KR20220083714A - 니만-피크 질환 c형의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 벡터 - Google Patents

니만-피크 질환 c형의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 벡터 Download PDF

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가렛 베리
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Abstract

NPC1을 치료, 예방 및/또는 치유하기 위한 유전자 요법 조성물 및 방법이 본 발명에 제공된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 NPC1을 치료, 예방 및/또는 치유하기 위한 핵산 및 핵산(AAV 전달 카세트 포함)의 전달을 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다.

Description

니만-피크 질환 C형의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 벡터
본 출원은 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 재조합 AAV 벡터는 형질도입 효율을 감소시키지 않고 중화 항체를 회피한다.
니만-피크(Niemann-Pick) 질환, C1형(NPC1)은 엔도리소좀 구획에 콜레스테롤 축적을 특징으로 하는 신경퇴행성 장애이다. 이는 세포 내 콜레스테롤 수송을 매개하는 엔도리소좀 단백질인 NPC1을 암호화하는 유전자의 돌연변이에 의해 발생한다.
NPC1은 유아, 어린이 또는 성인에게 나타날 수 있다. 신생아는 간 침윤으로 인한 복수 및 중증 간 질환 및/또는 폐 침윤으로 인한 호흡 부전을 나타낼 수 있다. 간이나 폐 질환이 없는 다른 영아는 근육긴장저하와 발달 지연이 있다. 고전적인 표현은 운동 실조, 수직 핵상 주시 마비(VSGP) 및 치매의 교활한 발병과 함께 아동기 중후반에 발생한다. 근긴장이상과 발작이 흔하다. 구음 곤란과 연하 곤란은 결국 무력화되어, 경구 수유가 불가능하게 되며; 사망은 일반적으로 흡인성 폐렴으로 20대 또는 30대 후반에 발생한다. 성인은 치매나 정신과적 증상을 보일 가능성이 더 크다.
2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린(HPBCD)은 콜레스테롤과 지질 축적을 감소시키고 NPC1 동물 모델에서 생존을 연장하는 것으로 나타났다. 그러나, 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 NPC1에 대한 치료법은 없다. 따라서, NPC1을 치료, 경화 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법이 시급히 필요하다.
NPC1을 치료, 예방 및/또는 치유하기 위한 유전자 요법 조성물 및 방법이 본 발명서에 제공된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 NPC1을 치료, 예방 및/또는 치유하기 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 핵산(AAV 전달 카세트를 포함하는 핵산 포함)을 제공한다.
일부 실시태양에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 (i) SEQ ID NO: 180의 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하며; 여기서 핵산은 전달 카세트를 포함하고; 여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 (i) SEQ ID NO: 180의 서열, 또는 SEQ ID NO: 180에 대해 약 1 내지 약 25개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하고; 여기서 핵산은 전달 카세트를 포함하고; 여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, 전달 카세트는 인트론 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 프로모터와 이식유전자 사이에 위치할 수 있다.
일부 실시태양에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 3' ITR은 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 프로모터는 CBA 프로모터이다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 SEQ ID NO: 3005의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질이다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 3001의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 3002의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 3012의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 전달 카세트는 인핸서를 포함한다.
일부 실시태양에서, 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3014의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3015-3019 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
본 발명의 AAV 벡터를 포함하는 조성물이 또한 본 발명에 제공된다. 본 발명의 AAV 벡터를 포함하는 세포가 또한 본 발명에 제공된다.
본 발명의 유효량의 AAV 벡터, 핵산, 조성물, 또는 세포를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법이 또한 본 발명에서 제공된다. 일부 실시태양에서, 대상은 니만-피크 질환 유형 C를 갖는다. 일부 실시태양에서, 대상은 인간 대상이다
이들 및 다른 실시태양은 아래에서 보다 상세하게 기술된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1a-1c. 버블 플롯은 새로운 항원 발자국의 라이브러리 다양성, 유도 진화 및 농축에 대한 분석을 보여준다. Illumina MiSeq 플랫폼을 사용하여 진화의 첫 번째 라운드(도 1b) 및 두 번째 라운드(도 1c)의 상위 라이브러리(도 1a) 및 진화된 라이브러리에 고 처리량 시퀀싱을 적용하였다. 맞춤형 Perl 스크립트로 분석한 후, 풍부한 아미노산 서열이 그려졌다. 각 버블은 각 라이브러리의 해당 변이체에 대한 판독 수에 비례하는 버블 반경을 갖는 별개의 캡시드 단백질 서브유닛 아미노산 서열을 나타낸다. y축은 시퀀싱 실행에서 전체 판독의 백분율을 나타낸다. 데이터는 용이한 시각화를 위해 x축을 따라 분산된다. 고유한 클론의 감소율(96.5%)은 첫 번째 및 두 번째 진화 라운드 후에 수많은 "부적합한" 서열이 제거되었음을 직접적으로 보여준다. 추가 분석을 위해 우세한 분리주를 선택하였다.
도. 2. 야생형 AAV9와 비교하여 캡시드 단백질 서브유닛 변이체 STRD.101 및 STRD.102를 포함하는 단백질 캡시드를 포함하는 AAV 벡터의 부피 수율. 막대는 평균 +/- 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도. 3. 표준 TCID50 분석을 사용하여 결정된 AAV-STRD.101 및 야생형 AAV9의 감염성 값. 데이터는 감염 단위를 생성하는 데 필요한 입자 수의 자연 로그로 그래프로 표시된다(P:I 비율). 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도. 4a-4d. 루시퍼라제 서열을 유사하게 패키징하는 야생형 AAV9 벡터와 비교하여, STRD.101 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하고 루시퍼라제 이식유전자를 패키징하는 재조합 AAV 벡터에 의한 U87 세포(도 4a), N2A 세포(도 4b), Sy5Y 세포(도 4c) 및 U2OS 세포(도 4d)의 형질도입. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도. 5. 4% PFA로 고정 후 24시간 동안 관상 진동체 섹션에서 tdTomato 발현을 보여주는 대표적인 형광 현미경 이미지. 각 섹션의 두께는 25μm이다. 상단 패널은 기본 tdTomato 형광이 있는 4X 대물 렌즈를 사용하여 얻은 이미지를 보여준다. 하단 패널은 기본 tdTomato 형광이 있는 10X 대물 렌즈를 사용하여 얻은 이미지를 보여준다.
도. 6. 4% PFA로 고정 후 24시간 동안 관상 진동체 섹션에서 tdTomato 발현을 보여주는 대표적인 면역조직화학 이미지. 각 섹션의 두께는 25μm이다.
도. 7. 4% PFA로 고정 후 24시간 동안 비브라트롬 간 섹션에서 TdTomato 발현을 보여주는 대표적인 형광 현미경 이미지. 각 섹션의 두께는 25μm이다. 패널은 DAPI 대조염색을 사용한 기본 tdTomato 형광을 보여준다.
도. 8. 4% PFA로 고정 후 24시간 동안 비브라트롬 심장 섹션에서 TdTomato 발현을 보여주는 대표적인 형광 현미경 이미지. 각 섹션의 두께는 50μm이다. 패널은 DAPI 대조염색을 사용한 기본 tdTomato 형광을 보여준다.
도. 9. 비인간 영장류에서 재조합 AAV의 생체분포. 수평선은 감지 한계를 나타낸다.
도 10a는 5 x 103 또는 10 x 103의 감염 다중도(MOI)에서 야생형 U2OS 세포, NPC1-결핍(NPC1-/-) U2OS 세포, 및 AAV2-hNPC로 형질도입된 NPC1-/- 세포에서 LysoTracker® 축적을 측정하여 결정된 리소좀 표현형을 보여주는 그래프이다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA를 사용하여 결정된다. 오차 막대는 평균(SEM)의 표준 오차를 나타낸다.
도 10b는 5 x 103 또는 10 x 103의 감염 다중도(MOI)에서 야생형 U2OS 세포, NPC1-결핍(NPC1-/-) U2OS 세포, 및 AAV2-hNPC로 형질도입된 NPC1-/- 세포에서 필리핀 염색을 사용하여 결정된 콜레스테롤 축적을 보여주는 그래프이다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA를 사용하여 결정된다. 오차 막대 SEM의 표준 오차를 나타낸다.
도 11은 식염수 또는 AAV9-hNPC1을 사용하는 안와후주사 후 NPC1-/- 마우스의 생존을 보여주는 카플란-마이어 생존 곡선이다. AAV9-hNPC1이 주입된 모든 동물은 실험 기간 동안 생존했으며 조직학적 분석을 위해 약 100일령에 희생되었다.
도 12는 야생형 마우스, 식염수 처리된 NPC1-/- 마우스, 또는 AAV9-hNPC1이 주사된 NPC1-/- 마우스의 약 10주(70일)령에서의 행동 표현형 점수를 나타낸다. 통계적 유의성은 짝지어지지 않은 T-검정을 사용하여 결정되었으며 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 13은 야생형 마우스, 식염수 처리된 NPC1-/- 마우스, 또는 AAV9-hNPC1로 처리된 NPC1-/- 마우스에서 약 8주(56일)령의 균형 대들보 보행 테스트에서 미끄러짐의 수를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
항체 인식을 회피하고/하거나 CNS의 조직을 선택적으로 표적화하는 재조합 AAV 벡터가 본 발명에 제공된다. 이러한 AAV 벡터는 NPC1과 같은 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 데 유용할 수 있다.
AAV는 유전자 전달제로 유용하며 인간 유전자 치료를 위한 강력한 도구이다. AAV를 사용하면 생체 내 및 시험관 내에서 다양한 세포에서 고주파수 DNA 전달 및 안정적인 발현이 달성될 수 있다. 일부 다른 바이러스 벡터 시스템과 달리, AAV는 표적 세포에서 안정적인 통합을 위해 활성 세포 분열을 필요로 하지 않다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서의 상세한 설명에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시태양을 기술하기 위해 사용된 것으로 한정하려는 의도가 아니다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, GenBank 또는 기타 기탁 번호 및 기타 참조는 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함된다.
본 발명 및 첨부된 청구항에서 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 내의 아미노산 위치의 지정은 VP1 넘버링에 관한 것이다. AAV 캡 유전자에 삽입되는 경우 본 명세서에 기술된 변형이 VP1, VP2 및/또는 VP3 영역에서 변형을 초래할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 대안적으로, VP1, VP2, 및/또는 VP3는 이들 영역(VP1, VP2, VP3, VP1 + VP2, VP1 + VP3, 또는 VP2 + VP3) 중 하나 또는 둘에서만 변형을 달성하기 위해 독립적으로 표현될 수 있다.
정의
다음 용어는 본 명세서의 기술과 첨부된 청구범위에서 사용된다:
단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함하도록 의도된다.
또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 길이의 양, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 명세서에 사용된 용어 "약"은 지정된 양의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5% 또는 심지어 ± 0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
또한 본 명세서에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 선택적("또는")으로 해석될 때 조합의 결여 뿐만 아니라 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합을 의미하고 포함한다.
문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 설명된 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 일부 실시태양에서, 본 명세서에 설명된 임의의 특징 또는 특징의 조합은 배제되거나 생략될 수 있다. 추가 설명을 위해, 예를 들어, 명세서가 특정 아미노산이 A, G, I, L 및/또는 V로부터 선택될 수 있다고 나타내는 경우, 이 기호는 또한 각각의 이러한 하위 조합이 여기에 명시적으로 설명된 것처럼, 아미노산(들)이 이들 아미노산의 임의의 서브세트, 예를 들어 A, G, I 또는 L; A, G, I 또는 V; A 또는 G; L만; 등으로부터 선택될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 기초는 지정된 아미노산 중 하나 이상이 거부될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 각각의 이러한 가능한 각 면책 조항이 여기에 명시적으로 설명된 것처럼, 아미노산은 A, G 또는 I이 아니고; A가 아니고; G 또는 V; 등이 아니다.
본 명세서에 사용된 용어 "감소시킨다", "감소시킨다", "감소" 및 유사한 용어는 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 35%, 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97% 또는 그 이상의 감소를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "증가시킨다", "개선시킨다", "향상시킨다", "향상시킨다", "향상" 및 유사한 용어는 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500% 또는 그 이상의 증가를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "파보바이러스"는 자가 복제 파보바이러스 및 의존바이러스를 포함하는 파보바이러스 과를 포괄한다. 자율 파보바이러스는 프로토파보바이러스(Protoparvovirus), 에리트로파보바이러스(Erythroparvovirus), 보카파보바이러스(Bocaparvovirus) 및 덴소바이러스(Densovirus) 아과의 구성원을 포함한다. 예시적인 자율 파보바이러스는 마우스의 미세 바이러스, 소 파보바이러스, 개 파보바이러스, 닭 파보바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 파보바이러스, 거위 파보바이러스, H1 파보바이러스, 사향오리 파보바이러스, B19 바이러스, 및 현재 알려져 있거나 나중에 발견된 임의의 다른 자율 파보바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 자율 파보바이러스는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, BERNARD N. FIELDS et al, VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers; Cotmore et al. Archives of Virology DOI 10.1007/s00705-013-1914-I) 참조.
본 명세서에 사용된 용어 "아데노-연관 바이러스"(AAV)는 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3(유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, AAV 유형 rh32.33, AAV 유형 rh8, AAV 유형 rh10, AAV 유형 rh74, AAV 유형 hu.68, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 뱀 AAV, 비어드 드래곤 AAV, AAV2i8, AAV2g9, AAV-LK03, AAV7m8, AAV Anc80, AAV PHP.B 및 현재 알려졌거나 나중에 발견된 임의의 다른 AAV를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers) 참조. 다수의 AAV 혈청형 및 단계통군이 확인되었다(예를 들어, Gao et al, (2004) J. Virology 78:6381-6388; Moris et al, (2004) Virology 33-:375-383; 및 표 2 참조). AAV1-9, AAVrh.10 및 AAV11에 대한 예시적인 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 서열은 SEQ ID NO: 1-11에 제공된다.
본 명세서에 사용된 용어 "키메라 AAV"는 AAV의 2개 이상의 상이한 혈청형으로부터 유래된 영역, 도메인, 개별 아미노산을 갖는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드를 포함하는 AAV를 의미한다. 일부 실시태양에서, 키메라 AAV는 제 1 AAV 혈청형으로부터 유래된 제 1 영역 및 제 2 AAV 혈청형으로부터 유래된 제 2 영역으로 구성된 캡시드 단백질 서브유닛을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키메라 AAV는 제 1 AAV 혈청형으로부터 유래된 제 1 영역, 제 2 AAV 혈청형으로부터 유래된 제 2 영역, 및 제 3 AAV 혈청형으로부터 유래된 제 3 영역으로 구성된 캡시드 단백질 서브유닛을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키메라 AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및/또는 AAV12로부터 유래된 영역, 도메인, 개별 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 AAV는 하기 나타낸 바와 같이(표 1) 제 1 및 제 2 AAV 혈청형으로부터의 영역, 도메인, 및/또는 개별 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 AAVX+Y는 AAVX 및 AAVY로부터 유래된 서열을 포함하는 키메라 AAV를 나타낸다:
[표 1]
키메라 AAV
Figure pct00001
하나의 캡시드 단백질 서브유닛에 다중 AAV 혈청형으로부터의 개별 아미노산 또는 영역을 포함함으로써, 다중 AAV 혈청형으로부터 개별적으로 유래되는 다중 원하는 특성을 갖는 캡시드 단백질 서브유닛이 수득될 수 있다.
AAV 및 자율 파보바이러스의 다양한 혈청형의 게놈 서열, 뿐만 아니라 천연 말단 반복부(TR), Rep 단백질 및 캡시드 단백질 서브유닛의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 서열은 문헌이나 GenBank와 같은 공공 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, GenBank 기탁 번호 NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852, AY530579 참조; 이의 개시내용은 파보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본 명세서에 참조로 포함된다. 또한, 예를 들어, Srivistava et al., (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al, (1998) J Virology 71:6823; Chiorini et al., (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al., (1999) J Virology 73:939; Xiao et al, (1999) J Virology 73:3994; Muramatsu et al., (1996) Virology 221:208; Shade et al, (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al, (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris et al, (2004) Virology 33:375-383; 및 국제 특허 공개 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 미국 특허 제6,156,303호 참조; 이의 개시내용은 파보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본 명세서에 참조로 포함된다. 표 2도 참조. 자율 파보바이러스 및 AAV의 단백질 캡시드 구조는 BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)에 상세히 기술된다. 또한, AAV2(Xie et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 10405-10), AAV9(DiMattia et al., (2012) J. Virol. 86:6947-6958), AAV8(Nam et al, (2007) J. Virol. 81: 12260-12271), AAV6(Ng et al., (2010) J. Virol. 84:12945-12957), AAV5(Govindasamy et al. (2013) J. Virol. 87, 11187-11199), AAV4(Govindasamy et al. (2006) J. Virol. 80:11556-11570), AAV3B(Lerch et al., (2010) Virology 403:26-36), BPV(Kailasan et al., (2015) J. Virol. 89:2603-2614) 및 CPV(Xie et al, (1996) J. Mol. Biol. 6:497-520 및 Tsao et al, (1991) Science 251:1456-64)의 결정 구조의 설명을 참조하기 바란다.
[표 2]
AAV 혈청형 및 단계통군
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
재조합 AAV(rAAV) 벡터는 바이러스 생산 세포주를 사용하여 배양물에서 생산될 수 있다. "바이러스 생산 세포", "바이러스 생산 세포주" 또는 "바이러스 생산 세포"라는 용어는 바이러스 벡터를 생산하는 데 사용되는 세포를 의미한다. HEK293 및 239T 세포는 일반적인 바이러스 생산 세포주이다. 하기 표 3은 다양한 바이러스 벡터에 대한 예시적인 바이러스 생산 세포주를 나열한다. rAAV의 생산은 일반적으로 세포에 세 가지 요소의 존재를 필요로 한다: 1) AAV 역 말단 반복부(ITR) 서열이 플랭킹된 이식유전자, 2) AAV rep 및 cap 유전자, 및 3) 헬퍼 바이러스 단백질 서열. 이 세 가지 요소는 하나 이상의 플라스미드에 제공될 수 있으며 세포 내로 형질감염되거나 형질도입될 수 있다.
[표 3]
예시적인 바이러스 생산 세포주
Figure pct00005
"HEK293"은 원래 조직 배양에서 성장한 인간 배아 신장 세포에서 유래한 세포주를 의미한다. HEK293 세포주는 배양에서 쉽게 자라며 일반적으로 바이러스 생산에 사용된다. 본 발명에 사용된 "HEK293"은 또한 하나 이상의 변이체 HEK293 세포주, 즉, 하나 이상의 유전적 변경을 추가로 포함하는 원래의 HEK293 세포주로부터 유래된 세포주를 의미할 수 있다. 많은 변형 HEK293 라인이 하나 이상의 특정 응용분야를 위해 개발 및 최적화되었다. 예를 들어, 293T 세포주는 SV40 복제 기점을 함유하는 형질감염된 플라스미드의 에피솜 복제를 허용하는 SV40 큰 T-항원을 포함하여, 원하는 유전자 산물의 발현을 증가시킨다.
"Sf9"는 모 담배거세미나방종(Spodoptera frugiperda) 세포주 IPLB-Sf-21-AE로부터 유래된 클론 분리물인 곤충 세포주를 의미한다. Sf9 세포는 혈청이 없는 상태에서 성장될 수 있으며 부착되거나 현탁액에서 배양될 수 있다.
"형질감염 시약"은 핵산의 세포 내로의 전달을 향상시키는 조성물을 의미한다. 당업계에서 일반적으로 사용되는 일부 형질감염 시약은 핵산 및 세포 표면에 결합하는 하나 이상의 지질(예를 들어, 리포펙타민TM)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "감염 다중도" 또는 "MOI"는 세포와 접촉된 비리온의 수를 의미한다. 예를 들어, 배양된 세포는 세포당 1 x 102 내지 1 x 105 비리온 범위의 MOI에서 AAV와 접촉될 수 있다.
용어 "자가-상보적 AAV" 또는 "scAAV"는 기존의 단일 가닥(ss) AAV 게놈과 비교하여, 자발적으로 어닐링되어 보다 빠르고 보다 강력한 이식유전자 발현을 초래하는 이량체 역 반복부 분자를 형성하는 핵산(즉, DNA)을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 의미한다. 예를 들어 McCarty, D.M., et al., Gene Therapy 8, 1248-1254(2001) 참조. 기존의 ssAAV와 달리, scAAV는 유전자 발현을 위한 속도 제한 단계인 두 번째 가닥 합성을 우회할 수 있다. 또한, 이중 가닥 scAAV는 바이러스 형질도입 후 DNA 분해가 덜 일어나므로 안정적인 에피솜의 사본 수를 증가시킨다. 특히, scAAV는 일반적으로 기존 AAV 벡터 크기의 절반인 약 2.4kb인 게놈만 보유할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 AAV 벡터는 자가-상보적 AAV이다.
본 명세서에 사용된 용어 "펩타이드"는 짧은 아미노산 서열을 의미한다. 펩타이드라는 용어는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 아미노산 서열의 일부 또는 영역을 의미하기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드는 천연 AAV 캡시드 단백질에서 자연적으로 발생하는 펩타이드이거나, 천연 AAV 캡시드 단백질에서 자연적으로 발생하지 않는 펩타이드일 수 있다. AAV 캡시드 단백질에서 천연 발생 AAV 펩타이드는 비-천연 발생 펩타이드로 대체될 수 있다. 예를 들어, 비-천연 펩타이드는 AAV 캡시드 단백질로 치환되어 천연-발생 펩타이드가 비-천연 펩타이드로 대체되도록 변형된 캡시드 단백질을 제공할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "방향성"은 특정 세포 또는 조직으로의 바이러스의 우선적 진입, 선택적으로는 세포에서 바이러스 게놈에 의해 운반되는 서열(들)의 발현(예를 들어, 전사 및 선택적으로, 번역), 예를 들어 재조합 바이러스의 경우, 관심 이식유전자의 발현이 뒤따르는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "전신 방향성" 및 "전신 형질도입"(및 동등한 용어)은 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터 또는 바이러스-유사 입자가 각각 신체 전체의 조직(예를 들어, 뇌, 폐, 골격근, 심장, 간, 신장 및/또는 췌장)에 대해 방향성을 나타내거나 형질도입하는 것을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 근육 조직(예를 들어, 골격근, 횡격막 및 심장 근육)의 전신 형질도입이 달성된다. 일부 실시태양에서, 골격근 조직의 전신 형질도입이 달성된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본질적으로 신체 전체의 모든 골격근이 형질도입된다(형질도입의 효율은 근육 유형에 따라 다를 수 있음). 일부 실시태양에서, 사지 근육, 심장 근육 및 횡격막 근육의 전신 형질도입이 달성된다. 선택적으로, 바이러스 벡터 또는 바이러스-유사 입자는 전신 경로(예를 들어, 정맥내, 관절내 또는 림프내와 같은 전신 경로)를 통해 투여된다.
대안적으로, 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터 또는 바이러스-유사 입자는 국소적으로(예를 들어, 발바닥에, 근육내, 피내, 피하, 국소적으로) 전달된다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터 또는 바이러스-유사 입자는 뇌 또는 척수와 같은 중추신경계(CNS)의 조직에 국부적으로 전달된다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터 또는 바이러스-유사 입자는 척수강내, 뇌내 또는 뇌실내 주사에 의해 투여된다.
달리 나타내지 않는 한, "효율적인 형질도입" 또는 "효율적인 방향성" 또는 유사한 용어는 적절한 대조군(예를 들어, 대조군의 각각 형질도입 또는 방향성의 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 이상)을 참조하여 결정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터(예를 들어, AVV 벡터)는 골격근, 심장근, 횡격막 근육, 췌장(β-섬 세포 포함), 비장, 위장관(예를 들어, 상피 및/또는 또는 평활근), 중추신경계, 폐, 관절 세포 및/또는 신장의 세포를 효율적으로 형질도입하거나 이에 대해 효율적인 방향성을 가진다. 적절한 제어는 원하는 방향성 프로파일을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, AAV8 및 AAV9는 골격근, 심장 근육 및 횡격막 근육의 형질도입에 매우 효율적이지만 간도 고효율로 형질도입하는 단점이 있다. 따라서, AAV8 또는 AAV9의 골격, 심장 및/또는 횡격막 근육의 효율적인 형질도입을 나타내지만 간에 대한 형질도입 효율이 훨씬 낮은 바이러스 벡터를 확인할 수 있다. 또한, 관심 방향성 프로파일이 다중 표적 조직에 대한 방향성을 반영할 수 있기 때문에, 적절한 바이러스 벡터가 일부 트레이트오프(tradeeoffs)를 나타낼 수 있음을 이해할 것이다. 설명하기 위해, 바이러스 벡터는 골격근, 심장 근육 및/또는 횡격막 근육을 형질도입함에 있어서 AAV8 또는 AAV9보다 덜 효율적일 수 있지만, 그럼에도 불구하고 간의 낮은 수준 형질도입 때문에 매우 바람직할 수 있다.
유사하게, 바이러스가 표적 조직에 대해 "효율적으로 형질도입하지 않는지" 또는 "효율적인 방향성을 갖지 않는지" 또는 유사한 용어를 적절한 대조군을 참조하여 결정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 간, 신장, 생식선 및/또는 생식 세포에 대해 효율적으로 형질도입하지 않는다(즉, 효율적인 방향성을 갖지 않는다). 일부 실시태양에서, 조직(들)(예를 들어, 간)의 바람직하지 않은 형질도입은 원하는 표적 조직(들)(예를 들어, 골격근, 횡격막 근육, 심장 근육 및/또는 중추 신경계의 세포)의 형질도입 수준의 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 1% 이하, 약 0.1% 이하이다.
AAV 벡터(또는 이의 단백질 캡시드, 캡시드 단백질 서브유닛, 또는 펩타이드)와 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "선택적으로 결합한다", "선택적 결합" 및 유사한 용어는 특정 분자 구조의 존재에 의존하는 방식으로 표적에 대한 AAV 벡터(또는 이의 단백질 캡시드, 캡시드 단백질 서브유닛, 또는 펩타이드)의 결합을 의미한다. 일부 실시태양에서, 선택적 결합은 다른 표적에 대한 실질적 또는 유의적 결합 없이 주로 특정 표적에 대한 AAV의 결합을 의미한다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터(또는 이의 단백질 캡시드, 캡시드 단백질 서브유닛, 또는 펩타이드)는 관심 세포 또는 조직의 수용체에 특이적으로 결합하지만, 다른 수용체에 대한 실질적 또는 유의적 결합을 나타내지 않는다.
"폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 염기의 서열이고, RNA, DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드 서열(천연 발생 및 비-천연 발생 뉴클레오타이드 모두 포함)일 수 있다. 일부 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드는 단일 또는 이중 가닥 DNA 서열이다.
본 명세서에 사용된 "분리된" 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, "분리된 DNA" 또는 "분리된 RNA")는 천연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분, 예를 들어, 세포 또는 바이러스의 구조성 구성요소 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련되어 일반적으로 발견되는 기타 폴리펩타이드 또는 핵산 중 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 일부 실시태양에서, "분리된" 뉴클레오타이드는 출발 물질과 비교하여 적어도 약 10배, 약 100배, 약 1000배, 약 10,000배 이상 풍부하다.
유사하게, "분리된" 폴리펩타이드는 천연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분, 예를 들어, 세포 또는 바이러스의 구조성 구성요소 또는 폴리펩타이드와 관련되어 일반적으로 발견되는 기타 폴리펩타이드 또는 핵산 중 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된 폴리펩타이드를 의미한다. 일부 실시태양에서, "분리된" 폴리펩타이드는 출발 물질과 비교하여 적어도 약 10배, 약 100배, 약 1000배, 약 10,000배 이상 풍부하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 바이러스 벡터를 "분리하다" 또는 "정제하다"(또는 문법적으로 등가물)는 바이러스 벡터가 출발 물질의 다른 성분의 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리됨을 의미한다. 일부 실시태양에서, "분리된" 또는 "정제된" 바이러스 벡터는 출발 물질과 비교하여 적어도 약 10배, 약 100배, 약 1000배, 약 10,000배 이상 풍부하다.
"치료" 폴리펩타이드 또는 단백질은 세포 또는 대상에서 단백질의 부재 또는 결함으로 인한 증상을 완화, 감소, 예방, 지연 및/또는 안정화할 수 있는 것이고/거나 그렇지 않으면 대상에게 이점, 예를 들어 항암 효과 또는 이식 생존율의 개선을 수여하는 폴리펩타이드이다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "의 치료"(및 이의 문법적 변형)는 대상의 상태의 중증도가 감소, 적어도 부분적으로 개선 또는 안정화되고/되거나 일부 완화가, 적어도 하나의 임상 증상의 완화, 감소 또는 안정화가 달성되고/거나 질환 또는 장애의 진행이 지연되는 것을 의미한다.
용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"(및 이들의 문법적 변형)은 대상에서 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 개시의 예방 및/또는 지연, 및/또는 본 명세서에 기술된 조성물 및/또는 방법의 부재하에 발생할 것에 비해 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 개시의 중증도의 감소를 의미한다. 예방은, 예를 들어, 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 완전한 부재와 같이 완전할 수 있다. 예방은 또한 부분적일 수 있어, 대상에서 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발생 및/또는 개시의 중증도는 본 명세서에 기술된 조성물 및/또는 방법의 부재하에 발생할 것보다 적다.
본 명세서에 사용된 "유효량"은 대상의 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하거나 이의 징후 또는 증상을 개선하는데 효과적인 본 명세서에 제공된 AAV 벡터, 핵산, 또는 기타 작용제의 양이다. "유효량"은, 예를 들어, 질환 및/또는 질환의 증상, 질환의 중증도 및/또는 질환 또는 장애의 증상, 치료될 환자의 연령, 체중 및/또는 건강 및 처방 의사의 판단에 따라 달라질 수 있다. 임의의 주어진 경우에 적절한 양은 당업자에 의해 확인될 수 있거나 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "바이러스 벡터", "벡터"는 핵산 전달 비히클로서 기능하고 비리온 또는 바이러스-유사 입자 내에 포장된 벡터 게놈(예를 들어, 이식유전자를 포함하는 핵산)을 포함하는 바이러스(예를 들어, AAV) 입자를 의미한다.
"아데노-연관 바이러스 벡터" 또는 "AAV 벡터"는 일반적으로 단백질 캡시드, 및 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산(예를 들어, 이식유전자를 포함하는 핵산)을 포함한다. "단백질 캡시드"는 T=1 정이십면체 대칭으로 연관되고 배열된 개별 "캡시드 단백질 서브유닛"(예를 들어, 약 60개의 캡시드 단백질 서브유닛)을 포함하는 구형에 가까운 단백질 껍질이다. 본 명세서에 기술된 AAV 벡터의 단백질 캡시드는 복수의 캡시드 단백질 서브유닛을 포함한다. AAV 벡터가 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 것으로 본 명세서에서 기술될 때, AAV 벡터는 단백질 캡시드를 포함하고, 여기서 단백질 캡시드는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에 사용된 용어 "캡시드 단백질"은 때때로 캡시드 단백질 서브유닛을 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "바이러스성-유사 입자" 또는 "바이러스-유사 입자"는 전달 카세트 또는 이식유전자를 포함하는 임의의 벡터 게놈 또는 핵산을 포함하지 않는 단백질 캡시드를 의미한다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 "전달 카세트"를 포함하는 핵산, 즉 AAV에 의해 세포로 전달될 수 있는 하나 이상의 서열을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 핵산은 자가-상보적이다(즉, 이중 가닥). 일부 실시태양에서, 핵산은 자가-상보적이 아니다(즉, 단일 가닥).
"rAAV 벡터 게놈" 또는 "rAAV 게놈"은 하나 이상의 이종 핵산 서열을 포함하는 AAV 게놈(즉, vDNA)이다. rAAV 벡터는 일반적으로 핵산 복제를 촉진하기 위해 시스(cis)로 역 말단 반복부(들)(ITR(들))만을 필요로 한다. 다른 모든 바이러스 서열은 없어도 되고 트랜스로 공급될 수도 있다(Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97). 전형적으로, rAAV 벡터 게놈은 AAV 벡터에 의해 효율적으로 패키징될 수 있는 이식유전자의 크기를 최대화하기 위해 1개 또는 2개의 ITR 서열만을 보유할 것이다. 구조적 및 비구조적 단백질 암호 서열은 트랜스로(예를 들어, 플라스미드로부터, 또는 서열을 패키징 세포 내로 안정적으로 통합시킴으로써) 제공될 수 있다. 일부 실시태양에서, rAAV 벡터 게놈은 적어도 하나의 ITR 서열(예를 들어, AAV ITR 서열), 선택적으로 2개의 ITR(예를 들어, 2개의 AAV ITR)을 포함하며, 이는 전형적으로 벡터 게놈의 5' 및 3' 말단(즉, 5' ITR 및 3' ITR)에 있을 것이고, 이종 핵산의 측면에 위치하지만 이에 인접할 필요는 없을 것이다.
