CN101250522A - 改进高盐法提取线粒体dna的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种在高盐法的基础上改进的高盐法提取基因组和线粒体DNA的方法及其应用。本改进高盐法提取线粒体DNA的方法中使用包含异硫氰酸胍、盐酸胍等的蛋白变性剂进行细胞裂解，不仅具有沉淀蛋白质的作用，还具有抑制核酸酶的作用，可以大大提高DNA的纯度和产量。结合吸附柱使用后更为快速，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成，多次柱漂洗确保高纯度，可直接用于PCR、Southern－blot和各种酶切反应。该方法操作简便、成本低，尤其适用于从临床标本中(特别是外周血中)快速提取基因组和线粒体DNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA提取的方法，是一种从细胞中提取染色体DNA和细胞器DNA的方法，特别是涉及到线粒体DNA提取的方法及其应用。
背景技术
细胞中重要的细胞器线粒体在细胞凋亡、衰老及程序化死亡中发挥有重要作用。现已在多种疾病中发现患者细胞的线粒体DNA(mtDNA)发生突变。对此线粒体疾病的分子遗传机理的研究可以进一步阐明这些疾病的病因，并为治疗提供理论指导。将此mtDNA从细胞中分离提取出来是最基本的工作。胡义德、Tamura和Palva等用碱变性法提取了人血白细胞、心肌等组织中的mtDNA；戴纪刚等建立了Triton法，先除去细胞核，再分离提取胞浆中的mtDNA。还有常用的高盐法通过SDS(十二烷基硫酸钠)破坏细胞膜、核膜，使蛋白质变性，从而游离出核酸，EDTA抑制细胞中DNA酶的活性，蛋白酶K进一步将蛋白质降解成小肽，加入饱和乙酸钠后，绝大部分线性大分子量DNA和蛋白质在SDS作用下变性形成沉淀，环状mtDNA仍为自然状态，通过高速离心，即可得到mtDNA。此3种方法各有优缺点：碱变性法操作时间较短，但要求条件比较严格，不易重复，不适合临床大批量应用；Triton法通过核质分离提取mtDNA操作时间较短，但产量低，易降解。而高盐法操作简单，但一般常用的高盐主要是氯化钠，醋酸钠等，只具有沉淀DNA的作用，所提取的mtDNA纯度较低，质量不易控制。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种在高盐法的基础上改进的高盐法提取线粒体DNA的方法及其应用。本改进高盐法提取线粒体DNA的方法中除了使用醋酸钠等盐类外，还在裂解细胞时同时使用了异硫氰酸胍、盐酸胍等蛋白变性剂，其具有去除细胞内蛋白质的作用，可以大大提高其后步骤中提取线粒体DNA的纯度。
一种改进高盐法提取线粒体DNA的方法，包括以下步骤：
(1)细胞清洗：取100～300μl的分离好的细胞或组织匀浆液，加入20～900μl细胞清洗液，所述细胞清洗液为pH7.4的PBS缓冲液或生理盐水，温和条件下混匀，室温或冰浴约10分钟，在8000～10000rpm转速下离心20～30秒，弃上清，重复上述步骤一或两次后，得沉淀物A；
(2)细胞裂解：向所述沉淀物A中加入约300μl的含有浓度为1～10mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍的细胞裂解液，温和振荡或反复用移液器吸打沉淀物A 4～6次，在8000～10000rpm转速下离心约30秒，取上清液B，弃沉淀物；
(3)乙醇或异丙醇沉淀：向所述上清液B中加入1/10其体积的浓度为3mol/L的pH5.2的NaAc溶液和2倍于其体积的乙醇或直接加入等体积的异丙醇，充分混匀，得混合物C；
(4)将所述混合物C在12000～14000rpm转速下离心5分钟，弃上清，再用75％乙醇重悬沉淀，12000～14000rpm转速下离心5分钟，弃上清，室温放置5～10分钟后，加入约25μl TE缓冲液，所述TE缓冲液为pH7.2的0.01M Tris.HCl和0.01M EDTA，混匀，50℃保温5～10分钟，在12000～14000rpm转速下离心约1分钟，吸取上清，即得到所提取的线粒体DNA。
本发明改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其中所述步骤(2)中的细胞裂解液的基础成分为0.5％的NP-40裂解液，其包括50mM Tris.HCl、15mM NaCl、5mM EDTA、0.5％NP-40和1mM PMSF，pH 6.8，用时配制好后再加入异硫氰酸胍或盐酸胍，使其浓度为1～10mol/L；也可以采用其他已知的可以破除细胞膜和核膜的常用裂解溶液。
