벡터 시료는 생산 과정에서 캡시드화되지 않은 AAV 게놈 DNA 및 오염 플라스미스 DNA를 제거하기 위해 DNA 분해효소로 우선 처리한다. 그런 다음 DNA 분해효소 저항성 입자를 캡시드로부터 게놈을 방출시키기 위해 열처리를 시킨다. 그런 다음 방출된 게놈을 바이러스 게놈의 특정 부위 (일반적으로 폴리 A 신호)를 표적화하는 프라이머/프로브 세트를 사용하여 실시간 PCR에 의해 정량화한다. 또 다른 방법에서 최적화된 레베르실린 코딩 서열을 암호화하는 핵산 서열을 운반하는 재조합 아데노 관련 바이러스의 유효량을 그 전체가 참조로서 포함된, S.K. McLaughlin et al, 1988 J. Virol., 62:1963에서 기술된 바와 같이 측정한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여량"은 치료 과정에서 대상에 전달되는 총 투여량, 또는 단일 유닛 (또는 다중 유닛 또는 분할 투여량) 투여에서 전달된 양을 지칭할 수 있다. 약제학적 바이러스 조성물은 본원에서 기술된 바와 같이 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 약 1.0 x 109 GC 내지 약 1.0 x 1015 GC의 범위인 코돈 최적화된 레베르실린을 암호화하는 핵산 서열을 운반하는 복제-불완전 바이러스의 양을 함유하도록 투여량 단위로 제형화될 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 또는 9x109 GC를 함유하도록 제형화된다. 다른 양태에서, 조성물은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1010, 2x1010,3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 또는 9x1010 GC를 함유하도록 제형화된다. 다른 양태에서, 조성물은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1011, 2x10u, 3x10u, 4x10u, 5x10u, 6x10u, 7x10u, 8x10u, 또는 9x1011 GC를 함유하도록 제형화된다. 다른 양태에서, 조성물은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012 GC를 함유하도록 제형화된다. 다른 양태에서, 조성물은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013, 또는 9x1013 GC를 함유하도록 제형화된다. 다른 양태에서, 조성물은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 또는 9x1014 GC를 함유하도록 제형화된다. 다른 양태에서, 조성물은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 또는 9x1015 GC 를 함유하도록 제형화된다. 한 양태에서, 인간 적용을 위해 용량은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 1x1010 내지 약 1x1012 GC의 범위일 수 있다. 모든 투여량은 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2): 115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131에서 기술된 바와 같은, oqPCR 또는 디지털 액적 PCR (ddPCR)에 의해 측정된 것을 포함하는 임의의 공지된 방법에 의해 측정될 것이다.
한 양태에서, LCA 환자에 투여하기에 적합한 수성 현탁액이 제공된다. 현탁액은 LCA의 치료제로서 유용한 본원에서 기술된 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)의 눈 당 수성 현탁 액체 및 약 1 xl010 GC 또는 바이러스 입자 내지 약 1 xl012 GC 또는 바이러스 입자를 포함한다.
다중 "부스터" 투여량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들어, 안구 표적 세포 내 이식유전자의 지속 기간에 따라, 6개월 간격으로, 또는 첫 번째 투여 후 매년 부스터 투여량을 전달할 수 있다. rAAV 벡터의 투여에 의해 AAV-중화 항체가 생성되지 않았다는 사실은 추가 부스터 투여를 허용해야 한다.
이러한 부스터 투여량 및 그 필요성은 예를 들어, 하기 실시예에 기술된 망막 및 시각 기능 검사 및 시각 거동 검사를 사용하여 주치의에 의해 모니터링될 수 있다. 다른 유사한 검사가 시간에 걸쳐 치료된 대상의 상태를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 적절한 검사의 선택은 주치의에 의해 이루어질 수 있다. 여전히 대안적으로, 본 발명의 방법은 야생형 망막에서 발견되는 것과 가까운 시각 기능 수준을 허용하기 위해 단일 또는 다중 감염에서 더 많은 부피 바이러스- 함유하는 용액의 주사를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 벡터, 바이러스 및 레베르실린을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열을 운반하는 본원에서 기술된 복제-불완전 바이러스의 양은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 눈 당 약 1.0 x 107 VG 내지 눈 당 약 1.0x1015 VG의 범위이다. 한 양태에서, 이의 양은 적어도 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 또는 9x107 VG 눈 당 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 한 양태에서, 이의 양은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 눈 당 적어도 1x10s, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 또는 9x108 VG이다. 한 양태에서, 이의 양은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 눈 당 적어도 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 또는 9x109 VG이다. 한 양태에서, 이의 양은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 눈 당 적어도 1x1010, 2x1010,3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 또는 9x1010 VG이다. 한 양태에서, 이의 양은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 눈 당 적어도 1x1011, 2x10u, 3x10u, 4x10u, 5x10u, 6x10u, 7x10u, 8x10u, 또는 9x10u VG이다. 한 양태에서, 이의 양은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 눈 당 적어도 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012 VG이다. 한 양태에서, 이의 양은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 눈 당 적어도 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013, 또는 9x1013 VG이다. 한 양태에서, 이의 양은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 눈 당 적어도 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 또는 9x1014 VG이다. 한 양태에서, 이의 양은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 또는 9x1015 GC이다. 한 양태에서, 방법은 범위 내 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는 용량 당 눈 당 1x109 내지 약 1x1013 VG의 범위의 용량을 포함한다. 다른 양태에서, 방법은 수성 현탁액에서의 벡터의 전달을 포함한다. 다른 양태에서, 방법은 본원에서 기술된 rAAV를 약 또는 적어도 150 마이크로리터 부피에서 1 x 109 내지 1x1013 GC의 투여량으로써, 상기 대상에서 시각 기능을 회복시키는 것을 포함한다. 모든 투여량은 예를 들어, 본원에 참조로 포함된, M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2): 115-25. doi:10.1089/hgtb.2013.131에서 기술된 바와 같이 oqPCR 또는 디지털 액적 PCR (ddPCR)에 의해 측정된 것 포함하는 임의의 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
이들 상기 용량은 치료될 영역의 크기, 사용된 바이러스 역가, 투여 경로, 및 방법의 원하는 효과에 따라 범위 내 모든 수를 포함하여, 약 25 내지 약 1000 마이크로리터 범위의 다양한 부피의 담체, 부형제 또는 완충제 제형으로 투여될 수 있다. 한 양태에서, 담체, 부형제 또는 완충제의 부피는 적어도 약 25 μL이다. 한 양태에서, 부피는 약 50 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 75 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 100 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 125 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 150 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 175 μL이다. 또 다른 양태에서, 부피는 약 200 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 225 μL이다. 또 다른 양태에서, 부피는 약 250 μL이다. 또 다른 양태에서, 부피는 약 275 μL이다. 또 다른 양태에서, 부피는 약 300 μL이다. 또 다른 양태에서, 부피는 약 325 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 350 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 375 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 400 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 450 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 500 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 550 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 600 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 650 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 700 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 800 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 150 내지 800 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 윈 약 700 내지 1000 μL이다. 다른 양태에서, 부피는 약 250 내지 500 μL이다.
한 양태에서, 바이러스 작제물은 마우스와 같은 소동물 대상에 대해 약 1 μL 내지 약 3 μL의 부피 내에 적어도 1x109 내지 약 1x1011 GC의 용량으로 전달될 수 있다. 인간 눈과 거의 동일한 크기인 눈을 가지는 더 큰 동물 대상에 대해, 상기에서 언급한 더 큰 인간 투여량 및 부피가 유용하다. 다양한 동물에 대한 물질 투여에 관한 우수 사례의 논의를 위해 예를 들어, Diehl et al, J. Applied Toxicology, 21:15-23 (2001)를 참조한다. 이 문서는 본원에 참조로 포함된다
바람직하지 않은 효과, 예를 들어 독성, 망막 이형성증 및 분리의 위험을 감소시키기 위해 바이러스 또는 다른 전달 운반체의 최저 유효 농도가 이용되는 것이 바람직하다. 이들 범위에서의 또 다른 투여량은 치료중인 대상, 바람직하게는 인간의 신체 상태, 대상의 연령, LCA 및 장애가 진행성이고 발달된 경우, 이의 정도를 고려하여 주치의에 의해 선택될 수 있다.
본원에서 기술된 또 다른 측면은 포유류 대상에서 LCA의 진행을 치료하는, 지연시키는 또는 정지시키는 방법이다. 한 양태에서, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 담체, 희석제, 부형제 및/또는 보조제에 현탁된, 레베르실린 천연, 변형된 또는 코돈 최적화된 서열을 운반하는 rAAV가 인간 대상을 포함하는 원하는 대상에 투여될 수 있다. 이러한 방법은 임의의 핵산 서열, 발현 카세트, rAAV 게놈, 플라스미드, 벡터 또는 rAAV 벡터 또는 이를 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 망막하로 전달된다. 다른 양태에서, 조성물은 유리체내로 전달된다. 또 다른 양태에서, 조성물은 LCA의 치료에 적합한 투여 경로의 조합을 사용하여 전달되고, 또한 안검 정맥 또는 다른 정맥 내 또는 통상적인 투여 경로를 통한 투여를 포함할 수 있다.
이들 방법에서 사용하기 위해, 각각의 투여량의 부피 및 바이러스 역가가 추가로 본원에서 기술된 바와 같이 개별적으로 측정되고, 동일, 또는 반대측 눈에서 수행된 다른 치료와 동일하거나 상이할 수 있다. 투여량, 투여 및 요법은 본 명세서의 교시가 주어진 주치의 주치의에 의해 결정될 수 있다. 한 양태에서, 조성물은 영향을 받은 눈에 상기 열거된 것으로부터 선택된 단일 투여량으로 투여된다. 다른 양태에서, 조성물은 영향을 받은 눈 모두에 상기 열거된 것으로부터 선택된 단일 투여량으로, 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 순차적 투여는 한 눈에서 다른 눈으로의 수 분, 시간, 일, 주 또는 개월 간격의 시간 간격 투여를 의미할 수 있다. 다른 양태에서, 방법은 조성물은 눈에 2회 이상의 투여량 (예를 들어, 분할 투여량)으로 투여하는 것을 포함한다. 다른 양태에서, 다중 주사는 동일 눈의 상이한 부분에서 이루어진다. 다른 양태에서, 선택된 발현 카세트 (예를 들어, LCA5 함유하는 카세트)를 포함하는 rAAV의 2차 투여는 이후 시점에 수행된다. 이러한 시점은 첫 번째 투여 이후 수 주, 수개월 또는 수년일 수 있다. 이러한 두 번째 투여는, 한 양태에서, 첫 번째 투여의 rAAV와 상이한 캡시드를 가지는 rAAV로 수행된다. 다른 양태에서, 첫 번째 및 두 번째 투여로부터의 rAAV는 동일한 캡시드를 가진다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술된 조성물은 단일 조성물 또는 다중 조성물로 전달될 수 있다. 선택적으로, 둘 이상의 상이한 AAV, 또는 다중 바이러스 [예를 들어, WO 2011/126808 및 WO 2013/049493을 참조]가 전달될 수 있다. 다른 양태에서, 다중 바이러스는 상이한 복제-불완전 바이러스 (예를 들어, AAV 및 아데노바이러스)를 함유할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 치료법이 표적으로 하는 간상체 및 추상체 광수용체의 영역을 확인할 뿐만 아니라 치료의 효능을 시험하기 위해 비침습적 망막 이미징 및 기능적 연구를 수행하는 것이 바람직하다. 이들 양태에서, 임상 진단 검사는 하나 이상의 망막하 주사(들)을 위한 정확한 위치(들)을 결정하기 위해 사용된다. 이들 검사는 치료될 대상의 종, 이들의 신체 상태 및 건강 및 투여량에 따라 망막전위도검사 (ERG), 시야측정, 망막 층의 지형 매핑 및 공초점 스캐닝 레이저 검안경검사 (cSLO) 및 광간섭단층촬영장치 (OCT) 수단에 의한 그의 층 두께의 측정, 보정 광학 (AO)을 통한 추상체 밀도의 지형 매핑, 기능적 안구 검사, 다중 전극 어레이 (MEA), 동공 광 반응 등을 포함할 수 있다. 이미징 및 기능적 연구의 관점에서, 본 발명의 일부 양태에서, 영향을 받은 눈의 상이한 영역을 표적화하기 위해 동일한 눈에서 하나 이상의 주사가 수행된다. 각각의 주사의 부피 및 바이러스 역가는 추가로 본원에서 기술된 바와 같이 개별적으로 측정되고, 동일, 또는 반대측, 눈에서 수행된 다른 주사와 동일하거나 상이할 수 있다. 다른 양태에서, 전체 눈을 치료하기 위해 단일의, 더 큰 부피의 주사가 이루어진다. 한 양태에서, rAAV 조성물의 부피 및 농도는 손상된 안구 세포의 부위만이 영향을 받도록 선택된다. 다른 양태에서, rAAV 조성물의 부피 및/또는 농도는 비-손상된 광수용체를 포함하는 눈의 더 큰 부분에 도달하기 위해 더 많은 양이다.
다른 양태에서, 방법은 치료 효능을 측정하기 위해 추가 연구, 예를 들어, 기능적 및 이미징 연구를 수행하는 단계를 포함한다. 동물 검사의 경우, 이러한 검사는 간상체 및 추상체 광수용체 기능을 관찰하는 망막전위 (ERG)를 통한 망막 및 시각 기능 평가, 시선이동 안진, 동공이동, 수중 미로 시험, 명암 선호, 광간섭단층촬영장치 (망막의 다양한 층의 두께를 측정하기 위함), 조직학 (망막 두께, 외부 핵층의 핵 열, 이식유전자 발현을 기록하기 위한 면역형광, 추상체 광수용체 계수, 추상체 광수용체 수초를 확인하는 땅콩 아글루티닌(agglutinin)을 사용한 망막 절편의 염색)을 포함한다.
특히 인간 대상에 대해, 본 명세서에 기술된 조성물의 투여 후, 대상을 치료 효능에 대해 간상체 및 추상체 광수용체 기능을 검사하기 위해 망막전위 (ERG), 동공이동 시력, 대비 민감도 색상 시력 검사, 시각 필드 검사 (험프리 시각 필드/골드만 시각 필드), 시야측정 운동성 검사 (장애물 코스), 및 판독 속도 검사를 사용하여 검사하였다. 본원에서 기술된 약학 조성물로 치료한 후 대상을 노출시킨 다른 유용한 처리 후 효능 시험은 자기 공명 영상법(fMRI), 전장 감광성 검사, 광간섭단층촬영장치(optical coherence tomography), 안저(fundus) 촬영, 안저 자가형광, 보정 광학 레이저 스캐닝 검안경검사(ophthalmoscopy), 이동성 검사, 판독 속도 및 정확성 검사, 미세시야측정(microperimetry) 및/또는 검안경검사를 포함하는 망막 구조 연구이다. 이들 및 다른 효능 시험은 참조로 포함된 미국 특허 제 8,147,823호; 동시 출원 중인 국제 특허 출원 공보 WO 2014/011210 또는 WO 2014/124282에 기술되어 있다.
본원에서 기술된 방법의 한 양태에서, 본원에서 기술된 바와 같은 조성물의 1회 안구 내 전달, 예를 들어, 최적화된 LCA5 카세트의 AAV 전달은 대상에서 LCA를 치료하는데 유용하다. 본원에서 기술된 방법의 다른 양태에서, 본원에서 기술된 바와 같은 조성물의 1회 안구 내 전달, 예를 들어, 최적화된 LCA5 카세트의 AAV 전달은 위험한 대상에서 LCA를 치료하는데 유용하다.