본 명세서에 기술된 바이러스 벡터는 추가로 국제 특허 공개번호 WO 00/28004 및 Chao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619에 기재된 바와 같은 "표적화된" 바이러스 벡터(예를 들어, 지향된 방향성을 갖는 것) 및/또는 "혼성" 바이러스 벡터(즉, 바이러스 ITR 및 바이러스 단백질 캡시드가 상이한 바이러스로부터 유래됨)일 수 있다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 CNS의 세포 및/또는 조직을 표적으로 한다.
본 명세서에 기술된 바이러스 벡터는 국제 특허 공개번호 WO 01/92551(이의 개시내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 2중(duplexed) 바이러스 입자일 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 이중 가닥(2중) 게놈은 본 명세서에 기술된 바이러스 단백질 캡시드 내로 패키징될 수 있다. 또한, 단백질 캡시드, 단백질 캡시드 서브유닛 또는 게놈 요소는 삽입, 결실 및/또는 치환을 비롯한 다른 변형을 함유할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "아미노산"은 임의의 천연 발생 아미노산, 이의 변형된 형태, 및 합성 아미노산을 포함한다. 천연 발생의 좌선성(L-) 아미노산은 표 4에 제시된다.
[표 4]
아미노산 잔기 및 약어
Figure pct00006
대안적으로, 아미노산은 변형된 아미노산 잔기일 수 있고(비제한적인 예는 표 5에 제시됨) 및/또는 해독후 변형(예를 들어, 아세틸화, 아미드화, 포르밀화, 하이드록실화, 메틸화, 인산화 또는 황산화)에 의해 변형된 아미노산일 수 있다. 아미노산을 화학적으로 변형시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1st edition, Academic Press, 1996 참조).
[표 5]
변형된 아미노산 잔기
Figure pct00007
추가로, 비-천연 발생의 아미노산은 "비천연" 아미노산일 수 있다(Wang et al, Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)에 기술되어 있음). 이들 비천연 아미노산은 AAV 단백질 캡시드 또는 캡시드 단백질 서브유닛에 관심 분자를 화학적으로 연결시키는 데 유리하게 사용될 수 있다.
변형된 AAV 단백질 캡시드 서브유닛, 단백질 캡시드 및 이를 포함하는 AAV 벡터
AAV 벡터
추가로, (i) 재조합 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡시드화된 전달 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터가 본 발명에 제공된다. 일부 실시태양에서, 재조합 캡시드 단백질 서브유닛(VP1, VP2 및/또는 VP3 영역 포함)은 임의의 천연 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 서열에서 발생하지 않는 아미노산 서열의 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 펩타이드를 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛이 중화 항체를 회피하는 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 바람직한 특성을 바이러스 벡터에 부여할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 본 명세서에 기술된 AAV 벡터는 통상적인 AAV 벡터와 연관된 한계를 해결한다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 (i) 하나 이상의 재조합 캡시드 단백질 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡시드화된 전달 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 제공하며; 여기서 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 12-20 중 어느 하나의 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트는 5' 및 3' AAV 역 말단 반복부를 포함한다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트는 이식유전자(예를 들어, NPC1 이식유전자)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트는 이중 가닥이다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트는 단일 가닥이다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 치료 단백질 또는 RNA를 암호화한다. 일부 실시태양에서, 재조합 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV 또는 조류 AAV 캡시드 단백질의 천연 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시태양에서, 재조합 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질의 천연 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시태양에서, 펩타이드는 천연 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 451-458, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV 또는 조류 AAV에 있는 동등한 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치에 위치하고, 펩타이드는 SEQ ID NO: 12-18 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 펩타이드는 천연 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 587-594, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV 또는 조류 AAV에 있는 동등한 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치에 위치하고, 펩타이드는 SEQ ID NO: 19 또는 20으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 재조합 캡시드 단백질 서브유닛은 a) SEQ ID NO: 12-18 중 어느 하나의 서열을 갖는 제 1 펩타이드; 및 b) SEQ ID NO: 19-20 중 어느 하나의 서열을 갖는 제 2 펩타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 펩타이드는 아미노산 위치 451-458에 있고, 제 2 펩타이드는 아미노산 587-594에 있으며, 여기서 아미노산 넘버링은 천연 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛을 기반으로 하거나, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV 또는 조류 AAV의 동등한 아미노산 잔기를 기반으로 한다.
일부 실시태양에서, 펩타이드는 단백질 캡시드 또는 이의 캡시드 단백질 서브유닛에 대한 적어도 하나의 항체의 결합을 억제한다. 일부 실시태양에서, 펩타이드는 항체에 의한 AAV 벡터의 감염도의 중화를 억제한다.
일부 실시태양에서, 펩타이드는 중추신경계(CNS)의 세포 표면에서 발현되는 수용체에 선택적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 세포는 전운동 피질(premotor cortex), 시상, 소뇌 피질, 치상 핵, 척수, 또는 후근 신경절에 있다. 일부 실시태양에서, 펩타이드는 심장의 세포 표면 상에 발현된 수용체에 선택적으로 결합한다.
일부 실시태양에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 (i) 돌연변이 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡시드화된 전달 카세트를 포함하며, 여기서 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛 서열의 아미노산 451-458에 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO: 158)을 갖는 펩타이드를 포함하고, 이 펩타이드는 천연 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛 서열에서 발생하지 않는 것이다. 일부 실시태양에서, X1은 I가 아니고, X2는 N이 아니고, X3은 G가 아니고, X4는 S가 아니고, X5는 G가 아니고, X6은 Q가 아니고, X7은 N이 아니고, 및/또는 X8은 Q가 아니다. 일부 실시태양에서, X1은 S, F, Q, G, K, 또는 R이다. 일부 실시태양에서, X2는 C, G, R, D, T, 또는 Q이다. 일부 실시태양에서, X3은 Q, V, G, Y, R, F, 또는 D이다. 일부 실시태양에서, X4는 P, Q, A, 또는 R이다. 일부 실시태양에서, X5는 T, N, A, P, 또는 I이다. 일부 실시태양에서, X6은 V, Q, A, 또는 I이다. 일부 실시태양에서, X7은 M, P, R, Q, 또는 N이다. 일부 실시태양에서, X8은 N, L, F, E, H, 또는 A이다. 일부 실시태양에서, X1은 S이고, X2는 C이고, X3은 Q, X4는 P, X5는 T, X6은 V, X7은 M, X8은 N이다. 일부 실시태양에서, X1은 F, X2는 G, X3은 V, X4는 P, X5는 N, X6은 Q, X7은 P, X8은 L이다. 일부 실시태양에서, X1은 Q, X2는 R, X3은 G, X4는 Q, X5는 A, X6은 A, X7은 P, X8은 F이다. 일부 실시태양에서, X1은 G, X2는 D, X3은 Y, X4는 A, X5는 P, X6은 I, X7은 R, 및 X8은 E이다. 일부 실시태양에서, X1은 K, X2는 T, X3은 R, X4는 R, X5는 I, X6은 V, X7은 Q, X8은 H이다. 일부 실시태양에서, X1은 F, X2는 G, X3은 F, X4는 P, X5는 N, X6은 Q, X7은 P, 및 X8은 L이다. 일부 실시태양에서, X1은 R, X2는 Q, X3은 D, X4는 Q, X5는 P, X6은 I, X7은 N, X8은 A이다.
일부 실시태양에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 (i) 돌연변이 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡시드화된 전달 카세트를 포함하며, 여기서 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛 서열의 아미노산 587-594에 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO: 158)을 갖는 펩타이드를 포함하고, 이 펩타이드는 천연 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛 서열에서 발생하지 않는 것이다. 일부 실시태양에서, X1은 A가 아니고, X2는 Q가 아니고, X3은 A가 아니고, X4는 Q가 아니고, X5는 A가 아니고, X6은 Q가 아니고, X7은 T가 아니고, 및/또는 X8은 G가 아니다. 일부 실시태양에서, X1은 S이다. 일부 실시태양에서, X2는 K 또는 T이다. 일부 실시태양에서, X3은 V이다. 일부 실시태양에서, X4는 E 또는 D이다. 일부 실시태양에서, X5는 S이다. 일부 실시태양에서, X6은 W 또는 I이다. 일부 실시태양에서, X7은 T 또는 A이다. 일부 실시태양에서, X8은 E 또는 I이다. 일부 실시태양에서, X1은 S, X2는 K, X3은 V, X4는 E, X5는 S, X6은 W, X7은 T, 및 X8은 E이다. 일부 실시태양에서, X1은 S, X2는 T, X3은 V, X4는 D, X5는 S, X6은 I, X7은 A, X8은 I이다.
일부 실시태양에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 (i) 재조합 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡시드화된 전달 카세트를 포함하며, 여기서 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 165-187 중 어느 하나에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 165-187 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 175의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 전달 카세트를 중추 신경계의 세포 또는 조직으로 선택적으로 전달한다. 일부 실시태양에서, 중추 신경계의 조직은 전운동 피질, 시상, 소뇌 피질, 치상 핵, 척수 또는 후근 신경절이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 전달 카세트를 뇌로 전달하지만 AAV 벡터를 심장으로 전달하지 않는다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 전달 카세트를 뇌 및 심장로 전달한다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트의 전달은 심장보다 뇌로 더 많다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트의 전달은 뇌 및 심장에서 대략 동일하다.
AAV 캡시드 단백질 서브유닛 및 이를 포함하는 단백질 캡시드
일부 실시태양에서, 본 발명은 천연 AAV 캡시드 단백질 서브유닛과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환 및/또는 결실)을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질 서브유닛을 제공하며, 여기서 하나 이상의 변형은 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 상의 하나 이상의 항원 부위를 변형시킨다. 하나 이상의 항원 부위의 변형은 하나 이상의 항원 부위의 항체에 의한 감소된 인식 및/또는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 바이러스 입자의 감염도의 중화 억제를 초래한다. 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환 및/또는 결실)은 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 함유하는 AAV-항체 복합체의 펩타이드 에피토프 매핑 및/또는 극저온 전자 현미경검사 연구에 의해 식별되는 하나 이상의 항원 발자국에 있을 수 있다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 항원 부위는 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2017/058892에 기재된 바와 같은 공통 항원 모티프(common antigenic motif) 또는 CAM이다. 일부 실시태양에서, 항원 부위는 VR-I, VR-II, VR-III, VR-IV, VR-V, VR-VI, VR-VII, VR-VIII, VR-IX와 같은 AAV 캡시드 단백질 서브유닛의 가변 영역(VR)에 있다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 항원 부위는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛의 HI 루프에 있다.
일부 실시태양에서, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh32.22, 소 AAV 또는 조류 AAV 캡시드 단백질은 하기 표 6에서 식별되는 하나 이상의 영역에 아미노산 변형(예를 들어, 치환 또는 결실)을 포함한다.
[표 6]
부분 또는 완전히 치환/대체될 수 있는 다양한 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 상의 예시적인 항원 영역 또는 다른 영역. 천연 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 서열에 있는 잔기의 각 VP1 넘버링이 도시된다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
일부 실시태양에서, 아미노산 치환은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh32.22, 소 AAV 또는 조류 AAV 혈청형 중 어느 하나로부터의 AAV 캡시드 단백질 서브유닛에 있는 임의의 8개 아미노산을 대체한다. 예를 들어, 아미노산 치환은 상기 나열된 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형에서 다음 아미노산(VP1 넘버링)을 대체할 수 있다: 355-362, 363-370, 371-378, 379-386, 387-394, 395-402, 403-410, 411-418, 419-426, 427-434, 435-442, 443-450, 451-458, 459-466, 467-474, 475-482, 483-490, 491-498, 499-506, 507-514, 515-522, 523-530, 531-538, 539-546, 547-554, 555-562, 563-570, 571-578, 579-586, 587-594, 595-602, 603-610, 611-618, 619-626, 627-634, 635-642, 643-650, 651-658, 659-666, 667-674, 675-682, 683-690, 691-698, 699-706, 707-714, 715-722.
일부 실시태양에서, 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 19-20 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 12-18 중 어느 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 587-594에 상응하는 아미노산에서 이루어진다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 AAV1 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 587-594에 상응하는 아미노산에서 이루어진다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 AAV6 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 587-594에 상응하는 아미노산에서 이루어진다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 AAV8 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 589-596에 상응하는 아미노산에서 이루어진다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 AAVrh8 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 587-594에 상응하는 아미노산에서 이루어진다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 AAVrh10 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 589-596에 상응하는 아미노산에서 이루어진다.
일부 실시태양에서, 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 18-20 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 18-20 중 어느 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 AAV9 캡시드 단배질 서브유닛의 아미노산 451-458에 상응하는 아미노산에서 이루어진다.
일부 실시태양에서, 아미노산 결실은 야생형 캡시드 단백질 서브유닛과 비교하여 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 아미노산의 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 하나 이상의 아미노산 치환 및 하나 이상의 아미노산 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 적어도 하나의 아미노산 치환 및 적어도 하나의 아미노산 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 적어도 하나의 아미노산 치환 및 적어도 하나의 아미노산 결실을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 아미노산 치환 및 적어도 하나의 아미노산 결실은 캡시드 단백질 서브유닛 아미노산 서열에서 서로 바로 인접해 있다.
일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 AAV 바이러스 입자 또는 AAV 바이러스 벡터에 존재할 때, CNS(예를 들어, 뇌, 척수)를 선택적으로 표적으로 하는 표현형을 갖는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 생성하도록 변형된다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은은 AAV 바이러스 입자 또는 AAV 바이러스 벡터에 존재할 때, 중화 항체를 회피하는 표현형을 갖는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 생성하도록 변형된다. AAV 바이러-유사 입자 또는 AAV 벡터는 또한 중화 항체를 회피하고 및/또는 CNS를 표적화하는 표현형에 더하여 향상된 또는 유지된 형질도입 효율의 표현형을 가질 수 있다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 제 1 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 서브유닛으로부터의 하나 이상의 서열을 제 1 AAV 혈청형과 상이한 제 2 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 서브유닛 내로 도입시킬 수 있다.
변형이 추가되는 기본 AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh.32.33, AAVrh74, 소 AAV, 조류 AAV 또는 현재 알려져 있거나 향후에 식별되는 임의의 다른 AAV로부터 선택되는 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 서브유닛일 수 있다. 일부 실시태양에서, 기본 AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 AAV9 혈청형의 것이다. 일부 실시태양에서, 기본 AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 키메라이다. 일부 실시태양에서, 기본 AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 AAV8/9 키메라이다.
변형된 AAV 캡시드 단백질 서브유닛의 여러 예는 본 명세서에 제공된다. 하기 실시예에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 기술된 특정 치환을 포함할 수 있고, 일부 실시태양에서 기재된 것보다 더 적거나 더 많은 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "치환"은 단일 아미노산 치환, 또는 하나보다 많은 인접 아미노산의 치환을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 등의 단일 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 인접 아미노산의 하나 이상의 치환과 같은 다중 인접 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
또한, 아미노산 잔기가 야생형 또는 천연 아미노산 서열에 존재하는 아미노산 잔기 외에 다른 임의의 아미노산 잔기에 의해 치환되는 본 명세서에 기술된 일부 실시태양에서, 임의의 다른 아미노산 잔기는 당업계에 공지된 임의의 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기일 수 있다(예를 들어, 표 2 및 4 참조). 일부 실시태양에서, 치환은 보존적 치환일 수 있고, 일부 실시태양에서, 치환은 비보존적 치환일 수 있다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 치환은 표 7.1에 제시된 바와 같은 SEQ ID NO: 12-18로부터 각각 개별적으로 선택된다.
[표 7.1]
아미노산 치환
Figure pct00012
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 치환은 표 7.2에 제시된 바와 같은 SEQ ID NO: 19-20으로부터 각각 선택된다.
[표 7.2]
아미노산 치환
Figure pct00013
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 표 7.1에 열거된 서열로부터 선택되는 제 1 치환 및 표 7.2에 열거된 서열로부터 선택되는 제 2 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 표 7.3 및 7.4에 제시된 바와 같은 제 1 치환, 제 2 치환을 포함할 수 있다.
[표 7.3]
아미노산 치환의 조합
Figure pct00014
[표 7.4]
아미노산 치환의 조합
Figure pct00015
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 아미노산 변형(예를 들어, 치환 및/또는 결실)을 포함하고, 여기서 아미노산 변형은 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 상에 항원성 영역과 같은 하나 이상의 표면-노출 영역을 변형시킨다.
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 치환 중 적어도 하나는 SEQ ID NOs: 19-20 중 하나를 포함한다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 587-594에 상응하는 아미노산을 대체한다.
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 치환 중 적어도 하나는 SEQ ID NOs: 12-18 중 하나를 포함한다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 451-458에 상응하는 아미노산을 대체한다.
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 캡시드 단백질 서브유닛 서열에서 발생하지 않는 8개 아미노산의 서열(X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8)(SEQ ID NO: 158)을 포함하는 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, X1은 I이 아니고, X2는 N이 아니고, X3은 G가 아니고, X4는 S가 아니고, X5는 G가 아니고, X6은 Q가 아니고, X7은 N이 아니고, 및/또는 X8은 Q가 아니다. 일부 실시태양에서, X1은 S, F, Q, G, K, 또는 R이다. 일부 실시태양에서, X2는 C, G, R, D, T, 또는 Q이다. 일부 실시태양에서, X3은 Q, V, G, Y, R, F, 또는 D이다. 일부 실시태양에서, X4는 P, Q, A, 또는 R이다. 일부 실시태양에서, X5는 T, N, A, P, 또는 I이다. 일부 실시태양에서, X6은 V, Q, A, 또는 I이다. 일부 실시태양에서, X7은 M, P, R, Q, 또는 N이다. 일부 실시태양에서, X8은 N, L, F, E, H, 또는 A이다. 일부 실시태양에서, X1은 S, X2는 C, X3은 Q, X4는 P, X5는 T, X6은 V, X7은 M, X8은 N이다. 일부 실시태양에서, X1은 F, X2는 G, X3은 V, X4는 P, X5는 N이고, X6은 Q, X7은 P, 및 X8은 L이다. 일부 실시태양에서, X1은 Q, X2는 R, X3은 G, X4는 Q, X5는 A, X6은 A, X7은 P, 및 X8은 F이다. 일부 실시태양에서, X1은 G, X2는 D, X3은 Y, X4는 A, X5는 P, X6은 I, X7은 R, 및 X8은 E이다. 일부 실시태양에서, X1은 K, X2는 T, X3은 R, X4는 R, X5는 I, X6은 V, X7은 Q, X8은 H이다. 일부 실시태양에서, X1은 F, X2는 G, X3은 F, X4는 P, X5는 N, X6은 Q, X7은 P, 및 X8은 L이다. 일부 실시태양에서, X1은 R, X2는 Q, X3은 D, X4는 Q, X5는 P, X6은 I, X7은 N, X8은 A이다.
일부 실시태양에서, X1은 A가 아니고, X2는 Q가 아니고, X3은 A가 아니고, X4는 Q가 아니고, X5는 A가 아니고, X6은 Q가 아니고, X7은 T가 아니고, 및/또는 X8은 G가 아니다. 일부 실시태양에서, X1은 S이다. 일부 실시태양에서, X2는 K 또는 T이다. 일부 실시태양에서, X3은 V이다. 일부 실시태양에서, X4는 E 또는 D이다. 일부 실시태양에서, X5는 S이다. 일부 실시태양에서, X6은 W 또는 I이다. 일부 실시태양에서, X7은 T 또는 A이다. 일부 실시태양에서, X8은 E 또는 I이다. 일부 실시태양에서, X1은 S이고, X2는 K, X3은 V, X4는 E, X5는 S, X6은 W, X7은 T, 및 X8은 E이다. 일부 실시태양에서, X1은 S, X2는 T, X3은 V, X4는 D, X5는 S, X6은 I, X7은 A, X8은 I이다.
일부 실시태양에서, AAV 서브유닛 단백질은 하나 이상의 아미노산 결실을 포함하고, 여기서 아미노산 결실은 야생형 AAV 캡시드 단백질 서브유닛과 비교하여 적어도 6개 또는 적어도 8개의 아미노산의 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 캡시드 단백질 서브유닛 서열과 비교하여 8개의 연속 아미노산의 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 캡시드 단백질 서브유닛 서열과 비교하여 6개의 연속 아미노산의 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 서열 LSKTQTLK(SEQ ID NO: 1374) 또는 서열 LSKTDPQTLK(SEQ ID NO: 1375)를 포함한다. 일부 실시태양에서, SEQ ID NO: 1374 또는 1375를 포함하는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV로부터 선택된 혈청형의 것이다.
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 12-18로부터 선택되는 서열을 포함하는 제 1 치환; 및 SEQ ID NO: 19-20에서 선택되는 서열을 포함하는 제 2 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 아미노산 결실 및 치환을 포함하고, 여기서 치환은 SEQ ID NO: 12-20으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 재조합 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 9(AAV9)에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하고 하기 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 서열을 갖는다: I451S, I451F, I451Q, I451G, I451K, I451R, N452C, N452G, N452R, N452D, N452T, N452Q, G453Q, G453V, G453Y, G453R, G453F, G453D, S454P, S454Q, S454A, S454R, G455T, G455N, G455A, G455P, G455I, Q456V, Q456A, Q456I, N457M, N457P, N457R, N457Q, Q458N, Q458L, Q458F, Q458E, Q458H, Q458A, A587S, Q588K, Q588T, A589V, Q590E, Q590D, A591S, Q592W, Q592I, T593A, G594E, G594I.
본 명세서에 기술된 임의의 AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 HI 루프에 변형(예를 들어, 치환 또는 결실)을 추가로 포함할 수 있다. HI 루프는 이웃하는 5중 VP와 중첩되는 각 바이러스 단백질(VP) 서브유닛으로부터 확장되는, β 가닥 βH와 βI 사이인 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 표면의 두드러진 도메인이다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 HI 루프에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 HI 루프에 하기 치환 중 하나 이상을 포함한다: P661R, T662S, Q666G, S667D, 여기서 넘버링은 야생형 AAV8 캡시드 단백질 서브유닛(SEQ ID NO: 8)에 상응한다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 HI 루프에서 하기 치환 중 하나 이상을 포함한다: P659R, T660S, A661T, K664G, 여기서 넘버링은 야생형 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛(SEQ ID NO: 9)에 상응한다.
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각각의 치환은 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 상의 상이한 항원성 부위를 변형시키고, 여기서 아미노산 치환 중 적어도 하나는 캡시드 단백질 서브유닛의 HI 루프를 변형시킨다.
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 치환 중 적어도 하나는 캡시드 단백질 서브유닛의 HI 루프를 변형시킨다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 HI 루프에서 하기 치환 중 하나 이상을 포함한다: P661R, T662S, Q666G, S667D, 여기서 넘버링은 야생형 AAV8 캡시드 단백질 서브유닛(SEQ ID NO: 8)에 상응한다; 또는 P659R, T660S, A661T, K664G, 여기서 넘버링은 야생형 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛(SEQ ID: 9)에 상응한다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 185-187 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 165-187 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 명세서에 기술된 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 또는 이를 포함하는 플라스미드가 본 명세서에 제공된다. 뉴클레오타이드 서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열일 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 핵산 또는 플라스미드를 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 단백질 캡시드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 포함한다. 또한, AAV 단백질 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터 뿐만 아니라 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 AAV 단백질 캡시드, AAV 캡시드 단백질 서브유닛 및/또는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 추가로 본 명세서에 제공된다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 항원 부위의 변형은 하나 이상의 항원 부위에 대한 항체에 의한 감소된 결합을 초래한다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 항원 부위의 변형은 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 바이러스 입자의 감염도의 중화 억제를 초래한다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 다수의 AAV로부터의 캡시드 단백질 서브유닛의 핵산 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 천연 AAV 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 위치에 "상응하는" 아미노산은 임의의 다른 AAV에 대해 쉽게 결정될 수 있다(예를 들어, 서열 정렬을 사용하여).
변형된 캡시드 단백질 서브유닛은 현재 알려져 있거나 향후에 발견되는 임의의 AAV의 캡시드 단백질 서브유닛을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 추가로, 변형되어야 하는 기본 AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 발생 AAV 캡시드 단백질 서브유닛(예를 들어, AAV2, AAV3a 또는 3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질 서브유닛 또는 표 2에 도시된 임의의 AAV)일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛에 대한 다양한 조작이 당업계에 공지되어 있고 본 발명은 천연 발생 AAV 캡시드 단백질 서브유닛의 변형에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 변형되어야 하는 캡시드 단백질은 천연 발생 AAV(예를 들어, 천연 발생 AAV 캡시드 단백질 서브유닛, 예를 들어 AAV2, AAV3a, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 현재 알려져 있거나 향후에 발견되는 임의의 다른 AAV에서 유래됨)와 비교하여 이미 변경을 갖고 있을 수 있다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 키메라성 캡시드 단백질 서브유닛일 수 있다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 조작된 AAV, 예컨대 AAV2i8, AAV2g9, AAV-LK03, AAV7m8, AAV Anc80, AAV PHP.B일 수 있다.
따라서, 일부 실시태양에서, 변형될 AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 발생 AAV로부터 유래될 수 있지만, 캡시드 단백질 서브유닛에 삽입 및/또는 치환되고, 및/또는 하나 이상의 아미노산의 결실에 의해 변경된 하나 이상의 외래 서열(예를 들어, 천연 바이러스에 외인성임)을 추가로 포함한다.
따라서, 본 명세서에서 특정 AAV 캡시드 단백질 서브유닛(예를 들어, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질 서브유닛 또는 표 2 등에 도시된 임의의 AAV에서 유래하는 캡시드 단백질 서브유닛)을 지칭하는 경우, 천연 캡시드 단백질 서브유닛뿐만 아니라 본 명세서에 기술된 변형 외에 다른 변경을 갖는 캡시드 단백질 서브유닛을 포괄하는 것으로 의도된다. 이러한 변경은 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 서열과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만, 또는 70개 미만의 아미노산이 내부에 삽입된 것(본 명세서에 기술된 삽입 외에 다른 것)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 서열과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만, 또는 70개 미만의 아미노산 치환(본 명세서에 기술된 아미노산 치환 외에 다른 것)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 서열과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만, 또는 70개 미만의 아미노산의 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 서열과 적어도 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
2개 이상의 아미노산 서열 사이의 서열 유사성 또는 동일성을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 서열 유사성 또는 동일성은 핵산의 전체 길이 또는 핵산의 지시된 부분에 대해 결정될 수 있다. 서열 유사성 또는 동일성은 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)의 국소 서열 동일성, Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48,443 (1970)의 서열 동일성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,2444 (1988)의 유사한 방법에 대한 연구, 이러한 알고리즘(Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)의 컴퓨터화 구현, Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)에 의해 기술된 베스트 핏 시퀀스 프로그램 또는 검색을 포함하나 이에 제한되지 않는 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
다른 적합한 알고리즘은 Altschul et al., J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990) and Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)에 기술된 BLAST 프로그램이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 Altschul et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480(1996); http:// blast.wustl/edu/blast/README.html로부터 얻은 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 선택적으로 기본 값으로 설정되는 여러 검색 매개변수를 사용한다. 매개변수는 동적 값이며 특정 시퀀스의 구성과 관심 시퀀스가 검색되는 특정 데이터베이스의 구성에 따라 프로그램 자체에 의해 설정된다; 그러나 값은 감도를 높이기 위해 조정될 수 있다.
또한, 추가로 유용한 알고리즘은 Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402에 의해 보고된 갭이 있는 BLAST이다.
본 발명의 목적을 위해, 달리 명시되지 않는 한, 퍼센트 동일성은 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 온라인으로 이용 가능한 기본 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool(BLAST))를 사용하여 계산된다. 당업자는 다른 알고리즘이 적절하게 대체될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시태양에서, 단백질 캡시드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 포함한다. 일부 실시태양에서, 단백질 캡시드는 파보바이러스 캡시드이며, 이는 추가로 자율적인 파보바이러스 캡시드 또는 디펜도바이러스 캡시드일 수 있다. 선택적으로, 단백질 캡시드는 AAV 단백질 캡시드이다. 일부 실시태양에서, AAV 단백질 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV3a, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, 소 AAV 단백질 캡시드, 조류 AAV 단백질 캡시드, 또는 현재 알려져 있거나 이후에 확인된 임의의 다른 AAV이다. AAV 혈청형의 비제한적 목록은 표 2에 도시된다. AAV 단백질 캡시드는 표 2에 열거된 임의의 AAV 혈청형일 수 있거나 하나 이상의 삽입, 치환 및/또는 결실에 의해 상기 중 임의의 것에서 유래될 수 있다. 변형된 바이러스 단백질 캡시드에 의해 포장되고 세포로 전달될 수 있는 분자는 전달 카세트(예를 들어, 이종 DNA 또는 RNA), 폴리펩타이드, 작은 유기 분자, 금속 또는 이들의 조합을 포함한다.
이종 분자는 AAV 감염에서 자연적으로 발견되지 않는 것, 예를 들어 야생형 AAV 게놈에 의해 암호화되지 않는 것으로서 정의된다. 또한, 치료적으로 유용한 분자는 이 분자를 숙주 표적 세포로 전달하기 위해 키메라 단백질 캡시드의 외부와 관련될 수 있다. 이러한 관련 분자는 DNA, RNA, 작은 유기 분자, 금속, 탄수화물, 지질 및/또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 치료적으로 유용한 분자는 단백질 캡시드 또는 이의 캡시드 부분에 공유 연결(즉, 접합 또는 화학적 커플링)된다. 분자를 공유적으로 연결하는 방법은 당업계의 기술자에게 공지되어 있다.
변형된 단백질 캡시드는 또한 신규 단백질 캡시드 구조에 대해 항체를 유발시키는 데 사용된다. 추가 대안으로서, 외인성 아미노산 서열은 세포에 대한 항원 제시를 위해, 예를 들어 외인성 아미노산 서열에 대한 면역 반응을 생성하도록 대상에 투여하기 위해, 변형된 단백질 캡시드 또는 이의 캡시드 단백질 서브유닛 내에 삽입할 수 있다.
일부 실시태양에서, 단백질 캡시드는 관심 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA를 암호화하는 핵산을 전달하는 바이러스 벡터의 투여 이전 및/또는 동시에(예를 들어, 서로 몇 분 또는 몇 시간 내에) 특정 세포 부위를 차단하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질 캡시드는 간 세포 상의 세포 수용체를 차단하기 위해 전달될 수 있고 전달 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는 후속적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 이는 간 세포의 형질도입을 감소시키고 다른 표적(예를 들어, 골격, 심장 및/또는 횡격막 근육)의 형질도입을 향상시킬 수 있다.
일부 실시태양에 따르면, 변형된 단백질 캡시드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 바이러스 벡터 이전에 및/또는 동시에 대상에게 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 변형된 단백질 캡시드 또는 이의 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 조성물 및 약학적 제제를 제공하고; 선택적으로, 조성물은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 실시태양에서, 핵산(선택적으로, 분리된 핵산)은 본 명세서에 기술된 변형된 단백질 캡시드 서브유닛을 암호화한다. 또한, 핵산, 및 본 명세서에 기술된 핵산 및/또는 바이러스 벡터를 포함하는 세포(생체내 또는 배양물 중)가 추가로 제공된다. 한 예로서, 바이러스 벡터는 (a) 본 명세서에 기술된 변형된 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (b) 적어도 하나의 말단 반복부 서열을 포함하는 핵산을 포함할 수 있고, 여기서 핵산은 AAV 단백질 캡시드에 의해 캡시드화된다.
적합한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 백시니아, 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 렌티바이러스, 코로나바이러스 등을 포함한다. 적합한 핵산은 플라스미드, 파지, YAC, BAC 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 핵산, 및 세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 변형된 바이러스 단백질 캡시드, 단백질 캡시드 서브유닛 또는 바이러스 벡터의 생산을 위한 시약(예를 들어, 헬퍼 패키징 구조체 또는 패키징 세포)으로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 단백질 캡시드 및 캡시드 단백질 서브유닛은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어 바큘로바이러스 시스템을 사용하여 생성할 수 있다(Brown et al., (1994) Virology 198:477-488).
