JP7153009B2 - 高収率の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを生成するための、規模拡大可能な高回収率の方法、及びそれにより生成される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター - Google Patents

高収率の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを生成するための、規模拡大可能な高回収率の方法、及びそれにより生成される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター Download PDF

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Description

[0002]タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）は、限外ろ過プロセス（ＵＦ）により生成物を濃縮するため、及びダイアフィルトレーション（ＤＦ）を介したバッファー交換により生成物を処方するために、バイオテクノロジー産業において使用される技術である。しかし、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターにＴＦＦを使用してＵＦ／ＤＦを行う場合、相当量のｒＡＡＶベクターが、プロセス中に失われた。ｒＡＡＶベクターを高度に濃縮する場合、さらに一層ベクターが失われる。ＵＦ／ＤＦプロセスにおけるベクター損失量により、ｒＡＡＶに関連する遺伝子治療製品の開発において大変望ましい高濃度ｒＡＡＶベクター調製物の生成が、ほとんど不可能となっている。
[0003]ｒＡＡＶベクターの製造においてよく認められる別の現象は、１ｍｌ当たり１Ｅ＋１３ｖｇ（１×１０１３ベクターゲノム／ｍｌ、ｖｇ：ベクターゲノム）以上等、高度にベクターの調製物を濃縮する場合は特に、ｒＡＡＶベクターが、ＵＦ／ＤＦプロセスにおいて凝集する傾向があることである。ｒＡＡＶベクターの凝集は、力価依存的であり、力価が高くなるほど、ベクターは、より凝集すると考えられる。ベクターの凝集によりまた、製造中にベクターの損失が生じる。さらに、凝集したベクターは、臨床の場で使用した場合、患者の安全に対する一懸念事項である。
[0004]上記のＴＦＦ技術を使用したＵＦ／ＤＦプロセスにおけるｒＡＡＶベクター凝集及びベクター損失に関する問題は、ｒＡＡＶベクターの製造及び／又は精製における意味のあるプロセスチャレンジの代表である。本明細書における本発明では、このような問題に取り組む。
[0005]多くの異なる仮説の中でも、ＴＦＦ技術を使用したＵＦ／ＤＦプロセスにおけるｒＡＡＶベクター凝集及びベクター損失は、プロセス依存的及び／又は処方依存的となり得る。このような仮説に基づいて、ベクター回収率を向上させ、ｒＡＡＶベクターの凝集を減少、最小化又は防止するために、ＵＦ／ＤＦプロセス用に、新規の処方を考案し、新規の操作パラメーターを作製した。ＵＦ／ＤＦプロセス用の発明の処方及び操作パラメーターでは、ｒＡＡＶベクター回収率が向上し、ｒＡＡＶ凝集が減少した。本明細書に開示するデータは、ＵＦ／ＤＦプロセス用に作製した新規の処方及び操作パラメーターは、単独で又は組み合わせて、最初のｒＡＡＶベクター調製物から回収した全ｒＡＡＶベクターの著しい増加をもたらすことを示す。実際、ｒＡＡＶベクターは、顕著なベクター損失もなく５Ｅ＋１３ｖｇ／ｍｌ（５×１０１３ベクターゲノム／ｍｌ）まで濃縮することができ、また、ベクターは、主にモノマーであり、これは凝集の減少を示す。
[0006]本明細書に開示の発明の処方及び／又は操作パラメーターは、ｒＡＡＶ凝集体がなしに、又はほとんどなしに、例えば、１ミリリットル当たり（Ｖｇ／ｍｌ）５Ｅ＋１３（５×１０１３）ベクターゲノムまで、高濃度にｒＡＡＶベクターを濃縮することを可能とする。さらに、本明細書に開示の発明の処方及び／又は操作パラメーターは、タンジェンシャルフローろ過技術（ＴＦＦ）を使用して、バッファー交換からのｒＡＡＶベクター回収率を向上させるか、又はベクターを濃縮する。本明細書に開示の発明の処方及び／又は操作パラメーターによって、リソソーム蓄積症、例えば、神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ２）等のためのｒＡＡＶを介した遺伝子治療、血液凝固因子欠乏症（血友病Ａ及び血友病Ｂ）等のためのｒＡＡＶを介した遺伝子治療等、高濃度のｒＡＡＶ調製物が望ましい場合の、ｒＡＡＶベクターを使用する、いかなる遺伝子治療の臨床応用をも支援することが可能である。ＴＦＦを使用した、限外ろ過（ＵＦ）及びダイアフィルトレーション（ＤＦ）プロセスによりベクター回収率が向上するとまた、ｒＡＡＶベクター製造の製品コストが減少し、より安定で着実なｒＡＡＶベクター又は臨床応用がもたらされる。
[0007]したがって、本発明は、ｒＡＡＶ製造プロセスに様々な利点を提供する。一実施形態では、ｒＡＡＶベクター回収率を高め、著しく強化することができ、それによって、開始から終了までの収率の向上をもたらす（例えば、開始から終了まで７０％以上のｒＡＡＶベクター収率）。別の実施形態では、高ｒＡＡＶベクター力価にｒＡＡＶベクターを濃縮する場合は特に、ｒＡＡＶ凝集を減少、最小化又は防止する。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶベクターを高力価及び／又は少量で投与すること（例えば、注射又は点滴）が望ましい臨床応用に適した高濃度（例えば、少なくとも１Ｅ＋１２、５Ｅ＋１２、１Ｅ＋１３、又は５Ｅ＋１３ｖｇ／ｍｌで）でｒＡＡＶベクターを生成する。さらなる実施形態では、本発明は、以下、
（１）操作の可変性に基づいた製造リスクを減少させることができる、ｒＡＡＶベクターを製造するための高度に信頼性を有する／着実なＵＦ／ＤＦプロセス、
（２）ｒＡＡＶベクター収率の全体的な増加（例えば、開始から終了まで７０％以上）をもたらす、ＵＦ／ＤＦプロセスからの効率的なｒＡＡＶベクター回収、
（３）著しいｒＡＡＶベクター損失の回避、
（４）ｒＡＡＶベクター凝集（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー及び／又は動的光散乱等の技術により検出不可能なｒＡＡＶベクター凝集）を減少、最小化又は防止すること、
（５）ｒＡＡＶベクター凝集を減少、最小化した状態、又は（サイズ排除クロマトグラフィー及び／又は動的光散乱等の技術により）ほとんど若しくは全く検出不可能な状態で、ｒＡＡＶベクターを高濃度、例えば、５Ｅ＋１３ｖｇ／ｍｌまで濃縮することを可能とすること、並びに／或いは
（６）高力価ｒＡＡＶベクター調製物を生成して、臨床応用において少量投与を可能とすること
のうちの１つ又は複数を単独、又は相互に任意の組合せ、又は本明細書に開示の他の実施形態との任意の組合せで提供する。
