JP2023029832A - Aavベクターのカラム精製方法 - Google Patents
Aavベクターのカラム精製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023029832A JP2023029832A JP2022177960A JP2022177960A JP2023029832A JP 2023029832 A JP2023029832 A JP 2023029832A JP 2022177960 A JP2022177960 A JP 2022177960A JP 2022177960 A JP2022177960 A JP 2022177960A JP 2023029832 A JP2023029832 A JP 2023029832A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- column
- produced
- raav vector
- vector particles
- aav
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 241
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 46
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 202
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 65
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 202
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 claims description 185
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 147
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 140
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 115
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 115
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 105
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 103
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 101
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 84
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 80
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 56
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 49
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 41
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 claims description 39
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 39
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 35
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 32
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 31
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 25
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 24
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 24
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 23
- -1 antisense molecules Proteins 0.000 claims description 23
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 23
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 23
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 20
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 20
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 18
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 17
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 16
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 15
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 13
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 claims description 12
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 claims description 12
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 claims description 12
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 claims description 12
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 claims description 12
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 claims description 12
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims description 12
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 claims description 12
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 7
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 7
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 6
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 6
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 6
- 102000015225 Connective Tissue Growth Factor Human genes 0.000 claims description 6
- 108010039419 Connective Tissue Growth Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 6
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 6
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 claims description 6
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 claims description 6
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 claims description 6
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 claims description 6
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims description 6
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 claims description 6
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 claims description 6
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 claims description 6
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 claims description 6
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims description 6
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 claims description 6
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 claims description 6
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 claims description 6
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 claims description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 6
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 6
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 6
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 6
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 claims description 6
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 6
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 claims description 6
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 claims description 6
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 5
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 5
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 4
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 4
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 claims description 3
- 101150079978 AGRN gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100040026 Agrin Human genes 0.000 claims description 3
- 108700019743 Agrin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 3
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 claims description 3
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004452 Arginase Human genes 0.000 claims description 3
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 claims description 3
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 claims description 3
- 102100029115 Fumarylacetoacetase Human genes 0.000 claims description 3
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 claims description 3
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003638 Glucose-6-Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010086800 Glucose-6-Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010015451 Glutaryl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100028603 Glutaryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000826 Glycine dehydrogenase (decarboxylating) Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004327 Glycine dehydrogenase (decarboxylating) Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 3
- 101000729271 Homo sapiens Retinoid isomerohydrolase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010056651 Hydroxymethylbilane synthase Proteins 0.000 claims description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- 206010062018 Inborn error of metabolism Diseases 0.000 claims description 3
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 claims description 3
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 claims description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 3
- 108010013792 Isovaleryl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025392 Isovaleryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010085747 Methylmalonyl-CoA Decarboxylase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000019010 Methylmalonyl-CoA Mutase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051862 Methylmalonyl-CoA mutase Proteins 0.000 claims description 3
- 101710169105 Minor spike protein Proteins 0.000 claims description 3
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100030626 Myosin-binding protein H Human genes 0.000 claims description 3
- 101710139548 Myosin-binding protein H Proteins 0.000 claims description 3
- 108010074223 Netrin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009065 Netrin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 101710198224 Ornithine carbamoyltransferase, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 3
- 108010069013 Phenylalanine Hydroxylase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038223 Phenylalanine-4-hydroxylase Human genes 0.000 claims description 3
- 102000014750 Phosphorylase Kinase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010064071 Phosphorylase Kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 3
- 102100034391 Porphobilinogen deaminase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010035004 Prephenate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031176 Retinoid isomerohydrolase Human genes 0.000 claims description 3
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 claims description 3
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 claims description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 claims description 3
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 claims description 3
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 claims description 3
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N cystathionine Chemical compound OC(=O)C(N)CCSCC(N)C(O)=O ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108060002566 ephrin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000012803 ephrin Human genes 0.000 claims description 3
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 108010022687 fumarylacetoacetase Proteins 0.000 claims description 3
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 claims description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims description 3
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims description 3
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 3
- 108010081726 netrin-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims description 3
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 claims description 3
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 3
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 2
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 claims 2
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 claims 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 claims 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 claims 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 20
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 abstract description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 82
- 230000006870 function Effects 0.000 description 32
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 26
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 25
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 17
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 16
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 16
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 15
- 239000012606 POROS 50 HQ resin Substances 0.000 description 15
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 15
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 15
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 15
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 14
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 14
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 13
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 13
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 12
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 10
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 7
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 5
- DDXLVDQZPFLQMZ-UHFFFAOYSA-M dodecyl(trimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C DDXLVDQZPFLQMZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 4
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 description 4
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 108700011325 Modifier Genes Proteins 0.000 description 4
- 229910014130 Na—P Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 4
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 4
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- GNENVASJJIUNER-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tricyclohexyloxy-1,3,5,2,4,6-trioxatriborinane Chemical compound C1CCCCC1OB1OB(OC2CCCCC2)OB(OC2CCCCC2)O1 GNENVASJJIUNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 2
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012518 Poros HS 50 resin Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZVQOOHYFBIDMTQ-UHFFFAOYSA-N [methyl(oxido){1-[6-(trifluoromethyl)pyridin-3-yl]ethyl}-lambda(6)-sulfanylidene]cyanamide Chemical compound N#CN=S(C)(=O)C(C)C1=CC=C(C(F)(F)F)N=C1 ZVQOOHYFBIDMTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWRBNPKJOOWZPW-GPADLTIESA-N 1,2-di-[(9E)-octadecenoyl]-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-GPADLTIESA-N 0.000 description 1
