KR20150057120A - 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하기 위한 세포 용해 조성물 - Google Patents

간염 바이러스로부터 핵산을 추출하기 위한 세포 용해 조성물 Download PDF

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KR20150057120A
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Abstract

본 발명은 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN), 소디움 도데실 설페이트(SDS), 트리톤 X-100 및 완충제를 포함하는 세포 용해 조성물 및 이를 이용하여 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 세포 용해 조성물 및 이를 이용한 핵산 추출 방법은 상기 바이러스로부터 핵산을 추출하여 간염을 초기 진단하거나, 간염 치료 또는 치료제에 대한 연구, 또는 간염 바이러스에 대한 연구 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

간염 바이러스로부터 핵산을 추출하기 위한 세포 용해 조성물{CELL LYSIS COMPOSITION FOR EXTRACTING NUCLEIC ACID FROM HEPATITIS VIRUS}
본 발명은 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하기 위한 세포 용해 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN), 소디움 도데실 설페이트(SDS), 트리톤 X-100(TX) 및 완충제를 포함하는 세포 용해 조성물 및 이를 이용하여 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법에 관한 것이다.
간염은 바이러스 감염으로 인한 간 염증으로서, 급성 또는 만성 형태로 존재할 수 있다. 간염은 5종의 간친화성 바이러스인 A형, B형, C형, D형 및 E형 간염 바이러스로 인해 유발되며, 이 중 A형, B형 및 C형 간염이 전세계적으로 널리 퍼져있다.
구체적으로, A형 간염은 A형 간염 바이러스(HAV)의 감염에 의해 발생하는 급성 간염 질환이다. A형 간염은 열, 권태, 식욕부진, 구역, 복부불쾌 및 황달 등 다른 바이러스 간염과 유사한 증상을 보인다. A형 간염은 주로 감염된 사람의 분변에 의해 오염된 물체, 음식, 음료수 등과 접촉했을 때, A형 간염 바이러스가 입을 통해 체내로 들어오면서 전염된다. A형 간염의 원인인 A형 간염 바이러스(HAV)는 피코르나바이러스(Picornavirus)에 속하는 작고 비외피성인 구형 바이러스로서, 선형의 단일 가닥으로서 7.5 kb의 RNA 게놈을 가지고 있다. A형 간염바이러스는 잠복기가 약 30일이며, 주로 10세 미만의 어린이들에게 감염되어 간염을 일으킨다. 증상은 대부분 감기 같은 증세로 약하게 지나가며 바이러스에 감염된 사람 중 50-90%가 무증상 감염을 일으키나 0.1% 이하는 심한 간 괴사를 일으키는 경우도 있다. 성인 감염의 경우 발병 후 회복이 지연되는 경우도 있으나 만성간염이나 간경변증으로 이행된 보고는 없다. A형 간염의 치료는 대중요법이 주된 방법이고, 예방 백신이 개발 중이지만 실용성은 아직 없고 면역글로불린 주사는 예방 효과가 없다.
B형 간염은 B형 간염 바이러스(HBV)에 의해 발병되는 전염성 질환으로서, 다른 간염과 마찬가지로 만성 바이러스 감염증, 임파종 질환 및 만성 신장장애를 일으키며, 만성감염은 더욱 강력한 형태의 질환으로 발전하여 결국 환자의 사망에까지 이르게 하는 치사율이 매우 높은 질환이라 할 수 있다[Don Ganem et al., Ann . Rev. Biochem ., 56, 651(1987): R.P. Beasley et al., Lancet , 2, 1129 (1981): D.A. Shafritz et al., New England J. of Medicine , 305, 1067(1981): S.N. Zaman et al., Lancet , 1, 1357(1985)]. B형 간염의 원인인 B형 간염 바이러스(HBV)는 인체에 특이적으로 감염되는 헤파드나바이러스(Hepadnavirus)에 속하는 바이러스로서, 전 세계적으로 약 2억 5천만 명의 인구가 HBV에 감염되어 있는 것으로 알려져 있다. HBV는 다른 바이러스와 달리 외피의 지질성분이 매우 낮은 특징이 있다. HBV의 외피에는 당단백질인 표면항원(surface antigen, HBsAg)이 있고, 입자 내부에는 코어 항원으로 구성된 캡시드가 원형인 DNA 게놈을 싸고 있다. HBV의 잠복기는 60-110일 정도이며 다양한 정도의 임상기를 거쳐 감염자의 90-95%가 완전히 회복되나, 감염에서 회복되지 않은 환자의 경우 HBV의 게놈 DNA가 사람 간세포의 게놈 DNA에 삽입 및 동화되어 만성 활동성 간염, 간경변증, 간암 등으로 발전하게 된다.
C형 간염은 C형 간염 바이러스(HCV)에 의해 발병되는 전염성 질환으로서, B형 간염에 비해 경미하긴 하나, 권태, 식욕부진, 구토, 우상복부 동통 등의 증상을 보인다. C형 간염의 원인인 C형 간염 바이러스(HCV)는 플라비바이러스(Flavivirus)에 속하며, 급성 간염 및 만성 간 질환을 유발한다. HCV 바이러스 감염은 5 내지 24%의 사례에서 간경화 및 그 다음 20 내지 30년의 기간에 걸쳐 간세포 암종으로 발전될 수 있는 높은 비율(54-86%)의 만성과 관련된다(McHutchinson, 2004, The American Journal of Managed Care 10, S21-29). 최근, 유럽 및 미국에서의 간 이식 중 20-30% 및 간암 15-33%는 HCV 감염에 기인한 것이다. 세계 보건 기구는 1999년에 전세계적으로 약 1억 7천 명의 사람들이 HCV에 만성적으로 감염되었으며, 매년 3 내지 4백만 명의 사람들이 새로이 감염되는 것으로 추정하였다. HCV는 약 9,600개의 뉴클레오티드의 양성, 단일-가닥 리보핵산(RNA) 게놈을 갖는 껍질보유바이러스(enveloped virus)이며, 그 조직은 모든 HCV 스트레인 및 분리체에 대하여 공통적이다. HCV 게놈의 번역으로 유전형에 따른 3010 내지 3030 아미노산의 큰 폴리프로테인이 생성되며, 이는 바이러스 및 세포 프로테아제에 의하여 단백질 가수분해로 절단되어, 10개의 바이러스 단백질이 생성된다.