따라서, 한 양태에서, 조성물은 질환 발병 전에 투여된다. 다른 양태에서, 조성물은 시력 장애 또는 상실의 개시 이전에 투여된다. 다른 양태에서, 조성물은 시력 장애 또는 상실의 개시 후에 투여된다. 또 다른 양태에서, 조성물은 90% 미만의 간상체 및/또는 추상체 또는 광수용체가 병에 걸리지 않은 눈과 비교하여 기능하거나 유지되는 경우 투여된다. 한 양태에서, 신생아 치료는 본원에서 기술된 바와 같은 레베르실린 코딩 서열, 발현 카세트 또는 벡터가 분만 8 시간, 처음 12 시간, 처음 24 시간, 또는 처음 48 시간 이내에 투여되는 것으로 정의한다. 다른 양태에서, 특히 영장류 (인간 또는 비-인간)의 경우, 신생아 분만은 약 12 시간 내지 약 1 주, 2 주, 3 주, 또는 약 1개월, 또는 약 24 시간 내지 약 48 시간 후의 기간 이내이다. 다른 양태에서, 조성물은 증상의 발병 후 전달된다. 한 양태에서, 환자의 치료 (예를 들어, 첫번째 주사)는 생후 첫 1 년 이전에 개시된다. 다른 양태에서, 치료는 첫 1 년 후, 또는 첫 2 내지 3 세 이후, 5 세 이후, 11 세 이후, 또는 더 많은 나이에서 개시된다. 한 양태에서, 치료는 약 4 세 내지 약 12 세의 나이에 개시된다. 한 양태에서, 치료는 약 4 세 또는 그 이후에 개시된다. 한 양태에서, 치료는 약 5 세 또는 그 이후에 개시된다. 한 양태에서, 치료는 약 6 세 또는 그 이후에 개시된다. 한 양태에서, 치료는 약 7 세 또는 그 이후에 개시된다. 한 양태에서, 치료는 약 8 세 또는 그 이후에 개시된다. 한 양태에서, 치료는 약 9 세 또는 그 이후에 개시된다. 한 양태에서, 치료는 약 10 세 또는 그 이후에 개시된다. 한 양태에서, 치료는 약 11 세 또는 그 이후에 개시된다. 한 양태에서, 치료는 약 12 세 또는 그 이후에 개시된다. 하지만, 치료는 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 또는 약 40 세에 개시될 수 있다. 한 양태에서, 자궁에서의 치료는 태아에서 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 투여하는 것으로 정의된다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된, David et al, Recombinant adeno- associated virus-mediated in utero gene transfer gives therapeutic transgene expression in the sheep, Hum Gene Ther. 2011 Apr;22(4):419-26. doi: 10.1089/hum.2010.007. Epub 2011 Feb 2를 참조.
다른 양태에서, 조성물은 나중에 재투여된다. 선택적으로, 하나 이상의 재투여가 허용된다. 이러한 재투여는 동일 유형의 벡터, 상이한 바이러스 벡터, 또는 본원에서 기술된 바와 같은 비바이러스성 전달을 통해 이루어질 수 있다. 한 양태에서, 벡터는 초기에 주입된 망막의 상이한 부분으로 환자에게 재투여된다. 한 양태에서, 벡터는 초기에 주입된 망막의 동일한 부분으로 환자에게 재투여된다.
또 다른 양태에서, 임의의 상기 기술된 방법은 또 다른, 또는 이차, 치료법과 조합하여 수행된다. 이차 치료법은 이들 돌연변이 또는 결함 또는 이와 관련된 임의의 효과를 예방, 정지 또는 개선시키는 것을 돕는 공지된, 또는 아직 알려지지 않은 치료법일 수 있다. 이차 치료법은 상기 기술된 조성물의 투여 전, 동시, 또는 후에 투여될 수 있다. 한 양태에서, 2차 치료법은 신경 영양 인자, 항산화제, 항세포사멸제의 투여와 같은 망막 세포의 건강을 유지하기 위한 비특이적 접근법을 포함한다. 비특이적 접근법은 단백질, 재조합 DNA, 재조합 바이러스 벡터, 줄기 세포, 태아 조직, 또는 유전자 변형 세포의 주사를 통해 달성된다. 후자는 캡슐화된 유전자 변형 세포를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 재조합 rAAV를 생성하는 방법은 상기 기술된 바와 같은 AAV 발현 카세트를 함유하는 플라스미드를 수득하고 AAV 바이러스 게놈을 감염성 AAV 외피 또는 캡시드로의 패키징을 허용하는 충분한 바이러스 서열의 존재 하에서 플라스미드를 운반하는 패키징 세포를 배양하는 것을 포함한다. rAAV 벡터 생성의 특정 방법은 상기에 기술되어 있고 발현 카세트 및 상기 기술된 게놈 및 하기 실시예에서 코돈 최적화된 LCA5를 전달할 수 있는 rAAV 벡터를 생성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 대상은 본 발명의 구성 요소, 조성물 및 방법이 치료하도록 설계된, 레베르 선천성 흑암시 (LCA)를 가진다. 본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 사용된 용어 "대상"은 인간, 수의 또는 농장 동물, 가축 또는 애완 동물, 및 임상 연구를 위해 일반적으로 사용되는 동물을 포함하는, 포유류 동물을 의미한다. 한 양태에서, 이들 방법 및 조성물의 대상은 인간이다. 또 다른 적합한 대상은 쥐, 랫트, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 비-인간 영장류 및 다른 것을 제한없이 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 "환자"와 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료(treatment)" 또는 "치료하는(treating)"은 LCA의 하나 이상의 증상의 개선을 목적으로 본원에서 기술된 하나 이상의 화합물 또는 조성물을 대상에 대해 투여하는 것을 포함하는 것으로 정의된다. "치료"는 따라서 하나 이상의 LCA의 발병 또는 진행의 감소, 질환 예방, 질환 증상의 중증도 감소, 또는 실명의 진행을 포함하는, 이들의 진행 지연, 질환 증상 제거, 질환 발병 지연 또는 주어진 대상에서 질환 진행 또는 치료법 효능 모니터링을 포함한다.
용어 "a" 또는 "an"은 하나 이상을 지칭하는 것을 유의해야 한다. 이와 같이, 용어 "a" (및 "an"), "하나 이상의(one or more)," 및 "적어도 하나의(at least one)"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
단어 "포함한다(comprise)", "포함한다(comprises)", 및 "포함하는(comprising)"은 배타적이 아닌 포괄적으로 해석되어야 한다. 단어 "이루어지다(consist)", "이루어지는(consisting)", 및 그의 변이는 포괄적이 아닌 배타적으로 해석되어야 한다. 본 명세서의 다양한 양태는 "포함하는" 언어를 사용하여 제시되지만, 다른 상황에서, 관련 양태는 또한 "로 이루어지는(consisting of)' 또는 "로 본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)' 언어를 사용하여 해석되고 기술되도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "질환", "장애" 및 "병태"는 대상에서 비정상적 상태를 나타내기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약(about)" 또는 "~"은 달리 명시되지 않는 한, 주어진 참고 문헌으로부터 10%의 변동성을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "조절(regulation)" 또는 이의 변이는 생물학적 경로의 하나 이상의 구성 요소를 저해하는 조성물의 능력을 지칭한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학 용어는 당업자 및 본 출원에서 사용되는 다수의 용어에 대해 당업자에게 일반적 지침을 제공하는 공개된 참조문헌에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시일 뿐이며, 본 발명을 제한하고자 의도하지 않는다.
실시예 1: 재조합 rAAV 및 시험관 내 발현 연구
가장 철저하게 연구된 재조합 AAV 혈청형, AAV2를 사용하여 망막 유전자 전달을 인간 대상에서 310개 이상의 눈, 및 29개의 상이한 임상 시험 (clinicaltrials.gov)에서 수행하였다. 이 시험은 상염색체 결함 (RPE65 결핍, MERTK 돌연변이로 인한 색소성 망막염(retinitis pigmentosa), 맥락막결손(choroideremia), 전색맹(achromatopsia)), 미토콘드리아 질환 (레베르 유전성 시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy)), 노년기 황반 변성의 합병증 (맥락막 신혈관형성(choroidal neovascularization)) 및 말기 망막 변성을 포함하는 다양한 질환을 표적으로 한다 (광유전 치료법을 사용). 이들 연구의 대부분 (18/29 또는 AAV 및 망막 하 주사를 사용한 22개의 연구 중 18개)에서, 목표는 RPE 세포를 효율적으로 표적화하는 것이었다. 그 결과 AAV의 안구 내 전달과 관련하여 많은 양의 안전성 데이터가 생성되었다. 망막하 주사는 LCA5 환자에서 광수용체를 표적화하는 데 필요한 동일한 외과적 접근법이다.
획득된 정보에 기초하여 LCA5 및 1차 광수용체 결함을 포함하는 다른 질환을 극복하기 위한 경로를 개발하기 위해 많은 노력을 기울였다. 불행하게도, AAV2 벡터는 효율적으로 광수용체를 표적화하지 않으며, 상기 언급된 바와 같이, 광수용체는 LCA5의 1차 세포 유형 및 대부분의 다른 유전 망막 변성을 포함한다. 이러한 이유로, 진화적 설계에 의해 생성된 벡터, AAV7m8이 선택되었다. 이러한 벡터는 다양한 종 (마우스 및 비-인간 영장류 (NHP))에서 상이한 투여 경로를 사용하여 광수용체를 효율적으로 표적화하는 것으로 나타났다.
본원에서 보고된 효능은 치료된 동물의 시각 신호를 사용하여 탐색하는 능력의 개선, 동공측정에 의해 나타난 바와 같은 뇌로의 시각 경로의 회복, 광수용체 세포사멸의 감소, 및 외부 망막의 로돕신의 존재를 포함하는, 이러한 세포 유형의 형태 및 마커 특징을 가지는 기능적 광수용체의 보존을 포함한다. 처리된 Lca5gt/gt 광수용체는 적층된 외부 세그먼트 디스크와 함께 보존된 외부 세그먼트를 가지는 두꺼운 외부 핵 층을 보여준다. 이는 19세 3개월까지 단일 열의 비-인접한 광수용체 핵으로 감소된, 처리되지 않은 Lca5gt/gt 망막과 현저하게 대조적이다. 개선은 영구적이지 않았다. 하지만, 이들은 처리되지 않은 Lca5gt/gt 마우스에 남아있는 광수용체가 없는 시점에 적어도 3개월 동안 지속하였다. 망막전위도검사 및 MEA 결과는 광수용체의 성공적인 형질도입으로 LCA5 유전자 치료가 간상체 및 추상체 광수용체 모두에 의해 적어도 부분적으로 매개된 반응을 회복할 수 있음을 보여준다. 세포의 반응은 처리되지 않은 Lca5gt/gt 망막에서 관찰된 지배적인 멜라놉신 반응의 역전뿐만 아니라 다양한 신경절 세포 유형의 활성을 반영하는 반응을 포함하는 근사 정상 동역학을 가진다. 결과는 동공이동 및 시각 행동 결과와 상보적이며, 치료 효과를 추가로 특징화하고 최적화하는 것을 목적하는 향후 연구 (낮은 조도 조건에서의 시각 행동 연구를 포함)를 위한 뼈대를 제공할 것이다. 이들 데이터는 Lca5gt/gt 마우스에서 사용된 것과 유사한 인간에서의 유전자 증강 접근법이 개선된 시력 초래할 수 있다는 희망을 제공한다. 훨씬 더욱 견고한 구조 효과를 획득하기 위해 중재를 추가로 최적화하는 것이 가능할 수 있다. 이식유전자 카세트의 구성 요소 (프로모터 등), 및 치료된 망막 영역의 변경은 추가 혜택을 초래할 수 있다. 투약 연구는 치료 효과를 위한 최적 용량을 확인하여야 한다. LCA5가 없는 환자가 성인까지 광수용체를 보유할 수 있다는 사실 (반면 마우스에서 생애 초기에 광수용체가 손실됨)은 Lca5-/- 마우스에 비해 LCA5 인간에서 더 많은 기회 창이 있을 수 있다는 것을 제시한다. LCA5가 없는 인간의 중심와(foveal) 외부 핵 층에서 최대 30년 동안 광수용체가 기록되어 있다. 성공적인 유전자 치료는 영향을 받은 세포가 존재하는 것이 필요하기 때문에 중요하다. LCA5 돌연변이를 가지는 성인에서 보유한 광수용체가 정상 시력 개체로부터의 광수용체와 유사한 시간적 패턴의 광반응성(진폭은 감소됨)을 보여준다는 것을 입증할 수 있었다. 이들 결과는 LCA5 환자의 잔류 광수용체가 구조적 및 생리학적 결함에도 불구하고 기능적임을 나타낸다. LCA5 돌연변이 환자로부터 유래한 iPSC-RPE의 1차 섬모는 대조군 세포로부터의 것들보다 훨씬 적었다. Lca5gt/gt 마우스의 광수용체의 섬모 결손이 유전자 증강 치료법에 의해 교정될 수 있고, 섬모의 수가 정상 수준으로 증가할 수 있다는 사실은 이러한 병태를 가진 인간에서 존재하는 섬모 결손이 개선될 수 있음을 제안한다.
A. 재조합 AAV
AAV2보다 더 효율적으로 광수용체를 감염시키는 것으로 알려진 AAV7m8 캡시드를 사용하여 [Center for Advanced Retinal and Ocular Therapeutics (CAROT)]에서 재조합 AAV를 생성하였다(Dalkara D, Byrne LC, Klimczak RR, Visel M, Yin L, Merigan WH, et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med (2013) 5(189): 189ra76. doi:10.1126/scitranslmed.3005708.) 인간 (h) 야생형 레베르실린-암호화 최적화 cDNA (hopt.LCA5)는 최적 코돈 사용을 위해 맞춤 설계하고 DNA2.0 (Menlo Park, CA)에 의해 합성하였다. LCA5 cDNA를 인트론 1 서열로 둘러싸인 교배 닭 β-액틴 (CBA) 엑손 1의 제어 하에 두고 시토메갈로바이러스 (CMV) 전초기 인핸서와 함께 배치하였다 (도 1a 및 1e). 소 성장 호르몬 폴리(A)를 cDNA 뒤에 배치하였다. AAV2 역 말단 반복으로부터의 역 패키징 (즉, 비-이식유전자를 함유함) 벡터를 방지하기 위해 긴 스터퍼 서열을 포함하였다. 벡터를 삼중 형질주입에 의해 제조하였고 0.001% 플루로닉 F68 (PF68)을 함유하는 인산염-완충 식염수 (PBS)로 이루어진 부형제에서 제제화하였다. 예를 들어 문헌[Mizukami, Hiroaki, et al. A Protocol for AAV vector production and purification. Diss. Di-vision of Genetic Therapeutics, Center for MolecularMedicine, 1998]을 참조. 대조군 벡터는 LCA5 cDNA 대신에 증진된 녹색 형광 단백질 (eGFP) cDNA를 포함하였다.
적절한 크기의 이식유전자 단백질의 발현에 대해 rAAV를 웨스턴 블랏에 의해 검사하였다. 8431 세포를 웰 당 2 x 106 세포로 플레이팅하였다. 플레이팅 후 2일에, 세포를 AAV7m8.hopt.LCA5 (또는 대조군으로서 AAV7m8.CBA.EGFP)를 사용하여 1 x 105 또는 5 x 105 vg로 형질도입시켰다. 48 시간 후, 세포를 채취하였고 전기영동 및 웨스턴 블랏을 진행하였다. 항체는 LCA5 토끼 다클론 항체 (Proteintech, Rosemont, IL)를 포함하며, 각각의 값은 배경 및 GAPDH 면역신호에 의한 정규화를 통한 단백질 로딩 차이에 대해 보정하여, 신호를 정량화한다.
AAV7m8.CBA.hopt.LCA5 바이러스는 8431 세포에서 LCA5 이식유전자의 효율적인 발현을 유도할 수 있다. AAV7m8.CBA.hopt.LCA5로 감염 후 예측된 ~8 1kDA 레베르실린 단백질의 생산은 용량-의존적 반응을 입증한다.
