BR112019017327A2 - terapia gênica para distúrbios oculares - Google Patents

Abstract

são fornecidos composições e métodos para o tratamento da amaurose congênita de leber (lca - "leber congenital amaurosis") em um sujeito. em um aspecto, é fornecido um vetor de vírus adeno-associado recombinante que inclui uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica a lebercilina. em outro aspecto, a lebercilina tem uma sequência de aminoácidos da seq id no: 1. em ainda outro aspecto, a molécula de ácido nucleico tem uma sequência da seq id no: 3 ou uma variante desta. nas modalidades desejadas, o sujeito é um ser humano, gato, cão, ovelha ou primata não humano.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para TERAPIA GÊNICA PARA DISTÚRBIOS OCULARES.

DECLARAÇÃO CONCERNENTE A PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL [001] Essa invenção foi feita com apoio do governo sob os N^Q de Concessão R21EY020662 e P30EY001583 concedidos pelo National Eye Institute (NEI)/National Institutes of Health (NIH). O governo tem determinados direitos nesta invenção.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DO MATERIAL APRESENTADO EM FORMULÁRIO ELETRÔNICO [002] O depositante incorpora por referência o material de Listagem de Sequência depositado em formato eletrônico. Este arquivo é nomeado UPN-16-7696PCT_Seq_Listing_ST25.txt.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] Um dos grupos mais graves de doenças hereditárias causadoras de cegueira é a amaurose congênita de Leber (LCA - Leber Congenital Amaurosis; OMIM 204000). A LCA é rara, ocorrendo em 1:50.000 indivíduos, é geralmente herdada de forma autossômica recessiva e pode ser causada por mutações em pelo menos 22 genes diferentes (sph.uth.edu/RetNet/sum-dis.htm). As características clínicas incluem visão severamente anormal (acuidade visual, campos visuais reduzidos) na infância ou primeira infância, nistagmo e perda progressiva da visão deficiente que existe no início da vida. Os testes clínicos revelam respostas eletrorretinianas escotópicas e fotópicas (ERG), pupilas amauróticas, sensibilidade à luz reduzida e alterações pigmentares na retina. Atualmente, não há tratamento aprovado para a LCA.

[004] Uma forma de LCA causada por mutações no gene de codificação da proteína de 65 kDa do epitélio pigmentar da retina, RPE65 (Redmond TM, Yu S, Lee E, Bok D, Hamasaki D, Chen N, et al. Rpe65

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2/105 is necessary for production of 11-cis-vitamin A in the retinal visual cycle. Nat Genet (1998) 20(4):344-51; Redmond T, Hamel C. Genetic analysis of RPE65: from human disease to mouse model. Methods in Enzymol (2000) 317:705-24, ambos incorporados neste documento por referência), recebeu grande atenção nos últimos anos, uma vez que foi alvo de múltiplos ensaios clínicos de terapia de aumento de genes. Usando o serotipo 2 do vírus adeno-associado (AAV), vários grupos mostraram que a transmissão da cópia de tipo selvagem do cDNA de RPE65 para o epitélio pigmentar da retina (RPE) é segura, e que isso pode reverter muitos dos déficits, incluindo nictalopia.(3-9) Um estudo randomizado de Fase 3 multicêntrico testando AAV2hRPE65v2 (ou voretigene neparvovec, patrocinado pela Spark Therapeutics, Filadélfia, PA), mostrou que a injeção sub-retiniana desse reagente leva a melhorias na sensibilidade à luz, campos visuais e até mesmo na capacidade de se navegar com precisão e rapidez usando dicas visuais ao longo de uma gama de condições de luminância. (10, 11) A Food and Drug Administration (FDA) dos EUA concedeu a aprovação de medicamentos para Voretigene neparvovec-rzyl em 19 dezembro de 2017, tornando este um dos primeiros medicamentos de terapia genética aprovados nos EUA. O progresso no desenvolvimento de um tratamento para LOA causado por mutações RPE65, LCA2, abre o caminho para o desenvolvimento de tratamentos para outras formas de degeneração da retina de início precoce, a maioria das quais são causadas por mutações em genes específicos de fotorreceptores, não apenas genes específicos de RPE.

[005] Uma das formas mais graves dessa condição já grave (LOA) é causada por mutações no gene específico de fotorreceptores que codifica Lebercilina, LCA5 (12-20). Estima-se que a mutação LCA5 seja responsável por ~2% dos casos de LOA, embora possa ser mais prevalente em populações geneticamente isoladas.(16) As muta

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3/105 ções LCA5 também foram identificadas como a causa de outras formas precoces de degeneração da retina, incluindo a distrofia do cone e a retinite pigmentosa autossômica recessiva (ARRP).(15, 16, 21) [006] Portanto, composições úteis para expressar Lebercilina em sujeitos necessitados são necessárias.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [007] As modalidades descritas neste documento são direcionadas a composições e métodos relacionados a um vetor de terapia gênica de AAV para administração de LCA5 humano a um indivíduo em necessidade respectiva, após administração intravítrea ou subretiniana do vetor que resulta em correção clinicamente significativa em longo prazo, talvez 10 anos ou mais, da amaurose congênita de Leber (LCA).

[008] Em um aspecto, é proporcionada uma sequência de ácido nucleico manipulada, com códons otimizados, que codifica a Lebercilina humana. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico com códons otimizados é uma variante da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 2. Em uma outra modalidade, a sequência de ácido nucleico com códons otimizados é a SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a sequência de ácido nucleico é codificada para expressão em seres humanos.

[009] Em outro aspecto, proporciona-se um cassete de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico com códons otimizados que codifica a Lebercilina. Em uma modalidade, o cassete de expressão inclui a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3 que codifica a Lebercilina humana. Ainda em outras modalidades, a sequência de codificação de Lebercilina é posicionada entre as sequências ITR 5' e 3' de AAV.

[0010] Ainda em outro aspecto, é proporcionado um vetor de vírus adeno-associado recombinante (rAAV). O rAAV compromete um capsídeo de AAV e um genoma de vetor empacotado nele. Em uma mo

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4/105 dalidade, o genoma do vetor compreende: (a) uma sequência de repetição terminal invertida 5' de AAV (ITR); (b) um promotor; (c) uma sequência de codificação que codifica uma Lebercilina humana; e (d) uma ITR 3' de AAV. Em uma modalidade, o vetor de rAAV compreende ainda sequências de controle de expressão que direcionam a expressão da Lebercilina em uma célula hospedeira. Em outra modalidade, a sequência de Lebercilina é a sequência proteica da SEQ ID NO:

1. Em uma modalidade, o genoma do vetor é a sequência de nt 1 -4379 da SEQ ID NO: 8. Em outra modalidade, o genoma do vetor é a sequência de nt 1-4368 da SEQ ID NO: 9. Ainda em outra modalidade, a sequência de codificação de LCA5 em qualquer um dos genomas de vetor identificados é trocada por outra sequência de codificação de LCA5 como descrita neste documento.

[0011] Em outro aspecto, é proporcionada uma suspensão aquosa adequada para administração a um paciente com LCA. Em uma modalidade, a suspensão compreende um líquido de suspensão aquosa e cerca de 1 x 1O¹⁰ GC ou partículas virais a cerca de 1 x 10¹³ GC ou partículas virais por olho de um vírus adeno-associado recombinante (rAAV) descrito neste documento como terapêutico para LCA.

[0012] Em outro aspecto, uma composição farmacêutica compreende um veículo, diluente, excipiente e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável e a sequência de ácido nucleico, um plasmídeo, um vetor ou um vetor viral, tal como o rAAV, descrito especificamente neste documento.

[0013] Em outro aspecto, um método para tratar a Amaurose Congênita de Leber causada por um defeito no gene da Lebercilina (LCA5) e/ou restaurar a função visual em um sujeito mamífero contendo LCA compreende administrar por injeção intravítrea, sub-retiniana ou intravascular a um sujeito, dele necessitado, vetor AAV recombinante que codifica Lebercilina, como descrito neste documento.

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5/105 [0014] Em outro aspecto, o uso de um vetor de AAV como descrito neste documento é fornecido no tratamento da amaurose congênita de Leber causada por um defeito no gene da lebercilina (LCA5) e/ou na restauração da função visual em um sujeito mamífero possuindo LCA. O uso inclui administração via injeção intravítrea, sub-retiniana ou intravascular a um sujeito, com tal necessidade, do vetor de AAV recombinante que codifica a Lebercilina, como descrito neste documento.

[0015] Outros aspectos e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0016] A Figura 1A mostra os cassetes de transgene utilizados para gerar AAV7m8.CBA.hopt.LCA5 e AAV7m8.CBA.EGFP como descritos neste documento.

[0017] As Figuras 1B-1D proporcionam um alinhamento da sequência de ácido nucleico humano de LCA5 (Native_LCA5) da SEQ ID NO: 2 e a sequência de LCA5 com códons otimizados (Codonoptimized_LCA5) da SEQ ID NO: 3.

[0018] As Figuras 1E-1F fornecem um mapa de plasmídeo e uma lista de características do vetor de Lebercilina com códons otimizados pAAV.CMV.CBA.human. A sequência de ácido nucleico é reproduzida na SEQ ID NO: 8.

[0019] As Figuras 1G-1H proporcionam análise de imunofluorescência de olhos injetados com AAV7m8-hopt-LCA5 em P5 e os analisados em P15 mostram a Lebercilina co-localizada com a base de segmentos externos positivos para tubulina como descrito nos Exemplos 1, 2 e 4. Após injeção intravítrea (IVT, FIG 1G) ou injeção subretiniana (SR, FIG 1L), a Lebercilina foi distribuída por toda a retina, que estava quase desprovida de fotorreceptores em P95. Em contraste, a lebercilina está ausente nas retinas P15 e P95 Lca5-/- não trataPetição 870190095862, de 25/09/2019, pág. 10/143

6/105 das. SR, sub-retiniano; IVT, intravitreo; (-) Lca5 não tratada -/-. Desenhos são fornecidos mostrando o esquema de injeção intravítrea (FIG 1G) e esquema de injeção sub-retiniana (FIG 1H).

[0020] A Figura 11 mostra a expressão de Lebercilina em camundongos de tipo selvagem e camundongos Lca5-/- em P20 injetados por via sub-retiniana com o vetor AAV.LCA5.

[0021] As Figuras 2A-2I mostram as amplitudes do reflexo pupilar normalizado medidas aos 3 meses de idade dos camundongos injetados com AAV7m8.hopt-LCA5 em comparação com os olhos de controle (injetados com placebo) dos camundongos Lca5-/- tratados em PN5 e PN15. Os resultados são apresentados após (A) injeção intravítrea e (B) sub-retiniana ou (C) em camundongos de controle (-) não tratados. (D) As amplitudes relativas do reflexo pupilar (% do diâmetro inicial da pupila) dos olhos direitos dos animais em cada um dos subgrupos mostrados em (A-C) mais em camundongos positivos (+) de controle do tipo selvagem (C57B16) são mostrados graficamente (E). As Figuras 2F e 2G são representações do esquema de teste utilizado para gerar os resultados mostrados nas Figuras 2A-2D. As FIGs 2H e 2I mostram uma comparação das amplitudes do reflexo pupilar normalizado em camundongos experimentais e de controle, mostrados nas FIG 2A-2D, tratados em PN5 versus PN15 via injeção sub-retiniana (SR, I) ou intravítrea (IV, H). *p<0,1; **p<0,05; ***p<0,01.

[0022] As Figuras 3A-3F mostram resultados do teste de labirinto aquático de olhos injetados com AAV7m8.hopt-LCA5 vs. controle (injetados com placebo) de camundongos Lca5-/- tratados em PN5 e PN15 e medidos aos 3 meses de idade como descrito no Exemplo 3. A FIG. 3A é uma tabela mostrando o resultado da análise estatística. A FIG. 3B é uma ilustração de resultados representativos do teste do labirinto de água. A FIG. 3D é um gráfico de barras mostrando os dias até o primeiro sucesso no treinamento de camundongos Lca5-/- em PN5 ou

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PN15 tratados ao nascimento com o vetor AAV7m8.LCA5 intravítreo ou sub-retiniano no nascimento. Camundongos do tipo selvagem foram fornecidos como controles. A FIG. 3D é um gráfico de linhas de taxas de sucesso sob várias intensidades de luz (eixo x) de camundongos Lca5-/- em PN5 tratados no nascimento com o vetor AAV7m8.LCA5 intravítreo. A FIG. 3E é um gráfico de linhas de taxas de sucesso sob várias intensidades de luz (eixo x) de camundongos Lca57- em PN5 tratados no nascimento com o vetor AAV7m8.LCA5 sub-retiniano. A FIG. 3F é um gráfico de linhas de taxas de sucesso sob várias intensidades de luz (eixo x) de camundongos Lca5-/- em PN15 tratados no nascimento com o vetor AAV7m8.LCA5 intravítreo.

[0023] A Figura 4 é um gráfico que fornece os resultados da histologia representativa após a entrega de AAV7m8.hopt-LCA5 à retina Lca5gt/gt no dia pós-natal (PN)5. O gráfico mostra o número de fileiras na camada nuclear externa (ONL) após o tratamento IVT ou SR com AAV.LCA5 vs. injeção de placebo.

[0024] A Figura 5A fornece o resultado da imunofluorescência e mostra que a rodopsina (vermelha) persiste nos fotorreceptores tratados (mas não nos controles não tratados) ao longo do período de 3 meses. Células fotorreceptoras ocasionais são positivas para eGFP (região de injeção identificada através de co-injeção com AAV7m8.eGFP).

[0025] As Figuras 5B-5D fornecem respostas de matriz de eletrodos múltiplos (MEA) de cones e bastonetes tratados com Lca5gt/gt AAV7m8.hopt-LCA5 que são similares àquelas das retinas de tipo selvagem (WT). (B) Amplitude de resposta (diferença nas taxas de disparo antes e depois do início do flash) vs. dados de intensidade do flash medidos a partir de traços calculados por média (não mostrados). As respostas das retinas tratadas são tão altas quanto 70% da resposta da retina WT; há uma resposta mínima à abolida da retina não tratada.

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8/105 (C) Amplitudes de resposta das retinas do painel A para as séries de 1- e 2- intensidade (antes/durante e depois das exposições mais brilhantes no final da 1- execução, durante cada série de intensidade a intensidade da série de estimulação foi aumentada de escotópica para os valores mais brilhantes em incrementos de -0,5 log) (D) Amplitudes de respostas ON transientes (diferença nas taxas de disparo antes e depois do início (onset) do flash), respostas ON sustentadas (diferença antes do início (onset) e fim (offset) do flash) e respostas OFF (diferença antes e depois do fim (offset) do flash) como funções da intensidade do flash para as 1- e 2- execuções de séries de intensidade. As áreas sombreadas azul-claro representam o intervalo de respostas WT (4 retinas, MÉDIA±STD), os traçados apenas de linha fornecem amplitudes médias da resposta WT. As setas horizontais ilustram a mudança para a direita na sensibilidade causada pela exposição aos flashes mais brilhantes no final da primeira execução de séries. As retinas tratadas Lca5gt/gt e WT tratadas apresentam dependências de resposta/intensidade semelhantes antes e depois do branqueamento, enquanto respostas de retina Lca5gt/gt não tratada da retina são achatadas. Os círculos conectados por linhas representam LCA5gt/gt tratada. Triângulos conectados por linhas representam LCA5gt/gt de controle.

[0026] As Figuras 6A-6E mostram que existe uma morte celular maciça durante a degeneração dos fotorreceptores no início da vida na retina Lca5-/- não tratada (e atraso desta degeneração após o tratamento com AAV.hopt.LCA5) conforme evidenciado pelo (A) ensaio TUNEL (FIG 6A, FIG 6B-E, terceira fileira) e (B) análise de imunofluorescência por rodopsina. (FIG 6B-E, fileiras 1,3 e 4).

[0027] As Figuras 7A-7D mostram que os segmentos exteriores estavam presentes nas retinas Lca5-/- tratadas com AAV7m8.hopt.LCA5 mas não nas retinas Lca5-/- de controle. A avalia

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9/105 ção por microscopia eletrônica de transmissão das retinas injetadas com AAV7m8.hopt.LCA5 revela os segmentos externos do fotorreceptor do bastonete e do cone com discos empilhados e conectando cílios em Lca5-/- com 3 meses de idade. Nenhuma dessas estruturas estava presente nas retinas Lca5-/- não tratadas. (A, B) PN80 após injeção intravítrea em PN5 com AAV7m8p643 (Lebercilina com códons otimizados), imagens representativas; (A1-A3): resolução de 12K, imagens costuradas mostrando fileiras de células fotorreceptoras, células de bastonete (cabeças de seta), células de cone (setas), muitas mitocôndrias de células fotorreceptoras (asteriscos); (B), resolução de 20K; (B1) corte transversal de cílios mostrando estrutura de 9 +0 de microtúbulo, disco membranoso de OS de célula de bastonete (setas); (C) resolução de 30K, corpo basal (cabeça de seta); (C1) seção sagital do cílio de ligação; (D) resolução de 12K, nenhuma célula fotorreceptora permaneceu em ONL; (D1) núcleos picnóticos (cabeça de seta) de uma célula moribunda; (D2) restos flutuantes de organelas de células mortas, incluindo RE rugoso (setas).

[0028] A Figura 8 mostra o resultado de Respostas à Luz Pupilares de uma retina de um homem adulto com LCA5 (traço vermelho linha de cima) tendo características temporais semelhantes às de um homem com visão normal comparável em idade (traço azul - linha de fundo). A amplitude de constrição foi reduzida no paciente LCA5 comparado ao indivíduo normal.

[0029] A Figura 9 é uma tabela da espessura de várias camadas retinianas mostrando que a espessura da camada nuclear externa (ONL) permanece mais espessa durante pelo menos 3 meses no tratamento (*) em comparação com as retinas de controle. Não houve uma tendência tão clara nas outras camadas retinianas (camada plexiforme externa, OPL; camada nuclear interna, INL, camada plexiforme interna, IPL). Para cada ponto de tempo, as barras da esquerda para a

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10/105 direita representam as espessuras de ONL, OPL, INL e IPL, respectivamente.

[0030] A Figura 10 proporciona resultados de alterações mediadas por luz na posição de moléculas específicas da fototransdução após a injeção com AAV7m8.hopt.LCA5.

[0031] As Figuras 11A-11B fornecem um mapa de plasmídeos e uma lista de características do vetor de Lebercilina nativo de pAAV.CMV.CBA.human. A sequência de ácido nucleico é reproduzida na SEQ ID NO: 9.

[0032] As Figuras 12A-12F demonstram o fenótipo dos cílios recuperados em LCA5 homozigótica humana p.(Q279*) iPSC-RPE após tratamento com AAV7m8.hopt-LCA5. (A) As imagens confocais mostram a morfologia hexagonal de células RPE maduras, juntamente com os marcadores de RPE detectáveis por imunofluorescência; ZO-1 e MITF. As imagens de contraste de fase (PC) exibem a arquitetura das culturas de iPSC-RPE de RPE derivadas tanto da pessoa com visão normal quanto do paciente de LCA5; (B) PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) da expressão de mRNA de LCA5 em RPEs de controle de visão normal e RPEs derivados de paciente de LCA5. O GAPDH é usado para normalizar os níveis de expressão. (C) As análises de transferência de Western mostram a proteína Lebercilina endógena (*) em células de controle de visão comum que são não tratadas (-) ou tratadas com AAV7m8.eGFP (G). Não há lebercilina endógena em células afetadas por LCA5 não tratadas ou tratadas com AAV7m8.GFP. Existem níveis robustos de lebercilina após a infecção de células de indivíduos com visão normal e LCA5 com AAV7m8.LCA5 (L). Análises de imunofluorescência mostram presença de cílios primários positivos para Ari 13b em iPSC-RPE de visão normal (D) e derivado de LCA5 (E). A lebercilina está presente em células afetadas por LCA5 em controle de visão normal e em tratadas com AAV7m8.LCA5

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11/105 (mas não com tratadas com AAV7m8.eGFP). (F) A análise quantitativa do número de cílios por célula no LPE5-ÍPSC-RPE de visão normal mostra o efeito de resgate da formação de cílios após o tratamento de células LCA5-ÍPSC-RPE com AAV7m8.LCA5 (mas não com AAV7m8.eGFP).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0033] Os métodos e composições descritos neste documento envolvem composições e métodos para distribuir uma sequência de ácido nucleico de LCA5 que codifica a proteína Lebercilina para sujeitos com essa necessidade de tratamento para a amaurose congênita de Leber (LCA). Em uma modalidade, tais composições envolvem a otimização de códons da sequência de codificação de Lebercilina. É desejável aumentar a eficácia do produto e, assim, aumentar a segurança, uma vez que pode ser utilizada uma dose menor de reagente. Também são abrangidas neste documento composições que incluem as sequências de codificação da lebercilina nativa, como mostrado na SEQ ID NO: 2.

[0034] Os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que aquele entendido na técnica a que esta invenção pertence e por referência a textos publicados, que proporcionem, àqueles versados na técnica, uma orientação geral para vários dos termos usados no presente pedido. As definições contidas nesta especificação são fornecidas para maior clareza na descrição dos componentes e composições neste documento e não se destinam a limitar a invenção reivindicada.

[0035] A Lebercilina é codificada pelo gene de LCA5 no cromossomo 6q14 e é uma proteína ciliar que se localiza nos cílios de ligação dos fotorreceptores e nos microtúbulos, centríolos e cílios primários das células de mamíferos cultivadas.

[0036] A Lebercilina é expressa amplamente ao longo do desen

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12/105 volvimento e é encontrada nos cílios das células cultivadas, bem como no cílio de ligação das células fotorreceptoras maduras. O cílio de conexão é uma estrutura estreita entre o segmento interno do fotorreceptor que abriga a maquinaria biossintética da célula e os segmentos externos que contêm a cascata visual acionada pela opsina. O cílio de conexão funciona como um condutor, suportando o tráfego bidirecional de proteínas e vesículas ao longo dos trilhos de microtúbulos ciliares em um processo conhecido como transporte intraflagelar (IFT). Aplicando proteômica de afinidade quantitativa a um modelo de camundongo Lca5 geneticamente manipulado, Boldt et al. demonstraram que a perda de função de Lca5 perturba o IFT, causando defeitos no desenvolvimento do segmento externo de fotorreceptores e falha no tráfego de arrestina e opsina. Os camundongos nulos para Lca5 (Lca5gt/gt) não possuem respostas a ERG de cone e bastonete e passam por uma degeneração da retina precoce e progressiva com apenas uma única fileira de núcleos dispersos (em comparação com 8-10 fileiras de células contíguas em retinas de camundongo selvagem) presentes na camada nuclear externa (ONL) aos 2 meses de idade 19. [0037] Mutações em LCA5 levam a uma forma hereditária de degeneração da retina chamada Amaurose Congênita de Leber (LCA). O fenótipo nos indivíduos afetados é limitado ao olho e resulta em cegueira. Em 6 famílias estudadas por den Hollander, 5 apresentavam mutações frameshift e homozigóticas nonsense e, em uma família, o transcrito de LCA5 estava completamente ausente. Os ácidos nucleicos codificando o cDNA de Lebercilina ou uma versão deste com códons otimizados são do tamanho apropriado para se ajustarem a um vetor de vírus adeno-associado (AAV). Ver, por exemplo, as sequências nas Figuras 1A e 1E a 1F e Figuras 11A-11B. Tal como descrito nos exemplos, abaixo, utilizando uma estratégia de aumento de genes mediada por rAAV, mostra-se que a degeneração da retina devido a

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13/105 mutações de LCA5 pode ser corrigida. Essa terapia é particularmente vantajosa se o tipo selvagem ou a cópia otimizada do gene for administrada precocemente na vida, por exemplo, na infância ou no período pós-natal precoce. Além disso, essa administração intravítrea ou subretiniana usada em uma modalidade, fornece o gene eficientemente às células-alvo (por exemplo, fotorreceptores).