상기 간염의 초기 진단 및 치료, 치료제에 대한 연구, 바이러스에 대한 연구 등을 위해서는 생물학적 시료로부터 간염 바이러스의 핵산을 추출하는 것이 선결되어야 한다.
종래 생물학적 물질로부터 핵산을 분리하는 방법으로서, 단백질 분해효소 존재 하에 계면활성제를 사용하여 생물학적 물질을 용해시킨 후, 유기 용매, 예컨대 페놀 및/또는 클로로포름으로 수회 추출하고, 에탄올 침전시킨 다음 핵산을 투석하는 방법이 알려져 있었다. 하지만, 이들 방법은 많은 시간 및 노동력이 소모되며, 핵산을 분리하기까지 여러 단계를 거쳐야 되므로, 각종 임상시료들을 동시에 처리하는 경우 시료들 상호 간에 핵산이 혼입될 위험성이 매우 높다.
이를 개선하기 위하여, 미국 특허 제5234809호는 출발 물질과 카오트로픽(chaotropic) 물질, 및 핵산 결합 고체상을 혼합하고, 이 혼합액으로부터 핵산이 결합된 고체상을 분리한 후, 수득된 고체상-핵산 복합제를 세정하고, 필요하다면 이어서 상기 복합체로부터 핵산을 용리시키는 것을 특징으로 하는, 핵산-함유 출발물질로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공하며, 사용될 수 있는 카오트로픽 물질로서 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN)과, 핵산 결합 고체상으로서 실리카 입자를 개시하고 있다.
하지만, 상기 방법은 전혈액, 혈청, 연막(혈액담황층 또는 혈액의 백혈구 분획), 요, 분변, 뇌척수액, 정자, 타액, 조직, 세포 배양물과 같은 가능한 모든 생물학적 물질로부터 핵산을 분리하는 것이어서, 특정 미생물, 예를 들어 간염 바이러스로부터 핵산을 분리하는데 효과적이지 못하다. 특히, 간염 바이러스마다 바이러스를 구성하는 요소가 상이하여 상기 방법으로 A형, B형 또는 C형 간염 바이러스로부터 목적하는 핵산을 분리하는데 어려움이 있다. 이에, A형, B형 또는 C형 간염 바이러스로부터 목적하는 핵산을 효과적으로 분리해내기 위한 조성물 및 방법의 개선이 요구된다.
따라서, 본 발명의 목적은 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하기 위한 세포 용해 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 3 내지 6 M의 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN); (b) 0.5 내지 1.5 부피%의 소디움 도데실 설페이트(SDS); (c) 10 내지 20 부피%의 트리톤 X-100; 및 (d) pH 3 내지 5의 완충제를 포함하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하기 위한 세포 용해(lysis) 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 간염 바이러스가 포함된 시료를, 3 내지 6 M의 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN), 0.5 내지 1.5 부피%의 소디움 도데실 설페이트(SDS), 10 내지 20 부피%의 트리톤 X-100 및 pH 3 내지 5의 완충제를 포함하는 세포 용해 조성물, 및 핵산을 결합시키기 위한 고체상(solid phase)과 혼합하는 단계; (2) 상기 혼합물로부터 핵산이 결합된 고체상을 분리하는 단계; (3) 상기 핵산이 결합된 고체상을 세정용 조성물을 이용하여 세정하는 단계; 및 (4) 상기 핵산이 결합된 고체상으로부터 핵산을 용리하는 단계를 포함하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세포 용해 조성물은 다양한 간염 바이러스, 예를 들어 A형, B형 또는 C형 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는데 매우 효과적이므로, 본 발명의 세포 용해 조성물 및 이를 이용한 핵산 추출 방법은 상기 바이러스로부터 핵산을 추출하여 간염을 초기 진단하거나, 간염 치료 또는 치료제에 대한 연구, 또는 간염 바이러스에 대한 연구 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 비교예 1(GuSCN), 비교예 2(GuSCN+SDS) 및 실시예 1(GuSCN+SDS+트리톤 X-100)의 세포 용해 조성물을 이용하여 C형 간염 바이러스로부터 핵산을 추출한 후, 핵산 용리 수준(A) 및 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준(B)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 비교예 2(GuSCN+SDS) 및 실시예 1(GuSCN+SDS+트리톤 X-100)의 세포 용해 조성물을 이용하여 A형 간염 바이러스로부터 핵산을 추출한 후, 핵산 용리 수준(A) 및 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준(B)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 비교예 2(GuSCN+SDS) 및 실시예 1(GuSCN+SDS+트리톤 X-100)의 세포 용해 조성물을 이용하여 B형 간염 바이러스로부터 핵산을 추출한 후, 핵산 용리 수준(A) 및 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준(B)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 트리톤 X-100의 함량을 달리하여 제조된 실시예 1 및 비교예 3의 세포 용해 조성물을 이용하여 A형, B형, C형 간염 바이러스로부터 각각 핵산을 추출한 후, PCR에 의해 핵산을 증폭할 때의 순환 주기 값(Ct)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 SDS의 함량을 달리하여 제조된 실시예 2 및 비교예 4의 세포 용해 조성물을 이용하여 A형 간염 바이러스로부터 각각 핵산을 추출한 후, 핵산 용리 수준(A) 및 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준(B)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 GuSCN의 함량을 달리하여 제조된 실시예 3 및 비교예 5의 세포 용해 조성물을 이용하여 A형 간염 바이러스로부터 각각 핵산을 추출한 후, 핵산 용리 수준(A) 및 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준(B)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 A형 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 과정 중에 20 mM의 염화나트륨을 포함하거나 포함하지 않는 세정 용액 II를 이용할 때의 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준(A) 및 PCR에 의해 핵산을 증폭할 때의 순환 주기 값(Ct)(B)을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 (a) 3 내지 6 M의 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN); (b) 0.5 내지 1.5 부피%의 소디움 도데실 설페이트(SDS); (c) 10 내지 20 부피%의 트리톤 X-100; 및 (d) pH 3 내지 5의 완충제를 포함하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하기 위한 세포 용해(lysis) 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 조성물은 다양한 간염 바이러스, 예를 들어 A형, B형, C형, D형 또는 E형 간염 바이러스, 바람직하게는 A형, B형 또는 C형 간염 바이러스를 효율적으로 용해시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 다양한 간염 바이러스 또는 상기 바이러스를 포함하는 시료로부터 핵산을 추출하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 '핵산(nucleic acid)'은 DNA 또는 RNA를 의미하며, 이들은 임의의 가능한 결합, 즉 이중-가닥(ds) 핵산, 또는 단일-가닥(ss) 핵산, 또는 이들의 조합체(부분적으로 ds 또는 ss) 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 핵산을 추출하고자 하는 바이러스가 A형 간염 바이러스인 경우 상기 추출된 핵산은 단일-가닥(ss) RNA이고, 핵산을 추출하고자 하는 바이러스가 B형 간염 바이러스인 경우 상기 추출된 핵산은 환형 이중-가닥(ds) DNA이며, 핵산을 추출하고자 하는 바이러스가 C형 간염 바이러스인 경우 상기 추출된 핵산은 단일 가닥(ss) RNA이다.