실시예 2: LCA 마우스 모델 Lca5-/- 마우스 연구
Lca5gt/gt 마우스 모델에서 유전자 증강 치료법의 개념 증명의 개발은 여러 과제를 수반한다: 1) 망막 퇴행성 변화가 매우 일찍 시작되고 빠르게 진행되기 때문에, 신생아 마우스에서 중재를 수행해야 한다; 2) 이것이 광수용체-특이적 질환이므로, 재조합 AAV 벡터는 표적 광수용체를 효율적으로 이용하여야 한다. RPE 세포를 표적화하기 위해 동물 및 인간 연구에서 광범위하게 사용된 AAV2 벡터는 동등한 용량으로 감염 후 상이한 혈청형의 형질도입 비교에 의해 보여준 바와 같이 다른 AAV 혈청형만큼 효율적으로 광수용체를 표적화하지 않는다. 이상적으로, 인간 임상 시험으로 궁극적으로 진행될 수 있는 치료제가 개발되어야 한다; 그리고 3) 결과 측정은 기준선에서 매우 낮아서 점수를 매기기가 어려운, 망막 및 시각 기능의 개선을 정확하게 식별하고 정량화하도록 개발되어야 한다. 코돈 최적화된 인간 레베르실린-암호화 cDNA를 전달하기 위해, 유도 진화에 의해 설계된 재조합 AAV 벡터 (AAV7m8)를 사용하였다. AAV7m8을 사용하여 생애 초기에 질환에 걸린 광수용체에 대해 LCA5를 전달함으로써, 유전자 증강 치료법은 Lca5gt/gt 마우스 망막의 구조적 개선 및 시력의 기능적 개선 둘 다를 유발한다.
레베르실린은 광수용체 세포의 연결 섬모에 국소화된다 (22). 연결 섬모는 단백질 및 막 소포의 선택적 수송을 지원하는 안테나 유사 외부 세그먼트와 광수용체 세포체 내부 세그먼트 사이의 전이 구역이다. 따라서 연결 섬모는 섬모 미세소관 트랙을 따라 양방향 단백질 수송, 또는 편모내 운반 (IFT)을 지원하는 도관이다. 정량적 친화도 단백질체학 (친화도 정제, 질량 분석 및 생물정보학 분석) 및 유전자 조작된 마우스 모델 모두를 사용하여, Boldt 등은 LCA5 돌연변이가 IFT를 간섭함으로써,(22) 광수용체 외부 세그먼트 발달에서 초기-발병 결손 및 광수용체, 어레스틴 및 옵신에서 특징적으로 발현되는 2개의 상이한 단백질을 정확하게 수송 실패를 유발함을 입증하였다. 마우스에서 LCA5 유전자의 넉아웃은 망막 변성 표현형을 초래하였다. Lca5-/- 마우스는 탈색소 망막 패치를 발달시키고, 외부 세그먼트를 절대 발달시키지 않으며, 빛에 대한 추상체 및 간상체 ERG 반응이 결여된다. 조기에 빠르게 진행되는 망막 변성이 존재하고 생후 2개월에 ONL에 단 한 (병약한) 열의 핵이 존재한다. (22) 따라서, Lca5-/- 마우스가 LCA에 대한 동물 모델로서 활용되었다.
성체 Lca5gt/gt (Lca5-/-) 마우스를 Jackson Labs (Bar Harbor, ME)으로부터 구매하였고 형제-자매 교차에 의해 후대를 생성하였다. 연구에서 사용된 모든 동물의 유전자형의 검증을 수행하였다 (보충 방법 참조). 마우스를 12 시간 광/12 시간 암 주기에 두고, 음식/물을 임의로 제공하였다. 연방 및 기관 규정에 따라 연구를 수행하였다.
강아지 코호트에서 상기 기술한 바와 같이 (28) 망막하 주사를 신생아 마우스에서 일방적으로 수행하였다. 출생 후 5일 (PN5)에 마우스의 마취는 저체온요법이었다. 출생 후 15일 (PN15)에, 동물을 케타민/자일라진으로 마취시켰다. 표 1은 코호트 당 사용된 동물의 수를 나타낸다.
이러한 벡터가 이전에 유리체 측면으로부터 마우스 망막을 관통하여 광 수용체를 표적화하는 것으로 나타났기 때문에 AAV7m8의 유리체내 주사를 또한 수행하였다.(25) 코호트 1에서 1 μl에 총 9.20 x 109 vg로 AAV7m8.CBA.hopt.LCA5를 주입하였다 (표 1). 주사 용액은 5% v/v의 AAV7m8.CBA.EGFP를 함유하여, 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 존재를 통해 이후 시점에서 주입 영역을 확실하게 식별할 수 있었다. 추가 동물은 샴 주사를 주입받고 (코호트 2), AAV7m8.CBA.EGFP 단독 주사를 주입받거나 (코호트 3), 대조군으로서 주입되지 않은 상태로 유지하였다 (코호트 4). 주사 후, 강아지는 이유 시까지 그 어미에게 돌려보냈다.
표 1. 지정된 출생 후 일 (PN)에 주입하고 생체 내 투여 경로(ROA)를 연구한 신생아 Lca5-/-마우스의 코호트
Figure pat00001
주사 후 약 1개월에 매질이 투명하고, 망막이 분리되지 않았으며, 따라서 외과적 합병증이 없음을 증명하기 위해 검안검사를 수행하였다. 각막 및 유리체 혼탁을 가지는 임의의 동물은 추가 연구에서 배제하였다.
마우스 코호트를 사육하고 연구하였고, 주사를 출생 후 초기 (PN5) 및 청소년 (PN15) 시점에 수행하였다 (표 1). 주사는 대개 합병증이 없었다. PN5에서의 주사 후, 대부분의 동물은 추가 시험을 간섭할 수 있는 각막 또는 유리체 혼탁이 없는 것으로 밝혀졌다. 혼탁이 있는 소수의 동물은 추가 분석에서 배제하였다.
AAV7m8.CβA.hopt-LCA5 바이러스는 유리체내 (IVT) 및 망막하 (SR) 투여 (도 1c 및 1d, 각각) 후 마우스 망막에서 인간 LCA5 이식유전자의 효율적인 발현을 유도할 수 있었다 (도 1a 및 1b). 웨스턴 블랏 분석은 PN20에서 Lca5gt/gt 및 야생형 마우스에서 AAV7m8.CβA.hopt-LCA5의 안구 내 전달 후 예측된 ~81 kDa LCA5 단백질의 생산을 나타낸다 (도 1b). 면역형광 분석은 야생형 성체 망막의 ONL, 내부 세그먼트 (IS) 및 연결 섬모 (CC)에서의 레베르실린 단백질의 존재를 보여준다 (도 1e). Lca5gt/gt 망막에서 유리체내로 또는 망막하로 AAV7m8.CβA.hopt-LCA5를 주입한 후, 레베르실린은 CC 뿐만 아니라 IS 및 ONL에서 발견된다 (도 1g 및 1h). 대조적으로, 샴-주입된 Lca5gt/gt 망막에는 레베르실린이 없다 (도 1f). 게다가, IVT 주사 후, 상당수의 뮬러 세포가 레베르실린을 생산한다 (도 1g).
실시예 3: 망막/시각 기능의 검사
시각 및 망막 기능의 검사는 광단서 수중 미로 (주사 후 2 내지 3개월) , 동공측정 (주사 후 2.5개월), 다중 전극 어레이 (주사 후 3개월) 및 지시된 또는 실시예 2에서 기술된 마우스를 이용한 망막전위도검사를 포함한다. 그런 다음, 망막을 실시예 4에서 기술된 바와 같은 조직병리학 및 면역형광에 대해 평가하였다. 또한 철저한 조직 분석을 수행하였다.
A. 망막전위도검사
Lca5gt/gt 마우스 8 마리, 야생형 동물 5 마리, 및 왼쪽 눈에는 부형제 및 오른쪽 눈에는 AAV7m8. CβA.hopt- LCA5가 PN5에 유리체내로 주입된 Lca5gt/gt 마우스 16 마리로부터의 ERG를 기록하였다. Lca5gt/gt 미주입 대조군의 눈 또는 부형제가 주입된 Lca5gt/gt 눈 (총 32개의 눈) 중 어느 것도 검출 가능한 ERG 반응을 생성하지 않았다. AAV7m8. CβA.hopt-LCA5가 주입된 16개의 눈 중, 4개가 신호의 간상체-매개와 일치하는 암적응 상태에서의 희미한 섬광에 대한 ERG 반응뿐만 아니라 야생형 (WT) 혼합 간상체-추상체 ERG 파형의 더 작은, 축소된 버전과 유사한 밝은 섬광에 대한 혼합 간상체-추상체 반응을 보여주었다 (도 S2). 또한 명적응 ERG가 이들 눈에서 검출 가능하며, 명소시 반응의 추상체-매개를 제시한다. 처리 후 검출 가능한 ERG는 WT 진폭의 20 내지 25% 진폭범위였다 (도 S2). 결과는 일부 동물에서 유전자 치료 후 간상체 및 추상체 광수용체 모두에서 기능의 회복을 제시한다. 전장 ERG 결과의 불일치는 출생 초기에 수행된 이러한 기술적으로 어려운 망막하 주사 후 불완전한 망막 유효 범위 및/또는 조직 손상 (백내장, 미해결 분리, 등)이 지속될 수 있음을 반영한다. 하지만, 규모상 가변적인 또는 드문, 결과는 처리되지 않은 Lca5gt/gt 눈에서 관찰된 검출할 수 없는 ERG와는 극적으로 상이하였다.
B. 수중 미로 탐색 연구
5 챔버 수중 미로에서 잠긴 플랫폼을 포함하는 챔버를 식별하는 각각의 동물의 능력을 평가하기 위해 수중 미로 시험을 수행하였다 (도 11). 기구는 외부 광이 없는 실내에서 유지되었고 광 공급원을 검사 전에 플랫폼 바로 위에 배치하였다. 암적응 마우스를 미로의 중앙에서 풀어놓았고 중단 없이, 탐색하기 위해 60 초를 주었고, 네 발을 조명 플랫폼 상에 두었다.
마우스를 암적응시키기 전에 실내 조명 (약 200 럭스)에서 훈련을 수행하였고, 희미한 광 절차 하에서 검사를 수행하였다. 훈련 동안, 마우스가 60 초가 지나도 플랫폼을 찾지 못하는 경우, 실험자가 마우스를 플랫폼으로 안내하였다. 각각의 시험에 대해, 광 및 플랫폼을 무작위 선택을 사용하여 상이한 챔버에 두었다.
훈련 통과 기준은 9회의 순차적 시험 중 5회 이상에서 60 초 이내에 상이한 챔버로 벗어나지 않으면서, 독립적으로 정확한 챔버에 들어가서 플랫폼에 올라가는 마우스의 능력으로 정의하였다. 훈련 통과 기준에 충족된 날에 상관없이 모든 마우스를 5일 동안 훈련시켰다. 훈련에 사용된 것과 동일하지만 광원을 더 희미하게 하기 위해 일련의 필터를 사용하여 검사를 4일 동안 수행하였다. 필터의 사용을 통해 휘도는 1.06 x105, 8.69 x 103, 5.87 x 102 scot cd m2이거나, 광이 꺼진 경우, 휘도는 0 scot cd m2이었다.
동물을 훈련시킨 후 2 내지 2.5개월 령에 광-단서 수중 미로로 시험하였다. 광단서 수중 미로 시험 결과는 망막하로 또는 유리체내로 AAV7m8.CBA.hopt.LCA5가 주입된 군이 대조군보다 현저하게 더 양호하게 수행함을 보여주었다. (표 2B; 굵게 표시된 값을 참조; 도 3). 표 2A는 각각의 코호트에서 분석한 후 수중 미로를 사용하여 지정된 광 수준 하에서 시험한 동물의 수인 미가공 데이터를 나타낸다. 표 2B는 일원 분산 분석 (ANOVA)을 사용한 통계적 분석의 결과를 나타낸다. 처리된 동물은 8.69 x 103 scot cd m2에서 검사를 통과할 수 있었으나 대조군 부형제-주입된 코호트의 동물은 그렇지 않았다(p<0.01).
표 2. Lca5-/- 마우스의 수중 미로 시험 결과
Figure pat00002
C. 동공 광 반사(Pupillary Light Reflex)
동공 수축의 진폭을 눈 당 일련의 10회 섬광 동안 측정하였다. 섬광 강도는 1,000 scot 럭스였다. PLR은 예비 자극 직경의 3 표준 편차보다 큰 섬광 후 0.6 내지 1.2 초 간격 이내에 동공 수축 반응의 최대 진폭을 가지는 것으로 정의하였다. 치료 패러다임에 대해 차폐된 과학자가 각각의 동공이 정확하게 추적되었는지 확인하기 위해 분석 전에 각각의 동물로부터의 데이터를 평가하였다. 그렇지 않은 경우, 특정 동물은 추가 분석에서 배제하였다.
통계적 분석을 위해, 처리된 (오른쪽) 및 반대측 샴-주입된 대조군 (왼쪽) Lca5-/- 눈으로부터의 정규화된 동공 직경을 각각의 광 강도에서 비교하였다. 처리된 눈의 수축의 정규화된 진폭을 처리되지 않은 눈의 진폭으로 나눔으로써, 반응의 최대 차등 진폭 (Maximum Differential Amplitude of Response, MDAR)의 백분율을 획득할 수 있었다. MDAR의 백분율이 높을수록 중재에 대한 강한 반응을 나타낸다. 추가의 연령 일치 처리되지 않은 Lca5-/- 및 야생형 (C57B1/6) 마우스를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 처리되지 않은 Lca5-/- 및 C57B1/6 마우스의 MDAR은 두 눈 사이 차이가 최소이기 때문에 약 0이었다.
추가 분석은 마우스의 상이한 코호트의 오른쪽 눈에서 동공 수축의 진폭의 크기를 평가하였다. 따라서, 수축의 진폭은 처리된 및 처리되지 않은 Lca5-/- 마우스 및 처리되지 않은 C57B1/6 마우스 사이에서 비교될 수 있었다.
처리군 대 대조군 눈의 자극에 의해 생성된 동공 광 반사의 진폭의 분석은 처리되지 않은 대조군 Lca5-/- 동물과 비교하여 AAV7m8.hopt-LCA5를 사용하여 망막하로 또는 유리체내로 처리된 Lca5-/- 마우스의 눈에서 동공 반사의 진폭에서 유의한 (p<0.05) 개선을 밝혀냈다 (도 2). 두 전달 경로 (도 2a, 2b, 2h, 및 2i)에 의해 PN5에 주입된 동물 및 유리체내 전달 (도 2h 및 2i)에 의해 개선된 경향도 존재하였지만, 망막하 전달에 의해 PN15에 주입된 동물에서 현저하게 개선된 동공 광 반사 (PLR)가 검출되었다.