- PVOAHINGSUIXLS-UHFFFAOYSA-N 1-Methylpiperazine Chemical compound CN1CCNCC1 PVOAHINGSUIXLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYDSIOSLHQWFOU-UHFFFAOYSA-N 2-cyclohexylidenecyclohexan-1-one Chemical compound O=C1CCCCC1=C1CCCCC1 TYDSIOSLHQWFOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 1
- 208000001593 Bernard-Soulier syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000028702 Congenital thrombocyte disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 1
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000289669 Erinaceus europaeus Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000013607 Glanzmann thrombasthenia Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-M Methanesulfonate Chemical compound CS([O-])(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 1
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 1
- 108091034131 VA RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004210 Vitamin K Epoxide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000779 Vitamin K Epoxide Reductases Proteins 0.000 description 1
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 239000012538 diafiltration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 150000004675 formic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 1
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000012607 strong cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- 239000012608 weak cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子の精製、産生及び製造方法を提供する。【解決手段】rAAVベクター粒子の精製、産生及び製造方法は、例えば、少なくとも2種のカラムクロマトグラフィーステップを含む。カラムクロマトグラフィーステップは、例えば、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及び/又はAAV親和性クロマトグラフィーを、単独又は組み合わせて及び任意の順で含む。【選択図】図1
Description
[0002]遺伝子送達は、後天性及び遺伝性の疾患の治療のために有望な方法である。アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づく系を含む遺伝子移動が目的の幾つかのウイルスに基づく系が記載されている。
[0003]AAVは、ディペンドウイルス属に属するヘルパー依存型DNAパルボウイルスである。AAVは、増殖性感染を起こすためにヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアの機能を必要とする。ヘルパーウイルス機能の非存在下で、AAVは、そのゲノムを宿主細胞の染色体中に挿入することにより潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによるその後の感染により、組み込まれたウイルスのゲノムがレスキューされ、次にそのゲノムが複製されて、感染性AAVの子孫を産生し得る。
[0004]AAVは、広宿主域を有しており、適当なヘルパーウイルスの存在下で任意の種からの細胞で複製することができる。例えば、ヒトAAVは、イヌのアデノウイルスに共感染したイヌの細胞で複製することができる。AAVは、いかなるヒト又は動物の疾患とも関連したことがなく、組み込まれて宿主細胞の生物学的性質に悪く影響するようには思われない。
[0005]AAVベクターは、AAVゲノムの内部部分を全体又は一部で欠失させて、目的の核酸配列をITR間に挿入することにより、目的の異種核酸配列(例えば、治療用タンパク質、阻害性の核酸、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、miRNA等をコードする選択された遺伝子)を担持するように作り変えることができる。ITRは、目的の異種核酸配列を含有するrAAVの複製及びパッケージングを可能にするそのようなベクター中で依然機能する。異種核酸配列は、患者の標的細胞中における核酸の発現を推進することができるプロモーター配列にも典型的には連結される。ポリアデニル化部位などの停止シグナルも、ベクター中に含まれ得る。
[0006]感染性の組換えAAV(rAAV)ベクターの構築は、幾つかの出版物に記載されている。例えば、米国特許第5,173,414号及び第5,139,941号;国際公開第92/01070号及び国際公開第93/03769号;Lebkowskiら(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988~3996;Vincentら(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press);Carter,B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533~539;Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97~129;及びKotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793~801を参照されたい。
[0007]組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、複数のグループによる幾つかの初期臨床試験で優れた治療の見込みを示した。承認に向けたこの新しいクラスの生物学的製品の開発は、ベクターの設計及び製造プロセスのパラメーターが、臨床グレードのベクターにおける不純物プロファイルにどのように影響するかという、より良い理解を含むベクターの特徴付け及び品質制御方法における改善を含むであろう。
[0008]rAAV製造及び精製系の設計における重要な目的は、製造に関連する不純物、例えば、タンパク質、核酸、及び野生型/偽野生型AAV種(wtAAV)を含むベクター関連不純物、並びにAAVカプシド形成された残存DNA不純物の発生を最小限化/制御する戦略を実行することである。AAVベクター中の不純物の除去は、rAAVベクターが製造される方法のために複雑である。1つの製造プロセスでは、rAAVベクターは、3種のプラスミドを使用する一過性のトランスフェクションプロセスにより製造される。相当な量のプラスミドDNAが細胞中に導入されてrAAVベクターを産生する。加えて、rAAVベクターが産生する細胞から放出されるときに、細胞のタンパク質及び核酸も共に放出される。rAAVベクターがバイオマスの約1%に過ぎないことを考えると、rAAVベクターを臨床のヒト遺伝子療法製品として使用され得るレベルの純度に精製することは非常な難題である。(Smith PH Wright JF.Qu G.ら2003、Mo.Therapy、7:8348;Chadeuf G.ら、Mo.Therapy 2005、12:744。CHMP遺伝子療法のエキスパートグループのミーティングからの報告。欧州医薬品庁EMEA/CHMP 2005、183989/2004)。
[0009]組換えAAVを、ヒトの疾患を治療するための製品として精製する製造プロセスの開発では、以下の目的を達成すべきである:1)一貫したベクター純度、力価及び安全性;2)製造プロセス大規模化の可能性;並びに3)許容される製造コスト。現行の「工業標準」のスケーラブルなAAVベクターの精製プロセスは、上に挙げた第1の目的(一貫したベクター純度、力価及び安全性)を満たすために重要な不純物の除去を適切に達成しない。その上、現行の工業標準のスケーラブルな精製プロセスを使用して不純物を適切に除去できなかったのは:1)ワクチン以外の用途の組換えAAVなどのウイルス製品の精製プロセスの開発(そこでは、免疫応答が、典型的には、避けられるよりもむしろ求められる)が比較的新しいこと;2)AAVベクターのためのスケーラブルな精製プロセスの開発に関与する多くのグループが、高レベルのベクター関連不純物に気づかないできたこと、及び/又はそのような不純物が、臨床的に有意なベクターの免疫原性に寄与しないと仮定してきたこと;並びに3)rAAVベクターの工業規模製造のために適当なスケーラブルな精製プロセスを開発することが技術的に難題であることのためである。
[0010]本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子の精製及び産生方法を提供する。本発明の方法は、少なくとも2種のカラムクロマトグラフィーステップを含む。
[0011]一実施形態では、方法は、(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、(b)任意選択でステップ(a)で製造された回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、(c)ステップ(a)で製造された回収物又はステップ(b)で製造された濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、(d)ステップ(c)で製造された溶解物を処理して溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、(e)任意選択でステップ(d)で製造された核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、(f)ステップ(d)で核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択でカラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、(g)ステップ(f)で製造されたカラム溶出物又は希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、(h)第2のカラム溶出物又はステップ(g)で製造されて濃縮された第2のカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で第3のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第3のカラム溶出物を製造するステップと、(i)ステップ(h)で製造された第3のカラム溶出物又は濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップとを含む。
[0012]別の実施形態では、方法は、(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、(b)任意選択でステップ(a)で製造された回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、(c)ステップ(a)で製造された回収物又はステップ(b)で製造された濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、(d)ステップ(c)で製造された溶解物を処理して溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、(e)任意選択でステップ(d)で製造された核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、(f)ステップ(d)で核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択でカラム溶出物を濃縮して、濃縮されたカラム溶出物を製造するステップと、(g)ステップ(f)で製造されたカラム溶出物又は濃縮されたカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で第2のカラム溶出物を希釈して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、(h)ステップ(g)で製造された第2のカラム溶出物又は希釈された第2のカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で第3のカラム溶出物を希釈して、希釈された第3のカラム溶出物を製造するステップと、(i)ステップ(h)で製造された第3のカラム溶出物又は濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップとを含む。
[0013]さらなる実施形態では、方法は、(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、(b)任意選択でステップ(a)で製造された回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、(c)ステップ(a)で製造された回収物又はステップ(b)で製造された濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、(d)ステップ(c)で製造された溶解物を処理して溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、(e)任意選択でステップ(d)で製造された核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、(f)ステップ(d)で核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択でカラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、(g)ステップ(f)で製造されたカラム溶出物又は希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、(h)ステップ(g)で製造された第2のカラム溶出物又は濃縮された第2のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップとを含む。
[0014]追加の実施形態では、方法は、(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、(b)任意選択でステップ(a)で製造された回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、(c)ステップ(a)で製造された回収物又はステップ(b)で製造された濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、(d)ステップ(c)で製造された溶解物を処理して、溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、(e)任意選択でステップ(d)で製造された核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、(f)ステップ(d)で核酸が減少した溶解物、又はステップ(e)で製造された清澄化された溶解物若しくは希釈され清澄化された溶解物を、AAV親和性カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択でカラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、(g)ステップ(f)で製造されたカラム溶出物又は希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、(h)任意選択でステップ(g)で製造された第2のカラム溶出物又は濃縮された第2のカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で第3のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第3のカラム溶出物を製造するステップと、(i)ステップ(g)で製造された第2のカラム溶出物若しくは希釈された第2のカラム溶出物を濾過するか、又はステップ(h)で製造された第3のカラム溶出物若しくは濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップとを含む。
[0015]さらに別の実施形態では、方法は、(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、(b)任意選択でステップ(a)で製造された回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、(c)ステップ(a)で製造された回収物又はステップ(b)で製造された濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、(d)ステップ(c)で製造された溶解物を処理して、溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、(e)任意選択でステップ(d)で製造された核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、(f)ステップ(d)で核酸が減少した溶解物、又はステップ(e)で製造された清澄化された溶解物若しくは希釈され清澄化された溶解物を、AAV親和性カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択でカラム溶出物を濃縮して、濃縮されたカラム溶出物を製造するステップと、(g)ステップ(f)で製造されたカラム溶出物又は濃縮されたカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で第2のカラム溶出物を希釈して、希釈された第2のカラム溶出物を製造するステップと、(h)任意選択でステップ(g)で製造された第2のカラム溶出物又は希釈された第2のカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で第3のカラム溶出物を希釈して、希釈された第3のカラム溶出物を製造するステップと、(i)ステップ(g)で製造された第2のカラム溶出物若しくは希釈された第2のカラム溶出物を濾過するか、又はステップ(h)で製造された第3のカラム溶出物若しくは濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップとを含む。
[0016]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(b)及び/又はステップ(f)及び/又はステップ(g)及び/又はステップ(h)の濃縮は、限外濾過/透析濾過により、例えば、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)による。
[0017]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(b)の濃縮は、回収された細胞及び細胞培養上清の体積を約2~20分の1に減少させる。
[0018]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(f)及び/又はステップ(g)及び/又はステップ(h)の濃縮は、カラム溶出物の体積を約5~20分の1に減少させる。
[0019]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(a)で製造された回収物又はステップ(b)で製造された濃縮された回収物の溶解は、物理的又は化学的手段による。物理的手段の非限定的な例は、微小流動化及び均質化を含む。化学的手段の非限定的な例は、洗浄剤を含む。洗浄剤は、非イオン性及びイオン性洗浄剤を含む。非イオン性洗浄剤の非限定的な例は、トリトンX-100を含む。洗浄剤濃度の非限定的な例は、両端を含めて約0.1~1.0%の間である。
[0020]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(d)は、ヌクレアーゼで処理して、それにより混入核酸を減少させることを含む。ヌクレアーゼの非限定的な例は、ベンゾナーゼを含む。
[0021]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(e)の清澄化された溶解物又は希釈され清澄化された溶解物の濾過は、フィルターによる。フィルターの非限定的な例は、両端を含めて約0.1~10.0ミクロンの間の細孔直径を有するものである。
[0022]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(e)の清澄化された溶解物の希釈は、リン酸緩衝水溶液、酢酸塩緩衝水溶液又はトリス緩衝水溶液を用いる。溶液のpHの非限定的な例は、両端を含めて約4.0~7.4の間である。トリス溶液のpHの非限定的な例は、7.5を超える、例えば、両端を含めて約8.0~9.0の間である。
[0023]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(f)のカラム溶出物又はステップ(g)の第2のカラム溶出物の希釈は、リン酸緩衝水溶液、酢酸塩緩衝水溶液又はトリス緩衝水溶液を用いる。溶液のpHの非限定的な例は、両端を含めて約4.0~7.4の間である。トリス溶液のpHの非限定的な例は、7.5を超える、例えば、両端を含めて約8.0~9.0の間である。
[0024]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(i)から生じたrAAVベクター粒子は、界面活性剤を用いて製剤化されて、AAVベクター製剤が製造される。
[0025]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(f)、(g)及び/又は(h)のアニオン交換カラムクロマトグラフィーは、ポリエチレングリコール(PEG)調整カラムクロマトグラフィーを含む。
[0026]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(g)及び/又は(h)のアニオン交換カラムクロマトグラフィーは、rAAVベクター粒子のカラムからの溶出の前に、PEG溶液で洗浄される。
[0027]本発明の方法の特定の態様では、PEGは、両端を含めて約1,000~80,000g/molの範囲の平均分子量を有する。
[0028]本発明の方法の特定の態様では、PEGは、両端を含めて約4%~約10%の濃度にある。
[0029]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(g)及び/又は(h)のアニオン交換カラムは、rAAVベクター粒子のカラムからの溶出の前に、界面活性剤水溶液で洗浄される。
[0030]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(f)のカチオン交換カラムは、rAAVベクター粒子のカラムからの溶出の前に、界面活性剤溶液で洗浄される。
[0031]本発明の方法の特定の態様では、PEG溶液及び/又は界面活性剤溶液は、トリスCl/NaCl緩衝水溶液、リン酸/NaCl緩衝水溶液、又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液を含む。
[0032]本発明の方法の特定の態様では、緩衝液又は溶液中のNaClは、両端を含めて約20~300mMの間のNaCl、又は両端を含めて約50~250mMの間のNaClの範囲である。
[0033]本発明の方法の特定の態様では、界面活性剤は、カチオン又はアニオン界面活性剤を含む。
[0034]本発明の方法の特定の態様では、界面活性剤は、炭素12個の鎖を有する界面活性剤を含む。
[0035]本発明の方法の特定の態様では、界面活性剤は、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド(DTAC)又はサルコシルを含む。
[0036]本発明の方法の特定の態様では、rAAVベクター粒子は、ステップ(f)、(g)及び/又は(h)のアニオン交換カラムから、トリスCl/NaCl緩衝水溶液で溶出される。
[0037]本発明の方法の特定の態様では、トリスCl/NaCl緩衝液は、両端を含めて100~400mMのNaClを、任意選択で両端を含めて約7.5~約9.0の範囲のpHで含む。
[0038]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(f)、(g)及び/又は(h)のアニオン交換カラムは、トリスCl/NaCl緩衝水溶液で洗浄される。
[0039]本発明の方法の特定の態様では、トリスCl/NaCl緩衝水溶液中のNaClは、両端を含めて約75~125mMの範囲である。
[0040]本発明の方法の特定の態様では、トリスCl/NaCl緩衝水溶液は、両端を含めて約7.5~約9.0のpHを有する。
[0041]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(f)、(g)及び/又は(h)のアニオン交換カラムは、1回又は複数回洗浄されて、第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を減少させる。
[0042]本発明の方法の特定の態様では、アニオン交換カラムの洗浄は、カラムから、rAAV除去の前に、及び/又はrAAVの代わりに、AAVの空のカプシドを除去して、それにより第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を減少させる。
[0043]本発明の方法の特定の態様では、アニオン交換カラムの洗浄は、カラムから、rAAV除去の前に、及び/又はrAAVの代わりに、全AAVの空のカプシドの少なくとも約50%を除去して、それにより第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を約50%減少させる。
[0044]本発明の方法の特定の態様では、トリスCl/NaCl緩衝水溶液中のNaClは、両端を含めて約110~120mMの範囲である。
[0045]本発明の方法の特定の態様では、溶出されたrAAVベクター粒子及びAAVの空のカプシドの比及び/又は量は、洗浄緩衝液により制御される。
[0046]本発明の方法の特定の態様では、ベクター粒子は、ステップ(f)のカチオン交換カラムから、リン酸/NaCl緩衝水溶液又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液に溶出される。非限定的な緩衝液中のNaCl濃度は、両端を含めて約125~500mMの範囲のNaClである。緩衝液のpHの非限定的な例は、両端を含めて約5.5~約7.5の間である。
[0047]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(f)、(g)及び/又は(h)のアニオン交換カラムは、四級化されたポリエチレンイミンなどの第四級アンモニウム官能基を含む。
[0048]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(g)及び/又は(h)のサイズ排除カラム(SEC)は、両端を含めて約10,000~約600,000の分離/分画範囲(分子量)を有する。
[0049]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(f)のカチオン交換カラムは、スルホプロピルなどのスルホン酸又は官能基を含む。
[0050]本発明の方法の特定の態様では、AAV親和性カラムは、AAVのカプシドタンパク質に結合するタンパク質又はリガンドを含む。タンパク質の非限定的な例は、AAVのカプシドタンパク質に結合する抗体を含む。より特定の非限定的な例は、AAVのカプシドタンパク質に結合するラマ(ラクダ科の動物)の単鎖抗体を含む。