본 명세서에 기술된 AAV 캡시드 단백질 서브유닛에 대한 변형은 "선택적" 변형이다. 이 접근법은 AAV 혈청형 간에 전체 서브유닛 또는 큰 도메인 스와프(swap)가 사용되는 종래의 연구와 대조적이다(예를 들어, 국제 특허 공개 WO 00/28004 및 Hauck et al., (2003) J. Virology 77:2768-2774 참조). 일부 실시태양에서, "선택적" 변형은 약 20, 18, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 이하의 인접 아미노산의 삽입 및/또는 치환 및/또는 결실을 초래한다.
본 명세서에 기술된 변형된 캡시드 단백질 서브유닛 및 단백질 캡시드는 현재 알려져 있거나 향후에 식별되는 임의의 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, AAV 캡시드 단백질 서브유닛 및 단백질 캡시드는, 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 00/28004에 기술된 바와 같이, 다른 바이러스, 선택적으로 다른 파보바이러스 또는 AAV로부터의 캡시드 단백질 서브유닛의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다는 점에서 키메라일 수 있다.
일부 실시태양에서, 단백질 캡시드 또는 캡시드 단백질 서브유닛은 원하는 표적 조직(들) 상에 존재하는 세포-표면 분자와 상호작용하도록 단백질 캡시드 또는 캡시드 단백질 서브유닛을 유도하는 표적화 서열(예를 들어, 단백질 캡시드 또는 캡시드 단백질 서브유닛에 치환되거나 삽입됨)을 포함하는 표적화된 바이러스 캡시드일 수 있다(예를 들어, 국제 특허 공개 WO 00/28004 및 Hauck et al., (2003) J. Virology 77:2768-2774); Shi et al., Human Gene Therapy 17:353-361 (2006)[AAV 캡시드 단백질 서브유닛의 위치 520 및/또는 584에 인테그린 수용체 결합 모티프 RGD의 삽입을 기술함]; 및 미국 특허 번호 7,314,912[AAV2 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 위치 447, 534, 573 및 587 다음에 RGD 모티프를 함유하는 PI 펩타이드의 삽입을 기술함]). 삽입을 허용하는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 내의 다른 위치는 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Grifman et al., Molecular Therapy 3:964-975 (2001)에 의해 기술된 위치 449 및 588).
예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 단백질 캡시드 또는 캡시드 단백질 서브유닛은 관심 특정 표적 조직(예를 들어, 간, 골격근, 심장, 횡격막 근육, 신장, 뇌, 위, 장, 피부, 내피 세포 및/또는 폐)에 대해 상대적으로 비효율적인 방향성을 가질 수 있다. 표적화 서열은 유리하게는 이들 저-형질도입(low-transduction) 벡터에 통합되어, 원하는 방향성 및 선택적으로 특정 조직(들)에 대한 선택적인 방향성을 단백질 캡시드(또는 이의 캡시드 단백질 서브유닛)에 부여할 수 있다. 표적화 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 및 AAV 벡터는, 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 00/28004에 기재되어 있다. 다른 예로서, Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49(2006)에 기술된 바와 같은 하나 이상의 비-천연 발생의 아미노산은 저-형질도입 벡터를 원하는 표적 조직(들)으로 재유도하는 수단으로서 직교 부위에서 본 명세서에 기술된 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 내로 통합될 수 있다. 이들 비천연 아미노산은 글리칸(만노스 - 수지상 세포 표적화); 특정 암 세포 유형으로의 표적 전달을 위한 RGD, 봄베신 또는 신경펩타이드; 성장 인자 수용체, 인테그린 등과 같은 특정 세포 표면 수용체를 표적으로 하는 파지 디스플레이로부터 선택되는 RNA 압타머 또는 펩타이드를 제한 없이 포함하는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛에 관심 분자를 화학적으로 연결하는 데 유리하게 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 표적화 서열은 특정 세포 유형(들)에 대한 감염을 유도하는 캡시드 단백질 서브유닛 서열(예를 들어, 자율적인 파보바이러스 캡시드 서열, AAV 캡시드 단백질 서브유닛 서열, 또는 임의의 다른 바이러스 캡시드 서열)일 수 있다.
또 다른 비제한적인 예로서, 헤파린 또는 헤파란 설페이트 결합 도메인(예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스 헤파린 결합 도메인)은 전형적으로 HS 수용체(예를 들어, AAV4, AAV5)에 결합하지 않는 캡시드 단백질 서브유닛에 삽입되거나 치환되어 최종 돌연변이체에 헤파린 및/또는 헤파란 설페이트 결합을 부여할 수 있다.
B19는 글로보사이드를 수용체로서 사용하여 1차 적혈구 전구 세포를 감염시킨다(Brown et al., (1993) Science 262: 114). B19의 구조는 8Å 해상도로 결정되었다(Agbandje-McKenna et al., (1994) Virology 203: 106). 글로보사이드에 결합하는 B19 캡시드 영역은 β-배럴 구조 E와 F 사이의 루프 아웃(looped out) 영역(Chipman et al., (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:7502)인 아미노산 399-406 사이에 매핑되었다(Chapman et al., (1993) Virology 194:419). 따라서, B19 캡시드의 글로보사이드 수용체 결합 도메인을 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 내로 치환시켜 단백질 캡시드 또는 이를 포함하는 바이러스 벡터를 적혈구 세포로 표적화할 수 있다.
일부 실시태양에서, 외인성 표적화 서열은 단백질 캡시드 또는 변형된 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 바이러스 벡터의 방향성을 변경하는 펩타이드를 암호화하는 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 일부 실시태양에서, 표적화 펩타이드 또는 단백질은 천연 발생이거나, 또는 대안적으로 완전히 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 예시적인 표적화 서열은 세포 표면 수용체 및 당단백질에 결합하는 리간드 및 다른 펩타이드, 예컨대, ROD 펩타이드 서열, 브래디키닌, 호르몬, 펩타이드 성장 인자(예를 들어, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자 I 및 II 등), 사이토카인, 멜라닌세포 자극 호르몬(예를 들어, a, β 또는 γ), 신경펩타이드 및 엔돌핀 et al., 및 이들의 동족 수용체로 세포를 표적화하는 능력을 보유하는 이의 단편을 포함한다. 다른 예시적인 펩타이드 및 단백질은 물질 P, 각질세포 성장 인자, 신경펩타이드 Y, 가스트린 방출 펩타이드, 인터루킨 2, 계란 흰자 리소자임, 에리트로포이에틴, 고나돌립크린, 코르티코스타틴, β-엔돌핀, leu-엔케팔린, 리모르핀, 알파-네오-엔케팔린, 안지오텐신, 뉴마딘, 혈관활성 장 펩타이드, 뉴로텐신, 모틸린 및 전술한 바와 같은 이들의 단편을 포함한다. 또 다른 대안으로서, 독소(예를 들어, 파상풍 독소 또는 뱀 독소, 예컨대 알파-붕가로톡신 등)로부터의 결합 도메인은 표적화 서열로서 캡시드 단백질 서브유닛 내로 치환될 수 있다. 일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛은 Cleves(Current Biology 7:R318(1997))에 의해 기술된 바와 같은 "비고전적" 수입/수출 신호 펩타이드(예를 들어, 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 인터루킨 1, HIV-1 Tat 단백질, 헤르페스 바이러스 VP22 단백질 등)를 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 내로 치환시켜 변형시킬 수 있다. 또한, 특정 세포에 의한 흡수를 유도하는 펩타이드 모티프도 포함하며, 예를 들어 FVFLP(SEQ ID NO: 22) 펩타이드 모티프는 간 세포에 의한 흡수를 유발한다.
파지 디스플레이 기술 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 기술을 사용하여 임의의 관심 세포 유형을 인식하는 펩타이드를 식별할 수 있다.
표적화 서열은 수용체(예를 들어, 단백질, 탄수화물, 당단백질 또는 프로테오글리칸)를 포함하여, 세포 표면 결합 부위를 표적으로 하는 임의의 펩타이드를 암호화할 수 있다. 세포 표면 결합 부위의 예로는 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 다른 글리코사미노글리칸, 뮤신, 당단백질 및 강글리오사이드에서 발견되는 시알산 모이어티, MHC 1 당단백질, 막 당단백질에서 발견되는 탄수화물 성분, 예컨대, 만노스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민, 푸코스, 갈락토스 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 헤파란 설페이트(HS) 또는 헤파린 결합 도메인은 캡시드 단백질 서브유닛(예를 들어, 그렇지 않으면 HS 또는 헤파린에 결합하지 않는 AAV 단백질 캡시드 서브유닛) 내로 치환된다. HS/헤파린 결합이 아르기닌 및/또는 리신이 풍부한 "염기성 패치"에 의해 매개된다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시태양에서, 모티프 BXXB(SEQ ID NO: 23)를 따르는 서열이 이용될 수 있으며, 여기서 "B"는 염기성 잔기이고 X는 중성 및/또는 소수성 잔기이다. 비제한적인 예로서, BXXB는 RGNR(SEQ ID NO: 24)일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, BXXB는 천연 AAV2 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 위치 262 내지 265 대신에 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 서브유닛의 상응하는 위치(들)에 치환된다.
표 8은 적합한 표적화 서열의 다른 비제한적인 예를 보여준다.
[표 8]
표적화 서열
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Y*는 포스포-Tyr이다
일부 실시태양에서, 표적화 서열은 세포 내로의 진입을 표적화하는 또 다른 분자에 화학적 커플링하기 위해 사용될 수 있는 펩타이드일 수 있다(예를 들어, R 기를 통해 화학적으로 커플링될 수 있는 아르기닌 및/또는 리신 잔기를 포함할 수 있음).
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 단백질 서브유닛 또는 단백질 캡시드는 WO 2006/066066에 기술된 바와 같은 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 AAV2 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 위치 263, 705, 708 및/또는 716에서의 선택적인 아미노산 치환, 또는 또 다른 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 서브유닛의 상응하는 변화(들)를 포함할 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터는 AAV2 캡시드 단백질 서브유닛의 아미노산 위치 264 바로 다음에 선택적인 아미노산 삽입, 또는 다른 AAV로부터의 캡시드 단백질 서브유닛의 상응하는 변화를 포함한다. "아미노산 위치 X 바로 다음"이란, 표시된 아미노산 위치 바로 다음에 삽입이 후속된다는 것을 의미한다(예를 들어, "아미노산 위치 264 다음"은 위치 265에서의 점 삽입 또는 예를 들어, 위치 265 내지 268에 더 큰 삽입 등을 나타낸다).
또한, 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터는 PCT 공개 번호 WO 2010/093784(예를 들어, 2i8) 및/또는 PCT 공개 번호 WO 2014/144229(예를 들어, 이중 글리칸)에 기재된 바와 같은 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터는 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터가 기원하는 AAV 혈청형의 형질도입 효율에 비해 동등하거나 향상된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터는 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터가 기원하는 AAV 혈청형의 형질도입 효율에 비해 감소된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터는 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터가 기원하는 AAV 혈청형의 방향성에 비해 동등하거나 향상된 방향성을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터는 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터가 기원하는 AAV 혈청형의 방향성에 대해 변경된 또는 상이한 방향성을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터는 뇌 조직에 대한 방향성을 갖거나 갖도록 조작될 수 있다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 또는 바이러스 벡터는 간 조직에 대한 방향성을 갖거나 갖도록 조작될 수 있다.
본 명세서에 기술된 AAV 벡터는 이종 핵산을 세포 또는 대상으로 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 변형된 벡터는 리소좀 저장 장애, 예컨대, 점액다당류증 장애(예를 들어, 슬라이(Sly) 증후군[β-글루쿠로니다제], 헐러(Hurler) 증후군[알파-L-이두로니다제], 샤이(Scheie) 증후군[알파-L-이두로니다제], 헐러-샤이 증후군[알파-L-이두로니다제], 헌터(Hunter) 증후군[이두로네이트 설파타제], 산필리포(Sanfilippo) 증후군(A[헤파란 설파미다제], B[N-아세틸글루코사미니다제], C[아세틸-CoA:알파-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제], D[N-아세틸글루코사민 6-설파타제]), 모르퀴오(Morquio) 증후군(A[갈락토스-6-설페이트 설파타제], B[β-갈락토시다제]), 마로토-라미(Maroteaux-Lamy) 증후군[N-아세틸갈락토사민-4-설파타제] 등), 파브리병(a-갈락토시다제), 고셔(Gaucher)병(글루코세레브로시다제), 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 글리코겐 저장 장애(예를 들어, 폼페(Pompe) 병; 리소좀산 알파-글루코시다제)를 치료하는데 사용될 수 있다.
당업자는 일부 AAV 캡시드 단백질 서브유닛의 경우에, 상응하는 아미노산 위치가 바이러스에 부분적으로 또는 완전히 존재하는지 또는 대안적으로 완전히 존재하지 않는지 여부에 따라 상응하는 변형이 삽입 및/또는 치환일 것임을 인식할 것이다.
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 본 명세서에 기술된 변형된 캡시드 단백질 서브유닛 및 단백질 캡시드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 파보바이러스 벡터(예를 들어, 파보바이러스 단백질 캡시드 및/또는 벡터 게놈을 포함함), 예를 들어 AAV 벡터(예를 들어, AAV 단백질 캡시드 및/또는 벡터 게놈을 포함함)이다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 본 명세서에 기술된 변형된 캡시드 단백질 서브유닛 및 벡터 게놈을 포함하는 변형된 AAV 단백질 캡시드를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 (a) 본 명세서에 기술된 변형된 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 변형된 단백질 캡시드(예를 들어, 변형된 AAV 단백질 캡시드); 및 (b) 말단 반복 서열(예를 들어, AAV TR)을 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 말단 반복 서열을 포함하는 핵산은 변형된 단백질 캡시드에 의해 캡시드화된다. 핵산은 선택적으로 2개의 말단 반복부(예를 들어, 2개의 AAV TR)를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 관심 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA를 암호화하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터이다. 재조합 바이러스 벡터는 아래에 더 자세히 기술된다.
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 (i) 변형된 캡시드 단백질 서브유닛이 없는 바이러스 벡터에 의한 형질도입 수준과 비교하여 간의 감소된 형질도입을 갖고; (ii) 변형된 캡시드 단백질 서브유닛이 없는 바이러스 벡터에 의해 관찰된 수준과 비교하여 동물 대상에서 바이러스 벡터에 의한 향상된 전신 형질도입을 나타내거나; (iii) 변형된 캡시드 단백질 서브유닛이 없는 바이러스 벡터에 의한 이동 수준과 비교하여 내피 세포를 가로질러 향상된 이동을 입증하며; 및/또는 (iv) 근육 조직(예를 들어, 골격근, 심장근 및 /또는 횡격막 근육)의 형질도입에서 선택적인 향상을 나타내고, (v) 간 조직의 형질도입에서 선택적인 향상을 나타내고, 및/또는 (vi) 변형된 캡시드 단백질 서브유닛이 없는 바이러스 벡터에 의한 형질도입 수준과 비교하여 뇌 조직(예를 들어, 뉴런)에서 감소된 형질도입을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 간에 대한 전신 형질도입을 갖는다.
일부 실시태양에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 (i) SEQ ID NO: 180 또는 175의 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 전달 카세트를 포함하며; 여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 180의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ IN NO: 175의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 (i) SEQ ID NO 180 또는 175의 서열, 또는 SEQ ID NO: 180 또는 175에 대한 약 1 내지 약 25개 아미노산 돌연변이를 포함하는 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 전달 카세트를 포함하며; 여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 180 또는 175에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 실시태양에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 길이가 약 110 내지 약 160개 뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이이다. 일부 실시태양에서 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는다. 일부 실시태양에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 분리되거나 유래된다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 3' ITR은 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, HSVTK 프로모터, CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, Rous 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 다면체 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터 및 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, 및 HSVTK 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 SEQ ID NO: 3005, SEQ ID NO: 3006, SEQ ID NO: 3007, 또는 SEQ ID NO: 3008 중 어느 하나와 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질이다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 3001의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 3002의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 원숭이 바이러스 40(SV40), rBG, α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 및 소 성장 호르몬(bGH)으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 rBG 폴리아데닐화 신호이다.
일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 3012 또는 SEQ ID NO: 3013과 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 전달 카세트는 인핸서를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 인핸서는 CMV 인핸서이다. 일부 실시태양에서, 인핸서는 SEQ ID NO: 3009의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 전달 카세트는 인트론 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 키메라 서열이다.
일부 실시태양에서, 인트론 서열은 하이브리드 서열이다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SV40으로부터 분리되거나 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SEQ ID NO: 3010-3011 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3014-3019 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
본 명세서에 기술된 변형된 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 및 바이러스 벡터는 천연 상태(즉, 돌연변이가 아니다)로 특정 위치에 지시된 아미노산을 갖는 이런 캡시드 단백질 서브유닛, 단백질 캡시드 및 바이러스 벡터를 배제한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
AAV 전달 카세트
재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터의 생산에 사용되는 AAV 전달 카세트, 핵산 및 플라스미드가 본 명세서에 기술된다. 개시된 카세트, 핵산 및 플라스미드는 하나 이상의 질환 또는 장애의 개선, 치료 및/또는 예방에서 치료 효능을 갖는 하나 이상의 이식유전자를 발현하는데 사용될 수 있는 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' 역 말단 반복부(ITR); 이식유전자; 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, 프로모터, 이식유전자, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, 프로모터, 이식유전자, 폴리아데닐화 서열 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, 프로모터, 이식유전자, 폴리아데닐화 서열 및 3' ITR을 포함하며; 여기서 전달 카세트는 인트론 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, 프로모터, 인트론 서열, 이식유전자, 폴리아데닐화 서열 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 NPC1 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화한다.
역 말단 반복부
역 말단 반복부 또는 ITR 서열은 AAV 프로바이러스 통합을 매개하고 AAV DNA를 비리온으로 패키징하기 위한 서열이다. ITR은 AAV 수명 주기의 다양한 활동에 관여한다. 예를 들어, 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 ITR 서열은 형질감염 후 플라스미드로부터의 절제, 벡터 게놈의 복제, 숙주 세포 게놈으로부터의 통합 및 구조에 역할을 한다.
본 발명의 AAV 전달 카세트는 5' ITR 및 3' ITR을 포함할 수 있다. ITR 서열은 길이가 약 110개 내지 약 160개 뉴클레오타이드, 예를 들어 길이가 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 125, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시태양에서, ITR 서열은 길이가 약 141개 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이이다. 일부 실시태양에서, 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 3' ITR보다 더 길고, 다른 실시태양에서, 3' ITR은 5' ITR보다 더 길다.
ITR은 임의의 AAV, 예를 들어 표 1에 나열된 AAV의 게놈으로부터 분리되거나 유래될 수 있다. 일부 실시태양에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 분리되거나 유래된다. 일부 실시태양에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV 이외의 다른 파보바이러스 종의 구성원으로부터 분리된 야생형 또는 돌연변이된 ITR일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, ITR은 보카바이러스 또는 파보바이러스 B19로부터 분리되거나 유래된 야생형 또는 돌연변이 ITR일 수 있다.
일부 실시태양에서, ITR은 scAAV의 생산을 촉진하기 위한 변형을 포함한다. 일부 실시태양에서, scAAV의 생산을 촉진하기 위한 변형은 ITR로부터 말단 분해 서열(TRS)의 결실이다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 야생형 ITR이고, 3' ITR은 말단 분해 서열이 결여된 돌연변이된 ITR이다. 일부 실시태양에서, 3' ITR은 야생형 ITR이고, 5' ITR은 말단 분해 서열이 결여된 돌연변이된 ITR이다. 일부 실시태양에서, 말단 분해 서열은 5' ITR 및 3' ITR 둘 다에 존재하지 않는다. 다른 실시태양에서, scAAV의 생산을 촉진하기 위한 변형은 ITR을 shRNA-형성 서열과 같은 상이한 헤어핀-형성 서열로 대체하는 것이다.
일부 실시태양에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 3003의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 3' ITR은 SEQ ID NO: 3004의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하고, 3' ITR은 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 하나 이상의 "대리" ITR, 즉 ITR과 동일한 기능을 하는 비-ITR 서열을 포함한다. 예를 들어, Xie, J. et al., Mol. Ther., 25(6): 1363-1374(2017) 참조. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트의 ITR은 대리 ITR로 대체된다. 일부 실시태양에서, 대리 ITR은 헤어핀 형성 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 대리 ITR은 짧은 헤어핀(sh)RNA-형성 서열이다.
프로모터, 인핸서, 리프레서 및 기타 조절 서열
유전자 발현은 주어진 단백질에 대한 코딩 영역에 플랭킹하는 프로모터 및 인핸서라고 하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 제어될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "프로모터"는 작동가능하게 연결된 핵산의 전사를 지시하는 하나 이상의 핵산 조절 서열을 의미한다. 프로모터는 TATA 요소와 같은 전사 시작 부위 근처의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 시스-작용 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
"구조성" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 조건하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발달 조절하에서 활성인 프로모터이다. "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제 2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하며, 여기서 발현 제어 서열은 제 2 서열에 해당하는 핵산의 전사를 지시한다.
유전자 발현은 또한 전사 시작 부위로부터 수천 염기쌍만큼 위치할 수 있는 하나 이상의 말단 "인핸서" 또는 "리프레서" 요소에 의해 제어될 수 있다. 인핸서 또는 리프레서 요소는 인핸서 요소가 전사 시작 위치에서 멀리 떨어져서 작용할 수 있다는 점을 제외하고는, 전사 시작 위치 근처의 시스 작용 요소와 유사한 방식으로 전사를 조절한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트는 프로모터를 포함한다. 이들 프로모터는, 예를 들어, 구조성 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다.
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트에 사용될 수 있는 예시적인 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 로우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 다면체 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터 및 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터를 포함한다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, 및 EF-1 알파 짧은 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 SEQ ID NO: 3005-3008 중 어느 하나로부터 선택된 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트는 인핸서를 포함한다. 인핸서는, 예를 들어, CMV 인핸서일 수 있다. 일부 실시태양에서, 인핸서는 SEQ ID NO: 3009의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트에 사용될 수 있는 예시적인 조직-특이적 프로모터 및 인핸서의 비제한적 목록은 HMG-COA 환원효소 프로모터; 스테롤 조절 요소 1(SRE-1); 포스포에놀 피루베이트 카복시 키나아제(PEPCK) 프로모터; 인간 C-반응성 단백질(CRP) 프로모터; 인간 글루코키나제 프로모터; 콜레스테롤 7-알파 하이드로일라제(CYP-7) 프로모터; 베타-갈락토시다제 알파-2,6 시알릴트랜스퍼라제 프로모터; 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP-1) 프로모터; 알돌라제 B 프로모터; 인간 트랜스페린 프로모터; 콜라겐 유형 I 프로모터; 전립선산 포스파타제(PAP) 프로모터; 94(PSP 94) 프로모터의 전립선 분비 단백질; 전립선 특이적 항원 복합체 프로모터; 인간 선 칼리크레인 유전자 프로모터(hgt-1); 근세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2; 근육 크레아틴 키나아제 프로모터; 췌장염-연관 단백질 프로모터(PAP); 엘라스타제 1 전사 인핸서; 췌장 특이적 아밀라아제 및 엘라스타아제 인핸서 프로모터; 췌장 콜레스테롤 에스테라제 유전자 프로모터; 자궁글로빈 프로모터; 콜레스테롤 측쇄 절단(SCC) 프로모터; 감마-감마 에놀라제(뉴런-특이적 에놀라제, NSE) 프로모터; 신경섬유 중쇄(NF-H) 프로모터; 인간 CGL-1/그랜자임 B 프로모터; 말단 데옥시 트랜스퍼라제(TdT), 람다 5, VpreB 및 lck(림프구 특이적 티로신 단백질 키나아제 p561ck) 프로모터; 인간 CD2 프로모터 및 이의 3' 전사 인핸서; 인간 NK 및 T 세포 특이적 활성화(NKG5) 프로모터; pp60c-src 티로신 키나아제 프로모터; 기관-특이적 신생항원(OSN), mw 40kDa(p40) 프로모터; 결장 특이적 항원-P 프로모터; 인간 알파-락트알부민 프로모터; 포스포에홀피루베이트 카복시키나아제(PEPCK) 프로모터, HER2/neu 프로모터, 카제인 프로모터, IgG 프로모터, 융모막 배아 항원 프로모터, 엘라스타제 프로모터, 포르포빌리노겐 데아미나제 프로모터, 인슐린 프로모터, 성장 호르몬 인자 프로모터, 티로신 하이드록실라제 프로모터, 알부민 프로모터, 알파태아단백질 프로모터, 아세틸-콜린 수용체 프로모터, 알코올 탈수소효소 프로모터, 알파 또는 베타 글로빈 프로모터, T-세포 수용체 프로모터, 오스테오칼신 프로모터, IL-2 프로모터, IL-2 수용체 프로모터, 유청(wap) 프로모터 및 MHC 클래스 II 프로모터를 포함한다.
이식유전자
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트는 표적 세포에서의 발현을 위한 이식유전자를 포함한다.
이식유전자는 관심 있는 임의의 이종 핵산 서열(들)일 수 있다. 이러한 핵산은 치료(예를 들어, 의료 또는 수의학적 용도) 또는 면역원성(예를 들어, 백신) 폴리펩타이드 또는 RNA를 포함하는 폴리펩타이드 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 대안적으로, 핵산은 안티센스 핵산, 리보자임, 스플라이세오솜-매개/램-스플라이싱에 영향을 미치는 RNA, 유전자 침묵을 매개하는 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 포함하는 간섭 RNA(RNAi), 및 기타 번역되지 않은 RNA를 암호화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 핵산 서열은 유전자 편집을 지시할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 가이드 RNA 또는 뉴클레아제와 같은 유전자 편집 분자를 암호화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 핵산은 아연-핑거 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제, TALEN(전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제), NgAgo(아그로노트 엔도뉴클레아제), SGN(구조 유도 엔도뉴클레아제), 또는 RGN( RNA-가이드 뉴클레아제), 예를 들어 Cas9 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제를 암호화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 핵산은 숙주 염색체 상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 이와 재조합할 수 있다. 이 접근법은, 예를 들어, 숙주 세포의 유전적 결함을 교정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 분할 및 비분할 세포를 포함하는 광범위한 세포 내로 이식유전자를 전달하기 위한 수단을 제공한다. 바이러스 벡터는 시험관내에서 세포에 이식유전자를 전달하기 위해, 예를 들어 시험관내에서 또는 생체외 유전자 요법을 위해 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는, 예를 들어, 면역원성 또는 치료적 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA를 발현하기 위해 이를 필요로 하는 대상에게 이식유전자를 전달하는 방법에 추가로 유용하다. 이러한 방식으로, 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA는 대상에서 생체내에서 생산될 수 있다. 대상은 폴리펩타이드가 결핍되어 있기 때문에 대상에게 폴리펩타이드가 필요할 수 있다. 또한, 대상에서 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA의 생산이 일부 유익한 효과를 줄 수 있기 때문에 방법이 실행될 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "기능성 RNA"는 이전 단락에 기술된 것과 같은 세포에서 하나 이상의 기능을 갖는 임의의 비-암호화 RNA 서열을 의미한다.
바이러스 벡터는 또한 배양된 세포 또는 대상에서 관심 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA의 생산을 위한 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 대상을 생물반응기로 사용하여 폴리펩타이드를 생산하거나 예를 들어, 스크리닝 방법과 관련하여 대상에 대한 기능성 RNA의 효과를 관찰할 수 있다).
일반적으로, 본 발명의 바이러스 벡터는 치료용 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA를 전달하는 것이 유익한 임의의 질환 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA를 암호화하는 이식유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 이식유전자는 NPC1을 치료하는 데 유용하다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 NPC1 단백질을 암호화한다. NPC1 단백질은, 예를 들어, 인간 NPC1 단백질일 수 있다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 표 9에 나열된 단일 뉴클레오타이드 변화 중 하나 이상을 포함한다(SEQ ID NO: 3001 또는 3020에 기초한 넘버링). 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 절단된 형태이다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 3001의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 3020의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 3001 또는 3020의 서열을 표 9에 나열된 단일 뉴클레오타이드 변화 중 하나 이상과 함께 SEQ ID NO: 3001 또는 3020의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 UniProt 기탁 번호 O15118에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 3002의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 3002의 서열 또는 이에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 그 이상의 핵산 변화를 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 3020의 아미노산 서열을 암호화한다.
[표 9]
NPC1 변이체 서열
SEQ ID NO: 3001 또는 SEQ ID NO: 3020을 기초로 한 위치 넘버링
Figure pct00022
Figure pct00023
폴리아데닐화(PolyA) 신호
폴리아데닐화 신호는 거의 모든 포유동물 유전자에서 발견되는 뉴클레오타이드 서열이며 유전자 전사체의 3' 말단에 일련의 약 200개의 아데노신 잔기(폴리(A) 꼬리)의 추가를 제어한다. 폴리(A) 꼬리는 mRNA의 안정성에 기여하며 폴리(A) 꼬리가 없는 mRNA는 빠르게 분해된다. 폴리(A) 꼬리의 존재가 번역 개시에 영향을 주어 mRNA의 번역성에 긍정적으로 기여한다는 증거도 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 AAV 전달 카세트는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 원숭이 바이러스 40(SV40), α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 및 소 성장 호르몬(bGH)의 폴리아데닐화 신호로부터 선택될 수 있다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 rBG 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 3012 또는 SEQ ID NO: 3013의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 3012 또는 SEQ ID NO: 3013의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
스터퍼 서열
AAV 벡터는 일반적으로 정의된 크기 범위, 일반적으로 약 4kb 내지 약 5.2kb 또는 약간 더 많은 DNA 삽입물을 허용한다. 따라서, 더 짧은 이식유전자 서열의 경우, AAV 벡터에 허용 가능한 필요한 길이를 달성하기 위해 삽입물 단편에 추가 핵산을 포함하는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 AAV 전달 카세트는 스터퍼 서열을 포함할 수 있다. 스터퍼 서열은 예를 들어 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 1,000-1,500, 1,500-2,000, 2,000-2,500, 2,500- 3,000, 3,000-3,500, 3,500-4,000, 4,000-4,500 내지 4,500-5,000개 뉴클레오타이드 길이 사이의 서열일 수 있다. 스터퍼 서열은 임의의 원하는 위치의 카세트에 위치될 수 있어서 벡터의 기능 또는 활성을 방해하지 않는다.
인트론 서열
일부 실시태양에서, 본 발명의 AAV 전달 카세트는 인트론 서열을 포함할 수 있다. 인트론 서열의 포함은 인트론 서열 부재하에서의 발현과 비교하여 발현을 향상시킬 수 있다. 일부 인트론 서열은 전사 인자의 결합 부위로 기능하지 않고 유전자 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 인트론 서열은 전사 속도, 핵 외이송 및 전사 안정성에 영향을 주어 전사 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 mRNA 번역의 효율을 증가시킨다.
일부 실시태양에서, 인트론 서열은 하이브리드 또는 키메라 서열이다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SV40, β-글로빈, 닭 베타-액틴, 마우스 미세 바이러스(MVM), 인자 IX, 및/또는 인간 IgG(중쇄 또는 경쇄)의 하나 이상의 인트론 서열로부터 분리되거나 유래된다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SV40으로부터 분리되거나 유래된다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 키메라이다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SEQ ID NO: 3010 또는 SEQ ID NO: 3011의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
인트론 서열은 AAV 벡터의 생성을 방해하지 않는 전달 카세트의 아무 곳에나 위치될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 프로모터와 이식유전자 사이에 위치될 수 있다.