本发明改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其中所述步骤(1)和步骤(2)之间还包括步骤：加入约20μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液。可以更好地去除蛋白质。
本发明改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其中所述步骤(2)中在加入含有异硫氰酸胍或盐酸胍的细胞裂解液反复振荡后再向沉淀物A中加入10～20μl的25mg/ml的RNA酶A，室温放置约10分钟，再加入约800μl浓度为4mol/L的NaClO4溶液，调节PH5.2，加入约20μl树脂，混匀，室温放置约5分钟后再离心取上清液B。
本发明改进高盐法提取线粒体DNA的方法，所述步骤(4)为以下步骤所替代：将所述混合物C全部加入一个离心管式吸附柱中，所述吸附柱放入收集管中，在13000rpm转速下离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，加入约500μl抑制物去除液，所述抑制物去除液为50％异丙醇水溶液，在12000rpm转速下离心30秒，弃废液，再加入约700μl漂洗液，所述漂洗液为75％无水乙醇和3M NaAc的混合溶液，在12000rpm转速下离心30秒，弃掉废液，再加入500μl漂洗液，在12000rpm转速下离心30秒，弃掉废液，然后将吸附柱放至原先的收集管中，在13000rpm转速下离心2分钟，尽量除去漂洗液，取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附柱的吸附膜的中间部位加50μl已在65～70℃水浴中预热的洗脱缓冲液TE，室温放置3～5分钟，在12000rpm转速下离心1分钟，将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2分钟，在12000rpm转速下离心1分钟，吸取上清，即得到所提取的线粒体DNA。
本发明改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其中所述吸附柱的芯材料包括尼龙膜、硅胶膜或硝酸纤维素膜。
本发明的改进高盐法提取线粒体DNA的方法可以使用常规生物学试剂制成试剂盒，直接应用在临床标本中快速提取线粒体DNA。也可以直接应用在临床标本中快速提取线粒体DNA。
本发明改进高盐法提取线粒体DNA的方法是非常方便快速提取线粒体DNA的方法。本方法不需要使用有毒的苯酚等试剂，结合吸附柱使用后更为快速，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成，多次柱漂洗确保高纯度，典型的产量200μl全血可提取出3～6μg，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达30kb～50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。该方法操作简便、成本低，尤其适用于从临床标本中(特别是外周血中)快速提取线粒体DNA。
具体实施方式
实施例1：不同浓度异硫氰酸胍处理与传统高盐法提取线粒体DNA对比：
实验步骤：
(一)新鲜抗凝血或冷冻抗凝血
1.取300μl全血，血液标本最好先去除红细胞，加入900μl红细胞裂解液(0.16M NH4Cl，0.13mM EDTA，12mM NaHCO3；16.96mmol/L Tris，用1mol/L HCL调PH至7.2，也可以直接采用商品化的红细胞裂解液)温和混匀5～6次，室温或冰浴10分钟，8000rpm离心20～30秒，弃上清。若红细胞溶解不完全，则沉淀物发红，可再加900μl红细胞裂解液，重复上述步骤一次。若全血在使用之前被冷冻，则需重复步骤1、2两次。
2.沉淀物中加入300μl细胞清洗液，所述细胞清洗液为pH7.4的PBS缓冲液，温和条件下混匀，室温或冰浴约10分钟，在8000rpm转速下离心20～30秒，弃上清，重复上述步骤一或两次后，得沉淀物。
3.加入300μl含有不同浓度的异硫氰酸胍(1，3，5，7，10mol/L)的细胞裂解液，温和振荡或反复用移液器吸打白色沉淀物4～6次，加入10μlRNA酶A(25mg/ml)，室温放置10分钟。其中细胞裂解液的基础成分为0.5％的NP-40裂解液，其包括50mM Tris.Cl、15mM NaCl、5mM EDTA、0.5％NP-40和1mM PMSF，pH 6.8，用时配制好后再加入异硫氰酸胍，使其浓度为1，3，5，7，10mol/L。