이하, 본 발명에 따른 세포 용해 조성물에 사용되는 필수 성분들을 설명한다.
(1) 구아니딘 티오시아네이트( GuSCN )
본 발명의 조성물에서 구아니딘 티오시아네이트(또는 구아니디늄 티오시아네이트)는 카오트로픽(chaotropic) 물질로서 사용된다. 상기 카오트로픽 물질은 단백질과 핵산의 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 변경시킬 수 있으며, 최소한 일차적인 구조는 본래 상태로 유지시킬 수 있다. 상기 구아니딘 티오시아네이트는 본 발명에 따른 세포 용해 조성물의 총량을 기준으로 3 내지 6 M의 양으로 포함될 수 있다. 구아니딘 티오시아네이트가 상기 범위에 포함될 때, A형, B형 또는 C형 간염 바이러스를 효과적으로 용해시킬 수 있다.
(2) 소디움 도데실 설페이트( SDS )
본 발명의 조성물에서 소디움 도데실 설페이트는 세포막을 용해시키는 세제(detergent) 또는 세포 용해 완충액으로 사용된다. 소디움 도데실 설페이트는 CH3(CH2)11OSO3Na의 화학식을 갖는 유기 화합물로서 많은 세정 및 위생 제품에서 음이온성 계면활성제로 사용되고 있다.
상기 소디움 도데실 설페이트는 본 발명에 따른 세포 용해 조성물의 총량을 기준으로 0.5 내지 1.5 부피%의 양으로 포함될 수 있다. 소디움 도데실 설페이트가 상기 범위에 포함될 때, A형, B형 또는 C형 간염 바이러스를 효과적으로 용해시킬 수 있을 뿐만 아니라, PCR 반응에 도움을 주며, 핵산 추출 후 불순물(예컨대, 잔존 세제)의 양을 현저히 감소시킬 수 있다.
(3) 트리톤 X-100( TX )
본 발명의 조성물에서 트리톤 X-100은 세포막을 용해시키는 세제(detergent) 또는 세포 용해 완충액으로 사용된다. 트리톤 X-100은 친수성 폴리에틸렌 옥사이드 그룹과 탄화수소 친유성 또는 소수성 그룹을 갖는 비이온성 계면활성제이다.
상기 트리톤 X-100은 본 발명에 따른 세포 용해 조성물의 총량을 기준으로 10 내지 20 부피%의 양으로 포함될 수 있다. 트리톤 X-100이 상기 범위에 포함될 때, A형, B형 또는 C형 간염 바이러스를 효과적으로 용해시킬 수 있을 뿐만 아니라, PCR 반응에 도움을 주며, 핵산 추출 후 불순물(예컨대, 잔존 세제)의 양을 현저히 감소시킬 수 있다.
(4) 완충제
본 발명의 조성물에서 완충제는 전술한 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN), 소디움 도데실 설페이트(SDS) 및 트리톤 X-100(TX)를 용해시키고, 세포 용해 조성물의 pH를 유지시키는 역할을 한다.
상기 완충제로는 시트레이트, 글리신 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 시트레이트 완충제가 사용될 수 있다. 시트레이트 완충제는 0.05 내지 1 M의 농도로 사용될 수 있으며, 적정 pH는 3 내지 5의 범위일 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 세포 용해 조성물은 염화나트륨 또는 단백질 가수분해효소를 추가로 포함할 수 있다.
염화나트륨은 SDS 및 트리톤 X-100의 임계 미셀 농도(Critical Micelle Concentration)를 낮춰 세포 용해 기능을 강화시킬 수 있다. 상기 염화나트륨은 전체 조성물의 총량을 기준으로 10 내지 50 mM의 양으로 사용될 수 있다.
단백질 가수분해효소는 바이러스 단백질을 파괴하는 보조 역할을 하며, 예를 들어 단백질 가수분해효소 K(proteinase K) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단백질 가수분해효소는 전체 조성물의 총량을 기준으로 100 내지 100,000 유닛의 양으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 용해 조성물은 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 과정에 사용될 수 있다.