[0051]本発明の方法の特定の態様では、方法は、塩化セシウム勾配超遠心分離のステップを除外する。
[0052]本発明の方法の特定の態様では、rAAVベクター粒子は、siRNA、アンチセンス分子、miRNA、リボザイム及びshRNAからなる群から選択される核酸をコードする導入遺伝子を含む。
[0053]本発明の方法の特定の態様では、rAAVベクター粒子は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン(hCG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織成長因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング成長因子α(TGFα)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子I及びII(IGF-I及びIGF-II)、TGFβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質(BMP)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィンNT-3及びNT4/5、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、アグリン、ネトリン-1及びネトリン-2、肝細胞成長因子(HGF)、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物をコードする導入遺伝子を含む。
[0054]本発明の方法の特定の態様では、rAAVベクター粒子は、トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン(IL1~IL-17)、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、flk-2/flt3リガンド、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、単鎖T細胞受容体、クラスI及びクラスIIのMHC分子からなる群から選択される遺伝子生成物をコードする導入遺伝子を含む。
[0055]本発明の方法の特定の態様では、rAAVベクター粒子は、カルバモイルシンテターゼI、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ-1アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第V因子、第VIII因子、第IX因子、シスタチオンベータ-シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-coAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ-グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、RPE65、H-タンパク質、T-タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子(CFTR)配列、及びジストロフィンcDNA配列からなる群から選択される先天性代謝異常の修正に有用なタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。
[0056]本発明の方法の特定の態様では、rAAVベクター粒子は、第VIII因子又は第IX因子をコードする導入遺伝子を含む。
[0057]本発明の方法の特定の態様では、方法は、ステップ(a)で製造された回収物、又はステップ(b)で濃縮された回収物から全rAAVベクター粒子の約50~90%を回収する。
[0058]本発明の方法の特定の態様では、方法は、1回のAAV親和性カラム精製により製造又は精製されたrAAVベクター粒子よりも高い純度を有するrAAVベクター粒子を製造する。
[0059]本発明の方法の特定の態様では、ステップ(c)及び(d)は、実質的に同時に実施される。
[0060]本発明の方法の特定の態様では、NaClは、ステップ(c)の後であるがステップ(f)の前に、両端を含めて約100~400mMの範囲のNaCl、又は両端を含めて約140~300mMの範囲のNaClであるように調節される。
[0061]本発明の方法の特定の態様では、rAAVベクター粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10及びRh74からなる群から選択されるAAVから誘導される。
[0062]本発明の方法の特定の態様では、rAAVベクター粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、Rh74、配列番号1又は配列番号2のカプシド配列と70%以上の同一性を有するカプシド配列を含む。
[0063]本発明の方法の特定の態様では、rAAVベクター粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、又はRh74のITR配列と70%以上の同一性を有するITR配列を含む。
[0064]本発明の方法の特定の態様では、細胞は、懸濁又は付着の細胞である。
[0065]本発明の方法の特定の態様では、細胞は、哺乳動物の細胞である。非限定的な例には、HEK細胞、例えば、HEK-293細胞が含まれる。
[0066]本発明の方法の特定の態様では、方法は、実施例1~3のいずれかに記載の、任意の1つ又は複数のカラム、条件、濃度、モル濃度、体積、容量、流速、圧、材料、温度、pH、又はステップによって実施される。
[0067]本発明の方法の特定の態様では、本明細書に記載のカラム精製の前の細胞溶解及び/又は調製は、実施例4に記載の、任意の1つ又は複数の条件、濃度、モル濃度、体積、容量、流速、圧、材料、温度、pH、又はステップによって実施される。
[0072]本発明は、大規模にスケールアップされ得る組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(rAAV)ベクターの精製及び製造方法を提供する。例えば、懸濁液は、5、10、10~20、20~50、50~100、100~200リットル以上の体積を培養する。本発明は、多種多様なAAVの血清型/カプシド変異体にも適用され得る組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(rAAV)ベクターの精製及び製造方法を提供する。rAAVベクターの精製又は製造のために使用される本発明の方法は、プロセス不純物及び製造に関連する不純物の除去を含む。本発明の方法は、多くの異なる血清型/偽型のrAAVベクターを精製する大規模化の可能性を提供する、クロマトグラフィーステップ及びプロセスステップの独特の組合せを含む。
[0073]不純物には、タンパク質、核酸(例えばDNA)、細胞成分、例えば、AAVベクターとはっきり区別される不純物である細胞内及び膜の成分を含むAAVベクター製造に関連する不純物が含まれる。用語「製造又はプロセスに関連する不純物」とは、AAVの精製及び製造プロセス中に放出される、真のrAAV粒子でない任意の成分を指す。
[0074]真の(bona fide)rAAVベクターとは、標的細胞に感染することができる異種核酸(例えば導入遺伝子)を含むrAAVベクター粒子を指す。フレーズは、空のAAVカプシド、パッケージングされたゲノム中に完全な挿入を欠くAAVベクター、又は混入宿主細胞の核酸を含有するAAVベクターを除外する。ある実施形態では、真のrAAVベクターとは、パッケージングされたベクターゲノム中に混入プラスミド配列も欠くrAAVベクター粒子を指す。
[0075]「空のカプシド」及び「空の粒子」とは、AAVカプシドシェルを含むが、片側又は両側にAAVのITRが隣接する異種核酸配列を含むゲノムを全体又は部分で欠くAAV粒子又はビリオンを指す。そのような空のカプシドは、異種核酸配列を宿主細胞又は生物体内の細胞中に移動させるように機能しない。
[0076]用語「ベクター」とは、核酸分子の小さい担体、プラスミド、ウイルス(例えば、rAAVベクター)、又は核酸の挿入若しくは組み込みにより操作され得る他のビヒクルを指す。ベクターは、ポリヌクレオチドを細胞中に導入/移動するために、及び挿入されたポリヌクレオチドを細胞中で転写又は翻訳するために、遺伝子操作(即ち、「ベクターをクローニング」)するために使用することができる。「発現ベクター」は、宿主細胞における発現のために必要な調節領域を有する遺伝子又は核酸配列を含有するベクターである。ベクター核酸配列は、少なくとも、細胞中における増殖のための複製の起点及び任意選択で追加の要素、例えば、異種核酸配列、発現制御要素(例えば、プロモーター、エンハンサー)、イントロン、逆位末端反復(ITR)、任意選択の選択可能なマーカー、ポリアデニル化シグナルを一般的に含有する。
[0077]rAAVベクターは、アデノ随伴ウイルスから誘導される。AAVベクターは、遺伝子療法ベクターとして有用であり、その理由は、AAVベクターが、細胞中に、核酸/遺伝子材料を導入することができて、その結果、核酸/遺伝子材料が細胞中で維持され得るからである。AAVは、ヒトにおける病原性疾患と関連しないので、rAAVベクターは、異種核酸配列(例えば、治療用タンパク質及び作用物質)をヒトの患者に、実質的なAAV病原性又は疾患を引き起こすことなく送達することができる。
[0078]rAAVベクターなどのベクターの変更遺伝子として、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの変更遺伝子の配列としての用語「組換え」は、一般的に天然では起こらない様式で、組成が操作された(即ち、作り変えられた)ことを意味する。組換えAAVベクターの特定の例は、野生型AAVゲノムには通常存在しない核酸が、ウイルスのゲノム内に挿入された場合であろう。例は、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする核酸(例えば、遺伝子)が、遺伝子がAAVゲノム内で通常関連する5’、3’及び/又はイントロン領域とともに又はそれなしでベクター中にクローニングされる場合であろう。本明細書では、用語「組換え」が、AAVベクター、並びにポリヌクレオチドなどの配列に関して使用されるとは限らないが、AAVベクター、ポリヌクレオチド等を含む組換え形態は、任意のそのような省略にも拘わらず明らかに含まれる。
[0079]「rAAVベクター」は、AAVゲノムから野生型ゲノムを除去して、非天然の(異種)核酸、例えば治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする核酸で置き換える分子法を使用することにより、AAVなどのウイルスの野生型ゲノムから誘導される。典型的には、AAVについて、AAVゲノムの片側又は両側の逆位末端反復(ITR)配列が、rAAVベクターで保持される。rAAVは、AAVゲノムの全部又は一部が、AAVゲノムの核酸に関して、非天然の配列で、例えば、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸で置き換えられているので、AAVゲノムと明白に区別される。非天然の配列の組み込みは、それゆえに、AAVを「組換え」AAVベクターと定義し、「rAAVベクター」と称することができる。
[0080]組換えAAVベクター配列は、パッケージングすることができて、エクスビボ、インビトロ又はインビボにおける細胞のその後の感染(形質導入)について、本明細書では「粒子」と称する。組換えベクター配列が、AAV粒子中にカプシド形成されているか又はパッケージングされている場合、粒子は、「rAAV」又は「rAAV粒子」又は「rAAVビリオン」と称することもできる。そのようなrAAV、rAAV粒子及びrAAVビリオンは、ベクターゲノムをカプシド形成するか又はパッケージングするタンパク質を含む。特定の例として、AAVの場合、カプシドタンパク質が含まれる。
[0081]ベクター「ゲノム」とは、最終的にパッケージングされるか又はカプシド形成されてrAAV粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドが組換えAAVベクターを構築するか又は製造するために使用される場合に、AAVベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。この組換えプラスミドの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と称され、プラスミド骨格は、プラスミドのクローニング及び増幅、増殖及び組換えウイルス産生のために必要なプロセスのために重要であるが、それ自体はrAAV粒子中にパッケージング又はカプシド形成されない。したがって、ベクター「ゲノム」とは、rAAVによりパッケージングされているか又はカプシド形成された核酸を指す。
[0082]「AAVヘルパー機能」とは、AAV由来のコード配列(タンパク質)を指し、そのコード配列は、発現されてAAV遺伝子生成物及びAAVベクターを提供することができて、順送りで、transの形態で増殖性AAV複製及びパッケージングのために自動的に機能する。したがって、AAVヘルパー機能は、rep及びcap並びにその他、例えば、あるAAV血清型のためのAAPを含む、AAVオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。Rep発現生成物は、とりわけ:DNA複製のAAV起源の認識、結合及びニッキング;DNAヘリカーゼ活性;並びにAAV(又は他の異種)プロモーターからの転写の調整を含む多くの機能を有することが示されている。cap発現生成物(カプシド)は必要なパッケージング機能を供給する。AAVヘルパー機能は、AAVベクターゲノムから消失しているAAV機能をtransの形態で補うために使用される。
[0083]「AAVヘルパー構築物」とは、例えば、対象に対する遺伝子療法のために、目的の核酸配列を送達するための形質導入AVVベクターを製造するために使用されるべきAAVベクターから欠失されたAAV機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸配列を一般的に指す。AAVヘルパー構築物は、AAVベクター複製に必要な消失しているAAV機能を補うために、AAVのrep及び/又はcap遺伝子を一過性で発現させるために、通常使用される。ヘルパー構築物は、AAVのITRを一般的に欠いて、それら自体で複製もパッケージングもできない。AAVヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態にあることができる。幾つかのAAVヘルパー構築物は、Rep及びCap発現生成物の両方をコードするプラスミドpAAV/Ad及びpIM29+45などと記載されている(例えば、Samulskら(1989)J.Virol.63:3822~3828;及びMcCartyら(1991)J.Virol.65:2936~2945を参照されたい)。Rep及び/又はCap発現生成物をコードする多くの他のベクターが記載されている(例えば、米国特許第5,139,941号及び第6,376,237号を参照されたい)。
[0084]用語「補助機能」とは、AAVが複製のために依存する、AAVに由来しないウイルスの及び/又は細胞の機能を指す。用語は、AAV遺伝子転写の活性化、ステージ特異的なAAVのmRNAスプライシング、AAVのDNA複製、Cap発現生成物の合成及びAAVカプシドのパッケージングに関与する部分を含むAAV複製で必要とされるタンパク質及びRNAを含む。ウイルスに基づく補助機能は、任意の公知のヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス(1型単純ヘルペスウイルス以外)及びワクシニアウイルスから誘導することができる。
[0085]「補助機能ベクター」とは、補助機能を提供するポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を一般的に指す。そのような配列は、補助機能ベクター上にあり、適当な宿主細胞にトランスフェクトされ得る。補助機能ベクターは、宿主細胞中におけるrAAVビリオン産生を支持することができる。補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン又はコスミドの形態にあることができる。加えて、全部のアデノウイルス遺伝子は、補助機能のために必要ではない。例えば、DNA複製及び晩発の遺伝子合成ができないアデノウイルス突然変異体は、AAV複製の複製を許容すると報告されている(Itoら、(1970)J.Gen.Virol.9:243;Ishibashiら、(1971)Virology 45:317)。同様に、E2B及びE3領域内の突然変異体は、AAV複製を支持することが示されており、E2B及びE3領域は、補助機能を提供することにおそらく関与しないことが示される(Carterら、(1983)Virology 126:505)。E1領域に欠陥があるか、又はE4領域が欠失しているアデノウイルスは、AAV複製を支持することができない。したがって、E1A及びE4領域は、直接又は間接的のいずれかで、AAV複製のために必要であると思われる(Laughlinら、(1982)J.Virol.41:868;Janikら、(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1925;Carterら、(1983)Virology 126:505)。他のキャラクタライズされているアデノウイルス突然変異体には:E1B(Laughlinら(1982)、前出;Janikら(1981)、前出;Ostroveら、(1980)Virology 104:502);E2A(Handaら、(1975)J.Gen.Virol.29:239;Straussら、(1976)J.Virol.17:140;Myersら、(1980)J.Virol.35:665;Jayら、(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2927;Myersら、(1981)J.Biol.Chem.256:567);E2B(I CRC Handbook of Parvoviruses(P.Tijssen編、1990)におけるCarter、Adeno-Associated Virus Helper Functions);E3(Carterら(1983)、前出);及びE4(Carterら(1983)、前出;Carter(1995))が含まれる。E1Bコード領域における突然変異を有するアデノウイルスにより提供される補助機能の研究は、相反する結果を生じたが、E1B55kはAAVビリオン産生のために必要である可能性があり、一方、E1B19kは必要ではない(Samulskiら、(1988)J.Virol.62:206~210)。加えて、国際公開第97/17458号及びMatshushitaら、(1998)Gene Therapy 5:938~945には、種々のアデノウイルス遺伝子をコードする補助機能ベクターが記載されている。例示的な補助機能ベクターは、アデノウイルスVA RNAコード領域、アデノウイルスE4 ORF6コード領域、アデノウイルスE2A 72kDコード領域、アデノウイルスE1Aコード領域、及び完全E1B55kコード領域を欠くアデノウイルスE1B領域を含む。そのような補助機能ベクターは、例えば、国際公開第01/83797号に記載されている。
[0086]本明細書において使用する用語「血清型」は、他のAAV血清型と血清学的に区別されるカプシドを有するAAVを指して使用される区別である。血清学的特殊性は、あるAAVを別のAAVと比較して抗体間の交差反応性の欠如を根拠に決定される。交差反応性の差は、カプシドタンパク質の配列/抗原決定基における差に通常起因する(例えば、VP1、VP2、及び/又はVP3配列のAAV血清型の差に起因する)。
[0087]従来の定義に基づき、血清型は、目的ウイルスが、全ての既存の及びキャラクタライズされた血清型に対して特異的な血清に対して、中和活性について試験されて、目的ウイルスを中和する抗体が見出されなかったことを意味する。より多くの天然に生ずるウイルス単離体が発見されて及び/又はカプシド突然変異体が発生するので、現在存在する血清型のいずれかと血清学的差があることもあり、ないこともある。したがって、新しいウイルス(例えば、AAV)が血清学的差を有しない場合、この新しいウイルス(例えば、AAV)は、対応する血清型のサブグループ又は変異体である。多くの場合、カプシド配列が改変された突然変異体ウイルスについて、血清型の従来の定義による別の血清型のものであるかどうかを決定するために、中和活性についての血清学試験が、さらに実施されなければならない。したがって、便宜上及び繰り返しを避けるために、用語「血清型」とは、血清学的に区別されるウイルス(例えばAAV)並びに所与の血清型のサブグループ又は変異体の内であり得て血清学的に区別されないウイルス(例えば、AAV)の両方を広く指す。
[0088]rAAVベクターは、任意のウイルス株又は血清型を含む。非限定的な例として、rAAVプラスミド又はベクターゲノム又は粒子(カプシド)は、任意のAAV血清型、例えば、AAV-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11などに基づき得る。そのようなベクターは、同じ株又は血清型に基づき得るか(又はサブグループ若しくは変異体)、又は互いに異なることもできる。非限定的な例として、1つの血清型のゲノムに基づくrAAVプラスミド又はベクターゲノム又は粒子(カプシド)は、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質の1種又は複数と同一であることができる。加えて、rAAVプラスミド又はベクターゲノムは、ベクターゲノムをパッケージングするカプシドタンパク質の1種又は複数と区別されるAAV(例えば、AAV2)の血清型ゲノムに基づき得、その場合、3種のカプシドタンパク質のうちの少なくとも1種が、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、配列番号1若しくは配列番号2、又はそれらの変異体であることができる。rAAVベクターは、それゆえに、特定の血清型、並びに混合血清型に対して特徴的な遺伝子/タンパク質配列と同一の遺伝子/タンパク質配列を含む。
[0089]種々の例示的な実施形態では、rAAVベクターは、1種又は複数のAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、配列番号1又は配列番号2のカプシドタンパク質と少なくとも70%以上(例えば、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等)同一のカプシド配列を含むか又はそれらからなる。種々の例示的な実施形態では、rAAVベクターは、1種又は複数のAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、又はRh74 ITR(複数可)と少なくとも70%以上(例えば、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等)同一の配列を含むか又はそれらからなる。
[0090]rAAV、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、配列番号1及び配列番号2、並びに変異体、ハイブリッド及びキメラ配列は、当業者に公知の組換え技法を使用して、1種又は複数の機能的AAVのITR配列が隣接する1種又は複数の異種ポリヌクレオチド配列(導入遺伝子)を含むように構築することができる。そのようなベクターは、全体又は一部が欠失した野生型のAAV遺伝子の1種又は複数を有するが、rAAVベクター粒子中に組換えベクターをレスキュー、複製、及びパッケージングするために必要なので、少なくとも1種の機能的な隣接して存在するITR配列(複数可)を保持する。rAAVベクターゲノムは、それゆえに、複製及びパッケージングのために必要な配列(例えば、機能的ITR配列)を、cisの形態で含む。
[0091]用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では、デオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)を含む核酸、オリゴヌクレオチドの全て形態を指して互換的に使用される。核酸は、ゲノムDNA、cDNA及びアンチセンスDNA、及びスプライスされた又はスプライスされていないmRNA、rRNA、tRNA及び阻害DNA又はRNA(RNAi、例えば、小さい若しくは短いヘアピン(sh)RNA、ミクロRNA(miRNA)、小さい若しくは短い干渉(si)RNA、trans-スプライシングRNA、又はアンチセンスRNA)を含む。核酸は、天然に生ずる、合成の、及び意図的に改変された又は変えられたポリヌクレオチドを含む。核酸は、一重、二重、又は三重、直鎖状又は環状であることができ、任意の長さのものであることができる。核酸を論ずる際に、本明細書では、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、5’から3’方向で配列を提供する慣行に従って記載されることがある。
[0092]「異種」核酸配列とは、ベクターに媒介される、ポリヌクレオチドの細胞中への移動/送達を目的として、AAVプラスミド又はベクターに挿入されたポリヌクレオチドを指す。異種核酸配列は、AAV核酸と区別される、即ち、AAV核酸に関して非天然である。細胞中に移動/送達されれば、ベクター内に含有される異種核酸配列が、発現され得る(例えば、適当ならば、転写されて翻訳される)。或いは、細胞中の移動/送達されたベクター内に含有される異種ポリヌクレオチドは、発現されなくてもよい。用語「異種」は、本明細書では、核酸配列及びポリヌクレオチドの言及に使用されるとは限らないが、核酸配列又はポリヌクレオチドに対する言及は、「異種」変更遺伝子の非存在下でさえ、省略にも拘わらず、異種核酸配列及びポリヌクレオチドを含むことが意図される。
[0093]「核酸配列」によりコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、結果として、改変された形態又は変異体が天然の全長タンパク質のある程度の機能性を保持する限り、天然に生ずるタンパク質、並びに機能的部分配列、改変された形態又は配列変異体と同様に、天然の全長配列を含む。核酸配列によりコードされるそのようなポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、処置される哺乳類で欠陥のある、又は発現が不十分若しくは不完全である内因性タンパク質と同一であることができるが、そうである必要はない。
[0094]「導入遺伝子」は、本明細書では、細胞又は生物体に意図されるか又は導入されている核酸(例えば異種)を指して便利に使用される。導入遺伝子は、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸などの任意の核酸を含む。
[0095]導入遺伝子を有する細胞中で、導入遺伝子は、プラスミド又はAAVベクター、細胞の「形質導入」又は「トランスフェクション」により、導入/移動されている。用語「形質導入」及び「トランスフェクト」とは、核酸などの分子の宿主細胞(例えば、HEK293)又は生物体の細胞中への導入を指す。導入遺伝子は、受容細胞のゲノム核酸中に組み込まれてもよく組み込まれなくてもよい。導入された核酸が受容細胞又は生物体の核酸(ゲノムDNA)中に組み込まれれば、導入された核酸は、その細胞又は生物体中で安定に維持されることができ、受容細胞又は生物体の細胞の子孫細胞又は生物体にさらに受け渡され、又はそれらにより継承される。
[0096]「宿主細胞」とは、AAVベクターのプラスミド、AAVヘルパー構造体、補助機能ベクター、又は他の転移DNAのレシピエントとして使用され得るか又は使用された、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物の細胞を指す。用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」とは、外来性DNA配列をトランスフェクトされた細胞を一般的に指す。単一の親細胞の子孫は、自然の、偶発性の、又は故意の突然変異に起因して、形態又はゲノム又は全DNAの相補体が、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいと理解される。例示的な宿主細胞は、HEK293などのヒト胚腎臓(HEK)細胞を含む。
[0097]「形質導入された細胞」は、導入遺伝子が導入されている細胞である。したがって、「形質導入された」細胞は、外来性分子、例えば、核酸(例えば、導入遺伝子)の細胞中への組み込み後の細胞における遺伝的変化を意味する。したがって、「形質導入された」細胞は、外来性核酸が導入されている細胞又はその子孫である。細胞(複数可)は、増殖する(培養する)ことができ、細胞により、導入されたタンパク質が発現され若しくは核酸が転写され、又はrAAVなどのベクターが産生される。遺伝子療法の使用及び方法のために、形質導入された細胞は対象に存在し得る。