D. 다중 전극 어레이
5% (v/v) AAV7m8.CBA.GFP로 스파이크된(spiked) AAV7m8.CMV/CBA.hopt.LCA5 (약 9.87 x 1010 vg/눈)로 단독 유리체내 주사를 주입받은 후 2.5 내지 3.5개월에 5 마리의 동물에서 다중 전극 어레이 (MEA) 검사를 수행하였다. 반대측 눈에는 샴- 주입하고 음성 대조군으로 사용하였다. 5 마리의 처리되지 않은 연령 일치 야생형 (WT) C57B1/6 마우스를 양성 대조군으로 이용하였다. 명적응 마우스로부터의 망막을 적색 광 하에서 절개하고 천공된 MEA 챔버에서 신경절 세포를 아래로 장착하였다. 외식편(explant)에서의 GFP의 존재는 광수용체의 AAV에 대한 노출을 확인시켜주었다. 상이한 강도의 455 nm 광의 보정된 전장 섬광 (색소 여기(excitation)의 효율 약 40%:로돕신 및 M-옵신; 약 0.2%:S-옵신)을 광 자극을 위해 사용하였다 (0.1 Hz에서 2 초 섬광 또는 4 Hz에서 50 ms 섬광). Matlab (MatLab, Natick, MA)에서 맞춤 코드를 사용하여 데이터를 분석하였다; 스파이크 정렬을 Plexon Offline Sorter (Plexon, Dallas, TX)에서 수행하였다. PN5에 AAV7m8.CβA.hopt-LCA5를 다중 전극 어레이 (MEA) 분석을 사용하여 프로브시켰다. MEA 사용에 대한 근거는 뇌로 전송된 망막의 출력 신호를 측정하고, 따라서, 광수용체 기능을 시험할 뿐만 아니라, 또한 망막 배선에 대한 정보를 제공한다는 것이다. MEA로 시험한 5개의 망막/동물 중, 2개는 명확하게 검출 가능한 간상체 및 추상체 ERG을 가지고 있었으며 (도 S2의 대표 기록을 참조), 1개는 잔류 소형, ~10
Figure pat00003
V ERG를 가지고 있었고, 2개는 임의의 검출 가능한 ERG를 가지고 있지 않았다. AAV7m8.CBA.hopt.LCA5-주입된 망막 5개 중 3개는 MEA 검사에서 강한 광 반응을 나타냈고, 1개는 중간 반응을 보였고 1개는 최소 반응을 보였다 (도 5a 내지 d). 반응은 암소시 강도 (42 내지 112 광자*s-1*μm-2, 또는 평균, 8.28el hv/ μm2; 455 nm)에서 검출 가능하였고, 강한 반응이 2.00e9 광자*s-1*μm-2의 가장 밝은 광도에서 관찰되었다. 말단 조명에 대한 간상체 및 추상체에 대한 수집 영역이 피크 민감도의 파장에서 약 1 μm2 이고 (23, 24) (ERG 및 MEA 실험 모두에서 빛이 신경절 세포 측면으로부터 망막으로 들어감을 유의) 로돕신 및 M- 및 S-추상체 옵신의 455 nm 광에 의한 자극의 효율이 각각 약 60%, 50% 및 0.3%인 것으로 가정하면 (25-27), 본 실험에서 명확하게 검출 가능한 반응을 생성하는 희미한 광은 간상체에서 세포 당 초 당 70 미만 광이성화, M-추상체에서 60 미만, 및 S-추상체에서 초 당 약 0.3 광이성화를 생성해야 한다. 흡입 피펫 기록으로부터의 데이터는 색소 여기 간상체의 이러한 속도에서 검출 가능한 광 반응 (최대 20% 이상의 반응 진폭)을 생성할 수 있는 반면 추상체 반응은 가장 유리한 조건 (간상체-트랜스듀신 넉아웃 망막의 암순응 M추상체)하에서 적어도 20 배 더 작을 것으로 예상되고 간상체 우세 마우스 망막에서 검출할 수 없어야 한다 (25, 26, 28) (흡입 피펫 기록에서 측면 조명에 대한 수집 영역은 간상체에 대해 약 0.5 μm-2 및 추상체에 대해 0.2 μm-2임을 유의)는 것을 보여준다. 따라서 본 실험에서 더 희미한 강도 범위에서 광 반응의 관찰은 치료된 Lca5gt/gt 망막에서 간상체 기능의 회복을 증명한다. 더 밝은 말단의 강도에서의 반응은 추상체에서 시작해야 한다 (가장 밝은 강도는 각각 M- 및 S-추상체에서 세포 당 초 당 약 1.00e9 및 6.00e6 광이성화를 생성함에 의해 M- 및 S-추상체 모두를 유도할 수 있는 것 이상이어야 함). 간상체/추상체 주도 반응에 대해 예상된 바와 같이, 1차 강도 시리즈 런의 끝에서 가장 밝은 자극 시리즈에 대한 노출 후 (광 민감성 망막은 희미한 암소시부터 가장 밝은 명소시 강도까지 ~0.5 로그 증분 범위의 적어도 2개의 강도 시리즈 런에 노출됨), 암소시 반응이 사라졌지만, 명소시 반응은 현저하게 영향받지 않았다 (도 5c 및 d). WT 및 처리된 Lca5gt/gt 망막은 또한 추상체 반응을 유도할 것으로 예상되는 강도에서 4Hz 명멸 자극에 반응하였다 (데이터를 나타내지 않음). 샴-주입된 반대측 눈의 망막은 높은 자발적인 발화 및 현저한 멜라놉신 반응이 있는 최소 내지 무효화된 반응을 보여주었다.
느린 멜라놉신 주도 반응이 또한 AAV7m8.CβA.hopt-LCA5- 처리된 Lca5gt/gt 망막 및 야생형 마우스의 망막 모두에서 검출되었다 (일련의 멜라놉신 반응에서 첫 번째 섬광 후 느린 회복으로 인한 두 번째 섬광의 시작에서 증가된 발화율은 처리되지 않은 것에 비해 처료된 망막에서 약화된 것으로 보임을 뚜렷하게 함).
표 3. 치료군 및 대조군 Lca5-/- 마우스의 MEA 반응의 요약
Figure pat00004
처리된 Lca5-/- 망막 중 2개는 주사 후 손상의 징후를 보였고 강한 자발적인 발화에도 불구하고 광 반응을 보이지 않았다.
AAV7m8.CBA.hopt.LCA5-처리된 망막의 반응은 처리되지 않은 야생형 망막의 반응과 유사하였다. 주사 후 가장 짧은 기간 후에 시험된 하나의 망막은 감소된 광 민감도 및 오프- 의 부재 및 지속된 온-반응을 입증하였다 (도 5d에서 적색 하향 삼각형). 오프-반응의 발달은 온-반응과 비교하여 주사 후 더 긴 시간을 요구하는 것으로 보이며, 10개의 처리된 망막에 대해 관찰된 오프-반응 진폭의 변동성이 증가한 것과 일치한다. 전장 자극 하 WT 망막에서 식별 가능한 모든 신경절 세포 유형의 기능이 스파이크 정렬 후 Lca5gt/gt AAV- 처리된 망막에서 검출되었다 (도 S10). 암소시 및 명소시 자극, 가장 밝은 강도 (거의 100 mW/cm2)까지 하에서 강한 반응이 관찰되었다. 간상체/추상체 주도 반응에 대해 예상된 바와 같이, 가장 밝은 빛에 대한 노출 후, 암소시 반응은 사라졌지만, 명소시 반응은 현저하게 영향받지 않았다 (데이터를 나타내지 않음).
AAV7m8.hopt.LCA5-처리된 망막에서의 반응은 암소시 강도 (42 내지 112 광자*s-1*μm-2, 또는 평균, 8.28el hv/μm2; 455 nm)에서 검출 가능해지고, 강한 반응은 가장 밝은 명소시 강도 2.00e9 광자*s-1*μm-2을 통해 관찰되었다. 샴-주입된 반대측 눈으로부터의 망막은 최소 내지 무효화된 반응을 보여주었다 (데이터를 나타내지 않음. 대조군 Lca5-/-). AAV7m8.hopt.LCA5-처리된 망막에서의 반응은 야생형 마우스의 망막과 유사하였다. 가장 밝은 빛 (2E9 hv/cm2)에 대한 노출 후 나타나는 명멸 반응, 명소시 반응은 현저하게 영향받지 않았다 (데이터를 나타내지 않음, 처리된 Lca5-/-). 대표적인 AAV7m8.CBAhopt.LCA5-처리된 망막의 3.53E2 내지 1.52E6 hv/cm2에서 명멸 반응 강도 시리즈는 광 강도가 증가함에 따라, 반응의 진폭이 증가함을 보여주었다. 가장 밝은 섬광 후 간상체 및 추상체 내구 반응의 시험은 야생형 망막에서 발견된 것과 유사한, 추상체 반응의 지속성을 보여주었다. 명멸 반응 시험은 야생형 마우스의 망막과 비교하여 처리된 Lca5-/- 망막에서 유사한 반응을 나타낸다. 처리된 Lca5-/- 망막에서의 간상체 및 추상체의 발화율은 광 강도의 함수로서 야생형 망막 (대조군 처리되지 않은 Lca5-/- 망막과 반대임)에 접근한다.
반응 동역학은 WT 망막의 데이터와 유사하였다 (데이터를 나타내지 않음). 8 내지 21 광자*s-1*μm-2에서 첫 번째 반응이 검출된 처리된 Lca5-/- 대 가장 민감한 WT 망막에서 광 민감도는 약간 낮았다 (데이터를 나타내지 않음.). 전장 자극 (온-, 오프 및 온/오프-유형) 하 WT 망막에서 식별 가능한 모든 신경절 세포 유형이 스파이크 정렬 후 Lca5- /- 처리된 망막에서 검출되었다. WT 및 처리된 Lca5-/- 망막은 3.53e2-2.00e9 광자*s-1*μm-2에서 4Hz 명멸 자극에 반응하였다 (데이터를 나타내지 않음). 모든 처리되지 않은 Lca5-/- 망막은 광 민감성 처리된 Lca5-/- 망막에는 없었던 밝은 강도에서의 느린 멜라놉신 주도 반응을 보였다. 결과 요약은 표 3에 표시되어 있다.
망막전위도검사 및 MEA 실험으로 획득한 결과가 적어도 일부 동물에서 간상체 및 추상체 기능의 회복을 입증하였지만, 이 방법은 치료된 마우스의 1/4만이 유용한 ERG 신호를 생성하였기 때문에 대부분의 동물에서 중재 효율을 평가하기에 부적절하였다. 따라서 본 발명자는 첫째, 전기생리학보다 높은 민감도 및, 둘째, Lca5gt/gt 망막의 AAV7m8.CβA.hopt-LCA5로의 처리가 뇌로의 시각 경로를 통해 망막을 넘어 전달된 광-유도 신호를 유발하였다는 증거를 제공하는, 두 가지 추가 접근법, 동공 광 반사 (PLR) 및 시각 행동 분석에 의한 중재 효능 평가에 기초하였다.
동공 광 반사 (PLR)는 처음에 광수용체에서 망막 신경절 세포로의, 그런 다음 뇌의 에딩거-웨스트팔(Edinger-Westphal) 핵으로의, 그리고 최종적으로 홍채 직경을 제어하는 섬모 신경절을 통한 동공 괄약근 근육으로의 신호의 전달에 의존한다. 처리군 대 대조군 눈의 자극 후 PLR의 분석은 샴-주입된 대조군과 비교하여 AAV7m8.CβA.hopt- LCA5로 처리된 Lca5gt/gt 마우스의 눈에서 PLR의 진폭의 유의한 (p<0.05) 증가를 드러냈다 (도 2c). PN5에 유리체내로 또는 망막하로 주입된 동물에서 현저하게 개선된 PLR이 검출되어 (도 2a 내지 2b 및 2e 내지 2f) 거의 야생형 반응이 관찰되었다 (도 2d). 반응의 최대 차등 진폭의 비교를 통해 PLR의 진폭의 통계적으로 유의한 개선이 또한 입증되었다 (MDAR; 도 2g 내지 2i; 도 S1). IVT 또는 SR 전달에 의해 AAV7m8.CβA.hopt-LCA5를 투여받은 동물은 또한 MDAR에 의해 정량화된 바와 같이 현저하게 개선된 PLR을 보여주었다 (도 2h 및 2i).
PLR은 망막 신호 및 기능을 보여주지만 형성된 시력에 대한 정보를 제공하지 않기 때문에 상기 기술된 바와 같이 기능적 시력을 측정하기 위해 광단서 수중 미로 시험을 사용하였다. 대부분의 처리되지 않은 야생형 (정상 시력) 마우스는 모든 광 수준에서 성공적으로 수중 미로를 탐색할 수 있는 반면, 처리되지 않은 Lca5gt/gt는 심각하게 장애가 있었다 (표 2, 도 3a). 수중 미로 시험의 결과는 IVT 및 망막하로 AAV7m8.CβA.hopt-LCA5 주입된 Lca5gt/gt 동물 모두 적어도 하나의 광 조건 하에서 통계적으로 유의한 방식으로 주입되지 않은 대조군보다 우수하게 수행하였다는 것을 보여주었다. (표 2; 도 3). PN5에 망막하로 처리된 동물은 모든 조명 시험 조건 (1.06E+05, 8.69E+03, 및 5.87E+02 scot cd m-2)에서 대조군 부형제-주입된 코호트보다 현저하게 개선된 통과율을 보여주었다 (p<0.01). 동물이 PN15에 주입된 (IVT 또는 SR) 경우, 개선은 미미하였다 (도 3). 마우스가 주어진 빛 신호만을 사용했음을 확인하기 위해, 빛이 없는 상태 (0.00 scot cd m2)에서 시험을 수행하였고 90 % 이상의 마우스가 시험에 실패하였다 (정상 시력 마우스를 포함; 도 3b).
실시예 4: 안구 조직학, 조직병리학, 면역형광 및 TUNEL 검정
PN5에 AAV7m8.CβA.hopt- LCA5 로 처리한 후 Lca5gt/gt 광수용체의 조직학적 구제를 광전도 캐스케이드의 적절한 기능에 관련된 분자의 평가 및 구조적 측정 모두를 통해 평가하였다. 실시예 2 및 3에서 기술된 바와 같이 동물을 3 개월 령에 안락시켰다. 눈을 적출하여 Boldt 등에 의해 기술된 방법의 변형에 의해 망막 절편을 평가하였다.(22) 조직을 PBS 중 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 그런 다음 동결 및 냉동절편 생성 전에 30% 수트로오스/PBS에서 동결방지시켰다. 조직병리는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, Thermo Fisher Scientific, Philadelphia, PA)-염색 절편의 검사 및/또는 헤마톡실린 및 에오신 염색에 의해 분석하였다. 면역형광 연구를 위해, 절편을 차단 용액의 존재 하에서 항레베르실린 (1:300)으로 배양하고, (12, 22) 세척한 후, 그런 다음 Cy3-접합체화 2차 항체로 처리하였다. 사용된 추가 항체는 항로돕신 (1:500, Leico Technologies), 항적색/녹색 추상체 옵신 (1:250, Chemicon), 항-아세틸화 튜불린 (1:1,000, Sigma-Aldrich)이었다. 염색된 절편을 DAPI (Electron Microscopy Services, Hatsfield, PA)를 함유하는 Citifluor 장착 배지로 덮었다. TUNEL 염색을 제조자 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 지시에 따라 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소 (TdT) dUTP 닉(nick) 말단 표지 (TUNEL) 검정 키트를 사용하여 수행하였다. 절편을 표면형광 및 Axio-Vision 4.6 소프트웨어가 장착된 Zeiss Axio Imager M2 현미경 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (Olympus Fluoview 1000, Center Valley, PA, USA)으로 평가하였다. FEI-Tecnai T12 S/TEM을 사용하여 지정된 조직 시료에 대해 투과 전자 현미경검사 (TEM)를 수행하였다.
PN5에 AAV7m8-hopt-LCA5로 주입되고 PN15에서 분석된 눈의 면역형광 분석은 튜불린 양성 외부 세그먼트의 염기와 함께 공동국소화된 레베르실린을 보여주었다. 유리체내 주사 후, 레베르실린은 PN95에 광수용체가 거의 없었던 망막에 걸쳐 분포되었다. 대조적으로, 처리되지 않은 PN15 및 PN95 Lca5-/- 망막에는 레베르실린이 없었다.
AAV7m8.hopt-LCA5 (5% v/v AAV7m8.eGFP 포함)의 유리체내 (IVT) 또는 망막하 (SR) 주사 후 PN40 대 PN99에서 헤마톡실린 및 에오신-염색 처리 및 대조군 망막 절편 비교 결과를 샴 주사와 비교하였다. 헤마톡실린 및 에오신-염색 (H&E) 망막의 현미경사진은 AAV7m8.hopt-LCA5의 IVT 또는 SR 주사 후 3 개월 시점 (PN99)까지 내부/외부 세그먼트 (IS/OS) 및 ONL이 보존됨을 보여주었다 (데이터를 나타내지 않음). 대조적으로, 샴-주입된 대조군 망막은 PN99에 이러한 층이 결여되었다 (데이터를 나타내지 않음). 추가로, 레베르실린은 처리된 대조군에서는 검출되었지만, 샴 처리된 대조군 망막에서는 검출되지 않았다 (데이터를 나타내지 않음). ONL에서 로돕신의 지속적인 발현이 또한 면역형광 분석에 의해 확인되었지만 (데이터를 나타내지 않음) 처리된 눈에서만 발견되었다.