ＴＦＦプロセス中のせん断速度の増加が、ｒＡＡＶベクター回収率をどのように著しく向上させたかを示すグラフである。ＣｓＣｌ超遠心分離後のＡＡＶ２－ｈＴＰＰ１ｖ１ベクター（２．５Ｅ＋１４ｖｇ）を、ダイアフィルトレーションバッファーを使用して、５０ｍＬ（５．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ）に最初に希釈した。ダイアフィルトレーションの１サイクルでは、２５ｍＬのダイアフィルトレーションバッファーを５０ｍＬの希釈したベクター中に加え、次いで、ダイアフィルトレーションを開始し、量が５０ｍＬに減少するまで行った。ダイアフィルトレーションステップを２４回繰り返した。２５サイクルのダイアフィルトレーションプロセス後、ベクターを５ｍＬまで限外ろ過した。５ｍＬのベクターをアッセイ用に収集した。（Ａ）ｑＰＣＲ解析により、ＴＦＦプロセス中に、高せん断速度（約１０，０００／秒）を採用した場合、ベクター力価は、４．８１Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬであったことが示されており、９０％以上のベクター回収率を示したが、一方、低せん断速度（約３０００／秒）では、１．３８Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬとなったことが示されており、約３０％のベクター回収率を示した。（Ｂ）動的光散乱（ＤＬＳ）解析により、高せん断速度（約１０，０００／秒）又は低せん断速度（約３０００／秒）のいずれの場合に収集したベクターの直径も、同様であったことが示された。 膜差圧（ＴＭＰ）が、ＴＦＦプロセスからのｒＡＡＶ回収率にどのように影響するかを示すグラフである。ＣｓＣｌ超遠心分離後のＡＡＶ２－ｈＴＰＰ１ｖ１ベクター（２．５Ｅ＋１４ｖｇ）を、ダイアフィルトレーションバッファーを使用して、５０ｍＬ（５．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ）に最初に希釈し、ＤＦプロセスを開始した。各ダイアフィルトレーションサイクルでは、２５ｍＬのダイアフィルトレーションバッファーを５０ｍＬの希釈したベクター中に加え、量を５０ｍｌまで減らした。ダイアフィルトレーションステップを２５回実施して、適切なバッファー交換を達成した。次いで、ベクターを５ｍＬまで限外ろ過した。Ｑ－ＰＣＲ解析（Ａ）により、ＴＭＰ（約１０．５ｐｓｉｇ）を採用した場合、ベクター力価は、３．４３Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬであり、高ＴＭＰ（約１５．５ｐｓｉｇ）では、力価は、２．９０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬであったことが示された。ＤＬＳ解析により、ベクター調製物の直径は、低ＴＭＰ（約１０ｐｓｉｇ）及び比較的高いＴＭＰ（約１５．５ｐｓｉｇ）のそれぞれについて、２９．０７ｎｍ及び３８．２ｎｍであったことが示された。直径が大きくなるほど、ｒＡＡＶベクターが調製物中で、より凝集したことを表す。 ＵＦ／ＤＦプロセス後の循環を実施しないベクターを収集すると、ベクター調製物中の凝集したｒＡＡＶ粒子の回収が回避されることを示すデータを表すグラフである。ＣｓＣｌ超遠心分離後のＡＡＶ２－ｈＴＰＰ１ｖ１ベクター（２．５Ｅ＋１４ｖｇ）を、ダイアフィルトレーションバッファーを使用して、５０ｍＬ（５．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ）に希釈し、ＵＦ／ＤＦプロセスを完了した。ＵＦ／ＤＦの流量よりも低い流量で、濃縮したベクターを直接漏出させること（押出し）、又は数分の循環（ｃｙｃｕｌａｔｉｏｎ）（循環）後に濃縮したベクターを漏出させることによりベクターを収集した。Ｑ－ＰＣＲ解析（Ａ）により、ベクター力価は、２つの異なるベクター回収方法で同様であることが示された。しかし、ＤＬＳ解析（Ｂ）により、ベクターの直径は、循環調製物では著しく大きかったことが示されており、ｒＡＡＶベクターが、より凝集したことを示唆した。 低力価のベクター（約５Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ）を希釈すると、ＵＦ／ＤＦプロセスによりベクター凝集が大幅に減少したことを示すデータを表すグラフである。ＣｓＣｌ超遠心分離後のＡＡＶ２－ｈＴＰＰ１ｖ１ベクター（２．５Ｅ＋１４ｖｇ）に直接ダイアフィルトレーションを行うか、又はダイアフィルトレーションバッファーを使用して最初に希釈し、次いで、ダイアフィルトレーションを２５サイクル行った。ダイアフィルトレーションプロセスの後、ダイアフィルトレーションを行った両方のベクターを５ｍＬまで限外ろ過した。ＤＬＳ解析により、ダイアフィルトレーションプロセスから回収した未希釈のベクター（左の棒グラフ）の直径は、希釈したベクター（右の棒グラフ）の直径よりも著しく大きかったことが示された。 ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８が、ｒＡＡＶベクターが大きな粒子（例えば、凝集体）を形成することを減少、最小化又は防止したことを示すデータを表すグラフである。ＣｓＣｌ超遠心分離後のＡＡＶ２－ｈＴＰＰ１ｖ１の中空粒子を、モデルウイルス粒子として、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８含有の（バッファー１と命名）又はＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８不含の（バッファー２と命名）ダイアフィルトレーションバッファーで最初に希釈した。次いで、ダイアフィルトレーションバッファー１又はバッファー２のいずれかをサイクル毎に使用して、希釈した中空粒子にダイアフィルトレーションを２５サイクル行った。ダイアフィルトレーションプロセスの後、中空粒子を５ｍＬまで限外ろ過した。５ｍＬの中空粒子をアッセイ用に収集した。（Ａ）ＤＬＳ解析により、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８を使用した中空粒子（右の棒グラフ）の平均カウント（ｋｃｐｓ）は、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８を使用しない中空粒子（左の棒グラフ）の平均カウントよりも著しく高かったことが示されており、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８の存在下で、より良い回収率を達成したことを示唆した。（Ｂ）ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８を使用しない中空粒子（左の棒グラフ）の直径は、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８を使用した中空粒子（左の棒グラフ）の直径よりも大きかった。
[0013]タンジェンシャルフローろ過は、バイオ製品におけるバッファー交換の実行（ダイアフィルトレーション、ＤＦ）及び濃縮（限外ろ過、ＵＦ）に広く使用されている技術である。しかし、ｒＡＡＶベクターのバッファー交換及び最終製法にＴＦＦ技術を使用した場合、ＵＦ／ＤＦプロセスにおいて相当量のベクターが失われたことが認められた。高ｒＡＡＶベクター力価／濃度が、特定のヒト疾患を治療するのに頻繁に必要とされる。しかし、現在のＵＦ／ＤＦ用処方及び操作パラメーターでは、ｒＡＡＶベクターを１Ｅ＋１３ｖｇ／ｍｌ以上のベクター力価等、所望の濃度に生成することは不可能であった。さらに、ｒＡＡＶベクターは、１Ｅ＋１３ｖｇ／ｍｌ以上のレベルに濃縮した場合、凝集する傾向がある。