간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 과정은, 예를 들어 세포 용해 단계, 핵산 결합 단계, 세정 단계 및 핵산 용리 단계로 이루어질 수 있으며, 본 발명에 따른 세포 용해 조성물은 상기 과정 중 세포 용해 단계에 사용될 수 있다. 상기 세포 용해 단계와 핵산 결합 단계는 동시에 이루어질 수 있으며, 본 발명에 따른 세포 용해 조성물은 핵산 결합용 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 간염 바이러스를 포함하는 시료에 세포 용해 조성물과 핵산 결합용 조성물을 혼합하여 세포 용해 및 핵산 결합을 동시에 수행할 수 있다.
상기 핵산 결합용 조성물은 핵산 물질을 가역적으로 결합시킬 수 있는 고체상(solid phase)을 포함할 수 있다. 고체상에 관한 상세한 내용은 본 발명의 상세한 설명 중 '핵산의 추출 방법'에 관한 설명을 참조한다.
또한, 상기 핵산 결합용 조성물은 운반체(carrier) RNA를 포함할 수 있다. 운반체 RNA는 핵산농도가 적을 경우, 상기 고체상에 대한 핵산의 결합력을 증가시켜 주는 역할을 한다. 상기 운반체 RNA의 예로는 폴리-A RNA 운반체(QIAGEN)을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 운반체 RNA는 세포 용해 조성물의 총량을 기준으로 3 내지 6 μg의 양으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 핵산 결합용 조성물은 에탄올을 포함할 수 있다. 상기 에탄올은 고체 표면을 건조시키는 역할을 하며, 세포 용해 조성물의 총량을 기준으로 5 내지 20 부피%의 양으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 용해 조성물은 구아니딘 티오시아네이트, 소디움 도데실 설페이트 및 트리톤 X-100의 상승작용에 의해 A형, B형 및 C형 간염 바이러스로부터의 효율적인 핵산 추출을 가능하게 한다. 본 발명의 세포 용해 조성물은 저농도와 고농도의 간염 바이러스 시료로부터의 운반체 RNA의 회수능력을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 용해 조성물은 잔존 불순물(예컨대, 세제)의 양을 현저히 감소시킬 수 있고, 그 결과 종래 세포 용해 조성물을 사용할 때보다 더 적은 양의 세정용 조성물을 사용하여도 불순물의 충분한 제거가 가능하다.
본 발명은 (1) 간염 바이러스가 포함된 시료를, 3 내지 6 M의 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN), 0.5 내지 1.5 부피%의 소디움 도데실 설페이트(SDS), 10 내지 20 부피%의 트리톤 X-100 및 pH 3 내지 5의 완충제를 포함하는 세포 용해 조성물, 및 핵산을 결합시키기 위한 고체상(solid phase)과 혼합하는 단계; (2) 상기 혼합물로부터 핵산이 결합된 고체상을 분리하는 단계; (3) 상기 핵산이 결합된 고체상을 세정용 조성물을 이용하여 세정하는 단계; 및 (4) 상기 핵산이 결합된 고체상으로부터 핵산을 용리하는 단계를 포함하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에서, 단계 (1)은 간염 바이러스를 세포 용해 조성물과 접촉시켜 세포를 용해시키고, 세포로부터 추출된 핵산을 핵산 물질을 가역적으로 결합시킬 수 있는 핵산 결합 고체상(solid phase)에 결합시키는 단계이다.
상기 세포 용해 조성물은 전술한 바와 같으며, 상기 핵산과 결합하는 고체상은 카오트로픽 물질의 존재 하에 핵산과 결합할 수 있는 물질로서, 예를 들어, 실리카 입자를 들 수 있다. 실리카(silica)는 SiO2 결정체 및 다른 형태의 산화 규소, 즉 SiO2, 무정형 산화 규소 및 유리분말로부터 구성된 2원자 골격을 지칭한다. 또한, 알킬실리카, 알루미늄 실리케이트(제올라이트), -NH2를 지닌 활성화된 실리카, 라텍스 입자, 큐벳 또는 미량역가 평판의 내벽을 형성하는 특정한 중합체 물질, 또는 예컨대 니트로셀룰로오스를 포함하는 필터 재료도 본 발명에 따른 핵산-결합 고체상으로서 적합하다. 상기 실리카는 핵산에 고순도로 결합되고 핵산의 용리를 용이하게 할 수 있도록 적절하게 선택된 입자 크기를 가질 수 있으며, 바람직하게는 약 0.05 내지 500 ㎛ 범위일 수 있다. 결합된 핵산을 용이하게 처리하기 위해서 사용되는 실리카 입자들이 주로 0.1 내지 200 ㎛ 범위 내의 입자 크기를 갖는 것이 바람직하고, 또한 사용되는 실리카 입자들이 주로 1 내지 200 ㎛ 범위내의 입자 크기를 갖는 방법이 가장 바람직하다. 상기 실리카 입자는 분리를 용이하게 하기 위해 자성 입자와 결합될 수 있으며, 예를 들어, 실리카 표면을 가진 자성입자가 사용될 수 있다. 상기 실리카 표면을 가진 자성입자는 자석을 이용하여 세포 용해액으로부터 용이하게 분리될 수 있다.
상기 단계 (1)에서, 핵산 결합을 돕기 위한 부가적인 성분이 추가될 수 있다. 상기 성분의 예로는 운반체(carrier) RNA, 에탄올 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 전술한 바와 같이, 운반체 RNA는 상기 고체상에 대한 핵산의 결합력을 증가시켜 주는 역할을 하며, 에탄올은 고체 표면을 건조시키는 역할을 한다.
본 발명에 따른 방법에서, 단계 (2)는 상기 혼합물로부터 핵산이 결합된 고체상을 분리하는 단계이다. 단계 (1)에서 형성된 핵산이 결합된 고체상(핵산-실리카 복합체)은 상기 혼합물로부터, 예를 들면 신속한 침강처리(원심 분리) 및 상충액의 제거(예, 흡인 처리)에 의해 분리될 수 있다. 또한, 고체상으로 실리카 표면을 가진 자성입자가 사용되는 경우, 상기 핵산이 결합된 고체상은 자석을 이용하여 상기 혼합물로부터 분리될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 단계 (3)은 상기 핵산이 결합된 고체상을 세정용 조성물을 이용하여 세정하는 단계이다.