[0038] O gene da Lebercilina, LCA5, codifica a Lebercilina, uma proteína de 697 aminoácidos que se acredita estar envolvida nas funções centrossomais ou ciliares e menos no transporte de microtúbulos dirigido à extremidade. Como utilizados neste documento, os termos LCA5 e Lebercilina são utilizados indistintamente quando se referem à sequência de codificação. As sequências de ácidos nucleicos nativas codificando a Lebercilina humana são relatadas na Sequência de Referência NCBI NM_181714.3 (variante 1 do transcrito), NM_001122769.2 (variante 2 do transcrito), XM_011535504.1 (variante X1 do transcrito) e XM_005248665.4 (variante X2 do transcrito), e reproduzidas nas SEQ ID NO: 4, 5, 6 e 7, respectivamente. A sequência de aminoácidos humana nativa reproduzida neste documento na SEQ ID NO: 1 (Sequência de Referência NCBI: NP_001116241.1 ou NP_859065.2, bem como UniProtKB/Swiss-Prot ID: Q86VQ0-1). Mutações no gene de LCA5 estão associadas à amaurose congênita de Leber (LCA). Em certas modalidades, os termos LCA5 e Lebercilina são usados de forma intercambiável.

[0039] A amaurose congênita de Leber (LCA) é uma doença ocular que afeta principalmente a retina, que é o tecido especializado na parte de trás do olho que detecta luz e cor. As pessoas com esse distúrbio geralmente têm deficiência visual grave desde a infância. A deficiência visual tende a ser estável, embora possa piorar muito lentamente ao longo do tempo. A amaurose congênita de Leber também está associada a outros problemas de visão, incluindo um aumento da

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14/105 sensibilidade à luz (fotofobia), movimentos involuntários dos olhos (nistagmo) e hipermetropia extrema (hipermetropia). As pupilas, que geralmente se expandem e se contraem em resposta à quantidade de luz que entra no olho, não reagem normalmente à luz. Em vez disso, eles se expandem e se contraem mais lentamente que o normal, ou podem não responder à luz. Além disso, o revestimento frontal claro do olho (a córnea) pode ser em forma de cone e anormalmente fino, uma condição conhecida como ceratocone. Um comportamento específico chamado sinal oculodigital de Franceschetti é característico da amaurose congênita de Leber. Este sinal consiste em cutucar, pressionar e esfregar os olhos com a mão ou o dedo. Pesquisadores suspeitam que esse comportamento possa contribuir para olhos profundos e ceratocone em crianças afetadas. Em casos raros, o atraso no desenvolvimento e a deficiência intelectual foram relatados em pessoas com as características da amaurose congênita de Leber. No entanto, os pesquisadores não têm certeza se esses indivíduos realmente têm amaurose congênita de Leber ou outra síndrome com sinais e sintomas semelhantes. Pelo menos 13 tipos de amaurose congênita de Leber foram descritos. Os tipos são distinguidos por sua causa genética, padrões de perda de visão e anomalias relacionadas aos olhos.

[0040] Os termos identidade percentual (%), identidade de sequência, identidade de sequência percentual ou porcentagem idêntica no contexto de sequências de ácidos nucleicos referem-se aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para correspondência. O comprimento da comparação de identidade de sequência pode ser ao longo do comprimento completo do genoma, o comprimento completo de uma sequência de codificação de gene ou um fragmento de pelo menos cerca de 500 a 5000 nucleotídeos, é desejado. No entanto, a identidade entre fragmentos menores, por exemplo, de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, usualmente pelo

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15/105 menos cerca de 20 a 24 nucleotídeos, pelo menos cerca de 28 a 32 nucleotídeos, pelo menos cerca de 36 ou mais nucleotídeos, também pode ser desejada.

[0041] A identidade percentual pode ser prontamente determinada para sequências de aminoácidos ao longo de todo o comprimento de uma proteína, polipeptideo, cerca de 32 aminoácidos, cerca de 330 aminoácidos, ou um fragmento peptídico dos mesmos ou os sequências de codificação da sequência de ácido nucleico correspondente. Um fragmento de aminoácido adequado pode ter pelo menos cerca de 8 aminoácidos de comprimento e pode ter até cerca de 700 aminoácidos. Geralmente, quando se refere a identidade, homologia ou semelhança entre duas sequências diferentes, identidade, homologia ou semelhança é determinada em referência a sequências alinhadas. Sequências alinhadas ou alinhamentos referem-se a sequências de múltiplos ácidos nucleicos ou sequências de proteínas (aminoácidos), frequentemente contendo correções para bases ou aminoácidos ausentes ou adicionais em comparação com uma sequência de referência.

[0042] A identidade pode ser determinada preparando um alinhamento das sequências e através do uso de uma variedade de algoritmos e/ou programas de computador conhecidos na técnica ou comercialmente disponíveis [por exemplo, BLAST, ExPASy; ClustalO; FASTA; usando, por exemplo, algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmo de Smith-Waterman]. Os alinhamentos são realizados usando qualquer um dos vários Programas de Alinhamento de Sequência Múltipla disponíveis publicamente ou comercialmente. Programas de alinhamento de sequências estão disponíveis para sequências de aminoácidos, por exemplo, os programas Clustal Omega, Clustal X, MAP, PIMA, MSA, BLOCKMAKER, MEME e Match-Box. Geralmente, qualquer um destes programas é usado nas configurações padrão,

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16/105 embora um versado na técnica possa alterar estas configurações conforme necessário. Alternativamente, um versado na técnica pode usar outro algoritmo ou programa de computador que forneça pelo menos o mesmo nível de identidade ou alinhamento que aquele fornecido pelos algoritmos e programas referenciados. Veja, por exemplo, JD Thomson et al, Nucl. Acids. Res., A comprehensive comparison of multiple sequence alignments, 27(13):2682-2690 (1999).

[0043] Programas de alinhamento de múltiplas sequências também estão disponíveis para sequências de ácido nucleico. Exemplos de tais programas incluem Clustal Omega Clustal W, CAP Sequence Assembly, BLAST, MAP e MEME, que são acessíveis através de servidores da Web na Internet. Outras fontes para tais programas são conhecidas dos versados na técnica. Alternativamente, os utilitários Vector NTI também são usados. Existem também vários algoritmos conhecidos na técnica que podem ser utilizados para medir a identidade de sequência de nucleotídeos, incluindo os contidos nos programas descritos acima. Como outro exemplo, as sequências polinucleotídicas podem ser comparadas utilizando o Fasta™, um programa no GCG Versão 6.1. O Fasta™ fornece alinhamentos e porcentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e busca. Por exemplo, a identidade de sequência percentual entre as sequências de ácido nucleico pode ser determinada usando Fasta™ com seus parâmetros padrão (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de pontuação) conforme fornecidos no GCG Versão 6.1, incorporado neste documento por referência.

[0044] Em um aspecto, é fornecida uma sequência de ácido nucleico manipulada, com códons otimizados, que codifica a Lebercilina humana. De preferência, a sequência de codificação da Lebercilina com códons otimizados tem menos de cerca de 80% de identidade, de

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17/105 preferência cerca de 75% de identidade ou menos da sequência de codificação da Lebercilina nativa de comprimento completo (FIGs. IBID, SEQ ID NO: 2). Em uma modalidade, a sequência de codificação da Lebercilina com códons otimizados tem cerca de 74% de identidade com a sequência de codificação da Lebercilina nativa da SEQ ID NO:

2. Em uma modalidade, a sequência de codificação da Lebercilina com códons otimizados é caracterizada pela taxa de tradução aprimorada quando comparado à distribuição mediada por AAV (por exemplo, rAAV). Em uma modalidade, a sequência de codificação de Lebercilina com códons otimizados compartilha menos de cerca de 99%, 98%,

97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%,

85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%,

73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%,

61% ou menos de identidade com a sequência de codificação da Lebercilina nativa de comprimento completo da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico com códons otimizados é uma variante da SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a sequência de ácido nucleico com códons otimizados é uma sequência compartilhando cerca de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% ou mais de identidade com a SEQ ID NO:

3. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico com códons otimizados é a SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a sequência de ácido nucleico é codificada para expressão em humanos. Em outra modalidade, a sequência de codificação da lebercilina é nt de 1883 a nt 3976 da SEQ ID NO: 8. Em outras modalidades, é selecionada uma sequência de codificação de Lebercilina diferente.

[0045] As regiões de codificação com códons otimizados podem ser projetadas por vários métodos diferentes. Essa otimização pode

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18/105 ser realizada usando métodos que estão disponíveis on-line (por exemplo, GeneArt), métodos publicados ou uma empresa que fornece serviços de otimização de codificação, por exemplo, DNA2.0 (Menlo Park, CA). Um método de otimização de códons é descrita, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional US N^Q WO 2015/012924, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade. Ver também, por exemplo, a Publicação de Patente US 2014/0032186 e a Publicação de Patente US N^Q 2006/0136184. Adequadamente, o comprimento total da estrutura de leitura aberta (ORF) para o produto é modificado. No entanto, em algumas modalidades, apenas um fragmento da ORF pode ser alterado. Utilizando um destes métodos, podem-se aplicar as frequências a qualquer sequência polipeptídica e produzir um fragmento de ácido nucleico de uma região codificadora com códons otimizados que codifica o polipeptídeo.

[0046] Estão disponíveis várias opções para efetuar as alterações reais aos códons ou para sintetizar as regiões de codificação com códons otimizados concebidas como descrito neste documento. Tais modificações ou síntese podem ser realizadas utilizando manipulações biológicas moleculares padrão e de rotina bem conhecidas dos versados na técnica. Em uma abordagem, uma série de pares oligonucleotídeos complementares de 80-90 nucleotídeos cada um em comprimento e abrangendo o comprimento da sequência desejada são sintetizados através de métodos padrão. Estes pares de oligonucleotídeos são sintetizados de tal modo que após o emparelhamento, formam fragmentos de cadeia dupla de 80-90 pares de bases, contendo extremidades coesivas, por exemplo, cada oligonucleotídeo no par é sintetizado para se estender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, ou mais bases para além da região que é complementar ao outro oligonucleotídeo no par. As extremidades de cadeia simples de cada par de oligonucleotídeos são concebidas para emparelhar com a extremidade de cadeia sim

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19/105 pies de outro par de oligonucleotideos. Os pares de oligonucleotideos são autorizados a emparelhar, e aproximadamente cinco a seis destes fragmentos de cadeia dupla são então permitidos emparelharem juntos através das extremidades coesivas de cadeia simples, e depois são ligados e clonados em um vetor de clonagem bacteriano padrão, por exemplo, um vetor TOPO® disponível pela Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia. O construto é então sequenciado por métodos padrão. Vários destes construtos consistindo de 5 a 6 fragmentos de fragmentos de 80 a 90 pares de bases ligados entre si, isto é fragmentos de cerca de 500 pares de bases, são preparados de tal modo que toda a sequência desejada é representada em uma série de construtos plasmáticos. As inserções destes plasmídeos são então cortadas com enzimas de restrição apropriadas e ligadas em conjunto para formar o construto final. O construto final é então clonado em um vetor de clonagem bacteriana padrão e sequenciada. Métodos adicionais seriam imediatamente evidentes para o versado na técnica. Além disso, a síntese genética está prontamente disponível comercialmente.

[0047] Por manipulado pretende-se significar que as sequências de ácido nucleico que codificam a proteína Lebercilina descritas neste documento são montadas e colocadas em qualquer elemento genético adequado, por exemplo, DNA nu, fago, transposon, cosmídeo, epissoma, etc., que transfere as sequências de Lebercilina ali transportadas a uma célula hospedeira, por exemplo, para gerar sistemas de distribuição não virais (por exemplo, sistemas baseados em RNA, DNA nu, ou semelhantes) ou para gerar vetores virais em uma célula hospedeira de empacotamento e/ou para distribuição a células hospedeiros em um sujeito. Em uma modalidade, o elemento genético é um plasmídeo. Os métodos usados para fazer tais construtos manipulados são conhecidos daqueles versados na manipulação de ácido nucleico e incluem manipulação genética, manipulação recombinante e técni

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20/105 cas sintéticas. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).

[0048] Como utilizado neste documento, o termo célula hospedeira pode referir-se à linhagem celular de empacotamento na qual um AAV recombinante é produzido a partir de um plasmídeo de produção. Em alternativa, o termo célula hospedeira pode referir-se a qualquer célula alvo em que a expressão da sequência de codificação é desejada. Assim, uma célula hospedeira refere-se a uma célula procariótica ou eucariótica que contém DNA exógeno ou heterólogo que foi introduzido na célula por qualquer meio, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção, transformação, infecção viral, transfecção, distribuição de lipossoma, técnicas de fusão de membrana, grânulos revestidos com DNA de alta velocidade, infecção viral e fusão de protoplastos. Em certas modalidades, o termo célula hospedeira refere-se às células utilizadas para gerar e empacotar o vetor viral ou vírus recombinante. Em outras modalidades neste documento, o termo célula hospedeira refere-se a culturas de células oculares de várias espécies de mamífero para avaliação in vitro das composições descritas neste documento. Ainda em outras modalidades, o termo célula hospedeira quer se referir às células oculares do sujeito a ser tratado in vivo contra LCA.

[0049] Como utilizado neste documento, o termo células oculares refere-se a qualquer célula associada à função do olho ou que esteja nele. O termo pode referir-se a qualquer uma das células fotorreceptoras, incluindo fotorreceptores de bastonete, fotorreceptores de cone e células ganglionares fotossensíveis, células de epitélio pigmentado da retina (RPE), células de Mueller, células coroidais, células bipolares, células horizontais e células amácrinas. Em uma modalidade, as células oculares são as células fotorreceptoras. Em outra modalidade, as

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21/105 células oculares são fotorreceptores de cone. Em outra modalidade, as células oculares são fotorreceptores de bastonete.

[0050] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica a Lebercilina compreende ainda um ácido nucleico que codifica um polipeptideo marcador ligado covalentemente a este. O polipeptideo marcador pode ser selecionado de marcadores de epítopo conhecidos incluindo, sem limitação, um polipeptideo marcador de myc, um polipeptideo marcador de glutationa-S-transferase, um polipeptideo marcador de proteína verde fluorescente, um polipeptideo marcador de myc-piruvato-quinase, um polipeptideo marcador de His6, um polipeptideo marcador da hemaglutinina do vírus influenza, um polipeptideo marcador flag e um polipeptideo marcador da proteína de ligação à maltose.

[0051] Em outro aspecto, é fornecido um cassete de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a Lebercilina. Em uma modalidade, a sequência é uma sequência com códons otimizados. Em outra modalidade, a sequência de ácido nucleico com códons otimizados é SEQ ID NO: 3 que codifica a Lebercilina humana.

[0052] Como utilizado neste documento, um cassete de expressão refere-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende as sequências codificantes para a proteína lebercilina, promotor, e pode incluir outras sequências reguladoras, cassete o qual que pode estar empacotado no capsídeo de um vetor viral (por exemplo, partícula viral). Em geral, esse cassete de expressão para gerar um vetor viral contém as sequências de LCA5 descritas neste documento, flanqueada por sinais de empacotamento do genoma viral e outras sequências de controle de expressão, conforme descritas neste documento. Por exemplo, para um vetor viral AAV, os sinais de empacotamento são a repetição terminal invertida 5' (ITR) e a ITR 3'. Quando empacotadas

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22/105 no capsideo de AAV, as ITRs em conjunção com o cassete de expressão podem ser referidas neste documento como o genoma de AAV (rAAV) recombinante ou genoma de vetor. Em uma modalidade, um cassete de expressão compreende uma sequência de ácido nucleico com códons otimizados que codifica a proteína Lebercilina. Em uma modalidade, o cassete proporciona o LCA5 com códons otimizados, operacionalmente associado a sequências de controle de expressão que dirigem a expressão da sequência de ácido nucleico com códons otimizados que codifica Lebercilina em uma célula hospedeira. Em uma modalidade, o genoma do vetor é a sequência de nt 1-4379 da SEQ ID NO: 8. Em outra modalidade, o genoma do vetor é a sequência de nt 1-4368 da SEQ ID NO: 9. Ainda em outra modalidade, a sequência de codificação de LCA5 em qualquer um dos genomas de vetor identificados é trocada por outra sequência de codificação de LCA5 como descrita neste documento.

[0053] Em outra modalidade, é proporcionado um cassete de expressão para uso em um vetor AAV. Nesta modalidade, o cassete de expressão de AAV inclui pelo menos uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) de AAV. Em outra modalidade, o cassete de expressão compreende sequências de ITR 5' e ITR 3'. Em uma modalidade, as ITR 5' e 3' flanqueiam a sequência de ácido nucleico com códons otimizados que codifica Lebercilina, opcionalmente com sequências adicionais que direcionam a expressão da sequência de ácido nucleico com códons otimizados que codifica Lebercilina em uma célula hospedeira. Assim, como descrito neste documento, um cassete de expressão de AAV pretende descrever um cassete de expressão como descrito acima, flanqueada na sua extremidade 5' por uma sequência de repetição terminal invertida 5' de AAV (ITR) e na sua extremidade 3' por uma ITR 3' de AAV. Assim, este genoma de rAAV contém as sequências mínimas necessárias para empacotar o cassete de expres

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23/105 são em uma partícula viral de AAV, isto é, as ITRs 5' e 3' de AAV. As ITRs de AAV podem ser obtidas a partir das sequências ITR de qualquer AAV, tal como descrito neste documento. Essas ITRs podem ser da mesma origem de AAV que o capsídeo empregue no AAV recombinante resultante, ou de uma origem de AAV diferente (para produzir um pseudotipo de AAV). Em uma modalidade, as sequências de ITR de AAV2, ou sua versão deletada (AITR), são utilizadas por conveniência e para acelerar a aprovação regulamentar. No entanto, pode ser selecionado um AAV de outras fontes adequadas. Quando a fonte das ITRs vier de AAV2 e o capsídeo de AAV for de outra fonte de AAV, o vetor resultante pode ser denominado pseudotipado. Tipicamente, o genoma do vetor AAV compreende uma ITR 5' de AAV, as sequências codificadoras de Lebercilina e quaisquer sequências reguladoras, e uma ITR 3' de AAV. No entanto, outras configurações desses elementos podem ser adequadas. Uma versão abreviada da ITR 5', denominada AITR, foi descrita, em que o sítio da resolução terminal (trs) e a sequência D são deletados. Em outras modalidades, são utilizadas ITRs 5' e 3' de AAV completas. Cada genoma de rAAV pode ser então introduzido em um plasmídeo de produção.

[0054] Como utilizado neste documento, o termo sequências reguladoras, sequência de controle transcricional ou sequência de controle de expressão refere-se a sequências de DNA, tais como sequências iniciadoras, sequências potenciadoras e sequências promotoras, que induzem, reprimem ou controlam a transcrição de sequências de ácidos nucleicos que codificam proteína às quais estão operacionalmente ligadas.

[0055] Como utilizado neste documento, o termo operacionalmente ligado ou operacionalmente associado refere-se a ambas as sequências de controle de expressão que são contíguas com a sequência de ácido nucleico que codifica a Lebercilina e/ou sequências de

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24/105 controle de expressão que atuam in trans ou a uma distância para controlar a transcrição e sua expressão.

[0056] Em um aspecto, é fornecido um vetor compreendendo qualquer um dos cassetes de expressão descritos neste documento. Como descrito neste documento, esses vetores podem ser plasmídeos de várias origens e são úteis em certas modalidades para a geração de vírus defeituosos de replicação recombinante, como descrito neste documento adicionalmente.

[0057] Um vetor como utilizado neste documento é uma molécula de ácido nucleico na qual um transgene de ácido nucleico exógeno ou heterólogo ou manipulado pode ser inserido, o qual pode então ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. Os vetores preferencialmente têm uma ou mais origens de replicação e um ou mais sítios nos quais o DNA recombinante pode ser inserido. Os vetores geralmente têm meios pelos quais as células com vetores podem ser selecionadas daquelas sem vetores, por exemplo, eles codificam genes de resistência a drogas. Vetores comuns incluem plasmídeos, genomas virais e (principalmente em leveduras e bactérias) cromossomos artificiais. Certos plasmídeos são descritos neste documento.

[0058] Em uma modalidade, o vetor é um plasmídeo não viral que compreende um cassete de expressão deste descrito, por exemplo, DNA nu, DNA plasmidial nu, RNA e mRNA; acoplado com várias composições e nanopartículas, incluindo, por exemplo, micelas, lipossomas, composições de ácido nucleico-lipídico catiônico, composições de poliglicano e outros polímeros, lipídios e/ou colesterol - conjugados de ácido nucleico, e outros construtos, tais como são descritos neste documento. Ver, por exemplo, X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011,8 (3), pp. 774-787; publicação na Web: 21 de março de 2011; WO2013/182683, WO 2010/053572 e WO 2012/170930, todos os quais são incorporados neste documento por referência. Esse vetor de

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Lebercilina não viral pode ser administrado pelas vias descritas neste documento. Os vetores virais, ou vetores não virais, podem ser formulados com um veículo fisiologicamente aceitável para utilização em aplicações de transferência gênica e terapia gênica.

[0059] Em outra modalidade, o vetor é um vetor viral que compreende um cassete de expressão descrito no documento em questão. Vetores virais são definidos como vírus deficientes na replicação contendo o transgene de ácido nucleico LCA5 exógeno ou heterólogo. Em uma modalidade, um cassete de expressão como descrito neste documento pode ser manipulado dentro de um plasmídeo que é usado para distribuição de fármaco ou para a produção de um vetor viral. Vetores virais adequados são preferencialmente defeituosos na replicação e selecionados entre aqueles que têm como alvo as células oculares. Os vetores virais podem incluir qualquer vírus adequado para terapia gênica, incluindo, mas não se limitando a, adenovirus; herpes vírus; lentivírus; retrovirus; parvovirus, etc. Contudo, para facilidade de compreensão, o vírus adenoassociado é referido neste documento como um vetor de vírus exemplar.

[0060] Um vírus com replicação defeituosa ou vetor viral se refere a uma partícula viral sintética ou recombinante na qual um cassete de expressão contendo um gene de interesse é empacotado em um capsídeo ou envelope viral, em que qualquer sequência genômica viral também empacotada dentro do capsídeo viral ou envelope são deficientes em replicação; isto é, eles não podem gerar virions de progênies, mas retêm a capacidade de infectar células-alvo. Em uma modalidade, o genoma do vetor viral não inclui os genes de codificação das enzimas necessários para replicar (o genoma pode ser projetado para ser sem soro - contendo apenas o transgene de interesse flanqueado pelos sinais necessários para amplificação e empacotamento do genoma artificial), mas esses genes podem ser fornecidos durante a pro

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26/105 dução. Por conseguinte, considera-se seguro para uso em terapia gênica, uma vez que a replicação e a infecção por virions de progênie não podem ocorrer, exceto na presença da enzima viral necessária para a replicação.

[0061] Em outra modalidade, é proporcionado um vetor de vírus adeno-associado recombinante (rAAV). O rAAV compromete um capsídeo de AAV e um genoma de vetor empacotado nele. O genoma do vetor compreende, em uma modalidade: (a) uma sequência de repetição terminal invertida 5' de AAV (ITR); (b) um promotor; (c) uma sequência de codificação que codifica uma Lebercilina humana; e (d) uma ITR 3' de AAV. Em outra modalidade, o genoma do vetor é o cassete de expressão descrito neste documento. Em uma modalidade, a sequência de LCA5 codifica uma proteína Lebercilina de comprimento completo. Em outra modalidade, a sequência de Lebercilina é a sequência proteica da SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a sequência codificante é SEQ ID NO: 3 ou uma variante desta.