[0014]高力価ｒＡＡＶベクターの製造に対する、このような実質的な技術的限界を克服するために、本発明では、ｒＡＡＶベクターのＴＦＦプロセス用の新規の処方を作製した。さらに、本発明では、ＴＦＦプロセス用の新規の操作パラメーターを作製した。新規に開発した処方を、新規に作製したＴＦＦプロセスで（新規に開発したパラメーターと共に）使用して、最終ＵＦ／ＤＦプロセスを経ることによりｒＡＡＶベクター調製物を処方すると、ｒＡＡＶベクター回収率が著しく向上し、ｒＡＡＶベクターがモノマーのまま残ったことが認められた。特に、新規のＴＦＦ処方を新規のＴＦＦ操作技術と組み合わせて用いると、５Ｅ＋１３ｖｇ／ｍｌまで濃縮した場合であっても、実質的なｒＡＡＶベクターの凝集もなくｒＡＡＶベクターが濃縮された。さらに、ｒＡＡＶベクター回収率（全収率）は、著しく向上した。
[0015]本発明は、検出可能なｒＡＡＶベクター凝集もなく高濃度に、検出可能なｒＡＡＶ凝集もなく５Ｅ＋１３ｖｇ／ｍｌまで、ｒＡＡＶベクター生成物を濃縮することを可能とする解決法を提供する。本発明はまた、相当量のベクターの損失のない、ｒＡＡＶベクター用ＴＦＦ技術を使用するＵＦ／ＤＦプロセスを完了するための解決法を提供する。例えば、このＵＦ／ＤＦプロセスからのｒＡＡＶベクターの回収率は、開始から終了まで７０％～９５％の範囲である。本発明により、ＴＦＦが、濃縮したｒＡＡＶベクターを製造する場合は特に効率的なｒＡＡＶ製造プロセスのための技術となった。
[0016]用語「ベクター」は、小担体核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）、又は核酸の挿入又は組込みにより操作可能な他の媒体を指す。このようなベクターは、遺伝子操作に使用して（すなわち、「クローニングベクター」）、ポリヌクレオチドを細胞中に導入／転換し、細胞に挿入したポリヌクレオチドを転写又は翻訳することができる。「発現ベクター」は、宿主細胞における発現に必要とされる必須調節領域を有する遺伝子又は核酸配列を含む、特殊化したベクターである。ベクター核酸配列は、一般に、細胞における増殖のための少なくとも１つの複製起点を含み、任意選択で、導入遺伝子、発現調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、ＩＴＲ（複数可）、ポリアデニル化シグナル等の追加要素を含む。
[0017]ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ又は複数の核酸要素に由来するか、又はウイルスゲノムを含む１つ又は複数の核酸要素をベースとしている。特定のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。
[0018]用語「組換え」は、組換えウイルス、例えば、パルボウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）ベクター等のベクターの修飾語として、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチド等の配列の修飾語句として、構成体に、一般に自然には起こらないように操作（すなわち、技巧的操作）がされていることを意味する。ｒＡＡＶベクター等の組換えベクターの特定の例は、通常、野生型のウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムに存在しないポリヌクレオチドをウイルスゲノムに挿入するような場合である。用語「組換え」は、本明細書において、ＡＡＶベクター等のベクター、並びにポリヌクレオチド等の配列に関連して、常には使用されていないが、このような任意の省略にかかわらず、組換え体を明示的に含む。
[0019]組換えウイルス「ベクター」又は「ｒＡＡＶベクター」は、野生型ゲノムをウイルス（例えば、ＡＡＶ）から除去する分子的方法を使用し、非天然の核酸で置き換えることにより、ＡＡＶ等のウイルスの野生型ゲノムから誘導される。一般的には、ＡＡＶでは、ＡＡＶゲノムの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列の一方又は両方が、ｒＡＡＶベクター中に保持される。「組換え」ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）は、ウイルスゲノムの全部又は一部が、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノム核酸について非天然配列と置き換えられているため、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムから区別される。したがって、非天然配列を組み込むことにより、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）が「組換え」ベクターであると定義され、ＡＡＶの場合、「ｒＡＡＶベクター」と呼ぶことができる。
[0020]組換えベクターは、パッケージングすることができる－本明細書では、エクスビボ、インビトロ又はインビボの細胞への後続の感染（形質導入）のための「粒子」と呼ぶことができる。組換えベクター配列が、ＡＡＶ粒子中にカプシド封入又はパッケージングされている場合では、粒子はまた、「ｒＡＡＶ」と呼ばれ得る。このような粒子は、ベクターゲノムをカプシド封入又はパッケージングするタンパク質を含む。特定の例では、ウイルスエンベロープタンパク質、及びＡＡＶの場合では、カプシドタンパク質を含む。
[0021]便宜上「ｖｇ」と略される「ベクターゲノム」は、最終的にパッケージング又はカプシド封入されてウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）粒子を形成する、組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドが、組換えベクターの構築又は製造に使用される場合では、ベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列と対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、増殖及び組換えＡＡＶベクターの生成に必要とされるプロセスである、プラスミドのクローニング及び増幅に重要である「プラスミド骨格」と呼ばれているが、それ自体はウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子中にパッケージング又はカプシド封入されていない。したがって、「ベクターゲノム」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によりパッケージング又はカプシド封入されている核酸を指す。