예시적 AAV 전달 카세트
일부 실시태양에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트는 5' 역 말단 반복부(ITR), 프로모터, 이식유전자, 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트는 5' 역 말단 반복부(ITR), 프로모터, 인트론 서열, 이식유전자, 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 NPC1 단백질을 암호화한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 인핸서를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 인트론 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하고 3' ITR은 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인핸서는 SEQ ID NO: 3009의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 SEQ ID NO: 3005-3008 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SEQ ID NO: 3010 또는 3011의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 3002의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리A 신호는 SEQ ID NO: 3012 또는 3013의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3014-3019 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, CBA 프로모터, SV40 인트론, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, SV40 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, GUSB240 프로모터, 키메라 인트론, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, rBG 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, GUSB379 프로모터, SV40 인트론, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, rBG 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, GUSB240 프로모터, 키메라 인트론, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, SV40 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, GUSB240 프로모터, SV40 인트론, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, SV40 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, CMV 인핸서, HSVTK 프로모터, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, rBG 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하는 5' ITR, SEQ ID NO: 3005의 서열을 포함하는 CBA 프로모터, SEQ ID NO: 3010의 서열을 포함하는 SV40 인트론, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 3001)을 암호화하는 이식유전자, SEQ ID NO: 3012를 포함하는 SV40 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하는 5' ITR, SEQ ID NO: 3006의 서열을 포함하는 GUSB240 프로모터, SEQ ID NO: 3011을 포함하는 키메라 인트론, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 3001), SEQ ID NO: 3013을 포함하는 rBG 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하는 5' ITR, SEQ ID NO: 3006을 포함하는 GUSB379 프로모터, SEQ ID NO: 3010의 서열을 포함하는 SV40 인트론, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 3001), SEQ ID NO: 3013을 포함하는 rBG 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하는 5' ITR, SEQ ID NO: 3007을 포함하는 GUSB240 프로모터, SEQ ID NO: 3011의 서열을 포함하는 키메라 인트론, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 3001), SEQ ID NO: 3012를 포함하는 SV40 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하는 5' ITR, SEQ ID NO: 3006을 포함하는 GUSB240 프로모터, SEQ ID NO: 3010의 서열을 포함하는 SV40 인트론, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 3001), SEQ ID NO: 3012를 포함하는 SV40 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하는 5' ITR, CMV 인핸서, SEQ ID NO: 3008을 포함하는 HSVTK 프로모터, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 3001)을 암호화하는 이식유전자, SEQ ID NO: 3013을 포함하는 rBG 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, 핵산은 AAV 전달 카세트를 포함한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 이식유전자를 포함하고, 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 3001의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 이식유전자를 포함하고, 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 3020의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하며; 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 3001 또는 SEQ ID NO: 3020의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하며; 여기서 핵산은 인트론 서열을 포함하며; 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 3001 또는 SEQ ID NO: 3020의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 닭 베타-액틴 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하며; 여기서 이식유전자는 인트론 서열을 포함하며; 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 3001 또는 SEQ ID NO: 3020의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 인트론 서열; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하며; 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 3001 또는 SEQ ID NO: 3020의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 닭 베타-액틴 프로모터; 인트론 서열; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하며; 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 3001 또는 SEQ ID NO: 3020의 아미노산 서열을 암호화한다. 본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 백미드)에 포함될 수 있다. 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 백미드)는, 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 단백질 서열을 포함하는 AAV의 생산 동안 사용되는 하나 이상의 유전적 요소를 추가로 포함할 수 있다.
바이러스 벡터를 생산하는 방법
바이러스 벡터를 생산하는 방법이 본 발명에 또한 제공된다. 일부 실시태양에서, 중화 항체를 회피하는 AAV 벡터를 생산하는 방법은 a) AAV 캡시드 단백질 서브유닛 또는 단백질 캡시드 상에 3차원 항원 발자국을 형성하는 접촉 아미노산 잔기를 식별하는 단계; b) (a)에서 식별된 접촉 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛의 라이브러리를 생성하는 단계; c) (b)의 AAV 캡시드 단백질 서브유닛의 라이브러리로부터 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 AAV 입자를 생산하는 단계; d) 감염 및 복제가 일어날 수 있는 조건하에서 (c)의 AAV 입자를 세포와 접촉시키는 단계; e) 적어도 하나의 감염 주기를 완료하고 대조군 AAV 입자와 유사한 역가로 복제할 수 있는 AAV 입자를 선택하는 단계: 1) 감염 및 복제가 일어날 수 있는 조건하에서 (e)에서 선택된 AAV 입자를 중화 항체 및 세포와 접촉시키는 단계; 및 g) (f)의 중화 항체에 의해 중화되지 않는 AAV 입자를 선택하는 단계를 포함한다. 접촉 아미노산 잔기를 식별하는 방법의 비제한적인 예는 펩타이드 에피토프 매핑 및/또는 극저온 전자 현미경검사법을 포함한다.
3차원 항원 발자국 내에서 항체 접촉 잔기의 해상력 및 식별은 추가 선택 및/또는 스크리닝을 통해 식별될 수 있는 항체 회피성 AAV 단백질 캡시드 및/또는 캡시드 단백질 서브유닛을 생성하기 위해 무작위(random), 합리적 및/또는 축퇴성 돌연변이유발을 통한 후속 변형을 가능하게 한다.
따라서, 일부 실시태양에서, 중화 항체를 회피하는 AAV 벡터를 생성하는 방법은 a) AAV 캡시드 단백질 서브유닛 및/또는 단백질 캡시드 상에 3차원 항원 발자국을 형성하는 접촉 아미노산 잔기를 식별하는 단계; b) 무작위, 합리적 및/또는 축퇴성 돌연변이유발에 의한, (a)에서 식별된 접촉 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 생성하는 단계; c) (b)의 AAV 캡시드 단백질 서브유닛으로부터 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 AAV 입자를 생산하는 단계; d) 감염 및 복제가 일어날 수 있는 조건하에서 (c)의 AAV 입자를 세포와 접촉시키는 단계; e) 적어도 하나의 감염 주기를 완료하고 대조군 AAV 입자와 유사한 역가로 복제할 수 있는 AAV 입자를 선택하는 단계; f) 감염 및 복제가 일어날 수 있는 조건하에서 (e)에서 선택된 AAV 입자를 중화 항체 및 세포와 접촉시키는 단계; 및 g) (f)의 중화 항체에 의해 중화되지 않는 AAV 입자를 선택하는 단계를 포함한다.
접촉 아미노산 잔기를 식별하는 방법의 비제한적 예는 펩타이드 에피토프 매핑 및/또는 극저온 전자 현미경검사법을 포함한다. 무작위, 합리적 및/또는 축퇴성 돌연변이유발에 의한 접촉 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
이러한 포괄적인 접근 방식은 임의의 AAV 단백질 캡시드 및/또는 캡시드 단백질 서브유닛을 변형시키는 데 적용될 수 있는 플랫폼 기술을 제시한다. 이 플랫폼 기술을 적용하면 형질도입 효율의 손실 없이 원래 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 주형에서 유래된 AAV 항원 변이체를 산출한다. 한 가지 장점이자 이점으로서, 이 기술의 적용은 AAV 벡터를 사용한 유전자 요법에 적격인 환자 코호트를 확대할 것이다.
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터를 생산하는 방법은 (a) 적어도 하나의 TR 서열(예를 들어, AAV TR 서열)을 포함하는 핵산 주형, 및 (b) 핵산 주형의 복제 및 AAV 단백질 캡시드 내로 캡시드화에 충분한 AAV 서열(예를 들어, AAV rep 서열 및 AAV 캡시드 서브유닛을 암호화하는 AAV cap 서열)을 세포에 제공하는 것을 포함한다. 선택적으로, 핵산 주형은 적어도 하나의 이종 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 핵산 주형은 이종 핵산 서열(존재하는 경우)에 대해 5' 및 3'에 위치하는 2개의 AAV ITR 서열을 포함하지만, 이 ITR 서열은 이종 핵산 서열에 직접 인접할 필요는 없다.
핵산 주형 및 AAV rep 및 cap 서열은 AAV 단백질 캡시드 내에 패키징된 핵산 주형을 포함하는 바이러스 벡터가 세포에서 생산되도록 하는 조건하에서 제공된다. 방법은 세포로부터 바이러스 벡터를 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 배지로부터 수집될 수 있고, 및/또는 세포를 용해시켜 수집할 수 있다.
세포는 AAV 바이러스 복제를 허용하는 세포일 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 세포가 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 포유류 세포이다. 또 다른 옵션으로서, 세포는 복제-결함 헬퍼 바이러스로부터 결실된 기능을 제공하는 트랜스-보완 패키징 세포주, 예를 들어, 293 세포 또는 다른 E1a 트랜스-보완 세포일 수 있다.
AAV 복제 및 캡시드 단백질 서브유닛 서열은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제공될 수 있다. 현행 프로토콜은 전형적으로 단일 플라스미드에서 AAV rep/cap 유전자를 발현한다. AAV 복제 및 패키징 서열은 함께 제공될 필요는 없지만, 그렇게 하는 것이 편리할 수 있다. AAV rep 및/또는 cap 서열은 임의의 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, rep/cap 서열은 혼성 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터(예를 들어, 결실된 아데노바이러스 벡터의 E1a 또는 E3 영역에 삽입됨)에 의해 제공될 수 있다. 또한, AAV cap 및 rep 유전자를 발현하기 위해 EBV 벡터가 사용될 수도 있다. 이 방법의 한 가지 장점은 EBV 벡터가 에피솜이지만, 연속적인 세포 분열 전반에 걸쳐 높은 카피 수를 유지할 것이라는 점이다(즉, "EBV 기반의 핵 에피솜"으로 표시된 염색체외 요소로서 세포에 안정적으로 통합되며, Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67 참조).
추가 대안으로서, rep/cap 서열은 세포에 안정적으로 통합될 수 있다.
전형적으로 AAV rep/cap 서열은 이들 서열의 구조(rescue) 및/또는 패키징을 방지하기 위해 TR에 의해 플랭킹되지 않을 것이다.
핵산 주형은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 주형은 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 의해 공급될 수 있다. 일부 실시태양에서, 핵산 주형은 헤르페스바이러스 또는 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 결실된 아데노바이러스의 E1a 또는 E3 영역 내로 삽입됨)에 의해 공급된다. 다른 예시로서, Palombo et al., (1998) J. Virology 72:5025는 AAV TR에 의해 플랭킹된 리포터 유전자를 운반하는 바큘로바이러스 벡터를 기술한다. EBV 벡터는 또한 rep/cap 유전자와 관련하여 상기 기술된 바와 같이 주형을 전달하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 핵산 주형은 복제성 rAAV 바이러스에 의해 제공된다. 일부 실시태양에서, 핵산 주형을 포함하는 AAV 프로바이러스는 세포의 핵 내로 안정적으로 통합된다.
바이러스 역가를 향상시키기 위해, 생산적인 AAV 감염을 촉진하는 헬퍼 바이러스 기능(예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)이 세포에 제공될 수 있다. AAV 복제에 필요한 헬퍼 바이러스 서열은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 이들 서열은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터에 의해 제공될 것이다. 대안적으로, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 서열은 다른 비-바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해, 예를 들어, Ferrari et al., (1997) Nature Med. 3: 1295, 및 미국 특허 제6,040,183호 및 제6,093,570호에 기술된 바와 같이 효율적인 AAV 생산을 촉진하는 모든 헬퍼 유전자를 운반하는 비감염성 아데노바이러스 미니플라스미드로서 제공될 수 있다.
추가로, 헬퍼 바이러스 기능은 헬퍼 서열이 염색체에 내장되거나 안정한 염색체외 요소로서 유지되는 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다. 일반적으로, 헬퍼 바이러스 서열은 AAV 비리온 내로 패키징될 수 없고, 예를 들어 ITR에 의해 플랭킹되지 않는다.
당업계의 기술자는 단일 헬퍼 구조체에 AAV 복제 및 캡시드 단백질 서브유닛 서열 및 헬퍼 바이러스 서열(예를 들어, 아데노바이러스 서열)을 제공하는 것이 유리할 수 있음을 이해할 것이다. 이 헬퍼 구조체는 비-바이러스성 또는 바이러스성 구조체일 수 있다. 하나의 비제한적인 예시로서, 헬퍼 구조체는 AAV rep/cap 유전자를 포함하는 혼성 아데노바이러스 또는 혼성 헤르페스바이러스일 수 있다.
일부 실시태양에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. 이 벡터는 핵산 주형을 추가로 포함할 수 있다. AAV rep/cap 서열 및/또는 rAAV 주형은 아데노바이러스의 결실된 영역(예를 들어, E1a 또는 E3 영역)에 삽입될 수 있다.
일부 실시태양에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. 이 실시태양에 따르면, rAAV 주형은 플라스미드 주형으로 제공될 수 있다.
일부 실시태양에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 제공되고, rAAV 주형은 프로바이러스로서 세포에 통합된다. 대안적으로, rAAV 주형은 염색체외 요소(예를 들어, EBV 기반 핵 에피솜)로서 세포 내에 유지되는 EBV 벡터에 의해 제공된다.
일부 실시태양에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼에 의해 제공된다. rAAV 주형은 별도의 복제 바이러스 벡터로서 제공될 수 있다. 예를 들어, rAAV 주형은 rAAV 입자 또는 제 2 재조합 아데노바이러스 입자에 의해 제공될 수 있다.
상기 방법에 따르면, 혼성 아데노바이러스 벡터는 전형적으로 아데노바이러스 복제 및 패키징에 충분한 아데노바이러스 5' 및 3' 시스 서열(즉, 아데노바이러스 말단 반복부 및 PAC 서열)을 포함한다. AAV rep/cap 서열 및 존재하는 경우 rAAV 주형은 아데노바이러스 백본에 내장되고 5' 및 3' 시스 서열에 의해 플랭킹되어, 이들 서열은 아데노바이러스 단백질 캡시드 내로 패키징될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 아데노바이러스 헬퍼 서열 및 AAV rep/cap 서열은 일반적으로 ITR에 의해 플랭킹되지 않아서 이들 서열은 AAV 비리온으로 패키징되지 않는다. Zhang et al.,((2001) Gene Ther. 18:704-12)은 아데노바이러스와 AAV rep 및 cap 유전자를 모두 포함하는 키메라 헬퍼를 기술한다.
헤르페스바이러스는 또한 AAV 패키징 방법에서 헬퍼 바이러스로서 사용될 수도 있다. AAV Rep 단백질(들)을 암호화하는 혼성 헤르페스바이러스는 유리하게는 확장가능한(scalable) AAV 벡터 생산 계획을 촉진할 수 있다. AAV-2 rep 및 cap 유전자를 발현하는 혼성 단순 포진 바이러스 I형(HSV-1) 벡터는 기술되어 있다(Conway et al., (1999) Gene Therapy 6:986 및 WO 00/17377).
추가 대안으로서, 바이러스 벡터는 예를 들어 Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13: 1935-43에 기술된 바와 같이 rep/cap 유전자 및 rAAV 주형을 전달하기 위해 바큘로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 생산될 수 있다.
오염성 헬퍼 바이러스가 없는 AAV 벡터 스톡은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, AAV와 헬퍼 바이러스는 크기에 기반하여 쉽게 구별할 수 있다. AAV는 또한 헤파린 기질에 대한 친화도에 기초하여 헬퍼 바이러스로부터 분리될 수 있다(Zolotukhin 등 (1999) Gene Therapy 6:973). 결실된 복제 결함 헬퍼 바이러스가 사용될 수 있어서 임의의 오염성 헬퍼 바이러스는 복제 능력이 없다. 추가 대안으로서, 아데노바이러스 초기 유전자 발현만이 AAV 바이러스의 패키징을 매개하기 위해 필요하기 때문에, 후기 유전자 발현이 결여된 아데노바이러스 헬퍼가 사용될 수 있다. 후기 유전자 발현에 결함이 있는 아데노바이러스 돌연변이체(예를 들어, ts100K 및 ts149 아데노바이러스 돌연변이체)는 당업계에 공지되어 있다.
재조합 바이러스 벡터
본 명세서에 기술된 바이러스 벡터는 시험관내, 생체외 및 생체내에서 세포로 핵산을 전달하는데 유용하다. 특히, 바이러스 벡터는 포유류를 비롯한 동물 세포에 핵산을 전달하거나 전이시키는 데 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 핵산은 본 명세서에 기술된 단백질 캡시드에 의해 캡시드화될 수 있다. 일부 실시태양에서, 핵산은 전달 카세트이다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트는 벡터 게놈(예를 들어, 5' ITR, 이식유전자, 및 3' ITR)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 AAV 전달 카세트이다.
바이러스 벡터에 의해 전달되는 전달 카세트는 관심 임의의 이종 핵산 서열(들)일 수 있다. 관심 핵산은 치료(예를 들어, 의학적 또는 수의학적 용도를 위한) 또는 면역원성(예를 들어, 백신용) 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 RNA를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트는 5' ITR 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트는 5' ITR, 이식유전자, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 치료 단백질 또는 RNA를 암호화한다.
치료용 폴리펩타이드는 낭포성 섬유증 막관통 조절 단백질(CFTR), 디스트로핀(미니 및 마이크로 디스트로핀 포함, 예를 들어 Vincent et al., (1993) Nature Genetics 5: 130; 미국 특허 공개 번호 2003/017131; 국제 공개 WO/2008/088895; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13714-13719(2000); 및 Gregorevic et al., Mol. Ther. 16:657-64(2008) 참조), 미오스타틴 프로펩타이드, 폴리스타틴, 액티빈 유형 11 가용성 수용체, IGF-1, 아포지단백질, 예컨대, apoA(apoA1, apoA2, apoA4, apoA-V), apoB(apoB100, ApoB48), apoC(apoCI, apoCII, apoCIII, apoCIV), apoD, apoE, apoH, apoL, apo(a), 항염증성 폴리펩타이드, 예컨대 Ikappa B 우성 돌연변이, 아밀로이드 베타, 타우, 사르코스판, 유트로핀(Tinsley et al., (1996) Nature 384:349), 미니-유트로핀, 응고 인자(예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X 등), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 카탈라제, 티로신 하이드록실라제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, LDL 수용체, 지단백 리파제, 프로그래뉼린, 오르니틴 트랜스카바밀라제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린, 알파-1-항트립신, 아데노신 데아미나제, 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, β-글루코세레브로시다제, 바테닌, 스핑고미엘리나제, 리소좀 헥소사미니다제 A, 분지쇄 케토산 탈수소효소, 프라탁신, RP65 단백질, 사이토카인(예를 들어, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 감마-인터페론, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 알파 시누클레인, 파킨, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 림프독소 등), 펩타이드 성장 인자, 신경영양 인자 및 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경영양 인자-3 및 -4, 뇌 유래 신경영양 인자, 골형성 단백질[RANKL 및 VEGF 포함], 신경교 유래 성장인자, 형질전환 성장인자 -α 및 -β 등), 헌팅긴(huntingin), 리소좀 산 알파-글루코시다제, 이두로네이트-2-설파타제, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제, 알파-갈락토시다제 A, 수용체(예를 들어, 종양 괴사 성장 인자 가용성 수용체), S100A1, 유비퀴틴 단백질 리가제 E3, 파르브알부민, 아데닐릴 사이클라제 6형, 칼슘 처리를 조절하는 분자(예를 들어, SERCA2A, PP1의 억제제 1 및 이의 단편[예를 들어, WO 2006/029319 및 WO 2007/100465]), 절두된 구성적 활성 bARKct와 같은 G-단백질 커플링된 수용체 키나제 2형 녹다운(knockdown)에 영향을 미치는 분자, 항염증 인자, 예컨대, IRAP, 항-미오스타틴 단백질, 아스파르토아실라제, 단클론 항체(단일 사슬 단클론 항체 포함; 예시적인 Mab는 Herceptin® Mab임), 신경펩타이드 및 이의 단편[예를 들어, 갈라닌, Neuropeptide Y(미국 제7,071,172호 참조)], 혈관신생 억제제, 예컨대 바소히빈(Vasohibin) 및 기타 VEGF 억제제(예를 들어, Vasohibin 2[WO JP2006/073052 참조])를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 예시적인 이종 핵산 서열은 자살 유전자 산물(예를 들어, 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소 및 종양 괴사 인자), 숙주 인자의 전사를 향상 또는 억제하는 단백질(예를 들어, 전사 인핸서 또는 억제제 요소에 연결된 뉴클레아제-사멸 Cas9, 전사 인핸서 또는 억제제 요소에 연결된 아연-핑거 단백질, 전사 인핸서 또는 억제제 요소에 연결된 전사 활성인자-유사(TAL) 이펙터), 암 치료법에 사용되는 약물에 대한 내성을 부여하는 단백질, 종양 억제 유전자 산물(예를 들어, p53, Rb, Wt-1), TRAIL, FAS-리간드, 및 이를 필요로 하는 대상에서 치료 효과를 갖는 임의의 다른 폴리펩타이드를 암호화한다. AAV 벡터는 또한 단클론 항체 및 항체 단편, 예를 들어 미오스타틴에 대해 지향성인 항체 또는 항체 단편(예를 들어, Fang et al., Nature Biotechnology 23:584-590 (2005) 참조)을 전달하는데 사용될 수도 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열은 리포터 폴리펩타이드(예를 들어, 효소)를 암호화하는 것을 포함한다. 리포터 폴리펩타이드는 당업계에 공지되어 있으며 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제, 알칼리 포스파타제, 루시페라제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
선택적으로, 이종 핵산은 분비된 폴리펩타이드(예를 들어, 천연 상태에서 분비된 폴리펩타이드이거나, 또는 예를 들어 당업계에 공지된 바와 같은 분비 신호 서열과 작동가능한 결합에 의해 분비되도록 조작된 폴리펩타이드)를 암호화한다.
대안적으로, 일부 실시태양에서, 이종 핵산은 안티센스 핵산, 리보자임(예를 들어, 미국 특허 제5,877,022호에 기재된 바와 같음), 스플라이세오솜(spliceosome)-매개/ram-스플라이싱(ram-splicing)에 영향을 미치는 RNA(Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; 미국 특허 제6,013,487호, 미국 특허 제6,083,702호), 유전자 침묵을 매개하는 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 포함하는 간섭 RNA(RNAi)(Sharp et al., (2000) Science 287:2431 참조), 및 다른 비해독 RNA, 예컨대, "가이드" RNA(Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; Yuan 등에게 허여된 미국 특허 제5,869,248호) 등을 암호화할 수 있다. 예시적인 비해독 RNA는 다중 약물 내성(MDR) 유전자 산물에 대한 RNAi(예를 들어, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위해 및/또는 화학요법에 의한 손상을 방지하기 위해 심장 투여용으로), 미오스타틴에 대한 RNAi(예를 들어, 뒤센 근이영양증을 위한), VEGF에 대한 RNAi(예를 들어, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위해), 포스포람반에 대한 RNAi(예를 들어, 심혈관 질환 치료용, 예를 들어, Andino et al., J. Gene Med. 10: 132-142(2008) 및 Li et al., Acta Pharmacol Sin. 26:51-55(2005) 참조); 포스포람반 억제 또는 우성-음성 분자, 예컨대 포스포람반 S16E[예를 들어, 심혈관 질환을 치료하기 위해, 예를 들어, Hoshijima 등 Nat. Med. 8:864-871(2002) 참조], 아데노신 키나제에 대한 RNAi(예를 들어, 간질용), 및 병원성 유기체 및 바이러스에 대해 지향성인 RNAi(예를 들어, B형 및/또는 C형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, CMV, 단순 포진 바이러스, 인간 유두종 바이러스 등)를 포함한다.
또한, 대안적 스플라이싱을 유도하는 핵산 서열이 전달될 수 있다. 예시하는 것으로, 디스트로핀 엑손 51의 5' 및/또는 3' 스플라이스 부위에 상보적인 안티센스 서열(또는 다른 억제 서열)은 U1 또는 U7 소형 핵(sn) RNA 프로모터와 함께 전달되어 이 엑손의 스키핑(skipping)을 유도할 수 있다. 예를 들어, 안티센스/억제 서열(들)의 5'에 위치한 U1 또는 U7 snRNA 프로모터를 포함하는 DNA 서열은 변형된 캡시드에 패키징되어 전달될 수 있다.
일부 실시태양에서, 유전자 편집을 유도하는 핵산 서열이 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 가이드 RNA를 암호화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 가이드 RNA는 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)이다. 일부 실시태양에서, 핵산은 뉴클레아제를 암호화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 뉴클레아제는 아연-핑거 뉴클레아제, 귀환(homing) 엔도뉴클레아제, TALEN(전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제), NgAgo(아그로노트 엔도뉴클레아제), SGN(구조 유도 엔도뉴클레아제), RGN(RNA-유도 뉴클레아제), 또는 이의 변형된 또는 절두된 변이체이다. 일부 실시태양에서, RNA-유도 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, Cas12(a) 뉴클레아제(Cpf1), Cas12b 뉴클레아제, Cas12c 뉴클레아제, TrpB-유사 뉴클레아제, Cas13a 뉴클레아제(C2c2), Cas13b 뉴클레아제, 이들의 변형된 또는 절두된 변이체이다. 일부 실시태양에서, Cas9 뉴클레아제는 S. 피오게네스(S. pyogenes) 또는 S. 아우레우스(S. aureus)로부터 분리되거나 유래된다.
일부 실시태양에서, 유전자 녹다운을 지시하는 핵산 서열이 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 핵산을 암호화할 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 숙주 염색체 상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 재조합하는 이종 핵산을 포함할 수 있다. 이 접근법은 예를 들어 숙주 세포의 유전자 결함을 교정하는 데 사용될 수 있다.
또한, 예를 들어 백신접종을 위해, 면역원성 폴리펩타이드를 발현하는 바이러스 벡터도 제공된다. 핵산은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 시미안 면역결핍 바이러스(SIV), 인플루엔자 바이러스, HIV 또는 SIV gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 관심 있는 임의의 면역원을 암호화할 수 있다.
백신 벡터로서 파르보바이러스의 사용은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Miyamura et al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci USA 91:8507; Young 등에게 특허 허여된 미국 특허 제5,916,563호, Mazzara 등에게 특허 허여된 미국 특허 제5,905,040호, Samulski 등에게 특허 허여된 미국 특허 제5,882,652호, 미국 특허 제5,863,541호 참조). 항원은 파르보바이러스 캡시드에 존재할 수 있다.
대안적으로, 항원은 재조합 벡터 게놈 내로 도입된 이종 핵산으로부터 발현될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 및/또는 당업계에 공지된 바와 같은 관심 있는 임의의 면역원은 본 명세서에 기술된 바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다.
면역원성 폴리펩타이드는 미생물, 박테리아, 원생동물, 기생충, 진균 및/또는 바이러스 감염 및 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 감염 및/또는 질환에 대해 면역 반응을 유도하고/하거나 대상을 보호하기에 적합한 임의의 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 면역원성 폴리펩타이드는 오르토믹소바이러스 면역원(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 면역원, 예컨대 인플루엔자 바이러스 혈구응집소(HA) 표면 단백질 또는 인플루엔자 바이러스 핵단백질, 또는 말 인플루엔자 바이러스 면역원) 또는 렌티바이러스 면역원(예를 들어, 말 감염성 빈혈 바이러스 면역원, 시미안 면역결핍 바이러스(SIV) 면역원, 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 면역원, 예컨대, HIV 또는 SIV 엔벨로프 GP 160 단백질, HIV 또는 SIV 기질/캡시드 단백질, 및 HIV 또는 SIV gag, pol 및 env 유전자 산물)일 수 있다. 면역원성 폴리펩타이드는 또한 아레나바이러스 면역원(예를 들어, 라사(Lassa) 발열 바이러스 면역원, 예컨대 라사 발열 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 및 라사 발열 엔벨로프 당단백질), 폭스바이러스 면역원(예를 들어, 백시니아 LI 또는 L8 유전자 산물과 같은 백시니아 바이러스 면역원), 플라비바이러스 면역원(예를 들어, 황열병 바이러스 면역원 또는 일본 뇌염 바이러스 면역원), 필로바이러스 면역원(예를 들어, 에볼라 바이러스 면역원, 또는 Marburg 바이러스 면역원, 예컨대, NP 및 GP 유전자 산물), 부냐바이러스 면역원(예를 들어, RVFV, CCHF 및/또는 SFS 바이러스 면역원), 또는 코로나바이러스 면역원(예를 들어, 감염성 인간 코로나바이러스 면역원, 예컨대, 인간 코로나바이러스 엔벨로프 당단백질, 또는 돼지 전염성 위장염 바이러스 면역원, 또는 조류 감염성 기관지염 바이러스 면역원)일 수도 있다. 면역원성 폴리펩타이드는 추가로 소아마비 면역원, 헤르페스 면역원(예를 들어, CMV, EBV, HSV 면역원), 볼거리 면역원, 홍역 면역원, 풍진 면역원, 디프테리아 독소 또는 다른 디프테리아 면역원, 백일해 항원, 간염(예를 들어, A형 간염, B형 간염, C형 간염 등) 면역원, 및/또는 현재 당업계에 공지되어 있거나 향후에 면역원으로서 식별되는 임의의 다른 백신 면역원일 수도 있다.
대안적으로, 면역원성 폴리펩타이드는 임의의 종양 또는 암 세포 항원일 수 있다. 선택적으로, 종양 또는 암 항원은 암 세포의 표면에서 발현된다.
예시적인 암 및 종양 세포 항원은 S.A. Rosenberg(Immunity 10:281(1991))에 기재되어 있다. 다른 예시적인 암 및 종양 항원으로는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: BRCA1 유전자 산물, BRCA2 유전자 산물, gp100, 티로시나제, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, LAGE, NY-ESO-1, CDK-4, β-카테닌, MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, FRAME, p15, 흑색종 종양 항원(Kawakami et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515; Kawakami et al.,(1994) J. Exp. Med., 180:347; Kawakami et al., (1994) Cancer Res. 54:3124), MART-1, gp100, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, TRP-1, TRP-2, P-15, 티로시나제(Brichard et al., (1993) J Exp. Med. 178:489); HER-2/neu 유전자 산물(미국 특허 제 4,968,603호), CA 125, LK26, FB5(엔도시알린), TAG 72, AFP, CA 19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN(시알릴 Tn 항원), c-erbB-2 단백질, PSA, L-CanAg, 에스트로겐 수용체, 유지방 글로불린, p53 종양 억제인자 단백질(Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623); 뮤신 항원(국제 특허 공개 번호 WO 90/05142); 텔로머라제; 핵 기질 단백질; 전립선산 포스파타제; 유두종 바이러스 항원; 및/또는 다음 암과 관련이 있는 것으로 현재 알려져 있거나 향후에 발견될 항원: 흑색종, 선암종, 흉선종, 림프종(예를 들어, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종), 육종, 폐암, 간암, 결장암, 백혈병, 자궁 암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 췌장암, 뇌암 및 현재 알려져 있거나 향후에 식별되는 임의의 다른 암 또는 악성 상태 또는 이의 전이(예를 들어, Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91 참조).
추가 대안으로서, 이종 핵산은 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포에서 바람직하게 생산되는 임의의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 배양된 세포 내로 도입될 수 있고, 이로부터 발현된 유전자 산물이 분리될 수 있다.
관심 있는 이종 핵산(들)이 적절한 제어 서열과 작동가능하게 관련될 수 있다는 것은 당업계의 기술자라면 알고 있을 것이다. 예를 들어, 이종 핵산은 전사/번역 제어 신호, 복제 기점, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 프로모터 및/또는 인핸서 등과 같은 발현 제어 요소와 작동가능하게 관련될 수 있다.
또한, 관심 있는 이종 핵산(들)의 조절된 발현은, 예를 들어, 특정 부위에서 스플라이싱 활성을 선택적으로 차단하는 올리고뉴클레오타이드, 소분자 및/또는 다른 화합물의 존재 또는 부재에 의해 상이한 인트론의 선택적 스플라이싱을 조절함으로써, 전사후 수준에서 달성될 수 있다(예를 들어, WO 2006/119137에 기술됨).
당업계의 기술자는 원하는 조직-특이적 발현 및 수준에 따라 다양한 프로모터/인핸서 요소가 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 프로모터/인핸서는 원하는 발현 패턴에 따라 구성적이거나 유도성일 수 있다. 프로모터/인핸서는 천연 또는 외래일 수 있고, 천연 서열 또는 합성 서열일 수 있다. 외래란, 전사 개시 영역이 도입된 야생형 숙주에서 그 전사 개시 영역이 발견되지 않는 것을 의미한다.
일부 실시태양에서, 프로모터/인핸서 요소는 치료될 표적 세포 또는 대상에게 천연일 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로모터/인핸서 요소는 이종 핵산 서열에게 천연일 수 있다. 프로모터/인핸서 요소는 일반적으로 관심 표적 세포(들)에서 기능하도록 선택된다. 추가로, 일부 실시태양에서, 프로모터/인핸서 요소는 포유류 프로모터/인핸서 요소이다. 프로모터/인핸서 요소는 구성적이거나 유도성일 수 있다.