4.再加入800μl 4mol/L NaClO4 PH5.2，20μl树脂，混匀，室温放置5分钟。
5.8000rpm离心30秒，取上清，弃沉淀物。
6.向上清中加入1/10其体积的浓度为3mol/L的pH5.2的NaAc溶液，以及2倍于其体积的75％乙醇，充分混匀，得混合物。
7.将所述混合物在12000转速下离心5分钟，弃上清，得沉淀物；
8.用75％乙醇重悬沉淀，12000转速下离心5分钟，弃上清，室温放置5～10分钟后，加入约25μl TE(0.01M TrisHCl pH7.2，0.01M EDTA)缓冲液，混匀，50℃保温5～10分钟，在12000rpm转速下离心约1分钟，吸取上清，即得到所提取的线粒体DNA。
(二)分离好的白细胞
1.取100μl白细胞，按1∶3的比例加入细胞清洗液，所述细胞清洗液为生理盐水，温和条件下混匀，室温或冰浴约10分钟，在8000rpm转速下离心20～30秒，弃上清，重复上述步骤一或两次后，得沉淀物。
2.加入300μl含有不同浓度的异硫氰酸胍(1，3，5，7，10mol/L)的细胞裂解液，充分混匀，加入10μl RNA酶A(25mg/ml)，室温放置10分钟。
3.其余接(一)的步骤4。
表1：实施例1线粒体DNA提取的结果
| 样本处理方法 | 传统高盐NaAc3mol/L | 前加异硫氰酸胍1mol/L | 前加异硫氰酸胍3mol/L | 前加异硫氰酸胍5mol/L | 前加异硫氰酸胍7mol/L | 前加异硫氰酸胍10mol/L |
| DNA量 | 0.23 | 0.19 | 0.24 | 0.28 | 0.29 | 0.26 |
| OD260/280 | 1.73 | 1.81 | 1.84 | 1.92 | 1.95 | 1.93 |
表1结果表明改进的前加异硫氰酸胍的高盐法比传统的高盐法在DNA产量上有所提高，而且DNA质量上也有显著的改善。
实施例2：不同浓度盐酸胍处理与传统高盐法提取线粒体DNA对比
实验步骤：
1.取300μl全血，血液标本最好先去除红细胞，加入900μl红细胞裂解液(0.16M NH4Cl，0.13mM EDTA，12mM NaHCO3；16.96mmol/L Tris，用1mol/L HCL调PH至7.2，也可以直接采用商品化的红细胞裂解液)温和混匀5～6次，室温或冰浴10分钟，8000rpm离心20～30秒，弃上清。若红细胞溶解不完全，则沉淀物发红，可再加900μl红细胞裂解液，重复上述步骤一次。若全血在使用之前被冷冻，则需重复步骤1、2两次。
2.沉淀物中加入300μl细胞清洗液，所述细胞清洗液为pH7.4的PBS缓冲液，温和条件下混匀，室温或冰浴约10分钟，在8000rpm转速下离心20～30秒，弃上清，重复上述步骤一或两次后，得沉淀物。
3.加入300μl含有不同浓度的盐酸胍(1，3，5，7，10mol/L)的细胞裂解液，温和振荡或反复用移液器吸打白色沉淀物4～6次，加入10μlRNA酶A(25mg/ml)，室温放置10分钟。其中细胞裂解液的基础成分为0.5％的NP-40裂解液，其包括50mM Tris.Cl、15mM NaCl、5mM EDTA、0.5％NP-40和1mM PMSF，pH 6.8，用时配制好后再加入盐酸胍，使其浓度为1，3，5，7，10mol/L。
4.再加入800μl 4mol/L NaClO4 PH5.2，20μl树脂，混匀，室温放置5分钟。
5.8000rpm离心30秒，取上清，弃沉淀物。
6.向上清中加入1/10其体积的浓度为3mol/L的pH5.2的NaAc溶液，以及2倍于其体积的75％乙醇，充分混匀，得混合物。
7.将所述混合物在12000转速下离心5分钟，弃上清，得沉淀物；
8.用75％乙醇重悬沉淀，12000转速下离心5分钟，弃上清，室温放置5～10分钟后，加入约25μl TE(0.01M TrisHClpH7.2，0.01M EDTA)缓冲液，混匀，50℃保温5～10分钟，在12000rpm转速下离心约1分钟，吸取上清，即得到所提取的线粒体DNA。
(二)分离好的白细胞
1.取100μl白细胞，按1∶3的比例加入细胞清洗液，所述细胞清洗液为生理盐水，温和条件下混匀，室温或冰浴约10分钟，在8000rpm转速下离心20～30秒，弃上清，重复上述步骤一或两次后，得沉淀物。
2.加入300μl含有不同浓度的盐酸胍(1，3，5，7，10mol/L)的细胞裂解液，充分混匀，加入10μl RNA酶A(25mg/ml)，室温放置10分钟。