[0098]細胞に関して、本明細書において使用する用語「安定」、又は「安定に組み込まれた」は、選択可能なマーカー若しくは異種核酸配列などの核酸配列、又はプラスミド若しくはベクターが、染色体に挿入されているか(例えば、相同性組換え、非相同性末端結合、トランスフェクション等により)、又は受容細胞若しくは宿主生物体の染色体外で維持され、及び染色体中にとどまるか、又はある期間、染色体外で維持されることを意味する。培養細胞の場合、染色体中に挿入された異種核酸配列などの核酸配列、又はプラスミド若しくはベクターは、複数の細胞継代の過程にわたり維持され得る。
[0099]「細胞株」とは、インビトロの適当な培養条件下で連続した又は長期の成長及び分割が可能な細胞の集団を指す。細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローンの集団であり得るが、そうである必要はない。細胞株では、自発的な又は誘導された変化が、そのようなクローンの集団の貯蔵又は移動中、並びに組織培養における長期の継代中に核型で起こり得る。したがって、細胞株に由来する子孫細胞は、祖先細胞又は培養物と厳密には同一でないこともある。本発明の精製方法に適用可能な例示的な細胞株はHEK293である。
[0100]「発現制御要素」とは、作動可能に連結した核酸の発現に影響する核酸配列(複数可)を指す。制御要素は、本明細書で説明されるプロモーター及びエンハンサーなどの発現制御要素を含む。rAAVベクターは1種又は複数の「発現制御要素」を含むことができる。典型的には、そのような要素が含まれて、適当な異種ポリヌクレオチドの転写及び適当ならば翻訳を容易にする(例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのためのスプライシングシグナル、mRNAのフレーム内翻訳を可能にする遺伝子の正確な読み取りフレームの維持、及び停止コドン等)。そのような要素は、典型的には、cisの形態で作用して、「cis作用性」要素と称されるが、transの形態で作用することもある。
[0101]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージの安定性等のレベルで影響され得る。典型的には、転写を調整する発現制御要素は、転写される核酸の5’末端付近(即ち、「上流」)に並置される。発現制御要素は、転写される配列の3’末端(即ち、「下流」)に又は転写物内(例えば、イントロン中)に配置することもできる。発現制御要素は、転写される配列に隣接して、又は距離をおいて(例えば、ポリヌクレオチドから1~10、10~25、25~50、50~100、100~500、又はそれを超えるヌクレオチド)、かなりの距離でも配置され得る。それにも拘わらず、rAAVベクターの長さの制限があるので、発現制御要素は、典型的には、転写される核酸から1~1000ヌクレオチド以内である。
[0102]機能的に、作動可能に連結した核酸の発現は、要素(例えば、プロモーター)により少なくとも部分的に制御可能であり、その結果、要素が核酸の転写及び、適当な場合には、転写物の翻訳を調整する。発現制御要素の具体的な例は、プロモーターであり、プロモーターは転写される配列の5’に通常位置する。プロモーターは、典型的には、作動可能に連結した核酸から発現される量を、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して増大させる。
[0103]本明細書において使用する「エンハンサー」は、選択可能なマーカーなどの核酸配列又は異種核酸配列に隣接して位置する配列を指すことができる。エンハンサー要素は、典型的には、プロモーター要素の上流に位置するが、機能しもする、そして配列の下流又は配列内部に位置することもできる。それゆえに、エンハンサー要素は、上流でも下流でも、例えば、選択可能なマーカー、及び/又は治療用タンパク質若しくはポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸の100塩基対、200塩基対、又は300以上の塩基対以内に位置することができる。エンハンサー要素は、典型的には、作動可能に連結した核酸の発現を、プロモーター要素により生ずる発現を超えて増大させる。
[0104]用語「作動可能に連結した」は、核酸配列の発現に必要な調節配列が、核酸配列の発現に効果をもたらすように、配列に対して適当な位置に置かれることを意味する。この同じ定義が、時には、発現ベクター、例えば、rAAVベクターにおける核酸配列及び転写制御要素(例えば、プロモーター、エンハンサー、及び停止要素)の配置に適用される。
[0105]核酸と作動可能に連結している発現制御要素の例では、関係は、制御要素が核酸の発現を調整するようになっている。より詳細には、例えば、作動可能に連結した2つのDNA配列は、2つのDNAがDNA配列の少なくとも1つが他の配列に対して生理学的効果を及ぼすことができる、そのような関係で配置されている(cis又はtrans)ことを意味する。
[0106]したがって、ベクターのための追加要素は、AAVのITR配列、又はイントロンの1つ又は複数のコピーなどの配列に隣接して存在する、発現制御要素(例えば、プロモーター/エンハンサー)、転写停止シグナル又は停止コドン、5’又は3’の非翻訳領域(例えば、ポリアデニル化(polyA)配列)を含むが、これらに限定されない。
[0107]さらなる要素は、例えば、パッケージングを改善し、混入核酸の存在を減少させるための、例えば、フィラー又はスタッファーのポリヌクレオチド配列を含む。AAVベクターは、典型的には、一般的に約4kb~約5.2kb、又は僅かにそれを超えるサイズ範囲を有するDNAの挿入を受け入れる。したがって、より短い配列に対して、rAAV粒子中へのベクターのパッケージングのために許容されるウイルスゲノム配列の正常サイズ近くに又は正常サイズに、長さを調節するために、スタッファー又はフィラーが含まれる。種々の実施形態では、フィラー/スタッファーの核酸配列は、核酸の非翻訳(非タンパク質コード)セグメントである。4.7Kb未満の核酸配列に対して、フィラー又はスタッファーのポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わされたときに(例えば、ベクター中に挿入)、約3.0~5.5Kbの間、又は約4.0~5.0Kbの間、又は約4.3~4.8Kbの間の全長を有する長さを有する。
[0108]「治療用タンパク質」は、一実施形態では、細胞又は対象におけるタンパク質の不十分な量、不在又は欠陥から生ずる症状を緩和するか又は軽減することができるペプチド又はタンパク質である。導入遺伝子によりコードされる「治療用」タンパク質は、対象に恩恵を与える、例えば、遺伝的欠陥を修正する、遺伝子の(発現又は機能的)欠損等を修正することができる。
[0109]本発明により有用な遺伝子生成物(例えば、治療用タンパク質)をコードする異種核酸の非限定的な例は、「鬱血」又は血液凝固障害、例えば、血友病A、阻害抗体を有する血友病A患者、血友病B、凝固因子VII、VIII、IX及びX、XI、V、XII、II、フォンウィレブラント因子の欠損、組み合わされたFV/FVIII欠損、地中海貧血、ビタミンKエポキシドレダクターゼC1欠損、ガンマ-カルボキシラーゼ欠損;貧血、外傷、傷害、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝血異常、播種性血管内凝固(DIC)と関連する出血;ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワーファリン、低分子抗血栓薬(即ち、FXa阻害剤)に関連する過抗凝固;並びに血小板障害、例えば、ベルナールスリエ症候群、グランツマン血小板無力症、及び貯蔵プール欠乏症を含むが、これらに限定されない疾患又は障害の治療で使用され得るものを含む。
[0110]核酸分子、ベクター、例えば、クローニングベクター、発現ベクター(例えば、ベクターゲノム)及びプラスミドは、組換えDNA技法を使用して調製することができる。ヌクレオチドの配列情報が入手できることは、種々の手段による核酸分子の調製を可能にする。例えば、ベクター又はプラスミドを含む第IX因子(FIX)をコードする異種核酸は、種々の標準的クローニング、組換えDNA技術を使用して、細胞発現又はインビトロ翻訳及び化学合成技法により作製することができる。ポリヌクレオチドの純度は、配列決定、ゲル電気泳動等により決定することができる。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション又はコンピューターに基づくデータベーススクリーニング技法を使用して単離することができる。そのような技法は、(1)相同性ヌクレオチド配列を検出するプローブを用いるゲノムDNA又はcDNAライブラリーのハイブリダイゼーション;(2)例えば、発現ライブラリーを使用して、共有される構造的特徴を有するポリペプチドを検出する抗体スクリーニング;(3)目的の核酸配列とアニーリングすることができるプライマーを使用するゲノムDNA又はcDNAにおけるポリメラーゼ連鎖反応(PCR);(4)関連する配列についての配列データベースのコンピューター検索;及び(5)差し引かれた核酸ライブラリーの示差的スクリーニングを含むが、これらに限定されない。
[0111]用語「単離された」は、組成物の変更遺伝子として使用される場合、組成物がヒトの手により作製されるか、又は完全に若しくは少なくとも部分的に、天然に生ずるものからインビボ環境で分離されることを意味する。一般的に、単離された組成物は、通常天然に伴う1種又は複数の材料、例えば、1種又は複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。
[0112]タンパク質に関して、用語「単離されたタンパク質」又は「単離され精製されたタンパク質」は、時に、本明細書で使用される。この用語は、核酸分子の発現により産生するタンパク質を主として指す。或いは、この用語は、天然で伴われる他のタンパク質から十分に分離されて、その結果「実質的に純粋」な形態で存在するタンパク質を指すこともある。
[0113]用語「単離された」は、ヒトの手によって製造した組合せ、例えば、組換えrAAV及び薬学的製剤を除外しない。用語「単離された」は、組成物の代替的物理的形態、例えば、ハイブリッド/キメラ、多量体/オリゴマー、改変(例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質修飾)若しくは誘導体化された形態、又はヒト手により製造した宿主細胞中で発現された形態も除外しない。
[0114]用語「実質的に純粋」とは、少なくとも50~60重量%の目的の化合物(例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質等)を含む調製物を指す。調製物は、少なくとも75重量%、又は約90~99重量%の目的のある化合物を含むことができる。純度は、目的のある化合物に適当な方法(例えば、クロマトグラフィーの方法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC分析等)により測定される。
[0115]「から本質的になる」というフレーズは、特定のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を指す場合、所与の配列の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用される場合、フレーズは、配列それ自体及び配列の基本的及び新規特性に影響しない分子改変を含む。
[0116]rAAVビリオンを発生させるための方法、例えば:AAVベクター及びAAVヘルパー配列を、1種のAAVヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス)との共感染と併せて使用するトランスフェクション、又は組換えAAVベクター、AAVヘルパーベクター、及び補助機能ベクターを用いるトランスフェクションが当技術分野で公知である。rAAVビリオンを発生させるための非限定的な方法は、例えば、米国特許第6,001,650号及び第6,004,797号、国際出願PCT/US16/64414(国際公開第2017/096039号として公開)並びに米国特許仮出願第62/516,432号及び第62/531,626号に記載されている。組換えrAAVベクターの産生(即ち、細胞培養系におけるベクターの発生)の後、rAAVビリオンが宿主細胞及び細胞培養上清から得られ、本明細書で説明されるように精製され得る。
[0117]初期ステップとして、典型的には、rAAVビリオンを産生する宿主細胞が、任意選択で、rAAVビリオンを産生している宿主細胞(懸濁又は付着)が培養された細胞培養上清(培地)の回収と組み合わせて回収され得る。本明細書の方法では、回収された細胞及び任意選択で細胞培養上清は、適当な場合は、そのままで使用されても精製されてもよい。さらに、感染が補助機能を発現させるために用いられる場合、残存ヘルパーウイルスを、不活性化することができる。例えば、アデノウイルスは、約60℃の温度に例えば20分以上加熱することにより不活性化することができ、それにより、AAVは熱に安定であるがヘルパーのアデノウイルスは熱不安定性であることから、ヘルパーウイルスのみが不活性化される。
[0118]回収物の細胞及び/又は上清は、細胞を粉砕することにより、例えば、化学的又は物理的手段、例えば、洗浄剤、微小流動化及び/又は均質化して、rAAV粒子を放出することにより、溶解される。細胞溶解中に同時に又はその後で細胞溶解後に、ベンゾナーゼなどのヌクレアーゼを加えて、混入DNAを分解することもできる。典型的には、生じた溶解物を、清澄化して、濾過、遠心分離などで細胞残骸を除去して、清澄化された細胞溶解物にする。特定の例では、溶解物を、直径がミクロンサイズの細孔フィルター(0.1~10.0μmの細孔サイズのフィルターなど、例えば、0.45μm及び/又は0.2μmの細孔サイズのフィルター)を用いて濾過して、清澄化された溶解物を得る。
[0119]溶解物(任意選択で清澄化された)は、AAV粒子(真のrAAVベクター、及びAAVの空のカプシド)及びAAVベクター製造/プロセスに関連する不純物、例えば、とりわけ、細胞タンパク質、脂質、及び/又は核酸を含み得る宿主細胞からの可溶細胞成分、並びに細胞培養培地成分を含有する。任意選択で清澄化された溶解物は、次に、クロマトグラフィーを使用して、追加の精製ステップに供して、不純物からAAV粒子(真のrAAVベクターを含む)を精製する。清澄化された溶解物は、クロマトグラフィーの第1のステップの前に、適当な緩衝液で希釈されても濃縮されてもよい。
[0120]本明細書で開示されるように、細胞溶解、任意選択の清澄化、及び任意選択の希釈又は濃縮の後、複数の逐次クロマトグラフィーステップが使用されて、rAAV粒子が精製される。そのような方法は、典型的には、塩化セシウム勾配超遠心分離のステップを除外する。
[0121]本明細書で開示されるように、第1のクロマトグラフィーステップは、カチオン交換クロマトグラフィー又はアニオン交換クロマトグラフィーであってもよい。第1のクロマトグラフィーステップがカチオン交換クロマトグラフィーである場合、第2のクロマトグラフィーステップは、アニオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)であり得る。したがって、1つのrAAV精製方法では、精製は、カチオン交換クロマトグラフィーにより、その後アニオン交換クロマトグラフィーにより精製する。
[0122]或いは、第1のクロマトグラフィーステップがカチオン交換クロマトグラフィーである場合、第2のクロマトグラフィーステップは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)であり得る。したがって、別のrAAV精製方法では、精製は、カチオン交換クロマトグラフィーにより、その後サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製する。
[0123]本明細書でも開示されるように、第1のクロマトグラフィーステップは親和性クロマトグラフィーであってもよい。第1のクロマトグラフィーステップが親和性クロマトグラフィーである場合、第2のクロマトグラフィーステップは、アニオン交換クロマトグラフィーであり得る。したがって、さらなるrAAV精製方法では、精製は、親和性クロマトグラフィーにより、その後アニオン交換クロマトグラフィーにより精製する。
[0124]任意選択で第3のクロマトグラフィーを、前述のクロマトグラフィーステップに追加することができる。典型的には、任意選択の第3のクロマトグラフィーステップは、カチオン交換、アニオン交換、サイズ排除又は親和性クロマトグラフィーに続く。
[0125]したがって、追加のrAAV精製方法では、精製は、カチオン交換クロマトグラフィーにより、次にアニオン交換クロマトグラフィーにより精製し、その後サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製する。なお、さらに別のrAAV精製方法では、精製は、カチオン交換クロマトグラフィーより、次にサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製し、その後アニオン交換クロマトグラフィーにより精製する。
[0126]さらなる追加のrAAV精製方法では、精製は、親和性クロマトグラフィーにより、次にアニオン交換クロマトグラフィーにより精製し、その後サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製する。さらに別のrAAV精製方法では、精製は、親和性クロマトグラフィーにより、次にサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製し、その後アニオン交換クロマトグラフィーにより精製する。
[0127]カチオン交換クロマトグラフィーは、清澄化された溶解物及び/又はサイズ排除クロマトグラフィーからのカラム溶出物中に存在する細胞及び他の成分から、AAV粒子を分離するように機能する。広いpH範囲にわたってrAAV粒子を結合することができる強カチオン交換樹脂の例には、アリール及びアルキル置換スルホネート、例えば、スルホプロピル又はスルホエチル樹脂を含むスルホネート官能基の存在により示される任意のスルホン酸系樹脂が含まれるが、これらに限定されない。代表的マトリックスには、POROS HS、POROS HS50、POROS XS、POROS SP、及びPOROS S(強カチオン交換体、Thermo Fisher Scientific,Inc.、Waltham、マサチューセッツ州から入手可能)が含まれるが、これらに限定されない。追加の例には、Capto S、Capto S ImpAct、Capto S ImpRes(強カチオン交換体、GE Healthcare、Marlborough、マサチューセッツ州から入手可能)、並びに市販のDOWEX(登録商標)、AMBERLITE(登録商標)、及びAMBERLYST(登録商標)ファミリーの樹脂、Aldrich Chemical Company(Milliwaukee、ウィスコンシン州から入手可能)が含まれる。弱カチオン交換樹脂には、任意のカルボン酸系樹脂が含まれるが、これらに限定されない。例示的なカチオン交換樹脂には、カルボキシメチル(CM)、ホスホ(リン酸官能基に基づく)、メチルスルホネート(S)及びスルホプロピル(SP)樹脂も含まれる。
[0128]アニオン交換クロマトグラフィーは、清澄化された溶解物及び/又はサイズ排除クロマトグラフィーからのカラム溶出物中に存在するタンパク質、細胞及び他の成分から、AAV粒子を分離するように機能する。アニオン交換クロマトグラフィーは、溶出物中のAAVの空のカプシドの量を制御するためにも使用することができる。例えば、結合したrAAVベクターを有するアニオン交換カラムは、穏当な濃度(例えば、約100~125mM、例えば、110~115mM)のNaClで洗浄することができ、空のカプシドの一部がrAAVベクターの実質的溶出なしに、通過画分で溶出され得る。その後、アニオン交換カラムに結合したrAAVベクターを、NaClをより高い濃度(例えば、約130~300mM Nacl)で使用して溶出させ、それによりAAVの空のカプシドが減少したか又は激減した量及びrAAVの比例的に増大した量を有するカラム溶出物が製造され得る。
[0129]例示的なアニオン交換樹脂は、ポリアミン樹脂に基づく樹脂及び他の樹脂を含むが、これらに限定されない。強アニオン交換樹脂の例は、トリアルキルベンジルアンモニウム樹脂などの第四級アンモニウム塩樹脂を含むが、これらに限定されない四級化された窒素原子に一般的に基づく樹脂を含む。適当な交換クロマトグラフィーには、MACRO PREP Q(強アニオン交換体、BioRad、Hercules、カリフォルニア州から入手可能);UNOSPHERE Q(強アニオン交換体、BioRad、Hercules、カリフォルニア州から入手可能);POROS 50HQ(強アニオン交換体、Applied Biosystems、Foster City、カリフォルニア州から入手可能);POROS XQ(強アニオン交換体、Applied Biosystems、Foster City、カリフォルニア州から入手可能);POROS 50D(弱アニオン交換体、Applied Biosystems、Foster City、カリフォルニア州から入手可能);POROS 50PI(弱アニオン交換体、Applied Biosystems、Foster City、カリフォルニア州から入手可能);Capto Q、Capto XQ、Capto Q ImpRes、及びSOURCE 30Q(強アニオン交換体、GE healthcare、Marlborough、マサチューセッツ州から入手可能);DEAE SEPHAROSE(弱アニオン交換体、Amersham Biosciences、Piscataway、ニュージャージー州から入手可能);Q SEPHAROSE(強アニオン交換体、Amersham Biosciences、Piscataway、ニュージャージー州から入手可能)が含まれるが、これらに限定されない。追加の例示的なアニオン交換樹脂には、アミノエチル(AE)、ジエチルアミノエチル(DEAE)、ジエチルアミノプロピル(DEPE)及び第四級アミノエチル(QAE)が含まれる。
[0130]カチオン交換、アニオン交換、サイズ排除及び親和性などのクロマトグラフィー媒体は、pH、及び緩衝体積などの種々の条件下で種々の緩衝液を用いて、平衡化、洗浄及び溶出され得る。以下では、特定の非限定的な例を記載することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。
[0131]カチオン交換クロマトグラフィーは、標準的緩衝液を使用して、メーカーの仕様に従って平衡化することができる。例えば、クロマトグラフィー媒体は、5~100mM、又は10~50mM、例えば10~30mMのリン酸緩衝液、及び塩化ナトリウムを用いて平衡化することができる。平衡化後、次に、試料をロードする。その後、クロマトグラフィー媒体を、少なくとも1回以上、例えば、2~10回洗浄する。クロマトグラフィー媒体からの溶出は、少なくとも1回の高塩濃度緩衝液によるが、溶出は、2回以上同じか又はより高い塩濃度の緩衝液によることもできる。
[0132]カチオン交換クロマトグラフィーのための洗浄及び溶出のための典型的な平衡緩衝液及び溶液は、約pH3~pH8、より典型的には約pH4~pH7.5、例えばpH6.0~6.5、6.5~7.0、7.0~7.5、又は上述の範囲の若しくはその間、例えば7.0、7.1、7.2、7.3若しくは7.4、の任意のpHの適当なpHである。
[0133]カチオン交換カラムのための洗浄及び溶出のための適当な平衡緩衝液及び溶液は、当技術分野において公知であり、一般的にアニオン性である。そのような緩衝液には、以下の緩衝イオン:リン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、ホウ酸イオン、又は硫酸イオンを用いる緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。
[0134]一実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィー媒体は、最初に平衡化されて、試料を適用され、低い塩濃度、例えば、10~150mMのNaCl、例えば10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、60~125mM、又はこれらの範囲若しくはその範囲内、例えば、100mM、の任意の濃度で洗浄される。
[0135]第1の洗浄に続いて、クロマトグラフィー媒体は、不純物を溶出させるためにより高い塩濃度で、例えば、より高いNaCl濃度で、又はより強いイオン強度の別の緩衝液で処理することもできる。追加の不純物がカラムから溶出された後、rAAV粒子を溶出させるために、緩衝液のイオン強度を、NaCl、KCl、硫酸塩、ギ酸塩又は酢酸塩などの塩を使用して増大させて、回収することができる。一実施形態では、溶出は、高塩濃度、例えば、200~500mMのNaCl、又は250mM、300mM、350mM、又は400mMなどの任意の濃度若しくはこれらの範囲内で行われる。
[0136]追加の成分は、洗浄及び溶出のための平衡緩衝液及び溶液に含まれ得る。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーのための洗浄緩衝液は、サルコシル(例えば、1~10mM)などのアニオン界面活性剤を含むことができ、アニオン交換クロマトグラフィーのための洗浄緩衝液は、ドデシルトリメチルアンモニウム塩化(例えば、1~10mM)などのカチオン界面活性剤を含むことができる。
[0137]アニオン交換クロマトグラフィーのための洗浄及び溶出のための典型的な平衡緩衝液及び溶液は、約pH7.5~pH12、より典型的には約pH8.0~pH10、さらにより典型的には約pH8.0~pH9.0、例えば、pH8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9又は9.0のpHで適当である。
[0138]アニオン交換カラムのための洗浄及び溶出のために適当な平衡緩衝液及び溶液は、一般的に性質はカチオン性又は双性イオン性である。そのような緩衝液には、以下の緩衝剤:N-メチルピペラジン;ピペラジン;ビス-トリス;ビス-トリスプロパン;トリエタノールアミン;トリス;N-メチルジエタノールアミン;1,3-ジアミノプロパン;エタノールアミン;酢酸等を有する緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。試料を溶出させるために、出発時の緩衝液のイオン強度を、NaCl、KCl、硫酸塩、ギ酸塩又は酢酸塩などの塩を使用して増大させる。洗浄及び溶出のためのそのような平衡緩衝液及び溶液は、約5~100mM、より典型的には約10~50mMの前述の緩衝剤を有することができる。
[0139]一実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、最初に平衡化され、試料を適用され、低い塩濃度、例えば、50~150mMのNaCl、例えば、50~60、60~70、70~80、80~90、90~100、100~100mM、又はこれらの範囲若しくはその範囲内における任意の濃度で洗浄される。第1の洗浄に続いて、クロマトグラフィー媒体を、AAVの空のカプシドなどの不純物を溶出させるためにより高い塩濃度で、例えば、より高いNaCl濃度で、又はより強いイオン強度の別の緩衝液で処理することもできる。第2の緩衝液として使用するための一例は、約110mM~125mMのNaCl濃度、又は上述の範囲若しくはその範囲内の任意の濃度を有するトリスに基づく緩衝液である。
[0140]追加の不純物がカラムから溶出された後、AAV粒子は、より高い濃度の塩を用いる溶出により回収することができる。溶出緩衝液のための一例は、125mM以上のNaCl濃度、例えば、125~150mM、150~200mM又は200~250MMのNaCl、又はこれらの上述の範囲若しくはその範囲内の任意の濃度を有するトリスに基づく緩衝液である。
[0141]アニオン交換クロマトグラフィー媒体の洗浄溶液には、ポリエチレングリコール(PEG)が含まれることがある。これは、ポリエチレングリコール(PEG)調整カラムクロマトグラフィーと称される。PEG洗浄溶液は、AAVベクター粒子の溶出の前に、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に適用することができる。
[0142]典型的には、そのような洗浄溶液中のPEGは、両端を含めて約1,000~80,000g/molの範囲の平均分子量を有する。そのような洗浄溶液中のPEGの典型的な量は、約0.1%~約20%のPEGの範囲若しくは上述の範囲若しくはその範囲内の任意の量、又は約1%~約10%のPEG若しくは上述の範囲若しくはその範囲内における任意の量である。