유도성 발현 제어 요소는 전형적으로 이종 핵산 서열(들)의 발현에 대해 조절을 제공하는 것이 바람직한 적용예에서 유리하다. 유전자 전달을 위한 유도성 프로모터/인핸서 요소는 조직-특이적 또는 -선호 프로모터/인핸서 요소일 수 있으며, 근육 특이적 또는 선호(심장, 골격 및/또는 평활근 특이적 또는 선호 포함), 신경 조직 특이적 또는 선호(뇌-특이적 또는 선호 포함), 눈 특이적 또는 선호(망막-특이적 및 각막-특이적 포함), 간 특이적 또는 선호, 골수 특이적 또는 선호, 췌장 특이적 또는 선호, 비장 특이적 또는 선호, 폐 특이적 또는 선호 프로모터/인핸서요소를 포함한다. 다른 유도성 프로모터/인핸서 요소로는 호르몬 유도성 및 금속 유도성 요소를 포함한다. 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 Tet 온/오프 요소, RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
이종 핵산 서열(들)이 전사된 다음, 표적 세포에서 해독되는 일부 실시태양에서, 삽입된 단백질 암호 서열의 효율적인 해독을 위해 특정 개시 신호가 일반적으로 포함된다. ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있는 이러한 외인성 해독 제어 서열은 천연 및 합성 둘 모두인 다양한 기원의 서열일 수 있다.
본 명세서에 기술된 바이러스 벡터는 이종 핵산을 분열 세포 및 비분열 세포를 비롯한 광범위한 세포 내로 전달하기 위한 수단을 제공한다. 바이러스 벡터는 시험관내에서 세포에 관심 핵산을 전달하는데, 예를 들어 시험관내에서 또는 생체외 유전자 요법에서 폴리펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들어 면역원성 또는 치료 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 발현하도록, 필요로 하는 대상에 핵산을 전달하는 방법에도 추가적으로 유용하다. 이러한 방식으로, 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA는 대상에서 생체내 생산될 수 있다. 대상은 그 폴리펩타이드가 결핍되어 있기 때문에 대상은 폴리펩타이드를 필요로 할 수 있다. 또한, 대상에서 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA의 생산은 일부 유익한 효과를 줄 수 있기 때문에 이 방법은 실용적일 수 있다.
바이러스 벡터는 또한 배양된 세포 또는 대상에서 관심 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 생산하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 대상을 생물반응기로서 사용하여 폴리펩타이드를 생산하거나 대상에 대한 기능적 RNA의 효과를, 예를 들어, 스크리닝 방법과 연관지어 관찰함).
일반적으로, 본 명세서에 기술된 바이러스 벡터는 치료 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 전달하는 것이 유익한 임의의 질환 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 암호화하는 이종 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 상태로는 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 낭포성 섬유증(낭포성 섬유증 막관통 조절인자 단백질) 및 다른 폐 질환, 혈우병 A(인자 VIII), 혈우병 B(인자 IX), 지중해빈혈(β-글로빈), 빈혈(에리트로포이에틴) 및 다른 혈액 장애, 알츠하이머병(GDF; 네프릴리신), 다발성 경화증(β-인터페론), 파킨슨병(신경교 세포주 유래 신경영양인자[GDNF]), 헌팅턴병(반복부를 제거하는 RNAi), 카나반병, 근위축성 측삭 경화증, 간질(갈라닌, 신경영양 인자) 및 기타 신경 장애, 암(엔도스타틴, 안지오스타틴, TRAIL, FAS-리간드, 인터페론을 포함하는 사이토카인; VEGF에 대한 RNAi을 포함하는 RNAi 또는 다중 약물 내성 유전자 산물, mir-26a[예를 들어, 간세포 암종용]), 진성 당뇨병(인슐린), 뒤센(Duchenne)을 포함한 근이영양증(디스트로핀, 미니 디스트로핀, 인슐린 유사 성장 인자 I, 사르코글리칸[예를 들어, a, β, γ], 근정지성 미오스타틴 프로펩타이드에 대한 RNAi, 폴리스타틴, 액티빈 II형 가용성 수용체, 항염증성 폴리펩타이드, 예컨대, Ikappa B 우성 돌연변이체, 사르코스판, 유트로핀, 미니-유트로핀, 엑손 스키핑을 유도하기 위한 디스트로핀 유전자 내의 스플라이스 접합부에 대한 안티센스 또는 RNAi[예를 들어, WO/2003/095647 참조], 엑손 스키핑을 유도하기 위한 U7 snRNA에 대한 안티센스[예를 들어, WO/2006/021724 참조], 및 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩타이드에 대한 항체 또는 항체 단편) 및 Becker, 근긴장성 이영양증 1 또는 2, 안면견갑상완 근이영양증(FSHD), 고셔병(글루코세레브로시다제), 헐러병(a-L-이두로니다제), 아데노신 데아미나제 결핍증(아데노신 데아미나제), 글리코겐 축적 질환(예를 들어, 파브리병[a-갈락토시다아제] 및 폼페병[리소좀산 알파-글루코시다아제]) 및 기타 대사 장애, 선천성 폐기종(알파-1-항트립신), 레쉬-니한(Lesch-Nyhan) 증후군(하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제), 니만-픽병(스핑고미엘리나제), 테이-삭스(Tay-Sachs) 병(리소좀 헥소사미니다제 A), 전두측두엽 치매, 메이플 시럽 소변 병(분지-사슬 케토산 탈수소효소), 망막 변성 질환(및 눈 및 망막의 기타 질환; 예를 들어, 황반 변성에 대한 PDGF 및/또는 바소히빈 또는 VEGF의 다른 억제제 또는 망막 장애, 예를 들어 I형 당뇨병에서와 같은 망막 장애를 치료/예방하기 위한 다른 혈관신생 억제제), 고형 기관, 예컨대, 뇌(파킨슨병[GDNF], 성상세포종[엔도스타틴, 안지오스타틴 및/또는 VEGF에 대한 RNAi], 교모세포종[엔도스타틴, 안지오스타틴 및/또는 VEGF에 대한 RNAi]), 간, 신장, 심장의 질환, 예를 들어, 울혈성 심부전 또는 말초 동맥 질환(PAD)(예를 들어, 단백질 포스파타제 억제제 I(I-1) 및 이의 단편(예를 들어, IIC), serca2a, 포스포람반(phospholamban) 유전자를 조절하는 아연 핑거 단백질, Barkct, [32-아드레날린성 수용체, 2-아드레날린성 수용체 키나제(BARK), 포스포이노시타이드-3 키나제(PI3 키나제), S100A1, 파르브알부민, 아데닐릴 사이클라제 6형, 절두된 구성적 활성 bARKct와 같은 G-단백질 커플링된 수용체 키나제 2형 녹다운에 영향을 미치는 분자; 칼사르신, 포스포람반에 대한 RNAi; 포스포람반 억제 또는 우성-음성 분자, 예컨대, 포스포람반 S16E 등), 관절염(인슐린 유사 성장 인자), 관절 장애(인슐린 유사 성장 인자 1 및/또는 2), 내막 과증식(예를 들어, enos, inos를 전달하여), 심장 이식의 생존율 개선(슈퍼옥사이드 디스뮤타제), AIDS(용해성 CD4), 근육 소모(인슐린 유사 성장 인자 I), 신장 부전(에리트로포이에틴), 빈혈(에리트로포이에틴), 관절염(IRAP 및 TNFα 가용성 수용체와 같은 항염증 인자), 간염(a-인터페론), LDL 수용체 결핍(LDL 수용체), 고암모니아혈증(오르니틴 트랜스카르바밀라제), 크라베(Krabbe)병(갈락토세레브로시다제), 바텐(Batten)병, SCA1, SCA2 및 SCA3을 포함한 척수성 뇌실조증, 페닐케톤뇨증(페닐알라닌 수산화효소), 자가면역 질환 등. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 이식 성공을 증가시키기 위해 및/또는 장기 이식 또는 보조 요법(adjunct therapy)의 부정적인 부작용을 감소시키기 위해 기관 이식 후에 사용될 수 있다(예를 들어, 사이토카인 생산을 차단하는 면역억제제 또는 억제성 핵산을 투여함으로써). 또 다른 예로서, 골 형성 단백질(BNP 2, 7 등, RANKL 및/또는 VEGF 포함)은, 예를 들어, 암 환자에서 절단 또는 수술 제거 후에 골 동종이식편과 함께 투여될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 바이러스 벡터는 간 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하기 위해 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 암호화하는 이종 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 간 질환 또는 장애는, 예를 들어, 원발성 담즙성 간경변증, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH), 자가면역 간염, B형 간염, C형 간염, 알코올성 간 질환, 섬유증, 황달, 원발성 경화성 담관염(PSC), 버드 키아리(Budd-Chiari) 증후군, 혈색소 침착증, 윌슨병, 알코올성 섬유증, 비알코올성 섬유증, 간 지방증, 길버트 증후군, 담도 폐쇄증, 알파-1-항트립신 결핍증, 알라지에(alagille) 증후군, 진행성 가족성 간내 담즙정체, 혈우병 B 유전성 혈관부종(HAE), 동형접합 가족성 고콜레스테롤혈증(HoFH), 이형접합 가족성 고콜레스테롤혈증(HeFH), 폰 지에르케병(GSD I), 혈우병 A, 메틸말론산혈증, 프로피온산혈증1, 호모시스틴뇨증, 페닐케톤뇨증(PKU), 티로신혈증 1형, 아르기나제 1 결핍, 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍, 카르바모일-인산염 합성효소 1 결핍, 시트룰린혈증 1형, 시트린 결핍, 크리글러-나자르(Crigler-Najjar) 증후군 1형, 시스틴증, 파브리병, 글리코겐 축적 질환 1b, LPL 결핍, N-아세틸글루타메이트 합성효소 결핍, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍, 오르니틴 트랜스로카제 결핍, 원발성 과산소증 1형 또는 ADA SCID일 수 있다.
본 명세서에 기술된 조성물 및 방법은 또한 유도 만능 줄기 세포(iPS)를 생산하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바이러스 벡터는 줄기 세포 관련 핵산(들)을 비-다능성 세포, 예컨대 성체 섬유아세포, 피부 세포, 간 세포, 신장 세포, 지방 세포, 심장 세포, 신경 세포, 상피 세포, 내피 세포 등으로 전달하는데 사용될 수 있다.
줄기 세포와 관련된 인자를 암호화하는 핵산은 당업계에 공지되어 있다. 줄기 세포 및 다능성과 관련된 이러한 인자의 비제한적인 예로는 Oct-3/4, SOX 계열(예를 들어, SOX 1, SOX2, SOX3 및/또는 SOX 15), Klf 계열(예를 들어, Klfl, KHZ Klf4 및/또는 Klf5), Myc 계열(예를 들어, C-myc, L-myc 및/또는 N-myc), NANOG 및/또는 LIN28을 포함한다.
본 명세서에 기술된 방법은 또한 대사 장애, 예컨대 당뇨병(예를 들어, 인슐린), 혈우병(예를 들어, 인자 IX 또는 인자 VIII), 리소좀 축적 장애, 예를 들어 점액다당류증 장애(예를 들어, 슬라이 증후군[β-글루쿠로니다제], 헐러 증후군[알파-L-이두로니다제], 샤이 증후군[알파-L-이두로니다제], 헐러-샤이 증후군[알파-L-이두로니다제], 헌터 증후군[이두로네이트 설파타제], 산필리포 증후군 A[헤파란 설파미다제], B[N-아세틸글루코사미니다제], C[아세틸-CoA:알파-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제], D[N-아세틸글루코사민 6-설파타제], 모르퀴오 증후군 A[갈락토스-설페이트 설파타제], B[β-갈락토시다제], 마로토-라미 증후군[N-아세틸갈락토사민-4-설파타제] 등), 파브리병(알파-갈락토시다제), 고셔병(글루코세레브로시다제), 또는 글리코겐 축적 장애(예를 들어, 폼페 병; 리소좀산 알파-글루코시다제)를 치료 및/또는 예방하기 위해 수행될 수 있다.
유전자 전달은 질환 상태를 이해하고 치료법을 제공하는 데 실질적으로 사용된다. 결함 유전자가 알려져 있고 클로닝되어 있는 유전병에는 다수가 있다. 일반적으로 상기 질환 상태는 2가지 부류에 속한다: 일반적으로 열성 방식으로 유전되는, 보통 효소의 결핍 상태, 및 조절 또는 구조 단백질을 수반할 수 있고 전형적으로 우성 방식으로 유전되는 불균형 상태. 결핍 상태 질환의 경우, 유전자 전달은 대체 요법으로서 정상 유전자를 이환 조직으로 이동시키고, 뿐만 아니라 안티센스 돌연변이를 사용하여 질환에 대한 동물 모델을 만드는데 사용될 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, 유전자 전달은 모델 시스템에 질환 상태를 만들어, 질환 상태에 대응하기 위한 노력에 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터는 유전 질환의 치료 및/또는 예방을 가능하게 한다.
본 명세서에 기술된 바이러스 벡터는 또한 시험관내 또는 생체내에서 세포에 기능적 RNA를 제공하는 데에도 사용될 수 있다. 기능적 RNA는, 예를 들어, 비-암호 RNA일 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포에서 기능적 RNA의 발현은 세포에 의한 특정 표적 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 따라서, 기능적 RNA는 필요로 하는 대상에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포에서 기능적 RNA의 발현은 세포에 의한 특정 표적 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 기능적 RNA는 필요로 하는 대상에서 특정 단백질의 발현을 증가시키기 위해 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 기능적 RNA의 발현은 세포에서 특정 표적 RNA의 스플라이싱을 조절할 수 있다. 따라서, 기능적 RNA는 필요로 하는 대상에서 특정 RNA의 스플라이싱을 조절하기 위해 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포에서 기능적 RNA의 발현은 특정 표적 단백질의 기능을 그 세포에 의해 조절할 수 있다. 따라서, 기능적 RNA는 이를 필요로 하는 대상에서 특정 단백질의 기능을 조절하기 위해 투여될 수 있다. 기능적 RNA는 또한 시험관내 세포에 투여되어, 예를 들어 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 또는 스크리닝 방법에서 유전자 발현 및/또는 세포 생리학을 조절할 수 있다.
또한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터는 관심 핵산을 세포 배양 시스템, 또는 대안적으로 트랜스제닉 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현되게 하여 진단 및 스크리닝 방법에 사용될 수 있다.
바이러스 벡터는 또한 당업자에게 명백한 것으로서, 유전자 표적화, 청소, 전사, 해독 등을 평가하기 위한 프로토콜에서의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 비-치료적 목적에 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 안전성(확산, 독성, 면역원성 등)을 평가하기 위한 목적에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 데이터는 임상 효능 평가 전에 규제 승인 과정의 일부로서 미국 식품의약국(FDA)에서 고려된다.
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 대상에서 면역 반응을 생산하는데 사용될 수 있다. 이 실시태양에 따르면, 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터는 대상에게 투여될 수 있고, 능동 면역 반응은 면역원성 폴리펩타이드에 대해 대상에 의해 시작된다. 면역원성 폴리펩타이드는 상기 기재된 바와 같다. 일부 실시태양에서, 보호 면역 반응이 유도된다.
대안적으로, 바이러스 벡터는 생체외에서 세포에 투여될 수 있고 변경된 세포는 대상에게 투여된다. 이종 핵산을 포함하는 바이러스 벡터가 세포에 도입되고, 이 세포가 대상에 투여되며, 여기서 면역원을 암호화하는 이종 핵산은 발현되어 대상에서 면역원에 대해 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포)이다.
"능동 면역 반응" 또는 "능동 면역"은 "면역원과의 조우 후 숙주 조직 및 세포의 참여를 특징으로 한다. 이는 림프망상 조직에서 면역적격 세포의 분화 및 증식을 수반하여, 항체 합성 또는 세포 매개 반응성의 발달, 또는 둘 모두를 야기한다". Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, in IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117(Joseph A. Bellanti ed., 1985). 대안적으로 말하면, 능동 면역 반응은 감염 또는 백신 접종에 의해 면역원에 노출된 후 숙주에 의해 시작된다. 능동 면역은 미리 형성된 물질(항체, 전달 인자, 흉선 이식편, 인터루킨-2)을 능동 면역된 숙주로부터 비면역 숙주로 전달함으로써 획득되는 수동 면역과 대비될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "보호" 면역 반응 또는 "보호" 면역은 면역 반응이 질환의 발생을 예방하거나 감소시킨다는 점에서 대상에게 약간의 이점을 부여한다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 보호 면역 반응 또는 보호 면역은 질환, 특히 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다(예를 들어, 암 또는 종양 형성을 예방하고, 암 또는 종양의 퇴행을 유발하고 및/또는 전이를 예방하고 및/또는 전이성 결절의 성장을 예방함으로써). 치료의 이점이 임의의 단점을 능가하는 한, 보호 효과는 완전하거나 부분적일 수 있다.
일부 실시태양에서, 이종 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 또는 세포는 하기에 기재된 바와 같이 면역학적 유효량으로 투여될 수 있다.
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 하나 이상의 암세포 항원(또는 면역학적으로 유사한 분자) 또는 암세포에 대한 면역 반응을 생산하는 임의의 다른 면역원을 발현하는 바이러스 벡터의 투여에 의해 암 면역요법을 위해 투여될 수 있다. 예시하는 것으로서, 면역 반응은 암 세포 항원을 암호화하는 이종 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 투여함으로써 대상에서 암 세포 항원에 대하여 생성되어, 예를 들어 암 환자를 치료하고 및/또는 암이 대상에서 발생하지 않도록 예방할 수 있다. 바이러스 벡터는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 생체내에서 또는 생체외 방법을 사용함으로써 대상에게 투여될 수 있다.
대안적으로, 암 항원은 캡시드 단백질 서브유닛의 일부로서 발현될 수 있거나, 또는 단백질 캡시드와 다른 방식으로 연관될 수 있다(예를 들어, 전술한 바와 같음).
또 다른 대안으로서, 당업계에 공지된 임의의 다른 치료 핵산(예를 들어, RNAi) 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 사이토카인)는 암을 치료 및/또는 예방하기 위해 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "암"은 종양 형성 암을 포함한다. 이와 유사하게, 용어 "암성 조직"은 종양을 포함한다. "암 세포 항원"은 종양 항원을 포함한다.
용어 "암"은 당업계에서 이해되는 의미, 예를 들어 신체의 먼 부위로 확산(즉, 전이) 가능성이 있는 조직의 제어되지 않는 성장을 의미한다. 예시적인 암은 흑색종, 선암종, 흉선종, 림프종(예를 들어, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종), 육종, 폐암, 간암, 결장암, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 췌장암, 뇌암 및 현재 알려져 있거나 향후에 식별되는 다른 임의의 암 또는 악성 상태를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시태양에서, 종양 형성 암을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
용어 "종양"은 또한 예를 들어 다세포 유기체 내의 미분화 세포의 비정상적인 덩어리로서 당업계에서 이해된다. 종양은 악성 또는 양성일 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 방법은 악성 종양을 예방 및 치료하는 데 사용된다.
용어 "암을 치료하는", "암 치료" 및 동등한 용어는 암의 중증도가 감소되거나 적어도 부분적으로 제거되고, 및/또는 질환의 진행이 지연되고 및/또는 제어되며, 및/또는 질환이 안정화되는 것을 의미한다. 일부 실시태양에서, 이들 용어는 암의 전이가 예방 또는 감소되거나 적어도 부분적으로 제거되고, 및/또는 전이성 결절의 성장이 예방 또는 감소되거나 적어도 부분적으로 제거됨을 나타낸다.
용어 "암 예방" 또는 "암을 예방하는" 및 동등한 용어는 방법이 암 발병의 발생 및/또는 중증도를 적어도 부분적으로 제거하거나 감소 및/또는 지연시키는 것을 의미한다. 대안적으로 언급하면, 대상에서 암의 발병은 가능성 또는 확률이 감소될 수 있고, 및/또는 지연될 수 있다.
일부 실시태양에서, 세포는 암에 걸린 대상으로부터 제거될 수 있고 본 명세서에 기술된 바와 같은 암 세포 항원을 발현하는 바이러스 벡터와 접촉될 수 있다. 그 다음, 변형된 세포는 대상에게 투여되어, 암 세포 항원에 대한 면역 반응이 유발된다. 이 방법은 생체 내에서 충분한 면역 반응을 일으킬 수 없는(즉, 충분한 양으로 항체 향상을 생성할 수 없는) 면역타협된 대상에 의해 유리하게 사용될 수 있다.
면역 반응이 면역조절 사이토카인(예를 들어, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 감마-인터페론, 오메가-인터페론, 타우-인터페론, 인터루킨-1-알파, 인터루킨-1β, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨 5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-8, 인터루킨-9, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-14, 인터루킨-18, B 세포 성장 인자, CD40 리간드, 종양 괴사 인자-알파, 종양 괴사 인자-β, 단핵구 화학유인 단백질-1, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 및 림프독소)에 의해 향상될 수 있음은 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 면역조절 사이토카인(바람직하게는, CTL 유도 사이토카인)은 바이러스 벡터와 함께 대상에게 투여될 수 있다. 사이토카인은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 외인성 사이토카인은 대상에게 투여될 수 있거나, 대안적으로 사이토카인을 암호화하는 핵산이 적절한 벡터를 사용하여 대상에게 전달될 수 있고, 사이토카인은 생체내에서 생성될 수 있다.
대상, 약학적 제제 및 투여 방식
본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터 및 바이러스-유사 입자는 수의학적 및 의학적 응용분야 모두에서 사용될 수 있다. 적합한 대상은 조류 및 포유류를 모두 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "조류"는 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조, 꿩, 앵무새, 잉꼬 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용된 용어 "포유류"는 인간, 비-인간 영장류, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개, 토끼목 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 인간 대상은 신생아, 유아, 청소년, 성인 및 노인 대상을 포함한다.
일부 실시태양에서, 대상은 본 명세서에 기술된 방법을 "필요로 하는" 것이다.
일부 실시태양에서, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 선택적으로 다른 의약 제제, 약학적 제제, 안정화제, 완충액, 담체, 보조제, 희석제 등에 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 주사용인 경우, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 다른 투여 방법의 경우, 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 흡입 투여의 경우, 담체는 호흡가능할 것이고, 선택적으로 고체 또는 액체 미립자 형태일 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한"은 독성이 없거나 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 즉 이 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않고 대상에게 투여될 수 있다.
또한, 시험관내에서 핵산을 세포로 전달하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 바이러스 벡터는 특정 표적 세포에 적합한 표준 형질도입 방법에 따라 적절한 감염 다중도로 세포 내로 도입될 수 있다. 투여할 바이러스 벡터의 역가는 표적 세포 유형 및 수, 및 특정 바이러스 벡터에 따라 달라질 수 있으며, 과도한 실험 없이 당업계의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 적어도 약 103 감염 단위, 선택적으로 적어도 약 105 감염 단위가 세포로 도입된다.
바이러스 벡터가 도입되는 세포(들)는 신경 세포(말초 및 중추 신경계의 세포, 특히 뉴런 및 희돌기아교세포와 같은 뇌 세포 포함), 폐 세포, 눈의 세포(망막 세포, 망막 색소 상피 및 각막 세포 포함), 상피 세포(예를 들어, 장 및 호흡기 상피 세포), 근육 세포(예를 들어, 골격근 세포, 심장 근육 세포, 평활근 세포 및/또는 횡격막 근육 세포), 수지상 세포, 췌장 세포(섬 세포 포함), 간 세포, 심근 세포, 뼈 세포(예를 들어, 골수 줄기 세포), 조혈 줄기 세포, 비장 세포, 각질세포, 섬유아세포, 내피 세포, 전립선 세포, 생식 세포 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 유형일 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 임의의 전구 세포일 수 있다. 추가 가능성으로서, 세포는 줄기 세포(예를 들어, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포)일 수 있다. 또 다른 대안으로서, 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다. 더욱이, 세포는 위에 나타낸 바와 같은 임의의 종의 기원에서 유래될 수 있다.
바이러스 벡터는 변형된 세포를 대상에 투여할 목적으로 시험관내 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 대상으로부터 제거되었고, 이 세포에 바이러스 벡터가 도입된 다음, 세포가 대상 내로 다시 투여된다. 생체외 조작을 위해 대상으로부터 세포를 제거하는 방법, 및 이어서 대상으로 다시 도입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호 참조). 대안적으로, 재조합 바이러스 벡터는 공여자 대상으로부터의 세포 내로, 배양된 세포 내로, 또는 임의의 다른 적합한 공급원으로부터의 세포 내로 도입될 수 있고, 세포는 이를 필요로 하는 대상(즉, "수혜자" 대상)에게 투여된다.
생체외 핵산 전달에 적합한 세포는 상기 기재된 바와 같다. 대상에게 투여하기 위한 세포의 투여량은 대상의 연령, 상태 및 종, 세포 유형, 세포에 의해 발현되는 핵산, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 적어도 약 102 내지 약 108의 세포 또는 적어도 약 103 내지 약 106의 세포가 약학적으로 허용 가능한 담체에서 용량마다 투여될 것이다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포는 약학적 담체와 조합하여 유효량으로 대상에게 투여된다.
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 세포 내로 도입되고 이 세포는 대상에게 투여되어 전달된 폴리펩타이드(예를 들어, 이식유전자로서 또는 단백질 캡시드에서 발현됨)에 대한 면역원성 반응을 유발할 수 있다. 전형적으로, 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합으로 면역원성 유효량의 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 양이 투여된다. "면역원성 유효량"은 약학적 제제가 투여되는 대상에서 폴리펩타이드에 대해 능동 면역 반응을 유발하기에 충분한 발현된 폴리펩타이드의 양이다. 일부 실시태양에서, 투여량은 보호 면역 반응(상기 정의된 바와 같음)을 생성하기에 충분하다. 부여된 보호 정도는, 면역원성 폴리펩타이드의 투여 이점이 이의 임의의 단점을 능가하는 한, 완전하거나 영구적일 필요는 없다.
따라서, 일부 실시태양에서, 핵산을 세포에 투여하는 방법은 세포를 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다.
또한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 바이러스-유사 입자를 대상에게 투여하는 방법이 본 발명에 제공된다. 일부 실시태양에서, 대상에게 핵산을 전달하는 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스 입자, 바이러스 벡터 및/또는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 바이러스-유사 입자를 이를 필요로 하는 인간 대상 또는 동물에 투여하는 단계는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 선택적으로, 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 바이러스-유사 입자는 약학적으로 허용 가능한 담체에서 유효량으로 전달된다. 일부 실시태양에서, 유효량의 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 바이러스-유사 입자가 전달된다.
본 명세서에 기술된 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 면역원성 반응을 유발하기 위해(예를 들어, 백신으로서) 추가로 투여될 수 있다. 전형적으로, 면역원성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합으로 면역원성 유효량의 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함한다. 선택적으로, 투여량은 보호 면역 반응(상기 정의된 바와 같음)을 생성하기에 충분하다. 부여되는 보호 정도는, 면역원성 폴리펩타이드를 투여하는 이점이 이의 임의의 단점을 능가하는 한, 완전하거나 영구적일 필요는 없다. 대상 및 면역원은 상기 기재된 바와 같다.
대상에게 투여될 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자의 용량은 투여 방식, 치료 및/또는 예방될 질환 또는 상태, 개별 대상의 상태, 특정 바이러스 벡터 또는 단백질 캡시드, 및 전달될 핵산 등에 따라 달라질 것이고, 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 재조합 AAV의 용량은 유효 용량이다. 예시적인 유효 용량은 예를 들어 적어도 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010, 약 1011, 약 1012, 약 1013, 약 1014, 약 1015 형질도입 단위, 선택적으로 약 108 내지 약 1013 형질도입 단위의 용량일 수 있다. 일부 실시태양에서, 재조합 AAV의 유효 용량은 대상의 체중 킬로그램당 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1015 벡터 게놈 범위의 용량이다. 예를 들어, 유효 용량은 대상의 체중 킬로그램당 약 1 x 1011, 약 5 x 1011, 약 1 x 1012, 약 5 x 1012, 약 1 x 1013, 약 5 x 1013, 약 1 x 1014, 약 5 x 1014, 또는 약 1 x 1015 벡터 게놈(vg/kg)일 수 있다. 일부 실시태양에서, 투여된 AAV의 용량은 2.8 x 1013 vg/kg 또는 2.9 x 1013 vg/kg일 수 있다. 일부 실시태양에서, 용량은 2.1 x 1013 vg 또는 3.0 x 1013 vg일 수 있다.
일부 실시태양에서, 다양한 간격, 예를 들어, 매일, 매주, 매월, 매년 등의 기간에 걸쳐 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 1회 초과의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 투여)가 사용될 수 있다.
예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 질, 척수강내, 안내, 경피, 자궁내(또는 난소), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 근육내[골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에 대한 투여 포함], 피내, 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소(예를 들어, 피부 및 기도 표면을 포함하는 점막 표면 모두에, 및 경피 투여), 림프내 등 뿐만 아니라 직접 조직 또는 기관 주사(예를 들어, 간, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 또는 뇌)를 포함한다. 투여는 또한 종양(예를 들어, 종양 또는 림프절 내부 또는 근처)에 대한 것일 수 있다. 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 치료 및/또는 예방될 상태의 특성 및 중증도 및 사용 중인 특정 벡터의 특성에 따라 달라질 것이다.
골격근에 대한 투여는 사지(예를 들어, 윗쪽 팔, 아랫쪽 팔, 윗쪽 다리 및/또는 아랫쪽 다리), 등, 목, 머리(예를 들어, 혀), 흉부, 복부, 골반/회음부 및/또는 손(발)가락의 골격근에 대한 투여를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 골격근으로는 소지 외전근(손), 소지 외전근(발), 엄지외전근, 제5 중족골 외전근, 짧은 무지외전근, 긴 무지외전근, 짧은 내전근, 엄지 내전근, 긴 내전근, 큰 내전근, 무지 내전근, 주근, 전사각근, 무릎관절근, 상완이두근, 상완대퇴근, 상완근, 상완요골근, 협근, 부리상완근, 추미근, 삼각근, 구각하체근, 하순하체근, 이복근, 배측골간근(손), 배측골간근(발), 단요측수근신근, 장요측수근신근, 척측수근신근, 소지신근, 지신근, 단지신근, 장지신근, 엄지신근, 장족엄지신근, 시지신근, 단무지신근, 장무지신근, 요측수근굴근, 척측수근굴근, 단소지굴근(손), 단소지굴근(발), 단지굴근, 장지굴근, 심지굴근, 천지굴근, 단족엄지굴근, 장족엄지굴근, 단수무지굴근, 장수무지굴근, 전두근, 비복근, 이설골근, 대둔근, 중둔근, 소둔근, 대퇴박근, 경장늑근, 요장늑근, 흉장늑근, 장골근, 하쌍자근, 하사근, 하직근, 극하근, 가시사이근, 횡돌기간근, 외측익돌근, 외측직근, 광배근, 구각거근, 상순거근, 상순비익거근, 안검거근, 견갑거근, 긴회전근, 두최장근, 경최장근, 흉최장근, 두장근, 경장근, 충양근(손), 충양근(발), 교근, 내측익돌근, 내직근, 중앙사각근, 다열근, 악설골, 후두하근, 상두하근, 외폐쇄근, 내폐쇄근, 후두근, 견갑설골, 소지대립근, 무지대립근, 안륜근, 구륜근, 장측골간근, 단장근, 장장근, 치골근, 대흉근, 소흉근, 단비골근, 장비골근, 제 3 비골근, 이상근, 척측골간근, 족척근, 광경근, 슬와근, 후사각근, 방형회내근, 원회내근, 대요근, 대퇴방형근, 족저방형근, 두직근, 외측두직근, 대후두직근, 소후두직근, 대퇴직근, 대능형근, 소능형근, 소근, 봉공근, 최소사각근, 반막근, 두반극근, 경반극근, 흉반극근, 반형건근, 전거근, 단회전근, 비장근, 두극근, 경극근, 흉극근, 두판상근, 경판상근, 흉쇄유돌근, 흉골설골, 흉골갑상근, 경돌설골, 쇄골하근, 견갑하근, 상쌍자근, 상사근, 상직근, 회외근, 극상근, 측두근, 대퇴근막 장조, 대원근, 소원근, 흉부근, 갑상설골, 전경골근, 후경골근, 승모근, 상완삼두근, 중간광근, 외측광근, 내광근, 큰광대근, 및 작은광대근, 및 본 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적합한 골격근으로의 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복막내 투여, 사지 관류(선택적으로, 다리 및/또는 팔의 격리된 사지 관류; 예를 들어 Arruda 등,(2005) Blood 105: 3458-3464 참조), 및/또는 직접 근육내 주사에 의해 골격근으로 전달될 수 있다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 대상(예를 들어, 뒤셴 근이영양증(DMD) 또는 지대근 이영양증(LGMD)과 같은 근이영양증을 갖는 대상)의 사지(팔 및/또는 다리)로, 사지 관류, 선택적으로 격리된 사지 관류(예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여)에 의해 투여된다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 "유체역학" 기술을 사용함이 없이 유리하게 투여될 수 있다. 선행 기술의 벡터의 조직 전달(예를 들어, 근육으로)은 혈관계의 압력을 증가시키고 벡터가 내피 세포 장벽을 통과하는 능력을 촉진하는 유체역학 기술(예를 들어, 큰 부피로 정맥내/정맥내 투여)에 의해 종종 향상된다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 큰 부피 주입 및/또는 상승된 혈관내 압력(예를 들어, 정상 수축기압 초과, 예를 들어 정상 수축기 압력보다 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 이하로 증가)과 같은 유체역학적 기술의 부재하에서 투여될 수 있다. 이러한 방법은 부종, 신경 손상 및/또는 구획 증후군과 같은 유체역학 기술과 관련된 부작용을 줄이거나 피할 수 있다. 심장 근육에 대한 투여는 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 중격에 대한 투여를 포함한다. 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 예컨대 대동맥내 투여, 직접 심장 주사(예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 내로) 및/또는 관상 동맥 관류에 의해 심장 근육으로 전달될 수 있다.