상기 단계에서 사용되는 세정용 조성물은 에탄올, Tris-HCl 및 염화마그네슘으로 이루어진 세정 용액 I, 에탄올, Tris-HCl 및 염화나트륨으로 이루어진 세정 용액 II 또는 Tris-HCl로 이루어진 세정 용액 III일 수 있으며, 이들 세정 용액은 세정 과정에 순차적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 100% 에탄올이 40% 함유된 50 mM Tris-HCl 및 150 mM의 염화마그네슘으로 구성된 세정 용액 I(pH 6.3), 100% 에탄올이 80% 함유된 50 mM Tris-HCl 및 20 mM의 염화나트륨으로 구성된 세정 용액 II(pH 6.6) 또는 50 mM Tris-HCl로 구성된 세정 용액 III(pH 5.75)이 사용될 수 있으며, 이들 세정 용액은 세정 과정에 순차적으로 사용될 수 있다.
상기 단계는, 예를 들어, 핵산이 결합된 고체상(핵산-실리카 복합체)에 상기 세정용 조성물을 혼합하고 볼텍스 믹서를 사용하여 세정(재분산 또는 균질화처리)한 후, 다시 침강시킴으로써 수행될 수 있다. 이때, 세정 완충액으로 세정한 실리카-핵산 복합체를 다시 알코올-수용액(가장 바람직하게는, 수율 손실을 축소시키기 위해서 약 70%의 에탄올 사용) 및 아세톤으로 연속적으로 세정한 후, 건조(예를 들면, 가열처리)시켜 아세톤을 제거하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에서, 단계 (4)은 상기 핵산이 결합된 고체상으로부터 핵산을 용리하는 단계이다.
상기 단계에서는 단계 (3)에서 세정 및 건조된 실리카-핵산 복합체 내에 존재하는 핵산을 용리 조성물을 사용하여 용리시킨다. 적합한 용리 조성물의 예로는 Tris-HCl 완충액, TE 완충액, 아쿠아 비데스트(aqua bidest) 및 PCR 완충액 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 50 mM Tris-HCl로 구성된 용액(pH 8.37)일 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 세포 용해 조성물, 핵산 결합용 조성물(고체상 포함), 세정용 조성물 및 용리 조성물은 키트(kit)화하여 사용될 수 있으며, 상기 조성물을 이용한 방법은 간염 바이러스가 포함된 시료, 예를 들어 혈청 시료로부터 A형, B형 또는 C형 간염 바이러스의 DNA와 RNA를 동시에 간단하게 추출 및 정제할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포 용해 조성물의 제조
0.1M 시트레이트 완충액(pH 4.4, 시그마-알드리치)에 0.58 부피%의 소디움 도데실 설페이트(SDS; 시그마-알드리치), 10 부피%의 트리톤 X-100(Triton X-100; 시그마-알드리치) 및 3 M의 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN)를 용해시켜 세포 용해 조성물을 제조하였다.
비교예 1: 세포 용해 조성물의 제조
실시예 1에서 트리톤 X-100 및 소디움 도데실 설페이트를 사용하지 않고, 구아니딘 티오시아네이트만으로 구성된 세포 용해 조성물을 제조하였다.
비교예 2: 세포 용해 조성물의 제조
실시예 1에서 트리톤 X-100을 사용하지 않고, 구아니딘 티오시아네이트 및 소디움 도데실 설페이트만으로 구성된 세포 용해 조성물을 제조하였다.
실험예 1: C형 간염 바이러스로부터의 핵산 추출
중앙대학교 혈액센터로부터 입수한 C형 간염 바이러스를 포함하는 양성 혈청 10개를 섞은 다음, 이를 중앙대학교 혈액센터로부터 입수한 음성 혈청을 이용하여 1/10 또는 1/5의 희석 배율로 희석하여 각각 200 ㎕의 시료 용액을 준비하였다.
상기 바이러스 시료 용액 200 ㎕에 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에서 제조된 세포 용해 조성물 378 ㎕를 각각 첨가하고, 핵산 결합 고체상으로서 20 ㎕의 실리카(Silica) 표면을 가진 자성입자 용액, 10 ㎕의 단백질 가수분해효소(Proteinase K; 20 mg/mL), 6 ㎕의 운반용 RNA(Carrier RNA; 1 ㎍/1 ㎕) 및 170 ㎕의 에탄올(100%)을 첨가한 후, 56℃에서 20분간 방치하여 C형 간염 바이러스를 용해시켰다.
한편, 100% 에탄올이 40% 함유된 50 mM Tris-HCl 및 150 mM의 염화 마그네슘으로 구성된 세정 용액 I(pH 6.3), 100% 에탄올이 80% 함유된 50 mM Tris-HCl 및 20 mM의 염화나트륨으로 구성된 세정 용액 II(pH 6.6) 및 50 mM Tris-HCl로 구성된 세정 용액 III(pH 5.75)을 준비하고, 50 mM Tris-HCl로 구성된 핵산 용리 용액(pH 8.37)을 준비하였다.
자석을 이용하여 바이러스 용해물 내에 존재하는 실리카 표면을 가진 자성입자를 채집한 후, 이를 세정용액 I 500 ㎕에 넣어 2분간 방치하였다. 이후 실리카 표면을 가진 자성입자를 다시 자석을 이용하여 채집한 후, 이를 세정 용액 II 500 ㎕에 넣어 2분간 방치하였다. 이후 실리카 표면을 가진 자성입자를 다시 자석을 이용하여 채집한 후, 이를 세정 용액 III 500 ㎕에 넣어 30초간 방치하였다. 이후 실리카 표면을 가진 자성입자를 다시 자석을 이용하여 채집한 후, 이를 용리 용액에 넣어 5분간 방치하여 RNA를 실리카 표면을 가진 자성입자로부터 용리시켰다.