PN5에 AAV7m8.CβA.hopt-LCA5로 IVT 또는 SR 주사에 의해 처리된 망막에서 광수용체 세포 층의 두께는 대조군 망막에서보다 현저하게 더 컸다 (도 4). 또한 망막하 주사에 의해 처리된 망막에서 AAV에 노출된 또는 노출되지 않은 망막 영역 사이의 두께의 뚜렷한 경계가 존재하였다 (데이터를 나타내지 않음). 광수용체 층의 보존은 가장 늦은 시점까지 지속되었다 (PN99). 증가된 두께는 외부 핵층의 증가된 열 수, 및 내부 및 외부 세그먼트의 존재로 인한 것이었다 (도 4). 이와 일치하게, 특히 중재 후 첫 달 이내에, TUNEL 표지에 의해 판단되는 죽어가는 광수용체의 비율이 AAV.LCA5-처리된 망막과 비교하여 대조군에서 훨씬 더 높았다 (데이터를 나타내지 않음).
PN5에 AAV7m8.hLCA5로 망막 주입된 Lca5-/- 마우스의 주사 후 1 내지 3 개월에서 평가는 외부 핵층의 증가된 두께를 나타낸다 (도 5a 및 도 9). 면역형광 분석은 레베르실린이 AAV7m8.hOP.LCA5-처리된 Lca5-/- 망막에서 튜불린 양성 외부 세그먼트의 염기와 함께 공동국소화됨을 나타내었다 (도 1M). 처리되지 않은 Lca5-/- 망막에서 생후 첫 달에 수많은 TUNEL-양성 세포가 존재하였지만, AAV7m8.hOPT.LCA5-처리된 망막에서는 유의하게 적었다 (도 6b 및 6c). TUNEL-양성 세포의 수는 동물이 3 개월 령이 되면 감소하였다 (도 6d 및 6e). 대조군 (처리되지 않은) 망막에서 시간이 지남에 따라 처리되지 않은 Lca5-/- 망막에서 변성되는 대부분의 세포는 로돕신-양성 세포가 AAV-처리된 망막에서만 발견된다는 사실에 의해 나타난 바와 같이, 광수용체였다 (도 6b). 면역형광 분석은 이러한 결과를 확인시켜주었고 (청색 DAPI-염색된 ONL를 참조), 3개월 시점 동안 지속된 증가된 로돕신 (적색 염색)을 나타냈다 (도 6d). AAV7m8.hopt.LCA5로 주사 후 광변환-특이적 분자의 위치에서 광 매개 변화의 증거가 존재하였다 (도 10).
AAV7m8.hopt.LCA5-처리된 망막의 투과 전자 현미경 검사 (TEM)는 적층된 외부 세그먼트 디스크, 1차 섬모 (도 7b) 및 연결 섬모 (도 7)의 전형적인 9+0 미세소관 어레이로 완성된 외부 세그먼트의 정교화를 보여주었다. 대조적으로, 처리되지 않은 Lca5-/- 망막은 연결 섬모 및 외부 세그먼트 모두 결여되었다. 처리되지 않은 망막은 외부 세그먼트가 결여되고, 농축핵 및 광수용체 세포기관의 잔해 만을 가지는 광수용체의 거대한 변성을 보여준다. 비조직화된, 변성 광수용체 세포체 만이 대조군 처리되지 않거나 샴-주입된 망막에 존재하였다.
PN5에 AAV7m8.hopt-LCA5로 처리된 암적응 성체 Lca5gt/gt 망막의 광 자극은 광전도 단백질의 외부 세그먼트로의 정상 전위 패턴을 초래하였다. 어레스틴은 AAV7m8.hopt-LCA5- 처리된 망막에서 광 노출 후 적절하게 전위된다. 이러한 활동은 IS/OS의 변성으로 인해 대조군 망막에서 평가될 수 없다. 데이터는 야생형 (WT) hLCA5 cDNA의 전달 후 마우스 망막에서 편모내 운반 결함의 회복을 반영한다.
Lca5-/- 마우스 모델에서 유전자 증강 치료법의 개념 증명의 개발은 여러 과제를 수반한다: 1) 망막 퇴행성 변화가 급속하게 및 생애 초기에 진행되기 때문에, 중재은 신생아 마우스에서 수행되어야 한다; 2) 이것이 광수용체- 특이적 질환이기 때문에, 광수용체를 효율적으로 표적하는 재조합 AAV 벡터가 이용되어야 한다. RPE 세포를 표적화하기 위해 동물 및 인간 연구에서 광범위하게 사용되어온 AAV2 벡터는 다른 AAV만큼 효율적으로 광수용체를 표적화하지 않는다 (23, 24). 이상적으로, 인간 임상 시험에서 최종적으로 사용될 수 있는 시약이 사용되어야 한다; 그리고 3) 기준선에서 너무 낮아서 측정하기 어려운, 망막 및 시각 기능의 개선을 반영하는 결과 측정이 개발되어야 한다. 여기 유도 진화에 의해 설계된 재조합 AAV, AAV7m8(25)가 천연 인간 레베르실린-암호화 cDNA의 전달 후 효능을 시험하기 위해 사용되었다. 이 벡터는 다른 이들에 의해 유리체내 전달 후 광수용체를 효율적으로 표적화하는 것으로 밝혀졌다.(25-27). hLCA5 cDNA를 질환에 걸린 광수용체에 생애 초기에 전달하기 위해 AAV7m8을 사용함으로써, 유전자 증강 치료법은 Lca5-/- 마우스 망막 및 시력의 구조적 및 기능적 개선 모두를 초래하였다.
실시예 3 및 4에서, Lca5-/- 마우스에서 AAV7m8-매개 유전자 증강 치료법이 망막 및 시각 기능 및 또한 망막 구조를 구제함을 입증하였다.
본 실시예에서 보고된 효능은 시각 신호를 사용하여 탐색하는 이러한 모델의 개선된 능력, 다중 전극 어레이 (MEA)에 의해 나타낸 바와 같은 간상체 및 추상체 광수용체 반응의 회복, 세포자멸식(apoptotic) 세포 사멸의 감소 (및 따라서 광수용체의 보존), 및 정상으로 작동하는 광수용체의 세포 생물학적 및 물리적 특성 특징의 존재, 예를 들어 외부 망막에서의 로돕신의 존재 및 적층된 외부 세그먼트 디스크와 함께, 정상으로 보이는 외부 세그먼트의 발달을 포함하였다. MEA 결과는 성공적인 주사 및 이식유전자 단백질을 발현하고 간상체/추상체 외부 세그먼트의 기능을 회복하기에 충분한 주사 후 시간이 주어졌을 때, 유전자 치료법이 WT 조건과 거의 구별할 수 없는 상태로 변성된 망막 세포를 회복시켰음을 보여주었다. 추가로, 야생형 LCA5의 전달이 광수용체의 변성으로부터 보호하였다. 처리되지 않은 Lca5-/- 망막이 3개월 령에 단일 열의 병든 광수용체로 감소된 반면, AAV-처리된 부위는 후에 내부 및 외부 세그먼트로 완성된 두꺼운 외부 핵을 가졌다. 개선은 적어도 3개월 지속되었으며 - 특히 이 나이 경에는, 처리되지 않은 Lca5-/- 마우스 망막에 남아있는 광수용체가 없다는 것을 고려하면 매우 유의한 발견이었다. 데이터는 Lca5-/- 마우스에서 사용된 것과 유사한 인간에서의 유전자 증강 접근법이 개선된 시력을 초래할 수 있음을 제시한다.
실시예 5: 인간 연구: 동공 광 반사 시험
IRB 승인 프로토콜 (#815348)에 대한 서면 사전 동의를 얻은 후 시험을 수행하였다. Procyon P3000 동공측정계 및 PupilFit6 소프트웨어 (Monmouthshire, UK)를 사용하여 두 눈에서 동시에 동공 반응을 기록하였다. 10 럭스의 녹색 광 자극을 오른쪽 눈에 0.2 초 간 제시한 후 어두운 간격으로 광에 대한 동공 반응을 기록하였다. 초 당 25 프레임으로 비디오 이미지를 포착하는 적외선 감지 카메라로 매 40 ms 마다 두 눈의 동공 직경이 측정되도록 하였다.
동형 LCA5 돌연변이를 가지는 성인에 존재하는 잔류 광수용체의 기능의 임의의 증거가 있는지를 측정하기 위해 동공 광 반사 시험을 수행하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 동공 광 반사는 이러한 개인에서 정상 시력 개인과 동일 시간 순서로 존재하였다. 하지만, 반응의 진폭은 정상 시력 개인과 비교하여 상당히 감소되었다.
실시예 6: LCA5의 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 모델
마우스 구조 연구를 인간으로 변환하는데 도움을 주기 위해, 본 발명자는 정상 시력을 가진 개인 및 LCA5 돌연변이로 인해 LCA에 영향을 받은 사람으로부터 연구를 위해 생성된 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 주를 연구하였다. 최근에, iPSC-유래 망막 색소 상피 (RPE)는 태아 및 성인 RPE와 비교하여, 분비, 유전자 발현 및 돌연변이 특징을 가지는 극성 상피의 기능적 표현형을 개괄하는 것으로 나타났다 (29). 이들 세포는 섬모 생물학의 결함과 관련된 질환 메카니즘을 이해하는데 큰 가능성을 보여준다 (30, 31). 여기에서, 본 발명자는 iPSC를 RPE 세포로 분화시켰고 (도 12a), 신경/광수용체 세포가 생성되는 것보다 더 짧은 기간 및 더욱 효율적으로 섬모 세포의 평가를 가능하게 하는 과정이었다 (도 S12). 본 발명자는 LCA5 유전자 발현을 평가하였고 LCA5 mRNA가 영향받지 않은 iPSC-유래 RPE에서 발현되고, LCA 환자 RPE에서 LCA5의 발현 수준이 대조군과 비교하여 현저하게 감소됨을 보여준다 (도 12b). 섬모 분포를 측정한 경우, 정상 시력 개인의 RPE보다 LCA5 환자로부터 유래한 iPSC-RPE에 섬모가 현저하게 적었다 (도 12d 내지 e). AAV7m8.hopt-LCA5로의 LCA5-iPSC-RPE의 처리는 레베르실린 단백질의 생산을 유발하였고 (도 12c) AAV7m8.LCA5 처리된 및 정상 시력 개인 RPE 세포에서 비슷한 섬모 수를 초래하였다 (도 12d 내지 f).
말초 혈액 단핵구 (PBMC)를 LCA5 돌연변이를 가지는 2개의 상이한 발단자(proband)로부터 사전 서명 동의 (IRB 승인 프로토콜 #808828) 후 수집하였다. 하나의 발단자, JB605는 LCA5 Gln279Stop CAG>TAG het 및 Lys172del4ctcAAAG het에 대한 화합물 이형접합체이고; 다른 JB590는 LCA5 c.835C>T p.Q279X에 대한 동형이었다. 야생형 세포는 개별 PBWT4.6으로부터 유래하였다. 유도 만능 줄기 세포주를 각각 3명의 개체로부터 생성하였다. PBMC를 사이토카인 및 호르몬으로 보충된 QBSF-60 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 배지로 이루어진 팽창 배지에서 배양하였다. 세포가 지수 성장의 단계에 진입할 때까지 7 내지 9일의 기간 동안 2 내지 3일 마다 배지를 보충하였다.
재프로그래밍을 위해, 팽창된 PBMC를 TetO/CMV 프로모터에 의해 구동되는 OCT4, KLF4, SOX2, 및 cMyc cDNA 및 microRNA 302/367 클러스터를 전달하는 렌티바이러스 벡터에서 rTTA 렌티바이러스 및 독시사이클린 유도성 "줄기 세포 카세트"로 형질도입시켰다. 폴리브렌 (5 μg/ ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이 보충된 팽창 배지에서 세포를 성장시켰다. 37 ℃에서 20 내지 24 시간 동안 세포를 배양하였다. 그런 다음 감염된 세포를 세척하였고, 1 μg/ml의 독시사이클린 (DOX)이 보충된 팽창 배지에 두었다. 48 시간 후, 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS), 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 베타-메르캅토에탄올, 비필수 아미노산, 4 ng/ml의 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 및 1 μg/ml 의 DOX (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)와 함께 이스코브 변형 둘베코 배지 (Iscove’s modified Dolbecco’s medium, IMDM)에서 재현탁시키고, 그런 다음 마트리겔 코팅된 (BD Biosciences, San Jose, CA) 마우스 배아 섬유모세포 플레이트 (MEF 플레이트)로 이동시켰다. 세포를 이러한 배지에서 10일 동안 유지시키고, 그런 다음 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 배지로 (DMEM/F12, 20% 넉아웃 혈청 대체물, 비필수 아미노산, 4 ng/ml bFGF, 0.001% 베타-메르캅토에탄올, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 및 1 μg/ml의 DOX (Invitrogen, Carlsbad, CA))로 옮겼다. 4 주 후, iPSC-유사 콜로니를 수동으로 선택하고 마트리겔코팅된 MEF 플레이트에서 6 계대(passage) 동안 팽창시키고, 그런 다음 최소 15 계대 동안 0.1% 젤라틴-코팅된 MEF 플레이트로 이행시켰다. iPSC의 특성화는 SSEA3+, SSEA4+, TRA-1-60, 및 TRA-1-81 (Biolegend, San Diego, CA)에 대한 항체를 사용하여 유동 세포 분석에 의해 측정된 표면 항원 발현을 기반으로 하고, RT-qPCR 분석은 다능성 발현 마커: DMNT3B, ABCG2, REX1, OCT4, SOX2, 나노G, cMYC, KLF4를 포함하였다. iPSC의 핵형 분석을 가시적인 핵형을 생산하기 위해 G 밴딩에 의해 수행하였다. 다수의 상이한 계통으로 분화하는 세포의 능력을 사용하여 PCR 생식 층 검정 (Qiagen. Germantown, MD, USA)을 사용하여 수행시켰다.
특징화된 iPSC는 Wnt 신호 경로의 활성화, 섬유모세포 성장 인자 신호 경로의 저해, 및 Rho- 관련, 이중 코일 함유 단백질 키나아제 신호 경로의 저해에 의해 RPE로 분화된다. 팽창된 색소 세포를 겔트렉스 매트릭스의 8-챔버 슬라이드 상에서 플레이트 접착에 의해 정제하였다. 농축된 세포를 입방형의 조약돌 외관을 발달시킬 때까지 배양하였다. iPS-RPE의 특징은 유전자 발현, 면역세포화학, 및 현미경에 의해 확인하였다. 섬모 길이를 ARL13B 및 페리센트린에 대한 고정 및 염색 후 측정하였다. 섬모 길이를 위스타 이미징 설비 (Wistar Institute, Philadelphia, PA)에 의해 설계된 맞춤 설계 소프트웨어를 사용하여 삼차원으로 측정하였다.
대조군 및 LCA5 iPSC-RPE 세포주에서 밀도 및 길이에 대해 섬모를 평가한다. 야생형 세포주보다 2명의 LCA5 환자로부터 유래한 RPE 세포에 존재하는 섬모가 현저하게 적다. 게다가, LCA5-유래 주의 섬모는 야생형 세포의 섬모보다 현저하게 짧다.