횡격막 근육에 대한 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다.
표적 조직으로의 전달은 또한 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 저장소(depot)를 전달함으로써 달성될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, "저장소"의 전달은 바이러스의 느린 방출 및/또는 점진적인 전파를 허용하여 바이러스가 표준 주사로 가능한 것보다 더 긴 기간 동안 작용할 수 있도록 하는 지속 작용 제제의 투여를 의미한다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 저장소는 골격, 심장 및/또는 횡격막 근육 조직에 이식되거나 조직은 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 필름 또는 기타 매트릭스와 접촉될 수 있다. 이러한 이식가능한 매트릭스 또는 기질은 미국 특허 제7,201,898호에 기술되어 있다.
일부 실시태양에서, 이에 따라 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 골격근, 횡격막 근육 및/또는 심장 근육에 투여된다(예를 들어, 근이영양증, 심장 질환[예를 들어, PAD 또는 울혈성 심부전]을 치료 및/또는 예방하기 위해).
일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법은 골격, 심장 및/또는 횡경막 근육의 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 데 사용된다. 근육의 질환 또는 장애는, 예를 들어, 근이영양증, 근병증, 운동신경질환, 및 심근병증일 수 있다. 근육의 질환 또는 장애는, 예를 들어, 디스트로핀병증, 뒤셴 근이영양증, 베커 근이영양증, 근긴장성 이영양증(예를 들어, 근긴장성 이영양증 1 및 2), 안면견갑상완 근이영양증(FDHD), 에머리-드레이푸스 근이영양증, 지대근 질환, 안면견갑상완 근이영양증, 안인두 근이영양증, 원위 근이영양증, 선천성 근이영양증, 소아 황반 이영양증, 중심핵 근병증, 중심핵 근병증 및 봉입체 근염일 수 있다.
일부 실시태양에서, 필요로 하는 대상에서 근이영양증을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공되며, 이 방법은 바이러스 벡터의 치료 또는 예방 유효량을 포유류 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 바이러스 벡터는 디스트로핀, 미니-디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 미오스타틴 프로펩타이드, 폴리스타틴, 액티빈 II형 가용성 수용체, IGF-1, 항염증성 폴리펩타이드, 예컨대, Ikappa B 우성 돌연변이체, 사르코스판, 유트로핀, 마이크로-디스트로핀, 라미닌-a2, 알파-사르코글리칸, 베타-사르코글리칸, 감마-사르코글리칸, 델타-사르코글리칸, IGF-1, 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩타이드에 대한 항체 또는 항체 단편, 및/또는 미오스타틴에 대한 RNAi를 암호화하는 이종 핵산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에 투여될 수 있다.
대안적으로, 본 명세서에 기술된 방법은 핵산을 골격, 심장 또는 횡격막 근육에 전달하도록 실시될 수 있으며, 이는 혈액에서 정상적으로 순환하거나, 또는 장애(예를 들어, 대사 장애, 예를 들어 당뇨병[예를 들어, 인슐린], 혈우병[예를 들어, 인자 IX 또는 인자 VIII], 점액다당류 장애[예를 들어, 슬라이 증후군, 헐러 증후군, 샤이 증후군, 헐러-샤이 증후군, 헌터 증후군, 산필리포 증후군 A, B, C, D, 모르퀴오 증후군, 마로토-라미 증후군 등], 또는 리소좀 축적 장애, 예컨대 고셔병[글루코세레브로시다제], 또는 파브리 질환[a-갈락토시다제 A] 또는 글리코겐 축적 장애, 예컨대, 폼페병[리소좀산 알파-글루코시다제])를 치료 및/또는 예방하기 위해 다른 조직으로 전신 전달하기 위한 폴리펩타이드(예를 들어, 효소) 또는 기능적 RNA(예를 들어, RNAi, 마이크로 RNA, 안티센스 RNA)를 생산하기 위한 플랫폼으로서 사용된다. 대사 장애를 치료 및/또는 예방하기에 적합한 다른 단백질은 본 명세서에 기재되어 있다. 관심 핵산을 발현하기 위한 플랫폼으로서 근육의 사용은 미국 특허 공개 US 2002/0192189에 기술되어 있다.
일부 실시태양에서, 필요로 하는 대상에서 대사 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법은 치료 또는 예방 유효량의 바이러스 벡터를 대상의 골격근으로 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 바이러스 벡터는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산을 포함하고, 여기서 대상 장애는 그 폴리펩타이드의 결함 및/또는 결손의 결과이다. 예시적인 대사 장애 및 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산은 본 명세서에 기술되어 있다. 선택적으로, 폴리펩타이드는 분비된다(예를 들어, 천연 상태에서 분비된 폴리펩타이드이거나, 또는 예를 들어 본 기술분야에 공지된 바와 같은 분비성 신호 서열과 작동가능한 결합에 의해, 분비되도록 조작된 폴리펩타이드). 임의의 특정 이론에 제한됨이 없이, 이 실시태양에 따르면, 골격근으로의 투여는 폴리펩타이드를 전신 순환으로 분비 및 표적 조직(들)으로 전달을 초래할 수 있다. 골격근으로 바이러스 벡터를 전달하는 방법은 본 명세서에 더 상세하게 기술된다.
본 명세서에 기술된 방법은 또한 전신 전달을 위해 안티센스 RNA, RNAi 또는 다른 기능적 RNA(예를 들어, 리보자임)와 같은 비암호 RNA를 생산하도록 실시될 수 있다.
일부 실시태양에서, 필요로 하는 대상에서 선천성 심부전 또는 PAD를 치료 및/또는 예방하는 방법은 바이러스 벡터의 치료 또는 예방 유효량을 포유류 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 바이러스 벡터는, 예를 들어, 근형질 내재세망 Ca2+-ATPase(SERCA2a), 혈관신생 인자, 포스파타제 억제제 I(I-1) 및 이의 단편(예를 들어, I1C), 포스포람반에 대한 RNAi; 포스포람반 억제 또는 우성-음성 분자, 예컨대, 포스포람반 S16E, 포스포람반 유전자를 조절하는 아연 핑거 단백질, 베타-2-아드레날린성 수용체, 베타-2-아드레날린성 수용체 키나제(BARK), PI3 키나제, 칼사르칸, β-아드레날린성 수용체 키나제 억제제(PARKct), 단백질 포스파타제 1의 억제제 1 및 이의 단편(예를 들어, I1C), S100A1, 파르브알부민, 아데닐릴 사이클라제 6형, G-단백질 커플링된 수용체 키나제 2형 녹다운에 영향을 미치는 분자, 예컨대, 절두된 구성적 활성 bARKct, Pim-1, PGC-Iα, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, 칼리크레인, HIF, 티모신-p4, mir-1, mir-133, mir-206, mir-208 및/또는 mir-26a를 암호화하는 이종 핵산을 포함한다.
주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼과 같은 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 전신 방식보다는 국소 방식으로, 예를 들어 저장소 또는 서방성 제제로 투여할 수 있다. 또한, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 외과적으로 이식가능한 매트릭스에 부착되어 전달될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US-2004-0013645-A1에 기재된 바와 같음).
본 명세서에 개시된 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 임의의 적합한 수단에 의해, 선택적으로 대상은 흡입하는, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 호흡가능한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여함으로써 대상의 폐로 투여될 수 있다. 호흡가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 당업자에게 공지된 바와 같은 압력-구동 에어로졸 분무기 또는 초음파 분무기와 같은 임의의 적합한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,501,729호 참조. 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 마찬가지로 약학적 기술분야에 공지된 기술에 의해 임의의 고체 미립자 약제 에어로졸 발생기로 생산할 수 있다.
바이러스 벡터 및 바이러스-유사 입자는 CNS의 조직(예를 들어, 뇌, 눈)으로 투여될 수 있고, 유리하게는 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법의 부재에서 관찰되는 것보다 바이러스 벡터 또는 바이러스-유사 입자의 더 넓은 분배를 초래할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 바이러스 벡터는 유전자 장애, 신경변성 장애, 정신 장애 및 종양을 비롯한 CNS의 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다. CNS의 예시적인 질환으로는 부신척수신경병증(AMN), 알츠하이머병, 엔젤만 증후군, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 헌팅턴병, 취약 X 증후군, 카나반병, 레이병, 레프섬병, 투렛 증후군, 원발성 측삭 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 진행성 근위축증, 픽병, 근이영양증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 빈스방거병, 척수 또는 두부 손상으로 인한 외상, 테이 삭스병(GM2 강글리오시드증), 레쉬-니한병, MC4R 비만, 이색성 백질이영양증(MLD), MPS I(Hurler/Scheie), MPS IIIA(Sanfilippo A), 니만 픽(Niemann Pick) C1, 렛트(Rett) 증후군, 척수 근육 위축(SMA), AADC 결핍, 단인성 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알파 만노시드증, 아스파르틸글루코사민뇨, 드라베 증후군, 거대 축삭 신경병증, 구상 세포 백질이영양증(Krabbe), 글루트(Glut) 1 결핍, GM1 강글리오시드증, 영아 신경세포질 지방갈색소증(INCL, Batten), 청소년 신경세포질 지방갈색소증(JNCL, Batten), 후기 영아 신경세포질 지방갈색소증(LINCL, Batten), MPS II(Hunter), MPS IIIB(Sanfilippo B), MPS IIIC(Sanfilippo C), MPS IVA(Morquio 증후군), MPS VI(Maroteaux-Lamy), 퍼옥시솜 생물속생설 장애(Zellweger Syndrome Spectrum), 샌드호프병(Sandhoff Disease)(GM2 강글리오시드증), 간질, 뇌경색, 기분 장애를 포함한 정신 장애(예를 들어, 우울증, 양극성 정동 장애, 지속적인 정동 장애, 이차 기분 장애), 정신분열증, 약물 의존(예를 들어, 알코올 중독 및 다른 약물 의존), 신경증(예를 들어, 불안, 강박 장애, 신체형 장애, 해리 장애, 슬픔, 산후 우울증), 정신병(예를 들어, 환각 및 망상), 치매, 편집증, 주의력 결핍 장애, 정신성욕 장애, 수면 장애, 통증 장애, 섭식 장애 또는 체중 장애(예를 들어, 비만, 악액질, 신경성 식욕 부진, 및 폭식증) 및 CNS의 암 및 종양(예를 들어, 뇌하수체 종양)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
CNS의 장애는 망막, 후관 및 시신경을 포함하는 안과 장애(예를 들어, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증 및 기타 망막 변성 질환, 포도막염, 연령-관련 황반 변성, 녹내장)를 포함한다.
전부는 아니지만 대부분의 안과 질환 및 장애는 (1) 혈관신생, (2) 염증 및 (3) 퇴행의 3가지 유형의 징후 중 하나 이상과 관련이 있다. 본 명세서에 기술된 바이러스 벡터는 항-혈관신생 인자; 항염증 인자; 세포 퇴행을 지연시키거나, 세포 보존을 촉진하거나, 세포 성장을 촉진하는 인자 및 이들의 조합을 전달하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 당뇨병성 망막병증은 혈관신생을 특징으로 한다. 당뇨병성 망막병증은 하나 이상의 항혈관신생 인자를 안구내(예를 들어, 유리체내) 또는 안구주위(예를 들어, 테논(Tenon)아래 영역)로 전달하여 치료할 수 있다. 하나 이상의 신경영양 인자는 또한 안내(예를 들어, 유리체내) 또는 안구 주위로 공동전달할 수 있다.
포도막염은 염증을 수반한다. 하나 이상의 항염증 인자는 바이러스 벡터의 안내(예를 들어, 유리체 또는 전방) 투여에 의해 투여될 수 있다.
이에 비해, 색소성 망막염은 망막 변성을 특징으로 한다. 일부 실시태양에서, 색소성 망막염은 하나 이상의 신경영양 인자를 암호화하는 바이러스 벡터의 안내(예를 들어, 유리체 투여)로 치료될 수 있다.
연령-연관 황반 변성은 혈관신생 및 망막 변성을 모두 수반한다. 이 장애는 하나 이상의 신경영양 인자를 암호화하는 본 발명의 바이러스 벡터를 안구내(예를 들어, 유리체) 및/또는 하나 이상의 항-혈관신생 인자를 안구내 또는 안구주위(예를 들어, 테논 아래 영역)로 투여함으로써 치료될 수 있다.
녹내장은 증가된 안압 및 망막 신경절 세포의 손실을 특징으로 한다. 녹내장 치료는 본 발명의 전달 벡터를 사용하여 흥분독성 손상으로부터 세포를 보호하는 하나 이상의 신경보호제의 투여를 포함한다. 이러한 제제로는 안구내, 선택적으로 유리체내로 전달되는 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 길항제, 사이토카인 및 신경영양 인자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법은 발작을 치료하기 위해, 예를 들어 발작의 발병, 발생 또는 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 발작에 대한 치료요법적 치료의 효능은 행동(예를 들어, 떨림, 눈이나 입의 틱) 및/또는 전위기록 수단(대부분의 발작은 특징적인 전위기록 이상을 가짐)으로 평가할 수 있다. 따라서, 시간이 지남에 따라 다발성 발작으로 표시되는 간질도 치료될 수 있다.
일부 실시태양에서, 필요로 하는 대상을 치료하는 방법은 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드를 포함하는 AAV 벡터를 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 165-187 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 175의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드를 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 175의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단배질 캡시드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 대상은 드라베(Dravet) 증후군을 갖는다. 일부 실시태양에서, 대상은 레트(Rett) 증후군을 갖는다. 일부 실시태양에서, 대상은 엔젤만(Angelman) 증후군을 갖는다. 일부 실시태양에서, 대상은 니만-픽병을 갖는다. 일부 실시태양에서, 대상은 취약 X 증후군을 갖는다. 일부 실시태양에서, 대상은 알츠하이머병을 갖는다. 일부 실시태양에서, 대상은 고셔병을 갖는다. 일부 실시태양에서, 대상은 헌팅턴병을 갖는다. 일부 실시태양에서, 대상은 파킨슨병을 갖는다. 일부 실시태양에서, 대상은 프리드리히 운동실조증을 갖고 있다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 뇌실내(ICV) 주사에 의해 대상에게 투여된다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 척추강내(IT) 주사에 의해 대상에게 투여된다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 정맥내(IV) 주사에 의해 대상에게 투여된다.
일부 실시태양에서, 필요로 하는 대상을 치료하는 방법은 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드를 포함하는 AAV 벡터를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 175 또는 180의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 대상은 드라베 증후군, 레트 증후군, 엔젤만 증후군, 니만픽병, 또는 취약 X 증후군을 갖고 있고, 여기서 AAV 벡터는 ICV 또는 IT 주사에 의해 대상에게 투여된다.
일부 실시태양에서, 필요로 하는 대상을 치료하는 방법은 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드를 포함하는 AAV 벡터를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 175 또는 180의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 대상은 고셔병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 또는 프리드리히 운동실조증을 갖고 있고, 여기서 AAV 벡터는 ICV 또는 IT 주사에 의해 대상에게 투여된다.
일부 실시태양에서, 소마토스타틴(또는 이의 활성 단편)은 뇌하수체 종양을 치료하기 위해 바이러스 벡터를 사용하여 뇌에 투여된다. 이 실시태양에 따르면, 소마토스타틴(또는 이의 활성 단편)을 암호화하는 바이러스 벡터는 뇌하수체 내로 미세주입(microinfusion)에 의해 투여된다. 마찬가지로, 이러한 치료는 말단비대증(뇌하수체로부터 비정상적인 성장 호르몬 분비)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 소마토스타틴의 핵산 서열(예를 들어, GenBank 기탁 번호 J00306) 및 아미노산 서열(예를 들어, GenBank 기탁 번호 P01166; 처리된 활성 펩타이드 함유 소마토스타틴-28 및 소마토스타틴-14 함유)은 본 기술분야에 공지되어 있다.
일부 실시태양에서, 벡터는 미국 특허 제7,071,172호에 기술된 바와 같은 분비 신호를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 CNS(예를 들어, 뇌 또는 눈)에 투여된다. 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 척수, 뇌간(연수, 뇌교), 중뇌(시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑질, 송과선), 소뇌, 종뇌(선조체, 후두엽, 측두엽, 두정엽 및 전두엽을 포함하는 대뇌, 피질, 기저핵, 해마 및 편도체문맥), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌 및 하구 내로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 또한 망막, 각막 및/또는 시신경과 같은 눈의 상이한 영역으로 투여될 수 있다.
바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 벡터의 보다 분산된 투여를 위해 뇌척수액(예를 들어, 요추 천자에 의해)으로 전달될 수 있다. 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황(예를 들어, 뇌종양 또는 뇌경색)에서 CNS로 추가로 혈관내 투여될 수 있다.
바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 척수강내, 안구내, 뇌내, 뇌실내, 정맥내(예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재 하에), 비강내, 귀내, 안구내(예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위(예를 들어, 테논 아래 영역) 전달 뿐만 아니라 운동 뉴런으로의 역행 전달과 함께 근육내 전달을 포함하나, 이에 제한되지 않는 본 기술분야에 공지된 임의의 경로에 의해 CNS의 원하는 영역(들)으로 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 CNS의 원하는 영역 또는 구획에 직접 주사(예를 들어, 정위 주사)에 의해 액체 제제로 투여된다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 원하는 영역에 국소 적용에 의해 또는 에어로졸 제제의 비내 투여에 의해 제공될 수 있다. 눈에 대한 투여는 액체 소적의 국소 적용에 의해 이루어질 수 있다. 추가 대안으로서, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자는 고체의 서방성 제제로 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,201,898호 참조).
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 운동 뉴런을 수반하는 질환 및 장애(예를 들어, 근위축성 측삭 경화증(ALS); 척수 근육 위축(SMA) 등)를 치료 및/또는 예방하기 위한 역행 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 뉴런으로 이동할 수 있는 근육 조직으로 전달될 수 있다.
실시예
예시 목적으로만 본 명세서에 포함된 다음 실시예는 제한하려는 것이 아니다. 본 명세서에 사용된 용어 STRD.101 및 STRD.102는 캡시드 단백질 서브유닛 서열을 기술하는 데 사용되며 AAV-STRD.101 및 AAV-STRD.102는 재조합 또는 변형 캡시드 단백질 서브유닛 서열을 포함하는 AAV 벡터를 기술하는 데 사용된다. 그러나, STRD.101 및 STRD.102라는 용어는 일부 문맥에서 당업자에게 자명하듯이, 명명된 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드를 포함하는 AAV 벡터를 기술하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 1. 항체 회피 AAV 벡터의 조합 조작 및 선택
AAV 돌연변이체를 회피하는 항체를 다음 방법에 따라 제조한다. 제 1 단계는, 예를 들어 극저온 전자 현미경검사를 사용하여, AAV 캡시드 단백질 캡시드 표면에서 입체형태적 3D 항원 에피토프를 식별하는 것을 수반한다. 항원 모티프 내에서 선택된 잔기는 각 코돈이 뉴클레오타이드 NNK에 의해 치환된 축퇴성 프라이머 및 깁슨 어셈블리 및/또는 다단계 PCR에 의해 함께 조합된 유전자 단편을 사용하여 돌연변이유발에 의해 처리된다. 돌연변이된 항원성 모티프의 축퇴성 라이브러리를 함유하는 캡시드 단백질 서브유닛-암호화 유전자는 원래의 Cap 암호화 DNA 서열을 대체하기 위해 야생형 AAV 게놈 내로 클로닝되어 플라스미드 라이브러리를 생성한다. 그 다음, 플라스미드 라이브러리는 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드와 함께 293 생산자 세포주 내로 형질감염되어 AAV 캡시드 단백질 서브유닛 라이브러리를 생성하고, 그 다음 선택될 수 있다. AAV 라이브러리의 성공적인 생성은 DNA 시퀀싱을 통해 확인된다.
중화 항체(NAb)를 회피할 수 있고/있거나 중추신경계(CNS)를 표적화할 수 있는 새로운 AAV 균주를 선택하기 위해, AAV 라이브러리는 비-인간 영장류에서 여러 감염 라운드로 처리한다. 각 단계에서 관심 있는 조직은 동물 대상으로부터 분리한다. 관심 조직에서 수확한 세포 용해물은 시퀀싱하여 항체 중화를 회피하는 AAV 분리물을 식별한다. 비인간 영장류에서 여러 감염 라운드 후, 각 돌연변이유발된 영역에서 분리된 서열을 모든 순열 및 조합으로 조합한다.
특정 예로서, AAV 캡시드 단백질(VP1) 상의 공통 항원성 모티프를 상기 기재된 바와 같이 돌연변이유발로 처리하였다. 그 다음, 축퇴성 라이브러리(도 1a)를 비인간 영장류에서 제 1 감염 라운드로 처리하였다(정맥내 주사). 감염 후 7일째에 조직을 수확하고 시퀀싱하여 단일 AAV 분리물을 식별하였다.
다양한 재조합 AAV 분리물을 척수, 후근 신경절, 전두엽, 측두엽, 후두엽, 피각, 담창구, 시상, 편도체, 해마, 흑색질, 뇌교, 소뇌, 수질을 비롯한 조직 샘플에서 식별하였다. 이 제 1 진화 라운드의 결과는 도 1b에 도시된다.
제 1 진화 라운드 동안 분리된 재조합 AAV(도 1b)는 이어서 제 2 비-인간 영장류 내로 재도입하였다. 감염 후 7일째에 조직을 수확하고 시퀀싱하여 단일 AAV 분리물을 식별하였다. 이 제 2 진화 라운드의 결과는 도 1c에 도시된다.
가장 높은 빈도를 갖는 재조합 AAV를 시퀀싱하였다. 이러한 AAV에 존재하는 치환은 표 7.1 및 7.2에 제시된다. 이들 데이터는 표 7.1 및 7.2에 열거된 치환을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 갖는 재조합 AAV 비리온이 비-인간 영장류의 생체내에서 중화 항체를 회피하고 원하는 표적 조직에 대한 방향성을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 2: 재조합 AAV 벡터의 제조가능성
실시예 1에서 식별된 다양한 재조합 AAV가 대규모 시스템에서 제조될 수 있는지 여부를 확인하기 위해, AAV를 표준 방법에 따라 생산하고, 수율을 야생형 AAV 벡터와 비교하였다.
AAV는 표준 삼중 형질감염 프로토콜에 따라 HEK293 세포에서 생산하였다. 간략히 설명하면, 세포를 (i) 야생형 AAV9 캡시드 단백질 서브유닛 서열인, STRD.101 캡시드 단백질 서브유닛 변이체 서열(SEQ ID NO: 180) 또는 STRD.102 캡시드 단백질 서브유닛 변이체 서열(SEQ ID NO: 175)을 포함하는 플라스미드, (ii) 5'ITR, 이식유전자 및 3' ITR 서열을 포함하는 플라스미드, 및 (ii) AAV 생산에 필요한 헬퍼 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 2가지 상이한 이식유전자를 각각의 캡시드 단백질 서브유닛과 함께 자기-상보적 작제물에 사용하였다. 이어서 세포를 용해시키고, 친화성 컬럼, CsCl 밀도 초원심분리 및 투석을 사용하여 비리온을 정제하였다. 그 후, PCR 기반의 정량화 접근법을 사용하여 각 AAV의 수율을 측정하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, STRD.101 및 STRD.102 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 재조합 AAV 벡터는 야생형 AAV9의 수율과 유사한 수율을 가졌다. 이 데이터는 재조합 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 재조합 AAV가 상업적 제조에 적합하다는 것을 확인시켜준다.
실시예 3: 재조합 AAV 바이러스 벡터를 사용한 시험관내 형질도입
실시예 1의 재조합 AAV 벡터가 일반적으로 감염성이고 배양물에서 세포를 형질도입시킬 수 있는지 확인하기 위해, 다양한 AAV 벡터를 표준 프로토콜에 따라 제조하였다.
재조합 AAV의 감염도는 표준 TCID50 검정을 사용하여 테스트하였다. 간단히 말해서, HeLaRC32 세포를 아데노바이러스(Ad5)의 존재 하에 재조합 AAV 입자로 5 크기 정도(order of magnitude)에 걸친 용량으로 감염시켰다. 72시간 후, DNA를 추출하고, 벡터 게놈 복제를 qPCR로 정량화하였다.
감염도를 결정하기 위해 입자 대 감염도 비율을 계산하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, AAV-STRD.101 벡터의 감염도 비율은 야생형 AAV9에 비해 더 낮았다. 낮은 감염도 비율은 더 높은 효능으로 해석되기 때문에. AAV-STRD.101은 야생형 AAV9보다 더욱 감염성이다.
이와 별도로, 다양한 세포주에서도 감염도를 결정하였다. 루시페라제 이식유전자를 패키징하는 재조합 AAV를 생성하고 세포당 10,000 벡터 게놈(vg) 용량의 배양물 중 세포와 접촉시켰다. 감염 48시간 후, 세포를 용해시켰다. 용해물을 생물발광 기질과 접촉시키고, 상대 형광 단위(RFU)를 측정하였다. 도 4a-4d에 도시된 바와 같이, AAV-STRD.101 벡터는 야생형 AAV9와 비슷한 수준으로 U87 세포(인간 교모세포종 세포주, 도 4a), N2A 세포(마우스 신경 능선 유래 세포주, 도 4b), SY5Y 세포(인간 신경모세포종 세포주, 도 4c), 및 U2OS 세포(인간 골육종 세포주, 도 4d)를 감염시켰다.
따라서, 이 데이터는 실시예 1의 재조합 AAV 벡터가 배양물에서 세포를 효과적으로 형질도입시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 4: 중추신경계를 표적으로 하는 재조합 AAV의 생체내 특징화
재조합 캡시드 단백질 서브유닛인, STRD.101 및 STRD.102를 생체내 특징화를 위해 선택하였다. 이러한 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하고 천연 tdTomato 형광 이식유전자를 패키징하는 재조합 AAV가 생성되었다. 재조합 AAV는 0일째 뇌실내 주사에 의해 신생 마우스에게 투여하였다. 주사 후 3주째, 뇌 조직을 수확하고 고정하여 tdTomato 형광을 육안 평가하여 발현을 평가하였다. 도 5는 4% PFA로 고정 후 24시간 후 관상 비브라톰 절편에서 tdTomato 발현을 보여주는 대표적인 이미지를 제공한다. 이들 동일 절편은 또한 면역조직화학을 사용하여 가시화하였다(도 6). 도 5 및 도 6의 이미지에 도시된 바와 같이, AAV9, AAV-STRD.102 및 AAV-STRD.101 벡터는 각각 뇌 조직에서 상이한 분포를 보였고, 가장 높은 이식유전자 발현은 주사 부위 근처에 국한되었다. 종합하면, 이 데이터는 테스트된 재조합 AAV가 뇌실내 주사 후 생체내 표적 세포로 이식유전자를 성공적으로 전달한다는 것을 보여준다.
tdTomato를 패키징한 AAV-STRD.101 및 AAV-STRD.102 벡터는 또한 5.5 x 1013 vg/kg의 용량으로 정맥내 주사에 의해 4 마리의 성체 마우스에게 투여하였다. 주사 3주 후, 간 및 심장을 수확하고 고정하여 tdTomato 형광을 육안 평가에 의해 발현 프로파일을 평가하였다.
4% PFA로 고정 후 24시간 후 비브라톰 간 절편에서 TdTomato 발현을 보여주는 하나의 마우스로부터의 대표적인 이미지는 도 7에 제공된다. 특히, AAV-STRD.102 및 AAV-STRD.101 벡터는 야생형 AAV9와 비교하여 간으로 표적화되지 않았다. 이러한 바람직한 특성은, 진화하는 동안 간에서 대비 스크린은 수행되지 않았기 때문에 예상하지 못하였다.
4% PFA로 고정 후 24시간 후 비브라톰 심장 절편에서 TdTomato 발현을 나타내는 하나의 마우스로부터의 대표적인 이미지는 도 8에 제공된다. 특히, 테스트된 벡터는 심장에 대해 다른 방향성을 보였다. 구체적으로, AAV-STRD.102 벡터는 AAV-STRD.101에 비해 심장에서 덜 감염성이었다. 진화 중에 심장 스크린은 전혀 수행하지 않았기 때문에, 이 차등적인 형질도입은 전혀 예상하지 못하였다.
종합하면, 이 데이터는 AAV-STRD.102 및 AAV-STRD.101 벡터가 생체내에서 CNS 조직을 표적화하고, 간에 의한 청소를 피하는데 성공적으로 사용될 수 있고, 유전자 요법에 강력한 도구임을 나타낸다. 서로 다른 방향성을 감안할 때(즉, AAV-STRD.101이 AAV-STRD.102보다 심장에서 더 감염성이 높음), 이들 벡터는 특정 원하는 조직에 대해 유전자 요법 치료를 표적화하는데 강력한 도구가 될 것이다.
실시예 5: 비인간 영장류에서 재조합 AAV의 생체분포
생체분포를 결정하기 위해 재조합 AAV를 비인간 영장류에 투여하였다. 재조합 AAV는 정맥내(IV) 및 뇌혈관내(ICV) 주사로 투여하였다(도 9). AAV-STRD.101은 IV 주사에 의해 2.9 x 1013 킬로그램당 벡터 게놈(vg/kg), 및 ICV 주사에 의해 2.1 x 1013 vg의 용량으로 투여하였다(검은 점). AAV-STRD.102는 IV 주사에 의해 2.8 x 1013 vg/kg, 및 ICV 주사에 의해 3.0 x 1013 vg의 용량으로 투여하였다(흰색 점). 30일 후, 동물을 희생시키고 다양한 CNS 조직에서 바이러스 부하를 qPCR로 측정하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, AAV-STRD.102 및 AAV-STRD.101은 둘 모두가 다양한 CNS 조직을 감염시켰다. 또한, AAV는 높은 형질도입 수준을 보여주었기 때문에, 이 데이터는 이들 AAV가 생체내에서 항체 중화를 회피하는 것 같다는 것을 시사한다.
실시예 6: 필요로 하는 대상을 치료하기 위한 세포 치료 방법
세포는 생체외에서 AAV 벡터를 사용하여 형질도입한다. 일부 목적을 위해, 세포는 자가 유래(즉, 치료될 대상로부터 유래됨) 또는 동종이계(즉, 상이한 대상/공여자에서 유래됨)일 수 있다. AAV를 사용하여 세포를 형질도입하고, 이식유전자의 발현을 검증한 후, 표준 임상 방법을 사용하여 대상에 세포를 투여한다.
세포는 대상에게 1회 투여될 수 있거나 여러 번 투여가 반복될 수 있다. 투여된 세포의 수는, 예를 들어, 치료할 질환 또는 상태, 대상의 질환/상태의 중증도, 및 대상의 신장 및 체중에 따라 달라진다.
