CN114250222A - 一种从动物组织中提取aav dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从动物组织中提取AAV DNA的方法，其步骤包括：配制所需的溶液1‑6，获取组织样本并匀浆；取适量样本加入容器管并添加适量的溶液1；先后加入适量的溶液2和溶液6，振荡孵育并使样本细胞裂解完成；冷却至室温，向其中添加溶液5，孵育后加入适量的溶液3，混合并降温；离心然后过滤；向上清液中加入1倍体积的乙醇；溶液加载到回收柱中，用溶液4洗涤回收柱若干次；用水对回收柱洗脱若干次，取适量洗脱溶液转移至新容器管中，涡旋并剪切洗脱溶液中的染色体DNA；添加适量的10X的核酸外切酶V缓冲液；添加适量的ATP溶液；添加适量的核酸外切酶V，去除宿主DNA和非附加型病毒DNA，添加适量的溶液5，孵育过夜；使用DNA纯化试剂盒进行纯化等步骤。

Description

一种从动物组织中提取AAV DNA的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是一种从动物组织中提取AAV DNA的方法。
背景技术
AAV是指腺相关病毒载体。现有技术中，从动物组织中提取AAV DNA的方法通常是使用基因组 DNA 提取试剂盒提取整个 DNA，或是使用质粒 DNA 提取试剂盒提取低分子量DNA 或遵循 Hirt 程序 (Hirt, 1967) 或它的一些修改版本 (Arad, 1998; Bardelli etal , 2017)。
在 AAV 衣壳的体内定向进化过程中，需要从动物组织中对衣壳序列进行 PCR 扩增，以生成能够感染特定组织靶标的丰富变体文库。最简单的样品制备方法是从非常小的组织样品（通常约为 10 mg）开始，然后使用 DNA 纯化试剂盒从中分离出总 DNA。一个明显的限制是样本可能不代表整个组织或器官，甚至可能不包括任何 AAV。另一个困难是，与宿主基因组 DNA 的数量相比，AAV DNA 的数量通常微不足道。由于 DNA 聚合酶被 DNA 抑制，因此样品需要高度稀释才能用作 PCR 模板，导致会进一步稀释可能存在的少量 AAVDNA。因此，当 PCR 产物完全可以产生时，可能无法包含最有希望的序列变体，而可能只包含少数碰巧被偶然扩增的序列。为解决上述的问题，现有技术中第一种方法是从组织的不同部位收集多个样本并并行处理它们。另一种方法是使用所谓的 Hirt (1) 程序或其衍生物 (2,3) 或简单的质粒分离试剂盒选择性分离低分子量 DNA 而不是总 DNA。这些都不是完全令人满意的方法，因为实际回收的 AAV DNA 数量有限，通常与大量污染的宿主 DNA混合，最终导致 PCR 期间的序列偏差。
发明内容
本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有的AAV回收方法存在的问题，提供一种能够解决前述问题的从动物组织中提取AAV DNA的方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：从动物组织中提取AAV DNA的方法，其包括以下步骤：
S1、配制所需的溶液，溶液1包含有Tris-HCl和EDTA，pH值为 7.5；溶液2包含有SDS水溶液；溶液3包含有CsCl、K-乙酸和乙酸；溶液4包含有NaCl、Tris-HCl和乙醇，pH值为7.5；溶液5为RNase A 溶液；溶液6为蛋白酶 K 溶液；
S2、从所选动物的整个器官中获取组织样本，将组织样本转移到洁净的研钵中，将组织样本切碎成小块，然后用研杵匀浆直至糊状物变稠；
S3、从步骤S2处理后的样本中取适量转移到容器管中，向容器管内添加适量的溶液1；
S4、向步骤S3所述的容器管中加入适量的溶液2，然后加入适量的溶液6，在50-60℃下振荡孵育2-6小时，使样本细胞裂解完成；
S5、将S4裂解完成的样本细胞溶液冷却至室温，向其中添加适量的溶液5，混合均匀，并在室温下孵育30分钟以上；
S6、向步骤S5所述的溶液中加入适量的溶液3，立即轻轻混合并置于冰上降温30分钟以上；
S7、在4℃下以5000g离心15-30分钟，通过纱布对溶液进行过滤，将上清液转移到新的容器管中，再通过真空过滤器对上清液进行过滤；
S8、向步骤S7中用真空过滤器过滤后的上清液中加入1倍体积的乙醇，通过沉淀大部分DNA来防止目标AAV DNA的损失；
S9、将步骤S8处理后的溶液加载到回收柱中，用溶液4洗涤回收柱若干次，然后以最大速度离心3-10分钟以去除回收柱内残留的洗涤缓冲液；
S10、用适当体积的水对回收柱洗脱若干次，从洗脱得到的洗脱溶液中取适量的洗脱溶液转移至新的容器管中，涡旋3-10秒，通过小直径移液器吸头吹打以剪切洗脱溶液中的染色体DNA；