상기 용리된 RNA를 자외선 및 가시광선 분광분석법(Nanodrop 1000, Thermo, US)으로 확인하였다.
상기 실험 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1A는 260 nm에서 측정된 값으로서, 추출된 RNA의 양, 즉 핵산의 용리된 수준을 의미하고, 도 1B는 350 nm 내지 400 nm에서 측정된 평균값으로서, 용리된 용액의 불순물 정도, 즉 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준을 의미한다.
도 1A에서 보는 바와 같이, 구아니딘 티오시아네이트만을 함유한 비교예 1의 세포 용해 조성물과 구아니딘 티오시아네이트 및 소디움 도데실 설페이트를 함유한 비교예 2의 세포 용해 조성물과 비교하여, 구아니딘 티오시아네이트, 소디움 도데실 설페이트 및 트리톤 X-100을 함유한 실시예 1의 세포 용해 조성물을 이용하여 핵산을 추출하는 경우 핵산 용리 수준이 가장 높음을 알 수 있었다.
또한, 도 1B에서 보는 바와 같이, 비교예 1 및 비교예 2의 세포 용해 조성물과 비교하여, 실시예 1의 세포 용해 조성물을 이용하여 핵산을 추출하는 경우 용리된 용액 내 불순물 수준이 가장 낮은 것으로 확인되었다.
상기 결과는 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN), 소디움 도데실 설페이트(SDS) 및 트리톤 X-100(Triton X-100)으로 구성된 핵산 용해 조성물을 이용하여 C형 간염 바이러스로부터 보다 효과적으로 핵산을 추출할 수 있음을 보여준다.
실험예 2: A형 간염 바이러스로부터의 핵산 추출
중앙대학교 혈액센터로부터 입수한 A형 간염 바이러스를 포함하는 양성 혈청을 이용하여 실험예 1과 동일한 방법으로 핵산을 추출하였다. 다만, 핵산 추출 과정에서 실시예 1의 세포 용해 조성물의 핵산 추출 효율을 비교예 2의 세포 용해 조성물의 핵산 추출 효율과 비교하였다.
용리된 RNA를 자외선 및 가시광선 분광분석법(Nanodrop 1000, Thermo, US)으로 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2A는 260 nm에서 측정된 값으로서, 추출된 RNA의 양, 즉 핵산의 용리된 수준을 의미하고, 도 2B는 350 nm 내지 400 nm에서 측정된 평균값으로서, 용리된 용액의 불순물 정도, 즉 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준을 의미한다.
도 2A에서 보는 바와 같이, 구아니딘 티오시아네이트 및 소디움 도데실 설페이트를 함유한 비교예 2의 세포 용해 조성물과 비교하여, 구아니딘 티오시아네이트, 소디움 도데실 설페이트 및 트리톤 X-100을 함유한 실시예 1의 세포 용해 조성물을 이용하여 핵산을 추출하는 경우 핵산 용리 수준이 현저히 높음을 알 수 있었다.
또한, 도 2B에서 보는 바와 같이, 비교예 2의 세포 용해 조성물과 비교하여, 실시예 1의 세포 용해 조성물을 이용하여 핵산을 추출하는 경우 용리된 용액 내 불순물 수준이 현저히 낮은 것으로 확인되었다.
상기 결과는 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN), 소디움 도데실 설페이트(SDS) 및 트리톤 X-100(Triton X-100)으로 구성된 핵산 용해 조성물을 이용하여 A형 간염 바이러스로부터 보다 효과적으로 핵산을 추출할 수 있음을 보여준다.
실험예 3: B형 간염 바이러스로부터의 핵산 추출
중앙대학교 혈액센터로부터 입수한 B형 간염 바이러스를 포함하는 양성 혈청을 이용하여 실험예 1과 동일한 방법으로 핵산을 추출하였다. 다만, 핵산 추출 과정에서 실시예 1의 세포 용해 조성물의 핵산 추출 효율을 비교예 2의 세포 용해 조성물의 핵산 추출 효율과 비교하였다.
용리된 DNA를 자외선 및 가시광선 분광분석법(Nanodrop 1000, Thermo, US)으로 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3A는 260 nm에서 측정된 값으로서, 추출된 DNA의 양, 즉 핵산의 용리된 수준을 의미하고, 도 3B는 350 nm 내지 400 nm에서 측정된 평균값으로서, 용리된 용액의 불순물 정도, 즉 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준을 의미한다.
도 3A에서 보는 바와 같이, 구아니딘 티오시아네이트 및 소디움 도데실 설페이트를 함유한 비교예 2의 세포 용해 조성물과 비교하여, 구아니딘 티오시아네이트, 소디움 도데실 설페이트 및 트리톤 X-100을 함유한 실시예 1의 세포 용해 조성물을 이용하여 핵산을 추출하는 경우 핵산 용리 수준이 현저히 높음을 알 수 있었다.
또한, 도 3B에서 보는 바와 같이, 비교예 2의 세포 용해 조성물과 비교하여, 실시예 1의 세포 용해 조성물을 이용하여 핵산을 추출하는 경우 용리된 용액 내 불순물 수준이 현저히 낮은 것으로 확인되었다.
상기 결과는 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN), 소디움 도데실 설페이트(SDS) 및 트리톤 X-100(Triton X-100)으로 구성된 핵산 용해 조성물을 이용하여 B형 간염 바이러스로부터 보다 효과적으로 핵산을 추출할 수 있음을 보여준다.
비교예 3: 트리톤 X-100의 함량을 달리한 세포 용해 조성물의 제조
본 발명에 따른 세포 용해 조성물의 성분 중에서 트리톤 X-100의 함량에 따른 핵산 추출 효율을 비교하기 위하여, 실시예 1에서 트리톤 X-100의 함량을 1 부피%로 변경하여 비교예 3의 세포 용해 조성물을 제조하였다.