[0022]用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、核酸、オリゴヌクレオチドのすべての形態を指すように、本明細書において互換的に使用する。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライシングされた又はスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び抑制性ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子若しくは短鎖のヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子若しくは短鎖の干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、天然品、合成品、及び意図的に改変又は変更したポリヌクレオチド（例えば、変異型核酸）を含む。ポリヌクレオチドは、単鎖、二重鎖、又は三重鎖、直鎖又は環状であってもよく、いかなる長さであってもよい。ポリヌクレオチドについて考察する場合、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、配列を５’から３’方向で示す慣習に従って本明細書に記載し得る。
[0023]「導入遺伝子」は、目的とする又は細胞若しくは生物中に導入されている、ポリヌクレオチド又は核酸を便宜上指すように本明細書において使用する。導入遺伝子は、ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子等の任意の核酸を含む。
[0024]「核酸」若しくは「ポリヌクレオチド」配列又は「導入遺伝子」によりコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、天然の野生型タンパク質のような完全長天然配列、並びに機能的な部分配列、改変体又は配列変異体が、天然完全長タンパク質のある程度の機能性を保持する限り、その部分配列、改変体又は変異体を含む。核酸配列によりコードされるこのようなポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、不完全な、又は処置した哺乳動物において発現が不十分若しくは欠損した、内在性タンパク質と同一でもよいが、同一である必要はない。
[0025]組換えＡＡＶベクターは、任意のウイルスの株又は血清型を含む。非限定的な例として、ｒＡＡＶベクターは、例えば、ＡＡＶ－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０又はＡＡＶ－２ｉ８等のあらゆるＡＡＶゲノム又はＡＡＶカプシドをベースとすることができる。このようなベクターは、同一の株又は血清型（又は亜群又は変異体）をベースとするか、又は相互に異なってもよい。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムをベースとした組換えＡＡＶベクターは、ＩＴＲ又はベクターをパッケージングするカプシドタンパク質のうちの１つ又は複数と同一となり得る。さらに、組換えＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ ＩＴＲ又はベクターをパッケージングするカプシドタンパク質のうちの１つ又は複数と明確に異なるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）血清型ゲノムをベースとすることができる。例えば、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ２をベースとすることができ、一方、例えば、３つのカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－２ｉ８又はその変異体であってもよい。
[0026]特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ－２ｉ８、並びにその変異体（例えば、アミノ酸挿入、付加、置換及び欠失等のＩＴＲ及びカプシド変異体）、例えば、国際公開第２０１３／１５８８７９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３７１７０）、国際公開第２０１５／０１３３１３号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４７６７０）及び米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号（米国特許出願第１３／５９４，７７３号、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３等を開示）に記載するものを含む。
[0027]ＡＡＶ変異体は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ－２ｉ８のＩＴＲ並びにカプシドの変異体及びキメラを含む。したがって、ＡＡＶベクター及びＡＡＶ変異体（例えば、ＩＴＲ及びカプシド変異体）が含まれる。
[0028]種々の例示的実施形態では、参照血清型に関連するＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８と少なくとも８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％等）同一な配列（例えば、ＩＴＲ、又はＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはＶＰ３配列等）を含む、又はからなる、ポリヌクレオチド（例えば、ＩＴＲ）、又はポリペプチド（例えば、カプシド）を有する。
[0029]本明細書で使用する場合、句「真正なＡＡＶベクター」又は「真正なｒＡＡＶベクター」は、標的細胞に感染させることが可能な目的の導入遺伝子を含むＡＡＶベクターを指す。この句は、中空のＡＡＶベクター（導入遺伝子が全く存在しない）、及び完全には挿入されていないＡＡＶベクター（例えば、導入遺伝子断片）又は宿主細胞核酸を含むＡＡＶベクターを除外する。
[0030]用語「単離された」は、構成体の修飾語として使用する場合、構成体が、人の手により作製される、及び／又は天然のインビボ環境から完全に若しくは少なくとも部分的に分離されることを意味する。一般に、単離された構成体は、例えば、１つ又は複数のタンパク質、核酸、脂質、糖、細胞膜等の、通常、自然では付随する１つ又は複数の物質を実質的に含んでいない。例えば、「単離された核酸」は、ｒＡＡＶベクター等のベクター中に挿入されたＤＮＡ又はｃＤＮＡ分子を含み得る。
[0031]他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的及び化学的用語は、本発明の属する分野の当業者により一般的に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は等価である方法及び材料を、本発明の実施又は試験で使用することができるが、適切な方法及び材料を本明細書に記載する。
[0032]本明細書で引用する、すべての特許、特許出願、公開、及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引用並びにＡＴＣＣの引用は、その全内容を参照により組み込む。矛盾する場合には、定義を含む本明細書により規制されることとなる。
