JP7153009B2 - 高収率の組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを生成するための、規模拡大可能な高回収率の方法、及びそれにより生成される組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター - Google Patents
高収率の組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを生成するための、規模拡大可能な高回収率の方法、及びそれにより生成される組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター Download PDFInfo
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Description
(1)操作の可変性に基づいた製造リスクを減少させることができる、rAAVベクターを製造するための高度に信頼性を有する/着実なUF/DFプロセス、
(2)rAAVベクター収率の全体的な増加(例えば、開始から終了まで70%以上)をもたらす、UF/DFプロセスからの効率的なrAAVベクター回収、
(3)著しいrAAVベクター損失の回避、
(4)rAAVベクター凝集(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー及び/又は動的光散乱等の技術により検出不可能なrAAVベクター凝集)を減少、最小化又は防止すること、
(5)rAAVベクター凝集を減少、最小化した状態、又は(サイズ排除クロマトグラフィー及び/又は動的光散乱等の技術により)ほとんど若しくは全く検出不可能な状態で、rAAVベクターを高濃度、例えば、5E+13vg/mlまで濃縮することを可能とすること、並びに/或いは
(6)高力価rAAVベクター調製物を生成して、臨床応用において少量投与を可能とすること
のうちの1つ又は複数を単独、又は相互に任意の組合せ、又は本明細書に開示の他の実施形態との任意の組合せで提供する。
rAAVベクターの損失及び/又は凝集を説明し得る多くの仮説のうちの1つは、非最適化UF/DFプロセスにおいてTFF装置にゲル層が蓄積し得ることであり、これがrAAVベクター損失の原因となり得ることである。蓄積したゲル層のこの仮説は、ベクターがより濃縮されるほど、より激しいゲル層が蓄積され得るので、rAAVベクターを高濃度に濃縮した場合、より多くのrAAVベクターが失われるという現象も説明し得る。ゲル層の蓄積は、特にrAAVベクターを高濃度に濃縮した場合UF/DFプロセスにおいて極めて頻繁に認められる現象である、rAAV凝集も引き起こし得る。
TFF操作パラメーターに加えて、多くの仮説のうちの1つは、処方が、ゲル層を減少させ、またrAAVの凝集を防ぐのに重要な役割を果たし得るということである。現在のUF/DFプロセスで使用される溶液/バッファーのほとんどにおいて、バッファー/溶液に使用される化学物質は、塩及びpHを調節するための化学物質である。プロセスを通してUF/DF溶液に界面活性剤を使用すると、rAAVベクター間の会合及びrAAVベクターとUF/DF装置の表面との間の会合が減少し得る。次いで、これにより、UF/DFプロセスを通してrAAVベクターのゲル層が減少又は防止され得る。加えて、界面活性剤は、UF/DFプロセスを完了する間、疎水性相互作用を減少又は防止することにより、rAAVの会合をさらに減少させ得る。これによって、rAAVの凝集を減少、最小化又は防止する。さらなる仮説は、UF/DFプロセス中に、せん断速度を増加させ、膜差圧(TMP)を調節すると、ゲル層の蓄積が減少し得るということである。このようなすべての仮説に基づいて一連の試験を行い、これにより、本明細書に開示する特定の発明の処方及び操作パラメーターがもたらされた。
本発明によれば、rAAVの凝集を減少、最小化又は防止し、rAAVベクターの回収率(全収率)を増加させる、新規のUF/DF操作パラメーターは、高力価のrAAVベクター調製物が望ましい場合、特に適切である。例えば、UF/DFステップの前のCsCl勾配遠心法において等、rAAVベクター調製物が高濃度のrAABVを含む場合は特に、第1の操作パラメーターでは、低rAAV力価でUF/DFプロセスを開始するべきである。10mMのリン酸ナトリウム、180mMのNaCl及び0.001%のPluronicF-68をpH7.3で含む、作製したダイアフィルトレーションバッファーを使用して、CsCl中の高度に濃縮したrAAVを最初に5E+12vg/ml以下の力価に希釈した。作製したダイアフィルトレーションバッファーを使用して、約8,000/秒以上のせん断速度の流量で、DFプロセスを運用する。ダイアフィルトレーションプロセスを終了して効率的なバッファー交換を達成し、次いで、UFプロセスを開始してrAAVベクターを所望の力価に濃縮する。
[0001]本出願は、2016年7月21日出願の米国特許仮出願第62/365,312号に対する優先権を主張する。先の出願の全内容は、すべての文章、表、配列表及び図面を含めて、参照により本明細書に組み込む。
Claims (66)
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を生成する方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を収穫して収穫物を生成するステップと、
(b)ステップ(a)において生成した前記収穫物を溶解して、ライセートを生成するステップと、
(c)ステップ(b)において生成した前記ライセートをろ過して、清澄ライセートを生成するステップと、
(d)ステップ(c)において生成した前記清澄ライセートをイオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、精製rAAVベクター粒子からなるカラム溶出液を生成するステップと、
(e)ステップ(d)において生成した前記カラム溶出液を塩化セシウムと混合して、混合物を生成し、前記混合物を勾配超遠心分離に供して、真正なrAAVベクター粒子を中空カプシドAAV粒子及び他のAAVベクター関連不純物から実質的に分離するステップと、
(f)(1)ステップ(e)において分離した前記真正なrAAVベクター粒子を収集するステップ、及び(f)(2)非イオン界面活性剤を含むバッファー中に、収集した前記真正なrAAVベクター粒子を処方するステップと、