실험예 4: 트리톤 X-100의 함량에 따른 핵산 추출 효율 분석
트리톤 X-100의 함량을 달리하여 제조된 실시예 1 및 비교예 3의 세포 용해 조성물을 이용하여, A형, B형 및 C형 간염 바이러스 시료로부터 각각 핵산을 추출하였다.
실험예 1 내지 3에서와 같이, A형 간염 바이러스(150,000 바이러스/ml), B형 간염 바이러스(360 IU/ml), 및 C형 간염 바이러스(1.3 S/co)를 상기 실시예 1 및 비교예 3의 세포 용해 조성물을 이용하여 용해시키고, 세정 및 용리하여 핵산을 추출하였다. 그리고 나서, 상기 용리된 핵산을 SyBr green 형광 신호 또는 Taqman 형광 신호를 이용하여 하기 표 1의 조건에 따라 PCR(light cycler 480, 로슈)에 의해 증폭시켰다.
이후, 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 순환 주기 값(Ct)을 비교하였다. Ct는 PCR 반응 중 처음으로 나타나는 형광 신호에 대한 사이클 수를 의미한다. PCR 반응 중 초기 주형이 되는 DNA 수가 많을수록 Ct 값이 낮게 나오고, 주형이 되는 DNA 수가 적을수록 Ct 값이 높게 나타난다. 즉, 핵산 추출 효율이 높을수록 Ct 값은 낮게 나타나므로, Ct 값을 통해 핵산 추출 효율을 분석할 수 있다.
A형 간염 바이러스 B형 간염 바이러스 C형 간염 바이러스
프라이머 정방향: AATGGATCCGTAGGAGTCTAAATTGGGGA (서열번호 1)
역방향: CGGCGTTGAATGGTTTTT
(서열번호 2)		 정방향: ACGTCCTTTGTTTACGTCCCGT (서열번호 3)
역방향: CCCAACTCCTCCCAGTCCTTAA (서열번호 4)		 정방향: ATAGTGGTCTGCGGAACC
(서열번호 5)
역방향: CAAGCACCCTATCAGGCAG (서열번호 6)
형광신호 SyBr Green SyBr Green Taqman (FAM)
PCR
조건
(45 사이클)		 예열 95℃ (5분) 95℃ (5분) 50℃-95℃
(10분-30초)
증폭 95℃-60℃-72℃
(10초-10초-10초)		 95℃-60℃-72℃
(10초-10초-15초)		 95℃-60℃
(15초-35초)
용융 95℃-65℃
(5초-1분)		 95℃-65℃
(5초-1분)		 -
해열 40℃ (30초) 40℃ (30초) 40℃ (30초)
상기 실험 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, A형, B형 및 C형 간염 바이러스의 경우 10 부피%의 트리톤 X-100을 함유한 실시예 1의 세포 용해 조성물을 사용하였을 때가 1 부피%의 트리톤 X-100을 함유한 비교예 3의 세포 용해 조성물을 사용한 때보다 Ct 값이 더 낮았다. 상기 결과는 트리톤 X-100을 10 부피%의 함량으로 사용하는 것이 핵산 추출 효율면에서 바람직하다는 것을 보여준다.
실시예 2: SDS 의 함량을 달리한 세포 용해 조성물의 제조
본 발명에 따른 세포 용해 조성물의 성분 중에서 SDS의 함량에 따른 핵산 추출 효율을 비교하기 위하여, 실시예 1에서 SDS를 1 부피%로 변경하여 실시예 2의 세포 용해 조성물을 제조하였다.
비교예 4: SDS 의 함량을 달리한 세포 용해 조성물의 제조
실시예 1에서 SDS를 0.1 부피%로 변경하여 비교예 4의 세포 용해 조성물을 제조하였다.
실험예 5: SDS 의 함량에 따른 핵산 추출 효율 분석
SDS의 함량을 달리하여 제조된 실시예 2 및 비교예 4의 세포 용해 조성물을 이용하여, A형 간염 바이러스 시료로부터 각각 핵산을 추출하였다.
상기 용리된 RNA를 자외선 및 가시광선 분광분석법(Nanodrop 1000, Thermo, US)으로 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5A는 260 nm에서 측정된 값으로서, 추출된 RNA의 양, 즉 핵산의 용리된 수준을 의미하고, 도 5B는 350 nm 내지 400 nm에서 측정된 평균값으로서, 용리된 용액의 불순물 정도, 즉 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준을 의미한다.
도 5에서 보는 바와 같이, SDS를 0.1 부피%의 양으로 포함하는 비교예 4의 세포 용해 조성물에 비해 SDS를 1 부피%의 양으로 포함하는 실시예 2의 세포 용해 조성물을 사용하여 핵산 추출시 핵산 용리 수준 및 핵산 정제 수준이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 SDS를 0.5 내지 1.5 부피%의 함량 범위로 사용하는 것이 핵산 추출 효율면에서 바람직하다는 것을 보여준다.
실시예 3: GuSCN 의 함량을 달리한 세포 용해 조성물의 제조
본 발명에 따른 세포 용해 조성물의 성분 중에서 GuSCN의 함량에 따른 핵산 추출 효율을 비교하기 위하여, 실시예 1에서 GuSCN을 5 M로 변경하여 실시예 3의 세포 용해 조성물을 제조하였다.
비교예 5: GuSCN 의 함량을 달리한 세포 용해 조성물의 제조
실시예 1에서 GuSCN을 2 M로 변경하여 비교예 5의 세포 용해 조성물을 제조하였다.
실험예 6: GuSCN 의 함량에 따른 핵산 추출 효율 분석
GuSCN의 함량을 달리하여 제조된 실시예 3 및 비교예 5의 세포 용해 조성물을 이용하여, A형 간염 바이러스 시료로부터 각각 핵산을 추출하였다.