[0033]本発明の生体分子に関連する種々の用語は、上記並びにまた、本明細書及び特許請求の範囲にわたって使用する。
[0034]本明細書に開示のすべての特徴は、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示する各特徴は、同一、等価、又は同様の目的を果たす代替的な特徴により置き換えることができる。したがって、他に明示的に提示しない限り、開示の特徴は、等価又は同様の特徴に属する一例である。
[0035]本明細書で使用する場合、文脈上明白に他に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（核酸）」の指示では、このような核酸のうちの複数を含み、「ａ ｖｅｃｔｏｒ（ベクター）」の指示では、このようなベクターのうちの複数を含み、「ａ ｖｉｒｕｓ（ウイルス）」又は「ｐａｒｔｉｃｌｅ（粒子）」の指示では、このようなウイルス／粒子のうちの複数を含む。
[0036]本明細書で使用する場合、すべての数値又は数値の範囲は、文脈上明白に他に指示しない限り、このような範囲内の整数及び範囲内の値又は整数の割合を含む。したがって、例示すると、８０％以上の同一性の指示では、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％等、並びに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％等、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％等その他を含む。
[0037]大なる又は小なる整数の指示では、参照の数よりも大きいか又は小さい任意の数をそれぞれ含む。したがって、例えば、１００未満の指示では、９９、９８、９７等、ずっと下って数１までを含み、１０未満では、９、８、７等、ずっと下って数１までを含む。
[0038]本明細書で使用する場合、すべての数値又は数値の範囲は、文脈上明白に他に指示しない限り、このような範囲内の値の割合及び整数及びこのような範囲内の整数の割合を含む。したがって、例示すると、１～１０等の数値の範囲の指示では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等その他を含む。したがって、１～５０の範囲の指示では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等、５０まで、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５等その他を含む。
[0039]一連の範囲の指示では、その一連内の異なる範囲の境界値を組み合わせた範囲を含む。したがって、一連の範囲の指示を例示すると、例えば、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～８５０の一連の範囲の指示では、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、５０～７５、５０～１００、５０～１５０、５０～２００、５０～２５０、１００～２００、１００～２５０、１００～３００、１００～３５０、１００～４００、１００～５００、１５０～２５０、１５０～３００、１５０～３５０、１５０～４００、１５０～４５０、１５０～５００等の範囲を含む。
[0040]本発明は、本明細書において、多数の実施形態及び態様を記載するのに肯定的な言語を使用して、一般的に開示する。本発明はまた、物質若しくは材料、方法ステップ及び条件、プロトコル、又は手順等の特定の主題を完全又は部分的に除外する実施形態を特に含む。例えば、本発明の特定の実施形態又は態様では、材料及び／又は方法ステップを除外する。したがって、本発明が、本発明が含まないものに関して、本明細書において一般的に表されていなくても、本発明において明示的に除外しない態様は、やはり本明細書において開示する。
[0041]本発明の実施形態のうちの多数を記載した。それにかかわらず、当業者は、本発明の概念及び範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更及び改変を行って、その種々の変更及び改変を種々の利用及び条件に適応させることができる。したがって、以下の実施例は、例示することを意図するものであるが、主張する本発明の範囲を決して限定するものではない。
[0042]実施例１
ｒＡＡＶベクターの損失及び／又は凝集を説明し得る多くの仮説のうちの１つは、非最適化ＵＦ／ＤＦプロセスにおいてＴＦＦ装置にゲル層が蓄積し得ることであり、これがｒＡＡＶベクター損失の原因となり得ることである。蓄積したゲル層のこの仮説は、ベクターがより濃縮されるほど、より激しいゲル層が蓄積され得るので、ｒＡＡＶベクターを高濃度に濃縮した場合、より多くのｒＡＡＶベクターが失われるという現象も説明し得る。ゲル層の蓄積は、特にｒＡＡＶベクターを高濃度に濃縮した場合ＵＦ／ＤＦプロセスにおいて極めて頻繁に認められる現象である、ｒＡＡＶ凝集も引き起こし得る。
[0043]実施例２
ＴＦＦ操作パラメーターに加えて、多くの仮説のうちの１つは、処方が、ゲル層を減少させ、またｒＡＡＶの凝集を防ぐのに重要な役割を果たし得るということである。現在のＵＦ／ＤＦプロセスで使用される溶液／バッファーのほとんどにおいて、バッファー／溶液に使用される化学物質は、塩及びｐＨを調節するための化学物質である。プロセスを通してＵＦ／ＤＦ溶液に界面活性剤を使用すると、ｒＡＡＶベクター間の会合及びｒＡＡＶベクターとＵＦ／ＤＦ装置の表面との間の会合が減少し得る。次いで、これにより、ＵＦ／ＤＦプロセスを通してｒＡＡＶベクターのゲル層が減少又は防止され得る。加えて、界面活性剤は、ＵＦ／ＤＦプロセスを完了する間、疎水性相互作用を減少又は防止することにより、ｒＡＡＶの会合をさらに減少させ得る。これによって、ｒＡＡＶの凝集を減少、最小化又は防止する。さらなる仮説は、ＵＦ／ＤＦプロセス中に、せん断速度を増加させ、膜差圧（ＴＭＰ）を調節すると、ゲル層の蓄積が減少し得るということである。このようなすべての仮説に基づいて一連の試験を行い、これにより、本明細書に開示する特定の発明の処方及び操作パラメーターがもたらされた。
[0044]実施例３
本発明によれば、ｒＡＡＶの凝集を減少、最小化又は防止し、ｒＡＡＶベクターの回収率（全収率）を増加させる、新規のＵＦ／ＤＦ操作パラメーターは、高力価のｒＡＡＶベクター調製物が望ましい場合、特に適切である。例えば、ＵＦ／ＤＦステップの前のＣｓＣｌ勾配遠心法において等、ｒＡＡＶベクター調製物が高濃度のｒＡＡＢＶを含む場合は特に、第１の操作パラメーターでは、低ｒＡＡＶ力価でＵＦ／ＤＦプロセスを開始するべきである。１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１８０ｍＭのＮａＣｌ及び０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８をｐＨ７．３で含む、作製したダイアフィルトレーションバッファーを使用して、ＣｓＣｌ中の高度に濃縮したｒＡＡＶを最初に５Ｅ＋１２ｖｇ／ｍｌ以下の力価に希釈した。作製したダイアフィルトレーションバッファーを使用して、約８，０００／秒以上のせん断速度の流量で、ＤＦプロセスを運用する。ダイアフィルトレーションプロセスを終了して効率的なバッファー交換を達成し、次いで、ＵＦプロセスを開始してｒＡＡＶベクターを所望の力価に濃縮する。