실시예 7: 필요로 하는 대상을 치료하기 위한 유전자 치료 방법
본 명세서에 기술된 AAV 벡터(예를 들어, SEQ ID NO: 175 또는 180의 서열을 갖는 캡시드를 포함하는 AAV 벡터)를 필요로 하는 대상에게 투여하며, 여기서 대상은 CNS의 질환 또는 장애를 갖는다. AAV 벡터는 대상에게 1회 투여하거나 여러 번 투여를 반복할 수 있다. 투여는 정맥내(IV), 뇌실내(ICV), 또는 척추강내(IT) 주사와 같은 하나 이상의 경로에 의한 것이다. AAV 벡터의 용량은, 예를 들어, 치료할 질환 또는 상태, 대상의 질환/상태의 중증도, 대상의 신장 및 체중에 따라 달라진다. 예를 들어, 대상에 투여된 AAV의 용량은 AAV 벡터가 IV 주사에 의해 투여되는 경우 2.8 x 1013 vg/kg 또는 2.9 x 1013 vg/kg일 수 있다. AAV 벡터가 ICV 주사에 의해 투여되는 경우, 용량은 2.1 x 1013 vg 또는 3.0 x 1013 vg일 수 있다. 일부 프로토콜에서, AAV 벡터는 IV 및 ICV 주사 둘 모두에 의해 대상에게 투여될 수 있다.
실시예 8: 포유동물 세포에서 재조합 AAV 벡터의 제조
3개의 플라스미드가 제공된다. 제 1 플라스미드는 2개의 ITR(SEQ ID NO: 3003 및 3004)이 플랭킹된 NPC1을 암호화하는 이식유전자(SEQ ID NO: 3002)를 포함하는 전달 카세트를 포함한다. 제 1 플라스미드는 SEQ ID NO: 3014-3019 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 제 2 플라스미드는 Rep 및 Cap 유전자를 암호화하는 서열을 포함한다. 제 3 플라스미드는 AAV 생산에 필요한 다양한 "헬퍼(helper)" 인자(E4, E2a 및 VA)를 포함한다.
3개의 플라스미드는 적절한 형질감염 시약(예를 들어, 리포펙타민TM)을 사용하여 바이러스 생산 세포(예를 들어, HEK293)로 형질감염된다. 소정의 시간 동안 37℃에서 배양한 후, AAV 입자를 배지로부터 수집하거나 세포를 용해시켜 AAV 입자를 방출한다. 그런 다음 AAV 입자를 정제하고 표준 방법에 따라 정량적 PCR(qPCR) 또는 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 적정한다. AAV 입자는 나중에 사용하기 위해 -80℃에서 보관될 수 있다.
실시예 9: 곤충 세포에서 재조합 AAV 벡터의 제조
제 1 재조합 바큘로바이러스 벡터가 제공된다. 제 1 재조합 배큘로바이러스 벡터는 2개의 ITR(SEQ ID NO: 3003 및 3004)에 의해 플랭킹된 NPC1을 암호화하는 이식유전자(SEQ ID NO: 3002)를 포함하는 전달 카세트 서열을 포함한다. 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3014-3019 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
곤충 세포(예를 들어, Sf9)는 AAV Rep 및 Cap 단백질(예를 들어, STRD.101 또는 STRD.012 캡시드 단백질 서브유닛)을 암호화하는 서열을 포함하는 제 1 재조합 배큘로바이러스 벡터 및 적어도 하나의 추가 재조합 배큘로바이러스 벡터와 함께 현탁 배양에서 동시 감염된다. 소정의 시간 동안 28℃에서 배양한 후, AAV 입자를 배지로부터 수집하거나 세포를 용해시켜 AAV 입자를 방출한다. 그런 다음 AAV 입자를 정제하고 표준 방법에 따라 정량적 PCR(qPCR) 또는 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 적정한다. AAV 입자는 나중에 사용하기 위해 -80℃에서 보관될 수 있다.
실시예 10: 시험관내 효능 분석
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트가 배양된 세포에서 NPC1 리소좀 표현형을 구조할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, hNPC1 전달 카세트(SEQ ID NO: 3014)를 패키징하는 재조합 AAV2 벡터를 삼중-형질감염 프로토콜을 사용하여 HEK293 세포에서 제조하였다(예를 들어, 실시예 1 참조). 그런 다음 AAV2-hNPC1 벡터를 사용하여 야생형 U2OS 세포(골육종) 및 5 x 103(5K) 또는 10 x 103(10K)의 감염 다중도(MOI)에서 시험관 내에서 NPC1을 발현하지 않는 U2OS 세포(NPC-/-)를 형질도입하는데 사용하였다. 그런 다음 세포를 5% CO2 분위기에서 37℃에서 배양하였다.
NPC1 세포는 리소좀에서 콜레스테롤의 특징적인 축적을 나타내며, 이는 세포 내 리소좀의 크기와 수를 관찰하여 모니터하였다. 이 분석법에서, 리소좀 표현형은 세포에서 형광성 소기관 염료 LysoTracker®(ThermoFisher Scientific®)의 축적을 측정하여 모니터하였다. AAV2-hNPC1 벡터로 형질도입한 지 72시간 후, 50mM의 LysoTracker®를 세포에 첨가하였다. 2시간 후, 세포를 고정하고 LysoTracker® 형광을 측정하였다.
결과를 도 10a에 나타내었다. 예상대로, 야생형 U2OS 세포는 리소좀에서 LysoTracker® 형광의 상당한 축적을 나타내지 않은 반면 NPC1-/- 세포는 축적을 보였다. 5K 또는 10K의 MOI에서 AAV2-hNPC1으로 형질도입된 세포는 리소좀에서 LysoTracker® 형광 축적이 상당히 감소하였다.
별도의 분석에서, hNPC1으로 형질도입된 세포를 고정하고 콜레스테롤에 대한 조직화학적 염색인 필리핀(filipin)을 사용하여 염색하였다. 스트렙토마이세스 필리피넨시스(Streptomyces filipinensis)에서 유래한 필리핀 균주는 폴리사이언스에서 구입하여 50μg/mL의 최종 농도로 사용하였다. Pico Automated Cell Imaging System(ImageXpress®)을 사용하여 세포를 시각화하고 필리핀 염색을 정량화하였다. 결과를 도 10b에 나타내었다. 예상대로, 야생형 U2OS 세포는 유의미한 콜레스테롤 축적을 나타내지 않은 반면 NPC1-/- 세포는 콜레스테롤 축적을 보였다. 5K 또는 10K의 MOI에서 AAV2-hNPC1으로 형질도입된 세포는 콜레스테롤 축적을 상당히 감소시켰다.
종합하면, 이러한 데이터는 AAV2-hNPC를 사용하는 세포의 형질도입이 NPC1-결핍 U2OS 세포에서 리소좀 표현형을 성공적으로 구조했음을 보여준다.
실시예 11: 생체내 효능 분석
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트가 생체내에서 NPC1 표현형을 구조할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, hNPC1 전달 카세트(SEQ ID NO: 3014)를 패키징하는 재조합 AAV9 벡터를 삼중-형질감염 프로토콜을 사용하여 HEK293 세포에서 제조하였다(예를 들어, 실시예 1 참조). 24-28일령의 NPC1이 결핍된 마우스(즉, NPC1-/- 마우스)는 식염수 또는 AAV9-hNPC1 벡터와 함께 안와후주사에 의해 킬로그램당 3.0 x 1014 벡터 게놈(vg/kg)의 용량으로 정맥내 주사되었다. 결과를 도 11에 나타내었다. 모든 식염수 처리된 마우스는 약 80일령에 사망하였다. 그러나, 모든 AAV9-hNPC1 주사 동물은 실험 기간 동안 생존하였다. AAV9-hNPC1 주사 마우스는 분석을 위해 약 100일령에 희생되었다.
마우스는 또한 균형 대들보를 가로질러 걸을 때 미끄러짐의 수를 측정하는 균형 대들보 보행 테스트에 도전하였다. 테스트는 생후 약 8주령(56일)에 실시하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 야생형 마우스는 균형 대들보에서 미끄러지지 않았다. AAV9-hNPC1로 처리한 NPC1-/- 마우스와 식염수-처리된 NPC1-/- 마우스 사이에 미끄러짐 수에 통계적으로 유의한 차이가 없었지만, AAV9-hNPC1 그룹에서 관찰된 미끄러짐의 평균 수는 더 적었다.
마우스의 행동 표현형 점수는 또한 약 10주령(70일)에 평가하였다. 행동 표현형 점수는 몸단장, 보행, 척추 후만증, 렛지 테스트, 뒷다리 잡기 및 떨림을 포함하는 다양한 질환 증상을 측정하는 종합 점수이다. (Alam et al, Sci Transl Med, 2016; Guyenet et al, J Vis Exp, 2010 참조). 도 12에 도시된 바와 같이, AAV9-hNPC1로 처리된 NPC1-/- 마우스는 식염수 처리된 NPC1-/- 마우스와 비교하여 유의하게 감소된 점수를 가졌다.
종합하면, 이러한 데이터는 AAV9-hNPC1이 NPC1 결핍 마우스의 질환 표현형을 적어도 부분적으로 구조할 수 있음을 입증한다.
실시예 12: 시험관내 및 생체내에서 NPC1을 암호화하는 카세트를 패키징하는 STRD.101 벡터의 테스팅
인간 NPC1을 암호화하는 전달 카세트(예를 들어, SEQ ID NO: 14의 전달 카세트)를 포함하는 핵산을 포함하는 AAV-STRD.101 벡터는 실시예 8 또는 9의 방법에 따라 제조된다. 이 벡터는 본 명세서에서 AAV-STRD.101-hNPC1로 지칭된다.
AAV-STRD.101 벡터가 배양된 세포에서 NPC1 리소좀 표현형을 구조할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, AAV-STRD.101-hNPC1 벡터를 사용하여 5 x 103(5K) 또는 10 x 103(10K)의 감염 다중도(MOI)에서 시험관내에서 NPC1(NPC-/-)을 발현하지 않는 야생형 U2OS 세포(골육종) 및 U2OS 세포를 형질도입한다. 그런 다음 세포는 5% CO2 분위기에서 37℃에서 배양된다.
NPC1 세포는 세포 내 리소좀의 크기 및 수를 관찰함으로써 모니터링될 수 있 리소좀에서 콜레스테롤의 특징적인 축적을 나타낸다. 따라서, 리소좀 표현형은 세포에서 형광성 소기관 염료 LysoTracker®(ThermoFisher Scientific®)의 축적을 측정하여 모니터링된다. AAV2-hNPC1 벡터로 형질도입한 지 72시간 후, 50mM의 LysoTracker®가 세포에 첨가된다. 2시간 후, 세포를 고정하고 LysoTracker® 형광을 측정한다.
별도의 분석에서, AAV-STRD.101-hNPC1 벡터로 형질도입된 세포를 고정하고 콜레스테롤에 대한 조직화학적 염료인 필리핀을 사용하여 염색한다. 스트렙토마이세스 필리피넨시스(Streptomyces filipinensis)에서 유래한 필리핀 염료는 50μg/mL의 최종 농도로 사용된다. Pico Automated Cell Imaging System(ImageXpress®)을 사용하여 세포를 시각화하고 필리핀 염색을 정량화한다.
AAV-STRD.101-hNPC1 벡터는 또한 이것이 생체내에서 NPC1 표현형을 구조할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 테스트된다. NPC1이 결핍된 마우스(즉, NPC1-/- 마우스)는 3.0 x 1014 vg/kg의 용량으로 식염수 또는 AAV9-hNPC1 벡터와 함께 24-28일령 전후의 안와후주사에 의해 정맥내 주사됩니다. 생존은 적어도 100일령까지 모니터링된다.
마우스는 또한 밸런스 빔 보행 테스트에서 면역성검사되며, 여기서 미끄러짐의 수는 마우스가 균형 대들보를 가로질러 걸을 때 측정된다. 테스트는 생후 약 8주령(56일)에 실행된다.
마우스의 행동 표현형 점수는 또한 약 10주령(70일)에 평가된다. 행동 표현형 점수는 몸단장, 보행, 후만, 렛지 테스트, 뒷다리 걸쇠, 떨림 등을 포함하는 다양한 질환 증상을 측정하는 종합 점수이다. (Alam et al, Sci Transl Med, 2016; Guyenet et al, J Vis Exp, 2010 참조).
전술한 내용은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명은 다음의 청구항에 의해 정의되며, 청구항의 등가물이 그 안에 포함된다.
번호를 매긴 실시태양
첨부된 청구항에도 불구하고, 개시내용은 다음의 번호가 매겨진 실시태양을 설명한다.
1. (i) SEQ ID NO: 180 또는 175의 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서; 여기서 핵산은 전달 카세트를 포함하고; 여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
2. 실시태양 1에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 길이가 약 110 내지 약 160개 뉴클레오타이드인 AAV 벡터.
3. 실시태양 1 또는 2에 있어서,
5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이인 AAV 벡터.
4. 실시태양 1 또는 2에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는 것인 AAV 벡터.
5. 실시태양 1-4 중 어느 하나에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 분리되거나 유래되는 것인 AAV 벡터.
6. 실시태양 1에 있어서,
5' ITR은 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
7. 실시태양 1에 있어서,
3' ITR은 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
8. 실시태양 1-7 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 구조성 프로모터인 AAV 벡터.
9. 실시태양 1-7 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 유도성 프로모터인 AAV 벡터.
10. 실시태양 1-9 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 조직-특이적 프로모터인 AAV 벡터.
11. 실시태양 1-7 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, HSVTK 프로모터, CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 다면체 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터, 및 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 AAV 벡터.
12. 실시태양 11에 있어서,
프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, 및 HSVTK 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 AAV 벡터.
13. 실시태양 1-7 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 SEQ ID NO: 3005, SEQ ID NO: 3006, SEQ ID NO: 3007 또는 SEQ ID NO: 3008 중 어느 하나와 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
14. 실시태양 1-13 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질인 AAV 벡터.
15. 실시태양 1-13 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 갖는 것인 AAV 벡터.
16. 실시태양 15에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 것인 AAV 벡터.
17. 실시태양 16에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 갖는 것인 AAV 벡터.
18. 실시태양 1-13 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 3001의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
19. 실시태양 1-13 중 어느 하나에 있어서,
이식유전자는 SEQ ID NO: 3002의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
20. 실시태양 1-18 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 원숭이 바이러스 40(SV40), 토끼 베타 글로빈(rBG), α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 및 소 성장 호르몬(bGH)으로부터 선택되는 것인 AAV 벡터.
21. 실시태양 2O에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호인 AAV 벡터.
22. 실시태양 2O에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 rBG 폴리아데닐화 신호인 AAV 벡터.
23. 실시태양 1-19 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 3012 또는 3013과 적어도 95% 또는 적어도 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
24. 실시태양 1-23 중 어느 하나에 있어서,
카세트는 인핸서를 추가로 포함하는 것인 AAV 벡터.
25. 실시태양 24에 있어서,
인핸서는 CMV 인핸서인 AAV 벡터.
26. 실시태양 24에 있어서,
인핸서는 SEQ ID NO: 3009의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
27. 실시태양 1-26 중 어느 하나에 있어서,
카세트는 인트론 서열을 추가로 포함하는 것인 AAV 벡터.
28. 실시태양 27에 있어서,
인트론 서열은 키메라 서열인 AAV 벡터.
29. 실시태양 27에 있어서,
인트론 서열은 하이브리드 서열인 AAV 벡터.
30. 실시태양 27에 있어서,
인트론 서열은 SV40으로부터 분리되거나 유래된 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
31. 실시태양 27에 있어서,
인트론 서열은 SEQ ID NO: 3010-3011 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
32. 실시태양 1에 있어서,
AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3014-3019 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
33. (i) SEQ ID NO: 180 또는 175의 서열, 또는 SEQ ID NO: 180 또는 175에 비해 약 1 내지 약 25개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 전달 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서; 여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자 서열; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
34. 실시태양 1-33 중 어느 하나의 AAV 벡터를 포함하는 조성물.
35. 실시태양 34에 있어서,
약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 것인 조성물.
36. 치료 유효량의 실시태양 1-33 중 어느 하나의 AAV 벡터, 또는 실시태양 34-35 중 어느 하나의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하여 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법.
37. 실시태양 36에 있어서,
대상은 니만-피크 질환 C형을 갖는 것인 방법.
38. 실시태양 36 또는 37에 있어서,
대상은 인간 대상인 방법.
39. (i) SEQ ID NO: 180 또는 175의 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 전달 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서; 여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; SEQ ID NO: 3002의 서열을 포함하는 이식유전자 서열; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
40. (i) SEQ ID NO: 180 또는 175의 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서; 여기서 핵산은 전달 카세트를 포함하고; 여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자 서열, 여기서 NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 3001의 서열; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
41. 실시태양 1-33, 39 및 40 중 어느 하나에 있어서,
AAV 벡터가 전달 카세트를 중추신경계의 세포 또는 조직에 선택적으로 전달하는 것인 AAV 벡터.
42. 실시태양 41에 있어서,
중추 신경계의 조직은 전운동 피질, 시상, 소뇌 피질, 치상 핵, 척수 또는 후근 신경절인 AAV 벡터.
43. 실시태양 1-33, 39 및 40 중 어느 하나에 있어서,
AAV 벡터가 전달 카세트를 뇌로 전달하지만 AAV 벡터를 심장으로 전달하지 않는 것인 AAV 벡터.
44. 실시태양 1-33, 39 및 40 중 어느 하나에 있어서,
AAV 벡터가 전달 카세트를 뇌 및 심장에 전달하는 AAV 벡터.
45. 실시태양 44에 있어서,
전달 카세트의 전달이 심장보다 뇌에 더 큰 것인 AAV 벡터.
46. 실시태양 44에 있어서,
전달 카세트의 전달이 심장과 뇌에서 거의 동일한 것인 AAV 벡터.
47. 실시태양 1-33 및 39-46 중 어느 하나의 AAV 벡터를 포함하는 세포.
48. 세포를 실시태양 1-33 및 39-46 중 어느 하나의 AAV 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여 세포 내로 전달 카세트를 도입하는 시험관내 방법.
49. 약제로서 사용하기 위한 실시태양 1-33 및 39-46 중 어느 하나의 AAV 벡터.
50. 실시태양 1-33 및 39-46 중 어느 하나에 있어서,
필요로 하는 대상에서 니만-피크 질환 C형을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 AAV 벡터.
51. 실시태양 1-33 및 39-46 중 어느 하나에 있어서,
캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 180의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
52. 실시태양 1-33 및 39-46 중 어느 하나에 있어서,
캡시드 단백질 서브유닛은 SEQ ID NO: 175의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
53. 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트로서; 여기서 이식유전자는 NPC1 단백질을 암호화하는 것인 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트.
54. 실시태양 53에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 길이가 약 110 내지 약 160개 뉴클레오타이드인 AAV 전달 카세트.
55. 실시태양 53 또는 54에 있어서,
5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이인 AAV 전달 카세트.
56. 실시태양 53 또는 54에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는 것인 AAV 전달 카세트.
57. 실시태양 53-56 중 어느 하나에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 분리되거나 유래되는 것인 AAV 전달 카세트.
58. 실시태양 53에 있어서,
5' ITR은 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
59. 실시태양 53에 있어서,
3' ITR은 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
60. 실시태양 53-59 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 구조성 프로모터인 AAV 전달 카세트.
61. 실시태양 53-59 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 유도성 프로모터인 AAV 전달 카세트.
62. 실시태양 53-59 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 조직-특이적 프로모터인 AAV 전달 카세트.
63. 실시태양 53-59 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, HSVTK 프로모터, CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 다면체 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터, 및 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 AAV 벡터.
64. 실시태양 63에 있어서,
프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, 및 HSVTK 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 AAV 전달 카세트.
65. 실시태양 53-59 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 SEQ ID NO: 3005, SEQ ID NO: 3006, SEQ ID NO: 3007 또는 SEQ ID NO: 3008 중 어느 하나와 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
66. 실시태양 53-65 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질인 AAV 전달 카세트.
67. 실시태양 53-65 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 갖는 것인 AAV 전달 카세트.
68. 실시태양 67에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 것인 AAV 전달 카세트.
69. 실시태양 68에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 갖는 것인 AAV 전달 카세트.
70. 실시태양 53-65 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 3001의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
71. 실시태양 53-65 중 어느 하나에 있어서,
이식유전자는 SEQ ID NO: 3002의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
72. 실시태양 53-71 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 원숭이 바이러스 40(SV40), 토끼 베타 글로빈(rBG), α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 및 소 성장 호르몬(bGH)으로부터 선택되는 것인 AAV 전달 카세트.
73. 실시태양 72에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호인 AAV 전달 카세트.
74. 실시태양 72에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 rBG 폴리아데닐화 신호인 AAV 전달 카세트.
75. 실시태양 53-71 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 3012 또는 3013과 적어도 95% 또는 적어도 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
76. 실시태양 53-75 중 어느 하나에 있어서,
카세트는 인핸서를 추가로 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
77. 실시태양 76에 있어서,
인핸서는 CMV 인핸서인 AAV 전달 카세트.
78. 실시태양 76에 있어서,
인핸서는 SEQ ID NO: 3009의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
79. 실시태양 53-78 중 어느 하나에 있어서,
카세트는 인트론 서열을 추가로 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
80. 실시태양 79에 있어서,
인트론 서열은 키메라 서열인 AAV 전달 카세트.
81. 실시태양 79에 있어서,
인트론 서열은 하이브리드 서열인 AAV 전달 카세트.
82. 실시태양 79에 있어서,
인트론 서열은 SV40으로부터 분리되거나 유래된 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
83. 실시태양 79에 있어서,
인트론 서열은 SEQ ID NO: 3010-3011 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
84. 실시태양 53에 있어서,
AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3014-3019 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
85. 실시태양 53-84 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트를 포함하는 플라스미드.
86. 실시태양 53-84 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트 또는 실시태양 85의 플라스미드를 포함하는 세포.
87. AAV 생산자 세포를 실시태양 53-84 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트 또는 실시태양 85의 플라스미드와 접촉시키는 단계를 포함하여 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법.
88. 실시태양 87의 방법에 의해 생산된 재조합 AAV 벡터.
89. 실시태양 88에 있어서,
벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV로부터 선택된 혈청형인 재조합 AAV 벡터.
90. 실시태양 53-84 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트, 실시태양 85의 플라스미드, 실시태양 86의 세포, 또는 실시태양 88 또는 89의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물.
91. 대상에게 유효량의 실시태양 53-84 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트, 실시태양 85의 플라스미드, 실시태양 86의 세포, 또는 실시태양 88 또는 89의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하여 이를 필요로 하는 대상을 치료하기 위한 방법.
92. 실시태양 91에 있어서,
대상은 질환 NPC1을 앓고 있는 것인 방법.
93. 실시태양 91 또는 92에 있어서,
대상은 인간 대상인 방법.
94. (i) SEQ ID NO: 180의 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서; 여기서 핵산은 전달 카세트를 포함하고; 여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
95. (i) SEQ ID NO: 180의 서열, 또는 SEQ ID NO: 180에 비해 약 1 내지 약 25개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및 (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서; 여기서 핵산은 전달 카세트를 포함하고; 여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
96. 실시태양 94 또는 95에 있어서,
전달 카세트는 인트론 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
97. 실시태양 94-96 중 어느 하나에 있어서,
인트론 서열은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
98. 실시태양 94-97 중 어느 하나에 있어서,
5' ITR은 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
99. 실시태양 94-98 중 어느 하나에 있어서,
3' ITR은 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
100. 실시태양 94-99 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 CBA 프로모터인 AAV 벡터.
101. 실시태양 94-99 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 SEQ ID NO: 3005의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
102. 실시태양 94-101 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질인 AAV 벡터.
103. 실시태양 94-101 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 3001의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
104. 실시태양 94-101 중 어느 하나에 있어서,
이식유전자는 SEQ ID NO: 3002의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
105. 실시태양 94-104 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호인 AAV 벡터.
106. 실시태양 94-104 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 3012의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
107. 실시태양 94-106 중 어느 하나에 있어서,
카세트는 인핸서를 포함하는 것인 AAV 벡터.
108. 실시태양 94에 있어서,
AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3014의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터
109. 실시태양 94에 있어서,
AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3015-3019 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
110. 실시태양 94-109 중 어느 하나의 AAV 벡터를 포함하는 조성물.
111. 실시태양 94-109 중 어느 하나의 AAV 벡터를 포함하는 세포.
112. 유효량의 실시태양 94-109 중 어느 하나의 AAV 벡터, 실시태양 110의 조성물, 또는 실시태양 111의 세포를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법.
113. 실시태양 112에 있어서,
대상은 니만-피크 질환 C형을 갖는 것인 방법.
114. 실시태양 112 또는 113에 있어서,
대상은 인간 대상인 방법.