상기 용리된 RNA를 자외선 및 가시광선 분광분석법(Nanodrop 1000, Thermo, US)으로 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6A는 260 nm에서 측정된 값으로서, 추출된 RNA의 양, 즉 핵산의 용리된 수준을 의미하고, 도 6B는 350 nm 내지 400 nm에서 측정된 평균값으로서, 용리된 용액의 불순물 정도, 즉 용리된 핵산 용액 내 불순물 수준을 의미한다.
도 6에서 보는 바와 같이, GuSCN을 2 M로 포함하는 비교예 5의 세포 용해 조성물에 비해 GuSCN을 5 M로 포함하는 실시예 3의 세포 용해 조성물을 사용하여 핵산 추출시 핵산 용리 수준 및 핵산 정제 수준이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 GuSCN을 3 내지 6 M의 범위로 사용하는 것이 핵산 추출 효율면에서 바람직하다는 것을 보여준다.
실험예 7: 세정 용액 II 의 성분에 따른 핵산 추출 효율 분석
본 발명에 따른 핵산이 결합된 고체상을 세정하는 과정에서 두 번째로 사용되는 세정 용액 II의 성분에 따른 핵산 추출 효율을 살펴보기 위하여, Tris-HCl을 기반으로 80%의 알코올이 포함된 세정 용액 II 및 여기에 20 mM의 염화나트륨이 첨가된 세정 용액 II를 제조한 후, 이를 이용하여 실험예 2와 동일한 방법으로 A형 간염 바이러스 시료로부터 핵산을 추출하였다. 이후, 실험예 1에 기재된 과정과 마찬가지로 핵산 용액 내 불순물 수준을 측정하였고, 실험예 4에 기재된 과정과 마찬가지로 Ct 값을 측정하였다. 상기 측정 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7A에서 보는 바와 같이, 20 mM의 염화나트륨을 함유한 세정 용액 II를 이용하여 세정하는 경우, A형 간염 바이러스의 가장 높은 농도인 150000 virus/ml에서 불순물 수준이 가장 낮게 측정되어, 세정 용액 II에 염화나트륨을 포함시킴으로써 더 효과적으로 핵산을 정제할 수 있음을 확인하였다.
또한, 도 7B에 나타난 바와 같이, 20 mM의 염화나트륨을 포함한 세정 용액 II를 사용한 경우에, 모든 농도(1500 바이러스/ml ~ 150000 바이러스 /ml)의 A형 간염 바이러스로의 핵산으로부터 얻은 Ct 값이 염화나트륨을 포함하지 않은 세정 용액에 비해 더 낮게 측정되어, 20 mM의 염화나트륨을 포함한 세정 용액이 핵산 추출에 더 효과적임을 확인할 수 있었다.
<110> SK TELECOM CO., LTD <120> CELL LYSIS COMPOSITION FOR EXTRACTING NUCLEIC ACID FROM HEPATITIS VIRUS <130> FPD/201309-0033 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of HAV nucleic acid <400> 1 aatggatccg taggagtcta aattgggga 29 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of HAV nucleic acid <400> 2 cggcgttgaa tggttttt 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of HBV nucleic acid <400> 3 acgtcctttg tttacgtccc gt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of HBV nucleic acid <400> 4 cccaactcct cccagtcctt aa 22 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of HCV nucleic acid <400> 5 atagtggtct gcggaacc 18 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of HCV nucleic acid <400> 6 aatggatccg taggagtcta aattgggga 29

Claims (11)

  1. (a) 3 내지 6 M의 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN);
    (b) 0.5 내지 1.5 부피%의 소디움 도데실 설페이트(SDS);
    (c) 10 내지 20 부피%의 트리톤 X-100; 및
    (d) pH 3 내지 5의 완충제
    를 포함하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하기 위한 세포 용해(lysis) 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 간염 바이러스가 A형, B형 또는 C형 간염 바이러스인 것을 특징으로 하는 세포 용해 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 완충제가 시트레이트 완충제인 것을 특징으로 하는 세포 용해 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 염화나트륨, 단백질 가수분해효소 또는 이 둘을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 용해 조성물.
  5. (1) 간염 바이러스가 포함된 시료를, 3 내지 6 M의 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN), 0.5 내지 1.5 부피%의 소디움 도데실 설페이트(SDS), 10 내지 20 부피%의 트리톤 X-100 및 pH 3 내지 5의 완충제를 포함하는 세포 용해 조성물, 및 핵산을 결합시키기 위한 고체상(solid phase)과 혼합하는 단계;
    (2) 상기 혼합물로부터 핵산이 결합된 고체상을 분리하는 단계;
    (3) 상기 핵산이 결합된 고체상을 세정용 조성물을 이용하여 세정하는 단계; 및
    (4) 상기 핵산이 결합된 고체상으로부터 핵산을 용리하는 단계
    를 포함하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 간염 바이러스가 A형, B형 또는 C형 간염 바이러스인 것을 특징으로 하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 고체상이 실리카 입자인 것을 특징으로 하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 단계 (1)에 운반체(carrier) RNA, 에탄올 또는 이 둘을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 세정용 조성물이 에탄올, Tris-HCl 및 염화마그네슘으로 이루어진 세정 용액 I, 에탄올, Tris-HCl 및 염화나트륨으로 이루어진 세정 용액 II 또는 Tris-HCl로 이루어진 세정 용액 III인 것을 특징으로 하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세정 용액 I, 세정 용액 II 및 세정 용액 III이 순차적으로 세정에 사용되는 것을 특징으로 하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법.
  11. 제5항에 있어서, 상기 단계 (4)가 Tris-HCl 완충액, TE 완충액, 아쿠아 비데스트(aqua bidest) 및 PCR 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용리 조성물을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 간염 바이러스로부터 핵산을 추출하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113186249A (zh) * 2020-08-31 2021-07-30 上海科华生物工程股份有限公司 一种病毒核酸的快速提取试剂盒及其使用方法
WO2022154214A1 (ko) * 2021-01-15 2022-07-21 (주)진이어스 컬럼 방식의 단일튜브 pcr용 핵산 분리를 위한 버퍼 조성물 및 이의 용도

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