LCA5 환자는 최대 30년 동안 중심와(foveal) 외부 핵층을 포함하여 광수용체를 보유할 수 있는 것으로 이전에 관찰되었다 (21, 29). 성공적인 유전자 요법은 세포가 (아프더라도) 존재해야 하기 때문에, LCA5 광수용체는 치료가 가능할 수 있다. 본 실시예는 LCA5를 가지는 성인에서 보유된 광수용체가 정상 시력 개인로부터의 광수용체가 장려하는 것과 유사한 시간적 패턴의 광 반응성 (비록 진폭은 감소됨)을 보여주었다는 사실을 입증하였다. 이러한 결과는 이들 비정상적 망막의 잔류 광수용체가 구조적 및 기능적 결함에도 불구하고 생존할 수 있었다는 사실을 추가로 지지하였다. 또한, LCA 환자-유래 iPSC-RPE 세포의 섬모는 야생형 대조군 세포의 섬모보다 현저하게 짧다. Lca5-/- 마우스에서 광수용체의 섬모 결손이 유전자 증강 치료법에 의해 교정될 수 있다는 사실은 이러한 병태를 가지는 인간에 존재하는 섬모 결손을 개선할 수 있다는 것을 제시한다. iPSC-유래 RPE 세포에서 시험관 내 섬모 결손을 교정하기 위한 연구가 현재 진행 중이다.
LCA5를 가지는 인간에서 유전자 증강 치료법은 이의 안전성 및 효능에 대해 시험하기 위해 조사 중이다. 이러한 심각한 실명 상태에 대해 적절한 결과 측정법을 개발해야 할 필요성뿐만 아니라, 본 출원은 구조 달성에 대한 제약 조건을 개발하는 것을 포함하는 인간 임상 시험 계획에서 심각한 문제에 대해 해결책을 제공하였다. Lca5-/- 마우스에서, 실시예는 신생아 (PN5) 및 청소년 (PN15) 마우스 모두에서 구조를 입증하였다. 이러한 마우스 모델에서 조기 광수용체 상실 때문에 질환의 후기 단계에서의 중재는 관찰되지 않았다. 마우스 모델에서 발달 이상 (광수용체의 변성과 일치함)은 질환의 발달 구성 요소가 존재함을 제시하였다. 인간 조건에서도 발달 구성 요소가 존재할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, LCA5를 가지는 인간에서, 성인에서도 일부 황반 광수용체 지속의 증거가 있다.(21) 이들 광수용체의 기능을 개선하는 방법을 결정하는 것 뿐만 아니라 수십 년 간 제한된 시력으로 고통을 겪은 이후에 RPE65 유전자 치료 임상 시험에 등록된 인간에서 피질 시력을 소생시키는 데 성공하였다는 사실에 기반하여 LCA5를 가지는 인간에서 시각 경로가 소생될 수 있는지를 결정하기 위해 조사가 진행되고 있다. (4, 30, 31)
실시예 7: Lca5-/- 마우스의 유전형 분석
하기 올리고를 사용하여 게놈 DNA를 PCR-증폭시켰다: LCA-13F6 (공통 F) GCCTGTTCCTGCTTGCTTAC (서열번호: 13로서 봉입); LCA-13R2 (역 WT) TGCTTTCCAAAGTAAGCACAAA (서열번호: 14로서 봉입)
en2.8r (역 돌연변이) CCTGGCCTCCAGACAAGTAG (서열번호: 15로서 봉입). 어닐링 온도 50 ℃ 및 72 ℃ 연장 단계에서 PCR을 35 사이클 동안 수행하였다. 예측된 생성물은 353 bp (야생형) 및 439 bp (Lca5-/-)이다.
실시예 8: AAV7m8.hLCA5의 유리체내 주사는 Lca5-/- 마우스에서 광수용체 기능을 거의 WT 수준으로 회복시킨다
조기 발병 시력 상실은 광수용체의 건강 및 기능에 중요한 단백질, 레베르실린을 암호화하는 유전자, LCA5의 돌연변이로부터 유발된다. 광수용체의 상대적 보존이 존재할 수 있기 때문에, LCA5 질환은 유전자 증강 치료법을 받아들일 수 있다. AAV7m8.CMV/CBA.hLCA5의 유리체내 전달을 사용하는 유전자 증강 치료법이 광수용체 및 망막 기능을 회복시킬 가능성을 LCA5 마우스 모델 (Lca5-/-)에서 다중 전극 어레이 (MEA)를 사용하여 시험하였다.
생후 5일 Lca5-/- 마우스에 5% (v/v) AAV7m8.CBA.GFP와 혼합된 AAV7m8.CMV/CBA.hLCA5 (대략 9.87 x 1010 vg/눈)를 유리체내로 주입하였다. 반대측 눈은 주입하지 않고 음성 대조군으로 사용하였다. 중재 3개월 후 및 광 적응 조건 하에서, Lca5-/- 망막을 적색 광 하에 절개하고 천공된 MEA 챔버에서 신경절 세포가 아래로 향하도록 장착하였다. 양성 대조군으로서 처리되지 않은 연령 일치 야생형 마우스 (C57B1/6)에 대해 동일한 절개 및 제조 절차를 수행하였다. GFP의 존재는 AAV에 대한 광수용체의 노출을 확인시켰다. 암소시 및 명소시 강도 범위 (0.1 Hz에서 10 2 s 섬광 또는 4 Hz에서 400 50 ms 섬광)에서 455 nm 광의 보정된 전장 섬광을 광 자극으로 사용하였다 (M- 및 S-추상체 모두를 표적으로 하여 반응 검출의 가능성을 최대화하기 위해 청색 광을 사용하였고, M- 및 S-추상체 여기의 효율은 상응하게 약 40% 및 0.2%이어야 함). Matlab에서 맞춤 코드를 사용하여 데이터를 분석하였고, Pllexon Offline Sorting을 사용하여 스파이크 정렬을 수행하였다.
3개월 후, 온전한 망막이 있는 눈 중에서, MEA 기록을 사용하여 검사했을 때, 5개 중 3개는 강한 광 반응을 입증하였고, 1개는 중간 반응을 보여주었고 1개는 최소 반응을 보여주었다. 강한 반응을 보이는 3개의 망막에서, 광 반응은 암소시 범위 (42 내지 112 광자 x s-1 x μm-2)에서 검출 가능해졌고 강한 반응은 2.00 x 109 광자 x s-1 x μm-2의 가장 밝은 명소시 강도까지 관찰되었다. 반면 주입되지 않은 반대측 눈의 망막 최소 내지 무효화된 반응을 보였다. 간상체/추상체 주도 반응에 대해 예상된 바와 같이, 가장 밝은 자극 시리즈에 대한 노출 후, 암소시 반응은 사라지지만 명소시 범위에서의 반응은 현저하게 영향받지 않았다. 반응 동역학 및 감도는 동일한 프로토콜 하에 시험된 5개의 WT 망막으로부터 관찰된 것과 매우 유사하였다 (처리된 망막의 감도는 간상체-주도 반응을 생성하는 가장 희미한 섬광이 8 내지 21 광자 x s-1 x μm-2 범위인 가장 민감한 WT 망막에 비하여 약간 낮음). 주사 2개월 후 시험된 치료된 망막 중 하나는 낮은 광 민감도를 입증하였고 (1.52 x 104 광자 x s-1 x μm-2의 명소시 강도에서 시작된 반응) 가장 밝은 노출 후 반응은 대부분 사라졌다. 이는 표적화된 단백질의 충분한 발현 및 기능적 간상체/추상체 외부 세그먼트의 생성을 위해 3개월이 필요함을 나타낼 수 있다. 전장 자극 하에 WT 망막에서 식별 가능한 모든 신경절 세포 유형 (온-, 오프- 및 온/오프-유형)이 스파이크 정렬 후 Lca5-/- 처리된 망막에서 검출되었다. WT 망막 뿐만 아니라, 처리된 Lca5-/- 망막이 3.53 x 102 내지 2.00 x 109 광자 x s-1 x μm-2의 강도 범위에서 4Hz 명멸 자극에 대해 반응하였다. 7개의 대조군 Lca5-/- 처리되지 않은 망막 중 하나만이 남아있는 추상체 기능을 나타내는 밝은 명소시 자극에서 매우 약한 광 반응을 나타냈다. 모든 처리되지 않은 Lca5-/- 망막은 광 민감성 처리된 Lca5-/- 망막에 없었던 밝은 강도에서 느린 멜라놉신 주도 반응을 나타냈다.
처리된 Lca5-/- 망막 중 2개는 주사 후 손상의 징후가 있었고 강한 자발적인 발화에도 불구하고 광 반응을 보이지 않았다. 1개의 처리된 망막은 주사 후 손상의 분명한 징후를 보이지 않았지만 표적화된 단백질의 낮은 발현 및/또는 약한 남아있는 추상체 기능을 나타낼 수 있는 자극 강도 (8.07 x 108 광자 x s-1 x μm-2 이상)의 명단에서 매우 약한 광 반응만을 나타냈다.
성공적인 주사 및 표적화된 단백질이 발현되고 간상체/추상체 외부 세그먼트의 기능을 회복할 충분한 주사 후 시간이 주어진 경우, 유전자 치료법은 WT 조건과 거의 구별할 수 없는 상태로 변성된 망막 세포를 회복시킨다.
요약하면, LCA 자체는 가장 심각한 망막 퇴행성 질환 중 하나이며, LCA5는 이 범주에서 가장 심각한 하위 유형 중 하나이다. LCA5 환자는 종종 생애 초기에 약한 지각만을 누리며, 안진으로 인해 이러한 초저시력 대상에서 구조적 연구와 시각 기능에 대해 특수한 테스트를 수행하는 것조차 어렵다. 따라서 이 질병은 접근하기 어려운 것으로 간주된다. 하지만, Lca5 -/- 마우스의 표현형은 LCA5 돌연변이를 가지는 인간에서 다수의 임상적 발견을 반영한다. Lca5-/- 마우스의 구조 데이터는 인간에서의 유사한 유전자 증강 접근법이 개선된 시력을 초래할 수 있다는 희망을 제공한다. 인간 임상 시험으로 이어지는 전임상 연구와 병행하여, 임상 시험에서 유전자 치료의 효과가 확실하고 정확하게 포착될 수 있도록 LCA5 망막의 구조 및 기능를 정확하게 측정하는 방법론을 개발하는 것이 중요하다. 이러한 연구 및 유전자 치료 임상 시험은 이러한 절박한 병태에 대한 치료로 이어질 수 있을 뿐만 아니라, 또한 다른 심각한, 조기 발병 실명 병태에서의 중재의 효과를 측정하기 위한 틀을 제공할 수 있다.
실시예 9: 인간에서 LCA5 질환의 예비 분석
동형 LCA5 돌연변이를 가지는 인간 성인에 존재하는 잔류 광수용체에서 기능의 증거가 있는지 측정하기 위해 PLR 검사를 수행하였다. 도 S11에 나타낸 바와 같이, PLR은 정상 시력 개인과 동일한 시간적 서열로 이러한 개인에 존재하였다. 하지만, 반응의 진폭은 정상 시력 개인에 비해 상당히 감소되었다.
실시예 10: 레베르실린의 상실은 세포 및 동물 모델에서 RPE 성숙 및 섬모 기능의 조절장애를 유발한다
레베르실린-암호화 LCA5 유전자의 발현의 상실에 의해 유발되는 질환, 레베르 선천성 흑암시 5 (LCA5)의 시각 시스템에서 발생하는 병리학적 변화를 조사하였다. 이전의 연구는 신경 망막, 특히 광수용체에 대한 레베르실린 결핍의 유해한 영향을 설명하였다. 이 연구는 망막 색소 상피 (RPE)의 발달 및 기능에 대한 정상적인 LCA5 발현의 기여에 초점을 맞춤으로써 LCA5로 이어지는 병원성 메카니즘을 추가로 밝히는 것을 목표로 하였다.
2개의 독립적인 실험 패러다임을 구축하였다: 하나는 정상 시력 개인 및 LCA5를 가지는 개인의 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)로부터의 RPE 세포 생성을 사용하였다. RPE 세포 형태, 색소 형성, 세포 특이적 마커 및 1차 섬모의 특징을 측정하였다. 두 번째 접근법은 LCA5 결핍 (LCA5gt/gt 마우스)에 대한 쥐 모델과 비교하여 야생형 마우스의 망막의 연구를 평가하였다. 공간-시간적 분화 패턴을 LCA5 단백질의 결여에 의해 유발된 시각 시스템에서 발생하는 퇴행성 대 발달 변화를 묘사하기 위해 특징화하였다.
결과는 인간 RPE 세포 모델 및 살아있는 마우스의 RPE 모두에서 LCA5 결핍 이들 세포의 발달에 중대한 변화를 유발한다는 것을 입증한다. 유전자 발현 분석을 통해, 섬모형성 및 편모내 운반, 색소 형성, 및 발달 WNT 신호 경로를 담당하는 주요 단백질의 조절장애를 확인하였다. 면역염색은 또한 LCA5 단백질 기능의 상실로 인한 변형된 돌연변이와 일치하는 상피 상벽의 차이를 확인하였다.
이 연구는 잠재적으로 세포 내 수송의 저해로 인해 또는 간접적으로 이들 세포의 성숙 진행을 지연시킴으로써, 색소 형성과 같은 과정의 변경을 통해 RPE에서 LCA5 억제의 유해한 효과를 나타낸다. 이 연구에서 우리는 전통적으로 광수용체 기능 장애 탓으로 돌리던 망막 병리학에서 RPE 세포의 잠재적인 주요 역할을 소개한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 공보 및 다른 공보뿐만 아니라 우선권 출원, 2017년 3월 1일 출원된 미국 특허 가출원 제 62/465,649호 및 2017년 3월 10일 출원된 미국 특허 가출원 제 62/469,642호가 본원에 참조로 포함된다. 유사하게, 본원에서 참조되고 첨부된 서열 목록에 나타낸 서열번호는 참조로 포함된다. 본 발명은 특정 양태를 참조하여 기술되었지만, 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 변경은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하도록 의도한다.