3.其余接(一)的步骤4。
表2：实施例2线粒体DNA提取的结果
| 样本处理方法 | 传统高盐NaAc3mol/L | 前加盐酸胍1mol/L | 前加盐酸胍3mol/L | 前加盐酸胍5mol/L | 前加盐酸胍7mol/L | 前加盐酸胍10mol/L |
| DNA量 | 0.23 | 0.21 | 0.24 | 0.28 | 0.29 | 0.26 |
| OD260/280 | 1.73 | 1.77 | 1.81 | 1.88 | 1.91 | 1.89 |
表2结果表明改进的高盐盐酸胍比传统的高盐法在DNA产量上有所提高，而且DNA质量上也有显著的改善。
实施例3：结合使用柱吸附离心法与传统方法的比较
实验步骤：
1、取200μl新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入1.5ml离心管。如果全血起始量小于200μl，则用缓冲液或生理盐水补足到200μl。如果起始量介于200μl～300μl之间，则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μl～1ml之间，则需要先进行红细胞裂解操作。
2、加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl含有5mol/L异硫氰酸胍或盐酸胍的细胞裂解液，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。
可选步骤，一般不需要：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μl细胞裂解液前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5～10分钟。
3、冷却后加入100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
4、将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个柱芯材料采用硅基质吸附膜的吸附柱中，(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心30～60秒，倒掉收集管中的废液。
5、加入500μl抑制物去除液(50％异丙醇水溶液)，12000rpm离心30秒，弃废液。其中抑制物去除液用于去除蛋白酶。
6、加入700μl漂洗液(75％无水乙醇和3M NaAc)，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
7、加入500μl漂洗液，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
8、将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液TE(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好)，室温放置3～5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，收集洗脱液即为DNA样品。
本实施例采用高盐法结合柱离心式吸附柱方法从细胞或组织中提取线粒体DNA(mtDNA)，独特的高盐裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。所得的线粒体DNA纯度为1.8±0.1，得率为每毫升血液0.8～1.0μg线粒体DNA，以此为模板进行PCR反应，扩增线粒体DNA编码基因，产量丰富、特异性高。本实施例所提取的线粒体DNA质量和产量与实施例1、2相似，但是所耗费的时间缩短了大约一半，实施例1、2的所有操作步骤需要大约50～60分钟，而结合吸附柱离心只需要20～30分钟，大大缩短了时间，提高了效率。
本方法所提取得到的线粒体DNA可以存放在2～8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)细胞清洗：取100～300μl的分离好的细胞或组织匀浆液，加入20～900μl细胞清洗液，所述细胞清洗液为pH7.4的PBS缓冲液或生理盐水，温和条件下混匀，室温或冰浴约10分钟，在8000～10000rpm转速下离心20～30秒，弃上清，重复上述步骤一或两次后，得沉淀物A；