[0062] O vírus adenoassociado (AAV), um membro da família Parvovirus, é um pequeno vírus icosaédrico sem envelope, com genomas de DNA linear de fita simples de 4,7 kilobases (kb) a 6 kb. Entre os serotipos conhecidos de AAV estão AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 e outros. As ITRs ou outros componentes de AAV podem ser prontamente isoladas ou construídas usando técnicas disponíveis para os versados na técnica a partir de um AAV. Tal AAV pode ser isolado, manipulado ou obtido de fontes acadêmicas, comerciais ou públicas (por exemplo, American Type Culture Collection, Manassas, VA). Alternativamente, as sequências de AAV podem ser manipuladas através de meios sintéticos ou outros meios adequados por referência a sequências publicadas tais como as que estão disponíveis na literatura ou em bases de dados tais como, por exemplo, GenBank, PubMed ou semelhantes. Os vírus AAV podem ser ma

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27/105 nipulados por técnicas convencionais de biologia molecular, tornando possível otimizar essas partículas para distribuição específica de células de sequências de ácido nucleico, para minimizar a imunogenicidade, para ajustar a estabilidade e a vida útil das partículas, para degradação eficiente, para distribuição precisa ao núcleo, etc.

[0063] Fragmentos de AAV podem ser prontamente utilizados em uma multiplicidade de sistemas de vetores e células hospedeiras. Entre os fragmentos desejáveis de AAV estão as proteínas caps, incluindo as regiões vp1, vp2, vp3 e hipervariáveis, as proteínas rep, incluindo rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40, e as sequências que codificam estas proteínas. Tais fragmentos podem ser utilizados sozinhos, em combinação com outras sequências ou fragmentos do serotipo de AAV, ou em combinação com elementos de outras sequências virais de AAV ou não de AAV. Como utilizado neste documento, os serotipos artificiais de AAV incluem, sem limitação, AAV com uma proteína de capsídeo de ocorrência não natural. Um tal capsídeo artificial pode ser gerado por qualquer técnica adequada, utilizando uma nova sequência de AAV da invenção (por exemplo, um fragmento de uma proteína de capsídeo vp1) em combinação com sequências heterólogas que podem ser obtidas de outro serotipo de AAV (conhecido ou novo), porções não contíguos do mesmo serotipo de AAV, de uma mesma fonte viral não AAV ou de outra fonte não viral. Um serotipo de AAV artificial pode ser, sem limitação, um capsídeo de AAV quimérico, um capsídeo de AAV recombinante ou um capsídeo de AAV humanizado. Em uma modalidade, um vetor contém as sequências rep e/ou cap de AAV8 da invenção. Ver, por exemplo, publicação de pedido de Patente US N^Q US2009/02270030, incorporado por referência neste documento.

[0064] O termo AAV ou serotipo de AAV, tal como é utilizado neste documento, refere-se às dezenas de vírus adeno-associados que ocorrem naturalmente e estão disponíveis, bem como a AAVs arti

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28/105 ficiais. Entre os AAVs isolados ou manipulados a partir de primatas humanos ou não humanos (NHP) e bem caracterizados, o AAV2 humano é o primeiro AAV que foi desenvolvido como um vetor de transferência de genes; tem sido amplamente utilizado para experiências eficientes de transferência de genes em diferentes tecidos alvo e modelos animais. Salvo indicação em contrário, o capsídeo de AAV, ITRs e outros componentes de AAV selecionados descrito neste documento podem ser facilmente selecionados de entre qualquer AAV, incluindo, sem limitação, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAV7M8 e AAVAnc80, variantes de qualquer um dos AAVs ou AAVs conhecidos ou mencionados a serem descobertos ou variantes ou suas misturas. Ver, por exemplo, WO 2005/033321, que é incorporado neste documento por referência. Em outra modalidade, o capsídeo de AAV é um capsídeo de AAV8bp, que preferencialmente se direciona a células bipolares. Ver WO 2014/024282, que é incorporado neste documento por referência. Em outra modalidade, o capsídeo de AAV é um capsídeo de AAV7m8, que mostrou distribuição preferencial à retina exterior. A sequência de ácido nucleico do capsídeo de AAV7m8 é reproduzida na SEQ ID NO: 11 e na sequência de aminoácidos na SEQ ID NO: 12. Ver, Dalkara et al., In Vivo-Directed Evolution of a New Adeno-Associated Virus for Therapeutic Outer Retinal Gene Delivery from the Vitreous, Sci Transl Med 5, 189ra76 (2013), que é incorporado neste documento por referência.

[0065] Como usado neste documento, um capsídeo de AAV7m8 é um capsídeo de AAV automontado composto por múltiplas proteínas vp de AAV7m8 (proteína variável). As proteínas vp de AAV7m8 são tipicamente expressas como variantes de splice codificadas por uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99%

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29/105 a esta, que codifica a sequência de aminoácidos de vp1 da SEQ ID NO: 12. Essas variantes de splice resultam em proteínas de diferentes comprimentos da SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, capsídeo de AAV7m8 inclui urn AAV com uma sequência de aminoácidos que é 99% idêntica à SEQ ID NO: 12.

[0066] Em outra modalidade, o capsídeo de rAAV é selecionado de um capsídeo de AAV8 ou uma sua variante, um capsídeo de AAV6 ou uma sua variante, um capsídeo de AAV9 ou uma sua variante, um capsídeo de AAV7 ou uma sua variante, um capsídeo de AAV5 ou uma sua variante, um capsídeo de AAV2 ou uma sua variante, um capsídeo de AAV1 ou uma sua variante, um capsídeo de AAV3 ou uma sua variante, e um capsídeo de AAV4 ou sua variante. Em uma modalidade, é fornecido o vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) que compreende um capsídeo de AAV7m8 e um cassete de expressão descrito neste documento, em que o cassete de expressão compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam Lebercilina, sequências de repetição terminal invertida e sequências de controle de expressão que direcionam a expressão de Lebercilina em uma célula hospedeira.

[0067] Ainda em outra modalidade, é fornecido um vetor de vírus adeno-associado recombinante (AAV) para a entrega dos construtos de LCA5 e sequências otimizadas descritas neste documento. Um vetor viral de vírus adeno-associado (AAV) é uma partícula resistente à DNase de AAV possuindo um capsídeo de proteína de AAV na qual estão sequências de ácido nucleico empacotadas para distribuição a células alvo. Um capsídeo de AAV é composto por 60 subunidades proteicas de capsídeo (cap), VP1, VP2 e VP3, que são organizadas em uma simetria icosaédrica em uma proporção de aproximadamente 1:1:10 a 1:1:20, dependendo do AAV selecionado. Os AAV podem ser selecionados como fontes para capsídeos de vetores virais AAV como

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30/105 identificados acima. Ver, por exemplo, o pedido de patente publicado US N^Q 2007-0036760-A1; Pedido de Patente US N^Q 2009-0197338-A1; EP 1310571. Ver também, WO 2003/042397 (AAV7 e outros AAV símios), Patente US 7790449 e Patente US 7282199 (AAV8), WO 2005/033321 e US 7906111 (AAV9), e WO 2006/110689, e WO 2003/042397 (rh. 10) e (Dalkara D, Byrne LC, Klimczak RR, Visei M, YinL, Merigan WH, et al. In vivo-directed evolution of a new adenoassociated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med (2013) 5(189):

189ra76.doi:10.1126/scitranslmed.3005708.) (AAV7m8). Cada um destes documentos é incorporado neste documento por referência. Estes documentos também descrevem outros capsídeos de AAV que podem ser selecionados para gerar AAV e são incorporados por referência. Em algumas modalidades, um cap de AAV para uso no vetor viral pode ser gerado por mutagênese (isto é, por inserções, deleções ou substituições) de um dos capsídeos de AAV supramencionados ou do seu ácido nucléico de codificação. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV é quimérico, compreendendo domínios de duas ou três ou quatro ou mais das proteínas do capsídeo de AAV acima mencionadas. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV é um mosaico de monômeros de Vp1, Vp2 e Vp3 de dois ou três AAV diferentes ou AAV recombinantes. Em algumas modalidades, uma composição de rAAV compreende mais do que uma das Caps acima mencionadas.

[0068] Como utilizado neste documento, relacionado com AAV, o termo variante significa qualquer sequência de AAV derivada de uma sequência de AAV conhecida, incluindo aquelas que compartilham pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência sobre a sequência de ácido nucleico ou aminoácido. Em outra modalidade, o capsídeo de AAV inclui

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31/105 variantes que podem incluir uma variação de até cerca de 10% de qualquer sequência de capsídeo de AAV descrita ou conhecida. Isto é, o capsídeo de AAV compartilha cerca de 90% de identidade a cerca de 99,9% de identidade, cerca de 95% a cerca de 99% de identidade ou cerca de 97% a cerca de 98% de identidade com um capsídeo de AAV fornecido neste documento e/ou conhecido na técnica. Em uma modalidade, o capsídeo de AAV compartilha pelo menos 95% de identidade com um capsídeo de AAV. Quando se determina a porcentagem de identidade de um capsídeo de AAV, a comparação pode ser feita a respeito de qualquer uma das proteínas variáveis (por exemplo, vp1, vp2 ou vp3). Em uma modalidade, o capsídeo de AAV compartilha pelo menos 95% de identidade com o AAV7m8 sobre a vp1, vp2 ou vp3. Em outra modalidade, o capsídeo é um capsídeo de AAV8 com mutações Y447F, Y733F e T494V (também chamado de AAV8(C&G+T494V) e rep2-cap8(Y447F+733F+T494V)), como descrito por Kay et al, Targeting Photoreceptors via Intravitreal Delivery Using Novel, Capsid- Mutated AAV Vectors, PLoS One. 2013; 8(4): e62097. Publicado on-line em 26 de abril de 2013, que é incorporado neste documento por referência.

[0069] Em uma modalidade, é desejável utilizar um capsídeo de AAV, que demonstre tropismo para a célula alvo desejada, por exemplo, fotorreceptores (por exemplo, bastonetes e/ou cones), RPE ou outras células oculares. Em uma modalidade, o capsídeo de AAV é um mutante de capsídeo de tirosina no qual certos resíduos de tirosina expostos à superfície são substituídos com fenilalanina (F). Tais variantes de AAV são descritas, por exemplo, em Mowat et al, Tyrosine capsid-mutant AAV vectors for gene delivery to the canine retina from a sub-retinal or intravitreal approach, Gene Therapy 21,96-105 (Janeiro de 2014), que é incorporado neste documento por referência.

[0070] Como utilizado neste documento, AAV artificial significa,

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32/105 sem limitação, um AAV com uma proteína de capsídeo não natural. Um tal capsídeo artificial pode ser gerado por qualquer técnica adequada, utilizando uma sequência de AAV selecionada (por exemplo, um fragmento de uma proteína vp1 de capsídeo) em combinação com sequências heterólogas que podem ser obtidas a partir de um AAV selecionado diferente, porções não contíguas do mesmo AAV, de uma fonte viral não AAV, ou de uma fonte não viral. Um AAV artificial pode ser, sem limitação, um AAV pseudotipado, um capsídeo de AAV quimérico, um capsídeo de AAV recombinante ou um capsídeo de AAV humanizado. Os vetores pseudotipados, em que o capsídeo de um AAV é substituído por uma proteína da capsídeo heterólogo, são úteis na invenção. Em uma modalidade, AAV2/5 e AAV2/8 são exemplos de vetores pseudotipados.

[0071] Em outra modalidade, um AAV autocomplementar é usado. AAV autocomplementar refere-se a um plasmídeo ou vetor possuindo um cassete de expressão em que uma região codificadora transportada por uma sequência de ácido nucleico recombinante de AAV foi projetada para formar um modelo de DNA de cadeia dupla intramolecular. Após a infecção, em vez de esperar pela síntese mediada por células da segunda cadeia, as duas metades complementares de scAAV irão se associar para formar uma unidade de DNA de cadeia dupla (dsDNA) que está pronta para replicação e transcrição imediatas. Ver, por exemplo, DM McCarty et al. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis, Gene Therapy, (agosto de 2001), vol. 8, número 16, páginas 1248-1254. Os AAVs autocomplementares são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N^Q 6,596,535; 7,125,717; e 7,456,683, cada uma delas sendo incorporadas a este documento por referência em sua totalidade.

[0072] O termo exógeno como utilizado para descrever uma se

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33/105 quência de ácido nucleico ou proteína significa que o ácido nucleico ou proteína não ocorre naturalmente na posição em que existe em um cromossomo ou célula hospedeira. Uma sequência de ácido nucleico exógena também se refere a uma sequência derivada e inserida na mesma célula hospedeira ou sujeita, mas que está presente em um estado não natural, por exemplo, um número de cópia diferente ou sob o controle de diferentes elementos reguladores.

[0073] O termo heterólogo como utilizado para descrever uma sequência ou proteína de ácido nucleico significa que o ácido nucleico ou proteína foi derivado de um organismo diferente ou de uma espécie diferente do mesmo organismo que a célula hospedeira ou sujeito em que ele é expresso. O termo heterólogo quando utilizado com referência a uma proteína ou um ácido nucleico em um plasmídeo, cassete de expressão ou vetor, indica que a proteína ou o ácido nucleico está presente com outra sequência ou subsequência com a qual a proteína ou ácido nucleico em questão não é encontrada na mesma relação uma com a outra na natureza.

[0074] Ainda em outra modalidade, o cassete de expressão, incluindo qualquer um dos descritos neste documento, é utilizado para gerar um genoma de AAV recombinante.

[0075] Em uma modalidade, o cassete de expressão descrito neste documento é manipulado em um elemento genético adequado (vetor) útil para gerar vetores virais e/ou para distribuição a uma célula hospedeira, por exemplo, DNA nu, fago, transposon, cosmídeo, epissoma etc. que transfere as sequências de LCA5 ali transportadas. O vetor selecionado pode ser distribuído por qualquer método adequado, incluindo transfecção, eletroporação, distribuição de lipossomas, técnicas de fusão de membrana, grânulos revestidos com DNA de alta velocidade, infecção viral e fusão de protoplasto. Os métodos usados para fazer tais construtos são conhecidos daqueles versados na mani

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34/105 pulação de ácido nucleico e incluem manipulação genética, manipulação recombinante e técnicas sintéticas. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.

[0076] Para empacotar um cassete de expressão ou genoma de rAAV ou plasmídeo de produção em virions, as ITRs são os únicos componentes de AAV necessários em cis no mesmo construto que o cassete de expressão. Em uma modalidade, as sequências de codificação para a replicação (rep) e/ou capsideo (cap) são removidas do genoma de AAV e fornecidas in trans ou por uma linhagem celular de empacotamento de modo a gerar o vetor de AAV.

[0077] Os métodos para gerar e isolar vetores virais de AAV adequados para distribuição a um sujeito são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Patente US 7790449; Patente US 7282199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; e US 7588772 B2], Em um sistema, uma linhagem celular produtora é transientemente transfectada com um construto que codifica o transgene flanqueado por ITRs e construtos) que codifica rep e cap. Em um segundo sistema, uma linhagem celular de empacotamento que supre de forma estável rep e cap é transientemente transfectada com um construto que codifica o transgene flanqueado por ITRs. Em cada um destes sistemas, os virions de AAV são produzidos em resposta a infecção com adenovirus auxiliar ou herpesvirus, requerendo a separação dos rAAV de vírus contaminantes. Mais recentemente, foram desenvolvidos sistemas que não requerem infecção com vírus auxiliar para recuperar o AAV - as funções auxiliares necessárias (isto é, adenovirus E1, E2a, VA e E4 ou herpesvirus UL5, UL8, UL52 e UL29 e polimerase de herpesvirus) também são fornecidos, in trans, pelo sistema. Nestes sistemas mais recentes, as funções auxiliares podem ser fornecidas por transfecção transiente das células com construtos que codificam as

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35/105 funções auxiliares necessárias, ou as células podem ser manipuladas para conter de forma estável os genes que codificam as funções auxiliares, cuja expressão pode ser controlada no nível transcricional ou pós-transcricional.

[0078] O termo isolado significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ele é natural). Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo ocorrendo naturalmente presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de algum ou de todos os materiais no sistema natural, são isolados, mesmo que subsequentemente reintroduzidos no sistema natural. Esses polinucleotídeos podem fazer parte de um vetor e/ou esses polinucleotídeos ou polipeptídeos podem fazer parte de uma composição e ainda serem isolados pelo fato de tal vetor ou composição não fazer parte do seu ambiente natural.

[0079] Ainda em um outro sistema, o cassete de expressão flanqueada por ITRs e genes rep/cap é introduzida em células de inseto por infecção com vetores baseados em baculovírus. Para revisões sobre estes sistemas de produção, ver geralmente, por exemplo, Zhang et al., 2009, Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production, Human Gene Therapy 20:922-929, o conteúdo dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Métodos de produção e utilização destes e de outros sistemas de produção de AAV são também descritos nas seguintes patentes US, o conteúdo de cada um das quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade: 5,139,941; 5,741,683; 6,057,152; 6,204,059; 6,268,213; 6,491,907; 6,660,514; 6,951,753; 7,094,604; 7,172,893; 7,201,898; 7,229,823; e 7,439,065. Ver, em geral, por exemplo, Grieger & Samulski, 2005, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector deve

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36/105 lopment, production and clinical applications, Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, Recent developments in adeno-associated virus vector technology, J. Gene Med. 10: 717-733; e as referências citadas abaixo, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência na sua totalidade.

[0080] Os métodos usados construir qualquer modalidade desta invenção são conhecidos daqueles versados na manipulação de ácido nucleico e incluem manipulação genética, manipulação recombinante e técnicas sintéticas. Ver, por exemplo, Green e Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012). De um modo semelhante, os métodos de geração de virions de rAAV são bem conhecidos e a seleção de urn método adequado não é uma limitação da presente invenção. Ver, por exemplo, K. Fisher et al, (1993) J. Virol., 70:520-532 e Patente US N^Q 5,478,745.

[0081] Plasmídeos geralmente são designados neste documento por uma letra minúscula p precedida e/ou seguida por letras maiúsculas e/ou números, de acordo com as convenções de nomenclatura padrão que são familiares aos versados na técnica. Muitos plasmídeos e outros vetores de clonagem e expressão que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção são bem conhecidos e facilmente disponíveis para os versados na técnica. Além disso, os versados podem prontamente construir qualquer número de outros plasmídeos adequados para uso na invenção. As propriedades, construção e utilização de tais plasmídeos, bem como outros vetores, na presente invenção, serão facilmente evidentes para versados na técnica a partir da presente descrição.

[0082] Em uma modalidade, o plasmídeo de produção é o descrito neste documento, ou como descrito no documento WO2012/158757, que é incorporado neste documento por referência. Vários plasmídeos

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37/105 são conhecidos na técnica para uso na produção de vetores de rAAV e são úteis neste documento. Os plasmídeos de produção são cultivados nas células hospedeiras que expressam as proteínas cap e/ou rep de AAV. Nas células hospedeiras, cada genoma de rAAV resgatado e empacotado na proteína do capsídeo ou proteína do envelope para formar uma partícula viral infecciosa.

[0083] Em um aspecto, é fornecido um plasmídeo de produção compreendendo um cassete de expressão descrito acima. Em uma modalidade, o plasmídeo de produção é o mostrado na SEQ ID NO: 8 e FIG. 1E-1F, que é denominado p643. Este plasmídeo é utilizado nos exemplos para a geração do vetor de Lebercilina com códons otimizados humanos de rAAV. Tal plasmídeo é um que contém uma sequência ITR 5' de AAV; um promotor selecionado; uma sequência poliA; e uma ITR 3'; adicionalmente, também contém uma sequência de preenchimento (stuffer), tal como lambda. Em uma outra modalidade, a sequência de preenchimento mantém o genoma do vetor rAAV com um tamanho entre cerca de 3 kilobases (kb) a cerca de 6 kb, cerca de

4,7 kb a cerca de 6 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5,5 kb ou cerca de 4,7 kb a 5,5 kb. Em uma modalidade, uma região lambda não codificadora é incluída na cadeia principal do vetor. Um exemplo de p643 que inclui a sequência de codificação de lebercilina pode ser encontrado em SEQ ID NO: 8. Em outra modalidade, o plasmídeo de produção é o mostrado nas Figuras 11A-11B e SEQ ID NO: 9. Em outra modalidade, o plasmídeo de produção é modificado para eficiência de produção de plasmídeo de vetor otimizada. Tais modificações incluem adição de outras sequências neutras ou deleção de porção(ões) ou de toda a sequência do agente lambda para modular o nível de superenrolamento do plasmídeo de vetor. Tais modificações são contempladas neste documento. Em outras modalidades, a sequência terminadora e outras sequências estão incluídas no plasmídeo.

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38/105 [0084] Em certas modalidades, o cassete de expressão de rAAV, ο vetor (tal como vetor rAAV), o vírus (tal como rAAV), o plasmídeo de produção compreende sequências de repetição terminal invertida de AAV, uma sequência de ácido nucleico com códons otimizados que codifica Lebercilina e sequências de controle de expressão que direcionam a expressão das proteínas codificadas em uma célula hospedeira. Em outras modalidades, o cassete de expressão de rAAV, o vírus, o vetor (tal como o vetor rAAV), o plasmídeo de produção compreendem ainda um ou mais de um íntron, uma sequência Kozak, um poliA, elementos reguladores pós-transcrição e outros. Em uma modalidade, o elemento regulador pós-transcrição é o Elemento Regulador PósTranscricional do Vírus da Hepatite de Woodchuck (WHP) (WPRE).

[0085] Os cassetes de expressão, vetores e plasmídeos incluem outros componentes que podem ser otimizados para uma espécie específica utilizando técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, otimização de códons, como descrito neste documento. Os componentes dos cassetes, vetores, plasmídeos e vírus ou outras composições descritas neste documento incluem uma sequência promotora como parte das sequências de controle da expressão. Em outra modalidade, o promotor é específico da célula. O termo específico de células significa que o promotor particular selecionado para o vetor recombinante pode dirigir a expressão da sequência de codificação de Lebercilina otimizada em um tipo de célula ocular particular. Em uma modalidade, o promotor é específico para expressão do transgene nas células fotorreceptoras. Em outra modalidade, o promotor é específico para expressão nos bastonetes e cones. Em outra modalidade, o promotor é específico para expressão nos bastonetes. Em outra modalidade, o promotor é específico para expressão nos cones. Em uma modalidade, o promotor específico do fotorreceptor é um promotor da rodopsina quinase humana. Demonstrou-se que o promotor de rodop

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39/105 sina quinase é ativo tanto em bastonetes como em cones. Observa-se, por exemplo, Sun et al., Gene Therapy with a Promoter Targeting Both Rods and Cones Rescues Retinal Degeneration Caused by AIPL1 Mutations, Gene Ther. Janeiro de 2010; 17(1): 117-131, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Em uma modalidade, o promotor é modificado para adicionar um ou mais sítios de restrição para facilitar a clonagem.

[0086] Em outra modalidade, o promotor é um promotor de rodopsina humana. Em uma modalidade, o promotor é modificado para incluir restrição nas extremidades para clonagem. Ver, por exemplo, Nathans e Hogness, Isolation and nucleotide sequence of the gene encoding human rhodopsin, PNAS, 81:4851-5 (agosto de 1984), que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Em outra modalidade, o promotor é uma porção ou fragmento do promotor da rodopsina humana. Em outra modalidade, o promotor é uma variante do promotor de rodopsina humana.