S11、向步骤S10处理后的溶液中添加适量的10X的核酸外切酶V缓冲液；
S12、向步骤S11处理后的溶液中添加适量的ATP溶液；
S13、添加适量的核酸外切酶V，去除宿主DNA和非附加型病毒DNA，然后添加适量的溶液5，用封口膜密封，并在37℃下孵育过夜；
S14、使用基于微型柱的DNA纯化试剂盒进行纯化，用温洗脱缓冲液双重洗脱，获得纯化的AAV DNA；
S15、以PCR反应体积的5%的纯化的AAV DNA用作PCR模板，进行PCR扩增检测。
作为上述的从动物组织中提取AAV DNA的方法的进一步改进，步骤S2中，用研杵匀浆直至糊状物变稠时，加入适量的溶液 1。
作为上述的从动物组织中提取AAV DNA的方法的进一步改进，步骤S3中，步骤S2处理后的样品取适量转移到容器管中，剩余样品在-80℃下储存。
作为上述的从动物组织中提取AAV DNA的方法的进一步改进，步骤S7中，通过纱布对溶液过滤后，使用移液管将上清液转移到新的容器管中，避免转移的上清液中含有漂浮物。
作为上述的从动物组织中提取AAV DNA的方法的进一步改进，步骤S9中，所述的回收柱为Zymo-spin VI 离心柱或其他具有 500 µg DNA 结合能力的硅胶柱。
作为上述的从动物组织中提取AAV DNA的方法的进一步改进，步骤S9中，使用真空机或离心机将步骤S8处理后的溶液加载到回收柱中。
作为上述的从动物组织中提取AAV DNA的方法的进一步改进，所述溶液4洗涤缓冲液为包含有NaCl、Tris-HCl pH 7.5和80% 乙醇的溶液。
作为上述的从动物组织中提取AAV DNA的方法的进一步改进，所述溶液5的RNaseA 溶液是将 RNase A 溶解在 Tris-HCl pH 7.5、NaCl 溶液中，然后在沸水浴中放置5-15分钟，冷却至室温得到的RNase A 溶液。
作为上述的从动物组织中提取AAV DNA的方法的进一步改进，所述溶液6的蛋白酶K 溶液是将蛋白酶 K 溶解在 Tris-HCl pH 8.0、CaCl2 溶液中， 再用甘油定容得到的蛋白酶 K 溶液。
作为上述的从动物组织中提取AAV DNA的方法的进一步改进，步骤S14所述的基于微型柱的DNA纯化试剂盒为大于20 µg 结合能力的DNA纯化试剂盒。
本发明的有益效果为：1）本发明能从所选动物的整个组织或器官中分离和浓缩提取附加型 AAV DNA，能生成真正代表目标组织的 PCR 模板；2）本发明的提取附加型 AAVDNA的方法，在步骤S13中采用了核酸外切酶 V来去除宿主 DNA 和非附加型AAV DNA，得到的AAV DNA中，排除了非附加型 AAV DNA，且残留的宿主 DNA 的比率极低，能得到可以有效转导靶细胞的衣壳相对应的病毒序列；3）本发明的提取AAV DNA的方法，在步骤S6加入溶液3对DNA进行沉淀处理及步骤S7进行真空过滤后，在步骤S8中，将AAV DNA加入回收柱进行回收柱纯化前，在过滤后的上清液中加入 1 倍体积的乙醇，能沉淀上清液中的大部分的DNA，能有效防止 AAV DNA的损失。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种从动物组织中提取AAV DNA的方法，其包括以下步骤：
S1、配制所需的溶液；
溶液 1：包括50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM EDTA溶液；例如对于 1 L的溶液1，其配制方法为用50 ml 1 M的 Tris-HCl pH 7.5和20 ml 0.5 M EDTA和930 ml水配制溶液1；
溶液 2：包括1.2% SDS，例如对于 1 L的溶液2，其配制方法为将12 g的 SDS 溶于H2O 中，SDS为十二烷基硫酸钠；
溶液 3：包括3 M CsCl、1 M K-乙酸盐、0.67 M 乙酸溶液；例如对于 2 L的溶液3，其配制方法为用1 kg CsCl、196 g K 乙酸盐和76.6 ml 冰乙酸，其余用 H2O 补足至 2 L；
溶液 4：溶液4为洗涤缓冲液，包括20mM NaCl、2mM Tris-HCl pH 7.5、80% 乙醇，例如对于 1 L的溶液4，其配制方法为用4 ml 5M NaCl、2 ml 1M Tris-HCl pH7.5、800 ml乙醇、194 ml H2O配制而成；
溶液 5：溶液5为RNase A 溶液，例如对于100 ml的溶液5，其配制方法为将 1 gRNase A 溶解在 100 ml 10 mM Tris-HCl pH 7.5、15 mM NaCl 中，然后在沸水浴中放置10 分钟，冷却至室温，分装到 2 ml 试管中并储存在 -20°C环境中；