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참고문헌
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SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> GENE THERAPY FOR OCULAR DISORDERS <130> UPN-16-7696PCT <150> US 62/465,649 <151> 2017-03-01 <150> US 62/469,642 <151> 2017-03-10 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 697 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Glu Arg Ala Gly Ser Pro Gly Thr Asp Gln Glu Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gly Lys His His Tyr Ser Tyr Leu Ser Asp Phe Glu Thr Pro Gln Ser 20 25 30 Ser Gly Arg Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Pro Ala Ser Val Arg Arg 35 40 45 Lys Asn Pro Lys Arg Gln Thr Ser Asp Gly Gln Val His His Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Lys Pro Ser Pro Lys Gly Leu Pro Asn Arg Lys Gly Val Arg 65 70 75 80 Val Gly Phe Arg Ser Gln Ser Leu Asn Arg Glu Pro Leu Arg Lys Asp 85 90 95 Thr Asp Leu Val Thr Lys Arg Ile Leu Ser Ala Arg Leu Leu Lys Ile 100 105 110 Asn Glu Leu Gln Asn Glu Val Ser Glu Leu Gln Val Lys Leu Ala Glu 115 120 125 Leu Leu Lys Glu Asn Lys Ser Leu Lys Arg Leu Gln Tyr Arg Gln Glu 130 135 140 Lys Ala Leu Asn Lys Phe Glu Asp Ala Glu Asn Glu Ile Ser Gln Leu 145 150 155 160 Ile Phe Arg His Asn Asn Glu Ile Thr Ala Leu Lys Glu Arg Leu Arg 165 170 175 Lys Ser Gln Glu Lys Glu Arg Ala Thr Glu Lys Arg Val Lys Asp Thr 180 185 190 Glu Ser Glu Leu Phe Arg Thr Lys Phe Ser Leu Gln Lys Leu Lys Glu 195 200 205 Ile Ser Glu Ala Arg His Leu Pro Glu Arg Asp Asp Leu Ala Lys Lys 210 215 220 Leu Val Ser Ala Glu Leu Lys Leu Asp Asp Thr Glu Arg Arg Ile Lys 225 230 235 240 Glu Leu Ser Lys Asn Leu Glu Leu Ser Thr Asn Ser Phe Gln Arg Gln 245 250 255 Leu Leu Ala Glu Arg Lys Arg Ala Tyr Glu Ala His Asp Glu Asn Lys 260 265 270 Val Leu Gln Lys Glu Val Gln Arg Leu Tyr His Lys Leu Lys Glu Lys 275 280 285 Glu Arg Glu Leu Asp Ile Lys Asn Ile Tyr Ser Asn Arg Leu Pro Lys 290 295 300 Ser Ser Pro Asn Lys Glu Lys Glu Leu Ala Leu Arg Lys Asn Ala Ala 305 310 315 320 Cys Gln Ser Asp Phe Ala Asp Leu Cys Thr Lys Gly Val Gln Thr Met 325 330 335 Glu Asp Phe Lys Pro Glu Glu Tyr Pro Leu Thr Pro Glu Thr Ile Met 340 345 350 Cys Tyr Glu Asn Lys Trp Glu Glu Pro Gly His Leu Thr Leu Asp Leu 355 360 365 Gln Ser Gln Lys Gln Asp Arg His Gly Glu Ala Gly Ile Leu Asn Pro 370 375 380 Ile Met Glu Arg Glu Glu Lys Phe Val Thr Asp Glu Glu Leu His Val 385 390 395 400 Val Lys Gln Glu Val Glu Lys Leu Glu Asp Glu Trp Glu Arg Glu Glu 405 410 415 Leu Asp Lys Lys Gln Lys Glu Lys Ala Ser Leu Leu Glu Arg Glu Glu 420 425 430 Lys Pro Glu Trp Glu Thr Gly Arg Tyr Gln Leu Gly Met Tyr Pro Ile 435 440 445 Gln Asn Met Asp Lys Leu Gln Gly Glu Glu Glu Glu Arg Leu Lys Arg 450 455 460 Glu Met Leu Leu Ala Lys Leu Asn Glu Ile Asp Arg Glu Leu Gln Asp 465 470 475 480 Ser Arg Asn Leu Lys Tyr Pro Val Leu Pro Leu Leu Pro Asp Phe Glu 485 490 495 Ser Lys Leu His Ser Pro Glu Arg Ser Pro Lys Thr Tyr Arg Phe Ser 500 505 510 Glu Ser Ser Glu Arg Leu Phe Asn Gly His His Leu Gln Asp Ile Ser 515 520 525 Phe Ser Thr Pro Lys Gly Glu Gly Gln Asn Ser Gly Asn Val Arg Ser 530 535 540 Pro Ala Ser Pro Asn Glu Phe Ala Phe Gly Ser Tyr Val Pro Ser Phe 545 550 555 560 Ala Lys Thr Ser Glu Arg Ser Asn Pro Phe Ser Gln Lys Ser Ser Phe 565 570 575 Leu Asp Phe Gln Arg Asn Ser Met Glu Lys Leu Ser Lys Asp Gly Val 580 585 590 Asp Leu Ile Thr Arg Lys Glu Lys Lys Ala Asn Leu Met Glu Gln Leu 595 600 605 Phe Gly Ala Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Ser Lys Ser Ser Asp Pro 610 615 620 Asn Ser Val Ala Ser Ser Lys Gly Asp Ile Asp Pro Leu Asn Phe Leu 625 630 635 640 Pro Gly Asn Lys Gly Ser Arg Asp Gln Glu His Asp Glu Asp Glu Gly 645 650 655 Phe Phe Leu Ser Glu Gly Arg Ser Phe Asn Pro Asn Arg His Arg Leu 660 665 670 Lys His Ala Asp Asp Lys Pro Ala Val Lys Ala Ala Asp Ser Val Glu 675 680 685 Asp Glu Ile Glu Glu Val Ala Leu Arg 690 695 <210> 2 <211> 2094 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgggggaaa gagcaggaag tccaggtact gaccaagaaa gaaaggcagg caaacaccat 60 tattcttact tatctgattt tgaaacgcca cagtcttctg gccgatcatc gctggtcagt 120 tcttcacctg caagtgttag gagaaaaaat cctaaaagac aaacttcaga tggccaagta 180 catcaccaag cccctcggaa accaagcccc aagggtctac caaacagaaa gggagtccga 240 gtgggatttc gctcccagag cctcaataga gagccacttc ggaaagatac tgatcttgtt 300 acaaaacgga ttctgtctgc aagactgcta aaaatcaatg agttgcagaa tgaagtatct 360 gaactccagg tcaagttagc tgagctgcta aaagaaaata aatctttgaa aaggcttcag 420 tacagacagg agaaagccct gaataagttt gaagatgccg aaaatgaaat ctcacaactt 480 atatttcgtc ataacaatga gattacagca ctcaaagaac gcttaagaaa atctcaagag 540 aaagaacggg caactgagaa aagggtaaaa gatacagaaa gtgaactatt taggacaaaa 600 ttttccttac agaaactgaa agagatctct gaagctagac acctacctga acgagatgat 660 ttggcaaaga aactagtttc agcagagtta aagttagatg acaccgagag aagaattaag 720 gagctatcga aaaaccttga actgagtact aacagtttcc aacgacagtt gcttgctgaa 780 aggaaaaggg catatgaggc tcatgatgaa aataaagttc ttcaaaagga ggtacagcga 840 ctatatcaca aattaaagga aaaggagaga gaactggata taaaaaatat atattctaat 900 cgtctgccaa agtcctctcc aaataaagag aaagaacttg cattaagaaa aaatgctgca 960 tgccagagtg attttgcaga cctgtgtaca aaaggagtac aaaccatgga agacttcaag 1020 ccagaagaat atcctttaac tccagaaaca attatgtgtt acgaaaacaa atgggaagaa 1080 ccaggacatc ttactttgga cttgcaatct caaaagcaag acaggcatgg agaagcaggg 1140 attctaaacc caattatgga aagagaagaa aaatttgtta cagatgaaga actccatgtc 1200 gtaaaacagg aggttgaaaa gctggaggat gaatgggaaa gagaagaact tgataaaaag 1260 caaaaagaaa aggcatcttt actggaaaga gaagaaaagc cagagtggga aactggaagg 1320 taccaactag gaatgtatcc aattcagaat atggataaat tgcaaggaga ggaagaagaa 1380 agactgaaga gagaaatgct acttgctaaa ctgaatgaaa ttgacagaga actccaagat 1440 tctcgaaatc taaaataccc tgttttgcca ttgttacctg attttgaatc aaaactacac 1500 tccccagaga gaagccccaa aacatacagg ttctctgaat cctcagagag attatttaat 1560 gggcatcatt tgcaagacat cagtttctca actccaaaag gagaaggtca gaattcagga 1620 aatgttagaa gtccagcctc ccctaatgag ttcgcatttg gtagctacgt gccttcgttt 1680 gcaaaaacat cagagaggtc aaatccattt agtcaaaaaa gtagtttttt ggatttccaa 1740 agaaacagta tggaaaaact tagtaaagat ggtgtagatt taattacaag aaaagagaaa 1800 aaagctaatt tgatggaaca gttatttggt gccagtggta gcagcaccat ttcctccaaa 1860 agcagtgacc caaattctgt ggcttccagt aaaggagaca ttgaccctct aaattttctc 1920 cctgggaata aaggcagcag agatcaagaa catgatgaag atgaaggctt tttcctcagt 1980 gaaggaagaa gttttaatcc aaataggcac cgattaaaac atgcagacga taaaccagca 2040 gtaaaagcag ctgattctgt agaagatgaa attgaagaag tagcactgag atga 2094 <210> 3 <211> 2093 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 3 atgggagaac gagcaggcag ccctggtacg gaccaggaac gcaaggcggg gaaacaccac 60 tatagctatt tgtcagactt tgagacaccg cagagctcgg gtcggtcatc cttggtgtcg 120 tcaagcccgg ctagcgtccg gcgaaagaat ccaaagcgcc aaacgtcaga tggccaggtg 180 catcatcagg ctccccggaa accctcgccc aaaggattgc cgaacagaaa gggggtccgg 240 gtagggttta gatcgcagag cctgaatcgc gagcctctta gaaaagatac agaccttgtg 300 actaagagga ttctgtcggc acgactgttg aagattaacg aacttcagaa tgaggtgtca 360 gaactccaag taaaacttgc ggaactgctt aaggagaaca aatcgctcaa gcggcttcag 420 tatcgccaag agaaagcgct caacaagttc gaggacgcgg aaaacgagat ttcgcagttg 480 atctttaggc ataacaacga gatcaccgcc cttaaagaac gcttgcgcaa aagccaggag 540 aaagaacgcg ccacggagaa gagggtcaag gacaccgaat cggaactgtt tagaactaag 600 ttttcgcttc aaaagcttaa agaaatctcg 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attttgaatc aaaacttcac 1500 tcccccgaac ggagccccaa gacctatcga ttctcggaat cgtcggagag actcttcaat 1560 ggacaccatt tgcaagacat ctccttttca acacccaaag gggaaggcca gaattccgga 1620 aatgtgcggt cgccagcgtc gccaaatgag ttcgcattcg gttcgtacgt gccctcattc 1680 gcgaaaacct cggagagatc caaccccttc agccaaaagt cgtcattctt ggatttccag 1740 agaaactcca tggaaaagct ctccaaggat ggagtcgatc tcatcactag aaaagagaag 1800 aaggccaatc tcatggaaca gttgttcgga gcgtcgggtt cgtccaccat ctcctccaag 1860 tcatcagacc ccaattcggt cgcatcctca aagggagaca tcgacccttt gaatttcctg 1920 ccgggaaaca agggttcgcg agatcaggaa catgacgagg acgaggggtt tttcttgtcc 1980 gaagggaggt ccttcaatcc gaatcgccac agattgaaac acgcggatga caagcctgcg 2040 gtgaaggctg cggactcagt agaggacgag atcgaggaag tggccctgag atg 2093 <210> 4 <211> 2094 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgggggaaa gagcaggaag tccaggtact gatcaagaaa gaaaggcagg caaacaccat 60 tattcttact tatctgattt tgaaacgcca cagtcttctg gccgatcatc gctggtcagt 120 tcttcacctg caagtgttag gagaaaaaat cctaaaagac aaacttcaga tggccaagta 180 catcaccaag cccctcggaa accaagccct aagggtctac caaacagaaa gggagtccga 240 gtgggatttc gctcccagag cctcaataga gagccacttc ggaaagatac tgatcttgtt 300 acaaaacgga ttctgtctgc aagactgcta aaaatcaatg agttgcagaa tgaagtatct 360 gaactccagg tcaagttagc tgagctgcta aaagaaaata aatctttgaa aaggcttcag 420 tacagacagg agaaagccct gaataagttt gaagatgccg aaaatgaaat ctcacaactt 480 atatttcgtc ataacaatga gattacagca ctcaaagaac gcttaagaaa atctcaagag 540 aaagaacggg caactgagaa aagggtaaaa gatacagaaa gtgaactatt taggacaaaa 600 ttttccttac agaaactgaa agagatctct gaagctagac acctacctga acgagatgat 660 ttggcaaaga aactagtttc agcagagtta aagttagatg acaccgagag aagaattaag 720 gagctatcga aaaaccttga actgagtact aacagtttcc aacgacagtt gcttgctgaa 780 aggaaaaggg catatgaggc tcatgatgaa aataaagttc ttcaaaagga ggtacagcga 840 ctatatcaca aattaaagga aaaggagaga gaactggata taaaaaatat atattctaat 900 cgtctgccaa agtcctctcc aaataaagag aaagaacttg cattaagaaa aaatgctgca 960 tgccagagtg attttgcaga cctgtgtaca aaaggagtac aaaccatgga agacttcaag 1020 ccagaagaat atcctttaac tccagaaaca attatgtgtt acgaaaacaa atgggaagaa 1080 ccaggacatc ttactttgga cttgcaatct caaaagcaag acaggcatgg agaagcaggg 1140 attctaaacc caattatgga aagagaagaa aaatttgtta cagatgaaga actccatgtc 1200 gtaaaacagg aggttgaaaa gctggaggat gaatgggaaa gagaagaact tgataaaaag 1260 caaaaagaaa aggcatcttt actggaaaga gaagaaaagc cagagtggga aactggaagg 1320 taccaactag gaatgtatcc aattcagaat atggataaat tgcaaggaga ggaagaagaa 1380 agactgaaga gagaaatgct acttgctaaa ctgaatgaaa ttgacagaga actccaagat 1440 tctcgaaatc taaaataccc tgttttgcca ttgttacctg attttgaatc aaaactacac 1500 tccccagaga gaagccccaa aacatacagg ttctctgaat cctcagagag attatttaat 1560 gggcatcatt tgcaagacat cagtttctca actccaaaag gagaaggtca gaattcagga 1620 aatgttagaa gtccagcctc ccctaatgag ttcgcatttg gtagctacgt gccttcgttt 1680 gcaaaaacat cagagaggtc aaatccattt agtcaaaaaa gtagtttttt ggatttccaa 1740 agaaacagta tggaaaaact tagtaaagat ggtgtagatt taattacaag aaaagagaaa 1800 aaagctaatt tgatggaaca gttatttggt gccagtggta gcagcaccat ttcctccaaa 1860 agcagtgacc caaattctgt ggcttccagt aaaggagaca ttgaccctct aaattttctc 1920 cctgggaata aaggcagcag agatcaagaa catgatgaag atgaaggctt tttcctcagt 1980 gaaggaagaa gttttaatcc aaataggcac cgattaaaac atgcagacga taaaccagca 2040 gtaaaagcag ctgattctgt agaagatgaa attgaagaag tagcactgag atga 2094 <210> 5 <211> 2094 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgggggaaa gagcaggaag tccaggtact gatcaagaaa gaaaggcagg caaacaccat 60 tattcttact tatctgattt tgaaacgcca cagtcttctg gccgatcatc gctggtcagt 120 tcttcacctg caagtgttag gagaaaaaat cctaaaagac aaacttcaga tggccaagta 180 catcaccaag cccctcggaa accaagccct aagggtctac caaacagaaa gggagtccga 240 gtgggatttc gctcccagag cctcaataga gagccacttc ggaaagatac tgatcttgtt 300 acaaaacgga ttctgtctgc aagactgcta aaaatcaatg agttgcagaa tgaagtatct 360 gaactccagg tcaagttagc tgagctgcta aaagaaaata aatctttgaa aaggcttcag 420 tacagacagg agaaagccct gaataagttt gaagatgccg aaaatgaaat ctcacaactt 480 atatttcgtc ataacaatga gattacagca ctcaaagaac gcttaagaaa atctcaagag 540 aaagaacggg caactgagaa aagggtaaaa gatacagaaa gtgaactatt taggacaaaa 600 ttttccttac agaaactgaa agagatctct gaagctagac acctacctga acgagatgat 660 ttggcaaaga aactagtttc agcagagtta aagttagatg acaccgagag aagaattaag 720 gagctatcga aaaaccttga actgagtact aacagtttcc aacgacagtt gcttgctgaa 780 aggaaaaggg catatgaggc tcatgatgaa aataaagttc ttcaaaagga ggtacagcga 840 ctatatcaca aattaaagga aaaggagaga gaactggata taaaaaatat atattctaat 900 cgtctgccaa agtcctctcc aaataaagag aaagaacttg cattaagaaa aaatgctgca 960 tgccagagtg attttgcaga cctgtgtaca aaaggagtac aaaccatgga agacttcaag 1020 ccagaagaat atcctttaac tccagaaaca attatgtgtt acgaaaacaa atgggaagaa 1080 ccaggacatc ttactttgga cttgcaatct caaaagcaag acaggcatgg agaagcaggg 1140 attctaaacc caattatgga aagagaagaa aaatttgtta cagatgaaga actccatgtc 1200 gtaaaacagg aggttgaaaa gctggaggat gaatgggaaa gagaagaact tgataaaaag 1260 caaaaagaaa aggcatcttt actggaaaga gaagaaaagc cagagtggga aactggaagg 1320 taccaactag gaatgtatcc aattcagaat atggataaat tgcaaggaga ggaagaagaa 1380 agactgaaga gagaaatgct acttgctaaa ctgaatgaaa ttgacagaga actccaagat 1440 tctcgaaatc taaaataccc tgttttgcca ttgttacctg attttgaatc aaaactacac 1500 tccccagaga gaagccccaa aacatacagg ttctctgaat cctcagagag attatttaat 1560 gggcatcatt tgcaagacat cagtttctca actccaaaag gagaaggtca gaattcagga 1620 aatgttagaa gtccagcctc ccctaatgag ttcgcatttg gtagctacgt gccttcgttt 1680 gcaaaaacat cagagaggtc aaatccattt agtcaaaaaa gtagtttttt ggatttccaa 1740 agaaacagta tggaaaaact tagtaaagat ggtgtagatt taattacaag aaaagagaaa 1800 aaagctaatt tgatggaaca gttatttggt gccagtggta gcagcaccat ttcctccaaa 1860 agcagtgacc caaattctgt ggcttccagt aaaggagaca ttgaccctct aaattttctc 1920 cctgggaata aaggcagcag agatcaagaa catgatgaag atgaaggctt tttcctcagt 1980 gaaggaagaa gttttaatcc aaataggcac cgattaaaac atgcagacga taaaccagca 2040 gtaaaagcag ctgattctgt agaagatgaa attgaagaag tagcactgag atga 2094 <210> 6 <211> 2094 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atgggggaaa gagcaggaag tccaggtact gatcaagaaa gaaaggcagg caaacaccat 60 tattcttact tatctgattt tgaaacgcca cagtcttctg gccgatcatc gctggtcagt 120 tcttcacctg caagtgttag gagaaaaaat cctaaaagac aaacttcaga tggccaagta 180 catcaccaag cccctcggaa accaagccct aagggtctac caaacagaaa gggagtccga 240 gtgggatttc gctcccagag cctcaataga gagccacttc ggaaagatac tgatcttgtt 300 acaaaacgga ttctgtctgc aagactgcta aaaatcaatg agttgcagaa tgaagtatct 360 gaactccagg tcaagttagc tgagctgcta aaagaaaata aatctttgaa aaggcttcag 420 tacagacagg agaaagccct gaataagttt gaagatgccg aaaatgaaat ctcacaactt 480 atatttcgtc ataacaatga gattacagca ctcaaagaac gcttaagaaa atctcaagag 540 aaagaacggg caactgagaa aagggtaaaa gatacagaaa gtgaactatt taggacaaaa 600 