[0087] Outros promotores exemplificativos incluem o promotor da proteína quinase 1 (GRK1) receptora acoplada à proteína G humana (número de acesso do Genbank AY327580). Em outra modalidade, o promotor é um fragmento de 292 nt (posições 1793-2087) do promotor GRK1 (ver Beltran et al., Gene Therapy 2010 17: 1162-74, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Em outra modalidade preferencial, o promotor é o promotor proximal de proteína de ligação ao interfotorreceptor retinoide (IRBP) humana. Em uma modalidade, o promotor é um fragmento de 235 nt do promotor hIRBP. Em uma modalidade, o promotor é o promotor proximal RPGR (Shu et al, IOVS, maio de 2102, que é incorporado por referência na sua totalidade). Outros promotores úteis na invenção incluem, sem limitação, o promotor de opsina de bastonete, o promotor de opsina vermelho-verde, o promotor de opsina azul, o promotor da cGMP-β

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40/105 fosfodi este rase (Qgueta et al., IOVS, Invest Ophthalmol Vis Sci. Dezembro de 2000; 41 (13): 4059-63), o promotor de opsina de camundongo (Beltran et al., 2010, acima citado), o promotor de rodopsina (Mussolino et al., Gene Ther, Julho de 2011,18 (7): 637-45); a subunidade alfa da transducina do cone (Morrissey et al., BMC Dev, Biol, Jan 2011, 11: 3); promotor de fosfodiesterase beta (PDE); o promotor da retinite pigmentosa (RP1) (Nicord et al., J. Gene Med, Dez. 2007, 9(12): 1015-23); o promotor de NXNL2/NXNL1 (Lambard et al., PLoS One, Out. 2010, 5(10): e13025), o promotor RPE65; o promotor de degeneração retiniana lenta/periferina 2 (Rds/perph2) (Cai et al., Exp Eye Res. Agosto de 2010; 91 (2): 186-94); e o promotor VMD2 (Kachi et al., Human Gene Therapy, 2009 (20 31-9)). Cada um destes documentos é incorporado por referência neste documento em sua totalidade. Em outra modalidade, o promotor selecionado de promotor EF1a humano, promotor de rodopsina, rodopsina quinase, proteína de ligação de interfotorreceptor (IRBP), promotores de opsina do cone (vermelhoverde, azul), sequências a montante de opsina do cone contendo a região de controle do locus do cone vermelho-verde, transdução de cone e promotores de fator de transcrição (zíper de leucina da retina neural (Nrl) e receptor nuclear específico de fotorreceptores Nr2e3, bZIP).

[0088] Em outra modalidade, o promotor é um promotor ubíquo ou constitutivo. Um exemplo de um promotor adequado é um promotor híbrido de β-actina de galinha (CBA) com elementos potenciadores de citomegalovírus (CMV), tal como a sequência mostrada na FIG 1E-1F. Em outra modalidade, o promotor é o promotor CB7. Outros promotores adequados incluem o promotor de β-actina humana, o promotor do fator 1a de alongamento humano, o promotor do citomegalovírus (CMV), o promotor do vírus do símio 40 e o promotor da timidina quinase do vírus herpes simplex. Ver, por exemplo, Damdindorj et al,

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41/105 (agosto de 2014) A Comparative Analysis of Constitutive Promoters Located in Adeno- Associated Viral Vectors. PLoS ONE 9 (8): e 106472. Ainda outros promotores adequados incluem promotores virais, promotores constitutivos, promotores reguláveis [ver, por exemplo, WO 2011/126808 e WO 2013/04943]. Alternativamente, um promotor responsive a sinais fisiológicos pode ser utilizado no cassete de expressão, genomas de rAAV, vetores, plasmídeos e vírus descritos neste documento. Em uma modalidade, o promotor é de um tamanho pequeno, inferior a 1000 bp, devido às limitações de tamanho do vetor AAV. Em outra modalidade, o promotor está abaixo de 400 bp. Outros promotores podem ser selecionados por aquele versado na técnica.

[0089] Em uma outra modalidade, o promotor é selecionado de promotor SV40, promotor de di-hidrofolato redutase e o promotor da fosfoglicerol quinase (PGK), promotor de rodopsina quinase, o promotor de opsina do bastonete, o promotor de opsina vermelho-verde, o promotor de opsina azul, o promotor de proteína de ligação ao interfotorreceptor (IRBP) e o promotor da cGMP-p-fosfodiesterase, um promotor do fago lambda (PL), um promotor de vírus herpes simplex (HSV), um sistema promotor (tet) responsive a trans-ativador controlado por tetraciclina, um promotor de repetição terminal longa (LTR), como um RSV LTR, MoMLV LTR, BIV LTR ou um HIV LTR, um promotor de região U3 de vírus do sarcoma murine Moloney, um promotor de Granzima A, uma ou mais sequências reguladoras do gene da metalotioneína, um promotor de CD34, um promotor de CD8, um promotor de timidina quinase (TK), um promotor de Parvovirus B19, um promotor de PGK, um promotor de glicocorticoide, um promotor de proteína de choque térmico (HSP), tais como promotores de HSP65 e HSP70, um promotor de imunoglobulina, um promotor de MMTV, um promotor do sarcoma vírus de Rous (RSV), um promotor de lac, um promotor de CaMV 35S, um promotor de nopalina sintetase, um pro

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42/105 motor de MND ou um promotor de MNC. As suas sequências promotoras são conhecidas daquele versado na técnica ou estão disponíveis publicamente, tal como na literatura ou em bases de dados, por exemplo, GenBank, PubMed ou semelhantes.

[0090] Em uma outra modalidade, o promotor é um promotor indutível. O promotor indutível pode ser selecionado a partir de promotores conhecidos incluindo o promotor de rapamicina/rapalog, o promotor de ecdisona, o promotor responsive a estrogênio e o promotor responsive a tetraciclina, ou interruptor repressor heterodimérico. Ver Sochor et al., An Autogenously Regulated Expression System for Gene Therapeutic Ocular Applications. Scientific Reports, 24 de novembro de 2015; 5:17105 e Daber R, Lewis M., A novel molecular switch. J Mol Biol. 28 de Agosto de 2009; 391(4):661-70, Epub 2009 Jun 21, ambos os quais incorporados neste documento por referência na sua totalidade.

[0091] Em uma modalidade adicional, o promotor é um promotor de beta-actina de galinha com uma sequência de ácido nucleico de nt 546 ao nt 283 de SEQ ID NO. 8.

[0092] Em outras modalidades, o cassete de expressão, vetor, plasmídeo e vírus descritos neste documento contêm outras sequências apropriadas de iniciação, terminação, potenciação de transcrição, sinais eficientes de processamento de RNA, como junção e poliadenilação (poliA); sequências TATA; sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que aumentam a eficiência da tradução (isto é, sequência de consenso de Kozak); introns; sequências que aumentam a estabilidade proteica; e quando desejado, sequências que aumentam a secreção do produto codificado. O cassete ou vetor de expressão pode conter nenhum, um ou mais de qualquer dos elementos descritos neste documento.

[0093] Exemplos de sequências poliA adequadas incluem, por

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43/105 exemplo, um poliA sintético ou a partir de hormônio de crescimento bovino (bGH), hormônio do crescimento humano (hGH), SV40, coelho (β-globina (RGB) ou RGB modificado (mRGB). Em uma outra modalidade, a poli A tem uma sequência de ácido nucleico do nt 3993 ao nt 4200 da SEQ ID NO: 8.

[0094] Exemplos de potenciadores adequados incluem, por exemplo, o potenciador de CMV, o potenciador de RSV, o potenciador de alfa-fetoproteína, o promotor/potenciador mínimo de TTR, LSP (promotor de globulina de ligação a TH/potenciador de alfalmicroglobulina/bikunina), um potenciador de APB, potenciador de ABPS, um potenciador de alfa mic/bik, potenciador de TTR, en34, ApoE, entre outros. Em uma modalidade, o potenciador tem uma sequência de ácido nucleico de nt 241 ao nt 544 da SEQ ID NO: 8.

[0095] Em uma modalidade, uma sequência de Kozak é incluída a montante da sequência de codificação de Lebercilina para potenciar a tradução do códon de iniciação correto. Em outra modalidade, íntron e éxon 1 de CBA estão incluídos no cassete de expressão. Em uma modalidade, a sequência de codificação da Lebercilina é colocada sob o controle de um promotor híbrido da β-actina de galinha (CBA). Este promotor consiste no potenciador precoce imediato de citomegalovírus (CMV), no promotor proximal da β-actina de galinha e no éxon 1 de CBA flanqueado pelas sequências de íntron 1.

[0096] Em outra modalidade, o íntron é selecionado de CBA, betaglobina humana, IVS2, SV40, bGH, alfa-globulina, beta-globulina, colágeno, ovalbumina, p53 ou um seu fragmento.

[0097] Em uma modalidade, o cassete de expressão, o vetor, o plasmídeo e o vírus contêm um promotor de ITR 5', promotor de betaactina de galinha (CBA), potenciador de CMV, íntron e éxon 1 de CBA, sequência de Lebercilina com códons otimizados humanos, bGH poli A e ITR 3'. Em uma outra modalidade, o cassete de expressão inclui nt 1

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44/105 ao 4379 da SEQ ID NO: 8. Ainda em uma outra modalidade, a ITR 5' tem uma sequência de ácido nucleico de nt 1 ao nt 130 da SEQ ID NO: 8 e a ITR 3' tem uma sequência de ácido nucleico de nt 4250 ao nt 4379 da SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade adicional, o exonl e o intron de CBA possuem uma sequência de ácido nucleico do nt 824 ao nt 1795 da SEQ ID NO: 8. Em uma outra modalidade, o plasmídeo de produção tem uma sequência de SEQ ID NO: 8, também mostrada nas Figuras 1E-1F. Em uma outra modalidade, o plasmídeo de produção tem uma sequência de SEQ ID NO: 9, também mostrada nas Figuras 1A-11B.

[0098] Em outro aspecto, um método para tratar a Amaurose Congênita de Leber causada por um defeito no gene da Lebercilina e/ou restaurar a função visual em um sujeito que tem LCA compreende administrar, a um sujeito em respectiva necessidade, um vetor (tal como rAAV) que codifica Lebercilina, como descrito neste documento. Em uma modalidade, é fornecido um método de tratamento de um sujeito com LCA com um rAAV descrito neste documento.

[0099] Administrar, tal como utilizado nos métodos, significa distribuir a composição à célula selecionada alvo que é caracterizada por LCA. Em uma modalidade, o método envolve a entrega da composição por injeção sub-retiniana ao RPE, células fotorreceptoras ou outras células oculares. Em outra modalidade, a injeção intravítrea ao sujeito é empregue. Em outra modalidade, é empregue injeção subretiniana no sujeito. Ainda em outro método, injeções intravasculares, como injeção via veia palpebral, podem ser empregues. Ainda outros métodos de administração podem ser selecionados por aquele versado na técnica, dada esta descrição.

[00100] Por administrar ou via de administração significa-se a distribuição da composição descrita neste documento, com ou sem um veículo ou excipiente farmacêutico, do sujeito. As vias de administra

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45/105 ção podem ser combinadas, se desejado. Em algumas modalidades, a administração é repetida periodicamente. As composições farmacêuticas descritas neste documento são projetadas para serem distribuídas a sujeitos em necessidade respectiva por qualquer via adequada ou por uma combinação de diferentes vias. Em algumas modalidades, distribuição direta ao olho (opcionalmente, através de distribuição ocular, injeção sub-retiniana, injeção intrarretinal, intravítrea, tópica) ou distribuição através de vias sistêmicas é empregue, por exemplo, intravascular, intra-arterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica e outras vias parenterais de administração. As moléculas de ácido nucleico, o cassete de expressão e/ou vetores descritos neste documento podem ser distribuídos em uma única composição ou em múltiplas composições. Opcionalmente, dois ou mais AAV diferentes podem ser distribuídos, ou vários vírus [ver, por exemplo, WO20 2011/126808 e WO 2013/049493]. Em outra modalidade, vários vírus podem conter diferentes vírus com defeito de replicação (por exemplo, AAV e adenovirus), sozinhos ou em combinação com proteínas.

[00101] Também são fornecidas neste documento composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas descritas neste documento são projetadas para serem distribuídas a sujeitos em necessidade respectiva por qualquer via adequada ou por uma combinação de diferentes vias. Estes meios de distribuição são projetados para evitar a distribuição sistêmica direta da suspensão contendo a(s) composição(ões) de AAV descrita(s) neste documento. Adequadamente, isto pode ter o benefício de reduzir a dose em comparação com a administração sistêmica, reduzindo a toxicidade e/ou reduzindo respostas imunológicas indesejáveis ao produto de AAV e/ou transgene.

[00102] Ainda em outros aspectos, essas sequências de ácidos nucleicos, vetores, cassetes de expressão e vetores virais de rAAV são

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46/105 úteis em uma composição farmacêutica, que também compreende um veículo, excipiente, tampão, diluente, tensoativo, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável etc. Tais composições farmacêuticas são utilizadas para expressar a Lebercilina otimizada nas células hospedeiras através da entrega por tais AAVs recombinantes ou AAVs artificiais.

[00103] Para preparar estas composições farmacêuticas contendo as sequências de ácido nucleico, vetores, cassetes de expressão e vetores virais rAAV, as sequências ou vetores ou vetor viral são preferencialmente avaliados quanto à contaminação por métodos convencionais e depois formulados em uma composição farmacêutica adequada para administração ao olho. Essa formulação envolve o uso de um veículo ou veículo farmaceuticamente e/ou fisiologicamente aceitável, particularmente um adequado para administração ao olho, como solução salina tamponada ou outros tampões, por exemplo, HEPES, para manter o pH em níveis fisiológicos apropriados e, opcionalmente, outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, agentes estabilizantes, tampões, carreadores, adjuvantes, diluentes, tensoativos ou excipientes etc. Para injeção, o veículo será tipicamente um líquido. Os carreadores fisiologicamente aceitáveis exemplares incluem água estéril isenta de pirogênios e solução salina tamponada com fosfato, isenta de pirogênios, estéril. Uma variedade de tais carreadores conhecidos é fornecida na Publicação de Patente US N^Q 7,629,322, incorporada neste documento por referência. Em uma modalidade, o veículo é uma solução isotônica de cloreto de sódio. Em outra modalidade, o veículo é uma solução salina equilibrada. Em uma modalidade, o veículo inclui tween. Se o vírus for armazenado em longo prazo, ele pode ser congelado na presença de glicerol ou Tween20.

[00104] Em certas modalidades, para administração a um paciente humano, o rAAV é adequadamente suspenso em uma solução aquosa

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47/105 contendo solução salina, um tensoativo e um sal ou mistura de sais fisiologicamente compatível. Adequadamente, a formulação é ajustada a um pH fisiologicamente aceitável, por exemplo, no intervalo de pH de 6 a 9 ou pH de 6,5 a 7,5, pH de 7,0 a 7,7 ou pH de 7,2 a 7,8. Na medida em que o pH do fluido cérebro-espinhal é de cerca de 7,28 a cerca de 7,32, para administração intratecal, pode ser desejável um pH dentro deste intervalo; enquanto que para distribuição intravítrea ou subretiniana, um pH de 6,8 a cerca de 7,2 pode ser desejável. No entanto, outros pHs dentro dos intervalos mais amplos e esses subintervalos podem ser selecionados para outra via de administração.

[00105] Um tensoativo adequado, ou combinação de tensoativos, pode ser selecionado de entre tensoativos não iônicos que são não tóxicos. Em uma modalidade, um tensoativo de copolímero em bloco difuncional que termina em grupos hidroxila primários é selecionado, por exemplo, como Pluronic® F68 [BASF], também conhecido como Poloxamer 188, que tem um pH neutro e um peso molecular médio de 8400. Outros tensoativos e outros poloxâmeros podem ser selecionados, quais sejam, copolímeros tribloco não iônicos compostos por uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (óxido de polipropileno) flanqueado por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (óxido de polietileno)), SOLUTOL HS 15 (Macrogol-15 Hidroxiestearato), LABRASOL (glicerídeo polióxi-caprílico), polióxi-10 oleil éter, TWEEN (ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano), etanol e polietilenoglicol. Em uma modalidade, a formulação contém um poloxâmero. Esses copolímeros geralmente são nomeados com a letra P (de poloxâmero) seguidos de três dígitos: os dois primeiros dígitos x 100 dão a massa molecular aproximada do núcleo de polioxipropileno e o último dígito x 10 indica o percentual de polioxietileno. Em uma modalidade, o Poloxamer 188 é selecionado. O tensoativo pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,0005% até cerca de 0,001% da

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48/105 suspensão.

[00106] Em um exemplo, a formulação pode conter, por exemplo, solução salina tamponada compreendendo um ou mais de cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, dextrose, sulfato de magnésio (por exemplo, sulfato de magnésio ·7Η2Ο), cloreto de potássio, cloreto de cálcio (por exemplo, cloreto de cálcio ·2Η2Ο), fosfato de sódio dibásico e suas misturas em água. Adequadamente, para a administração intratecal, a osmolaridade está dentro de um intervalo compatível com o líquido cefalorraquidiano (por exemplo, de cerca de 275 a cerca de 290); ver, por exemplo, http://emedicine.medscape.com/article/2093316-overview. Opcionalmente, para a administração intratecal, pode ser utilizado um diluente comercialmente disponível como agente de suspensão ou em combinação com outro agente de suspensão e outros excipientes opcionais. Ver, por exemplo, a solução Elliotts B® [Lukare Medicai]. Em outras modalidades, a formulação pode conter um ou mais potenciadores de permeação. Exemplos de potenciadores de permeação adequados podem incluir, por exemplo, manitol, glicolato de sódio, taurocolato de sódio, desoxicolato de sódio, salicilato de sódio, caprilato de sódio, caprato de sódio, lauril sulfato de sódio, éter de polioxietileno-9-laurel ou EDTA.

[00107] Em outra modalidade, a composição inclui um veículo, diluente, excipiente e/ou adjuvante. Os carreadores adequados podem ser facilmente selecionados por um versado na técnica em vista da indicação para a qual o vírus de transferência é direcionado. Por exemplo, um veículo adequado inclui solução salina, que pode ser formulada com uma variedade de soluções tampão (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato). Outros veículos exemplificativos incluem solução salina estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, ágar, pectina, óleo de amendoim, óleo de gergelim e água. O

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49/105 tampão/veículo deve incluir um componente que impede que o rAAV cole na tubagem de infusão, mas não interfira com a atividade de ligação ao rAAV in vivo.

[00108] Opcionalmente, as composições da invenção podem conter, além do rAAV e veículo(s), outros ingredientes farmacêuticos convencionais, tais como conservantes ou estabilizadores químicos. Conservantes exemplares adequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, gaiato de propila, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol e paraclorofenol. Estabilizadores químicos adequados incluem gelatina e albumina.

[00109] As composições de acordo com a presente invenção podem compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como definido acima. Adequadamente, as composições descritas neste documento compreendem uma quantidade eficaz de um ou mais AAV suspensos em um veículo farmaceuticamente adequado e/ou misturado com excipientes adequados projetados para distribuição ao sujeito por injeção, bomba osmótica, cateter intratecal, ou para entrega por outro dispositivo ou via. Em um exemplo, a composição é formulada para distribuição intravítrea. Em um exemplo, a composição é formulada para entrega sub-retiniana.

[00110] Em uma modalidade específica exemplificativa, a composição do veículo ou excipiente contém 180 mM de NaCI, 10 mM de NaPi, pH 7,3 com 0,0001% - 0,01% de Pluronic F68 (PF68). A composição exata do componente salino do tampão varia entre 160 mM e 180 mM de NaCI. Opcionalmente, é utilizado um tampão de pH diferente (potencialmente HEPES, bicarbonate de sódio, TRIS) em vez do tampão especificamente descrito. Ainda alternativamente, um tampão contendo NaCI a 0,9% é útil.

[00111] No caso de vetores virais de AAV, a quantificação das cópias do genoma (GC), genomas do vetor (VG) ou partículas de ví

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50/105 rus pode ser usada como a medida da dose contida na formulação ou suspensão. Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para determinar o número de cópias do genoma (GC) das composições de vírus com defeito de replicação da invenção. Um método para realizar a titulação do número de GC de AAV é o seguinte: as amostras de vetor de AAV purificadas são primeiro tratadas com DNase para eliminar o DNA do genoma do AAV não encapsulado ou o DNA do plasmídeo contaminado do processo de produção. As partículas resistentes à DNase são então submetidas a tratamento térmico para liberar o genoma do capsídeo. Os genomas liberados são então quantificados por PCR em tempo real utilizando conjuntos de primer/sonda direcionados para a região específica do genoma viral (normalmente sinal de poli A). Em outro método, a dose eficaz de um vírus adenoassociado recombinante contendo uma sequência de ácido nucleico codificando a sequência de codificação de Lebercilina otimizada é medida como descrito em SK McLaughlin et al., 1988 J. Virol., 62:1963, que é incorporado neste documento na sua totalidade.

[00112] Conforme usado neste documento, o termo dosagem pode referir-se à dosagem total administrada ao sujeito no decurso do tratamento, ou à quantidade administrada em uma administração unitária única (ou administração de unidades múltiplas ou doses divididas). As composições farmacêuticas de vírus podem ser formuladas em unidades de dosagem para conter uma quantidade de vírus defeituoso à replicação que transporta as sequências de ácido nucleico com códons otimizados que codificam Lebercilina, como descrito neste documento, que está no intervalo de 1,0 x 10⁹ GC a cerca de 1,0 x 10¹⁵ GC por dose incluindo todos os números inteiros ou frações dentro do intervalo. Em uma modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹ ou 9x10⁹ GC por dose incluindo todos os números intei

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51/105 ros ou quantidades fraccionadas dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x10¹⁰, 2x1O¹°,3x1O¹⁰, 4x1O¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x1O¹⁰, 8x10¹⁰ ou 9x10¹⁰ GC por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fraccionadas dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1 x10¹¹, 2x10¹¹, 3x10¹¹, 4x10¹¹, 5x10¹¹, 6x10¹¹, 7x10¹¹, 8x10¹¹ ou 9x10¹¹ GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fraccionadas dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x10¹², 2x10¹², 3x10¹², 4x10¹², 5x10¹², 6x10¹², 7x10¹², 8x10¹² ou 9x10¹² GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fraccionadas dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x10¹³, 2x10¹³, 3x10¹³, 4x10¹³, 5x10¹³, 6x10¹³, 7x10¹³, 8x10¹³ ou 9x10¹³ GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fraccionadas dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x10¹⁴, 2x10¹⁴, 3x10¹⁴, 4x10¹⁴, 5x10¹⁴, 6x10¹⁴, 7x10¹⁴, 8x10¹⁴ ou 9x10¹⁴ GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fraccionadas dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x10¹⁵, 2x10¹⁵, 3x10¹⁵, 4x10¹⁵, 5x10¹⁵, 6x10¹⁵, 7x10¹⁵, 8x10¹⁵ ou 9x10¹⁵ GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fraccionadas dentro do intervalo. Em uma modalidade, para aplicação humana a dose pode variar de 1x10¹⁰ a cerca de 1x10¹² GC por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fraccionadas dentro do intervalo. Todas as dosagens podem ser medidas por qualquer método conhecido, incluindo como medido por oqPCR ou por PCR de gotículas digitais (ddPCR) como descrito em, por exemplo, M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. Abril de 2014;25(2):115-25. doi: 10,1089/hgtb.2013.131, que é incorporado neste documento por refePetição 870190095862, de 25/09/2019, pág. 56/143

52/105 rência.