溶液6：溶液6为蛋白酶 K 溶液，例如对于 25 毫升的溶液6，其配制方法为将 500mg 蛋白酶 K 溶解在 12.5 ml 200 mM Tris-HCl pH 8.0、3 mM CaCl2 中，用甘油定容至25 ml，分装并储存在 -20°C环境中；
S2、用漂白剂处理研钵和研杵3-10分钟，然后在研钵和研杵使用前，用去离子水充分清洗并置于无菌罩中；
S3、从所选动物的整个器官中获取组织样本，例如从整个猴子器官中获取组织样本，然后将组织样本转移到研钵中，将组织样本切碎成小块，然后用研杵匀浆直至糊状物变稠，必要时可以加入少量的溶液1；
S4、从步骤S3处理后的样本中取20-25g转移到容器管中，容器管可以选用锥形管，向容器管内添加适量的溶液1，使最终体积达到 50 毫升；剩余样品在-80℃温度下储存；
S5、向步骤S4所述的容器管中加入50ml的溶液2，然后加入1ml的溶液6，在50-60℃下振荡孵育2-6小时，使样本细胞裂解完成；
S6、将S5裂解完成的样本细胞溶液冷却至室温，向其中添加1ml溶液5，混合均匀，并在室温下孵育30分钟以上；
S7、向步骤S6所述的溶液中加入70ml的溶液3，立即轻轻混合并置于冰上降温30分钟以上；
S8、在4℃下以5000g离心25分钟，通过纱布对溶液进行过滤，将上清液转移到新的容器管中，使用移液管将上清液转移到新的容器管中，避免转移的上清液中含有漂浮物，再通过0.45 µm真空过滤器对上清液进行过滤；
S9、向步骤S8中用真空过滤器过滤后的上清液中加入1倍体积的乙醇，通过沉淀大部分DNA来防止目标AAV DNA的损失；
S10、使用真空机或离心机将步骤S9处理后的溶液加载到回收柱中，回收柱可以选用Zymo-spin VI 离心柱或是其他具有 500 µg DNA 结合能力的硅胶柱，用溶液4洗涤回收柱若干次，例如洗涤两次，然后以最大速度离心3-10分钟以去除回收柱内残留的洗涤缓冲液；
S11、用适当体积的水对回收柱洗脱若干次，例如洗脱3次，洗脱液最终体积为 6ml，从洗脱得到的洗脱溶液中取适量的洗脱溶液转移至新的容器管中，例如取166μl的洗脱溶液转移至新的容器管中，涡旋3-10秒，通过小直径移液器吸头吹打以剪切洗脱溶液中的染色体DNA；
S12、向步骤S11处理后的溶液中添加20μl的10X的核酸外切酶V缓冲液；
S13、向步骤S12处理后的溶液中添加8 µl的 25 mM的ATP溶液；
S14、添加4 µl的10 U/µl的核酸外切酶V，去除宿主DNA和非附加型病毒DNA，然后添加2 µl的10 mg/ml的溶液5，用封口膜密封，并在37℃下孵育过夜；
S15、使用基于微型柱的DNA纯化试剂盒进行纯化，DNA纯化试剂盒选用结合能力大于20 µg的DNA纯化试剂盒，用45+45 µl温洗脱缓冲液双重洗脱，获得纯化的AAV DNA；
S16、以PCR反应体积的5%的纯化的AAV DNA用作PCR模板，进行PCR扩增检测。
上述步骤S11中，取166μl的洗脱溶液转移至新的容器管中；步骤S12中，向步骤S11处理后的溶液中添加20μl的10X的核酸外切酶V缓冲液；步骤S13中，向步骤S12处理后的溶液中添加8 µl的 25 mM的ATP溶液；步骤S14中，添加4 µl的10 U/µl的核酸外切酶V，然后添加2 µl的10 mg/ml的溶液5，因此，从步骤S11-步骤S14，容器管内加入的5种液体的总量刚好为200μl，且步骤S11-S14添加的5种液体的配比为优选的配比方案，200μl的体积又适于按照步骤S14的方法在容器管内对AAV DNA进行孵育，因而，孵育得到的AAV DNA经步骤S15的DNA纯化试剂盒进一步纯化后，能得到高纯度的AAV DNA。
通过对上述的提取方法的说明和实验检测可知，本发明的提取AAV DNA的方法能从所选动物的整个组织或器官中分离和浓缩提取附加型 AAV DNA，例如可以选择整个猴子器官来实施本发明的提取AAV DNA的方法，与现有技术中采用非常小的组织样品（通常约为10 mg），使用 DNA 纯化试剂盒，从中分离出总 DNA的方案相比，本发明能使提取的AAV DNA代表所选动物的整个组织或器官；本发明的提取附加型 AAV DNA的方法采用了核酸外切酶V来去除宿主 DNA 和非附加型AAV DNA，得到的AAV DNA中排除了非附加型的 AAV DNA，而且宿主 DNA 的含量极低，能得到可以有效转导靶细胞的衣壳相对应的病毒序列；本发明的提取AAV DNA的方法，在步骤S10将AAV DNA加入回收柱进行回收柱纯化前加入 1 倍体积的乙醇可以沉淀大部分的 DNA，能有效防止 AAV DNA 的损失。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种从动物组织中提取AAV DNA的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