(g)ステップ(f)(2)の前記真正なrAAVベクター粒子を、タンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換に供して、AAVベクター処方物を生成するステップと、
(h)ステップ(g)において生成した前記AAVベクター処方物をろ過し、これにより真正なrAAVベクター粒子の処方物を生成するステップと
を含む、方法。 - ステップ(f)(2)の前記バッファーが、塩化ナトリウム及び/又はリン酸ナトリウムを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(f)(2)の前記バッファーが、10mMの濃度から500mMの濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(f)(2)の前記バッファーが、5mMの濃度から50mMの濃度のリン酸ナトリウムを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(f)(2)の前記非イオン界面活性剤が、ポリアルキレングリコールを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)(2)の前記非イオン界面活性剤が、少なくとも1つのポリエチレングリコールブロック及び少なくとも1つのポリプロピレングリコールブロックを含むブロック共重合体を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)(2)の前記非イオン界面活性剤が、アルキルポリグリコシド、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドDEA、コカミドMEA、デシルグルコシド、エトキシレート、IGEPAL CA-630、イソテセス-20、グルコシド、マルトシド、モノラウリン、ノニデットP-40、ノノキシノール、ノノキシノール-9、NP-40、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-オクチルβ-D-チオグルコピラノシド、オクチルグルコシド、オレイルアルコール、PEG-10ヒマワリグリセリド、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポロキサマー、ポロキサマー407、ポロキサマー188(ポリ(エチレンオキシド-co-ポリプロピレンオキシド))、ポリグリセリンポリリシノレエート、ソルビタン、ステアリルアルコール、TritonX-100、及びTween80を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エトキシレートが、エトキシ化脂肪酸、アルコールエトキシレート、トリスチリルフェノールエトキシレート、又はエトキシ化ソルビタン脂肪酸エステルを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記ソルビタンが、ソルビタンモノステアレート又はソルビタントリステアレートを含む、請求項7に記載の方法。
- ステップ(f)(2)の前記非イオン界面活性剤が、cetomacrogol 1000、ポリソルベート、ポリソルベート20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート)、ポリソルベート40(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート)、ポリソルベート60(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート)、ポリソルベート80(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート);ポリグリセリンポリリシノレエート、オクタデカン酸[2-[(2R,3S,4R)-3,4-ジヒドロキシ-2-テトラヒドロフラニル]-2-ヒドロキシエチル]エステル、オクタデカン酸[(2R,3S,4R)-2-[1,2-ビス(1-オキソオクタデコキシ)エチル]-4-ヒドロキシ-3-テトラヒドロフラニル]エステル;C8~C22の長鎖アルコール、ヘキサデカン-1-オール及びcis-9-オクタデセン-1-オール;置換基が、ポリエトキシエタノール基を含み得る、置換又は非置換のオクチルフェノール;ポリエチレングリコールモノイソヘキサデシルエーテル;ドデカン酸2,3-ジヒドロキシプロピルエステル;ラウリルグルコシド、オクチルグルコシド及びデシルグルコシドを含み得るグルコシド;脂肪酸アミド;並びに親水性ポリエチレンオキシド鎖及び親油性又は親水性の芳香族炭化水素基を有する非イオン界面活性剤を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)(2)の前記非イオン界面活性剤が、ポリエチレングリコール-ブロック-ポリプロピレングリコール-ブロック-ポリエチレングリコール、又はポリオキシエチレン(ポリ(エチレンオキシド))の2つの親水性鎖に挟まれたポリオキシプロピレン(ポリ(プロピレンオキシド))の中央疎水性鎖からなるトリブロック共重合体を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリエチレングリコール-ブロック-ポリプロピレングリコール-ブロック-ポリエチレングリコール又はトリブロック共重合体が、SYNPERONIC F108(Aldrich)を含む、請求項11に記載の方法。