[00113] Em uma modalidade, é proporcionada uma suspensão aquosa adequada para administração a um paciente com LCA. A suspensão compreende um líquido de suspensão aquosa e cerca de 1x10¹⁰ GC ou partículas virais a cerca de 1x10¹² GC ou partículas virais por olho de um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) descrito neste documento como terapêutico para LCA.

[00114] Pode também ser desejável administrar múltiplas dosagens de reforço das composições farmacêuticas desta invenção. Por exemplo, dependendo da duração do transgene dentro da célula alvo ocular, pode-se administrar dosagens de reforço a intervalos de 6 meses, ou anualmente após a primeira administração. O facto de os anticorpos neutralizantes de AAV não terem sido gerados pela administração do vetor de rAAV deve permitir administrações de reforço adicionais.

[00115] Tais dosagens de reforço e a sua necessidade podem ser monitorizadas pelos médicos assistentes, utilizando, por exemplo, os testes da função retiniana e visual e os testes de comportamento visual descritos nos exemplos abaixo. Outros testes similares podem ser usados para determinar o status do sujeito tratado ao longo do tempo. A seleção dos testes apropriados pode ser feita pelo médico assistente. Ainda alternativamente, o método desta invenção também pode envolver a injeção de um volume maior de solução contendo vírus em uma infecção única ou múltipla para permitir níveis de função visual próximos àqueles encontrados em retinas de tipo selvagem.

[00116] Em outra modalidade, a quantidade de vetores, o vírus e o vírus com defeito de replicação descritos neste documento, e portando as sequências de ácido nucleico com códons otimizados que codificam Lebercilina, estão no intervalo de cerca de 1,0x10⁷ VG por olho a cerca de 1,0x10¹⁵ VG por olho, incluindo todos os números inteiros ou

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53/105 quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em uma modalidade, a quantidade da mesma é pelo menos cerca de 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷ ou 9x10⁷ VG por olho, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em uma modalidade, a quantidade respectiva é pelo menos 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸ ou 9x10⁸ VG por olho, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em uma modalidade, a quantidade da mesma é pelo menos 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹ ou 9x10⁹ VG por olho, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em uma modalidade, a sua quantidade é pelo menos 1x10¹°, 2x10¹°,3x10¹°, 4x10¹°, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x1O¹⁰, 8x10¹⁰ ou 9x10¹⁰ VG por olho, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em uma modalidade, a quantidade da mesma é pelo menos 1x10¹¹, 2x10¹¹, 3x10¹¹, 4x10¹¹, 5x10¹¹, 6x10¹¹, 7x10¹¹, 8x10¹¹ ou 9x10¹¹ VG por olho, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em uma modalidade, a quantidade da mesma é pelo menos 1x10¹², 2x10¹², 3x10¹², 4x10¹², 5x10¹², 6x10¹², 7x10¹², 8x10¹² ou 9x10¹² VG por olho, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em uma modalidade, a quantidade da mesma é pelo menos 1x10¹³, 2x10¹³, 3x10¹³, 4x10¹³, 5x10¹³, 6x10¹³, 7x10¹³, 8x10¹³ ou 9x10¹³ VG por olho, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em uma modalidade, a sua quantidade é pelo menos 1x10¹⁴, 2x10¹⁴, 3x10¹⁴, 4x10¹⁴, 5x10¹⁴, 6x10¹⁴, 7x10¹⁴, 8x10¹⁴ ou 9x10¹⁴ VG por olho, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em uma modalidade, a quantidade da mesma é pelo menos 1x10¹⁵, 2x10¹⁵, 3x10¹⁵, 4x10¹⁵, 5x10¹⁵, 6x10¹⁵, 7x10¹⁵, 8x10¹⁵ ou 9x10¹⁵ GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracioná

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54/105 rias dentro do intervalo. Em uma modalidade, os métodos compreendem doses que variam de 1x10⁹ a cerca de 1x10¹³ VG por olho por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em outra modalidade, o método compreende a entrega do vetor em uma suspensão aquosa. Em outra modalidade, o método compreende administrar o rAAV descrito neste documento em uma dosagem de 1x10⁹ a 1x10¹³ GC em um volume de cerca de ou de pelo menos 150 microlitros, restaurando assim a função visual no referido sujeito. Todas as dosagens podem ser medidas por qualquer método conhecido, incluindo como medido por oqPCR ou por PCR de gotículas digitais (ddPCR) como descrito em, por exemplo, M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. Abril de 2014;25(2):115-25. doi: 10,1089/hgtb.2013.131, que é incorporado neste documento por referência.

[00117] Estas doses acima podem ser administradas em uma variedade de volumes de formulação de veículo, excipiente ou tampão, variando de cerca de 25 a cerca de 1000 microlitros, incluindo todos os números dentro do intervalo, dependendo do tamanho da área a ser tratada, o título viral usado, a via de administração e o efeito desejado do método. Em uma modalidade, o volume de veículo, excipiente ou tampão é pelo menos cerca de 25 pL. Em uma modalidade, o volume é de cerca de 50 pL. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 75 pL. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 100 pL. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 125 pL. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 150 pL. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 175 pL. Ainda em outra modalidade, o volume é de cerca de 200 pL. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 225 pL. Ainda em outra modalidade, o volume é de cerca de 250 pL. Ainda em outra modalidade, o volume é de cerca de 275 pL. Ainda em outra modalidade, o volume é de cerca de 300 pL. Ainda em outra modalidade, o

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55/105 volume é de cerca de 325 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 350 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 375 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 400 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 450 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 500 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 550 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 600 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 650 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 700 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 800 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de entre cerca de 150 e 800 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de entre cerca de 700 e 1000 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de entre cerca de 250 e 500 μΙ_.

[00118] Em uma modalidade, os construtos virais podem ser distribuídos em doses de pelo menos 1x10⁹ a cerca de 1x10¹¹ GCs em volumes de cerca de 1 μΙ_ a cerca de 3 μΙ_ para pequenos animais, como camundongos. Para sujeitos veterinários maiores com olhos do mesmo tamanho dos olhos humanos, as dosagens e volumes humanos maiores indicados acima são úteis. Ver, por exemplo, Diehl et al, J. Applied Toxicology, 21:15-23 (2001) para uma discussão de boas práticas para administração de substâncias a vários animais veterinários. Este documento é incorporado neste documento por referência.

[00119] É desejável que seja utilizada a menor concentração eficaz de vírus ou outro veículo de entrega, a fim de reduzir o risco de efeitos indesejáveis, tais como toxicidade, displasia da retina e descolamento. Ainda outras dosagens nestes intervalos podem ser selecionadas pelo médico assistente, tendo em conta o estado físico do sujeito, de preferência humano, a ser tratado, a idade do sujeito, a LCA e o grau em que a doença, se progressiva, já se desenvolveu.

[00120] Ainda outro aspecto descrito neste documento é um método para tratar, retardar ou parar a progressão de LCA em um sujeito

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56/105 mamífero. Em uma modalidade, um rAAV transportando a sequência nativa de Lebercilina, modificada ou com códons otimizados, de preferência suspensa em um veículo, diluente, excipiente e/ou adjuvante fisiologicamente compatível, pode ser administrada a um sujeito desejado, incluindo um sujeito humano. Este método compreende a administração a um sujeito, em necessidade respectiva, de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos, cassetes de expressão, genomas de rAAV, plasmídeos, vetores ou vetores de rAAV ou composições contendo-os. Em uma modalidade, a composição é administrada de forma sub-retiniana. Em outra modalidade, a composição é administrada por via intravítrea. Ainda em outra modalidade, a composição é administrada utilizando uma combinação de vias administrativas adequadas para o tratamento de LCA, e pode também envolver administração através da veia palpebral ou outras vias de administração intravenosa ou convencional.

[00121] Para uso nesses métodos, o volume e o título viral de cada dosagem são determinados individualmente, como adicionalmente descrito neste documento, e podem ser iguais ou diferentes de outros tratamentos realizados no mesmo olho, ou no contralateral. As dosagens, administrações e regimes podem ser determinados pelo médico assistente, dados os ensinamentos desta especificação. Em uma modalidade, a composição é administrada em uma dose única selecionada a partir daquelas listadas acima em um olho afetado. Em outra modalidade, a composição é administrada como uma dosagem única selecionada das listadas acima em ambos os olhos afetados, quer simultaneamente, quer sequencialmente. A administração sequencial pode implicar um intervalo de tempo de administração de um olho para outro a partir de intervalos de minutos, horas, dias, semanas ou meses. Em outra modalidade, o método envolve a administração das composições a um olho em duas ou mais dosagens (por exemplo, dosagens dividi

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57/105 das). Em outra modalidade, múltiplas injeções são feitas em diferentes partes do mesmo olho. Em outra modalidade, uma segunda administração de um rAAV incluindo o cassete de expressão selecionado (por exemplo, cassete contendo LCA5) é realizada em um momento posterior. Esse ponto temporal pode ser semanas, meses ou anos após a primeira administração. Tal segunda administração, em uma modalidade, é realizada com um rAAV possuindo um capsídeo diferente do rAAV a partir da primeira administração. Em outra modalidade, o rAAV da primeira e segunda administração tem o mesmo capsídeo.

[00122] Ainda em outras modalidades, as composições descritas neste documento podem ser entregues em uma composição única ou em múltiplas composições. Opcionalmente, dois ou mais AAV diferentes podem ser distribuídos ou vários vírus [ver, por exemplo, WO 2011/126808 e WO 2013/049493]. Em outra modalidade, vários vírus podem conter diferentes vírus com defeito de replicação (por exemplo, AAV e adenovirus).

[00123] Em certas modalidades da invenção, é desejável realizar estudos de imagiologia da retina não invasivos e estudos funcionais para identificar áreas dos fotorreceptores de bastonete e cone a serem direcionados para terapia, bem como para testar a eficácia do tratamento. Nestas modalidades, são utilizados testes de diagnóstico clínico para determinar a(s) localização(ões) precisa(s) de uma ou mais injeções sub-retinianas. Estes testes podem incluir eletrorretinografia (ERG), perimetria, mapeamento topográfico das camadas da retina e mensuração da espessura de suas camadas por meio de oftalmoscopia confocal de varredura a laser (cSLO) e tomografia de coerência óptica (OCT), mapeamento topográfico da densidade do cone através de óptica adaptativa (AO), exame oftalmológico funcional, matriz de eletrodos múltiplos (MEA), respostas à luz pupilar, etc., dependendo das espécies do sujeito a ser tratado, seu estado físico e saúde e a

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58/105 dosagem. Tendo em vista os estudos de imagiologia e funcionais, em algumas modalidades da invenção, uma ou mais injeções são realizadas no mesmo olho de modo a se direcionarem a diferentes áreas do olho afetado. O volume e o título viral de cada injeção são determinados individualmente, como adicionalmente descrito, e podem ser iguais ou diferentes de outras injeções realizadas no mesmo olho, ou no contralateral. Em outra modalidade, uma única injeção de volume maior é feita para tratar todo o olho. Em uma modalidade, o volume e a concentração da composição de rAAV são selecionados para que apenas a região das células oculares danificadas seja impactada. Em outra modalidade, o volume e/ou concentração da composição do rAAV é uma quantidade maior, para atingir porções maiores do olho, incluindo fotorreceptores não danificados.

[00124] Em outra modalidade, o método inclui a realização de estudos adicionais, por exemplo, estudos funcionais e de imagem para determinar a eficácia do tratamento. Para exame em animais, tais testes incluem avaliação da função retiniana e visual via eletrorretinogramas (ERGs), observando a função fotorreceptora de bastonetes e cone, nistagmo optocinético, pupilometria, teste de labirinto aquático, preferência luz-escura, tomografia de coerência óptica (para medir a espessura de várias camadas da retina), histologia (espessura da retina, fileiras de núcleos na camada nuclear externa, imunofluorescência para documentar a expressão do transgene, contagem de fotorreceptores do cone, coloração das seções retinianas com aglutinina de amendoim - que identifica as bainhas fotorreceptoras do cone).

[00125] Especificamente para sujeitos humanos, após a administração de uma dosagem de uma composição descrita nesta especificação, o sujeito é testado quanto à eficácia do tratamento utilizando eletrorretinogramas (ERGs) para examinar a função fotorreceptor do bastonete e cone, acuidade visual de pupilometria, teste de visão de cores

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59/105 com sensibilidade ao contraste, teste de campo visual (campos visuais de Humphrey/campos visuais de Goldmann), teste de mobilidade de perimetria (pista de obstáculos) e teste de velocidade de leitura. Outro teste de eficácia útil pós-tratamento ao qual o sujeito é exposto após tratamento com uma composição farmacêutica descrita neste documento é a ressonância magnética funcional (fMRI), teste de sensibilidade à luz de campo total, estudos da estrutura retiniana incluindo tomografia de coerência óptica, fotografia de fundo de fundo, autofluorescência de fundo, oftalmoscopia óptica por laser de adaptação, teste de mobilidade, teste de velocidade e precisão de leitura, microperimetria e/ou oftalmoscopia. Estes e outros testes de eficácia estão descritos na Patente US N^Q 8,147,823; na publicação copendente do Pedido de Patente Internacional WO 2014/011210 ou WO 2014/124282, incorporada por referência.

[00126] Em uma modalidade dos métodos descritos neste documento, uma distribuição intraocular única de uma composição como descrita neste documento, por exemplo, uma distribuição de AAV de um cassete de LCA5 otimizado, é útil no tratamento de LCA em um sujeito. Em outra modalidade dos métodos descritos neste documento, uma distribuição intraocular única de uma composição como descrita neste documento, por exemplo, uma distribuição de AAV de um cassete de LCA5 otimizado, é útil no tratamento de LCA em um sujeito em risco.

[00127] Assim, em uma modalidade, a composição é administrada antes do início da doença. Em outra modalidade, a composição é administrada antes do início da deficiência ou perda da visão. Em outra modalidade, a composição é administrada após o início da deficiência ou perda da visão. Ainda em outra modalidade, a composição é administrada quando menos de 90% do bastonete e/ou cones ou fotorreceptores funcionam ou permanecem, em comparação com um olho

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60/105 não doente. Em uma modalidade, o tratamento neonatal é definido como ter administrada uma sequência de codificação, cassete de expressão ou vetor de Lebercilina, como descrito neste documento, dentro de 8 horas, nas primeiras 12 horas, nas primeiras 24 horas ou nas primeiras 48 horas da distribuição. Em outra modalidade, particularmente para um primata (humano ou não humano), a distribuição neonatal está dentro do período de cerca de 12 horas a cerca de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, ou cerca de 1 mês, ou após de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. Em outra modalidade, a composição é administrada após o início dos sintomas. Em uma modalidade, o tratamento do paciente (por exemplo, uma primeira injeção) é iniciado antes do primeiro ano de vida. Em outra modalidade, o tratamento é iniciado após o 1^Q ano, ou após os primeiros 2 a 3 anos de idade, após os 5 anos de idade, após os 11 anos de idade ou em uma idade mais avançada. Em uma modalidade, o tratamento é iniciado a partir de cerca dos 4 anos de idade até aos 12 anos de idade. Em uma modalidade, o tratamento é iniciado em ou após cerca de 4 anos de idade. Em uma modalidade, o tratamento é iniciado em ou após cerca de 5 anos de idade. Em uma modalidade, o tratamento é iniciado em ou após cerca de 6 anos de idade. Em uma modalidade, o tratamento é iniciado em ou após cerca de 7 anos de idade. Em uma modalidade, o tratamento é iniciado em ou após cerca de 8 anos de idade. Em uma modalidade, o tratamento é iniciado em ou após cerca de 9 anos de idade. Em uma modalidade, o tratamento é iniciado em ou após cerca de 10 anos de idade. Em uma modalidade, o tratamento é iniciado em ou após cerca de 11 anos de idade. Em uma modalidade, o tratamento é iniciado em ou após cerca de 12 anos de idade. No entanto, o tratamento pode ser iniciado em ou após cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35 ou cerca de 40 anos de idade. Em uma modalidade, o tratamento no útero é definido como a administra

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61/105 ção da composição, como descrita neste documento, no feto. Ver, por exemplo, David et al., Recombinant adeno- associated virus-mediated in utero gene transfer gives therapeutic transgene expression in the sheep, Hum Gene Ther. Abril de 2011; 22 (4): 419-26. doi: 10.1089/hum.2010.007. Epub de 2 de fevereiro de 2011, que é incorporado neste documento por referência.

[00128] Em outra modalidade, a composição é administrada novamente em uma data posterior. Opcionalmente, mais de uma nova administração é permitida. Tal nova administração pode ser com o mesmo tipo de vetor, um vetor viral diferente, ou via distribuição não viral como descrita neste documento. Em uma modalidade, o vetor é administrado novamente ao paciente para uma porção diferente da retina inicialmente injetada. Em uma modalidade, o vetor é administrado novamente ao paciente para a mesma porção da retina inicialmente injetada.

[00129] Ainda em outra modalidade, qualquer um dos métodos acima descritos é realizado em combinação com outra terapia, ou terapia secundária. A terapia secundária pode ser qualquer terapia agora conhecida, ou ainda desconhecida, que ajude a prevenir, interromper ou melhorar essas mutações ou defeitos ou qualquer um dos efeitos associados a eles. A terapia secundária pode ser administrada antes, concomitantemente ou após a administração das composições descritas acima. Em uma modalidade, uma terapia secundária envolve abordagens não específicas para manter a saúde das células da retina, tais como a administração de fatores neurotróficos, antioxidantes, agentes antiapoptóticos. As abordagens não específicas são conseguidas através da injeção de proteínas, DNA recombinante, vetores virais recombinantes, células-tronco, tecido fetal ou células geneticamente modificadas. Este último pode incluir células geneticamente modificadas que são encapsuladas.

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62/105 [00130] Em uma modalidade, um método para gerar um rAAV recombinante compreende a obtenção de um plasmídeo contendo um cassete de expressão de AAV conforme descrito acima e fazer a cultura de uma célula de empacotamento que transporta o plasmídeo na presença de sequências virais suficientes para permitir o empacotamento do genoma viral de AAV em um envelope AAV infeccioso ou capsídeo. Métodos específicos de geração do vetor de rAAV são descritos acima e podem ser empregues na geração de um vetor de rAAV que pode fornecer o LCA5 com códons otimizados nos cassetes de expressão e nos genomas descritos acima e nos exemplos abaixo.

[00131] Em certas modalidades desta invenção, um sujeito tem amaurose congênita de Leber (LCA), para a qual os componentes, composições e métodos desta invenção são projetados para tratar. Como usado neste documento, o termo paciente ou sujeito, como utilizado neste documento, significa um animal mamífero, incluindo um ser humano, um veterinário ou animal de fazenda, um animal doméstico ou animal de estimação e animais normalmente utilizados para investigação clínica. Em uma modalidade, o sujeito destes métodos e composições é um humano. Ainda outros sujeitos adequados incluem, sem limitação, murinos, ratos, caninos, felinos, porcinos, bovinos, ovinos, primatas não humanos e outros. Como utilizado neste documento, o termo sujeito é utilizado indistintamente de paciente.

[00132] Como utilizado neste documento, o termo tratamento ou tratar é definido abrangendo a administração a um sujeito de um ou mais compostos ou composições descritos neste documento, com o objetivo de amenizar um ou mais sintomas de LCA. Tratamento pode assim incluir um ou mais de reduzir o aparecimento ou progressão da LCA, prevenir a doença, reduzir a gravidade dos sintomas da doença ou retardar a sua progressão, incluindo a progressão da cegueira, remover os sintomas da doença, retardar o início da doença ou monito

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63/105 rar progressão da doença ou eficácia da terapia em um determinado sujeito.

[00133] É de notar que o termo um ou uma se refere a um ou mais. Desse modo, os termos um (ou uma), um ou mais e pelo menos um são utilizados neste documento de forma intercambiável.

[00134] As palavras compreendem, compreende e compreendendo devem ser interpretadas inclusivamente em vez de exclusivamente. As palavras consistir, consistindo e suas variantes devem ser interpretadas exclusivamente, e não de forma inclusiva. Embora várias modalidades na especificação sejam apresentadas usando linguagem compreendendo, em outras circunstâncias, uma modalidade relacionada também se destina a ser interpretada e descrita usando linguagem consistindo em ou consistindo essencialmente em.

[00135] Como utilizados neste documento, doença, distúrbio e condição são utilizados alternadamente, para indicar um estado anormal em um sujeito.

[00136] Conforme usado neste documento, o termo cerca de ou significa uma variabilidade de 10% em relação à referência dada, salvo especificação em contrário.

[00137] O termo regulação ou suas variações, tal como utilizado neste documento, refere-se à capacidade de uma composição inibir um ou mais componentes de uma via biológica.

[00138] Salvo definido em contrário neste relatório descritivo, os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que aquele entendido na técnica e por referência a textos publicados que proporcionem àqueles versados na técnica uma orientação geral para vários dos termos usados no presente pedido. EXEMPLOS [00139] Os exemplos a seguir são apenas ilustrativos e não pretendem limitar a presente invenção.

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Exemplo 1: Estudos de Expressão Recombinante de rAAV e In Vitro [00140] A transferência de genes da retina usando o serotipo de AAV recombinante mais bem estudado, AAV2, foi realizada em >310 olhos em seres humanos, e em 29 diferentes ensaios clínicos (clinicaltrials.gov). Estes ensaios visam diversas doenças, incluindo defeitos autossômicos (deficiência de RPE65, retinite pigmentosa devido a mutações no MERTK, coroideremia, acromatopsia), uma doença mitocondrial (neuropatia óptica hereditária de Leber), uma complicação da degeneração macular relacionada à idade (neovascularização da coroide) e degeneração retiniana em estágio final (usando terapia optogenética). Na maioria desses estudos (18/29 ou 18 dos 22 estudos que empregaram AAV e injeção sub-retiniana), o objetivo era atingir eficientemente as células de RPE. O resultado líquido tem sido um grande corpo de dados de segurança em relação à entrega intraocular de AAV. A injeção sub-retiniana é a mesma abordagem cirúrgica que será necessária para atingir os fotorreceptores nos pacientes com LCA5.

[00141] Esforços tremendos foram feitos para desenvolver um caminho para vencer a LCA5 e outras doenças envolvendo defeitos de fotorreceptor primários com base nas informações obtidas. Infelizmente, os vetores de AAV2 não se direcionam eficazmente aos fotorreceptores e, como mencionado acima, os fotorreceptores compreendem o tipo de célula primária em LCA5 e a maioria das outras degenerações retinianas herdadas. Por esse motivo, foi selecionado o AAV7m8, vetor gerado pelo design evolutivo. Mostrou-se que este vetor tem como alvo os fotorreceptores de maneira eficiente em diversas espécies (camundongos e primatas não humanos (NHPs)) e usa diferentes vias de administração.