[0143]サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)媒体は、標準的緩衝液を使用して、メーカーの仕様に従って平衡化することができる。例えば、クロマトグラフィー媒体は、例えば、約1~5mM、5~50mM、又は5~25mMのリン酸緩衝液、及び、例えば、約50~100mM、100~150mM、150~200mM、200~250mM、250~300mM、若しくは300~400mM、又はこれらの上述の範囲若しくはその範囲内の任意の量のNaClで平衡化することができる。
[0144]平衡化後、次に、試料をロードする。その後、rAAV粒子を含有する通過画分が回収される。緩衝液(例えば、リン酸緩衝液)の追加の体積を、クロマトグラフィー媒体の量及び/又はカラムサイズに基づいて、rAAV粒子回収のために加えることができる。
[0145]特定の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー媒体は、両端を含めて約10,000~600,000の間の分離範囲(分子量)を有する。サイズ排除クロマトグラフィーのために適当な特定の樹脂(媒体)には、多孔質セルロースの粒子又はビーズ、架橋されたアガロース(セファロース(Sepharose)、GE Healthcare、Marlborough、マサチューセッツ州)、架橋されたデキストラン(セファデックス(Sephadex)、GE Healthcare、Marlborough、マサチューセッツ州)、スチレン-ジビニルベンゼン(ディアノン(Dianon) HP-20)、ポリアクリルアミド(バイオゲル(Bio Gel))、メタクリル系(トヨパール(Toyopearl))、及び制御された細孔ガラスが含まれるが、これらに限定されない。
[0146]親和性カラムは、基質に連結された又はコンジュゲートされたリガンドで典型的には構成される。リガンドの特定の例には、AAVと結合する抗体が含まれる。そのような基質は、セファロース及びそのような親和性精製の用途で典型的に使用される他の材料を含み、作製することができるか又は市販されている(例えば、AVBセファロース(Sepharose)(商標)High Performance、GE healthcare、Marlborough、マサチューセッツ州)。
[0147]親和性カラムのための適当な平衡緩衝液並びに洗浄及び溶出のための溶液は、典型的にはトリス又は酢酸塩に基づく。例えば、親和性クロマトグラフィー媒体は、例えば、約1~5mM、5~50mM、又は5~20mMのトリス緩衝液、及び、例えば、約50~100mM、100~150mM、150~200mM、200~250mM、250~300mM、又はこれらの上述の範囲若しくはその範囲内の任意の量のNaClで平衡化することができる。
[0148]親和性クロマトグラフィーのための典型的な平衡緩衝液は、約pH7.5~pH9.0、より典型的には約pH8.0~pH8.5のpH、及びさらにより典型的にはpH8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、又は8.5などのpHである。
[0149]平衡化後、次に試料をロードする。その後、rAAV粒子は、緩衝液のpHを7.0未満に低下させることにより、親和性カラムから溶出される。溶出緩衝液は、酢酸塩に基づくことができて、典型的にはpHは、5.0未満、より典型的には4.0未満、例えば3.0未満、より詳細には約2.0~3.0の間、又はこれらの上述の範囲又は範囲内の任意のpHである。
[0150]平衡化、洗浄及び溶出のための緩衝液の体積は、rAAV粒子回収を達成するためのクロマトグラフィー媒体の量及び/又はカラムサイズに基づくことができる。典型的な体積はカラムの体積の1~10倍である。
[0151]カラム溶出物は、クロマトグラフィーステップの各々からの溶出(複数可)/通過の後に捕集される。AAVは、260及び280nmにおけるUV吸収のモニタリングなどの標準的技法を使用して分画中で検出することができる。
[0152]カチオン又はアニオン交換クロマトグラフィー媒体の使用、使用される媒体(即ち強又は弱イオン交換体)の性質並びに塩濃度、使用される緩衝液、及びpHの条件は、AAVカプシド(即ちAAVカプシドの血清型又は偽型)に基づいて変わり得る。AAVカプシドの構造は、典型的には、サイズ及び形状などの特徴を共有するが、カプシドは、異なるアミノ酸配列を有することができて、その結果、分子トポロジー及び表面電荷分布の微妙な差が生ずる。したがって、カプシドの配列変異体は、本発明の方法により精製することに適応すると期待され、関係する方法は、rAAV粒子精製のためのAAVカプシド変異体のために、異なる条件が使用されるかを決定するために、クロマトグラフィー媒体及び緩衝液スクリーニングの研究を使用して、系統的様式で決定することができる。
[0153]本明細書で記載された、カチオン交換、アニオン交換、サイズ排除、及び/又は親和性クロマトグラフィーステップのいずれかからのrAAV粒子を含む溶出物は、所望であれば、限外濾過/透析濾過により効率的に濃縮することができる。体積の減少は当業者により制御され得る。特定の非限定的な例では、達成される体積の減少は、両端を含めて約1~30分の1の間である。したがって、1分の1の減少は体積を半分減少させ、例えば、1000mlが500mLに濃縮される。10分の1の減少は、体積を10の倍率で減少させ、例えば、2000mlが200mLに濃縮される。20分の1の減少は、体積を20の倍率で減少させ、例えば、2000mlが100mLに濃縮される。30分の1の減少は、体積を30の倍率で減少させ、例えば、2000mlが66.67mLに濃縮される。
[0154]限外濾過/透析濾過の非限定的な例は、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)である。例えば、100kDaの分子量カットオフに対応する名目細孔サイズを有する中空繊維膜であり、それにより、大量のAAVベクターがより大きい体積の溶出物中に存在する場合に調製が可能である。
[0155]本明細書で記載された、カチオン交換、アニオン交換、サイズ排除、又は親和性クロマトグラフィーステップのいずれかからのrAAV粒子を含む細胞溶解物及びカラム溶出物は、所望であれば、希釈することができる。典型的な希釈は、25~100%、1~2倍、2~5倍の範囲、又はこれらの上述の範囲又は範囲内の体積若しくは量である。
[0156]本発明の方法によりrAAV粒子の実質的回収が達成される。例えば、本発明の方法により、回収された宿主細胞及び宿主細胞培養上清からの全rAAVベクター粒子の約40~70%のrAAV粒子の回収が達成される。別の例では、rAAV粒子は、最終の(例えば、第3のカラムの)溶出物中に約100mg/mLの濃度で存在する。rAAVベクター粒子は、最終の(例えば、第3のカラムの)溶出物中に、1mL当たり約1010~1011粒子以上、1mL当たり約1011~1012粒子、1mL当たり1012~1013粒子の濃度で存在し得る。
[0157]或いは、rAAVベクター粒子濃度がより低い場合、精製されたrAAV粒子を濃縮することができる。例えば、精製されたAAV粒子を、限外濾過/透析濾過(例えば、TFF)により濃縮することができる。より高い濃度のベクターが所望される場合、精製されたAAV粒子を、限外濾過/透析濾過(例えば、TFF)により、1mL当たり1012~1013粒子以上に、1mL当たり1013~1014粒子以上に、又はさらに高く濃縮することができる。
[0158]他の実施形態では、パッケージングされたゲノムを有するrAAV粒子(即ち、真のrAAVベクター粒子)は、存在するビリオンの少なくとも約30%以上がパッケージングされたゲノムを有するrAAV粒子(即ち、真のrAAVベクター粒子)である場合、AAVカプシド形成された核酸不純物を「実質的に踏まない」。AAVカプシド形成された核酸不純物を実質的に含まない、パッケージングされたゲノムを有するrAAV粒子(即ち、真のrAAVベクター粒子)の産生は、AAVカプシド形成された核酸不純物を含む生成物の約40%~約20%又はそれ未満、約20%~約10%若しくはそれ未満、約10%~約5%若しくはそれ未満、約5%~約1%若しくはそれ未満、又はそれ未満であり得る。
[0159]導入遺伝子を含有するAAVベクターの感染性力価を決定する方法は、当技術分野において公知である(例えば、Zhenら、(2004)Hum.Gene Ther.(2004)15:709を参照されたい)。空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを有するAAVベクター粒子をアッセイするための方法は公知である(例えば、Grimmら、Gene Therapy(1999)6:1322~1330;Sommerら、Molec.Ther.(2003)7:122~128を参照されたい)。
[0160]分解された/変性されたカプシドの存在又は量を決定するために、精製されたAAVを、3種のカプシドタンパク質を分離できる任意のゲル、例えば、勾配ゲルからなるSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供して、次に試料が分離されるまでゲルを作動させて、ゲルをナイロン又はニトロセルロース膜上にブロッティングすることができる。次に、抗AAVカプシド抗体を、変性されたカプシドタンパク質に結合する1次抗体として使用する(例えば、Wobusら、J.Virol.(2000)74:9281~9293を参照されたい)。1次抗体に結合する2次抗体は、1次抗体を検出するための手段を含有する。1次と2次抗体との間の結合が、半定量的に検出されてカプシドの量が決定される。別の方法は、SECカラムを備えた分析HPLC又は分析超遠心分離であり得る。
[0161]特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解される同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様な又は等価の方法及び材料が、本発明の実行又は試験で使用され得るが、適当な方法及び材料が本明細書に記載されている。
[0162]本明細書に挙げた全ての特許出願、出版物、特許及び他の参考文献、GenBankの引用及びATCCの引用は、参照によりそれらの全体で組み込まれる。相容れない場合には、定義を含む本明細書が優先する。
[0163]本明細書で開示された特徴の全ては、任意の組合せで組み合わされてもよい。本明細書で開示された各特徴は、同じ、等価の、又は同様な目的に役立つ代替的特徴により置き換えることもできる。したがって、別段明確に述べられていない限り、開示された特徴(例えば、核酸配列、ベクター、rAAVベクター等)は、等価の又は同様な特徴の部類の例である。
[0164]本明細書において使用する、単数形「ある(a)」、「ある(an)」、及び「その(the)」は、文脈上別段明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「あるAAVベクター」、又は「AAV粒子」への言及は、複数のそのようなAAVベクター及びAAV粒子を含み、「ある細胞(a cell)」又は「宿主細胞(host cell)」への言及は、複数の細胞及び宿主細胞を含む。
[0165]本明細書において使用する用語「約」は、基準値の10%(プラス又はマイナス)以内にある値を意味する。
[0166]本明細書において使用する、全て数値又は数の範囲は、前後関係で他のように明確に示されない限り、そのような範囲内の整数及び範囲内の値の端数又は整数を含む。したがって、例示すると、80%以上の同一性への言及は、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%等、並びに81.1%、81.2%、81.3%、81.4%、81.5%等、82.1%、82.2%、82.3%、82.4%、82.5%等を含む。
[0167]超又は未満を伴う整数への言及は、言及された数を超えるか又は未満の任意の数をそれぞれ含む。したがって、例えば、100未満への言及は、99、98、97等、ずっと下がって数1までの全てを含み;10未満は、9、8、7等、ずっと下がって数1までの全てを含む。
[0168]本明細書において使用する、全て数値又は範囲は包括的である。さらに、全ての数値又は範囲は、文脈上別段明確に示されていない限り、そのような範囲内の値の端数及び整数、並びにそのような範囲内の整数の端数を含む。したがって、例示すると、1~10などの数の範囲への言及は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、並びに1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等を含む。それゆえに、1~50の範囲への言及は、50を含め50までを含み、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等、並びに1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等(以下同様)を含む。
[0169]一連の範囲への言及は、その一連の範囲内の異なる範囲の境界の値を組み合わせる範囲を含む。したがって、例示すると、一連の範囲、例えば、1~10、10~20、20~30、30~40、40~50、50~60、60~75、75~100、100~150、150~200、200~250、250~300、300~400、400~500、500~750、750~1,000、1,000~1,500、1,500~2,000、2,000~2,500、2,500~3,000、3,000~3,500、3,500~4,000、4,000~4,500、4,500~5,000、5,500~6,000、6,000~7,000、7,000~8,000、又は8,000~9,000への言及は、10~50、50~100、100~1,000、1,000~3,000、2,000~4,000等の範囲を含む。
[0170]本発明は、本明細書で肯定的言語を使用して一般的に開示され、多数の実施形態及び態様が説明されている。本発明は、物質若しくは材料、方法ステップ及び条件、プロトコール、又は手順などの特定の対象事物が全部又は一部除外される実施形態も特定して含む。例えば、本発明のある実施形態又は態様では、材料及び/又は方法ステップが除外される。したがって、本発明が含まないことに関して、たとえ本発明が本明細書で一般的に表現されていなくても、それにも拘わらず、本発明で明白に除外されていない態様が、本明細書で開示されている。
[0171]本発明の幾つかの実施形態が記載されている。それにも拘わらず、当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更及び改変を行って、本発明を種々の用途及び条件に適合させることができる。したがって、以下の例は、例示することを意図するが、特許請求された本発明の範囲を限定することは意図しない。
実施例1
例示的な第1のカラム、カチオン交換又は親和性
1.1. カチオン、Poros50 HS(又はThermoFisherからのPoros XS)。前提条件、平衡化、ロード材料、洗浄及び溶出
1.1.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.1.1.1. 緩衝液、pH、導電性
a) 前提条件:注射用水
b) 3×希釈緩衝液:60mMリン酸Na、pH7.3
c) 平衡緩衝液:20mMリン酸Na、pH7.3、100mM NaCl
d) 洗浄緩衝液1及び3:20mMリン酸Na、pH7.3、100mM NaCl
e) 洗浄緩衝液2:20mMリン酸Na、pH7.3、100mM NaCl、界面活性剤(5mM)、例えばサルコシル
f) 溶出緩衝液:20mMリン酸Na、pH7.3、300mM NaCl(300mMを超えることができる、例えば300~400、例えば400mM NaCl)。
g) 溶出緩衝液の体積(例えば、所定であるピーク前体積の後の溶出物を捕集する)又はO.D.A280の増大、例えば、ベースラインO.D.A280の1mAuの増大のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
h) カラムストリッピング溶液:高塩、例えば、1M NaCl
i) 殺菌溶液:1M NaCl、1N NaOH
j) 貯蔵溶液:約22.5%エタノール(例えば18~22.5%)
1.1.2. 例示的なカラム準備
1.1.2.1. 前提条件ダウンフロー(4CV)WFI
1.1.2.2. 平衡化ダウンフロー(4CV)平衡緩衝液
1.1.3. 例示的な精製
1.1.3.1. ロード材料ダウンフロー(25CV)試料
1.1.3.2. 洗浄1ダウンフロー(4CV)洗浄1の緩衝液
1.1.3.3. 洗浄2ダウンフロー(6CV)洗浄2の緩衝液
1.1.3.4. 洗浄3ダウンフロー(8CV)洗浄3の緩衝液
1.1.4. 規模により決定される例示的なブロック(洗浄)体積(複数可)、カラムサイズ
1.1.5. 結合容量:2.5~3×ローディング(Poros50 HS)、UF(限外濾過)/DF(透析濾過)あり又はなし。
1.1.6. 例示的な流速:150cm/h~300cm/h
1.1.7. ロード容量:10L以上
1.1.8. 予想される回収:60~90%
1.2. 親和性、AVB-セファロースHP
1.2.1. 緩衝液のリスト
1.2.1.1. 緩衝液(pH、導電性)各ブロック体積
1.2.1.2. 例示的な緩衝液/溶液
a) 平衡緩衝液:20mMトリス、pH8.0、250mM NaCl
b) 溶出緩衝液:10mM 酢酸Na、pH2.5、250mM NaCl
c) 中和緩衝液:1MトリスCl、pH10.5
d) 消毒溶液:PAB(120mMリン酸、167mM酢酸、2.2%ベンジルアルコール)
e) 貯蔵溶液:約22.5%エタノール(18~22.5%)
1.2.2. 例示的な流速:約150cm/h以上
1.2.3. 予想される回収:70~90%(AAVビリオンカプシド)、15~70%(ベクターゲノム)
例示的な第1のカラム、カチオン交換又は親和性
1.1. カチオン、Poros50 HS(又はThermoFisherからのPoros XS)。前提条件、平衡化、ロード材料、洗浄及び溶出
1.1.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.1.1.1. 緩衝液、pH、導電性
a) 前提条件:注射用水
b) 3×希釈緩衝液:60mMリン酸Na、pH7.3
c) 平衡緩衝液:20mMリン酸Na、pH7.3、100mM NaCl
d) 洗浄緩衝液1及び3:20mMリン酸Na、pH7.3、100mM NaCl
e) 洗浄緩衝液2:20mMリン酸Na、pH7.3、100mM NaCl、界面活性剤(5mM)、例えばサルコシル
f) 溶出緩衝液:20mMリン酸Na、pH7.3、300mM NaCl(300mMを超えることができる、例えば300~400、例えば400mM NaCl)。
g) 溶出緩衝液の体積(例えば、所定であるピーク前体積の後の溶出物を捕集する)又はO.D.A280の増大、例えば、ベースラインO.D.A280の1mAuの増大のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
h) カラムストリッピング溶液:高塩、例えば、1M NaCl
i) 殺菌溶液:1M NaCl、1N NaOH
j) 貯蔵溶液:約22.5%エタノール(例えば18~22.5%)
1.1.2. 例示的なカラム準備
1.1.2.1. 前提条件ダウンフロー(4CV)WFI
1.1.2.2. 平衡化ダウンフロー(4CV)平衡緩衝液
1.1.3. 例示的な精製
1.1.3.1. ロード材料ダウンフロー(25CV)試料
1.1.3.2. 洗浄1ダウンフロー(4CV)洗浄1の緩衝液
1.1.3.3. 洗浄2ダウンフロー(6CV)洗浄2の緩衝液
1.1.3.4. 洗浄3ダウンフロー(8CV)洗浄3の緩衝液
1.1.4. 規模により決定される例示的なブロック(洗浄)体積(複数可)、カラムサイズ
1.1.5. 結合容量:2.5~3×ローディング(Poros50 HS)、UF(限外濾過)/DF(透析濾過)あり又はなし。
1.1.6. 例示的な流速:150cm/h~300cm/h
1.1.7. ロード容量:10L以上
1.1.8. 予想される回収:60~90%
1.2. 親和性、AVB-セファロースHP
1.2.1. 緩衝液のリスト
1.2.1.1. 緩衝液(pH、導電性)各ブロック体積
1.2.1.2. 例示的な緩衝液/溶液
a) 平衡緩衝液:20mMトリス、pH8.0、250mM NaCl
b) 溶出緩衝液:10mM 酢酸Na、pH2.5、250mM NaCl
c) 中和緩衝液:1MトリスCl、pH10.5
d) 消毒溶液:PAB(120mMリン酸、167mM酢酸、2.2%ベンジルアルコール)
e) 貯蔵溶液:約22.5%エタノール(18~22.5%)
1.2.2. 例示的な流速:約150cm/h以上
1.2.3. 予想される回収:70~90%(AAVビリオンカプシド)、15~70%(ベクターゲノム)
実施例2
例示的な第2のカラム、アニオン交換又はサイズ排除
1.3. アニオン、Poros 50HQ(ThermoFisherからのPoros XQ)。前提条件、平衡化、ロード材料、洗浄及び溶出:二重機能のために使用される(さらなる精製及び空/中実ベクター比制御)
1.3.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.3.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 3×(又は4×)希釈緩衝液:約60mM(又は約80mM)トリス、pH8.5(例えば、希釈後、ローディング材料は10~50mMトリスの範囲であり、pH8.0~8.5、100mM NaCl)
c) 平衡緩衝液(及び洗浄1の緩衝液):20mMトリス、pH8.5、100mM NaCl
d) 洗浄2の緩衝液(AAVの空のカプシド除去のため):20mMトリス、pH8.5、115mM NaCl
e) 溶出緩衝液:20mMトリス、pH8.5、NaCl≧120mM、例えば、200mM NaCl
f) カラムストリッピング緩衝液:1M NaCl
g) 消毒溶液:1N NaOH
h) 貯蔵溶液:約22.5%エタノール(例えば18~22.5%)
1.3.2. 例示的な分カラム準備
1.3.2.1. 前提条件ダウンフロー(5CV)WFI
1.3.2.2. 平衡化ダウンフロー(4CV)平衡緩衝液
1.3.3. 例示的な精製
1.3.3.1. ロード材料ダウンフロー(50CV)CEX溶出物及び希釈物
1.3.3.2. 洗浄1ダウンフロー(5CV)平衡緩衝液
1.3.3.3. 溶出1(空のカプシド除去)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液1
1.3.3.4. 溶出2(中実AAVベクター回収)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液2
1.3.4. 例示的な流速:150cm/h~300cm/h
1.4. サイズ排除、SEC(例えば、Superdex 200分取規格 GE healthcareから)、任意選択
1.4.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.4.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 平衡洗浄及び溶出緩衝液:10mMリン酸Na、pH7.2、150~300mM NaCl(より高いNaCl、例えば、300mMがAAVベクター(vg)の回収を改善するはずである。
c) 溶出緩衝液の体積(例えば、所定であるピーク前体積の後の溶出物を捕集する)又はO.D.A280の増大、例えば、ベースラインO.D.A280の1mAuの増大のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
d) 消毒溶液:0.5N NaOH
e) 貯蔵溶液:22.5%エタノール(例えば18~22.5%)
1.4.2. 例示的な分カラム準備
1.4.2.1. 前提条件ダウンフロー(2CV)WFI
1.4.2.2. 平衡化ダウンフロー(2CV)平衡緩衝液(PBS300)
1.4.3. 例示的な精製
1.4.3.1. ロード材料ダウンフロー(0.05CV)
1.4.3.2. 溶出ダウンフロー(1.5CV)平衡緩衝液(dPBS)
1.4.4. 例示的なローディング容量:カラム体積の≦5%
1.4.5. 例示的な流速:45cm/h
1.4.6. 溶出緩衝液の体積又はO.D.A280のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
例示的な第2のカラム、アニオン交換又はサイズ排除
1.3. アニオン、Poros 50HQ(ThermoFisherからのPoros XQ)。前提条件、平衡化、ロード材料、洗浄及び溶出:二重機能のために使用される(さらなる精製及び空/中実ベクター比制御)
1.3.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.3.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 3×(又は4×)希釈緩衝液:約60mM(又は約80mM)トリス、pH8.5(例えば、希釈後、ローディング材料は10~50mMトリスの範囲であり、pH8.0~8.5、100mM NaCl)
c) 平衡緩衝液(及び洗浄1の緩衝液):20mMトリス、pH8.5、100mM NaCl
d) 洗浄2の緩衝液(AAVの空のカプシド除去のため):20mMトリス、pH8.5、115mM NaCl
e) 溶出緩衝液:20mMトリス、pH8.5、NaCl≧120mM、例えば、200mM NaCl
f) カラムストリッピング緩衝液:1M NaCl
g) 消毒溶液:1N NaOH
h) 貯蔵溶液:約22.5%エタノール(例えば18~22.5%)
1.3.2. 例示的な分カラム準備
1.3.2.1. 前提条件ダウンフロー(5CV)WFI
1.3.2.2. 平衡化ダウンフロー(4CV)平衡緩衝液
1.3.3. 例示的な精製
1.3.3.1. ロード材料ダウンフロー(50CV)CEX溶出物及び希釈物
1.3.3.2. 洗浄1ダウンフロー(5CV)平衡緩衝液
1.3.3.3. 溶出1(空のカプシド除去)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液1
1.3.3.4. 溶出2(中実AAVベクター回収)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液2
1.3.4. 例示的な流速:150cm/h~300cm/h
1.4. サイズ排除、SEC(例えば、Superdex 200分取規格 GE healthcareから)、任意選択
1.4.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.4.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 平衡洗浄及び溶出緩衝液:10mMリン酸Na、pH7.2、150~300mM NaCl(より高いNaCl、例えば、300mMがAAVベクター(vg)の回収を改善するはずである。
c) 溶出緩衝液の体積(例えば、所定であるピーク前体積の後の溶出物を捕集する)又はO.D.A280の増大、例えば、ベースラインO.D.A280の1mAuの増大のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
d) 消毒溶液:0.5N NaOH
e) 貯蔵溶液:22.5%エタノール(例えば18~22.5%)
1.4.2. 例示的な分カラム準備
1.4.2.1. 前提条件ダウンフロー(2CV)WFI
1.4.2.2. 平衡化ダウンフロー(2CV)平衡緩衝液(PBS300)
1.4.3. 例示的な精製
1.4.3.1. ロード材料ダウンフロー(0.05CV)
1.4.3.2. 溶出ダウンフロー(1.5CV)平衡緩衝液(dPBS)
1.4.4. 例示的なローディング容量:カラム体積の≦5%
1.4.5. 例示的な流速:45cm/h
1.4.6. 溶出緩衝液の体積又はO.D.A280のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
実施例3
例示的な第3のカラム、サイズ排除又はアニオン交換。第3のカラムは、任意選択であり、親和性カラム(例えば、AVB-セファロースHP)が第1のカラムである場合には必要とされないこともある。使用される第3のカラムは使用される第2のカラムにも基づく(SEC>HQ、又はHQ>SEC等)。
1.5. サイズ排除、SEC(例えば、Superdex 200分取規格 GE healthcareから)、任意選択
1.5.1. 例示的な緩衝液リスト
1.5.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 平衡及びランニング緩衝液:10mM Na-P、pH7.2、150~300mM NaCl(より高いNaCl、例えば、300mMがAAVベクター(vg)の回収を改善するはずである。