- ステップ(f)(2)の前記非イオン界面活性剤が、0.0001%の濃度から0.1%の濃度を有する、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)(2)の前記非イオン界面活性剤が、0.0001%の濃度から0.01%の濃度を有する、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真正なrAAVベクター粒子が、ステップ(h)において生成した前記処方物中に1mL当たり1015粒子の濃度から1mL当たり1018の濃度で存在する、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)の前記真正なrAAVベクター粒子の収率が、少なくとも5×1012真正rAAVベクター粒子/mlである、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)の前記真正なrAAVベクター粒子の収率が、少なくとも1×1013真正rAAVベクター粒子/mlである、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)の前記真正なrAAVベクター粒子の収率が、少なくとも5×1013真正rAAVベクター粒子/mlである、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)の前記真正なrAAVベクター粒子の回収率が、ステップ(a)の総rAAVベクター粒子の少なくとも60%である、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)の前記真正なrAAVベクター粒子の回収率が、ステップ(a)の総rAAVベクター粒子の少なくとも70%である、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真正なrAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及びRh74からなる群から選択されるAAVに由来する、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真正なrAAV粒子が、抑制性核酸をコードする導入遺伝子を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抑制性核酸が、siRNA、アンチセンス分子、miRNA、リボザイム及びshRNAからなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記真正なrAAV粒子が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織成長因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子α(TGFα)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン成長因子I及びII(IGF-I及びIGF-II)、TGFβ、アクチビン、インヒビン、骨形態形成タンパク質(BMP)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニュートロフィンNT-3及びNT4/5、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、アグリン、ネトリン-1及びネトリン-2、肝細胞増殖因子(HGF)、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される、遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真正なrAAV粒子が、トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン、IL1~IL-17、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子、flk-2/flt3リガンド、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、単鎖T細胞受容体、MHCクラスI及びクラスII分子からなる群から選択される、遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真正なrAAVベクター粒子が、カルバモイルシンテターゼI、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α-1アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第V因子、第VIII因子、第IX因子、シスタチオニンβシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-coAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、βグルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、RPE65、H-タンパク質、T-タンパク質、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、及びジストロフィンからなる群から選択される、先天代謝異常の矯正に有用なタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、第VIII因子又は第IX因子である、請求項26に記載の方法。
- 前記真正なrAAVベクター粒子が、神経変性疾患の矯正に有用なタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、トリペプチジルペプチダーゼ1(TPP1)である、請求項28に記載の方法。
- ステップ(e)において別々に中空カプシド粒子を収集することを含む、請求項1~29のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)後の前記真正なrAAVベクター粒子の純度が、少なくとも80%である、請求項1~30のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)後の前記真正なrAAVベクター粒子の純度が、少なくとも90%である、請求項1~30のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)後の前記真正なrAAVベクター粒子の純度が、少なくとも95%である、請求項1~30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中空カプシド粒子が、ステップ(h)後に10%以下の量で存在する、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中空カプシド粒子が、ステップ(h)後に5%以下の量で存在する、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