[0045]新規に作製したＵＦ／ＤＦ処方物において有するべき一成分は、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８であり、これにより高力価のｒＡＡＶ調製物が得られた。理論により拘束されることは望まないが、この新規処方（ダイアフィルトレーションバッファー）が、ゲル層の形成を減少させることが考えられる。
[0046]ＵＦ／ＤＦプロセスにおいて新規処方を新規操作パラメーターと組み合わせる場合、ｒＡＡＶベクターを、検出可能なベクター凝集もなく１ｍｌ当たり５Ｅ＋１３ｖｇに濃縮した。さらに、ｒＡＡＶベクター回収率は、実質的に一般的に７０％以上のレベルであった。
〔関連出願〕
[0001]本出願は、２０１６年７月２１日出願の米国特許仮出願第６２／３６５，３１２号に対する優先権を主張する。先の出願の全内容は、すべての文章、表、配列表及び図面を含めて、参照により本明細書に組み込む。

Claims (66)

  1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子を生成する方法であって、
    （ａ）ｒＡＡＶベクター粒子を含む細胞及び／又は細胞培養上清を収穫して収穫物を生成するステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）において生成した前記収穫物を溶解して、ライセートを生成するステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）において生成した前記ライセートをろ過して、清澄ライセートを生成するステップと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）において生成した前記清澄ライセートをイオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、精製ｒＡＡＶベクター粒子からなるカラム溶出液を生成するステップと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）において生成した前記カラム溶出液を塩化セシウムと混合して、混合物を生成し、前記混合物を勾配超遠心分離に供して、真正なｒＡＡＶベクター粒子を中空カプシドＡＡＶ粒子及び他のＡＡＶベクター関連不純物から実質的に分離するステップと、
    （ｆ）（１）ステップ（ｅ）において分離した前記真正なｒＡＡＶベクター粒子を収集するステップ、及び（ｆ）（２）非イオン界面活性剤を含むバッファー中に、収集した前記真正なｒＡＡＶベクター粒子を処方するステップと、
    （ｇ）ステップ（ｆ）（２）の前記真正なｒＡＡＶベクター粒子を、タンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換に供して、ＡＡＶベクター処方物を生成するステップと、
    （ｈ）ステップ（ｇ）において生成した前記ＡＡＶベクター処方物をろ過し、これにより真正なｒＡＡＶベクター粒子の処方物を生成するステップと
    を含む、方法。
  2. ステップ（ｆ）（２）の前記バッファーが、塩化ナトリウム及び／又はリン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。
  3. ステップ（ｆ）（２）の前記バッファーが、１０ｍＭの濃度から５００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。
  4. ステップ（ｆ）（２）の前記バッファーが、５ｍＭの濃度から５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。
  5. ステップ（ｆ）（２）の前記非イオン界面活性剤が、ポリアルキレングリコールを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. ステップ（ｆ）（２）の前記非イオン界面活性剤が、少なくとも１つのポリエチレングリコールブロック及び少なくとも１つのポリプロピレングリコールブロックを含むブロック共重合体を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  7. ステップ（ｆ）（２）の前記非イオン界面活性剤が、アルキルポリグリコシド、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドＤＥＡ、コカミドＭＥＡ、デシルグルコシド、エトキシレート、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、イソテセス－２０、グルコシド、マルトシド、モノラウリン、ノニデットＰ－４０、ノノキシノール、ノノキシノール－９、ＮＰ－４０、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ－オクチルβ－Ｄ－チオグルコピラノシド、オクチルグルコシド、オレイルアルコール、ＰＥＧ－１０ヒマワリグリセリド、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポロキサマー、ポロキサマー４０７、ポロキサマー１８８（ポリ（エチレンオキシド－ｃｏ－ポリプロピレンオキシド））、ポリグリセリンポリリシノレエート、ソルビタン、ステアリルアルコール、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、及びＴｗｅｅｎ８０を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記エトキシレートが、エトキシ化脂肪酸、アルコールエトキシレート、トリスチリルフェノールエトキシレート、又はエトキシ化ソルビタン脂肪酸エステルを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ソルビタンが、ソルビタンモノステアレート又はソルビタントリステアレートを含む、請求項７に記載の方法。