c) 溶出緩衝液の体積(例えば、所定であるピーク前体積の後の溶出物を捕集する)又はO.D.A280の増大、例えば、ベースラインO.D.A280の1mAuの増大のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
d) 消毒溶液:0.5N NaOH
e) 貯蔵溶液:22.5%エタノール
1.5.2. 例示的なカラム準備
1.5.2.1. 前提条件ダウンフロー(2CV)WFI
1.5.2.2. 平衡化ダウンフロー(2CV)平衡緩衝液(PBS300)
1.5.3. 例示的な精製
1.5.3.1. ロード材料ダウンフロー(0.05CV)
1.5.3.2. 溶出ダウンフロー(1.5CV)平衡緩衝液(dPBS)
1.5.4. 例示的なローディング容量:カラム体積の≦5%
1.5.5. 例示的な流速:45cm/h
1.5.6. 溶出緩衝液の体積又はO.D.A280のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
1.6. 二重機能(さらなるrAAV精製及び空/中実rAAVベクター比制御)のための、アニオン、Poros 50HQ(ThermoFisherからのPoros XQ)。前提条件、平衡化、ロード材料、洗浄及び溶出
1.6.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.6.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 3×(又は4×)希釈緩衝液:60mM(又は80mM)トリス、pH8.5(例えば、希釈後、ローディング材料は、10~50mMトリスの範囲であり、pH8.0~8.5、100mM NaCl)
c) 平衡緩衝液(及び洗浄1の緩衝液):20mMトリス、pH8.5、100mM NaCl
d) 洗浄2の緩衝液(AAVの空のカプシド除去のため):20mMトリス、pH8.5、115mM NaCl
e) 溶出緩衝液:20mMトリス、pH8.5、NaCl≧120mM、例えば、200mM NaCl
f) カラムストリッピング緩衝液:1M NaCl
g) 消毒溶液:1N NaOH
h) 貯蔵溶液:22.5%エタノール(例えば18~22.5%)
1.6.2. 例示的なカラム準備
1.6.2.1. 前提条件ダウンフロー(5CV)WFI
1.6.2.2. 平衡化ダウンフロー(4CV)平衡緩衝液
1.6.3. 例示的な精製
1.6.3.1. ロード材料ダウンフロー(50CV)CEX溶出物及び希釈物
1.6.3.2. 洗浄1ダウンフロー(5CV)平衡緩衝液
1.6.3.3. 溶出1(空のカプシド除去)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液1
1.6.3.4. 溶出2(中実AAVベクター回収)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液2
1.6.4. 例示的な流速:150cm/h~300cm/h
例示的な第3のカラム、サイズ排除又はアニオン交換。第3のカラムは、任意選択であり、親和性カラム(例えば、AVB-セファロースHP)が第1のカラムである場合には必要とされないこともある。使用される第3のカラムは使用される第2のカラムにも基づく(SEC>HQ、又はHQ>SEC等)。
1.5. サイズ排除、SEC(例えば、Superdex 200分取規格 GE healthcareから)、任意選択
1.5.1. 例示的な緩衝液リスト
1.5.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 平衡及びランニング緩衝液:10mM Na-P、pH7.2、150~300mM NaCl(より高いNaCl、例えば、300mMがAAVベクター(vg)の回収を改善するはずである。
c) 溶出緩衝液の体積(例えば、所定であるピーク前体積の後の溶出物を捕集する)又はO.D.A280の増大、例えば、ベースラインO.D.A280の1mAuの増大のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
d) 消毒溶液:0.5N NaOH
e) 貯蔵溶液:22.5%エタノール
1.5.2. 例示的なカラム準備
1.5.2.1. 前提条件ダウンフロー(2CV)WFI
1.5.2.2. 平衡化ダウンフロー(2CV)平衡緩衝液(PBS300)
1.5.3. 例示的な精製
1.5.3.1. ロード材料ダウンフロー(0.05CV)
1.5.3.2. 溶出ダウンフロー(1.5CV)平衡緩衝液(dPBS)
1.5.4. 例示的なローディング容量:カラム体積の≦5%
1.5.5. 例示的な流速:45cm/h
1.5.6. 溶出緩衝液の体積又はO.D.A280のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
1.6. 二重機能(さらなるrAAV精製及び空/中実rAAVベクター比制御)のための、アニオン、Poros 50HQ(ThermoFisherからのPoros XQ)。前提条件、平衡化、ロード材料、洗浄及び溶出
1.6.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.6.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 3×(又は4×)希釈緩衝液:60mM(又は80mM)トリス、pH8.5(例えば、希釈後、ローディング材料は、10~50mMトリスの範囲であり、pH8.0~8.5、100mM NaCl)
c) 平衡緩衝液(及び洗浄1の緩衝液):20mMトリス、pH8.5、100mM NaCl
d) 洗浄2の緩衝液(AAVの空のカプシド除去のため):20mMトリス、pH8.5、115mM NaCl
e) 溶出緩衝液:20mMトリス、pH8.5、NaCl≧120mM、例えば、200mM NaCl
f) カラムストリッピング緩衝液:1M NaCl
g) 消毒溶液:1N NaOH
h) 貯蔵溶液:22.5%エタノール(例えば18~22.5%)
1.6.2. 例示的なカラム準備
1.6.2.1. 前提条件ダウンフロー(5CV)WFI
1.6.2.2. 平衡化ダウンフロー(4CV)平衡緩衝液
1.6.3. 例示的な精製
1.6.3.1. ロード材料ダウンフロー(50CV)CEX溶出物及び希釈物
1.6.3.2. 洗浄1ダウンフロー(5CV)平衡緩衝液
1.6.3.3. 溶出1(空のカプシド除去)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液1
1.6.3.4. 溶出2(中実AAVベクター回収)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液2
1.6.4. 例示的な流速:150cm/h~300cm/h
実施例4
カラム精製の前の例示的な細胞溶解及び調製。
1. 細胞溶解、化学的又は物理的
1.1 例示的な化学的溶解方法
1.6.5. トリトンX-100又は等価な非イオン性界面活性剤
i. 最終濃度、0.1%~1%
ii. インキュベーション時間、1時間まで
iii. インペラーの撹拌速度は、典型的には約400~600rpm(以上)である
iv. インキュベーション温度は約25~37℃(例えば、37℃)である
1.6.6. ベンゾナーゼ
i. 最終濃度、≧50U/mL、例えば、100U/mL
ii. 処理は、界面活性剤と同時又は逐次的であることができる。
iii. MgCl2濃度は1.0~5.0mM(例えば、2mM)である
1.1.3. 濾過ステップ中又は後にAAVベクターを回収するために役立つ追加の塩
II. NaClの最終濃度は、200~400mM(例えば、300mM)である
III. NaCl、NaClに対する他の塩等価物も使用することができる
1.7. 例示的な物理的溶解方法(微小流動化、均質化等)
1.7.1. 作業条件(より大きい体積にスケールアップすることができる10Lの付着細胞の培養に基づく)
i. 圧≦約5,000psi
ii. 温度、約18~25℃
1.7.2. 前処理済み及び追跡緩衝液
i. 緩衝液、pH、導電性
全て第1のカラムローディング条件に依存する;大部分の場合、DF緩衝液は、同じか又は第1のカラムで平衡化のために使用された等価の緩衝液である。HSが第1のカラムである場合、PBSは共通の緩衝液であり得る)
ベンゾナーゼ処理のために、pH及び導電性の両方がベンゾナーゼの加工条件の範囲内であるべきである(例えば、約pH6.5~8.5、導電性>15mS/cm)。DNA消化のための典型的なベンゾナーゼ量は100~200U/mLである。2mM MgCl2が適当な消化のために加えられるべきである。
ii. 体積:前処理済み体積は系の残留液体積より大きい必要がある(ほとんどの場合、残留液体積の3倍)。
:追跡体積は試料体積の5~10%である。
2. タンジェンシャルフロー濾過(TFF、別称UF/DF)、任意選択
2.1. 中空繊維カートリッジを備えるTFF
2.1.1. 10L細胞培養の場合
i. TFFは、細胞溶解前に実行される。
ii. 10Lのためには、GE中空繊維カートリッジUFP-100-C-9A(1.2m2)などのフィルター
iii. 容量。予備データは20Lが同じUFP-100-C-9A中空繊維カートリッジで作動するはずであることを示す。
iv. 細胞溶解前又は細胞溶解後のTFF。細胞溶解前のTFR
v. 最大圧。TMP。細胞溶解前の場合≧5psig(細胞溶解後の場合5~10psi)
vi. 前処理又は追跡のための緩衝液。(カチオンHSの場合)第1のカラムとして、20mMリン酸緩衝液、pH7~7.5/100~150mM NaClが妥当な緩衝液であり、(アニオンHQ)の場合、第1のカラムとして、20mMトリス、pH7.5~8.5/100~150mM NaClが適当な緩衝液である。
2.1.2. SECカラム前、精製されたAAVベクターの中間体を濃縮するための限外濾過の場合
i. アニオン交換(Poros 50 HQ)溶出物をSECカラム体積の約5%に濃縮するためのTFF
ii. 材料:Poros 50HQ溶出物0.75カラム体積
iii. 配置:中空繊維UFP-C-100-4MA(10Lの出発体積の場合)
iv. フラッシング体積(残留液体積):約45mL
v. 平衡緩衝液:PBS300(10mM Na-P、pH7.2/300mM NaCl)
vi. 消毒緩衝液:1N NaOH
vii. 付着細胞培養と同じ条件が適用可能。
viii. TFFは、細胞溶解前でも細胞溶解後でも実施することができる。
2.1.3. 最終製剤化及び分子量の小さい可能な不純物の除去のためのTFF
i. 材料:Poros50 HQ溶出物(又はSECベクターピーク)
ii. 配置:中空繊維UFP-C-100-4MA(10Lの出発体積の場合)
iii. フラッシング体積(残留液体積):約45mL
iv. 平衡緩衝液:PBS180(10mM Na-P、pH7.3/180mM NaCl)
v. 透析濾過緩衝液:PBS180(10mM Na-P、pH7.3/180mM NaCl)
vi. 消毒緩衝液:1N NaOH
vii. 標的濃度:1.0E+13vg/mL
viii. 透析濾過:UF標的体積の12倍の体積(5.0E12vg/mL)
2.2. 渦巻き型膜モジュール又は平坦なプレートモジュールのいずれかを備える交互タンジェンシャルフロー(ATF)又はTFFが中空繊維カートリッジを備えるTFFの代替物である
3. 清澄化及び濾過
3.1. デプスフィルター
i. フィルター選択肢は、Clarisolve 20MS(0.5~20μM)、Sartoclear DLシリーズ(10~1μM)又はMillistak C0HC若しくはD0HC(0.65~8μM)を含む
ii. 容量は1L/25cm2であり得る。
iii. 最大流速、約250mL/分/25cm2(10mL/分/cm2)
iv. 最大作業圧 約32psig
v. 調整緩衝液 約PBS300が適当であり得る
vi. 濾過ステップの数(1又は2、粗次に精密フィルター):可能性として単一ステップ:粗フィルター
3.2. Millipore SHC(0.5/0.2μM)又はSartopore 2(0.45/0.2μM、Sartorius)
i. 容量 約500mL/500cm2(0.2%トリトンX-100が少し役立つ、10~20%増大)
ii. 最大流速 約1000mL/分/500cm2(2mL/分/cm2)
iii. 最大作業圧 約35psig
iv. 調整緩衝液ための例はPBS300である
v. 最終ステップ 容量は限定され得る(約55maxi Sartopore 2(1.8m2)が必要とされる);これが第2の濾過ステップである場合、容量は増大され得る
3.3. 例示的な10L規模の付着細胞培養の場合
i. Sartopore 2 MaxiCaps(1.2m2)が10L培養体積のために使用され得る
ii. この同じフィルターを20L培養体積で使用することができる。
iii. 前処理及び追跡緩衝液の導電性は、AAVベクターと膜との間の可能な相互作用を防止するために約15~30mS/cmであり得る。
カラム精製の前の例示的な細胞溶解及び調製。
1. 細胞溶解、化学的又は物理的
1.1 例示的な化学的溶解方法
1.6.5. トリトンX-100又は等価な非イオン性界面活性剤
i. 最終濃度、0.1%~1%
ii. インキュベーション時間、1時間まで
iii. インペラーの撹拌速度は、典型的には約400~600rpm(以上)である
iv. インキュベーション温度は約25~37℃(例えば、37℃)である
1.6.6. ベンゾナーゼ
i. 最終濃度、≧50U/mL、例えば、100U/mL
ii. 処理は、界面活性剤と同時又は逐次的であることができる。
iii. MgCl2濃度は1.0~5.0mM(例えば、2mM)である
1.1.3. 濾過ステップ中又は後にAAVベクターを回収するために役立つ追加の塩
II. NaClの最終濃度は、200~400mM(例えば、300mM)である
III. NaCl、NaClに対する他の塩等価物も使用することができる
1.7. 例示的な物理的溶解方法(微小流動化、均質化等)
1.7.1. 作業条件(より大きい体積にスケールアップすることができる10Lの付着細胞の培養に基づく)
i. 圧≦約5,000psi
ii. 温度、約18~25℃
1.7.2. 前処理済み及び追跡緩衝液
i. 緩衝液、pH、導電性
全て第1のカラムローディング条件に依存する;大部分の場合、DF緩衝液は、同じか又は第1のカラムで平衡化のために使用された等価の緩衝液である。HSが第1のカラムである場合、PBSは共通の緩衝液であり得る)
ベンゾナーゼ処理のために、pH及び導電性の両方がベンゾナーゼの加工条件の範囲内であるべきである(例えば、約pH6.5~8.5、導電性>15mS/cm)。DNA消化のための典型的なベンゾナーゼ量は100~200U/mLである。2mM MgCl2が適当な消化のために加えられるべきである。
ii. 体積:前処理済み体積は系の残留液体積より大きい必要がある(ほとんどの場合、残留液体積の3倍)。
:追跡体積は試料体積の5~10%である。
2. タンジェンシャルフロー濾過(TFF、別称UF/DF)、任意選択
2.1. 中空繊維カートリッジを備えるTFF
2.1.1. 10L細胞培養の場合
i. TFFは、細胞溶解前に実行される。
ii. 10Lのためには、GE中空繊維カートリッジUFP-100-C-9A(1.2m2)などのフィルター
iii. 容量。予備データは20Lが同じUFP-100-C-9A中空繊維カートリッジで作動するはずであることを示す。
iv. 細胞溶解前又は細胞溶解後のTFF。細胞溶解前のTFR
v. 最大圧。TMP。細胞溶解前の場合≧5psig(細胞溶解後の場合5~10psi)
vi. 前処理又は追跡のための緩衝液。(カチオンHSの場合)第1のカラムとして、20mMリン酸緩衝液、pH7~7.5/100~150mM NaClが妥当な緩衝液であり、(アニオンHQ)の場合、第1のカラムとして、20mMトリス、pH7.5~8.5/100~150mM NaClが適当な緩衝液である。
2.1.2. SECカラム前、精製されたAAVベクターの中間体を濃縮するための限外濾過の場合
i. アニオン交換(Poros 50 HQ)溶出物をSECカラム体積の約5%に濃縮するためのTFF
ii. 材料:Poros 50HQ溶出物0.75カラム体積
iii. 配置:中空繊維UFP-C-100-4MA(10Lの出発体積の場合)
iv. フラッシング体積(残留液体積):約45mL
v. 平衡緩衝液:PBS300(10mM Na-P、pH7.2/300mM NaCl)
vi. 消毒緩衝液:1N NaOH
vii. 付着細胞培養と同じ条件が適用可能。
viii. TFFは、細胞溶解前でも細胞溶解後でも実施することができる。
2.1.3. 最終製剤化及び分子量の小さい可能な不純物の除去のためのTFF
i. 材料:Poros50 HQ溶出物(又はSECベクターピーク)
ii. 配置:中空繊維UFP-C-100-4MA(10Lの出発体積の場合)
iii. フラッシング体積(残留液体積):約45mL
iv. 平衡緩衝液:PBS180(10mM Na-P、pH7.3/180mM NaCl)
v. 透析濾過緩衝液:PBS180(10mM Na-P、pH7.3/180mM NaCl)
vi. 消毒緩衝液:1N NaOH
vii. 標的濃度:1.0E+13vg/mL
viii. 透析濾過:UF標的体積の12倍の体積(5.0E12vg/mL)
2.2. 渦巻き型膜モジュール又は平坦なプレートモジュールのいずれかを備える交互タンジェンシャルフロー(ATF)又はTFFが中空繊維カートリッジを備えるTFFの代替物である
3. 清澄化及び濾過
3.1. デプスフィルター
i. フィルター選択肢は、Clarisolve 20MS(0.5~20μM)、Sartoclear DLシリーズ(10~1μM)又はMillistak C0HC若しくはD0HC(0.65~8μM)を含む
ii. 容量は1L/25cm2であり得る。
iii. 最大流速、約250mL/分/25cm2(10mL/分/cm2)
iv. 最大作業圧 約32psig
v. 調整緩衝液 約PBS300が適当であり得る
vi. 濾過ステップの数(1又は2、粗次に精密フィルター):可能性として単一ステップ:粗フィルター
3.2. Millipore SHC(0.5/0.2μM)又はSartopore 2(0.45/0.2μM、Sartorius)
i. 容量 約500mL/500cm2(0.2%トリトンX-100が少し役立つ、10~20%増大)
ii. 最大流速 約1000mL/分/500cm2(2mL/分/cm2)
iii. 最大作業圧 約35psig
iv. 調整緩衝液ための例はPBS300である
v. 最終ステップ 容量は限定され得る(約55maxi Sartopore 2(1.8m2)が必要とされる);これが第2の濾過ステップである場合、容量は増大され得る
3.3. 例示的な10L規模の付着細胞培養の場合
i. Sartopore 2 MaxiCaps(1.2m2)が10L培養体積のために使用され得る
ii. この同じフィルターを20L培養体積で使用することができる。
iii. 前処理及び追跡緩衝液の導電性は、AAVベクターと膜との間の可能な相互作用を防止するために約15~30mS/cmであり得る。
実施例5
1.0 500~600mlのrAAV回収物体積のために開発されたプロセスに基づく1.2L及びより大きい体積のrAAVベクター製造のための望ましい開発基準
1.1 1.2Lバイオリアクター懸濁培養から回収されたrAAVベクター(例えばLK03-FVIII)
1.2 1.2Lバイオリアクター懸濁培養からのrAAVベクターの精製
1.0 500~600mlのrAAV回収物体積のために開発されたプロセスに基づく1.2L及びより大きい体積のrAAVベクター製造のための望ましい開発基準
1.1 1.2Lバイオリアクター懸濁培養から回収されたrAAVベクター(例えばLK03-FVIII)
1.2 1.2Lバイオリアクター懸濁培養からのrAAVベクターの精製
実施例6
2.0 1.2Lバイオリアクター懸濁培養からのrAAVベクターの回収物(例えばLK03-FVIII)
2.1 プロセス流れ図
2.1.1 以下は、rAAVベクターの下流プロセスの回収部分についての例示的なプロセス流れ図である。
2.2 プロセスの流れの説明
2.2.1 以下は、rAAVベクターの下流プロセスの回収部分についての例示的なプロセスの流れの説明である:
2.3 回収作業プロセスの開発研究中に変化したパラメーター
2.3.1 以下のパラメーターが、rAAVベクターの下流プロセスの回収部分の開発について評価される:
2.0 1.2Lバイオリアクター懸濁培養からのrAAVベクターの回収物(例えばLK03-FVIII)
2.1 プロセス流れ図
2.1.1 以下は、rAAVベクターの下流プロセスの回収部分についての例示的なプロセス流れ図である。
2.2 プロセスの流れの説明
2.2.1 以下は、rAAVベクターの下流プロセスの回収部分についての例示的なプロセスの流れの説明である:
2.3 回収作業プロセスの開発研究中に変化したパラメーター
2.3.1 以下のパラメーターが、rAAVベクターの下流プロセスの回収部分の開発について評価される:
実施例7
本明細書で開示されるように、溶解方法、カラム数及びカラムのタイプは、種々の順序で選択して使用することができる。
4.0 1.2Lバイオリアクター懸濁培養のためのクロマトグラフィープロセス
4.1 rAAVベクター(例えばLK03-FVIII)クロマトグラフィープロセスの開発研究中に変化したパラメーター
4.1.1 以下の選択肢が、rAAVベクターの下流プロセスのクロマトグラフィー部分のために開発される:
4.2 例示的な非限定的カラム精製順序(A~E):
A) 第1のカラム、カチオン(Poros 50HS)→第2のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)
B) 第1のカラム、カチオン(Poros 50HS)→第2のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)→第3のカラム、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)、
C) 第1のカラム、カチオン(Poros 50HS)→第2のカラム、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)→第3のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)
D) 第1のカラム、親和性(AVBセファロースHP)→第2のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)→第3のカラム(任意選択)、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)
E) 第1のカラム、親和性(AVBセファロースHP)→第2のカラム、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)→第3のカラム(任意選択)、アニオン(例えば、Poros 50HQ)
本明細書で開示されるように、溶解方法、カラム数及びカラムのタイプは、種々の順序で選択して使用することができる。
4.0 1.2Lバイオリアクター懸濁培養のためのクロマトグラフィープロセス
4.1 rAAVベクター(例えばLK03-FVIII)クロマトグラフィープロセスの開発研究中に変化したパラメーター
4.1.1 以下の選択肢が、rAAVベクターの下流プロセスのクロマトグラフィー部分のために開発される:
4.2 例示的な非限定的カラム精製順序(A~E):
A) 第1のカラム、カチオン(Poros 50HS)→第2のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)
B) 第1のカラム、カチオン(Poros 50HS)→第2のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)→第3のカラム、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)、
C) 第1のカラム、カチオン(Poros 50HS)→第2のカラム、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)→第3のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)
D) 第1のカラム、親和性(AVBセファロースHP)→第2のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)→第3のカラム(任意選択)、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)
E) 第1のカラム、親和性(AVBセファロースHP)→第2のカラム、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)→第3のカラム(任意選択)、アニオン(例えば、Poros 50HQ)
実施例8
代表的なAAVカプシド(VP1)タンパク質。
AAV-SPK VP1カプシド(配列番号1)
1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLD
61 KGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ
121AKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDS
181ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV
241ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ
301RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA
361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFED
421VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW
481LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSS
541GVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNS
601QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP
661PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTE
721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL
AAV-LK03 VP1カプシド(配列番号2)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
代表的なAAVカプシド(VP1)タンパク質。
AAV-SPK VP1カプシド(配列番号1)
1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLD
61 KGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ
121AKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDS
181ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV
241ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ
301RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA
361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFED
421VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW
481LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSS
541GVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNS
601QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP
661PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTE
721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL
AAV-LK03 VP1カプシド(配列番号2)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
[0171]本発明は、以下の態様であってもよい。
1.