S1、配制所需的溶液，溶液1包含有Tris-HCl和EDTA，pH值为 7.5；溶液2包含有SDS水溶液；溶液3包含有CsCl、K-乙酸和乙酸；溶液4包含有NaCl、Tris-HCl和乙醇，pH值为 7.5；溶液5为RNase A 溶液；溶液6为蛋白酶 K 溶液；
S2、从所选动物的整个器官中获取组织样本，将组织样本转移到洁净的研钵中，将组织样本切碎成小块，然后用研杵匀浆直至糊状物变稠；
S3、从步骤S2处理后的样本中取适量转移到容器管中，向容器管内添加适量的溶液1；
S4、向步骤S3所述的容器管中加入适量的溶液2，然后加入适量的溶液6，在50-60℃下振荡孵育2-6小时，使样本细胞裂解完成；
S5、将S4裂解完成的样本细胞溶液冷却至室温，向其中添加适量的溶液5，混合均匀，并在室温下孵育30分钟以上；
S6、向步骤S5所述的溶液中加入适量的溶液3，立即轻轻混合并置于冰上降温30分钟以上；
S7、在4℃下以5000g离心15-30分钟，通过纱布对溶液进行过滤，将上清液转移到新的容器管中，再通过真空过滤器对上清液进行过滤；
S8、向步骤S7中用真空过滤器过滤后的上清液中加入1倍体积的乙醇，通过沉淀大部分DNA来防止目标AAV DNA的损失；
S9、将步骤S8处理后的溶液加载到回收柱中，用溶液4洗涤回收柱若干次，然后以最大速度离心3-10分钟以去除回收柱内残留的洗涤缓冲液；
S10、用适当体积的水对回收柱洗脱若干次，从洗脱得到的洗脱溶液中取适量的洗脱溶液转移至新的容器管中，涡旋3-10秒，通过小直径移液器吸头吹打以剪切洗脱溶液中的染色体DNA；
S11、向步骤S10处理后的溶液中添加适量的10X的核酸外切酶V缓冲液；
S12、向步骤S11处理后的溶液中添加适量的ATP溶液；
S13、添加适量的核酸外切酶V，去除宿主DNA和非附加型病毒DNA，然后添加适量的溶液5，用封口膜密封，并在37℃下孵育过夜；
S14、使用基于微型柱的DNA纯化试剂盒进行纯化，用温洗脱缓冲液双重洗脱，获得纯化的AAV DNA；
S15、以PCR反应体积的5%的纯化的AAV DNA用作PCR模板，进行PCR扩增检测。
2.根据权利要求1所述的从动物组织中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步骤S2中，用研杵匀浆直至糊状物变稠时，加入适量的溶液 1。
3.根据权利要求1所述的从动物组织中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步骤S3中，步骤S2处理后的样品取适量转移到容器管中，剩余样品在-80℃下储存。
4.根据权利要求1所述的从动物组织中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步骤S7中，通过纱布对溶液过滤后，使用移液管将上清液转移到新的容器管中，避免转移的上清液中含有漂浮物。
5.根据权利要求1所述的从动物组织中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步骤S9中，所述的回收柱为Zymo-spin VI 离心柱或其他具有 500 µg DNA 结合能力的硅胶柱。
6.根据权利要求1所述的从动物组织中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步骤S9中，使用真空机或离心机将步骤S8处理后的溶液加载到回收柱中。
7.根据权利要求1所述的从动物组织中提取AAV DNA的方法，其特征在于：所述溶液4洗涤缓冲液为包含有NaCl、Tris-HCl pH 7.5和80% 乙醇的溶液。
8.根据权利要求1所述的从动物组织中提取AAV DNA的方法，其特征在于：所述溶液5的RNase A 溶液是将 RNase A 溶解在 Tris-HCl pH 7.5、NaCl 溶液中，然后在沸水浴中放置5-15分钟，冷却至室温得到的RNase A 溶液。
9.根据权利要求1所述的从动物组织中提取AAV DNA的方法，其特征在于：所述溶液6的蛋白酶 K 溶液是将蛋白酶 K 溶解在 Tris-HCl pH 8.0、CaCl2 溶液中， 再用甘油定容得到的蛋白酶 K 溶液。