  10. ステップ（ｆ）（２）の前記非イオン界面活性剤が、ｃｅｔｏｍａｃｒｏｇｏｌ １０００、ポリソルベート、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、ポリソルベート４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、ポリソルベート６０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート）、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）；ポリグリセリンポリリシノレエート、オクタデカン酸［２－［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－２－テトラヒドロフラニル］－２－ヒドロキシエチル］エステル、オクタデカン酸［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－２－［１，２－ビス（１－オキソオクタデコキシ）エチル］－４－ヒドロキシ－３－テトラヒドロフラニル］エステル；Ｃ８～Ｃ２２の長鎖アルコール、ヘキサデカン－１－オール及びｃｉｓ－９－オクタデセン－１－オール；置換基が、ポリエトキシエタノール基を含み得る、置換又は非置換のオクチルフェノール；ポリエチレングリコールモノイソヘキサデシルエーテル；ドデカン酸２，３－ジヒドロキシプロピルエステル；ラウリルグルコシド、オクチルグルコシド及びデシルグルコシドを含み得るグルコシド；脂肪酸アミド；並びに親水性ポリエチレンオキシド鎖及び親油性又は親水性の芳香族炭化水素基を有する非イオン界面活性剤を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. ステップ（ｆ）（２）の前記非イオン界面活性剤が、ポリエチレングリコール－ブロック－ポリプロピレングリコール－ブロック－ポリエチレングリコール、又はポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に挟まれたポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖からなるトリブロック共重合体を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ポリエチレングリコール－ブロック－ポリプロピレングリコール－ブロック－ポリエチレングリコール又はトリブロック共重合体が、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ Ｆ１０８（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. ステップ（ｆ）（２）の前記非イオン界面活性剤が、０．０００１％の濃度から０．１％の濃度を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. ステップ（ｆ）（２）の前記非イオン界面活性剤が、０．０００１％の濃度から０．０１％の濃度を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記真正なｒＡＡＶベクター粒子が、ステップ（ｈ）において生成した前記処方物中に１ｍＬ当たり１０１５粒子の濃度から１ｍＬ当たり１０１８の濃度で存在する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ステップ（ｈ）の前記真正なｒＡＡＶベクター粒子の収率が、少なくとも５×１０１２真正ｒＡＡＶベクター粒子／ｍｌである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ステップ（ｈ）の前記真正なｒＡＡＶベクター粒子の収率が、少なくとも１×１０１３真正ｒＡＡＶベクター粒子／ｍｌである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. ステップ（ｈ）の前記真正なｒＡＡＶベクター粒子の収率が、少なくとも５×１０１３真正ｒＡＡＶベクター粒子／ｍｌである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  19. ステップ（ｈ）の前記真正なｒＡＡＶベクター粒子の回収率が、ステップ（ａ）の総ｒＡＡＶベクター粒子の少なくとも６０％である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  20. ステップ（ｈ）の前記真正なｒＡＡＶベクター粒子の回収率が、ステップ（ａ）の総ｒＡＡＶベクター粒子の少なくとも７０％である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記真正なｒＡＡＶベクター粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＲｈ７４からなる群から選択されるＡＡＶに由来する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記真正なｒＡＡＶ粒子が、抑制性核酸をコードする導入遺伝子を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記抑制性核酸が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記真正なｒＡＡＶ粒子が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロフィンＮＴ－３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される、遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記真正なｒＡＡＶ粒子が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン、ＩＬ１～ＩＬ－１７、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子からなる群から選択される、遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記真正なｒＡＡＶベクター粒子が、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオニンβシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、βグルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、及びジストロフィンからなる群から選択される、先天代謝異常の矯正に有用なタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記真正なｒＡＡＶベクター粒子が、神経変性疾患の矯正に有用なタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記タンパク質が、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）である、請求項２８に記載の方法。