ttttccttac agaaactgaa agagatctct gaagctagac acctacctga acgagatgat 660 ttggcaaaga aactagtttc agcagagtta aagttagatg acaccgagag aagaattaag 720 gagctatcga aaaaccttga actgagtact aacagtttcc aacgacagtt gcttgctgaa 780 aggaaaaggg catatgaggc tcatgatgaa aataaagttc ttcaaaagga ggtacagcga 840 ctatatcaca aattaaagga aaaggagaga gaactggata taaaaaatat atattctaat 900 cgtctgccaa agtcctctcc aaataaagag aaagaacttg cattaagaaa aaatgctgca 960 tgccagagtg attttgcaga cctgtgtaca aaaggagtac aaaccatgga agacttcaag 1020 ccagaagaat atcctttaac tccagaaaca attatgtgtt acgaaaacaa atgggaagaa 1080 ccaggacatc ttactttgga cttgcaatct caaaagcaag acaggcatgg agaagcaggg 1140 attctaaacc caattatgga aagagaagaa aaatttgtta cagatgaaga actccatgtc 1200 gtaaaacagg aggttgaaaa gctggaggat gaatgggaaa gagaagaact tgataaaaag 1260 caaaaagaaa aggcatcttt actggaaaga gaagaaaagc cagagtggga aactggaagg 1320 taccaactag gaatgtatcc aattcagaat atggataaat tgcaaggaga ggaagaagaa 1380 agactgaaga gagaaatgct acttgctaaa ctgaatgaaa ttgacagaga actccaagat 1440 tctcgaaatc taaaataccc tgttttgcca ttgttacctg attttgaatc aaaactacac 1500 tccccagaga gaagccccaa aacatacagg ttctctgaat cctcagagag attatttaat 1560 gggcatcatt tgcaagacat cagtttctca actccaaaag gagaaggtca gaattcagga 1620 aatgttagaa gtccagcctc ccctaatgag ttcgcatttg gtagctacgt gccttcgttt 1680 gcaaaaacat cagagaggtc aaatccattt agtcaaaaaa gtagtttttt ggatttccaa 1740 agaaacagta tggaaaaact tagtaaagat ggtgtagatt taattacaag aaaagagaaa 1800 aaagctaatt tgatggaaca gttatttggt gccagtggta gcagcaccat ttcctccaaa 1860 agcagtgacc caaattctgt ggcttccagt aaaggagaca ttgaccctct aaattttctc 1920 cctgggaata aaggcagcag agatcaagaa catgatgaag atgaaggctt tttcctcagt 1980 gaaggaagaa gttttaatcc aaataggcac cgattaaaac atgcagacga taaaccagca 2040 gtaaaagcag ctgattctgt agaagatgaa attgaagaag tagcactgag atga 2094 <210> 7 <211> 2094 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgggggaaa gagcaggaag tccaggtact gatcaagaaa gaaaggcagg caaacaccat 60 tattcttact tatctgattt tgaaacgcca cagtcttctg gccgatcatc gctggtcagt 120 tcttcacctg caagtgttag gagaaaaaat cctaaaagac aaacttcaga tggccaagta 180 catcaccaag cccctcggaa accaagccct aagggtctac caaacagaaa gggagtccga 240 gtgggatttc gctcccagag cctcaataga gagccacttc ggaaagatac tgatcttgtt 300 acaaaacgga ttctgtctgc aagactgcta aaaatcaatg agttgcagaa tgaagtatct 360 gaactccagg tcaagttagc tgagctgcta aaagaaaata aatctttgaa aaggcttcag 420 tacagacagg agaaagccct gaataagttt gaagatgccg aaaatgaaat ctcacaactt 480 atatttcgtc ataacaatga gattacagca ctcaaagaac gcttaagaaa 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caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgcc 12120 cgggctaatt agggggtgtc gcccttattc gactctatag tgaagttcct attctctaga 12180 aagtatagga acttctgaag tggggtcgac ttaattaagg 12220 <210> 10 <211> 583 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 10 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattaa 300 catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc cctccccacc 360 cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg cggggggggg 420 gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag 480 aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg 540 gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcg 583 <210> 11 <211> 2238 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 11 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60 cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120 gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctatgac 240 cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300 caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360 gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420 ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480 aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540 tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600 aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660 gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcacc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780 tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840 tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900 aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960 aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020 caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080 tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140 aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200 cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260 cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320 tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380 cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440 ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500 tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560 ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620 atctttggga agcaaggctc 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Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Thr 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Glu 580 585 590 Thr Thr Arg Pro Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln 595 600 605 Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln 610 615 620 Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro 625 630 635 640 Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile 645 650 655 Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser 660 665 670 Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val 675 680 685 Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp 690 695 700 Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Ile Asn Val 705 710 715 720 Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile 725 730 735 Gly Thr Arg Tyr 740 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 13 gcctgttcct gcttgcttac 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 14 tgctttccaa agtaagcaca aa 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 15 cctggcctcc agacaagtag 20

Claims (25)

  1. 인간 레베르실린을 암호화하는 서열번호: 3의 코돈 최적화된, 조작된 핵산 서열.
  2. 인간 레베르실린을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열 서열번호: 3을 포함하는, 발현 카세트.
  3. 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)가 AAV 캡시드, 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은 하기를 포함하는, rAAV:
    (a) AAV 5' 역 말단 반복 (ITR) 서열;
    (b) 프로모터;
    (c) 인간 레베르실린을 암호화하는 코딩 서열;
    (d) AAV 3' ITR.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 (c)의 코딩 서열이 코돈 최적화된 인간 LCA5이고, 이는 서열번호: 2의 천연 인간 레베르실린 코딩 서열과 적어도 70% 동일한, rAAV.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 (c)의 코딩 서열이 서열번호: 3인, rAAV.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 캡시드가 AAV7m8 또는 이의 변이체, AAV8 캡시드, AAV6 캡시드 또는 이의 변이체, AAV9 캡시드 또는 이의 변이체, AAV7 캡시드, 또는 이의 변이체, AAV5 캡시드, 또는 이의 변이체, AAV2 캡시드 또는 이의 변이체, AAV1 캡시드 또는 이의 변이체, AAV3 캡시드 또는 이의 변이체, 또는 AAV4 캡시드 또는 이의 변이체인, rAAV.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 또는 CMV 프로모터 서열 및 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터 서열을 포함하는 혼성 프로모터인, rAAV.
  8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 5' ITR 및/또는 AAV3' ITR이 AAV2로부터 유래한, rAAV.
  9. 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 폴리A를 추가로 포함하는, rAAV.
  10. 제 3 항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 인트론을 포함하는, rAAV.
  11. 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 인핸서를 포함하는, rAAV.
  12. 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 rAAV 및 상기 눈에 전달하기에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 조성물.
  13. LCA 환자에 투여하기에 적합한 수성 현탁액으로서, 상기 현탁액은 수성 현탁 액체 및 LCA에 대한 치료제로서 유용한 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)의 눈 당 약 1 x1010 바이러스 입자 내지 약 1 x1012 GC 또는 바이러스 입자를 포함하고, 상기 rAAV는 AAV 캡시드를 가지고, 그 안에 하기를 포함하는 벡터 게놈이 패키징된, 수성 현탁액:
    (a) AAV 5' 역 말단 반복 (ITR) 서열;
    (b) 프로모터;
    (c) 인간 레베르실린을 암호화하는 코딩 서열; 및
    (d) AAV 3' ITR.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 현탁액이 망막하 또는 유리체내 주사에 적합한, 현탁액.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호: 10이고, 상기 암호화 코딩 서열이 SED ID NO: 3인, 현탁액.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 캡시드가 AAV7m8 캡시드인, 현탁액.
  17. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 8의 nt 824 내지 nt 1795의 CBA 엑손 l 및 인트론을 추가로 포함하는, 현탁액.
  18. 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV, 제 12 항에 따른 조성물, 또는 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 현탁액의, LCA를 가지는 대상의 치료를 위한 용도
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 rAAV가 수성 현탁액 중 눈 당 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈 (vg/눈)으로 전달되는, 용도.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 rAAV가 망막하로 또는 유리체내로 투여되는, 용도.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 약 또는 적어도 150 마이크로리터를 포함하는 부피 중 1 x 109 내지 1 x 1013 rAAV의 투여량으로 투여됨으로써, 상기 대상에서 시각 기능을 회복시키는, 용도.
  22. 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV, 제 12 항에 따른 조성물, 또는 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 현탁액을 사용하는, LCA를 가지는 대상을 치료하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 rAAV가 수성 현탁액 중 눈 당 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈 (vg/눈)으로 전달되는, 방법.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 상기 rAAV가 망막하로 또는 유리체내로 투여되는, 방법.
  25. 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 약 또는 적어도 150 마이크로리터를 포함하는 부피 중 1 x 109 내지 1 x 1013 rAAV의 투여량으로 투여됨으로써, 상기 대상에서 시각 기능을 회복시키는, 방법.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3814492A4 (en) * 2018-06-29 2022-02-23 Wuhan Neurophth Biotechnology Limited Company COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING LEBER'S HEREDITARY OPTIC NEUROPATHY
MX2023008826A (es) 2021-02-01 2023-09-15 Regenxbio Inc Terapia génica para lipofuscinosis neuronal ceroidea.
US20220387627A1 (en) * 2021-06-03 2022-12-08 Hope for Hasti Vectors and gene therapy for treating cornelia de lange syndrome

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US6268213B1 (en) 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
US5869305A (en) 1992-12-04 1999-02-09 The University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US5741683A (en) 1995-06-07 1998-04-21 The Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
ES2224375T3 (es) 1997-04-14 2005-03-01 Cell Genesys, Inc. Metodos para aumentar la eficacia del producto de aav recombinante.
EP1080218A1 (en) 1998-05-27 2001-03-07 University of Florida Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions by using an iodixanol gradient
WO2000028004A1 (en) 1998-11-10 2000-05-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Virus vectors and methods of making and administering the same
ATE403715T1 (de) 1999-08-09 2008-08-15 Targeted Genetics Corp Erhöhung der expression einer einzelsträngigen, heterologen nukleotidsequenz von einem rekombinanten viralen vektor durch ausgestaltung der sequenz in einer art und weise, dass basenpaarungen innerhalb der sequenz entstehen
US7201898B2 (en) 2000-06-01 2007-04-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compounds for controlled release of recombinant parvovirus vectors
EP1381276A4 (en) 2001-04-13 2005-02-02 Univ Pennsylvania METHOD FOR TREATMENT OR DEVELOPMENT SLUDGE DEGRADATION
PL220644B1 (pl) 2001-11-13 2015-11-30 Univ Pennsylvania Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV), kompozycja, wyizolowane białko kapsydowe, wyizolowane lub syntetyczne cząsteczki kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania zrekombinowanego wirusa, komórka gospodarza
ES2602352T3 (es) 2001-12-17 2017-02-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Secuencias de serotipo 8 de virus adenoasociado (VAA), vectores que las contienen y usos de las mismas
US20070015238A1 (en) 2002-06-05 2007-01-18 Snyder Richard O Production of pseudotyped recombinant AAV virions
EP1486567A1 (en) 2003-06-11 2004-12-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved adeno-associated virus (AAV) vector for gene therapy
WO2005013090A2 (en) 2003-08-01 2005-02-10 Dna Twopointo Inc. Systems and methods for biopolymer engineering
US8005620B2 (en) 2003-08-01 2011-08-23 Dna Twopointo Inc. Systems and methods for biopolymer engineering
US7906111B2 (en) 2003-09-30 2011-03-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
EP4234687A2 (en) 2005-04-07 2023-08-30 The Trustees of the University of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
WO2006132118A1 (ja) 2005-06-09 2006-12-14 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. 振幅誤差補償装置及び直交度誤差補償装置
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
WO2008065430A2 (en) * 2006-12-01 2008-06-05 Oxford Biomedica (Uk) Limited Promoter construct
MX353900B (es) 2008-11-07 2018-02-01 Massachusetts Inst Technology Lipidoides de aminoalcohol y usos de los mismos.
SG10201502270TA (en) 2010-03-29 2015-05-28 Univ Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
US9249425B2 (en) * 2011-05-16 2016-02-02 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Proviral plasmids and production of recombinant adeno-associated virus
CN103906527B (zh) 2011-06-08 2020-07-10 川斯勒佰尔公司 Mrna递送的脂质纳米颗粒组合物和方法
CA2873274C (en) 2012-06-08 2021-06-01 Ethris Gmbh Pulmonary delivery of messenger rna
EP2872183B1 (en) 2012-07-11 2018-09-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-mediated gene therapy for rpgr x-linked retinal degeneration
US9567376B2 (en) 2013-02-08 2017-02-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Enhanced AAV-mediated gene transfer for retinal therapies
EP2970972B1 (en) * 2013-03-11 2018-08-15 Fondazione Telethon Mir-204 and mir-211 and uses thereof
KR102527259B1 (ko) 2013-03-15 2023-04-27 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아 스터퍼/필러 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 벡터 및 사용 방법
US9158889B2 (en) * 2013-04-26 2015-10-13 Oral4D Systems Ltd. Electronic dental charting
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
US10392622B2 (en) * 2014-08-01 2019-08-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for self-regulated inducible gene expression

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