[00142] A eficácia relatada neste documento inclui melhorias na capacidade dos animais tratados para navegar usando pistas visuais, a

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65/105 restauração de vias visuais para o cérebro, como mostrado pela pupilometria, uma redução na apoptose de fotorreceptores e a preservação de fotorreceptores funcionais com morfologia e marcadores característicos deste tipo de célula, incluindo a presença de rodopsina na retina externa. Os fotorreceptores Lca5gt/gt tratados mostram camadas nucleares espessas externas com segmentos externos preservados com discos de segmento externo empilhados. Isto está em contraste marcante com as retinas Lca5gt/gt não tratadas, que foram reduzidas a uma única fileira de núcleos fotorreceptores não contíguos aos 3 meses dos 19 anos de idade. As melhorias não foram permanentes. No entanto, elas persistiram por pelo menos 3 meses, altura em que não há fotorreceptores restantes no camundongo Lca5gt/gt não tratado. Resultados de eletrorretinografia e MEA mostram que, com a transdução bem-sucedida de fotorreceptores, a terapia gênica com LCA5 é capaz de restaurar, pelo menos em parte, respostas mediadas por fotorreceptores de bastonete e cone. As respostas das células têm cinética quase normal, incluindo respostas que refletem a atividade de uma variedade de tipos de células ganglionares, bem como uma reversão das respostas de melanopsina dominantes observadas nas retinas Lca5gt/gt não tratadas. Os resultados são complementares aos achados da pupilometria e do comportamento visual e fornecerão a estrutura para estudos futuros com o objetivo de melhor caracterizar e otimizar os efeitos do tratamento (incluindo estudos de comportamento visual em condições de baixa luminância). Esses dados fornecem a esperança de que uma abordagem similar de aumento de genes em humanos, como a usada no camundongo Lca5gt/gt, podería resultar em melhora da visão. Pode ser possível otimizar ainda mais a intervenção para se obter um efeito de resgate ainda mais duradouro. Alterações de componentes do cassete de transgene (promotor, etc.) e áreas de retina tratadas podem levar a benefícios adicionais. Os estudos de do

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66/105 sagem devem identificar a dose ideal para efeito terapêutico. O fato de os pacientes nulos com LCA5 poderem reter fotorreceptores até a idade adulta (enquanto os fotorreceptores são perdidos no início da vida em camundongos) sugere que pode haver uma janela de oportunidade mais ampla em humanos com LCA5 em comparação com camundongos Lca5-/-. Fotorreceptores foram documentados em humanos nulos com LCA5 na camada nuclear externa da camada foveal, por até 3 décadas. Isso é importante, pois a terapia genética bem-sucedida requer que as células afetadas estejam presentes. Nós fomos capazes de demonstrar que os fotorreceptores retidos em um adulto com mutações em LCA5 demonstraram um padrão temporal similar de responsividade à luz (embora reduzida em amplitude) como fotorreceptores de um indivíduo com visão normal. Esses resultados indicam que os fotorreceptores residuais em pacientes com LCA5 são funcionais, apesar dos déficits estruturais e fisiológicos. Os cílios primários de iPSCRPE derivados de pacientes mutantes com LCA5 eram muito menos numerosos do que aqueles das células de controle. Os fatos de que o defeito ciliar nos fotorreceptores nos camundongos Lca5gt/gt podem ser corrigidos pela terapia de aumento de genes e que o número de cílios pode ser aumentado para níveis normais, sugere que pode ser possível melhorar o defeito ciliar presente em humanos com esta condição.

A. AAV Recombinante [00143] AAVs recombinantes foram gerados no Center for Advanced Retinal and Ocular Therapeutics (CAROT) usando capsídeo de AAV7m8, que é conhecido por infectar fotorreceptores mais eficientemente que AAV2 (Dalkara D, Byrne LC, Klimczak RR, Visei M, YinL, Merigan WH, e al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med (2013) 5(189): 189ra76.

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67/105 doi:10.1126/scitranslmed.3005708.) O cDNA otimizado que codifica a lebercilina humana (h) do tipo selvagem (hopt.LCAõ/ foi projetado de forma personalizada para o use ideal do códon e sintetizado por DNA2.0 (Menlo Park, CA). O cDNA de LCA5foi colocado sob o controle de um éxon 1 de β-actina de galinha (CBA) híbrida flanqueado por sequências do intron 1 e com potenciador precoce imediato do citomegalovírus (CMV) (FIG. 1A e 1E). Um hormônio de crescimento bovino poli(A) seguiu o cDNA. Uma sequência longa de preenchimento foi incluída para evitar empacotamento reverso (ou seja, não contendo transgene) do vetor das repetições terminais invertidas do AAV2. Os vetores foram preparados por transfecção tripla e formulados em excipiente consistindo em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 0,001% de Pluronic F68 (PF68). Ver, por exemplo, Mizukami, Hiroaki, et al. A Protocol for AAV vector production and purification. Diss. Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, 1998. Os vetores de controle incorporaram o cDNA da proteína verde fluorescente aprimorada (eGFP) no lugar do cDNA de LCA5.

[00144] Os rAAVs foram testados quanto à expressão da proteína transgênica de tamanho apropriado por Western blot. Foram plaqueadas 8431 células a 2x10⁶ células por poço. Dois dias após o plaqueamento, as células foram transduzidas com AAV7m8.hopt.LCA5 (ou AAV7m8.CBA.EGFP como controle) em 1x10⁵ ou 5x10⁵vg. 48 horas depois, as células foram coletadas e processadas para eletroforese e Western blot. Os anticorpos incluem um anticorpo policlonal de coelho de LCA5 (Proteintech, Rosemont, IL) e os sinais são quantificados, sendo cada valor corrigido para diferenças de fundo e de carga proteica através da normalização com o sinal imunológico de GAPDH.

[00145] O vírus AAV7m8.CBA.hopt.LCA5 é capaz de conduzir a expressão eficiente do transgene LCA5 em 8431 células. Produção da proteína lebercilina de ~81kDA prevista após infecção com

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AAV7m8.CBA.hopt.LCA5 demonstra uma resposta dose-dependente. Exemplo 2: Estudos com Camundongo Lca5-/- de Modelo de Camundongo com LCA [00146] O desenvolvimento de uma prova de conceito de terapia de aumento de genes no modelo de camundongo Lca5gt/gt implica vários desafios: 1) porque as alterações degenerativas da retina começam muito cedo e progridem rapidamente, a intervenção deve ser realizada em camundongos neonatais; 2) uma vez que esta é uma doença específica do fotorreceptor, os vetores de AAV recombinantes devem ser empregues de modo eficiente para os fotorreceptores alvo. O vetor de AAV2 amplamente utilizado em estudos em animais e humanos para atingir células de RPE não tem como alvo fotorreceptores tão eficientemente quanto outros serotipos de AAV, como mostrado por comparações de transdução de diferentes serotipos após infecção com doses equivalentes. Idealmente, devem ser desenvolvidas terapias que possam, em última instância, progredir para ensaios clínicos em humanos; e 3) devem ser desenvolvidas medidas de resultado que identifiquem e quantifiquem com precisão as melhorias na função retiniana e visual, que é tão baixa na linha de base que é difícil pontuar. Aqui foi utilizado um vetor de AAV recombinante (AAV7m8) projetado por evolução dirigida, para fornecer um cDNA codificando a lebercilina humana com códons otimizados. Usando AAV7m8 para distribuir LCA5 aos fotorreceptores doentes no início da vida, mostramos que a terapia de aumento de genes resulta tanto na melhora estrutural da retina de camundongo Lca5gt/gt quanto na melhora funcional de sua visão.

[00147] A lebercilina localiza-se conectando os cílios das células fotorreceptoras (22). O cílio de conexão é uma zona de transição entre o segmento interno do corpo da célula fotorreceptora e os segmentos externos antenas que suportam o transporte seletivo de proteínas e vesículas de membrana. O cílio de conexão é, portanto, o condutor

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69/105 que suporta o tráfego de proteína bidirecional ao longo dos trilhos de microtúbulos ciliares, ou transporte intraflagelar (IFT). Utilizando tanto proteômica de afinidade quantitativa (purificação de afinidade, espectrometria de massa e análise de bioinformática) quanto um modelo de camundongo geneticamente modificado, Boldt et al demonstraram que mutações em LCA5 interferem no IFT, (22) causando um defeito de início precoce no desenvolvimento do segmento externo de fotorreceptores e uma falha no tráfego correto de duas proteínas diferentes expressas especificamente em fotorreceptores, arrestina e opsina. O nocaute do gene Lca5 em camundongos resultou em um fenótipo de degeneração da retina. Os camundongos Lca5-/- desenvolvem fragmentos de retina despigmentada, nunca desenvolvem segmentos externos e não possuem respostas ERG de cone e bastonete à luz. Há uma degeneração da retina precoce e rapidamente progressiva e apenas uma fileira (adoentada) de núcleos está presente no ONL aos 2 meses de idade. (22) Assim, os camundongos Lca5-/- foram utilizados como modelo animal para LCA.

[00148] Camundongos adultos Lca5^gt/gt (Lca5-/-) foram adquiridos dos Jackson Labs (Bar Harbor, ME) e uma linhagem foi gerada por cruzamentos irmão-irmã. A verificação do genótipo de todos os animais utilizados no estudo foi realizada (ver Métodos Suplementares). Os camundongos ficaram em um ciclo escuro de 12 horas de luz/12 horas e a comida/água foi fornecida ad libitum. Os estudos foram realizados em conformidade com os regulamentos federais e institucionais. [00149] Injeções sub-retinianas foram realizadas unilateralmente em camundongos neonatais, como descrito anteriormente (28) em coortes de filhotes. Anestesia em camundongos no dia 5 pós-natal (PN5) em hipotermia. No dia 15 pós-natal (PN15), os animais foram anestesiados com cetamina/xilazina. A Tabela 1 mostra o número de animais utilizados por coorte.

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70/105 [00150] Injeções intravítreas de AAV7m8 também foram realizadas desde que se demonstrou que esse vetor penetrava previamente na retina do camundongo, desde o aspecto vítreo, para os fotorreceptores-alvo.(25) AAV7m8.CBA.hopt.LCA5 foi injetado em um total de 9,20 x 10⁹ vg em 1 μΙ na coorte 1 (Tabela 1). A solução de injeção continha 5% v/v de AAV7m8.CBA.EGFP para que a área de injeção pudesse ser identificada com certeza em pontos posteriores através da presença de proteína fluorescente verde potencializada (EGFP). Animais adicionais receberam injeção de placebo (coorte 2), receberam injeção de AAV7m8.CBA.EGFP apenas (coorte 3), ou foram mantidos não injetados como controles (coorte 4). Após a injeção, os filhotes foram devolvidos às mães até o momento do desmame.

Tabela 1· Coortes de camundonqos Lca5-/- neonatais injetados no dia pós-natal designado (PN) e estudados in vivo. ROA - via de administração

	PN5
Número do Grupo	Olho#1	Olho #2	Número do Animal
	Material de teste	ROA	Material de teste	ROA
1	excipiente	intravítreo	NA	simulado com placebo	5+4
2	excipiente	subretiniano	NA	simulado com placebo	7+4
3	AAV7m8.hopt.L CA5 (+ 5% de AAV7m8.GFP)	intravítreo	NA	simulado com placebo	10+8
4	AAV7m8.hopt.L CA5 + 5% AAV7m8.GFP)	subretiniano	NA	simulado com placebo	17+8

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	PN15
Número do Grupo	Olho#1	Olho #2	Número do Animal
	Material de teste	ROA	Material de teste	ROA
5	excipiente	intravítreo	NA	simulado com placebo	13
6	excipiente	subretiniano	NA	simulado com placebo	6
7	AAV7m8.hopt.L CA5 (+ 5% de AAV7m8.GFP)	intravítreo	NA	simulado com placebo	13
8	AAV7m8.hopt.L CA5 (+ 5% de AAV7m8.GFP)	subretiniano	NA	simulado com placebo	11

[00151] A oftalmoscopia foi realizada cerca de 1 mês após a injeção para verificar se os meios estavam limpos, as retinas não foram descoladas e, portanto, que não houve complicações cirúrgicas. Qualquer animal que tivesse opacidade córnea ou vítrea foi excluído do estudo.

[00152] Coortes de camundongos foram criadas e estudadas, e as injeções foram realizadas nos pontos temporais iniciais precoces pósnatais (PN5) e juvenis (PN15) (Tabela 1). As injeções foram encontradas em grande parte sem complicações. Após injeções em PN5, a maioria dos animais encontrava-se livre de opacidades da córnea ou vítreo que interferiríam nos testes posteriores. Os poucos animais com opacidades foram excluídos de análises posteriores.

[00153] O vírus AAV7m8.CpA.hopt-LCA5 foi capaz de conduzir a expressão eficiente do transgene de LCA5 humano na retina de camundongo (Figura 1A e 1B) após administração intravítrea (IVT) e subretiniana (SR) (Figuras 1C e 1D, respectivamente). A análise de transferência de Western blot mostra a produção da proteína LCA5 de ~81

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72/105 kDa prevista após distribuição intraocular com AAV7m8.CpA.hoptLCA5 em camundongos Lca5gt/gt e do tipo selvagem em PN20 (Figura 1B). A análise de imunofluorescência mostra a presença de proteína lebercilina no ONL, segmentos internos (IS) e cílios conectores (CC) na retina adulta do tipo selvagem (Figura 1E). Depois de injetar AAV7m8.CpA.hopt-LCA5 intravítrea ou sub-retiniana nas retinas Lca5gt/gt, a lebercilina é encontrada tanto em CC como em IS e ONL (Figura 1G e 1H). Em contraste, na retina Lca5gt/gt com injeção de placebo, não há lebercilina (Figura 1F). Além disso, após a injeção IVT, um número substancial de células Muller produzem lebercilina (Figura 1G).

Exemplo 3: Testes de função retiniana/visual [00154] Os testes de função visual e retiniana incluíram um labirinto de água com indicações luminosas (2-3 meses após a injeção), pupilometria (2,5 meses após a injeção), matriz de eletrodos múltiplos (3 meses após a injeções) e eletrorretinografia utilizando os camundongos indicados ou descritos no Exemplo 2. As retinas foram então avaliadas para histopatologia e imunofluorescência como descrito no Exemplo 4. Uma análise completa do tecido também foi seguida.

A. Eletrorretinografia [00155] Registramos ERGs de 8 camundongos Lca5gt/gt, 5 animais do tipo selvagem e 16 camundongos Lca5gt/gt cujos olhos esquerdos foram injetados com excipiente e os olhos direitos com AAV7m8. CpA.hopt-LCA5 em PN5 por via intravítrea. Nenhum dos olhos dos controles não injetados Lca5gt/gt ou olhos Lca5gt/gt injetados com excipiente (um total de 32 olhos) produziu respostas ERG detectáveis. Dos 16 olhos injetados com AAV7m8.CpA.hopt-LCA5, quatro mostraram respostas de ERG a flashes de luz fraca no estado escuro adaptado, consistentes com a mediação de bastonetes dos sinais, bem como respostas mistas de cone-bastonete a flashes mais intensos de

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73/105 luz que se assemelhavam a uma versão menor e dimensionada de formas de onda ERG bastonete-cone do tipo selvagem (WT) (Figura S2). ERGs adaptados à luz também foram detectados nesses olhos, sugerindo a mediação cônica das respostas fotópicas. ERGs detectáveis pós-tratamento variaram em amplitude de 20 a 25% das amplitudes de WT (Figura S2). Os resultados sugerem a restauração da função fotorreceptora de bastonete e do cone após a terapia gênica em alguns dos animais. A inconsistência dos achados de ERG em campo total provavelmente reflete cobertura incompleta da retina e/ou dano tecidual (catarata, descolamento não resolvido, etc.) mantidos após essas injeções sub-retinianas tecnicamente desafiadoras, realizadas no período pós-natal inicial. Os resultados, embora variáveis em magnitude ou infrequentes, foram dramaticamente diferentes dos ERGs indetectáveis observados em olhos não tratados de Lca5gt/gt. B. Estudo de navegação no labirinto aquático [00156] Testes de labirinto de água foram realizados para avaliar a capacidade de cada animal de identificar a câmara contendo uma plataforma submersa em um labirinto de água de 5 câmaras (FIG. 11). O aparelho foi mantido em uma sala sem luz externa e a fonte de luz foi colocada diretamente sobre a plataforma antes do teste. O camundongo adaptado ao escuro foi solto no centro do labirinto e dado 60 segundos, sem interrupção, para encontrar e colocar as quatro patas na plataforma iluminada.

[00157] O treino foi efetuado em luz ambiente (cerca de 200 Lux) antes do escurecimento, adaptando os camundongos e realizando o teste sob procedimentos de luz fraca. Durante o treinamento, se o camundongo não conseguiu encontrar a plataforma no final dos 60 segundos, o experimentador guiou o camundongo até a plataforma. Para cada tentativa, a luz e a plataforma foram colocadas em uma câmara diferente usando seleção aleatória.

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74/105 [00158] Os critérios de aprovação de treinamento foram definidos como a capacidade do camundongo de entrar independentemente na câmara correta, sem se desviar para uma câmara diferente, e montar a plataforma dentro de 60 segundos em mais de 5 dos 9 ensaios sequenciais. Todos os camundongos foram treinados por 5 dias, independentemente do dia em que os critérios de aprovação de treinamento foram atendidos. O teste foi realizado durante 4 dias, utilizando o mesmo procedimento utilizado no treinamento, mas com uma série de filtros para diminuir ainda mais a fonte de luz. Através do uso de filtros, as luminâncias foram: 1,06x10⁵, 8,69x10³, 5,87x10² scot cd m², ou, com a luz apagada, a luminância foi 0 scot cd m².

[00159] Os animais foram treinados e, em seguida, testados com o labirinto de água com pistas de luz aos 2-2,5 meses de idade. Os resultados do teste de labirinto de água com indicações luminosas mostraram que os grupos injetados com AAV7m8.CBA.hopt.LCA5 por via sub-retiniana ou intravítrea tiveram desempenho significativamente melhor que os controles. (Tabela 2B; ver os valores em NEGRITO; FIG. 3). A Tabela 2A mostra os dados brutos, que são números de animais analisados em cada coorte e depois testados sob os níveis de luz designados utilizando o labirinto aquático. A Tabela 2B mostra os resultados das análises estatísticas usando análise de variância unidirecional (ANOVA). Os animais tratados foram capazes de passar no teste a 8,69x10³ scot cd m², enquanto os animais da coorte injetada com excipiente de controle não foram (p<0,01).

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Tabela 2. Resultados do teste do labirinto aquático em camundonqos

Lca5-/-·

(A) Intervenção	n	Média (SD) para % de Aprovação
Nível de Luz (scot cd m2)
1,06x105	8,69x103	5,87x102	0
Excipiente (PBS) Intravítreo em PN5	5	53,3 (36,36)	31,1 (9,29)	31,1 (21,38)	13,3 (9,29)
Excipiente (PBS) Intravítreo em PN15	13	46,15 (17,5)	33,31 (17,57)	17,08 (9,74)	33,32 (13,64)
Excipiente (PBS) Sub-retiniano em PN5	7	73,0 (16,78)	34,9 (16,28)	22,2 (16,96)	14,3 (12,35)
AAV7m8-hoptLCA5 (+ 5% GFP) intravítreo em PN5	10	70,0 (17,43)	52,3 (13,93)	40,0 (21,09)	15,5 (13,03)
AAV7m8-hoptLCA5 (+ 5% GFP) intravítreo em PN15	13	53,85 (24,80)	28,19 (17,35)	18,78 (11,45)	27,75 (11,64)
AAV7m8-hoptLCA5 (+ 5% GFP) sub-retiniano em PN5	17	88,9 (16,2)	77,1 (15,9)	47,7 (23,8)	14,4 (8,6)

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(B)	Nível de Luz (scot cd m2)
1,06x105	8,69x103	5,87x102	0
Valor P para comparação por pares com grupo de controle PBSf
AAV7m8-hoptLCA5 intravítreo em PN5 vs. Excipiente intravítreo em PN5		0,24	0,01	0,46	0,74
AAV7m8-hoptLCA5 intravítreo em PN15 vs. Excipiente Intravítreo em PN15		0,37	0,46	0,69	0,48
AAV7m8-hoptLCA5 sub-retiniano em PN5 vs. Excipiente subretiniano em PN5		0,042	0,00001	0,018	0,981

C· Reflexo de Luz Pupilar [00160] As amplitudes de constrição pupilar foram medidas durante uma série de 10 flashes de luz por olho. A intensidade do flash foi de 1.000 scot lux. As PLRs foram definidas como tendo uma amplitude máxima de resposta de constrição da pupila dentro do intervalo de 0,6-

1,2 segundos após o flash que foi mais de 3 desvios padrão do diâmetro pré-estímulo. Um cientista mascarado para o paradigma de tratamento avaliou os dados de cada animal antes das análises para ter certeza de que cada pupila foi rastreada com precisão. Caso contrário, esse animal em particular foi excluído de análises posteriores.

[00161] Para análise estatística, os diâmetros de pupila normalizados dos olhos Lca5-/- tratados (direita) e de controle contralaterais

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77/105 com injeção de placebo (esquerda) foram comparados em cada intensidade de luz. Ao dividir a amplitude normalizada de constrição do olho tratado com a do olho não tratado, a porcentagem da Amplitude Diferencial Máxima de Resposta (MDAR) podería ser obtida. Maior porcentagem de MDAR indicou uma resposta mais forte à intervenção. Foram utilizados camundongos Lca5-/- e tipo selvagem (C57B1/6) não tratados, pareados por idade, como controles positivos e negativos, respectivamente. Os MDARs de camundongos Lca5-/- e C57B1/6 não tratados foram cerca de 0, uma vez que houve diferença mínima entre os dois olhos.

[00162] Análises adicionais avaliaram as magnitudes de amplitude de constrição pupilar no olho direito das diferentes coortes de camundongos. Assim, as amplitudes de constrição podem ser comparadas entre camundongos Lca5-/- tratados e não tratados e camundongos C57B1/6 não tratados.

[00163] Análises de amplitudes do reflexo de luz pupilar geradas pela estimulação dos olhos tratados versus controle revelaram uma melhora significativa (p<0,05) na amplitude do reflexo pupilar nos olhos de camundongos Lca5-/- que foram tratados por via subretiniana ou intravítrea com AAV7m8.hopt-LCA5 em comparação com animais Lca5-/- de controle não tratados (Figura 2). Houve melhora significativa do Reflexo de Luz Pupilar (PLR) em animais injetados em PN5 por qualquer via de distribuição (Figuras 2A, 2B, 2H e 2I) e em PN15 com distribuição sub-retiniana, embora também houvesse uma tendência à melhora com distribuição intravítrea (Figuras 2H e 2I).