  30. ステップ（ｅ）において別々に中空カプシド粒子を収集することを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. ステップ（ｈ）後の前記真正なｒＡＡＶベクター粒子の純度が、少なくとも８０％である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. ステップ（ｈ）後の前記真正なｒＡＡＶベクター粒子の純度が、少なくとも９０％である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. ステップ（ｈ）後の前記真正なｒＡＡＶベクター粒子の純度が、少なくとも９５％である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記中空カプシド粒子が、ステップ（ｈ）後に１０％以下の量で存在する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記中空カプシド粒子が、ステップ（ｈ）後に５％以下の量で存在する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. ステップ（ｈ）後に、１０％以下の凝集ｒＡＡＶ粒子が存在する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. ステップ（ｈ）後に、５％以下の凝集ｒＡＡＶ粒子が存在する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  38. ステップ（ｈ）後に、３％未満の凝集ｒＡＡＶ粒子が存在する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  39. ステップ（ｈ）後に、１～３％の凝集ｒＡＡＶ粒子が存在する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  40. ステップ（ｅ）の前記遠心分離が、１段階で行われる、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. ステップ（ｅ）の前記遠心分離が、密度勾配超遠心分離である、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  42. ステップ（ｅ）の前記カラム溶出液を、タンジェンシャルフローろ過により濃縮して、濃縮カラム溶出液を生成する、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. ステップ（ｂ）において生成したライセートにヌクレアーゼを加えるステップをさらに含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  44. ステップ（ｇ）のタンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換後にＡＡＶベクター処方物に非イオン界面活性剤を加えた場合、ステップ（ｇ）のタンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換後にＡＡＶベクター処方物に非イオン界面活性剤を加えずに生成したｒＡＡＶベクター粒子と比較してより高い回収率を有するｒＡＡＶベクター粒子を生成する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. ステップ（ｇ）のタンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換後にＡＡＶベクター処方物に非イオン界面活性剤を加えた場合、ステップ（ｇ）のタンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換後にＡＡＶベクター処方物に非イオン界面活性剤を加えずに生成したｒＡＡＶベクター粒子と比較してより高い力価を有するｒＡＡＶベクター粒子を生成する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  46. ステップ（ｆ）（１）の収集した前記真正なｒＡＡＶベクター粒子が、ステップ（ｇ）（２）の前、実質的に同時又は後に、５×１０１２ｒＡＡＶベクター粒子／ｍｌ未満の濃度まで希釈される、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  47. ステップ（ｇ）の前記タンジェンシャルフローろ過が、２～１５ｐｓｉｇの間の膜差圧で行われる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  48. ステップ（ｇ）の前記タンジェンシャルフローろ過が、４～１２ｐｓｉｇの間の膜差圧で行われる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  49. ステップ（ｇ）の前記タンジェンシャルフローろ過が、３０００／秒よりも高いせん断速度で行われる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  50. ステップ（ｇ）の前記タンジェンシャルフローろ過が、５０００／秒よりも高いせん断速度で行われる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  51. ステップ（ｇ）の前記タンジェンシャルフローろ過が、５０００～１５，０００／秒の間のせん断速度で行われる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  52. ステップ（ｇ）の前記タンジェンシャルフローろ過が、８，０００～１２，０００／秒のせん断速度で行われる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  53. ステップ（ａ）の前記収穫物がステップ（ｂ）の前に濃縮され、濃縮収穫物が生成される、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記濃縮がタンジェンシャルフローろ過によるものである、請求項５３に記載の方法。
  55. ステップ（ｂ）における前記溶解が微細流動化によるものである、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記濃縮収穫物を溶解することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  57. 前記濃縮収穫物の溶解が微細流動化によるものである、請求項５６に記載の方法。
  58. ステップ（ｄ）の前記カラム溶出液が濃縮され、濃縮カラム溶出液が生成される、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記濃縮がタンジェンシャルフローろ過によるものである、請求項５８に記載の方法。
  60. 生成された前記濃縮カラム溶出液が塩化セシウムと混合され、混合物が生成される、請求項５８又は５９に記載の方法。
  61. 前記タンジェンシャルフローろ過が、２～１５ｐｓｉｇの間の膜差圧で行われる、請求項５４又は５９に記載の方法。
  62. 前記タンジェンシャルフローろ過が、４～１２ｐｓｉｇの間の膜差圧で行われる、請求項５４又は５９に記載の方法。
  63. 前記タンジェンシャルフローろ過が、３０００／秒よりも高いせん断速度で行われる、請求項５４又は５９に記載の方法。
  64. 前記タンジェンシャルフローろ過が、５０００／秒よりも高いせん断速度で行われる、請求項５４又は５９に記載の方法。
  65. 前記タンジェンシャルフローろ過が、５０００～１５，０００／秒の間のせん断速度で行われる、請求項５４又は５９に記載の方法。
  66. 前記タンジェンシャルフローろ過が、８，０００～１２，０００／秒のせん断速度で行われる、請求項５４又は５９に記載の方法。
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