(2)细胞裂解：向所述沉淀物A中加入约300μl的含有浓度为1～10mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍的细胞裂解液，温和振荡或反复用移液器吸打沉淀物A 4～6次，在8000～10000rpm转速下离心约30秒，取上清液B，弃沉淀物；
(3)乙醇或异丙醇沉淀：向所述上清液B中加入1/10其体积的浓度为3mol/L的pH5.2的NaAc溶液和2倍于其体积的乙醇或只加入等体积的异丙醇，充分混匀，得混合物C；
(4)将所述混合物C在12000～14000rpm转速下离心5分钟，弃上清，再用75％乙醇重悬沉淀，12000～14000rpm转速下离心5分钟，弃上清，室温放置5～10分钟后，加入约25μl TE缓冲液，所述TE缓冲液为pH7.2的0.01M Tris.HCl和0.01M EDTA，混匀，50℃保温5～10分钟，在12000～14000rpm转速下离心约1分钟，吸取上清，即得到所提取的线粒体DNA。
2.根据权利要求1所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的细胞裂解液的基础成分为0.5％的NP-40裂解液，其包括50mM Tris.HCl、15mM NaCl、5mM EDTA、0.5％NP-40和1mM PMSF，pH 6.8，用时配制好后再加入异硫氰酸胍或盐酸胍，使其浓度为1～10mol/L。
3.根据权利要求2所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)之间还包括步骤：加入约20μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液。
4.根据权利要求3所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)中在加入含有异硫氰酸胍或盐酸胍的细胞裂解液反复振荡后再向沉淀物A中加入10～20μl的25mg/ml的RNA酶A，室温放置约10分钟，再加入约800μl浓度为4mol/L的NaClO4溶液，调节PH5.2，加入约20μl树脂，混匀，室温放置约5分钟后再离心取上清液B。
5.根据权利要求1所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(4)为以下步骤所替代：将所述混合物C全部加入一个离心管式吸附柱中，所述吸附柱放入收集管中，在13000rpm转速下离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，加入约500μl抑制物去除液，所述抑制物去除液为50％异丙醇水溶液，在12000rpm转速下离心30秒，弃废液，再加入约700μl漂洗液，所述漂洗液为75％无水乙醇和3M NaAc的混合溶液，在12000rpm转速下离心30秒，弃掉废液，再加入500μl漂洗液，在12000rpm转速下离心30秒，弃掉废液，然后将吸附柱放至原先的收集管中，在13000rpm转速下离心2分钟，尽量除去漂洗液，取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附柱的吸附膜的中间部位加50μl已在65～70℃水浴中预热的洗脱缓冲液TE，室温放置3～5分钟，在12000rpm转速下离心1分钟，将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2分钟，在12000rpm转速下离心1分钟，吸取上清，即得到所提取的线粒体DNA。
6.根据权利要求5所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述吸附柱的芯材料包括尼龙膜、硅胶膜或硝酸纤维素膜。
7.一种在权利要求1-6中任一项所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法中使用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-6任一项所述的方法中使用的全部试剂，且按照使用的顺序排列。
8.权利要求1-6任一项所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法在临床标本中快速提取线粒体DNA的应用。
9.权利要求7所述的试剂盒在临床标本中快速提取线粒体DNA的应用。
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