D. Matriz de eletrodos múltiplos [00164] Realizou-se o teste de matriz de eletrodos múltiplos (MEA) em 5 animais 2,5-3,5 meses após terem recebido injeção intravítrea unilateral com AAV7m8.CMV/CBA.hopt.LCA5 (cerca de 9,87 x 10¹° vg/olho) fortificado com 5% (v/v) de AAV7m8.CBA.GFP. Olhos contra

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78/105 laterais foram injetados com placebo e usados como controles negativos. Cinco camundongos C57B1/6 de tipo selvagem (WT) pareados por idade não tratados serviram como controles positivos. Retinas de camundongos adaptados à luz foram dissecadas sob luz vermelha e montadas no lado da célula ganglionar para baixo na câmara MEA perfurada. A presença de GFP nos explantes confirmou a exposição dos fotorreceptores a AAV. Foram utilizados flashes de campo completo calibrados de luz a 455 nm (eficiência de excitação do pigmento a cerca de 40%: rodopsina e M-opsina; cerca de 0,2%: S-opsina) de diferentes intensidades para estimulação luminosa (flashes de 2 s a 0,1 Hz ou flashes de 50 ms a 4 Hz). Os dados foram analisados usando código personalizado em Matlab (MatLab, Natick, MA); a classificação de disparos neuronais (spike sorting) foi realizada no Plexon Offline Sorter (Plexon, Dallas, TX). AAV7m8.CpA.hopt-LCA5 em PN5 foram sondados usando análises de matriz de eletrodos múltiplos (MEA). A justificativa para o uso de MEA é que ele mede o sinal de saída da retina enviado ao cérebro e, assim, além de testar a função fotorreceptora, também fornece informações sobre a fiação da retina. Das cinco retinas/animais testadas com MEA, duas tinham ERGs de bastonete e cone claramente detectáveis (ver um registro representativo na Figura S2), uma tinha um ERG residual pequeno de ~10 nV e duas não tinham ERG detectável. Três de 5 retinas com AAV7m8.CBA.hopt.LCA5 tiveram respostas fortes à luz, uma apresentou respostas médias e 1 apresentou resposta mínima no teste MEA (FIG. 5A-D). As respostas tornaram-se detectáveis em intensidades escotópicas (42-112 fótons*s’¹*pm’² ou, em média, 8,28e1 hv/ pm²; 455 nm) e fortes respostas foram observadas através da intensidade fotópica mais brilhante de 2,00e9 fótons*s'¹*pmr². Presumindo que a área de coleta para bastonetes e cones para iluminação final esteja em torno de 1 pm2 no comprimento de onda do pico de sensibilidade 23, 24 (note-se que tan

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79/105 to nos experimentos de ERG quanto nos nossos de MEA, luz entra na retina do lado da célula ganglionar) e eficiência da estimulação por 455 nm de luz de rodopsina e de opsinas em cones M e S sendo em torno de 60%, 50% e 0,3% respectivamente, 25-27, a luz fraca que gera respostas claramente detectáveis em nossos experimentos deve produzir menos de 70 fotoisomerizações por segundo por célula em bastonetes, menos de 60 em cones M e cerca de 0,3 fotoisomerizações por segundo em cones S. Os dados do registro de pipeta de sucção mostram que a esta taxa de pigmento os bastonetes de excitação podem gerar respostas à luz detectáveis (amplitude de resposta acima de 20% do máximo), ao mesmo tempo espera-se que a resposta do cone seja pelo menos 20 vezes menor nas condições mais favoráveis (cones M adaptados ao escuro em retinas nocaute para bastonetetransducina) e deve ser indetectável na retina de camundongos dominada por bastonetes 25, 26, 28 (observe-se que a área de coleta para iluminação lateral em pipeta de sucção é de cerca de 0,5 μιτι-2 para bastonetes e 0,2 μιτι-2 para cones). Assim, a observação de respostas à luz no intervalo de intensidade de intensidade de luz nos experimentos prova a recuperação da função de bastonete nas retinas Lca5gt/gt tratadas. As respostas na extremidade mais brilhante das intensidades devem se originar dos cones (a intensidade mais brilhante deve ser mais do que capaz de acionar os cones M e S, produzindo em torno de 1,00e9 e 6,00e6 fotoisomerizações por segundo por célula nos cones M e S, respectivamente). Como esperado para as respostas acionadas por bastonete/cone, após a exposição à série de estimulação mais brilhante no final da série de intensidade de 1- execução (retinas sensíveis à luz foram submetidas de a pelo menos 2 séries de intensidades variando da escotópica fraca às intensidades fotópicas mais brilhantes em incrementos de ~0,5 log), as respostas escotópicas desapareceram, mas as respostas fotópicas não foram significativamente

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80/105 afetadas (Figuras 5C e D). As retinas Lca5gt/gt tratadas e WT e tratadas também foram responsivas à estimulação de cintilação de 4Hz nas intensidades que se esperavam acionar as respostas do cone (dados não mostrados). As retinas dos olhos contralaterais injetadas com placebo mostraram respostas de mínimas a abolidas com alta quantidade de disparos espontâneos e respostas proeminentes de melanopsina.

[00165] Respostas acionadas por melanopsina lenta também foram detectadas em ambos as retinas tratadas com AAV7m8.CpA.hoptLCA5 e retinas Lca5 gt/gt de camundongos do tipo selvagem (manifestando-se como taxa de disparo elevada no início do segundo flash devido à lenta recuperação após o 1^Q flash de uma série) da resposta de melanopsina parecem ser silenciadas em retinas tratadas em comparação com as não tratadas.

Tabela 3· Resumo das respostas MEA em camundongos Lca5-/- tratados e controle

tratamento/resultado	número de registros	comentários
retina Lca5-/- tratada /responsiva à luz	4	3 retinas com respostas quase indistinguíveis de WT, uma com respostas mais fracas, mas ainda proeminentes
retina Lca5-/- tratada /não responsiva à luz	2	uma com disparo espontâneo mais fraco
Lca5-/- não tratada (controle de retina esquerda) /não responsiva à luz	6	todas as retinas Lca5-/- responsivas (direita) têm controle correspondente do olho esquerdo
WT/responsiva à luz	5	intervalo de intensidade de 40 a 2e9 fótons por umA2 por segundo
Todas as retinas (exceto uma retina Lca5-/- tratada) demonstraram forte queima espontânea, quando testadas para respostas guiadas por melanopsina (intervalo interflash longo para permitir recuperação lenta). As retinas Lca5-/- não tratadas demonstraram fortes respostas acionadas pela melanopsina.

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81/105 [00166] Duas das retinas Lca5-/- tratadas apresentavam sinais de lesão pós-injeção e não apresentavam respostas leves, apesar de fortes disparos espontâneos.

[00167] Respostas das retinas tratadas com AAV7m8.CBA.hopt.LCA5 foram semelhantes às de retinas de tipo selvagem não tratadas. Uma retina tratada testada após o menor período pós-injeção demonstrou sensibilidade à luz reduzida e ausência de respostas OFF e sustentadas de ON (triângulos vermelhos para baixo na Figura 5D). O desenvolvimento das respostas OFF parece requerer um tempo mais longo após a injeção em comparação com as respostas ON, consistente com a variabilidade aumentada nas amplitudes da resposta OFF observadas para 10 das retinas tratadas. A função de todos os tipos de gânglio identificáveis nas retinas WT sob estimulação de campo completo foi detectada nas retinas tratadas com AAV de Lca5gt/gt após classificação de disparos neuronais (Figura S10). Respostas fortes foram observadas sob estimulação escotópica e fotópica, até as intensidades mais brilhantes (quase 100 mW/cm²). Como esperado para as respostas guiadas por bastonetes/cones, após a exposição à luz mais brilhante, as respostas escotópicas desapareceram, mas as respostas fotópicas não foram significativamente afetadas (dados não mostrados).

[00168] As respostas nas retinas tratadas com AAV7m8.hopt.LCA5 tornaram-se detectáveis em intensidades escotópicas (42-112 fótons*s-1*pm-2, ou em média, 8,28e1 hv/pm2; 455 nm) e fortes respostas foram observadas através da intensidade fotópica mais brilhante de 2,00e9 fótons*s-1*pm-2. Retinas de olhos contralaterais injetados com placebo mostraram respostas de mínimas a abolidas (Dados não mostrados. Lca5-/- de controle). As respostas nas retinas tratadas com AAV7m8.hopt.LCA5 foram semelhantes àquelas nas retinas de camundongos de tipo selvagem. Respostas de cintilação mostrando que

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82/105 após a exposição à luz mais brilhante (2E9 hv/cm2), as respostas fotópicas não foram significativamente afetadas (Dados não mostrados, tratado com Lca5-/-). Série de intensidades de resposta à cintilação (desde 3,53E2 - 1,52E6 hv/cm2 da retina tratada com AAV7m8.CBAhopt.LCA5 representativa mostrou que, à medida que a intensidade da luz aumenta, a amplitude da resposta aumenta. O teste das respostas de resistência do bastonete e do cone após os flashes mais brilhantes mostrou persistência da resposta de cone, semelhante à encontrada nas retinas do tipo selvagem. O teste de resposta à cintilação mostra respostas semelhantes nas retinas Lca5-/- tratadas em comparação com retinas de camundongos de tipo selvagem. A taxa de disparo dos bastonetes e cones nas retinas tratadas com Lca5-/- se aproxima à de retinas de tipo selvagem (em oposição às retinas Lca5/- não tratadas de controle) como uma função da intensidade da luz.

[00169] A cinética de resposta foi semelhante à das retinas WT (Dados não mostrados). A sensibilidade à luz foi ligeiramente menor em retinas Lca5-/- tratadas versus as retinas WT mais sensíveis, enquanto primeiras respostas foram detectadas em 8-21 fótons*s'¹*pm’² (Dados não mostrados). Todos os tipos de células ganglionares nas retinas WT sob estimulação de campo completo (tipos ON, OFF e ON/OFF) foram detectados nas retinas Lca5-/- tratadas após a classificação de disparos neuronais. Retinas WT e Lca5-/- tratadas foram responsivas à estimulação de oscilação de 4Hz a 3,53e2-2,00e9 fótons*s'¹*pm’² (Dados não mostrados). Todas as retinas Lca5-/- não tratadas mostraram respostas acionadas por melanopsina lentas a intensidades mais brilhantes que estavam ausentes nas retinas Lca5-/tratadas sensíveis à luz. Um resumo dos resultados é mostrado na Tabela 3.

[00170] Embora os resultados obtidos com eletrorretinografia e experimentos MEA tenham demonstrado a restauração da função de

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83/105 bastonetes e cones em pelo menos alguns animais, esses métodos eram inadequados para avaliação da eficiência de intervenção na maioria dos animais, já que apenas um quarto dos camundongos tratados produziu sinais de ERG úteis. Portanto, baseamos a avaliação da eficácia da intervenção em duas abordagens adicionais, análises dos reflexos de luz pupilar (PLR) e comportamento visual, que ofereceram, primeiro, maior sensibilidade que a eletrofisiologia e, segundo, prova de que tratamento da retina Lca5gt/gt com AAV7m8.CpA.hopt-LCA5 resulta em sinal induzido pela luz transmitido para além da retina, através de vias visuais para o cérebro.

[00171] Os reflexos de luz pupilar (PLR) são dependentes de retransmissão de sinais inicialmente de fotorreceptores para células ganglionares da retina, depois para o núcleo de Edinger-Westphal no cérebro e finalmente de volta para o músculo do esfíncter pupilar através do gânglio ciliar, que controla o diâmetro da íris. Análises de PLR após estimulação dos olhos tratados vs. controle revelaram um aumento significativo (p<0,05) da amplitude de PLR nos olhos de camundongos Lca5 gt/gt tratados com AAV7m8.CpA.hopt-LCA5 comparado aos controles com injeção de placebo (Figura 2C). Houve PLR significativamente melhorado detectado em animais injetados em PN5 tanto por via intravítrea quanto sub-retiniana (Figuras 2A-2B e 2E-2F), de tal forma que respostas do tipo quase selvagem foram observadas (Figura 2D). A melhoria estatisticamente significativa da amplitude do PLR também foi demonstrada através de comparações da amplitude diferencial máxima de resposta (MDAR; Figuras 2G-2I; Figura S1). Animais que recebem AAV7m8.CpA.hopt-LCA5, tanto pela administração IVT como pela SR, também demonstraram um PLR significativamente melhorado, quantificado por MDAR (Figuras 2H e 2I).

[00172] Como PLRs demonstram sinalização e função da retina, mas não fornecem informações sobre a visão formada, usamos um

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84/105 teste de labirinto de água com indicações luminosas para medir a visão funcional, conforme descrito acima. A maioria dos camundongos não tratados de tipo selvagem (com visão normal) foi capaz de navegar no labirinto aquático com sucesso em todos os níveis de luz, enquanto que os Lca5gt/gt não tratados estavam severamente incapacitados (Tabela 2, Figura 3A). Os resultados do teste do labirinto aquático mostraram que ambos os animais Lca5gt/gt injetados com AAV7m8.CpA.hopt-LCA5 IVT ou por via sub-retiniana tiveram um melhor desempenho do que os controles não injetados de uma maneira estatisticamente significativa sob pelo menos uma condição de luz. (Tabela 2; Figura 3). Os animais tratados por via sub-retiniana em PN5 mostraram uma taxa de aprovação significativamente melhor em todas as condições de teste de iluminação (1,06E+05, 8,69E+03 e 5,87E+02 scot cd m-2), do que na coorte de controle injetada com excipiente (p<0,01). Quando os animais foram injetados em PN15 (IVT ou SR), as melhorias foram mínimas (Figura 3). Para confirmar que os camundongos usavam apenas a indicação luminosa fornecida, o teste foi realizado sob nenhuma condição de luz (0,00 scot cd m2) e mais de 90% dos camundongos falharam no teste (incluindo camundongos com visão normal; Figura 3B).

Exemplo 4: Histoloqia Ocular, Histopatoloqia, Imunofluorescência e Ensaio TUNEL [00173] Resgate histológico de fotorreceptores Lca5gt/gt após tratamento com AAV7m8.CpA.hopt-LCA5 em PN5 foi avaliado através da avaliação de moléculas relevantes para o funcionamento adequado da cascata de fototransdução e através de medidas estruturais. Os animais descritos nos exemplos 2 e 3 foram submetidos à eutanásia aos 3 meses de idade. Os olhos foram enucleados e as seções da retina avaliadas por modificações dos métodos descritos por Boldt et al.(22) O tecido foi fixado com paraformaldeído a 4% em PBS e depois crio

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85/105 protegido em sacarose a 30%/PBS antes do congelamento e da geração de criossecções. A histopatologia foi analisada por exame de secções coradas com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Thermo Fisher Scientific, Filadélfia, PA) e/ou por coloração com hematoxilina e eosina. Para estudos de imunofluorescência, secções foram incubadas com antilebercilina (1:300, (12, 22) na presença de solução de bloqueio, lavadas e depois tratadas com anticorpos secundários conjugados com Cy3. Anticorpos adicionais utilizados foram antirrodopsina (1:500, Leico Technologies), opsina de cone antivermelho/verde (1:250, Chemicon), tubulina antiacetilada (1:1000, Sigma-Aldrich). Secções coradas foram cobertas com material de suporte Citifluor contendo DAPI (Electron Microscopy Services, Hatsfield, PA). A coloração TUNEL foi realizada utilizando um kit de ensaio de marcação de nickend dUTP (TUNEL) de desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) seguindo as recomendações do fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, CA). As secções foram avaliadas com um microscópio Zeiss Axio Imager M2 equipado com epifluorescência e software Axio-Vision 4.6 e com um microscópio confocal de varredura a laser (Olympus Fluoview 1000, Center Valley, PA, EUA). A microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi realizada em amostras de tecido designadas usando um FEI-Tecnai T12 S/TEM.

[00174] A análise de imunofluorescência dos olhos injetados com AAV7m8-hopt-LCA5 em PN5 e analisados em PN15 mostrou Lebercilina co-localizada com a base de segmentos externos positivos para tubulina. Após injeção intravítrea, a Lebercilina foi distribuída por toda a retina, que era quase desprovida de fotorreceptores em PN95. Em contraste, a Lebercilina estava ausente nas retinas Lca5-/- PN15 e PN95 não tratadas.

[00175] Secções retinianas tratadas e controladas com hematoxilina e eosina em PN40 vs. PN99 comparando os resultados após injeção

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86/105 intravítrea (IVT) ou sub-retiniana (SR) de AAV7m8.hopt-LCA5 (com 5% v/v AAV7m8.eGFP) foram comparadas com injeção de placebo. Micrografias de retina com hematoxilina e eosina (H&E) mostraram que os segmentos interno/externo (IS/OS) e ONL são preservados ao longo do período de 3 meses (PN99) após injeção IVT ou SR de AAV7m8.hopt-LCA5 (dados não mostrados). Em contraste, as retinas de controle com injeção de placebo não possuem essas camadas em PN99 (dados não mostrados). Além disso, a lebercilina foi detectada nas retinas de controle tratadas, mas não nas de controle com placebo (dados não mostrados). A expressão persistente de rodopsina em ONL também foi confirmada por análise de imunofluorescência (dados não mostrados), mas apenas observada em olhos tratados.

[00176] A espessura das camadas de células fotorreceptoras nas retinas que foram tratadas por injeção IVT ou SR com AAV7m8.CpA.hopt-LCA5 em PN5 foi significativamente maior do que nas retinas de controle (FIG. 4). Havia também uma borda perceptível na espessura entre as áreas das retinas expostas ou não expostas ao AAV nas retinas tratadas por injeção sub-retiniana (dados não mostrados). A preservação das camadas fotorreceptoras persistiu até o último momento (PN99). A espessura aumentada deveu-se a um aumento do número de fileiras na camada nuclear externa e à presença de segmentos interno e externo (FIG. 4). Consistente com isso, houve uma proporção muito maior de fotorreceptores que morrem no controle em comparação com as retinas tratadas com AAV.LCA5, conforme julgado pela marcação TUNEL, particularmente dentro do primeiro mês após a intervenção (dados não mostrados).

[00177] A avaliação de retinas de camundongo Lca5-/- injetadas em PN5 com AAV7m8.hLCA5 aos 1-3 meses após a injeção revela uma espessura aumentada da camada nuclear externa (FIG. 5A e FIG. 9). A análise de imunofluorescência revelou que a Lebercilina colocalizou

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87/105 com a base de segmentos externos positivos para a tubulina em retinas Lca57- tratadas com AAV7m8.hOP.LCA5 (FIG 1M). Havia numerosas células positivas para TUNEL no primeiro mês de vida nas retinas Lca5-/- não tratadas, mas significativamente menos nas retinas tratadas com AAV7m8.hOPT.LCA5 (FIGs 6B e 6C). O número de células positivas para TUNEL diminuiu quando os animais tinham 3 meses de idade (FIGs 6D e 6E). A maioria das células que degeneram na retina Lca5-/- não tratada ao longo do tempo nas retinas de controle (não tratadas) eram fotorreceptoras, como mostrado pelo fato de as células positivas para rodopsina terem sido encontradas apenas nas retinas tratadas com AAV (FIG 6B). A análise de imunofluorescência confirmou este resultado (ver ONL corado com DAPI azul) e mostrou aumento da rodopsina (coloração vermelha) persistindo ao longo do período de tempo de 3 meses (FIG 6D). Havia evidências de alterações mediadas pela luz na posição de moléculas específicas da fototransdução após injeção com AAV7m8.hopt.LCA5 (FIG 10).

[00178] A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de retinas tratadas com AAV7m8.hopt.LCA5 mostrou a elaboração de segmentos externos completos com discos de segmento externo empilhados, arranjos de microtúbulos de 9+0 típicos de cílios primários (FIG. 7B) e cílios conectores (FIG 7). Em contraste, as retinas Lca5-/- não tratadas não possuíam ambos os cílios conectores e segmentos externos. As retinas não tratadas carecem de segmentos externos e mostram degeneração maciça de fotorreceptores, com apenas núcleos picnóticos e remanescentes de organelas fotorreceptoras. Apenas corpos celulares fotorreceptores em degeneração e desorganizados estavam presentes nas retinas de controle sem tratamento ou com injeção de placebo.

[00179] A estimulação leve de retinas de Lca5gt/gt adultas adaptadas ao escuro tratadas em PN5 com AAV7m8.hopt-LCA5 resultou em

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88/105 padrões normais de translocação de proteínas de fototransdução em segmentos exteriores. Arrestina transloca-se adequadamente após exposição à luz nas retinas tratadas com AAV7m8.hopt-LCA5. Tal atividade não pode ser avaliada nas retinas de controle devido à degeneração do IS/OS. Os dados refletem a restauração do defeito de transporte intraflagelar na retina de camundongo após distribuição do cDNA de hl_CA5 do tipo selvagem (WT).

[00180] O desenvolvimento de uma prova de princípio de terapia de aumento de genes no modelo de camundongo Lca5-/- implica vários desafios: 1) porque as alterações degenerativas da retina progridem rapidamente e começam cedo durante a vida, a intervenção deve ser realizada em camundongos neonatais; 2) uma vez que esta é uma doença específica do fotorreceptor, os vetores de AAV recombinantes devem ser empregues de modo eficiente para os fotorreceptores alvos. O vetor de AAV2 que tem sido amplamente utilizado em estudos em animais e humanos para atingir células de RPE não se direciona aos fotorreceptores de forma tão eficiente quanto os outros AAVs.(23, 24). Idealmente, devem ser utilizados reagentes que possam ser utilizados em ensaios clínicos em humanos; e 3) devem ser desenvolvidas medidas de desfecho que reflitam melhorias na função retiniana e visual, níveis tão baixos na linha de base que são difíceis de medir. Aqui, um AAV recombinante projetado por evolução dirigida, AAV7m8.(25) foi utilizado para testar a eficácia após a entrega do cDNA que codifica Lebercilina humana nativa. Este vetor, foi demonstrado por outros, eficientemente se direciona a fotorreceptores após distribuição intravítrea.(25-27). Utilizando AAV7m8 para administrar o cDNA de hl_CA5 aos fotorreceptores doentes cedo na vida, a terapia de aumento de genes resultou na melhoria estrutural e funcional da retina de camundongo Lca5-/- e da visão.

[00181] Nos Exemplos 3 e 4, demonstrou-se que a terapia de au

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89/105 mento de genes mediada por AAV7m8 no camundongo Lca5-/- recuperou a função retiniana e visual e também a estrutura retiniana.

[00182] A eficácia relatada no presente exemplo incluiu a habilidade aprimorada deste modelo em navegar usando pistas visuais, restauração das respostas dos fotorreceptores em bastonete e cone, como mostrado por matriz de eletrodos múltiplos (MEA), uma redução na morte celular apoptótica (e, portanto, preservação de fotorreceptores), e presença de características biológicas e físicas celulares típicas de fotorreceptores em funcionamento normal, tais como presença de rodopsina na retina externa e desenvolvimento de segmentos externos aparentes, com discos de segmento externo empilhados. Os resultados de MEA mostraram que, dada injeção bem-sucedida e tempo pósinjeção suficiente para expressar a proteína transgênica e restaurar a função dos segmentos externos de bastonete/cone, a terapia gênica restaurou as células retinianas degeneradas para um estado quase indistinguível das condições de WT. Além disso, a distribuição de LCA5 de tipo selvagem protegido contra a degeneração de fotorreceptores. Enquanto a retina Lca5-/- não tratada foi reduzida a uma única fileira de fotorreceptores adoentados aos 3 meses de idade, as regiões tratadas com AAV tinham um núcleo externo mais espesso, mais tarde completo com segmentos interno e externo. Os ganhos persistiram por pelo menos 3 meses - um achado muito significativo, especialmente considerando que, nessa idade, não havia fotorreceptores remanescentes na retina de camundongo Lca5-/- não tratada. Os dados sugeriram que uma abordagem similar de aumento de genes em seres humanos, como a usada no camundongo Lca5-/-, podería resultar em melhora da visão.

Exemplo 5: Estudos Humanos: Teste de Reflexo da Luz Pupilar [00183] O teste foi realizado após a obtenção do consentimento informado por escrito em um protocolo aprovado por IRB (#815348). As

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90/105 respostas das pupilas foram registradas simultaneamente em ambos os olhos com um pupilômetro Procyon P3000 e o software PupilFit6 (Monmouthshire, Reino Unido). As respostas pupilares à luz foram registradas após a apresentação de estímulos de luz verde de 10 lux no olho direito por 0,2 segundos, seguidos por intervalos escuros. Uma câmera sensível a infravermelho que captura imagens de vídeo a 25 quadros por segundo, permitindo que o diâmetro da pupila de ambos os olhos seja medido a cada 40 ms.