10.根据权利要求1所述的从动物组织中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步骤S14所述的基于微型柱的DNA纯化试剂盒为大于20 µg 结合能力的DNA纯化试剂盒。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071186A (zh) * 2009-11-19 2011-05-25 北京金麦格生物技术有限公司 一种从生物样品中快速分离病毒核酸的试剂盒及方法
EP3323895A1 (en) * 2016-11-22 2018-05-23 He Dao-Yao Methods compositions and kits for extraction and purification of adeno-associated virus and adenovirus from host cells
US20180143117A1 (en) * 2016-11-22 2018-05-24 Dao-Yao He Lysis, extraction and purification of adeno-associated virus and adenovirus from host cells
CN109385418A (zh) * 2017-08-03 2019-02-26 杭州优思达生物技术有限公司 一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法及试剂
CN110468125A (zh) * 2019-09-17 2019-11-19 广州欣源生物科技有限公司 一种用于病毒核酸提取的试剂盒及其提取方法
CN111088249A (zh) * 2020-01-19 2020-05-01 泰州健为医学检验实验有限公司 一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法
CN111235143A (zh) * 2020-02-27 2020-06-05 上海探普生物科技有限公司 一种病毒核酸的提取方法
US20210079422A1 (en) * 2017-06-30 2021-03-18 Spark Therapeutics, Inc. Aav vector column purification methods

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071186A (zh) * 2009-11-19 2011-05-25 北京金麦格生物技术有限公司 一种从生物样品中快速分离病毒核酸的试剂盒及方法
EP3323895A1 (en) * 2016-11-22 2018-05-23 He Dao-Yao Methods compositions and kits for extraction and purification of adeno-associated virus and adenovirus from host cells
US20180143117A1 (en) * 2016-11-22 2018-05-24 Dao-Yao He Lysis, extraction and purification of adeno-associated virus and adenovirus from host cells
CN108085301A (zh) * 2016-11-22 2018-05-29 贺道耀 从宿主细胞提取和纯化腺相关病毒和腺病毒的方法及其组分和试剂盒
US20210079422A1 (en) * 2017-06-30 2021-03-18 Spark Therapeutics, Inc. Aav vector column purification methods
CN109385418A (zh) * 2017-08-03 2019-02-26 杭州优思达生物技术有限公司 一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法及试剂
CN110468125A (zh) * 2019-09-17 2019-11-19 广州欣源生物科技有限公司 一种用于病毒核酸提取的试剂盒及其提取方法
CN111088249A (zh) * 2020-01-19 2020-05-01 泰州健为医学检验实验有限公司 一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法
CN111235143A (zh) * 2020-02-27 2020-06-05 上海探普生物科技有限公司 一种病毒核酸的提取方法

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