)後に、10%以下の凝集rAAV粒子が存在する、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)後に、5%以下の凝集rAAV粒子が存在する、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)後に、3%未満の凝集rAAV粒子が存在する、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(h)後に、1~3%の凝集rAAV粒子が存在する、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)の前記遠心分離が、1段階で行われる、請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)の前記遠心分離が、密度勾配超遠心分離である、請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)の前記カラム溶出液を、タンジェンシャルフローろ過により濃縮して、濃縮カラム溶出液を生成する、請求項1~41のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)において生成したライセートにヌクレアーゼを加えるステップをさらに含む、請求項1~41のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)のタンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換後にAAVベクター処方物に非イオン界面活性剤を加えた場合、ステップ(g)のタンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換後にAAVベクター処方物に非イオン界面活性剤を加えずに生成したrAAVベクター粒子と比較してより高い回収率を有するrAAVベクター粒子を生成する、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)のタンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換後にAAVベクター処方物に非イオン界面活性剤を加えた場合、ステップ(g)のタンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換後にAAVベクター処方物に非イオン界面活性剤を加えずに生成したrAAVベクター粒子と比較してより高い力価を有するrAAVベクター粒子を生成する、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)(1)の収集した前記真正なrAAVベクター粒子が、ステップ(g)(2)の前、実質的に同時又は後に、5×1012rAAVベクター粒子/ml未満の濃度まで希釈される、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)の前記タンジェンシャルフローろ過が、2~15psigの間の膜差圧で行われる、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)の前記タンジェンシャルフローろ過が、4~12psigの間の膜差圧で行われる、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)の前記タンジェンシャルフローろ過が、3000/秒よりも高いせん断速度で行われる、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)の前記タンジェンシャルフローろ過が、5000/秒よりも高いせん断速度で行われる、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)の前記タンジェンシャルフローろ過が、5000~15,000/秒の間のせん断速度で行われる、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)の前記タンジェンシャルフローろ過が、8,000~12,000/秒のせん断速度で行われる、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)の前記収穫物がステップ(b)の前に濃縮され、濃縮収穫物が生成される、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮がタンジェンシャルフローろ過によるものである、請求項53に記載の方法。
- ステップ(b)における前記溶解が微細流動化によるものである、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮収穫物を溶解することをさらに含む、請求項53に記載の方法。
- 前記濃縮収穫物の溶解が微細流動化によるものである、請求項56に記載の方法。
- ステップ(d)の前記カラム溶出液が濃縮され、濃縮カラム溶出液が生成される、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮がタンジェンシャルフローろ過によるものである、請求項58に記載の方法。
- 生成された前記濃縮カラム溶出液が塩化セシウムと混合され、混合物が生成される、請求項58又は59に記載の方法。
- 前記タンジェンシャルフローろ過が、2~15psigの間の膜差圧で行われる、請求項54又は59に記載の方法。
- 前記タンジェンシャルフローろ過が、4~12psigの間の膜差圧で行われる、請求項54又は59に記載の方法。
- 前記タンジェンシャルフローろ過が、3000/秒よりも高いせん断速度で行われる、請求項54又は59に記載の方法。
- 前記タンジェンシャルフローろ過が、5000/秒よりも高いせん断速度で行われる、請求項54又は59に記載の方法。
- 前記タンジェンシャルフローろ過が、5000~15,000/秒の間のせん断速度で行われる、請求項54又は59に記載の方法。
- 前記タンジェンシャルフローろ過が、8,000~12,000/秒のせん断速度で行われる、請求項54又は59に記載の方法。
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