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して、前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記濃縮された第2のカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物又は前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。
2.
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を濃縮して、濃縮されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記濃縮されたカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を希釈して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記希釈された第2のカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を希釈して、希釈された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物又は前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。
3.
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記濃縮された第2のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。
4.
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって:
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で核酸が減少した前記溶解物、又はステップ(e)で製造された清澄化された溶解物若しくは希釈され清澄化された溶解物を、AAV親和性カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)任意選択でステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記濃縮された第2のカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物若しくは前記希釈された第2のカラム溶出物を濾過するか、又はステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物若しくは前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。
5.
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、又はステップ(e)で製造された清澄化された溶解物若しくは希釈され清澄化された溶解物を、AAV親和性カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を濃縮して、濃縮されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記濃縮されたカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を希釈して、希釈された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)任意選択でステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記希釈された第2のカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を希釈して、希釈された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物若しくは前記希釈された第2のカラム溶出物を濾過するか、又はステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物若しくは前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。
6.
ステップ(b)及び/又はステップ(f)及び/又はステップ(g)及び/又はステップ(h)の前記濃縮が、限外濾過/透析濾過により、任意選択でタンジェンシャルフロー濾過(TFF)による、項目1~5のいずれか一項に記載の方法。
7.
ステップ(b)の前記濃縮が、前記回収された細胞及び細胞培養上清の体積を約2~20分の1に減少させる、項目1~6のいずれか一項に記載の方法。
8.
ステップ(f)及び/又はステップ(g)及び/又はステップ(h)の前記濃縮が、前記カラム溶出物の体積を約5~20分の1に減少させる、項目1~7のいずれか一項に記載の方法。
9.
前記ステップ(a)で製造された回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物の前記溶解が、物理的又は化学的手段による、項目1~8のいずれか一項に記載の方法。
10.
前記物理的手段が、微小流動化又は均質化を含む、項目9に記載の方法。
11.
前記化学的手段が、洗浄剤、任意選択で非イオン性洗浄剤、例えば、トリトンX-100を、任意選択で両端を含めて約0.1~1.0%の間の濃度で含む、項目9に記載の方法。
12.
ステップ(d)が、ヌクレアーゼで処理して、それにより混入核酸を減少させることを含む、項目1~11のいずれか一項に記載の方法。
13.
前記ヌクレアーゼがベンゾナーゼを含む、項目12に記載の方法。
14.
ステップ(e)の前記清澄化された溶解物又は前記希釈され清澄化された溶解物の前記濾過が、両端を含めて約0.1~10.0ミクロンの間の細孔直径を有するフィルターによる、項目1~13のいずれか一項に記載の方法。
15.
ステップ(e)の前記清澄化された溶解物の前記希釈が、リン酸緩衝水溶液、酢酸塩緩衝水溶液又はトリス緩衝水溶液による、項目1~14のいずれか一項に記載の方法。
16.
ステップ(f)の前記カラム溶出物又はステップ(g)の前記第2のカラム溶出物の前記希釈が、リン酸緩衝水溶液、酢酸塩緩衝水溶液又はトリス緩衝水溶液による、項目1~15のいずれか一項に記載の方法。
17.
前記リン酸緩衝水溶液又は酢酸塩緩衝水溶液が、両端を含めて約4.0~7.4の間のpHを有する、項目15又は16に記載の方法。
18.
前記トリス緩衝水溶液が、7.5を超える、任意選択で両端を含めて約8.0~9.0の間のpHを有する、項目15又は16に記載の方法。
19.
ステップ(i)から生じた前記rAAVベクター粒子が、界面活性剤を用いて製剤化されて、AAVベクター製剤が製造される、項目1~18のいずれか一項に記載の方法。
20.
ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムクロマトグラフィーが、ポリエチレングリコール(PEG)調整カラムクロマトグラフィーを含む、項目1~19のいずれか一項に記載の方法。
21.
ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムクロマトグラフィーが、前記rAAVベクター粒子の前記カラムからの溶出の前に、前記カラムをPEG溶液で洗浄することを含む、項目20に記載の方法。
22.
前記PEGが、両端を含めて約1,000~80,000g/molの範囲の平均分子量を有する、項目20又は21に記載の方法。
23.
前記PEGが、両端を含めて約4%~約10%の濃度である、項目20~22のいずれか一項に記載の方法。
24.
ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、前記rAAVベクター粒子の前記カラムからの溶出の前に、前記カラムを界面活性剤水溶液で洗浄することを含む、項目1~23のいずれか一項に記載の方法。
25.
ステップ(f)の前記カチオン交換カラムが、前記rAAVベクター粒子の前記カラムからの溶出の前に、前記カラムを界面活性剤溶液で洗浄することを含む、項目1~24のいずれか一項に記載の方法。
26.
前記PEG溶液及び/又は前記界面活性剤溶液が、トリスCl/NaCl緩衝水溶液、リン酸/NaCl緩衝水溶液、又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液を含む、項目21~25のいずれか一項に記載の方法。
27.
前記NaCl緩衝液が、両端を含めて約20~300mMの間のNaCl、又は両端を含めて約50~250mMの間のNaClの範囲を含む、項目26に記載の方法。
28.
前記界面活性剤が、カチオン又はアニオン界面活性剤を含む、項目24~26のいずれか一項に記載の方法。
29.
前記界面活性剤が、炭素12個の鎖を有する界面活性剤を含む、項目24~28のいずれか一項に記載の方法。
30.
前記界面活性剤が、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド(DTAC)又はサルコシルを含む、項目24~29のいずれか一項に記載の方法。
31.
前記rAAVベクター粒子が、ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムから、トリスCl/NaCl緩衝水溶液で溶出される、項目1~30のいずれか一項に記載の方法。
32.
前記トリスCl/NaCl緩衝液が、両端を含めて100~400mM NaClを含み、任意選択で両端を含めて約7.5~約9.0の範囲のpHである、項目31に記載の方法。
33.
ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、トリスCl/NaCl緩衝水溶液で洗浄される、項目1~32のいずれか一項に記載の方法。
34.
前記トリスCl/NaCl緩衝水溶液中の前記NaClが、両端を含めて約75~125mM NaClの範囲である、項目33に記載の方法。
35.
前記トリスCl/NaCl緩衝水溶液が、両端を含めて約7.5~約9.0のpHである、項目31~33のいずれか一項に記載の方法。
36.
ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、1回又は複数回洗浄されて、第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を減少させる、項目1~39のいずれか一項に記載の方法。
37.
前記アニオン交換カラムの洗浄が、カラムから、rAAV除去の前に、及び/又はrAAVの代わりに、AAVの空のカプシドを除去して、それにより第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を減少させる、項目33又は36に記載の方法。
38.
前記アニオン交換カラムの洗浄が、カラムから、rAAV除去の前に、及び/又はrAAVの代わりに、全AAVの空のカプシドの少なくとも約50%を除去して、それにより第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を約50%減少させる、項目33又は36に記載の方法。
39.
前記トリスCl/NaCl緩衝水溶液中の前記NaClが、両端を含めて約110~120mM NaClの範囲である、項目33、又は36~38のいずれか一項に記載の方法。
40.
前記溶出されたrAAVベクター粒子及びAAVの空のカプシドの比及び/又は量が、前記洗浄緩衝液により制御される、項目33~40のいずれか一項に記載の方法。
41.
前記rAAVベクター粒子が、ステップ(f)の前記カチオン交換カラムからリン酸/NaCl緩衝水溶液又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液に溶出される、項目1~41のいずれか一項に記載の方法。
42.
前記リン酸/NaCl緩衝液又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液が、両端を含めて約125~500mM NaClの範囲である、項目41に記載の方法。
43.
前記リン酸/NaCl緩衝液又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液が、両端を含めて約5.5~約7.5の範囲のpHを有する、項目41に記載の方法。
44.
ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、四級化されたポリエチレンイミンなどの第四級アンモニウム官能基を含む、項目1~43のいずれか一項に記載の方法。
45.
ステップ(g)及び/又は(h)の前記サイズ排除カラム(SEC)が、両端を含めて約10,000~約600,000の分離/分画範囲(分子量)を有する、項目1~44のいずれか一項に記載の方法。
46.
ステップ(f)の前記カチオン交換カラムが、スルホン酸又はスルホプロピルなどの官能基を含む、項目1~45のいずれか一項に記載の方法。
47.
前記AAV親和性カラムが、AAVのカプシドタンパク質に結合するタンパク質又はリガンドを含む、項目3~46のいずれか一項に記載の方法。
48.
前記タンパク質が、AAVのカプシドタンパク質に結合する抗体を含む、項目47に記載の方法。
49.
AAVのカプシドタンパク質に結合する前記抗体が、ラマ(ラクダ科の動物)の単鎖抗体を含む、項目48に記載の方法。
50.
塩化セシウム勾配超遠心分離のステップが除外される、項目1~49のいずれか一項に記載の方法。
51.
前記rAAVベクター粒子が、siRNA、アンチセンス分子、miRNA、リボザイム及びshRNAからなる群から選択される核酸をコードする導入遺伝子を含む、項目1~50のいずれか一項に記載の方法。
52.
前記rAAVベクター粒子が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン(hCG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織成長因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング成長因子α(TGFα)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子I及びII(IGF-I及びIGF-II)、TGFβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質(BMP)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィンNT-3及びNT4/5、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、アグリン、ネトリン-1及びネトリン-2、肝細胞成長因子(HGF)、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物をコードする導入遺伝子を含む、項目1~50のいずれか一項に記載の方法。
53.
前記rAAVベクター粒子が、トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン(IL1~IL-17)、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、flk-2/flt3リガンド、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、単鎖T細胞受容体、クラスI及びクラスIIのMHC分子からなる群から選択される遺伝子生成物をコードする導入遺伝子を含む、項目1~50のいずれか一項に記載の方法。
54.
前記rAAVベクター粒子が、カルバモイルシンテターゼI、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ-1アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第V因子、第VIII因子、第IX因子、シスタチオンベータ-シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-coAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ-グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、RPE65、H-タンパク質、T-タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子(CFTR)配列、及びジストロフィンcDNA配列からなる群から選択される先天性代謝異常の修正に有用なタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、項目1~50のいずれか一項に記載の方法。
55.
前記rAAVベクター粒子が、第VIII因子又は第IX因子をコードする導入遺伝子を含む、項目1~54のいずれか一項に記載の方法。
56.
ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物から全rAAVベクター粒子の約50~90%を回収する、項目1~55のいずれか一項に記載の方法。
57.
1回のAAV親和性カラム精製により製造又は精製されたrAAVベクター粒子よりも高い純度を有するrAAVベクター粒子を製造する、項目1~56のいずれか一項に記載の方法。
58.
ステップ(c)及び(d)が、実質的に同時に実施される、項目1~57のいずれか一項に記載の方法。
59.
ステップ(c)の後であるがステップ(f)の前に、NaClが、両端を含めて約100~400mM NaClの範囲、又は両端を含めて約140~300mM NaClの範囲であるように調節される、項目1~58のいずれか一項に記載の方法。
60.
前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10及びRh74からなる群から選択されるAAVから誘導される、項目1~59のいずれか一項に記載の方法。
61.
前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、Rh74、配列番号1又は配列番号2のカプシド配列と70%以上の同一性を有するカプシド配列を含む、項目1~60のいずれか一項に記載の方法。
62.
前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、又はRh74のITR配列と70%以上の同一性を有するITR配列を含む、項目1~61のいずれか一項に記載の方法。
63.
前記細胞が、懸濁又は付着の細胞を含む、項目1~62のいずれか一項に記載の方法。
64.
前記細胞が、哺乳動物の細胞を含む、項目1~63のいずれか一項に記載の方法。
65.
前記細胞が、HEK-293細胞を含む、項目1~64のいずれか一項に記載の方法。
66.
実施例1~3のいずれかに記載の、任意の1つ又は複数のカラム、条件、濃度、モル濃度、体積、容量、流速、圧、材料、温度、pH、又はステップによって実施される、項目1~65のいずれか一項に記載の方法。
67.
カラム精製の前の前記細胞溶解及び/又は調製が、実施例4に記載の任意の1つ又は複数の条件、濃度、モル濃度、体積、容量、流速、圧、材料、温度、pH、又はステップによって実施される、項目1~66のいずれか一項に記載の方法。
1.
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して、前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記濃縮された第2のカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物又は前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。
2.
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を濃縮して、濃縮されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記濃縮されたカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を希釈して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記希釈された第2のカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を希釈して、希釈された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物又は前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。
3.
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記濃縮された第2のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。
4.
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって:
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で核酸が減少した前記溶解物、又はステップ(e)で製造された清澄化された溶解物若しくは希釈され清澄化された溶解物を、AAV親和性カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)任意選択でステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記濃縮された第2のカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物若しくは前記希釈された第2のカラム溶出物を濾過するか、又はステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物若しくは前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。
5.
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、又はステップ(e)で製造された清澄化された溶解物若しくは希釈され清澄化された溶解物を、AAV親和性カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を濃縮して、濃縮されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記濃縮されたカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を希釈して、希釈された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)任意選択でステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記希釈された第2のカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を希釈して、希釈された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物若しくは前記希釈された第2のカラム溶出物を濾過するか、又はステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物若しくは前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。
6.
ステップ(b)及び/又はステップ(f)及び/又はステップ(g)及び/又はステップ(h)の前記濃縮が、限外濾過/透析濾過により、任意選択でタンジェンシャルフロー濾過(TFF)による、項目1~5のいずれか一項に記載の方法。
7.
ステップ(b)の前記濃縮が、前記回収された細胞及び細胞培養上清の体積を約2~20分の1に減少させる、項目1~6のいずれか一項に記載の方法。
8.
ステップ(f)及び/又はステップ(g)及び/又はステップ(h)の前記濃縮が、前記カラム溶出物の体積を約5~20分の1に減少させる、項目1~7のいずれか一項に記載の方法。
9.
前記ステップ(a)で製造された回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物の前記溶解が、物理的又は化学的手段による、項目1~8のいずれか一項に記載の方法。
10.
前記物理的手段が、微小流動化又は均質化を含む、項目9に記載の方法。
11.
前記化学的手段が、洗浄剤、任意選択で非イオン性洗浄剤、例えば、トリトンX-100を、任意選択で両端を含めて約0.1~1.0%の間の濃度で含む、項目9に記載の方法。
12.
ステップ(d)が、ヌクレアーゼで処理して、それにより混入核酸を減少させることを含む、項目1~11のいずれか一項に記載の方法。
13.
前記ヌクレアーゼがベンゾナーゼを含む、項目12に記載の方法。
14.
ステップ(e)の前記清澄化された溶解物又は前記希釈され清澄化された溶解物の前記濾過が、両端を含めて約0.1~10.0ミクロンの間の細孔直径を有するフィルターによる、項目1~13のいずれか一項に記載の方法。
15.
ステップ(e)の前記清澄化された溶解物の前記希釈が、リン酸緩衝水溶液、酢酸塩緩衝水溶液又はトリス緩衝水溶液による、項目1~14のいずれか一項に記載の方法。
16.
ステップ(f)の前記カラム溶出物又はステップ(g)の前記第2のカラム溶出物の前記希釈が、リン酸緩衝水溶液、酢酸塩緩衝水溶液又はトリス緩衝水溶液による、項目1~15のいずれか一項に記載の方法。
17.
前記リン酸緩衝水溶液又は酢酸塩緩衝水溶液が、両端を含めて約4.0~7.4の間のpHを有する、項目15又は16に記載の方法。
18.
前記トリス緩衝水溶液が、7.5を超える、任意選択で両端を含めて約8.0~9.0の間のpHを有する、項目15又は16に記載の方法。
19.
ステップ(i)から生じた前記rAAVベクター粒子が、界面活性剤を用いて製剤化されて、AAVベクター製剤が製造される、項目1~18のいずれか一項に記載の方法。
20.
ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムクロマトグラフィーが、ポリエチレングリコール(PEG)調整カラムクロマトグラフィーを含む、項目1~19のいずれか一項に記載の方法。
21.
ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムクロマトグラフィーが、前記rAAVベクター粒子の前記カラムからの溶出の前に、前記カラムをPEG溶液で洗浄することを含む、項目20に記載の方法。
22.
前記PEGが、両端を含めて約1,000~80,000g/molの範囲の平均分子量を有する、項目20又は21に記載の方法。
23.
前記PEGが、両端を含めて約4%~約10%の濃度である、項目20~22のいずれか一項に記載の方法。
24.
ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、前記rAAVベクター粒子の前記カラムからの溶出の前に、前記カラムを界面活性剤水溶液で洗浄することを含む、項目1~23のいずれか一項に記載の方法。
25.
ステップ(f)の前記カチオン交換カラムが、前記rAAVベクター粒子の前記カラムからの溶出の前に、前記カラムを界面活性剤溶液で洗浄することを含む、項目1~24のいずれか一項に記載の方法。
26.
前記PEG溶液及び/又は前記界面活性剤溶液が、トリスCl/NaCl緩衝水溶液、リン酸/NaCl緩衝水溶液、又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液を含む、項目21~25のいずれか一項に記載の方法。
27.
前記NaCl緩衝液が、両端を含めて約20~300mMの間のNaCl、又は両端を含めて約50~250mMの間のNaClの範囲を含む、項目26に記載の方法。
28.
前記界面活性剤が、カチオン又はアニオン界面活性剤を含む、項目24~26のいずれか一項に記載の方法。
29.
前記界面活性剤が、炭素12個の鎖を有する界面活性剤を含む、項目24~28のいずれか一項に記載の方法。
30.
前記界面活性剤が、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド(DTAC)又はサルコシルを含む、項目24~29のいずれか一項に記載の方法。
31.
前記rAAVベクター粒子が、ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムから、トリスCl/NaCl緩衝水溶液で溶出される、項目1~30のいずれか一項に記載の方法。
32.
前記トリスCl/NaCl緩衝液が、両端を含めて100~400mM NaClを含み、任意選択で両端を含めて約7.5~約9.0の範囲のpHである、項目31に記載の方法。
33.
ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、トリスCl/NaCl緩衝水溶液で洗浄される、項目1~32のいずれか一項に記載の方法。
34.
前記トリスCl/NaCl緩衝水溶液中の前記NaClが、両端を含めて約75~125mM NaClの範囲である、項目33に記載の方法。
35.
前記トリスCl/NaCl緩衝水溶液が、両端を含めて約7.5~約9.0のpHである、項目31~33のいずれか一項に記載の方法。
36.
ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、1回又は複数回洗浄されて、第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を減少させる、項目1~39のいずれか一項に記載の方法。
37.
前記アニオン交換カラムの洗浄が、カラムから、rAAV除去の前に、及び/又はrAAVの代わりに、AAVの空のカプシドを除去して、それにより第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を減少させる、項目33又は36に記載の方法。
38.