SEQUENCE LISTING <110> StrideBio Inc. McCoy, Daniel Berry, Garrett E. 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Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His 260 265 270 Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe 275 280 285 His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn 290 295 300 Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln 305 310 315 320 Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn 325 330 335 Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro 340 345 350 Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala 355 360 365 Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly 370 375 380 Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro 385 390 395 400 Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe 405 410 415 Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp 420 425 430 Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg 435 440 445 Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg 565 570 575 Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala 580 585 590 Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu 705 710 715 720 Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735 <210> 2 <211> 735 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus 2 <400> 2 Met Ala Ala Asp Gly Tyr 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300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 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Asp Gly Pro Pro Glu Gly Ser Thr Ser Gly Ala Met Ser 180 185 190 Asp Asp Ser Glu Met Arg Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Val Glu Gly 195 200 205 Gly Gln Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys 210 215 220 Asp Ser Thr Trp Ser Glu Gly His Val Thr Thr Thr Ser Thr Arg Thr 225 230 235 240 Trp Val Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Gly Glu 245 250 255 Ser Leu Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr 260 265 270 Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln 275 280 285 Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Met Arg Pro Lys Ala Met Arg Val 290 295 300 Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Ser Asn Gly Glu 305 310 315 320 Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Ile Phe Ala Asp 325 330 335 Ser Ser Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Met Asp Ala Gly Gln Glu Gly Ser 340 345 350 Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr 355 360 365 Cys Gly Leu Val Thr Gly Asn Thr Ser Gln Gln Gln Thr Asp Arg Asn 370 375 380 Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly 385 390 395 400 Asn Asn Phe Glu Ile Thr Tyr Ser Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser 405 410 415 Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile 420 425 430 Asp Gln Tyr Leu Trp Gly Leu Gln Ser Thr Thr Thr Gly Thr Thr Leu 435 440 445 Asn Ala Gly Thr Ala Thr Thr Asn Phe Thr Lys Leu Arg Pro Thr Asn 450 455 460 Phe Ser Asn Phe Lys Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Ser Ile Lys Gln 465 470 475 480 Gln Gly Phe Ser Lys Thr Ala Asn Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Thr 485 490 495 Gly Ser Asp Ser Leu Ile Lys Tyr Glu Thr His Ser Thr Leu Asp Gly 500 505 510 Arg Trp Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Pro Met Ala Thr Ala Gly Pro 515 520 525 Ala Asp Ser Lys Phe Ser Asn Ser Gln Leu Ile Phe Ala Gly Pro Lys 530 535 540 Gln Asn Gly Asn Thr Ala Thr Val Pro Gly Thr Leu Ile Phe Thr Ser 545 550 555 560 Glu Glu Glu Leu Ala Ala Thr Asn Ala Thr Asp Thr Asp Met Trp Gly 565 570 575 Asn Leu Pro Gly Gly Asp Gln Ser Asn Ser Asn Leu Pro Thr Val Asp 580 585 590 Arg Leu Thr Ala 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Dependovirus adeno-associated virus <400> 2716 Gly Pro Ser Asp Gly Asp Phe 1 5 <210> 2717 <211> 6 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2717 Val Thr Gly Asn Thr Thr 1 5 <210> 2718 <211> 10 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2718 Thr Thr Ala Pro Ile Thr Gly Asn Val Thr 1 5 10 <210> 2719 <211> 2 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2719 Ser Ser 1 <210> 2720 <211> 7 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2720 Asp Thr Thr Gly Lys Tyr Thr 1 5 <210> 2721 <211> 8 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2721 Arg Ile Gly Thr Thr Ala Asn Ser 1 5 <210> 2722 <211> 10 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2722 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys 1 5 10 <210> 2723 <211> 9 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2723 Gly Asn Ser Leu Asn Gln Gly Thr Ala 1 5 <210> 2724 <211> 2 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2724 Ala Tyr 1 <210> 2725 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Dependovirus adeno-associated virus <400> 2742 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys 1 5 10 <210> 2743 <211> 9 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2743 Gly Gly Thr Leu Asn Gln Gly Asn Ser 1 5 <210> 2744 <211> 2 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2744 Ser Gly 1 <210> 2745 <211> 12 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2745 Ala Ser Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Gln Gly Arg Asn 1 5 10 <210> 2746 <211> 7 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2746 Ala Asn Asp Ala Thr Asp Phe 1 5 <210> 2747 <211> 6 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2747 Ile Thr Gly Asn Thr Thr 1 5 <210> 2748 <211> 10 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2748 Thr Thr Val Pro Thr Val Asp Asp Val Asp 1 5 10 <210> 2749 <211> 2 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2749 Asp Ser 1 <210> 2750 <211> 7 <212> PRT <213> Dependovirus adeno-associated virus <400> 2750 Asp Asn Ala Gly Ala Tyr 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cagacactaa aagacaacct gcagctgcct ctacagtttc tgtccagatg tccatcctgt 300 ttttataacc tactgaacct gttttgtgag ctgacatgta gccctcgaca gagtcagttt 360 ttgaatgtta cagctactga agattatgtt gatcctgtta caaaccagac gaaaacaaat 420 gtgaaagagt tacaatacta cgtcggacag agttttgcca atgcaatgta caatgcctgc 480 cgggatgtgg aggccccctc aagtaatgac aaggccctgg gactcctgtg tgggaaggac 540 gctgacgcct gtaatgccac caactggatt gaatacatgt tcaataagga caatggacag 600 gcacctttta ccatcactcc tgtgttttca gattttccag tccatgggat ggagcccatg 660 aacaatgcca ccaaaggctg tgacgagtct gtggatgagg tcacagcacc atgtagctgc 720 caagactgct ctattgtctg tggccccaag ccccagcccc cacctcctcc tgctccctgg 780 acgatccttg gcttggacgc catgtatgtc atcatgtgga tcacctacat ggcgtttttg 840 cttgtgtttt ttggagcatt ttttgcagtg tggtgctaca gaaaacggta ttttgtctcc 900 gagtacactc ccatcgatag caatatagct ttttctgtta atgcaagtga caaaggagag 960 gcgtcctgct gtgaccctgt cagcgcagca tttgagggct gcttgaggcg gctgttcaca 1020 cgctgggggt ctttctgcgt ccgaaaccct ggctgtgtca ttttcttctc gctggtcttc 1080 attactgcgt gttcgtcagg cctggtgttt gtccgggtca caaccaatcc agttgacctc 1140 tggtcagccc ccagcagcca ggctcgcctg gaaaaagagt actttgacca gcactttggg 1200 cctttcttcc ggacggagca gctcatcatc cgggcccctc tcactgacaa acacatttac 1260 cagccatacc cttcgggagc tgatgtaccc tttggacctc cgcttgacat acagatactg 1320 caccaggttc ttgacttaca aatagccatc gaaaacatta ctgcctctta tgacaatgag 1380 actgtgacac ttcaagacat ctgcttggcc cctctttcac cgtataacac gaactgcacc 1440 attttgagtg tgttaaatta cttccagaac agccattccg tgctggacca caagaaaggg 1500 gacgacttct ttgtgtatgc cgattaccac acgcactttc tgtactgcgt acgggctcct 1560 gcctctctga atgatacaag tttgctccat gacccttgtc tgggtacgtt tggtggacca 1620 gtgttcccgt ggcttgtgtt gggaggctat gatgatcaaa actacaataa cgccactgcc 1680 cttgtgatta ccttccctgt caataattac tataatgata cagagaagct ccagagggcc 1740 caggcctggg aaaaagagtt tattaatttt gtgaaaaact acaagaatcc caatctgacc 1800 atttccttca ctgctgaacg aagtattgaa gatgaactaa atcgtgaaag tgacagtgat 1860 gtcttcaccg ttgtaattag ctatgccatc atgtttctat atatttccct agccttgggg 1920 cacatcaaaa gctgtcgcag gcttctggtg gattcgaagg tctcactagg catcgcgggc 1980 atcttgatcg tgctgagctc ggtggcttgc tccttgggtg tcttcagcta cattgggttg 2040 cccttgaccc tcattgtgat tgaagtcatc ccgttcctgg tgctggctgt tggagtggac 2100 aacatcttca ttctggtgca ggcctaccag agagatgaac gtcttcaagg ggaaaccctg 2160 gatcagcagc tgggcagggt cctaggagaa gtggctccca gtatgttcct gtcatccttt 2220 tctgagactg tagcattttt cttaggagca ttgtccgtga tgccagccgt gcacaccttc 2280 tctctctttg cgggattggc agtcttcatt gactttcttc tgcagattac ctgtttcgtg 2340 agtctcttgg ggttagacat taaacgtcaa gagaaaaatc ggctagacat cttttgctgt 2400 gtcagaggtg ctgaagatgg aacaagcgtc caggcctcag agagctgttt gtttcgcttc 2460 ttcaaaaact cctattctcc acttctgcta aaggactgga tgagaccaat tgtgatagca 2520 atatttgtgg gtgttctgtc attcagcatc gcagtcctga acaaagtaga tattggattg 2580 gatcagtctc tttcgatgcc agatgactcc tacatggtgg attatttcaa atccatcagt 2640 cagtacctgc atgcgggtcc gcctgtgtac tttgtcctgg aggaagggca cgactacact 2700 tcttccaagg ggcagaacat ggtgtgcggc ggcatgggct gcaacaatga ttccctggtg 2760 cagcagatat ttaacgcggc gcagctggac aactataccc gaataggctt cgccccctcg 2820 tcctggatcg acgattattt cgactgggtg aagccacagt cgtcttgctg tcgagtggac 2880 aatatcactg accagttctg caatgcttca gtggttgacc ctgcctgcgt tcgctgcagg 2940 cctctgactc cggaaggcaa acagaggcct caggggggag acttcatgag attcctgccc 3000 atgttccttt cggataaccc taaccccaag tgtggcaaag ggggacatgc tgcctatagt 3060 tctgcagtta acatcctcct tggccatggc accagggtcg gagccacgta cttcatgacc 3120 taccacaccg tgctgcagac ctctgctgac tttattgacg ctctgaagaa agcccgactt 3180 atagccagta atgtcaccga aaccatgggc attaacggca gtgcctaccg agtatttcct 3240 tacagtgtgt tttatgtctt ctacgaacag tacctgacca tcattgacga cactatcttc 3300 aacctcggtg tgtccctggg cgcgatattt ctggtgacca tggtcctcct gggctgtgag 3360 ctctggtctg cagtcatcat gtgtgccacc atcgccatgg tcttggtcaa catgtttgga 3420 gttatgtggc tctggggcat cagtctgaac gctgtatcct tggtcaacct ggtgatgagc 3480 tgtggcatct ccgtggagtt ctgcagccac ataaccagag cgttcacggt gagcatgaaa 3540 ggcagccgcg tggagcgcgc ggaagaggca cttgcccaca tgggcagctc cgtgttcagt 3600 ggaatcacac ttacaaaatt tggagggatt gtggtgttgg cttttgccaa atctcaaatt 3660 ttccagatat tctacttcag gatgtatttg gccatggtct tactgggagc cactcacgga 3720 ttaatatttc tccctgtctt actcagttac atagggccat cagtaaataa agccaaaagt 3780 tgtgccactg aagagcgata caaaggaaca gagcgcgaac ggcttctaaa tttc 3834 <210> 3003 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 prime Inverted Terminal Repeat <400> 3003 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 3004 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 prime Inverted Terminal Repeat <400> 3004 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 3005 <211> 278 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 3005 tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60 ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120 ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180 cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240 ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcg 278 <210> 3006 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUSB240 Promoter <400> 3006 cggctggggc tgagggtgag ggtcccgttt ccccaaaggc ctagcctggg gttccagcca 60 caagccctac cgggcagcgc ccggccccgc ccctccaggc ctggcactcg tcctcaacca 120 agatggcgcg gatggcttca ggcgcatcac gacaccggcg cgtcacgcga cccgccctac 180 gggcacctcc cgcgcttttc ttagcgccgc agacggtggc cgagcggggg accgggaagc 240 <210> 3007 <211> 379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUSB379 Promoter <400> 3007 attcctgctg ggaaaagcaa gtggaggtgc tccttgaaga aacaggggga tcccaccgat 60 ctcaggggtt ctgttctggc ctgcggccct ggatcgtcca gcctgggtcg gggtggggag 120 cagacctcgc ccttatcggc tggggctgag ggtgagggtc ccgtttcccc aaaggcctag 180 cctggggttc cagccacaag ccctaccggg cagcgcccgg ccccgcccct ccaggcctgg 240 cactcgtcct caaccaagat ggcgcggatg gcttcaggcg catcacgaca ccggcgcgtc 300 acgcgacccg ccctacgggc acctcccgcg cttttcttag cgccgcagac ggtggtcgag 360 cgggggaccg ggaagctta 379 <210> 3008 <211> 146 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Herpes simplex virus <400> 3008 atgacacaaa ccccgcccag cgtcttgtca ttggcgaatt cgaacacgca gatgcagtcg 60 gggcggcgcg gtcccaggtc cacttcgcat attaaggtga cgcgtgtggc ctcgaacacc 120 gagcgaccct gcagcgaccc gcttaa 146 <210> 3009 <211> 301 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Cytomegalovirus sp. <400> 3009 tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 60 gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 120 ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 180 tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 240 gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 300 g 301 <210> 3010 <211> 97 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> simian virus 40 <400> 3010 gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60 agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 97 <210> 3011 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric Intron <400> 3011 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120 tttctctcca cag 133 <210> 3012 <211> 122 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> SV40 poly A signal <400> 3012 taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60 tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120 tt 122 <210> 3013 <211> 56 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 3013 aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctca 56 <210> 3014 <211> 4685 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV transfer cassette 1 <400> 3014 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgcgtcgac tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc 180 tccccatctc ccccccctcc 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atgacaaggc cctgggactc ctgtgtggga 1080 aggacgctga cgcctgtaat gccaccaact ggattgaata catgttcaat aaggacaatg 1140 gacaggcacc ttttaccatc actcctgtgt tttcagattt tccagtccat gggatggagc 1200 ccatgaacaa tgccaccaaa ggctgtgacg agtctgtgga tgaggtcaca gcaccatgta 1260 gctgccaaga ctgctctatt gtctgtggcc ccaagcccca gcccccacct cctcctgctc 1320 cctggacgat ccttggcttg gacgccatgt atgtcatcat gtggatcacc tacatggcgt 1380 ttttgcttgt gttttttgga gcattttttg cagtgtggtg ctacagaaaa cggtattttg 1440 tctccgagta cactcccatc gatagcaata tagctttttc tgttaatgca agtgacaaag 1500 gagaggcgtc ctgctgtgac cctgtcagcg cagcatttga gggctgcttg aggcggctgt 1560 tcacacgctg ggggtctttc tgcgtccgaa accctggctg tgtcattttc ttctcgctgg 1620 tcttcattac tgcgtgttcg tcaggcctgg tgtttgtccg ggtcacaacc aatccagttg 1680 acctctggtc agcccccagc agccaggctc gcctggaaaa agagtacttt gaccagcact 1740 ttgggccttt cttccggacg gagcagctca tcatccgggc ccctctcact gacaaacaca 1800 tttaccagcc atacccttcg ggagctgatg taccctttgg acctccgctt gacatacaga 1860 tactgcacca ggttcttgac ttacaaatag ccatcgaaaa cattactgcc tcttatgaca 1920 atgagactgt gacacttcaa gacatctgct tggcccctct ttcaccgtat aacacgaact 1980 gcaccatttt gagtgtgtta aattacttcc agaacagcca ttccgtgctg gaccacaaga 2040 aaggggacga cttctttgtg tatgccgatt accacacgca ctttctgtac tgcgtacggg 2100 ctcctgcctc tctgaatgat acaagtttgc tccatgaccc ttgtctgggt acgtttggtg 2160 gaccagtgtt cccgtggctt gtgttgggag gctatgatga tcaaaactac aataacgcca 2220 ctgcccttgt gattaccttc cctgtcaata attactataa tgatacagag aagctccaga 2280 gggcccaggc ctgggaaaaa gagtttatta attttgtgaa aaactacaag aatcccaatc 2340 tgaccatttc cttcactgct gaacgaagta ttgaagatga actaaatcgt gaaagtgaca 2400 gtgatgtctt caccgttgta attagctatg ccatcatgtt tctatatatt tccctagcct 2460 tggggcacat caaaagctgt cgcaggcttc tggtggattc gaaggtctca ctaggcatcg 2520 cgggcatctt gatcgtgctg agctcggtgg cttgctcctt gggtgtcttc agctacattg 2580 ggttgccctt gaccctcatt gtgattgaag tcatcccgtt cctggtgctg gctgttggag 2640 tggacaacat cttcattctg gtgcaggcct accagagaga tgaacgtctt caaggggaaa 2700 ccctggatca gcagctgggc agggtcctag 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tgtcaataat tactataatg atacagagaa gctccagagg gcccaggcct gggaaaaaga 2280 gtttattaat tttgtgaaaa actacaagaa tcccaatctg accatttcct tcactgctga 2340 acgaagtatt gaagatgaac taaatcgtga aagtgacagt gatgtcttca ccgttgtaat 2400 tagctatgcc atcatgtttc tatatatttc cctagccttg gggcacatca aaagctgtcg 2460 caggcttctg gtggattcga aggtctcact aggcatcgcg ggcatcttga tcgtgctgag 2520 ctcggtggct tgctccttgg gtgtcttcag ctacattggg ttgcccttga ccctcattgt 2580 gattgaagtc atcccgttcc tggtgctggc tgttggagtg gacaacatct tcattctggt 2640 gcaggcctac cagagagatg aacgtcttca aggggaaacc ctggatcagc agctgggcag 2700 ggtcctagga gaagtggctc ccagtatgtt cctgtcatcc ttttctgaga ctgtagcatt 2760 tttcttagga gcattgtccg tgatgccagc cgtgcacacc ttctctctct ttgcgggatt 2820 ggcagtcttc attgactttc ttctgcagat tacctgtttc gtgagtctct tggggttaga 2880 cattaaacgt caagagaaaa atcggctaga catcttttgc tgtgtcagag gtgctgaaga 2940 tggaacaagc gtccaggcct cagagagctg tttgtttcgc ttcttcaaaa actcctattc 3000 tccacttctg ctaaaggact ggatgagacc aattgtgata gcaatatttg tgggtgttct 3060 gtcattcagc atcgcagtcc tgaacaaagt agatattgga ttggatcagt ctctttcgat 3120 gccagatgac tcctacatgg tggattattt caaatccatc agtcagtacc tgcatgcggg 3180 tccgcctgtg tactttgtcc tggaggaagg gcacgactac acttcttcca aggggcagaa 3240 catggtgtgc ggcggcatgg gctgcaacaa tgattccctg gtgcagcaga tatttaacgc 3300 ggcgcagctg gacaactata cccgaatagg cttcgccccc tcgtcctgga tcgacgatta 3360 tttcgactgg gtgaagccac agtcgtcttg ctgtcgagtg gacaatatca ctgaccagtt 3420 ctgcaatgct tcagtggttg accctgcctg cgttcgctgc aggcctctga ctccggaagg 3480 caaacagagg cctcaggggg gagacttcat gagattcctg cccatgttcc tttcggataa 3540 ccctaacccc aagtgtggca aagggggaca tgctgcctat agttctgcag ttaacatcct 3600 ccttggccat ggcaccaggg tcggagccac gtacttcatg acctaccaca ccgtgctgca 3660 gacctctgct gactttattg acgctctgaa gaaagcccga cttatagcca gtaatgtcac 3720 cgaaaccatg ggcattaacg gcagtgccta ccgagtattt ccttacagtg tgttttatgt 3780 cttctacgaa cagtacctga ccatcattga cgacactatc ttcaacctcg gtgtgtccct 3840 gggcgcgata tttctggtga ccatggtcct cctgggctgt gagctctggt ctgcagtcat 3900 catgtgtgcc accatcgcca tggtcttggt caacatgttt ggagttatgt ggctctgggg 3960 catcagtctg aacgctgtat ccttggtcaa cctggtgatg agctgtggca tctccgtgga 4020 gttctgcagc cacataacca gagcgttcac ggtgagcatg aaaggcagcc gcgtggagcg 4080 cgcggaagag gcacttgccc acatgggcag ctccgtgttc agtggaatca cacttacaaa 4140 atttggaggg attgtggtgt tggcttttgc caaatctcaa attttccaga tattctactt 4200 caggatgtat ttggccatgg tcttactggg agccactcac ggattaatat ttctccctgt 4260 cttactcagt tacatagggc catcagtaaa taaagccaaa agttgtgcca ctgaagagcg 4320 atacaaagga acagagcgcg aacggcttct aaatttctag gtttaaacaa gctttaagat 4380 acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 4440 aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttctcg 4500 agccatgggc gcgccatcga tgaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 4560 cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 4620 cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 4663 <210> 3019 <211> 4691 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV Transfer Casette 6 <400> 3019 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgcgtcgac tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 180 ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 240 gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 300 ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 360 atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 420 catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggatgacaca aaccccgccc agcgtcttgt 480 cattggcgaa ttcgaacacg cagatgcagt cggggcggcg cggtcccagg tccacttcgc 540 atattaaggt gacgcgtgtg gcctcgaaca ccgagcgacc ctgcagcgac ccgcttaaat 600 gcataccggt cgccaccatg accgctcgcg gcctggccct tggcctcctc ctgctgctac 660 tgtgtccagc gcaggtgttt tcacagtcct gtgtttggta tggagagtgt ggaattgcat 720 atggggacaa gaggtacaat tgcgaatatt ctggcccacc aaaaccattg ccaaaggatg 780 gatatgactt agtgcaggaa ctctgtccag gattcttctt tggcaatgtc agtctctgtt 840 gtgatgttcg gcagcttcag acactaaaag acaacctgca gctgcctcta cagtttctgt 900 ccagatgtcc atcctgtttt tataacctac tgaacctgtt ttgtgagctg acatgtagcc 960 ctcgacagag tcagtttttg aatgttacag ctactgaaga ttatgttgat cctgttacaa 1020 accagacgaa aacaaatgtg aaagagttac aatactacgt cggacagagt tttgccaatg 1080 caatgtacaa tgcctgccgg gatgtggagg ccccctcaag taatgacaag gccctgggac 1140 tcctgtgtgg gaaggacgct gacgcctgta atgccaccaa ctggattgaa tacatgttca 1200 ataaggacaa tggacaggca ccttttacca tcactcctgt gttttcagat tttccagtcc 1260 atgggatgga gcccatgaac aatgccacca aaggctgtga cgagtctgtg gatgaggtca 1320 cagcaccatg tagctgccaa gactgctcta ttgtctgtgg ccccaagccc cagcccccac 1380 ctcctcctgc tccctggacg atccttggct tggacgccat gtatgtcatc atgtggatca 1440 cctacatggc gtttttgctt gtgttttttg gagcattttt tgcagtgtgg tgctacagaa 1500 aacggtattt tgtctccgag tacactccca tcgatagcaa tatagctttt tctgttaatg 1560 caagtgacaa aggagaggcg tcctgctgtg accctgtcag cgcagcattt gagggctgct 1620 tgaggcggct gttcacacgc tgggggtctt tctgcgtccg aaaccctggc tgtgtcattt 1680 tcttctcgct ggtcttcatt actgcgtgtt cgtcaggcct ggtgtttgtc cgggtcacaa 1740 ccaatccagt tgacctctgg tcagccccca gcagccaggc tcgcctggaa aaagagtact 1800 ttgaccagca ctttgggcct ttcttccgga cggagcagct catcatccgg gcccctctca 1860 ctgacaaaca catttaccag ccataccctt cgggagctga tgtacccttt ggacctccgc 1920 ttgacataca gatactgcac caggttcttg acttacaaat agccatcgaa aacattactg 1980 cctcttatga caatgagact gtgacacttc aagacatctg cttggcccct ctttcaccgt 2040 ataacacgaa ctgcaccatt ttgagtgtgt taaattactt ccagaacagc cattccgtgc 2100 tggaccacaa gaaaggggac gacttctttg tgtatgccga ttaccacacg cactttctgt 2160 actgcgtacg ggctcctgcc tctctgaatg atacaagttt gctccatgac ccttgtctgg 2220 gtacgtttgg tggaccagtg ttcccgtggc ttgtgttggg aggctatgat gatcaaaact 2280 acaataacgc cactgccctt gtgattacct tccctgtcaa taattactat aatgatacag 2340 agaagctcca gagggcccag gcctgggaaa aagagtttat taattttgtg aaaaactaca 2400 agaatcccaa tctgaccatt tccttcactg ctgaacgaag tattgaagat gaactaaatc 2460 gtgaaagtga cagtgatgtc ttcaccgttg taattagcta tgccatcatg tttctatata 2520 tttccctagc cttggggcac atcaaaagct gtcgcaggct tctggtggat tcgaaggtct 2580 cactaggcat cgcgggcatc ttgatcgtgc tgagctcggt ggcttgctcc ttgggtgtct 2640 tcagctacat tgggttgccc ttgaccctca ttgtgattga agtcatcccg ttcctggtgc 2700 tggctgttgg agtggacaac atcttcattc tggtgcaggc ctaccagaga gatgaacgtc 2760 ttcaagggga aaccctggat cagcagctgg gcagggtcct aggagaagtg gctcccagta 2820 tgttcctgtc atccttttct gagactgtag catttttctt aggagcattg tccgtgatgc 2880 cagccgtgca caccttctct ctctttgcgg gattggcagt cttcattgac tttcttctgc 2940 agattacctg tttcgtgagt ctcttggggt tagacattaa acgtcaagag aaaaatcggc 3000 tagacatctt ttgctgtgtc agaggtgctg aagatggaac aagcgtccag gcctcagaga 3060 gctgtttgtt tcgcttcttc aaaaactcct attctccact tctgctaaag gactggatga 3120 gaccaattgt gatagcaata tttgtgggtg ttctgtcatt cagcatcgca gtcctgaaca 3180 aagtagatat tggattggat cagtctcttt cgatgccaga tgactcctac atggtggatt 3240 atttcaaatc catcagtcag tacctgcatg cgggtccgcc tgtgtacttt gtcctggagg 3300 aagggcacga ctacacttct tccaaggggc agaacatggt gtgcggcggc atgggctgca 3360 acaatgattc cctggtgcag cagatattta acgcggcgca gctggacaac tatacccgaa 3420 taggcttcgc cccctcgtcc tggatcgacg attatttcga ctgggtgaag ccacagtcgt 3480 cttgctgtcg agtggacaat atcactgacc agttctgcaa tgcttcagtg gttgaccctg 3540 cctgcgttcg ctgcaggcct ctgactccgg aaggcaaaca gaggcctcag gggggagact 3600 tcatgagatt cctgcccatg ttcctttcgg ataaccctaa ccccaagtgt ggcaaagggg 3660 gacatgctgc ctatagttct gcagttaaca tcctccttgg ccatggcacc agggtcggag 3720 ccacgtactt catgacctac cacaccgtgc tgcagacctc tgctgacttt attgacgctc 3780 tgaagaaagc ccgacttata gccagtaatg tcaccgaaac catgggcatt aacggcagtg 3840 cctaccgagt atttccttac agtgtgtttt atgtcttcta cgaacagtac ctgaccatca 3900 ttgacgacac tatcttcaac ctcggtgtgt ccctgggcgc gatatttctg gtgaccatgg 3960 tcctcctggg ctgtgagctc tggtctgcag tcatcatgtg tgccaccatc gccatggtct 4020 tggtcaacat gtttggagtt atgtggctct ggggcatcag tctgaacgct gtatccttgg 4080 tcaacctggt gatgagctgt ggcatctccg tggagttctg cagccacata accagagcgt 4140 tcacggtgag catgaaaggc agccgcgtgg agcgcgcgga agaggcactt gcccacatgg 4200 gcagctccgt gttcagtgga atcacactta caaaatttgg agggattgtg gtgttggctt 4260 ttgccaaatc tcaaattttc cagatattct acttcaggat gtatttggcc atggtcttac 4320 tgggagccac tcacggatta atatttctcc ctgtcttact cagttacata gggccatcag 4380 taaataaagc caaaagttgt gccactgaag agcgatacaa aggaacagag cgcgaacggc 4440 ttctaaattt ctaggtttaa acaagcttaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg 4500 tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgag ccatgggcgc gccatcgatg aggaacccct 4560 agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc 4620 aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 4680 ctgcctgcag g 4691 <210> 3020 <211> 1278 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3020 Met Thr Ala Arg Gly Leu Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Pro Ala Gln Val Phe Ser Gln Ser Cys Val Trp Tyr Gly Glu Cys Gly 20 25 30 Ile Ala Tyr Gly Asp Lys Arg Tyr Asn Cys Glu Tyr Ser Gly Pro Pro 35 40 45 Lys Pro Leu Pro Lys Asp Gly Tyr Asp Leu Val Gln Glu Leu Cys Pro 50 55 60 Gly Phe Phe Phe Gly Asn Val Ser Leu Cys Cys Asp Val Arg Gln Leu 65 70 75 80 Gln Thr Leu Lys Asp Asn Leu Gln Leu Pro Leu Gln Phe Leu Ser Arg 85 90 95 Cys Pro Ser Cys Phe Tyr Asn Leu Leu Asn Leu Phe Cys Glu Leu Thr 100 105 110 Cys Ser Pro Arg Gln Ser Gln Phe Leu Asn Val Thr Ala Thr Glu Asp 115 120 125 Tyr Val Asp Pro Val Thr Asn Gln Thr Lys Thr Asn Val Lys Glu Leu 130 135 140 Gln Tyr Tyr Val Gly Gln Ser Phe Ala Asn Ala Met Tyr Asn Ala Cys 145 150 155 160 Arg Asp Val Glu Ala Pro Ser Ser Asn Asp Lys Ala Leu Gly Leu Leu 165 170 175 Cys Gly Lys Asp Ala Asp Ala Cys Asn Ala Thr Asn Trp Ile Glu Tyr 180 185 190 Met Phe Asn Lys Asp Asn Gly Gln Ala Pro Phe Thr Ile Thr Pro Val 195 200 205 Phe Ser Asp Phe Pro Val His Gly Met Glu Pro Met Asn Asn Ala Thr 210 215 220 Lys Gly Cys Asp Glu Ser Val Asp Glu Val Thr Ala Pro Cys Ser Cys 225 230 235 240 Gln Asp Cys Ser Ile Val Cys Gly Pro Lys Pro Gln Pro Pro Pro Pro 245 250 255 Pro Ala Pro Trp Thr Ile Leu Gly Leu Asp Ala Met Tyr Val Ile Met 260 265 270 Trp Ile Thr Tyr Met Ala Phe Leu Leu Val Phe Phe Gly Ala Phe Phe 275 280 285 Ala Val Trp Cys Tyr Arg Lys Arg Tyr Phe Val Ser Glu Tyr Thr Pro 290 295 300 Ile Asp Ser Asn Ile Ala Phe Ser Val Asn Ala Ser Asp Lys Gly Glu 305 310 315 320 Ala Ser Cys Cys Asp Pro Val Ser Ala Ala Phe Glu Gly Cys Leu Arg 325 330 335 Arg Leu Phe Thr Arg Trp Gly Ser Phe Cys Val Arg Asn Pro Gly Cys 340 345 350 Val Ile Phe Phe Ser Leu Val Phe Ile Thr Ala Cys Ser Ser Gly Leu 355 360 365 Val Phe Val Arg Val Thr Thr Asn Pro Val Asp Leu Trp Ser Ala Pro 370 375 380 Ser Ser Gln Ala Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Phe Asp Gln His Phe Gly 385 390 395 400 Pro Phe Phe Arg Thr Glu Gln Leu Ile Ile Arg Ala Pro Leu Thr Asp 405 410 415 Lys His Ile Tyr Gln Pro Tyr Pro Ser Gly Ala Asp Val Pro Phe Gly 420 425 430 Pro Pro Leu Asp Ile Gln Ile Leu His Gln Val Leu Asp Leu Gln Ile 435 440 445 Ala Ile Glu Asn Ile Thr Ala Ser Tyr Asp Asn Glu Thr Val Thr Leu 450 455 460 Gln Asp Ile Cys Leu Ala Pro Leu Ser Pro Tyr Asn Thr Asn Cys Thr 465 470 475 480 Ile Leu Ser Val Leu Asn Tyr Phe Gln Asn Ser His Ser Val Leu Asp 485 490 495 His Lys Lys Gly Asp Asp Phe Phe Val Tyr Ala Asp Tyr His Thr His 500 505 510 Phe Leu Tyr Cys Val Arg Ala Pro Ala Ser Leu Asn Asp Thr Ser Leu 515 520 525 Leu His Asp Pro Cys Leu Gly Thr Phe Gly Gly Pro Val Phe Pro Trp 530 535 540 Leu Val Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Gln Asn Tyr Asn Asn Ala Thr Ala 545 550 555 560 Leu Val Ile Thr Phe Pro Val Asn Asn Tyr Tyr Asn Asp Thr Glu Lys 565 570 575 Leu Gln Arg Ala Gln Ala Trp Glu Lys Glu Phe Ile Asn Phe Val Lys 580 585 590 Asn Tyr Lys Asn Pro Asn Leu Thr Ile Ser Phe Thr Ala Glu Arg Ser 595 600 605 Ile Glu Asp Glu Leu Asn Arg Glu Ser Asp Ser Asp Val Phe Thr Val 610 615 620 Val Ile Ser Tyr Ala Ile Met Phe Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Leu Gly 625 630 635 640 His Met Lys Ser Cys Arg Arg Leu Leu Val Asp Ser Lys Val Ser Leu 645 650 655 Gly Ile Ala Gly Ile Leu Ile Val Leu Ser Ser Val Ala Cys Ser Leu 660 665 670 Gly Val Phe Ser Tyr Ile Gly Leu Pro Leu Thr Leu Ile Val Ile Glu 675 680 685 Val Ile Pro Phe Leu Val Leu Ala Val Gly Val Asp Asn Ile Phe Ile 690 695 700 Leu Val Gln Ala Tyr Gln Arg Asp Glu Arg Leu Gln Gly Glu Thr Leu 705 710 715 720 Asp Gln Gln Leu Gly Arg Val Leu Gly Glu Val Ala Pro Ser Met Phe 725 730 735 Leu Ser Ser Phe Ser Glu Thr Val Ala Phe Phe Leu Gly Ala Leu Ser 740 745 750 Val Met Pro Ala Val His Thr Phe Ser Leu Phe Ala Gly Leu Ala Val 755 760 765 Phe Ile Asp Phe Leu Leu Gln Ile Thr Cys Phe Val Ser Leu Leu Gly 770 775 780 Leu Asp Ile Lys Arg Gln Glu Lys Asn Arg Leu Asp Ile Phe Cys Cys 785 790 795 800 Val Arg Gly Ala Glu Asp Gly Thr Ser Val Gln Ala Ser Glu Ser Cys 805 810 815 Leu Phe Arg Phe Phe Lys Asn Ser Tyr Ser Pro Leu Leu Leu Lys Asp 820 825 830 Trp Met Arg Pro Ile Val Ile Ala Ile Phe Val Gly Val Leu Ser Phe 835 840 845 Ser Ile Ala Val Leu Asn Lys Val Asp Ile Gly Leu Asp Gln Ser Leu 850 855 860 Ser Met Pro Asp Asp Ser Tyr Met Val Asp Tyr Phe Lys Ser Ile Ser 865 870 875 880 Gln Tyr Leu His Ala Gly Pro Pro Val Tyr Phe Val Leu Glu Glu Gly 885 890 895 His Asp Tyr Thr Ser Ser Lys Gly Gln Asn Met Val Cys Gly Gly Met 900 905 910 Gly Cys Asn Asn Asp Ser Leu Val Gln Gln Ile Phe Asn Ala Ala Gln 915 920 925 Leu Asp Asn Tyr Thr Arg Ile Gly Phe Ala Pro Ser Ser Trp Ile Asp 930 935 940 Asp Tyr Phe Asp Trp Val Lys Pro Gln Ser Ser Cys Cys Arg Val Asp 945 950 955 960 Asn Ile Thr Asp Gln Phe Cys Asn Ala Ser Val Val Asp Pro Ala Cys 965 970 975 Val Arg Cys Arg Pro Leu Thr Pro Glu Gly Lys Gln Arg Pro Gln Gly 980 985 990 Gly Asp Phe Met Arg Phe Leu Pro Met Phe Leu Ser Asp Asn Pro Asn 995 1000 1005 Pro Lys Cys Gly Lys Gly Gly His Ala Ala Tyr Ser Ser Ala Val 1010 1015 1020 Asn Ile Leu Leu Gly His Gly Thr Arg Val Gly Ala Thr Tyr Phe 1025 1030 1035 Met Thr Tyr His Thr Val Leu Gln Thr Ser Ala Asp Phe Ile Asp 1040 1045 1050 Ala Leu Lys Lys Ala Arg Leu Ile Ala Ser Asn Val Thr Glu Thr 1055 1060 1065 Met Gly Ile Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Val Phe Pro Tyr Ser Val 1070 1075 1080 Phe Tyr Val Phe Tyr Glu Gln Tyr Leu Thr Ile Ile Asp Asp Thr 1085 1090 1095 Ile Phe Asn Leu Gly Val Ser Leu Gly Ala Ile Phe Leu Val Thr 1100 1105 1110 Met Val Leu Leu Gly Cys Glu Leu Trp Ser Ala Val Ile Met Cys 1115 1120 1125 Ala Thr Ile Ala Met Val Leu Val Asn Met Phe Gly Val Met Trp 1130 1135 1140 Leu Trp Gly Ile Ser Leu Asn Ala Val Ser Leu Val Asn Leu Val 1145 1150 1155 Met Ser Cys Gly Ile Ser Val Glu Phe Cys Ser His Ile Thr Arg 1160 1165 1170 Ala Phe Thr Val Ser Met Lys Gly Ser Arg Val Glu Arg Ala Glu 1175 1180 1185 Glu Ala Leu Ala His Met Gly Ser Ser Val Phe Ser Gly Ile Thr 1190 1195 1200 Leu Thr Lys Phe Gly Gly Ile Val Val Leu Ala Phe Ala Lys Ser 1205 1210 1215 Gln Ile Phe Gln Ile Phe Tyr Phe Arg Met Tyr Leu Ala Met Val 1220 1225 1230 Leu Leu Gly Ala Thr His Gly Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Leu 1235 1240 1245 Ser Tyr Ile Gly Pro Ser Val Asn Lys Ala Lys Ser Cys Ala Thr 1250 1255 1260 Glu Glu Arg Tyr Lys Gly Thr Glu Arg Glu Arg Leu Leu Asn Phe 1265 1270 1275

Claims (21)

  1. (i) SEQ ID NO: 180의 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드; 및
    (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서;
    여기서 핵산은 전달 카세트를 포함하고;
    여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로:
    5' 역 말단 반복부(ITR);
    프로모터; NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자;
    폴리아데닐화 신호; 및
    3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    전달 카세트는 인트론 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서,
    인트론 서열은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
  4. 제 1 항에 있어서,
    5' ITR은 SEQ ID NO: 3003의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
  5. 제 1 항에 있어서,
    3' ITR은 SEQ ID NO: 3004의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
  6. 제 1 항에 있어서,
    프로모터는 CBA 프로모터인 AAV 벡터.
  7. 제 1 항에 있어서,
    프로모터는 SEQ ID NO: 3005의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
  8. 제 1 항에 있어서,
    NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질인 AAV 벡터.
  9. 제 1 항에 있어서,
    NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 3001의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
  10. 제 1 항에 있어서,
    이식유전자는 SEQ ID NO: 3002의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
  11. 제 1 항에 있어서,
    폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호인 AAV 벡터.
  12. 제 1 항에 있어서,
    폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 3012의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
  13. 제 1 항에 있어서,
    카세트는 인핸서를 포함하는 것인 AAV 벡터.
  14. 제 1 항에 있어서,
    AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3014의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
  15. 제 1 항에 있어서,
    AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3015-3019 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 AAV 벡터.
  16. (i) SEQ ID NO: 180의 서열을 포함하는 캡시드 단백질 서브유닛, 또는 SEQ ID NO: 180에 비해 약 1 내지 약 25개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 서열을 포함하는 단백질 캡시드; 및
    (ii) 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서;
    여기서 핵산은 전달 카세트를 포함하며;
    여기서 전달 카세트는 5'에서 3'로:
    5' 역 말단 반복부(ITR);
    프로모터;
    NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자;
    폴리아데닐화 신호; 및
    3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함하는 조성물.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함하는 세포.
  19. 유효량의 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터, 제 17 항의 조성물, 또는 제 18 항의 세포를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    대상은 니만-피크 질환 C형을 갖는 것인 방법.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    대상은 인간 대상인 방법.
KR1020227013462A 2019-10-17 2020-10-16 니만-피크 질환 c형의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 벡터 KR20220083714A (ko)

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