[00184] O teste do reflexo de luz pupilar foi realizado para determinar se havia alguma evidência de função nos fotorreceptores residuais presentes em um adulto com mutações LCA5 homozigóticas. Como mostrado na FIG 8, os reflexos de luz pupilar estavam presentes neste indivíduo com a mesma sequência temporal que os de um indivíduo com visão normal. No entanto, as amplitudes de resposta diminuíram consideravelmente em comparação com o indivíduo com visão normal. Exemplo 6: Modelos de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas (iPSC) de LCA5 [00185] Para auxiliar na tradução dos estudos de resgate de camundongos para humanos, estudamos linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSC) que foram geradas para o estudo de indivíduos com visão normal e aqueles afetados com LCA devido a mutações de LCA5. Recentemente, demonstrou-se que o epitélio pigmentado da retina (RPE) derivado de iPSC recapitula o fenótipo funcional do epitélio polarizado, com secreção, expressão gênica e características de maturação comparadas aos RPEs fetal e adulto 29. Essas células são promissoras para o entendimento dos mecanismos de doença associados a defeitos em biologia ciliar 30, 31. Aqui, nós diferenciamos iPSCs em células RPE (Figura 12A), um processo que permitiu a avaliação de células ciliadas em um período de tempo mais curto e mais eficientemente do que se células neuro

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91/105 nais/fotorreceptoras tivessem sido geradas (Figura S12). Avaliamos a expressão do gene LCA5 e mostra que o mRNA do LCA5 é expresso em RPEs derivados de iPSC não afetados e o nível de expressão de LCA5 em RPEs de pacientes com LCA é significativamente reduzido em comparação aos controles (Figura 12B). Quando a distribuição ciliar foi medida, havia significativamente menos cílios presentes em iPSC-RPE, derivados do paciente com LCA5, do que nos RPEs do indivíduo com visão normal (Figura 12D-E). O tratamento do LCA5iPSC-RPE com AAV7m8.hopt-LCA5 levou à produção de proteína lebercilina (Figura 12C) e resultou em números ciliares comparáveis nas células tratadas com AAV7m8. LCA5 e células de RPE individuais de visão normal (Figuras 12D-F).

[00186] Monócitos do sangue periférico (PBMCs) foram coletados após o consentimento informado assinado (protocolo aprovado por IRB #808828) de dois probandos diferentes com mutações de LCA5. Um probando, JB605, era um heterozigoto composto para LCA5 Gln279Stop CAG>TAG het e Lys172del4ctcAAAG het; o outro, JB590, era homozigótico para LCA5 c.835C>T p.Q279X. As células de tipo selvagem eram de PBWT4.6 individuais. Linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas foram geradas a partir de cada um dos três indivíduos. As PBMCs foram cultivadas em meio de expansão consistindo em meio QBSF-60 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com citocinas e hormona. A mídia foi reabastecida a cada 2-3 dias por um período de 7-9 dias até que as células entrassem em um estágio de crescimento exponencial.

[00187] Para reprogramação, as PBMC expandidas foram transduzidas com o lentivírus rTTA e o cassete de células-tronco indutíveis por doxiciclina no vetor de lentivírus que distribui o cDNA de OCT4, KLF4, SOX2 e cMyc e cluster de microRNA 302/367 conduzido pelo promotor TetO/CMV. As células foram cultivadas em meio de expan

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92/105 são suplementado com polibreno (5 pg/ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As células foram incubadas durante 20-24 h a 370. As células infectadas foram então lavadas e colocadas em meio de expansão suplementado com 1 pg/ml de doxiciclina (DOX). Após 48 h, as células foram ressuspensas em meio de Dolbecco modificado por Iscove (IMDM) com 10% de soro bovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina, L-glutamina, beta-mercaptoetanol, aminoácidos não essenciais, 4 ng/ml de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), e 1 pg/ml de DOX (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram então transferidos para placas de fibroblastos embrionários de camundongos revestidos com matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) (placas MEF). As células permaneceram neste meio durante 10 dias, depois foram transferidas para meios de células-tronco embrionárias humanas (hESC) (DMEM/F12, 20% de substituição de soro de nocaute, aminoácidos não essenciais, 4 ng/ml de bFGF, 0,001% de beta-mercaptoetanol, penicilina/estreptomicina, L-glutamina e 1 pg/mL de DOX (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após 4 semanas, as colônias semelhantes a iPSC foram escolhidas manualmente e expandidas em placas MEF revestidas com Matrigel durante 6 passagens, depois transicionadas para placas MEF revestidas com gelatina a 0,1% durante um mínimo de 15 passagens. A caracterização de iPSCs foi baseada na expressão do antigeno de superfície medida por citometria de fluxo utilizando anticorpos contra SSEA3+, SSEA4+, TRA-1-60 e TRA-1-81 (Biolegend, San Diego, CA) e RT-qPCR incluindo marcadores de expressão de pluripotência: DMNT3B, ABCG2, REX1, OCT4, SOX2, NANOG, cMYC, KLF4. A cariotipagem de iPSCs foi realizada pela bandagem G para produzir um cariótipo visível. A capacidade das células de se diferenciarem em múltiplas linhagens diferentes foi levada a cabo usando um ensaio de PCR em camada germinativa (Qiagen. Germantown, MD, EUA).

[00188] As iPSCs caracterizadas foram diferenciadas em RPE pela

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93/105 ativação da via de sinalização de Wnt, inibição da via de sinalização do fator de crescimento de fibroblastos e inibição da via de sinalização de proteína quinase contendo espiral enrolada associada a Rho. Células pigmentadas expandidas foram purificadas por adesão de placas em lâminas de 8 câmaras na matriz de geltrex. Células enriquecidas foram cultivadas até desenvolverem uma aparência de paralelepípedos com formato cuboide. As características do iPS-RPE foram confirmadas por expressão gênica, imunocitoquímica e microscopia. Comprimentos ciliares foram medidos após a fixação e coloração para ARL13B e pericentrina. Os comprimentos dos cílios foram medidos em três dimensões usando um software personalizado projetado pela Wistar Imaging Facility (Instituto Wistar, Filadélfia, PA) [00189] Os cílios são avaliados nas linhagens de células LCA5 iPSC-RPE e de controle quanto à densidade e comprimento. Há significativamente menos cílios presentes nas células do RPE, derivados dos dois pacientes com LCA5, do que na linhagem celular do tipo selvagem. Além disso, os cílios nas linhagens derivadas de LCA5 são significativamente mais curtos do que aqueles nas células de tipo selvagem.

[00190] Foi observado anteriormente que pacientes com LCA5 podem reter fotorreceptores, incluindo na camada nuclear externa da camada foveal, por até 3 décadas.(21,29). Uma vez que a terapia gênica bem-sucedida requer que as células estejam presentes (mesmo se estiverem adoentadas), os fotorreceptores LCA5 podem ser receptivos ao tratamento. O facto de os presentes exemplos terem demonstrado que os fotorreceptores retidos em um adulto com LCA5 apresentaram um padrão temporal semelhante de capacidade de resposta à luz (embora de amplitude reduzida), como fotorreceptores de um indivíduo com visão normal é encorajador. Esses resultados reforçaram ainda mais o fato de que os fotorreceptores residuais nestas retinas

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94/105 anormais eram viáveis, apesar de seus déficits estruturais e funcionais. Além disso, os cílios das células iPSC-RPE derivadas de pacientes com LCA foram significativamente mais curtos do que aqueles das células de controle de tipo selvagem. O fato de que o defeito ciliar nos fotorreceptores no camundongo Lca5-/- poderia estar corrigido pela terapia de aumento de genes, sugeriu que poderia amenizar o defeito ciliar presente em humanos com essa condição. Estudos com o objetivo de corrigir o defeito ciliar in vitro em células RPE derivadas de iPSC estão atualmente em andamento.

[00191] A terapia de aumento de genes em seres humanos com LCA5 está sendo investigada para testar sua segurança e eficácia. Além da necessidade de desenvolver medidas de resultado adequadas para essa grave condição de cegueira, a aplicação instantânea forneceu soluções para vários problemas no planejamento de testes clínicos em seres humanos, incluindo o desenvolvimento de restrições para a obtenção de resgate. No camundongo Lca5-/-, os exemplos demonstraram salvamento em camundongos neonatais (PN5) e juvenis (PN15). Não foi observada uma intervenção em fases posteriores da doença devido à perda precoce de fotorreceptores neste modelo de camundongo. As anormalidades do desenvolvimento no modelo do camundongo (coincidindo com a degeneração dos fotorreceptores) sugeriram que havia componentes do desenvolvimento da doença. Provavelmente havia componentes de desenvolvimento na condição humana também. Como mencionado acima, em humanos com LCA5, há evidências de persistência de alguns fotorreceptores maculares, mesmo em adultos.(21) A pesquisa está sendo realizada para determinar como melhorar a função desses fotorreceptores, bem como para determinar se as vias visuais podem ser ressuscitadas em humanos com LCA5 com base no fato de que houve sucesso na ressuscitação da visão cortical em humanos inscritos na terapia genética da RPE65

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95/105 ensaios, mesmo depois de sofrer por décadas com visão limitada.(4, 30, 31)

Exemplo 7: Genotipagem do Camundongo Lca5-/[00192] O DNA genômico foi amplificado por PCR utilizando os seguintes oligos: LCA-13F6 (comum F) GCCTGTTCCTGCTTGCTTAC (incluído como SEQ ID NO: 13); LCA-13R2 (WT reverso) TGCTTTCCAAAGTAAGCACAAA (incluído como SEQ ID NO: 14) [00193] en2.8r (mutante reverse) CCTGGCCTCCAGACAAGTAG (incluído como SEQ ID NO: 15). A PCR foi realizada durante 35 ciclos com uma temperatura de anelamento de 50G e uma eta pa de extensão a 72G. Os produtos previstos são 353 bp (tipo selvagem) e 439 bp (Lca5-/-).

Exemplo 8: Injeção intravítrea de AAV7m8.hl CA5 restaura a função fotorreceptora em camundongos Lca5-/- para níveis guase WT [00194] A perda precoce da visão resulta de mutações no LCA5, um gene que codifica a Lebercilina, uma proteína crítica para a saúde e a função dos fotorreceptores. Como pode haver preservação relativa de fotorreceptores, a doença de LCA5 pode ser passível de terapia de aumento de genes. A possibilidade de que a terapia de aumento de genes usando distribuição intravítrea de AAV7m8.CMV/CBA.hLCA5 restaura a função fotorreceptora e retiniana usando a matriz de eletrodos múltiplos (MEA) em um modelo de camundongo Lca5 (Lca5-/-).

[00195] No dia 5 pós-natal, camundongos Lca5-/- foram injetados por via intravítrea com AAV7m8.CMV/CBA.hLCA5 (aproximadamente 9,87 x 10¹⁰ vg/olho) misturado com 5% (v/v) de AAV7m8.CBA.GFP. Olhos contralaterais não foram injetados e usados como controle negativo. 3 meses após a intervenção e sob condições adaptadas à luz, as retinas Lca5-/- foram dissecadas sob luz vermelha e montadas no lado da célula ganglionar para baixo na câmara MEA perfurada. O mesmo procedimento de dissecação e preparação foi feito para ca

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96/105 mundongos do tipo selvagem não tratados pareados por idade (C57B1/6) como controle positivo. A presença de GFP confirmou a exposição de fotorreceptores ao AAV. Foram utilizados flashes de campo completo calibrados de luz a 455 nm nos intervalos de intensidade escotópica e fotópica (flashes de 10 2 s a 0,1 Hz ou flashes de 400 50 ms a 4 Hz) para estimulação luminosa (foi utilizada luz azul para maximizar as hipóteses de detecção de resposta por segmentação tanto para os cones M como para os cones S, a eficiência da excitação do cone M e S deve ser de aproximadamente 40% e 0,2% correspondentemente). Os dados foram analisados por meio de código customizado no Matlab, classificação de disparos neuronais foi realizada usando Pllexon Offline Sorting.

[00196] Após três meses, entre os olhos com retina intata, 3 de 5 demonstraram respostas fortes à luz, 1 apresentou respostas medianas e 1 apresentou respostas mínimas quando testado usando gravação de MEA. Em 3 retinas com respostas fortes, as respostas à luz tornam-se detectáveis no intervalo escotópico (de 42 a 112 fótons x s^-1 x μιττ²) e respostas fortes foram observadas até as intensidades fotópicas mais brilhantes de 2,00 x 10⁹ fótons x s^-1 x μιττ². Enquanto isso, as retinas do olho contralateral não injetado mostraram respostas de mínimas a abolidas. Como esperado para respostas acionadas por bastonete/cone, após exposições à série de estimulação mais brilhante, as respostas escotópicas desapareceram, mas as respostas no intervalo fotópica não foram significativamente afetadas. A cinética de resposta e a sensibilidade foram muito semelhantes às observadas nas 5 retinas WT testadas sob um protocolo idêntico (a sensibilidade das retinas tratadas é um pouco menor em comparação com as retinas WT mais sensíveis para as quais os flashes mais fracos que produzem respostas acionadas por bastonete estavam no intervalo de 821 fótons x s'¹ x μιττ²). Uma das retinas tratadas testadas dois meses

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97/105 após a injeção demonstrou menor sensibilidade à luz (respostas iniciadas na intensidade fotópica de 1,52 x 10⁴ fótons x s^-1 x μην²) e as respostas desapareceram principalmente após as exposições mais brilhantes. Isto pode indicar que são necessários 3 meses para expressão suficiente da proteína alvo e geração de segmentos exteriores de bastonete/cone funcionais. Todos os tipos de células ganglionares nas retinas WT sob estimulação de campo completo (tipos ON, OFF e ON/OFF) foram detectados nas retinas Lca5-/- tratadas após a classificação de disparos neuronais. Assim como as retinas WT, as retinas Lca5-/- tratadas foram responsivas à estimulação de cintilação de 4Hz no intervalo de intensidade de 3,53 x 10²-2,00 x 10⁹ fótons x s^-1 x μιττ². Apenas uma das 7 retinas Lca5-/- não tratadas de controle demonstrou respostas à luz muito fracas aos estímulos fotópicos brilhantes, provavelmente indicativos da função de cone remanescente. Todas as retinas Lca5-/- não tratadas mostraram respostas acionadas por melanopsina lentas a intensidades mais brilhantes que estavam ausentes nas retinas Lca5-/- tratadas sensíveis à luz.

[00197] Duas das retinas Lca5-/- tratadas apresentavam sinais de lesão pós-injeção e não apresentavam respostas leves, apesar de fortes disparos espontâneos. Uma retina tratada não mostrou sinais óbvios de lesão pós-injeção, mas demonstrou apenas respostas à luz muito fracas no final mais brilhante das intensidades de estimulação (8,07 x 10⁸ fótons x s^-1 x μιττ² e acima), o que pode ser indicativo da baixa expressão da proteína alvo e/ou a fraca função remanescente do cone.

[00198] Dados injeção bem-sucedida e tempo pós-injeção suficiente para expressar a proteína alvo e restaurar a função dos segmentos externos de bastonete/cone, a terapia gênica restaurou as células retinianas degeneradas para um estado quase indistinguível das condições de WT.

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98/105 [00199] Em resumo, a LCA em si é uma das mais severas doenças degenerativas da retina, e a LCA5 é um dos subtipos mais graves dentro desta categoria. Muitas vezes, os pacientes com LCA5 desfrutam apenas de percepção de luz no início da vida, e é difícil até mesmo realizar estudos estruturais e testes especializados de função visual nesses indivíduos com visão ultrabaixa devido ao nistagmo. Assim, esta doença é considerada difícil de abordar. No entanto, o fenótipo do camundongo Lca5-/- reflete muitos dos achados clínicos em humanos com mutações em LCA5. Os dados de resgate no camundongo Lca5/- fornecem a esperança de que uma abordagem semelhante de aumento de genes em humanos podería resultar em melhor visão. Paralelamente aos estudos pré-clínicos conducentes a um ensaio clínico em humanos, é importante desenvolver a metodologia com a qual medir com precisão a estrutura e função da retina LCA5, para que os efeitos da terapia gênica em um ensaio clínico possam ser capturados de forma fiável e precisa. Esses estudos e um ensaio clínico de terapia gênica não apenas conduziríam a um tratamento para essa condição devastadora, mas também poderíam fornecer a estrutura para medir os efeitos da intervenção em outras condições severas de início precoce de cegueira.

Exemplo 9: Análise Preliminar da Doença de LCA5 em Humanos [00200] O teste do reflexo de luz pupilar (PLR) foi realizado para determinar se havia alguma evidência de função nos fotorreceptores residuais presentes em um humano adulto com mutações LCA5 homozigóticas. Como mostrado na Figura S11, os PLRs estavam presentes neste indivíduo com a mesma sequência temporal que as de um indivíduo com visão normal. No entanto, as amplitudes de resposta diminuíram consideravelmente em comparação com o indivíduo com visão normal.

Exemplo 10: Perda de Lebercilina causa desrequlacão da maturação

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99/105 do RPE e função ciliar em modelos celulares e animais [00201] As alterações patológicas que ocorreram no sistema visual em Amaurose Congênita de Leber 5 (LCA5), uma doença causada pela perda da expressão do gene LCA5 codificador da Lebercilina, foram exploradas. Estudos anteriores elucidaram o efeito prejudicial da deficiência de Lebercilina na neurorretinina e, especificamente, nos fotorreceptores. Este estudo teve como objetivo elucidar os mecanismos patogênicos que levam a LCA5, concentrando-se na contribuição da expressão normal de LCA5 para o desenvolvimento e função do epitélio pigmentado da retina (RPE).

[00202] Dois paradigmas experimentais independentes foram implementados: um utilizou a geração de células RPE a partir de célulastronco pluripotentes induzidas (iPSCs) de indivíduos com visão normal e com LCA5. A morfologia celular de RPE, a pigmentação, os marcadores específicos das células e as características dos cílios primários foram medidos. A segunda abordagem avaliou estudos das retinas de camundongos de tipo selvagem comparados com aqueles de um modelo murino para deficiência de LCA5 (camundongos LCA5 gt/gt). Os padrões de diferenciação espaço-temporal foram caracterizados para delinear as alterações degenerativas versus desenvolvimento ocorridos no sistema visual causadas pela falta de proteína LCA5.

[00203] Os resultados demonstram que a deficiência de LCA5 em modelos de células no RPE humano e RPE de camundongos vivos provoca profundas alterações no desenvolvimento dessas células. Através da análise da expressão gênica, identificamos a desregulação das principais proteínas responsáveis pela ciliogênese e transporte intraflagelar, pigmentação e via de sinalização de WNT. A imunocoloração também identificou diferenças na barreira epitelial consistentes com a maturação alterada devido à perda da função da proteína LCA5. [00204] Este trabalho revela o efeito deletério da supressão de

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LCA5 no RPE por meio da alteração de processos como a pigmentação, potencialmente devido à inibição do tráfego intracelular ou indiretamente por retardar a progressão da maturação dessas células. Neste estudo, apresentamos o potencial papel primário das células de RPE na patologia da retina tradicionalmente atribuída ao mau funcionamento dos fotorreceptores.

[00205] Todas as patentes, publicações de patentes e outras publicações citadas nesta especificação são incorporadas neste documento por referência, bem como os pedidos de prioridade, Pedido de Patente Provisório US N^Q 62/465,649, depositado em 1 de março de 2017, e Pedido de Patente Provisório N^Q US 62/469,642, depositado em 10 de março de 2017. Da mesma forma, as SEQ ID NOs as quais se refere neste documento e que aparecem na listagem de sequências anexa são incorporadas por referência. Embora a invenção tenha sido descrita com referência a modalidades particulares, será apreciado que modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção. Tais modificações se destinam a permanecer dentro do escopo das reivindicações anexas.

(Listagem de Sequência em Texto Livre) [00206] As seguintes informações são fornecidas para sequências que contêm texto livre sob o identificador numérico <223>.

SEQ ID NO: (contendo texto livre)	Texto Livre sob <223>
3	<223> sequência construída
8	<223> sequência construída
9	<223> sequência construída
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Claims (25)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Sequência de ácido nucleico manipulada com códons otimizados da SEQ ID NO: 3, caracterizada pelo fato de que codifica a Lebercilina humana.
2. 2. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico com códons otimizados, SEQ ID NO: 3, que codifica a Lebercilina humana.
3. 3. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV) caracterizado pelo fato de que o referido rAAV compreende um capsídeo de AAV e um genoma do vetor empacotado nele, com o referido genoma do vetor compreendendo:

   (a) uma sequência de repetição de terminal invertida (ITR) 5' de AAV;

   (b) um promotor;

   (c) uma sequência codificante que codifica uma Lebercilina humana;

   (d) uma 3' ITR de AAV.
4. 4. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência codificante de (c) é uma LCA5 humana com códons otimizados, que é pelo menos 70% idêntica à sequência codificante de Lebercilina humana nativa da SEQ ID NO: 2.
5. 5. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a sequência codificante de (c) é a SEQ ID NO: 3.
6. 6. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o capsídeo de rAAV é um AAV7m8 ou uma variante deste, um capsídeo de AAV8, um capsídeo de AAV6 ou uma variante deste, um capsídeo de AAV9 ou uma variante deste, um capsídeo de AAV7, ou

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   2/4 uma variante deste, um capsídeo de AAV5, ou uma variante deste, um capsídeo de AAV2 ou uma variante deste, um capsídeo de AAV 1 ou uma variante deste, um capsídeo de AAV3 ou uma variante deste, ou um capsídeo de AAV4 ou uma variante deste.
7. 7. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMV) ou um promotor híbrido que compreende uma sequência promotora de CMV e uma sequência promotora de beta-actina de galinha (CBA).
8. 8. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de que a 5' ITR de AAV e/ou a 3' ITR de AAV é de AAV2.
9. 9. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizado pelo fato de que o genoma do vetor compreende ainda um poliA.
10. 10. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um íntron.
11. 11. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um potenciador.
12. 12. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o rAAV, como definido nas reivindicações 3 a 11, e um carreador ou excipiente farmacêutico aceitável adequado para distribuição aos olhos.
13. 13. Suspensão aquosa adequada para administração a um paciente com LCA, com a referida suspensão caracterizada pelo fato de que compreende um líquido em suspensão aquosa e cerca de 1 x1O¹⁰ de partículas virais a cerca de 1 x10¹² GC ou partículas virais por olho de um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) útil como

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    3/4 um terapêutico para LCA, com o referido rAAV tendo um capsídeo de AAV, e tendo empacotado nele um genoma do vetor compreendendo:

    (a) uma sequência de repetição de terminal invertida (ITR) 5' de AAV;

    (b) um promotor;

    (c) uma sequência codificante que codifica uma Lebercilina humana; e (d) uma 3' ITR de AAV.
14. 14. Suspensão, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a suspensão é adequada para injeção subretiniana ou intravítrea.
15. 15. Suspensão, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que o promotor é a SEQ ID NO: 10 e a sequência codificante que codifica é a SED ID NO: 3.
16. 16. Suspensão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada pelo fato de que o capsídeo do rAAV é um capsídeo de AAV7m8.
17. 17. Suspensão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda o éxonl de CBA e o intron do nt 824 ao nt 1795 da SEQ ID NO:8.
18. 18. Uso do rAAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 11, da composição, de acordo com a reivindicação 12, ou da suspensão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 18, caracterizado pelo fato de que é para tratamento de um sujeito com LCA.
19. 19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o rAAV é distribuído em cerca de 1 x 10⁹ a cerca de 1 x 10¹³ genomas do vetor por olho (vg/olho) em uma suspensão aquosa.
20. 20. Uso, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracte

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    4/4 rizado pelo fato de que o rAAV é administrado por via sub-retiniana ou intravítrea.
21. 21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que o referido rAAV é administrado em uma dosagem de 1 x 10⁹ a 1 x 10¹³ rAAV em um volume compreendendo cerca de ou pelo menos 150 microlitros, reparando, desse modo, a função visual no referido sujeito.
22. 22. Método de tratamento de um sujeito com LCA caracterizado pelo fato de que se utiliza do rAAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 11, da composição, como definida na reivindicação 12, ou da suspensão, como definida em qualquer uma das reivindicações 13 a 18.
23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o rAAV é distribuído em cerca de 1 x 10⁹ a cerca de 1 x 10¹³ genomas do vetor por olho (vg/olho) em uma suspensão aquosa.
24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o rAAV é administrado por via subretiniana ou intravítrea.
25. 25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que o referido rAAV é administrado em uma dosagem de 1 x 10⁹ a 1 x 10¹³ rAAV em um volume compreendendo cerca de ou pelo menos 150 microlitros, reparando, desse modo, a função visual no referido sujeito.