前記アニオン交換カラムの洗浄が、カラムから、rAAV除去の前に、及び/又はrAAVの代わりに、全AAVの空のカプシドの少なくとも約50%を除去して、それにより第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を約50%減少させる、項目33又は36に記載の方法。
39.
前記トリスCl/NaCl緩衝水溶液中の前記NaClが、両端を含めて約110~120mM NaClの範囲である、項目33、又は36~38のいずれか一項に記載の方法。
40.
前記溶出されたrAAVベクター粒子及びAAVの空のカプシドの比及び/又は量が、前記洗浄緩衝液により制御される、項目33~40のいずれか一項に記載の方法。
41.
前記rAAVベクター粒子が、ステップ(f)の前記カチオン交換カラムからリン酸/NaCl緩衝水溶液又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液に溶出される、項目1~41のいずれか一項に記載の方法。
42.
前記リン酸/NaCl緩衝液又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液が、両端を含めて約125~500mM NaClの範囲である、項目41に記載の方法。
43.
前記リン酸/NaCl緩衝液又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液が、両端を含めて約5.5~約7.5の範囲のpHを有する、項目41に記載の方法。
44.
ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、四級化されたポリエチレンイミンなどの第四級アンモニウム官能基を含む、項目1~43のいずれか一項に記載の方法。
45.
ステップ(g)及び/又は(h)の前記サイズ排除カラム(SEC)が、両端を含めて約10,000~約600,000の分離/分画範囲(分子量)を有する、項目1~44のいずれか一項に記載の方法。
46.
ステップ(f)の前記カチオン交換カラムが、スルホン酸又はスルホプロピルなどの官能基を含む、項目1~45のいずれか一項に記載の方法。
47.
前記AAV親和性カラムが、AAVのカプシドタンパク質に結合するタンパク質又はリガンドを含む、項目3~46のいずれか一項に記載の方法。
48.
前記タンパク質が、AAVのカプシドタンパク質に結合する抗体を含む、項目47に記載の方法。
49.
AAVのカプシドタンパク質に結合する前記抗体が、ラマ(ラクダ科の動物)の単鎖抗体を含む、項目48に記載の方法。
50.
塩化セシウム勾配超遠心分離のステップが除外される、項目1~49のいずれか一項に記載の方法。
51.
前記rAAVベクター粒子が、siRNA、アンチセンス分子、miRNA、リボザイム及びshRNAからなる群から選択される核酸をコードする導入遺伝子を含む、項目1~50のいずれか一項に記載の方法。
52.
前記rAAVベクター粒子が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン(hCG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織成長因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング成長因子α(TGFα)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子I及びII(IGF-I及びIGF-II)、TGFβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質(BMP)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィンNT-3及びNT4/5、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、アグリン、ネトリン-1及びネトリン-2、肝細胞成長因子(HGF)、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物をコードする導入遺伝子を含む、項目1~50のいずれか一項に記載の方法。
53.
前記rAAVベクター粒子が、トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン(IL1~IL-17)、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、flk-2/flt3リガンド、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、単鎖T細胞受容体、クラスI及びクラスIIのMHC分子からなる群から選択される遺伝子生成物をコードする導入遺伝子を含む、項目1~50のいずれか一項に記載の方法。
54.
前記rAAVベクター粒子が、カルバモイルシンテターゼI、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ-1アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第V因子、第VIII因子、第IX因子、シスタチオンベータ-シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-coAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ-グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、RPE65、H-タンパク質、T-タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子(CFTR)配列、及びジストロフィンcDNA配列からなる群から選択される先天性代謝異常の修正に有用なタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、項目1~50のいずれか一項に記載の方法。
55.
前記rAAVベクター粒子が、第VIII因子又は第IX因子をコードする導入遺伝子を含む、項目1~54のいずれか一項に記載の方法。
56.
ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物から全rAAVベクター粒子の約50~90%を回収する、項目1~55のいずれか一項に記載の方法。
57.
1回のAAV親和性カラム精製により製造又は精製されたrAAVベクター粒子よりも高い純度を有するrAAVベクター粒子を製造する、項目1~56のいずれか一項に記載の方法。
58.
ステップ(c)及び(d)が、実質的に同時に実施される、項目1~57のいずれか一項に記載の方法。
59.
ステップ(c)の後であるがステップ(f)の前に、NaClが、両端を含めて約100~400mM NaClの範囲、又は両端を含めて約140~300mM NaClの範囲であるように調節される、項目1~58のいずれか一項に記載の方法。
60.
前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10及びRh74からなる群から選択されるAAVから誘導される、項目1~59のいずれか一項に記載の方法。
61.
前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、Rh74、配列番号1又は配列番号2のカプシド配列と70%以上の同一性を有するカプシド配列を含む、項目1~60のいずれか一項に記載の方法。
62.
前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、又はRh74のITR配列と70%以上の同一性を有するITR配列を含む、項目1~61のいずれか一項に記載の方法。
63.
前記細胞が、懸濁又は付着の細胞を含む、項目1~62のいずれか一項に記載の方法。
64.
前記細胞が、哺乳動物の細胞を含む、項目1~63のいずれか一項に記載の方法。
65.
前記細胞が、HEK-293細胞を含む、項目1~64のいずれか一項に記載の方法。
66.
実施例1~3のいずれかに記載の、任意の1つ又は複数のカラム、条件、濃度、モル濃度、体積、容量、流速、圧、材料、温度、pH、又はステップによって実施される、項目1~65のいずれか一項に記載の方法。
67.
カラム精製の前の前記細胞溶解及び/又は調製が、実施例4に記載の任意の1つ又は複数の条件、濃度、モル濃度、体積、容量、流速、圧、材料、温度、pH、又はステップによって実施される、項目1~66のいずれか一項に記載の方法。
[関連出願]
[0001]本特許出願は、2017年6月30日出願の米国特許出願第62/527,633号;2017年7月12日出願の米国特許出願第62/531,744号;及び2017年10月4日出願の米国特許出願第62/567,905号の利益を主張する。前述の出願の全内容は、本文、表、図面及び配列の全てを含めて参照により本明細書に組み込まれる。
[0001]本特許出願は、2017年6月30日出願の米国特許出願第62/527,633号;2017年7月12日出願の米国特許出願第62/531,744号;及び2017年10月4日出願の米国特許出願第62/567,905号の利益を主張する。前述の出願の全内容は、本文、表、図面及び配列の全てを含めて参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (22)
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって:
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で核酸が減少した前記溶解物、又はステップ(e)で製造された清澄化された溶解物若しくは希釈され清澄化された溶解物を、AAV親和性カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)任意選択でステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記濃縮された第2のカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物若しくは前記希釈された第2のカラム溶出物を濾過するか、又はステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物若しくは前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。 - 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、又はステップ(e)で製造された清澄化された溶解物若しくは希釈され清澄化された溶解物を、AAV親和性カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を濃縮して、濃縮されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記濃縮されたカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を希釈して、希釈された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)任意選択でステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記希釈された第2のカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を希釈して、希釈された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物若しくは前記希釈された第2のカラム溶出物を濾過するか、又はステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物若しくは前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。 - ステップ(b)及び/又はステップ(f)及び/又はステップ(g)及び/又はステップ(h)の前記濃縮が、限外濾過/透析濾過により、又は任意選択でタンジェンシャルフロー濾過(TFF)による、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ステップ(a)で製造された回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物の前記溶解が、物理的又は化学的手段による、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記物理的手段が、微小流動化又は均質化を含む、請求項4に記載の方法。
- ステップ(e)の前記清澄化された溶解物の前記希釈が、リン酸緩衝水溶液、酢酸塩緩衝水溶液又はトリス緩衝水溶液による、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)の前記カラム溶出物又はステップ(g)の前記第2のカラム溶出物の前記希釈が、リン酸緩衝水溶液、酢酸塩緩衝水溶液又はトリス緩衝水溶液による、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(i)から生じた前記rAAVベクター粒子が、界面活性剤を用いて製剤化されて、AAVベクター製剤が製造される、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムクロマトグラフィーが、ポリエチレングリコール(PEG)調整カラムクロマトグラフィーを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムクロマトグラフィーが、前記rAAVベクター粒子の前記カラムからの溶出の前に、前記カラムをPEG溶液又は界面活性剤水溶液で洗浄することを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムから、トリスCl/NaCl緩衝水溶液で溶出される、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、トリスCl/NaCl緩衝水溶液で洗浄されるか、又は1回又は複数回洗浄されて、第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を減少させる、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、四級化されたポリエチレンイミンなどの第四級アンモニウム官能基を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)及び/又は(h)の前記サイズ排除カラム(SEC)が、両端を含めて約10,000~約600,000の分離/分画範囲(分子量)を有する、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV親和性カラムが、AAVのカプシドタンパク質に結合するタンパク質又はリガンドを含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 塩化セシウム勾配超遠心分離のステップが除外される、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、
siRNA、アンチセンス分子、miRNA、リボザイム及びshRNAからなる群から選択される核酸、又は、
インスリン、グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン(hCG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織成長因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング成長因子α(TGFα)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子I及びII(IGF-I及びIGF-II)、TGFβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質(BMP)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィンNT-3及びNT4/5、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、アグリン、ネトリン-1及びネトリン-2、肝細胞成長因子(HGF)、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物、又は、
トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン(IL1~IL-17)、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、flk-2/flt3リガンド、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、単鎖T細胞受容体、クラスI及びクラスIIのMHC分子からなる群から選択される遺伝子生成物、
をコードする導入遺伝子を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。 - 前記rAAVベクター粒子が、カルバモイルシンテターゼI、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ-1アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第V因子、第VIII因子、第IX因子、シスタチオンベータ-シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-coAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ-グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、RPE65、H-タンパク質、T-タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子(CFTR)配列、及びジストロフィンcDNA配列からなる群から選択される先天性代謝異常の修正に有用なタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物から全rAAVベクター粒子の約50~90%を回収する、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)及び(d)が、実質的に同時に実施される、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、Rh74、配列番号1又は配列番号2のカプシド配列と70%以上の同一性を有するカプシド配列を含むか、
又は、前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、又はRh74のITR配列と70%以上の同一性を有するITR配列を含む、
請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞が、懸濁又は付着の細胞、又は、哺乳動物の細胞、又はHEK-293細胞を含む、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762527633P | 2017-06-30 | 2017-06-30 | |
US62/527,633 | 2017-06-30 | ||
US201762531744P | 2017-07-12 | 2017-07-12 | |
US62/531,744 | 2017-07-12 | ||
US201762567905P | 2017-10-04 | 2017-10-04 | |
US62/567,905 | 2017-10-04 | ||
PCT/US2018/040430 WO2019006390A1 (en) | 2017-06-30 | 2018-06-29 | AAV VECTOR COLUMN PURIFICATION METHOD |
JP2019572175A JP2020526190A (ja) | 2017-06-30 | 2018-06-29 | Aavベクターのカラム精製方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019572175A Division JP2020526190A (ja) | 2017-06-30 | 2018-06-29 | Aavベクターのカラム精製方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023029832A true JP2023029832A (ja) | 2023-03-07 |
Family
ID=64742749
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019572175A Pending JP2020526190A (ja) | 2017-06-30 | 2018-06-29 | Aavベクターのカラム精製方法 |
JP2022177960A Pending JP2023029832A (ja) | 2017-06-30 | 2022-11-07 | Aavベクターのカラム精製方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019572175A Pending JP2020526190A (ja) | 2017-06-30 | 2018-06-29 | Aavベクターのカラム精製方法 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210079422A1 (ja) |
EP (1) | EP3658250A4 (ja) |
JP (2) | JP2020526190A (ja) |
CN (1) | CN111032176A (ja) |
AU (1) | AU2018291023B2 (ja) |
BR (1) | BR112019028299A2 (ja) |
CA (1) | CA3068622A1 (ja) |
CL (1) | CL2019003915A1 (ja) |
CO (1) | CO2020000911A2 (ja) |
IL (1) | IL271745A (ja) |
MX (1) | MX2020000216A (ja) |
PE (1) | PE20200737A1 (ja) |
PH (1) | PH12020500044A1 (ja) |
SG (1) | SG11201913157RA (ja) |
WO (1) | WO2019006390A1 (ja) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201508026D0 (en) | 2015-05-11 | 2015-06-24 | Ucl Business Plc | Capsid |
WO2020210600A1 (en) * | 2019-04-11 | 2020-10-15 | Regenxbio Inc. | Methods of size exclusion chromatography for the characterization of recombinant adeno-associated virus compositions |
EP3919613A1 (en) | 2020-06-05 | 2021-12-08 | Bia Separations D.O.O. | Enhanced purification of adeno-associated virus to more effectively remove contaminating dna |
CA3183557A1 (en) * | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Methods for the removal of free factor viii from preparations of lentiviral vectors modified to express said protein |
US20220033782A1 (en) * | 2020-07-29 | 2022-02-03 | Pall Corporation | Adenovirus-associated viruses separation method |
CA3197726A1 (en) | 2020-10-15 | 2022-04-21 | Simon Auslaender | Nucleic acid constructs for simultaneous gene activation |
MX2023004052A (es) | 2020-10-15 | 2023-05-03 | Hoffmann La Roche | Constructos de acido nucleico para transcripcion de arn asociado a un virus (arn va). |
JP2022182360A (ja) * | 2021-05-28 | 2022-12-08 | ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社 | 細胞外小胞の分離精製方法 |
JP2022182361A (ja) * | 2021-05-28 | 2022-12-08 | ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社 | 微小有用物質の分離精製方法と分離精製装置 |
EP4351755A1 (en) * | 2021-06-11 | 2024-04-17 | Spark Therapeutics, Inc. | Aav vector column purification methods |
WO2023053031A1 (en) * | 2021-09-28 | 2023-04-06 | Kashiv Biosciences, Llc | An improved process of purification of fusion protein |
CN114250222A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-03-29 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 一种从动物组织中提取aav dna的方法 |
GB202117844D0 (en) * | 2021-12-09 | 2022-01-26 | Oxford Biomedica Ltd | Purification method |
JP2023141423A (ja) * | 2022-03-24 | 2023-10-05 | 国立大学法人 東京大学 | ウイルスの精製方法 |
WO2023198685A1 (en) | 2022-04-13 | 2023-10-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for determining aav genomes |
WO2023227438A1 (en) | 2022-05-23 | 2023-11-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Raman-based method for the differentiation of aav particle serotype and aav particle loading status |
WO2023232922A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing recombinant aav particles |
WO2024013239A1 (en) | 2022-07-14 | 2024-01-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing recombinant aav particles |
WO2024024337A1 (ja) * | 2022-07-28 | 2024-02-01 | 株式会社ダイセル | 微小有用物質を含む液の精製濃縮装置及びそれを用いた微小有用物質を含む精製濃縮液の製造方法 |
WO2024056561A1 (en) | 2022-09-12 | 2024-03-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for separating full and empty aav particles |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2995542A1 (en) * | 1997-09-05 | 1999-03-11 | Genzyme Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors |
US6593123B1 (en) * | 2000-08-07 | 2003-07-15 | Avigen, Inc. | Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification |
DK2277996T3 (da) * | 2003-05-21 | 2014-10-20 | Genzyme Corp | Fremgangsmåder til fremstilling af præparationer af rekombinante aav-virioner, der i hovedsagen er fri for tomme capsider |
CA3077531C (en) * | 2009-06-16 | 2022-09-20 | Genzyme Corporation | Improved methods for purification of recombinant aav vectors |
BR112012018899A2 (pt) * | 2010-01-28 | 2015-09-15 | Philadelphia Children Hospital | "método para purificar partículas de vetor de vírus adeno-associado." |
MX2018006682A (es) * | 2015-12-01 | 2018-09-26 | Spark Therapeutics Inc | Metodos escalables para producir vector viral adenoasociado (aav) recombinante en un sistema de cultivo celular en suspension libre de suero adecuado para su uso clinico. |
US11028372B2 (en) * | 2015-12-11 | 2021-06-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAVRH10 |
ES2934848T3 (es) * | 2015-12-11 | 2023-02-27 | Univ Pennsylvania | Método de purificación escalable para AAV8 |
US11015173B2 (en) * | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV1 |
WO2017173283A1 (en) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | Spark Therapeutics, Inc. | Column-based fully scalable raav manufacturing process |
-
2018
- 2018-06-29 PE PE2019002713A patent/PE20200737A1/es unknown
- 2018-06-29 US US16/627,227 patent/US20210079422A1/en active Pending
- 2018-06-29 CA CA3068622A patent/CA3068622A1/en active Pending
- 2018-06-29 SG SG11201913157RA patent/SG11201913157RA/en unknown
- 2018-06-29 BR BR112019028299-8A patent/BR112019028299A2/pt unknown
- 2018-06-29 EP EP18823181.5A patent/EP3658250A4/en active Pending
- 2018-06-29 MX MX2020000216A patent/MX2020000216A/es unknown
- 2018-06-29 CN CN201880053245.7A patent/CN111032176A/zh active Pending
- 2018-06-29 WO PCT/US2018/040430 patent/WO2019006390A1/en active Application Filing
- 2018-06-29 AU AU2018291023A patent/AU2018291023B2/en active Active
- 2018-06-29 JP JP2019572175A patent/JP2020526190A/ja active Pending
-
2019
- 2019-12-29 IL IL271745A patent/IL271745A/en unknown
- 2019-12-30 CL CL2019003915A patent/CL2019003915A1/es unknown
-
2020
- 2020-01-03 PH PH12020500044A patent/PH12020500044A1/en unknown
- 2020-01-28 CO CONC2020/0000911A patent/CO2020000911A2/es unknown
-
2022
- 2022-11-07 JP JP2022177960A patent/JP2023029832A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2020103743A (ru) | 2021-07-30 |
AU2018291023A1 (en) | 2020-02-06 |
CO2020000911A2 (es) | 2020-06-19 |
EP3658250A1 (en) | 2020-06-03 |
SG11201913157RA (en) | 2020-01-30 |
KR20200040749A (ko) | 2020-04-20 |
AU2018291023B2 (en) | 2023-11-02 |
CN111032176A (zh) | 2020-04-17 |
CA3068622A1 (en) | 2019-01-03 |
WO2019006390A1 (en) | 2019-01-03 |
JP2020526190A (ja) | 2020-08-31 |
RU2020103743A3 (ja) | 2021-09-30 |
IL271745A (en) | 2020-02-27 |
US20210079422A1 (en) | 2021-03-18 |
EP3658250A4 (en) | 2021-10-27 |
CL2019003915A1 (es) | 2020-06-19 |
PE20200737A1 (es) | 2020-07-23 |
PH12020500044A1 (en) | 2020-09-14 |
BR112019028299A2 (pt) | 2020-07-14 |
MX2020000216A (es) | 2020-09-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2023029832A (ja) | Aavベクターのカラム精製方法 | |
JP7364306B2 (ja) | カラムに基づく高度にスケーラブルなrAAVの製造プロセス | |
CN109563496B (zh) | 用于重组蛋白和/或病毒载体生产的细胞系 | |
JP6868572B2 (ja) | アフィニティー精製工程を含む組換えアデノ随伴ウイルス粒子の精製 | |
AU2017299779B2 (en) | Scalable high recovery methods for producing high yield recombinant adeno-associated viral (rAAV) vector and recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors produced thereby | |
KR20240021231A (ko) | Aav 벡터 컬럼 정제 방법 | |
KR102669561B1 (ko) | Aav 벡터 컬럼 정제 방법 | |
EP4281552A2 (en) | Method for purifying recombinant viral particles | |
RU2772876C2 (ru) | Колоночные способы очистки вектора на основе aav | |
CN117794629A (zh) | Aav载体的柱纯化方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221122 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231121 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240213 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240520 |